CN109122581A - Fra-1与XPA复合物在细胞周期调控中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Fra‑1与XPA复合物在细胞周期调控中的应用，通过过量的光照射SD大鼠构建RLD模型，检测Fra‑1与XPA的表达、定位变化与相互作用、RGC表达cyclin D1的变化及上述变化与RGC凋亡的关系，初步分析Fra‑1与XPA结合与RGC再进入细胞周期后发生凋亡的关系，接着在原代大鼠RGC中，验证Fra‑1与XPA的相互作用，并分析上述复合物的形成调节cyclin D1表达的机制，在此基础上，分析光损伤细胞模型中XPA与Fra‑1结合调节cyclin D1的表达对RGC凋亡的影响，最后构建大鼠RLD模型，分析靶向干预RGC中Fra‑1与XPA的相互作用对RGC凋亡及RLD预后的影响。
Description
技术领域
本发明涉及编码蛋白在细胞周期调控中的应用技术领域，具体为一种Fra-1与XPA复合物在细胞周期调控中的应用。
背景技术
细胞周期(cell cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。
生命是从一代向下一代传递的连续过程，因此是一个不断更新、不断从头开始的过程。细胞的生命开始于产生它的母细胞的分裂，结束于它的子细胞的形成，或是细胞的自身死亡。通常将子细胞形成作为一次细胞分裂结束的标志，细胞周期是指从一次细胞分裂形成子细胞开始到下一次细胞分裂形成子细胞为止所经历的过程。在这一过程中，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。
Cyclin D1，即G1/S-特异性周期蛋白-D1，是一个由人类CCND1基因所编码的蛋白质。Cyclin D1的基因属于高度保守的细胞周期家族。该家族在整个细胞周期中蛋白丰度具有周期性变化。
目前XPA-Fra-1复合物的形成对cyclin D1的表达变化以及对RGC凋亡的影响是在自然情况下完成的，现拟证明RGC中Fra-1与XPA形成复合物，通过调节cyclin D1的转录，促进RGC再进入细胞周期，诱导RGC凋亡，因此，亟待一种改进的技术来解决现有技术中所存在的这一问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Fra-1与XPA复合物在细胞周期调控中的应用，证明了RGC中Fra-1与XPA形成复合物，通过调节cyclin D1的转录，促进RGC再进入细胞周期，诱导RGC凋亡，从而分析干预XPA-Fra-1复合物的形成对cyclin D1的表达变化以及对RGC凋亡的影响，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种Fra-1与XPA复合物在细胞周期调控中的应用，包括以下步骤：
步骤一：通过过量的光照射SD大鼠构建RLD模型，检测Fra-1与XPA的表达、定位变化与相互作用、RGC表达cyclin D1的变化及上述变化与RGC凋亡的关系，初步分析Fra-1与XPA结合与RGC再进入细胞周期后发生凋亡的关系；
步骤二：接着在原代大鼠RGC中，验证Fra-1与XPA的相互作用，并分析上述复合物的形成调节cyclin D1表达的机制；
步骤三：在此基础上，分析光损伤细胞模型中XPA与Fra-1结合调节cyclin D1的表达对RGC凋亡的影响；
步骤四：最后构建大鼠RLD模型，分析靶向干预RGC中Fra-1与XPA的相互作用对RGC凋亡及RLD预后的影响。
优选的，步骤一中Fra-1为原癌基因，定位于染色体11q13，长度为1.7kb的成熟mRNA，编码271个氨基酸组，相对分子量为29×103。
优选的，步骤一中XPA为NER过程中不可缺少的蛋白，XPA基因含有六个外显子。
优选的，步骤一中RGC为RGC32，RGC32基因定位于13q14.11，全长1126个bp，编码137个氨基酸，有5个外显子和4个内含子。
优选的，步骤一在大鼠RLD模型中，用western blot方法检测Fra-1、XPA、cyclinD1、activecaspase-3的表达情况；免疫共沉淀、免疫荧光检测Fra-1与XPA之间的相互作用变化及定位变化；免疫荧光、TUNEL检测RGC凋亡；分析Fra-1、XPA的表达变化、相互作用以及cyclin D1表达变化与RGC凋亡之间的关系。
优选的，步骤二在体外，利用GSTpull-down分析Fra-1和XPA的相互作用，在工具细胞中利用截短突变质粒外转分析Fra-1和XPA相互作用的结构域及机制以及对cyclin D1表达的影响。
优选的，步骤三建立大鼠原代RGC光损伤模型，western blot方法检测Fra-1、XPA、cyclin D1、activecaspase-3的蛋白表达情况；核浆分离的方法检测XPA的核转位情况；免疫共沉淀方法检测Fra-1与XPA之间的相互作用，流式细胞仪检测损伤后RGC的细胞周期；TUNEL方法检测RGC的凋亡情况；分析Fra-1、XPA的表达变化、相互作用以及cyclin D1表达变化对RGC凋亡的影响。
优选的，步骤四构建Fra-1、XPA慢病毒干预载体，视网膜下注射，western blot及免疫荧光检测干预效果；建立大鼠RLD模型，检测cyclin D1的表达；用TUNEL方法检测大鼠视网膜RGC的凋亡情况；分析干预XPA-Fra-1复合物的形成对cyclin D1的表达变化以及对RGC凋亡的影响。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
证明了RGC中Fra-1与XPA形成复合物，通过调节cyclin D1的转录，促进RGC再进入细胞周期，诱导RGC凋亡，从而分析干预XPA-Fra-1复合物的形成对cyclin D1的表达变化以及对RGC凋亡的影响。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种Fra-1与XPA复合物在细胞周期调控中的应用。
实施例一：
1、用western blot方法检测Fra-1、XPA、cyclin D1、activecaspase-3的表达情况
取用过量光照射后的SD大鼠，迅速处死，制备蛋白质样品，在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白；冷却到室温后，进行SDS-PAGE电泳，随后用电转仪转膜，将转膜电流设置为300mA，转膜时间为45分钟；转膜完毕后，将膜放置到预先准备好的western洗涤液中，漂洗1分钟，将膜上的转膜液洗去，用滴管吸净洗涤液；加入western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟；用滴管吸净封闭液，立即加入稀释好的一抗，在侧摆摇床上摇动，室温放置60分钟；回收一抗，加入western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟，吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5分钟，一共洗涤3次；加入荧光素偶联的二抗，在侧摆摇床上摇动，室温放置60分钟；回收二抗，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟，吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5分钟，一共洗涤3次；将膜放置在滤纸上吸干后，通过BeyoECL Plus试剂检测，用X光片扫膜显影。
2、免疫共沉淀Fra-1与XPA之间的相互作用变化及定位变化
细胞转染后24～48h收蛋白，将细胞培养皿放于冰上，用预冷PBS洗三次，加入适量细胞裂解缓冲液，冰上裂解30min，用细胞刮轻轻刮下细胞，用移液枪将细胞裂解液转移至干净EP管中，冰上轻轻吹打，避免气泡产生，然后于4℃离心机，最大转速离心13000rpm，离心10min后取上清，取少量裂解液转移至干净EP管中，以备Western blot分析，剩余裂解液加100ul相应的带有X抗体琼脂糖珠加入到细胞裂解液，4℃缓慢摇晃孵育过夜，免疫沉淀反应后，在4℃以3000rpm速度离心5min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，管底的琼脂糖珠用预冷PBS洗三次。然后加入500ul裂解缓冲液，最后加入125μl的5×SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟,以游离抗原、抗体、珠子，4℃离心机，最大转速离心10min，取上清，样品经缓冲液处理，经过western blot检测，ECL法显色。
3、免疫荧光检测Fra-1与XPA之间的相互作用变化及定位变化
将标记的特异性荧光抗体直接加在样品上，经染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检；滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，持续10分钟，使标本保持一定湿度；滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温30分钟；取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序经过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3～5分钟，不时振荡；取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖；立即用荧光显微镜观察，观察标本的特异性荧光强度来判断免疫复合物的多少。
4、免疫荧光检测RGC凋亡
取得凋亡细胞，加入洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟，吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5分钟，一共洗涤3次；制备细胞裂解液，按1ml DAB稀释液+1滴DAB色原进行配制；随后加如Ac-DEVD-AMC，37℃情况下反应60分钟；荧光分光光度计分析荧光强度。
5、TUNEL检测RGC凋亡
取得凋亡细胞，用二甲苯浸洗2次，每次5分钟；用梯度乙醇(100、95、90、80、70％)各浸洗1次，每次3分钟；加入洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟，吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5分钟，一共洗涤2次；用工作液处理组织20分钟；加入洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟，吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5分钟，一共洗涤2次；玻片干后，加100μl的TUNEL反应混合液，封口膜在37℃情况下反应60分钟；加入洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟，吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5分钟，一共洗涤3次；加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞；玻片干后加100μlconverter-POD于标本上，封口膜在37℃情况下反应60分钟；加入洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟，吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5分钟，一共洗涤3次；在组织处加100μlDAB底物，在20℃情况下反应10分钟；加入洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟，吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5分钟，一共洗涤3次；拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗；加一滴PBS在视野下，用光学显微镜进行计数并拍照。
实施例二：
利用GSTpull-down分析Fra-1和XPA的相互作用
挑取融合蛋白Fra-1样品，将其放置到10mlLB的10ml试管里，37℃的环境下过夜；将培养菌液转移到含有500mlLB的1L瓶中，37℃的环境下，转速为200转培养至OD600＝1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在25℃下培养，10分钟，4℃离心收集，去净上清，放置与-20℃；室温冻融菌体，马上放置与冰上，每500ml培养液加入10ml细菌裂解液，混合均匀；伤病超声破碎，开2秒，停7秒，一共60分钟，至裂解液充分清凉；10000转，15分钟，4℃分离上清，-80℃保存备用；挑取融合蛋白XPA样品，放置真核表达载体上，进行细胞转染，48小时后，取适量融合蛋白GST-Fra-1冰上冻融，取50μlGST-XPA到EP观众，PBS洗一次，将冻融融合蛋白GST-Fra-1与其混合，4℃层析柜结合60分钟；PBS洗3次，同时，裂解融合蛋白XPA，去尽培养基，PBS洗一次，加入300μl裂解液，4℃放置30分钟；混合收集至1.5mlEP管，超声破碎，13000转，15分钟，4℃离心取上清，BCA蛋白定量留取20ul，其余样品加入到已纯化蛋白的EP管中，用PBS补足液体到500ul左右，以便蛋白之间能充分结合，4℃旋转结合PBS+1％Triton-100洗3次，PBS洗3次；40ul 5×loading buffer溶解beads上的蛋白，煮沸3分钟，高速离心，SDSPAGE做Western Blot检测。
实施例三：
1、用western blot方法检测Fra-1、XPA、cyclin D1、activecaspase-3的蛋白表达情况。
实验方法同实施例一1、用western blot方法检测Fra-1、XPA、cyclin D1、activecaspase-3的表达情况，样品采用大鼠原代RGC光损伤模型。
2、核浆分离的方法检测XPA的核转位情况
正常收取大鼠细胞，一个小圆盘的量即可；Buffer A 300uL吹吸，冰上静止15min过程中，间断振荡混匀；4℃，13000rpm,30s,转移上清保存即为浆成分；700uL BufferA洗3遍，吹散，静查3min后，4C,13000rpm 30s,最后次吸干；Buffer B 100uL或lysis buffer裂解(推荐CHZ的lysis buffer),超声25％10次，4℃,13000rpm,10min；转移上清即为核的成分；测蛋白浓度(如用Buffer B,ctrl较高)。收集细胞，用100μL Buffer A重悬，冰上孵育10分钟后，12000转4℃情况下离心1分钟,取上清储存于一80℃.用1mLBufferA洗沉淀3次，重悬于150μLBufferB(20mMHEPES,PH 7.9,0.4mM NaCl,1mM EDTA,1mM EGTA,0.5％NP-40)，12000转4℃情况下离心30分钟后，取上清即核)储存于-80℃。
实施例四：
western blot及免疫荧光检测干预效果，用TUNEL方法检测大鼠视网膜RGC的凋亡情况，实验方法同实施例一，样品采用大鼠视网膜。
根据实施例一-四中的检测结果，分析干预XPA-Fra-1复合物的形成对cyclin D1的表达变化以及对RGC凋亡的影响。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.一种Fra-1与XPA复合物在细胞周期调控中的应用，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：通过过量的光照射SD大鼠构建RLD模型，检测Fra-1与XPA的表达、定位变化与相互作用、RGC表达cyclin D1的变化及上述变化与RGC凋亡的关系，初步分析Fra-1与XPA结合与RGC再进入细胞周期后发生凋亡的关系；
步骤二：接着在原代大鼠RGC中，验证Fra-1与XPA的相互作用，并分析上述复合物的形成调节cyclin D1表达的机制；
步骤三：在此基础上，分析光损伤细胞模型中XPA与Fra-1结合调节cyclin D1的表达对RGC凋亡的影响；
步骤四：最后构建大鼠RLD模型，分析靶向干预RGC中Fra-1与XPA的相互作用对RGC凋亡及RLD预后的影响。
2.根据权利要求1所述的一种Fra-1与XPA复合物在细胞周期调控中的应用，其特征在于：所述步骤一中Fra-1为原癌基因，定位于染色体11q13，长度为1.7kb的成熟mRNA，编码271个氨基酸组，相对分子量为29×103。
3.根据权利要求1所述的一种Fra-1与XPA复合物在细胞周期调控中的应用，其特征在于：所述步骤一中XPA为NER过程中不可缺少的蛋白，XPA基因含有六个外显子。
4.根据权利要求1所述的一种Fra-1与XPA复合物在细胞周期调控中的应用，其特征在于：所述步骤一中RGC为RGC32，RGC32基因定位于13q14.11，全长1126个bp，编码137个氨基酸，有5个外显子和4个内含子。
5.根据权利要求1所述的一种Fra-1与XPA复合物在细胞周期调控中的应用，其特征在于：所述步骤一在大鼠RLD模型中，用western blot方法检测Fra-1、XPA、cyclin D1、activecaspase-3的表达情况；免疫共沉淀、免疫荧光检测Fra-1与XPA之间的相互作用变化及定位变化；免疫荧光、TUNEL检测RGC凋亡；分析Fra-1、XPA的表达变化、相互作用以及cyclin D1表达变化与RGC凋亡之间的关系。
6.根据权利要求1所述的一种Fra-1与XPA复合物在细胞周期调控中的应用，其特征在于：所述步骤二在体外，利用GSTpull-down分析Fra-1和XPA的相互作用，在工具细胞中利用截短突变质粒外转分析Fra-1和XPA相互作用的结构域及机制以及对cyclin D1表达的影响。
7.根据权利要求1所述的一种Fra-1与XPA复合物在细胞周期调控中的应用，其特征在于：所述步骤三建立大鼠原代RGC光损伤模型，western blot方法检测Fra-1、XPA、cyclinD1、activecaspase-3的蛋白表达情况；核浆分离的方法检测XPA的核转位情况；免疫共沉淀方法检测Fra-1与XPA之间的相互作用，流式细胞仪检测损伤后RGC的细胞周期；TUNEL方法检测RGC的凋亡情况；分析Fra-1、XPA的表达变化、相互作用以及cyclin D1表达变化对RGC凋亡的影响。
8.根据权利要求1所述的一种Fra-1与XPA复合物在细胞周期调控中的应用，其特征在于：所述步骤四构建Fra-1、XPA慢病毒干预载体，视网膜下注射，western blot及免疫荧光检测干预效果；建立大鼠RLD模型，检测cyclin D1的表达；用TUNEL方法检测大鼠视网膜RGC的凋亡情况；分析干预XPA-Fra-1复合物的形成对cyclin D1的表达变化以及对RGC凋亡的影响。
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