CN110447601A - 一种靶向巨噬细胞过表达基因小鼠模型的制备方法 - Google Patents

一种靶向巨噬细胞过表达基因小鼠模型的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110447601A
CN110447601A CN201910734696.3A CN201910734696A CN110447601A CN 110447601 A CN110447601 A CN 110447601A CN 201910734696 A CN201910734696 A CN 201910734696A CN 110447601 A CN110447601 A CN 110447601A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
supernatant
pbs
mouse
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910734696.3A
Other languages
English (en)
Inventor
陈琪
贲晶晶
江斌
王冬冬
张永静
徐涌
柏惠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing University
Nanjing Medical University
Original Assignee
Nanjing Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Medical University filed Critical Nanjing Medical University
Priority to CN201910734696.3A priority Critical patent/CN110447601A/zh
Publication of CN110447601A publication Critical patent/CN110447601A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Humanized animals, e.g. knockin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/35—Animals modified by environmental factors, e.g. temperature, O2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Abstract

一种靶向巨噬细胞过表达基因小鼠模型的制备方法，属于疾病靶向治疗领域，利用慢病毒感染骨髓细胞再结合骨髓移植的方法，能够快速高效实现小鼠巨噬细胞特异性基因过表达。相比于转基因小鼠构建等技术，时效性更高。

Description

一种靶向巨噬细胞过表达基因小鼠模型的制备方法
技术领域
本发明属于疾病靶向治疗领域，具体涉及一种基于慢病毒感染和骨髓移植方法快速高效靶向巨噬细胞过表达基因小鼠模型的制备方法。
背景技术
巨噬细胞(macrophage)是机体的固有免疫细胞，在组织修复、组织再生以及宿主防御、维持稳态等方面具有广泛重要作用。它们的主要功能是对细胞残片及病原体进行吞噬消化，并激活其他免疫细胞，使其对病原体作出反应。巨噬细胞在多种急慢性炎症疾病中起重要调控作用，如恶性肿瘤、动脉粥样硬化和自身免疫性疾病。在肿瘤发生发展过程中，巨噬细胞是肿瘤微环境的重要组成部分，被称为肿瘤相关巨噬细胞，它主要起着调控肿瘤生长、影响肿瘤血管生成、从而引起肿瘤侵袭、转移等功能改变的作用。巨噬细胞介导的慢性炎性反应与心血管疾病如动脉粥样硬化的发生发展也密切相关，在病变的不同阶段，巨噬细胞均扮演重要角色。因此，巨噬细胞这种异质性固有免疫细胞，目前已成为重大疾病靶向治疗研究的新热点，具有极其重要的理论研究和临床应用前景。
因此对巨噬细胞进行基因修饰和干预，成为学者们改造巨噬细胞来治疗感染与炎症性疾病的研究方向。现阶段，靶向巨噬细胞进行基因修饰的方法主要有骨髓移植，flox/cre系统构建特异性敲除小鼠以及针对启动子区域构建过表达转基因小鼠等手段。这些方法具有特异性差，耗时长，经费消耗大等缺点。所以，建立新的技术手段快速高效在体靶向干预巨噬细胞，提高巨噬细胞基因转导效率，实现巨噬细胞功能改造，具有较高的应用价值。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一种基于慢病毒感染和骨髓移植方法快速高效靶向巨噬细胞过表达基因小鼠模型的制备方法。
技术方案：一种靶向巨噬细胞过表达基因小鼠模型的制备方法，步骤为：1)首先制备编码目标基因慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其辅助包装原件载体质粒，使用Buffer A进行共转染HEK293T细胞，转染后16-18h更换为完全培养基，培养48～72h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，初步过滤后，将其进行浓缩得到高滴度的慢病毒浓缩液；2)取3-4周龄Lyz2-Cre小鼠股骨和胫骨，用含有10wt.％FBS，1wt.％P/S以及1wt.％NEAA的DMEM培养液冲洗骨髓腔，经BD FalconTM100μm细胞过滤网过滤，收集骨髓腔提取物，于4℃、1000g离心10min，弃上清，以5mL红细胞裂解液重新悬浮细胞，于室温下孵育1分钟；经PBS清洗后，用含有10wt.％FBS，10ng/mL IL-3，10ng/mL IL-6，10ng/mL Stem cell factor的DMEM条件培养基重悬细胞，并计数种于10cm培养皿中，置CO2培养箱中培养；3)细胞培养过夜后，收集悬浮细胞，于4℃、1000g离心10分钟，弃上清；PBS液洗涤细胞2次；用10mL DMEM条件培养基重悬细胞，种板于12孔板，1mL/孔；每孔加入慢病毒，1800g，120分钟悬浮感染；后将细胞放入培养箱继续培养，隔天进行骨髓移植；4)(1)提前一周准备体重23-25g C57/B6小鼠，以抗生素水喂养一周，所述抗生素水组成为1L去离子水+100mg新霉素+10mg多粘菌素+700μL浓盐酸(36wt.％～38wt.％)；(2)一周后，对步骤(1)C57/B6小鼠按7-9格雷剂量进行辐照；(3)步骤(2)辐照小鼠休息4-6小时后，收集病毒感染悬浮细胞，1000g，10分钟离心；用含10ng/mLIL-3，10ng/mL IL-6，10ng/mL stem cell factor的PBS洗涤细胞；弃上清，用PBS重悬细胞，将骨髓细胞尾静脉注射入辐照受体小鼠内完成模型制备。
上述慢病毒浓缩液的制备方法为：(1)HEK293T细胞准备：用0.05wt.％Trypsin-EDTA消化HEK 293T细胞，按1:4传代，加入完全培养基，所述完全培养基组成为DMEM+10wt.％FBS+1wt.％青链霉素，置CO2培养箱中培养，待细胞融合度100％准备转染；(2)转染前换液：转染前1～2h将细胞培养基更换为不含青链霉素的完全培养基，6mL/10cm培养皿；(3)转染：取无菌的1.5mL EP管，按下列组分配制反应体系，混匀后，室温静置20min～30min，均匀加入步骤2)的细胞中，后置于CO2培养箱中培养；转染1块10cm培养皿的用量：DMEM 1mL，携带目标基因片段的慢病毒载体DNA 10μg，Pla-Mix 10μL，Buffer A 60μL；(4)换液：转染18～20h后，弃步骤(3)的细胞培养上清，加12mL新鲜的培养基继续培养，所述新鲜的培养基组成为DMEM+10wt.％FBS+1wt.％Buffer B；(5)病毒上清收集：48h～72h后，吸取细胞上清液于50mL离心管中，4℃，3000rpm，离心5min；(6)病毒过滤：准备0.45μm孔径滤器，用2～3mL 5wt.％Buffer C润湿，使用前用1×PBS稀释，将步骤(5)后的病毒上清通过湿润的0.45μm孔径滤器过滤；此时滤过后的上清液中的病毒颗粒可以直接用于检测滴度或者感染目的细胞；(7)病毒浓缩：将步骤(6)后的病毒上清进行超速离心，18000rpm，2小时，4℃，弃上清后用100～200μL 5wt.％Buffer C重悬，使用前用1×PBS稀释。
有益效果：利用慢病毒感染骨髓细胞再结合骨髓移植的方法，能够快速高效实现小鼠巨噬细胞特异性基因过表达。相比于转基因小鼠构建等技术，时效性更高。靶向更为精准，可直接对巨噬细胞进行基因过表达。
附图说明
图1为Western Blot检测FLAG表达图；
图2为细胞蛋白荧光图；
图3为Western Blot检测FLAG表达图；
图4为免疫组化检测小鼠脾脏中Flag和mCherry的表达图；
图5为免疫组化检测小鼠附睾脂肪中Flag和mCherry的表达图；
图6为Western Blot鉴定小鼠脾脏中Flag的表达图；
图7为Western Blot鉴定小鼠附睾脂肪中Flag的表达图。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员可全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
以在体实现小鼠巨噬细胞过表达穹窿主体蛋白(MVP)为例，详细实验步骤如下：
1.病毒包装及滴度测定
根据专利号ZL 2017 1 0680328.6《高滴度慢病毒的制备试剂盒及应用》包装慢病毒。首先制备编码MVP基因慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其辅助包装原件载体质粒，使用Buffer A进行共转染HEK293T细胞，转染后18h更换为完全培养基，培养48～72h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，初步过滤后，将其进行浓缩得到高滴度的慢病毒浓缩液。
(1)HEK293T细胞准备：用0.05wt.％Trypsin-EDTA消化HEK 293T细胞，按1:4传代，加入完全培养基(DMEM+10wt.％FBS+1wt.％青链霉素)，置CO2培养箱中培养，待细胞融合度100％准备转染。
(2)转染前换液：转染前1～2h将细胞培养基更换为不含青链霉素的新鲜培养基(DMEM+10wt.％FBS)，6mL/10cm培养皿。
(3)转染：取无菌的1.5mL EP管，按下列组分配制反应体系，混匀后，室温静置20min～30min，均匀加入步骤2)的细胞中，后置于CO2培养箱中培养。
包装携带MVP基因片段的慢病毒颗粒(转染1块10cm培养皿的用量)
组分 体积
DMEM(No Phenol Red)： 1mL
携带MVP基因片段的慢病毒载体DNA 10μg
Pla-Mix 10μL
Buffer A 60μL
(4)换液：转染18～20h后，弃步骤3)的细胞培养上清于盛有消毒液的废液杯中，加12mL新鲜的培养基(DMEM+10wt.％FBS+1wt.％Buffer B)继续培养。
(5)病毒上清收集：48h～72h后，吸取细胞上清液于50mL离心管中，4℃，3000rpm，离心5min。
(6)病毒过滤：准备0.45μm孔径滤器，用2～3mL 5wt.％Buffer C(使用前用1×PBS稀释)润湿，将步骤(5)后的病毒上清通过湿润的0.45μm孔径滤器过滤。此时滤过后的上清液中的病毒颗粒可以直接用于检测滴度或者感染目的细胞，如果对病毒的滴度及纯度有较高要求，可进一步对病毒上清液进行浓缩纯化。
(7)病毒浓缩：将步骤(6)后的病毒上清进行超速离心(Beckman水平转头)，18000rpm，2小时，4℃，弃上清后用100～200μL 5wt.％Buffer C(用前用1×PBS稀释)重悬。
(8)病毒分装与保存：将病毒以10～20μL分装于200μL EP管，可长期保存于-80℃，避免反复冻融。
(9)病毒滴度的测定:测定病毒滴度前，用0.05wt.％Trypsin-EDTA消化HEK293T细胞后，将其吹打成单细胞悬液，覆盖于96孔板上。将获得的MVP基因病毒稀释成不同浓度对HEK293T细胞进行感染24h，换完全培养基培养72h后观察各个组别mCherry荧光差异，及各孔中荧光细胞数量，计算病毒滴度。病毒滴度的计算方法为各孔中表达荧光的细胞数平均值除以每孔中含有的慢病毒液体积。
2.提取培养骨髓细胞
取3-4周龄Lyz2-Cre小鼠股骨和胫骨，用含有10wt.％FBS，1wt.％P/S以及1wt.％NEAA的DMEM培养液冲洗骨髓腔，经BD FalconTM100μm细胞过滤网过滤，收集骨髓腔提取物，于4℃、1000g离心10min，弃上清，以5mL红细胞裂解液重新悬浮细胞，于室温下孵育1分钟；经PBS清洗后，用含有10wt.％FBS，10ng/mL IL-3，10ng/mL IL-6，10ng/mL Stem cellfactor的DMEM条件培养基(骨髓细胞培养液)重悬细胞，并计数种于10cm培养皿中，置CO2培养箱中培养。
3.骨髓细胞进行病毒感染
细胞培养过夜后，收集悬浮细胞，于4℃、1000g离心10分钟，弃上清。PBS液洗涤细胞2次。用10mL骨髓细胞培养液重悬细胞，种板于12孔板，1mL/孔。每孔加入包装好并测定好滴度的Lenti-flex-flag-MVP-mCherry慢病毒，1800g，120分钟悬浮感染。后将细胞放入培养箱继续培养，隔天进行骨髓移植实验。
4.骨髓移植
(1)提前一周准备8周龄(约23-25g)C57/B6小鼠，以抗生素水(1L去离子水+100mg新霉素+10mg多粘菌素+700μL浓盐酸)喂养一周。
(2)一周后，对步骤(1)C57/B6小鼠按7格雷剂量进行辐照。
(3)步骤(2)辐照小鼠休息4小时后，收集病毒感染悬浮细胞，1000g，10分钟离心。用含10ng/mL IL-3，10ng/mL IL-6，10ng/mL stem cell factor的PBS(细胞洗液)洗涤细胞2次。弃上清，用PBS重悬细胞，将骨髓细胞尾静脉注射入辐照受体小鼠内。观察4周后，可进行后续实验干预。
5.鉴定模型构建成功
收取步骤4骨髓移植4周后小鼠，采用异弗烷吸入麻醉后，小鼠心脏经生理盐水进行灌流，分别取小鼠含有较丰富的巨噬细胞脏器如脾脏及附睾脂肪组织。以上组织部分经液氮速冻后，-80℃冰箱低温保存，后进行Western Blot检测Flag-MVP-mCHerry的表达。部分组织标本置于4wt.％的多聚甲醛溶液中固定，待石蜡切片，免疫组织化学染色检测观察Flag-MVP-mCHerry的表达。
(1)免疫组化：
①脾脏、脂肪组织石蜡切片脱蜡至水：经二甲苯I、II、III，3次，每次5分钟，要确保二甲苯足量有效；醇苯一次，5分钟；无水乙醇2次，每次5分钟；95％乙醇2次，每次5分钟；蒸馏水2次，每次5分钟；1×PBS洗3次，每次5分钟；
②3wt.％过氧化氢封闭15分钟：30wt.％过氧化氢与蒸馏水1:9配制，新鲜配制，现配现用；PBS洗3次，每次5分钟；10wt.％正常山羊血清封闭30分钟；
③封闭后不洗，加入一抗anti-Flag以及anti-mCherry，4℃孵育过夜；
④第二天，室温平衡30分钟；PBS洗3次，每次5分钟；
⑤加入相应二抗孵育，37℃，1小时后，PBS洗3次，每次5分钟；
⑥DAB显色，显色完毕置于蒸馏水，梯度浓度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
(2)免疫印迹：
①聚丙烯酰胺凝胶配置：配置10wt.％的分离胶，用水隔绝空气，室温放置30分钟，发分离胶聚合后灌入4wt.％的浓缩胶，插入梳子，室温放置15分钟；
②电泳：将制备好的蛋白样品加入对应孔中，设置电压为80V，待蛋白Marker进入分离胶后，将电压改为120V，待溴酚蓝到达分离胶底部时停止电泳；
③转膜(湿转)；首先配置转膜液，再将PVDF膜用甲醇激活15秒，浸泡于转膜液中。电泳结束后，取出凝胶，切去浓缩胶，将夹子打开，黑面朝下，从上到下依次放上海绵垫，两层滤纸，胶、PVDF膜，两层滤纸和海绵垫。赶走气泡，将夹子夹紧，放入槽中。设置电流0.35A，2小时；
④封闭：转膜结束后，取出PVDF膜，将膜浸于含5wt.％BSA的TBS-T中1.5小时；
⑤抗体敷育：封闭结束将膜置于杂交袋内，加入相应的特异性一抗Anti-Flag(2.5wt.％BSA-TBS-T稀释)，4℃摇床过夜。次日用TBS-T清洗，10分钟一次，洗3遍。将膜与辣根过氧化物酶标记的相应二抗在室温下敷育1.5小时，TBS-T清洗10分钟一次，洗3遍；
⑥显影：将ECL显色液A与B按1:1混合，现用现配，均匀滴加至膜表面，用高敏荧光成像系统观察结果。
实验结果
1.为了鉴定Flex-Cre系统的表达，首先将Lenti-flex-flag-MVP-mCherry质粒和Lyz2-Cre质粒通过脂质体转染的方法转染HEK293T细胞。24小时后，收集细胞蛋白，WesternBlot检测FLAG表达(图1)。结果表明，Flex-Cre系统有效。
2.为了鉴定高滴度慢病毒感染骨髓细胞效率，将高滴度慢病毒Lenti-flex-flag-MVP-mCherry感染骨髓细胞，72小时后，收集细胞蛋白，荧光观察(图2)和Western Blot检测FLAG表达(图3)。结果表明，包装的慢病毒能够有效实现骨髓细胞过表达Flag-MVP。
3.为了鉴定小鼠骨髓移植后巨噬细胞中MVP的表达，首先取骨髓移植后4周小鼠的脾脏和附睾脂肪组织，免疫组化检测小鼠脾脏(图4)和附睾脂肪(图5)中Flag和mCherry的表达。Western Blot鉴定小鼠脾脏(图6)和附睾脂肪(图7)中Flag的表达。以上实验结果表明，经过骨髓移植后，小鼠的脾脏和脂肪这两种含有巨噬细胞的脏器中，实现了Flag-MVP的过表达。
以上的实验结果充分证明，Flex-Cre系统可以实现特异性细胞靶向。利用慢病毒感染骨髓细胞再结合骨髓移植的方法，能够快速高效实现基因过表达。

Claims (2)

1.一种靶向巨噬细胞过表达基因小鼠模型的制备方法，其特征在于步骤为：
1）首先制备编码目标基因慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其辅助包装原件载体质粒，使用Buffer A进行共转染HEK293T细胞，转染后16-18h 更换为完全培养基，培养48~72h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，初步过滤后，将其进行浓缩得到高滴度的慢病毒浓缩液；
2）取3-4周龄Lyz2-Cre小鼠股骨和胫骨，用含有10wt.%FBS，1wt.% P/S以及1wt.% NEAA的DMEM培养液冲洗骨髓腔，经 BD Falcon™ 100 µ m 细胞过滤网过滤，收集骨髓腔提取物，于4℃、1000g 离心10 min，弃上清，以5mL红细胞裂解液重新悬浮细胞，于室温下孵育1分钟；经PBS清洗后，用含有10wt.%FBS，10ng/mL IL-3，10ng/mL IL-6，10ng/mL Stem cellfactor的DMEM条件培养基重悬细胞，并计数种于10cm培养皿中，置CO2培养箱中培养；
3）细胞培养过夜后，收集悬浮细胞，于4℃、1000g 离心10分钟，弃上清；PBS液洗涤细胞2次；用10mL DMEM条件培养基重悬细胞，种板于12孔板，1mL/孔；每孔加入慢病毒，1800g，120分钟悬浮感染；后将细胞放入培养箱继续培养，隔天进行骨髓移植；
4）（1）提前一周准备体重23-25g C57/B6小鼠，以抗生素水喂养一周，所述抗生素水组成为1L去离子水+100mg新霉素+10mg多粘菌素+700μL浓盐酸；（2）一周后，对步骤（1）C57/B6小鼠按7-9格雷剂量进行辐照；（3）步骤（2）辐照小鼠休息4-6小时后，收集病毒感染悬浮细胞，1000g，10分钟离心；用含10ng/mL IL-3，10ng/mL IL-6，10ng/mL stem cell factor的PBS洗涤细胞；弃上清，用PBS重悬细胞，将骨髓细胞尾静脉注射入辐照受体小鼠内完成模型制备。
2.根据权利要求1所述靶向巨噬细胞过表达基因小鼠模型的制备方法，其特征在于所述慢病毒浓缩液的制备方法为：（1）HEK293T细胞准备：用0.05wt.%Trypsin-EDTA消化HEK293T细胞，按1:4传代，加入完全培养基，所述完全培养基组成为DMEM+10wt.% FBS+1wt.%青链霉素，置CO2培养箱中培养，待细胞融合度100%准备转染；（2）转染前换液：转染前1～2h将细胞培养基更换为不含青链霉素的完全培养基，6mL/10cm培养皿；（3）转染：取无菌的1.5mL EP管，按下列组分配制反应体系，混匀后，室温静置20min～30min，均匀加入步骤2）的细胞中，后置于CO2培养箱中培养；转染1块10cm培养皿的用量：DMEM 1mL，携带目标基因片段的慢病毒载体DNA 10μg，Pla-Mix 10μL，Buffer A 60μL；（4）换液：转染18～20h后，弃步骤（3）的细胞培养上清，加12mL 新鲜的培养基继续培养，所述新鲜的培养基组成为DMEM+10wt.%FBS+1wt.%Buffer B；（5）病毒上清收集：48h～72h后，吸取细胞上清液于50mL离心管中，4℃，3000rpm，离心5min；（6）病毒过滤：准备0.45μm孔径滤器，用2～3mL 5wt.% BufferC润湿，使用前用1×PBS稀释，将步骤（5）后的病毒上清通过湿润的0.45μm孔径滤器过滤；此时滤过后的上清液中的病毒颗粒可以直接用于检测滴度或者感染目的细胞；（7）病毒浓缩：将步骤（6）后的病毒上清进行超速离心，18000rpm，2小时，4℃，弃上清后用100～200μL5wt.%Buffer C重悬，使用前用1×PBS稀释。
CN201910734696.3A 2019-08-09 2019-08-09 一种靶向巨噬细胞过表达基因小鼠模型的制备方法 Pending CN110447601A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910734696.3A CN110447601A (zh) 2019-08-09 2019-08-09 一种靶向巨噬细胞过表达基因小鼠模型的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910734696.3A CN110447601A (zh) 2019-08-09 2019-08-09 一种靶向巨噬细胞过表达基因小鼠模型的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110447601A true CN110447601A (zh) 2019-11-15

Family

ID=68485738

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910734696.3A Pending CN110447601A (zh) 2019-08-09 2019-08-09 一种靶向巨噬细胞过表达基因小鼠模型的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110447601A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111254112A (zh) * 2020-02-13 2020-06-09 宁夏大学 小鼠骨髓巨噬细胞的制备和鉴定试剂盒及其用途
CN114457014A (zh) * 2021-12-15 2022-05-10 南京医科大学 骨痂巨噬细胞分离用组合试剂及其应用
CN114457014B (zh) * 2021-12-15 2024-05-17 南京医科大学 骨痂巨噬细胞分离用组合试剂及其应用

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050100986A1 (en) * 2003-06-05 2005-05-12 Verma Inder M. Compositions and methods for targeting a polypeptide to the central nervous system
JP2009171980A (ja) * 2000-04-06 2009-08-06 Kos Pharmaceuticals Inc 高トリグリセリド血症を誘発することなくコレステロールレベルを低下するための化合物と方法
CN101912618A (zh) * 2010-08-09 2010-12-15 祝荫 携带nk4基因的骨髓间充质干细胞的制备方法及其应用
CN102864172A (zh) * 2012-10-15 2013-01-09 中国人民解放军第二军医大学 基因共转染技术建立的白血病小鼠模型及其制备方法
CN104127438A (zh) * 2008-02-22 2014-11-05 新加坡科技研究局 间充质干细胞颗粒
CN104800243A (zh) * 2014-01-28 2015-07-29 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种重组间充质干细胞在制备免疫抑制剂中的应用
CN107164332A (zh) * 2017-05-24 2017-09-15 上海交通大学医学院附属新华医院 经干扰序列修饰的TGF‑β1缄默的白血病细胞外泌体及其制备方法和应用
CN107384872A (zh) * 2017-08-10 2017-11-24 南京医科大学 高滴度慢病毒的制备试剂盒及其应用
CN107604005A (zh) * 2017-09-18 2018-01-19 马利民 VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建方法
CN109468282A (zh) * 2018-11-22 2019-03-15 青岛协和华美医学诊断技术有限公司 一种靶向cd19的嵌合抗原受体t细胞的制备方法及应用

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009171980A (ja) * 2000-04-06 2009-08-06 Kos Pharmaceuticals Inc 高トリグリセリド血症を誘発することなくコレステロールレベルを低下するための化合物と方法
US20050100986A1 (en) * 2003-06-05 2005-05-12 Verma Inder M. Compositions and methods for targeting a polypeptide to the central nervous system
CN104127438A (zh) * 2008-02-22 2014-11-05 新加坡科技研究局 间充质干细胞颗粒
CN101912618A (zh) * 2010-08-09 2010-12-15 祝荫 携带nk4基因的骨髓间充质干细胞的制备方法及其应用
CN102864172A (zh) * 2012-10-15 2013-01-09 中国人民解放军第二军医大学 基因共转染技术建立的白血病小鼠模型及其制备方法
CN104800243A (zh) * 2014-01-28 2015-07-29 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种重组间充质干细胞在制备免疫抑制剂中的应用
CN107164332A (zh) * 2017-05-24 2017-09-15 上海交通大学医学院附属新华医院 经干扰序列修饰的TGF‑β1缄默的白血病细胞外泌体及其制备方法和应用
CN107384872A (zh) * 2017-08-10 2017-11-24 南京医科大学 高滴度慢病毒的制备试剂盒及其应用
CN107604005A (zh) * 2017-09-18 2018-01-19 马利民 VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建方法
CN109468282A (zh) * 2018-11-22 2019-03-15 青岛协和华美医学诊断技术有限公司 一种靶向cd19的嵌合抗原受体t细胞的制备方法及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
临床执业医师资格考试专家组: "《临床执业医师资格考试应试指导 2018年》", 31 January 2018, 中国协和医科大学出版社 *
朱颖炜: ""转染TIMP-1-shRNA基因的骨髓间充质干细胞治疗大鼠肝纤维化"", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
黄馨 等: ""shRNA重组慢病毒载体在小鼠造血系统中的长期高效表达"", 《军事医学科学院院刊》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111254112A (zh) * 2020-02-13 2020-06-09 宁夏大学 小鼠骨髓巨噬细胞的制备和鉴定试剂盒及其用途
CN114457014A (zh) * 2021-12-15 2022-05-10 南京医科大学 骨痂巨噬细胞分离用组合试剂及其应用
CN114457014B (zh) * 2021-12-15 2024-05-17 南京医科大学 骨痂巨噬细胞分离用组合试剂及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112121063B (zh) 外泌体在制备治疗肺纤维化的药物中的应用
CN103254307B (zh) Hpv18e7单克隆抗体、相关杂交瘤细胞株和应用
WO2021031884A1 (zh) 一种尿源性肾干细胞的培养方法及其应用
JPH07504398A (ja) 真皮に対する表皮ケラチン細胞の接着を改善する生成物および方法
Schmidt et al. Establishment and characterization of osteogenic cell lines from a spontaneous murine osteosarcoma
CN105675873A (zh) 一种检测试剂盒及其应用
WO2022032496A1 (zh) 一种预防新型冠状病毒微颗粒的制备方法及应用
CN104250655A (zh) Bmp-2/vegf165双基因修饰的骨髓间充质干细胞及其制备方法
CN114209814B (zh) Tnfsf15蛋白在促进骨髓干细胞分化为巨噬细胞并扩增中的用途
CN110447601A (zh) 一种靶向巨噬细胞过表达基因小鼠模型的制备方法
CN108379275A (zh) 溶血磷脂酸、溶血磷脂酸受体3以及溶血磷脂酸受体3激动剂的应用
CN113559273B (zh) 一种静脉注射用成体干细胞的预处理方法、成体干细胞注射液及应用
CN109504710B (zh) Kdm4d的用途
Wang et al. Establishment of immortalized yak ruminal epithelial cell lines by lentivirus-mediated SV40T and hTERT gene transduction
CN114292848A (zh) 一种高表达抑癌miRNA并靶向肺癌的工程化外泌体
CN113667645A (zh) 一种犬乳腺癌细胞系、其建立方法及应用
CN107217060A (zh) Kdm1a的用途
CN104928319B (zh) hTERT慢病毒重组体永生化人牙周膜干细胞系的方法
CN115671137A (zh) 人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体在制备肌腱损伤药物中的应用
JPH11243948A (ja) 動物細胞増殖用の細胞培養床基材及びその調製方法
CN108841786A (zh) 人羊膜来源的间充质干细胞预处理方法及其应用
CN104450781B (zh) 一种过表达ciapin1蛋白的细胞系及其制备方法和应用
Sottile et al. Differential response of early and late passage fibroblasts to collagenase stimulatory factor in conditioned media
CN108330101B (zh) 一种杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体和应用
CN106434540A (zh) 一种细胞培养液及其应用和诱导骨骼肌干细胞向骨细胞分化的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20191115

RJ01 Rejection of invention patent application after publication