CN1759122B - 包含mda-7的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含MDA-7的组合物和方法。更具体地说，本发明涉及治疗癌症和其它新生血管形成相关疾病(抗新生血管形成疗法)的诊断、预后和治疗性组合物和方法。本发明还涉及MDA-7的纯化方法。

Description

包含MDA-7的组合物和方法
背景技术
本申请要求与本发明具有同样的名称和发明人的2003年3月3日提交的美国专利申请No.60/452,257，2003年5月30日提交的美国专利申请No.60/474,529，2003年6月4日提交的美国专利申请No.60/476,159，2003年7月11日提交的美国专利申请No.60/486,862，2003年10月29日提交的美国专利申请No.60/515,285，2003年12月10日提交的美国专利申请No.60/528,506的优先权。这些申请的各个内容完整地本文引入作为参考。
美国政府依据国立癌症研究所授予本发明的基金CA86587，R41CA88421，P01CA78778，P01CA06294，CA70907和P30CA16672而拥有本发明的权利。
A.发明领域
本发明总地涉及分子生物学和基因治疗领域。更具体地说，本发明涉及治疗癌症和其它新生血管形成相关病症(抗新生血管形成治疗)的诊断、预后和治疗性组合物和方法。本发明还涉及MDA-7的纯化方法以及含纯化MDA-7的组合物。
B.相关领域所述
1.新生血管形成(angiogenesis)
血管通过两个过程构建：脉管生成，由此在从多能间质前体细胞的胚胎发生过程中建立了原始血管网络；和新生血管形成，在此过程中已存在的血管发出毛细管芽产生新的血管。内皮细胞在每个过程都扮演主要角色。它们迁移、增殖然后以紧密的细胞-细胞连接组装成血管(Hanahan，1997)。当内皮细胞释放的酶和白细胞开始侵蚀基底膜时，在内皮细胞周围发生新生血管形成使内皮细胞突出于基底膜。然后这些内皮细胞响应血管原性刺激开始迁移，形成血管分枝，并且继续增殖直到这些分枝互相融合形成新的血管。
通常，人类和动物中新生血管形成只在很有限的几种情况下发生，例如胚胎发育、伤口愈合以及黄体、子宫内膜和胎盘的形成。然而，异常的新生血管形成与包括癌转移在内的很多疾病相关。事实上，普遍认为肿瘤的生长依赖于血管生成过程的。因此，增加或降低新生血管形成的能力分别对临床状况例如伤口愈合(例如移植存活)或癌症治疗有重要的意义。
现有几方面的直接证据表明新生血管形成对于实体瘤的生长维持及其转移是必须的(Folkman，1989；Hon等，1991；Kim等，1993；Millauer等，1994)。为了刺激新生血管形成，肿瘤上调它们多种血管原性因子的产生，包括成纤维细胞生长因子(FGF和DTCF)(Kandel等，1991)和血管内皮细胞生长因子/血管渗透性因子(VEGF/VPP)的产生。然而，很多恶性肿瘤也产生新生血管形成抑制因子，包括血管抑素(血管抑素)和血小板反应素(Chen等，1995；Good等，1990；O’Reilly等，1994)。推测血管原性表型是这些新生血管形成的正调控因子和负调控因子之间净平衡的结果(Good等，1990；O’Reilly等，1994；Parangi等，1996；Rastineiad等，1998)。已鉴定到其它几种新生血管形成的内源性抑制剂，虽然不是所有这几种都与肿瘤的存在相关。这些抑制剂包括，血小板因子4(Gupta等，1995；Maione等，1990)，干扰素-α，白细胞介素和/或干扰素-γ诱导的(Voest等，1995)干扰素诱导蛋白质10(Angiolillo等，1995；Strieter等，1995)，gro-β(Cao等，1995)，以及催乳素16kDa的N-末端片段(Clapp等，1993).
2.新生血管形成相关疾病
本发明的方法可用于治疗内皮细胞相关疾病和病症。尤其重要的内皮细胞过程是新生血管形成，即上述的血管形成。利用本发明所述的方法抑制内皮细胞增殖可能能够治疗新生血管形成相关疾病。
新生血管形成相关疾病包括，但不限于，新生血管形成依赖性癌症，包括例如，实体瘤，血源性肿瘤例如白血病，以及肿瘤转移；良性肿瘤，例如血管瘤，听神经瘤，神经纤维瘤，沙眼，以及脓性肉芽肿；类风湿性关节炎；牛皮癣；眼血管原性疾病，例如，糖尿病视网膜病变，早熟性视网膜病，黄斑变性，角膜移植排异，新生血管性青光眼，晶状体后纤维增生，虹膜发红；Osler-Webber综合征；心肌新生血管形成；斑块新生新生血管形成；毛细管扩张症；血友病关节；血管纤维瘤；以及创伤性肉芽肿。本发明的内皮细胞增殖抑制方法可用于内皮细胞过分或异常刺激疾病的治疗。这些疾病包括，但不限于，肠粘连，动脉粥样硬化.硬皮病，以及肥厚性瘢痕，即瘢痕瘤.它们还可用于治疗以新生血管形成为病理结果的疾病，例如猫抓伤疾病(Rochele minalia quintosa)和溃疡(Helobacter pylori)。
3.癌症
正常组织内环境的稳定是一种细胞增殖和死亡高度协调的过程。这种平衡一旦被破坏可能发展成为生癌状态(Solyanik等，1995；Stokke等，1997；Mumby和Walter，1991；Natoli等，1998；Magi-Galluzzi等，1998)。例如，宫颈癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌和脑癌就是这种结果导致的许多癌症中的几种(Erlandsson，1998；Kolmel，1998；Mangray和King，1998；Mougin等，1998)。事实上，肿瘤的发生率很高，仅美国每年死于肿瘤的人数就超过500,000。
原癌基因至少部分地调节细胞增殖和细胞死亡的维持。原癌基因可编码诱导细胞增殖的蛋白质(例如，sis，erbB，src，ras和myc)，抑制细胞增殖的蛋白质(例如，Rb，p16，p19，p21，p53，NF1和WT1)或调节程序性细胞死亡的蛋白质(例如，bcl-2)(Ochi等，1998；Johnson和Hamdy，1998；Liebermann等，1998)。然而，这些原癌基因的遗传重排或突变可能导致原癌基因转变为强烈致癌的癌基因。常常，单点突变就足以使原癌基因转化为癌基因。例如，p53肿瘤抑制蛋白中的点突变可导致野生型p53功能完全丧失(Vogelstein和Kinzler，1992；Fulchi等，1998)并获得显性的肿瘤促进功能。
当前，对于许多普通类型的肿瘤来说几乎没有有效的治疗方案可供选择。不同个体的治疗方案取决于病人的诊断、疾病的发展阶段以及年龄、性别和健康状况等因素。最常规的癌症治疗方案选择是手术治疗、放射治疗和化疗。手术在癌症的诊断和治疗中起着主要作用。一般，需要手术方法来进行活体检查和切除癌生长物。然而，如果癌症已经转移和广泛扩散，手术不可能治愈，必须采取另外的方法。放疗、化疗和免疫治疗是手术治疗的替代方案(Mayer，1998；Ohara，1998；Ho等，1998)。放射治疗包括高能放射的精确瞄准以摧毁癌细胞，与手术很相似，它主要在治疗未转移的局部癌细胞时有效。放射治疗的副作用包括皮肤刺激、吞咽困难、口干、恶心、腹泻、脱发和丧失精力(Curran，1998；Brizel，1998)。
化疗，用抗癌药物治疗癌症，是癌症治疗的另外一种方式。抗癌药物治疗的有效性通常会因为药物难以输送到达实体瘤内而受到限制(el-Kareh和Secomb，1997)。化疗策略依据肿瘤组织生长，其中抗癌药物靶向于快速分裂的癌细胞。大多数化疗方法包括一种以上抗癌药物的联合应用，已证明这样可增加各种癌症的反应率(美国专利5,824,348；美国专利5,633,016和美国专利5,798,339，本文引入作为参考)。化疗药物的主要副作用是它们也影响正常的组织细胞，最可能受影响的细胞是快速分裂的细胞(例如，骨髓、胃肠道、生殖系统和毛囊)。化疗药物的其它毒副作用为口腔溃疡、吞咽困难、口干、恶心、腹泻、呕吐、疲劳、出血、脱发和感染。
免疫疗法，癌症研究中一个进展快速的领域，也是治疗某些类型癌症的可选方案。例如，免疫系统可以将肿瘤细胞识别为外源物质，因此肿瘤细胞成为免疫系统摧毁的目标。不幸的是，免疫应答一般不足以阻止大多数肿瘤的生长。但是，免疫治疗领域最近的研究集中在开发能增强或补充免疫系统天然防御机制的方法。最近正在研究或应用的免疫治疗的例子是免疫佐剂(如牛型结核杆菌、恶性疟原虫、二硝基氯苯和芳香族化合物)(美国专利5,801,005；5,739,169；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides等，1998)，细胞因子治疗(如干扰素，IL-1，GM-CSF和TNF)(Bukowski等，1998；Davidson等，1998；Hellstrand等，1998)和基因治疗(如TNF、IL-1、IL-2、p53)(Qin等，1998；美国专利5,830,880和5,846,945)以及单克隆抗体(如抗神经节苷脂GM2抗体、抗HER-2抗体、抗p185抗体)(Pietras等，1998；Hanibuchi等，1998；美国专利5,824,311)。
4.基因治疗
基因治疗是生物医药研究中一个新出现的领域，其焦点集中在通过将治疗性重组核酸导入患者的体细胞内而治疗疾病。现在有多项基因治疗的临床试验已开始进行，其中包括各种癌症、AIDS、囊性纤维化、腺苷脱氨酶缺乏症、心血管疾病、Gaucher病、类风湿性关节炎等的治疗。目前，腺病毒是运送基因治疗药物的优选运载体。利用腺病毒作为基因治疗药物的优点在于其转导效率高、能感染非分裂细胞、其基因组易于操作以及与宿主基因组发生非同源重组的概率低。
5.细胞因子
IL-10是免疫系统细胞和一些肿瘤细胞产生的多效性同型二聚体细胞因子(Howard等，1992；Ekmekcioglu等，1999)。其免疫抑制功能包括对促炎性细胞因子包括IFNγ、TNFα和IL-6合成的强烈抑制(De WaalMalefyt等，1991)。IL-10样细胞因子家族由1q32染色体上一个很小的195kb基因簇编码，由一些与IL-10结构和序列同源的细胞蛋白质(IL-10，IL-19，IL-20，MDA-7)组成(Moore等，1990；Kotenko等，2000；Gallagher等，2000；Blumberg等，2001；Dumoutier等，2000；Knapp等，2000；Jiang等，1995a；Jiang等，1996)。MDA-7已被鉴定为IL-10家族成员，也称为IL-24。
染色体定位、转录调控、小鼠和大鼠同源物表达以及推定的蛋白质结构都暗示MDA-7是细胞因子(Knapp等，2000；Schaefer等，2000；Soo等，1999；Zhang等，2000)。与GM-CSF，TNFα，和IFNγ的转录物类似，它们在其3’UTR中都含有靶向mRNA使其快速降解的富含AU的元件，MDA-7在其3’UTR有三个AREs(Wang等，2002)。已在人PBMC中鉴定到Mda-7mRNA(Ekmekcioglu等，2001)，虽然以前没有人MDA-7蛋白具有细胞因子功能的报道，但根据其基因和蛋白序列的特征，MDA-7已被命名为IL-24(NCBI数据库登录号：XM_001405)。鼠MDA-7蛋白同源物FISP(IL-4-诱导的分泌蛋白)已报道为是Th2特异性的细胞因子(Schaefer等，2001)。如敲除研究所证实的，TCR和IL-4受体的结合及随后的PKC和STAT6活化可诱导FISP的转录。已分析了FISP的表达特征，但还没有发现这个推定的细胞因子的功能。大鼠MDA-7同源物C49a(Mob-5)与mda-7基因有78％的同源性，已证实与伤口愈合有关(Soo等，1999；Zhang等，2000)。Mob-5也是一种分泌蛋白，鉴定为在大鼠转化细胞上的一种可能的细胞表面受体(Zhang等，2000)。因此，可在各物种中表达和分泌mda-7基因和MDA-7分泌蛋白的同源物。但是，没有数据显示MDA-7具有细胞因子活性。这种活性可通过促进治疗性免疫应答反应或增强抗原的免疫原性用于治疗各种疾病和感染。
发明概述
本发明涉及纯化MDA-7的方法和纯化的MDA-7，以及含MDA-7蛋白质或编码MDA-7的核酸在治疗和预防性治疗以及诊断试验中应用的方法和组合物。
本文提供了纯化MDA-7的多种实施方式。在有些实施方式中，纯化的MDA-7是人MDA-7，可以是全长的、截短的或其片段。在其它实施方式中，MDA-7来自其它动物或来源，例如其它哺乳动物，包括小鼠、大鼠和猴子。在一些实施方式中，MDA-7是糖基化的，而在另外的实施方式中MDA-7是非糖基化的。有些情况下，MDA-7缺少其信号序列，有些情况下，它具有异源信号序列。所有这些MDA-7多肽都可通过本发明的方法纯化。
本文所述的纯化方法产生纯度至少约20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，最高约100％均一的MDA-7蛋白质。或者，将MDA-7蛋白质纯化到至少或至多约20％-95％，30％-90％，40％-80％，50％-75％，20％-50％，50％-70％，50％-90％，70％-90％以及其中的范围。术语“均一性”具有蛋白质纯化领域技术人员所知的通常含义并可理解为指特定蛋白质的纯度水平。当与百分数连用时，指与蛋白质总量相比较时MDA-7蛋白质所占的百分比(以分子)。术语“均一的”是指均一水平的形容词。术语“约”指蛋白质量测定的不精确性，意思包括任何具体试验的至少一个标准差或对测定的蛋白质浓度的校准。例如，如果通过凝胶电泳以考马斯(coomassie)凝胶染色来测定蛋白质浓度和均一性，将MDA-7纯化到至少约25％均一性指置于凝胶上的样品与该分子的总蛋白质浓度比较，是至少25％的MDA-7加减考马斯染料染色的蛋白质凝胶的标准差。
此外，预计纯化的MDA-7组合物可能含有20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，最高约100％活性的MDA-7蛋白质。
在药理或药学上可接受的溶液或组合物的情况下，就均一性而言提到MDA-7纯度时指，与任何污染蛋白质相比较该溶液或组合物中有多少比例是MDA-7，此处污染蛋白质指不想要的或不需要的蛋白质。这种区别意味着排除有意加入该溶液或组合物中的蛋白质的浓度，例如用于诱导针对MDA-7免疫应答反应的免疫原性多肽的蛋白质浓度。
在本发明的很多实施方式中，纯化的MDA-7蛋白质是活性蛋白。术语“活性”通常指纯化的MDA-7蛋白质具有MDA-7的一些活性。这可以用百分比来定量衡量，在一些实施方式中，通过测定MDA-7活性的任何具体试验，纯化的MDA-7蛋白质至少约10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，最高约100％具有对照MDA-7多肽一样的活性。这种活性可定义为包括但不限于下列任何一种：结合活性，功能活性(包括但不限于诱导凋亡，抑制新生血管形成或诱导抗新生血管形成，结合IL-22，激活STAT3，调节PKR，诱导免疫应答反应的能力)，翻译后修饰的能力(糖基化)，形成正确的三级结构的能力，正确定位的能力。
纯化MDA-7蛋白质的方法包括很多可单独使用或相互组合使用的步骤。可从表达重组MDA-7或非重组MDA-7(例如，从内源表达MDA-7的基因组基因)的细胞中纯化得到MDA-7。对于表达重组MDA-7的细胞，宿主细胞型在MDA-7翻译后是否修饰中起作用。在具体的实施方式中，利用能使MDA-7糖基化的真核细胞作为宿主细胞或MDA-7蛋白质的细胞来源。因此，该细胞可以是真核或原核细胞，具体考虑是哺乳动物、昆虫、细菌、人或真菌细胞。在有些实施方式中，制备含有MDA-7蛋白质的细胞提取物或上清并将其用不同的纯化步骤包括层析来纯化。
被纯化的MDA-7可以是该蛋白质的分泌形式，对应于SEQ ID NO：2所确定的全长蛋白质的氨基酸49-206。或者，该纯化的MDA-7可以是全长的，或可以含有一个或多个异源氨基酸区域，例如异源N-末端区域或信号序列。而且，该蛋白质可以糖基化。MDA-7糖基化可能发生在不同位置不同程度。考虑纯化的MDA-7可以是不统一的糖基化。此外，考虑可将MDA-7纯化成为复合物例如二聚体的一部分。
在具体实施方式中，采用亲和层析。在本发明的方法中，亲和层析包含有抗-MDA-7抗体。具体考虑采用抗MDA-7单克隆和多克隆抗体，可采用一种以上的单克隆或多克隆抗体，和同时采用多克隆和单克隆抗体。在其它实施方式中，亲和层析涉及MDA-7和不基于蛋白质序列的其它分子之间的亲和力。本发明的有些方面采用了结合糖基化分子的凝集素。在有些情况下，将具有MDA-7亲和力的基础分子与树脂复合，所述树脂可以是非反应性物质例如琼脂糖。可根据本发明的一些实施方式制作亲和树脂柱。作为本发明方法的一部分，可使细胞提取物或上清通过该树脂。在有些实施方式中，经过含抗体的亲和层析之后，使富集或纯化的蛋白质暴露于结合任何污染性抗体的蛋白质A。可将蛋白质A络合于或结合于非反应性结构例如柱子或珠子，从而使蛋白质A与富集或纯化的MDA-7分离。
可采用的其它类型的层析为离子交换，尤其是阴离子交换层析。此外，层析包括非反应性纯化过程，例如尺寸排斥层析。尺寸排斥包括但不限于，凝胶电泳，利用柱中的珠子进行尺寸排斥，或可分辨分子大小的任何其它类型的非反应性物理结构。在有些情况下，采用至少1，2，3，4，5或更多不同类型的纯化步骤。特别考虑亲和层析结合阴离子交换层析来纯化MDA-7。在另外的实施方式中，还采用尺寸排斥层析。在一实施方式中，将样品进行亲和层析，尺寸排斥层析，然后进行阴离子交换层析。每个层析步骤之后，可在样品中加入蛋白质运载体，和/或可将样品进行透析或尺寸排斥。在有些实施方式中，取决于所用的纯化工艺类型，选择的工艺包括或不包括结合MDA-7的多肽，例如IL-22或IL-20受体或PKR。因此，特别考虑本发明的纯化方法可用于纯化MDA-7单体，MDA-7复合物-糖基化或未糖基化，以及直接或间接结合MDA-7的蛋白质(单体或作为复合物)。
在具体实施方式中，在进行层析之前、过程中或之后加入蛋白质运载体。可在任何层析或其它富集步骤之前将该蛋白质运载体加入细胞提取物或上清中。在有些情况下，在MDA-7从柱子洗脱之后加入运载体使其稳定。在某些实施方式中，所述蛋白质运载体是白蛋白。白蛋白可以有很多种来源包括人。在有些实施方式中，白蛋白是BSA。此外，可在纯化工艺的后续步骤中除去该蛋白质运载体。
在层析过程中，包括阴离子交换和亲和层析中，可使用盐梯度。在本发明的一些实施方式中，可使用盐溶液，浓度为0.05，0.1，0.15，0.20，0.25，0.30.0.35，0.40，0.45，0.50，0.55，0.60，0.65，0.70，0.75，0.80，0.85，0.90，0.95，1.00，1.05，1.10，1.15，1.20.1.25M或更高，可递增多至约0.005，0.010，0.015，0.020，0.025，0.030，0.035，0.040，0.045，0.050，0.055，0.060，0.065，0.070，0.075，0.080，0.085，0.090，0.095，0.100，0.200，0.300，0.400，0.500M或更多。在一些实施方式中，阴离子交换层析包括高至浓度1.0M的盐梯度步骤。在另外的实施方式中，用含盐浓度约0.9M-1.0M的溶液将MDA-7蛋白质从柱子或其它物理结构上洗脱。在本发明的具体实施方式中所用的盐为NaCl。
在层析过程中，可以有一个或更多洗涤步骤。在有些情况下，使树脂与含有MDA-7蛋白质的细胞提取物或上清接触后洗涤树脂。洗涤液可含有缓冲剂和浓度至多约0.05，0.1，0.15，0.20，0.25，0.30.0.35，0.40，0.45，0.50，0.55，0.60，0.65，0.70，0.75，0.80，0.85，0.90，0.95，1.00M或更低的盐。洗涤步骤之后，可进行洗脱步骤。在有些实施方式中，使用含有1M盐pH低于5.0的溶液。洗脱液pH至多约5.0，4.5，4.0，3.5，3.0或更低。
根据本发明的一些实施方式，洗脱之后进行中和步骤。在具体实施方式中，中和步骤包括采用缓冲液。
本发明包括含有用本发明任何方法纯化的MDA-7蛋白质的组合物。纯化的MDA-7蛋白质如上所述认为是本发明的一部分。
纯化的MDA-7蛋白质的使用也是本发明的一部分。在有些实施方式中，抑制患者新生血管形成的方法包括给予患者有效剂量的药学上可接受的含纯化的MDA-7蛋白质的组合物，其中该蛋白质有活性且至少约80％均一。
在其它实施方式中，治疗癌症患者的方法包括给予患者有效剂量的药学上可接受的含纯化MDA-7蛋白质的组合物，其中该蛋白质有活性且至少约80％均一。在另外的实施方式中，所述方法还包括给患者进行放疗或化疗。特别考虑患内皮细胞癌或黑素瘤的癌症患者可得益于本发明的方法。内皮细胞表达能与MDA-7结合的受体。联合放疗和给予MDA-7导致肿瘤相关内皮的凋亡。因此用MDA-7治疗人肿瘤不限于细胞表达MDA-7受体的肿瘤。此外，患有白血病或淋巴瘤的患者因癌细胞表达MDA-7受体也可得益于给予MDA-7。
此外，本发明涉及的方法包括给予患者一种免疫原性分子和含纯化MDA-7蛋白的药学上可接受的组合物，以诱导患者产生抗该免疫原性分子的免疫应答反应，其中该蛋白质有活性且至少约80％均一。术语“均一”指在多大程度上MDA-7蛋白质已纯化到均一。如上所述，该组合物可含有所需要的不认为是污染物的其它蛋白质，因此它们不影响MDA-7纯度含量的任何参数。在本发明另外的实施方式中，患者可对其产生免疫应答反应的免疫原性分子是病毒、细菌、真菌或肿瘤抗原。在另外的实施方式中，给予患者干扰素。该干扰素可以是IFN-α、IFN-β、IFN-γ或λIFN。在另外的实施方式中，给予患者细胞因子或其它免疫刺激分子。
本发明另一方法涉及采用MDA-7蛋白质来诱导拮抗肿瘤的新生血管形成。肿瘤变成血管化，并诱导了肿瘤周围的新生血管形成。本发明使用MDA-7多肽通过诱导抗新生血管形成而抑制或逆转该过程。词组“诱导抗新生血管形成”指血管化的逆转或抑制或对已经开始的新生血管形成的抑制。在有些实施方式中，给予肿瘤患者有效剂量的MDA-7多肽以结合IL-22-受体阳性细胞上的IL-22受体并诱导抗肿瘤新生血管形成。IL-22-受体-阳性细胞是在其表面表达结合MDA-7的IL-22受体的细胞。因此，在有些实施方式中，给予患者的IL-22-受体-阳性细胞有效剂量的MDA-7。在另外的实施方式中，IL-22-受体-阳性细胞是内皮细胞。所以，考虑可给予患者的内皮细胞MDA-7多肽。此外，这些细胞不需要与肿瘤或肿瘤细胞相毗邻(“邻接”或“相邻”)。考虑这些细胞可距肿瘤较远(不邻近)。而且，在有些实施方式中，MDA-7多肽是分泌形式的MDA-7并且是糖基化的。
本发明还包括在时间和/空间上将MDA-7多次给予癌症患者包括肿瘤患者的相关方法和组合物。因此，在本发明的有些实施方式中，治疗肿瘤患者的方法包括将医学上可接受的组合物注射入肿瘤中第一部位和注射入肿瘤中第二部位，该组合物包含i)MDA-7多肽或ii)含受启动子控制的编码MDA-7的核酸的腺病毒载体。考虑给予患者包含MDA-7蛋白质或编码MDA-7的核酸的组合物，给药次数至少，至多，或以下数值：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，或更多次。因此，在肿瘤内，可在至少或至多1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20个位点注射MDA-7组合物(指包含MDA-7蛋白质或编码MDA-7蛋白质的核酸的组合物)。“注射点”指针或其它穿刺装置与患者接触的点。注射点沿肿瘤表面或沿肿瘤平面互相相隔可以是，至少或至多，在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145，150，155，160，165，170，175，180，185，190，200毫米内或更多。特别考虑当给予一点以上注射时，两个或多个或所有注射点可彼此均匀相隔。
也考虑可将MDA-7组合物注射在肿瘤外，例如外围。在有些实施方式中，将该组合物注射在距肿瘤24，20，16，12，8，4，或2毫米内。
在本发明的有些实施方式中，给予一次注射，并在第一次注射完成后马上进行一次后续注射。或者，在注射之间可相隔一些时间。因此，给予后续注射可在前次注射后下列时间内，至少下列时间内或至多下列时间内：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60分钟或1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，2，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24小时或1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31天或1，2，3，4，5周，或1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12个月或更久。
此外，本发明包括使用一种或多种化疗、放疗、基因治疗和/或免疫治疗的联合治疗策略。
应理解，除非另有说明，纯化的MDA-7可从真核细胞或原核细胞纯化得到。在有些情况下，MDA-7以MDA-7编码核酸转染的原核细胞中纯化得到。在有些情况下，不使MDA-7糖基化但仍可用于本发明的一些方法中。在其它实施方式中，MDA-7从原核细胞纯化，有些情况下，从哺乳动物细胞纯化得到。在具体实施方式中，MDA-7从小鼠、大鼠、猴子、仓鼠或人细胞中纯化得到。在这些细胞中MDA-7可以是内源或外源产生的。
本发明其它方法包括用纯化的MDA-7治疗过度增生性疾病，尤其是癌症。因此，在本发明的有些实施方式中，治疗患者癌症的方法包括给予该患者有效剂量的含有纯化到一定均一性并有活性的纯化MDA-7的药学上可接受的组合物。可用作该方法一部分的均一性百分比包括本文所所述的任何百分比。
在本发明的另外实施方式中，还对患者进行放疗。本发明专门包括使细胞放射致敏的方法。术语“放射致敏”指使细胞对放射更敏感。因此，放射治疗前细胞的放射致敏提高了其相对放射治疗前未放射致敏的细胞对放射的敏感性。因此，在本发明的有些实施方式中，方法是采用MDA-7使细胞放射致敏。
放疗，一种众所周知的癌症治疗方法，可在给予患者纯化的MDA-7蛋白质之前或之后给予患者。考虑给予患者一次剂量的纯化MDA-7蛋白质后下列时间内，至少或至多：5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55分钟或1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，30，36，42，48，54，60，66，72，78，86，84，90，96，102，108，114，120，126，130，136，142小时，或1，2，3，4，5，6，7天，或1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12周或更久后对患者进行至少一个疗程的放疗，或它们的组合治疗。在具体实施方式中，在患者接受一次剂量的纯化MDA-7蛋白质治疗96小时内进行放疗。对于放疗、MDA-7蛋白质或两者，考虑可给予患者多次或多个治疗疗程。考虑可用纯化的MDA-7蛋白质和/或放疗来治疗本文所述的任何癌症或癌细胞。在具体实施方式中，待治疗的癌症是胰腺起源的或是黑素瘤。特别考虑可将纯化的MDA-7蛋白质给予癌症或肿瘤细胞相毗邻或位置相近的非癌细胞。
在具体实施方式中，所述方法包括放射致敏癌细胞，该方法包括给予细胞有效剂量的在该细胞中受可操作启动子控制的编码MDA-7的核酸的腺病毒载体。也可使用其它载体。此外，采用本发明的任何其它方法，可给予纯化的MDA-7来代替编码MDA-7多肽的表达构建物，或反之亦然。特别考虑所述癌细胞可以是内皮细胞，或本文所述的任何其它癌细胞。
本发明还涉及使MDA-7-编码多聚核苷酸、表达构建物或载体与精蛋白形成复合体的方法。精蛋白是带电分子，可以和MDA-7核酸分子一起包含在组合物内或与MDA-7核酸分子形成复合物。
本发明的其它方法包括通过给予它莫西芬和纯化的MDA-7蛋白质或含受启动子控制的编码MDA-7的核酸的腺病毒载体，来治疗对象或癌症患者中的癌细胞的方法。可在给予MDA-7蛋白质或腺病毒载体的同时给予它莫西芬，或在这之前或之后给予。考虑可在给予患者一次剂量的纯化的MDA-7蛋白质或腺病毒载体后的下列时间内，至少或至多：5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55分钟或1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，30，36，42，48，54，60，66，72，78，86，84，90，96，102，108，114，120，126，130，136，142小时或1，2，3，4，5，6，7天，或1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12周或更久后给予该患者或对象它莫西芬，或它们的组合治疗。
本发明的另外实施方式包括诱导细胞中STAT3活化的方法，该方法包括给予该细胞有效剂量的纯化到一定百分比均一性并有活性的纯化MDA-7。可用作该方法一部分的均一性百分比包括本文所述的任何百分比。词组“STAT3活化”指激发STAT3多肽的活性。可用本文实施例部分所述的方法检测STAT3的活化。
本发明的其它方法涉及利用MDA-7来抑制平滑肌细胞。所以，在有些实施方式中，抑制平滑肌细胞的方法包括给予该细胞有效剂量的含有纯化的MDA-7蛋白质或含有受启动子控制的编码MDA-7的核酸的腺病毒载体的组合物。抑制平滑肌细胞包括诱导该细胞进入凋亡或抑制其迁移。
本发明还涉及治疗患者的癌症或癌细胞的方法，该方法包括给予NF-kB抑制剂和含有纯化的MDA-7蛋白质或含有受启动子控制的编码MDA-7的核酸的腺病毒载体的组合物。NF-kB抑制剂指抑制NF-kB表达或活性的物质。在有些实施方式中，该NF-kB抑制剂是苏灵大。在其它实施方式中，该NF-kB抑制剂是I-kB蛋白质或含有编码I-kB的核酸的载体。具体考虑可给予患者编码MDA-7和NF-kB抑制剂的单一载体或者可通过不同的载体提供。类似地，可给予患者含有一种或多种载体和/或一种或多种蛋白质的单一组合物。
本发明方法还包括用带电分子精蛋白治疗癌症。在有些实施方式中，本发明涉及治疗癌症的方法，该方法包括给予癌症患者有效剂量的一种病毒组合物，该组合物包含：(a)精蛋白分子；和(b)含有受启动子控制的编码人MDA-7多肽的核酸的表达构建物。在本发明的有些实施方式中考虑使精蛋白分子与该表达构建物形成复合物。病毒组合物可含有约108，109，1010，1011，1012，1013，1014，1015或更多的病毒颗粒与约10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，120，140，160，180，200，220，240，260，280，300，320，340，360，380，400，420，440，460，480，500，520，540，560，580，600，620，640，660，680，700，720，740，760，780，800，820，840，860，880，900，920，940，960，980，1000或更多μg精蛋白的比率。在具体实施方式中，该病毒组合物含有约1010或1011病毒颗粒与约100μg精蛋白，约200μg精蛋白，或约300μg精蛋白的比率。
用于本发明方法和组合物中的MDA-7肽或多肽考虑至少含有SEQ IDNO：2的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、156、157、160、170、180、190、200或206个连续氨基酸，或者含有SEQ ID NO：2的全部氨基酸。重组MDA-7多肽可以是经修饰的，或者是其末端之一被截短的。在本发明的某些实施方式中，MDA-7多肽含有SEQ ID NO：2的49-206、75-206或100-206位的氨基酸。分泌型MDA-7多肽含有SEQ ID NO：2的49-206位的氨基酸，但前面48个氨基酸缺失，这种分泌形式的多肽被称为“MDA-7多肽”，可用于本发明的任何组合物和方法中。另外，MDA-7氨基酸序列还可包含异源氨基酸序列，如分泌信号序列。在某些实施方式中，分泌信号序列是带正电荷的N-末端区域，含有一个疏水核心。在另外的实施方案中，该分泌信号可引导MDA-7或其截短形式进入内质网或线粒体。
表达构建物可以是病毒或非病毒载体。认为是本发明一部分的病毒载体包括，但不限于，腺病毒、腺病毒相关病毒、疱疹病毒、逆转录病毒(包括慢病毒)、多瘤病毒或牛痘病毒。
可用本发明的方法和组合物治疗的癌细胞包括来自膀胱、血、骨、骨髓、脑、乳房、结肠、食道、肠胃、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫的细胞。此外，具体地癌症可以是下列的组织类型，虽然不限于这些：瘤，恶性；癌；癌，未分化的；巨大和纺锤形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；转化细胞癌；乳头状转化细胞癌；腺癌；促胃液素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；组合肝细胞癌和胆管癌；小梁型腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌肿瘤，恶性；腮-肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色性癌；嗜酸性癌；嗜氧性腺癌；嗜碱性癌；透明细胞腺癌；粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包封硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属癌；顶泌腺癌；皮质性腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印指环状细胞癌；渗透导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏(paget′s)病，乳腺；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌w/鳞状化生；胸腺瘤，恶性；卵巢基质瘤，恶性；泡膜细胞瘤，恶性；粒层细胞瘤，恶性；睾丸足细胞瘤，恶性；足细胞癌；睾丸间质细胞瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；外乳腺副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑色素性黑素瘤；表面传播性黑素瘤；巨大色素痣中的恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎型横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；基质肉瘤；混合肿瘤，恶性；缪勒氏(mullerian)混合肿瘤；肾胚细胞瘤；肝胚细胞瘤；癌肉瘤；间质瘤，恶性；布伦纳氏(brenner)瘤，恶性；叶状柄肿瘤，恶性；滑液肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎型癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺肿瘤，恶性；绒毛膜癌；间质肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波济氏(kaposi’s)肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；成软骨细胞瘤，恶性；间叶细胞软骨肉瘤；骨巨大细胞瘤；尤文氏(ewing’s)肉瘤；牙原性肿瘤，恶性；成釉细胞性牙瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞性纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性；室骨膜瘤；星细胞瘤；原浆性星细胞瘤；纤维型星细胞瘤；星形母细胞瘤；成胶质细胞瘤；少突神经胶质细胞瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层瘤；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；成神经细胞瘤；眼癌；嗅觉神经性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；粒细胞肿瘤，恶性；恶性淋巴瘤；何杰金氏(hodgkin’s)病；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞的；恶性淋巴瘤，大细胞，扩散；恶性淋巴瘤，滤泡，蕈样真菌病；其它特定非何杰金氏淋巴瘤；恶性组织细胞增多病；多发骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴样白血病；血浆细胞白血病；红白细胞白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓样白血病；嗜碱性白血病；嗜曙红细胞白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；成巨核细胞白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。
可通过以下途径将组合物给予细胞或对象：静脉内，皮内，动脉内，腹膜内，病灶内，颅内，关节内，前列腺内，胸膜内，气管内，鼻内，玻璃体内，阴道内，直肠内，表面，瘤内，肌肉内，腹膜内，皮下，结膜下，囊泡内，粘膜，心包内，脐内，眼内，口服，表面，局部，通过吸入(例如，气雾剂吸入)，通过注射，通过灌输，通过连续灌输，通过局部灌注洗浴直接靶向细胞，通过导管，通过灌洗，在软膏中，或在液体组合物中。
本发明的其它方面内容具有诊断性或预后性目的。本发明包括评价诊断为癌症或怀疑有癌症的对象癌症进程的方法，该方法包括：(a)获得对象的样品；(b)检测过度增生组织样品中的MDA-7表达；(c)检测过度增生组织样品中的iNOS表达；和(d)比较iNOS表达水平与MDA-7表达水平。如实施例所示，与MDA-7表达水平升高或处于正常细胞例如非黑素瘤皮肤细胞一般所见水平时的iNOS表达水平相比较，当MDA-7表达较低或缺乏时iNOS的表达较高。可计算具体样品中MDA-7表达水平和iNOS表达水平的相对比率，作为评价或诊断癌症的一部分。根据本领域技术人员所熟知的技术，可根据蛋白质或转录水平来测定MDA-7或iNOS的表达。将该比率与获自非癌症细胞的标准品或对照作比较。
此外，可用MDA-7相对iNOS的比率或水平来评价对癌症治疗的反应。iNOS表达降低可作为治疗的阳性指示。在有些实施方式中，可用于监测MDA-7的治疗效果。因此，测定对对象癌症治疗的反应的方法包括：(a)在以MDA-7治疗之前和之后从对象取得样品；和(b)比较样品中的iNOS表达水平。如上所述，以MDA-7治疗可包括给予对象有效剂量的纯化的活性MDA-7蛋白质或包含受启动子控制的编码人MDA-7多肽的核酸序列的表达盒。
考虑该方法可用于多种癌症，但在具体实施方式中，应用于黑素瘤，包括转移性黑素瘤。可根据患者面谈或病历、初步检查结果或其它提示某患者可能患有癌症或有患癌症危险的指征/因素怀疑该患者患有癌症。
本发明还涉及治疗卵巢癌患者的方法。本发明的某些实施方式涉及治疗卵巢癌患者的方法，该方法包括给予患者有效剂量的药学上可接受的含有MDA-7蛋白质的组合物。例如，MDA-7蛋白质可以是有活性并且至少80％均一的基本上纯化的MDA-7蛋白质。其它实施方式涉及治疗患有卵巢肿瘤的患者的方法，该方法包括将有效剂量的药学上可接受的组合物注射入肿瘤中的第一个位点，和注射入肿瘤中的第二个位点，该组合物包含i)MDA-7多肽或ii)含有受启动子控制的编码MDA-7的核酸的腺病毒载体。涉及腺病毒载体使用的方法在整个说明书中都有讨论。只要被论及，这些方法都可用于MDA-7组合物在卵巢癌治疗中使用。
本发明的其它实施方式包括治疗肿瘤患者的方法，该方法包括给予患者有效剂量的药学上可接受的含有诱导肿瘤中APC表达的物质的组合物。本发明考虑能诱导肿瘤中APC表达的任何物质。例如，该物质可以是小分子、核酸或蛋白质性质的组合物。在某些实施方式中，该物质是MDA-7、MDA-7多肽或含有编码MDA-7多肽的核酸的表达构建物。涉及表达构建物使用的方法在整个说明书中都有讨论。本领域技术人员熟悉这方面可用的表达构建物和方法学的范围。
本发明考虑使用给予诱导APC表达的物质的任何方法。本领域普通技术人员熟悉将该物质递送给患者的可用方法的范围。例如，可静脉内、瘤内或口服给予该物质。在本发明有些实施方式中，还将该组合物定义为可降低肿瘤中β-连环蛋白表达的组合物。测定肿瘤中β-连环蛋白表达的方法包括本领域技术人员所知的任何方法。这些方法的实施例在本说明书其它地方讨论。
在本发明的有些实施方式中，该组合物降低对象中β-连环蛋白的表达。例如，β-连环蛋白表达的降低可发生在对象的肿瘤中。
本发明其它实施方式包括筛选抗癌化合物的方法，该方法包括：(1)使候选药物与第一种癌细胞接触；(2)测定第一种癌细胞中APC的表达；和(3)比较第一种癌细胞和没有接触该候选药物的第二种癌细胞中APC的表达，其中若第一种癌细胞中APC表达增加，确认该候选药物为候选抗癌化合物。这些方法可以包括或不包括测定第一和第二种癌细胞中β-连环蛋白的表达并确定与第二个癌细胞相比较，第一种癌细胞中β-连环蛋白的表达是否降低。涉及测定β-连环蛋白表达的步骤可以独立或不独立于涉及APC测定的步骤。本发明考虑任何候选药物，本领域普通技术人员熟悉可用候选药物类型的广泛范围。例如，候选药物可以是小分子、核酸或蛋白质性质的组合物，可包括β-连环蛋白核糖核酸酶，siRNA，或反义分子。
本发明还包括含有SEQ ID NO：2 175-206位氨基酸的多肽以及内质网靶向序列。本说明书其它地方提供了SEQ ID NO：2的氨基酸序列。具体考虑包括SEQ ID NO：2 175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，和206位氨基酸残基的多肽。考虑SEQ ID NO：2 175-206位的氨基酸是连续的氨基酸残基。
在本发明的其它实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO：2 150-206位的氨基酸以及内质网靶向序列。在另外的实施方式中，该多肽包含SEQ IDNO：2 100-206位的氨基酸以及内质网(ER)靶向序列。在另外的实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO：2 49-206位的氨基酸以及内质网靶向序列。在每一种这些实施方式中，考虑SEQ ID NO：2的氨基酸是连续的氨基酸残基。在本发明的有些实施方式中，内质网靶向序列可操作性连接于截短的MDA-7多肽的N末端部分。本文所述的和本领域技术人员所知的内质网靶向序列认为是本发明MDA-7多肽组成的一方面。
本发明的实施方式可以或可以不包括内质网保留信号。本领域普通技术人员熟悉内质网靶向序列和内质网保留信号。
本发明还考虑包含上述的编码MDA-7序列的核酸以及内质网靶向序列的表达盒。整个说明书都有表达盒的讨论，讨论表达盒的说明书部分也适用于包含编码SEQ ID NO：2氨基酸的核酸的表达盒。
此外，本发明涉及治疗癌症患者的方法，该方法包括给予患者有效剂量的药学上可接受的含有MDA-7蛋白质和一种或多种选自IL-2，IL-7，和IL-15的白细胞介素的组合物。而且，认为在本发明的任何方法中可将MDA-7与其它白细胞介素组合使用。
已证明某些白细胞介素具有细胞因子活性。这些白细胞介素的例子包括IL-19，IL-20，IL-22，和IL-26。认为在本发明涉及抑制新生血管形成和刺激免疫应答反应的方法中，这些具有细胞因子活性的白细胞介素可替代MDA-7。
本发明还涉及抑制或预防患者中的癌症局部侵袭和/或转移的方法，包括给予该患者有效剂量的药学上可接受的含有MDA-7蛋白质的组合物，其中MDA-7抑制或预防癌症的局部侵袭和/或转移。本发明考虑本领域普通技术人员所知的任何给药方法。本领域普通技术人员有能力测定癌症的局部侵袭和/或转移是否被预防或抑制了。
本发明考虑抑制或预防任何类型原发癌的局部侵袭和/或转移的方法。例如，该原发癌可以是黑素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、成视网膜细胞瘤、星状细胞瘤、成胶质细胞瘤、牙龈、舌、白血病、成神经细胞瘤、头、颈、乳房、胰腺、前列腺、肾、骨、睾丸、卵巢、间皮瘤、颈部、肠胃道、淋巴瘤、脑、结肠，或膀胱癌。在本发明的某些实施方式中，该原发癌是肺癌。例如，该肺癌可以是非小细胞肺癌。
此外，本发明可用于预防癌症或治疗初期癌或恶变前的细胞，包括化生、发育异常或增生。本发明也可用于抑制不希望的但是良性的细胞，例如鳞状化生、发育异常、良性前列腺增生细胞、增生性病损等。如本文所述的，通过给予本发明的包含MDA-7多肽以及含MDA-7编码核酸的构建物的方法可阻止、破坏或延迟它们发展成为癌症或更严重的癌症形式。
任何制备或配制MDA-7的方法都包括在本发明的方法中。在某些实施方式中，按照本发明上述小结的任何方法纯化MDA-7。例如，可通过上述的方法将MDA-7从细胞中纯化到至少20％均一，其中将含有MDA-7蛋白质的细胞提取物或上清进行亲和层析，将MDA-7纯化到至少20％均一并有活性。
本发明的其它方面包括抑制或预防患者中癌症局部侵袭和/或转移的方法，包括给予该患者有效剂量的药学上可接受的含有编码MDA-7多肽的寡核苷酸的组合物，其中MDA-7多肽抑制或预防癌症的局部侵袭和/或转移。在某些实施方式中，该编码MDA-7多肽的寡核苷酸包括在表达构建物中。例如，该表达构建物可包含含有受启动子控制的编码MDA-7多肽的核酸的腺病毒载体。
本发明还包括其它方法例如治疗显微残留癌细胞的方法，该方法包括下面步骤，鉴定患有可切除肿瘤的患者，切除该肿瘤，使瘤床接触MDA-7蛋白质或含有在真核细胞中有功能的启动子和编码MDA-7多肽的多聚核苷酸的表达载体，其中所述多聚核苷酸受启动子的转录控制。
本发明的其它方法是治疗患有癌症对象的方法，该方法包括下面步骤：手术暴露肿瘤并使肿瘤接触MDA-7多肽或含有在真核细胞中有功能的启动子和编码MDA-7多肽的多聚核苷酸的表达载体，其中所述多聚核苷酸受启动子的转录控制。或者，给予MDA-7多肽或MDA-7编码核酸后，切除所有或部分肿瘤。这种辅助治疗形式也认为是本发明的一部分。
本发明还包括治疗患有癌症对象的其它方法，该方法包括下面步骤：以MDA-7多肽或含有在真核细胞中有功能的启动子和编码MDA-7多肽的多聚核苷酸的表达载体(其中该寡聚核苷酸受启动子的转录控制)灌注肿瘤一段延长的时间。
采用MDA-7作为辅助治疗也认为是本发明的一部分。该辅助治疗可以和一种或多种其它癌症治疗联合使用，其它癌症治疗包括，但不限于，手术、化疗、放疗、免疫治疗，或基因治疗。实施例包括手术和化疗；手术和放射；手术和免疫治疗；放射和化疗；放射和免疫治疗；化疗和免疫治疗；手术、放射和化疗；手术、化疗和免疫治疗的联合等。此外，化疗治疗可包括一种以上的化疗疗法。在本发明的有些实施例中，可将MDA-7(多肽或编码核酸)与脱乙酰基紫杉醇(taxotere)、Herceptin和Aa-mda7一起使用。例如这样使用对治疗例如乳腺癌非常有效。如上所述，Aa-mda7也认为可与它莫西芬一起使用。
还提供治疗复发性癌症对象的方法，包括(a)选择患者，根据(i)曾经手术或放疗或化疗或免疫疗法治疗过癌症；和(ii)治疗后癌症复发，和(b)给予该患者MDA-7多肽或含编码MDA-7多肽的核酸区段的表达构建物，该区段受在该患者癌细胞中有活性的启动子的控制，该表达构建物在癌细胞中表达MDA-7。随步骤(b)的后续步骤(c)给予该患者第二次放疗或化疗或免疫治疗期，从而MDA-7使癌细胞对所述第二次放疗或化疗或免疫治疗敏感，因此也提供了癌症治疗。
第一次癌症治疗和第二次癌症治疗可以相同或不同。患者可以是非人动物，或人患者。第一次和/或第二次放疗或化疗可以是化疗，例如白消安、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、环磷酰胺、氮烯唑胺、异环磷酰胺、氮芥、美法仑、5-FU、Ara-C、氟达拉滨(fludarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、氨甲蝶呤、阿霉素、博来霉素、放线菌素D、红比霉素、去甲基毛霉素(idarubicin)、丝裂霉素C、多西紫杉(docetaxel)、紫杉醇、依托泊苷、紫杉醇(paclitaxel)、长春碱、长春新碱、长春烯碱(vinorelbine)、喜树碱、亚硝脲氮芥或环己亚硝脲。第一次和/或第二次放疗或化疗可以是放疗，例如x-射线，γ射线，或微波。第一次和/或第二次放疗或化疗可以特征性所述为DNA损伤治疗。免疫治疗可包括用靶向特定蛋白质的单克隆抗体例如herceptin(trastuzumab)，rituxan(rituximab)，Erbitux(cetuximab)，ABX-EGF，bexxar，zevalin，oncolym，Mylotarg，LymphoCide，或Alemtuzumab来治疗。
治疗的癌症可以是脑癌、头颈癌、食道癌、气管癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌、直肠癌、淋巴癌或白血病。
所述该表达构建物可以是病毒表达构建物，例如逆转录病毒构建物、疱疹病毒构建物、腺病毒构建物、腺病毒相关病毒构建物或牛痘病毒构建物。病毒表达构建物可以是可复制型病毒或腺病毒，或复制缺陷型病毒或腺病毒。或者，表达构建物可以是非病毒表达构建物，例如包含在脂质运载体中的表达构建物。所述启动子可以是CMV IE，RSV LTR，β-肌动蛋白，Ad-E1，Ad-E2或Ad-MLP。也可使用本领域技术人员所知的其它基因治疗载体和启动子。
步骤(b)和(c)之间的时间段可以是约24小时，约2天，约3天，约7天，约14天，约1月，约2月，约3月，或约6月。复发可以是在原发癌位点或转移位点的复发。该对象可在步骤(b)之前已接受过手术切除，和/或该方法还可包括在步骤(c)之后进行手术切除。步骤(b)中给药可以是瘤内或肿瘤脉管系统，肿瘤局部，肿瘤区域，或全身给药。步骤(c)中给药可以是瘤内或肿瘤脉管系统，肿瘤局部，肿瘤区域，或全身给药。
本发明还包括诱导抗MDA-7免疫应答反应的方法和组合物。因此，在本发明的有些实施方式中，将MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的核酸的全部或部分作为疫苗提供给对象。可用该疫苗预防或治疗涉及MDA-7的任何病症或疾病，包括癌症。
本发明的方法和组合物还包括采用抗MDA-7抗体，尤其是中和MDA-7活性的抗体，抗MDA-7抗体包括抑制MDA-7与其受体(例如IL-20R和IL-22R)结合的抗体。可用单克隆和多克隆抗体及其人源化形式来治疗炎性疾病，自身免疫疾病和病症，包括牛皮癣、炎性大肠病(IBD)、类风湿性关节炎和狼疮。本发明方法包括给予患者有效剂量的MDA-7抗体(也称为抗-MDA-7抗体)从而达到治疗效益的治疗方法。治疗效益包括，但不限于，症状数目降低或症状严重性降低，诱导了缓解，炎症或炎症特征降低，痛苦减少。
对本发明一个实施方式所述的任何限制可适用于本发明的其它实施方式。此外，可用本发明的任何方法来生产或利用本发明的任何组合物。
虽然本说明书支持“或”的定义只指或者和“和/或”，但除非另有明确的说明，“或”只指或者或可选物是相互排斥的，权利要求书中的术语“或”用于表示“和/或”。
在整个本申请中，术语“约”用于表示某数值包含测定该数值的装置和/或方法所产生的标准误差。
除非有明确的说明，本说明书中所用的“一个”或“一种”可以指一个或多个。如本文权利要求书中所用，当“一个”或“一种”与单词“含有”连用时，可以指一个，也可以指一个以上。本文所用的“另一个”至少是指第二个或更多个。
附图说明
下面的附图构成本说明书的一部分，用于显示本发明的特定方面。通过参考这些附图中的一个或多个结合本文特定实施方式的详细所述可以更好地理解本发明。
图1A-D.sMDA-7体外抑制内皮细胞分化但不抑制增殖。将HUVEC和HMVEC血清饥饿24小时，置于含1ng/ml bFGF和所示浓度sMDA-7的2孔室载玻片中(A)。以PBS和血管抑素处理的细胞分别作为阴性和阳性对照。如实施例1所示72小时后检测增殖(B)，在所示浓度sDMA-7处理的2孔室载玻片中接种肺肿瘤细胞(H1299和A549)。以PBS和Ad-mda7处理的细胞分别作为阴性和阳性对照。如实施例1所示72小时后检测增殖。在以PBS，sMDA-7(50ng/ml)或sMDA-7的免疫耗竭制品处理的包被基质胶的96孔板中接种HUVEC并观察管的形成(C)。所有处理都设双复孔。sMDA-7完全消除了内皮微管的形成，而与用PBS处理的对照细胞中看到的相似，sMDA-7蛋白质的免疫耗竭导致微管形成恢复。放大，X10倍。半定量分析sMDA-7/IL-24处理的HUVEC和HMVEC中的内皮微管数目，显示在两种细胞型中sMDA-7都显著(P＝0.001)抑制微管形成(C)。竖条，标准差。
图2.sMDA-7比内皮抑素更有效抑制体外内皮细胞分化。将HUVEC接种于包被基质胶的含有1ng/ml bFGF和所示等摩尔浓度sMDA-7和内皮抑素的96孔板中。处理后24小时在显微镜下观察板中的微管形成并计数微管数目。PBS处理的细胞作为阴性对照。所有处理都设双复孔。实验重复5-6次。sMDA-7而非内皮抑素以剂量依赖方式显著(P＝0.001)抑制内皮微管形成，在高于10ng/ml浓度时完全消除了内皮微管形成。只在最高浓度(300ng/ml)时观察到内皮抑素对微管形成的抑制。数值为3次实验的平均值。竖条，标准差。
图3.sMDA-7抑制内皮细胞迁移。将HUVEC在0.5％FBS中饥饿过夜，接种到24孔穿孔插片(transwell insert)的上室中置于含有100ng/mlVEGF和10ng/ml sMDA-7的24孔板中。在高倍显微镜下计数迁移到孔下室的细胞。24小时内，与只用VEGF处理的细胞相比，SMDA-7显著(P＝0.001)抑制了VEGF诱导的HUVEC迁移。PBS处理的细胞作为阴性对照。
图4A-D.MDA-7的抑制活性并非由于HUVEC产生的IFN-γ和IP-10所致。以sMDA-7/IL-24(10ng/ml)处理接种于6孔板中的HUVEC。在所示时间点收集细胞培养上清并通过ELISA分析IFN-γ(A)和IP-10(B)。以IFN-γor Ad-mda7处理的HUVEC的上清分别作为IP-10和IFN-γELISA的阳性对照。PBS处理的细胞的上清作为阴性对照。所有处理都设双复孔。(C)，以等摩尔浓度的sMDA-7，IFN-γ或IP-10处理接种于基质胶包被的96孔板中的HUVEC并分析微管的形成。通过计数微管数目测定抑制活性。与IFN-γ或IP-10相比，sMDA7在低浓度显著(P＝0.01)抑制微管形成。IFN-γ或IP-10抑制活性只在高浓度才观察到。(C).通过计数微管数目测定抑制活性。与IFN-γ或IP-10相比，sMDA7在低浓度显著(P＝0.01)抑制管的形成。IFN-γ或IP-10抑制活性只在高浓度才观察得到。(D)，将以抗-IP-10或抗-IFN-γ中和抗体预处理的HUVEC接种于基质胶包被的96孔板中，以sMDA-7处理，分析微管形成。sMDA-7显著抑制了微管形成(P＝0.001)竖条，标准差。
图5.sMDA-7通过IL-22R1抑制内皮细胞分化。在接种于含有PBS或所示浓度的sMDA-7、内皮抑素或IP-10的基质胶包被的96孔板中之前，以两种不同浓度的IL-22R1阻抑抗体处理或不处理HUVEC 24小时。第二天，在明视野显微镜下检查细胞中管的形成并定量。以sMDA-7/IL-24处理的HUVEC微管形成受到了抑制但PBS处理的对照细胞未受抑制(A)。然而，存在IL-22R1阻抑抗体时，sMDA-7对HUVEC微管形成的抑制作用以剂量依赖的方式被消除。内皮抑素或IP-10抑制了用IL-22R1抗体预处理HUVEC的微管形成(B)。竖条，标准差。
图6A-E.新生血管形成和肿瘤生长的体外研究。将包裹在含有60ng bFGF的基质胶中的sMDA-7(12.5ng)皮下植入无胸腺裸鼠。只含有bFGF的基质胶作为阳性对照，含有PBS的基质胶作为阴性对照。10天后，收获基质胶，如实施例1所述分析血红素水平。与对照相比，在含有sMDA-7/IL-24的基质胶中观察到血红素水平显著(P＝0.0001)下降(A)。测量了裸鼠中植入A549肿瘤细胞和亲代293细胞或293-mda-7细胞的等量(1∶1)混合物所长出的皮下肿瘤(B)。与含有亲代293细胞的肿瘤相比，观察到含有293-mda-7细胞的肿瘤生长显著抑制(P＝0.001)(B)。各时间点代表各组的平均肿瘤体积。竖条代表标准差。用western印迹分析检测含有293-mda-7细胞的肿瘤组织中MDA-7蛋白质表达，与含有亲代293细胞的肿瘤比较。在实验结束时，收获肿瘤并分析。与含有亲代293细胞的动物肿瘤样品比较，含有293-mda-7细胞的动物肿瘤样品中的血红素水平较低(C)。通过在右下腹注射A549肿瘤细胞建立皮下肿瘤(D)。当肿瘤可触知时，以基质胶包裹的亲代293细胞或基质胶包裹的293-mda-7细胞植入每只小鼠右上腹。用卡尺测量肿瘤生长。与以293细胞处理的肿瘤相比，以293-mda-7细胞处理的肿瘤生长抑制更明显(P＝0.001)。各时间点代表各组的平均肿瘤体积。竖条代表标准差。对肿瘤组织CD31染色的半定量分析显示了，与以亲代293细胞处理的肿瘤相比，以293-mda-7处理的肿瘤中微管密度的显著降低(E)。竖条，标准差。
图7.剂量递升的I期临床试验研究设计，其中mda-7通过瘤内注射给予晚期癌症患者，采用非复制型的腺病毒构建物(Ad-mda7)。试验设计表明每组患者的数目、病毒的剂量和活组织检查的时间。
图8.直方图表明DNA拷贝数/μg DNA和瘤内注射后小时数。在注射24小时内，MDA-7蛋白质表达呈剂量依赖性升高，在96小时时下降。
图9.患者结果图表表明通过TUNEL染色显示凋亡在病灶中心最强烈。病灶外围切片显示与未注射病灶相比TUNEL反应强烈。
图10.图示对Ad-mda7诱导的血清细胞因子反应动力学，结果用血清细胞因子升高百分率对注射后的天数表示。结果表明瘤内注射Ad-mda7后血清细胞因子出现瞬时升高。
图11.每组瘤内注射Ad-mda7所产生的血清细胞因子反应。大多数患者出现全身细胞因子(IL-6，IL-10，IFNγ，TNFα，GM-CSF)的瞬时升高。
图12.接受瘤内注射Ad-mda7的患者CD8+T细胞百分率增加的水平。在mda7处理后15天CD3+CD8+T细胞增加了30+13％。
图13.瘤内注射Ad-mda7后患者外周血CD8+细胞增加。
图14.MDA-7的一步阴离子交换纯化。在western印迹中用多克隆抗-MDA-7抗体检测阴离子交换柱的每个MDA-7峰(1，2，3，4)。
图15.保留时间与分子质量的比较。MDA-7复合物在85-95kDa洗脱。
图16.MDA-7过表达抑制细胞增殖。以PBS、Ad-luc或Ad-mda7处理肿瘤细胞(DU 145，LNCaP，和PC-3)和正常细胞s(PrEC)并分析不同时间点的MDA-7表达或细胞活力。测定用PBS、Ad-luc或Ad-mda7处理后肿瘤或正常细胞的增殖。数值代表三次重复的平均值。统计学显著性设为P＝＜0.05。差错条代表标准差(SE)。
图17.MDA-7的表达在肿瘤细胞中但不在正常细胞中诱导凋亡。处理后72h收获以PBS、Ad-luc或Ad-mda7处理的肿瘤细胞(DU 145，LNCaP，和PC-3)以及正常内皮细胞(PrEC)并以流式细胞计量术分析处于sub-G0/G1期的细胞。每种处理停滞2万个细胞。数据显示为柱状图。数值为三次重复的平均值。差错条代表标准差(SE)。
图18.MDA-7导致细胞周期停滞于G2期。以PBS、Ad-luc或Ad-mda7处理肿瘤细胞(DU 145，LNCaP，和PC-3)以及正常细胞(PrEC)。处理后72h收获细胞并以流式细胞计量术进行细胞周期分析。每种处理停滞2万个细胞，数据显示为柱状图。数值为三次试验的平均值。差错条代表标准差(SE)。
图19A-D.根据克隆存活试验测定Ad-mda7引起的放射致敏。用于Ad-mda7和Ad-luc的载体浓度对于A549细胞系为1000vp/细胞(A)；对于H1299细胞系为250(B)，对于CCD-16(C)和MRC-9细胞系(D)为1500。转染后48小时进行照射。每个数据代表三次独立试验的平均值。符号代表模拟感染(实心菱形)；Ad-mda7，(实心正方形)；Ad-luc，(实心三角形)。竖条：标准差。
图20A-D.通过对A549(A)，H1299(B)，CCD-16(C)和MRC-9(D)细胞的TUNEL试验评估凋亡。转染后48小时照射细胞，照射后两天或转染后4天收获细胞。所用载体浓度与图19所用相同。每个数据代表两次独立试验的平均值。竖条：标准差。
图21.以Ad-mda7或噻氨酯哒唑(Nocodazole)(200ng/ml)处理的A549和H1299的细胞周期分析。噻氨酯哒唑的剂量和暴露时间积累的G2/M期细胞的比例与预试验中测定的Ad-mda7转染后48小时相同。所示数据代表两次独立的试验。
图22.克隆存活试验测定噻氨酯哒唑(200ng/ml)诱导的G2/M停滞引起的放射致敏。A549细胞系暴露噻氨酯哒唑后4小时进行照射，H1299细胞系暴露噻氨酯哒唑后3.5小时进行照射。符号代表只辐射(实心菱形)；噻氨酯哒唑，(空心正方形)竖条：标准差。
图23.克隆存活试验测定姜黄素或姜黄素加Ad-mda7处理的A549和H1299细胞对放射线的敏感性。转染2天后进行照射。转染1天后添加姜黄素。所用载体浓度与图19所用相同。每个数据代表三次独立试验的平均值。竖条：标准差。
图24.rhMDA-7蛋白质杀伤黑素瘤细胞。以0-20ng/ml rhMDA-7处理MeWo细胞，4天后用台盼蓝测定活力。也在抗-MDA-7抗体(兔多克隆：Pab或鼠单克隆：Mab)或对照人IgG存在时以20ng/ml rhMDA-7处理细胞。
图25A-25B.黑素瘤MDA-7的表达与肿瘤iNOS表达负相关。iNOS计数和MDA-7计数平均值之间呈负相关(A)。Kendallτ-b相关性系数是-0.209，以P＜0.05显著区别于0。iNOS密度和MDA-7密度平均值之间呈负相关(B)。Kendallτ-b相关性系数是-0.201，P＜0.05显著区别于0；竖条，±标准差。
图26.以rhMDA-7处理人黑素瘤细胞系MeWo 4h后IRF-1和IRF-2的免疫印迹分析。处理包括只有培养基(泳道1，阴性对照)；未转染HEK293细胞上清(泳道2，阴性对照)；5ng/ml rhMDA-7(泳道3)；和20ng/mlrhMDA-7(泳道4)。膜用抗-IRF1和IRF-2抗体(1∶2000稀释液)免疫印染。所示为一个代表性试验。图表显示以肌动蛋白标准化后细胞溶解物中的IRF-1和IRF-2表达，代表两次试验的平均值；竖条，±标准差。
图27.Ad-mda7增强了它莫西芬的抗肿瘤效应。
图28.Ad-mda7和MDA-7蛋白质调控了黑素瘤细胞的细胞因子分泌。
图29.Ad-mda7对A549肺转移的作用
图30.以腺病毒载体强效转导PAC1细胞。用50或100pfu/细胞的Ad-SM22-β-gal(Ad-SM22)或Ad-RSV-β-gal(Ad-RSV)以所示MOIs转导人H1299肺癌或PAC1细胞。24小时后，将细胞染色检测β-gal活性并计数X-gal阳性细胞。所示数据为三次计数的平均植。
图31.MDA-7抑制PAC1细胞生长。用Ad-mda7或Ad-luc以所示MOI转导PAC1 SMC。转导3天后手工计数一式三份的存活细胞。数据表示为平均值±标准差。与对照病毒(Ad-luc)比较p＜0.05(*)。
图32A-C.Ad-mda7凋亡PAC1诱导。A.Ad-mda7提高胱冬酶-3(caspase3)的活性。用Ad-mda7或Ad-luc以100MOI转导PAC1细胞。转导后48小时，一组细胞裂解物用于胱冬酶-3活性测定，另一组用于总蛋白质定量。胱冬酶-3活性以总蛋白质标准化，表示为单位/10μg总蛋白质。与对照病毒(Ad-luc)和未处理对照比较p＜0.05(*)(A)。膜联蛋V结合试验。用Ad-mda7或Ad-luc以100MOI转导PAC1细胞，转导后24小时以FITC标记的膜联蛋白V染色。用流式细胞计量术分析处理的细胞(B)。用Modfit软件分析早期凋亡细胞百分比。与对照病毒(Ad-luc)比较p＜0.05(*)。DAPI染色试验(C)。用Ad-mda7或Ad-luc以100MOI转导PAC1细胞，转导后24、48、72小时以DAPI染色，如果细胞核显示出染色质解凝聚则该凋亡的细胞核计数为阳性。与对照病毒(Ad-luc)比较p＜0.05(*)。
图33.Ad-mda7抑制PAC1细胞迁移。以100MOI的Ad-mda7或Ad-luc转导汇合的PAC1并如实施例22所述处理。直方图显示显微镜观察到的向伤害部位迁移的细胞定量计数。对于+FBS和-FBS，p＜0.01(#)；对于Ad-mda7和未处理的或Ad-luc+FBS，p＜0.01(*)；对于Ad-mda7和未处理的或Ad-luc-FBS，p＜0.05(Δ)。
图34.INGN 241生物作用的时间过程和剂量反应。在INGN 241的临床试验中显示了6个不同组的时间过程和剂量。
图35.MDA-7蛋白质表达与凋亡诱导相关。测定了MDA-7蛋白质水平，对10个不同患者的切片进行了tunel试验。
图36.评价了患有黑色素细胞瘤患者4的不同肿瘤部位的MDA-7RNA，DNA和蛋白质表达水平。
图37.评价了10个患者MDA-7DNA和RNA从注射位点的扩散。
图38.评价了一些患者不同部位的MDA-7蛋白质水平和凋亡程度。
图39.用TUNEL试验评价了MDA-7表达的扩散及与凋亡水平的相关性。
图40.评价了注射点MDA-7DNA(变化)的时间过程。
图41.评价了注射点MDA-7蛋白质和凋亡水平(变化)的时间过程。
图42.II期临床试验初步结果。
图43.以2000vp/细胞Ad-mda7和Ad-luc处理AsPc1，Capan2和MiaPaCa2胰腺癌细胞72小时，用台盼蓝分析其活力，用膜联蛋白V染色分析凋亡。数据显示为平均值+标准差(SD)。
图44.以Ad-mda7或对照处理MiaPaCa2细胞，照射40小时后接种进行克隆试验。
图45.以2000vp/细胞Ad-luc或Ad-mda7处理AsPc1和MiaPaCa胰腺癌系细胞，24小时后再用XRT(5Gy)处理。第三天用碘化丙锭处理和以FACS分析评价细胞周期变化。
图46.Ad-mda7激活NF-κB依赖的报告基因表达。
图47.Ad-mda7在显性失活I-κBα稳定细胞中的细胞毒作用。
图48.Ad-mda7显著抑制显性失活I-κBα细胞的生长。
图49A-C.Ad-mda7与苏灵大(苏灵大)协同诱导凋亡。A.只以Ad-mda7以及与苏灵大联合处理细胞的凋亡率。B.以PBS，Ad-luc，或Ad-mda7处理肿瘤(A549 and H1299)和正常(CCD-16)细胞3h。处理后，细胞与所示浓度的苏灵大一起孵育。72h后，用台盼蓝排斥试验测定细胞活力。细胞生长百分数计数为每组细胞数的平均值，表示为以PBS，Ad-luc，或只以Ad-mda7处理(设为100％)的各组的相对值。与PBS和Ad-luc处理比较，以Ad-mda7/苏灵大处理的肿瘤而非正常细胞受到了显著抑制(P＝0.001)。苏灵大介导的抑制作用是剂量依赖的。竖条，标准差。C.通过FACS分析凋亡细胞。在各种剂量苏灵大存在时，以PBS，Ad-luc，或Ad-mda7处理肿瘤细胞(A549 and H1299)和正常(CCD-16)细胞。处理后72h，以碘化丙锭将细胞染色，并进行FACS分析。通过定量处于sub-GI期的细胞来测定凋亡细胞的百分数。表示为一式两份样品的平均值；在至少两次独立的试验中观察到相似结果。竖条，标准差。D.将带有皮下H1299肿瘤的裸鼠分组(n＝8/组)。与以PBS，苏灵大，Ad-mda7，或Ad-luc/苏灵大处理的动物比较，以Ad-mda7/苏灵大处理的动物显示出显著的肿瘤生长抑制。过瘤内注射一周三次给予Ad-mda7(3×109vp)，通过i.p.注射每天给予苏灵大(40mg/kg)。给出的肿瘤体积代表每个时间点每组的平均值。竖条，标准差。
图50.通过以Ad-GFP感染细胞测定5个卵巢癌细胞系(MDAH2774，OVCAR 420，DOV 13，HEY，和SKOV3-ip)的腺病毒转导。
图51.以Ad-mda-7感染后抑制了卵巢癌细胞系MDAH 2774和OVCA 420的细胞增殖。
图52.流式细胞计量术分析表明，5个卵巢癌细胞系中有两个，MDAH 2774和OVCA 420，显示了显著的生长抑制，其G2/M群体百分数有显著增加。
图53.MDA-MB-486乳腺癌细胞的存活。
图54.放射处理前给予Ad-mda7对A549肿瘤生长(A)和小鼠存活的效果(B)。A549细胞(5×106)作为异种移植肿瘤在裸鼠中生长。以放射(5Gy)，Ad-mda7(三组分中为3×1010vp)或这两种的组合处理荷瘤小鼠。如实施例27所述测定肿瘤体积，当肿瘤达到直径15mm或发生溃烂时处死动物。数据表示为平均值±标准差(A)。
图55.不同联合治疗方案对A549肿瘤生长的效果。对荷瘤小鼠按如下处理：对照，Ad-mda7(第1天)加照射(第6天)，Ad-mda7(第5天)加照射(第6天)或照射(第6天)加Ad-mda7(第7天)。
图56.TUNEL的免疫组化分析。用TUNEL染色测定处理后(第8天)肿瘤中的凋亡，在光学显微镜下计数凋亡细胞(×400倍)，凋亡指数计为至少1000个癌细胞中的凋亡百分数。
图57.通过免疫组化阳性染色分析VEGF，bFGF和IL-8蛋白质表达。第14天收获皮下肿瘤。在光学显微镜下计数阳性染色细胞(×400倍)，阳性百分数计为至少1000个癌细胞中的阳性细胞百分数(A，B，C)。
图58.通过计数CD31阳性血管结构测定微管密度。
图59.HUVECS的克隆存活。生长因子饥饿12小时后，使HUVECS暴露于MDA7蛋白质(10ng/ml)(A)，血管抑素(100ng/ml；B)，或内皮抑素(100ng/ml；C)12小时。然后将细胞照射(0-6Gy)、收获并置于常规培养基中。14天后将克隆染色并测定存活组分。数据显示为三次独立试验的平均值±标准差。
图60.A549细胞(A)和CCD16细胞(B)的克隆存活。细胞血清饥饿12小时，以含有mda7蛋白质(10ng/ml)的条件培养基处理。12小时后，将细胞照射(0-6Gy)、收获并置于常规培养基中。孵育14天后，计数克隆并存活。
图61.靶向性质粒构建物，包括全长，细胞质，核和内质网(ER)部分。
图62.MDA-7的ER靶向部分可阻抑克隆形成。
图63.MDA-7的ER靶向部分是促凋亡部分。
图64.Ad-mda7引起卵巢癌细胞系生长抑制。
图65.Ad-mda7处理的卵巢癌细胞的细胞周期分析。A：MDAH2774；B：OVCA 420.
图66.Ad-mda7诱导卵巢癌细胞凋亡。
图67.MDA-7/IL-24抑制肿瘤细胞迁移。以Ad-luc或Ad-mda7处理肺肿瘤细胞(A549和H1299)。转染后6h收获细胞并接种于穿刺孔单元的上室中。A：48小时后，固定膜并以结晶紫染色，在明视野显微镜下(上图；X200倍)计数已迁移到孔下层的细胞数。以Ad-mda7处理的细胞的迁移能力显著(P＝0.002)低于PBS或Ad-luc处理的细胞(下层)。B：处理后24小时和48小时细胞活力分析未显示肿瘤细胞增殖受到显著抑制。竖条代表标准差。
图68.MDA-7/IL-24抑制肿瘤细胞侵袭。以PBS，Ad-luc(2500vp/细胞)，或Ad-mda7(2500vp/细胞)或10μMLY 294002或1μg/ml MMP-II抑制剂处理肺肿瘤细胞(H1299和A549)。6h后，收获细胞，计数，并加入到基质胶包被的孔的上层。37℃孵育细胞使其侵袭。48h后，固定细胞并以结晶紫染色。在光学显微镜下放大200倍观察和计数迁移到孔下层的细胞。以盲法计数每种处理的侵袭细胞数，记录为三次独立试验的平均值。以Ad-mda7处理的细胞显示出比PBS或Ad-luc处理的细胞侵袭要差(P＝0.001)。MDA-7介导的抑制作用与以LY 294002和MMP-II抑制剂观察到的抑制作用相似。竖条代表标准差。
图69.MDA-7/IL-24抑制肺转移。活体外以PBS，Ad-luc，和Ad-mda7处理A549肺肿瘤细胞。6h后，收获细胞，洗涤，重悬于PBS，通过尾静脉注射入雌裸鼠。每组5只动物。肿瘤细胞注射后3周，吸入CO2窒息处死动物，在解剖显微镜下计数肺肿瘤节结。观察到注射用Ad-mda7处理的肿瘤细胞的动物肺肿瘤显著(P＝0.01)少于注射用PBS或Ad-luc处理的肿瘤细胞的动物。结果是两次独立试验的平均值。竖条代表标准差。
图70.MDA-7/IL-24抑制肺转移。将荷有实验性A549肺转移瘤变的小鼠不处理(对照)或以DOTAP：Chol.CAT，或DOTAP：Chol-mda7复合物处理。通过尾静脉注射每天处理动物共6次剂量。最后一次处理3周后，处死动物，计数肺肿瘤数目。以DOTAP：Chol-mda7复合物处理的动物与未处理或以DOTAP：Chol-CAT复合物处理的动物相比，显示肺转移受到显著抑制(P＝0.001)。竖条代表标准差。
图71A-C.DOTAP：Chol-mda-7复合物抑制皮下肿瘤生长。将荷有皮下肿瘤(A549 or UV223m)的裸鼠和C3H小鼠分组，每天(50μg/剂)如下处理共6次：不处理，PBS，DOTAP：Chol-LacZ复合物或DOTAP：Chol-CAT复合物，和DOTAP：Chol-mda-7复合物。A，A549。B，UV2237m。各时间点代表每组的平均肿瘤体积。竖条代表标准差。C.处理后48小时收获皮下肿瘤，分析MDA-7蛋白质表达。在以DOTAP：Chol-mda-7复合物处理的肿瘤中，18％的A549肿瘤细胞和13％的UV2237m肿瘤细胞产生了MDA-7蛋白质，而对照肿瘤不产生MDA-7蛋白质。
图72.以DOTAP：Chol-mda-7复合物处理后MDA-7诱导细胞凋亡。收获未经处理或经PBS，DOTAP：Chol-LacZ或DOTAP：Chol-CAT复合物或DOTAP：Chol-mda-7复合物处理的动物的皮下肿瘤(A549和UV2237m)，通过TUNEL染色分析凋亡细胞。以DOTAP：Chol-mda-7复合物处理的肿瘤中发生凋亡而死亡的细胞百分数(A549为13％，UV2237m为9％)显著(P＝0.001)高于其它处理组。竖条代表标准差。
图73.DOTAP：Chol-mda-7复合物抑制肿瘤血管化。未经处理或经PBS，DOTAP：Chol-LacZ或DOTAP：Chol-CAT复合物或DOTAP：Chol-mda-7复合物处理的皮下肿瘤(A549和UV2237m)做CD31染色并进行半定量分析。在DOTAP：Chol-mda7处理的肿瘤中，CD31染色阳性的内皮细胞显著低于(P＝0.01)其它处理组的肿瘤。竖条代表标准差。
图74.DOTAP：Chol-mda-7复合物抑制实验性肺转移。以每天剂量(50μg/剂)的PBS，DOTAP：Chol-CAT复合物或DOTAP：Chol-mda-7复合物处理荷有肺肿瘤(A549，UV2237m)的nu/nu或C3H小鼠共6次。与两个对照组比较，以DOTAP：Chol-mda-7复合物处理的裸鼠和C3H小鼠中的转移性肿瘤生长受到了显著(P＝＜0.05)抑制。竖条代表标准差。
                说明性实施方式描述
A.MDA-7
本发明的组合物和方法利用MDA-7多肽和编码这些多肽的核酸。MDA-7多肽是另一类推断的肿瘤抑制因子，已经证明可抑制p53野生型、p53缺失型及p53突变型癌细胞的生长。另外，p53缺失型细胞内凋亡相关B基因的表达上调说明MDA-7能够以不依赖p53的机制诱导肿瘤细胞的损伤。申请人观察到腺病毒介导的MDA-7的过量表达可导致双链RNA活化的丝氨酸/苏氨酸激酶(PKR)快速诱导和活化，从而使eIF-2α以及其他PKR靶底物磷酸化，诱导凋亡。肺癌细胞中2-氨基嘌呤(2-AP)对PKR的特异性抑制消除了Ad-mda7导致的PKR活化，PKR靶底物的磷酸化和凋亡。如PKR缺失型成纤维细胞所显示，Ad-mda7诱导的凋亡依赖功能性PKR通路。这些特征说明MDA-7作为PKR的诱导剂，具有广泛的治疗、预后及诊断潜能，因此可作为诱导的免疫应答反应的增强剂。
PKR具有抗病毒和抗细胞功能，可参与某些生理过程的调节，如细胞的生长和分化(美国专利No.6,326,466；Feng等，1992；Petryshyn等，1988；Petryshyn等，1984；Judware等，1991)、肿瘤抑制(Koromilas等，1992；Meurs等，1993)以及信号转导通路的调节(Kumar等，1994)。
PKR的上调可诱导各种肿瘤细胞系的凋亡。而且，在脊髓发育不良中，染色体5q上IRF-1基因的关键性致癌性缺失看来与PKR水平的降低有关(Beretta等，1996)，肺癌和结直肠癌的免疫组化分析表明与PKR的表达和生存期的延长有关(Haines等，1992)。PKR看来通过激活多种信号转导通路而介导抗肿瘤形成活性，从而达到抑制生长和诱导凋亡的作用。这些通路的活化发生在潜伏的无活性同质二聚体形式受活化信号诱导发生结构改变导致其自身磷酸化并活化之后(Vattem等，2001)。PKR一旦活化后就能使各种靶底物磷酸化，这对生长调控和凋亡诱导很重要(Saelens等，2001；Sudhakar等，2000)。免疫系统的刺激与凋亡有关(Albert等，1998；Chen等，2001；Saif-Muthama等，2000；Restifo等，2001)。另外，人工诱导的凋亡已证明可增强疫苗的免疫原性，这是因为凋亡细胞的转染活化了树突状细胞的刺激效应(Sasaki等，2001；Chattergoon等，2000)。
已在人PMBC中鉴定到Mda-7mRNA(Ekmekcioglu等，2001)，据报道人MDA-7无细胞因子功能。根据其基因和蛋白序列的特征，MDA-7已被命名为IL-24(NCBI数据库登录号：XM_001405)。鼠MDA-7蛋白同源物FISP(IL-4-诱导的分泌蛋白)已报道为Th2特异性的细胞因子(Schaefer等，2001)。如敲除试验所证实，TCR和IL-4受体结合及随后的PKC和STAT6的活化可诱导FISP的转录。FISP的表达特点已证实，但没有发现这个推断出的细胞因子有何功能。大鼠MDA-7同源物C49a(Mob-5)与mda-7基因有78％的同源性，已证实与伤口愈合有关(Soo等，1999；Zhang等，2000)。Mob-5也是一种分泌蛋白，在大鼠转化细胞鉴定到其推定的细胞表面受体(Zhang等，2000)。因此，mda-7基因和MDA-7分泌蛋白的同源物可在各种动物中表达和分泌。但是，没有数据显示MDA-7具有细胞因子活性。这种活性可通过增强抗原的免疫原性用于治疗各种疾病和感染。
Mda-7cDNA(SEQ ID NO：1)编码一种新型的、进化保守的、含206个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：2)，预测分子量为23.8kDa。据推测氨基酸序列含有一个疏水性骨架，位置约为氨基酸26到45，具有信号序列的特征。除了含42个氨基酸残基的片段与白细胞介素10(IL-10)有54％的相同性外，该蛋白质的序列与已知的蛋白无显著同源性。结构分析表明MDA-7(IL-BKW或IL-20)具有细胞因子家族的结构特征(WO 98/28425，本文已引入作为参考)。其结构特征和一小段氨基酸片段的有限相同性表明MDA-7可能具有细胞外功能。MDA-7的表达与黑素瘤的恶性程度呈负相关关系，试验证明与原发和转移性黑素瘤相比，正常黑色素细胞内mRNA表达水平升高，而裸鼠内增强肿瘤形成的处于垂直生长早期的黑素瘤细胞内mda-7mRNA的表达水平下降。其他有关MDA-7的信息和数据见专利申请09/615,154，10/017,472，60/404,932，60/370,335，60/361,755和美国非临时专利申请于2003年3月3日提交的，以Sunil Chada，Abujiang Pataer，Abner Mhashilkar，Rajagopal Ramesh，Jack Roth，和Steve Swisher为发明人的“包括MDA-7的增强免疫诱导的方法”，所有这些申请本文已引入作为参考。
其他研究证明MDA-7表达的升高可在体外抑制肿瘤细胞的生长，并选择性地诱导人乳腺癌细胞的凋亡和抑制裸鼠体内肿瘤的生长(Jiang等，1996和Su等，1998)。Jiang等(1996)报道发现mda-7在各种起源的肿瘤细胞内都是一种强力生长抑制基因，包括乳腺、中枢神经系统、宫颈、结肠、前列腺和结缔组织的肿瘤。用克隆抑制试验证明MDA-7表达升高可增强对人宫颈癌(HeLa)、人乳腺癌(MCF-7和T47D)、结肠癌(LS174T和SW480)、鼻咽癌(HONE-1)、前列腺癌(DU-145)、黑素瘤(HO-1和C8161)、成胶质细胞瘤多形体(glioblastome multiforme)(GBM-18和T98G)以及骨肉瘤(Saos-2)生长的抑制。Mda-7在正常细胞(HMECs、HBL-100和CREF-Trans6)内的过量表达显示出有限的生长抑制作用，这说明mda-7转基因的作用在正常细胞内不明显。综上所述，这些数据说明MDA-7表达升高所产生的生长抑制作用在体外对肿瘤细胞的作用高于对正常细胞的作用。
Su等(1998)报道了对MDA-7抑制癌细胞生长机制的研究。研究报告通过细胞周期分析和TUNEL试验表明MDA-7在乳腺癌细胞系MCF-7和T47D内的异位表达诱导了凋亡，但对正常HBL-100细胞无影响。感染腺病毒mda-7(“Ad-mda-7”)的细胞裂解物的Western印迹分析表明凋亡刺激蛋白BAX的表达上调。Ad-mda-7感染上调BAX蛋白的表达只发生在MCF-7和T47D细胞内，而不发生在正常的HBL-100或HMEC细胞内。这些数据使研究人员得以评价Ad-mda-7活体外转导对MCF-7肿瘤细胞异种移植肿瘤形成的作用。活体外转导可抑制肿瘤异种移植模型中肿瘤的形成和发展。
利用基因治疗方法治疗癌症的主要模式是诱导凋亡。这可以通过使癌细胞对其他药物敏感或通过刺激细胞内通路直接诱导凋亡来实现。其他癌症治疗方法利用了肿瘤需要新生血管形成以供应其生长所必要的营养素。内皮抑制素和新生血管抑制素就是这种治疗方法的例子(WO 00/05356和WO 00/26368)。
申请人发现了一种抑制新生血管形成的方法。这种新的方法包括给予编码人mda-7的核酸。当体外添加于增殖的内皮细胞时，Ad-mda7具有抑制内皮分化的能力。mda-7表达提高的抗-新生血管形成作用使该分子成为新生血管形成相关疾病尤其是癌症的理想基因治疗方法。考虑可通过病毒或非病毒载体给予包括内皮细胞的抗-新生血管形成靶标细胞编码mda-7的核酸，也可给予肿瘤细胞。这种联合治疗使临床医生不但可依靠肿瘤细胞的直接转导而且可依靠抑制新生血管形成的作用。因此，通过利用两种不同的向不同靶细胞群输送药物的疗法来饥饿和攻击肿瘤。
新生血管形成相关疾病包括，但不限于，新生血管形成依赖性癌症，包括例如，实体瘤，血源性肿瘤例如白血病，以及肿瘤转移；良性肿瘤，例如血管瘤，听神经瘤，神经纤维瘤，沙眼，以及脓性肉芽肿；类风湿性关节炎；牛皮癣；眼血管原性疾病，例如，糖尿病视网膜病变，早熟性视网膜病，黄斑变性，角膜移植排异，新生血管性青光眼，晶状体后纤维增生，虹膜发红；Osler-Webber综合征；心肌新生血管形成；斑块新生新生血管形成；毛细管扩张症；血友病关节；血管纤维瘤；以及创伤性肉芽肿。本发明的内皮细胞增殖抑制方法可用于内皮细胞过分或异常刺激疾病的治疗。这些疾病包括，但不限于，肠粘连，动脉粥样硬化.硬皮病，以及肥厚性瘢痕，即瘢痕瘤.它们还可用于治疗以新生血管形成为病理结果的疾病，例如猫抓伤疾病(Rochele minalia quintosa)和溃疡(Helobacter pylori)。
本发明的方法可用于治疗内皮细胞相关疾病和病症。尤其重要的内皮细胞过程是新生血管形成，即上述的血管形成。利用本发明所述的方法通过提高MDA-7的表达抑制内皮细胞增殖可治疗新生血管形成相关疾病。
虽然不受这些构建物可操作性的专门理论束缚，但各种动物间mda-7和IL-10的位于C末端涉及与受体结合的D-螺旋区有显著的氨基酸同源性。因此，尤其优选含有该30-35位的氨基酸区域的分子。
因此，在本发明的一个实施方式中，新生血管形成相关疾病的治疗包括给予治疗性肽或多肽。在其他实施方式中，治疗包括给予靶细胞包括患病细胞或内皮细胞编码mda-7的核酸表达构建物。认为这些靶细胞摄吸该构建物，并表达核酸编码的治疗性多肽，因此抑制靶细胞的分化。表达MDA-7的细胞进而可分泌该蛋白与未被表达构建物转导或感染的相邻细胞相互反应。通过这种方式，抑制了肿瘤建立新脉管系统所需的复杂的相互作用并实现了肿瘤的治疗。
在本发明的其他实施方式中，认为可用MDA-7或表达MDA-7的构建物治疗新生血管形成相关疾病。本发明预期可治疗的一些新生血管形成相关疾病是牛皮癣、类风湿性关节炎(RA)、炎性大肠病(IBD)、骨关节炎和肺肿瘤前病变。
在其他实施方式中，很多种癌症的治疗都在本发明的范围内。例如，黑素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、成视网膜细胞瘤、星状细胞瘤、成胶质细胞瘤、牙龈、舌、白血病、成神经细胞瘤、头、颈、乳房、胰腺、前列腺、肾、骨、睾丸、卵巢、间皮瘤、颈部、肠胃道、淋巴瘤、脑、结肠或膀胱癌。在更优选的实施方式中，所述新生血管形成相关疾病是类风湿性关节炎、炎性大肠病、骨关节炎、平滑肌瘤、ademonas、脂肪瘤、血管瘤、纤维瘤、血管闭塞、再狭窄、动脉粥样硬化、肿瘤前病变、原位癌、口腔毛状白斑或牛皮癣可能是治疗的对象。
在本发明的某些实施方式中，mda-7是作为表达MDA-7多肽的核酸来提供的。在某些具体实施方式中，所述核酸是病毒载体，其中病毒载体的剂量至少为103，104，105，106，107，108，109，1010，1011，1012，1013，1014，1015或更高的pfu或病毒颗粒。在某些实施方式中，病毒载体是腺病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺伴随病毒载体、多瘤病毒载体、α病毒载体、杆状病毒载体或疱疹病毒载体。最优选的病毒载体是腺病毒载体。在其他特殊的实施方式中，所述核酸是非病毒载体。
在某些实施方式中，表达所述多肽的核酸可操作性连接于启动子。适于本发明的启动子的非限定性例子包括CMV IE、dectin-1、dectin-2、人CD11c、F4/80、SM22和MHC II类分子的启动子，但是据信任何可用于驱动mda-7基因或本发明的免疫基因表达的其它启动子，如本文所所述的那些启动子，都可用于实施本发明。
本发明的核酸优选通过注射给药。其他的实施方式包括通过多次注射给予核酸。在某些实施方式中，注射可在患病或肿瘤的局部、区域或远离部位。在某些实施方式中，核酸的注射是通过连续灌注、瘤内注射、腹腔注射或静脉注射。在其他的实施方式中，核酸是在切除肿瘤前、或切除肿瘤后，或者切除肿瘤前后都注射到瘤床部位。另外，核酸可在化疗、生物治疗、免疫治疗、手术或放疗前、期间或之后给予患者。患者优选人。在其他的实施方式中，患者是癌症患者。
B.核酸，载体和调节信号
本发明涉及mda-7基因相关的多聚核苷酸或核酸分子及该基因的产物MDA-7。另外，本发明还涉及与免疫原性分子相关的多聚核苷酸或核酸分子。这些多聚核苷酸或核酸分子可以从哺乳动物细胞分离并纯化。认为分离和纯化的MDA-7核酸分子，不论是分泌性或是全长的，都是与mda-7基因产物相关的核酸分子，可以是RNA或DNA的形式。同样，与免疫原性分子相关的核酸分子也可以是RNA或DNA形式。本文所用的术语“RNA转录物”指DNA核酸分子转录的产物-RNA分子。这种转录物可编码一种或多种多肽。
如本申请书所用，术语“多聚核苷酸”指核酸分子、RNA或DNA，可从总基因组核酸中分离。因此，“编码MDA-7的多聚核苷酸”指含MDA-7编码序列的核酸片段，也可以从基因组总DNA和蛋白质分离或纯化。当本申请书提到MDA-7编码多聚核苷酸或核酸的功能或活性时，意味着该多聚核苷酸编码能增强免疫应答的分子。另外，“编码免疫原的多聚核苷酸”指含免疫原编码序列的核酸片段，也可以从基因组总DNA和蛋白质分离或纯化。当本申请书提到编码免疫原的免疫基因的功能或活性时，意味着该多聚核苷酸编码能诱导人体免疫应答的免疫原性分子。
术语“cDNA”指以RNA为模板制备的DNA。与基因组DNA或RNA转录物相比，利用cDNA的优势在于其稳定性和能够用重组DNA技术操纵序列(见Sambrook，1989；Ausubel，1996)。得到全部或部分基因组序列的一些时，需要时间。或者，cDNA具有优点是因为它提供了某多肽的编码区，并剔除了内含子和其他调节序列。
另外认为某给定细胞的给定MDA-7编码核酸或mda-7基因可由核酸序列略有差异但仍能编码MDA-7多肽的天然突变体或突变株提供；人的MDA-7多肽是特殊的实施方式。因此，本发明也包括具有细微氨基酸改变但活性相同的MDA-7衍生物。
术语“基因”简单地说指功能性蛋白质、多肽或肽的编码核酸单元。正如本领域技术人员所理解的，此功能术语包括能表达或适于表达蛋白质、多肽、功能域、肽、融合蛋白以及突变体的基因组序列、cDNA序列和较小的基因工程基因片段。编码MDA-7或其他治疗性多肽如免疫原的核酸分子含有下列长度，或含有至少下列长度的连续核酸序列：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2b00、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900、10000、10100、10200、10300、10400、10500、10600、10700、10800、10900、11000、11100、11200、11300、11400、11500、11600、11700、11800、11900、12000或更多个核苷酸、核苷或碱基对。这些序列可与SEQ ID NO：1(MDA-7编码序列)相同或互补。
“与其他编码序列有实质区别的”指感兴趣基因为核酸片段的部分编码序列，这个片段不含有天然编码核酸的大部分，如大的染色体片段或其他功能基因或cDNA编码区。当然，这是指天然分离的核酸片段，不包括后来人工添加到片段上的基因或编码区。
在具体实施方式中，本发明涉及插入编码MDA-7蛋白、多肽或肽的DNA序列的分离的DNA片段和重组载体，这些MDA-7蛋白、多肽或肽的氨基酸序列中含有与上述SEQ ID NO：2一致的连续氨基酸序列，与MDA-7相应的序列命名为“人MDA-7”或“MDA-7多肽”。
术语“与上述SEQ ID NO：2基本一致的序列”指与SEQ ID NO：2的一部分基本对应的序列，只有相当少的氨基酸是与SEQ ID NO：2的氨基酸不相同，但其生物功能是等价的。
术语“生物功能等价”是本领域所熟知的，在本文中还有更详细的定义。因此，如果一个序列的氨基酸有约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或者约99％，以及它们之间的任何范围，如约70％到约80％、优选约81％到约90％；或者更优选约91％到约99％与SEQ ID NO：2的氨基酸相同或功能等价，则该序列是“与上述SEQ ID NO：2基本一致”，只要保留了该蛋白的生物活性。在具体实施方式中，MDA-7蛋白、多肽或肽或生物功能等价物的生物活性包括增强免疫应答。此外，在具体实施方式中，蛋白质、多肽或肽或者生物功能等价物的免疫原、免疫原性分子的生物活性包括免疫原性，这是指该分子能诱导人体的免疫应答。在其他某些实施方式中，本发明涉及分离的DNA片段和重组载体，这些片段和载体的序列内含有与上述SEQ ID NO：1基本一致的序列。术语“与上述SEQ ID NO：1基本一致”与如上所述的含义相同，指该核酸序列与SEQ ID NO：1的一部分基本对应，只有相当少的密码子与SEQ ID NO：1的密码子不同，但功能是等价的。而且，编码具有MDA-7活性的蛋白、多肽或肽的DNA片段是最常用的。
在具体实施方式中，本发明涉及插入有编码MDA-7多肽或肽的DNA序列的分离的核酸片段和重组载体，这些多肽或肽的氨基酸序列中含有与MDA-7多肽基本上对应的连续氨基酸序列。在其他的实施方式中，本发明涉及插入有编码免疫原、蛋白、多肽或肽的DNA序列的分离的核酸片段和重组载体，这些免疫原、蛋白、多肽或肽的氨基酸序列中含有与该免疫原基本上相对应的连续氨基酸序列。
设计本发明的载体主要用于转化细胞使其含有在调控性真核细胞启动子(即可诱导性、可阻抑性、组织特异性启动子)控制下的mda-7基因。另外，如果无其他原因，为了便于载体的体外操作，该载体内可含有选择性标记。而此选择性标记在产生重组细胞时可能发挥重要作用。
表1和2，见下，列出了可用于本发明的各种调节信号。
                              表1-可诱导元件
  元件   诱导剂   参考文献
  MT II   佛波酯(TPA)重金属   Palmiter等，1982；Haslinger和Karin，1985；Searle等，1985；Stuart等，1985；Imagawa等，1987；Karin等，1987；Angel等，1987b；McNeall等，1989
  MMTV(鼠乳腺肿瘤病毒)   糖皮质激素   Huang等，1981；Lee等，1981；Majors和Varmus，1983；Lee等，1984；Ponta等，1985
  β-干扰素   poly(rI)Xpoly(rc)   Tavernier等，1983
  腺病毒5E2   Ela   Imperiale和Nevins，1984
  胶原酶   佛波酯(TPA)   Angel等，1987a
  基质降解酶(Stromelysin)   佛波酯(TPA)   Angel等，1987b
  SV40   佛波酯(TFA)   Angel等，1987b
  鼠MX基因   干扰素，新城病病毒   Hug等，1988
  GRP78基因   A23187   Resendez等，1988
  α-2-巨球蛋白   IL-6   Kunz等，1989
  波形蛋白   血清   Rittling等，1989
  MHCI类基因H-2κb   干扰素   Blanar等，1989
  HSP70   Ela，SV40大T抗原   Taylor等，1989；Taylor和Kingston，1990a，b
  增殖蛋白   佛波酯-TPA   Mordacq和Linzer，1989
  肿瘤坏死因子   PMA   Hensel等，1989
  甲状腺刺激激素α基因   甲状腺激素   Chatterjee等，1989
                         表2-其它启动子/增强子元件
Figure G04805918X19960403D000431
  启动子/增强子   参考文献
  Stephens和Hentschel，1987
  乙型肝炎病毒   Bulla和Siddiqui，1988；Jameel和Siddiqui，1986；Shaul和Ben-Levy，1987；Spandau和Lee，1988
  人免疫缺陷病毒   Muesing等，1987；Hauber和Cullan，1988；Jakobovits等，1988；Feng和Holland，1988；Takebe等，1988；Berkhout等，1989；Laspia等，1989；Sharp和Marciniak，1989；Braddock等，1989
  巨细胞病毒   Weber等，1984；Boshart等，1985；Foecking和Hofstetter，1986
  长臂猿白血病病毒   Holbrook等，1987；Quinn等，1989
真核细胞内控制蛋白编码基因转录的启动子和增强子是由多个基因元件组成的。细胞内的机器能将每个元件所传递的调节信息收集起来并整合，使不同的基因分别进化，通常形成转录调节复合物模式。
本文所用的术语“启动子”指一组转录调控模块，在RNA聚合酶II的起始位点周围聚集成簇。许多关于启动子是如何组织的构想都来自于对几种病毒启动子的分析，其中包括HSV胸腺嘧啶激酶(tk)和SV40早期转录单元的启动子。这些试验得到最近研究的支持，表明启动子是由不连续的功能模块组成的，每个模块约含7-20bp的DNA，并且每个模块含有转录活化蛋白的一个或多个识别位点。
每个启动子中至少有一个模块的功能是定位RNA合成的起始位点。最知名的例子是TATA框，但是某些启动子没有TATA框，如哺乳动物末端脱氧核酸转移酶基因和SV40晚期基因的启动子，这些启动子含有与起始位点本身重叠的一个不连续元件帮助固定起始的位置。
加入的启动子元件可调节转录起始的频率。一般来说，这些元件位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管最近证明有许多启动子也含有位于起始位点下游的功能元件。诸元件之间的距离是很灵活的，因此当元件反转或相对移动时启动子的功能保持不变。在tk启动子中，诸元件之间的间距增加到50bp时活性才开始下降。根据启动子的不同，看来每个元件或者协同、或者独立发挥功能以活化转录。
增强子最初鉴定为能增强启动子转录的基因元件，位于同一DNA分子的较远位置。这种在远处发挥作用的能力在原核细胞转录调节的经典研究中几乎没有先例。后来的工作表明具有增强子活性的DNA区域的结构与启动子很相似。它们是由许多单个元件组成的，每个元件都可以结合一个或多个转录蛋白。
增强子和启动子之间的基本区别是可操作性区别。增强子区必须以整体的形式才能在远处刺激转录；而启动子区或其组成元件则不需要这样。另一方面，启动子必须含有一个或多个在特定位点并且以特定方向指导启动RNA合成的元件，而增强子缺乏这种特异性。除了这种可操作性的不同，启动子和增强子十分相似。
启动子和增强子具有相同的活化细胞转录的基本功能。它们常是重叠的，并且相毗连，似乎常具有很相似的组织结构。综合这些考虑，提示增强子和启动子是同源性实体，结合到这些序列上的转录活化蛋白与细胞内的转录机器以基本相同的方式相互作用。
在某些实施方式中，本发明所用的启动子是巨细胞病毒(CMV)的启动子。该启动子位于pcDNAIII内，可从Invitrogen购买，在本发明中普遍使用。其他可用于本发明的启动子有dectin-1和dectin-2启动子。下面列出了其他一些可用于本发明的病毒启动子、细胞启动子/增强子和可诱导的启动子/增强子。其他任何的启动子/增强子的组合(如真核启动子数据库EPDB中的每一个)也可用于驱动编码寡糖加工酶、蛋白质折叠辅助蛋白、选择性标记蛋白质或感兴趣的异源蛋白质的结构基因的表达。
另一被证明有用的信号是聚腺苷酸信号。这种信号可得自人生长激素(hGH)基因，牛生长激素(BGH)基因或SV40。
可利用内部核糖体结合位点(IRES)元件来产生多基因、多顺反子信使RNA。IRES元件能绕过5-甲基化加帽依赖的翻译所需要的核糖体扫描模式，在内部位点起始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。小核糖核酸病毒家族两个成员(脊髓灰质炎病毒和脑心肌炎病毒)的IRES元件已被所述(Pelletier和Sonenberg，1988)，另外报道了哺乳动物信使RNA的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。可将IRES元件与异源性开放阅读框架相连接。多个开放阅读框架可一起转录，每个阅读框被一个IRES分开，而产生多顺反子信使RNA。利用IRES元件，每个开放阅读框架都可以接近核糖体进行有效翻译。多个基因可利用单一启动子/增强子转录出一条信使RNA而有效表达。
在任何情况下都应该清楚启动子是DNA元件，当其位于某基因的上游时才能发挥功能导致该基因的表达。本发明的大多数的转基因构建物在功能上都位于启动子元件的下游。
提供本发明的组合物和方法以给予患者本发明的组合物。
1.病毒转化
a.腺病毒感染
输送重组DNA的一个方法涉及采用腺病毒表达载体。尽管已知腺病毒载体整合到基因组DNA中的容量很低，但是这一缺点被其基因转移的高效率所抵消。“腺病毒表达载体”是指那些含腺病毒序列的构建物，这些腺病毒序列足以(a)支持构建物的包装以及(b)最终使克隆到其中的重组基因构建物得以表达。
腺病毒可以是复制缺陷型，或者至少是条件性复制缺陷型，腺病毒载体的特性不认为是成功实现本发明的关键。腺病毒可以是已知的42种不同血清型或A-F亚组中的任何一种。C亚组中的5型腺病毒是常用的起始材料以便于获得可用于本发明的条件性复制缺陷型腺病毒载体。这是因为5型腺病毒是一种大量生化信息和遗传信息已知的人腺病毒，历史上大多数构建物已采用腺病毒作为载体。
如上所述，本发明典型的载体是复制缺陷型的并且不含腺病毒的E1区。因此，将转化构建物导入到E1编码序列被删除的位置上是最方便的。但是，腺病毒序列内构建物插入的位置不是本发明的关键。编码感兴趣基因的多聚核苷酸也可插入到E3替代载体的E3删除区，如Karlsson等(1986)所述，或者插入E4区，辅助细胞系或辅助病毒可补充E4缺失。
腺病毒的生长和操作方法是本领域技术人员所熟知的，腺病毒在体内和体外都有很宽的宿主范围。这组病毒可以获得很高的滴度，如可达到每毫升109-1011噬菌斑形成单位，并且具有较高的感染性。腺病毒的生命周期不需要整合到宿主基因组中。腺病毒输送的外源基因是游离体，因此对宿主细胞的遗传毒性很低。已报道用野生型腺病毒进行疫苗接种没有副作用(Couch等，1963；Top等，1971)，证明腺病毒是安全的具有治疗潜能，可以作为体内基因转移的载体。
b.逆转录病毒感染
逆转录病毒是一组单链RNA病毒，其特点是可以在感染细胞内通过逆转录过程将其RNA转变成双链DNA(Coffin，1990)。产生的DNA能以前病毒的形式稳定地整合到细胞染色体内，指导病毒蛋白的合成。病毒的整合会导致病毒的基因序列留在受体细胞及其子代细胞内。
为了构建逆转录病毒载体，将编码感兴趣基因的核酸插入到病毒基因组内以替换某些病毒序列，产生复制缺陷型的病毒。为了产生病毒颗粒，需要构建含有gag、pol和env基因但不含LTR及包装成分的包装细胞系(Mann等，1983)。当将含cDNA的重组质粒与逆转录病毒的LTR和包装序列一起导入到该细胞系时(如通过磷酸钙沉淀法)，包装序列可使重组质粒的RNA转录物包装到病毒颗粒，然后分泌到培养基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。收集含重组逆转录病毒的培养基，任选地浓缩，然后用于基因转移。逆转录病毒载体可以感染多种类型的细胞。但是其整合和稳定表达需要宿主细胞分裂(Paskind等，1975)。
c.AAV感染
腺伴随病毒(AAV)是一种可用于本发明的诱人的载体系统，因为它的整合频率高、能感染非分裂细胞，因此可用于将基因输送给组织培养中的哺乳动物细胞内(Muzyczka，1992)。AAV具有广泛的宿主范围(Tratschin等，1984；Laughlin等，1986；Lebkowski等，1988；McLaughlin等，1988)，这就意味着它可用于本发明。有关rAAV载体的产生和用途的详细所述见美国专利5,139,941和4,797,368，本文都已引入作为参考。
利用AAV输送基因的研究包括LaFace等(1988)；Zhou等(1993)；Flotte等(1993)；以及Walsh等(1994)所所述的。重组AAV载体已成功地用于标记基因的体内和体外转导(Kaplitt等，1994；Lebkowski等，1988；Samulski等，1989；Shelling和Smith，1994；Yoder等，1994；Zhou等，1994；Hermonat和Muzyczka，1984；Tratschin等，1985；McLaughlin等，1988)以及人类疾病相关基因的转导(Flotte等，1992；Ohi等，1990；Walsh等，1994；Wei等，1994)。最近，已批准AAV载体治疗囊性纤维化的I期临床试验。
一般来说，重组AAV(rAAV)病毒是通过共转染含感兴趣基因的质粒而制备的，感兴趣基因侧接两个AAV末端重复序列(McLaughlin等，1988；Samulski等，1989；本文都已引入作为参考)，和含野生型AAV编码序列的表达质粒共感染，其中AAV编码序列不含末端重复序列，如pIM45(McCarty等，1991；本文已引入作为参考)。也可用腺病毒或携带AAV辅助功能所需腺病毒基因的质粒转染或感染细胞。以这种方法制备的rAAV病毒贮液中污染的腺病毒必须用物理方法从rAAV病毒颗粒中分离出去(例如通过氯化铯密度梯度离心)。或者可采用含AAV编码区的腺病毒载体或含AAV编码区和部分或全部腺病毒辅助基因的细胞系(Yang等，1994a；Clark等，1995)。也可以使用携带整合的原病毒形式的rAAV DNA的细胞系(Flotte等，1995)。
d.精蛋白
也可利用精蛋白与表达构建物形成复合物。然后将这种复合物与上述脂类组合物一起配制给予细胞。精蛋白是小的与DNA结合的高度碱性的核蛋白质。它们在核酸输递中的用途在美国专利No.5,187,260中的所述，本文引入作为参考。涉及将病毒载体与精蛋白分子构成复合物以提高病毒载体转导效率的方法和组合物见美国专利申请No.10/391,068(2003年3月24日提交)本文特地引入作为参考。
2.非病毒输送
除了利用病毒输送编码MDA-7蛋白的核酸外，下面是将重组基因输送给制定宿主细胞的其它方法，也包含在本发明的范围之内。
                        a.脂质介导的转化
在本发明的另外一个实施方式中，可将基因构建物包裹在脂质体或脂质制剂内。脂质体是特征为由磷脂双层膜和内部水性介质组成的囊状结构。多室脂质体具有被水性介质分隔的多层脂质。当将磷脂悬浮在过量的水溶液中可以自发地形成脂质体。在形成封闭的结构前脂质成分发生自身重排，将水和溶解的溶质包裹到脂双层内(Ghosh和Bachhawat，1991)。也考虑将基因构建物与脂转染胺(Lipofectamine)(Gibco BRL)构成复合物。
最近脂质制剂的进展提高了体内基因转运的效率(Smyth-Templeton等，1997；WO 98/07408)。一种由等摩尔的1，2-二(油酰氧基)-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)和胆固醇组成的新型脂质制剂明显提高了全身性体内基因转运效率，大约提高了150倍。DOTAP：胆固醇脂质制剂据说形成了一种独特的结构，称为“三明治脂质体”。这种制剂据报道可以将DNA夹到双层和“瓶状结构”之间。这些脂质结构的特征优点是胆固醇增强了阳电荷胶体的稳定性、两个二维DNA包装及血清稳定性提高。
C.蛋白质，肽和多肽
1.生物功能等价物
本发明涉及MDA-7多肽的方法和组合物。在某些实施方式中，MDA-7多肽用于治疗新生血管形成相关疾病例如癌症。在某些实施方式中，直接提供MDA-7多肽。在具体实施方式中，MDA-7多肽在治疗前提供。在具体实施方式中，MDA-7多肽与免疫原性分子，如抗原同时给予以达到免疫治疗的目的。在其他具体实施方式中，MDA-7多肽在治疗后提供，在某些情况下是在提供免疫原性分子以后，以达到治疗、诊断或预测免疫应答反应的诱导的目的。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。
本发明的其他实施方式包括使用纯化的蛋白组合物，该组合物中含有MDA-7蛋白、截短形式的MDA-7以及衍生自MDA-7氨基酸序列的肽，给予细胞或对象以抑制新生血管形成。截短的MDA-7分子包括从MDA-7氨基酸残基46-49开始的和N端截短的分子。具体考虑这些分子起始于46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181和182、残基和末端206位残基。在其他的实施方式中，残基1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45和46包含在MDA-7的其他连续氨基酸残基内，如SEQ ID NO：2所示。
如本领域技术人员所知的，可对MDA-7多肽或肽、免疫原性分子或免疫基因产物进行修饰和改变，产生的分子具有同样的或所需的特征。例如，蛋白质结构中的某些氨基酸可被其他氨基酸所替代，但是不会丧失与某些结构如抗体的抗原结合区的结合能力或丧失某些分子如Tat和RNA聚合酶II的结合位点。由于蛋白质的反应能力和性质决定了蛋白质的生物功能活性，因此在蛋白序列(当然也包括其编码DNA序列)中可进行某些氨基酸序列的替代而得到具有相同性能的蛋白质(激动性)。因此，发明者认为可在HIV多肽或肽(或其编码DNA)序列中进行各种改变而不会相应地丧失其生物功能或活性。
就功能等价物而言，本领域技术人员也理解该概念来自于生物功能等价蛋白或肽的定义，是指一个分子的特定部分内发生一些有限的改变，所得到的分子具有可接受水平的相等的生物活性。因此本文所定义的生物功能等价肽是指某些而不是大多数或全部氨基酸被替代的那些肽。特别是对于小肽来说，可以改变的氨基酸很少。当然，根据本发明可以不难地制备和使用含有不同取代的多种不同的蛋白/肽。
很容易理解某些残基对于蛋白质或肽的生物或结构特性十分重要，例如位于酶或RNA聚合酶II结合区的活性位点上的残基，这些残基一般不允许改变。对于本发明来说，那些诱导免疫应答反应所必须的残基一般不能改变，对于MDA-7多肽和免疫基因产物也是如此。
氨基酸的替代一般根据氨基酸侧链取代基的相对相似性，如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。通过对氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型的分析发现精氨酸、赖氨酸和组氨酸是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸是较小的氨基酸；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有基本相似的形状。因此，基于这些考虑，本文把下列的亚类定义为生物功能等价物：精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
为了有效地量化这种改变，可考虑氨基酸的亲水性指数。根据它们的疏水性和电荷特征，每个氨基酸都设定了一个亲水性指数，分别为异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
氨基酸的亲水性指数赋予蛋白质的生物反应功能的重要性是本领域所熟知的(Kyte & Doolittle，1982，本文已引入作为参考)。已知某些氨基酸被具有相似亲水性指数或评分的其他氨基酸替代可以保持相似的生物活性。在基于亲水性指数进行改变时，优选用亲水性指数在±2以内的氨基酸进行替代，特别优选的是亲水性指数在±1以内的，甚至更优选的是亲水性指数在±0.5以内的。
可根据亲水性进行有效的氨基酸替代也是本领域所熟知的，尤其是当用于免疫实施方式中所产生的生物功能等价蛋白或肽时，如本发明的实施方式。美国专利4,554,101(本文已引入作为参考)描述了蛋白质的局部最大平均亲水性是由其毗连氨基酸的亲水性控制的，与其免疫原性和抗原性相关，即与蛋白的生物特性有关。
如美国专利4,554,101详细描述的，氨基酸残基被赋予了下列的亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
在基于相似的亲水性值进行改变时，优选用亲水性值在±2以内的氨基酸进行替代，特别优选的是亲水性值在±1以内的，甚至更优选的是亲水性值在±0.5以内的。
当讨论集中在因氨基酸改变而产生的功能等价多肽时，应理解编码DNA的改变也会影响上述氨基酸的变化，也需要考虑基因密码子的简并性即两个或多个密码子可以编码同一个氨基酸。氨基酸及其密码子的表列在本文的下面以便于这种实施方式的应用，或其他的应用，如设计探针和引物等。
2.合成肽
本发明的组合物可以包括经修饰来保护其生物功能的肽。生物功能保护肽与未保护肽相比在给予人体时具有某种点，见美国专利5,028,592的所述，本文已引入作为参考，保护肽通常具有更高的药理活性。
本发明所用的组合物也可包括含所有L氨基酸、所有D氨基酸或其混合物的肽。D氨基酸的使用可以提高蛋白质对人体天然蛋白酶的耐受性，降低其免疫原性，因而预计可能具有更长的生物半衰期。
本发明描述了用于本发明各种实施方式的MDA-7肽。例如，测试了特异性肽诱发抗新生血管形成应答反应的能力。在该肽相对较小的具体实施方式中，本发明的肽也可按常规技术在溶液中或固相支持物上合成。各种自动合成仪可从商业上购买到，可根据已知的操作方法使用。见Stewart和Young，(1984)；Tam等，(1983)；Merrifield，(1986)；以及Barany和Merrifield(1979)，本文都已引入作为参考。短肽序列或重叠肽文库一般约含有35到50个氨基酸，与本文所述的所选区域相对应，可以很容易地合成并通过筛选试验鉴定具有活性的肽。另外，可采用重组DNA技术，将编码本发明肽的核苷酸序列插入到表达载体内，然后转化或转染到适当的宿主细胞内，在适宜表达的条件下培养。
本发明的组合物可以包括经修饰而保护其生物功能的肽。生物功能保护肽与未保护肽相比在给予人体时具有某种优点，见美国专利5,028,592的所述，本文已引入作为参考，保护肽通常具有更高的药理活性。
本发明所用的组合物也可包括含所有L氨基酸、所有D氨基酸或其混合物的肽。D氨基酸的使用可以提高蛋白质对人体天然蛋白酶的耐受性，降低其免疫原性，因而预计可能具有更长的生物半衰期。
3.体外蛋白质的产生
除了实施例提供的纯化方法外，还讨论了体外蛋白质产生的通用工艺。按照本发明的某些实施方式用病毒载体转导后，可通过各种方式制备原代哺乳动物细胞培养物。为了使细胞在体外以及与表达构建物接触时保持活力必需保证细胞维持与正确比例的氧、CO2和养分环境接触但不被微生物污染。细胞培养技术在文献中已有详述，在本文参考文献中也有描述(Freshner，1992)。
上述的一个实施方式包括利用基因转移至永生的细胞以制备和/或生产蛋白质。感兴趣蛋白质的基因可按上述方法转移到适当的宿主细胞中，然后在适宜的条件下培养细胞。事实上任何多肽的基因都适用这种方法。重组表达载体及其所含元件的制备已在上面讨论过。另外，所产生的蛋白可以是所述细胞正常合成的内源性蛋白。
本发明的其他实施方式利用自身的B淋巴细胞系，这些细胞系用表达免疫基因产物、更具体说是具有免疫活性的蛋白的病毒载体转染。哺乳动物宿主细胞系的其他例子包括Vero和HeLa细胞、其他B细胞系和T细胞系，如CEM、721.221、H9、Jurkat、Raji等，以及中国仓鼠卵巢细胞系、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN和MDCK细胞。另外，可以选择调节插入序列表达的或能以所需方式修饰和加工基因产物的宿主细胞系。蛋白质产物的这种修饰(如糖基化)和加工(如断裂)对于蛋白质的功能十分重要。不同的宿主细胞具有不同的蛋白质翻译后加工和修饰的特征性机制。可选择合适的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白质的正确修饰和加工。
可使用许多筛选系统，包括但不限于，HSV胸腺嘧啶激酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶和腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因，分别位于tk-、hgprt-和aprt-细胞内。另外，抗代谢耐受性也可作为筛选的基础：dhfr使细胞对耐受；gpt使细胞对霉酚酸耐受；neo使细胞对氨基糖苷G418耐受；hygro使细胞对潮霉素耐受。
动物细胞可以两种模式在体外增殖：非锚定依赖的细胞悬浮在培养液中生长大量培育，或锚定依赖的细胞需要粘附在固相基质上增殖(即细胞呈单层生长)。
能连续传代的细胞系通过非锚定依赖的培育或悬浮培养，是最广泛应用的大规模制备细胞和细胞产物的方法。但是悬浮培养的细胞也有其局限性，如与粘附细胞相比其致瘤性弱，蛋白产生较低。
4.ER-靶向序列
本发明多肽包含一种或多种内质网靶向序列。蛋白质在细胞中的最终定位取决于蛋白质序列内编码的靶向序列。在最简单的情况中，缺少信号肽将蛋白质引导到缺省途径，即细胞质。注定留在ER中的蛋白质必须有某些信号肽使蛋白质留在ER中。本发明的多肽在N末端或C末端可以包含或不包含附加的氨基酸残基。
ER是膜封闭式导管和囊(池)的网络，从核膜延伸到整个细胞质。蛋白质的分泌途径如下：粗ER→高尔基体→分泌囊泡→细胞外部。
对于分泌性蛋白质，这类蛋白质一般必须从ER到高尔基体。然而，也有一些蛋白质必须留在ER内，例如BiP，信号肽酶，蛋白质二硫化物异构酶。特定的定位信号可使蛋白质靶向ER。
一些蛋白质因为在其羧基末端存在ER靶向序列Lys-Asp-Glu-Leu(KDEL，单字码)而留在ER腔中。如果该序列不是蛋白质的一部分，则该蛋白质改为运输到高尔基中并由细胞分泌。羧基末端(KKXX)KDEL序列或KKXX序列的存在导致蛋白质滞留在ER中。这些序列的存在导致该蛋白质结合于这些腔室膜中的特定循环受体，然后选择性地被运回ER。
从ER运出蛋白质不只是通过总体流动形式而发生，而且还通过特异性识别靶向信号的调控途径介导蛋白质选择性运往高尔基体。16-30个残基ER信号序列的存在，指导核糖体结合ER膜并启动蛋白质穿过ER膜运输。
ER信号序列通常位于蛋白质的N末端。这些靶向序列通常含有一个或多个带正电的氨基酸然后是连续的6-12个疏水残基。通常当信号序列尚在核糖体上增长时就从蛋白质上断裂下来。几个信号序列疏水残基的特异性缺失或其中一个突变为带电氨基酸残基导致该蛋白质不能穿过ER膜进入腔。随机N末端氨基酸序列的添加将引起细胞溶质蛋白质移位到ER腔中，表明疏水残基形成的结合位点对于ER靶向很关键。
内质网靶向序列可包含任何数目的氨基酸残基，只要这些氨基酸残基指导此多肽最终进入内质网中。本发明的多肽可含有一个ER靶向序列，或一个以上的ER靶向序列。涉及ER靶向信号的另外的信息可见InvitrogenCatalog Nos.V890-20，V891-20，V892-20和V893-20，“pShooter VectorManual I(pEF/myc vector)”，因特网上在invitrogen.com/content/sfs/manuals/pshooter_pef_man.pdf，整体引入本文作为参考。信号序列识别和蛋白质靶向ER的综述也可在Walter和Johnson，1994；Koch等，2003；和Kabat等，1987中找到，特地引入本文作为参考。
                       5.抗体
本发明的另一实施方式是抗体，在有些情况下，是与MDA-7多肽序列(SEQ ID NO：1)起免疫反应的人单克隆抗体。可理解的是，这类抗体可用于抑制或调节MDA-7。此外，抗体可用于癌症的被动免疫治疗。发现的所述抗体和抗原或表位序列的所有这些应用都属于本发明范围。下面叙述适用于本发明方法的抗MDA-7抗体的用途。
                      a.MDA-7抗原序列
作为影响对象中MDA-7调控的另外一个方法，也可制备与本发明MDA-7多肽一个或多个抗原决定簇对应的肽，从而增强抗MDA-7的免疫应答反应。因此，考虑以MDA-7肽或多肽疫苗接种可能在被免疫动物中产生自身免疫应答反应从而产生特异性识别该动物内源MDA-7蛋白质的自身抗体。这类疫苗接种技术见美国专利6,027,727；5,785,970和5,609,870，引入本文作为参考。
此类肽长度上一般应至少为5或6个氨基酸残基，优选约10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25或约30个氨基酸残基，可含有多达约30-35个残基。例如，这些肽可包含MDA-7氨基酸序列，例如5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45和50或更多个SEQ ID NO：2的连续氨基酸。合成肽一般长约35个残基，大约是自动肽合成仪例如Applied Biosystems(Foster City，CA)提供的仪器的最大长度。也可制备更长的肽，例如通过重组方法。
美国专利4,554,101，引入本文作为参考，说明了基于亲水性鉴定和制备一级氨基酸序列中表位的方法。通过Hopp中所述的方法，本领域技术人员应该能够鉴定例如本文SEQ ID NO：2所示的MDA-7序列等氨基酸序列表位。
很多科学出版物致力于依据氨基酸序列分析来预测二级结构和鉴定表位(Chou & Fasman，1974a，b；1978a，b；1979)。如果需要，可利用任何这些出版物来补充美国专利4,554,101 Hopp所述的方法。
此外，现在也可用计算机程序来帮助预测蛋白质的抗原部分和表位的核心区域。例子包括基于Jameson-Wolf分析的程序(Jameson & Wolf，1988；Wolf等，1988)，程序PepPlot
Figure 10003_0
(Brutlag等，1990；Weinberger等，1985)，和其它蛋白质三级结构预测的新程序(Fetrow & Bryant，1993)。其它可进行这种分析的商业软件程序是Mac Vector(IBI，New Haven，CT)。
在另外的实施方式中，可利用实验方法鉴定MDA-7多肽的主要抗原决定簇，其中，将编码MDA-7多肽基因的各部分在重组宿主中表达，检测产生的蛋白质引起免疫应答反应的能力。例如，可利用PCRTM来制备缺少该蛋白质C末端较长连续性区段的一些肽。测定各肽的免疫活性来鉴定该多肽的免疫优势片段或区域。进一步研究包括，在每次重复中只去除很小数目的氨基酸，然后更精确地测定该多肽的抗原决定簇位置。
测定多肽主要抗原决定簇的另一种方法是SPOTsTM系统(GenosysBiotechnologies，Inc.，The Woodlands，TX)。该方法中，在纤维素膜上合成重叠的肽，合成和去保护后，用多克隆抗体或单克隆抗体筛选。初步鉴定到的该肽抗原决定簇可通过后续合成具有更大重叠的更小的肽和最终替代免疫反应性肽中每个位置的各个氨基酸来进一步定位。
一旦完成了一种或多种此类分析，即可制备含有至少一个或多个抗原决定簇的关键特性的多肽。然后可用该肽产生抗该多肽的抗血清。也可构建编码这些决定簇的小基因或融合基因并用标准方法将其插入表达载体，例如用PCRTM克隆方法。
将这些小肽用于产生抗体或疫苗时，一般需要将这些肽与免疫原性载体蛋白质例如肝炎B表面抗原，钥孔帽贝血蓝蛋白或牛血清白蛋白偶联，或其它上述佐剂(辅助性多肽)。明矾是已充分证明用于人体无毒的佐剂。进行偶联的方法在本领域内是周知的。也可考虑其它免疫活化化合物与本发明的组合物一起使用，例如多糖包括壳聚糖，在美国专利No.5,980,912中有所述，引入本文作为参考。多个(1个以上)MDA-7表位可互相交联(例如，聚合)。或者，可将编码Fortilin肽或多肽的核酸序列与可提高免疫应答反应的核酸序列联合。这种融合蛋白质可含有外源(非自身)蛋白质例如细菌序列的一部分或全部。
对实现抗内源MDA-7有效免疫应答反应的抗体滴度随疫苗接种动物的种类和所给予肽的序列不同而不同。然而，有效滴度不难测定，例如，通过以不同剂量的特异性抗原免疫一组动物，然后用已知技术例如ELISA测定其诱导的自身抗体(或抗自身抗体)的滴度，将所测滴度与MDA-7相关癌症特征例如肿瘤生长或大小相关联。
本领域普通技术人员知道有多种试验可测定是否产生了抗MDA-7免疫应答反应。词组“免疫应答反应”包括细胞和体液免疫应答反应。各种B淋巴细胞和T淋巴细胞的试验是众所周知的，例如ELISA，细胞毒T淋巴细胞(CTL)试验，例如铬释放试验，采用外周血淋巴细胞(PBL)的增殖试验，四聚体试验以及细胞因子产生试验。见Benjamini等，1991，引入本文作为参考。
D.MDA-7纯化方法
本发明提供MDA-7纯化方法。可用下列方法或本领域技术人员所知的类似方法来施行本文所述的MDA-7纯化方法。
1.凝胶电泳
凝胶电泳是众所周知可用于纯化步骤的技术。可在纯化过程中用标准方法(Sambrook等，2001)进行琼脂糖，琼脂糖-丙烯酰胺或聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2.层析技术
或者，可利用层析技术进行MDA-7分离和纯化。有很多种可用于本发明的层析方法：吸附，亲和，分配，离子交换和分子筛，以及使用这些层析法的很多专门技术包括柱，纸，薄层和气相层析(Freifelder，1982)。
3.免疫试剂
本发明的某些方面包括免疫试剂的使用。在本发明的某些实施方式中，采用免疫试剂来纯化MDA-7制剂。本文所述抗体也可用于本发明。
如本文所用，术语“抗体”广义指任何免疫结合制剂例如IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。一般优选IgG和/或IgM，因为它们是生理状态下最常见的抗体并且在实验室设施中最易制备。
术语″抗体″用于指具有抗原结合区的任何抗体类型分子，包括抗体的片段例如Fab′，Fab，F(ab′)2，单区域抗体(DABs)，Fv，scFv(单链Fv)等。制备和使用各种抗体构建物和片段的技术在本领域内是周知的。用于制备和签定抗体的方法在本领域内也是周知的(见，例如，Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988；引入本文作为参考)。
单克隆抗体(MAbs)被认为具有某些优点，例如，重复性好和大规模生产，所以通常优选使用它们。因此本发明提供人、鼠、猴、大鼠、仓鼠、兔子甚至鸡源性单克隆抗体。因为制备简单并且试剂易获得，鼠单克隆抗体经常是优选的。
然而，也考虑“人源化”抗体，即从小鼠、大鼠或其它动物的携带有人恒定和/或可变区的嵌合抗体，双特异性抗体、重组或工程抗体及其片段。已知还有为患者的牙齿疾病“个体定制”的抗体的生产方法，这些定制的抗体也在考虑范围内。
产生单克隆抗体(MAbs)的方法一般以与制备多克隆抗体同样的路线开始。简言之，制备多克隆抗体是通过以本发明的LEE或CEE组合物免疫动物然后收集免疫动物抗血清。
很多动物物种可用于生产抗血清。一般，用于生产抗血清的动物是兔子、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或山羊。动物的选择可取决于操作难易度、成本和所需血清数量，如本领域技术人员知道的那样。
多克隆抗体生产的免疫原组合物用量可根据免疫原的性质和所用的免疫动物而不同。可用很多种途径给予免疫原，包括但不限于皮下、肌肉内、皮内、表皮内、静脉内和腹膜内。可通过在免疫接种后不同时间采取免疫动物的血液样品监测多克隆抗体的产生。
也可给予第二次的，加强剂量(以注射法提供)。可重复加强和滴定过程直到获得合适的滴度。当获得所需的免疫原性水平时，可收集免疫动物血液，分离和储存血清，和/或利用该动物产生Mabs。
对于兔单克隆抗体的生产，可通过耳静脉或者心脏穿刺给动物放血。使分离的血凝结然后离心将所有细胞和血凝块与血清成分分离。该血清可有多种应用或用周知的方法纯化所需抗体组分，例如用结合于固体基质的其它抗体或肽作亲和层析，，或利用例如蛋白质A或蛋白质G层析。
利用周知的技术不难制得MAbs，如美国专利4,196,265所示的技术，引入本文作为参考。一般，这种技术包括以所选的免疫原组合物，例如纯化或部分纯化的蛋白质，多肽，肽或其结构域，可以是野生型或突变组合物来免疫合适的动物。将免疫组合物以有效刺激抗体产生细胞的方式给予。
产生单克隆抗体(MAbs)的方法一般以制备多克隆抗体同样的路线开始。啮齿动物例如小鼠和大鼠是优选的动物，然而，也可采用兔、绵羊和蛙细胞。利用大鼠可能有几个优点(Goding，1986，60-61页)，但优选小鼠，以BALB/c小鼠最优，它是最常规使用的并且一般稳定融合的百分比较高。
以抗原注射动物，抗原可为肽、多肽的一部分，或整个多肽，例如MDA-7，一般如上所述。抗原可与佐剂混合，例如弗氏完全或非完全佐剂。可间隔约两周以同样的抗原或编码该抗原的DNA加强免疫。
免疫之后，选择具有产生抗体潜力的体细胞具体说是B淋巴细胞(B细胞)用于Mab生产程序。这些细胞可从活体检查的脾、扁桃腺或淋巴结获得，或获自于外周血样品。优选脾细胞和外周血细胞，前者是因为它们是处于分裂性浆母细胞阶段的抗体产生细胞的丰富来源，后者是因为外周血易获得。
通常，一组动物被免疫之后，切取具有最高抗体滴度的动物的脾，用注射器将脾均质化得到脾淋巴细胞。一般，免疫小鼠的脾含有约5×107-2×108个淋巴细胞。
然后将得自免疫动物的产生抗体的B淋巴细胞与无限增殖的骨髓瘤细胞进行细胞融合，所述骨髓瘤细胞通常应与免疫动物属于同一物种。适于在杂交瘤生产融合过程中使用的骨髓瘤细胞，优选不产生抗体的、具有高融合效率和酶缺乏的从而不能在某些只供所需融合细胞(杂交瘤)生长的选择培养基上生长的骨髓瘤细胞。
如本领域技术人员所知，可使用任一种骨髓瘤细胞(Goding，65-66页，1986；Campbell，75-83页，1984)。例如，当免疫动物是小鼠时，可用P3-X63/Ag8，X63-Ag8.653，NS1/1.Ag 41，Sp210-Ag14，FO，NSO/U，MPC-11，MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0 Bul；对于大鼠，可用R210.RCY3，Y3-Ag 1.2.3，IR983F和4B210；对于人细胞融合，可用U-266，GM 1500-GRG2，LICR-LON-HMy2和UC729-6。
融合步骤产生活的杂交细胞概率通常较低，约1×10-6-1×10-8。然而这不是问题，因为通过在选择性培养基上培养从亲代未融合细胞(尤其是正常地继续不停分裂的未融合骨髓瘤细胞)分化产生活的融合杂交细胞。选择培养基通常含有在组织培养基中阻抑核苷酸从头合成的试剂。示范性和优选的试剂是氨基蝶呤、氨甲喋呤和重氮丝氨酸。
这种培养提供了杂交瘤群体，从中可选出特异性杂交瘤。一般，杂交瘤的筛选是在微量滴定板中培养单个克隆稀释液的细胞，然后检测各个克隆上清中(2-3周后)所需的(抗体)活性。试验方法应该灵敏、简单和迅速，例如放射免疫试验、酶免疫试验、细胞毒性试验、空斑试验、斑点免疫结合试验等。
然后将所选杂交瘤作系列稀释克隆成为单一抗体产生细胞系，这些克隆可无限繁殖提供Mabs。可用两种基本方法利用这些细胞系进行MAbs生产。第一，可将杂交瘤样品注射入(经常注射入腹膜腔)提供原初融合用的体细胞和杂交瘤细胞的同类组织相容性动物中(例如同系小鼠)。任选地，可在注射前以碳氢化合物尤其是油例如降植烷(四甲基十五烷)处理动物。被注射动物产生的肿瘤分泌由融合杂交细胞产生的特异性单克隆抗体。然后可抽取该动物的体液例如血清或腹水提供高浓度MAbs。第二，可体外培养单独的细胞系，细胞将MAbs自然分泌入培养基中，在培养基中可很容易地得到高浓度的MAbs。
如果需要，还可用过滤、离心和各种层析方法例如HPLC或亲和层析进一步纯化产生的MAbs。可通过包括酶切例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化和/或化学还原断裂二硫键等方法，从所产生的单克隆抗体获得本发明单克隆抗体的片段。或者，可用自动肽合成仪合成本发明的单克隆抗体片段。
4.免疫检测方法
在其它实施方式中，本发明涉及结合、纯化、去除、定量和/或检测生物组分例如MDA-7表达的信使、蛋白质、多肽或肽的免疫检测方法。一些免疫检测方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)，放射免疫试验(RIA)，免疫放射试验，荧光免疫试验，化学发光试验，生物发光试验以及Western印迹等。各种有用的免疫检测方法的步骤已在科学文献中有所述，例如，Doolittle MH和Ben-Zeev O，1999；Gulbis B和Galand P，1993；DeJager R等，1993；和Nakamura等，1987，均引入本文作为参考。这些技术是本领域技术人员周知。
E.药物制剂及其输递
在本发明的某些实施方式中，涉及输递编码MDA-7蛋白的表达构建物的方法。在一些实施方式中，该方法涉及输递编码免疫原的表达构建物。或者，该表达构建物含有编码MDA-7和免疫原的序列。涉及免疫应答的疾病包括那些可用疫苗预防或治疗的疾病。其中包括肺癌、头颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、肺的癌前病变、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌以及其他任何与免疫应答有关的、能通过给予MDA-7蛋白来增强所诱导的免疫应答进行治疗的疾病。
所述药用组合物的“有效剂量”一般定义为可检测到的、可重复获得所需结果例如改善、减轻、降低或限制疾病或其症状的足够剂量。更严格的定义是指消除、根除或治愈疾病的用量。
1.给药
在某些特殊的实施方式中，期望利用本发明的方法和组合物杀死细胞、抑制细胞的生长、抑制肿瘤的转移、降低肿瘤和组织的大小以及逆转和降低肿瘤细胞的恶性表型，诱导免疫应答反应或抑制新生血管形成。给药途径可以多种多样，应根据损伤的部位和性质或目标靶点，包括皮内、皮下注射、胃肠外、静脉内、肌肉内、鼻内、全身和口服给药。
直接注射、瘤内注射或肿瘤血管内注射特别考虑适于散发的、固体的、易接近的肿瘤或其它可接近的靶区域。局部、区域或全身给药都可以。对于＞4cm的肿瘤，注射的体积约为4-10ml(优选10ml)，而对于＜4cm肿瘤，注射的体积约为1-3ml(优选3ml)。
多点注射可输递的单个剂量约为0.1-0.5ml。病毒颗粒优选通过多点注射与肿瘤或靶位点接触，间隔约为1cm。
对于肿瘤的手术治疗来说，可在手术前使用本发明(的组合物)以使那些不宜手术的肿瘤可以被切除。或者，本发明(组合物)也可在手术时和/或手术后使用以治疗残存的肿瘤或转移瘤。例如，肿瘤切除后可在肿瘤床内注射或灌注含MDA-7或者编码MDA-7的构建物加或不加免疫原性分子的组合物。可以通过植入手术部位的导管在切除肿瘤后持续灌注。周期性的术后治疗也可以考虑。
也可考虑持续灌注表达构建物或病毒构建物。持续灌注中输送的构建物或肽的量可由所需的吸收量确定。
在适当的时候，例如在切除肿瘤或其它受影响的区域后需要处理肿瘤床或目标位点以消除残存的微小肿瘤时，可以进行持续给药。通过注射器或导管给药是常用的。这种持续灌注可以进行一段时间，如在开始治疗后持续约1-2小时、约2-6小时、约6-12小时、约12-24、约1-2天、约1-2周或更长时间。一般情况下，通过持续灌注给予的治疗性组合物的剂量与单次给药或多点注射的剂量相同，在灌注期间可以在一段时间内略作调整。
治疗方案也可不同，一般根据肿瘤的类型、肿瘤的位置、免疫状况、目标位点、病情进展、患者的健康状况和年龄来定。显然某些类型的的肿瘤需要攻击性较强的治疗措施，同时，某些患者不能耐受繁重的治疗措施。医生最适宜根据对治疗药物的效力和毒性(如果有)的了解作出决定。
在某些实施方式中，待治疗的肿瘤或受影响区域可能是，至少最初可能是无法切除的。利用治疗性病毒构建物处理可以增加切除肿瘤的可行性，因为经处理后肿瘤的边缘可能萎缩，或者某些特殊侵袭性部位可能消失。经治疗后肿瘤就可能被切了。切除后进行其他治疗可根除肿瘤部位或目标位点中微小的残存肿瘤。
对于原发肿瘤和切除后的肿瘤床来说，典型的治疗方式是进行多次处理。一般来说原发肿瘤的治疗是在2周内进行6次注射。此种两周疗程可重复进行1、2、3、4、5、6或更多次。在治疗期间，可以从新评价是否需要完成计划的剂量。
治疗包括不同“单位剂量”。单位剂量是指预定量的治疗组合物。注射的量以及注射途径和制剂都是临床治疗领域技术人员所熟知的。单位剂量不一定必须一次注射，可以在一段时间内连续注射。本发明(组合物)的单位剂量用术语病毒构建物的噬菌斑形成单位(pfu)或病毒颗粒表示更方便。单位剂量可以是103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013pfu或病毒颗粒(vp)，或者更高。
给予患者的蛋白的剂量为，或者至少为0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0.9.0、10、15、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000ng/ml或更高。
2.可注射组合物和制剂
输递免疫原性分子、编码MDA-7蛋白和/或免疫原的表达构建物的某些实施方式是全身给药。但是，本文所述的药用组合物还可以通过胃肠外、皮下、直接静脉内、气管内、皮内注射、肌肉内注射或腹腔内注射给药，见美国专利5,543,158；5,641,515和5,399,363的所述(本文都已完整引入作为参考)。
核酸构建物的注射可以通过注射器或注射溶液的其他方法完成，只要该表达构建物可以通过注射针头的孔径。最近报道了一种新型无针注射系统(美国专利5,846,233)，该系统含有一个称为喷嘴的小室用于盛溶液，一个动力装置将溶液推出喷嘴到达输递部位。也报道了用于基因治疗的注射器系统，将预定量的溶液精确多点注射到任何深度(美国专利5,846,225)。
活性化合物溶液可将其游离碱或药学上可接受的盐溶于水来制备，混以适当的表面活性剂，如羟丙纤维素。也可用甘油、液体聚乙二醇、及其混合物或油制成分散剂。在普通储存或使用条件下，这些制剂需要加入防腐剂以防止微生物的生长。适宜注射的药用形式包括无菌水溶液、无菌分散液或无菌粉末，后者可在临用时制备成无菌可注射溶液或分散液(美国专利5,466,468，本文已完整引入作为参考)。无论何种形式都必须是无菌的，并且要有一定的流动性以便于用注射器注射。各种制剂在制造和储存条件下都必须是稳定的，并且必须要防止微生物，如细菌和真菌的污染。运载体可以是溶剂和分散介质，例如包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、以及上述物质的适当混合物和/或植物油。可以利用包被剂如卵磷脂，使分散液中颗粒保持所需大小和用表面活性剂使制剂保持适当的流动性。微生物的作用可通过加入各种抗生素和抗真菌药物如对羟基苯甲酸酯(parabens)、氯代丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等来预防。大多数情况下优选含有等渗物质，如糖或氯化钠。可在该组合物中加入延缓吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶来延迟注射组合物的吸收。
对于胃肠外途径给予的水溶液，在需要时该溶液应适当缓冲，首先用足量的盐和葡萄糖使稀释液达到等渗。这些特殊的水溶液特别适于静脉注射、肌肉注射、皮下注射、瘤内注射和腹膜内注射。在这种联系中，本领域的技术人员按照本说明书的所述知道可采用的无菌水性介质。例如，可将单次剂量的药物溶解于1ml等渗NaCl溶液中，或者加入到1000ml皮下输液液体中，或者注射到适当的灌注部位(见《Remington药物学》(″Remington’s Pharmaceutical Sciences″)，第15版，1035-1038页和1570-1580页)。根据所治疗患者的状况必须对剂量作一些变化。在任何情况下，负责给药的人将确定每位患者的适合剂量。而且对于人的治疗，制剂应符合FDA生物标准办公室要求的无菌、热源、一般安全性和纯度标准。
无菌注射液可通过如下过程制备：将活性化合物以所需量溶于合适溶剂中，然后与各种上述其他组分混合，如果需要再过滤除菌。一般来说，分散液是通过如下过程制备的：将各种无菌活性组分加入到含基础分散介质的无菌载体内，再与所需要的上述其他组分混合。如果利用无菌粉末制备无菌注射液，某些制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术制备活性组分的粉末，然后加上述事先过滤除菌溶液所需组分。
本文所所述的组合物可制备成中性或盐溶液形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基结合)，可用无机酸如盐酸或磷酸，或者有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等制备。用游离羧基制备的盐溶液可以来源于无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱如异丙胺、三甲胺、组胺、普鲁卡因等。制备完成后，溶液就可以通过与剂型相容的方式和治疗有效量给予患者。制剂可以各种剂型如注射液、药物释放颗粒等给药。
本文所用的“载体”包括各种溶剂、分散介质、载体、包被剂、稀释剂、抗菌药和抗真菌药、等渗剂和吸收延缓剂、缓冲液、载体溶液、悬液、胶体等。这些介质和试剂作为药学活性物质使用是本领域所熟知的。除了那些与该活性组分不相容的常规介质或试剂外，都可用于本发明治疗组合物。额外的活性组分也可以掺入到该组合物中。
短语“医学上可接受的”指给予人体时不会产生变态反应或类似不良反应的分子实体和组合物。含有作为活性组分的蛋白质的水性组合物的制剂是本领域所熟知的。一般来说，可将这种组合物制成可注射形式，如溶液或悬液；也可制成适于在注射前制成溶液或悬液的固体形式。
c.佐剂
正如本领域所熟知的，免疫原性分子、免疫原或肽组合物的免疫原性可通过采用免疫应答的非特异性刺激剂来增强，即大家所熟知的佐剂。合适的佐剂包括所有可接受的免疫刺激化合物，如细胞因子、毒素或合成的组合物。在本发明中，给予有效量的MDA-7多肽可增强免疫应答，因而可视其为佐剂。在其他的实施方式中，增强PKR表达的分子也认为可以增强免疫应答，因而可以是本发明可接受的免疫刺激化合物。
除了MDA-7外，也可以采用其他佐剂，其中包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、γ-干扰素、GMCSF、BCG、氢氧化铝、MDP化合物、如thur-MDP和nor-MDP、CGP(MTP-PE)、脂质A以及单磷酸脂质A(MPL)。RIBI佐剂含有三种从细菌中提取的组分：MPL、海藻糖二真菌烷(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，溶于2％角鲨烷/吐温80中形成乳液。MHC抗原也可以使用。
佐剂的例子包括完全弗氏佐剂(含灭活的结核杆菌的非特异性免疫应答刺激剂)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
除了MDA-7外，本发明的某些方面也涉及其他具有佐剂活性的组合物。佐剂及其功能和转运机制都是本领域所熟知的，其他佐剂的非限定性例子包括AdjumerTM(即PCPP盐；聚磷腈)；Adju-Phos(即磷酸铝凝胶)；AlgalGlucan(即b-葡聚糖；葡聚糖)；Algammulin(即γ菊酚/明矾组合佐剂)；Alhydrogel(即氢氧化铝凝胶；明矾)；抗原制剂(即SPT，AF)；Avridine
Figure 10003_1
(即N，N-二八癸酰-N’，N’-双(2-羟乙基)丙二酰胺；CP20，961)；BAY R1005(即N-(2-脱氧-2-L-亮氨酰氨基-b-D-吡喃葡萄糖酰)-N-八癸酰十二烷基胺羟乙酸盐)；骨化三醇(即la，25-二羟维生素D3；1，25-二(OH)2D3；1，25-DHCC；la，25-二羟基胆骨化醇)；磷酸钙凝胶(即磷酸钙)；霍乱毒素(CT)和霍乱毒素B亚单位(CTB)(即CT；CTB亚单位；CTB)；霍乱毒素A1-亚单位-蛋白AD-片断融合蛋白(即CTA1-DD基因融合蛋白)；CRL1005(即封闭共聚物P1205)；含细胞因子的脂质体(即含细胞因子的脱水复水囊泡)；DDA(即溴化二甲基八癸酰胺；溴化二甲基二硬脂酰胺(CAS注册号：3700-67-2))；DHEA(即脱氢表雄酮；雄甾烯二酮；普拉睾酮)；DMPC(即二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱；1，2-二肉豆蔻酰-sn-3-磷脂酰胆碱；(CAS注册号：18194-24-6))；DMPG(即二肉豆蔻酰磷脂酰甘油；sn-3-磷脂酰甘油-1，2-二肉豆蔻酰钠；(CAS注册号：67232-80-8))；DOC/铝复合物(即脱氧胆酸钠盐；DOC/Al(OH)3/矿物质载体复合物)；弗氏完全佐剂(即CIA；FCA)；弗氏不完全佐剂(即IFA；FIA)；γ菊酚；Gerbu佐剂；GM-CSF(即粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；沙莫司汀(酵母来源的rh-GM-CSF))；GMDP(即N-乙酰氨基葡萄糖-(β1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CAS注册号：70280-03-4))；咪喹莫特(即1-(2-甲丙基)-IH-咪唑基[4，5-c]喹啉-4-胺；R-837；S26308)；ImmTherTM(即N-乙酰氨基葡萄糖-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-甘油二软脂酸盐；DTP-GDP)；含共刺激分子的抗体的免疫脂质体(即从脱水-复水载体制备的免疫脂质体(DRVs))；干扰素-g(即Actimmune(rhIFN-γ，Genentech，Inc.)；免疫干扰素；IFN-g；γ-干扰素)；白细胞介素-1β(即IL-10；IL-1；人白细胞介素1β成熟多肽117-259)；白细胞介素-2(即IL-2；T-细胞生长因子；阿地白介素(去-丙酰胺-1，丝氨酸-125人白细胞介素2)；Proleukin；Teceleukin)；白细胞介素-7(即IL-7)；白细胞介素-12(即IL-12；自然杀伤细胞刺激因子(NKSF)；细胞毒淋巴细胞成熟因子(CLMF))；ISCOM(s)TM(即免疫刺激复合物)；Iscoprep 7.0.3.TM；脂质体(即含蛋白或Th细胞和/或B细胞肽的脂质体，含有或不含有共包裹的白细胞介素-2的微生物，BisHOP或DOTMA；A，[L(抗原)])；洛索立宾(即7-烯丙基-8-氧鸟苷)；LT-OA或LT口服佐剂(即大肠杆菌不稳定肠毒素原型毒素)；MF59；MONTANIDE ISA 51(即纯化的IFA；不完全弗氏佐剂)；MONTANIDE ISA 720(即可代谢的油佐剂)；MPLTM(即3-Q-去酰基-4’-单磷酰脂质A；3D-MLA)；MTP-PE(即N-乙酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-(羟基-磷酰氧))乙胺单钠盐)；MTP-PE脂质体(即MTP-PE抗原呈递脂质体)；Murametide(即Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3)；Murapalmitine(即Nac-Mur-L-Thr-D-isoGIn-sn-甘油二棕榈酰)；D-Murapalmitine(即Nac-Mur-D-Ala-D-isoGln-sn-甘油二棕榈酰)；NAGO(即神经酰胺酶半乳糖氧化酶)；非离子表面活性载体(即NISV)；Pleuran(即b-葡聚糖；葡聚糖；PLGA，PGA和PLA(即乳酸和羟乙酸的同聚物或共聚物；丙交酯/乙交酯聚合物；聚乳酸共乙交酯)；Pluronic L121(即泊洛沙姆401)；PMMA(即聚甲基甲基丙烯酸酯)；PODDSTM(即类蛋白微球)；Poly rA：Poly rU(即聚腺苷酸多聚尿苷酸复合物)；Polysorbate 80(即吐温80；脱水山梨糖醇单-9-八癸盐聚(氧-1，2-乙烷二酰)衍生物)；Protein Cochleates；QS-21(即StimulonTM QS-21佐剂)；Quil-A(即Quil-A皂甙，Quillaja皂甙)；Rehydragel HPA(即高蛋白吸附性氢氧化铝凝胶；明矾)；Rehydragel LV(即低粘度的氢氧化铝凝胶；明矾)；S-28463(即4-氨基-otec，-二甲基-2-乙氧基甲基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-乙醇)；SAF-1(即SAF-m；Syntex佐剂)；Sclavo肽(即IL-1b 163-171肽)；Sendai脂蛋白体，含Sendai的脂质基质(即含Sendai糖蛋白的载体；fusogenic脂蛋白体；FPLs)；Span85(即Arlacel 85，脱水山梨醇三油酸酯)；Specol；Squalane(即Spinacane；Robane；2，6，10，15，19，23-六甲基二十四烷)；角鲨烷(Spinacene；Supraene；2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22二十四己烷)；硬脂酰酪氨酸(即八癸酰酪氨酸氢氯化物)；TheramideTM(即N-乙酰葡萄糖胺-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-二棕榈氧丙胺(DTP-DPP))；苏氨酰-MDP(即TermurtideTM；[thr1]-MDP；N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺)；Ty粒子(即Ty-VLPs，(病毒样颗粒))；WalterReed脂质体(即含有吸附于氢氧化铝的脂质A的脂质体，[L(脂质A+抗原)+铝])。
除了佐剂以外，共注射生物反应性调节剂(BRM)可能也是需要的，试验表明该物质可上调T细胞免疫力或下调抑制性细胞的活性。这种BRM包括但不限于西咪替丁(CIM；1200mg/d)(Smith/Kline，PA)；或低剂量的环磷酰胺(CYP；300mg/m2)(Johnson/Mead，NJ)以及细胞因子如γ-干扰素、IL-2、IL-12，或编码具有免疫辅助功能的蛋白质如B-7的基因。
3.疫苗
本发明包括预防癌或初期癌发生的方法和组合物。因此，本发明考虑可采用主动或被动免疫实施方式的疫苗。可很容易地直接从本文所述制备的纯化的MDA-7制备适合用作疫苗的免疫原性组合物。优选将抗原物质充分透析以除去不需要的小分子量分子和/或冻干，以更容易配制到所需的载体中。
以类似方式，制备包含MDA-7序列作为活性成分的疫苗是本领域通常熟知的，如美国专利Nos.5,958,895，6,004,799，和5,620,896所示，均引入本文作为参考。一般，将这类疫苗制备成可注射的液体溶液或悬液：也可制备成适于在注射前配成溶液或悬液的固体形式。也可将制剂乳化。常将活性免疫原性组分与药学上可接受的与该活性组分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂是，例如，水，盐水、葡萄糖，甘油，乙醇等或其组合。此外，如果需要，疫苗可含有少量的辅助物质例如湿润或乳化剂，pH缓冲剂，或增强疫苗效果的佐剂。
可按常规经胃肠道外通过注射例如皮下或肌肉内注射给予疫苗。适于其它给药方式的另外制剂包括栓剂，有些情况下是口服制剂。对于栓剂，可包括传统的粘合剂和运载体，例如，聚二烷基醇或甘油三酯：这些栓剂可由含有约0.5％-10％优选1％-2％活性组分的混合物制成。口服制剂包括平常用的赋形剂，例如，药用级甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等。这些组合物采用溶液，悬液，片剂，丸剂，胶囊，持续释放制剂或粉剂的形式，含有约10％-95％活性组分，优选约25％-70％。
可将MDA-7蛋白质(或其片段)或编码全部或部分MDA-7的核酸以中性或盐的形式配制到疫苗中。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与多肽的游离氨基形成盐)和与无机酸例如盐酸或磷酸或有机酸例如乙酸，草酸，酒石酸，杏仁酸等形成的盐。与游离羧基形成的盐可由无机碱例如氢氧化钠，钾，铵，钙或铁和有机碱例如异丙胺，三甲铵，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等产生。
将疫苗以与剂型相容的方式和以治疗有效性量和免疫原性量给药。给药量取决于治疗对象，包括例如个体免疫系统合成抗体的能力和需保护的程度。需给予的活性组分的精确量取决于医师的判断。然而，合适的剂量范围每次疫苗接种几百微克活性成分。首次给药和加强接种的合适方案也可不同，但通常是首次给药然后是后续接种或其它给药。
疫苗应用的方式可能有很大不同。任何常规的疫苗给药方法都可应用。认为方式包括以生理上可接受的固体基质口服或生理上可接受的分散，经胃肠道外注射给药等。疫苗剂量将取决于给药途径并视宿主大小而不同。
为达到辅助疫苗效果的各种方法包括使用例如氢氧化铝或磷酸铝(明矾)等制剂，常用磷酸缓冲液配成0.05％-0.1％的溶液，与糖的合成聚合物(Carbopol)混合成为0.25％溶液，在约70°-101℃热处理30秒-2分种使疫苗中的蛋白质凝聚后使用。也可利用下列方式使蛋白质凝聚：使胃蛋白酶处理(Fab)的抗体与白蛋白反应，与细菌细胞例如短小棒状杆菌或内毒素或革兰氏阴性细菌脂多糖混合，用生理上可接受的油性载体例如一油酸二缩甘露醇(Aracel A)乳化，或用20％全氟化碳(Fluosol-DA
Figure 10003_7
)作为封闭替代物乳化。
在许多情况下，需要多次给予疫苗，通常不超过6次疫苗接种，更通常不超过4次疫苗接种，优选为一次以上，通常至少约三次疫苗接种。通常疫苗接种间隔2-12周，更常间隔3-5周。
需要间隔1-5年常为3年进行定期加强接种以保持抗体的保护水平。免疫过程中可检测上清中的抗原和抗体。可采用常规标记例如放射性核素、酶、荧光等标记来进行这种检测。这些技术是周知的，并且在很多专利中都可找到，例如美国专利Nos.3,791,932；4,174,384和3,949,064，说明了该类试验。
4.联合治疗
在某些实施方式中，本发明的组合物和方法包括MDA-7多肽或编码MDA-7多肽的表达构建物与能增强MDA-7的效应或提高MDA-7的治疗、诊断或预后作用的其它药物或组合物联合使用。这些组合物以联合有效剂量来提供以杀伤癌细胞或抑制新生血管形成来获得所需效果。这个过程包括使细胞与所述表达构建物和药物或多种因子同时接触。这一过程可通过使细胞与一种组合物或含两种制剂的药物制剂接触、或者使细胞与两种不同的组合物或制剂同时接触而完成，其中一种组合物含有表达构建物，另一种组合物含第二种药物。
在本发明的一个实施方式中，除了其他促凋亡抗新血管形成，抗癌药物或细胞周期调节药物外，mda-7基因治疗也可以和免疫治疗联合使用。或者，免疫治疗可在其他药物治疗之前或之后间隔数分钟到数周内进行。在其他药物和表达构建物分别给予细胞的实施方式中，一般要确保两种治疗药物给予的间隔不要超过每种治疗的有效期，这样药物和表达构建物对细胞仍能产生有益的联合效应。在这种情况下，实施两种治疗措施的间隔时间约在12-24小时之内，优选6-12小时之内。在某些情况下，可能需要延长治疗的间隔期，如两种治疗措施之间间隔数天(2，3，4，5，6或7)到数周(1，2，3，4，5，6，7或8)。
可采用治疗措施的各种组合，例如，A代表基因治疗，B代表作为免疫治疗方案一部分的免疫原性分子，如抗原：
A/B/A  B/A/B  B/B/A  A/A/B  A/B/B  B/A/A  A/B/B/B  B/A/B/B
B/B/B/A  B/B/A/B  A/A/B/B  A/B/A/B  A/B/B/A  B/B/A/A
B/A/B/A  B/A/A/B  A/A/A/B  B/A/A/A  A/B/A/A  A/A/B/A
给予患者本发明的治疗性表达构建物要遵循给予这种化合物的通用方案，同时要考虑载体的毒性(如果有的话)。预计需要重复多个疗程。各种标准的治疗措施以及手术都可以和本文所述的治疗措施联合应用。
在具体实施方式中，考虑将抗癌治疗，例如化疗、放疗、免疫治疗或其它基因治疗，与如本文所述的MDA-7治疗联合使用。
a.化疗
癌症的治疗也包括化疗和放疗等各种方法的联合治疗。联合化疗包括顺铂(CDDP)、卡铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝脲、放线菌素、柔红霉素、阿霉素、博来霉素、plicomycin、丝裂霉素、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合剂、紫杉醇、吉西他滨、新霉酰胺、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、transplatinum、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春花碱和氨甲蝶呤，以及上述物质的类似物或衍生物。
b.放疗
引起DNA损伤并被广泛应用的因素包括大家所熟知的γ-射线、X-射线和/或向肿瘤细胞直接输送放射性同位素。其他形式的DNA损伤因素如微波、质子束辐射(美国专利5,760,395和4,870287)和紫外辐射也可以考虑。所有这些因素最可能引起对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持的大范围损伤。X射线的剂量范围从每天50-200伦琴，持续一段时间(3到4周)，到2000-6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围很宽，可根据同位素的半衰期、所发出射线的强度和类型以及肿瘤细胞摄取的量而定。
本文所用的术语“使接触”或“暴露于”用于细胞时指将治疗性构建物和化疗或放疗药物输送给靶细胞、或直接与靶细胞一起放置的过程。为了达到杀死或抑制肿瘤细胞的目的，两种药物应以能联合有效杀死细胞或阻止细胞分裂的剂量给予细胞。
c.免疫治疗
对于癌症治疗，免疫治疗一般依赖于利用免疫效应细胞和分子来靶向和摧毁癌细胞。Trastuzumab(HerceptinTM)就是这样的例子。免疫效应分子可以是，例如，肿瘤细胞表面某种标记的特异性抗体。抗体可以单独作为治疗的效应分子或可征集其它细胞来实施细胞杀伤。也可将抗体与药物或毒素(化疗药物，放射性核素，蓖麻毒素A链，霍乱毒素，百日咳毒素等)偶联，抗体只作为靶向试剂。或者，效应分子可以是携带有可与肿瘤细胞靶子直接或间接相互作用表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒T细胞和NK细胞。这些治疗方式的组合，即直接细胞毒活性和ErbB2的抑制或减少可对ErbB2过表达癌症治疗提供有益治疗效果。
也可利用其它免疫治疗作为与MDA-7联合治疗的一部分。下面讨论联合治疗的一般方法。在免疫治疗的一方面，肿瘤细胞必须带有可供靶向的标记，即大多数其它细胞不存在的标记。存在很多肿瘤标记，它们中的任何标记都可能适于本文所述的靶向。常用肿瘤标记包括癌胚抗原，前列腺特异性抗原，泌尿肿瘤相关抗原，胚胎性抗原，酪氨酸酶，(p97)，gp68，TAG-72，HMFG，Sialyl Lewis抗原，MucA，MucB，PLAP，雌激素受体，层连蛋白受体，erb B和p155。免疫治疗的另一方面是将抗癌效应与免疫刺激效应相结合。现有免疫刺激分子包括：细胞因子例如IL-2，IL-4，IL-12，GM-CSF，γ-IFN，趋化因子例如MIP-1，MCP-1，IL-8和生长因子例如FLT3配体。将免疫刺激分子，以蛋白质形式或利用基因输送与肿瘤抑制剂例如MDA-7联用已显示可增强抗肿瘤效果(Ju等，2000)。
如前所述，现在正在研究或已投入使用的免疫治疗的例子是免疫佐剂例如牛分枝杆菌，恶性疟原虫，二硝基氯苯和芳香族化合物(美国专利5,801,005；美国专利5,739,169；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides等，1998)，细胞因子治疗例如，干扰素α，β和γ；IL-1，GM-CSF和TNF(Bukowski等，1998；Davidson等，1998；Hellstrand等，1998)基因治疗例如，TNF，IL-1，IL-2，p53(Qin等，1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；美国专利5,830,880和美国专利5,846,945)以及单克隆抗体例如，抗-神经节苷脂GM2，抗-HER-2，抗-p185；Pietras等，1998；Hanibuchi等，1998；美国专利5,824,311)。Herceptin(trastuzumab)是阻抑HER2-neu受体的嵌合(小鼠-人)性单克隆抗体，它具有抗-肿瘤活性并已被批准用于恶性肿瘤治疗(Dillman，1999)。一种或多种抗癌治疗可与本文所述的MDA-7治疗一起使用。
有很多不同的癌症被动免疫治疗方法。广义上可将它们分为以下几种：只注射抗体；注射抗体偶联的毒素或化疗剂；注射抗体偶联的放射性同位素；注射抗独特型抗体；和最后，清除骨髓中的肿瘤细胞。
优选地，在被动免疫治疗中采用人单克隆抗体，因为它们在患者中很少的或不产生副作用。然而，由于它们难以得到一定程度上限制了它们的应用，至今只在病灶内使用。已将神经节苷脂抗原的人单克隆抗体病灶内给予患有皮肤复发性黑素瘤的患者(Irie and Morton，1986)。每天或每周病灶内注射后，10个患者中6个观察到肿瘤减退。在另一项研究中，两种人单克隆抗体病灶内注射取得了中等成功(Irie等，1989)。
给予多于一种以上抗两种不同抗原或甚至具有多种抗原特异性的单克隆抗体可能有益。如Bajorin等(1988)所述，治疗方案也可包括给予淋巴因子或其它免疫增强剂。本说明书中更详细地所述了人单克隆抗体的开发。
在主动免疫治疗中，给予抗原性肽、多肽或蛋白质，自体或同种异体肿瘤细胞组合物或疫苗时，一般加上特殊的细菌佐剂(Ravindranath和Morton，1991；Morton等，1992；Mitchell等，1990；Mitchell等，1993)。在黑素瘤的免疫治疗中，诱生了高IgM反应的患者常常比那些未诱生或低IgM抗体的患者存活情况要好(Morton等，1992)。IgM抗体常常是短暂性抗体，而抗-神经节苷脂或抗糖抗体例外。
在过继性免疫治疗中，将患者循环淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞体外分离，以淋巴因子例如IL-2激活或以肿瘤坏死基因转导，然后再给予患者(Rosenberg等，1988；1989)。为了实现治疗目的，如本文所述将免疫有效量的活化淋巴细胞与加有佐剂的抗原性肽组合物联合给予动物或人患者。活化的淋巴细胞最优选是预先分离自患者血液或肿瘤样品并经体外激活(或扩增)的患者自己的细胞。这种形式的免疫治疗已导致了几例黑素瘤和肾癌的减退，但反应者的百分率与不起反应者相比不高。
d.基因治疗
在其它实施方式中，联合治疗包括基因治疗，其中在给予MDA-7多肽或编码该多肽的核酸之前、之后或同时给予治疗性多聚核苷酸。MDA-7多肽或其编码核酸与编码下列基因产物之一的载体一起输递对靶组织有联合治疗效果。本发明包括很多种蛋白质，下面所述了其中一些。表3列出可与本发明联合使用的某些形式的基因治疗中可作为靶子的各种基因。
i)细胞增殖诱导因子
诱导细胞增殖的蛋白质根据功能可分成各种类型。所有这些蛋白质的共性是它们可调控细胞增殖。例如，PDGF的一种形式，sis癌基因，是分泌性生长因子。编码生长因子的基因很少产生癌基因，迄今，sis是唯一所知自然发生的致癌生长因子。在本发明的一个实施方式中，考虑利用细胞增殖特异性诱导因子相关的反义mRNA或siRNA来阻止该细胞增殖诱导因子的表达。
如ErbB一样，蛋白质FMS和ErbA是生长因子受体。这些受体的突变导致调控功能的丧失。例如，影响Neu受体蛋白质跨膜区域的点突变产生neu癌基因。erbA癌基因产生自甲状腺激素的细胞内受体。认为经修饰的致癌ErbA受体可与内源甲状腺激素受体竞争，引起生长失控。
癌基因最大的一类包括信号转导蛋白质(例如，Src，Abl和Ras)。蛋白质Src是细胞质蛋白质-酪氨酸激酶，某些情况下通过酪氨酸残基527位突变使它从原癌基因转化为癌基因。与之相比较，在一个实施例中，GTP酶蛋白质ras从原癌基因转化为癌基因是因为其序列中氨基酸12位的缬氨酸突变为甘氨酸降低了ras的GTP酶活性。
蛋白质Jun，Fos和Myc是作为转录因子在细胞核功能上直接发挥作用的蛋白质。
ii)细胞增殖抑制因子
肿瘤抑制性癌基因的功能是抑制过量的细胞增殖。这些基因的失活破坏它们的抑制活性，导致增殖失控。可利用肿瘤抑制因子p53 mda-7，FHIT，p16和C-CAM。
除p53之外，其它细胞增殖抑制因子是p16。真核细胞周期的主要转换是由细胞周期蛋白依赖性激酶或CDK’s来启动的。一种CDK，细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)调控G1进程。该酶可能在G1晚期因磷酸化Rb而活化。CDK4的活性由活化亚基D-型细胞周期蛋白和抑制亚基控制，生化鉴定已确认p16INK4为特异性结合和抑制CDK4因此可能调控Rb磷酸化的蛋白质(Serrano等，1993；Serrano等，1995)。既然p16INK4蛋白质是CDK4抑制因子，那么该基因的删除将提高CDK4的活性，导致Rb蛋白质的超磷酸化。还已知p16可调控CDK6的功能。
p16INK4属于新所述的CDK-抑制蛋白质，该类蛋白质还包括p16B，p19，p21WAF1，和p27KIP1。p16INK4基因图谱定位于9p21，这是在很多肿瘤类型中常常缺失的染色体区。p16INK4基因的纯合性缺失和突变在人肿瘤细胞系中时常发生。这个证据提示p16INK4基因是肿瘤抑制基因。然而，因观察到p16INK4基因改变的频率在原代未培养的肿瘤中比培养细胞系中低得多(Caldas等，1994；Cheng等，1994；Hussussian等，1994；Kamb等，1994；Kamb等，1994；Mori等，1994；Okamoto等，1994；Nobori等，1995；Orlow等，1994；Arap等，1995)，上面的解释已受到质疑。以质粒表达载体转染来恢复野生型p16INK4功能降低了某些人癌细胞系的集落形成(Okamoto，1994；Arap，1995)。
本发明可利用的其它基因包括Rb，APC，DCC，NF-1，NF-2，WT-1，MEN-I，MEN-II，zac1，p73，VHL，MMAC1/PTEN，DBCCR-1，FCC，rsk-3，p27，p27/p16融合物，p21/p27融合物，抗-血栓形成基因(例如，COX-1，TFPI)，PGS，Dp，E2F，ras，myc，neu，raf，erb，fms，trk，ret，gsp，hst，abl，E1A，p300，参与新生血管形成的基因(例如，VEGF，FGF，凝血栓蛋白(thrombospondin)，BAI-1，GDAIF，或它们的受体)和MCC。
iii)细胞程序性死亡的调节因子
凋亡或细胞程序性死亡是正常胚胎发育、成年组织内环境稳定的维持以及癌变的抑制中的一种基本过程(Kerr等，1972)。已证明Bcl-2蛋白家族和ICE样蛋白酶家族是其他系统中凋亡的重要调节因子和效应因子。发现Bcl-2蛋白与滤泡性淋巴瘤有关，在控制各种凋亡刺激因子引起的凋亡以及提高细胞的存活中起着重要作用(Bakhshi等，1985；Cleary和Sklar，1985；Cleary等，1986；Tsujimoto等，1985；Tsujimoto和Croce，1986)。现认为进化保守的Bcl-2蛋白是相关蛋白家族的一个成员，可以归类为死亡激动剂或死亡拮抗剂。
Bcl-2被发现以后，证明它可以抑制各种刺激因素引起的细胞死亡。而且现已知道存在一个Bcl-2细胞死亡调节蛋白家族，它们具有相同的结构，其序列同源。这个家族内的不同成员或者具有Bcl-2的相似功能(如BclXL、BclW、Mcl-1、A1、Bfl-1)，或者具有Bcl-2的相反功能，可促进细胞死亡(如Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri)。
5.手术
约60％患有癌症的人将进行一些类型的手术，包括预防性、诊断性或阶段性、治疗性和姑息性手术。治疗性手术是可与其它治疗例如本发明的治疗、化疗、放疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或其它治疗联合使用的癌症治疗。
治疗性手术包括切除术，其中将全部或部分癌组织从身体移除、切除和/或摧毁。肿瘤切除指将肿瘤的至少一部分从身体移除。除肿瘤切除术之外，手术治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微镜控制的手术(Mohs’surgery)。本发明还可与表面癌、初癌或偶然量的正常组织切除联合使用。
移除所有癌性细胞、组织或肿瘤的一部分之后，身体可能形成了腔隙。可通过灌注、直接注射或在该区域局部应用另外的抗癌治疗。这种治疗可以重复，例如每1，2，3，4，5，6，或7天，或每1，2，3，4，和5周或每1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，或12个月。这些治疗的剂量也可不同。
6.其它物质
可与本发明联合使用以提高治疗效果的其他药物也可以考虑。这些药物包括可上调细胞表面受体和GAP连接的免疫调节剂、抑制细胞增殖和分化的药物、细胞粘附抑制剂以及能提高过度增殖细胞对凋亡诱导因子敏感性的药物或其它生物制剂。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子；干扰素α、β、γ；IL-2和其他细胞因子；F42K和其他细胞因子类似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES和其他趋化因子。本发明还考虑上调细胞表面受体或其配基如Fas/Fas配基、DR4或DR5/TRAIL(Apo-2配体)的表达，通过对过度增殖细胞的自分泌或旁分泌作用提高本发明(组合物)的凋亡诱导能力。通过增加GAP连接的数量来提高细胞内的信号传递也可以增强对附近过度增殖细胞的抗增殖效应。在其他的实施方式中，细胞增殖或分化抑制剂可与本发明联合使用以提高治疗的抗过度增殖效应。细胞粘附的抑制剂也可以提高本发明的效果。细胞粘附抑制剂的例子有病灶粘连激酶(FAKs)抑制剂和洛伐他丁。能增加过度增殖细胞对凋亡的敏感性的其他药物，如抗体c225，也可与本发明组合物联用以提高治疗效果。
Apo2配体(Apo2L，也称为TRAIL)是肿瘤坏死因子(TNF)细胞因子家族的成员。TRAIL在很多类型的癌细胞中激活快速凋亡，但对正常细胞没有毒性。TRAIL mRNA发生在很多类型组织中。大多数正常细胞表现出抗TRAIL的细胞毒性作用，表明存在有防止TRAIL诱导凋亡的机制。第一个所述的TRAIL的受体，称为死亡受体4(DR4)，含有细胞质“死亡结构域”；DR4传导TRAIL携带的凋亡信号。已鉴定到结合于TRAIL的其它受体。一个称为DR5的受体，含有细胞质死亡结构域并像DR4一样传导凋亡信号。DR4和DR5 mRNA在很多正常组织和癌细胞系中表达。最近，已鉴定到假目标(decoy)受体例如DcR1和DcR2，阻止TRAIL通过DR4和DR5诱导凋亡。因此这些假目标受体提供了直接在细胞表面调控对促调亡细胞因子敏感性的新机制。这些抑制受体在正常组织中的优先表达提示TRAIL可能能够用作抗癌剂在癌细胞中诱导凋亡而不伤害正常细胞(Marsters等，1999)。
在引入细胞毒化疗药物后癌症治疗已获得很多进展。然而，化疗的一个后果是产生/获得了药物抗性表型和产生了多重抗药性。抗药性的产生在此类肿瘤治疗中仍然是一个主要的障碍，因此，显然需要替代方法例如基因治疗。
与化疗、放射治疗或生物治疗联合使用的治疗的其它形式包括高热治疗，在此方法中将患者组织暴露于高温(高达106°F)。在局部、区域或全身极高热应用中可能包括外部或内部加热装置。局部高热包对小区域例如肿瘤加热。可从体外装置向肿瘤发射高频波产生热。体内加热可包括无菌探头，探头内有细的加热金属线或充满热水的中空管，植入的微波天线，或射频电极。
加热患者的器官或肢体进行区域治疗，区域治疗采用可产生高能量例如磁能的装置来完成的。或者，抽取患者的一些血液并加热后将其灌注到内部加热区域。当癌已扩散到全身时也可进行全身加热。为此目的可利用温水毯、热蜡、电感线圈和加温室。
也可将激素治疗与本发明(组合物)或上述任何其它癌症治疗方法联合使用。可在某些癌症例如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或宫颈癌的治疗中使用激素以降低某些激素例如睾酮素或雌激素的水平或阻抑其作用。这种治疗经常作为一种治疗选择或用于减少转移危险与至少一种其它癌症治疗联合使用。
                                        表3
                                       癌基因
Figure G04805918X19960403D000791
Figure G04805918X19960403D000801
Figure G04805918X19960403D000811
Figure G04805918X19960403D000831
Figure G04805918X19960403D000841
e.免疫原性多肽/肽和核酸
在另外的实施方式中，免疫原性分子作为基因治疗方案的一部分提供。可直接提供免疫原性分子或作为编码该免疫原性分子的表达载体提供。编码mda-7的载体与编码下列基因产物之一的第二载体一起输送可联合诱导对靶组织的作用。或者，也可采用编码两个基因的单一载体。
(i)抗原
在某些实施方式中，本发明涉及改进的免疫治疗方法。抗肿瘤抗原的免疫应答也可以用MDA-7来诱导。肿瘤抗原包括PSA、CEA、MART、MAGE1、MAGE3、gp100、BAGE、GAGE、TRP-1、TRP-2、PMSA、结核杆菌可溶性因子(Mtb)、酚可溶性调节素(PSM)、CMV-G、CMV-M、EBV外壳-EB核抗原(EBNA)、gp120、gp41、tat、rev、gag、弓形骨针抗原、风疹抗原、流行性腮腺炎抗原、甲胎蛋白(AFP)、腺癌抗原(ART-4)、CAMEL、CAP-I、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AMLI、ETS G250、GnT-V、HAGE、HER2/neu、HLA-A*0201-R1701、HPV-E7、HSP 70-2M、HST-2、hTERT、ICE、KIAA 0205、LAGE、LDLR/FUT、MC1R、MUCI、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NY-ESO-I、p15、Pml/RARα、PRAME、PSM、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m或WT1。特别考虑用它们来诱导抗肿瘤抗原的免疫应答，见美国专利5,552,293和6,132,980的描述，本文已特地引入作为参考。
3.疫苗
本发明包括预防癌或初期癌发生的方法和组合物。因此，本发明考虑可采用主动或被动免疫实施方式的疫苗。可很容易地直接从本文所述制备的纯化的MDA-7制备适合用作疫苗的免疫原性组合物。优选将抗原物质充分透析以除去不需要的小分子量分子和/或冻干，以更容易配制到所需的载体中。
以类似方式，制备包含MDA-7序列作为活性成分的疫苗是本领域通常熟知的，如美国专利Nos.5,958,895，6,004,799，和5,620,896所示，均引入本文作为参考。一般，将这类疫苗制备成可注射的液体溶液或悬液：也可制备成适于在注射前配成溶液或悬液的固体形式。也可将制剂乳化。常将活性免疫原性组分与药学上可接受的与该活性组分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂是，例如，水，盐水、葡萄糖，甘油，乙醇等或其组合。此外，如果需要，疫苗可含有少量的辅助物质例如湿润或乳化剂，pH缓冲剂，或增强疫苗效果的佐剂。
可按常规经胃肠道外通过注射例如皮下或肌肉内注射给予疫苗。适于其它给药方式的另外制剂包括栓剂，有些情况下是口服制剂。对于栓剂，可包括传统的粘合剂和运载体，例如，聚二烷基醇或甘油三酯：这些栓剂可由含有约0.5％-10％优选1％-2％活性组分的混合物制成。口服制剂包括平常用的赋形剂，例如，药用级甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等。这些组合物采用溶液，悬液，片剂，丸剂，胶囊，持续释放制剂或粉剂的形式，含有约10％-95％活性组分，优选约25％-70％。
可将MDA-7蛋白质(或其片段)或编码全部或部分MDA-7的核酸以中性或盐的形式配制到疫苗中。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与多肽的游离氨基形成盐)和与无机酸例如盐酸或磷酸或有机酸例如乙酸，草酸，酒石酸，杏仁酸等形成的盐。与游离羧基形成的盐可由无机碱例如氢氧化钠，钾，铵，钙或铁和有机碱例如异丙胺，三甲铵，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等产生。
将疫苗以与剂型相容的方式和以治疗有效性量和免疫原性量给药。给药量取决于治疗对象，包括例如个体免疫系统合成抗体的能力和需保护的程度。需给予的活性组分的精确量取决于医师的判断。然而，合适的剂量范围每次疫苗接种几百微克活性成分。首次给药和加强接种的合适方案也可不同，但通常是首次给药然后是后续接种或其它给药。
疫苗应用的方式可能有很大不同。任何常规的疫苗给药方法都可应用。认为方式包括以生理上可接受的固体基质口服或生理上可接受的分散，经胃肠道外注射给药等。疫苗剂量将取决于给药途径并视宿主大小而不同。
为达到辅助疫苗效果的各种方法包括使用例如氢氧化铝或磷酸铝(明矾)等制剂，常用磷酸缓冲液配成0.05％-0.1％的溶液，与糖的合成聚合物(Carbopol
Figure 10003_8
)混合成为0.25％溶液，在约70°-101℃热处理30秒-2分种使疫苗中的蛋白质凝聚后使用。也可利用下列方式使蛋白质凝聚：使胃蛋白酶处理(Fab)的抗体与白蛋白反应，与细菌细胞例如短小棒状杆菌或内毒素或革兰氏阴性细菌脂多糖混合，用生理上可接受的油性载体例如一油酸二缩甘露醇(Aracel A)乳化，或用20％全氟化碳(Fluosol-DA)作为封闭替代物乳化。
在许多情况下，需要多次给予疫苗，通常不超过6次疫苗接种，更通常不超过4次疫苗接种，优选为一次以上，通常至少约三次疫苗接种。通常疫苗接种间隔2-12周，更常间隔3-5周。
需要间隔1-5年常为3年进行定期加强接种以保持抗体的保护水平。免疫过程中可检测上清中的抗原和抗体。可采用常规标记例如放射性核素、酶、荧光等标记来进行这种检测。这些技术是周知的，并且在很多专利中都可找到，例如美国专利Nos.3,791,932；4,174,384和3,949,064，说明了该类试验。
F.免疫原性分子的鉴定
本发明利用了申请人的以下发现，即MDA-7可上调干扰素诱导的、ds-RNA依赖的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PKR)的表达。PKR看来可通过活化参与生长抑制和凋亡诱导的多个信号转导通路介导抗肿瘤形成活性。这些通路的活化发生在潜伏的无活性的同源二聚体受活化信号的诱导发生构形改变导致其自身磷酸化而活化之后(Vattem等，2001)。PKR一旦活化后就能使各种靶底物磷酸化，这在生长调控和凋亡诱导中有很重要的作用(Saelens等，2001；Sudharkar等，2000)。
PKR的活化是Ad-mda7诱导凋亡中的关键事件。利用特异性苏氨酸/激酶抑制剂2氨基嘌呤(2-AP)抑制PKR，可使Ad-mda7诱导的凋亡几乎完全逆转，eIF-2α磷酸化消失以及蛋白合成抑制。蛋白合成的抑制对于凋亡的诱导很关键，这可能是因为一种或几种短寿命蛋白质参与了凋亡的抑制。另外，受到PKR控制的其他通路也很重要，如参与NF-κB、p53、MEK、IRF-1或FADD调节的那些通路(Jagus等，1999；Gil等，1999；Cuddihy等，1999；Balachandran等，1998)。
即使参与多个信号通路，但是PKR的活化对Ad-mda7介导的凋亡是关键性的，因为缺少PKR的MEFs不能发生凋亡，而含有野生型PKR的MEFs可以发生凋亡。凋亡的这种抑制作用好像是mda-7特异性的，因为用促凋亡Ad-Bak载体转导缺乏PKR的MEFs可以导致非损伤性凋亡。为研究这种现象构建了一种模型，其中MDA-7和PKR位于凋亡级联反应中Bak促凋亡基因的上游。在这个模型中，MDA-7可诱导PKR活化，通过各种细胞内信号通路诱导胱冬酶活化和凋亡。Bak若位于PKR的下游，它诱导凋亡就不依赖于PKR的活化。数据还显示发生了BID的断裂和胱冬酶8活化，这与该领域其它人研究结果一致，说明PKR诱导的凋亡常通过Fas、FADD、胱冬酶-8和BID的活化所介导(Balachandran等，1998)。
因此，腺病毒介导的MDA-7过量表达可导致PKR被快速诱导和活化，随即eIF-2α以及PKR的其他靶底物被磷酸化，然后诱导凋亡。通过2-AP特异性抑制肺癌细胞内的PKR可消除Ad-mda7诱导的PKR活化、PKR靶底物磷酸化和凋亡的发生。通过无PKR的成纤维细胞试验发现Ad-mda7诱导的凋亡依赖于具有正常功能的PKR通路。这些结果说明多功能的PKR基因的新作用是作为Ad-mda7介导凋亡的关键性介质。而且，由于如本文所述PKR对于MDA-7诱导的凋亡是关键因素，故已提议用PKR来诱导免疫应答，因此，本发明的某些实施方式考虑通过诱导PKR的表达来增强免疫应答，数据显示MDA-7多肽可以增强免疫应答。
在其它实施方式中，本发明的方法用于鉴定免疫原性分子。本发明特别适用于增强抗以下免疫原性分子的免疫应答，这些免疫原性分子或是未曾鉴定的，或是其免疫原性水平低于常规免疫检测方法检测限度的。
本发明还涉及预测候选患者对免疫治疗效果的方法。本发明的诊断试验可通过分析抗免疫原性分子，如抗原的免疫应答来评价某患者的病情是否能保持长期不发展。本发明涉及的其他诊断试验可用于评价某患者是否是可采用本发明治疗方法来预防涉及免疫应答的疾病的候选者。
在一实施方式中，本发明包括的诊断试验可确定对象是否产生了抗免疫原性分子的免疫应答。在另一实施方式中，用诊断试验来测定对象的T细胞、NK细胞或巨噬细胞活性是否升高。在另一实施方式中，用诊断试验来测定对象的细胞因子浓度是否升高。无论那种情况，如果对象出现肯定的结果，则本发明包括本文所述的组合物来激发免疫应答。在其它实施方式中，给予显示或可能显示诱导了免疫应答的对象本发明的治疗方法来诱导这种免疫应答。
                              实施例
下面的实施例用于显示本发明的某些实施方式。本领域的技术人员应该了解实施例中所所述的技术是发明人发现的具有代表性的技术，可认为构成了实施本发明的某些模式。但是，本领域技术人员根据本说明书公开的内容可对本文所述的具体实施方式作各种修改，而不背离本发明的构思和范围，仍可以得到相似或相同的结果。
实施例1：MDA-7是通过IL-22受体调节新生血管形成的新型配体
材料和方法
1.细胞培养
得自美国典型培养物收集中心(ATCC；Rockville，MD)的人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系A549(腺癌)和人胚肾细胞(293)用Hams/F12培养基(A549)和含10％胎牛血清的(GIBCO-BRL，Grand Island，NY)Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)培养。HUVEC和HMVEC购自Clonetics(Walkerville，MD)，在含5％胎牛血清和厂商提供的“弹头试剂盒”内的试剂的内皮细胞基础培养基中培养。所用的内皮细胞是3-9代细胞。
2.分泌型MDA-7蛋白质的产生和纯化
用携带有全长mda-7cDNA的真核表达载体转染293细胞产生MDA-7蛋白质。转染完成后，将细胞在潮霉素(0.4μg/ml)中筛选14天。通过western印迹分析和ELISA检测稳定细胞系(293-mda-7)产生的可溶性MDA-7(sMDA-7)蛋白质。如ELISA所测定的，24小时内每份106个细胞(293-mda-7)产生约30-50ng/ml sMDA-7。为了大规模纯化sMDA-7蛋白质，将293-mda-7细胞在150-mm组织培养板中培养到90％汇合(confluency)。收集和合并组织培养上清用于亲和层析进行蛋白质纯化，如前所述(Caudel等，2002)。用凝胶银染和Western印迹分析测定sMDA-7蛋白质的大小和纯度。
3.内皮细胞增殖试验
为了检测sMDA-7蛋白质对细胞增殖的作用，将内皮细胞(HUVEC，HMVEC)血清饥饿过夜。第二天，将细胞接种于2孔室载玻片(1×104/孔)。使细胞附着和扩展4-6小时，加入含有1ng/ml bFGF作为促血管新生刺激因子和各种浓度sMDA-7/IL-24(1，5，10，and 50ng/ml)的新鲜培养基。用PBS处理的细胞作为对照。然后收集处理后3天的细胞，如前所述(Saeki等，2000)通过台盼蓝排斥试验方法检测细胞增殖。还测定了sMDA-7对肺肿瘤细胞(H1299，和A549)增殖的作用。除不以bFGF刺激肿瘤细胞以外，实验条件与上述内皮细胞的相同。用Ad-mda7(3000vp/细胞)处理的肿瘤细胞作为阳性对照。
4.内皮细胞分化试验
用体外抗血管新生试验试剂盒(Chemicon，Temecula，CA)进行内皮细胞分化(微管形成)试验。简要地说，将HUVEC和HMVEC培养到80％汇合，收集，在培养基中重悬，以2×104细胞/孔的浓度置于Matrigel(Chemicon，Temecula，CA)包被的96孔板中。用sMDA蛋白质(1，5，10，和50ng/ml)或免疫耗竭sMDA蛋白质的制品在37℃处理细胞24小时。在这些实验中，用PBS处理的细胞作为阴性对照。通过在明视野显微镜下计数微管数目来检测和定量sMDA-7抑制微管形成的能力。
对于包括对照研究的实验，，以等摩尔浓度的sMDA-7(5，10，and 300ng/ml)，重组人内皮抑素(5.2，10.4，和315ng/ml；Calbiochem，La Jolla，CA)，重组IFN-γ(4.5，9，和268ng/ml；R&D systems，Minneapolis，MN)或重组IP-10(2.4，4.5，和134ng/ml；R&D systems，Minneapolis，MN)处理细胞，并如上所述以微管形成试验分析细胞。所有的样品都设双复孔。实验重复至少5-6次。
对于受体阻抑研究，用IL-22R1阻抑抗体(1ng/ml和5ng/ml)预处理生长在6孔板中的HUVEC。过夜孵育后，收获细胞、洗涤并置于Matrigel包被的96孔板中。将新鲜的IL-22R1阻抑抗体和sMDA-7以1∶1比率(1ng/ml IL-22R1抗体：1ng/ml sMDA-7)或1∶5比率(1ng/ml IL-22R1抗体：5ng/ml sMDA-7)添加到孔中，37℃孵育。过夜孵育后，检测板中的微管形成。其他所有的实验过程都与上述相同。对于涉及内皮抑素或IP-10的实验，使用更高浓度的在微管形成试验中显示有抑制活性的这些蛋白质(内皮抑素，315ng/ml；IP-10，134ng/ml)。对于涉及内皮抑素的实验所用的IL-22R1相对量为315ng/ml(1∶1比率)，对于涉及IP-10的实验为134ng/ml(1∶1比率)。其他所有的实验过程都与上述相同。对于利用抗-IP-10或抗-IFN-γ中和抗体(R & D Systems)的阻抑研究，除以sMDA-7(300ng/ml)处理前用适当的中和抗体(1μg和5μg/ml)处理HUVEC之外，实验的进行与上述受体研究相同。
5.内皮细胞迁移试验
用HUVEC进行迁移试验。细胞在含5％胎牛血清(FBS)的基础培养基中饥饿过夜，然后收集细胞并重悬于同样的培养基中，以每孔1×105个细胞的浓度接种到带8μm滤膜(Millipore，Cambridge，MA)的24孔穿孔插片(transwell insert)的上表面。将插片放到6孔板中，这些孔中含有PBS和VEGF(100ng/ml)或VEGF和MDA-7(10或50ng/ml)的培养基。含穿孔插片的培养板37℃孵育过夜使细胞迁移。第二天，拆开孔，膜用结晶紫固定，迁移到孔的下层的细胞在高倍显微镜(×40)下计数。
6.检测产生的IP-10和IFN-γ
最近的研究已证实用sMDA-7处理PBMC可引起IFN-γ的分泌(Caudell等，2002)。此外，IFN-γ是IP-10的强诱导剂(Majumder等，1998)。IFN-γ和IP-10都报道具有抗血管新生活性(Fathallah-Shaykh等，2000；Angiolillo等，1996)。进行了研究以确定sMDA-7的抗血管新生活性是否是IFN-γ或IP-10介导的。HUVEC细胞接种到6孔板内(每孔1×106个细胞)并用sMDA-7(10ng/ml)处理。处理后6、24和48小时收集细胞培养上清液，1200rpm离心，然后用购买的ELISA试剂盒分析产生的IP-10和IFN-γ蛋白。试验按照厂商(R&D Systems，Minneapolis，MN)的说明书进行。以重组IFN-γ(4.5ng/ml)处理的细胞作为IP-10试验的阳性对照，以Ad-mda7(3000vp/细胞)处理的细胞作为IFN-γ试验的阳性对照，以PBS处理的细胞作为这些试验的阴性对照。样品设四复孔，对于检测的每种浓度的sMDA-7，数据为四复孔的平均值。
7.Western印迹分析
最近的研究已证实HACAT细胞中STAT-3表达的活化可作为sMDA-7结合于其受体的一种衡量(Dumoutier等，2001；Wang等，2002)。因此，进行研究以确定sMDA-7处理后内皮细胞中STAT-3表达的活化。HUVEC细胞接种到6孔板内(每孔5×105个细胞)并用sMDA-7(10ng/ml)处理。未处理细胞作为阴性对照。处理后4和24小时收集细胞，如前所述(Mhashilkar等，2001；Pataer等，2002).通过western印迹分析分析STAT-3表达。用兔抗-人pSTAT-3抗体(1∶1000，细胞Signaling Technology，Beverly，MA)和辣根过氧化物酶标记的二抗(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)来检测磷酸化的STAT-2(pSTAT-3)蛋白。最后，利用Amersham的增强型化学发光western印迹检测系统观察增强型化学发光胶片(Hyperfilm，Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)上的蛋白质。在以总STAT-3蛋白质表达标准化之后用Image Quant软件(Molecular Dynamics，AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)定量STAT-3蛋白质表达水平。
8.免疫荧光试验
还利用免疫荧光试验检测了STAT-3的活化。HUVEC接种到双孔室载玻片上(每孔1×104个细胞)，然后用PBS(对照)或sMDA-7(10ng/ml)处理4小时，PBS洗涤，冷乙酸固定，然后用兔抗人pSTAT-3抗体(1∶1000，细胞SignalingTechnology，Beverly，MA)和罗丹明标记的抗兔二抗(1∶5000；MolecularProbes，Eugene，OR)染色以检测磷酸化的STAT-3(pSTAT-3)。载玻片用抗褪色的封固试剂(Vector Laboratories)封固。染色后1-2小时用荧光显微镜拍照。
9.利用基质胶塞试验评估体内新生血管形成活性
为了确定sMDA-7的抗新生血管形成活性，进行了体内新生血管形成试验。简言之，sMDA-7(12.5ng)和bFGF(60ng)与500μl基质胶(Beckton Dickinson，Bedford，MA)在冰上混合，然后注射到无胸腺裸鼠的皮下。注射只含bFGF(60ng)的基质胶的动物作为阳性对照，注射不含生长因子的基质胶的动物作为阴性对照。每组5只动物，试验进行两次。注射后10天处死动物。收获基质胶，拍照后按照前述的方法进行血红蛋白分析(Pessaniti等，1992)。
10.对裸鼠异种移植肿瘤的作用
先检测亲本293细胞和293-mda-7细胞形成肿瘤的能力。将106细胞等份皮下注射到无胸腺BALB/c雌裸鼠的右下腹部，观察注入部位1个月。这种浓度的细胞接种没有观察到肿瘤形成，因此后续试验采用该细胞数目。为了进行体内混合试验，人肺癌细胞(A549)生长到90％汇合时用胰蛋白酶消化，洗涤并重悬于无菌PBS中，浓度为5×106个细胞/毫升。将此肿瘤细胞悬液与等量的亲本293细胞或293-mda-7细胞(5×106个细胞/毫升)混合，温和振荡后皮下注射裸鼠(每只动物注射106个细胞)。每组8只动物，试验进行两次。如前所述监测和测量肿瘤的生长情况(Saeki等，2002)。试验结束时吸入CO2窒息处死动物，取出肿瘤进行组织病理分析、western印迹分析和CD31及TUNEL染色。
为了评价sMDA-7对肿瘤生长的影响，在裸鼠右下腹部皮下注射A549肿瘤细胞(5×106细胞)以建立皮下肿瘤。当肿瘤长到50-60mm3时，将动物分成两组，每组10只。一组以含亲本293细胞(1×106)的基质胶注射，一组以含293-mda-7细胞(1×106)的基质胶注射。将含细胞的基质胶皮下注射到荷瘤小鼠的右上腹部。如上所述监测sMDA-7对肿瘤生长的影响。在试验结束时窒息处死动物，如上所述取出肿瘤进行下一步的分析。所述的所有动物实验进行至少2次，检测肿瘤生长差别的统计学显著性。
11.免疫组化分析
按照以前所述的方法(Saeki等，2002)将组织染色以检测CD31和TUNEL。阴性对照是不用初级抗体染色或用同型抗体染色的组织切片。组织切片进行定量分析，用双盲法解释结果。
12.统计学分析
用斯氏t-检验计算实验结果的统计学意义。P值小于0.05认为有统计学显著性。
实施例2：sMDA-7抑制内皮细胞分化但不抑制细胞增殖
在初步研究中，利用HUVEC和HMVEC检测了sMDA-7对内皮细胞增殖的抑制作用。以各种sMDA-7浓度(1，5，10，和50ng/ml)处理细胞与以PBS处理的对照细胞相比无显著抗增殖活性(图1A，B)。然而，用上述sMDA-7浓度处理HUVEC和HMVEC显著抑制(P＝0.001)两种类型内皮细胞的毛细管样结构的形成(图1C，图1D)。在所有浓度都观察到了抑制效果并且是剂量依赖性的，在浓度高于10ng/ml时最终完全消除了微管形成(图1D)。
为了排除sMDA-7蛋白对内皮细胞微管形成的抑制可能是制品中的无关蛋白质所致，进行了耗竭试验。在加入到HUVEC前用免疫方法耗竭测试制品中的sMDA-7蛋白质，导致内皮细胞微管形成的完全恢复(图1C，图1D)。这些数据显示在内皮细胞试验中观察到的抑制活性是sMDA-7所致，表明sMDA-7具有有效的抗新生血管形成活性。
实施例3：sMDA-7比内皮抑素更有效抑制内皮细胞分化
在微管形成试验中将sMDA-7显示的抑制活性和内皮抑素比较。用等摩尔浓度的sMDA-7或内皮抑素处理HUVEC。与对照细胞比较，sMDA-7而非内皮抑素在低浓度显著(P＝0.001)抑制了微管形成(图2)。然而，与对照细胞比较，在高浓度时(315ng/ml)内皮抑素显著抑制微管形成(超过对照40-50％；P＝0.001)，证明所用的该内皮抑素蛋白质是有功能的(图2)。这些结果表明sMDA-7是比内皮抑素更强的抗新生血管形成制剂。
实施例4：sMDA-7抑制内皮细胞迁移
为了确定sMDA-7是否抑制内皮细胞迁移，进行研究以检测VEGF对细胞迁移的作用。sMDA-7响应VEGF显著抑制内皮细胞迁移(P＝0.001)(图3)。不含sMDA-7/IL-24未观察到对对照细胞有抑制作用。抑制是剂量依赖的，在50ng/ml时完全抑制(图3)。当bFGF作为诱导剂时，sMDA-7/IL-24显示出相似的抑制活性。
实施例5：sMDA-7对内皮细胞分化的抑制不是由IFN-γ或IP-10介导的最近已有报道以sMDA-7处理后人PBMC产生IFN-γ(Caudell等，2002)。基于该报道，进行了研究以评价是否sMDA-7对微管形成的抑制是通过IFN-γ或IP-10的产生介导的。在不同时间收集以PBS处理和sMDA-7处理的HUVEC细胞的组织培养上清，通过ELISA分析IFN-γ和IP-10。与对照细胞相比，sMDA-7在48小时内诱导IFN-γ(＜30pg/ml)和IP-10(＜32pg/ml)的分泌。为了进一步测试观察到的对HUVEC微管形成的抑制作用是否由于sMDA-7诱导了少量的IFN-γ或IP-10所致，进行了对照研究。直接比较了sMDA-7和IFN-γ或IP-10在等摩尔浓度时的抑制活性显示，为显著抑制HUVEC微管形成(P＝0.01；图4C)相比(10ng/ml)sMDA-7需要更高浓度的IFN-γ(268ng/ml)或IP-10(134ng/ml)。此外，当存在抗-IP-10或抗-IFN-γ中和抗体时sMDA-7不丧失对HUVEC微管形成的抑制活性(P＝0.01；图4D)。这些结果表明，在体外sMDA-7比IFN-γ和IP-10更有效，sMDA-7介导的对HUVEC微管形成的抑制活性不是由于IFN-γ或IP-10所致。
实施例6：sMDA-7激活STAT-3表达并通过其受体介导其抑制活性
1.sMDA-7/IL-24激活STAT-3表达
最近的研究证明了sMDA-7通过受体结合可激活HACAT细胞和PBMC的STAT-3表达(Dumoutier等，2001；Wang等，2002)。根据这些报道，推测sMDA-7对内皮细胞的活性是受体介导的，受体结合后将激活STAT-3。Western印迹分析和免疫荧光试验显示，向HUVEC中添加sMDA-7在短至4h内提高了磷酸化形式STAT-3蛋白质(pSTAT-3)的表达水平，甚至在处理24小时后仍持续升高。pSTAT-3表达的提高比PBS处理的对照细胞高2-3倍。以sMDA-7/IL-24处理后在HUVEC中也增加了pSTAT-3蛋白质的细胞核定位。相比较，在未处理的对照细胞中未观察到STAT-3表达的变化。此外，在抗-MDA-7抗体存在时STAT-3的活化受到抑制，表明这种活化是受体介导的。
2.sMDA-7通过其受体介导其抑制活性
最近已鉴定了sMDA-7的两个相关受体(Dumoutier等，2001；Wang等，2002).sMDA-7可结合于这两个受体复合物IL-20R1/IL-20R2(IL-20受体)以及IL-22R1和IL-20R2(IL-22受体)中的任何一个。根据这些报道，进行研究以确定是否sMDA-7介导的内皮细胞抑制作用是受体介导的。在存在或不存在sMDA-7时用抗IL-22R1封闭抗体评价了内皮分化(图5A，图5B)。在HUVEC中单用sMDA-7(5ng/ml)完全抑制了微管形成，而在未处理的对照细胞中未观察到抑制(图5A)。然而，以IL-22R1封闭抗体预处理HUVEC以剂量依赖方式显著(P＝0.001)消除sMDA-7对微管形成的抑制作用(图5A)。向HUVEC中添加1ng/ml封闭抗体(1∶5比率)只能部分恢复微管形成(＜60％)，但添加5ng/ml封闭抗体(1∶1比率)完全恢复了微管形成(＞90％)。用封闭抗体不显著影响HUVEC形成微管的能力。此外，将sMDA-7蛋白质添加到HUVEC后，pSTAT-3蛋白质表达量显著增加，而在IL-22R1抗体存在时sMDA-7介导的pSTAT-3表达不增加。这些结果显示，sMDA-7介导的对内皮细胞微管形成的抑制作用是通过IL-22R1发生的。
为检测这种抑制的特异性，在IL-22R1抗体存在时以高浓度的IP-10或内皮抑素处理HUVEC。甚至在存在IL-22R1抗体时，与PBS处理的对照细胞比较，以IP-10或内皮抑素处理显著抑制了HUVEC微管形成(P＝0.001；图5B)。这些结果证明IL-22R1抗体可特异性抑制sMDA-7/IL-24介导的活化但不抑制内皮抑素，IFN-γ或IP-10介导的活化。
实施例7：研究新生血管形成和肿瘤生长的体内模型
1.在基质胶塞模型中sMDA-7抑制新生血管形成
将包裹于含有bFGF的基质胶中的sMDA-7皮下植入裸鼠。只含bFGF的基质胶和含有PBS的基质胶分别作为阳性和阴性对照。当与只含bFGF的基质胶和含有PBS的基质胶比较时，在sMDA-7/IL-24存在时bFGF诱导的新生血管形成受到显著抑制(P＝0.0001；图6A)。
2.sMDA-7体内抑制皮下异种移植肿瘤生长
将人肺肿瘤(A549)细胞(1∶1比率)与亲代293细胞(对照动物)或产生sMDA-7蛋白质(293-mda-7)的293细胞混合皮下注射入小鼠的右下腹。接受A549和293-mda-7细胞混合物的动物中肿瘤生长显著低于(图6B)接受A549和亲代293细胞的动物(P＝0.001)。单独注射293或293-mda-7细胞在裸鼠中不形成肿瘤。植入后第22天处死动物，收获肿瘤作进一步评价。Western印迹分析证明MDA-7蛋白质在含有293-mda-7细胞的肿瘤中表达。在含有亲代293细胞的对照肿瘤中未检测到MDA-7蛋白质表达。肿瘤组织的组织病理学检查未发现对照和实验动物间在肿瘤细胞增殖指数或肿瘤细胞浸润有任何显著差别。然而，通过CD31染色含有293-mda-7细胞的肿瘤比含有亲代293细胞的对照肿瘤显示更少的血管化。试验动物肿瘤组织的TUNEL染色显示了处于凋亡性细胞死亡的内皮细胞和肿瘤细胞。相比较，在对照肿瘤组织中未观察到TUNEL阳性染色。此外，含有293-mda-7细胞的肿瘤中血红素水平显著(P＝0.02)低于含有亲代293细胞的肿瘤(图6C)。CD31染色的减少和血红素水平的降低表明sMDA-7抑制新生血管形成。
3.sMDA-7体内系统性抑制皮下异种移植肿瘤生长
进行研究以确定是否293-mda-7细胞产生的sMDA-7可以系统性抑制肿瘤生长。以A549肿瘤细胞在右下腹皮下接种小鼠。当肿瘤达到50-100mm3时，将产生sMDA-7蛋白质的293细胞(293-mda-7细胞)或亲代293细胞(对照)包裹于基质胶中，皮下植入右上腹。293细胞植入后开始测量肿瘤。以293-mda-7细胞处理的小鼠中A549肺肿瘤异种移植物的生长显著小于对照组(图6D)。与对照小鼠肿瘤生长比较，以包裹的293-mda-7细胞植入的小鼠中的肿瘤的生长被抑制了40-50％。为了确定这种抑制效果是sMDA-7所致，通过Western印迹分析和ELISA检测动物血清样品中的MDA-7蛋白质。通过Western印迹分析在植入293-mda-7细胞的动物血清中观察到sMDA-7考虑的40-kDa大小的强条带。然而，在对照动物血清中也观察到微弱条带，表明与小鼠血清蛋白质有一些交叉反应性。ELISA检测到的植入后3天的循环血清sMDA-7水平约为50ng/ml。
在实验结束时，收获肿瘤和注入的含有293-mda-7细胞的基质胶进行评价。肿瘤的总体检查表明接受293-mda-7细胞的动物中的肿瘤生长受到了抑制。肿瘤组织的组织病理学分析显示接受293细胞和接受293-mda-7细胞的样品之间无差别。此外，如CD31阳性染色所证明的，以293-mda-7处理的小鼠的肿瘤血管化显著(P＝0.001)低于以亲代293细胞处理的小鼠(图6E)。接受293-mda-7细胞的动物的基质胶的免疫组化分析显示有MDA-7蛋白质表达。相比较，从接受亲代293细胞的动物中回收的基质胶中未检测到MDA-7。这些结果表明sMDA-7通过抑制新生血管形成系统地抑制了肿瘤生长。
实施例8：AD-MDA-7在晚期癌症患者中诱导凋亡并激活免疫系统
研究设计和患者标准
在一项正在进行的I期剂量递升的临床试验中，用非复制型腺病毒构建物(Ad-mda7)通过瘤内注射将mda-7给予晚期癌症患者。患者具有至少有一个注射针可达到的可手术切除的病灶，组织学证实为癌，Karnofsky行为状态≥70％，可接受的hemotologic，肾和肝功能。将具有活跃的CNS转移，长期使用免疫抑制剂，或之前接受过腺病毒治疗的患者排除在外。
可手术切除晚期癌症患者接受一次2×1010-2×1012病毒颗粒(vp)瘤内注射(图7)。至今，已有8组(18名患者)完成了注册。为了鉴定瘤内mda-7治疗的效果，注射后24-96h手术切除注射病灶，作连续切片，分析载体DNA和RNA的分布，形态，MDA-7蛋白质表达，凋亡活性，微管密度，Ki-67阳性细胞数，以及iNOS和β-连环蛋白表达。
实施例9：瘤内注射AD-MDA7的作用
Ad-mda7似乎是安全的并且注射部位疼痛可耐受，有短暂低烧和中度类似流感的症状是最初的毒性。这些作用在Ad-mda7剂量更高时更易见到。注射后48小时所有作用消失。通过DNA PCR分析，Ad-mda7拷贝数在低剂量治疗的患者中为7×106/μg DNA至接受高剂量的患者中高达4×108/μg DNA(图8)。最高的载体拷贝数位于被注射病灶的中心，虽然一般在离注射点1cm的切片中可检测到载体DNA。mRNA分布反映DNA分布。通过IHC分析，在所有注射病灶中发现了MDA-7蛋白质强表达。与低剂量注射后高达20％阳性染色细胞比较，在高剂量注射肿瘤中心发现了高达80％的MDA-7阳性细胞。未注射的对照均为阴性。此外，如TUNEL染色所确定的，MDA-7表达区显示凋亡活性增高。在病灶中心凋亡最强，高达70％的细胞为阳性；然而与未注射病灶比较，外周区切片也显示显著的TUNEL反应(图9)。8个Ad-mda7治疗的肿瘤病灶中有8个显示β-连环蛋白表达明显降低和/或从细胞核到细胞膜的重新分布，与临床前期的发现一致。在该进行试验的有限数目的黑素瘤病例中也发现了iNOS表达明显降低。注射部位附近的微管密度减低但难以定量。因此，Ad-mda7瘤内注射耐受性很好。注射后24小时内，MDA-7蛋白质表达呈剂量依赖性增加，凋亡细胞明显增加，这些都与离注射部位的距离相关。72-96小时内，MDA-7表达和凋亡逐渐下降(图8)。注射后30天，MDA-7表达和凋亡已停止。
通过血清细胞因子和淋巴细胞亚组分析了对Ad-mda7的全身性免疫应答反应。大多数患者显示出系统细胞因子(IL-6，14/18被测患者；IL-10，15/18；γIFN，8/18；TNFα，10/18)有短暂增加(图10，图11)。一些高剂量患者也显示IL-6，γIFN和IL-10细胞因子mRNA的瘤内表达提高。此外，mda-7处理后第15天CD3+CD8+T细胞增加了30±13％(图12，图13)。这些发现提示MDA-7提高系统性TH1细胞因子的产生并动员了CD8+T细胞。Ad-mda7注射后，循环性IL-6，IFN-γ，IL-10和TNF-α大量增加然后到30天降低到基线水平。细胞因子增加与CD8+细胞增加和CD4/CD8比率转变相关。因此，这些结果提示了Ad-mda7导致免疫激活并与培养物中rhMDA-7的促-TH1活性相一致。
实施例10：抗体生产
在大肠杆菌中生产重组的his-标记的MDA-7蛋白质并在镍NTA琼脂糖柱上纯化。以成批的方式使材料结合于镍树脂45分钟，然后灌注于柱中，使洗脱液流过柱床。以含有0.5％chaps的10mM Tris pH 8.0洗涤，最后以10mM Tris pH 8.0、400mM咪唑从柱上洗脱。洗脱的MDA-7以10mM Tris pH 8.0透析。终产物显示为分子质量约23kDa的一条带。氨基末端蛋白质序列显示正确，纯度估计为90％以上。
用如下程序将该材料注射入兔子：皮下注射400mg MDA-7蛋白质和IFA以及100mg MDP，3周后注射200ug MDA-7蛋白质和IFA，再3周后，皮下注射另外100mg MDA-7蛋白质。ELISA试验显示，抗血清的滴度大于1/100,000。如所需给予动物加强注射。
通过巯基连接将MDA-7蛋白质与固体支持树脂耦联。彻底洗涤树脂和结合的蛋白质。被洗涤的材料用于制作抗体纯化用MDA-7柱。在将兔多克隆血清以20mMTris缓冲液pH 8.0 1∶1稀释并通过0.2微米滤器过滤后泵到MDA-7柱上。然后以同样的20mM Tris缓冲液pH 8.0洗涤柱子直到吸光率回到基线。以0.1M乙酸将抗体从柱上洗脱。将含有抗体的洗脱液立即调回到pH 8.0。然后该亲和纯化的抗体以10mM Tris pH 8.0透析并浓缩。
实施例11：用多克隆抗体纯化和鉴定分泌型MDA-7
1.亲和柱的产生
纯化从兔血清得来的抗人MDA-7的不同的多克隆抗体。将冷冻的兔血清解冻并以无菌1X PBS缓冲液1∶1稀释。将稀释的样品各自在4℃水浴中轻摇过夜与2ml蛋白质A-Sepharose(SIGMA)混合。创建了四个不同的柱子。以10倍柱体积的20mM磷酸二钠(61ml)洗涤树脂达到pH7.0。用3份3倍柱体积的0.15M NaCl(pH3.0)洗脱并以0.5M HEPES中和。用Bradford蛋白质试验(BioRad)定量洗脱的抗体。然后通过在10,000MWCO透析盒中透析过夜，将抗体液交换成含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO3(pH 8.3)液。
为了活化干的CNBr-Sepharose，以10-15倍柱体积的1mM冷HCl洗涤1克CNBr-Sepharose。用一系列5ml体积洗涤确保去除蔗糖。然后通过1倍柱体积作一系列洗涤以10倍柱体积洗涤活化的CNBr-Sepharose，交换成0.1M NaHCO3，pH 8.3液。每次，纯化和缓冲液交换后回收到约80-90毫克的抗体。然后将5ml膨胀的活化CNBr-Sepharose与80-90毫克的纯化抗体在0.1M NaHCO3，pH 8.3中轻摇室温孵育4小时。
通过Bradford蛋白质试验测定抗体结合效率，每次结合到活化CNBr-Sepharose上的抗体大于95％。耦联后，用25-30倍柱体积的0.1M Tris，pH 8.0洗涤封闭未发生反应的基团。然后以0.1M Tris，pH 8.0，0.5M NaCl，5倍柱子体积洗涤柱子5次，换以0.1M醋酸盐缓冲液，pH 4.0，0.5M NaCl连续洗涤。评估洗液中的蛋白质，未检测到蛋白质。
2.亲和层析纯化
得到分泌可溶性和糖基化MDA-7的稳定转染的293T细胞，并在含有5％胎牛血清、1∶100L-谷胺酰胺，1∶100pen/strep和1∶100HEPES的RPMI中培养至高汇合度。每2-3天分离细胞，每7天更换含1∶1000稀释度的潮霉素(20mg/ml贮液)培养液。每2-3天收获400ml上清，以在10,000分子量截留膜上用AMICON搅动小室来浓缩。将50ml浓缩的上清分批暴露于5ml床体积的抗体-CNBr-琼脂糖，(亲和树脂)4℃2天轻微摇动。然后将亲和树脂置于Pharmacia XK 26柱中，上清通过柱3次以保证抗原同抗体的最大结合。通过重力流动以5×20ml 0.1MTris pH 8.0洗涤亲和树脂。以3×5ml 1M NaCl，0.1M甘氨酸，pH 3.0洗脱MDA-7并立即以0.5mls HEPES缓冲液中和。洗脱和中和后立即添加2mg人白蛋白以保护蛋白质不损失。然后洗脱的蛋白质在10,000分子量截留旋转柱(AMICON)上浓缩，交换成无菌的1X PBS。将1-1.5ml 1X PBS交换的亲和纯化的蛋白质室温摇动接触200毫升3次洗涤的蛋白质-A Sepharose(SIGMA)2小时，或4℃摇动过夜。蛋白质A暴露能吸附脱落到洗脱液组分中的抗体。
亲和层析中检测了4种不同的多克隆抗体，本文所述了它们的产生。亲和层析前利用尺寸分辨纯化(见大小排斥)从上清中除去主要的污染蛋白质，其中最丰富的是牛血清白蛋白(BSA)。然而，以这种方式接触分离的MDA-7时柱子上的抗体不能保留MDA-7。这可能是因为BSA封闭了在缺少BSA时保留MDA-7的非特异性结合位点。MDA-7是高度糖基化的蛋白质，被认为非常容易粘附在塑料和其它表面。
从含有MDA-7的上清中除去BSA妨碍了亲和层析对MDA-7的纯化。在流穿液中存在大多数蛋白质，而亲和柱上不能留住MDA-7蛋白质直至洗脱。含有大量BSA(银染法测定为2-3mgs/ml)的上清作亲和纯化MDA-7生物功能的保留比含BSA明显为少的上清纯化时更长。BSA存在下的亲和纯化使MDA-7留在亲和柱上直到以高摩尔的NaCl和低pH洗脱。通过多克隆抗体亲和树脂进行亲和纯化产生多批数量相似的MDA-7。考马斯染色分析显示污染蛋白质含量较低。观察到MDA-7的纯度高于约20％均一性。
反复进行亲和纯化，并通过12％聚丙烯酰胺凝胶考马斯染色分析使MDA-7富集到相对纯净。通过在Western印迹检测条带的强度，抗原暴露于亲和树脂时间越长留住的MDA-7越多。当将透析盒和旋转柱比较时，将缓冲液交换成1XPBS的方法间几乎无差别。
3.阴离子交换纯化
将2-3批亲和纯化的MDA-7合并在10,000MWCO透析盒中室温2-12小时交换成50mM MES，pH 5.0。然后将蛋白质以流速1ml/min装于5ml床体积的阴离子交换柱中。取10ml流穿液用50mM MES，pH 5.0(含1M NaCl)分步梯度洗脱结合的蛋白质。洗脱程序开始于用10ml 50mM MES pH 5.0以流速2ml/min洗涤。第一步洗脱是5分钟内用0-0.25M NaCl，50mM MES，0.25M NaCl，pH5.0洗涤5分钟。第二梯度步骤是5分钟内从0.25到0.5M NaCl，然后是5分钟洗涤。最后的洗脱是从0.5M NaCl至1M NaCl。MDA-7留于柱子上直到以0.9-1.0M NaCl洗脱；将MDA-7纯化到约90％-95％均一。
18Kda的未糖基化的蛋白质在pH 5.0时不结合阴离子交换柱。亲和后阴离子交换组分的MDA-7银染分析显示MDA-7的非糖基化形式与共纯化的糖基化蛋白质相分离。原始的MDA-7复合物似乎含有至少3种分子质量为31，28和27/26的蛋白质。以前，曾经尝试过用一步阴离子交换纯化来纯化MDA-7，纯化中将含有MDA-7的上清交换成50mM MES，pH 6.0。一步阴离子交换纯化显示从阴离子交换柱得来的每个峰含有western印迹上可用多克隆抗-MDA-7检测到的MDA-7(图14)。用这种方法纯化不能在任何离子强度范围有效富集MDA-7，因为在所用的所有NaCl摩尔浓度，MDA-7都从柱子滤去。
4.尺寸排斥层析
在XK 261米柱(Pharmacia)中倒入S200 Sephadex(Pharmacia)产生200ml床体积的尺寸排斥层析柱。让柱子在重力作用下沉降，然后以BioRad BioLogicWorkstation 3.5ml/min流速压积。
为了测定293t细胞分泌的MDA-7的表观分子质量，组合蛋白质分子量标准品(小鼠IgG 5mg，碱性磷酸酶3mg，BSA 10mg，和人β2微球蛋白3mg)测定相对保留时间。将纯化的蛋白质的洗脱时间对分子量绘图，得到了0.97的R2值。在AMICON搅动小室的10,000MWCO滤膜上将200ml 293t上清浓缩为10ml(1XPBS)，以2mls/min流速加到尺寸分辨柱中。收取每5ml组分。通过连续样品的Western印迹分析确定相对滞留时间并与从已知标准品得到的曲线比较。结合的MDA-7的表观分子量测定为80-100kDa。发现小于0.1％的总MDA-7为单体31kDa形式。图15显示保留时间与分子量的比较。MDA-7复合物在分子量85-95kDa之间时洗脱。
6.尺寸，阴离子和凝集素纯化
尝试利用伴刀豆素A-Sepharose柱的凝集素纯化来纯化MDA-7。然而，未得到相对纯度的净增加。故采用联合纯化，其中联合了尺寸排斥、阴离子和凝集素纯化法来富集MDA-7。然而，这些方法的联合没有提供比亲和层析然后阴离子层析更高的MDA-7纯度。这些结果表明可通过亲和和阴离子交换层析将MDA-7纯化到至少90-95％均一。
实施例12：用单克隆抗体纯化和鉴定分泌型MDA-7
1.抗体产生
将称为7G11F.2(单克隆抗体)的杂交瘤克隆用于产生抗体，所产生的抗体在已用Brefeldin A处理的稳定转染的293t细胞作细胞内FACS分析检测IL-24/mda-7阳性细胞时是最有效的。基于这些初步的数据，用该克隆产生了5升上清。简言之，将细胞(7G11F.2)以1×106细胞/ml接种于含有10％胎牛血清和1∶100谷氨酰胺，1∶100pen/strep和1∶100HEPES的50ml DMEM中。接种细胞并使其生长10天，然后收获上清。
2.抗体纯化
通过2000rpm离心10分钟除去细胞并澄清上清液。然后澄清的上清以0.22μm微醋酸纤维滤膜过滤除菌，并以Amicon搅动小室在氮气中以YMCO 30kDa膜浓缩到50ml。4℃将浓缩的上清暴露于与琼酯糖交联的rProtein G，(Sigma)。以1M NaCl pH 3.0，3份3倍柱体积洗脱抗体，并以0.5M HEPES中和。为了去除污染的牛IgG，通过透析盒(Pierce/Endogen，YMCO 30kDa)将产生的洗脱液交换成含有0.4M NaCl(总)的1X PBS。4℃将该蛋白质暴露于与琼酯糖交联的rProtein A，(Sigma)。因为蛋白质A结合牛IgG的亲和力比结合小鼠IgGla高，取柱子的过流，以SDS PAGE分析测定相对纯度，显示为90％纯，(7G11F.2)污染蛋白质全部由牛IgG组成。用Bradford蛋白试验，(BioRad)定量洗脱抗体。然后在10,000MWCO透析盒中透析过夜将抗体交换成含有0.5M NaCl的0.1MNaHCO3，pH 8.3。
3.亲和柱的产生
为了活化干的CNBr-Sepharose，用10-15倍柱体积的1mM冷HCl洗涤1克CNBr-Sepharose。用一系列5ml体积洗涤确保去除了蔗糖。然后用1倍柱体积连续洗涤以10倍柱体积洗涤活化的CNBr-Sepharose交换成为0.1M NaHCO3，pH 8.3。每次，纯化和缓冲液交换后回收约25mg抗体，(7G11F.2)。然后将2ml膨胀的活化CNBr-Sepharose与纯化的抗体在0.1M NaHCO3，pH 8.3中轻微摇动室温孵育4小时。
通过Bradford蛋白质试验测定抗体结合效率，活化CNBr-Sepharose结合了95％以上的抗体。耦联后，通过用25-30倍柱体积0.1M Tris，pH 8.0洗涤封闭未起反应的基团。最后以0.1M Tris，pH 8.0，0.5M NaCl，5倍柱体积5次洗涤柱子，换成0.1M醋酸盐缓冲液，pH 4.0，0.5M NaCl连续洗涤。评估洗液中的蛋白质，未检测到蛋白质。
4.亲和纯化
从Introgeh，Inc.得到分泌可溶性糖基化IL-24的稳定转染的293T细胞，在含有5％胎牛血清、1∶100L-谷胺酰胺，1∶100pen/strep和1∶100HEPES的RPMI中培养至高汇合度。每2-3天分离细胞，每7天更换含1∶1000稀释度的潮霉素(20mg/ml贮液)培养液。每2-3天收获400ml上清，在10,000分子质量截留膜上用AMICON搅动小室浓缩。将50ml浓缩的上清分批暴露于5ml床体积的抗体-CNBr-琼脂糖，(亲和树脂)4℃2天轻微摇动。然后将亲和树脂置于Pharmacia XK26柱中，上清通过柱子3次以保证抗原同抗体的最大结合。通过重力流动以5×20ml 0.1M Tris pH 8.0洗涤亲和树脂。以3×5ml 1M NaCl，0.1M甘氨酸，pH3.0洗脱IL-24并立即以0.5mls HEPES缓冲液中和。洗脱和中和后立即添加2mg人白蛋白以保护蛋白质不损失。然后将洗脱的蛋白质在10,000分子量截留旋转柱(AMICON)上浓缩，交换成无菌的1X PBS。将1-1.5ml 1X PBS交换的亲和纯化的蛋白质室温摇动接触200毫升3次洗涤的蛋白质-A Sepharose(SIGMA)2小时，或4℃摇动过夜。蛋白质A接触并吸附脱落到洗脱液中的抗体，去除这些抗体对保留IL-24的功能很关键。
7G11F.2单克隆抗体柱保留了与实施例11中的多克隆抗体柱数量类似的IL-24/mda-7。
实施例13：MDA-7和胰腺癌细胞
1.Ad-mda7直接杀伤和致敏胰腺癌细胞
对4个不同胰腺癌细胞系的评估表明这些细胞系大多数可以用Ad-mda7高度感染。此外，显示Ad-mda7在这4个细胞系中的3个中可直接杀伤和诱导凋亡(图43)。选择反应最大的两个细胞系MiaPaCa2和AsPc1作进一步分析，进行不同的试验以检测Ad-mda7是否致敏这些细胞。MiaPaCa2细胞以Ad-mda7预处理，48小时后照射。当克隆存活为终点时观察到了显著的致敏(图44)。最后，通过FACS分析根据sub G1/G0 DNA含量评估凋亡(图45)。当将Ad-mda7和照射联合时，该实验显示大于叠加的凋亡诱导。
2.MDA-7蛋白质激活STAT3并直接杀伤胰腺癌细胞
如实施例11所述，以纯化的重组人MDA-7蛋白质处理MiaPaCa2胰腺癌细胞。通过免疫荧光，观察到了STAT3的充分活化(磷酸化)以及伴随的p-STAT3向细胞核的移动。在抗-MDA-7抗体存在时STAT3活化受到阻抑。在MDA-7处理30分钟内STAT3活化明显，表明MiaPaCa2细胞有MDA-7的受体，发生了配体-受体结合。
在另一项研究中，MDA-7蛋白质处理诱导了剂量依赖的MiaPaCa2细胞杀伤。胰腺癌细胞有MDA-7的受体，MDA-7结合后，诱导了STAT3信号转导导致了肿瘤细胞死亡。
实施例14：选择性诱导前列腺癌细胞中细胞周期停滞和凋亡
材料和方法
1.细胞系和细胞培养
人前列腺癌细胞系DU 145，LNCaP，和PC-3得自美国典型培养物收集中心(ATCC；Rockville，MD，USA)，在添加了10％胎牛血清、抗生素和L-谷胺酰胺(GIBCO-BRL；Grand Island，NY，USA)的RPMI-1640培养基中培养。正常前列腺内皮细胞系(PrEC)得自Clonetics(San Diego，CA，USA)，在按厂商说明含添加物的PrEBM培养基中培养。
2.病毒构建和转导效率
携带mda-7或荧光素酶(luc)基因的复制缺陷型腺病毒(Ad5)载体的构建和产生以前已有所述(Saeki等，2000；Mhashilkar等，2001)。利用编码绿色荧光蛋白质的腺病毒载体(Ad-GFP)所做的预备试验显示以感染复数(MOI)3000输递的腺病毒剂量可感染93.4％以上的DU 145和PC-3细胞，76.2％的LNCaP细胞，和82％的PrEC细胞。因此，发明人在所有后续研究中使用了3000MOI的Ad-mda7或Ad-luc。
3.细胞增殖试验
将所有细胞系以1×105细胞/孔密度接种在6孔组织培养板中。然后以Ad-mda7或Ad-luc或0.1M磷酸缓冲盐水(PBS)作为模拟对照来处理肿瘤细胞。各处理组的细胞设三复孔，培养4天。然后，在设定的时间点，通过胰蛋白酶化收获细胞以0.4％台盼蓝(GIBCO-BRL；Grand Island，NY，USA)染色以显示死亡细胞。然后将存活细胞以血球计计数。对于凋亡细胞，感染后72h以Hoechst33258将细胞染色并如前所述(Saeki等，2000，2002)进行分析。
4.细胞周期分析
为了检测Ad-mda7对细胞周期的影响，将细胞接种于10-cm培养皿中(5-10×105细胞/皿)以Ad-mda7，Ad-luc或以0.1M PBS处理。在处理后特定的时间，通过胰蛋白酶化收获细胞，以冰冷的0.1M PBS洗涤一次，以70％乙醇固定并储存于-20℃。然后以冰冷的0.1M PBS洗涤细胞2次，以Rnase处理(37℃，30分钟，500单位/ml；Sigma Chemicals；St.Louis，MO，USA)，DNA以碘化丙锭(PI)染色(50μg/ml；Boehringer Mannheim；Indianapolis，IN，USA)。用荧光激活细胞分选仪(EPICS XL-MCL，Beckman Coulter，Inc.，Fullerton，CA，USA)分析细胞周期的时期和凋亡率(处于sub-G0/G1期的细胞)。
5.有丝分裂指数
对于有丝分裂指数的测定，以Ad-mda7处理后72h收获细胞。将细胞固定如上所述以PI染色以荧光显微镜进行细胞周期分析。每份样品，通过荧光显微镜以高倍(X 40)随机计数至少500个细胞，见到缺少细胞核膜和染色体凝集时判定为有丝分裂细胞。
6.免疫印迹分析
用Ad-mda7，Ad-luc或PBS处理肿瘤细胞(DU 145和LNCaP)后72h收获，如前所述(Saeki等，2000)制备细胞提取物进行western印迹分析。下列抗体用作第一抗体：抗-MDA-7抗体(Introgen Therapeutics，Inc.，Houston，TX，USA)胱冬酶-3；PARP；and细胞周期蛋白E(Pharmingen；San Diego，CA，USA)；细胞周期蛋白A，β-肌动蛋白(Sigma Chemicals；St.Louis，MO，USA)；NFkB，Chk1，Cdc2，磷酸特异性-Jak1 p27Kip1，磷酸特异性-JNK，磷酸特异性-STAT3(SantaCruz Biotechnology；Santa Cruz，CA，USA)；磷酸特异性-Tyk2，磷酸特异性-STAT1，和Cdc25C(Cell Signaling Technology，Inc，Boston，MA，USA)；细胞周期蛋白B1(Lab Vision Corp.，Fremont，CA，USA)；Chk2(Novus Biologicals，Littleton，CO，USA)；p21WAF1(Oncogene Research Products，Boston，MA，USA).
7.统计学分析
斯氏t检验用于计算实验结果的统计学显著性。显著性水平设为P＜0.05。
结果
1.Ad-mda7处理人前列腺癌和内皮细胞后MDA-7的表达
为检测细胞中的外源MDA-7表达，将DU 145，LNCaP，PC-3，和PrEC细胞在6孔组织培养板中培养(1×105细胞/孔)，并以Ad-mda7和Ad-luc处理。以PBS处理的细胞作为阴性对照。感染后24h，48h和72h制备细胞裂解物，通过Western印迹分析评价蛋白质表达。与以PBS和以Ad-luc处理的细胞比较，以Ad-mda7处理的所有细胞系中都检测到了MDA-7表达。观察到MDA-7蛋白质表达是时间依赖性的，在48h-72h间表达最高。在被测细胞系中未检测到内源MDA-7表达。
2.MDA-7过表达导致的前列腺癌细胞中的细胞增殖抑制
为测定Ad-mda7处理对细胞增殖的影响，以PBS，Ad-luc，或Ad-mda7处理肿瘤细胞(DU 145，LNCaP，和PC-3)和正常细胞(PrEC)。处理后各不同时间点收获细胞并分析细胞存活。与以Ad-luc或PBS处理的对照细胞比较，从第3天开始，在以Ad-mda7处理的所有细胞系中都观察到显著的(P≤0.01)细胞增殖抑制。PC-3和PrEC细胞中观察到的细胞增殖抑制少于DU 145和LNCaP细胞，提示这些细胞可能对Ad-mda-7的敏感度较低(图16)。然而，在较后时间点(第5和6天)的细胞增殖分析表明PC-3细胞比PrEC细胞对Ad-mda7更敏感。
3.MDA-7过表达诱导前列腺癌细胞凋亡
为了检测以Ad-mda7处理是否诱导凋亡，将以Ad-mda7，以Ad-luc，或以PBS处理的细胞进行流式细胞计量分析。与以Ad-luc或以PBS处理的细胞比较，以Ad-mda7处理的肿瘤细胞(DU 145，LNCaP，PC-3)显示了处于sub-G0/G1期的细胞数目的增加(图17)，处于sub-G0/G1期的细胞是一种凋亡指示。然而，上述肿瘤细胞系间的凋亡细胞数目(5-18％)不相同。相反，与PBS处理的细胞相比时，以Ad-mda7或Ad-luc处理的正常细胞(PrEC)未显示处于sub-G0/G1期细胞数目的显著变化。为进一步确证这些结果，细胞感染后72h以Hoechst 33258染色，以Ad-mda7处理的肿瘤细胞而非正常细胞显示出凝缩的和片段化的细胞核，这是凋亡的信号。以Ad-luc处理的任何对照细胞中未观察到变化。这些结果表明，MDA-7可通过诱导凋亡选择性抑制肿瘤细胞但不抑制正常细胞。
4.MDA-7过表达诱导细胞周期停滞于G2期
为了检测MDA-7是否可诱导前列腺癌细胞停滞于G2/M细胞周期，如以前对人肺癌细胞系、乳腺癌细胞系和黑素瘤细胞系的研究中报道的(Saeki等，2000；Mhashilkar等，2001；Lebedeva等，2002)，通过流式细胞计量术分析细胞周期阶段。细胞周期分析显示，与以Ad-luc或PBS处理的肿瘤细胞比较，以Ad-mda7处理后72h时，处于G2/M期的肿瘤细胞数目有所增加(图18)。与肿瘤细胞不同，与对照细胞比较，以Ad-mda7处理的正常细胞未显示处于G2/M期的细胞数目的显著增加。这些结果表明，MDA-7可能选择性地作用于肿瘤细胞。此外，有丝分裂指数分析证明MDA-7在肿瘤细胞中诱导G2但不诱导M期停滞(图18)。
5.MDA-7调节前列腺癌细胞中的细胞内信号途径导致凋亡性细胞死亡
然后评价了可能参与MDA-7诱导前列腺肿瘤细胞(DU 145 and LNCaP)凋亡的细胞内信号途径。与以PBS和Ad-luc处理的细胞比较，以Ad-mda7处理的DU145和LNCaP细胞中都观察到了Stat1(pSTAT-1)和JNK(pJNK)磷酸化形式的增加。相反，以Ad-mda7处理的二肿瘤细胞系中都观察到了STAT-3(pSTAT-3)和NFkB磷酸化形式的减少。在两个肿瘤细胞系间观察到的唯一区别是JAK1和Tyk2的表达。在DU 145细胞中，与对照细胞比较，Ad-mda7处理导致pJAK1表达降低pTyk2表达升高。相反，在LNCaP细胞中Ad-mda7处理导致pJAK1表达升高pTyk2表达降低，表明两个细胞系中信号传导的启动可能不同。
对下游靶点，称为胱冬酶的进一步分析显示，DU 145和LNCaP细胞Ad-mda7处理后72h时，胱冬酶-9，胱冬酶-3，和PARP活化。这些结果表明，Ad-mda7可调节前列腺癌细胞的细胞内信号途径，通过胱冬酶级联反应导致诱导凋亡。
6.MDA-7的G2细胞周期停滞与Cdc25C下调有关
为了研究MDA-7在前列腺癌细胞中显著诱导停滞于G2的机制，通过Western印迹分析检测与G1/S和G2/M细胞周期检查点相关的蛋白质。Ad-mda7处理的DU 145和LNCaP细胞显示出磷酸化和非磷酸化的Cdc25C表达下降，Chk1和Chk2以及与G2/M期相关的细胞周期蛋白B1蛋白质表达下降。以PBS或Ad-luc处理的细胞中未观察到这些蛋白质的显著变化。Cdc2检查显示了以Ad-mda7处理的LNCaP细胞中Cdc2表达的轻微下降，但在DU 145细胞中不下降。此外，观察到以Ad-mda7处理的两个细胞系中细胞周期蛋白A而非细胞周期蛋白E减少。与MDA-7调控的G1/S和/或r G2/M细胞-周期检测点相关的其它蛋白质的检查，显示LNCaP细胞中p27和p21表达增加，但在DU 145细胞中不增加。因为在p53突变DU 145细胞中未观察到p27和p21表达变化，所以这二蛋白质在p53基因野生型的LNCaP细胞中的表达增加可能是由于p53表达的增强。这些结果表明MDA-7通过下调G2/M相关蛋白质诱导G2细胞周期停滞，与如上所述细胞周期分析一致。
实施例15：AD-MDA7放射致敏癌细胞
材料和方法
1.细胞培养，载体和化学品
人NSCLC细胞系，A549(wt-p53/wt-Rb)和H1299(del-p53/wt-Rb)，和正常人肺成纤维细胞系(NHLF)，CCD-16和MRC-9得自美国典型培养物收集中心(ATCC)。所有细胞系都按ATCC的说明来维持。
将含有CMV启动子的重组腺病毒载体(Ad-mda7)，野生型mda-7cDNA，和小基因盒中的SV40聚腺苷酸信号插入经修饰的Ad5的E1-缺失区。腺病毒介导的荧光素酶(Ad-Luc)用作对照载体。以前已所述过这些载体(Mhashilkar等，2001)。检测制品并确定其不含可复制型腺病毒和支原体。姜黄素和噻氨酯哒唑购自Sigma-Aldrich(Poole，UK)。在试验当天将姜黄素溶于乙醇新鲜制备姜黄素贮液(10mM)。模拟处理的细胞接受同样浓度的乙醇。然后将其以10μM浓度稀释入培养基。将噻氨酯哒唑化合物溶于DMSO制备噻氨酯哒唑贮液(5mg/ml)。然后将其稀释入培养基(200ng/ml)。
2.基因输送
将2×105细胞接种于T25烧瓶中进行所有细胞系的体外转染研究。接种后48小时，将细胞在1ml无血清的培养基中与纯化的载体孵育1小时。1小时后，将含有10％FBS的新鲜培养基加入烧瓶。不含血清的培养基用于模拟转染。细胞再孵育48小时，然后建立存活曲线。
3.照射和克隆试验
在室温T25烧瓶中以高剂量比率137Cs单位(3.7Gy/分钟)照射细胞。载体处理48小时后进行照射。用克隆试验检测处理的效果。简言之，如上所述在T25烧瓶中处理单层的A549，H1299，CCD-16，和MRC-9细胞，各种放射剂量照射后，将细胞胰蛋白酶解并计数。然后将已知数目的细胞转入100mm培养皿中并返回到孵育箱中使其产生肉眼可见的集落。10-14天后计数集落，根据以模拟感染、Ad-Luc或Ad-mda7处理的未照射细胞的存活数来计算给定处理后接种效率百分数和存活组分的百分比。将所用处理载体调整到各细胞系在接种效率产生与Ad-mda7同样的下降，即80％。因此，所用载体浓度对于A549是1000vp/细胞，对于H1299是250vp/细胞，对于CCD-16和MRC-9细胞是1500vp/细胞。这些处理产生接近100％的转染效率。一些对于A549细胞的实验采用了不同批的Ad-mda7载体，需要2000vp/细胞才能获得相同的转染效率。
4.凋亡指数和细胞周期分析
用APO-BRDUTM试剂盒(Pharmingen，San Diego，CA)通过流式细胞计量术定量凋亡。简言之，将2×106细胞以PBS配的1％多聚甲醛室温固定15分钟，以PBS洗涤两次，-20℃储存于70％乙醇。将细胞在DNA标记溶液中室温孵育过夜用于分析。加入荧光标记的抗-BrdU抗体溶液室温黑暗下孵育细胞30分钟。用EPICS流式细胞计量仪(Coulter Corp.，Hialeah，FL)通过流式细胞计量分析染色的细胞。所有步骤都按厂商建议进行。根据阴性对照设置了一个分析区，计算该区标记细胞的百分数。
以5Gy照射后2天或感染后4天分析凋亡诱导。这个时间段是根据最大凋亡反应时间的初步结果确定的。如上所述，在照射前48小时以Ad-mda7或Ad-Luc感染。
5.Western分析
简言之，将细胞从板上刮下，以PBS洗涤，在细胞裂解缓冲液中裂解。将30毫克蛋白质在8％(pRb)，12％(细胞周期蛋白B1，p-c-Jun，Fas，Bax和p53)，或15％(MDA-7)SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离并转移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore，Bedford，MA)。pRb，细胞周期蛋白B1(Pharmingen，San Diego，CA)，p53(DAKO，Carpinteria，CA)，Fas(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)的小鼠单克隆抗体和Bax(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)，MDA-7(Introgen TherapeuticsInc.，Houston，TX)，JNK-1(Promega，Madison，WI)的兔多克隆抗体用作第一抗体。p-c-Jun的初级抗体，对丝氨酸-63位磷酸化的c-Jun p39有特异性，得自Santa CruzBiotechnology。JNK-1的第一抗体检测胁迫激活蛋白质激酶(SAPK)也称为c-Jun N末端激酶，JNK的磷酸化活性形式。根据厂商说明，用ECLTM western印迹检测试剂(Amersham Corp，Arlington Heights，IL)通过化学发光增强膜。将加于各泳道的总细胞蛋白质调整到与BCA蛋白质试验试剂(Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA)相同的浓度，并以考马斯亮蓝染色方法确证。
结果
1.Ad-mda7增强NSCLC细胞但不增强NHLF细胞系的放射敏感度
检测了Ad-mda7体外感染是否使NSCLC细胞对放射敏感。在两个NSCLC细胞系A549和1299以及两个正常人肺成纤维细胞系(NHLF)CCD-16和MRC-9上进行克隆试验。这些细胞系以Ad-mda7或Ad-Luc(对照载体)感染，48小时后照射。这个48小时的时间段是根据细胞周期分析显示在此时间框中可产生最大G2停滞而确定的(见下)。如图19所示，即使用2Gy临床相关剂量照射，Ad-mda7也可放射致敏两种NSCLC细胞。例如，A549细胞在2Gy时存活百分数从69.8％±3.1降到38.5％±3.2(图19A)，在A549细胞中Ad-mda7加照射，在50％存活水平时计算出的剂量降低因子(DRF)是1.93。H1299细胞在2Gy时存活百分数从78.2％±3.7降到45.7％±4.5(图19B)，H 1299细胞的DRF为2.06。当用相同载体浓度时，对照载体Ad-Luc对A549或H1299细胞无致敏作用。另一方面，在2Gy临床相关剂量时Ad-mda7不放射致敏NHLF细胞系。只以2Gy照射以及照射加Ad-mda7处理的CCD-16细胞存活百分数分别为43.6％±7.0和45.4％±3.4(图19C)，对于MRC-9细胞分别为24.2％±3.4和27.2％±1.6(图19D)。
2.Ad-mda7在NSCLC细胞中但不在正常细胞中诱导凋亡
用TUNEL试验检测凋亡水平(图20)。以模拟感染，单独的5Gy，单独的Ad-Luc，Ad-Luc和5Gy，单独的Ad-mda7，或Ad-mda7和5Gy处理的A549细胞(图20A)，H1299细胞(图20B)，CCD-16细胞(图20C)，和MRC-9(图20D)中的TUNEL阳性细胞数示于图20。与A549细胞中的对照比较，单独的照射导致TUNEL阳性细胞增加11％。这种作用在H1299细胞中较不明显。如预期的，单独的Ad-mda7感染中度地增加了TUNEL标记细胞的比例，在A549细胞中增加到10％，在H1299细胞中增加到18％。然而，Ad-mda7和照射的联用在两种NSCLC细胞系中TUNEI阳性细胞产生了大于叠加的增加，在A549和H1299细胞中分别达到了38％和35％。当用Ad-Luc替代Ad-mda7时，这种照射诱导凋亡的增强不明显。另一方面，与对照比较，以单独Ad-mda7处理的CCD-16(图20C)和MRC-9(图20D)中的TUNEL阳性细胞没有很大的增加，Ad-mda7和5Gy联合处理只轻微增加了NHLF细胞系中TUNEL阳性细胞的比例。
3.Ad-mda7使细胞停滞在细胞周期的G2/M期
以前的一篇报道指出Ad-mda7在NSCLC细胞系中抑制增殖并诱导其停滞在G2/M期(Saeki等，2000)。已证实了这些作用并检测到已知参与细胞周期调控的两种蛋白质pRb和细胞周期蛋白B1的表达。Western印迹分析证明感染后24h内MDA-7蛋白质在A549和H1299细胞中开始表达。因为检测到该蛋白质的糖基化形式，所以出现了多个条带(Wang等，2002；Lebedeva等，2002)。因为在A549和H1299细胞中给予Ad-mda7后MDA-7蛋白质开始表达，2-4天内pRb的表达下降。相反，在A549和H1299细胞中细胞周期蛋白B1的表达在2天内轻微上调，但这种水平A549细胞在3天H1299细胞在4天降到低于对照。这些结果表明Ad-mda7转染后约2天内细胞可能积聚在G2/M期。Ad-mda7处理后第2天A549和H1299细胞的流式细胞计量术分析证实了这一结论(图21)。研究了是否G2/M停滞本身在增强这些细胞的放射敏感性中发挥作用。噻氨酯哒唑，一种可逆性阻抑微管聚合的药物，用于积聚处于G2/M期的A549和H1299细胞。使噻氨酯哒唑(200ng/ml)诱导与Ad-mda7相同程度的G2/M停滞的处理方案是A549细胞4小时，H1299细胞3.5小时。然后用克隆试验测定了以噻氨酯哒唑处理的A549和H1299细胞的放射敏感性，与对照比较。图22所示结果表明G2/M停滞本身，至少与Ad-mda7介导的程度相同，不增强NSCLC细胞的放射敏感性。
4.Ad-mda7增强放射敏感性不依赖于p53，Bax和Fas
分析了以单独照射，单独Ad-mda7，Ad-mda7加照射，Ad-Luc，或Ad-Luc和照射处理后A549和H1299细胞中p53，Bax，和Fas蛋白质的表达。以照射或Ad-mda7处理的A549细胞中p53蛋白质水平显著增加，但以Ad-Luc处理的无显著增加。以放射或Ad-mda7处理的A549细胞中Fas蛋白质表达也有增加，因为这些处理没有增强H1299细胞(不表达p53)中Fas蛋白质的表达，所以这种作用与对野生型p53的依赖相符。另一方面，这些处理在这二细胞系中都不显著改变Bax蛋白质表达。因此，因为A549和H1299细胞同等地被Ad-mda7放射致敏，不论p53，Fas，或Bax都与Ad-mda7引起的放射致敏无关。
5.Ad-mda7增强p-c-Jun蛋白质的表达
已有报道射线诱导的凋亡需要c-Jun N末端激酶(JNK)的活化(Chen等，1996a；Chen等，1996b)。研究了Ad-mda7是否可以激活JNK以及这种激活是否与放射致敏有关。测定了以单独放射，单独Ad-mda7，Ad-mda7加照射，Ad-Luc，或Ad-Luc和照射处理后的A549，H1299和CCD-16细胞系中的Rb，p-c-Jun和JNK-1蛋白质水平。Rb蛋白质表达在以Ad-mda7处理的A549和H1299细胞中显著降低，但在对照载体处理的这些细胞系中无变化。在以Ad-mda7处理的A549和H1299细胞中，p-c-Jun和JNK-1的表达都增强。然而，在CCD-16细胞中，通过Ad-mda7处理，Rb蛋白质表达轻微下降，p-c-Jun和JNK-1的表达未增强。这些结果与Ad-mda7通过激活JNK-1再激活p-c-Jun来介导放射致敏和增强凋亡的可能性一致。
6.姜黄素消除了Ad-mda7介导的放射致敏
已有报道姜黄素，一种使咖喱显黄色的食用色素，可抑制JNK活化(Chen和Tan，1998)。因此，检测了在以单独放射，单独姜黄素，单独Ad-mda7，照射和姜黄素，放射和Ad-mda7，或照射加姜黄素加Ad-mda7处理的A549和H1299细胞中p-c-Jun蛋白质的表达。如单独使用Ad-mda7一样，单独使用姜黄素可增强p-c-Jun表达。在照射和未照射细胞中，姜黄素降低Ad-mda7介导的p-c-Jun活化。为了检测姜黄素是否抑制Ad-mda7介导的放射致敏，发明人用A549和H1299细胞系进行了克隆试验。以Ad-mda7感染细胞，48小时后照射。如图23所示，在两个细胞系中姜黄素消除了Ad-mda7所致的放射致敏。
实施例16：MDA-7蛋白质抗黑素瘤细胞的旁观者作用
用亲和层析从293-mda7细胞纯化得到rhMDA-7(IL-24)蛋白质。根据银染，各批蛋白质的纯度为30％-＞80％。将rhMDA-7蛋白质用于黑素瘤细胞系，用台盼蓝试验检测细胞活力。如图24所示，rhMDA-7蛋白质在黑素瘤细胞中引起剂量依赖性死亡。以rhMDA-7处理黑素瘤细胞导致STAT3的快速激活(通过磷酸化)。抗-MDA-7抗体抑制了黑素瘤细胞中观察到的细胞毒性。图24显示多克隆兔抗-MDA-7和单克隆抗-MDA-7抗体抑制rhMDA-7介导的杀伤，而对照的人IgG无作用。在平行研究中，抗-MDA-7抗体还抑制MDA-7介导的STAT3活化。
还评价了rhMDA-7抗肿瘤活性的机制。以rhMDA-7蛋白质处理黑素瘤细胞，用TUNEL试验测定凋亡。如表4所示，以40ng/ml rhMDA-7处理3天的6个黑素瘤细胞系中有5个在rhMDA-7处理后显示了细胞毒性。这些细胞系还显示凋亡诱导增高。这些新数据表明黑素瘤细胞对于MDA-7蛋白质的直接细胞杀伤作用易感。因此，预期肿瘤细胞的Ad-mda7转导将引起可杀伤邻近细胞的MDA-7蛋白质的活跃分泌。这些研究以纯化的rhMDA-7蛋白质进行。还以293-mda7细胞或对照293细胞的上清处理了黑素瘤细胞。只有293-mda7上清引起细胞杀伤。
                   表4
Figure G04805918X19960403D001131
实施例17：黑素瘤分化相关基因(mda-7)和可诱导一氧化氮合成酶(iNOS)在 人黑素瘤中负相关：黑素瘤细胞中MDA-7调节iNOS的表达
材料和方法
在转移性黑素瘤中mda-7蛋白质表达下降到几乎检测不到的水平。相反，可诱导一氧化氮合成酶(iNOS)的表达在黑素瘤晚期增加，已提议(iNOS)表达可作为该疾病一种可能的预后性标记。因此，这些分子在同一肿瘤中的表达似乎具有相反的特征。推测这些黑素瘤进程分子的相对比率可能决定了在人黑素瘤中肿瘤是进展还是抑制。本研究的第一个目的是测定黑素瘤中MDA-7表达是否与iNOS表达负相关。第二个目的是测定黑素瘤细胞中iNOS表达是否可被MDA-7表达调节。
1.患者样品
本研究中所用肿瘤样品为原代皮肤黑素瘤和从很多不同位点转移的黑素瘤。福尔马林固定，石蜡包埋的黑素瘤肿瘤切片得自M.D.Anderson癌症中心的黑素瘤和皮肤癌中心实验室(Melanoma and Skin Cancer Core Laboratory)
2.细胞培养
转移性黑素瘤细胞系A375和A375.S2得自美国典型培养物收集中心(Rockville，MD)。径向生长期和垂直生长期的黑素瘤细胞系WM35，WM793以及它们侵袭性更强的亚克隆由Dr.Robert Kerbel(Sunnybrook Health ScienceCenter，Toronto，Ontario，Canada)提供。高度转移性黑素瘤细胞系MeWo由Dr.David Menter(M.D.Anderson Cancer Center)提供。本研究所用黑素瘤细胞系维持在添加10％胎牛血清(Life Technologies，Inc.)，100units/ml青霉素，100μg/ml链霉素，2mM L-谷胺酰胺，和HEPES缓冲液(Life Technologies，Inc.)的RPMI1640(Life Technologies，Inc.，Grand Island，NY)中。以1-20ng/ml纯化的MDA-7处理细胞，或以Ad-mda7或对照Ad-luc感染细胞进行体外研究。
3.人MDA-7的纯化
将全长MDA-7cDNA克隆入含有CMV启动子的pCEP4 FLAG载体(Invitrogen，San Diego，CA)中。将该质粒转染入HEK 293细胞，用潮霉素(0.4μg/ml)分离稳定的亚克隆。向含有分泌型MDA-7的上清添加蛋白酶抑制剂(1μg/ml亮抑肽酶，1μg/ml抑肽素，和0.5mM苯甲基磺酰氟)和0.05％叠氮钠，然后以Amicon搅动小室(Amicon，Beverly，MA)在YM1O膜上浓缩10倍。将10ml等份浓缩的上清(1×PBS pH 7.4)在S200 Superdex制备的柱(AmershamPharmacta，Piscataway，NJ)上分离，合并经Western印迹和ELISA鉴定含有MDA-7的部分。在Amicon搅动小室将缓冲液交换成50mM 4-吗啉丙磺酸(morpholinepropanesulfonic acid)(pH 6)后，用Bio-Rad S柱进行第二个纯化步骤。柱子条件由以下组成：0-90-mM NaCl梯度，5分钟保持90mM NaCl，30分钟90-250-mM梯度1ml/min，和5分钟保持250mM NaCl。整个纯化过程在4℃进行。用ELISA和Westem印迹程序鉴定MDA-7。如ELISA所测定的，最终样品含有至少300ng/ml MDA-7。用QCL 1000定量显色LAL试剂盒(BioWhittaker，Walkersville，MD)检测各批次部分纯化MDA-7中的内毒素。
4.基因转移
携带有mda-7基因的复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)得自Introgen Therapeutics(Houston，TX)。将mda-7基因连于内部CMV-IE启动子，后接SV40聚腺苷酸。Ad-Luc和Ad-CMV聚腺苷酸(分别为荧光素酶和空载体)用作对照病毒。在感染前一天接种细胞。以腺病毒载体(Ad-mda7或Ad-luc)用每细胞1000-5000病毒颗粒感染黑素瘤细胞。根据免疫组化染色结果，优化试验条件达到＞70％细胞有MDA-7蛋白质表达。
5.试剂
抗-iNOS小鼠单克隆抗体(Transduction Laboratories，Lexington，KY)用于iNOS免疫组化，并确认其在物种间有交叉反应性。亲和纯化的多克隆兔MDA-7抗体由Introgen Therapeutics提供。IRF-1和IRF-2多克隆抗体购自Santa CruzBiotechnology Inc.(Santa Cruz，CA)。Phospho-Stat1(Tyr701)和Phospho-Stat3(Tyr705)抗体得自Cell Signaling Tech(Beverly，MA)。预免疫正常小鼠IgG(VectorLaboratories，Burlingame，CA)用作阴性对照。抗波形蛋白抗体(BioGenexLaboratories，San Ramon，CA)用作所有黑素瘤染色的阳性对照。
6.免疫组化
在10％福尔马林固定石蜡包埋的黑素瘤组织上进行免疫组化标记，切片4-6μm厚，将切片置于硅烷化载玻片(Histology Control Systems，Glen Head，NY)上，在二甲苯中脱蜡，在浓度递减(从100至85％)的乙醇中再水合。为了增强免疫染色和恢复细胞因子的最大抗原性，将切片置于抗原去封闭溶液中(VectorLaboratories)并间歇地以微波照射多达10分钟以保持沸腾温度。玻片室温冷却30分钟后，以蒸馏水和PBS洗涤。在这种初步始准备以后，将玻片除去PBS以含3％H2O2甲醇(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)覆盖以封闭内源过氧化物酶活性。所有的孵育都在室温下在潮湿的覆盖的玻片室中进行。以PBS洗涤玻片，然后与含有0.05％Triton X-100(Sigma Chemical Co.)的PBS孵育15分钟以渗透细胞。然后用抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物试剂盒(Vectastain；VectorLaboratories)检测染色。将玻片与封闭血清孵育30分钟后，加入各种稀释度(1∶100 to 1∶200)的第一抗体，玻片在室温孵育60分钟。然后洗涤玻片，将其与第二生物素抗体孵育30分钟，再洗涤，然后与抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物试剂孵育30分钟。以PBS洗涤玻片后，用3-氨基-9-乙基咔唑作为chrornagen免疫染色15分钟。以苏木精(Vector Laboratories)将玻片复染并以Aqua-Mount(Lerner Laboratories，Pittsburgh，PA)固定。对于各样品，波形蛋白和同型相配的对照IgG分别作为阳性和阴性第一抗体对照。这些抗体的特异性和灵敏度以前已发表(Ekmekcioglu等，2000；Lebedeva等，2002)。给定患者的所有组织样品都在同一试验中作免疫标记。
7.免疫组化评分
对于一下两种变量分别作免疫标记评分：第一，对于阳性细胞数目，第二，对于阳性细胞免疫反应性的总体强度。阳性细胞数评分按如下确定：(0)＜5％阳性细胞；(1)5-50％阳性细胞；(2)50-90％阳性细胞；最后，(3)＞90％阳性细胞。强度评分按如下确定：(0)不着色；(1)轻微染色；(2)中度染色；和(3)强烈染色。由两个独立的读者解读玻片。
8.免疫印迹试验
将2×106个黑素瘤细胞系用冰冷PBS淋洗两次，以60μl含有5mM EDTA，0.2mM原钒酸盐，10mM NaF，亮抑肽酶，抑肽酶，和苯甲基磺酰氟的裂解缓冲液[25mM Tris，140mM NaCl，和1％NP40(pH 7.5)]冰上裂解10分钟。将等量的总蛋白质(以DC Protein Assay Reagent测定；Bio-Rad Labs，Hercules，CA)加到标准的10％SDS聚丙烯酰胺凝胶上，将分离的蛋白质电渍到硝化纤维膜上。用1×PBS配的5％脱脂奶室温封闭硝化纤维膜1h，室温下在含有0.05％Tween 20的PBS中洗涤3次，每次5分钟。将膜与在1×PBS 10ml 5％脱脂奶/0.1％Tween 20中的IRF-1和IRF-2多克隆抗体1∶2000稀释液在密封袋中4℃孵育过夜。将膜用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤3次，每次5分钟，然后将膜与过氧化物酶耦联的抗兔IgG二抗(Transduction Laboratories)在5％脱脂奶和0.1％Tween 20 PBS配的1∶2000稀释液室温孵育45分钟。用增强型化学发光检测试剂盒观察印迹(Amersham，Arlington Heights，IL)。
9.统计学分析
计算了iNOS和MDA-7变量的平均值和标准差。为了研究iNOS和MDA-7计数及强度检测之间的相关性，用Kendallτ-b检验(Woolson，1987)进行了缺少相关性检验。
结果
1.黑素瘤肿瘤MDA-7表达与肿瘤iNOS表达负相关
为了测定是否在同一肿瘤中MDA-7表达与iNOS表达负相关，发明人进行了连续石蜡包埋的恶性黑素瘤肿瘤切片的免疫组化分析。在这些试验中分析了38个原发性黑素瘤和43个转移病(共81个肿瘤样品)。以抗-MDA-7多克隆抗体和抗-iNOS单克隆抗体免疫染色后，基于阳性细胞和染色强度分析了样品的免疫反应性。MDA-7染色细胞数和iNOS染色细胞数的直接比较显示了负相关。图25A显示了iNOS和MDA-7阳性染色细胞数目的显著负相关(相关系数＝-0.209，P＜0.05，Kendallτ-b检验)。类似地，通过比较染色强度分析了iNOS和MDA-7相关的数据。图25B显示了iNOS和MDA-7强度的负相关(相关系数＝-0.201，P＜0.05，Kendallτ-b检验)，反映了随着MDA-7强度额增加iNOS平均强度显著降低。肿瘤iNOS和MDA-7表达的测定显示了原发性黑素瘤连续切片和其转移瘤连续切片中iNOS和MDA-7表达呈负相关。
一对样品中的原发性黑素瘤肿瘤的MDA-7免疫反应性显示强烈的细胞质免疫标记，而淋巴结转移瘤和脑转移瘤均为阴性。相反，原发性黑素瘤肿瘤缺少iNOS，而淋巴结转移瘤和脑转移瘤免疫标记强烈。
2.Ad-mda7和rhMDA-7下调人黑素瘤细胞系的iNOS表达
免疫组化证明iNOS和MDA-7表达呈负相关，提示了可能的因果关系。因此，发明人进行了一系列体外试验以检测MDA-7是否可能调节iNOS表达。首先，发明人以Ad-mda-7(每细胞500，1000，和2000病毒颗粒)或以Ad-luc(每细胞1000病毒颗粒)感染黑素瘤细胞系A375，MeWo，WM35，和WM793。在基线上，这些黑素瘤细胞表达高水平的iNOS，而MDA-7为阴性。载体处理48h后，收集细胞，制备cytospins以分析iNOS表达。至48h每细胞用1000和2000病毒颗粒的Ad-mda7处理的细胞完全下调了iNOS表达，而Ad-luc感染无作用。在这个短暂的孵育过程中，抑制iNOS表达的Ad-mda7载体剂量似乎不导致显著的细胞死亡。这些试验结果表明在黑素瘤细胞中该基因的转移表达特异性阻抑iNOS表达。以前已证明MDA-7是由Ad-mda7感染的黑素瘤细胞分泌的(Lebedova等，2002；Mhashilkar等，2001)。为了说明是否分泌型MDA-7可能参与iNOS的调节，发明人将黑素瘤细胞与0，5，或20ng/ml rhMDA-7一起孵育，染色检测iNOS表达。至48h，20mg/ml浓度的rhMDA-7导致A375黑素瘤细胞iNOS表达完全下调。
3.MDA-7调节黑素瘤细胞中IRF-1和IRF-2的表达
黑素瘤细胞的rh-MDA-7蛋白质处理导致iNOS表达的强烈下调，提示MDA-7可能通过受体介导的途径发挥功能。最近已证明MDA-7可结合并通过IL-20和受体进行信号转导。因此，发明人预计IL-20和/或1L-22受体信号转导途径(均为参与STAT活化的II类细胞因子受体)在暴露于MDA-7的黑素瘤细胞中被活化。起初对于STAT1和STAT3磷酸化的研究是通过对rhMDA-7孵育的黑素瘤样品进行免疫组化标记分析。虽然未观察到STAT1磷酸化的改变，但与未处理细胞比较，持续地检测到MDA-7处理的MeWo细胞中的STAT3上调。在黑素瘤细胞系A375，WM35和A375.S2以及健康献血者得来的外周血单核细胞中也观察到了类似的发现。首先在20ng/ml rhMDA-7处理的MeWo细胞的细胞质中观察到STAT3表达增加。此外，在免疫组化标记研究中，rhMDA7处理的黑素瘤细胞的细胞核中观察到磷酸-STAT3的染色。
4.MDA-7调节黑素瘤细胞中IRF-1和IRF-2的表达
在暴露于MDA-7后发现诱导STAT-3磷酸化的基础上，进一步检测STAT蛋白质的下游靶点。这些靶点中的两个，IRF-1和IRF-2，肿瘤细胞中它们的活化是相互对抗的。需注意的是，IRF-1诱导iNOS基因表达(Saura等，1999；Dell’Albani等，2001)。为了研究连接MDA-7信号转导和iNOS表达的可能分子途径，检测了rhMDA-7处理后黑素瘤细胞中的IRF1和IRF2的表达。rhMDA-7处理的细胞裂解物中的IRFl和IRF2分子的免疫印迹表明了4h内IRF-2表达的上调。另一方面，通过以rhMDA-7处理MeWo细胞，4h内IRF-1表达被显著降低(图26)。虽然因为样品数小，差别未达到显著性，但IRF-1表达几乎降低了4倍，而IRF-2表达增加了4.7倍。
实施例18：AD-MDA7增加它莫西芬的抗肿瘤功效
用递增MOIs(0-1000vp/细胞)的Ad-载体和递增浓度的它莫西芬(0-2μg/ml)同时处理T47D细胞。处理后4天，用氚标记-胸苷掺入试验分析细胞增殖。图27显示Ad-mda7增强它莫西芬的抗肿瘤效果。
实施例19：MDA-7在内皮细胞中激活STAT3
在室载玻片中以10-20ng纯化的MDA-7处理HUVEC细胞(1000细胞/小室)。MDA-7是亲和纯化的MDA-7。4h后洗涤细胞并与兔抗-p-Stat3抗体(CellSignaling，1∶1000稀释液)4℃孵育1-2小时。然后细胞以PBS洗涤3次，并用二抗，德克萨斯-红耦联的抗-兔-IgG(1∶1000稀释液)处理。洗涤细胞然后通过荧光显微镜分析pStat3细胞核染色。结果显示MDA-7激活内皮细胞的Stat3。用天然293-MDA-7得到了类似结果。细胞同时以Hoescht染料染色观察细胞核。
实施例20：AD-MDA7和MDA-7蛋白质调节黑素瘤细胞细胞因子分泌
图28显示了Ad-mda7或MDA-7蛋白质处理的黑素瘤细胞的细胞因子诱导比较的结果。
实施例21：AD-MDA7对A549肺转移瘤的作用
将A549肺癌细胞静脉注射入裸鼠中以建立肺转移病变。将Ad载体(Ad-空(Ad-EV)；Ad-luc，Ad-p53，和Ad-mda7)与鱼精蛋白复合静脉注射入裸鼠中，检测肺中的肿瘤负荷。结果示于图29。
实施例22：MDA-7选择性抑制血管平滑肌细胞生长和迁移
材料和方法
1.细胞培养和细胞计数
在37℃，5％CO2，添加10％FBS的DMEM(GIBCO/BRL，Life Technologies)中维持PAC-1SMC。所用PAC1是70-85代的细胞。通过0.1％FBS使PAC1细胞生长停滞至少24小时。利用正常大鼠主动脉平滑肌细胞(RASMC)10-20代的细胞。原代人冠状动脉SMC(HCASMC)得自一个厂商，在SmGM-2培养基(Clonetics，San Diego，CA)中生长，用其5-10代的细胞。在所示时间点以血球计(Fisher)手工计数活细胞(重复3次)检测病毒转导后的细胞存活。
2.台盼蓝排斥
用台盼蓝排斥测定细胞活力。简言之，全部细胞(悬液胰蛋白酶化)与台盼蓝溶液(Gibco-BRL)1∶1混合，然后通过光学显微镜在血球计下观察。计数蓝色细胞(死细胞)百分数(3-5个视野的平均数)。
3.腺病毒转导
指导人mda-7(Ad-mda7)或荧光素酶(Ad-Luc)表达的(Mhashilkar等，2001)重组复制缺陷型腺病毒，Ad-RSV-β-gal和Ad-SM22-β-gal已有所述(Kim等，1997)。PAC-1SMC在完全培养基的6孔板或100mm皿中生长。当细胞50％-90％汇合时，将培养基换为含有2％FBS的DMEM，如果需要，将储存的病毒制品用上述培养基稀释以所示感染复数(MOI；pfu/细胞)与细胞单层一起孵育。37℃每10分钟手摇使病毒吸附1小时后，将完全培养基添加于转导的培养物，细胞在37℃以所示时间孵育。作为有些试验中的对照，留下一组相同的细胞不转导但在含有2％FBS的DMEM中每10分钟摇动孵育1小时。如所述进行X-gal组化分析(Kim等，1997)。
4.Northern印迹
用酸性酚提取方法(Chomczynski and Sacchi，1987)从病毒转导的PAC1细胞中分离总RNA。将10μg总RNA在含有甲醛的1.2％琼脂糖中电泳，转移到尼龙膜(Zeta Probe，BioRad Laboratory)上，与32P标记的人mda-7cDNA片段杂交。杂交后，洗涤尼龙膜并将其暴光胶片作放射自显影。还用GAPDH探针与剥离的膜杂交以检测作为同等上样量对照的GAPDH mRNA。
5.Western印迹
试验处理后，以裂解缓冲液收获PAC1。然后将细胞裂解物超声波处理，4℃14,000×g离心15分钟。将上清转移，用Bio-Rad蛋白质试剂盒测定样品中的蛋白质浓度。在有些试验中，在裂解细胞前，还收集条件培养基以分析蛋白质分泌。将30-50μg细胞蛋白质或10-20μl条件培养基在10-12％SDS-PAGE上分离，转移到固定剂-P膜(Millipore)。以蛋白质特异性抗血清MDA-7抗体(1∶1000，Introgen Therapeutics，Houston，TX)和其它凋亡抗体(BAK，BAX，BCL-2，BCL-xL，1∶1000，Santa Cruz，CA)探测膜。用兔抗人pSTAT-3抗体(1∶1000，CellSignalling Technology，Beverly，MA)检测pSTAT-3蛋白质。用抗-β-微管蛋白抗体测定同等的蛋白质加样量。用碱性磷酸酶耦联的物种特异性IgG和增强型化学发光(PIERCE)验证经免疫学鉴定的蛋白质。
6.凋亡分析
用ApoAlert Annexin V-FITC试剂盒(CLONTECH)分析PAC1细胞凋亡。简言之，通过胰蛋白酶化收获病毒转导的细胞，以PBS和结合缓冲液充分洗涤。然后将细胞与用结合缓冲液稀释的Annexin V-FITC试剂室温黑暗下孵育30分钟，每隔10分钟摇动一次。以PBS洗涤细胞2次，进行FACS分析。还用DAPI染色试验分析了PAC1细胞凋亡。简言之，各时间点的病毒转导的细胞以PBS洗涤，在4％多聚甲醛中固定，与PBS稀释的300nM DAPI室温孵育1-4分钟。然后以PBS洗涤细胞，通过荧光显微镜观察，如前所述(Dimmeler等，1997)，通过细胞核分析测定凋亡细胞表示为在总计400个细胞核中凋亡细胞核数目x 100％。根据厂商说明，用Apo-ONETM Homogeneous胱冬酶-3/7试验试剂盒(Promega，Madison，WI)分析PAC1细胞的胱冬酶-3活性。简言之，通过冻融2次然后4℃13,500rpm离心15分钟用低渗缓冲液(25mM HEPES，PH 7.5，5mM MgCl，5mM EDTA，5mM DTT，2mM PMSF，10μg/mL抑肽素，10μg/mL亮抑肽酶)裂解病毒转导的细胞。将上清转移到新管进行活性分析。用NHE缓冲液收获另外一组实验细胞作总蛋白质定量。对于各反应，在存在或不存在150nM胱冬酶-3抑制剂(Ac-DEVD-CHO)时用25μL细胞裂解物与25μL HomogeneousCaspase 3/7 Reagent(用缓冲液稀释的底物)室温孵育4小时，持续摇动。在荧光板读数仪中以激发波长485nm和发射波长535nm检测荧光。通过总蛋白质将测定的荧光标准化进行胱冬酶3活性分析，表示为单位/10μg总蛋白质。
7.流式细胞计量术
通过流式细胞计量术评估病毒转导后的细胞凋亡和细胞表面的整联蛋白表达。通过胰蛋白酶化收获病毒转导的PAC1细胞，以PBS洗涤，冷70％乙醇固定12小时。将细胞离心，以PBS洗涤两次，重悬于PBS，然后与终浓度50μg/mL的碘化丙锭(PI)和20μg/mL RNAse室温孵育。留下作为对照的一组相同细胞不转导但如上所述进行同样的处理。然后用FACSCalibur流式细胞计量仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)通过FACS分析评价105个细胞/mL PBS悬液处理的细胞。用Modfit凋亡分析程序(Becton Dickinson，San Jose，CA)测定细胞凋亡百分数。以3个不同细胞群体进行了3个独立试验。如所述(Li等，2001)，还进行了流式细胞计量分析评价细胞表面的整联蛋白表达。
8.细胞迁移分析
如所述(Huang and Kontos，2002)利用刮伤试验测定PAC1细胞的迁移率。简言之，在60mm板中培养PAC1细胞直到90％汇合，然后以病毒转导24小时或留置不转导。24小时饥饿后，以无菌移液管头破坏细胞单层以产生无细胞区域。然后将细胞以或不以10％PBS处理。处理后24小时，在与照相机连接的OlympusIX-70显微镜下观察细胞。通过以手工设定的标尺测定3个不同位置的无细胞区的宽度(受损单层边缘间的距离)，定量测定PAC1细胞的迁移。
9.STAT-3活化
将细胞接种在室载玻片中以MDA-7蛋白质处理60分钟，然后以PBS(3×)彻底洗涤。将细胞以甲醇∶乙酸(95∶5 vol∶vol)固定并以抗-pStat3单克隆抗体(1∶1000稀释；Cell Signalling)4℃染色1h。然后以PBS洗涤细胞3次，用二抗(1∶1000稀释；得克萨斯红-耦联的-兔抗小鼠IgG；Sigma)4℃处理1h。然后洗涤细胞，在荧光显微镜下检查。
10.统计学分析
所有数值都表示为平均值±标准差(SEM)。除图30代表2次重复外，所有图表数据都代表至少3个独立试验。试验差别显著性检验通过ANOVA或斯氏t检验进行。显著性设为p＜0.05。
结果
1.PAC1 SMC的鉴定
将PAC1细胞从大鼠肺部动脉平滑肌细胞(SMC)中分离，根据通过多次亚培养该细胞的分化特性维持稳定而使其衍生(Rothman等，1986；Firulli等，1998)。本研究所用细胞是从一个独立克隆多次传代(在70-85代使用)。以前的研究已证实，因为PAC1表达多种不同的SMC特异性标记并表现对不同生理刺激的功能性反应，因此PAC1可作为SMC分化的很好的模型(见表5)(Firulli等，1998；Rothman等，1994)。PAC1细胞表达与正常大鼠主动脉平滑肌细胞(RASMC)SMC标记的类似互补物，而这些标记一般在L6骨骼成肌细胞或正常人脐血管内皮(HUVEC)中不表达(见表5)。
首先评价了腺病毒在PAC1 SMC中的转导效率。如图30所示，用50pfu/细胞MOI Ad-RSV-β-gal转导PAC1 SMC，产生约60％β-ga阳性细胞(图30)。为了进一步确定PAC1细胞的SMC表型，以Ad-SM22-β-gal，含有驱动β-半乳糖苷酶表达的平滑肌特异性启动子(SM22α)的载体(Kim等，1997)转导PAC1细胞。将PAC1细胞与可高度转导的肺癌细胞系比较。用Ad-RSV-β-gal作为对照载体，以类似于PAC1细胞的效率转导H1299 NSCLC细胞。然而，以Ad-SM22-β-gal处理后，PAC1细胞被转导的效率高于H1299细胞10倍(图30)。在其它肿瘤细胞中也发现了较低的β-gal表达，表明是PAC1细胞的SMC谱系。以Ad-mda7转导还导致转基因蛋白质的高水平表达。通过分析参与腺病毒转导的细胞表面分子进一步评价PAC1细胞的有效转导。通过FACS分析表明PAC1细胞在细胞表面高水平表达CAR和αv整联蛋白。
                           表5
Figure G04805918X19960403D001231
2.Ad-mda7转导的PAC1 SMC中人MDA-7的表达
在完全培养基中培养的PAC1中未检测到内源mda-7mRNA。然而，Ad-mda7转导的PAC1中发现了mda-7mRNA和MDA-7蛋白质，在对照病毒处理的细胞中未检测到mda-7mRNA或蛋白质。在条件培养基中检测到MDA-7蛋白质，表明Ad-mda7转导的PAC1分泌可溶性MDA-7蛋白质。这一发现与以前在Ad-mda7转导的人肿瘤细胞系中的研究(Mhashilkar等，2001)一致。MDA-7以比细胞内形式更大的蛋白质从PAC1细胞分泌，说明发生了一些翻译后修饰(例如糖基化)，与以前用人肿瘤细胞系所做的研究(Mhashilkar等，2001)一致。分泌型MDA-7蛋白质水平的分析表明以100pfu/细胞(MOI)Ad-mda7转导3天后PAC1细胞蛋白质分泌有暂时增加。在以递增MOI的Ad-mda7转导PAC1细胞的条件培养基和细胞裂解物中也观察到MDA-7蛋白质剂量依赖性增加。这些研究确定了实现PAC1 SMC中MDA-7表达大量增加的可行性。
3.异常MDA-7表达抑制PAC1 SMC生长
接下来研究了mda-7的增强表达是否对PAC1细胞生长有抑制作用。以0，40，100，和200MOI Ad-mda7或Ad-Luc转导PAC1 SMC，转导后3天计数活细胞数。图31显示了一个代表性研究。与Ad-Luc转导的细胞比较，Ad-mda7转导的PAC1SMC显示出活细胞数显著较低。在100MOI(与Ad-Luc比较p＝0.02)观察到mda-7表达对PAC1细胞生长的最大抑制作用；在更高MOI时，Ad-Luc显示毒性。因此，所有后续试验都用100MOI Ad-mda7。
4.MDA-7表达增强PAC1 SMC凋亡
以前的研究证实Ad-mda7在各种衍生于乳腺、结肠和肺的人肿瘤细胞系中诱导凋亡(Mhashilkar等，2001；Saeki等，2002)。MDA-7对PAC1细胞生长的抑制可能部分是由凋亡的增加介导。最初的研究是测定胱冬酶-3的活性，该酶是胱冬酶(caspase)家族的成员，在哺乳动物细胞凋亡中起效应器作用(Nicholson等，1995)。与未处理或Ad-Luc处理的细胞比较，Ad-mda7处理的PAC1细胞中观察到胱冬酶3活性的显著增加(与Ad-Luc比较p＜0.05)(图32A)。胱冬酶-3活性是由胱冬酶-3抑制剂(Ac-DEVD-CHO)特异性抑制的。这些发现表明mda-7的过表达激活胱冬酶3并促进PAC1细胞凋亡。
为了定量MDA-7表达对PAC1 SMC的凋亡作用，接下来发明人用Annexin V染色结合FACS分析，检查细胞表面存在的磷脂和磷脂丝氨酸(PS)以作为早期凋亡的一种衡量。与对照Ad-Luc转导的细胞比较，在早至转导后24小时Ad-mda7处理就导致了凋亡PAC1 SMC细胞数目的显著增加(p＜0.05)(图32B)。进行DAPI染色试验通过分析细胞核凝集和破裂来定量Ad-mda7对晚期凋亡的作用。与对照病毒比较，在各时间点Ad-mda7转导导致凋亡细胞数目的显著增加(p＜0.05)(图32C)。在另一个独立的凋亡检测中，发明人注意到Ad-mda7处理的细胞显示出处于细胞周期sub G0/G1期细胞数目的极大增加。综合这些发现，表明凋亡的增加可能归因于Ad-mda7对PAC1 SMC生长的抑制。
以前的研究说明BAX，BAK的水平以及BAX和BCL-2蛋白质比率的变化可能是mda-7诱导癌细胞凋亡的重要介质(Lebedeva等，2002；Su等，1998；Madireddi等，2000)。为了确定这些凋亡相关分子是否通过PAC1细胞中异位mda-7介导了细胞程序性死亡，Ad-mda7转导后6-72小时通过Western印迹分析检测各种蛋白质水平。100MOI Ad-mda7转导后72小时，PAC1 SMC中发生了促调亡(BAK，BAX)蛋白质的上调，虽然在早至24hr BAK蛋白质便有增加。Ad-Luc处理72小时未显示蛋白质水平的变化。相反，100MOI Ad-mda7转导后72小时的PAC1细胞中抗凋亡(BCL-2)蛋白质表达下降，而BCL-xL蛋白质只有轻微改变。这些结果表明，Ad-mda7转导所致的促调亡(BAK，BAX)蛋白质和抗凋亡(BCL-2，BCL-xL)蛋白质水平的增加，可能引发PAC1细胞中的后期凋亡。注意到Ad-mda7处理24小时内凋亡是可检测到的(图32B，and 32C)，与BAK水平的增加相符，但与BAX不相符。因此，BAK促调亡蛋白质可能是PAC1细胞凋亡的引发剂。
5.MDA-7抑制PAC1 SMC迁移
细胞迁移是血管病理学中neointima发展中的另一个关键过程。为了研究是否mda-7表达改变PAC1 SMC迁移，检测刮伤单层后腺病毒转导或不转导的PAC1 SMC的迁移。血清刺激显著增加了PAC1向创伤处的迁移。相反，100MOImda-7过表达显著抑制了基础的(p＜0.05)和FBS刺激(p＜0.01)的PAC1细胞迁移(图33)。因此mda-7甚至可在缺少血清刺激时阻抑迁移。
6.Ad-mda7不抑制正常SMC细胞生长
以不同MOIs的Ad-mda7或Ad-luc转导原代人冠状动脉SMC(HCASMC；5-10代)和正常大鼠主动脉SMC(RASMC；10-20代)。Western印迹分析表明MDA-7蛋白质以与PAC1 SMC中观察到的同等的水平在细胞内产生，也从正常类型的SMC分泌。正常SMC或Ad-Luc处理后不内源表达MDA-7。以100MOIAd-mda7转导后HCASMC和RASMC中表达与PAC1细胞中相似水平的MDA-7蛋白质。然而，细胞存活研究说明Ad-mda7处理HCASMC或RASMC后无细胞活力损失。用细胞周期分析作为凋亡诱导的独立试验，观察到了类似的结果(见表6)。100MOI Ad-mda7处理24小时后只有PAC1 SMC显示了sub G0/G1期细胞的增加。因此在大鼠PAC1 SMC中观察到的细胞生长抑制和凋亡诱导，在正常大鼠SMC或原代人SMC中观察不到。
为了了解PAC1细胞和正常大鼠和人SMC中mda-7过表达的活性差别，评价了本研究所用PAC1细胞的染色体伸展。70-85代的PAC1细胞染色体组型分析显示与早期PAC1或RASMC染色体组型报道(Firulli等，1998)比较时染色体条带存在基本差别。具体说，PAC1细胞显示了20个三体性，产生更长p臂的11号染色体发生易位，以及一个额外的未知起源的标志染色体。因此，对MDA-7介导的细胞死亡易感的PAC1细胞株中存在着实质性染色体异常。
                                表6
7.MDA-7通过细胞内途径影响细胞死亡
为了测定Ad-mda7在PAC1 SMC中诱导的选择性死亡是否由表面受体介导的过程所致或通过一些细胞内途径，重组MDA-7(rMDA-7)刺激PAC1 SMC和RASMC后测定细胞死亡和STAT-3活化(一种MDA-7/IL-24受体激活的测定)。rMDA-7刺激的PAC1 SMC中未观察到细胞死亡的统计学显著增加。与该发现一致的是未能显示这些细胞中STAT-3活化的任何证据。这些结果表明在PAC1SMC中Ad-mda7通过细胞内机制介导选择性细胞死亡。
实施例23：与Ad-MDA7给药和表达相关的临床试验结果和信息
材料和方法
1.患者标准
组织学确定的癌，至少有一个注射针可达到的可手术切除的病灶(I期患者)，Karnofsky行为状态≥70％，可接受的hemotologic，肾和肝功能。患者没有活跃的CNS转移，长期采用免疫抑制剂，或之前接受过需要给予腺病毒的治疗。
2.定量PCR，RT-PCR
用基于TaqManTM的试验检测样品。该试验检测到109nt的扩增子，位于CMV启动子的3’区和mda-7基因的5’区之间。该试验特异性检测DNA或RNA中的INGN 241(Ad-MDA-7如美国专利申请Nos.09/615,154，10/017,472，和10/378,590所述，引入本文作为参考)。
3.免疫组化分析
按TUNEL反应(Deadend Colorimetric Apoptosis Detection System，Promega)分析了INGN 241注射肿瘤连续切片的凋亡活性。
4.MDA-7蛋白质
通过自动化IHC用Introgen Therapeutics提供的mda-7反应性兔抗体(Ab506-71)分析INGN 241注射的肿瘤连续切片。
结果
进行了INGN 241公开性标记的I期单剂量剂量递增的研究，通过瘤内注射将INGN 241给予晚期癌症患者。进行了评价，关注INGN 241载体的扩散半径以及其在瘤块内产生的蛋白质和生物效果。
通过在给予的产品中包括一种染料来标记参考注射点。
还以最佳剂量进行了2期试验，测定局部肿瘤衰退和可能的远距离效应。
如图34所示，分组给予不同浓度和时间长短的INGN 241。病毒浓度为每次给药2×1010，2×1011，或2×1012病毒颗粒(vp)。末次注射24小时后，收获肿瘤并切片。一面进行免疫组化而另一面进行RT-PCR以评价RNA和DNA浓度。在一个5cm×5cm病灶给药2×1012vp的患者中，检测到中央切片(离注射点约6mm内)含有4.7×108拷贝MDA-7DNA/μg和5.6×107拷贝MDA-7RNA/μg。离注射点约6mm的切片含有1.2×106拷贝MDA-7DNA/μg和4.6×107拷贝MDA-7RNA/μg。离注射点约12mm的切片含有约1.1×106拷贝MDA-7DNA/μg和5.0×103拷贝MDA-7RNA/μg。而离注射点18mm的切片含有约1.9×105拷贝MDA-7DNA/μg和9.8×103拷贝MDA-7RNA/μg。离注射点约12mm的切片的免疫染色和TUNEL分析说明MDA-7表达与凋亡区域共定位。也见图35。
检测了另外一个黑素瘤患者MDA-7DNA，RNA和蛋白质距注射点距离的表达水平。见图36。分析了多个患者的表达水平(图37)，表达水平和凋亡相关联(图38)。
还测定和评估了MDA-7的扩散以及它对凋亡的作用(图39)。
注射后第1天，第2天，第4天和第30天进行DNA浓度的时间评估(图40)。类似地，还作了蛋白质表达及其与凋亡相关性的时间评估(图41)。观察到了MDA-7蛋白质表达呈时间依赖性增加以及凋亡细胞的显著增加与距注射点的距离显著相关。在载体DNA检测点之外可检测到MDA-7蛋白质和凋亡，说明有可扩散的活性产物。至96小时，瘤内INGN 241DNA水平逐渐降低；第30天观察到4log的降低(中等)。注射后30天，检测不到MDA-7蛋白质表达和凋亡活性。
2期临床研究中，在各种肿瘤类型中将INGN 241一次给药与多次给药(每2星期2×1012vp，共3次)相比较(图42)。
瘤内反复注射的INGN 241在给予6次2×1012vp INGN 241瘤内注射的黑素瘤患者中产生了客观的肿瘤退化。
副作用示于图41。总体来说，研究表明INGN 241瘤内注射有很好的耐受性。
实施例24：MDA-7诱导NF-κB；苏灵大增强AD-MDA7介导的人肺癌中的
                           凋亡
材料和方法
1.细胞系和细胞培养
在有些试验中采用人NSCLC细胞系A549(腺癌，p53野生型)和H1299(大细胞癌，p53无义表型)。正常肺成纤维细胞系CCD-16得自美国典型培养物收集中心(ATCC；Rockville，MD)。如前所述(5)，在合适的培养基中维持A549和H1299细胞。CCD-16细胞在添加了10％胎牛血清(Gibco-BRL，Grand Island，NY)的α培养基中培养，在37℃潮湿的5％CO2加95％空气的环境中维持。
2.试剂
苏灵大，苏灵大砜，MG132(蛋白酶抑制剂)，和放线菌酮(蛋白质合成抑制剂)得自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。将苏灵大溶于1M Tris-HCl，pH8.0，中制成100mM贮液。将MG132溶于DMSO制成10mM贮液。这些贮液-20℃冷冻储存。
3.重组腺病毒载体
如前所述(Saeki等，2000；Mhashilkar等，2001)构建和纯化Ad-mda7和Ad-luc载体。以携带有GFP(Ad-GFP)的腺病毒载体测定细胞系的转导效率。当以3000vp/细胞感染时，转导效率大于80％。根据此结果，在所有后续试验中以3000vp/细胞处理细胞。
为了检测苏灵大对腺病毒转导的作用，用Ad-GFP以100vp/细胞感染肿瘤和正常细胞并通过FACS分析24h时GFP表达。
4.细胞增殖试验
将所有3个细胞系(A549，H1299，and CCD-16)以1×105细胞/皿的密度接种于直径60mm的组织培养皿中，设3复孔。第二天，以PBS(对照)，Ad-luc(3000vp/细胞；对照)，Ad-mda7(3000vp/细胞；对照)，苏灵大，或PBS加苏灵大，Ad-1uc和苏灵大，或Ad-mda7和苏灵大处理细胞。试验用的苏灵大浓度是0.125，0.25，和0.5mM。处理开始后72小时，通过胰蛋白酶化收获细胞，洗涤，并如前所述进行台盼蓝排斥试验(Saeki等，2000)。通过计算各组细胞数的平均值来测定细胞生长，表示为单用以PBS，Ad-luc，或Ad-mda7处理(设为100％)的细胞总数的百分比。
5.细胞周期分布和凋亡
将细胞(5×105)接种于直径10mm的组织培养皿中并以PBS，Ad-luc(3000vp/细胞)，Ad-mda7(3000vp/细胞)，苏灵大，或PBS加苏灵大，Ad-luc和苏灵大，或Ad-mda7和苏灵大处理细胞。各处理组设3复孔。所用苏灵大浓度与细胞增殖试验中相同。处理开始后72小时，收获细胞，洗涤，并如前所述分析细胞周期的时期和凋亡百分率(Saeki等，2000)。利用FACScan(EPICS XL-MCL；BeckmanCoulter，Fullerton，CA)分析细胞周期和DNA含量。
6.免疫荧光试验
将细胞(1×104)接种于2孔室载玻片(Fisher Scientific)中并以PBS，Ad-mda7(3000vp/细胞)，PBS和苏灵大(0.5mM)，或Ad-mda7和苏灵大(0.5mM)处理。处理开始后48h，以PBS洗涤细胞，并以PBS缓冲的4％多聚甲醛在室温固定30分钟。然后以0.1％Triton X-100和0.1％柠檬酸钠室温渗透细胞10分钟，再与正常山羊血清孵育。孵育开始30分钟后，以PBS洗涤细胞，并与兔多克隆抗人MDA7抗体(Introgen Therapeutics Inc.，Houston，TX)在37℃孵育1h。然后细胞以PBS洗涤3次并与山羊抗兔FITC标记的二抗(Vector Laboratories，Burlingame，CA)孵育1h，在PBS中洗涤3次，以盖玻片固定，用Nikon荧光显微镜(Melville，NY)观察MDA-7蛋白质表达。在高倍放大下获得显微照片。
7.蛋白酶体活性试验
如前所述进行蛋白酶体活性试验(Choi等，2003)。简言之，将H1299细胞接种于6孔板中(2×105细胞/孔)并以Ad-mda7，Ad-mda7和苏灵大，或Ad-mda7和MG132(5μM)处理。试验用苏灵大浓度和其它试验相同。处理开始后24h，用蛋白酶体缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA，20％glycerol，5mMATP，and 4mM DTT)裂解细胞，然后4℃1300×g离心10分钟。收集上清相，如前所述(Saeki等，2000)测定细胞裂解物中的蛋白质浓度。
为了测定蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性，利用了荧光底物Suc-LLVY-AMC(Chemicon International，Inc.，Temecula，CA)。将如上所述各处理组的20毫克总蛋白质用反应缓冲液(25mM HEPES，pH 7.5，0.5mM EDTA，0.05％NP-40，和0.001％SDS)稀释到100μl。将荧光底物添加于各样品并在37℃孵育1h。用荧光板读数仪(Dynatech Laboratories，Chantily，VA)在360-nm激发波长和460-nm发射波长测定各样品溶液中的荧光强度。所有读数都用相同体积的游离7-氨基-4-甲基香豆精(AMC)溶液(50μM)的荧光强度标准化。数值表示为比厂商提供的内部阳性对照品百分率更高的对照百分率。
8.实时定量RT-PCR
将接种于6孔板中的H1299细胞(5×105/孔)以Ad-mda7(3000vp/细胞)或Ad-mda7和苏灵大(0.125，0.25，or 0.5mM)处理。未处理细胞在这些试验中作为阴性对照。处理开始后36h，细胞以PBS洗涤，胰蛋白酶化，并重悬于1.0ml PBS中。将细胞悬液转入1.5ml Eppendorf管中，4℃10,000rpm离心5分钟。扔掉上清，如厂商所述(Ambion Corp.，Austin，TX)用RNA分离试剂盒提取细胞团中的总RNA。然后分离的RNA以DNase I处理除去残留的DNA，接着用分光光度计在260-nm和280-nm波长进行定量。用SuperScript RT试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)将各样品中的总RNA(0.1μg)反转录。用实时定量RT-PCR进行mda-7mRNA的定量。简言之，定量PCR在含有1μl总RNA，10μl PCR Supermix(PE Applied BioSystems，Foster City，CA)，0.2μM mda-7特异性引物，和0.1μM荧光探针的20-μl体积中进行。PCR扩增过程中用7700序列测定仪(PE AppliedBioSystems)实时监测产生的报告和淬灭荧光染料发射光的相对增加。两步PCR循环如下进行：50℃2分钟，95℃10分钟，40个循环的95℃15分钟和60℃1分钟。人GAPDH管家基因用作扩增反应的内部对照，引物由厂商提供(PEApplied Biosystems)。
如上所述在这些试验中用到的寡聚核苷酸序列如下：
MDA-75’引物，CCCGTAATAAGCTTGGTACCG；和
MDA-73’引物，TAAATTGGCGAAAGCAGCTC；
探针，FAM-TGGAATTCGGCTTACAAGACATGACTGTG-TAMRA。
所有反应都设三复管。循环反应完成后，用7700序列测定系统软件(PEApplied Biosystems)根据标准曲线，测定各样品的域循环(Ct)值以及相应的起始量。不同处理组mda-7mRNA表达的差别表示为GAPDH值的变化。
9.半衰期分析
将H1299细胞以2×105细胞密度接种于60mm直径的组织培养皿中。第二天，以Ad-mda7(3000vp/细胞)感染细胞。在感染后48小时添加或不添加苏灵大(1mM)，继续孵育。2小时后，将蛋白质合成抑制剂放线菌酮(10μg/ml)加入细胞中，继续孵育。放线菌酮处理后0，3，6，9，11，和13h收获细胞；然后制备细胞裂解物，如以前所述(Saeki等，2000；Mhashilkar等，2001)通过Western印迹分析MDA-7蛋白质表达。
10.Western印迹分析
如以前所述(Saeki等，2000；Mhashilkar等，2001)将以PBS，Ad-mda7，Ad-luc，苏灵大，苏灵大砜，Ad-luc或Ad-mda7加苏灵大或苏灵大砜处理的细胞进行western印迹分析。用下列第一抗体进行检测：胱冬酶-3和PARP(BDPharmingen，San Diego，CA)；胱冬酶-9，pJNK，和pp38MAPK(Cell SignalingTechnology Inc.，Beverly，CA)，PKR，BAX，BAK，BCL-2，BCL-XL，COX-2，和Ub(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)；β-肌动蛋白(Sigma)；以及MDA-7(Introgen Therapeutics)。用合适的辣根过氧化物酶耦联的二抗检测这些蛋白质，利用Amersham的增强型化学发光western印迹检测系统在增强型化学发光胶片(Hyperfilm；Amersham)上观察。
11.体内分析
为了检测体内苏灵大是否增强Ad-mda7介导的异种移植肿瘤的肿瘤生长抑制，将H1299肺肿瘤细胞(5×106)皮下注射入无胸腺BALB/c雌裸鼠(n＝40)的右下腹。当肿瘤达到50-100mm3时，将动物分组并处理：PBS(n＝8)，苏灵大(n＝8)，Ad-mda7(n＝8)，Ad-luc加苏灵大(n＝8)，或Ad-mda7加苏灵大(n＝8)。一周3次以Ad-luc或Ad-mda7(3×109vp/dose)瘤内注射处理小鼠。在接受苏灵大的小鼠中，每天ip给予40mg/kg。每周称重小鼠以确定体重。如前所述(Saeki等，2002；Ramesh等，2003)一周3次监测和测量肿瘤生长。处理开始后22-25天，通过CO2吸入处死所有动物，切除肿瘤进行组织病理学检查和western印迹分析。为了重复性和统计学显著性分析，进行两次独立地试验。
12.统计学分析
用斯氏t检验和ANOVA计算实验结果的统计学显著性。认为P＜0.05有统计学显著性。
结果
1.MDA-7诱导NF-κB
在本研究中，腺病毒介导的mda-7(Ad-mda7)基因转染到两种NSCLC细胞系(H1299和A549)中，导致了NF-κB的激活，如电泳迁移率试验(EMSA)所显示。20到48小时之间，在用Ad-mda7处理过的细胞中而不是在用PBS或者AD-荧光素酶处理的对照组细胞中，观察到NF-κB明显激活。而且，NF-κB的激活呈剂量依赖方式，随着Ad-mda7浓度的增加会导致NF-κB激活的增加。
与NF-κB激活相符合的是NF-κB的抑制蛋白I-κBα降解。发现Ad-mda7诱导的NF-κB由p50和p60两个亚基组成。根据感染后36到48小时的A549细胞和感染后42到48小时的H1299细胞所做的EMSA实验，Ad-mda7可以剂量依赖方式诱导NF-κB(p65)转位到细胞核并且提高NF-κB与DNA结合的活性。
Ad-mda7也可以激活依赖于NF-κB的报告基因的表达(图46)。在显性I-κBα缺陷的细胞中，Ad-mda7具有细胞毒性(图47)。Ad-mda7明显地抑制了显性失活I-κBα细胞的生长(图48)。而且，用过表达显性失活突变I-κB(Ad-mIκB)的腺病毒载体转染H1299细胞明显地抑制了Ad-mda7诱导的NF-κB的转录激活和与DNA结合的活性，与用AD-luc处理的对照细胞相比较，导致了肿瘤细胞凋亡增加。
通过EMSA检测发现，苏林大以剂量依赖的方式抑制NF-κB激活。另外，苏林大，一种非激素类抗炎症药物，抑制MDA-7介导的NF-κB激活，产生了协同治疗效应(图49A)。这些结果显示MDA-7在肺癌细胞中的表达诱导NF-κB，用Ad-mIκB或者苏林大对其抑制增强了疗效。
2.苏灵大增强Ad-mIκB介导的肺癌细胞生长抑制
由于过去的研究表明苏灵大对癌细胞有具有细胞毒效应(Sanchez-Alcazar等，2003)，初步实验是以检测苏灵大对NSCLC(A549和H1299)细胞和正常(CCD-16)细胞的最小细胞毒性剂量。用不同浓度(0.062，0.12，0.25，0.5，1，and 2mM)的苏灵大处理这些细胞显示了不同程度的生长抑制，对A549，H1299，和CCD-16细胞，IC50分别是0.58，0.61，和0.94mM。在更高浓度下(1和2mM)，在肿瘤细胞和正常细胞中细胞增殖均受到抑制，导致了细胞凋亡(数据没有显示)。然而，对肿瘤细胞的抑制效果(＞90％)要高于正常细胞(60％)。根据这些结果，苏灵大在以后的实验中均使用小于0.5mM的浓度。
为了探明苏灵大与Ad-mda7联合使用是否能抑制细胞增殖和诱导凋亡，分别单独用PBS，AD-luc和Ad-mda7或与苏灵大(0.125，0.25，or 0.5mM)联用来处理A549，H1299和CCD-16细胞。处理后72小时作细胞分析，显示苏灵大和Ad-mda7联用与单独用苏灵大或者Ad-mda7处理的细胞相比，明显地抑制了肿瘤细胞的增殖(P＝0.001；图49B)。由这种联合疗法产生的生长抑制效应相对于其他治疗组也是明显的，而且苏灵大呈剂量依赖方式。相反，相对于其它治疗组在用任何浓度的Ad-mda7加苏灵大处理的正常成纤维细胞中没有观察到明显的生长抑制效应。这些结果表明，在肿瘤细胞中而不是正常细胞中苏灵大选择性地增强Ad-mda7介导的抑制活性。
为了进一步评价Ad-mda7加苏灵大是否诱导细胞凋亡，用FACS分析了处理后72小时的的肿瘤细胞和正常细胞凋亡变化。单独用Ad-mda7或者与苏灵大组合处理的肿瘤细胞(H1299和A549)处于亚G0/G1期的细胞数目(一种凋亡变化指标)，明显地高于接受相同处理的正常细胞(P＝0.001).(图.49C).然而，用Ad-mda7加苏灵大处理的肿瘤细胞其凋亡细胞数量明显高于单独用Ad-mda7处理的肿瘤细胞(P＜0.01)而且苏灵大呈剂量依赖方式。单独用Ad-luc或者与苏灵大组合处理后，凋亡细胞数量并没有明显高于用PBS处理的细胞。然而，当与Ad-luc联合处理A549肿瘤细胞，相对于与PBS结合处理的细胞，凋亡细胞数量在苏灵大最高浓度(0.5mM)明显增加(P＝0.01)。用Ad-mda7或者Ad-mda7加苏灵大处理的CCD-16细胞，即使在苏灵大最高浓度(0.5mM)，相对于对照细胞凋亡细胞数量也没有产生明显差异(图.49C)。用Ad-mda7与苏灵大砜联合处理肺癌细胞观察到相似的生长抑制效应增强。这些结果表明，当用Ad-mda7和苏灵大或苏灵大砜处理，肺瘤细胞而不是正常细胞选择性地发生凋亡。而且，Ad-mda7和苏灵大介导的生长抑制效应的发生不依赖于p53的状态，因为这可发生在p-53缺失和p53野生型肿瘤细胞系中。
3.苏灵大不增加Ad-mda7转导
治疗剂能够增强腺病毒转导效率已有报道(Lin等，2003)。基于这样的报道，检测了苏灵大是否能增强腺病毒的转导。出于这个目的，用100vp/细胞的Ad-GFP感染用不同浓度苏灵大处理的肿瘤和正常细胞(表7下)。由于超过80％的细胞在更高的vp下转导，使用低颗粒数量的Ad-GFP转导细胞，使得难以确定苏灵大对转导的作用。处理24小时后，用流式细胞术分析细胞。用Ad-GFP加上苏灵大和单独用Ad-GFP处理的细胞之间，转导效率没有明显差别(表7下)。然而，与用更低浓度苏灵大处理的其它组相比，用0.5mM苏灵大处理的A549细胞转导提高(P.＝0.001)。
表7用Ad-GFP和苏灵大处理的肺癌细胞(A549和H1299)和正常细胞(CCD-16)的转导效率。
用Ad-GFP(100vp/细胞)处理细胞3小时，然后用所示浓度的苏灵大处理24小时。转导效率百分率用流式细胞术测定。
a与Ad-GFP单独处理相比较P＜0.05。其他所示组间的差别不明显。
4.苏灵大提高外源MDA-7的表达
为了鉴定苏灵大增强Ad-mda7介导的肺癌细胞生长抑制和凋亡的机制，用Western印迹检测转基因MDA-7蛋白表达。三个细胞系(H1299，A549，和CCD-16)均用Ad-mda7/苏灵大处理36小时，然后分析MDA-7的表达。在Ad-mda7处理的A549和H1299细胞中，苏灵大以剂量依赖的方式显著地增加了转基因MDA-7的稳定表达水平，在单独用PBS或者苏灵大处理的细胞中未检测到内源MDA-7的表达。而且，苏灵大增加转基因蛋白表达量的能力不仅限于MDA-7：在分别用Ad-GFP和Ad-p53处理的肿瘤细胞中，苏灵大增加转基因GFP和p53蛋白的稳定表达水平。相反，在用Ad-mda7处理的正常CCD-16细胞中，苏灵大仅轻微提高外源MDA-7蛋白表达。苏灵大对外源GFP和p53蛋白的作用在正常细胞中未检测到。
为了评价MDA-7蛋白的亚细胞定位，进行了免疫荧光研究。与Western印迹数据相一致，与单独用Ad-mda7处理的细胞相比，用Ad-mda7/苏灵大处理的细胞其MDA-7表达明显升高。而且，MDA-7的亚细胞定位没有被苏灵大处理所改变。MDA-7的表达没有在单独用PBS或苏灵大处理的细胞中检测到。这些结果表明，苏灵大以剂量依赖方式提高了转基因MDA-7的表达，并提示这种提高导致凋亡活性增加。
为了检测增加外源蛋白表达水平的能力是否仅苏灵大具有，也用苏灵大砜进行了实验。与单独用Ad-mda7处理的细胞相比，用Ad-mda7和苏灵大砜处理的细胞显示出外源MDA-7表达的增加。MDA-7的表达没有在用PBS或苏灵大砜处理的细胞中检测到。这些结果表明了苏灵大及其代谢产物能促进外源蛋白表达。
5.苏灵大增强Ad-mda7介导的凋亡信号传导
先前报道过Ad-mda7介导的细胞肺癌凋亡的诱导，与胱冬酶级联反应的激活，包括胱冬酶-9，胱冬酶-3，和PARP的切割相关(Saeki等，2000；Mhashilkar等，2001)。为了检测Ad-mda7和苏灵大的处理是否能够影响胱冬酶级联，在肿瘤和正常细胞中分析了这些分子标记。单独用Ad-mda7或与苏灵大联合处理的肿瘤细胞(A549 and H1299)显示了capase-9，胱冬酶-3，和PARP的切割，这些是胱冬酶级联激活的指标。切割后的胱冬酶-9，胱冬酶-3，和PARP的表达与苏灵大的浓度和MDA-7的表达相对应。在用Ad-luc加最高浓度(0.5mM)的苏灵大处理的A549(而非H1299)中观察到胱冬酶-9，胱冬酶-3，和PARP的激活，这与用FACS分析显示在这些细胞中凋亡细胞组分增加相一致(图.49C)。然而，激活水平显著低于用Ad-mda7或Ad-mda7/苏灵大处理的A549细胞。在没有处理或只用苏灵大处理的A549或H1299细胞中胱冬酶级联没有被激活。在CCD-16细胞中，与没有处理或者仅用苏灵大，仅用Ad-luc，或Ad-luc与苏灵大联合处理相比，只用Ad-mda7或与苏灵大组合处理的细胞没有激活胱冬酶级联。这些结果显示，苏灵大选择性地在肿瘤细胞而不是正常细胞中激活胱冬酶级联。
下一步研究胱冬酶级联上游的受Ad-mda7和苏灵大调节的其它效应分子表达。过去的研究表明在Ad-mda7诱导的肺癌细胞凋亡中PKR，p38MAPK，和pJNK很重要(Pataer等，2002；Kawabe等，2002；Sarkar等，2002)。相似地，研究显示Bcl-2家族蛋白(Bax，Bak，Bcl-2，and Bcl-XL)的调控对于苏灵大诱导的细胞凋亡很关键，而且不依赖于p53的状态(Yang等，2003；McEntee等，1999)。根据这些报道，检测了用Ad-mda7和苏灵大处理后的H1299细胞中PKR，pJNK，pp38MAPK，以及几个Bcl-2家族成员的表达。与没有处理，用苏灵大处理和用Ad-luc处理的细胞相比，单独用Ad-mda7或与苏灵大联合处理的细胞中PKR，pJNK，和pp38MAPK表达增加。与没有处理，用Ad-luc处理和用苏灵大处理的细胞相比，用Ad-luc加苏灵大处理的细胞PKR轻微上升。然而，在用Ad-luc加苏灵大处理的细胞中PKR水平比在用Ad-mda7加苏灵大处理的细胞中水平低。PKR，pJNK，和pp38MAPK的增加与苏灵大诱导的MDA-7表达水平相关。在任何处理组中没有检测到Bax或Bak(两种凋亡诱导剂)，或Bcl-XL，(一种凋亡抑制剂)，表达水平的变化。Bcl-2的表达水平在用Ad-mda7和0.5mM苏灵大处理的细胞中有轻微降低。这些结果支持Ad-mda7加苏灵大诱导凋亡主要依赖于苏灵大增强异位MDA-7表达的能力的观点。
进一步研究Ad-mda7加苏灵大处理加强了肿瘤细胞杀伤力是由于COX-2的抑制作用的可能性。在用Ad-mda7和Ad-mda7加苏灵大处理的细胞中观察到了COX-2表达升高。然而，在两个治疗组织间COX-2的表达水平没有明显差别。在用PBS，苏灵大、Ad-luc，和Ad-luc加苏灵大处理的细胞中没有观察到COX-2的表达。
6.苏灵大和Ad-mda7处理对细胞周期的影响。
以往的研究显示，苏灵大诱导细胞周期停滞在G1期(Piazza等，1997)，Ad-mda7诱导细胞周期在G2/M期停滞(Saeki等，2000；Mhashilkar等，2001；Ekmekcioglu等，2001)。根据这些报道，用FACS分析研究苏灵大/Ad-mda7处理对细胞周期调控的组合效应。肿瘤细胞不处理或用苏灵大，Ad-luc，Ad-mda7或Ad-mda7加苏灵大处理72小时。与以往报道相同，Ad-mda7而不是Ad-luc处理在两种细胞中都增加了处于G2/M期细胞数目，A549(27.2％)和H1299(42.5％)(表8下)。仅用苏灵大处理增加处于G1期的细胞数目。在两个肿瘤细胞系中，与用0.125mM苏灵大相比，用0.5mM苏灵大G1期细胞数目显著增加(分别是75.6％与64.8％在A54中和74.6％与66.4％在H1299细胞中)。用苏灵大和Ad-mda7处理消除了Ad-mda7诱导的G2/M期停滞。这种效应在用0.5mM苏灵大与Ad-mda7组合时更加显著，导致G2/M期细胞数目减少，分别是A549从27.2％减少到12.3％，H1299从42.5％减少到32.4％。苏灵大导致Ad-mda7诱导的G2/M期停滞的消除也是在处理后48小时观察到的。这些结果显示苏灵大和Ad-mda7影响细胞周期中的不同时期，而且苏灵大增强的Ad-mda-7肿瘤细胞杀伤不是通过增加G2/M期停滞发生的。
表8.用苏灵大，Ad-mda7或两者共同处理的肺癌细胞细胞周期分布。
用PBS，Ad-luc，或仅Ad-mda7，或与0.5mM苏灵大组合处理细胞72小时，然后FACS分析。处于细胞周期中各个时期的细胞百分比通过DNA含量表分析确定。数值是一式两份样品的平均值。至少在两次独立的实验中观察到相似结果。
Figure G04805918X19960403D001371
7.苏灵大延迟外源MDA-7蛋白降解
为了探究苏灵大通过何种机制提高外源MDA-7蛋白，在H1299细胞中检测苏灵大对转录活性和MDA-7蛋白降解的作用。为了检测苏灵大对Ad-mda7的转录活性的影响，对从没有处理或用Ad-mda7单独处理或与不同浓度苏灵大一起处理的细胞抽提的RNA样品进行适时定量PCR分析。与没有处理，和Ad-mda7处理的细胞相比，在用Ad-mda7/苏灵大处理的细胞中没有观察到mRNA水平的明显差别。为了阐明苏灵大处理是否调控MDA-7蛋白质降解，用仅Ad-mda7，或与苏灵大联合处理H1299细胞不同时间，测定MDA-7的半寿期。Ad-mda7对照细胞中MDA-7蛋白水平随时间推移减少；在11小时时蛋白降解完全。相反，在用Ad-mda7加苏灵大处理的细胞中MDA-7蛋白的降解被延迟，13小时仍可检测到该蛋白的实质水平。蛋白质水平半定量分析显示，在13小时，用Ad-mda7加苏灵大处理的细胞中MDA-7蛋白质水平比Ad-mda7处理的细胞高8-15倍。这些结果表明在用Ad-mda7/苏灵大处理的细胞中MDA-7蛋白表达增加是苏灵大介导的MDA-7蛋白降解延迟的结果。
8.苏灵大增强MDA-7表达不是由于蛋白酶体活性的抑制
鉴于最近的研究表明有些NSAIDs抑制蛋白酶体的活性(Choi等，2003；Huang等，2002)，研究了苏灵大介导的MDA-7蛋白表达增强是否是由于其抑制蛋白酶体活性的能力。为此，通过Western印迹，Ub降解试验，和蛋白酶体酶活性试验，将苏灵大的作用与MG132，一种已知的蛋白酶体抑制剂(He等，2003)作比较。Western印迹显示与仅用Ad-mda7处理的细胞相比，用苏灵大或MG132与Ad-mda7组合处理12小时增强了MDA-7蛋白表达。然而，苏灵大增加了总MDA-7蛋白水平，包括新合成的没有糖基化的蛋白和被不同程度糖基化了的MDA-7蛋白，如多条带所表明的那样。相反，MG132只增加新合成MDA-7蛋白的水平，尽管没有苏灵大那样强，并且只有一种糖基化形式的MDA-7蛋白。因此，苏灵大和MG132增加MDA-7蛋白的机制看来是不同的。
下一步检测了苏灵大抑制蛋白酶体活性的能力。Western印迹分析总泛素化蛋白质，一种蛋白酶体途径抑制的指标，显示MG132处理而不是苏灵大处理的细胞中有泛素化蛋白。这些结果显示苏灵大，与MG132不同，不抑制蛋白酶体活性或者蛋白酶体途径。蛋白酶活性实验的结果与这些发现相一致，与没有处理的对照细胞相比，单用Ad-mda7或用苏灵大处理不能抑制蛋白酶体活性。相反，用Ad-mda7加MG132处理导致蛋白酶体活性显著抑制(P＝0.01)。这些结果表明苏灵大提高的MDA-7蛋白表达不是由于对蛋白酶体活性的抑制。
9.苏灵大增强Ad-mda7介导的肺癌细胞生长抑制
为测定Ad-mda7加苏灵大处理是否能增强肿瘤生长抑制，通过一种肺肿瘤外源移植模型进行了前导性体内实验。与用PBS，苏灵大，Ad-mda7，或Ad-luc/苏灵大治疗的小鼠相比，用Ad-mda7/苏灵大治疗的小鼠显示出明显的生长抑制(P＝＜0.001)(图.49D)。与用PBS处理的小鼠相比，用仅Ad-mda7或Ad-luc加苏灵大处理的小鼠中也观察到显著的肿瘤抑制(P＝0.03)。与用PBS处理的小鼠相比，没有在用苏灵大处理的小鼠中观察到明显的生长抑制。而且，没有在用Ad-mda7加苏灵大的小鼠中观察到发病，体重丧失，和死亡，证明没有处理相关的毒性，表明这种治疗能很好地被耐受。
最后用苏灵大治疗24小时后的皮下肿瘤分析显示，在用Ad-mda7加苏灵大处理的小鼠肿瘤中MDA-7蛋白水平比用Ad-mda7治疗的小鼠高3-12倍。这些结果表明一个与体外实验一致的发现，用Ad-mda7加苏灵大治疗肺肿瘤增强了生长抑制，与MDA-7蛋白表达增强相平行，此发现与体外实验结果相一致。
实施例25：腺病毒介导的mda-7基因转移
诱导人卵巢癌细胞细胞周期的停滞和凋亡
材料和方法
1.细胞系和试剂
卵巢癌细胞OVCA 420和MDAH 2774得自J.K.Wolf医生，医学博士，Anderson癌症中心，Houston，TX。这些实验中还使用了卵巢癌细胞SKOV3-ip，HEY和DOV 13。SKOV-3ip培养在高葡萄糖的含有10％FBS的DMEM培养基中。DOV 13和HEY培养在含有10％FBS的RPMI 1640中。MDAH 2774和OVCA 420培养在含有10％FBS的最低非必需氨基酸培养基中。
2.测定转导效率
用表达GFP基因的腺病毒(Ad-GFP)感染细胞研究了每种卵巢癌细胞系的腺病毒转导效率。以5×105细胞每孔的密度将卵巢癌细胞(SKOV3-ip，Hey，DOV 13，MDAH 2774和OVCA 420)接种于6孔组织培养皿中。第二天，细胞或者不感染(空白)；或者用Ad-GFP或者Ad-luc感染。感染后24小时，用PBS洗涤细胞，离心沉淀。然后，再将细胞重新悬浮于PBS中，振荡然后进行流式细胞分析。
3.构建重组腺病毒载体
表达mda-7的复制缺陷型Ad-mda7的构建和纯化已有所述(Saeki等2000)。简言之，构建的复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)载体携带一个连接于内部启动子CMV-IE的mda-7基因或荧光素酶基因，随后是SV40聚腺苷酸(pA)信号。病毒在293细胞中增殖，并用层析法纯化。
4.测定细胞生长率
以1×105细胞每孔的密度将肿瘤细胞(SKOV3-ip，Hey，DOV 13，MDAH2774和OVCA 420)接种在6孔细胞培养皿中。第二天，细胞或者不感染(空白)；或者用Ad-mda7或Ad-luc感染。在感染后的1，2，3，4和5天收集细胞并用血球记数板计数。
5.细胞周期的分析
以(3000v.p./细胞)的感染量在6孔板中用Ad-luc或Ad-mda7处理MDAH 2774和OVCA 420细胞(5×105)。收集细胞，离心沉淀，用PBS洗涤，并用70％的乙醇-20℃固定过夜。将细胞重悬于含有RNase A(1mg/ml)和50μg/ml碘化丙锭的PBS中，振荡后用FACS分析。未感染细胞用作阴性对照。
6.凋亡细胞染色(Hoechst染色)
以5×105细胞每孔的密度将细胞接种于6孔板中，用Ad-mda7或Ad-luc(3000v.p./细胞)进行处理。感染后72小时，将细胞与Hoechst 33342(Sigma，St.Louis，MO，USA)一同孵育15min，用磷酸缓冲液(PBS)洗涤两次，并在荧光显微镜下进行观察。
7.Western印迹分析
用冷的PBS洗涤细胞一次，重悬于裂解缓冲液中(62.5mM Tris-HCl，2％SDS，10％甘油，4M尿素)。将细胞裂解物收集在eppendorf管中，超声处理30秒钟，在95℃的水浴中加热5分钟，然后4℃14,400rpm离心10分钟。将上清液与5％的2-巯基乙醇混合，存放在-80℃。用Bio-Rad蛋白试验系统测定蛋白质的浓度。将含有50μg总蛋白质的一部分细胞提取物在10％SDS-PAGE中分离，将其从凝胶转移到硝酸纤维素膜上(Hybond-ECL；Amersham Pharmacia Biotech，UK)，然后在室温下封闭1h(5％脱脂奶粉和0.1％Tween 20，溶于TBS或PBS中)。
然后，将膜与以下一抗一同孵育，PKR(1∶500)、p53(1∶1000)、磷酸特异性p38(1∶1000)、磷酸特异性pJNK(1∶1000)、磷酸特异性p44/42(1∶1000)、磷酸特异性pAKT(1∶1000)、磷酸特异性eIF2抗体(1∶1000)、胱冬酶-3(1∶1000)、PARP(1∶500)、胱冬酶-9(1∶500)。p53和PKR抗体购自Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA，USA。磷酸特异性p38、磷酸特异性pJNK、磷酸特异性p44/42、磷酸特异性pAKT和磷酸特异性eIF2抗体购自CellSignaling。胱冬酶-3、胱冬酶-9和PARP抗体购自PharMingen。
然后，将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗(Amersham)一同孵育。最后，利用Amersham的增强型化学发光蛋白印迹检测系统在增强型化学发光胶片(Hyperfilm，Amersham)上观察蛋白。
8.Rnase保护试验(RPA)
以5×105的密度在6孔板中接种肿瘤细胞(MDAH 2774)，并用PBS、Ad-luc或Ad-mda7处理。处理后24、48和72h，用上述方法使用Trizol试剂分离这些细胞的总RNA。使用hApo-3 Multi-Probe探针模板组(Pharmingen)来分析以下凋亡相关基因的mRNA转录物：胱冬酶-8、Fas、FasL、FADD、FAF-1、TRAIL、TNFr、TRADD和RIP以及内部对照L32和甘油醛-3-磷酸脱氢酶。根据生产商的指南，使用RiboQuant Multi-Probe保护试验系统(PharMingen)实施探针的合成、杂交和RNase处理。用变性聚丙烯酰胺凝胶(5％)电泳分离保护的转录物，-80℃曝光hyperfilm胶片过夜。
9.电泳迁移试验(EMSA)
在6孔板中用Ad-luc或Ad-mda7处理MDAH 2774(5×105)。在不同的时间点(24，48，和72h)收集细胞，并制备其细胞质和细胞核的提取物，再如上文所述进行EMSA。简言之，使用T4多聚核苷酸激酶对AP-1共有的双链寡核苷酸(Promega)进行[γ-32P]-ATP末端标记。将含有标记寡核苷酸和0.5μg聚(dI-dC)以及核蛋白提取物(10μg)的典型结合反应混合物在5X凝胶迁移结合缓冲液[20％甘油、5mM MgCl2、2.5mM EDTA、2.5mM DTT、250mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH7.5)]中在25℃条件下孵育30分钟。用非变性的5％聚丙烯酰胺凝胶在0.5X Tris-硼酸EDTA缓冲液中分离复合物，电泳时间为1h30min，电压为300V.。用放射自显影法显影条带，并用Image Quant软件(Molecular Dynamics，Amersham-Pharmacia，Biotech，Piscatway，NY)进行定量。
10.Fas启动子分析
用质粒(FHR+)转染接种于6孔板中的MDAH 2774细胞(5×105)，该质粒含有受人Fas(CD95)启动子控制的荧光素酶基因。在这些实验中，用质粒(Δ6)转染的细胞作为对照，该质粒在Fas启动子中有一个突变。如前文所述，使用DOTAP：胆固醇(DOTAP：Chol)脂质体实施转染。转染后6小时，用PBS、Ad-βgal、或Ad.mda-7处理细胞。在处理后的12，24，48h收集细胞，用PBS洗涤，用200μl报告裂解缓冲液(Promega)裂解细胞。如前所述测定荧光素酶的表达，表示为每毫克蛋白质的相对光单位(RLU)。至少重复实验两次，用两次实验结果的平均值表示。
11.用显性失活FADD表达载体进行的实验
将肿瘤细胞接种于双孔室载玻片或6孔板中，并用携带黄色荧光蛋白(YFP)和显性失活FADD(YFP-dnFADD)的质粒表达载体转染细胞，或者用仅携带YFP的质粒载体转染细胞。YFP-dnFADD质粒以融合蛋白的形式表达YFP和FADD，这样既能显示FADD蛋白，又有功能。如上所述，转染细胞的质粒包裹在DOTAP：Chol.脂质体中。转染后24小时，用PBS或Ad-mda7处理细胞。处理24h和48h之后，在荧光显微镜下观察转导效率，或者制备细胞裂解物探测FADD，并用Western印迹分析胱冬酶9和胱冬酶8。
为了测定dnFADD对Ad-mda7介导的凋亡的影响，用上述方法处理细胞，并用流式细胞计数法分析处于亚G0期的细胞数量，该数量是凋亡细胞的一种指标。
12.SiRNA分析
用siRNA试剂盒(Ambion，Austin TX)合成并纯化Fas特异性的siRNA用于siRNA分析。用以下序列合成siRNA：
a)靶(Fas)siRNA：
5’-AAGTAAAGGTAGAGGGGGAGCCCTGTCTC-3’
5’-AAGCTCCCCCTCTACCTTTACCCTGTCTC-3’b)杂乱(对照)siRNA
5’-AAAAGTTTCCGATACGCTTTACCTGTCTC-3’
5’-AATAAAGCGTATCGGAAACTTCCTGTCTC-3’
使用oligofectamine用siRNA(Fas或对照)转染接种于6孔板的细胞。在这些实验中，仅用空的oligofectamine处理的细胞作为对照。为了分析siRNA对Fas的抑制作用，在转染后的48h收集细胞，制备细胞裂解物，并用western印迹分析法分析Fas的表达。为确定siRNA对Ad-mda7介导的凋亡的影响，如上文所述，用Fas特异性的或杂乱的siRNA转染细胞。转染后48h，用PBS或Ad-mda7处理细胞。处理后24h，收集细胞、固定并用流式细胞术分析凋亡细胞。
结果
1.卵巢细胞系中的转导效率
为了研究不同细胞系之间病毒载体转移基因的效率关系，用Ad-GFP感染细胞来测定所研究的5个卵巢癌细胞系的腺病毒转导效率。5个细胞系的转导效率是不同的，MDAH 2774、OVCA 420、DOV13和Hey细胞最易转导，其在MOI为3000转导条件下得到的转导效率高于90％，而SKOV3-ip细胞最难转导，即使在MOI为10,000的条件下也很难转导(图50)。
2.腺病毒输送的mda-7对卵巢肿瘤和正常成纤维细胞的作用
在用mda-7感染以后，SKOV3-ip、Hey和DOV13肿瘤细胞系的生长不受抑制。相反，与用Ad-luc感染或用PBS处理的对照细胞相比，观察到用Admda-7感染的MDAH 2774和OVCA 420细胞的增殖受到抑制。用Ad-Luc和Ad-mda7感染正常的人成纤维细胞后，没有观察到显著的生长抑制(图51)。
3.MDA-7在卵巢细胞中选择性地诱导G2/M细胞周期停滞和凋亡
为了进一步研究生长抑制的分子机制，进行了流式细胞分析。分析发现在5个细胞系中有2个细胞系MDAH 2774和OVCA 420表现出显著生长抑制，G2/M细胞群体的百分比显著增加(图52)。用对照Ad-luc感染并不改变处于细胞周期G2/M期的细胞百分比。在用Ad-mda7感染后，MDAH 2774和OVCA 420肿瘤细胞发生了细胞程序性死亡。然而，在用Ad-Luc感染或模拟感染的细胞中，没有观察到任何改变。
4.用Ad-mda7感染卵巢细胞诱导细胞内和分泌性蛋白的表达
用Ad-mda7和Ad-luc感染卵巢癌细胞。在感染后的24，48和72h收集细胞，制备细胞提取物用于western印迹分析。来自未感染细胞的提取物用作额外的对照。在所有Ad-mda7感染的细胞系中都检测到MDA-7蛋白的表达，但在模拟感染对照或Ad-luc感染的细胞中均没有检测到该蛋白的表达。
5.表达mda-7引起PKR，pPKR，peIF2，p38，和JNK的上调
在MDAH 2774和OVCA 420细胞中，mda-7活化了PKR，pPKR，peIF2，p38和JNK。当感染细胞的Ad-mda 7MOI为3000时，48小时后观察到PKR及其底物的最大活化。
6.mda-7表达后胱冬酶的级联活化和PARP的切割
Ad-mda71处理导致胱冬酶-9和胱冬酶-3的活化以及PARP的切割，PARP是胱冬酶的一种底物。
这些结果表明mda-7对卵巢癌细胞具有选择性作用，为Ad-mda7用于卵巢癌治疗提供了依据。
7.MDA-7可调节多种凋亡相关蛋白质
先前的研究表明MDA-7在人肺癌细胞和黑色素瘤中能够活化多种凋亡相关蛋白(PKR，pJNK，p38 MAPK，)。根据这些观察，在Ad-mda7处理后的24和48h研究了卵巢癌细胞中这些蛋白的活化情况。先前证明在MDA-7介导的肺癌细胞死亡中起关键作用的PKR仅在48h时显著活化，而在24h时未活化。与PKR相关的是其下游底物peIF2的活化。p38MAPK和pJNK也仅在48h时显著活化，而在24h时未活化。然而，MDA-7在24h时活化pc-Jun和pATF-2持续至48h时。这些结果表明MDA-7在不同的时间点差异性活化不同的信号分子。
8.MDA-7可活化卵巢癌细胞的Fas和Fas相关蛋白
为了确定其它信号转导活动或分子被活化/触发是否早于过去报道的凋亡级联反应的启动，用PBS、Ad-luc或Ad-mda7处理卵巢癌细胞，并用RPA分析凋亡相关分子。与PBS和Ad-luc处理的细胞相比，在Ad-mda7处理的细胞中观察到Fas，Fas-L，FADD，胱冬酶-8和FAF1的mRNA表达水平的显著升高。观察到FAP的表达水平中等升高。在各处理组中，均未观察到TRADD，DR3，TNF和RIP表达水平的改变，提示早期活动可能是Fas-相关家族成员的活化而非TNF-相关家族成员的活化。由于mRNA水平的改变不总和蛋白表达相关联，因此还进行了Western印迹分析。与PBS和Ad-luc处理的细胞相比，在Ad-mda7处理的细胞中观察到Fas，Fas-L，FAF1和FADD蛋白表达显著上升。蛋白表达的升高与mRNA结果相一致。然而，与PBS和Ad-luc处理的细胞相比，在Ad-mda7处理的细胞中FAP蛋白表达降低。在各处理组中，均未观察到TRADD表达水平的改变。这些结果表明在卵巢癌细胞中，MDA-7激活Fas-FasL是一个早期事件。
9.MDA-7激活AP-1和NFκB
AP-1和NFkB是Jun家族(c-Jun，JunD和JunB)转录蛋白作为同型二聚体或异型二聚体与Fos家族成员或其它转录因子(如ATF2，CREB和NFAT)相结合而激活的主要转录因子。根据这些信息以及MDA-7能激活c-jun和ATF-2，我们推测MDA-7介导的信号传导涉及AP-1和/或NFκB。为此，在用PBS、Ad-luc或Ad-mda7处理后的24和48小时，制备细胞核裂解物，并用EMSA分析AP-1和NFκB的活化。Ad-mda-7处理的细胞的核裂解物比Ad-luc和PBS处理的细胞核裂解物表现出更高的AP-1和NFκB结合活性。在24和48h时都观察到活性的升高，而最大活性出现于48h时。
10.MDA-7增强Fas在细胞表面的表达
为了确定MDA-7是否增强Fas在细胞表面的表达，对PBS、Ad-luc或Ad-mda7处理的细胞用荧光标记的抗Fas抗体进行染色，并在荧光显微镜下观察。与PBS和Ad-luc处理的细胞相比，在Ad-mda7处理的细胞中观察到细胞表面Fas表达的增加。
11.MDA-7活化Fas启动子
接着研究Ad-mda7处理对Fas启动子的活化能力。用携带在野生型Fas启动子控制下的luc基因的质粒转染细胞，与PBS或Ad-βgal处理的细胞相比，用Ad-mda7处理显著地活化了细胞(P＝0.001)。与PBS处理的细胞相比，观察到Ad-βgal处理的细胞中荧光素酶的表达略有增加(P＝0.04)。相反，当用含有突变型Fas启动子的质粒转染细胞，各处理组中均未观察到荧光素酶表达显著升高，表明Ad-mda7处理可导致野生型Fas启动子的特异性活化。
12.显性失活FADD的过表达抑制MDA-7介导的凋亡
由于FADD是在FAS诱导信号转导之后形成的死亡诱导信号复合物(DISC)的一部分，因此研究了显性失活FADD的过表达对MDA-7介导的凋亡所起的作用。在实验开始之前，用EYFP或EYFP-dnFADD质粒转染细胞，并测定转导效率和dnFADD的表达情况。注意，以EYFP融合蛋白形式表达的dnFADD与内源性FADD的不同可以通过条带模式的改变加以区分。在此后的实验中，细胞或者不转染或者用EYFP或EYFP-dnFADD转染，然后再用PBS或Ad-mda7处理。用流式细胞仪分析凋亡细胞，用Western印迹分析法分析胱冬酶-9和胱冬酶-8。与只用PBS、EYFP质粒处理的细胞相比，在只用Ad-mda7处理的细胞中观察到大量的凋亡细胞(15％；P＝0.001)。然而，在转染了EYFP-dnFADD过度表达dnFADD的细胞中，Ad-mda7介导的凋亡显著地受到抑制。相反，对EYFP转染的细胞用Ad-mda7进行处理则会增加凋亡。此外，用Ad-mda7处理亲代细胞或转染了EYFP质粒的细胞则会激活胱冬酶-8和-9。相反，MDA-7介导的胱冬酶-8和-9的活化在过度表达dnFADD的细胞中被抑制。在用PBS处理、仅用EYFP处理和仅用EYPF-dnFADD处理的细胞中，没有观察到胱冬酶的活化。
13.由siRNA抑制Fas抑制MDA-7介导的凋亡
为了进一步检测Fas是否在MDA-7介导的凋亡中起作用，进行了siRNA实验。先只用载体、用杂乱的siRNA或靶向Fas的siRNA转染细胞，并用western印迹分析方法进行分析。在转染了靶向Fas的siRNA的细胞中观察到Fas蛋白表达受到了显著的抑制，但在转染了杂乱siRNA的细胞中未观察到该现象。在转染了200nm siRNA的细胞中观察到Fas的抑制。根据这些结果，使用200nm的Fas或杂乱siRNA进行后面的实验。用Ad-mda7处理Fas siRNA或杂乱siRNA转染的细胞，并分析凋亡细胞。在Fas siRNA转染的细胞中观察到MDA-7诱导的凋亡细胞的数目为9％，显著地低于用杂乱siRNA转染的细胞中观察到的数目(19.2％)。在用PBS处理的细胞中未观察到凋亡细胞数目的显著增加。这些结果表面Fas在MDA-7介导的卵巢癌细胞凋亡中起一定作用。
实施例26：肿瘤生长抑制基因mda-7
诱导的凋亡并影响人乳房癌中的
APC/β-CATENIN通路
材料和方法
在体侧乳房癌异种移植模型中，分别进行了MDA-MD-468乳房癌细胞的体外和体内研究。使用的重组腺病毒携带mda-7转基因(Ad-mda7)，该基因在CMV启动子控制下表达mda-7。用Ad-Luc或PBS处理对照细胞。48小时后，直接细胞计数评估细胞生长，以胱冬酶-3和PAEP的切割来衡量凋亡。体内实验中，在肿瘤体积达到100mm3时，向肿瘤内注射Ad-mda7、Ad-Luc或PBS进行肿瘤治疗。治疗后48小时，收集肿瘤并用胱冬酶-3和PARP的切割以及TUNEL染色法来评估凋亡情况。测定Ad-mda7处理以后体外和体内MDA-MB-468细胞中的APC和β-连环蛋白的表达，评估腺瘤性息肉肠蛋白(APC)/β-连环蛋白通路。
结果
与对照处理细胞相比，用Ad-mda7处理MDA-MB-468细胞在体外和体内均引起显著的凋亡和生长抑制(图53；P＜0.01，ANOVA)。用Ad-mda7处理后，在体外和体内都观察到APC表达水平显著升高。相应地，与对照相比，Ad-mda7处理细胞中的β-连环蛋白水平显著降低。这些研究确认Ad-mda7对MDA-MB-468乳房癌细胞具有显著的生长抑制和促进凋亡的作用。此外，这些数据还表明这种细胞死亡可能是由于Ad-mda7转染后，APC上调造成核β-连环蛋白的降低而引起的。目前正在开展进一步的研究来验证这些观察结果。
实施例27：腺病毒介导的MDA-7基因治疗
抑制新生血管形成并放射致敏异种移植肿瘤
材料和方法
1.细胞培养和化学药品
从美国典型培养物收集中心(ATCC，Rockville，MD)获得NSCLC细胞系A549。A549细胞生长在含有10％胎牛血清(HyClone，Logan，UT)和1％青霉素-链霉素(Invitrogen，Grand Island，NY)的F-12培养基中，培养条件为37℃，5％CO2。从美国典型培养物收集中心获得的正常人肺成纤维细胞系CCD16培养在含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的MEM-α培养基中。稳定地转染了mda7或对照载体的人胚肾293细胞由Introgen Therapeutics Inc.(Houston，TX)提供。293细胞培养在含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的MEM高葡萄糖培养基中。人脐静脉内皮细胞(HUVECs)来自Clonetics(San Diego，CA)，根据生产商说明培养在EGM-2完全培养基中(Clonetics，San Diego，CA)。根据ELISA试验，检测到培养了24小时的293细胞(1×106)在其培养基中产出30ng/ml的MDA-7蛋白。
人血管抑素(kringle 1-3)和人重组内皮抑素购自Calbiochem(San Diego，CA)，以100ng/ml的浓度稀释加入培养基中用于细胞处理。
2.动物研究
在4-5周龄雄性无胸腺裸鼠(nu/nu；Harlan)的后腿内s.c注射5×106活细胞(悬浮在无血清培养基中)，建立A549异种移植肿瘤。在10-14天之内，肿瘤体积达到200mm3(第0天)。评估治疗后肿瘤细胞生长的迟滞。以三维直角尺度测量肿瘤，假定为椭圆体估算体积。当肿瘤直径超过15mm或肿瘤溃烂时处死动物。用于这些实验的所有动物都按美国农业部和国家卫生研究院的规章和标准居住和饲养在公共设施中。动物的使用按动物护理和使用委员会批准的方案进行。
3.腺病毒的产生
获得美国专利申请序列号09/615,154所述的Ad-mda7。这一重组腺病毒载体在修饰Ad5的E1缺失区域中插入微基因盒，该微基因盒含有CMV启动子、野生型mda-7cDNA和SV40的聚腺苷酸信号。检测并确定该载体中没有可复制型腺病毒和支原体。
4.基因递送
在生长于裸鼠后腿中的s.c.异种移植肿瘤上进行体内实验。当肿瘤体积达到200mm3时，给予总剂量为3×106vp的腺病毒载体，分成三等份，在第1、3和5天瘤内注射。注射的纯化载体稀释于总体积100μl的PBS中，用27.5号胰岛素针头一次注射。
5.放射治疗
对于体内治疗，对携带A549异种移植肿瘤的动物实施麻醉同时给予60Co远距放射疗法单位治疗。将小鼠置于射线场内，仅使其携带肿瘤的后腿位于射线场中，身体其余部分用铅板掩盖。对于体外处理，在室温下以高剂量速率137Cs单位照射细胞(3.4Gy/min)。
6.免疫组化分析
第8天收集治疗作MDA-7免疫染色，或第14天收集肿瘤作血管内皮生长因子(VEGF)、基本成纤维细胞生长因子(bFGF)、白细胞介素-8(IL-8)或CD31免疫染色。对于VEGF，bFGF，IL-8或MDA-7免疫染色，使用5-微米厚的甲醛固定石蜡包埋组织切片。对于CD31免疫染色，从冰冻组织制作8微米厚的切片。将甲醛固定石蜡包埋组织的切片用二甲苯脱蜡，并在浓度逐步降低的乙醇(从100到75％)中再水合。再将切片放置在抗原封闭溶液(Vector Laboratories Inc.，Burlingame，CA)中，间歇性微波炉加热10分钟使其保持在沸腾温度，以增强免疫染色。将玻片置于室温中冷却30min以后，用蒸馏水和PBS洗涤。此种初步准备后，用含有3％的H2O2的甲醇覆盖甲醛固定石蜡包埋组织的玻片或冷冻组织的玻片，封闭内源性过氧化酶的活性。然后，用亲和素-生物素-过氧化酶复合物试剂盒(VectorLaboratories Inc.)来检测着染情况。使用封闭血清和内源性亲和素/生物素封闭溶液(Vector Laboratories Inc.)处理以后，将玻片与1∶500稀释的兔抗VEGF多克隆抗体(Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，CA)、1∶500稀释的兔抗bFGF多克隆抗体(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)、1∶50稀释的兔抗IL-8多克隆抗体(BiosourceInternational，Camarillo，CA)、1∶100稀释的大鼠抗小鼠CD31单克隆抗体(PharMingen，San Diego，CA)或1∶250稀释的兔抗MDA-7多克隆抗体(IntrogenTherapeutics，Houston，TX)4℃孵育过夜然后，洗涤玻片，与生物素化二抗一同孵育30min，再次洗涤，然后与亲和素-生物素-过氧化酶复合物试剂一同孵育30min。用PBS洗涤玻片以后，使用3，3’-二氨基联苯胺使免疫染色显示。用甲基绿(VectorLaboratories，Inc.)复染玻片，并用Permount(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)固定标本。
为了确定免疫染色阳性细胞的百分比，至少计数1000细胞/玻片，记录×400个视野(Bianco等，2002；Weidner等，1991)。根据Weidner等(1991)所述的方法，使用CD31免疫染色的切片定量微血管。微血管的密度表示为×400视野中鉴定到的三个血管最高区域的平均值。
7.TUNEL试验
使用末端脱氧核酸转移酶(TdT)介导的dUTP标记(TUNEL)方法检测凋亡细胞。为此，我们使用ApopTag
Figure 10003_10
Plus过氧化酶原位凋亡检测试剂盒(SerologicalCorporation，Norcross，GA)。根据生产商的步骤进行染色。将试剂盒内的切片染色作为阳性对照。在光学显微镜(×400放大率)下计数随机选择区域中凋亡细胞数目，以至少1000个计数细胞中的百分比计算凋亡指数。
8.细胞存活分析
在4孔板(Nunc，Roskilde，Denmark)中接种HUVEC后的12小时用不含血清/生长因子的培养基替换原有培养基。在血清/生长因子饥饿12小时后，用含有MDA-7蛋白(10ng/ml)(从293细胞培养基中得到的)、血管抑素(100ng/ml)或内皮抑素(100ng/ml)的完全培养基处理细胞。12小时以后，在室温下用137Cs单位(3.4Gy/min)照射细胞、用胰蛋白酶处理并计数。将已知数目的细胞重新接种于60mm培养皿中，并孵育使其产生大的细胞集落。14天后对集落的数目进行计数，并根据未照射细胞的存活率，计算百分比接种效率和治疗后的存活百分率。
9.统计分析
适当采用单向ANOVA或斯氏t测验确定统计显著性。如果p＜0.05，认为差异具有显著性。
结果
1.Ad-mda7和放射联合治疗对A549异种移植肿瘤的效果
将A549细胞s.c.注射进无胸腺裸鼠的后腿中(n＝20)。当肿瘤体积达到200mm3时(第0天)，将动物随机分至4个治疗组中：对照组(注射盐水)、仅接受放射治疗(在第6天接受1次5Gy的治疗)、仅用Ad-mda7治疗(第1、3和5天分3次共3×1010vp)或联合治疗(Ad-mda7加上放射治疗)。根据最初在SW620异种移植物上使用Ad-p53的研究选择该治疗方案，而且该治疗方案与在A549上测试Ad-p53和放射联合治疗的后续研究所使用的方案相同(Kawabe等，2002；Spitz等，1996)。从而能比较Ad-p53和Ad-mda7使A549异种移植肿瘤对放射治疗敏感的能力。如图54所示，单独用放射或单独用Ad-mda7仅能中等程度延迟肿瘤的生长。另一方面，用Ad-mda7和放射联合治疗导致实质性的长期延迟肿瘤的生长(图54A)。对于我们的动物方案，当肿瘤的直径达到15mm时，必需处死小鼠。记录了每只小鼠被处死的时间并作图54B。可见，联合治疗大大延长了该时间，而且该组5只动物中的1只得到治愈，该动物共存活240天后被处死。验尸时该动物中没有发现肿瘤。
2.治疗方案决定了联合治疗的效果
为了确定一次施以3×1010vp Ad-mda7和5Gy照射进行联合治疗的最佳方案，检测了以下治疗方法：对照，Ad-mda7(第1天)加照射(第6天)，Ad-mda7(第5天)加照射(第6天)，或照射治疗(第6天)加Ad-mda7(第7天)。肿瘤生长延迟的结果表明联合治疗的最佳时间是在给予Ad-mda7后5天进行5Gy照射治疗(图55)。
3.给予Ad-mda7后肿瘤中MDA-7蛋白的表达
在第8天用免疫组化检查样品中MDA-7蛋白的表达。给予Ad-mda7治疗以后，在肿瘤中细胞质内检测到MDA-7蛋白的强表达，而在未接受Ad-mda7的肿瘤中没有检测到特异性染色。该模式在同样接受放射治疗的样品中未见改变。
4.用Ad-mda7和放射联合治疗在体内加强了凋亡的诱导
过去，曾经在体外治疗中观察到在NSCLC细胞中联合进行Ad-mda7与放射治疗时，对凋亡的诱导有所增强(Kawabe等，2002)。为了确定在体内是否同样能观察到类似的凋亡增强，在各种治疗以后对收集的样品进行了TUNEL染色。观察到TUNEL阳性细胞散布遍及组织切片的各处，尤其在治疗组的样品中。对TUNEL阳性细胞计数，所得的数值表示在图63中。用Ad-mda7和放射联合治疗得到的凋亡指数扣除1.2％的背景水平后为4.6％，高于单用放射治疗(2.2％)或单用Ad-mda7(1.3％)的叠加值。
5.Ad-mda7阻遏了因放射治疗诱导的新生血管形成因子表达的增强
用免疫组化分析了第14天收集的样品中VEGF，bFGF和IL-8蛋白的表达。对每个样品都记录了阳性细胞的百分比，将所得值作图64A-64C。在未治疗对照组中可以看见这些新生血管形成标记的每一种的一些组成型表达。然而，单用放射治疗大大增强了每种蛋白的表达量。Ad-mda7治疗抑制了VEGF和bFGF的组成型表达水平，并且基本上阻遏了由放射治疗诱导的所有这3种新生血管形成标记表达的增强。
6.用Ad-mda7和放射联合治疗抑制微血管密度
先前的报道提出Ad-mda7通过抑制新生血管形成来抑制肿瘤生长(Saeki等，2002)。因此，评估了Ad-mda7作为单一治疗制剂和与放射治疗联合对新生血管形成的效果。第14天收集肿瘤组织，取冷冻切片作CD31(血小板内皮细胞粘附分子-1)染色评估微血管密度。CD31染色切片微血管密度评估表明，在未接受治疗的对照肿瘤组中，每400个视野平均微血管数目为45±12。单用Ad-mda7和单用放射疗法可以部分抑制微血管的生长，计数分别为26±3和30±6。然而，在Ad-mda7和放射联合治疗的肿瘤中，平均微血管数目进一步受到抑制，为12±2(图58)。联合治疗微血管密度降低了3.8倍，与其它组相比具统计学显著性。
7.重组人MDA-7蛋白使内皮细胞对放射治疗敏感
过去的研究报道Ad-mda7感染的肿瘤细胞可以分泌MDA-7蛋白，其可起低浓度细胞因子IL-24作用(Dumoutier等，2001；Wang等，2002)。因此，Ad-mda7放射致敏A549异种移植肿瘤的能力可能是某些因素的联合作用，这些因素包括直接放射致敏感染的肿瘤细胞、抑制新生血管形成因子、加上感染肿瘤细胞分泌的MDA-7蛋白的抗新生血管形成和放射致敏特性。为了测定分泌MDA-7蛋白对内皮细胞的放射致敏效果，使用人脐静脉内皮细胞(HUVECs)进行了克隆存活试验。在接受照射之前，先用含有重组人MDA-7蛋白的培养基预处理HUVECs 12个小时。此培养基来自培养的分泌MDA-7蛋白的293细胞的培养基。如图59A所示，在估计浓度为10ng/ml时，MDA-7蛋白使HUVECs对电离辐射敏感。作为阳性对照，我们还用100ng/ml的血管抑素对HUVECs进行预处理(图59B)或用内皮抑素进行预处理(图59C)。血管抑素和内皮抑素分别是血纤维蛋白溶酶原和胶原蛋白XVIII的蛋白水解片段，两者都定义为抗新生血管形成制剂(O’Reilly等，1994；O’Reilly等，1997)。过去的报道表明血管抑素和内皮抑素都能使内皮细胞对放射线敏感(Mauceri等，1998，Hanna等，2000)。尽管在100ng/ml的浓度下，血管抑素和内皮抑素都能对HUVECs产生放射致敏效果(图59B，C)，但在这方面MDA-7蛋白似乎更有效。
8.重组人MDA-7蛋白不能使A549细胞或正常人成纤维细胞对放射线敏感
过去报道在体外，Ad-mda7能放射致敏A549细胞，但不能放射致敏正常的人肺成纤维细胞CCD16细胞(Kawabe等，2002)。为了评估重组的人MDA-7蛋白能否使这些细胞对放射敏感，如上所述，使用来自稳定转染的293细胞的条件培养基进行克隆试验。结果表明MDA-7蛋白不能对A549细胞或CCD16细胞产生放射致敏效果(图60A，B)。
实施例28：MDA-7肿瘤抑制蛋白的抗癌活性由内质网(ER)的信号所介导
该研究针对的问题是如果使细胞内MDA-7蛋白靶向特定的亚细胞位置，该蛋白的杀伤活性是否会增强。使用能将表达的蛋白质靶向各亚细胞区域的载体构建了几个mda-7质粒，所述靶向的亚细胞区域包括细胞质、细胞核和ER(图61)。此外，将全长的mda-7cDNA(包括分泌信号)亚克隆到细胞质骨架中。通过转染至肺肿瘤细胞，评估重新靶向载体MDA-7蛋白的表达，western印迹分析发现，所有的载体都导致细胞内MDA-7高水平表达。免疫组化分析确认了亚细胞重新靶向的MDA-7蛋白表达。使用流式细胞仪和集落形成试验研究了重新靶向的MDA-7杀伤癌细胞的能力(图62)。靶向细胞质和细胞核的MDA-7构建物不能引起细胞死亡，而全长(分泌型的)MDA-7具有细胞毒性。靶向ER的mda-7构建物也能在肿瘤细胞中引起细胞死亡(图63)。因此，似乎MDA-7必需进入分泌途径才能有效地诱导凋亡。
实施例29：在人外周血单核细胞中MDA-7的细胞因子诱导作用
1.在人外周血单核细胞(PBMC)中表达MDA-7
在用促有丝分裂凝集素刺激整个PBMC细胞群后，首先使用免疫印迹检测MDA-7/IL-24蛋白是否存在。在Histopaque(Sigma，St.Louis，MO)上离心，从而从正常健康献血者的外周血中分离出PBMC。以1×106细胞/ml的密度将细胞培养在RPMI-1640基础培养基中，添加了L-谷氨酸、Hepes、青霉素、链霉素和10％的人AB型血清(Pelfreez，Brown Deer，WI)，在存在5μg/ml PHA-P或10μg/ml LPS(都购自Sigma，St.Louis，MO)的条件下培养72hr。收集前4小时，以终浓度10μg/ml加入Brefeldin A(BFA，Sigma-Aldrich)来抑制细胞因子分泌。根据标准方案，制备活化PBMC细胞的细胞裂解物。将煮沸还原的样品在12％的凝胶上用SDS-PAGE分离，转移到硝酸纤维素膜上。膜封闭后，将膜与兔抗-MDA-7多克隆抗体一同孵育，洗涤并偶联HRP的山羊抗兔二抗一同孵育。用ECL试剂(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)对印迹显影。将膜剥离，并用抗肌动蛋白抗体再检测。
检测了PHA和LPS刺激后72小时PBMC中MDA-7的表达。用直接偶联的抗体和MiniMax(Miltenyi Biotec，Sunnyvale CA)进行磁性细胞分选，将所得的活化细胞群体分成CD3+，CD19+，CD56+亚群。用7G9抗MDA-7单克隆抗体染色作免疫组化染色确定这些细胞群MDA-7的表达。此时，CD3+细胞为MDA-7阴性，而CD19+、B细胞以及CD56+、NK细胞为MDA-7阳性。根据这些结果，设计实验来测定活化PBMC中MDA-7表达的动力学。
2.PHA诱导PBMC产生IL-24蛋白质和mRNA
为了测定在活化细胞中诱生IL-24的动力学，用PHA刺激PBMC并检测该蛋白的早期表达。用细胞内流式细胞技术测定MDA-7蛋白的表达，用实时RT PCR检测PBMC mRNA的表达。
用含有10％正常人血清和5μg/ml PHA的培养基刺激PBMC0，2，6，12，24和48小时。在指定时间分离细胞测定蛋白质水平，分离RNA。根据生产商的方案(Applied Biosystems，Foster City CA)，应用TaqMan OneStep程序进行实时RT-PCR。MDA-7和HPRT基因的特异性引物/探针购自Applied Biosystems。根据生产商的方案，使用ABI Prism 7900HT序列检测系统进行反应，使用序列检测软件2.9版进行分析。用细胞内FACs分析检测MDA-7蛋白。在收集细胞之前4hr，以10μg/ml浓度的Brefeldin A处理细胞，来抑制细胞因子的分泌。在可以使用的情况下，先用直接偶联的抗体对细胞表面进行染色，然后再检测细胞内蛋白，用4％的多聚甲醛处理固定细胞，再用去污剂7mg/ml的正辛基吡喃葡萄糖苷增强细胞的渗透性。作为渗透性对照，还用针对细胞内蛋白波形蛋白的单克隆抗体进行染色。接下去，用标准方案进行免疫荧光染色。在FACSCalibur上用细胞检索软件(BD Immunosciences)分析免疫荧光。
作为这些实验的对照，还分析了IL-2的表达。发现MDA-7的信使(mRNA)跟在IL-2的后面，在刺激后6至8小时达到峰值，与未刺激的PBMCs相比，其增加倍数达到11,000。用细胞内流式细胞技术检测MDA-7蛋白表达在8小时达到最大值，跟在信使之后。
3.MDA-7的细胞因子诱导
以上实验表明MDA-7mRNA在PHA刺激后较早达到峰值。为了确定哪些细胞因子促进其表达，用IL-2刺激PBMC，IL-2是PHA激活期间产生的主要细胞因子。用含有10％人血清的培养基刺激正常的PBMC。在特定的时间收集细胞，并用细胞内FACs检测MDA-7蛋白的表达情况，用实时RT PCR检测MDA-7mRNA的表达。
发现蛋白表达在4hr时开始上升。表达水平低于用PHA刺激所见，这能反映出与纯化的细胞因子刺激相比，促有丝分裂刺激的强度。还能反映出不表达IL-2受体的细胞也产生MDA-7。mRNA表达提示双相动力学特征，一个峰值出现在1hr，然后降低至12hr处再度升高。在另一个实验中，在PHA刺激开始时，将中和性IL-2抗体加入PBMC中。8hr时收集细胞，并用细胞内FACs检测MDA-7蛋白，用RT PCR检测mRNA。与IgG对照相比，MDA-7蛋白和mRNA的表达受到约50％抑制。
还检测了其它细胞因子诱导休眠PBMC表达MDA-7的能力。在用100U/ml的IL-2，IL-4，IL-7，IL-15或IFNγ刺激后的6hr，分析PBMC的MDA-7表达情况。此时，IL-7和IL-15刺激MDA-7mRNA和蛋白质的表达。
这些数据显示IL-2，IL-7和IL-15参与PBMC中上调对MDA-7的表达。这三种细胞因子共用相同的细胞因子受体γ链(γc)。IL-7R由一个独特的α-链和γc组成。而IL-2R和IL-15R由三个亚基组成：IL-2/IL-15Rβ、γc以及各有一个独特的α-链。大量证据表面与含有γc的受体相结合的细胞因子参与T细胞的维持和自身稳定。这些细胞因子刺激MDA-7在PBMC中的表达则暗示MDA-7可能也参与T细胞自身稳定。
4.用抗IL2R抗体阻遏II-24的表达
为了进一步确立与γc结合的细胞因子是否对MDA-7的表达起作用，使用针对IL-2受体三个亚基(IL-2Rα，IL-2/IL-15Rβ和γc(IL-2Rγ))的封闭抗体(R&DSystems，Minneapolis，MN)进行研究，试图阻遏PHA活化的PBMC中MDA-7的诱导表达。预先加入含有PHA的培养基中的抗体浓度为5μg/ml，以小鼠的IgG作为非特异性阻遏对照。在三次独立的实验中，都观察到了MDA-7mRNA表达的阻遏，抗IL2Rα的阻遏率从0％至24％，抗-IL2/IL-15Rβ的阻遏率为19％至36％，抗-IL2Rγ的阻遏率为15％至26％。
在PHA刺激之初加入抗-IL-2单克隆抗体阻遏了MDA-7蛋白的表达。因此，IL-2，IL-7和IL-15可诱导PBMCs表达MDA-7。这三种细胞因子都利用功能性IL-2受体的组分。这些结果支持了以下观点，即MDA-7是参与Th1型免疫反应的促炎性细胞因子。
实施例30：MDA-7/IL-24介导的人卵巢癌细胞的杀伤涉及Fas/FasL信号通路
材料和方法
1.细胞系和试剂
Dr.J.K.Wolf(M.D.Anderson Cancer Center，Houston，TX)惠赠了人卵巢癌细胞系OVCA 420和MDAH 2774。细胞生长在添加了10％FBS的最低非必需氨基酸培养基中。人成纤维细胞系CCD-16购自ATCC(Rockville，MD)。AP-1通用寡核苷酸(5′-cgcttgatgagtcagccggaa-3′(序列号：3))购自Promega(Madison，WI)。携带mda-7的腺病毒(Ad-mda7)或携带荧光素酶基因的腺病毒(Ad-luc)来自IntrogenTherapeutics，Inc.(Houston，TX)。
2.测定转导效率
使用表达GFP基因的腺病毒(Ad-GFP)测定人卵巢癌细胞系和正常成纤维细胞系(MRC-9)的转导效率。将细胞(MDAH 2774，OVCA 420和MRC-9)以5×105细胞每孔的密度接种到6孔组织培养皿中。第二天，细胞或者不感染(模拟)或者以2500，3000，5000，10000病毒颗粒每个细胞(vp/细胞)感染Ad-GFP。感染后24小时，洗涤细胞，重新悬浮于PBS中，并用流式细胞法进行分析。在3000vp/细胞时，所有细胞系90％以上的细胞都被转导。因此，对于以下所有实验，我们使用的moi都为3000vp/细胞。
3.细胞增殖试验
肿瘤细胞(MDAH 2774和OVCA 420)以及正常(MRC-9)细胞以1×105细胞每孔的密度接种于6孔组织培养皿中。第二天，用PBS、Ad-luc或Ad-mda7处理细胞(3000vp/细胞)。在感染后的1，2，3，4和5天收集细胞，并用台盼兰试验进行计数。至少进行三次独立实验，结果表示为三次实验的平均值。
4.细胞周期分析
在6孔板中用PBS、Ad-luc或Ad-mda7(3000v.p./细胞)处理肿瘤(MDAH 2774和OVCA 420；5×105)细胞，37℃培养。处理后的24、48和72小时，收集细胞，用PBS洗涤，并用70％的乙醇在-20℃条件下固定过夜。然后，将细胞重新悬浮于含有RNase A(1mg/ml)和50μg/ml碘化丙锭(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)的PBS中，并进行FACS分析。在这些实验中，未感染细胞用作阴性对照。
5.凋亡细胞染色
以5×105细胞每孔的密度将细胞(MDAH 2774和OVCA 420)接种于6孔板中，并用PBS、Ad-mda7或Ad-luc(3000v.p./细胞)处理。感染后72小时，将细胞与Hoechst 33342(Sigma，St.Louis，MO，USA)一同孵育15min，用PBS洗涤两次，并在荧光显微镜下进行观察，片段化的细胞核为凋亡细胞。
6.Western印迹分析
使用本领域普通技术人员已知的技术对PBS、Ad-mda7或Ad-luc处理过的肿瘤细胞实施Western印迹分析。使用以下一抗：PKR、磷酸特异性p38、pJNK、p44/42、peIF2、胱冬酶-9(Cell Signaling，Boston，MA)；胱冬酶-3、PARP、FAF1、FADD、Fas和FasL(PharMingen，San Diego，CA)。MDA-7多克隆抗体来自Introgen Therapeutics，Inc.(Houston，TX)。利用Amersham的增强型化学发光蛋白印迹检测系统在增强型化学发光胶片(Hyperfilm，Amersham)上观察蛋白。
7.电泳迁移试验(EMSA)
在6孔板中用Ad-luc或Ad-mda7(3000v.p./细胞)处理MDAH 2774(5×105)。在不同的时间点(24，48，和72h)收集细胞，并制备其细胞质和细胞核的提取物，再用本领域普通技术人员已知的技术对提取物进行EMSA。简言之，使用T4多聚核苷酸激酶将AP-1共有序列的双链寡核苷酸(Promega)进行[γ-32P]-ATP末端标记。典型的结合反应混合液含有标记寡核苷酸和0.5μg聚(dI-dC)以及核蛋白提取物(10μg)，将其在5X凝胶迁移结合缓冲液[20％甘油、5mM MgCl2、2.5mM EDTA、2.5mM DTT、250mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH 7.5)]中25℃孵育30分钟。用非变性的5％聚丙烯酰胺凝胶在0.5X Tris-硼酸EDTA缓冲液中分离复合物，电泳时间为1h30min，电压为300V.。用放射自显影法显示条带，并用Image Quant软件(Molecular Dynamics，Amersham-Pharmacia，Biotech，Piscatway，NY)进行计量。
8.Rnase保护试验(RPA)
以5×105的密度在6孔板中接种细胞(MDAH 2774)，并用PBS、Ad-luc或Ad-mda7进行处理。在处理后的24、48和72h，使用Trizol试剂分离这些细胞的总RNA。使用hApo-3Multio-Probe探针模板组(Pharmingen)来分析以下凋亡相关基因的mRNA转录物：胱冬酶-8、Fas、FasL、FADD、FAF-1、TRAIL、TNFr、TRADD和RIP以及内部对照L32和甘油醛-3-磷酸脱氢酶。根据生产商说明，使用RiboQuant Multio-Probe RNA酶保护试验系统(PharMingen)实施探针的合成、杂交和RNA酶处理。在变性聚丙烯酰胺凝胶(5％)上电泳分离保护的转录物，-80℃曝光hyperfilm胶片过夜。
9.Fas启动子分析
用质粒(FHR+)转染接种于6孔板中的MDAH 2774细胞(5×105)，该质粒含有受人Fas(CD95)启动子控制的荧光素酶基因。在这些实验中，用质粒(Δ6)转染的细胞作为对照，该质粒在Fas启动子中有一个突变。使用DOTAP脂质体实施转染。转染后6小时，用PBS、Ad-βgal、或Ad.mda-7处理细胞。在处理后的不同时间点(12，24，48h)收集细胞，用PBS洗涤，用200μl报告裂解缓冲液(Promega)裂解细胞。用前文所述的方法测定荧光素酶的表达，表示为每毫克蛋白质所发出的相对光单位(RLU)。至少重复实验两次，实验结果为平均值。
10.SiRNA分析
使用本领域普通技术人员熟知的方法进行用SiRNA分析。
结果
1.Ad-mda7选择性地抑制卵巢癌细胞的增殖
用Ad-mda7和Ad-luc感染卵巢癌细胞(MDAH2774，OVCA420)(3000vp/细胞)。在感染后的不同时间点收集细胞，并分析MDA-7蛋白的表达情况和生长抑制效果。用PBS处理的细胞作为对照。在所有用Ad-mda7处理的细胞系中均观察到外源MDA-7蛋白的表达。用PBS或Ad-luc处理的细胞也显示出少许表达。然而，这是由于抗-MDA7多克隆抗体与非特异性蛋白的交叉反应。尽管在所有的细胞系中均观察到MDA-7表达，然而，与PBS和Ad-luc处理的细胞相比，仅在MDAH2774和OVCA 420细胞中观察到显著的(P＝0.001)由Ad-mda7引起的生长抑制(图64)。在用Ad-mda7处理的Hey和DOV13肿瘤细胞系中没有观察到显著的生长抑制效果。
2.MDA-7在卵巢细胞中诱导G2/M细胞周期停滞和凋亡
接下去研究了Ad-mda7引发生长抑制的作用机制。与用PBS和Ad-luc处理的细胞相比，Ad-mda7处理的MDAH2774(图65A)和OVCA 420细胞(图65B)中处于G2/M期的细胞数目显著增加。然而，在Ad-mda7处理的Hey、DOV13和SKOV3-ip细胞中，没有观察到G2/M期细胞数目的显著改变。与细胞周期停滞相关的是如Hoechst染色所证明诱导了MDAH2774和OVCA 420细胞凋亡(图66)。在用PBS或Ad-luc感染的细胞中没有观察到凋亡变化。
3.PKR诱导卵巢细胞的凋亡
为了研究MDA-7诱导凋亡的分子机制，对各种曾经显示参与MDA-7的信号分子的表达进行了分析。曾经提出PKR在dsRNA、病毒和胁迫介导的凋亡中起作用(Lee等，1994；Yeung等，1996；Kibler等，1997)。据报道，Ad-mda7在肺癌细胞系A549和H1299中诱导的凋亡由PKR介导。因此，进行了研究以确定用Ad-luc和Ad-mda-7处理以后，PKR的活性在敏感(MDAH 2774，OVCA 420)和抗性(Hey和DOV 13)细胞系中是否升高。研究发现，Admda-7感染后24-48小时，MDAH2774和OVCA 420细胞中PKR水平显著上升，48小时后其底物peIF2升高。然而，用Ad.mda-7感染Hey和DOV13对PKR及其底物peIF2没有诱导作用，它们对于Admda-7的凋亡诱导作用具有抗性。
4.用MDA-7处理MDAH 2774细胞诱导MAPKs、JNK和p38的活化
进行实验以确定MDA-7向Fas的信号传递是否通过p38和/或JNK通路。在多种癌细胞中，引发胁迫诱发凋亡的通路中都包含JNK和/或p38MAPK的激活(磷酸化)过程。Admda-7处理后，用western印迹法分析了MDAH 2774和OVCA420中磷酸化-JNK和磷酸化-38MAPK的表达。在MDA-7感染的MDAH 2774和OVCA 420中，磷酸化的JNK和p38水平在48hrs时显著地升高。这一发现提示磷酸化的JNK和p38MAPK参与凋亡过程。为了证实c-Jun和p-ATF2参与此过程，在用Ad-mda7和Ad-luc感染后的24和48h，用Western印迹分析测定了AP-1主要组分(c-Jun和ATF-2)的表达水平。在24和48h时，Ad-mda7显著地提高pcJun和ATF-2的水平。Ad-luc感染细胞和模拟感染(PBS)细胞不激活pc-Jun和pATF-2。这些结果表明c-Jun和pATF2可能参与AP-1活化，并进一步支持AP-1活化刺激FasL的作用。然而，Ad-mda7在抗性细胞系Hey和DOV 13中不激活磷酸化-38，JNK，pc-Jun，ATF-2及其靶分子AP-1。
5.MDA-7刺激通过激活AP-1元件能上调MDAH 2774细胞中CD95L启动子的活性
AP-1是主要的转录因子，包括Jun家族(c-Jun，JunD和JunB)或Jun家族成员与任一Fos家族成员(c-Fos，FosB，Fra-1和Fra-2)或其它转录因子(如，ATF2，CREB和NFAT)形成的异质二聚体。因为所有三个MAPK通路(ERK，JNK和p38)都能激活AP-1，接着进行实验来检验AP-1是否作为传送p38和JNK的整合域而发挥其功能的。用EMSA确定AP-1与合成的AP-1通用序列的结合活性。24和48hrs时，Ad-mda7感染的细胞核裂解物比Ad-luc和PBS处理的细胞核裂解物具有更高的AP-1结合活性。
6.Ad-mda7感染时CD95L水平上调
这些数据表明CD95-CD95L相互作用对于Ad-mda-7感染后的凋亡诱导很重要。为了了解MDAH 2774细胞中Fas转录物的表达状况，使用核糖核酸酶保护实验来测定参与细胞死亡信号转导的几个基因的mRNA水平。发现MDA-7表达后24hrs，Fas，FasL，FADD和胱冬酶-8的mRNA水平升高，而33hrs时，表达水平没有变化。此外，Ad-luc和模拟处理的细胞中Fas，FasL，FADD和胱冬酶-8的mRNA表达水平没有变化。总的看来，这些数据支持以下假设，即MDA-7通过依赖p38和JNK的c-Jun-pATF2/AP-1通路激活FasL。
7.MDA-7表达后，胱冬酶的级联激活
然后研究了引发凋亡的下游靶位。与PBS或Ad-luc处理的细胞相比，在Ad-mda7处理的MDAH 2774和OVCA420细胞中，观察到胱冬酶9和胱冬酶3的活化。与胱冬酶活化相关的是PARP的切割，PARP是胱冬酶的底物。
实施例31：mda-7基因转移利用多种分子通路来抗击癌症
使用复制缺陷型的腺病毒(Ad-mda7)将黑色素瘤分化相关基因7(mda-7)导入细胞中，能在广谱癌细胞中引起生长抑制和细胞凋亡，包括乳房癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌和黑色素瘤细胞。Ad-mda7的细胞毒性活性是肿瘤选择性的，因为正常细胞能够抵抗MDA-7诱导的死亡。使用裸鼠中的多个异种移植模型证实了Ad-mda7的抗肿瘤活性。积累的数据表明MDA-7能够激活对于引起凋亡和十分重要的基因和信号通路(例如，p53，BAX，TRAIL，fas，PKR，MAPK，jnk)，并且抑制存活信号通路(例如PI3K)。
目前的生物信息学和结构分析已经揭示，MDA-7蛋白是白介素-10(IL-10)超家族中的一个新成员，该超家族包括IL-10；-19；-20；-22和-26。mda-7基因包含在位于1q31/32位的细胞因子基因簇中。MDA-7蛋白与IL-10共有6螺旋构型，然而MDA-7不具有IL-10的免疫抑制特性，而是起着Th1细胞因子的作用。MDA-7在激活的淋巴细胞中表达。用MDA-7处理人PBMC能够诱导IL-6、γ-IFN、IL-12、TNF-a和GM-CSF的分泌。这些Th1细胞因子的分泌会被IL-10所抑制。MDA-7也能结合内皮细胞起着强效的抗新生血管形成蛋白作用。这一活性是由IL-22受体所介导的。用Ad-mda7或MDA-7处理黑色素瘤细胞会诱导IL-6和γIFN的分泌。因此，最近将mda-7分类为IL-24，一种具有多重抗肿瘤特性的新型IL-10同源物。这种凋亡诱导、抗新生血管形成和免疫刺激的独特联合应当能为抗击癌症提供强有力的工具。
实施例32：MDA-7/IL-24的异位生成抑制人肺癌细胞的侵袭和迁移
材料和方法
1.细胞培养
NSCLC细胞系A549购自美国典型培养物收集中心(Rockville，MD)。人大细胞肺癌细胞系H1299是Drs.A.Gazdar和J.D.Minna(The University of TexasSouthwestern Medical Center，Dallas，TX)的惠赠。肿瘤细胞培养在含有10％的胎牛血清(FBS；GIBCO-BRL，Grand Island，NY)、抗生素(GIBCO)和L-谷氨酸的RPMI-1640培养基中。实验开始之前，先确定细胞中不含有支原体。使用处于对数生长期的细胞。
2.重组腺病毒载体
携带MDA-7基因的复制缺陷型人5型腺病毒(Ad-mda7)载体的构建已有所述(Saeki等2000，和Mhashilkar等，2001)。在人胚肾293细胞中增殖病毒，并用层析法纯化。
3.细胞迁移试验
以5×105细胞/孔的密度将肿瘤细胞(H1299和A549)接种于6孔组织培养板中。第二天，以2500病毒颗粒/细胞的感染复数用Ad-mda7或Ad-luc感染细胞。感染后6小时，用胰蛋白酶消化细胞，用磷酸缓冲液(PBS)洗涤，并重新悬浮在不含血清的RPMI-1640培养基中。如过去所述的方法(Ramesh等，2003)，在24孔Transwell单元(Millip或e，Cambridge，MA)中进行细胞迁移试验。简言之，使用孔径为8μm的聚碳酸酯滤膜。Transwell单元的下室充入不含血清的培养基，上室中，接种各处理组的1×104细胞一式三份。孵育24h和48h以后，计数通过滤膜而进入下室的细胞，数值表示为上下室细胞总数的百分比。进行4次实验，结果记录为MDA-7的平均值。
在一组平行实验中，肿瘤细胞进行上述的各种处理，在24h和48h时进行细胞活力测试，如过去所述(Saeki等，2000；Mhashilkar等，2001)。进行这些实验的目的是排除MDA-7抑制细胞迁移是由于其细胞毒性引起的可能性。
4.细胞侵袭试验
以5×105细胞/孔的密度将肿瘤细胞(H1299和A549)接种于6孔组织培养板中。第二天，以2500vp/细胞的MOI用Ad-mda7或Ad-luc感染细胞，或用10μMLY 294002(Cell signaling，Beverly，MA)处理，或用1μg/ml MMP-II抑制剂(SantaCruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)处理。转染后，用完全培养基更新原有培养基。感染后6小时，用胰蛋白酶消化细胞，用PBS洗涤，并重新悬浮在不含血清的RPMI-1640培养基中。如过去所述的方法(Stewart等，2002)，在包被了基质胶(Becton，Dickinson和Company，Franklin Lakes，NJ)的24孔Transwell单元中进行细胞侵袭试验。简言之，包被基质胶的Transwell单元的下室充入不含血清的培养基，上室中接种各处理组的1×104细胞一式三份。孵育24h和48h以后，计数通过包被基质胶的滤膜进入下室的细胞，作为侵袭的测量值。计数每种处理的侵袭细胞数目，表示为上下室细胞总数的百分比。至少进行3次实验，结果记录为这些实验的平均值。
5.明胶酶谱分析
为了确定Ad-mda7治疗对MMP产生的影响，如过去所述(Zhang等，2002)进行明胶酶谱试验。简言之，将生长在低血清(1％FBS)培养基中的肿瘤细胞(H1299和A549)以5×105细胞/孔的密度接种于6孔组织培养板中并以2500vp/细胞的MOI用Ad-mda7或Ad-luc感染细胞。在这些实验中，用PBS处理的细胞作为阴性对照。感染后6h，去除培养基并用含有1％FBS的新鲜培养基替换。感染后24h和48h，收集细胞培养上清液，离心澄清，在与明胶共聚合的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)中进行电泳。然后洗涤凝胶，与反应缓冲液(50mM Tris-HCl[pH 7.4]，0.02％NaN3，和10mM CaCl2)一同孵育，在37℃条件下持续震摇16h，染色并脱色。测定培养清液中蛋白质浓度以证实诸试验采用了相同量。用ImageQuant软件(Amersham Pharmaci Biotech，Piscataway，NJ)定量MMP-2和-9的相对活性。
6.免疫印迹
如过去所述(Saeki等，2000)使用多种抗体进行免疫印迹分析。简言之，用胰蛋白酶消化收集细胞，并将细胞重新悬浮在裂解缓冲液中(62.5mM Tris-HCl，2％SDS，10％甘油，和4M尿素)。将蛋白质样品(每份50μg)稀释加入20μl的裂解缓冲液和5％2-巯基乙醇的溶液中(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，95℃水浴加热5min。然后，用10％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在垂直平板凝胶电泳装置(Bio-Rad)中分离蛋白提取液。接着，将分离的蛋白质从凝胶上转移到硝酸纤维素膜上(Hybond-ECL；Amersham Pharmacia Biotech，Buckinghamshire，England)，再用封闭溶液(溶解在PBS中的5％的奶粉和0.3％Tween 20)封闭1h。然后，将膜与MMP-2，MMP-9和p85 PI3K(Santa Cruz Biotechnology)、磷酸化FAK(Pharmingen，San Diego，Ca)、MDA-7(Introgen Therapeutics，Inc.，Houston，TX)和β-肌动蛋白(Sigma Chemicals)的一抗共同孵育。然后，将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗一同孵育(Amersham，England)。最后，利用Amersham的增强型化学发光蛋白印迹检测系统在增强型化学发光胶片(Hyperfilm，Amersham)上观察蛋白。使用ImageQuant软件(Amersham Pharmaci Biotech，Piscataway，NJ)定量各种处理后蛋白表达水平的相对改变，以PBS处理的细胞所得值作为1，以所得值与1的比值表示。
7.实验性肺癌转移模型
为了确定MDA-7/IL-24的产生是否能抑制癌转移，使用实验性肺癌转移模型(Ramesh et al.，2001)进行动物实验。简言之，对接种于150-mm组织培养皿中的A549肿瘤细胞(5×106)用PBS、Ad-luc或Ad-mda7进行处理(2500vp/cell)。感染后6h，收集细胞、洗涤、并重新悬浮于灭菌PBS中，最终体积为1ml(1×106细胞/100μl)。将细胞通过尾静脉注射入雌性裸鼠。每个处理组5只动物。细胞注射后3周，吸入CO2处死动物。如过去所述(Ramesh等，2001)，在三组中每只小鼠的气管内注射墨汁，并在Fekete’s溶液中固定。在解剖显微镜下对每个肺内的转移肿瘤进行计数，测定MDA-7/IL-24对肿瘤转移的作用。实验进行2次，结果记录为2次实验的平均值。
8.统计分析
使用ANOVA和Mann-Whitney检验计算实验结果的统计学显著性。如果P值低于0.05，认为组间差异具有统计学显著性。
结果
1.MDA-7/IL-24抑制肿瘤细胞迁移
用Ad-mda7处理的肿瘤细胞的迁移能力显著(P＝0.002)低于Ad-luc或PBS处理的细胞(图67)。用Ad-mda7处理后，迁移细胞(A549和H1299)的数目(＜250细胞)显著地低于PBS(＞500)或Ad-luc(＞350)处理后的细胞数。48h时观察到的抑制效果高于24h时观察到的抑制效果。为了证明对细胞迁移的抑制不是由MDA-7/IL-24-介导的细胞死亡所引起的，在一组独立但平行的实验中，对PBS、Ad-luc和Ad-mda7处理的细胞进行感染后24h和48h的细胞活力试验。在这两个时间点没有观察到细胞活力的显著差异，表明MDA-7/IL-24对细胞迁移的抑制不是由于细胞死亡造成的(图67B)。注意，转导后的24h，所有三个实验组都一样(superimposable)，表明没有显著的细胞死亡。到48hr时，出现了一些细胞死亡，然而使用这样的载体剂量时，仅在转导后的72和96hr才观察到显著的Ad-mda7介导的细胞死亡。这些结果表明MDA-7/IL-24的确抑制细胞迁移。
2.MDA-7抑制肿瘤细胞侵袭
在Matrigel侵袭实验膜的外膜上，Ad-mda7处理的肿瘤细胞数比PBS或Ad-luc处理的细胞少，表示Ad-mda7处理的肿瘤细胞具有更低的侵袭性(图68)。在A549细胞和H1299细胞中，Ad-mda7处理后侵袭细胞的数目(＜50细胞s；P＝0.001)都显著地低于PBS(＞140细胞)或Ad-luc(＞150细胞)处理后的侵袭细胞数目。由MDA-7带来的抑制效果与LY 94002、PI3K抑制剂或MMP-II抑制剂处理的细胞中观察到的抑制效果相似。细胞活力试验表明抑制不是由MDA-7/IL-24-介导的细胞死亡引起的。这些结果表明MDA-7/IL-24的确能抑制细胞侵袭。
3.MDA-7下调细胞迁移和侵袭相关蛋白质的产生
用Western印迹分析检测了细胞迁移和侵袭信号通路相关蛋白质的调控。使用的细胞系是含有野生型p53(A549)和不含p53(H1299)的细胞系。在PBS或Ad-luc处理的肿瘤细胞中，没有观察到MDA-7IL-24的产生，但是在Ad-mda7处理的细胞中发现了MDA-7IL-24的高水平表达。在H1299和A549肿瘤细胞系中MDA-7/IL-24蛋白的过度产生导致p85PI3K和pFAK产生减少以及pJNK，p38MAPK和p44/42MAPK产生增加。相反，在PBS或Ad-luc处理的细胞中，没有观察到这些蛋白产生的显著变化。在PI3K抑制剂LY 294002处理的细胞中也观察到了p85 PI3K和pFAK的抑制，尽管在两个细胞系中抑制情况有所不同。过度表达MDA-7的细胞系中pFAK表达的降低高于LY294004处理的细胞系。此外，LY 294002处理造成H1299细胞中p38 MAPK和p44/42M APK产生增加。在A549细胞中，LY 294004加强pJNK和p44/42 MAPK的产生。这些结果表明与LY 294002一样，MDA-7选择性地抑制PI3K，而对本实验研究的其它信号分子没有显著影响。
4.MDA-7/IL-24抑制肿瘤细胞中基质金属蛋白质酶的产生
然后，用酶谱和western印迹分析检测了过度表达MDA-7的肿瘤细胞中MMP的调控。酶谱和Western印迹分析表明，与PBS或Ad-luc处理的细胞相比，Ad-mda7处理的A549肿瘤细胞中MMP-2和-9蛋白的产生减少。对于H1299细胞，与PBS或Ad-luc处理的细胞相比，在Ad-mda7处理的细胞中观察到MMP-2减少，但是MMP-9不减少。酶谱分析的结果与Western印迹分析的结果相互关联。因此，在p53野生型和p53缺失的NSCLC细胞系中，Ad-mda7能调节MMP的表达和活性。
5.MDA-7/IL-24抑制实验性肺癌转移
在使用A549人肺癌细胞的实验肺癌转移裸鼠模型中，注射Ad-mda7处理的肿瘤细胞的小鼠中，形成的肺肿瘤节结数显著(P＝0.01)少于注射PBS或Ad-luc处理的肿瘤细胞的小鼠(图69)。实验性癌转移的抑制与组织染色显示肿瘤数少相关联。
为了进一步证实实验性癌转移的抑制不仅仅是由细胞死亡引起的，还进行了体内实验。与未接受治疗或用DOTAP：Chol-CAT复合物治疗的小鼠相比，用DOTAP：Chol-mda7治疗肺部荷瘤动物使实验癌转移显著地(P＝0.001)受到抑制(图70)。我们认为抑制实验性癌转移的能力是与抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭间接相关的。这些结果表明MDA-7在体内也能抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，这与体外研究的结果一致。
实施例33：用脂质体介导MDA-7/IL-24基因递送后局部和系统性抑制了肺肿 瘤的生长
材料和方法
1.材料
所有的脂质(DOTAP，胆固醇)购自Avanti Polar Lipids(Albaster，AL)。Ham’s/F12培养基和胎牛血清(FBS)购自GIBCO-BRL-Life Technologies(NewYork，NY)。多克隆兔抗人MDA-7抗体来自Introgen Therapeutics，Inc.(Houston，TX)，抗小鼠CD31抗体来自Santa Cruz Biotechnology，Inc.(Palo Alto，CA)。
2.细胞系和动物
人非小细胞肺癌细胞系A549来自美国典型培养物收集中心，培养在添加了10％FBS、1％谷氨酸和抗生素的Ham’s-F12培养基中。鼠UV2237M细胞来自Dr.Isaiah J.Fidler(M.D.Anderson Cancer Center)，培养条件如文献所述(Ramesh等，2001)。定期给细胞传代并检测是否存在支原体。本研究使用的4至6周龄的雌性BALB/c裸鼠(nu/nu)(Harlan-Sprague Dawley Inc.，Indianapolis，IN)和C3H/Ncr小鼠(National Cancer Institute，Fredericksburg，MD)，饲养在无病原体环境中，并根据已建立的动物饲养和使用指南进行处理。
3.质粒的纯化
本研究使用的质粒是在pVax质粒载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中克隆得到的，并用文献所述的方法纯化(Templeton等，1997；Gaensler等，1999)。简言之，将携带在巨细胞病毒(CMV)启动子控制下的细菌β-半乳糖苷酶(Lac-Z)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)或人mda-7cDNA的质粒转入大肠杆菌宿主菌株DH5α中，并在卡那霉素筛选条件下生长。使用鲎生色变形细胞裂解物动力学试验试剂盒(Kinetic-QCL；Biowhittaker，Walkersville，MD)测定纯化质粒的内毒素水平。纯化质粒的DNA浓度和纯度用OD 260/280比值确定。
4.DOTAP：Chol脂质体的合成和DOTAP：Chol-DNA混合物的制备
如文献所述的方法(Chada等，2003；Templeton等，1997)，合成DOTAP：Chol脂质体并挤压通过孔径逐渐减小(1.0，0.45，0.2，和0.1μm)的Whatman滤膜(Kent，UK)。在对小鼠注射前2至3小时，制备新鲜的DOTAP：Chol-DNA复合物。
5.颗粒尺寸分析
使用N4颗粒尺寸分析仪(Coulter，Miami，FL)分析新鲜制备的DOTAP：Chol-DNA复合物的平均粒径寸。脂质体-DNA复合物的平均粒径在300nm至325nm之间。
6.DOTAP：Chol-mda7复合物对皮下肿瘤异种抑制物的作用
在所有的实验中，将悬浮在100μl无菌磷酸缓冲液(PBS)中的5×106肿瘤细胞(A549)注射到小鼠右侧背。当肿瘤体积达到4-5mm2时，将动物随机地分成几个组并开始接受治疗。将荷瘤动物分成4个组，每组6只动物。第1组不接受治疗，第2组接受PBS，第3组接受DOTAP：Chol-LacZ复合物(50μg/剂)，而第4组则接受DOTAP：Chol-mda-7复合物(50μg/剂)的治疗；所有治疗试剂经肿瘤内注射，每日一次，共6剂。根据动物实验指南，肿瘤内注射时用二氟二氯乙基甲醚(Schering-Plough，Kenilworth，NJ)麻醉动物。每两天由不了解各治疗组情况的观测者记录肿瘤测量结果，使用公式V(mm3)＝a×b2/2计算肿瘤体积，其中“a”是最大尺度，“b”是正交直径(Saeki等，2002；Ramesh等，2001)。用每组中所有动物的累计肿瘤体积代表了抗肿瘤效果，这种累计考虑了肿瘤体积和数目。在所有的实验中，用ANOVA测定肿瘤体积变化的统计学显著性。
为了检测mda-7对小鼠肿瘤细胞的作用，使用同源的肿瘤模型。为了这一目的，对C3H小鼠皮下注射鼠UV2237m纤维肉瘤细胞(1×106)，将小鼠分成三组(n＝8/组)。当肿瘤体积达到4-5mm2-时，动物接受以下物质瘤内治疗：不治疗(对照)，DOTAP：Chol-CAT复合物，或DOTAP：Chol-mda-7复合物。治疗时间表和治疗效果分析A549肿瘤模型所述相同。重复实验2次，作显著性统计学分析。
7.测定MDA-7、凋亡和CD31
分别收集nu/nu或C3H小鼠中形成的皮下A549或UV2237m肿瘤，并用4％缓冲甲醛固定，包埋在石蜡中，切成4-μm的切片。如文献所述(Saeki等，2002；Ramesh等，2003)，对组织切片进行免疫染色，以确定MDA-7转基因的表达。在亮视野显微镜下分析MDA-7阳性染色的肿瘤细胞，并由不了解治疗组情况的观测者进行计数。每个样品至少分析5个视野。为了确定治疗后肿瘤细胞的命运，用先前已述的方法(Saeki等，2002；Ramesh等，2001)用末端脱氧核苷转移酶(Tdt)试剂盒(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)染色含有肿瘤的切片用亚甲基蓝或甲基绿复染观察编程性细胞死亡。在所有的染色步骤中，都包括合适的阴性对照。对于CD-31染色，用已述的方法(Saeki等，2002；Ramesh等，2003)用抗-CD31抗体对组织染色。
8.治疗后的肿瘤特性分析
为了确定mda-7基因的治疗效果，在最后一次治疗后收集小鼠肿瘤，并进行组织病理评估。由不了解治疗组情况的病理学家进行分析。
9.DOTAP：Chol-mda7复合物对实验性肺癌转移的作用
为了检测DOTAP：Chol-mda-7复合物对肺癌转移的作用，尾静脉注射给予雌性裸鼠悬浮在100μl无菌PBS中的106个A549肿瘤细胞。6天后，将小鼠分成3组，并接受如下治疗：不接受治疗(第1组)，用DOTAP：Chol-CAT复合物进行治疗(第2组)，和用DOTAP：Chol-mda-7复合物进行治疗(第3组)。每组中有8只小鼠。所有的治疗制剂都含有50μg脂质体-DNA复合物，使用27号针头尾静脉注射每日一次，共6剂。最后一剂后6周，吸入CO2处死动物。向每只小鼠肺气管内注入墨汁，用Feketes溶液(Ramesh等，2003)固定。由不了解治疗组的观测者在解剖显微镜下对每个肺中的转移肿瘤进行计数，以此来确定系统性mda-7基因治疗的效果。分析所得数据，根据Mann-Whitney秩和测验，如果P值＜0.05，那么认为将组间差异具有统计显著性。
作为同源肿瘤模型，给C3H小鼠注射鼠UV2237m纤维肉瘤细胞(1×106)，分成3组(n＝7/组)。注射后6周，对动物实施如下治疗：不治疗，用DOTAP：Chol-CAT进行治疗，或用DOTAP：Chol-mda-7复合物治疗。治疗时间表和对治疗效果的分析和A549模型所述相同。进行2次实验作统计学显著性分析。
结果
1.用DOTAP：Chol-mda-7复合物对肿瘤细胞进行体外转染
研究了DOTAP：Chol脂质体将质粒DNA递送至人(A549)和小鼠(UV2237m)肿瘤细胞的能力，使用的质粒为编码人MDA-7/IL-24蛋白的表达质粒。用含mda-7质粒DNA的DOTAP：Chol脂质体复合物进行转染，导致24和48h时A549和UV2237m肿瘤细胞中均有外源MDA-7蛋白表达。在PBS处理的对照细胞中没观察到MDA-7的表达。分析DOTAP：Chol-mda-7转染的A549和UV2237m细胞的组织培养上清液，表明48h时有MDA-7蛋白的分泌，但在24h时却没有。在48h时检测到分泌的MDA-7蛋白，不同于Ad-mda7处理的细胞中24h时就能检测到分泌的MDA-7蛋白(Mhashilkar等，2001)。提示使用DOTAP：Chol脂质体得到的转基因MDA-7表达效果不如用Ad-mda7得到的转基因效果。在PBS处理的细胞中，未观察到分泌的MDA-7蛋白。因此，DOTAP：Chol脂质体能够有效地将mda-7DNA递送到肿瘤细胞中，并导致细胞内和分泌型转基因MDA-7的产生，尽管其表达量低于用Ad-mda7所得的表达量。
2.MDA-7抑制皮下肿瘤生长
在nu/nu小鼠中评估了DOTAP：Chol-mda-7复合物对A549人肺部皮下肿瘤生长的抑制作用。与不治疗、用PBS治疗、或用DOTAP：Chol-LacZ复合物治疗的动物肿瘤的生长情况相比，通过瘤内注射DOTAP：Chol-mda-7复合物来治疗荷瘤小鼠显著地(P＝0.001)抑制肿瘤生长(图71A)。对肿瘤进行的组织病理分析表明在各治疗组中，肿瘤浸润细胞的数目没有显著变化。
接着评估了mda-7基因对C3H小鼠中皮下鼠肿瘤的治疗效果。将UV223M荷瘤小鼠分成3组：第1组不接受治疗，第2组用DOTAP：Chol-CAT复合物进行治疗，第3组则用DOTAP：Chol-mda-7复合物进行治疗。与两个对照组中的肿瘤生长情况相比，在瘤内注射DOTAP：Chol-mda-7复合物的小鼠中，UV2237m肿瘤的生长受到显著地抑制(P＝0.01；图71B)。
为了证明观察到的肿瘤抑制作用是由mda-7基因的表达引起的，在注射后的48h获取皮下A549和UV2237m肿瘤，并对MDA-7蛋白的表达进行免疫组化分析。用DOTAP：Chol-mda-7复合物治疗的肿瘤中，观察到A549和UV223m肿瘤内MDA-7蛋白的表达分别为18％和13％(P＝0.001；图71C)，显著高于不治疗、PBS治疗、DOTAP：Chol LacZ治疗或DOTAP：Chol-CAT复合物治疗的动物。在用DOTAP：Chol-CAT复合物治疗的A549肿瘤中观察到一定水平的非特异性染色。对MDA-7表达模式的分析表明，除了模式呈现细胞外较弥散的染色外，还存在强烈的细胞内染色。在人肿瘤异种移植模型和鼠同源肿瘤中均观察到了这种染色模式。
3.用DOTAP：Chol-mda-7复合物治疗的肺部肿瘤的程序性细胞死亡
为了确定用DOTAP：Chol-mda-7复合物治疗以后肿瘤细胞的命运，用先前所述的方法(Saeki等，2002)对来自nu/nu小鼠和C3H小鼠的皮下肿瘤(A549，UV2237m)分析其程序性细胞死亡的情况。与对照动物(也就是，未接受治疗，用PBS进行治疗，用DOTAP：Chol-CAT或DOTAP：Chol-LacZ进行治疗的动物)的肿瘤相比，在用DOTAP：Chol-mda-7治疗的肿瘤中观察到的TUNEL阳性染色细胞(13％A549和9％UV2237m)达到显著水平(P＝0.001)，表明是程序性细胞死亡(图72)。
4.用DOTAP：Chol-mda-7复合物治疗的肺部肿瘤中CD31-阳性染色水平降低
为了确定mda-7治疗对肿瘤血管生成的效果，用先前所述的方法(Saeki等，2002；Ramesh等，2003)对肿瘤组织进行CD31染色。与未接受治疗，用PBS进行治疗，用DOTAP：Chol-CAT或DOTAP：Chol-LacZ进行治疗的小鼠的肿瘤组织相比，DOTAP：Chol-mda7治疗的A549和UV2237m中，CD31-阳性染色的水平显著地(P＝0.01)降低，分别为10％和5.8％(图73)。CD31染色降低表示血管生成减少。
5.MDA-7抑制实验性肺癌转移
然后，在使用人A549肺癌细胞或小鼠UV227m细胞的实验性肺癌转移模型中研究DOTAP：Chol-mda-7复合物的活性。静脉内注射肿瘤细胞使肺内很快形成很多肿瘤病灶，30天以后，动物就由于肺部肿瘤负担过重而死亡。使用DOTAP：Chol-mda-7复合物全身给药治疗肺部荷瘤(A549和UV2237m)裸鼠或C3H小鼠，其肺转移癌数目显著地(P＜0.05)低于用PBS或DOTAP：Chol-CAT复合物治疗的小鼠(图74)。在UV2237m小鼠中，与用PBS治疗相比，用DOTAP：Chol-CAT复合物进行治疗使肿瘤节结数目显著地降低，这就提示存在一些非特异性的抗肿瘤活性(图74)。此外，小鼠能够很好地耐受该治疗剂，没有观察到任何与治疗相关的毒性作用，证据是没有发病和死亡。
实施例34：AD-MDA7和TRASTUZUMAB联合治疗导致HER-2/NEU-过表 达的乳房癌细胞死亡增加
材料和方法
1.细胞系
SKBr3和MCF-7乳房癌细胞来自美国典型培养物收集中心。感谢Dr.Mien-Chie Hung惠赠的MCF-7-Her-18细胞。细胞培养在添加了10％胎牛血清、10-mmol/L谷氨酸、100-U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(GIBCO InvitrogenCorporation，Grand island，NY)的高葡萄糖DMEM培养基中，培养条件为37℃，5％CO2。
2.腺病毒转导
携带mda-7基因的重组腺病毒载体(Ad-mda7)和携带荧光素酶报告基因的的重组腺病毒载体(Ad-Luc)来自(Introgen Therapeutics，Houston，TX)。以2500病毒颗粒(vp)每个细胞的MOI，用Ad-mda7和Ad-Luc转导6×105肿瘤细胞。选择的载体剂量能确保转导效率≥70％。以5μg/ml的剂量向培养基中加入Herceptin。
3.Western印迹
裂解细胞并用Biorad试验(Bio Rad laboratories，Hercules，Ca)测定蛋白质浓度。在10％SDS凝胶上用Western印迹分析法分析裂解物。在泳道中加入30-50μg蛋白质，以90V的电压电泳2hrs。将凝胶转移至硝酸纤维素膜上用1％的奶粉液封闭，与一抗(β-连环蛋白，Akt和p-Akt；Santa Cruz Biotechnology，Inc.，SantaCruz，Ca)4℃孵育过夜。洗膜并将其与二抗在室温下一同孵育1hr。给膜显影，并使用增强化学发光(ECL)蛋白印迹检测试剂(Amersham Biosciences，Buckinghamshire，England)检测蛋白质信号。将膜与抗β-肌动蛋白的抗体(SantaCruz)一同孵育，评估所加的蛋白质量是否相等。并用光密度分析结果。
4.动物研究
裸鼠来自Charles River Laboratories(Wilmington，MA)。以每剂0.5mg的剂量在颈后区域注射雌激粒。2天后，以每只小鼠5×106细胞的密度，将MCF-7-Her-18细胞注入胸部乳腺脂肪垫中。当肿瘤体积达到100mm3时，将小鼠分成6个治疗组：磷酸缓冲液(PBS)、仅施用Ad-Luc、仅施用Ad-mda7、仅施用Herceptin、施用Ad-Luc+Herceptin和施用Ad-mda7+Herceptin。每周1次以2×1010病毒颗粒的剂量直接将病毒载体注入肿瘤中，持续3周。以每只动物110μg的剂量向腹膜内注射Herceptin，每周2次，持续3周。每周2次测量肿瘤体积并做记录直至动物被处死。
5.统计学分析
图中报道的数据代表的3次独立实验的平均值和标准差。用斯氏t测验分析肿瘤体积差异的显著性。还用斯氏t测验分析了Western光密度差异的显著性。
结果
1.Ad-mda7治疗抑制乳房癌细胞的生长
用Ad-mda7或Ad-luc处理乳房癌细胞系SKBr3(Her2+)和MCF-7(Her2-)，并对细胞活力进行评估。如图1所示，Ad-mda7抑制Her2+和Her2-乳房细胞系的生长，表明MDA-7介导的杀伤作用和Her2状态无关。在其它Her2+和Her2-乳房肿瘤系中确认了该结果。为了评估Herceptin与Ad-mda7联合处理的效果，仅用Herceptin、或与Ad-mda7或Ad-luc联合处理同一细胞系。Herceptin导致Her2+SKBr3乳房肿瘤细胞杀伤，但不导致杀伤Her2-MCF-7细胞。当与低剂量的Herceptin联合施用时，Ad-mda7的细胞裂解活性仅在Her2+细胞中大大增强，并引发额外的超级杀伤作用。正相反，在Her2-细胞中，Herceptin带来的细胞毒性差异并不显著。当Ad-luc与Herceptin联合施用时，效果与单独施用Herceptin相当。在这些和其它乳房细胞系上进行的进一步研究表明图1中观察到增强的细胞裂解活性是由Ad-mda7+Herceptin联合处理的Her2+细胞中凋亡诱导作用的增强引起的。
评估了Herceptin与Ad-mda7协同作用的机制，也评估了异种移植模型中的联合协同机制。不幸的是，以上段落所述的Her2+细胞系不能在裸鼠中形成，因此我们改进了该模型系统，而利用MCF-7-Her-18细胞系。该细胞系源自Her2-MCF-7细胞，在该细胞中稳定地转染了Her-2/neu表达载体。
2.Ad-mda7降低β-连环蛋白，Akt和p-Akt的水平
用Ad-mda7处理乳房癌和肺癌细胞系能够降低Akt和p-Akt2的表达。研究还表明β-连环蛋白受Ad-mda7的负调控。为了研究施用Ad-mda7之外额外施用Herceptin是否会引起β-连环蛋白，Akt和p-Akt水平的进一步降低，对MCF-7-Her-18细胞单独转导Ad-mda7或Ad-luc，或者联合施用Herceptin。在以2500vp/细胞的剂量转染Ad-mda7以后，观察到Akt，p-Akt和β-连环蛋白水平的降低。在用Ad-mda7+Herceptin对细胞进行联合处理时，这三个蛋白的稳定态表达水平进一步降低。Western印迹分析表明转染了Ad-mda7和Herceptin以后，MCF-7-Her 18细胞中Akt的表达有所降低。与PBS相反，在施用Ad-mda7和Herceptin的情况下观察到蛋白表达水平的降低。然而，与单独施用Ad-mda-7或Herceptin相比，联合施用Herceptin+Ad-mda7表现出更显著的(p＜0.05)蛋白表达水平的降低。对照腺病毒荧光素酶载体转导显示出Akt蛋白水平很少或不降低。类似地，对p-Akt进行的Western印迹分析得出类似的结果。用Ad-mda-7和Herceptin处理以后，p-Akt蛋白水平显著地低于PBS和Ad-luc处理后的水平。与Ad-mda7+Herceptin介导的Akt表达的抑制相比，Herceptin+Ad-mda-7的联合施用对p-Akt表现出更强的抑制效应。另一项对β-连环蛋白进行的Western印迹分析显示，与单独施用Ad-mda7或Herceptin相比，Herceptin+Ad-mda-7联合治疗更显著地降低β-连环蛋白的表达水平。
3.Ad-mda7+Herceptin抑制裸鼠体内的肿瘤生长
当肿瘤体积达到100mm3时，在皮下荷瘤(由MCF-7-Her-18细胞形成的)裸鼠的肿瘤内注射Ad-mda7或Ad-Luc，并向腹膜内全身性地注射Herceptin。用PBS或Ad-Luc治疗的肿瘤体积继续增加，而与对照组相比，单独注射Ad-mda7或注射Herceptin+Ad-mda7的肿瘤生长则显著地受到抑制。注意，对所有动物组的治疗都开始于肿瘤体积达到约100mm3时。PBS和Ad-luc治疗的肿瘤生长速率相当。然而，从图5所示的动力学分析中显然可以看到用Ad-mda7或Herceptin治疗的肿瘤其生长速率大大减慢。用Herceptin和Ad-Luc+Herceptin治疗的肿瘤表现出十分相似的生长模式，这就确定Ad-Luc不具有抗肿瘤效果。用Ad-mda7单独进行治疗的肿瘤显示生长抑制情况比用Herceptin单独治疗的稍高一些。然而，联合施用Ad-mda7+Herceptin则表现出增强的活性和至15天几乎完全的生长抑制，此后，肿瘤呈现生长缓慢。生长速率常用的替代指标是肿瘤加倍所需的时间。对于PBS和Ad-Luc对照，该时间分别出现于第5天和第11天。用Herceptin和Ad-Luc+Herceptin治疗的肿瘤，其加倍时间分别为16天和14天。用Ad-mda7治疗的肿瘤，其体积加倍大约出现于第21天，而用Ad-mda7+Herceptin联合治疗肿瘤加倍时间超过28天。
4.Ad-mda7和herceptin联合治疗增加HER2/NEU过表达乳房癌细胞的凋亡
对过表达HER-2/neu的MCF-7乳房癌细胞系(MCF/HER2-18)分别转导Ad-mda7、herceptin、对照腺病毒荧光素酶载体(Ad-Luc)和联合转导herceptin与Ad-mda7和Ad-Luc。用比色(MTT)试验评估细胞活力，用荧光激活细胞分选分析(FACS)评估细胞凋亡。用western印迹分析评估Bcl-2和PARP的表达情况。
MTT试验显示，与单独施用herceptin或Ad-mda7相比，在MCF/HER2-18细胞中联合施用Ad-mda7和herceptin导致细胞生长速率的急剧降低(P＜0.01ANOVA)。此外，FACS分析表明该联合治疗导致显著的细胞程序性死亡。由western印迹分析显示的PARP的切割和Bcl-2的减少证实了细胞凋亡。
实施例35：MDA-7与由双链RNA激活的蛋白激酶PKR发生物理结合
材料和方法
1.细胞系和试剂
先前已述(Pataer等，2002)，A549(wt p53)和H1299(不含p53)人肺癌细胞系来自美国典型培养物收集中心。PKR+/+和PKR-/-细胞来自Dr.Glen N Barber(University of Miami School of Medicine)。PKR+/+和PKR-/-细胞培养在含有10％胎牛血清、10mM谷氨酸、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素(Life Technologies，Inc.，Grand Island，NY)的Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(DMEM)中，培养条件为37℃，5％CO2。放线菌酮(CHX)购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。重组MDA-7蛋白购自Introgen Therapeutics(Houston，TX)。
2.腺病毒的产生
Ad-mda7，Ad-bak，Ad-lacZ和Ad-Luc载体的构建先前已有报道(Pataer等，2002)。腺病毒载体在各种癌细胞中转导效率的确定方法如下，先用Ad-LacZ感染细胞，再确定转导至少70％的细胞所需的滴度。
3.流式细胞分析
利用碘化丙啶染色和FACS分析法来测定凋亡细胞的数目。收集细胞，离心沉淀，并重新悬浮在含有50μg/ml碘化丙啶、0.1％Triton X-100和0.1％柠檬酸钠的磷酸缓冲液中。将样品储存在4℃条件下1-3小时，并在进行FACS分析之前进行蜗旋振荡(Becton-Dickenson FACScan，Mountain View，CA；FL-3channel)。
4.实时PCR
根据生产商(Life Technologies，Gaithersburg，MD，USA)提供的指南用Thermoscript RT-PCR系统试剂盒实施RT-PCR。根据TRIzol提取方案(LifeTechnologies)分离总RNA，并用含有2mM脱氧核苷酸混合物、100mM DTT、40个单位的RNase抑制剂、50ng的随机引物和15个单位的Thermoscript逆转录酶将1μg每种样品逆转录成为互补DNA(cDNA)。使用先前报道的方案(Vorburger等，2002)实施实时PCR。
5.Western印迹分析
转染后48h，制备细胞提取物，如Pataer等，2002所述用所示抗体实施免疫印迹。使用以下抗体：抗p53的单克隆抗体购自PharMingen(San Diego，CA)。抗-PKR(K-17)、抗-β-肌动蛋白、抗-stat3(F-2)和磷酸特异性抗-stat3(B-7)抗体购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。MDA-7的多克隆抗体购自Introgen Therapeutics Inc(Houston，TX)。
6.免疫共沉淀分析
用Ad-mda7或Ad-Luc处理细胞48hrs，用RIPA缓冲液(1×PBS，1％Nonidet P-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)裂解细胞。将500μl细胞裂解液与20μl蛋白A/G琼脂糖一同在4℃条件下孵育30分钟。将一抗加入事先澄清的细胞提取液中，并在4℃条件下温和振荡孵育过夜。将蛋白A/G琼脂糖加入混合物中，孵育4hrs。在4℃条件下，以2500rpm的速度离心沉淀5min以沉降珠子。用1ml RIPA缓冲液洗涤珠子4次。最后一次洗涤之后，向珠子中加入50μl1X SDS-PAGE样品缓冲液。蜗旋振荡该混合物，然后煮沸5min。以2500rpm的速度离心混合物1min，然后将上清液加样上胶。
7.细胞定位研究
使A549和H1299细胞(5×104细胞/孔)生长在室载玻片上直到覆盖率达到70％，然后，用Ad-luc，Ad-mda7或PBS进行转染。48小时以后，用PBS洗涤细胞，并用新鲜制备的4％多聚甲醛/PBS固定15分钟。然后，在4℃条件下，用0.2％Triton X-100渗透细胞20min，并用1％的正常山羊血清封闭1小时。将兔多克隆抗-PKR(K-17)抗体和小鼠单克隆抗-MDA-7抗体在4℃条件下孵育过夜，并用若丹明或荧光素-5-异硫氰酸盐二抗在37℃条件下显影30min。在荧光显微镜下观察细胞，并用共聚焦显微镜作进一步分析。
8.统计分析
报道的数据代表的是三次独立实验的平均值，竖条表示标准差(SD)。
结果
1.Ad-mda7诱导人肺癌细胞凋亡和PKR产生
在用Ad-mda7，Ad-luc和PBS感染后的48hrs，对A549(wt p53)和H1299(p53缺失)人肺癌细胞进行流式细胞分析。与Ad-luc和PBS相比，Ad-mda7在A549和H1299人肺癌细胞中引起高水平的细胞凋亡。为了确定Ad-mda7是否能在体外诱导PKR诱发，用Western免疫印迹分析评估了Ad-mda7治疗的A549细胞。Ad-mda7治疗在A549细胞中引发了剂量依赖性的PKR诱导。即使是低水平的Ad-mda7(500vp/细胞；25pfu/细胞)也能引起PKR的诱导，然而PKR水平会随着Ad-mda7剂量的增长而升高。在H1299细胞中也观察到类似的PKR诱导。
2.细胞内的MDA-7蛋白在Ad-mda7-诱导的细胞死亡中起到很重要的作用
最近的研究表明转导了Ad-mda7的细胞分泌出一种可溶形式的MDA-7蛋白，该蛋白可以对邻近的非转导癌细胞触发一种旁观者杀伤效应(Mhashilkar等，2001)。Ad-mda7转导的细胞裂解物在大约30和23kD处显示出与MDA-7发生反应的免疫反应双条带，而上清液样品则在约40kD处显示一个新的蛋白质条带(Mhashilkar等，2001)。因此，评估了分泌型MDA-7对A549(wt p53)和H1299(p53缺失)人肺癌细胞的抗肿瘤效果。MDA-7分泌蛋白不能在A549或H1299肺癌细胞系中诱导细胞生长的抑制或细胞的死亡。正相反，Ad-mda7治疗能在两种肺癌细胞系中引发细胞生长的抑制和伴随而来的细胞凋亡。为了确定MDA-7分泌蛋白能否在体外引发PKR诱导，用Western印迹分析评估了MDA-7蛋白处理的细胞。MDA-7分泌蛋白不能在A549细胞中诱导出PKR。相反，Ad-mda7处理的A549细胞诱导出很强的PKR表达和Stat3的磷酸化。
3.MDA-7与依赖dsRNA的蛋白激酶PKR发生物理互作
使用免疫荧光染色和共聚焦激光扫描显微镜检测MDA-7和PKR蛋白质在A549和H1299细胞中的亚细胞定位。先前的研究表明PKR定位在细胞质和细胞核中(Taylor等，1999)。免疫荧光研究表明MDA-7蛋白分布主要在细胞质内。MDA-7诱导内源性PKR蛋白，并在两个NSCLC细胞系中都与PKR共同定位。
几种dsRNA-结合蛋白，包括：细胞蛋白质如NF90(细胞核因子90)和PACT(PKR的蛋白激活物)，以及病毒蛋白质TRBP(TAR RNA结合蛋白)，和牛痘病毒E3L蛋白都与PKR发生相互作用(Yin等，2003)。在A549和H1299细胞中检测了MDA-7蛋白是否能与PKR发生物理性相互作用。从PBS，Ad-luc和Ad-mda7处理的细胞裂解物中用抗PKR抗体免疫共沉淀出PKR蛋白质，并用抗MDA-7抗体采用免疫印迹法分析样品。在PBS或Ad-luc处理的细胞中，抗-PKR抗体不与MDA-7蛋白发生免疫共沉淀。相反，在转导Ad-mda7的细胞中，能够用抗PKR抗体将MDA-7免疫共沉淀出来。用MDA-7抗体识别到一个MDA-7-免疫反应的主要条带。为了确定蛋白质之间的相互作用，还进行了相反的实验。当用抗MDA-7的抗体对PBS，Ad-luc和Ad-mda7处理的细胞裂解物进行免疫共沉淀时，只能在Ad-mda7处理的细胞裂解物中检测到PKR。免疫共沉淀研究表明和TRBP，PACT，NF90和E3L一样，MDA-7也能与依赖dsRNA的蛋白激酶PKR发生物理互作。
4.PKR蛋白在Ad-mda7-诱导的细胞中所起的作用
为了评估PKR诱导对Ad-mda7-诱导的细胞死亡所起的作用，使用了同基因的PKR缺陷型细胞系(PKR+/+和PKR-/-)。尽管在PKR缺陷的(-/-)和野生型PKR细胞系中，都充分转导和表达了MDA-7蛋白，但是只有野生型PKR(+/+)细胞系在Ad-mda7处理后发生细胞死亡，这就表明Ad-mda7诱导的细胞死亡是依赖PKR的。正如所预计的一样，Ad-mda7在PKR+/+细胞系中引发PKR的诱导。不同于Ad-mda7，Ad-Bak介导的细胞杀伤不依赖PKR基因的状态，在PKR缺陷和野生型PKR的细胞系中都有细胞死亡的发生。然后，使用PKR+/+和PKR-/-细胞系进行了免疫沉淀试验来检测磷酸化形式的MDA-7和PKR。只能在PKR+/+细胞中检测到磷酸化形式的MDA-7和PKR，而在PKR-/-细胞中未能检测到。在Ad-mda7转导的细胞中，PKR和MDA-7蛋白都在苏氨酸和丝氨酸位点进行磷酸化。在Ad-mda7转导的细胞中，没有检测到PKR和MDA-7蛋白的在酪氨酸磷酸化。
实施例36：重组人MDA-7/IL-24蛋白在内皮细胞中抑制参与DNA修复和参 与凋亡抑制的蛋白的表达
重组MDA-7/IL-24蛋白在体外抑制人内皮细胞的生长并使内皮细胞对辐射敏感。为了评估MDA-7/IL-24蛋白可能介导的恢复凋亡和放射致敏的分子效应，用10ng/ml MDA-7/IL-24蛋白处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs)12hrs，并用Western印迹分析细胞。观察到pSTAT3和pATF的激活，但是pAKT和p-p38有所减少。参与细胞凋亡Bcl-xL和survivin的蛋白质水平也受到抑制。用MDA-7/IL-24处理以后，还观察到Ku70和XRCC4蛋白下调(这两个蛋白参与对辐射引发的DNA损伤的修复)，以及IL-8的抑制(该蛋白参与新生血管形成)。其它很多蛋白质的水平，例如，Bax，p21，p27和p53在这些处理中保持恒定。
为了检测MDA-7/IL-24处理以后，HUVECs蛋白质表达的变化是否由于编码这些蛋白质的基因转录受到抑制而引起的，用RPA分析方法分析了MDA-7/IL-24处理后的HUVECs。结果表明用MDA-7/IL-24处理HUVECs影响几个基因的转录，这些基因的蛋白质产物是参与修复辐射引发的DNA损伤的关键蛋白质。因此，MDA-7/IL-24蛋白可能发动了一个信号级联通路，导致基因转录的改变。这些改变进而导致抑制参与DNA修复的蛋白的表达。即使这些蛋白质各自改变相对微小，但几个关键的修复蛋白一起受到抑制，它们可能对DNA的修复起到负面影响，从而导致放射致敏。
实施例37：PERK参与人MDA-7/IL-24介导的鼠肿瘤细胞生长的抑制
MDA-7介导的肿瘤抑制活性的机制在不同类型的肿瘤细胞中有所不同，认为PKR、p38MAPK和pJNK通路是诱发凋亡的主要通路。
在本研究中，探究了MDA-7/IL-24是否能够对鼠肿瘤细胞引发类似的抑制活性。用携带mda-7/IL-24基因的腺病毒载体(Ad-mda7；10,000vp/细胞)处理鼠纤维肉瘤(UV2237m和MCA-16)细胞，与PBS或Ad-luc处理(载体对照)的细胞相比，Ad-mda7处理导致外源性MDA-7/IL-24蛋白的表达，并显著抑制细胞生长停滞于G2/M期(P＝0.001)。相反，用Ad-mda7处理正常的鼠成纤维细胞(10T1/2)，没有观察到生长抑制效果。探究生长抑制和凋亡机制的研究显示，与人细胞不同，在鼠肿瘤细胞中没有观察到PKR，p38MAPK和pJNK的激活。正相反，观察到了PERK及其下游靶蛋白elF2-α和胱冬酶-12的活化，进一步导致胱冬酶-9、胱冬酶-3的活化以及PARP的切割。
此外，与用PBS或包裹在DOTAP：Chol.脂质体中的对照质粒的治疗相比，用包裹在DOTAP：胆固醇(DOTAP：Chol)脂质体载体中的mda-7/IL-24基因治疗在同系C3H/Ncr小鼠中建立的皮下UV2237m肿瘤，显著地抑制了肿瘤的生长。每周3次瘤内注射制剂(50μg DNA/dose)持续3周治疗动物。此外，在用mda-7/IL-24治疗的40％的动物中观察到了肿瘤的完全消退。这些结果表明人MDA-7/IL-24能够通过PERK通路在体外和体内抑制鼠肿瘤的生长。
实施例38：腺病毒介导的MDA-7表达抑制了非小细胞型肺癌细胞的DNA修 复能力并能够放射致敏
材料和方法
1.细胞培养
人非小细胞型肺癌(NSCLC)细胞系A549、正常人肺成纤维细胞系(NHLF)CCD-16和人神经胶质瘤细胞系MO59J和MO59K来自美国典型培养物收集中心(ATCC)。所有的细胞系都用ATCC指定的方法进行培养。
2.腺病毒载体和基因递送
Ad-mda7，Ad-Luc和Ad-β-gal都购自Introgen Therapeutics，Inc.(Houston，TX，USA)。Ad-Luc用作对照载体，而Ad-β-gal用作报告载体。检测载体中是否存在，并确定其中不含有可复制型腺病毒和支原体。接种后48小时，将细胞与纯化的载体一同在1ml不含血清的培养基中，孵育1h。孵育后，向每个培养瓶中加入含10％胎牛血清的新鲜培养基中。在一个相同的方案中也使用不含血清的培养基，除了用模拟载体转染外。对未处理的培养瓶中的细胞进行计数以确定这些细胞数目的病毒感染复数。
3.核蛋白提取
用冷磷酸缓冲液淋洗细胞2次，用细胞刮棒收集细胞，并以500×g的转速在4℃条件下离心10min。将细胞沉淀重新悬浮在400μl冷的裂解缓冲液中(10.0mMHEPES，pH 7.9，10.0mM KCl，0.1mM乙二胺四乙酸，0.1mM依他酸，1.0mM二硫苏糖醇，2.0μg/ml亮肽素，2.0μg/ml抑肽酶，0.5mM苯甲磺酰氟)，并在冰上孵育10min；此后，加入12.5μl 10％NP-40，并将混合物蜗旋振荡5秒。然后，在4℃条件下以500×g的转速离心裂解液5min，除去上清液，作为细胞质提取物保存。将沉淀重新悬浮在30μl提取缓冲液中(20.0mM HEPES，pH 7.9，400.0mM NaCl，1.0mM乙二胺四乙酸，1.0mM依他酸，1.0mM二硫苏糖醇，2.0μg/ml亮肽素，2.0μg/ml抑肽酶，0.5mM苯甲磺酰氟)，彻底混匀，并在冰上孵育30min。然后每隔10min振荡沉淀一次。30min后，在微量离心机中以最大转速离心提取物10min。上清液即为核提取物，等分分装-70℃保存。根据生产商的说明，使用Bio-Rad蛋白试验(Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA，USA)确定所得核蛋白的量，以牛血清白蛋白作为蛋白质标准品。
4.抗体
抗DNA-PKcs和XRCC4的兔多克隆抗体购自GeneTex(San Antonio，TX，USA)。抗Ku70和β-肌动蛋白的山羊多克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA，USA)。抗Ku86和克隆Ku15的小鼠单克隆抗体购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。抗DNA连接酶IV的兔多克隆抗体购自Serotec(Raleigh，NC，USA)。
5.Western印迹分析
在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳中(8％-12％聚丙烯酰胺，含4％浓缩胶)分离等量的核蛋白，然后，转移至稳定素-P膜(Millipore，Bedford，MA，USA)。含5％脱脂奶粉的TBS-T(TBS加入0.05％Tween-20)用作封闭溶液，而单用TBS-T作为洗涤缓冲液。用溶解在封闭溶液中的一抗处理膜，在4℃条件下处理过夜，再用溶解在封闭溶液中的二抗在室温下处理1h。根据生产商的方案，用增强型化学发光法(Amersham，Arlington Heights，IL，USA)观察结果。
6.RNase保护试验
用Ad-mda7或Ad-Luc转染细胞。孵育48h后，使用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)提取RNA。用32P-UTP标记探针，并使其与分离所得的RNA进行杂交。使用的探针组是hDSBR-2(Pharmingen，San Diego，CA，USA)。管家基因L32和GAPDH用于样品的标准化。RNase消化后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离保护片段。所有的步骤均根据生产商的推荐使用方法进行。
7.DNA DSB修复试验
暴露于电离辐射后，如先前文献所述(Kurimasa等，1999；Story等，1994)进行DNA DSB修复活性试验。简言之，载体处理后48h，在冰上使用137Cs单位(3.5Gy/min)的剂量照射细胞，总共接受的辐射剂量为40Gy。辐射后，立即用已经温热至37℃的培养基更换冷培养基，将细胞置于37℃的组织培养孵育箱中，培养一定时间(0min，15min，30min，1h，2h，4h或24h)，使DSBs得到修复。然后，在冰上用胰蛋白酶消化细胞，洗涤，包埋在琼脂糖块中，裂解，并用蛋白酶K消化。使用contour-clamped均一电场PFGE(CHEF-DR III system，Bio-Rad Laboratories)分离DNA，电压为1.5V/cm，在25℃条件下在0.5×TBE缓冲液中电泳20h。在室温下，将凝胶转移到尼龙膜上，需时3天。然后用32P-标记的人Alu+探针在45℃条件下与膜杂交18h。使用贮存磷酸成像系统与ImageQuant软件程序(MolecularDynamics，Sunnyvale，CA，USA)确定从琼脂糖中释放进入泳道的活性分数。
8.HCR
使用改进版本的HCR试验来评估DNA的修复能力(Eady等，1992；McDonald等，1996；Rainbow，1974；Rainbow和Mak，1972)。简言之，将细胞接种于6孔板上，并用如上所述的方法用Ad-mda7，Ad-Luc或模拟进行预处理。预处理后48h，再用未接受照射或接受过照射的Ad-β-gal转染细胞。以1/100的稀释度将Ad-β-gal稀释在含1％胎牛血清的培养基中，并在室温下使用高剂量比率的137Cs单位(34.3Gy/min)照射。Ad-β-gal转染后24小时，用含有2.00％的甲醛和0.05％戊二醛的磷酸缓冲液固定细胞，并用X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷)染色。在显微镜下，对阳性染色的细胞进行计数，以此评估细胞修复系统的修复能力。用接受过照射的Ad-β-gal处理的细胞所得的结果与用未接受照射的Ad-β-gal处理的细胞所得的结果相比较。实验重复3次。
结果
1.Ad-mda7抑制NSCLC细胞中参与DNA修复的蛋白的表达，但不抑制正常成纤维细胞中此类蛋白的表达
Ad-mda7放射致敏NSCLC细胞，但是并不能放射致敏正常成纤维细胞，这与该载体能在NSCLC细胞中诱导c-Jun转录因子的激活，但不在成纤维细胞中诱导激活是相关联的。因此，感兴趣的是检测在放射致敏的调控中起重要作用的基因(如处于DNA修复通路中的基因)表达的变化。
在哺乳动物细胞中，非同源重组型末端连接(NHEJ)是修复DSBs的主要通路，暴露在电离辐射中或诱导该通路的激活。为了确定Ad-mda7是否影响参与NHEJ通路的蛋白质表达水平，对核蛋白提取物进行了western印迹分析。用Ad-mda7处理A549细胞会降低Ku70，XRCC4和DNA连接酶IV蛋白的表达水平。另一方面，在用相同方式处理的CCD16细胞中，未观察到这些蛋白表达水平的降低。NSCLC细胞中的效果似乎是Ad-mda7特异性的，作为对照载体的Ad-Luc并不影响任一细胞系中这些蛋白质的表达情况。
2.Ad-mda7降低A549细胞中DNA修复基因mRNA的表达
为了确定蛋白表达水平的抑制是否反映了编码这些蛋白的基因其转录有所减少，对感兴趣的基因进行了RNAse保护试验。结果表明，Ad-mda7处理的A549中细胞中几个DNA修复基因的mRNA水平低于未处理的对照细胞。对于一些基因，对照载体Ad-Luc也会影响转录。然而，感兴趣基因中的一些基因的转录-KU70，Lig4，XRCC4和DNA-PK-受Ad-mda7的影响程度高于Ad-Luc带来的影响。
3.Ad-mda7转染抑制辐射后DNA DSB的修复
尽管，如上所述，在照射引起的DSBs修复中起关键作用的那些蛋白质的基因表达受到抑制，与Ad-mda7的放射致敏作用是一致的，然而需要证实这些DNA损伤的修复的确是在该处理后才受到抑制的。因此，使用脉冲电场凝胶电泳(PFGE)来检测照射后总的DSB诱导和重新连接，以此来确定Ad-mda7转染是否影响了A549细胞中DSB的重新连接动力学。该分析的结果表明，施加40Gy剂量的辐射后，在时间点0检测时有大量的片段化DNA从琼脂糖块中迁移出来进入泳道。该效应与Ad-mda7-处理的细胞和对照细胞相类似，这就表明Ad-mda7处理不会增强辐射对DSBs的诱导作用。然而，作为时间的函数，泳道中的DNA比例在DSBs重新连接时会有所降低；Ad-mda7-处理的细胞中该过程的进度似乎比对照细胞中的要慢。对一些凝胶进行了定量测定，对平均值描点作图来评估不同处理后DSB的修复动力学。尽管各组中总体的修复动力学很相似，但是与未处理的对照细胞或用Ad-Lu处理的细胞相比，用Ad-mda7进行预处理的细胞似乎在24h时有更高水平的未重新连接的残留DNA损伤。
4.Ad-mda7抑制A549细胞但不抑制CCD16细胞的宿主细胞再激活(HCR)
严格说来，如上所述的检测DSB修复的PFGE试验实际上检测的是总的DSB重新连接，也就是包括破损DNA片段的不恰当重新连接，如那些会造成染色体易位的连接。此外，由于该方法不能检测损伤的错误修复，这样的修复可能导致缺失，该方法高估了可以使细胞存活的修复量。因此，为了研究DNA修复的保真度及其总的修复能力，使用HCR试验进一步检测Ad-mda7抑制DNA修复通路(调控放射致敏通路)的能力。接受过γ-辐射的携带β-半乳糖苷酶的腺病毒(Ad-β-gal)用作报告载体，而读数则是β-半乳糖苷酶的活性。通过检测用Ad-mda7或Ad-Luc预处理或模拟转染的A549细胞和CCD16细胞中报告基因的表达量来修复的程度。结果表明，与用Ad-Luc进行预处理或模拟转染的对照细胞相比，Ad-mda7预处理的A549细胞中的HCR受到抑制。相反，Ad-mda7预处理后，在CCD16细胞中未观察到显著的HCR抑制。为了确定HCR试验对于已知DNA修复的检测足够灵敏，在人胶质母细胞瘤细胞系MO59K和MO59J上对该试验进行校验，这两个细胞系分别具有和没有依赖DNA的蛋白激酶(DNA-PK)。与MO59K中的HCR相比，MO59J细胞中的HCR显著降低，比值接近50％。DNA-PK包括Ku70/Ku80异二聚体和DNA-PKcs的催化亚基，是DSB修复的NHEJ通路所必需的。由于DNA-PK组分缺陷而缺乏DNA-PK活性的细胞，如M059J细胞，对电离辐射表现出高度敏感，和有缺陷的DSB重新连接动力学(Allalunis-Turner等，1993；Lees-Miller等，1995)。
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本说明书和权利要求书中所公开的所有组合物和/或方法，按照本说明书的描述，无须过多实验都可以制备和实施。虽然本发明的组合物和方法是以某些实施方式的形式来所述的，但是，本领域的技术人员知道可在本发明的概念、构思和范围内，对本发明的组合物和方法或者本文所描述的方法步骤以及步骤的顺序作出各种变化。更具体说，他们知道某些化学和生理相关的试剂可替代本文所述的试剂，也可以得到相同或相似的结果。本领域技术人员应知道所有这些相似的替代或调整都应认为是属于本申请权利要求所定义的本发明的构思、范围和概念之内。
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Claims (4)

1.编码MDA-7的核酸在制备药物中的应用，所述药物用于抑制或预防患者中癌症局部侵袭和/或转移，其中所述MDA-7抑制或预防癌症的局部侵袭和/或转移，其中所述MDA-7蛋白是SEQ ID NO：2。
2.如权利要求1所述的应用，其中所述编码MDA-7的核酸是腺病毒载体。
3.如权利要求1或2所述的应用，其中所述癌症是黑素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、成视网膜细胞瘤、星状细胞瘤、成胶质细胞瘤、牙龈、舌、白血病、成神经细胞瘤、头、颈、乳房、胰腺、前列腺、肾、骨、睾丸、卵巢、间皮瘤、颈部、肠胃道、淋巴瘤、脑、结肠，或膀胱癌。
4.如权利要求3所述的应用，其中所述癌症是肺癌。
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