ES2160707T5

ES2160707T5 - Composiciones que comprenden agentes deteriorantes del adn y p53.

Info

Publication number: ES2160707T5
Application number: ES95917100T
Authority: ES
Inventors: Jack A. Roth; Toshiyoshi Fujiwara; Elizabeth A. Grimm; Tapas Mukhopadhyay; Wei-Wei Zhang; Laurie B. Owen-Schaub
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1994-04-25
Filing date: 1995-04-24
Publication date: 2008-05-16
Anticipated expiration: 2015-04-24
Also published as: HU221279B1; CN1147768A; US20060182718A1; CA2188560C; BR9507506A; CN1209164C; JP3847334B2; US6069134A; NO964527D0; DE69535684D1; AU2392495A; SK136796A3; EP0760675B2; KR970702060A; ES2160707T3; ES2298174T3; EP0760675B1; UA43917C2; US6797702B1; DE69521994D1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION HACE REFERENCIA AL USO DE GENES SUPRESORES DE TUMORES EN COMBINACION CON UN AGENTE QUE DETERIORA EL DNA O UN FACTOR PARA UTILIZAR EN CELULAS ASESINAS, Y EN PARTICULAR CELULAS CANCEROSAS. UN GEN SUPRESOR DE TUMORES, P53, SE ENVIA MEDIANTE UNA TRANSFERENCIA DE GENES MEDIADOS POR ADENOVIRUS RECOMBINANTES TANTO IN VIVO COMO IN VITRO, EN COMBINACION CON UN AGENTE QUIMIOTERAPEUTICO. LAS CELULAS TRATADAS MANTIENEN LA APOPTOSIS CON UNA FRAGMENTACION DNA ESPECIFICA. LA INYECCION DIRECTA DE LA CONSTRUCCION DE ADENOVIRUS-P53 EN LOS TUMORES DE FORMA SUBCUTANEA, SEGUIDA DE LA ADMINISTRACION INTRAPERITONEAL DE UN AGENTE QUE DETERIORA EL DNA, CISPATIN, INDUJO LA DESTRUCCION APOPTOTICA MASIVA DE LOS TUMORES. LA INVENCION TAMBIEN PERMITE LA APLICACION CLINICA DE UN REGIMEN QUE COMBINA LA SUSTITUCION GENICA UTILIZANDO ADENOVIRUS P53 BRUTO DE ESCASA REPLICACION Y MEDICAMENTOS DESTRUCTORES DEL DNA PARA EL TRATAMIENTO DEL CANCER HUMANO.

Description

Composiciones que comprenden agentes deteriorantes del ADN y p53.

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, al sector de nuevas estrategias para la mejora de la intervención quimioterapéutica. En otros aspectos, la presente invención proporciona nuevos métodos y composiciones que combinan la potencia de agentes deteriorantes del ADN con la aportación combinada de un supresor de tumores. La combinación de factores deteriorantes del ADN con la expresión heteróloga de un gen supresor de tumores conduce a una sinergia pronunciada sobre y por encima de las acciones de los componentes individuales.

2. Descripción de la técnica relacionada

Se sabe que los actuales métodos de tratamiento del cáncer, incluida la terapia de radiación, cirugía y quimioterapia, tienen una eficacia limitada. El cáncer de pulmón solo mata a más de 140.000 personas anualmente en los Estados Unidos. Recientemente, la mortalidad ajustada a la edad de cáncer de pulmón ha sobrepasado a la del cáncer de mama en mujeres. A pesar de que la puesta en práctica de programas para la reducción de fumar ha disminuido el predominio de fumar, las tasas de mortalidad de cáncer de pulmón seguirán siendo muy elevadas hasta bien entrado el siglo XXI. El desarrollo racional de nuevas terapias para el cáncer de pulmón dependerá de la comprensión de la biología del cáncer de pulmón al nivel molecular.

Se ha establecido bien ahora que una diversidad de cánceres son provocados, al menos en parte, por anormalidades genéticas que resultan ya sea en la sobre-expresión de uno o más genes, o en la expresión de un gen o genes anormales o mutantes. Por ejemplo, en muchos casos, se sabe que la expresión de oncogenes da como resultado el desarrollo del cáncer. "Oncogenes" son genes genéticamente alterados, cuyo producto de expresión mutado interrumpe de algún modo la función o el control normal de las células (Spandidos et al., 1989).

Se ha encontrado que la mayoría de los oncogenes estudiados hasta la fecha son "activados" como resultado de una mutación, a menudo una mutación puntual, en la región codificante de un gen celular normal, es decir un "proto-oncogen", que da como resultado sustituciones de aminoácidos en el producto proteínico expresado. Este producto de expresión alterado exhibe una función biológica anormal que participa en el proceso neoplástico (Travali et al., 1990). Las mutaciones subyacentes pueden surgir por diversos medios tales como mutagénesis química o radiación ionizante. Se han identificado y caracterizado ahora, en medida variable, un cierto número de oncogenes y familias de oncogenes, incluidos ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun y abl (Travali et al., 1990; Bishop, 1987).

Durante el crecimiento normal de una célula, se piensa que los proto-oncogenes fomentadores del crecimiento están contrarrestados por genes supresores de tumores que limitan el crecimiento. Varios factores pueden contribuir a un desequilibrio en estas dos fuerzas, conduciendo a un estado neoplástico. Un factor de este tipo son las mutaciones en genes supresores de tumores (Weinberg, 1991).

Un gen supresor de tumores importante es el gen que codifica la proteína celular, p53, que es una fosfoproteína nuclear de 53 kD que controla la proliferación de las células. Mutaciones en el gen p53 y la pérdida de alelos en el cromosoma 17p, en donde está localizado este gen, se encuentran entre las alteraciones más frecuentes identificadas en malignidades humanas. La proteína p53 está muy conservada a lo largo de la evolución y se expresa en la mayoría de los tejidos normales. p53 de tipo salvaje ha demostrado estar implicada en el control del ciclo celular (Mercer, 1992), en la regulación transcripcional (Fields et al., 1990, y Mietz et al., 1992), en la replicación de ADN (Wilcock y Lane, 1991, y Bargonetti et al., 1991) y en la inducción de la apoptosis (Yonish-Rouach et al., 1991, y Shaw et al., 1992).

Se conocen diversos alelos p53 mutantes, en los que una sustitución en una sola base da como resultado la síntesis de proteínas que tienen propiedades reguladoras del crecimiento bastante diferentes y, en última instancia, conducen a malignidades (Hollstein et al., 1991). De hecho, se ha encontrado que el gen p53 es el gen más frecuentemente mutado en cánceres humanos comunes (Hollstein et al., 1991; Weinberg, 1991), y está particularmente asociado a aquellos cánceres ligados al acto de fumar cigarrillos (Hollstein et al., 1991; Zakut-Houri et al., 1985). También se ha documentao la sobre-expresión de p53 en tumores de mama (Casey et al., 1991).

Uno de los aspectos más desafiantes de la terapia génica del cáncer se refiere a la utilización de genes supresores de tumores tal como p53. Se ha reseñado que la transfección de p53 de tipo salvaje en determinados tipos de células cancerígenas de mama y pulmón puede restaurar el control de la supresión del crecimiento en líneas de células (Casey et al., 1991; Takahasi et al., 1992). A pesar de que la transfección de ADN no constituye un medio viable para introducir ADN en células de pacientes, estos resultados sirven para demostrar que el suministro de p53 de tipo salvaje a células cancerígenas, que tienen un gen p53 mutado, puede ser un método de tratamiento eficaz si se pudieran desarrollar medios mejorados para aportar el gen p53.

Actualmente, están siendo investigados y desarrollados sistemas para la aportación de genes aplicables a la terapia génica de la supresión de tumores. Vehículos de transferencia de genes basados en virus son de particular interés, debido a la eficacia de los virus para infectar células vivas reales, un procedimiento en el que se transfiere el propio material genético viral. A este respecto, se ha conseguido un cierto progreso, por ejemplo, en la generación de vectores retrovirales tratados por ingeniería para aportar una diversidad de genes. Sin embargo, con el uso de vectores retrovirales para la terapia génica están asociados grandes problemas, ya que su infectividad depende de la disponibilidad de receptores retrovirales en las células diana, que son difíciles de concentrar y purificar, y que sólo se integran de manera eficaz en células en replicación.

La resistencia de células tumorales a fármacos quimioterapéuticos representa un gran problema en la oncología clínica. El cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) constituye la causa de al menos el 80% de los casos de cáncer de pulmón; sin embargo, pacientes con NSCLC no responden, por lo general, a la quimioterapia (Doyle, 1993). Un objetivo de la actual investigación del cáncer es encontrar modos para mejorar la eficacia de la terapia del cáncer por reemplazamiento de genes al investigar la interacción entre el producto génico y fármacos quimioterapéuticos. El gen herpes simplex-timidina-quinasa (HS-tk), cuando se aporta a tumores cerebrales mediante un sistema de vector retroviral, inducía con éxito la susceptibilidad al agente antiviral ganciclovir (Culver, et al., 1992). El producto génico HS-tk es una enzima viral exógena, mientras que la proteína p53 de tipo salvaje (wt-p53) se expresa en tejidos normales, sugiriendo que la modulación de la quimiorresistencia por alteraciones en la expresión de wt-p53 podría ser un intento alternativo utilizando una vía mediada por un programa genético endógeno.

Un sistema de adenovirus tiene ventajas potenciales para la aportación de genes in vivo, tal como la facilidad de producir un elevado título de virus, una elevada eficacia de la infección y una infectividad para muchos tipos de células. Sin embargo, siguen siendo una controversia la estabilidad y la duración de expresión del gen introducido. El aumento en los niveles de p53 en células que son sensibles a fármacos quimioterapéuticos puede producirse en el espacio de 6 horas después de estímulos deteriorantes del ADN (Fritsche et al., 1993, Zhan et al., 1993), aunque la actividad incrementada de unión del ADN de p53 se puede invertir en el curso de 4 horas si se retira el estímulo (Tishler, et al., 1993). Por lo tanto, se puede mantener un alto nivel de la expresión de p53, incluso después de cesar con la exposición del fármaco. La expresión de la proteína wt-p53 mediante Ad-p53 forma un pico el día 3 post-infección (14 veces mayor que el tipo salvaje endógeno) y disminuye hasta un nivel bajo hacía el día 9 (Zhang et al., 1993). Esto sugiere que un nivel transitoriamente elevado de la expresión de wt-p53 es suficiente para iniciar el programa citotóxico en la célula cancerígena.

p53 juega un papel importante como un determinante de la quimiosensibilidad en células cancerígenas de pulmón humanas. Se ha intentado una diversidad de protocolos de tratamiento, incluidos cirugía, quimioterapia y radioterapia para NSCLC humano, pero la tasa de supervivencia a largo plazo sigue siendo insatisfactoria. Lo que se necesita es una terapia de combinación que se utilice sola o como un tratamiento adyuvante eficaz para prevenir la recurrencia local después de una resección del tumor primario o en forma de un tratamiento que pudiera administrarse mediante inyecciones intralesionales en cáncer de pulmón primario, metastático o localmente recurrente, resistente a fármacos. Se necesitan también composiciones y métodos para desarrollar, explorar y mejorar la aplicabilidad clínica de nuevas composiciones para el tratamiento del cáncer. Además, estos métodos y composiciones deben demostrar su valía en una disposición in vivo.

Sumario de la invención

Como se especifica en las reivindicaciones, la presente invención se dirige a la necesidad de preparaciones terapéuticas mejoradas para uso en el exterminio de células al combinar los efectos de un gen o proteína supresor de tumores y un agente o factor deteriorante del ADN. La presente invención proporciona también composiciones y métodos, incluidos aquellos que utilizan la transferencia de genes mediada por virus, para fomentar la expresión de un gen supresor de tumores de tipo salvaje, tal como p53, en células diana y para aportar un agente o factor que induce el deterioro del ADN. Los autores de la invención encontraron, sorprendentemente, que al utilizar las composiciones descritas en esta memoria, fueron capaces de inducir la muerte programada de las células, también conocida como apoptosis, en un número muy significativo de células diana.

Utilizando la presente invención, sus autores han demostrado un marcado efecto para controlar el crecimiento celular y, en particular, el crecimiento de células tumorales. La formación y el crecimiento de células tumorales, también conocido como "transformación", describe la formación y proliferación de células que han perdido su capacidad para controlar la división celular, es decir son cancerígenas. Se considera que un cierto número de diferentes tipos de células transformadas son dianas potenciales para los métodos y las composiciones de la presente invención tales como sarcomas, melanomas, linfomas y una amplia diversidad de tumores sólidos y similares. A pesar de que cualquier tejido con un crecimiento celular maligno puede ser una diana, las dianas preferidas son el tejido pulmonar y de mama. Los autores de la presente invención describen en esta memoria que un vector de aportación, recombinante, que expresa p53 era capaz de reducir acusadamente la tasa de crecimiento de células cuando se utiliza en unión con un agente deteriorante del ADN.

La invención proporciona, en determinadas realizaciones, métodos y composiciones para exterminar una célula o células tales como una célula o células malignas, al poner en contacto o exponer una célula o población de células con una proteína o gen p53 y uno o más agentes deteriorantes del ADN en una cantidad combinada, eficaz para exterminar la o las células. Células que se pueden exterminar utilizando la invención incluyen, por ejemplo, células indeseables pero benignas tales como células de la hiperplasia de la próstata benignas o células del tiroide supra-activas; células relacionadas con enfermedades autoinmunes tales como células B que producen anticuerpos implicados en artritis, lupus, miastenia grave, metaplasia escamosa, displasia y similares. Aunque aplicable en general a exterminar todas las células indeseables, la invención tiene una particular utilidad para exterminar células malignas. "Células malignas" se definen como células que han perdido la capacidad de controlar el ciclo de división celular, lo que conduce a un fenotipo "transformado" o "cancerígeno".

Para exterminar células tales como células malignas o metastáticas utilizando los métodos y las composiciones de la presente invención, en general se podría poner en contacto una célula "diana" con una proteína o gen p53 y al menos un agente deteriorante del ADN en una cantidad combinada eficaz para exterminar la célula.

Naturalmente, se contempla que, según las reivindicaciones, la célula diana se expone primeramente al o a los agentes deteriorantes del ADN y luego sea puesta en contacto con una proteína o gen p53. Sin embargo, en realizaciones en las que el factor deteriorante del ADN y p53 se aplican por separado a la célula, se podría asegurar, de manera general, que no expirara un periodo de tiempo significativo entre el tiempo de cada aportación, de modo que el agente deteriorante del ADN y p53 podrían seguir siendo capaces de ejercer un efecto ventajosamente combinado sobre la célula. En tales casos, se contempla que se podría poner en contacto la célula con los dos agentes en el espacio de aproximadamente 12-24 horas uno de otro y, más preferiblemente, en el espacio de aproximadamente 6-12 horas uno de otro, siendo lo más preferido un tiempo de demora de sólo aproximadamente 12 horas.

Los términos "contactado" y "expuesto", cuando se aplican a una célula, se utilizan en esta memoria para describir el proceso mediante el cual un gen o una proteína supresora de tumores, tal como p53, y un agente o factor deteriorante del ADN son aportados a una célula diana o son colocados en yuxtaposición directa con la célula diana. Para conseguir el exterminio de la célula, los dos agentes se aportan a una célula en una cantidad combinada eficaz para exterminar la célula, es decir para inducir una muerte programada de la célula o apoptosis. Los términos y expresiones "exterminio", "muerte programada de la célula" y "apoptosis" se utilizan de manera indistinta en el presente texto para describir una serie de sucesos intracelulares que conducen a la muerte de la célula diana. El proceso de la muerte de la célula implica la activación de proteasas y nucleasas intracelulares que conduce, por ejemplo, a la involución del núcleo de la célula y a la fragmentación del ADN nuclear. Para llevar a la práctica la presente invención no es necesario una comprensión de los mecanismos precisos mediante los cuales diversas moléculas intracelulares interactuan para conseguir la muerte de la célula.

Agentes o factores deteriorantes del ADN se definen en esta memoria como cualquier compuesto químico o método de tratamiento que induzca un deterioro del ADN cuando se aplican a una célula. Agentes y factores de este tipo incluyen radiación y ondas que inducen el deterioro del ADN tal como irradiación \gamma, rayos X, irradiación UV, microondas, emisiones electrónicas y similares. Una diversidad de compuestos químicos, también descritos como "agentes quimioterapéuticos", funcionan para inducir el deterioro del ADN, todos los cuales están destinados a ser utilizados en los métodos de tratamiento combinado descritos en esta memoria. Agentes quimioterapéuticos contemplados de utilidad incluyen, por ejemplo, adriamicina, 5-fluorouracilo (5FU), etopósidos (VP-16), camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C, cisplatino (CDDP), e incluso peróxido de hidrógeno. La invención abarca también el uso de una combinación de uno o más agentes deteriorantes del ADN, ya sean basados en la radiación o compuestos reales, tales como el uso de rayos X con cisplatino o el uso de cisplatino con etopósido. En determinadas realizaciones, en calidad de este compuesto se prefiere particularmente el uso de cisplatino en combinación con una proteína o gen p53.

Se puede utilizar también cualquier método para poner en contacto una célula con una proteína p53, en tanto que el método dé como resultado niveles incrementados de proteína p53 funcional dentro de la célula. Esto incluye tanto la aportación directa de una proteína p53 a la célula como la aportación de un gen o segmento de ADN que codifique p53, gen que dirigirá la expresión y producción de p53 dentro de la célula. Debido a que la aportación de proteínas es objeto de inconvenientes tales como una degradación de la proteína y una baja absorción celular, se contempla que el uso de un vector recombinante que expresa una proteína p53 proporcionará ventajas particulares.

Una amplia diversidad de plásmidos y vectores recombinantes puede ser tratada por ingeniería para expresar una proteína p53 y, así, ser utilizados para aportar p53 a una célula. Estos incluyen, por ejemplo, el uso de ADN desprovisto de defensas y plásmidos p53 para transferir directamente material genético a una célula (Wolfe et al., 1990); formulaciones de ADN codificador de p53 atrapado en liposomas (Ledley et al., 1987) o en proteoliposomas que contienen proteínas receptoras de la envuelta viral (Nicolau et al., 1983); y ADN codificador de p53 acoplado a un complejo de vehículo de polilisina-glicoproteína.

También se prevé el uso de virus recombinantes tratados por ingeniería para expresar p53. Se puede emplear una diversidad de vectores virales tales como vectores retrovirales, virus herpes simplex (patente de EE.UU. 5.288.641), citomegalovirus y similares, según se describe por Miller (Miller, 1992); al igual que también virus adeno-asociados recombinantes (vectores AAV) tales como los descritos por la patente de EE.UU. 5.139.941 y, en particular, vectores adenovirales recombinantes. En la técnica son bien conocidas técnicas para preparar virus infecciosos defectuosos en la replicación, según se ejemplifica por Ghosh-Choudhury y Graham (1987); McGrory et al. (1988); y Gluzman et al. (1982).

Para exterminar una célula de acuerdo con la presente invención, generalmente la célula se pondría en contacto con una proteína o gen p53 y un agente deteriorante del ADN en una cantidad combinada, eficaz para exterminar la célula. La expresión "en una cantidad combinada eficaz para exterminar la célula" significa que las cantidades de p53 y agentes deteriorantes del ADN son suficientes de modo que, cuando se combinan dentro de la célula, se induce a que la célula sufra una apoptosis. Aunque no se requiere en todas las realizaciones, la cantidad eficaz combinada de p53 y agente deteriorante del ADN será, preferiblemente, una cantidad que induzca significativamente una mayor muerte de las células que el uso de cualquier elemento solo y, lo más preferiblemente, la cantidad eficaz combinada será una cantidad que induzca la muerte sinérgica de las células en comparación con los efectos observados al utilizar cualquier elemento solo.

Para determinar el efecto producido por las composiciones y los métodos de la presente invención se puede utilizar un cierto número de parámetros in vitro. Estos parámetros incluyen, por ejemplo, la observación del número neto de células antes y después de la exposición a las composicones descritas en esta memoria, así como el tamaño de los esferoides de tumores multicelulares formados tales como las colonias formadas en cultivo de tejidos. El exterminio de la célula in vitro se muestra particularmente en el Ejemplo 7 de la presente descripción. Alternativamente, se pueden medir parámetros que son indicativos de que una célula está sufriendo una muerte celular programada tal como la fragmentación del ADN genómico celular en fragmentos de tamaño de nucleosoma, generalmente identificados al separar los fragmentos mediante electroforesis en gel de agarosa, tinción del ADN y comparando el ADN con una escala del tamaño de ADN. Fragmentos de tamaño de nucleosoma se identifican como peldaños progresivos o escalas de monómeros y multímeros que tienen una unidad base de aproximadamente 200 pares de bases.

De manera similar, una "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad de una proteína o gen p53 y agente deteriorante del ADN que, cuando se administra a un animal en combinación, es eficaz para exterminar células dentro del animal. Esto se evidencia de manera particular mediante el exterminio de células cancerígenas tales como células de cáncer de pulmón, mama o colon, dentro de un animal o sujeto humano que tiene un tumor. Así, "combinaciones terapéuticamente eficaces" son, generalmente, cantidades combinadas de p53 y agentes deteriorantes del ADN que funcionan para exterminar más células que cualquier elemento solo y, de preferencia, cantidades combinadas que producen una reducción sinérgica en la carga del tumor.

El estudio de determinados parámetros, in vivo y ex vivo, de la muerte de células constituye también un medio eficaz mediante el cual se confirma la eficacia de la composición y de los métodos de la invención. Por ejemplo, al observar efectos sobre la inhibición de la tumorigenicidad, según se mide por la expresión de TdT de secciones de tejidos congelados o utilizando otros métodos de tinción y antígenos diana, tal como se conoce por los patólogos expertos. Naturalmente, también se pueden utilizar, para confirmar el exterminio de células diana, otros medios para determinar la masa, el crecimiento y la viabilidad del tumor. En particular, se pueden confirmar los efectos en diversos sistemas de cáncer con modelos en animales, incluidos aquellos en los que las células cancerígenas humanas están localizadas dentro del animal. Se sabe que modelos de animales de cáncer, a diferencia de los del SIDA, son altamente predictivos de regímenes de tratamiento en seres humanos (Roth et al., compiladores (1989)). Una realización ejemplar de un modelo de animal predictivo es aquella en la que células de cáncer de pulmón de células pequeñas humano (células H358) se desarrollan subcutáneamente. Al utilizar este sistema, los autores de la invención han demostrado que adenovirus portador de p53, instilado por vía intratumoral, junto con la co-administración de un agente quimioterapéutico, da origen a una reducción del tumor sorprendentemente eficaz.

Un método particularmente preferido para aportar una proteína p53 a una célula es poner en contacto la célula con un virion o partícula de adenovirus recombinante que incluye un vector adenoviral recombinante que comprende una región de expresión de p53 situada bajo el control de un promotor capaz de dirigir la expresión de p53 en el tipo de célula dado.

La región de la expresión de p53 en el vector puede comprender una secuencia genómica pero, por simplicidad, se contempla que generalmente se preferirá emplear una secuencia de ADNc de p53, ya que éstas se encuentran fácilmente disponibles en la técnica y se manipulan más fácilmente. Además de comprender una unidad de expresión de p53 y una región promotora, el vector comprenderá también, generalmente, una señal de poliadenilación tal como un gen temprano SV40, o un gen de protamina, una señal de poliadenilación o similar.

En realizaciones preferidas se contempla que se deseará disponer la región de expresión de p53 bajo el control de un promotor fuerte constitutivo tal como un promotor de CMV, un promotor de LTR, SRS o SV40 viral o un promotor asociado con genes que se expresan a altos niveles en células de mamíferos tales como el factor-1 de alargamiento o promotores de actina. Se prevé que todas estas variantes sean útiles con la presente invención. Actualmente, un promotor particularmente preferido es el promotor IE de citomegalovirus (CMV).

El gen o ADNc de p53 se puede introducir en un adenovirus recombinante de acuerdo con la invención, insertando o añadiendo simplemente la secuencia codificadora de p53 en un genoma viral. Sin embargo, los adenovirus preferidos serán virus defectuosos en la replicación, en los que un gen viral, esencial para la replicación y/o empaquetamiento, ha sido suprimido de la construcción de vector adenoviral, permitiendo que la región de expresión de p53 sea introducida en su lugar. Cualquier gen, ya sea esencial (por ejemplo E1A, E1B, E2 y E4) o no esencial (por ejemplo E3) para la replicación, se puede suprimir y sustituir por p53. Particularmente preferidos son aquellos vectores y viriones en los que las regiones E1A y E1B del vector de adenovirus han sido suprimidas y, en su lugar, ha sido introducida la región de expresión de p53, según se ejemplifica por la estructura del genoma de la figura 1.

En la técnica son bien conocidas técnicas para preparar adenovirus defectuosos en la replicación según se ejemplifica por Ghosh-Chodhury y Graham (1987); McGrory et al. (1988); y Gluzman et al. Es también bien conocido que se pueden utilizar diversas líneas celulares para propagar adenovirus recombinantes, en tanto que éstos complementen cualquier defecto de replicación que pueda estar presente. Una línea de células preferida es la línea de células 293 humana, pero se puede emplear cualquier otra línea de células que sea permisiva para la replicación, es decir, en el caso preferido, que exprese E1A y E1B. Además, las células se pueden propagar ya sea sobre platillos de plástico o en cultivos en suspensión, con el fin de obtener materiales de virus de las mismas.

La invención no se limita a virus que carecen de E1 y a células que expresan E1 solas. De hecho, en relación con la presente invención se pueden emplear otras combinaciones complementarias de virus y células hospedantes. Se pueden utilizar virus que carecen de E2 funcional y de células que expresan E2, así como virus que carecen de E4 funcional y células que expresan E4, y similares. En los casos en los que un gen que, no es esencial para la replicación, es suprimido y reemplazado tal como, por ejemplo, el gen E3, este defecto no necesita ser específicamente complementado por la célula hospedante.

Más que el requisito de que los vectores de adenovirus a tratar por ingeniería expresen p53, no se piensa que la naturaleza del adenovirus inicial sea crucial para la práctica con éxito de la invención. El adenovirus puede ser cualquiera de los 42 serotipos o subgrupos A-F diferentes conocidos. El adenovirus tipo 5 del subgrupo C es el material de partida preferido con el fin de obtener el vector de adenovirus defectuoso en la replicación condicional para uso en el método de la presente invención. Esto se debe a que el adenovirus tipo 5 es un adenovirus humano del que existe una cantidad significativa de información bioquímica y genética conocida y que históricamente ha sido utilizado para la mayoría de las construcciones que emplean adenovirus como vector.

Los métodos y las composiciones de la presente invención son igualmente adecuados para exterminar una célula o células, tanto in vitro como in vivo. Cuando las células a exterminar están localizadas dentro de un animal, por ejemplo células de cáncer de pulmón, mama o colon u otras células portadoras de una mutación p53, tanto la proteína o gen p53 como el agente deteriorante del ADN se administrarán al animal en una forma farmacológicamente aceptable. La expresión "una forma farmacológicamente aceptable", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere tanto a la forma de cualquier composición que se puede administrar a un animal, como también a la forma de poner en contacto un animal con radiación, es decir la manera en la que es irradiada una zona del cuerpo del animal, por ejemplo con irradiación \gamma, rayos X, irradiación UV, microondas, emisiones electrónicas y similares. Para los expertos en la técnica de la terapia de irradiación es conocido el uso de radiación deteriorante del ADN y ondas.

La presente invención proporciona también el uso de una combinación terapéuticamente eficaz de una proteína o gen p53 y un agente deteriorante del ADN para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, como se especifica en las reivindicaciones.

Esto se puede conseguir utilizando un virus recombinante, particularmente un adenovirus, que porta un vector capaz de expresar p53 en las células del tumor. La composición suministradora del gen p53 se administraría, de manera general, al animal, a menudo en estrecho contacto con el tumor, en forma de una composición farmacéuticamente aceptable. Un método preferido es la inyección intralesional directa de una cantidad terapéuticamente eficaz de un gen p53, tal como se encuentra alojado dentro de un virus recombinante, en un sitio del tumor. Sin embargo, también se contemplan otras vías de administración parenterales tales como la inyección intravenosa, percutánea, endoscópica o subcutánea.

En el tratamiento del cáncer de acuerdo con la invención se pondrían en contacto las células tumorales con un agente deteriorante del ADN, además de la proteína o gen p53. Esto se puede conseguir irradiando el sitio localizado del tumor con radiación deteriorante del ADN tal como rayos X, luz UV, rayos \gamma, o incluso microondas. Alternativamente, las células tumorales se pueden poner en contacto con el agente deteriorante del ADN administrando al animal una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un compuesto deteriorante del ADN tal como adriamicina, 5-fluorouracilo, etopósidos, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C o, más preferiblemente, cisplatino. El agente deteriorante del ADN se puede preparar y utilizar en forma de estuche, al combinarla con una proteína, gen o sistema de aportación de gen p53, según se ha descrito antes.

El éxito sorprendente de la presente invención se evidencia mediante el hallazgo de que al utilizar el virus
Ad5CMV-p53 en combinación con cisplatino se proporcionaron profundos resultados en los estudios utilizando un modelo de ratón desprovisto del sistema inmunológico. El régimen de terapia combinada de deterioro del virus-ADN inhibía significativamente la tumorigenicidad de células H358, una célula que normalmente produce una masa de tumor significativa. La tumorigenicidad de células de cáncer de pulmón fue inhibida a través del tratamiento con Ad5CMV-p53, pero no por el virus testigo que expresa luciferasa, indicando que la proteína p53, en combinación con un agente deteriorante del ADN, tiene una gran eficacia terapéutica.

Para los expertos en la técnica es conocido un cierto número de métodos para aportar formulaciones quimioterapéuticas, incluidas construcciones de expresión de ADN, en células eucarióticas. A la vista de la presente descripción, el experto en la técnica será capaz de aportar tanto agentes deteriorantes del ADN como proteínas o genes p53 a células de muchas maneras eficaces diferentes.

Para la aportación in vivo de ADN, los autores de la invención contemplan el uso de cualquier sistema de aportación de genes tal como la transfección mediada por virus y liposomas. Tal como se utiliza en esta memoria, el término "transfección" se utiliza para describir la aportación dirigida a diana de ADN a células eucarióticas utilizando sistemas de aportación tal como métodos de transferencia de genes de aportación adenovirales, AAV, retrovirales o plásmidos. La especificidad de la aportación de genes virales se puede seleccionar para dirigir preferencialmente el gen a una célula diana particular tal como utilizando virus que son capaces de infectar tipos de células particulares. Naturalmente, las diferentes gamas de hospedantes virales dictarán el virus elegido para la transferencia de genes, así como el probable gen supresor de tumores a expresar para exterminar un tipo de célula maligna dado.

También se contempla que se puede proporcionar el agente quimioterapéutico deteriorante del ADN a través de una diversidad de medios, tales como utilizando métodos de aportación parenteral tales como inyección intravenosa y subcutánea, y similar. Métodos de este tipo son conocidos para los expertos en la técnica de la aportación de fármacos y se describen adicionalmente en esta memoria en las secciones relacionadas con las preparaciones y el tratamiento farmacéuticos.

Para la aportación de genes in vitro se puede emplear una diversidad de métodos tal como, por ejemplo, transfección mediada por fosfato de calcio o sulfato de dextrano; electroporación; disparo a diana de proyectiles de vidrio; y similares. Estos métodos son conocidos por los expertos en la técnica, siendo las composiciones exactas y la ejecución evidentes a la vista de la presente descripción.

Soluciones farmacológicamente aceptables preferidas incluyen soluciones salinas neutras tamponadas con fosfato, lactato, Tris y similares.

Naturalmente, al utilizar sistemas de aportación virales, se deseará purificar el virión lo suficientemente para que quede esencialmente exento de contaminantes indeseables tal como partículas virales interferentes defectuosas o endotoxinas y otros pirógenos, de manera que no provocará reacciones adversas en la célula, animal o individuo que recibe la construcción de vector. Medios preferidos para purificar el vector implican el uso de gradientes de densidad boyantes tal como centrifugación en gradiente de cloruro de cesio.

Agentes quimioterapéuticos ejemplares son adriamicina, 5-fluorouracilo, camptotecina, actinomicina-D, peróxido de hidrógeno, mitomicina C, cisplatino (CDDP) y etopósidos (VP-16), siendo el uso de cisplatino particularmente preferido.

Todavía realizaciones adicionales de la presente invención son estuches de ensayo para uso en el exterminio de células tales como células malignas, ya que se pueden formular en estuches de ensayo terapéuticos para uso en el tratamiento del cáncer. Los estuches de ensayo de la invención comprenderán, generalmente, en medios contenedores adecuados, una formulación farmacéutica de un vector recombinante que sea capaz de expresar una proteína p53 en una célula animal, y una formulación farmacéutica de un agente deteriorante del ADN. Los vectores recombinantes y los agentes deteriorantes del ADN pueden estar presentes dentro de un único contenedor, o estos componentes se pueden proporcionar en medios de contenedor distintos o separados. En una realización preferida, el vector recombinante será un vector adenoviral recombinante que expresa p53, presente dentro de una partícula de adenovirus, y el agente deteriorante del ADN será cisplatino.

Los componentes del estuche de ensayo se proporcionan preferiblemente en forma de una solución líquida, o en forma de un polvo seco. Cuando los componentes se proporcionan en una solución líquida, la solución líquida es una solución acuosa, siendo particularmente preferida una solución acuosa estéril. Cuando los reactivos o componentes se proporcionan en forma de un polvo seco, el polvo puede reconstituirse mediante la adición de un disolvente adecuado. Se contempla el hecho de que el disolvente también pueda ser proporcionado en otros medios de contenedor.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y están incluidos para demostrar adicionalmente determinados aspectos de la presente invención. La invención se puede comprender mejor haciendo referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en esta memoria.

Figura 1. Esquema para la generación de adenovirus p53 recombinante. La casete de expresión de p53 se insertó entre los sitios Xba I y Cla I de pXCJL.1. El vector de expresión p53 (pEC53) y el plásmido recombinante pJM17 se co-transfectaron en células 293. Las células transfectadas se mantuvieron en el medio hasta el inicio del efecto citopático. Identificación de adenovirus recombinantes p53 recientemente generados (Ad5CMV-p53) mediante análisis por PCR del ADN utilizando moldes de ADN preparados a partir de los sobrenadantes de CPE tratados con proteinasa K y extracción con fenol.

Figura 2A. Mapa utilizado para el análisis estructural de ADN de Ad5CMV-p53. Un mapa de ADN genómico de Ad5CMV-p53, con las localizaciones de la casete de expresión de p53, los cebadores de PCR y los sitios de restricción. El tamaño del genoma es de aproximadamente 35,4 kb, dividido en 100 unidades de mapa (1 u.m. = 0,35 kb). La casete de expresión de p53 reemplazó la región E1 (1,3-9,2 u.m.) del genoma de Ad5. El cebador 1 está situado en el primer intrón situado más abajo del promotor del gen IE principal de CMV humano. El cebador 2 está situado en la señal de poliadenilación temprana de SV40. Ambos cebadores, separados 15-20 pb de la inserción de ADNc de p53 en ambos extremos, definen un producto de PCR de 1,40 kb. Los cebadores 3 y 4 están situados a 11 u.m. y 13,4 u.m. del genoma de Ad5, respectivamente, que definen un producto de PCR específico del genoma viral de 0,86 kb.

Figura 2B. Análisis en gel de agarosa de productos PCR. En cada reacción se utilizaron dos pares de cebadores que definen fragmentos de ADN de 1,4 kb (p53) y 0,86 kb (Ad5). Los moldes de ADN utilizados en cada reacción eran el plásmido pEC53 (pista 1), ADN de Ad5/RSV/GL2 (pista 2), sin ADN (pista 3) y ADN de Ad5CMV-p53 (pista 4). La pista marcada (M) corresponde a los marcadores del peso molecular.

Figura 2C. Representación en mapa de restricción de ADN de Ad5CMV-p53. Muestras de ADN de Ad5CMV-p53, purificadas mediante un gradiente de CsCl, se digerieron sin enzima (U), con Hind III (H), Bam HI (B), Eco RI (E) y Cla I (C), respectivamente, y se analizaron en un gel de agarosa al 1%. Las pistas marcadas (M) son marcadores de peso molecular.

Figura 3A, figura 3B, figura 3C y figura 3D. Observación de efectos citopáticos en 293 mediante adenovirus recombinante. Figura 3A, figura 3B, figura 3C y figura 3D son una serie de imágenes por contraste de fase (x400) de células 293. Figura 3A, figura 3B, figura 3C y figura 3D son cuatro paneles de una figura de una sola página. Figura 2A, antes de la transfección; figura 3B, control negativo el día 12 después de la transfección; figura 3C, inicio de CPE el día 14 después de la transfección; figura 3D, compleción de CPE el día 14 después de la transfección.

Figura 4A, figura 4B, figura 4C y figura 4D. Inmunohistología de células infectadas con adenovirus recombinantes. Figura 4A, figura 4B, figura 4C y figura 4D son una serie de imágenes inmunohistológicas de células H358. Figura 4A, figura 4B, figura 4C y figura 4D son cuatro paneles de una figura de una sola página. Infectividad de Ad5CMV-p53 en células H358. Células H358 se infectaron con Ad5CMV-p53 o Ad5/RSV/GL2 a 50 UFP/célula durante 24 h. Como infección ficticia se utilizó medio solo. Las células infectadas se analizaron mediante inmunotinciones. Figura 4A es una infección ficticia sondeada con anticuerpo anti-p53. Figura 4B son células infectadas con el testigo Ad5/RSV/GL2 y sondeadas con anticuerpo anti-p53. Figura 4C son células infectadas con Ad5CMV-p53 sondeadas con un anticuerpo no relacionado (MOPC-21). Figura 4D es la infección de células con Ad5CMV-p53 sondeada con anticuerpo anti-p53. El anticuerpo anti-p53 utilizado era Pab 1801 y para la tinción se utilizó el método de avidina-biotina.

Figura 5A. Gel SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie que compara el nivel relativo de expresión de p53 exógena en células H358. Muestras de células H358, que se infectaron con Ad5CMV-p53 o Ad5/RSV/GL2 a 30 UFP/célula, se prepararon 24 y 72 h después de la infección. La tinción con azul de Coomassie de un análisis por SDS-PAGE, que muestra cantidades relativas de muestras de proteínas cargadas. Las pistas 1 y 4 contienen las muestras de las células infectadas con Ad5/RSV/GL2. Las pistas 2 y 3 contienen las muestras de las células infectadas con dos materiales individuales de Ad5CMV-p53 a las 24 h después de la infección. Las pistas 5 y 6 son muestras de células infectadas con Ad5CMV-p53 recogidas a las 72 h después de la infección. La pista 7 es una muestra de H358 infectada de modo ficticio 72 h después de la infección. Pista M, marcadores de peso molecular pre-teñidos en kDa (GIBCO-BRL).

Figura 5B. Análisis de transferencia Western del gel idéntico de establecimiento de pista que el de SDS-PAGE en la figura 5A. Los niveles relativos de expresión de p53 se analizaron mediante transferencia Western utilizando anti-p53. Los anticuerpos primarios utilizados eran anticuerpos monoclonales contra la proteína p53 (PAb 1801, Oncogene Science Inc.) y \beta-actina (Amersham Inc.). El segundo anticuerpo conjugado con HRP y el revelador ECL procedían de células H358 infectadas con virus mediante transferencia Western de Amersham Inc. La transferencia Western de la figura 5B tiene un ajuste y orden equivalentes al de la figura 5A.

Figura 6. Transcurso en el tiempo de la expresión de p53, determinada por transferencia Western. Múltiples platillos de células H358 se infectaron con Ad5CMV-p53 a razón de 10 UFP/célula. Los lisados de células se prepararon a los instantes indicados después de la infección. La transferencia Western se sondeó con anticuerpos anti-p53 y anti-actina, simultáneamente. Las pistas designadas "C" representan controles negativos. El histograma representa las cantidades relativas de p53 según se determina mediante un densitómetro.

Figura 7A. Curva de crecimiento de células de cáncer de pulmón humanas infectadas víricamente de líneas de células H358. Las células se inocularon a razón de 10^{5} células por platillo (60 mm) y 6 platillos por cada línea de células. Después de 24 horas, las células se infectaron con Ad5CMV-p53 o Ad5/RSV/GL2 a 10 m.d.i. (multiplicidad de infección, es decir UFP/célula). Después de la infección, las células se recontaron diariamente durante 6 días. Las curvas de crecimiento representan datos obtenidos a partir de 4 estudios separados.

Figura 7B. Curva de crecimiento de células de cáncer de pulmón humanas infectadas víricamente de líneas de células H322. Las células se inocularon a razón de 10^{5} células por platillo (60 mm) y 6 platillos por cada línea de células. Después de 24 horas, las células se infectaron con Ad5CMV-p53 o Ad5/RSV/GL2 a 10 m.d.i. (multiplicidad de infección, es decir UFP/célula). Después de la infección, las células se recontaron diariamente durante 6 días. Las curvas de crecimiento representan datos obtenidos a partir de 4 estudios separados.

Figura 7C. Curva de crecimiento de células de cáncer de pulmón humanas infectadas víricamente de líneas de células H460. Las células se inocularon a razón de 10^{5} células por platillo (60 mm) y 6 platillos por cada línea de células. Después de 24 horas, las células se infectaron con Ad5CMV-p53 o Ad5/RSV/GL2 a 10 m.d.i. (multiplicidad de infección, es decir UFP/célula). Después de la infección, las células se recontaron diariamente durante 6 días. Las curvas de crecimiento representan datos obtenidos a partir de 4 estudios separados.

Figura 8. Diagrama de flujo de ensayos de Ad5CMV-p53 en un modelo de cáncer de pulmón ortóptico. En el diagrama de flujo se resumen las dosificaciones y la lista de tratamiento de ratones desprovistos del sistema inmunológico inoculados con células H226Br y virus.

Figura 9A, figura 9B, figura 9C y Figura 9D. Muestras de la disección de pulmón y del mediastino de ratones tratados y ratones testigo. Figura 9A, figura 9B, figura 9C y figura 9D son cuatro paneles de una sola figura. Los ratones se sacrificaron al final del período de post-tratamiento de 6 semanas. Los tejidos de pulmón y del mediastino se diseccionaron para la evaluación de la formación del tumor. La figura 9A es una muestra de un bloque mediastinal procedente de ratones normales desprovistos del sistema inmunológico; la figura 9B es la muestra de bloque mediastinal procedente de ratones tratados con vehículo (PBS); la figura 9C es la muestra de un bloque mediastinal procedente de ratones tratados con Ad5CMV-p53; la figura 9D es la muestra de un bloque mediastinal procedente de ratones tratados con Ad5/RSV/GL2. Las flechas indican las masas de tumores.

Figura 10A. Los efectos de la exposición continua a CDDP sobre las tasas de crecimiento de células H358 parentales, infectadas con Ad-Luc e infectadas con Ad-p53. Células H358 (1,5 x 10^{5} células/pocillo) se sembraron en duplicado en una placa de 24 pocillos. Después de 24 horas se añadieron 100 \mul de medio, material viral Ad-Luc (10^{8} UFP/ml) o material viral Ad-p53 (10^{8} UFP/ml). Después de una incubación adicional durante 24 horas, el medio que contenía virus se reemplazó por medio de reciente aportación que contenía 10 \mug/ml de CDDP.

Figura 10B. Exposición durante 24 horas a CDDP sobre las tasas de crecimiento de células H358 parentales, infectadas con Ad-Luc e infectadas con Ad-p53. Las células se expusieron a CDDP (figura 10A) continuamente o (figura 10B) durante 24 horas, seguido de recuperación en medio exento de fármaco. Las células que permanecían como una monocapa fijada se verificaron en cuanto a la viabilidad a lo largo de 5 días midiendo la absorción de azul triptano. Se muestra el +/- ET (error típico) medio. El número de células del día 5 para el grupo Ad-p53:CDDP difiere significativamente de todos los otros grupos tanto para A como para B (p<0,05 por ensayo t de Student).

Figura 10C. Los efectos de diferentes concentraciones de CDDP sobre la viabilidad de células H358 infectadas con Ad-p53. Después de 24 horas de exposición al virus Ad-Luc o Ad-p53, las células se trataron con 0, 10 ó 100 \mug/ml de CDDP durante 24 horas y luego se verificaron en cuanto a la viabilidad.

Figura 11A. Fragmentación de ADN nucleosomal en células H358 infectadas con Ad-p53 expuestas a CDDP. Las células se infectaron y trataron con CDDP durante 24 horas según se describe en la leyenda de la figura 10.

Figura 11B, figura 11C, figura 11D, figura 11E, figura 11F y Figura 11G. Células H358 que se hicieron crecer sobre portaobjetos de cámara, infectadas con Ad-p53 durante 24 horas, tratadas con CDDP durante 24 horas adicionales y fijadas para el marcaje in situ de la fragmentación de ADN. Se representan células H358 parentales (B) sin o (C) con CDDP; células infectadas con Ad-Luc (D) sin o (E) con CDDP; y células infectadas con Ad-p53 (F) sin o (G) con CDDP. La punta de flecha muestra un ejemplo de fragmentos nucleares oscuramente teñidos. Segmento = 100 \mum.

Figura 12A. Efecto de la combinación de la infección por Ad-p53 con tratamiento con CDDP en esferoides de tumores H358. Esferoides de tumores multicelulares de células H358 se prepararon tal como se describe previamente (Takahashi, et al. (1989)). El día 0, esferoides con un diámetro de 150 a 200 \mum se colocaron en una placa revestida con agar de 24 pocillos y se expusieron a Ad-p53 o Ad-Luc durante 24 horas. El día 1 se añadió medio con 10 \mug/ml de CDDP, seguido de la separación de medio que contenía virus. El día 2, después de una incubación durante 24 horas, la capa superior se reemplazó por 1 ml de medio exento de fármaco de reciente aportación. Los diámetros perpendiculares se midieron utilizando un microscopio invertido. El cambio relativo en volumen se calculó de acuerdo con la fórmula a^{2} x b /a_{1}^{2} x b_{1}, en que a y b son los diámetros más pequeño y mayor del esferoide, respectivamente, y a_{1} y b_{1} son los diámetros del día 1. Solamente el volumen relativo de los esferoides Ad-p53/CDDP es significativamente menor (p<0,05 por ensayo t de Student) que el grupo testigo (Ctl).

Figura 12B, figura 12C, figura 12D y figura 12E. Marcaje in situ de dUTP con TdT para la detección de apoptosis. Esferoides H358 se fijaron el día 3 y se tiñieron tal como se describe en Materiales y Métodos del Ejemplo 7. (B) esferoide testigo sin tratar, (C) esferoide tratado con CDDP, (D) esferoide infectado por Ad-p53 y (E) esferoide infectado por Ad-p53, tratado con CDDP. Segmento = 100 \mum.

Figura 13A. Inducción de la apoptosis mediante CDDP después de la infección in vivo con Ad-p53 según se mide por cambios en el volumen de tumores. Células H358 (5 x 10^{6}) en 0,1 ml de solución salina equilibrada de Hank se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones nu/nu hembras BALB/c. Treinta días más tarde, se inyectaron en tumores con un diámetro de 5 a 6 mm 200 \mul de medio solo o medio que contenía Ad-Luc (10^{8} UFP/ml) o Ad-p53 (10^{8} UFP/ml). Se realizaron una inyección intratumoral (100 \mul) y una inyección peritumoral en dos sitios opuestos (50 \mul en cada caso). Se administró por vía introperitoneal CDDP (3 mg/kg) o solución salina fisiológica testigo. Los tumores se midieron con calibradores en dos diámetros perpendiculares sin el conocimiento de los grupos de tratamiento, y se calculó un volumen de tumor asumiendo una forma esférica, calculándose el diámetro medio del tumor como la raiz cuadrada del producto de los diámetros en sección transversal. Para cada grupo de tratamiento se utilizaron cinco ratones y se muestra el +/- ET medio. Los datos se analizaron utilizando el ensayo t de Student. La flecha muestra el día de tratamiento. Se muestran dos determinaciones independientes. p < 0,05 desde el día 5 en el ensayo 1; p < 0,05 desde el día 7 en el ensayo 2 (B-E).

Figura 13B, figura 13C, figura 13D y Figura 13E. Estudio histológico utilizando la técnica de marcaje con biotina-dUTP mediada por TdT. Los tumores se recolectaron 5 días después del comienzo del tratamiento e inmediatamente se embebieron dentro de un compuesto O.C.T. Tejidos congelados se cortaron en un criostato a espesores de 5 \mum. Las secciones se trataron con 1 \mug/ml de proteinasa K y se tiñieron según se describe en la leyenda de la figura 12. Se representan tumores H358 tratados con (B) CDDP solo, (C) Ad-p53 solo o (D, E) Ad-p53 en combinación con CDDP. Segmento = 0,5 mm. Todo el cuidado de los animales se realizó de acuerdo con UT M. D. Anderson Institutional Animal Care and Use Committee.

Descripción detallada A. Sucesos moleculares en el desarrollo de cáncer de pulmón

Por parte de los autores de la presente invención se llevaron a cabo estudios que han identificado sucesos moleculares críticos que conducen al desarrollo y progreso del cáncer. Esto permitió a los autores de la invención desarrollar nuevos métodos para restaurar determinadas funciones de proteínas normales, de modo que pudiera suprimirse in vivo el fenotipo maligno.

Las histologías de cáncer de pulmón más comunes (80%) están agrupadas bajo la expresión cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) e incluyen cáncer escamoso, adenocarcinoma y cáncer de células grandes no diferenciadas. Muchos de los actuales datos sobre la biología molecular de cáncer del pulmón proceden del estudio del cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) más inhabitual. SCLC se puede distinguir de NSCLC por las características neuroendocrinas de las células; SCLC responde mucho a la quimioterapia, pero recurre rápidamente después del tratamiento. NSCLC puede servir también como un modelo para otros cánceres epiteliales inducidos por carcinógeno. Los enfoques y las observaciones desarrollados en este estudio pueden ser aplicables a otros tipos de cánceres epiteliales.

Se ha acumulado abundante evidencia de que el proceso de transformación maligno es mediado por un paradigma genético. Las lesiones principales detectadas en células cancerígenas se producen en oncogenes dominantes y en genes supresores de tumores. Los oncogenes dominantes tienen alteraciones en una clase de genes denominada proto-oncogenes que participan en las funciones críticas normales de las células, incluidas la transducción y transcripción de señales. Modificaciones primarias en los oncogenes dominantes que confieren la capacidad para la transformación incluyen mutaciones puntuales, translocaciones, redisposiciones y amplificación. Parece que los genes supresores de tumores requieren una pérdida homozigótica de la función, por mutación, deleción o una combinación de éstas para que se produzca la transformación. Parece que algunos genes supresores de tumores juegan un papel en el gobierno de la proliferación mediante la regulación de la transcripción. Es probable que la modificación de la expresión de oncogenes dominantes y oncogenes supresores de tumores influya sobre determinadas características de células que contribuyen al fenotipo maligno.

A pesar del conocimiento creciente de los mecanismos implicados en la transformación mediada por oncogenes, se ha producido poco progreso para desarrollar estrategias terapéuticas que apunten específicamente a oncogenes y sus productos. Inicialmente, la investigación en este sector se enfocó sobre oncogenes dominantes, ya que éstos fueron los primeros en ser caracterizados. Estudios de transferencia de genes mediada por ADN mostraron una adquisición del fenotipo maligno por parte de células normales después de la transferencia de ADN procedente de tumores humanos malignos.

B. p53 y mutaciones de p53 en cáncer

p53 se reconoce actualmente como un gen supresor de tumores (Montenarh, 1992). Se han encontrado altos niveles en muchas células transformadas por carcinogénesis química, radiación ultravioleta y varios virus, incluido SV40. El gen p53 es una diana frecuente de la inactivación mutacional en una amplia diversidad de tumores humanos y ya se ha documentado que es el gen más frecuentemente mutado en cánceres humanos comunes (Mercer, 1992). Este gen está mutado en más del 50% de NSCLC humano (Hollestein et al., 1991) y en un amplio espectro de otros tumores.

El gen p53 codifica una fosfoproteína de 375 aminoácidos que puede formar complejos con proteínas hospedantes tales como antígeno T y E1B. La proteína se encuentra en tejidos y células normales, pero a concentraciones que son minúsculas en comparación con células transformadas o tejido de tumor. De manera interesante, parece que p53 de tipo salvaje es importante en la regulación del crecimiento y división celular. La sobre-expresión de p53 de tipo salvaje ha demostrado, en algunos casos, ser anti-proliferativa en líneas de células de tumores humanas. Así, p53 puede actuar como un regulador negativo del crecimiento celular (Weinberg, 1991) y puede suprimir directamente el crecimiento descontrolado de células o activar indirectamente genes que suprimen este crecimiento. Así, la ausencia o inactivación de p53 de tipo salvaje puede contribuir a la transformación. Sin embargo, algunos estudios indican que la presencia de p53 mutante puede ser necesaria para la expresión completa del potencial transformador del gen.

A pesar de que p53 de tipo salvaje es reconocido como un regulador del crecimiento centralmente importante en muchos tipos de células, sus características genéticas y bioquímicas parecen jugar también un papel. Mutaciones de mal-sentido son comunes para el gen p-53 y son esenciales para la capacidad de transformación del oncogen. Un simple cambio genético iniciado por mutaciones puntuales puede crear p53 carcinogénico. A diferencia de otros oncogenes, sin embargo, se sabe que mutaciones puntuales de p53 se producen en al menos 30 codones distintos, creando a menudo alelos dominantes que producen desplazamientos en el fenotipo celular sin una reducción a la homozigosidad. Adicionalmente, muchos de estos alelos negativos dominantes parecen ser tolerados en el organismo y pasar a la línea germinal. Parece que diversos alelos mutantes oscilan desde alelos dominantes negativos mínimamente disfuncionales a fuertemente penetrantes (Weinberg, 1991).

Casey y colegas han informado que la transfección de ADN que codifica p53 de tipo salvaje en dos líneas de células cancerígenas de mama humanas restaura el control de supresión del crecimiento en tales células (Casey et al., 1991). También se ha demostrado un efecto similar sobre la transfeción de p53 de tipo salvaje pero no mutante, en líneas de células cancerígenas de pulmón humanas (Takahasi et al., 1992). El p53 aparece dominante frente al gen mutante y seleccionará frente a una proliferación cuando se transfecta en células con el gen mutante. La expresión normal del p53 transfectado no afecta al crecimiento de células con p53 endógeno. Así, construcciones de este tipo podrían ser tomadas por células normales sin efectos adversos.

Así, es posible que el tratamiento cánceres asociados a p53 con p53 de tipo salvaje pueden reducir el número de células malignas. Sin embargo, estudios tales como los descritos anteriormente están todavía lejanos de conseguir un objetivo de este tipo, en última instancia debido a que la transfección de ADN no puede ser empleada para introducir ADN en células cancerígenas dentro de un cuerpo de un paciente.

C. Técnicas de terapia génica

Hasta la fecha se han propuesto varios enfoques experimentales de la terapia génica, pero cada uno adolece de sus particulares inconvenientes (Mulligan, 1993). Tal como se ha mencionado antes, existen métodos de transfección básicos en los que el ADN que contiene el gen de interés se introduce en células de manera no biológica, por ejemplo permeabilizando la membrana celular por medios físicos o químicos. Naturalmente, este enfoque está limitado a células que puedan ser separadas transitoriamente del cuerpo y que puedan tolerar la citotoxicidad del tratamiento, es decir linfocitos. Para la transfección se pueden utilizar liposomas o conjugados de proteínas formados con determinados lípidos y péptidos anfofílicos, pero la eficacia de la integración del gen sigue siendo muy baja, del orden de un suceso de integración por cada 1.000 a 100.000 células y, a menudo, la expresión de genes transfectados está limitada a días en células proliferantes o a semanas en células no proliferantes. Por lo tanto, la transfección de ADN no es, claramente, un método adecuado para el tratamiento del cáncer.

Un segundo enfoque se capitaliza en la capacidad natural de virus para penetrar en células, llevando consigo su propio material genético. Retrovirus han prometido como vectores de aportación de genes debido a su capacidad de integrar sus genes en el genoma hospedante, transfiriendo una gran cantidad de material genético extraño, infectando un amplio espectro de especies y tipos de células y siendo empaquetados en líneas celulares especiales. Sin embargo, tres problemas principales impiden el uso práctico de vectores de retrovirus. En primer lugar, la infectividad retroviral depende la disponibilidad de los receptores virales sobre la superficie diana. En segundo lugar, los retrovirus sólo se integran eficazmente en células replicantes. Y, finalmente, los retrovirus son difíciles de concentrar y purificar.

D. Construcciones de adenovirus para uso en la terapia génica

Adenovirus humanos son virus de tumores de ADN de doble cadena con tamaños de genoma de aproximadamente 36 kb (Tooza, 1981). Como un sistema modelo para la expresión de genes eucarióticos, los adenovirus han sido ampliamente estudiados y bien caracterizados, lo que les hace un sistema atractivo para el desarrollo de adenovirus en calidad de un sistema de transferencia de genes. Este grupo de virus es fácil de desarrollar y manipular, y exhiben una amplia gama de hospedantes in vitro e in vivo. En células líticamente infectadas, los adenovirus son capaces de interrumpir la síntesis de proteínas del hospedante, dirigir maquinarias celulares para sintetizar grandes cantidades de proteínas virales y producir cantidades copiosas de virus.

La región E1 del genoma incluye E1A y E1B que codifican proteínas responsables de la regulación de la transcripción del genoma viral, así como unos pocos genes celulares. La expresión de E2, que incluye E2A y E2B, permite la síntesis de funciones replicativas virales, por ejemplo proteína de unión a ADN, ADN polimerasa y una proteína terminal que ceba la replicación. Productos génicos E3 previenen la citolisis mediante células T citotóxicas y factor de necrosis de tumores y parecen ser importantes para la propagación viral. Funciones asociadas con las proteínas E4 incluyen la replicación de ADN, la expresión tardía del gen y la intercepción de la célula hospedante. Los productos génicos tardíos incluyen la mayoría de las proteínas de la cápsida del virión y éstas se expresan sólo después de que se haya producido la mayor parte del tratamiento de un transcrito primario sencillo procedente del promotor tardío principal. El promotor tardío principal (MLP) exhibe una elevada eficacia durante la fase tardía de la infección (Stratford-Perricaudet y Perricaudet, 1991a).

Dado que sólo una pequeña porción del genoma viral parece ser requerida en cis (Tooza, 1981), vectores derivados de adenovirus ofrecen un potencial excelente para la sustitución de fragmentos grandes de ADN cuando se utilizan en relación con líneas celulares tales como células 293. Se han desarrollado líneas celulares de riñón embriónico humano transformadas con Ad5 (Graham, et al., 1977) para proporcionar las proteínas virales esenciales en trans. Los autores de la invención razonaron, así, que las características de adenovirus les hacen buenos candidatos para el uso en apuntar a células cancerígenas in vivo (Grunhaus y Horwitz, 1992).

Ventajas particulares de un sistema de adenovirus para aportar proteínas extrañas a una célula incluyen (i) la capacidad de sustituir trozos relativamente grandes de ADN viral por ADN extraño; (ii) la estabilidad estructural de adenovirus recombinantes; (III) la seguridad de la administración adenoviral a seres humanos; y (iv) la carencia de cualquier asociación conocida de infección adenoviral con el cáncer o malignidades; (v) la capacidad de obtener elevados títulos del virus recombinante; y (vi) la elevada infectividad de adenovirus.

Ventajas adicionales de vectores de adenovirus frente a retrovirus incluyen los altos niveles de la expresión de genes. Adicionalmente, la replicación de adenovirus es independiente de la replicación del gen hospedante, a diferencia de las secuencias retrovirales. Dado que genes transformantes de adenovirus en la región E1 pueden ser fácilmente suprimidos y pueden seguir proporcionando vectores de expresión eficaces, se piensa que es despreciable el riesgo oncogénico procedente de vectores de adenovirus (Grunhaus y Horwitz, 1992).

En general, sistemas de transferencia de genes de adenovirus se basan en adenovirus recombinantes y tratados por ingeniería a los que se ha convertido en incompetentes en la replicación por deleción de una porción de su genoma, tal como E1, y que todavía conservan su competencia para la infección. Se pueden expresar proteínas extrañas relativamente grandes cuando se realizan deleciones adicionales en el genoma del adenovirus. Por ejemplo, adenovirus suprimidos tanto en las regiones E1 como E3, son capaces de portar hasta 10 kb de ADN extraño y pueden desarrollarse hasta títulos elevados en células 293 (Stratford-Perricaudet y Perricaudet, 1991a). También se ha reseñado de una expresión sorprendentemente persistente de transgenes después de la infección adenoviral.

La transferencia de genes mediada por adenovirus ha sido investigada recientemente como medio de mediar en la transferencia de genes en células eucarióticas y en animales enteros. Por ejemplo, en el tratamiento de ratones con el raro de trastorno genético recesiva, deficiencia de ornitina-transcarbamilasa (OTC), se encontró que construcciones adenovíricas podrían emplearse para suministrar la enzima OTC normal. Desgraciadamente, la expresión de niveles normales de OTC se consiguió solamente en 4 de 17 casos (Stratford-Perri-caudet et al., 1991b). Por lo tanto, el defecto se corrigió sólo parcialmente en la mayoría de los ratones y no condujo a ningún cambio fisiológico ni fenotípico. Este tipo de resultados infunde, por lo tanto, poco ánimo para el uso de vectores adenovirales en la terapia del cáncer.

Intentos de utilizar adenovirus para transferir el gen para el regulador de la conductancia en la transmembrana de fibrosis quística (CFTR) en el epitelio pulmonar de ratas del algodón han tenido también un éxito parcial, a pesar de que no ha sido posible confirmar la actividad biológica del gen transferido en el epitelio de los animales (Rosenfeld et al., 1992). De nuevo, estos estudios demostraron la transferencia y expresión de genes de la proteína CFTR en células de las vías respiratorias pulmonares, pero no mostraron ningún efecto fisiológico. En el artículo de Science de 1991, Rosenfeld et al. mostró la expresión en pulmones de la proteína \alpha1-antitripsina, pero, de nuevo, no demostró ningún efecto fisiológico. De hecho, estos autores estimaron que los niveles de expresión que observaron eran sólo de aproximadamente el 2% del nivel requerido para la protección de los pulmones en seres humanos, es decir muy por debajo del necesario para un efecto fisiológico.

El gen para \alpha1-antitripsina humana ha sido introducido en el hígado de ratas normales mediante inyección intraportal, en donde se expresó y dio como resultado la secreción de la proteína humana introducida en el plasma de estas ratas (Jaffe et al., 1992). Sin embargo, y de forma desilusionante, los niveles que se obtuvieron no eran lo suficientemente elevados como para ser de un valor terapéutico.

Estos tipos de resultados no demuestran que el adenovirus sea capaz de dirigir la expresión de proteína suficiente en células recombinantes para conseguir un efecto fisiológicamente relevante y, por lo tanto, no sugieren una utilidad del sistema de adenovirus para uso en relación con la terapia del cáncer. Además, antes de la presente invención se pensó que p53 no podría ser incorporada en una célula de empaquetamiento, tales como las utilizadas para preparar adenovirus, ya que sería tóxica. Dado que E1B de adenovirus se une a p53, se pensó que ésto era una razón adicional de por qué no se podría combinar la tecnología de adenovirus y p53.

\vskip1.000000\baselineskip

E. Construcciones de adenovirus p53 y supresión de tumores

La presente invención proporciona una terapia génica del cáncer con un vector supresor de tumores nuevo y más eficaz. Este virus recombinante explota las ventajas de vectores adenovirales tales como un elevado título, un amplio intervalo de diana, una transducción eficaz y una no integración en células diana. En una realización de la invención, se crea un adenovirus defectuoso en la replicación e independiente de cooperadores que expresa p53 de tipo salvaje (Ad5CMV-p53) bajo el control del promotor de citomegalovirus humano.

Cuando se desea la expresión en células de mamífero, se proporcionan a menudo a partir de virus funciones de control sobre vectores de expresión. Por ejemplo, promotores comúnmente utilizados se derivan de polioma, adenovirus 2 y virus de simio 40 (SV40). Los promotores temprano y tardío del virus SV40 son particularmente útiles ya que ambos se obtienen fácilmente a partir del virus en forma de un fragmento que también contiene el origen de replicación viral de SV40. También se pueden utilizar fragmentos de SV40 menores o mayores, con la condición de que esté incluida la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio HindIII hasta el sitio BglI situado en el origen de replicación del virus. Además, también es posible y, a menudo, deseable, utilizar secuencias de promotor o control normalmente asociadas con la secuencia del gen incluida, con la condición de que tales secuencias de control sean compatibles con los sistemas de las células hospedantes.

Un origen de la replicación puede ser proporcionado por la construcción del vector para que incluya un origen exógeno tal como se puede derivar de SV40 o de otra fuente viral (por ejemplo polioma, adeno, VSV, BPV), o se puede proporcionar por el mecanismo de replicación cromosomal de la célula hospedante. Si el vector está integrado en el cromosoma de la célula hospedante, ésta última es a menudo suficiente.

El diseño y la propagación del adenovirus p53 preferido se representa en un diagrama en la figura 1. En relación con ésto, se ha desarrollado un protocolo mejorado para propagar e identificar adenovirus recombinantes (comentado más abajo). Después de la identificación, el adenovirus recombinante p53 fué estructuralmente confirmado por el análisis por PCR según se indica en la figura 2. Después del aislamiento y de la confirmación de su estructura, el adenovirus p53 se utilizó para infectar la línea de células cancerígenas de pulmón humanas H358, que tiene una deleción del gen p53 homozigótica. Transferencias Western mostraron que la proteína p53 exógena se expresaba a un elevado nivel (figura 4 y figura 5) y mostraba un pico el día 3 después de la infección (figura 6).

Se demostró también en una línea celular H322 de mutación puntual p53 que la p53 mutante quedó reducida en su regulación por la expresión de la p53 exógena. Como un control experimental, se utilizó un virión (Ad5/RSV/GL2) que tenía una similitud estructural con el de Ad5CMV-p53. Este virión contenía un ADNc de luciferasa accionado por el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous en la casete de expresión del virión. Ni la expresión de p53 ni el cambio en la expresión de actina se detectaron en células infectadas por el virión Ad5/RSV/GL2. El desarrollo de las células H358 infectadas con Ad5CMV-p53 fue grandemente inhibido en contraposición al de células no infectadas o al de las células infectadas con el virión testigo (figura 7A). El crecimiento de células H322 también fue grandemente inhibido por parte del virión de p53 (figura 7B), mientras que el de células H460 de cáncer de pulmón humano que contenían p53 de tipo salvaje, se vió menos afectado (figura 7C).

Ad5CMV-p53 mediaba en un fuerte efecto inhibidor sobre el crecimiento de células cancerígenas de pulmón in vitro. La inhibición del crecimiento no era tan evidente cuando las células se infectaron con Ad5CMV-p53 a una m.d.i. menor que 1 UFP/célula, mientras que a m.d.i's mayores que 100 UFP/célula, la citotoxicidad se podía observar incluso con virus testigo Ad5/RSV/GL2. En los estudios realizados por los autores de la invención, la dosis óptima para los estudios de la tasa de crecimiento era 10-50 UFP/célula. Dentro de este intervalo de dosis, la inhibición del crecimiento de la célula era atribuible a la proteína p53 expresada.

Ensayos en ratones desprovistos del sistema inmunológico demostraron que la tumorigenicidad de las células H358 tratadas con Ad5CMV-p53 era fuertemente inhibida. En un modelo con ratones de cáncer de pulmón humano ortóptico, las células H226Br tumorigénicas, con una mutación puntual en p53, se inocularon por vía intratraqueal 3 días antes del tratamiento con el virus. La instilación intratraqueal de Ad5CMV-p53 evitó la formación del tumor en este sistema modelo, sugiriendo que el adenovirus modificado es un vector eficaz para mediar en la transferencia y la expresión de genes supresores de tumores en células cancerígenas humanas, y que el virus Ad5CMV-p53 se puede desarrollar adicionalmente en un agente terapéutico para uso en la terapia génica del cáncer.

Ad5CMV-p53 mediaba en un alto nivel de expresión del gen p53 en células cancerígenas de pulmón humanas según se demuestra mediante el análisis de transferencia Western. Proteína p53 exógena era aproximadamente 14 veces más abundante que la p53 de tipo salvaje endógena en células H460, y aproximadamente dos a cuatro veces más abundante que el control interno \beta-actina en células H358. El alto nivel de expresión se puede atribuir a (1) una transferencia de genes muy eficaz, (2) un fuerte promotor de CMV que activa el ADNc de p53 y (3) el reforzador E1 adenoviral que refuerza la transcripción de ADNc de p53. La duración de la expresión de p53 después de la infección era de más de 15 días en células H358. Sin embargo, se produjo una rápida disminución en la expresión después del día 5 post-infección. El análisis por PCR de las muestras de ADN procedentes de las células H358 infectadas mostró una disminución del nivel de ADN viral con el nivel de proteína disminuido, indicando la pérdida de ADN viral durante el crecimiento continuo de células cancerígenas in vitro.

La disminución en la expresión de p53 también puede haber resultado de la atenuación celular del promotor de CMV que controla la expresión de p53, ya que el fenómeno de la interrpción del protomor de CMV mediada por la célula hospedante ya ha sido previamente reseñado (Dai, et al., 1992). Vectores adenovirales son vectores de transferencia de genes no integrativos y, por lo tanto, la duración de la expresión del gen depende de un cierto número de factores, incluidas las células hospedantes, los genes transferidos y el promotor relevante. Crystal y colaboradores mostraron que el bajo nivel de expresión del gen regulador de la conductancia en la transmembrana de fibrosis quística en células epiteliales de la rata del algodón era detectable 6 semanas después de la infección (Rosenfeld, et al., 1992). El laboratorio de Perricaudet demostró que la expresión mínima del gen minidistrofina en el músculo de ratones mdx duraba más de 3 meses después de la infección. El alto nivel de expresión a corto plazo de la proteína p53 de tipo salvaje, observado en el presente estudio, puede tener el efecto beneficioso de reducir posibles efectos secundarios en células normales después del tratamiento in vivo con Ad5CMV-p53.

Los estudios descritos en esta memoria indican que el adenovirus recombinante de p53 posee propiedades de supresión de tumores, que parece operar restaurando la función de la proteína p53 en células tumorales. Estos resultados proporcionan un soporte para el uso del virión Ad5CMV-p53 como agente terapéutico para el tratamiento del cáncer.

F. Agentes deteriorantes del ADN

Con la presente invención se puede utilizar una amplia diversidad de agentes deteriorantes del ADN, tales como agentes que reticulan directamente ADN, agentes que se intercalan en ADN y agentes que conducen a aberraciones cromosómicas y mitóticas afectando a la síntesis de ácidos nucleicos.

Agentes que reticulan directamente ácidos nucleicos, específicamente ADN, están previstos y se muestran en esta memoria para provocar un deterioro del ADN que conduzca a una combinación antineoplástica sinérgica. Se pueden utilizar agentes tales como cisplatino y otros agentes alquilantes del ADN. Cisplatino ha sido ampliamente utilizado para tratar el cáncer, con dosis eficaces utilizadas en aplicaciones clínicas de 20 mg/m^{2} durante 5 días cada tres semanas para un total de tres cursos. Cisplatino no se absorbe por vía oral y, por lo tanto, debe ser suministrado a través de inyección intravenosa, subcutánea, intratumoral o intraperitoneal.

Agentes que deterioran el ADN incluyen también compuestos que interfieren en la replicación del ADN, mitosis y segregación cromosomal. Ejemplos de estos compuestos incluyen adriamicina, también conocida como doxorubicina, etopósidos, verapamil, podofilotoxina y similares. Ampliamente utilizados en una disposición clínica para el tratamiento de neoplasmas, estos compuestos se administran a través de inyecciones de bolo por vía intravenosa en dosis que oscilan desde 25-75 mg/m^{2} a intervalos de 21 días para adriamicina, hasta 35-50 mg/m^{2} para etopósidos por vía intravenosa o doblando la dosis intravenosa por vía oral.

Agentes que interrumpen la síntesis y fidelidad de los precursores de ácidos nucleicos y subunidades conducen también al deterioro del ADN. Como tales, se ha desarrollado un cierto número de precursores de ácidos nucleicos. Particularmente útiles son agentes que han experimentado un amplio ensayo y están fácilmente disponibles. Como tales, por parte del tejido neoplástico se utilizan preferencialmente agentes tales como 5-fluorouracilo (5-FU), haciendo a este agente particularmente útil para apuntar como objetivo a células neoplásticas. A pesar de ser bastante tóxico, 5-FU es aplicable en una amplia gama de vehículos incluidos los tópicos, siendo sin embargo comúnmente utilizada la administración intravenosa con dosis que oscilan entre 3 y 15 mg/kg/día.

Otros factores que provocan el deterioro del ADN y que han sido utilizados ampliamente incluyen los que comúnmente se conocen como rayos \gamma, rayos X y/o la aportación dirigida de radioisótopos a células tumorales. Se contemplan también otras formas de factores deteriorantes del ADN tales como microondas e irradiación UV. Lo más probable es que todos estos factores efectúen una amplia gama de deterioros sobre los precursores de ADN, la replicación y reparación de ADN y la conjunción y el mantenimiento de cromosomas. Los intervalos de dosificación para rayos X oscilan desde dosis diarias de 50 a 200 roentgens durante períodos de tiempo prolongados (3 a 4 semanas) a dosis sencillas de 2000 a 6000 roentgens. Los intervalos de dosificación para radioisótopos varían ampliamente y dependen de la semivida del isótopo, de la resistencia y tipo de radiación emitida y de la absorción por parte de las células neoplásticas.

Se remite al practicante experto a "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15ª edición, capítulo 33, en particular páginas 624-652. Necesariamente, se producirá una cierta variación en la dosificación, dependiendo del estado del sujeto que esté siendo tratado. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Además de ello, para la administración a seres humanos, las preparaciones deberían cumplir los patrones de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y de pureza, según se requiere por la Oficina Federal de Patrones Biológicos.

G. p53 y tratamiento con cisplatino

En un esfuerzo para determinar la eficacia de una combinación de una terapia de reemplazamiento de genes y quimioterapia en el cáncer humano, los autores de la invención examinaron si la administración secuencial de Ad-p53 y CDDP podría inducir la apoptosis in vivo. 3 días después de la inyección intratumoral directa de Ad-p53 o de la administración intraperitoneal de CDDP, tumores H358 implantados por vía subcutánea en ratones nu/nu mostraron una modesta ralentización del crecimiento. Sin embargo, si Ad-p53 y CDDP se administraban simultáneamente, los tumores remitían parcialmente y el tamaño del tumor permanecía de manera estadísticamente menos significativa que aquellos tumores en cualquiera de los otros grupos de tratamiento. El efecto inhibidor del crecimiento era incluso más pronunciado después de dos ciclos de tratamiento (figura 13A). El examen histológico reveló una destrucción masiva de células tumorales en la zona en la que se inyectó Ad-p53 en ratones tratados con CDDP. La tinción in situ demostró muchas células apoptóticas en torno a espacios acelulares (figuras 13B-E). En contraposición, tumores tratados con CDDP solo o Ad-p53 solo no mostraron ni una acelularidad ni zonas apoptóticas.

Como se especifica en las reivindicaciones, la presente invención describe una nueva estrategia para la terapia génica humana combinada con una quimioterapia convencional utilizando un agente reticulante de ADN. La resistencia de células tumorales a fármacos quimioterapéuticos representa un problema principal en la oncología clínica. NSCLC representa al menos el 80% de los casos de cáncer de pulmón; sin embargo, pacientes con NSCLC no responden generalmente a la quimioterapia (Doyle, 1993). Un objetivo de la actual investigación del cáncer es encontrar vías para mejorar la eficacia de la terapia de reemplazamiento de genes para el cáncer al investigar la interacción entre el producto génico y los fármacos quimioterapéuticos. El gen herpes simplex-timidina-quinasa (HS-tK), cuando se administra a tumores cerebrales mediante un sistema de vector retroviral, inducía con éxito la suceptibilidad al agente antiviral ganciclovir (Culver, et al., 1992). El producto génico HS-tK es una enzima viral exógena, mientras que la proteína wt-p53 se expresa en tejidos normales, sugiriendo que la modulación de la quimiorresistencia por parte de alteraciones en la expresión de wt-p53 podría ser un enfoque alternativo utilizando una vía mediada por un programa genético endógeno.

Un sistema de adenovirus tiene ventajas potenciales para la aportación de genes in vivo, tal como una facilidad de producir elevados títulos de virus, elevada eficacia de la infección e infectividad para muchos tipos de células. Sin embargo, la estabilidad y duración de la expresión del gen introducido siguen siendo una controversia. Para la terapia quimiogénica, los niveles de expresión y la alta infectividad pueden ser más significativos que la duración de la expresión, ya que los fármacos pueden exterminar células infectadas en el espacio de varios días. El aumento en los niveles de p53 en células que son sensibles a fármacos quimioterapéuticos se puede producir en el espacio de 6 horas después de los estímulos deteriorantes del ADN (Fritsche, et al., 1993, Zhan, et al., 1993), a pesar de que la actividad de unión del ADN a p53 incrementada puede invertirse a lo largo del curso de 4 horas si se retira el estímulo (Tishler, et al., 1993). En el presente modelo, la expresión del gen wt-p53 es impulsada independientemente por el promotor de citomegalovirus contenido en un vector Ad-p53. Por lo tanto, se puede mantener un alto nivel de la expresión de p53, incluso después de cesar en la exposición al fármaco. La expresión de la proteína wt-p53 por parte de Ad-p53 presenta un pico el día 3 después de la infección (14 veces mayor que el tipo salvaje endógeno) y disminuye hasta un bajo nivel hacia el día 9 (Zhang, et al., 1993). Este sugiere que un nivel transitoriamente elevado de la expresión de wt-p53 es suficiente para iniciar el programa citotóxico en la célula cancerígena.

H. Pacientes y protocolos de tratamiento

Los autores de la invención proponen que la aportación regional de construcciones de genes adenovirales-p53 a células cancerígenas de pulmón en pacientes con cánceres ligados a p53, tales como cánceres endobronquiales obstructivos no reseccionables, serán un método muy eficaz para aportar un gen terapéuticamente eficaz para que contrarreste la enfermedad clínica. La aportación del gen p53 se ha de producir en combinación con agentes o factores que conduzcan al deterioro del ADN. Este enfoque combinado es una mejora significativa en las actuales terapias del cáncer, por ejemplo la pérdida de la sensibilidad a cisplatino solo, que se basa en intentos para exterminar o eliminar la última célula cancerígena efectuando el deterioro del ADN. Dado que la latencia de la célula tumoral es un fenómeno establecido, ésto hace muy improbable el exterminio eficaz.

Se anticipa que la absorción de las construcciones de adenovirus por parte de células NSCLC disminuirá la tasa de proliferación de estas células, pero los presentes ejemplos demuestran que el uso combinado de un agente o factor deteriorante del ADN con el adenovirus p53 conduce a una profunda disminución del crecimiento celular y del tamaño del tumor, no mostrada con cualquier factor solo. Las composiciones y los métodos descritos en esta memoria presagian fuertemente un aumento en la duración del tiempo que el pulmón afectado permanecería expandido, prevendría el re-crecimiento del tumor y la división de células tumorales y prolongaría la supervivencia del paciente.

Para este protocolo combinado se considerarán pacientes con una recurrencia del tumor endobronquial no reseccionable que está obstruyendo parcial o completamente las vías respiratorias y que han fallado o que son incapaces de recibir una radioterapia de haces externa. Las terapias existentes para este estado ofrecen sólo una paliación a corto plazo. La mayoría de los pacientes han sufrido una recurrencia, a pesar de la radioterapia de haces externa. Puede ser posible insertar un catéter de braquiterapia y administrar una radioterapia adicional, la administración intravenosa de agentes deteriorantes del ADN. Los pacientes que reciben los actuales tratamientos tienen una supervivencia mediana de 6 meses. Para recibir la terapia génica, también se podría elegir a pacientes que fallaran en la braquiterapia. El tumor se puede eliminar de las vías respiratorias con el láser o un forceps de biopsia. Esto se puede realizar en unión con la inyección de las construcciones adenovirales, disminuyendo así el volumen que ha de ser inyectado. La administración de las construcciones virales no excluye el hecho de que el paciente reciba otra terapia paliativa si el tumor progresa.

I. Otras técnicas de transferencia de genes

La terapia génica con éxito requiere generalmente la integración de un gen capaz de corregir el trastorno genético en el genoma del hospedante, en donde co-existe y se replica con el ADN del hospedante y se puede expresar a un nivel para compensar el gen defectuoso. De manera ideal, la enfermedad se curaría mediante uno o unos pocos tratamientos, sin efectos secundarios graves. Han existido varios enfoques para la terapia génica propuestos hasta la fecha, que se pueden utilizar con la presente invención.

Un primer enfoque consiste en transfectar el ADN que contiene el gen de interés en células, por ejemplo al permeabilizar la membrana celular ya sea por medios químicos o físicos. Este enfoque está generalmente limitado a células que pueden ser eliminadas temporalmente del cuerpo y que pueden tolerar la citotoxicidad del tratamiento (es decir linfocitos). Para la transfección in vivo se pueden utilizar liposomas o conjugados de proteínas formados con determinados lípidos y péptidos anfofílicos (Stewart et al., 1992; Torchilin et al., 1992, Zhu et al., 1993), pero la actual eficacia de la integración de genes es muy baja. Se estima que el gen de interés se integra en el genoma de sólo una célula de 1.000 a 100.000. En ausencia de la integración, la expresión del gen transfectado se limita a varios días en células proliferantes o a varias semanas en células no proliferantes debido a la degradación de los ADNs no integrados.

Un segundo enfoque se capitaliza sobre la capacidad natural de virus de penetrar en células, llevando consigo su propio material genético. Los retrovirus han prometido como vectores de aportación de genes debido a su capacidad para integrar sus genes en el genoma hospedante, transfiriendo una gran cantidad de material genético extraño, infectando un amplio espectro de especies y tipos de células y siendo empaquetados en líneas celulares especiales (Miller, 1992).

Un tercer método utiliza otros virus tales como adenovirus, virus herpex simplex (HSV), citomegalovirus (CMV) y virus adeno-asociados (AAV) que son tratados por ingeniería para que actúen como vectores para la transferencia de genes. A pesar de que algunos virus pueden aceptar material genético extraño están limitados en el número de nucleótidos que pueden alojar y en el intervalo de células que pueden infectar, estos virus han demostrado efectuar con éxito la expresión de genes. Sin embargo, los adenovirus no integran su material genético en el genoma del hospedante y, por lo tanto, no requieren la replicación del hospedante para la expresión del gen, haciéndoles idealmente adecuados para una expresión del gen rápida, eficaz y heteróloga.

A pesar de que la invención se ha descrito con un cierto grado de particularidad, es evidente que para los expertos en la técnica, a la vista de la descripción que antecede, resultarán evidentes muchas alternativas, modificaciones y variaciones. Por consiguiente, se pretende que todas dichas alternativas, modificaciones y variaciones que caen dentro del espíritu y el alcance de la invención queden abarcadas por las reivindicaciones definidas.

Se incluyen los siguientes ejemplos para demostrar realizaciones preferidas de la invención. Deberá apreciarse por parte del experto en la técnica que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por el autor de la invención que funcionan bien en la práctica de la invención y, así, se pueden considerar que constituyen modos preferidos para su puesta en práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deberían apreciar, a la vista de la presente descripción, que se pueden realizar muchos cambios en las realizaciones específicas que se describen y se puede seguir obteniendo un resultado parecido o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1 Construcción del vector de expresión de p53

Este ejemplo describe la construcción de un vector de expresión de p53. Este vector se construye tal como se indica y se utiliza para reemplazar la región E1 (1,3-9,2 u.m.) del genoma de la cepa Ad5 de adenovirus y se emplea para construir el virión de adenovirus descrito en el Ejemplo 2.

La casete de expresión de p53 mostrada en la figura 1, que contiene promotor de citomegalovirus (CMV) humano (Boshart, et al., 1985), ADNc de p53 y una señal de poliadenilación temprana de SV40, se insertó entre los sitios Xba I y Cla I de pXCJL1 (proporcionado por el Dr. Frank L. Graham, McMaster University, Canadá).

El tamaño del genoma es de aproximadamente 35,4 kb, dividido en 100 unidades de mapa (1 u.m. = 0,35 kb). La casete de expresión de p53 reemplazó a la región E1 (1,3-9,2 u.m.) del genoma de Ad5.

El cebador 1 tiene la secuencia 5'-GGCCCACCCCCTTGGCTTC-3' (SEQ ID NO:1) y está situado en el primer intrón situado más abajo del promotor del gen IE principal de CMV humano (Boshart, et al., 1985). El cebador 2 tiene la secuencia 5'-TTGTAACCATTATAAGCTGC-3' (SEQ ID NO:2) y está situado en la señal de poliadenilación temprana de SV40. Los dos cebadores, separados 15-20 pb de la inserción de ADNc de p53 en ambos extremos, definen un producto por PCR de 1,40 kb. El cebador 3 tiene la secuencia 5'-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3' (SEQ ID NO:3) y el cebador 4 tiene la secuencia 5'-CATCTGAACTCAAAGCGTGG-3' (SEQ ID N:4) y están situados a 11 u.m. y 13,4 u.m. del genoma de Ad5, respectivamente, que definen un producto de PCR específico del genoma viral de 0,86 kb.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Generación y propagación de adenovirus p53 recombinantes

Este ejemplo describe un método adecuado para generar adenovirus recombinantes, independientes de células cooperadoras, que expresan p53. La estrategia molecular empleada para producir adenovirus recombinantes se basa en el hecho de que, debido al límite de empaquetamiento de adenovirus, pJM17 no puede formar virus por sí mismo. Por lo tanto, la recombinación homóloga entre el plásmido del vector de expresión de p53 y pJM17 dentro de una célula transfectada da como resultado un virus viable que se puede empaquetar sólo en células que expresan las proteínas adenovíricas necesarias.

El método de este ejemplo utiliza células 293 como células hospedantes para propagar virus que contienen sustituciones de casetes de expresión de ADN heterólogas en las regiones E1 o E3. Este proceso requiere la co-transfección de ADN en células 293. La transfección determina ampliamente la eficacia de la propagación viral. El método utilizado para la transfección de ADN en células 293 antes de la presente invención consistía, habitualmente, en la co-precipitación de fosfato de calcio/ADN (Graham y van der Eb, 1973). Sin embargo, este método, junto con el análisis de placas, es relativamente difícil y, típicamente, da como resultado una baja eficacia de la propagación viral. Como se ilustra en este ejemplo la transfección y la subsiguiente identificación de células infectadas fueron significativamente mejoradas utilizando la transfección mediada por liposomas, cuando se identifican las células transfectadas por el efecto citopático (CPE).

La línea de células 293 se mantuvo en medio esencial mínimo modificado por Dulbecco, suplementado con suero de caballo al 10% inactivado por calor. El vector de expresión de p53 y el plásmido pJM17 (McGrory, et al., 1988) para la recombinación homóloga se co-transfectaron en células 293 mediante la transfección mediada por DOTAP de acuerdo con el protocolo del fabricante (Boehringer Mannheim Biochemicals, 1992). Esto se muestra esquemáticamente en la figura 1.

Las células 293 (paso 35, 60% de confluencia) se inocularon 24 horas antes de la transfección en cualquiera de platillos de 60 mm o placas de 24 pocillos. Las células en cada pocillo se transfectaron con: 30 \mul de DOTAP, 2 \mug de vector de expresión de p53 y 3 \mug de plásmido pJM17. Después de la transfección, las células se alimentaron en el medio MEM cada 2-3 días hasta el inicio del CPE.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Confirmación de la identidad de adenovirus recombinantes

Este ejemplo ilustra un nuevo ensayo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para confirmar la identidad de viriones recombinantes después de la co-transfección de la línea celular apropiada.

Partes alícuotas de sobrenadantes del cultivo de células (50 a 370 \mul) se recogieron de las placas de ensayo, se trataron con proteinasa K (50 \mug/ml con SDS al 0,5% y EDTA 20 mM) a 56ºC durante 1 hora, se extrajeron con fenol-cloroformo y los ácidos nucleicos se precipitaron con etanol. Los sedimentos de ADN se resuspendieron en 20 \mul de dH_{2}O y se utilizaron como molde para la amplificación por PCR. Las localizaciones relativas de los cebadores de PCR y sus secuencias se describen en la figura 1 y son las SEQ ID NO: 1, 2, 3 y 4, respectivamente. Los cebadores específicos de la inserción de ADNc definen un producto de PCR de 1,4 kb, y los cebadores específicos del genoma viral definen un producto de PCR de 0,86 kb. Las reacciones PCR se llevaron a cabo en un volumen de 50 \mul que contenía MgCl_{2} 4 mM, KCl 50 mM, Triton X-100 al 0,1%, 200 \muM de cada uno de los dNTPs, Tris-Cl 10 mM (pH 9,0), 2 \muM de cada uno de los cebadores y 1,0 unidad de Taq polimerasa (Promega). Las reacciones se llevaron a cabo a 94ºC, 0,5 min, a 56ºC, 0,5 min y a 72ºC, 1 min durante 30 ciclos.

Con el fin de simplificar el procedimiento de identificación de virus recombinantes recientemente propagados, se desarrolló un ensayo PCR directo en muestras de ADN procedentes de sobrenadante de cultivo celular. Partes alícuotas (50 ó 370 \mul) del sobrenadante del medio celular con CPE se trataron con proteinasa K y se extrajeron con fenol/cloroformo. Después de la precipitación con etanol, las muestras de ADN se analizaron utilizando PCR empleando dos pares de cebadores para amplificar las secuencias específicas de la inserción y específicas del genoma viral. Las dianas de los cebadores PCR y sus secuencias se describen en la figura 1. Los cebadores 1, 2, 3 y 4 se representan por las SEQ ID NOs: 1, 2, 3 y 4, respectivamente.

Como resultado, una inserción de ADNc de 1,4 kb y un fragmento del genoma viral de 0,86 kb se amplificaron a partir del vector de expresión (testigo positivo) y las muestras de ADN del cultivo de células positivas (figura 2B, pistas 1 y 4, respectivamente). Únicamente el fragmento de 0,86 kb se amplificó a partir de la muestra de ADN de virus Ad5/RSV/GL2 (testigo negativo, pista 2). No aparecieron bandas amplificadas de reacciones PCR que utilizaban sobrenadante de medio de cultivo celular positivo no tratado (pista 3).

Estos resultados indicaron que los adenovirus liberados al medio de cultivo celular son detectables por PCR, utilizando una cantidad tan pequeña como 50 \mul del sobrenadante del medio de cultivo celular para preparar moldes de ADN. Estos resultados permitirán el desarrollo de un método cuantitativo para utilizar esta técnica para determinar títulos de adenovirus, tradicionalmente realizados mediante análisis de placas.

La secuencia de tipo salvaje del ADNc de p53 en el virus Ad5CMV-p53 se confirmó mediante la secuenciación de didesoxi-ADN sobre el ADN viral purificado por gradiente de CsCl. El virus testigo Ad5/RSV/GL2, generado de una manera similar, tiene una estructura similar a la Ad5CMV-p53, excepto que en su casete de expresión se utilizaron un promotor viral del sarcoma de Rous y ADNc de luciferasa. El adenovirus recombinante que porta un gen \beta-galactosidasa de E. coli (LacZ), Ad5CMV-LacZ, tiene también una estructura similar a la de Ad5CMV-p53, y se puede obtener según se describe en Zhang et al. y a partir del Dr. Frank L. Graham (por favor, véase Graham, et al., 1991).

Material, título o infección viral. Clones individuales de los virus Ad5CMV-p53, Ad5/RSV/GL2 y Ad5CMV-LacZ se obtuvieron mediante purificación en placa de acuerdo con el método de Graham y Prevec (1991). Clones sencillos de virus se propagaron en células 293. El medio de cultivo de las células 293 que muestra el efecto citopático completo se recogió y centrifugó a 1000 x g durante 10 min. Los sobrenadantes agrupados se repartieron en partes alícuotas y se almacenaron a -20ºC en forma de materiales virales. Los títulos virales se determinaron mediante análisis de placas (Graham y Prevec, 1991). Las infecciones de las líneas celulares se llevaron a cabo mediante la adición de las soluciones virales (0,5 ml por cada platillo de 60 mm) a monocapas de células e incubación a la temperatura ambiente durante 30 min con una breve agitación cada 5 min. Esto fue seguido por la adición de medio de cultivo y la devolución de las células infectadas a la incubadora a 37ºC.

La eficacia de la transferencia de genes de los adenovirus recombinantes también se evaluó utilizando Ad5CMV-LacZ en una diversidad de líneas celulares tales como H226Br, H322, H460, HeLa, Hep G2, LM2 y Vero. Mediante tinción con X-gal, todas las líneas celulares se tiñieron en un 97-100% de azul después de la infección con Ad5CMV-LacZ a una m.d.i. de 30 UFP/célula.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Expresión del gen p53 dirigida por Ad5CMV-p53 en células de cáncer de pulmón humanas

Este ejemplo describe el uso de adenovirus p53 recombinantes para infectar células de cáncer de pulmón humanas con una delección del gen p53 homozigótica. Los resultados demuestran que el crecimiento de estas células y la expresión de p53 mutante fue suprimida, indicando el potencial del virión Ad5CMV-p53 como un agente útil para el control de células metastáticas.

La inmunohistoquímica se efectuó sobre monocapas de células infectadas que se fijaron con 3,8% de formalina y se trataron con 3% de H_{2}O_{2} en metanol durante 5 min. El análisis inmunohistoquímico se efectuó utilizando el estuche Vectastain Elite (Vector, Burlingame, CA). El anticuerpo primario utilizado era anticuerpo PAb 1801 anti-p53 (Oncogene Science, Manhasset, NY); MOPC-21 (Organon Teknika Corp., West Chester, PA) se utilizó como testigo negativo. El segundo anticuerpo era una IgG anti-raton marcada con avidina (Vector). Se utilizó el reactivo complejo de peroxidasa de rábano picante ABC biotinilado para detectar el complejo de antígeno-anti-cuerpo. Finalmente, las células se tiñieron de forma antagonista con hematoxilina de Harris (Sigma) y se montaron con Cytoseal 60 (Stephens Scientific, Riverdale, NJ).

El análisis inmunohistoquímico de las líneas celulares infectadas se efectuó para examinar la expresión in situ de la expresión de p53 impulsada por el promotor de CMV del virus Ad5CMV-p53. En la línea celular H358, que tiene una deleción homozigótica de p53, el gen p53 se transfirió con una eficacia del 97-100%, según se detecta por análisis inmunohistoquímico, cuando las células se infectaron con Ad5CMV-p53 a una multiplicidad de infección de 30-50 unidades formadoras de placas (UFP)/célula (figura 4).

La elevada eficacia de la transferencia de adenovirus recombinantes se confirmó mediante Ad5CMV-LacZ, un virus que porta el gen LacZ transcrito por el promotor de IE de CMV humano. A una m.d.i. de 30-50 UFP/célula, todas las células examinadas, incluidas HeLa, Hep G2, LM2 y las líneas de células cancerígenas de NSCLC humanas eran en un 97-100% positivas para la actividad de \beta-galactosidasa mediante tinción con X-gal. Estos resultados indican que los vectores adenovirales son un vehículo eficaz para la transferencia de genes en células cancerígenas humanas.

Se efectuó un análisis por transferencia Western sobre los lisados totales de células, preparados al lisar células monocapa en platillos con tampón de muestra SDS-PAGE (0,5 ml por cada platillo de 60 mm) después de aclarar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Para el análisis por SDS-PAGE, las pistas se cargaron con lisados de células equivalentes a 5 x 10^{4} células (10-15 ml). Las proteínas en el gel se transfirieron a una membrana Hybond®-ECL (Amersham, Arlington Heights, IL). Las membranas se bloquearon con 0,5% de leche seca en PBS y se sondearon con los anticuerpos primarios: anticueropo PAb 1801 monoclonal p53 anti-humano de ratón y anticuerpo monoclonal \beta-actina anti-humano de ratón (Amersham), se lavaron y sondearon con el anticuerpo secundario: IgG anti-ratón de conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Las membranas se desarrollaron de acuerdo con el protocolo de quimioluminiscencia mejorado por Amersham. Cantidades relativas del p53 exógeno expresado se determinaron mediante un densitómetro (Molecular Dynamics Inc., Sunnyvale, CA).

Las transferencias Western mostraron que la proteína p53 exógena se expresaba a un elevado nivel (figura 5A, pistas 2, 3 y 5, 6). La proteína mostró un pico el día 3 después de la infección (figura 6, inserción, 0,5 días a 3 días). Como testigo, se construyó un virión con una estructura similar al Ad5CMV-p53 recombinante del Ejemplo 1. Este virión contiene un ADNc de luciferasa impulsado por el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous en la casete de expresión del virión. Ni la expresión de p53 ni el cambio en la expresión de actina se detectaron en las células infectadas por el virión Ad5/RSV/GL2.

El adenovirus p53 recombinante se utilizó para infectar tres líneas celulares NSCLC de pulmón humanas: la línea celular H358, que tiene una deleción homozigótica en el gen p53, la línea celular H322, que tiene una mutación puntual del gen p53 en el codón 248 (G a T), y la línea celular H460, que tiene un gen p53 de tipo salvaje. La tasa de crecimiento de células NSCLC humanas se determinó después de la inoculación de H322 y H460 (1 x 10^{5}) o H358 (2 x 10^{5}) en platillos de cultivo de 60 mm 24 h antes de la infección viral. Las células se infectaron con los virus a una multiplicidad de infección (m.d.i.) de 10 UFP/célula. Medio de cultivo se utilizó para la infección ficticia del testigo. Cultivos triples de cada línea celular con diferentes tratamientos se recontaron diariamente durante los días 1-6 después de la infección.

El crecimiento de las células H358 infectadas con Ad5CMV-p53 quedó grandemente inhibido en contraposición con el de células no infectadas o las células infectadas con el virión testigo (figura 7A). El crecimiento de células H322 también fue grandemente inhibido por el virión p53 (figura 7B), mientras que las células H460 de cáncer de pulmón humanas que contienen p53 de tipo salvaje se vieron afectadas en un menor grado (figura 7C). El crecimiento de las células H358 infectadas con el virus Ad5CMV-p53 fue inhibido en un 79%, mientras que el de las células no infectadas o las células infectadas con el virus testigo no fueron inhibidas. El crecimiento de la línea celular H322, que tiene una mutación puntual en p53, fue inhibido en un 72% por Ad5CMV-p53, mientras que la línea celular H460 que contiene p53 de tipo salvaje fue menos afectada (inhibición del 28%).

Los resultados indican que el adenovirus recombinante de p53 posee propiedades de supresión de tumores, actuando a través de la restauración de la función de la proteína p53 en células de tumores.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Ad5CMV-p53 en el tratamiento de células deficientes en p53

El presente ejemplo se refiere al uso de adenovirus p53 recombinante para restaurar la supresión del crecimiento de células de tumores in vitro y, así, tratar el crecimiento maligno o metastático de células. Describe alguno de los modos en los que se prevé utilizar la presente invención en el tratamiento del cáncer a través de la terapia génica mediada por adenovirus.

Células H358 se infectaron con Ad5CMV-p53 y Ad5/SRV/GL2 a una m.d.i. de 10 UFP/célula. Una cantidad igual de células se trató con un medio en calidad de una infección ficticia. Veinticuatro horas después de la infección, las células tratadas se recolectaron y se aclararon dos veces con PBS. Para cada tratamiento, se inyectaron s.c. a cada ratón desprovisto del sistema inmunológico tres millones (3 x 10^{6}) células en un volumen de 0,1 ml (Harlan Co., Houston, TX). Para cada tratamiento se utilizaron cinco ratones. Los ratones se irradiaron (300 cGy, ^{60}Co) antes de la inyección y se examinaron semanalmente después de la inyección. La formación del tumor se evaluó al final de un período de 6 semanas y el volumen del tumor se calculó asumiendo una forma esférica y calculándose el diámetro medio del tumor como la raiz cuadrada del producto de los diámetros en sección transversal.

Para determinar el efecto inhibidor sobre la tumorigenicidad mediada por Ad5CMV-p53, a ratones desprovistos del sistema inmunológico se les inyectaron s.c. células H358 (una célula de tipo NSCLC humana) para inducir el crecimiento neoplástico. Cada ratón recibió una inyección de células que habían sido infectadas con Ad5CMV-p53 o Ad5/RSV/GL2 a razón de 10 UFP/célula durante 24 h. Células H358 tratadas con medio solo se utilizaron como testigos infectados de modo ficticio. Los tumores, primeramente palpables el día 14 después de la infección, se indujeron únicamente mediante las células infectadas de modo ficticio o por virus testigo según se demuestra en la Tabla I:

TABLA I Efecto de Ad5CMV-p53 sobre la tumorigenicidad de H358 en ratones desprovistos del sistema inmunológico^{a}

1

Tal como se muestra en la Tabla I, ratones que recibieron células tratadas con Ad5CMV-p53 no desarrollaron tumores. Los tumores al final de un período de 6 semanas tenían un diámetro de 4-10 mm. Este estudio se inició con cinco ratones por grupo; un ratón en cada uno de los grupos Ad5CMV-p53 o Ad5/RSV/GL2 fallaron para completar el estudio. Las muertes tempranas fueron debidas presumiblemente a una infección nosocomial.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 Ad5CMV-p53 en el tratamiento del cáncer de pulmón

El presente ejemplo se refiere al uso de adenovirus p53 recombinante para restaurar la supresión del crecimiento de células tumorales in vivo y, así, para tratar cánceres en animales. Describe alguno de los modos en los que se prevé utilizar la presente invención en el tratamiento del cáncer a través de la terapia génica mediada por adenovirus.

La eficacia de Ad5CMV-p53 para inhibir la tumorigenicidad se evalúa adicionalmente en el modelo de ratones de cáncer de pulmón humano ortotópico. Dado que células H358 y H322 no producían tumores en este modelo, se utilizó la línea de células H226Br. Esta línea de células tiene un origen de cáncer de pulmón escamoso y se metastatiza a partir del pulmón hacia el cerebro. H226Br tiene una mutación puntual (ATC a GTC) en el exón 7, codón 254 del gen p53 y es tumorígena en ratones.

El procedimiento para ensayos en el modelo con ratones del cáncer de pulmón humano ortotópico ha sido previamente descrito (Georges, et al., 1993). En síntesis, ratones desprovistos de defensas tratados con radiación (300 cGy, ^{60}Co) se inocularon con células H226Br mediante instilación intratraqueal. Cada ratón recibió 2 x 10^{6} células en un volumen de 0,1 ml de PBS. Tres días después de la inoculación, 10 ratones por grupo se trataron con 0,1 ml de virus o vehículo (PBS) mediante instilación intratraqueal una vez al día durante dos días. La dosificación de virus utilizada era 5 x 10^{7} Ad5CMV-p53 o Ad5/RSV/GL2 por ratón. Los ratones se eutanizaron al final de un período de 6 semanas. La formación del tumor se evaluó diseccionando los tejidos del pulmón y del mediastino y midiendo el tamaño del tumor. Los tumores se confirmaron mediante análisis histológico de las secciones de la masa de tumor.

Los ratones desprovistos de defensas irradiados se inocularon con 2 x 10^{6} células H226Br/ratón mediante instilación intratraqueal. Tres días después de la inoculación, cada uno de los ratones (8-10 ratones por grupo) se trató con 0,1 ml de Ad5CMV-p53 o Ad5/RSV/GL2 o vehículo (PBS) mediante instilación intratraqueal una vez al día durante dos días. La dosificación de virus utilizada era 5 x 10^{7} UFP/ratón. La formación del tumor se evaluó al final de un período de 6 semanas diseccionando los tejidos del pulmón y del mediastino y midiendo el tamaño del tumor. En la figura 7 se representa un diagrama de flujo del procedimiento, estando mostradas en la figura 8 las muestras representativas de la disección. Los tumores detectados se confirmaron mediante análisis histológico. Los datos de las mediciones del tumor se resumen en la Tabla II:

TABLA II Efecto de Ad5CMV-p53 sobre la tumorigenicidad de H226Br en ratones despovistos del sistema inmunológico^{a}

2

Sólo el 25% de los ratones tratados con Ad5CMV-p53 formó tumores, mientras que en el grupo vehículo o el grupo testigo Ad5/RSV/GL2, el 70-80% de los ratones tratados formó tumores. El tamaño medio del tumor del grupo Ad5CMV-p53 era significativamente más pequeño que los de los grupos testigo. Estos resultados indican que Ad5CMV-p53 puede evitar que H226Br forme tumores en el modelo con ratones de cáncer de pulmón humano ortotópico.

Ejemplo 7 Sinergismo entre p53 y deterioro del ADN

Las características bioquímicas de la muerte programada de células (apoptosis) muestra un modelo característico de fragmentación del ADN que resulta de la escisión de ADN nuclear. Estudios recientes han demostrado que la inducción de la apoptosis por parte de fármacos quimioterapéuticos o radiación ionizante puede relacionarse con el estado del gen p53 y que estímulos deteriorantes del ADN son capaces de elevar los niveles de proteína p53 intracelulares en células que están en el proceso de la apoptosis (Lowe, et al., 1993, Clarke, et al., 1993, Fritsche, et al., 1993, Harper, et al., 1993, El-Deiry, et al., 1993). La inhibición del ciclo celular en la fase G_{1} por parte de niveles incrementados de la proteína p53 de tipo salvaje (wt-p53) permite más tiempo para la reparación del ADN; si es imposible una reparación óptima, p53 puede disparar una muerte programada de la célula. Así, p53 puede contribuir en la inducción de la muerte de la célula por tumor apoptótica por parte de agentes quimioterapéuticos.

\global\parskip0.900000\baselineskip

La inactivación del gen p53 mediante una mutación o deleción de mal sentido es la alteración genética más común en cánceres humanos (Levine, et al., 1991, Hollstein, et al., 1991). La pérdida de la función de p53 ha sido reseñada para reforzar la resitencia celular a una diversidad de agentes quimioterapéuticos (Lowe, et al., 1993). Los estudios de los autores de la invención demostraron que células H358 de cáncer de pulmón de células no pequeñas humano (NSCLC) en las que los dos alelos de p53 están suprimidos, eran resistentes a fármacos quimioterapéuticos, mientras que la línea de células WTH226b, que tiene una wt-p53 endógena, mostró fácilmente una muerte apoptótica de la célula 16 horas después del tratamiento con cisplatino (CDDP) y etopósido (VP-16) (T. Fujiwara, E. A. Grimm, T. Mukhopadhyay, J. A. Roth, datos no publicados). Por lo tanto, los autores de la invención buscaron determinar si la introducción del gen wt-p53 en células H358 mediante un vector adenoviral podría incrementar la sensibilidad de la célula al agente CDDP reticulante de ADN in vitro e in vivo.

Materiales y métodos

Células H358 fueron gustosamente proporcionadas por A. Gazdar y J. Minna (Takahashi, et al., 1989).

Vectores de adenovirus

La construcción e identificación de un vector de adenovirus recombinante que contiene el ADNc que codifica wt-p53 humana (Ad-p53) o luciferasa (Ad-Luc) se reseñaron previamente (Zhang, et al., 1993). En síntesis, la casete de expresión de p53 que contiene el promotor de citomegalovirus humano, ADNc de wt-p53 y la señal de poliadenilación temprana de SV40, se insertó entre los sitios XbaI y ClaI de pXCJL.1. El vector de lanzadera de p53 y el plásmido recombinante pJM17 se co-transfectaron en células 293 (línea de células de riñón embriónico humano transformadas con Ad5) mediante una técnica mediada por liposomas. El sobrenadante de cultivo de células 293 que muestra el efecto citopático completo se recogió y utilizó para las subsiguientes infecciones. El virus Ad-Luc testigo se generó de una manera similar. Virus Ad-p53 y Ad-Luc se propagaron en células 293. La presencia del virus competente de la replicación se excluyó mediante análisis con células HeLa. Los títulos virales se determinaron mediante análisis de placas (Graham, et al., 1991).

Detección de la fragmentación de ADN nucleosomal

ADN se aisló a partir de células parentales, infectadas con Ad-Luc e infectadas con Ad-p53 que recibieron o no recibieron un tratamiento mediante CDDP, incubando las células a 55ºC durante 6 horas en tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 100 mM, NaCl 100 mM, SDS al 1% y 50 \mug/ml de proteinasa K). El ADN se extrajo dos veces con volúmenes iguales de fenol y una vez con cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) y luego se precipitó en etanol. Las muestras se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio.

El marcaje del extremo de mella de dUTP mediado por TdT se efectuó de acuerdo con un procedimiento previamente rese-ñado (Gavrieli, et al., 1992). Células monocapa se trataron con NP-40 al 0,01%. Los portaobjetos se sumergieron en tampón TdT (Tris-HCl 30 mM, pH 7,2; cacodilato de sodio 140 mM; cloruro de cobalto 1 mM) y se incubaron con dUTP biotinilado (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) y TdT a 37ºC durante 45 min. Los portaobjetos se cubrieron con albúmina de suero bovino al 2% durante 10 min y se incubaron con un complejo de avidina-biotina (Vectastain Elite Kit; Vector Laboratories, Burlingame, CA) durante 30 min. La detección colorimétrica se efectuó utilizando diamino-bencidina.

Resultados

Células H358 se transdujeron in vitro con el ADNc de wt-p53 humana mediante exposición a Ad-p53. El análisis de la transferencia Western demostró un alto nivel de la expresión de la proteína wt-p53 en una fase tan temprana como 24 horas después de la infección con Ad-p53, pero no se detectó wt-p53 en células parentales (no infectadas) o en células testigo infectadas con Ad-Luc (datos no mostrados). La evaluación inmunohistoquímica concurrente demostró una proteína wt-p53 detectable en más del 80% de las células infectadas, sugiriendo que la transferencia y expresión de p53 por parte de Ad-p53 era muy eficaz (datos no mostrados).

La exposición continua de células H358 infectadas con Ad-p53 a CDDP redujo rápidamente su viabilidad, mientras que la muerte significativa de las células para células parentales y células infectadas con Ad-Luc se produjo sólo después de 72 horas de exposición a CDDP (figura 10A). La pérdida de viabilidad fue grandemente reforzada en células transducidas con Ad-p53. Además de ello, la reducción de la viabilidad se pudo observar incluso cuando las células se mantuvieron en un medio exento de fármaco después de 24 horas de exposición, sugiriendo que el deterioro letal podría ser inducido en el espacio de 24 horas (figura 10B). La sensibilidad de células H358 transducidas con wt-p53 a CDDP era dependiente de la dosis (figura 10C).

Una escala de ADN intranucleosomal, indicativa de la fragmentación del ADN, era evidente en células que expresan wt-p53 24 horas después de la exposición a CDDP; sin embargo, células parentales y células infectadas con Ad-Luc no mostraron ninguna fragmentación de ADN (figura 11A). El marcaje del extremo de mella de 2'-desoxiuridina-5'-trifosfato (dUTP), mediado por desoxinucleotidil-transferasa (TdT), que detecta la fragmentación del ADN característica de apoptosis in situ, mostró muchas células apoptóticas en células infectadas con Ad-p53 tratadas con CDDP durante 24 horas, tal como se muestra en la figura 11 G, que demuestra núcleos fuertemente teñidos y fragmentos nucleares no presentes en las figuras 11B-F.

\global\parskip1.000000\baselineskip

Se conoce la introducción de wt-p53 para inducir la apoptosis en algunos tipos de líneas de células de tumores con p53 suprimida o mutada (Yonish-Rouach, et al., 1991, Shaw, et al., 1992, Ramqvist, et al., 1993). Sin embargo, la sobre-expresión de wt-p53 sola no pudo fomentar la fragmentación del ADN en la línea de células de H358 p53-negativa (figura 11), a pesar de que su crecimiento fue suprimido por Ad-p53 (figura 10). Esto es compatible con las observaciones previas de los autores de la invención que muestran que clones estables de H358 podrían obtenerse después de la transferencia de wt-p53 mediada por retrovirus, y que los clones crecían más lentamente que las células parentales (Cai, et al., 1993).

La eficacia terapéutica potencial de la combinación de Ad-p53 y CDDP se evaluó en términos del cambio relativo en volumen de esferoides H358. El modelo esferoide de tumores multicelular exhibe in vitro una estructura histológica similar a la tumores primarios y micrometástasis. El tratamiento con CDDP provocó una reducción del volumen relativo en esferoides H358 infectados con Ad-p53, pero no tenía ningún efecto significativo sobre esferoides parentales o esferoides infectados con Ad-Luc (figura 12A). El marcaje con dUTP mediado por TdT in situ mostró muchas células en el proceso de apoptosis sobre la superficie de esferoides infectados con Ad-p53, mientras que no se observaron células apoptóticas en esferoides no infectados con Ad-p53 (figuras 12B-E). Los autores de la invención han reseñado previamente que la expresión de wt-p53 mediada por retrovirus inhibía el crecimiento de esferoides H322a, inducida por el factor de crecimiento transformante \alpha (TGF-\alpha) (Fujiwara, et al., 1993). Sin embargo, el vector retroviral no podía infectar esferoides H358, ya que las células en estos esferoides no proliferaban rápidamente en respuesta a TGF-\alpha exógeno. El hallazgo de que la exposición a CDDP reducía el tamaño de esferoides H358 infectados con Ad-p53 al inducir la apoptosis sobre la superficie sugiere que Ad-p53 infecta células no proliferantes y que CDDP inicia el proceso apoptótico en células en reposo.

Ejemplo 8

(Con fines informativos)

Utilización de p53 y agentes deteriorantes del ADN en regímenes de tratamiento

Un modelo con animales ha sido empleado como parte de ensayos preclínicos según se describe aquí en lo que sigue y en los Ejemplos 5, 6 y 7. Pacientes para los que se ha establecido la indicación médica de un tratamiento de transferencia de genes mediada por adenovirus pueden ser ensayados en cuanto a la presencia de anticuerpos dirigidos contra adenovirus. Si están presentes anticuerpos y el paciente tiene un historial de alergia a sustancias farmacológicas o que se producen en la naturaleza, sería indicada una aplicación de una dosis de ensayo del orden de 10^{3} a 10^{6} adenovirus recombinantes bajo estrecha observación clínica.

Para el tratamiento del cáncer utilizando Ad5CMV-p53, adenovirus recombinantes que expresan p53 bajo el control de elementos promotores/reforzadores adecuados, tal como el promotor de CMV, se prepararían y purificarían de acuerdo con un método que sería aceptable para la Food and Drug Administration (FDA) para la administración a seres humanos. Métodos de este tipo incluyen, pero no se limitan a la centrifugación por gradiente de densidades de cloruro de cesio, seguido del ensayo en cuanto a eficacia y pureza.

Para métodos de tratamiento de adenovirus p53 se consideran adecuados dos métodos básicos, una administración directa o local y una administración más general. Los presentes métodos son adecuados para tratar cualquiera de una diversidad de diferentes cánceres que se sabe están relacionados con mutaciones p53. En relación con la administración general, una simple inyección intravenosa de adenovirus ha demostrado ser suficiente como para dar como resultado la infección viral de tejidos en sitios distantes de la inyección (Stratford-Perricaudet et al., 1991b) y, así, es adecuado para el tratamiento de todas las malignidades ligadas a p53. El virus se puede administrar a pacientes por medio de administración intravenosa en cualquier solución farmacológicamente aceptable, o en forma de una infusión a lo largo de un período de tiempo. Hablando en términos generales, se piensa que el número eficaz de partículas de virus funcionales a administrar oscilaría entre 1 x 10^{10} y 5 x 10^{12}.

También, en particular en lo que concierne al cáncer de pulmón, si se desea se podría emplear un ataque físico directo del adenovirus recombinante, de una manera análoga a la administración intratraqueal del regulador de la conductancia en la transmembrana de fibrosis quística (Rosenfeld et al., 1992). Esto daría como resultado la aportación de adenovirus p53 recombinantes en un lugar más próximo al lugar de las células diana.

Métodos

Marcaje con dUTP in situ con TdT para la detección de la apoptosis. Esferoides H358 se fijaron el día 3 y se tiñieron según se describe en el Ejemplo 7. En síntesis, sondas de TdT marcadas se pusieron en contacto con portaobjetos sumergidos en tampón TdT y se incubaron con dUTP biotinilado y TdT a 37ºC durante 45 min. Los portaobjetos se cubrieron con albúmina de suero bovino al 2% durante 10 min y se incubaron con un complejo de avidina-biotina durante 30 min. La detección colorimétrica se efectuó utilizando diamino-bencidina.

Inducción de la apoptosis por CDDP después de la infección in vivo con Ad-P53. Células H358 (5 x 10^{6}) en 0,1 ml de solución salina equilibrada de Hank se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones nu/nu hembras BALB/c. Treinta días más tarde, se inyectaron en tumores con un diámetro de 5 a 6 mm 200 \mul de medio solo o medio que contenia Ad-Luc (10^{8} UFP/ml) o Ad-p53 (10^{8} UFP/ml). Se efectuaron la inyección intratumoral (100 \mul) y la inyección peritumoral en dos sitios opuestos (en cada caso 50 \mul). Se administró por vía intraperitoneal CDDP (3 mg/kg) o solución salina fisiológica testigo. (A) Cambios en el volumen del tumor. Los tumores se midieron con calibradores en dos diámetros perpendiculares sin el conocimiento de los grupos de tratamiento, y un volumen del tumor se calculó asumiendo una forma esférica, calculando el diámetro medio del tumor como la raíz cuadrada del producto de los diámetros en sección transversal. Para cada grupo de tratamiento se utilizaron cinco ratones y se muestra el +/- ET medio. Los datos se analizaron utilizando el ensayo t de Student. La flecha muestra el día del tratamiento. Se muestran dos determinaciones independientes. p < 0,05 a partir del día 5 en el ensayo 1; p < 0,05 a partir del día 7 en el ensayo 2. Estudio histológico utilizando la técnica de marcaje con biotina-dUTP mediada por TdT. Los tumores se recolectaron 5 días después del comienzo del tratamiento e inmediatamente se sumergieron en compuesto de O.C.T. Tejidos congelados se cortaron en un criostato a espesores de 5 \mum. Las secciones se trataron con 1 \mug/ml de proteinasa K y se tiñieron como se describe antes. Todo el cuidado de los animales se efectuó de acuerdo con la UT M.D. Anderson Institutional Animal Care and Use Committee.

Resultados

Para demostrar la eficacia in vivo de los métodos y la eficacia de las composiciones de una combinación de terapia de reemplazamiento de genes y quimioterapia en cáncer humano, los autores de la invención examinaron si la administración secuencial de Ad-p53 y CDDP podría inducir la apoptosis in vivo. 3 días después de la inyección intratumoral directa de Ad-p53 o de la administración intraperitoneal de CDDP, tumores de H358 implantados subcutáneamente en ratones nu/nu mostraron una modesta ralentización del crecimiento. Sin embargo, si Ad-p53 y CDDP se administraban simultáneamente, los tumores sufrían una regresión parcial y el tamaño del tumor permanecía estadísticamente con un tamaño significativamente más pequeño que los de cualquiera de los otros grupos de tratamiento. El efecto inhibidor del crecimiento era incluso más pronunciado después de dos ciclos de tratamiento (figura 13A). El exámen histológico reveló una destrucción masiva de células de tumores en la zona en la que se inyectó Ad-p53 en ratones tratados con CDDP. La tinción in situ mostró muchas células apoptóticas en torno a espacios acelulares (figuras 13B-E). En contraposición, tumores tratados con CDDP solo o Ad-p53 solo no mostraron ni acelularidad ni zonas apoptóticas.

Con más detalle, los protocolos de tratamiento preferidos se pueden desarrollar a lo largo de las siguientes líneas. Primeramente, los pacientes pueden ser sometidos a una broncoscopia para confirmar el grado de obstrucción. Por vía endoscópica se debería reseccionar la mayor cantidad posible de tumor grande. Los pacientes deberían ser sometidos preferiblemente a una broncoscopia bajo anestesia tópica o general. Una aguja de aspiración transbronquial Stifcor® (21 g) se hará pasar a través del canal de biopsia del broncoscopio. El sitio del tumor residual sería luego inyectado con adenovirus p53 en un volumen pequeño tal como de aproximadamente 10 ml o menor.

En cualquier caso, dado que el adenovirus empleado será incompetente para la replicación, no se anticipa ningún efecto deletéreo del propio virus sobre la salud del sujeto. Sin embargo, los pacientes quedarían hospitalizados durante el tratamiento durante al menos 48 horas para controlar reacciones adversas agudas y retardadas. En el pasado se han reseñado preocupaciones relacionadas con la seguridad del uso de adenovirus deficientes en la replicación como un vehículo de transferencia de genes en seres humanos (Rosenfeld et al., 1992; Jaffe et al., 1992), pero la dosis de adenovirus a administrar debería ser apropiadamente vigilada con el fin minimizar adicionalmente la posibilidad de efectos secundarios adversos.

Existen diversos criterios que se deberían considerar tales como presentar la existencia de una necesidad de respuesta o la existencia de toxicidad. Para ayudar a determinar la existencia de toxicidad, el lecho del tumor debería ser fotografiado antes de iniciar el curso de una terapia. Se medirán el diámetro más largo y su perpendicular. El tamaño se reseñará como el producto de los diámetros. A partir de estos datos se puede calcular, a partir de estos números, la tasa de re-crecimiento del tumor.

El tiempo hasta la progresión también se puede medir desde la primera observación con reducción en la masa del tumor hasta que exista evidencia de una enfermedad progresiva. La enfermedad progresiva se define como un incremento de \geq 25% en la suma de los productos de los diámetros de la lesión medida. Los pacientes deben recibir al menos dos cursos de terapia antes de que se realice una designación del progreso. La supervivencia de los pacientes se medirá a partir de la entrada en el protocolo.

Exámenes posteriores incluirían todos los rutinariamente empleados en la terapia del cáncer, incluidos la vigilancia de signos clínicos y la toma de biopsias para análisis convencional y de biología molecular en los que podría confirmarse el modelo de expresión de diversos genes p53. Esto también suministraría información sobre el número de células que han absorbido el gen transferido y en relación con la resistencia relativa del promotor in vivo. Basado en los datos obtenidos, pueden ser deseables ajustes de tratamiento. Estos ajustes podrían incluir construcciones de adenovirus que utilicen diferentes promotores o un cambio en el número de ufp inyectadas para asegurar una infección de más o de la totalidad de células de tumores sin una sobre-expresión no fisiológica de los genes recombinantes.

Se contempla que la expresión de genes exógenos transferidos in vivo por parte de adenovirus puede persistir durante períodos prolongados de tiempo. La expresión a largo plazo terapéuticamente eficaz de genes exógenos transferidos viralmente deberá ser tratada sobre una base de caso por caso. Genes marcadores están limitados en su utilidad para confirmar una persistencia terapéuticamente relevante de la expresión de genes, ya que los niveles de expresión requeridos para la mejora de cualquier trastorno genético dado podrían diferir considerablemente del nivel requerido para curar por completo otra enfermedad.

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias

Las siguientes referencias proporcionan detalles de procedimiento ejemplares u otros detalles suplementarios a los recogidos en esta memoria.

Bargonetti, et al. (1991) Cell 65:1083-1091.

Bishop (1987) Science 235:305-311.

Boehringer Mannheim Biochemicals (1992). DOTAP for high efficiency transfections, BMBiochemica 9(1):17.

Boshart, M. et al. (1985). A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell, 41:521-530.

Cai, D.W., Mukhopadhyay, T., Liu, T., Fujiwara, T., y Roth, J.A. Stable expression of the wild-type p53 gene in human lung cancer cells after retrovirus-mediated gene transfer. Human Gene Ther, 4: 617-624, 1993.

Culver, K.W., Ram, Z., Wallbridge, S., Ishii, H., Oldfield, E.H., y Blaese, R.M. In vivo gene transfer with retroviral vector-producer cells for treatment of experimental brain tumors. Science, 256: 1550-1552, 1992.

Casey, G. Lo-Hueh, M., Lopez, M.E., Vogelstein, B., y Stanbridge, E.J. (1991). Growth suppression of human breast cancer cells by the introduction of a wild-type p53 gene. Oncogene 6:1791-1797.

Clarke, A.R., Purdie, C.A., Harrison, D.J., Morris, R.G., Bird, C.C., Hooper, M.L., y Wyllie, A.H. Thymocyte apoptosis induced by p53-dependent and independent pathways. Nature, 362: 849-852, 1993.

Dai, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:10892-10895.

Doyle, L.A. Mechanisms of drug resistance in human lung cancer cells. Semin Oncol, 20: 326-337, 1993.

El-Deiry, W.S., Tokino, T., Velculescu, V.E., Levy, D.B., Parsons, R., Trent, J.M., Lin, D., Mercer, E., Kinzler, K.W., y Vogelstein, B. WAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression. Cell, 75: 817-825, 1993.

Fritsche, M., Haessler, C., y Brandner, G. Induction of nuclear accumulation of the tumor-suppressor protein p53 by DNA-damaging agents. Oncogene, 8: 307-318, 1993.

Fields et al. (1990) Science 249:1046-1049.

Fujiwara, T., Grimm, E.A., Mukhopadhyay, T., Cai, D.W., Owen-Schaub, L.B., y Roth, J.A. A retroviral wild-type p53 expression vector penetrates human lung cancer spheroids and inhibits growth by inducing apoptosis. Cancer Res, 53: 4129-4133, 1993.

Gavrieli, Y., Sherman, Y., y Ben-Sasson, S.A. Identification of programmed cell death in situ via specific labelling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol, 119: 493-501, 1992.

Georges et al. (1993) Cancer Res 53: 1743-1746.

Ghosh-Choudhury y Graham (1987) Biochem. Biophys. Res. Comm. 147: 964-973.

Gluzman et al., (1982) in Eukaryotic Viral Vectors (Gluzman, Y., comps.) págs. 187-192, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York.

Graham, F. L. y A.J. van der Eb. (1973). A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 52: 456-467.

Graham, F.L. y Prevec, L. Manipulation of adenovirus vectors. En: Murray E.J. (comp.), Methods in Molecular Biology, Gene Transfer and Expression Protocols, págs. 109-128. New Jersey: The Humana Press Inc, 1991.

Graham, F.L., J. Smiley, W.C. Russell y R. Nairn (1977). Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5, J. Gen Virol. 36:59-72.

Grunhaus, A. y Horwitz, M.S. (1992). Adenoviruses as cloning vectors. Semin. Virology 3:237-2542.

Harper, J.E., Adami, G.R., Wei, N., Keyomarsi, K., y Elledge, S.J. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell, 75: 805-816, 1993.

Hollstein, M., Sidransky, D., Vogelstein, B., y Harris, C. (1991). p53 mutations in human cancers. Science 253:49-53.

Jaffe et al., (1992) Nature Genetics 1:372-378.

Le Gal et al., (1993) Science 259: 988-990.

Ledley, J. (1987). J. Pediatrics 110, 1.

Levine, A.J., Momand, J., y Finlay, C.A. The p53 tumour suppressor gene. Nature, 351: 453-456, 1991.

Lowe, S.W., Ruley, H.E., Jacks, T., y Housman, D.E. p53-dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents. Cell, 74: 957-967, 1993.

Lowe, S.W., Schmitt, E.M., Smith, S.W., Osborne, B.A., y Jacks, T. p53 is required for radiation-induced apoptosis in mouse thymocytes. Nature, 362: 847-849, 1993.

McGrory, W.J. et al. (1988). A simple technique for the rescue of early region I mutations into infectious human adenovirus type 5. Virology 163: 614-617.

Mercer, W.E. (1992). Cell cycle regulation and the p53 tumor suppressor protein. Critic. Rev. Eukar. Gene Express. 2:251-263.

Mietz, et al. (1992) EMBO 11:5013-5020.

Miller 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:1.

Montenarh, M. (1992). Biochemical, immunological, and functional aspects of the growth-suppressor/oncoprotein p53. Critic. Rev. Onco. 3:233-256.

Mulligan, (1993), Science 260:926.

Nicolau, C., et al. (1983). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 1068.

Ragot et al., (1993) Nature, 361: 647-650.

Ramqvist, T., Magnusson, K.P., Wang, Y., Szekeley, L., y Klein, G. Wild-type p53 induces apoptosis in a Burkitt lymphoma (BL) line that carries mutant p53. Oncogene, 8: 1495-1500, 1993.

Rosenfeld et al., (1992) Cell 68: 143-155.

Rosenfeld et al., (1991) Science, 232:431-434.

Roth, J., Ruckdeschel, Weisenburger, compiladores, Thoracic Oncology, Primera Edición, Capítulo 49, págs. 711-721, Sanders, Nueva York, 1989.

Shaw, P., Bovey, R., Tardy, S., Sahli, R., Sordat, B., y Costa, J. Induction of apoptosis by wild-type 53 in a human colon tumor-derived cell line. Proc Natl Acad Sci USA, 89: 4495-4499, 1992.

Spandidos, et al. (1989), J. Pathol., 157:1-10.

Stewart et al., 1992, Hum. Gene Ther. 3:267.

Stratford-Perricaudet, L. y M. Perricaudet. (1991a). Gene transfer into animals: the promise of adenovirus. p. 51-61, En O. Cohen-Haguenauer y M. Boiron (comps.), Human Gene Transfer, Ediciones John Libbey Eurotext, Francia.

Stratford-Perricaudet et al., (1991b) Hum. Gene. Ther. 1:241-256.

Takahashi, T., Nau, M.M., Chiba, I., Birrer, M.J., Rosenberg, R.K., Vinocour, M., Levitt, M., Pass, H., Gazdar, A.F., y Minna, J.D. p53: a frequent target for genetic abnormalities in lung cancer. Science, 246: 491-494, 1989.

Takahashi, T., Carbone, D., Takahashi, T., Nau, M.M., Hida, T., Linnoila, I., Ueda, R., y Minna, J.D. (1992). Wild-type but not mutant p53 suppresses the growth of human lung cancer cells bearing multiple genetic lesions. 1992. Cancer Res. 52:2340-2342.

Tishler, R.B., Calderwood, S.K., Coleman, C.N., y Price, B.D. Increases in sequence specific DNA binding by p53 following treatment with chemotherapeutic and DNA damaging agents. Cancer Res, 53:2212-2216, 1993.

Tooza, J. (1981). Molecular biology of DNA Tumor viruses, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York.

Torchilin et al., 1992, Faseb J. 6:2716

Travali, et al. (1990), FASEB, 4:3209-3214.

Weinberg, R.A. (1991). Tumor suppressor gene. Science 254:1138-1145.

Wilcock, et al. (1991) Nature 349:429-431.

Wolff, J.A., Malone, R.W., Williams, P., Chong, W., Acsadi, G., Jani, A., y Felgner, P.L. (1990) Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science 247, 1465-1468.

Yonish-Rouach, E., Resnitzky, D., Rotem, J., Sachs, L., Kimchi, A., y Oren, M. Wild-type p53 induces apoptosis of myeloid leukemic cells that is inhibited by interleukin-6. Nature, 352: 345-347, 1991.

Zakut-Houri et al. (1985), EMBO J., 4: 1251-1255.

Zhan, Q., Carrier, F., y Fornace Jr., A.J. Induction of cellular p53 activity by DNA-daging agents and growth arrest. Mol Cell Biol, 13: 4242-4250, 1993.

Zhang, W.W., Fang, X., Branch, C.D., Mazur, W., French, B.A., y Roth, J.A. Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis. BioTechniques, 1993.

Zhang, W.W., Fang, X., Mazur, W., French, B.A., Georges, R.N., y Roth, J.A. High-efficiency gene transfer and high-level expression of wild-type p53 in human lung cancer cells mediated by recombinant adenovirus. Cancer Gene Therapy, 1993.

Zhu, et al., 1993, Science 261: 209-211.

\global\parskip0.000000\baselineskip

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.800000\baselineskip

: NOMBRE: BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM

\vskip0.800000\baselineskip

: CALLE: 201 West 7th Street

\vskip0.800000\baselineskip

: CIUDAD: Austin

\vskip0.800000\baselineskip

: ESTADO: Texas

\vskip0.800000\baselineskip

: PAÍS: Estados unidos de América

\vskip0.800000\baselineskip

: CÓDIGO POSTAL: 8701

\vskip0.800000\baselineskip

: TELÉFONO Nº: (512)499-4462

\vskip0.800000\baselineskip

: TELEFAX: (512)499-4523

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): INVENTORES

\vskip0.800000\baselineskip

: ROTH, Jack A.

\vskip0.800000\baselineskip

: FUJIWARA, Toshiyoshi

\vskip0.800000\baselineskip

: GRIMM, Elizabeth A.

\vskip0.800000\baselineskip

: MUKHOPADHYAY, Tapas

\vskip0.800000\baselineskip

: ZHANG, Wei-Wei y

\vskip0.800000\baselineskip

: OWEN-SCHAUB, Laurie B.

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): Título de la invención: MÉTODOS Y COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN AGENTES DETERIORANTES DEL ADN Y p53

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): Número de secuencias: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(v): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: ARNOLD, WHITE & DURKEE

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: P.O. BOX 4433

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: HOUSTON

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: TEXAS

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CP: 77210

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: DISCO BLANDO/ASCII

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: PC COMPATIBLE CON IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): EQUIPO LOGICIAL: WORDPERFECT 5.1

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: DESCONOCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: SIMULTÁNEAMENTE CON LA PRESENTE

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN: DESCONOCIDA

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): DATOS DE LA SOLICITUD PRIORITARIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: USSN 08/233.022

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 25 ABRIL 1994

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN: DESCONOCIDA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN SOBRE EL APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: HIGHLANDER, STEVEN L.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 37.642

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: UTFC403PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(x): INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (512) 418-3000

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: (713) 789-2679

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TELEX: 79-0924

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de cadena: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Descripción de la secuencia: SEQ ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCCCACCC CCTTGGCTTC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de cadena: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Descripción de la secuencia: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGTAACCAT TATAAGCTGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de cadena: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Descripción de la secuencia: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGTTTCTCA GCAGCTGTTG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): Longitud: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de cadena: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): Topología: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): Descripción de la secuencia: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATCTGAACT CAAAGCGTGG

\hfill

Claims

1. Uso de una proteína o gen p53 y un compuesto deteriorante del ADN en una forma farmacológicamente aceptable para la preparación de un medicamento para exterminar células de tumores que están localizadas dentro de un animal, en donde el animal se expone en primer lugar al compuesto deteriorante del ADN y después se pone en contacto con una proteína o gen p53, en donde el tumor se pone en contacto con un compuesto deteriorante del ADN administrando al animal una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un compuesto deteriorante del ADN.

2. El uso de la reivindicación 1, en donde una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica se inyecta en un sitio del tumor y comprende un adenovirus recombinante que contiene un vector recombinante que expresa p53 en la célula del tumor, y en donde el tumor se pone en contacto con el compuesto deteriorante del ADN.

3. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el compuesto deteriorante del ADN se selecciona del grupo que consiste en actinomicina-D, mitomicina C, cisplatino, doxorubicina, etopósido, verapamil, podofilotoxina y 5-FU.

4. Uso de una proteína o gen p53 en una forma farmacológicamente aceptable para la preparación de un medicamento para exterminar células de tumores que están localizadas dentro de un animal, en donde el medicamento se administra en combinación con un agente deteriorante del ADN, seleccionado del grupo que consiste en radiación de rayos X, radiación UV, radiación \gamma o microondas, en donde el tumor se expone primero al agente deteriorante del ADN y después se pone en contacto con la proteína o gen p53.

5. El uso de la reivindicación 4, en donde una cantidad terapéuticamente eficaz del medicamento se inyecta en un sitio del tumor y comprende un adenovirus recombinante que contiene un vector recombinante que expresa p53 en la célula del tumor, y en donde el tumor se pone en contacto con el compuesto deteriorante del ADN.