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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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A. GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Gentherapie.
Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Verabreichung einer
therapeutischen Nukleinsäure
zur Behandlung von hyperproliferativen Krankheiten, wie in den Ansprüchen ausgeführt. Bei
einer Ausführungsform
betrifft die Erfindung die Expression einer Nukleinsäure, die
eine verkürzte
Form des menschlichen MDA-7(mda7TF)-Proteins
codiert, zur Behandlung von hyperproliferativen Krankheiten, während die
Erfindung bei anderen Ausführungsformen
die Volllängenform
des menschlichen MDA-Polypeptids zur Behandlung von hyperproliferativen
Krankheiten umfasst.
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B. BESCHREIBUNG DER VERWANDTEN TECHNIK
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1. Gentherapie
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Die
Gentherapie ist ein in der biomedizinischen Forschung auftretenden
Gebiet, das sich auf die Krankheitsbehandlung durch das Einschleusen
von therapeutischen rekombinanten Nukleinsäuren in somatische Zellen von
Patienten konzentriert. Verschiedene klinische Versuche unter Anwendung
von Gentherapien wurden bereits gestartet und umfassen die Behandlung
verschiedener Krebse, von AIDS, zystischer Fibrose, Adenosindesaminasemangel,
Herz-Kreislauf-Erkrankung Gaucher-Krankheit, rheumatoider Arthritis
und anderen. Derzeit ist das Adenovirus das bevorzugte Vehikel zur
Abgabe von gentherapeutischen Mitteln. Vorteile in der Verwendung
von Adenovirus als ein gentherapeutisches Mittel sind die hohe Transduktionseffizienz,
die Infektion von sich nicht teilenden Zellen, die leichte Manipulation
seines Genoms und die geringe Wahrscheinlichkeit nicht homologer
Rekombination mit dem Wirtsgenom.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt eine neue Nukleinsäure, die
eine verkürzte
Form von menschlichem MDA-7 (mda7TF) codiert,
zur Behandlung von hyperproliferativer Krankheit in Menschen.
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Außerdem beschreibt
die Erfindung auch eine Nukleinsäure,
die eine lösliche
Form des MDA-7-Proteins codiert, und Anwendungen davon.
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2. MDA-7
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Die
cDNA, die das MDA-7-Protein codiert, wurde bereits von Jiang et
al., 1995 (
WO 9511986 )
beschrieben. Das von der mda-7 cDNA codierte Protein wurde als ein
potentieller Regulator der Melanomprogression erkannt. Jiang et
al. verwendeten eine subtraktive Hybridisierungstechnik (Jiang et
al., 1995) zur Identifizierung von Genen, die an der Regulierung
des Wachstums und der Differenzierung in menschlichen Melanomzellen
beteiligt sind. Eine cDNA-Bibliothek, die durch Subtraktionshybridisierung
von cDNAs hergestellt wurde, die aus aktiv proliferierenden menschlichen
HO-1 Melanomzellen hergestellt wurden, die aus Interferon-beta (IFN-β) und Mezerin-differenzierten
menschlichen HO-1 Melanomzellen hergestellt wurden, wurde zur Identifizierung
mehrerer Melanomdifferenzierung-assoziierter (mda) cDNAs, einschließlich von
mda-7, verwendet. Die Expression von mda-7 mRNA steht zu der Melanomprogression
in ungekehrter Relation, wie gezeigt durch erhöhte mRNA-Spiegel in normalen
Melanozyten im Vergleich zu primären
und metastatischen Melanomen, sowie durch herabgesetzte mda-7 mRNA
Expression in frühen
vertikalen Wachstumsphasen-Melanomzellen, die zur verstärkten Tumorbildung
in Nacktmäusen
gewählt
werden.
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Die
mda-7 cDNA codiert ein neues, evolutionär konserviertes Protein von
206 Aminosäuren
mit einer vorausberechneten Größe von 23,8
kDa. Die hergeleitete Aminosäuresequenz
enthält
eine hydrophobe Spanne von etwa der Aminosäure 26 bis 45, die Merkmale
einer Signalsequenz aufweist. Die Proteinsequenz zeigt keine signifikante
Aminosäure-Sequenzhomologie
mit bekannten Proteinen oder Proteinmotiven, mit Ausnahme einer
42-Aminosäure-Spanne,
die zu 54% mit Interleukin 10 (IL-10) identisch ist. Die von Bazan
et al. durchgeführte
Strukturanalyse hat bestimmt, dass mda-7 (IL-BKW oder IL-20) die
Strukturmerkmale der Zytokinfamilie zeigt (
WO 9828425 ). Die Strukturmerkmale
und die eingeschränkte
Identität über eine
kleine Spanne von Aminosäuren
legt für
MDA-7 eine extrazelluläre
Funktion nahe.
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Zusätzliche
Studien haben gezeigt, dass eine erhöhte Expression von MDA-7 Krebszellenwachstum in
vitro unterdrückte
und selektiv Apoptose in menschlichen Brustkrebszellen auslöste, sowie
die Tumorigenizität
in Nacktmäusen
hemmte (Jiang et al., 1996; Su et al., 1998). Jiang et al. (1996)
berichten über
Befunde, dass MDA-7 ein potentes wachstumsunterdrückendes
Gen in Krebszellen diverser Ursprünge ist, einschließlich Brust-,
Zentralnervensystem-, Cervix-, Dickdarm-, Prostata- und Bindegewebe.
Ein Kolonien-Hemmtest wurde
eingesetzt, um zu zeigen, dass die erhöhte Expression von mda-7 die
Wachstumsinhibition in menschlichem Zervikalkarzinom (HeLa), menschlichem
Brustkarzinom (MCF-7 und T47D), Dickdarmkarzinom (LS174T und SW480),
Nasopharyngealkarzinom (HONE-1), Prostatakarzinom (DU-145), Melanom
(HO-1 und C8161), multiformem Glioblastom (GBM18 und T98G), und
Osteosarkom (Saos-2) verstärkte.
Eine MDA-7-Überexpression
in normalen Zellen (HMECs, HBL-100 und CREF-Trans6) zeigte eingeschränkte Wachstumsinhibition,
die angibt, dass mda-7 Transgeneffekte in normalen Zellen nicht
manifest sind. Zusammenfassend ist die Wachstumsinhibition durch
eine erhöhte
Expression von MDA-7 in vitro in Krebszellen wirksamer als in normalen
Zellen.
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Su
et al. (1998) berichteten über
Untersuchungen hinsichtlich des Mechanismus, durch den MDA-7 das
Krebszellenwachstum unterdrückte.
Die Untersuchungen berichteten, dass eine ektopische Expression von
MDA7 in den Brustkrebszelllinien MCF-7 und T47D Apoptose auslöste, wie
durch Zellzyklusanalyse und TUNEL-Essay nachgewiesen, ohne eine
Wirkung auf normale HBL-100-Zellen. Die Western-Blot-Analyse von Zelllysaten
aus mit Adenovirus mda-7 („Ad-mda-7") infizierten Zellen
zeigte eine Aufregulierung des Apoptosestimulierenden Proteins BAX.
Die Ad-mda7-Infektion erhöhte
die Niveaus von BAX-Protein nur in MCF-7- und T47D-Zellen und nicht
in normalen HBL-100- oder HMEC-Zellen.
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Das
Bax-Gen spielt bei der Auslösung
der Apoptose eine bedeutende Rolle. Steigerungen in der Bax-Transkripition
können
zum Teil für
den p53-regulierten Weg der Apoptose-Induktion verantwortlich sein (Miyashita
et al., 1995). Die Überexpression
von BAX und eine Zunahme in dem Bax/Bcl-2-Proteinverhältnis führt zu einer
Dissipation von mitochondrialem Membranpotential und zur Freisetzung
von Zytochrom c (Rosse, 1998). Das BAX-Protein bindet direkt an
den mitochondrialen Porinkanal (spannungsabhängiger Anionenkanal VDAC genannt)
und gestattet es dem Cytochrom c, den VDAC zu passieren (Shimizu
et al., 1999). Cytochrome-c komplexiert mit Apaf-1, und dieser Komplex
spaltet und aktiviert Caspase-9, eine Initiator-Caspase. Die Caspase-Kaskade
wird von dieser Initiator-Caspase aktiviert. Bei einigen beschriebenen
Wegen des Zelltodes spielen die Caspase- und Bcl-2-Proteinfamilien
eine Schlüsselrolle
bei der Regulierung und Ausführung
der Apoptose.
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Auf
der Grundlage der ermittelten Wechselwirkungen unter den bekannten
Mediatoren der Apoptose tauchten drei klassische Wege der apoptotischen
Signalgebung in der Säugerzelle
auf (Dragovich, 1998). Der erste wird durch den Abzug von Wachstumsfaktoren
gestartet und wird durch die Bcl-2-Familie von Proteinen reguliert.
Dieser Weg führt
zur Cytochrom-c-Freisetzung
aus Mitochondrien, zur Aktivierung von Apaf-1 und zur Auslösung der
Caspase-Kaskade.
Der andere, gut ermittelte Apoptoseweg umfasst die Signalgebung durch
Zelloberflächentod-Rezeptoren,
wie TNF oder Fas, die, über
Adaptermoleküle,
Caspasen rekrutieren und aktivieren können. Der dritte und letzte
gut charakterisierte Weg wird durch DNA-Schädigung ausgelöst. Diese
wird zum Teil durch Proteine, wie p53 und ATM, reguliert. Bei allen
dreien von diesen Wegen des Zelltodes spielt die Caspase- und Bcl-2-Proteinfamilie eine
Schlüsselrolle
bei der Regulierung und Ausführung
der Apotose.
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3. Krebs
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Die
normale Gewebe-Homöostase
ist ein hoch regulierter Prozess von Zellproliferation und Zelltod. Ein
Ungleichgewicht entweder von Zellproliferation oder Zelltod kann
sich zu einem kanzerösen
Zustand entwickeln (Solyanik et al., 1995; Stokke et al., 1997;
Mumby and Walter, 1991; Natoli et al., 1998; Magi-Galluzzi et al.,
1998). Beispielsweise sind Zervikal-, Nieren-, Lungen-, Pankreas-,
Kolorektal- und Gehirnkrebs nur einige wenige Beispiele der vielen
Krebse, die die Folge sein können
(Erlandsson, 1998; Kolmel, 1998; Mangray and King, 1998; Gertig
and Hunter, 1997; Mougin et al., 1998). In der Tat ist das Auftreten
von Krebs so hoch, dass dem Krebs allein in den USA über 500.000
Tote pro Jahr zuzuschreiben sind.
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Die
Aufrechterhaltung von Zellproliferation und Zelltod wird zumindest
teilweise durch Proto-Onkogene reguliert. Ein Proto-Onkogen kann
Proteine, die Zellproliferation auslösen (z. B. sis, erbB, src,
ras und myc), Proteine, die die Zellproliferation hemmen (z. B.
Rb, p16, p19, p21, p53, NF1 und WT1), oder Proteine, die den programmierten
Zelltod regulieren (z. B. bcl-2) codieren (Ochi et al., 1998; Johnson
and Hamdy, 1998; Liebermann et al., 1998). Allerdings führen genetische
Umlagerungen oder Mutationen an diesen Proto-Onkogenen zur Konversion
eines Proto-Onkogens zu einem potenten Krebs-verursachenden Onkogen.
Oft genügt
eine einzige Punktmutation zur Transformation eines Proto-Onkogens
zu einem Onkogen. Beispielsweise führt eine Punktmutation in dem
p53-Tumorsuppressor-Protein zum vollständigen Verlust der Wildtyp-p53-Funktion
(Vogelstein and Kinzler, 1992; Fulchi et al., 1998) und zur Akquisition
einer „dominanten" Tumor-Promotionsfunktion.
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Derzeit
gibt es wenige wirksame Möglichkeiten
zur Behandlung der vielen allgemeinen Krebstypen. Der Verlauf der
Behandlung für
ein gegebenes Individuum hängt
von der Diagnose, dem Zustand, zu dem sich die Krankheit entwickelt
hat, und von Faktoren, wie Alter, Geschlecht und allgemeine Gesundheit
des Patienten, ab. Die häufigsten
Möglichkeiten
der Krebsbehandlung sind Operation, Strahlungstherapie und Chemotherapie.
Die Operation sielt bei der Diagnose und Behandlung von Krebs eine
zentrale Rolle. Typischerweise ist ein operativer Ansatz zur Biopsie
und zur Entfernung von kanzerösem
Wachstum erforderlich. Wenn allerdings der Krebs metastasiert hat
und weit verbreitet ist, führt
eine Operation wahrscheinlich nicht zu einer Heilung, und es muss
ein alternativer Ansatz herangezogen werden. Strahlungstherapie,
Chemotherapie und Immuntherapie sind Alternativen zur operativen
Behandlung von Krebs (Mayer, 1998; Ohara, 1998; Ho et al., 1998).
Strahlungstherapie umfasst ein exaktes Ausrichten von hochenergetischer
Strahlung zur Zerstörung von
Krebszellen, und genau wie eine Operation ist sie hauptsächlich bei
der Behandlung von nicht-metastasierten, lokalisierten Krebszellen
wirksam. Nebenwirkungen der Strahlungstherapie umfassen Hautreizung, Schluckbeschwerden,
Mundtrockenheit, Nausea, Diarrhö,
Haarausfall und Energieverlust (Curran, 1998; Brizel, 1998).
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Die
Chemotherapie, die Behandlung von Krebs mit Antikrebsarzneimitteln,
ist ein weiterer Modus der Krebstherapie. Die Wirksamkeit einer
gegebenen Antikrebs-Arzneimitteltherapie ist oft durch die Schwierigkeit des
Erzielens einer Arzneimittelabgabe überall in soliden Tumoren eingeschränkt (el-Kareh
and Secomb, 1997). Chemotherapeutische Strategien beruhen auf dem
Tumorgewebewachstum, wobei das Antikrebsarzneimittel auf die sich
schnell teilenden Krebszellen abzielt. Die meisten chemotherapeutischen
Ansätze
umfassen die Kombination von mehr als einem Antikrebsarzneimittel,
von dem bewiesen wurde, dass es die Reaktionsrate einer breiten
Varietät
von Krebsen steigert (
US-Patentschrift
5,824,348 ,
US-Patentschrift 5,633,016 und
US-Patentschrift 5,798,339 ).
Eine hauptsächliche
Nebenwirkung der chemotherapeutischen Arzneimittel besteht darin,
dass sie auch normale Gewebezellen befallen, wobei die Zellen, die
am wahrscheinlichsten befallen werden, diejenigen sind, die sich
schnell teilen (z. B. Knochenmark, Gastrointestinaltrakt, Reproduktionssystem
und Haarfollikel). Weitere toxische Nebenwirkungen von chemotherapeutischen Arzneimitteln
sind Wunden im Mund, Schluckbeschwerden, Mundtrockenheit, Nausea,
Diarrhö,
Erbrechen, Müdigkeit,
Blutung, Haarausfall und Infektion.
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Die
Immuntherapie, ein sich schnell entwickelndes Gebiet in der Krebsforschung,
ist noch eine andere Möglichkeit
der Behandlung bestimmter Typen von Krebsen. Beispielsweise identifiziert
das Immunsystem Tumorzellen als fremd, und somit werden sie ein
Ziel der Zerstörung
durch das Immunsystem. Leider reicht die Reaktion typischerweise
nicht aus, um den größten Teil
des Tumorwachstums zu verhindern. Allerdings wurde neuerdings ein
Schwerpunkt im Bereich der Immuntherapie auf die Entwicklung von
Verfahren gelegt, die den natürlichen
Abwehrmechanismus des Immunsystems steigern oder ergänzen. Beispiele
für Immuntherapien, die
derzeit in der Erforschung oder in Gebrauch sind, sind Immunadjuvanzien
(z. B. Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum, Dinitrochlorbenzol
und aromatische Verbindungen) (
US-Patentschrift
5,801,005 ;
US-Patentschrift
5,739,169 ; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et
al., 1998), Zytokintherapie (z. B. Interferone α, β und γ; IL-1, GM-CSF und TNF) (Bukowski
et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998) Gentherapie
(z. B. TNF, IL-1, IL-2, p53) (Qin et al., 1998; Austin-Ward and
Villaseca, 1998;
US-Patentschrift
5,830,880 und
US-Patentschrift
5,846,945 ) und monoklonale Antikörper (z. B. Anti-Gangliosid
GM2, anti-HER-2, Anti-p185) (Pietras et al., 1998; Hanibuchi et
al., 1998;
US-Patentschrift 5,824,311 ).
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Wie
vorstehend erwähnt,
spielen Tumorsuppressoren in der Krebsbiologie eine bedeutende Rolle.
Von diesen ist das p53-Tumorsuppressor-Proto-Onkogen zur Aufrechterhaltung
des nicht-tumorigenen Phänotyps von
Zellen essentiell (Übersicht
von Soddu und Sacchi, 1998). Es wurde festgestellt, dass ungefähr 50% aller Krebse
mit Mutationen des p53-Gens zusammenhängen, was zum Verlust der p53-Tumorsuppressor-Eigenschaften
führt (Levine
et al., 1991; Vogelstein and Kinzler, 1992; Hartmann et al., 1996a;
Hartmann et al., 1996b). Mutationen in dem p53-Gen führen auch
zur Stabilisierung des p53-Proteins in Zellen mit gleichzeitiger Überexpression
von p53-Protein. In normalen Zellen ist das p53-Protein im Allgemeinen
aufgrund seiner hohen Umsatzrate nicht nachweisbar. Die hohe Inzidenz
von mit Krebs zusammenhängenden
Mutationen in dem p53-Gen hat viele Forschergruppen ermutigt, p53
als einen Weg der Krebsbehandlung über Genersatz zu untersuchen.
Es hat sich gezeigt, dass Ad-mda7 das Wachstum von Krebszellen unterdrückt, die
p53-Wildtyp, p53-Null
und p53-mutiert sind. Auch gibt die Aufregulierung des Apoptose-verwandten
bax-Gens an, dass MDA-7 in der Lage ist, p53-unabhängige Mechanismen
zur Induktion der Zerstörung
von Krebszellen zu verwenden. Diese Merkmale legen nahe, dass MDA-7
ein breites therapeutisches Potential als antiproliferatives Mittel
besitzt.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Darum
ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein alternatives Medikament
zur Behandlung eines Patienten mit Krebs bereitzustellen. Das Ziel
wurde durch Bereitstellen als ein Medikament einer therapeutischen
Nukleinsäure,
wie DNA, gelöst,
die entweder ein Volllängen-
oder ein verkürztes
menschliches MDA-7-Protein oder Polypeptid unter der Kontrolle eines
Promotors codiert, der in eukaryotischen Zellen funktionsfähig ist,
wobei das Medikament in Kombination mit mindestens einer anderen
Antikrebsbehandlung verabreicht wird, wobei die Antikrebsbehandlung
Chemotherapie ist, wobei die Chemotherapie ein DNA-schädigendes
Mittel, Tamoxifen oder Herceptin umfasst. Die therapeutische Nukleinsäure besteht
aus einer Expressionskassette oder einen Konstrukt, welches ein
Nukleinsäuremolekül ist, das
in der Lage ist, die Expression von mindestens einem Teil der Nukleinsäuresequenz
zu ermöglichen.
Bei den erfindungsgemäßen Anwendungen
ist der Patient vorzugsweise ein Mensch. Die Sequenz eines Volllängen-MDA-7-Polypeptids
ist in der SEQ ID. NO: 2 bereitgestellt. Eine verkürzte Version
von MDA-7 würde
einen Teil oder Teile von zusammenhängenden Aminosäureregionen
der Volllängensequenz,
wie in den Ansprüchen
spezifiziert, umfassen, würde
allerdings nicht die gesamte Sequenz enthalten. Die verkürzte Version
kann durch eine beliebige Anzahl von zusammenhängenden Aminosäuren an
jeder beliebigen Stelle in dem Polypeptid verkürzt sein.
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Die
Anwendungen zur Behandlung eines Patienten mit Krebs bei der vorliegenden
Erfindung umfassen die Übertragung
einer Nukleinsäure,
die entweder eine Volllängen-
oder eine verkürzte
Form des menschlichen MDA-7-Proteins oder Polypeptids codiert. Nach
der Verabreichung der Nukleinsäure
an einen Patienten mit Krebs wird die Nukleinsäure, unter Kontrolle eines
in eukaryotischen Zellen aktiven Promotors, durch hyperproliferative
Zellen exprimiert, wodurch der Wachstumsstopp oder die Apoptose
dieser Zellen stimuliert wird. Alternativ kann die Nukleinsäure, die
alles oder einen Teil eines MDA-7-Proteins codiert, in normalen,
d. h. nicht-hyperproliferativen Zellen exprimiert und sezerniert
werden, um eine Bystander-Aktivität zu erzielen, wobei benachbarte
hyperproliferative Zellen von MDA-7 befallen werden. Es wird somit
davon ausgegangen, dass Zellen, die nicht hyperproliferativ (nicht-hyperproliferative
Zellen) sind, wie normale oder nicht-kanzeröse Zellen (d. h. Zellen, die
keine Merkmale des ungeregelten kanzerösen Zellwachstums aufweisen)
eine Population von MDA-7-Protein exprimieren können, wovon etwas zu einer
sezernierbaren Form prozessiert wird, die sezerniert und von nicht-transduzierten
(oder nicht transfizierten) Zellen, die in der Nähe sind, aufgenommen wird.
Nicht-transduzierte oder nicht-transfizierte Zellen sind Zellen,
die die endogene Expressionskassette nicht internalisiert haben,
und dadurch exprimieren solche Zellen nicht das durch sie codierte
Polypeptid. Nicht-transfizierte Zellen könnten hyperproliferative oder
nicht-normale Zellen einschließen,
die eine sezernierte Form des MDA-7-Polypeptids oder -Proteins aufnehmen
können,
derart, dass die hyperproliferativen oder nicht-normalen Zellen
dazu induziert werden, die Apoptose zu durchlaufen, oder dass sie
wachstumsgehemmt werden. Diese nicht-normalen Zellen können Tumorzellen
sein. Es wird davon ausgegangen, dass nicht-transduzierte oder nicht-transfizierte Zellen,
die von transduzierten oder transfizierten Zellen befallen werden,
proximal zu ihnen, benachbart (am nächsten) zu ihnen oder nahe
bei ihnen sind. Im Wesentlichen befindet sich die nicht-transduziert
oder nicht-transfizierte Zelle nahe genug an der transduzierten
oder transfizierten Zelle, sodass das MDA-7-Protein, das durch die
transfizierte Zelle sezerniert wird, die nicht-transfizierte Zelle
erreicht.
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Bei
weiteren Ausführungsformen
ist der Krebs ein Melanom, nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, kleinzelliger
Lungenkrebs, Lungenkrebs, Leberkarzinom, Retinoblastom, Astrocytom,
Glioblastom, Leukämie,
Neuroblastom, Kopf-, Nacken-, Brust-, Pancreas-, Prostata-, Nieren-,
Knochen-, Hoden-, Eierstock-, Mesotheliom, Zervikal-, Gastrointestinal-,
Lymphom, Gehirn-, Darmkrebs, ein Sarkom oder Blasenkrebs. Der Krebs
kann einen Tumor umfassen, der aus Tumorzellen besteht. Bei anderen
Ausführungsformen
ist die hyperproliferative Krankheit rheumatoide Arthritis, entzündliche
Darmerkrankung, Osteoarthritis, Leinmyome, Adenome, Lipome, Hämangiome,
Fibrome, vaskuläre
Okklusion, Restenose, Atherosklerose, präneoplastische Läsionen (wie adenomatöse Hyperplasie
und prostatische intraepitheliale Neoplasie), Karzinome in situ,
orale haarige Leukoplakie oder Psoriasis.
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Bei
einigen Ausführungsformen
codiert das Nukleinsäuremolekül die Aminosäuren von
etwa 49 bis etwa 206; von etwa 75 bis etwa 206; von etwa 100 bis
etwa 206; von etwa 125 bis etwa 206; von etwa 150 bis etwa 206;
von etwa 175 bis etwa 206; oder von etwa 182 bis etwa 206 der SEQ
ID NO: 2. Bei einigen Ausführungsformen
codiert die Expressionskassette oder der Vektor ein verkürztes MDA-7-Polypeptid,
wie vorstehend definiert. Es wird somit davon ausgegangen, dass
bei einigen Ausführungsformen
die Nukleinsäuresequenz,
die ein verkürztes
MDA-7-Polypeptid codiert, wie vorstehend definiert, weniger zusammenhängende Nukleotide
umfasst als in der SEQ ID NO: 1 vorhanden sind, d. h. das Nukleinsäuresegment
ist ebenfalls kleiner als das Volllängen- oder das verkürzte Segment.
Beispielsweise können
dem Expressionsvektor oder der Expressionskassette codierende Sequenzen
fehlen, entsprechend der Aminosäure
1 bis etwa der Aminosäure 49,
der Aminosäure
1 bis etwa der Aminosäure
75, der Aminosäure
1 bis etwa der Aminosäure
100, der Aminosäure
1 bis etwa der Aminosäure
125, der Aminosäure
1 bis etwa der Aminosäure
150, der Aminosäure
1 bis etwa der Aminosäure
175, oder der Aminosäure
1 bis etwa der Aminosäure
182 der SEQ ID NO: 2.
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Die
bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküle können Sequenzen
enthalten, die ein menschliches Volllängen-mda-7-Gen codieren, wie
in der SEQ ID NO: 1 offenbart. Bei einigen Ausführungsformen der Erfindung
kann ein Nukleinsäuremolekül weniger
Nukleotide als in der SEQ ID NO: 1 beschrieben codieren, derart
dass das Molekül
weniger als 700 zusammenhängende
Nukleotide aus der SEQ ID NO: 1 enthält, um das verkürzte MDA-7-Polypeptid,
wie vorstehend definiert, zu codieren. In einigen Aspekten kann
ein Nukleinsäuremolekül etwa 50,
100, 200, 300, 400, 500, 600, oder 700 zusammenhängende Nukleotide aus der SEQ
ID NO: 1 enthalten, um das verkürzte
MDA-7-Polypeptid,
wie vorstehend definiert, zu codieren. Alternativ kann das Molekül ein Nukleinsäuremolekül codieren,
das ein MDA-7-Polypeptid codiert, dem die ersten 49 Aminosäuren der
SEQ ID NO: 2 fehlen, da die Nukleinsäuresequenz entsprechend den
ersten 49 Aminosäuren
nicht vorhanden ist.
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Bei
bestimmten anderen Ausführungsformen
umfasst die Nukleinsäure
weiterhin Nukleotide, die eine heterologen sekretorische Signalsequenz
codieren, in der die heterologen Sequenz sich von einer Nicht-MDA-7-Nukleinsäuresequenz
oder einem -Polypeptid ableitet. Eine "Signalsequenz" bezieht sich auf eine Sequenz, typischerweise
eine kurze Sequenz, die ein neu translatiertes sekretorisches oder
Membranpolypeptid zu dem und durch das endoplasmatische Retikulum
oder über
eine Membran dirigiert. Die Signalsequenz erlaubt die Sekretion
eines Proteins aus einer Zelle. Bei weiteren Ausführungsformen
umfasst die Nukleinsäure
weiterhin eine heterologe sekretorische Signalsequenz, die als eine
positiv geladene N-terminale Region definiert ist, in Kombination
mit einem hydrophoben Kern.
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Bei
bestimmten Ausführungsformen
ist der Promotor CMV IE, Dectin-1, Dectin-2, humanes CD11c, F4/80,
SM22, RSV, SV40, Ad MLP, beta-Actin, ein MHC-Klasse-I- oder MHC-Klasse-II-Promotor,
allerdings wird angenommen, dass jeder beliebige andere Promotor,
der zum Antreiben der Expression des mda-7-Gens der vorliegenden
Erfindung geeignet ist, wie diejenigen, die hier nachstehend ausgeführt sind,
auf die Praxis der vorliegenden Erfindung anwendbar ist. Bei anderen
Ausführungsformen
ist ein Polyadenylierungssignal funktionsfähig mit einer MDA-7-codierenden
Region verknüpft.
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Bei
bestimmten Ausführungsformen
ist die Nukleinsäure
ein viraler Vektor, wobei die virale Vektordosis etwa 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012 pfu und
mehr beträgt.
Alternativ kann die Dosis in Einheiten von Viruspartikeln (Vp) ausgedrückt werden;
somit können
die vorstehend in „pfu"-Einheiten aufgeführten Zahlen
in Einheiten von Einheiten oder oder „Viruspartikeln" ausgedrückt werden.
Es wird davon ausgegangen, dass etwa 103 bis
1015, etwa 105 bis
etwa 1012, oder 107 bis
etwa 1010 Viruspartikel einem Patienten verabreicht
werden können.
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Bei
einigen Ausführungsformen
ist der virale Vektor ein adenoviraler Vektor, ein retroviraler
Vektor, ein Vaccinia-viraler Vektor, ein Adeno-assoziierter viraler
Vektor, ein Polyom-viraler Vektor, ein Alpha-viraler Vektor oder
ein Herpes-viraler Vektor. In einigen Anspekten ist der virale Vektor
ein adenoviraler Vektor. Es wird davon ausgegangen, dass der virale
Vektor replikationsdefizient oder -defekt sein kann. Obgleich bei
anderen Ausführungsformen
ein Adenovirus-Vektor, der Ad-5-Sequenzen enthält, eingesetzt werden kann,
fehlen in einigen Aspekten einem Adenovirus-Vektor-Konstrukt E1-codierende
Regionen, die eine Deletion sowohl von E1A- als auch E1B-Sequenzen
einschließen
können.
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Die
Anwendungen der vorliegenden Erfindung umfassen die Dispersion von
Expressionskonstrukten, Vektoren und Kassetten in pharmakologisch
verträglicher
Lösung
zur Verabreichung an einen Patienten. In einigen Fällen umfasst
die pharmakologisch vertragliche Lösung ein Lipid. Bei weiteren
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung wird ein Nukleinsäuremolekül, das ein Volllängen- oder
ein verkürztes
MDA-7-Polypeptid codiert, in einem Lipoplex (d. h. wie ein Lipid-Nukleinsäure-Komplex)
verabreicht, der, wie bei einigen Ausführungsformen beschrieben, DOTAP
und mindestens ein Cholesterol, Cholesterolderivativ oder Cholesterolgemisch
enthalten kann. Diese Nukleinsäuremoleküle können dem
Patienten intravenös,
intraperitoneal, intratracheal, intratumoral, intramuskulär, endoskopisch,
intraläsional,
perkutan, subkutan, regional, oder durch direkte Injektion oder
Perfusion verabreicht werden. Es wird weiterhin davon ausgegangen,
dass Behandlungsverfahren mehrere Verabreichungen einschließen können.
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Die
bei der vorliegenden Erfindung verwendete Nukleinsäure kann
durch Injektion verabreicht werden. Weitere Ausführungsformen umfassen die Verabreichung
der Nukleinsäure
durch mehrere Injektionen. Bei bestimmten Ausführungsformen wird die Injektion
lokal, regional oder distal an einer Krankheits- oder Tumorstelle durchgeführt. Bei
einigen Ausführungsformen
erfolgt die Verabreichung der Nukleinsäure über kontinuierliche Infusion,
intratumorale Injektion oder intravenöse Injektion. Bei bestimmten
anderen Ausführungsformen
wird die Nukleinsäure
dem Tumorbett vor oder nach oder sowohl vor als auch nach der Resektion
des Tumors verabreicht.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst kombinationstherapeutische Verfahren
unter Verwendung einer Nukleinsäuresequenz,
die ein Volllängen-
oder ein verkürztes
MDA-7-Polypeptid codiert, in Kombination mit einer zweiten Therapie
zur Behandlung eines Krebses. Das Nukleinsäuremolekül kann dem Patienten vor während oder
nach der Chemotherapie verabreicht werden.
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Bei
anderen Ausführungsformen
wird hingegen Chemotherapie, die mindestens ein DNA-schädigendes
Mittel umfasst, in Kombination mit der Verabreichung eines MDA-7- codierenden Nukleinsäuremoleküls eingesetzt.
Das DNA-schädigende
Mittel kann Adriamycin, 5-Fluorouracil (5FU), Etoposide (VP-16),
Camptothecin, Actinomycin-D, Mitomycin CH oder
Cisplatin (CDDP) sein. Bei anderen Ausführungsformen ist das DNA-schädigende
Mittel Adriamycin. In einem Aspekt der Erfindung umfasst die Chemotherapie
Tamoxifen, während
sie in einem Aspekt Adriamycin umfasst. Weiter Ausführungsformen
umfassen Immuntherapie mit Herceptin.
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In
Fällen,
die einen kanzerösen
Tumor umfassen, kann eine Kombinationsbehandlung die Verabreichung
eines Nukleinsäuremoleküls, das
ein Volllängen-
oder ein verkürztes
MDA-7-Polypeptid
codiert, und Tumorresektion umfassen, die vor, nach oder während der
mda-7-gentherapeutischen
Verabreichung erfolgen kann. Wenn die mda-7-Behandlung nach der
Tumorresektion erfolgt, kann das Expressionskonstrukt oder der Vektor,
der MDA-7 codiert, an das Tumorbett verabreicht werden.
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Weitere
Anwendungen der Erfindung umfassen die Behandlung eines Patienten
mit Krebs bei einem Verfahren, das mindestens den folgenden Schritt
umfasst: Verabreichung an den Patienten einer Adenovirus-Zusammensetzung,
die ein Adenovirus-Konstrukt mit einem menschlichen mda-7-Gen unter
der Kontrolle eines Promotors enthält, und mindestens einer anderen
Antikrebsbehandlung, wie vorstehend definiert, in einer Menge, die
zur Übertragung
eines therapeutischen Vorteils auf den Patienten wirksam ist. Ein
weiterer Aspekt umfasst die Anwendungen zur Induktion von Apoptose
in einer Krebszelle durch Verabreichung an eine Krebszelle in einem
Individuum einer Expressionskassette, die eine Nukleinsäuresequenz
enthält,
die ein menschliches MDA-7-Protein unter der Kontrolle eines Promotors
codiert, der in eukaryotischen Zellen funktionsfähig ist, und mindestens einer
anderen Antikrebsbehandlung, wie vorstehend definiert. Bei wieder
anderen Ausführungsformen
umfasst die Erfindung die Anwendungen zur Induktion von Apoptose
in einer Krebszelle durch Verabreichung an eine nicht-kanzeröse Zelle
in einem Individuum einer Expressionskassette, die eine Nukleinsäuresequenz
enthält,
die ein menschliches MDA-7-Polypeptid
unter der Kontrolle eines Promotors codiert, der in eukaryotischen
Zellen funktionsfähig
ist, und mindestens einer anderen Antikrebsbehandlung, wie vorstehend
definiert, wobei das MDA-7-Polypeptid exprimiert und sezerniert
wird. Mit diesen Typen von Bystander-Verfahren kann eine transfizierte,
nicht-kanzeröse
Zelle benachbart oder nahe genug an einer Krebszelle vorhanden sein,
derart, dass die nicht-kanzeröse
Zelle ein MDA-7- Polypeptid
sezerniert, das in der untransfizierten Krebszelle Wachstumsstopp
oder Apoptose auslöst.
Weitere Anwendungen umfassen diejenigen, die auf die Behandlung
eines Patienten mit Krebs durch Verabreichung an eine nicht-kanzeröse Zelle in
dem Patienten einer wirksamen Menge einer Adenovirus-Zusammensetzung
gerichtet sind, um einen therapeutischen Vorteil auf diesen Patienten
zu übertragen,
und mindestens einer anderen Antikrebsbehandlung, wie vorstehend
definiert. Diese Adenovirus-Zusammensetzung kann ein Adenovirus-Vektor-Konstrukt
einschließen,
das ein mda-7-Gen unter der Kontrolle eines Promotors enthält.
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Die
Verwendungen der vorliegenden Erfindung umfassen auch Medikamente
zur Behandlung eines Tumors durch Induktion von Apoptose in transfizierten
und untransfizierten Tumorzellen, umfassend die Verabreichung an
den Tumor einer Adenovirus-Zusammensetzung,
die ein Adenovirus-Vektor-Konstrukt umfasst, das ein menschliches
mda-7-Gen unter
der Kontrolle eines Promotor umfasst, und mindestens einer anderen Antikrebsbehandlung,
wie vorstehend definiert, derart, dass transfizierte Zellen ein
verkürztes
MDA-7-Polypeptid exprimieren und sezernieren. Und wieder andere
Ausführungsformen
umfassen Anwendungen zur Behandlung von Krebs durch Verabreichung
an ein Individuum mit Krebs einer Adenovirus-Zusammensetzung, die
ein Adenovirus-Vektor-Konstrukt enthält, mit einem menschlichen
mda-7-Gen unter der Kontrolle eines Promotors an eine Zelle, die
kein mutiertes p53-, Rb-, ras-, oder p16-Gen aufweist, und mindestens
einer anderen Antikrebsbehandlung, wie vorstehend definiert, in
einer Menge, die wirksam ist, um in einer Zelle, die kein mutiertes
p53-, Rb-, ras- oder p16-Gen aufweist, Apoptose auszulösen.
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Weitere
Anwendungen der Erfindung umfassen die Behandlung eines Individuums
mit einem Tumor durch Verabreichung an das Individuum eines Nukleinsäuremoleküls, das
ein humanes mda-7-Gen unter der Kontrolle eines Promotors umfasst,
und mindestens einer anderen Antikrebsbehandlung, wie vorstehend
definiert, in einer Menge, die wirksam ist, um die Angiogenese um
den Tumor herum zu hemmen. Solche Verfahren können auch Schritte zur Evaluierung
des Angiogenese-Inhibitionsniveaus einschließen. Es wird davon ausgegangen,
dass andere Ausführungsformen
der Behandlung, die hier beschrieben sind, mit diesen Anwendungen
eingesetzt werden können.
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Die
erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
umfassen einen Expressionsvektor, der eine mda-7-codierende Region
unter der Kontrolle eines Promotors, der in einer eukaryotischen
Zelle funktionsfähig
ist, codiert, derart, dass die codierende Region eine Deletion entsprechend
N-terminalen Sequenzen enthält.
Die Expressionsvektor-Zusammensetzungen umfassen jede beliebige
Expressionskassette, die bezüglich
der Verfahren der vorliegenden Erfindung beschrieben ist. Gleichermaßen können alle
hier beschriebenen Zusammensetzungen in der Praxis von einer der
hier offenbarten Anwendungen eingesetzt werden.
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Die
Verwendung des Wortes „ein" oder „eine" kann bei Verwendung
in Verbindung mit dem Begriff „umfassend" in den Ansprüchen und/oder
in der Spezifikation „ein" bedeuten, jedoch
steht sie auch mit der Bedeutung von „ein oder mehrere", „mindestens
eines" und „ein oder
mehr als eines" im
Einklang.
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Weitere
Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen
aus der folgenden ausführlichen
Beschreibung hervor. Es sollte allerdings verstanden werden, dass
die ausführliche
Beschreibung und die speziellen Beispiele, obgleich sie spezielle
Ausführungsformen
der Erfindung angeben, nur zur Erläuterung angegeben sind, da
den Fachleuten verschiedene Änderungen
und Modifikationen innerhalb des Geistes und Umfangs der Erfindung
aus der ausführlichen
Beschreibung klar werden.
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KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
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Die
folgenden Zeichnungen bilden einen Teil der vorliegenden Spezifikation
und sind zur weiteren Demonstration bestimmter Aspekte der vorliegenden
Erfindung eingeschlossen. Die Erfindung kann besser durch Bezugnahme
auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Kombination mit der
ausführlichen
Beschreibung der speziellen, hier dargestellten Ausführungsformen
verstanden werden.
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1.
Schematische Erläuterung
von Ad-Vektoren. Replikationsdefizientes menschliches Typ 5 Adenovirus
(Ad5), das das mda-7 (oder Luziferasegen) trägt, verknüpft mit einem internen CMVIE-Promotor
und gefolgt von dem SV40-Polyadenylierungs(pA)-Signal, wurde verwendet.
Zusätzlich
wurde als Kontrolle Ad-CMVp(A) (leerer Vektor) verwendet.
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2A. T47D-Zellen, behandelt mit Ad-mda7
bei verschiedenen MOIs (Viruspartikel/Zelle). 2B. MCF-7-Zellen,
behandelt mit Ad-mda7 bei verschiedenen MOIs (Viruspartikel/Zelle).
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3A. MDA-MB-361-Zellen, behandelt mit Ad-mda7
bei verschiedenen MOIs (Viruspartikel/Zelle). 3B.
BT-20-Zellen, behandelt mit Ad-mda7 bei verschiedenen MOIs (Viruspartikel/Zelle).
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4A. H1299-Zellen, behandelt mit Ad-mda7
bei verschiedenen MOIs (Viruspartikel/Zelle). 4B. H322-Zellen,
behandelt mit Ad-mda7 bei verschiedenen MOIs (Viruspartikel/Zelle).
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5A. SW620-Zellen, behandelt mit Ad-mda7
bei verschiedenen MOIs (Viruspartikel/Zelle). 5B. DLD-1-Zellen,
behandelt mit Ad-mda7 bei verschiedenen MOIs (Viruspartikel/Zelle).
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6A. MJ90-Zellen, behandelt mit Ad-mda7
bei verschiedenen MOIs (Viruspartikel/Zelle). 6B. HUVEC-Zellen,
behandelt mit Ad-mda7 bei verschiedenen MOIs (Viruspartikel/Zelle).
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7.
Annexin V-Assay zur Bestimmung der Apoptose-Induktion nach Ad-mda7
Transduktion in Brustkrebszelllinien. Drei Brustkrebszelllinien
(T47D, MDA MB-468, MCF-7)
wurden mit Ad-mda7 oder Ad-CMVp(A)-leerem Kontroll-Vektor infiziert
und unter Verwendung von Annexin V auf Apoptose evaluiert.
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8.
DLD-1-Zellen wurden mit Ad-mda7 oder Ad-luc infiziert und 48 Stunden
später
auf Annexin V-Färbung
durch FACS-Analyse untersucht.
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9.
Schaubild A zeigt die Apoptose-Induktion in H1299-Zellen, infiziert
mit Ad-mda7 oder Ad-luc. Die Zellen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten
nach Infektion unter Verwendung von Annexin V-Färbung und FACS-Analyse evaluiert.
Schaubild B erläutert
die Apoptose in DLD-1-Zellen, die mit Ad-mda7 oder Ad-luc zu verschiedenen
Zeitpunkten nach Infektion infiziert wurden (wie durch Annexin V-Einfärben und
FACS-Analyse untersucht).
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10. H460-Zellen wurden mit zunehmenden MOIs von
Ad-mda7 oder Ad-luc infiziert und 48 Stunden später auf MDA-7-Oberflächenexpression
prozessiert und durch FACS analysiert.
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11A. Lösliches
MDA-7 (sMDA7) tötet
Tumorzellen. H1299-Zellen wurden mit den folgenden Proben provoziert
und der Prozentsatz an toten Zellen nach 48 Stunden bewertet: 1)
Ad-mda7-Virus, positive Kontrolle, infiziert mit 1000 Vp/Zelle;
2) Löslicher
MDA7-Überstand
aus mit Ad-mda-7 infizierten H1299-Zellen (1000 Vp/Zelle); 3) Ad-tue-Virus,
Kontrolle infiziert mit 1000 Vp/Zelle; 4) Überstand aus mit Ad-luc infizierten H1299-Zellen
(1000 Vp/Zelle); 5) Ad-p53-Virus, positive Kontrolle, infiziert
mit 20 Vp/Zelle; 6) ein separater Vorrat an löslichem MDA-7-Überstand,
erhalten aus 293-Zellen, infiziert mit Ad-mda-7 (sup M, 500 Vp/Zelle); und 7)
ein separater Vorrat von löslichem
MDA-7-Überstand,
erhalten aus modifizierten serumfreien 293-Zellen, infiziert mit
Ad-mda-7 (sup P, 500 Vp/Zelle). Alle Überstände, die bei diesem Experiment
verwendet wurden, wurden über
ein 0,1-Mikron-Filter vor der Provokation mit H1299-Zellen filtriert. 11B. H1299-Zellen
wurden mit löslichem
MDA-7-Überstand
aus vier verschiedenen Vorräten
provoziert und der Prozentsatz an toten Zellen nach 48 Stunden bewertet:
1) 293*NF: nicht-filtrierter Überstand,
erhalten aus modifizierten 293-Zellen (die Zellen wurden unter serumfreien
Bedingungen gezüchtet);
2) 293*F: 0,1 Mikron-filtrierter Überstand, erhalten aus modifizierten
293-Zellen; 3) 293F: 0,1 Mikron-filtrierter Überstand, erhalten aus regulären 293-Zellen
(FBS+); und 4) H1299F: 0,1 Mikron-filtrierter Überstand, erhalten aus H1299-Zellen. D0 ist nicht
verdünntes Material,
wohingegen D1:1; D1:5, D1:10 die eingesetzten Verdünnungen
angeben. Unverdünnter
Kontrollüberstand
aus Ad-luc-behandelten H1299-Zellen
zeigte 20% tote Zellen.
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12. Kombination mit Tamoxifen. Ad-mda7
wurde mit Tamoxifen kombiniert und auf die Antitumor-Wirkung in
Brustkrebszelllinien evaluiert. Die Graphen zeigen, dass das Kombinieren
dieser beiden Mittel überlegene
Antitumor-Aktivität
im Vergleich mit einem Mittel allein bereitstellt.
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13. Kombination mit Adriamycin. Ad-mda7
wurde mit Adriamycin kombiniert und auf die Antitumor-Wirkung in
Brustkrebszelllinien evaluiert. Die Graphen zeigen, dass das Kombinieren
dieser beiden Mittel überlegene
Antitumor-Aktivität
im Vergleich zu einem Mittel allein bereitstellt.
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14. Linkes Schaubild: MDA-7-Proteinexpression
in NSCLC-Zellen und normalen Lungenzellen nach Transduktion mit
Ad-mda7. NHFB-normale menschliche Bronchialzellen. Rechtes oberes
Schaubild: Wirkung von Ad-mda7 auf das Wachstum von NSCLC-Zellen
und normalen Lungenzellen. Ad-mda7 (Kreise), PBS (Rauten), Ad-luc
(Quadrate). Unteres Schaubild: Zellzyklusanalyse von NSCLC-Zellen
und normalen Lungenzellen nach Transduktion mit Ad-mda7. Zu beachten
ist die signifikante Abnahme in G1 und die Zunahme in G2/M.
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15. Kombination von Ad-mda7 und Herceptin auf
Brustkrebszelllinien. Die mit Ad-mda7
behandelten Zelllinien werden in einer Her2-exprimierenden Zelllinie
verstärkt,
im Vergleich zu einer nicht-exprimierenden Zelllinie, was die erhöhte Wirksamkeit
von Herceptin auf das Abtöten
von Zellen nach Kontakt mit Ad-mda7 zeigt.
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BESCHREIBUNG DER ERLÄUTERNDEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
vorliegende Erfindung betrachtet die Behandlung von Krebs durch
Identifizieren von Patienten mit einer solchen Krankheit und Exprimieren
entweder einer Volllängen-
oder einer verkürzten
Form des menschlichen MDA-7-Polypeptids in diesen hyperproliferativen
Zellen oder in normalen Zellen in der Nachbarschaft der hyperproliferativen
Zellen mittels Nukleinsäuretransfer.
Die Behandlung einer solchen hyperproliferativen Krankheit umfasst
bei einer Ausführungsform
die intratumorale Verabreichung eines Volllängen- oder verkürzten menschlichen
MDA-7 Expressionskonstruktes an die hyperproliferativen Zellen.
Die hyperproliferativen Zellen oder normalen Zellen exprimieren
dann eine Volllängenform
oder eine verkürzte
Form von menschlichem MDA-7, was zu der Wachstumsinhibition oder
zum Tod der hyperproliferativen Zellen führt. Außerdem können benachbarte hyperproliferative
Zellen, die das MDA-7 Expressionskonstrukt nicht aufgenommen haben,
ebenfalls wachstumsinhibiert werden und/oder durch die lösliche Form
von MDA-7 abgetötet
werden.
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A. HYPERPROLIFERATIVE KRANKHEIT UND MDA-7
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Eine
Vielzahl von Krebsen kann durch die erfindungsgemäßen Verfahren
behandelt werden. Die vorliegende Erfindung weist wichtige Verzweigungen
bezüglich
einer hyperproliferative Krankheit auf: Krebs
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Krebs
wurde zu einer der führenden
Todesursachen in der westlichen Welt, als zweites nur hinter Herzerkrankung.
Derzeitige Schätzungen
sagen voraus, dass eine von drei Personen in den USA Krebs entwickelt,
und dass eine von fünf
Personen an Krebs stirbt. Krebse können als veränderte Zellen
betrachtet werden, die die normalen wachstumsregulierenden Mechanismen
verloren haben.
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Es
gibt derzeit drei Hauptkategorien von Onkogenen, die ihre verschiedenen
Aktivitäten
widerspiegeln. Eine Kategorie von Onkogenen codiert Proteine, die
die Zellproliferation induzieren. Eine zweite Kategorie von Onkogenen,
die Tumorsuppressor-Gene genannt werden oder Anti-Onkogene genannt
werden, funktionieren zur Inhibierung von übermäßiger Zellproliferation. Die
dritte Kategorie von Onkogenen blockiert oder induziert die Apoptose
durch Codieren von Proteinen, die den programmierten Zelltod regulieren.
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Die
cDNA, die das MDA-7-Protein codiert, wurde bereits von Jiang et
al., 1995 (
WO 9511986 )
beschrieben Das von der mda-7 cDNA codierte Protein wurde als ein
potentieller Regulator der Melanomprogression erkannt. Jiang et
al. verwendeten eine subtraktive Hybridisierungstechnik (Jiang et
al., 1995) zur Identifizierung von an der Regulation des Wachstums
und an der Differenzierung in menschlichen Melanomzellen beteiligten
Genen. Eine subtrahierte cDNA-Bibliothek, die durch Subtraktionshybridsierung
von cDNAs hergestellt wurde, die aus aktiv proliferierenden menschlichen
HO-1 Melanomzellen gegen cDNAs hergestellt wurden, die aus Interferon
(IFN-P)- und Mezerindifferenzierten menschlichen HO-1 Melanomzellen
hergestellt wurden, wurde zur Identifizierung von mehreren Melanomdifferenzierungs-assoziierten
(mda) cDNAs verwendet. Die cDNA für MDA-7 wurde als erhöhte Expressionsniveaus
in den differenzierten Melanomzellen aufweisend identifiziert.
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Dass
MDA-7 in Krebszelllinien die BAX-Niveaus erhöhte, führte zu einer Evaluierung der
Wirkung der ex vivo Ad-mda-7-Transduktion auf die Xenograft-Tumorigenizität von MCF-7 Tumorzellen.
Die ex vivo Transduktion führte
zur Inhibition der Tumorbildung und der Progression in dem Tumor-Xenograft-Modell.
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Die
Behandlung von Zellen mit einem mda-7 Expressionsvektor führt zur
Sekretion einer löslichen Form
des MDA-7-Proteins. Dieses lösliche
Protein besitzt Antitumor-Aktivität. Darum stellt die Kombination
der direkten Induktion von Apoptose und der Freisetzung von löslichem
Mediator mit Antitumor-Eigenschaften eine verstärkte Aktivität gegen
hyperproliferative Krankheiten bereit. Die krebszellenspezifischen
antiproliferativen Wirkungen der erhöhten MDA-7 Expression macht
dieses Molekül
zu einer idealen gentherapeutischen Behandlung für die hyperproliferative Krankheit,
Insbesondere Krebs, bei Kombination mit mindestens einer anderen
Krebsbehandlung, wie vorstehend definiert.
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Bei
einigen Ausführungsformen
liegt die Behandlung einer breiten Varietät von kanzerösen Zuständen oder
Gewebe/Organtypen im Umfang der Erfindung, beispielsweise Melanom,
nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, kleinzelliger Lungenkrebs, Lungenkrebs,
Leberkarzinom, Retinoblastom, Astrocytom, Glioblastom, Leukämie, Blut-,
Gehirn-, Haut-, Augen-, Zungen-, Zahnfleischkrebs, Neuroblastom,
Kopf-, Nacken-, Brust-, Pankreas-, Prostata-, Nieren-, Knochen-,
Hoden-, Eierstock-Krebs, Mesotheliom, Zervikalkrebs, Gastrointestinal-Krebs,
Lymphom, Gehirnkrebs, Dickdarmkrebs oder Blasenkrebs. Bei noch stärker bevorzugten
Ausführungsformen
ist die hyperproliferative Krankheit, die erfindungsgemäß behandelt
wird, rheumatoide Arthritis, entzündliche Darmerkrankung, Osteoarthritis,
Leinmyome, Adenome, Lipome, Hämangiome,
Fibrome, vaskuläre
Okklusion, Restenose, Atherosklerose, pre-neoplastische Lesionen,
Karzinom in situ, orale haarige Leukoplakie oder Psoriasis.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens einem
Teil eines MDA-7-Proteins zur
Behandlung von Patienten mit Krebs, derart, dass diesem Patienten
als Ergebnis der Behandlung ein therapeutischer Vorteil zuteil wird.
Der Begriff „therapeutischer
Vorteil", der durchwegs
bei dieser Anmeldung verwendet wird, bezieht sich auf etwas, was
das Wohlbefinden des Patienten beschleunigt oder verstärkt, bezüglich der
medizinischen Behandlung seines Krebses. Eine Liste von nicht erschöpfenden
Beispielen hierfür
umfasst die Verlängerung
des Patientenlebens im einen beliebigen Zeitraum; Herabsetzung oder
Verzögerung
in der neoplastischen Entwicklung der Krankheit; herabgesetzte Hyperproliferation;
Reduktion im Tumorwachstum; Verzögerung
von Metastasen; Reduktion im Proliferationszustand einer Krebszelle
oder Tumorzelle; Induktion von Apoptose in einer behandelten Zelle
oder in einer Zelle, die von einer behandelten Zelle befallen ist;
und Herabsetzung im Schmerz für
den Patienten, was zu dem Zustand des Patienten beitragen kann.
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1. MDA-Protein, -Polypeptide und -Peptide
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Die
mda-7 cDNA codiert ein neues, evolutionär konserviertes Protein von
206 Aminosäuren
mit einer vorausberechneten Größe von 23,8
kDa. Die hergeleitete Aminosäuresequenz
enthält
eine hydrophobe Spanne von etwa Aminosäure 26 bis 45. Die Proteinsequenz
zeigt keine signifikante Homologie mit bekannten Proteinen oder
Proteinmotiven, mit der Ausnahme einer 42-Aminosäure-Spanne, die zu 54% mit
Interleukin 10 (IL-10) identisch ist. Die von Bazan et al. durchgeführte Strukturanalyse
hat bestimmt, dass eine verkürzte
lösliche
Form von MDA-7 (IL-BKW oder IL-20) Strukturmerkmale der Zytokinfamilie
(
WO 9828425 ) aufweist
und die IL-10-Funktion antagonisiert. Bazan et al. stellen fest,
dass die codierende Region der mda-7 cDNA falsch benannt wurde (S.
6, 1.30). Außerdem
erklärten
sie, dass die „Pre-Sequenz
von IL-BKW/mda-7 wahrscheinlich entweder an der M(et) an Position
28 oder 30. (S. 9, 1.3)" der
MDA-7-Sequenz beginnt. Die Strukturmerkmale und die begrenzte Identität über eine
kleine Spanne von Aminosäuren
impliziert eine potentielle extrazelluläre Funktion für MDA-7.
Die Erfinder zeigten, dass Ad-mda7,
das die Volllängen-206-Aminosäurensequenz
codiert, ein intrazelluläres
Protein von ungefähr
23 kD entstehen lässt.
Weiterhin verursacht der Ad-mda7-Vektor auch die Freisetzung einer
löslichen
Form des MDA-7-Proteins aus behandelten Zellen. Das lösliche MDA-7-Protein
ist etwa 40 kD lang und glycosyliert. Die Behandlung mit Glycosidasen
setzt die Molekülmasse des
löslichen
Proteins herab. Inhibitoren der Proteinsekretion, Brefeldin A und
Tunicamycin, verursachen eine intrazelluläre Akkumulation von MDA-7 und
hemmen die Freisetzung dieses Proteins aus Zellen. Das lösliche MDA-7-Protein
verursacht Wachstumsinhibition von Tumorzellen. Darum kann die Freisetzung
dieses löslichen
MDA-7 einen „Bystander"-Effekt entstehen
lassen, wobei Tumorzellen, die nicht durch ein mda-7 Expressionskonstrukt
kontaktiert werden, im Wachstum gehemmt sind.
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Zusätzliche
Studien haben gezeigt, dass erhöhte
Expression von MDA-7 Krebszellenwachstum unterdrückte und selektiv Apoptose
in menschlichen Brustkrebszellen auslöste, sowie die Tumorigenizität in Nacktmäusen hemmte
(Jiang et al., 1996 und Su et al., 1998). Jiang et al. (1996) berichten über Befunde,
dass mda-7 ein potentes wachstumsunterdrückendes Gen in Krebszellen
diverser Ursprünge
ist, einschließlich Brust-,
Zentralnervensystem-, Zervix-, Dickdarm-, Prostata- und Bindegewebe.
Ein Kolonien-Inhibitionstest wurde
verwendet, um zu zeigen, dass erhöhte Expression von mda-7 die
Wachstumsinhibition in menschlichem Zervikalkarzinom (HeLa), menschlichem
Brustkarzinom (MCF-7 und T47D), Dickdarmkarzinom (LS174T und SW480),
Nasopharyngealkarzinom (HONE-1), Prostatakarzinom (DU-145), Melanom
(HO-1 und C8161), multiformem Glioblastom (GBM-18 und T98G), und
Osteosarkom (Saos-2) verstärkte.
in normalen Zellen (HMECs, HBL-100 und CREF-Trans6) überexprimiertes
Mda-7 zeigte keine
signifikanten Wirkungen.
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Die
Wachstumsinhibition durch erhöhte
Expression von MDA-7 ist in Krebszellen wirksamer als in normalen
Zellen. Su et al. (1998) erforschten den Mechanismus, durch den
MDA-7 das Krebszellenwachstum unterdrückte. Die Untersuchungen berichten,
dass die ektopische Expression von MDA-7 in den Brustkrebszelllinien
MCF-7 und T47D Apoptose auslöste,
wie nachgewiesen durch Zellzyklusanalyse und TUNEL-Assay, ohne eine
Wirkung auf die normalen HBL-100-Zellen. Western Blot von Lysaten
aus Zellen, die mit Adenovirus-mda-7 infiziert waren, zeigte eine
Aufregulierung des Apoptose-stimulierenden Proteins BAX. Eine Ad-mda-7-Infektion
erhöhte
die Niveaus von BAX-Protein nur in MCF-7 und T47D-Zellen und nicht
in normalen HBL-100- oder HMEC-Zellen. Diese Daten führten die
Forscher zur Evaluierung der Wirkung der ex vivo Ad-mda-7-Transduktion
auf die Xenograft-Tumorigenizität von MCF-7-Tumorzellen.
Die ex vivo Transduktion führte
zur Hemmung der Tumorbildung und -progression in dem Tumor-Xenograft-Modell.
Es hat sich gezeigt, dass MDA-7 bei der Tumorzellen-spezifischen,
apoptotischen Induktion wirksam ist. Somit ist eine Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines mda-7-adenoviralen Konstruktes,
das Volllängen-
oder verkürztes
MDA-7 codiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung
von Krebs in Kombination mit mindestens einer anderen Antikrebsbehandlung,
wie vorstehend definiert.
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Von
besonderem Interesse ist erfindungsgemäß die Verwendung einer löslichen
Form von MDA-7.
WO 98/28425 beschreibt
ein Zytokinmolekül,
das angeblich mit IL10 verwandt ist. Dieses Molekül, das als IL-BKW
bezeichnet wird, leitet sich anscheinend von dem gleichen Gen wie
MDA-7 ab. Allerdings beschreiben die Autoren die codierende Region-Bezeichnung von
MDA-7 als „falsch
identifiziert".
Die reife Form von IL-BKW soll angeblich etwa bei Rest 47 oder 49
der mda-7-codierenden Region beginnen und sich einige 158–160 Reste
fortsetzen, d. h. bis zu den Resten 206 der mda-7-Sequenz. Somit
würde einem
bevorzugten Molekül
vorzugsweise alles oder ein Teil sowohl der putativen Signalsequenz
(Reste 1–25)
als auch einer putativen Membran-umspannenden hydrophoben Domäne (Reste
26–45)
des Volllängen-MDA-7
fehlen.
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Weitere,
sogar noch kürzere
Moleküle
werden betrachtet. Während
beispielsweise Moleküle,
die bei ungefähr
den MDA-7-Resten 46–49
beginnen, die größten Moleküle sind,
liegen weitere N-terminale Verkürzungen
innerhalb des Umfangs der Erfindung. Somit werden speziell Moleküle betrachtet,
die etwa am Rest 49, 100, 150, 175, 182 beginnen und etwa am Rest
206 enden.
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Obwohl
nicht einer bestimmten Theorie hinsichtlich der Funktionsfähigkeit
dieser Konstrukte festgehalten wird, besteht eine bemerkenswerte
Homologie zwischen MDA-7 und IL-10, sowie über Spezies in den C-, E- und
F-helikalen Regionen und auch in den Aminosäurepositionen, die am Rezeptor-Binden
beteiligt wurden. Die Teritärstruktur
von MDA-7 lehnt sich eng an die bekannte Struktur von IL-10 an,
was weiterhin nahelegt, dass diese Moleküle verwandt sind. Somit sind
Moleküle,
die etwas oder alles von Aminosäureregionen enthalten,
besonders bevorzugt.
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Alternativ
wird bei anderen Ausführungsformen
ein Volllängen-
oder ein im Wesentlichen Volllängen-MDA-7-Polypeptid
betrachtet, das bei der Behandlung von Krebs verwendet wird. Bei
Verwendung im Zusammenhang mit humanem MDA-7 bezieht sich der Begriff „Volllängen-„ auf ein
MDA-7-Polypeptid, das mindestens die 206 Aminosäuren enthält, die von der menschlichen
mda-7 cDNA codiert werden. Der Begriff „im Wesentlichen Volllängen-„ im Zusammenhang
mit menschlichem MDA-7 bezieht sich auf ein MDA-7-Polypeptid, das mindestens
80% der zusammenhängenden
Aminosäuren
des menschlichen Volllängen-MDA-7-Polypeptid
(SEQ ID NO: 2) enthält.
Es wird allerdings auch berücksichtigt,
dass MDA-7 Polypeptide, die mindestens etwa 85%, 90% und 95% der
SEQ ID NO: 2 enthalten, im Umfang der Erfindung liegen, wie „im Wesentlichen
Volllängen„-MDA-7. Ein „verkürztes MDA-7-Polypeptid" oder „verkürztes MDA-7" bezieht sich auf
ein MDA-7-Polypeptid, dem zusammenhängende Aminosäuren aus
der Volllängen-MDA-7- Aminosäuresequenz fehlen,
wie in den Ansprüchen
definiert. Der Begriff „sezerniertes
MDA-7" bezieht sich auf
ein MDA-7-Polypeptid, das aus einer Zelle sezerniert wird, d. h.
ein Polypeptid, das von einer Volllängen-mda7-cDNA codiert werden
kann oder nicht und dessen N-Terminus bei etwa Aminosäure 46 des
Volllängen-MDA-7-Polypeptids
beginnt. Der Begriff „verkürztes MDA-7" und "verkürztes MDA-7-Polypeptid" umfasst ein sezerniertes
MDA-7-Polypeptid, wenn beispielsweise die Signalsequenz nicht fehlt
oder wenn eine heterologe Signalsequenz an das Polypeptid angeknüpft ist.
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Der
Begriff „biologisch
funktionsäquivalent" wird auf dem Fachgebiet
gut verstanden und ist weiter hier im Einzelnen definiert. Demnach
ist eine Sequenz, die zwischen etwa 70% und etwa 80% oder stärker bevorzugt
zwischen 81% und etwa 90%; oder auch noch stärker bevorzugt zwischen etwa
91% und etwa 99% der Aminosäuren
aufweist, die identisch mit den Aminosäuren der SEQ ID NO: 2 oder
funktionsäquivalent
sind, eine Sequenz, die in „im
Wesentlichen wie in der SEQ ID NO: 2 ausgeführt" ist, mit der Maßgabe, dass die biologische
Aktivität
des Proteins, Polypeptids oder Peptids beibehalten wird.
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Der
Begriff „funktionsäquivalentes
Codon" wird hier
zur Bezeichnung von Codons verwendet, die die gleiche Aminosäure codieren,
wie die sechs Codons für
Arginin und Serin, und bezieht sich auch auf Codons, die biologisch äquivalente
Aminosäuren
codieren.
-
Dadurch,
dass Intron-Regionen und flankierende Regionen erwartet werden und
dadurch, dass Degeneriertheit des genetischen Codes erlaubt ist,
sind Nukleinsäuresequenzen,
die zwischen etwa 70% und etwa 79%; oder stärker bevorzugt zwischen etwa
80% und etwa 89%; oder auch noch stärker bevorzugt zwischen etwa
90% und etwa 99% der Nukleinsäuren
aufweisen, die mit den Nukleotiden der SEQ ID NO: 1 identisch sind,
Nukleinsäuresequenzen,
die „im
Wesentlichen wie in der SEQ ID NO: 1 ausgeführt" sind.
-
Es
ist auch selbstverständlich,
dass die Erfindung nicht auf die bestimmte Nukleinsäure- und
Aminosäuresequenzen
der SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 2 beschränkt ist. Darum können rekombinante
Vektoren und isolierte Nukleinsäuresegmente
diese codierenden Regionen an sich in diverser Weise einschließen, wobei
die codierenden Regionen ausgewählte Änderungen
oder Modifikationen in der codierenden Grundregion tragen, und sie
können
größere Polypeptide
oder Peptide, die dennoch solche codierenden Regionen einschließen, oder
biologisch funktionsäquivalente
Proteine, Polypeptide oder Peptide, die variante Aminosäuresequenzen
aufweisen, codieren.
-
2. mda-7-Nukleinsäuren und Verwendungen davon
-
Eine
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung besteht auch im Transfer der Nukleinsäuren, die
die Volllängen-,
im Wesentlichen Volllängen-
oder die verkürzte
Form von menschlichem MDA-7 codieren, um die Zerstörung, Apoptose
oder die Lyse von hyperproliferativen Zellen zu induzieren. Die
Expression von MDA-7 ist umgekehrt korreliert mit der Tumorprogression,
wie durch erhöhte
mRNA-Spiegel in normalen Melanozyten im Vergleich zu primären und
metastastischen Tumoren gezeigt, sowie mit einer herabgesetzten
MDA-7 Expression in frühen
vertikalen Wachstumsphasen-Tumorzellen, die zur verstärken Tumorbildung
in Nacktmäusen
gewählt
sind.
-
Somit
umfasst bei einigen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung die Behandlung die Verabreichung eines
therapeutischen Nukleinsäure-Expressionskonstruktes,
das eine Volllängen-,
im Wesentlichen Volllängen-
oder verkürzte
Form von MDA-7 codiert, an hyperproliferative Zellen. Es wird davon
ausgegangen, dass die hyperproliferativen Zellen das Konstrukt aufnehmen
und das therapeutische Polypeptid, das von Nukleinsäure codiert
wird, exprimieren, wodurch wieder eine Wachstumskontrolle hergestellt
wird oder wodurch die hyperproliferativen Zellen zerstört werden.
Außerdem
ist das lösliche
MDA-7, das aus transfizierten oder transduzierten Zellen freigesetzt
wird, lokal verfügbar
und stellt eine Bystander-Wirkung auf benachbarten Tumorzellen bereit.
Es wird somit davon ausgegangen, dass das therapeutische mda-7 Expressionskonstrukt
an normale Zellen abgegeben werden kann und der freigesetzte Bystander-Effektor
(MDA-7, volle Länge
oder verkürzt)
die Antitumorwirkungen herbeiführen
würde,
insbesondere bezüglich
hyperproliferativer Zellen.
-
Bestimmte
Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen mindestens ein menschliches
mda-7-Nukleinsäuremolekül. Bei bestimmten
Aspekten umfasst die mda-7-Nukleinsäure eine Wildtyp- oder mutierte mda-7-Nukleinsäure. Bei
bestimmten Aspekten codiert die mda-7-Nukleinsäure mindestens eine transkribierte Nukleinsäure. Die
mda-7-Nukleinsäure
codiert mindestens ein MDA-7-Polypeptid. In anderen Aspekten umfasst
die menschliche mda-7-Nukleinsäure mindestens
ein Nukleinsäuresegment
der SEQ ID NO: 1.
-
Die
vorliegende Beschreibung offenbart auch die Isolierung oder Erzeugung
von mindestens einem rekombinanten Konstrukt oder von mindestens
einer rekombinanten Wirtszelle durch Anwenden der Nukleinsäure-Rekombinationstechnik
die den Fachleuten bekannt ist oder wie sie hier beschrieben ist.
Das rekombinante Konstrukt oder die rekombinante Wirtszelle kann
mindestens eine mda-7-Nukleinsäure
umfassen und kann mindestens ein MDA-7-Polypeptid exprimieren.
-
Wie
hier verwendet, bezieht sich „Wildtyp" auf die natürlich vorkommende
Sequenz einer Nukleinsäure an
einem genetischen Lokus in dem Genom eines Organismus und auf von
einer solchen Nukleinsäure
transkribierte oder translatierte Sequenzen. So kann der Begriff „Wildtyp" auch die Aminosäuresequenz
bezeichnen, die von der Nukleinsäure
codiert wird. Da ein genetischer Lokus mehr als eine Sequenz oder
Allele in einer Population von Individuen aufweisen kann, umfasst
der Begriff „Wildtyp" alle derartigen
natürlich
vorkommenden Allele. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „polymorph", dass Variation
(d. h. zwei oder mehrere Allele existieren) an einem genetischen
Lokus in den Individuen einer Population vorkommt. Wie hier verwendet,
bezieht sich „Mutante" auf eine Änderung
in der Sequenz einer Nukleinsäure
oder ihrem codierten Protein, Polypeptid oder Peptid, welche das
Ergebnis von DNA-Rekombinationstechnologie ist.
-
Eine
Nukleinsäure
kann durch jede dem Fachmann bekannte Technik hergestellt werden.
Nicht einschränkende
Beispiele für
synthetische Nukleinsäure,
insbesondere ein synthetisches Oligonukleotid, umfassen eine Nukleinsäure, die
durch in vitro chemische Synthese unter Verwendung der Phosphotriester-,
Phosphit- oder Phosphoramidit-Chemie und von Festphasentechniken,
wie in
EP 266,032 beschrieben,
oder über Deoxynukleosid-H-phosphonat-Intermediate,
wie durch Froehler et al., 1986, und in der
US-Patentschrift mit der Seriennummer 5,705,629 beschrieben,
hergestellt wurde. Ein nicht einschränkendes Beispiel für enzymatisch
hergestellte Nukleinsäure
umfasst eine Nukleinsäure,
die durch Enzyme in Amplifikationsreaktionen hergestellt wurde,
wie PCR
TM (siehe beispielsweise
US-Patentschrift Nr. 4,683,202 und
US-Patentschrift 4,682,195 ),
oder die Synthese von Oligonukleotiden, die in der Patentschrift
Nr.
5,645,897 beschrieben
ist. Ein nicht einschränkendes
Beispiel für
eine biologisch produzierte Nukleinsäure umfasst die rekombinante
Nukleinsäure-Produktion
in lebenden Zellen, wie die rekombinante DNA-Vektor-Produktion in Bakterien (siehe
beispielsweise Sambrook et al. 1989) Eine Nukleinsäure kann
auf Polyacrylamid-Gelen, Cesiumchlorid-Zentrifugationsgradienten
oder durch jedes andere, einem Fachmann bekannten Mittel gereinigt
werden (siehe beispielsweise Sambrook et al. 1989)
-
Der
Begriff „Nukleinsäure" bezieht sich im
Allgemeinen auf mindestens ein Molekül oder einen Strang von DNA,
RNA oder ein Derivat oder eine Nachstellung davon, die mindestens
eine Nukleobase umfasst, wie beispielsweise eine natürlich vorkommende
Purin- oder Pyrimidinbase, die in DNA (z. B. Adenine „A", Guanin „G", Thymin „T", und Cytosin „C") oder RNA (z. B.
A, G, Uracil „U" und „C") vorkommt. Der Begriff „Nukleinsäure" umfasst die Begriffe „Oligonukleotid" und „Polynukleotid". Der Begriff „Oligonukleotid" bezieht sich auf
mindestens ein Molekül
mit einer Länge
von etwa 3 bis etwa 100 Nukleobasen. Der Begriff „Polynukleotid" bezieht sich auf
mindestens ein Molekül
mit einer Länge
von mehr als etwa 100 Nukleobasen. Diese Definitionen beziehen sich
im Allgemeinen auf mindestens ein einzelsträngiges Molekül, jedoch
sind bei speziellen Ausführungsformen
auch mindestens ein zusätzlicher
Strang mit eingeschlossen, der teilweise, im Wesentlichen oder vollständig zu
dem mindestens einen einzelsträngigen
Molekül
komplementär
ist. Somit kann eine Nukleinsäure
mindestens ein doppelsträngiges
Molekül
oder mindestens ein dreifachsträngiges
Molekül
einschließen, das
einen oder mehrere komplementäre
Sträng(e)
oder „Komplement(e)" einer bestimmten
Sequenz einschließt,
die einen Strang des Moleküls
einschließt.
-
Bei
bestimmten Ausführungsformen
bezieht sich ein „Gen" auf eine Nukleinsäure, die
transkribiert wird. Wie hier verwendet, ist ein „Gensegment" ein Nukleinsäuresegment
eines Gens. In bestimmten Aspekten umfasst das Gen regulatorische
Sequenzen, die an der Transkription oder an der Message-Produktion
oder -Komposition beteiligt sind. Bei bestimmten Ausführungsformen
umfasst das Gen transkribierte Sequenzen, die ein Protein, Polypeptid
oder Peptid codieren. In anderen bestimmten Aspekten umfasst das
Gen eine mda-7-Nukleinsäure und/oder
codiert ein MDA-7-Polypeptid oder Peptid-codierende Sequenzen. In
Anlehnung an die hierin beschriebene Terminologie kann ein in „isoliertes
Gen" transkribierte
Nukleinsäure(n),
regulatorische Sequenzen, codierende Sequenzen oder dergleichen
einschließen,
die im Wesentlichen von anderen derartigen Sequenzen isoliert sind,
wie andere natürliche
vorkommende Gene, regulatorische Sequenzen, Polypeptid- oder Peptid-codierende
Sequenzen etc.. In dieser Hinsicht wird der Begriff „Gen" zur Vereinfachung
der Bezugnahme auf eine Nukleinsäure
eingesetzt, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die transkribiert ist,
und das Komplement davon. In bestimmten Aspekten umfasst die transkribierte
Nukleotidsequenz mindestens eine funktionelle Protein-, Polypeptid- und/oder Peptid-codierende
Einheit. Wie es von den Fachleuten verstanden wird, umfasst dieser
funktionelle Begriff „Gen" sowohl genomische
Sequenzen, RNA- oder cDNA-Sequenzen
oder kleinere, gentechnisch hergestellte Nukleinsäuresegmente,
einschließlich
von Nukleinsäuresegmenten
eines nicht-transkribierten Teils eines Gens, einschließlich, jedoch
nicht begrenzt auf, die nicht-transkribierten Promotor- oder Enhancer-Regionen
eines Gens. Kleinere gentechnisch hergestellte Gen-Nukleinsäuresegmente
können
exprimiert werden oder können
zur Expression unter Verwendung von Nukleinsäure-Manipulationstechnologie,
von Proteinen, Polypeptiden, Domänen,
Peptiden, Domänen,
Fusionsproteinen, Mutanten und/oder derartigen übernommen werden. Somit bezieht
sich ein „verkürztes Gen" auf eine Nukleinsäuresequenz,
der eine Spanne von zusammenhängenden
Nukleinsäure-Resten
fehlt, die einen Teil des Volllängen-MDA-7-Polypeptids
codieren. Beispielsweise darf ein verkürztes Gen die Nukleinsäuresequenz
für die
N-terminale Region des MDA-7-Polypeptids, wie die ersten 46 Aminosäuren, nicht
enthalten. Es wird davon ausgegangen, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
weniger als 95% der zusammenhängenden
Nukleinsäure-Reste
der SEQ ID NO: 1 enthalten können.
Alternativ können
diese Sequenzen weniger als 90%, 85%, 80%, 75%, oder 70% der zusammenhängenden
Nukleinsäure-Reste
der SEQ ID NO: 1 codieren.
-
„Isoliert,
im Wesentlichen von anderen codierenden Sequenzen" bedeutet, dass das
Gen von Interesse, in diesem Fall das mda-7-Gen, den signifikanten
Teil der codierenden Region der Nukleinsäure bildet, oder dass diese
Nukleinsäure
keine großen
Teile von natürlich
vorkommenden codierenden Nukleinsäuren enthält, wie große chromosomale Fragmente,
andere funktionelle Gene, RNA- oder cDNA-codierende Regionen. Natürlich bezieht
sich dies auf die Nukleinsäure,
wie ursprünglich
isoliert, und schließt
Gene oder codierende Regionen nicht aus, die später an die Nukleinsäure durch
Nukleinsäure-Rekombinationstechnik
addiert wurden.
-
Bei
bestimmten Ausführungsformen
ist die Nukleinsäure
ein Nukleinsäuresegment.
Wie hier verwendet, ist der Begriff „Nukleinsäuresegment" kleinere Fragmente einer Nukleinsäure, wie
als nicht einschränkendes
Beispiel diejenigen, die nur Teil MDA-7-Peptids oder der Polypeptidsequenz
codieren. Somit kann ein „Nukleinsäuresegment" einen beliebigen
Teil der mda-7-Gensequenz umfassen, von etwa 2 Nukleotiden bis zu
der vollen Länge
der MDA-7-Peptid-
oder -Polypeptid-codierenden Region. Bei bestimmten Ausführungsformen umfasst
das „Nukleinsäuresegment" die mda-7-Gensequenz
voller Länge.
Bei bestimmten Ausführungsformen
umfasst die Nukleinsäure
jeden beliebigen Teil der SEQ ID NO: 1 von etwa 2 Nukleotiden bis
zu der vollen Länge
der Sequenz, die die SEQ ID NO: 2 codiert.
-
Verschiedene
Nukleinsäuresegmente
können
auf der Grundlage einer bestimmten Nukleinsäuresequenz konstruiert werden
und können
jede beliebige Länge
aufweisen. Durch Zuordnen numerischer Werte einer Sequenz, beispielsweise
ist der erste Rest 1, der zweite Rest 2, etc., kann ein Algorithmus
kreiert werden, der alle Nukleinsäuresegmente definiert:
n
bis n + y,
wobei n eine ganze Zahl von 1 bis zu der letzten
Zahl der Sequenz ist und y die Länge
des Nukleinsäuresegmentes
minus 1 ist, wobei n + y die letzte Zahl der Sequenz nicht übersteigt.
Somit entsprechen für
ein 10-mer die Nukleinsäuresegmente
den Basen 1 bis 10, 2 bis 11, 3 bis 12, ... und/oder so weiter.
Für ein
15-mer entsprechen die Nukleinsäuresegmente
den Basen 1 bis 15, 2 bis 16, 3 bis 17 ... und/oder so weiter. Für ein 20-mer
entsprechen die Nukleinsäuresegmente
den Basen 1 bis 20, 2 bis 21, 3 bis 22... und/oder so weiter. Bei
bestimmten Ausführungsformen
kann das Nukleinsäuresegment
eine Sonde oder ein Primer sein.
-
Die
Nukleinsäure(n)
kann (können),
ohne Rücksicht
auf die Länge
der Sequenz selbst, mit anderen Nukleinsäuresequenzen kombiniert werden,
einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf Promotoren, Enhancer, Polyadenylierungssignale, Restriktionsenzymstellen,
multiple Klonierungsstellen, codierende Segmente und dergleichen,
um ein oder mehrere Nukleinsäure-Konstrukt(e)
zu erzeugen. Die Gesamtlänge
kann zwischen Nukleinsäure-Konstrukten beträchtlich
variieren. So kann ein Nukleinsäuresegment
von fast jeder beliebigen Länge
eingesetzt werden, wobei die Gesamtlänge vorzugsweise durch die
Leichtigkeit der Herstellung oder Verwendung bei dem beabsichtigten
Nukleinsäure-Rekombinationsprotokoll
begrenzt ist.
-
In
einem nicht einschränkenden
Beispiel können
ein oder mehrere Nukleinsäure-Konstrukte
hergestellt werden, die eine zusammenhängende Spanne von Nukleinsäuren einschließen, die
identisch oder komplementär
sind zu der SEQ ID NO: 1, die ein menschliches MDA-7-Polypeptid, wie in
den Ansprüchen
dargelegt, codiert. Eine solche Spanne von Nukleinsäuren oder
ein Nukleinsäure-Konstrukt
kann sein: etwa 95, etwa 100, etwa 105, etwa 110, etwa 115, etwa
120, etwa 125, etwa 130, etwa 135, etwa 140, etwa 145, etwa 150, etwa
155, etwa 160, etwa 165, etwa 170, etwa 175, etwa 180, etwa 185,
etwa 190, etwa 195, etwa 200, etwa 210, etwa 220, etwa 230, etwa
240, etwa 250, etwa 260, etwa 270, etwa 280, etwa 290, etwa 300,
etwa 310, etwa 320, etwa 330, etwa 340, etwa 350, etwa 360, etwa
370, etwa 380, etwa 390, etwa 400, etwa 410, etwa 420, etwa 430,
etwa 440, etwa 450, etwa 460, etwa 470, etwa 480, etwa 490, etwa
500, etwa 510, etwa 520, etwa 530, etwa 540, etwa 550, etwa 560,
etwa 570, etwa 580, etwa 590, etwa 600, etwa 610, etwa 618, etwa 650,
etwa 700, etwa 750, etwa 1.000, etwa 2.000, etwa 3.000, etwa 5.000,
etwa 10.000, etwa 15.000, etwa 20.000, etwa 30.000, etwa 50.000,
etwa 100.000, etwa 250.000, etwa 500.000, etwa 750.000, bis etwa 1.000.000
Nukleotide in der Länge,
sowie Konstrukte von größerer Größe bis zu
und einschließlich
von chromosomalen Größen (einschließlich sämtlicher
dazwischenliegender Längen
und dazwischenliegender Bereiche), mit der Maßgabe, dass das Aufkommen von
Nukleinsäure-Konstrukten, wie
ein künstliches
Hefe-Chromosom, den Fachleuten bekannt ist. Es ist unschwer zu verstehen,
dass „dazwischenliegende
Längen" und „dazwischenliegende
Bereiche", wie hier
verwendet, jede beliebige Länge
oder jeden beliebigen Bereich einschließlich oder zwischen den angegebenen
Werten (d. h. alle ganzen Zahlen einschließlich und zwischen solchen
Werten) bedeutet. Nicht einschränkende
Beispiele für
dazwischenliegende Längen
umfassen etwa 101, etwa 102, etwa 103, etc.; etwa 151, etwa 152,
etwa 153, etc.; etwa 1.001, etwa 1.002, etc.; etwa 50.001, etwa 50.002,
etc; etwa 750.001, etwa 750.002, etc.; etwa 1.000.001, etwa 1.000.002,
etc. Nicht einschränkende
Beispiele umfassen etwa 150 bis etwa 500.001, etwa 3.032 bis etwa
7.145, etwa 5.000 bis etwa 15.000, etwa 20.007 bis etwa 1.000.003,
etc.
-
Es
ist weiterhin zu verstehen, dass eine Nukleinsäuresequenz, die alles oder
einen Teil eines MDA-7-Polypeptids codiert, aus zusammenhängenden,
komplementären
oder identischen Nukleinsäuresequenzen
von einer der vorstehend beschriebenen Länge und aus der SEQ ID NO:
1 bestehen kann.
-
Es
wird davon ausgegangen, dass die Nukleinsäure-Konstrukte ein Volllängen-MDA-7
oder eine verkürzte
Version von MDA-7 codieren können,
wie in den Ansprüchen
dargelegt, derart, dass das Transkript der codierenden Region die
verkürzte
Version darstellt. Das verkürzte
Transkript kann dann in ein verkürztes
Protein translatiert werden. Alternativ kann eine Nukleinsäuresequenz
eine Volllängen-MDA-7-Proteinsequenz
codieren, die durch die zelluläre
Maschinerie prozessiert wird, um ein verkürztes MDA-7, wie in den Ansprüchen dargelegt,
zu produzieren. Solche Nukleinsäuremoleküle können zusammenhängende Nukleotide
der obigen Längen
aus SEQ ID NO: 1 enthalten. So können
die Sequenzen der vorliegenden Erfindung zusammenhängende Nukleinsäuren enthalten,
die komplementär
oder identisch zu SEQ ID NO: 1 sind, und dennoch weniger als die
ganze Sequenz der SEQ ID NO: 1 sind. Beispielsweise kann die Sequenz
weniger als 718 zusammenhängende
Nukleinsäuren
aus der SEQ ID NO: 1 enthalten; sie kann stattdessen weniger als
700, 690, 680, 670, 660, 650, 640, 630, 620, 610, 600, 590, 580,
570, 560, 550, 540, 530, 520, 510, 500, 490, 480, 470, 310, 300,
290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200 oder weniger zusammenhängende Nukleotide
oder Nukleotide aus der SEQ ID NO: 1 enthalten.
-
Der
Begriff „eine
Sequenz, im Wesentlichen wie in der SEQ ID NO: 1 dargelegt" oder „eine Sequenz, im
Wesentlichen wie in der SEQ ID NO: 1 dargelegt" bedeutet, dass die Sequenz im Wesentlichen
einem Teil der SEQ ID NO: 1 entspricht und relativ wenige Aminosäuren aufweist,
die nicht identisch sind zu oder die keine biologisch funktionellen Äquivalente
der Aminosäuren
der SEQ ID NO: 2 sind.
-
a. Vektoren und regulatorische Signale
-
Die
erfindungsgemäße Vektoren
sind hauptsächlich
zur Transformation hyperproliferativer Zellen mit einem therapeutischen
mda-7-Gen unter der Kontrolle von regulierten eukaryotischen Promotoren
(d. h. konstitutiv, induzierbar, repressierbar, gewebespezifisch)
ausgelegt. Ferner können
die Vektoren einen selektierbaren Marker enthalten, falls, aus keinem
anderen Grund, ihre Manipulation in vitro erleichtert wird. Allerdings können selektierbare
Marker bei der Produktion rekombinanter Zellen eine bedeutende Rolle
spielen.
-
Die
Tabellen 1 und 2 nachstehend führen
eine Vielzahl regulatorischer Signale zur erfindungsgemäßen Verwendung
auf. Tabelle 1 – Induzierbare Elemente
Element | Inducer | Druckschriften |
MT
II | Phorbol
Ester (TFA)
Schwermetalle | Palmiter
et al., 1982; Haslinger und Karin, 1985; Searle et al., 1985; Stuart
et al., 1985; Imagawa et al., 1987; Karin®, 1987;
Angel et al., 1987b; McNeall et al., 1989 |
MMTV
(Maus-Mammatumorvirus) | Glucocorticoid | Huang
et al., 1981; Lee et al., 1981; Majors und Varmus, 1983; Chandler
et al., 1983; Lee et al., 1984; Fonta et al., 1985; Sakai et al.,
1986 |
β-Interferon | poly(rI)X
poly(rc) | Tavernier
et al., 1983 |
Adenovirus
5 E2 | E1A | Imperiale
und Nevins, 1984 |
Collagenase | Phorbol
Ester (TPA) | Angel
et al., 1987a |
Stromelysin | Phorbol
Ester (TPA) | Angel
et al., 1987b |
SV40 | Phorbol
Ester (TFA) | Angel
et al., 1987b |
murines
MX Gen | Interferon,
Newcastle Disease Virus | Hug
et al., 1988 |
GRP78
Gen | A23187 | Resendez
et al., 1988 |
α-2-Macroglobulin | IL-6 | Kunz
et al., 1989 |
Vimentin | Serum | Rittling
et al., 1989 |
MHC-Klasse
I-Gen H-2κb | Interferon | Blanar
et al., 1989 |
HSP70 | E1A,
SV40 Large T Antigen | Taylor
et al., 1989; Taylor and Kingston, 1990a, b |
Proliferin | Phorbol
Ester-TPA | Mordacq
und Linzer, 1989 |
Tumornekrosefaktor | PMA | Hensel
et al., 1989 |
Thyroid-stimulierendes
Hormon-αGen | Thyroid
Hormon | Chatterjee
et al., 1989 |
Tabelle 2 – Weitere Promotoren/Enhancer-Elemente
Promotor/Enhancer | Druckschriften |
Immunglobulin,
schwere Kette | Banerji
et al., 1983; Gilles et al., 1983; Grosschedl und Baltimore, 1985;
Atchinson und Perry, 1986, 1987; Imler et al., 1987; Weinberger et
al., 1988; Kiledjian et al., 1988; Porton et al., 1990 |
Immunglobulin,
leichte Kette | Queen
und Baltimore, 1983; Picard und Schaffner, 1984 |
T-Zellen-Rezeptor | Luria
et al., 1987, Winoto und Baltimore, 1989; Redondo et al., 1990 |
HLA
DQα und
DQβ | Sullivan
und Peterlin, 1987 |
β-Interferon | Goodbourn
et al., 1986; Fujita et al., 1987; Goodbourn und Maniatis, 1985 |
Interleukin-2 | Greene
et al., 1989 |
Interleukin-2-Rezeptor | Greene
et al., 1989; Lin et al., 1990 |
MHC
Klasse II | Koch
et al., 1989 |
MHC
Klasse II HLA-DRα | Sherman
et al., 1989 |
β-Actin | Kawamoto
et al., 1988; Ng et al., 1989 |
Muskelkreatinkinase | Jaynes
et al., 1988; Horlick und Benfield, 1989; Johnson et al., 1989a |
Prealbumin
(Transthyretin) | Costa
et al., 1988 |
Elastase
I | Omitz
et al., 1987 |
Metallothionein | Karin
et al., 1987; Culotta und Hamer, 1989 |
Collagenase | Pinkert
et al., 1987; Angel et al., 1987 |
Albumin
Gen | Pinkert
et al., 1987, Tronche et al., 1989, 1990 |
α-Fetoprotein | Godbout
et al., 1988; Campere und Tilghman, 1989 |
γ-Globin | Bodine
und Ley, 1987; Perez-Stable Constantini, 1990 |
β-Globin | Trudel
und Constantini, 1987 |
c-fos | Cohen
et al., 1987 |
c-HA-ras | Triesman,
1986; Deschamps et al., 1985 |
Insulin | Edlund
et al., 1985 |
neurales
Zelladhäsionsmolekül (NCAM) | Hirsch
et al., 1990 |
a1-antitrypsin | Latimer
et al., 1990 |
H2B
(TH2B) Histon | Hwang
et al., 1990 |
Maus-
oder Typ 1-Collagen | Ripe
et al., 1989 |
Glucose-Regulate
Proteine (GRP94 GRP78) | Chang
et al., 1989 |
Ratten-Wachstumshormon | Larsen
et al., 1986 |
humanes
Serum-Amyloid A (SAA) | Edbrooke
et al., 1989 |
Troponin
I (TN I) | Yutzey
et al., 1989 |
Plättchen-abgeleiter
Wachstumsfaktor | Pech
et al., 1989 |
Duchenne-Muskeldystrophie | Klamut
et al., 1990 |
SV40 | Banerji
et al., 1981; Moreau et al., 1981; Sleigh und Lockett, 1985; Firak
und Subramanian, 1986; Herr und Clarke. 1986; Imbra und Karin, 1986;
Kadesch und Berg, 1986; Wang und Calame, 1986; Ondek et al., 1987;
Kuhl et al., 1987 Schaffner et al., 1988 |
Polyom | Swartzendruber
und Lehman, 1975; Vasseur et al., 1980; Katinka et al., 1980, 1981;
Tyndell et al., 1981; Dandolo et al., 1983; deVilliers et al., 1984;
Hen et al., 1986; Satake et al., 1988; Campbell und Villarreal, 1988 |
Retroviren | Kriegler
und Botchan, 1982, 1983; Levinson et al., 1982; Kriegler et al., 1983,
1984a, b, 1988; Bosze et al., 1986; Miksicek et al., 1986; Celander
und Haseltine, 1987; Thiesen et al., 1988; Celander et al., 1988; Chol
et al., 1988; Reisman und Rotter, 1989 |
Papilloma
Virus | Campo
et al., 1983; Lusky et al., 1983; Spandidos und Wilkie, 1983; Spalholz
et al., 1985; Lusky und Botchan, 1986; Cripe et al., 1987; Gloss
et al., 1987; Hirochika et al., 1987, Stephens und Hentschel, 1987;
Glue et al., 1988 |
Hepatitis
B Virus | Bulla
und Siddiqui, 1986; Jameel und Siddiqui, 1986; Shaul und Ben-Levy,
1987; Spandau and Lee, 1988 |
Human
Immunodeficiency Virus | Muesing
et al., 1987; Hauber und Cullan, 1988; Jakobovits et al., 1988; Feng
und Holland, 1988; Takebe et al., 1988; Rowen et al., 1988; Berkhout
et al., 1989; Laspia et al., 1989; Sharp und Marciniak, 1989; Braddock
et al., 1989 |
Cytomegalovirus | Weber
et al., 1984; Boshart et al., 1985; Foecking und Hofstetter, 1986 |
Gibbonaffen-Leukämievirus | Holbrook
et al., 1987; Quinn et al., 1989 |
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Die
Promotoren und Enhancer, die die Transkription von Protein-codierenden
Genen in eukaryotischen Zellen kontrollieren, bestehen aus mehreren
genetischen Elementen. Die Zellmaschinerie ist in der Lage, die
regulatorische Information, die von jedem Element geliefert wird,
zu sammeln und zu integrieren, wodurch es möglich ist, dass verschiedene
Gene distinkte, oft komplexe Muster von transkriptionaler Regulation entwickeln.
Ein Promotor, der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung
verwendet wird, umfasst konstitutive, induzierbare und gewebespezifische
Promotoren.
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Der
Begriff „Promotor" wird hier zur Bezugnahme
auf eine Gruppe von transkriptionalen Kontrollmolekülen verwendet,
die um die Initiationsstelle für
RNA Polymerase II geclustert sind. Ein großer Teil der Vorstellung darüber, wie
Promotoren organisiert sind, entstammt Analysen mehrerer viraler
Promotoren, einschließlich
derjenigen für
die HSV-Thymidinkinase
(tk) und die SV40-frühen
Transkriptionseinheiten. Diese Studien, die um neuere Arbeiten ergänzt wurden,
haben gezeigt, dass Promotoren aus diskreten funktionellen Modulen bestehen,
die jeweils aus ungefähr
7–20 bp
DNA bestehen und eine oder mehrere Erkennungsstellen für transkriptionale
Aktivatorproteine enthalten.
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Mindestens
ein Molekül
in jedem Promotor hat die Funktion der Positionierung der Startstelle
für die RNA-Synthese.
Das am besten bekannte Beispiel hierfür ist die TATA-Box, jedoch
unterstützt
in einigen Promotoren, denen eine TATA-Box fehlt, wie der Promotor
für das
Säuger-terminale
Deoxynucleotidyl-Transferase-Gen und der Promotor für die SV40-späten Gene,
ein diskretes Element, das über
der Startstelle selbst liegt, die Fixierung der Initiationsstelle.
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Zusätzliche
Promotorelemente regulieren die Frequenz der transkriptionalen Initiation.
Typischerweise sind diese in der Region 30–110 bp stromaufwärts von
der Startstelle lokalisiert, obwohl es sich neuerdings gezeigt hat,
dass eine Anzahl von Promotoren auch funktionelle Elemente stromabwärts von
der Startstelle enthalten. Der Abstand zwischen Elementen ist flexibel,
sodass die Promotorfunktion konserviert wird, wenn Elemente umgekehrt
oder relativ zueinander bewegt werden. In dem tk-Promotor kann der
Abstand zwischen Elementen auf bis 50 Basenpaare Abstand erhöht werden,
bevor die Aktivität
abzunehmen beginnt. In Abhängigkeit
von dem Promotor können
anscheinend individuelle Elemente entweder kooperativ oder unabhängig zur
Aktivierung der Transkription funktionieren.
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Enhancer
wurden ursprünglich
als genetische Elemente nachgewiesen, die die Transkription aus
einem Promotor erhöhten,
der an einer beabstandeten Position auf dem gleichen DNA-Molekül lokalisiert
ist. Die Fähigkeit, über einen
großen
Abstand hinweg zu wirken, hat bei klassischen Studien der prokaryotischen
transkriptionalen Regulation wenig Vorläufer. Spätere Arbeiten zeigten, dass
DNA-Regionen mit Enhancer-Aktivität weitgehend wie Promotoren
organisiert sind. Das heißt,
sie bestehen aus vielen einzelnen Elementen, die jeweils an ein
oder mehrere transkriptionale Proteine binden.
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Die
Grundunterscheidung zwischen Enhancern und Promotoren ist funktionell.
Eine Enhancer-Region als Ganzes muss in der Lage sein, die Transkription
in einem Abstand zu stimulieren; dies braucht für eine Promotor-Region oder
ihre Komponentenelemente nicht zuzutreffen. Andererseits muss ein
Promotor ein oder mehrere Elemente aufweisen, die die Initiation
der RNA-Synthese an einer bestimmten Stelle und in einer bestimmten
Orientierung lenkt, wohingegen den Enhancern diese Spezifität fehlt.
Abgesehen von dieser funktionellen Unterscheidung sind Enhancer
und Promotoren sehr ähnliche
Einheiten.
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Promotoren
und Enhancer besitzen die gleiche allgemeine Funktion der Aktivierung
der Transkription in der Zelle. Sie sind oft überlappend und zusammenhängend, und
scheinen oft eine sehr ähnliche
modulare Organisation aufzuweisen. Zusammengenommen legen diese Überlegungen
nahe, dass Enhancer und Promotoren homologe Einheiten sind und dass
die transkriptionalen Aktivatorproteine, die an diese Sequenzen gebunden
sind, mit der zellulären
Transkriptionsmaschinerie im Grunde genommen auf die gleiche Weise Wechselwirken
können.
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Bevorzugt
zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung ist der Cytomegalovirus(CMV)-Promotor. Dieser
Promotor ist im Handel von der Firma Invitrogen in dem Vektor pcDNAIII
erhältlich,
der zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist.
Ebenfalls als bei der vorliegenden Erfindung geeignet betrachtet werden
die Dectin-1- und Dectin-2-Promotoren.
Zusätzliche
virale Promotoren, zelluläre
Promotoren/Enhancer und induzierbare Promotoren/Enhancer, die in
Kombination mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind
in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt.
Zusätzlich
könnte
jede Promotor/Enhancer-Kombination (wie
durch die Eukaryotic Promotor Data Base EPDB) auch zum Antreiben
der Expression von Strukturgenen verwendet werden, die Oligosaccharid-prozessierende
Enzyme, Protein-faltende akzessorische Proteine, selektierbare Markerproteine
oder ein heterologes Protein von Interesse codieren. Alternativ
kann ein gewebespezifischer Promotor für die Krebsgentherapie (Tabelle
3) oder das Targeting von Tumoren (Tabelle 4) mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen eingesetzt
werden. Tabelle 3: Gewebespezifische Kandidatenpromotoren
für die
Krebsgentherapie
Gewebespezifischer
Promotor | Krebse,
in denen der Promotor aktiv ist | Normale
Zellen, in denen der Promotor aktiv ist |
Karzinoembryonische
Antigen-;
(CEA) | die
meisten Kolorektalkarzinome; 50% der Lungenkarzinome; 40–50% von
Magenkarzinomen; die meisten Pankreaskarzinome; viele Brustkarzinome;
die meisten Prostatakarzinome | Darm-Mukosa;
gastrische Mukosa; Lungenepithel; endokrine Schweißdrüsenzellen
in Hoden |
Prostata-spezifisches
Antigen (PSA) | die
meisten Prostatakarzinome | Prostataepithel |
Vasoaktives
intestinales Peptid (VIP) | die
Mehrheit von nicht-kleinzelligen
Lungenkrebsen | Neuronen;
Lymphozyten; Mastzellen; Eosinophile |
Oberflächenprotein
A (SPA)-Zellen; | Viele
Lungenadenokarzinome | Typ
II Pneumozyten; Clara |
Humanes
Achaete-scute-Homolog
(hASH) | die
meisten kleinzelligen Lungenkrebse | Neuroendokrine
Zellen in der Lunge |
Mucin-I
(MUCI)** | die
meisten Adenokarzinome (entstammend einem beliebigen Gewebe) | GF-anduläre Epithelzellen
in der Brust und in den Atemwegen, im Gastrointestinaltrakt und
im Genitourinaltrakt |
Alpha-Fetoprotein | die
meisten Leberzellenkarzinome; möglicherweise
viele testikuläre
Krebse | Hepatozyten
(unter bestimmten Bedingungen); Hoden |
Albumin | die
meisten Leberzellenkarzinome | Hepatozyten |
Tyrosinase | die
meisten Melanome | Melanozyten;
Astrozyten; Schwann-Zellen; einige Neuronen |
Tyronsin-bindendes
Protein (TRP) | die
meisten Melanome | Melanozyten;
Astrozyten; Schwann-Zellen; einige Neuronen |
Keratin
14 | vermutlich
viele Schuppenzellen Karzinome (z. B. Kopf- und Nackenkrebse) | Keratinozyten |
EBV
LD-2 | viele
Platten-Epithelkarzinome | Keratinozyten
des oberen Verdauungstraktes Kopf und Nacken |
Glial
Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | viele
Astrozytome | Astrozyten |
Myelin
Basic Protein (MBP) | viele
Gliome | Oligodentrozyten |
Hoden-spezifisches
Angiotensin-Umwandlungsenzym
(Hoden-spezifisches ACE) | möglicherweise
viele Hodenkrebse | Spermatozoen |
Osteocalcin | möglicherweise
viele Osteosarkome | Osteoblasten |
Tabelle 4: Kandidatenpromotoren zur Verwendung
mit einem gewebespezifischen Targeting von Tumoren
Promotor | Krebse,
in denen der Promotor aktiv ist | Normale
Zellen, in denen der Promotor aktiv ist |
E2F-regulierter
Promotor | fast
alle Krebse | proliferierende
Zellen |
HLA-G | viele
Kolorektalkarzinome; viele Melanome; möglicherweise viele andere Krebse | proliferierende
Zellen; Lymphozyten; Monozyten; Spermatozyten; Trophoblasten |
FasL | viele
Melanome; viele Pankreaskarzinome; die meisten Astrozytome | aktivierte
Leukozyten; Neuronen; Endothelzellen; Keratinzytenzellen in immunpriviligierten
Geweben; einige Zellen Lungen, Eierstöcken, Leber und Prostata |
Myc-regulierter
Promotor | die
meisten Lungenkarzinome (sowohl kleinzelliges als auch nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom);
die meisten Kolorektalkarzinome | proliferierende
Zellen (nur einige Zelltypen: Mamma-Epithelzellen (einschließlich nicht-proliferierender
Zellen) |
MAGE-1 | viele
Melanome; einige nicht-kleinzellige Lungenkarzinome; einige Brustkarzinome | Hoden |
VEGF | 70%
aller Krebse (konstitutive Überexpression
in vielen Krebsen) | Zellen
an Stellen von Neovaskularisation (jedoch im Gegensatz zu Tumoren
ist die Expression transient, weniger stark und niemals konstitutiv) |
bFGF | Vermutlich
viele verschiedene Krebse, das bFGF-Expression durch ischämische Zustände ausgelöst wird | Zellen
an Stellen von Ischämie (jedoch
im Gegensatz zu Tumoren ist die Expression transient, weniger stark
und niemals konstitutiv) |
COX-2 | die
meisten Kolorektal-karzinome;
viele Lungenkarzinome; möglicherweise
viele andere Krebse | Zellen
an Entzündungsstellen |
IL-10 | die
meisten Kolorektalkarzinome; viele Lungenkarzinome; viele squamöse Zellkarzinome
von Kopf und Nacken; möglicherweise
viele andere Krebse | Leukozyten |
GRP78/BiP | Vermutlich
viele verschiedene Krebse, da die GRP7S-Expression durch tumorspezifische
Zustände
induziert wird | Zellen
an Stellen von Ischämie |
CArG-Elemente
aus Egr-1 | Induziert
durch ionisierende Strahlung, so vermutlich die meisten Tumoren
bei Bestrahlung | Zellen,
die ionisierender Strahlung exponiert sind; Leukozyten |
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Ein
weiteres Signal, das sich als geeignet erweisen kann, ist ein Polyadenylierungssignal
(hGH, BGH, SV40). Die Verwendung von internen Ribosomen-Bindungsstellen(IRES)-Elementen wird zur
Erzeugung von multigenen oder polyzistronischen Botschaften verwendet.
IRES-Elemente sind in der Lage, das Ribosomen-Scanningmodell der
5'-methylierten cap-abhängigen Translation
zu umgehen und die Translation an internen Stellen zu beginnen (Pelletier
and Sonenberg, 1988). IRES-Elemente von zwei Mitgliedern der Picornavirus-Familie
(Polio- und Encephalomyocarditis) (Pelletier and Sonenberg, 1988),
sowie eine IRES aus einer Säugerbotschaft
(Macejak and Sarnow, 1991) wurden bereits beschrieben. IRES-Elemente
können
mit heterologen offenen Leserastern verknüpft sein. Mehrere offene Leseraster
können
miteinander transkribiert werden, jeweils getrennt durch eine IRES;
was polycistronische Botschaften erzeugt. Aufgrund des IRES-Elements
ist jedes offene Leseraster Ribosomen zur effizienten Translation
zugänglich.
Mehrere Gene können wirksam
unter Verwendung eines einzigen Promotors/Enhancers zur Transkription
einer einzigen Botschaft exprimiert werden.
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Auf
jeden Fall ist es selbstverständlich,
dass Promotoren DNA-Elemente sind, die, wenn sie funktionell stromaufwärts von
einem Gen positioniert sind, zur Expression dieses Gens führen. Die
meisten transgenen Konstrukte der vorliegenden Erfindung sind funktionell
stromabwärts
von einem Promotorelement positioniert.
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b. Gentransfer
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i. Virale Transformation
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a) Adenovirale Infektion
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Ein
Verfahren der Abgabe der rekombinanten DNA umfasst die Verwendung
eines Adenovirus-Expressionsvektors. Obwohl Adenovirus-Vektoren
bekanntlich ein geringes Vermögen
der Integration in genomische DNA besitzen, wird diesem Merkmal
durch die hohe Effizienz des Gentransfers, der von diesen Vektoren geleistet
wird, entgegengewirkt. „Adenovirus-Expressionsvektor" bedeutet, dass diejenigen
Konstrukte eingeschlossen sind, die Adenovirus-Sequenzen enthalten,
die ausreichen, um (a) das Verpacken der Konstrukte zu unterstützen und
(b) um letztendlich ein rekombinantes Genkonstrukt zu exprimieren,
das darin kloniert wurde.
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Der
Vektor umfasst eine genetisch hergestellte Form von Adenovirus.
Die Kenntnis der genetischen Organisation von Adenovirus, ein 36
kb, lineares, doppelsträngiges
DNA-Virus, erlaubt den Ersatz von großen Stücken von adenoviraler DNA mit
Fremdsequenzen bis zu 7 kb (Grunhaus and Horwitz, 1992). Im Gegensatz zu
Retrovirus führt
die adenovirale Infektion von Wirtszellen nicht zur chromosomalen
Integration, da adenovirale DNA episomal ohne potentielle Genotoxizität replizieren
kann. Auch sind Adenoviren strukturell stabil, und es wurde nach
extensiver Amplifikation keine Genom-Umlagerung nachgewiesen.
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Adenovirus
ist zur Verwendung als ein Gentransfervektor aufgrund seines mittelgroßen Genoms,
der Leichtigkeit der Manipulation des hohen Titers, des breiten
Zielzellenbereiches und der hohen Infektiosität besonders geeignet. Beide
Enden des viralen Genoms enthalten 100–200 Basenpaare invertierte
Wiederholungseinheiten (ITRs), welches cis-Elemente sind, die zur
viralen DNA-Replikation und zum Verpacken notwendig sind. Die frühen (E)
und späten
(L) Regionen des Genoms enthalten verschiedene Transkriptionseinheiten,
die durch das Einsetzen der viralen DNA-Replikation unterteilt werden.
Die E1-Region (E1A und E1B) codiert Proteine, die für die Regulation
der Transkription des viralen Genoms und einiger zellulärer Gene
verantwortlich sind. Die Expression der E2-Region (E2A und E2B)
führt zur
Synthese der Proteine für
die virale DNA-Replikation. Diese Proteine sind an der DNA-Replikation, der
späten
Genexpression und dem Wirtszellen-Abschalten beteiligt (Renan, 1990).
Die Produkte der späten
Gene, einschließlich
des Mehrheit der viralen Caspid-Proteine,
werden nur nach signifikanter Prozessierung eines einzelnen primären Transkripts
exprimiert, das von dem Major Late Promotor (MLP) ausgegeben wird.
Der MLP (lokalisiert bei 16.8 m.u.) ist besonders während der
späten
Phase der Infektion wirksam, und alle mRNAs, die diesem Promotor
entstammen, besitzen eine 5'-tripartite
Leader (TPL) Sequenz, die sie für
die Translation von mRNAs bevorzugt macht.
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Bei
einem aktuellen System wird rekombinantes Adenovirus aus homologer
Rekombination zwischen Shuttle-Vektor und Provirus-Vektor erzeugt.
Aufgrund der möglichen
Rekombination zwischen zwei proviralen Vektoren kann das Wildtyp-Adenovirus
aus diesem Prozess erzeugt werden. Darum ist es kritisch, einen
einzelnen Virusklon aus einer individuellen Plaque zu isolieren
und seine genomische Struktur zu untersuchen.
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Erzeugung
und Propagation der aktuellen Adenovirus-Vektoren, die replikationsdefizient
sind, hängen von
einer einzigartigen Helfer-Zelllinie ab, die als 293 bezeichnet
wird, die aus menschlichen embryonalen Nierenzellen durch Ad5-DNA-Fragmente
und konstitutiv exprimierten 1-Proteinen transformiert wurde (Graham
et al., 1977). Da die E3-Region aus dem Adenovirus-Genom entbehrlich
ist (Jones and Shenk, 1978), tragen die aktuellen Adenovirus-Vektoren,
mit der Hilfe der 293-Zellen, Fremd-DNA entweder in der E1-, der
E3-, oder in beiden Regionen (Graham and Prevec, 1991). In der Natur
kann Adenovirus ungefähr
105% des Wildtypgenoms verpacken (Ghosh-Choudhury et al., 1987),
was Kapazität
für etwa
2 extra kb DNA bereitstellt. Kombiniert mit den ungefähr 5,5 kb
DNA, die in der E1- und E3-Region ersetzbar sind, ist die maximale
Kapazität des
aktuellen Adenovirus-Vektor unter 7,5 kb, oder etwa 15% der gesamten
Länge des
Vektors. Mehr als 80% des Adenovirus-viralen Genoms verbleiben in
dem Vektorgerüst.
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Helfer-Zelllinien
können
sich von menschlichen Zellen, wie menschlichen embryonalen Nierenzellen, Muskelzellen,
hämatopoietischen
Zellen oder anderen menschlichen embryonalen mesenchymalen der epithelialen
Zellen ableiten. Alternativ können
sich Helferzellen von den Zellen von anderen Säugerspezies ableiten, die für das menschliche
Adenovirus zugelassen sind. Solche Zellen umfassen z. B. Vero-Zellen
oder andere embroyonale Affen-Mesenchym- oder Epithel-Zellen. Wie
vorstehend ausgeführt,
ist die bevorzugte Helfer-Zelllinie 293.
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Racher
et al. (1995) haben verbesserte Verfahren der Kultivierung von 293-Zellen
und der Propagation von Adenovirus offenbart. In einem Format werden
natürliche
Zellaggregate durch Überimpfen
von einzelnen Zellen in 1-Liter-Silikon-Schwenkkolben (rechne, Cambridge,
UK), die 100–200
ml Medium enthalten, gezüchtet.
Nach dem Rühren
bei 40 U/min wird die Zell-Überlebensfähigkeit
mit Trypanblau evaluiert. Bei einem anderen Format werden Fibra-Cel-Mikroträger (Bibby
Sterlin, Stone, UK) (5 g/l) wie folgt eingesetzt. Ein Zell-Inokulum,
resuspendiert in 5 ml Medium, wird dem Träger (50 ml) in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben
zugesetzt und und 1 Stunde bis 4 Stunden unter gelegentlichem Rühren stehen
gelassen. Das Medium wird dann durch 50 ml frisches Medium ersetzt
und das Schütteln
wird begonnen. Zur viralen Produktion werden die Zellen bei etwa
bis zu etwa 80% Konfluenz wachsen gelassen, wonach das Medium ersetzt
(bis auf 25% des Endvolumens) und Adenovirus bei einer MOI von 0,05
zugesetzt wird. Die Kulturen werden über Nacht stehen gelassen,
wonach das Volumen um 100% vergrößert ist,
und das Schütteln
wird für
weitere 72 Stunden begonnen.
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Der
Adenovirus-Vektor kann replikationsdefekt sein oder mindestens konditional
defekt sein, die Natur des Adenovirus-Vektors wird nicht als essentiell
für die
erfolgreiche Praxis der Erfindung betrachtet. Das Adenovirus kann
jeder beliebige der 42 verschiedenen bekannten Serotypen oder Untergruppen
A–F sein.
Adenovirus-Typ 5 der Untergruppe C ist das bevorzugte Ausgangsmaterial,
um den konditionalen replikationsdefekten Adenovirus-Vektor zur
Verwendung bei der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Dies beruht
darauf, da Adenovirus-Typ 5 ein menschliches Adenovirus ist, über das
eine beträchtliche
biochemische und genetische Information bekannt ist, und der bereits
historisch gesehen für
die meisten Konstruktionen unter Verwendung von Adenovirus als ein
Vektor verwendet worden ist.
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Wie
vorstehend ausgeführt,
ist der typische erfindungsgemäße Vektor
replikationsdefekt und besitzt keine Adenovirus-E1-Region. Es ist
somit besonders zweckmäßig, das
transformierende Konstrukt an der Position einzubringen, wovon die
E1-codierenden Sequenzen entfernt wurden. Allerdings ist die Position
der Insertion des Konstrukts innerhalb der Adenovirus-Sequenzen
für die
Erfindung nicht kritisch. Das Polynukleotid, das das Gen von Interesse
codiert, kann ebenfalls anstelle der deletierten E3-Region in den
E3-Ersatz-Vektoren
inseriert werden, wie von Karlsson et al. (1986) beschrieben, oder
in die E4-Region inseriert werden, wo eine Helfer-Zelllinie oder
Helfer-Virus den E4-Defekt ergänzt.
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Adenovirus-Wachstum
und -Manipulation sind den Fachleuten bekannt und zeigen in vitro
und in vivo einen breiten Wirtsbereich. Diese Gruppe von Viren kann
in hohen Titern, z. B. 109–1011 Plaque-bildende Einheiten pro ml, erhalten
werden, und sie sind hoch infektiös. Der Lebenszyklus von Adenovirus
erfordert keine Integration in das Wirtszellengenom. Die Fremdgene,
die von Adenovirus-Vektoren abgegeben werden, sind episomal und
besitzen darum gegenüber
Wirtszellen eine geringe Genotoxizität. Es wurden in Untersuchungen
der Beimpfung mit Wildtyp-Adenovirus keine Nebenwirkungen berichtet
(Couch et al., 1963; Top et al., 1971), was ihre Sicherheit und
ihre therapeutisches Potential als in vivo Gentransfer-Vektoren
zeigt.
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Adenovirus-Vektoren
werden bereits bei der eukaryotischen Genexpression (Levrero et
al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992) und bei der Impfstoffentwicklung
(Grunhaus and Horwitz, 1992; Graham and Prevec, 1992) verwendet.
Tierversuche haben nahegelegt, dass rekombinantes Adenovirus zur
Gentherapie verwendet werden könnte
(Stratford-Perricaudet and Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet
et al., 1990; Rich et al., 1993). Studien bei der Verabreichung
von rekombinantem Adenovirus an verschiedene Gewebe umfassen Tracheainstillation
(Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), Muskelinjektion
(Ragot et al., 1993), periphere intravenöse Injektionen (Herz and Gerard,
1993) und stereotaktische Inokulation in das Gehirn (Le Gal La Salle
et al., 1993).
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b) Retrovirale Infektion
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Die
Retroviren sind eine Gruppe von einzelsträngigen RNA-Viren, die durch
eine Fähigkeit
der Umwandlung ihrer RAN in doppelsträngige DNA in infizierten Zellen
durch ein Verfahren der reversen Transkription (Coffin, 1990) gekennzeichnet
ist. Die resultierende DNA integriert sich dann stabil in Zellchromosomen als
ein Provirus und steuert die Synthese von viralen Proteinen. Diese
Integration führt
zur Retention der viralen Gensequenzen in der Empfängerzelle
und ihren Nachkommen. Das retrovirale Genom enthält drei Gene, gag, pol und
env, die Capsid-Proteine, Polymeraseenzym bzw. Hüllkomponenten codieren. Eine
stromaufwärts
des gag-Gens gefundene Sequenz enthält ein Signal zum Verpacken
des Genoms in Virionen. Zwei lange terminale Wiederholungs-(LTR)-Sequenzen
sind am 5'- und
3'-Ende des viralen
Genoms vorhanden. Diese enthalten starke Promotor- und Enhancer-Sequenzen und sind
ebenfalls zur Integration in das Wirtszellengenom erforderlich (Coffin,
1990).
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Um
einen retroviralen Vektor zu konstruieren, wird eine Nukleinsäure, die
ein Gen von Interesse codiert, anstelle bestimmter viraler Sequenzen
in das virale Genom inseriert, um ein Virus zu produzieren, das replikationsdefekt
ist. Um Virionen zu produzieren, wird eine Verpackungszelllinie,
die gag-, pol- und env-Gen enthält,
jedoch ohne die LTR und die Verpackungskomponenten konstruiert (Mann
et al., 1983). Wenn ein rekombinantes Plasmid, das eine cDNA enthält, zusammen
mit der retroviralen LTR und den Packungssequenzen in diese Zelllinie
eingebracht wird (beispielsweise durch Calciumphosphat-Präzipitation),
ermöglicht
es die Verpackungssequenz, dass das RNA-Transkript des rekombinanten
Plasmids in Viruspartikel verpackt wird, die dann in die Kulturmedien
sezerniert werden (Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann
et al., 1983). Die Medien, die die rekombinanten Retroviren enthalten,
werden dann gesammelt, gegebenenfalls konzentriert und zum Gentransfer
verwendet. Retrovirale Vektoren sind in der Lage, eine breite Vielzahl
von Zelltypen zu infizieren. Allerdings erfordern Integration und
stabile Expression die Teilung von Wirtszellen (Paskind et al.,
1975).
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Fragen
hinsichtlich der Verwendung von defekten Retrovirus-Vektoren ist
das potentielle Aussehen des Wildtyp-replikationskompeneten Virus
in den Verpackungszellen. Dies kann aus Rekombinationsereignissen
herrühren,
wobei die intakte Sequenz aus dem rekombinanten Virus stromaufwärts der
gag-, pol-, env-Sequenzen inseriert, die in das Wirtszellengenom
integriert ist. Allerdings sind Verpackungszelllinien verfügbar, die
die Wahrscheinlichkeit der Rekombination stark herabsetzen sollten
(Markowitz et al., 1988; Hersdorffer et al., 1990).
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c) AAV-Infektion
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Adeno-assoziiertes
Virus (AAV) ist ein attraktives Vektorsystem zur Verwendung bei
der vorliegenden Erfindung, das eine hohe Integrationsfrequenz aufweist
und sich nicht teilende Zellen infizieren kann, was es somit zur
Abgabe von Genen in Säuerzellen
in Gewebekulturen geeignet macht (Muzyczka, 1992). AAV besitzt einen
breiten Wirtsbereich zur Infektiosität (Tratschin et al., 1984;
Laughlin et al., 1986; Lebkowski et al., 1988; McLaughlin et al.,
1988), was bedeutet, dass es zur Verwendung bei der vorliegenden
Erfindung anwendbar ist. Einzelheiten hinsichtlich der Erzeugung
und der Verwendung von rAAV-Vektoren sind in de
US-Patentschrift Nr. 5,139,941 und
in der
US-Patentschrift Nr. 4,797,368 beschrieben.
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Studien,
die die Verwendung von AAV bei der Genabgabe demonstrieren, umfassen
LaFace et al. (1988); Zhou et al. (1993); Flotte et al. (1993);
und Walsh et al. (1994). Rekombinante AAV-Vektoren werden bereits
erfolgreich zur in vitro und in vivo Transduktion von Markergenen
(Kaplitt et al., 1994; Lebkowski et al., 1988; Samulski et al.,
1989; Shelling and Smith, 1994; Yoder et al., 1994; Zhou et al.,
1994; Hermonat and Muzyczka, 1984; Tratschin et al., 1985; McLaughlin
et al., 1988) und von Genen, die an menschlichen Krankheiten beteiligt
sind (Flotte et al., 1992; Luo et al., 1994; Ohi et al., 1990; Walsh
et al., 1994; Wei et al., 1994), verwendet. Unlängst wurde ein AAV-Vektor für Phase-I-Menschenversuche
zur Behandlung der zystischen Fibrose genehmigt.
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AAV
ist ein abhängiges
Parvovirus, insofern als es die Coinfektion mit einem anderen Virus
(entweder Adenovirus oder ein Mitglied der Herpesvirusfamilie) erfordert,
um eine produktive Infektion in kultivierten Zellen zu erfahren
(Muzyczka, 1992). In Abwesenheit einer Coinfektion mit Helfervirus
integriert sich das Wildtyp-AAV-Genom über seine Enden in das menschliche
Chromosom 19, wo es in einem latenten Zustand als Provirus verbleibt
(Kotin et al., 1990; Samulski et al., 1991). Allerdings ist es zur
Intregration nicht auf das Chromosom 19 beschränkt, es sein denn, das AAV-Rep-Protein
wird ebenfalls exprimiert (Shelling and Smith, 1994). Wenn eine
Zelle, die ein AAV-Provirus trägt,
mit einem Helfervirus superinfiziert wird, wird das AAV-Genom aus
dem Chromosom oder aus einem rekombinanten Plasmid „gerettet", und es wird eine
normale produktive Infektion entwickelt (Samulski et al., 1989;
McLaughlin et al., 1988; Kotin et al., 1990; Muzyczka, 1992).
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Typischerweise
wird ein rekombinantes AAV(rAAV)-Virus durch Cotransfizieren eines
Plasmids hergestellt, das das Gen von Interesse, das von den beiden
AAV-terminalen Wiederholungseinheiten flankiert wird (McLaughlin
et al., 1988; Samulski et al., 1989, die jeweils hier durch Bezugnahme
eingearbeitet sind), und ein Expressionsplasmid, das die Wildtyp-AAV-codierenden
Sequenzen ohne die terminalen Wiederholungseinheiten enthält, beispielsweise
pIM45 (McCarty et al., 1991), enthält. Die Zellen werden auch
mit Adenovirus oder Plasmiden infiziert oder transfiziert, die die
Adenovirus-Gene tragen, die für
die AAV-Helferfunktion
erforderlich sind. rAAV-Virus-Substrate, die auf solche Weise hergestellt
sind, sind mit Adenovirus kontaminiert, der physikalisch von den
rAAV-Partikeln abgetrennt werden muss (beispielsweise durch Cäsiumchlorid-Dichtezentrifugation).
Alternativ könnten
Adenovirus-Vektoren, die die AAV-codierenden Regionen enthalten,
oder Zelllinien, die die AAV-codierenden Regionen und einige oder
alle der Adenovirus-Helfergene enthalten, verwendet werden (Yang
et al., 1994; Clark et al., 1995). Zelllinien, die die rAAV-DNA
als ein integriertes Porvirus tragen, können ebenfalls verwendet werden
(Flotte et al., 1995).
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d) Weitere virale Vektoren
-
Weitere
virale Vektoren können
als Konstrukte bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Vektoren, die sich von Viren ableiten, wie Vaccinia-Virus (Ridgeway,
1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988) und Herpesviren
können
verwendet werden. Sie bieten mehrere attraktive Merkmale für verschiedene
Säugerzellen
(Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar
et al., 1988; Horwich et al., 1990).
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Ein
molekular klonierter Stamm von Venezuelan Equine Encephalitis (VEE)
Virus wurde bereits als ein replikationskompetenter Vaccin-Vektor
zur Expression von heterologen viralen Proteinen genetisch ausgearbeitet
(Davis et al., 1996). Studien haben gezeigt, dass die VEE-Infektion potente
CTL-Antworten stimuliert, und es wurde nahegelegt, dass VEE ein äußerst geeigneter
Vektor für
Immunisierungen sein kann (Caley et al., 1997). Es wird bei der
vorliegenden Erfindung davon ausgegangen, dass das VEE-Virus beim
Targeting dentritischer Zellen geeignet sein kann.
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Mit
der jüngsten
Kenntnis über
defekte Hepatitis B Viren wurden neue Einblicke in die Struktur-Funktionsbeziehung
verschiedener viraler Sequenzen erzielt. In vitro Untersuchungen
zeigten, dass das Virus die Fähigkeit
für das
helferabhängige
Verpacken und die reverse Transkription trotz Deletion von bis zu
80% seines Genoms beibehalten könnte
(Horwich et al., 1990). Dies legt nahe, dass ein großer Teil
des Genoms mit fremdem, genetischem Material ersetzt werden könnte. Chang
et al. führten
unlängst
das Chloramphenicol-Acetyltransferase(CAT)-Gen in das Enten Hepatitis
B Virus Genom anstelle der Polymerase-, Oberflächen- und Prä-Oberflächen-codierenden
Sequenzen ein. Es wurde mit Wildtyp-Virus in eine aviäre Hepatomzelllinie cotransfiziert.
Kulturmedien, die hohe Titer des rekombinaten Virus enthielten,
wurden zur Infektion primärer Entenküken-Hepatozyten verwendet.
Eine stabile CAT-Genexpression wurde für mindestens 24 Tage nach Transfektion
nachgewiesen (Chang et al., 1991).
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Bei
noch weiteren Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure, die das menschliche mda-7
codiert, von einem infektiösen
Virus beherbergt, der gentechnisch hergestellt wurde, um einen spezifischen
Bindungsliganden zu exprimieren. Das Viruspartikel bindet somit
spezifisch an die Erkennungsrezeptoren der Zielzelle und gibt den
Inhalt an die Zelle ab. Eine neuer Ansatz, der dazu ausgelegt ist, spezifisches
Targeting von Retrovirus-Vektoren
zu ermöglichen,
wurde unlängst
auf der Grundlage der chemischen Modifikation eines Retrovirus durch
die chemische Addition von Laktoseresten an die virale Hülle entwickelt.
Diese Modifikation kann die spezifische Infektion von Hepatozyten über Sialoglycoprotein-Rezeptoren ermöglichen.
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Beispielsweise
wurde das Targeting von rekombinanten Retroviren, wobei biotinylierte
Antikörper
gegen ein retrovirales Hüllprotein
und gegen einen spezifischen Zellrezeptor verwendet werden, konzipiert.
Die Antikörper
wurden über
die Biotinkomponenten unter Verwendung von Streptavidin gekoppelt
(Roux et al., 1989). Unter Verwendung von Antikörpern gegen Haupt-Histokompatibilitätskomplex
Klasse I- und Klasse II-Antigene zeigten sie die Infektion einer
Vielzahl von menschlichen Zellen, die diese Oberflächenantigene
trugen, mit einem ektopischen Virus in vitro (Roux et al., 1989).
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ii. Nicht-virale Abgabe
-
Zusätzlich zur
viralen Abgabe der Nukleinsäure,
die Volllängen-
oder verkürztes
MDA-7-Protein codiert,
gibt es die folgenden zusätzlichen
Verfahren der rekombinanten Genabgabe an eine gegebene Wirtszelle,
und sie werden somit bei der vorliegenden Erfindung berücksichtigt.
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a) Elektroporation
-
Bei
bestimmten bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung wird das Genkonstrukt in hyperproliferative
Zielzellen über
Elektroporation eingebracht. Die Elektroporation umfasst die Exposition von
Zellen (oder Geweben) und DNA (oder eines DNA-Komplexes) gegenüber einer
elektrischen Hochspannungsentladung.
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Die
Transfektion von eukaryotischen Zellen unter Verwendung der Elektroporation
war bereits recht erfolgreich. Maus-pre-B-Lymphozyten wurden mit
menschlichen Kappa-Immunoglobulingenen
transfiziert (Potter et al., 1984), und Ratten-Hepatozyten wurden
mit dem Chloramphenicol-Acetyltransferasegen auf diese Weise transfiziert
(Tur-Kaspa et al., 1986)
-
Es
wird davon ausgegangen, dass die Elektroporationsbedingungen für hyperproliferative
Zellen aus verschiedenen Quellen optimiert werden können. Es
kann besonders erwünscht
sein, solche Parameter, wie Spannung, Kapazitanz, Zeit und Elektroporationsmedienzusammensetzung,
zu optimieren. Die Ausführung von
weiteren Routineeinstellungen ist den Fachleuten bekannt. See z.
B. Hoffman, 1999; Heller et al., 1996.
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b) Partikelbombardement
-
Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung zum Übertragen
eines nackten DNA-Konstruktes
in Zellen umfasst Partikelbombardement. Dieses Verfahren hängt von
der Fähigkeit
zur Beschleunigung DNA-beschichteter Mikroprojektile auf eine hohe
Geschwindigkeit ab, was es ihnen erlaubt, Zellmembranen zu durchstoßen und
in Zellen, ohne sie abzutöten,
einzudringen (Klein et al., 1987). Die verwendeten Mikroprojektile bestanden
aus biologisch inerten Substanzen, wie Wolfram-, Platin- oder Goldkügelchen.
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Es
wird davon ausgegangen, dass in einigen Fällen eine DNA-Präzipitation
auf Metallpartikel zur DNA-Abgabe an eine Empfängerzelle unter Verwendung
des Partikel-Bombardements notwendig sein würde. Es wird davon ausgegangen,
dass die Partikel DNA enthalten können statt mit DNA beschichtet
zu sein. Es wird darum vorgeschlagen, dass DNA-beschichtete Partikel
das Niveau der DNA-Abgabe über
Partikel-Bombardement steigern können,
dass sie es aber in und an sich nicht benötigen.
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Mehrere
Vorrichtungen zur Beschleunigung von kleinen Partikeln wurden bereits
entwickelt. Eine solche Vorrichtung beruht auf einer Hochspannungsentladung,
um einen elektrischen Strom zu erzeugen, der wiederum die Bewegungskraft
bereitstellt (Yang et al., 1990). Ein weiteres Verfahren umfasst
die Verwendung eines biolistischen Partikel-Abgabesystems, das zum
Antreiben von mit DNA beschichteten Partikeln durch ein Gitter,
wie Edelstahlgitter oder Nytexgitter, auf eine Filteroberfläche, die
mit Zellen in Suspension bedeckt ist, verwendet werden kann. Das
Gitter dispergiert die Partikel, sodass sie nicht in großen Aggregaten
an die Empfängerzellen
abgegeben werden. Es wird angenommen, dass ein Gitter, das zwischen
dem Projektilgerät
und den zu bombardierenden Zellen liegt, die Größe der Projektilaggregate herabsetzt
und zu einer höheren
Transformationsfrequenz durch Herabsetzung des Schadens beitragen
kann, der auf die Empfängerzellen
durch Projektile, die zu groß sind,
ausgeübt
wird.
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Für das Bombardement
werden die Zellen in Suspension vorzugsweise auf Filter oder alternativ
auf festem Kulturmedium konzentriert. Die zu bombardierenden Zellen
werden in einem entsprechenden Abstand unterhalb der Makroprojektil-Stoppplatte
positioniert. Sofern gewünscht,
werden auch ein oder mehrere Gitter zwischen der Beschleunigungsvorrichtung
und den zu bombardierenden Zellen positioniert.
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Bei
der Bombardement-Transformation können die Kulturbedingungen
vor dem Bombardement und die Bombardement-Parameter optimiert werden,
um die maximale Anzahl stabiler Transformanten zu ergeben. Sowohl
die physikalischen als auch die biologischen Parameter für ein Bombardement
sind bei dieser Technologie wichtig. Physikalische Faktoren sind
diejenigen, die das Manipulieren des DNA/Mikroprojektil-Präzipitats
umfassen oder diejenigen, die den Flug und die Geschwindigkeit oder
entweder die Makro- oder Mikroprojektile beeinflussen. Biologische
Faktoren umfassen sämtliche
Schritte, die an der Manipulation von Zellen vor und sofort nach
dem Bombardement beteiligt sind, die osmotische Anpassung von Zielzellen,
um das mit dem Bombardement verbundene Trauma zu lindern helfen
und ebenfalls die Natur der transformierenden DNA, wie beispielsweise
linearisierte DNA, oder intakte supercoiled Plasmide. Kürzlich wurden
Ergebnisse von einer klinischen Studie, die den Nutzen dieser Abgabesysteme
zur Impfung bewertet, veröffentlicht.
Die Studie war zur Bestimmung der Sicherheit und immunogenen Aktivität eines
DNA-Impfstoffes bei Freiwilligen vorgesehen, der aus einem Plasmidkodierendem
Hepatitis B Oberflächenantigen
bestand, das mittels des PowderJect XR1 Gen-Abgabesystems in die menschliche Haut
(Tacket et al., 1999) abgegeben wurde.
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Demnach
wird davon ausgegangen, dass man verschiedene Bombardement-Parameter
in Studien kleineren Umfangs anpassen möchte, um die Bedingungen vollständig zu
optimieren. Man kann sich insbesondere wünschen, die physikalischen
Parameter, wie beispielsweise Spaltzwischenraum, Flugstrecke, Gewebeabstand
und Heliumdruck, anzupassen. Auch die Faktoren zur Verringerung
des Traumas können
optimieren werden, indem die Bedingungen, die den physiologischen
Zustand der Empfängerzellen
beeinflussen, und die daher die Transformations- und Integrationseffizienzen
beeinflussen können,
modifiziert werden. Es können
beispielsweise der osmotische Zustand, Gewebehydratation und die
Unterkulturphase oder Zellzyklus der Empfängerzellen zur optimalen Transformation
angepasst werden. Die Durchführung
anderer routinemäßiger Anpassungen
ist den Fachleuten bekannt.
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c) Calciumphosphat Copräzipitation
oder DEAE-Dextran-Behandlung
-
Bei
weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsformen
wird das transgene Konstrukt unter Verwendung von Calciumphosphat
Copräzipitation
in die Zellen eingebracht. Urkeimzellen von Mäusen wurden mit dem SV40-Groß-T-Antigen
mit hervorragenden Ergebnissen transfiziert (Watanabe et al., 1997).
Humane KB Zellen wurden mit Adenovirus 5 DNA (Graham und Van Der
Eb, 1973) unter Verwendung dieser Technik transfiziert. Ebenfalls
auf diese Art und Weise wurden Maus L(A9)-, Maus C127-, CHO-, CV-1-,
BHK-, NIH3T3- und HeLa-Zellen mit einem Neomycin-Markergen (Chen
und Okayama, 1987) transfiziert und Hepatocyten von Ratten wurden
mit einer Vielzahl von Markergenen (Rippe et al., 1990) transfiziert.
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Bei
einer weiteren Ausführungsform
wird das Expressionskonstrukt unter Verwendung von DEAE-Dextran,
gefolgt von PolyethylenGlycol in die Zelle abgegeben. Bei dieser
Art und Weise werden Reporterplasmide in Myelom- und erythroleukämische Zellen
von Mäusen
(Gopal, 1985) verbracht.
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d) Direkte Mikroinjektion oder Ultrabeschallung
-
Weitere
erfindungsgemäße Ausführungsformen
umfassen die Einbringung des Nukleinsäurekonstrukts durch direkte
Mikroinjektion oder Ultrabeschallung. Direkte Mikroinjektion wurde
zur Einbringung von Nukleinsäurekonstrukten
in Xenopus Oocyten (Harland und Weintraub, 1985) verwendet und LTK
Fibroblasten wurden mit dem Thymidinkinase-Gen durch Ultrabeschallung
(Fechheimer et al., 1987) transfiziert.
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e) Lipid-vermittelte Transformation
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Bei
einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform
kann das Genkonstrukt in einer Liposomen- oder Lipid-Formulation
eingeschlossen sein. Liposome sind blasenförmige Strukturen, die durch
eine Phospholipid-Doppelschichtmembran und ein inneres wässriges
Medium gekennzeichnet sind. Multilamellare Liposome weisen mehrere
Lipidschichten auf, die durch ein wässriges Medium getrennt sind.
Sie bilden sich spontan, wenn Phospholipide in einem Überschuss
wässriger
Lösung
suspendiert werden. Die Lipid-Komponenten ordnen sich selbst vor
der Bildung geschlossener Strukturen neu an und schließen Wasser
und gelöste
Substanzen zwischen den Lipiddoppelschichten ein (Ghosh und Bachhawat,
1991). Auch ein Genkonstrukt, das mit Lipofectamin (Gibco BRL) einen
Komplex bildet, wird in Betracht gezogen.
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Die
Lipid-vermittelte Nukleinsäureabgabe
und Expression fremder DNA in vitro waren sehr erfolgreich (Nicolau
und Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987). Wong
et al. (1980) zeigten die Durchführbarkeit
von Lipid-vermittelter Abgabe und Expression fremder DNA in kultivierten
Huhnembryo-, HeLa- und Hepatoma-Zellen.
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Lipid-basierte
nicht virale Formulierungen stellen eine Alternative zu adenoviralen
Gentherapien bereit. Obwohl viele Studien von Zellkulturen einen
Lipid-basierten nicht viralen Gentransfer dokumentiert haben, war
die systemische Genabgabe über
Lipid-basierte Formulierungen beschränkt. Eine Haupteinschränkung der
nicht viralen Lipid-basierten Genabgabe ist die Toxizität der kationischen
Lipide, die das nicht virale Abgabevehikel umfassen. Die in vivo
Toxizität
von Liposomen erklärt
teilweise die Abweichung zwischen Ergebnissen des in vitro und in
vivo Gentransfers. Ein weiterer Faktor, der zu diesen widersprüchlichen
Daten beiträgt, ist
der Unterschied der Stabilität
der Lipidvehikel in Gegenwart und Abwesenheit von Serumproteinen.
Die Wechselwirkung zwischen Lipidvehikeln und Serumproteinen hat
einen drastischen Einfluss auf die Stabilitätsmerkmale von Lipidvehikeln
(Yang und Huang, 1997). Kationische Lipide ziehen negativ geladene
Serumproteine an und binden sie. Zu Serumproteinen gehörige Lipidvehikel
sind entweder gelöst
oder von Makrophagen aufgenommen, was dazu führt, dass sie aus dem Blutkreislauf
ausgeschieden werden. Derzeitige Verfahren zur in vivo Lipidabgabe
verwenden subkutane, intradermale, intratumorale oder intracraniale
Injektion, um die mit den kationischen Lipiden im Blutkreislauf
verbundenen Toxizitäts-
und Stabilitätsprobleme
zu vermeiden. Die Wechselwirkung von Lipidvehikeln und Plasmaproteinen
ist verantwortlich für
die Verschiedenheit zwischen der Wirksamkeit von in vitro (Felgner
et al., 1987) und in vivo Gentransfer (Zhu et al., 1993; Philip
et al., 1993; Solodin et al., 1995; Liu et al., 1995; Thierry et
al., 1995; Tsukamoto et al., 1995; Aksentijevich et al., 1996).
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Neueste
Fortschritte bei Lipid-Formulierungen haben die Wirksamkeit von
Gentransfer in vivo (Templeton et al., 1997;
WO 98/07408 ) verbessert. Eine neue
Lipid-Formulierung, die aus einem äquimolaren Verhältnis von
1,2-Bis(oleoyloxy)-3-(trimethylammonium)propan (DOTAP) und Cholesterin
zusammengesetzt ist, verbessert den systemischen in vivo Gentransfer
deutlich, in etwa 150-fach. Die DOTAP:Cholesterin Lipid-Formulierung
bildet eine einzigartige Struktur, die als „Sandwich-Liposom" bezeichnet wird.
Diese Formulierung wird an „Sandwich"-DNA zwischen einer
invaginierten Doppelschicht oder „Vasen"-Struktur berichtet. Vorteilhafte Merkmale
dieser Lipidstrukturen umfassen eine positive ρ, kolloidale Stabilisierung
durch Cholesterin, zweidimensionale DNA-Wickelung und erhöhte Serumstabilität. Patentanmeldungen
Nr. 60/135,818 und 60/133,116 diskutieren Formulierungen, die mit
der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
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Die
Herstellung von Lipid-Formulierungen wird oft durch Sonikation oder
serielles Extrudieren liposomaler Gemische nach (I) reverser Phaseneindampfung
(II) Dehydratation-Rehydratation
(III) Reinigungsmitteldialyse und (IV) Dünnfilmhydratation ausgeführt. Einmal
hergestellt, können
Lipidstrukturen zum Einkapseln von Verbindungen, die toxisch (Chemotherapeutika)
oder labil (Nukleinsäuren)
sind, wenn sie sich im Blutkreislauf befinden, verwendet werden.
Lipidverkapselung führte
zu einer geringeren Toxizität
und einer längeren
Serumhalbwertszeit für
solche Verbindungen (Gabizon et al., 1990). Zahlreiche Behandlungen
von Krankheiten verwenden Lipid-basierte Strategien zum Gentransfer,
um herkömmliche
Therapien zu verbessern oder neue Therapien zu begründen, insbesondere
Therapien zur Behandlung hyperproliferativer Krankheiten.
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Bei
bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen
kann das Lipidvehikel mit einem hämagglutinierenden Virus (HVJ)
einen Komplex bilden. Dies zeigte eine Erleichterung der Verschmelzung
mit der Zellmembran und förderte
den Zelleintritt von Lipid-verkapselter DNA (Kaneda et al., 1989).
Bei anderen Ausführungsformen
kann das Lipidvehikel einen Komplex bilden mit oder angewendet werden
in Verbindung mit nuklearen Nicht-Histon chromosomalen Proteinen
(HMG-1) (Kato et al., 1991). Bei noch weiteren Ausführungsformen
kann das Lipidvehikel einen Komplex bilden mit oder angewendet werden
in Verbindung mit sowohl HVJ als auch HMG-1.
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Ein
betrachtetes Verfahren zur Herstellung einer Lipid-Zusammensetzung
in kommerziellem Rahmen besteht im Allgemeinen aus dem Mischen der
Komponenten, dem Trocknen des Gemisches, dem Rehydrieren des Gemisches,
dem Dispergieren des Gemisches, dem Extrudieren der Lipid-Zusammensetzung
durch Filter mit abnehmender Porengröße und Mischen der Lipid-Zusammensetzung
mit einem therapeutischen Mittel, um einen Lipoplex zu bilden. Im
Folgenden werden zusätzliche
Informationen über
die Herstellung und Formulierung eines Lipoplexes zur Verwendung
bei der Abgabe eines mda-7 Polynukleotides an eine Zelle bereitgestellt.
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Pulverkomponenten
werden gewogen, gemischt und in einem geeigneten Lösungsmittel,
wie beispielsweise tertiärem
Butanol, Chloroform, Methanol, Ethylenchlorid, Ethanol oder Gemischen
dieser Lösungsmittel,
gelöst.
Es wird davon ausgegangen, dass jegliche der beiden Lösungsmittel
in einem Verhältnis von
etwa 1:1000, 1:500, 1:100, 1:50, 1:25, 1:10, 1:5 oder 1:1 vorliegen.
Solubilisierung mit tertiärem
Butanol kann, aufgrund der kanzerogenen Eigenschaften von Chloroform,
angewandt werden. Trotzdem kann Chloroform verwendet werden, wenn
Schritte unternommen werden, um das rückständige Chloroform, das in der
Lipid-Zusammensetzung vorliegt, auf verträgliche Niveaus zu begrenzen.
Es wird in Erwägung
gezogen, dass andere lipophile Lösungsmittel
zur Solubilisierung der Lipid-Komponenten
verwendet werden können.
Das Lipidgemisch kann in tert-Butanol bei einer Temperatur von etwa
0°C, 2°C, 4°C, 6°C, 8°C, 10°C, 12°C, 14°C, 16°C, 18°C, 20°C, 22°C, 24°C, 26°C, 28°C, 30°C, 32°C, 34°C, 36°C, 38°C, 40°C, 42°C, 44°C, 46°C, 48°C, 50°C, 52°C, 54°C, 56°C, 58°C, 60°C, 62°C, 64°C, 66°C, 68°C, 70°C, 72°C, 74°C, 76°C, 78°C, 80°C, 82°C, 84°C, 86°C, 88°C oder 90°C solubilisiert
werden. Temperaturbereiche wie beispielsweise von 5°C bis 80°C, 10°C bis 70°C, 20°C bis 60°C und 30°C bis 50°C werden
ebenfalls zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung betrachtet.
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Im
Anschluss an die Herstellung der Lipid-Zusammensetzung wird ein
Lipidkomplex formuliert, indem die Lipid-Zusammensetzung und ein
therapeutisches Mittel in einer pharmazeutisch verträglichen
Trägerlösung durch
schnelles Mischen vereint werden. Schnelles Mischen kann durchgeführt werden
unter Verwendung eines T-Mischgeräts oder Ethanolinjektion des
therapeutischen Mittels. Bei bestimmten Ausführungsformen wird eine DOTAP:Cholesterin
Lipid-Zusammensetzung mittels der beschriebenen Verfahren hergestellt und
mit einen Polynukleotid vereint, das ein therapeutisches Protein
kodiert. Die Lipid-Zusammensetzung
wird in einer Menge bereitgestellt, um das Polynukleotid einzukapseln
und um eine kolloidale Suspension des Lipoplexes zu ergeben.
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DOTAP
(kationisches Lipid) kann mit Cholesterin bei äquimolaren Konzentrationen
gemischt werden. Dieses Gemisch gepulverter Lipide wird sodann mit
tert-Butanol gelöst,
die Lösung
zu einem dünnen
Film getrocknet und der Film in Wasser, das 5% Dextrose (Gew./Vol.)
enthält,
hydratisiert, um eine Endkonzentration von etwa 20 mM DOTAP und
etwa 20 mM Cholesterin zu ergeben. Der hydratisierte Lipidfilm wird
in einem erwärmten
Wasserbad etwa 45 Minuten gerührt,
dann bei etwa 35°C
zusätzliche
10 Minuten und bei Raumtemperatur über Nacht stehen gelassen.
Am folgenden Tag wird das Gemisch 5 Minuten bei etwa 50°C mit Ultraschall
behandelt. Das mit Ultraschall behandelte Gemisch wird 10 Minuten
bei etwa 50°C
erwärmt.
Dieses Gemisch wird anschließend
durch Filter mit abnehmender Porengröße (1 μm, 0,45 μm, 0,2 μm, 0,1 μm) extrudiert. Diese Lipid-Zusammensetzung
wird dann mit DNA gemischt, um einen Lipidkomplex herzustellen.
-
Eine
Lipid-Zusammensetzung kann DOTAP und Cholesterin, ein Cholesterin-Derivat
oder eine Cholesterin-Mischung und ein Polynukleotid, das ein therapeutisches
Protein, wie beispielsweise MDA-7, kodiert, Antisense-RNA oder Ribozym
zur Abgabe in kranke Zellen oder in Zellen, nahe den kranken Zellen,
umfassen. Die Behandlung einer Krankheit umfasst bei einer Ausführungsform
die intravenöse
Verabreichung eines Polynukleotid-Lipoplexes an einen Patienten,
der anschließend
ein von dem Polynukleotid kodiertes Therapeutikum exprimiert. Die
Lipoplex-Behandlung des Patienten gibt das Polynukleotid an normale
und hyperproliferative Zellen ab, die das Therapeutikum exprimieren,
was zu der Hemmung oder Zerstörung
der hyperproliferativen Zellen führt.
-
Das
anfängliche
Lipid-Gemisch besteht bevorzugt aus gepulverten Lipid-Komponenten,
die gewogen und in geeigneten molaren Verhältnissen gemischt werden können. Die
Komponenten können
anionische Lipide, kationische Lipide, neutrale Lipide, Sterole
und/oder andere hydrophobe Moleküle
in Verhältnissen
sein, die notwendig sind, um die gewünschten Merkmale der endgültigen Lipid-Zusammensetzung
oder -komplexes zu erzeugen. Die eigentliche Zusammensetzung des
Lipid-Gemisches wird von den Eigenschaften bestimmt, die zur wirksamen
Abgabe des/der Mittels/Mittel zu den gewünschten Zielzellen durch die
gewünschten
Verabreichungsmittel, die nachstehend detailliert beschrieben werden,
erforderlich sind. Komponenten der Zusammensetzung können gemischt
werden, um verschiedene molare Verhältnisse bereitzustellen. Die
molaren Konzentrationen jeder Komponente der Lipid-Zusammensetzung
können
von etwa 0,5 mM, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM,
9 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM und
50 mM reichen. Das molare Verhältnis
jeder der beiden Komponenten kann von etwa 1:100, 1:50, 1:25, 1:20,
1:18, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6,
1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 1:0,5, 1:0,25, 1:0,1, 1:0,05 oder 1:0,01
reichen.
-
Die
Lipid-Zusammensetzungen sind in der Lage, biologisch aktive Mittel
zu tragen. Die Lipid-Zusammensetzung kann toxische Verbindungen
absondern, um freie Konzentrationen im Serum zu verringern, Verbindungen
vor abbauenden Mitteln im Körper
zu schützen
und/oder als Antigen wirkende Komponenten zu maskieren, um die immunogene
Aktivität
des Mittels zu verringern. DOTAP:Cholesterin Lipid-Zusammensetzungen
bilden beispielsweise mit Polynukleotiden Komplexe, derart, dass
die Polynukleotide abgesondert und resistent auf Abbau im Serum
werden. Die Lipid-Zusammensetzung kann mit einer Vielzahl therapeutischer Mittel
zu Komplexen zusammengeschlossen werden, einschließlich, aber
nicht darauf beschränkt,
Polynukleotiden, Proteinen, Peptiden, Chemotherapeutika, kleinen
Molekülen,
Peptonukleotiden und Kohlehydrattherapeutika.
-
Eine
bevorzugte Lipid-Zusammensetzung ist DOTAP und Cholesterin oder
ein Cholesterin-Derivat. Das
Verhältnis
von DOTAP zu Cholesterin, Cholesterin-Derivat oder Cholesterin-Mischung kann in
etwa 4:1 bis 1:4, 3:1 bis 1:3, stärker bevorzugt 2:1 bis 1:2
oder 1:1 sein. Die DOTAP oder Cholesterin-Konzentrationen können zwischen
etwa 1 bis 8 mM, 2 bis 7 mM, 3 bis 6 mM oder 4 bis 5 mM liegen.
Cholesterin-Derivate können leicht
gegen das Cholesterin ausgetauscht oder mit dem Cholesterin in der
vorliegenden Erfindung gemischt werden. Eine Anzahl an Cholesterin-Derivaten
ist dem Fachmann bekannt. Cholesterinacetat und Cholesterinoleat
können
verwendet werden. Polynukleotide werden bevorzugt den Liposomen
in einer Konzentration von 20 bis 200 μg pro 200 μl Endvolumen zugesetzt.
-
Der
Lipoplex wird hergestellt, indem ein bestimmtes Polynukleotid und
eine Lipid-Zusammensetzung in
5% Dextrose in Wasser verdünnt
werden, um eine geeignete Konzentration Nukleinsäure und Lipide zu erhalten.
Gleiche Volumina von Nukleinsäure
und Lipiden bei einer Konzentration, um 100 μg Nukleinsäure/5 mM Lipide/100 μl zu erhalten,
werden gemischt, indem die Nukleinsäure durch schnelles Mischen
oder mit einem Prallstrahl schnell der Oberfläche der Lipid-Zusammensetzung
zugesetzt wird.
-
3. Pharmazeutische Formulierungen und
Abgabe
-
Erfindungsgemäß wird ein
Expressionskonstrukt, das entweder ein humanes mda-7 Protein in
voller Länge
oder ein verkürztes,
wie in den Ansprüchen
spezifiziert, kodiert, in Betracht gezogen, wobei das Arzneimittel
in Kombination mit mindestens einer weiteren Anti-Krebs-Behandlung wie vorstehend
definiert verabreicht wird. Krebse, die höchstwahrscheinlich in der vorliegenden
Erfindung behandelt werden, sind diejenigen, die sich aus Mutationen
in einem Onkogen und/oder der verringerten Expression eines Wildtyp-Proteins
in den hyperproliferativen Zellen ergeben. Beispiele von zur Behandlung
in Betracht gezogener Krebse umfassen Lungenkrebs, Kopf- und Nackenkrebs,
Brustkrebs, Pankreaskrebs, Prostatakrebs, Nierenkrebs, Knochenkrebs,
Hodenkrebs, Gebärmutterhalskrebs,
Gastrointestinalkrebs, Lymphome, prä-neoplastische Läsionen in der
Lunge, Dickdarmkrebs, Melanome, Blasenkrebs und jegliche andere
Krebse, die durch Verabreichung einer Nukleinsäure, die entweder ein humanes
mda-7 Protein in voller Länge
oder ein verkürztes,
wie in den Ansprüchen
spezifiziert, kodiert, behandelt werden können.
-
Eine
wirksame Menge des Arzneimittels ist im Allgemeinen als diejenige
Menge definiert, die ausreicht, um nachweisbar und wiederholt das
Ausmaß der
Krankheit oder ihrer Symptome zu verbessern, verringern, minimieren
oder begrenzen. Strengere Definitionen können zutreffen, einschließlich Behebung,
Beseitigung oder Heilung der Krankheit.
-
Bevorzugt
besitzen Patienten ausreichende Knochenmarksfunktion (definiert
als eine periphere absolute Granulozytenzahl von > 2.000/mm3 und
eine Blutplättchenzahl
von 100.000/mm3), ausreichende Leberfunktion
(Bilirubin < 1,5
mg/dl) und ausreichende Nierenfunktion (Kreatinin < 1,5 mg/dl).
-
a. Verabreichung
-
Um
Zellen abzutöten,
Zellwachstum zu hemmen, Metastasenbildung zu hemmen, Tumor- oder Gewebegröße zu verringern
und anderweitig unter Verwendung der vorliegenden Erfindung den
malignen Phänotyp von
Tumorzellen umzukehren oder zu verringern, würde man im Allgemeinen eine
hyperproliferative Zelle mit dem therapeutischen Expressionskonstrukt
in Kontakt bringen. Die Verabreichungswege variieren natürlich mit der
Stelle und Natur der Läsion
und umfassen z. B. intradermale, transdermale, parenterale, intravenöse, intramuskuläre, intranasale,
subkutane, perkutane, intratracheale, intraperitoneale, intratumorale
Perfusion, Spülung,
direkte Injektion und orale Verabreichung und Formulierung.
-
Intratumorale
Injektion oder Injektion in das Gefäßsystem des Tumors wird speziell
für einzelne,
solide, zugängliche
Tumore in Betracht gezogen. Lokale, regionale oder systemische Verabreichung
kann ebenfalls geeignet sein. Für
Tumore, die > 4 cm
sind, beträgt
das zu verabreichende Volumen in etwa 4–10 ml (bevorzugt 10 ml), während für Tumore
mit < 4 cm ein
Volumen von in etwa 1–3
ml verwendet wird (bevorzugt 3 ml). Mehrfachinjektionen, die als
Einzeldosis abgegeben werden, umfassen in etwa 0,1 bis in etwa 0,5
ml Volumina. Die viralen Partikel können zweckmäßigerweise kontaktiert werden,
indem Mehrfachinjektionen in Abständen zu etwa 1 cm Intervallen
an den Tumor verabreicht werden.
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Im
Falle eines chirurgischen Eingriffs kann die vorliegende Erfindung
vor der Operation angewendet werden, um es zu ermöglichen,
dass ein inoperabler Tumor einer Resektion unterworfen werden kann.
Alternativ kann die vorliegende Erfindung zum Zeitpunkt des Eingriffs
angewendet werden und/oder danach, um eine verbleibende oder metastasenbildende
Krankheit zu behandeln. Ein resektiertes Tumorbett kann zum Beispiel
mit einer Formulierung, die ein mda-7 oder ein mda-7 kodierendes
Konstrukt umfasst, injiziert oder perfusioniert werden. Die Perfusion
kann nach der Resektion weitergeführt werden, zum Beispiel indem
ein Katheter an der Stelle des Eingriffs implantiert bleibt. Regelmäßige Behandlung
nach dem Eingriff ist ebenfalls vorgesehen.
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Kontinuierliche
Verabreichung kann ebenfalls angewendet werden, wo es indiziert
ist, zum Beispiel wo ein Tumor operativ entfernt wurde und das Tumorbett
behandelt wird, um verbleibende, mikroskopische Krankheiten zu beseitigen.
Abgabe über
eine Spritze oder Katheterisierung ist bevorzugt. Solch eine kontinuierliche Perfusion
kann über
einen Zeitraum von etwa 1–2
Stunden bis etwa 2–6
Stunden, bis etwa 6–12
Stunden, bis etwa 12–24
Stunden, bis etwa 1–2
Tage bis etwa 1–2
Wochen oder länger
im Anschluss an den Beginn der Behandlung erfolgen. Im Allgemeinen
entspricht die Dosis der therapeutischen Zusammensetzung über kontinuierliche
Perfusion denjenigen, die mittels einer Einmalinjektion oder Mehrfachinjektionen
gegeben werden, die über
einen Zeitraum, während
der die Perfusion stattfindet, angepasst wird. Es wird ferner davon
ausgegangen, dass eine Perfusion in die Gliedmaßen angewendet werden kann,
um erfindungsgemäße therapeutische
Zusammensetzungen insbesondere bei der Behandlung von Melanomen
und Sarkomen zu verabreichen.
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Therapien
können
ebenfalls variieren und hängen
oft von dem Tumortyp, der Stelle des Tumors, Fortschreiten der Krankheit
und Gesundheitszustand und Alter des Patienten ab. Offensichtlich
erfordern bestimmte Tumorarten aggressivere Behandlungen während zur
gleichen Zeit bestimmte Patienten anstrengendere Verfahren nicht
durchhalten. Der Krankenhausarzt ist bestens geeignet, solche Entscheidungen
aufgrund der bekannten Wirksamkeit und Toxizität (falls eine solche vorliegt)
der therapeutischen Zusammensetzungen zu treffen.
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Bei
bestimmten Ausführungsformen
kann der behandelte Tumor zumindest anfangs nicht entfernt werden.
Behandlungen mit therapeutischen viralen Konstrukten können die
Resektierbarkeit des Tumors aufgrund von Schrumpfen an den Rändern oder
mittels Beseitigung bestimmter besonders invasiver Teile erhöhen. Im Anschluss
an Behandlungen kann eine Resektion möglich sein. Zusätzliche
Behandlungen im Anschluss an eine Resektion dienen zur Beseitigung
mikroskopischer verbleibender Krankheiten an der Stelle des Tumors.
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Ein
typischer Verlauf einer Behandlung für einen primären Tumor
oder ein Tumorbett nach der Entfernung umfasst Mehrfachdosen. Eine
typische Behandlung eines primären
Tumors umfasst eine 6-Dosen Anwendung über einen Zeitraum von zwei
Wochen. Die zweiwöchige
Therapie kann einmal, zweimal, dreimal, viermal, fünfmal, sechsmal
oder öfter
wiederholt werden. Während
eines Verlaufs einer Behandlung kann die Notwendigkeit, die geplanten
Dosierungen abzuschließen,
erneut bewertet werden.
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Die
Behandlungen können
verschiedene „Dosiereinheiten" einschließen. Dosiereinheit
ist so definiert, dass sie eine vorher festgelegte Menge der therapeutischen
Zusammensetzung enthält.
Die zu verabreichende Menge und der bestimmte Weg und die Formulierung
liegen im Kenntnisstand der Fachärzte.
Eine Dosiereinheit muss nicht als eine Einzelinjektion verabreicht
werden, sondern kann kontinuierliche Infusionen über einen festgelegten Zeitraum
umfassen. Erfindungsgemäße Dosiereinheit
kann in geeigneter Weise als Plaquebildende Einheiten (pfu) für ein virales
Konstrukt beschrieben werden. Dosiereinheiten reichen von 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 pfu und mehr. Alternativ werden, abhängig von
der Art des Virus und dem erreichbaren Titer, 1 bis 100, 10 bis
50, 100–1000
oder bis zu etwa 1 × 104, 1 × 105, 1 × 106, 1 × 107, 1 × 108, 1 × 109, 1 × 1010, 1 × 1011, 1 × 1012, 1 × 1013, 1 × 1014 oder 1 × 1015 oder
mehr infektiöse
Viruspartikel (Vp) an den Patienten oder an die Zellen des Patienten
abgegeben.
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b. Injizierbare Zusammensetzungen und
Formulierungen
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Das
bevorzugte Verfahren zur Abgabe eines Expressionskonstrukts, das
entweder ein humanes MDA-7-Protein in voller Länge oder ein verkürztes an
hyperproliferative Zellen bei der vorliegenden Erfindung kodiert,
erfolgt über
intratumorale Injektion. Die hierin offenbarten Arzneimittel können allerdings
alternativ parenteral, intravenös,
intradermal, intramuskulär,
transdermal oder sogar intraperitoneal, wie in der
US-Patentschrift 5,543,158 ; der
US-Patentschrift 5,641,515 und
der
US-Patentschrift 5,399,363 beschrieben,
verabreicht werden.
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Eine
Injektion von Nukleinsäurekonstrukten
kann durch Spritzen oder jedes andere Verfahren, das zur Injektion
einer Lösung
verwendet wird, abgegeben werden, solange das Expressionskonstrukt
den speziellen Querschnitt von zur Injektion benötigten Nadeln passieren kann.
Ein neues nadelloses Injektionssystem wurde kürzlich beschrieben (
US-Patentschrift 5,846,233 ), mit
einer Mündung,
die eine Ampullenkammer definiert, um die Lösung zu halten, und einer Energievorrichtung,
um die Lösung
aus der Mündung
an die Stelle der Abgabe zu drücken.
Es wurde auch ein Spritzensystem zur Anwendung in der Gentherapie
beschrieben, das Mehrfachinjektionen vorher festgelegter Mengen
einer Lösung
genau in jeder Tiefe (
US-Patentschrift
5,846,225 ) erlaubt.
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Lösungen der
aktiven Verbindungen als freie Base oder pharmakologisch verträgliche Salze
können in
Wasser, das in geeigneter Weise mit einem oberflächenaktiven Stoff, wie beispielsweise
Hydroxypropylcellulose, gemischt ist, hergestellt werden. Dispersionen
können
ebenfalls in Glycerol, flüssigen
Polyethylenglycolen und Gemischen davon und in Ölen hergestellt werden. Unter
normalen Lagerungs- und Anwendungsbedingungen enthalten diese Zubereitungen
ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu
verhindern. Die pharmazeutischen Formen, die zur Injektion geeignet
sind, umfassen sterile wässrige
Lösungen
oder Dispersionen und sterile Puder, um eine Rezeptur steriler injizierbarer
Lösungen
oder Dispersionen (
US-Patentschrift
5,466,468 ) herzustellen. In allen Fällen muss die Form steril sein
und muss zu dem Maße
flüssig
sein, dass sie leicht in eine Spritze aufgezogen werden kann. Sie
muss unter den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil sein
und muss gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen, wie
beispielsweise Bakterien und Pilze, konserviert sein. Der Träger kann
ein Lösungsmittel
oder Dispersionsmedium sein, das zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol
(z. B. Glycerol, Propylenglycol und flüssigen Polyethylenglycol und
dergleichen), geeignete Gemische davon und/oder pflanzliche Öle enthält. Ein
geeignetes Fließvermögen kann
zum Beispiel durch die Verwendung eines Überzugs, wie beispielsweise
Lecithin, durch die Einhaltung der erforderlichen Partikelgröße im Falle
der Dispersion und durch die Verwendung von oberflächenaktiven
Stoffen erhalten werden. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen
kann durch verschiedene antibakterielle und antimykotische Mittel,
beispielsweise Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thiomersal
und dergleichen herbeigeführt
werden. In vielen Fällen
ist es bevorzugt, isotonische Mittel, beispielsweise Zucker oder
Natriumchlorid einzuschließen.
Eine verlängerte
Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch die Verwendung
von Mitteln in den Zusammensetzungen, die die Absorption verzögern, beispielsweise
Aluminiummonostearat und Gelatine, herbeigeführt werden.
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Zur
parenteralen Verabreichung beispielsweise in einer wässrigen
Lösung
sollte die Lösung,
wenn nötig,
in geeigneter Weise gepuffert sein und das flüssige Verdünnungsmittel zuerst mit einer
geeigneten Saline oder Glucose isotonisch gemacht werden. Diese
speziellen wässrigen
Lösungen
sind insbesondere geeignet zur intravenösen, intramuskulären, subkutanen,
intratumoralen und intraperitonealen Verabreichung. In diesem Zusammenhang
sind sterile wässrige
Medien, die verwendet werden können,
den Fachleuten angesichts der vorliegenden Offenbarung bekannt.
Eine Dosierung kann zum Beispiel in 1 ml isotonischer NaCl-Lösung gelöst werden
und entweder zu 1000 ml Hypodermoclysis-Flüssigkeit zugesetzt oder an
der vorgeschlagenen Stelle der Infusion injiziert werden (siehe
beispielsweise "Remington's Pharmaceutical
Sciences" 15. Ausgabe, Seiten
1035–1038
und 1570–1580).
Einige Dosisschwankungen treten notwendigerweise auf, abhängig von dem
Zustand des behandelten Individuums. Die für die Verabreichung verantwortliche
Person bestimmt auf jeden Fall die geeignete Dosis für das einzelne
Individuum. Darüber
hinaus sollten Zubereitungen zur Verabreichung an Menschen Sterilitäts-, Pyrogenizitäts-, allgemeine
Sicherheits- und Reinheitsstandards, wie sie von der FDA Office
of Biological standards gefordert sind, entsprechen.
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Sterile
injizierbare Lösungen
werden hergestellt, indem die Wirkstoffe in der erforderlichen Menge
in dem geeigneten Lösungsmittel
mit verschiedenen der anderen vorstehend aufgezählten Bestandteile, wie erforderlich,
eingebracht werden, gefolgt von filtrierter Sterilisation. Im Allgemeinen
werden Dispersionen hergestellt, indem die verschiedenen sterilisierten
Wirkstoffe in ein steriles Vehikel eingebracht werden, das das grundlegende
Dispersionsmedium und die erforderlichen weiteren Bestandteile von
denjenigen, die vorstehend aufgezählt sind, enthält. Im Falle
von sterilen Pulvern zur Herstellung steriler injizierbarer Lösungen,
sind die bevorzugten Verfahren zur Herstellung Vakuumtrocknungs- und Gefriertrocknungsverfahren,
die ein Pulver des Wirkstoffs mit jedem zusätzlichen gewünschten
Bestandteil aus einer vorab steril gefilterten Lösung davon ergeben.
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Die
hierin offenbarten Zusammensetzungen können in einer neutralen oder
in Salzform formuliert sein. Pharmazeutisch verträgliche Salze
umfassen die Säureadditionssalze
(gebildet mit den freien Aminogruppen des Proteins) und sind gebildet
mit anorganischen Säuren
wie zum Beispiel Chlorwasserstoff- oder Phosphorsäuren, oder
solch organischen Säuren
wie Essig-, Oxal-, Wein-, Mandelsäure und dergleichen. Salze,
die mit den freien Carboxylgruppen gebildet sind, können ebenfalls
von anorganischen Basen wie zum Beispiel Natrium-, Kalium-, Ammonium-,
Calcium- oder Eisenhydroxiden oder solchen organischen Basen wie
Isopropylamin, Trimethylamin, Histidin, Procain und dergleichen
abgeleitet werden. Nach der Formulierung werden die Lösungen auf
eine Art und Weise verabreicht, die mit der Darreichungsformulierung
kompatibel ist, und in einer solchen Menge, wie sie therapeutisch
wirksam ist. Die Formulierungen können in verschiedensten Darreichungsformen,
wie beispielsweise injizierbare Lösungen, Arzneistoff-freisetzende
Kapseln und dergleichen, verabreicht werden.
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Wie
hierin verwendet, umfasst „Träger" jegliche und alle
Lösungsmittel,
Dispersionsmedien, Vehikel, Überzüge, Verdünnungsmittel,
antibakterielle und antimykotische Mittel, isotonische und Absorptionsverzögernde Mittel,
Puffer, Trägerlösungen,
Suspensionen, Kolloide und dergleichen. Die Verwendung solcher Medien
und Mittel für
pharmazeutisch aktive Substanzen ist auf dem Fachgebiet wohl bekannt.
Mit Ausnahme insoweit als jedes herkömmliche Medium oder Mittel
mit dem Wirkstoff inkompatibel ist, wird seine Verwendung in den
therapeutischen Zusammensetzungen in Betracht gezogen. Zusätzliche
Wirkstoffe können
ebenfalls in die Zusammensetzungen eingebracht sein.
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Der
Begriff „pharmazeutisch
verträglich" oder „pharmakologisch
verträglich" bezieht sich auf
molekulare Einheiten und Zusammensetzungen, die bei einer Verabreichung
an einen Menschen keine allergische oder ähnliche unerwünschte Reaktion
hervorrufen. Die Herstellung einer wässrigen Zusammensetzung, die ein
Protein als einen Wirkstoff enthält,
ist auf dem Fachgebiet wohl verstanden. Typischerweise werden solche Zusammensetzungen
als Injektionen, entweder als flüssige
Lösungen
oder Suspensionen, hergestellt; feste Formen, die zur Lösung in
oder Suspendierung in einer Flüssigkeit
vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt
werden.
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4. Kombinationsbehandlungen
-
Um
die Wirksamkeit eines mda-7 Polypetids in voller Länge, im
Wesentlichen in voller Länge
oder eines verkürzten
Polypeptids oder eines dafür
kodierenden Expressionskonstrukts zu erhöhen, wird es mit anderen bei
der Behandlung von Krebs wirksamen Mitteln, nämlich einer Anti-Krebs-Behandlung
wie vorstehend definiert, kombiniert. Ein „Antikrebs"-Mittel ist in der Lage, Krebs bei einem
Individuum negativ zu beeinflussen, zum Beispiel durch das Abtöten von
Krebszellen, Herbeiführen
von Apoptose in Krebszellen, Verringern der Wachstumsrate von Krebszellen,
Verringern der Häufigkeit
oder Anzahl an Metastasen, Verringern der Tumorgröße, Hemmen
des Tumorwachstums, Verringern der Blutzufuhr zu einem Tumor oder
Krebszellen, Fördern einer
Immunantwort gegen Krebszellen oder eines Tumors, Verhindern oder
Hemmen des Fortschreitens von Krebs oder Erhöhen der Lebensspanne eines
Individuums mit Krebs. Antikrebsmittel sind Chemotherapie-Mittel,
nämlich
ein DNA-schädigendes
Mittel, Tamoxifen oder Herceptin. Allgemeiner würden diese anderen Zusammensetzungen
in einer kombinierten Menge bereitgestellt, die wirksam ist, um
eine Zelle zu töten
oder ihre Vermehrung zu hemmen. Dieser Prozess kann es mit sich
bringen, die Zellen mit dem Expressionskonstrukt und dem/den Mittel(n)
oder mehreren Faktor(en) zur gleichen Zeit in Kontakt zu bringen.
Dies kann erreicht werden, indem die Zelle mit einer einzelnen Zusammensetzung
oder pharmakologischen Formulierung, die beide Mittel umfasst, in
Kontakt gebracht wird, oder indem die Zelle mit zwei verschiedenen
Zusammensetzungen oder Formulierungen zur gleichen Zeit in Kontakt
gebracht wird, wobei eine Zusammensetzung das Expressionskonstrukt
umfasst und die andere das/die zweite(n) Mittel umfasst.
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Eine
Resistenz der Tumorzellen auf Mittel der Chemotherapie und Strahlentherapie
stellt ein Hauptproblem in der klinischen Onkologie dar. Ein Ziel
der derzeitigen Krebsforschung ist es, Wege zu finden, um die Wirksamkeit
von Chemo- und Strahlentherapie zu verbessern, indem sie mit Gentherapie
kombiniert werden. Das Herpes Simplex-Thymidinkinase (HS-tK) Gen
führte
beispielsweise erfolgreich die Aufnahmefähigkeit gegenüber dem
antiviralen Mittel Ganciclovir (Culver et al., 1992) herbei, wenn
es durch ein retrovirales Vektorsystem an Gehirntumore abgegeben
wurde. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird mda-7 Gentherapie
ebenso in Verbindung mit chemotherapeutischen Eingriffen, wie vorstehend
definiert, zusätzlich
zu anderen pro-apoptotischen oder Zellzyklus-regulierenden Mitteln
angewendet.
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Alternativ
kann die Gentherapie der Behandlung mit dem anderen Mittel vorangehen
oder im Anschluss an sie stattfinden, wobei die Intervalle von Minuten
zu Wochen reichen. Bei Ausführungsformen,
bei denen das andere Mittel und Expressionskonstrukt getrennt an
der Zelle appliziert werden, würde
im Allgemeinen sichergestellt werden, dass zwischen dem Zeitpunkt
einer jeden Abgabe keine bestimmte Zeitspanne verstreichen würde, derart,
dass das Mittel und Expressionskonstrukt immer noch in der Lage
waren, eine zweckmäßigerweise
kombinierte Wirkung auf die Zelle auszuüben. In solchen Fällen wird
davon ausgegangen, dass die Zelle mit beiden Modalitäten innerhalb
von in etwa 12–24
h, und, stärker
bevorzugt, innerhalb von in etwa 6–12 h miteinander in Kontakt
gebracht wird. In einigen Situationen kann es wünschenswert sein, die Zeitspanne
zur Behandlung deutlich auszuweiten, wobei allerdings mehrere Tage
(2, 3, 4, 5, 6 oder 7) bis mehrere Wochen (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder
8) zwischen den jeweiligen Verabreichungen liegen.
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Verschiedene
Kombinationen können
angewandt werden, Gentherapie ist „A" und das sekundäre Mittel, d. h. Chemotherapie,
ist „B":
A/B/A | B/A/B | B/B/A | A/A/B | A/B/B | B/A/A | A/B/B/B | B/A/B/B |
B/B/B/A | B/B/A/B | A/A/B/B | A/B/A/B | A/B/B/A | B/B/A/A |
B/A/B/A | B/A/A/B | A/A/A/B | B/A/A/A | A/B/A/A | A/A/B/A |
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Die
Verabreichung der erfindungsgemäßen therapeutischen
Expressionskonstrukte an einen Patienten wird gemäß den allgemeinen
Protokollen zur Verabreichung von Chemotherapeutika ablaufen, wobei
die Toxizität
des Vektors, falls eine vorliegt, in Betracht gezogen wird. Es wird
erwartet, dass die Behandlungszyklen wie nötig wiederholt würden. Es
wird ebenfalls davon ausgegangen, dass verschiedene Standardtherapien,
sowie chirurgische Eingriffe, in Verbindung mit der beschriebenen
hyperproliferativen Zelltherapie angewendet werden können.
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a. Chemotherapie
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Krebstherapien
im Allgemeinen umfassen ebenfalls eine Vielzahl von Kombinationstherapien
sowohl mit Behandlungen auf chemischer als auch auf Strahlenbasis.
Kombinationschemotherapien umfassen beispielsweise Cisplatin (CDDP),
Carboplatin, Procarbazin, Mechlorethamin, Cyclophosphamid, Camptothecin, Ifosfamid,
Melphalan, Chlorambucil, Busulfan, Nitroharnstoff, Dactinomycin,
Daunorubicin, Doxorubicin, Bleomycin, Plicomycin, Mitomycin, Etoposid
(Vp16), Tamoxifen, Raloxifen, Östrogenrezeptor-bindende
Mittel, Taxol, Gemcitabien, Navelbin, Farnesyl-Protein-Transferase-Inhibitoren,
Transplatin, 5-Fluoruracil, Vincristin, Vinblastin und Methotrexat,
Temazolomid (eine wässrige
Form von DTIC) oder jede analoge oder Derivatvariante der vorstehenden.
Die Kombination von Chemotherapie mit biologischer Therapie ist
als Biochemotherapie bekannt.
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b. Strahlentherapie
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Weitere
Faktoren, die DNA-Schäden
verursachen und die weitgehend angewendet wurden, umfassen, was
gemeinhin als γ-Strahlen,
Röntgenstrahlen
und/oder die direkte Abgabe von Radioisotopen an Tumorzellen bekannt
ist. Weitere Formen von DNA-schädigenden
Faktoren sind ebenfalls bekannt, wie beispielsweise Mikrowellen
und UV-Strahlung. Es ist äußerst wahrscheinlich,
dass alle diese Faktoren verschiedenste Schäden an der DNA, an den Vorstufen
von DNA, bei der Reduplikation und Reparatur von DNA und bei der Ansammlung
und Versorgung von Chromosomen bewirken. Dosierungsbereiche für Röntgenstrahlen
liegen zwischen täglichen
Dosen von 50 bis 200 Röntgen
für verlängerte Zeitspannen
(3 bis 4 Wochen) und Einzeldosen von 2000 bis 6000 Röntgen. Dosierungsbereiche
für Radioisotope
sind sehr verschieden und hängen von
der Halbwertszeit des Isotops, der Stärke und Art der emittierten
Strahlung und der Aufnahme durch die neoplastischen Zellen ab.
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Die
Begriffe „kontaktiert" und „ausgesetzt", wenn sie sich auf
eine Zelle beziehen, werden hierin verwendet, um den Prozess zu
beschreiben, durch den ein therapeutisches Konstrukt und ein chemotherapeutisches
oder strahlentherapeutisches Mittel an eine Zielzelle abgegeben
werden oder direkt neben der Zielzelle platziert werden. Um ein
Töten der
Zelle oder Stasis zu erreichen, werden beide Mittel in einer kombinierten Menge
an die Zelle abgegeben, die wirksam ist, um die Zelle zu töten oder
sie an einer Teilung zu hindern.
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c. Immuntherapie
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Immuntherapeutika
im Allgemeinen beruhen auf der Verwendung von Immuneffektorzellen
und Molekülen,
um auf Krebszellen zu zielen und sie zu zerstören. Der Immuneffektor kann
zum Beispiel ein Antikörper sein,
der auf irgendeinen Marker auf der Oberfläche einer Tumorzelle spezifisch
ist. Der Antikörper
alleine kann als ein Effektor der Therapie dienen oder er kann andere
Zellen herbeiholen, um die tatsächliche
Zelltötung
zu bewirken. Der Antikörper
kann ebenfalls an einen Arzneistoff oder Toxin (Chemotherapeutikum,
Radionuklid, Ricin-A-Kette, Choleratoxin, Pertussistoxin etc.) gebunden
sein und lediglich als ein zielführendes
Mittel dienen. Alternativ kann der Effektor ein Lymphozyt sein,
der ein Oberflächenmolekül trägt, das
entweder direkt oder indirekt mit einem Tumorzellen-Ziel wechselwirkt.
Verschiedene Effektorzellen umfassen zytotoxische T-Zellen und NK-Zellen.
Mda-7 Gentransfer zu Tumorzellen verursacht Tod und Apoptose von
Tumorzellen. Die apoptotischen Tumorzellen werden durch retikuloendotheliale
Zellen, einschließlich
dentritischen Zellen und Makrophagen, gereinigt und dem Immunsystem
präsentiert,
um Anti-Tumorimmunität
zu erzeugen (Rovere et al., 1999; Steinman et al., 1999). Die lösliche Form
von MDA-7-Protein weist eine Cytokin-artige Struktur und Aktivitäten auf,
wie beispielsweise Aktivierung von Immunzellen. Die Kombination
von therapeutischen Heilmitteln, d. h. direkte zytotoxische Aktivität und Immunaktivierung
durch MDA-7 würde
einen therapeutischen Vorteil bei der Behandlung von Krebs bereitstellen.
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Der
allgemeine Ansatz für
eine kombinierte Therapie wird nachstehend diskutiert. Bei einem
Aspekt der Immuntherapie muss die Tumorzelle irgendeinen Marker
tragen, der für
Targeting empfänglich
ist, d. h. der nicht auf der Mehrheit der anderen Zellen vorhanden
ist. Es gibt viele Tumormarker und jeder dieser kann zum Targeting
im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sein. Herkömmliche
Tumormarker umfassen carcinoembryonisches Antigen, Prostata-spezifisches
Antigen, Harntumor-assoziiertes Antigen, fötales Antigen, Tyrosinase (p97),
gp68, TAG-72, HMFG, Sialyl Lewis Antigen, MucA, MucB, PLAP, Östrogenrezeptor,
Lamininrezeptor, erb B und p155. Ein alternativer Aspekt der Immuntherapie
ist es, die pro-apoptotische Wirkung, die durch Ad-mda7-Behandlung
vermittelt wird, mit immunstimulierenden Wirkungen zu kombinieren.
Letztere können
inhärent
in dem löslichen
MDA-7-Protein sein. Es gibt allerdings auch andere immunstimulierende
Moleküle,
einschließlich:
Cytokine wie beispielsweise IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, gamma-IFN,
Chemokine wie beispielsweise MIP-1, MCP-1, IL-8 und Wachstumsfaktoren
wie beispielsweise FLT3 Ligand. Die Kombination von immunstimulierenden
Molekülen,
entweder als Proteine oder unter Verwendung von Genabgabe in Kombination
mit Ad-mda7, verbessert antitumorale Wirkungen (Ju et al., 2000).
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Wie
früher
diskutiert, sind Beispiele von derzeit untersuchten oder verwendeten
Immuntherapien Immunhilfsstoffe (z. B. Mycobacterium bovis, Plasmodium
falciparum, Dinitrochlorbenzol und aromatische Verbindungen) (
US-Patentschrift 5,801,005 ;
US-Patentschrift 5,739,169 ; Hui
und Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998), Cytokintherapie
(z. B. Interferone α, β und γ; IL-1, GM-CSF
und TNF) (Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand
et al., 1998), Gentherapie (z. B. TNF, IL-1, IL-2, p53) (Qin et
al., 1998; Austin-Ward und Villaseca, 1998;
US-Patentschrift 5,830,880 und
US-Patentschrift 5,846,945 ) und
monoklonale Antikörper
(z. B. Anti-Gangliosid GM2, anti-HER-2, anti-p185) (Pietras et al., 1998;
Hanibuchi et al., 1998;
US-Patentschrift
5,824,311 ). Herceptin (trastuzumab) ist ein chimärer (Maus-Mensch)
monoklonaler Antikörper,
der den HER2-neu Rezeptor blockiert. Er besitzt antitumorale Aktivität und wurde
zur Anwendung bei der Behandlung maligner Tumore (Dillman, 1999)
zugelassen. Eine Kombinationstherapie von Krebs mit Herceptin und
Chemotherapie stellte sich als wirksamer als die einzelnen Therapien
heraus. Es wird somit davon ausgegangen, dass eine oder mehrere
Krebstherapien mit der hier beschriebenen Ad-mda7 Therapie angewendet werden
können.
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i. Passive Immuntherapie
-
Es
gibt eine Reihe verschiedener Ansätze für eine passive Immuntherapie
von Krebs. Sie können
allgemein in folgende Kategorien eingeteilt sein: Injektion von
Antikörpern
allein; Injektion von Antikörpern
gekoppelt an Toxine oder chemotherapeutische Mittel; Injektion von
Antikörpern
gekoppelt an radioaktive Isotope; Injektion von anti-Idiotyp-Antikörpern; und
schließlich
Eliminieren von Tumorzellen in Knochenmark.
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Bevorzugt
werden humane monoklonale Antikörper
in der passiven Immuntherapie eingesetzt, da sie kaum oder keine
Nebenwirkungen bei dem Patienten hervorrufen. Ihre Anwendung ist
allerdings etwas durch ihre Knappheit begrenzt, und sie wurden bislang
lediglich intraläsional
verabreicht. Humane monoklonale Antikörper gegen Gangliosid-Antigene wurden Patienten
intraläsional
verabreicht, die an rezidivierenden Hautmelanomen (Irie & Morton, 1986)
litten. Bei sechs von zehn Patienten wurde im Anschluss an tägliche oder wöchentliche
intraläsionale
Injektionen eine Regression beobachtet. Bei einer anderen Studie
wurde ein mäßiger Erfolg
durch intraläsionale
Injektionen zweier humaner monoklonaler Antikörper (Irie et al., 1989) erzielt.
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Es
kann erwünscht
sein, mehr als einen monoklonalen Antikörper, der gegen zwei verschiedene
Antigene gerichtet ist, oder sogar Antikörper mit multipler Antigenspezifität zu verabreichen.
Behandlungsprotokolle können
ebenfalls die Verabreichung von Lymphokinen oder anderen Immunverbesserern,
wie durch Bajorin et al. (1988) beschrieben, umfassen. Die Entwicklung
humaner monoklonaler Antikörper
ist in weiteren Details an anderer Stelle in der Beschreibung beschrieben.
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ii. Aktive Immuntherapie
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Bei
der aktiven Immuntherapie wird ein als Antigen wirkendes Peptid,
Polypeptid oder Protein oder eine autologe oder allogene Tumorzellzusammensetzung
oder „Impfstoff" verabreicht, im
Allgemeinen mit einem bestimmten bakteriellen Hilfsstoff (Ravindranath & Morton, 1991;
Morton & Ravindranath,
1996; Morton et al., 1992; Mitchell et al., 1990; Mitchell et al.,
1993). Bei der Melanom-Immuntherapie überleben diejenigen Patienten,
die eine hohe IgM Antwort auslösen
oft besser, als diejenigen, die keine oder geringe IgM Antikörper auslösen (Morton
et al., 1992). IgM-Antikörper
sind oft transiente Antikörper
und die Ausnahme von der Regel scheinen Anti-Gangliosid- oder Antikohlenhydrat-Antikörper zu
sein.
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iii. Adoptive Immuntherapie
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Bei
der adoptiven Immuntherapie werden die zirkulierenden Lymphozyten
oder tumor-infiltrierten
Lymphozyten des Patienten in vitro isoliert, durch Lymphokine wie
beispielsweise IL-2 aktiviert, oder mit Genen zur Tumornekrose transduziert
und erneut verabreicht (Rosenberg et al., 1988; 1989). Um dies zu
erreichen, würde
einem Tier oder einem menschlichen Patienten eine immunologisch
wirksame Menge aktivierter Lymphozyten in Kombination mit einer
wie hierin beschriebenen Zusammensetzung eines als Antigen wirkenden
Peptids, das in einen Hilfsstoff eingebracht ist, verabreicht. Die
aktivierten Lymphozyten sind am stärksten bevorzugt die eigenen
Zellen des Patienten, die vorher aus einer Blut- oder Tumorprobe
isoliert wurden und in vitro aktiviert (oder „expandiert") wurden. Diese Form
der Immuntherapie erzeugte mehrere Fälle von Regression von Melanomen
und Nierenkarzinomen, aber der Prozentsatz derer, die darauf ansprachen,
war gering im Gegensatz zu denjenigen, die nicht ansprachen.
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d. Gene
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Die
Abgabe eines Vektors, der ein MDA-7 entweder in voller Länge oder
verkürzt
kodiert, in Verbindung mit einem zweiten Vektor, der eines der folgenden
Genprodukte kodiert, weist eine kombinierte antihyperproliferative
Wirkung auf Zielgewebe aus. Alternativ kann ein einziger Vektor
verwendet werden, der beide Gene kodiert. Eine Vielzahl an Proteinen
ist hier in die Erfindung eingeschlossen, einige davon sind nachstehend
beschrieben. Tabelle 6 listet verschiedene Gene auf, auf die eine
Gentherapie in irgendeiner Form in Kombination mit der vorliegenden
Erfindung gerichtet sein kann.
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i. Auslöser von Zellvermehrung
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Die
Proteine, die Zellvermehrung auslösen, zerfallen weiter in verschiedene
Kategorien, abhängig
von der Funktion. Was alle diese Proteine gemeinsam haben, ist ihre
Fähigkeit,
Zellvermehrung zu regulieren. Eine Form von PDGF beispielsweise,
das sis-Onkogen, ist ein abgesonderter Wachstumsfaktor. Onkogene
gehen selten aus Genen hervor, die Wachstumsfaktoren kodieren, und
derzeit ist sis der einzige bekannte, natürlich vorkommende onkogene
Wachstumsfaktor. Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird davon ausgegangen,
dass Antisense-mRNA, die auf einen bestimmten Auslöser von
Zellvermehrung gerichtet ist, verwendet wird, um eine Expression
des Auslösers
von Zellvermehrung zu verhindern.
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Die
Proteine FMS, ErbA, ErbB und neu sind Wachstumsfaktor-Rezeptoren.
Mutationen dieser Rezeptoren führen
zu einem Verlust der Regulierungsfunktion. Eine Punktmutation beispielsweise,
die den transmembranen Bereich des Neu Rezeptor-Proteins schädigt, führt zu dem
neu Onkogen. Das erbA Onkogen stammt von dem intrazellularen Rezeptor
für Schilddrüsenhormone.
Man glaubt, dass der modifizierte onkogene ErbA-Rezeptor mit dem
endogenen Schilddrüsenhormonrezeptor
konkurriert, was unkontrolliertes Wachstum verursacht.
-
Die
größte Klasse
von Onkogenen umfasst die Signal-transduzierenden Proteine (z. B.
Src, Abi und Ras). Das Protein Src ist eine Protein-Tyrosinkinase
des Cytoplasmas und ihre Umwandlung von einem Protoonkogen führt in einigen
Fällen über Mutationen
an dem Tyrosinrest 527 zu einem Onkogen. Im Gegensatz dazu führt eine
Umwandlung des GTPase Proteins ras von einem Protoonkogen bei einem
Beispiel von einer Valin zu einer Glycin-Mutation an der Aminosäure 12 in
der Sequenz zu einem Onkogen, was die ras GTPase Aktivität verringert.
-
Die
Proteine Jun, Fos und Myc sind Proteine, die ihre Wirkungen direkt
auf Kernfunktionen als Transkriptionsfaktoren ausüben.
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ii. Inhibitoren der Zellvermehrung
-
Die
den Tumor unterdrückenden
Onkogene fungieren als Inhibitoren exzessiver Zellvermehrung. Die Inaktivierung
dieser Gene zerstört
ihre hemmende Aktivität,
was zu einer unkontrollierten Vermehrung führt. Die Tumorsuppressoren
p53, p16 und C-CAM sind nachstehend beschrieben.
-
Hohe
Spiegel von mutierendem p53 wurden in vielen Zellen gefunden, die
durch chemische Karzinogenese, ultraviolette Strahlung und verschiedene
Viren transformiert waren. Das p53-Gen ist ein häufiges Ziel der veränderlichen
Inaktivierung bei vielen verschiedenen menschlichen Tumoren und
wurde bereits als das am häufigsten
mutierte Gen bei herkömmlichen
menschlichen Krebsen dokumentiert. Es ist bei mehr als 50% menschlichem
NSCLCs (Rollstein et al., 1991) und bei einem breiten Spektrum anderer
Tumore mutiert.
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Das
p53-Gen kodiert ein 393-Aminosäurephosphoprotein,
das Komplexe mit Wirtsproteinen, wie beispielsweise Groß-T-Antigen
und E1B, bilden kann. Das Protein kommt in normalen Geweben und
Zellen vor, aber in Konzentrationen, die im Vergleich mit transformierten
Zellen oder Tumorgewebe winzig sind.
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Wildtyp
p53 wird als ein wichtiger Wachstumsfaktor bei vielen Zelltypen
angesehen. Missense-Mutationen sind bekannt für das p53-Gen und sind entscheidend
für die
Transformationsfähigkeit
des Onkogens. Eine einzige genetische Veränderung, die durch Punktmutationen
ausgelöst
wird, kann kanzerogenes p53 erzeugen. Im Gegensatz zu anderen Onkogenen
allerdings, sind p53 Punktmutationen dafür bekannt, dass sie an mindestens
30 bestimmten Codons auftreten, wobei oftmals dominante Allele erzeugt
werden, die Shifts im Zellphänotyp
ohne eine Verringerung der Hornozygosität erzeugen. Zusätzlich scheinen
viele dieser dominanten negativen Allele im Organismus toleriert
und in der Keimbahn weiter gegeben zu werden. Verschiedene mutante
Allele scheinen von minimal dysfunktionellen bis stark penetranten,
dominanten negativen Allelen (Weinberg, 1991) zu reichen.
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Ein
weiterer Inhibitor der Zellvermehrung ist p16. Die Haupttransitionen
des eukaryotischen Zellzyklus werden von Cyclin-abhängigen Kinasen
oder CDKs ausgelöst.
Eine CDK, Cyclin abhängige
Kinase 4 (CDK 4), reguliert die Progression durch das G1.
Die Aktivität
dieses Enzyms kann eine Phosphorylierung von Rb an spätem G1 sein. Die Aktivität von CDK4 wird durch eine
aktivierende Untereinheit, D-Typ Cyclin, und durch eine hemmende
Untereinheit geregelt. Das p16INK4 wurde
biochemisch als ein Protein gekennzeichnet, das spezifisch an CDK4
bindet und es hemmt, und somit die Rb Phosphorylierung regulieren
kann (Serrano et al., 1993; Serrano et al., 1995). Da das p16INK4 Protein ein CDK4-Inhibitoren ist (Serrano,
1993), kann eine Zerstörung dieses
Gens die Aktivität
von CDK4 erhöhen,
was zu einer Hyperphosphorylierung des Rb Proteins führt. P16 ist
ebenfalls dafür
bekannt, dass es die Funktion von CDK6 reguliert.
-
p16INK4 gehört
zu einer neu beschriebenen Klasse von CDK-hemmenden Proteinen, die
ebenfalls p16B, p19, p21WAF1 und
p27KIP1 umfassen. Das p16INK4-Gen
bildet auf 9p21 ab, einer Chromosomenregion, die bei vielen Tumorarten
häufig
zerstört
ist. Homozygote Zerstörungen
und Mutationen des p16INK4-Gens kommen bei
menschlichen Tumorzelllinien häufig
vor. Diese Anzeichen legen nahe, dass das p16INK4-Gen
ein Tumorsuppressor-Gen ist. Diese Interpretation wurde allerdings
durch die Beobachtung in Frage gestellt, dass die Häufigkeit
der Veränderungen
des p16INK4-Gens bei primären unkultivierten
Tumoren sehr viel geringer ist als bei kultivierten Zelllinien (Caldas
et al., 1994; Cheng et al., 1994; Hussussian et al., 1994; Kamb
et al., 1994; Kamb et al., 1994; Mori et al., 1994; Okamoto et al.,
1994; Nobori et al, 1995; Orlow et al., 1994; Arap et al., 1995).
Die Wiederherstellung der Wildtyp-16INK4_
Funktion durch Transfektion mit einem Plasmidexpressionsvektor verringerte
die Koloniebildung bei einigen menschlichen Krebszelllinien (Okamoto,
1994; Arap, 1995).
-
Weitere
Gene, die angewendet werden können,
umfassen Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, zac1, p73,
VHL, MMAC1/PTEN, DBCCR-1, FCC, rsk-3, p27, p27/p16-Fusionen, p21/p27-Fusionen, antithrombotische
Gene (z. B. COX-1, TFPI), PGS, Dp, E2F, ras, myc, neu, raf, erb,
fms, trk, ret, gsp, hst, abl, E1A, p300, an der Angiogenese beteiligte
Gene (z. B. VEGF, FGF, Thrombospondin, BAI-1, GDAIF oder ihre Rezeptoren)
und MCC.
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iii. Regulatoren des programmierten Zelltods
-
Apoptose
oder programmierter Zelltod ist ein grundlegender Prozess für die normale
embryonische Entwicklung, wobei Homöostase in erwachsenen Geweben
erhalten wird und Karzinogenese (Kerr et al., 1972) unterdrückt wird.
Es wurde gezeigt, dass die Bcl-2-Familie von Proteinen und ICE-ähnliche
Proteasen wichtige Regulatoren und Effektoren von Apoptose in anderen
Systemen sind. Das Bcl-2-Protein, das in Verbindung mit follikularen
Lymphomen entdeckt wurde, spielt eine bedeutende Rolle bei der Steuerung
der Apoptose und Verbesserung des Zellüberlebens in Antwort auf unterschiedliche
apoptotische Stimuli (Bakhshi et al., 1985; Cleary und Sklar, 1985;
Cleary et al., 1986; Tsujimoto et al., 1985; Tsujimoto und Croce,
1986). Das evolutionär
konservierte Bcl-2 Protein wird heutzutage als Mitglied einer Familie
verwandter Proteine anerkannt, die als Todesagonisten oder Todesantagonisten
klassifiziert werden können.
-
Im
Anschluss an seine Entdeckung wurde gezeigt, dass Bcl-2 wirkt, um
Zelltod, der von einer Vielzahl an Stimuli ausgelöst wurde,
zu unterdrücken.
Es ist heutzutage ebenfalls offensichtlich, dass eine Familie von Bcl-2
Zelltod-regulierenden Proteinen gibt, die strukturelle und sequentielle
Homologien gemeinsam haben. Diese verschiedenen Familienmitglieder
besitzen nachgewiesenermaßen
entweder ähnliche
Funktionen wie Bcl-2 (z. B. BclXL, BclW, BclS, Mcl-1, A1,
Bfl-1) oder sie wirken der Bcl-2 Funktion entgegen und fördern Zelltod (z.
B. Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad, Harakiri).
-
e. chirurgische Eingriffe
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In
etwa 60% der Personen mit Krebs unterziehen sich chirurgischen Eingriffen
irgendeiner Art, die präventive,
diagnostische oder in Stadien einteilende, kurative und palliative
Chirurgie umfassen. Kurative Chirurgie ist eine Krebsbehandlung,
die in Verbindung mit anderen Therapien, wie beispielsweise der
Behandlung der vorliegenden Erfindung, Chemotherapie, Strahlentherapie,
hormoneller Therapie, Gentherapie, Immuntherapie und/oder alternativen
Therapien angewendet werden kann.
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Kurative
Chirurgie umfasst eine Resektion, bei der das gesamte oder ein Teil
des karzinomatösen
Gewebes physikalisch entfernt, herausgeschnitten und/oder zerstört wird.
Tumorresektion bezieht sich auf physikalische Entfernung von mindestens
einem Teil eines Tumors. Zusätzlich
zu einer Tumorresektion umfasst eine Behandlung durch chirurgische
Eingriffe Laserchirurgie, Cryochirurgie, Elektrochirurgie und mikroskopisch
kontrollierte Chirurgie (Mohs' Chirurgie).
Es wird ferner davon ausgegangen, dass die vorliegende Erfindung
in Verbindung mit der Entfernung von Oberflächenkrebsen, Präkanzerosen
oder zufälligen
Mengen normalen Gewebes angewendet werden kann.
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Nach
einer Exzision eines Teils aller karzinomatösen Zellen, Gewebe oder Tumore
kann eine Höhle im
Körper
gebildet werden. Eine Behandlung kann mittels Perfusion, direkter
Injektion oder lokaler Applikation des Bereichs mit einer zusätzlichen
Anti-Krebs-Therapie durchgeführt
werden. Solch eine Behandlung kann zum Beispiel alle 1, 2, 3, 4,
5, 6 oder 7 Tage oder alle 1, 2, 3, 4 und 5 Wochen oder alle 1,
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Monate wiederholt werden.
Diese Behandlungen können
auch bei der Dosierung variieren.
-
f. weitere Mittel
-
Es
wird davon ausgegangen, dass weitere Mittel in Kombination mit der
vorliegenden Erfindung angewendet werden können, um die therapeutische
Wirksamkeit der Behandlung zu verbessern. Diese zusätzlichen
Mittel umfassen immunmodulatorische Mittel, Mittel, die die Aufregulation
von Zelloberflächenrezeptoren und
GAP Berührungsstellen
beeinflussen, zytostatische und Differenzierungsmittel, Inhibitoren
von Zelladhäsion,
Mittel, die die Empfindlichkeit der hyperproliferativen Zellen auf
apoptotische Auslöser
erhöhen
oder weitere biologische Mittel. Immunmodulatorische Mittel umfassen
Tumornekrosefaktor, Interferon alpha, beta und gamma; IL-2 und andere
Cytokine; F42K und andere Cytokin-Analoga; oder MIP-1, MIP-1 beta, MCP-1,
RANTES und andere Chemokine. Es wird ferner davon ausgegangen, dass
die Aufregulation von Zelloberflächenrezeptoren
oder ihren Liganden, wie beispielsweise Fas/Fas Ligand, DR4 oder
DR5/TRAIL (Apo-2 Ligand), die Apoptose auslösenden Fähigkeiten der vorliegenden
Erfindung durch Erzeugung einer autokrinen oder parakrinen Wirkung
auf hyperproliferative Zellen potenzieren würde. Erhöhtes interzellulares Signalisieren
durch Erhöhung
der Anzahl an GAP-Berührungsstellen,
würde die
anti-hyperproliferativen Wirkungen auf die benachbarte hyperproliferative
Zellpopulation erhöhen.
Bei weiteren Ausführungsformen
können
zytostatische oder Differenzierungsmittel in Kombination mit der
vorliegenden Erfindung angewendet werden, um die anti-hyperproliferative
Wirksamkeit der Behandlungen zu verbessern. Inhibitoren von Zelladhäsion werden
in Erwägung
gezogen, um die Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung zu verbessern.
Beispiele von Zelladhäsionshemmern
sind fokale Adhäsionskinase
(FAK)-Inhibitoren
und Lovastatin. Es wird ferner davon ausgegangen, dass weitere Mittel,
die die Empfindlichkeit einer hyperproliferativen Zelle auf Apoptose
erhöhen,
wie beispielsweise der Antikörper
c225, in Kombination mit der vorliegenden Erfindung angewendet werden
könnten,
um die Wirksamkeit der Behandlung zu verbessern.
-
Apo2
Ligand (Apo2L, auch TRAIL genannt) ist ein Mitglied der Cytokinfamilie
der Tumornekrosefaktoren (TNF). TRAIL aktiviert schnelle Apoptose
bei vielen Arten von Krebszellen, ist allerdings nicht toxisch gegenüber normalen
Zellen. TRAIL mRNA kommt in vielen verschiedenen Geweben vor. Die
meisten normalen Zellen scheinen gegenüber der zytotoxischen Wirkung
von TRAIL resistent zu sein, was die Existenz von Mechanismen nahe
legt, die vor einer Apoptose-Induktion durch TRAIL schützen können. Der
erste für
TRAIL beschriebene Rezeptor, Todesrezeptor 4 (DR4) genannt, enthält eine
cytoplasmatische „Todesdomäne"; DR4 überträgt das Apoptosesignal,
das von TRAIL getragen wird. Zusätzliche
Rezeptoren wurden identifiziert, die an TRAIL binden. Ein Rezeptor,
DR5 genannt, enthält
eine cytoplasmatische Todesdomäne
und signalisiert Apoptose praktisch genauso wie DR4. Die mRNAs von
DR4 und DR5 sind in vielen normalen Geweben und Tumorzelllinien
exprimiert. Kürzlich
wurden Köderrezeptoren,
wie beispielsweise DcR1 und DcR2, identifiziert, die verhindern,
dass TRAIL Apoptose mittels DR4 und DR5 induziert. Diese Köderrezeptoren
stellen somit einen neuartigen Mechanismus zur Regulierung der Empfindlichkeit
auf ein pro-apoptotisches Cytokin direkt an der Oberfläche der
Zelle dar. Die bevorzugte Expression dieser hemmenden Rezeptoren
in normalen Geweben legt nahe, dass TRAIL als ein Antikrebsmittel
nützlich
sein könnte,
das Apoptose in Krebszellen induziert, während es normale Zellen verschont.
(Marsters et al., 1999).
-
Es
gab nach der Einführung
cytotoxischer chemotherapeutischer Arzneimittel viele Fortschritte
bei der Therapie von Krebs. Eine der Folgen der Chemotherapie ist
allerdings die Entwicklung/Aneignung von Arzneimittel-resistenten
Phänotypen
und die Entwicklung einer mehrfachen Arzneimittelresistenz. Die
Entwicklung einer Arzneimittelresistenz bleibt ein Haupthindernis
bei der Behandlung solcher Tumore und daher besteht ein offensichtlicher
Bedarf an alternativen Ansätzen,
wie beispielsweise Gentherapie.
-
Studien
vieler Forscher zeigten, dass Tumorzellen, die auf TRAIL resistent
sind, mittels subtoxischer Konzentrationen von Arzneimitteln/Cytokinen
sensibilisiert werden können
und die sensibilisierten Tumorzellen werden maßgeblich von TRAIL getötet (Bonavida
et al., 1999; Bonavida et al., 2000; Gliniak et al., 1999; Keane
et al., 1999). Ad-mda7 Behandlung von Krebszellen führt zu der
Aufregulation von mRNA für
TRAIL und TRAIL-Rezeptoren. Daher kann eine Verabreichung der Kombination
aus Ad-mda7 mit rekombinantem TRAIL als eine Behandlung angewendet
werden, um eine verbesserte Anti-Tumor-Aktivität bereitzustellen. Außerdem führt die
Kombination von Chemotherapeutika, wie beispielsweise CPT-11 oder
Doxorubicin, mit TRAIL ebenfalls zu einer verbesserten Anti-Tumor-Aktivität und einer
Zunahme der Apoptose. Die Kombination von Ad-mda7 mit Chemotherapeutika
und Strahlentherapie, einschließlich
DNA-schädigenden
Mitteln, stellt ebenfalls verbesserte Anti-Tumor-Wirkungen bereit.
Einige dieser Wirkungen können über Aufregulation
von TRAIL oder verwandte Rezeptoren vermittelt werden, während dies
bei anderen nicht funktioniert. Es wurde beispielsweise eine verbesserte
Anti-Tumor-Aktivität
mit den Kombinationen von Ad-mda7 und Tamoxifen oder Doxorubicin
(Adriamycin) beobachtet. Weder Tamoxifen noch Adriamycin sind bekannt
dafür,
TRAIL oder verwandte Rezeptoren hoch zu regulieren.
-
Eine
weitere Form der Therapie, die in Verbindung mit Chemotherapie,
Strahlentherapie oder biologischer Therapie angewendet werden kann,
umfasst Hyperthermie, welches eine Verfahrensweise darstellt, bei der
das Gewebe eines Patienten hohen Temperaturen (bis zu 106°F) ausgesetzt
wird. Externe oder interne Wärmevorrichtungen
können
an der Applikation lokaler, regionaler oder Ganzkörperhyperthermie
beteiligt sein. Lokale Hyperthermie umfasst die Applikation von
Wärme auf
einen kleinen Bereich, wie beispielsweise einen Tumor. Wärme kann
extern mit Hochfrequenzwellen erzeugt werden, die von einer Vorrichtung
außerhalb
des Körpers
auf einen Tumor zielen. Interne Wärme kann eine sterile Sonde,
einschließlich
dünnen,
erwärmten
Drähten
oder hohlen Schläuchen,
die mit warmem Wasser gefüllt
sind, implantierte Mikrowellenantennen oder Hochfrequenzelektroden,
umfassen.
-
Ein
Organ oder eine Extremität
eines Patienten wird zur regionalen Therapie erwärmt, die unter Verwendung von
Vorrichtungen durchgeführt
wird, die hohe Energie erzeugen, wie beispielsweise Magneten. Alternativ
kann ein Teil des Blutes des Patienten entnommen werden und vor
einer Perfusion in einen Bereich, der intern erwärmt wird, erwärmt werden.
Ganzkörpererwärmung kann
ebenfalls in Fällen
umgesetzt werden, in denen der Krebs sich über den gesamten Körper ausgebreitet
hat. Warmwasserdecken, Heißwachs,
Induktionsspulen und Wärmekammern
können
zu diesem Zweck verwendet werden.
-
Hormonelle
Therapie kann ebenfalls in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung
oder in Kombination mit jeder anderen vorstehend beschriebenen Krebstherapie
angewendet werden. Die Anwendung von Hormonen kann bei der Behandlung
bestimmter Krebse wie beispielsweise Brust-, Prostata-, Eierstock-
oder Zervikalkrebs eingesetzt werden, um den Spiegel bestimmter
Hormone, wie beispielsweise Testosteron oder Östrogen, zu senken oder ihre
Wirkung zu blockieren. Diese Behandlung wird oftmals in Kombination
mit mindestens einer weiteren Krebstherapie als eine Behandlungsoption
angewendet, oder um das Risiko von Metastasen zu verringern. TABELLE 6: Onkogene
Gen | Quelle | Humanerkrankung | Funktion |
Wachstumsfaktoren1 |
HST/KS | Transfektion | | Mitglied
der FGF-Familie |
INT-2 | MMTV-Promotorinsertion | | Mitglied
der FGF-Familie |
INT-1/WNT-1 | MMTV-Promotorinsertion | | faktorartig |
SIS | Affensarkomvirus | | PDGF-B |
Rezeptortyrosinkinasen1,2 |
ERBB/HER | Vogel-Erythroblastose-Virus; ALV-Promotorinsertion;
Amplifizierte Humantumoren | Amplifiziertes,
deletiertes Plattenepithelkarzinom; Glioblastom | EGF/TGF-α/Amphiregulin/Hetacellulin-Rezeptor |
ERBE-2/NEU/HER-2 | transfiziert
aus Glioblastomen aus Ratte | Amplifizierte
Brust-, Ovarial-, Magenkarzinome | Reguliert
durch NDF/Hergulin und mit EGF verwandte Faktoren |
FMS | Susan
McDonough SM)-Katzensarkomvirus (FeSV) | | CSF-1-Rezeptor |
KIT | Hardy-Zuckerman (HZ)-FeSV | | MGF/Steel-Rezeptor,
Hämatopoese |
TRK | Transfektion
aus humanem Dickdarmkarazinom | | NGF(Nerve
Growth Faactor)-Rezeptor |
MET | Transfektion
aus humanem Osteosarkom | | Scatter-Factor/HGF-Rezeptor |
RET | Translokation und Punktmutationen | Sporadisches
Schilddrüsenkarzinom;
familiäres medulläres Schilddrüsenkarzinom;
Multipe endokrine Neoplasie 2A und 2B | Orphan-Rezeptortyrosinkinase |
ROS | URII-Vogelsarkomvirus (ASV) | | Orphan-Rezeptortyrosinkinase |
PDGF-Rezeptor | Translokation | chronische
myelomonozytäre
Leukämie | TEL(ETS-like
Transcription Factor)/PDGF-Rezeptor-Genfusion |
TGF-β-Rezeptor | | Dickdarmkarzinom
Basenfehlpaarungsmutationsziel | |
Nichtrezentor-Tyrosinkinasen1 |
ABL | Abelson-Maus-Leukämievirus | Chronische
myeloische Leukämie
Translokation mit BCR | Interagiert
mit RB, RNA-Polymerase CRK, CBL |
FPS/FES | Vogel-Fujinami-Sarkomvirus; Gardner-Arnstein (GA)-FeSV | | |
LCK | MLV(Maus-Leukämievirus)-Promotorinsertion | | Src-Familie;
T-Zell-Signaltransduktion;
interagiert mit CD4/CD8-T-Zellen |
SRC | Rous-Sarkomvirus | | Membranassoziierte
Tyrosinkinase mit Signaltransduktionsfunktion; aktiviert durch Rezeptortyrosinkinasen |
YES | Vogel-Y73-Virus | | Src-Familie;
Signaltransduktion |
SER-THR-PROTEININASEN1 |
AKT | AKT8-Maus-Retrovirus | | reguliert
durch PI(3)Kinase? reguliert 70-kd-S6-Kinase? |
MOS | Moloney-Maus-Sarkomvirus (MoMSV) | | GVBD;
zytostatischer Faktor; MAP-Kinasekinase |
PIM-1 | Promotorinsertion
Maus | | |
RAF/MIL | 3611
Maus-SV; MH2-ASV | | Signaltransduktion
im RAS-Signalweg |
DIVERSE-ZELLOBERFLÄCHE1 |
APC | Tumorsuppressor | Dickdarmkarzinom | interagiert
mit Cateninen |
DCC | Tumorsuppressor | Dickdarmkarzinom | CAM-Domänen |
E-Cadherin | Tumorsuppressorkadidat | Brustkrebs | extrazellulär: homotypische
Bindung, intrazelluär: interagiert
mit Cateninen
12 |
PTC/NBCCS | Tumorsuppressor
und Drosophila-Homolog | Basalzellnävussyndrom (Gorlin-Goltz-Syndrom) | Transmembrandomänen; Signaltransduktion
durch Gli-Homolog C1 antagonistisch zum Hedgehog-Signalweg |
TAN-1 Notch-Homolog | Translokation | T-ALL | Signalgebung |
DIVERSE-SIGNAL TRANSDUKTION1,3 |
BCL-2 | Translokation | B-Zell-Lymphome | Apoptose |
CBL | Maus-Cas-NS-1-Virus | | tyrosinphosphorylierter RING-Finger,
interagiert mit Abl adaptorgebundene |
CRK | CT1010-ASV | | SH2/SH3
interagiert mit Abl |
DPC4 | Tumorsuppressor | Pankreaskarzinom | TGF-β-abhängiger |
MAS | Transfektion
und Tumorigenizität | | Signalweg
Möglicher |
NCK | | | Angiotensinrezeptor SH2/SH3-Adaptor |
GUANINNUKLEOTIDAUSTAUSCH-
UND BINDEPROTEINE,4 |
BCR | | Transloziert
mit ABL in CML | Austauscher;
Proteinkinase |
DBL | Transfektion | | Austauscher |
GSP | | | |
NF-1 | Erblicher
Tumorsuppressor | Tumorsuppressor
Neurofibromatose | RAS-GAP |
OST | Transfektion | | Austauscher |
Harvey-Kirsten, N-RAS | Ha-Ratten-SV;
Ki-Ratten-SV, Balb MoMSV; Transfektion | Punktmutationen
in vielen humanen Tumoren | Signalkaskade |
VAV | Transfektion | | S112/S113;
Austauscher |
NUKLEÄRE PROTEINE
UND TRANSKIPTIONSFAKTOREN1,5–9 |
BRCA1 | Erblicher
Tumorsuppressor | Mammakarzinom/Ovarialkarzinom | Lokalisation
ungeklärt |
BRCA2 | Erblicher
Tumorsuppressor | Mammakarzinom | Funktion
unbekannt |
ERBA | Vogel-Erythoblastose-Virus | | Thyroidhormonrezeptor (Transkription) |
ETS | Vogel-E26-Virus | | DNA-Bindung |
EVII | MLV-Promotorinsertion | AML | Transkriptionsfaktor |
FOS | FBI/FBR-Maus-Osteosarkomviren | | AP1-Transkriptionsfaktor mit
c-Jun Zinkfinger; Cubitus-Interruptus-Homolog |
GLI | Amplifiziertes
Gliom | Gliom | Bestandteil
des Hedgehog-Signalweg; inhibitorische Verknüpfung PTC und Hedgehog |
HMG1/LIM | Translokation t(3:12) t(12:15) | Lipom | Genfusion
High Mobility Group HMG1-C(XT-hook) und
Transkriptionsfaktor LIM oder saurer Domäne |
JUN | ASV-17 | | Transkriptionsfaktor
AP-1 mit FOS |
MLL/VHRX + ELI/MEN | Translokation/Fusion
ELL mit MLL Trithorax-like-Gen | akute myeloische Leukämie | Genfusion
von DNA-Bindeprotein
und Methyltransferase MLL mit ELI RNA-Pol-II-Elongationsfaktor |
MYB | Vogel-Myeloblastosevirus | | DNA-Bindung |
MYC | Vogel-MC29;
Translokation B-Zell-Lymphome;
Promotorinsertion Vogel-Leukosevirus | Burkitt-Lymphom | DNA-Bindung
mit AMX-Partner; Cyclin-Regulation;
interagiert mit RB? reguliert Apoptose? |
N-MYC | Amplifiziert | Neuroblastom | |
L-MYC | | Lungenkrebs | |
REL | Vogel-Reticuloendotheliosevirus | | Transkriptionsfaktor
der NF-κB-Familie |
SKI | Vogel-SKV770-Retrovirus | | Transkriptionsfaktor |
VHL | Erblicher
Tumorsuppressor | Hippel-Lindau-Syndrom | Negativer
Regulator oder Elongin; transkriptioneller Elongationskomplex |
WT-1 | | Wilms-Tumor | Transkriptionsfaktor |
ZELLZYKLUS/ANTWORT
AUF DNA-SCHÄDEN10-21 |
ATM | Erbkrankheit | Ataxia
teleangiectatica | Protein/Lipidkinase-Homologie; Antwort
auf DNA-Schäden
stromaufwärts
im P53-Signalweg |
BCL-2 | Translokation | Follikuläres Lymphom | Apoptose |
FACC | Punktmutation | Fanconi-Anämie Gruppe
C (Prädisposition
Leukämie) | |
ZELLZYKLUS/ANTWORT
AUF DNA-SCHÄDEN10–21 |
FHIT | Fragile
Site 3p14.2 | Lungenkarzinom | Histidintriadeverwandtes Diadenosin
5',3'-P1p4-Tetraphospat asymmetrische Hydrolase |
hML1/MutL | | HNPCC | Basenfehlpaarungsreparatur;
MutL-Homolog |
hMSH2/MutS | | HNPCC | Basenfehlpaarungsreparatur;
MutS-Homolog |
hPMS1 | | HNPCC | Basenfehlpaarungsreparatur;
MutL-Homolog |
hPMS2 | | HNPCC | Basenfehlpaarungsreparatur;
MutL-Homolog |
INK4/MTS1 | angrenzend
an INK-4B auf 9p21; CDK-Komplexe | MTS1-Tumorsuppressorkandidat
und MLM-Melanoma-Gen | p16-CDK-Inhibitor |
INK4/MTS2 | | Tumorsuppressorkandidat | p15-CDK-Inhibitor |
MDM-2 | Amplifiziert | Sarkom | Negativer
Regulator von p53 |
p53 | Assoziation mit SV40-T-Antigen | Mutiert
in > 50% der humanen
Tumoren, einschließlich
erbliches Li-Fraumeni-Syndrom | Transkriptionsfaktor; Checkpoint-Kontrolle;
Apoptose |
PRAD1/BCL1 | Translokation
mit Parathyroidhormon oder IgG | Parathyroid-Adenoma; B-CLL | Cyclin
D |
RB | Erbliches
Retinoblastom; Assoziation mit vielen DNA-Virus-Tumorantigenen | Retinoblastom;
Osteosarkom; Brustkrebs; andere sporadische Karzinome | Interagiert
mit Cyclin/Cdk; reguliert E2F-Transkriptionsfaktor |
XPA | | Xeroderma
Pigmentosum; Hautkrebs-Prädisposition | Exzisionsreparatur;
Photoprodukterkennung; Zinkfinger |
-
B. BEISPIELE
-
Die
folgenden Beispiele sind beigefügt,
um bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung zu zeigen. Fachleute sollten bemerken, dass die in
den Beispielen offenbarten Techniken, die repräsentativen Techniken folgen,
von denen die Erfinder festgestellt haben, dass sie bei der Anwendung
der Erfindung gut funktionieren, somit als bevorzugte Verfahrensweisen
für deren
Anwendung betrachtet werden können.
Jedoch sollten die Fachleute angesichts der vorliegenden Offenbarung
wissen, dass viele Änderungen
in den spezifischen Ausführungsformen,
die offenbart werden, vorgenommen werden können, wobei immer noch ein
gleiches oder ähnliches
Ergebnis erhalten werden kann ohne vom Geist und Umfang der Erfindung
abzuweichen.
-
BEISPIEL 1: VERKÜRZTES MDA-7
-
1. Material und Methoden
-
a. Tiere
-
3–6 Wochen
alte weibliche/männliche
BALB/c-Nacktmäuse
wurden von Harlan Inc. (Indianapolis, Indiana) bezogen.
-
b. Virus
-
Kontroll-Adenovirus
(Ad-c) wurde hergestellt durch Deletion von E1 und teilweise der
E3-Regionen von
Adenovirus, Serotyp 5. Ein Adenovirus, das humanes extrazelluläres MDA-7
codiert (Ad-mda7EC), wird von Introgen Therapeutics
Inc. Houston, Texas konstruiert. Extrazelluläres MDA-7 bezeichnet den sekretierten
Teil des MDA-7-Proteins.
-
c. Vorbereitung der Zellen und Infektion
mit Adenovirus
-
Soweit
möglich
werden Zelllinien aus der American Type Culture Collection (ATTC,
Rockville, Maryland) bezogen. Die Zellen werden nach Empfehlung
der ATTC in DMEM-Medium
(GIBCO/BRL, Life Technologies, Grand Island, New York) mit 100 IU/ml
Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 10% fötalem Rinderserum, HyClone,
Logan, Utah) kultiviert. Die Zellen werden getestet, es wird bestätigt, dass
sie frei von Mycoplasmen sind, und sie werden in der logarithmischen
Wachstumsphase verwendet. Zellen werden routinemäßig mit 0,125% Trypsin/1,3
mM EDTA (GIBCO) geerntet.
-
d. In vitro Transfektion
-
Zellen
werden in einer Dichte von ca. 5 × 105 Zellen
pro 60 mm2 in RPMI/10% FBS-Medium ausplattiert und
in 5% CO2 bei 37°C kultiviert. Die Ausplattierungsdichte
variiert geringfügig,
abhängig
von der Zellwachstumsgeschwindigkeit usw., und wird empirisch bestimmt.
-
e. Herstellung von rekombinantem Adenovirus
-
Replikationsdefizientes
humanes Adenovirus Typ 5 (Ad5), das die Nukleinsäure trägt, die extrazelluläres humanes
MDA-7 (oder Luciferase-Gen), verknüpft mit einem internen CMV-IE-Promotor und gefolgt
von dem SV40-Polyadenylierungs (pA)-Signal codiert, wird konstruiert.
Das Adenoviruskonstrukt, das extrazelluläres humanes MDA-7 codiert,
wird als Ad-mda7TF, Ad-mda7EC oder
Ad-mda7TR bezeichnet. Diese Bezeichnungen
werden austauschbar verwendet, zur Bezeichnung eines Adenoviruskonstrukts,
das einen Teil der vollständigen
Mda-7-Gensequenz codiert. Ad-mda7TF enthält eine
Nukleinsäuresequenz,
die ein verkürztes
Transkript codiert, das ein verkürztes
humanes MDA-7 codiert. Ein Adenovirus (Ad5)-Konstrukt, das die vollständige Mda-7-Gensequenz
codiert, wurde wie unten beschrieben hergestellt und für einige
dieser Experimente verwendet.
-
Die
Ad5-Vektoren, welche die Genkassetten beherbergen, werden mit dem
Plasmid pJM17 (Graham und Prevec 1992) in 293-Zellen kotransfiziert,
um rekombinante Viren Ad-mda7TF wieder herzustellen.
Plaques werden gepickt, Virenstammkulturen angezogen, und die Korrektheit
ihrer Genome durch PCR/Restriktionsanalyse und Sequenzierung bestätigt. Viren
werden in 293-Zellen fortgepflanzt und durch Chromatographie gereinigt.
Kontrollvektoren, einschließlich
Ad-luc (welches das Firefly-Luciferase-Gen codiert), Ad-beta-gal
(welches das bakterielle beta-Gal-Gen codiert), Ad-GFP (welches
das Grün
Fluoreszierende Protein codiert) und Ad-CMVpA (welches die Expressionskassette,
aber kein Transgen enthält),
wurden konstruiert und gereinigt.
-
f. Transduktion und Zellproliferationsanalyse
-
Die
bei dieser Analyse verwendeten Krebs- oder normalen Zelllinien werden
mit Ad-mda7TR (mit entweder Ad-CMVpA oder
Ad-luc als Kontrolle) in zunehmenden MOIs (Multiplicities of Infection)
bzw. Virenpartikeln(Vp)/Zelle (0, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000,
10000 Vp/Zelle, zunehmende Konzentrationen) infiziert. Zellen werden
zu 500–2000
Zellen/Vertiefung im 96-Well-Format ausplattiert für 3H-Thymidineinbau-Zellproliferations-Assays, oder zu 105–106 Zellen/Vertiefung in einer 6-Well-Platte
ausplattiert für Proteinexpressions- oder
Apoptose-Assays, oder zu 104/Zellen/Vertiefung
ausplattiert für
den Alamarblau-Assay.
-
Zur
Infektion werden Ad-mda7TR oder Ad-luc (oder
Ad-CMVpA) in zunehmenden MOIs (basierend auf Virenpartikeln/Zelle;
MOI im Bereich von 0–10
000 Virenpartikeln/Zelle) verwendet. Für 3H-Thymidin-,
Apoptose-, Proteinexpressions- und Alamarblau-Assays werden die
Zellen 3 und 5 Tage nach der Infektion analysiert.
-
g. 3H-Thymidineinbau-Assay
-
Die
Wachstumsinhibition von Zellen nach der Behandlung wird durch Analyse
der DNA-Synthese
gemessen. Kurz, für
den 3H-Thymidineinbau-Assay werden Zellen
zu 200–5000
Zellen pro Vertiefung im 96-Well-Format ausplattiert und in DMEM/10%
FBS in einem 5% CO2-Inkubator bei 37°C über Nacht
kultiviert. Am nächsten
Tag wird das Medium abgesaugt und ersetzt durch 50 μl DMEM/10%
FBS, enthaltend das entsprechende Adenovirus in der entsprechenden
MOI. Die Zellen werden für
1 bis 4 Stunden mit Infektionsmedium inkubiert und dann auf 200 μl Gesamtvolumen
verdünnt
und über
Nacht kultiviert. Das Medium wird ersetzt durch DMEM/10% FBS/mCi 3H-Thymidin und für 18 bis 18 Stunden kultiviert.
Die Stammlösungen
von 100 μCi/ml 3H-Thymidin (Amersham) wird hergestellt durch
Verdünnung
in High-Glucose-DMEM (GIBCO). In jede Vertiefung wird 3H-Thymidin
in einer Endkonzentration von 1 μCi/ml
gegeben. Die Reaktion wird nach 15 Stunden durch Entfernung des Überstands
von den Rezipientenzellen abgestoppt. Die Zellen werden durch Zugabe
von 100 × Trypsin/EDTA
(GIBCO) in jede Vertiefung für
15 Minuten bei 37°C
geerntet. Zellen werden auf einem Filter im 96-Well-Format unter
Verwendung eines Packard Filtermate Zellernters unter Befolgung des
Herstellerprotokolls gesammelt und in entionisiertem Wasser und
Methanol gewaschen. Die Filter werden getrocknet und in einem Matrix
9600 (Packard) analysiert, und die Zellproliferation wird unter
Angabe von Virenpartikeln/Zelle gegen die Zählwerte für die Aufnahme von tritiummarkiertem
Thymidin aufgetragen.
-
h. Alamarblau-Assay
-
Die
Wachstumsinhibition der Zellen wird auch durch den Alamarblau-Assay
gemessen. Kurz, Zellen werden bei einer Dichte von 104 Zellen/Vertiefung
im 96-Well-Platten-Format ausplattiert. Vier Tage nach der Infektion
mit verschiedenen MOIs von Ad-mda7TR oder
Kontrollvektoren (wie zuvor beschrieben), werden 20 μl Alamarblau-Farbstoff
zu jeder Vertiefung gegeben, und die Platte wird bei 37°C für 6–8 Stunden
inkubiert. Die Platten werden dann zur Bestimmung der optischen
Dichte auf dem Dynatech MRX-Plattenlesegerät bei einer Wellenlänge von
595 nm gelesen. Das Revelation 3.2 Softwareprogramm wird verwendet
zum Auftragen der MOIs gegen die Werte für die optische Dichte bei 595
nm.
-
i. TUNEL-Assay
-
Krebszellen
werden in Lab-Tek-Kammerobjektträgern
(Nunc) in einer Dichte von 104 Zellen/Kammer ausgesät. Die Zellen
werden mit der gewünschten
Konzentration von Ad-Vektoren
transduziert. An verschiedenen Tagen nach der Infektion werden die
Zellen unter Verwendung des chromogenen TUNEL-Peroxidase-Assays
("In Situ Death
Detection Kit, POD",
Boehringer Mannheim) nach der Anleitung des Herstellers bezüglich Apoptose
analysiert.
-
j. Annexin-V-Assay
-
Krebszellen
werden nach Ad-mda7TR-Behandlung auch durch
das "ApoAlert" Annexin-V-FITC-Kit (CLONTECH)
bezüglich
Apoptose analysiert. Nach Induktion von Apoptose in Zellen wird
Phosphatidylserin (PS), das vorwiegend in der inneren Schicht der
Plasmamembran lokalisiert ist, über
einen Flippase-Mechanismus schnell in die äußere Schicht gebracht. In der
Gegenwart von Ca2+ bindet Annexin-V PS mit
hoher Affinität,
und mit Hilfe von mit Annexin konjugiertem FITC lassen sich apoptotische
Zellen genau erkennen, sowohl mittels Fluoreszenzmikroskopie als
auch mittels FACS-Analyse.
-
k. DNA-Färbung mit Propidiumiodid (PI)
-
Zur
Bestimmung von Zellen in verschiedenen Stadien des Zellzyklus, wird
aus Ad-mda7TR-infizierten Krebszellen eine Einzelzellsuspension
von 1–2 × 106 Zellen/ml PBS hergestellt. Nach der Fixierung
der Zellen mit kaltem 70%igen Ethanol für 2 Stunden werden die Zellen zentrifugiert
und das Fixiermittel abdekantiert, 2 × mit PBS gewaschen und anschließend mit
Propidiumiodid-Arbeitslösung
gefärbt,
die PI zu 50 μg/ml
und RNase zu 20 μg/ml
in PBS enthält.
Die behandelten Zellen werden dann durch FACS analysiert.
-
1. Tumorxenograft-Modelle
-
Tumorzellen
werden in einer Dichte von ca. 20–40% Konfluenz in 150-mm2-Schalen in RPMI/10%-FBS-Medium, ergänzt mit
Penicillin, Streptomycin und Fungizon, ausplattiert und in 5% CO2 bei 37°C bis
zu ca. 80%iger Konfluenz kultiviert. Die Zellen werden 2-mal in
PBS gewaschen, trypsinisiert und gezählt. Die Zellen werden auf
eine Konzentration von 5 × 106 Zellen/100 μl PBS verdünnt. BALB/c-Nacktmäuse werden
subkutan mit 5 × 106 Tumorzellen in 100 μl PBS injiziert.
-
2. Adenovirus, welches das verkürzte humane
MDA-7-Protein codiert (Ad-mda7TF), produziert
ein sekretiertes Protein
-
Grobe
Zellfraktionierungsstudien werden durchgeführt, um zu zeigen, dass MDA-7TF aus Zellen, die mit Ad-mda7TF transduziert
sind, sekretiert wird. MDA-7TF bezeichnet
speziell eine verkürzte
Form des MDA-7-Proteins; sie umfasst die sekretierte Form von MDA-7.
Zellen werden wie beschrieben ausplattiert und in DMEM/10% FBS in
einem 5%-CO2-Inkubator bei 37°C über Nacht kultiviert. Am nächsten Tag
wird das Medium durch Absaugen entfernt und durch frisches Medium,
das Ad-mda7TF oder Ad-Kontrolle enthält, ersetzt. Das
Medium wird nach 3 h Inkubation mit Adenovirus abgesaugt und durch
frisches Medium ersetzt. Die Zellen werden in den 5%-CO2-Inkubator
zurückgestellt
und über
Nacht bei 37°C
kultiviert. Zellen werden am nächsten Tag
geerntet und das Medium wird durch Zentrifugation geerntet. Westernblot-Analyse
zur Detektion des MDA-7-Proteins wird mit Zellextrakten und Gesamtmedium
durchgeführt.
Dieses Protokoll wurde mit Ad-mda7 verwendet, und auf dem Westernblot
wurden unter Verwendung von anti-MDA-7-Antikörper zwei immunreaktive Banden
detektiert. Die Banden wurden auf 23 kDa und 18 kDa geschätzt, was
der unprozessierten und der prozessierten Form von MDA-7 entspricht
(MDA-7 in voller
Länge und
die intrazellulär
gespaltene Form von MDA-7).
-
3. MDA-7 wird mittels Konfokalmikroskopie
in Vesikeln und auf der Zelloberfläche lokalisiert
-
Die
Expression von MDA7 wurde auch durch FACS und Konfokalmikroskopie
analysiert. Kurz, Krebszellen (H460, DLD-1, H1299) wurden mit Ad-mda7
transduziert, mit MOIs von 1000 und 5000 Vp/Zelle. 24 Stunden später wurden
die Zellen mit PBS gewaschen und für 1 Stunde bei 4°C mit polyklonalem
Anti-MDA-7-Kaninchenantikörper
(1:5000 Verdünnung
von 1 mg/ml affinitätsgereinigtem
Antikörper
bezogen von Corixa Inc.) markiert. Nach der ersten Behandlung folgten
aufeinanderfolgende PBS-Waschgänge
und die Behandlung mit Sekundärantikörper, Anti-Kaninchen-IgG-FITC
(1:1000 Verdünnung,
Santa Cruz Biotechnology), der mit den Zellen für 1 Stunde auf Eis inkubiert
wurde. Die Zellen wurden gewaschen und mit 4% HCHO-PBS fixiert und
mittels FACS und Konfokalmikroskopie analysiert.
-
4. Erhöhte
Expression von MDA-7TR in vitro induziert
krebszellspezifischen Wachstumsarrest und Apoptose
-
Die
Expression von MDA-7TR hemmt das Wachstum
und induziert Apoptose in Krebszelllinien aber nicht in normalen
Zelllinien. Ad-mda7TR wird wie zuvor beschrieben
transduziert. Wachstumsinhibition wird durch 3H-Thymidineinbau-
und Alamarblau-Assays bewertet. Mit MDA-7TF behandelte
Krebszellen zeigen verglichen mit normalen Zellen, die mit Ad-mda7TF und Vektorkontrollen transduziert wurden,
eine Verringerung in der Rate des 3H-Thymidineinbaus.
Alamarblau-Assays zeigen eine verringerte optische Dichte in MDA7TF-exprimierenden normalen Zellen und transduzierten
Kontrollen verglichen mit MDA7TF-exprimierenden
Krebszellen. Diese Assays sind ein Zeichen dafür, dass MDA7TF-Expression spezifisch
in Krebszellen einen Wachstumsarrest induziert.
-
Zusätzlich wird
das Ausmaß an
Apoptose, unter Verwendung des TUNEL-Assays, anhand der Oberflächenexpression
von Annexin-V und mittels Zellzyklusanalyse unter Verwendung der
Propidiumiodid-Färbung
bestimmt. Der TUNEL-Assay bestimmt die zelluläre Nukleaseaktivität. Aktivierte
Nukleaseaktivität,
ein Zeichen für
Zellen, die Apoptose unterlaufen, erzeugt – im Vergleich mit der Hintergrundfärbung, die
mit nichtapoptotischen Zellen assoziiert – ist eine intensive Farbreaktion.
Krebszelllinien, die MDA-7TF exprimieren,
zeigen im Vergleich zu MDA-7TF-exprimierenden
normalen Zelllinien und mit Kontrollvektor transduzierten Zellen einen
signifikanten Anstieg in der Anzahl TUNEL-positiver Zellen. Ein
weiteres Maß für apoptotische
Aktivität ist
die Oberflächenexpression
von Annexin-V, detektiert durch Oberflächenfärbung unter Verwendung eines Annexin-V-Antikörpers1. Krebszelllinien, die MDA-7TF exprimieren,
zeigen verglichen mit MDA-7TF-exprimierenden
normalen Zelllinien und mit Kontrollvektor transduzierten Zellen
einen signifikanten Anstieg in der Anzahl der Annexin-V-positiven
Zellen, was verglichen mit normalen Zellen und kontrollbehandelten
Krebszellen eine erhöhte
Apoptoserate in den behandelten Krebszelllinien anzeigt.
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5. Intratumorale Verabreichung von Ad-mda7TF in subkutane H1299-Tumoren hemmt das Tumorwachstum
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Zur
intratumoralen Abgabe von Ad-mda7TF werden
3–4 Wochen
alte weibliche BALB/c-Nacktmäuse subkutan
mit 5 × 106 H1299-Zellen pro Tier injiziert. Tiere
werden 5 Tage nach der H1299-Injektion durch intratumorale Injektion
von 100 μl
Ad-mda7TF behandelt. Die Tumoren werden
jeden zweiten Tag gemessen. Behandlungs-Gruppen sind 1) keine Behandlung,
2) intratumorale Injektion von Ad-mda7TF jeden
Tag über
6 Tage 3) intratumorale Injektion von Ad-Kontrolle jeden Tag über 6 Tage.
Die Tumorgröße wird über 16 Tage
jeden zweiten Tag gemessen. Ad-mda7TF-DNA
zeigt verglichen mit den nicht und den mit DNA allein behandelten Tumoren
eine signifikante Hemmung des Tumorwachstums.
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BEISPIEL 2: MATERIAL UND METHODEN
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1. Zelllinien und Zellkultur
-
Alle
verwendeten Tumorzelllinien wurden aus der American Type Culture
Collection (ATCC, Rockville, Maryland) bezogen. Die bewerteten Zelllinien
waren: Brust-(MCF-7, T47D, SKBr3, HBL-100, BT-20, MDA-MB-231, MDA-MB-468,
MDA-MB-361), kolorektale (DLD-1, SW-620, SW-480, HT-29, HCT-116, LS174T),
Lungen-(H1299, H460, A549, H322, H358) und Osteosarkom-(SaosLM2)Krebszelllinien.
Normale Zelllinien wurden bezogen von Clonetics (San Diego) und
umfassten HUVEC (humane Nabelschnurendothelzellen), normale Melanozyten,
und HMEC (humane Brustepithelzellen). MJ90 Primärfibroblasten (bezogen vom
Baylor College of Medicine) wurden ebenfalls verwendet. Die Zellen
wurden in DMEM-Medium (GIBCO/BRL Life Technologies, Grand Island,
New York) und fötalem
Rinderserum (zu 5%–10%
Endkonzentration, nach Empfehlung des Händlers) kultiviert. Die Zellen
waren frei von Mycoplasmen und wurden in der logarithmischen Wachstumsphase
verwendet. Zellen wurden mit 0,125% Trypsin – 1,3 mM EDTA (GIBCO) geerntet.
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2. Herstellung rekombinanter
Adenoviren
-
Die
Konstruktion von Ad-mda7 wurde unter Verwendung eines Konstrukts,
bezogen von Dr. Paul Fisher (Columbia University, New York), begonnen,
in dem die Mda-7-cDNA in einen TA-Klonierungsvektor (Invitrogen
Inc., San Diego, Kalifornien) inseriert ist. Die Mda-7-cDNA, isoliert als
ein HindIII-NotI-Fragment, wurde unter Verwendung der HindIII-NotI-Restriktionsstellen
in einen Shuttle-Vektor (pIN147, bezogen von dem Labor von J.A.
Roth, M.D., Anderson Cancer Center, Houston, Texas) kloniert. pIN147
ist ein Shuttle-Plasmid, das auf einem pBR322-Rückgrat basiert und die CMV-Promotor-
und SV40-polyA-Elemente enthält,
die ersatzweise in die E1-Region von Ad5 eingesetzt sind. pIN147
enthält
Basen Nr. 1–456
von dem linken Ende von Ad5, die CMV-Expressionskassette und anschließend Ad5-Basen Nr. 3333-5789.
Das pIN147-mda-7-cDNA-Expressionskonstrukt wurde pIN207 genannt.
Ad-mda7 wurde durch Kotransfektion von 293-Zellen mit pIN207 und
pIN153 konstruiert, unter Verwendung des Calciumphosphat-Kits und
-protokolls, bereitgestellt durch GibcoBRL (Nr. 123, S. 44–46). pIN153
ist identisch mit JM17, bezogen von dem Labor von Graham, 1988 (A
simple technique for the rescue of early region 1 mutations into
infectious human adenovirus type 5, McGrory et al., 1988) und enthält den größten Teil
des Ad5-Genoms;
ihm fehlt aber das linke Ende. Nach Beobachten eines zytopathischen
Effekts (CPE) wurden mit dem resultierenden Zelllysat, das den Vektor, Ad-mda7,
enthielt, zwei aufeinanderfolgende Runden von Plaque-Reinigung unter
Verwendung des folgenden Protokolls durchgeführt. Kurz, mit dem vektorenthaltenden
Lysat wurde in Fünffach-Schritten eine Verdünnungsreihe
in Medium (DMEM) angesetzt, und 400 μl von jeder Verdünnung wurden
zur Infektion einer konfluenten Schicht von 293-Zellen, ausplattiert
in 6-Well-Platten,
verwendet. Die Vertiefungen wurden mit 1% Agar in Medium überschichtet und
die resultierenden Plaques wurden eine Woche später gepickt. Jede von vier
Plaques wurde in 500 μl
Medium resuspendiert, auf dem Vortex verwirbelt und zentrifugiert,
und der Überstand
zur Infektion einer Vertiefung von konfluenten 293-Zellen, ausplattiert
in 6-Well-Platten,
verwendet. Wenn die Zellen aufgrund der Ad-Vektorreplikation lysiert
waren, wurde DNA aus jeder vermehrten Primärplaque gereinigt, unter Verwendung
des QIAmp-DNA-Reinigungs-Kits
und -protokolls, bereitgestellt durch Qiagen, Inc. Die DNA wurde
mittels PCR-Analyse untersucht, und eine Plaque wurde zur Sekundär-Plaque-Reinigung
gepickt, die wie vorstehend beschrieben durchgeführt wurde. Plaques wurden isoliert
und zur Infektion von 293-Zellen (wie vorstehend) in einer Vertiefung
einer 6-Well-Platte verwendet; dieses Lysat wurde dann zur Infektion
konfluenter 293-Zellen, ausplattiert in einer T-75-Flasche, verwendet.
-
Schließlich wurden
ca. 50 × 108 Zellen mit dem resultierenden Zelllysat
infiziert. Lysat von dieser Probe wurde dann zur großtechnischen
Amplifikation und Reinigung an die Herstellung übergeben. Ad-mda7 (Charge Nr.
B2119901) und Ad-luc (Charge Nr. 00697004) wurden in den nachstehenden
präklinischen
Studien verwendet. Frühe
Forschungsstudien verwendeten Ad-mda7-Vektor, bezogen von Dr. Paul
Fisher, Columbia University. Der Fisher-Vektor verwendet einen ähnlichen
Ad-Vektor der ersten Generation mit E1- und E3-Deletionen. Dieses Material wurde bei
Introgen Therapeutics Inc. gereinigt und amplifiziert, und es wurde
gezeigt, dass es bioäquivalent
zu dem Introgen Ad-mda7 ist, der in allen nachfolgenden Experimenten
verwendet wurde.
-
Ad-luc
und Ad-CMVpA (Luciferase- bzw. leerer Vektor) wurden als Kontrollviren
verwendet (1). Zur Herstellung von Ad-Vektoren
wurden Ad5-Vektoren, welche die Genkassetten beherbergen, zur Wiederherstellung
rekombinanter Ad-mda7, Ad-luc und Ad-CMVpA-Viren mit Plasmid pKM17
(Graham und Prevec, 1992) in 293-Zellen kotransfiziert. Plaques
wurden gepickt, Virusstammkulturen angezogen, und die Korrektheit
ihrer Genome wurde mittels PCR/Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung
bestätigt.
Viren wurden in 293-Zellen fortgepflanzt und durch HPLC gereinigt.
-
3. Polyklonale MDA-7-Antikörper und
Westernblot-Analyse
-
Rekombinantes
MDA-7-Protein wurde in E. coli hergestellt und wurde auf einer Nickel- NTA-Agarosesäule gereinigt.
Das Material wurde in einem Batch-Verfahren für 45 Minuten an das Nickelharz
gebunden und dann in eine Säule
gegossen, und das Eluat wurde durch das Säulenbett laufen gelassen. Das
Material wurde mit 10 mM Tris, pH 8,0, enthaltend 0,5% Chaps, gewaschen
und schließlich
mit 10 mM Tris pH 8,0 und 400 mM Imidazol von der Säule eluiert.
Das eluierte MDA-7 wurde gegen 10 mM Tris, pH 8,0 dialysiert. Es
wurde gezeigt, dass das Endprodukt eine einzige Bande mit einem
Molekulargewicht von ca. 23 kDa war. Es wurde gezeigt, dass die
Proteinsequenz des Aminoterminus korrekt war, und die Reinheit wurde
auf über
90% geschätzt.
-
Dieses
Material wurde unter Verwendung des folgenden Protokolls in Kaninchen
injiziert: 400 μg MDA-7-Protein
mit IFA und 100 μg
MDP wurden subkutan injiziert, 3 Wochen später wurden 200 μg MDA-7-Protein
mit IFA injiziert, und 3 Wochen danach wurden weitere 100 μg MDA-7-Protein
intravenös
injiziert. Es wurde gezeigt, dass der Titer des Antiserums, basierend
auf einem ELISA-Assay, mehr als 1/100 000 betrug.
-
Das
MDA-7-Protein wurde über
Sulfhydrylverknüpfung
an ein festes Trägerharz
gekoppelt. Das Harz und das gebundene Protein wurden gründlich gewaschen.
Das gewaschene Material wurde zur Herstellung einer MDA-7-Säule zur
Antikörperaufreinigung
verwendet. Die polyklonalen Kaninchenseren wurden 1:1 mit 20 mM
Trispuffer, pH 8,0 verdünnt
und durch einen 0,2-Mikrometerfilter filtriert, bevor sie auf die
MDA-7-Säule gepumpt
wurden. Die Säule
wurde dann mit dem gleichen 20 mM Trispuffer, pH 8,0 gewaschen bis
die Absorption auf Basisniveau zurückgegangen war. Der Antikörper wurde
mit 0,1 M Essigsäure
von der Säule
eluiert. Das Eluat, das den Antikörper enthielt, wurde sofort
wieder auf pH 8,0 eingestellt. Der affinitätsgereinigte Antikörper wurde
dann gegen 10 mM Tris, pH 8,0 dialysiert und konzentriert.
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Rekombinantes
MDA-7-Protein wurde in E. coli exprimiert und unter Verwendung einer
Nickel-NTA-Agarosesäule
gereinigt. Das rekombinante MDA-7-Protein wurde zur Erzeugung polyklonaler
Kaninchenantikörper
verwendet, die durch Affinitätschromatographie
gereinigt wurden. Dieser Antikörper
wurde in Westernblot-Analysen
in Konzentrationen im Bereich von 1:1000–1:10 000 Verdünnung (aus
einer Stammlösung
von 1 mg/ml) verwendet. Zelllysate (105–106 Zellen wurden in 500 μl Laemmli-Puffer mit 5% 2-Mercaptoethanol
(2ME) suspendiert) oder Überstände (1:1 Gemisch
mit Laemmli-Puffer + 2ME) wurden gewonnen, nachdem Krebszellen mit
Ad-mda7 für
die gewünschte
Zeitdauer behandelt wurden, und gefolgt von SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Westernblot-Analyse
unter Verwendung des Super-Signal-Substrats
für Meerrettichperoxidase
(Pierce Inc.). Weitere, monoklonale Antikörper, die bei dieser Untersuchung
verwendet wurden, erkannten spezifisch Bax (Santa Cruz Biotechnology)
und β-Actin
(Sigma).
-
4. Transduktion und Zellproliferationsanalysen
-
Krebs-
oder normale Zelllinien, die bei dieser Untersuchung verwendet wurden,
wurden mit Ad-mda7 infiziert (unter Verwendung von Ad-CMVpA oder
Ad-luc als Kontrollen), mit ansteigenden MOIs (0, 100, 250, 500,
1000, 2500, 5000 und 10 000 Virenpartikel (Vp)/Zelle). Zellen wurden
entweder zu 500–2000
Zellen/Vertiefung im 96-Well-Format für den 3H-Thymidineinbau-Assay,
oder zu 105–106 Zellen/Vertiefung
im 6-Well-Plattenformat für
Proteinexpressions- oder Apoptose-Assays ausplattiert, und zu 104 Zellen/Vertiefung (96-Well-Format) für den Alamarblau-Assay ausplattiert.
Zur Infektion wurden Ad-mda7 oder Ad-luc (oder Ad-CMVpA) in steigenden
MOIs (basierend auf Virenpartikeln/Zelle; MOI lag im Bereich von
0–10 000
Vp/Zelle) verwendet. Für 3H-Thymidineinbau-, Apoptose-, Proteinexpressions-
und Alamarblau-Assays wurden die Zellen 3 und 5 Tage nach der Infektion
analysiert.
-
5. 3H-Thymidineinbau-Assay
-
Die
Wachstumsinhibition von Zellen nach der Behandlung wurde hauptsächlich durch
Analyse des Einbaus von 3H-Thymidin in replizierende
DNA gemessen. Kurz, eine Stammlösung
von 100 μCi/ml 3H-Thymidin (Amersham) wurde hergestellt
durch Verdünnung
in High-Glucose-DMEM (GIBCO). In jede Vertiefung wurde 3H-Thymidin
in einer Endkonzentration von 1 μCi/ml
gegeben. Die Reaktion wurde nach 15 Stunden durch Entfernung des Überstands
von den Rezipientenzellen abgestoppt. Die Zellen wurden durch Zugabe
von 100 × Trypsin/EDTA
(GIBCO) in jede Vertiefung, für
15 Minuten bei 37°C,
geerntet. Zellen wurden auf einem Filter unter Verwendung eines
Packard Filtermate Zellernters unter Befolgung des Herstellerprotokolls
gesammelt und in entionisiertem Wasser und Methanol gewaschen. Die
Filter werden getrocknet und in einem Matrix 9600 (Packard) analysiert.
-
6. Alamarblau-Assay
-
Die
Wachstumsinhibition von Zellen wurde auch unter Verwendung des Alamarblau-Assays
gemessen. Zellen wurden in einer Dichte von 104 Zellen/Vertiefung
im 96-Well-Platten-Format
ausplattiert. Vier Tage nach Infektion mit verschiedenen MOIs von
Ad-mda7 oder Kontrollvektoren (wie zuvor erwähnt), wurden 20 μl Alamarblau-Farbstoff
zu jeder Vertiefung gegeben, und die Platte wurde bei 37°C für 6–8 Stunden
inkubiert.
-
Die
Platten wurden dann weiterbearbeitet zur Absorptionsanalyse der
optischen Dichte unter Verwendung des Dynatech MRX-Plattenlesegeräts bei dualer
Wellenlänge
von 595 nm und 600 nm. Zur Analyse der Daten wurde das Revelation
3.2 Softwareprogramm verwendet.
-
7. TUNEL-Assay
-
Krebszellen
wurden in Lab-Tek-Kammerobjektträgern
(Nunc) in einer Dichte von 103–104 Zellen/Kammer ausgesät. Zellen wurden mit der gewünschten
Konzentration von Ad-Vektoren
transduziert. An verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion wurden
die Zellen unter Verwendung des chromogenen TUNEL-POD-Assays (Boehringer
Mannheim) nach der Anleitung des Herstellers bezüglich Apoptoseinduktion analysiert.
Zellen wurden 2–5
Tage nach der Infektion analysiert. Das Kit verwendet ein Desoxythymidintransferase
(TdT)-Enzym zum
Einbau von fluoresceingebundener Desoxythymidinmoleküle in fragmentierte
DNA mit freien Hydroxylgruppen. Nach dem Waschen mit PBS wird Meerrettichperoxidase
(PDO)-markierter Anti-Fluorescein-Antikörper als Sekundärreagenz
verwendet, und die Proben werden zur Identifizierung TUNEL-positiver
Zellen DAB ausgesetzt (dunkelbraune Färbung).
-
8. Annexin-V-Assay
-
Krebszellen
wurden auch unter Verwendung des ApoAlert Annexin-V-FITC-Kits (CLONTECH)
bezüglich
Apoptose analysiert. Mit Ad-Vektor transduzierte Zellen (105–106 Zellen insgesamt) wurden ausgiebig in PBS
gewaschen und anschließend
für 30
Minuten auf Eis mit Annexin-V-FITC-Reagenz inkubiert. Die Zellen wurden
dann gewaschen und zur FACS-Analyse und Fluoreszenzmikroskopie weiterbearbeitet.
-
9. Hoechst-Proteinfärbung
-
Hoechst-Farbstoff
(33258) war ein Produkt von ICN-Biomedicals (Ohio, USA). Kurz, die
Zellen in Kammer-Objektträgern
wurden für
5 min fixiert (Methanol:Essigsäure
= 3:1), und dann erneut für
10 min mit dem gleichen Fixiermittel fixiert. Sie wurden für 30 min
luftgetrocknet und dann für
30 min in 1,0 ml Färbelösung gelegt
(0,05 mg/ml Hoechst 33258 in 1 × PBS-Puffer),
gefolgt von drei Mal Waschen (jeweils 1 min) mit destilliertem Wasser.
Nach den Waschgängen
wurden die Objektträger
an der Luft getrocknet, und es wurden Photos unter einem Fluoreszenzmikroskop
aufgenommen oder die Objektträger
mittels Konfokalmikroskopie analysiert.
-
10. DNA-Färbung mit Propidiumiodid (PI)
-
Zellzyklus-Stadienbestimmung
erfolgte durch die Bestimmung des DNA-Gehalts mittels PI-Färbung. Zur Identifizierung
von Zellen in verschiedenen Stadien des Zellzyklus wurde aus vektorinfizierten
Krebszellen eine Einzelzellsuspension von 1–2 × 106 Zellen/ml
PBS hergestellt. Nachdem die Zellen für 2 Stunden mit kaltem Ethanol
fixiert worden waren, wurden die Zellen zentrifugiert, das Fixiermittel
abdekantiert und Zellen 2 × mit
PBS gewaschen und dann mit Propidiumiodid (PI) in einer Endkonzentration
von 50 μg/ml
und RNase zu 20 μg/ml
in PBS gefärbt.
Behandelte Zellen wurden dann mittels FACS-Analyse analysiert.
-
J. Oberflächenexpressionsanalysen
-
Krebszelllinien
wurden mit steigenden MOIs (Multiplicities of Infection) von Ad-mda7
oder Ad-luc als Kontrolle behandelt. Kurz, 1 × 106 Zellen
(in einer 6-Well-Platte) wurden mit Ad-Vektoren infiziert, und 48 Stunden später wurden
die Zellen mit 500 μl
Versene abgetrennt. Die Zellen wurden 3 × mit PBS gewaschen (3 ml pro
Waschgang) und bei 4°C
für 2 h
mit 500 μl
des 1:2000 verdünnten
affinitätsgereinigten
Anti-mda7-Kaninchen-Antikörpers (Konzentration
der Stammlösung
1 mg/ml) behandelt. Nach dieser Behandlung wurden die Zellen mit
PBS (3 ×)
gewaschen und mit 1:1000 verdünntem
Anit-Kaninchen-IgG-FITC-Ziegenantiköper für 2 h bei
4°C behandelt.
Zellen wurden gewaschen, unter Verwendung von 4% Formaldehyd in
PBS fixiert und durch FACS-Analyse analysiert.
-
Für die in
diesem Bericht beschriebenen Arbeiten am Konfokalmikroskop wurde
die Zentrale Einrichtung für
Fluoreszenzmikroskopie und Bildgebung des UC Health Science Centers
verwendet. Die folgenden Systeme des Zentrums wurden verwendet:
das Molecular Dynamics 2001 CSLM (Konfokales Laserrastermikroskop),
das Applied Precision Deltavision Dekonvolutionsmikroskop, das Nikon
8000 RSCM (Echtzeit-Rasterkonfokalmikroskop)
und das Wallac/Olympus Concord System (Echtzeit-Fluoreszenzbildgebungssystem).
-
Für die MDA-7-Proteinfärbung wurden
Zellen mit Ad-mda7 (oder Ad-luc) mit einer MOI von 1000 Vp/Zelle
infiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen 3 × mit PBS gewaschen (3 ml pro
Waschgang) und bei 4°C
für 2 h
mit 500 μl
des 1:2000 verdünnten
affinitätsgereinigten
Anti-mda7-Kaninchen-Antikörpers
(Konzentration der Stammlösung
1 mg/ml) behandelt. Nach der Behandlung wurden die Zellen mit PBS
gewaschen (3 ×)
und mit 1:1000 verdünntem
Rhodamin-Anti-Kaninchen-IgG-Ziegenantikörper behandelt. Die Zellen
wurden außerdem
mit Annexin-V und Hoechst-Farbstoff gefärbt. Zellen wurden nach der
Färbung
unter Verwendung von 4% Formaldehyd in PBS fixiert.
-
Zur
Charakterisierung der intrazellulären Ca2+-Konzentration
wurden Ad-mda7-transduzierte Zellen im Dunkeln für 15 min bei 37°C mit der
Calciumsonde FLUO3 in einer Endkonzentration von 2 μM (Minta
et al. 1989, Molecular Probes, Eugene, Oregon) beladen, dann mit
einem konfokalen Laserrastermikroskop von Molecular Dynamics bei
einer Wellenlänge
von 488 nm visualisiert. Flächeninhalt
und Volumen der Zellen wurden unter Verwendung der Image Space Software
(Molecular Dynamics, Sunnyvale, Kalifornien) bestimmt, im Anschluss
an die Anfertigung von Stapeln optischer Schnitte der Zellen. Zur
Visualisierung von Calciumwellen, die Ad-mda7-transduzierte Krebszellen
durchlaufen, wurden Schnellscan-Bildaufnahmen gemacht, und diese Bilder
wurden dann zusammengestellt und aneinandergereiht.
-
Der
Mitochondrieninhalt wurde unter Verwendung ähnlicher Protokolle wie vorstehend
(Ca2 +-Experimente)
bestimmt, mit dem Unterschied, dass die verwendete Sonde MitoTrack
(Molecular Probes) war. Die Beladungsparameter und Sondenkonzentration
waren dieselben wie bei FLUO3, wobei die Scans bei einer eingestellten
Wellenlänge
von 595 nm durchgeführt
wurden (Marin et al. 1996).
-
K. Glycosylierungsanalysen
-
Überstand
wurde mit den folgenden drei Enzymen behandelt, entweder einzeln
oder in verschiedenen Kombinationen. Die verwendeten Enzyme waren
Sialidase (Neuraminidase), Endoglycosidase H und Endoglycosidase
F (alle bezogen von Sigma). Die Pufferbedingungen waren 100 mM Tris,
pH 8,2. Für
jedes Mikrogramm des Gesamtproteingehalts des verwendeten Überstands
wurden ca. 0,1 Einheiten Enzym/e verwendet. Die verwendeten Enzyme
waren Sialidase (Neuraminidase), Endoglycosidase H und Endoglycosidase
F (alle bezogen von Sigma). Die Pufferbedingungen waren 100 mM Tris,
pH 8,2. Die Reaktion wurde für
eine Stunde bei 37°C
durchgeführt,
und anschließend
wurden die Proben auf einem SDS-PAGE laufen gelassen und mittels
Westernblot unter Verwendung des spezifischen polyklonalen Anti-MDA-7-Kaninchenantikörpers analysiert.
-
BEISPIEL 3: AD-MDA7 TÖTET KREBSZELLEN UND INDUZIERT
APOPTOSE
-
1. Brustkrebszellen
-
Eine
Reihe von Brustkrebszelllinien (T47D, MCF-7, BT-20, MDA-MB-361,
SKBr3, MDA-MB-231, MDA-MB-468)
wurden mit Ad-mda7 (oder Ad-CMVpA oder Ad-luc als Kontrollvektoren)
transduziert. Das Wachstum der Zelllinien wurde durch Ad-mda7-Transduktion stark
gehemmt. Die beiden Zelllinien, welche die höchste Sensitivität gegenüber Ad-mda7
aufwiesen, waren T47D (p53 mutiert) und MCF-7 (p53 Wildtyp) (
2A und
2B),
wie durch den
3H-Thymidineinbauassay bestimmt
wurde. Krebszellen wurden 3–6
Tage nach Ad-mda7-Transduktion analysiert. Siehe nachstehende Tabelle. TABELLE 7: Zusammenfassung der für Ad-mda7-Untersuchungen
verwendeten Brustkrebszelllinien.
Zelllinie | Tumortyp | p53-Status | Quelle |
Brustkrebs |
(1)
T47D | Carcinoma
ductale | L194F | ATCC |
(2)
MCF-7 | Karzinom | Wildtyp | ATCC |
(3)
MDA-MB-361 | Adenokarzinom | Wildtyp | ATCC |
(4)
MDA-MB-231 | Adenokarzinom | R280K | ATCC |
(5)
MDA-MB-468 | Adenokarzinom | R273H | ATCC |
(6)
SKBr-3 | Adenokarzinom | mutiert | ATCC |
(7)
BT-20 | Karzinom | mutiert | ATCC |
Normal |
(1)
MJ90 | Fibroblasten | Wildtyp | Smith-Labor |
(2)
HUVECs | Endothel | Wildtyp | Clonetics |
(3)
HMECs | Brustepithel | Wildtyp | Clonetics |
-
7 stellt
das hohe Ausmaß an
Apoptose dar (gemessen durch Annexin-V-Färbung), das in Brustkrebszelllinien
durch Ad-mda7 induziert wurde. Annexin-V-Färbung identifiziert Zellen
in frühen
und mittleren Stadien der Apoptose, während der TUNEL-Assay DNA-Spaltprodukte detektiert,
eines der Endstadien der Apoptose. TUNEL-Assays, durchgeführt mit
MCF-7-Zellen, die mit Ad-mda7 infiziert waren, bestätigten,
dass diese Zellen durch Apoptosesignalwege getötet werden. Die Kontrollvektoren
Ad-CMVpA und Ad-luc waren bezüglich
der Induktion von Apoptose unwirksam.
-
Die
beiden Zelllinien, welche die höchste
Sensitivität
gegenüber
Ad-mda7 aufwiesen, waren T47D (p53 mutiert) und MCF-7 (p53 Wildtyp)
(
2A und
2B).
Die Ad-mda7-Konzentration,
die zur Hemmung des Wachstums der T47D- oder MCF-7-Zellen um 50%
(IC
50) benötigt wurde, betrug im Durchschnitt
500 bzw. 1500 Vp/Zelle (TABELLE 8). Ebenfalls in
3 enthalten
(Schaubild A und B) sind repräsentative
Experimente unter Verwendung von MDA-MB-361 und BT-20-Zellen. Diese
beiden Zelllinien zeigten ebenfalls eine ausgeprägte Sensitivität gegenüber Ad-mda7-Infektion.
Tabelle 8 fasst die Empfindlichkeit von Brustkrebszellen gegenüber Ad-mda7-Infektion
(bestimmt durch einen Vergleich der IC
50-Werte
für Ad-mda7-
und Kontroll-Ad-Vektor) zusammen. Ebenfalls in der Tabelle enthalten
sind die IC
50-Werte in normalen Zelllinien. Tabelle 8: Zusammenfassung von IC
50-Werten von Ad-mda7 in Brustkrebs- und
normalen Zelllinien
Zelllinie | Tumortyp | IC50-Bereich | |
| | Ad-mda7 | Kontrolle* |
Brustkrebs |
(1)
T47D | Carcinoma
ductale | 150–500 | > 10 000 |
(2)
MCF-7 | Karzinom | 1200–4000 | > 10 000 |
(3)
MDA-MB-361 | Adenokarzinom | ~1500 | > 10 000 |
(4)
MDA-MB-231 | Adenokarzinom | ~3000 | > 10 000 |
(5)
MDA-MB-468 | Adenokarzinom | > 10 000 | > 10 000 |
(6)
SKBr-3 | Adenokarzinom | ~5000 | > 10 000 |
(7)
BT-20 | Karzinom | ~2500 | > 10 000 |
Normal |
(1)
MJ90 | Fibroblasten | > 10 000 | > 10 000 |
(2)
HUVECs | Endothel | > 10 000 | > 10 000 |
(3)
HMECs | Brustepithel | > 10 000 | > 10 000 |
- * Die bei diesen Experimenten verwendeten
Kontrollvektoren waren entweder Ad-CMVpA oder Ad-luc.
-
2. AD-MDA7 TÖTET LUNGENKREBSZELLEN UND INDUZIERT
APOPTOSE
-
Sechs
Lungenkrebszelllinien (H1299, H460, A549, H322, H358 und SaosLM2)
wurden mit Ad-mda7 infiziert. Alle diese Zelllinien zeigten wirksame
Abtötung
durch Ad-mda7-Transduktion.
Die H1299- und H322-Zelllinien waren gegenüber Abtötung durch Ad-mda7 am empfindlichsten
(siehe 4A und B). Der IC50 lag
in diesen Zelllinien im Bereich von 600 Vp/Zelle bis 2000 Vp/Zelle,
bestimmt durch 3H-Thymidineinbau-Assay.
-
3. AD-MDA7 TÖTET KOLOREKTALE KREBSZELLEN
UND INDUZIERT APOPTOSE
-
Sechs
kolorektale Krebszelllinien (DLD-1, SW-620, SW-480, HT-29, HCT-116,
LS174T) wurden mit Ad-mda7 infiziert. Das Wachstum aller dieser
Zelllinien wurde durch Ad-mda7-Transdution
wirksam gehemmt, wobei SW620, DLD-1 und SW-480 die empfindlichsten
waren. SW620-Zellen, die mit Ad-mda7 in verschiedenen MOIs behandelt
wurden, sind in 5A gezeigt, während DLD-1-Zellen
in 5B gezeigt sind. Bezüglich der
Zellproliferation, bestimmt durch 3H-Thymidineinbau-Assay,
wurde ein IC50 beobachtet, der im Durchschnitt 1000
Vp/Zelle in den empfindlicheren Zelllinien betrug und bis zu 2000
Vp/Zelle in den anderen, weniger empfindlichen Zelllinien. Die DLD-1-Zelllinie
wurde mit Ad-mda7 zu 1000 und 5000 Vp/Zelle infiziert, unter Verwendung
von nichtinfizierten Zellen und Ad-luc als Kontrolle. Nach 48 Stunden
wurden die transduzierten Zellen unter Verwendung von Annexin-V-Färbung in
Verbindung mit FACS-Analyse bezüglich
Apoptose analysiert. Weder die nichtinfizierten noch die Ad-luc-infizierten
(5000 Vp/Zelle) Zellen zeigten Anzeichen von Apoptose, während Ad-mda7-infizierte
Zellen bei 1000 Vp/Zelle ca. 26% apoptotische Zellen aufwiesen sowie
58% apoptotische Zellen bei 5000 Vp/Zelle (8).
-
4. AD-MDA7-INFEKTION IN NORMALEN ZELLEN
-
Drei
normale humane Zelllinien (MJ90-Fibroblasten, HUVEC-Endothelzellen
und humane Brustepithelzellen) zeigten keine Wachstumsinhibition
bei Infektion mit Ad-mda7. Die Primärfibroblastenzelllinie MJ90 zeigte
bei Behandlung mit Ad-mda7 bzw. Kontrollvektor Ad-luc überlappende
Wachstumskurven (6A). HUVEC und humane
Brustepithelzellen zeigten ähnliche
Ergebnissen (6B).
-
5. PROTEINANALYSEN
-
Zelllysate,
gewonnen aus Ad-mda7-transduzierten Krebszelllinien, wurden durch
SDS-PAGE ihrer Größe nach
fraktioniert, gefolgt von Westernblot-Analyse unter Verwendung eines
Anti-MDA-7-Kaninchenantikörpers. Das
Laufverhalten des MDA-7-Proteins war übereinstimmend mit einer Größe von ca.
23 kDa, allerdings wurde auch eine zusätzliche Bande bei 17 kDa beobachtet.
Eine Westernblot-Analyse von H1299 (Lungenkrebs)- und DLD-1 (Kolorektalkrebs)-Zelllinien
wurde nach Ad-mda7 und Ad-luc-Infektion durchgeführt. Zwei Banden, bei ca. 23
und 17 kDa, wurden beobachtet. Banden mit ähnlichem Molekulargewicht wurden auch
in Brustkrebszelllinien beobachtet, die mit Ad-mda7 infiziert waren.
Während
der ersten 48 Stunden nach der Infektion war die 17-kDa-Bande die
Hauptspezies, die in DLD-1-Zellen beobachtet wurde. 72 und 96 Stunden
nach der Infektion nahm die Intensität der 23 kDa Bande mit der
Zeit ab, und andere, kleinere Abbauprodukte wurden beobachtet. In
H1299-Zellen hatten beide Banden eine ähnliche Intensität. Die Blots
wurden auch auf β-Actin getestet und,
72 und 96 Stunden nach der Infektion, war Actin erheblich abgebaut
(Daten nicht gezeigt), in Übereinstimmung
mit dem schnellen apoptotischen Zelltod.
-
Wie
bei diesen Proteinexpressionsuntersuchungen beobachtet, zeigten
Lysate von Ad-mda7-infizierten
Zellen eine 23-kDa/17-kDa-Dublette, was vermuten lässt, dass
MDA-7 intrazellulär
prozessiert wird. Frühere
Untersuchungen von Su et al., 1998, wiesen darauf hin, dass in humanen
Melanomzellen, die mit Interferon β und Mezerin induziert wurden,
das 23-kDa-MDA-7-Protein
aus dem Zytosol in den Zellkern transloziert. Auf der Basis von
Primärproteinsequenzanalysen
besitzt MDA-7 kein Konsensus-Kernlokalisationsmotiv, was darauf
hindeuten könnte,
dass das MDA-7-Protein mit einem zytoplasmatischen Chaperon (wie
HMC) assoziiert (Jiang et al., 1995, 1996). Es wurde vorgeschlagen,
dass diese Assoziation die Translokation von MDA-7 in den Zellkern
erleichtern könnte.
-
6. APOPTOSE-UNTERSUCHUNGEN
-
Annexin-V-Färbung identifiziert
Zellen in frühen
und mittleren Stadien von Apoptose, während der TUNEL-Assay DNA-Spaltprodukte
detektiert, eines der Endstadien von Apoptose. 7 stellt
das hohe Ausmaß an
Apoptose dar (gemessen durch Annexin-V-Färbung),
das in Brustkrebszelllinien durch Ad-mda7 induziert wurde. TUNEL-Assays
wurden mit MCF-7-Zellen, die infiziert mit Ad-mda7waren, durchgeführt, und
somit wurde bestätigt,
dass diese Zellen über
Apoptosesignalwege getötet
werden. Ad-CMVpA oder Ad-luc-Kontrollvektoren
waren bezüglich
der Induktion von Apoptose unwirksam.
-
Weitere
Beispiele für
Ad-mda7-induzierte Apoptose sind in den 10 und 11 gezeigt. Die DLD-1-Zelllinie wurde mit
Ad-mda7 zu 1000 und 5000 Vp/Zelle infiziert, unter Verwendung von
nichtinfizierten Zellen und Ad-luc als Kontrollen. 48 Stunden später wurden
die transduzierten Zellen unter Verwendung von Annexin-V-Färbung in
Verbindung mit FACS-Analyse bezüglich
Apoptose analysiert (8). Weder die nichtinfizierten
noch die Ad-luc-infizierten (5000 Vp/Zelle) Zellen zeigten Anzeichen
von Apoptose, während Ad-mda7-infizierte Zellen
bei 1000 Vp/Zelle ca. 26% apoptotische Zellen und 58% apoptotische
Zellen bei 5000 Vp/Zelle aufwiesen. Ad-mda7 verursachte eine schnelle
Induktion von Apoptose (9). Zwei Zelllinien, die nichtkleinzelligen
Lungenkrebs (NSCLC) bzw. kolorektalen Krebs repräsentieren, sind gezeigt. Ein
erhebliches Ausmaß an
Apoptose war schon 12 Stunden nach Infektion mit Ad-mda7 offensichtlich,
und nahm über die
nächsten
Tage zu. Das Auftreten von Apoptose schon 12 Stunden nach der Infektion
ist bemerkenswert, da immunreaktives MDA-7-Protein nach 12 Stunden
gerade nachweisbar ist und Spitzenwerte im Allgemeinen nicht bis
24–48
h nach Infektion erreicht. Ad-p53 kann ebenfalls schnelle Induktion
von Apoptose verursachen, andere Tumorsuppressoren jedoch, wie p16
oder PTEN verursachen Apoptose tendenziell erst 2–3 Tage
nach Infektion mit dem Ad-Expressionsvektor.
-
7. AD-MDA7 ERHÖHT BAX-PROTEINKONZENTRATIONEN
IN LUNGEN-, BRUST- UND KOLOREKTALEN KREBSLINIEN
-
Die
Regulierung des programmierten Zelltods beruht auf der Wechselwirkung
zwischen Signalwegen, die die Apoptose entweder begünstigen
oder hemmen (Reed 1997; White 1996). Die Vertreter der bcl-2-Familie
(bcl-2, bcl-w, bax, bad, bak, bcl-xs) spielen eine wichtige Rolle
bei der apoptotischen Signalgebung (Sedlak et al., 1995; Reed et
al., 1996). Bei der Verwendung der Westernblot-Analyse in Verbindung
mit einem anti-bax-Antikörper
wurde festgestellt, dass eine Ad-mda7-Infizierung das BAX-Protein
in T47D-, DLD-1-, A549- und H460-Zellen induzierte. Die Westernblot-Analyse
von Lysaten, die 24 Stunden nach Infizierung mit 30 bis 150 pfu/Zelle
von Ad-mda7 hergestellt wurden, zeigte eine erhöhte Expression von BAX in sämtlichen
getesteten Zelllinien. Zum Beispiel wurde die Induzierung von BAX
in mit Ad-mda7 infizierten T47D-Krebszellinien durch Westernblot-Analyse beobachtet.
Die Zellen wurden mit Ad-mda7 infiziert und auf die MDA7- und BAX-Proteinexpression
analysiert. Ad-mda7 erhöhte
die BAX-Expression in T47D, wie bei den anderen Zelllinien beobachtet
wurde.
-
8. ENDOGENE EXPRESSION VON MDA-7 IN KREBS-
UND NORMALZELLEN
-
Von
den mehr als 50 Tumorzellinien, die auf endogene MDA-7-Proteinexpression
untersucht wurden, waren nur zwei DLD-1 (kolorektal) und LnCap (Prostata)
positiv. Es gibt laufende Untersuchungen zur Betrachtung von mda-7
mRNA bei den verschiedenen Krebslinien. Die Tabelle 9 ist eine Liste
einiger der Krebslinien, die in den Ad-mda7-Untersuchungen verwendet
wurden, und ihres endogenen MDA-7-Status. Zwischen der Anti-Tumoraktivität von Ad-mda7
und endogener MDA-7-Expression bestand auf der Basis der Westernblot-Analyse keine Korrelation
(Tabelle 9).
TABELLE
9 |
Zelltyp | Endogenes
MDA-7-Protein | Ad-mda7-Abtötung |
(A)
Normale Linien | | |
(1)
MJ90 | -- | -- |
(2)
HUVEC | -- | -- |
(3)
HMEC | -- | -- |
(B)
Brustkrebslinien | | |
(1)
T47D | -- | ++++ |
(2)
MCF-7 | -- | +++ |
(3)
MDA-MB231 | -- | ++ |
(4)
MDA-MB468 | -- | ++ |
(C)
Lungenkrebslinien | | |
(1)
H1299 | -- | ++++ |
(2)
A549 | -- | ++ |
(3)
H460 | -- | ++ |
(D)
Kolorektal-Krebslinien | | |
(1)
DLD-1 | ++ | +++ |
(2)
SW620 | -- | +++ |
(3)
HCT116 | -- | ++ |
(4)
HT29 | -- | ++ |
(E)
Prostatakrebslinien | | |
(1)
LnCap | ++ | +++ |
(2)
Du 145 | -- | ++ |
- Anmerkung: -- bezeichnet nicht nachweisbares
endogenes Protein/keine Reaktion auf Admda7-Infizierung; ++ bezeichnet
Vorhandensein von endogenem mda7-Protein oder wirksame Reaktion
auf Ad-mda7.
-
9. AD-MDA7 WIRKT UNABHÄNGIG VON ENDOGENEM P53-, RB-,
RAS- UND P16-STATUS
-
Die
Tabelle 10 stellt den Status von verschiedenen Tumorsuppressor/Onkogen/Zellzyklus-Regulatorgenen und
ihre Reaktion auf Ad-mda7-Infizierung in verschiedenen Zelllinien
dar, die bei dieser Untersuchung verwendet wurden. Die wachstumshemmende
Wirkung von MDA-7 wurde bei einer breiten Vielfalt von Krebszellinien
unabhängig
von ihrem p53-, RB-, p16- und Ras-Status beobachtet. Obwohl die
Bax-Expression von dem Wildtyp p53 (Han et al., 1996) positiv reguliert
wird, scheint die Fähigkeit
von MDA-7 zur BAX-Induzierung von p53 unabhängig zu sein, da die BAX-Induzierung
bei der p53-Mutante (DLD-1, T47D) und dem p53-Wildtyp (H460) beobachtet
wird. Es ist erwähnenswert,
dass MDA-7 die Apoptose bei den MCF-7-Brustkrebszellen, denen Caspase
3 fehlt, eine der mehreren Caspasen, die bei den nachgelagerten
apoptotischen Vorgängen
involviert ist, wirksam induzieren konnte.
TABELLE
10 |
Zelltyp | Ad-mda7-Wirkung | p53 | RB | ras | p16 |
(A) Normale
Linien |
(1)
Melanozyten | NB | wt | wt | wt | wt |
(2)
MJ90 Fibroblasten | -- | wt | wt | wt | wt |
(3)
HUVEC | -- | wt | wt | wt | wt |
(4)
HMEC | -- | wt | wt | wt | wt |
(B) Krebslinien |
(1)
T47D | ++++ | mut | -- | wt | -- |
(2)
MCF-7 | +++ | wt | -- | wt | -- |
(3)
H1299 | ++++ | null | wt | mut | -- |
(4)
Saos-LM2 | ++ | del | -- | wt | del |
(5)
A549 | ++ | wt | -- | mut | -- |
(6)
H460 | ++ | wt | wt | mut | del |
(7)
SW620 | +++ | mut | -- | mut | -- |
(8)
HCT116 | ++ | wt | -- | mut | -- |
Anmerkung:
NB, nicht bestimmt; mut, Mutante; del, Deletion; wt, Wildtyp |
-
BEISPIEL 4: ZELLULÄRE LOKALISATIONSUNTERSUCHUNGEN
FÜR MDA-7
-
1. OBERFLÄCHENEXPRESSIONSUNTERSUCHUNGEN
-
Die
H460-NSCLC-Zelllinie wurde mit steigenden MOIs von Ad-mda7 oder
Ad-luc als Kontrolle behandelt und 48 h später wurden die Zellen mit dem
polyklonalen anti-MDA-7-Antikörper gefärbt und über FACS-Analyse
analysiert (10). Ein hohes Ausmaß der Färbung wurde
nur bei den mit Ad-mda7 behandelten Zellen beobachtet. Die Färbung war
dosisabhängig
und in etwa 50% der Zellen waren MDA-7 positiv bei 1000 Vp/Zelle.
Dieses Ergebnis zeigte, dass die Ad-mda7-Behandlung von H460-Zellen
zu hohen Niveaus von Proteinproduktion führte (bestätigt durch Westernblot-Analyse)
und dass das Protein an der Zelloberfläche aufgetreten ist.
-
B. Konfokale Mikroskopieuntersuchungen
-
Zur
Bestätigung
und Ausweitung der in der 10 gezeigten
Ergebnisse wurden konfokale Mikroskopieanalysen an verschiedenen
Zelllinien (H460-, H1299-, T47D- und DLD-1-Zellen) durchgeführt, um die sub-zelluläre Verteilung
des MDA-7-Proteins nach Ad-mda7-Behandlung
zu bestimmen. Die Hintergrundfärbung
in unbehandelten oder mit Ad-luc behandelten Zellen war gering und
diffus. Es wird angenommen, dass der Hintergrund auftritt, da das
anti-MDA-7-Reagenz ein polyklonales Antiserum ist. Allerdings wurde
eine sehr spezifische Färbung
beobachtet, wenn Zellen mit Ad-mda7 behandelt wurden. Bei niedrigen
MOIs wurde eine ausgeprägte
Membranfärbung
mit punktierter Färbung
in dem Zytoplasma beobachtet. Bei höheren MOIs wurden die punktierte
Färbung
und Membranfärbung
reproduziert und intensiver. Das Muster der Färbung deutete auf ein sezerniertes
Protein hin, wobei die punktierte Färbung Proteintransport und
-freisetzung an der Plasmamembran verkörpert. Vergleichbare Beobachtungen
wurden bei den anderen Zelllinien festgestellt.
-
Bei
zusätzlichen
konfokalen Mikroskopieexperimenten wurden Krebszellinien mit Ad-mda7
behandelt und auf Apoptose (Färbung
mit Annexin V), DNA-Gehalt (Hoechst), Ca2+-Einstrom/Ausstrom
(Fluo 3, Molecular Probes) und Mitochondrienintegrität (MitoTrack,
Molecular Probes) analysiert. Die verwendeten Protokolle waren diejenigen,
die sich bei der Confocal Microscope Facility, UTHSC, Houston, TX
etabliert haben.
-
Konfokale
Mikroskopieuntersuchungen von H460- und MCF-7-Zellen wurden durchgeführt. Sie
zeigen eine Zusammensetzung von einzelnen Mikroskopiefeldern: (1)
bedeutet Oberflächenexpression
von MDA-7 (rote Oberfläche
und punktierte Färbung),
(2) zeigt in Apoptose befindliche Zelle (polarisierte grüne Färbung), (3)
Hoechst-Färbung
zur Identifizierung von Nuklei (blau) und (4) Zusammensetzung aus
(1), (2) und (3).
-
Calcium-
und Mitochondrien-Färbung
wurden in mit Ad-mda7- oder Ad-luc-transduzierten Kontrollzellen
durchgeführt.
Die Zellen wurden auf Laminin-beschichteten Objektträger ausplattiert
und mit FLUG-3 (für Ca2+) oder mit Mitotracker (für Mitochondrien)
behandelt. Die mit Ad-luc behandelten Kontrollzellen zeigen einen
gut verteilten intrazellulären
Calciumgehalt (grüne
Fluoreszenz) und zeigten gute Mitochondrienintegrität (rote
Färbung).
Jedoch sind bei der Ad-mda7-Behandlung die intrazellulären Ca2+-Konzentrationen gestört und die Mitochondrienintegrität ist zerstört.
-
BEISPIEL 5: SEZERNIERTES MDA-7 PROTEIN
-
1. Sezernierung von MDA-7
-
H1299-Zellen
wurden mit Ad-mda7 (MOI von 1000 Vp/Zelle) für 6 Stunden infiziert, mit
frischen Medien gewaschen und bei 37°C in frischen DMEM-Medien inkubiert.
Vierundzwanzig Stunden später
wurden das Zelllysat und die Zuchtmedien auf MDA-7-Proteinexpression
unter Verwendung von Westernblotting analysiert. Mit Ad-mda7 transduzierte
Zellen zeigten ein spezifisches Protein von 40 kD, das in Zuchtmedien
erzeugt wurde, welches bei nicht transduzierten oder mit Ad-luc
transduzierten Zellen, die nur Banden von 19 kD und 23 kD zeigten,
nicht vorhanden war. Eine dosisabhängige Erhöhung bei dem intrazellulären MDA-7
und dem extrazellulären
MDA-7-Protein wurde beobachtet. Als eine Kontrolle wurde der Blot
in Platte B mit einem anti-Actin-Antikörper getestet. Gemäß der Vorhersage
zeigten die Zelllysate ein Actin-Signal bei etwa 40 kD, wobei die
Zellüberstände überhaupt
kein Actin-Signal zeigten. Dies legt nahe, dass das in den Überständen beobachtete
MDA-7-Proteinsignal wegen der aktiven Freisetzung/Sezernierung von
MDA-7 und nicht wegen der Freisetzung aus absterbenden Zellen vorhanden
ist.
-
2. Glycosylierung von sezerniertem MDA-7-Protein
-
Der Überstand
von mit Ad-mda7 transduzierten H1299-Zellen war eine gute Bezugsquelle
für das
sezernierte MDA-7-Protein. Der Überstand
wurde ferner auf Proteinglycosylierung untersucht. Der Überstand wurde
mit den folgenden drei Enzymen behandelt, und zwar entweder einzeln
oder in verschiedenen Kombinationen. Die verwendeten Enzyme waren
Sialidase (Neuraminidase), Endoglycosidase-H und Endoglycosidase-F
(alle wurden von Sigma bezogen). Die Proben wurden durch Westernblotting
unter Verwendung des spezifischen polyklonalen anti-MDA-7-Antikörpers aus
Kaninchen analysiert.
-
Die
Behandlung mit Endoglycosidase legt nahe, dass lösliches MDA-7-Protein glycosyliert
wird. Unter Verwendung von verschiedenen Glycosidasen, insbesondere
Endo F, wird ferner eine niedermolekulare Bande beobachtet (die
in etwa gleich groß ist
wie die in Zelllysat beobachtete MDA-7-Proteinbande).
-
3. Hemmung der Glycosylierung und Sezernierung
von MDA-7-Protein
-
Zwei
Antibiotika, Tunicamycin und Brefeldin A, wurden zur Bereitstellung
einer genaueren Charakterisierung der Sezernierung von löslichem
MDA-7 verwendet. N-verknüpfte
Glycosylierung spielt bei der endgültigen Prozessierung eines
Proteins eine bedeutende Rolle, und zwar ob eine Zuordnung einem
lysosomalen Weg oder die Translokation an die Zelloberfläche oder
die Sezernierung erfolgt. Unter Verwendung von Tunicamycin kann
der N-verknüpfte
Glycosylierungsprozess im Golgi-Apparat gehemmt werden, womit die
Proteinsezernierung gehemmt wird oder andere Zucker-abhängige Zuordnungsprozesse
gehemmt werden. Brefeldin A ist ein Pilzmetabolit (macrocyclisches
Lacton), der eine breite Vielfalt an antibiotischen Wirkungen aufweist.
Brefeldin A hemmt reversibel die intrazelluläre Translokation von Proteinen
(während
des Transports von Protein zu der Zelloberfläche für die Sezernierung oder Expression).
Sowohl Tunicamycin als auch Brefeldin A hemmen wirksam die Sezernierung
von löslichem
MDA-7-Protein. Daher scheint es, dass intrazelluläre Prozessierung
und Glycosylierung zur MDA-7-Sezernierung erforderlich sind.
-
4. Sezerniertes MDA-7-Protein induziert
Abtötung
bei Krebszellen
-
Die
sezernierte Form von MDA-7 (sMDA-7) wurde unter Verwendung von verschiedenen
Zelllinien hergestellt und auf Anti-Tumoraktivität untersucht. Ein repräsentatives
Beispiel ist in der 11 gezeigt. Lösliches
MDA-7 wurde auf dessen antiproliferative Wirkung bei H1299-Zellen
untersucht. Kurz gefasst wurden H1299-Zellen bei einer Zelldichte
von 103 Zellen/Kammer in Nunc Chamber Slides
plattiert. 24 Stunden später wurden
die Zellen mit Überständen behandelt,
die von H1299-Zellen erhalten wurden, die entweder mit Ad-mda-7
oder Ad-luc (bei 1000 Vp/Zell-Infizierung) transduziert wurden.
Ad-mda7- und Ad-luc-Viren wurden ferner als zusätzliche Kontrollen verwendet.
Die löslichen
Proteinüberstände (500 μl Gesamtvolumen,
verschiedene Verdünnungen)
wurden auf native H1299-Zellen aufgebracht und 24 Stunden später wurden
zusätzliche
0,5 ml von 10% FBS in DMEM zugegeben. Nach 24 und 48 Stunden wurden
die Zellen mikroskopisch auf ihre Lebensfähigkeit unter Verwendung der
Trypanblau-AusschlussFärbung
untersucht. Das lösliche MDA-7-Protein
zeigte die Abtötung
von H1299 nach 48 Stunden; jedoch hatten Ad-luc-Überstände eine geringe Wirkung (11A).
-
Verschiedene
Verdünnungen
von löslichem
MDA-7-Überstand
wurden ebenfalls auf H1299-Abtötung unter
Verwendung des Trypanblau-Ausschlusstests untersucht. Eine Konzentrations-abhängige Bystander-Abtötungswirkung
von löslichem
MDA-7 wurde beobachtet (11B).
-
BEISPIEL 6: KOMBINATIONSUNTERSUCHUNGEN
VON AD-MDA-7 IN BRUSTKREBSLINIEN
-
1. Kombination mit Tamoxifen
-
Ad-mda7
wurde mit Tamoxifen kombiniert und auf die Anti-Tumorwirkungen bei
Brustkrebs-Zelllinien (12) untersucht.
Die Graphen zeigen, dass die Kombination dieser beiden Wirkstoffe
eine ausgezeichnete Anti-Tumoraktivität im Vergleich zu einem der
beiden Wirkstoffe alleine bereitstellt. Die Wirkung von Tamoxifen auf
T47D-Zellen (12A) und auf MCF-7-Zellen (12B) ist gezeigt. Die Zellen wurden plattiert
und vier Tage nach der Behandlung wurde ein Tritium-markierter Thymidintest
zur Messung der DNA-Replikation durchgeführt. Die Zellen wurden mit
0/0 (kein Wirkstoff und kein Vektor) oder variierenden Dosen von
Tamoxifen oder Vektoren (Ad-luc oder Ad-mda7) behandelt. Bei T47D-Zellen hatte
Tamoxifen oder Ad-mda7 eine minimale Wirkung auf die DNA-Replikation.
Wenn jedoch das Tamoxifen und Ad-mda7 kombiniert wurden, wurde eine
supra-additive Wirkung beobachtet. Bei MCF-7-Zellen hatte Tamoxifen
eine geringe Wirkung bei einer Dosis von 1 ng/ml. Ad-mda7 verringerte
das Signal im Vergleich zu Ad-luc. Wenn jedoch Tamoxifen mit Ad-mda7 kombiniert
wurde, wurde eine supra-additive Wirkung beobachtet, was wiederum
die verbesserten Wirkungen der Kombination eines Chemotherapeutikums
mit Ad-mda7 zeigte.
-
2. Kombination mit Adriamycin
-
Ad-mda7
wurde mit Adriamycin kombiniert und auf die Anti-Tumorwirkungen
bei Brustkrebs-Zelllinien (13) untersucht.
Die Graphen zeigen, dass die Kombination dieser beiden Wirkstoffe
eine ausgezeichnete Anti-Tumoraktivität im Vergleich zu einem der
beiden Wirkstoffe alleine bereitstellt.
-
BEISPIEL 7: AKTIVIERUNG DER CASPASE-KASKADE
DURCH AD-MDA7
-
1. Materialien und Verfahren
-
a. Zellkultur
-
Humane
nicht-kleinzellige Lungenkarzinomzellen A549, H460, H1299, humane
Prostatakrebszellen DU145 und humane Brustkrebszellen MCF-7 wurden
von der American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, MD) bezogen.
Sämtliche
Zellen wurden in DMEM-Medium, enthaltend 10% fötales Kälberserum, Antibiotika und
L-Glutamin, gehalten. Normale humane bronchiale Epithelzellen (NHBE-Zellen)
wurden von Clonetics Inc (Clonetics Inc., Walkersville, MD) bezogen
und gemäß den Anweisungen
des Herstellers gehalten.
-
Es
wurde sicher gestellt, dass die Zellen frei von Mycoplasma waren
und in der log-Phase des Wachstums verwendet wurden. Die Zellen
wurden routinemäßig mit
0,125% Trypsin – 1,3
mM EDTA (GIBCO) geerntet.
-
b. Konstruktion des rekombinanten adenoviralen
Vektors
-
Dasselbe
wie vorstehend beschrieben.
-
c. Bestimmung der Zellwachstumsrate
-
Krebs-
oder normale Zelllinien, die in dieser Untersuchung verwendet wurden,
wurden in 12-Lochplatten
mit 2 × 104 Zellen in jeder Vertiefung plattiert. Die
Zellen wurden mit Ad-mda7, mit Ad-luc-Kontrollen (5000 Viren/Zelle)
oder mit PBS als eine zusätzliche
Kontrolle infiziert. Die Zellen wurden durch Trypsinisierung geerntet,
mit Trypanblau (GIBCO) verdünnt
und die Zahlen der lebensfähigen
Zellen wurden auf einem Hämozytometer
gezählt.
Außerdem
wurde die Hemmung des Zellwachstums mit dem XTT-Test gemäß den Richtlinien des
Herstellers (Cell Proliferation Detection Kit II, Roche) oder mit
dem H3-Thymidintest
getestet.
-
d. Zellzyklusanalyse
-
Eine
fluoreszenzaktivierte Zellsorteranalyse wurde wie folgt durchgeführt: die
Zellen (5 × 105//Platte) wurden auf Platten von 10 cm angesetzt
und mit PBS, Ad-mda7 oder Ad-Luc bei 5000 Vp/Zelle infiziert. Die Zellen
wurden durch Trypsinisierung zu festgelegten Zeiten (24, 48, 72
h nach Infizierung) geerntet und zweimal mit PBS gewaschen. Die
Zellen wurden mit 70% Ethanol fixiert, zweimal mit PBS gewaschen
und mit 500 μl
PI-Lösung
(5 μg/ml
PI und 10 μg/ml
RNase) resuspendiert. Die Zellen wurden unter Verwendung eines FASCscan-Analysegeräts analysiert.
-
e. Nachweis der Apoptose
-
Tumorzellen
wurden in Chamber Slides (Falcon) bei einer Dichte von 1 × 105 Zellen/Kammer angesetzt. Die Zellen wurden
mit Ad-mda7- oder Ad-Luc-Vektoren transduziert. An verschiedenen
Tagen nach der Infizierung wurden die Zellen auf Apoptose durch
Hoechst-33342-Färbung (Boehringer
Mannheim) und TUNEL-Färbung
(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated Biotinylated UTP
Nick End Labeling) mit Terminal Transferase (Boehringer Mannheim)
analysiert.
-
f. Immunhistochemische Färbung
-
Die
immunhistochemische Färbung
wurde bei Virus-infizierten Zellen zur Bestimmung der MDA-7-Proteinexpression
durchgeführt.
Kurz gefasst wurden Zellen (141299, A549, 14460 und NHBE) bei einer
Dichte von 1 × 105 in Chamber Slides (Falcon) plattiert und
mit Ad-mda7 oder
Ad-Luc (5000 Viren/Zelle) infiziert. 48 h später wurden die Zellen mit PBS
gewaschen und in 4% Formalin-Lösung
für 2 Minuten
fixiert. Nach Blockierung der endogenen Peroxidaseaktivität mit 0,3%
H2O2 in Methanol
für 30
Minuten wurden die Zellen mit normalem Ziegenserum für 30 Minuten
bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurden
die Slides mit polyklonalem anti-MDA-7-Antikörper aus Kaninchen (1:5000
Verdünnung)
für 60
Minuten behandelt. Nach 30 Minuten Inkubation mit sekundärem anti-Kaninchen-Antikörper (geliefert
mit ABC Kit, Vector) wurde die Expression von MDA-7 in Zellen mit DAB
durch Verstärkung
mit Avidin-Biotin-Reaktion ABC Kit detektiert. Die Slides wurden
mit Hämatoxylin
kontrastgefärbt
und dann mit Aqua-mount (Lemer Labs, Pittsburgh, PA) befestigt.
Die negativen Kontrollen schlossen nicht infizierte Zellen ein,
die sämtlichen
Färbungsverfahren
unterzogen wurden (?).
-
g. Westernblot-Analyse
-
Die
Zellen wurden durch Trypsinisierung geerntet, mit PBS gewaschen
und in 100 μl
Lysepuffer (62,5 mM Tris-HCl, 2% SDS, 10% Glycerol, 4 M Harnstoff)
resuspendiert. Die Zellextrakte wurden mit Sonikator für 30 s homogenisiert
und nach einer Stunde Inkubation auf Eis wurden die Zellextrakte
für 5 min
bei 14000 Upm bei 4°C
geschleudert. Die Zellextrakte wurden gesammelt und bei –70°C gelagert.
Die Proteinkonzentrationen von sämtlichen
Extrakten wurden unter Verwendung des Bio-Rad Kits zur Proteinbestimmung
(Bio-Rad) bestimmt. Jeweils 50 μg
Proteinproben wurden auf 20 μl
mit Lysepuffer und 5% 2-Mercaptoethanol (Bio-Rad) verdünnt und
in einem Wasserbad bei 95°C
für 5 min
erwärmt.
Dann wurden die Proteinextrakte auf einem 10% SDS-PAGE-Gel in einer
Gelelektrophoresezelle (Bio-Rad) mit senkrechter Platte aufgetrennt.
Die Proteine wurden von dem Gel auf Nitrozellulosemembran (Hybond-ECL
Membrane, Amersham International, Little Chalfont, England) überführt. Die
Proteine wurden in einer Blockierlösung (5% Trockenmilch und 0,3%
Tween 20 in PBS) für
eine Stunde bei Raumtemperatur geblockt.
-
Die
Membranen wurden mit primärem
Antikörper
und dann mit Meerretich-Peroxidasemarkierten sekundären Antikörpern inkubiert,
worauf der Einsatz des Enhanced Chemiluminescence Western Blotting
Detection System (Amersham) für
30 Sekunden gefolgt ist. Die Proteine wurden auf mit Amersham Hyperfilm
verstärktem
Chemolumineszenzfilm unter Verwendung einer zwischen 30 Sekunden
bis 30 Minuten variierenden Expositionszeit sichtbar gemacht.
-
2. Hemmung der Zellproliferation durch Überexpression
von MDA-7
-
Zur
Erfassung der MDA-7-Expression in Zellen wurden A549-, H1299-, H460-
und NHBE-Zellen
mit 5000 Vp/Zelle Ad-mda7 infiziert. Achtundvierzig Stunden später wurden
die Zellen fixiert und mit anti-MDA-7-Antikörper gefärbt. Nicht infizierte Zellen
wurden mit dem gleichen Antikörper
als Kontrollen gefärbt. Ein
hohes Niveau der MDA-7-Expression wurde im Zytoplasma von Zellen
beobachtet, während
in nicht infizierten Kontrollen keine gefärbten Zellen zu sehen waren
(14).
-
A549-,
H1299-, H460- und NHBE-Zellen wurden in 12-Lochplatten vorgelegt
und mit Ad-mda7,
Ad-Luc oder PBS behandelt. Die Zahlen der lebensfähigen Zellen
wurden von Tag 1 bis Tag 5 nach der Behandlung gezählt. Die
Infektion mit Ad-mda7 unterdrückte
signifikant die Zellproliferation in sämtlichen Tumorzellinien im Vergleich
zu den PBS- oder Ad-Luc-Kontrollen
(23).
-
Die
Zellzyklusanalyse unter Verwendung der PI-Färbung zeigte eine G2/M-Zellzyklusarretierung
in Ad-mda7-infizierten A549- und H1299-Zellen. Im Gegensatz dazu
beeinflusste die PBS- und Ad-Luc-Infektion den Zellzyklus nicht
(14).
-
Im
Anschluss an die Ad-mda7-Infektion wurden morphologische Veränderungen
bei Tumorzellen beobachtet. Diese Veränderungen, wie Abflachung und
Vergrößerung,
wurden bei sämtlichen
infizierten Zelllinien beobachtet. Apoptotische morphologische Veränderungen
wurden unter Verwendung von Hoechst 33342 sichtbar gemacht. 72 Stunden
nach der Infektion mit Ad-mda7 oder Ad-Luc wurden nukleare Verdichtung
und Fragmentierung bei Ad-mda7-infizierten A549-, H1299- und H460-Zellen
beobachtet, während
apoptotische Änderungen
bei NHBE-Zellen nicht zu sehen waren. Die TUNEL- Färbung
zeigte viele positive Zellen bei Ad-mda7-infizierten A549-Zellen,
während
sehr wenig positive Zellen bei NHBE-Zellen zu sehen waren. TUNEL-positive
Zellen waren ebenfalls sehr selten bei den mit Ad-luc behandelten
Proben.
-
Diese
Ergebnisse zeigten die signifikante Unterdrückung der Zellproliferation
mit gleichzeitiger G2/M-Zellzyklusarretierung und Induzierung von
Apoptose bei Lungenkrebs-Zelllinien.
Im Gegensatz dazu führte
bei NHBE-Zellen die Überexpression
von MDA-7 zu einer minimalen Unterdrückung der Zellproliferation,
induzierte jedoch keine Apoptose.
-
3. Hufregulation von p53 und Bax in Zellen
mit Wildtyp p53
-
Die
Zellen wurden mit Ad-mda7 und Ad-Luc infiziert und die Zellextrakte
wurden bei 24, 48 und 72 Stunden nach Infektion für die Westernblot-Analyse
geerntet. Die Zellextrakte aus unbehandelten Zellen wurden als eine
Kontrolle geerntet. Die MDA-7-Proteinexpression wurde bei sämtlichen
der Ad-mda7-infizierten Krebszellinien festgestellt. Unbehandelte
Kontrollen und Ad-Luc-infizierte Zellen zeigten überhaupt keine Expression von
MDA-7-Protein. Die
Hochregulierung von p53-Protein war bei A549- und H460-Zellen mit p53-Wildtyp nach Ad-mda7-Infektion
zu sehen. Erwartungsgemäß war keine
Expression oder Modulation von p53 in p53-deletierten H1299-Zellen
zu sehen. Ein Anstieg der BAX-Proteinkonzentrationen
wurde bei A549- und H460-Zellen (p53-Wildtyp) gezeigt, während keine
Veränderung
bei H1299-(p53-Null)Zellen beobachtet wurde. Das Expressionsniveau
von Bcl-2 war bei sämtlichen
der drei untersuchten Zelllinien unverändert. Bei der Bax-defizienten humanen
Prostatakrebs-Zelllinie DU145 waren die p53-Expressionsniveaus unverändert und
BAX wurde nicht nachgewiesen. Jedoch sprachen DU-145-Zellen auf
die Ad-mda7-Infektion an und zeigten Wachstumsarretierung und Apoptose.
p53 und bax werden von Ad-mda7 in p53-Wildtyp-Tumorzellen aufreguliert.
Außerdem
werden die Caspasen 3 und 9 und PARP durch Ad-mda7 aktiviert. Normale
Zellen zeigen keine Änderungen
bei apoptotischen Mediatoren.
-
4. Aktivierung der Caspase-Kaskade
und Spaltung von PARP
-
Westernblots
zeigten die Aktivierung der Caspase-Kaskade durch Ad-mda7-Infektion
(14B). Die Vorformen Caspase-9 und
Caspase-3 wurden gespalten und in die aktivierten/ gespaltenen Formen
48 h nach Ad-mda7-Infektion in A549- und H460-Zellen und nach 72
h in H1299-Zellen überführt. Die
Spaltung von Caspase-8 wurde nach 48 h der Ad-mda7-Infektion in A549-
und H460-Zellen gezeigt. Poly-(ADP-Ribose)Polymerase (PARP) wurde
in A549- und H460-Zellen nach 48 h in H1299-Zellen gespalten. In
Bax-defizienten DU 145-Zellen
wurden Caspase-9 und Caspase-3 nach 72 h der Ad-mda7-Infektion gespalten.
-
BEISPIEL 8: IN VIVO WIRKUNGEN VON AD-MDA7
-
1. Materialien und Verfahren
-
A. Zellkultur
-
Humane
nicht-kleinzellige Lungenkarzinomzellen A549 und H1299 wurden von
der American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, MD) bezogen.
Sämtliche
Zellen wurden in RPMI1640-Medium, enthaltend 10% fötales Kälberserum,
Antibiotika und L-Glutamin,
gehalten. Vor dem Beginn der Experimente wurde sicher gestellt,
dass die Zellen frei von Mycoplasma waren und in der log-Phase des
Wachstums verwendet wurden. Die Zellen wurden routinemäßig mit
0,125% Trypsin – 1,3
mM EDTA (GIBCO) geerntet.
-
B. Konstruktion des rekombinanten adenoviralen
Vektors
-
Replikations-defiziente
humane Typ 5 adenovirale Vektoren (Ad5), die die mda-7- oder Luc-Gene trugen, die
mit einem internen CMV-IE-Promotor verknüpft waren, der von einem SV40-Polyadenylierungs-(PA)-Signal
gefolgt wurde, wurden konstruiert und werden als Ad-mda7 bzw. Ad-luc
bezeichnet. Die Viren wurden in 293-Zellen propagiert und durch
Chromatographie gereinigt.
-
C. Färbung
apoptotischer Zellen
-
Die
Abschnitte wurden auf apoptotischen Zelltod unter Verwendung des
Kits Terminal Deoxynucleotide Transferase (Tdt) (Boehringer Mannheim)
gefärbt
und mit Methylenblau oder Methylengrün, wie beschrieben (Fujiwara
et al., 1994), kontrastgefärbt.
-
D. Westernblot-Analyse
-
Das
Westernblotting wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die
Zellen wurden durch Trypsinisierung geerntet, mit PBS gewaschen
und in 100 μl
Lysepuffer (62,5 mM Tris-HCl,
2% SDS, 10% Glycerol, 4 M Harnstoff) resuspendiert. Die Zellextrakte
wurden mit Sonikator für
30 s homogenisiert und nach einer Stunde Inkubation auf Eis wurden
die Zellextrakte für
5 min bei 14000 Upm bei 4°C
geschleudert. Die Zellextrakte wurden gesammelt und bei –70°C gelagert.
Die Proteinkonzentrationen von sämtlichen
Extrakten wurden unter Verwendung des Bio-Rad Kits zur Proteinbestimmung
(Bio-Rad) bestimmt. Jeweils 50 μg
Proteinproben wurden auf 20 μl
mit Lysepuffer und 5% 2-Mercaptoethanol (Bio-Rad) verdünnt und
in einem Wasserbad bei 95°C
für 5 min
erwärmt.
Dann wurden die Proteinextrakte auf einem 10% SDS-PAGE-Gel in einer Gelelektrophoresezelle
(Bio-Rad) mit doppelter senkrechter Platte aufgetrennt.
-
Die
Proteine wurden von dem Gel auf Nitrozellulosemembran (Hybond-ECL
Membrane) überführt. Die Proteine
wurden in einer Blockierlösung
(5% Trockenmilch und 0,3% Tween 20 in PBS) für 1 Stunde bei Raumtemperatur
geblockt. Dann wurden die Membrane mit primärem Antikörper inkubiert. Meerretichperoxidase-markierte
sekundäre
Antikörper
wurden verwendet und das Enhanced Chemiluminescence Western Blotting
Detection System (Amersham) wurde für 30 Sekunden eingesetzt und
die Proteine wurden danach auf mit Amersham Hyperfilm verstärktem Chemolumineszenzfilm
unter Verwendung einer von 30 s bis 30 min variierenden Expositionszeit
sichtbar gemacht.
-
E. Evaluierung von Tumorwachstum und Behandlungen
in vivo
-
Vor
dem Beginn sämtlicher
Experimente, die subkutanes Tumorwachstum und Behandlungen enthielten,
wurden nu/nu Mäuse
unter Verwendung einer Cäsiumquelle
zur Verbesserung der Tumoraufnahme bestrahlt (3,5 Gy). Bei sämtlichen
Experimenten wurden 5 × 106 Tumorzellen (H1299, A549), suspendiert
in 100 μl
steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), in die rechte dorsale
Seite injiziert. Bei Erreichen des Tumors einer Größe von 50–100 mm3 wurden die Tiere in drei Gruppen (n = 8
Tiere/Gruppe) randomisiert und die Behandlung wie folgt gestartet.
Die Gruppe 1 erhielt keine Behandlung, die Gruppe 2 erhielt Ad-Luc
(5 × 109 Vp/Dosis) und die Gruppe 3 erhielt Ad-mda-7
(5 × 109 Vp/Dosis) jeden zweiten Tag für insgesamt
drei Dosen. Intratumorale Injektionen wurden bei Betäubung unter
Verwendung von Methoxyfluran (Schering Plough, Kenilworth, NJ) gemäß den institutionellen
Richtlinien durchgeführt.
Tumormessungen wurden an jedem anderen Tag ohne Kenntnis der Behandlungsgruppe
aufgezeichnet und das Volumen wurde unter Verwendung der Formel
V (mm3) = a × b2/2
berechnet, worin "a" die größte Abmessung
ist und "b" der senkrechte Durchmesser
ist. Die Daten der Antitumorwirksamkeit sind als kumulative Tumorvolumina
für sämtliche
Tiere in jeder Gruppe dargestellt, um sowohl Größe als auch Anzahl der Tumore
zu berücksichtigen.
-
F. Immunhistochemische Analyse
-
Die
in Nacktmäusen
subkutan erzeugten Tumore wurden entnommen und in 10% gepuffertem
Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und als Schnitte mit einer
Dicke von 4 μm
geschnitten. Die Schnitte wurden auf mda-7-Genexpression gefärbt. Kurz
gefasst wurden die Gewebeschnitte mit 0,3% H2O2 in Methanol für 30 Minuten zur Blockierung
der endogenen Peroxidaseaktivität
behandelt und danach mit normalem Ziegenserum für 30 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Slides mit
polyklonalem anti-MDA-7-Antikörper
aus Kaninchen (1:5000 Verdünnung)
für 60
Minuten behandelt. Nach 30 Minuten Inkubation mit sekundärem anti-Kaninchen-Antikörper (geliefert
mit ABC Kit, Vector) wurde die Proteinexpression von MDA-7 in Gewebe
mit DAB durch Verstärkung
mit Avidin-Biotin-Reaktion ABC Kit detektiert. Die Slides wurden
mit Hämatoxylin
kontrastgefärbt
und dann mit Aqua-mount (Lemer Labs, Pittsburgh, PA) befestigt.
Die Anzahl der auf MDA-7 positiv gefärbten Tumorzellen wurde unter
einem Hellfeld-Mikroskop analysiert und unter Verwendung von Bildanalyse
und Statpro Software blind quantifiziert. Insgesamt wurden mindestens
fünf Felder
pro Probe analysiert.
-
G. TUNEL-Färbung
-
Die
aus subkutanen Tumoren erhaltenen Gewebeschnitte wurden auf apoptotischen
Zelltod unter Verwendung des Terminal Deoxynucleotide Transferase
Kits (Tdt) (Boehringer Mannheim) gefärbt. Bei sämtlichen Färbungsverfahren wurden entsprechende
negative Kontrollen eingeschlossen. Die Anzahl der auf TUNEL positiv
gefärbten
Tumorzellen wurde unter einem Hellfeld-Mikroskop analysiert und
unter Verwendung von Bildanalyse und Statpro Software blind quantifiziert.
Insgesamt wurden mindestens fünf
Felder pro Probe analysiert.
-
H. Statistische Auswertung
-
Die
statistische Signifikanz der experimentellen Ergebnisse wurde unter
Verwendung des t-Tests
nach Student für
Tumormessungen berechnet.
-
2. In vivo Unterdrückung von örtlichem Tumorwachstum durch
Ad-mda7
-
Die
therapeutische Wirkung des mda-7-Gens auf subkutane H1299- und A549-Tumore
wurde bei Nacktmäusen
untersucht. Mäuse,
die beide Tumorzelltypen (H1299 und A549) trugen, wurden in drei
Gruppen aufgeteilt, wobei eine keine Behandlung, eine Behandlung
mit Ad-Luc und eine
Behandlung mit dem Ad-mda-7 täglich
für insgesamt
drei Dosen (5 × 109 Viren/Dosis) erhielt. Eine signifikante
Wachstumsinhibition von H1299-Tumoren und A540-Tumoren wurde bei Mäusen, die mit dem Ad-mda-7
behandelt wurden, im Vergleich zu den Tumorwachstum in den beiden
Kontrollgruppen für
jeden Tumortyp beobachtet.
-
Ein
weiterer Beleg dafür,
dass die beobachtete therapeutische Wirkung durch die mda-7-Genexpression bedingt
war, wurde durch Entfernen von subkutanen Tumoren 48 Stunden nach
Injektion und ihre Analyse mittels Immunhistochemie erhalten. Die
mda-7-Genexpression
wurde in Tumorzellen bei Tieren, die das Ad-mda7 erhielten, im Vergleich
zu keiner positiven Färbung
in Kontrolltumoren, die entweder nicht behandelt oder mit Ad-Luc
behandelt waren, beobachtet.
-
Die
MDA-7-Genexpression in situ führt
zu apoptotischem Zelltod durch Aktivierung von Caspase-3 und Apo2/TRAIL.
Zum Verständnis
des Mechanismus der von mda-7 vermittelten Tumorhemmung wurden subkutane
Tumore, die 48 Stunden nach der letzten Behandlung entnommen wurden,
auf apoptotischen Tumorzelltod durch TUNEL-Färbung analysiert. Tumore aus
Kontrollmäusen,
die entweder unbehandelt oder mit Ad-Luc behandelt waren, zeigten
einen minimalen apoptotischen Zelltod während Tumore aus Tieren, die
mit Ad-mda-7 behandelt
waren, eine weitgehende Apoptose zeigten.
-
Da
Apoptose durch die Aktivierung von Caspasen vermittelt wird, wurden
Tumorgewebe auf Caspase-3, eine nachgeschaltete Caspase, untersucht.
Die aktivierte Form von Caspase-3 wurde in Geweben beobachtet, die
mit Ad-mda-7 behandelt waren, während
keine Aktivierung von Caspase-3 in den Geweben aus Kontrollmäusen beobachtet
wurde. Ebenso wurde die Aktivierung von Apo2/TRAIL in mda-7 exprimierenden Tumoren
beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde die TRAIL-Expression in Tumoren,
die nicht behandelt oder mit Ad-luc
behandelt waren, nicht beobachtet.
-
3. Ergebnisse der MDA-7-Expression bei
Aufregulation von costimulierenden Molekülen
-
Die
Fähigkeit
von sterbenden Tumorzellen zur Aktivierung von costimulierenden
Molekülen,
B7 und ICAM in situ wurde untersucht. Subkutane Tumore, die mit
Ad-MDA7 oder Ad-Luc injiziert wurden, wurden 48 h nach der letzten
Dosis geerntet und mittels Immunhistochemie analysiert. Die Expression
von B7 (7.1 und 7.2) und ICAM wurde bei Tumoren beobachtet, die
MDA-7 exprimierten, während
keine Expression bei Tumoren beobachtet wurde, die mit Ad-Luc behandelt
waren.
-
4. Expression von MDA-7 in in situ Tumor
hemmt Angiogenese
-
Zur
weiteren Bestimmung der Tumor-unterdrückenden Wirkungen von mda-7
wurden subkutane Tumore auf CD31-Expression, ein zur Identifizierung
von Angiogenese in Tumoren häufig
verwendeter Marker, analysiert. Mit Ad-mda-7 behandelte subkutane
Tumore zeigten eine geringere Anzahl von Blutgefäßen im Vergleich zu Tumoren,
die mit Ad-luc behandelt wurden, oder zu nicht behandelten Gruppen.
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BEISPIEL 9: EFFIZIENZ VON AD-MDA7 ZUR
VERHINDERUNG METASTATISCHER VERBREITUNG EINES TUMORS
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Experimente
haben gezeigt, dass Ad-mda7 die metastatische Verbreitung von Lungenkrebstumoren in
vivo hemmen kann. Weitere Experimente wurden unter Verwendung von
Melanom-Zelllinien durchgeführt, um
die Fähigkeit
von MDA-7 zur Verhinderung der metastatischen Verbreitung von Melanomtumoren
zu bewerten. Die vorstehend erläuterten
Verfahren und Protokolle wurden verwendet.
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Humane
Melanom-Xenografts wurden durch subkutane Injektion von humanen
Melanomzellen (1 × 106 Zellen) in die Seiten von Nacktmäusen hergestellt.
TXM-1- oder TXM-18-Zellen können
verwendet werden. Sobald der Tumor einen mittleren Durchmesser von
5 mm erreichte, wurden steigende Dosen von Ad-mda7 oder Kontroll-Ad-luc
in die Tumore injiziert. Dosen von 3 × 107 bis
3 × 109 pfu wurden getestet. Der adenovirale Vektor
wurde in drei Injektionen von etwa 33 ml, insgesamt 100 ml, intraläsional abgegeben.
Jede Injektion wurde senkrecht zu der vorhergehenden Injektion ausgerichtet,
um eine wirksame Beladung des Tumors sicherzustellen. Nach Erreichen
der zweckmäßigen Dosis
wurde die Tumor-Xenografts mit einer einzigen Dosis von 100 ml oder
mehreren 100 ml gleich kommenden Teildosen über eine Zeitperiode von drei
Tagen behandelt, um die Wirksamkeit der beschriebenen Verabreichungregime
zu bewerten. Im Anschluss an diese Untersuchungen wurde ein Vergleich
zwischen Einzeldosis-Verabreichung gegenüber Mehrfachdosis-Verabreichung durchgeführt, wobei
eine Dosis als eine Injektion von 100 ml der zuvor optimierten Konzentrationen
in pfus definiert wurde. Die Effizienzuntersuchungen bestanden aus
der Behandlung von Tumor-Xenografts, worauf die etablierten adenoviralen
Konzentrationen und das Behandlungsregime für 3 bis 5 Tage folgten. Die Wirksamkeit
wurde durch die Verringerung der Tumorgröße bewertet. Die Tumorgröße wurde über die
direkte Messung der Tumordurchmesser bestimmt.
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Ad-mda7-behandelte
Tumore wurden auf die Expression von MDA-7-Protein und Induktion
der Apoptose untersucht. Der immunhistochemische Nachweis von MDA-7
und der Nachweis von Apoptose mit TUNEL-Test wurden zur Untersuchung
der Effizienz von Ad-mda7-Behandlung
auf der zellulären
Ebene verwendet. Ein MDA-7-Antikörper,
der MDA-7-Protein
spezifisch erkennt, wurde für
immunhistochemische Verfahren verwendet. Endothelzellen in den Melanom-Xenografts
wurden mit gegen Maus-CD-31 gerichteten Antikörpern nachgewiesen. Die Bereiche
der Tumorschnitte mit einer großen
Anzahl von Kapillaren und kleinen Venen wurden durch Abtastung der
Schnitte bei geringer Stärke
(× 40
und × 100)
gefunden. Bei diesen Bereichen wurden einzelne Gefäße in Vergrößerungsfeldern
von × 200
gezählt
und Durchschnittswerte wurden für
die behandelten und unbehandelten Tumorproben aufgezeichnet. Dieses
Verfahren wurde zum Vergleich der Blutverteilung und -dichte in
humanen Xenografts bei Nacktmäusen
verwendet (Yoneda et al., 1998).
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BEISPIEL 10: MODULATION VON WACHSTUMSFAKTOREN
WÄHREND
EKTOPISCHER EXPRESSION VON MDA-7
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Auf
Grund der aufgestellten Hypothese, dass MDA-7 über eine autokrine/parakrine
Aktivität
verfügt, wurde
die Wirkung von Ad-mda7 auf Melanomzellen hinsichtlich der Sezernierung
von Faktoren untersucht, die bei der Progression eines Melanoms
beteiligt sind. ELISA-Tests wurden verwendet, um die Freisetzung
von diesen löslichen
Mediatoren, wie verschiedene Typen von TGF-β1, IL-8, IL-10 und bFGF anzugehen.
Die Melanom-Zelllinien und normalen Zellen wurden mit Ad-mda7, Ad-luc
oder Verdünnungskontrolle
behandelt und danach auf Modulation von Wachstumsfaktorkonzentrationen
im Kulturüberstand
nach 24–48
Stunden beobachtet. Immunblotting der Lysate kann ebenfalls zu unterschiedlichen
Zeiten nach der Behandlung durchgeführt werden.
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BEISPIEL 11: AD-MDA7 VERBESSERT DIE AKTIVITÄT VON HERCEPTIN
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Die
Brustkrebs-Zelllinien SkBr3 (Her2+) und MCF-7 (Her2-) wurden beide
von ATCC bezogen. Die Zellen wurden bei einer Dichte von 1000 Zellen/Vertiefung
in Nunc 2-Kammerobjektträger plattiert
und in DMEM-Medium mit 10% FBS propagiert. Am darauf folgenden Tag
wurden die Zellen nicht behandelt oder mit Ad-mda7 (bei steigenden
MOIs: 0, 500, 1000 und 2000 Vp/Zelle) ohne (M-Reihe) oder mit Herceptin (M+H-Reihe)
mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml
behandelt. Die Zellen wurden nach 3 Stunden gewaschen und Wachstumsmedium
(mit oder ohne Herceptin, wie angegeben) wurde ausgetauscht. Drei
Tage später
wurden lebensfähige
Zellen unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlusstests (durchschnittlich
3–4 Felder)
gezählt
und aufgetragen, wie in der 15 gezeigt
ist. Herceptin alleine führt
zu etwa 12% toten Zellen bei beiden Zelllinien. Jedoch zeigte sich,
dass Ad-mda7 die
Abtötungswirkung
von Herceptin bei Brustkrebs-Zelllinien verbesserte.
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LITERATURHINWEISE
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Die
folgenden Druckschriften sind hierin speziell durch Bezugnahme in
dem Maße
mit eingeschlossen als sie beispielhafte verfahrensbezogene Einzelheiten
odere andere Einzelheiten zusätzlich
zu den hierin ausgeführten
bereitstellen.
- U.S.-Patentschrift
4 682 195 , ausgegeben am 21. Juli 1987
- U.S.-Patentschrift 4 683
202 , ausgegeben am 28. Juli 1987
- U.S.-Patentschrift 4 979
368 , ausgegeben am 10. Januar 1989
- U.S.-Patentschrift 5 139
941 , ausgegeben am 18. August 1992
- U.S.-Patentschrift 5 399
363 , ausgegeben am 21. März 1995
- U.S.-Patentschrift 5 466
468 , ausgegeben am 14. November 1995
- U.S.-Patentschrift 5 543
158 , ausgegeben am 6. August 1996
- U.S.-Patentschrift 5 633
016 , ausgegeben am 27. Mai 1997
- U.S.-Patentschrift 5 641
515 , ausgegeben am 24. Juni 1997
- U.S.-Patentschrift 5 645
897 , ausgegeben am 8. Juil 1997
- U.S.-Patentschrift 5 705
629 , ausgegeben am 6. Januar 14. April 1998
- U.S.-Patentschrift 5 798
339 , ausgegeben am 25. August 1998
- U.S.-Patentschrift 5 824
311 , ausgegeben am 20. Oktober 1998
- U.S.-Patentschrift 5 824
348 , ausgegeben am 20. Oktober 1998
- U.S.-Patentschrift 5 830
880 , ausgegeben am 3. November 1998
- U.S.-Patentschrift 5 846
225 , ausgegeben am 8. Dezember 1998
- U.S.-Patentschrift 5 846
233 , ausgegeben am 8. Dezember 1998
- U.S.-Patentschrift 5 846
945 , ausgegeben am 8. Dezember 1998
- U.S.-Patentschrift 5 801
005 , ausgegeben am 1. September 1998
- EP 266 032
- WO 9828425
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