DE60038508T2

DE60038508T2 - Methoden zur behandlung von hyperproliferativen krankheiten mit menschlichem mda-7

Info

Publication number: DE60038508T2
Application number: DE60038508T
Authority: DE
Inventors: Abner Houston MHASHILKAR; Bob Schrock; Sunil Chada
Original assignee: Introgen Therapeutics Inc
Current assignee: Introgen Therapeutics Inc
Priority date: 1999-07-15
Filing date: 2000-07-13
Publication date: 2009-04-30
Anticipated expiration: 2020-07-14
Also published as: AU6349400A; WO2001005437A3; EP1307234A2; CA2379171A1; DE60038508D1; WO2001005437A2; EP1307234B1; ATE390937T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
A. GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Gentherapie. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Verabreichung einer therapeutischen Nukleinsäure zur Behandlung von hyperproliferativen Krankheiten, wie in den Ansprüchen ausgeführt. Bei einer Ausführungsform betrifft die Erfindung die Expression einer Nukleinsäure, die eine verkürzte Form des menschlichen MDA-7(mda7^TF)-Proteins codiert, zur Behandlung von hyperproliferativen Krankheiten, während die Erfindung bei anderen Ausführungsformen die Volllängenform des menschlichen MDA-Polypeptids zur Behandlung von hyperproliferativen Krankheiten umfasst.
B. BESCHREIBUNG DER VERWANDTEN TECHNIK
1. Gentherapie
Die Gentherapie ist ein in der biomedizinischen Forschung auftretenden Gebiet, das sich auf die Krankheitsbehandlung durch das Einschleusen von therapeutischen rekombinanten Nukleinsäuren in somatische Zellen von Patienten konzentriert. Verschiedene klinische Versuche unter Anwendung von Gentherapien wurden bereits gestartet und umfassen die Behandlung verschiedener Krebse, von AIDS, zystischer Fibrose, Adenosindesaminasemangel, Herz-Kreislauf-Erkrankung Gaucher-Krankheit, rheumatoider Arthritis und anderen. Derzeit ist das Adenovirus das bevorzugte Vehikel zur Abgabe von gentherapeutischen Mitteln. Vorteile in der Verwendung von Adenovirus als ein gentherapeutisches Mittel sind die hohe Transduktionseffizienz, die Infektion von sich nicht teilenden Zellen, die leichte Manipulation seines Genoms und die geringe Wahrscheinlichkeit nicht homologer Rekombination mit dem Wirtsgenom.
Die vorliegende Erfindung beschreibt eine neue Nukleinsäure, die eine verkürzte Form von menschlichem MDA-7 (mda7^TF) codiert, zur Behandlung von hyperproliferativer Krankheit in Menschen.
Außerdem beschreibt die Erfindung auch eine Nukleinsäure, die eine lösliche Form des MDA-7-Proteins codiert, und Anwendungen davon.
2. MDA-7
Die cDNA, die das MDA-7-Protein codiert, wurde bereits von Jiang et al., 1995 ( WO 9511986 ) beschrieben. Das von der mda-7 cDNA codierte Protein wurde als ein potentieller Regulator der Melanomprogression erkannt. Jiang et al. verwendeten eine subtraktive Hybridisierungstechnik (Jiang et al., 1995) zur Identifizierung von Genen, die an der Regulierung des Wachstums und der Differenzierung in menschlichen Melanomzellen beteiligt sind. Eine cDNA-Bibliothek, die durch Subtraktionshybridisierung von cDNAs hergestellt wurde, die aus aktiv proliferierenden menschlichen HO-1 Melanomzellen hergestellt wurden, die aus Interferon-beta (IFN-β) und Mezerin-differenzierten menschlichen HO-1 Melanomzellen hergestellt wurden, wurde zur Identifizierung mehrerer Melanomdifferenzierung-assoziierter (mda) cDNAs, einschließlich von mda-7, verwendet. Die Expression von mda-7 mRNA steht zu der Melanomprogression in ungekehrter Relation, wie gezeigt durch erhöhte mRNA-Spiegel in normalen Melanozyten im Vergleich zu primären und metastatischen Melanomen, sowie durch herabgesetzte mda-7 mRNA Expression in frühen vertikalen Wachstumsphasen-Melanomzellen, die zur verstärkten Tumorbildung in Nacktmäusen gewählt werden.
Die mda-7 cDNA codiert ein neues, evolutionär konserviertes Protein von 206 Aminosäuren mit einer vorausberechneten Größe von 23,8 kDa. Die hergeleitete Aminosäuresequenz enthält eine hydrophobe Spanne von etwa der Aminosäure 26 bis 45, die Merkmale einer Signalsequenz aufweist. Die Proteinsequenz zeigt keine signifikante Aminosäure-Sequenzhomologie mit bekannten Proteinen oder Proteinmotiven, mit Ausnahme einer 42-Aminosäure-Spanne, die zu 54% mit Interleukin 10 (IL-10) identisch ist. Die von Bazan et al. durchgeführte Strukturanalyse hat bestimmt, dass mda-7 (IL-BKW oder IL-20) die Strukturmerkmale der Zytokinfamilie zeigt ( WO 9828425 ). Die Strukturmerkmale und die eingeschränkte Identität über eine kleine Spanne von Aminosäuren legt für MDA-7 eine extrazelluläre Funktion nahe.
Zusätzliche Studien haben gezeigt, dass eine erhöhte Expression von MDA-7 Krebszellenwachstum in vitro unterdrückte und selektiv Apoptose in menschlichen Brustkrebszellen auslöste, sowie die Tumorigenizität in Nacktmäusen hemmte (Jiang et al., 1996; Su et al., 1998). Jiang et al. (1996) berichten über Befunde, dass MDA-7 ein potentes wachstumsunterdrückendes Gen in Krebszellen diverser Ursprünge ist, einschließlich Brust-, Zentralnervensystem-, Cervix-, Dickdarm-, Prostata- und Bindegewebe. Ein Kolonien-Hemmtest wurde eingesetzt, um zu zeigen, dass die erhöhte Expression von mda-7 die Wachstumsinhibition in menschlichem Zervikalkarzinom (HeLa), menschlichem Brustkarzinom (MCF-7 und T47D), Dickdarmkarzinom (LS174T und SW480), Nasopharyngealkarzinom (HONE-1), Prostatakarzinom (DU-145), Melanom (HO-1 und C8161), multiformem Glioblastom (GBM18 und T98G), und Osteosarkom (Saos-2) verstärkte. Eine MDA-7-Überexpression in normalen Zellen (HMECs, HBL-100 und CREF-Trans6) zeigte eingeschränkte Wachstumsinhibition, die angibt, dass mda-7 Transgeneffekte in normalen Zellen nicht manifest sind. Zusammenfassend ist die Wachstumsinhibition durch eine erhöhte Expression von MDA-7 in vitro in Krebszellen wirksamer als in normalen Zellen.
Su et al. (1998) berichteten über Untersuchungen hinsichtlich des Mechanismus, durch den MDA-7 das Krebszellenwachstum unterdrückte. Die Untersuchungen berichteten, dass eine ektopische Expression von MDA7 in den Brustkrebszelllinien MCF-7 und T47D Apoptose auslöste, wie durch Zellzyklusanalyse und TUNEL-Essay nachgewiesen, ohne eine Wirkung auf normale HBL-100-Zellen. Die Western-Blot-Analyse von Zelllysaten aus mit Adenovirus mda-7 („Ad-mda-7") infizierten Zellen zeigte eine Aufregulierung des Apoptosestimulierenden Proteins BAX. Die Ad-mda7-Infektion erhöhte die Niveaus von BAX-Protein nur in MCF-7- und T47D-Zellen und nicht in normalen HBL-100- oder HMEC-Zellen.
Das Bax-Gen spielt bei der Auslösung der Apoptose eine bedeutende Rolle. Steigerungen in der Bax-Transkripition können zum Teil für den p53-regulierten Weg der Apoptose-Induktion verantwortlich sein (Miyashita et al., 1995). Die Überexpression von BAX und eine Zunahme in dem Bax/Bcl-2-Proteinverhältnis führt zu einer Dissipation von mitochondrialem Membranpotential und zur Freisetzung von Zytochrom c (Rosse, 1998). Das BAX-Protein bindet direkt an den mitochondrialen Porinkanal (spannungsabhängiger Anionenkanal VDAC genannt) und gestattet es dem Cytochrom c, den VDAC zu passieren (Shimizu et al., 1999). Cytochrome-c komplexiert mit Apaf-1, und dieser Komplex spaltet und aktiviert Caspase-9, eine Initiator-Caspase. Die Caspase-Kaskade wird von dieser Initiator-Caspase aktiviert. Bei einigen beschriebenen Wegen des Zelltodes spielen die Caspase- und Bcl-2-Proteinfamilien eine Schlüsselrolle bei der Regulierung und Ausführung der Apoptose.
Auf der Grundlage der ermittelten Wechselwirkungen unter den bekannten Mediatoren der Apoptose tauchten drei klassische Wege der apoptotischen Signalgebung in der Säugerzelle auf (Dragovich, 1998). Der erste wird durch den Abzug von Wachstumsfaktoren gestartet und wird durch die Bcl-2-Familie von Proteinen reguliert. Dieser Weg führt zur Cytochrom-c-Freisetzung aus Mitochondrien, zur Aktivierung von Apaf-1 und zur Auslösung der Caspase-Kaskade. Der andere, gut ermittelte Apoptoseweg umfasst die Signalgebung durch Zelloberflächentod-Rezeptoren, wie TNF oder Fas, die, über Adaptermoleküle, Caspasen rekrutieren und aktivieren können. Der dritte und letzte gut charakterisierte Weg wird durch DNA-Schädigung ausgelöst. Diese wird zum Teil durch Proteine, wie p53 und ATM, reguliert. Bei allen dreien von diesen Wegen des Zelltodes spielt die Caspase- und Bcl-2-Proteinfamilie eine Schlüsselrolle bei der Regulierung und Ausführung der Apotose.
3. Krebs
Die normale Gewebe-Homöostase ist ein hoch regulierter Prozess von Zellproliferation und Zelltod. Ein Ungleichgewicht entweder von Zellproliferation oder Zelltod kann sich zu einem kanzerösen Zustand entwickeln (Solyanik et al., 1995; Stokke et al., 1997; Mumby and Walter, 1991; Natoli et al., 1998; Magi-Galluzzi et al., 1998). Beispielsweise sind Zervikal-, Nieren-, Lungen-, Pankreas-, Kolorektal- und Gehirnkrebs nur einige wenige Beispiele der vielen Krebse, die die Folge sein können (Erlandsson, 1998; Kolmel, 1998; Mangray and King, 1998; Gertig and Hunter, 1997; Mougin et al., 1998). In der Tat ist das Auftreten von Krebs so hoch, dass dem Krebs allein in den USA über 500.000 Tote pro Jahr zuzuschreiben sind.
Die Aufrechterhaltung von Zellproliferation und Zelltod wird zumindest teilweise durch Proto-Onkogene reguliert. Ein Proto-Onkogen kann Proteine, die Zellproliferation auslösen (z. B. sis, erbB, src, ras und myc), Proteine, die die Zellproliferation hemmen (z. B. Rb, p16, p19, p21, p53, NF1 und WT1), oder Proteine, die den programmierten Zelltod regulieren (z. B. bcl-2) codieren (Ochi et al., 1998; Johnson and Hamdy, 1998; Liebermann et al., 1998). Allerdings führen genetische Umlagerungen oder Mutationen an diesen Proto-Onkogenen zur Konversion eines Proto-Onkogens zu einem potenten Krebs-verursachenden Onkogen. Oft genügt eine einzige Punktmutation zur Transformation eines Proto-Onkogens zu einem Onkogen. Beispielsweise führt eine Punktmutation in dem p53-Tumorsuppressor-Protein zum vollständigen Verlust der Wildtyp-p53-Funktion (Vogelstein and Kinzler, 1992; Fulchi et al., 1998) und zur Akquisition einer „dominanten" Tumor-Promotionsfunktion.
Derzeit gibt es wenige wirksame Möglichkeiten zur Behandlung der vielen allgemeinen Krebstypen. Der Verlauf der Behandlung für ein gegebenes Individuum hängt von der Diagnose, dem Zustand, zu dem sich die Krankheit entwickelt hat, und von Faktoren, wie Alter, Geschlecht und allgemeine Gesundheit des Patienten, ab. Die häufigsten Möglichkeiten der Krebsbehandlung sind Operation, Strahlungstherapie und Chemotherapie. Die Operation sielt bei der Diagnose und Behandlung von Krebs eine zentrale Rolle. Typischerweise ist ein operativer Ansatz zur Biopsie und zur Entfernung von kanzerösem Wachstum erforderlich. Wenn allerdings der Krebs metastasiert hat und weit verbreitet ist, führt eine Operation wahrscheinlich nicht zu einer Heilung, und es muss ein alternativer Ansatz herangezogen werden. Strahlungstherapie, Chemotherapie und Immuntherapie sind Alternativen zur operativen Behandlung von Krebs (Mayer, 1998; Ohara, 1998; Ho et al., 1998). Strahlungstherapie umfasst ein exaktes Ausrichten von hochenergetischer Strahlung zur Zerstörung von Krebszellen, und genau wie eine Operation ist sie hauptsächlich bei der Behandlung von nicht-metastasierten, lokalisierten Krebszellen wirksam. Nebenwirkungen der Strahlungstherapie umfassen Hautreizung, Schluckbeschwerden, Mundtrockenheit, Nausea, Diarrhö, Haarausfall und Energieverlust (Curran, 1998; Brizel, 1998).
Die Chemotherapie, die Behandlung von Krebs mit Antikrebsarzneimitteln, ist ein weiterer Modus der Krebstherapie. Die Wirksamkeit einer gegebenen Antikrebs-Arzneimitteltherapie ist oft durch die Schwierigkeit des Erzielens einer Arzneimittelabgabe überall in soliden Tumoren eingeschränkt (el-Kareh and Secomb, 1997). Chemotherapeutische Strategien beruhen auf dem Tumorgewebewachstum, wobei das Antikrebsarzneimittel auf die sich schnell teilenden Krebszellen abzielt. Die meisten chemotherapeutischen Ansätze umfassen die Kombination von mehr als einem Antikrebsarzneimittel, von dem bewiesen wurde, dass es die Reaktionsrate einer breiten Varietät von Krebsen steigert ( US-Patentschrift 5,824,348 , US-Patentschrift 5,633,016 und US-Patentschrift 5,798,339 ). Eine hauptsächliche Nebenwirkung der chemotherapeutischen Arzneimittel besteht darin, dass sie auch normale Gewebezellen befallen, wobei die Zellen, die am wahrscheinlichsten befallen werden, diejenigen sind, die sich schnell teilen (z. B. Knochenmark, Gastrointestinaltrakt, Reproduktionssystem und Haarfollikel). Weitere toxische Nebenwirkungen von chemotherapeutischen Arzneimitteln sind Wunden im Mund, Schluckbeschwerden, Mundtrockenheit, Nausea, Diarrhö, Erbrechen, Müdigkeit, Blutung, Haarausfall und Infektion.
Die Immuntherapie, ein sich schnell entwickelndes Gebiet in der Krebsforschung, ist noch eine andere Möglichkeit der Behandlung bestimmter Typen von Krebsen. Beispielsweise identifiziert das Immunsystem Tumorzellen als fremd, und somit werden sie ein Ziel der Zerstörung durch das Immunsystem. Leider reicht die Reaktion typischerweise nicht aus, um den größten Teil des Tumorwachstums zu verhindern. Allerdings wurde neuerdings ein Schwerpunkt im Bereich der Immuntherapie auf die Entwicklung von Verfahren gelegt, die den natürlichen Abwehrmechanismus des Immunsystems steigern oder ergänzen. Beispiele für Immuntherapien, die derzeit in der Erforschung oder in Gebrauch sind, sind Immunadjuvanzien (z. B. Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum, Dinitrochlorbenzol und aromatische Verbindungen) ( US-Patentschrift 5,801,005 ; US-Patentschrift 5,739,169 ; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998), Zytokintherapie (z. B. Interferone α, β und γ; IL-1, GM-CSF und TNF) (Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998) Gentherapie (z. B. TNF, IL-1, IL-2, p53) (Qin et al., 1998; Austin-Ward and Villaseca, 1998; US-Patentschrift 5,830,880 und US-Patentschrift 5,846,945 ) und monoklonale Antikörper (z. B. Anti-Gangliosid GM2, anti-HER-2, Anti-p185) (Pietras et al., 1998; Hanibuchi et al., 1998; US-Patentschrift 5,824,311 ).
Wie vorstehend erwähnt, spielen Tumorsuppressoren in der Krebsbiologie eine bedeutende Rolle. Von diesen ist das p53-Tumorsuppressor-Proto-Onkogen zur Aufrechterhaltung des nicht-tumorigenen Phänotyps von Zellen essentiell (Übersicht von Soddu und Sacchi, 1998). Es wurde festgestellt, dass ungefähr 50% aller Krebse mit Mutationen des p53-Gens zusammenhängen, was zum Verlust der p53-Tumorsuppressor-Eigenschaften führt (Levine et al., 1991; Vogelstein and Kinzler, 1992; Hartmann et al., 1996a; Hartmann et al., 1996b). Mutationen in dem p53-Gen führen auch zur Stabilisierung des p53-Proteins in Zellen mit gleichzeitiger Überexpression von p53-Protein. In normalen Zellen ist das p53-Protein im Allgemeinen aufgrund seiner hohen Umsatzrate nicht nachweisbar. Die hohe Inzidenz von mit Krebs zusammenhängenden Mutationen in dem p53-Gen hat viele Forschergruppen ermutigt, p53 als einen Weg der Krebsbehandlung über Genersatz zu untersuchen. Es hat sich gezeigt, dass Ad-mda7 das Wachstum von Krebszellen unterdrückt, die p53-Wildtyp, p53-Null und p53-mutiert sind. Auch gibt die Aufregulierung des Apoptose-verwandten bax-Gens an, dass MDA-7 in der Lage ist, p53-unabhängige Mechanismen zur Induktion der Zerstörung von Krebszellen zu verwenden. Diese Merkmale legen nahe, dass MDA-7 ein breites therapeutisches Potential als antiproliferatives Mittel besitzt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Darum ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein alternatives Medikament zur Behandlung eines Patienten mit Krebs bereitzustellen. Das Ziel wurde durch Bereitstellen als ein Medikament einer therapeutischen Nukleinsäure, wie DNA, gelöst, die entweder ein Volllängen- oder ein verkürztes menschliches MDA-7-Protein oder Polypeptid unter der Kontrolle eines Promotors codiert, der in eukaryotischen Zellen funktionsfähig ist, wobei das Medikament in Kombination mit mindestens einer anderen Antikrebsbehandlung verabreicht wird, wobei die Antikrebsbehandlung Chemotherapie ist, wobei die Chemotherapie ein DNA-schädigendes Mittel, Tamoxifen oder Herceptin umfasst. Die therapeutische Nukleinsäure besteht aus einer Expressionskassette oder einen Konstrukt, welches ein Nukleinsäuremolekül ist, das in der Lage ist, die Expression von mindestens einem Teil der Nukleinsäuresequenz zu ermöglichen. Bei den erfindungsgemäßen Anwendungen ist der Patient vorzugsweise ein Mensch. Die Sequenz eines Volllängen-MDA-7-Polypeptids ist in der SEQ ID. NO: 2 bereitgestellt. Eine verkürzte Version von MDA-7 würde einen Teil oder Teile von zusammenhängenden Aminosäureregionen der Volllängensequenz, wie in den Ansprüchen spezifiziert, umfassen, würde allerdings nicht die gesamte Sequenz enthalten. Die verkürzte Version kann durch eine beliebige Anzahl von zusammenhängenden Aminosäuren an jeder beliebigen Stelle in dem Polypeptid verkürzt sein.
Die Anwendungen zur Behandlung eines Patienten mit Krebs bei der vorliegenden Erfindung umfassen die Übertragung einer Nukleinsäure, die entweder eine Volllängen- oder eine verkürzte Form des menschlichen MDA-7-Proteins oder Polypeptids codiert. Nach der Verabreichung der Nukleinsäure an einen Patienten mit Krebs wird die Nukleinsäure, unter Kontrolle eines in eukaryotischen Zellen aktiven Promotors, durch hyperproliferative Zellen exprimiert, wodurch der Wachstumsstopp oder die Apoptose dieser Zellen stimuliert wird. Alternativ kann die Nukleinsäure, die alles oder einen Teil eines MDA-7-Proteins codiert, in normalen, d. h. nicht-hyperproliferativen Zellen exprimiert und sezerniert werden, um eine Bystander-Aktivität zu erzielen, wobei benachbarte hyperproliferative Zellen von MDA-7 befallen werden. Es wird somit davon ausgegangen, dass Zellen, die nicht hyperproliferativ (nicht-hyperproliferative Zellen) sind, wie normale oder nicht-kanzeröse Zellen (d. h. Zellen, die keine Merkmale des ungeregelten kanzerösen Zellwachstums aufweisen) eine Population von MDA-7-Protein exprimieren können, wovon etwas zu einer sezernierbaren Form prozessiert wird, die sezerniert und von nicht-transduzierten (oder nicht transfizierten) Zellen, die in der Nähe sind, aufgenommen wird. Nicht-transduzierte oder nicht-transfizierte Zellen sind Zellen, die die endogene Expressionskassette nicht internalisiert haben, und dadurch exprimieren solche Zellen nicht das durch sie codierte Polypeptid. Nicht-transfizierte Zellen könnten hyperproliferative oder nicht-normale Zellen einschließen, die eine sezernierte Form des MDA-7-Polypeptids oder -Proteins aufnehmen können, derart, dass die hyperproliferativen oder nicht-normalen Zellen dazu induziert werden, die Apoptose zu durchlaufen, oder dass sie wachstumsgehemmt werden. Diese nicht-normalen Zellen können Tumorzellen sein. Es wird davon ausgegangen, dass nicht-transduzierte oder nicht-transfizierte Zellen, die von transduzierten oder transfizierten Zellen befallen werden, proximal zu ihnen, benachbart (am nächsten) zu ihnen oder nahe bei ihnen sind. Im Wesentlichen befindet sich die nicht-transduziert oder nicht-transfizierte Zelle nahe genug an der transduzierten oder transfizierten Zelle, sodass das MDA-7-Protein, das durch die transfizierte Zelle sezerniert wird, die nicht-transfizierte Zelle erreicht.
Bei weiteren Ausführungsformen ist der Krebs ein Melanom, nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, kleinzelliger Lungenkrebs, Lungenkrebs, Leberkarzinom, Retinoblastom, Astrocytom, Glioblastom, Leukämie, Neuroblastom, Kopf-, Nacken-, Brust-, Pancreas-, Prostata-, Nieren-, Knochen-, Hoden-, Eierstock-, Mesotheliom, Zervikal-, Gastrointestinal-, Lymphom, Gehirn-, Darmkrebs, ein Sarkom oder Blasenkrebs. Der Krebs kann einen Tumor umfassen, der aus Tumorzellen besteht. Bei anderen Ausführungsformen ist die hyperproliferative Krankheit rheumatoide Arthritis, entzündliche Darmerkrankung, Osteoarthritis, Leinmyome, Adenome, Lipome, Hämangiome, Fibrome, vaskuläre Okklusion, Restenose, Atherosklerose, präneoplastische Läsionen (wie adenomatöse Hyperplasie und prostatische intraepitheliale Neoplasie), Karzinome in situ, orale haarige Leukoplakie oder Psoriasis.
Bei einigen Ausführungsformen codiert das Nukleinsäuremolekül die Aminosäuren von etwa 49 bis etwa 206; von etwa 75 bis etwa 206; von etwa 100 bis etwa 206; von etwa 125 bis etwa 206; von etwa 150 bis etwa 206; von etwa 175 bis etwa 206; oder von etwa 182 bis etwa 206 der SEQ ID NO: 2. Bei einigen Ausführungsformen codiert die Expressionskassette oder der Vektor ein verkürztes MDA-7-Polypeptid, wie vorstehend definiert. Es wird somit davon ausgegangen, dass bei einigen Ausführungsformen die Nukleinsäuresequenz, die ein verkürztes MDA-7-Polypeptid codiert, wie vorstehend definiert, weniger zusammenhängende Nukleotide umfasst als in der SEQ ID NO: 1 vorhanden sind, d. h. das Nukleinsäuresegment ist ebenfalls kleiner als das Volllängen- oder das verkürzte Segment. Beispielsweise können dem Expressionsvektor oder der Expressionskassette codierende Sequenzen fehlen, entsprechend der Aminosäure 1 bis etwa der Aminosäure 49, der Aminosäure 1 bis etwa der Aminosäure 75, der Aminosäure 1 bis etwa der Aminosäure 100, der Aminosäure 1 bis etwa der Aminosäure 125, der Aminosäure 1 bis etwa der Aminosäure 150, der Aminosäure 1 bis etwa der Aminosäure 175, oder der Aminosäure 1 bis etwa der Aminosäure 182 der SEQ ID NO: 2.
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküle können Sequenzen enthalten, die ein menschliches Volllängen-mda-7-Gen codieren, wie in der SEQ ID NO: 1 offenbart. Bei einigen Ausführungsformen der Erfindung kann ein Nukleinsäuremolekül weniger Nukleotide als in der SEQ ID NO: 1 beschrieben codieren, derart dass das Molekül weniger als 700 zusammenhängende Nukleotide aus der SEQ ID NO: 1 enthält, um das verkürzte MDA-7-Polypeptid, wie vorstehend definiert, zu codieren. In einigen Aspekten kann ein Nukleinsäuremolekül etwa 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, oder 700 zusammenhängende Nukleotide aus der SEQ ID NO: 1 enthalten, um das verkürzte MDA-7-Polypeptid, wie vorstehend definiert, zu codieren. Alternativ kann das Molekül ein Nukleinsäuremolekül codieren, das ein MDA-7-Polypeptid codiert, dem die ersten 49 Aminosäuren der SEQ ID NO: 2 fehlen, da die Nukleinsäuresequenz entsprechend den ersten 49 Aminosäuren nicht vorhanden ist.
Bei bestimmten anderen Ausführungsformen umfasst die Nukleinsäure weiterhin Nukleotide, die eine heterologen sekretorische Signalsequenz codieren, in der die heterologen Sequenz sich von einer Nicht-MDA-7-Nukleinsäuresequenz oder einem -Polypeptid ableitet. Eine "Signalsequenz" bezieht sich auf eine Sequenz, typischerweise eine kurze Sequenz, die ein neu translatiertes sekretorisches oder Membranpolypeptid zu dem und durch das endoplasmatische Retikulum oder über eine Membran dirigiert. Die Signalsequenz erlaubt die Sekretion eines Proteins aus einer Zelle. Bei weiteren Ausführungsformen umfasst die Nukleinsäure weiterhin eine heterologe sekretorische Signalsequenz, die als eine positiv geladene N-terminale Region definiert ist, in Kombination mit einem hydrophoben Kern.
Bei bestimmten Ausführungsformen ist der Promotor CMV IE, Dectin-1, Dectin-2, humanes CD11c, F4/80, SM22, RSV, SV40, Ad MLP, beta-Actin, ein MHC-Klasse-I- oder MHC-Klasse-II-Promotor, allerdings wird angenommen, dass jeder beliebige andere Promotor, der zum Antreiben der Expression des mda-7-Gens der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wie diejenigen, die hier nachstehend ausgeführt sind, auf die Praxis der vorliegenden Erfindung anwendbar ist. Bei anderen Ausführungsformen ist ein Polyadenylierungssignal funktionsfähig mit einer MDA-7-codierenden Region verknüpft.
Bei bestimmten Ausführungsformen ist die Nukleinsäure ein viraler Vektor, wobei die virale Vektordosis etwa 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹² pfu und mehr beträgt. Alternativ kann die Dosis in Einheiten von Viruspartikeln (Vp) ausgedrückt werden; somit können die vorstehend in „pfu"-Einheiten aufgeführten Zahlen in Einheiten von Einheiten oder oder „Viruspartikeln" ausgedrückt werden. Es wird davon ausgegangen, dass etwa 10³ bis 10¹⁵, etwa 10⁵ bis etwa 10¹², oder 10⁷ bis etwa 10¹⁰ Viruspartikel einem Patienten verabreicht werden können.
Bei einigen Ausführungsformen ist der virale Vektor ein adenoviraler Vektor, ein retroviraler Vektor, ein Vaccinia-viraler Vektor, ein Adeno-assoziierter viraler Vektor, ein Polyom-viraler Vektor, ein Alpha-viraler Vektor oder ein Herpes-viraler Vektor. In einigen Anspekten ist der virale Vektor ein adenoviraler Vektor. Es wird davon ausgegangen, dass der virale Vektor replikationsdefizient oder -defekt sein kann. Obgleich bei anderen Ausführungsformen ein Adenovirus-Vektor, der Ad-5-Sequenzen enthält, eingesetzt werden kann, fehlen in einigen Aspekten einem Adenovirus-Vektor-Konstrukt E1-codierende Regionen, die eine Deletion sowohl von E1A- als auch E1B-Sequenzen einschließen können.
Die Anwendungen der vorliegenden Erfindung umfassen die Dispersion von Expressionskonstrukten, Vektoren und Kassetten in pharmakologisch verträglicher Lösung zur Verabreichung an einen Patienten. In einigen Fällen umfasst die pharmakologisch vertragliche Lösung ein Lipid. Bei weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird ein Nukleinsäuremolekül, das ein Volllängen- oder ein verkürztes MDA-7-Polypeptid codiert, in einem Lipoplex (d. h. wie ein Lipid-Nukleinsäure-Komplex) verabreicht, der, wie bei einigen Ausführungsformen beschrieben, DOTAP und mindestens ein Cholesterol, Cholesterolderivativ oder Cholesterolgemisch enthalten kann. Diese Nukleinsäuremoleküle können dem Patienten intravenös, intraperitoneal, intratracheal, intratumoral, intramuskulär, endoskopisch, intraläsional, perkutan, subkutan, regional, oder durch direkte Injektion oder Perfusion verabreicht werden. Es wird weiterhin davon ausgegangen, dass Behandlungsverfahren mehrere Verabreichungen einschließen können.
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendete Nukleinsäure kann durch Injektion verabreicht werden. Weitere Ausführungsformen umfassen die Verabreichung der Nukleinsäure durch mehrere Injektionen. Bei bestimmten Ausführungsformen wird die Injektion lokal, regional oder distal an einer Krankheits- oder Tumorstelle durchgeführt. Bei einigen Ausführungsformen erfolgt die Verabreichung der Nukleinsäure über kontinuierliche Infusion, intratumorale Injektion oder intravenöse Injektion. Bei bestimmten anderen Ausführungsformen wird die Nukleinsäure dem Tumorbett vor oder nach oder sowohl vor als auch nach der Resektion des Tumors verabreicht.
Die vorliegende Erfindung umfasst kombinationstherapeutische Verfahren unter Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die ein Volllängen- oder ein verkürztes MDA-7-Polypeptid codiert, in Kombination mit einer zweiten Therapie zur Behandlung eines Krebses. Das Nukleinsäuremolekül kann dem Patienten vor während oder nach der Chemotherapie verabreicht werden.
Bei anderen Ausführungsformen wird hingegen Chemotherapie, die mindestens ein DNA-schädigendes Mittel umfasst, in Kombination mit der Verabreichung eines MDA-7- codierenden Nukleinsäuremoleküls eingesetzt. Das DNA-schädigende Mittel kann Adriamycin, 5-Fluorouracil (5FU), Etoposide (VP-16), Camptothecin, Actinomycin-D, Mitomycin C_H oder Cisplatin (CDDP) sein. Bei anderen Ausführungsformen ist das DNA-schädigende Mittel Adriamycin. In einem Aspekt der Erfindung umfasst die Chemotherapie Tamoxifen, während sie in einem Aspekt Adriamycin umfasst. Weiter Ausführungsformen umfassen Immuntherapie mit Herceptin.
In Fällen, die einen kanzerösen Tumor umfassen, kann eine Kombinationsbehandlung die Verabreichung eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Volllängen- oder ein verkürztes MDA-7-Polypeptid codiert, und Tumorresektion umfassen, die vor, nach oder während der mda-7-gentherapeutischen Verabreichung erfolgen kann. Wenn die mda-7-Behandlung nach der Tumorresektion erfolgt, kann das Expressionskonstrukt oder der Vektor, der MDA-7 codiert, an das Tumorbett verabreicht werden.
Weitere Anwendungen der Erfindung umfassen die Behandlung eines Patienten mit Krebs bei einem Verfahren, das mindestens den folgenden Schritt umfasst: Verabreichung an den Patienten einer Adenovirus-Zusammensetzung, die ein Adenovirus-Konstrukt mit einem menschlichen mda-7-Gen unter der Kontrolle eines Promotors enthält, und mindestens einer anderen Antikrebsbehandlung, wie vorstehend definiert, in einer Menge, die zur Übertragung eines therapeutischen Vorteils auf den Patienten wirksam ist. Ein weiterer Aspekt umfasst die Anwendungen zur Induktion von Apoptose in einer Krebszelle durch Verabreichung an eine Krebszelle in einem Individuum einer Expressionskassette, die eine Nukleinsäuresequenz enthält, die ein menschliches MDA-7-Protein unter der Kontrolle eines Promotors codiert, der in eukaryotischen Zellen funktionsfähig ist, und mindestens einer anderen Antikrebsbehandlung, wie vorstehend definiert. Bei wieder anderen Ausführungsformen umfasst die Erfindung die Anwendungen zur Induktion von Apoptose in einer Krebszelle durch Verabreichung an eine nicht-kanzeröse Zelle in einem Individuum einer Expressionskassette, die eine Nukleinsäuresequenz enthält, die ein menschliches MDA-7-Polypeptid unter der Kontrolle eines Promotors codiert, der in eukaryotischen Zellen funktionsfähig ist, und mindestens einer anderen Antikrebsbehandlung, wie vorstehend definiert, wobei das MDA-7-Polypeptid exprimiert und sezerniert wird. Mit diesen Typen von Bystander-Verfahren kann eine transfizierte, nicht-kanzeröse Zelle benachbart oder nahe genug an einer Krebszelle vorhanden sein, derart, dass die nicht-kanzeröse Zelle ein MDA-7- Polypeptid sezerniert, das in der untransfizierten Krebszelle Wachstumsstopp oder Apoptose auslöst. Weitere Anwendungen umfassen diejenigen, die auf die Behandlung eines Patienten mit Krebs durch Verabreichung an eine nicht-kanzeröse Zelle in dem Patienten einer wirksamen Menge einer Adenovirus-Zusammensetzung gerichtet sind, um einen therapeutischen Vorteil auf diesen Patienten zu übertragen, und mindestens einer anderen Antikrebsbehandlung, wie vorstehend definiert. Diese Adenovirus-Zusammensetzung kann ein Adenovirus-Vektor-Konstrukt einschließen, das ein mda-7-Gen unter der Kontrolle eines Promotors enthält.
Die Verwendungen der vorliegenden Erfindung umfassen auch Medikamente zur Behandlung eines Tumors durch Induktion von Apoptose in transfizierten und untransfizierten Tumorzellen, umfassend die Verabreichung an den Tumor einer Adenovirus-Zusammensetzung, die ein Adenovirus-Vektor-Konstrukt umfasst, das ein menschliches mda-7-Gen unter der Kontrolle eines Promotor umfasst, und mindestens einer anderen Antikrebsbehandlung, wie vorstehend definiert, derart, dass transfizierte Zellen ein verkürztes MDA-7-Polypeptid exprimieren und sezernieren. Und wieder andere Ausführungsformen umfassen Anwendungen zur Behandlung von Krebs durch Verabreichung an ein Individuum mit Krebs einer Adenovirus-Zusammensetzung, die ein Adenovirus-Vektor-Konstrukt enthält, mit einem menschlichen mda-7-Gen unter der Kontrolle eines Promotors an eine Zelle, die kein mutiertes p53-, Rb-, ras-, oder p16-Gen aufweist, und mindestens einer anderen Antikrebsbehandlung, wie vorstehend definiert, in einer Menge, die wirksam ist, um in einer Zelle, die kein mutiertes p53-, Rb-, ras- oder p16-Gen aufweist, Apoptose auszulösen.
Weitere Anwendungen der Erfindung umfassen die Behandlung eines Individuums mit einem Tumor durch Verabreichung an das Individuum eines Nukleinsäuremoleküls, das ein humanes mda-7-Gen unter der Kontrolle eines Promotors umfasst, und mindestens einer anderen Antikrebsbehandlung, wie vorstehend definiert, in einer Menge, die wirksam ist, um die Angiogenese um den Tumor herum zu hemmen. Solche Verfahren können auch Schritte zur Evaluierung des Angiogenese-Inhibitionsniveaus einschließen. Es wird davon ausgegangen, dass andere Ausführungsformen der Behandlung, die hier beschrieben sind, mit diesen Anwendungen eingesetzt werden können.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfassen einen Expressionsvektor, der eine mda-7-codierende Region unter der Kontrolle eines Promotors, der in einer eukaryotischen Zelle funktionsfähig ist, codiert, derart, dass die codierende Region eine Deletion entsprechend N-terminalen Sequenzen enthält. Die Expressionsvektor-Zusammensetzungen umfassen jede beliebige Expressionskassette, die bezüglich der Verfahren der vorliegenden Erfindung beschrieben ist. Gleichermaßen können alle hier beschriebenen Zusammensetzungen in der Praxis von einer der hier offenbarten Anwendungen eingesetzt werden.
Die Verwendung des Wortes „ein" oder „eine" kann bei Verwendung in Verbindung mit dem Begriff „umfassend" in den Ansprüchen und/oder in der Spezifikation „ein" bedeuten, jedoch steht sie auch mit der Bedeutung von „ein oder mehrere", „mindestens eines" und „ein oder mehr als eines" im Einklang.
Weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der folgenden ausführlichen Beschreibung hervor. Es sollte allerdings verstanden werden, dass die ausführliche Beschreibung und die speziellen Beispiele, obgleich sie spezielle Ausführungsformen der Erfindung angeben, nur zur Erläuterung angegeben sind, da den Fachleuten verschiedene Änderungen und Modifikationen innerhalb des Geistes und Umfangs der Erfindung aus der ausführlichen Beschreibung klar werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die folgenden Zeichnungen bilden einen Teil der vorliegenden Spezifikation und sind zur weiteren Demonstration bestimmter Aspekte der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Die Erfindung kann besser durch Bezugnahme auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Kombination mit der ausführlichen Beschreibung der speziellen, hier dargestellten Ausführungsformen verstanden werden.
1. Schematische Erläuterung von Ad-Vektoren. Replikationsdefizientes menschliches Typ 5 Adenovirus (Ad5), das das mda-7 (oder Luziferasegen) trägt, verknüpft mit einem internen CMVIE-Promotor und gefolgt von dem SV40-Polyadenylierungs(pA)-Signal, wurde verwendet. Zusätzlich wurde als Kontrolle Ad-CMVp(A) (leerer Vektor) verwendet.
2A. T47D-Zellen, behandelt mit Ad-mda7 bei verschiedenen MOIs (Viruspartikel/Zelle). 2B. MCF-7-Zellen, behandelt mit Ad-mda7 bei verschiedenen MOIs (Viruspartikel/Zelle).
3A. MDA-MB-361-Zellen, behandelt mit Ad-mda7 bei verschiedenen MOIs (Viruspartikel/Zelle). 3B. BT-20-Zellen, behandelt mit Ad-mda7 bei verschiedenen MOIs (Viruspartikel/Zelle).
4A. H1299-Zellen, behandelt mit Ad-mda7 bei verschiedenen MOIs (Viruspartikel/Zelle). 4B. H322-Zellen, behandelt mit Ad-mda7 bei verschiedenen MOIs (Viruspartikel/Zelle).
5A. SW620-Zellen, behandelt mit Ad-mda7 bei verschiedenen MOIs (Viruspartikel/Zelle). 5B. DLD-1-Zellen, behandelt mit Ad-mda7 bei verschiedenen MOIs (Viruspartikel/Zelle).
6A. MJ90-Zellen, behandelt mit Ad-mda7 bei verschiedenen MOIs (Viruspartikel/Zelle). 6B. HUVEC-Zellen, behandelt mit Ad-mda7 bei verschiedenen MOIs (Viruspartikel/Zelle).
7. Annexin V-Assay zur Bestimmung der Apoptose-Induktion nach Ad-mda7 Transduktion in Brustkrebszelllinien. Drei Brustkrebszelllinien (T47D, MDA MB-468, MCF-7) wurden mit Ad-mda7 oder Ad-CMVp(A)-leerem Kontroll-Vektor infiziert und unter Verwendung von Annexin V auf Apoptose evaluiert.
8. DLD-1-Zellen wurden mit Ad-mda7 oder Ad-luc infiziert und 48 Stunden später auf Annexin V-Färbung durch FACS-Analyse untersucht.
9. Schaubild A zeigt die Apoptose-Induktion in H1299-Zellen, infiziert mit Ad-mda7 oder Ad-luc. Die Zellen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach Infektion unter Verwendung von Annexin V-Färbung und FACS-Analyse evaluiert. Schaubild B erläutert die Apoptose in DLD-1-Zellen, die mit Ad-mda7 oder Ad-luc zu verschiedenen Zeitpunkten nach Infektion infiziert wurden (wie durch Annexin V-Einfärben und FACS-Analyse untersucht).
10. H460-Zellen wurden mit zunehmenden MOIs von Ad-mda7 oder Ad-luc infiziert und 48 Stunden später auf MDA-7-Oberflächenexpression prozessiert und durch FACS analysiert.
11A. Lösliches MDA-7 (sMDA7) tötet Tumorzellen. H1299-Zellen wurden mit den folgenden Proben provoziert und der Prozentsatz an toten Zellen nach 48 Stunden bewertet: 1) Ad-mda7-Virus, positive Kontrolle, infiziert mit 1000 Vp/Zelle; 2) Löslicher MDA7-Überstand aus mit Ad-mda-7 infizierten H1299-Zellen (1000 Vp/Zelle); 3) Ad-tue-Virus, Kontrolle infiziert mit 1000 Vp/Zelle; 4) Überstand aus mit Ad-luc infizierten H1299-Zellen (1000 Vp/Zelle); 5) Ad-p53-Virus, positive Kontrolle, infiziert mit 20 Vp/Zelle; 6) ein separater Vorrat an löslichem MDA-7-Überstand, erhalten aus 293-Zellen, infiziert mit Ad-mda-7 (sup M, 500 Vp/Zelle); und 7) ein separater Vorrat von löslichem MDA-7-Überstand, erhalten aus modifizierten serumfreien 293-Zellen, infiziert mit Ad-mda-7 (sup P, 500 Vp/Zelle). Alle Überstände, die bei diesem Experiment verwendet wurden, wurden über ein 0,1-Mikron-Filter vor der Provokation mit H1299-Zellen filtriert. 11B. H1299-Zellen wurden mit löslichem MDA-7-Überstand aus vier verschiedenen Vorräten provoziert und der Prozentsatz an toten Zellen nach 48 Stunden bewertet: 1) 293*NF: nicht-filtrierter Überstand, erhalten aus modifizierten 293-Zellen (die Zellen wurden unter serumfreien Bedingungen gezüchtet); 2) 293*F: 0,1 Mikron-filtrierter Überstand, erhalten aus modifizierten 293-Zellen; 3) 293F: 0,1 Mikron-filtrierter Überstand, erhalten aus regulären 293-Zellen (FBS+); und 4) H1299F: 0,1 Mikron-filtrierter Überstand, erhalten aus H1299-Zellen. D0 ist nicht verdünntes Material, wohingegen D1:1; D1:5, D1:10 die eingesetzten Verdünnungen angeben. Unverdünnter Kontrollüberstand aus Ad-luc-behandelten H1299-Zellen zeigte 20% tote Zellen.
12. Kombination mit Tamoxifen. Ad-mda7 wurde mit Tamoxifen kombiniert und auf die Antitumor-Wirkung in Brustkrebszelllinien evaluiert. Die Graphen zeigen, dass das Kombinieren dieser beiden Mittel überlegene Antitumor-Aktivität im Vergleich mit einem Mittel allein bereitstellt.
13. Kombination mit Adriamycin. Ad-mda7 wurde mit Adriamycin kombiniert und auf die Antitumor-Wirkung in Brustkrebszelllinien evaluiert. Die Graphen zeigen, dass das Kombinieren dieser beiden Mittel überlegene Antitumor-Aktivität im Vergleich zu einem Mittel allein bereitstellt.
14. Linkes Schaubild: MDA-7-Proteinexpression in NSCLC-Zellen und normalen Lungenzellen nach Transduktion mit Ad-mda7. NHFB-normale menschliche Bronchialzellen. Rechtes oberes Schaubild: Wirkung von Ad-mda7 auf das Wachstum von NSCLC-Zellen und normalen Lungenzellen. Ad-mda7 (Kreise), PBS (Rauten), Ad-luc (Quadrate). Unteres Schaubild: Zellzyklusanalyse von NSCLC-Zellen und normalen Lungenzellen nach Transduktion mit Ad-mda7. Zu beachten ist die signifikante Abnahme in G1 und die Zunahme in G2/M.
15. Kombination von Ad-mda7 und Herceptin auf Brustkrebszelllinien. Die mit Ad-mda7 behandelten Zelllinien werden in einer Her2-exprimierenden Zelllinie verstärkt, im Vergleich zu einer nicht-exprimierenden Zelllinie, was die erhöhte Wirksamkeit von Herceptin auf das Abtöten von Zellen nach Kontakt mit Ad-mda7 zeigt.
BESCHREIBUNG DER ERLÄUTERNDEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung betrachtet die Behandlung von Krebs durch Identifizieren von Patienten mit einer solchen Krankheit und Exprimieren entweder einer Volllängen- oder einer verkürzten Form des menschlichen MDA-7-Polypeptids in diesen hyperproliferativen Zellen oder in normalen Zellen in der Nachbarschaft der hyperproliferativen Zellen mittels Nukleinsäuretransfer. Die Behandlung einer solchen hyperproliferativen Krankheit umfasst bei einer Ausführungsform die intratumorale Verabreichung eines Volllängen- oder verkürzten menschlichen MDA-7 Expressionskonstruktes an die hyperproliferativen Zellen. Die hyperproliferativen Zellen oder normalen Zellen exprimieren dann eine Volllängenform oder eine verkürzte Form von menschlichem MDA-7, was zu der Wachstumsinhibition oder zum Tod der hyperproliferativen Zellen führt. Außerdem können benachbarte hyperproliferative Zellen, die das MDA-7 Expressionskonstrukt nicht aufgenommen haben, ebenfalls wachstumsinhibiert werden und/oder durch die lösliche Form von MDA-7 abgetötet werden.
A. HYPERPROLIFERATIVE KRANKHEIT UND MDA-7
Eine Vielzahl von Krebsen kann durch die erfindungsgemäßen Verfahren behandelt werden. Die vorliegende Erfindung weist wichtige Verzweigungen bezüglich einer hyperproliferative Krankheit auf: Krebs
Krebs wurde zu einer der führenden Todesursachen in der westlichen Welt, als zweites nur hinter Herzerkrankung. Derzeitige Schätzungen sagen voraus, dass eine von drei Personen in den USA Krebs entwickelt, und dass eine von fünf Personen an Krebs stirbt. Krebse können als veränderte Zellen betrachtet werden, die die normalen wachstumsregulierenden Mechanismen verloren haben.
Es gibt derzeit drei Hauptkategorien von Onkogenen, die ihre verschiedenen Aktivitäten widerspiegeln. Eine Kategorie von Onkogenen codiert Proteine, die die Zellproliferation induzieren. Eine zweite Kategorie von Onkogenen, die Tumorsuppressor-Gene genannt werden oder Anti-Onkogene genannt werden, funktionieren zur Inhibierung von übermäßiger Zellproliferation. Die dritte Kategorie von Onkogenen blockiert oder induziert die Apoptose durch Codieren von Proteinen, die den programmierten Zelltod regulieren.
Die cDNA, die das MDA-7-Protein codiert, wurde bereits von Jiang et al., 1995 ( WO 9511986 ) beschrieben Das von der mda-7 cDNA codierte Protein wurde als ein potentieller Regulator der Melanomprogression erkannt. Jiang et al. verwendeten eine subtraktive Hybridisierungstechnik (Jiang et al., 1995) zur Identifizierung von an der Regulation des Wachstums und an der Differenzierung in menschlichen Melanomzellen beteiligten Genen. Eine subtrahierte cDNA-Bibliothek, die durch Subtraktionshybridsierung von cDNAs hergestellt wurde, die aus aktiv proliferierenden menschlichen HO-1 Melanomzellen gegen cDNAs hergestellt wurden, die aus Interferon (IFN-P)- und Mezerindifferenzierten menschlichen HO-1 Melanomzellen hergestellt wurden, wurde zur Identifizierung von mehreren Melanomdifferenzierungs-assoziierten (mda) cDNAs verwendet. Die cDNA für MDA-7 wurde als erhöhte Expressionsniveaus in den differenzierten Melanomzellen aufweisend identifiziert.
Dass MDA-7 in Krebszelllinien die BAX-Niveaus erhöhte, führte zu einer Evaluierung der Wirkung der ex vivo Ad-mda-7-Transduktion auf die Xenograft-Tumorigenizität von MCF-7 Tumorzellen. Die ex vivo Transduktion führte zur Inhibition der Tumorbildung und der Progression in dem Tumor-Xenograft-Modell.
Die Behandlung von Zellen mit einem mda-7 Expressionsvektor führt zur Sekretion einer löslichen Form des MDA-7-Proteins. Dieses lösliche Protein besitzt Antitumor-Aktivität. Darum stellt die Kombination der direkten Induktion von Apoptose und der Freisetzung von löslichem Mediator mit Antitumor-Eigenschaften eine verstärkte Aktivität gegen hyperproliferative Krankheiten bereit. Die krebszellenspezifischen antiproliferativen Wirkungen der erhöhten MDA-7 Expression macht dieses Molekül zu einer idealen gentherapeutischen Behandlung für die hyperproliferative Krankheit, Insbesondere Krebs, bei Kombination mit mindestens einer anderen Krebsbehandlung, wie vorstehend definiert.
Bei einigen Ausführungsformen liegt die Behandlung einer breiten Varietät von kanzerösen Zuständen oder Gewebe/Organtypen im Umfang der Erfindung, beispielsweise Melanom, nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, kleinzelliger Lungenkrebs, Lungenkrebs, Leberkarzinom, Retinoblastom, Astrocytom, Glioblastom, Leukämie, Blut-, Gehirn-, Haut-, Augen-, Zungen-, Zahnfleischkrebs, Neuroblastom, Kopf-, Nacken-, Brust-, Pankreas-, Prostata-, Nieren-, Knochen-, Hoden-, Eierstock-Krebs, Mesotheliom, Zervikalkrebs, Gastrointestinal-Krebs, Lymphom, Gehirnkrebs, Dickdarmkrebs oder Blasenkrebs. Bei noch stärker bevorzugten Ausführungsformen ist die hyperproliferative Krankheit, die erfindungsgemäß behandelt wird, rheumatoide Arthritis, entzündliche Darmerkrankung, Osteoarthritis, Leinmyome, Adenome, Lipome, Hämangiome, Fibrome, vaskuläre Okklusion, Restenose, Atherosklerose, pre-neoplastische Lesionen, Karzinom in situ, orale haarige Leukoplakie oder Psoriasis.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens einem Teil eines MDA-7-Proteins zur Behandlung von Patienten mit Krebs, derart, dass diesem Patienten als Ergebnis der Behandlung ein therapeutischer Vorteil zuteil wird. Der Begriff „therapeutischer Vorteil", der durchwegs bei dieser Anmeldung verwendet wird, bezieht sich auf etwas, was das Wohlbefinden des Patienten beschleunigt oder verstärkt, bezüglich der medizinischen Behandlung seines Krebses. Eine Liste von nicht erschöpfenden Beispielen hierfür umfasst die Verlängerung des Patientenlebens im einen beliebigen Zeitraum; Herabsetzung oder Verzögerung in der neoplastischen Entwicklung der Krankheit; herabgesetzte Hyperproliferation; Reduktion im Tumorwachstum; Verzögerung von Metastasen; Reduktion im Proliferationszustand einer Krebszelle oder Tumorzelle; Induktion von Apoptose in einer behandelten Zelle oder in einer Zelle, die von einer behandelten Zelle befallen ist; und Herabsetzung im Schmerz für den Patienten, was zu dem Zustand des Patienten beitragen kann.
1. MDA-Protein, -Polypeptide und -Peptide
Die mda-7 cDNA codiert ein neues, evolutionär konserviertes Protein von 206 Aminosäuren mit einer vorausberechneten Größe von 23,8 kDa. Die hergeleitete Aminosäuresequenz enthält eine hydrophobe Spanne von etwa Aminosäure 26 bis 45. Die Proteinsequenz zeigt keine signifikante Homologie mit bekannten Proteinen oder Proteinmotiven, mit der Ausnahme einer 42-Aminosäure-Spanne, die zu 54% mit Interleukin 10 (IL-10) identisch ist. Die von Bazan et al. durchgeführte Strukturanalyse hat bestimmt, dass eine verkürzte lösliche Form von MDA-7 (IL-BKW oder IL-20) Strukturmerkmale der Zytokinfamilie ( WO 9828425 ) aufweist und die IL-10-Funktion antagonisiert. Bazan et al. stellen fest, dass die codierende Region der mda-7 cDNA falsch benannt wurde (S. 6, 1.30). Außerdem erklärten sie, dass die „Pre-Sequenz von IL-BKW/mda-7 wahrscheinlich entweder an der M(et) an Position 28 oder 30. (S. 9, 1.3)" der MDA-7-Sequenz beginnt. Die Strukturmerkmale und die begrenzte Identität über eine kleine Spanne von Aminosäuren impliziert eine potentielle extrazelluläre Funktion für MDA-7. Die Erfinder zeigten, dass Ad-mda7, das die Volllängen-206-Aminosäurensequenz codiert, ein intrazelluläres Protein von ungefähr 23 kD entstehen lässt. Weiterhin verursacht der Ad-mda7-Vektor auch die Freisetzung einer löslichen Form des MDA-7-Proteins aus behandelten Zellen. Das lösliche MDA-7-Protein ist etwa 40 kD lang und glycosyliert. Die Behandlung mit Glycosidasen setzt die Molekülmasse des löslichen Proteins herab. Inhibitoren der Proteinsekretion, Brefeldin A und Tunicamycin, verursachen eine intrazelluläre Akkumulation von MDA-7 und hemmen die Freisetzung dieses Proteins aus Zellen. Das lösliche MDA-7-Protein verursacht Wachstumsinhibition von Tumorzellen. Darum kann die Freisetzung dieses löslichen MDA-7 einen „Bystander"-Effekt entstehen lassen, wobei Tumorzellen, die nicht durch ein mda-7 Expressionskonstrukt kontaktiert werden, im Wachstum gehemmt sind.
Zusätzliche Studien haben gezeigt, dass erhöhte Expression von MDA-7 Krebszellenwachstum unterdrückte und selektiv Apoptose in menschlichen Brustkrebszellen auslöste, sowie die Tumorigenizität in Nacktmäusen hemmte (Jiang et al., 1996 und Su et al., 1998). Jiang et al. (1996) berichten über Befunde, dass mda-7 ein potentes wachstumsunterdrückendes Gen in Krebszellen diverser Ursprünge ist, einschließlich Brust-, Zentralnervensystem-, Zervix-, Dickdarm-, Prostata- und Bindegewebe. Ein Kolonien-Inhibitionstest wurde verwendet, um zu zeigen, dass erhöhte Expression von mda-7 die Wachstumsinhibition in menschlichem Zervikalkarzinom (HeLa), menschlichem Brustkarzinom (MCF-7 und T47D), Dickdarmkarzinom (LS174T und SW480), Nasopharyngealkarzinom (HONE-1), Prostatakarzinom (DU-145), Melanom (HO-1 und C8161), multiformem Glioblastom (GBM-18 und T98G), und Osteosarkom (Saos-2) verstärkte. in normalen Zellen (HMECs, HBL-100 und CREF-Trans6) überexprimiertes Mda-7 zeigte keine signifikanten Wirkungen.
Die Wachstumsinhibition durch erhöhte Expression von MDA-7 ist in Krebszellen wirksamer als in normalen Zellen. Su et al. (1998) erforschten den Mechanismus, durch den MDA-7 das Krebszellenwachstum unterdrückte. Die Untersuchungen berichten, dass die ektopische Expression von MDA-7 in den Brustkrebszelllinien MCF-7 und T47D Apoptose auslöste, wie nachgewiesen durch Zellzyklusanalyse und TUNEL-Assay, ohne eine Wirkung auf die normalen HBL-100-Zellen. Western Blot von Lysaten aus Zellen, die mit Adenovirus-mda-7 infiziert waren, zeigte eine Aufregulierung des Apoptose-stimulierenden Proteins BAX. Eine Ad-mda-7-Infektion erhöhte die Niveaus von BAX-Protein nur in MCF-7 und T47D-Zellen und nicht in normalen HBL-100- oder HMEC-Zellen. Diese Daten führten die Forscher zur Evaluierung der Wirkung der ex vivo Ad-mda-7-Transduktion auf die Xenograft-Tumorigenizität von MCF-7-Tumorzellen. Die ex vivo Transduktion führte zur Hemmung der Tumorbildung und -progression in dem Tumor-Xenograft-Modell. Es hat sich gezeigt, dass MDA-7 bei der Tumorzellen-spezifischen, apoptotischen Induktion wirksam ist. Somit ist eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines mda-7-adenoviralen Konstruktes, das Volllängen- oder verkürztes MDA-7 codiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs in Kombination mit mindestens einer anderen Antikrebsbehandlung, wie vorstehend definiert.
Von besonderem Interesse ist erfindungsgemäß die Verwendung einer löslichen Form von MDA-7. WO 98/28425 beschreibt ein Zytokinmolekül, das angeblich mit IL10 verwandt ist. Dieses Molekül, das als IL-BKW bezeichnet wird, leitet sich anscheinend von dem gleichen Gen wie MDA-7 ab. Allerdings beschreiben die Autoren die codierende Region-Bezeichnung von MDA-7 als „falsch identifiziert". Die reife Form von IL-BKW soll angeblich etwa bei Rest 47 oder 49 der mda-7-codierenden Region beginnen und sich einige 158–160 Reste fortsetzen, d. h. bis zu den Resten 206 der mda-7-Sequenz. Somit würde einem bevorzugten Molekül vorzugsweise alles oder ein Teil sowohl der putativen Signalsequenz (Reste 1–25) als auch einer putativen Membran-umspannenden hydrophoben Domäne (Reste 26–45) des Volllängen-MDA-7 fehlen.
Weitere, sogar noch kürzere Moleküle werden betrachtet. Während beispielsweise Moleküle, die bei ungefähr den MDA-7-Resten 46–49 beginnen, die größten Moleküle sind, liegen weitere N-terminale Verkürzungen innerhalb des Umfangs der Erfindung. Somit werden speziell Moleküle betrachtet, die etwa am Rest 49, 100, 150, 175, 182 beginnen und etwa am Rest 206 enden.
Obwohl nicht einer bestimmten Theorie hinsichtlich der Funktionsfähigkeit dieser Konstrukte festgehalten wird, besteht eine bemerkenswerte Homologie zwischen MDA-7 und IL-10, sowie über Spezies in den C-, E- und F-helikalen Regionen und auch in den Aminosäurepositionen, die am Rezeptor-Binden beteiligt wurden. Die Teritärstruktur von MDA-7 lehnt sich eng an die bekannte Struktur von IL-10 an, was weiterhin nahelegt, dass diese Moleküle verwandt sind. Somit sind Moleküle, die etwas oder alles von Aminosäureregionen enthalten, besonders bevorzugt.
Alternativ wird bei anderen Ausführungsformen ein Volllängen- oder ein im Wesentlichen Volllängen-MDA-7-Polypeptid betrachtet, das bei der Behandlung von Krebs verwendet wird. Bei Verwendung im Zusammenhang mit humanem MDA-7 bezieht sich der Begriff „Volllängen-„ auf ein MDA-7-Polypeptid, das mindestens die 206 Aminosäuren enthält, die von der menschlichen mda-7 cDNA codiert werden. Der Begriff „im Wesentlichen Volllängen-„ im Zusammenhang mit menschlichem MDA-7 bezieht sich auf ein MDA-7-Polypeptid, das mindestens 80% der zusammenhängenden Aminosäuren des menschlichen Volllängen-MDA-7-Polypeptid (SEQ ID NO: 2) enthält. Es wird allerdings auch berücksichtigt, dass MDA-7 Polypeptide, die mindestens etwa 85%, 90% und 95% der SEQ ID NO: 2 enthalten, im Umfang der Erfindung liegen, wie „im Wesentlichen Volllängen„-MDA-7. Ein „verkürztes MDA-7-Polypeptid" oder „verkürztes MDA-7" bezieht sich auf ein MDA-7-Polypeptid, dem zusammenhängende Aminosäuren aus der Volllängen-MDA-7- Aminosäuresequenz fehlen, wie in den Ansprüchen definiert. Der Begriff „sezerniertes MDA-7" bezieht sich auf ein MDA-7-Polypeptid, das aus einer Zelle sezerniert wird, d. h. ein Polypeptid, das von einer Volllängen-mda7-cDNA codiert werden kann oder nicht und dessen N-Terminus bei etwa Aminosäure 46 des Volllängen-MDA-7-Polypeptids beginnt. Der Begriff „verkürztes MDA-7" und "verkürztes MDA-7-Polypeptid" umfasst ein sezerniertes MDA-7-Polypeptid, wenn beispielsweise die Signalsequenz nicht fehlt oder wenn eine heterologe Signalsequenz an das Polypeptid angeknüpft ist.
Der Begriff „biologisch funktionsäquivalent" wird auf dem Fachgebiet gut verstanden und ist weiter hier im Einzelnen definiert. Demnach ist eine Sequenz, die zwischen etwa 70% und etwa 80% oder stärker bevorzugt zwischen 81% und etwa 90%; oder auch noch stärker bevorzugt zwischen etwa 91% und etwa 99% der Aminosäuren aufweist, die identisch mit den Aminosäuren der SEQ ID NO: 2 oder funktionsäquivalent sind, eine Sequenz, die in „im Wesentlichen wie in der SEQ ID NO: 2 ausgeführt" ist, mit der Maßgabe, dass die biologische Aktivität des Proteins, Polypeptids oder Peptids beibehalten wird.
Der Begriff „funktionsäquivalentes Codon" wird hier zur Bezeichnung von Codons verwendet, die die gleiche Aminosäure codieren, wie die sechs Codons für Arginin und Serin, und bezieht sich auch auf Codons, die biologisch äquivalente Aminosäuren codieren.
Dadurch, dass Intron-Regionen und flankierende Regionen erwartet werden und dadurch, dass Degeneriertheit des genetischen Codes erlaubt ist, sind Nukleinsäuresequenzen, die zwischen etwa 70% und etwa 79%; oder stärker bevorzugt zwischen etwa 80% und etwa 89%; oder auch noch stärker bevorzugt zwischen etwa 90% und etwa 99% der Nukleinsäuren aufweisen, die mit den Nukleotiden der SEQ ID NO: 1 identisch sind, Nukleinsäuresequenzen, die „im Wesentlichen wie in der SEQ ID NO: 1 ausgeführt" sind.
Es ist auch selbstverständlich, dass die Erfindung nicht auf die bestimmte Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 2 beschränkt ist. Darum können rekombinante Vektoren und isolierte Nukleinsäuresegmente diese codierenden Regionen an sich in diverser Weise einschließen, wobei die codierenden Regionen ausgewählte Änderungen oder Modifikationen in der codierenden Grundregion tragen, und sie können größere Polypeptide oder Peptide, die dennoch solche codierenden Regionen einschließen, oder biologisch funktionsäquivalente Proteine, Polypeptide oder Peptide, die variante Aminosäuresequenzen aufweisen, codieren.
2. mda-7-Nukleinsäuren und Verwendungen davon
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht auch im Transfer der Nukleinsäuren, die die Volllängen-, im Wesentlichen Volllängen- oder die verkürzte Form von menschlichem MDA-7 codieren, um die Zerstörung, Apoptose oder die Lyse von hyperproliferativen Zellen zu induzieren. Die Expression von MDA-7 ist umgekehrt korreliert mit der Tumorprogression, wie durch erhöhte mRNA-Spiegel in normalen Melanozyten im Vergleich zu primären und metastastischen Tumoren gezeigt, sowie mit einer herabgesetzten MDA-7 Expression in frühen vertikalen Wachstumsphasen-Tumorzellen, die zur verstärken Tumorbildung in Nacktmäusen gewählt sind.
Somit umfasst bei einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung die Behandlung die Verabreichung eines therapeutischen Nukleinsäure-Expressionskonstruktes, das eine Volllängen-, im Wesentlichen Volllängen- oder verkürzte Form von MDA-7 codiert, an hyperproliferative Zellen. Es wird davon ausgegangen, dass die hyperproliferativen Zellen das Konstrukt aufnehmen und das therapeutische Polypeptid, das von Nukleinsäure codiert wird, exprimieren, wodurch wieder eine Wachstumskontrolle hergestellt wird oder wodurch die hyperproliferativen Zellen zerstört werden. Außerdem ist das lösliche MDA-7, das aus transfizierten oder transduzierten Zellen freigesetzt wird, lokal verfügbar und stellt eine Bystander-Wirkung auf benachbarten Tumorzellen bereit. Es wird somit davon ausgegangen, dass das therapeutische mda-7 Expressionskonstrukt an normale Zellen abgegeben werden kann und der freigesetzte Bystander-Effektor (MDA-7, volle Länge oder verkürzt) die Antitumorwirkungen herbeiführen würde, insbesondere bezüglich hyperproliferativer Zellen.
Bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen mindestens ein menschliches mda-7-Nukleinsäuremolekül. Bei bestimmten Aspekten umfasst die mda-7-Nukleinsäure eine Wildtyp- oder mutierte mda-7-Nukleinsäure. Bei bestimmten Aspekten codiert die mda-7-Nukleinsäure mindestens eine transkribierte Nukleinsäure. Die mda-7-Nukleinsäure codiert mindestens ein MDA-7-Polypeptid. In anderen Aspekten umfasst die menschliche mda-7-Nukleinsäure mindestens ein Nukleinsäuresegment der SEQ ID NO: 1.
Die vorliegende Beschreibung offenbart auch die Isolierung oder Erzeugung von mindestens einem rekombinanten Konstrukt oder von mindestens einer rekombinanten Wirtszelle durch Anwenden der Nukleinsäure-Rekombinationstechnik die den Fachleuten bekannt ist oder wie sie hier beschrieben ist. Das rekombinante Konstrukt oder die rekombinante Wirtszelle kann mindestens eine mda-7-Nukleinsäure umfassen und kann mindestens ein MDA-7-Polypeptid exprimieren.
Wie hier verwendet, bezieht sich „Wildtyp" auf die natürlich vorkommende Sequenz einer Nukleinsäure an einem genetischen Lokus in dem Genom eines Organismus und auf von einer solchen Nukleinsäure transkribierte oder translatierte Sequenzen. So kann der Begriff „Wildtyp" auch die Aminosäuresequenz bezeichnen, die von der Nukleinsäure codiert wird. Da ein genetischer Lokus mehr als eine Sequenz oder Allele in einer Population von Individuen aufweisen kann, umfasst der Begriff „Wildtyp" alle derartigen natürlich vorkommenden Allele. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „polymorph", dass Variation (d. h. zwei oder mehrere Allele existieren) an einem genetischen Lokus in den Individuen einer Population vorkommt. Wie hier verwendet, bezieht sich „Mutante" auf eine Änderung in der Sequenz einer Nukleinsäure oder ihrem codierten Protein, Polypeptid oder Peptid, welche das Ergebnis von DNA-Rekombinationstechnologie ist.
Eine Nukleinsäure kann durch jede dem Fachmann bekannte Technik hergestellt werden. Nicht einschränkende Beispiele für synthetische Nukleinsäure, insbesondere ein synthetisches Oligonukleotid, umfassen eine Nukleinsäure, die durch in vitro chemische Synthese unter Verwendung der Phosphotriester-, Phosphit- oder Phosphoramidit-Chemie und von Festphasentechniken, wie in EP 266,032 beschrieben, oder über Deoxynukleosid-H-phosphonat-Intermediate, wie durch Froehler et al., 1986, und in der US-Patentschrift mit der Seriennummer 5,705,629 beschrieben, hergestellt wurde. Ein nicht einschränkendes Beispiel für enzymatisch hergestellte Nukleinsäure umfasst eine Nukleinsäure, die durch Enzyme in Amplifikationsreaktionen hergestellt wurde, wie PCR^TM (siehe beispielsweise US-Patentschrift Nr. 4,683,202 und US-Patentschrift 4,682,195 ), oder die Synthese von Oligonukleotiden, die in der Patentschrift Nr. 5,645,897 beschrieben ist. Ein nicht einschränkendes Beispiel für eine biologisch produzierte Nukleinsäure umfasst die rekombinante Nukleinsäure-Produktion in lebenden Zellen, wie die rekombinante DNA-Vektor-Produktion in Bakterien (siehe beispielsweise Sambrook et al. 1989) Eine Nukleinsäure kann auf Polyacrylamid-Gelen, Cesiumchlorid-Zentrifugationsgradienten oder durch jedes andere, einem Fachmann bekannten Mittel gereinigt werden (siehe beispielsweise Sambrook et al. 1989)
Der Begriff „Nukleinsäure" bezieht sich im Allgemeinen auf mindestens ein Molekül oder einen Strang von DNA, RNA oder ein Derivat oder eine Nachstellung davon, die mindestens eine Nukleobase umfasst, wie beispielsweise eine natürlich vorkommende Purin- oder Pyrimidinbase, die in DNA (z. B. Adenine „A", Guanin „G", Thymin „T", und Cytosin „C") oder RNA (z. B. A, G, Uracil „U" und „C") vorkommt. Der Begriff „Nukleinsäure" umfasst die Begriffe „Oligonukleotid" und „Polynukleotid". Der Begriff „Oligonukleotid" bezieht sich auf mindestens ein Molekül mit einer Länge von etwa 3 bis etwa 100 Nukleobasen. Der Begriff „Polynukleotid" bezieht sich auf mindestens ein Molekül mit einer Länge von mehr als etwa 100 Nukleobasen. Diese Definitionen beziehen sich im Allgemeinen auf mindestens ein einzelsträngiges Molekül, jedoch sind bei speziellen Ausführungsformen auch mindestens ein zusätzlicher Strang mit eingeschlossen, der teilweise, im Wesentlichen oder vollständig zu dem mindestens einen einzelsträngigen Molekül komplementär ist. Somit kann eine Nukleinsäure mindestens ein doppelsträngiges Molekül oder mindestens ein dreifachsträngiges Molekül einschließen, das einen oder mehrere komplementäre Sträng(e) oder „Komplement(e)" einer bestimmten Sequenz einschließt, die einen Strang des Moleküls einschließt.
Bei bestimmten Ausführungsformen bezieht sich ein „Gen" auf eine Nukleinsäure, die transkribiert wird. Wie hier verwendet, ist ein „Gensegment" ein Nukleinsäuresegment eines Gens. In bestimmten Aspekten umfasst das Gen regulatorische Sequenzen, die an der Transkription oder an der Message-Produktion oder -Komposition beteiligt sind. Bei bestimmten Ausführungsformen umfasst das Gen transkribierte Sequenzen, die ein Protein, Polypeptid oder Peptid codieren. In anderen bestimmten Aspekten umfasst das Gen eine mda-7-Nukleinsäure und/oder codiert ein MDA-7-Polypeptid oder Peptid-codierende Sequenzen. In Anlehnung an die hierin beschriebene Terminologie kann ein in „isoliertes Gen" transkribierte Nukleinsäure(n), regulatorische Sequenzen, codierende Sequenzen oder dergleichen einschließen, die im Wesentlichen von anderen derartigen Sequenzen isoliert sind, wie andere natürliche vorkommende Gene, regulatorische Sequenzen, Polypeptid- oder Peptid-codierende Sequenzen etc.. In dieser Hinsicht wird der Begriff „Gen" zur Vereinfachung der Bezugnahme auf eine Nukleinsäure eingesetzt, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die transkribiert ist, und das Komplement davon. In bestimmten Aspekten umfasst die transkribierte Nukleotidsequenz mindestens eine funktionelle Protein-, Polypeptid- und/oder Peptid-codierende Einheit. Wie es von den Fachleuten verstanden wird, umfasst dieser funktionelle Begriff „Gen" sowohl genomische Sequenzen, RNA- oder cDNA-Sequenzen oder kleinere, gentechnisch hergestellte Nukleinsäuresegmente, einschließlich von Nukleinsäuresegmenten eines nicht-transkribierten Teils eines Gens, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, die nicht-transkribierten Promotor- oder Enhancer-Regionen eines Gens. Kleinere gentechnisch hergestellte Gen-Nukleinsäuresegmente können exprimiert werden oder können zur Expression unter Verwendung von Nukleinsäure-Manipulationstechnologie, von Proteinen, Polypeptiden, Domänen, Peptiden, Domänen, Fusionsproteinen, Mutanten und/oder derartigen übernommen werden. Somit bezieht sich ein „verkürztes Gen" auf eine Nukleinsäuresequenz, der eine Spanne von zusammenhängenden Nukleinsäure-Resten fehlt, die einen Teil des Volllängen-MDA-7-Polypeptids codieren. Beispielsweise darf ein verkürztes Gen die Nukleinsäuresequenz für die N-terminale Region des MDA-7-Polypeptids, wie die ersten 46 Aminosäuren, nicht enthalten. Es wird davon ausgegangen, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen weniger als 95% der zusammenhängenden Nukleinsäure-Reste der SEQ ID NO: 1 enthalten können. Alternativ können diese Sequenzen weniger als 90%, 85%, 80%, 75%, oder 70% der zusammenhängenden Nukleinsäure-Reste der SEQ ID NO: 1 codieren.
„Isoliert, im Wesentlichen von anderen codierenden Sequenzen" bedeutet, dass das Gen von Interesse, in diesem Fall das mda-7-Gen, den signifikanten Teil der codierenden Region der Nukleinsäure bildet, oder dass diese Nukleinsäure keine großen Teile von natürlich vorkommenden codierenden Nukleinsäuren enthält, wie große chromosomale Fragmente, andere funktionelle Gene, RNA- oder cDNA-codierende Regionen. Natürlich bezieht sich dies auf die Nukleinsäure, wie ursprünglich isoliert, und schließt Gene oder codierende Regionen nicht aus, die später an die Nukleinsäure durch Nukleinsäure-Rekombinationstechnik addiert wurden.
Bei bestimmten Ausführungsformen ist die Nukleinsäure ein Nukleinsäuresegment. Wie hier verwendet, ist der Begriff „Nukleinsäuresegment" kleinere Fragmente einer Nukleinsäure, wie als nicht einschränkendes Beispiel diejenigen, die nur Teil MDA-7-Peptids oder der Polypeptidsequenz codieren. Somit kann ein „Nukleinsäuresegment" einen beliebigen Teil der mda-7-Gensequenz umfassen, von etwa 2 Nukleotiden bis zu der vollen Länge der MDA-7-Peptid- oder -Polypeptid-codierenden Region. Bei bestimmten Ausführungsformen umfasst das „Nukleinsäuresegment" die mda-7-Gensequenz voller Länge. Bei bestimmten Ausführungsformen umfasst die Nukleinsäure jeden beliebigen Teil der SEQ ID NO: 1 von etwa 2 Nukleotiden bis zu der vollen Länge der Sequenz, die die SEQ ID NO: 2 codiert.
Verschiedene Nukleinsäuresegmente können auf der Grundlage einer bestimmten Nukleinsäuresequenz konstruiert werden und können jede beliebige Länge aufweisen. Durch Zuordnen numerischer Werte einer Sequenz, beispielsweise ist der erste Rest 1, der zweite Rest 2, etc., kann ein Algorithmus kreiert werden, der alle Nukleinsäuresegmente definiert:
n bis n + y,
wobei n eine ganze Zahl von 1 bis zu der letzten Zahl der Sequenz ist und y die Länge des Nukleinsäuresegmentes minus 1 ist, wobei n + y die letzte Zahl der Sequenz nicht übersteigt. Somit entsprechen für ein 10-mer die Nukleinsäuresegmente den Basen 1 bis 10, 2 bis 11, 3 bis 12, ... und/oder so weiter. Für ein 15-mer entsprechen die Nukleinsäuresegmente den Basen 1 bis 15, 2 bis 16, 3 bis 17 ... und/oder so weiter. Für ein 20-mer entsprechen die Nukleinsäuresegmente den Basen 1 bis 20, 2 bis 21, 3 bis 22... und/oder so weiter. Bei bestimmten Ausführungsformen kann das Nukleinsäuresegment eine Sonde oder ein Primer sein.
Die Nukleinsäure(n) kann (können), ohne Rücksicht auf die Länge der Sequenz selbst, mit anderen Nukleinsäuresequenzen kombiniert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Promotoren, Enhancer, Polyadenylierungssignale, Restriktionsenzymstellen, multiple Klonierungsstellen, codierende Segmente und dergleichen, um ein oder mehrere Nukleinsäure-Konstrukt(e) zu erzeugen. Die Gesamtlänge kann zwischen Nukleinsäure-Konstrukten beträchtlich variieren. So kann ein Nukleinsäuresegment von fast jeder beliebigen Länge eingesetzt werden, wobei die Gesamtlänge vorzugsweise durch die Leichtigkeit der Herstellung oder Verwendung bei dem beabsichtigten Nukleinsäure-Rekombinationsprotokoll begrenzt ist.
In einem nicht einschränkenden Beispiel können ein oder mehrere Nukleinsäure-Konstrukte hergestellt werden, die eine zusammenhängende Spanne von Nukleinsäuren einschließen, die identisch oder komplementär sind zu der SEQ ID NO: 1, die ein menschliches MDA-7-Polypeptid, wie in den Ansprüchen dargelegt, codiert. Eine solche Spanne von Nukleinsäuren oder ein Nukleinsäure-Konstrukt kann sein: etwa 95, etwa 100, etwa 105, etwa 110, etwa 115, etwa 120, etwa 125, etwa 130, etwa 135, etwa 140, etwa 145, etwa 150, etwa 155, etwa 160, etwa 165, etwa 170, etwa 175, etwa 180, etwa 185, etwa 190, etwa 195, etwa 200, etwa 210, etwa 220, etwa 230, etwa 240, etwa 250, etwa 260, etwa 270, etwa 280, etwa 290, etwa 300, etwa 310, etwa 320, etwa 330, etwa 340, etwa 350, etwa 360, etwa 370, etwa 380, etwa 390, etwa 400, etwa 410, etwa 420, etwa 430, etwa 440, etwa 450, etwa 460, etwa 470, etwa 480, etwa 490, etwa 500, etwa 510, etwa 520, etwa 530, etwa 540, etwa 550, etwa 560, etwa 570, etwa 580, etwa 590, etwa 600, etwa 610, etwa 618, etwa 650, etwa 700, etwa 750, etwa 1.000, etwa 2.000, etwa 3.000, etwa 5.000, etwa 10.000, etwa 15.000, etwa 20.000, etwa 30.000, etwa 50.000, etwa 100.000, etwa 250.000, etwa 500.000, etwa 750.000, bis etwa 1.000.000 Nukleotide in der Länge, sowie Konstrukte von größerer Größe bis zu und einschließlich von chromosomalen Größen (einschließlich sämtlicher dazwischenliegender Längen und dazwischenliegender Bereiche), mit der Maßgabe, dass das Aufkommen von Nukleinsäure-Konstrukten, wie ein künstliches Hefe-Chromosom, den Fachleuten bekannt ist. Es ist unschwer zu verstehen, dass „dazwischenliegende Längen" und „dazwischenliegende Bereiche", wie hier verwendet, jede beliebige Länge oder jeden beliebigen Bereich einschließlich oder zwischen den angegebenen Werten (d. h. alle ganzen Zahlen einschließlich und zwischen solchen Werten) bedeutet. Nicht einschränkende Beispiele für dazwischenliegende Längen umfassen etwa 101, etwa 102, etwa 103, etc.; etwa 151, etwa 152, etwa 153, etc.; etwa 1.001, etwa 1.002, etc.; etwa 50.001, etwa 50.002, etc; etwa 750.001, etwa 750.002, etc.; etwa 1.000.001, etwa 1.000.002, etc. Nicht einschränkende Beispiele umfassen etwa 150 bis etwa 500.001, etwa 3.032 bis etwa 7.145, etwa 5.000 bis etwa 15.000, etwa 20.007 bis etwa 1.000.003, etc.
Es ist weiterhin zu verstehen, dass eine Nukleinsäuresequenz, die alles oder einen Teil eines MDA-7-Polypeptids codiert, aus zusammenhängenden, komplementären oder identischen Nukleinsäuresequenzen von einer der vorstehend beschriebenen Länge und aus der SEQ ID NO: 1 bestehen kann.
Es wird davon ausgegangen, dass die Nukleinsäure-Konstrukte ein Volllängen-MDA-7 oder eine verkürzte Version von MDA-7 codieren können, wie in den Ansprüchen dargelegt, derart, dass das Transkript der codierenden Region die verkürzte Version darstellt. Das verkürzte Transkript kann dann in ein verkürztes Protein translatiert werden. Alternativ kann eine Nukleinsäuresequenz eine Volllängen-MDA-7-Proteinsequenz codieren, die durch die zelluläre Maschinerie prozessiert wird, um ein verkürztes MDA-7, wie in den Ansprüchen dargelegt, zu produzieren. Solche Nukleinsäuremoleküle können zusammenhängende Nukleotide der obigen Längen aus SEQ ID NO: 1 enthalten. So können die Sequenzen der vorliegenden Erfindung zusammenhängende Nukleinsäuren enthalten, die komplementär oder identisch zu SEQ ID NO: 1 sind, und dennoch weniger als die ganze Sequenz der SEQ ID NO: 1 sind. Beispielsweise kann die Sequenz weniger als 718 zusammenhängende Nukleinsäuren aus der SEQ ID NO: 1 enthalten; sie kann stattdessen weniger als 700, 690, 680, 670, 660, 650, 640, 630, 620, 610, 600, 590, 580, 570, 560, 550, 540, 530, 520, 510, 500, 490, 480, 470, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200 oder weniger zusammenhängende Nukleotide oder Nukleotide aus der SEQ ID NO: 1 enthalten.
Der Begriff „eine Sequenz, im Wesentlichen wie in der SEQ ID NO: 1 dargelegt" oder „eine Sequenz, im Wesentlichen wie in der SEQ ID NO: 1 dargelegt" bedeutet, dass die Sequenz im Wesentlichen einem Teil der SEQ ID NO: 1 entspricht und relativ wenige Aminosäuren aufweist, die nicht identisch sind zu oder die keine biologisch funktionellen Äquivalente der Aminosäuren der SEQ ID NO: 2 sind.
a. Vektoren und regulatorische Signale
Die erfindungsgemäße Vektoren sind hauptsächlich zur Transformation hyperproliferativer Zellen mit einem therapeutischen mda-7-Gen unter der Kontrolle von regulierten eukaryotischen Promotoren (d. h. konstitutiv, induzierbar, repressierbar, gewebespezifisch) ausgelegt. Ferner können die Vektoren einen selektierbaren Marker enthalten, falls, aus keinem anderen Grund, ihre Manipulation in vitro erleichtert wird. Allerdings können selektierbare Marker bei der Produktion rekombinanter Zellen eine bedeutende Rolle spielen.

Die Tabellen 1 und 2 nachstehend führen eine Vielzahl regulatorischer Signale zur erfindungsgemäßen Verwendung auf. Tabelle 1 – Induzierbare Elemente

Element	Inducer	Druckschriften
MT II	Phorbol Ester (TFA) Schwermetalle	Palmiter et al., 1982; Haslinger und Karin, 1985; Searle et al., 1985; Stuart et al., 1985; Imagawa et al., 1987; Karin^®, 1987; Angel et al., 1987b; McNeall et al., 1989
MMTV (Maus-Mammatumorvirus)	Glucocorticoid	Huang et al., 1981; Lee et al., 1981; Majors und Varmus, 1983; Chandler et al., 1983; Lee et al., 1984; Fonta et al., 1985; Sakai et al., 1986
β-Interferon	poly(rI)X poly(rc)	Tavernier et al., 1983
Adenovirus 5 E2	E1A	Imperiale und Nevins, 1984
Collagenase	Phorbol Ester (TPA)	Angel et al., 1987a
Stromelysin	Phorbol Ester (TPA)	Angel et al., 1987b
SV40	Phorbol Ester (TFA)	Angel et al., 1987b
murines MX Gen	Interferon, Newcastle Disease Virus	Hug et al., 1988
GRP78 Gen	A23187	Resendez et al., 1988
α-2-Macroglobulin	IL-6	Kunz et al., 1989
Vimentin	Serum	Rittling et al., 1989
MHC-Klasse I-Gen H-2κb	Interferon	Blanar et al., 1989
HSP70	E1A, SV40 Large T Antigen	Taylor et al., 1989; Taylor and Kingston, 1990a, b
Proliferin	Phorbol Ester-TPA	Mordacq und Linzer, 1989
Tumornekrosefaktor	PMA	Hensel et al., 1989
Thyroid-stimulierendes Hormon-αGen	Thyroid Hormon	Chatterjee et al., 1989

Tabelle 2 – Weitere Promotoren/Enhancer-Elemente

Promotor/Enhancer	Druckschriften
Immunglobulin, schwere Kette	Banerji et al., 1983; Gilles et al., 1983; Grosschedl und Baltimore, 1985; Atchinson und Perry, 1986, 1987; Imler et al., 1987; Weinberger et al., 1988; Kiledjian et al., 1988; Porton et al., 1990
Immunglobulin, leichte Kette	Queen und Baltimore, 1983; Picard und Schaffner, 1984
T-Zellen-Rezeptor	Luria et al., 1987, Winoto und Baltimore, 1989; Redondo et al., 1990
HLA DQα und DQβ	Sullivan und Peterlin, 1987
β-Interferon	Goodbourn et al., 1986; Fujita et al., 1987; Goodbourn und Maniatis, 1985
Interleukin-2	Greene et al., 1989
Interleukin-2-Rezeptor	Greene et al., 1989; Lin et al., 1990
MHC Klasse II	Koch et al., 1989
MHC Klasse II HLA-DRα	Sherman et al., 1989
β-Actin	Kawamoto et al., 1988; Ng et al., 1989
Muskelkreatinkinase	Jaynes et al., 1988; Horlick und Benfield, 1989; Johnson et al., 1989a
Prealbumin (Transthyretin)	Costa et al., 1988
Elastase I	Omitz et al., 1987
Metallothionein	Karin et al., 1987; Culotta und Hamer, 1989
Collagenase	Pinkert et al., 1987; Angel et al., 1987
Albumin Gen	Pinkert et al., 1987, Tronche et al., 1989, 1990
α-Fetoprotein	Godbout et al., 1988; Campere und Tilghman, 1989
γ-Globin	Bodine und Ley, 1987; Perez-Stable Constantini, 1990
β-Globin	Trudel und Constantini, 1987
c-fos	Cohen et al., 1987
c-HA-ras	Triesman, 1986; Deschamps et al., 1985
Insulin	Edlund et al., 1985
neurales Zelladhäsionsmolekül (NCAM)	Hirsch et al., 1990
a₁-antitrypsin	Latimer et al., 1990
H2B (TH2B) Histon	Hwang et al., 1990
Maus- oder Typ 1-Collagen	Ripe et al., 1989
Glucose-Regulate Proteine (GRP94 GRP78)	Chang et al., 1989
Ratten-Wachstumshormon	Larsen et al., 1986
humanes Serum-Amyloid A (SAA)	Edbrooke et al., 1989
Troponin I (TN I)	Yutzey et al., 1989
Plättchen-abgeleiter Wachstumsfaktor	Pech et al., 1989
Duchenne-Muskeldystrophie	Klamut et al., 1990
SV40	Banerji et al., 1981; Moreau et al., 1981; Sleigh und Lockett, 1985; Firak und Subramanian, 1986; Herr und Clarke. 1986; Imbra und Karin, 1986; Kadesch und Berg, 1986; Wang und Calame, 1986; Ondek et al., 1987; Kuhl et al., 1987 Schaffner et al., 1988
Polyom	Swartzendruber und Lehman, 1975; Vasseur et al., 1980; Katinka et al., 1980, 1981; Tyndell et al., 1981; Dandolo et al., 1983; deVilliers et al., 1984; Hen et al., 1986; Satake et al., 1988; Campbell und Villarreal, 1988
Retroviren	Kriegler und Botchan, 1982, 1983; Levinson et al., 1982; Kriegler et al., 1983, 1984a, b, 1988; Bosze et al., 1986; Miksicek et al., 1986; Celander und Haseltine, 1987; Thiesen et al., 1988; Celander et al., 1988; Chol et al., 1988; Reisman und Rotter, 1989
Papilloma Virus	Campo et al., 1983; Lusky et al., 1983; Spandidos und Wilkie, 1983; Spalholz et al., 1985; Lusky und Botchan, 1986; Cripe et al., 1987; Gloss et al., 1987; Hirochika et al., 1987, Stephens und Hentschel, 1987; Glue et al., 1988
Hepatitis B Virus	Bulla und Siddiqui, 1986; Jameel und Siddiqui, 1986; Shaul und Ben-Levy, 1987; Spandau and Lee, 1988
Human Immunodeficiency Virus	Muesing et al., 1987; Hauber und Cullan, 1988; Jakobovits et al., 1988; Feng und Holland, 1988; Takebe et al., 1988; Rowen et al., 1988; Berkhout et al., 1989; Laspia et al., 1989; Sharp und Marciniak, 1989; Braddock et al., 1989
Cytomegalovirus	Weber et al., 1984; Boshart et al., 1985; Foecking und Hofstetter, 1986
Gibbonaffen-Leukämievirus	Holbrook et al., 1987; Quinn et al., 1989

Die Promotoren und Enhancer, die die Transkription von Protein-codierenden Genen in eukaryotischen Zellen kontrollieren, bestehen aus mehreren genetischen Elementen. Die Zellmaschinerie ist in der Lage, die regulatorische Information, die von jedem Element geliefert wird, zu sammeln und zu integrieren, wodurch es möglich ist, dass verschiedene Gene distinkte, oft komplexe Muster von transkriptionaler Regulation entwickeln. Ein Promotor, der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfasst konstitutive, induzierbare und gewebespezifische Promotoren.
Der Begriff „Promotor" wird hier zur Bezugnahme auf eine Gruppe von transkriptionalen Kontrollmolekülen verwendet, die um die Initiationsstelle für RNA Polymerase II geclustert sind. Ein großer Teil der Vorstellung darüber, wie Promotoren organisiert sind, entstammt Analysen mehrerer viraler Promotoren, einschließlich derjenigen für die HSV-Thymidinkinase (tk) und die SV40-frühen Transkriptionseinheiten. Diese Studien, die um neuere Arbeiten ergänzt wurden, haben gezeigt, dass Promotoren aus diskreten funktionellen Modulen bestehen, die jeweils aus ungefähr 7–20 bp DNA bestehen und eine oder mehrere Erkennungsstellen für transkriptionale Aktivatorproteine enthalten.
Mindestens ein Molekül in jedem Promotor hat die Funktion der Positionierung der Startstelle für die RNA-Synthese. Das am besten bekannte Beispiel hierfür ist die TATA-Box, jedoch unterstützt in einigen Promotoren, denen eine TATA-Box fehlt, wie der Promotor für das Säuger-terminale Deoxynucleotidyl-Transferase-Gen und der Promotor für die SV40-späten Gene, ein diskretes Element, das über der Startstelle selbst liegt, die Fixierung der Initiationsstelle.
Zusätzliche Promotorelemente regulieren die Frequenz der transkriptionalen Initiation. Typischerweise sind diese in der Region 30–110 bp stromaufwärts von der Startstelle lokalisiert, obwohl es sich neuerdings gezeigt hat, dass eine Anzahl von Promotoren auch funktionelle Elemente stromabwärts von der Startstelle enthalten. Der Abstand zwischen Elementen ist flexibel, sodass die Promotorfunktion konserviert wird, wenn Elemente umgekehrt oder relativ zueinander bewegt werden. In dem tk-Promotor kann der Abstand zwischen Elementen auf bis 50 Basenpaare Abstand erhöht werden, bevor die Aktivität abzunehmen beginnt. In Abhängigkeit von dem Promotor können anscheinend individuelle Elemente entweder kooperativ oder unabhängig zur Aktivierung der Transkription funktionieren.
Enhancer wurden ursprünglich als genetische Elemente nachgewiesen, die die Transkription aus einem Promotor erhöhten, der an einer beabstandeten Position auf dem gleichen DNA-Molekül lokalisiert ist. Die Fähigkeit, über einen großen Abstand hinweg zu wirken, hat bei klassischen Studien der prokaryotischen transkriptionalen Regulation wenig Vorläufer. Spätere Arbeiten zeigten, dass DNA-Regionen mit Enhancer-Aktivität weitgehend wie Promotoren organisiert sind. Das heißt, sie bestehen aus vielen einzelnen Elementen, die jeweils an ein oder mehrere transkriptionale Proteine binden.
Die Grundunterscheidung zwischen Enhancern und Promotoren ist funktionell. Eine Enhancer-Region als Ganzes muss in der Lage sein, die Transkription in einem Abstand zu stimulieren; dies braucht für eine Promotor-Region oder ihre Komponentenelemente nicht zuzutreffen. Andererseits muss ein Promotor ein oder mehrere Elemente aufweisen, die die Initiation der RNA-Synthese an einer bestimmten Stelle und in einer bestimmten Orientierung lenkt, wohingegen den Enhancern diese Spezifität fehlt. Abgesehen von dieser funktionellen Unterscheidung sind Enhancer und Promotoren sehr ähnliche Einheiten.
Promotoren und Enhancer besitzen die gleiche allgemeine Funktion der Aktivierung der Transkription in der Zelle. Sie sind oft überlappend und zusammenhängend, und scheinen oft eine sehr ähnliche modulare Organisation aufzuweisen. Zusammengenommen legen diese Überlegungen nahe, dass Enhancer und Promotoren homologe Einheiten sind und dass die transkriptionalen Aktivatorproteine, die an diese Sequenzen gebunden sind, mit der zellulären Transkriptionsmaschinerie im Grunde genommen auf die gleiche Weise Wechselwirken können.

Bevorzugt zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung ist der Cytomegalovirus(CMV)-Promotor. Dieser Promotor ist im Handel von der Firma Invitrogen in dem Vektor pcDNAIII erhältlich, der zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist. Ebenfalls als bei der vorliegenden Erfindung geeignet betrachtet werden die Dectin-1- und Dectin-2-Promotoren. Zusätzliche virale Promotoren, zelluläre Promotoren/Enhancer und induzierbare Promotoren/Enhancer, die in Kombination mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt. Zusätzlich könnte jede Promotor/Enhancer-Kombination (wie durch die Eukaryotic Promotor Data Base EPDB) auch zum Antreiben der Expression von Strukturgenen verwendet werden, die Oligosaccharid-prozessierende Enzyme, Protein-faltende akzessorische Proteine, selektierbare Markerproteine oder ein heterologes Protein von Interesse codieren. Alternativ kann ein gewebespezifischer Promotor für die Krebsgentherapie (Tabelle 3) oder das Targeting von Tumoren (Tabelle 4) mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen eingesetzt werden. Tabelle 3: Gewebespezifische Kandidatenpromotoren für die Krebsgentherapie

Gewebespezifischer Promotor	Krebse, in denen der Promotor aktiv ist	Normale Zellen, in denen der Promotor aktiv ist
Karzinoembryonische Antigen-; (CEA)	die meisten Kolorektalkarzinome; 50% der Lungenkarzinome; 40–50% von Magenkarzinomen; die meisten Pankreaskarzinome; viele Brustkarzinome; die meisten Prostatakarzinome	Darm-Mukosa; gastrische Mukosa; Lungenepithel; endokrine Schweißdrüsenzellen in Hoden
Prostata-spezifisches Antigen (PSA)	die meisten Prostatakarzinome	Prostataepithel
Vasoaktives intestinales Peptid (VIP)	die Mehrheit von nicht-kleinzelligen Lungenkrebsen	Neuronen; Lymphozyten; Mastzellen; Eosinophile
Oberflächenprotein A (SPA)-Zellen;	Viele Lungenadenokarzinome	Typ II Pneumozyten; Clara
Humanes Achaete-scute-Homolog (hASH)	die meisten kleinzelligen Lungenkrebse	Neuroendokrine Zellen in der Lunge
Mucin-I (MUCI)**	die meisten Adenokarzinome (entstammend einem beliebigen Gewebe)	GF-anduläre Epithelzellen in der Brust und in den Atemwegen, im Gastrointestinaltrakt und im Genitourinaltrakt
Alpha-Fetoprotein	die meisten Leberzellenkarzinome; möglicherweise viele testikuläre Krebse	Hepatozyten (unter bestimmten Bedingungen); Hoden
Albumin	die meisten Leberzellenkarzinome	Hepatozyten
Tyrosinase	die meisten Melanome	Melanozyten; Astrozyten; Schwann-Zellen; einige Neuronen
Tyronsin-bindendes Protein (TRP)	die meisten Melanome	Melanozyten; Astrozyten; Schwann-Zellen; einige Neuronen
Keratin 14	vermutlich viele Schuppenzellen Karzinome (z. B. Kopf- und Nackenkrebse)	Keratinozyten
EBV LD-2	viele Platten-Epithelkarzinome	Keratinozyten des oberen Verdauungstraktes Kopf und Nacken
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	viele Astrozytome	Astrozyten
Myelin Basic Protein (MBP)	viele Gliome	Oligodentrozyten
Hoden-spezifisches Angiotensin-Umwandlungsenzym (Hoden-spezifisches ACE)	möglicherweise viele Hodenkrebse	Spermatozoen
Osteocalcin	möglicherweise viele Osteosarkome	Osteoblasten

Tabelle 4: Kandidatenpromotoren zur Verwendung mit einem gewebespezifischen Targeting von Tumoren

Promotor	Krebse, in denen der Promotor aktiv ist	Normale Zellen, in denen der Promotor aktiv ist
E2F-regulierter Promotor	fast alle Krebse	proliferierende Zellen
HLA-G	viele Kolorektalkarzinome; viele Melanome; möglicherweise viele andere Krebse	proliferierende Zellen; Lymphozyten; Monozyten; Spermatozyten; Trophoblasten
FasL	viele Melanome; viele Pankreaskarzinome; die meisten Astrozytome	aktivierte Leukozyten; Neuronen; Endothelzellen; Keratinzytenzellen in immunpriviligierten Geweben; einige Zellen Lungen, Eierstöcken, Leber und Prostata
Myc-regulierter Promotor	die meisten Lungenkarzinome (sowohl kleinzelliges als auch nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom); die meisten Kolorektalkarzinome	proliferierende Zellen (nur einige Zelltypen: Mamma-Epithelzellen (einschließlich nicht-proliferierender Zellen)
MAGE-1	viele Melanome; einige nicht-kleinzellige Lungenkarzinome; einige Brustkarzinome	Hoden
VEGF	70% aller Krebse (konstitutive Überexpression in vielen Krebsen)	Zellen an Stellen von Neovaskularisation (jedoch im Gegensatz zu Tumoren ist die Expression transient, weniger stark und niemals konstitutiv)
bFGF	Vermutlich viele verschiedene Krebse, das bFGF-Expression durch ischämische Zustände ausgelöst wird	Zellen an Stellen von Ischämie (jedoch im Gegensatz zu Tumoren ist die Expression transient, weniger stark und niemals konstitutiv)
COX-2	die meisten Kolorektal-karzinome; viele Lungenkarzinome; möglicherweise viele andere Krebse	Zellen an Entzündungsstellen
IL-10	die meisten Kolorektalkarzinome; viele Lungenkarzinome; viele squamöse Zellkarzinome von Kopf und Nacken; möglicherweise viele andere Krebse	Leukozyten
GRP78/BiP	Vermutlich viele verschiedene Krebse, da die GRP7S-Expression durch tumorspezifische Zustände induziert wird	Zellen an Stellen von Ischämie
CArG-Elemente aus Egr-1	Induziert durch ionisierende Strahlung, so vermutlich die meisten Tumoren bei Bestrahlung	Zellen, die ionisierender Strahlung exponiert sind; Leukozyten

Ein weiteres Signal, das sich als geeignet erweisen kann, ist ein Polyadenylierungssignal (hGH, BGH, SV40). Die Verwendung von internen Ribosomen-Bindungsstellen(IRES)-Elementen wird zur Erzeugung von multigenen oder polyzistronischen Botschaften verwendet. IRES-Elemente sind in der Lage, das Ribosomen-Scanningmodell der 5'-methylierten cap-abhängigen Translation zu umgehen und die Translation an internen Stellen zu beginnen (Pelletier and Sonenberg, 1988). IRES-Elemente von zwei Mitgliedern der Picornavirus-Familie (Polio- und Encephalomyocarditis) (Pelletier and Sonenberg, 1988), sowie eine IRES aus einer Säugerbotschaft (Macejak and Sarnow, 1991) wurden bereits beschrieben. IRES-Elemente können mit heterologen offenen Leserastern verknüpft sein. Mehrere offene Leseraster können miteinander transkribiert werden, jeweils getrennt durch eine IRES; was polycistronische Botschaften erzeugt. Aufgrund des IRES-Elements ist jedes offene Leseraster Ribosomen zur effizienten Translation zugänglich. Mehrere Gene können wirksam unter Verwendung eines einzigen Promotors/Enhancers zur Transkription einer einzigen Botschaft exprimiert werden.
Auf jeden Fall ist es selbstverständlich, dass Promotoren DNA-Elemente sind, die, wenn sie funktionell stromaufwärts von einem Gen positioniert sind, zur Expression dieses Gens führen. Die meisten transgenen Konstrukte der vorliegenden Erfindung sind funktionell stromabwärts von einem Promotorelement positioniert.
b. Gentransfer
i. Virale Transformation
a) Adenovirale Infektion
Ein Verfahren der Abgabe der rekombinanten DNA umfasst die Verwendung eines Adenovirus-Expressionsvektors. Obwohl Adenovirus-Vektoren bekanntlich ein geringes Vermögen der Integration in genomische DNA besitzen, wird diesem Merkmal durch die hohe Effizienz des Gentransfers, der von diesen Vektoren geleistet wird, entgegengewirkt. „Adenovirus-Expressionsvektor" bedeutet, dass diejenigen Konstrukte eingeschlossen sind, die Adenovirus-Sequenzen enthalten, die ausreichen, um (a) das Verpacken der Konstrukte zu unterstützen und (b) um letztendlich ein rekombinantes Genkonstrukt zu exprimieren, das darin kloniert wurde.
Der Vektor umfasst eine genetisch hergestellte Form von Adenovirus. Die Kenntnis der genetischen Organisation von Adenovirus, ein 36 kb, lineares, doppelsträngiges DNA-Virus, erlaubt den Ersatz von großen Stücken von adenoviraler DNA mit Fremdsequenzen bis zu 7 kb (Grunhaus and Horwitz, 1992). Im Gegensatz zu Retrovirus führt die adenovirale Infektion von Wirtszellen nicht zur chromosomalen Integration, da adenovirale DNA episomal ohne potentielle Genotoxizität replizieren kann. Auch sind Adenoviren strukturell stabil, und es wurde nach extensiver Amplifikation keine Genom-Umlagerung nachgewiesen.
Adenovirus ist zur Verwendung als ein Gentransfervektor aufgrund seines mittelgroßen Genoms, der Leichtigkeit der Manipulation des hohen Titers, des breiten Zielzellenbereiches und der hohen Infektiosität besonders geeignet. Beide Enden des viralen Genoms enthalten 100–200 Basenpaare invertierte Wiederholungseinheiten (ITRs), welches cis-Elemente sind, die zur viralen DNA-Replikation und zum Verpacken notwendig sind. Die frühen (E) und späten (L) Regionen des Genoms enthalten verschiedene Transkriptionseinheiten, die durch das Einsetzen der viralen DNA-Replikation unterteilt werden. Die E1-Region (E1A und E1B) codiert Proteine, die für die Regulation der Transkription des viralen Genoms und einiger zellulärer Gene verantwortlich sind. Die Expression der E2-Region (E2A und E2B) führt zur Synthese der Proteine für die virale DNA-Replikation. Diese Proteine sind an der DNA-Replikation, der späten Genexpression und dem Wirtszellen-Abschalten beteiligt (Renan, 1990). Die Produkte der späten Gene, einschließlich des Mehrheit der viralen Caspid-Proteine, werden nur nach signifikanter Prozessierung eines einzelnen primären Transkripts exprimiert, das von dem Major Late Promotor (MLP) ausgegeben wird. Der MLP (lokalisiert bei 16.8 m.u.) ist besonders während der späten Phase der Infektion wirksam, und alle mRNAs, die diesem Promotor entstammen, besitzen eine 5'-tripartite Leader (TPL) Sequenz, die sie für die Translation von mRNAs bevorzugt macht.
Bei einem aktuellen System wird rekombinantes Adenovirus aus homologer Rekombination zwischen Shuttle-Vektor und Provirus-Vektor erzeugt. Aufgrund der möglichen Rekombination zwischen zwei proviralen Vektoren kann das Wildtyp-Adenovirus aus diesem Prozess erzeugt werden. Darum ist es kritisch, einen einzelnen Virusklon aus einer individuellen Plaque zu isolieren und seine genomische Struktur zu untersuchen.
Erzeugung und Propagation der aktuellen Adenovirus-Vektoren, die replikationsdefizient sind, hängen von einer einzigartigen Helfer-Zelllinie ab, die als 293 bezeichnet wird, die aus menschlichen embryonalen Nierenzellen durch Ad5-DNA-Fragmente und konstitutiv exprimierten 1-Proteinen transformiert wurde (Graham et al., 1977). Da die E3-Region aus dem Adenovirus-Genom entbehrlich ist (Jones and Shenk, 1978), tragen die aktuellen Adenovirus-Vektoren, mit der Hilfe der 293-Zellen, Fremd-DNA entweder in der E1-, der E3-, oder in beiden Regionen (Graham and Prevec, 1991). In der Natur kann Adenovirus ungefähr 105% des Wildtypgenoms verpacken (Ghosh-Choudhury et al., 1987), was Kapazität für etwa 2 extra kb DNA bereitstellt. Kombiniert mit den ungefähr 5,5 kb DNA, die in der E1- und E3-Region ersetzbar sind, ist die maximale Kapazität des aktuellen Adenovirus-Vektor unter 7,5 kb, oder etwa 15% der gesamten Länge des Vektors. Mehr als 80% des Adenovirus-viralen Genoms verbleiben in dem Vektorgerüst.
Helfer-Zelllinien können sich von menschlichen Zellen, wie menschlichen embryonalen Nierenzellen, Muskelzellen, hämatopoietischen Zellen oder anderen menschlichen embryonalen mesenchymalen der epithelialen Zellen ableiten. Alternativ können sich Helferzellen von den Zellen von anderen Säugerspezies ableiten, die für das menschliche Adenovirus zugelassen sind. Solche Zellen umfassen z. B. Vero-Zellen oder andere embroyonale Affen-Mesenchym- oder Epithel-Zellen. Wie vorstehend ausgeführt, ist die bevorzugte Helfer-Zelllinie 293.
Racher et al. (1995) haben verbesserte Verfahren der Kultivierung von 293-Zellen und der Propagation von Adenovirus offenbart. In einem Format werden natürliche Zellaggregate durch Überimpfen von einzelnen Zellen in 1-Liter-Silikon-Schwenkkolben (rechne, Cambridge, UK), die 100–200 ml Medium enthalten, gezüchtet. Nach dem Rühren bei 40 U/min wird die Zell-Überlebensfähigkeit mit Trypanblau evaluiert. Bei einem anderen Format werden Fibra-Cel-Mikroträger (Bibby Sterlin, Stone, UK) (5 g/l) wie folgt eingesetzt. Ein Zell-Inokulum, resuspendiert in 5 ml Medium, wird dem Träger (50 ml) in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben zugesetzt und und 1 Stunde bis 4 Stunden unter gelegentlichem Rühren stehen gelassen. Das Medium wird dann durch 50 ml frisches Medium ersetzt und das Schütteln wird begonnen. Zur viralen Produktion werden die Zellen bei etwa bis zu etwa 80% Konfluenz wachsen gelassen, wonach das Medium ersetzt (bis auf 25% des Endvolumens) und Adenovirus bei einer MOI von 0,05 zugesetzt wird. Die Kulturen werden über Nacht stehen gelassen, wonach das Volumen um 100% vergrößert ist, und das Schütteln wird für weitere 72 Stunden begonnen.
Der Adenovirus-Vektor kann replikationsdefekt sein oder mindestens konditional defekt sein, die Natur des Adenovirus-Vektors wird nicht als essentiell für die erfolgreiche Praxis der Erfindung betrachtet. Das Adenovirus kann jeder beliebige der 42 verschiedenen bekannten Serotypen oder Untergruppen A–F sein. Adenovirus-Typ 5 der Untergruppe C ist das bevorzugte Ausgangsmaterial, um den konditionalen replikationsdefekten Adenovirus-Vektor zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Dies beruht darauf, da Adenovirus-Typ 5 ein menschliches Adenovirus ist, über das eine beträchtliche biochemische und genetische Information bekannt ist, und der bereits historisch gesehen für die meisten Konstruktionen unter Verwendung von Adenovirus als ein Vektor verwendet worden ist.
Wie vorstehend ausgeführt, ist der typische erfindungsgemäße Vektor replikationsdefekt und besitzt keine Adenovirus-E1-Region. Es ist somit besonders zweckmäßig, das transformierende Konstrukt an der Position einzubringen, wovon die E1-codierenden Sequenzen entfernt wurden. Allerdings ist die Position der Insertion des Konstrukts innerhalb der Adenovirus-Sequenzen für die Erfindung nicht kritisch. Das Polynukleotid, das das Gen von Interesse codiert, kann ebenfalls anstelle der deletierten E3-Region in den E3-Ersatz-Vektoren inseriert werden, wie von Karlsson et al. (1986) beschrieben, oder in die E4-Region inseriert werden, wo eine Helfer-Zelllinie oder Helfer-Virus den E4-Defekt ergänzt.
Adenovirus-Wachstum und -Manipulation sind den Fachleuten bekannt und zeigen in vitro und in vivo einen breiten Wirtsbereich. Diese Gruppe von Viren kann in hohen Titern, z. B. 10⁹–10¹¹ Plaque-bildende Einheiten pro ml, erhalten werden, und sie sind hoch infektiös. Der Lebenszyklus von Adenovirus erfordert keine Integration in das Wirtszellengenom. Die Fremdgene, die von Adenovirus-Vektoren abgegeben werden, sind episomal und besitzen darum gegenüber Wirtszellen eine geringe Genotoxizität. Es wurden in Untersuchungen der Beimpfung mit Wildtyp-Adenovirus keine Nebenwirkungen berichtet (Couch et al., 1963; Top et al., 1971), was ihre Sicherheit und ihre therapeutisches Potential als in vivo Gentransfer-Vektoren zeigt.
Adenovirus-Vektoren werden bereits bei der eukaryotischen Genexpression (Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992) und bei der Impfstoffentwicklung (Grunhaus and Horwitz, 1992; Graham and Prevec, 1992) verwendet. Tierversuche haben nahegelegt, dass rekombinantes Adenovirus zur Gentherapie verwendet werden könnte (Stratford-Perricaudet and Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993). Studien bei der Verabreichung von rekombinantem Adenovirus an verschiedene Gewebe umfassen Tracheainstillation (Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), Muskelinjektion (Ragot et al., 1993), periphere intravenöse Injektionen (Herz and Gerard, 1993) und stereotaktische Inokulation in das Gehirn (Le Gal La Salle et al., 1993).
b) Retrovirale Infektion
Die Retroviren sind eine Gruppe von einzelsträngigen RNA-Viren, die durch eine Fähigkeit der Umwandlung ihrer RAN in doppelsträngige DNA in infizierten Zellen durch ein Verfahren der reversen Transkription (Coffin, 1990) gekennzeichnet ist. Die resultierende DNA integriert sich dann stabil in Zellchromosomen als ein Provirus und steuert die Synthese von viralen Proteinen. Diese Integration führt zur Retention der viralen Gensequenzen in der Empfängerzelle und ihren Nachkommen. Das retrovirale Genom enthält drei Gene, gag, pol und env, die Capsid-Proteine, Polymeraseenzym bzw. Hüllkomponenten codieren. Eine stromaufwärts des gag-Gens gefundene Sequenz enthält ein Signal zum Verpacken des Genoms in Virionen. Zwei lange terminale Wiederholungs-(LTR)-Sequenzen sind am 5'- und 3'-Ende des viralen Genoms vorhanden. Diese enthalten starke Promotor- und Enhancer-Sequenzen und sind ebenfalls zur Integration in das Wirtszellengenom erforderlich (Coffin, 1990).
Um einen retroviralen Vektor zu konstruieren, wird eine Nukleinsäure, die ein Gen von Interesse codiert, anstelle bestimmter viraler Sequenzen in das virale Genom inseriert, um ein Virus zu produzieren, das replikationsdefekt ist. Um Virionen zu produzieren, wird eine Verpackungszelllinie, die gag-, pol- und env-Gen enthält, jedoch ohne die LTR und die Verpackungskomponenten konstruiert (Mann et al., 1983). Wenn ein rekombinantes Plasmid, das eine cDNA enthält, zusammen mit der retroviralen LTR und den Packungssequenzen in diese Zelllinie eingebracht wird (beispielsweise durch Calciumphosphat-Präzipitation), ermöglicht es die Verpackungssequenz, dass das RNA-Transkript des rekombinanten Plasmids in Viruspartikel verpackt wird, die dann in die Kulturmedien sezerniert werden (Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). Die Medien, die die rekombinanten Retroviren enthalten, werden dann gesammelt, gegebenenfalls konzentriert und zum Gentransfer verwendet. Retrovirale Vektoren sind in der Lage, eine breite Vielzahl von Zelltypen zu infizieren. Allerdings erfordern Integration und stabile Expression die Teilung von Wirtszellen (Paskind et al., 1975).
Fragen hinsichtlich der Verwendung von defekten Retrovirus-Vektoren ist das potentielle Aussehen des Wildtyp-replikationskompeneten Virus in den Verpackungszellen. Dies kann aus Rekombinationsereignissen herrühren, wobei die intakte Sequenz aus dem rekombinanten Virus stromaufwärts der gag-, pol-, env-Sequenzen inseriert, die in das Wirtszellengenom integriert ist. Allerdings sind Verpackungszelllinien verfügbar, die die Wahrscheinlichkeit der Rekombination stark herabsetzen sollten (Markowitz et al., 1988; Hersdorffer et al., 1990).
c) AAV-Infektion
Adeno-assoziiertes Virus (AAV) ist ein attraktives Vektorsystem zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung, das eine hohe Integrationsfrequenz aufweist und sich nicht teilende Zellen infizieren kann, was es somit zur Abgabe von Genen in Säuerzellen in Gewebekulturen geeignet macht (Muzyczka, 1992). AAV besitzt einen breiten Wirtsbereich zur Infektiosität (Tratschin et al., 1984; Laughlin et al., 1986; Lebkowski et al., 1988; McLaughlin et al., 1988), was bedeutet, dass es zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung anwendbar ist. Einzelheiten hinsichtlich der Erzeugung und der Verwendung von rAAV-Vektoren sind in de US-Patentschrift Nr. 5,139,941 und in der US-Patentschrift Nr. 4,797,368 beschrieben.
Studien, die die Verwendung von AAV bei der Genabgabe demonstrieren, umfassen LaFace et al. (1988); Zhou et al. (1993); Flotte et al. (1993); und Walsh et al. (1994). Rekombinante AAV-Vektoren werden bereits erfolgreich zur in vitro und in vivo Transduktion von Markergenen (Kaplitt et al., 1994; Lebkowski et al., 1988; Samulski et al., 1989; Shelling and Smith, 1994; Yoder et al., 1994; Zhou et al., 1994; Hermonat and Muzyczka, 1984; Tratschin et al., 1985; McLaughlin et al., 1988) und von Genen, die an menschlichen Krankheiten beteiligt sind (Flotte et al., 1992; Luo et al., 1994; Ohi et al., 1990; Walsh et al., 1994; Wei et al., 1994), verwendet. Unlängst wurde ein AAV-Vektor für Phase-I-Menschenversuche zur Behandlung der zystischen Fibrose genehmigt.
AAV ist ein abhängiges Parvovirus, insofern als es die Coinfektion mit einem anderen Virus (entweder Adenovirus oder ein Mitglied der Herpesvirusfamilie) erfordert, um eine produktive Infektion in kultivierten Zellen zu erfahren (Muzyczka, 1992). In Abwesenheit einer Coinfektion mit Helfervirus integriert sich das Wildtyp-AAV-Genom über seine Enden in das menschliche Chromosom 19, wo es in einem latenten Zustand als Provirus verbleibt (Kotin et al., 1990; Samulski et al., 1991). Allerdings ist es zur Intregration nicht auf das Chromosom 19 beschränkt, es sein denn, das AAV-Rep-Protein wird ebenfalls exprimiert (Shelling and Smith, 1994). Wenn eine Zelle, die ein AAV-Provirus trägt, mit einem Helfervirus superinfiziert wird, wird das AAV-Genom aus dem Chromosom oder aus einem rekombinanten Plasmid „gerettet", und es wird eine normale produktive Infektion entwickelt (Samulski et al., 1989; McLaughlin et al., 1988; Kotin et al., 1990; Muzyczka, 1992).
Typischerweise wird ein rekombinantes AAV(rAAV)-Virus durch Cotransfizieren eines Plasmids hergestellt, das das Gen von Interesse, das von den beiden AAV-terminalen Wiederholungseinheiten flankiert wird (McLaughlin et al., 1988; Samulski et al., 1989, die jeweils hier durch Bezugnahme eingearbeitet sind), und ein Expressionsplasmid, das die Wildtyp-AAV-codierenden Sequenzen ohne die terminalen Wiederholungseinheiten enthält, beispielsweise pIM45 (McCarty et al., 1991), enthält. Die Zellen werden auch mit Adenovirus oder Plasmiden infiziert oder transfiziert, die die Adenovirus-Gene tragen, die für die AAV-Helferfunktion erforderlich sind. rAAV-Virus-Substrate, die auf solche Weise hergestellt sind, sind mit Adenovirus kontaminiert, der physikalisch von den rAAV-Partikeln abgetrennt werden muss (beispielsweise durch Cäsiumchlorid-Dichtezentrifugation). Alternativ könnten Adenovirus-Vektoren, die die AAV-codierenden Regionen enthalten, oder Zelllinien, die die AAV-codierenden Regionen und einige oder alle der Adenovirus-Helfergene enthalten, verwendet werden (Yang et al., 1994; Clark et al., 1995). Zelllinien, die die rAAV-DNA als ein integriertes Porvirus tragen, können ebenfalls verwendet werden (Flotte et al., 1995).
d) Weitere virale Vektoren
Weitere virale Vektoren können als Konstrukte bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Vektoren, die sich von Viren ableiten, wie Vaccinia-Virus (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988) und Herpesviren können verwendet werden. Sie bieten mehrere attraktive Merkmale für verschiedene Säugerzellen (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).
Ein molekular klonierter Stamm von Venezuelan Equine Encephalitis (VEE) Virus wurde bereits als ein replikationskompetenter Vaccin-Vektor zur Expression von heterologen viralen Proteinen genetisch ausgearbeitet (Davis et al., 1996). Studien haben gezeigt, dass die VEE-Infektion potente CTL-Antworten stimuliert, und es wurde nahegelegt, dass VEE ein äußerst geeigneter Vektor für Immunisierungen sein kann (Caley et al., 1997). Es wird bei der vorliegenden Erfindung davon ausgegangen, dass das VEE-Virus beim Targeting dentritischer Zellen geeignet sein kann.
Mit der jüngsten Kenntnis über defekte Hepatitis B Viren wurden neue Einblicke in die Struktur-Funktionsbeziehung verschiedener viraler Sequenzen erzielt. In vitro Untersuchungen zeigten, dass das Virus die Fähigkeit für das helferabhängige Verpacken und die reverse Transkription trotz Deletion von bis zu 80% seines Genoms beibehalten könnte (Horwich et al., 1990). Dies legt nahe, dass ein großer Teil des Genoms mit fremdem, genetischem Material ersetzt werden könnte. Chang et al. führten unlängst das Chloramphenicol-Acetyltransferase(CAT)-Gen in das Enten Hepatitis B Virus Genom anstelle der Polymerase-, Oberflächen- und Prä-Oberflächen-codierenden Sequenzen ein. Es wurde mit Wildtyp-Virus in eine aviäre Hepatomzelllinie cotransfiziert. Kulturmedien, die hohe Titer des rekombinaten Virus enthielten, wurden zur Infektion primärer Entenküken-Hepatozyten verwendet. Eine stabile CAT-Genexpression wurde für mindestens 24 Tage nach Transfektion nachgewiesen (Chang et al., 1991).
Bei noch weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure, die das menschliche mda-7 codiert, von einem infektiösen Virus beherbergt, der gentechnisch hergestellt wurde, um einen spezifischen Bindungsliganden zu exprimieren. Das Viruspartikel bindet somit spezifisch an die Erkennungsrezeptoren der Zielzelle und gibt den Inhalt an die Zelle ab. Eine neuer Ansatz, der dazu ausgelegt ist, spezifisches Targeting von Retrovirus-Vektoren zu ermöglichen, wurde unlängst auf der Grundlage der chemischen Modifikation eines Retrovirus durch die chemische Addition von Laktoseresten an die virale Hülle entwickelt. Diese Modifikation kann die spezifische Infektion von Hepatozyten über Sialoglycoprotein-Rezeptoren ermöglichen.
Beispielsweise wurde das Targeting von rekombinanten Retroviren, wobei biotinylierte Antikörper gegen ein retrovirales Hüllprotein und gegen einen spezifischen Zellrezeptor verwendet werden, konzipiert. Die Antikörper wurden über die Biotinkomponenten unter Verwendung von Streptavidin gekoppelt (Roux et al., 1989). Unter Verwendung von Antikörpern gegen Haupt-Histokompatibilitätskomplex Klasse I- und Klasse II-Antigene zeigten sie die Infektion einer Vielzahl von menschlichen Zellen, die diese Oberflächenantigene trugen, mit einem ektopischen Virus in vitro (Roux et al., 1989).
ii. Nicht-virale Abgabe
Zusätzlich zur viralen Abgabe der Nukleinsäure, die Volllängen- oder verkürztes MDA-7-Protein codiert, gibt es die folgenden zusätzlichen Verfahren der rekombinanten Genabgabe an eine gegebene Wirtszelle, und sie werden somit bei der vorliegenden Erfindung berücksichtigt.
a) Elektroporation
Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird das Genkonstrukt in hyperproliferative Zielzellen über Elektroporation eingebracht. Die Elektroporation umfasst die Exposition von Zellen (oder Geweben) und DNA (oder eines DNA-Komplexes) gegenüber einer elektrischen Hochspannungsentladung.
Die Transfektion von eukaryotischen Zellen unter Verwendung der Elektroporation war bereits recht erfolgreich. Maus-pre-B-Lymphozyten wurden mit menschlichen Kappa-Immunoglobulingenen transfiziert (Potter et al., 1984), und Ratten-Hepatozyten wurden mit dem Chloramphenicol-Acetyltransferasegen auf diese Weise transfiziert (Tur-Kaspa et al., 1986)
Es wird davon ausgegangen, dass die Elektroporationsbedingungen für hyperproliferative Zellen aus verschiedenen Quellen optimiert werden können. Es kann besonders erwünscht sein, solche Parameter, wie Spannung, Kapazitanz, Zeit und Elektroporationsmedienzusammensetzung, zu optimieren. Die Ausführung von weiteren Routineeinstellungen ist den Fachleuten bekannt. See z. B. Hoffman, 1999; Heller et al., 1996.
b) Partikelbombardement
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung zum Übertragen eines nackten DNA-Konstruktes in Zellen umfasst Partikelbombardement. Dieses Verfahren hängt von der Fähigkeit zur Beschleunigung DNA-beschichteter Mikroprojektile auf eine hohe Geschwindigkeit ab, was es ihnen erlaubt, Zellmembranen zu durchstoßen und in Zellen, ohne sie abzutöten, einzudringen (Klein et al., 1987). Die verwendeten Mikroprojektile bestanden aus biologisch inerten Substanzen, wie Wolfram-, Platin- oder Goldkügelchen.
Es wird davon ausgegangen, dass in einigen Fällen eine DNA-Präzipitation auf Metallpartikel zur DNA-Abgabe an eine Empfängerzelle unter Verwendung des Partikel-Bombardements notwendig sein würde. Es wird davon ausgegangen, dass die Partikel DNA enthalten können statt mit DNA beschichtet zu sein. Es wird darum vorgeschlagen, dass DNA-beschichtete Partikel das Niveau der DNA-Abgabe über Partikel-Bombardement steigern können, dass sie es aber in und an sich nicht benötigen.
Mehrere Vorrichtungen zur Beschleunigung von kleinen Partikeln wurden bereits entwickelt. Eine solche Vorrichtung beruht auf einer Hochspannungsentladung, um einen elektrischen Strom zu erzeugen, der wiederum die Bewegungskraft bereitstellt (Yang et al., 1990). Ein weiteres Verfahren umfasst die Verwendung eines biolistischen Partikel-Abgabesystems, das zum Antreiben von mit DNA beschichteten Partikeln durch ein Gitter, wie Edelstahlgitter oder Nytexgitter, auf eine Filteroberfläche, die mit Zellen in Suspension bedeckt ist, verwendet werden kann. Das Gitter dispergiert die Partikel, sodass sie nicht in großen Aggregaten an die Empfängerzellen abgegeben werden. Es wird angenommen, dass ein Gitter, das zwischen dem Projektilgerät und den zu bombardierenden Zellen liegt, die Größe der Projektilaggregate herabsetzt und zu einer höheren Transformationsfrequenz durch Herabsetzung des Schadens beitragen kann, der auf die Empfängerzellen durch Projektile, die zu groß sind, ausgeübt wird.
Für das Bombardement werden die Zellen in Suspension vorzugsweise auf Filter oder alternativ auf festem Kulturmedium konzentriert. Die zu bombardierenden Zellen werden in einem entsprechenden Abstand unterhalb der Makroprojektil-Stoppplatte positioniert. Sofern gewünscht, werden auch ein oder mehrere Gitter zwischen der Beschleunigungsvorrichtung und den zu bombardierenden Zellen positioniert.
Bei der Bombardement-Transformation können die Kulturbedingungen vor dem Bombardement und die Bombardement-Parameter optimiert werden, um die maximale Anzahl stabiler Transformanten zu ergeben. Sowohl die physikalischen als auch die biologischen Parameter für ein Bombardement sind bei dieser Technologie wichtig. Physikalische Faktoren sind diejenigen, die das Manipulieren des DNA/Mikroprojektil-Präzipitats umfassen oder diejenigen, die den Flug und die Geschwindigkeit oder entweder die Makro- oder Mikroprojektile beeinflussen. Biologische Faktoren umfassen sämtliche Schritte, die an der Manipulation von Zellen vor und sofort nach dem Bombardement beteiligt sind, die osmotische Anpassung von Zielzellen, um das mit dem Bombardement verbundene Trauma zu lindern helfen und ebenfalls die Natur der transformierenden DNA, wie beispielsweise linearisierte DNA, oder intakte supercoiled Plasmide. Kürzlich wurden Ergebnisse von einer klinischen Studie, die den Nutzen dieser Abgabesysteme zur Impfung bewertet, veröffentlicht. Die Studie war zur Bestimmung der Sicherheit und immunogenen Aktivität eines DNA-Impfstoffes bei Freiwilligen vorgesehen, der aus einem Plasmidkodierendem Hepatitis B Oberflächenantigen bestand, das mittels des PowderJect XR1 Gen-Abgabesystems in die menschliche Haut (Tacket et al., 1999) abgegeben wurde.
Demnach wird davon ausgegangen, dass man verschiedene Bombardement-Parameter in Studien kleineren Umfangs anpassen möchte, um die Bedingungen vollständig zu optimieren. Man kann sich insbesondere wünschen, die physikalischen Parameter, wie beispielsweise Spaltzwischenraum, Flugstrecke, Gewebeabstand und Heliumdruck, anzupassen. Auch die Faktoren zur Verringerung des Traumas können optimieren werden, indem die Bedingungen, die den physiologischen Zustand der Empfängerzellen beeinflussen, und die daher die Transformations- und Integrationseffizienzen beeinflussen können, modifiziert werden. Es können beispielsweise der osmotische Zustand, Gewebehydratation und die Unterkulturphase oder Zellzyklus der Empfängerzellen zur optimalen Transformation angepasst werden. Die Durchführung anderer routinemäßiger Anpassungen ist den Fachleuten bekannt.
c) Calciumphosphat Copräzipitation oder DEAE-Dextran-Behandlung
Bei weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsformen wird das transgene Konstrukt unter Verwendung von Calciumphosphat Copräzipitation in die Zellen eingebracht. Urkeimzellen von Mäusen wurden mit dem SV40-Groß-T-Antigen mit hervorragenden Ergebnissen transfiziert (Watanabe et al., 1997). Humane KB Zellen wurden mit Adenovirus 5 DNA (Graham und Van Der Eb, 1973) unter Verwendung dieser Technik transfiziert. Ebenfalls auf diese Art und Weise wurden Maus L(A9)-, Maus C127-, CHO-, CV-1-, BHK-, NIH3T3- und HeLa-Zellen mit einem Neomycin-Markergen (Chen und Okayama, 1987) transfiziert und Hepatocyten von Ratten wurden mit einer Vielzahl von Markergenen (Rippe et al., 1990) transfiziert.
Bei einer weiteren Ausführungsform wird das Expressionskonstrukt unter Verwendung von DEAE-Dextran, gefolgt von PolyethylenGlycol in die Zelle abgegeben. Bei dieser Art und Weise werden Reporterplasmide in Myelom- und erythroleukämische Zellen von Mäusen (Gopal, 1985) verbracht.
d) Direkte Mikroinjektion oder Ultrabeschallung
Weitere erfindungsgemäße Ausführungsformen umfassen die Einbringung des Nukleinsäurekonstrukts durch direkte Mikroinjektion oder Ultrabeschallung. Direkte Mikroinjektion wurde zur Einbringung von Nukleinsäurekonstrukten in Xenopus Oocyten (Harland und Weintraub, 1985) verwendet und LTK Fibroblasten wurden mit dem Thymidinkinase-Gen durch Ultrabeschallung (Fechheimer et al., 1987) transfiziert.
e) Lipid-vermittelte Transformation
Bei einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform kann das Genkonstrukt in einer Liposomen- oder Lipid-Formulation eingeschlossen sein. Liposome sind blasenförmige Strukturen, die durch eine Phospholipid-Doppelschichtmembran und ein inneres wässriges Medium gekennzeichnet sind. Multilamellare Liposome weisen mehrere Lipidschichten auf, die durch ein wässriges Medium getrennt sind. Sie bilden sich spontan, wenn Phospholipide in einem Überschuss wässriger Lösung suspendiert werden. Die Lipid-Komponenten ordnen sich selbst vor der Bildung geschlossener Strukturen neu an und schließen Wasser und gelöste Substanzen zwischen den Lipiddoppelschichten ein (Ghosh und Bachhawat, 1991). Auch ein Genkonstrukt, das mit Lipofectamin (Gibco BRL) einen Komplex bildet, wird in Betracht gezogen.
Die Lipid-vermittelte Nukleinsäureabgabe und Expression fremder DNA in vitro waren sehr erfolgreich (Nicolau und Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987). Wong et al. (1980) zeigten die Durchführbarkeit von Lipid-vermittelter Abgabe und Expression fremder DNA in kultivierten Huhnembryo-, HeLa- und Hepatoma-Zellen.
Lipid-basierte nicht virale Formulierungen stellen eine Alternative zu adenoviralen Gentherapien bereit. Obwohl viele Studien von Zellkulturen einen Lipid-basierten nicht viralen Gentransfer dokumentiert haben, war die systemische Genabgabe über Lipid-basierte Formulierungen beschränkt. Eine Haupteinschränkung der nicht viralen Lipid-basierten Genabgabe ist die Toxizität der kationischen Lipide, die das nicht virale Abgabevehikel umfassen. Die in vivo Toxizität von Liposomen erklärt teilweise die Abweichung zwischen Ergebnissen des in vitro und in vivo Gentransfers. Ein weiterer Faktor, der zu diesen widersprüchlichen Daten beiträgt, ist der Unterschied der Stabilität der Lipidvehikel in Gegenwart und Abwesenheit von Serumproteinen. Die Wechselwirkung zwischen Lipidvehikeln und Serumproteinen hat einen drastischen Einfluss auf die Stabilitätsmerkmale von Lipidvehikeln (Yang und Huang, 1997). Kationische Lipide ziehen negativ geladene Serumproteine an und binden sie. Zu Serumproteinen gehörige Lipidvehikel sind entweder gelöst oder von Makrophagen aufgenommen, was dazu führt, dass sie aus dem Blutkreislauf ausgeschieden werden. Derzeitige Verfahren zur in vivo Lipidabgabe verwenden subkutane, intradermale, intratumorale oder intracraniale Injektion, um die mit den kationischen Lipiden im Blutkreislauf verbundenen Toxizitäts- und Stabilitätsprobleme zu vermeiden. Die Wechselwirkung von Lipidvehikeln und Plasmaproteinen ist verantwortlich für die Verschiedenheit zwischen der Wirksamkeit von in vitro (Felgner et al., 1987) und in vivo Gentransfer (Zhu et al., 1993; Philip et al., 1993; Solodin et al., 1995; Liu et al., 1995; Thierry et al., 1995; Tsukamoto et al., 1995; Aksentijevich et al., 1996).
Neueste Fortschritte bei Lipid-Formulierungen haben die Wirksamkeit von Gentransfer in vivo (Templeton et al., 1997; WO 98/07408 ) verbessert. Eine neue Lipid-Formulierung, die aus einem äquimolaren Verhältnis von 1,2-Bis(oleoyloxy)-3-(trimethylammonium)propan (DOTAP) und Cholesterin zusammengesetzt ist, verbessert den systemischen in vivo Gentransfer deutlich, in etwa 150-fach. Die DOTAP:Cholesterin Lipid-Formulierung bildet eine einzigartige Struktur, die als „Sandwich-Liposom" bezeichnet wird. Diese Formulierung wird an „Sandwich"-DNA zwischen einer invaginierten Doppelschicht oder „Vasen"-Struktur berichtet. Vorteilhafte Merkmale dieser Lipidstrukturen umfassen eine positive ρ, kolloidale Stabilisierung durch Cholesterin, zweidimensionale DNA-Wickelung und erhöhte Serumstabilität. Patentanmeldungen Nr. 60/135,818 und 60/133,116 diskutieren Formulierungen, die mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Die Herstellung von Lipid-Formulierungen wird oft durch Sonikation oder serielles Extrudieren liposomaler Gemische nach (I) reverser Phaseneindampfung (II) Dehydratation-Rehydratation (III) Reinigungsmitteldialyse und (IV) Dünnfilmhydratation ausgeführt. Einmal hergestellt, können Lipidstrukturen zum Einkapseln von Verbindungen, die toxisch (Chemotherapeutika) oder labil (Nukleinsäuren) sind, wenn sie sich im Blutkreislauf befinden, verwendet werden. Lipidverkapselung führte zu einer geringeren Toxizität und einer längeren Serumhalbwertszeit für solche Verbindungen (Gabizon et al., 1990). Zahlreiche Behandlungen von Krankheiten verwenden Lipid-basierte Strategien zum Gentransfer, um herkömmliche Therapien zu verbessern oder neue Therapien zu begründen, insbesondere Therapien zur Behandlung hyperproliferativer Krankheiten.
Bei bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann das Lipidvehikel mit einem hämagglutinierenden Virus (HVJ) einen Komplex bilden. Dies zeigte eine Erleichterung der Verschmelzung mit der Zellmembran und förderte den Zelleintritt von Lipid-verkapselter DNA (Kaneda et al., 1989). Bei anderen Ausführungsformen kann das Lipidvehikel einen Komplex bilden mit oder angewendet werden in Verbindung mit nuklearen Nicht-Histon chromosomalen Proteinen (HMG-1) (Kato et al., 1991). Bei noch weiteren Ausführungsformen kann das Lipidvehikel einen Komplex bilden mit oder angewendet werden in Verbindung mit sowohl HVJ als auch HMG-1.
Ein betrachtetes Verfahren zur Herstellung einer Lipid-Zusammensetzung in kommerziellem Rahmen besteht im Allgemeinen aus dem Mischen der Komponenten, dem Trocknen des Gemisches, dem Rehydrieren des Gemisches, dem Dispergieren des Gemisches, dem Extrudieren der Lipid-Zusammensetzung durch Filter mit abnehmender Porengröße und Mischen der Lipid-Zusammensetzung mit einem therapeutischen Mittel, um einen Lipoplex zu bilden. Im Folgenden werden zusätzliche Informationen über die Herstellung und Formulierung eines Lipoplexes zur Verwendung bei der Abgabe eines mda-7 Polynukleotides an eine Zelle bereitgestellt.
Pulverkomponenten werden gewogen, gemischt und in einem geeigneten Lösungsmittel, wie beispielsweise tertiärem Butanol, Chloroform, Methanol, Ethylenchlorid, Ethanol oder Gemischen dieser Lösungsmittel, gelöst. Es wird davon ausgegangen, dass jegliche der beiden Lösungsmittel in einem Verhältnis von etwa 1:1000, 1:500, 1:100, 1:50, 1:25, 1:10, 1:5 oder 1:1 vorliegen. Solubilisierung mit tertiärem Butanol kann, aufgrund der kanzerogenen Eigenschaften von Chloroform, angewandt werden. Trotzdem kann Chloroform verwendet werden, wenn Schritte unternommen werden, um das rückständige Chloroform, das in der Lipid-Zusammensetzung vorliegt, auf verträgliche Niveaus zu begrenzen. Es wird in Erwägung gezogen, dass andere lipophile Lösungsmittel zur Solubilisierung der Lipid-Komponenten verwendet werden können. Das Lipidgemisch kann in tert-Butanol bei einer Temperatur von etwa 0°C, 2°C, 4°C, 6°C, 8°C, 10°C, 12°C, 14°C, 16°C, 18°C, 20°C, 22°C, 24°C, 26°C, 28°C, 30°C, 32°C, 34°C, 36°C, 38°C, 40°C, 42°C, 44°C, 46°C, 48°C, 50°C, 52°C, 54°C, 56°C, 58°C, 60°C, 62°C, 64°C, 66°C, 68°C, 70°C, 72°C, 74°C, 76°C, 78°C, 80°C, 82°C, 84°C, 86°C, 88°C oder 90°C solubilisiert werden. Temperaturbereiche wie beispielsweise von 5°C bis 80°C, 10°C bis 70°C, 20°C bis 60°C und 30°C bis 50°C werden ebenfalls zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung betrachtet.
Im Anschluss an die Herstellung der Lipid-Zusammensetzung wird ein Lipidkomplex formuliert, indem die Lipid-Zusammensetzung und ein therapeutisches Mittel in einer pharmazeutisch verträglichen Trägerlösung durch schnelles Mischen vereint werden. Schnelles Mischen kann durchgeführt werden unter Verwendung eines T-Mischgeräts oder Ethanolinjektion des therapeutischen Mittels. Bei bestimmten Ausführungsformen wird eine DOTAP:Cholesterin Lipid-Zusammensetzung mittels der beschriebenen Verfahren hergestellt und mit einen Polynukleotid vereint, das ein therapeutisches Protein kodiert. Die Lipid-Zusammensetzung wird in einer Menge bereitgestellt, um das Polynukleotid einzukapseln und um eine kolloidale Suspension des Lipoplexes zu ergeben.
DOTAP (kationisches Lipid) kann mit Cholesterin bei äquimolaren Konzentrationen gemischt werden. Dieses Gemisch gepulverter Lipide wird sodann mit tert-Butanol gelöst, die Lösung zu einem dünnen Film getrocknet und der Film in Wasser, das 5% Dextrose (Gew./Vol.) enthält, hydratisiert, um eine Endkonzentration von etwa 20 mM DOTAP und etwa 20 mM Cholesterin zu ergeben. Der hydratisierte Lipidfilm wird in einem erwärmten Wasserbad etwa 45 Minuten gerührt, dann bei etwa 35°C zusätzliche 10 Minuten und bei Raumtemperatur über Nacht stehen gelassen. Am folgenden Tag wird das Gemisch 5 Minuten bei etwa 50°C mit Ultraschall behandelt. Das mit Ultraschall behandelte Gemisch wird 10 Minuten bei etwa 50°C erwärmt. Dieses Gemisch wird anschließend durch Filter mit abnehmender Porengröße (1 μm, 0,45 μm, 0,2 μm, 0,1 μm) extrudiert. Diese Lipid-Zusammensetzung wird dann mit DNA gemischt, um einen Lipidkomplex herzustellen.
Eine Lipid-Zusammensetzung kann DOTAP und Cholesterin, ein Cholesterin-Derivat oder eine Cholesterin-Mischung und ein Polynukleotid, das ein therapeutisches Protein, wie beispielsweise MDA-7, kodiert, Antisense-RNA oder Ribozym zur Abgabe in kranke Zellen oder in Zellen, nahe den kranken Zellen, umfassen. Die Behandlung einer Krankheit umfasst bei einer Ausführungsform die intravenöse Verabreichung eines Polynukleotid-Lipoplexes an einen Patienten, der anschließend ein von dem Polynukleotid kodiertes Therapeutikum exprimiert. Die Lipoplex-Behandlung des Patienten gibt das Polynukleotid an normale und hyperproliferative Zellen ab, die das Therapeutikum exprimieren, was zu der Hemmung oder Zerstörung der hyperproliferativen Zellen führt.
Das anfängliche Lipid-Gemisch besteht bevorzugt aus gepulverten Lipid-Komponenten, die gewogen und in geeigneten molaren Verhältnissen gemischt werden können. Die Komponenten können anionische Lipide, kationische Lipide, neutrale Lipide, Sterole und/oder andere hydrophobe Moleküle in Verhältnissen sein, die notwendig sind, um die gewünschten Merkmale der endgültigen Lipid-Zusammensetzung oder -komplexes zu erzeugen. Die eigentliche Zusammensetzung des Lipid-Gemisches wird von den Eigenschaften bestimmt, die zur wirksamen Abgabe des/der Mittels/Mittel zu den gewünschten Zielzellen durch die gewünschten Verabreichungsmittel, die nachstehend detailliert beschrieben werden, erforderlich sind. Komponenten der Zusammensetzung können gemischt werden, um verschiedene molare Verhältnisse bereitzustellen. Die molaren Konzentrationen jeder Komponente der Lipid-Zusammensetzung können von etwa 0,5 mM, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM und 50 mM reichen. Das molare Verhältnis jeder der beiden Komponenten kann von etwa 1:100, 1:50, 1:25, 1:20, 1:18, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 1:0,5, 1:0,25, 1:0,1, 1:0,05 oder 1:0,01 reichen.
Die Lipid-Zusammensetzungen sind in der Lage, biologisch aktive Mittel zu tragen. Die Lipid-Zusammensetzung kann toxische Verbindungen absondern, um freie Konzentrationen im Serum zu verringern, Verbindungen vor abbauenden Mitteln im Körper zu schützen und/oder als Antigen wirkende Komponenten zu maskieren, um die immunogene Aktivität des Mittels zu verringern. DOTAP:Cholesterin Lipid-Zusammensetzungen bilden beispielsweise mit Polynukleotiden Komplexe, derart, dass die Polynukleotide abgesondert und resistent auf Abbau im Serum werden. Die Lipid-Zusammensetzung kann mit einer Vielzahl therapeutischer Mittel zu Komplexen zusammengeschlossen werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Polynukleotiden, Proteinen, Peptiden, Chemotherapeutika, kleinen Molekülen, Peptonukleotiden und Kohlehydrattherapeutika.
Eine bevorzugte Lipid-Zusammensetzung ist DOTAP und Cholesterin oder ein Cholesterin-Derivat. Das Verhältnis von DOTAP zu Cholesterin, Cholesterin-Derivat oder Cholesterin-Mischung kann in etwa 4:1 bis 1:4, 3:1 bis 1:3, stärker bevorzugt 2:1 bis 1:2 oder 1:1 sein. Die DOTAP oder Cholesterin-Konzentrationen können zwischen etwa 1 bis 8 mM, 2 bis 7 mM, 3 bis 6 mM oder 4 bis 5 mM liegen. Cholesterin-Derivate können leicht gegen das Cholesterin ausgetauscht oder mit dem Cholesterin in der vorliegenden Erfindung gemischt werden. Eine Anzahl an Cholesterin-Derivaten ist dem Fachmann bekannt. Cholesterinacetat und Cholesterinoleat können verwendet werden. Polynukleotide werden bevorzugt den Liposomen in einer Konzentration von 20 bis 200 μg pro 200 μl Endvolumen zugesetzt.
Der Lipoplex wird hergestellt, indem ein bestimmtes Polynukleotid und eine Lipid-Zusammensetzung in 5% Dextrose in Wasser verdünnt werden, um eine geeignete Konzentration Nukleinsäure und Lipide zu erhalten. Gleiche Volumina von Nukleinsäure und Lipiden bei einer Konzentration, um 100 μg Nukleinsäure/5 mM Lipide/100 μl zu erhalten, werden gemischt, indem die Nukleinsäure durch schnelles Mischen oder mit einem Prallstrahl schnell der Oberfläche der Lipid-Zusammensetzung zugesetzt wird.
3. Pharmazeutische Formulierungen und Abgabe
Erfindungsgemäß wird ein Expressionskonstrukt, das entweder ein humanes mda-7 Protein in voller Länge oder ein verkürztes, wie in den Ansprüchen spezifiziert, kodiert, in Betracht gezogen, wobei das Arzneimittel in Kombination mit mindestens einer weiteren Anti-Krebs-Behandlung wie vorstehend definiert verabreicht wird. Krebse, die höchstwahrscheinlich in der vorliegenden Erfindung behandelt werden, sind diejenigen, die sich aus Mutationen in einem Onkogen und/oder der verringerten Expression eines Wildtyp-Proteins in den hyperproliferativen Zellen ergeben. Beispiele von zur Behandlung in Betracht gezogener Krebse umfassen Lungenkrebs, Kopf- und Nackenkrebs, Brustkrebs, Pankreaskrebs, Prostatakrebs, Nierenkrebs, Knochenkrebs, Hodenkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Gastrointestinalkrebs, Lymphome, prä-neoplastische Läsionen in der Lunge, Dickdarmkrebs, Melanome, Blasenkrebs und jegliche andere Krebse, die durch Verabreichung einer Nukleinsäure, die entweder ein humanes mda-7 Protein in voller Länge oder ein verkürztes, wie in den Ansprüchen spezifiziert, kodiert, behandelt werden können.
Eine wirksame Menge des Arzneimittels ist im Allgemeinen als diejenige Menge definiert, die ausreicht, um nachweisbar und wiederholt das Ausmaß der Krankheit oder ihrer Symptome zu verbessern, verringern, minimieren oder begrenzen. Strengere Definitionen können zutreffen, einschließlich Behebung, Beseitigung oder Heilung der Krankheit.
Bevorzugt besitzen Patienten ausreichende Knochenmarksfunktion (definiert als eine periphere absolute Granulozytenzahl von > 2.000/mm³ und eine Blutplättchenzahl von 100.000/mm³), ausreichende Leberfunktion (Bilirubin < 1,5 mg/dl) und ausreichende Nierenfunktion (Kreatinin < 1,5 mg/dl).
a. Verabreichung
Um Zellen abzutöten, Zellwachstum zu hemmen, Metastasenbildung zu hemmen, Tumor- oder Gewebegröße zu verringern und anderweitig unter Verwendung der vorliegenden Erfindung den malignen Phänotyp von Tumorzellen umzukehren oder zu verringern, würde man im Allgemeinen eine hyperproliferative Zelle mit dem therapeutischen Expressionskonstrukt in Kontakt bringen. Die Verabreichungswege variieren natürlich mit der Stelle und Natur der Läsion und umfassen z. B. intradermale, transdermale, parenterale, intravenöse, intramuskuläre, intranasale, subkutane, perkutane, intratracheale, intraperitoneale, intratumorale Perfusion, Spülung, direkte Injektion und orale Verabreichung und Formulierung.
Intratumorale Injektion oder Injektion in das Gefäßsystem des Tumors wird speziell für einzelne, solide, zugängliche Tumore in Betracht gezogen. Lokale, regionale oder systemische Verabreichung kann ebenfalls geeignet sein. Für Tumore, die > 4 cm sind, beträgt das zu verabreichende Volumen in etwa 4–10 ml (bevorzugt 10 ml), während für Tumore mit < 4 cm ein Volumen von in etwa 1–3 ml verwendet wird (bevorzugt 3 ml). Mehrfachinjektionen, die als Einzeldosis abgegeben werden, umfassen in etwa 0,1 bis in etwa 0,5 ml Volumina. Die viralen Partikel können zweckmäßigerweise kontaktiert werden, indem Mehrfachinjektionen in Abständen zu etwa 1 cm Intervallen an den Tumor verabreicht werden.
Im Falle eines chirurgischen Eingriffs kann die vorliegende Erfindung vor der Operation angewendet werden, um es zu ermöglichen, dass ein inoperabler Tumor einer Resektion unterworfen werden kann. Alternativ kann die vorliegende Erfindung zum Zeitpunkt des Eingriffs angewendet werden und/oder danach, um eine verbleibende oder metastasenbildende Krankheit zu behandeln. Ein resektiertes Tumorbett kann zum Beispiel mit einer Formulierung, die ein mda-7 oder ein mda-7 kodierendes Konstrukt umfasst, injiziert oder perfusioniert werden. Die Perfusion kann nach der Resektion weitergeführt werden, zum Beispiel indem ein Katheter an der Stelle des Eingriffs implantiert bleibt. Regelmäßige Behandlung nach dem Eingriff ist ebenfalls vorgesehen.
Kontinuierliche Verabreichung kann ebenfalls angewendet werden, wo es indiziert ist, zum Beispiel wo ein Tumor operativ entfernt wurde und das Tumorbett behandelt wird, um verbleibende, mikroskopische Krankheiten zu beseitigen. Abgabe über eine Spritze oder Katheterisierung ist bevorzugt. Solch eine kontinuierliche Perfusion kann über einen Zeitraum von etwa 1–2 Stunden bis etwa 2–6 Stunden, bis etwa 6–12 Stunden, bis etwa 12–24 Stunden, bis etwa 1–2 Tage bis etwa 1–2 Wochen oder länger im Anschluss an den Beginn der Behandlung erfolgen. Im Allgemeinen entspricht die Dosis der therapeutischen Zusammensetzung über kontinuierliche Perfusion denjenigen, die mittels einer Einmalinjektion oder Mehrfachinjektionen gegeben werden, die über einen Zeitraum, während der die Perfusion stattfindet, angepasst wird. Es wird ferner davon ausgegangen, dass eine Perfusion in die Gliedmaßen angewendet werden kann, um erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzungen insbesondere bei der Behandlung von Melanomen und Sarkomen zu verabreichen.
Therapien können ebenfalls variieren und hängen oft von dem Tumortyp, der Stelle des Tumors, Fortschreiten der Krankheit und Gesundheitszustand und Alter des Patienten ab. Offensichtlich erfordern bestimmte Tumorarten aggressivere Behandlungen während zur gleichen Zeit bestimmte Patienten anstrengendere Verfahren nicht durchhalten. Der Krankenhausarzt ist bestens geeignet, solche Entscheidungen aufgrund der bekannten Wirksamkeit und Toxizität (falls eine solche vorliegt) der therapeutischen Zusammensetzungen zu treffen.
Bei bestimmten Ausführungsformen kann der behandelte Tumor zumindest anfangs nicht entfernt werden. Behandlungen mit therapeutischen viralen Konstrukten können die Resektierbarkeit des Tumors aufgrund von Schrumpfen an den Rändern oder mittels Beseitigung bestimmter besonders invasiver Teile erhöhen. Im Anschluss an Behandlungen kann eine Resektion möglich sein. Zusätzliche Behandlungen im Anschluss an eine Resektion dienen zur Beseitigung mikroskopischer verbleibender Krankheiten an der Stelle des Tumors.
Ein typischer Verlauf einer Behandlung für einen primären Tumor oder ein Tumorbett nach der Entfernung umfasst Mehrfachdosen. Eine typische Behandlung eines primären Tumors umfasst eine 6-Dosen Anwendung über einen Zeitraum von zwei Wochen. Die zweiwöchige Therapie kann einmal, zweimal, dreimal, viermal, fünfmal, sechsmal oder öfter wiederholt werden. Während eines Verlaufs einer Behandlung kann die Notwendigkeit, die geplanten Dosierungen abzuschließen, erneut bewertet werden.
Die Behandlungen können verschiedene „Dosiereinheiten" einschließen. Dosiereinheit ist so definiert, dass sie eine vorher festgelegte Menge der therapeutischen Zusammensetzung enthält. Die zu verabreichende Menge und der bestimmte Weg und die Formulierung liegen im Kenntnisstand der Fachärzte. Eine Dosiereinheit muss nicht als eine Einzelinjektion verabreicht werden, sondern kann kontinuierliche Infusionen über einen festgelegten Zeitraum umfassen. Erfindungsgemäße Dosiereinheit kann in geeigneter Weise als Plaquebildende Einheiten (pfu) für ein virales Konstrukt beschrieben werden. Dosiereinheiten reichen von 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³ pfu und mehr. Alternativ werden, abhängig von der Art des Virus und dem erreichbaren Titer, 1 bis 100, 10 bis 50, 100–1000 oder bis zu etwa 1 × 10⁴, 1 × 10⁵, 1 × 10⁶, 1 × 10⁷, 1 × 10⁸, 1 × 10⁹, 1 × 10¹⁰, 1 × 10¹¹, 1 × 10¹², 1 × 10¹³, 1 × 10¹⁴ oder 1 × 10¹⁵ oder mehr infektiöse Viruspartikel (Vp) an den Patienten oder an die Zellen des Patienten abgegeben.
b. Injizierbare Zusammensetzungen und Formulierungen
Das bevorzugte Verfahren zur Abgabe eines Expressionskonstrukts, das entweder ein humanes MDA-7-Protein in voller Länge oder ein verkürztes an hyperproliferative Zellen bei der vorliegenden Erfindung kodiert, erfolgt über intratumorale Injektion. Die hierin offenbarten Arzneimittel können allerdings alternativ parenteral, intravenös, intradermal, intramuskulär, transdermal oder sogar intraperitoneal, wie in der US-Patentschrift 5,543,158 ; der US-Patentschrift 5,641,515 und der US-Patentschrift 5,399,363 beschrieben, verabreicht werden.
Eine Injektion von Nukleinsäurekonstrukten kann durch Spritzen oder jedes andere Verfahren, das zur Injektion einer Lösung verwendet wird, abgegeben werden, solange das Expressionskonstrukt den speziellen Querschnitt von zur Injektion benötigten Nadeln passieren kann. Ein neues nadelloses Injektionssystem wurde kürzlich beschrieben ( US-Patentschrift 5,846,233 ), mit einer Mündung, die eine Ampullenkammer definiert, um die Lösung zu halten, und einer Energievorrichtung, um die Lösung aus der Mündung an die Stelle der Abgabe zu drücken. Es wurde auch ein Spritzensystem zur Anwendung in der Gentherapie beschrieben, das Mehrfachinjektionen vorher festgelegter Mengen einer Lösung genau in jeder Tiefe ( US-Patentschrift 5,846,225 ) erlaubt.
Lösungen der aktiven Verbindungen als freie Base oder pharmakologisch verträgliche Salze können in Wasser, das in geeigneter Weise mit einem oberflächenaktiven Stoff, wie beispielsweise Hydroxypropylcellulose, gemischt ist, hergestellt werden. Dispersionen können ebenfalls in Glycerol, flüssigen Polyethylenglycolen und Gemischen davon und in Ölen hergestellt werden. Unter normalen Lagerungs- und Anwendungsbedingungen enthalten diese Zubereitungen ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern. Die pharmazeutischen Formen, die zur Injektion geeignet sind, umfassen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Puder, um eine Rezeptur steriler injizierbarer Lösungen oder Dispersionen ( US-Patentschrift 5,466,468 ) herzustellen. In allen Fällen muss die Form steril sein und muss zu dem Maße flüssig sein, dass sie leicht in eine Spritze aufgezogen werden kann. Sie muss unter den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil sein und muss gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen, wie beispielsweise Bakterien und Pilze, konserviert sein. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium sein, das zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (z. B. Glycerol, Propylenglycol und flüssigen Polyethylenglycol und dergleichen), geeignete Gemische davon und/oder pflanzliche Öle enthält. Ein geeignetes Fließvermögen kann zum Beispiel durch die Verwendung eines Überzugs, wie beispielsweise Lecithin, durch die Einhaltung der erforderlichen Partikelgröße im Falle der Dispersion und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Stoffen erhalten werden. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antimykotische Mittel, beispielsweise Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thiomersal und dergleichen herbeigeführt werden. In vielen Fällen ist es bevorzugt, isotonische Mittel, beispielsweise Zucker oder Natriumchlorid einzuschließen. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch die Verwendung von Mitteln in den Zusammensetzungen, die die Absorption verzögern, beispielsweise Aluminiummonostearat und Gelatine, herbeigeführt werden.
Zur parenteralen Verabreichung beispielsweise in einer wässrigen Lösung sollte die Lösung, wenn nötig, in geeigneter Weise gepuffert sein und das flüssige Verdünnungsmittel zuerst mit einer geeigneten Saline oder Glucose isotonisch gemacht werden. Diese speziellen wässrigen Lösungen sind insbesondere geeignet zur intravenösen, intramuskulären, subkutanen, intratumoralen und intraperitonealen Verabreichung. In diesem Zusammenhang sind sterile wässrige Medien, die verwendet werden können, den Fachleuten angesichts der vorliegenden Offenbarung bekannt. Eine Dosierung kann zum Beispiel in 1 ml isotonischer NaCl-Lösung gelöst werden und entweder zu 1000 ml Hypodermoclysis-Flüssigkeit zugesetzt oder an der vorgeschlagenen Stelle der Infusion injiziert werden (siehe beispielsweise "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15. Ausgabe, Seiten 1035–1038 und 1570–1580). Einige Dosisschwankungen treten notwendigerweise auf, abhängig von dem Zustand des behandelten Individuums. Die für die Verabreichung verantwortliche Person bestimmt auf jeden Fall die geeignete Dosis für das einzelne Individuum. Darüber hinaus sollten Zubereitungen zur Verabreichung an Menschen Sterilitäts-, Pyrogenizitäts-, allgemeine Sicherheits- und Reinheitsstandards, wie sie von der FDA Office of Biological standards gefordert sind, entsprechen.
Sterile injizierbare Lösungen werden hergestellt, indem die Wirkstoffe in der erforderlichen Menge in dem geeigneten Lösungsmittel mit verschiedenen der anderen vorstehend aufgezählten Bestandteile, wie erforderlich, eingebracht werden, gefolgt von filtrierter Sterilisation. Im Allgemeinen werden Dispersionen hergestellt, indem die verschiedenen sterilisierten Wirkstoffe in ein steriles Vehikel eingebracht werden, das das grundlegende Dispersionsmedium und die erforderlichen weiteren Bestandteile von denjenigen, die vorstehend aufgezählt sind, enthält. Im Falle von sterilen Pulvern zur Herstellung steriler injizierbarer Lösungen, sind die bevorzugten Verfahren zur Herstellung Vakuumtrocknungs- und Gefriertrocknungsverfahren, die ein Pulver des Wirkstoffs mit jedem zusätzlichen gewünschten Bestandteil aus einer vorab steril gefilterten Lösung davon ergeben.
Die hierin offenbarten Zusammensetzungen können in einer neutralen oder in Salzform formuliert sein. Pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen die Säureadditionssalze (gebildet mit den freien Aminogruppen des Proteins) und sind gebildet mit anorganischen Säuren wie zum Beispiel Chlorwasserstoff- oder Phosphorsäuren, oder solch organischen Säuren wie Essig-, Oxal-, Wein-, Mandelsäure und dergleichen. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet sind, können ebenfalls von anorganischen Basen wie zum Beispiel Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisenhydroxiden oder solchen organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, Histidin, Procain und dergleichen abgeleitet werden. Nach der Formulierung werden die Lösungen auf eine Art und Weise verabreicht, die mit der Darreichungsformulierung kompatibel ist, und in einer solchen Menge, wie sie therapeutisch wirksam ist. Die Formulierungen können in verschiedensten Darreichungsformen, wie beispielsweise injizierbare Lösungen, Arzneistoff-freisetzende Kapseln und dergleichen, verabreicht werden.
Wie hierin verwendet, umfasst „Träger" jegliche und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Vehikel, Überzüge, Verdünnungsmittel, antibakterielle und antimykotische Mittel, isotonische und Absorptionsverzögernde Mittel, Puffer, Trägerlösungen, Suspensionen, Kolloide und dergleichen. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist auf dem Fachgebiet wohl bekannt. Mit Ausnahme insoweit als jedes herkömmliche Medium oder Mittel mit dem Wirkstoff inkompatibel ist, wird seine Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen in Betracht gezogen. Zusätzliche Wirkstoffe können ebenfalls in die Zusammensetzungen eingebracht sein.
Der Begriff „pharmazeutisch verträglich" oder „pharmakologisch verträglich" bezieht sich auf molekulare Einheiten und Zusammensetzungen, die bei einer Verabreichung an einen Menschen keine allergische oder ähnliche unerwünschte Reaktion hervorrufen. Die Herstellung einer wässrigen Zusammensetzung, die ein Protein als einen Wirkstoff enthält, ist auf dem Fachgebiet wohl verstanden. Typischerweise werden solche Zusammensetzungen als Injektionen, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, hergestellt; feste Formen, die zur Lösung in oder Suspendierung in einer Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden.
4. Kombinationsbehandlungen
Um die Wirksamkeit eines mda-7 Polypetids in voller Länge, im Wesentlichen in voller Länge oder eines verkürzten Polypeptids oder eines dafür kodierenden Expressionskonstrukts zu erhöhen, wird es mit anderen bei der Behandlung von Krebs wirksamen Mitteln, nämlich einer Anti-Krebs-Behandlung wie vorstehend definiert, kombiniert. Ein „Antikrebs"-Mittel ist in der Lage, Krebs bei einem Individuum negativ zu beeinflussen, zum Beispiel durch das Abtöten von Krebszellen, Herbeiführen von Apoptose in Krebszellen, Verringern der Wachstumsrate von Krebszellen, Verringern der Häufigkeit oder Anzahl an Metastasen, Verringern der Tumorgröße, Hemmen des Tumorwachstums, Verringern der Blutzufuhr zu einem Tumor oder Krebszellen, Fördern einer Immunantwort gegen Krebszellen oder eines Tumors, Verhindern oder Hemmen des Fortschreitens von Krebs oder Erhöhen der Lebensspanne eines Individuums mit Krebs. Antikrebsmittel sind Chemotherapie-Mittel, nämlich ein DNA-schädigendes Mittel, Tamoxifen oder Herceptin. Allgemeiner würden diese anderen Zusammensetzungen in einer kombinierten Menge bereitgestellt, die wirksam ist, um eine Zelle zu töten oder ihre Vermehrung zu hemmen. Dieser Prozess kann es mit sich bringen, die Zellen mit dem Expressionskonstrukt und dem/den Mittel(n) oder mehreren Faktor(en) zur gleichen Zeit in Kontakt zu bringen. Dies kann erreicht werden, indem die Zelle mit einer einzelnen Zusammensetzung oder pharmakologischen Formulierung, die beide Mittel umfasst, in Kontakt gebracht wird, oder indem die Zelle mit zwei verschiedenen Zusammensetzungen oder Formulierungen zur gleichen Zeit in Kontakt gebracht wird, wobei eine Zusammensetzung das Expressionskonstrukt umfasst und die andere das/die zweite(n) Mittel umfasst.
Eine Resistenz der Tumorzellen auf Mittel der Chemotherapie und Strahlentherapie stellt ein Hauptproblem in der klinischen Onkologie dar. Ein Ziel der derzeitigen Krebsforschung ist es, Wege zu finden, um die Wirksamkeit von Chemo- und Strahlentherapie zu verbessern, indem sie mit Gentherapie kombiniert werden. Das Herpes Simplex-Thymidinkinase (HS-tK) Gen führte beispielsweise erfolgreich die Aufnahmefähigkeit gegenüber dem antiviralen Mittel Ganciclovir (Culver et al., 1992) herbei, wenn es durch ein retrovirales Vektorsystem an Gehirntumore abgegeben wurde. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird mda-7 Gentherapie ebenso in Verbindung mit chemotherapeutischen Eingriffen, wie vorstehend definiert, zusätzlich zu anderen pro-apoptotischen oder Zellzyklus-regulierenden Mitteln angewendet.
Alternativ kann die Gentherapie der Behandlung mit dem anderen Mittel vorangehen oder im Anschluss an sie stattfinden, wobei die Intervalle von Minuten zu Wochen reichen. Bei Ausführungsformen, bei denen das andere Mittel und Expressionskonstrukt getrennt an der Zelle appliziert werden, würde im Allgemeinen sichergestellt werden, dass zwischen dem Zeitpunkt einer jeden Abgabe keine bestimmte Zeitspanne verstreichen würde, derart, dass das Mittel und Expressionskonstrukt immer noch in der Lage waren, eine zweckmäßigerweise kombinierte Wirkung auf die Zelle auszuüben. In solchen Fällen wird davon ausgegangen, dass die Zelle mit beiden Modalitäten innerhalb von in etwa 12–24 h, und, stärker bevorzugt, innerhalb von in etwa 6–12 h miteinander in Kontakt gebracht wird. In einigen Situationen kann es wünschenswert sein, die Zeitspanne zur Behandlung deutlich auszuweiten, wobei allerdings mehrere Tage (2, 3, 4, 5, 6 oder 7) bis mehrere Wochen (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8) zwischen den jeweiligen Verabreichungen liegen.
Verschiedene Kombinationen können angewandt werden, Gentherapie ist „A" und das sekundäre Mittel, d. h. Chemotherapie, ist „B":

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B

B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A

B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
Die Verabreichung der erfindungsgemäßen therapeutischen Expressionskonstrukte an einen Patienten wird gemäß den allgemeinen Protokollen zur Verabreichung von Chemotherapeutika ablaufen, wobei die Toxizität des Vektors, falls eine vorliegt, in Betracht gezogen wird. Es wird erwartet, dass die Behandlungszyklen wie nötig wiederholt würden. Es wird ebenfalls davon ausgegangen, dass verschiedene Standardtherapien, sowie chirurgische Eingriffe, in Verbindung mit der beschriebenen hyperproliferativen Zelltherapie angewendet werden können.
a. Chemotherapie
Krebstherapien im Allgemeinen umfassen ebenfalls eine Vielzahl von Kombinationstherapien sowohl mit Behandlungen auf chemischer als auch auf Strahlenbasis. Kombinationschemotherapien umfassen beispielsweise Cisplatin (CDDP), Carboplatin, Procarbazin, Mechlorethamin, Cyclophosphamid, Camptothecin, Ifosfamid, Melphalan, Chlorambucil, Busulfan, Nitroharnstoff, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Bleomycin, Plicomycin, Mitomycin, Etoposid (Vp16), Tamoxifen, Raloxifen, Östrogenrezeptor-bindende Mittel, Taxol, Gemcitabien, Navelbin, Farnesyl-Protein-Transferase-Inhibitoren, Transplatin, 5-Fluoruracil, Vincristin, Vinblastin und Methotrexat, Temazolomid (eine wässrige Form von DTIC) oder jede analoge oder Derivatvariante der vorstehenden. Die Kombination von Chemotherapie mit biologischer Therapie ist als Biochemotherapie bekannt.
b. Strahlentherapie
Weitere Faktoren, die DNA-Schäden verursachen und die weitgehend angewendet wurden, umfassen, was gemeinhin als γ-Strahlen, Röntgenstrahlen und/oder die direkte Abgabe von Radioisotopen an Tumorzellen bekannt ist. Weitere Formen von DNA-schädigenden Faktoren sind ebenfalls bekannt, wie beispielsweise Mikrowellen und UV-Strahlung. Es ist äußerst wahrscheinlich, dass alle diese Faktoren verschiedenste Schäden an der DNA, an den Vorstufen von DNA, bei der Reduplikation und Reparatur von DNA und bei der Ansammlung und Versorgung von Chromosomen bewirken. Dosierungsbereiche für Röntgenstrahlen liegen zwischen täglichen Dosen von 50 bis 200 Röntgen für verlängerte Zeitspannen (3 bis 4 Wochen) und Einzeldosen von 2000 bis 6000 Röntgen. Dosierungsbereiche für Radioisotope sind sehr verschieden und hängen von der Halbwertszeit des Isotops, der Stärke und Art der emittierten Strahlung und der Aufnahme durch die neoplastischen Zellen ab.
Die Begriffe „kontaktiert" und „ausgesetzt", wenn sie sich auf eine Zelle beziehen, werden hierin verwendet, um den Prozess zu beschreiben, durch den ein therapeutisches Konstrukt und ein chemotherapeutisches oder strahlentherapeutisches Mittel an eine Zielzelle abgegeben werden oder direkt neben der Zielzelle platziert werden. Um ein Töten der Zelle oder Stasis zu erreichen, werden beide Mittel in einer kombinierten Menge an die Zelle abgegeben, die wirksam ist, um die Zelle zu töten oder sie an einer Teilung zu hindern.
c. Immuntherapie
Immuntherapeutika im Allgemeinen beruhen auf der Verwendung von Immuneffektorzellen und Molekülen, um auf Krebszellen zu zielen und sie zu zerstören. Der Immuneffektor kann zum Beispiel ein Antikörper sein, der auf irgendeinen Marker auf der Oberfläche einer Tumorzelle spezifisch ist. Der Antikörper alleine kann als ein Effektor der Therapie dienen oder er kann andere Zellen herbeiholen, um die tatsächliche Zelltötung zu bewirken. Der Antikörper kann ebenfalls an einen Arzneistoff oder Toxin (Chemotherapeutikum, Radionuklid, Ricin-A-Kette, Choleratoxin, Pertussistoxin etc.) gebunden sein und lediglich als ein zielführendes Mittel dienen. Alternativ kann der Effektor ein Lymphozyt sein, der ein Oberflächenmolekül trägt, das entweder direkt oder indirekt mit einem Tumorzellen-Ziel wechselwirkt. Verschiedene Effektorzellen umfassen zytotoxische T-Zellen und NK-Zellen. Mda-7 Gentransfer zu Tumorzellen verursacht Tod und Apoptose von Tumorzellen. Die apoptotischen Tumorzellen werden durch retikuloendotheliale Zellen, einschließlich dentritischen Zellen und Makrophagen, gereinigt und dem Immunsystem präsentiert, um Anti-Tumorimmunität zu erzeugen (Rovere et al., 1999; Steinman et al., 1999). Die lösliche Form von MDA-7-Protein weist eine Cytokin-artige Struktur und Aktivitäten auf, wie beispielsweise Aktivierung von Immunzellen. Die Kombination von therapeutischen Heilmitteln, d. h. direkte zytotoxische Aktivität und Immunaktivierung durch MDA-7 würde einen therapeutischen Vorteil bei der Behandlung von Krebs bereitstellen.
Der allgemeine Ansatz für eine kombinierte Therapie wird nachstehend diskutiert. Bei einem Aspekt der Immuntherapie muss die Tumorzelle irgendeinen Marker tragen, der für Targeting empfänglich ist, d. h. der nicht auf der Mehrheit der anderen Zellen vorhanden ist. Es gibt viele Tumormarker und jeder dieser kann zum Targeting im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sein. Herkömmliche Tumormarker umfassen carcinoembryonisches Antigen, Prostata-spezifisches Antigen, Harntumor-assoziiertes Antigen, fötales Antigen, Tyrosinase (p97), gp68, TAG-72, HMFG, Sialyl Lewis Antigen, MucA, MucB, PLAP, Östrogenrezeptor, Lamininrezeptor, erb B und p155. Ein alternativer Aspekt der Immuntherapie ist es, die pro-apoptotische Wirkung, die durch Ad-mda7-Behandlung vermittelt wird, mit immunstimulierenden Wirkungen zu kombinieren. Letztere können inhärent in dem löslichen MDA-7-Protein sein. Es gibt allerdings auch andere immunstimulierende Moleküle, einschließlich: Cytokine wie beispielsweise IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, gamma-IFN, Chemokine wie beispielsweise MIP-1, MCP-1, IL-8 und Wachstumsfaktoren wie beispielsweise FLT3 Ligand. Die Kombination von immunstimulierenden Molekülen, entweder als Proteine oder unter Verwendung von Genabgabe in Kombination mit Ad-mda7, verbessert antitumorale Wirkungen (Ju et al., 2000).
Wie früher diskutiert, sind Beispiele von derzeit untersuchten oder verwendeten Immuntherapien Immunhilfsstoffe (z. B. Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum, Dinitrochlorbenzol und aromatische Verbindungen) ( US-Patentschrift 5,801,005 ; US-Patentschrift 5,739,169 ; Hui und Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998), Cytokintherapie (z. B. Interferone α, β und γ; IL-1, GM-CSF und TNF) (Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998), Gentherapie (z. B. TNF, IL-1, IL-2, p53) (Qin et al., 1998; Austin-Ward und Villaseca, 1998; US-Patentschrift 5,830,880 und US-Patentschrift 5,846,945 ) und monoklonale Antikörper (z. B. Anti-Gangliosid GM2, anti-HER-2, anti-p185) (Pietras et al., 1998; Hanibuchi et al., 1998; US-Patentschrift 5,824,311 ). Herceptin (trastuzumab) ist ein chimärer (Maus-Mensch) monoklonaler Antikörper, der den HER2-neu Rezeptor blockiert. Er besitzt antitumorale Aktivität und wurde zur Anwendung bei der Behandlung maligner Tumore (Dillman, 1999) zugelassen. Eine Kombinationstherapie von Krebs mit Herceptin und Chemotherapie stellte sich als wirksamer als die einzelnen Therapien heraus. Es wird somit davon ausgegangen, dass eine oder mehrere Krebstherapien mit der hier beschriebenen Ad-mda7 Therapie angewendet werden können.
i. Passive Immuntherapie
Es gibt eine Reihe verschiedener Ansätze für eine passive Immuntherapie von Krebs. Sie können allgemein in folgende Kategorien eingeteilt sein: Injektion von Antikörpern allein; Injektion von Antikörpern gekoppelt an Toxine oder chemotherapeutische Mittel; Injektion von Antikörpern gekoppelt an radioaktive Isotope; Injektion von anti-Idiotyp-Antikörpern; und schließlich Eliminieren von Tumorzellen in Knochenmark.
Bevorzugt werden humane monoklonale Antikörper in der passiven Immuntherapie eingesetzt, da sie kaum oder keine Nebenwirkungen bei dem Patienten hervorrufen. Ihre Anwendung ist allerdings etwas durch ihre Knappheit begrenzt, und sie wurden bislang lediglich intraläsional verabreicht. Humane monoklonale Antikörper gegen Gangliosid-Antigene wurden Patienten intraläsional verabreicht, die an rezidivierenden Hautmelanomen (Irie & Morton, 1986) litten. Bei sechs von zehn Patienten wurde im Anschluss an tägliche oder wöchentliche intraläsionale Injektionen eine Regression beobachtet. Bei einer anderen Studie wurde ein mäßiger Erfolg durch intraläsionale Injektionen zweier humaner monoklonaler Antikörper (Irie et al., 1989) erzielt.
Es kann erwünscht sein, mehr als einen monoklonalen Antikörper, der gegen zwei verschiedene Antigene gerichtet ist, oder sogar Antikörper mit multipler Antigenspezifität zu verabreichen. Behandlungsprotokolle können ebenfalls die Verabreichung von Lymphokinen oder anderen Immunverbesserern, wie durch Bajorin et al. (1988) beschrieben, umfassen. Die Entwicklung humaner monoklonaler Antikörper ist in weiteren Details an anderer Stelle in der Beschreibung beschrieben.
ii. Aktive Immuntherapie
Bei der aktiven Immuntherapie wird ein als Antigen wirkendes Peptid, Polypeptid oder Protein oder eine autologe oder allogene Tumorzellzusammensetzung oder „Impfstoff" verabreicht, im Allgemeinen mit einem bestimmten bakteriellen Hilfsstoff (Ravindranath & Morton, 1991; Morton & Ravindranath, 1996; Morton et al., 1992; Mitchell et al., 1990; Mitchell et al., 1993). Bei der Melanom-Immuntherapie überleben diejenigen Patienten, die eine hohe IgM Antwort auslösen oft besser, als diejenigen, die keine oder geringe IgM Antikörper auslösen (Morton et al., 1992). IgM-Antikörper sind oft transiente Antikörper und die Ausnahme von der Regel scheinen Anti-Gangliosid- oder Antikohlenhydrat-Antikörper zu sein.
iii. Adoptive Immuntherapie
Bei der adoptiven Immuntherapie werden die zirkulierenden Lymphozyten oder tumor-infiltrierten Lymphozyten des Patienten in vitro isoliert, durch Lymphokine wie beispielsweise IL-2 aktiviert, oder mit Genen zur Tumornekrose transduziert und erneut verabreicht (Rosenberg et al., 1988; 1989). Um dies zu erreichen, würde einem Tier oder einem menschlichen Patienten eine immunologisch wirksame Menge aktivierter Lymphozyten in Kombination mit einer wie hierin beschriebenen Zusammensetzung eines als Antigen wirkenden Peptids, das in einen Hilfsstoff eingebracht ist, verabreicht. Die aktivierten Lymphozyten sind am stärksten bevorzugt die eigenen Zellen des Patienten, die vorher aus einer Blut- oder Tumorprobe isoliert wurden und in vitro aktiviert (oder „expandiert") wurden. Diese Form der Immuntherapie erzeugte mehrere Fälle von Regression von Melanomen und Nierenkarzinomen, aber der Prozentsatz derer, die darauf ansprachen, war gering im Gegensatz zu denjenigen, die nicht ansprachen.
d. Gene
Die Abgabe eines Vektors, der ein MDA-7 entweder in voller Länge oder verkürzt kodiert, in Verbindung mit einem zweiten Vektor, der eines der folgenden Genprodukte kodiert, weist eine kombinierte antihyperproliferative Wirkung auf Zielgewebe aus. Alternativ kann ein einziger Vektor verwendet werden, der beide Gene kodiert. Eine Vielzahl an Proteinen ist hier in die Erfindung eingeschlossen, einige davon sind nachstehend beschrieben. Tabelle 6 listet verschiedene Gene auf, auf die eine Gentherapie in irgendeiner Form in Kombination mit der vorliegenden Erfindung gerichtet sein kann.
i. Auslöser von Zellvermehrung
Die Proteine, die Zellvermehrung auslösen, zerfallen weiter in verschiedene Kategorien, abhängig von der Funktion. Was alle diese Proteine gemeinsam haben, ist ihre Fähigkeit, Zellvermehrung zu regulieren. Eine Form von PDGF beispielsweise, das sis-Onkogen, ist ein abgesonderter Wachstumsfaktor. Onkogene gehen selten aus Genen hervor, die Wachstumsfaktoren kodieren, und derzeit ist sis der einzige bekannte, natürlich vorkommende onkogene Wachstumsfaktor. Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird davon ausgegangen, dass Antisense-mRNA, die auf einen bestimmten Auslöser von Zellvermehrung gerichtet ist, verwendet wird, um eine Expression des Auslösers von Zellvermehrung zu verhindern.
Die Proteine FMS, ErbA, ErbB und neu sind Wachstumsfaktor-Rezeptoren. Mutationen dieser Rezeptoren führen zu einem Verlust der Regulierungsfunktion. Eine Punktmutation beispielsweise, die den transmembranen Bereich des Neu Rezeptor-Proteins schädigt, führt zu dem neu Onkogen. Das erbA Onkogen stammt von dem intrazellularen Rezeptor für Schilddrüsenhormone. Man glaubt, dass der modifizierte onkogene ErbA-Rezeptor mit dem endogenen Schilddrüsenhormonrezeptor konkurriert, was unkontrolliertes Wachstum verursacht.
Die größte Klasse von Onkogenen umfasst die Signal-transduzierenden Proteine (z. B. Src, Abi und Ras). Das Protein Src ist eine Protein-Tyrosinkinase des Cytoplasmas und ihre Umwandlung von einem Protoonkogen führt in einigen Fällen über Mutationen an dem Tyrosinrest 527 zu einem Onkogen. Im Gegensatz dazu führt eine Umwandlung des GTPase Proteins ras von einem Protoonkogen bei einem Beispiel von einer Valin zu einer Glycin-Mutation an der Aminosäure 12 in der Sequenz zu einem Onkogen, was die ras GTPase Aktivität verringert.
Die Proteine Jun, Fos und Myc sind Proteine, die ihre Wirkungen direkt auf Kernfunktionen als Transkriptionsfaktoren ausüben.
ii. Inhibitoren der Zellvermehrung
Die den Tumor unterdrückenden Onkogene fungieren als Inhibitoren exzessiver Zellvermehrung. Die Inaktivierung dieser Gene zerstört ihre hemmende Aktivität, was zu einer unkontrollierten Vermehrung führt. Die Tumorsuppressoren p53, p16 und C-CAM sind nachstehend beschrieben.
Hohe Spiegel von mutierendem p53 wurden in vielen Zellen gefunden, die durch chemische Karzinogenese, ultraviolette Strahlung und verschiedene Viren transformiert waren. Das p53-Gen ist ein häufiges Ziel der veränderlichen Inaktivierung bei vielen verschiedenen menschlichen Tumoren und wurde bereits als das am häufigsten mutierte Gen bei herkömmlichen menschlichen Krebsen dokumentiert. Es ist bei mehr als 50% menschlichem NSCLCs (Rollstein et al., 1991) und bei einem breiten Spektrum anderer Tumore mutiert.
Das p53-Gen kodiert ein 393-Aminosäurephosphoprotein, das Komplexe mit Wirtsproteinen, wie beispielsweise Groß-T-Antigen und E1B, bilden kann. Das Protein kommt in normalen Geweben und Zellen vor, aber in Konzentrationen, die im Vergleich mit transformierten Zellen oder Tumorgewebe winzig sind.
Wildtyp p53 wird als ein wichtiger Wachstumsfaktor bei vielen Zelltypen angesehen. Missense-Mutationen sind bekannt für das p53-Gen und sind entscheidend für die Transformationsfähigkeit des Onkogens. Eine einzige genetische Veränderung, die durch Punktmutationen ausgelöst wird, kann kanzerogenes p53 erzeugen. Im Gegensatz zu anderen Onkogenen allerdings, sind p53 Punktmutationen dafür bekannt, dass sie an mindestens 30 bestimmten Codons auftreten, wobei oftmals dominante Allele erzeugt werden, die Shifts im Zellphänotyp ohne eine Verringerung der Hornozygosität erzeugen. Zusätzlich scheinen viele dieser dominanten negativen Allele im Organismus toleriert und in der Keimbahn weiter gegeben zu werden. Verschiedene mutante Allele scheinen von minimal dysfunktionellen bis stark penetranten, dominanten negativen Allelen (Weinberg, 1991) zu reichen.
Ein weiterer Inhibitor der Zellvermehrung ist p16. Die Haupttransitionen des eukaryotischen Zellzyklus werden von Cyclin-abhängigen Kinasen oder CDKs ausgelöst. Eine CDK, Cyclin abhängige Kinase 4 (CDK 4), reguliert die Progression durch das G₁. Die Aktivität dieses Enzyms kann eine Phosphorylierung von Rb an spätem G₁ sein. Die Aktivität von CDK4 wird durch eine aktivierende Untereinheit, D-Typ Cyclin, und durch eine hemmende Untereinheit geregelt. Das p16^INK4 wurde biochemisch als ein Protein gekennzeichnet, das spezifisch an CDK4 bindet und es hemmt, und somit die Rb Phosphorylierung regulieren kann (Serrano et al., 1993; Serrano et al., 1995). Da das p16^INK4 Protein ein CDK4-Inhibitoren ist (Serrano, 1993), kann eine Zerstörung dieses Gens die Aktivität von CDK4 erhöhen, was zu einer Hyperphosphorylierung des Rb Proteins führt. P16 ist ebenfalls dafür bekannt, dass es die Funktion von CDK6 reguliert.
p16^INK4 gehört zu einer neu beschriebenen Klasse von CDK-hemmenden Proteinen, die ebenfalls p16^B, p19, p21^WAF1 und p27^KIP1 umfassen. Das p16^INK4-Gen bildet auf 9p21 ab, einer Chromosomenregion, die bei vielen Tumorarten häufig zerstört ist. Homozygote Zerstörungen und Mutationen des p16^INK4-Gens kommen bei menschlichen Tumorzelllinien häufig vor. Diese Anzeichen legen nahe, dass das p16^INK4-Gen ein Tumorsuppressor-Gen ist. Diese Interpretation wurde allerdings durch die Beobachtung in Frage gestellt, dass die Häufigkeit der Veränderungen des p16^INK4-Gens bei primären unkultivierten Tumoren sehr viel geringer ist als bei kultivierten Zelllinien (Caldas et al., 1994; Cheng et al., 1994; Hussussian et al., 1994; Kamb et al., 1994; Kamb et al., 1994; Mori et al., 1994; Okamoto et al., 1994; Nobori et al, 1995; Orlow et al., 1994; Arap et al., 1995). Die Wiederherstellung der Wildtyp-16^INK4_ Funktion durch Transfektion mit einem Plasmidexpressionsvektor verringerte die Koloniebildung bei einigen menschlichen Krebszelllinien (Okamoto, 1994; Arap, 1995).
Weitere Gene, die angewendet werden können, umfassen Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, zac1, p73, VHL, MMAC1/PTEN, DBCCR-1, FCC, rsk-3, p27, p27/p16-Fusionen, p21/p27-Fusionen, antithrombotische Gene (z. B. COX-1, TFPI), PGS, Dp, E2F, ras, myc, neu, raf, erb, fms, trk, ret, gsp, hst, abl, E1A, p300, an der Angiogenese beteiligte Gene (z. B. VEGF, FGF, Thrombospondin, BAI-1, GDAIF oder ihre Rezeptoren) und MCC.
iii. Regulatoren des programmierten Zelltods
Apoptose oder programmierter Zelltod ist ein grundlegender Prozess für die normale embryonische Entwicklung, wobei Homöostase in erwachsenen Geweben erhalten wird und Karzinogenese (Kerr et al., 1972) unterdrückt wird. Es wurde gezeigt, dass die Bcl-2-Familie von Proteinen und ICE-ähnliche Proteasen wichtige Regulatoren und Effektoren von Apoptose in anderen Systemen sind. Das Bcl-2-Protein, das in Verbindung mit follikularen Lymphomen entdeckt wurde, spielt eine bedeutende Rolle bei der Steuerung der Apoptose und Verbesserung des Zellüberlebens in Antwort auf unterschiedliche apoptotische Stimuli (Bakhshi et al., 1985; Cleary und Sklar, 1985; Cleary et al., 1986; Tsujimoto et al., 1985; Tsujimoto und Croce, 1986). Das evolutionär konservierte Bcl-2 Protein wird heutzutage als Mitglied einer Familie verwandter Proteine anerkannt, die als Todesagonisten oder Todesantagonisten klassifiziert werden können.
Im Anschluss an seine Entdeckung wurde gezeigt, dass Bcl-2 wirkt, um Zelltod, der von einer Vielzahl an Stimuli ausgelöst wurde, zu unterdrücken. Es ist heutzutage ebenfalls offensichtlich, dass eine Familie von Bcl-2 Zelltod-regulierenden Proteinen gibt, die strukturelle und sequentielle Homologien gemeinsam haben. Diese verschiedenen Familienmitglieder besitzen nachgewiesenermaßen entweder ähnliche Funktionen wie Bcl-2 (z. B. Bcl_XL, Bcl_W, Bcl_S, Mcl-1, A1, Bfl-1) oder sie wirken der Bcl-2 Funktion entgegen und fördern Zelltod (z. B. Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad, Harakiri).
e. chirurgische Eingriffe
In etwa 60% der Personen mit Krebs unterziehen sich chirurgischen Eingriffen irgendeiner Art, die präventive, diagnostische oder in Stadien einteilende, kurative und palliative Chirurgie umfassen. Kurative Chirurgie ist eine Krebsbehandlung, die in Verbindung mit anderen Therapien, wie beispielsweise der Behandlung der vorliegenden Erfindung, Chemotherapie, Strahlentherapie, hormoneller Therapie, Gentherapie, Immuntherapie und/oder alternativen Therapien angewendet werden kann.
Kurative Chirurgie umfasst eine Resektion, bei der das gesamte oder ein Teil des karzinomatösen Gewebes physikalisch entfernt, herausgeschnitten und/oder zerstört wird. Tumorresektion bezieht sich auf physikalische Entfernung von mindestens einem Teil eines Tumors. Zusätzlich zu einer Tumorresektion umfasst eine Behandlung durch chirurgische Eingriffe Laserchirurgie, Cryochirurgie, Elektrochirurgie und mikroskopisch kontrollierte Chirurgie (Mohs' Chirurgie). Es wird ferner davon ausgegangen, dass die vorliegende Erfindung in Verbindung mit der Entfernung von Oberflächenkrebsen, Präkanzerosen oder zufälligen Mengen normalen Gewebes angewendet werden kann.
Nach einer Exzision eines Teils aller karzinomatösen Zellen, Gewebe oder Tumore kann eine Höhle im Körper gebildet werden. Eine Behandlung kann mittels Perfusion, direkter Injektion oder lokaler Applikation des Bereichs mit einer zusätzlichen Anti-Krebs-Therapie durchgeführt werden. Solch eine Behandlung kann zum Beispiel alle 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Tage oder alle 1, 2, 3, 4 und 5 Wochen oder alle 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Monate wiederholt werden. Diese Behandlungen können auch bei der Dosierung variieren.
f. weitere Mittel
Es wird davon ausgegangen, dass weitere Mittel in Kombination mit der vorliegenden Erfindung angewendet werden können, um die therapeutische Wirksamkeit der Behandlung zu verbessern. Diese zusätzlichen Mittel umfassen immunmodulatorische Mittel, Mittel, die die Aufregulation von Zelloberflächenrezeptoren und GAP Berührungsstellen beeinflussen, zytostatische und Differenzierungsmittel, Inhibitoren von Zelladhäsion, Mittel, die die Empfindlichkeit der hyperproliferativen Zellen auf apoptotische Auslöser erhöhen oder weitere biologische Mittel. Immunmodulatorische Mittel umfassen Tumornekrosefaktor, Interferon alpha, beta und gamma; IL-2 und andere Cytokine; F42K und andere Cytokin-Analoga; oder MIP-1, MIP-1 beta, MCP-1, RANTES und andere Chemokine. Es wird ferner davon ausgegangen, dass die Aufregulation von Zelloberflächenrezeptoren oder ihren Liganden, wie beispielsweise Fas/Fas Ligand, DR4 oder DR5/TRAIL (Apo-2 Ligand), die Apoptose auslösenden Fähigkeiten der vorliegenden Erfindung durch Erzeugung einer autokrinen oder parakrinen Wirkung auf hyperproliferative Zellen potenzieren würde. Erhöhtes interzellulares Signalisieren durch Erhöhung der Anzahl an GAP-Berührungsstellen, würde die anti-hyperproliferativen Wirkungen auf die benachbarte hyperproliferative Zellpopulation erhöhen. Bei weiteren Ausführungsformen können zytostatische oder Differenzierungsmittel in Kombination mit der vorliegenden Erfindung angewendet werden, um die anti-hyperproliferative Wirksamkeit der Behandlungen zu verbessern. Inhibitoren von Zelladhäsion werden in Erwägung gezogen, um die Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung zu verbessern. Beispiele von Zelladhäsionshemmern sind fokale Adhäsionskinase (FAK)-Inhibitoren und Lovastatin. Es wird ferner davon ausgegangen, dass weitere Mittel, die die Empfindlichkeit einer hyperproliferativen Zelle auf Apoptose erhöhen, wie beispielsweise der Antikörper c225, in Kombination mit der vorliegenden Erfindung angewendet werden könnten, um die Wirksamkeit der Behandlung zu verbessern.
Apo2 Ligand (Apo2L, auch TRAIL genannt) ist ein Mitglied der Cytokinfamilie der Tumornekrosefaktoren (TNF). TRAIL aktiviert schnelle Apoptose bei vielen Arten von Krebszellen, ist allerdings nicht toxisch gegenüber normalen Zellen. TRAIL mRNA kommt in vielen verschiedenen Geweben vor. Die meisten normalen Zellen scheinen gegenüber der zytotoxischen Wirkung von TRAIL resistent zu sein, was die Existenz von Mechanismen nahe legt, die vor einer Apoptose-Induktion durch TRAIL schützen können. Der erste für TRAIL beschriebene Rezeptor, Todesrezeptor 4 (DR4) genannt, enthält eine cytoplasmatische „Todesdomäne"; DR4 überträgt das Apoptosesignal, das von TRAIL getragen wird. Zusätzliche Rezeptoren wurden identifiziert, die an TRAIL binden. Ein Rezeptor, DR5 genannt, enthält eine cytoplasmatische Todesdomäne und signalisiert Apoptose praktisch genauso wie DR4. Die mRNAs von DR4 und DR5 sind in vielen normalen Geweben und Tumorzelllinien exprimiert. Kürzlich wurden Köderrezeptoren, wie beispielsweise DcR1 und DcR2, identifiziert, die verhindern, dass TRAIL Apoptose mittels DR4 und DR5 induziert. Diese Köderrezeptoren stellen somit einen neuartigen Mechanismus zur Regulierung der Empfindlichkeit auf ein pro-apoptotisches Cytokin direkt an der Oberfläche der Zelle dar. Die bevorzugte Expression dieser hemmenden Rezeptoren in normalen Geweben legt nahe, dass TRAIL als ein Antikrebsmittel nützlich sein könnte, das Apoptose in Krebszellen induziert, während es normale Zellen verschont. (Marsters et al., 1999).
Es gab nach der Einführung cytotoxischer chemotherapeutischer Arzneimittel viele Fortschritte bei der Therapie von Krebs. Eine der Folgen der Chemotherapie ist allerdings die Entwicklung/Aneignung von Arzneimittel-resistenten Phänotypen und die Entwicklung einer mehrfachen Arzneimittelresistenz. Die Entwicklung einer Arzneimittelresistenz bleibt ein Haupthindernis bei der Behandlung solcher Tumore und daher besteht ein offensichtlicher Bedarf an alternativen Ansätzen, wie beispielsweise Gentherapie.
Studien vieler Forscher zeigten, dass Tumorzellen, die auf TRAIL resistent sind, mittels subtoxischer Konzentrationen von Arzneimitteln/Cytokinen sensibilisiert werden können und die sensibilisierten Tumorzellen werden maßgeblich von TRAIL getötet (Bonavida et al., 1999; Bonavida et al., 2000; Gliniak et al., 1999; Keane et al., 1999). Ad-mda7 Behandlung von Krebszellen führt zu der Aufregulation von mRNA für TRAIL und TRAIL-Rezeptoren. Daher kann eine Verabreichung der Kombination aus Ad-mda7 mit rekombinantem TRAIL als eine Behandlung angewendet werden, um eine verbesserte Anti-Tumor-Aktivität bereitzustellen. Außerdem führt die Kombination von Chemotherapeutika, wie beispielsweise CPT-11 oder Doxorubicin, mit TRAIL ebenfalls zu einer verbesserten Anti-Tumor-Aktivität und einer Zunahme der Apoptose. Die Kombination von Ad-mda7 mit Chemotherapeutika und Strahlentherapie, einschließlich DNA-schädigenden Mitteln, stellt ebenfalls verbesserte Anti-Tumor-Wirkungen bereit. Einige dieser Wirkungen können über Aufregulation von TRAIL oder verwandte Rezeptoren vermittelt werden, während dies bei anderen nicht funktioniert. Es wurde beispielsweise eine verbesserte Anti-Tumor-Aktivität mit den Kombinationen von Ad-mda7 und Tamoxifen oder Doxorubicin (Adriamycin) beobachtet. Weder Tamoxifen noch Adriamycin sind bekannt dafür, TRAIL oder verwandte Rezeptoren hoch zu regulieren.
Eine weitere Form der Therapie, die in Verbindung mit Chemotherapie, Strahlentherapie oder biologischer Therapie angewendet werden kann, umfasst Hyperthermie, welches eine Verfahrensweise darstellt, bei der das Gewebe eines Patienten hohen Temperaturen (bis zu 106°F) ausgesetzt wird. Externe oder interne Wärmevorrichtungen können an der Applikation lokaler, regionaler oder Ganzkörperhyperthermie beteiligt sein. Lokale Hyperthermie umfasst die Applikation von Wärme auf einen kleinen Bereich, wie beispielsweise einen Tumor. Wärme kann extern mit Hochfrequenzwellen erzeugt werden, die von einer Vorrichtung außerhalb des Körpers auf einen Tumor zielen. Interne Wärme kann eine sterile Sonde, einschließlich dünnen, erwärmten Drähten oder hohlen Schläuchen, die mit warmem Wasser gefüllt sind, implantierte Mikrowellenantennen oder Hochfrequenzelektroden, umfassen.
Ein Organ oder eine Extremität eines Patienten wird zur regionalen Therapie erwärmt, die unter Verwendung von Vorrichtungen durchgeführt wird, die hohe Energie erzeugen, wie beispielsweise Magneten. Alternativ kann ein Teil des Blutes des Patienten entnommen werden und vor einer Perfusion in einen Bereich, der intern erwärmt wird, erwärmt werden. Ganzkörpererwärmung kann ebenfalls in Fällen umgesetzt werden, in denen der Krebs sich über den gesamten Körper ausgebreitet hat. Warmwasserdecken, Heißwachs, Induktionsspulen und Wärmekammern können zu diesem Zweck verwendet werden.

Hormonelle Therapie kann ebenfalls in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung oder in Kombination mit jeder anderen vorstehend beschriebenen Krebstherapie angewendet werden. Die Anwendung von Hormonen kann bei der Behandlung bestimmter Krebse wie beispielsweise Brust-, Prostata-, Eierstock- oder Zervikalkrebs eingesetzt werden, um den Spiegel bestimmter Hormone, wie beispielsweise Testosteron oder Östrogen, zu senken oder ihre Wirkung zu blockieren. Diese Behandlung wird oftmals in Kombination mit mindestens einer weiteren Krebstherapie als eine Behandlungsoption angewendet, oder um das Risiko von Metastasen zu verringern. TABELLE 6: Onkogene

Gen	Quelle	Humanerkrankung	Funktion
Wachstumsfaktoren¹
HST/KS	Transfektion		Mitglied der FGF-Familie
INT-2	MMTV-Promotorinsertion		Mitglied der FGF-Familie
INT-1/WNT-1	MMTV-Promotorinsertion		faktorartig
SIS	Affensarkomvirus		PDGF-B
Rezeptortyrosinkinasen^1,2
ERBB/HER	Vogel-Erythroblastose-Virus; ALV-Promotorinsertion; Amplifizierte Humantumoren	Amplifiziertes, deletiertes Plattenepithelkarzinom; Glioblastom	EGF/TGF-α/Amphiregulin/Hetacellulin-Rezeptor
ERBE-2/NEU/HER-2	transfiziert aus Glioblastomen aus Ratte	Amplifizierte Brust-, Ovarial-, Magenkarzinome	Reguliert durch NDF/Hergulin und mit EGF verwandte Faktoren
FMS	Susan McDonough SM)-Katzensarkomvirus (FeSV)		CSF-1-Rezeptor
KIT	Hardy-Zuckerman (HZ)-FeSV		MGF/Steel-Rezeptor, Hämatopoese
TRK	Transfektion aus humanem Dickdarmkarazinom		NGF(Nerve Growth Faactor)-Rezeptor
MET	Transfektion aus humanem Osteosarkom		Scatter-Factor/HGF-Rezeptor
RET	Translokation und Punktmutationen	Sporadisches Schilddrüsenkarzinom; familiäres medulläres Schilddrüsenkarzinom; Multipe endokrine Neoplasie 2A und 2B	Orphan-Rezeptortyrosinkinase
ROS	URII-Vogelsarkomvirus (ASV)		Orphan-Rezeptortyrosinkinase
PDGF-Rezeptor	Translokation	chronische myelomonozytäre Leukämie	TEL(ETS-like Transcription Factor)/PDGF-Rezeptor-Genfusion
TGF-β-Rezeptor		Dickdarmkarzinom Basenfehlpaarungsmutationsziel
Nichtrezentor-Tyrosinkinasen¹
ABL	Abelson-Maus-Leukämievirus	Chronische myeloische Leukämie Translokation mit BCR	Interagiert mit RB, RNA-Polymerase CRK, CBL
FPS/FES	Vogel-Fujinami-Sarkomvirus; Gardner-Arnstein (GA)-FeSV
LCK	MLV(Maus-Leukämievirus)-Promotorinsertion		Src-Familie; T-Zell-Signaltransduktion; interagiert mit CD4/CD8-T-Zellen
SRC	Rous-Sarkomvirus		Membranassoziierte Tyrosinkinase mit Signaltransduktionsfunktion; aktiviert durch Rezeptortyrosinkinasen
YES	Vogel-Y73-Virus		Src-Familie; Signaltransduktion
SER-THR-PROTEININASEN¹
AKT	AKT8-Maus-Retrovirus		reguliert durch PI(3)Kinase? reguliert 70-kd-S6-Kinase?
MOS	Moloney-Maus-Sarkomvirus (MoMSV)		GVBD; zytostatischer Faktor; MAP-Kinasekinase
PIM-1	Promotorinsertion Maus
RAF/MIL	3611 Maus-SV; MH2-ASV		Signaltransduktion im RAS-Signalweg
DIVERSE-ZELLOBERFLÄCHE¹
APC	Tumorsuppressor	Dickdarmkarzinom	interagiert mit Cateninen
DCC	Tumorsuppressor	Dickdarmkarzinom	CAM-Domänen
E-Cadherin	Tumorsuppressorkadidat	Brustkrebs	extrazellulär: homotypische Bindung, intrazelluär: interagiert mit Cateninen 12
PTC/NBCCS	Tumorsuppressor und Drosophila-Homolog	Basalzellnävussyndrom (Gorlin-Goltz-Syndrom)	Transmembrandomänen; Signaltransduktion durch Gli-Homolog C1 antagonistisch zum Hedgehog-Signalweg
TAN-1 Notch-Homolog	Translokation	T-ALL	Signalgebung
DIVERSE-SIGNAL TRANSDUKTION^1,3
BCL-2	Translokation	B-Zell-Lymphome	Apoptose
CBL	Maus-Cas-NS-1-Virus		tyrosinphosphorylierter RING-Finger, interagiert mit Abl adaptorgebundene
CRK	CT1010-ASV		SH2/SH3 interagiert mit Abl
DPC4	Tumorsuppressor	Pankreaskarzinom	TGF-β-abhängiger
MAS	Transfektion und Tumorigenizität		Signalweg Möglicher
NCK			Angiotensinrezeptor SH2/SH3-Adaptor
GUANINNUKLEOTIDAUSTAUSCH- UND BINDEPROTEINE^,4
BCR		Transloziert mit ABL in CML	Austauscher; Proteinkinase
DBL	Transfektion		Austauscher
GSP
NF-1	Erblicher Tumorsuppressor	Tumorsuppressor Neurofibromatose	RAS-GAP
OST	Transfektion		Austauscher
Harvey-Kirsten, N-RAS	Ha-Ratten-SV; Ki-Ratten-SV, Balb MoMSV; Transfektion	Punktmutationen in vielen humanen Tumoren	Signalkaskade
VAV	Transfektion		S112/S113; Austauscher
NUKLEÄRE PROTEINE UND TRANSKIPTIONSFAKTOREN^1,5–9
BRCA1	Erblicher Tumorsuppressor	Mammakarzinom/Ovarialkarzinom	Lokalisation ungeklärt
BRCA2	Erblicher Tumorsuppressor	Mammakarzinom	Funktion unbekannt
ERBA	Vogel-Erythoblastose-Virus		Thyroidhormonrezeptor (Transkription)
ETS	Vogel-E26-Virus		DNA-Bindung
EVII	MLV-Promotorinsertion	AML	Transkriptionsfaktor
FOS	FBI/FBR-Maus-Osteosarkomviren		AP1-Transkriptionsfaktor mit c-Jun Zinkfinger; Cubitus-Interruptus-Homolog
GLI	Amplifiziertes Gliom	Gliom	Bestandteil des Hedgehog-Signalweg; inhibitorische Verknüpfung PTC und Hedgehog
HMG1/LIM	Translokation t(3:12) t(12:15)	Lipom	Genfusion High Mobility Group HMG1-C(XT-hook) und Transkriptionsfaktor LIM oder saurer Domäne
JUN	ASV-17		Transkriptionsfaktor AP-1 mit FOS
MLL/VHRX + ELI/MEN	Translokation/Fusion ELL mit MLL Trithorax-like-Gen	akute myeloische Leukämie	Genfusion von DNA-Bindeprotein und Methyltransferase MLL mit ELI RNA-Pol-II-Elongationsfaktor
MYB	Vogel-Myeloblastosevirus		DNA-Bindung
MYC	Vogel-MC29; Translokation B-Zell-Lymphome; Promotorinsertion Vogel-Leukosevirus	Burkitt-Lymphom	DNA-Bindung mit AMX-Partner; Cyclin-Regulation; interagiert mit RB? reguliert Apoptose?
N-MYC	Amplifiziert	Neuroblastom
L-MYC		Lungenkrebs
REL	Vogel-Reticuloendotheliosevirus		Transkriptionsfaktor der NF-κB-Familie
SKI	Vogel-SKV770-Retrovirus		Transkriptionsfaktor
VHL	Erblicher Tumorsuppressor	Hippel-Lindau-Syndrom	Negativer Regulator oder Elongin; transkriptioneller Elongationskomplex
WT-1		Wilms-Tumor	Transkriptionsfaktor
ZELLZYKLUS/ANTWORT AUF DNA-SCHÄDEN^10-21
ATM	Erbkrankheit	Ataxia teleangiectatica	Protein/Lipidkinase-Homologie; Antwort auf DNA-Schäden stromaufwärts im P53-Signalweg
BCL-2	Translokation	Follikuläres Lymphom	Apoptose
FACC	Punktmutation	Fanconi-Anämie Gruppe C (Prädisposition Leukämie)
ZELLZYKLUS/ANTWORT AUF DNA-SCHÄDEN^10–21
FHIT	Fragile Site 3p14.2	Lungenkarzinom	Histidintriadeverwandtes Diadenosin 5',3'-P¹p⁴-Tetraphospat asymmetrische Hydrolase
hML1/MutL		HNPCC	Basenfehlpaarungsreparatur; MutL-Homolog
hMSH2/MutS		HNPCC	Basenfehlpaarungsreparatur; MutS-Homolog
hPMS1		HNPCC	Basenfehlpaarungsreparatur; MutL-Homolog
hPMS2		HNPCC	Basenfehlpaarungsreparatur; MutL-Homolog
INK4/MTS1	angrenzend an INK-4B auf 9p21; CDK-Komplexe	MTS1-Tumorsuppressorkandidat und MLM-Melanoma-Gen	p16-CDK-Inhibitor
INK4/MTS2		Tumorsuppressorkandidat	p15-CDK-Inhibitor
MDM-2	Amplifiziert	Sarkom	Negativer Regulator von p53
p53	Assoziation mit SV40-T-Antigen	Mutiert in > 50% der humanen Tumoren, einschließlich erbliches Li-Fraumeni-Syndrom	Transkriptionsfaktor; Checkpoint-Kontrolle; Apoptose
PRAD1/BCL1	Translokation mit Parathyroidhormon oder IgG	Parathyroid-Adenoma; B-CLL	Cyclin D
RB	Erbliches Retinoblastom; Assoziation mit vielen DNA-Virus-Tumorantigenen	Retinoblastom; Osteosarkom; Brustkrebs; andere sporadische Karzinome	Interagiert mit Cyclin/Cdk; reguliert E2F-Transkriptionsfaktor
XPA		Xeroderma Pigmentosum; Hautkrebs-Prädisposition	Exzisionsreparatur; Photoprodukterkennung; Zinkfinger

B. BEISPIELE
Die folgenden Beispiele sind beigefügt, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zu zeigen. Fachleute sollten bemerken, dass die in den Beispielen offenbarten Techniken, die repräsentativen Techniken folgen, von denen die Erfinder festgestellt haben, dass sie bei der Anwendung der Erfindung gut funktionieren, somit als bevorzugte Verfahrensweisen für deren Anwendung betrachtet werden können. Jedoch sollten die Fachleute angesichts der vorliegenden Offenbarung wissen, dass viele Änderungen in den spezifischen Ausführungsformen, die offenbart werden, vorgenommen werden können, wobei immer noch ein gleiches oder ähnliches Ergebnis erhalten werden kann ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.
BEISPIEL 1: VERKÜRZTES MDA-7
1. Material und Methoden
a. Tiere
3–6 Wochen alte weibliche/männliche BALB/c-Nacktmäuse wurden von Harlan Inc. (Indianapolis, Indiana) bezogen.
b. Virus
Kontroll-Adenovirus (Ad-c) wurde hergestellt durch Deletion von E1 und teilweise der E3-Regionen von Adenovirus, Serotyp 5. Ein Adenovirus, das humanes extrazelluläres MDA-7 codiert (Ad-mda7^EC), wird von Introgen Therapeutics Inc. Houston, Texas konstruiert. Extrazelluläres MDA-7 bezeichnet den sekretierten Teil des MDA-7-Proteins.
c. Vorbereitung der Zellen und Infektion mit Adenovirus
Soweit möglich werden Zelllinien aus der American Type Culture Collection (ATTC, Rockville, Maryland) bezogen. Die Zellen werden nach Empfehlung der ATTC in DMEM-Medium (GIBCO/BRL, Life Technologies, Grand Island, New York) mit 100 IU/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 10% fötalem Rinderserum, HyClone, Logan, Utah) kultiviert. Die Zellen werden getestet, es wird bestätigt, dass sie frei von Mycoplasmen sind, und sie werden in der logarithmischen Wachstumsphase verwendet. Zellen werden routinemäßig mit 0,125% Trypsin/1,3 mM EDTA (GIBCO) geerntet.
d. In vitro Transfektion
Zellen werden in einer Dichte von ca. 5 × 10⁵ Zellen pro 60 mm² in RPMI/10% FBS-Medium ausplattiert und in 5% CO₂ bei 37°C kultiviert. Die Ausplattierungsdichte variiert geringfügig, abhängig von der Zellwachstumsgeschwindigkeit usw., und wird empirisch bestimmt.
e. Herstellung von rekombinantem Adenovirus
Replikationsdefizientes humanes Adenovirus Typ 5 (Ad5), das die Nukleinsäure trägt, die extrazelluläres humanes MDA-7 (oder Luciferase-Gen), verknüpft mit einem internen CMV-IE-Promotor und gefolgt von dem SV40-Polyadenylierungs (pA)-Signal codiert, wird konstruiert. Das Adenoviruskonstrukt, das extrazelluläres humanes MDA-7 codiert, wird als Ad-mda7^TF, Ad-mda7^EC oder Ad-mda7^TR bezeichnet. Diese Bezeichnungen werden austauschbar verwendet, zur Bezeichnung eines Adenoviruskonstrukts, das einen Teil der vollständigen Mda-7-Gensequenz codiert. Ad-mda7^TF enthält eine Nukleinsäuresequenz, die ein verkürztes Transkript codiert, das ein verkürztes humanes MDA-7 codiert. Ein Adenovirus (Ad5)-Konstrukt, das die vollständige Mda-7-Gensequenz codiert, wurde wie unten beschrieben hergestellt und für einige dieser Experimente verwendet.
Die Ad5-Vektoren, welche die Genkassetten beherbergen, werden mit dem Plasmid pJM17 (Graham und Prevec 1992) in 293-Zellen kotransfiziert, um rekombinante Viren Ad-mda7^TF wieder herzustellen. Plaques werden gepickt, Virenstammkulturen angezogen, und die Korrektheit ihrer Genome durch PCR/Restriktionsanalyse und Sequenzierung bestätigt. Viren werden in 293-Zellen fortgepflanzt und durch Chromatographie gereinigt. Kontrollvektoren, einschließlich Ad-luc (welches das Firefly-Luciferase-Gen codiert), Ad-beta-gal (welches das bakterielle beta-Gal-Gen codiert), Ad-GFP (welches das Grün Fluoreszierende Protein codiert) und Ad-CMVpA (welches die Expressionskassette, aber kein Transgen enthält), wurden konstruiert und gereinigt.
f. Transduktion und Zellproliferationsanalyse
Die bei dieser Analyse verwendeten Krebs- oder normalen Zelllinien werden mit Ad-mda7^TR (mit entweder Ad-CMVpA oder Ad-luc als Kontrolle) in zunehmenden MOIs (Multiplicities of Infection) bzw. Virenpartikeln(Vp)/Zelle (0, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000 Vp/Zelle, zunehmende Konzentrationen) infiziert. Zellen werden zu 500–2000 Zellen/Vertiefung im 96-Well-Format ausplattiert für ³H-Thymidineinbau-Zellproliferations-Assays, oder zu 10⁵–10⁶ Zellen/Vertiefung in einer 6-Well-Platte ausplattiert für Proteinexpressions- oder Apoptose-Assays, oder zu 10⁴/Zellen/Vertiefung ausplattiert für den Alamarblau-Assay.
Zur Infektion werden Ad-mda7^TR oder Ad-luc (oder Ad-CMVpA) in zunehmenden MOIs (basierend auf Virenpartikeln/Zelle; MOI im Bereich von 0–10 000 Virenpartikeln/Zelle) verwendet. Für ³H-Thymidin-, Apoptose-, Proteinexpressions- und Alamarblau-Assays werden die Zellen 3 und 5 Tage nach der Infektion analysiert.
g. ³H-Thymidineinbau-Assay
Die Wachstumsinhibition von Zellen nach der Behandlung wird durch Analyse der DNA-Synthese gemessen. Kurz, für den ³H-Thymidineinbau-Assay werden Zellen zu 200–5000 Zellen pro Vertiefung im 96-Well-Format ausplattiert und in DMEM/10% FBS in einem 5% CO₂-Inkubator bei 37°C über Nacht kultiviert. Am nächsten Tag wird das Medium abgesaugt und ersetzt durch 50 μl DMEM/10% FBS, enthaltend das entsprechende Adenovirus in der entsprechenden MOI. Die Zellen werden für 1 bis 4 Stunden mit Infektionsmedium inkubiert und dann auf 200 μl Gesamtvolumen verdünnt und über Nacht kultiviert. Das Medium wird ersetzt durch DMEM/10% FBS/mCi ³H-Thymidin und für 18 bis 18 Stunden kultiviert. Die Stammlösungen von 100 μCi/ml ³H-Thymidin (Amersham) wird hergestellt durch Verdünnung in High-Glucose-DMEM (GIBCO). In jede Vertiefung wird ³H-Thymidin in einer Endkonzentration von 1 μCi/ml gegeben. Die Reaktion wird nach 15 Stunden durch Entfernung des Überstands von den Rezipientenzellen abgestoppt. Die Zellen werden durch Zugabe von 100 × Trypsin/EDTA (GIBCO) in jede Vertiefung für 15 Minuten bei 37°C geerntet. Zellen werden auf einem Filter im 96-Well-Format unter Verwendung eines Packard Filtermate Zellernters unter Befolgung des Herstellerprotokolls gesammelt und in entionisiertem Wasser und Methanol gewaschen. Die Filter werden getrocknet und in einem Matrix 9600 (Packard) analysiert, und die Zellproliferation wird unter Angabe von Virenpartikeln/Zelle gegen die Zählwerte für die Aufnahme von tritiummarkiertem Thymidin aufgetragen.
h. Alamarblau-Assay
Die Wachstumsinhibition der Zellen wird auch durch den Alamarblau-Assay gemessen. Kurz, Zellen werden bei einer Dichte von 10⁴ Zellen/Vertiefung im 96-Well-Platten-Format ausplattiert. Vier Tage nach der Infektion mit verschiedenen MOIs von Ad-mda7^TR oder Kontrollvektoren (wie zuvor beschrieben), werden 20 μl Alamarblau-Farbstoff zu jeder Vertiefung gegeben, und die Platte wird bei 37°C für 6–8 Stunden inkubiert. Die Platten werden dann zur Bestimmung der optischen Dichte auf dem Dynatech MRX-Plattenlesegerät bei einer Wellenlänge von 595 nm gelesen. Das Revelation 3.2 Softwareprogramm wird verwendet zum Auftragen der MOIs gegen die Werte für die optische Dichte bei 595 nm.
i. TUNEL-Assay
Krebszellen werden in Lab-Tek-Kammerobjektträgern (Nunc) in einer Dichte von 10⁴ Zellen/Kammer ausgesät. Die Zellen werden mit der gewünschten Konzentration von Ad-Vektoren transduziert. An verschiedenen Tagen nach der Infektion werden die Zellen unter Verwendung des chromogenen TUNEL-Peroxidase-Assays ("In Situ Death Detection Kit, POD", Boehringer Mannheim) nach der Anleitung des Herstellers bezüglich Apoptose analysiert.
j. Annexin-V-Assay
Krebszellen werden nach Ad-mda7^TR-Behandlung auch durch das "ApoAlert" Annexin-V-FITC-Kit (CLONTECH) bezüglich Apoptose analysiert. Nach Induktion von Apoptose in Zellen wird Phosphatidylserin (PS), das vorwiegend in der inneren Schicht der Plasmamembran lokalisiert ist, über einen Flippase-Mechanismus schnell in die äußere Schicht gebracht. In der Gegenwart von Ca²⁺ bindet Annexin-V PS mit hoher Affinität, und mit Hilfe von mit Annexin konjugiertem FITC lassen sich apoptotische Zellen genau erkennen, sowohl mittels Fluoreszenzmikroskopie als auch mittels FACS-Analyse.
k. DNA-Färbung mit Propidiumiodid (PI)
Zur Bestimmung von Zellen in verschiedenen Stadien des Zellzyklus, wird aus Ad-mda7^TR-infizierten Krebszellen eine Einzelzellsuspension von 1–2 × 10⁶ Zellen/ml PBS hergestellt. Nach der Fixierung der Zellen mit kaltem 70%igen Ethanol für 2 Stunden werden die Zellen zentrifugiert und das Fixiermittel abdekantiert, 2 × mit PBS gewaschen und anschließend mit Propidiumiodid-Arbeitslösung gefärbt, die PI zu 50 μg/ml und RNase zu 20 μg/ml in PBS enthält. Die behandelten Zellen werden dann durch FACS analysiert.
1. Tumorxenograft-Modelle
Tumorzellen werden in einer Dichte von ca. 20–40% Konfluenz in 150-mm²-Schalen in RPMI/10%-FBS-Medium, ergänzt mit Penicillin, Streptomycin und Fungizon, ausplattiert und in 5% CO₂ bei 37°C bis zu ca. 80%iger Konfluenz kultiviert. Die Zellen werden 2-mal in PBS gewaschen, trypsinisiert und gezählt. Die Zellen werden auf eine Konzentration von 5 × 10⁶ Zellen/100 μl PBS verdünnt. BALB/c-Nacktmäuse werden subkutan mit 5 × 10⁶ Tumorzellen in 100 μl PBS injiziert.
2. Adenovirus, welches das verkürzte humane MDA-7-Protein codiert (Ad-mda7^TF), produziert ein sekretiertes Protein
Grobe Zellfraktionierungsstudien werden durchgeführt, um zu zeigen, dass MDA-7^TF aus Zellen, die mit Ad-mda7^TF transduziert sind, sekretiert wird. MDA-7^TF bezeichnet speziell eine verkürzte Form des MDA-7-Proteins; sie umfasst die sekretierte Form von MDA-7. Zellen werden wie beschrieben ausplattiert und in DMEM/10% FBS in einem 5%-CO₂-Inkubator bei 37°C über Nacht kultiviert. Am nächsten Tag wird das Medium durch Absaugen entfernt und durch frisches Medium, das Ad-mda7^TF oder Ad-Kontrolle enthält, ersetzt. Das Medium wird nach 3 h Inkubation mit Adenovirus abgesaugt und durch frisches Medium ersetzt. Die Zellen werden in den 5%-CO₂-Inkubator zurückgestellt und über Nacht bei 37°C kultiviert. Zellen werden am nächsten Tag geerntet und das Medium wird durch Zentrifugation geerntet. Westernblot-Analyse zur Detektion des MDA-7-Proteins wird mit Zellextrakten und Gesamtmedium durchgeführt. Dieses Protokoll wurde mit Ad-mda7 verwendet, und auf dem Westernblot wurden unter Verwendung von anti-MDA-7-Antikörper zwei immunreaktive Banden detektiert. Die Banden wurden auf 23 kDa und 18 kDa geschätzt, was der unprozessierten und der prozessierten Form von MDA-7 entspricht (MDA-7 in voller Länge und die intrazellulär gespaltene Form von MDA-7).
3. MDA-7 wird mittels Konfokalmikroskopie in Vesikeln und auf der Zelloberfläche lokalisiert
Die Expression von MDA7 wurde auch durch FACS und Konfokalmikroskopie analysiert. Kurz, Krebszellen (H460, DLD-1, H1299) wurden mit Ad-mda7 transduziert, mit MOIs von 1000 und 5000 Vp/Zelle. 24 Stunden später wurden die Zellen mit PBS gewaschen und für 1 Stunde bei 4°C mit polyklonalem Anti-MDA-7-Kaninchenantikörper (1:5000 Verdünnung von 1 mg/ml affinitätsgereinigtem Antikörper bezogen von Corixa Inc.) markiert. Nach der ersten Behandlung folgten aufeinanderfolgende PBS-Waschgänge und die Behandlung mit Sekundärantikörper, Anti-Kaninchen-IgG-FITC (1:1000 Verdünnung, Santa Cruz Biotechnology), der mit den Zellen für 1 Stunde auf Eis inkubiert wurde. Die Zellen wurden gewaschen und mit 4% HCHO-PBS fixiert und mittels FACS und Konfokalmikroskopie analysiert.
4. Erhöhte Expression von MDA-7^TR in vitro induziert krebszellspezifischen Wachstumsarrest und Apoptose
Die Expression von MDA-7^TR hemmt das Wachstum und induziert Apoptose in Krebszelllinien aber nicht in normalen Zelllinien. Ad-mda7^TR wird wie zuvor beschrieben transduziert. Wachstumsinhibition wird durch ³H-Thymidineinbau- und Alamarblau-Assays bewertet. Mit MDA-7^TF behandelte Krebszellen zeigen verglichen mit normalen Zellen, die mit Ad-mda7^TF und Vektorkontrollen transduziert wurden, eine Verringerung in der Rate des ³H-Thymidineinbaus. Alamarblau-Assays zeigen eine verringerte optische Dichte in MDA7^TF-exprimierenden normalen Zellen und transduzierten Kontrollen verglichen mit MDA7^TF-exprimierenden Krebszellen. Diese Assays sind ein Zeichen dafür, dass MDA7^TF-Expression spezifisch in Krebszellen einen Wachstumsarrest induziert.
Zusätzlich wird das Ausmaß an Apoptose, unter Verwendung des TUNEL-Assays, anhand der Oberflächenexpression von Annexin-V und mittels Zellzyklusanalyse unter Verwendung der Propidiumiodid-Färbung bestimmt. Der TUNEL-Assay bestimmt die zelluläre Nukleaseaktivität. Aktivierte Nukleaseaktivität, ein Zeichen für Zellen, die Apoptose unterlaufen, erzeugt – im Vergleich mit der Hintergrundfärbung, die mit nichtapoptotischen Zellen assoziiert – ist eine intensive Farbreaktion. Krebszelllinien, die MDA-7^TF exprimieren, zeigen im Vergleich zu MDA-7^TF-exprimierenden normalen Zelllinien und mit Kontrollvektor transduzierten Zellen einen signifikanten Anstieg in der Anzahl TUNEL-positiver Zellen. Ein weiteres Maß für apoptotische Aktivität ist die Oberflächenexpression von Annexin-V, detektiert durch Oberflächenfärbung unter Verwendung eines Annexin-V-Antikörpers¹. Krebszelllinien, die MDA-7^TF exprimieren, zeigen verglichen mit MDA-7^TF-exprimierenden normalen Zelllinien und mit Kontrollvektor transduzierten Zellen einen signifikanten Anstieg in der Anzahl der Annexin-V-positiven Zellen, was verglichen mit normalen Zellen und kontrollbehandelten Krebszellen eine erhöhte Apoptoserate in den behandelten Krebszelllinien anzeigt.
5. Intratumorale Verabreichung von Ad-mda7^TF in subkutane H1299-Tumoren hemmt das Tumorwachstum
Zur intratumoralen Abgabe von Ad-mda7^TF werden 3–4 Wochen alte weibliche BALB/c-Nacktmäuse subkutan mit 5 × 10⁶ H1299-Zellen pro Tier injiziert. Tiere werden 5 Tage nach der H1299-Injektion durch intratumorale Injektion von 100 μl Ad-mda7^TF behandelt. Die Tumoren werden jeden zweiten Tag gemessen. Behandlungs-Gruppen sind 1) keine Behandlung, 2) intratumorale Injektion von Ad-mda7^TF jeden Tag über 6 Tage 3) intratumorale Injektion von Ad-Kontrolle jeden Tag über 6 Tage. Die Tumorgröße wird über 16 Tage jeden zweiten Tag gemessen. Ad-mda7^TF-DNA zeigt verglichen mit den nicht und den mit DNA allein behandelten Tumoren eine signifikante Hemmung des Tumorwachstums.
BEISPIEL 2: MATERIAL UND METHODEN
1. Zelllinien und Zellkultur
Alle verwendeten Tumorzelllinien wurden aus der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland) bezogen. Die bewerteten Zelllinien waren: Brust-(MCF-7, T47D, SKBr3, HBL-100, BT-20, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-361), kolorektale (DLD-1, SW-620, SW-480, HT-29, HCT-116, LS174T), Lungen-(H1299, H460, A549, H322, H358) und Osteosarkom-(SaosLM2)Krebszelllinien. Normale Zelllinien wurden bezogen von Clonetics (San Diego) und umfassten HUVEC (humane Nabelschnurendothelzellen), normale Melanozyten, und HMEC (humane Brustepithelzellen). MJ90 Primärfibroblasten (bezogen vom Baylor College of Medicine) wurden ebenfalls verwendet. Die Zellen wurden in DMEM-Medium (GIBCO/BRL Life Technologies, Grand Island, New York) und fötalem Rinderserum (zu 5%–10% Endkonzentration, nach Empfehlung des Händlers) kultiviert. Die Zellen waren frei von Mycoplasmen und wurden in der logarithmischen Wachstumsphase verwendet. Zellen wurden mit 0,125% Trypsin – 1,3 mM EDTA (GIBCO) geerntet.
2. Herstellung rekombinanter Adenoviren
Die Konstruktion von Ad-mda7 wurde unter Verwendung eines Konstrukts, bezogen von Dr. Paul Fisher (Columbia University, New York), begonnen, in dem die Mda-7-cDNA in einen TA-Klonierungsvektor (Invitrogen Inc., San Diego, Kalifornien) inseriert ist. Die Mda-7-cDNA, isoliert als ein HindIII-NotI-Fragment, wurde unter Verwendung der HindIII-NotI-Restriktionsstellen in einen Shuttle-Vektor (pIN147, bezogen von dem Labor von J.A. Roth, M.D., Anderson Cancer Center, Houston, Texas) kloniert. pIN147 ist ein Shuttle-Plasmid, das auf einem pBR322-Rückgrat basiert und die CMV-Promotor- und SV40-polyA-Elemente enthält, die ersatzweise in die E1-Region von Ad5 eingesetzt sind. pIN147 enthält Basen Nr. 1–456 von dem linken Ende von Ad5, die CMV-Expressionskassette und anschließend Ad5-Basen Nr. 3333-5789. Das pIN147-mda-7-cDNA-Expressionskonstrukt wurde pIN207 genannt. Ad-mda7 wurde durch Kotransfektion von 293-Zellen mit pIN207 und pIN153 konstruiert, unter Verwendung des Calciumphosphat-Kits und -protokolls, bereitgestellt durch GibcoBRL (Nr. 123, S. 44–46). pIN153 ist identisch mit JM17, bezogen von dem Labor von Graham, 1988 (A simple technique for the rescue of early region 1 mutations into infectious human adenovirus type 5, McGrory et al., 1988) und enthält den größten Teil des Ad5-Genoms; ihm fehlt aber das linke Ende. Nach Beobachten eines zytopathischen Effekts (CPE) wurden mit dem resultierenden Zelllysat, das den Vektor, Ad-mda7, enthielt, zwei aufeinanderfolgende Runden von Plaque-Reinigung unter Verwendung des folgenden Protokolls durchgeführt. Kurz, mit dem vektorenthaltenden Lysat wurde in Fünffach-Schritten eine Verdünnungsreihe in Medium (DMEM) angesetzt, und 400 μl von jeder Verdünnung wurden zur Infektion einer konfluenten Schicht von 293-Zellen, ausplattiert in 6-Well-Platten, verwendet. Die Vertiefungen wurden mit 1% Agar in Medium überschichtet und die resultierenden Plaques wurden eine Woche später gepickt. Jede von vier Plaques wurde in 500 μl Medium resuspendiert, auf dem Vortex verwirbelt und zentrifugiert, und der Überstand zur Infektion einer Vertiefung von konfluenten 293-Zellen, ausplattiert in 6-Well-Platten, verwendet. Wenn die Zellen aufgrund der Ad-Vektorreplikation lysiert waren, wurde DNA aus jeder vermehrten Primärplaque gereinigt, unter Verwendung des QIAmp-DNA-Reinigungs-Kits und -protokolls, bereitgestellt durch Qiagen, Inc. Die DNA wurde mittels PCR-Analyse untersucht, und eine Plaque wurde zur Sekundär-Plaque-Reinigung gepickt, die wie vorstehend beschrieben durchgeführt wurde. Plaques wurden isoliert und zur Infektion von 293-Zellen (wie vorstehend) in einer Vertiefung einer 6-Well-Platte verwendet; dieses Lysat wurde dann zur Infektion konfluenter 293-Zellen, ausplattiert in einer T-75-Flasche, verwendet.
Schließlich wurden ca. 50 × 10⁸ Zellen mit dem resultierenden Zelllysat infiziert. Lysat von dieser Probe wurde dann zur großtechnischen Amplifikation und Reinigung an die Herstellung übergeben. Ad-mda7 (Charge Nr. B2119901) und Ad-luc (Charge Nr. 00697004) wurden in den nachstehenden präklinischen Studien verwendet. Frühe Forschungsstudien verwendeten Ad-mda7-Vektor, bezogen von Dr. Paul Fisher, Columbia University. Der Fisher-Vektor verwendet einen ähnlichen Ad-Vektor der ersten Generation mit E1- und E3-Deletionen. Dieses Material wurde bei Introgen Therapeutics Inc. gereinigt und amplifiziert, und es wurde gezeigt, dass es bioäquivalent zu dem Introgen Ad-mda7 ist, der in allen nachfolgenden Experimenten verwendet wurde.
Ad-luc und Ad-CMVpA (Luciferase- bzw. leerer Vektor) wurden als Kontrollviren verwendet (1). Zur Herstellung von Ad-Vektoren wurden Ad5-Vektoren, welche die Genkassetten beherbergen, zur Wiederherstellung rekombinanter Ad-mda7, Ad-luc und Ad-CMVpA-Viren mit Plasmid pKM17 (Graham und Prevec, 1992) in 293-Zellen kotransfiziert. Plaques wurden gepickt, Virusstammkulturen angezogen, und die Korrektheit ihrer Genome wurde mittels PCR/Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung bestätigt. Viren wurden in 293-Zellen fortgepflanzt und durch HPLC gereinigt.
3. Polyklonale MDA-7-Antikörper und Westernblot-Analyse
Rekombinantes MDA-7-Protein wurde in E. coli hergestellt und wurde auf einer Nickel- NTA-Agarosesäule gereinigt. Das Material wurde in einem Batch-Verfahren für 45 Minuten an das Nickelharz gebunden und dann in eine Säule gegossen, und das Eluat wurde durch das Säulenbett laufen gelassen. Das Material wurde mit 10 mM Tris, pH 8,0, enthaltend 0,5% Chaps, gewaschen und schließlich mit 10 mM Tris pH 8,0 und 400 mM Imidazol von der Säule eluiert. Das eluierte MDA-7 wurde gegen 10 mM Tris, pH 8,0 dialysiert. Es wurde gezeigt, dass das Endprodukt eine einzige Bande mit einem Molekulargewicht von ca. 23 kDa war. Es wurde gezeigt, dass die Proteinsequenz des Aminoterminus korrekt war, und die Reinheit wurde auf über 90% geschätzt.
Dieses Material wurde unter Verwendung des folgenden Protokolls in Kaninchen injiziert: 400 μg MDA-7-Protein mit IFA und 100 μg MDP wurden subkutan injiziert, 3 Wochen später wurden 200 μg MDA-7-Protein mit IFA injiziert, und 3 Wochen danach wurden weitere 100 μg MDA-7-Protein intravenös injiziert. Es wurde gezeigt, dass der Titer des Antiserums, basierend auf einem ELISA-Assay, mehr als 1/100 000 betrug.
Das MDA-7-Protein wurde über Sulfhydrylverknüpfung an ein festes Trägerharz gekoppelt. Das Harz und das gebundene Protein wurden gründlich gewaschen. Das gewaschene Material wurde zur Herstellung einer MDA-7-Säule zur Antikörperaufreinigung verwendet. Die polyklonalen Kaninchenseren wurden 1:1 mit 20 mM Trispuffer, pH 8,0 verdünnt und durch einen 0,2-Mikrometerfilter filtriert, bevor sie auf die MDA-7-Säule gepumpt wurden. Die Säule wurde dann mit dem gleichen 20 mM Trispuffer, pH 8,0 gewaschen bis die Absorption auf Basisniveau zurückgegangen war. Der Antikörper wurde mit 0,1 M Essigsäure von der Säule eluiert. Das Eluat, das den Antikörper enthielt, wurde sofort wieder auf pH 8,0 eingestellt. Der affinitätsgereinigte Antikörper wurde dann gegen 10 mM Tris, pH 8,0 dialysiert und konzentriert.
Rekombinantes MDA-7-Protein wurde in E. coli exprimiert und unter Verwendung einer Nickel-NTA-Agarosesäule gereinigt. Das rekombinante MDA-7-Protein wurde zur Erzeugung polyklonaler Kaninchenantikörper verwendet, die durch Affinitätschromatographie gereinigt wurden. Dieser Antikörper wurde in Westernblot-Analysen in Konzentrationen im Bereich von 1:1000–1:10 000 Verdünnung (aus einer Stammlösung von 1 mg/ml) verwendet. Zelllysate (10⁵–10⁶ Zellen wurden in 500 μl Laemmli-Puffer mit 5% 2-Mercaptoethanol (2ME) suspendiert) oder Überstände (1:1 Gemisch mit Laemmli-Puffer + 2ME) wurden gewonnen, nachdem Krebszellen mit Ad-mda7 für die gewünschte Zeitdauer behandelt wurden, und gefolgt von SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Westernblot-Analyse unter Verwendung des Super-Signal-Substrats für Meerrettichperoxidase (Pierce Inc.). Weitere, monoklonale Antikörper, die bei dieser Untersuchung verwendet wurden, erkannten spezifisch Bax (Santa Cruz Biotechnology) und β-Actin (Sigma).
4. Transduktion und Zellproliferationsanalysen
Krebs- oder normale Zelllinien, die bei dieser Untersuchung verwendet wurden, wurden mit Ad-mda7 infiziert (unter Verwendung von Ad-CMVpA oder Ad-luc als Kontrollen), mit ansteigenden MOIs (0, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000 und 10 000 Virenpartikel (Vp)/Zelle). Zellen wurden entweder zu 500–2000 Zellen/Vertiefung im 96-Well-Format für den ³H-Thymidineinbau-Assay, oder zu 10⁵–10⁶ Zellen/Vertiefung im 6-Well-Plattenformat für Proteinexpressions- oder Apoptose-Assays ausplattiert, und zu 10⁴ Zellen/Vertiefung (96-Well-Format) für den Alamarblau-Assay ausplattiert. Zur Infektion wurden Ad-mda7 oder Ad-luc (oder Ad-CMVpA) in steigenden MOIs (basierend auf Virenpartikeln/Zelle; MOI lag im Bereich von 0–10 000 Vp/Zelle) verwendet. Für ³H-Thymidineinbau-, Apoptose-, Proteinexpressions- und Alamarblau-Assays wurden die Zellen 3 und 5 Tage nach der Infektion analysiert.
5. ³H-Thymidineinbau-Assay
Die Wachstumsinhibition von Zellen nach der Behandlung wurde hauptsächlich durch Analyse des Einbaus von ³H-Thymidin in replizierende DNA gemessen. Kurz, eine Stammlösung von 100 μCi/ml ³H-Thymidin (Amersham) wurde hergestellt durch Verdünnung in High-Glucose-DMEM (GIBCO). In jede Vertiefung wurde ³H-Thymidin in einer Endkonzentration von 1 μCi/ml gegeben. Die Reaktion wurde nach 15 Stunden durch Entfernung des Überstands von den Rezipientenzellen abgestoppt. Die Zellen wurden durch Zugabe von 100 × Trypsin/EDTA (GIBCO) in jede Vertiefung, für 15 Minuten bei 37°C, geerntet. Zellen wurden auf einem Filter unter Verwendung eines Packard Filtermate Zellernters unter Befolgung des Herstellerprotokolls gesammelt und in entionisiertem Wasser und Methanol gewaschen. Die Filter werden getrocknet und in einem Matrix 9600 (Packard) analysiert.
6. Alamarblau-Assay
Die Wachstumsinhibition von Zellen wurde auch unter Verwendung des Alamarblau-Assays gemessen. Zellen wurden in einer Dichte von 10⁴ Zellen/Vertiefung im 96-Well-Platten-Format ausplattiert. Vier Tage nach Infektion mit verschiedenen MOIs von Ad-mda7 oder Kontrollvektoren (wie zuvor erwähnt), wurden 20 μl Alamarblau-Farbstoff zu jeder Vertiefung gegeben, und die Platte wurde bei 37°C für 6–8 Stunden inkubiert.
Die Platten wurden dann weiterbearbeitet zur Absorptionsanalyse der optischen Dichte unter Verwendung des Dynatech MRX-Plattenlesegeräts bei dualer Wellenlänge von 595 nm und 600 nm. Zur Analyse der Daten wurde das Revelation 3.2 Softwareprogramm verwendet.
7. TUNEL-Assay
Krebszellen wurden in Lab-Tek-Kammerobjektträgern (Nunc) in einer Dichte von 10³–10⁴ Zellen/Kammer ausgesät. Zellen wurden mit der gewünschten Konzentration von Ad-Vektoren transduziert. An verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion wurden die Zellen unter Verwendung des chromogenen TUNEL-POD-Assays (Boehringer Mannheim) nach der Anleitung des Herstellers bezüglich Apoptoseinduktion analysiert. Zellen wurden 2–5 Tage nach der Infektion analysiert. Das Kit verwendet ein Desoxythymidintransferase (TdT)-Enzym zum Einbau von fluoresceingebundener Desoxythymidinmoleküle in fragmentierte DNA mit freien Hydroxylgruppen. Nach dem Waschen mit PBS wird Meerrettichperoxidase (PDO)-markierter Anti-Fluorescein-Antikörper als Sekundärreagenz verwendet, und die Proben werden zur Identifizierung TUNEL-positiver Zellen DAB ausgesetzt (dunkelbraune Färbung).
8. Annexin-V-Assay
Krebszellen wurden auch unter Verwendung des ApoAlert Annexin-V-FITC-Kits (CLONTECH) bezüglich Apoptose analysiert. Mit Ad-Vektor transduzierte Zellen (10⁵–10⁶ Zellen insgesamt) wurden ausgiebig in PBS gewaschen und anschließend für 30 Minuten auf Eis mit Annexin-V-FITC-Reagenz inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und zur FACS-Analyse und Fluoreszenzmikroskopie weiterbearbeitet.
9. Hoechst-Proteinfärbung
Hoechst-Farbstoff (33258) war ein Produkt von ICN-Biomedicals (Ohio, USA). Kurz, die Zellen in Kammer-Objektträgern wurden für 5 min fixiert (Methanol:Essigsäure = 3:1), und dann erneut für 10 min mit dem gleichen Fixiermittel fixiert. Sie wurden für 30 min luftgetrocknet und dann für 30 min in 1,0 ml Färbelösung gelegt (0,05 mg/ml Hoechst 33258 in 1 × PBS-Puffer), gefolgt von drei Mal Waschen (jeweils 1 min) mit destilliertem Wasser. Nach den Waschgängen wurden die Objektträger an der Luft getrocknet, und es wurden Photos unter einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen oder die Objektträger mittels Konfokalmikroskopie analysiert.
10. DNA-Färbung mit Propidiumiodid (PI)
Zellzyklus-Stadienbestimmung erfolgte durch die Bestimmung des DNA-Gehalts mittels PI-Färbung. Zur Identifizierung von Zellen in verschiedenen Stadien des Zellzyklus wurde aus vektorinfizierten Krebszellen eine Einzelzellsuspension von 1–2 × 10⁶ Zellen/ml PBS hergestellt. Nachdem die Zellen für 2 Stunden mit kaltem Ethanol fixiert worden waren, wurden die Zellen zentrifugiert, das Fixiermittel abdekantiert und Zellen 2 × mit PBS gewaschen und dann mit Propidiumiodid (PI) in einer Endkonzentration von 50 μg/ml und RNase zu 20 μg/ml in PBS gefärbt. Behandelte Zellen wurden dann mittels FACS-Analyse analysiert.
J. Oberflächenexpressionsanalysen
Krebszelllinien wurden mit steigenden MOIs (Multiplicities of Infection) von Ad-mda7 oder Ad-luc als Kontrolle behandelt. Kurz, 1 × 10⁶ Zellen (in einer 6-Well-Platte) wurden mit Ad-Vektoren infiziert, und 48 Stunden später wurden die Zellen mit 500 μl Versene abgetrennt. Die Zellen wurden 3 × mit PBS gewaschen (3 ml pro Waschgang) und bei 4°C für 2 h mit 500 μl des 1:2000 verdünnten affinitätsgereinigten Anti-mda7-Kaninchen-Antikörpers (Konzentration der Stammlösung 1 mg/ml) behandelt. Nach dieser Behandlung wurden die Zellen mit PBS (3 ×) gewaschen und mit 1:1000 verdünntem Anit-Kaninchen-IgG-FITC-Ziegenantiköper für 2 h bei 4°C behandelt. Zellen wurden gewaschen, unter Verwendung von 4% Formaldehyd in PBS fixiert und durch FACS-Analyse analysiert.
Für die in diesem Bericht beschriebenen Arbeiten am Konfokalmikroskop wurde die Zentrale Einrichtung für Fluoreszenzmikroskopie und Bildgebung des UC Health Science Centers verwendet. Die folgenden Systeme des Zentrums wurden verwendet: das Molecular Dynamics 2001 CSLM (Konfokales Laserrastermikroskop), das Applied Precision Deltavision Dekonvolutionsmikroskop, das Nikon 8000 RSCM (Echtzeit-Rasterkonfokalmikroskop) und das Wallac/Olympus Concord System (Echtzeit-Fluoreszenzbildgebungssystem).
Für die MDA-7-Proteinfärbung wurden Zellen mit Ad-mda7 (oder Ad-luc) mit einer MOI von 1000 Vp/Zelle infiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen 3 × mit PBS gewaschen (3 ml pro Waschgang) und bei 4°C für 2 h mit 500 μl des 1:2000 verdünnten affinitätsgereinigten Anti-mda7-Kaninchen-Antikörpers (Konzentration der Stammlösung 1 mg/ml) behandelt. Nach der Behandlung wurden die Zellen mit PBS gewaschen (3 ×) und mit 1:1000 verdünntem Rhodamin-Anti-Kaninchen-IgG-Ziegenantikörper behandelt. Die Zellen wurden außerdem mit Annexin-V und Hoechst-Farbstoff gefärbt. Zellen wurden nach der Färbung unter Verwendung von 4% Formaldehyd in PBS fixiert.
Zur Charakterisierung der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration wurden Ad-mda7-transduzierte Zellen im Dunkeln für 15 min bei 37°C mit der Calciumsonde FLUO3 in einer Endkonzentration von 2 μM (Minta et al. 1989, Molecular Probes, Eugene, Oregon) beladen, dann mit einem konfokalen Laserrastermikroskop von Molecular Dynamics bei einer Wellenlänge von 488 nm visualisiert. Flächeninhalt und Volumen der Zellen wurden unter Verwendung der Image Space Software (Molecular Dynamics, Sunnyvale, Kalifornien) bestimmt, im Anschluss an die Anfertigung von Stapeln optischer Schnitte der Zellen. Zur Visualisierung von Calciumwellen, die Ad-mda7-transduzierte Krebszellen durchlaufen, wurden Schnellscan-Bildaufnahmen gemacht, und diese Bilder wurden dann zusammengestellt und aneinandergereiht.
Der Mitochondrieninhalt wurde unter Verwendung ähnlicher Protokolle wie vorstehend (Ca² ⁺-Experimente) bestimmt, mit dem Unterschied, dass die verwendete Sonde MitoTrack (Molecular Probes) war. Die Beladungsparameter und Sondenkonzentration waren dieselben wie bei FLUO3, wobei die Scans bei einer eingestellten Wellenlänge von 595 nm durchgeführt wurden (Marin et al. 1996).
K. Glycosylierungsanalysen
Überstand wurde mit den folgenden drei Enzymen behandelt, entweder einzeln oder in verschiedenen Kombinationen. Die verwendeten Enzyme waren Sialidase (Neuraminidase), Endoglycosidase H und Endoglycosidase F (alle bezogen von Sigma). Die Pufferbedingungen waren 100 mM Tris, pH 8,2. Für jedes Mikrogramm des Gesamtproteingehalts des verwendeten Überstands wurden ca. 0,1 Einheiten Enzym/e verwendet. Die verwendeten Enzyme waren Sialidase (Neuraminidase), Endoglycosidase H und Endoglycosidase F (alle bezogen von Sigma). Die Pufferbedingungen waren 100 mM Tris, pH 8,2. Die Reaktion wurde für eine Stunde bei 37°C durchgeführt, und anschließend wurden die Proben auf einem SDS-PAGE laufen gelassen und mittels Westernblot unter Verwendung des spezifischen polyklonalen Anti-MDA-7-Kaninchenantikörpers analysiert.
BEISPIEL 3: AD-MDA7 TÖTET KREBSZELLEN UND INDUZIERT APOPTOSE
1. Brustkrebszellen

Eine Reihe von Brustkrebszelllinien (T47D, MCF-7, BT-20, MDA-MB-361, SKBr3, MDA-MB-231, MDA-MB-468) wurden mit Ad-mda7 (oder Ad-CMVpA oder Ad-luc als Kontrollvektoren) transduziert. Das Wachstum der Zelllinien wurde durch Ad-mda7-Transduktion stark gehemmt. Die beiden Zelllinien, welche die höchste Sensitivität gegenüber Ad-mda7 aufwiesen, waren T47D (p53 mutiert) und MCF-7 (p53 Wildtyp) (2A und 2B), wie durch den ³H-Thymidineinbauassay bestimmt wurde. Krebszellen wurden 3–6 Tage nach Ad-mda7-Transduktion analysiert. Siehe nachstehende Tabelle. TABELLE 7: Zusammenfassung der für Ad-mda7-Untersuchungen verwendeten Brustkrebszelllinien.

Zelllinie	Tumortyp	p53-Status	Quelle
Brustkrebs
(1) T47D	Carcinoma ductale	L194F	ATCC
(2) MCF-7	Karzinom	Wildtyp	ATCC
(3) MDA-MB-361	Adenokarzinom	Wildtyp	ATCC
(4) MDA-MB-231	Adenokarzinom	R280K	ATCC
(5) MDA-MB-468	Adenokarzinom	R273H	ATCC
(6) SKBr-3	Adenokarzinom	mutiert	ATCC
(7) BT-20	Karzinom	mutiert	ATCC
Normal
(1) MJ90	Fibroblasten	Wildtyp	Smith-Labor
(2) HUVECs	Endothel	Wildtyp	Clonetics
(3) HMECs	Brustepithel	Wildtyp	Clonetics

7 stellt das hohe Ausmaß an Apoptose dar (gemessen durch Annexin-V-Färbung), das in Brustkrebszelllinien durch Ad-mda7 induziert wurde. Annexin-V-Färbung identifiziert Zellen in frühen und mittleren Stadien der Apoptose, während der TUNEL-Assay DNA-Spaltprodukte detektiert, eines der Endstadien der Apoptose. TUNEL-Assays, durchgeführt mit MCF-7-Zellen, die mit Ad-mda7 infiziert waren, bestätigten, dass diese Zellen durch Apoptosesignalwege getötet werden. Die Kontrollvektoren Ad-CMVpA und Ad-luc waren bezüglich der Induktion von Apoptose unwirksam.

Die beiden Zelllinien, welche die höchste Sensitivität gegenüber Ad-mda7 aufwiesen, waren T47D (p53 mutiert) und MCF-7 (p53 Wildtyp) (2A und 2B). Die Ad-mda7-Konzentration, die zur Hemmung des Wachstums der T47D- oder MCF-7-Zellen um 50% (IC₅₀) benötigt wurde, betrug im Durchschnitt 500 bzw. 1500 Vp/Zelle (TABELLE 8). Ebenfalls in 3 enthalten (Schaubild A und B) sind repräsentative Experimente unter Verwendung von MDA-MB-361 und BT-20-Zellen. Diese beiden Zelllinien zeigten ebenfalls eine ausgeprägte Sensitivität gegenüber Ad-mda7-Infektion. Tabelle 8 fasst die Empfindlichkeit von Brustkrebszellen gegenüber Ad-mda7-Infektion (bestimmt durch einen Vergleich der IC₅₀-Werte für Ad-mda7- und Kontroll-Ad-Vektor) zusammen. Ebenfalls in der Tabelle enthalten sind die IC₅₀-Werte in normalen Zelllinien. Tabelle 8: Zusammenfassung von IC₅₀-Werten von Ad-mda7 in Brustkrebs- und normalen Zelllinien

Zelllinie	Tumortyp	IC₅₀-Bereich
		Ad-mda7	Kontrolle*
Brustkrebs
(1) T47D	Carcinoma ductale	150–500	> 10 000
(2) MCF-7	Karzinom	1200–4000	> 10 000
(3) MDA-MB-361	Adenokarzinom	~1500	> 10 000
(4) MDA-MB-231	Adenokarzinom	~3000	> 10 000
(5) MDA-MB-468	Adenokarzinom	> 10 000	> 10 000
(6) SKBr-3	Adenokarzinom	~5000	> 10 000
(7) BT-20	Karzinom	~2500	> 10 000
Normal
(1) MJ90	Fibroblasten	> 10 000	> 10 000
(2) HUVECs	Endothel	> 10 000	> 10 000
(3) HMECs	Brustepithel	> 10 000	> 10 000

* Die bei diesen Experimenten verwendeten Kontrollvektoren waren entweder Ad-CMVpA oder Ad-luc.

2. AD-MDA7 TÖTET LUNGENKREBSZELLEN UND INDUZIERT APOPTOSE
Sechs Lungenkrebszelllinien (H1299, H460, A549, H322, H358 und SaosLM2) wurden mit Ad-mda7 infiziert. Alle diese Zelllinien zeigten wirksame Abtötung durch Ad-mda7-Transduktion. Die H1299- und H322-Zelllinien waren gegenüber Abtötung durch Ad-mda7 am empfindlichsten (siehe 4A und B). Der IC₅₀ lag in diesen Zelllinien im Bereich von 600 Vp/Zelle bis 2000 Vp/Zelle, bestimmt durch ³H-Thymidineinbau-Assay.
3. AD-MDA7 TÖTET KOLOREKTALE KREBSZELLEN UND INDUZIERT APOPTOSE
Sechs kolorektale Krebszelllinien (DLD-1, SW-620, SW-480, HT-29, HCT-116, LS174T) wurden mit Ad-mda7 infiziert. Das Wachstum aller dieser Zelllinien wurde durch Ad-mda7-Transdution wirksam gehemmt, wobei SW620, DLD-1 und SW-480 die empfindlichsten waren. SW620-Zellen, die mit Ad-mda7 in verschiedenen MOIs behandelt wurden, sind in 5A gezeigt, während DLD-1-Zellen in 5B gezeigt sind. Bezüglich der Zellproliferation, bestimmt durch ³H-Thymidineinbau-Assay, wurde ein IC₅₀ beobachtet, der im Durchschnitt 1000 Vp/Zelle in den empfindlicheren Zelllinien betrug und bis zu 2000 Vp/Zelle in den anderen, weniger empfindlichen Zelllinien. Die DLD-1-Zelllinie wurde mit Ad-mda7 zu 1000 und 5000 Vp/Zelle infiziert, unter Verwendung von nichtinfizierten Zellen und Ad-luc als Kontrolle. Nach 48 Stunden wurden die transduzierten Zellen unter Verwendung von Annexin-V-Färbung in Verbindung mit FACS-Analyse bezüglich Apoptose analysiert. Weder die nichtinfizierten noch die Ad-luc-infizierten (5000 Vp/Zelle) Zellen zeigten Anzeichen von Apoptose, während Ad-mda7-infizierte Zellen bei 1000 Vp/Zelle ca. 26% apoptotische Zellen aufwiesen sowie 58% apoptotische Zellen bei 5000 Vp/Zelle (8).
4. AD-MDA7-INFEKTION IN NORMALEN ZELLEN
Drei normale humane Zelllinien (MJ90-Fibroblasten, HUVEC-Endothelzellen und humane Brustepithelzellen) zeigten keine Wachstumsinhibition bei Infektion mit Ad-mda7. Die Primärfibroblastenzelllinie MJ90 zeigte bei Behandlung mit Ad-mda7 bzw. Kontrollvektor Ad-luc überlappende Wachstumskurven (6A). HUVEC und humane Brustepithelzellen zeigten ähnliche Ergebnissen (6B).
5. PROTEINANALYSEN
Zelllysate, gewonnen aus Ad-mda7-transduzierten Krebszelllinien, wurden durch SDS-PAGE ihrer Größe nach fraktioniert, gefolgt von Westernblot-Analyse unter Verwendung eines Anti-MDA-7-Kaninchenantikörpers. Das Laufverhalten des MDA-7-Proteins war übereinstimmend mit einer Größe von ca. 23 kDa, allerdings wurde auch eine zusätzliche Bande bei 17 kDa beobachtet. Eine Westernblot-Analyse von H1299 (Lungenkrebs)- und DLD-1 (Kolorektalkrebs)-Zelllinien wurde nach Ad-mda7 und Ad-luc-Infektion durchgeführt. Zwei Banden, bei ca. 23 und 17 kDa, wurden beobachtet. Banden mit ähnlichem Molekulargewicht wurden auch in Brustkrebszelllinien beobachtet, die mit Ad-mda7 infiziert waren. Während der ersten 48 Stunden nach der Infektion war die 17-kDa-Bande die Hauptspezies, die in DLD-1-Zellen beobachtet wurde. 72 und 96 Stunden nach der Infektion nahm die Intensität der 23 kDa Bande mit der Zeit ab, und andere, kleinere Abbauprodukte wurden beobachtet. In H1299-Zellen hatten beide Banden eine ähnliche Intensität. Die Blots wurden auch auf β-Actin getestet und, 72 und 96 Stunden nach der Infektion, war Actin erheblich abgebaut (Daten nicht gezeigt), in Übereinstimmung mit dem schnellen apoptotischen Zelltod.
Wie bei diesen Proteinexpressionsuntersuchungen beobachtet, zeigten Lysate von Ad-mda7-infizierten Zellen eine 23-kDa/17-kDa-Dublette, was vermuten lässt, dass MDA-7 intrazellulär prozessiert wird. Frühere Untersuchungen von Su et al., 1998, wiesen darauf hin, dass in humanen Melanomzellen, die mit Interferon β und Mezerin induziert wurden, das 23-kDa-MDA-7-Protein aus dem Zytosol in den Zellkern transloziert. Auf der Basis von Primärproteinsequenzanalysen besitzt MDA-7 kein Konsensus-Kernlokalisationsmotiv, was darauf hindeuten könnte, dass das MDA-7-Protein mit einem zytoplasmatischen Chaperon (wie HMC) assoziiert (Jiang et al., 1995, 1996). Es wurde vorgeschlagen, dass diese Assoziation die Translokation von MDA-7 in den Zellkern erleichtern könnte.
6. APOPTOSE-UNTERSUCHUNGEN
Annexin-V-Färbung identifiziert Zellen in frühen und mittleren Stadien von Apoptose, während der TUNEL-Assay DNA-Spaltprodukte detektiert, eines der Endstadien von Apoptose. 7 stellt das hohe Ausmaß an Apoptose dar (gemessen durch Annexin-V-Färbung), das in Brustkrebszelllinien durch Ad-mda7 induziert wurde. TUNEL-Assays wurden mit MCF-7-Zellen, die infiziert mit Ad-mda7waren, durchgeführt, und somit wurde bestätigt, dass diese Zellen über Apoptosesignalwege getötet werden. Ad-CMVpA oder Ad-luc-Kontrollvektoren waren bezüglich der Induktion von Apoptose unwirksam.
Weitere Beispiele für Ad-mda7-induzierte Apoptose sind in den 10 und 11 gezeigt. Die DLD-1-Zelllinie wurde mit Ad-mda7 zu 1000 und 5000 Vp/Zelle infiziert, unter Verwendung von nichtinfizierten Zellen und Ad-luc als Kontrollen. 48 Stunden später wurden die transduzierten Zellen unter Verwendung von Annexin-V-Färbung in Verbindung mit FACS-Analyse bezüglich Apoptose analysiert (8). Weder die nichtinfizierten noch die Ad-luc-infizierten (5000 Vp/Zelle) Zellen zeigten Anzeichen von Apoptose, während Ad-mda7-infizierte Zellen bei 1000 Vp/Zelle ca. 26% apoptotische Zellen und 58% apoptotische Zellen bei 5000 Vp/Zelle aufwiesen. Ad-mda7 verursachte eine schnelle Induktion von Apoptose (9). Zwei Zelllinien, die nichtkleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC) bzw. kolorektalen Krebs repräsentieren, sind gezeigt. Ein erhebliches Ausmaß an Apoptose war schon 12 Stunden nach Infektion mit Ad-mda7 offensichtlich, und nahm über die nächsten Tage zu. Das Auftreten von Apoptose schon 12 Stunden nach der Infektion ist bemerkenswert, da immunreaktives MDA-7-Protein nach 12 Stunden gerade nachweisbar ist und Spitzenwerte im Allgemeinen nicht bis 24–48 h nach Infektion erreicht. Ad-p53 kann ebenfalls schnelle Induktion von Apoptose verursachen, andere Tumorsuppressoren jedoch, wie p16 oder PTEN verursachen Apoptose tendenziell erst 2–3 Tage nach Infektion mit dem Ad-Expressionsvektor.
7. AD-MDA7 ERHÖHT BAX-PROTEINKONZENTRATIONEN IN LUNGEN-, BRUST- UND KOLOREKTALEN KREBSLINIEN
Die Regulierung des programmierten Zelltods beruht auf der Wechselwirkung zwischen Signalwegen, die die Apoptose entweder begünstigen oder hemmen (Reed 1997; White 1996). Die Vertreter der bcl-2-Familie (bcl-2, bcl-w, bax, bad, bak, bcl-xs) spielen eine wichtige Rolle bei der apoptotischen Signalgebung (Sedlak et al., 1995; Reed et al., 1996). Bei der Verwendung der Westernblot-Analyse in Verbindung mit einem anti-bax-Antikörper wurde festgestellt, dass eine Ad-mda7-Infizierung das BAX-Protein in T47D-, DLD-1-, A549- und H460-Zellen induzierte. Die Westernblot-Analyse von Lysaten, die 24 Stunden nach Infizierung mit 30 bis 150 pfu/Zelle von Ad-mda7 hergestellt wurden, zeigte eine erhöhte Expression von BAX in sämtlichen getesteten Zelllinien. Zum Beispiel wurde die Induzierung von BAX in mit Ad-mda7 infizierten T47D-Krebszellinien durch Westernblot-Analyse beobachtet. Die Zellen wurden mit Ad-mda7 infiziert und auf die MDA7- und BAX-Proteinexpression analysiert. Ad-mda7 erhöhte die BAX-Expression in T47D, wie bei den anderen Zelllinien beobachtet wurde.
8. ENDOGENE EXPRESSION VON MDA-7 IN KREBS- UND NORMALZELLEN

Von den mehr als 50 Tumorzellinien, die auf endogene MDA-7-Proteinexpression untersucht wurden, waren nur zwei DLD-1 (kolorektal) und LnCap (Prostata) positiv. Es gibt laufende Untersuchungen zur Betrachtung von mda-7 mRNA bei den verschiedenen Krebslinien. Die Tabelle 9 ist eine Liste einiger der Krebslinien, die in den Ad-mda7-Untersuchungen verwendet wurden, und ihres endogenen MDA-7-Status. Zwischen der Anti-Tumoraktivität von Ad-mda7 und endogener MDA-7-Expression bestand auf der Basis der Westernblot-Analyse keine Korrelation (Tabelle 9).

TABELLE 9
Zelltyp	Endogenes MDA-7-Protein	Ad-mda7-Abtötung
(A) Normale Linien
(1) MJ90	--	--
(2) HUVEC	--	--
(3) HMEC	--	--
(B) Brustkrebslinien
(1) T47D	--	++++
(2) MCF-7	--	+++
(3) MDA-MB231	--	++
(4) MDA-MB468	--	++
(C) Lungenkrebslinien
(1) H1299	--	++++
(2) A549	--	++
(3) H460	--	++
(D) Kolorektal-Krebslinien
(1) DLD-1	++	+++
(2) SW620	--	+++
(3) HCT116	--	++
(4) HT29	--	++
(E) Prostatakrebslinien
(1) LnCap	++	+++
(2) Du 145	--	++

Anmerkung: -- bezeichnet nicht nachweisbares endogenes Protein/keine Reaktion auf Admda7-Infizierung; ++ bezeichnet Vorhandensein von endogenem mda7-Protein oder wirksame Reaktion auf Ad-mda7.

9. AD-MDA7 WIRKT UNABHÄNGIG VON ENDOGENEM P53-, RB-, RAS- UND P16-STATUS

Die Tabelle 10 stellt den Status von verschiedenen Tumorsuppressor/Onkogen/Zellzyklus-Regulatorgenen und ihre Reaktion auf Ad-mda7-Infizierung in verschiedenen Zelllinien dar, die bei dieser Untersuchung verwendet wurden. Die wachstumshemmende Wirkung von MDA-7 wurde bei einer breiten Vielfalt von Krebszellinien unabhängig von ihrem p53-, RB-, p16- und Ras-Status beobachtet. Obwohl die Bax-Expression von dem Wildtyp p53 (Han et al., 1996) positiv reguliert wird, scheint die Fähigkeit von MDA-7 zur BAX-Induzierung von p53 unabhängig zu sein, da die BAX-Induzierung bei der p53-Mutante (DLD-1, T47D) und dem p53-Wildtyp (H460) beobachtet wird. Es ist erwähnenswert, dass MDA-7 die Apoptose bei den MCF-7-Brustkrebszellen, denen Caspase 3 fehlt, eine der mehreren Caspasen, die bei den nachgelagerten apoptotischen Vorgängen involviert ist, wirksam induzieren konnte.

TABELLE 10
Zelltyp	Ad-mda7-Wirkung	p53	RB	ras	p16
(A) Normale Linien
(1) Melanozyten	NB	wt	wt	wt	wt
(2) MJ90 Fibroblasten	--	wt	wt	wt	wt
(3) HUVEC	--	wt	wt	wt	wt
(4) HMEC	--	wt	wt	wt	wt
(B) Krebslinien
(1) T47D	++++	mut	--	wt	--
(2) MCF-7	+++	wt	--	wt	--
(3) H1299	++++	null	wt	mut	--
(4) Saos-LM2	++	del	--	wt	del
(5) A549	++	wt	--	mut	--
(6) H460	++	wt	wt	mut	del
(7) SW620	+++	mut	--	mut	--
(8) HCT116	++	wt	--	mut	--
Anmerkung: NB, nicht bestimmt; mut, Mutante; del, Deletion; wt, Wildtyp

BEISPIEL 4: ZELLULÄRE LOKALISATIONSUNTERSUCHUNGEN FÜR MDA-7
1. OBERFLÄCHENEXPRESSIONSUNTERSUCHUNGEN
Die H460-NSCLC-Zelllinie wurde mit steigenden MOIs von Ad-mda7 oder Ad-luc als Kontrolle behandelt und 48 h später wurden die Zellen mit dem polyklonalen anti-MDA-7-Antikörper gefärbt und über FACS-Analyse analysiert (10). Ein hohes Ausmaß der Färbung wurde nur bei den mit Ad-mda7 behandelten Zellen beobachtet. Die Färbung war dosisabhängig und in etwa 50% der Zellen waren MDA-7 positiv bei 1000 Vp/Zelle. Dieses Ergebnis zeigte, dass die Ad-mda7-Behandlung von H460-Zellen zu hohen Niveaus von Proteinproduktion führte (bestätigt durch Westernblot-Analyse) und dass das Protein an der Zelloberfläche aufgetreten ist.
B. Konfokale Mikroskopieuntersuchungen
Zur Bestätigung und Ausweitung der in der 10 gezeigten Ergebnisse wurden konfokale Mikroskopieanalysen an verschiedenen Zelllinien (H460-, H1299-, T47D- und DLD-1-Zellen) durchgeführt, um die sub-zelluläre Verteilung des MDA-7-Proteins nach Ad-mda7-Behandlung zu bestimmen. Die Hintergrundfärbung in unbehandelten oder mit Ad-luc behandelten Zellen war gering und diffus. Es wird angenommen, dass der Hintergrund auftritt, da das anti-MDA-7-Reagenz ein polyklonales Antiserum ist. Allerdings wurde eine sehr spezifische Färbung beobachtet, wenn Zellen mit Ad-mda7 behandelt wurden. Bei niedrigen MOIs wurde eine ausgeprägte Membranfärbung mit punktierter Färbung in dem Zytoplasma beobachtet. Bei höheren MOIs wurden die punktierte Färbung und Membranfärbung reproduziert und intensiver. Das Muster der Färbung deutete auf ein sezerniertes Protein hin, wobei die punktierte Färbung Proteintransport und -freisetzung an der Plasmamembran verkörpert. Vergleichbare Beobachtungen wurden bei den anderen Zelllinien festgestellt.
Bei zusätzlichen konfokalen Mikroskopieexperimenten wurden Krebszellinien mit Ad-mda7 behandelt und auf Apoptose (Färbung mit Annexin V), DNA-Gehalt (Hoechst), Ca²⁺-Einstrom/Ausstrom (Fluo 3, Molecular Probes) und Mitochondrienintegrität (MitoTrack, Molecular Probes) analysiert. Die verwendeten Protokolle waren diejenigen, die sich bei der Confocal Microscope Facility, UTHSC, Houston, TX etabliert haben.
Konfokale Mikroskopieuntersuchungen von H460- und MCF-7-Zellen wurden durchgeführt. Sie zeigen eine Zusammensetzung von einzelnen Mikroskopiefeldern: (1) bedeutet Oberflächenexpression von MDA-7 (rote Oberfläche und punktierte Färbung), (2) zeigt in Apoptose befindliche Zelle (polarisierte grüne Färbung), (3) Hoechst-Färbung zur Identifizierung von Nuklei (blau) und (4) Zusammensetzung aus (1), (2) und (3).
Calcium- und Mitochondrien-Färbung wurden in mit Ad-mda7- oder Ad-luc-transduzierten Kontrollzellen durchgeführt. Die Zellen wurden auf Laminin-beschichteten Objektträger ausplattiert und mit FLUG-3 (für Ca²⁺) oder mit Mitotracker (für Mitochondrien) behandelt. Die mit Ad-luc behandelten Kontrollzellen zeigen einen gut verteilten intrazellulären Calciumgehalt (grüne Fluoreszenz) und zeigten gute Mitochondrienintegrität (rote Färbung). Jedoch sind bei der Ad-mda7-Behandlung die intrazellulären Ca²⁺-Konzentrationen gestört und die Mitochondrienintegrität ist zerstört.
BEISPIEL 5: SEZERNIERTES MDA-7 PROTEIN
1. Sezernierung von MDA-7
H1299-Zellen wurden mit Ad-mda7 (MOI von 1000 Vp/Zelle) für 6 Stunden infiziert, mit frischen Medien gewaschen und bei 37°C in frischen DMEM-Medien inkubiert. Vierundzwanzig Stunden später wurden das Zelllysat und die Zuchtmedien auf MDA-7-Proteinexpression unter Verwendung von Westernblotting analysiert. Mit Ad-mda7 transduzierte Zellen zeigten ein spezifisches Protein von 40 kD, das in Zuchtmedien erzeugt wurde, welches bei nicht transduzierten oder mit Ad-luc transduzierten Zellen, die nur Banden von 19 kD und 23 kD zeigten, nicht vorhanden war. Eine dosisabhängige Erhöhung bei dem intrazellulären MDA-7 und dem extrazellulären MDA-7-Protein wurde beobachtet. Als eine Kontrolle wurde der Blot in Platte B mit einem anti-Actin-Antikörper getestet. Gemäß der Vorhersage zeigten die Zelllysate ein Actin-Signal bei etwa 40 kD, wobei die Zellüberstände überhaupt kein Actin-Signal zeigten. Dies legt nahe, dass das in den Überständen beobachtete MDA-7-Proteinsignal wegen der aktiven Freisetzung/Sezernierung von MDA-7 und nicht wegen der Freisetzung aus absterbenden Zellen vorhanden ist.
2. Glycosylierung von sezerniertem MDA-7-Protein
Der Überstand von mit Ad-mda7 transduzierten H1299-Zellen war eine gute Bezugsquelle für das sezernierte MDA-7-Protein. Der Überstand wurde ferner auf Proteinglycosylierung untersucht. Der Überstand wurde mit den folgenden drei Enzymen behandelt, und zwar entweder einzeln oder in verschiedenen Kombinationen. Die verwendeten Enzyme waren Sialidase (Neuraminidase), Endoglycosidase-H und Endoglycosidase-F (alle wurden von Sigma bezogen). Die Proben wurden durch Westernblotting unter Verwendung des spezifischen polyklonalen anti-MDA-7-Antikörpers aus Kaninchen analysiert.
Die Behandlung mit Endoglycosidase legt nahe, dass lösliches MDA-7-Protein glycosyliert wird. Unter Verwendung von verschiedenen Glycosidasen, insbesondere Endo F, wird ferner eine niedermolekulare Bande beobachtet (die in etwa gleich groß ist wie die in Zelllysat beobachtete MDA-7-Proteinbande).
3. Hemmung der Glycosylierung und Sezernierung von MDA-7-Protein
Zwei Antibiotika, Tunicamycin und Brefeldin A, wurden zur Bereitstellung einer genaueren Charakterisierung der Sezernierung von löslichem MDA-7 verwendet. N-verknüpfte Glycosylierung spielt bei der endgültigen Prozessierung eines Proteins eine bedeutende Rolle, und zwar ob eine Zuordnung einem lysosomalen Weg oder die Translokation an die Zelloberfläche oder die Sezernierung erfolgt. Unter Verwendung von Tunicamycin kann der N-verknüpfte Glycosylierungsprozess im Golgi-Apparat gehemmt werden, womit die Proteinsezernierung gehemmt wird oder andere Zucker-abhängige Zuordnungsprozesse gehemmt werden. Brefeldin A ist ein Pilzmetabolit (macrocyclisches Lacton), der eine breite Vielfalt an antibiotischen Wirkungen aufweist. Brefeldin A hemmt reversibel die intrazelluläre Translokation von Proteinen (während des Transports von Protein zu der Zelloberfläche für die Sezernierung oder Expression). Sowohl Tunicamycin als auch Brefeldin A hemmen wirksam die Sezernierung von löslichem MDA-7-Protein. Daher scheint es, dass intrazelluläre Prozessierung und Glycosylierung zur MDA-7-Sezernierung erforderlich sind.
4. Sezerniertes MDA-7-Protein induziert Abtötung bei Krebszellen
Die sezernierte Form von MDA-7 (sMDA-7) wurde unter Verwendung von verschiedenen Zelllinien hergestellt und auf Anti-Tumoraktivität untersucht. Ein repräsentatives Beispiel ist in der 11 gezeigt. Lösliches MDA-7 wurde auf dessen antiproliferative Wirkung bei H1299-Zellen untersucht. Kurz gefasst wurden H1299-Zellen bei einer Zelldichte von 10³ Zellen/Kammer in Nunc Chamber Slides plattiert. 24 Stunden später wurden die Zellen mit Überständen behandelt, die von H1299-Zellen erhalten wurden, die entweder mit Ad-mda-7 oder Ad-luc (bei 1000 Vp/Zell-Infizierung) transduziert wurden. Ad-mda7- und Ad-luc-Viren wurden ferner als zusätzliche Kontrollen verwendet. Die löslichen Proteinüberstände (500 μl Gesamtvolumen, verschiedene Verdünnungen) wurden auf native H1299-Zellen aufgebracht und 24 Stunden später wurden zusätzliche 0,5 ml von 10% FBS in DMEM zugegeben. Nach 24 und 48 Stunden wurden die Zellen mikroskopisch auf ihre Lebensfähigkeit unter Verwendung der Trypanblau-AusschlussFärbung untersucht. Das lösliche MDA-7-Protein zeigte die Abtötung von H1299 nach 48 Stunden; jedoch hatten Ad-luc-Überstände eine geringe Wirkung (11A).
Verschiedene Verdünnungen von löslichem MDA-7-Überstand wurden ebenfalls auf H1299-Abtötung unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlusstests untersucht. Eine Konzentrations-abhängige Bystander-Abtötungswirkung von löslichem MDA-7 wurde beobachtet (11B).
BEISPIEL 6: KOMBINATIONSUNTERSUCHUNGEN VON AD-MDA-7 IN BRUSTKREBSLINIEN
1. Kombination mit Tamoxifen
Ad-mda7 wurde mit Tamoxifen kombiniert und auf die Anti-Tumorwirkungen bei Brustkrebs-Zelllinien (12) untersucht. Die Graphen zeigen, dass die Kombination dieser beiden Wirkstoffe eine ausgezeichnete Anti-Tumoraktivität im Vergleich zu einem der beiden Wirkstoffe alleine bereitstellt. Die Wirkung von Tamoxifen auf T47D-Zellen (12A) und auf MCF-7-Zellen (12B) ist gezeigt. Die Zellen wurden plattiert und vier Tage nach der Behandlung wurde ein Tritium-markierter Thymidintest zur Messung der DNA-Replikation durchgeführt. Die Zellen wurden mit 0/0 (kein Wirkstoff und kein Vektor) oder variierenden Dosen von Tamoxifen oder Vektoren (Ad-luc oder Ad-mda7) behandelt. Bei T47D-Zellen hatte Tamoxifen oder Ad-mda7 eine minimale Wirkung auf die DNA-Replikation. Wenn jedoch das Tamoxifen und Ad-mda7 kombiniert wurden, wurde eine supra-additive Wirkung beobachtet. Bei MCF-7-Zellen hatte Tamoxifen eine geringe Wirkung bei einer Dosis von 1 ng/ml. Ad-mda7 verringerte das Signal im Vergleich zu Ad-luc. Wenn jedoch Tamoxifen mit Ad-mda7 kombiniert wurde, wurde eine supra-additive Wirkung beobachtet, was wiederum die verbesserten Wirkungen der Kombination eines Chemotherapeutikums mit Ad-mda7 zeigte.
2. Kombination mit Adriamycin
Ad-mda7 wurde mit Adriamycin kombiniert und auf die Anti-Tumorwirkungen bei Brustkrebs-Zelllinien (13) untersucht. Die Graphen zeigen, dass die Kombination dieser beiden Wirkstoffe eine ausgezeichnete Anti-Tumoraktivität im Vergleich zu einem der beiden Wirkstoffe alleine bereitstellt.
BEISPIEL 7: AKTIVIERUNG DER CASPASE-KASKADE DURCH AD-MDA7
1. Materialien und Verfahren
a. Zellkultur
Humane nicht-kleinzellige Lungenkarzinomzellen A549, H460, H1299, humane Prostatakrebszellen DU145 und humane Brustkrebszellen MCF-7 wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, MD) bezogen. Sämtliche Zellen wurden in DMEM-Medium, enthaltend 10% fötales Kälberserum, Antibiotika und L-Glutamin, gehalten. Normale humane bronchiale Epithelzellen (NHBE-Zellen) wurden von Clonetics Inc (Clonetics Inc., Walkersville, MD) bezogen und gemäß den Anweisungen des Herstellers gehalten.
Es wurde sicher gestellt, dass die Zellen frei von Mycoplasma waren und in der log-Phase des Wachstums verwendet wurden. Die Zellen wurden routinemäßig mit 0,125% Trypsin – 1,3 mM EDTA (GIBCO) geerntet.
b. Konstruktion des rekombinanten adenoviralen Vektors
Dasselbe wie vorstehend beschrieben.
c. Bestimmung der Zellwachstumsrate
Krebs- oder normale Zelllinien, die in dieser Untersuchung verwendet wurden, wurden in 12-Lochplatten mit 2 × 10⁴ Zellen in jeder Vertiefung plattiert. Die Zellen wurden mit Ad-mda7, mit Ad-luc-Kontrollen (5000 Viren/Zelle) oder mit PBS als eine zusätzliche Kontrolle infiziert. Die Zellen wurden durch Trypsinisierung geerntet, mit Trypanblau (GIBCO) verdünnt und die Zahlen der lebensfähigen Zellen wurden auf einem Hämozytometer gezählt. Außerdem wurde die Hemmung des Zellwachstums mit dem XTT-Test gemäß den Richtlinien des Herstellers (Cell Proliferation Detection Kit II, Roche) oder mit dem H³-Thymidintest getestet.
d. Zellzyklusanalyse
Eine fluoreszenzaktivierte Zellsorteranalyse wurde wie folgt durchgeführt: die Zellen (5 × 10⁵//Platte) wurden auf Platten von 10 cm angesetzt und mit PBS, Ad-mda7 oder Ad-Luc bei 5000 Vp/Zelle infiziert. Die Zellen wurden durch Trypsinisierung zu festgelegten Zeiten (24, 48, 72 h nach Infizierung) geerntet und zweimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit 70% Ethanol fixiert, zweimal mit PBS gewaschen und mit 500 μl PI-Lösung (5 μg/ml PI und 10 μg/ml RNase) resuspendiert. Die Zellen wurden unter Verwendung eines FASCscan-Analysegeräts analysiert.
e. Nachweis der Apoptose
Tumorzellen wurden in Chamber Slides (Falcon) bei einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen/Kammer angesetzt. Die Zellen wurden mit Ad-mda7- oder Ad-Luc-Vektoren transduziert. An verschiedenen Tagen nach der Infizierung wurden die Zellen auf Apoptose durch Hoechst-33342-Färbung (Boehringer Mannheim) und TUNEL-Färbung (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated Biotinylated UTP Nick End Labeling) mit Terminal Transferase (Boehringer Mannheim) analysiert.
f. Immunhistochemische Färbung
Die immunhistochemische Färbung wurde bei Virus-infizierten Zellen zur Bestimmung der MDA-7-Proteinexpression durchgeführt. Kurz gefasst wurden Zellen (141299, A549, 14460 und NHBE) bei einer Dichte von 1 × 10⁵ in Chamber Slides (Falcon) plattiert und mit Ad-mda7 oder Ad-Luc (5000 Viren/Zelle) infiziert. 48 h später wurden die Zellen mit PBS gewaschen und in 4% Formalin-Lösung für 2 Minuten fixiert. Nach Blockierung der endogenen Peroxidaseaktivität mit 0,3% H₂O₂ in Methanol für 30 Minuten wurden die Zellen mit normalem Ziegenserum für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Slides mit polyklonalem anti-MDA-7-Antikörper aus Kaninchen (1:5000 Verdünnung) für 60 Minuten behandelt. Nach 30 Minuten Inkubation mit sekundärem anti-Kaninchen-Antikörper (geliefert mit ABC Kit, Vector) wurde die Expression von MDA-7 in Zellen mit DAB durch Verstärkung mit Avidin-Biotin-Reaktion ABC Kit detektiert. Die Slides wurden mit Hämatoxylin kontrastgefärbt und dann mit Aqua-mount (Lemer Labs, Pittsburgh, PA) befestigt. Die negativen Kontrollen schlossen nicht infizierte Zellen ein, die sämtlichen Färbungsverfahren unterzogen wurden (?).
g. Westernblot-Analyse
Die Zellen wurden durch Trypsinisierung geerntet, mit PBS gewaschen und in 100 μl Lysepuffer (62,5 mM Tris-HCl, 2% SDS, 10% Glycerol, 4 M Harnstoff) resuspendiert. Die Zellextrakte wurden mit Sonikator für 30 s homogenisiert und nach einer Stunde Inkubation auf Eis wurden die Zellextrakte für 5 min bei 14000 Upm bei 4°C geschleudert. Die Zellextrakte wurden gesammelt und bei –70°C gelagert. Die Proteinkonzentrationen von sämtlichen Extrakten wurden unter Verwendung des Bio-Rad Kits zur Proteinbestimmung (Bio-Rad) bestimmt. Jeweils 50 μg Proteinproben wurden auf 20 μl mit Lysepuffer und 5% 2-Mercaptoethanol (Bio-Rad) verdünnt und in einem Wasserbad bei 95°C für 5 min erwärmt. Dann wurden die Proteinextrakte auf einem 10% SDS-PAGE-Gel in einer Gelelektrophoresezelle (Bio-Rad) mit senkrechter Platte aufgetrennt. Die Proteine wurden von dem Gel auf Nitrozellulosemembran (Hybond-ECL Membrane, Amersham International, Little Chalfont, England) überführt. Die Proteine wurden in einer Blockierlösung (5% Trockenmilch und 0,3% Tween 20 in PBS) für eine Stunde bei Raumtemperatur geblockt.
Die Membranen wurden mit primärem Antikörper und dann mit Meerretich-Peroxidasemarkierten sekundären Antikörpern inkubiert, worauf der Einsatz des Enhanced Chemiluminescence Western Blotting Detection System (Amersham) für 30 Sekunden gefolgt ist. Die Proteine wurden auf mit Amersham Hyperfilm verstärktem Chemolumineszenzfilm unter Verwendung einer zwischen 30 Sekunden bis 30 Minuten variierenden Expositionszeit sichtbar gemacht.
2. Hemmung der Zellproliferation durch Überexpression von MDA-7
Zur Erfassung der MDA-7-Expression in Zellen wurden A549-, H1299-, H460- und NHBE-Zellen mit 5000 Vp/Zelle Ad-mda7 infiziert. Achtundvierzig Stunden später wurden die Zellen fixiert und mit anti-MDA-7-Antikörper gefärbt. Nicht infizierte Zellen wurden mit dem gleichen Antikörper als Kontrollen gefärbt. Ein hohes Niveau der MDA-7-Expression wurde im Zytoplasma von Zellen beobachtet, während in nicht infizierten Kontrollen keine gefärbten Zellen zu sehen waren (14).
A549-, H1299-, H460- und NHBE-Zellen wurden in 12-Lochplatten vorgelegt und mit Ad-mda7, Ad-Luc oder PBS behandelt. Die Zahlen der lebensfähigen Zellen wurden von Tag 1 bis Tag 5 nach der Behandlung gezählt. Die Infektion mit Ad-mda7 unterdrückte signifikant die Zellproliferation in sämtlichen Tumorzellinien im Vergleich zu den PBS- oder Ad-Luc-Kontrollen (23).
Die Zellzyklusanalyse unter Verwendung der PI-Färbung zeigte eine G2/M-Zellzyklusarretierung in Ad-mda7-infizierten A549- und H1299-Zellen. Im Gegensatz dazu beeinflusste die PBS- und Ad-Luc-Infektion den Zellzyklus nicht (14).
Im Anschluss an die Ad-mda7-Infektion wurden morphologische Veränderungen bei Tumorzellen beobachtet. Diese Veränderungen, wie Abflachung und Vergrößerung, wurden bei sämtlichen infizierten Zelllinien beobachtet. Apoptotische morphologische Veränderungen wurden unter Verwendung von Hoechst 33342 sichtbar gemacht. 72 Stunden nach der Infektion mit Ad-mda7 oder Ad-Luc wurden nukleare Verdichtung und Fragmentierung bei Ad-mda7-infizierten A549-, H1299- und H460-Zellen beobachtet, während apoptotische Änderungen bei NHBE-Zellen nicht zu sehen waren. Die TUNEL- Färbung zeigte viele positive Zellen bei Ad-mda7-infizierten A549-Zellen, während sehr wenig positive Zellen bei NHBE-Zellen zu sehen waren. TUNEL-positive Zellen waren ebenfalls sehr selten bei den mit Ad-luc behandelten Proben.
Diese Ergebnisse zeigten die signifikante Unterdrückung der Zellproliferation mit gleichzeitiger G2/M-Zellzyklusarretierung und Induzierung von Apoptose bei Lungenkrebs-Zelllinien. Im Gegensatz dazu führte bei NHBE-Zellen die Überexpression von MDA-7 zu einer minimalen Unterdrückung der Zellproliferation, induzierte jedoch keine Apoptose.
3. Hufregulation von p53 und Bax in Zellen mit Wildtyp p53
Die Zellen wurden mit Ad-mda7 und Ad-Luc infiziert und die Zellextrakte wurden bei 24, 48 und 72 Stunden nach Infektion für die Westernblot-Analyse geerntet. Die Zellextrakte aus unbehandelten Zellen wurden als eine Kontrolle geerntet. Die MDA-7-Proteinexpression wurde bei sämtlichen der Ad-mda7-infizierten Krebszellinien festgestellt. Unbehandelte Kontrollen und Ad-Luc-infizierte Zellen zeigten überhaupt keine Expression von MDA-7-Protein. Die Hochregulierung von p53-Protein war bei A549- und H460-Zellen mit p53-Wildtyp nach Ad-mda7-Infektion zu sehen. Erwartungsgemäß war keine Expression oder Modulation von p53 in p53-deletierten H1299-Zellen zu sehen. Ein Anstieg der BAX-Proteinkonzentrationen wurde bei A549- und H460-Zellen (p53-Wildtyp) gezeigt, während keine Veränderung bei H1299-(p53-Null)Zellen beobachtet wurde. Das Expressionsniveau von Bcl-2 war bei sämtlichen der drei untersuchten Zelllinien unverändert. Bei der Bax-defizienten humanen Prostatakrebs-Zelllinie DU145 waren die p53-Expressionsniveaus unverändert und BAX wurde nicht nachgewiesen. Jedoch sprachen DU-145-Zellen auf die Ad-mda7-Infektion an und zeigten Wachstumsarretierung und Apoptose. p53 und bax werden von Ad-mda7 in p53-Wildtyp-Tumorzellen aufreguliert. Außerdem werden die Caspasen 3 und 9 und PARP durch Ad-mda7 aktiviert. Normale Zellen zeigen keine Änderungen bei apoptotischen Mediatoren.
4. Aktivierung der Caspase-Kaskade und Spaltung von PARP
Westernblots zeigten die Aktivierung der Caspase-Kaskade durch Ad-mda7-Infektion (14B). Die Vorformen Caspase-9 und Caspase-3 wurden gespalten und in die aktivierten/ gespaltenen Formen 48 h nach Ad-mda7-Infektion in A549- und H460-Zellen und nach 72 h in H1299-Zellen überführt. Die Spaltung von Caspase-8 wurde nach 48 h der Ad-mda7-Infektion in A549- und H460-Zellen gezeigt. Poly-(ADP-Ribose)Polymerase (PARP) wurde in A549- und H460-Zellen nach 48 h in H1299-Zellen gespalten. In Bax-defizienten DU 145-Zellen wurden Caspase-9 und Caspase-3 nach 72 h der Ad-mda7-Infektion gespalten.
BEISPIEL 8: IN VIVO WIRKUNGEN VON AD-MDA7
1. Materialien und Verfahren
A. Zellkultur
Humane nicht-kleinzellige Lungenkarzinomzellen A549 und H1299 wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, MD) bezogen. Sämtliche Zellen wurden in RPMI1640-Medium, enthaltend 10% fötales Kälberserum, Antibiotika und L-Glutamin, gehalten. Vor dem Beginn der Experimente wurde sicher gestellt, dass die Zellen frei von Mycoplasma waren und in der log-Phase des Wachstums verwendet wurden. Die Zellen wurden routinemäßig mit 0,125% Trypsin – 1,3 mM EDTA (GIBCO) geerntet.
B. Konstruktion des rekombinanten adenoviralen Vektors
Replikations-defiziente humane Typ 5 adenovirale Vektoren (Ad5), die die mda-7- oder Luc-Gene trugen, die mit einem internen CMV-IE-Promotor verknüpft waren, der von einem SV40-Polyadenylierungs-(PA)-Signal gefolgt wurde, wurden konstruiert und werden als Ad-mda7 bzw. Ad-luc bezeichnet. Die Viren wurden in 293-Zellen propagiert und durch Chromatographie gereinigt.
C. Färbung apoptotischer Zellen
Die Abschnitte wurden auf apoptotischen Zelltod unter Verwendung des Kits Terminal Deoxynucleotide Transferase (Tdt) (Boehringer Mannheim) gefärbt und mit Methylenblau oder Methylengrün, wie beschrieben (Fujiwara et al., 1994), kontrastgefärbt.
D. Westernblot-Analyse
Das Westernblotting wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die Zellen wurden durch Trypsinisierung geerntet, mit PBS gewaschen und in 100 μl Lysepuffer (62,5 mM Tris-HCl, 2% SDS, 10% Glycerol, 4 M Harnstoff) resuspendiert. Die Zellextrakte wurden mit Sonikator für 30 s homogenisiert und nach einer Stunde Inkubation auf Eis wurden die Zellextrakte für 5 min bei 14000 Upm bei 4°C geschleudert. Die Zellextrakte wurden gesammelt und bei –70°C gelagert. Die Proteinkonzentrationen von sämtlichen Extrakten wurden unter Verwendung des Bio-Rad Kits zur Proteinbestimmung (Bio-Rad) bestimmt. Jeweils 50 μg Proteinproben wurden auf 20 μl mit Lysepuffer und 5% 2-Mercaptoethanol (Bio-Rad) verdünnt und in einem Wasserbad bei 95°C für 5 min erwärmt. Dann wurden die Proteinextrakte auf einem 10% SDS-PAGE-Gel in einer Gelelektrophoresezelle (Bio-Rad) mit doppelter senkrechter Platte aufgetrennt.
Die Proteine wurden von dem Gel auf Nitrozellulosemembran (Hybond-ECL Membrane) überführt. Die Proteine wurden in einer Blockierlösung (5% Trockenmilch und 0,3% Tween 20 in PBS) für 1 Stunde bei Raumtemperatur geblockt. Dann wurden die Membrane mit primärem Antikörper inkubiert. Meerretichperoxidase-markierte sekundäre Antikörper wurden verwendet und das Enhanced Chemiluminescence Western Blotting Detection System (Amersham) wurde für 30 Sekunden eingesetzt und die Proteine wurden danach auf mit Amersham Hyperfilm verstärktem Chemolumineszenzfilm unter Verwendung einer von 30 s bis 30 min variierenden Expositionszeit sichtbar gemacht.
E. Evaluierung von Tumorwachstum und Behandlungen in vivo
Vor dem Beginn sämtlicher Experimente, die subkutanes Tumorwachstum und Behandlungen enthielten, wurden nu/nu Mäuse unter Verwendung einer Cäsiumquelle zur Verbesserung der Tumoraufnahme bestrahlt (3,5 Gy). Bei sämtlichen Experimenten wurden 5 × 10⁶ Tumorzellen (H1299, A549), suspendiert in 100 μl steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), in die rechte dorsale Seite injiziert. Bei Erreichen des Tumors einer Größe von 50–100 mm³ wurden die Tiere in drei Gruppen (n = 8 Tiere/Gruppe) randomisiert und die Behandlung wie folgt gestartet. Die Gruppe 1 erhielt keine Behandlung, die Gruppe 2 erhielt Ad-Luc (5 × 10⁹ Vp/Dosis) und die Gruppe 3 erhielt Ad-mda-7 (5 × 10⁹ Vp/Dosis) jeden zweiten Tag für insgesamt drei Dosen. Intratumorale Injektionen wurden bei Betäubung unter Verwendung von Methoxyfluran (Schering Plough, Kenilworth, NJ) gemäß den institutionellen Richtlinien durchgeführt. Tumormessungen wurden an jedem anderen Tag ohne Kenntnis der Behandlungsgruppe aufgezeichnet und das Volumen wurde unter Verwendung der Formel V (mm³) = a × b²/2 berechnet, worin "a" die größte Abmessung ist und "b" der senkrechte Durchmesser ist. Die Daten der Antitumorwirksamkeit sind als kumulative Tumorvolumina für sämtliche Tiere in jeder Gruppe dargestellt, um sowohl Größe als auch Anzahl der Tumore zu berücksichtigen.
F. Immunhistochemische Analyse
Die in Nacktmäusen subkutan erzeugten Tumore wurden entnommen und in 10% gepuffertem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und als Schnitte mit einer Dicke von 4 μm geschnitten. Die Schnitte wurden auf mda-7-Genexpression gefärbt. Kurz gefasst wurden die Gewebeschnitte mit 0,3% H₂O₂ in Methanol für 30 Minuten zur Blockierung der endogenen Peroxidaseaktivität behandelt und danach mit normalem Ziegenserum für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Slides mit polyklonalem anti-MDA-7-Antikörper aus Kaninchen (1:5000 Verdünnung) für 60 Minuten behandelt. Nach 30 Minuten Inkubation mit sekundärem anti-Kaninchen-Antikörper (geliefert mit ABC Kit, Vector) wurde die Proteinexpression von MDA-7 in Gewebe mit DAB durch Verstärkung mit Avidin-Biotin-Reaktion ABC Kit detektiert. Die Slides wurden mit Hämatoxylin kontrastgefärbt und dann mit Aqua-mount (Lemer Labs, Pittsburgh, PA) befestigt. Die Anzahl der auf MDA-7 positiv gefärbten Tumorzellen wurde unter einem Hellfeld-Mikroskop analysiert und unter Verwendung von Bildanalyse und Statpro Software blind quantifiziert. Insgesamt wurden mindestens fünf Felder pro Probe analysiert.
G. TUNEL-Färbung
Die aus subkutanen Tumoren erhaltenen Gewebeschnitte wurden auf apoptotischen Zelltod unter Verwendung des Terminal Deoxynucleotide Transferase Kits (Tdt) (Boehringer Mannheim) gefärbt. Bei sämtlichen Färbungsverfahren wurden entsprechende negative Kontrollen eingeschlossen. Die Anzahl der auf TUNEL positiv gefärbten Tumorzellen wurde unter einem Hellfeld-Mikroskop analysiert und unter Verwendung von Bildanalyse und Statpro Software blind quantifiziert. Insgesamt wurden mindestens fünf Felder pro Probe analysiert.
H. Statistische Auswertung
Die statistische Signifikanz der experimentellen Ergebnisse wurde unter Verwendung des t-Tests nach Student für Tumormessungen berechnet.
2. In vivo Unterdrückung von örtlichem Tumorwachstum durch Ad-mda7
Die therapeutische Wirkung des mda-7-Gens auf subkutane H1299- und A549-Tumore wurde bei Nacktmäusen untersucht. Mäuse, die beide Tumorzelltypen (H1299 und A549) trugen, wurden in drei Gruppen aufgeteilt, wobei eine keine Behandlung, eine Behandlung mit Ad-Luc und eine Behandlung mit dem Ad-mda-7 täglich für insgesamt drei Dosen (5 × 10⁹ Viren/Dosis) erhielt. Eine signifikante Wachstumsinhibition von H1299-Tumoren und A540-Tumoren wurde bei Mäusen, die mit dem Ad-mda-7 behandelt wurden, im Vergleich zu den Tumorwachstum in den beiden Kontrollgruppen für jeden Tumortyp beobachtet.
Ein weiterer Beleg dafür, dass die beobachtete therapeutische Wirkung durch die mda-7-Genexpression bedingt war, wurde durch Entfernen von subkutanen Tumoren 48 Stunden nach Injektion und ihre Analyse mittels Immunhistochemie erhalten. Die mda-7-Genexpression wurde in Tumorzellen bei Tieren, die das Ad-mda7 erhielten, im Vergleich zu keiner positiven Färbung in Kontrolltumoren, die entweder nicht behandelt oder mit Ad-Luc behandelt waren, beobachtet.
Die MDA-7-Genexpression in situ führt zu apoptotischem Zelltod durch Aktivierung von Caspase-3 und Apo2/TRAIL. Zum Verständnis des Mechanismus der von mda-7 vermittelten Tumorhemmung wurden subkutane Tumore, die 48 Stunden nach der letzten Behandlung entnommen wurden, auf apoptotischen Tumorzelltod durch TUNEL-Färbung analysiert. Tumore aus Kontrollmäusen, die entweder unbehandelt oder mit Ad-Luc behandelt waren, zeigten einen minimalen apoptotischen Zelltod während Tumore aus Tieren, die mit Ad-mda-7 behandelt waren, eine weitgehende Apoptose zeigten.
Da Apoptose durch die Aktivierung von Caspasen vermittelt wird, wurden Tumorgewebe auf Caspase-3, eine nachgeschaltete Caspase, untersucht. Die aktivierte Form von Caspase-3 wurde in Geweben beobachtet, die mit Ad-mda-7 behandelt waren, während keine Aktivierung von Caspase-3 in den Geweben aus Kontrollmäusen beobachtet wurde. Ebenso wurde die Aktivierung von Apo2/TRAIL in mda-7 exprimierenden Tumoren beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde die TRAIL-Expression in Tumoren, die nicht behandelt oder mit Ad-luc behandelt waren, nicht beobachtet.
3. Ergebnisse der MDA-7-Expression bei Aufregulation von costimulierenden Molekülen
Die Fähigkeit von sterbenden Tumorzellen zur Aktivierung von costimulierenden Molekülen, B7 und ICAM in situ wurde untersucht. Subkutane Tumore, die mit Ad-MDA7 oder Ad-Luc injiziert wurden, wurden 48 h nach der letzten Dosis geerntet und mittels Immunhistochemie analysiert. Die Expression von B7 (7.1 und 7.2) und ICAM wurde bei Tumoren beobachtet, die MDA-7 exprimierten, während keine Expression bei Tumoren beobachtet wurde, die mit Ad-Luc behandelt waren.
4. Expression von MDA-7 in in situ Tumor hemmt Angiogenese
Zur weiteren Bestimmung der Tumor-unterdrückenden Wirkungen von mda-7 wurden subkutane Tumore auf CD31-Expression, ein zur Identifizierung von Angiogenese in Tumoren häufig verwendeter Marker, analysiert. Mit Ad-mda-7 behandelte subkutane Tumore zeigten eine geringere Anzahl von Blutgefäßen im Vergleich zu Tumoren, die mit Ad-luc behandelt wurden, oder zu nicht behandelten Gruppen.
BEISPIEL 9: EFFIZIENZ VON AD-MDA7 ZUR VERHINDERUNG METASTATISCHER VERBREITUNG EINES TUMORS
Experimente haben gezeigt, dass Ad-mda7 die metastatische Verbreitung von Lungenkrebstumoren in vivo hemmen kann. Weitere Experimente wurden unter Verwendung von Melanom-Zelllinien durchgeführt, um die Fähigkeit von MDA-7 zur Verhinderung der metastatischen Verbreitung von Melanomtumoren zu bewerten. Die vorstehend erläuterten Verfahren und Protokolle wurden verwendet.
Humane Melanom-Xenografts wurden durch subkutane Injektion von humanen Melanomzellen (1 × 10⁶ Zellen) in die Seiten von Nacktmäusen hergestellt. TXM-1- oder TXM-18-Zellen können verwendet werden. Sobald der Tumor einen mittleren Durchmesser von 5 mm erreichte, wurden steigende Dosen von Ad-mda7 oder Kontroll-Ad-luc in die Tumore injiziert. Dosen von 3 × 10⁷ bis 3 × 10⁹ pfu wurden getestet. Der adenovirale Vektor wurde in drei Injektionen von etwa 33 ml, insgesamt 100 ml, intraläsional abgegeben. Jede Injektion wurde senkrecht zu der vorhergehenden Injektion ausgerichtet, um eine wirksame Beladung des Tumors sicherzustellen. Nach Erreichen der zweckmäßigen Dosis wurde die Tumor-Xenografts mit einer einzigen Dosis von 100 ml oder mehreren 100 ml gleich kommenden Teildosen über eine Zeitperiode von drei Tagen behandelt, um die Wirksamkeit der beschriebenen Verabreichungregime zu bewerten. Im Anschluss an diese Untersuchungen wurde ein Vergleich zwischen Einzeldosis-Verabreichung gegenüber Mehrfachdosis-Verabreichung durchgeführt, wobei eine Dosis als eine Injektion von 100 ml der zuvor optimierten Konzentrationen in pfus definiert wurde. Die Effizienzuntersuchungen bestanden aus der Behandlung von Tumor-Xenografts, worauf die etablierten adenoviralen Konzentrationen und das Behandlungsregime für 3 bis 5 Tage folgten. Die Wirksamkeit wurde durch die Verringerung der Tumorgröße bewertet. Die Tumorgröße wurde über die direkte Messung der Tumordurchmesser bestimmt.
Ad-mda7-behandelte Tumore wurden auf die Expression von MDA-7-Protein und Induktion der Apoptose untersucht. Der immunhistochemische Nachweis von MDA-7 und der Nachweis von Apoptose mit TUNEL-Test wurden zur Untersuchung der Effizienz von Ad-mda7-Behandlung auf der zellulären Ebene verwendet. Ein MDA-7-Antikörper, der MDA-7-Protein spezifisch erkennt, wurde für immunhistochemische Verfahren verwendet. Endothelzellen in den Melanom-Xenografts wurden mit gegen Maus-CD-31 gerichteten Antikörpern nachgewiesen. Die Bereiche der Tumorschnitte mit einer großen Anzahl von Kapillaren und kleinen Venen wurden durch Abtastung der Schnitte bei geringer Stärke (× 40 und × 100) gefunden. Bei diesen Bereichen wurden einzelne Gefäße in Vergrößerungsfeldern von × 200 gezählt und Durchschnittswerte wurden für die behandelten und unbehandelten Tumorproben aufgezeichnet. Dieses Verfahren wurde zum Vergleich der Blutverteilung und -dichte in humanen Xenografts bei Nacktmäusen verwendet (Yoneda et al., 1998).
BEISPIEL 10: MODULATION VON WACHSTUMSFAKTOREN WÄHREND EKTOPISCHER EXPRESSION VON MDA-7
Auf Grund der aufgestellten Hypothese, dass MDA-7 über eine autokrine/parakrine Aktivität verfügt, wurde die Wirkung von Ad-mda7 auf Melanomzellen hinsichtlich der Sezernierung von Faktoren untersucht, die bei der Progression eines Melanoms beteiligt sind. ELISA-Tests wurden verwendet, um die Freisetzung von diesen löslichen Mediatoren, wie verschiedene Typen von TGF-β1, IL-8, IL-10 und bFGF anzugehen. Die Melanom-Zelllinien und normalen Zellen wurden mit Ad-mda7, Ad-luc oder Verdünnungskontrolle behandelt und danach auf Modulation von Wachstumsfaktorkonzentrationen im Kulturüberstand nach 24–48 Stunden beobachtet. Immunblotting der Lysate kann ebenfalls zu unterschiedlichen Zeiten nach der Behandlung durchgeführt werden.
BEISPIEL 11: AD-MDA7 VERBESSERT DIE AKTIVITÄT VON HERCEPTIN
Die Brustkrebs-Zelllinien SkBr3 (Her2+) und MCF-7 (Her2-) wurden beide von ATCC bezogen. Die Zellen wurden bei einer Dichte von 1000 Zellen/Vertiefung in Nunc 2-Kammerobjektträger plattiert und in DMEM-Medium mit 10% FBS propagiert. Am darauf folgenden Tag wurden die Zellen nicht behandelt oder mit Ad-mda7 (bei steigenden MOIs: 0, 500, 1000 und 2000 Vp/Zelle) ohne (M-Reihe) oder mit Herceptin (M+H-Reihe) mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml behandelt. Die Zellen wurden nach 3 Stunden gewaschen und Wachstumsmedium (mit oder ohne Herceptin, wie angegeben) wurde ausgetauscht. Drei Tage später wurden lebensfähige Zellen unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlusstests (durchschnittlich 3–4 Felder) gezählt und aufgetragen, wie in der 15 gezeigt ist. Herceptin alleine führt zu etwa 12% toten Zellen bei beiden Zelllinien. Jedoch zeigte sich, dass Ad-mda7 die Abtötungswirkung von Herceptin bei Brustkrebs-Zelllinien verbesserte.
LITERATURHINWEISE
Die folgenden Druckschriften sind hierin speziell durch Bezugnahme in dem Maße mit eingeschlossen als sie beispielhafte verfahrensbezogene Einzelheiten odere andere Einzelheiten zusätzlich zu den hierin ausgeführten bereitstellen.

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung einer wirksamen Menge einer Expressionskassette umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ein humanes MDA-7 Polypeptid unter der Kontrolle eines in eukaryotischen Zellen funktionsfähigen Promotors kodiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines menschlichen Patienten mit Krebs, wobei das Medikament in Kombination mit mindestens einer anderen Anti-Krebs-Behandlung verabreicht wird, wobei die Anti-Krebs-Behandlung eine Chemotherapie ist, wobei die Chemotherapie ein DNA-schädigendes Mittel, Tamoxifen oder Herceptin umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Expressionskassette dem Patienten vor, während oder nach der anderen Anti-Krebs-Behandlung verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Expressionskassette ein humanes MDA-7 Protein in voller Länge kodiert.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Expressionkassette weiterhin ein sekretorisches Signal kodiert.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Krebs weiterhin einen Tumor umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Krebs ist Melanom, nichtkleinzelliger Lungenkrebs, kleinzelliger Lungenkrebs, Lungenkrebs, Leberkarzinom, Retinoblastom, Astrozytom, Glioblastom, Leukämie, Neuroblastom, Kopf-, Nacken-, Brust-, Pankreas-, Prostata-, Nieren-, Knochen-, Hoden-, Eierstock-, Mesotheliom, Zervikal-, Gastrointestinal-, Lymphom, Gehirn-, Darm- oder Blasenkrebs.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Expressionskassette ein Adenovirus-Vektor ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei der Adenovirus-Vektor mit zwischen etwa 10³ und etwa 10¹⁵ viralen Partikeln verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Expressionskassette dem Patienten in einem Lipoplex verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei der Lipoplex DOTAP und mindestens ein Cholesterin, Cholesterin-Derivat oder eine Cholesterin-Mischung umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Verabreichen durch Injektion der Expressionkassette erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Injektion lokal, regional oder distal zum Krebs erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Verabreichen mittels kontinuierlicher Infusion, intratumoraler Injektion oder intravenöser Injektion erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Promoter ein CMV IE, Dektin-1, Dektin-2, humaner CD11c, F4/80, SM22 oder ein MHC Klasse 2 Promotor ist.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Verabreichen mehrere Injektionen umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Expressionskassette vor oder nach Resektion des Tumors in das Tumorbett verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Expressionskassette sowohl vor als auch nach Tumorresektion in das Tumorbett verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz Aminosäuren von etwa 182 bis etwa 206 der SEQ ID NO: 2 kodiert.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz Aminosäuren von etwa 175 bis etwa 206 der SEQ ID NO: 2 kodiert.
Verwendungsverfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz Aminosäuren von etwa 150 bis etwa 206 der SEQ ID NO: 2 kodiert.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz Aminosäuren von etwa 100 bis etwa 206 der SEQ ID NO: 2 kodiert.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz Aminosäuren von etwa 49 bis etwa 206 der SEQ ID NO: 2 kodiert.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei dem MDA-7-Polypeptid eine Signalsequenz der Volllänge-MDA-7-Polypeptidsequenz fehlt.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei die Expressionskassette weiterhin eine zweite Nukleinsäuresequenz umfasst, die ein heterologes, sekretorisches Signal kodiert.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei das sekretorische Signal weiterhin definiert ist als eine positiv geladene N-terminale Region in Kombination mit einem hydrophoben Kernbereich.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das DNA-schädigende Mittel Adriamycin, Fluorouracil (5FU), Etoposid (VP-16), Camptothecin, Actinomycin-D, Mitomycin C oder Cisplatin (CDDP) ist.
Verwendung nach Anspruch 27, wobei das DNA-schädigende Mittel Adriamycin ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz in einer Menge verabreicht wird, die wirksam ist, Angiogenese um den Tumor herum zu inhibieren.