KR20060002793A

KR20060002793A - Ｍｄａ-7을 포함하는 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20060002793A
Application number: KR1020057016425A
Authority: KR
Inventors: 수닐 차다; 죤 비 뭄; 라자고팔 라메쉬; 아브너 마쉴카르; 레이몬드 이 메인; 엘리자베쓰 그림
Original assignee: 더 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템; 인트로겐 테라페티스, 인코퍼레이티드
Priority date: 2003-03-03
Filing date: 2004-03-02
Publication date: 2006-01-09
Also published as: CA2518150C; AU2004218407A1; CN102836420A; HK1180218A1; WO2004078124A3; CN1759122B; BRPI0408063A; CN1759122A; CA2518150A1; AU2004218407A2; US20060134801A1; WO2004078124A2; EP1603943A2; CN102836420B; JP2006523227A

Abstract

본 발명은 MDA-7을 포함하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 암 및 다른 혈관신생 관련 장애를 치료하기 위한 진단, 예후 및 치료적 치료 조성물 및 방법(항혈관신생 요법)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 MDA-7의 정제방법에 관한 것이다.

MDA-7, 아폽토시스, 혈관신생, 방사선요법, 화학요법, ER 표적화 서열, 술린닥

Description

ＭＤＡ-7을 포함하는 방법 및 조성물{Methods and compositions involving MDA-7}

발명의 배경

본 출원은 본 출원과 동일한 발명의 명칭으로, 동일한 발명자에 의해 출원된 미국 특허출원 제60/452,257호(2003.3.3), 미국 특허출원 제60/474,529호 (2003.5.30), 미국 특허출원 제60/476,159(2003.6.4)호, 미국 특허출원 제 60/486,862호(2003.7.11), 미국 특허출원 제60/515,285호(2003.10.29) 및 미국 특허출원 제60/528,506호(2003.12.10)를 우선권으로 주장한다. 이 출원들은 각각 그 전문이 본 발명에 참고원용된다.

미국 정부는 국립암연구소의 승인번호 CA86587, R41 CA88421, P01 CA78778, P01 CA06294, CA70907 및 P30 CA16672에 의거하여 본 발명에 일부 권리가 있다.

A. 발명의 분야

본 발명은 일반적으로 분자생물학 및 유전자요법 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 암 및 다른 혈관신생(angiogenesis) 관련 장애를 치료하기 위한 진단, 예후 및 치료적 처리 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다(항혈관신생 요법). 또한, 본 발명은 MDA-7의 정제방법 및 정제된 MDA-7을 함유하는 조성물에 관한 것이다.

B. 관련 분야의 기술

1. 혈관신생

혈관은 2가지 과정을 통해 구축되는데, 그 하나는 혈관형성(vasculogenesis)으로서, 이에 의해 다능성 중간엽 선조로부터 배아형성 동안 원시 혈관망이 구축되며, 다른 하나는 혈관신생으로서, 기존 혈관이 모세혈관 발아를 형성하여 신생 혈관을 생산한다. 이러한 각 과정에 중심 역할을 하는 것은 내피세포이다. 내피세포는 이동하고 증식한 뒤, 단단한 세포-세포 연결을 통해, 혈액을 함유하는 관으로 조립된다(Hanahan, 1997). 혈관신생은 내피세포에서 방출되는 효소와 백혈구가 내피세포 주위의 기저막을 침식시키기 시작하고, 이로써 내피세포가 상기 기저막을 통해 돌출될 때 일어난다. 그 다음, 이러한 내피세포는 혈관신생 자극에 반응하여 이동을 개시하여 혈관 분지들을 형성하고, 이 분지들이 서로 융합될 때까지 계속 증식하여 새로운 혈관을 형성한다.

보통, 혈관신생은 극히 제한된 환경 상태, 예를 들면 배아 발생, 상처 치유 및 황체, 자궁내막 및 태반 형성 등에서 사람과 동물에서 나타난다. 하지만, 비정상적 혈관신생은 종양 전이를 비롯한 다수의 장애와 관련된다. 사실상, 종양 성장은 혈관신생 과정에 의존한다는 것은 통념이다. 따라서, 혈관신생을 증가 또는 감소시키는 능력은 상처 치유(예를 들면, 이식편 생존) 또는 암치료와 같은 임상 상태와 각각 유의적 연관성이 있는 것이다.

현재, 혈관신생이 고형암의 성장과 존속 및 이의 전이에 필수적임을 암시하는 직접적인 증거는 몇몇 연구진을 통해 제안되어 있다(Folkman, 1989; Hon et al., 1991; Kim et al., 1993; Millauer et aL, 1994). 종양은 혈관신생을 자극하기 위해 섬유아세포 성장인자(FGF 및 DTCF) (Kandel et al., 1991) 및 혈관 내피세포 성장 인자/혈관 투과 인자(VEGF/VPP)를 포함하는 다양한 혈관신생 인자의 생산을 상향조절한다(up-regulate). 하지만, 많은 악성 종양들은 또한 안지오스타틴 및 트롬보스폰딘(Chen et al., 1995; Good et al., 1990; O'Reilly et al., 1994)을 포함하여 혈관신생의 억제제를 생산한다. 혈관신생의 표현형은 신생혈관증식의 양성 및 음성 조절인자 사이의 최종 균형의 결과로 추정되고 있다(Good et al., 1990; O'Reilly et al., 1994; Parangi et al., 1996; Rastineiad et al., 1989). 몇 가지 다른 혈관신생의 내인성 억제제가 확인되어 있으며, 이들 모두가 종양의 존재와 관련이 있는 것은 아니다. 그 예에는 혈소판 인자 4(Gupta et al., 1995; Maione et al, 1990), 인터페론-α, 인터루킨-12 및/또는 인터페론-γ (Voest et al., 1995)에 의해 유도되는 인터페론 유도 단백질 10(Angiolillo et al.; 1995; Stricter et al., 1995), gro-β(Cao et al., 1995), 및 프로락틴의 16 kDa N-말단 단편(Clapp et al., 1993)이 있다.

2. 혈관신생 관련 질환

본 발명의 방법은 내피세포 관련 질환 및 장애를 치료하는데 유용하다. 특히 중요한 내피세포의 과정은 전술한 바와 같은 혈관신생, 즉 혈관 형성 과정이다. 따라서, 혈관신생 관련 질환은 내피세포 증식을 억제하는 본 발명에 기술된 방법을 사용하여 치료할 수 있다. 혈관신생 관련 질환에는, 고형암, 혈액계 종양(예, 백혈병) 및 종양 전이와 같은 혈관신생 의존 암; 양성 종양, 예를 들면 혈관종, 청각 신경종, 신경섬유종, 트라코마 및 화농 육아종; 류마티스성 관절염; 건선; 안구 혈관신생 질환, 예를 들면 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증, 황반 변성, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 수정체뒤 섬유증식, 피부홍조; 오슬러-웨버(Osler-Webber) 증후군; 심근 혈관신생; 플라크 신생혈관증식; 모세혈관확장증; 혈우병 관절; 혈관섬유종; 및 상처 과립화가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 내피세포 증식 억제 방법은 내피세포의 과도한 또는 비정상적 자극이 있는 질환의 치료에 유용하다. 이러한 질환에는 장유착, 죽상동맥경화증, 피부경화증 및 비대 흉터, 즉 켈로이드가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 방법은 병리학적 결과로서 혈광형성을 나타내는 질환, 예를 들면 고양이긁힘병(로첼레 미날리아 퀸토사(Rochele minalia quintosa)) 및 궤양(헬로박터 파이롤리(Helobacter pylori))의 치료에도 유용하다.

3. 암

정상조직의 항상성은 고도로 조절되는 세포 증식과 세포 사멸의 과정이다. 세포 증식 또는 세포 사멸의 불균형은 암 상태를 발생시킬 수 있다(Solyanik et al., 1995; Stokke et al., 1997; Mumby and Walter, 1991; Natoli et al., 1998; Magi-Galluzzi et al., 1998). 예를 들어, 일어날 수 있는 많은 암의 몇 가지 예로는 자궁암, 신장암, 폐암, 췌장암, 결장직장암 및 뇌암이 있다(Erlandsson, 1998; Kolmel, 1998; Mangray and King, 1998; Mougin et al., 1998). 사실상, 암 발생은 미국에서만 암으로 인한 사망자가 연간 500,000명 이상일 정도로 높다.

세포 증식 및 세포사멸의 유지는 원형 종양유전자 및 종양억제제에 의해 적 어도 부분적으로 조절된다. 원형 종양유전자 또는 종양억제제는 세포 증식을 유도하는 단백질(예: sis, erbB, src, ras 및 myc), 세포 증식을 억제하는 단백질(예: Rb, p16, p19, p21, p53, NF1 및 WT1) 또는 프로그램된 세포사멸을 조절하는 단백질(예: bcl-2)[참조: Ochi et al., 1998; Johnson and Hamdy, 1998; Liebermann et al., 1998]룰 암호화할 수 있다. 그러나, 이러한 원형 종양유전자 또는 종양억제제의 유전자 재배열 또는 돌연변이로 인해 원형 종양유전자가 강력한 암 유발 종양유전자로 전환되거나 종양억제제가 비활성 폴리펩타이드로 전환된다. 종종, 단일 점 돌연변이가 형질전환을 달성하기에 충분하다. 예를 들면, p53 종양 억제제 단백질에서의 점 돌연변이로 야생형 p53 기능이 완전히 상실하게 되고[참조:Vogelstein and Kinzler, 1992], "우세한" 종양 촉진 기능을 갖게 한다.

현재, 다수의 암 유형에 대해 효과적인 선택사항은 거의 없다. 소정의 개인을 위한 치료 과정은 진단, 질병의 진전 단계 및 환자의 연령, 성별 및 일반적인 건강에 의존한다. 암 치료의 가장 통상적인 선택사항은 수술, 방사선 요법 및 화학요법이다. 수술은 암 진단 및 치료에서 중심적인 역할을 한다. 전형적으로, 수술 방법은 생검을 필요로 하고 암 증식을 제거한다. 그러나, 암이 전이되었거나 널리 퍼진 겨우, 수술로는 치유가 안 될 것이고 대체 방법이 취해져야 할 것이다. 방사선요법, 화학요법 및 면역요법은 암의 시술 치료에 대해 대체적인 것이다[참조: Mayer, 1998; Ohara, 1998; Ho et al., 1998]. 방사선요법은 고 에너지 방사선의 정확한 조준으로 암 세포를 파괴하는 것을 포함하고 수술과 아주 흡사하게, 주로 전이되지 않고 국소화된 암 세포 치료에 효과적이다. 방사선요법의 부작용은 피부 자극, 연하 곤란, 건조한 입, 메스꺼움, 설사, 모발 손실 및 에너지 손실을 포함한다[참조: Curran, 1998; Brizel, 1998].

화학요법, 즉 항암제로 암을 치료하는 것은 암 요법의 다른 방법이다. 소정의 항암제의 효과는 고형 종양을 통해 약물 전달을 달성하는 것이 어렵다는 사실에 의해 제한된다[참조: el-Kareh and Secomb, 1997]. 화학요법의 전략은 암조직 성장을 기본으로 하는데, 여기서 항암제가 급격히 분열하는 암 세포를 표적으로 한다. 대부분의 화학요법의 시도는 하나 이상의 항암제의 배합을 포함하는데, 이는 광범위한 암의 반응 비율을 증가시키는 것으로 입증되었다[참조: 본원에 참조문헌으로 인용된 미국 특허 제5,824,348호; 미국 특허 제5,633,016호 및 미국 특허 제5,798,339호]. 화학요법제의 주요한 부작용은 이들이 또한 정상 조직 세포에 영향을 미쳐, 영향받은 세포가 특정한 경우에 급속히 분열한다는 것이다[예: 골수, 위장관, 생식계 및 모낭]. 화학요법제의 다른 독성 효과는 입안 통증, 삼키기 어려움, 건조한 입, 메스꺼움, 설사, 구토, 피곤, 출혈, 모발 손실 및 감염을 포함한다.

암 연구 중에서 급속히 발전되고 있는 분야인 면역요법은 특정 암 종류의 치료에 사용될 수 있는 또 다른 선택방법이다. 예를 들어, 면역계는 종양 세포를 이종 세포로 식별하여 면역계가 파괴할 표적으로 삼는다. 하지만, 불행히도 이러한 반응은 일반적으로 대부분의 종양 성장을 차단하기에 충분하지 않다. 최근, 면역요법 분야에서 초점의 대상이 되는 것은 면역계의 자연 방어 기구를 강화 또는 보강하는 방법을 개발하는 것이다. 현재 연구 중이거나 사용 중인 면역요법의 예에는 면역 보조제(예를 들면, 마이코박테리움 보비스, 플라스모듐 팔시파럼, 디니트로클로로벤젠 및 방향족 화합물)(미국 특허 5,801,005; 미국 특허 5,739,169; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998); 사이토킨 요법(예, 인터페론), 및 (IL-1, GM-CSF 및 TNF)(Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998) 유전자 요법(예, TNF, IL-1, IL-2, p53) (Qin et al., 1998 ; 미국 특허 5,830,880 및 미국 특허 5,846,945) 및 모노클로날 항체(예, 항강글리오사이드 GM2, 항HER-2, 항p185) (Pietras et al., 1998; Hanibuchi et al, 1998; 미국 특허 5,824,311)가 있다.

4. 유전자요법

유전자요법은 환자의 체세포에 치료용 재조합 핵산을 도입시킴으로써 질환 치료에 초점을 맞추고 있는 생체의학연구의 최신 분야이다. 유전자요법을 이용하는 다양한 임상 시험이 이미 개시된 바 있고, 각종 암, AIDS, 낭성 섬유증, 아데노신 디아미나제 결핍증, 심혈관 질환, 고셔병, 류마티스성 관절염 등이 포함된다. 현재, 아데노바이러는 유전자 치료제의 전달에 바람직한 운반체이다. 유전자 치료제로서의 아데노바이러스의 장점은 높은 형질도입 효율, 비분열세포 감염, 이의 바이러스 게놈 조작의 용이성 및 숙주 게놈과 비상동성 재조합의 낮은 확률이다.

5. 사이토킨

IL-10은 면역계 세포 뿐만 아니라 일부 종양 세포에 의해 생산되는 다형질발현성 동종이량체 사이토킨이다(Howard et aL, 1992; Ekmekcioglu et al., 1999). 이의 면역억제성 기능에는 IFNγ, TNFα 및 IL-6을 비롯한 전염증성 사이토킨 합성 의 강력한 억제가 포함된다(De Waal Malefyt et aL, 1991). IL-10 유사 사이토킨의 패밀리는 염색체 1q32 상의 작은 195kb 유전자 일단에서 암호되며, IL-10과 구조 및 서열 상동성이 있는 다수의 세포 단백질(IL-10, IL-19, IL-20, MDA-7)로 구성되어 있다(Moore et aL, 1990; Kotenko et aL, 2000; Gallagher et aL, 2000; Blumberg et aL, 2001; Dumoutier et aL, 2000; Knapp et al., 2000; Jiang et al., 1995a; Jiang et aL, 1996). MDA-7은 IL-10 패밀리의 구성원으로 특성화되었고, IL-24로도 알려져 있다.

염색체 위치, 전사 조절, 쥐 및 랫트 동족체 발현 및 추정상의 단백질 구조는 모두 MDA-7이 사이토킨임을 암시한다(Knapp et al., 2000; Schaefer et al., 2000; Soo et al., 1999; Zhang et al., 2000). 신속 분해를 위해 mRNA를 표적화하는 3'UTR 내에 AU 풍부 인자를 함유하고 있는, GM-CSF, TNFα 및 IFNγ 전사체와 마찬가지로, MDA-7은 3'UTR 내에 3개의 ARE를 갖고 있다(Wang et al., 2002). Mda-7 mRNA는 사람의 PBMC에서 확인되었고(Ekmekcioglu, et al., 2001), 사람 MDA-7 단백질의 사이토킨 기능에 대해서는 종래 보고된 바 없지만, MDA-7은 유전자 및 단백질 서열 특성(NCBI 데이터베이스 수득번호 XM_001405)을 감안하여 IL-24로 명명되었다. 쥐의 MDA-7 단백질 동족체 FISP(IL-4-유도 분비형 단백질)는 Th2 특이적 사이토킨으로 보고되었다(Schaefer et al., 2001). FISP의 전사는 TCR과 IL-4 수용체의 체결 및 녹아웃 연구로 입증된 후속적 PKC와 STAT6 활성화에 의해 유도된다. FISP의 발현은 특성이 규명되었지만, 이 추정상 사이토킨에 기인하는 기능은 밝혀지지 않았다(Wang et al., 2002). 랫트 MDA-7 동족체 C49a(Mob-5)는 mda-7 유전자 와 78% 상동성이 있으며, 상처 치유에 연관이 있었다(Soo et al., 1999; Zhang et al., 2000). Mob-5는 또한 분비성 단백질로 밝혀졌으며, 추정상 세포 표면 수용체는 ras 형질전환된 세포에서 확인되었다(Zhang et al., 2000). 이와 같이, mda-7 유전자의 동족체 및 분비된 MDA-7 단백질은 다양한 종에서 발현 및 분비된다. 하지만, MDA-7이 사이토킨 활성을 가짐을 보여주는 자료는 전혀 밝혀지지 않았다. 이러한 활성은 치료적 면역반응 촉진 또는 항원의 면역원성 증강을 통해 다양한 질환 및 감염을 치료하는 분기가 된다.

발명의 개요

본 발명은 MDA-7 정제방법, 정제된 MDA-7, 및 치료적 및 예방적 치료 뿐만 아니라 진단 분석에서 MDA-7 단백질 또는 MDA-7을 암호하는 핵산을 포함하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.

MDA-7을 정제하는 다양한 양태가 본원에 제시되고 있다. 정제된 MDA-7은 일부 양태에서는 사람 MDA-7이고, 전체 길이이거나 또는 이의 절두 형태 또는 단편일 수 있다. 다른 양태에서, MDA-7은 다른 종이나 근원 유래, 예를 들면 다른 포유동물, 구체적으로 마우스, 랫트 및 원숭이 유래일 수도 있다. 일부 양태에서, MDA-7은 글리코실화되는 반면에, 다른 양태에서 MDA-7은 글리코실화되지 않는다. 일부 경우에, MDA-7은 이의 시그날 서열이 결여되어 있기도 하고, 일부 경우에는 이종 시그날 서열을 갖고 있기도 한다. 이러한 모든 MDA-7 폴리펩타이드는 본 발명의 방법으로 정제할 수 있다.

본 명세서에 기술된 정제 방법은 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 최고 약 100% 균질성으로 정제된 MDA-7 단백질을 생산한다. 또는, MDA-7 단백질은 적어도 또는 최대 약 20%-95%, 30%-90%, 40%-80%, 50%-75%, 20%-50%, 50%-70%, 50%-90%, 70%-90% 및 이들 사이의 범위로 정제된 것이다. "균질성"이란 용어는 단백질 정제 기술분야의 당업자에게 명백한 통상적 의미로서 사용된 것으로, 특정 단백질의 순도 수준을 뜻하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 백분율의 범주에서 상기 용어는 총 단백질 양(분자 당) 대비 MDA-7 단백질의 퍼센트를 의미한다. "균질한"이란 용어는 균질성 수준을 의미하는 형용사이다. "약"이란 용어는 단백질 양 측정의 부정확성을 의미하는 것으로서, 단백질 농도를 측정하는 임의의 특정 분석이나 측정에서 1 이상의 오차의 표준편차를 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 단백질 농도 및 균질성이 쿠마시 겔 염색을 동반한 겔 전기영동으로 측정된다면, 적어도 약 25% 균질성으로 정제된 MDA-7은, 겔에 위치하는 샘플이 분자 당 총 단백질 농도 대비 적어도 25%의 MDA-7과 +/-의 쿠마시 염료로 염색된 단백질 겔의 표준편차를 의미한다.

더욱이, 정제된 MDA-7의 조성물은 활성형이 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 최고 약 100%인 MDA-7 단백질을 보유할 수 있는 것으로 생각되어야 한다.

약리학적으로 또는 약제학적으로 허용되는 용액 또는 조성물의 범주에서, 균질성의 측면에서 MDA-7 순도에 대한 언급은 용액이나 조성물 중의 MDA-7의 양을, 임의의 오염 단백질의 단백질 농도 대비로 나타낸 것이며, 여기서 "오염 단백질"이 란 불필요한 또는 바람직하지 않은 단백질을 의미한다. 차이에는 MDA-7이 면역반응을 유도하도록 사용되어진 면역원성 폴리펩타이드와 같이, 용액이나 조성물에 의도적으로 첨가된 단백질에 기인하는 단백질 농도를 배제하고자 한다.

본 발명의 많은 양태에서, 정제된 MDA-7 단백질은 활성 형태이다. "활성"이란 용어는 일반적으로 정제된 MDA-7 단백질이 MDA-7의 일부 활성을 갖는다는 것을 의미한다. 이는 백분율로 표시될 수 있고, 일부 양태에서, 정제된 MDA-7 단백질은, 특정 MDA-7 활성용으로 특수화된 모든 분석으로 측정되는 바와 같이, 대조용 MDA-7 폴리펩타이드의 활성 대비 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 최고 약 100% 활성이다. 이러한 활성에는 다음과 같은 임의의 활성이 이에 국한됨이 없이 포함될 수 있다: 결합 활성, 기능 활성(예를 들면, 아폽토시스를 유도하는 능력, 혈관신생을 억제하는 능력 또는 항혈관신생으 유도하는 능력, IL-22에 결합하는 능력, STAT3를 활성화시키는 능력, PKR를 조절하는 능력 및 면역반응을 유도하는 능력이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다), 해독후 변형되는 능력(글리코실화), 적당한 3차 구조 형성 능력, 적당히 국재화되는 능력.

MDA-7 단백질 정제방법은 각각 사용되거나 서로 조합되어 사용될 수 있는 다수의 단계를 포함한다. MDA-7은 재조합체 MDA-7 또는 비재조합체 MDA-7(예를 들면, 내인성 MDA-7 발현성 게놈 유전자에서 유래되는 것)을 발현하는 세포로부터 정제될 수 있다. 재조합체 MDA-7을 발현하는 세포인 경우에, 숙주 세포의 종류는 MDA-7의 해독후 변형 여부에 영향을 미칠 것이다. 특정 양태에서는, MDA-7의 글리코실화를 허용하는 진핵세포가 MDA-7 단백질의 숙주 세포 또는 세포 공급원으로 이용된다. 이와 같이, 세포는 진핵세포 또는 원핵세포일 수 있고, 구체적으로, 포유동물, 곤충, 세균, 사람 또는 진균 세포일 수 있다. 일부 양태에서는, MDA-7 단백질을 함유하는 세포 추출물 또는 상청액이 제조되어, 크로마토그래피를 비롯한 상이한 정제 단계로 처리된다.

정제된 MDA-7은 서열번호 2에 제시된 바와 같은, 전체길이 단백질의 아미노산 49 내지 206번에 상응하는, 단백질의 분비 형태일 수 있다. 또는, 정제된 MDA-7은 전체길이 단백질이거나, 또는 이종 N-말단 영역 또는 이종 시그날 서열과 같은 하나 이상의 이종 아미노산 영역을 보유할 수 있다. 더욱이, 이 단백질은 글리코실화될 수 있다. MDA-7의 글리코실화는 여러 위치에서 상이한 정도로 일어날 수 있다. 또한, 정제된 MDA-7은 균일하게 글리코실화된 것이 아닐 수 있다. 더욱이, MDA-7은 이량체와 같은, 복합체의 일부로서 정제될 수도 있다.

특정 양태에서는 친화성 크로마토그래피가 이용된다. 본 발명의 방법에서, 친화성 크로마토그래피는 항-MDA-7 항체를 포함한다. 특히, MDA-7에 대한 모노클로날 및 폴리클로날 항체의 사용이 고려된다. 모노클로날 또는 폴리클로날 항체는 1종 이상이 사용될 수 있고, 이 폴리클로날 및 모노클로날 항체가 함께 동시에 사용될 수도 있다. 다른 양태에서, 친화성 크로마토그래피는 MDA-7과 단백질 서열에 기초하지 않는 다른 분자 사이의 친화성을 포함하기도 한다. 글리코실화된 분자에 결합하는 렉틴이 본 발명의 일부 양태에서 이용되기도 한다. MDA-7과의 친화성이 기본인 분자는 몇몇 경우에는 비반응성 물질일 수 있는, 세파로즈와 같은 수지와 복 합체를 형성할 수 있다. 친화성 수지 컬럼은 본 발명의 일부 양태에 따라 제조될 수 있다. 이러한 수지에는 본 발명에 따른 방법의 일부로서 세포 추출물 또는 상청액이 통과될 수 있다. 일부 양태에서, 항체를 포함하는 친화성 크로마토그래피 후, 농축 또는 정제된 단백질은, 임의의 오염 항체에 결합하는 단백질 A(Protein A)에 노출시킨다. 이러한 단백질 A는 컬럼이나 비드와 같은 비반응성 구조물에 부착되거나 복합체를 형성할 수 있고, 이 후 농축 또는 정제된 MDA-7으로부터 분리될 수 있다.

이용될 수 있는 다른 크로마토그래피 종류는 이온 교환, 특히 음이온 교환 크로마토그래피이다. 또한, 크로마토그래피에는 비반응성 정제 공정, 예를 들면 크기 배제 크로마토그래피가 포함될 수도 있다. 크기 배제에는 겔 전기영동, 크기 배제용 컬럼에 비드의 사용 또는 분자 크기를 구별하기 위한 임의의 다른 종류의 비반응성 물리적 구조물이 포함될 수 있는 것으로 생각되어야 하며, 이에 국한되는 것은 아니다. 몇몇 경우에는 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지 또는 그 이상의 다른 종류의 정제 단계가 이용될 수도 있다. 특히 주목할 것은, MDA-7을 정제하기 위해 친화성 크로마토그래피와 음이온 교환 크로마토그래피가 조합되는 것이다. 다른 양태에서는, 추가로 크기 배제 크로마토그래피가 이용되기도 한다. 일 양태에서, 샘플은 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 이어서 음이온 교환 크로마토그래피로 처리되기도 한다. 각각의 크로마토그래피 과정 후, 단백질 담체가 샘플에 첨가될 수 있고(있거나) 샘플을 투석이나 크기 배제 과정으로 처리할 수 있다. 사용된 정제방법의 종류에 따라, 일부 양태에서 정제방법은 MDA-7 에 결합하는 폴리펩타이드, 예를 들면 IL-22 또는 IL-20 수용체 또는 PKR을 포함하거나 배제시키는 방법이 선택되기도 한다. 따라서, 본 발명의 정제방법은 MDA-7 단량체, MDA-7 복합체(글리코실화 여부를 불문하고), 및 MDA-7(단량체 또는 복합체일 때)에 직접 또는 간접적으로 결합하는 단백질의 정제에 사용될 수 있다는 것이 특히 중요한 점이다.

특정 양태에서, 단백질 담체는 크로마토그래피 수행 전, 수행 동안 또는 수행 후에 첨가된다. 이러한 단백질 담체는 임의의 크로마토그래피 또는 다른 농축 단계 전에 세포 추출물 또는 상청액에 첨가될 수 있다. 몇몇 경우에, 담체는 MDA-7을 컬럼에서 용출시켜 안정화시킨 후에 첨가되기도 한다. 특정 양태에서, 단백질 담체는 알부민이다. 알부민은 다양한 급원 중 하나에서 유래하는 것, 예를 들면 사람 유래인 것일 수 있다. 일부 양태에서, 알부민은 BSA이다. 또한, 단백질 담체는 정제방법의 후속 단계에서 제거될 수 있다.

음이온 교환 및 친화성 크로마토그래피를 비롯한 크로마토그래피 과정 동안에는 염 구배가 이용될 수 있다. 염 용액은 본 발명의 일부 양태에서, 0.05, 0.1, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.45, 0.50, 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0. 85, 0.90, 0.95, 1.00, 1.05, 1.10, 1.15, 1.20, 1.25 M 또는 그 이상의 농도로, 분획 마다 최고 약 0.005, 0.010, 0.015, 0.020, 0.025, 0.030, 0.035, 0.040, 0.045, 0.050, 0.055, 0.060, 0.065, 0.070, 0.075, 0.080, 0.085, 0.090, 0.095, 0.100, 0.200, 0.300, 0.400, 0.500M 또는 그 이상의 증가량으로 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 최고 1.0M 농도인 염의 단계 적 구배를 포함한다. 또 다른 양태에서, MDA-7 단백질은 염 농도가 약 0.9M 내지 1.0M인 용액에서 컬럼이나 다른 물리적 구조로부터 용출되기도 한다.사용된 염은 본 발명의 특정 양태에서 NaCl이다.

크로마토그래피 과정 동안에는 1 이상의 세척 단계가 사용될 수도 있다. 몇몇 경우에, 수지는 MDA-7 단백질을 보유한 세포 추출물 또는 상청액과 접촉된 후 세척된다. 세척 용액은 완충액을 함유하고, 염 농도가 최대 약 0.05, 0.1, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30. 0.35, 0.40, 0.45, 0.50, 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.95, 1.00 M 또는 그 이하일 수 있다. 세척 단계 후, 용출 단계가 실시될 수 있다. 일부 양태에서는 염 농도가 1M 이상이고 pH가 5.0 이하인 용액이 이용된다. 용출 용액은 pH가 최대 약 5.0, 4.5, 4.0, 3.5, 3.0 또는 그 이하일 수 있다.

용출 후, 중화 단계가 본 발명의 일부 양태에 따라 실시될 수 있다. 중화에는 특정 양태에서 완충액이 포함된다.

본 발명은 본 발명의 임의의 방법에 따라 정제된 MDA-7 단백질을 함유하는 조성물을 포함한다. 전술한 바와 같이 정제된 MDA-7 단백질은 본 발명의 일부로 고려된다.

또한, 본 발명의 일부로서, 정제된 MDA-7의 용도가 포함된다. 일부 양태로서, 활성 형태이고 적어도 약 80% 균질한, 정제된 MDA-7 단백질을 함유하는 약제학적으로 허용되는 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자의 혈관신생을 억제하는 방법이 제공된다.

다른 양태로서, 활성 형태이고 균질성이 적어도 약 80%인, 정제된 MDA-7 단백질을 함유하는 약제학적으로 허용되는 조성물의 유효량을 암 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암환자 치료 방법도 제공된다. 또 다른 양태로서, 추가로 환자에게 방사선요법 또는 화학요법을 수행하는 방법도 제공된다. 특히 주목할 점은, 상피 암세포를 포함한 암을 보유한 암 환자 또는 흑색종을 보유한 암 환자에게도 본 발명의 방법이 사용될 수 있다는 점이다. 방사선요법과 MDA-7 투여의 조합은 종양 관련 내피의 아폽토시스를 초래한다. 즉, MDA-7을 이용한 사람 종양의 치료는 MDA-7 수용체를 발현하는 세포의 종양에만 제한되지 않는다. 더욱이, 암 세포가 MDA-7의 수용체를 발현하는 백혈병 또는 림프종 환자도 MDA-7 투여로 인해 유효한 효과를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명은 환자에게 면역원성 분자, 및 활성 형태이고 적어도 약 80% 균질한 정제된 MDA-7 단백질을 함유하는 약제학적으로 허용되는 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 상기 면역원성 분자에 대한 환자의 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. "균질한"이란 용어는 MDA-7 단백질이 정제된 균질성 정도를 의미한다. 전술한 바와 같이, 조성물은 MDA-7 순도 범위에 대한 모든 언급에 영향을 미치지 않는 정도로, 오염물로 간주되지 않고 바람직한 다른 단백질을 함유할 수도 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 환자에서의 면역반응이 바람직한 면역원성 분자는 바이러스, 미생물, 진균 또는 종양 항원이다. 또 다른 양태에서는 인터페론이 환자에게 투여된다. 인터페론은 IFN-α, IFN-β, IFN-γ 또는 람다 IFN일 수 있다. 또 다른 양태에서, 사이토킨 또는 다른 면역 자극 분자가 환자에게 투여된다.

본 발명의 다른 방법은 종양의 항혈관신생을 유도하기 위한 MDA-7 단백질의 용도에 관한 것이다. 종양이 혈관화되고, 이 종양 주위로 혈관신생이 유도된다. 본 발명은 항혈관신생을 유도하여 상기 과정을 억제 또는 반전시키기 위해 MDA-7 폴리펩타이드를 사용한다. "항혈관신생을 유도하는"이란 표현은 혈관신생의 반전이나 억제, 또는 이미 개시된 혈관신생의 억제를 의미한다. 일부 양태에서, 종양 환자는 IL-22 수용체 양성 세포 상의 IL-22 수용체에 결합하여 종양의 항혈관신생을 유도하는 유효량의 MDA-7 폴리펩타이드를 투여받는다. IL-22 수용체 양성 세포는 그 표면 상에, MDA-7과 결합하는 IL-22 수용체를 발현하는 세포이다. 따라서, 일부 양태에서, 환자의 IL-22 수용체-양성 세포에 유효량의 MDA-7이 제공된다. 또 다른 양태에서, IL-22 수용체 양성 세포는 내피 세포이다. 따라서, 환자의 내피 세포는 MDA-7 폴리펩타이드를 공급받을 수 있는 것으로 생각된다. 또한, 이러한 세포는 종양이나 종양 세포에 인접("접하거나" 또는 "이웃하거나")할 필요는 없다. 즉, 이러한 세포는 종양과 이격(비인접)되어 있을 수 있다. 더욱이, 일부 양태에서, MDA-7 폴리펩타이드는 MDA-7의 분비 형태이고 글리코실화된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 종양 환자를 비롯한 암 환자에게 MDA-7을 시간 및/또는 공간적으로 다중 투여하는 것과 관련된 방법 및 조성물에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 일부 양태로서 i) MDA-7 폴리펩타이드 또는 ii) 프로모터의 제어하에 있는 MDA-7을 암호하는 핵산을 함유하는 아데노바이러스 벡터를 포함하는 약제학적으로 허용되는 조성물을 종양의 제1 부위에 주사하는 단계; 및 상기 조성물을 종양의 제2 부위에 주사하는 단계를 포함하는, 종양 환자의 치료방법을 제공한다. 또한, 환 자는 MDA-7 단백질 또는 MDA-7을 암호화하는 핵산을 함유하는 조성물을 적어도 또는 최대로 또는 다음과 같은 횟수로 투여받을 수 있다: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20회 또는 그 이상. 따라서, MDA-7 조성물(MDA-7 단백질 또는 MDA-7 단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 조성물을 의미함)이 주사될 수 있는 종양 내의 주사 부위는 적어도 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개일 수 있다. "주사 부위"란 주사바늘이나 다른 천공 기구가 환자와 접촉되는 지점을 의미한다. 이러한 주사 부위는 종양의 표면을 따라 또는 종양의 임의의 평면을 따라 서로 적어도 또는 최대로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 26, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 200 mm(밀리미터) 이내 또는 그 이상 이격될 수 있다. 특히 주목할 점은, 1회 이상 주사되는 경우 2개 이상의 주사 부위 또는 모든 주사 부위는 서로 균등한 간격으로 떨어져 있는 것으로 고려된다.

MDA-7 조성물은 또한 종양 외부, 예를 들면 주변에 주사될 수도 있다. 일부 양태에서, 조성물은 종양으로부터 24, 20, 16, 12, 8, 4 또는 2mm 이내에 주사되기도 한다.

본 발명의 일부 양태에서, 주사는 1회 실시된 후, 후속 주사가 제1 주사 실시 후 즉시 실시된다. 또는, 주사 사이에 약간의 시간을 둘 수도 있다. 따라서, 후속 주사는 이전 주사 이후 다음과 같은 시간 이내에, 또는 최소한 또는 최대한 다음과 같은 시간 이내에 실시될 수 있다: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60분, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24시간, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31일, 또는 1, 2, 3, 4, 5주, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월 또는 그 이상.

또한, 본 발명은 하나 이상이 화학요법, 방사선요법, 유전자요법 및/또는 면역요법의 사용을 포함하는 배합 치료 방법도 제공한다.

정제된 MDA-7은 별다른 언급이 없는 한, 진핵세포 또는 원핵세포로부터 정제될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 몇몇 경우에, MDA-7은 MDA-7을 암호하는 핵산으로 형질감염된 원핵 세포로부터 정제된다. 이러한 경우에, MDA-7은 글리코실화되지 않은 것일 수 있으나, 그래도 본 발명의 일부 방법에 이용될 수 있다. 다른 양태에서, 특히, MDA-7은 원핵세포로부터 정제되고, 몇몇 경우에는 포유동물 세포로부터 정제되는 것으로 고려된다. 특정 양태에서, MDA-7은 마우스, 랫트, 원숭이, 햄스터 또는 사람 세포로부터 정제된 것이다. MDA-7은 이러한 세포에서 내인적 또 는 외인적으로 생산될 수 있다.

본 발명의 다른 방법은 과다증식 질환, 특히 암의 치료제로서 정제된 MDA-7을 사용함을 포함한다. 따라서, 본 발명의 일부 양태로서, 특정 비율의 균질성%로 정제되고 활성인, 정제된 MDA-7 단백질을 함유하는 약제학적으로 허용되는 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자의 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법의 일부로서 사용될 수 있는 균질성 비율은 본 명세서에서 설명된 임의의 비율을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 환자는 방사선요법에 노출되기도 한다. 본 발명은 특히 세포의 방사선민감화를 포함하는 방법을 제공한다. "방사선민감화"란 용어는 세포가 방사선에 보다 민감하게 하는 것을 의미한다. 즉, 방사선 치료 전의 방사선민감화는 방사선 치료 전에 방사선민감화되지 않은 세포보다 방사선에 대한 민감성을 증가시킨다. 즉, 본 발명은 일부 양태로서 MDA-7을 사용하여 세포의 방사선민감화를 수행하는 방법을 제공한다.

공지된 암 치료법인 방사선요법은 정제된 MDA-7 단백질의 투여 전 또는 후에 환자에게 제공될 수 있다. 즉, 환자는 정제된 MDA-7 단백질의 1회 용량을 투여받은 시간으로부터 다음과 같은 시간 이내에, 또는 최소한 또는 최대한 다음과 같은 시간 이내에, 적어도 1회의 방사선요법 코스에 노출될 수 있다: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55분 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 86, 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 130, 136, 142시간, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12주 또는 그 이상, 또는 이의 조합된 시간. 특정 양태에서, 환자는 정제된 MDA-7 단백질 치료의 1회 용량을 투여받은 후 96시간 이내에 방사선요법에 노출된다. 방사선요법, MDA-7 단백질 또는 이들 둘다에 있어서, 다중 투여 또는 다중 치료 과정이 환자에게 실시될 수도 있다. 본 명세서에서 논의된 모든 암이나 암세포는 정제된 MDA-7 단백질 및/또는 방사선요법으로 치료될 수 있는 것으로 고려된다. 특정 양태에서, 치료되는 암은 췌장 기원이거나 또는 암이 흑색종일 수도 있다. 특히, 정제된 MDA-7 단백질은 암이나 종양 세포 부근에 위치하거나 인접한 비암성 세포에 투여될 수 있는 것으로 고려된다.

특정 양태로서, 방법은 암 세포에서 작동할 수 있는 프로모터의 제어하에 있는 MDA-7을 암호화하는 핵산을 함유하는 아데노바이러스 벡터의 유효량을 상기 암세포에 투여하는 것을 포함하는, 암세포 방사선민감화 방법을 제공한다. 다른 벡터도 물론 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 임의의 다른 방법에서와 같이, MDA-7 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 작제물 대신에, 정제된 MDA-7을 투여할 수 있고, 그 반대일 수도 있다. 특히, 암세포는 상피세포이거나 또는 본 명세서에 기술된 임의의 다른 암세포일 수 있는 것으로 고려된다.

또한, 본 발명은 프로타민과 복합체화된 MDA-7 암호화 폴리뉴클레오타이드, 발현 작제물 또는 벡터를 포함하는 방법에 관한 것이다. 프로타민은 조성물 중에서 MDA-7 핵산 분자와 함께 존재할 수 있거나 또는 MDA-7 핵산 분자와 복합체화될 수 있는 하전성 분자이다.

본 발명의 또 다른 방법에는, 프로모터의 제어하에 있는 MDA-7을 암호화하는 핵산을 함유하는 아데노바이러스 벡터 또는 정제된 MDA-7 단백질 중 어느 하나와 타목시펜(tamoxifen)을 투여하여 피검체 또는 암환자의 암 세포를 치료하는 방법이 포함된다. 타목시펜은 MDA-7 단백질 또는 아데노바이러스 벡터가 투여될 때 동시에 투여되거나, 또는 그 전이나 후에 투여될 수도 있다. 특히, 타목시펜은 상기 환자가 정제된 MDA-7 단백질 또는 아데노바이러스 벡터의 1회 용량을 투여받은 시기로부터 다음과 같은 시간 이내, 또는 최소한 또는 최대한 다음과 같은 시간 이내에 상기 환자 또는 검체에게 투여될 수 있다: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55분 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 86, 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, 130, 136, 142시간, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12주 또는 그 이상, 또는 이의 조합.

본 발명의 또 다른 양태에는, 특정 균질성%로 정제되고 활성인, 정제된 MDA-7 단백질의 유효량을 세포에 투여하는 것을 포함하여, 세포의 STAT3 활성화를 유도하는 방법이 포함된다. 본 발명의 일부로서 사용될 수 있는 균질성의 백분율에는 본 명세서에 기술된 임의의 백분율이 포함된다. "STAT3 활성화"란 어구는 STAT3 폴리펩타이드의 활성을 자극하는 것을 의미한다. 이러한 STAT3 활성화는 본 명세서의 실시예 부분에 기술된 방법을 사용하여 검출할 수 있다.

본 발명의 또 다른 방법은 평활근 세포를 억제하기 위한 MDA-7의 용도에 관한 것이다. 따라서, 일부 양태로서, 프로모터의 제어하에 있는 MDA-7을 암호화하는 핵산을 함유하는 아데노바이러스 벡터 또는 정제된 MDA-7 단백질 중 어느 하나를 함유하는 조성물의 유효량을 평활근 세포에 투여하는 것을 포함하는, 평활근 세포의 억제방법이 제공된다. 평활근 세포의 억제는 이 세포가 아폽토시스를 수행하도록 유도하거나 이 세포의 이동을 억제함을 포함한다.

또한, 본 발명은 프로모터의 제어하에 있는 MDA-7을 암호화하는 핵산을 함유하는 아데노바이러스 벡터 또는 정제된 MDA-7 단백질 중 어느 하나를 함유하는 조성물 및 NF-κB 억제제를 투여하는 것을 포함하여, 환자의 암이나 암세포를 치료하는 방법을 제공한다. NF-kB 억제제는 NF-kB의 발현이나 활성을 억제하는 물질을 의미한다. 일부 양태에서, NF-kB 억제제는 술린닥(Sulindac)이다. 다른 양태에서, NF-kB 억제제는 I-kB 단백질이거나, 또는 I-kB를 암호화하는 핵산을 함유하는 벡터이다. 특히, 환자에게 투여될 수 있는 벡터는 MDA-7 및 NF-kB 억제제를 모두 암호화하는 단일 벡터이거나 또는 각각 암호화하는 별도의 벡터일 수 있다. 이와 마찬가지로, 1종 이상의 벡터 및/또는 1종 이상의 단백질을 함유하는 단일 조성물이 환자에게 투여될 수도 있다.

또한, 본 발명의 방법에는 하전성 분자인 프로타민을 포함하는 암 치료방법이 포함된다. 일부 양태에서, 본 발명은 (a) 프로타민 분자; 및 (b) 프로모터의 제어하에 있는 사람 MDA-7 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 함유하는 발현 작제물을 함유하는 바이러스 조성물의 유효량을 암환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 치료방법을 제공한다. 상기 프로타민 분자는 본 발명의 일부 양태로서, 발현 작제물과 복합되어질 수도 있다. 바이러스 조성물은 바이러스 입자 : 프로타민의 비가 약 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 10¹⁵ 또는 그 이상 : 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 52O, 540, 560, 580, 600, 620, 640, 660, 680, 700, 720, 740, 760, 780, 800, 820, 840, 860, 880, 900, 920, 940, 960, 980, 1000㎍ 또는 그 이상일 수 있다. 특정 양태에서, 바이러스 조성물은 약 10¹⁰ 또는 10¹¹개 바이러스 입자 대 약 100㎍ 프로타민, 또는 약 200㎍ 프로타민, 또는 약 300㎍ 프로타민의 비를 포함한다.

본 발명의 방법 및 조성물에 사용되는 MDA-7 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 서열번호 2의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 156, 157, 160, 170, 180, 190, 200 또는 206개의 연속적 아미노산을 함유하거나 또는 서열번호 2의 모든 아미노산을 함유할 수 있다. 재조합 MDA-7 폴리펩타이드는 변형되거나 또는 어느 한 말단이 절두된 형태일 수 있다. 본 발명의 일부 양태에서, MDA-7 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 49 내지 206, 75 내지 207 또는 100 내지 206을 함유한다. MDA-7의 분비 형태는 서열번호 2의 아미노산 49 내지 206을 함유하고, 처음 48개의 아미노산은 제거된 것이다. 특히 이러한 분비 형태는 "MDA-7 폴리펩타이드"로 지칭한 것으로서, 본 발명의 임의의 조성물 또는 방법에 사용될 수 있다. 또는, MDA-7 아미노산 서열은 분비 시그날과 같은 이종 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 분비 시그날은 소수성 코어를 보유한 양하전성 N-말단 영역이다. 다른 양태에서, 분비 시그날은 MDA-7 또는 이의 절두 형태를 소포체 또는 미토콘드리아로 표적 유도한다.

발현 작제물은 바이러스 또는 비바이러스 벡터일 수 있다. 본 발명의 일부로 간주되는 바이러스 벡터에는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus), 헤르페스바이러스, 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 폴리오마 바이러스 또는 백시니아 바이러스가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명의 방법 및 조성물로 치료될 수 있는 암세포에는 방광, 혈액, 뼈, 골수, 유방, 결장, 식도, 위장, 잇몸, 두부, 신장, 간, 인후, 경부, 난소, 전립선, 피부, 위, 정소, 혀 또는 자궁 유래의 세포가 포함된다. 또한, 암은 특히 다음과 같은 조직 유형의 암일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다: 악성 신생물; 암종; 미분화 암종; 거대 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두 암종; 편평세포 암종; 림프상피 암종; 기저세포 암종; 모기질 암종; 전이세포 암종; 유두 전이세포 암종; 선암종; 악성 가스트린종; 담관 암종; 간세포 암종; 복합 간세포 암종 및 담관 암종; 잔기둥 선암종; 선양낭포암종; 선종 폴립증의 선암종; 가족성 결장 폴립증; 고형 암종; 악성 유암종; 아가미-폐포 선암종; 유두 선암종; 혐색소 암종; 호산성 암종; 호산세포 선암종; 호염기성 암종; 투명세포 선암종; 과립세포 암종; 소포 선암종; 유두 및 소포 선암종; 비피막성 경화 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막성 암종; 피부 부속기관 암종; 아포크린 선암종; 피지 선암종; 귀지샘 선암종; 점막표피계 암종; 낭선암종; 유두낭선암종; 유두장액낭선암종; 점액낭선암종; 점액선암종; 반지세포 암종; 침윤성관 암종; 속질 암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 유선 파젯병; 샘꽈리세포 암종; 샘편평세포 암종; 편평상피화생 선암종; 악성 흉선종; 악성 난소 기질 종양; 악성 난포막종; 악성 과립층세포 종양; 악성 남성모세포종; 버팀세포 암종; 악성 레이디히 세포 종양; 악성 지질 세포 종양; 악성 부신경절종; 유방외 악성 부신경절종; 크롬친화세포종; 사구맥관육종; 악성 흑색종; 멜라닌결핍 흑색종; 표재 확산형 흑색종; 거대 색소 신경의 악성 흑색종; 상피계 세포 흑색종; 악성 청색 모반; 육종; 섬유육종; 악성 섬유 조직구종; 점액육종; 지질육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 기질 육종; 악성 혼합 종양; 뮬러관 혼합 종양; 신장모세포종; 간모세포종; 암육종; 악성 간엽종; 악성 브렌너 종양; 악성 엽상 종양; 윤활막 육종; 악성 중피종; 미분화세포종; 배아 암종; 악성 기형종; 악성 난소 갑상선종; 융모막암종; 악성 중간신장종; 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시육종; 악성 혈관주위세포종; 림프관육종; 골육종; 피질곁 골육종; 연골육종; 악성 연골모세포종; 중간엽 연골모세포종; 뼈의 거대 세포 종양; 유잉 육종; 악성 치원 종양; 사기질모세포 치아육종; 악성 사기질모세포종; 사기질모세포 섬유육종; 악성 솔방울선종; 척삭종; 악성 신경아교종; 뇌실막세포종; 성상아교세포종; 원형질 성상아교세포종; 원섬유 성상아교세포종; 성상모세포종; 아교모세포종; 희소돌기아교세포종; 희소돌기아교모세포종; 원시 신경외배엽종양; 소뇌 육종; 신경절신경모세포종; 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 악성 수막종; 신경섬유육종; 악성 신경집종; 악성 과립세포 종양; 악성 림프종; 호지킨병; 호지킨 부육아종; 소림프구의 악성 림프종; 대세포 광범위 악성 림프종; 소포 악성 림프종; 균상식육종; 기타 특정 비호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프계 백혈병; 혈장세포 백 혈병; 적백혈병; 림프육종세포 백혈병; 골수계 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산성 백혈병; 단핵구 백혈병; 비만세포 백혈병; 거대핵모세포 백혈병; 골수계 육종; 및 모발상세포 백혈병.

조성물은 세포 또는 검체로, 정맥내, 피내, 동맥내, 복강내, 병변내, 두개내, 관절내, 전립선내, 흉막내, 기관내, 비내, 유리체내, 질내, 직장내, 국소적, 종양내, 근육내, 복강내, 피하, 결막하, 소포내, 점막, 심장막내, 제대내, 안내, 경구, 국소, 국부, 흡입(예를 들면, 에어로졸 흡입)에 의해, 주사, 주입, 연속 주입에 의해, 표적 세포를 직접 목욕시키는 국소 관류, 카테터를 통해, 세척액, 크림 조성물 또는 지질 조성물로서 투여될 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 진단용 또는 예후용 역할을 하는 것이다. 즉, 본 발명은 암으로 진단된 검체 또는 암이 의심되는 검체에서 암의 진행을 평가하는 방법으로서, (a) 상기 검체로부터 샘플을 수득하는 단계; (b) 과다증식성 조직 샘플 중에서 MDA-7 발현을 측정하는 단계; (c) 과다증식성 조직 샘플 중에서 iNOS 발현을 측정하는 단계; 및 (d) MDA-7 발현의 수준과 iNOS 발현의 수준을 비교하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 명세서의 실시예에서 밝혀지는 바와 같이, iNOS 발현은, MDA-7 발현 수준이 상승되거나 정상 세포, 예를 들면 비흑색종 피부 세포에서 일반적으로 관찰되는 수준으로 존재할 경우의 iNOS 발현 수준이 비해, MDA-7 발현 수준이 낮거나 발현이 관찰되지 않을 경우보다 높다. 특정 샘플에서 관찰되는 MDA-7 발현 수준과 iNOS 발현 수준의 상대적 비는 암 평가 또는 진단의 일부로서 계산될 수 있다. MDA-7 또는 iNOS의 발현은 당업자에게 공지된 기술에 따라서 단백 질이나 전사체의 수준에 기초하여 측정될 수 있다. 이러한 상대적 비는 비암세포 유래의 대조군이나 표준물과 비교될 수 있다.

또한, MDA-7 대 iNOS의 비 또는 수준은 암 치료에 대한 반응을 평가하는데 사용할 수 있다. iNOS 발현의 감소는 치료의 양성 표시인자 역할을 한다. 일부 양태에서는 MDA-7을 이용한 치료가 모니터된다. 따라서, 본 발명은 검체의 암 치료 반응을 측정하는 방법으로서, (a) MDA-7 치료 전 및 후의 검체로부터 샘플을 채취하는 단계; 및 (b) 채취한 샘플들의 iNOS 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 전술한 바와 같이, MDA-7을 이용한 치료는 검체에게 유효량의 정제된 활성 MDA-7 단백질, 또는 프로모터의 제어하에 있는 사람 MDA-7 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 발현 카세트를 투여하는 것을 포함할 수 있다.

이러한 방법은 다양한 암에 사용될 수 있으나, 특정 양태로서 전이 흑색종 암을 비롯한 흑색종 암에 적용가능하다. 환자는 환자와의 면담이나 약력, 예비 검사 결과, 또는 암이나 암의 위험을 암시하는 다른 징후/소인에 기초하여 암이 의심되는 검체일 수 있다.

또한, 본 발명은 난소암 환자의 치료방법에 관한 것이다. 본 발명의 특정 양태는 MDA-7 단백질을 함유하는 약제학적으로 허용되는 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 난소암 환자의 치료방법에 관한 것이다. 예를 들어, 상기 MDA-7 단백질은 활성 형태이며, 적어도 약 80% 균질한 실질적으로 정제된 MDA-7 단백질일 수 있다. 다른 양태는 i) MDA-7 폴리펩타이드 또는 ii) 프로모터의 제어하 에 있는 MDA-7을 암호하는 핵산을 함유하는 아데노바이러스 벡터를 함유하는 약제학적으로 허용되는 조성물의 유효량을 난소 종양의 제1 부위에 주사하는 단계; 및 상기 조성물을 상기 종양의 제2 부위에 주사하는 단계를 포함하는, 난소 종양 환자의 치료방법에 관한 것이다. 아데노바이러스 벡터의 사용에 관한 방법은 본 명세서 전반에 논의되어진다. 논의되는 상기 사용 방법은 난소암의 치료에 사용되는 MDA-7 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 양태는 종양에서 APC 발현을 유도하는 제제를 함유한 약제학적으로 허용되는 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 환자의 치료 방법에 관한 것이다. 종양에서 APC 발현을 유도하는 모든 제제는 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 제제는 소분자, 핵산 또는 단백질성 조성물일 수 있다. 특정 양태에서, 제제는 MDA-7, MDA-7 폴리펩타이드 또는 MDA-7 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 함유하는 발현 작제물이다. 발현 작제물의 사용에 관한 방법은 본 명세서에 전반에 논의되고 있다. 당업자라면 발현 작제물의 사용 및 이와 관련하여 이용할 수 있는 방법론의 범위를 잘 알고 있을 것이다.

APC 발현을 유도하는 제제의 투여 방법은 가능한 모든 방법이 본 발명에도 사용될 수 있다. 당업자라면 본 제제를 환자에게 전달하는데 이용할 수 있는 방법의 범위을 잘 알고 있을 것이다. 예를 들어, 상기 제제는 정맥내, 종양내 또는 경구적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 조성물은 종양 내의 β-카테닌 발현을 감소시키는 조성물로서 정의된다. 종양 중의 β-카테닌 발현을 측정하는 방법에는 당업자에게 공지된 모든 방법이 포함된다. 이러한 방법의 예 에 대해서는 본 명세서의 다른 부분에서 논의되고 있다.

본 발명의 일부 양태에서, 조성물은 검체에서 β-카테닌 발현을 감소시키는 것이다. 예를 들어, β-카테닌 발현의 감소는 검체의 종양 내에서 일어날 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 항암 화합물의 선별 방법으로서, (1) 제1 암세포와 후보 물질을 접촉시키는 단계; (2) 제1 암세포 내의 APC 발현을 측정하는 단계; 및 (3) 제1 암세포 내의 APC 발현을, 후보 물질과 접촉되지 않은 제2 암세포 내의 APC 발현과 비교하는 단계를 포함하고, 제1 암세포에서의 APC 발현의 증가가 후보 물질이 후보 항암 화합물임을 확인시키는 선별 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 제1 암세포 및 제2 암세포 내의 β-카테닌을 측정하는 단계 및 이러한 β-카테닌 발현이 제2 암세포에 비해 제1 암세포에서 감소되는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하거나 포함하지 않아도 된다. β-카테닌 발현의 측정을 포함하는 단계는 APC 측정을 포함한 단계와 무관하거나 관련이 있을 수 있다. 모든 후보 물질이 본 발명에서 고찰될 수 있으며, 당업자라면 고려될 수 있는 후보 물질의 다양한 종류의 범위를 잘 알고 있을 것이다. 예를 들어, 후보 물질은 소분자, 핵산 또는 단백질계 조성물일 수 있고, β-카테닌 리보자임, siRNA 또는 안티센스 분자를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 175 내지 206번 및 소포체 표적화 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 제공한다. 상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 본 명세서의 다른 부분에 제시되어 있다. 구체적으로, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 잔기 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205 및 206을 함유하는 폴리펩타이드이다. 또한, 서열번호 2의 아미노산 175 내지 206번은 연속적 아미노산 잔기인 것이다.

본 발명의 다른 양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 150 내지 206번과 소포체(ER) 표적화 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 100 내지 206번과 소포체 표적화 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 49 내지 206번과 소포체 표적화 서열을 포함하는 것이다. 이러한 각 양태에서, 서열번호 2의 아미노산은 연속적 아미노산 잔기인 것이다. ER 표적화 서열은 본 발명의 일부 양태에서는 절두형 MDA-7 폴리펩타이드의 N-말단 부분에 작동가능하게 연결된다. 본 명세서에 기술되고 당업자에게 공지된 ER 표적화 서열은 MDA-7 폴리펩타이드와 관련된 상황에서 본 발명의 일면으로서 고려되어야 한다.

본 발명의 양태들은 ER 보유 시그날을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 당업자라면 ER 표적화 서열 및 소포체 보유 시그날을 잘 알고 있을 것이다.

또한, 본 발명은 전술한 MDA-7 서열을 암호화하는 핵산 및 ER 표적화 서열을 함유하는 발현 카세트에 관한 것이다. 발현 카세트는 본 명세서 전반에 논의되고 있고, 발현 카세트를 논의하는 본 명세서의 부분들은 서열번호 2의 아미노산을 암호화하는 핵산을 함유한 발현 카세트에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 MDA-7 단백질과, IL-2, IL-7 및 IL-15로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 1종 이상의 인터루킨을 함유하는 약제학적으로 허용되는 조성물의 유효량을 암환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암환자 치료 방법에 관한 것이다. 또한, 다른 인터루킨도 본 발명의 모든 방법에서 MDA-7과 함께 사용할 수 있는 것으로 고려된다.

특정 인터루킨은 사이토킨 활성이 있는 것으로 증명되어 있다. 이러한 인터루킨의 예에는 IL-19, IL-20, IL-22 및 IL-26이 포함된다. 이러한 사이토킨 활성이 있는 인터루킨은, 혈관신생 억제 방법 및 면역 반응 자극 방법에 관한 본 발명의 방법에서 MDA-7 대신 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 암의 국소 침입성 및/또는 전이성을 억제하거나 예방하는 MDA-7 단백질을 함유하는 약제학적으로 허용되는 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자의 암의 국소 침입성 및/또는 전이성을 억제 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 이러한 본 발명에는 당업자에게 공지된 모든 투여 방법이 사용될 수 있다. 당업자라면 암의 국소 침입성 및/또는 전이성이 예방 또는 억제되었는지의 여부를 결정할 수 있을 것이다.

본 발명은 모든 유형의 원발성 암의 국소 침입성 및/또는 전이성을 억제 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 원발성 암은 흑색종, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 폐암, 간암종, 망막모세포종, 성상아교세포종, 아교모세포종, 잇몸암, 혀암, 백혈병, 신경모세포종, 두부암, 경부암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 골암, 정소암, 난소암, 중피종, 자궁경부암, 위장암, 림프종, 뇌암, 결장암 또는 방광암일 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 원발성 암은 폐암이다. 예를 들어, 폐암은 비소세포 폐암종일 수 있다.

또한, 본 발명은 암을 예방하거나 또는 화생, 형성이상 및 과다형성을 비롯 한 전암 또는 악성 전암세포를 치료하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 바람직하지 않은 양성 세포, 예를 들면 편평세포 화생, 형성이상, 양성 전립선 과다형성 세포, 과다형성 병변 등의 억제에도 사용될 수 있다. 즉, 암으로의 진행이나 암의 보다 심각한 형태로의 진행이 본 명세서에 논의된 MDA-7 폴리펩타이드 및 MDA-7 암호화 핵산을 함유한 발현 작제물을 포함하는 본 발명의 방법에 의해 정지, 붕괴 또는 지연될 수 있다.

MDA-7을 제조 또는 제형화하는 임의의 방법은 본 발명의 방법에 포함된다. 특정 양태에서, MDA-7은 발명의 개요 부분에서 전술한 임의의 방법에 따라 정제된다. 예를 들어, MDA-7은, MDA-7 단백질을 함유하는 세포 추출물이나 상청액을 친화성 크로마토그래피로 처리하는 전술한 방법에 의해 세포로부터 적어도 20%의 균질성으로 정제되어, 적어도 20% 균질성으로 정제되고 활성 형태인 것이다.

본 발명의 다른 관점은 암의 국소 침입성 및/또는 전이를 억제 또는 예방하는 MDA-7 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유한 약제학적으로 허용되는 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자에서 암의 국소 침입성 및/또는 전이를 억제 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 특정 양태에서, MDA-7 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 발현 작제물에 포함된다. 예를 들어, 이러한 발현 작제물은 프로모터의 제어하에 있는 MDA-7 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 함유하는 아데노바이러스 벡터를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 절제성 종양을 보유한 환자를 확인하는 단계, 이 종양을 절제하는 단계 및 이 종양 상(bed)을, MDA-7 단백질 또는 진핵세포에서 작용성인 프 로모터 및 프로모터의 전사 조절하에 있는 MDA-7 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하여, 현미경적 잔류 암의 치료방법과 같은 기타 다른 방법도 포함한다.

본 발명의 또 다른 방법은 수술로 종양을 노출시키는 단계 및 이러한 종양을, MDA-7 폴리펩타이드 또는 진핵세포에서 작용성인 프로모터 및 프로모터의 전사 조절하에 있는 MDA-7 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하여, 종양이 있는 검체의 치료 방법에 관한 것이다. 또는, MDA-7 폴리펩타이드 또는 MDA-7 암호화 핵산을 투여한 후에는 모든 종양이나 종양의 일부가 절제될 수도 있다. 이러한 부가 치료의 형태도 본 발명의 일부로서 특별히 포함되어야 한다.

본 발명은 종양을 MDA-7 폴리펩타이드 또는 진핵세포에서 작용성인 프로모터 및 프로모터의 전사 조절하에 있는 MDA-7 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터로 장기간에 걸쳐 관류시키는 단계를 포함하여, 종양이 있는 검체를 치료하는 또 다른 방법을 제공한다.

보조 치료로서의 MDA-7의 용도도 본 발명의 일부로서 고찰되어야 한다. 이러한 보조 치료는 1종 이상의 다른 암 치료와 함께 사용될 수 있는데, 예에는 수술, 화학요법, 방사선요법, 면역요법 또는 유전자 요법이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 구체적으로, 수술과 화학요법; 수술과 방사선요법; 수술과 면역요법; 방사선요법과 화학요법; 방사선요법과 면역요법; 화학요법과 면역요법; 수술, 방사선요법 및 화학요법; 수술, 화학요법 및 면역요법 등이 있다. 또한, 화학요법 치료는 1 종 이상의 화학치료제가 사용될 수 있는 것으로 생각되어야 한다. 본 발명의 일부 양태에서, MDA-7(폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 핵산)은 특히 탁소테르(taxotere), 헤르셉틴(Herceptin) 및 Ad-mda7과 함께 사용될 수 있다. 이러한 조합은 예를 들면 유방암 치료에 상당히 효과적으로 사용될 수 있다. 전술한 바와 같이, Ad-mda7은 또한 타목시펜과 사용될 수도 있다.

또한, 본 발명은 재발암이 나타난 검체의 치료 방법으로서, (a) (i) 수술, 방사선요법 또는 화학요법 또는 면역요법에 의한 이전 암 치료; 및 (ii) 이러한 치료에 이은 암의 재발성에 기초하여 환자를 선택하는 단계; 및 (b) 이 환자에게 MDA-7 폴리펩타이드, 또는 환자의 암 세포에서 활성 형태인 프로모터의 제어하에 있는 MDA-7을 암호화하는 핵산 분절을 함유하는, 암세포 중에서 MDA-7을 발현하는 발현 작제물을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 제공한다. 상기 단계 (b)에 이어, 환자에게 2차 방사선요법, 화학요법 또는 면역요법 치료를 실시하는 후속 단계 (c)를 통해, 암세포가 MDA-7에 의해 2차 방사선요법, 화학요법 또는 면역요법에 민감하게 됨으로써 암을 치료하는 방법도 제공되어진다.

1차 암치료 및 2차 암치료는 동시에 실시되거나 별도로 실시될 수 있다. 환자는 사람을 제외한 동물이거나 사람일 수 있다. 1차 및/또는 2차 방사선요법 또는 화학요법은 부설판, 클로람부실, 시스플라티넘, 사이클로포스파미드, 다카바진, 이포스파미드, 메클로레타민, 멜팔란, 5-FU, Ara-C, 플루다라빈, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 옥소루비신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 이다루비신, 미토마이신 C, 독세탁셀, 탁솔, 에토포사이드, 파클리탁셀, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 캄토테신, 카무스틴 또는 로무스틴과 같은 화학요법일 수 있다. 1차 및/또는 2차 방사선요법 또는 화학요법은 x선, 감마선 또는 마이크로파와 같은 방사선요법일 수 있다. 1차 및/또는 2차 방사선요법 또는 화학요법은 DNA 손상 요법을 특징으로 하는 것일 수 있다. 면역요법은 특정 단백질, 예를 들면 헤르셉틴(trastuzumab), 리툭산(rituximab), 에르비툭스(cetuximab), ABX-EGF, 벡사, 제발린, 온콜림, 밀로타르(Mylotarg), 림포사이드(LymphoCide) 또는 Alemtuzumab 등을 표적으로 하는 모노클로날 항체를 이용한 치료를 포함할 수 있다.

치료된 암은 뇌암, 두경부암, 식도암, 기관암, 폐암, 간암, 위암, 결장암, 췌장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁암, 방광암, 전립선암, 정소암, 피부암, 직장암, 림프종 또는 백혈병일 수 있다.

발현 작제물은 바이러스 발현 작제물, 예를 들면 레트로바이러스 작제물, 헤르페스바이러스 작제물, 아데노바이러스 작제물, 아데노관련 바이러스 작제물, 또는 백시니아 바이러스 작제물일 수 있다. 이러한 바이러스 발현 작제물은 복제 유능성 바이러스 또는 아데노바이러스이거나 또는 복제 결손성 바이러스 또는 아데노바이러스일 수 있다. 또는, 발현 작제물은 비바이러스 발현 작제물, 예를 들면 지질 운반체 내에 함유된 발현 작제물일 수 있다. 프로모터는 CMV IE, RSV LTR, β-액틴, Ad-E1, Ad-E2 또는 Ad-MLP일 수 있다. 당업자에게 공지된 다른 유전자요법 벡터 및 프로모터도 사용될 수 있다.

단계 (b)와 (c) 사이의 시간 간격은 약 24시간, 약 2일, 약 3일, 약 7일, 약 14일, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월 또는 약 6개월일 수 있다. 재발은 원발성 종 양 부위 또는 전이 부위에서의 재발일 수 있다. 이 때, 검체는 단계 (b) 이전에 절제 수술을 받은 적이 있는 검체이고(이거나) 단계 (c) 이후에 절제 수술을 추가로 받는 것도 본 방법에 포함될 수 있다. 단계 (b)에서의 투여는 종양내 투여, 종양 혈관으로의 투여, 종양 국소로의 투여, 종양 국부로의 투여 또는 전신 투여일 수 있다. 단계 (c)에서의 투여는 종양내 투여, 종양 혈관으로의 투여, 종양 국소로의 투여, 종양 국부로의 투여 또는 전신 투여일 수 있다.

또한, 본 발명은 MDA-7에 대해 면역반응을 유발하는 방법 및 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명의 일부 양태에서, MDA-7 폴리펩타이드 전체 또는 일부, 또는 이를 암호화하는 핵산은 백신으로서 검체에게 제공된다. 이러한 백신은 암을 비롯하여, MDA-7을 포함하는 모든 증상이나 질환을 예방하거나 치료하는데 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 방법 및 조성물에는 MDA-7에 대한 항체, 구체적으로 MDA-7 활성을 중화시키는 항체, 예를 들면 MDA-7 수용체에 대한 결합을 억제하는 항체(예를 들면, IL-20R 및 IL-22R)의 사용이 포함된다. 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체 뿐만 아니라, 이의 사람화된 형태는 염증성 질환, 자가면역 질환 및 증상, 예를 들면 건선, 염증성 장 질환(IBD), 류마티스성 관절염 및 낭창 등의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 MDA-7 항체(본 명세서에서, 항MDA-7 항체라고도 지칭됨)의 유효량을 환자에게 투여하여 치료적 효과가 제공되는 치료 방법을 제공한다. 이러한 치료 효과에는 증후군 수의 감소 또는 증후군 병도의 감소, 경감 유도, 염증 또는 염증의 특징 감소, 통증 감소 등이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.

특히, 본 발명의 일 양태와 관련하여 기술된 모든 제한은 본 발명의 임의의 다른 양태에도 적용되는 것이다. 또한, 본 발명의 임의의 조성물은 본 발명의 모든 방법에 사용될 수 있으며, 본 발명의 모든 방법은 본 발명의 모든 조성물을 생산하거나 이용하는데 사용될 수 있다.

청구의 범위에 사용된 "또는"이라는 용어는, 본 명세서에서 단지 대안만을 의미하는 정의 및 "및/또는"으로 표시되어 있을지라도, 대안만을 의미한다는 분명한 표시가 없는 한 또는 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 것이다.

본 명세서 전반에 사용된 "약"이라는 용어는 수치 측정에 사용된 장치 및/또는 방법의 오차에 대한 표준편차를 포함하는 수치임을 나타내는 것이다.

본 명세서에 사용된 단어("a" 또는 "an")는 분명한 다른 표시가 없는 한 하나 이상을 의미할 수 있다. "포함하는"이란 표현과 함께 사용되었을 때 청구의 범위에 사용된 단어("a" 또는 "an")는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "다른"이란 표현은 적어도 두번째 또는 그 이상을 의미할 수 있다.

다음 도면은 본 발명의 일부를 구성하는 것으로서, 본 발명의 특정 양태를 보다 구체적으로 확인시켜준다. 따라서, 본 발명은 이러한 도면 중 하나 이상과 함께 본원에 제시된 특정 양태의 상세한 설명을 참고로 하여 보다 분명하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1A 내지 1D. sMDA-7은 시험관내 내피세포 분화를 억제하며, 증식은 억제하지 않는다. HUVEC 및 HMVEC는 24시간동안 혈청 공급을 중단시키고, bFGF 1ng/ml와 제시된 농도의 sMDA-7를 함유하는 2웰 챔버에서 평판배양했다(A). PBS 및 안지오스타틴으로 처리된 세포는 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용된다. 증식은 실시예 1에 제시된 바와 같이 72시간 후에 측정되었다. (B), 2웰 챔버 슬라이드에 평판배양된 폐종양 세포(H1299 및 A549)를 제시된 농도의 sMDA-7로 처리했다. PBS 및 Ad-mda7로 처리된 세포는 각각 음성 및 양성 대조군으로서 사용되었다. 증식은 실시예 1에 제시된 바와 같이 72시간 후에 측정되었다. 매트리겔(Matrigel) 코팅된 96웰 평판에서 평판배양된 HUVEC를 PBS, sMDA-7(50ng/ml) 또는 sMDA-7이 면역고갈된 제제로 처리한 후, 관 형성에 대해 관찰했다(C). 모든 처리는 이중으로 분석했다. sMDA-7은 내피세포 관 형성을 완전히 억제하는 반면, sMDA-7 단백질의 면역고갈은 PBS 처리된 대조군 세포에서 보여지는 것과 유사한 관 형성을 재개했다. 배율, X10. sMDA-7/IL-24 처리된 HUVEC 및 HMVEC에서 내피세포 관 형성 수의 반정량적 분석 결과, 두 세포 유형 모두에서 sMDA-7에 의해 관 형성이 유의적으로(P=0.001) 억제됨을 확인했다(C). 막대, SE.

도 2. sMDA-7은 시험관내 내피세포 분화 억제에 있어 엔도스타틴보다 효능적이다. HUVEC를 bFGF 1ng/ml과 제시된 등몰 농도의 sMDA-7 및 엔도스타틴을 함유하는 매트리겔 코팅된 96웰 평판에 접종했다. 처리 24시간 후, 현미경으로 평판의 관 형성을 관찰하고, 형성된 관 수를 계수했다. PBS로 처리된 세포는 음성 대조군으로 사용했다. 모든 처리는 이중으로 실시했고, 실험은 5 내지 6회 반복했다. sMDA-7은 내피세포 관 형성을 용량 의존적 방식으로 유의적으로(P=0.001) 억제하고 10ng/ml보다 높은 농도에서 완전 억제하는 반면, 엔도스타틴은 억제하지 못했다. 엔도스타틴에 의한 관 형성의 억제는 최고 농도(300ng/ml)에서만 관찰되었다. 제시된 값은 3회 실험의 평균값이다. 막대. SE.

도 3. sMDA-7은 내피세포 이동을 억제한다. HUVEC를 0.5% FBS 중에서 밤새 혈청 공급을 중단시키고, 24웰 트란스웰 인서트(Transwell insert)의 상층 챔버에 접종한 뒤, VEGF 100ng/ml와 sMDA-7 10ng/ml이 주입된 24웰 평판에서 평판배양했다. 하층 챔버로 이동된 세포 수는 고배율 하에 계수했다. sMDA-7은 VEGF 만으로 처리된 세포에 비해 24시간 동안 VEGF 유도성 HUVEC 이동을 유의적으로 억제했다(P=0.001). PBS 처리 세포는 음성 대조군으로 사용했다.

도 4A-D. MDA-7 억제 활성은 HUVEC의 IFN-γ 및 IP-10 생산에 따른 것이 아니다. HUVEC를 6웰 평판에 접종하고 sMDA-7/IL-24(10ng/ml)로 처리했다. 제시된 시점에서 세포 배양 상청액을 수거하여 ELISA로 IFN-γ(A) 및 IP-10(B)을 분석했다. IFN-γ 또는 Ad-mda7로 처리된 HUVEC의 상청액은 각각 IP-10 및 IFN-γ ELISA의 양성 대조군으로 사용했다. PBS 처리된 세포의 상청액은 음성 대조군으로 사용했다. 모든 처리는 사중으로 분석했다. (C), 매트리겔 코팅된 96웰 평판에 접종된 HUVEC는 등몰 농도의 sMDA-7, IFN-γ 또는 IP-10으로 처리하고 관 형성에 대해 분석했다. 억제 활성은 형성된 관 수를 계수하여 측정했다. sMDA7은 IFN-γ 또는 IP-10에 비해 낮은 농도에서도 관 형성을 유의적으로(P=0.01) 억제했다. IFN-γ 또는 IP-10의 억제 활성은 높은 농도일 때만 관찰되었다. (C). 억제 활성은 형성된 관 수를 계수하여 확인했다. sMDA7은 IFN-γ 또는 IP-10에 비해 낮은 농도에서도 관 형성을 유의적으로(P=0.01) 억제했다. IFN-γ 또는 IP-10의 억제 활성은 높은 농도일 때만 관찰되었다. (D), HUVEC를 항IP-10 또는 항IFN-γ 중화 항체로 전처리한 후 매트리겔 코팅된 96웰 평판에 접종하고, sMDA-7으로 처리한 후, 관 형성을 분석했다. sMDA-7은 관 형성을 유의적으로(P=0.001) 억제했다. 막대, SE.

도 5. sMDA-7은 IL-22R1을 통해 내피세포 분화를 억제한다. HUVEC를 처리하지 않거나 또는 2가지 상이한 농도의 IL-22R1 차단 항체로 24시간 동안 처리한 후, PBS, 또는 제시된 농도의 sMDA-7, 엔도스타틴 또는 IP-10을 함유한, 매트리겔 코팅된 96웰 평판에 접종했다. 다음 날, 세포를 명시야 현미경을 사용하여 관 형성을 검사하고 정량했다. 관 형성은 sMDA-7/IL-24 처리된 HUVEC에서 억제된 반면, PBS 처리된 대조군 세포에서는 억제되지 않았다(A). 하지만, IL-22R1 차단 항체 존재 시, HUVEC 관 형성에 미치는 sMDA-7의 억제 효과는 용량 의존적 방식으로 소실되었다. 엔도스타틴 또는 IP-10은 IL-22R1 항체가 전처리된 HUVEC의 관 형성을 억제했다(B). 막대, SE.

도 6A-E. 생체내 혈관신생 및 종양 성장 연구. bFGF 60ng을 함유하는 매트리겔에 캡슐화된 sMDA-7(12.5ng)을 무흉선 누드 마우스에 피하 이식했다. bFGF만을 함유하는 매트리겔은 양성 대조군으로 사용하고, PBS만을 함유하는 매트리겔은 음성 대조군으로 사용했다. 10일 후, 매트리겔을 수거하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 헤모글로빈 농도에 대해 분석했다. 대조군에 비해 sMDA-7/IL-24를 함유하는 매트리겔에서의 헤모글로빈 농도의 유의적(P=0.0001) 감소가 관찰되었다(A). 누드 마우스에 A549 종양 세포와 294 모세포 또는 293-mda-7 세포의 동량 혼합물(1:1)을 이식하여 피하 종양의 성장을 측정했다(B). 293-mda-7 세포를 함유하는 종양에서는 모(母) 293 세포를 함유한 종양에 비해 유의적인 성장 억제가 관찰되었다(P=0.001) (B). 각 그룹 마다 각 시점에서의 평균 종양 부피를 나타냈다. MDA-7 단백질 발현은 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 293-mda-7세포를 함유하는 종양 조직과 모 293 세포를 함유하는 종양에서 비교 분석했다. 실험 말에 종양을 수거하여 분석했다. 293-mda-7 세포를 함유하는 동물의 종양 샘플 중에 존재하는 헤모글로빈 농도는 모 293 세포를 함유하는 동물의 종양 샘플에서 관찰되는 헤모글로빈 농도보다 낮았다(C). 피하 종양은 우측 옆구리 하부에 A549 종양 세포를 주사하여 형성시켰다(D). 종양이 감지되면, 이 동물들에게 매트리겔 캡슐화 모 293 세포 또는 매트리겔 캡슐화 293-mda-7 세포를 각 마우스의 우측 옆구리 상부로 이식시켰다. 캘리퍼스를 사용하여 종양 성장을 측정했다. 종양 성장은 293 세포로 처리된 종양에서보다 293-mda-7 세포로 처리된 종양에서 유의적으로 더 많이 억제되었다(P=0.001). 각 시점 마다 각 그룹의 평균 종양 부피를 나타내었다. 막대는 표준 오차를 나타낸다. CD31 염색을 이용한 종양 조직의 반정량적 분석은 모 293 세포로 처리된 종양에서보다 293-mda-7으로 처리된 종양에서의 미세혈관 밀도의 유의적 감소를 나타냈다(E). 막대. SE.

도 7. 단계 I 용량 상승식 임상 시험의 연구 설계. 여기서, mda-7은 비복제성 아데노바이러스 작제물(Ad-mda7)을 사용하여, 진행성 암종을 보유한 환자에게 종양내 주사를 통해 투여된다. 본 연구 설계에는 코호트당 환자의 수, 바이러스 용 량 및 생검 시간을 제시한다.

도 8. 막대 그래프는 종양내 주사 후 시간에 대한 DNA 카피수/DNA ㎍를 제시한다. 주사 후 24시간 이내에는 MDA-7 단백질 발현의 용량 의존적 증가가 나타나지만, 96시간까지는 감소되었다.

도 9. TUNEL 염색을 통해 확인되는 아폽토시스가 병변부의 중심에서 가장 집중된 것을 나타내는 환자 시험 결과 차트. 병변의 주변의 단명느 주사되지 않은 병변부에 비해 높은 TUNEL 반응을 나타냈다.

도 10. Ad-mda7에 대한 혈청 사이토킨 반응의 속도를 나타낸 그래프적 설명. 결과는 처리 후 경과일에 대한 혈청 사이토킨 증가율(%)로 나타냈다. 실험 결과는 Ad-mda7의 종양내 주사 후 혈청 사이토킨의 일시적 증가를 입증한다.

도 11. 코호트 당 종양내 Ad-mda7 처리에 대한 혈청 사이토킨 반응. 대부분의 환자들은 전신 사이토킨(IL-6, IL-10, IFNγ, TNFα, GM-CSF)의 일시적 증가를 나타냈다.

도 12. Ad-mda7을 종양내 투여받은 환자에서의 CD8+ T 세포 빈도의 증가. CD3+ CD8+ T 세포는 mda7 처리 후 15일째 30±13% 정도 증가했다.

도 13. 검체에게 Ad-mda7을 종양내 주사한 후 말초혈액의 CD8+ 세포 증가.

도 14. MDA-7의 1단계 음이온 교환 정제. 음이온 교환 컬럼의 각 피크(1, 2, 3, 4)는 웨스턴 블롯 분석에서 폴리클로날 항MDA-7에 의해 검출되는 MDA-7을 함유한다.

도 15. 체류 시간 대 분자량 비교. MDA-7 복합체는 85 내지 95kDa 사이에서 용출되었다.

도 16. MDA-7 과발현은 세포 증식을 억제한다. 종양 세포(DU 145, LNCaP 및 PC-3)와 정상 세포(PrEC)를 PBS, Ad-luc 또는 Ad-mda7로 처리하고 각 시점에서의 MDA-7 발현 또는 세포 생존성을 분석했다. PBS, Ad-luc 및 Ad-mda7로 처리 후 종양 세포 및 정상 세포의 세포 증식을 측정했다. 결과는 3회 반복한 값의 평균으로 나타냈다. 통계학적 유의성은 P=<0.05로 설정했다. 오차 막대는 표준 오차(SE)를 나타낸다.

도 17. MDA-7 발현은 종양 세포에서 아폽토시스를 유도하지만 정상 세포에서는 유도하지 않는다. 종양 세포(DU145, LNCaP 및 PC-3) 및 정상 상피 세포(PrEC)를 PBS, Ad-luc 또는 Ad-mda7로 처리하고, 처리 72시간 후 수거하여 유세포측정법으로 서브-G0/G1기의 세포를 분석했다. 각 처리군마다 20x10³개가 포착되었다. 그 데이터는 히스토그램으로 나타냈다. 각 데이터는 3개 값의 평균이다. 막대는 표준오차(SE)를 나타낸다.

도 18. MDA-7에 의한 G2 세포 주기 정지의 유도. 종양 세포(DU145, LNCaP 및 PC-3) 및 정상 세포(PrEC)를 PBS, Ad-luc 또는 Ad-mda7로 처리했다. 처리 72시간 후 세포를 수거하고, 유세포측정법을 사용하여 세포 주기 분석을 실시했다. 각 처리군마다 20x10³개가 포착되고, 그 데이터는 히스토그램으로 나타냈다. Y축은 세포수를 나타내고, X축은 세포주기 단계를 나타낸다. 데이터는 이중 실험의 평균값이다. 막대는 표준 오차(SE)를 나타낸다.

도 19A-D. Ad-mda7에 의한 방사선민감화는 클론원성 생존 분석에 기초하여 측정했다. Ad-mda7 및 Ad-luc에 사용된 벡터 농도는 A549 세포주의 경우에는 1000vp/세포(A)이고; H1299 세포주의 경우에는 250vp/세포(B)이며; CCD-16 세포주(C) 및 MRC-9 세포주(D)의 경우에는 1500vp/세포이다. 형질감염 48시간 후 방사선을 조사했다. 각 데이터 점은 3회의 독립적 실험의 평균값이다. 기호들은 모의 감염(◆); Ad-mda7(■) 및 Ad-luc(▲)를 나타낸다. 막대: SE.

도 20A-D. TUNEL 분석으로 평가된 A549(A), H1299(B), CCD-16(C) 및 MRC-9(D) 세포의 아폽토시스. 세포들에 형질감염 48시간 후 방사선조사하고 조사 2일 후 또는 형질감염 4일 후 수거했다. 사용된 벡터 농도는 도 19에 사용된 것과 동일했다. 각 데이터 점은 독립적인 2회 실험의 평균값을 나타낸다. 막대: SE.

도 21. Ad-mda7 또는 노코다졸(200ng/ml)로 처리된 A549 및 H1299의 세포 주기 분석. Ad-mda7 형질감염 48시간 후 존재하는 양과 동일한 비율의 G2/M 기의 세포를 축적시키는 노코다졸의 용량 및 노출 시간을 예비 실험을 통해 측정했다. 제시된 데이터는 독립적인 2회 실험의 평균값을 나타낸다.

도 22. 노코다졸(200ng/ml)에 의해 유도된 G2/M 정지를 통해 방사선민감화를 측정하기 위한 클론원성 생존 분석. A549 세포주는 노코다졸 4시간 노출 후 방사선 조사하고, H1299 세포주는 3.5시간 노출 후 방사선 조사했다. 기호는 방사선 단독(◆); 노코다졸(□)를 나타낸다. 막대: SE.

도 23. 커큐민 또는 커큐민과 Ad-mda7로 처리된 A549 세포 및 H1299 세포에서의 방사선민감화를 측정하는 클론원성 생존 분석. 커큐민은 형질감염 1일 후 첨 가했다. 사용된 벡터 농도는 도 19에서 사용된 농도와 동일하게 사용했다. 각 데이터 점은 독립적인 3회 실험의 평균값을 나타낸다. 막대: SE.

도 24. rhMDA-7 단백질은 흑색종 세포를 사멸시킨다. MeWo 세포를 rhMDA-7 0 내지 20ng/ml로 처리하고, 4일 후 트립판 블루를 이용하여 생존성을 측정했다. 또한, 항MDA-7 항체(토끼 폴리클로날 항체:Pab 또는 쥐 모노클로날 항체:MAb) 또는 대조용 사람 IgG 항체의 존재하에 rhMDA-7 20ng/ml로도 세포를 처리했다.

도 25A-25B. 흑색종 종양 MDA-7 발현은 종양 iNOS 발현과 역 상관성이 있다. 평균 iNOS 수와 MDA-7 수 사이의 역 관련성(A). 켄달 τ-b 상관성 계수는 -0.209로서, 0과 유의적으로 차이를 보였다(P<0.05). 평균 iNOS 강도와 MDA-7 강도 사이의 역 상관성(B). 켄달 τ-b 상관성 계수는 -0.201로서, 0과 유의적으로 차이를 보였다(P<0.05; 막대, ±SD).

도 26. 사람 흑색종 세포주 MeWo를 rhMDA-7으로 4시간 처리한 후의 IRF-1 및 IRF-2의 면역블롯팅 분석. 처리는 배지 단독(레인 1, 음성 대조군); 비형질감염성 HEK 293 세포의 상청액(레인 2, 음성 대조군); rhMDA-7 5ng/ml (레인 3); 및 rhMDA-7 20ng/ml(레인 4) 처리를 포함한다. 막은 희석율 1:2000의 항IRF-1 및 IRF-2 항체로 면역블롯팅시켰다. 대표적인 한 실험 결과를 제시했다. 그래프는 세포 용해물에 존재하는 액틴 단백질에 대해 정규화된 후의 IRF-1 및 IRF-2 발현을 나타낸 것으로, 2회 실험의 평균값이다; 막대, ±SD.

도 27. Ad-mda7은 타목시펜의 항종양능을 증가시킨다.

도 28. Ad-mda7 및 MDA-7 단백질은 흑색종 세포로부터의 사이토킨 분비를 조절한다.

도 29. A549 폐 전이에 미치는 Ad-mda7의 효과

도 30. PAC1 세포는 아데노바이러스 벡터에 의해 상당한 형질도입 효율을 나타낸다. 사람 H1299 폐암 세포 또는 PAC1 세포를 제시된 MOI의 Ad-SM22-베타-gal(Ad-SM22) 또는 Ad-RSV-베타-gal(Ad-RSV) 50 또는 100pfu/세포로 형질도입시켰다. 24시간 후, 세포를 베타-gal 활성에 대해 염색하고 X-gal 양성 세포를 계수했다. 데이터는 3회 반복한 계수값의 평균을 나타낸다.

도 31. MDA-7은 PAC1 세포 성장을 억제한다. PAC1 SMC를 제시된 MOI의 Ad-mda7 또는 Ad-luc로 형질도입시켰다. 생존성 세포는 삼중으로 3일간 형질도입 후 육안으로 계수했다. 데이터는 대조용 바이러스(Ad-luc)와 비교한 평균값±SD(p<0.05(^*))으로서 나타냈다.

도 32A-C. Ad-mda7에 의한 PAC1의 아폽토시스 유도. Ad-mda7은 카스파제-3 활성을 증가시킨다. PAC1 세포를 100MOI의 Ad-mda7 또는 Ad-luc로 형질도입시켰다. 48시간 동안 형질도입시킨 후, 세포 용해물 한 세트는 카스파제-3 활성 분석에 사용하고 다른 세트는 총 단백질 정량 분석에 사용했다. 카스파제-3 활성을 총 단백질 농도로 정규화하여, 총 단백질 10㎍ 당 단위로 나타냈다. p<0.05(*)를 대조용 바이러스(Ad-luc) 및 미처리 대조군(A)과 비교했다. 안넥신 V 결합 분석. PCA1 세포를 100MOI의 Ad-mda7 또는 Ad-luc로 형질도입시키고, 24시간 형질도입 후 FITC-표지된 안넥신 V로 염색했다. 처리된 세포를 유세포측정법으로 분석했다(B). 초기 아폽토시스 세포의 백분율은 모드핏(Modfit) 소프트웨어로 계산했다. p<0.05(^*)를 대조용 바이러스(Ad-luc)와 비교했다. DAPI 염색 분석(C). PAC1 세포는 MOI 100의 Ad-mda7 또는 Ad-luc로 형질도입시키고, 형질도입 24시간, 48시간, 72시간 후 DAPI로 염색했다. 염색질 탈응집의 증거가 확인되면 양성의 아폽토시스 핵으로 간주했다. p<0.05(^*)를 대조용 바이러스(Ad-luc)와 비교했다.

도 33. Ad-mda7에 의한 PAC1 세포 이동의 억제. 융합성 PAC1 세포를 100MOI의 Ad-mda7 또는 Ad-luc로 형질도입시키고, 실시예 22에 기술된 바와 같이 처리했다. 막대 그래프는 현미경으로 확인된, 손상부 중으로 이동된 세포 측정량을 나타낸다. +FBS 대 -FBS의 경우는 p<0.01(#); Ad-mda7 대 미처리 또는 Ad-luc + FBS의 경우는 p<0.01(^*); Ad-mda7 대 미처리 또는 Ad-luc-FBS의 경우는 p<0.05(△)를 나타냈다.

도 34. INGN 241의 생물학적 효과에 대한 시간 경과 및 용량 반응. INGN 241의 임상 시험에 사용된 6가지 코호트에서 관찰되는 시간 경과 및 용량.

도 35. MDA-7 단백질 발현은 아폽토시스 유도와 상관성이 있다. MDA-7 단백질 농도를 측정하고 10명의 각 환자 유래의 절편에 대해 TUNEL 분석을 실시했다.

도 36. 흑색종을 갖고 있는 환자 4에 대하여, 여러 종양 절편 중에 존재하는 MDA-7의 RNA, DNA 및 단백질 발현의 수준을 평가했다.

도 37. 주사 부위로부터의 MDA-7 DNA 및 RNA 확산을 10명의 환자들 중에서 평가했다.

도 38. MDA-7 단백질 농도와 아폽토시스 정도는 다수의 환자 유래의 여러 절편 중에서 평가했다.

도 39. MDA-7 발현의 확산을 평가하고 TUNEL분석을 이용하여 아폽토시스 수준과 상호관계시켰다.

도 40. 경과 시간별로 주사 부위에서의 MDA-7 DNA를 평가했다.

도 41. 경과 시간별로 주사 부위에서의 MDA-7 단백질 및 아폽토시스 수준을 평가했다.

도 42. 단계 II 임상 시험 초기 결과.

도 43. AsPc1, Capan2 및 MiaPaCa2 췌장 암세포를 Ad-mda7 및 Ad-luc 2000 vp/세포로 72시간 동안 처리하고 트립판 블루를 이용하여 생존성을 분석하고 아넥신(ANNEXIN) V 염색을 이용하여 아폽토시스를 분석했다. 데이터는 평균값+SD로 나타냈다.

도 44. MiaPaCa2 세포를 Ad-mda7 또는 대조군으로 처리하고 40시간 후 방사선 조사한 다음 클론원성 분석을 위해 평판배양했다.

도 45. AsPc1 및 MiaPaCa 췌장 암세포주를 Ad-luc 또는 Ad-mda7 2000 vp/세포로 처리하고, 24시간 후 XRT(5Gy)로 처리했다. 3일째 프로피듐 요오다이드를 처리하여 세포 주기 변화를 평가하고 FACS로 분석했다. Ad-mda7/XRT 샘플에서 G2/M기의 차단 및 서브-G0 시그날이 주지된다.

도 46. Ad-mda7은 NF-κB 의존적 리포터 유전자 발현을 활성화한다.

도 47. 우세한 음성 I-κBα 안정한 세포에서의 Ad-mda7의 세포독성 효과.

도 48. Ad-mda7은 주로 음성인 I-κBα 세포의 세포 성장을 억제한다.

도 49A-C. Ad-mda7은 술린닥과 상승작용하여 아폽토시스를 유도한다. A. Ad-mda7 단독 처리된 세포 및 술린닥과 병용 처리된 세포에서의 아폽토시스 비율. B. 종양 세포(A549 및 H1299) 및 정상 세포(CCD-16)를 PBS, Ad-luc 또는 Ad-mda7로 3시간 동안 처리했다. 처리 후, 세포를 제시된 농도의 술린닥과 항온배양했다. 72시간 후, 세포 생존성을 트립판블루 배제 분석법으로 측정했다. 세포 성장의 백분율은 각 그룹 마다 평균 세포수로 계산하고 단독의 PBS, Ad-luc 또는 Ad-mda7로 처리한 각 샘플(100%로 설정)에 대해 상대적 값으로 나타냈다. 정상 세포와 달리, Ad-mda7/술린닥으로 처리된 종양 세포는 PBS 및 Ad-luc 처리군에 비해 유의적으로 억제되었다(P=0.001). 술린닥에 의해 매개된 억제 효과는 용량 의존적이었다. 막대. SE. C. FACS에 의한 아폽토시스 세포 분석. 종양 세포(A549 및 H1299) 및 정상세포(CCD-16)를 다양한 용량의 술린닥의 존재하에 PBS, Ad-luc 또는 Ad-mda7로 처리했다. 72시간 처리 후, 세포를 프로피듐 요오다이드로 염색하고 FACS 분석을 실시했다. 서브-G₁기의 세포를 정량하여 아폽토시스 세포의 백분율을 측정했다. 이중 샘플의 평균값을 제시했고, 적어도 2회의 독립적 실험에서 유사한 결과가 관찰되었다. 막대, SE. D. 피하에 H1299 종양을 보유한 누드 마우스를 그룹지었다(n=8/그룹). PBS, 술린닥, Ad-mda7 또는 Ad-luc/술린닥으로 처리된 동물과 비교했을 때 Ad-mda7/술린닥으로 처리된 동물에서 유의적인 종양 성장 억제 효과가 확인되었다. Ad-mda7(3x10⁹vp)은 주당 3회씩 종양내 주사하고, 술린닥(40mg/kg)은 매일 복강내 주사했다. 제시된 종양 부피는 각 시점에서의 각 그룹의 평균값을 나타낸다. 막대, SE.

도 50. 5가지 난소암 세포주(MDAH2774, OVCAR420, DOV 13, HEY 및 SKOV3-ip)를 Ad-GFP로 감염시켜 상기 세포들의 아데노바이러스 형질도입 효율을 측정했다.

도 51. Ad-mda7 감염 후 난소암 세포주 MDAH 2774 및 OVCA 420의 세포 증식 억제성.

도 52. 유세포측정 분석으로 5가지 난소암 세포주 중 현저한 성장 억제를 보이는 2가지 세포주, 즉 MDAH 2774 및 OVCA 420의 G₂/M기 집단의 현저한 증가율을 확인했다.

도 53. MDA-MB-486 유방암 세포의 세포 생존율.

도 54. A549 종양 성장(A) 및 마우스 생존성에 미치는 방사선 조사 처리 전 Ad-mda7 투여 효과. A549 세포(5x10⁶)를 누드 마우스의 이종이식 종양으로서 성장시켰다. 이러한 종양 보유 마우스를 방사선(5Gy), Ad-mda7(3분획 중에 3x10¹⁰) 또는 이 둘의 조합으로 처리하고, 종양 부피를 실시예 27에 기술된 바와 같이 측정했다. 종양의 직경이 15mm가 되거나 궤양화되면 동물을 희생시켰다. 데이터는 평균값±SE를 나타낸다(A).

도 55. A549 종양 성장에 미치는 다양한 조합 치료 섭생 효과. 종양 보유 마우스를 다음과 같이 처리했다: 대조군, Ad-mda7(1일) + 방사선 조사(6일), Ad- mda7(5일) + 방사선 조사(6일) 또는 방사선 조사(6일) + Ad-mda7(7일).

도 56. TUNEL 면역조직화학 분석. 종양의 아폽토시스를 TUNEL 염색으로 처리한 후(8일) 분석하고, 광학 현미경(x400 배율)을 이용하여 아폽토시스성 세포를 계수했다. 아폽토시스 지수는 최소한 1000개 암세포의 백분율로서 나타냈다.

도 57. 양성 염색에 대한 면역조직화학을 통해 VEGF, bFGF 및 IL-8의 단백질 발현을 분석했다. 14일째 피하 종양을 수거했다. 양성 염색 세포는 광학 현미경(x400 배율)을 이용하여 계수하고 양성 세포의 백분율을 최소한 1000개 암세포의 백분율로서 계산했다(A, B, C).

도 58. 미세혈관 밀도는 CD31 양성 혈관 구조의 계수를 통해 측정했다.

도 59. HUVEC의 클론원성 생존. 12시간 동안 성장인자 중단 후, HUVEC를 MDA7 단백질(10ng/ml)(A), 안지오스타틴(100ng/ml;B) 또는 엔도스타틴(100ng/ml; C)에 12시간 동안 노출시켰다. 그 다음, 세포에 방사선을 조사하고(0 내지 6Gy), 수거한 뒤 정규 배지에 평판배양했다. 14일 후 콜로니를 염색하고 생존율을 측정했다. 데이터는 3회의 독립적 실험 후 얻은 평균값±SE를 나타낸다.

도 60. A549 세포(A) 및 CCD16 세포(B)의 클론원성 생존율. 세포를 12시간 동안 혈청 공급을 중단시킨 후, mda7 단백질(10ng/ml)을 함유하는 적응용 배지로 처리했다. 24시간 후, 세포에 방사선을 조사하고, 수거한 뒤 정규 배지에 평판배양했다. 14일간 항온배양 후, 콜로니를 계수하고 생존율을 측정했다.

도 61. 표적화 플라스미드 작제물(전체길이 작제물. 세포질용, 핵용 및 소포체(ER)용).

도 62. MDA-7의 ER 표적화는 콜로니 형성을 차단한다.

도 63. ER 표적화된 MDA-7은 아폽토시스-촉진성이다.

도 64. 난소암 세포주에서의 Ad-mda7에 의한 성장 억제.

도 65. Ad-mda7 처리된 난소암 세포의 세포 주기 분석. A: MDAH 2774; B: OVCA 420

도 66. 난소암 세포에서의 Ad-mda7에 의한 아폽토시스 유도.

도 67. MDA-7/IL-24는 종양 세포 이동을 억제한다. 폐종양 세포(A549 및 H1299)를 Ad-luc 또는 Ad-mda7로 처리했다. 6시간 동안 형질감염 후 세포를 수거하고, 트란스웰 유닛의 상층 챔버에 접종했다. A: 48시간 후, 막을 고정시켜 크리스탈 바이올렛으로 염색시킨 뒤 웰의 하층면으로 이동한 세포 수를 명시야 현미경을 이용하여 계수했다(패널 상: X200 배율). Ad-mda7로 처리한 세포는 PBS 또는 Ad-luc로 처리된 세포에 비해 유의적(P=0.002) 이동을 나타내지 않았다(패널 하). B: 24시간 및 48시간 처리 후 세포 생존성 분석 결과, 종양 세포 증식의 유의적 억제가 일어나지 않았음을 확인했다. 막대는 표준 오차를 나타낸다.

도 68. MDA-7/IL-24는 종양 세포 침입을 억제한다. 폐종양 세포(H1299 및 A549)를 PBS, Ad-luc(2500 vp/세포) 또는 Ad-mda7(2500 vp/세포)로 처리하거나, 또는 10μM LY 294002 또는 1㎍/ml MMP-II 억제제로 처리했다. 6시간 후, 세포를 수거하여 계수하고, 매트리겔 코팅 웰의 상층 웰에 첨가했다. 37℃에서 항온배양하여 세포의 침입이 일어나게 했다. 48시간 후, 세포를 고정시키고 크리스탈 바이올렛으로 염색했다. 웰의 하부 면으로 이동한 세포를 확인하여 X200 배율의 광학 현미경 하에서 계수했다. 처리 그룹 당 침입성 세포의 수를 맹검 방식으로 계수하고 3회의 독립적 실험 결과의 평균값으로 기록했다. Ad-mda7 처리된 세포는 PBS 또는 ad-luc 처리된 세포보다 덜한 침입성(P=0.001)으로 나타났다. MDA-7에 의해 매개되는 억제 효과는 LY294002 및 MMP-II 억제제에 의해 관찰되는 억제 효과와 유사했다. 막대는 표준 오차를 나타낸다.

도 69. MDA-7/IL-24는 폐 전이를 억제한다. A549 폐종양 세포를 생체외에서 PBS, Ad-luc 및 Ad-mda7로 처리했다. 6시간 후, 세포를 수거하고, PBS로 세척한 뒤 PBS에 재현탁시킨 뒤, 꼬리 정맥을 통해 누드 마우스 암컷에게 주사했다. 각 그룹 당 5마리 동물을 사용했다. 종양 세포 주사 3주 후, 동물을 CO₂ 흡입으로 안락사시키고 폐종양 혹을 해부 현미경 하에서 계수했다. Ad-mda7 처리된 종양 세포가 주사된 동물에서는 PBS 또는 Ad-luc 처리된 종양 세포가 주사된 동물에서보다 훨씬 적은 수의 폐종양(P=0.01)이 관찰되었다. 결과는 2회의 독립적 실험의 평균값을 나타낸다. 막대는 표준 오차를 나타낸다.

도 70. MDA-7/IL-24는 폐전이를 억제한다. 실험용 A549 vP 전이를 보유한 마우스는 처리하지 않거나(대조군) 또는 DOTAP:Chol.CAT 또는 DOTAP:Cho1-mda-7 복합체로 처리했다. 처리는 꼬리 정맥 주사를 통해 매일 6회 용량을 동물에게 주사하여 실시했다. 마지막 처리 3주 후 동물을 안락사시키고 폐종양의 수를 계수했다. DOTAP:Cho1-mda-7 복합체로 처리된 동물은, 미처리되거나 DOTAP:Cho1-CAT 복합체로 처리된 동물에 비해, 폐 전이의 유의적 억제를 나타냈다(P=0.001). 막대는 표준 오 차를 나타낸다.

도 71A-C. DOTAP:Cho1-mda-7 복합체는 피하 종양의 성장을 억제한다. 피하 종양 보유(A549 또는 UV223m) 누드 마우스 및 C3H 마우스를 그룹으로 나누고, 다음과 같이 총 6회 용량(50㎍/ml)을 매일 처리했다: 미처리, PBS, DOTAP:Cho1-LacZ 복합체 또는 DOTAP:Cho1-CAT 복합체, 및 DOTAP:Cho1-mda-7 복합체. A, A549. B, UV2237m. 각 시점은 각 그룹이 평균 종양 부피를 나타낸다. 막대는 표준 오차를 나타낸다. C. 처리 48시간 후 피하 종양을 수거하고 MDA-7 단백질 발현을 분석했다. DOTAP:Cho1-mda-7 복합체로 처리된 종양에서는, A549 종양 세포의 18% 및 UV2237m 종양 세포의 13%가 MDA-7 단백질을 생산하는 반면, 대조군 종양은 전혀 MDA-7 단백질을 생산하지 않았다.

도 72. MDA-7은 DOTAP:Cho1-mda-7 복합체 처리 후 아폽토시스성 세포 사멸을 유도한다. 무처리, PBS, DOTAP:Cho1-LacZ 또는 DOTAP:Cho1-CAT 복합체 또는 DOTAP:Cho1-mda-7 복합체 처리된 동물의 피하 종양(A549 및 UV2237m)을 수거하고 TUNEL 염색으로 아폽토시스성 세포 사멸을 분석했다. DOTAP:Cho1-mda-7 복합체로 처리된 종양에서 아폽토시스성 세포 사멸을 나타내는 세포의 백분율(A549에서 13%, UV2237m에서 9%)은 다른 처리 그룹에서보다 훨씬 높았다(P=0.001). 막대는 표준 편차를 나타낸다.

도 73. DOTAP:Cho1-mda-7 복합체는 종양 혈관신생을 억제한다. 무처리, PBS, DOTAP:Cho1-LacZ 또는 DOTAP:Cho1-CAT 복합체 또는 DOTAP:Cho1-mda-7 복합체 처리된 피하 종양(A549 및 UV2237m)을 CD31에 대해 염색하고 반정량적 분석을 실시 했다. CD31 양성의 내피세포 염색율은 다른 처리 그룹의 종양에서보다 DOTAP:Cho1-mda7-처리된 종양에서 휠씬 낮았다(P=0.01). 막대는 표준 편차를 나타낸다.

도 74. DOTAP:Cho1-mda-7 복합체는 실험적 폐 전이를 억제한다. 폐종양(A549, UV2237m)을 보유하는 nu/nu 또는 C3H 마우스를 총 6회 용량(50㎍//용량)의 PBS, DOTAP:Cho1-CAT 복합체 또는 DOTAP:Cho1-mda-7 복합체로 매일 처리했다. 그 결과, 전이성 종양 성장은 다른 두 대조 그룹에서보다 DOTAP:Cho1-mda-7 복합체로 처리된 두 누드 마우스 및 C3H 마우스에서 모두 유의적으로 억제되었다(P=<0.05). 막대는 표준편차를 나타낸다.

예시적 양태의 설명

A. MDA-7

본 발명의 조성물 및 방법은 MDA-7 폴리펩타이드 및 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 이용한다. MDA-7은 p53 야생형, p53 무효성(null) 및 p53 돌연변이체인 암세포들의 성장을 억제하는 것으로 밝혀진 또 다른 추정상의 종양 억제인자이다. 또한, p53 무효성 세포에서 관찰되는 아폽토시스 관련 B 유전자의 상향조절은 MDA-7이 p53-비의존적 기작을 이용하여 암세포의 파괴를 유도할 수 있음을 가리킨다. 본 출원인들이 관찰한 바에 따르면, 아데노바이러스를 매개로 한 MDA-7의 과발현은 이본쇄 RNA 활성화된 세린 트레오닌 키나제(PKR)를 급속 유도 및 활성화하고, 이어서 다른 PKR 표적 기질인 eIF-2α를 인산화하고 아폽토시스를 유도했다. 폐암 세포에서 2-아미노퓨린(2-AP)에 의한 PKR의 특이적 억제는 Ad-mda7 유도성 PKR 활성화, PKR 기질 표적 인산화 및 아폽토시스 유도를 소실시켰다. PKR 무효 성 섬유아세포에 의해 입증되는 바와 같이, Ad-mda7 아폽토시스는 기능성 PKR 경로에 의존적이다. 이러한 특성은 MDA-7이 PKR 유도인자 및 이에 따른 유도된 면역반응의 증강인자로서 광범위한 치료적, 예후적 및 진단적 효력이 있음을 시사한다.

PKR은 항바이러스 및 항세포 기능을 발휘하고, 세포 성장 및 분화(미국 특허 제6,326,466호; Feng et al., 1992; Petryshyn et al., 1988; Petryshyn et al., 1984; Judware et al., 1991), 종양 억제(Koromilas et al., 1992; Meurs et al., 1993), 및 시그날 형질도입(signal transduction) 경로의 조절(Kumar et al., 1994)를 비롯한 다수의 생리적 과정을 조절하는데 관여한다.

PKR의 상향조절은 다양한 암세포주에서 아폽토시스를 유도한다. 또한, 골수형성이상에서 염색체 5q상의 중요한 종양원성 IRF-1 유전자의 결실(Beretta et al., 1996)은 PKR 수준의 감소와 관련이 있는 것으로 나타나고, 폐암 및 결장직장암의 면역조직화학 분석으로 PKR 발현과 지속 생존과 관련이 있는 것으로 입증된다(Haines et al., 1992). PKR은 다수의 형질도입 경로의 활성화를 통해 항종양원성 활성을 매개하고, 궁극적으로 성장 억제와 아폽토시스 유도를 제공하는 것으로 보인다. 이러한 경로의 활성화는, 잠재적인 불활성 동종이량체 형태가 활성화 시그날에 의해 형태적 변화를 일으켜 자가인산화 및 활성화된 후 일어난다(Vattem et al., 2001). 일단 활성화되면, PKR은 다양한 기질 표적을 인산화할 수 있고, 이는 성장 조절과 아폽토시스 유도에 중요하다(Saelens et al., 2001; Sudhakar et al., 2000). 면역계의 자극은 아폽토시스와 연관되어 왔다(Albert et al., 1998; Chen et al., 2001; Saif-Muthama et al., 2000; Restifo, 2001). 또한, 아폽토시스의 인공적 유도는 아폽토시스성 세포의 형질감염에 의해 활성화된 수지상 세포의 자극 효과 때문에 백신의 면역원성을 증강시키는 것으로 확인되었다(Sasaki et al., 2001; Chattergoon et al., 2000).

mda-7 mRNA는 사람 PBMC에서 확인되었으나(Ekmekcioglu et al., 2001), 사람 MDA-7 단백질의 사이토킨 기능에 대해서는 보고된 바 없다. MDA-7은 그 유전자와 단백질 서열의 특성에 근거하여 IL-24로 지정되었다(NCBI 데이터베이스 수탁번호 XM_001405). 쥐 MDA-7 단백질 동족체 FISP(IL-4에 의해 유도되는 분비형 단백질)는 Th2 특이적 사이토킨인 것으로 보고되어 있다(Schaefer et al., 2001). FISP의 전사는 TCR과 IL-4 수용체 체결 및 녹아웃 연구를 통해 입증된 후속적 PKC 및 STAT6의 활성화에 의해 유도되었다. FISP 발현은 특성이 규명되었으나, 이것이 사이토킨일 것으로 추정되는 기능은 아직 밝혀지지 않았다¹⁷. 랫트 MDA-7 동족체인 C49a(Mob-5)는 mda-7 유전자와 78% 상동성이며, 상처 치유와 관련이 있다(Soo et al., 1999; Zhang et al., 2000). Mob-5는 또한 분비형 단백질로 보이고, ras 형질전환된 세포에서 추정상의 세포 표면 수용체가 확인되었다(Zhang et al., 2000). 이와 같이, mda-7 유전자 및 분비형 MDA-7 단백질의 동족체는 다양한 종에서 발현되고 분비된다. 하지만, MDA-7이 사이토킨 활성을 갖는지의 여부를 밝히는 연구 결과는 아직까지 나타나지 않고 있다. 이러한 활성은 항원의 면역원성을 증강시켜 다양한 질환과 감염을 치료하기 위한 분기가 될 것이다.

당해 mda-7 cDNA(서열번호 1)는 예상 크기가 23.8kDa인 206개 아미노산(서열 번호 2)의 진화상 보존된 신규 단백질을 암호화한다. 추론된 아미노산 서열은 시그날 서열의 특정을 가진 약 26 내지 45개의 소수성 신장부(stretch)를 함유한다. 단백질 서열은 인터루킨 10(IL-10)과 54% 동일한 42개 아미노산 신장부를 제외하고는 공지의 단백질과 유의적 상동성도 없다. 구조 분석을 통해, MDA-7(IL-BKW 또는 IL-20)은 사이토킨 계열(제WO 98/28425호, 참고원용됨)의 구조 특성을 보이는 것으로 결정되었다. 이러한 구조적 특성과 소형 아미노산 신장부에서의 한정된 동일성은 MDA-7의 세포외 기능을 암시한다. 원발성 및 전이 흑색종에 비해 정상 멜라닌세포에서의 mRNA 농도의 증가와 누드 마우스에서 종양 형성 증강을 통해 선별된 조기 수직 성장기 흑색종 세포에서의 MDA-7 발현의 감소에 의해 입증된 바와 의하면, MDA-7의 발현은 흑색종 진행과 역상관관계가 있다. MDA-7에 관한 추가 정보 및 데이터는 본원에 각 전문이 모두 인용되고 있는, 다음과 같은 특허 출원들을 참조할 수 있다[미국 특허 출원 제09/615,154호, 제10/017,472호, 제60/404,932호, 제60/370,335호, 제60/361,755호 및 2003년 3월 3일 Sunil Chada, Abujiang Pataer, Abner Mhashilkar, Rajagopal Ramesh, Jack Roth, and Steve Swisher의 명의로 출원된 "Methods for Enhancing Immune Induction Involving MDA-7" 명칭의 미국 비가특허 출원].

추가의 연구에서는 MDA-7의 상승 발현이 시험관내 암세포 성장을 억제하고, 사람 유방암 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도하며 누드 마우스에서 종양 성장을 억제한다는 것이 밝혀져 있다(Jiang et al., 1996 and Su et al., 1998). 지앙 등(1996)은 mda-7이 유방, 중추신경계, 자궁경부, 결장, 전립선 및 연결조직을 비롯한 다양한 기원의 암세포에서 강력한 성장 억제 유전자라는 발견을 보고했다. 결장 억제 분석은, MDA-7의 상승 발현이 사람 자궁경부 암종(HeLa), 사람 유방 암종(MCF-7 및 T47D), 결장 암종(LS174T 및 SW480), 비인두 암종(HONE-1), 전립선 암종(DU-145), 흑색종(HO-1 및 C8161), 다형성아교모세포종(GBM-18 및 T98G) 및 골육종(Saos-2)의 성장 억제를 증가시킴을 입증하는데 사용되었다. 정상 세포(HMEC, HBL-100 및 CREF-Trans6)에서의 mda-7 과발현은 한정된 성장 억제를 보였고, 이는 mda-7 형질전환유전자 효과가 정상 세포에서는 나타나지 않음을 시사한다. 이를 종합해보면, 이러한 데이터들은 MDA-7의 상승 발현에 의한 성장 억제가 정상 세포보다는 암세포에서보다 효과적이라는 것을 시사한다.

수(Su) 등(1998)은 MDA-7이 암세포 성장을 억제하는 기작에 대한 연구를 보고했다. 이러한 연구에서는, 유방암 세포주 MCF-7 및 T47D에서의 MDA-7의 이소 발현이 아폽토시스를 유도하고(세포 주기 분석 및 TUNEL 분석을 통해 검출됨), 정상 세포인 HBL-100에는 영향을 미치지 않는다고 보고했다. 아데노바이러스 mda-7("Ad-mda7")로 감염된 세포 유래의 세포 용균물의 웨스턴 블롯 분석에서는 아폽토시스 자극 단백질 BAX의 상향조절이 관찰되었다. Ad-mda7 감염은 MCF-7 및 T47D 세포에서만 BAX 단백질의 수준을 상승시켰고, 정상 HBL-100 또는 HMEC 세포에서는 상승시키지 않았다. 이러한 데이터들을 근거로, 이 연구진들은 MCF-7 종양 세포의 이종이식 종양 형성에 미치는 생체외 Ad-mda7 형질도입의 효과를 평가했다. 생체외 형질도입 평가 결과, 종양 이종이식 모델에서 종양 형성 및 진행이 억제됨이 확인되었다.

유전자 요법을 이용한 암 치료의 기본 양상은 아폽토시스의 유도이다. 이는, 암세포를 다른 요인에 대해 민감화하게 하거나 또는 직접 세포내 경로를 자극하여 아폽토시스를 유도함으로써 달성될 수 있다. 다른 암 치료법은 성장 종양에 필요한 영양소를 공급하기 위하여 암이 혈관신생의 유도를 필요로 함을 이용한다. 엔도스타틴과 안지오스타틴은 이러한 2가지 치료법의 예이다(WO 00/05356 및 WO 00/26368).

본 출원인은 혈관신생을 억제하는 방법을 발견했다. 이러한 신규 방법은 사람 mda-7을 암호화하는 핵산을 투여함을 포함한다. Ad-mda7은 시험관내에서 증식성 내피세포에 첨가했을 때 내피세포 분화를 억제하는 능력을 갖고 있다. mda-7 상승 발현의 항혈관신생 효과는 이 분자가 혈관신생 관련 질환, 특히 암의 이상적인 유전자 요법 치료제로서 작용하게 한다. 종양 세포로의 투여 뿐만 아니라, 내피세포를 포함할 수 있는 항혈관신생 표적 세포로의 바이러스 또는 비바이러스 벡터를 통한 mda-7 암호화 핵산의 투여가 고려된다. 이러한 복합 치료는 임상의가 종양 세포의 직접 형질도입 뿐만 아니라 혈관신생 억제 효과도 이용할 수 있게 한다. 즉, 다른 표적 세포 집단으로 전달될 수 있는 2가지 별도 양상을 이용하여 종양을 영양중단 및 공격할 수 있다.

혈관신생 관련 질환에는 예를 들면, 고형암, 혈액계 종양(예, 백혈병) 및 종양 전이 등과 같은 혈관신생 의존 암; 양성 종양, 예를 들면 혈관종, 청각 신경종, 신경섬유종, 트라코마 및 화농 육아종; 류마티스성 관절염; 건선; 안구 혈관신생 질환, 예를 들면 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증, 황반 변성, 각막 이식 거 부, 신생혈관 녹내장, 수정체뒤 섬유증식, 피부홍조; 오슬러-웨버(Osler-Webber) 증후군; 심근 혈관신생; 플라크 신생혈관증식; 모세혈관확장증; 혈우병 관절; 혈관섬유종; 및 상처 과립이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 내피세포 증식 억제 방법은 내피세포의 과잉 또는 이상 자극이 있는 질환의 치료에 유용하다. 이러한 질환에는 장유착, 죽상동맥경화증, 피부경화증 및 비대 흉터, 즉 켈로이드가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 방법은 병리학적 결과로서 혈광형성을 나타내는 질환, 예를 들면 고양이긁힘병(로첼레 미날리아 퀸토사(Rochele minalia quintosa)) 및 궤양(헬로박터 파이롤리(Helobacter pylori))의 치료에도 유용하다.

본 발명의 방법은 내피세포 관련 질환 및 장애의 치료에도 유용하다. 특히 중요한 내피 세포 과정은 전술한 바와 같이 혈관신생, 즉 혈관의 형성이다. 혈관신생 관련 질환은 본 발명에 기술된 방법을 이용하여 MDA-7의 상승 발현을 통해 내피세포 증식을 억제함으로써 치료할 수 있다.

이들 구조물의 작동성에 관하여 특정 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, mda-7은 수용체 결합과 관련있는 C-말단에 위치하는 D-나선 영역에서 종에 걸쳐 IL-10과 상당한 아미노산 상동성이 있다. 따라서, 이러한 30 내지 35개 아미노산 영역을 함유하는 분자가 특히 바람직하다.

따라서, 본 발명의 일 양태에서, 혈관신생 관련 질환의 치료는 치료용 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 투여를 포함한다. 다른 양태에서, 치료는 질병에 걸린 세포 또는 내피 세포를 포함한 표적에 mda-7를 암호화하는 핵산 발현 작제물을 투 여함을 포함한다. 표적 세포는 상기 작제물을 흡수하여 핵산에 의해 암호화된 치료용 폴리펩타이드를 발현하고, 이로써 표적 세포의 분화가 억제되는 것으로 고려된다. MDA-7을 발현하는 세포는 그 다음 발현 작제물에 의해 형질도입 또는 감염되지 않은 주변 세포와 상호작용할 수 있는 단백질을 분비할 수 있다. 이런 방식으로 종양의 새로운 혈관계를 확립하는데 필요한 복잡한 상호작용이 억제되고 종양의 치료가 달성된다.

본 발명의 다른 양태에서는, 혈관신생 관련 질환이 MDA-7 또는 이를 발현하는 작제물에 의해 치료될 수 있다. 본 발명의 치료가 효과적일 것으로 생각되는 혈관신생 관련 질환의 일부 예에는 건선, 류마티스성 관절염(RA), 염증성 장 질환(IBD), 골관절염(OA) 및 폐의 종양전 병변이 있다.

또 다른 양태에서는, 다양한 암 상태의 치료는 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어, 흑색종, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 폐암, 간암종, 망막모세포종, 성상아교세포종, 아교모세포종, 백혈병, 신경모세포종, 두부암, 경부암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 골암, 정소암, 난소암, 중피종, 자궁경부암, 위장암, 림프종, 뇌암, 결장암 또는 방광암일 수 있다. 또 다른 바람직한 양태에서 상기 혈관신생 관련 질환은 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 골관절염, 평활근종, 선종, 지방종, 혈관종, 섬유종, 혈관 폐색, 재협착, 죽상동맥경화증, 종양전 병변, 상피내암종, 경구 털백색판증 또는 건선이 치료 대상일 수 있다.

본 발명의 특정 양태에서, mda-7은 MDA-7 폴리펩타이드를 발현하는 핵산으로서 제공된다. 특정 양태에서, 핵산은 바이러스 벡터이고, 이러한 바이러스 벡터 용 량은 적어도 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 10¹⁵, 또는 그 이상의 pfu 또는 바이러스 입자이다. 특정 양태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 아데노관련 바이러스 벡터, 폴리오마 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 랍도바이러스 벡터 또는 헤르페스바이러스 벡터이다. 가장 바람직하게는, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 다른 특정 양태에서, 핵산은 비바이러스 벡터이다.

특정 양태에서, 상기 폴리펩타이드를 발현하는 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 본 발명에 적당한 프로모터의 비제한적 예로는 CMV IE, 덱틴-1, 덱틴-2, 사람 CD11c, F4/80, SM22 또는 MHC II형 프로모터가 포함되지만, mda-7 유전자 또는 전술한 바와 같은 본 발명의 면역원의 발현을 유도하는데 유용하다면 어떠한 프로모터라도 본 발명의 실시에 사용할 수 있는 것으로 생각된다.

바람직하게는, 본 발명의 핵산은 주사를 통해 투여된다. 다른 양태로는 다중 주사를 통한 핵산 투여가 포함된다. 특정 양태에서, 주사는 질병이나 종양 부위의 국소, 국부 또는 말단에 실시되는 것이다. 일부 구체적으로, 핵산 투여는 연속 주입, 종양내 주사, 복강내 또는 정맥내 주사를 통해 실시된다. 다른 양태에서, 핵산은 종양 절제 전 또는 후; 또는 전과 후에 종양 상에 투여된다. 또는, 핵산은 화학요법, 생물요법, 면역요법, 수술 또는 방사선요법 처리 전, 처리 동안 또는 처리 후에 투여된다. 환자는 사람인 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 환자는 암환자이다.

B. 핵산, 벡터 및 조절 시그날

본 발명은 mda-7 유전자와 관련있는 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 핵산 분자 및 이의 유전자 산물 MDA-7에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 면역원성 분자와 관련있는 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 분자에 관한 것이다. 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 분자는 포유동물 세포로부터 분리 및 정제할 수 있다. mda-7 유전자 산물과 관련있는 핵산 분자인 분비형 또는 전체길이 형태의 분리 및 정제된 MDA-7 핵산 분자는 RNA 또는 DNA 형태일 수 있다. 이와 마찬가지로, 면역원성 분자와 관련있는 핵산분자도 RNA 또는 DNA 형태일 수 있다. 본 명세서에 사용된 "RNA 전사체"란 용어는 DNA 핵산 분자의 전사 산물인 RNA 분자를 의미한다. 이러한 전사체는 1개 또는 2개 이상의 폴리펩타이드를 암호할 수 있다.

본 명세서에 사용된 "폴리뉴클레오타이드"란 용어는 총 게놈 핵산으로부터 분리된 핵산 분자인 RNA 또는 DNA를 의미한다. 따라서, "MDA-7을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드"는 MDA-7 암호 서열을 함유하는 핵산 분절로서, 총 게놈 DNA 및 단백질로부터 분리되거나 정제되어 이들이 제거된 핵산 분절을 의미한다. 본 명세서에서 MDA-7을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산의 기능이나 활성이 언급된다면, 이러한 폴리뉴클레오타이드는 면역 반응을 향상시키는 특성을 보유한 분자를 암호화함을 의미한다. 또한, "면역원을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드"는 면역원성 암호 서열을 함유하는 핵산 분절로서, 총 게놈 DNA 및 단백질로부터 분리되거나 정제되어, 이들이 제거된 핵산 분절을 의미한다. 본 명세서에서 면역원을 암호화하는 면역유전자의 기능이나 활성이 언급될 때, 이 폴리뉴클레오타이드는 인체내에서 면역 반응을 유도하는 특성을 보유한 면역원성 분자를 암호화함을 의미한다.

"cDNA"란 용어는 주형으로서 RNA를 사용하여 제조된 DNA를 의미하는 것이다. 게놈 DNA 또는 RNA 전사체와 달리 cDNA 사용시의 장점은 안정성 및 재조합 DNA 기술을 이용하여 서열을 조작하는 능력이다(Sambrook, 2001; Ausubel, 1996 참조). 이 때 종종 전체 게놈 서열 또는 부분적 게놈 서열이 약간 있는 때도 있을 수 있다. 또는, cDNA는 폴리펩타이드의 암호 영역을 나타내고 인트론과 다른 조절 영역이 없기 때문에 유리할 수도 있다.

또한, 소정의 MDA-7을 암호화하는 핵산 또는 소정 세포로부터 유래하는 mda-7 유전자는, 핵산 서열이 약간 다르지만 그럼에도 불구하고 MDA-7 폴리펩타이드를 암호하는 천연 변이체 또는 변형체로 대표될 수 있는 것으로 고려되어야 하고, 사람의 MDA-7 폴리펩타이드는 특정 양태이다. 결론적으로, 본 발명은 최소의 아미노산 변화를 갖고 있지만 동일한 활성을 보유하는 MDA-7 유도체도 포함한다.

"유전자"란 용어는 간단히 기능성 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 암호화 핵산 단위를 의미하기 위해 사용된다. 당업자라면 잘 알고 있듯이, 이러한 기능성 용어에는 단백질, 폴리펩타이드, 도메인, 펩타이드, 융합 단백질 및 돌연변이체를 발현하거나, 또는 발현하도록 적합화될 수 있는 게놈 서열, cDNA 서열 및 이보다 작은 조작된 유전자 분절이 포함된다. MDA-7 또는 다른 치료용 폴리펩타이드, 예를 들면 면역원을 암호화하는 핵산 분자는 다음과 같은 길이를 갖거나 최소한 다음과 같은 길이를 갖는 인접 핵산 서열을 함유할 수 있다: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320,330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000, 6100, 6200, 6300, 6400, 6500, 6600, 6700, 6800, 6900, 7000, 7100, 7200, 7300, 7400, 7500, 7600, 7700, 7800, 7900, 8000, 8100, 8200, 8300, 8400, 8500, 8600, 8700, 8800, 8900, 9000, 9100, 9200, 9300, 9400, 9500, 9600, 9700, 9800, 9900, 10000, 10100, 10200, 10300, 10400, 10500, 10600, 10700, 10800, 10900, 11000, 11100, 11200, 11300, 11400, 11500, 11600, 11700, 11800, 11900, 12000 또는 그 이상의 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드 또는 염기쌍. 이러한 서열은 서열번호 1(MDA 암호화 서열)과 동일하거나 상보성일 수 있다.

"다른 암호 서열로부터 실질적으로 분리된"이란, 관심대상의 유전자가 핵산 분절의 암호 영역의 일부를 형성하고 있고, 상기 분절이 자연발생 암호 핵산의 상당 부분, 예를 들면 큰 염색체 단편이나 다른 기능성 유전자 또는 cDNA 암호 영역을 함유하지 않는 것을 의미한다. 물론, 이는 본래 분리된 핵산 분절을 의미하지만, 이후에 사람의 조작을 통해 상기 분절에 첨가된 유전자 또는 암호 영역을 배제하는 것은 아니다.

특정 양태에서, 본 발명은 아미노산 서열내에, "사람 MDA-7" 또는 "MDA-7 폴리펩타이드"로도 지칭되는 MDA-7에 상응하는, 서열번호 2에 따른 또는 본질적으로 서열번호 2에 기재된 바와 같은 인접 아미노산 서열을 함유하는, MDA-7 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열이 통합되어진 분리된 DNA 분절 및 재조합 벡터에 관한 것이다.

본질적으로 "실시예 2에 기재된 바와 같은 서열"이란 용어는 당해 서열이 서열번호 2의 일부에 실질적으로 상응하고, 서열번호 2의 아미노산과 동일하지 않거 나, 그 아미노산의 생물학적 기능성 등가물이 아닌 아미노산은 비교저 소수로 갖는 것을 의미한다.

"생물학적 기능성 등가물"이란 용어는 당업계에 익히 이해되고 있으며, 본 명세서에 보다 상세히 설명되고 있다. 따라서, 서열번호 2의 아미노산과 동일하거나 기능상 등가물인 아미노산의 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 및 이 중의 임의의 범위, 예를 들면 약 70% 내지 약 80%, 보다 바람직하게는 약 81% 내지 약 90%; 또는 보다 더 바람직하게는, 약 91% 내지 약 99%를 갖는 서열은, 이러한 단백질의 생물학적 활성이 유지되기만 한다면 본질적으로 "서열번호 2에 기재된 바와 같은" 서열이다. 특정 양태에서, MDA-7 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드, 또는 생물학적 기능성 등가물의 생물학적 활성에는 면역 반응 향상이 포함된다. 또한, 특정 양태에서, 면역원, 면역원성 분자(예를 들면, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드), 또는 생물학적 기능성 등가물의 생물학적 활성에는 면역원성이 포함되며, 이는 인체내에서 면역 반응을 유도하는 분자의 특성을 의미하는 것이다. 다른 특정 양태에서, 본 발명은 서열번호 1에 실질적으로 기재된 바와 같은 핵산 서열을 자신의 서열 중에 함유하고 있는 분리된 DNA 분절 및 재조합 벡터에 관한 것이다. 본질적으로 "서열번호 1에 기재된 바와 같은"이란 표현은 전술한 바와 같은 의미로 사용된 것으로서, 핵산 서열이 서열번호 1의 일부 서열에 실질적으로 상응하고, 서열번호 1의 코돈과 동일 하지 않거나 기능성 등가물이 아닌 코돈을 비교적 소수로 갖는 것을 의미한다. 또한, MDA-7 활성을 나타내는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 DNA 분절은 대부분 일부일 것이다.

특정 양태에서, 본 발명은 아미노산 서열내에 MDA-7 폴리펩타이드에 따른 또는 MDA-7 폴리펩타이드에 본질적으로 상응하는 연속적 아미노산 서열을 함유하는 MDA-7 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열이 통합되어진 분리된 핵산 분절 및 재조합 벡터에 관한 것이다. 다른 양태에서, 본 발명은 아미노산 서열 내에 면역원과 일치하거나 또는 면역원에 본질적으로 상응하는 인접 아미노산 서열을 함유하는 면역원, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열이 통합되어진 분리된 핵산 분절 및 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 벡터는 기본적으로 조절성 진핵세포 프로모터(즉, 유도성, 억제성, 조직 특이성)의 조절하에 있는 치료용 mda-7 유전자로 세포를 형질전환시키도록 설계된다. 또한, 벡터는 어떤 다른 이유 없이 시험관내에서 조작 용이성을 도모한다면 선별가능한 마커를 함유할 수 있다. 하지만, 선별가능한 마커는 재조합 세포 생산에 중요한 역할을 담당할 수도 있다.

다음 표 1과 2는 본 발명에 따라 사용할 수 있는 다양한 조절 시그날을 기술한 것이다.

유도성 요소
요소	유도제	참조문헌
MT II	포르볼 에스테르(TFA) 중금속	Palmiter et al., 1982; Haslinger et al., 1985; Searle et al., 1985; Stuart et al., 1985; Imagawa et al., 1987, Karin et al., 1987; Angel et al., 1987b; McNeall et al., 1989
MMTV(마우스 유선 종양 바이러스)	글루코코르티코이드	Huang et al., 1981; Lee et al., 1981; Majors et al., 1983 ; Chandler et al., 1983; Lee et al., 1984; Ponta et al., 1985 ; Sakai et al., 1988
β-인터페론	폴리(rI)x 폴리(rc)	Tavaernier et al., 1983
아데노바이러스 5 E2	ElA	Imperiale et al., 1984
콜라게나제	포르볼 에스테르(TPA)	Angel et al., 1987a
스토로멜리신	포르볼 에스테르(TPA)	Angel et al., 1987b
SV40	포르볼 에스테르(TPA)	Angel et al., 1987b
쥐 MX 유전자	인터페론 뉴캣슬병 바이러스	Hug et al., 1988
GRP78 유전자	A23187	Resendez et al., 1988
α-2-마크로글로불린	IL-6	Kunz et al., 1989
비멘틴	혈청	Rittling et al., 1989
MHC I형 유전자 H-2Kb	인터페론	Blanar et al., 1989
HSP70	E1A, SV40 대형 T 항원	Taylor et al., 1989,1990a, 1990b
프로리페린	포르볼 에스테르-TPA	Mordacq et al., 1989
종양 괴사 인자	PMA	Hensel et al., 1989
갑상선 자극 α유전자	갑상선 호르몬	Chatterjee et al., 1989

기타 프로모터 및/또는 인핸서 요소
프로모터/인핸서	참조문헌
면역글로불린 중쇄	Banerji et al., 1983; Gilles et al., 1983 ; Grosschedl et al., 1985; Atchinson et al., 1986, 1987; Imler et al., 1987; Weinberger et al., 1984; Kiledjian et al., 1988; Porton et cul. ; 1990
면역글로불린 경쇄	Queen et al., 1983; Picard et al., 1984
T-세포 수용체	Luria et al., 1987; Winoto et al., 1989; Redondo et al. ; 1990
HLA DQ α 및/또는 DQ β	Sullivan et al., 1987
β-인터페론	Goodbournet aL, 1986 ; Fujitan et al., 1987; Goodbourn et al., 1988
인터류킨-2	Greene et al., 1989
인터류킨-2 수용체	Greene et al., 1989; Lin et al., 1990
MHC 제II형 5	Koch et al., 1989
MHC 제II형 HLA-Dra	Sherman et al., 1989
β-액틴	Kawamoto et al., 1988; Ng et al., ; 1989
근육 크레아틴 키나제(MCK)	Jaynes et al., 1988; Horlick et al., 1989 ; Johnson et al., 1989
전구알부민(트랜스티레틴)	Costa et al., 1988
엘라스타제 I	Omitz et al., 1987
메탈로티오네인 (MTII)	Karin et al, 1987; Culotta et al., 1989
콜라게나제	Pinkert et al., 1987; Angel et al., 1987
알부민	Pinkert et al., 1987; Tronche et al., 1989,1990
α-태아단백	Godbout et al., 1988; Campere et al., 1989
γ-글로빈	Bodine et al., 1987; Perez-Stable et al., 1990
P-글로빈	Trudel et al., 1987
c-fos	Cohen et al., 1987
c-HA-ras	Triesman, 1986; Deschamps et al., 1985
인슐린	Edlund et al., 1985
신경 세포 부착 분자(NCAM)	Hirsh et al., 1990
α_l-안티트리파인	Latimer et al., 1990
H2B (TH2B) 히스톤	Hwang et al., 1990
마우스 및/또는 I형 콜라겐	Ripe et al., 1989

프로모터 및/또는 인핸서
프로모터/인핸서	참조문헌
글루코스-조절된 단백질 (GRP94 및 GRP78)	Chang et al., 1989
랫트 성장 호르몬	Larsen et al., 1986
사람 혈청 아밀로이드 A (SAA)	Edbrooke et al., 1989
트로포닌 I (TN I)	Yutzey et al., 1989
혈소판 유래의 성장 인자 (PDGF)	Pech et al., 1989
뒤시엔느 근이영양증	Klamut et al., 1990
SV40	Banerji et al., 1981; Moreau et al., 1981; Sleigh et al., 1985; Firak et al., 1986; Herr et al., 1986; Imbra et al., 1986; Kadesch et al., 1986; Wang et al., 1986; Ondek et al., 1987; Kuhl et al., 1987; Schaffner et al., 1988
폴리오마	Swartzendruber et al., 1975; Vasseur et al., 1980; Katinka et al., 1980, 1981; Tyndell et al., 1981; Dandolo et al., 1983; de Villiers et al., 1984; Hen et al., 1986; Satake et al., 1988; Campbell et al., 1988
레트로바이러스	Kriegler et al., 1982, 1983; Levinson et al., 1982; Kriegler et al., 1983, 1984a, b, 1988; Bosze et al., 1986; Miksicek et al., 1986; Celander et al., 1987; Thiesen et al., 1988; Celander et al., 1988; Chol et al., 1988; Reisman et al., 1989
파필로마 바이러스	Campo et al., 1983; Lusky et al., 1983; Spandidos and Wilkie, 1983; Spalholz et al., 1985; Lusky et al., 1986; Cripe et al., 1987; Gloss et al., 1987; Hirochika et al., 1987; Stephens et al., 1987
B형 간염 바이러스	Bulla et al., 1986; Jameel et al., 1986; Shaul et al., 1987; Spandau et al., 1988; Vannice et al., 1988
사람 면역결핍 바이러스	Muesing et al., 1987; Hauber et al., 1988; Jakobovits et al., 1988; Feng et al., 1988; Takebe et al., 1988; Rosen et al., 1988; Berkhout et al., 1989; Laspia et al., 1989; Sharp et al., 1989; Braddock et al., 1989
사이토메갈로바이러스(CMV)	Weber et al., 1984; Boshart et al., 1985; Foecking et al., 1986
기본 원숭이 백혈병 바이러스	Holbrook et al., 1987; Quinn et al., 1989

진핵 세포에서 단백질 암호 유전자의 전사를 조절하는 프로모터와 인핸서는 다수의 유전 요소로 구성되어 있다. 세포 기구는 각 인자에 의해 전달된 조절 정보를 수집하고 통합하여 상이한 유전자에 의한 독특하고 종종 복잡한 전사 조절 패턴을 발생시킨다.

본원에 사용된 "프로모터"란 용어는 RNA 폴리머라제 II의 개시 부위 주위에 군집되어 있는 전사 조절 모듈 그룹을 의미한다. 프로모터가 구성되는 방식에 대한 대부분의 사고는 HSV 티미딘 키나제(tk)용 프로모터 및 SV40 초기 전사 단위를 비롯한 여러 바이러스 프로모터의 분석으로부터 나온것이다. 이러한 연구들은 최근 많은 작업을 통해 보강되어, 프로모터가 각각 약 7 내지 20bp의 DNA로 구성되고 전사 활성인자 단백질에 대한 하나 이상의 인식 부위를 함유하고 있는 분리된 기능성 모듈로 구성되어 있음을 밝히고 있다.

각 프로모터 중의 적어도 하나의 모듈은 RNA 합성에 대한 개시 부위에 위치하는 작용을 한다. 이러한 프로모터로서 가장 널리 알려진 예는 TATA 박스이지만, 일부 프로모터, 예를 들면 포유동물의 말단 데옥시뉴클레오티딜 트란스퍼라제 유전자의 프로모터 및 SV40 후기 유전자의 프로모터에는 TATA 박스가 없고, 개시 부위 자체와 중첩되는 별개 요소가 개시 위치에 고정되도록 돕는다.

또 다른 프로모터 요소는 전사 개시 빈도를 조절한다. 일반적으로, 이러한 프로모터는 개시 부위의 상류에서 30 내지 110bp 영역에 위치해 있지만, 최근에는 다수의 프로모터가 이러한 기능성 요소를 개시 부위의 하류에 함유하는 것으로 밝혀지기도 했다. 요소들 사이의 간격은 유동적이어서, 요소들이 서로 전위되거나 이동될 때에도 프로모터 기능은 보존되어진다. tk 프로모터의 경우, 요소들 사이의 간격은 50bp 떨어진 곳까지 증가될 수 있다. 활성이 경감되기 시작하기 전에 프로모터에 따라서, 각 요소들은 협동적으로 또는 독립적으로 전사를 활성화하는 기능을 할 수 있는 것으로 나타난다.

인핸서는 본래 동일 DNA 분자 상의 먼 거리에 위치한 프로모터로부터 전사를 증가시키는 유전 요소로서 검출되었다. 이러한 상당한 거리 너머로 작용하는 능력은 원핵세포 전사 조절에 관한 고전적인 연구에서는 선례가 거의 없는 것이다. 인핸서 활성을 갖는 DNA 영역이 프로모터와 매우 유사하게 구성된다는 사실은 이후 연구에서 밝혀졌다. 즉, 인핸서는 1종 이상의 전사 단백질에 각각 결합하는 많은 개별 인자들로 구성되어진다.

인핸서와 프로모터 사이의 기본적인 차이는 작동성이다. 인핸서 영역은 모두 일정 거리를 두고 전사를 자극할 수 있어야 하는 반면, 프로모터 영역이나 이의 성분 요소는 그럴 필요가 없다. 반면에, 프로모터는 특정 부위에서 특정 배향으로 RNA 합성 개시를 유도하는 하나 이상의 요소를 갖고 있어야 하는 반면, 인핸서는 이러한 특이성이 없다. 이러한 작동성의 차이 외에는 인핸서와 프로모터는 매우 유사한 실체이다.

프로모터와 인핸서는 세포내에서 전사를 활성화시키는 동일한 일반 기능을 갖고 있다. 이들은 종종 중첩되고 인접되어 있어서, 종종 모듈 구성이 매우 유사한 것으로 보인다. 이러한 고찰을 종합해보면, 인핸서와 프로모터는 상동성 실체로서, 이들 서열에 결합된 전사 활성화 단백질은 세포 전사 기구와 기본적으로 동일한 방식으로 상호작용할 수 있을 것으로 생각된다.

일부 양태에서, 본 발명에 사용되는 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터이다. 이 프로모터는 벡터 pcDNAIII 중에서 인비트로겐으로부터 상업적으로 입수할 수 있는데, 이는 본 발명에 일부 사용되고 있다. 또한, 본 발명에는 덱틴-1 프로모터 및 덱틴-2 프로모터도 유용하다. 이하에는 본 발명과 함께 사용될 수 있는 또 다른 바이러스 프로모터, 세포 프로모터/인핸서 및 유도성 프로모터/인핸서를 기재했다. 또한, 임의의 프로모터/인핸서 조합(진핵세포 프로모터 데이터 베이스 EPDB에 따라서)은 올리고사카라이드 프로세싱 효소, 단백질 폴딩 부속 단백질, 선별가능한 마커 단백질 또는 관심대상의 이종 단백질을 암호화하는 구조 유전자의 발현을 유도하는데 사용될 수도 있다.

유용성이 입증된 또 다른 시그날에는 폴리아데닐화 시그날이 있다. 이 시그날은 사람 성장 호르몬(hGH) 유전자, 소 성장 호르몬(BGH) 유전자 또는 SV40으로부터 수득할 수 있다.

내부 리보솜 결합 부위(IRES) 요소의 사용은 다중유전자 정보 또는 폴리시스트론성 정보 생성에 이용될 수 있다. IRES 인자는 5-메틸화된 캡에 의존적인 해독의 리보솜 스캐닝 모델을 대체하고 내부 부위에서 해독을 개시할 수 있다(Pelletier and Sonenberg, 1988). 피코나바이러스 과에 속하는 두 성분(소아마비 및 뇌척수심근염) 유래의 IRES 인자(Pelletier and Sonenberg, 1988) 및 포유동물 정보 유래의 IRES(Macejak and Sarnow, 1991)도 개시되어 있다. IRES 인자는 이종의 오픈 리딩 프레임에 연결될 수 있다. 다수의 오픈 리딩 프레임은 각각 IRES에 의해 이격되면서 함께 전사되어 폴리시스트론성 정보를 생성할 수 있다. IRES 인자에 의하면 각각의 오픈 리딩 프레임을 효과적인 해독을 위해 리보솜에 접근될 수 있다. 다수 유전자는 하나의 프로모터/인핸서를 사용하여 효과적으로 발현되어 단일 정보를 전사시킬 수 있다.

어떤 경우든지, 프로모터는 유전자 상류에 기능적으로 위치되었을 때 그 유전자의 발현을 유도하는 DNA 인자로서 이해되어야 한다. 본 발명에 따른 대부분의 돌연변이유전자 작제물은 프로모터 인자의 하류에 기능적으로 배치되어진다.

본 발명의 조성물 및 방법은 본 발명의 조성물을 환자에게 투여하기 위해 제공된다.

1. 바이러스 형질전환

a. 아데노바이러스 감염

재조합 DNA를 전달하는 1가지 방법은 아데노바이러스 발현 벡터를 사용하는 것이다. 아데노바이러스 벡터는 게놈 DNA로의 통합능이 낮은 것으로 알려져 있지만, 이러한 특징은 이들 벡터의 높은 유전자 전이율에 의해 상쇄되어진다. "아데노바이러스 발현 벡터"란 표현은 (a) 작제물의 패키징을 보조하기에 충분하고, (b) 클로닝된 재조합 유전자 작제물을 궁극적으로 발현시키기에 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 작제물을 포함하는 것이다.

아데노바이러스 벡터는 복제 결손형이거나 또는 적어도 조건 결손형일 수 있으나, 이러한 아데노바이러스 벡터의 본성은 본 발명의 성공적인 실시에 중요한 역할을 하는 것으로 생각되지 않는다. 아데노바이러스는 42종의 공지된 혈청형 또는 서브그룹 A 내지 F 중 하나일 수 있다. 아데노바이러스 5형(서브그룹 C)는 본 발명에 유용한 조건 복제 결손 아데노바이러스 벡터를 수득하기 위한 일부 출발 물질이다. 이는, 아데노바이러스 5형이 상당한 생화학적, 유전적 정보가 공지되고 오래전부터 벡터로서 아데노바이러스를 이용하는 다양한 작제에 사용되어 온 사람 아데노바이러스이기 때문이다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 벡터 전형은 복제 결손성이고 아데노바이러스 E1 영역이 없는 것으로서, 이러한 벡터는 E1 암호 서열이 제거된 위치에 형질전환용 작제물을 도입시킬 수 있어 매우 편리하다. 하지만, 아데노바이러스 서열 내의 작제물 삽입 위치는 본 발명에 중요한 요소가 아니다. 즉, 당해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 칼슨 등(Karlsson et al., 1986)에 의해 기술된 바와 같은 E3 치환 벡터 중의 결실된 E3 영역 대신 삽입되거나 또는 헬퍼 세포주 또는 헬퍼 바이러스가 E4 결손을 보충하고 있는 E4 영역에 삽입될 수도 있다.

아데노바이러스 성장과 조작은 당업계에 공지되어 있고, 시험관내 및 생체내에서 다양한 숙주 범위를 나타낸다. 이 그룹의 바이러스는 높은 역가(예를 들면, 1ml 당 10⁹ 내지 10¹¹ 플라크 형성 단위)로 수득될 수 있고 감염성도 높다. 아데노바이러스의 생활사에는 숙주 세포 게놈으로의 통합이 요구되지 않는다. 아데노바이러스 벡터에 의해 전달되는 이종 유전자는 에피솜이어서 숙주 세포에 미치는 유전자독성이 낮다. 야생형 아데노바이러스를 이용한 백신 연구에서 부작용에 대해 보고된 적이 없는 바(Couch et al., 1963; Top et al., 1971), 이는 생체내 유전자 전달 벡터로서 안정성과 치료능이 있음을 증명한다.

b. 레트로바이러스 감염

레트로바이러스는 자신의 RNA를 역전사 과정을 통해 감염 세포 중에서 이본쇄 DNA로 전환시키는 성질을 특징으로 하는 일본쇄 RNA 바이러스 그룹이다(Coffin, 1990). 그 결과 수득되는 DNA는 그 다음 프로바이러스로서 세포 염색체 중에 안정적으로 통합되고 바이러스 단백질의 합성을 유도한다. 이러한 통합은 바이러스 유전자 서열을 수용체 세포 및 그 후손들 중에 잔류시킨다.

레트로바이러스 벡터 작제를 위해서, 당해 유전자를 암호하는 핵산을 바이러스 게놈 중의 특정 바이러스 서열 위치에 삽입하여 복제 결손형 바이러스를 제작한다. 비리온 제조를 위해서는 gag, pol 및 env 유전자를 함유하고 LTR과 패키징 성분은 함유하지 않는 패키징 세포주를 제작한다(Mann et al., 1983). 이러한 세포주로, 레트로바이러스 LTR 및 패키징 서열과 함께 cDNA를 함유하는 재조합 플라스미드를 도입시키면(예를 들면, 인산칼슘 침전법으로), 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체는 바이러스 입자 중으로 패키징되어, 배양액 중으로 분비되어진다(Nicolas and Rubenstein; 1988; Temin, 1986; Mann et al. 1983). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배양액을 그 다음 수집하고, 경우에 따라 농축시킨 뒤, 유전자 전달용으로 사용한다. 레트로바이러스 벡터는 다양한 종류의 세포를 감염시킬 수 있다. 하지만, 통합과 안정한 발현은 숙주 세포의 분열을 필요로 한다(Paskind et al., 1975).

c. AAV 감염

아데노관련 바이러스(AAV)는 본 발명에 사용되기에 바람직한 벡터 시스템인데, 그 이유는 이 바이러스가 통합 빈도가 높고 비분열 세포도 감염시킬 수 있어 조직 배양 중의 포유동물 세포로 유전자를 전달하기에 유용하기 때문이다(Muzyczka, 1992). AAV는 감염의 다양한 숙주 범위를 갖고 있고(Tratschin et al., 1984 ; Laughlin et al., 1986 ; Lebkowski et al., 1988 ; McLaughlin et al., 1988), 이는 본 발명에 사용하기에 적당하다는 것을 의미한다. rAAV 벡터의 작제 및 사용에 관한 상세한 설명은 본원에 참고원용되는 미국 특허 제5,139,941호 및 미국 특허 제4,797,368호에 기술되어 있다.

유전자 전달에서의 AAV의 용도를 입증한 연구는 문헌[LaFace et al. (1988); Zhou et al.(1993); Flotte et al.(1993); 및 Walsh et al.(1994)]에 기술되어 있다. 재조합 AAV 벡터는 마커 유전자(Kaplitt et aL, 1994; Lebkowski et al., 1988 ; Samulski et al., 1989; Shelling and Smith, 1994; Yoder et al., 1994; Zhou et al., 1994; Hermonat and Muzyczka, 1984 ; Tratschin et al., 1985; McLaughlin et al., 1988) 및 사람 질환 관련 유전자(Flotte et al., 1992; Ohi et al., 1990; Walsh et al., 1994; Wei et al., 1994)의 시험관내 및 생체내 형질도입에 성공적으로 사용되었다. 최근, AAV 벡터는 낭섬유증 치료의 I기 인체 실험에서 인정받은 바 있다.

일반적으로, 재조합 AAV(rAAV) 바이러스는 2개의 AAV 말단 반복체와 인접되어 있는 당해 유전자를 함유하는 플라스미드(본원에 참고원용되는 McLaughlin et al., 1988 ; Samulski et al., 1989)와 말단 반복체 없이 야생형 AAV 암호 서열을 함유하는 발현 플라스미드, 예를 들면 pIM45(본원에 참고원용되는 McCarty et al., 1991)를 공동형질감염시켜 제조한다. 이러한 세포들은 또한 AAV 헬퍼 기능에 필요한 아데노바이러스 유전자를 보유하는 플라스미드 또는 아데노바이러스로 감염되거나 형질감염되기도 한다. 이러한 방식으로 제조된 rAAV 바이러스 스톡은 아데노바이러스로 오염되어 있는 바, rAAV 입자로부터 아데노바이러스의 물리적 분리가 요구된다(예를 들면, 염화세슘 밀도 원심분리를 이용한다). 또는, AAV 암호 영역을 함유하는 아데노바이러스 벡터 또는 AAV 암호 영역과 아데노바이러스 헬퍼 유전자의 일부 또는 전부를 함유하는 세포주가 사용될 수도 있다(Yang et al., 1994a ; Clark et al., 1995). 또한, 통합된 프로바이러스로서 rAAV DNA를 보유하는 세포주가 사용될 수도 있다(Flotte et al., 1995).

d. 프로타민

프로타민도 또한 발현 작제물과 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 복합체는 이후 세포에 투여될 수 있는 전술한 바와 같은 지질 조성물로 조제될 수 있다. 프로타민은 DNA와 결합되는 작은 고염기성 핵단백질이다. 이의 핵산 전달 용도는 본원에 참고원용되는 미국 특허 5,187,260에 기술되어 있다. 특히, 프로타민 분자와 바이러스 벡터를 결합시켜 바이러스 벡터의 형질도입 효율을 증가시키는 방법 및 조성물에 관한 미국 특허 출원 10/391,068(2003.3.24)을 참고할 수 있다.

2. 비-바이러스 전달

MDA-7 단백질을 암호화하는 핵산의 바이러스 전달 외에도, 재조합 유전자를 소정의 숙주 세포 중으로 전달할 수 있는 또 다른 방법이 있으며, 이 역시 본 발명에 속하는 것이다.

a. 지질 매개 형질전환

본 발명의 또 다른 양태에서, 유전자 작제물은 리포좀 또는 지질 배합물에 내포될 수 있다. 리포좀은 인지질 이중막과 내부 수성 매질을 특징으로 하는 소포성 구조물이다. 다중라멜라형 리포좀은 다수의 지질 층이 수성 매질에 의해 분리되어 있는 것이다. 이러한 리포좀은 인지질을 과량의 수용액에 현탁시키면 자발적으로 형성된다. 이 때, 지질 성분은 폐쇄 구조를 형성하기에 앞서 자가재배열을 일으키고 지질 이중층 상에 물과 용해된 용질을 내포시킨다(Ghosh and Bachhawat, 1991). 또한, 리포펙타민과 결합된 유전자 작제물도 있다(Gibco BRL).

최근 지질 배합물의 발전은 생체내 유전자 전달 효율을 향상시켰다(Smyth-Templeton et al., 1997; WO 98/07408). 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸암모니오)프로판(DOTAP) 및 콜레스테롤 등몰비로 구성된 신규 지질 배합물은 전신 생체내 유전자 전달을 유의적으로 향상시킨다(약 150배). 이러한 DOTAP:콜레스테롤 지질 배합물은 "샌드위치 리포좀"이라는 독특한 구조를 형성한다고 한다. 이 배합물은 함입된 이중층 또는 '꽃병' 구조 사이에 DNA를 "샌드위치"시키는 것으로 보고되어 있다. 이러한 지질 구조물의 장점에는 콜레스테롤에 의한 양성 콜로이드성 안정화, 2차원 DNA 패키징 및 혈청 안정성 증가가 포함된다.

C. 단백질, 펩타이드 및 폴리펩타이드

1. 생물학적 기능성 등가물

본 발명은 MDA-7 폴리펩타이드 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특정 양태에서, MDA-폴리펩타이드는 암과 같은 혈관신생 관련 질환의 치료에 사용된다. 특정 양태에서, MDA-7 폴리펩타이드는 직접 제공되기도 한다. 특정 양태에서, MDA-7 폴리펩타이드는 치료 전에 제공되기도 한다. 특정 양태에서, MDA-7 폴리펩타이드는 면역요법을 위한 면역원성 분자(예, 항원)의 투여와 동시에 투여되기도 한다. 다른 특정 양태에서, MDA-7 폴리펩타이드는 치료 후, 일부 양태로서 면역 반응 유도를 치료, 진단 또는 예후 측정하기 위한 면역원성 분자를 제공한 후 제공되기도 한다. 본원에 사용된 "단백질"과 "폴리펩타이드"란 용어는 호환되어 쓰이고 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 혈관신생 억제를 위해 세포 또는 검체에 투여되는, MDA-7 단백질, MDA-7의 절두형 및 MDA-7 아미노산 서열 유래의 펩타이드를 함유하는 정제된 단백질 조성물의 용도를 제공한다. MDA-7의 절두형 분자에는, 예를 들면 MDA-7 아미노산 잔기 약 46 내지 49에서부터 시작되는 분자 및 또 다른 N-말단 절두가 포함된다. 구체적으로, 다음과 같은 잔기에서 시작하고 잔기 206에서 종결되는 분자가 포함된다: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90,91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99,100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159,160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 및 182. 또 다른 양태에서, 잔기 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,26, 27, 28, 29,30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39,40, 41, 42, 43,44, 45, 46, 47, 및 48은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 MDA-7의 다른 인접 잔기들과 함께 포함된다.

당업자라면 잘 알다시피, MDA-7 폴리펩타이드 또는 펩타이드, 면역원성 분자 또는 면역원의 구조에는 변형과 변화가 이루어질 수 있지만, 여전히 바람직한 유사 특성 또는 바람직한 기타 다른 특성을 보유한 분자를 생산할 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산은 항체의 항원 결합 영역 또는 Tat 및 RNA 폴리머라제 II와 같은 분자 상의 결합 부위와 같은 구조물과 인지가능한 상호작용성 결합능의 손실 없이 단백질 구조 중에서 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 이러한 상호작용능과 단백질의 본성이 단백질의 생물학적 기능성을 좌우하기 때문에, 단백질 서열(또는 이의 기본 DNA 암호 서열)에는 특정 아미노산 서열의 치환이 이루어질 수 있고, 이러한 치환에도 불구하고 유사(작동성) 성질을 가진 단백질이 수득될 수 있다. 즉, 본 발명자들은 생물학적 유용성 또는 활성의 인지가능한 상실없이 HIV 폴리펩타이드 또는 펩타이드(또는 기본 DNA) 서열에 다양한 변화가 이루어질 수 있을 것으로 생각한다.

기능성 등가물의 측면에서, 당업자는 생물학적 기능상 등가인 단백질 또는 펩타이드의 정의에 허용되는 수준의 동등한 생물학적 활성을 가진 분자를 제공하는 분자의 소정 부위에서 이루어질 수 있는 변화의 수로의 제한 개념이 본래 내재되어 있음을 잘 알고 있을 것이다. 따라서, 본원에서 생물학적 기능성 등가 펩타이드는 아미노산 중 일부(대부분 또는 전부가 아니다)가 치환될 수 있는 펩타이드로서 정의된다. 구체적으로, 펩타이드가 작은 경우에는 더 적은 수의 아미노산이 변화될 수 있다. 물론, 다른 치환을 가진 다수의 상이한 단백질/펩타이드가 본 발명에 따라 용이하게 제조 및 사용될 수 있음은 자명한 것이다.

또한, 특정 잔기가 단백질 또는 펩타이드의 생물학적 또는 구조적 성질에 특히 중요한 것으로 밝혀진 경우, 예를 들어, 효소의 활성 부위에 존재하는 잔기, 또는 RNA 폴리머라제 II 결합 영역에 존재하는 잔기 등의 잔기들은 일반적으로 치환될 수 없다는 것은 공지되어 있다. 이러한 사실은 본 발명에도 마찬가지인 것으로서, 면역반응 유도에 필수적인 것으로 밝혀진 잔기는 일반적으로 변화되지 않아야 하며, 이는 MDA-7 폴리펩타이드 및 면역원 산물 모두에 적용되는 것이다.

아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환체의 상대적 유사성, 예를 들어 소수성, 친수성, 하전, 크기 등에 근거하여 이루어진다. 아미노산 측쇄 치환체의 크기, 형태 및 종류를 분석해보면, 아르기닌, 리신 및 히스티딘은 모두 양하전 잔기이고; 알라닌, 글리신 및 세린은 모두 크기가 유사하며, 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 모두 일반적으로 형태가 유사하다. 따라서, 이러한 고찰에 근거하여 다음과 같은 아군들을 생물학적 기능성 등가물로서 본원에 정의한다: 아르기닌, 리신 및 히스티딘; 알라닌, 글리신 및 세린; 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신.

보다 정량적 변화를 실시하기 위해서는 아미노산의 수치료 지수(hydropathic index)를 고려할 수 있다. 각 아미노산의 수치료 지수는 이들의 소수성 및 하전 특성에 근거해 할당된다: 즉 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5)이다.

단백질에 생물학적 상호작용 기능을 부여하는데 있어서 아미노산 수치료 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다(Kyte & Doolittle, 1982, 본원에 참고원용됨). 특정 아미노산은 유사한 수치료 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환되어 유사한 생물학적 활성을 그대로 제공할 수 있다는 것은 공지되어 있다. 수치료 지수에 근거하여 변화를 시도하는 경우에, 바람직한 일부는 수치료 지수가 ±2 이내인 아미노산간의 치환이고, 특히 바람직한 일부는 ±1 이내인 것이며, 보다 더 특히 바람직한 일부는 ±0.5 이내인 것이다.

또한, 유사 아미노산의 치환은 특히 본 발명에서와 같이 형성되는 생물학적 기능성 등가 단백질 또는 펩타이드가 면역학적 측면에서 사용하기 위해 의도되는 경우, 친수성에 근거하여 효과적으로 이루어질 수 있음은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 본원에 참고원용된 미국 특허 제4,554,101호는 인접 아미노산의 친수성에 의해 좌우되는, 단백질 최대 국소 평균 친수성이 단백질의 면역원성 및 항원성, 즉 단백질의 생물학적 성질과 상관성이 있다고 기술하고 있다.

미국 특허 제4,554,101호에 상세히 설명된 바와 같이, 아미노산 잔기에 할당된 친수성 값은 다음과 같다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).

유사한 친수성 값에 근거하여 변화를 실시하는 경우에, 바람직하게는 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환, 특히 바람직하게는 ±1 이내인 것, 보다 더 특히 바람직하게는 ±0.5 이내인 것이다.

이상, 아미노산 변화에 기인하는 기능성 등가 폴리펩타이드에 대해서만 집중 설명했지만, 이러한 변화는 유전자 코드가 축퇴성이어서 2종 이상의 코돈이 동일 아미노산을 암호할 수 있다는 점을 고려해 볼 때, 암호 DNA의 변경에 의해 실현될 수음은 명백한 것이다. 이러한 양태 뿐만 아니라 프로브 및 프라이머 설계 등과 같은 다른 용도에 사용될 수 있는 아미노산 및 이의 코돈에 관한 표는 본 명세서 전반에 참고된다.

2. 합성 펩타이드

본 발명의 조성물은 생물학적 보호를 위해 변형 펩타이드를 함유할 수 있다. 생물학적 보호 펩타이드는 인체에 투여되었을 때 미보호 펩타이드보다 특정 장점을 갖고 있으며, 본원에 참고원용되는 미국 특허 5,028,592에 개시된 바와 같이 보호 펩타이드는 종종 약리 활성의 증가를 보이기도 한다.

본 발명에 유용한 조성물은 또한 모든 L-아미노산, 모든 D-아미노산 또는 이의 혼합물을 포함하는 펩타이드를 함유할 수 있다. D-아미노산의 사용은 인체에서 자연적으로 발견되는 프로테아제에 대한 내성을 추가로 부여하고 면역원성이 적어서, 생물학적 반감기를 연장시킬 것으로 예상된다.

본 발명은 다양한 본 발명의 양태에 사용되는 MDA-7 펩타이드를 제공한다. 예를 들어, 특정 펩타이드는 항혈관신생 반응의 유도능에 대해 분석될 수 있다. 펩타이드 크기가 비교적 작은 특정 양태에서, 본 발명의 펩타이드는 통상의 기법에 따라 용액 합성법 또는 고상 지지체를 이용한 합성법으로 합성될 수 있다. 다양한 자동 합성기는 시중에서 입수용이하며 공지의 프로토콜에 따라 사용할 수 있다[본원에 참고원용되는 Stewart and Young, (1984); Tam et al., (1983); Merrifield, (1986); and Barany and Merrifield (1979) 참조]. 본 명세서에 기술되어 있는 선별된 영역에 상응하는, 아미노산이 보통 약 6개 이상 내지 약 35 내지 50개 이하인 짧은 펩타이드 서열 또는 중첩 펩타이드 라이브러리는 쉽게 합성할 수 있으며, 그 다음 반응성 펩타이드 확인을 위해 설계된 선별 분석법에 따라 선별될 수 있다. 또는, 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 발현 벡터에 삽입시켜 적당한 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킨 뒤, 발현에 적당한 조건하에서 배양하는 재조합 DNA 기술을 이용할 수도 있다.

3. 시험관내 단백질 생산

실시예에 제시된 정제 방법 외에도, 시험관내 단백질 생산의 일반적 과정을 논할 수 있다. 본 발명의 일부 양태에 따른 바이러스 벡터로 형질도입 후, 원시 포유동물 세포 배양물은 다양한 방법으로 제조할 수 있다. 세포가 시험관내에서 발현 작제물과 접촉되는 동안 생존성을 유지하도록 하기 위해, 세포는 미생물 오염으로부터 보호되면서 적당한 비율의 산소 및 이산화탄소와 영양소와 지속적인 접촉을 이루어야 한다. 세포 배양 기술은 공지되어 있으며 본원에 참고 개시했다(Freshney, 1992).

전술한 일 양태는 단백질 생산 및/또는 제공을 위해 세포를 무한증식화하는 유전자 전달의 사용을 포함한다. 당해 단백질의 유전자는 전술한 바와 같이 적당한 숙주 세포로 전달된 후 적당한 조건 하에서 세포 배양될 수 있다. 사실상 모든 폴리펩타이드의 유전자가 이러한 방식으로 이용될 수 있다. 재조합 발현 벡터의 제작 및 이 벡터에 함유된 인자들은 전술한 바와 같다. 또한, 생산될 단백질은 당해 세포에서 보통 합성되는 내인성 단백질일 수도 있다.

본 발명의 다른 양태는 자가유래의 B 림프구 세포주를 이용하기도 하는데, 이 세포주는 면역원 산물, 보다 구체적으로 면역원성 활성을 보유한 단백질을 발현하는 바이러스 벡터로 형질감염된다. 다른 포유동물 숙주 세포주의 예에는 Vero 세포, HeLa 세포, 기타 다른 B 세포주 및 T 세포주, 예를 들면 CEM, 721.221, H9, Jurkat, Raji 등, 뿐만 아니라 중국 햄스터 난소 세포주, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포도 포함된다. 또한, 숙주 세포 균주는 삽입된 서열의 발현을 조절하는 균주, 또는 유전자 산물을 바람직한 방식으로 변형 및 프로세싱하는 균주가 선택될 수 있다. 이와 같은 단백질 산물의 변형(예, 글리코실화) 및 프로세싱(예, 절단)은 단백질 기능에 중요한 역할을 한다. 상이한 숙주 세포는 단백질의 해독후 프로세싱 및 변형에 특징적이고 특이적인 기구를 갖고 있다. 따라서, 세포주 또는 숙주계는 발현되는 이종 단백질을 정확하게 변형 및 프로세싱하는 것이 적당하다.

선별 시스템은 tk 세포, hgprt 세포 또는 aprt 세포에서의 각 HSV 티미딘 키나제, 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트란스퍼라제 및 아데닌 포스포리보실트란스퍼라제 유전자를 비롯하여 다양한 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 항대사산물 내성도 선별 기준으로 사용될 수 있다: 즉, 내성을 부여하는 dhfr; 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt; 아미노글리코사이드 G418에 대한 내성을 부여하는 neo; 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro.

동물 세포는 2가지 방식으로 시험관내에서 증식될 수 있다: 즉 배양물 부피 전반에서 현탁상태로 증식하는 비고착형 세포 또는 증식에 고체 기질에 대한 부착을 필요로 하는 고착형 세포(즉, 단일층 유형의 세포 성장).

연속 배양된 세포주의 비고착형 또는 현탁 배양물은 대량 세포 생산 및 세포 산물 생산에 가장 널리 이용되는 수단이다. 하지만, 현탁 배양 세포는 부착 세포보다 낮은 단백질 생산능 및 종양원능과 같은 단점을 갖고 있다.

4. ER 표적화 서열

본 발명의 폴리펩타이드는 1 이상의 소포체 표적화 서열을 함유한다. 세포 중의 단백질의 최종 위치는 단백질 서열 내에 암호화된 표적화 서열에 따라 달라진다. 가장 단순한 경우로서, 시그날 부족은 단백질을 세포질인 디폴트 경로로 유도한다. ER에 잔류되도록 정해진 단백질은 ER에 단백질을 잔류시키는 특정 시그날 펩타이드를 갖고 있어야 한다. 이러한 본 발명의 폴리펩타이드는 N-말단이나 C-말단에 추가 아미노산 잔기를 포함하거나 포함하지 않아도 좋다.

ER은 핵막에서부터 세포질을 통해 뻗어있는 망형의 막에 싸인 세관 및 낭(수조) 구조물이다. 단백질의 분비 경로는 다음과 같다: 조면 ER → 골지 → 분비소포 → 세포 외부.

분비되는 단백질은, 일반적으로 ER에서부터 골지로 이동해야 한다. 하지만, ER 내에 유지되어야 하는 특정 단백질도 있으며, 그 예에는 BiP, 시그날 펩타다제, 단백질 디설파이드 이소머라제가 있다. 특정 국재화 시그날은 단백질을 ER로 표적화한다.

카르복시 말단에 ER 표적화 서열 Lys-Asp-Glu-Leu(1문자 코드로는 KDEL) 존재로 인해 특정 단백질은 ER 내강에 잔류한다. 이 서열은 단백질의 일부는 아니지만, 그 대신 단백질을 골지로 이동시켜 세포로부터 분비시킨다. 카르복시 말단(KKXX 서열)에 KKXX서열이나 KDEL 서열의 존재는 단백질을 ER 중에 잔류시킨다. 이러한 서열의 존재는 이 구역의 막에 있는 특정 재순환 수용체에 단백질을 결합시킨 뒤 ER로 선택적으로 재이송시킨다.

ER로부터 단백질의 배출은 대량 흐름 뿐만 아니라 골지체로의 단백질의 선택적 수송을 매개하는 표적화 시그날을 특이적으로 인식하는 조절 경로에 의해서도 일어난다. 16 내지 30 잔기의 ER 시그날 서열의 존재는 리보좀을 ER 막으로 유도하고, ER 막을 따라 단백질 이동을 개시한다.

ER 시그날 서열은 일반적으로 단백질의 N-말단에 위치한다. 이러한 표적화 서열은 종종 1 또는 그 이상의 양하전된 아미노산과 그 이후에 6 내지 12의 소수성 잔기의 연속 스트레치를 함유한다. 시그날 서열은 일반적으로 단백질이 리보좀에서 성장되는 동안에 단백질로부터 절단되어진다. 시그날 서열로부터 여러 소수성 아미노산의 특정 결실이나 이러한 아미노산 중 한 아미노산의 하전성 아미노산으로의 돌연변이는 ER 막을 따라 내강으로 단백질을 이동시키지 못한다. 랜덤 N-말단 아미노산 서열의 부가는 세포질 단백질을 ER 내강으로 이동시키는데, 이는 소수성 잔기가 ER 표적화에 중요한 결합 부위를 형성함을 시사한다.

소포체 표적화 서열은 아미노산 잔기가 폴리펩타이드의 목적지를 소포체로 표적화하기만 한다면 아미노산 잔기 수는 임의의 수이어도 좋다. 본 발명의 폴리펩타이드는 ER 표적화 서열을 하나만 함유해도 좋고, 1개 이상 함유해도 좋다. ER 표적화 시그날에 관한 추가 정보는 전문이 본원에 참고원용되는 인비트론 카탈로그[V890-21, V891-20, V892-20 및 V893-20, "pShooter Vector Manual I(pEF/myc 벡터)", 인터넷 주소: invitrogen.com/content/sfs/manuals/pshooter_pef_man.pdf]에서 찾아볼 수 있다. 시그날 서열 인식 및 ER을 표적으로 하는 단백질에 대한 개설은 본원에 참고원용된 문헌[Walter and Johnson, 1994; Koch et al., 2003; Kabat et al., 1987]에서도 찾아볼 수 있다.

5. 항체

본 발명의 다른 양태는 항체이며, 구체적으로 MDA-7의 폴리펩타이드 서열(서열번호 1)과 면역반응성인 사람 모노클로날 항체이다. 항체는 MDA-7을 억제 또는 조절하는데 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 항체는 암의 수동 면역요법에 효과적일 수 있다. 이러한 항체의 용도 및 이에 따라 발견된 임의의 항원이나 에피토프 서열은 모두 본 발명의 범위에 속한다. 이하에는 본 발명의 방법에 사용되는 MDA-7에 대한 항체의 용도에 대해 설명하였다.

a. MDA-7 항원성 서열

검체 중에서 MDA-7을 조절할 수 있는 또 다른 방법으로서, 본 발명의 MDA-7 폴리펩타이드 중에서 1 이상의 항원 결정인자에 상응하는 펩타이드를 제조하여 MDA-7에 대한 면역반응을 일으킬 수 있다. 즉, MDA-7 펩타이드 또는 폴리펩타이드 백신접종은 면역된 동물 중에서 자가항체가 자신의 내인성 MDA-7 단백질을 특이적으로 인식하도록 자가면역반응을 형성시킬 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 백신접종 기술은 본원에 참고원용되는 미국 특허 6,027,727; 5,785,970 및 5,609,870에 제시되어 있다.

이러한 펩타이드는 일반적으로 길이가 적어도 5개 또는 6개인 아미노산이어야 하며, 바람직하게는 아미노산 잔기 길이가 약 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개 또는 약 30개인 것이며, 최고 약 35개 내지 50개일 수도 있다. 예를 들어, 이러한 펩타이드는 MDA-7 아미노산 서열, 구체적으로 서열번호 2에 기재된 인접 아미노산을 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 및 50개 또는 그 이상 함유할 수 있다. 합성 펩타이드는 일반적으로 잔기 길이가 약 35개인 것인데, 이 길이는 자동 펩타이드 합성기(예를 들면, Applied Biosystems(캘리포니아, 포스터 시티 소재) 시판품)의 대략적인 상한 길이 범위이다. 예를 들어, 재조합 수단을 이용하면 보다 긴 펩타이드도 제조할 수 있다.

본원에 참고원용된 미국 특허 제4,554,101호는 친수성을 기초로 하여 1차 아미노산 서열로부터 에피토프의 확인과 제조에 대하여 교시하고 있다. Hopp에 의해 개시된 방법을 이용하면 당업자는 서열번호 2에 개시된 MDA-7 서열과 같은 아미노산 서열 중의 에피토프를 확인할 수 있을 것이다.

다수의 과학 문헌들에는 아미노산 서열 분석으로부터 2차 구조 예측과 에피토프 확인에 관한 집중적인 연구가 이루어져 있다(Chou & Fasman, 1974a,b; 1978a, b; 1979). 이 중 임의의 연구는 필요한 경우, 미국 특허 4,554,101에 제시된 호프의 교시에 보충적으로 사용될 수도 있다.

더욱이, 단백질의 항원 부 및 에피토프 코어 영역의 예측에 도움을 주는 컴퓨터 프로그램이 현재 이용 가능하다. 그 예에는 제임슨-울프 분석에 기초한 프로그램(Jameson & Wolf, 1988 ; Wolf et al., 1988), PepPlot® 프로그램(Bratlag et aL, 1990; Weinberger et al., 1985), 및 기타 다른 단백질 3차 구조 예측용 신규 프로그램(Fetrow & Bryant, 1993)이 있다. 이러한 분석을 수행할 수 있는 또 다른 상업적으로 입수용이한 소프트웨어 프로그램은 MacVector(IBI, New Haven, CT)이다.

또 다른 양태에서, MDA-7 폴리펩타이드의 주요 항원 결정인자는, MDA-7 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자의 일부를 재조합 숙주에서 발현시키고, 수득되는 단백질을 면역반응 유도능에 대해 시험하는 실험적 시도로 확인할 수도 있다. 예를 들어, PCR™은 단백질의 C-말단 중에서 보다 긴 단편이 성공적으로 결실된 일군의 펩타이드를 제조하는데 사용할 수 있다. 이러한 펩타이드 각각의 면역활성을 측정하면, 면역우성인 폴리펩타이드의 단편이나 도메인을 확인할 수 있다. 그 다음, 반복 실험마다 소수의 아미노산을 제거하는 추가 연구를 실시하면, 폴리펩타이드의 항원 결정인자의 위치가 정확하게 측정될 것이다.

폴리펩타이드의 주요 항원 결정인자를 측정하는 또 다른 방법은 SPOTs™ 시스템(Genosys Biotechnologies, Inc., The Woodlands, TX)이다. 이 방법에서는, 셀룰로스 막에 중첩 펩타이드를 합성하고, 합성 및 탈보호 후, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하여 선별한다. 처음 확인된 펩타이드의 항원 결정인자는 이어서 보다 큰 중첩부를 가진 소형 펩타이드를 합성하고, 마지막으로 면역원성 펩타이드를 따라 각 위치의 각 아미노산을 치환시켜 추가로 범위를 좁힐 수 있다.

이러한 분석을 1회 이상 완료하면, 적어도 1 이상의 항원 결정인자의 필수적인 특징을 함유한 폴리펩타이드가 제조될 것이다. 제조된 펩타이드는 그 다음 폴리펩타이드에 대한 항혈청 생산에 이용한다. 또한, 이러한 결정인자를 암호화하는 미니유전자 또는 유전자 융합체를 작제하여 PCR™ 클로닝법과 같은 표준 방법을 통해 발현 벡터에 삽입시킬 수도 있다.

이러한 소형 펩타이드의 항체 생산 또는 백신접종 시의 용도에는 일반적으로 면역원성 운반 단백질, 예를 들면 B형 간염 표면 항원, 키홀 림펫 헤모시아닌 또는 소혈청 알부민 또는 전술한 바와 같은 다른 보조제(보강 펩타이드)와 펩타이드의 접합을 필요로 한다. 백반은 인체에 충분히 비독성인 것으로 입증되어진 보조제가다. 이러한 접합을 수행하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 또한, 다당류(예를 들면, 키토산)와 같은 다른 면역강화 화합물도 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 것으로 생각되며, 다당류에 대해서는 본원에 참고원용된 미국 특허 5,980,912에 기술되어 있다. 다수(1개 이상)의 MDA-7 에피토프는 서로 가교결합될 수 있다(예를 들면, 중합). 대안적으로, 포틀린(Fortilin) 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 면역반응을 강화시키는 핵산 서열과 조합될 수 있다. 이러한 융합 단백질은 박테리아 서열과 같은 이종(비자기) 단백질 일부 또는 전체를 함유할 수 있다.

내인성 MDA-7에 대한 반응을 수득하는데 효과적인 항체 역가는 백신접종된 동물의 종류, 뿐만 아니라 투여된 펩타이드의 서열에 따라 달라질 수 있다. 하지만, 유효 역가는, 예를 들면 특정 항원의 다양한 용량을 동물 시험군에 실험하고, 공지의 기술(예를 들면, ELISA법)로 자가항체(또는 항-자가항체)의 유도 역가를 측정한 뒤, 이 역가를 MDA-7 관련 암 특성, 예를 들면 종양 성장 또는 크기와 상관지어, 용이하게 측정할 수 있다.

당업자라면, MDA-7에 대한 면역반응의 발생 여부를 결정하는 다양한 분석법을 잘 알고 있을 것이다. "면역반응"이란 용어에는 세포 면역반응 및 체액 면역반응이 모두 포함된다. 다양한 B 림프구 및 T 림프구 분석법은 널리 공지되어 있으며, 그 예에는 ELISA, 세포독성 T 림프구(CTL) 분석법(예, 크롬 방출 분석법), 말초혈액 림프구(PBL)를 이용한 증식 분석법, 사량체 분석법 및 사이토킨 생산 분석법 등이 있다(본원에 참고원용된 Benjamini et al., 1991 문헌 참조).

D. MDA-7 정제방법

본 발명은 MDA-7 정제방법을 제공한다. 이하에 제시되는 방법 및 이와 유사한 당업자에게 공지된 방법은 본원에 개시된 MDA-7 정제방법을 실시하는데 사용될 수 있을 것이다.

1. 겔 전기영동

겔 전기영동은 정제 과정 중에 사용될 수 있는 공지의 기술이다. 이러한 정제방법에는, 아가로스, 아가로스-아크릴아마이드 또는 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 이용한 표준 방법(Sambrook et al., 2001)이 사용될 수 있다.

2. 크로마토그래피 기술

또는, 크로마토그래피 기술을 이용하여 MDA-7의 분리 및 정제를 실시할 수도 있다. 본 발명에 사용할 수 있는 크로마토그래피법에는 다수의 종류가 있다. 즉, 흡착, 친화성, 분배, 이온교환 및 분자체. 이들을 이용하는 특수 기술에는 컬럼, 종이, 박층 및 기체 크로마토그래피를 비롯하여 다수가 있다(Freifelder, 1982).

3. 면역 시약

본 발명의 특정 양태에는 면역 시약의 사용도 포함된다. 본 발명의 특정 양태에서, 면역 시약은 MDA-7의 정제 또는 제조에 사용된다. 본 명세서에 논의되고 있는 항체도 본 발명에 사용되는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에 사용된, "항체"란 용어는 모든 면역 결합제, 예를 들면 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 포괄적으로 의미하는 것이다. 일반적으로, IgG 및/또는 IgM은 생리적 상태에서 가장 일반적인 항체이고 실험실 조건에서 가장 용이하게 제조될 수 있기 때문에 바람직하다.

"항체"란 용어는 항원 결합 영역을 보유한 임의의 항체 유사 분자를 의미하기도 하며, 그 예에는 Fab', Fab, F(ab')₂. 단일 도메인 항체(DAB), Fv, scFv(일본쇄 Fv) 등과 같은 항체 단편이 있다. 각종 항체계 작제물과 단편을 제조 및 사용하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 항체를 제조 및 특성분석하는 방법도 당업계에 공지되어 있다(Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 ; 본원에 참고원용됨).

모노클로날 항체(MAb)는 특정 장점, 예를 들면 재현성 및 대량 생산의 장점을 갖고, 이러한 항체의 사용은 일반적으로 바람직한 것으로 인식되고 있다. 따라서, 본 발명은 사람, 쥐, 원숭이, 랫트, 햄스터, 토끼 및 심지어 병아리 기원의 모노클로날 항체를 제공한다. 제조 용이성과 시약의 용이한 입수용이성으로 인하여, 쥐 모노클로날 항체가 보통 바람직하다.

또한, "사람화된" 항체도 본 발명에 포함되며, 그 예에는 사람의 불변 영역 및/또는 가변 영역 도메인을 보유하는 마우스, 랫트 또는 다른 종 유래의 키메라 항체, 이중특이 항체, 재조합 및 조작된 항체 및 이의 단편이 있다. 이와 유사하게, 환자의 치아 질환에 대한 "주문제작식(custom-tailored)" 항체의 개발 방법도 공지되어 있으며, 이러한 주문제작식 항체도 본 발명에 포함되는 것이다.

모노클로날 항체(MAb)의 생산 방법은 일반적으로 폴리클로날 항체 제조방법과 동일한 단계를 따라 시작한다. 간략히 설명하면, 폴리클로날 항체는 본 발명에 따른 LEE 또는 CEE 조성물로 동물을 면역화한 뒤, 이와 같이 면역화된 동물로부터 항혈청을 채집하여 제조한다.

항혈청 생산에는 다양한 범위의 동물 종이 사용될 수 있다. 일반적으로, 항혈청 생산에 사용되는 동물은 토끼, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니아 피그 또는 염소이다. 동물의 선택은 당업자에게 공지된 바와 같이 조작용이성, 비용 또는 필요한 혈청양에 따라 결정될 수 있다.

폴리클로날 항체 생산에 사용되는 면역원 조성물의 양은 면역에 사용되는 동물 뿐만 아니라 면역원의 성질에 따라서도 달라진다. 면역원은 다양한 경로를 통해 투여될 수 있으며, 그 예에는 피하, 근육내, 피내, 표피내, 정맥내 및 복강내가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 폴리클로날 항체의 생산은 면역화 후 면역화된 동물의 혈액을 다양한 시점에서 채취하여 모니터할 수 있다.

또한, 2차 부스터 용량(예를 들면, 주사 투여)이 제공될 수도 있다. 부스터 및 역가측정 방법은 적당한 역가가 수득될 때까지 반복한다. 필요한 수준의 면역원성이 수득되면, 면역화된 동물의 혈액을 채혈하여, 혈청을 분리 및 저장하고(하거나) 이 동물을 이용하여 MAb를 생산할 수도 있다.

토끼 폴리클로날 항체 생산시에는, 이 동물의 혈액을 귀정맥 또는 심장 천자를 통해 채혈할 수 있다. 수거한 혈액은 응집시킨 뒤, 원심분리하여 전세포와 응혈로부터 혈청 성분을 분리한다. 이러한 혈청은 다양한 이용분야 등에서와 같이 사용되거나, 다른 항체, 고체 매트릭스에 결합된 펩타이드를 이용하는 친화성 크로마토그래피 또는 단백질 A 또는 단백질 G 크로마토그래피 등과 같은 공지의 방법을 이용하여 항체 분획을 정제해낼 수도 있다.

MAb는 본원에 참고원용된 미국 특허 4,196,265에 예시된 바와 같은 공지의 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 일반적으로, 이러한 기술은 선택한 면역원 조성물(예를 들면, 정제 또는 부분 정제된 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 도메인이 있고, 이들은 야생형 또는 돌연변이 조성물일 수 있다)로 적당한 동물을 면역화하는 것을 포함한다. 면역화 조성물은 항체 생산 세포의 자극에 효과적인 방식으로 투여한다.

모노클로날 항체(Mab) 생산 방법은 일반적으로 폴리클로날 항체 제조 방법과 동일한 단계를 따라 시작한다. 마우스 및 랫트와 같은 설치류가 바람직한 동물이지만, 토끼, 양 또는 개구리 세포도 사용가능하다. 랫트 사용은 특정한 장점을 제공하지만(Goding, 1986, pp. 60-61), 마우스가 바람직하며, 특히 BALB/c 마우스는 가장 통상적으로 사용되고 일반적으로 안정한 높은 융합율을 제공하기 때문에 가장 바람직하다.

먼저, 이러한 동물에게 항원(일반적으로, 전술한 바와 같은, 펩타이드, 폴리펩타이드의 일부 또는 폴리펩타이드 전체(예를 들면, MDA-7))을 주사한다. 여기서, 항원은 보조제, 예를 들면 프로인트 완전 또는 불완전 보조제와 혼합될 수 있다. 동일 항원 또는 이러한 항원을 암호화하는 DNA의 부스터 투여는 약 2주 간격으로 실시할 수 있다.

면역화 후, 항체 생산능이 있는 체세포, 구체적으로 B 림프구(B 세포)를 선별하여 MAb 생산 프로토콜에 사용한다. 이러한 세포는 비장, 편도선, 림프절 생검이나 말초혈액 샘플로부터 수득할 수 있다. 비장세포와 말초혈액 세포가 바람직하한데, 그 이유는 비장세포는 분열 형질모세포 단계에 있는 항체 생산 세포가 풍부한 급원이고, 말초혈액 세포는 용이하게 입수할 수 있기 때문이다.

흔히, 사용되는 방법은 동물 패널을 면역화한 후, 항체 역가가 가장 높은 동물의 비장을 분리한 다음, 이 비장을 주사기를 통해 균질화하여 비장 림프구를 수득한다. 일반적으로, 면역화된 마우스의 비장은 약 5x10⁷ 내지 2x10⁸ 림프구를 함유한다.

이와 같이 면역화된 동물 유래의 항체 생산성 B 림프구는 그 다음 무한증식성 골수종 세포의 세포들(일반적으로, 면역화된 동물과 동일한 종의 세포)과 융합시킨다. 이와 같은 하이브리도마 생산 융합 과정에 사용하기에 적당한 골수종 세포주는 비항체생산성이고, 융합율이 높고, 목적의 융합 세포(하이브리도마)만을 성장시키는 특정 선택 배지에서 성장할 수 없게 된 효소 결핍성인 것이 바람직하다.

골수종 세포는 수많은 종류 중 임의의 것을 사용할 수 있고, 이러한 종류는 당업계에 공지되어 있다(Goding, pp. 65-66, 1986; Campbell, pp. 75-83, 1984). 예를 들어, 면역화된 동물이 마우스라면, P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NSl/l.Ag 4 1, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 및 S194/5XXO Bul을 사용할 수 있고, 랫트라면, R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F 및 4B210을 사용할 수 있으며, U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 및 UC729-6은 사람 세포 융합 시 모두 유용하다.

융합 과정은 일반적으로 생존성 하이브리드를 낮은 빈도, 약 1x10^-6 내지 1x10^-8 으로 생산한다. 하지만, 이것은 문제가 되지 않는데, 그 이유는 생존성의 융합 하이브리드는 선택 배지에서 배양하면 미융합 모세포(특히, 일반적으로 계속하여 무한 분열하는 미융합 골수종 세포)와 구별되기 때문이다. 선택 배지는 일반적으로 조직 배양 배지에 뉴클레오타이드의 재합성 차단 제제를 함유한 것이다. 이러한 제제의 예로는 아미노프테린, 메토트렉세이트 및 아자세린이 바람직하다.

이러한 배양은 하이브리도마 집단을 제공하며, 이로부터 특정 하이브리도마를 선택한다. 일반적으로, 하이브리도마의 선택은 세포를 미량역가 평판에서 단일 클론 희석 배양한 뒤, 각 클론의 상청액(약 2 내지 3주 후에)을 목적한 반응성에 대해 검사하여 수행한다. 따라서, 검사법은 민감하고, 단순하며, 신속한 것이어야 하고, 예를 들면 방사선면역분석법, 효소 면역분석법, 세포독성 분석법, 플라크 분석법, 점 면역결합 분석법 등이 있다.

이와 같이 선택한 하이브리도마는, 그 다음 연속 희석한 뒤, 각각 항체 생산 세포주로 클로닝한다. 이러한 클론들은 그 다음 무한 증식하여 MAb를 제공할 수 있다. 이러한 세포주는 2가지 기본 방식으로 MAb 생산에 이용할 수 있다. 그 하나는 초기 융합용 체세포 및 골수종 세포를 제공하는데 사용된 유형의 조직적합성 동물(예를 들면, 동계 마우스)에 하이브리도마 샘플을 주사할 수 있다(종종 복강 내로). 경우에 따라, 동물은 주사에 앞서 탄화수소, 특히 프리스탄(테트라메틸펜타데칸)과 가은 오일로 초회항원민감화시킨다. 주사 후 동물은 융합 세포 하이브리드에 의해 생산되는 특정 모노클로날 항체를 분비하는 종양을 발생시킨다. 그 후, 혈청 또는 복수액과 같은 동물의 체액을 수집하면 MAb를 고농도를 수득할 수 있다. 다른 하나는, 각 세포주를 MAb가 배양액 중에 자연 분비되는 시험관내에서 배양하여, 이로부터 MAb를 고농도를 쉽게 수득할 수 있는 방법이다.

이러한 어느 한 방법에 의해 수득된 MAb는 필요하다면 여과, 원심분리 및 HPLC 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 각종 크로마토그래피법을 통해 추가로 정제할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체의 단편은 상기와 같이 생산된 모노클로날 항체를 펩신 또는 파파인과 같은 효소 분해 및/또는 화학적 환원에 의한 이황화 결합의 절단을 포함하는 방법들로 처리하여 수득할 수 있다. 또는, 본 발명의 범위에 포함되는 모노클로날 항체 단편은 자동 펩타이드 합성기를 사용하여 합성할 수도 있다.

4. 면역검출 방법

또 다른 양태로서, 본 발명은 MDA-7 발현성 정보, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드와 같은 생물학적 성분을 결합, 정제, 분리, 정량 및/또는 기타 다른 일반적 검출하는 면역검출 방법에 관한 것이다. 일부 면역검출 방법에는, 예를 들어, 효소 결합된 면역흡착 분석법(ELISA), 방사선면역분석법(RIA), 면역방사선측정 분석법, 형광면역분석법, 화학발광 분석법, 생물발광 분석법 및 웨스턴 블롯법이 있다. 각종 유용한 면역검출법의 단계들은 다음과 같은 과학 문헌들에 기술되어 있다(Doolittle MH and Ben-Zeev O, 1999; Gulbis B and Galand P, 1993; De Jager R et al., 1993; and Nakamura et al., 1987, 각각 본원에 참고원용됨). 이러한 기술들은 당업자에게 공지되어 있다.

E. 약제학적 제형 및 전달

본 발명의 특정 양태에서는 MDA-7 단백질을 암호화하는 발현 작제물의 전달을 포함하는 방법이 고려된다. 일부 양태에서, 이러한 방법은 면역원을 암호화하는 발현 작제물의 전달에 관한 것이다. 대안적으로, 발현 작제물은 MDA-7 폴리펩타이드와 면역원을 암호화하는 서열을 포함한다. 면역반응을 수반하는 질환 및 증상의 예에는 백신에 의해 예방되거나 치료되는 질환이 포함된다. 폐암, 두경부암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 골암, 정소암, 자궁경부암, 위장암, 림프종, 폐의 전암 병변, 결장암, 유방암, 방광암 및 기타 유도성 면역반응을 향상시키는 MDA-7 폴리단백질의 투여로 치료될 수 있는 면역반응과 관련있는 질환 또는 증상이 있다.

약제학적 조성물의 "유효량"은 일반적으로 전술한 목적한 결과를 검출가능하고 반복적으로 달성하기에 충분한 양, 예를 들면 상기 질환이나 이의 증후군의 정도를 경감, 감소, 최소화 또는 제한시키기에 충분한 양을 의미한다. 이 용어의 정의가 보다 엄격히 적용되는 예에는 질환의 제거, 근절 또는 치료가 있다.

1. 투여

특정 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 세포 사멸, 세포 성장 억제, 전이 억제, 종양이나 조직 크기 감소, 기타 종양 세포의 악성 표현형 전환 또는 감소, 면역 반응 유도 또는 혈관신생 억제를 제공하는 것이 요구된다. 투여 경로는 본래 표적 병변 또는 부위의 위치 및 성질에 따라 달라지는데, 그 예에는 피내, 피하, 국부, 비경구, 정맥내, 근육내, 비내, 전신 및 경구 투여 및 배합이 있다.

특히, 불연속, 고형, 접근가능한 종양 또는 다른 접근가능한 표적 부위에 대해서는 직접 주사, 종양내 주사 또는 종양 혈관구조로의 주사가 고려된다. 국소, 국부 또는 전신계적 투여 또한 적용가능하다. 4㎝ 초과의 종양에 대해, 투여될 용적은 약 4 내지 10㎖(바람직하게는 10㎖)일 것인 반면, 4㎝ 미만의 종양에 대해서는 약 1 내지 3㎖의 양이 사용될 것이다(바람직하게는 3㎖).

단일 용량으로서 전달되는 분할 주사는 약 0.1 내지 약 0.5㎖ 용적을 포함한다. 바이러스 입자는 분할 주사제를 투여함으로써 약 1㎝ 간격으로 위치해 있는 종양에 유리하게 접촉될 수 있다.

외과수술적 발명의 경우, 본 발명은 수술불가능한 종양을 절제술에 대해 적용하도록 하기 위해 수술 전에 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명은 수술, 및/또는 수술 후에 잔류 질병 또는 전이성 질병을 치료하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, MDA-7 또는 MDA-7-암호화 작제물을 포함하는 제형을 면역원성 분자와 함께 또는 면역원성 분자의 부재하에 절제된 종양층에 주사하거나 이로 관류시킬 수 있다. 당해 관류는 절제 후, 예를 들면, 수술 위치에 삽입된 도관을 남겨둠으로써 계속될 수 있다. 주기적 수술후 치료 또한 고려된다.

발현 작제물 또는 바이러스 박제물의 연속적 관류도 또한 고려된다. 연속적 관류로서 전달되는 작제물 또는 펩타이드의 양은 목적하는 흡수량에 의해 측정할 수 있다.

또한, 바람직한 경우(예를 들면, 종양이 제거되고 종양상이 치료되어 잔류, 미세 질병이 제거된 경우), 계속적 투여를 적용할 수 있다. 주사 또는 도관을 통한 전달이 바람직하다. 이러한 연속적 관류는 치료 개시 후 약 1 내지 2시간, 약 2 내지 6시간, 약 6 내지 12시간, 약 12 내지 24시간, 약 1 내지 2일, 약 1 내지 2주 또는 보다 장기간에 걸쳐 발생할 수 있다. 일반적으로, 연속적 관류를 통한 치료적 조성물의 용량은 관류가 발생되는 동안의 시간에 걸쳐 조정된 단일 또는 다중 주사에 의해 제공되는 것과 동량일 것이다.

치료 요법은 흔히 종양 유형, 종양 위치, 질병 진행 및 환자의 건강 및 연령에 따라 다양할 수 있다. 명백하게는, 종양의 특정 유형은 보다 공격적인 치료를 필요로 할 것인 반면, 동시에, 특정 환자는 보다 힘든 프로토콜을 견딜 수 없다. 임상의는 치료학적 제형의 공지된 효능 및 독성(만약 있다면)을 기준으로 하여 이러한 결정을 내리는 데 가장 적합할 것이다.

특정 양태에서, 치료될 종양 또는 질환 부위는 최소한 초기에 절제될 수 없다. 치료적 바이러스 작제물을 사용한 치료는 경계에서의 수축 또는 특정한 두드러진 침략적 부위의 제거에 기인하여 종양의 절제가능성을 증가시킬 수 있다. 치료 후, 절제가 가능할 수 있다. 종양 위치에서 극미 잔류 질병을 제거하기 위해 절제에 이은 추가의 치료가 제공될 것이다.

원발성 종양 또는 절제 후 종양층에 대한 통상의 치료 과정은 다중 용량을 포함할 것이다. 통상의 원발성 종양 치료는 2주에 걸친 6회의 용량 적용을 포함한다. 2주간의 섭생을 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 그 이상 반복할 수 있다. 치료 과정 중, 계획된 투여를 완료하기 위해 재평가가 필요할 수 있다.

치료는 각종 "단위 용량"을 포함할 수 있다. 단위 용량은 치료적 조성물의 예비측정량을 함유하는 것으로 정의된다. 투여될 양 및 특정 경로 및 제형이 임상 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 단위 용량은 단일 주사로 투여될 필요는 없지만, 기간 세트에 걸친 계속적 주사를 포함할 수 있다. 본 발명의 단위 용량은 통상적으로 바이러스 작제물에 대한 플라크 형성 단위(pfu)의 용어로 기술될 수 있다. 단위 용량은 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³pfu 및 그 이상의 범위이다.

단백질은 환자에게 다음과 같은 용량이나 적어도 다음과 같은 용량으로 투여될 수 있다: 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10, 15, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000ng/ml 또는 그 이상.

2. 주사가능한 조성물 및 제형

일부 양태에서, 면역원성 분자, MDA-7 단백질을 암호화하는 발현 작제물, MDA-7 단백질 및/또는 면역원의 전달 방법은 전신 투여이다. 하지만, 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 대안적으로 비경구, 피하, 직접, 기관내, 정맥내, 피내, 근육내, 또는 심지어 복강내로 투여될 수도 있다(본 발명에 각각 전문이 인용된 미국 특허 5,543,158; 미국 특허 5,641,515 및 미국 특허 5,399,363 참조).

핵산 작제물의 주사는 발현 작제물이 주사를 위해 필요한 특정 게이지의 바늘을 통해 통과될 수 있는 한 주사기 또는 용액의 주사를 위해 사용되는 임의의 다른 방법에 의해 전달될 수 있다. 용액을 저장하기 위한 앰플 챔버를 한정하기 위한 노즐 및 용액을 노즐로부터 전달 위치로 밀어내기 위한 에너지 장치를 갖는 신규한 무바늘 주사 시스템이 최근에 기술되어 있다(미국 특허 제5,846,233호). 또한 주사기 시스템은 임의의 깊이에서 정확하게 미리 측정된 양의 용액을 다중 주사할 수 있는 유전자 요법에서의 용도에 대해 기술되어 있다(미국 특허 제5,846,225호).

유리 염기 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서의 활성 화합물의 용액은 하이드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적합하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 또한 분산제는 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 일반적인 조건하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 예방하기 위한 보존제를 함유한다. 주사가능한 용도에 적합한 약제학적 형태는 멸균 주사액 또는 분산제의 즉석 제조용 멸균 수용액 또는 분산제 및 멸균 산제를 포함한다(미국 특허 제5,466,468호, 이의 전문이 본원에 참조로서 명확히 인용되어 있음). 모든 경우에, 당해 형태는 멸균되어야 하며 용이한 주사가능성이 존재하는 범위로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에서 안정적이어야 하며 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다. 담체는 용매 또는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유하는 분산 매질, 적합한 이의 혼합물 및/또는 식물성 오일일 수 있다. 적합한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 피복물의 사용, 분산제의 경우 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 각종 항세균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 수행될 수 있다. 많은 경우, 등장제, 예를 들면, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 당해 조성물에 흡수를 지연시키는 제제(예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴)를 사용함으로써 주사가능한 조성물을 지속적으로 흡수시킬 수 있다.

예를 들면, 수용액 중의 비경구 투여를 위해, 당해 용액은 필요에 따라 적합하게 완충되거나 액체 희석제는 우선 적합한 염수 또는 글루코스로 등장성이 되어야 한다. 이들 특정 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하, 종양내 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본원을 고려하여 당해 분야의 숙련가에게 공지될 것이다. 예를 들면, 하나의 투여량은 등장성 NaCl 용액 1㎖에 용해될 수 있으며 피하주사 용액 1000㎖에 첨가되거나 제안된 주사 위치로 주사될 수 있다(예를 들면, 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 및 1570-1580]). 치료될 피검체의 상태에 따라 투여량에 일부 변형이 필요할 것이다. 투여를 담당하는 사람은 어떠한 경우에도 개별 피검체에 대한 적합한 용량을 결정할 것이다. 추가로, 사람 투여를 위해, 생물학적 표준의 FDA 관청에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열성, 일반적 안정성 및 순도 표준을 충족시켜야 한다.

멸균 주사액은 필요에 따라, 상기한 각종 다른 성분과 적합한 용매의 요구량의 활성 화합물을 혼입시킨 후 여과 멸균하여 제조한다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기한 바로부터의 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클로 각종 멸균된 활성 성분을 흡입시킴으로써 제조한다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 산제의 경우, 바람직한 제조방법은 활성 성분의 산제와 임의의 추가의 바람직한 성분을 미리 멸균-여과시킨 이의 용액으로부터 생성시키는 진공-건조 및 동결-건조 기법이다.

본원에 개시된 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산부가염(단백질의 유리 아미노 그룹으로 형성된)을 포함하며 이는 예를 들면, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산으로 형성된다. 유리 카복실 그룹으로 형성된 염은 또한 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제2철과 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래할 수 있다. 제형에 따라, 용액은 투여량 제형과 혼화가능한 방식 및 치료학적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 당해 제형은 주사액, 약물 방출 캡슐 등과 같은 각종 투여 형태로 용이하게 투여된다.

본원에 사용된 바와 같은 "담체"는 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 피복물, 희석제, 항세균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 용도가 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 물질과 비혼화적임을 제외하는 한에서, 치료적 조성물에서의 이의 용도가 고려된다. 또한 추가의 활성 성분을 당해 조성물에 혼입시킬 수 있다.

어구 "약제학적으로 허용되는" 또는 "약리학적으로 허용되는"은 사람에게 투여될 시, 알러지 또는 유사한 바람직하지 않은 반응을 유발하지 않는 분자 물질 및 조성물을 지칭한다. 활성 성분으로서 단백질을 함유하는 수성 조성물의 제조가 당해 분야에서 널리 이해되고 있다. 통상, 이러한 조성물은 주사용, 액체 용액 또는 현탁액; 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로 제조되며, 주사 전 액체로도 또한 제조될 수 있다.

c. 보조제

당업계에 공지된 바와 같이, 면역원성 분자, 면역원 또는 펩타이드 조성물의 면역원성은 보조제로 알려진, 면역반응의 비특이적 자극인자의 사용을 통해 향상될 수 있다. 적당한 보조제에는 사이토킨, 독소 또는 합성 조성물과 같은 허용되는 모든 면역자극성 화합물이 포함된다. 본 발명에서, 유효량의 MDA-7 폴리펩타이드의 투여는 면역반응을 향상시켜, 보조제로서 작용한다. 또한, 다른 양태에서, PKR의 발현을 증가시키는 분자는 면역반응을 향상시키는 것으로 생각되며, 따라서 본 발명에 허용되는 면역자극 화합물일 수 있다.

하지만, MDA-7 외에도 다른 보조제가 사용될 수 있는데, 그 예에는 IL-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, γ-인터페론, GMCSP, BCG, 수산화알루미늄, MDP 화합물(예를 들면, thur-MDP 및 nor-MDP), CGP(MTP-PE), 지질 A 및 모노포스포릴 지질 A(MPL)가 있다. 또한, 박테리아에서 추출된 3가지 성분인 MPL, 트레할로스 디마이콜레이트(TDM) 및 세포벽 골격(CWS)을 2% 스쿠알렌/Tween 80 에멀젼에 함유하는 RIBI도 사용할 수 있다. MHC 항원도 사용할 수 있다.

보조제의 예에는, 완전 프로인트 보조제(사멸된 마이코박테리움 튜베르큘로시스를 함유하는 면역반응의 비특이적 자극인자), 불완전 프로인트 보조제 및 수산화알루미늄 보조제가 포함된다.

또한, 본 발명의 특정 양태에는 MDA-7 외에도, 보강 활성이 있는 다른 화합물이 포함될 수 있는 것도 본 발명에 속하는 것이다. 보조제, 기능 및 전달 기구는 당업계에 공지되어 있다. 다른 보조제의 비제한적 예에는 Adjumer™ 9(즉, PCPP 염; 폴리포스파젠); Adju-Phos(즉, 인산알루미늄 겔); Algal Glucan(즉, b-글루칸; 글루칸); Algammulin(즉, 감마 이눌린/백반 복합 보조제); Alhydrogel(즉, 수산화알루미늄 겔; 백반); 항원 제형(즉, SPT, AF); Avridine®(즉, N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)프로판디아민; CP20,961); BAY R1005(즉, N-(2-데옥시-2-L-류실아미노-b-D-글루코피라노실)-N-옥타데실도데카노일아미드 하이드로아세테이트); 칼시트리올(즉, la, 25-디하이드록시비타민 D3; 1,25-디(OH)2D3; 1,25-DHCC; la, 25-디하이드록시콜레칼시페롤); 인산칼슘 겔(즉, 인산칼슘); 콜레라 홀로톡신(CT) 및 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB)(즉, CT; CTB 서브유닛; CTB); 콜레라 독소 Al-서브유닛-단백질A D-단편 융합 단백질(즉, CTA1-DD 유전자 융합 단백질); CRL1005(즉, 블록 공중합체 P1205), 사이토킨 함유 리포좀(즉, 사이토킨 함유 탈수 재수화 소포); DDA(즉, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드; 디메틸 디스테아릴암모늄 브로마이드(CAS 등록번호 3700-67-2)); DHEA(즉, 데하이드로에피안드로스테론; 안드로스테놀론; 프라스테론); DMPC(즉, 디미리스토일 포스파티딜콜린; 1,2-디미리스토일-sn-3-포스파티딜 콜린; (CAS 등록번호 18194-24-6) ); DMPG(즉, 디미리스토일 포스파티딜글리세롤; sn-3-포스파티딜 글리세롤-1,2-디미리스토일, 나트륨염(CAS 등록번호 67232-80-8)); DOC/명반 복합체(즉, 데옥시콜린산 나트륨염; DOC/Al(OH)3/무기담체 복합체); 프로인트 완전 보조제(즉, CIA; FCA); 프로인트 불완전 보조제(즉, IFA; FIA); 감마 이눌린; Gerbu 보조제; GM-CSF(즉, 과립세포-대식세포 콜로니 자극 인자; Sargramostim(효모-derivedrh-GM-CSF)); GMDP(즉, N-아세틸글루코사민일-(β1-4)-N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CAS 등록번호 70280-03-4)); Imiquimod(즉, 1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민; R-837; S26308); ImmTher™(즉, N-아세틸글루코사민일-N-아세틸누라밀-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-글리세롤 디팔미테이트; DTP-GDP); 공자극 분자에 대한 항체를 함유하는 면역리포좀(즉, 탈수-재수화 소포(DRVs)로 제조된 면역리포좀); 인터페론-g(즉, Actimmune®(rhIFN-감마, Genentech, Inc.); 면역 인터페론; IFN-g; 감마-인터페론); 인터루킨-1β(즉, IL-10; IL-1; 사람 인터루킨 lβ 성숙 폴리펩타이드 117-259); 인터루킨-2(즉, IL-2; T-세포 성장 인자; 알데스루킨(데스알라닐-1, 세린-125 사람 인터루킨 2); Proleukin®; Teceleukin®); 인터루킨-7(즉, IL-7); 인터루킨-12(즉, IL-12; 천연 킬러 세포 자극 인자(NKSF); 세포독성 림프구 성숙 인자(CLMF)); ISCOM(s)™(즉, 면역자극 복합체); Iscoprep 7.0.3.™; 리포좀(즉, 단백질 또는 Th-세포 및/또는 B-세포 펩타이드, 또는 인터루킨-2, BisHOP 또는 DOTMA가 공동내포되거나 내포되지 않은 미생물을 함유하는 리포좀(L); A, [L(항원)]); 록소리빈(즉, 7-알릴-8-옥소구아노신); LT-OA 또는 LT 경구 보조제(즉, 대장균 불안정성 장독소 프로톡신); MF59; MONTANIDE ISA 51(즉, 정제된 IFA; 불완전 프로인트 보조제); MONTANIDE ISA 720(즉, 대사 오일 보조제); MPLTM(즉, 3-Q-데스아실-4'-모노포스포릴 지질 A; 3D-MLA); MTP-PE(즉, N-아세틸-L-알라닌-D-이소글루타민일-L-알라닌-2-(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-(하이드록시-포스포릴옥시))에틸아미드, 일나트륨염); MTP-PE 리포좀(즉, MTP-PE 항원 제공 리포좀); 뮤라메타이드(Murametide)(즉, Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3); 뮤라팔미틴(Murapalmitine)(즉, Nac-Mur-L-Thr-D-isoGIn-sn-글리세롤 디팔미토일); D-뮤라팔미티엔(즉, Nac-Mur-D-Ala-D-isoGln-sn-글리세롤 디팔미토일); NAGO(즉, 뉴라미니다제-갈락토스 옥시다제); 비이온성 계면활성제 소포(즉, NISV); 플루란(Pleuran) (즉, b-글루칸; 글루칸); PLGA, PGA, 및 PLA(즉, 젖산 및 글리콜산의 동종중합체 또는 공중합체; 락타이드/글리콜라이드 중합체; y-락틱-코-글리콜라이드); 플루로닉(Pluronic) L121(즉, Poloxamer 401); PMMA(즉, 폴리메틸 메타크릴레이트); PODDSTM(즉, 단백성 미소구); 폴리rA : 폴리rU(즉, 폴리아데닐산-폴리우리딜산 복합체); 폴리소르베이트(Polysorbate) 80(즉, Tween 80; 소르비탄 모노-9-옥타데세노에이트 폴리(옥시-1,2-에탄디일) 유도체); 단백질 코킬레이트; QS-21(즉, Stimulon™ QS-21 보조제); Quil-A(즉, Quil-A 사포닌, Quillaja 사포닌); Rehydragel HPA(즉, 고단백질 흡착성 수산화알루미늄 겔; 백반); Rehydragel LV(즉, 저점도 수산화알루미늄 겔; 백반); S-28463(즉, 4-아미노-옥텍,-디메틸-2-에톡시메틸-lH-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올); SAF-1(즉, SAF-m; Syntex Adjuvant Formulation); Sclavo 펩타이드(즉, I L-1b 163-171 펩타이드); 센다이 프로테오리포좀, 센다이 함유 지질 매트릭스(즉, 센다이 당단백질 함유 소포; 융합원성 프로테오리포좀; FPLs); Span 85(즉, Arlacel 85, 소르비탄 트리올레이트); 스페콜(Specol); 스쿠알란(Squalane) (즉, 스피나칸; Robane®; 2,6,10,15,19,23-헥사메틸테트라코산); 스쿠알렌(스피나센; Supraene; 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22 테트라코사헥사엔); 스테아릴 타이로신(즉, 옥타데실 타이로신 염산염); Theramide™(즉, N-아세틸글루코사민일-N-아세틸이누라밀-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-디팔미톡시 프로필아미드(DTP-DPP)); 트레오닐-MDP(즉, Termurtide™; [thrl]-MDP; N-아세틸뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민); Ty 입자(즉, Ty-VLPs, (바이러스 유사 입자)); Walter Reed 리포좀(즉, 수산화알루미늄에 흡착된 지질 A를 함유하는 리포좀, [L(지질 A + 항원) + 백반])이 있다.

보조제 외에도, T 세포 면역성을 상향조절하거나 억제인자 세포 활성을 하향조절하는 것으로 밝혀져 있는 생물학적 반응 변형제(BRM)을 공동투여하는 것이 바람직할 수도 있다. 이러한 BRM에는 비제한적으로, 시메티딘(CIM; 1200mg/d) (Smith/Kline, PA); 또는 저용량 사이클로포스포아미드(CYP; 300mg/㎡) (Johnson/Mead, NJ) 및 사이토킨(예를 들면, γ-인터페론, IL-2, 또는 IL-12) 또는 면역 헬퍼 기능에 관여하는 단백질을 암호화하는 유전자, 예를 들면 B-7이 있다.

3. 백신

본 발명은 암 또는 전암의 발생을 예방하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 이와 같은 본 발명은 능동 및 수동 면역 양태에 유용한 백신에 관한 것이다. 백신으로 사용하기에 적합한 것으로 제안된 면역원성 조성물은 본 명세서에 개시된 방법으로 제조된, 정제된 MDA-7로부터 직접 제조되는 것이 가장 용이하다. 항원 물질은 불필요한 소분자량 분자의 제거를 위해 충분히 투석하고(하거나) 동결건조하여, 바람직한 운반체에 즉석 배합용 제형으로 제조될 수 있다.

활성 성분으로서 MDA-7 서열을 함유하는 백신의 제조방법은 일반적으로 당업계에 널리 알려져 있는데, 예를 들면 본원에 참고되는 미국 특허 5,958,895, 6,004,709 및 5,620,896에 예시된 것과 유사하게 실시할 수 있다. 일반적으로, 이러한 백신은 액체 용액 또는 현탁액과 같은 주사제로 제조되지만, 주사 전 액체 용액 또는 액체 현탁액으로 제조하기에 적당한 고체 형태로 제조할 수도 있다. 또한, 제제는 유화될 수 있는 것이다. 활성 면역원성 성분은 종종 약제학적으로 허용되는이며 활성 성분과 화합성인 부형제와 혼합된다. 적당한 부형제에는, 예를 들면 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 이의 조합물이 있다. 또한, 필요한 경우에 백신은 습윤제, 유화제, pH 완충제 또는 백신의 유효성을 향상시키는 보조제와 같은 보조 물질을 소량 함유할 수 있다.

백신은 통상적으로 비경구 투여, 주사 투여, 예를 들면 피하 주사 또는 근육내 주사로 투여될 수 있다. 다른 투여 방식에 적당한 또 다른 배합물에는 좌약 및 일부 예로서 경구 배합물이 있다. 좌약인 경우에는 통상적인 결합제 및 담체, 예를 들면 폴리알킬렌글리콜 또는 트리글리세라이드가 포함될 수 있으며, 이러한 좌약은 활성 성분을 약 0.5% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 1% 내지 약 2% 범위로 함유하는 혼합물로 제조할 수 있다. 경구 배합물은 약학 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 소듐사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 일반적으로 이용되는 부형제를 함유한다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐, 지속방출형 제제 또는 분말 형태일 수 있고, 약 10% 내지 약 95%의 활성 성분, 바람직하게는 약 25% 내지 약 70%의 활성 성분을 함유할 수 있다.

MDA-7 단백질(또는 이의 단편) 또는 MDA-7 전체 또는 일부를 암호화하는 핵산은 중성 또는 염 형태로서 백신으로 조제될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염에는 무기산(예를 들면, 염산 또는 인산) 또는 유기산(예를 들면, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등)으로 제조된 산 부가 염(단백질의 유리 아미노 기에 의해 형성됨)이 있다. 또한, 유리 카르복실 기에 형성된 염은 무기 염기(예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철 수산화물) 또는 유기 염기(예를 들면, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등)로부터 유도될 수 있다.

백신은 투여 배합물에 적합한 방식으로, 치료적 유효성이며 면역원성인 정도의 양으로 투여한다. 투여되는 양은 치료받는 검체의 특성, 예를 들면 항체를 합성하는 개체 면역계의 능력 및 원하는 예방 정도 등에 따라 달라진다. 따라서, 투여받아야 활성 성분의 정확한 양은 담당의사의 판단에 따라 달라진다. 하지만, 적당한 투여량은 백신접종 당 수백㎍의 활성 성분 정도이다. 1차 투여 및 추가항원 접종에 적당한 섭생 역시 다양하지만, 일반적으로 1차 투여 후 후속 접종 또는 다른 투여를 실시한다.

적용 방식은 매우 다양할 수 있다. 통상적인 백신 투여방법 중 임의의 방법을 사용할 수 있다. 그 예에는, 고체 생리학적 허용성 베이스 상의 경구용, 또는 생리적 허용성 분산액 중의 경구용, 비경구용, 주사용 등이 포함될 수 있을 것으로 생각된다. 백신의 투여량은 투여 경로 및 숙주의 크기에 따라 달라질 수 있다.

백신의 보강 효과를 달성하기 위한 다양한 방법에는 일반적으로 인산염 완충 식염수 중에 약 0.05 내지 약 0.1% 용액으로 사용되거나, 약 0.25% 용액으로 사용되는 합성 당 중합체(Carbopol®)와의 혼합물로서 사용되거나, 약 70℃ 내지 약 101℃ 사이의 온도로 각각 30초 내지 2분간 열처리하여 수득되는 백신 중의 단백질 응집물로 사용되는 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄(백반)과 같은 제제의 사용이 포함된다. 또한, 알부민에 대한 펩신-처리된 (Fab) 항체를 이용한 재활성화에 의한 응집물, C.파르범과 같은 박테리아 세포, 내독소 또는 그람 음성 박테리아의 리포폴리사카라이드 성분과의 혼합물, 만나이드 모노-올레이트(Aracel A)와 같은 생리학적 허용성 오일 운반체 중의 에멀젼 또는 블록 치환체로서 사용된 퍼플루오로카본(Fluosol-DA®) 20% 용액에 의한 에멀젼도 사용될 수 있다.

많은 경우에, 백신 투여는 다중 투여인 것이 바람직하며, 일반적으로 6회 이하, 보다 일반적으로 4회 이하의 백신접종이 실시되고, 바람직하게는 1회 또는 그 이상, 흔히 적어도 약 3회의 백신접종으로 실시되는 것이 좋다. 백신접종은 일반적으로 2 내지 12주 간격으로 실시하고, 보다 일반적으로는 3 내지 5주 간격으로 실시한다. 1 내지 5년 간격, 일반적으로 3년의 주기적 부스터는 항체의 예방 정도를 유지시키는데 바람직할 것이다. 면역화 후, 상청액 항원에 대하여 항체 분석을 실시한다. 이러한 분석은 통상적인 표지, 예를 들면 방사선핵종, 효소, 형광물질 등으로 표지화하여 수행할 수 있다. 이러한 기술은 공지되어 있으며, 이러한 유형의 분석법을 예시하는 다양한 특허, 예를 들면 미국 특허 3,791,932; 4,174,384 및 3,949,064에서 찾아볼 수 있다.

4. 배합 치료

특정 양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 MDA-7 폴리펩타이드 또는 이를 암호하는 발현 작제물과 함께 MDA-7의 효과를 향상시키거나 또는 MDA-7을 이용하고 있는 임의의 치료, 진단 또는 예후 효과를 증가시키는 다른 제제 또는 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 암세포 사멸이나 혈관신생 억제와 같은 목적 효과를 달성하기에 효과적인 혼합 함량으로 제공될 수 있다. 이러한 과정은 세포를 발현 작제물 및 상기 제제(들) 또는 다수의 인자(들)와 동시에 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 이는, 상기 제제들을 함께 함유하는 단일 조성물 또는 약리학적 제형과 세포를 접촉시키거나 또는 한 조성물은 발현 작제물을 함유하고 다른 조성물은 제2 제제를 함유하는 2종의 다른 조성물이나 제형과 세포를 동시에 접촉시켜 수행할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, mda-7 유전자 요법은 다른 아폽토시스 촉진제, 항혈관신생제, 항암제 또는 세포 주기 조절제 외에, 면역 요법 시술과 함께 사용될 수 있다. 대안적으로, 이 요법은 수분 내지 수주 간격으로 다른 제제 처리를 전처리하거나 후처리할 수 있다. 다른 제제 및 발현 작제물이 세포에 각각 적용되는 양태의 경우에, 일반적으로 각 전달 시점 사이에 유의적인 시간이 경과되지 않도록 하여, 제제와 발현 작제물이 유리하게 조합된 효과가 세포에 지속적으로 발휘될 수 있도록 해야 한다. 이러한 경우, 세포는 두 치료 양태와 각각 약 12 내지 24시간 이내에, 보다 바람직하게는 각각 약 6 내지 12시간 이내에 접촉되는 것이 고려되어야 한다. 하지만, 일부 경우에는 치료 시점을 상당히 연장시켜, 각 투여 간격이 수일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)인 것이 바람직할 수도 있다.

다양한 조합이 다음과 같이 이용될 수 있다. 여기서 유전자 요법은 "A"이고, 면역요법 섭생의 일부로서 제공되는 면역원성 분자, 예를 들면 항원은 "B"이다:

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A

B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B

B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

본 발명의 치료용 발현 작제물의 환자로의 투여는 벡터의 독성(존재한다면)을 고려하여, 이러한 화합물의 투여에 일반적인 프로토콜에 따라 실시한다. 필요한 경우, 치료 사이클은 반복될 수 있을 것으로 생각된다. 또한, 이러한 치료법과 함께 수술 시술뿐만 아니라 다양한 표준 치료법을 적용할 수도 있다.

특정 양태에는 화학요법, 방사선요법, 면역요법 또는 기타 다른 요법과 같은 항암요법을 본 명세서에 기술된 바와 같이 MDA-7 치료법과 함께 사용하는 것도 포함된다.

a. 화학요법

암 요법은 또한 화학 및 방사선 기초 치료 둘 다를 사용한 각종 배합 요법을 포함한다. 배합 화학요법제는 예를 들면, 시스플라틴(CDDP), 카보플라틴, 프로카바진, 메클로르에타민, 사이클로포스파미드, 캄프토테신, 이포스파미드, 멜팔란, 클로르암부실, 부설판, 니트로스우레아, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 플리코마이신, 미토마이신, 에토포시드(VP16), 타목시펜, 랄록시펜, 에스트로겐 수용체 결합 제제, 탁솔, 겜시타비엔, 나벨빈, 파네실-단백질 트랜스퍼라제 억제제, 전이백금, 5-플루오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 메토트렉세이트, 또는 전술한 화합물의 임의의 유사체 또는 유도적 변형체를 포함한다.

b. 방사선요법

DNA 손상을 유도하고 광범위하게 사용되는 다른 인자는 통상 γ-선, X-선 및/또는 종양 세포로의 방사선동위원소의 지시적 전달로서 공지된 것을 포함한다. 마이크로파, 양성자빔 조사(미국 특허 제5,760,395호 및 미국 특허 제4,870,287호) 및 UV-조사와 같은 DNA 손상 인자의 다른 형태가 또한 고려된다. 이들 인자 모두 필시 DNA, DNA 전구체, DNA의 복제 및 수복 및 염색체의 조합 및 유지에 대한 넓은 범위의 손상에 영향을 준다. X-선에 대한 선량 범위는 연장된 기간(3주 내지 4주) 동안 50 내지 200뢴트겐의 1일 선량 내지 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 선량에 이른다. 방사선동위원소에 대한 선량 범위는 매우 다양하며, 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도 및 유형, 및 신생물 세포에 의한 흡수에 따라 좌우된다.

용어 "접촉된" 및 "노출된"(세포에 적용된 경우)은 본원에 사용되어 치료적 작제물 및 화학요법제 또는 방사선요법제가 표적 세포에 전달되거나 표적 세포와 직렬로 위치하는 방법을 기술한다. 세포 치사를 성취하기 위해, 예를 들면, 둘 다의 제제를 세포를 치사시키거나 분열을 방지하는데 유효한 배합량으로 세포에 전달한다.

c. 면역요법

암 치료의 측면에서, 일반적으로 면역요법은 암 세포를 표적으로 하거나 파괴하기 위한 면역 효과기 세포 및 분자의 사용에 의존한다. Trastuzumab(Herceptin™)는 이러한 한가지 예이다. 면역 효과기는 예를 들어 종양 세포의 표면에 존재하는 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 이러한 항체는 단독으로 치료 효과기로서 작용하거나 또는 실제 세포 사멸을 실시하는 다른 세포를 모집할 수 있다. 또한, 항체는 약물 또는 독소(화학치료제, 방사선핵종, 리신 A쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합되어, 단순히 표적화 제제로서 작용할 수도 있다. 대안적으로, 효과기는 직접 또는 간접적으로 종양 세포 표적과 상호작용하는 표면 분자가 실린 림프구일 수 있다. 다양한 주효세포에는 세포독성 T 세포 및 NK 세포가 있다. 치료 양태의 조합, 즉 직접 세포독성 활성과 ErbB2의 억제 또는 감소는 ErbB2 과발현 암의 치료에 치료적 효과를 제공할 수 있다.

또한, 또 다른 면역요법도 MDA-7과의 복합 치료의 일부로서 사용될 수 있다. 배합 치료의 일반적 방법은 이하에 설명되는 바와 같다. 면역요법의 한 측면에서,종양 세포는 표적화되기 쉬운, 즉 다른 세포 대부분에 존재하지 않는 일부 마커를 보유해야 한다. 다수의 종양 마커가 존재하고, 이 중 임의의 것이 본 발명의 측면에서 표적화하기에 적합할 수 있다. 통상의 종양 마커는 암배아 항원, 전립선 특이적 항원, 비뇨기 종양 관련 항원, 태아 항원, 타이로시나제(p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원, MucA, MucB, PLAP, 에스트로겐 수용체, 라미닌 수용체, erb B 및 p155를 포함한다. 면역요법의 대안적 측면은 항암 효과와 면역 자극 효과를 조합하기 위한 것이다. IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN과 같은 사이토카인, MIP-1, MCP-1, IL-8과 같은 키모카인 및 FLT3 리간드와 같은 성장 인자를 포함하는 면역자극 분자가 또한 존재한다. 종양 억제인자(MDA-7)와 조합된 단백질로서 또는 유전자 전달을 이용한 면역 자극 분자의 조합은 항암 효과를 증가시키는 것으로 확인되었다(Ju et al., 2000).

앞서 설명한 바와 같이, 현재 연구 중이거나 사용 중인 면역요법의 예에는 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 플라스모듐 팔시파럼(Plasmodium falciparum), 디니트로클로로벤젠 및 방향족 화합물과 같은 면역 보조제(U.S. Patent 5,801,005; U.S. Patent 5,739,169; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998), 인터페론 α,β 및 γ와 같은 사이토킨 치료; IL-1, GM-CSF 및 TNF(Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998 ; Hellstrand et al., 1998) 유전자 요법, 예를 들면, TNF, IL-1, IL-2, p53(Qin et al., 1998; Austin-Ward and Villaseca, 1998; 미국 특허 제5,830,880호 및 미국 특허 제5,846,945호) 및 모노클로날 항체, 예를 들면 항강글리오사이드 GM2, 항-HER-2, 항-pl85; Pietras et al., 1998 ; Hanibuchi et al., 1998; 미국 특허 제5,824,311호)가 있다. 헤르셉틴(trastuzuMAb)은 HER2-neu 수용체를 차단하는 키메라(마우스-사람) 모노클로날 항체이다. 이는 항암 활성이 있고, 악성 종양의 치료에 유용하다는 인정을 받고 있다(Dillman, 1999). 이러한 항암 치료 중 하나 이상을 본 명세서에 기술된 MDA-7 치료와 함께 사용되는 것도 본 발명에 포함된다.

암의 수동적 면역요법을 위한 다수의 상이한 접근방법이 존재한다. 이들은 다음과 같이 넓게 범주화될 수 있다: 항체만의 주사; 독소 또는 화학요법제와 커플링된 항체의 주사; 방사선 동위원소와 커플링된 항체의 주사; 항-유전형 항체의 주사; 및 마지막으로, 골수내의 종양 세포의 제거.

바람직하게는, 사람 모노클로날 항체는 환자에게 부작용을 거의 유발하지 않거나 전혀 유발하지 않기 때문에 수동적 면역요법에 사용될 수 있다. 그러나, 이들의 적용은 희귀성에 의해 다소 제한적이며 지금까지 오직 손상부위내로만 투여되었다. 강글리오시드 항원에 대한 사람 모노클로날 항체는 피부재발흑생종으로 투병중인 환자에 손상부위내적으로 투여된다(문헌[참조: Irie and Morton, 1986]). 손상부위내적 주사 후 매일 또는 주단위로, 10명 중 6명의 환자에게서 퇴행이 관찰되었다. 다른 연구에서, 2개의 사람 모노클로날 항체의 손상부위내적 주사로부터 중간정도의 성공이 성취되었다(Irie et al., 1989).

2개의 상이한 항원 또는 심지어 다중 항체 특이성을 갖는 항체에 대해 지시된 1개 이상의 모노클로날 항체를 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 치료 프로토콜은 또한 문헌[참조: Bajorin et al., (1988)]에 기술된 바와 같이 림포카인 또는 다른 면역 증진제의 투여를 포함할 수 있다. 사람 모노클로날 항체의 개발은 본 명세서의 다른 곳에 추가로 상세히 기술되어 있다.

능동적 면역요법에서는, 일반적으로 항원성 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질, 또는 자가 또는 동종 종양 세포 조성물 또는 "백신"을 독특한 세균성 보조제와 함께 투여한다(Ravindranath and Morton, 1991; Morton et al., 1992; Mitchell et al., 1990; Mitchell et al., 1993). 흑색종 면역요법에서, 고도의 IgM 반응을 유발하는 이들 환자는 흔히 IgM 항체를 전혀 유발하지 않거나 낮게 유발하는 환자보다 더 잘 생존한다(Morton et al., 1992). IgM 항체는 흔히 일과성 항체이며 항-강글리오시드 또는 항탄수화물 항체에 대해서는 당해 규칙에 대한 예외가 나타난다.

입양 면역요법에서, 환자의 순환 림프구 또는 종양 침투 림프구를 IL-2와 같은 림포카인으로 활성화시키거나 종양 괴사에 대한 유전자로 형질도입시켜 시험관내에서 분리하고 재투여했다(Rosenberg et al., 1988; 1989). 이를 수행하기 위해, 동물 또는 사람 환자에게, 본원에 기술된 바와 같은 보조제-혼입된 항원성 펩타이드 조성물과 배합된 면역학적 유효량의 활성 림프구를 투여할 것이다. 활성화된 림프구는 가장 바람직하게는 혈액 또는 종양 샘플로부터 초기에 분리되고 시험관내에서 활성화된(또는 "확장된") 환자 자신의 세포일 것이다. 이러한 면역요법의 형태는 여려 경우의 흑색종 및 신장 암종의 퇴행을 유발하였지만, 반응체의 퍼센트는 반응하지 않는 사람과 비교하여 매우 작았다.

d. 유전자 요법

다른 양태에서, 배합 치료는 치료적 폴리뉴클레오타이드를 MDA-7 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 투여하기 전, 후 또는 동시에 투여하는 유전자 요법을 포함한다. 다음의 유전자 생성물 중 하나를 암호화하는 벡터와 함께 MDA-7 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드의 전달은 표적 조직상에 조합된 항암 효과를 가질 것이다. 다양한 단백질이 본 발명에 포함되며, 이중 일부는 하기에 기술된다. 표 3에는 본 발명을 조합된 일부 형태의 유전자 요법의 표적이 될 수 있는 다양한 유전자들이 열거되어 있다.

i) 세포 증식의 유도제

추가로 세포 증식을 유도하는 단백질을 기능에 따라 각종 범주로 묶는다. 모든 이들 단백질의 공통점은 세포 증식을 조절할 수 있는 능력이다. 예를 들면, PDGF의 형태, 시스(sis) 종양유전자는 방출된 성장 인자이다. 종양유전자는 성장 인자를 암호화하는 유전자로부터 거의 발생하지 않으며, 현재, 시스는 유일하게 공지된 자연 발생적 종양유전성 성장 인자이다. 본 발명의 한 양태에서는, 세포성 증식의 특정 유도체로 지시된 안티-센스 mRNA를 세포 증식의 유도체의 발현을 억제하기 위해 사용하고자 한다.

단백질 FMS 및 ErbA는 ErbB와 마찬가지로 성장 인자 수용체이다. 이들 수용체의 돌연변이는 조절 기능의 손실을 초래한다. 예를 들면, Neu 수용체 단백질의 경막 도메인에 영향을 주는 점돌연변이는 neu 종양유전자를 초래한다. erbA 종양유전자는 갑상선 호르몬에 대한 세포내 수용체로부터 유래한다. 변형된 종양유전자성 ErbA 수용체는 내인성 갑상선 호르몬 수용체와 경쟁하여 비제어된 성장을 유도하는 것으로 사료된다.

종양유전자의 가장 큰 부류는 시그날 변환 단백질(예를 들면, Src, Abl 및 Ras)을 포함한다. 단백질 Src는 세포질 단백질-티로신 키나제이며, 몇몇 경우에 원발성-종양유전자의 종양유전자로의 형질전환이 티로신 잔기 527에의 돌연변이를 통해 발생한다. 대조적으로, 한가지 예에서, GTPase 단백질 ras의 원발성-종양유전자에서 종양유전자로의 형질전환은 서열 중 아미노산 12에서 발린의 글라이신으로의 돌연변이에 의해 초래되며, 이는 ras GTPase 활성을 감소시킨다.

단백질 Jun, Fos 및 Myc는 전사 인자로서 핵 기능에 대한 이들의 영향을 직접적으로 발휘하는 단백질이다.

ii) 세포 증식의 억제제

종양 억제제 종양유전자는 과도한 세포 증식을 억제하는 기능을 한다. 이들 유전자의 불활성화는 이들의 억제 활성을 파괴하며, 조절되지 않은 증식을 초래한다. 종양 억제제 p53, p16 및 C-CAM은 아래에 기술되어 있다.

p53외의 다른 세포 증식 억제제는 p16이다. 진핵세포 주기의 주된 전이는 사이클린-의존성 키나제 또는 CDK에 의해 유발된다. 한 CDK인 사이클린-의존성 키나제 4(CDK4)는 G₁기를 통해 진행을 조절한다. 당해 효소의 활성은 G₁ 후기에 Rb를 인산화시키는 것일 수 있다. CDK4의 활성은 활성화 아단위인 D-형 사이클린 및 억제성 아단위에 의해 제어되며, p16^INK4는 CDK4에 특이적으로 결합하여 이를 억제하는 단백질로서 생화학적으로 특징화되었고, 따라서 Rb 인산화를 조절할 수 있다( Serrano et al., 1993; Serrano et al., 1995). p16^INK4단백질이 CDK4 억제제이기 때문에(Serrano, 1993), 이들 유전자의 결실은 CDK4의 활성을 증가시켜 Rb 단백질의 과인산화를 초래할 수 있다. p16은 또한 CDK6의 기능을 조절하는 것으로 공지되어 있다.

p16^INK4는 또한 pl6^B, pl9,p21^WAFl 및 p27^KIP1을 포함하는 CDK-억제성 단백질의 신규히 기술된 부류에 속한다. p16^INK4유전자는 많은 종양 유형에서 빈번히 결실된 유전자 영역인 9p21에 대해 맵핑된다. 이러한 p16^INK4유전자의 동종접합 결실 및 돌연변이는 사람 종양 세포주에서 빈번하다. 이러한 증거는 p16^INK4유전자가 종양 억제 유전자임을 제안한다. 그러나 이러한 해석은 p16^INK4유전자 치환의 빈도가 배양된 세포주에서보다 원발성 비배양 종양에서 매우 낮다는 관찰에 의해 의심되기 시작했다(Caldas et al., 1994 ; Cheng et al., 1994; Hussussian et al., 1994; Kamb et al., 1994; Kamb et al., 1994; Mori et al., 1994; Okamoto et al., 1994; Nobori et al., 1994; Orlow et al., 1994; Arap et al., 1995). 플라스미드 발현 벡터를 사용한 형질감염에 의한 야생형 p16^INK4기능의 수복은 일부 사람 암 세포주에 의한 콜로니 형성을 감소시켰다(Okamoto, 1994; Arap, 1995).

본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 유전자는 Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, zacl, p73, VHL, MMAC1/PTEN, DBCCR-1, FCC, rsk-3, p27, p27/pl6 융합, p21/p27 융합, 항혈전 유전자(예를 들면, COX-1,TFPI), PGS, Dp, E2F, ras, myc, neu, raf, erb, fms, trk, ret, gsp, hst, abl, ElA, p300, 혈관신생에 포함되는 유전자(예를 들면, VEGF, FGF, 트롬보스폰딘, BAI-1, GDAIF 또는 이들의 수용체) 및 MCC를 포함한다.

iii) 프로그램된 세포사멸의 조절자

아폽토시스 또는 프로그램된 세포사멸은 정상 배아 발달, 성숙한 조직에서의 항상성 유지 및 발암 억제를 위한 필수 과정이다(문헌[참조: Kerr et al., 1972]). 단백질의 Bcl-2 계열 및 ICE-유사 프로테아제는 다른 시스템에서 중요한 조절자 및 아폽토시스의 효과기인 것으로 입증되어 왔다. 소포 림프종과 관련되어 발견된 Bcl-2 단백질은 다양한 아폽토시스성 자극에 대해 반응하여 아폽토시스 조절 및 세포 생존 증진에서 중요한 역할을 수행한다(Bakhshi et al., 1985; Cleary and Sklar, 1985; Cleary et al., 1986; Tsujimoto et al., 1985; Tsujimoto and Croce, 1986). 현재 진화적으로 보존된 Bcl-2 단백질은 관련 단백질계의 구성원인 것으로 인지되며, 이는 치사 효능제 또는 치사 길항제로서 범주화될 수 있다.

이의 발견에 이어, Bcl-2는 각종 자극에 의해 유발된 세포 치사를 억제하기 위해 작용하는 것으로 나타났다. 또한, 현재 공통적 구조 및 서열 상동성을 공유하는 Bcl-2 세포 치사 조절 단백질의 계열임이 명백하다. 이들 상이한 계열 구성원은 Bcl-2와 유사한 기능을 갖거나(예를 들면, Bcl_xL, Bcl_w, Bcl_s, Mcl-l, Al, Bfl-1) Bcl-2 기능에 역으로 작용하거나 세포 치사를 증진시키는 것으로 나타났다(예를 들면, Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad, Harakiri).

5. 수술

암환자 중 약 60%는 예방, 진단 또는 시기결정, 치료 및 완화 수술을 포함하는 일부 유형의 수술을 받을 것이다. 치료 수술은 본 발명의 치료, 화학요법, 방사선요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역요법 및/또는 대체 치료와 같은 다른 치료와 함께 사용될 수 있는 암 치료이다.

치료 수술은 암 조직의 모두 또는 이의 일부를 물리적으로 제거, 삭제 및/또는 파괴하는 절제를 포함한다. 종양 절제는 최소한 종양의 일부의 물리적 제거를 지칭한다. 종양 절제 외에, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 저온수술, 전자수술 및 현미경에 의해 조절되는 수술(모즈 수술)을 포함한다. 또한, 본 발명은 표재 암, 전암 또는 지엽적인 양의 정상 조직의 제거와 함께 사용될 수 있는 것으로 사료된다.

모든 암 세포, 조직 또는 종양 중 일부의 절제에 따라, 체내에 공동이 형성될 수 있다. 추가의 항암 치료와 함께 당해 영역의 관류, 직접 주사 또는 국소 적용에 의해 치료를 수행할 수 있다. 이러한 치료는 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일마다 또는 1, 2, 3, 4 및 5주마다 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12달마다 반복할 수 있다. 이들 치료는 또한 다양한 투여량으로 수행할 수 있다.

6. 다른 제제

치료의 치료 효능을 개선시키기 위해 본 발명과 함께 다른 제제를 사용하고자 한다. 이들 추가 제제는 면역조절제, 세포 표면 수용체 및 GAP 접합의 상향조절에 영향을 주는 제제, 세포증식 및 분화 제제, 세포 부착의 억제제, 아폽토시스 유도체에 대한 과다증식성 세포의 감수성을 증가시키는 제제 또는 다른 생물학적 제제를 포함한다. 면역조절제는 종양괴사인자; 인터페론 α, β및 γ; IL-2 및 다른 사이토카인; F42K 및 다른 사이토카인 유사체; 또는 MIP-1, MIP-1β, MCP-1, RANTES 및 다른 케모카인을 포함한다. 또한, 세포 표면 수용체 또는 이들의 리간드(예를 들면, Fas/Fas 리간드, DR4 또는 DR5/TRAIL(Apo-2 리간드))의 상향조절은 과다증식성 세포에 대한 자가분비 또는 외분비 효과의 성취에 의한 본 발명의 아폽토시스 유도 능력을 강화하는 것으로 사료된다. GAP 접합 수의 상승에 의한 증가된 세포내 시그날전달은 인접한 과다증식성 세포 집단에 대한 항과다증식성 효과를 증가시킬 것이다. 다른 양태에서, 세포증식 또는 분화 제제는 본 발명과 함께 사용되어 당해 치료의 항과다증식성 효능을 개선시킬 수 있다. 세포 부착의 억제제는 본 발명의 효능을 개선시키는 것으로 사료된다. 세포 부착 억제제의 예는 병소 부착 키나제(FAK) 억제제 및 로바스타틴이다. 또한, 아폽토시스에 대한 과다증식성 세포의 감수성을 증가시키는 다른 제제(예: 항체 c225)가 본 발명과 함께 사용되어 치료 효능을 개선시킬 수 있는 것으로 사료된다.

Apo2 리간드(Apo2L, 또한 TRAIL로 지칭됨)는 종양괴사인자(TNF) 사이토카인 계열의 구성원이다. TRAIL은 많은 유형의 암 세포에서 급속한 아폽토시스를 활성화시키지만, 정상 세포에는 유해하지 않다. TRAIL mRNA는 매우 다양한 조직에서 발생한다. 대부분의 정상 세포는 TRAIL 세포독성 작용에 내성인 것으로 나타나며, 이는 TRAIL에 의한 아폽토시스 유도에 대해 방어할 수 있는 메카니즘의 존재를 제안한다. TRAIL에 대해 기술된 제1 수용체(치사 수용체 4(DR4)로 지칭됨)는 세포질 "사멸 도메인"을 함유하고; DR4는 TRAIL에 의해 운반되는 아폽토시스 시그날을 전파한다. 추가의 수용체가 TRAIL에 결합하는 것으로 확인되었다. DR5로 지칭되는 한 수용체는 DR4와 같은 세포질 치사 도메인 및 시그날 아폽토시스를 함유한다. DR4 및 DR5 mRNA는 많은 정상 조직 및 종양 세포주에서 발현된다. 최근, DcR1 및 DcR2와 같은 유인 수용체가 TRAIL이 DR4 및 DR5를 통해 아폽토시스가 유도되는 것을 억제함이 확인되었다. 따라서 이들 유인 수용체는 세포 표면에서 직접적으로 전구-아폽토시스 사이토카인에 대한 감수성을 조절하는 신규한 메카니즘을 나타낸다. 정상 조직에서의 이들 억제제 수용체의 우선적 발현은 TRAIL이 정상 세포에는 해를 끼치지 않는 반면, 암 세포에서는 아폽토시스를 유도하는 항암제로서 유용할 수 있음을 제안한다(Marsters et al., 1999).

세포독성 화학요법 약물의 도입 후 암 치료에는 많은 발전이 있어왔다. 그러나, 화학요법의 결과 중 하나는 약물-내성 표현형의 발달/획득 및 다중 약물 내성의 발달이다. 약물 내성의 발달은 이러한 종양의 치료에 주요한 장애를 유지하며 따라서, 유전자 요법와 같은 대안적 접근에 대한 명백한 필요성이 있다.

화학요법, 방사선요법 또는 생물학적 요법과 함께 사용하기 위한 다른 치료 형태는 고체온증을 포함하며, 이는 환자의 조직을 높은 온도(106℉ 이하)에 노출시키는 과정이다. 외부 또는 내부 가열 장치는 국소, 국부 또는 전신 고체온증의 적용에 포함될 수 있다. 국소 고체온증은 종양과 같은 작은 영역에 대한 열 적용을 포함한다. 열은 신체 외부의 장치로부터 종양을 표적으로 하는 고주파를 사용하여 외부적으로 발생시킬 수 있다. 내부 열은 얇은 가열된 철사 또는 온수로 채워진 공동 관를 포함하는 멸균 프로브, 이식된 극초단파 안테나 또는 방사선주파수 일렉트로드를 포함할 수 있다.

환자의 기관 또는 사지를 국부 치료를 위해 자석과 같은 고에너지를 발생시키는 장치를 사용하여 가열시킨다. 대안적으로, 환자의 혈액 중 일부를 제거하고 가열 한 후 내부적으로 가열될 영역으로 관류시킬 수 있다. 또한 암이 전신에 퍼져있는 경우 전신 가열기를 삽입시킬 수 있다. 온수 블랭킷, 고온 왁스, 유도 코일 및 열 챔버를 이러한 목적을 위해 사용할 수 있다.

또한 호르몬 요법을 본 발명과 함께 또는 상기한 임의의 다른 암 치료와 함께 사용할 수 있다. 호르몬을 유방, 전립선, 난소 또는 자궁암과 같은 특정 암의 치료에 사용하여 테스토스테론 또는 에스트로겐과 같은 특정 호르몬의 효과의 수준을 낮추거나 차단할 수 있다. 이러한 치료는 흔히 치료 옵션으로서 또는 전이의 위험을 감소시키기 위해 하나 이상의 다른 암 치료와 함께 사용된다.

종양유전자
유전자	근원	사람 질병	기능
성장 인자 FGF 계열 구성원
HST/KS INT 2 INTI/WNTI SIS	형질감염 MMTV 프로모터 삽입 MMTV 프로모터 삽입 유인원 육종 바이러스		FGF 계열 구성원 인자-유사 PDGF B
수용체 타이로신 키나제
ERBB/HER ERBB 2/NEU/HER 2 FMS KIT TRK MET RET ROS PDGF 수용체 TGF-β수용체	조류 적혈모구증 바이러스; ALV 프로모터 삽입; 증폭된 사람 종양 랫트 아교모세포종으로부터 형질감염됨 SM 고양이 육종 바이러스 HZ 고양이 육종 바이러스 사람 결장암으로부터 형질감염 사람 골육종으로부터 형질감염 전위 및 점돌연변이 URII 조류 육종 바이러스 전위	증폭된, 결실된 편평세포 암; 아교모세포종 증폭된 유방, 난소, 위암 산발성 갑상선암; 가족수질 갑상선암; 다중 내분비 신생물 2A 및 2B 만성 골수단핵구밸혈병 결장 암종 미스매치 돌연변이 표적	EGF/TGF-α/ 암피레굴린/ 헤타셀룰린 수용체 NDF/헤레굴린 및 EGF-관련 인자에 의해 조절됨 CSF-1 수용체 MGF/스틸 수용체 조혈 NGF(신경성장인자) 수용체 산란 인자/HGF 수용체 오르판 수용체 Yyr 키나제 고아 수용체 Yyr 키나제 TEL(STS-유사 전사인자)/PDGF 수용체 유전자 융합

비수용체 타이로신 키나제
ABI. FPS/FES LCK SRC YES	아벨손 Mul.V 조류 푸지나미 SV; GA FeSV Mul.V(설치류 백혈병 바이러스) 프로모터 삽입 조류 로스 육종 바이러스 조류 Y73 바이러스	BCR을 갖는 만성 골수백혈병 전위	RB, RNA, 폴리머라제, CRK, CBL과의 상호작용 Src 계열; T 세포 시그날전달; CD4/CD8 T 세포와의 상호작용 시그날전달 기능을 갖는 막관련 Tyr 키나제; 수용체 키나제에 의해 활성화됨 Scr 계열; 시그날전달
SER/THR 단백질 키나제
AKT MOS PIM-1 RAF/MIL	AKT8 설치류 레트로바이러스 말로니 설치류 SV 프로모터 삽입 마우스 3611 설치류 SV; MH2 조류 SV		PI(3)K?에 의해 조절됨; 70-kd S6 k?를 조절함 GVBD; 세포증식 인자; MAP 키나제 키나제 RAS 경로 중 시그날전달
각종 세포 표면
APC DCC E-카드헤린 PTC/NBCCS TAN-1 홈 상동체	종양 억제제 종양 억제제 후보 종양 억제제 종양 억제제 및 초파리 상동성 전위	결장암 결장암 유방암 모반 기저 세포암 증후군(고를린 증후군) T-ALI.	카테닌과의 상호작용 CAM 도메인 세포외 동종 결합; 카테닌과의 세포내 상호작용 12개의 경막 도메인; 헷지호그 경로를 길항하기 위해 Gli 상동성 CI를 통해 시그날전달

각종 시그날전달
BCL-2 CBL CRK DPC4 MAS NCK	전위 Mu Cas NS-1 V CT1010 ASV 종양 억제제 형질감염 및 종양원성	B-세포 림프종 췌장암	아폽토시스 타이로신- 인산화된 RING 핑거는 Abl과 상호작용 적응된 SH2/SH3는 Abl과 상호작용 TGF-β-관련 시그날전달 경로 가능한 안지오텐신 수용체 적응기 SH2/SH3
구아닌 뉴클레오타이드 교환기 및 결합 단백질
BCR DBL GSP NF-1 OST 하비-키르스텐 N-RAS VAV	형질감염 유전성 종양 억제제 형질감염 HaRat SV; Ki RaSV; Balb-MoMuSV; 형질감염 형질감염	CML에서 ABL로 전위됨 종양 억제제 신경섬유종증 많은 사람 종양 내의 점 돌연변이	교환기; 단백질 키나제 교환기 RAS GAP 교환기 시그날 다단계 S112/S113; 교환기

핵 단백질 및 전사 인자
BRCA1 BRCA2 ERBA ETS EVII FOS GLI HMGI /LIM JUN MLL/VHRX + ELI/MEN MYB MYC N-MYC L-MYC REL SKI VHL WT-1	유전성 억제제 유전성 억제제 조류 적혈모구혈정 바이러스 조류 E26 바이러스 MuLV 프로모터 삽입 FBI/FBR 설치류 골육종 바이러스 증폭된 신경아교종 전위 t(3:12) t(12:15) ASV-17 전위/ELL과 MLL의 융합 트리토락스-유사 유전자 조류 골수보구증 바이러스 조류 MC29; 전위 B-세포 림프종; 프로모터 삽입 조류 백혈증 바이러스 증폭됨 조류 레트리쿨로엔도텔리오시스 바이러스 조류 SKV770 레트로바이러스 유전성 억제제	유방암/난소암 유방암 AML 신경아교종 림프종 급성 골수 백혈병 버킷 림프종 신경모세포종 폐암 폰 히펠-란다우 증후군 윌름 종양	국소화 동요 기능 비공지 갑상선 호르몬 수용체(전사) DNA 결합 전사 인자 c-JUN을 갖는 전사 인자 아연 핑거; 팔꿈치 인터럽투스 상동성이 헷지호그 시그날전달 경로에 있다; 억제성 연결 PTC 및 헷지호그 유전자 융합 고 이동성 그룹 HMGI-C(XT-훅) 및 전사 인자 LIM 또는 산성 도메인 FOS를 갖는 전사 인자 AP-1 DNA-결합의 유전자 융합 및 ELI RNA pol II 연장 인자를 갖는 메틸 트랜스퍼라제 MLL DNA 결합 MAX 파트너와 DNA 결합; 사이클린 조절; RB?와 상호작용; 아폽토시스 조절? NF-κB 계열 전사 인자 전사 인자 음성 조절자 또는 연장자; 전사 연장 복합체 전사 인자

유전자	근원	사람 질병	기능
세포 주기 상해 반응
ATM BCL-2 FACC FHIT hMLI/MutL HMSH2/MutS HPMS1 hPMS2 INK4/MTS1 INK4B/MTS2 MDM-2 p53 PRAD1/BCL1 RB XPA	유전성 장애 전위 점돌연변이 취약 위치 3p14.2 9p21에서의 인접 INK-4B; CDK 복합체 증폭됨 SV40 T 항원과 관련 부갑상선 호르몬 또는 IgG로 전위 유전성 망막모세포종; 많은 DNA 바이러스 종양 항원과 관련	모세혈관확장성조화운동불능 소포 림프종 판코니 빈혈 그룹 C(소인 백혈병) 폐 암종 HNPCC HNPCC HNPCC HNPCC 후보 MTSl 억제제 및 MLM 흑생종 유전자 후보 억제제 육종 유전성 Li-프라우메니 증후군을 포함한, 사람 종양의 50% 초과가 변이됨 부갑상선 부종; B-CLL 망막모세포종; 골육종; 유방암; 다른 산발성 암 색소성 피부건조증; 피부암 소인	단백질/지질 키나제 상동성; DNA 상해는 P53 경로 중 상류에서 반응한다 아폽토시스 히스티딘 세징후-관련 디아데노신 5',3''''-P¹.P⁴ 테트라포스페이트 비대칭 하이드롤라제 미스매치 수복; MutL 상동성 미스매치 수복; MutS 상동성 미스매치 수복; MutL 상동성 미스매치 수복; MutL 상동성 p16 CDK 억제제 p15 CDK 억제제 음성 조절제 p53 전사 인자; 확인점 조절; 아폽토시스 사이클린 D 사이클린/cdk와 상호작용; E2F 전사 인자 조절 삭제 수복; 광생성물 인지; 아연 핑거

e. 면역원성 폴리펩타이드/펩타이드 및 핵산

또 다른 양태에서, 면역원성 분자는 치료 섭생의 일부로서 제공된다. 면역원성 분자는 직접 제공되거나 면역원성 분자를 암호화하는 발현 벡터로서 제공될 수도 있다. 다음에 제시되는 유전자 산물 중 하나를 암호화하는 제2 벡터와 함께 mda-7을 암호화하는 벡터의 전달은 표적 조직에 대해 복합 유도 효과를 발휘할 수 있다. 대안적으로, 상기 두 유전자를 암호화하는 단일 벡터도 사용될 수 있다.

(i) 항원

특정 양태에서, 본 발명은 면역요법의 개선에 관한 것이다. 또한, 종양 항원에 대한 면역반응은 MDA-7에 의해 보충될 수 있다. 종양 항원에는 다음과 같은 것이 있다: PSA, CEA, MART, MAGE1, MAGE3, gp100, BAGE, GAGE, TRP-1, TRP-2, PMSA, 마이코박테리움 튜베르큘로시스(Mycobaterium tuberculosis) 가용성 인자(Mtb), 페놀 용해성 모듈린(PSM), CMV-G, CMV-M, EBV 캡시드-EB 핵 항원(EBNA), gpl20, gp41, tat, rev, gag, toxa 항원, 풍진 항원, 볼거리 항원, α-페토단백질(AFP), 선암종 항원(ART-4), CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27m, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AMLI, ETS G250, GnT-V, HAGE, HER2/neu, HLA-A*0201-R1701, HPV-E7, HSP 70-2M, HST-2, hTERT, ICE, KIAA 0205, LAGE, LDLR/FUT, MC1R, MUCI, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NY-ESO-1, pl5, Pml/RARalpha, PRAME, PSM, RAGE, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART-3, TEL/AML1, TPI/m 또는 WT1. 특히, 종양 항원에 대한 반응 유도에 사용되는 용도도 본 발명에 포함되는 것이며, 이러한 용도들은 본원에 참고원용된 미국 특허 5,552,293 및 6,132,980에서 찾아볼 수 있다.

3. 백신

본 발명은 암이나 전암의 발생을 방지하는 방법 및 조성물을 제공한다. 이와 같이, 본 발명은 능동 및 수동 면역 양태로 사용되는 백신에 관한 것이다. 백신으로 사용하기에 적당한 것으로 제안된 면역원성 조성물은 본 명세서에 개시된 방법으로 제조된, 정제된 MDA-7을 이용하여 직접 제조하는 것이 가장 용이하다. 바람직하게는, 항원 물질을 충분히 투석하여 바람직하지 않은 소분자량 분자를 제거하고(하거나) 바람직한 운반체에 즉석 제조할 수 있도록 동결건조시킬 수도 있다.

활성 성분으로서 MDA-7 서열을 함유하는 백신의 제조방법은 일반적으로 본원에 참고원용된 미국 특허 5,958,895, 6,004,799 및 5,620896에 예시된 바와 같은 유사법으로 당업계에 널리 알려져 있다. 일반적으로, 이러한 백신은 액체 용액 또는 현탁액과 같은 주사제로 제조되지만, 주사 전 액체 용액 또는 액체 현탁액으로 제조하기에 적당한 고체 형태로 제조할 수도 있다. 또한, 제제는 유화될 수 있는 것이다. 활성 면역원성 성분은 종종 약제학적으로 허용되는이며 활성 성분과 화합성인 부형제와 혼합된다. 적당한 부형제에는, 예를 들면 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 이의 조합물이 있다. 또한, 필요한 경우에 백신은 습윤활제, 유화제, pH 완충제 또는 백신의 유효성을 향상시키는 보조제와 같은 보조 물질을 소량 함유할 수 있다.

f. 면역원성 분자의 확인

본 발명은 MDA-7이 인터페론 유도성의 ds-RNA 의존적 세린/트레오닌 단백질 키나제(PKR)을 상향조절한다는 관찰을 이용한 것이다. PKR은 다수의 형질도입 경로의 활성화를 통해 항종양원성 활성을 매개하고, 궁극적으로 성장 억제와 아폽토시스 유도를 제공하는 것으로 보인다. 이러한 경로의 활성화는, 잠복성인 불활성 동종이량체 형태가 활성화 시그날에 의해 형태적 변화를 일으켜 자기인산화 및 활성화된 후 일어난다(Vattem et al., 2001). 일단 활성화되면, PKR은 다양한 기질 표적을 인산화할 수 있고, 이는 성장 조절과 아폽토시스 유도에 중요한 점이다(Saelens et al., 2001; Sudhakar et al., 2000).

PKR의 활성화는 Ad-mda7 아폽토시스의 중요한 과정이다. 특정 트레오닌/키나제 억제제인 2-아미노-퓨린(2-AP)을 이용한 PKR의 억제는 Ad-mda7 아폽토시스의 거의 완전한 전환, 및 eIF-2α 인산화 및 단백질 합성 억제 소실을 유도한다. 단백질 합성 억제는 아마도 아폽토시스 억제에 관여하는 1종 이상의 단기 단백질의 조절로 인해 아폽토시스 유도에 중요하다. 대안적으로, PKR에 의해 조절되는 기타 다른 경로로서, 예를 들면 NF-κB, p53, MEK, IRF-1 또는 FADD의 조절에 관여하는 경로 등이 중요할 수 있다(Jagus et al., 1999; Gil et al., 1999; Cuddihy et al., 1999; Balachandran et al., 1998).

PKR이 결실된 MEF는 야생형 PKR을 보유한 MEF와 달리 아폽토시스를 수행할 수 없으므로, PKR 활성화는 다수의 경로가 관련되어 있을지라도 Ad-mda7 아폽토시스에 중요한 과정이다. 이러한 아폽토시스 억제는, PKR 결실 MEF의 전아폽토시스 Ad-Bak 벡터에 의한 형질도입 시, 손상되지 않은 아폽토시스를 유도하였기 때문에 mda-7에 대한 특이성을 나타냈다. 이러한 관찰의 모델로서, 아폽토시스 캐스캐이드 중에 전아폽토시스 Bak 유전자 상류에 MDA-7 및 PKR을 배치한 모델을 합성했다. 이 모델에서, MDA-7은 PKR 활성화를 유도하고, 이 활성화는 다양한 세포 경로를 활성화한 다음, 카스파제 활성화 및 아폽토시스 유도를 이끌어낸다. PKR 하류에 있는 Bak는 아폽토시스를 유도하는 PKR 활성화에 의존적이지 않았다. 이 데이터는 또한 BID 절단과 카스파제 8 활성화를 시사했고, 이는 PKR 아폽토시스가 종종 Fas, FADD, 카스파제-8 및 BID의 활성화를 통해 매개됨을 입증한 당해 기술분야의 다른 연구(Balachandran et al., 1998)와 일치하는 것이었다.

따라서, 아데노바이러스를 매개로 한 MDA-7의 과발현은 PKR을 급속 유도 및 활성화하고, 이어서 다른 PKR 표적 기질인 eIF-2α를 인산화하고 아폽토시스를 유도했다. 폐암 세포에서 2-AP에 의한 PKR의 특이적 억제는 Ad-mda7 유도성 PKR 활성화, PKR 기질 표적 인산화 및 아폽토시스 유도를 소실시켰다. PKR 무효성 섬유아세포에 의해 확인되는 바와 같이, Ad-mda7 아폽토시스는 기능성 PKR 경로에 따라 상이했다. 이러한 결과는 Ad-mda7 아폽토시스의 중요한 매개인자로서 다기능성 PKR 유전자의 새로운 역할을 시사한다. 또한, PKR은 본 명세서에 기술된 바와 같이 MDA-7에 중요하고, 아폽토시스를 유도하며, 면역반응을 유도하는 것으로 암시되어 있는 바, 본 발명은 특정 양태로서 면역반응 향상을 위해 PKR 발현을 유도하는 방법에 관한 것이며, 그 실험 결과는 MDA-7 폴리펩타이드가 면역반응을 향상시킬 수 있음을 시사하고 있다.

다른 양태로서, 본 발명의 방법은 면역원성 분자의 확인방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 종래 미확인된 면역원성 분자 또는 예를 들면 통상적인 면역검출법의 검출 한계보다 낮은 수준으로 면역원성을 보유한 분자에 대한 면역반응을 향상시키는데 유용하다.

본 발명은 또한 면역요법에 바람직한 후보 환자의 예후방법에 관한 것이다. 이러한 본 발명에 따른 진단 검사를 사용하면, 항원과 같은 면역원성 분자에 대한 면역반응을 분석함으로써 환자가 장기간 비진행성인 후보인지의 여부를 평가할 수 있다. 본 발명에 포함되는 다른 진단 검사는 검체가 면역반응을 포함하는 질환 및 증상을 예방하는 치료 방법의 후보인지의 여부를 평가할 수 있다.

일 양태에서, 본 발명은 검체가 면역원성 분자에 대해 면역반응을 나타낼 수 있는지의 여부를 결정하는 진단 검사에 관한 것이다. 다른 양태에서, 이러한 진단 검사는 검체가 T-세포, NK 세포 또는 대식세포의 증가 활성을 나타내는지의 여부를 결정하는데 이용될 수 있다. 또 다른 양태에서, 상기 진단 방법은 검체가 사이토킨 농도의 증가 여부를 나타내는지를 측정하는데 이용한다. 어떤 양태에서든지, 검체가 양성 결과를 나타낸다면 본 발명은 본 명세서에 기술된 조성물을 이용하여 면역반응을 유도하는 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 유도된 면역반응을 나타내거나 또는 나타낼 수 있는 검체는 면역반응을 향상시키는 치료 방법으로 처리될 수 있다.

다음 실시예는 본 발명의 특정 양태를 증명하는 것이다. 이러한 실시예에 개시된 기술은 본 발명자들에 의해 개발된 대표적인 기술로서 본 발명의 실시에 양호하게 작용하는 기술로서, 본 발명의 실시에 사용되는 일부 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 또한, 당업자는 본 발명의 개시에 비추어, 개시된 특정 양태에 다양한 변화를 실시하여 본 발명의 취지 및 범위에 벗어나지 않는 유사 결과를 수득할 수 있음을 잘 알고 있을 것이다.

실시예 1: MDA-7은 IL-22 수용체를 통해 혈관신생을 조절하는 신규 리간드이다.

재료 및 방법

1. 세포 배양

사람 비소세포 폐암(NSCLC) 세포주 A549(선암종) 및 사람 배아 신장 세포(293)를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC; 매릴랜드 록크빌에 소재)에서 입수하여, 10% 태아 송아지 혈청(GIBCO-BRL, 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재)이 보충된 Hams/F12 배지(A549) 및 둘베코 변형 이글배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)(293)에 서 성장시켰다. HUVEC 및 HMVEC는 클론틱스(Clonetics, 매릴랜드 워커빌 소재)에서 구입하여, 5% 태아 송아지 혈청과 추가 시약(제조업자에 의해 "불렛 키트(bullet kit)"로 공급되는 시약)을 함유한 내피세포 기본 배지에서 성장시켰다. 내피세포는 3 내지 9회 계대하여 사용했다.

2. 분비형 MDA-7 단백질의 생산 및 정제

MDA-7 단백질은 293 세포를 전체길이 mda-7 cDNA를 보유하는 진핵세포 발현벡터로 형질감염시켜 생산했다. 형질감염을 완료한 후, 세포를 14일 동안 하이그로마이신(0.4㎍/ml) 중에서 선별했다. 안정한 세포주(293-mda-7)를, 웨스턴 블롯 분석 및 ELISA를 이용하여 가용성 MDA-7(sMDA-7) 단백질 생산에 대해 검사했다. ELISA로 측정한 바에 의하면, 10⁶개 세포(293-mda-7)의 분취량은 24시간 안에 약 30 내지 50ng/ml의 sMDA-7을 생산했다. sMDA-7 단백질을 대량으로 정제하기 위해, 293-mda-7 세포를 150mm 조직배양판에서 90% 융합성(cofluency)이 될 때까지 성장시켰다. 이러한 조직 배양 상청액을 수집하여 앞에서 기술된 바와 같은 친화성 크로마토그래피로 단백질 정제를 위해 모았다(Caudel et al., 2002). sMDA-7 단백질의 크기 및 순도는 은염색 겔 및 웨스턴 블롯 분석으로 측정했다.

3. 내피세포 증식 분석

세포 증식에 미치는 sMDA-7 단백질의 효과를 검사하기 위하여 내피세포(HUVEC, HMVEC)를 밤새 혈청 공급을 중단했다. 다음날, 세포를 2웰 챔버 슬라이드(1x10⁴/웰)에 접종했다. 이러한 세포를 4 내지 6시간 동안 부착되게 하고 확산시킨 뒤, 전혈관신생 자극인자로서의 bFGF 1ng/ml와 다양한 농도의 sMDA-7/IL-24(1,5,10 및 50ng/ml)를 함유하는 새로운 배지를 첨가했다. PBS로 처리된 세포를 대조군으로 사용했다. 그 다음, 3시간 동안 처리한 후 세포를 수거하고, 트립판 블루 배제 분석법(전술한 바와 같음, Saeki et al., 2000)으로 세포 증식을 측정했다. 폐암 세포(H1299 및 A549) 증식에 미치는 sMDA-7의 효과도 평가했다. 이의 실험 조건은 bFGF로 종양 세포를 자극하지 않은 것을 제외하고는 내피세포에서와 같은 전술한 조건을 사용했다. Ad-mda7(3000 vp/세포)로 처리된 종양 세포는 양성 대조군으로 사용했다.

4. 내피세포 분화 분석

내피세포 분화(관 형성) 분석은 시험관내 혈관신생 분석 키트(Chemicon, 캘리포니아 테메큘라 소재)를 사용하여 수행했다. 간략히 설명하면, HUVEC와 HMVEC를 80% 융합성으로 성장시키고, 수거한 뒤, 성장 배지에 재현탁시키고, 매트리겔이 코팅된 96웰 평판(Chemicon, 캘리포니아 테메큘라 소재)에 2x10⁴ 세포/웰의 농도로 평판배양했다. 이러한 세포를 37℃에서 24시간 동안 sMDA-7 단백질(1,5,10 및 50ng/ml) 또는 sMDA 단백질을 면역고갈시킨 제제로 처리했다. 당해 실험의 음성 대조군으로는, PBS로 처리한 세포를 사용했다. sMDA-7의 관 형성 억제능을 측정하고 명시야 현미경하에 관의 수를 계수하여 정량분석했다.

비교 연구를 포함하는 실험으로서, 세포를 등몰 농도의 sMDA-7(5, 10 및 300ng/ml), 재조합 사람 엔도스타틴(5.2, 10.4 및 315ng/ml; Calbiochem, 캘리포니 아 라졸라 소재), 재조합 IFN-γ(4.5, 9 및 268ng/ml; R&D Systems, 미네소타 미네아폴리스 소재) 또는 재조합 IP-10(2.4, 4.5 및 134ng/ml; R&D Systems, 미네소타 미네아폴리스 소재)로 처리한 뒤, 전술한 바와 같이 관 형성 분석법으로 분석했다. 모든 샘플은 이중으로 검사했다. 실험은 최소 5 내지 6회 반복했다.

수용체 차단 연구를 위해, 6웰 평판에서 성장시킨 HUVEC를 IL-22R1 차단 항체(1ng/ml 및 5ng/ml)로 전처리했다. 밤새 배양한 후, 세포를 수거하고, 세척한 뒤, 매트리겔 코팅된 96웰 평판에 평판배양했다. 이 웰들에 새로운 IL22R1 차단 항체 및 sMDA-7을 1:1 비(IL-22R1 항체 1ng/ml : sMDA-7 1ng/ml) 또는 1:5 비(IL-22R1 항체 1ng/ml : sMDA-7 5ng/ml)로 첨가하고 37℃에서 항온배양했다. 밤새 항온배양한 후, 평판을 관 형성에 관해 조사했다. 다른 모든 실험 과정은 전술한 바와 같이 실시했다. 엔도스타틴 또는 IP-10을 포함하는 실험에서는 이들 단백질을 관 형성 분석의 억제 활성이 확인되는 고농도로 사용했다(엔도스타틴, 315ng/ml; IP-10, 134ng/ml). 엔도스타틴을 포함하는 실험에 사용된 IL-22R1의 상대적 함량은 315ng/ml(1:1 비)이고, IP-10을 포함하는 실험(1:1 비)에서는 134ng/ml이었다. 모든 다른 실험 과정은 전술한 바와 같이 실시했다. 항IP-10 또는 항IFN-γ 중화 항체(R&D Systems)를 이용한 차단 연구에서는, HUVEC를 sMDA-7(300ng/ml)로 처리하기 전에 적당한 중화 항체(1㎍ 및 5㎍/ml)로 처리한 것을 제외하고는 상기 수용체 연구에서와 동일하게 수행했다.

5. 내피세포 이동 분석

세포 이동 분석은 HUVEC를 사용하여 수행했다. 세포를 0.5% 태아 송아지 혈 청을 함유하는 기본 배지에서 밤새 영양공급을 중단하고, 수거한 뒤, 동일 배지에 재현탁시킨 다음, 세공 크기가 8㎛인 24웰 트란스웰 인서트(Millipore, 매사츄세츠 캠브리지 소재)의 상층 표면에 10⁵ 세포/웰의 농도로 접종했다. 이 인서트를, 배지+PBS, 배지+VEGF(100ng/ml) 또는 VEGF+sMDA-7(10 또는 50ng/ml)을 함유하는 6웰 평판에 첨가했다. 이러한 트란스웰 인서트를 함유하는 평판을 37℃에서 밤새 배양하여 이동을 유발시켰다. 다음날, 웰을 해체하고, 막을 크리스탈 바이올렛에 고정시키고, 하층 웰로 이동한 세포 수를 고배율(X40) 하에 계수했다.

6. IP-10 및 IFN-γ 생산 측정

최근 연구에서는, sMDA-7으로 PBMC를 처리한 결과, IFN-γ가 분비됨이 입증되었다(Caudell et al., 2002). 또한, IFN-γ는 IP-10의 강력한 유도인자(Majumder et al., 1998)이다. IFN-γ와 IP-10은 모두 항혈관신생 활성을 지니는 것으로 보고되었다(Fathallah-Shaykh et al., 2000; Angiolillo et al., 1996). sMDA-7의 항혈관신생 활성이 IFN-γ 또는 IP-10에 의해 매개되는지의 여부를 결정하는 연구를 수행했다. HUVEC를 6웰 평판에 접종하고(1x10⁵/웰), sMDA-7(10ng/ml)로 처리했다. 세포 배양 상청액을 처리 후 6시간, 24시간 및 48시간째에 수집하여 원심분리한 다음, 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 IP-10 및 IFN-γ 단백질 생산에 대해 분석했다. 분석은 제조업자에 의해 권장된 바와 같이 수행했다(R&D Systems; 미네소타 미네아폴리스 소재). 재조합 IFN-γ(4.5ng/ml)로 처리된 세포는 IP-10 분석의 양성 대조군으로 사용하고, Ad-mda7(3000vp/세포)로 처리된 세포는 IFN-γ 분석의 양성 대조군으로 사용했다. 이 실험들의 음성 대조군으로는 PBS로 처리한 세포를 사용했다. 샘플은 사중으로 분석하고, 데이타는 시험된 각 sMDA-7 농도의 평균값으로 나타냈다.

7. 웨스턴 블롯 분석

최근 연구를 통해 HACAT 세포에서의 STAT-3 발현의 활성화가 sMDA-7 단백질의 그 수용체에 대한 결합의 척도임이 입증되었다(Dumoutier et al., 2001; Wang et al., 2002). 따라서, sMDA-7 처리 후 내피세포에서 STAT-3 발현의 활성화가 나타나지를 측정하는 연구를 수행했다. HUVEC를 6웰 평판에 접종하고(5x10⁵ 세포/웰), sMDA-7(10ng/ml)로 처리했다. 미처리 세포는 음성 대조군으로 사용했다. 세포를 처리 후 4시간 및 24시간째에 수거하고, 전술한 바와 같은 웨스턴 블롯 분석으로 STAT-3 발현을 분석했다(Mhashikar et al., 2001; Pataer et al., 2002). 인산화된 STAT-2(pSTAT-3) 단백질은 토끼 항-사람 pSTAT-3 항체(1:1000, Cell Signaling Technology, 매사츄세츠 비버리 소재) 및 양고추냉이 퍼옥시다제-표지된 2차 항체(Amersham Biosciences, 뉴저지 피스카타웨이 소재)를 사용하여 검측했다. 마지막으로, 아머샴(Amersham)의 개량된 화학발광 웨스턴 블롯팅 검출 시스템을 사용하여 개량된 화학발광 필름(Hyperfilm, Amersham Biosciences, 뉴저지 피스카타웨이 소재) 상에 단백질을 가시화시켰다. STAT-3 단백질 발현 수준은 Image Quant 소프트웨어(Molecular Dynamics, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)를 사용하여 총 STAT-3 단백질 발현으로 정규화한 후 정량분석했다.

8. 면역형광 분석

STAT-3의 활성화는 또한 면역형광성 분석을 통해 측정했다. 2웰 챔버 슬라이드(1x10⁴ 세포/웰)에 접종한 HUVEC는 4시간 동안 PBS(대조군) 또는 sMDA-7(10ng/ml)로 처리하고, PBS로 세척한 뒤, 냉 아세트산으로 고정시키고, 토끼 항-사람 pSTAT-3 항체(1:1000, Cell Signaling Technology, 매사츄세츠 비버리 소재) 및 로다민 표지화된 항토끼 2차 항체(1:5000; Molecular Probes, 오레곤 유진 소재)를 사용하여 pSTAT-3(pSTAT-3)을 염색했다. 탈색방지 표본제작 시약(Vector Laboratories, 캘리포니아 벌링감 소재)을 사용하여 슬라이드 표본을 제작했다. 1 내지 2시간 염색 후 형광현미경을 이용하여 사진촬영했다.

9. 매트리겔 플러그 분석을 이용한 항혈관형성 활성의 생체내 평가

sMDA-7의 항혈관신생 활성을 측정하기 위해, 생체내 혈관신생 분석을 수행했다. 간략히 설명하면, sMDA-7(12.5ng) 및 bFGF(60ng)를 빙상에서 매트리겔(Beckton Dickinson, 매사츄세츠 베드포드 소재) 500㎕와 혼합하고, 무흉선 누드 마우스에게 피하 주사했다. bFGF(60ng)만을 함유하는 매트리겔을 투여받은 동물은 양성 대조군으로 사용하고, 성장 인자 없이 매트리겔을 투여받은 동물은 음성 대조군으로 사용했다. 각 그룹 당 5마리의 동물을 배정하고, 실험을 이중으로 실시했다. 주사 10일 후 동물을 희생시켰다. 매트리겔 플러그를 회수하고, 사진촬영한 뒤, 전술한 바와 같이 헤모글로빈 분석을 수행했다(Pessaniti et al., 1992).

10. 누드 마우스에서 이종이식 종양에 대한 효과

먼저, 모 293 세포 및 293-mda-7 세포를 종양을 형성하는 능력에 대해 시험하였다. 10⁶개 세포의 분취량을 무흉선 BALB/c 암컷 누드 마우스의 하단 우측 옆구리에 피하 주사하고, 이식 부위를 1개월 동안 모니터링하였다. 상기 세포 농도에서는 종양이 형성되지 않았기 때문에, 상기 세포 수를 사용하여 후속적 실험을 수행하였다. 생체내 혼합 시험을 위해, 90% 합류성까지 성장시킨 사람 폐암 세포(A549)를 트립신 처리하고, 세척하고, 멸균 포스페이트-완충 식염수에 5X10⁶/ml의 농도로 재현탁시켰다. 종양-세포 현탁액을 동일한 수(5X10⁶/ml)의 모 293 세포 또는 293-mda-7 세포와 혼합하고, 가볍게 보텍싱하고, 상기한 바와 같이 누드 마우스(10⁶개 세포/동물)에게 피하 주사하였다. 각 그룹은 8마리의 동물로 이루어지며, 실험은 2회 수행하였다. 종양 성장을 모니터링하고 이미 기술한 바와 같이 측정하였다[참조: Saeki et al., 2002]. 실험 종결시, 동물을 CO₂ 흡입에 의해 안락사시키고, 종양을 조직병리학적 분석, 웨스턴 블롯 분석과 CD31 및 TUNEL 염색을 위해 수거하였다.

종양 성장에 대한 sMDA-7의 전신 효과를 평가하기 위해, A549 종양 세포(5X10⁶/ml)를 누드 마우스의 하단 우측 옆구리에 주사하여 피하 종양을 확립하였다. 종양의 크기가 50 내지 60mm³이 되면, 동물을 각각 10마리의 동물로 이루어진 두 그룹 중 한 그룹으로 나누었다. 하나의 동물 그룹에게는 모 293 세포(1X10⁶개)를 함유하는 매트리겔을 주사하고, 다른 그룹에게는 293-mda-7 세포(1X10⁶개)를 함유하는 매트리겔을 주사하였다. 당해 세포를 함유하는 매트리겔은 종양 보유 마우스의 상단 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 성장에 대한 sMDA-7의 효과를 상기한 바와 같이 모니터링하여다. 실험 종결시, 동물을 안락사시키고, 종양을 상기한 바와 같은 추가의 분석을 위해 수거하였다. 기술한 모든 동물 실험은 2회 이상 수행하고, 종양 성장의 차이를 통계학적 유의성에 대해 검정하였다.

11. 면역조직화학 분석

종양 조직을 전술한 바와 같이 CD31 및 TUNEL에 대해 염색했다(Saeki et al., 2002). 1차 항체없이 염색된 조직 절편 또는 동형 항체로 염색된 조직 절편을 음성 대조군으로 사용했다. 조직 절편을 분석하고 정량한 뒤, 맹검 방식으로 결과를 해석했다.

12. 통계 분석

스튜던트 t-검정을 사용하여 실험 결과의 통계적 유의성을 계산했다. 0.05 미만의 P 값은 통계학상 유의성이 있는 것으로 간주했다.

실시예 2: sMDA-7은 세포 증식이 아닌 내피세포 분화를 억제한다.

예비 연구로, HUVEC 및 HMVEC를 이용하여 내피 세포 증식에 미치는 sMDA-7의 억제 효과를 시험했다. 다양한 sMDA-7로 세포를 처리한 결과, PBS 처리된 대조군 세포에 비해 유의적인 항증식 활성이 나타나지 않았다(도 1A, B). 하지만, 전술한 농도의 sMDA-7로 HUVEC 및 HMVEC 처리한 결과, 두 내피 세포 종류 모두에 의한 모 세관 유사 구조물의 형성이 유의적으로 억제되었다(P=0.001)(도 1C, 도 1D). 이러한 억제 효과는 모든 농도에서 관찰되었고, 용량 의존적이어서, 10ng/ml 이상의 농도에서 관 형성이 사실상 완전히 소실되었다(도 1D).

sMDA-7 단백질에 의한 내피세포 관 형성의 억제가 제제 중의 관련없는 단백질로 인한 것일 수 있다는 불가능한 가능성을 배제시키기 위하여, 고갈 실험을 수행했다. HUVCE 첨가 전에 시험 제제 중의 sMDA-7 단백질을 면역고갈시킨 결과, 내피세포 관 형성이 완전히 복구되었다(도 1C, 도 1D). 이러한 데이터는 내피세포 분석에서의 관찰된 억제 활성이 sMDA-7에 의한 것이며, sMDA-7이 강력한 항혈관신생 활성을 갖고 있음을 보여준다.

실시예 3: sMDA-7은 내피세포 분화 억제에 있어 엔도스타틴보다 강력하다.

sMDA-7에 의해 입증된 억제 활성은 관 형성 분석을 통해 엔도스타틴과 비교했다. HUVEC를 등몰의 sMDA-7 또는 엔도스타틴으로 처리했다. sMDA-7은 대조군 세포에 비해 저농도에서 관 형성을 유의적으로 억제한 반면(P=0.001), 엔도스타틴은 그렇지 못했다(도 2). 하지만, 엔도스타틴은 고농도(315ng/ml)인 경우에는 대조군 세포에 비해 유의적인 관 형성을 억제하였으며(대조군 보다 40 내지 50%; P = 0.001), 이는 사용된 엔도스타틴 단백질이 기능성임을 입증한다(도 2). 이러한 결과는 sMDA-7이 엔도스타틴보다 항혈관신생제로서 훨씬 더 강력한 것임을 시사한다.

실시예 4: sMDA-7은 내피세포 이동을 억제한다.

sMDA-7이 내피세포 이동을 억제하는지를 결정하기 위해, 세포 이동에 미치는 VEGF의 효과를 검사하는 연구를 수행했다. sMDA-7은 VEGF에 대한 반응으로 내피세 포 이동을 유의적으로(P=0.001) 억제했다(도 3). sMDA-7/IL-24를 함유하지 않는 대조군 세포 이동에 대해서는 어떠한 억제 효과도 관찰되지 않았다. 억제는 용량 의존적 방식으로 일어났고, 50ng/ml에서 완전한 억제가 일어났다(도 3). sMDA-7/IL-24는 bFGF를 유도인자로서 사용했을 때 유사한 억제 활성을 나타냈다.

실시예 5: sMDA-7에 의한 내피세포 분화 억제는 IFN-γ 또는 IP-10에 의해 매개되지 않는다.

최근, sMDA-7으로 처리시 사람 PBMC에 의해 IFN-γ가 생성된다고 보고되었다(Caudell et al., 2002). 이 보고에 근거해, sMDA-7에 의한 관 형성의 억제가 IFN-γ 또는 IP-10 생산을 통해 매개되는지를 평가하는 연구를 수행했다. PBS 처리된 HUVEC 세포 및 sMDA-7 처리된 HUVEC 세포 유래의 조직 배양 상청액을 여러 시점에서 수거하여, ELISA로 IFN-γ 및 IP-10에 대해 분석했다. sMDA-7은 대조군 세포에 비해 48시간 안에 IFN-γ(<30pg/ml) 및 IP-10(<32pg/ml)의 분비를 유도했다(도 4A, 도 4B). sMDA-7에 의해 유도된 소량의 IFN-γ 또는 IP-10이 HUVEC 관 형성에대해 관찰되는 억제 효과의 원인이었는지를 추가 시험하기 위하여, 비교 연구를 수행했다. IFN-γ 또는 IP-10 등몰 농도로 sMDA-7의 억제 활성을 직접 비교한 결과, HUVEC 유브 형성을 유의적으로 억제하기 위해(P=0.01; 도 4C), sMDA-7(10ng/ml)에 비해 고농도의 IFN-γ(268ng/ml) 또는 IP-10(134ng/ml)이 요구된다는 것을 확인했다. 또한, HUVEC 관 형성에 대한 sMDA-7의 억제 활성은 항IP-10 또는 항IFN-γ 중화 항체의 존재에서도 상실되지 않았다(P=0.001; 도 4D). 이러한 결과는, sMDA-7이 시험관내에서 IFN-γ 및 IP-10 보다 훨씬 강력하고 HUVEC 관 형성에 대한 sMDA-7 매개 억제 활성이 IFN-γ 또는 IP-10에 의한 것이 아님을 시사한다.

실시예 6: sMDA-7은 STAT-3 발현을 활성화시키고 이의 수용체를 통해 억제 활성을 매개한다.

1. sMDA-7/IL-24는 STAT-3 발현을 활성화시킨다.

최근 연구를 통해, sMDA-7에 의한 수용체 체결시 HACAT 세포 및 PBMC 세포에서 STAT-3이 활성화된다는 것이 입증되었다(Dumoutier et al., 2001; Wang et al., 2002). 이러한 보고에 기초하여, 내피세포에 미치는 sMDA-7의 활성이 수용체 매개성이며, 수용체 결합 시 STAT-3을 확성화시키는 것으로 가정된다. 웨스턴 블롯 분석 및 면역형광 분석은, HUVEC에 대한 sMDA-7 첨가가 4 시간 안에 STAT-3 단백질의 인산화된 형태(pSTAT-3)의 발현 수준을 증가시키며, 처리 후 24시간까지도 지속되는 것을 보여주었다. pSTAT-3 발현의 증가는 PBS 처리된 대조군 세포보다 2 내지 3배 더 높았다. 또한, sMDA-7/IL-24 처리 후 HUVEC 중의 pSTAT-3 단백질은 증가된 핵 국재화를 보였다. 이와 달리, 미처리된 대조군 세포에서는 STAT-3 발현의 어떤 변화도 나타내지 않았다. 또한, STAT-3 활성화는 항-MDA-7 항체의 존재 하에 억제되었고, 이는 수용체 매개 활성화를 시사한다.

2. sMDA-7은 이의 수용체를 통해 이의 억제 활성을 매개한다.

sMDA-7에 대한 2가지 관련 수용체가 최근 확인되었다(Dumoutier et al., 2001; Wang et al., 2002). sMDA-7은 두 수용체 복합체, 즉 IL-20R1/IL-20R2(IL-20 수용체) 및 IL-22R1 및 IL-20R2(IL-22 수용체) 중 어느 하나에 결합할 수 있다. 이러한 보고에 따라서, 내피세포에 미치는 sMDA-7 매개 억제 효과가 수용체 매개성인 지의 여부를 결정하는 연구를 수행했다. sMDA-7 존재 또는 부재하에 IL-22R1에 대한 차단 항체를 이용하여 내피 분화를 평가했다(도 5A, 도 5B). 단독의 sMDA-7(5ng/ml) 단독물은 HUVEC 내에서 관 형성을 완전히 억제한 반면, 미처리 대조군 세포에서는 억제가 전혀 관찰되지 않았다(도 5A). 하지만, IL-22R1 차단 항체로 HUVEC를 전처리한 결과, 관 형성에 대한 sMDA-7의 억제 효과가 용량 의존적 방식으로 유의적으로(P=0.001) 소실되었다(도 5A). HUVEC에 차단 항체 1ng/ml(1:5 비율)의 첨가는 관 형성을 오직 부분적으로만 복구시킨 반면(<60%), 차단 항체 5ng/ml(1:1 비율)의 첨가는 관 형성을 완전 복구시켰다(>90%). 하지만, 단독의 차단 항체는 HUVEC의 관 형성능에 큰 영향을 미치지 않았다. 또한, pSTAT-3 단백질 발현은 sMDA-7 단백질이 HUVEC에 첨가된 후 크게 증가한 반면, sMDA-7 매개의 pSTAT-3 발현은 IL-22R1 항체의 존재 하에 증가되지 않았다. 이러한 결과는, 내피세포 관 형성에 미치는 sMDA-7 매개의 pSTAT-3 발현 억제 효과가 IL-22R1을 통해 일어난다는 것을 시사한다.

이러한 억제의 특이성을 검사하기 위해, HUVEC를 고농도의 IP-10 또는 엔도스타틴으로 IL-22R1 항체의 존재하에 처리했다. IP-10 또는 엔도스타틴 처리는 PBS 처리된 대조군 세포에 비해 IL-22R1 항체의 존재하에서도 HUVEC 관 형성을 유의적으로 억제했다(P=0.001; 도 5B). 이러한 결과는 IL-22R1 항체가 sMDA-7/IL-24 매개의 활성은 특이적으로 억제하지만 엔도스타틴, IFN-γ 또는 IP-10의 활성은 억제하지 않음을 보여준다.

실시예 7: 혈관신생 및 종양 성장 연구를 위한 생체내 모델

1. sMDA-7은 매트리겔 플러그 모델에서 혈관신생을 억제한다.

bFGF를 함유하는 매트리겔에 캡슐화된 sMDA-7을 누드 마우스에 피하 이식했다. bFGF만을 함유하는 매트리겔은 양성 대조군으로 사용하고, PBS만을 함유하는 매트리겔은 음성 대조군으로 사용했다. bFGF 유도성 혈관신생은 bFGF만을 함유하는 매트리겔 및 PBS를 함유하는 매트리겔과 비교했을 때 sMDA-7/IL-24의 존재하에 유의적으로 억제되었다(P=0.0001; 도 6A).

2. sMDA-7은 생체내 피하 이종이식 종양 성장을 억제한다.

사람 폐암(A549) 세포를 모 293 세포(대조 동물) 또는 sMDA-7 단백질 생산 293 세포(293-mda-7)와 혼합(1:1 비)하고 마우스의 우측 옆구리 하부에 피하 주사했다. 종양 성장은, A549와 모 293 세포의 혼합물을 투여받은 동물보다 A549와 293-mda-7 세포의 혼합물을 투여받은 동물(도 6B)에서 유의적으로 적었다(P=0.001). 293 세포 또는 293-mda-7 세포 단독 주사는 누드 마우스 안에 종양을 형성시키지 않았다. 이식 후 22일째 동물을 안락사시키고, 종양을 수거하여 추가 평가했다. 웨스턴 블롯 분석을 통해 MDA-7 단백질이 293-mda-7 세포를 함유한 종양에서 발현됨이 확인되었다. 모 293 세포를 함유하는 대조군 종양에서는 MDA-7 단백질 발현이 전혀 검출되지 않았다. 종양 조직의 조직병리학적 조사는 대조군 및 실험 동물 사이의 종양 세포 증식 지수 또는 종양 세포 침윤에 유의적 차이를 나타내지 않았다. 하지만, 293-mda-7 세포를 함유하는 종양은 CD31 염색을 통해 모 293 세포를 함유하는 대조 종양에 비해 보다 적은 혈관증식을 보였다. 실험 동물의 종양 조직의 TUNEL 염색에서는, 내피 세포와 종양 세포가 아폽토시스 세포사를 일으 키고 있음을 확인했다. 이에 반해, 대조 종양 조직에서는 TUNEL 양성 염색이 관찰되지 않았다. 또한, 헤모글로빈 수준은 모 293 세포를 함유하는 종양에서보다 293-mda-7 세포를 함유하는 종양에서 유의적으로(P=0.02) 낮았다(도 6C). CD31 염색 감소 및 헤모글로빈 수준 감소는 sMDA-7이 혈관신생을 억제함을 시사한다.

3. sMDA-7은 생체내에서 피하 이종이식 종양 성장을 전신 억제한다.

293-mda-7 세포에 의해 생산되는 sMDA-7가 종양 성장을 전신 억제할 수 있는지의 여부를 결정하는 연구를 수행했다. 마우스의 우측 옆구리 하부에 A549 종양 세포를 피하 접종했다. 이 종양이 50 내지 100㎣에 도달하면, 매트리겔에 캡슐화된 sMDA-7 단백질 생산 293 세포(293-mda-7 세포) 또는 모 293 세포(대조군)를 우측 옆구리 상부에 피하 이식했다. 293 세포 이식 후 종양을 측정하기 시작했다. A549 폐종양 이종이식편의 성장은 대조군에서보다 293-mda-7 세포로 처리된 마우스에서 유의적으로 적었다(P=0.001)(도 6D). 대조군 마우스에서의 종양 성장과 비교해 볼 때, 캡슐화된 293-mda-7 세포가 이식된 마우스에서의 종양 성장은 40 내지 50% 정도 억제되었다. 이러한 억제 효과가 sMDA-7에 의한 것인지를 확인하기 위하여, 동물 유래의 혈청 샘플을 웨스턴 블롯 분석 및 ELISA를 통해 MDA-7 단백질에 대해 조사했다. 예상된 40kDa 크기에서의 sMDA-7의 강한 밴드가 웨스턴 블롯 분석에서 293-mda-7 세포로 이식된 동물의 혈청에서 관찰되었다. 하지만, 대조군 동물의 혈청에서도 밴드가 희미하게 관찰되었는데, 이는 마우스 혈청 단백질과의 약간의 교차반응성을 시사하는 것이다. 이식 후 3일째 ELISA에 의해 검출되는 혈행성 sMDA-7의 혈청 농도는 약 50ng/ml였다.

실험 말기에 종양과 주사된 293-mda-7 세포 함유 매트리겔을 수거하여 평가했다. 종양의 육안 조사에서 293-mda-7 세포를 투여받은 동물에서의 종양 성장이 억제됨이 확인되었다. 종양 조직의 조직병리학적 분석에서는 293 세포를 투여받은 동물의 시편과 293-mda-7 세포를 투여받은 동물의 시편 사이에 전혀 차이를 나타내지 않았다. 또한, 293-mda-7으로 처리된 마우스의 종양은 CD31 양성 염색에서 확인되는 바와 같이 모 293 세포로 처리된 마우스의 종양 보다 혈관이 훨씬 적었다(P=0.001)(도 6E). 293-mda-7 세포를 투여받은 동물의 매트리겔에 대한 면역조직화학 분석은 MDA-7 단백질 발현을 입증했다. 이에 반해, MDA-7은 모 293 세포를 투여받은 동물에서 회수한 매트리겔에서는 검출되지 않았다. 이러한 결과는 sMDA-7이 혈관신생 억제에 의해 종양 성장을 전신 억제함을 입증한다.

실시예 8: Ad-mda-7은 아폽토시스를 유도하고 진행성 암 환자의 면역계를 활성화시킨다.

연구 설계 및 환자 기준

진행 단계 I 용량 상승식 임상 시험에서, mda-7은 진행성 암종을 보유한 환자에게 비복제성 아데노바이러스 작제물(Ad-mda7)을 종양내 주사하여 투여했다. 환자는 조직학적으로 확인된 암종을 갖고 있고, 이 중 바늘 주사에 접근용이한 적어도 하나의 병변이 수술로 절제가능한 것이며, 카노프스키 수행점수가 ≥70%이고, 혈액학적, 신장 및 간장 기능이 허용되는 수준인 환자이다. 활성 CNS 전이를 갖고 있거나, 만성 면역억제제를 사용하거나 또는 아데노바이러스 투여를 요하는 치료에 참여한 적이 있는 환자는 본 실험에서 제외시켰다.

수술로 절제가능한 진행성 암을 보유한 환자에게 2x10¹⁰ 내지 2x10¹² 바이러스 입자(vp)를 단독 종양내 주사로 투여했다(도 7). 지금까지 8개 코흐트(18명의 환자)가 등록 완료했다. 종양내 mda-7 치료 효과를 분석하기 위해, 주사된 병변을 주사 후 24시간 내지 96시간째 수술로 절제하고, 연속 절편화하여, 벡터 DNA 및 RNA 분포, 형태, MDA-7 단백질 발현, 아폽토시스 활성, 미세혈관 밀도, Ki-67 양성 세포 수, 및 iNOS 및 β-카테닌 발현에 대해 분석했다.

실시예 9: 종양내 Ad-mda7의 효과

Ad-mda7은 안전하고 주사 부위의 통증도 견딜만한 것이며 주요 독성인 일시적 약한 발열과 약한 감기 유사 증후군을 보인다. 이러한 효과는 Ad-mda7이 고용량인 경우 더 일정하게 관찰된다. 이러한 모든 효과는 주사 후 48시간이 지나면 사라진다. DNA PCR 분석에 의하면 Ad-mda7 카피수는 저용량 처리 환자에서는 7x10⁶/㎍ DNA에서부터 고용량 처리 환자에서는 4x10⁸/㎍ 이하의 범위에 이른다(도 8). 최고의 벡터 카피수는 주사된 병변의 중심에서 확인되었고, 통상적으로 벡터 DNA는 주사 지점으로부터 1cm 이내의 절편에서 관찰되었다. IHC 분석에 의하면, 주사한 모든 병변부에서 강한 MDA-7 단백질 발현이 관찰되었다. 고용량이 주사된 종양의 중심에서는 80% 이하의 MDA-7 양성 세포가 발견되었고, 저용량 주사 후에는 20% 이하의 양성 염색 세포가 관찰되었다. 주사하지 않은 대조군은 똑같이 음성이었다. 또한, MDA-7 발현 영역은 TUNEL 염색으로 확인되는 바와 같은 아폽토시스 활성을 증가를 보였다. 아폽토시스는 병변부 중심에서 가장 강하고, 세포의 70% 이하가 양성이었 으며, 주변 둘레의 절편도 주사하지 않은 병변부에 비해 증가된 TUNEL 반응성을 보였다(도 9). 핵에서부터 혈장막까지 β-카테닌 발현의 현저한 감소 및/또는 재분포는 검사된 8개 Ad-mda7 처리된 종양 병변부 중 8개 모두에서 관찰되었고, 임상전 관찰과 일치했다. 또한, 검사된 흑색종 검체 중 일정 수의 검체에서는 iNOS 발현이 현저하게 감소된 것으로 관찰되었다. 주사 부위 부근에서의 미세혈관 밀도는 감소하였지만, 그 정량이 어려웠다. 따라서, Ad-md17 종양내 주사는 충분히 허용되는 것이었다. 주사 후 24시간 이내에 MDA-7 단백질 발현의 용량의존적 증가가 관찰되고 아폽토시스 세포의 현저한 증가가 관찰되었는데, 이는 주사 부위로부터의 거리와 상관관련이 있었다. 72 내지 96시간이 경과하면 MDA-7 발현과 아폽토시스가 감소하는 추세였다(도 8). 주사 후 30일이 경과하면 MDA-7 발현과 아폽토시스 활성이 정지되었다.

Ad-mda7에 대한 전신 면역반응은 혈청 사이토킨과 림프구 서브세트를 이용하여 분석했다. 대부분의 환자들은 전신 사이토킨(IL-6, 14명/검사된 18명의 환자; IL-10, 15/18; γIFN, 8/18; TNFα, 10/18)의 일시적 증가를 보였다(도 10, 도 11). 또한, 몇몇 고용량 환자는 IL-6, γIFN 및 IL-10 사이토킨 mRNA의 증가된 종양내 발현을 보였다. 또한, mda-7 처리 후 15일째에는 CD3+ CD8+ T 세포가 30±13% 증가되었다(도 12, 도 13). 이러한 발견은 MDA-7이 전신 T_H1 사이토킨 생산을 증가시키고 CD8+ T 세포를 이동시킨다는 것을 암시한다. Ad-mda7 주사 후, 혈행의 TIL-6, IFN-γ, IL-10 및 TNF-α는 실질적으로 증가했고, 그 다음 30일이 경과하면 기 준선까지 떨어졌다. 사이토킨의 증가는 CD8+ 세포의 증가 및 CD4/CD8 비의 역수와 상관관련이 있다. 즉, 이러한 결과는 Ad-mda7에 의한 면역활성화를 암시하고 배양물에서의 고MDA-7의 프로-TH1 활성과 일치했다.

실시예 10: 항체 생산

재조합 his-태그된 MDA-7 단백질은 대장균에서 생산하고 니켈 NTA 아가로스 컬럼에서 정제했다. 이 물질은 배취 방식으로 니켈 수지에 45분 동안 결합시킨 다음, 컬럼에 주입하고 용출물을 컬럼 베드를 통해 용출시켰다. 단백질을 0.5% chap를 함유하는 10mM Tris pH 8.0으로 세척하고, 마지막에는 10mM Tris pH8.0+400mM 이미다졸로 용출시켰다. 용출된 MDA-7은 10mM Tris pH8.0으로 투석했다. 최종 산물은 분자량이 약 23kDa인 단일 밴드로 관찰되었다. 아미노 말단 단백질 서열분석 결과 정확한 단백질로 관찰되었고 순도는 90%를 넘는 것으로 추정되었다.

이 물질을 다음과 같은 프로토콜에 따라 토끼에게 주사했다: IFA 함유 MDA-7 단백질 400mg 및 MDP 100mg을 피하 주사하고, 3주 후 IFA 함유 MDA-7 단백질 200㎍을 주사하고, 3주 후 다시 MDA-7 단백질 100mg을 정맥내 주사했다. 항혈청의 역가는 ELISA 분석에 근거해 1/100,000을 넘는 것으로 관찰되었다. 필요에 따라, 동물을 부스터시켰다.

MDA-7 단백질은 설포하이드릴 결합을 통해 고체 지지체 수지에 커플링되었다. 이 수지와 결합된 단백질은 철저하게 세척했다. 세척된 물질을 사용하여 항체 정제용 MDA-7 컬럼을 제조했다. 토끼 폴리클로날 혈청을 MDA-7 컬럼에 주입하기에 앞서, 혈청을 20mM Tris 완충액(pH 8.0)과 1:1로 희석하고 0.2㎛ 필터를 통해 여과 시켰다. 그 다음, 컬럼을 흡광도가 기준값이 될 때까지 동일한 20mM Tris 완충액(pH 8.0)으로 세척했다. 항체는 0.1M 아세트산을 이용하여 컬럼으로부터 용출시켰다. 항체를 함유하는 용출물을 용출 즉시 pH 8.0으로 재조정했다. 이와같이 친화성 정제된 항체는 그 다음 10mM Tris(pH 8.0)에 대해 투석하고 농축시켰다.

실시예 11: 폴리클로날 항체를 이용한 분비형 MDA-7의 정제 및 특성분석

1. 친화성 컬럼 제작

먼저, 토끼 혈청으로부터 사람 MDA-7에 대한 여러 폴리클로날 항체를 정제했다. 동결된 토끼 혈청 샘플을 해동시키고 멸균 1X PBS 완충액과 1:1로 희석했다. 희석된 샘플을 각각 4℃, 밤새 욕법(浴法)으로 단백질 A-세파로스(SIGMA) 2ml에 완만한 진탕하에 노출시켰다. 4개의 다른 컬럼을 제작했다. 수지는 pH 7.0이 되도록 20mM 이염기성 인산나트륨(61ml) 10배 컬럼 부피로 세척하였다. 이 컬럼을 3배 컬럼 용적의 0.15M NaCl(pH 3.0)을 3회 분취량으로 사용하여 용출시킨 뒤 0.5M HEPES로 중화시켰다. 브래드포드 단백질 분석법(BioRad)을 사용하여 용출된 항체를 정량했다. 이러한 항체를 그 다음 10,000 MWCO 투석 카세트에서 밤새 투석하여 0.5M NaCl을 함유하는 0.1M NaHCO₃(pH 8.3)로 교환시켰다.

건조된 CNBr-세파로즈의 활성화를 위해, 1g을 10 내지 15 컬럼 용적의 1mM 냉 HCl로 세척했다. 연속 5ml 용적을 사용하여 슈크로스를 제거했다. 그 다음, 활성화된 CNBr-세파로즈를 1 컬럼 용적의 연속 세척을 통해 10배 컬럼 용적으로 세척하여 0.1M NaHCO₃(pH 8.3)으로 교환시켰다. 각각의 경우마다. 약 80 내지 90mg의 항 체가 정제 및 완충액 교환 후 회수되었다. 그 다음, 팽윤된 활성화 CNBr-세파로즈 5ml을 0.1M NaHCO₃(pH 8.3) 중의 정제 항체 80 내지 90mg과 완만한 진탕하에 실온에서 4시간 동안 항온처리했다.

항체 결합능은 브래드포드 단백질 분석법으로 측정하고, 각각 활성화 CNBr-세파로즈에 결합된 항체가 95%를 넘는 것으로 관찰되었다. 커플링 후, 미반응 그룹은 0.1M Tris(pH 8.0) 25 내지 30배 컬럼 부피로 세척하여 차단시켰다. 그 다음, 컬럼을 0.1M Tris(pH 8.0), 0.5M NaCl (5X 컬럼 용적)으로 연속 5회 세척한 뒤, 0.1M 아세테이트 완충액(pH 4.), 0.5M NaCl로 교환시켰다. 세척시 단백질 측정을 실시하였으나, 단백질이 검출되지 않았다.

2. 친화성 크로마토그래피 정제

가용성의 글리코실화된 MDA-7을 분비하는 안정하게 형질감염된 293 t 세포를 입수하여 5% 태아 송아지 혈청, 1:100 L-글루타민, 1:100 pen/strep 및 1:100 HEPES를 함유하는 RPMI에서 고융합성을 유지시켰다. 세포를 2 내지 3일 마다 분할하고, 7일마다 번갈아 1:1000 희석율의 하이그로마이신(20mg/ml 스톡)에서 유지시켰다. 그 다음, 상청액 400ml을 2 내지 3일 마다 수거하여, 분자량 컷오프가 10,000 이상인 막에서 AMICON 교반 셀로 농축시켰다. 농축된 상청액 50ml을 배취법으로 5ml 베드부피의 항체-CNBr-세파로즈(친화성 수지)에 4℃에서 2일 동안 완만한 진탕하에 노출시켰다. 그 다음, 이러한 친화성 수지를 파마시아 XK26 컬럼에 주입하고 상청액을 3회 통과시켜 항원이 항체에 최대한 결합되게 했다. 친화성 수지는 5x20ml의 0.1M Tris(pH 8.0)으로 중력 유동에 따라 세척했다. MDA-7은 3x5ml 1M NaCl, 0.1M 글리신 (pH 3.0)으로 용출시키고, 그 즉시 0.5ml HEPES 완충액으로 중화시켰다. 용출 및 중화 직후, 사람 알부민 2mg을 첨가하여 단백질 손실을 방지했다. 용출된 단백질은 그 다음 분자량 컷오프가 10,000인 스핀 컬럼(AMICON)을 통해 농축하고, 멸균 1X PBS로 교환시켰다. 그 다음, 1X PBS로 교환된 친화성 정제 단백질 1 내지 1.5ml을 200㎕의 3x 세척된 단백질-A 세파로즈(SIGMA)에 교반하에 실온에서 2시간 또는 교반하에 4℃에서 밤새 노출시켰다. 단백질 A 노출은 용출 분획으로 침출된 항체를 흡수한다.

본 명세서에 기술된 바와 같이 제조된 4가지 다른 폴리클로날 항체를 친화성 정제로 시험했다. 친화성 정제에 앞서 크기 분리 정제(크기 배제 참조)를 이용하여 상청액으로부터 상량량의 오염 단백질을 제거했는데, 이 오염 단백질 중 대부분은 소혈청 알부민(BSA)이었다. 하지만, 이러한 방식으로 분리된 MDA-7의 노출은 컬럼 상의 항체가 MDA-7을 보유할 수 있게 하지 못했다. 그 이유는 아마도 BSA의 부재하에 MDA-7을 보유할 수 있는 BSA 차단성 비특이적 결합 부위 때문인 것으로 생각된다. MDA-7은 다량의 글리코실화된 단백질로서 플라스틱 및 다른 표면에 매우 잘 점착할 수 있는 것으로 생각된다.

MDA-7을 함유하는 상청액으로부터 BSA 제거는 친화성 크로마토그래피에 의한 MDA-7 정제를 방해한다. 대부분의 단백질은 통류물 중에 존재했고, MDA-7 단백질도 용출될 때까지 친화성 컬럼에 잔류되지 않았다. 유의적인 양의 BSA(2 내지 3mg/ml, 은염색 시)를 함유한 친화성 정제는 BSA 오염이 유의적으로 적은 정제 시 보다 오 랫동안 생물학적 기능을 유지시켰다. 또한, BSA 존재하의 친화성 정제는 높은 몰량의 NaCl과 낮은 pH를 이용한 용출이 이루어질 때까지 친화성 컬럼 상에 MDA-7을 잔류시켰다. 폴리클로날 친화성 수지를 이용한 친화성 정제는 MDA-7 함량이 비교적 비슷한 여러 분획을 생산했다. 쿠마시 분석 결과, 비교적 소량의 오염 단백질이 확인되었다. MDA-7은 균질성이 약 20%를 넘게 정제되었다.

친화성 정제는 반복가능했고, MDA-7을 농축시켜 12% 폴리아크릴아미드 겔의 쿠마시 염색 분석 시 상대적 순도가 되게 했다. 웨스턴 블롯에서 검출되는 밴드의 강도를 통해, 항원을 친화성 수지에 오랫동안 노출시킬수록 MDA-7 잔류량이 증가됨을 알 수 있었다. 투석 카세트와 스핀 컬럼 비교 시, 1X PBS로의 교환 방법 사이에는 차이가 거의 없다.

3. 음이온 교환 정제

친화성 정제된 MDA-7의 2 내지 3 분획을 모아, 10,000 MWCO 투석 카세트에서 2 내지 12시간 동안 실온에서 50mM MES, pH5.0으로 교환시켰다. 단백질을 그 다음 5ml 층용적의 음이온 교환 컬럼 상에 1ml/분의 유속으로 부하시켰다. 통류물 10ml을 취하여, 결합된 단백질을 1M NaCl(50ml MES 중에, pH 5.0)의 단계 구배로 용출시켰다. 용출 프로그램은 50mM MES(pH 5.0) 10ml 세척액으로 2ml/min의 유속으로 시작했다. 1단계 용출에서는 0M 내지 0.25M NaCl, 5분과 50mM MES, 0.25M NaCl(pH 5.0), 5분 세척을 사용했다. 2단계 구배에서는 0.25M NaCl에서 0.5M NaCl, 5분과 그 다음 5분 세척을 실시했다. 최종 용출 단계에서는 0.5M NaCl 내지 1M NaCl을 사용했다. MDA-7은 0.9 내지 1.0M NaCl에 의한 용출이 이루어질 때까지 컬럼 상에 잔 류했다. 그 결과, MDA-7은 약 90% 내지 95% 균질성으로 정제되었다.

18kDa의 비글리코실화 단백질은 pH 5.0에서 음이온 교환 컬럼에 결합하지 않았다. MDA-7의 친화성 음이온 교환 후 분획의 은 염색 분석에서는 MDA-7의 비글리코실화 형태가 함께 정제된 글리코실화 단백질과 결합되지 않은 것으로 나타났다. 천연 MDA-7 복합체는 분자량 31, 28 및 27/26인 적어도 3종의 단백질을 함유하는 것으로 보인다. 종래에는 1단계 음이온 교환 정제를 이용하여 MDA-7을 정제하는 시도가 이루어졌는데, 여기서 MDA-7을 함유하는 상청액은 50mM MES, pH 6.0으로 교환되었다. 이러한 1단계 음이온 교환 정제에서는, 음이온 교환 컬럼의 각 피크가, 웨스턴 블롯에서 폴리클로날 항MDA-7에 의해 검출되는 MDA-7을 함유하고 있음이 증명되었다(도 14). 하지만, 이러한 방법에 의한 정제는 MDA-7이 이용된 모든 NaCl 몰 농도에서 컬럼으로부터 침출되는 바, 임의의 이온 강도 범위에서 MDA-7의 유의적 농축을 얻지 못했다.

4. 크기 배제 크로마토그래피

층용적이 200ml인 크기 배제 크로마토그래피 컬럼은 XK26 1 미터 컬럼(파마시아)에 주입시킨 S200 세파덱스(파마시아)를 이용하여 제작했다. 이 컬럼을 중력 침강시키고, 그 다음 BioRad BioLogic Workstation으로 3.5ml/min의 속도로 압착시켰다.

293 t 세포에 의해 분비되는 MDA-7의 겉보기 분자량을 측정하기 위하여, 상대적 체류 시간을 측정하기 위한 단백질 분자량 표준물(마우스 IgG 5mg, 알칼리성 포스파타제 3mg, BSA 10mg 및 사람 베타2 마이크로글로블린 3mg)을 혼합했다. 분자 량 표준물에 상대적인 정제 단백질의 용출 시간을 플롯팅했으며, 0.97의 R² 값이 유도되었다. MDA-7을 함유하는 293 t 세포 상청액 200ml은 AMICO 교반 셀 중의 10,000 MWCO 필터를 통해 10ml로 농축시키고, 크기 분리 컬럼 상에서 1X PBS로 2ml/분씩 부하하였다. 5ml씩 분획을 취하고, 일련의 샘플에 대한 웨스턴 블롯 분석을 실시하여 상대적 체류 시간을 측정하여 공지의 표준물 유래의 그래프 선과 비교했다. 결합된 MDA-7의 겉보기 분자량은 80 내지 100kDa으로 확인되었다. 존재하는 총 MDA-7 중 0.1% 미만은 단량체 31kDa 형태로 관찰되었다. 도 15는 분자량과 잔류시간을 비교한 것이다. MDA-7 복합체는 약 85 내지 95kDa의 분자량 사이에서 용출되었다.

6. 크기, 음이온 및 렉틴 정제

콘카나발린 A-세파로즈 컬럼 상에서의 렉틴 정제를 이용하여 MDA-7 정제를 시도했다. 하지만, 상대적 순도의 총 증가는 수득되지 않았다. 크기 배제, 음이온 및 렉틴 정제법을 모두 조합한 조합 정제법을 이용하여 MDA-7을 농축시켰다. 하지만, 이러한 방법의 조합은 친화성 크로마토그래피 후 음이온 크로마토그래피를 이용한 경우 보다 MDA-7 정제량을 증가시키지 못했다. 이러한 결과는, MDA-7이 친화성 및 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 적어도 90 내지 95% 균질성으로 정제될 수 있음을 증명한다.

실시예 12: 모노클로날 항체를 이용한 분비형 MDA-7의 정제 및 특성분석

1. 항체 생산

7G11F.2(모노클로날 항체)로 지칭된 하이브리도마 클론은, 브레펠딘(Brefeldin) A로 처리된 안정하게 형질감염된 293t 세포의 세포내 FACS 분석 결과, IL-24/mda-7 양성 세포를 검출하는데 있어서 가장 효과적인 항체를 생산하는 것으로 관찰되었다. 이러한 예시실험 결과를 바탕으로, 이 클론을 이용하여 상청액 5리터를 생산했다. 간략히 설명하면, 세포(7G11F.2)를 1x10⁶ 세포/ml의 농도로, 10% 태아 송아지 혈청과 1:100 L-글루타민, 1:100 pen/strep 및 1:100 HEPES가 보충된 DMEM 50ml에 접종했다. 접종 후, 세포를 10일 동안 성장시킨 다음, 상청액을 수거했다.

2. 항체 정제

상청액을 2000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 제거하고 분리했다. 분리한 상청액을 그 다음 0.22㎛의 셀룰로스아세테이트 필터를 통해 멸균 여과시키고, YMCO 30kDa 막을 이용하는 Amicon Stirred Cell을 질소 하에 사용하여 50ml로 농축시켰다. 농축된 상청액을, 4℃에서 밤새 rProtein G 가교결합된 세파로즈(Sigma)에 노출시켰다. 항체는 1M NaCl pH 3.0, 3 컬럼 용적을 3회 분취량으로 사용하여 용출시키고 0.5M HEPES로 중화시켰다. 오염성인 소의 IgG를 제거하기 위해, 수득된 용출물을 투석 카세트(Pierce/Endogen, YMCO 30kDa)를 통해 0.4M NaCl을 함유하는 1X PBS(총량)으로 교환시켰다. 수득되는 단백질을 rProtein A 가교결합된 세파로즈(Sigma)에 4℃에서 밤새 노출시켰다. 컬럼 통류물을 취해, 단백질 A가 마우스 IgG1a 보다 소의 IgG에 보다 높은 친화성으로 결합함을 확인했다. 상대적 순 도를 SDS PAGE 분석으로 측정한 결과, 소의 IgG가 유일한 오염 단백질인 90% 순도의 7G11F.2로 확인되었다. 브래드포드 단백질 분석법(BioRad)을 이용하여 용출된 항체를 정량 분석했다. 그 다음 항체는 10,000 MWCO 투석 카세트에서 밤새 투석하여 0.5M NaCl을 함유하는 0.1M NaHCO₃(pH 8.3)로 교환시켰다.

3. 친화성 컬럼 제작

건조된 CNBr-세파로즈의 활성화를 위해, 1g을 10 내지 15 컬럼 용적의 1mM 냉 HCl로 세척했다. 일련의 5ml 용적을 사용하여 슈크로스를 제거했다. 그 다음, 활성화된 CNBr-세파로즈를 1 컬럼 용적의 연속 세척을 통해 10배 컬럼 용적으로 세척하여 0.1M NaHCO₃(pH 8.3)으로 교환시켰다. 정제 및 완충액 교환 후, 25mg의 항체(7G11F.2)가 회수되었다. 그 다음, 팽윤된 활성화 CNBr-세파로즈 2ml을 0.1M NaHCO₃(pH 8.3) 중의 정제된 항체와 함께 완만한 진탕하에 실온에서 4시간 동안 항온처리했다.

항체 결합 효율은 브래드포드 단백질 분석법으로 측정하고, 활성화 CNBr-세파로즈에 결합된 항체가 95%를 넘는 것으로 관찰되었다.

커플링 후, 미반응 그룹을 0.1M Tris(pH 8.0) 중에서 25 내지 30 컬럼 부피로 세척하여 차단시켰다. 마지막으로, 컬럼을 0.1M Tris(pH 8.0), 5X 컬럼 용적의 0.5M NaCl로 0.1M 아세테이트 완충액(pH 4.), 0.5M NaCl와 번갈아 5회 세척하였다. 세척시 단백질 측정을 실시하였으나, 단백질이 검출되지 않았다.

4. 친화성 정제

가용성의 글리코실화된 IL-24를 분비하는 안정하게 형질감염된 293 t 세포를 인트로겐(Introgen)으로부터 입수하여 5% 태아 송아지 혈청, 1:100 L-글루타민, 1:100 pen/strep 및 1:100 HEPES를 함유하는 RPMI에서 고융합성을 유지시켰다. 세포를 2 내지 3일 마다 분할하고, 7일마다 번갈아 1:1000 희석율의 하이그로마이신(20mg/ml 스톡)에서 유지시켰다. 그 다음, 상청액 400ml을 2 내지 3일 마다 수거하여, 분자량 컷오프가 10,000 이상인 막에서 AMICON 교반 셀로 농축시켰다. 농축된 상청액 50ml을 배취법으로 5ml 베드부피의 항체-CNBr-세파로즈(친화성 수지)에 4℃에서 2일 동안 완만한 진탕하에 노출시켰다. 이러한 친화성 수지를 그 다음 파마시아 XK26 컬럼에 주입하고 상청액을 3회 통과시켜 항원이 항체에 최대한 결합되게 했다. 친화성 수지는 5x20ml의 0.1M Tris(pH 8.0)으로 중력 유동에 따라 세척했다. IL-24는 3x5ml 1M NaCl, 0.1M 글리신 (pH 3.0)으로 용출시키고, 그 즉시 0.5ml HEPES 완충액으로 중화시켰다. 용출 및 중화 직후, 사람 알부민 2mg을 첨가하여 단백질 손실을 방지했다. 용출된 단백질은 그 다음 분자량 컷오프가 10,000인 스핀 컬럼(AMICON)을 통해 농축하고, 멸균 1X PBS로 교환시켰다. 그 다음, 1X PBS로 교환된 친화성 정제 단백질 1 내지 1.5ml을 200㎕의 3x 세척된 단백질-A 세파로즈(SIGMA)에 교반하에 실온에서 2시간 또는 교반하에 4℃에서 밤새 노출시켰다. 단백질 A 노출은 용출 분획으로 침출된 항체를 흡수했으며, 이의 제거는 IL-24 기능 유지에 중요하다.

7G11F.2 모노클로날 항체 컬럼은 실시예 11의 폴리클로날 컬럼에서와 유사한 양의 IL-24/mda-7을 생산했다.

실시예 13: MDA-7 및 췌장암 세포

1. Ad-mda7은 췌장암 세포를 직접 치사시키고 방사선민감화시킨다.

4가지 다른 췌장암 세포주의 평가 결과, 이 세포주들은 대부분 Ad-mda-7에 고도로 감염될 수 있는 것으로 관찰되었다. 또한, Ad-mda7은 이러한 4가지 세포주 중 3가지에서 세포를 직접 치사시키고 아폽토시스를 유도하는 것으로 관찰되었다(도 43). 반응성이 가장 큰 2개의 세포주, MiaPaCa2 및 AsPc1은 추가 분석을 위해 선택하였고, Ad-mda7이 이들 세포를 방사선민감화시키는지의 여부를 평가하게 위하여 여러 가지 실험을 수행했다. MiaPaCa2 세포는 Ad-mda7로 전처리하고, 48시간 후 방사선 조사했다. 클론원성 생존이 종료될 때 급격한 방사선민감화가 관찰되었다(도 44). 마지막으로, FACS 분석을 통해 서브 G1/G0 DNA 함량에 기초하여 아폽토시스를 평가했다(도 45). 이 실험은 Ad-mda7과 방사선이 조합되었을 때 아폽토시스의 추가 유도 보다 큰 효과가 얻어짐을 입증했다.

2. MDA-7 단백질은 STAT3을 활성화시키고 췌장 암세포를 직접 치사시킨다.

MiaPaCa2 췌장암 세포를 실시예 11에 기술된 바와 같이 정제된 재조합 사람 MDA-7 단백질로 처리했다. 면역형광법으로 STAT3의 실질적인 활성화(인산화) 및 이에 포함되는 p-STAT3의 이동을 관찰했다. STAT3 활성화는 항MDA-7 항체의 존재하에 차단되었다. STAT3 활성화는 MDA-7 처리 30분 이내에 확인되었고, 이는 MiaPaCa2 세포가 MDA-7에 대한 수용체를 보유하여, 리간드-수용체 체결이 일어났음을 암시한다.

또 다른 연구에서는 MDA-7 단백질 처리로 MiaPaCa2 세포의 용량 의존적 사망 을 유도했다. 췌장암 세포는 MDA-7에 대한 수용체를 보유하고, MDA-7 결합시, STAT3 시그날전달이 유도되고, 종양 세포의 사멸을 초래했다.

실시예 14: 세포 주기 정지의 선택적 유도 및 전립선 암 세포의 아폽토시스

재료 및 방법

1. 세포주 및 세포 배양

사람 전립선 암세포주 DU 145, LNCaP 및 PC-3을 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC; 미국 매릴랜드 록크빌 소재)에서 입수하여, 10% 태아 송아지 혈청, 항생제 및 L-글루타민이 보충된 RPMI-1640 배지(GIBCO-BRL; 미국 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재)에서 성장시켰다. 정상 전립선 상피 세포주(PrEC)는 클론틱스(미국 캘리포니아 산디에고 소재)로부터 입수하여, 제조사의 지시에 따라 보충된 PrEBM 배지에서 성장시켰다.

2. 바이러스 작제 및 형질도입 효율

mda-7 또는 루시페라제(luc) 유전자를 보유하는 복제 결손형 아데노바이러스(Ad5) 벡터의 작제 및 생산은 종래 기술된 바와 같이 실시했다(Saeki et al., 2000; Mhashikar et al., 2001). 녹색 형광성 단백질을 암호화하는 아데노바이러스 벡터(Ad-GFP)를 이용한 예비 실험에서는 3000의 감염다중도(MOI)로 전달된 아데노바이러스 용량이 93.4% 초과의 DU145, 76.2% 초과의 LNC몌 세포 및 82% 초과의 PrEC 세포를 감염시킬 수 있는 것으로 관찰되었다. 따라서, 본 발명자들은 모든 후속 실험에서 MOI 3000의 Ad-mda7 또는 Ad-luc를 사용했다.

3. 세포 증식 분석법

모든 세포주를 1x10⁵ 세포/웰의 밀도로 6웰 조직 배양판에 평판배양했다. 그 다음, 종양 세포를 Ad-mda7 또는 Ad-luc로 처리하거나 모의 대조군으로서 0.1M 인산염 완충 식염수(PBS)로 처리했다. 각 처리군의 세포를 삼중으로 평판배양하고 4일 동안 배양했다. 그 다음, 지정된 시점에서 세포를 트립신처리를 통해 수거하고, 0.4% 트립판 블루(GIBCO-BRL; 미국 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재)로 염색하여 사멸된 세포를 확인했다. 그 다음, 생존 세포는 혈구계수기를 사용하여 계수했다. 아폽토시스 염색을 위해, 세포를 감염 72시간 후에 Hoechst 33258로 염색하고 전술한 바와 같이 분석하였다(Saeki et al., 2000, 2002).

4. 세포 주기 분석

세포 주기에 미치는 Ad-mda7의 효과를 측정하기 위해, 세포를 10cm 배양 접시(5 내지 10x10⁵ 세포/접시)에 접종하고 Ad-mda7, Ad-luc로 처리하거나 0.1M PBS로 처리했다. 처리 후 특정 시점에서 세포를 트립신처리로 수거하고, 빙냉 0.1M PBS로 1회 세척한 뒤, 70% 에탄올로 고정시키고 -20℃에 보관했다. 그 다음, 세포를 빙냉한 0.1M PBS로 2회 세척하고 RNase(37℃, 30분, 500단위/ml; Sigma Chemicals; 미국 미주리 세인트루이스)로 처리한 다음, DNA를 프로피듐 요오다이드(PI)(50㎍/ml; 뵈링거 만하임; 미국 인디애나 인디애나폴리스 소재)로 염색했다. 세포주기 단계와 아폽토시스 비율(서브 G0/G1 단계의 세포)는 형광표지 세포 분류기(EPICS XL-MCL, 베크만 쿨터, 인크. 제품; 미국 캘리포니아 풀러턴 소재)를 사용하여 분석했다.

5. 유사분열 지수

유사분열 지수 측정을 위해, 세포를 Ad-mda7로 처리한 후 72시간째에 수거했다. 세포를 고정시키고 세포주기 분석에 대한 전술한 바와 같이 PI로 염색하고 형광현미경으로 분석했다. 각 샘플마다 적어도 500개의 세포를 형광 현미경으로 고배율(X40) 하에 무작위로 계수하고, 핵막 결여와 염색체 응집을 통해 유사분열 세포를 육안으로 확인했다.

6. 면역블롯 분석

Ad-mda7, Ad-luc 또는 PBS로 처리한 종양 세포(DU 145 및 LNC몌)를 처리 후 72시간째에 수거하고, 세포 추출물을 전술한 바와 같이 웨스턴 블롯 분석으로 제조했다(Saeki et al., 2000). 1차 항체로서 다음과 같은 항체를 사용했다: 항-MDA-7 항체(Introgen Therapeutics, Inc., 미국 텍사스 휴스턴 소재) 카스파제-3; PARP; 및 사이클린 E(PHarmingen; 미국 캘리포니아 산디에고 소재); 사이클린 A, β-액틴(Sigma Chemicals; 미국 미주리 세인트 루이스 소재); NFκB, Chk1, Cdc2, 인특이성-Jak1 p27Kip1, 인특이성-JNK, 인특이성-STAT3(Santa Cruz Biotechnology; 미국 캘리포니아 산타 크루즈 소재); 인특이성-Tyk2, 인특이성-STAT1 및 Cdc25C(Cell Signalling Technology, Inc., 미국 매사츄세츠 보스톤 소재); 사이클린 B1(L뮤 Vision Corp., 미국 캘리포니아 프레몬트 소재); Chk2(Novus Biologicals, 미국 콜로라도 리틀톤 소재); p21WAF1(Oncogene Research Products, 미국 매사츄세츠 보스톤 소재).

7. 통계 분석

스튜던트 t-검정으로 실험 결과의 통계적 유의성을 계산했다. 유의성 수준은 P<0.05로 설정했다.

결과

1. 사람 전립선 암세포 및 상피세포에서의 Ad-mda7 처리 후 MDA-7 발현

세포내에서 외인성 MDA-7의 발현을 측정하기 위해, DU 145, LNCaP, PC-3 및 PrEC 세포를 6웰 조직 배양판(1x10⁵ 세포/웰)에서 성장시킨 뒤, Ad-mda7 및 Ad-luc로 처리했다. PBS로 처리한 세포는 음성 대조군으로 사용했다. 감염 24시간, 48시간 및 72시간 후, 세포 용해물을 제조하고 웨스턴 블롯 분석으로 단백질 발현을 평가했다. MDA-7 발현은 PBS 및 Ad-luc로 처리된 세포와 비교했을 때 Ad-mda7로 처리된 모든 세포주에서 관찰되었다. MDA-7 단백질 발현은 시간 의존적인 것으로 과찰되었으며, 48시간 내지 72시간 사이에서 최대 발현이 관찰되었다. 평가된 세포주들에서 내인성 MDA-7 발현은 전혀 검출되지 않았다.

2. MDA-7 과발현에 의한 전립선 암 세포의 세포 증식 억제

세포 증식에 미치는 Ad-mda7 처리 효과를 측정하기 위해, 종양 세포(DU145, LNCaP 및 PC-3) 및 정상 세포(PrEC)를 PBS, Ad-luc 또는 Ad-mda7로 처리했다. 처리 후 다양한 시점에서 세포를 수거하고 세포 생존성을 분석했다. Ad-luc 또는 PBS로 처리한 대조군 세포에서와 달리 Ad-mda7로 처리한 모든 세포주에서는 3일째부터 유의적인 세포 증식 억제(P≤0.01)가 관찰되었다. PC-3 및 PrEC 세포에서는 세포 증식의 억제가 DU 145 및 LNCaP 세포에서 관찰되는 것 보다 적었고, 이는 이들 세포가 Ad-mda-7에 덜 민감하다는 것을 암시한다(도 16). 하지만, 이후의 시점(5일 및 6일)에서의 세포 증식을 분석해보면 PC-3 세포가 PrEC 세포 보다 Ad-mda7에 더 민감한 것으로 확인되었다.

3. MDA-7 과발현에 의한 전립선 암세포의 아폽토시스 유도

Ad-mda7로의 처리가 아폽토시스를 유도하는지의 여부를 결정하기 위해, Ad-mda7, Ad-luc 또는 PBS로 처리된 세포를 유세포측정 분석법으로 처리했다. Ad-mda7로 처리된 종양 세포(DU 145, LNCaP, PC-3)에서는 Ad-luc 또는 PBS로 처리된 세포와 비교했을 때, 아폽토시스의 척도인 서브-G0/G1기 세포 수의 증가가 관찰되었다(도 17). 하지만, 아폽토시스 세포의 수(5 내지 18%)는 종양 세포주마다 상이했다. 이에 반해, Ad-mda7 또는 Ad-luc로 처리된 정상 세포(PrEC)는 PBS 처리된 세포에 비해 서브-G0/G1 기 세포수의 큰 변화를 나타내지 않았다. 이러한 결과를 추가로 확인하기 위하여, 세포를 72시간 감염시킨 후 Hoechst 33258로 염색했다. Ad-mda7로 처리된 비정상 세포인 종양 세포는 아폽토시스의 척도로서 응집 및 단편화된 핵을 나타냈다. Ad-luc로 처리된 대조 세포에서는 전혀 변화가 관찰되지 않았다. 이러한 결과는, MDA-7이 아폽토시스 유도를 통해 정상세포가 아닌 종양 세포만을 선택적으로 억제한다는 것을 시사한다.

4. MDA-7 과발현에 의한 G2 세포 주기 정지 유도

MDA-7이 종래 폐암, 유방암 및 흑색종 암 세포주 연구에서 보고된 바와 같이(Saeki et al., 2000; Mhashilkar et al., 2001; Lebedeva et al., 2002), 전립선 암세포에서 G2/M 세포주기 정지를 유도할 수 있는지의 여부를 결정하기 위하여, 세포주기 단계를 유세포측정법으로 분석했다. 세포주기 분석은 Ad-mda7로 72시간 처리된 후 Ad-luc 또는 PBS로 처리된 종양 세포에 비해, G2/M 집단의 종양 세포 수가 증가된 것을 시사했다(도 18). 종양 세포와 달리, Ad-mda7로 처리된 정상 세포는 대조군 세포와 비교했을 때 G2/M 기 세포 수의 유의적 증가를 나타내지 않았다. 이러한 결과는, MDA-7이 종양 세포에 선택적으로 영향을 미친다는 것을 암시한다. 또한, 유사분열 지수 분석은 MDA-7이 종양 세포에서 Mrl 정지가 아닌 G2기 정지를 유도함을 증명했다(도 18).

5. MDA-7은 전립선 암세포에서 세포내 시그날전달 경로를 조절하여 아폽토시스 세포사를 초래한다.

전립선 암 세포(DU 145 및 LNCaP)에서 MDA-7 유도성 아폽토시스에 관여할 수 있는 세포내 시그날전달 기구를 평가했다. Ad-mda7로 처리된 DU145 및 LNCaP 세포에서는 PBS 및 Ad-luc로 처리된 세포에 비해 Stat1 및 JNK의 인산화 형태(각각 pSTAT-1 및 pJNK)의 증가가 관찰되었다. 이에 반해, Ad-mda7로 처리된 두 종양 세포주에서 STAT-3의 인산화 형태(pSTAT-3) 및 NFκB는 감소되는 것으로 관찰되었다. 두 종양 세포주 사이에 관찰되는 유일한 차이는 JAK1 및 Tyk2의 발현 뿐이다. DU 145 세포에서, Ad-mda7 처리는 대조군 세포에 비해 pJAK1 발현 감소와 pTyk2 발현 증가를 초래했다. 이에 반해, LNCaP 세포에서 Ad-mda7 처리는 pJAK1 발현 증가와 pTyk2 발현 감소를 초래했는데, 이는 시그날전달 개시가 두 세포주 간에 차이가 있음을 시사한다.

하류 표적인 카스파제의 추가 분석에서는, DU145 세포 및 LNCaP 세포에 Ad-mda7 72시간 처리 후 카스파제-9, 카스파제-3 및 PARP의 활성화가 확인되었다. 이 러한 결과는 Ad-mda7이 전립선 암 세포 중의 세포내 시그날전달 경로를 조절할 수 있고, 이에 따라 카스파제 캐스캐이드를 통해 아폽토시스가 유도됨을 입증하는 것이다.

6. MDA-7에 의한 G2 세포주기 정지는 Cdc25C의 하향조절과 관련이 있다.

MDA-7이 전립선 암 세포의 G2 정지를 유의적으로 유도하는 기작을 조사하기 위하여, G1/S 및 G2/M 세포주기 검사점에 관계된 단백질을 웨스턴 블롯 분석으로 평가했다. Ad-mda7 처리된 DU 145 및 LNCaP 세포에서는 인산화 및 비인산화된 Cdc25C의 발현 감소 및 Chk1 및 Chk2와 G2/M 기와 관련있는 사이클린 B1 단백질의 발현 감소가 확인되었다. 이에 반해, PBS 또는 Ad-luc로 처리된 세포에서는 이러한 단백질의 유의적 변화가 관찰되지 않았다. Cdc2 검사에서는, Ad-mda7로 처리된 LNCaP 세포에서, 처리된 DU 145 세포와 달리 Cdc2 발현의 약간의 감소가 확인되었다. 또한, 사이클린 A는 Ad-mda7로 처리된 두 세포주 모두에서 감소되는 것으로 관찰되었으며, 사이클린 E는 그렇지 않았다. MDA-7에 의해 조절되는 G1/S 및/또는 G2/M 세포주기 검사점과 관련있는 다른 단백질의 조사에서는 LNCaP 세포에서 p27 및 p21의 발현 증가가 관찰되었으나 DU 145 세포에서는 관찰되지 않았다. 이러한 LNCaP 세포(야생형 p53 유전자 보유)에서의 p27 및 p21 발현 증가는 아마도 p53 발현 증가 때문인 것으로 생각되는데, 그 이유는 이러한 단백질의 발현이 p⁵³ 돌연변이 DU 145 세포에서는 관찰되지 않았기 때문이다. 이러한 결과는 MDA-7이 G2/M 관련 단백질을 하향조절하여 G2 세포주기 정지를 유도한다는 것을 시사하며, 이는 전 술한 세포주기 분석의 결과와 일치하는 것이었다.

실시예 15: Ad-MDA7은 암세포를 방사선민감화한다.

재료 및 방법

1. 세포 배양, 벡터 및 화학물질

사람 NSCLC 세포주, A549(wt-p53/wt-Rb) 및 H1299(del-p53/wt-Rb), 및 정상 사람 폐 섬유아세포주(NHLF), CCD-16 및 MRC-9는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에서 입수했다. 모든 세포주는 ATCC에서 규정한 바대로 유지시켰다.

재조합 아데노바이러스 벡터(Ad-mda7)는, 변형된 Ad5의 E1 결실 영역에 삽입되는 미니유전자 카세트 중에 CMV 프로모터, 야생형 mda-7 cDNA 및 SV40 폴리아데닐화 시그날을 함유한다. 아데노바이러스 매개 루시페라제(Ad-Luc)는 대조군 벡터로서 사용했다. 이 벡터들은 전술한 바와 같다(Mhashilkar et al., 2001). 이 제제는 검사 결과 복제능이 있는(replication-competent) 아데노바이러스 및 마이코플라즈마는 존재하지 않는 것으로 확인되었다.

커큐민 및 노코다졸은 시그마-알드리치(영국 푸울 소재)로부터 구입했다. 커큐민 스톡 용액(10mM)은 실험 당일에 이 화합물을 에탄올에 용해시켜 갓 제조했다. 모의 처리된 세포에도 동일 농도의 에탄올을 처리했다. 그 다음, 배지를 10μM 농도로 희석했다. 노코다졸(5mg/ml) 스톡 용액은 이 화합물을 DMSO에 용해시켜 제조했다. 그 다음, 배지로 희석했다(200ng/ml).

2. 유전자 전달

모든 세포주의 시험관내 형질감염 연구를 위해, 2x10⁵ 세포를 T25 플라스크에 평판배양했다. 배양 48시간 후, 세포를 무혈청 배지 1ml에서 정제된 벡터와 1시간 동안 항온배양했다. 1시간 후, 10% FBS가 보충된 새 배지를 이 플라스크에 첨가했다. 무혈청 배지는 모의 형질감염군으로 사용했다. 세포를 추가 48시간 동안 배양한 후 생존 곡선을 작도했다.

3. 방사선조사 및 클론원성 분석

T25 플라스크 중의 세포에 고선량율의 ¹³⁷Cs 단위(3.7Gy/분)을 이용하여 실온에서 방사선조사했다. 방사선 조사는 벡터 처리 후 48시간 동안 수행했다. 방사선 조사 처리의 효과는 클론원성 분석으로 평가했다. 간략히 설명하면, A549, H1299, CCD-16 및 MRC-9 단층 세포를 전술한 바와 같이 T25 플라스크에서 처리하고, 다양한 선량의 조사 후 세포를 트립신처리하고 계수했다. 그 다음, 공지된 수의 세포를 100mm 배양 접시에 재평판배양하고, 항온배양기에서 거시적으로 콜로니 발달을 유도했다. 10 내지 14일 후 콜로니를 계수하고, 소정 처리 후 평판배양율 백분율 및 생존율을, 모의 감염, Ad-Luc 또는 Ad-mda7 처리되고 방사선조사되지 않은 세포의 생존율과 비교하여 계산했다. 사용된 벡터 처리는 각 세포주마다 조정하여, Ad-mda7에 의한 평판배양율 감소가 동일하게, 즉 80%가 되게 했다. 사용된 벡터 농도는 A549의 경우는 1000 vp/세포, H1299 경우 250 vp/세포, CCD-16 및 MRC-9 세포의 경우 1500 vp/세포였다. 이들 처리는 거의 100%의 형질감염율을 제공했다. A549 세포의 일부 실험에는 동일한 형질감염율을 제공하기 위해 2000 vp/세포를 필요로 하 는 Ad-mda7 벡터의 다른 분획을 사용했다.

4. 이폽토시스 지수 및 세포 주기 분석

아폽토시스는 APO-BRDU™ 키트(Pharmingen, 캘리포니아 산디에고 소재)를 사용하여 유세포측정법으로 정량했다. 간략히 설명하면, 2x10⁶ 세포를 PBS 중의 1% 포름알데하이드로 실온에서 15분 동안 고정시키고, PBS로 2회 세척한 뒤, 70% 에탄올 중에서 -20℃ 하에 보관했다. 분석을 위해, 세포를 DNA 표지화 용액 중에서 밤새 실온에서 항온처리했다. 형광 표지화된 항BrdU 항체 용액을 첨가하고, 세포를 실온의 암실에서 30분 동안 항온처리했다. 염색된 세포는 EPICS 유세포측정기(Coulter Corp. 플로리다 히알레 소재)를 사용하여 유동세포측정법으로 분석했다. 모든 단계는 제조자의 지시에 따라 수행했다. 분석 범위는 음성 대조군을 바탕으로 정하고, 표지화된 표지의 백분율은 이 영역 중에서 계산했다.

아폽토시스 지수는 5Gy 조사 후 2일째 또는 감염 후 4일째 조사했다. 이러한 시간 설정은 아폽토시스 최대 반응을 나타내는 시간의 예비 시험결과에 근거한 것이다. 앞에서와 같이, Ad-mda7 또는 Ad-Luc로의 감염은 방사선 조사 48시간 전에 수행했다.

5. 웨스턴 분석

간략히 설명하면, 세포를 평판으로부터 긁어내어, PBS로 세척하고 세포 용해 완충액에서 용해시켰다. 30㎍의 단백질을 8%(pRb의 경우), 12%(사이클린 B1, p-c-Jun, Fas, Bax 및 p53의 경우), 또는 15%(MDA-7의 경우) SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동적으로 분리하고, 폴리비닐라이드 디플루오라이드 막으로 전이시켰다(Millipore, 매사츄세츠 베드포드 소재). 1차 항체로서, pRb, 사이클린 B1 (Phamingen, San Diego, CA), p53(DAKO, Carpinteria, CA), Fas(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)에 대한 마우스 모노클로날 항체 및 Bax(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), MDA-7 (Introgen Therapeutics Inc., Houston, TX), JNK-1 (Promega, Madison, WI)에 대한 토끼 폴리클로날 항체를 사용했다. 세린-63이 인산화된 c-Jun p39에 특이적인 p-c-Jun의 1차 항체는 산타크루즈 바이오테크놀로지에서 입수했다. JNK-1에 대한 1차 항체는 c-Jun N 말단 키나제, JNK로도 알려져 있는 스트레스 활성화 단백질 키나제(SAPK)의 인산화된 활성 형태를 검출한다. 이러한 막의 화학발광성은 ECL™ 웨스턴 블롯 검출 시약(Amersham Corp, Arlington Heights, IL)을 제조자의 지시에 따라 사용하여 증강시켰다. 각 레인에 적용된 총 세포 단백질은 BCA 단백질 분석 시약(Bio-Rad Laboratories, 캘리포니아 리치몬드 소재)을 사용하여 동일한 농도로 조정하고, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색법으로 확인했다.

결과

1. Ad-mda7은 NSCLC 세포의 방사선민감성을 증가시키나, NHLF 세포주는 증가시키지 않는다.

Ad-mda7 감염이 시험관내에서 방사선조사에 대해 NSCLC 세포를 민감화시키는지의 여부를 조사했다. 2가지 NSCLC 세포주, A549 및 H1299와, 2가지 정상 사람 폐섬유아세포(NHLF) 세포주, CCD-16 및 MRC-9에 대해 클론원성 분석을 수행했다. 이 러한 세포주를 Ad-mda7 또는 Ad-Luc(대조용 벡터)로 감염시키고 48시간 후 방사선조사했다. 48시간 과정은 이 시간 내에 G2 정지 세포가 최대임을 입증하는 세포 주기 분석에 기초를 둔 것이다. 도 19에 제시된 바와 같이, Ad-mda7는 임상적으로 관련있는 선량인 2Gy에서도 두 NSCLC 세포주를 모두 방사선민감화시켰다. 예를 들어, 2Gy에서 A549 세포의 생존율%는 69.8%±3.1에서 38.5%±3.2(도 19A)로 감소되었고, A549 세포의 Ad-mda7 + 방사선 조사에 대한 50% 생존율로 계산된 선량 감소 인자(DRF)는 1.93이었다. 2Gy에서 H1299 세포의 생존율은 78.2%±3.7에서 45.7%±4.5로 감소되고(도 19B), H1299 세포의 DRF는 2.06이었다. 대조용 벡터 Ad-Luc는 동일한 벡터 농도로 사용되어도 A549 또는 H1299 세포에 대해 민감화 효과를 제공하지 않았다. 한편, Ad-mda7은 임상 관련 선량인 2Gy에서 NHLF 세포주를 방사선민감화하지 못했다. 2Gy의 방사선 조사 단독 및 방사선 조사 + Ad-mda7로 처리된 CCD-16 세포의 생존율은 각각 43.6%±7.0 및 45.4%±3.4(도 19C)이고, MRC-9 세포는 각각 24.2%±3.4 및 27.2%±1.6이었다(도 19D).

2. Ad-mda7은 NSCLC 세포의 아폽토시스는 유도하나, 정상 세포의 아폽토시스는 유도하지 않는다.

TUNEL 분석을 사용하여 아폽토시스의 수준을 측정했다(도 20). A549 세포(도 20A), H1299 세포(도 20B), CCD-16 세포(도 20C) 및 MRC-9(도 20D)를 모의 감염, 5Gy 단독, Ad-Luc 단독, Ad-Luc + 5Gy, Ad-mda7 단독 또는 Ad-mda7 + 5Gy로 처리한 후의 TUNEL 양성 세포의 백분율을 도 20에 제시했다. 방사선조사 단독 처리는 A549 세포(대조군)에 비해 TUNEL 양성 세포율을 11% 증가시켰다. 이러한 효과는 H1299 세포에서는 뚜렷하지 않았다. 예상한 바와 같이, Ad-mda7 감염 단독 처리는 A549 세포에서 10%, H1299 세포에서 18%의 TUNEL 표지 세포율을 완만하게 증가시켰다. 하지만, Ad-mda7 및 방사선조사의 병용은 A549 및 H1299 세포에서 38%와 35%의 수준을 달성하는 두 NSCLC 세포주에서 TUNEL 양성 세포의 증가율을 부가 이상의 효과로서 생산했다. 이와 같은 방사선 유도성 아폽토시스의 증가는 Ad-mda7이 Ad-Luc로 대체되는 경우에는 분명하지 않았다. 한편, Ad-mda7 단독으로 처리된 CCD-16(도 20C) 및 MRC-9(도 20D)의 TUNEL 양성 세포화율은 대조군에 비해 실질적으로 증가되지 않았고, Ad-mda7 + 5Gy의 조합 처리는 NHLF 세포주 중의 TUNEL 양상 세포의 비율을 약간만 증가시켰다.

3. Ad-mda7은 세포 주기 중 G2/M 기의 세포를 정지시킨다.

종래 보고에 따르면 Ad-mda7은 NSCLC 세포주에 대하여 증식을 억제하고 G2/M 세포주기 정지를 유도한다(Saeki et al., 2000). 이러한 효과를 확인하고, 세포 주기 조절에 관여하는 것으로 알려진 두 단백질 pRb 및 사이클린 B1의 발현을 조사했다. 웨스턴 블롯 분석으로, 감염 24시간 후 549 세포주 및 H1299 세포주에서 MDA-7 단백질의 발현이 개시되는지를 확인했다. 이 단백질의 글리코실화 형태의 검출로 인하여 다수의 밴드가 확인되었다(Wang et al., 2002; Lebedeva et al., 2002). MDA-7 단백질은 Ad-mda7 투여 후 발견되기 시작하므로, A549 및 H1299 세포에서 pRb의 발현은 2 내지 4일 이내에 감소되었다. 이에 반해, 사이클린 B1은 2일째 약간 상향조절되었으나, 이러한 수준은 A549에서 3일째 또는 H1299 세포에서 4일째 대조군 이하의 수준으로 감소했다. 이러한 결과는 세포가 Ad-mda7 형질감염 후 약 2일째에 G2/M 기 상태로 축적된다는 것을 암시한다. 이를, Ad-mda7 처리 후 2일째에 A549 세포 및 H1299 세포의 유세포측정 분석으로 확인했다. G2/M 정지 자체가 이러한 세포의 방사선민감성 향상에 중요한 역할을 하는지의 여부를 조사했다. 미세소관 중합을 가역적으로 차단하는 약물은 노코다졸을 사용하여 G2/M 기의 A549 세포 및 H1299 세포를 축적시켰다. Ad-mda7과 비교하여 동일한 정도의 G2/M 기 정지를 유도하는 노코다졸(200ng/ml)의 처리 기간은 A549 세포의 경우 4시간이고 H1299 세포의 경우 3.5시간이었다. 그 다음, 클론원성 분석을 통해, 노코다졸로 처리된 A549 세포 및 H1299 세포의 방사선민감성을 대조군과 비교하여 측정했다. 도 22에 제시된 결과는 G2/M 정지 자체가 NSCLC 세포의 방사선민감성을 최소 Ad-mda7에 의해 매개되는 정도까지 향상시키지는 못한다는 것을 시사한다.

4. Ad-mda7은 p53, Bax 및 Fas와 무관하게 방사선민감성을 향상시킨다.

A549 및 H1299에서의 p53, Bax 및 Fas 단백질의 발현은 방사선조사 단독, Ad-mda7 단독, Ad-mda7 + 방사선조사, Ad-Luc 또는 Ad-Luc + 방사선조사로 처리 후 분석했다. p53 단백질 수준은 방사선조사 또는 Ad-mda7로 처리된 A549 세포에서는 급격히 증가한 반면 Ad-Luc로 처리된 세포에서는 증가되지 않았다. 방사선조사 또는 Ad-mda7로 처리된 A549 세포에서의 Fas 단백질 발현 역시 증가되었고, 이 효과는 야생형 p53에 대한 의존성과 일치하는 것인데, 그 이유는 H1299 세포(p53 미발현)에서의 Fas 단백질 발현이 이러한 처리에 의해 향상되지 않기 때문이다. 한편, Bas 단백질 발현은 이러한 처리들에 의해 어떤 세포주에서도 크게 변화되지 않았다. 즉, A549 세포 및 H1299 세포는 Ad-mda7에 의해 동일하게 방사선민감화되는 바 , p53, Fas 또는 Bax는 Ad-mda7에 의한 방사선민감화와 아무런 상관성이 없다.

5. Ad-mda7은 p-c-Jun 단백질의 발현을 향상시킨다.

방사선 유도된 아폽토시스에는 c-Jun N 말단 키나제(JNK)의 활성화가 필요하다고 보고된 바 있다(Chen et al., 1996a; Chen et al., 1996b). Ad-mda7이 JNK를 활성화시킬 수 있고, 이것이 방사선민감화와 상관성이 있는지의 의문이 제기되었다. Rb, p-c-Jun 및 JNK-1 단백질 수준을 방사선 단독, Ad-mda7 단독, Ad-mda7 + 방사선조사, Ad-Luc 또는 Ad-Luc + 방사선조사로 처리한 A549, H1299 및 CCD-16 세포주에서 측정했다. Rb 단백질 발현은 Ad-mda7 처리된 A549 및 H1299 세포에서 급격히 감소했으나, 이 세포주들의 대조군 벡터에서는 변화되지 않았다. p-c-Jun 및 JNK-1 모두의 발현은 Ad-mda7로 처리된 A549 및 H1299 세포에서 증가되었다. 하지만, CCD-16 세포에서, Rb 단백질 발현은 약간 감소하였지만, p-c-Jun 및 JNK-1의 발현은 Ad-mda7 처리에 의해 증가되지 않았다. 이러한 결과는 Ad-mda7이 방사선민감성을 매개하고 JNK-1의 활성화 및 후속 p-c-Jun의 활성화를 통해 아폽토시스를 증가시킨다는 가설과 일치하는 것이었다.

6. 커큐민은 Ad-mda7 매개의 방사선민감화를 소실시킨다.

카레의 황색을 나타내는 식용 색소인 커큐민은 JNK 활성화를 억제하는 것으로 보고되었다(Chen and Tan, 1998). 따라서, p-c-Jun 단백질의 발현을, 방사선 조사 단독, 커큐민 단독, Ad-mda7 단독, 방사선조사 + 커큐민, 방사선조사 + Ad-mda7 또는 방사선조사 + 커큐민 + Ad-mda7로 처리한 A549 세포 및 H1299 세포에서 측정했다. 커큐민은 단독 사용 시, Ad-mda7을 단독 사용했을 때와 마찬가지로 p-c-Jun 을 증가시켰다. 하지만, 커큐민은 방사선조사 세포 및 방사선 미조사 세포에서 Ad-mda7 매개의 p-c-Jun 활성화를 감소시켰다. 커큐민이 Ad-mda7 매개의 방사선민감성을 억제하는지의 여부를 조사하기 위해, A549 세포 및 H1299 세포주를 사용하여 클론원성 분석을 수행했다. 세포를 Ad-mda7로 감염시키고 48시간 후 방사선조사 처리했다. 도 23에 제시된 바와 같이, 커큐민은 두 세포주 모두에서 Ad-mda7 방사선민감화를 소실시켰다.

실시예 16: 흑색종 세포에 대한 MDA-7 단백질의 방관자 효과

rhMDA-7(IL-24) 단백질은 친화성 크로마토그래피를 사용하여 293-mda7 세포로부터 정제했다. 여러 단백질 분획들의 순도는 은 염색에 기초할 때 30% 내지 >80% 범위였다. rhMDA-7 단백질을 흑색종 세포주에 적용하고, 트립판 블루 분석법을 이용하여 세포 생존성을 평가했다. 도 24에 제시된 바와 같이, rhMDA-7 단백질은 흑색종 세포의 용량 의존적 사망을 유발했다. rhMDA-7에 의한 흑색종 세포의 처리는 STAT3의 급격한 활성화(인산화를 통한)를 유발했다. 흑색종 세포에서 관찰되는 세포독성은 항MDA-7 항체에 의해 억제되었다. 도 24는 폴리클로날 토끼 항-MDA-7 항체 및 모노클로날 항-MDA-7 항체가 모두 rhMDA-7 매개의 사망을 억제하는 반면, 대조용 사람 IgG에는 어떤 영향도 미치지 않음을 보여준다. 병행 연구에서, 항-MDA-7 항체는 MDA-7 매개의 STAT3 활성화도 억제했다.

또한, rhMDA-7의 항종양 활성 기구도 평가했다. 흑색종 세포를 rhMDA-7 단백질로 처리하고, TUNEL 분석을 이용하여 아폽토시스를 평가했다. 표 4에 제시된 바와 같이, rhMDA-7 40ng/ml을 3일 동안 처리한 6가지 흑색종 세포주 중 5가지는 rhMDA-4 처리 후 세포독성을 나타냈다. 이러한 세포주들은 또한 아폽토시스 유도 상승도 나타냈다. 이러한 새로운 데이터는 흑색종 세포가 MDA-7 단백질에 의한 세포 사멸 유도에 민감함을 입증한다. 즉, 종양 세포의 Ad-mda7 형질도입은 MDA-7 단백질의 활성 분비를 유발하여, 이후 주변 세포를 사망시킬 수 있는 것으로 예상된다. 이러한 연구는 정제된 rhMDA-7 단백질을 이용하여 수행했다. 또한, 이 흑색종 세포들에 대해 293-mda7 세포 또는 대조용 293 세포의 상청액도 처리했다. 293-mda7 상청액만이 세포사를 일으킨다.

실시예 17: 사람 흑색종에서 흑색종 분화 관련 유전자(mda-7)과 유도성 산화질소 합성효소(iNOS)의 역상관성: MDA-7은 흑색종 세포에서 iNOS 발현을 조절한다.

재료 및 방법

mda-7의 단백질 발현은 전이 흑색종에서는 거의 검출할 수 없는 수준으로 감소한다. 이에 반해, 유도성 산화질소 합성효소(iNOS)의 발현은 진행성 흑색종에서 증가되는데, iNOS 발현은 이 질환의 잠재적 예후 마커로 제안되었다. 즉, 동일한 종양에서 이러한 분자들의 발현은 상반되는 특성을 나타내는 것으로 보인다. 이러한 흑색종 진행 분자의 상대적 비율은 사람 흑색종이 종양 진행성인지 종양 억제성인지를 나타낼 수 있을 것으로 추정된다. 이에, 본 연구의 제1 목표는 흑색종 중의 MDA-7 발현이 iNOS 발현과 상반성이 있는지를 측정하는 것이다. 그 다음, 제2 목표는 흑색종 세포에서 iNOS 발현이 MDA-7 발현에 의해 조절될 수 있는지의 여부를 결정하는 것이다.

1. 환자 샘플

본 연구에 사용한 종양 샘플은 주로 피부 흑색종과 다양한 부위에서 유래하는 전이 흑색종으로 구성된다. 흑색종 종양의 포르말린 고정 및 파라핀 매립된 절편을 M.D.앤더슨 암센터(Melanoma and Skin Cancer Core Laboratory)로부터 입수했다.

2. 세포 배양

전이 흑색종 세포주인 A375 및 A375.S2는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(매릴랜드 록크빌 소재)으로부터 수득했다. 방사상 성장기 및 수직 성장기의 흑색종 세포주, WM35, WM793 및 침윤성이 보다 강한 이의 서브클론을 로버트 커벨 박사(Sunnybrook Health Science Center, Toronto, Ontario, Canada)로부터 제공받았다. 고도 전이성 흑색종 세포주 MeWo는 데이비드 멘터 박사(M. D. Anderson Cancer Center)로부터 제공받았다. 본 연구에 사용한 흑색종 세포주는 10% 태아 송아지 혈청(Life Technologies, Inc.), 100 단위/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 및 HEPES 완충액(Life Technologies, Inc.)이 보충된 RPMI 1640(Life Technologies, Inc., Grand Island, NY)에서 유지시켰다. 이 세포를 1 내지 20ng/ml의 정제 MDA-7으로 처리하거나 시험관내 연구에서 Ad-mda7 또는 대조용 Ad-luc로 감염시켰다.

3. 사람 MDA-7의 정제

MDA-7의 전장 cDNA는 CMV 프로모터를 함유하는 pCEP4 FLAG 벡터(Invitrogen, 캘리포니아 산디에고 소재)에 클로닝시켰다. 이 플라스미드를 이용하여 HEK 293 세포를 형질감염시키고, 하이그로마이신(0.4㎍/ml)을 사용하여 안정한 서브클론을 분리했다. 분비형 MDA-7을 함유하는 상청액에 프로테아제 억제제(1㎍/ml 류펩틴, 1㎍/ml 펩스타틴 및 0.5mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드)와 0.05% 아지드화나트륨을 보충하고, YM1O 막을 이용하는 Amicon 교반 셀(Amicon, 매사츄세츠 비버리 소재)을 통해 10배로 농축했다. 농축된 상청액 10ml를 S200 Superdex 분취용 컬럼(Amersham Pharmacia, 뉴저지 피스카타웨이 소재)을 통해 1xPBS(pH 7.4)로 분리하고, 웨스턴 블롯 및 ELISA를 통해 MDA-7을 함유하는 것으로 확인된 분획을 모았다. Amicon 교반 셀을 이용하여 50mM 4-모르폴린프로판설폰산(pH 6)으로 완충액 교환시킨 후, 제2 정제 단계를 Bio-Rad S 컬럼을 사용하여 수행했다. 컬럼 조건은 다음으로 이루어진다: 0 내지 90mm NaCl 구배, 90mM NaCl에서 5분 유지, 90 내지 250mM(1ml/min) 구배에서 30분, 250mM NaCl에서 5분 유지. 전체 정제공정을 4℃에서 수행했으며, MDA-7은 ELISA 및 웨스턴 블롯팅 과정로 확인했다. 최종 샘플에는 ELISA로 측정된 바와 같이 적어도 300ng/ml의 MDA-7을 함유하고 있었다. 부분 정제된 MDA-7의 각 분획을 QCL 100 정량용 색소 LAL 키트(BioWhittaker, 매릴랜드 워커스빌 소재)를 사용하여 내독소 검사를 수행했다.

4. 유전자 전달

mda-7 유전자를 보유하는 복제 결손 사람 5형 아데노바이러스(Ad5)는 Introgen Therapeutics(텍사스 휴스턴 소재)로부터 입수했다. 이러한 mda-7 유전자를 내부 CMV-IE 프로모터에 결합시킨 뒤, SV40 폴리아데닐을 결합시켰다. Ad-Luc 및 Ad-CMV 폴리아데닐(각각 루시페라제 및 공벡터)을 대조용 바이러스로서 사용했다. 감염 1일 전에 세포를 평판배양했다. 흑색종 세포는 1000 내지 5000 바이러스 입자/세포를 사용하여 아데노바이러스 벡터(Ad-mda7 또는 Ad-luc)로 감염시켰다. 실험 조건은 MDA-7 단백질 발현이 세포의 >70%(면역조직화학 염색 결과에 기초할 때)에 이르도록 최적화했다.

5. 시약

항-iNOS 마우스 모노클로날 항체(Transduction Laboratories, 켄터키 렉싱톤 소재)는 iNOS 면역조직화학 분석에 사용한 결과, 종간 교차반응성이 있는 것으로 확인되었다. MDA-7에 대한 친화성 정제된 폴리클로날 토끼 항체는 인트로겐 테라퓨틱스로부터 공급받았다. IRF-1 및 IRF-2 폴리클로날 항체는 산타 크루즈 바이오테크놀로지 인크.(캘리포니아 산타크루즈 소재)에서 구입했다. 인산화 Stat1(Tyr701) 항체 및 인산화 Stat3(Tyr705) 항체는 Cell Signalling Tech.(매사츄세츠 비버리 소재)로부터 구입했다. 면역전 일반 마우스 IgG(Vector Laboratories, 캘리포니아 버링감 소재)을 음성 대조군으로 사용했다. 안티비멘틴 항체(BioGenex Laboratories, 캘리포니아 산라몬 소재)는 모든 흑색종 염색 시 양성 대조군으로 사용했다.

6. 면역조직화학

면역조직화학물질 표지화는 4 내지 6cm 두께로 절단된 10% 포르말린 고정 및 파라핀-매립된 흑색종 조직에서 수행했다. 절편은 실란처리된 슬라이드(Histology Control Systems, 뉴욕 글렌 헤드 소재) 위에 놓고, 크실렌으로 탈파라핀화시킨 다음, 하강 등급(100%에서부터 85%까지) 에탄올로 재수화시켰다. 사이토킨의 면역염색성을 향상시키고 최대 항원성을 복원시키기 위해, 절편을 항원 탈보호 용액(Vector Laboratories)에 넣고, 가열 온도 유지를 위해 최고 10분 동안 간헐적으로 마이크로웨이브로 가열했다. 이러한 슬라이드를 실온에서 30분 동안 냉각시킨 후, 증류수와 PBS로 세척했다. 이러한 1차적인 준비 후, 슬라이드로부터 PBS를 제거하고, 메탄올 중의 3% H₂O₂(Sigma Chemical Co., 미주리 세인트 루이스 소재)를 도포하여 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단시켰다. 모든 항온처리는 가습된 밀폐 슬라이드 챔버에서 실온하에서 수행했다. 이러한 슬라이드를 PBS로 세척한 후, 세포의 투과성 향상을 위해 0.05% Triton X-100(Sigma Chemical Co.)을 함유하는 PBS에서 15분 동안 항온처리했다. 그 다음, 염색 여부를 검출하기 위해 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 복합체 키트(Vectastain; Vector Laboratories)를 사용했다. 이 슬라이드를 차단 혈청과 30분 동안 항온처리한 후, 다양한 희석율(1:100 내지 1:200)의 1차 항체를 첨가하고, 실온에서 60분동안 항온처리했다. 그 다음, 슬라이드를 세척하고, 2차 비오틴화된 항체와 30분 동안 항온처리하고, 다시 세척한 뒤 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 복합체 시약과 30분 동안 항온처리했다. 이 슬라이드를 PBS로 세척한 뒤, 발색원으로서 3-아미노-9-에틸카르바졸을 사용하여 면역염색을 15분 동안 발색시켰다. 이 슬라이드를 헤마톡실린(Vector Laboratories)으로 대비염색하고 Aqua-Mount(Lerner Laboratories, 펜실베니아 피츠버그 소재)로 표본을 제작했다. 각 샘플마다, 비멘틴 및 동형 부합성 대조용 IgG를 각각 양성 및 음성 1차 항체 대조군으로 사용했다. 이러한 항체의 특이성과 민감성은 종래 공지되어 있다(Ekmekcioglu et al., 2000; Lebedeva et al. 2002). 소정의 환자로부터 얻은 모든 조직 샘플은 동일한 실험으로 면역표지화시켰다.

7. 면역조직화학 평가

면역표지화는 2가지 변수, 즉 양성 세포 수 및 양성 세포 면역반응성의 총 강도에 대하여 각각 평가했다. 양성 세포 수의 평가는 다음과 같이 정의했다: (0) 양성 세포가 <5% 인 경우; (1) 양성 세포가 5 내지 50%인 경우; (2) 양성 세포가 50 내지 90%인 경우; 마지막으로 (3) 양성 세포가 >90%인 경우. 강도의 평가는 다음과 같이 정의했다: (0) 염색 안됨; (1) 약한 염색; (2) 보통 염색; (3) 강한 염색. 각 슬라이드의 판독은 2명의 판독자에 의해 별도로 실시했다.

8. 면역블롯팅 분석

2x10⁶개인 배양된 흑색종 세포주를 빙냉 PBS로 2회 세척하고, 5mM EDTA, 0.2mM 오르토바나데이트, 10mM NaF, 류펩틴, 아프로티닌 및 페닐메틸설포닐 플루오라이드를 함유하는 용해 완충액[25 mM Tris, 140 mM NaCI, and 1 % NP40 (pH 7.5)] 60㎕에 넣어 얼음 상에서 10분 동안 방치하여 용해시켰다. 전체 단백질을 동량씩[DC Protein Assay Reagent(Bio-Rad Labs, Hercules, CA)로 측정] 표준 10% SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩하고, 분리된 단백질은 니트로셀룰로스 막으로 전기블롯팅시켰다. 니트로셀룰로스 막은 1x PBS 중의 5% 분유를 사용하여 실온에서 1시간 동안 차단시킨 뒤, 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS로 각각 5분씩 3회 실온에서 세척했다. 이 막을 밀봉 백에 넣고, 1x PBS 중의 5% 분유/0.1% Tween 20 10ml에 희석된 IRF-1 및 IRF-2 폴리클로날 항체 1:2000 희석물과 함께 4℃에서 1시간 동안 항온처리했다. 그 다음, 막을 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS로 각각 5분씩 3회 세척한 후, 5% 분유 및 0.1% Tween 20을 함유한 PBS 중에 1:2000 희석율로 희석시킨 퍼옥시다제 접합된 항토끼 IgG 2차 항체(Transduction Laboratories)와 실온에서 45분 동안 항온처리했다. 개량된 화학발광 검출 키트(Amersham, 일리노이 아링톤 하이츠 소재)를 사용하여 블롯을 가시화했다.

9. 통계 분석

iNOS 및 MDA-7의 평균값 및 SD를 계산했다. iNOS 및 MDA-7 수와 강도 사이의 관련성을 조사하기 위하여, 켄달 τ-b 검사법(Woolson, 1987)을 사용하여 상관성 부재 검사를 수행했다.

결과

1. 흑색종 종양 MDA-7 발현은 종양 iNOS 발현과 역상관성이 있다.

MDA-7 발현이 동일 종양에서 iNOS 발현과 역상관성이 있는지를 조사하기 위하여, 연속으로 파라핀 매립된 악성 흑색종 종양 절편을 가지고 면역조직화학 분석을 수행했다. 본 실험에는 38개의 원발성 흑색종과 43개의 전이암(총 81개 종양 샘플)을 분석했다. 항MDA-7 폴리클로날 항체 및 항-iNOS 모노클로날 항체로 면역염색한 후, 양성 세포 수 및 염색 강도를 기반으로 한 샘플의 면역반응성을 분석했다. MDA-7 염색 세포 수와 iNOS 염색 세포 수의 직접 비교 결과, 역상관성이 확인되었다. 도 25A는 iNOS 및 MDA-7에 대해 양성 염색 세포 수 사이의 유의적인 역상관성이 존재함을 증명한다(상관계수 = -0.209, P<0.05, 켄달 τ-b 검사법). 이와 마찬가지로, 염색 강도 비교를 통해 iNOS 및 MDA-7 사이의 상관성을 분석했다. 도 25B는 MDA-7 강도가 증가하면 평균 iNOS 강도가 크게 감소하는, iNOS 강도와 MDA-7 강도 사이의 역상관성을 보여주었다(상관 계수 = -0.201, P<0.05, 켄달 τ-b 검사법). 즉, 종양의 MDA-7 및 iNOS 발현의 평가를 통해, 원발성 흑색종의 일련의 절편과 이 종양 유래의 전이암의 일련의 절편에서 iNOS 및 MDA-7 발현 사이의 역상관성이 확인되었다. 대립 샘플에서, 원발성 흑색종 종양 MDA-7 면역반응성은 강한 세포질 면역표지화를 보인 반면, 림프절 전이암과 뇌 전이암에서는 음성을 보였다. 이에 반해, 원발성 흑색종에서 iNOS는 나타나지 않은 반면, 림프절 전이암과 뇌 전이암에서는 강하게 면역표지화되었다.

2. Ad-mda7 및 rhMDA-7은 사람 흑색종 세포주에서 iNOS 발현을 하향조절한다.

면역조직화학을 통해 확인된 MDA-7과 iNOS의 역발현은 가능성있는 원인/결과의 관계를 제시했다. 따라서, 본 발명자들은 일련의 시험관내 실험을 통해 MDA-7에 의한 iNOS 발현 조절의 가능성을 조사했다. 먼저, 흑색종 세포주, A375, MeWo, WM35 및 WM793을 Ad-mda-7(500, 1000 및 2000 바이러스 입자/세포) 또는 Ad-luc(1000개의 바이러스 입자/세포)로 감염시켰다. 기준선에서, 이들 흑색종 세포주는 다량의 iNOS를 발현하고 MDA-7은 발현하지 않았다. 벡터 처리 후, 48시간이 경과하고, 세포를 수거하여 세포침전물을 만들어 iNOS 발현을 분석했다. 세포 당 1000 내지 2000 바이러스 입자로의 Ad-mda7 감염은 48시간 경과 후 iNOS 발현을 완전히 하향조절한 반면, Ad-luc 감염은 어떤 영향도 미치지 않았다. iNOS 발현을 억제한 Ad-mda7 벡터의 용량은 이러한 단기 배양 동안 유의적 세포사를 초래하는 것으로 보이지는 않았다. 이러한 실험 결과는, 유전자 전달 발현이 흑색종 세포에서 iNOS 발현을 특이적으로 차단한 것임을 시사한다. 이미 MDA-7은 Ad-mda7 감염된 흑색종 세포에서 분비되는 것으로 밝혀진 바 있다(Lebedova et al., 2002; Mhashikar et al., 2001). 분비형 MDA-7이 또한 iNOS 조절에 관여하는지를 조사하기 위하여, 흑색종 세포주를 0, 5 또는 20 ng/ml의 rhMDA-7과 항온배양하고 염색을 통해 iNOS 발현에 대해 조사했다. 20mg/ml 농도의 rhMDA-7 은 A375 흑색종 세포에서 48시간 경과 시 iNOS 발현을 분명하게 억제조질했다.

3. MDA-7은 흑색종 세포에서 IRF-1 및 IRF-2 발현을 조절한다.

흑색종 세포의 rh-MDA-7 단백질 처리는 iNOS 발현의 강력한 하향조절을 초래했고, 이는 MDA-7이 수용체 매개 경로를 통해 작용할 수 있음을 암시한다. 최근 밝혀진 바와 같이, MDA-7은 IL-20 및 수용체를 통해 결합하고 시그날을 부여할 수 있다. 따라서, IL-20 및/또는 IL-22 수용체 시그날 도입 경로(이 둘은 모두 STAT 활성화에 관여하는 II형 사이토킨 수용체들이다)는 MDA-7에 노출된 흑색종 세포에서 활성을 띠는 것으로 생각되었다. 이에, 먼저 rhMDA-7과 항온처리된 흑색종 샘플을 면역조직화학 표지화하여 STAT1 및 STAT3 인산화를 조사했다. STAT1 인산화에는 변화가 관찰되지 않았지만, STAT3은 미처리 세포에 비해 MDA-7 처리된 MeWo 세포에서 상향조절되는 일정한 검출 결과를 보였다. 이와 유사한 결과가 흑색종 세포주 A375 및 WM35, A375.S2와, 건강한 헌혈자의 말초혈액 단핵세포에서 관찰되었다. STAT3의 발현 증가는 rhMDA-7 20ng/ml로 처리된 MeWo 세포의 세포질에서 처음으로 관찰되었다. 또한, 면역조직화학 표지화 연구에서, 인산화 STAT3의 염색은 이러한 rhMDA-7 처리된 흑색종 세포의 핵에서도 관찰되었다.

4. MDA-7은 흑색종 세포에서 IRF-1 및 IRF-2 발현을 조절한다.

MDA-7에 노출 후 STAT3 인산화가 유도된다는 발견에 기초하여, STAT 단백질의 하류 표적을 평가했다. 이러한 표적 중 2가지인 IRF-1 및 IRF-2는 종양 세포에서 서로 상반된 활성을 갖고 있다. 특히, IRF-1은 iNOS 유전자 발현을 유도한다(Saura et al., 1999; Dell'Albani et al., 2001). MDA-7 시그날 형질도입과 iNOS 발현을 연결짓는 가능한 분자 경로를 조사하기 위하여, rhMDA-7 처리 후 흑색종 세포의 IRF1 및 IRF2 발현을 평가했다. rhMDA-7 처리된 세포 용해물 중의 IRF-1 및 IRF-2 분자의 면역블롯팅에서는 4시간 이내에 IRF-2 발현의 상향조절이 확인되었다. 한편, IRF-1 발현은 MeWo 세포의 rhMDA-7 처리에 의해 4시간 이내에 급격하게 감소했다(도 26). 샘플 크기가 작아서 유의적인 차이값을 얻지는 못했지만, IRF-1 발현은 거의 4배 떨어진 반면, IRF-2 발현은 4.7배 증가했다.

실시예 18: Ad-mda7은 타목시펜의 종양억제 효능을 증가시킨다.

T47D 세포를 증가되는 MOI(0 내지 1000vp/세포)의 Ad-벡터 및 증가되는 농도의 타목시펜(0 내지 2㎍/ml)으로 동시에 처리했다. 처리 후 4일째, 이 세포의 증식을 3중수소화된 티미딘 혼입율 분석을 통해 분석했다. 도 27은 Ad-mda-7이 타목시펜의 종양 억제 효능을 증가시킨다는 것을 보여주고 있다.

실시예 19: MDA-7은 내피세포 중의 STAT3을 활성화시킨다.

챔버 슬라이드 중에서 HUVEC 세포(1000 세포/챔버)를 정제된 MDA-7 10 내지 20ng으로 처리했다. 여기서, MDA-7은 친화성 정제된 MDA-7이다. 4시간 후, 세포를 세척하고, 토끼 항-p-Stat3 항체(세포 시그날전달, 1:1000 희석율)와 4℃에서 1 내지 2시간 동안 항온배양했다. 그 다음, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 2차 텍사스-레드 접합된 항-토끼 IgG(1:1000 희석율)로 처리했다. 처리된 세포를 세척한 뒤, 형광현미경 하에서 pStat3 핵 염색에 대해 분석했다. 분석 결과, MDA-7이 내피세포 중의 Stat3을 활성화시키는 것을 보여주었다. 이와 유사한 결과는 미정제 293-MDA-7 사용 시에도 수득되었다. 동시에 세포를 헥스트 염료로 염색하여 핵을 가시화했다.

실시예 20: Ad-mda7 및 MDA-7 단백질은 흑색종 세포 유래의 사이토킨 분비를 조절한다.

Ad-mda7 또는 MDA-7 단백질을 흑색종 세포에 처리하여 사이토킨 유도를 비교한 결과는 도 28에 제시한 바와 같다.

실시예 21: A549 폐 전이암에 미치는 Ad-mda7의 효과

A549 폐암세포를 누드 마우스의 정맥내로 주사하여 폐 전이암을 형성시켰다. 구체적으로, Ad 벡터(Ad-공(Ad-EV); Ad-luc, Ad-p53 및 Ad-mda7)를 프로타민과 혼합하여 누드 마우스의 정맥내로 주사한 뒤, 폐 중의 종양 형성량을 측정했다. 결과는 도 29에 제시했다.

실시예 22: MDA-7은 혈관의 평활근 세포의 성장 및 이동을 선택적으로 억제한다.

재료 및 방법

1. 세포 배양 및 세포 계수

PAC-1 SMC는 10% FBS가 보충된 DMEM(GIBCO/BRL, Life Technologies) 배지에서 5% CO₂, 37℃하에 유지시켰다. PAC1 세포를 계대 수준 70 내지 85회의 세포를 사용했다. PAC1 세포는 0.1% FBS로 적어도 24시간 동안 성장 정지시켰다. 정상 랫트의 대동맥 평활근 세포(RASMC)는 10 내지 20회 계대 수준에서 사용했다. 원발성 사람 심장 동맥 SMC(HCASMC) 세포는 제조업자로부터 입수하여, SmGM-2 배지(Clonetics, San Diego, CA)에서 성장시킨 후 5 내지 10회의 계대 수준에서 사용했다. 바이러스 형질도입 후 세포 생존성은 제시된 시점마다 혈구계(Fisher)로 생세포를 직접 계수하여 측정했다.

2. 트립판 블루 배제 분석

세포 생존성은 트립판-블루 배제 분석을 이용하여 측정했다. 간략히 설명하면, 총 세포(현탁액 + 트립신처리)를 트립판 블루 용액(Gibco-BRL)과 1:1로 혼합한 뒤, 광학 현미경 아래에서 혈구계를 이용하여 관찰했다. 청색 세포(죽은 세포)의 백분율을 계산했다(3 내지 5회 시야 중의 평균수).

3. 아데노바이러스 형질도입

사람 mda-7(Ad-mda7) 또는 루시페라제(Ad-Luc)(Mhashilkar et al., 2001) 중 어느 하나와 Ad-RSV-베타-gal 및 Ad-SM22-β-gal의 발현을 유도하는 재조합 복제 결손형 아데노바이러스는 이미 개시되어 있다(Kim et al., 1997). PCA-1 SMC를 완전 배지 중에서 6웰 평판이나 100mm 접시를 이용하여 성장시켰다. 세포가 50 내지 90%의 융합성이 되면, 상기 배지를 2% FBS 함유 DMEM으로 교환시켜 주고, 바이러스 스톡 제제는 필요한 경우에 상기 배지로 희석한 다음, 지정된 감염다중도(MOI; pfu/세포)로 상기 세포 단층 위에 접종했다. 바이러스 흡수를 위해 37℃에서 매10분마다 1시간 동안 수동으로 교반한 후, 이와 같이 형질도입된 배양물에 완전 배지를 첨가하고, 세포를 표시된 시간동안 37℃에서 항온배양했다. 대조군으로서 일부 실험에서는 동일한 그룹의 세포를 형질도입처리함이 없이 2% FBS를 함유하는 DMEM에서 매10분마다 교반하면서 1시간 동안 항온배양했다. X-gal 조직화학 염색은 종래 기술된 바와 같이 수행했다(Kim et al., 1997).

4. 노던 블롯팅

산 페놀 추출법(Chomczynski and Sacchi, 1987)을 사용하여 바이러스로 형질감염시킨 PAC1 세포로부터 총 RNA를 분리했다. 총 RNA 10㎍을, 포름알데하이드를 함유하는 1.2% 아가로스 겔 상으로 전기영동시키고, 나일론 막(Zeta Probe, BioRad Laboratory)으로 전이시킨 뒤, ³²P-표지된 사람 mda-7 cDNA 단편과 하이브리드화시켰다. 하이브리드화 후, 나일론 막을 세척한 뒤, 자가방사선술로 노출시켰다. 또한, 분리된 막과 하이브리드시키기 위해 GAPDH 프로브를 사용하여, 동일한 로딩량의 대조군오럿 GAPDH mRNA를 검출했다.

5. 웨스턴 블롯팅

실험 처리 후, PAC1 세포를 용해 완충액 중에 모았다. 세포 용해물을 그 다음 초음파처리한 후, 14,000 x g, 4℃에서 15분 동안 원심분리했다. 상청액을 옮겨서, Bio-Rad 단백질 분석 키트를 사용하여 샘플의 단백질 농도를 평가했다. 일부 실험에서는, 세포를 용해시키기 전에 단백질 분비량을 분석하기 위해 조정 배지를 모아두었다. 세포 단백질 30 내지 50㎍ 또는 조정 배지 10 내지 20㎕를 10 내지 12% SDS-PAGE 상에 분리시킨 후, 임모빌론-P 막(Millipore)으로 전이시켰다. 그 다음, 막을 단백질 특이적 항혈청 MDA-7 항체(1:1000, Introgen Therapeutics, 텍사스 휴스턴 소재) 및 다른 아폽토시스 항체(BAK, BAX, BCL-2, BCL-xL, 1:1000, 캘리포니아 산타크루즈 소재)로 탐침했다. pSTAT-3 단백질은 토끼 항-사람 pSTAT-3 항체(1:1000, Cell Signalling Technology, 매사츄세츠 비버리 소재)로 검출했다. 단백질 로딩량의 동일성은 항-β-튜블린 항체를 사용하여 평가했다. 면역학적 동일성이 있는 단백질은 알칼리 포스파타제-접합된 종 특이성 IgG 및 개량된 화학발광법(PIERCE)으로 확인했다.

6. 아폽토시스 분석

PCA1 세포의 아폽토시스를 ApoAlert 아넥신 V-FITC 키트(CLONTECH)를 사용하여 분석했다. 간략히 설명하면, 바이러스 형질도입된 세포를 트립신처리로 수거하고, PBS 및 결합 완충액으로 충분히 세척했다. 그 다음, 세척된 세포를 결합 완충액으로 희석한 아넥신 V-FITC 시약과 암실에서 실온하에 10분마다 가볍게 쳐주면서 30분 동안 항온배양했다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 FACS 분석을 위해 처리했다. 또한, PAC1 세포의 아폽토시스는 DAPI 염색 분석법을 이용해서도 분석했다. 간략히 설명하면, 바이러스 형질도입 세포를 각 시점마다 PBS로 세척하고, 4% 파라포름알데하이드로 고정시킨 뒤, PBS로 희석시킨 300nM DAPI와 실온에서 1 내지 4분 동안 항온배양했다. 그 다음, 세포를 PBS로 세척하고, 형광현미경으로 육안관찰한 뒤, 아폽토시스성 세포를 핵 분석으로 측정하고, 종래 기술된 바와 같이(Dimmeler et al., 1997), 400개의 핵의 총세포수 중 아폽토시스 핵 수 x 100%로 나타내었다. PAC1 세포는 Apo-ONETM 균질성 카스파제-3/7 분석 키트(Promega, 위스콘신 매디슨 소재)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 카스파제-3 활성에 대해 분석했다. 간략히 설명하면, 바이러스 형질도입된 세포를 저장성 완충액(25mM HEPES, pH 7.5, 5mM MgCl, 5mM EDTA, 5mM DTT, 2mM PMSF, 10㎍/ml 펩스타틴, 10㎍/ml 류펩틴) 중에서 동결-해동을 2회 실시하여 용해시킨 뒤, 13,500 rpm으로 4℃에서 15분 간 원심분리했다. 상청액을 활성 분석을 위해 새 시험관에 옮겨 담았다. 다른 실험군의 세포는 총 단백질 정량을 위해 NHE 완충액에 담아두었다. 각 반응 마다, 세포 용해물 25㎕를 사용하여, 균질성 카스파타제 3/7 시약(기질을 완충액으로 희석했다) 25㎕와, 150nM 카스파제-3 억제제(Ac-DEVD-CHO)의 존재 또는 부재 하에 연속 진탕시키면서 실온에서 4시간 동안 항온배양했다. 형광도는 485nm의 여기 파장과 535nm의 방출 파장에서 형광판 판독기로 측정했다. 카스파제 3 활성의 분석은 측정된 형광도를 총 단백질로 정규화하여 수행했고, 단위/10㎍(총 단백질)으로 표시했다.

7. 유세포측정법

바이러스 형질도입 및 세포 표면 상에 인테그린 발현 후 세포의 아폽토시스는 유세포측정법으로 평가했다. 바이러스로 형질도입된 PAC1 세포를 트립신처리로 수거하고, PBS로 세척한 뒤, 냉 70% 에탄올로 12시간 동안 고정시켰다. 이 세포를 원심분리하고 PBS로 2회 세척한 다음, PBS에 재현탁시키고, 최종 농도 50㎍/ml의 프로피듐 요오다이드(PI) 및 20㎍/ml의 RNAse와 실온에서 항온배양했다. 대조군으로서 동일한 그룹의 세포를 형질도입 처리함이 없이 상기와 동일하게 처리했다. 처리된 세포는 PBS 1ml 당 10⁵개 세포 농도의 단일 현탁액으로 제조한 뒤, FACSCalibur 유세포측정계(Becton Dickinson, 캘리포니아 산요세 소재)를 사용하여 FACS 분석으로 평가했다. 세포 아폽토시스의 백분율은 Modfit 아폽토시스 분석 프로그램(Becton Dickinson, 캘리포니아 산호세 소재)을 사용하여 측정했다. 독립된 3회 실험을 3가지 다른 세포 집단을 사용하여 수행했다. 또한, 종래 기술된 바와 같이(Li et al., 2001), 세포 표면 상의 인테그린 단백질 발현 측정에도 유세포측정 분석을 수행했다.

8. 세포 이동 분석

PAC1 세포의 이동 속도는 종래 기술된 바와 같이(Huang and Kontos, 2002) 긁음 손상(scratch wounding) 분석법을 사용하여 측정했다. 간략히 설명하면, PAC1 세포를 90% 융합성일 때까지 60mm 평판에 성장시키고, 형질도입 처리하지 않거나 또는 바이러스로 24시간 동안 형질도입 처리했다. 세포 단층을 멸균 피펫 팁으로 붕괴시켜 무세포 구역을 형성시킨 후 24시간 동안 영양공급을 중단했다. 그 다음, 세포를 10% FBS로 처리하거나 처리하지 않았다. 처리 후 24시간째, 세포를 카메라가 연결된 올림푸스 IX-70 현미경으로 관찰했다. PAC1 세포 이동은 무세포 구역(붕괴된 단층의 가장자리 사이의 거리)의 폭을 다른 3 위치에서 직접 자를 이용하여 정량분석했다.

9. STAT-3 활성화

세포를 챔버 슬라이드에 평판배양하고, MDA-7 단백질로 60분 동안 처리한 뒤, PBS로 철저하게 세척했다(3x). 그 다음, 세포를 메탄올:아세트산(95:5 vol:vol)으로 고정시킨 뒤, 항-pStat3 모노클로날 항체(1:1000 희석율: Cell Signalling)로 4℃에서 1시간 동안 처리했다. 그 다음, 세포를 세척하고 형광현미경으로 조사했다.

10. 통계 분석

모든 분석값은 평균±SEM으로 나타냈다. 그래프의 모든 데이터는 적어도 3회의 독립적 실험의 평균값이며, 단 도 30은 2회 반복한 값의 평균값이다. 차이의 유의성 검사는 경우에 따라 ANOVA 또는 스튜던트 t 검정으로 실시했다. 유의성은 p<0.05로 측정되었다,

결과

1. PAC1 SMC 특성분석

PAC1 세포는 랫트 폐동맥 평활근 세포(SMC)로부터 분리하고, 다수의 2차배양물을 통해 분화된 성질의 안정적인 유지에 기초하여 선별했다(Rothman et al., 1986; Firulli et al., 1998). 본 연구에 사용한 세포는 클론 분리물로부터 수배로 계대배양했다(70 내지 85회 계대한 세포를 사용했다). PAC1은 다양한 SMC 특이성 마커를 발현하고 각종 생리적 자극에 대해 기능성 반응을 나타내기 때문에 SMC 분화의 양호한 모델로서 사용된다는 연구 보고가 있었다(표 5 참조)(Firulli et al., 1998; Rothman et al., 1994). PAC1 세포는 정상 랫트의 대동맥 평활근 세포(RASMC)에 대해 SMC 마커의 유사한 보체를 발현하는 반면, 이러한 마커들은 L6 골격 근육모세포 EH는 정상인의 제대혈 내피(HUVEC)에서는 일반적으로 발현되지 않는다(표 5 참조).

먼저, PAC1 SMC에 아데노바이러스의 형질도입 효율을 평가했다. 도 30에 제시된 바와 같이, MOI 50 pfu/세포의 Ad-RSV-β-gal로 형질도입된 PAC1 SMC는 약 60%의 β-gal 양성 세포를 생산했다(도 30). PAC1 세포의 SMC 표현형을 확인하기 위하여, β-갈락토시다제의 발현을 유도하는 평활근 특이 프로모터(SM22α)를 함유한 벡터인 Ad-SM22-β-gal로 상기 세포를 형질도입시켰다(Kim et al., 1997). 이러한 PAC1 세포를 형질도입 효율이 높은 폐암 세포주와 비교했다. 대조 벡터로서 Ad-RSV-β-gal을 사용하여 H1299 NSCLC 세포를 PAC1 세포와 유사한 효율로 형질도입시켰다. 하지만, PAC1 세포는 Ad-SM22-β-gal로 처리 후 H1299 세포보다 10배 이상 효율적으로 형질도입되었다(도 30). 이에 반해, 다른 종양 세포에서는 β-gal 발현이 낮게 관찰되었으며, 이는 PAC1 세포의 SMC 계통성을 입증했다. PAC1 세포의 효율적인 형질도입성은 아데노바이러스 형질도입과 관련 있는 세포 표면 분자의 분석을 통해 추가로 평가했다. PAC1 세포는 FACS 측정 시, 세포 표면 상에 고농도의 CAR 및 알파 v 인테그린을 발현함을 확인했다.

2. Ad-mda7이 형질도입된 PAC1 SMC 중에서의 사람 MDA-7 발현

완전배지에서 성장한 PAC1에서는 내인성 mda-7 mRNA가 검출되지 않았다. 하지만, Ad-mda7로 형질도입된 PAC1에서는 mda-7 mRNA 및 MDA-7 단백질이 확인되었고, 대조군 바이러스로 처리된 세포에서는 mda-7 mRNA 또는 단백질이 검출되지 않았다. MDA-7 단백질은 조정 배지에서 검출되었는데, 이는 Ad-mda7 형질도입된 PAC1이 가용성 MDA-7 단백질을 분비한다는 것을 암시한다. 이러한 발견은 Ad-mda7로 형질도입된 사람 종양 세포주에서 실험된 종래 연구(Mhashilkar et al., 2001) 결과와 일치하는 것이었다. 사람 종양 세포를 이용한 종래 연구(Mhashilkar et al., 2001)와 일치하는 것으로서, MDA-7은 PAC1 세포에서 세포내 형태보다 큰 단백질로서 분비되었고, 이는 약간의 해독후 변형(예를 들면, 글리코실화)이 있었음을 시사한다. 분비된 MDA-7 단백질 농도 분석은 3일 동안에 걸친 100pfu/세포(MOI)의 Ad-mda7 형질도입 후 PAC1 세포로부터 일시적인 단백질 분비 증가를 보여주었다. 또한, 증가되는 Ad-mda7 MOI에 의해 형질도입된 PAC1 세포 유래의 세포 용해물 및 조정 배지에서도 MDA-7 단백질의 용량의존적 증가가 관찰되었다. 이러한 연구 결과들로부터, PAC1 SMC에서 MDA-7 발현을 다량 증가시키는 것이 가능함을 확인할 수 있었다.

3. 이소성 MDA-7 발현은 PAC1 SMC 성장을 억제한다.

다음으로, mda-7의 강제 발현이 PAC1 세포 성장에 억제 효과를 미치는지의 여부를 조사했다. PAC1 SMC를 0, 40, 100 및 200 MOI의 Ad-mda7 또는 Ad-Luc로 형질도입시키고, 형질도입 후 3일째 생육 세포를 계수했다. 대표적인 1가지 연구 결과를 도 31에 제시했다. Ad-mda7로 형질도입된 PAC1 SMC는 Ad-Luc 형질도입된 세포와 비교했을 때 생육 세포 수의 유의적인 감소를 나타냈다. PAC1 세포 성장의 mda-7 발현의 최대 억제 효과는 100 MOI에서 관찰되었고(Ad-Luc와 비교했을 때 p=0.02); 이보다 높은 MOI에서 Ad-Luc는 독성을 나타냈다. 따라서, 이후의 모든 연구에서는 MOI 100의 Ad-mda7을 사용했다.

4. MDA-7 발현은 PAC1 SMC 아폽토시스를 증가시킨다.

Ad-mda7은 유방, 결장 및 폐에서 유래되는 다양한 사람 종양 세포주에서 아폽토시스를 유도한다는 종래의 연구 결과가 보고된 바 있다(Mhashilkar et al., 2001; Saeki et al., 2002). MDA-7에 의한 PAC1 세포 성장의 억제는 부분적으로 아폽토시스의 증가 때문일 가능성이 있다. 초기 연구에서는 포유동물 세포의 아폽토시스에 중심 효과기 역할을 하는 카스파타제-3(시스테인 아스파르트산 특이 프로테아제(카스파제)계의 일원)의 활성을 측정했다(Nicholson et al., 1995). Ad-mda7 처리된 PAC1 세포에서는 미처리 또는 Ad-Luc 처리된 세포에서보다 유의적인 카스파타제 3 활성의 증가가 관찰되었다(Ad-Luc와 비교했을 때 p<0.05)(도 32A). 카스파제 3 활성은 카스파제-3 억제제(Ac-DEVD-CHO)에 의해 특이적으로 억제되었다. 이러한 발현은 mda-7의 과발현이 카스파제 3을 활성화시키고 PAC1 세포에서 아폽토시스를 촉진시킨다는 것을 암시한다.

PAC1 SMC에서 MDA-7 발현의 아폽토시스 효과를 정량분석하기 위하여, 본 발명자들은 이어서 초기 아폽토시스의 척도로서 FACS 분석과 함께 아넥신 V 염색을 이용하여 세포 표면 상에 존재하는 인지질, 포스파티딜세린(PS)을 조사했다. 대조군인 Ad-Luc 형질도입된 세포와 비교했을 때, Ad-mda7 처리는 형질도입 후 24시간이 경과한 정도의 초기에는 아폽토시스 PAC1 SMC 수의 유의적 증가(p<0.05)를 초래했다(도 32b). 그 다음, DAPI 염색 분석법을 실시하여 핵 응집 및 붕괴의 분석을 통해 후기 아폽토시스에 Ad-mda7이 미치는 영향을 정량분석했다. Ad-mda7 형질도입은 대조용 바이러스와 비교했을 때 각 시점마다 아폽토시스 세포 수의 유의적 증가(<0.05)를 나타냈다(도 32C). 또 다른 아폽토시스의 척도로서, 본 발명자들은 Ad-mda7 처리된 세포가 세포 주기의 서브-G0/G1기의 세포 수를 크게 증가시킨다는 것을 확인했다. 이러한 발견들을 종합해보면, 아폽토시스 증가가 Ad-mda7에 의한 PAC1 SMC 성장의 억제에 기여할 수 있음을 암시한다.

종래의 연구에서는, BAX, BAK의 농도 및 BAX 대 BCL-2 단백질의 비의 변화가 mda-7에 의한 암세포의 아폽토시스 유도에 중요한 매개인자일 수 있음이 밝혀진 바 있다(Lebedeva et al., 2002; Su et al., 1998; Madireddi et al., 2000). 이러한 아폽토시스 관련 분자가 PAC1 세포 중에서 이소성 mda-7에 의해 매개되는 계획 세포사에 기여하는지의 여부를 결정하기 위하여, Ad-mda7로 형질도입 후 6 내지 72시간째에 웨스턴 블롯팅을 통해 다양한 단백질의 농도를 측정했다. 그 결과, 100 MOI의 Ad-mda7로 형질도입 후 72시간째 PAC1 SMC 세포에서는 아폽토시스-촉진성 단백질(BAK, BAX)의 상향조절이 관찰되었고, 이 중 BAK 단백질은 초기인 24시간 째에도 증가된 것으로 나타났다. 72시간 Ad-Luc 처리 후에는 단백질 농도의 변화가 일어나지 않았다. 이와 달리, 100MOI의 Ad-mda7로 형질도입 후 72시간째 PAC1 세포에서는 아폽토시스-촉진성 단백질(BCL-2)의 발현이 감소되었고, BCL-xL 단백질은 소량만이 변화되었다. 이러한 결과는, Ad-mda7의 형질도입 후 산출되는 아폽토시스-촉진성 단백질(BAK, BAX) 대 아폽토시스-촉진성 단백질(BCL-2, BCL-xL) 농도 비의 증가가 PAC1 세포의 후기 아폽토시스를 촉발시킬 수 있음을 암시한다. 특히, Ad-mda7 처리 24시간 이내에 아폽토시스(도 32B 및 도 32C)가 BAK 농도(BAX는 아니다)의 증가와 함께 검출가능하다는 점은 주목할만하다. 즉, BAK 아폽토시스-촉진성 단백질은 PAC1 세포의 아폽토시스 개시인자일 수 있다.

5. MDA-7은 PAC1 SMC 이동을 억제한다.

세포 이동은 혈관 병리 중 신생혈관내막의 발생에 또 다른 중심 과정이다. mda-7 발현이 PAC1 SMC 이동을 변화시키는지의 여부를 조사하깅 위하여, 아데노바이러스 형질도입된 PAC1 SMC 또는 미처리 PAC1 SMC의 이동을 단층의 긁음 손상 후 측정했다. 혈청에 의한 자극은 손상부 중으로 PAC1의 이동을 유의적으로 증가시켰다. 이에 반해, mda-7 과발현은 100 MOI의 기본 PAC1 세포 이동(p<0.05) 및 FBS 자극된 PAC1 세포 이동(p<0.01)을 모두 유의적으로 억제했다(도 33). 즉, mda-7은 혈청 자극의 부재 시에도 이동을 차단할 수 있다.

6. Ad-mda7은 정상 SMC 세포의 성장을 억제하지 않는다.

원발성 사람 심장 동맥 SMC(HCASMC; 계대 5 내지 10회) 및 정상 랫트 대동맥 SMC(RASCM; 계대 10 내지 20회)을 다양한 MOI의 Ad-mda7 또는 Ad-luc로 형질도입시켰다. 웨스턴 블롯 분석 결과, MDA-7 단백질이 세포내 생산되고, 일반형 SMC 모두에서 PAC1 SMC와 비슷한 농도의 분비가 관찰되었다. MDA-7은 정상 SMC에서 또는 Ad-Luc 처리 후에는 내인적으로 발현되지 않았다. 100 MOI의 Ad-mda7 형질도입 후 PAC1 세포에서와 같이 HCASMC 및 RASMC에서도 유사한 농도의 MDA-7 단백질이 발현되었다. 하지만, HCASMC 또는 RASMC의 Ad-mda7 처리 후, 세포 생존성을 조사한 결과 세포 생존성의 상실은 관찰되지 않았다. 이와 유사한 결과가, 아폽토시스 유도에 대한 독립된 분석법인 세포 주기 분석에서도 관찰되었다(표 6). PCA1 SMC만이 100 MOI의 Ad-mda7로 24시간 동안 처리된 후 서브-G0/G1 세포의 증가를 보였다. 즉, 랫트 PAC1 SMC에서 관찰되는 세포 성장의 억제 및 아폽토시스 유도는 정상 랫트 SMC 또는 원발성 사람 SMC에서는 관찰되지 않았다.

PCA1 세포 대 정상 랫트 및 사람 SMC에서의 mda-7 과발현의 활성 차이를 연구하고 해명하기 위하여, 본 연구에 사용된 PAC1 세포의 염색체 확산을 조사했다. 70 내지 85회 계대배양된 PAC1 세포의 핵형분석에서는 종래 PAC1 또는 RASMC 핵형에 관한 보고(Firulli et al., 1998)와 비교했을 때 분염법(chromosome banding)의 근본적인 차이가 확인되었다. 구체적으로, PAC1 세포는 20 세염색체, p 아암(arm)을 확대시키는 염색체 11에서의 전좌 및 다른 미지 기원의 추가 마커 염색체를 나타내었다. 즉, MDA-7 매개의 세포사에 민감한 PAC1 세포 종에는 상당한 염색체 이상이 존재한다.

7. MDA-7은 세포내 경로를 통해 세포사에 작용한다.

PAC1 SMC에서 Ad-mda7에 의한 선택적인 사망이 표면 수용체 매개 과정에 기인하는 것인지 또는 일부 세포내 경로를 통해 일어나는 것인지의 여부를 조사하기 위하여, 세포사 및 STAT-3 활성화(MDA-7/IL-24 수용체 활성화의 척도)를, 재조합 MDA-7(rMDA-7)로 PAC1 SMC 및 RASMC를 자극한 후 측정했다. rMDA-7로 자극된 PAC1 SMC에서는 세포사의 통계적으로 유의적인 증가는 관찰되지 않았다. 이러한 관찰과 일치하게, 이들 세포에서 STAT-3 활성화의 어떤 증거도 확인하지 못했다. 이러한 결과는 Ad-mda7이 세포내 기구를 통해 PAC1 SMC에서 선택적 세포사를 매개한다는 것을 암시한다.

실시예 23: Ad-mda7 투여 및 발현에 관한 임상 시험 결과 및 정보

재료 및 방법

1. 환자 기준

주사 바늘이 접근용이하고, 그 다음 수술로 절제할 수 있는 병변부가 1개 이상인 조직학적으로 확인된 암종 환자(1기 환자). 카노프스키 수행 점수가 70% 초과이고, 혈액, 신장 및 간 기능이 허용되는 수준인 환자. 단, 활성 CNS 전이 환자, 만성 면역억제제 사용 환자 또는 아데노바이러스의 투여를 요하는 치료에 참여한 경험이 있는 환자는 제외시켰다.

2. 정량적 PCR, RT-PCR

TaqMan™을 기본으로 한 분석법을 사용하여 샘플을 검사했다. 이 분석법은 CMV 프로모터의 3' 영역과 mda-7 유전자의 5' 영역 사이에 위치한 109nt 앰플리콘을 검출한다. 이 분석법은 DNA 및 RNA 측면에서 INGN 241(본원에 참고원용된 미국 출원 09/615,154, 10/017,472 및 10/278,590에 기술된 바와 같은 Ad-mda7)을 검출하는데 특이적이다.

3. 면역조직화학

INGN 241이 주사된 종양의 일련의 절편을, TUNEL 반응에 의해 확인되는 바와 같은 아폽토시스 활성에 대해 분석했다(Deadend Colorimetric Apotosis Detection System, Promega).

4. MDA-7 단백질

INGN 241 주사된 종양의 여러 절편을 인트로겐 테라페티스 제품인 mda-7 반응성 토끼 항체(Ab 506-71)를 사용하여 자동 IHC로 분석했다.

결과

진행성 암종 환자에게 INGN 241을 종양내 주사로 투여하는, 개방 표지, 단계 I, 단독 투여, 용량 상승식 연구를 수행했다. 그 결과는 INGN 241 벡터의 확산 반경 및 그 결과 종양 물질에 대한 단백질 및 생물학적 효과에 초점을 맞추어 평가했다.

주사지점은 투여 산물에 염료를 첨가하여 참고적으로 표시했다.

또한, 국소 종양 퇴화 및 가능한 효과의 거리를 측정하기 위하여, 최적 용량으로 단계 2 파일로트 실험을 수행했다.

도 34에 도시한 바와 같이, 코호트들에게 상이한 농도 및 시간 코스의 INGN 241을 제공했다. 바이러스 농도는 1회 투여 당 2x10¹⁰, 2x10¹¹ 또는 2x10¹²의 바이러스 입자(vp)였다. 최종 주사하고 24시간 후, 종양을 수거하여 절편화했다. 한 면에는 면역조직화학을 수행하고, 다른 면에는 RT-PCR을 수행하여 RNA 및 DNA 농도를 평가했다. 5cm x 5cm 병변에 2x10¹² vp를 투여한 한 환자에서는 MDA-7 DNA 4.7 x 10⁸ 카피/㎍ 및 MDA-7 RNA 5.6 x 10⁷ 카피/㎍를 함유하는 중심 절편(주사 부위로부터 약 6mm 이내)이 확인되었다. 주사 부위로부터 약 6mm 떨어진 절편에는 MDA-7 DNA 1.2 x 10⁶ 카피/㎍ 및 MDA-7 RNA 4.6 x 10⁷ 카피/㎍가 함유되어 있었다. 주사 부위로부터 약 12mm 떨어진 절편에는 MDA-7 DNA 1.1 x 10⁶ 카피/㎍ 및 MDA-7 RNA 5.0 x 10³ 카피/㎍가 함유되어 있는 한편, 주사 부위로부터 18mm 떨어진 절편에는 MDA-7 DNA 약 1.9 x 10⁵ 카피/㎍ 및 MDA-7 RNA 9.8 x 10³ 카피/㎍가 함유되어 있었다. 주사 부위로부터 약 12mm 떨어진 절편의 면역염색 및 TUNEL 분석에서는 MDA-7 발현이 아폽토시스 구역에서 함께 나타나는 것으로 관찰되었다. 도 35 참조.

다른 흑색종 환자에 대해서는 주사 부위로부터의 이격 거리에 상적인 MDA-7 DNA, RNA 및 단백질의 발현 농도를 평가했다. 도 36 참조. 다수의 환자에 대하여, 발현 농도(도 37) 및 발현 농도와 아폽토시스 사이의 상관성(도 38)을 분석했다.

MDA-7의 확산 및 이것이 아폽토시스에 미치는 영향도 측정하여 평가했다(도 39).

DNA 농도는 경시적으로 주사 후 1일, 2일, 4일 및 30일째 측정했다(도 40). 단백질 발현 및 이것과 아폽토시스의 상관성도 이와 유사한 시간에 측정했다(도 41). MDA-7 단백질 발현의 시간 의존적 증가 및 아폽토시스 세포의 현저한 증가는 주사 지점으로부터의 거리와 깊은 상관성이 있는 것으로 관찰되었다. MDA-7 단백질 및 아폽토시스는 벡터 DNA의 검출 지점 이상에서 측정되었고, 이는 확산성이며 활성의 산물을 암시한다. 96시간 경에, 종양내 INGN 241 DNA 농도가 감소되었고, 30일째 4 log 감소(중간값)가 관찰되었다. 주사 후 30일 경에, MDA-7 단백질 발현 및 아폽토시스 활성은 관찰할 수 없었다.

단계 2 임상 연구에서는, 다양한 종양 종류를 가지고 INGN 241의 단독 투여와 다중 투여(2x10¹²vp/2주, 3회)를 비교분석했다(도 42).

INGN 241의 종양내 반복 투여량은 INGN 241 2x10¹² vp를 6회 종양내 주사한 흑색종 환자(2cm x 2cm 빗장위 덩어리)에서 객관적인 종양 퇴화를 나타내었다.

부작용은 도 41에 제시한 바와 같다. 종합해보면, 본 연구는 INGN241 종양내 주사가 충분히 허용되는 것임을 보여주었다.

실시예 24: MDA-7은 NF-κB를 유도하고; 술린닥은 사람 폐암에서 Ad-mda7 매개의 아폽토시스를 증가시킨다.

재료 및 방법

1. 세포주 및 세포배양

사람 NSCLC 세포주 A549(선암종, p53 야생형) 및 H1299(큰세포 암종, p53 미발현형)를 본 실험에 일부 사용했다. 정상 폐 섬유아세포주 CCD-16은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC; 매릴랜드 록크빌 소재)에서 입수했다. A549 및 H1299 세포는 종래 기술된 바와 같이 적당한 배지에서 유지시켰다(5). CCD-16 세포는 10% 태아 송아지 혈청이 보충된 알파 배지(Gibco-BRL, 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재)에서 배양하고, 가습 5% CO₂ + 95% 대기 중에서 37℃ 하에 유지시켰다.

2. 제제

술린닥, 술린닥 설폰, MG132(프로테오좀 억제제) 및 사이클로헥시미드(단백질 합성 억제제)는 시그마 케미컬 컴패니(미주리 세인트루이스 소재)에서 입수했다. 술린닥은 1M Tris-HCl(pH 8.0)에 용해하여 100mM 스톡 용액으로 제조했다. MG132는 DMSO에 용해하여 10mM 스톡 용액으로 제조했다. 이러한 스톡 용액을 -20℃에서 동결 보관했다.

3. 재조합 아데노바이러스 벡터

Ad-mda7 및 Ad-luc 벡터는 종래 보고된 바와 같이 작제하고 정제했다(Saeki et al., 2000; Mhashilkar et al., 2001). 세포의 형질도입 효율은 GFP를 보유하는 아데노바이러스 벡터(Ad-GFP)로 측정했다. 형질도입 효율은 3000vp/세포로 감염 시에 80%를 넘었다. 이러한 결과를 토대로, 이하 모든 실험에서는 세포를 3000vp/세포로 처리했다.

아데노바이러스 형질도입에 미치는 술린닥의 효과를 측정하기 위하여, 종양 세포 및 정상 세포를 100vp/세포의 Ad-GFP로 감염시키고, 24시간째 FACS로 GFP 발현을 분석했다.

4. 세포증식 분석

총 3가지 세포주(A549, H1299 및 CCD-16)를 60mm 직경의 조직배양 접시에 1x10⁵ 세포/접시의 밀도로 접종하고, 이를 삼중으로 수행했다. 다음 날, 세포를 PBS(대조군), Ad-luc(3000vp/세포; 대조군), Ad-mda7(3000vp/세포; 대조군), 술린닥 또는 PBS+술린닥 혼합물, Ad-luc+술린닥 또는 Ad-mda7+술린닥으로 처리했다. 시험된 술린닥의 농도는 0.125mM, 0.25mM 및 0.5mM을 사용했다. 처리 개시 후 72시간째, 세포를 트립신처리로 수거하고, 세척한 뒤, 종래 기술된 바와 같이 트립판 블루 배제 분석법으로 처리했다(Saeki et al., 2000). 세포 성장은 각 처리군마다 평균 세포수를 계산하여 측정하고, PBS, Ad-luc 또는 Ad-mda7 단독 처리된 총 세포수(100%)의 백분율로 나타내었다.

5. 세포 주기 분포 및 아폽토시스

세포(5x10⁵)를 10cm 직경의 조직배양 접시에 접종하고 PBS, Ad-luc(3000vp/세포), Ad-mda7(3000vp/세포), 술린닥 또는 PBS+술린닥의 혼합물, Ad-luc+술린닥 또는 Ad-mda7+술린닥으로 처리했다. 각 처리군은 삼중으로 검사했다. 사용된 술린닥 농도는 세포증식 분석에서와 동일하게 사용했다. 처리 개시 후 72시간째, 세포를 수거하고, 세척한 뒤, 세포 주기 단계 및 아폽토시스율을 종래 기술된 바와 같이(Saeki et al., 2000) 분석했다. 세포 주기 단계 및 DNA 함량은 FACScan(EPICS XL-MCL; Beckman Coulter, 캘리포니아 풀러톤 소재)을 사용하여 분석했다.

6. 면역형광 분석

세포(1x10⁴)를 2웰 챔버 슬라이드(Fisher Scientific)에 접종하고 PBS, Ad-mda7(3000vp/세포), PBS+술린닥(0.5mM) 또는 Ad-mda7+술린닥(0.5mM)으로 처리했다. 처리 개시 후 48시간째, 세포를 PBS로 세척하고 PBS 완충된 4% 파라포름알데하이드에서 실온하에 30분 동안 고정시켰다. 그 다음, 세포를 0.1% 트리톤 X-100 및 0.1% 구연산나트륨을 이용하여 실온에서 10분 동안 투과성이 되게 한 다음, 정상 염소 혈청과 항온배양했다. 항온배양 개시 30분 후, 세포를 PBS로 세척하고 토끼 폴리클로날 항-사람 MDA7 항체(Introgen Therapeutics Inc., 텍사스 휴스턴 소재)와 37℃에서 1시간 동안 항온배양했다. 그 다음, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 염소 항토끼 FITC 태그화된 2차 항체(Vector Laboratories, 캘리포니아 버링감 소재)와 1시간 동안 항온배양 후, PBS로 3회 세척하고, 커버슬립을 장착한 후 니콘 형광현미경(뉴욕 멜빌 소재)을 사용하여 MDA-7 단백질 발현을 관찰했다. 고배율로 확대하여 현미경사진을 촬영했다.

7. 프로테아좀 활성 분석

프로테아좀 활성 분석은 종래 기술된 바와 같이 수행했다(Choi et al., 2003). 간략히 설명하면, H1299 세포를 6웰 평판(2x10⁵ 세포/웰)에 접종하고 Ad-mda7, Ad-mda7+술린닥, 또는 Ad-mda7+MG132(5μM)로 처리했다. 술린닥 농도는 다른 분석에서와 동일한 농도로 사용했다. 처리 개시 24시간 후, 세포를 프로테아좀 완충액(10mM Tris-HCl, pH 7.5, 1mM EDTA, 20% 글리세롤, 5mM ATP 및 4mM DTT) 중에서 용해시키고, 초음파처리한 뒤, 4℃에서 10분 동안 1300xg로 원심분리했다. 상청액 상층을 수거하고, 세포 용해물의 단백질 농도를 종래 기술된 바와 같이 측정했다(Saeki et al., 2000).

프로테아좀의 키모트립신 유사 활성을 분석하기 위하여, 형광원성 기질 Suc-LLVY-AMC(Chemicon International, Inc., 캘리포니아 테메큘라 소재)를 사용했다. 전술한 각 처리 그룹 유래의 총 단백질 20㎍을 반응 완충액(25mM HEPES, pH 7.5, 0.5mM EDTA, 0.05% NP-40 및 0.001% SDS)에 100㎕ 농도로 희석했다. 각 샘플 마다 형광원성 기질을 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 항온배양했다. 각 샘플 용액의 형광 강도는 형광판 판독기(Dynatech Laboratories, 버지니아 찬틸리 소재)로 360nm 여기 파장과 460nm 방출 파장에서 측정했다. 모든 판독값은 동량의 유리 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC) 용액(50μM)의 형광 강도를 사용하여 표준화했다. 그 결과값은 제조업체에서 제공한 내부 양성 대조군 백분율을 초과하는 대조군 백분율로서 나타냈다.

8. 실시간 정량분석용 RT-PCR

6웰 평판(5x10⁵/웰)에 접종한 H1299 세포를 Ad-mda7(3000vp/세포) 또는 Ad-mda7+술린닥(0.125, 0.25 또는 0.5mM)md로 처리했다. 미처리 세포는 본 실험의 대조군으로 사용했다. 처리 개시 36시간 후, 세포를 PBS로 세척하고, 트립신처리한 후, PBS 1.0ml에 재현탁시켰다. 이러한 세포 현탁액을 1.5ml 에펜도르프 관에 담고, 4℃에서 10,000rpm으로 5분 동안 원심분리했다. 상청액을 분리해내고, 세포 펠릿 유래의 총 RNA를 RNA 분리 키트를 제조업체에서 제안한 방식(Ambion Corp., 텍사스 오스틴 소재)대로 추출했다. 분리된 RNA를 그 다음 DNaseI로 처리하여 잔류 DNA를 제거하고, 이어서 분광광도계를 사용하여 260nm 및 280nm 파장에서 정량했다. 각 샘플의 총 RNA(0.1㎍)를, SuperScript RT 키트(Invitrogen, 캘리포니아 칼스배드 소재)를 사용하여 역전사시켰다. mda-7 mRNA의 정량분석으로 실시간 정량분석용 RT-PCR로 수행했다. 간략히 설명하면, 정량분석용 PCR은 총 RNA 1㎕, PCR Supermix(PE Applied BioSystems, 캘리포니아 포스터 시트 소재) 10㎕, 0.2μM의 mda-7 특이 프라이머 및 0.1μM의 형광 프로브를 함유하는 20㎕ 부피에서 수행했다. 그 결과 수득되는 리포터 및 쿠엔처(quencher) 형광 염료 방출량의 상대적 증가를, 7700 서열 검출기(PE Applied BioSystems)를 사용하여 PCR 증폭 동안에 실시간으로 모니터했다. 2단계 PCR 사이클은 다음과 같이 실시했다: 50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 그 다음 95℃, 15분 및 60℃, 1분을 40회 반복. 사람 GAPDH 하우스키핑 유전자는 증폭 반응의 내부 대조군으로 사용하고, 프라이머는 공급업체(PE Applied Biosystems)에서 공급받았다.

전술한 분석에서 사용한 올리고뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다:

MDA-7 5'-프라이머, CCCGTAATAAGCTTGGTACCG; 및

MDA-7 3'-프라이머, TAAATTGGCGAAAGCAGCTC;

프로브, FAM-TGGAATTCGGCTTACAAGACATGACTGTG-TAMRA.

모든 반응은 삼중으로 수행했다. 사이클링 후, 반응을 종료시키고, 표준 곡선, 각 샘플의 한계 사이클링(Ct) 값 및 이에 상응하는 출발 함량(표준 곡선 기준)을 7700 서열 검출기 시스템 소프트웨어(PE Applied Biosystems)를 사용하여 측정했다. 각 처리 그룹 간의 mda-7 mRNA 발현의 차이는 GAPDH 값의 변화로 나타내었다.

9. 반감기 분석

H1299 세포는 60mm 직경의 조직배양 접시에서 2x10⁵ 세포 밀도로 접종했다. 다음 날, 세포를 Ad-mda7(3000vp/세포)로 감염시켰다. 감염 후 48시간째, 술린닥(1mM)을 첨가하거나 첨가함이 없이 항온배양을 지속했다. 2시간 후, 단백질 합성 억제제 사이클로헥시미드(10㎍/ml)를 세포에 첨가하고, 항온배양을 계속했다. 사이클로헥시미드 처리 후 0, 3, 6, 9, 11 및 13시간째 세포를 수거했다. 그 다음, 세포 용해물을 제조하고, 종래 기술된 바와 같이 웨스턴 블롯 분석으로 MDA-7 단백질 발현을 분석했다(Saeki et al., 2000; Mhashilkar et al., 2001).

10. 웨스턴 블롯 분석

PBS, Ad-mda7, Ad-luc, 술린닥, 술린닥 설폰 또는 Ad-luc 또는 Ad-mda7과 술린닥 또는 술린닥 설폰과의 혼합물로 처리한 세포에 대하여, 종래 기술된 바와 같이 웨스턴 블롯 분석을 수행했다(Saeki et al., Mhashilkar et al., 2001). 검출을 위해 다음과 같은 1차 항체를 사용했다: 카스파제-3 및 PARP(BD Pharmingen, 캘리포니아 산디에고 소재), PKR, BAX, BAK, BCL-2, BCL-XL, COX-2 및 Ub(Santa Cruz Biotechnologies, 캘리포니아 산타크루즈 소재); β-액틴(Sigma); 및 MDA-7(Introgen Therapeutics). 이 단백질들은 적당한 양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 2차 항체를 사용하여 검출하고, 아머샴의 개량 화학발광성 웨스턴 블롯팅 검출 시스템을 이용하여 개량 화학발광 필름(Hyperfilm; Amersham) 상에 가시화했다.

11. 생체내 분석

술린닥이 생체내에서 이종이식 종양의 Ad-mda7 매개 종양 성장 억제를 증가시키는지의 여부를 조사하기 위하여, H1299 폐 종양 세포(5 x 10⁶)를 무흉선 BALB/c 암컷 누드 마우스(n=40)의 우측 옆구리 하부로 피하 주사했다. 종양이 50 내지 100㎣에 도달하면, 동물을 그룹별로 나누어 처리했다: PBS(n=8), 술린닥(n=8), Ad-mda7(n=8), Ad-luc + 술린닥(n=8) 또는 Ad-mda7+술린닥(n=8). 이 마우스들에게 Ad-luc 또는 Ad-mda7(3x10⁹ vp/투여량)는 주당 3회 처리했다. 술린닥 처리 마우스에게는, 40mg/kg을 매일 복강내 투여했다. 이 동물들은 주당 1회씩 검량하여 체중을 측정했다. 종양 성장은 모니터하면서, 1주에 3회씩 종래 기술된 바와 같이 측정했다(Saeki et al., 2002; Ramesh et al., 2003). 처리 개시 22일 내지 25일 후, 동물을 모두 CO₂ 흡입으로 죽이고, 종양을 분리하여 조직병리학적 검사 및 웨스턴 블롯 분석했다. 실험은 별도로 2회 실시하여 재현성과 통계적 유의성을 확인했다.

12. 통계 분석

스튜던트 t 검정 및 ANOVA를 사용하여 실험 결과의 통계적 유의성을 계산했따. P<0.05의 값은 통계적 유의성이 있는 것으로 간주했다.

결과

1. MDA-7은 NF-κB를 유도한다.

본 연구에서는, 아데노바이러스 매개 mda-7(Ad-mda7) 유전자의 2종의 NSCLC 세포주(H1299 및 A549)로의 전달이 NF-κB를 활성화시킴을 확인했다(전기이동성 변위 분석(EMSA)으로 측정됨). NF-κB의 현저한 활성화는 Ad-mda7로 처리된 세포에서 20 내지 48시간 사이에 관찰된 반면, PBS로 처리된 대조군 세포 또는 Ad-루시페라제로 처리된 세포에서는 관찰되지 않았다. 또한, NF-κB의 활성화는 용량 의존적 방식으로 나타나서, Ad-mda7 농도의 증가는 NF-κB 활성화의 증가를 나타냈다.

NF-κB 활성화와 동시에, NF-κB 억제제인 I-κBα의 분해가 관찰되었다. Ad-mda7 유도성 NF-κB는 p50 및 p65 서브유닛으로 구성된 것으로 확인되었다. 또한, Ad-mda7은 NF-κB(p65) 핵 전위를 유도하고, NF-κB의 DNA 결합 활성을 용량 의존적 방식으로 증가시키는 것으로 관찰되었다(A549 세포 감염 후 36시간 및 48시간째, 그리고 H1299 세포 감염 후 42시간 및 48시간째 수행한 EMSA에 따라).

또한, Ad-mda7은 NF-κB 의존적 리포터 유전자 발현을 활성화시키는 것으로 관찰되었다(도 46). 또한, 우세한 음성 I-κBα 세포에 대해 세포독성 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다(도 47). Ad-mda7은 우세한 음성 I-κBα 세포에서 세포 성장을 현저하게 억제시켰다(도 48). 또한, H1299 세포를, 우세한 음성 I-κB를 과발현하는 아데노바이러스 벡터(Ad-mIκB)로 형질감염시킨 결과, Ad-mda7에 의해 유도된 NF-κB 의 전사 및 DNA 결합 활성이 크게 억제되어, Ad-luc로 처리한 대조군 세포와 비교했을 때 종양 세포 아폽토시스를 증가시키는 것으로 확인되었다.

술린닥은 EMDA로 측정되듯이, 용량 의존적 방식으로 NF-κB 활성화를 억제하는 것으로 관찰되었다. 또한, 비스테로이드성 항염증 약물인 술린닥에 의한, MDA-7 매개 NF-κB 활성화의 억제는 상승적 치료 효과를 나타냈다(도 49A). 이러한 결과는 폐 암세포에서의 MDA-7 발현이 NF-κB를 유도하는 바, 이를 Ad-mIκB 또는 술린닥을 이용하여 억제함으로써 치료 효과를 증가시킬 수 있음을 시사한다.

2. 술린닥은 폐암세포에서 Ad-mda7 매개의 성장 억제를 증가시킨다.

종래 연구에서 술린닥이 암세포에 세포독성 효과를 나타내는 것으로 보고된 바 있어서(Sanchez-Alcazar et al., 2003), 예비 실험을 통해 NSCLC(A549 및 H1299) 세포 및 정상(CCD-16) 세포에 대한 술린닥의 최소 세포독성 용량을 측정했다. 이러한 세포들에 술린닥을 다양한 농도(0.062, 0.12, 0.25, 0.5, 1 및 2mM)로 처리한 결과, A549, H1299 및 CCD-16 세포에서 각각 IC₅₀ 0.58, 0.61 및 0.94mM의 성장 억제가 확인되었다. 이보다 높은 용량(1mM 및 2mM)에서는 종양 세포 및 정상 세포에서 세포 증식이 억제되어 아폽토시스가 나타났다(데이터 제시 안됨). 하지만, 종양 세포 증식의 억제효과(>90%)가 정상세포(60%)에서보다 훨씬 높았다. 이러한 결과에 기초하여, 이후의 실험에서는 술린닥을 0.5mM 미만의 농도로 사용했다.

Ad-mda7과 함께 술린닥이 세포 증식을 억제하고 아폽토시스를 유도하는지의 여부를 조사하기 위하여, A549, H1299 및 CCD-16을 PBS, Ad-luc 및 Ad-mda7의 단독물 및 술린닥(각각 0.125, 0.25 또는 0.5mM)과의 조합물로 처리했다. 처리 후 72시간째 세포를 분석한 결과, 술린닥과 Ad-mda7의 조합물이 Ad-mda7 또는 술린닥 단독물로 처리된 세포에 비해 종양 세포 증식이 현저히 억제됨을 알 수 있었다(P=0.001; 도 49B). 이러한 조합 치료에 의한 성장 억제 효과는 다른 처리 그룹과 비교해도 현저한 것이었고, 술린닥의 용량에 의존적인 결과를 보였다. 이에 반해, 정상 섬유아세포에서는 Ad-mda7과 시험된 임의의 농도의 술린닥으로 처리 시에도 다른 처리 그룹에 비해 현저한 성장 억제 효과를 나타내지 않았다. 이러한 결과는 술린닥이 정상 세포가 아닌 종양 세포에서 Ad-mda7 매개의 억제 활성을 선택적으로 증가시킨다는 것을 시사한다.

Ad-mda7 및 술린닥으로의 처리가 아폽토시스를 유도하는지의 여부를 추가로 평가하기 위하여, 종양 세포 및 정상 세포를 처리 72시간 후 FACS 분석을 통해 아폽토시스 변화에 대해 분석했다. 분석 결과, 아폽토시스 변화의 지표인 서브-G0/G1기의 세포 수가, Ad-mda7 단독 또는 술린닥과의 조합으로 처리한 종양 세포(H1299 및 A549)에서, 동일하게 처리된 정상 세포에서보다 훨씬 많은 것으로 확인되었다(P=0.001)(도 49C). 또한, Ad-mda7 + 술린닥으로 처리된 종양 세포 중의 아폽토시스 세포 수는 Ad-mda7 단독으로 처리된 종양 세포 중의 아폽토시스 세포 수(P<0.01)보다 훨씬 컸고, 술린닥의 용량에 의존적이었다. Ad-luc 단독 또는 술린닥과의 조합으로 처리된 세포 중의 아폽토시스 세포 수는 PBS 처리 세포 중의 아폽토시스 세포 수보다 크게 높지 않았다. 하지만, A549 종양 세포 중에서는 Ad-luc 처리와 조합되었을 때 PBS 처리 세포에 비해 최고 술린닥 농도(0.5mM)에서 아폽토시스 세포 수의 현저한 증가(P=0.01)가 관찰되었다. Ad-mda7 또는 Ad-mda7과 술린닥으로의 CCD-16 세포의 처리는 술린닥 최고 농도(0.5mM)에서도 대조군 세포에 비해 아폽토시스 세포 수의 유의적 차이를 나타내지 않았다(도 49C). 이와 유사한 성장 억제 효과의 증가는 폐암세포를 술린닥 설폰과 함께 Ad-mda7로 처리했을 때에도 관찰되었다. 이러한 결과는 Ad-mda7과 술린닥 또는 술린닥 설폰에 의한 처리가 정상 세포가 아닌 폐 종양 세포에만 선택적으로 아폽토시스를 유발한다는 것을 보여준다. 또한, Ad-mda7 및 술린닥에 의한 성장 억제 효과는 p53 무효 종양 세포주 및 p53 야생형 종양 세포주에서 모두 나타나는 경향이 있는 바, p53 상태와 무관한 것으로 보인다.

3. 술린닥은 Ad-mda7 형질도입을 증가시키지 않는다.

아데노바이러스 형질도입 효율을 증가시키는 치료제의 활성은 아직 보고된 바가 없다(Lin et al., 2003). 이러한 보고에 기초하여, 술린닥이 아데노바이러스 형질도입을 증가시키는지의 여부를 결정했다. 이를 위해, 종양 세포 및 정상 세포를 100vp/세포의 Ad-GFP로 감염시키고, 다양한 농도의 술린닥으로 처리했다(표 7). 세포는 낮은 바이러스 입자 수에서도 Ad-GFP가 형질도입되었고, 높은 vp에서는 세포의 80% 이상이 형질도입되어, 형질도입에 미치는 술린닥의 효과를 측정하기가 곤란했다. 처리 24시간 후, 세포를 유세포측정법으로 분석했다. Ad-GFP+술린닥으로 처리된 세포와 Ad-GFP 단독으로 처리된 세포 사이에 형질도입 효율의 유의적 차이가 관찰되지 않았다(표 7). 하지만, 0.5mM 술린닥으로 처리된 A549 세포는 이보다 낮은 농도의 술린닥으로 처리된 다른 그룹에 비해 형질도입 효율의 증가를 보였다(P=0.001).

표 7. Ad-GFP 및 술린닥으로 처리된 폐암 세포(A549 및 H1299) 및 정상 세포(CCD-16)에서의 형질도입 효율.

세포를 Ad-GFP(100vp/세포)로 3시간 처리하고, 이하 표시된 농도의 술린닥으로 24시간 처리했다. 형질도입 효율의 백분율은 유세포측정기로 측정했다.

4. 술린닥은 외인성 MDA-7 발현을 증가시킨다.

술린닥이 폐암세포에서 Ad-mda7 매개의 성장 억제 및 아폽토시스를 증가시키는 기작을 확인하기 위하여, 돌연변이유전자 MDA-7 단백질의 발현을 웨스턴 블롯팅으로 조사했다. 총 3종의 세포주(H1299, A549 및 CCD-16)를 Ad-mda7/술린닥으로 36시간 동안 처리한 뒤 MDA-7 발현을 분석했다. Ad-mda7 처리된 A549 및 H1299 세포에서, 술린닥은 돌연변이유전자 MDA-7의 정지기 농도를 용량 의존적 방식으로 현저하게 증가시켰으며, 이에 반해 PBS 또는 술린닥 단독 처리된 세포에서는 내인성 MDA-7 발현이 검출되지 않았다. 더욱이, 돌연변이 단백질 발현을 증가시키는 술린닥의 활성은 MDA-7에만 제한되지 않고, Ad-GFP 및 Ad-p53으로 처리된 종양 세포에서 각각 돌연변이 GFP 및 p53 단백질의 정지기 농도를 증가시켰다. 이에 반해, Ad-mda7로 처리된 정상 CCD-16 세포에서, 술린닥은 외인성 MDA-7 단백질 발현을 약간만 증가시켰다. 외인성 GFP 또는 p53 단백질에 미치는 술린닥의 효과는 정상 세포에서는 검사하지 않았다.

MDA-7 단백질의 아세포(subcellular) 위치를 조사하기 위해, 면역형광 검사를 수행했다. 웨스턴 블롯 데이터와 마찬가지로, MDA-7 발현은 Ad-mda7/술린닥으로 처리된 세포에서, Ad-mda7 단독으로 처리된 세포에 비해 현저한 증가를 보였다. 또한, MDA-7의 아세포 위치는 술린닥 처리에 의해 변화되지 않았다. MDA-7 발현은 PBS 처리 세포 또는 술린닥 단독 처리 세포에서는 검출되지 않았다. 이러한 결과는, 술린닥이 용량 의존적 방식으로 돌연변이 MDA-7 발현을 증가시키며, 이러한 증가가 아폽토시스 활성 증가에 기여한다는 것을 암시한다.

외인성 단백질의 발현을 증가시키는 특성이 술린닥에만 의한 것인지를 조사하기 위하여, 술린닥 설폰을 이용해서도 실험을 수행했다. H1299 세포를 Ad-mda7 및 술린닥 설폰으로 처리한 결과, Ad-mda7 단독으로 처리된 세포에 비해 외인성 MDA-7 발현의 증가가 관찰되었다. MDA-7 발현은 PBS 또는 술린닥 설폰으로 처리된 세포에서는 검출되지 않았다. 이러한 결과는 술린닥 및 이의 대사산물의 외인성 단백질 발현을 증가시키는 특성을 확인시켜준다.

5. 술린닥은 Ad-mda7 매개의 아폽토시스 시그날전달을 증가시킨다.

폐 암세포에서 Ad-mda7 매개의 아폽토시스 유도가 카스파제-9, 카스파제-3 및 PARP의 절단을 비롯한 카스파제 캐스캐이드의 활성화와 관련이 있다는 연구는 종래 보고된 바 있다(Saeki et al., 2000; Mhashilkar et al., 2001). Ad-mda7 및 술린닥으로의 처리가 카스파제 캐스캐이드에 영향을 미치는지의 여부를 조사하기 위하여, 종양 세포와 정상 세포를 상기 분자 마커에 대해 분석했다. Ad-mda7 단독 또는 술린닥과의 조합으로 처리된 종양(A549 및 H1299) 세포는 카스파제 캐스캐이드 활성화의 지표인 카스파제-9, 카스파제-3 및 PARP의 절단을 보였다. 절단된 카스파제-9, 카스파제-3 및 PARP의 발현은 술린닥 농도 및 MDA-7 발현의 농도에 상응했다. 또한, 카스파제-9, 카스파제-3 및 PARP의 활성화는 Ad-luc 및 최고 농도의 술린닥(0.5mM)으로 처리된 A549 세포(H1299 세포는 아니다)에서 관찰되었으며, 이와 일치하는 결과로서 이 세포들에서의 아폽토시스율의 증가가 FACS 분석을 통해 관찰되었다(도 49C). 하지만, 이 때의 활성화 수준은 Ad-mda7 단독 또는 Ad-mda7/술린닥으로 처리된 A549 세포에서보다 훨씬 낮았다. 카스파제 캐스캐이드는 처리되지 않거나 또는 술린닥으로만 처리된 A549 또는 H1299 세포에서는 활성화되지 않았다. CCD-16 세포에서는, 술린닥 단독, Ad-luc 단독 또는 Ad-luc + 술린닥으로 처리되거나 처리되지 않은 세포와 비교했을 때 Ad-mda7 단독 또는 술린닥과의 조합으로 처리된 세포에서도 활성화되지 않았다. 이러한 결과는 술린닥이 정상 세포가 아닌 종양 세포에서만 선택적으로 카스파제 캐스캐이드 활성화를 증가시킨다는 것을 보여준다.

이어서, Ad-mda7 및 술린닥 처리에 의해 조절되는 카스파제 캐스캐이드 상류의 또 다른 주효 분자의 발현에 대해 조사했다. 종래 연구에서는 PKR, p38MARPK 및 pJNK가 폐암세포에서 Ad-mda-7 유도성 아폽토시스에 중요한 역할을 하는 것으로 입증되어 있다(Pataer et al., 2002; Kawabe et al., 2002; Sarkar et al., 2002). 이와 유사하게, Bcl-2 계통 단백질(Bax, Bak, Bcl-2 및 Bcl-X_L)의 조절이 술린닥 유도성 아폽토시스에 중요하고 p53 상태에 무관하다는 보고도 제시되어 있다(Yang et al., 2003; McEntee et al., 1999). 이러한 보고에 근거하여, PKR, pJNK, pp38MAPK 및 여러 Bcl-2 계통 구성원들의 발현을 Ad-mda7 및 술린닥 처리된 H1299 세포에서 조사했다. PKR, pJNK 및 pp38MAPK의 발현은 미처리, 술린닥 처리 및 Ad-luc 처리 세포와 비교했을 때 Ad-mda7 단독 또는 술린닥과의 조합으로 처리된 세포에서 증가된다는 것을 확인했다. PKR은 또한 미처리, 술린닥 처리 및 Ad-luc 처리 세포와 비교했을 때 Ad-luc+술린닥 처리 세포에서도 약간 증가되었다. 하지만, Ad-luc+술린닥으로 처리된 세포에서의 PKR 농도는 Ad-mda7+술린닥으로 처리된 세포에서의 농도보다 훨씬 적었다. 즉, PKR, pJNK 및 pp38MAPK의 증가는 술린닥에 의해 유도된 MDA-7 발현 농도와 관련이 있다. 또한, 아폽토시스의 2가지 유도인자인 Bax 또는 Bak, 또는 아폽토시스 억제인자인 Bcl-X_L의 발현 농도의 변화는 어떤 처리 그룹에서도 관찰되지 않았다. Bcl-2의 발현 농도는 Ad-mda7 및 0.5mM 술린닥으로 처리된 세포에서만 약간 감소되었다. 이러한 결과는 Ad-mda+술린닥을 이용한 아폽토시스 유도가 주로 이소성 MDA-7 발현을 증가시키는 술린닥의 특성에 기인할 것이라는 생각을 지지해준다.

다음으로, Ad-mda7+술린닥 처리에 의한 종양 세포 사망의 증가가 COX-2 억제에 기인할 것이라는 가능성을 조사했다. Ad-mda7 및 Ad-mda7+술린닥으로 처리된 세포에서는 COX-2 발현의 증가가 관찰되었다. 하지만, 두 처리 그룹 간의 COX-2 발현의 차이는 크지 않았다. COX-2 발현은 PBS, 술린닥, Ad-luc 및 Ad-luc+술린닥 처리 세포에서는 관찰되지 않았다.

6. 세포 주기에 미치는 술린닥 및 Ad-mda7 치료 효과

종래 연구에서 입증된 바에 따르면, 술린닥은 G1기에서 세포주기 정지를 유도하고(Piazza et al., 1997), Ad-mda7은 G₂/M기에서 세포주기 정지를 유도한다(Gaeki et al., 2000; Mhashilkar et al., 2001; Ekmekcioglu et al., 2001). 이러한 보고에 기초하여, 세포주기 조절에 미치는 술린닥/Ad-mda7 처리의 복합 효과를 FACS 분석을 통해 조사했다. 먼저, 종양 세포를 처리하지 않거나, 또는 술린닥, Ad-luc, Ad-mda7, 또는 Ad-mda7+술린닥으로 72시간 동안 처리했다. 종래 보고된 바와 같이, Ad-mda7은 Ad-luc 처리와 달리 A549 세포 및 H1299 세포에서 세포 주기 중 G₂/M기의 세포수를 각각 27.2% 및 42.5% 증가시켰다(표 8). 술린닥 단독 처리는 G₁기의 세포수를 증가시켰다. 두 종양 세포주에서는 술린닥을 0.125mM로 처리한 경우보다 0.5mM로 처리했을 때 G₁기 세포수의 현저한 증가를 보였다(A549에서는 64.8% 대 75.6%; H1299 세포에서는 66.4% 대 74.6%). 술린닥과 Ad-mda7의 처리는 Ad-mda7 유도성 G₂/M 기의 정지를 소실시켰다. 이러한 효과는 Ad-mda7과 함께 0.5mM 술린닥 처리된 세포 중에서 더욱 현저하여, G₂/Mrl 세포 수의 감소가 A549 세포에서는 27.2%에서 12.3%로, H1299 세포에서는 42.5%에서 32.4%로 감소했다. 술린닥에 의한 Ad-mda7 유도성 G₂/Mrl 정지의 소실은 또한 처리 후 48시간째에도 관찰되었다. 이러한 결과는 술린닥 및 Ad-mda7이 세포 주기의 다른 단계에 영향을 미치며, 술린닥에 의해 증가된 Ad-mda7 종양 세포 사망이 G₂/M 정지 증가를 통해 일어나지 않음을 확인시켜준다.

7. 술린닥은 외인성 MDA-7 단백질 분해를 지연시킨다.

술린닥이 외인성 MDA-7 단백질을 증가시키는 기작을 조사하기 위해, H1299 세포에서 전사 활성 및 MDA-7 단백질 분해에 미치는 술린닥의 효과를 측정했다. Ad-mda7의 전사 활성에 미치는 술린닥의 효과를 측정하기 위해, 처리되지 않거나 EH는 Ad-mda7 단독 또는 다양한 농도의 술린닥과의 조합으로 처리된 세포로부터 추출한 RNA 샘플을 사용하여 실시간 PCR 정량 분석을 수행했다. 미처리 또는 Ad-mda7 처리 세포와 비교했을 때, Ad-mda7/술린닥으로 처리된 세포에서 관찰되는 mRNA 농도의 차이는 크지 않았다.

술린닥 처리가 MDA-7 단백질 분해를 조절하는지의 여부를 조사하기 위하여, H1299 세포를 Ad-mda7 단독 또는 술린닥과의 조합으로 다양한 시간 동안 처리하고, MDA-7의 반감기를 측정했다. Ad-mda7-대조군 세포에서 관찰되는 MDA-7 단백질 농도는 경시적으로 감소했고; 단백질 분해가 11시간째 완료되었다. 이에 반해, Ad-mda7+술린닥으로 처리된 세포에서의 MDA-7 단백질의 분해는 지연되어, 13시간째에도 단백질의 검출가능한 실질적인 양이 확인되었다. 단백질 농도의 반정량적 분석에서는 0 내지 13시간 동안 Ad-mda7+술린닥으로 처리된 세포에서 MDA-7 단백질 농도가, Ad-mda7 처리된 세포에서보다 8 내지 15배 이상 높은 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 Ad-mda7/술린닥으로 처리된 세포에서 나타나는 MDA-7 단백질 발현의 증가가 술린닥에 의해 매개되는 MDA-7 단백질 분해 지연의 결과임을 증명하는 것이다.

8. 술린닥에 의해 증가된 MDA-7 발현은 프로테아좀 활성의 억제에 의한 것이 아니다.

최근 연구에서는 일부 NSAID가 프로테아좀 활성을 억제한다는 증거를 보고하고 있는 바(Choi et al., 2003; Huang et al., 2002), 술린닥에 의해 매개되는 MDA-7 단백질 발현 증가가 프로테아좀 활성을 억제하는 특성에 기인하는 것인지를 조사했다. 이를 위해, 술린닥의 효과를 웨스턴 블롯팅, Ub 분해 분석 및 프로테아좀 효소 활성 분석을 통해 공지의 프로테아좀 억제제(He et al., 2003)인 MG132와 비교했다. 웨스턴 블롯팅에서는 Ad-mda7과 함께 12시간 동안 술린닥 또는 MG132로의 처리가 Ad-mda7 단독으로 처리된 세포에서보다 MDA-7 단백질 발현을 증가시키는 것으로 확인되었다. 하지만, 술린닥은 다수의 밴드를 통해 알 수 있듯이, 글리코실화되지 않은 순수 단백질 및 다양한 글리코실화 정도의 MDA-7 단백질들을 모두 포함하는 총 MDA-7 단백질의 농도를 증가시키는 반면, MG132는 순수 MDA-7 단백질의 농도(술린닥보다는 덜 강하게) 및 한 형태의 글리코실화 MDA-7 단백질의 농도를 증가시켰다. 처리 후 6시간 및 24시간째에도 유사한 결과가 관찰되었다. 즉, MDA-7 단백질을 증가시키는 술린닥 및 MG132의 기작은 상이한 것으로 보인다.

이어서, 프로테아좀 활성을 억제하는 술린닥의 특성을 조사했다. 프로테아좀 경로의 억제반응에 대한 지표인 유비퀴틴화된 총 단백질의 웨스턴 블롯 분석에서는 유비퀴틴화된 단백질이 MG132 처리된 세포에서만 관찰되고 술린닥 처리된 세포에서는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 MG132와 달리 술린닥이 프로테아좀 활성 또는 프로테아좀 경로를 억제하지 않음을 보여주는 것이다. 이러한 발견과 일치하게, 프로테아좀 활성 분석 결과에서도 Ad-mda7 단독 또는 술린닥과의 조합 처리는 미처리 대조군 세포와 비교했을 때 프로테아좀 활성을 억제하지 않는 것으로 나타났다. 이에 반해, Ad-mda7+MG132로의 처리는 프로테아좀 활성의 유의적 억제를 초래했다(P=0.01). 이러한 결과는, 술린닥에 의한 MDA-7 단백질 발현의 증가가 프로테아좀 활성의 억제에 기인하는 것이 아님을 암시한다.

9. 술린닥은 Ad-mda7 매개의 폐암 성장 억제를 증가시킨다.

Ad-mda7+술린닥 처리가 종양 성장 억제를 증가시키는지의 여부를 결정하기 위해, 폐암 이종이식 모델을 이용하여 생체내 파일로트 실험을 수행했다. Ad-mda7/술린닥으로 처리된 마우스는 PBS, 술린닥, Ad-mda7 또는 Ad-luc/술린닥으로 처리된 마우스와 비교했을 때, 유의적인 성장 억제를 보여주었다(P= <0.001)(도 49D). 또한, Ad-mda7 단독 또는 Ad-luc+술린닥으로 처리된 마우스에서도 PBS 처리된 마우스와 비교했을 때, 종양 억제의 유의성이 관찰되었다(P=0.03). 하지만, 술린닥 처리된 마우스에서는 PBS 처리된 마우스에 비해 유의적인 성장 억제가 관찰되지 않았다. 또한, 이환율, 체중 감소 및 사망으로 확인되는 치료 관련 독성은 Ad-mda7+술린닥으로 처리된 마우스에서 관찰되지 않았으며, 이는 이러한 치료가 충분히 허용되는 치료임을 암시한다.

술린닥으로의 최종 치료 후 24시간째 피하 종양을 분석한 결과, MDA-7 단백질 농도가 Ad-mda7로 처리된 마우스 유래의 종양에서보다 Ad-mda7+술린닥으로 처리된 마우스 유래의 종양에서 3 내지 12배 높게 나타났다. 이러한 결과는 Ad-mda7+술린닥으로의 폐종양의 처리가 MDA-7 단백질 발현의 증가와 함께 성장 억제를 증가시키며, 이는 시험관내 결과와 일치된 결과임을 증명해준다.

실시예 25: 아데노바이러스 매개의 mda-7 유전자 전달은 사람 난소암세포에서 세포주기 정지 및 아폽토시스를 유도한다.

재료 및 방법

1. 세포주 및 시약

난소암세포 OVCA 420 및 MDAH 2774는 울프 박사(Dr.J.K. Wolf, MD Anderson Cancer Center, 택사스 휴스턴 소재)로부터 공급받았다. 또한, 난소암세포 SKOV3-ip, HEY 및 DOV13도 본 실험에 사용했다. SKOV-3 ip는 10% FBS가 보충된 DMEM 고포도당 배지에서 성장시켰다. DOV13 및 HEY는 10% FBS가 보충된 RPMI 1640에서 유지시켰다. MDAH 2774 및 OVCA 420은 10% FBS가 보충된 최소 비필수 아미노산 배지에서 성장시켰다.

2. 형질도입 효율의 측정

아데노바이러스의 형질도입 효율은 GFP 유전자를 발현하는 아데노바이러스(Ad-FGP)로 세포를 감염시켜 각 난소암세포주마다 조사했다. 난소암세포(SKOV3-ip, Hey, DOV13, MDAH 2774 및 OVCA 420)는 6웰 조직 배양 접시에 웰당 5x10⁵ 세포로 접종했다. 다음날, 세포를 감염처리하지 않거나(위대조군); Ad-GFP 또는 Ad-luc로 감염시켰다. 감염 24시간 후, 세포를 PBS로 세척하고, 원심분리로 펠릿화했다. 세포를 그 다음 PBS에 재현탁시켜 볼텍싱한 후 유세포측정 분석을 수행했다.

3. 재조합 아데노바이러스 벡터의 작제

mda-7을 발현하는 복제 결손형 Ad-mda7의 작제 및 정제는 이미 개시된 바 있다(Saeki et al., 2000). 간략히 설명하면, mda-7 유전자 또는 루시페라제 유전자가 CMV-IE 프로모터에 연결되어 있고, 그 뒤에 SV40 폴리아데닐화(pA) 시그날이 결합되어 있는 복제 결손형 사람 5형 아데노바이러스(Ad5) 벡터를 작제했다. 바이러스 전파는 293 세포에서 실시하고 크로마토그래피로 정제했다.

4. 세포성장율의 측정

종양 세포(SKOV3-ip, Hey, DOV 13, MDAH 2774 및 OVCA 420)를 6웰 조직배양 접시에 웰 당 1x10⁵ 세포로 접종했다. 다음 날, 세포를 감염시키지 않거나(위대조군); Ad-mda7 또는 Ad-luc로 감염시켰다. 세포를 수거하고 감염 후 1, 2, 3, 4 및 5일째 혈구계로 계수했다.

5. 세포주기 분석

MDAH 2774 및 OVCA 420 세포(5x 10⁵)를 6웰 평판에서 Ad-luc 또는 Ad-mda7(3000v.p./세포)로 처리했다. 세포를 수거하여 원심분리로 펠릿을 얻은 다음, PBS로 세척하고, -20℃하에 70% 에탄올 중에서 밤새 고정시켰다. 세포를 RNase A(1mg/ml), 50㎍/ml 프로피듐 요오다이드를 함유하는 PBS 중에 재현탁시킨 다음, 볼텍싱한 후 FACS 분석으로 처리했다. 감염시키지 않은 세포는 음성 대조군으로 사용했다.

6. 아폽토시스 세포 염색(헥스트 염색)

세포를 6웰 평판에 웰 당 5 x 10⁵ 세포의 밀도로 접종하고, Ad-mda7 또는 Ad-luc(3000 v.p./세포)로 처리했다. 감염 72시간 후, 세포를 헥스트 33342번(Sigma, 미국 미주리 세인트루이스 소재)와 15분 동안 항온배양한 뒤, 인산염완충 식염수(PBS)로 2회 세척한 다음, 형광현미경 하에서 관찰했다.

7. 웨스턴 블롯 분석

세포를 빙냉한 PBS로 1회 세척하고 용해 완충액(62.5mM Tris-HCl, 2% SDS, 10% 글리세롤, 4M 우레아)에 재현탁시켰다. 세포 용해물을 에펜도르프 관에 모아서 30초 동안 초음파 처리한 후, 95℃ 수조에서 5분 동안 가열하고, 4℃에서 14,400g로 10분 동안 원심분리했다. 상청액을 5% 2-머캅토에탄올과 혼합하고 -80℃에 보관했다. 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 분석 시스템을 사용하여 측정했다. 총 단백질 50㎍을 함유하는 세포 추출물의 함량을 10% SDS-PAGE에서 분리시키고, 이 겔로부터 니트로셀룰로스 막(Hybond-ECL; Amersham Pharmacia Biotech, UK)으로 전이시킨 다음, 실온에서 1시간 동안 차단시켰다(TBS 또는 PBS 중의 5% 탈지분유 및 1% Tween 20).

그 다음, 막을 1차 항체들인 PKR(1:500), p53(1:1000), 인산화특이성 p38(1:1000), 인산화특이성 pJNK(1:1000), 인산화특이성 p44/42(1:1000), 인산화특이성 pAKT(1:1000), 인산화특이성 eIF2 항체(1:1000), 카스파제-3(1:1000), PARP(1:500), 카스파제-9(1:500)와 항온배양했다. p53 및 PKR은 산타크루즈 바이오테크놀로지(미국 캘리포니아 산타크루즈 소재)로부터 입수했다. 인산화특이성 p38, 인산화특이성 pJNK, 인산화특이성 p44/42, 인산화특이성 pAKT 및 인산화특이성 eIF2 항체는 셀 시그날전달으로부터 입수했다. 카스파제-3, 카스파제-9 및 PARP 항체는 파밍겐으로부터 입수했다.

그 다음, 막은 양고추냉이 퍼옥시다제 표지된 2차 항체(Amersham)와 항온배양했다. 마지막으로, 단백질을 아머샴의 개량 화학발광 웨스턴 블롯팅 검출 시스템을 사용하여 개량 화학발광 필름(Hyperfilm; 아머샴) 상에 가시화했다.

8. RNase 보호 분석(RPA)

종양 세포(MDAH 2774)는 6웰 평판에 5x10⁵ 밀도로 평판배양하고, PBS, Ad-luc 또는 Ad-mda7로 처리했다. 이 세포들의 총 RNA는 종래 기술된 바와 같이 트리졸 시약을 처리한 후 24,48 및 72시간째에 분리했다. 표시된 아폽토시스 관련 유전자, 즉 카스파제-8, Fas, FasL, FADD, FAF-1, TRAIL, TNFr, TRADD 및 RIP, 뿐만 아니라 내부 대조군 L32와 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소의 mRNA 전사체들은 hApo-3 Multi-Probe 프로브 주형 세트(Pharmingen)를 사용하여 분석했다. 프로브 합성, 하이브리드화 및 RNase 처리는 RiboQuant Multi-Probe RNase 보호 분석 시스템을 공급업체의 지침에 따라 사용하여 수행했다. 보호된 전사체는 변성 폴리아크릴아마이드 겔(5%)에서의 전기영동으로 분리시키고, 하이퍼필름에 -80℃에서 밤새 노출시켰다.

9. 전기영동의 이동성 변위 분석(EMSA)

MDAH 2774(5x10⁵)는 6웰 평판에서 Ad-luc 또는 Ad-mda7로 처리했다. 세포를 다양한 시점(24, 48 및 72h)에서 수거하고, 세포질과 핵 추출물을 준비한 뒤, 전술한 바와 같이 EMSA를 수행했다. 간략히 설명하면, AP-1 콘센서스 이본쇄 올리고뉴클레오타이드(Promega)는 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여 [γ-³²P]-ATP로 말단 표지시켰다. 표지화된 올리고뉴클레오타이드 및 0.5㎍ 폴리(dI-dC) 및 핵 단백질 추출물(10㎍)을 함유하는 일반적인 결합 반응 혼합물을 5X 겔 변위 결합 완충액[20% 글리세롤, 5mM MgCl₂, 2.5mM EDTA, 2.5mM DTT, 250mM NaCl, 50mM Tris-HCl(pH 7.5)]에서 25℃ 하에 30분 동안 항온배양했다. 상기 혼합물을 미변성 5% 폴리아크릴아마이드 겔에서 0.5X Tris-붕산염 EDTA 완충액을 사용하여 300V 하에 1시간 30분 동안 분리시켰다. 자동방사선촬영술로 밴드를 가시화하고, Image Quant 소프트웨어(Molecular Dynamics, Amersham-Pharmacia, Biotech, 뉴욕 피스카타웨이 소재)로 정량했다.

10. Fas 프로모터 분석

MDAH 2774 세포(5 x 10⁵)는 6웰 평판에서 배양한 뒤, 사람 Fas(CD95) 프로모터의 제어하에 루시페라제 유전자를 함유하는 플라스미드(FHR+)로 형질감염시켰다. Fas 프로모터에 돌연변이를 함유하는 플라스미드(△6)로 형질감염된 세포는 본 실험의 대조군으로 사용했다. 형질감염은 종래 기술된 바와 같이 DOTAP:콜레스테롤(DOTAP:Chol) 리포좀을 사용하여 수행했다. 형질감염 6시간 후, 세포를 PBS, Ad-βgal 또는 Ad.mda-7로 처리했다. 처리 후 12, 24, 48시간째 세포를 수거하고, PBS로 세척한 뒤, 리포터 용해 완충액(프로메가) 200㎕ 중에 용해시켰다. 루시페라제 발현은 종래 기술된 바와 같이 측정하고 단백질 mg 당 상대적 광단위(RLU)로 표현했다. 실험은 적어도 2회 이상 반복하고 결과는 2회 실험의 평균값으로 나타냈다.

11. 우세한 음성 FADD 발현 벡터를 이용한 실험

종양 세포는 2웰 챔버 슬라이드 또는 6웰 평판에 평판배양하고, 황색 형광 단백질(YFP) 및 우세한 음성 FADD(YFP-dnFADD)를 보유하는 플라스미드 발현 벡터로 형질감염시키거나 또는 YFP만을 보유하는 플라스미드 벡터로 형질감염시켰다. YFP-dnFADD 플라스미드는 YFP 및 FADD를 융합 단백질로서 발현하여 FADD 단백질은 가시화 및 기능을 할 수 있다. 또한, 세포를 종래 기술된 바와 같이 DOTAP:Chol.리포좀에 캡슐화된 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후, 세포를 PBS로 처리하거나 Ad-mda7로 처리했다. 처리 후 24시간 및 48시간 후, 세포를 형광현미경 하에서 형질도입 효율을 조사하거나 또는 세포 용해물을 제조하고 웨스턴 블롯 분석을 통해 FADD, 카스파제 9 및 카스파제 8에 대해 탐침했다.

dnFADD의 Ad-mda7 매개된 아폽토시스에 대한 작용을 측정하기 위해, 세포를 상기와 같이 처리하고 유세포측정에 의해 서브-G₀ 단계에서의 세포수(아폽토시스 세포의 지시자)에 대해 분석하였다.

12. SiRNA 분석

siRNA 분석을 위해, Fas 특이성 siRNA를 합성하고, siRNA 키트(Ambion, 텍사스 오스틴 소재)를 사용하여 정제했다. 다음 서열을 사용하여 siRNA를 합성했다:

a) 표적 (Fas) siRNA:

5'-AAGTAAAGGTAGAGGGGGAGCCCTGTCTC-3'

5'-AAGCTCCCCCTCTACCTTTACCCTGTCTC-3'

b) 스크램블드(scrambled)(대조군) siRNA .

5'-AAAAGTTTCCGATACGCTTTACCTGTCTC-3'

5'-AATAAAGCGTATCGGAAACTTCCTGTCTC-3'

6웰 평판에 접종한 세포를 올리고펙타민을 사용하여 siRNA(Fas 또는 대조군)로 형질감염시켰다. 공 올리고펙타민 단독으로 처리한 세포는 본 실험의 대조군으로 사용했다. Fas에 미치는 siRNA의 억제 효과를 분석하기 위해, 세포를 형질감염 48시간 후 수거하여, 세포 용해물을 제조하고, 웨스턴 블롯 분석을 통해 Fas 발현을 분석했다. Ad-mda7 매개의 아폽토시스에 미치는 siRNA의 효과를 측정하기 위해, 세포를 전술한 바와 같이 Fas 특이성 siRNA 또는 스크램블드 siRNA로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 세포를 PBS로 처리하거나 Ad-mda7로 처리했다. 처리 24시간 후 세포를 수거하여, 고정시킨 다음, 유세포측정으로 아폽토시스 세포를 조사했다.

결과

1. 난소 세포주에서의 형질도입 효율

바이러스 벡터에 의한 유전자 전달 효율 사이의 관계를 조사하기 위하여, 세포들을 Ad-GFP로 감염시켜, 조사된 5종의 난소암세포주의 아데노바이러스 형질도입 효율을 측정했다. 5종의세포주는 각각 형질도입 효율이 상이했으며, MDAD 2774, OVCA 420, DOV13 및 Hey 세포는 3000 MOI에서 90% 이상의 형질도입 효율로 가장 용이하게 형질도입되었고, SKOV3-ip 세포는 10,000 MOI에서도 가장 어려웠다(도 50).

2. 난소 암세포 및 정상 섬유아세포에 미치는 아데노바이러스 투여성 mda-7의 효과

SKOV3-ip, Hey 및 DOV13 종양세포주는 mda-7 감염 후 성장 억제되지 않았다. 이에 반해, Ad-mda7로 감염된 MDAH 2774 및 OVCA 420에서는 Ad-luc로 감염되거나 PBS로 처리된 대조군 세포와 비교했을 때 세포 증식의 억제가 관찰되었다. Ad-Luc 및 Ad-mda7로 감염된 후의 정상 사람 섬유아세포에서는 유의적인 성장 억제가 관찰되지 않았다(도 51).

3. MDA-7은 난소세포에서 G2/M 세포 주기 정지 및 아폽토시스 선택성을 유도한다.

성장 억제의 분자 기구를 조사하기 이하여, 유세포측정분석을 수행했다. 5종의 세포 주 중에서 유의적인 성장 억제를 나타낸 2가지 세포주, 즉 MDAH 2774 및 OVCA 420에서는 G₂/M기 집단의 백분율이 현저히 증가된 것으로 확인되었다(도 52). 대조용 Ad-luc로의 감염은 세포 주기 중에서 G₂/M 기 세포의 백분율을 변화시키지 못했다. Ad-mda7로 감염 후, MDAH 2774 및 OVCA 420 종양 세포는 아폽토시스 세포사를 일으켰다. 하지만, Ad-Luc로 감염된 세포 또는 위대조군 세포에서는 어떤 변화도 관찰되지 않았다.

4. Ad-mda7로의 난소세포 감염은 세포내 및 분비형 단백질의 발현을 유도한다.

난소암 세포는 Ad-mda7 및 Ad-luc로 감염시켰다. 감염 후 24, 48 및 72시간째에 수거하고, 웨스턴 블롯 분석을 위해 추출물을 제조했다. 위감염된 세포 유래의 추출물도 또 다른 대조군으로 사용했다. MDA-7 단백질 발현은 Ad-mda7 감염된 세포주 모두에서 검출되었으나, 위감염된 대조군이나 Ad-luc 감염된 세포에서는 검출되지 않았다.

5. mda-7 발현은 PKR, pPKR, peIF2, p38 및 JNK의 상향조절을 초래한다.

MDAH 2774 및 OVCA 420 세포에서, mda-7은 PKR, pPKR, peIF₂, p38 및 JNK를 활성화시켰다. 세포들이 Ad-mda7 3000MOI로 감염된 경우에, PKR의 최대 활성화 및 이의 기질이 48시간째에 관찰되었다.

6. mda-7 발현 후 카스파제 캐스캐이드 활성화 및 PARP 절단

Ad-mda7 처리는 카스파제-9 및 카스파제-3의 활성화 및 카스파제 기질인 PARP의 절단을 유도했다.

이러한 결과는 난소암 세포에 대한 mda-7의 선택적 효과를 증명하는 바, 난소암 치료에 Ad-mda7을 사용할 수 있음을 지지해준다.

7. MDA-7을 이용한 각종 아폽토시스 관련 단백질의 조절

사람 폐암세포 및 흑색종에서는 여러 아폽토시스 관련 단백질(PKR, pJNK, p38 MAPK)이 MDA-7에 의해 활성화된다는 것은 이미 입증되어 있다. 이러한 관찰에 기초하여, 이러한 단백질들이 난소암세포에서도 Ad-mda7 처리 후 24시간 및 48시간째 활성화되는지 조사했다. 종래, MDA-7 매개 폐암 세포 사망에 중요한 인자로 확인된 바 있는 PKR은 48시간째에만 유의적으로 활성화되었고, 24시간째에는 활성화되지 못했다. PKR과 관련있는 이의 하류 기질 peIF2도 활성화되었다. p38MAPK 및 pJNK 역시 24시간째는 아니고 48시간째에 유의적으로 활성화되었다. 하지만, MDA-7은 pc-Jun 및 pATF-2는 24시간째 활성화시키고 48시간째에도 지속시켰다. 이러한 결과는 MDA-7이 다양한 시그날전달 분자를 다른 시점에서 활성화시킨다는 것을 보여준다.

8. MDA-7은 난소암세포에서 Fas 및 Fas 관련 단백질을 활성화시킨다.

아폽토시스 캐스캐이드의 개시에서 종래 보고된 결과 보다 조기에 또 다른 시그날전달 현상이나 분자가 활성화/자극되는지의 여부를 조사하기 위하여, 난소암세포를 PBS, Ad-luc 또는 Ad-mda7로 처리하고, 아폽토시스 관련 분자를 RPA로 분석했다. Ad-mda7 처리된 세포에서는 PBS 및 Ad-luc 처리된 세포와 비교했을 때 Fas, Fas-L, FADD, 카스파제-8 및 FAF1 mRNA 발현의 유의적 증가가 관찰되었다. FAP의 중간 수준의 증가도 관찰되었다. 각 처리 그룹 중에서 TRADD, DR3, TNF 및 RIP 발현의 변화는 관찰되지 않았는데, 이는 TNF 관련 계통의 구성원이 아닌 Fas 관련 계통의 구성원들의 활성화가 초기에 진행됨을 암시한다. mRNA 농도의 변화가 반드시 단백질 발현과 상관성이 있는 것은 아니므로, 웨스턴 블롯 분석을 수행했다. 그 결과, Ad-mda7 처리된 세포에서는 PBS 및 Ad-luc 처리된 세포에 비해 Fas, Fas-L, FAF1 및 FADD 단백질 발현의 유의적 증가가 관찰되었다. 단백질 발현의 증가는 mRNA 결과와 일치했다. 하지만, FAP 단백질 발현은 PBS 및 Ad-luc 처리된 세포에 비해 Ad-mda7 처리된 세포에 감소되었다. 각 처리 그룹에서 TRADD 발현의 변화는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 MDA-7에 의한 Fas-FasL 활성화가 난소암세포의 초기 현상임을 암시한다.

9. MDA-7은 AP-1 및 NFκB를 활성화시킨다.

AP-1 및 NFκB는 Fos 계통 구성원이나 다른 전사 인자(예를 들면 ATF2, CREB 및 NFAT)와 결합된 이종이량체로서 또는 동종이량체로서의 Jun 계통(c-Jun, JunD 및 JunB)의 전사 단백질의 결합을 통해 활성화되는 주요 전사 인자이다. 이러한 정보와 c-jun 및 ATF-2를 활성화시키는 MDA-7의 특성에 기초하여, MDA-7 매개 시그날전달이 AP-1 및/또는 NFκB를 포함하는지를 조사했다. 이를 위해, 핵세포 용해물을 PBS, Ad-luc 또는 Ad-mda7 처리 24시간 및 48시간째 제조하고, EMSA로 AP-1 및 NFκB 활성화를 분석했다. Ad-mda-7 처리된 세포의 핵 용해물에서는 Ad-luc 및 PBS 처리된 세포에서보다 높은 AP-1 및 NFκB 결합 활성이 관찰되었다. 24시간 및 48시간째 모두 활성 증가가 관찰되었는데, 최대 활성화는 48시간째 관찰되었다.

10. MDA-7은 세포 표면의 Fas 발현을 증가시킨다.

MDA-7은 세포 표면에서 Fas 발현을 증가시키는지의 여부를 조사하기 위하여, PBS, Ad-luc 또는 Ad-mda7로 처리한 종양 세포를 형광 표지된 항Fas 항체로 염색하고 형광현미경으로 조사했다. 세포 표면에서의 Fas 발현의 증가가 PBS 및 Ad-luc 처리된 세포에 비해 Ad-mda7 처리된 세포에서 관찰되었다.

11. MDA-7은 Fas 프로모터를 활성화시킨다.

다음에는, Fas 프로모터 활성화에 미치는 Ad-mda7 처리의 특성을 조사했다. 야생형 Fas 프로모터의 제어하에 luc 유전자를 보유하는 플라스미드로 형질감염시킨 세포는 Ad-mda7 처리 후, PBS 또는 Ad-βgal로 처리된 세포에 비해 유의적으로 활성화되었다(P=0.001). 또한, 루시페라제 발현의 증가도 PBS 처리된 세포에 비해 Ad-βgal 처리된 세포에서 관찰되었다(P=0.04). 이에 반해, 세포가 돌연변이 Fas 프로모터를 함유하는 플라스미드로 형질감염된 경우에는 다양한 처리 그룹들에서 루시페라제 발현의 유의적 증가가 관찰되지 않았으며, 이는 Ad-mda7 처리가 야생형 Fas 프로모터를 특이적으로 활성화시킨다는 것을 시사한다.

12. 우세한 음성 FADD의 과발현은 MDA-7 매개의 아폽토시스를 억제한다.

FADD는 FAS 유도 시그날전달 이후 형성되는 사망 유도 시그날전달 복합체(DISC)의 일부인 바, MDA-7 매개의 아폽토시스에 미치는 우세한 음성 FADD의 과발현의 효과를 조사했다. 실험 개시에 앞서, 세포를 EYFP 또는 EYFP- dnFADD 플라스미드로 형질감염시키고, 형질도입 효율 및 dnFADD 발현을 측정했다. 주목할 점은, EYFP 융합 단백질로서 발현된 dnFADD는 밴드 패턴의 변위를 통해 내인성 FADD와 상이하다는 것이다. 따라서, 이후 실험에서는 세포를 형질감염시키지 않거나, EYFP 또는 EYFP-dnFADD로 형질감염시킨 후 PBS 또는 Ad-mda7로 처리했다. 유세포측정으로 아폽토시스 세포를 조사하고, 웨스턴 블롯 분석으로 카스파제-9 및 카스파제-8을 확인했다. Ad-mda7 단독으로 처리된 세포(15%; P=0.001)에서는 PBS, EYFP 플라스미드 단독, 또는 EYFP-dnFADD 플라스미드 단독으로 처리된 세포에서보다 유의적인 수의 아폽토시스 세포가 관찰되었다. 하지만, Ad-mda7 매개의 아폽토시스는 dnFADD를 과발현하는 EYFP-dnFADD 형질감염된 세포에서 현저하게 억제되었다. 이에 반해, EYFP 형질감염 세포에서는 Ad-mda7 처리 시 아폽토시스를 증가시켰다. 더욱이, 모세포 또는 EYFP 플라스미드로 형질감염된 세포의 Ad-mda7 처리는 카스파제-8 및 -9를 활성화시켰다. 이에 반해, MDA-7 매개의 카스파제-8 및 -9의 활성화는 dnFADD 과발현 세포에서는 억제되었다. PBS 처리 세포, EYFP 단독 처리 세포 및 EYPF-dnFAPP 단독 처리 세포에서는 카스파제 활성화가 관찰되지 않았다.

13. siRNA에 의한 Fas의 억제는 MDA-7 매개의 아폽토시스를 억제한다.

Fas가 MDA-7 매개의 아폽토시스에 역할을 하는 것인지를 추가 시험하기 위하여, siRNA 실험을 수행했다. 먼저, 세포를 벡터 단독, 스크램블드 siRNA 또는 Fas에 대해 표적화된 siRNA로 형질감염시킨 뒤 웨스턴 블롯 분석으로 분석했다. Fas에 대해 표적화된 siRNA로 형질감염된 세포에서는 Fas 단백질 발현의 현저한 억제가 관찰되었으나, 스크램블드 siRNA로 형질감염된 세포에서는 관찰되지 않았다. Fas의 억제는 200nm siRNA에 의해 형질감염된 세포에서 관찰되었다. 이러한 결과에 기초하여 이후의 실험은 Fas 또는 스크램블드 siRNA 200nm을 사용하여 수행했다. Fas siRNA 또는 스크램블드 siRNA로 형질감염된 세포는 Ad-mda7로 처리하고 아폽토시스 세포에 대해 분석했다. MDA7로 유도된 아폽토시스 세포 수의 유의적 감소가, 스크램블드 siRNA로 형질감염된 세포(19.2%)에 비해 Fas siRNA 형질감염된 세포(9%)에서 관찰되었다. 아폽토시스 세포의 유의적 증가는 PBS 처리된 세포에서는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 Fas가 난소암 세포에서 MDA-7 매개의 아폽토시스에 역할을 하는 것임을 입증한다.

실시예 26: 종양 성장 억제 유전자 mda-7은 사람 유방암에서 아폽토시스를 유도하고 APC/β-카테닌 경로에 영향을 미친다.

재료 및 방법

MDA-MD-468 유방암세포는 유방암의 옆구리 이종이식 모델에서 시험관내 및 생체내 실험을 통해 연구했다. CMV 프로모터의 제어하에 mda-7 돌연변이유전자를 보유하여 mda-7을 발현하는 재조합 아데노바이러스(Ad-mda7)를 사용했다. 대조용 세포는 Ad-Luc 또는 PBS로 처리했다. 48시간째, 세포 성장은 직접 세포 계수하고, 카스파제-3 및 PARP 절단을 통해 측정되는 아폽토시스를 통해 평가했다. 생체내에서, 종양은 종양의 크기가 100㎣에 도달하면 Ad-mda7, Ad-Luc 또는 PBS를 종양내 주사하여 처리했다. 처리 후 48시간째, 종양을 수거하고 아폽토시스를 TUNEL 염색 및 카스파제-3 및 PARP 절단을 통해 평가했다. 선종성용종 콜리 단백질(APC)/β-카테닌 경로는 Ad-mda7 처리 후 시험관내 및 생체내에서 MDA-MB-468 세포 중의 APC 및 β-카테닌 발현을 측정하여 평가했다.

결과

MDA-MB-468 세포의 Ad-mda7로의 처리는 대조군 처리된 세포와 비교했을 때 시험관내 및 생체내에서 유의적인 아폽토시스 및 성장 억제를 초래했다(도 53; P<0.01, ANOVA). APC 발현의 유의적 상승률은 Ad-mda7 처리 후 시험관내 및 생체내에서 모두 관찰되었다. 이와 대응하게, Ad-mda7 처리된 세포 중의 β-카테닌 농도가 대조군에 비해 현저하게 감소되었다. 이와 같은 연구를 통해, MDA-MB-468 유방암 세포에 미치는 Ad-mda7의 유의적인 성장 억제 및 아폽토시스 효과를 확인했다. 또한, 이러한 데이터는 이 세포사가, Ad-mda7 형질감염 후 APC가 상향조절되고 이에 따라 핵의 β-카테닌이 하향조절되는 것에 기인하는 것임을 암시한다. 이러한 결과를 확인하기 위한 추가 연구가 현재 진행중이다.

실시예 27: 아데노바이러스 매개의 mda-7 유전자 요법은 혈관신생을 억제하고 이종이식 종양의 방사선 민감화를 유도한다.

재료 및 방법

1. 세포 배양 및 화학물질

NSCLC 세포주, A549는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(매릴랜드 록크빌 소재)에서 입수했다. A549 세포를 10% 태아 송아지 혈청(HyClone, 유타주 로간 소재)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen, 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재)이 보충된 F-12 배지에서 5% CO₂ 하에 37℃에서 성장시켰다. 정상인의 폐 섬유아세포주 CCD16도 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에서 입수하여 10% 태아 송아지 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 MEM-α 배지에서 유지시켰다. mda7 또는 대조용 백터로 안정하게 형질감염된 사람 배아 신장 293 세포는 Introgen Therapeutics Inc.(텍사스 휴스턴 소재)로부터 공급받았다. 293 세포는 10% 태아 송아지 혈청 및 1% 페니실린-스트렙트마이신이 보충된 MEM 고포도당 배지에서 유지시켰다. 사람 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)는 Clonetics(캘리포니아 산디에고 소재)로부터 입수하고 완전 EGM-2 배지(Clonetics, 캘리포니아 산디에고 소재)에서 공급업체의 지침에 따라 유지시켰다. 24시간 동안 배양된 293 세포(1x10⁶)는 ELISA 분석으로 측정 시, 배양 배지 중에 30ng/ml의 MDA-7 단백질을 생산했다.

사람 안지오스타틴(링글 1-3) 및 사람 재조합 엔도스타틴은 Calbiochem(캘리포니아 산디에고 소재)으로부터 구입하고, 세포처리에는 100ng/ml 농도로 배지에 희석하여 사용했다.

2. 동물 연구

A549 이종이식 종양은 무혈청 배지에 현탁시킨 5x10⁶ 생세포를 4 내지 5주령의 수컷 무흉선 누드 마우스(nu/nu; Harlan)의 뒷다리에 피하 주사하여 형성시켰다. 10 내지 14일 내에, 종양은 200㎣ 크기에 도달했다(0일). 처리 후 종양 성장 지연을 측정했다. 종양 측정은 직각을 이루는 3 지점에서 측정하고, 타원체로 가정하고 부피를 측정했다. 종양의 직경이 15mm를 초과하거나 종양이 궤양화되면 동물을 희생시켰다. 본 실험에 사용한 모든 동물은 미국 농림부 및 국립보건원의 규정과 기준을 준수하는 기관 시설에 수용하여 양육했다. 또한, 동물은 동물 보호 및 사용 협회에서 승인하는 프로토콜에 따라서 사용했다.

3. 아데노바이러스 생산

미국 특허 출원 09/615,154에 기술된 바와 같이 Ad-mda7을 수득했다. 이 재조합 아데노바이러스 벡터는 CMV 프로모터, 야생형 mda-7 cDNA 및 SV40 폴리아데닐화 시그날을, 변형된 Ad5의 E1 결실 영역에 삽입된 미니유전자 카세트에 함유하고 있다. 이 벡터들을 검사한 결과, 복제능이 있는 아데노바이러스 및 마이코플라즈마는 없는 것으로 확인되었다.

4. 유전자 전달

누드 마우스의 뒷다리에 성장하는 피하 이종이식 종양에 대해 생체내 실험을 수행했다. 종양이 200㎣에 도달하면, 총 3x10⁶ vp 용량을 1, 3 및 5일에 3회의 동일 비율로 투여하여 종양을 처리했다. 정제 벡터의 각 주사량은 PBS 총 부피 100㎕에 희석하여, 일회용 27.5게이지 인슐린 주사기를 이용하여 투여했다.

5. 방사선

생체내 처리를 위하여, A549 이종이식 종양을 보유한 동물을 ⁶⁰Co 원격치료 단위를 사용하여 마취동안에 방사선조사했다. 종양이 있는 뒷다리만 방사선 구역에 위치하고 나머지 신체는 납 블록에 의해 보호되도록 마우스를 배치했다. 시험관내 처리에서는 세포를 실온에서 고선량 ¹³⁷Cs 단위(3.4Gy/min)으로 방사선조사했다.

6. 면역조직화학

MDA-7 면역염색을 위해 종양을 8일째 수집하거나, 또는 혈관 내피세포 성장인자(VEGF), 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF), 인터루킨-8(IL-8) 또는 CD31 면역염색을 위해 종양을 14일째 수집했다. VEGF, bFGF, IL-8 또는 MDA-7 면역염색을 위해 5마이크론 두께의 포르말린 고정된 파라핀 매립 조직의 절편을 사용했다. CD31 면역염색에는 동결 절편으로부터 8마이크론 두께의 절편을 수득했다. 포르말린 고정된 파라핀 매립 조직의 절편을 크실렌을 이용하여 파라핀제거하고, 저하되는 등급의 에탄올(100%에서 75%로)로 재수화시켰다. 면역염색성을 강화시키기 위해, 절편을 절편을 항원 탈보호 용액(Vector Laboratories, 캘리포니아 버링감 소재)에 넣고, 가열 온도 유지를 위해 최고 10분 동안 간헐적으로 마이크로웨이브로 가열했다. 이러한 슬라이드를 실온에서 30분 동안 냉각시킨 후, 증류수와 PBS로 세척했다. 이러한 1차적인 준비 후, 포르말린 고정된 파라핀 매립 조직이나 동결 조직 중 어느 하나로부터 수득한 슬라이드를, 메탄올 중의 3% H₂O₂를 도포하여 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단시켰다. 그 다음, 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 복합체 키트(Vector Laboratories Inc.)를 사용하여 염색성을 확인했다. 차단 혈청과 내인성 아비딘/비오틴 차단 용액(Vector Laboratories Inc.)으로 처리한 후, 슬라이드를 1:500 희석율의 VEGF에 대한 토끼 폴리클로날 항체(Santa Cruz Biotech, 캘리포니아 산타크루즈), 1:500 희석율의 bFGF에 대한 토끼 폴리클로날 항체(Sigma Chemical Co., 미주리 세인트루이스 소재), 1:50 희석율의 IL-8에 대한 토끼 폴리클로날 항체(Biosource International, 캘리포니아 카말리오 소재), 1:100 희석율의 마우스 CD31에 대한 랫트 모노클로날 항체(PharMingen, 캘리포니아 산디에고 소재) 또는 1:250 희석율의 MDA-7에 대한 토끼 폴리클로날 항체(Introgen Therapeutics, 텍사스 휴스턴 소재)와 4℃에서 밤새 항온배양했다. 그 다음, 이 슬라이드들을 세척하고, 2차 비오틴화된 항체와 30분 동안 항온배양하고, 다시 세척한 뒤 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 복합체 시약과 30분 동안 항온배양했다. 이 슬라이드들을 PBS로 세척한 뒤, 3,3-디아미노벤지딘을 사용하여 면역염색을 발색시켰다. 이 슬라이드를 메틸 그린(Vector Laboratories Inc.)으로 대비염색하고 Permount(Fisher Scientific, 펜실베니아 피츠버그 소재)로 표본을 제작했다.

면역염색 양성 세포의 백분율을 측정하기 위하여, 적어도 1000개 세포/슬라이드를 x400 배율의 시야에서 계수하여 평가했다(Bianco et al., 2002; Weidner et al., 1991). 미세혈관은 바이드너 등(Weidner et al(1991))에 의해 기술된 방법에 따라 CD31에 대해 면역염색한 절편을 사용하여 정량분석했다. 미세혈관의 밀도는 x400 시야에서 확인되는 3개의 최대 구역의 평균값으로 나타냈다.

7. TUNEL 분석

아폽토시스 세포를 검출하기 위하여, 말단 데옥시뉴클레오타이드 전이효소(TdT) 매개의 dUTP 표지화(TUNEL)법을 사용했다. 이를 위하여, ApopTag^® Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit(Serological Corporation, 조지아주 노크로스 소재)를 사용했다. 염색은 공급업체의 과정에 따라 실시했다. 키트에 함유된 절편을 염색하여 양성 대조군으로 사용했다. 광학현미경(x400 배율)으로 무작위 선별된 시야 중의 아폽토시스 세포를 계수하고, 아폽토시스율을 평가된 적어도 1000개의 세포의 백분율로서 계산했다.

8. 세포 생존 분석

4웰 평판(Nunc, 덴마크 로스킬데)에 HUVEC를 접종한 후 12시간 경과하면 배지를 혈청/성장인자 제거 배지로 교환시켰다. 이와 같이 12시간 동안 혈청/성장인자 공급중단 후, 세포를 MDA-7 단백질(10ng/ml)(293 세포 배양물의 분리물), 안지오스타틴(100ng/ml) 또는 엔도스타틴(100ng/ml)을 함유하는 완전 배지로 처리했다. 12시간 후, 세포를 실온에서 ¹³⁷Cs 단위(3.4Gy/min)의 방사선조사로 처리하고, 트립신처리한 뒤 계수했다. 공지의 세포수를 60mm 배양 접시에 재평판배양하고, 육안으로 콜로니 형성이 관찰될 때까지 배양했다. 14일 후 콜로니를 계수하고, 소정 처리 후의 평판배양율(%) 및 생존율을, 방사선미처리 세포의 생존율을 기초로 하여 계산했다.

9. 통계 분석

통계적 유의성은 일원배치 ANOVA 또는 스튜던트 t 검정을 적당하기 사용하여 측정했다. P<0.05이면 차이가 유의적인 것으로 간주했다.

결과

1. A549 이종이식 종양에 미치는 Ad-mda7과 방사선조사의 조합 처리 효과

A549 세포를 무흉선 누드 마우스(n=20)의 뒷다리에 피하로 주사했다. 종양이 200㎣에 도달하면(0일), 동물을 4가지 처리 그룹 중 하나로 무작위로 선택했다: 대조군(식염수 주사), 방사선 단독(6일째 1회 조사에 5Gy), Ad-mda7 단독(1,3 및 5일에 3회 분할로 3x10¹⁰ vp) 또는 조합(Ad-mda7+방사선조사) 처리. 이러한 처리 프로토콜은 본래 SW620 이종이식편에 Ad-p53을 사용한 최초 연구에 기초하여 선택했고, 이후 A549 이종이식편에 Ad-p53과 방사선조사의 조합을 검사한 연구들에서 사용한 프로토콜과 동일한 것이다(Kawabe et al., 2002; Spitz et al., 1996). 이로써, A549 이종이식 종양을 방사선민감화하는 Ad-p53 및 Ad-mda7의 특성에 대한 비교 결과를 얻을 수 있을 것이다. 도 54에 도시된 바와 같이, 방사선 단독 처리 또는 Ad-mda7 단독 처리에서는 중간 수준의 종양 성장 지연만이 수득되었다. 반면, Ad-mda7과 방사선조사의 조합 치료는 실질적이고 장기지속적인 종양 성장 지연을 산출했다(도 54A). 본 연구자들의 동물 프로토콜에 따라서, 마우스는 종양의 직경이 15mm에 도달하면 희생시켰다. 각 마우스가 죽은 시간을 기록하여 도 54B에 플롯팅했다. 여기서 관찰되는 바와 같이, 조합 치료는 이 시간을 상당히 연장시켰고, 이 그룹의 5마리 중 1마리는 치유되었다. 이 동물은 총 240일 후에 희생시켰다. 부검시 이 동물 중에서는 종양이 발견되지 않았다.

2. 조합 처리 효과는 치료 스케줄에 따라 달라진다.

1회성 Ad-mda7 3x10¹⁰ vp 투여 및 5Gy 방사선조사로 이루어지는 조합 치료의 최적 섭생을 확인하기 위하여, 다음과 같은 치료를 조사했다: 대조군, Ad-mda7(1일) + 방사선조사(6일), Ad-mda7(5일) + 방사선조사(6일) 또는 방사선조사(6일) + Ad-mda7(7일). 이러한 치료 후 종양 성장의 지연 결과는 조합 치료의 최적 타이밍이 Ad-mda7 투여하고 5일 후에 5Gy 방사선을 조사하는 것임을 시사했다(도 55).

3. Ad-mda7 투여 후 종양의 MDA-7 단백질 발현

MDA-7 단백질 발현은 8일째 시편에 대한 면역조직화학으로 조사했다. Ad-mda7 처리 후 종양에서는 MDA-7 단백질이 세포질에서의 강하게 발현되는 것으로 검출되었고, 이에 반해, Ad-mda7이 처리되지 않은 종양에서는 특이적 염색성이 검출되지 않았다. 이러한 패턴은 방사선조사된 종양 유래의 시편에서도 동일했다.

4. Ad-mda7과 방사선조사의 조합 치료는 생체내 아폽토시스 유도를 증가시킨다.

NSCLC 세포에서 방사선조사와 함께 Ad-mda7 처리 시 아폽토시스 유도가 증가된다는 것은 시험관내 처리 시 이미 관찰된 바 있다(Kawabe et al., 2002). 이와 유사한 아폽토시스 증가가 생체내에서도 관찰되는지의 여부를 조사하기 위하여, 다양한 처리 후 수집한 시편에 대하여 TUNEL 염색을 실시했다. TUENL 양성 세포는 조직학적 절편 전반에 산재되어 있는 것으로 관찰되었고, 특히 처리 그룹 유래의 시편에서 확인되었다. TUNEL 양성 세포를 계수하여 그 결과값을 도 63에 제시했다. Ad-mda7 및 방사선조사의 조합 치료는 배경값(1.2%)을 감한 후 방사선 단독(2.2%) 또는 Ad-mda7 단독(1.3%)과 비교했을 때, 그 합보다 약간 더 큰 아폽토시스율(4.6%)을 나타내었다.

5. Ad-mda7은 혈관신생 인자의 방사선 유도성 발현 증가를 차단한다.

VEGF, bFGF 및 IL-8 단백질 발현은 14일째 수집한 시편에 대해 면역조직화학을 수행하여 분석했다. 각 시편의 양성세포율을 계산하고, 그 결과값을 도 64A 내지 64C에 플롯팅했다. 상기 각 혈관신생 마커들은 미처리 대조군에서도 약간의 구성형적 발현을 보였다. 하지만, 방사선조사 단독 처리는 이 단백질들의 각 발현을 실질적으로 증가시켰다. Ad-mda7 처리는 VEGF 및 bFGF의 구성형적 농도를 억제하고 모든 3 혈관신생 마커들의 방사선 유도성 발현 증가를 실질적으로 차단했다.

6. Ad-mda7과 방사선조사의 조합 치료는 미세혈관 밀도를 억제한다.

Ad-mda7이 혈관신생을 억제하여 종양 성장을 억제한다는 연구는 이미 보고된 바 있다(Saeki et al., 2002). 따라서, Ad-mda7의 단독제제로서의 혈관신생억제 효과 및 방사선조사와 조합처리될 때의 혈관신생억제 효과를 평가했다. 14일째 종양을 수집하고, 동결 절편을 CD31(혈소판 내피세포 유착 분자-1)에 대해 염색하여 미세혈관 밀도를 측정했다. CD31 염색된 절편에 존재하는 미세혈관 밀도를 평가한 결과, 미처리 대조군 종양에서 x400 시야 당 평균 미세혈관 수는 45±12인 것으로 확인되었다. Ad-mda7 및 방사선조사를 각각 단독 제제로서 사용한 경우에는, 각각 26±3 및 30±6으로 미세혈관 수의 부분적인 억제가 관찰되었다. 하지만, Ad-mda7 및 방사선조사의 조합으로 처리된 종양에서는 평균 미세혈관수가 12±2로 현저히 억제되었다(도 58). 이와 같은 조합처리 시의 미세혈관 밀도의 3.8배 감소는 다른 그룹과 비교했을 때 통계적 유의성이 있는 것이다.

7. 재조합 사람 MDA-7 단백질은 내피세포의 방사선 민감성을 증가시킨다.

MDA-7단백질이 Ad-mda7 감염된 종양 세포에서 분비되고, 저농도에서 사이토킨 IL-24로서 작용한다는 것은 이미 보고된 바 있다(Dumoutier et al., 2001; Wang et al., 2002). 즉, A549 이종이식 종양을 방사선민감화하는 Ad-mda7의 특성은 감염된 종양 세포의 직접적인 방사선민감화, 혈관신생인자의 억제뿐만 아니라, 감염된 종양 세포에서 분비되는 MDA-7 단백질의 혈관신생 및 방사선민감화 특성의 복합 효과에 기인할 가능성이 있다. 이에, 분비된 MDA-7 단백질이 내피세포에 미치는 방사선민감화 효과가 있는지의 여부를 조사하기 위하여, 사람 제대 정맥 내피세포(HUVEC)를 이용하여 클론원성 생존 분석을 수행했다. HUVEC는 방사선조사 전 12시간 동안 재조합 사람 MDA-7 단백질을 함유하는 배지로 전처리했다. 이 배지는 MDA-7 단백질을 분비하는 293 세포의 배양액으로부터 수득한 것이다. 도 59A에 도시된 바와 같이, MDA-7 단백질은 10ng/ml의 추정 농도에서 HUVEC를 이온화 방사선에 대해 민감화시켰다. 양성 대조군으로서, 안지오스타틴(도 59B) 또는 엔도스타틴(도 59C) 100ng/ml으로 HUVEC를 전처리하기도 했다. 안지오스타틴 및 엔도스타틴은 각각 플라스미노겐 및 콜라겐 XVIII의 단백분해 단편으로서, 모두 잘 알려진 혈관신생억제 인자(O'Reilly et al., 1994; O'Reilly et al., 1997). 이러한 안지오스타틴 및 엔도스타틴이 내피세포를 방사선민감화한다는 것은 이미 보고되었다(Mauceri et al., 1998, Hanna et al., 2000). 이러한 관점에서, 안지오스타틴 및 엔도스타틴은 100ng/ml에서 HUVEC에 대해 방사선민감화 효과를 나타내기는 하지만(도 59B, C), MDA-7 단백질은 이보다 훨씬 강력한 것임을 알 수 있었다.

8. 재조합 사람 MDA-7 단백질은 A549 세포 또는 정상인의 섬유아세포의 방사선 민감성을 증가시키지 않는다.

Ad-mda7이 Ad549 세포를 방사선민감화하지만, 정상 사람 폐섬유아세포, CCAD16 세포에는 시험관내에서 작용하지 않음은 이미 보고된 바 있다(Kawabe et al., 2002). 재조합 사람 MDA-7 단백질이 상기 세포의 방사선 민감성을 증가시키는지의 여부를 조사하기 위하여, 안정하게 형질감염된 293 세포 유래의 조정 배지를 이용한 클론원성 분석을 전술한 바와 같이 수행했다. 그 결과, MDA-7 단백질은 A549 세포 또는 CCD16 세포에는 방사선민감화 효과를 제공하지 않음을 확인했다(도 60A, B).

실시예 28: MDA-7 종양 억제인자 단백질의 항암 활성은 소포체(ER) 유래의 시그날전달 에 의해 매개된다.

본 연구는 세포내 MDA-7 단백질이 특정 아세포 위치에 대해 표적화된다면 사망 활성을 증가시키는지의 여부를 조사한 것이다. 여러 가지 mda-7 플라스미드 작제물을, 발현된 단백질이 다양한 아세포 구획, 예를 들면 세포질, 핵 및 ER로 표적화되게 하는 벡터를 사용하여 제조했다(도 61). 또한, 분비 시그날을 비롯한 전장 mda-7 cDNA를 세포질 골격에 서브클로닝했다. 이와 같이 재표적화된 벡터를, 폐암 세포로 형질감염시켜 MDA-7 단백질 발현에 대해 조사하였고, 그 결과, 모두 고농도의 세포내 MDA-7을 발현함을 관찰했다(웨스턴 블롯 분석). MDA-7 단백질의 아세포 재표적화는 면역조직화학을 통해 확인했다. 유세포측정 및 콜로니 형성 분석을 통해, 재표적화된 MDA-7의 암세포를 죽이는지의 여부를 조사했다(도 62). 세포질 MDA-7 작제물과 핵 MDA-7 작제물은 세포사를 유도하지 않았고, 이에 반해 전장(분비형) MDA-7은 세포독성이었다. 또한, ER 표적화된 mda-7 작제물은 종양 세포에서 세포사를 유도했다(도 63). 즉, 이러한 결과는 MDA-7이 분비 경로로 유입되어야만 아폽토시스 유도 효과를 발휘할 수 있음을 시사한다.

실시예 29: 사람 말초혈액 단핵세포에서의 MDA-7에 의한 사이토킨 유도

1. 사람 말초혈액 단핵세포(PBMC)에서의 MDA-7의 발현

총 PBMC 집단을 유사분열성 렉틴으로 자극한 후에 MDA-7/IL-24 단백질이 존재하는지의 여부를 조사하기 위하여 먼저 면역블롯팅을 실시했다. PBMC는 건강한 정상 수혈자의 말초혈액을 Histopaque(Sigma, 미주리 세인트루이스 소재) 상에서 원심분리하여 수득했다. 이러한 세포를 PHA-P(5㎍/ml) 또는 LPS 10㎍/ml(둘 다 시그마 제품, 미주리 세인트루이스 소재) 존재하에 L-글루타민, Hepes, 페니실린, 스트렙토마이신 및 10% 사람 AB 혈청(Pelfreez, 위스콘신 브라운 디어 소재)이 보충된 RPMI-1640계 배지에 1x10⁶ 세포/ml의 농도로 접종하여 72시간 동안 배양했다. 수집하기 4시간 전에 Brefeldin A(BFA, Sigma-Aldrich)를 10㎍/ml의 최종 농도로 첨가하여 사이토킨 분비를 억제했다. 세포 용해물은 활성화된 PBMC로부터 표준 프로토콜에 따라 제조했다. 비등 및 환원된 샘플을 12% SDS-PAGE 겔로 분리하고 니트로셀룰로스로 전이시켰다. 막을 차단한 후, 토끼 폴리클로날 항MDA-7과 항온배양하고, 세척한 뒤, HRP 접합된 염소 항토끼 2차 항체와 배양했다. 블롯의 발색은 ECL 시약(Amersham Pharmacia Biotech, 뉴저지 피스카타웨이 소재)으로 수행했다. 막을 꺼내어 항액틴 항체로 재탐침을 실시했다.

72시간 동안 PHA 및 LPS로 자극된 PBMC에서의 MDA-7의 발현을 조사했다. 그 결과 활성화된 집단은 직접 접합 항체 및 MiniMax(Miltenyl Biotec, 캘리포니아 서니베일 소재)를 이용한 자기 세포 분류법(magnetic cell sorting)을 통해 CD3+, CD19+, CD56+ 아세포집단으로 분리했다. 이들 집단에서의 MDA-7 발현은 7G9 항MDA-7 모노클로날 항체를 이용한 면역조직화학 염색을 통해 확인했다. 그 결과, CD3+ 세포는 MDA-7 음성이고, Cd19+, B세포 뿐만 아니라 CD56+, NK 세포는 MDA-7 양성이었다. 이러한 결과에 따라, 활성화된 PBMC에서의 MDA-7 발현의 속도를 측정하는 실험을 설정했다.

2. PBMC에서 PHA에 의한 IL-24 유도, 단백질 및 mRNA

활성화된 세포에서 IL-24 유도 속도를 측정하기 위하여, PBMC를 PHA로 자극한 뒤, 초기에 단백질 발현에 대해 세포를 조사했다. MDA-7 단백질 발현은 PBMC의 세포내 유세포측정으로 분석하고, mRNA 발현은 실시간 RT PCR로 분석했다.

PBMC를 10% 정상인의 혈청을 함유하는 배지 중의 5㎍/ml PHA로 0, 2, 6, 12, 24, 48시간 동안 자극했다. 각 지정 시점 마다 세포를 분리하여 단백질 농도를 측정하고 RNA를 분리했다. 실시간 RP-PCR은 TaqMan OneStep 과정을 사용하여 공급업체의 프로토콜에 따라 수행했다(Applied Biosystems, 캘리포니아 포스터 시티 소재). MDA-7 및 HPRT에 대한 유전자 특이성 프라이머/프로브는 어플라이드 바이오시스템즈 제품을 구입했다. 반응은 ABI Prism 7900 HT 서열 검출 시스템을 사용하여 공급업체의 프로토콜에 따라 수행하고, 분석은 Sequence Detection Software 버전 2.9를 사용하여 수행했다. MDA-7 단백질은 세포내 FACs 분석으로 검출했다. 세포를 수거하기 전에 Brefeldin A 10㎍/ml로 4시간 동안 처리하여 사이토킨 분비를 차단시켰다. 적용가능하다면, 세포는 먼저 직접 접합 항체를 사용하여 표면 염색시킨 다음, 세포내 단백질 검출을 위해 4% 파라포름알데하이드 처리로 고정화시킨 뒤, 세정제, 즉 n-옥틸 글루코피라노사이드를 7mg/ml 농도로 사용하여 투과성화시켰다. 투과성화의 대조군으로서 세포를 또한 세포내 단백질 비멘틴에 대해 지향성인 모노클로날 항체로 염색시켰다. 면역형광 염색은 표준 프로토콜에 따라 실시했다. 면역형광 분석은 FACSCalibur를 사용하여 Cell Quest 소프트웨어(BD Immunoscience)로 분석했다

본 실험의 대조군으로서, IL-2의 발현도 분석했다. MDA-7 메시지는 IL-2 발현 이후 관찰되었고, 최고 농도는 자극 후 6 내지 8시간째 도달되었으며, 증가량이 11,000 정도에 이르러서, 미자극 PBMC에 비해 배로 증가하는 것을 확인했다. 단백질 발현(세포내 유세포측정으로 분석)은 8시간째 최대 발현에 도달했다.

3. MDA-7의 사이토킨 유도

이상의 실험들은 MDA-7 mRNA 피크가 PHA 자극 후 비교적 조기에 나타난다는 것을 암시한다. 이러한 발현을 유도할 수 있는 사이토킨을 조사하기 위하여, PBMC를 PHA 활성화 동안 생산되는 주요 사이토킨인 IL-2로 자극했다. 정상 PBMC는 10% 사람 혈청을 함유하는 배지에서 자극되었다. 세포를 특정 시점마다 수집하여, 세포내 FACs 분석으로 MDA-7 단백질 발현을 조사하고, 실시간 RT PCR로 MDA-7 mRNA 발현을 조사했다.

단백질 발현은 4시간째 증가하기 시작하는 것으로 확인되었다. 발현 농도는 PHA 자극 시 관찰되는 농도보다 낮았고, 이는 정제 사이토킨에 비해 유사분열원의 자극 강도를 반영하는 것이다. 또한, IL-2 수용체를 발현하지 않는 세포가 MDA-7을 생산한다는 것을 반영할 수도 있다. mRNA 발현은 2상의 속도론을 보였는데, 1시간째 피크는 감소하고, 그 다음 12시간째 다시 증가하였다. 다른 실험에서는 IL-2에 대한 중화 항체를 PHA 자극 초기에 PBMC에 첨가했다. 8시간째 세포를 수집하여, MDA-7 단백질은 세포내 FACs로 측정하고, mRNA는 RT PCR로 측정했다. MDA-7 단백질 및 mRNA 발현은 IgG 대조군에 비해 약 50% 차단되었다.

나머지 PBMC를 가지고 다른 사이토킨의 MDA-7 발현 유도 특성을 조사했다. PBMC를 IL-2, IL-4, IL-7, IL-15 또는 IFNγ 100U/ml로 자극한 후, 6시간째 MDA-7 발현에 대해 분석했다. 이 때, IL-7 및 IL-15는 MDA-7 mRNA 및 단백질의 발현을 자극했다.

이러한 데이터들은 IL-2, IL-7 및 IL-15가 PBMC에서 MDA-7 발현의 상향조절에 관여한다는 것을 암시한다. 이 3가지 사이토킨은 공통의 사이토킨 수용체 감마쇄(γc)를 공유한다. IL-7R은 고유의 α쇄와 γc로 구성되어 있다. 반면, IL-2R 및 IL-15R은 3가지 서브유닛, 즉 IL-2/IL-15Rβ, γc 및 각각 고유의 α쇄로 구성되어 있다. 현재, γc를 함유하는 수용체에 결합하는 사이토킨이 T 세포 유지 및 항상성에 관여한다는 상당한 증거가 있고, 이러한 사이토킨이 PBMC에서 MDA-7의 발현을 자극한다는 사실은 MDA-7 또한 T 세포 항상성에 관여할 수 있다는 것을 암시한다.

4. 항IL2R 항체에 의한 Il-24 발현의 차단

γc에 결합하는 사이토킨이 MDA-7 발현에 중요한 역할을 하는지의 여부를 추가 조사하기 위하여, IL-2 수용체의 3가지 서브유닛, 즉 IL-2Rα, IL-2/IL-15Rβ 및 γc(IL-2Rγ)(R&D Systems, 미네소타 미네아폴리스 소재)에 대해 지향성인 차단 항체를 이용하여 PHA 활성화된 PBMC에서의 MDA-7 발현의 유도를 차단하는지의 여부를 조사했다. PHA와 함께 배양하기 시작할 때 항체를 5㎍/ml 농도로 사용하고, 마우스 IgG를 비특이적 차단을 검출하는 대조군으로 사용했다. 3회의 독립된 실험을 통해, MDA-7 mRNA 발현의 차단이 다음과 같은 범위로 확인되었다: 항IL-2Rα 0 내지 24%, 항-IL2/IL-15Rβ 19 내지 36% 및 항IL2Rγ 15 내지 26%.

MDA-7 단백질 발현은 PHA 자극 개시 시에 항IL-2 모노클로날 항체의 첨가에 의해 차단되었다. 즉, PBMC에서 MDA-7의 발현은 IL-2, IL-7 및 IL-15에 의해 유도되었다. 이러한 사이토킨은 모두 기능성 IL-2 수용체의 성분을 이용한다. 이러한 결과는 MDA-7이 Th1 유형 면역반응에 포함되는 전염증성 사이토킨이라는 발상을 지지해준다.

실시예 30: MDA-7/IL-24 매개의 사람난소암세포의 사망은 Fas/FasL 시그날전달 경로를 포함한다.

재료 및 방법

1. 세포주 및 시약

사람 난소암세포주 OVCA 420, MDAH 2774는 울프 박사(Dr.J.K. Wolf, MD Anderson Cancer Center, 택사스 휴스턴 소재)로부터 공급받았다. 세포는 10% FBS가 보충된 최소 비필수 아미노산 배지에서 성장시켰다. 사람 섬유아세포주 CCD-16은 ATCC(매릴랜드 록크빌 소재)에서 구입했다. AP-1 콘센서스 올리고뉴클레오타이드(5'-cgcttgatgagtcagccggaa-3'(서열번호 3))는 프로메가(위스콘신 매디슨 소재)에서 구입했다. mda-7 또는 루시페라제를 보유하는 아데노바이러스(각각 Ad-mda7 또는 Ad-luc)는 Introgen Therapeutics, Inc.(텍사스 휴스턴 소재)에서 입수했다.

2. 형질도입 효율의 측정

사람 난소암 세포주 및 정상 섬유아세포 세포주(MRC-9)의 형질도입 효율은 GFP 유전자를 발현하는 아데노바이러스(Ad-GFP)를 사용하여 측정했다. 세포(MDAH 2774, OVCA 420 및 MRC-9)는 6웰 조직 배양 접시에 웰당 5x10⁵ 세포로 접종했다. 다음날, 세포를 감염처리하지 않거나(위대조군); Ad-GFP, 2500, 3000, 5000, 10000 바이러스 입자/세포(vp/세포)로 감염시켰다. 감염 24시간 후, 세포를 PBS로 세척하고, PBS에 재현탁시켜 유세포측정 분석을 수행했다. 3000vp/세포에서 모든 세포주마다 세포의 90%를 넘는 세포가 형질도입된 것으로 확인되었다. 따라서, 이후 실험에서는 3000vp/세포의 moi를 사용했다.

3. 세포증식율 분석

종양 세포(MDAH 2774 및 OVCA 420) 및 정상(MRC-9) 세포를 6웰 조직배양 접시에 웰 당 1x10⁵ 세포로 접종했다. 다음 날, 세포를 PBS, Ad-luc 또는 Ad-mda7(3000 vp/세포)로 감염시켰다. 세포를 감염 후 1, 2, 3, 4 및 5일째 수거하고 트립판 블루 분석으로 계수했다. 실험은 적어도 3회 이상의 독립된 실험을 수행하여 3회 실험의 평균값으로 결과를 나타냈다.

4. 세포주기 분석

종양(MDAH 2774 및 OVCA 420; 5x 10⁵) 세포를 6웰 평판에서 PBS, Ad-luc 또는 Ad-mda7(3000v.p./세포)로 처리하고 37℃에서 배양했다. 세포를 처리 후 24, 48 및 72시간째 수거하여, PBS로 세척하고, -20℃하에 70% 에탄올 중에서 밤새 고정시켰다. 세포를 RNase A(1mg/ml), 50㎍/ml 프로피듐 요오다이드(Sigma Chemicals, 미주리 세인트루이스 소재)를 함유하는 PBS 중에 재현탁시킨 다음, FACS 분석으로 처리했다. 감염시키지 않은 세포는 본 실험에 음성 대조군으로 사용했다.

5. 아폽토시스 세포 염색

세포(MDAH 2774 및 OVCA 420)를 6웰 평판에 웰 당 5 x 10⁵ 세포의 밀도로 접종하고, PBS, Ad-mda7 또는 Ad-luc(3000 v.p./세포)로 처리했다. 감염 72시간 후, 세포를 헥스트 33342번(Sigma, 미국 미주리 세인트루이스 소재)과 15분 동안 항온배양한 뒤, PBS로 2회 세척한 다음, 형광현미경 하에서 단편화된 핵을 통해 측정되는 아폽토시스 세포를 관찰했다.

6. 웨스턴 블롯 분석

PBS, Ad-mda7 또는 Ad-luc로 처리한 종양 세포를 당업계에 공지된 기술을 사용하여 웨스턴 블롯 분석으로 처리했다. 1차 항체로는 다음과 같은 항체를 사용했다: PKR, 인산화특이성 p38, pJNK, p44/42, peIF2, 카스파제-9(Cell Signalling, 매사츄세츠 보스톤 소재); 카스파제-3, PARP, FAF1, FADD, Fas 및 FasL(PharMingen, 캘리포니아 산디에고 소재). MDA-7에 대한 폴리클로날 항체는 Introgen Therapeutics, Inc.(텍사스 휴스턴 소재)로부터 입수했다. 단백질을 아머샴의 개량 화학발광 웨스턴 블롯팅 검출 시스템을 사용하여 개량 화학발광 필름(Hyperfilm; 아머샴) 상에 가시화했다.

7. 전기영동의 이동성 변위 분석(EMSA)

MDAH 2774(5x10⁵)는 6웰 평판에서 Ad-luc 또는 Ad-mda7(3000v.p./세포)로 처리했다. 세포를 다양한 시점(24, 48 및 72h)에서 수거하고, 세포질과 핵 추출물을 준비한 뒤, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 EMSA를 수행했다. 간략히 설명하면, AP-1 콘센서스 이본쇄 올리고뉴클레오타이드(Promega)는 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여 [γ-³²P]-ATP로 말단 표지시켰다. 표지화된 올리고뉴클레오타이드 및 0.5㎍ 폴리(dI-dC) 및 핵 단백질 추출물(10㎍)을 함유하는 일반적인 결합 반응 혼합물을 5X 겔 변위 결합 완충액[20% 글리세롤, 5mM MgCl₂, 2.5mM EDTA, 2.5mM DTT, 250mM NaCl, 50mM Tris-HCl(pH 7.5)]에서 25℃ 하에 30분 동안 항온배양했다. 상기 혼합물을 미변성 5% 폴리아크릴아마이드 겔에서 0.5X Tris-붕산염 EDTA 완충액을 사용하여 300V 하에 1시간 30분 동안 분리시켰다. 자동방사선촬영술로 밴드를 가시화하고, Image Quant 소프트웨어(Molecular Dynamics, Amersham-Pharmacia, Biotech, 뉴욕 피스카타웨이 소재)로 정량했다.

8. RNase 보호 분석(RPA)

세포(MDAH 2774)는 6웰 평판에 5x10⁵ 밀도로 평판배양하고, PBS, Ad-luc 또는 Ad-mda7로 처리했다. 이 세포들의 총 RNA는 트리졸 시약을 처리한 후 24,48 및 72시간째에 분리했다. 표시된 아폽토시스 관련 유전자, 즉 카스파제-8, Fas, FasL, FADD, FAF-1, TRAIL, TNFr, TRADD 및 RIP, 뿐만 아니라 내부 대조군 L32와 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소의 mRNA 전사체들은 hApo-3 Multi-Probe 프로브 주형 세트(Pharmingen)를 사용하여 분석했다. 프로브 합성, 하이브리드화 및 RNase 처리는 RiboQuant Multi-Probe RNase 보호 분석 시스템을 공급업체의 지침에 따라 사용하여 수행했다. 보호된 전사체는 변성 폴리아크릴아마이드 겔(5%)에서의 전기영동으로 분리시키고, 하이퍼필름에 -80℃에서 밤새 노출시켰다.

9. Fas 프로모터 분석

MDAH 2774 세포(5 x 10⁵)는 6웰 평판에서 배양한 뒤, 사람 Fas(CD95) 프로모터의 제어하에 루시페라제 유전자를 함유하는 플라스미드(FHR+)로 형질감염시켰다. Fas 프로모터에 돌연변이를 함유하는 플라스미드(△6)로 형질감염된 세포는 본 실험의 대조군으로 사용했다. 형질감염은 종래 기술된 바와 같이 DOTAP 리포좀을 사용하여 수행했다. 형질감염 6시간 후, 세포를 PBS, Ad-βgal 또는 Ad.mda-7(3000vp/세포)로 처리했다. 처리 후 12, 24, 48시간째 세포를 수거하고, PBS로 세척한 뒤, 리포터 용해 완충액(프로메가) 200㎕ 중에 용해시켰다. 루시페라제 발현은 종래 기술된 바와 같이 측정하고 단백질 mg 당 상대적 광단위(RLU)로 표현했다. 실험은 적어도 2회 이상 반복하고 결과는 2회 실험의 평균값으로 나타냈다.

10. siRNA 분석

SiRNA 분석은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 수행했다.

결과

1. Ad-mda7은 난소암세포 증식을 선택적으로 억제한다.

난소암세포(MDAH2774, OVCA420)는 Ad-mda7 및 Ad-luc(3000vp/세포)로 감염시켰다. 세포를 감염후 다양한 시점에서 수거하고, MDA-7 단백질 발현 및 성장 억제 효과에 대해 분석했다. PBS로 처리한 세포는 대조군으로 사용했다. Ad-mda7로 처리된 모든 세포주에서 외인성 MDA-7 단백질 발현이 관찰되었다. 또한, PBS 또는 Ad-luc로 처리된 세포도 약간의 발현을 나타냈다. 하지만, 이것은 비특이성 단백질과 항-MDA7 폴리클로날 항체의 교차반응성 때문인 것으로 추정된다. MDA-7 발현이 모든 세포주에서 관찰되었지만, Ad-mda7에 의한 유의적인(P=0.001) 성장 억제는 PBS 및 Ad-luc 처리된 세포에 비해 MDAH 2774 및 OVCA 420 세포에서만 관찰되었다(도 64). Ad-mda7 처리된 Hey 및 DOV13 종양 세포주에서는 유의적 성장 억제 효과가 관찰되지 않았다.

2. MDA-7은 난소세포에서 G2/M 세포주기 정지 및 아폽토시스를 유도한다.

이어서, Ad-mda7에 의해 발휘되는 성장 억제의 기구를 조사했다. Ad-mda7 처리된 MDAH2774(도 65A) 및 OVCA 420세포(도 65B)는 PBS 및 Ad-luc 처리된 세포에 비해 G2/M 기 세포 수의 유의적 증가를 나타내었다. 하지만, Ad-mda7 처리된 Hey, DOV13 및 SKOV3-ip 세포에서는 G2/M 기 세포 수의 유의적 변화가 관찰되지 않았다. 즉, 세포 주기 정지는 헥스트 염색(도 66)으로 확인되듯이, MDAH2774 및 OVCA420 세포의 아폽토시스 유도와 관련이 있었다. PBS 또는 Ad-luc로 감염된 세포에서는 아폽토시스 변화가 관찰되지 않았다.

3. PKR은 난소세포의 아폽토시스를 유도한다.

MDA-7이 아폽토시스를 유도하는 분자 기구를 조사하기 위하여, 종래 MDA-7와 관련있는 것으로 밝혀진 바 있는 다양한 시그날전달 분자의 발현을 분석했다. PKR은 dsRNA, 바이러스 및 스트레스 매개의 아폽토시스에 역할을 하하는 것으로 제안된 바 있다(Lee et al., 1994; Yeung et al., 1996; Kibler et al., 1997). Ad-mda7은 폐암세포주 A549 및 H1299에서 PKR 매개로 아폽토시스를 유도한다고 보고되었다. 이에 따라, PKR 활성이 Ad-luc 및 Ad-mda7 처리 후 민감성 세포주(MDAH 2774, OVCA420) 및 내성 세포주(Hey 및 DOV13)에서 증가되는지의 여부를 결정하는 실험을 수행했다. 그 결과, PKR 농도는 MDAH 2774 및 OVCA 420 세포에서 24 내지 48시간째 급격히 증가하고, 그 기질인 peIF₂는 Admda-7 감염 후 48시간째 증가하는 것으로 관찰되었다. 하지만, Hey 및 DOV13의 Ad.mda-7 감염은 PKR 및 이의 기질인 peIF₂를 유도하지 못했고, 즉 Admda-7의 아폽토시스 유도 효과에 내성적이었다.

4. MDAH 2774 세포의 MDA-7 처리는 MAPKs, JNK 및 p38의 활성화를 유도한다.

MDA-7이 p38 및/또는 JNK 경로를 통해 Fas로 신호를 보내는지의 여부를 조사하는 실험을 수행했다. JNK 및/또는 p38 MAPK의 활성화(인산화)는 다양한 암세포에서 스트레스 유도성 아폽토시스를 유도하는 경로에 관련이 있는 것이다. MDAH 2774 및 OVCA 420에서의 인산화JNK 및 인산화-38 MAPK의 발현은 Admda-7 처리 후 웨스턴 블롯팅에 의해 분석되었다. 인산화된 JNK 및 p38은 MDA-7 감염된 MDAH 2774 및 OVCA 420에서 48시간째 유의적으로 증가되었다. 이러한 발견은 인산화된 JNK 및 p38 MAPK의 아폽토시스 관련성을 암시한다. c-Jun 및 p-ATF₂ 관련성도 확인하기 위하여, 주 AP-1 성분(c-Jun 및 ATF-2)의 농도를 Ad-mda7 및 Ad-luc로 감염 후 24시간 및 48시간째 웨스턴 블롯 분석으로 확인했다. Ad-mda7은 pcJun 및 ATF-2의 농도를 24시간 및 48시간째 유의적으로 유도했다. Ad-luc 및 위감염된(PBS) 세포는 pc-Jun 및 pATF-2를 활성화시키지 못했다. 이러한 결과는 AP-1 활성화에 c-Jun 및 pATF2의 잠재적 관련성을 암시하며, 또한 FasL 자극에 AP-1 활성의 역할도 지지해준다. 하지만, Ad-mda7은 내성 세포주인 Hey 및 DOV13에서는 인산화-38, JNK, pc-Jun, ATF-2 및 이의 표적인 AP-1의 활성화를 유도하지 못했다.

5. CD95L 프로모터 활성은 AP-1 인자의 활성화를 통해 MDA-7로 자극되면 MDAH 2774 세포에서 상향조절된다.

AP-1은 Jun 계통으로 이루어지거나(c-Jun, JunD 및 JunB), Jun 계통 구성원과 임의의 Fos 계통 구성원(c-Fos, FosB, Fra-1 및 Fra-2) 또는 다른 전사 인자(예를 들면 ATF2, CREB 및 NFAT)로 이루어진 이종이량체인 주요 전사 인자이다. 3가지 MAPK 경로(ERK, JUK 및 p38) 모두는 AP-1을 활성화시킬 수 있기 때문에, AP-1이 p38 및 JNK를 전달하는 통합 모듈로서 작용하는지의 여부를 조사했다. 합성된 AP-1 콘센서스 서열에 대한 AP-1의 결합 활성은 EMSA로 측정했다. Ad-mda7 감염된 세포 유래의 핵 용해물은 Ad-luc 및 PBS cfl된 세포 보다 24시간 및 48시간째 높은 AP-1 결합 활성을 나타냈다.

6. CD95L은 Ad-mda7 감염시 상향조절된다.

이러한 데이터들은 CD95-CD95L 상호작용이 Ad-mda7 감염 후 아폽토시스 유도에 중요하다는 것을 보여준다. MDAH 2774 세포에서 Fas 전사체의 발현 상태를 조사하기 위하여, 리보뉴클레아제 보호 분석을 사용하여 시그날전달 세포사에 관여하는 여거 유전자의 mRNA 농도를 측정했다. 그 결과, 24시간째 MDA-7 발현 후 Fas, FasL, FADD 및 카스파제-8 mRNA 농도가 증가되고 33시간째에는 발현 농도의 변화가 없는 것을 확인했다. 또한, Ad-luc 및 위처리 세포는 Fas, FasL, FADD 및 카스파제-8의 mRNA 발현 농도에 어떤 변화도 나타내지 않았다. 이를 종합해보면, 이러한 데이터들은 MDA-7이 p38 및 JNK 의존적 c-Jun-pATF2/AP-1 경로를 통해 FasL을 활성화시킨다는 가설을 지지해준다.

7. MDA-7 발현 후 카스파제 캐스캐이드의 활성화

다음으로, 아폽토시스에 중요한 역할을 하류 표적에 대해 조사했다. Ad-mda7 처리된 MDAH 2774 및 OVCA 420 세포에는 PBS 또는 Ad-luc 처리된 세포와 비교했을 때 카스파제 9 및 카스파제 3의 활성화를 나타내었다. 카스파제 활성화는 이 카스파제들의 기질인 PARP의 절단과도 연관되었다.

실시예 31: mda-7 유전자 전달은 다수의 분자 경로를 이용하여 암을 퇴치한다.

흑색종 분화 관련 유전자 7(mda-7)은 복제 결손형 아데노바이러스(Ad-mda7)를 이용하여 세포로 도입되면, 유방, 폐, 결장직장, 전립선, 췌장, 난소 및 흑색종 기원을 비롯한 광범위한 영역의 암세포의 성장 억제 및 아폽토시스를 유도한다. Ad-mda7의 세포독성 활성은 종양 선택성이어서, 정상 세포는 MDA-7 유도사에 내성적이다. Ad-mda7의 항종양 활성은 누드 마우스에서 다수의 이종이식 모델을 이용하여 확인되었다. 이와 같이 축적된 데이터들은 MDA-7이 아폽토시스 개시에 중요한 유전자 및 시그날전달 경로를 활성화시키고(예를 들면, p53, BAX, TRAIL, fas, PKR, MAPK, jnk), 생존 경로를 억제(예, PI3K)한다는 것을 시사한다.

현재, 생명정보학과 구조 분석은 MDA-7 단백질이 인터루킨-10(IL-10) 상과의 새로운 구성원임을 밝히고 있고, 여기에는 IL-10; -19; -20; -22 및 -26이 포함된다. mda-7 유전자는 1q31/32에서 사이토킨 클러스터로 함유되어 있다. MDA-7 단백질은 IL-10의 6 나선 구조를 공유하지만, IL-10의 면역억제성은 공유하지 않고 Th1 사이토킨으로서 작용한다. MDA-7은 활성화된 림프구에서 발현된다. 사람 PBMC의 MDA-7 처리는 IL-6, 감마-IFN, IL-12, TNF-a 및 GM-CSF의 분비를 유도한다. 이러한 Th1 사이토킨의 분비는 IL-10에 의해 억제된다. MDA-7은 또한 내피세포에 결합하여 강력한 혈관신생억제 단백질로서 작용한다. 이러한 활성은 IL-22 수용체를 통해 매개된다. 흑색종 세포의 Ad-mda7 또는 MDA-7 처리는 IL-6 및 감마 IFN의 분비를 유도한다. 따라서, 최근 IL-24로서 분류된 mda-7은 다중방식의 항암성을 보유한 신규 IL-10 동족체이다. 이러한 독특한 특성의 조합, 즉 아폽토시스 유도, 혈관신생억제 및 면역자극은 암을 공격하는 강력한 접근법을 제공한다.

실시예 32: MDA-7/IL-24의 이소성 생산은 사람 폐암세포의 침윤과 이동을 억제한다.

재료 및 방법

1. 세포 배양

사람 NSCLC 세포주 A549(선암종)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(매릴랜드 록크빌 소재)에서 구입했다. 사람 대세포 폐암종 세포주 H1299는 가즈다 박사 및 민나 박사(A. Gazdar and J.D.Minna, The University, of Texas Southwestern Medical Center, 텍사스 달라스 소재)로부터 증여받았다. 종양 세포는 10% 태아 송아지 혈청(FBS; GIBCO-BRL, 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재), 항생제(GIBCO) 및 L-글루타민을 함유하는 RPMI-1640 배지에서 유지시켰다. 실험을 시작하기 전에 세포에 마이코플라즈마가 없음을 확인했다. 세포는 대수기 성장 단계의 세포를 사용했다.

2. 재조합 아데노바이러스 벡터

MDA-7 유전자를 보유하는 복제 결손형 사람 5형 아데노바이러스 벡터의 작제는 종래 기술된 바와 같이 실시했다(Saeki et al,, 2000 and Mhashilkar et al., 2001). 바이러스는 사람 배아 신장 293 세포에서 전파시키고, 크로마토그래피로 정제했다.

3. 세포 이동 분석

종양 세포(H1299 및 A549)는 6웰 조직배양판에 5x10⁵ 세포/웰의 밀도로 접종했다. 다음 날, 세포를 2500 바이러스 입자/세포의 감염다중도인 Ad-mda7 또는 Ad-luc로 감염시켰다. 감염 후 6시간째, 세포를 트립신처리하고, 인산염완충 식염수(PBS)로 세척한 다음, 무혈청 RPMI-1640 배지에 재현탁시켰다. 세포 이동 분석은 24웰 트란스웰 유닛(Millipore, Cambridge, MA)에서 종래 기술된 바와 같이 수행했다(Ramesh et al., 2003). 간략히 설명하면, 세공이 8㎛인 폴리카보네이트 필터를 사용했다. 상기 트란스웰 유닛의 하층 챔버에는 무혈청 배지를 채우고, 상층 챔버에는 각 처리 그룹의 세포 1x10⁴을 3웰에 반복접종했다. 항온배양 24시간 및 48시간 후, 필터를 통해 하층 웰로 이동한 세포를 계수하고, 그 수를 상층웰과 하층웰 중의 총 세포수의 백분율로서 나타냈다. 본 실험은 4회 실시하고, 이 실험들의 평균값으로 MDA-7에 의한 결과값을 기록했다.

상기 실험과 함께, 전술한 바와 같이 각종 처리가 실시된 종양 세포에 대하여 24시간 및 48시간째, 종래 기술된 바와 같이 세포 생존성 분석을 실시했다(Saeki et al., 2000; Mhashilkar et al., 2001). 본 실험은 MDA-7에 의한 세포 이동의 억제가 세폭독성의 결과임을 배제하고 수행했다.

4. 세포 침윤 분석

종양 세포(H1299 및 A549)를 6웰 조직배양판에 5x10⁵ 세포/웰의 농도로 접종했다. 다음 날, 세포를 MOI 2500vp/세포의 Ad-mda7 또는 Ad-luc로 감염시키거나 10μM LY 294002(Cell Signaling, 매사츄세츠 비버리 소재) 또는 1㎍/ml NMP-II 억제제(Santa Cruz Biotechnology, 캘리포니아 산타크루즈 소재)로 처리했다. 형질감염 후, 배양물에 완전 배지를 보충했다. 처리 후 6시간째, 세포를 트립신처리하고, PBS로 세척한 뒤, 무혈청 RPMI-1640 배지에 재현탁시켰따. 세포 침윤 분석은 종래 기술된 바와 같이(Stewart wt al., 2002), 매트리겔(Becton, Dickinson and Company, 뉴저지 프랭클린 레익스 소재) 코팅된 24웰 트란스웰 유닛에서 수행했다. 간략히 설명하면, 매트리겔 코팅된 트란스웰 유닛의 하층 챔버에는 무혈청 배지를 채우고, 상층 챔버에는 각 처리 그룹의 세포 1x10⁴을 3웰에 반복 접종했다. 항온배양 24시간 및 48시간 후, 매트리겔 코팅된 필터 막을 통해 하층 웰로 이동한 세포를 침윤의 척도로서 계수했다. 침윤성 세포는 각 처리 그룹마다 계수했고, 그 수를 상층웰과 하층웰 중의 총 세포수의 백분율로서 나타냈다. 본 실험은 적어도 3회 이상 실시하고, 이 실험들의 평균값으로 결과를 기록했다.

5. 젤라틴 자이모그래피 분석

MMP 생산에 Ad-mda7 처리의 효과를 측정하기 위해, 젤라틴 자이모그래피 분석을 종래 기술된 바와 같이 수행했다(Zhang et al., 2002). 간략히 설명하면, 저혈청(1% FBS) 배지에서 성장시킨 종양 세포(H1299 및 A549)를 6웰 조직배양판에 5x10⁵ 세포/웰의 농도로 접종하고, MOI 2500vp/세포의 Ad-mda7 또는 Ad-luc로 감염시켰다. PBS로 처리한 세포는 본 실험의 음성 대조군으로 사용했다. 감염 6시간 후, 배양 배지를 제거하고, 1% FBS를 함유한 새 배지를 공급했다. 감염 24시간 및 48시간 후, 세포 배양 상청액을 모아서, 원심분리로 청징화한 뒤, 젤라틴 공중합된 소듐 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아마이드 겔(Sigma Chemicals, 미주리 세인트루이스 소재)에서 전기영동 처리했다. 이러한 겔을 그 다음 세척하고, 반응 완충액(50mM Tris-HCl(pH 7.4), 0.02% NaN₃ 및 10mM CaCl₂)에 담궈, 일정한 진탕하에 37℃에서 16시간 동안 항온배양하고, 염색 및 탈색시켰다. 본 분석에 동량이 사용되었는지를 확인하기 위해 배양 상청액 중의 단백질 농도를 측정했다. MMP-2 및 -9의 상대적 활성은 ImageQuant 소프트웨어(Amersham Pharmaci Biotech, 뉴저지 피스카타웨이 소재)를 사용하여 정량했다.

6. 면역블롯팅

다양한 항체를 이용한 면역블롯팅은 종래 기술된 바와 같이 실시했다(Saeki et al., 2000). 간략히 설명하면, 세포를 트립신처리로 수거하고, 용해 완충액(62.5mM Tris-HCl, 2% SDS, 10% 글리세롤 및 4M 우레아)에 재현탁시켰다. 단백질 샘플(각 50㎍)는 용해 완충액과 5% 2-머캅토에탄올(Bio-Rad Laboratories, 캘리포니아 헤르큘레스 소재) 용액 20㎕에 희석하여, 95℃의 수조에서 5분 동안 가열했다. 그 다음, 단백질 추출물을 수직 슬래브형 겔 전기영동 셀(Bio-Rad)에 로딩하여 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)로 분리했다. 이와 같이 분리된 단백질을 겔로부터 니트로셀룰로스 막(Hybond-ECL; Amersham Pharmacia Biotech, 영국 버킹햄셔 소재)으로 전이시킨 다음, 차단 용액(PBS 중에 5% 분유 및 0.3% Tween 20 용액)으로 1시간 동안 차단시켰다. 이러한 막을 MMP-2, MMP-9 및 p85 PI3K(산타크루즈 바이오테크놀로지), 인산화된 FAK(파밍겐, 캘리포니아 산디에고 소재), MDA-7(인트로겐 테라퓨틱스, 인크. 텍사스 휴스턴 소재) 및 β-액틴(시그마 케미컬스)에 대한 1차 항체와 항온배양했다. 그 다음, 이 막을 양고추냉이 퍼옥시다제 표지된 2차 항체(아머샴, 영국)와 항온배양했다. 마지막으로, 단백질을 아머샴의 개량 화학발광 웨스턴 블롯팅 검출 시스템을 사용하여 개량 화학발광 필름(Hyperfilm; 아머샴, 영국) 상에 가시화했다. 각종 처리 후 단백질 발현 농도의 상대적 변화는 ImageQuant 소프트웨어(Amersham Pharmaci Biotech, 뉴저지 피스카타웨이 소재)를 사용하여 정량분석하고, PBS 처리된 세포의 값을 1로 하여 그 비로서 나타냈다.

7. 폐 전이 실험 모델

MDA-7/IL-24 생산이 전이를 억제할 수 있는지의 여부를 조사하기 위하여, 폐전이 실험 모델(Ramesh et al., 2001)을 사용한 동물 실험을 수행했다. 간략히 설명하면, A549 종양 세포(5x10⁶)를 150mm 조직배양판에 접종한 뒤, PBS, Ad-luc 또는 Ad-mda7(2500vp/세포)로 처리했다. 감염 6시간 후, 세포를 수거하고, 세척한 뒤, 멸균 PBS로 최종 부피가 1ml이 되게 재현탁시켰다(1x10⁶ 세포/100㎕). 세포를 암컷 누드 마우스의 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사했다. 각 처리 그룹 마다 5마리씩 사용했다. 세포 주사 후 3주째에, 동물을 CO₂ 흡입으로 사망시켰다. 3 그룹의 각 마우스 유래의 폐로 인디아 잉크를 기관내로 주사하고, 페케트(Fekete) 용액에 담궈, 종래 기술된 바와 같이 고정시켰다(Ramesh et al., 2001). 종양 전이에 미치는 MDA-7/IL-24의 효과는 해부 현미경으로 관찰되는 각 폐의 전이 종양의 수를 계수하여 측정했다. 본 실험은 2회 실시하고, 이 실험의 평균값을 결과로 기록했다.

8. 통계 분석

실험 결과의 통계적 유의성은 ANOVA 및 Mann-Whitney 순위-합계 시험을 사용하여 계산했다. P값이 0.05 미만인 경우에 그룹 사이의 차이가 통계적으로 유의성인 있는 것으로 해석했다.

결과

1. MDA-7/IL-24는 종양 세포 이동을 억제한다.

Ad-mda7로 처리된 종양 세포는 Ad-luc 또는 PBS로 처리된 세포 보다 이동성이 유의적으로 적었다(P=0.002). 이동 세포(A549 및 H1299)수는 PBS 처리(>500) 또는 Ad-luc 처리(>350) 후보다 Ad-mda7 처리(<250 세포) 후에 유의적으로 적었다. 이러한 억제 효과는 24시간째보다 48시간째 훨신 효과적인 것으로 관찰되었다. 세포 이동의 억제가 MDA-7/IL-24 매개 세포사에 기인하는 것이 아님을 입증하기 위하여, 별도 실험으로서 PBS, Ad-luc 및 Ad-mda7 처리된 세포를 감염 후 24시간 및 48시간째 세포 생존성 분석으로 처리한 실험을 병행했다. 이 시점들에서 세포 생존성의 유의적 차이는 전혀 관찰되지 않았는데, 이는 MDA-7/IL-24에 의한 이동 억제가 세포사에 기인하는 것이 아님을 시사해준다(도 67B). 형질도입 24시간 후, 3가지 실험 그룹은 모두 중층될 수 있는 바, 유의적 세포사를 나타내지 않았다. 48시간째, 약간의 세포가 나타나지만, 이 벡터 용량에서는 형질도입 후 72시간 및 96시간째에야 Ad-mda7 매개의 사망이 유의적으로 관찰되었다. 이러한 결과는 MDA-7/IL-24가 세포 이동을 억제한다는 것을 보여주는 것이다.

2. MDA-7은 종양 세포 침윤을 억제한다.

Ad-mda7로 처리된 종양 세포는 매트리겔 침윤 분석 필터의 외막에 적은 세포수로 알 수 있듯이, PBS 또는 Ad-luc로 처리된 세포에 비해 침윤성이 훨씬 적었다(도 68). A549 세포 및 H1299 세포에서 모두 침윤 세포수가, PBS(>140 세포) 또는 Ad-luc(>150 세포) 처리 후보다 Ad-mda7(<50세포; P=0.001) 처리 후 유의적으로 적었다. MDA-7에 의한 억제 효과는 LY94001, PI3K 억제제 또는 MMP-II 억제제로 처리된 세포에서 관찰되는 억제 효과와 유사했다. 세포 생존성 분석은 이러한 억제가 MDA-7/IL-24 매개의 세포사의 결과가 아님을 보여주었다. 이러한 결과는 MDA-7/IL-24가 세포 침윤성을 억제한다는 것을 시사해준다.

3. MDA-7은 세포이동 및 침윤과 관련된 단백질 생산을 하향조절한다.

세포 이동 및 침윤 시그날전달 경로와 관련있는 단백질의 조절에 대하여 웨스턴 블롯 분석을 통해 조사했다. 야생형 p53을 함유하는 세포주(A549) 및 p53 무효성인 세포주(H1299)를 사용했다. MDA-7IL-24 생산은 PBS 또는 Ad-luc 처리된 종양 세포에서는 관찰되지 않았으며, Ad-mda7 처리된 세포에서는 다량의 MDA-7IL-24 생산이 관찰되었다. H1299 및 A549 종양 세포주에서의 MDA-7/IL-24 단백질의 과잉생산은 p85 PI3K 및 pFAK의 생산을 감소시키고, pJNK, p38 MAPK 및 p44/42 MAPK의 생산을 증가시켰다. 이에 반해, PBS 또는 Ad-luc로 처리된 세포에서는 상기 단백질들의 생산에 유의적 변화가 관찰되지 않았다. 또한 p85 PI3K 및 pFAK의 억제는 PI3K 억제제 LY 294002로 처리된 세포에서도 관찰되었는데, 물론 두 세포주 사이의 억제 정도의 차이는 있었다. MDA-7을 과발현하는 세포주들에서의 pFAK 발현의 감소는 LY294004에 의해 관찰되는 감소보다 훨씬 컸다. 또한, LY 294002 처리는 H1299 세포에서 p38 MAPK 및 p44/42 MAPK의 생산을 증가시켰다. A549 세포에서, LY 294004는 pJNK 및 p44/42 MAPK의 생산을 증가시켰다. 이러한 결과는 LY 294002처럼 MDA-7이 본 연구에서 조사된 다른 시그날전달 분자에는 유의적 영향을 미침이 없이 PI3K만을 선택적으로 억제한다는 것을 보여준다.

4. MDA-7/IL-24에 의한 종양 세포의 매트릭스 메탈로프로테이나제 생산의 억제

다음으로는 MDA-7을 과잉생산하는 종양 세포를 이용하여 자이모그래피와 웨스턴 블롯 분석을 통해 MMP 조절에 대해 조사했다. 자이모그래피 및 웨스턴 블롯 분석은 MMP-2 및 -9 단백질의 생산이 PBS 또는 Ad-luc로 처리된 세포와 비교했을 때 Ad-mda7로 처리된 A540 종양 세포에서 감소되었음을 보여주었다. Ad-mda7로 처리된 H1299 세포에서는 PBS 또는 Ad-luc로 처리된 세포에 비해, MMP-9이 아닌 MMP-2의 감소가 관찰되었다. 자이모그래피 분석 결과는 웨스턴 블롯 분석 결과와 상관성이 있었다. 즉, Ad-mda7은 p53 야생형 및 p53 무효성 NSCLC 세포주 모두에서 MMP 발현 및 활성을 조절할 수 있다.

5. MDA-7/IL-24는 실험용 폐전이 모델을 억제한다.

누드 마우스에 A549 사람 폐암 세포를 이용한 실험용 폐전이 모델에서, Ad-mda7로 처리된 종양 세포가 주사된 마우스에서 형성되는 폐종양 혹의 수는 PBS 또는 Ad-luc로 처리된 종양 세포가 주사된 마우스에서 형성된 폐종양 혹의 수보다 훨씬 적었다(P=0.01)(도 69). 실험용 전이의 억제는 조직학적 조직 염색 결과(보다 적은 수의 종양을 나타냄)와 상관성이 있었다.

실험용 전이의 억제의 원인이 세포사만이 아님을 추가 조사하기 위하여, 추가로 생체내 실험을 수행했다. 폐종양을 보유한 동물을 DOTAP:Cho1-mda7로 처리한 결과, 미처리 또는 DOTAP:Chol-CAT 복합체로 처리된 마우스에 비해 실험 전이의 유의적 억제(P=0.001)가 관찰되었다(도 70). 결과적으로, 실험 전이의 억제 특성은 종양 세포 이동 및 침윤의 억제로 인한 간접적인 상관작용인 것으로 간주된다. 이러한 결과는, MDA-7이 생체내 종양 세포 이동 및 침윤을 억제하고 시험관내 관찰된 결과와 일치된 결과를 보여준다는 것을 입증해준다.

실시예 33: 리포좀 매개의 MDA-7/IL-24 유전자 전달 후의 폐암 성장의 국소 및 전신 억제

재료 및 방법

1. 재료

모든 지질(DOTAP, 콜레스테롤)은 Avanti Polar Lipids(앨라배마 알바스터 소재)에서 구입했다. Ham's/F12 배지 및 태아 송아지 혈청(FBS)은 GIBCO-BRO-Life Technologies(뉴욕주 뉴욕시 소재)에서 구입했다. 폴리클로날 토끼 항-사람 MDA-7 항체는 Introgen Therapeutics, Inc.(텍사스 휴스턴 소재)에서 구입하고, 항마우스 CD31은 Santa Cruz Biotechnology, Inc.(캘리포니아 팔로 알토 소재)에서 구입했다.

2. 세포주 및 동물

사람 비소세포 폐 암종 세포주 A549는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에서 입수하고, 10% FBS, 1% 글루타메이트 및 항생제가 보충된 Ham's-F12 배지에서 유지시켰다. 쥐 UV2237M 세포는 휘들러 박사(Isaiah J. Fidler; M.D. Anderson Cancer Center)로부터 입수하여 문헌(Ramesh et al., 2001)에 기술된 바와 같이 유지시켰다. 세포를 정기적으로 계대배양하고, 마이코플라즈마의 존재를 검사했다. 본 연구에 사용한 4주 내지 6주령의 암컷 BALB/c 누드(nu/nu)마우스(Harlan-Sprague Dawley Inc., 인디애나 인디애나폴리스 소재) 및 C3H/Ncr 마우스(National Cancer Institute, 매릴랜드 프레데릭스버그 소재)는 무균 환경에서 보육하고, 동물 보호 및 사용에 관한 협회의 지침서에 따라 취급했다.

3. 플라스미드 정제

본 연구에 사용한 플라스미드는 pVax 플라스미드 벡터(Invitrogen, 캘리포니아 칼스배드 소재)에 클로닝하고, 문헌(Templeton et al., 1997; Gaensler et al., 1999)에 기술된 바와 같이 정제했다. 간략히 설명하면, 박테리아 β-갈락토시다제(Lac-Z), 클로람페니콜 아세틸 트란스퍼라제(CAT) 또는 사람 mda-7 cDNA를 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 제어하에 보유하는 플라스미드는 대장균 숙주 균종 DH5α를 이용하여 카나마이신 내성하에 성장시켰다. 정제된 플라스미드의 내독소 농도는 발색성 LAL(limulus amebocyte lysate) 반응속도론 분석 키트(Kinetic-QCL; Biowhittaker, 매릴랜드 워커스빌 소재)를 사용하여 측정했다. 정제된 플라스미드 DNA의 농도와 순도는 OD260/280 비로 측정했다.

4. DOTAP:Cho1 리포좀의 합성 및 DOTAP:Chol-DNA 복합체의 제조

DOTAP:Cho1 리포좀은 문헌(Chada et al., 2003; Templeton et al., 1997)에 기술된 바와 같이 합성하고, 체눈이 감소되는 와트만 필터(Kent, UK)(1.0, 0.45, 0.2 및 0.1㎛)를 통해 압출시켰다. DOTAP:Cho1-DNA 복합체는 마우스에게 주사하기 2 내지 3시간 전에 새로 제조하여 사용했다.

5. 입자 크기 분석

새로 제조한 DOTAP:Cho1-DNA 복합체는 N4 입자 크기 분석기(Coulter, 플로리다 마이애미 소재)를 사용하여 평균 입자 크기를 분석했다. 리포좀-DNA 복합체의 평균 입자 크기는 300nm 내지 325nm 사이였다.

6. 피하 종양 이종이식편에 미치는 DOTAP:Cho1-mda7 복합체의 효과

모든 실험에서 100㎕ 멸균 PBS(인산염 완충식염수)에 현탁시킨 5x10⁶ 종양 세포(A549)를 우측 등부분 옆구리에 주사했다. 종양이 4 내지 5㎟의 크기에 도달하면, 동물을 무작위로 나누어 처리를 개시했다. 종양 보유 동물은 6마리씩 4그룹으로 나누었다. 그룹 1에는 아무런 처리도 하지 않았다. 그룹 2에는 PBS를 처리하고, 그룹 3에는 DOTAP:Cho1-LacZ 복합체(50㎍/투여량)를, 그룹 4에는 DOTAP:Cho1-mda-7 복합체(50㎍/투여량)를 처리하였고, 모든 처리는 종양내 투여로 실시하고, 매일 총 6회 투여했다. 종양내 주사를 위해, 동물은 협회의 지침에 따라 메톡시플루란(Schering-Plough, 뉴저지 케닐워스 소재)으로 마취시켰다. 종양 측정은 관측자가 처리 그룹을 알지 못한 상태하에서 격일로 측정하여 기록하게하고, 종양 부피는 식[ V(㎣) = a x b²/2("a"는 가장 큰 수치이고 "b"는 수직 직경이다)]를 이용하여 계산했다(Saeki et al., 2002; Ramesh et al., 2001). 항종양 효능 데이터는 종양의 크기와 수를 모두 고려하기 위하여 각 그룹에 해당하는 모든 동물의 누적 종양 부피로서 나타내었다. 모든 실험에서, 종양 크기 변화의 통계적 유의성은 ANOVA로 측정했다.

마우스 종양 세포에 미치는 mda-7의 효과를 조사하기 위하여, 동계 종양 모델을 이용하여, 이를 위하여, C3H 마우스에게 쥐 UV2237m 섬유육종 세포(1x10⁶)를 피하 주사하고, 3그룹(n=8/그룹)으로 나누었다. 종양 크기가 4 내지 5㎟에 도다랗면, 동물에게 다음과 같은 처리를 종양내 실시했다: 무처리(대조군), DOTAP:Cho1-CAT 복합체, 또는 DOTAP:Cho1-mda-7 복합체. 치료 스케줄과 치료효과의 분석은 A549 종양 모델을 가지고 이미 기술한 바와 같이 실시했다. 실험은 통계적 분석 및 유의성을 위해 2회 반복했다.

7. MDA-7, 아폽토시스 및 CD31의 측정

nu/nu 마우스 또는 C3H 마우스에 각각 형성시킨 피하 A549 또는 UV2237m 종양을 수거하고, 4% 완충성 포르말린으로 고정시킨 뒤, 파라핀에 매립시키고, 4㎛ 절편으로 절단했다. 이러한 조직 절편을 문헌(Saeki et al., 2002; Ramesh et al., 2003)에 기술된 바와 같이, 면역염색하여 MDA-7 돌연변이유전자의 발현을 조사했다. MDA-7 양성으로 염색된 종양 세포는 그 다음 명시야 현미경으로 분석하고, 처리 그룹을 알지 못한 채 관측자가 정량분석하게 했다. 시편당 시야를 적어도 5곳 이상 분석했다. 처리 후 종양 세포의 운명을 측정하기 위하여, 종양 절편을 말단 데옥시뉴클레오타이드 트란스퍼라제(Tdt) 키트(Boehringer Mannheim, 인디애나 인디애나폴리스 소재)를 이용하여 아폽토시스 세포사에 대해 염색하고, 문헌에 기술된 바와 같이(Saeki et al., 2002; Ramesh et al. 2001) 메틸렌 블루 또는 메틸 그린으로 대비염색했다. 모든 염색 과정에는 적당한 음성 대조군을 포함시켰다. CD-31 염색에서는 조직을 종래 기술된 바와 같이(Saeki et al., 2002; Ramesh et al. 2003) 항-CD31 항체로 염색했다.

8. 처리후 종양 특성

mda-7 유전자의 치료 효과를 측정하기 위하여, 최종 처리 후 마우스로부터 종양을 수거하여 조직병리학적 평가를 수행했다. 분석은 처리 그룹을 알지 못한채 병리학자가 실시하게 했다.

9. 실험용 폐전이 모델에 미치는 DOTAP:Cho1-mda7 복합체의 효과

폐 전이에 미치는 DOTAP:Cho1-mda-7 복합체의 효과를 검사하기 위하여, 암컷 누드 마우스의 꼬리 정맥으로 멸균 PBS 100㎕에 현탁된 A549 종양 세포 10⁶을 주사했다. 6일 후, 마우스를 3개 그룹으로 나누어 다음과 같이 처리했다: 무처리(그룹 1), DOTAP:Chol-CAT 복합체(그룹 2) 및 DOTAP:Chol-mda-7 복합체(그룹 3). 각 그룹 당 마우스 8마리를 사용했다. 모든 처리에는 50㎍의 리포좀-DNA 복합체를 사용하고, 27게이지의 주사기를 사용하여 매일 총 6회에 걸쳐 꼬리 정맥을 통해 투여했다. 최종 투여하고 3주 후 동물을 CO₂ 흡입으로 사망시켰다. 각 마우스의 폐에 인디아 잉크를 기관내로 주입하고 페케테스 용액에 담궈 고정시켰다(Ramesh et al., 2003). 전신 mda-7 유전자 치료의 치료 효과는 처리 그룹을 알지 못한채 관측자가 해부 현미경을 통해 각 폐 중의 전이 종양의 수를 계수하여 측정하게 했다. 데이터를 분석하고, 그룹 간의 차이는 맨휘트니 순위-합계 검정을 통해 P값이 <0.05이면 통계적 유의성인 있는 것으로 간주했다.

동계 폐종양 모델로서, C3H 마우스에게는 쥐 UV2237 섬유육종 세포(1x10⁶)를 주사하고 3그룹으로 나누었다(n=7/그룹). 주사 6일 후, 동물을 다음과 같이 처리했다: 무처리, DOTAP:Chol-CAT 복합체, 또는 DOTAP:Chol-mda-7 복합체. 처리 스케줄과 치료 효과의 분석은 A549 모델에서 설명한 바와 동일하게 실시했다. 실험은 통계적 유의성을 위해 2회 반복실시했다.

결과

1. DOTAP:Cho1-mda-7 복합체를 이용한 종양 세포의 시험관내 형질감염

DOTAP:Cho1 리포좀이 플라스미드 DNA를 사람(A549) 및 마우스(UV2237m) 종양 세포로 전달하는 특성은 사람MDA-7/IL-24 단백질을 암호화하는 발현 플라스미드를 사용하여 조사했다. mda-7 플라스미드 DNA와 복합체를 형성한 DOTAP:Cho1 리포좀으로의 형질감염은 A549 및 UV2237m 종양 세포에서 24시간 및 48시간째 외인성 MDA-7 단백질을 발현시켰다. DOTAP:Chol-mda-7로 형질감염된 A549 및 UV2237m 세포의 조직배양물의 상청액에서는 24시간이 아닌 48시간째 분비형 MDA-7 단백질의 존재가 확인되었다. 48시간째 분비형 MDA-7 단백질의 검출은 분비형 MDA-7 단백질이 24시간째 검출가능했던 Ad-mda7 처리 세포에서의 관찰(Mhashilkar et al., 2001)과 상이한 것이었다. 이는, DOTAP:Chol.리포좀을 이용하여 수득되는 돌연변이성 MDA-7 발현이 Ad-mda7에 의해 수득되는 것보다 적다는 것을 암시한다. 분비형 MDA-7 단백질은 PBS 처리된 세포에서는 관찰되지 않았다. 즉, DOTAP:Cho1 리포좀은 mda-7 DNA를 종양 세포로 효과적으로 전달하여, Ad-mda7 보다는 적지만 돌연변이성 MDA-7 단백질을 세포내 및 분비 생산함을 알 수 있었다.

2. MDA-7은 피하 종양 성장을 억제한다.

A549 사람 폐의 피하 종양의 성장을 억제하는 DOTAP:Cho1-mda-7 복합체의 특성은 nu/nu 마우스에서 평가했다. 종양 보유 마우스에 대한 종양내 경로를 통한 DOTAP:Cho1-mda-7 복합체의 처리는, 미처리, PBS 처리 또는 DOTAP:Cho1-LacZ 복합체 처리된 동물의 종양 성장과 비교할 때 종양 성장을 유의적으로 억제했다(P=0.001)(도 71A). 종양의 조직병리학적 분석은 각 처리 그룹 간의 종양 침윤 세포의 유의적 변화를 나타내지 못했다.

다음에는, C3H 마우스의 피하 쥐 종양에 미치는 mda-7 유전자의 치료 효과를 평가했다. UV2237m 종양을 보유한 마우스를 3그룹으로 나누었다: 1번째는 무처리 그룹, 2번째는 DOTAP:Cho1-CAT 복합체 처리 그룹; 3번째는 DOTAP:Cho1-mda-7 복합체 처리 그룹이다. UV2237 종양의 성장은 DOTAP:Cho1-mda-7 복합체의 종양내 투여로 처리된 마우스에서, 다른 두 대조군의 종양 성장에 비해 유의적 억제를 보였다(P=0.01; 도 71B).

이와 같이 관찰된 종양 억제 효과가 mda-7 유전자 발현에 기인하는 것인지를 입증하기 위하여, 주사 48시간 후에 수득한 피하 A549 종양 및 UV2237m 종양을 가지고 MDA-7 단백질 발현 여부를 평가하는 면역조직화학 분석을 실시했다. 그 결과, MDA-7 단백질 발현은 DOTAP:Cho1-mda-7 복합체로 처리된 A549 종양 및 UV2237m 종양에서 각각 18% 및 13%로 관찰되었고(P=0.001; 도 71C); 무처리, PBS 처리, DOTAP:Cho1-LacZ 처리 또는 DOTAP:Chol-CAT 복합체 처리 동물에서는 유의적으로 높은 수가 관찰되었다. DOTAP:Cho1-CAT 복합체로 처리된 A549 종양에서는 약간의 비특이적 염색이 관찰되었다. MDA-7 발현 패턴의 분석은 강한 세포내 염색뿐만 아니라 보다 확산된 염색 패턴(세포외 염색으로 간주됨)을 보였다. 이러한 염색 패턴은 사람 종양 이종이식편 및 쥐 동계 종양 모두에서 관찰되었다.

3. DOTAP:Cho1-mda-7 복합체로 처리된 폐종양의 아폽토시스 세포사

DOTAP:Chol-mda-7 복합체 처리 후 종양 세포의 운명을 측정하기 위하여, nu/nu 마우스 및 C3H 마우스 유래의 피하 종양(A549, UV2237m)을 문헌(Saeki et al., 2002)에 기술된 바와 같이 아폽토시스 세포사에 대해 분석했다. 아폽토시스 세포사의 지표인 TUNEL 양성 세포의 유의적(P=0.001) 수준(A549 13% 및 UV2237m 9%)이, 미처리, PBS 처리, DOTAP:Chol-CAT 처리 또는 DOTAP:Chol-LacZ 처리된 대조 동물 유래의 종양과 비교했을 때 DOTAP:Chol-mda-7 처리된 종양에서 관찰되었다.(도 72).

4. DOTAP:Chol-mda-7 복합체로 처리된 폐종양의 CD31 양성 염색성의 감소

종양 혈관신생에 미치는 mda-7 처리의 효과를 측정하기 위하여, 종양 조직을 문헌(Saeki et al., 2002; Ramesh et al., 2003)에 기술된 바와 같이 CD31 염색법으로 처리했다. CD31-양성 염색의 수준은 미처리, PBS 처리, DOTAP:Chol-CAT 처리 또는 DOTAP:Chol-LacZ 처리된 마우스 유래의 종양 조직과 비교했을 때 DOTAP:Chol-mda-7 처리된 A549 종양 조직(10%) 및 UV2237m 종양 조직(5.8%)에서 유의적으로(P=0.01) 감소된 수준이 관찰되었다(도 73). CD31 염색성 감소는 혈관신생의 감소를 나타낸다.

5. MDA-7은 실험용 폐전이를 억제한다.

다음에는, 사람 A549 폐 암세포 또는 마우스 UV2237m 세포를 이용한 실험용 폐전이 모델에서의 DOTAP:Chol-mda-7 복합체의 활성을 조사했다. 종양 세포의 정맥내 전달은 폐로 신속히 종양을 파종시키며, 30일 후 압도적인 폐종양 부하로 인해 동물은 족게된다. A549 및 UV2237m 폐 종양을 보유한 누드 마우스 또는 C3H 마우스의 DOTAP:Chol-mda-7 복합체로의 처리는 폐 전이 수를 PBS 처리 또는 DOTAP:Chol-CAT 복합체 처리시 보다 유의적으로(P<0.05) 저하시켰다(도 74). UV2237m 마우스에서, DOTAP:Chol-CAT 복합체 처리는 PBS 처리된 대조군에 비해 종양 혹 수의 유의적 감소를 초래했는데, 이는 약간의 비특이적 종양억제 활성을 암시한다(도 74). 또한, 이러한 치료는 이환율 및 사망률의 감소로 확인되듯이, 치료 관련 독성이 관찰됨이 없이 충분히 허용적인 것이었다.

실시예 34: Ad-mda7과 트라스트주마브의 조합 치료는 her-2/neu 과발현성유방암세포의 세포사를 증가시킨다.

재료 및 방법

1. 세포주

SKBr3 및 MCF-7 유방암세포는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에서 입수했다. MCF-7-Her-18 세포는 미엔-치에 헝 박사로부터 증여받았다. 이 세포는 10% 태아 송아지 혈청, 10mmol/L 글루타민, 100U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(GIBCO Invitrogen Corporation, 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재)이 보충된 고포도당 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 하에서 유지시켰다.

2. 아데노바이러스 형질도입

mda-7 유전자를 보유하는 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad-mda7) 및 루시페라제 리포터 유전자를 보유하는 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad-Luc)는 Intrgen Therapeutics(텍사스 휴스턴 소재)로부터 입수했다. 6x10⁵ 종양 세포를 MOI 2500 바이러스 입자(vp)/세포의 Ad-mda7 및 Ad-Luc로 형질도입시켰다. 이 벡터의 용량은 형질도입 효율이 ≥70% 되게 선택된 것이다. 이러한 배양물에 헤르셉틴 5㎍/ml를 첨가했다.

3. 웨스턴 블롯

세포를 용해시키고 단백질 농도를 BioRad 분석법(Bio Rad laboratories, 캘리포니아 허큘레스 소재)에 따라 측정했다. 용해물은 10% SDS 겔을 이용하여 웨스턴 블롯 분석으로 분석했다. 각 레인에는 30 내지 50㎍의 단백질을 로딩하고 90V에서 2시간 동안 전기영동했다. 그 다음, 단백질을 겔로부터 1% 분유로 차단된 니트로셀룰로스 막으로 전이시키고, 1차 항체(β-카테닌, Akt 및 p-Akt; Santa Cruz Biotechnology, Inc., 캘리포니아 산타크루즈 소재)와 4℃에서 밤새 항온배양했다. 막을 세척하고, 2차 항체와 실온에서 1시간 동안 항온배양했다. 막을 발색시켜, 단백질 시그날을 개량 화학발광(ECL)-웨스턴 블롯팅 검출 시약(Amersham Biosciences, 영국 버킹햄셔)을 사용하여 검출했다. 막을 β-액틴에 대한 항체(Santa Cruz)와 항온배양하여 각 단백질의 로딩량을 측정했다. 결과는 농도계측으로 수득했다.

4. 동물 연구

누드 마우스는 챨스 리버 실험실(Charles River Laboratories, 매사츄세츠 윌밍톤 소재)에서 입수했다. 이 동물의 뒷목부위에 0.5mg 용량의 에스트로겐 펠릿을 주사했다. 2일 후, MCF-7-Her-18 세포를 마우스당 5x10⁶ 세포의 농도로 흉부 유방 지방체 중으로 주사했다. 종양의 크기가 100㎣에 도달하면, 마우스를 다음과 같은 6가지 처리 그룹으로 나누었다: 인산염 완충식염수(PBS), Ad-Luc 단독, Ad-mda7 단독, 헤르셉틴 단독, Ad-Luc+헤르셉틴 및 Ad-mda7+헤르셉틴. 이러한 바이러스 벡터들은 3주 동안 매주 1회씩 2x10¹⁰ 바이러스 입자의 용량으로 종양에 직접 주사했다. 헤르셉틴은 3주 동안 1주에 2회씩 동물마다 110㎍ 용량을 복강내 주사하여 투여했다. 종양 크기를 측정하고 죽이기 전까지 매주 2회씩 기록했다.

5. 통계적 분석

도면에 제시된 데이터들은 3회의 독립 실험의 평균값과 표준편차를 도시한 것이다. 종양 크기의 차이는 스튜던트 t 검정으로 유의성을 분석했다. 웨스턴 블롯의 농도계측도 스튜던트 t 검정으로 유의성을 분석했다.

결과

1. Ad-mda7 처리는 유방암세포의 성장을 억제한다.

유방암 세포주 SKBr3(Her2+) 및 MCF-7(Her2-)을 Ad-mda7 또는 Ad-luc로 처리하고 세포 생존성을 측정했다. 도 1에 제시된 바와 같이, Ad-mda7은 Her2+ 및 Her2- 유방 세포주 모두의 성장을 억제하는 바, MDA-7 매개의 사망이 Her2 상태와는 무관한다는 것을 시사한다. 이러한 결과는 또 다른 Her2+ 및 Her2- 유방암 세포주에서도 확인되었다. 헤르셉틴과 Ad-mda7의 조합 효과를 확인하기 위하여, 동일 세포주를 헤르셉틴 단독, 또는 Ad-mda7 또는 Ad-luc와의 조합으로 처리했다. 헤르셉틴은 Her2+ SKBr3 유방암세포의 사망을 유도하나, Her2- MCF-7 세포의 사망을 유도하지는 않았다. 저용량의 헤르셉틴과 조합된 Ad-mda7의 세포용해 활성은 Her2+ 세포에서만 크게 증가되어, 부가 이상의 사망률을 나타냈다. 이에 반해, Her2- 세포에서는 헤르셉틴에 의해 제공되는 세포독성의 유의적 차이가 관찰되지 않았다. Ad-luc는 헤르셉틴과 조합된 경우에도, 그 효과는 헤르셉틴 단독의 경우와 비슷했다. 이와 같은 연구 결과뿐만 아니라 또 다른 유방암 세포주에 대한 연구결과는, 도 1에 제시된 증가된 세포용해 활성이 Ad-mda7+헤르셉틴의 조합으로 처리된 Her2+ 세포에서 관찰되는 아폽토시스 유도 증가 때문이라는 것을 시사한다.

Ad-mda7과 헤르셉틴의 상승작용의 기작을 조사하고, 이러한 조합 상승작용을 이종이식 모델에서 실험했다. 불행히도, 앞 문단에 논의된 Her2+ 세포주는 누드 마우스에서 종양을 형성하지 않는 바, 모델 시스템을 변형시켜 MCF-7-Her-18 세포주를 이용했다. 이 세포주는 Her-2/neu 발현 벡터가 안정되게 형질감염된 Her2- MCF-7 세포 유래의 세포주이다.

2. Ad-mda7은 β-카테닌, Akt 및 p-Akt의 농도를 감소시킨다.

유방암세포주 및 폐암세포주의 Ad-mda7 처리는 Akt 및 p-Akt²의 발현을 감소시킨다. 또한, β-카테닌도 Ad-mda7에 의해 하향조절되는 것으로 밝혀져 있다. Ad-mda7과 함께 헤르셉틴이 β-카테닌, Akt 및 p-Akt 농도를 더 많이 감소시키는지의 여부를 조사하기 위하여, MCF-7-Her-18 세포를 Ad-mda7 또는 Ad-luc 단독 또는 헤르셉틴과의 조합으로 형질도입시켰다. Ad-mda7 2500vp/세포로 형질감염된 후, Akt, p-Akt 및 β-카테닌의 농도 감소가 관찰되었다. 세포를 Ad-mda7+헤르셉틴의 조합으로 처리한 경우에는 3가지 단백질 모두의 정지기 농도가 크게 감소되었다. 웨스턴 블롯 분석에서는 Ad-mda7과 헤르셉틴으로 형질감염된 후의 MCF-7-Her-18 세포에서 Akt의 발현 감소가 관찰되었다. 단백질 발현 감소는 PBS와 대조적으로 Ad-mda-7 및 헤르셉틴에 의해 관찰되었다. 하지만, 헤르셉틴+Ad-mda7의 조합은 Ad-mda-7 또는 헤르셉틴 단독과 비교했을 때 보다 유의적인 감소를 보였다(P<0.05). 대조용 아데노바이러스 루시페라제 벡터는 Akt 단백질 농도의 감소를 거의 또는 전혀 나타내지 않았다. 이와 마찬가지로, p-Akt의 웨스턴 블롯 분석에서도 유사한 결과를 보였다. Ad-mda-7 및 헤르셉틴 처리 후 p-Akt 단백질 농도는 PBS 및 Ad-luc 처리후보다 유의적으로 적었다. Ad-mda7+헤르셉틴 매개의 Akt 억제와 비교했을 때, 헤르셉틴+Ad-mda-7 조합의 p-Akt에 대한 억제 정도는 훨씬 큰 것으로 관찰되었다. 또 다른 β-카테닌에 대한 웨스턴 블롯 분석에서도 헤르셉틴+Ad-mda-7 조합 치료가 Ad-mda7 또는 헤르셉틴 단독 처리후보다 β-카테닌의 발현을 더욱 많이 감소시키는 것으로 확인되었다.

3. Ad-mda7 + 헤르셉틴은 누드 마우스의 종양 성장을 억제한다.

MCF-7-Her-18 세포로부터 생성되는 피하 종양을 보유한 누드 마우스에게, 종양 크기가 100㎣에 도달 후 Ad-mda7 또는 Ad-Luc를 종양내 주사하고, 헤르셉틴은 복강내 주사를 통해 전신 투여했다. PBS 또는 Ad-Luc로 처리된 종양은 크기가 계속하여 증가하였지만, Ad-mda7 단독 또는 헤르셉틴 + Ad-mda7의 조합이 주사된 종양은 대조군에 비해 성장의 유의적 억제를 나타내었다. 모든 그룹의 동물에 대한 처리는 종양이 약 100㎣에 도달하면 개시했음을 주의해야 한다. PBS 및 Ad-luc 처리된 종양의 성장률은 비슷했다. 하지만, 도 5에 제시된 반응속도론 분석으로부터 분명히 알 수 있듯이, Ad-mda7 또는 헤르셉틴으로 처리된 종양의 성장률은 상당히 지연되었다. 헤르셉틴 및 Ad-Luc+헤르셉틴으로 처리된 종양은 매우 유사한 성장 패턴을 보이는 바, Ad-Luc의 종양억제 효과가 부족하다는 것이 확인되었다. Ad-mda7 단독치료로 처리된 종양은 헤르셉틴 단독치료로 수득되는 수준보다 다소 높은 성장 억제율을 보였다. 하지만, Ad-mda7+헤르셉틴의 조합은 적어도 15일 동안 증가된 활성 및 거의 완전한 성장 억제를 나타냈으며, 그 후 종양은 서서히 성장하는 것으로 보였다. 일반적으로 사용되는 성장률의 대용물은 종양 2배화에 걸리는 시간이다. 이는, PBS 및 Ad-Luc 대조군의 경우에는 각각 5일 및 11일로 나타난다. 헤르셉틴과 Ad-Luc+헤르셉틴 처리된 종양에서는 각각 16일과 14일경에 2배가 된다. Ad-mda7로 처리된 종양은 약 21일경에 2배 크기가 되었고, 이에 반해 Ad-mda7+헤르셉틴의 조합은 28일을 지나서야 종양 크기가 2배가 되었다.

4. Ad-mda7 및 헤르셉틴의 조합 치료에 의한 HER2/neu 과발현성 유방암세포의 아폽토시스 증가

HER-2/neu를 과발현하는 MCF-7 유방암 세포주는 Ad-mda7, 헤르셉틴, 대조용 아데노바이러스 루시페라제 벡터(Ad-Luc) 및 헤르셉틴과 Ad-mda7 및 Ad-Luc 각각의 조합으로 형질도입시켰다. 세포 생존성은 비색(MTT) 분석, 및 형광표지세포분류 분석(FACS)으로 측정했다. Bcl-2 및 PARP 발현은 웨스턴 블롯으로 평가했다.

MCF/HER2- 18 세포에서의 Ad-mda7 및 헤르셉틴 조합 처리는 MTT 분석에서 확인되듯이 헤르셉틴 또는 Ad-mda7 단독 처리시에 비해 성장의 급격한 감소를 제공했다(P<0.01 ANOVA). 또한, FACS 분석은 상기 조합 치료 시, 유의적인 아폽토시스 세포사를 나타냈다. 아폽토시스는 웨스턴 블롯 분석에서 PARP 절단 및 Bcl-2 발현 감소를 통해 확인했다.

실시예 35: MDA-7은 이본쇄 RNA 활성화 단백질 키나제 PKR과 물리적 관련성이 있다.

재료 및 방법

1. 세포주 및 시약

A549(wt p53) 및 H1299(p53 무효성) 사람 폐암세포주는 문헌에 기술된 바와 같이(Pataer et al., 2002) 미국 모식균 배양수집소에서 입수했다. PKR+/+ 및 PKR-/- 세포는 바버 박사(Glen N Barber, University of Miami School of Medicine)로부터 입수했다. PKR+/+ 및 PKR-/- 세포는 10% 태아 송아지 혈청, 10mM 글루타민, 100 단위/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)(Life Technologies, Inc., 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재) 중에서 5% CO₂ 대기, 37℃하에 유지시켰다. 사이클로헥시미드(CHX)는 Sigma Chemical Co.(미주리 세인트루이스 소재)로부터 입수했다. 재조합 MDA-7 단백질은 Introgen Therapeutics(텍사스 휴스턴 소재)로부터 입수했다.

2. 아데노바이러스 생산

Ad-mda7, Ad-bak, Ad-lacZ 및 Ad-Luc 벡터의 작제는 문헌(Pataer et al., 2002)에 보고된 바와 같이 실시했다. 다양한 암세포주에 대한 아데노바이러스 벡터의 형질도입 효율은 세포를 Ad-LacZ로 감염시킨 뒤, 세포의 적어도 70%를 형질도입시키는데 필요한 역가를 측정하여 계산했다.

3. 유세포측정 분석

아폽토시스 세포의 수는 프로피듐 요오다이드 염색과 FACS 분석을 통해 측정했다. 세포를 수거한 뒤, 원심분리로 펠릿화하고, 50㎍/ml 프로피듐 요오다이드, 0.1% 트리톤 X-100 및 0.1% 구연산나트륨을 함유하는 인산염 완충 식염수에 재현탁시켰다. 샘플을 4℃에서 1 내지 3시간 동안 보관하고, FACS 분석(Becton-Dickenson FACScan, Mountain View, CA; FL-3 channel)전에 볼텍싱하여 사용했다.

4. 실시간 PCR

RT-PCR은 Thermoscript RT-PCR 시스템 키트를 공급업체(Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)의 지침에 따라 사용하여 수행했다. 총 RNA는 TRIzol 추출법(Life Technologies)의 프로토콜에 따라 분리하고, 각 샘플 1㎍을 2mM 데옥시뉴클레오타이드 혼합물, 100mM DTT, RNase 억제제 40 단위, 랜덤 프라이머 50ng 및 Thermoscript 역전사효소 15단위를 함유하는 반응액에서 상보성 DNA(cDNA)로 역전사시켰다. 실시간 PCR은 문헌(Vorburger et al., 2002)에 보고된 바와 같은 프로토콜에 따라 수행했다.

5. 웨스턴 블롯 분석

형질감염 48시간 후, 세포 추출물을 제조하고 면역블롯 분석은 이하에 제시되는 항체를 이용하여 문헌(Pataer et al., 2002)에 기술된 바와 같이 수행했다. 사용한 항체는 다음과 같다: p53에 대한 모노클로날 항체는 PharMingen(캘리포니아 산디에고 소재)으로부터 구입했다. 항-PKR (K-17), 항-p-액틴, 항-stat3 (F-2) 및 인산화 특이적 항-stat3 (B-7) 항체는 Santa Cruz Biotechnology(캘리포니아 산타크루즈 소재)로부터 구입했다. MDA-7에 대한 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체는 Introgen Therapeutics Inc.(텍사스 휴스턴 소재)로부터 입수했다.

6. 공면역침전 분석

세포를 48시간 동안 Ad-mda7 또는 Ad-Luc로 처리한 뒤, RIPA 완충액(1x PBS, 1% Nonidet P-40, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS) 중에 용해시켰다. 세포 용해물 500㎕를 단백질 A/G 아가로스 20㎕와 4℃에서 30분 동안 항온배양했다. 사전청정화된 세포 추출물에 1차 항체를 첨가하고 완만한 진탕하에 4℃에서 밤새 항온배양했다. 이 혼합물에 단백질 A/G 아가로스를 첨가하고, 4시간 동안 항온배양했다. 2500rpm에서 5분간 4℃에서 원심분리하여 펠릿 비드를 형성시켰다. 이 펠릿을 RIPA 완충액 1ml로 4회 세척했다. 최종 세척 후, 1X SDS-PAGE 샘플 완충액 50㎕를 비드에 첨가했다. 이 혼합물을 볼텍싱한 후, 5분 동안 비등가열했다. 혼합물을 2500rpm에서 1분동안 원심분리한 뒤, 상청액을 겔 위에 로딩했다.

7. 세포 국재화 연구

A549 세포 및 H1299 세포(5x10⁴ 세포/웰)를 70% 융합성에 도달할때까지 챔버 슬라이드에서 성장시키고, Ad-luc, Ad-mda7 또는 PBS로 형질감염시켰다. 48시간 후, 세포를 PBS로 세척하고, 새로 만든 4% 파라포름알데하이드/PBS로 15분 동안 고정시켰다. 그 다음, 세포를 0.2% Triton X-100과 4℃에서 20분 동안 반응시켜 투과성이 되게 만들고, 1% 정상 염소 혈청을 사용하여 1시간 동안 차단시켰다. 토끼 폴리클로날 항-PKR(K-17) 및 마우스 모노클로날 항-MDA-7을 4℃에서 밤새 항온배양하고, 로다민 또는 플루오레세인-5-이소티오시아네이트 2차 항체로 37℃에서 30분 동안 발색시켰다. 그 다음, 세포를 형광현미경을 통해 육안조사하고, 그 다음 동일초점 현미경으로 평가했다.

8. 통계 분석

보고된 데이터는 3회의 독립된 실험의 평균값이며, 막대는 표준편차(SD)를 나타낸다.

결과

1. Ad-mda7은 사람 폐암세포에서 아폽토시스 및 PKR 유도를 유발한다.

아폽토시스의 유세포측정 분석은 A549(wt p53) 및 H1299(무효성 p53) 사람폐암세포를 Ad-mda7, Ad-luc 및 PBS로 감염시킨 후 48시간째 수행했다. Ad-luc 및 PBS와 비교했을 때, Ad-mda7은 A549 및 H1299 사람폐암세포에서 높은 수준의 아폽토시스를 초래했다. Ad-mda7이 시험관내에서 PKR 유도를 유발할 수 있는지의 여부를 조사하기 위하여, Ad-mda7 처리된 A549 세포를 웨스턴 블롯 분석으로 평가했다. Ad-mda7 처리는 A549 세포에서 PKR을 용량 의존적으로 유도했다. 저농도의 Ad-mda7(500vp/세포; 25pfu/세포)에서도 PKR 유도를 유발했지만, PKR 농도는 Ad-mda7 용량에 따라 계속 증가되었다. 이와 유사한 PKR 유도가 H129 세포에서도 관찰되었다.

2. 세포내 MDA-7 단백질은 Ad-mda7 유도성 세포사에서 중요한 역할을 한다.

최근 연구에서는 Ad-mda7 형질도입된 세포가 가용성 형태의 MDA-7 단백질을 분비하여, 형질도입되지 않은 주변 암세포에도 방관자 사망 효과를 유발할 수 있다고 보고하고 있다(Mhashilkar et al., 2001). Ad-mda7 형질도입된 세포 용해물은 약 30kD 및 23kD에서 MDA-7의 면역반응성 이중선을 보이는 반면, 상청액 샘플은 약 40kD에서 새로운 단백질 밴드를 보였다(Mhashilkar et al., 2001). 이에 따라, A549(wt p53) 및 H1299(무효성 p53) 사람 폐암세포에 미치는 분비형 MDA-7의 종양억제 효과를 조사했다. MDA-7 분비형 단백질은 A549 또는 H1299 폐암세포주에 대하여 세포성장 억제 또는 세포사를 유도하지 못했다. 이에 반해, Ad-mda7 처리는 en 폐암세포주 모두에 대해 세포성장억제 및 이에 포함되는 아폽토시스를 유도했다. MDA-7 분비형 단백질이 시험관내에서 PKR 유도를 유발할 수 있는지의 여부를 조사하기 위하여, MDA-7 단백질 처리한 세포를 웨스턴 블롯 분석으로 평가했다. MDA-7 분비형 단백질은 A549 세포에서 PKR을 유도하지 않았다. 이에 반해, Ad-mda7 처리된 A549 세포에서는 강력한 PKR 발현과 Stat3 인산화가 유도되었다.

3. MDA-7은 dsRNA 의존적 단백질 키나제 PKR과 물리적으로 상호작용한다.

A549 세포 및 H1299 세포에 존재하는 MDA-7 및 PKR 단백질의 아세포 국재성을 조사하기 위하여, 면역형광 염색 및 동일초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용했다. 종래의 연구에서는 PKR이 시토졸과 핵에 위치한다고 보고한 바 있다(Taylor et al., 1999). 면역형광 연구 결과, MDA-7 단백질 분포는 주로 세포질인 것으로 확인되었다. MDA-7은 내인성 PKR 단백질을 유도하고, NSCLC 두 세포주에서 모두 PKR과 동일위치에 존재하는 것으로 확인되었다.

여러 dsRNA 결합 단백질, 예를 들면 NF90(핵인자 90) 및 PACT(PKR의 단백질 활성인자)와 같은 세포 단백질, 및 바이러스 단백질 TRBP(TRA RNA 결합 단백질), 및 백시니아 바이러스 E3L 단백질은 PKR과 상호작용한다(Yin et al., 2003). MDA-7 단백질이 PKR과 물리적으로 상호작용할 수 있는지의 여부를 조사하기 위하여, A549 및 H1299 세포를 사용했다. PKR 단백질은 PBS, Ad-luc 및 Ad-mda7 처리된 용해물로부터 항-PKR 항체를 이용하여 면역침전시키고, 수득되는 샘플을 MDA-7에 대한 항체와 면역블롯팅하여 분석했다. 항-PKR 항체는 PBS 또는 Ad-luc 처리된 세포에서 MDA-7 단백질을 면역침전시키지 못했다. 이에 반해, Ad-mda7 형질도입된 세포에서는 MDA-7이 PKR에 대한 항체에 의해 면역침전되었다. MDA-7 면역반응성 주 밴드 하나가 MDA-7 항체에 의해 인식되었다. 단백질-단백질 상호작용을 확인하기 위하여, 상반되는 실험을 수행했다. PBS, Ad-luc 및 Ad-mda7 처리된 세포 용해물을 MDA-7에 대한 항체를 이용하여 면역침전시킨 결과, PKR은 Ad-mda7 처리된 세포 용해물에서만 검출되었다. 공면역침전 시험 결과는, MDA-7이 TRBP, PACT, NF90 및 E3L과 같이 dsRNA 의존적 단백질 키나제 PKR과 물리적으로 상호작용할 수 있음을 보여주었다.

4. Ad-mda7 유도성 세포사에서의 PKR 단백질의 역할

Ad-mda7 유도성 세포사에 미치는 PKR 유도의 효과를 평가하기 위하여, 동계 PKR 결손형 세포주(PKR+/+ 및 PKR-/-)를 이용했다. PKR 무효성(-/-) 및 야생형 PKR 세포주 모두에서 MDA-7 단백질의 적당한 형질도입 및 발현이 관찰됨에도 불구하고, 야생형 PKR(+/+) 세포주만이 Ad-mda7 처리 후 세포사를 나타내는 바, Ad-mda7 유도 세포사는 PKR에 의존적인 것임이 암시되었다. 예상한 바와 같이, Ad-mda7은 PKR+/+ 세포주에서 PKR 유도를 유발했다. Ad-mda7과 달리, Ad-Bak 매개 세포사는, 세포사가 PKR 무효성 및 야생형 PKR 세포주 모두에서 관찰되는 바 PKR 게놈 상태에 의존적이지 않았다. 다음으로, 면역침전 분석을 통해 PKR+/+ 세포주 및 PKR-/- 세포주를 이용하여 MDA-7 및 PKR의 인산화된 형채를 검출했다. MDA-7 및 PKR의 인산화된 형태는 PKR+/+ 세포에서만 검출되었고, PKR-/-세포에서는 검출되지 않았다. PKR 및 MDA-7 단백질은 Ad-mda7 형질도입된 세포에서 트레오닌 및 세린 부위가 인산화되었다. 이에 반해, Ad-mda7 형질도입된 세포에서는 MDA-7 또는 PKR 단백질의 타이로신 인산화는 검출되지 않았다.

실시예 36: 재조합 사람 MDA-7/IL-24 단백질은 내피 세포에서의 DNA 수복 및 아폽토시스 억제에 포함되는 단백질의 발현을 억제한다.

재조합 MDA-7/IL-24 단백질은 시험관내에서 사람 내피 세포의 성장을 억제하고 내피세포의 방사선민감성을 증가시킨다.

아폽토시스 및 방사선민감화의 복구를 매개할 수도 있는 MDA-7/IL-24 단백질의 분자 효과를 평가하기 위하여, 사람 제대 정맥 내피세포(HUVEC)를 MDA-7/IL-24 단백질 10ng/ml로 12시간 동안 처리하고, 세포를 웨스턴 블롯으로 분석했다. 그 결과, pSTAT3 및 pATRF는 활성화되지만 pAKT 및 p-p38은 감소되는 것으로 관찰되었다. 또한, 아폽토시스 관련 단백질인 Bcl-xL 및 서비빈의 단백질 농도도 억제되었다. 또한, 방사선 유도성 DNA 손상의 복구에 관여하는 단백질인 Ku70 및 XRCC4의 하향조절 및 혈관신생에 포함되는 단백질인 IL-8의 억제도 MDA-7/IL-24 처리 후에 관찰되었다. 반면, 이러한 처리에도, 기타 많은 단백질, 즉 Bax, p21, p27 및 p53은 일정하게 유지되었다.

HUVEC에서 MDA-7/IL-24 처리 후 단백질 발현의 변화가 이 단백질을 암호화하는 유전자의 전사 억제 때문인지의 여부를 조사하기 위하여, MDA-7/IL-24로 처리된 HUVEC를 RPA 분석으로 처리했다. 그 결과, HUVEC의 MDA-7/IL-24 처리는 방사선 유도성 DNA 손상의 수복에 중대한 역할을 하는 단백질 산물을 암호화하는 여러 유전자의 전사에 영향을 미친다는 것을 암시했다. 즉, MDA-7/IL-24 단백질은 유전자 전사의 변화를 유도하는 시그날전달 캐스캐이드를 개시할 수 있다. 이것은 결과적으로 DNA 수복에 관여하는 단백질의 발현을 억제할 수 있다. 이러한 단백질의 각각의 변화가 비교적 적을지라도, 중요한 수복 단백질 여러 개가 억제되면, 이로 인해 DNA 수복능은 악영향을 받을 수 있고 방사선민감화된다.

실시예 37: 사람 MDA-7/IL-24 매개의 쥐 종양 세포 성장의 억제에 대한 PERK의 관련성

MDA-7 매개의 종양 억제 활성의 기작은 종양 세포 종류마다 다르며, PKR, p38MAPK 및 pJNK은 아폽토시스를 유도하는 주 경로로서 확인되었다.

본 연구에서는, MDA-7/IL-24가 쥐 종양 세포에 유사한 억제 활성을 나타내는지를 조사했다. 쥐 섬유육종(UV2237m 및 MCA-16)을 mda-7/IL-24 유전자를 보유하는 아데노바이러스 벡터(Ad-mda7; 10,000vp/세포)로 처리한 결과, 외인성 MDA-7/IL-24 단백질이 발현되었고, PBS 또는 Ad-luc(벡터 대조군)으로 처리된 세포와 비교했을 때 G2/M 기에서 유의적인(P=0.001) 성장 억제가 관찰되었다. 이에 반해, Ad-mda7로 처리된 정상 쥐 섬유아세포(10T1/2) 세포에서는 성장 억제 효과가 전혀 관찰되지 않았다. 성장 억제 및 아폽토시스 기작을 조사한 연구에서는 사람 세포에서와 달리 쥐 종양세포에서는 PKR, p38MAPK 및 pJNK의 활성화가 관찰되지 않았다. 이에 반해, PER 및 이의 하류 표적인 eIF2-α 및 카스파제-12의 활성화가 관찰되었고, 이에 따라 카스파제-9, 카스파제-3 활성화 및 PARP 절단이 관찰되었다.

또한, 동계 C3H/Ncr 마우스에 피하 형성시킨 UV2237m 종양을, DOTAP:콜레스테롤(DOTAP:Chol) 리포좀 벡터에 캡슐화된 mda-7/IL-24 유전자로 처리한 결과, PBS로 처리되거나 또는 DOTAP:Chol에 캡슐화된 대조용 플라스미드로 처리된 종양에 비해 유의적인 성장 억제가 관찰되었다. 동물의 처리는 3주 동안 1주에 3회씩 종양내 주사하여 처리했다(50㎍ DNA/투여량). 또한, mda-7/IL-24로 처리된 동물 중에서 40%는 완전한 퇴화를 보였다. 이러한 결과는, 사람 MDA-7/IL-24가 시험관내 및 생체내 모두에서 PERK 경로를 통해 쥐 종양의 성장을 억제할 수 있음을 시사한다.

실시예 38: 아데노바이러스 매개의 MDA-7 발현은 DNA 수복능을 억제하고 비소세포 폐암세포의 방사선민감성을 증가시킨다.

재료 및 방법

1. 세포 배양

사람 비소세포 폐암(NSCLC) 세포주인 A549, 정상인의 폐섬유아세포주(NHLF)인 CCD-16 및 사람 신경아교종 세포주인 MO59J 및 MO59K는 미국 모식균 배양수집소(ATCC)에서 입수했다. 모든 세포주는 ATCC에서 규정한 바와 같이 유지시켰다.

2. 아데노바이러스 벡터 및 유전자 전달

Ad-mda7, Ad-Luc 및 Ad-β-gal은 Introgen Therapeutics, Inc.(미국 텍사스 휴스턴 소재)에서 입수했다. Ad-Luc는 대조용 벡터로서 사용하고, Ad-β-gal은 리포터 벡터로서 사용했다. 벡터의 존재를 검사하여, 복제능이 있는 아데노바이러스 및 마이코플라즈마가 없는 것을 확인했다. 평판배양 48시간 후, 세포를 무혈청 배지 1ml에서 정제 벡터와 1시간 동안 항온배양했다. 항온배양 후, 10% 태아 송아지 혈청이 보충된 새 배지를 각 플라스크에 첨가했다. 모의 형질감염용 벡터를 포함시킨 것을 제외하고는 동일한 프로토콜에는 무혈청 배지를 사용했다. 감염다중도를 계산하기 위한 세포수는 미처리 플라스크에 존재하는 세포수를 계수하여 측정했다.

3. 핵 단백질 추출물

세포를 빙냉 인산염 완충 식염수로 2회 세척하고, 세포 스크래퍼로 수거한 뒤, 4℃, 500xg에서 10분 동안 원심분리했다. 세포 펠릿을 그 다음 저온 용해 완충액(10.0mM HEPES, pH 7.9, 10.0mM KCl, 0.1mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 0.1mM 에그타지산, 1.0mM 디티오트레이톨, 2.0㎍/ml 류펩틴, 2.0㎍/ml 아프로티닌, 0.5mM페닐메틸설포닐 플루오라이드) 400㎕에 재현탁시키고, 10분동안 얼음상에서 항온처리했다; 그 다음, 10% NP-40 12.5㎕를 첨가하고, 이 혼합물을 5초 동안 볼텍싱했다. 그 다음, 용해물을 500xg, 4℃에서 5분간 원심분리하고, 상청액을 제거한 뒤, 시토졸 추출물로 보관했다. 이 펠릿을 추출 완충액(20.0mM HEPES, pH7.9, 400.0mM NaCl, 10mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 1.0mM 에그타지산, 1.0mM 디티오트레이톨, 2.0㎍/ml 류펩틴, 2.0㎍/ml 아프로티닌, 0.5mM페닐메틸설포닐 플루오라이드) 30㎕에 재현탁시키고, 충분히 혼합한 뒤, 얼음상에서 30분 동안 항온처리했다. 이러한 펠릿을 매 10분마다 볼텍싱했다. 30분 후, 추출물을 마이크로원심분리기에서 최대 속도로 10분 동안 원심분리했다. 상청액은 핵 추출물로 사용하고, 분할하여 -70℃에 보관했다. 수득된 핵 단백질의 양은 Bio-Rad Protein Assay(Bio-Rad Laboratories, 미국 캘리포니아 리치먼드 소재)를 사용하여 공급업체의 지침에 따라, 단백질 표준물로서 소혈청 알부민을 사용하여 측정했다.

4. 항체

DNA-PKcs 및 XRCC4에 대한 토끼 폴리클로날 항체는 GeneTex(San Antonio, TX, USA)로부터 구입했다. Ku70 및 β-액틴에 대한 염소 폴리클로날 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입했다. Ku86에 대한 마우스 모노클로날 항체, 클론 Ku15는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입했다. DNA 리가제 IV에 대한 토끼 폴리클로날 항체는 Serotec(Raleigh, NC, USA)으로부터 구입했다.

5. 웨스턴 블롯 분석

동일한 양의 핵 단백질을 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(8% 내지 12% 폴리아크릴아마이드와 4% 스택킹 겔)으로 분리한 뒤, Immobilon-P 막(Millipore, Bedford, 미국 매사츄세츠주 소재)으로 전이시켰다. 차단용액으로 탈지분유 5%를 용해시킨 TBS-T(0.05% Tween 20을 함유한 TBS)를 사용하고, TBS-T 단독은 세척 완충액으로 사용했다. 막을 차단 용액 중의 1차 항체와 4℃에서 밤새 반응시키고, 그 다음 차단 용액 중의 2차 항체와 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 결과는 개량 화학발광(Amersham, 미국 일리노이 아링톤 하이츠 소재)을 공급업체의 프로토콜에 따라 사용하여 확인했다.

6. RNase 보호 분석

세포를 Ad-mda7 또는 Ad-luc로 형질감염시켰다. 배양 48시간 후, RNA를 TRIzol 시약(Invitrogen, 미국 캘리포니아 칼스배드 소재)으로 추출했다. 프로브는 ³²P-UTP로 표지화하고, 분리한 RNA와 하이브리드화했다. 사용된 프로브 세트는 hDSBR-2(Pharmingen, 미국 캘리포니아 산디에고 소재)이다. 샘플의 정규화를 위해, 하우스키핑 유전자 L32 및 GAPDH를 사용했다. RNase 분해 후, 보호된 단편은 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 통해 분리했다. 이러한 분석 단계들은 모두 공급업체의 지침에 따라 수행한 것이다.

7. DNA DSB 수복 분석

이온화 방사선에 노출시킨 후 DNA DSB 수복 활성을 문헌(Kurimasa et al., 1999; Story et al., 1994)에 기술된 바와 같이 분석했다. 간략히 설명하면, 벡터 처리 48시간 후, 세포를 얼음상에서 ¹³²Cs 단위(3.5Gy/분)을 사용하여 방사선 조사하여 40Gy의 누적 선량을 조사했다. 조사후 즉시, 저온 배지를 37℃로 승온된 배지로 교체하고, 세포를 37℃ 조직배양 항온기에 적당한 시간(0분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간 또는 24시간) 동안 방치하여 DSB가 복구되도록 했다. 그 다음, 세포를 얼음상에서 트립신처리하고, 세척한 뒤, 아가로스 플러그에 매립시킨 후, 용해하고, 프로테이나제 K로 분해했다. DNA를, 외곽이 조여진 균일 전기장 PFGE(CHEF-DR III 시스템, Bio-Rad Laboratories)를 사용하여, 0.5x TBE 완충액 중에서 25℃, 1.5V/cm 하에 20시간 동안 분리했다. 이러한 겔을 나일론 막으로 실온에서 3일 동안 전이시켰다. 그 다음, 막을 ³²P 표지된 사람 Alu⁺ 프로브와 45℃에서 18시간 동안 하이브리드화시켰다. 플러그에서 레인으로 해리되는 활성의 비율은 ImageQuant 소프트웨어 프로그램(Molecular Dynamics, 미국 캘리포니아 서니베일 소재)을 사용하는 스토리지 포스포이미지 시스템(storage phophorimaging system)을 사용하여 측정했다.

8. HCR

HCR 분석의 변형법을 사용하여 DNA 수복능을 평가했다(Eady et al., 1992; McDonald et al., 1996; Rainbow, 1974; Rainbow and Mak, 1972). 간략히 설명하면, 세포를 6웰 평판에 접종하고, 앞서 기술한 바와 같이 Ad-mda7, Ad-Luc 또는 위대조군으로 전처리했다. 그 다음, 세포를 전처리 후 48시간째 방사선조사처리되지 않은 Ad-β-gal 또는 방사선조사처리된 Ad-β-gal로 형질감염시켰다. Ad-β-gal은 1% 태아 송아지 혈청이 보충된 배지에 1/100의 희석율에서, 고선량의 ¹³⁷Cs 단위(34.3 Gy/분)을 사용하여 실온에서 방사선조사했다. Ad-β-gal로 24시간 형질감염한 후, 세포를 인산염 완충 식염수 중의 2.00% 포름알데하이드 및 0.05% 글루타르알데하이드로 고정시키고, X-Gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드)로 염색했다. 세포 수복 시스템의 성능은 현미경을 통해 염색 양성 세포를 계수하여 분석했다. 방사선조사처리된 Ad-β-gal 처리된 세포수는 방사선조사처리되지 않은 Ad-β-gal로 처리된 세포수와 비슷했다. 본 실험은 삼중으로 수행했다.

결과

1. Ad-mda7은 NSCLC 세포에서의 DNA 수복에 포함되는 단백질의 발현을 억제하지만, 정상 섬유아세포에는 영향을 미치지 않는다.

Ad-mda7은 NSCLC 세포를 방사선민감화시키지만, 정상 섬유아세포에는 영향을 미치지 않았고, 이는 상기 벡터가 섬유아세포에서와 달리 NSCLC 세포에서 c-Jun 전사 인자의 활성화를 유도하는 특성이 있는 것과 상관성이 있다. 이에 따라, DNA 수복 경로 중의 유전자와 같이, 방사선민감화에 중요한 역할을 하는 유전자 발현이 변화가 있는지 조사해보고자 했다.

포유동물 세포에서, 비상동성 말단 결합(NHEJ)은 이온화 방사선에 노출시 유도되는 DSB 수복의 주요 경로이다. Ad-mda7이 NHEJ 경로에 관여하는 단백질의 발현 농도에 영향을 미치는지의 여부를 조사하기 위하여, 핵 단백질 추출물에 대하여 웨스턴 블롯 분석을 수행했다. A549 세포의 Ad-mda7 처리 시, Ku70, XRCC4 및 DNA 리가제 IV 단백질의 발현 농도가 감소되었다. 한편, 동일한 방법으로 처리된 CCD16 세포에서는 상기 단백질 모두가 발현 감소되지 않았다. NSCLC 세포에서의 이러한 효과는 Ad-mda7에 특이적인 것으로 보였으며, 대조용 벡터인 Ad-Luc에 의해서는 어떤 세포주에서도 상기 단백질의 발현에 변화가 없었다.

2. Ad-mda7은 A549 세포에서 DNA 수복 유전자 mRNA의 발현을 감소시킨다.

상기 억제된 단백질이 이 단백질들을 암호화하는 유전자의 전사 감소를 반영하는지를 조사하기 위하여, 당해 유전자에 대해 RNAse 보호 분석을 수행했다. 그 결과, 여러 DNA 수복 유전자의 mRNA 농도는 미처리 대조군에 비해 Ad-mda7로 처리된 A549 세포에서 보다 낮은 것을 확인했다. 일부 유전자의 경우에는, 대조용 벡터인 Ad-Luc도 전사에 영향을 미쳤다. 하지만, 당해 유전자 중에서 여러 유전자(KU70, Lig4, XRCC4 및 DNA-PK)는 Ad-Luc 보다 Ad-mda7에 의해 상당한 영향을 받았다.

3. 방사선 조사후 DNA DSB 수복은 Ad-mda7 형질감염에 의해 억제된다.

발현 억제된 유전자의 단백질 산물이 전술한 바와 같이 방사선 유도성 DSB의 수복에 중요한 역할을 하는 유전자의 억제 발현은 Ad-mda7의 방사선민감화 효과와 일치하지만, 실제 병변의 수복이 상기 처리 후 약화되는지를 확인할 필요가 있다. 이에, 방사선조사 후 총 DSB 유도 및 재결합을 간헐영역겔전기이동(PFGE)으로 조사하여 Ad-mda7 형질감염이 A549 세포에서 DSB 재결합 반응속도론에 영향을 미치는지의 여부를 결정했다. 이 분석 결과, 40Gy 선량을 조사한 후 시점 0시간에서 조사했을 때 상당량의 단편화된 DNA가 플러그에서 레인으로 이동되었음이 확인되었다. 이러한 효과는 Ad-mda7 처리된 세포 및 대조군에서도 유사한 바, 이는 Ad-mda7 처리가 방사선조사에 의한 DSB 유도를 증가시키지 않음을 시사한다. 하지만, 시간이 경과함에 따라 레인에 존재하는 DNA의 비율은 DSB가 재결합함에 따라 감소되었고, 이는 대조군에서보다 Ad-mda7 처리된 세포에서 더 느린 과정으로 확인되었다. 다수의 겔을 정량분석하고, 그 평균값을 플롯팅하여 여러 처리 후의 DSB 수복의 반응속도론을 평가했다. 수복의 총 반응속도론은 여러 그룹에서 매우 유사했지만, Ad-mda7 전처리는 Ad-Luc로 전처리된 세포 또는 미처리 대조군에 비해 24시간째 잔류 미재결합 병변을 보다 많이 나타내었다.

4. 숙주 세포 재활성화(HCR)는 A549 세포에서 Ad-mda7에 의해 억제되지만 CCD16 세포에서는 억제되지 않는다.

엄밀히 말하면, DSB 수복의 PFGE 분석은 전술한 바와 같이 사용되었을 때, 사실상 총 DSB 재결합을 측정하는 것으로서, 이는 염색체 전위를 유발하는 것과 같은 붕괴된 DNA 단편의 부적절한 재결합도 포함한다. 또한, 결실부를 초래하는 부정수복된 병변부를 검출하지 못하기 때문에 세포 생존율을 제공하는 수복의 양을 과대 평가한다. 따라서, DNA 수복의 신뢰성과 총 DNA 수복능을 조사하기 위하여, HCR 검정법을, Ad-mda7의 방사선민감성을 지배하는 DNA 수복 경로 억제능의 추가 검정법으로서 사용했다. 리포터 벡터로는 감마선 조사된 아데노바이러스 매개의 β-갈락토시다제(Ad-β-gal)를 사용하고, β-갈락토시다제 활성을 판독값으로 사용했다. 수복의 정도는 Ad-mda7 또는 Ad-Luc로 전처리되거나 또는 위형질감염을 통해 전처리된 대조용 세포와 비교했을 때 Ad-mda7로 전처리된 A549 세포 및 CCD16 세포에서의 리포터 유전자 발현율을 측정하여 평가했다. 그 결과, HCR은 Ad-Luc로 전처리되거나 위형질감염된 대조군 세포에 비해, Ad-mda7로 전처리된 A549 세포에서 억제되는 것으로 확인되었다. 이에 반해, HCR의 유의적 억제는 Ad-mda7로 전처리된 CCD16 세포에서는 관찰되지 않았다. HCR 검정법이 DNA 수복의 공지된 결함을 검출하는데 충분히 민감한지의 여부를 확인하기 위하여, 이 검정법을 사람 아교모세포종 세포주 MO59K 및 MO59J(이 세포주들은 각각 DNA 의존적 단백질 키나제(DNA-PK)활성형 및 결손형이다)에 대해 검사했다. HCR은 MO59K 세포에서보다 MO59J 세포에서 유의적으로 감소되었고, 그 감소율은 약 50% 정도였다. Ku70/Ku80 이종이량체와 촉매성 서브유닛 DNA-PKcs를 함유하는 DNA-PK는 DSB 수복의 NHEJ 경로에 필요한 것이다. DNA-PK 성분의 결손으로 인해 DNA-PK 활성이 부족한 세포, 예를 들면 M059J 세포는 이온화 방사선에 과민감성이고 DSB 재결합 반응속도론이 약화되어 있다는 것은 밝혀진 바 있다(Allalunis-Turner et al., 1993; Lees-Miller et al., 1995).

본 명세서 및 청구의 범위에 개시된 모든 조성물 및/또는 방법은 본 발명의 개시에 비추어 과도한 실험없이도 제조 및 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 일부 양태들을 이용하여 설명되었지만, 당업자라면 본 명세서에 기술된 조성물 및 방법, 방법의 단계 또는 단계의 순서들에 변형이 본 발명의 개념, 취지 및 범위를 벗어남이 없이 이루어질 수 있음을 잘 알고 있을 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적 관련성이 있는 특정 제제는 동일하거나 유사한 결과를 성취할 수만 있다면 본 명세서에 기술된 제제 대신에 사용될 수 있음은 자명한 것이다. 이러한 당업자에게 자명한 유사 치환 및 변형은 모두 후속되는 청구의 범위로 정의된 바와 같은 본 발명의 취지, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주되어야 한다.

참고문헌

다음 참고문헌들은 본원에 구체적으로 참고원용된다.

미국 특허 제4,196, 265호

미국 특허 제4,367,110호

미국 특허 제4,452,901호

미국 특허 제4,554,101호

미국 특허 제4,797,368호

미국 특허 제4,870,287호

미국 특허 제5,028,592호

미국 특허 제5,139,941호

미국 특허 제5,187,260호

미국 특허 제5,221,605호

미국 특허 제5,238,808호

미국 특허 제5,310,687호

미국 특허 제5,399,363호

미국 특허 제5,466,468호

미국 특허 제5,543,158호

미국 특허 제5,552, 293호

미국 특허 제5,633,016호

미국 특허 제5,641,515호

미국 특허 제5,739,169호

미국 특허 제5,760,395호

미국 특허 제5,798,339호

미국 특허 제5,801,005호

미국 특허 제5,824,311호

미국 특허 제5,824,348호

미국 특허 제5,830,880호

미국 특허 제5,846,225호

미국 특허 제5,846,233호

미국 특허 제5,846,945호

미국 특허 제6,132,980호

미국 특허 제6,177,074호

미국 특허 제6,204,022호

미국 특허 제6,207,145호

미국 특허 제6,250,469호

미국 특허 제6,326,466호

미국 특허 제6,331,525호

미국 특허 제6,350,589호

미국 특허 제6,372,218호

미국 특허 제6,379,701호

미국 특허원 제09/615,154호

미국 특허원 제10/391,068호

미국 특허원 제60/404,932호

미국 특허원 제60/370,335호

미국 특허원 제60/361,755호

미국 특허원 제10/017,472호

Adams et al., Biochemistry, 37: 12927-12932,1998.

Ahnen et al., Eur. J. Surg. Suppl., 582 : 111-114, 1998. Aksentijevich et al., Hum Gene Ther 8 (9):1111-22, 1996.

Albert et al., Nature, 392 (6671) : 86-89, 1998.

Allalunis-Tumer et al., Radiat. Res., 134, 349-354, 1993.

Allen et al., Nature 287 : 408-411, 1980.

Angel et al., Cell 49 (6) : 729-39, 1987.

Angel et al., Mol CellBiol 7 (6): 2256-66, 1987.

Angiolillo et al., Ann. NY Acad. Sci., 795: 158-167, 1996.

Angiolillo et al., J. Exp. Med., 182 (1) : 155-162,1995.

Aringer et al., Life Sci 64 : 2173-86, 1999.

Ashkenazi et al., Science, 281 : 1305-1308,1998.

Atchinson et al., Cell 46 (2): 253-62, 1986.

Ausubel et aL, In : Current Protocols in Molecular Biology, Green Pub. Assoc., Inc., and John Wiley and Sons, Inc., NY, &commat; : 2.10. 3,1989.

Baichwal and Sugden, In : Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York, Plenum Press, 117-148,1986.

Baier et al., Nucleic Acids Res. 21: 4830-4835, 1993.

Bakhshi et al., Cell, 41 (3): 899-906, 1985.

Balachandran et al., Embo J., 17: 6888-6902, 1998.

Banerji et al., Cell 27 (2): 299-308, 1981.

Banerji et al., Cell 33 (3): 729-40, 1983.

Barany and Merrifield, In : The Peptides, Gross and Meienhofer (Eds. ), Academic Press, NY, 1-284, 1979.

Barber, Cell Death Differ. 2001 Feb;8 (2): 113-26.

Baud et al., Trends Cell Biol, 11, 372-377, 2001.

Began et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 44: 2382, 2003.

Berens et al., Clin. Exp. Metastasis 12 : 405-415, 1994.

Beretta et al., Oncogene, 4: 12 (7): 1593-15936,1996.

Berkhout et al., J. Virol., 63(12) : 5501-5504, 1989.

Berne, Expert Opin. Investig. Drugs, 10 (6): 1085-1098, 2001.

Bianco et al., Clin Cancer Res, 8 : 3250-3258, 2002.

Blanar et al., Embo. J., 8(4) : 1139-1144, 1989.

Blumberg et a Cell, 104 : 9-19, 2001.

Bodine et al., Embo. J., 6 (10): 2997-3004, 1987.

Boshart et al., Cell. 41 (2):521-530, 1985.

Bosze et al., Embo. J., 5 (7): 1615-1623, 1986.

Bowman et al., Oncogene, 19, 2474-2488, 2000.

Braddock et al., Cell, 58 (2): 269-279, 1989.

Brizel, Semin. Radiat. Oncol., 8 (4): 237-246, 1998.

Bryans et al., Mutat. Res., 433,53-58, 1999.

Bukowski et al., Clin. Cancer Res., 4 (10) : 2337-2347, 1998.

Bulla et al., J. Virol., 62 (4): 1437-1441, 1988.

Bunn et al., Semin. Oncod. 29 : 87-94,2002.

Caley et al., J. Virol., 71 (4): 3031-3038,1997.

CEpbelletal Mol CellBiol 8 (5) : 1993-2004, 1988.

Campbell, In : Monoclonal Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burden and Von Knippenberg (Eds.), Elseview, Amsterdam, 13: 71-74/75-83, 1984.

Camper et al., Biotechnology, 16: 81-7, 1991.

Camphausen et al., CancerRes, 61: 2207-2211, 2001.

Campo et al., Nature, 303 (5912): 77-80, 1983.

Cao et al., Mol Med., 12: 9-76,2002.

Cao et al., MoL Med. 8: 869-976,2002.

Caudell et al., Jlmmunol., 168 : 6041-6046,2002.

Cavallaro et aL, Cancer Lett., 176 (2): 123-8,2002.

Celander et al., J. Virol., 61 (2) : 269-75, 1987.

Celander et al., J. Virol., 62 (4): 1314-22, 1988.

Chada et al., Cancer Gene Ther. 8 : S3, 2001,2001.

Chada et al., Int. Immunopharmcol. (in press), 2004.

Chada et al., Mol. Ther. 7: S446, 2003.

Chan et al. , Clin. Cancer Res. 8:904-912, 2002.

Chang et al., Mol. Cell Biol., 9 (5):2153-62, 1989.

Chang et al., Nature, 410 : 37-40,2001.

Chang, Hepatology, 14 : 134A, 1991.

Chattergoon et al., Nature Biotechnology, 18 : 974-979,2000.

Chatterjee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 (23): 9114-8, 1989.

Chen and Tan, Oncogene, 17 : 173-178, 1998.

Chen et al. , J. Biol. Chem., 271:31929-31936, 1996b.

ChenetaL, J. Biol. Chem., 271: 631-634,1996a.

Chen et al., Mol. Ther. 8: 207-219,2003.

Chen et al Nat. Biotechnol., 19 : 537-542, 2001.

Choi et al. , Apoptosis, 8:301-305,2003.

Chol et aL Eur JBiochem 239 (3) : 579-87, 1996.

Chomczynski and Sacchi, Anal. Biochem., 162:156-159, 1987.

Christodoulides et al., Microbiology, 144 (Pt 11): 3027-3037, 1998.

Chu et al., Mol Cell Biol. 1998 Jan; 18 91) : 58-68, 1998.

Ciardiello et al., Clin Cancer Res, 7:1459-1465, 2001.

Clake et al NucleicAcids Res., 19 : 243-248 (1991).

Clark et al., Hum. Gene Ther., 6 (10): 1329-41,1995.

Cleary et al., Cell. 47 (1) : 19-28, 1986.

Cleary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 (21) : 7439-43, 1985.

Cobb et al., Prog. Biophys. Mol. Biol., 71: 479-500,1999.

Coffin, In : Fields Virology, Fields (Ed.), NY, Raven Press, 1437-1500,1990.

Cohen et al., J. Cell Physiol. Suppl., 5: 75-81, 1987.

Costa et al., Mol. Cell Biol., 8(1) : 81-90, 1988.

Couch, Am. Rev. Resp. Dis., 88 : 394-403,1963.

Coupar et al., Gene, 68 (1) : 1-10, 1988.

Coux et at, Anne. Rev. Biochem., 65 : 801-847, 1996.

Cripe et al., Embo. J., 6 (12): 3745-53, 1987.

Critchlow et al., Trends Biochem. Sci., 23, 394-398, 1998.

Cross et al., Science, 267: 1353-6, 1995.

Cryns et al. , Genes Dev., 12, 1551-1570, 1998.

Cuddihy et al. , Mol. Cell. Biol., 19:2475-2484, 1999.

Culotta et al., Mol. Cell. Biol., 9 (3): 1376-1380,1989.

D'Amico et al., J. Biol. Chem., 275 (42): 32649-32657,2000.

Dagon et al., Oncogene, 20: 8045-8056, 2001.

Dandolo et al., J. Virol., 47 (1) : 55-64, 1983.

Dantuma et al., FEBS Lett., 529 : 22-26, 2002.

Davidson et al., J. Immunother., 21 (5) : 389-398, 1998.

Davis et al., J. Virol., 70 (6): 3781-3787,1996.

Davis, Biochem. Soc. Symp., 64: 1-12,1999.

De Jager et al., Semin. Nucl. Med., 23 (2): 165-179,1993.

Deb et al., J. Immunol., 166: 6170-6180, 2001.

Dell'Albani et al., J. Neurosci. Res., 65 (5): 417-424,2001.

Der et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 3279-3283,1997.

Deregibus et al., J. Biol. Chem. 278 : 18008-18014, 2003.

Deschamps et al., Science, 230 (4730) : 1174-1177, 198 .

Dimmeler et al., Circ. Res., 81: 970-976,1997.

Doolittle and Ben-Zeev, Methods Mol. Biol., 109:215-237, 1999.

Dumoutier et al., Jlmmunol, 167 : 3545-3549,2001.

Eady et al., Br. J. Cancer, 66, 113-118, 1992.

Easwaran et al., J. Biol. Chem., 274 (23): 16641-16645,1999.

Edbrooke et al., Mol. Cell Biol., 9 (5): 1908-1916, 1989.

Edery et al., Cell, 56 : 303-312, 1989.

Edlund et al., Science, 230 (4728): 912-916, 1985.

Ekmekcioglu et al., Intl. J. Cancer, 94 (1) : 54-59,2001.

Ekmekcioglu et al., Melanoma Res., 9 (3) : 261-272, 1999. el-Kareh et al., Crit. Rev. Biomed. Eng., 25 (6) : 503-571, 1997.

Ellerbroek et al., Cancer Res. 61: 1855-1861, 2001.

Ellerhorst et al., JClin Oncol, 20: 1069-1074,2002.

Ellerhorst et al., J Clin. Oncol. 15: 1069-1074, 2001.

Erlandsson, Cancer Genet. Cytogenet., 104 (1) : 1-18, 1998.

Fan et al., Nat. Med. 9: 315-321, 2003.

Fathallah-Shaykh et al., J. Immunol., 164(1) : 217-222,2000.

Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 (21): 7413-7417, 1987.

Feng et al., Nature, 334 (6178) : 165-167, 1988.

Feng et al., PNAS USA, 89 (12): 5447-5451, 1992.

Fickenscher et al., Trends Immunol., 23: 89-96, 2002.

Firak et al., Mol. Cell Biol., 6 (11): 3667-3676.

Firulli et al., In vitro Cell. Dev. Biol. Animal, 34: 217-226,1998.

Fisher et al., Cancer Biol. Ther., 2: S23-S37, 2003.

Flotte et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 7 (3): 349-356,1992.

Flotte et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 (22): 10613-10617,1993.

Flotte, et al., Gene Ther., 2(1);29-37, 1995.

Foecking et al., Gene, 45 (1) : 101-105, 1986.

Folkman, N. Engl. J. Med., 320 (18) : 1211-1212,1989.

Folkman, Nat Med, 1: 27-31,1995.

FraleyetalProcNatlAcadSciUSX76 (7) : 3348-3352, 1979.

Freifelder, In : Physical Biochemistry Applications to Biochemistry and Molecular Biology, 2nd ed. Wm. Freeman and Co. , NY, 1982.

Friedmann, Science, 244 (4910): 1275-1281, 1989.

Fry, Breast Cancer Res., 3 (5): 304-312,2001.

Fujita et al., Cell, 49 (3): 357-367, 1987.

Gabizon et al., Cancer Res., 50 (19): 6371-6378,1990.

Gaensler et aL, Nat. BiotechnoL 17 : 1188-1192, 1999.

Geng et al., Cancer Res, 61: 2413-2419,2001.

Ghadge et al., J. Virol., 68 : 4137-4151, 1994.

Ghosh et al., Targeted Diagn Ther., 4 : 87-103, 1991.

Ghosh-Choudhury et al., Embo. J., 6 (6): 1733-1739, 1987.

Giaccone, Oncogene, 21 : 6970-6981,2002.

Giese et aL, Neuro-Oncology 1 : 3-13,1999.

Gil ot al., Apoptosis. 2000 Apr;5(2) : 107-14, 2000.

Gil et al., Mol. Cell. Biol., 19:4653-4663, 1999.

Gillies et al., Cell, 33 (3): 717-728, 1983.

Gloss et al., Embo. J., 6 (12): 3735-3743, 1987.

Godbout et al., Mol. Cell. Biol., 8 : 1169, 1988.

Goding, In:Monoclonal Antibodies:Principles and Practice, 2d ed., Orlando, Fla. , Academic Press, 60-61, 65-66, 71-74, 1986.

Goh et al., Embo.. J., 19: 4292-4297,2000.

Goldfarb et al., Semin. Thromb. Hemostasis, 12: 294-307,1986.

Gomez-Foix et al., J. Biol. Chem., 267 (35): 25129-25134,1992.

Goncharova et al., Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 283 : L354-L363, 2002.

Goodbourn and Maniatis, Cell, 41 (2) : 509-520, 1985.

Goodbourn et al., Cell, 45 (4) : 601-610, 1986.

Gopalan et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 44 : 331, 2003.

Gorski et al., Cancer Res, 58 : 5686-5689, 1998.

Gorski et al., Cancer Res, 59 : 3374-3378, 1999.

Grawunder et al., Nature, 388, 492-495, 1997.

Greene et al., Adv. Exp. Med. Biol., 254 : 55-60, 1989.

Grosschedo et al., Cell, 41 (3) : 885-897, 1985.

Grunhaus et al., Seminars in Virology, 3 : 237-252, 1992.

Gu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 94, 8076-8081, 1997a.

Gulbis and Galand, Hum. Pathol., 24 (12) : 1271-1285, 1993.

Gunnery et al., Proc. Natl. Aecad Sci. USA, 87 : 8687-8691, 1990.

Gupta et al., Nat Med. 6:974-975, 2000.

Haber et al., Trends Genet., 16, 259-264, 2000.

Haines et al., Virchows Arch. B. Cell Pathol., 62 : 151-158, 1992.

Hanahan et al., C'ell, 86 : 353-364, 1996.

Hanibuchi et al., Int. J. Cancer, 78 (4) : 480-485, 1998.

Hanna et al., Cancer J, 6 : 287-293, 2000.

Harlow and Lane, Antibodies:A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, NY, 553-612, 1988.

Haslinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82(24) : 8572-8576, 1985.

Hauber et al., J. Virol., 62 (3) : 673-679, 1988.

He et al., Oncogene. 2003.

Hellstrand et al., Acta Oncol., 37 (4) : 347-353, 1998.

Hen et al., Nature, 321 (6067) : 249-251, 1986.

Hensel et aL, Lwnphokine Res., 8 (3) : 347-351, 1989.

Herbst et al., Clin. Cancer. Res. 6 : 790-797, 2000.

Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (20) : 6466-6470, 1984.

Herr et al., Cell, 45 (3) : 461-470, 1986.

Herz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 (7): 2812-2816, 1993.

Hesdorffer et al., DNA Cell Biol., 9 (10): 717-723,1990.

Hess et al., Br J Cancer, 85: 2010-2016, 2001.

Hirochika et al., J. Virol., 61 (8): 2599-2606, 1987.

Hirsch et al., Mol. Cell Biol., 1 0 (5) : 1959-1968, 1990.

Ho et al., Cancer, 83 (9): 1894-1907, 1998.

Holbrook et al., Virology, 159 (1) : 178-182, 1987.

Hopfner et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 12,115-122, 2002.

Horlick et al., Mol. Cell Biol., 9 (6): 2396-2413,1989.

Horwich et al., J. Virol., 64 (2): 642-650,1990.

Hovanessian, J. Interferon Res., 9: 641-647, 1989.

Huang and Kontos, Arterioscler Tromb. Vasc. Biol., 22: 745-751,2002.

Huang et al., Cell, 27 (2 Pt 1): 245-255, 1981.

Huang et al., Mol. Pharmacol., 62: 1515-1521, 2002.

Huang et al., Oncogene, 20: 7051-7063, 2001.

Hug et al., Mol. Cell Biol., 8(8) : 3065-3079, 1988.

Hui et al., Infect. Immun., 66 (11): 5329-5336, 1998.

Hwang et al., Mol. Cell Biol., 10 (2): 585-592, 1990.

Icely et al., J. Biolog. Chem., 266 (24): 16073-16077, 1991.

Imagawa et al., Cell, 51 (2): 251-260, 1987.

Imbra, et al., Nature, 323 (6O88) : 555-55§, 1986.

Imler et al., Mol. Cell Biol., 7 (7): 2558-2567, 1987.

Imperiale et al., Mol. Cell Biol., 4 (5): 875-882, 1984.

Invitrogen Catalog Nos. V890-20, V891-20, V892-20, and V893-20,"pShooter Vector Manual I (pEF/myc vectors),"on the internet at invitrogen. com/content/sfs/ manuals/pshooter_pef man. pdf Ito et al., Mol. Ther. (in press).

Ito et al., Mol. Ther. 7: 409-418, 2003.

Ivanov et al., Biochem. (Mosc), 66: 1, 2001.

Jagus et al., Int. J. Biochem., 31: 123-138,1999.

Jakobovits et al., Mol. CellBiol., 8 (6): 2555-2561, 1988.

Jameel et al., Mol. Cell Biol., 6 (2): 710-715,1986.

Jaynes et al., Mol. Cell Biol., 8 (1) : 62-70, 1988.

Jeggo et al., Radiat. Res., 150, S80-91, 1998.

Jiang et al., Oncogene 11: 2477-2486, 1995.

Jiang et al., Oncogene, 11: 1179-1189,1995a.

Jiang et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 93: 9160-9165,1996.

Jimenez et aL, Nat. Med., 6: 41-48,2001.

Johnson et al., Mol. Cell Biol., 9 (8): 3393-3399, 1989.

Joki et al., Nat. Biotech., 19: 29-34,2001.

Jones et al., Cell, 13 (1) : 181-188, 1978.

Judware et al., J. Interferon Res., 13 (2): 153-160,1993.

Judware et al., Mol. Cell Biol., 11 (6): 3259-3267,1991.

Junop et al., EMBO J., 19,5962-5970, 2000.

Kabat et al., Sequences of Proteins oflmmunological Interest, U. S. Department of Health and Human Services, Washington, D. C., 1987.

Kadesch et al., Mol. Cell Biol., 6 (7): 2593-2601, 1986.

Kadri et al., Cell Growth Differ. 11: 573-580, 2000.

Kaneda et al., Science, 243 (4889): 375-378, 1989.

Kaplitt et al., Nat. Genet., 8 (2): 148-154, 1994.

Karin et al., Mol. Cell Biol., 7 (2) : 606-613, 1987.

Kami, Ann. N.Y. Acd. Sci., 851 : 139-146, 1998.

Karlsson et al., Embo. J., 5 (9): 2377-2385, 1986.

Katinka et al., Cell, 20 (2): 393-399,1980.

Kato et al., J. Biol. Chem., 266 (6): 3361-3364, 1991.

Katso et al., Annu. Rev. Call. Dev. Biol., 17: 615-675,2001.

Kaufmann et al., Trends Cell Biol. 11,526-534, 2001.

Kawabe et al., Int J Radiat Biol, 77: 185-194, 2001.

Kawabe et al., Mol 171er, 6: 637-644,2002.

Kawamoto et al., Mol. Cell Biol., 8 (1) : 267-272, 1988.

Kerr et al., Br. J. Cancer, 26 (4): 239-257, 1972.

Khanna et al., Nat. Genet., 27,247-254, 2001.

Kibler et al., J Virol., 71 (3): 1992-2003,1997.

Kiledjian et al., Mol. Cell Biol., 8 (1):145-152, 1988.

Kim et al. , J. Clin. Invest., 100:1006-1014, 1997.

Kitajewski et al., Cell, 45: 195-200,1986.

Klamut et al., Mol. Cell Biol., 10 (1) : 193-205,1990.

Koch, et al., Mol. Cell Biol., 9 (1) : 303-311, 1989.

Koch, et al., Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 146: 55-94, 2003.

Kolmel et al., J. Neurooncol., 38 (2-3): 121-125, 1998.

Koromilasetal., Science, 257 (5077): 1685-1689, 1992 Kotenko et al., Cytokine Growth Factor Rev., 13:223-240, 2002.

Kotenko etal, Oncogene, 192557-2565, 2000.

Kotenko et aL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 (4): 1695-1700,2000.

Kotin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (6): 2211-2215,1990.

Kozin et al., Cancer Res, 61 : 39-44, 2001.

Kriegler et al., Blood, 63 (6): 1348-1352, 1984.

Kriegler et al., Cell, 38 (2): 483-491, 1984.

Kriegler et al., Mol. Cell Biol., 3 (3): 325-339,1983.

Kuhen et al., Gene, 178 : 191-193,1996.

Kuhl et al., Cell, 50(7) : 1057-1069, 1987.

Kumar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (14): 6288-6292, 1994.

Kunz et ezl., Nucleic Acids Res., 17 (3): 1121-1138, 1989.

Kunmasa et al., A6ol. Cell Biol., 19, 3877-3884, 1999.

Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol., 157 (1) : 105-132, 1982.

Lakka et al., Clin. Exp. Metastasis. 18 : 245-252,2000.

Lancaster et al., Dig Dis., 12 : 170-1766,1994.

Larsen et al., J. Biol. Chem., 261 (31): 14373-14376, 1986.

Laspia et al., Cell, 59 (2): 283-292, 1989.

Latimer et al., Mol. Cell Biol., 10 (2): 760-769,1990.

Laughlinetal., J. Virol., 60 (2): 515-524. 1986.

Le Gal La Salle et al., Science, 259(5097):988-990, 1993.

Lebedevaetal., Oncogene, 21 (5): 708-18, 2002.

Lebkowski etal., Mol. CellBiol., 8 (10): 3988-3996, 1988.

Lee and Esteban, Virology, 199 (2): 491-496,1994.

Lee et al., Mol. Cell Biol., 16 (6): 3023-3034,1996.

Lee et al., Nature, 294 (5838): 228-232,1981.

Lee et al., Nucleic Acids Res., 12 (10): 4191-4206,1984.

Lees-Miller et al., Science, 267, 1183-1185, 1995.

Levine et al. , Nature 351:453-456, 1991.

Levrero et al., Gene, 101 (2): 195-202, 1991.

Li et al., Cancer Res., 63, 3268-3274, 2003.

Li et al., Cell, 94: 491-501, 1998.

Li et al., J. Virology, 75: 5405-5409,2001.

Lieber et al., Genes Cells, 4, 77-85, 1999.

Lim et al., iochem Pharmacol. 58:1097-1107,1999.

Lin et al., J Gene Med. 5:868-875, 2003.

Lin et al., Mol. Cell Biol., 10 (2): 850-853, 1990.

Liotta et al., Cancer Res. 46: 1-7,1986.

Liu et al., J Biol. Chem., 270 (42) : 24864-2486470, 1995.

Liu et al., Nucleic Acids Res. 25;23 (10): 1758-65, 1995.

Locksley et al., Cell, 104 : 487-501, 2001.

Lund et al., Clin Cancer Res, 6: 971-978, 2000.

Luria et aL, EMBO. J., 6 (11): 3307-3312, 1987.

Lusky et al., Mol. Cell Biol., 3 (6): 1108-1122, 1983.

Lusky et al., Proc. Natl. Acad .Sci. USA, 83 (11): 3609-3613, 1986.

Macejak and Sarnow, Nature, 353: 90-94,1991.

Madireddi et al., Adv Exp Med Biol, 465: 239-261, 2000.

Madireddi et al., In Cancer Gene Therapy : PastAchievements and Future Challenges, (N. Habib, Ed. ), pp. 239-261, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 2000.

Madireddi et al., J Cell Physiol, 185 : 36-46, 2000.

Magi-Galluzzi et al., Anal. Quant. Cytol. Histol., 20 (5) : 343-350, 1998.

Maheshwari et al., J. Cell Physiol., 146 : 164-169, 1991.

Majors et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80(19):5866-5870, 1983.

Majumder et al., J. Neurosci. Res. , 54 (2): 169-180,1998.

Mangray and King, Front Biosci., 3: D1148-1160, 1998.

Mangray et al., Front Biosci., 3 :D1148-11460, 1998.

Mann et al., Cell, 33 (1) : 153-159,1983.

Markowitz et al., J. Virol., 62 (4): 1120-1124, 1988.

Matrisianetal. Bioessays14 : 455-463, 1992.

Mauceri et aL, Nature, 394: 287-291, 1998.

Mayer et al., Cancer Metastasis Rev., 17 (2): 211-218, 1998.

McCarty et al., J Virol., 65 (6): 2936-2945, 1991.

McCormkick, Trends in Cell Biol., 12 : 53-86, 1999.

McDonald et al., Cancer Res., 56, 2250-2255, 1996.

McEntee et al., Carcinogenesis. 20: 635-640, 1999.

McLaughlin et al., J. Virol., 62 (6): 1963-1973, 1988.

McNeall et al., Gene, 76 (1) : 81-88, 1989.

Merrifield, Science, 232: 341-347,1986.

Meurs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 (1) : 232-236, 1993.

Mhashilkar et al., Mol Med 2001; 7: 271-282, 2001.

Mhashilkar et al., Mol. Ther. 8 : 220-229, 2003.

Mhashilkar et aL, MoL Ther. 8 : 207-219, 2003.

Mhashilkar, A., et al. MDA-7 regulates tumor suppressor gene activation and oncogene inactivation via ßcatenin and PI3K pathways in breast and lung tumor cells. Mol. Ther. (in press), 2003.

Michaelson et al., Oncogene, 20 (37): 5093-5099,2001.

Miksicek et al., Cell, 46 (2): 283-290, 1986.

Millauer et al., Nature, 367 (6463): 576-579, 1994.

Molina et al., Cancer Res. 59 : 4356-4362, 1999.

Mordacq et al., Genes Dev., 3 (6): 760-769, 1989.

Moreau et al., Nucleic Acids Res., 9 (22): 6047-6068, 1981.

Mougin et al., Ann. Biol. Clin., 56 (1) : 21-28,1998.

Muesing et al., Cell, 48 (4):691-701, 1987.

Mumby et al., Cell Regul., 2 (8): 589-598, 1991.

Muzio et al., Cell, 85 : 817-827, 1996.

Muzyczka, Curr. Top Microbiol. Immunol., 158 : 97-129, 1992.

Nakamura et al In:Handbook of Experimental Immunology (4th Ed.), Weir et al., (eds). 1: 27, Blackwell Scientific Publ. , Oxford, 1987.

Nakopoulou et al Breast Cancer Res. Treat. 77: 145-155,2003.

Natoli et al., Biochem. Pharmacol., 56 (8) : 915-920, 1998.

Natoli et al., Science, 275: 200-203,1997.

Neuberger et al., Nucleic Acids Res., 16 (14B): 6713-6724, 1988.

Neudauer et al., Exp. Cell Res. 286 : 128-137, 2003.

Ng et al., Nucleic Acids Res., 17 (2): 601-615, 1989.

Nicholson et al., Mature, 376: 37-43, 1995.

Nicolas and Rubenstein, In:Vectors:A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham : Butterworth, pp. 493-513, 1988.

Ning et al., Radiat Res, 157: 45-51, 2002.

Nishikawa et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 44: 331,2003.

O'Reilly et al., J. Biol. Chem., 274 (41) : 29568-29571, 1994.

Oberg et al., Anticancer Res. 20: 1085-1091, 2000.

Oehm et al., JBiol Chem 267: 10709-10715.

Ohara, Gan. To Kagaku Ryoho, 25 (6): 823-828, 1998.

Ohbayashi et al., Curr. Protein Pept. Sci. 3: 409-421, 2002.

Ohi et al., Gene, 89 (2): 279-282, 1990.

Olive, Radiat. Res., 150, S42-51, 1998.

Omori et al., DNA Repair (Amst), 1, 299-310,2002.

Ondek et aL, EMBO. J, 6 (4): 1017-1025, 1987.

Ono et al., Cell. Signal. 12,1-13, 2 000.

OReilly et al., Cell, 79: 315-328, 1994.

OReilly et al., Cell, 88: 277-285, 1997.

Ornitz et al., Mol. Cell Biol., 7 (10): 3466-3472, 1987.

Palmiter et al., Cell, 29 (2): 701-710,1982.

Parker et al., Br. J. Cancer, 85 (12): 1958-1963, 2001.

Parker et al., CA Cancer J. Clin., 47, 5-27, 1997.

Parker et al., Cancer statistics, 1997. CA Cancer J Clin, 47: 5-27,1997.

Paskind et al., Virology, 67 (1) : 242-248,1975.

Pataer et al., Cancer Res., 62: 2239-2243,2002.

Pataeretal., JThorac CardiovascSurg 125 (6): 1328-35,2003.

PCT Appl. WO 00/05356 PCT Appl. WO 00/26368 PCT Appl. WO 0005356 PCT Appl. WO 0026368 PCT Appl. WO 98/07408 PCT Appl. WO 98/28425 PCT Appl. WO 9807408 PCT Appl. WO 9828425 Pech et al., Mol. Cell Biol., 9 (2): 396-405, 1989.

Peifer et at., Science, 14: 1837-1851, 2000.

Pelletier et al., Nature, 334(6180) : 320-325, 1988.

Peng et al., Science, 277: 1501-1505, 1997.

Perez-Stable et al., Mol. Cell Biol., 10 (3): 1116-1125, 1990.

Petryshyn et al., J. Biol. Chem., 259 (23): 14736-14742, 1984.

Petryshyn et al., proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85(5) : 1427-1431, 1988

Philip et al., J. Biol. Chem., 268 (22): 16087-16090, 1993.

Piazza et al., Cancer Res., 55: 3110-3116,1995.

Piazza et al., Cancer Res., 57: 2909-2915,1997.

Picard et al., EMBO. J., 4 (11): 2831-2838,1985.

Pietras et al., Oncogene, 17 (17): 2235-2249,1998.

Pinkert et al., Genes Dev., 1 (3): 268-276, 1987.

Ponta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 (4): 1020-1024,1985.

Pritchard et al., Oncol. Rep. 8: 421-424,2001.

Qin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 (24): 14411-14416, 1998.

Queen and Baltimore, Cell, 35 : 741,1983.

Quinn et al., Mol. Cell Biol., 9 (11): 4713-4721, 1989.

Rainbow et al., Radiat. Res., 50, 319-333,1972.

Rainbow, Radiat. Res., 60, 155-164, 1974.

Ramesh et al., Cancer Res., 63 (16) : 5105-5113, 2003.

Ramesh et al., Mol. Ther. (in press).

Ramesh et al., Mol. Ther., 3 (3): 337-350,2001.

Ramesh, R., et al. The melanoma differentiation associated-7 gene (mda-7)/interleukin- 24 (IL-24) is a novel ligand that regulates angiogenesis via the IL-22 receptor.

Cancer Res. (in press), 2003.

Redondo et al., Science, 247(4947) : 1225-1229, 1990.

Reisman et al., Oyzcogerte, 4 (8) : 945-953, 1989.

Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th ed., pages 1035-1038 and 1570-1580, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980.

Renan, Radiother. Oncol., 19 (3): 197-218,1990.

Resendez et al., Mol. Cell Biol., 8 (10) :4579-4584, 1988.

Restifo, J. Immunother., 24(3) : 193-194, 2001.

Riballo et al., Curr. Biol., 9, 699-702, 1999.

Rippe et al., Mol. Cell Biol., 9 (5): 2224-2227, 1989.

Rittling et al., Nucleic Acids Res., 17 (4): 1619-1633, 1989.

Roth et al., Serin. Oncol., 28 : 50-56, 2001.

Rothman et al., Circulaton, 86: 1977-1986, 1992.

Rothman et aL, J BioL Chem., 269: 6399-6404, 1994.

Rye et al., JBiol Chem. 278 : 24003-24010,2003.

Sado et al., J. Biol. Chem., 276,9742-9748, 2001.

Saeki et al., Gene Ther. 7: 2051-2057,2000.

Saeki et al., Oncogene 21: 4558-4566,2002.

Saelens et al., J. Biol. Chem., 276: 41620-41628, 2001.

Saito et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 44: 247,2003, 2003.

Sambrook et al., In : Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001.

Samulski et al., J. Virol., 63 (9): 3822-38228, 1989.

Sanchez-Alcazar et al., Lung Cancer. 40 : 33-44, 2003.

Sarkar et al., Biotechniques. 8: 30-39,2002.

Sarkar et al., Proc NatlAcad Sci USA, 99: 10054-10059,2002.

Sasaki et aL, Nat. Biotechnol., 19 (6): 543-547, 2001.

Saura et al., J. Mol. Biol., 289 (3): 459-471,1999.

Schaefer et al., Immunol. 15: 5859-5863, 2001.

Schaefer et al., J. Immunol., 166: 5859,2001.

Schaffner et al., J. Mol. Biol., 201 (1) : 81-90, 1988.

Searle et al., Mol. Cell Biol., 5 (6): 1480-1489, 1985.

Shapiro et al., Curr. Opin. Cell Biol. 10: 602-608, 1998.

Sharp et al., Cell, 59 (2): 229-230, 1989.

Shaul et al., EMBO. J., 6 (7): 1913-1920, 1987.

Shelling et al., Gene Ther., 1 (3): 165-169,1994.

Sherman et Proc. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86(17):6739-6743, 1989.

Shi et at., J Interferon Cytokine Res, 21 : 553-566, 2001.

Sibanda et al. , Nat. Struct. Biol., 8, 1015-1019, 2001.

Sieger et al., Mol. ? her. (in press), 2004.

Sieger et al., Mol. lZer. (in press).

Sienel et al., Int. J. Cancer 103 : 647-651, 2003.

Sleigh and Locket, EMBO. J., 4:3831, 1985.

Smith et al., Genes Dev., 13, 916-934, 1999.

Solodin et al., Biochemistry, 34 (41): 13537-13544, 1995.

Solyanik et al., Cell Prolif., 28 (5): 263-278,1995.

Soo et al., J. Cell. Biochem., 74 (1) : 1-10,1999..

Soriano et al., Cancer Res., 59: 6178-6184, 1999.

Spalholz et al., Cell, 42: 183, 1985.

Spandau et aL, J. Virol., 62 (2): 427-434, 1988.

Spandidos et al., EMBO. J, 2 (7): 1193-1199,1983.

Spitz et al., Clin Cancer Res, 2: 1665-1671,1996.

Stephens et aL, Biochem. J., 248 (1) : 1-11, 1987.

Stewart and Young, In : Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. ed., Pierce Chemical Co. , 1984.

Stewart et aL, Mol. Med., 8 : 451-461,2002.

Stokke et al., Cell Prolif., 30 (5): 197-218, 1997.

Story et al., Int. J. Radiat. Biol., 65, 523-528. 1004.

Stuart et al., Nature, 317 (6040) : 828-831, 1985.

Su et al., Oncogene, 22: 1164-1180, 2003.

Su et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 95: 14400-14405, 1998.

Su et aL, Proc NatlAcad Sci USA, 98 : 10332-10337,2001.

Sudhakar et al., Biochem., 39: 12929-12938, 2000.

Sullivan et al., Mol. Cell Biol., 7 (9): 3315-3319, 1987.

Sundararaj an al., J. Biol. Chem., 276: 45120-45127, 2001.

Swartzendruber et al., J. Cell Physiol., 85 (2 Pt 1): 179-187, 1975.

Swisher et al., Clin Cancer Res, 9: 93-101,2003.

Swisher et al., Curr Oncol Rep. 4 (4): 334-40, 2002.

Swisher et al., J Natl Cancer Inst 91 : 763-771, 1999.

Takebe et al., Mol. Cell Biol., 8(1) : 466-472, 1988.

Tam et al., J. Am. Chem. Soc., 105: 6442, 1983.

Tang et al., Mol. Cell, 8 : 1005-1016, 2001.

Tartaglia et al., Immunol. Today, 13: 151-153,1992.

Tavemier et al., Nature, 301 (5901): 634-636, 1983.

Taylor et al., Mol. Cell Biol, 10 (1) : 176-183, 1990.

Taylor et al., Science. 1999 Jul 2; 285 (5424): 107-10,1999.

Tegeder et al., FASEB J. 15:2057-2072, 2001 Temin, In : Gene Transfer, Kucherlapati (ed. ), NY, Plenum Press, 149-188, 1986.

Templeton et al., Nat. Biotechnol. 15: 647-652,1997.

Thierry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92 (21) : 9742-9746, 1995.

Thiesen et al., J. Virol., 62 (2): 614-618,1988.

Thompson et al., Cancer Res. 57:267-271, 1997.

Thomson et al., Cancer Res. 60 : 3338-3342., 2000.

Top et al., J. Infect. Dis., 124 (2): 155-60, 1971.

Toyoshimaetal., Cell, 78 : 67-74,1994.

Tratschin et al., Mol. Cell Biol., 4 (10): 2072-2081,1984.

Tratschin et al., Mol. Cell Biol., 5 (11) : 3251-3260,1985.

Treisman et al., Cell, 42 (3): 889-902, 1985.

Tronche et aL, Mol. Biol. Med., 7 (2): 173-185, 1990.

Tronche et al., Mol. Cell Biol., 9 (11): 4759-4766, 1989.

Trudel et aL, Genes Dev., 1 (9): 954-961, 1987.

Tsuiki et al., Oncogene, 20: 420-429, 2001.

Tsujimoto and Croce, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83(14) : 5214-5218, 1986.

Tsujimoto et al., 228 (4706) : 1440-1443, 1985.

Tsukamoto et al., Nat. Genet., 9 (3): 243-248, 1995.

Turnier et al., Science (Wash. DC), 288 : 870-874, 2000.

Tyndall et al., NucleicAcids Res., 9 (23): 6231-6250, 1981.

Vane et al. , Annu Rev Pharmacol Toxicol. 38:97-120, 1998.

Varnavski et al., J viral. 76 : 5711-5719, 2002.

Vasseur et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 (2): 1068-1072, 1980.

Vattem et al., Eur.. J. Biochem., 268 : 3674-3684, 2001.

Vlachaki et al., Mol tuer. 6 : 342-348, 2002.

Vorburger et al., Oncogene. 2002 Sep 12; 21 (41): 6278-88, 2002.

Walker et al., Nature, 412, 607-614, 2001.

Walsh et al., J. Clin. Invest., 94 (4) : 1440-1448, 1994.

Walter and Johnson, Annu. Rev. Cell Biol. 10: 87-119, 1994.

Wang et al., Cell, 47 (2): 241-7 ; 1986.

Wang et al., Exp. Cell Res. 247: 17-28, 1999.

Wang et al., JBiol Chem, 277: 7341-7347,2002.

Wang et al., J. Biol. Chem., 281: 1680-1683, 1998.

Wang et al., Science, 281: 1680-1683, 1998.

Weber et al., Cell, 36 (4): 983-992,1984.

Wei et al., Gene Ther., 1 (4): 261-268, 1994.

Weidner et al., NEngl JMed, 324: 1-8,1991.

Williams et al., Oncogene. 18 : 7908-7916, 1999.

Williams et al., Sci STKE. 3; 2001 (89): RE2, 2001.

Winoto et al., EMBO. J 8 (3): 729-733, 1989.

Wolf et al., J. Biol. Chem. 274,20049-20052, 1999.

Wong et al., Gene, 10 (2): 87-94, 1980.

Woodfield et al., Biochem. J. , 360 (Pt 2): 335-344,2001.

Woolson, In : Statistical Methods for the Analysis of Biomedical Data, John Wiley & Sons, 206, NY, 1987.

Yacoub et al., Cancer Biol. Ther., 2003.

Yacoub et al., Cli7i Cancer Res. 9: 3272-3281, 2003.

Yacoub et aL, Mol Cancer Ther. 2: 623-632,2003.

Yang et al., Carcinogenesis. 24:605-611, 2003.

Yang et al., Int. J. Oncol., 18 (3): 541-548, 2001.

Yang et al., J. Virol., 68(8) : 4847-4856, 1994.

Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (24):9568-9572, 1990.

Yeung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(24) : 11413-11416, 1994.

Yin et al., J Biol Chem. 20;278 (25): 22838-45. Epub Apr 04,2003.

Yoder et al., Blood, 82 (Suppl. ) : 347A, 1994.

Yonehara et al., J Exp Med 169: 1747-1756, 1989.

Yutzey et al., Mol. Cell Biol., 9 (4) : 1397-1405, 1989.

Zamanian-Daryoush et al., Oncogene, 18 : 315-326,1999.

Zhang et aL, Biochem. Biophys. Res. Commun., 290: 1123-1127,2002.

Zhang et al., J Biol. Chem., 275: 24436-24443, 2000.

Zhang et al., R Biol. Chem., 276: 26946-24958, 2001.

Zhang et al., Science, 290 : 989-992, 2000.

Zhou et al., Exp. Hematol., 21 (7): 928-933,1993.

Zhou et al., J. Exp. Med., 179 (6): 1867-1875, 1994.

Zhu et al., Science, 261 (5118): 209-211, 1993.

<110> BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM INTROGEN THERAPEUTICS, INC. <120> Methods and compositions involving MDA-7 <130> INGN:105WO <150> US 60/528,506 <151> 2003-12-10 <150> US 60/515,285 <151> 2003-10-29 <140> US 60/486,862 <141> 2003-07-11 <150> US 60/476,159 <151> 2003-06-04 <150> US 60/474,529 <151> 2003-05-30 <150> US 60/452,257 <151> 2003-03-03 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 718 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 acaagacatg actgtgatga ggagctgctt tcgccaattt aacaccaaga agaattgagg 60 ctgcttggga ggaaggccag gaggaacacg agactgagag atgaattttc aacagaggct 120 gcaaagcctg tggactttag ccagaccctt ctgccctcct ttgctggcga cagcctctca 180 aatgcagatg gttgtgctcc cttgcctggg ttttaccctg cttctctgga gccaggtatc 240 aggggcccag ggccaagaat tccactttgg gccctgccaa gtgaaggggg ttgttcccca 300 gaaactgtgg gaagccttct gggctgtgaa agacactatg caagctcagg ataacatcac 360 gagtgcccgg ctgctgcagc aggaggttct gcagaacgtc tcggatgctg agagctgtta 420 ccttgtccac accctgctgg agttctactt gaaaactgtt ttcaaaaact accacaatag 480 aacagttgaa gtcaggactc tgaagtcatt ctctactctg gccaacaact ttgttctcat 540 cgtgtcacaa ctgcaaccca gtcaagaaaa tgagatgttt tccatcagag acagtgcaca 600 caggcggttt ctgctattcc ggagagcatt caaacagttg gacgtagaag cagctctgac 660 caaagccctt ggggaagtgg acattcttct gacctggatg cagaaattct acaagctc 718 <210> 2 <211> 206 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asn Phe Gln Gln Arg Leu Gln Ser Leu Trp Thr Leu Ala Arg Pro 1 5 10 15 Phe Cys Pro Pro Leu Leu Ala Thr Ala Ser Gln Met Gln Met Val Val 20 25 30 Leu Pro Cys Leu Gly Phe Thr Leu Leu Leu Trp Ser Gln Val Ser Gly 35 40 45 Ala Gln Gly Gln Glu Phe His Phe Gly Pro Cys Gln Val Lys Gly Val 50 55 60 Val Pro Gln Lys Leu Trp Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Asp Thr Met 65 70 75 80 Gln Ala Gln Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg Leu Leu Gln Gln Glu Val 85 90 95 Leu Gln Asn Val Ser Asp Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Val His Thr Leu 100 105 110 Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Thr Val Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg Thr 115 120 125 Val Glu Val Arg Thr Leu Lys Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn Phe 130 135 140 Val Leu Ile Val Ser Gln Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu Met Phe 145 150 155 160 Ser Ile Arg Asp Ser Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg Ala 165 170 175 Phe Lys Gln Leu Asp Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu Gly Glu 180 185 190 Val Asp Ile Leu Leu Thr Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu 195 200 205 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer >400> 3 cgcttgatga gtcagccgga a 21

Claims

MDA-7 단백질을 함유하는 세포 추출물 또는 상청액을 친화성 크로마토그래피로 처리하는 단계를 포함하여, 세포로부터 MDA-7 단백질을 정제하는 방법.
제1항에 있어서, MDA-7 단백질이 20% 이상의 균질성으로 정제되고 활성인 방법.
제1항에 있어서, MDA-7 단백질이 글리코실화되고 분비형 단백질인 방법.
제1항에 있어서, 친화성 크로마토그래피로 처리하기 전, 처리하는 동안 또는 처리한 후 세포 추출물 또는 상청액에 단백질 운반체를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 친화성 정제된 MDA-7 단백질을 음이온 교환 크로마토그래피로 처리하는 단계를 추가로 포함하고, 수득된 MDA-7 단백질이 30% 이상의 균질성으로 정제되고 활성인 방법.
제5항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피가 1.0M 농도 이하의 염의 단계 구배를 포함하는 방법.
제6항에 있어서, MDA-7 단백질이 염 농도가 약 0.9M 내지 1.0M인 용액에서 용출되는 방법.
제5항에 있어서, 수득되는 단백질이 50% 내지 70% 균질성으로 정제되는 방법.
제8항에 있어서, 수득되는 단백질이 70% 내지 90% 균질성으로 정제되는 방법.
제9항에 있어서, 수득되는 단백질이 90% 이상의 균질성으로 정제되는 방법.
제10항에 있어서, 수득되는 단백질이 95% 이상의 균질성으로 정제되는 방법.
제1항에 있어서, 친화성 크로마토그래피가 1종 이상의 항-MDA-7 폴리클로날 항체를 함유하는 친화성 수지를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 친화성 크로마토그래피가 1종 이상의 항-MDA-7 모노클로날 항체를 함유하는 친화성 수지를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 친화성 크로마토그래피가, 세포 추출물 또는 상청액을 친화성 수지와 접촉시키는 단계, 상기 수지를 세척하는 단계 및 상기 수지로부터 MDA-7 단백질을 용출시키는 단계를 포함하는 방법.
제14항에 있어서, MDA-7 단백질이, 1M 염을 함유하고 pH 5.0 이하인 용액으로 용출되는 방법.
제14항에 있어서, 용출된 MDA-7 단백질을 완충액으로 중화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 용출된 MDA-7 단백질을 단백질 A와 항온처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제17항에 있어서, 단백질 A가 미반응성 물질에 커플링되거나 부착되는 방법.
제1항에 있어서, 친화성 크로마토그래피 정제된 MDA-7 단백질을 크기 분리 정제(size resolution purification)로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제19항에 있어서, 크기 분리 정제가 음이온 교환 크로마토그래피 전 및/또는 후에 실시되는 방법.
제19항에 있어서, 크기 분리 정제가 단백질 겔 또는 크기 배제 컬럼을 포함하는 방법.
a) 분비형 MDA-7 단백질을 함유하는 세포 추출물 또는 상청액을, 항-MDA 항체를 포함하는 친화성 크로마토그래피로 처리하는 단계;

b) 친화성 크로마토그래피로 정제된 MDA-7 단백질을 크기 분리 정제로 처리하는 단계; 및

c) 크기 분리로 정제된 MDA-7을 음이온 교환 크로마토그래피로 처리하는 단계를 포함하여, 세포로부터 활성의 글리코실화된 분비형 MDA-7 단백질을 정제하는 방법.
제22항에 있어서, MDA-7 단백질이 80% 이상의 균질성으로 정제되는 방법.
활성인 정제된 MDA-7 단백질.
제24항에 있어서, 약 25% 이상의 균질성으로 정제된 MDA-7 단백질.
제25항에 있어서, 약 40% 이상의 균질성으로 정제된 MDA-7 단백질.
제26항에 있어서, 약 50% 이상의 균질성으로 정제된 MDA-7 단백질.
제27항에 있어서, 약 60% 이상의 균질성으로 정제된 MDA-7 단백질.
제28항에 있어서, 약 70% 이상의 균질성으로 정제된 MDA-7 단백질.
제29항에 있어서, 약 80% 이상의 균질성으로 정제된 MDA-7 단백질.
제30항에 있어서, 약 90% 이상의 균질성으로 정제된 MDA-7 단백질.
제31항에 있어서, 약 95% 이상의 균질성으로 정제된 MDA-7 단백질.
제24항에 따른 정제된 분비형 MDA-7 단백질을 포함하는 약제학적으로 허용되는 조성물의 유효량을 환자에게 투여함을 포함하는, 암환자의 치료방법.
제33항에 있어서, MDA-7 단백질이 활성이고 조성물 중에 존재하는 단백질에 대해서 약 80% 이상 균질한 방법.
제33항에 있어서, 환자를 방사선요법 또는 화학요법으로 처리함을 추가로 포함하는 방법.
제35항에 있어서, 암환자가 상피세포 암환자인 방법.
제33항에 있어서, 암환자가 흑색종 또는 전립선암 환자인 방법.
세포에서 작동가능한 프로모터의 제어하에 있는 MDA-7을 암호화하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터의 유효량을 세포로 투여함을 포함하는, 암세포의 방사선민감화 방법.
제38항에 있어서, 암세포가 상피세포인 방법.
제38항에 있어서, 아데노바이러스 벡터 투여 후 72시간 이내에 암세포를 방사선 처리함을 추가로 포함하는 방법.
MDA-7 단백질을 함유하거나 또는 프로모터의 제어하에 있는 MDA-7을 암호화하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물 및 NF-κB 억제제를 환자에게 투여함을 포함하는 환자의 암 치료방법.
제41항에 있어서, NF-κB 억제제가 술린닥인 방법.
서열번호 2의 아미노산 100번 내지 206번 및 소포체 표적화 서열을 함유하는 단백질.
암의 국소 침윤 및/또는 전이를 억제하거나 예방하는 MDA-7 단백질을 함유하는 약제학적으로 허용되는 조성물의 유효량을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자에서 암의 국소 침윤 및/또는 전이를 억제 또는 예방하는 방법.
제44항에 있어서, 암이 흑색종, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 폐암, 간암종, 망막모세포종, 성상아교세포종, 아교모세포종, 잇몸암, 혀암, 백혈병, 신경모세포종, 두부암, 경부암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 골암, 정소암, 난소암, 중피종, 자궁경부암, 위장암, 림프종, 뇌암, 결장암 또는 방광암인 방법.
제45항에 있어서, 암이 폐암인 방법.
암의 국소 침윤 및/또는 전이를 억제하거나 예방하는 MDA-7 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 약제학적으로 허용되는 조성물의 유효량을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자에서 암의 국소 침윤 및/또는 전이를 억제 또는 예방하는 방법.
제47항에 있어서, MDA-7 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 발현 작 제물을 포함하는 방법.
제48항에 있어서, 발현 작제물이 프로모터의 제어하에 있는 MDA-7 단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 아데노바이러스 벡터를 포함하는 방법.