UA43917C2 - Спосіб руйнування уражених та хворих клітин, спосіб лікування раку, композиція та терапевтичний набір для руйнування уражених та хворих клітин - Google Patents

Abstract

Винахід стосується використання генів-супресорів пухлин в поєднанні з агентами або факторами, які ушкоджують ДНК, з метою руйнування клітин, зокрема пухлинних клітин. За допомогою переносу гену у складі рекомбінантного аденовірусу ген-супресор пухлинного росту р53 вводиться до клітини як in vitro, так і in vivo в поєднанні з хіміотерапевтичним агентом. Оброблені таким чином клітини зазнавали апоптозу, що супроводжувалось специфічною фрагментацією ДНК. Безпосередня підшкірна ін’єкція до пухлини такої генної конструкції, що містить р53 у складі аденовірусного геному, з наступним внутрішньоочеревинним введенням агента, який ушкоджує ДНК, цисплатину, викликала масивне апоптичне руйнування пухлин. У винаході також пропонується клінічне застосування методу, в якому поєднується заміна гена з використанням дефектного за реплікацією аденовірусу з р53 "дикого" типу у сполученні з хіміопрепаратами, які ушкоджують ДНК, для лікування злоякісних пухлин людини.

Description

Настоящее изобретение относится, в основном, к области новьїх направлений в усовершенствованиий методов химиотерапевтического вмешательства. Кроме того, настоящее изобретение предлагаєт новье способь! и композиции, которне обьединяют потенциальнье возможности ЮМА-поражающих агентов с комбинированной доставкой гена- суппрессора новообразований. Обьединение ОМА-поражающих факторов с ксеногенной зкспрессией гена-суппрессора новообразований ведет к ощутимой синергии, подавляющей активность отдельньїх индивидуальньхх компонентов.

Современньюе методьй лечения рака, включающие радиационную терапию, хирургию и химическую терапию, характеризуются ограниченной зффективностью. Только рак легких убивает в Соединенньїх Штатах более 140000 человек ежегодно. Недавно для установленной возрастной группь! смертность от рака легких превьсила смертность от рака груди у женщин. Хотя введение в жизнь программь! борьбьй с курением снизило уровень распространения заболеваний от курения, уровень смертности от рака легких останется вьісоким даже в 21-м веке. Развитие новьх терапевтических методов лечения рака легких будет зависеть от проникновения в механизм биологии рака легких на молекулярном уровне.

В настоящеє время установлено, что разновидности рака вьізьіваются, по крайней меречастично, генетическими отклонениями, которье проявляются или в повьишенной зкспрессии одного или более генов, или в зкспрессий отклоненного от нормь или мутантного гена-или генов. Например, во многих случаях, как известно, зкспрессия онкогенов вьізьшаєт развитие рака. "Онкогеньи - зто генетически измененнье геньі, чей мутированньй продукт зкспрессии каким-то образом нарушаєт нормальноеє функционирование клетки или управление зтим процессом. (брепаідоз сеї аїЇ, 1989).:Большинство из изученньїх на настоящий момент онкогенов получили определение "активированньх" в результате мутации, часто точечной мутации, в кодирующей области нормального клеточного гена, то есть "прото-онкогена", результатом чего является замещение аминокислотьі в протеиновом продукте, зкспрессия которого претерпела изменение. Зтот продукт с видоизмененной зкспрессией проявляєт отклоненньюе от нормь! биологические функции, которне оказьвают влияние на протекание процесса образования опухолей (Ттгамаї! єї аї., 1990).Не проявляющие себя мутации могут развиваться при различньїх обстоятельствах, например в результате химического мутагенеза или ионизирующей радиации. Цельй ряд онкогенов или онкогенньїх семейств, включая гав, тус, пеи, гаї, егб, вгс, Піпів, )шп, арі, в настоящеєе время уже идентифицировань и в различной степени описань! (Тгамаї! єї а!.,1990, Візпор,1987).

Как установлено, при нормальном росте клетки, прото-онкогеньї, стимулирующие рост, сбалансировань! генами - супрессорами, сдерживающими рост новообразований. Некоторье факторь могут внести дисбаланс во взаймодействие зтих двух сил, ведущий к состоянию, предполагающему образованиє опухолей. Одним из таких факторов является мутация в генах -супрессорах новообразований (М/еіпрего 01991).

Одним из важньїхх генов-супрессоров новообразований является ген, кодирующий клеточньіїй протейин, р53, которьй представляет собой ядерньій фосфопротеин КО 53 (замещенньй в цикле фосфопротеин КО 53), которьій управляет клеточной пролифератией (процессом разрастания клеток). Мутации, происходящие с геном роі3, и потеря аллельного гена на хромосоме 17р, где зтот ген размещен, являются одними из найболее распространенньїх видоизменений, идентифицированньїх в злокачественньїх новообразованиях человека. Протеин р5о3 обладаєт вьсокой степенью сохранности в процессе зволюции и проявляется в найболее нормальньїх тканях. Бьіло продемонстрировано, как природньій р53 (в некоторьїх источниках р53 "дикого типа") должен бьіть вовлечен в управление клеточньїм циклом (Мегсег, 1992), в процесс транскрипционного регулирования (РієїЇдз еї аї., Мієї? еї аІ.,1992), в репликации ОМА (УМісОосК апа І апе,1991,апа Вагдопейії єї аі.,1991) и в возбуждение апоптоза (Хопізп - Воцасі еї аІ,1991, апа, ЗНаму єї аї.,1992).

Известньї различнье мутантнье аллельнве геньі р53,в которьїх единственное базовое замещение ведет к синтезу протеинов, которне имеют совершенно другие характеристики, определяющие закономерности роста, что, в конечном счете, ведет к злокачественньім новообразованиям (Ноіїзієїп еї аі.,1991). Действительно, бьіло установлено, что ген роз3 является найболее часто мутированньїм геном при раке у человека (НоіІвієїп еї а1.,1991) и, в частности, ассоциируется с теми разновидностями рака, возникновение которьїх связано с сигаретньім дьімом (Ноіївієїп еї аї.,2акиї - Ношигі еї аї.. 1985).Чрезмерная зкспрессия р53 в опухолях груди также бьіла документально подтверждена (Савзеу еї а1.,1991).

Одним из аспектов, привлекающих найбольшее внимание генной терапии рака, является использование генов - супрессоров, таких как р53, для лечения опухолей. Бьіло установлено, что трансфекция (заражение клеток чужеродной нуклеийновой кислотой, например вирусной) природного гена р53 в определенного типа опухолевьїх клетках рака груди и легких может восстановить управление процессом подавления роста в клеточньїх линиях (Савзеу 6вї а1,,1991, ТаКканазві єї аІ., 1992).Хотя трансфекция ЮМА не является жизнеспособньм средством введения ЮМА в клетки пациентов, зти результатьь служат демонстрацией того, что внедрениє природного гена р53 в раковье клетки, содержащие мутированньй р5З3, может стать зффективньм методом лечения, если будут разработаньі усовершенствованнье способьї внедрения гена роз.

В настоящее время ведется изучение проблемь и создаются системьі внедрения гена, которье могут бьть примененьі в генной терапий для подавления роста опухоли. Средства на основе вируса для трансфекции гена вьізьівают особьій интерес, благодаря способности вирусов инфицировать действительно живье клетки. Налицо способ, в котором перемещаеєтся сам вирусньй генетический материал. В зтой связи уже бьіли отмечень! некоторне успешнье решения, например воспроизведение ретровирусньїх векторов, разработанньх для доставки целого многообразия генов. Однако, существуют серьезнье проблемьі, связаннье с использованием ретровирусньїх векторов в генной терапии. Поскольку их зффективность зависит от наличия ретровирусньїх рецепторов на клетках-мишенях, их трудно сконцентрировать и обеззаразить, и кроме того, они могут зрфективно внедряться только в размножающиеся клетки (репликационньєе клетки).

Основную проблему клинической онкологии составляет устойчивость клетки злокачественного новообразования к воздействию химиотерапевтического лекарственного средства. Почти 8095 случаєев рака легких составляет рак легких с вовлечением значительного количества клеток (М5СІС)Однако больнье зтой формой рака, в основном, невосприимчивь! к химиотерапевтическим методам лечения (Ооуїе,1993).Одной из задач современньїх исследований в области лечения злокачественньїх новообразований является поиск путей улучшения действенности терапевтических методов лечения рака, основанньїх на перемещении гена, путем изучения механизма взаймодействия между продуктом гена и химиотерапевтическими лекарственньми средствами. Ген герпес-симплексо-тимидин-киназьі (Н5Б-К), будучи внедренньм в опухоль мозга с помощью ретровирусной векторной системьі, успешно вьізьвал восприймчивость к дапсіїсіоміг антивирусного агента (Сиїмег, еї аІ.,1992). Продукт гена Н5-К представляєт собой зкзогенньій вирусньй знзим, и поскольку зкспрессия протеина у - р53 проявляєтся в нормальньх тканях, возникает предположение, что модуляция устойчивости к воздействию химиотерапевтических средств, вьізванная альтерацией в зкспрессии м - роз,

возможно явится альтернативньмм подходом, использующим путь, которьій опосредствованно определен зндогенной генетической программой.

Аденовирусная система имеет потенциальнье преймущества при перемещении гена іп мімо, например легкость получения вьісокого значения титра вируса, внісокая степень инфекционной активности и невосприимственность для многих типов клеток. Однако стабильность и продолжительность существования зкспрессии внедренного гена все еще остаются проблематичньми. Рост уровней ро53З в клетках, которне отличаются чувствительностью /к химиотерапевтическим лекарственньм средствам, может наблюдаться в пределах б часов после воздействия ЮОМА- поражающих стимуляторов (Ргіїсне, еї аї.,1993, 2Нап,еї а!.,1993),хотя повьішенная активность, вьізванная действием

ОМА, может бьіть возвращена в первоначальное состояние в течение четьірех часов, если стимулятор удаляют (ТівПіег, еї аІ.,1993).Отсюда, вьісокий уровень зкспрессии ро53 может поддерживаться даже после прекращения воздействия на организм лекарственного средства. Обеспечение зкспрессии протеина уї - рбо5З3 с помощью Аа-р53 достигаєт кульминации на третий день после инфицирования (14 - складкой больше, чем зндогенньй "дикого типа") и снижаєется до низкого уровня к девятому дню (2Папо, єї аІ.,1993). Зто наводит на мьісль, что переменно вьсокого уровня зкспрессии мі-ро3 достаточно, чтобьї инициировать цитотоксическую программу в раковой клетке. роЗ играєт важную роль в определении чувствительности клеток рака легких человека к химиотерапевтическим лекарственньм средствам. Многообразие протоколов лечения(историй болезни) включающих хирургическое вмешательство, химиотерапию и радиотерапию, бьло изучено, в связи с лечением разновидности рака легких человека

М5СІ 5, однако козффициент вьїживаємости в течение продолжительного срока остается неудовлетворительнь/м. В чем возникает потребность, так зто в комбинированном терапевтическом методе, которьм мог бьї использоваться самостоятельно или в качестве вспомогательного лечения для предотвращения местного рецидива, следующего за предварительной резекцией, или которьйй заключаєтся в методе лечения, состоящем во введений иньекций в поврежденное место, которое первоначально бьіло невосприийимчивьм к воздействию лекарственного средства, и в котором имеются метастазь, или при местном рецидиве рака легких. Композиции и способьї требуют дальнейших исследований, разработки и совершенствования способов клинической применимости новьїх средств для лечения рака.

Кроме того, зти способь и композиции должнь! подтвердить свое право на использование іп мімо.

Настоящее изобретение направлено на решение задачи улучшения терапевтических средств и способов использования их в процессе уничтожения клеток путем обьединения воздействий гена-супрессора злокачественньх новообразований или протеина и ОМА-поражающего агента или фактора. Настоящее изобретение также предлагаєт композиции и способь, включающие такие, которне используют вирусное перемещение гена-посредника, с целью обеспечения зкспрессии природного гена-супрессора злокачественного новообразования, например р53, в клетках- мишенях и направить агент или фактор, которьй вьізьівает повреждение ОМА. Изобретатели неожиданно обнаружили, что используя композиции, раскрьттье в данном изобретений, они получили возможность вьізвать запрограммированное уничтожение клетки, явление, известное под названием "апоптоз", в значительном количестве клеток мишеней.

Используя настоящее изобретение, авторь продемонстрировали замечательньй зффект, заключающийся в контроле роста клетки ракового новообразования. Формирование и рост опухолевой клетки также известнь! под названием "трансфекция", которое описьмвает образование и пролифератию клеток, которне потеряли способность контролировать процесс клеточного деления, т.е. превратились в раковне клетки. Совершенно очевидно, что цельй ряд различньїх типов трансформированньїх клеток можно считать потенциальньми обьектами использования способов и композиций по данному изобретению, например, саркомьі, меланомь!, лимфомьі, широкий спектр твердьїх опухолей и т.п. Хотя любая ткань, в которой наблюдаєтся рост злокачественной клетки, может служить обьектом использования изобретения, предпочтительную область использования составляют ткани легких и груди. Изобретатели обнаружили, что вектор, осуществляющий перенос рекомбинанта, вьізь вающего зкспрессию р5З3,оказался в состоянии значительно снизить степень роста клеток в том случає, если он используется в сочетаниий с поражающим ОМА агентом.

Изобретение предлагаєет в определенньїх примерах осуществления способь! и композиции для уничтожения клетки или клеток, например раковьїх клеток или клетки, путем обеспечения контакта или облучения клетки или популяции клеток протеином р53З или геном и одним или более поражающими ОМА агентами, общее количество которьх оказьшвается достаточно зффективньм, чтобьї убить данную клетку (клетки).Перечень клеток, которье могут бьть уничтожень в результате использования настоящего изобретения, включаєт например, нежелательнье, но доброкачественньюе опухолевье клетки, такие как клетки гиперплазии, доброкачественной опухоли простать, клетки щитовидной железьі, отличающиеся повьишенной активностью, клетки, относящиеся к аутоиммунньмм заболеваниям, например клетки В которье производят антитела, присутствующие в артритах, волчанке, миастения гравис, плоскоклеточной метаплазии, дисплазии и т.п. Хотя изобретение применимо при уничтожении, в основном, все нежелательньх клеток, специфическая задача, которую оно решаєт - зто уничтожение злокачественньїх клеток. Термин "злокачественньсе клетки "относится к клеткам, которье потеряли способность к управлению циклом деления клетки, что ведет к появлению "трансформированного" или "ракового" фенотипа.

Для того, чтобьі убить клетки, такие как злокачественньюе или метастазньюе, используя способь! и композиции по настоящему изобретению, следует обеспечить контакт клетки-мишени с протеийном роз или геном и, по крайней мере, одним поражающим ОМА агентом, общее количество которьїх достаточно зффективно, чтобьї уничтожить данную клетку-мишень. Зтот процесс может включать обеспечение контакта с протеином ро3 или геном и поражающим (и) ОМА агентом (ами) или фактором(ами) одновременно. Зто может бьїть достигнуто путем обеспечения контакта клетки с одной единственной композицией или фармакологической единицей, которая включаєт оба компонента, или путем обеспечения контакта клетки с двумя отдельньмми композициями или фармакологическими единицами в одно и то же время, при условиийи, что одна композиция включает протейин ро53 или ген, а другая включает поражающий ОМА агент.

Совершенно очевидно, что клетка-мишень может бьть первоначально облучена поражающим (и) ОМА агентом(іами), а затем приведена в контакт с протеином роЗ3 или геном, или наоборот. Однако, для вариантов осуществления изобретения, где поражающий ЮМА фактор и р53 используют для воздействия на клетку раздельно, следует четко уяснить, что между каждьм из вводов указанньїх компонентов не должно бьіть значительного промежутка времени, чтобьї поражающий ОМА агент и р53 оставались бьі в состояниий в полной мере обьединенньмми усилиями оказать положительное воздействие на клетку. Установлено, что в таких случаях контакт с обоими компонентами следует осуществлять с промежутками в пределах 12 - 24 часов, а более предпочтительно, с промежутками в пределах 6 - 12 часов, при зтом найболеєе предпочтительньі!м временем задержки (опаздьівания) следует считать около 12 часов.

Терминьі "приведеннье в контакт "или "подверженнье воздействию", в применениий к клетке, используются в настоящем описаний для того, чтобьї охарактеризовать процесс, с помощью которого ген-супрессор злокачественной опухоли или протеин, например р53, и поражающий ОМА агент или фактор доставляєтся к клетке-мишени или приводится в непосредственное соприкосновение с данной клеткой-мишенью. Чтобьі обеспечить умерщвление клетки, оба компонента доставляются в клетку в общем количестве, достаточном для обеспечения процесса уничтожения зтой клетки, т.е. запрограммированной гибели клетки или апоптоза. Терминьі! "умерщвление", "запрограммированная гибель клетки" и "апоптоз" в настоящем контексте взаймозаменяемь! и используются для описания серии внутриклеточньх превращений, которне ведут к уничтожению клетки-мишени. Процесс уничтожения клетки-мишени приводит в активное состояние внутриклеточнье протеазьї и нуклеазь), что обеспечивает ядерную инволюцию клетки и фрагментацию ядерной ОМА. Понимание точньїх механизмов внутриклеточного молекулярного взаймодействия, направленньїх на осуществление умерщвления клетки, не обязательно при использований настоящего изобретения.

Поражающие ОМА факторь или агенть! в настоящем контексте определяются как любье химические соединения или методьї лечения, которье вьізь'вают повреждение ОМА в применений к клетке. Такие агенть! и факторьї включают излучение или волньі, которне стимулируют повреждение ОМА, например у. излучение, Х- излучение, ультрафиолетовое (ОМ) излучение, микроволньі, злектроннье змиссии и т.п. Многообразие химических соединений, присутствующее в описаний в виде термина "химиотерапевтические" агентьї, действуют как средства, вьізьівающие поражение ЮМА, при зтом все они могут бьть использованьь в комбинированньїх методах лечения, раскрьїтьх в настоящем изобретениий. Перечень предназначенньх к использованию химиотерапевтических агентов включаєт например: адриамицин,5-флуороурацил (5), зтопозид (УР-16), камптотецин, актиномицин-О, митомицин С, цисплатин (СОР) и даже пероксид водорода. Настоящееє изобретениє также очерчиваєт круг использования комбинаций из одного или нескольких поражающих ОМА агентов, которне основань! на принципе излучения, или представляют собой активнье соединения, например использование радиоактивного излучения совместно с цисплатином или использование цисплатина с зтопозидом. В отдельньїх случаях использование цисплатина в сочетаний с протеином роз3 или геном значительно предпочтительнееє, по сравнению с упомянутьм соединением.

Может бьіть использован любой способ обеспечения контакта клетки с протеином р53 в течениий периода времени, пока зтот способ обеспечиваєт вьісокие уровни инфицирования протеина р53 внутри клетки. Он включаєт как прямую доставку протеина ро53, так и доставку гена или ЮОМА- сегмента, которьій кодирует р5З, при зтом данньй ген должен будет возбудить зкспрессию и образование р53 внутри клетки. При таком способе доставки протеина наблюдаєтся недостаток, которьій заключается в деградации протеийна и низкой поглотительной способности клетки. Сделано заключение, что способ использования рекомбинантного вектора, вьізььвающего зкспрессию протеина ро3, обладаєт значительньмми преймуществами.

Может бьть разработано широкое многообразие рекомбинантньхх плазмидов и векторов, способньїх вьізвать зкспрессию протеина р5З3 и, будучи таким образом использованньми, доставить р53 в клетку. Например известно использование "голой" ОМА и плазмидов р53 для непосредственной доставки генетического материала в клетку (УУоїГе еї аї.,, 1990), соединения р53 - кодирующей ОМА, находящиеся в ловушке у липосом (І еаІєу еї а1.,1987) или у протолипосом, которне содержат протейинь! рецептора в вирусной оболочке (Місоїац еї а1!.,1983); и роЗз-кодирующие ОМА, присоединеннье к комплексу-переносчику полилизингликопротеийна.

Изучалось также использование вирусов-рекомбинантов, разработанньїх для обеспечения проявления зкспрессий роз.

Цельй набор вирусньхх векторов, например ретровируснье векторь, вирус простого пузьірькового герпеса (герпес- симплекс-вирус) (патент США Ме5 288 641, включенньій в перечень ссьілок), вирусьі цитомегалии и т.п. могут бьть использованьї, как описано Миллером (МіПШег, 1992); могут бьіть использованьі рекомбинантнье аденоассоциированнье вирусь! (векторьї ААМ), описанньюе в патенте США Ме5 139 941 и включеннье в перечень ссьлок, а также, в частности, векторьї аденовирусов-рекомбинантов. Технологиий приготовления решшкационно-дефектньїх инифицирующих вирусов хорошо известньі из уровня техники, а их примерьї! описаньі! в работах авторами: Споз-Споцапигу й Станат (1987);

Меагогу еї аї, (1988); и СіІи2тап еї а1!.(1982), каждая из которьїх приведена в перечне ссьлок.

Для того, чтобьї умертвить клетку в соответствии с настоящим изобретением, следует обеспечить контакт клетки с протеином р5З3 или геном и с поражающим ОМА агентом при их обьединенном количестве, достаточно зффективном для того чтобьії умертвить данную клетку. Термин "при обьединенном их количестве, достаточно зффективном для того, чтобьї умертвить данную клетку" означает, что количества р5З3 и поражающих ОМА агентов должнь! бьть достаточньми настолько, что, в том случає, если они будут обьєединень! внутри клетки, зто вьізовет апоптоз данной клетки. Хотя данного замечания и не требуется для каждого из примеров осуществления изобретения, в качестве обьединенного зффективного количества ро3 и поражающего ОМА агента, предпочтительно может бьїіть принято такое количество, которое инициирует умерщвление значительно большого количества клеток, чем использование каждого злемента в отдельности. Найболее предпочтительньмм может считаться такое зффективное обьединенное количество, которое будет составлять величину, инициирующую синергическое умерщвление клетки в сравнений с результатами, которне наблюдаются при использований каждого из злементов в отдельности.

Определенное количество параметров іп міго может бьть использовано для определения результата, которьй достигаєется в результате применения композиций и способов, предлагаемьх настоящим изобретением. Зти параметрь включают, например, подсчет результирующего количества клеток до и после воздействия композициями, описанньми в настоящем изобретении, а также измерением размеров многоклеточньїх опухолевьїх сфероидов, сформированньх таким же образом, каким формируются их колонии в культуре ткани. Іп міго процесс умерщвления клетки, в частности, показан в примере 1 осуществления способа настоящего описания. Дополнительно можно измерить параметрь,, которне характерньі для клетки, подвергающейся запрограммированному умерщвлению, например фрагментации клеточной геномной ОМА на фрагменть! с размерами нуклеосомь!, которье, в основном, идентифицировались путем вьіделения фрагментов при злектрофорезе геля агарозьї, окраски ОМА и сравнения ОМА с размерной цепочкой ОМА.

Фрагменть! с размером нуклеосомьї идентифицируются как возрастающие ступеньки (по типу спущенной петли) или цепочки мономеров или полимеров, имеющих основной блок приблизительно из 200 пар.

По аналогии, термин "терапевтически зффективное количество" означаєт обьединенное количество протеина роз или гена поражающего ОМА агента, которое при введений в организм животного в состояниий умертвить клетки внутри организма животного. Зто, в частности, подтверждаєтся умерщвлением раковьїх клеток, например, клеток рака легких, груди или клеток рака толстой кишки в организме животного или человека, пораженного злокачественной опухолью.

Термин "терапевтически зффективнье соединения " означает, в основном, таким образом обьединеннье количества роЗ и поражающих ОМА агентов, действие которьїх направлено на умерщвление большего количества клеток, чем каждьй из злементов в отдельности, и, предпочтительно, такие обьединеннье количества, которне обеспечивают синергическое снижение генетического груза в опухолевом новообразовании.

Изучение іп мімо и ех мімо определенньх параметров умерщвления клетки являются также зффективньми средствами, с помощью которьїх доказьвается зффективность композиций и способов по настоящему изобретению.

Например, наблюдения воздействуют на подавление онкогенности, измеренной с помощью озкспрессии тат замороженньїх вьісечек тканей или путем использования методов окрашивания и антигенов клетки-мишени, что не является новостью для паталогоанатомов. Естественно, другие способьі определения массьй опухоли, ее роста и жизнеспособности также могут бьть использованьь для установления факта умерщвления клеток -мишеней. В частности, можно определить такое поведение в живом организме различньїх моделей раковьх систем, включая те, в которьїх раковье клетки человека локализованьй в пределах организма животного. МИзвестно, что модели рака животного, в оотличие от модели АЇЮ5, имеют большое сходство(прогнозируемь) с режимами лечения, разрабатьзвваемьми для человеческого организма (Роїп еї а!., редакторьі), 1989). Существует один зкземпляр образца прогнозируемой модели животного, в которой подкожно вьращивали клетки рака легких человека, разновидность которого отличаєтся мальм размером клетки (клетки НЗ58). Используя данную систему, изобретатели показали, что аденовирус, несущий р53, введенньійй в виде капель внутрь пораженной опухолью области совместно с введением химиотерапевтического агента приводит к совершенно неожиданному зффективному уменьшению клеток опухоли.

Одним из предпочтительньїх способов доставки протеина ро53 в клетку является обеспечение контакта клетки с вирионом аденовируса-рекомбинанта или с частицей, которая включаєт вектор аденовируса-рекомбинанта, состоящий из области зкспресии р53, расположенной под контролем промотора, способного направлять зкспресию ро3 в данном типе клетки.

Область зкспрессии рб53 в векторе может содержать последовательность геномов, но для упрощения можно предположить, что более предпочтительно использование последовательности СОМА ро, так как зто легко доступно для анализа уровня техники в данной области и проще в управлении процессом. В дополнение к зкспрессии ро53 и зоне промотора вектор должен также включать сигнал полиаденилации (роїуадепіїайоп), например ранний ген 5М40 или ген протамина, или что-либо подобное.

В предпочтительньїхх вариантах изобретения предполагается, что может возникнуть необходимость в расположений зоньї зкспрессии роЗ3 под контролем сильного, существенного (структурного) промотора, например промотора цитомегаловируса (СМУ), вирусного промотора І ТА,А85М или 5М40 или промотора, ассоциированного с генами, которье проявляют зкспрессию на вьсоких уровнях в клетках млекопитающих (молочной железьі)), например промоторь фактора-ї злонгации или актина. Все зти варианть имеют право на существованиє в связи с использованием изобретения. В настоящее время найболее предпочтительньім промотором считаєтся промотор ІЕ вируса цитомегалий (СМУ).

Ген р53 или сОМА может бьть введен в аденовирус-рекомбинант, соответствии с настоящим изобретением, простьім включением или добавлением кодирующей последовательности ро53 в вирусньій геном. Однако, в качестве предпочтительньїх аденовирусов следуєт рассматривать дефектнье вирусьі репликаций, в которьїх вирусньй ген, существенньй для репликации и / или "упаковки" бьл удален из аденовирусной векторной структурьії, давая возможность зоне зкспрессии р53 переместиться на свое место. Любой ген, то ли существенньй, например ЕЇА, Е2, Е4, то ли несущественньй, например ЕЗ, для репликации, может бьть удален и замещен р33.В частности, предпочтительньіми являются те векторь! и вирионь, в которьїх области ЕТА и Е1В векторов аденовируса удалень,, а зона зкспрессии ро53 внедрена на их место, что показано в качестве примера на структуре генома на фиг.1.

Технологические процессь! приготовления репликационньїх дефектньїх аденовирусов хорошо известнь! из уровня техники, что подтверждаєтся приведенньіми в данном описаний аналогами спо55-Споцапигу и Стапат (1987); Ме Стогу еї аї., (1988); и Сіи2тап еї а!., (1982), перечисленньіми в ссьілках на использованную литературу. Кроме того, хорошо известно, что могут бьть использованьй различнье клеточнье линии, с целью воспроизведения аденовирусов- рекомбинантов, при зтом, их воспроизведениє может продолжаться до тех пор, пока существует возможность дополнения дефекта репликации, если таковой присутствует. Предпочтительной клеточной линией является клеточная линия 293 человека, но существуют также и другие клеточнье линии, приемлемьсе для репликации, например, могут бьіть использовань!ї в предпочтительном случає зкспрессии ЕТА и Е1В. Причем клетки могут воспроизводиться как на пластмассовьїх чашках, так и в культуре суспензии, чтобь! получить запась! культурь! вирусов.

Изобретение не ограничиваєтся вирусами с недостающим звеном Е1 и клетками с зкспрессией Е1. Действительно, в связи с настоящим изобретением, могут бьіть использованьі другие дополняемье комбинации вирусов и клеток - хозяев.

Могут бьіть использовань! клетки с зкспрессией Е2 и вирус, теряющий функциональное звено Е2 точно так же, как и клетки с зкспрессией Е4 и вирус, теряющий функциональное звено ЕА4 и т.д. В том случає, если несущественньй для репликации ген удаляєтся или замещается, каковьім, например, является ген ЕЗ, такой дефект нет надобности отдельно укомплектовьвать с помощью клетки-хозяина.

Для успешного использования изобретения единственньім требованием является создание векторов аденовирусов, которне способньії возбуждать зкспрессию р5З3.Природа же исходного аденовируса решающего значения для использования изобретения не имеет. Может бьть использован любой аденовирус из 42 известньїх различньх серотипов или подгрупп А-Е. Аденовирус типа 5 подгруппь! С является предпочтительньі!м стартовьмм материалом для получения цельного репликационно-дефектного вектора аденовируса для использования в методике, предлагаемой настоящим изобретением. Аденовирус типа 5 вьібран потому, что, в связи с зтим аденовирусом человека, накоплен значительньій обьем биохимической и генетической информации, и, кроме того, он традиционно применяєтся для большинства структур, использующих аденовирус в качестве вектора.

Способь и композиции, в связи с настоящим изобретением, одинаково пригодньї для умерщвления клетки или клеток как іп мімо, так и іп міо. В том случає, когда клетки, предназначеннье для умерщвления, сосредотачиваются внутри организма животного, например раковье клетки рака легкого, груди или прямой кишки, или другие клетки, несущие мутированньй ро, в данном случає протейин ро5З или ген, а также поражающий ОМА агент должнь! вводиться в организм животного в фармакологически приемлемом виде. Термин "фармакологически приемлемьй вид" в настоящем контексте относится как к форме любой из композиций, которая может бьть введена в организм животного, так и к методу обеспечения контакта живого организма с радиационньм излучением, т.е. к способу, с помощью которого облучаєтся какая-либо зо.ча тела животного, например путем у. излучения, Х- лучей, ультрафиолетового (ОМ) излучения, микроволн, злектронньїх змиссий и т.п. Использование поражающей ОМА радиации и волн известно всем, кто имеет опьїт работь! в области лучевой терапии.

Настоящее изобретение также предлагает способьі лечения рака, которне, в основном, включают введение в организм животного или человека, больного раком, терапевтически зффективной комбинации протеина р53 или гена и поражающего ОМА агента. Зто может бьіть достигнуто, благодаря использованию рекомбинантного вируса, в частности аденовируса, которьій несет вектор, способньій вьізвать зкспрессию роЗ в клетках опухолевьх новообразований.

Композиция, несущая ген р53, в основном, должна бьіть введена в организм животного часто при обеспечений тесного контакта с опухолью, в виде фармацевтически приемлемой композиции. Предпочтительньм способом является непосредственное впрьіскивание терапевтически зффективного количества гена роі3, такого, которьий размещается в пределах границ рекомбинантного вируса, в то место в организме, которое поражено опухолью. Однако имеют право на существование и другие парентеральнье способь! введения, например внутривенно, через кожу, зндоскопически или с помощью подкожного впрьіскивания.

При лечении рака, в соответствии с настоящим изобретением, можно обеспечить контакт клеток опухоли с поражающим ОМА агентом, в дополнение к воздействию протеина р53 или гена. Зтот способ может осуществляться путем облучения места сосредоточения опухолевьїх тканей поражающей ОМА радиацией, например рентгеновскими лучами, ультрафиолетовьм световьм излучением у. лучами или даже микроволнами. Кроме того, опухолевье клетки могут бьіть приведень! в контакт с поражающим ОМА агентом путем введения в организм животного фармацевтически зффективного количества фармацевтического средства, содержащего поражающее ОМА соединение, например адриамицин,5-флуороурацил, зтопозид, камптотецин, актиномицин-О, митомицин С, а еще лучше - цисплатин.

Поражающий ОМА агент может бьіть приготовлен и использован в виде сложной терапевтической композиции или фармакологического набора, полученного обьеединения поражающего ОМА агента с протеином ро53, геном или генной системой доставки, как бьіло описано вьіше.

Поразительньй положительньй зффект, возникающий при использований настоящего изобретения раскрьівается в том, что использование вируса Даб5СММ-ро3 в сочетаний с тшсплатином показало замечательнье результать! в исследованиях, использующих модель безволосой мьіши. Комбинированньй режим вирус-поражающей ОМА терапий значительно-снизил онкогенность клеток НЗ58, клеток, которнше нормально производят значительнье опухолевье массьі. Онкогенность раковьїх клеток рака легких бьіла подавлена, благодаря лечению с помощью даз5сСмм-роі3, но не благодаря лечению контрольньім вирусом, вьізьівающим зкспрессию люциферазь. Зто указьівает на то, ччо протеин роз3 в сочетаний с поражающим ОМА агентом имеет большую терапевтическую зффективность.

Специалистам, компетентнь!м в данной области знаний, известнь! методьі доставки химиотерапевтических средств, включая структурьї зкспрессии ОМА, в звкариотические клетки. В свете настоящего изобретения опьітньій специалист будет в состоянийи доставить как поражающие ОМА агентьї, так и протейнь роз или гень к клеткам, используя для зтого многообразие зффективньїх средств.

Для доставки ОМА іп мімо изобретатели предполагают использование различньх генньїх систем доставки, например вирусную и с промежуточньмм звеном липосомь! трансфекцию. В контексте описания настоящего изобретения термин "трансфекция" используется для описания адресной доставки ОМА в звкариотические клетки путем использования таких систем доставки, как например, аденовируснье, ААМ, ретровирусньсе или системь! доставки гена с помощью плазмидов.

Специфичность вирусной доставки может бьіть вибрана для предпочтительного непосредственного переноса гена в отдельную специфичную клетку-«мишень. При зтом используются вирусь, которье способньї инфицировать зти отдельнье специфичнье видь клеток. Естественно, различнье особенности разновидностей вирусов определяют специфику вьібора подходящего вируса для переноса гена по принципу того, как и ген-супрессор злокачественного новообразования должен проявить свою способность к умерщвлению злокачественной клетки указанного типа.

Бьло обнаружено, что применить поражающий ОМА химиотерапевтический агент можно, используя целое многообразие средств, например, с помощью использования парентеральньх способов доставки, таких как внутривеннье и подкожнье иньекции и т.п. Такие способь! известньї специалистам в области введения в организм лекарственньхх средств и будут описаньй в разделе, относящемуся к фармацевтическим препаратам и способам лечения.

Для доставки гена іп міо могут бьіть использовань! различньіе способьї, например применение фосфата кальция или трансфекция с промежуточньім звеном из декстрин-сульфата, злектрофорез; позиционирование (целеуказание) с помощью стеклянного микроснаряда и т.п. Зти методьі! хорошо известнь! из уровня техники, а точньій состав средств и методика их использования дается в описаний к данному изобретению.

Другие варианть! осуществления изобретения относятся к композициям, включающим фармацевтические средства, состоящие из протеина р53 или гена в сочетаний с поражающим ОМА агентом, например цисплатином. В таких композициях р53 может бьіть представлен в виде. сегмента ОМА рекомбинантного вектора или рекомбинантного вируса, которьій способен вьізьшвшать зкспрессию протеина ро53 в клетке животного. Даннье композиции, включая и такие, которне содержат систему-вируса-рекомбинанта, предназначенную для доставки гена, например аденовирусную частицу, могут бьіть приготовленьь для введения іп мійго путем диспергирования в фармакологически приемлемом растворе или буферной смеси. Предпочтительнье, фармакологически допустимье растворьї включают нейтральнье физиологические растворьі, защищеннье фосфатом, лактатом, тризом (Ттів) и т.п.

Безусловно, у всех, кто использует вирусную систему доставки, существует стремление очистить вирион до такой степени, чтобьі существенно освободить его от нежелательньх загрязнений, таких например, как дефектниьє, создающие помехи аденовируснье частицьї или зндотоксиньії и другие пирогень!, чтобь! зтот вирион, не вьізьівал побочньїх реакций в организме животного или человека, получающего векторную структуру. Предпочтительньіми средствами очистки вектора является создание условий для использования градиентов плавучей плотности, например, центрифугирование хлорида цезия в градиенте плотности.

Предпочтительньми фармацевтическими средствами по изобретению являются такие, которне включают, в пределах фармакологически приемлемого раствора или буферной смеси, протеин ро53, или предпочтительнее ген ро3, в сочетаний с химиотерапевтическим поражающим ОМА агентом. Примерами химиотерапевтических агентов могут служить адриамицин,флуороурацил-5,комптоцин,актиномицин-О, пероксид водорода, митомицин С, цисплатин (СООР) и зтопозид (УР-16), при зтом особенно предпочтительньїм является использование цисплатина.

Последующие вариантьї осуществления настоящего изобретения относятся к наборам, предназначенньм для умерщвления клеток, а именно раковьх клеток, которне могут бьїть определень! как терапевтические наборь! для лечения рака. Такие наборь, по настоящему изобретению, должнь, в основном, содержать размещенную в соответствующей контейнерной оболочке(капсуле)у фармацевтическое средство рекомбинантного вектора, которое способно вьізвать зкспрессию протеина р53 в клетке животного, и фармацевтическое средство поражающего ОМА агента. Рекомбинантнье векторьї и поражающие ОМА агенть! могут присутствовать в одной и той же капсуле или зти компонентьі могут вводиться в отдельньїх различньїх капсулах. В предпочтительном варианте в качестве рекомбинантного вектора используєтся вектор аденовируса-рекомбинанта, вьізьвающий зкспрессию ро53, при зтом данньій вектор присутствует в пределах аденовирусной частицьї, а в качестве поражающего ОМА агента используют цисплатин.

Компоненть набора, предпочтительно, вводятся в виде жидких растворов или сухого порошка. В том случає, когда компонентьі вводят в виде жидкого раствора, в качестве жидкого раствора используют водньій раствор, причем особенно предпочтительньм является стерильньій водньій раствор .В том случає, когда реагенть! или компоненть! вводятся в виде сухого порошка, порошок может менять свое состояние путем добавления подходящего растворителя.

Вполне очевидно, что растворитель может присутствовать в другом контейнерном средстве.

Краткое описание рисунков.

Частью настоящего описания являются рисунки, которне включеньі для дополнительного раскрьттия определенньх аспектов изобретения. Изобретение может бьіть лучше понято при обращений к одному или целому ряду приведенньх рисунков в сочетаний с подробньім описанием отдельньїх вариантов осуществления изобретения.

Фиг.1. Дана схема образования аденовируса-рекомбинанта р53. Кассета зкспрессии р53 бьіла введена между Хбва - и Сіа участками рхХСОЇ.1. Вектор зкспрессии р53 (рЕС53) и рекомбинантньй плазмид (руМ17) бьіли подвергнуть! котрансфекции в клетках 293. Зараженньюе клетки вьідерживались в среде до тех пор, пока не проявлялся цитопатогенньй зффект. Идентификация вновь образованньх аденовирусов-рекомбинантов р53 (АЙ5СММ - роз) производилась на пробах цепной реакции полимеризации (РСВ) ОМА с использованием матриц ОМА, приготовленньх из надосадочной жидкости, обработанной протейиназой К и зкстрактом фенола.

На фиг.2А показана карта, применяємая для структурньїх исследований ОМА да5хсСмм-ро3з.Карта ОМА генома дасму-р53 с местами расположения кассет зкспрессии р53,первичньїх материалов цепной реакции полимеризации (РСЕ) и ограничивающих участков. Размер генома около 35,4КЬ, разделенньсе на 100 ячеек карть (1 т.и. (ячейка карть - 0,35КБ).Кассета зкспрессии заняла место зоньі Е1 (1,3 - 9,2 т.и.) генома Аа5.Первичньій злемент 1 сосредоточен в первом интроне, расположенном вниз по траекторий движения промотора главного гена ІЕ цитомегаловируса (СМУМ) человека. Первичньй злемент 2 сосредоточен в зоне раннего сигнала полиаденилации 5М40. Оба зти злемента расположеннье в 15-20бр от ввода СОМА роЗ на двух концах, определяют продукт 1,40Ко цепной реакции полимеризации (РСА). Первичнье злементь З и 4 сосредоточень! в 11 ячейке карть! (т.и,) и 13,4 ячейке карть (т.и.) генома Ад5,соответственно, и определяют специфический продукт 0,86КЬ цепной реакции полимеризации (РСЕ) генома- вируса,

На фиг.2В8 показаньі пробьі геля агарозьї продукта цепной реакции полимеризации (РСНА). Две парьі первичньх злементов (параметров),которне определяют фрагменть! ОМА 1,4КБо (р53) и 0,86КЬ (Аа5), бьіли использовань! в каждой реакции. В каждой реакции бьіли использованьі! матриць ОМА: плазмид рЕС5З (1-я полоса), ОМА даз/АСм/ага2 ()1-я полоса, никаких ОМА (3-я полоса) и ОМА АДа5СМУ -р53 (4-я полоса).Полоса с обозначением (М) соответствует генам- маркерам молекулярного веса.

На фиг.2С показано картирование ограничения ОМА АабзСмММ-р53.Образцьії ОМА, очищенной от С5Сїі - градиента дазсмуУ - р53, бьіли классифицировань! по признаку отсутствия знзима (), Ніпа ПІ (Н) (задний, задняя нога туши), Ват

НІ (В), Есо ВІ (Е) и Сіа І (С), соответственно, и проанализировань!ї на 195 геле агарозьі. Дорожка с обозначением (М) соответствует генам-маркерам молекулярного веса.

На фиг.ЗА,3В,3С и 30 показань! результатьї наблюдения цитопатогенньїх зффектов на клетках 293, полученньмх с помощью аденовируса-рекомбинанта.

На фиг.ЗА,3В,3С и 30 дань серии фазовьїх контрастньїх изображений (х 400) клеток 293.

На фиг.З А,3В,3С и 30 дань четьре фотографии одной фигурьі, показанной на странице. Фигура 2А - перед трансфекцией, фигура ЗВ - отрицательньй контрольньй результат на 12-й день после трансфекции, фигура ЗС - появление цитопатогенного зффекта (СРЕ) на 12-й день после трансфекции, фигура ЗО - полное проявление цитопатогенного зффекта (СРЕ) на 14-й день после трансфекции.

На фиг.4А,48,4С и 40 дана иммунология клеток, инфицированньїх аденовирусами-рекомбинантами.

На фиг.4А,48,4С и 40 показаньії серии иммунологических изображений клеток НЗ58. На фиг.4А,48,4С и 40 дань 4 фотографии фигурьї, представленной на одной странице. Проявлениеє способности к инфицированию в клетках

НЗ58.Клетки НЗ58 бьли инфицированьь АДаз5хСмММ-ро3 или Ааб/яСмМ/312 в 50 РЕМО/клетка в течение 24 часов.

Питательная среда бьіла использована единственно, в качестве смоделированной инфекции. Инфицированнье клетки бьли проанализировань с помощью иммуноокрашивания.На фиг. 4А представлень результать! испьтаний смоделированной инфекции с помощью антитела апії-р53.На фиг.48 показань! клетки, инифицированнье контрольньім дабБ/А5М/312 и испьмштаннье с помощью антитела апії-р53.На фиг.4С дань инфицированньюе клетки Ааб5СмММ-р5з, испьтаннье с о помощью несвязанного антитела (МОРС21).На фиг.40О0 показана клеточная инфекция дазсмМуУ,испьітанная антителом апії-р53.В качестве антитела апії-р53 бьл использован Рар 1801,а для окрашивания применяли . авидино-биотиновьй метод.

На фиг.5А показано сравнение относительного уровня зкспрессии зкзогенного ро53 в клетках НЗ5В8 с помощью геля 5О5-РАСЕ, окрашенного в голубой цвет (Соотаввіє - рійє).Образцьй клеток НЗ58,которье бьли инфицировань даБсмм-ро3 или АабБ/А5М/312 в 30 РЕШ/клетка, препарировались в течение 24 и 72 часов после инфицирования.

Испьітьївались образцьї пробьі 505-РАСЕ, окрашенной в голубой цвет (Соотаввіє рійє), с целью определения относительного содержания протеийина. Полось 1 и 4 содержат образць! клеток, иифицированньїх АаБ/А5М/21 2. Полось! 2 и З содержат образцьї клеток, инфицированньїх двумя индивидуальньмми группами ДазсммУ - р53 через 24 часа после инфицирования. Полось 5 и б - зто образцьї АЯБСМУ-р5З3 - инфицированной клетки, собраннье через 72 часа после инфицирования. Полоса 7 - зто образец НЗ5ЗВ с моделированньм инфицированиеєм через 72 часа после инфицирования. Полоса М - зто предварительно окрашенньсєе геньі-маркерь! молекулярного веса в КОи (СІВСО - ВАГ).

На фиг.5В дан блотированньй УУезієтт анализ геля, размещенного на полосе, идентичной той, которая принадлежит 505-РАСЕ на фиг.5 А.Относительнье уровни зкспрессии р53 бьіли исследованьі! У/езієтп блотированием с использованием апії - р53.Первичнье антитела бьіли моноклинальньми антителами против протеина р53 (Рар 1801,Опсодепе 5сієпсе Іпс.) и Р-актина (АтегеНат Іпс.) НАР-коньюгированное вторичное антитело и ЕСІ - проявитель бьіли полученьї из вирус-инфицированньх клеток НЗ58, прошедших У/евісгп блотирование (Атегепат Іпс.). Отпечаток, полученньїій М/евіегп блотированием, на фиг.5В, имеет зквивалентную методику восстановления и лечения, что и у тех, которье представлень на фиг.5 А.

На фиг.6 показано время протекания зкспрессийи р53, определенное У/езієт блотированием. Множественнье чашки клеток НЗ58 бьіли инфицированьї АЯЗСММУ при 10 РЕШ/клетка. Клеточньсе лизать! бьіли приготовлень! в установленнье моментьї времени после инфицирования. М/евієтт блотированиеє бьло испьтано с помощью антител анти-р53 и антиактина одновременно. . Полосьі с отметкой "С" представляют отрицательнье результать!. Гистограмма показьівает относительньсе количества ро53, определеннье с помощью денситометра.

На фиг. 7А показана кривая роста вирус-инфицированньх клеток рака легких у человека в клеточньїх линиях Н 358.

Клетки бьіли засеяньі в количестве 10? клеток на чашку (бОмм), при зтом в процессе участвовали 6 чашек на одну клеточную линию. Через 24 часа клетки бьли инфицировань АйЙб5СММУ-р53 или АабБ/А5М/312 при 10 т.о.ї(множественность инфицирования, т.е. РЕШО/клетка). После инфицирования клетки подсчитьувались ежедневно в течение 6 дней. Кривье роста представляют даннье, полученнье при наблюдений четьірех отдельньїх исследований.

На фиг.7В показана кривая роста вирус-инфицированньх клеток рака легких у человека в клеточньїх линиях Н 322.

Клетки бьіли засеяньі в количестве 105 клеток на чашку (бОмм), при зтом в процессе участвовали 6 чашек на одну клеточную линию. Через 24 часа клетки бьли инфицировань Аа5сСмММУ-ро53 или Ааб/я5мМ/512 при 10 т.о.. (множественность инфицирования, т.е. РЕШ/клетка). После инфицирования клетки подсчитьвшались ежедневно в течение 6 дней. Кривнье роста представляют даннье, полученнье при наблюдений четьірех отдельньїх исследований.

На фиг.7С показана кривая роста вирус-инфицированньх клеток рака легких у человека в клеточньїх линиях Н 460.

Клетки бьіли засеяньі в количестве 10? клеток на чашку (бОмм), при зтом в процессе участвовали 6 чашек на одну клеточную линию. Через 24 часа клетки бьли инфицировань АйЙб5СММУ-р53 или АабБ/А5М/312 при 10 т.о.ї(множественность инфицирования, т.е. РЕШО/клетка). После инфицирования клетки подсчитьувались ежедневно в течение 6 дней. Кривнье роста представляют даннье, полученнье при наблюдений четьірех отдельньїх исследований.

На фиг.8 показана схема последовательности операций при исследований ДЯАЗСММУ - р53 в ортотопической модели рака легких. Дозировка и методика лечения безволосьх мьшей, зараженньх клетками Н226Вг и вирусами, представлень! в указанной схеме.

На фиг.9А,98,9С и 90 показань образць!ї средостений, легких мьішей, прошедших лечение, и контрольньїх мьішей.Ффиг.9А,98,9С и 90 - зто фотографии одной фигурьі. Особь бьіла принесена в жертву в конце 6- недельного периода, наступившего после прекращения лечения. Ткани легкого и средостения бьли иссечень! для изучения опухолевого формообразования.

На фиг.9А показан образец медиастинального блока от нормальной безволосой мьіши.

На фиг.9В дан образец медиастинального блока из мьши, которая бьла подвергнута лечению с помощью переносчика фосфатно-солевого буферного раствора (РВ5).

На фиг.9С показан образец медиастинального блока от мьішши, прошедшей курс лечения ДАЗСММ -р5оз.

На фиг.90 представлен образец медиастинального блока, взятого от мьіши, прошедшей курс лечения Даз/А5М/І 2.

Стрелки указьівают на опухолевне массь.

На фиг.10А показано непрерьівное воздействие СОЮР на степень роста родительских Ай-І ис-инфицированньх и да-р5З-инфицированньх клеток НЗ58. Клетки НЗ58(1,5 х 107 клеток/лунка) бьіли вьісеянь в двух зкземплярах на чашке с 24 лунками. Через 24 часа в 100 А | средь! бьіл добавлен Аа-Іис-вирусньій штамм (запас биомассь) (108 РЕШ/мл) или да-р5З-вирусньй штамм (108 РЕШ/мл). Через дополнительнье 24 часа инкубационного периода среда, содержащая вирус, била заменена свежей средой, которая содержала 1 М умл СОР.

На фиг.108 показано воздействие СООР в течение 24 часов на рост родительских Аа-І ис-инфицированньмх и Аа-ро3 - инфицированньїх клеток НЗ58. Клетки бьіли подверженьії воздействию СОР непрерьвно (фиг.10А) или в течение 24 часов (фиг.10вВ), после чего следовало восстановление в свободной от лекарственного средства среде Клетки, которье оставались в виде приложенного монослоя, бьіли испьітаньь на жизнеспособность в течение более пяти дней путем определения степени поглощения голубизньі! трипана. Показано значение ч/-8Е. На пятьій день клеточное число для

Ас1-ро53:СООР-группь! значительно отличалось от всех остальньх групп как для А, так и для В (р«0,05 определено с помощью исследований Зшаеєпів-їеві; (студенческого і-испьітания).

На фиг.10С показано воздействие различньїх концентраций СОЮОР на жизнеспособность АЯ-53-инфицированньх клеток НЗ58. После 24-часового воздействия вируса Ад-Гис или Аа-р53 на клетки, они бьіли обработань 0,10, или 100 н г/мл СООР в течение 24 часов, после чего бьіла определена их жизнеспособность.

На фиг.11А показано нуклеосомальное разрушение ОМА в клетках НЗ58, инфицированньїх Ад-р53, которье подвергаются воздействию СООР. Клетки бьіли инфицировань! и обработаньї СОР в течение 24 часов по методике, которая бьіла описана в комментариях к фиг.10.

На фиг.118,11С,118,11Е,11Р,115 показаньь клетки НЗ58, которье бьли вьращень на предметньїх стеклах, инфицированьі Ад-р53 в течение 24 часов, обработаньі в течение дополнительньїх 24 часов с помощью СООР и зафиксированьі для маркировки по месту фрагментов ОМА. Даньї изображения родительских клеток НЗ58 (В) без или (С) с СООР; Аа-І ис-инфицированньєе клетки (0) без или (Е) с СООР; и Аа-роз - инфицированньєе клетки (Р) без или (0) с

СООР. Размерная стрелка показьнваєт пример окрашенньх в темньй цвет фрагментов ядра. Ваг - 100 М у,

На фиг.12А показан зффект воздействия сочетания Ад-р5З-инфекции с обработкой СООР на сфероидь злокачественной опухолевой клетки НЗ58. Средьі многоклеточной опухоли с клетками НЗ58 бьіли приготовлень! по методике, описанной ранее (Таканавнї, етї а!, 1989). В нулевой день сфероидь! диаметром от 150 до 200 м бьіли помещеньї в 24 лунки агаровой накладки, покривающей пластину, и подверженьі! воздействию Аа-ро3 или да-їі ис в течение 24 часов. В первьй день среда, содержащая 10 г /мл СООР бьла добавлена после удаления вируссодержащеп средь. Во второй день после 24-часового инкубационного периода агаровая накладка бьла замещена мл свежей средьії, свободной от лекарственного средства. Перпендикулярнье диаметрь бьіли измерень с использованием Г-образного (инвертированного) микроскопа. Относительное изменение обьема бьло подсчитано по формуле: а: х р/а- х Брі, где а и Б - наийменьший и найбольший диаметрь! сфероида, а а: и бі - диаметрь! первого дня.

Только относительньій обьем Аа-р53/СООР сфероидов значительно меньше( р« 0,05, значение, полученное в результате испьітания "Зщшаєпіз і-їеві" (студенческого І-испьітания), чем у контрольной группь! (СІ).

На фиг.128,12С0,120,12Е показано маркирование по месту ДОТР с Тат- определением апоптоза. Сфероидь! НЗ58 бьли зафиксированьй на третий день и окрашень по методике, описанной в материалах и способах примера 7.

Контрольньйй необработанньй сфероид (В); сфероид (С), обработанньій СООР; сфероид(О), инфицированньйй Аа-рзоз и сфероид (Е),инфицированньй Аа-ро5з3 и обработанньій СООР. Ваг - 100 М.

На фиг1і3ЗА показана схема апоптоза с помощью СООР после инфицирования іп мімо посредством Аа-р53 по результатам измерений изменений, возникающих в обьемах меняющейся опухоли. Клетки НЗ58 (5 х 10 Є) в 0б1мл сбалансированного солевого раствора Напк бьли введень подкожно в правьй блок ВАЇ В/с - женских особей пи/пи мьшей. Через тридцать дней 200 самой средьі), содержащей Аа- ис (108 РЕМ/мл) или Аа-р53 (108 РЕМ/мл) бьло введено внутрь опухоли диаметром от 5 до б мм. Бьіли вьіполненьї внутриопухолевая иньекция (ЮОрл жи) и околоопухолевая иньекция в двух противоположньїх областях (Бо л каждая). СООР (Змг/кг) или контрольньй физиологический солевой раствор бьл введен интерперитонеально. Опухоли бьли измереньй по двум перпендикулярньім диаметрам без получения информации о лечебньх группах, а обьем опухоли бьіл рассчитан путем получения сферической формь! со средним диаметром опухоли, рассчитанньім как корень квадратньій произведения диаметров поперечньїх сечений. Бьіло использовано по пять мьішей для каждой лечебной группь, при зтом проявляєтся значение ч/-5Е. Даннье бьіли проанализировань! с использованием 5щшаеєпіз І-(еві. Стрелка указьіваєт на день лечения.

Дань!ї независимьсе показания ре0,05 в пятьй день опьїта 1; р«е0,05 в седьмой день опьїта 2 (В-Е).

На фиг.138,13С,130,13Е показань гистологические исследования, использующие биотин-аТР-технологию маркирования с ТатТ-промежуточньїм звеном. Опухоли бьіли проанализировань! через пять дней после начала лечения и сразу же помещень в О.С.Т.(подготовлен гистологический материал. Замороженнье ткани бьіли иссечень в криостате толщиной 5). Иссечения бьіли обработань че г/мл протеиназьї и окрашень!ї по методике, описанной в комментариях к фиг.12.Представленьі изображения опухоли НЗ58, обработаннье: (В) только СЮЮОР; (С) только Аа-рб53; (0,Е) Аа-рзз в сочетаний с СООР. Ваг: - 5мм.Животнье содержались с соблюдением требований ОТ МО ( ОТ МО Апаегзоп Іпзійшіопаї!

Апіта! Саге апа Озе Соттінеє) - организации, осуществляющей надзор за содержанием и уходом за животньми.

Детальное описание предпочтительньїх вариантов осуществления изобретения.

А. Явления, происходящие на молекулярном уровне при развитии рака легких.

Исследования, проведеннье авторами настоящего изобретения, идентифицировали принципиально важнье явления на молекулярном уровне, ведущие к появлению и прогрессированию рака. Зто дало возможность изобретателям разработать новне методь восстановления известньїх нормальньїх функций протейина до такой степени, когда фенотип, вьізьівающий раковье новообразования, может бьїіть подавлен іп мімо.

Найиболее распространеннье гистологии рака легких (8095) обьединень! под названием "рак легких с вовлечением значительного количества клеток (М5СІ С)" и включают сквамозньй рак, аденокарциному и неидентифицированную форму рака с обширньім вовлечением пораженньх клеток. Накоплен большой банк данньїх, касающихся молекулярной биологии рака легких, которне основань! на изучений не так часто встречающейся формь! рака легких с вовлечением небольшого числа клеток (501 С). 5СІ С может бьіть отличен от М5ЗСІ С по нейрозндокринньім признакам клеток; 5СІ С очень чувствителен к химиотерапии, но бьістро возобновляется после прохождения пациентом курса лечения. М5СІ С таюке может служить моделью для других форм зпителиального рака, вьізванного канцерогенньми веществами.

Научнье достижения, полученнье в результате создания настоящего изобретения, могут бьїть использовань! для лечения других форм зпителиального рака.

Накоплен богатьй опьіт, подтверждающий тот факт, что процессу злокачественньїх трансформаций предшествуєт генетическая парадигма.Основнье патологические изменения, происходящие в раковьїх клетках, касаются доминантньх онкогенов и генов - супрессоров новообразований. Доминантнье онкогеньй имеют альтернативь! в классе генов, названньюе протоонкогенами, которйше участвуют в принципиально важньїх функциях нормальньїх клеток, включая сигнальную трансдукцию и транскрипцию.Первостепенной важности модификации в доминантньїх онкогенах, которье обеспечивают возможность трансформации, включают точечнье мутации, трансформации, реклассификации и амплификации (расширения, усиления). Геньі-супрессорьі новообразований необходимьі для осуществления гомозигозной утратьь функций за счет мутации и удаления или комбинирования последних, с целью получения трансформаций. Некоторье геньі-супрессорьії новообразований предназначеньй для осуществления процессов управления разрастанием клеток путем регулирования трансплантации.

Модификация зкспрессиий доминантньх оонкогенов и сгенов-супрессоров, по всей вероятности, влияет на определенньсе характеристики клеток, которне способствуют возникновению злокачественного фенотипа.

Несмотря на увеличение накопленньх знаний о механизмах, происходящих в процессе трансформаций, испьітьївающих опосредствованное влияние онкогенов, недостаточное развитие получили терапевтические методь лечения, действие которьїх должно бьіть направлено специально на онкогень! и их продуктьї, служащие мишенью для воздействия на них при лечебном процессе. Первоначально исследования в зтой области бьіли сосредоточень! на доминантньїх онкогенах, поскольку они первьіми требовали описания. Исследования процесса переноса ОМА - промежуточного гена продемонстрировали механизм приобретения злокачественного фенотипа нормальньми клетками, в результате переноса ОМА от злокачественньїх опухолей человека.

В. ро53 и мутанть! р53 в раковьїх новообразованиях. роЗ известен как ген-супрессор опухолевьх новообразований (Мопіепагй,1992). Вьісокие уровни его бьли обнаружень во многих клетках, трансформированньїх химическим онкогенезом, ультрафиолетовой радиацией и различньмми вирусами, включающими 540. Ген р53 представляет собой часто встречающуюся мишень мутирующей инактивации в большом разнообразии опухолевьх новообразований человека, и уже документально подтверждено, что он является найболее часто встречающимся мутированньї!м геном в традиционньїх раковьїх новообразованиях (Мегсег, 1992).Он мутируется более чем в 5095 рака легких с довольно обширньм вовлечением клеток (М5СІ С) (НоїІезієїп єї аі.,1991)и в большом количестве других новообразований.

Ген р53 кодирует фосфопротеин аминовой кислоть! -375, коториій может формировать комплексь! с протеинами- хозяевами, например обширньй Т-антиген и Еї7В. Протеин обнаружен в нормальньх клетках и тканях, но в концентрациях, которье незначительньї, в сравнений с трансформированньми клетками или тканями опухолевьх новообразований. Интересен тот факт, что природньій р53, как бьіло установлено, играет важную роль в процессе регулирования роста клеток и их делениий. Чрезмерная зкспрессия природного р53, как вьіяснилось, в некоторьх случаях подавляєт пролифератию в клеточньїх линиях опухолевьїх новообразований человека. Так, р53 может действовать как негативньй регулятор клеточного роста (Меіїпрегу, 1991) и может непосредственно подавлять бесконтрольньій рост клеток или вьіполнять зту функцию опосредованно, активизируя геньі, которне подавляют зтот рост. Отсутствие природного р53З или лишение его активности может способствовать возникновению процесса трансформации.

Однако, некоторье исследования указьвают на то, что присутствие мутантного гена р53 может оказаться необходимь!м для полной зкспрессии трансформирующего потенциала гена. Хотя признано, что природньй ген роз является чрезвьчайно важньм регулятором роста для многих типов клеток, играют роль также его генетические и биохимические признаки. Мис -сенс мутации являются обьчньми для гена р5З3 и существенньми для трансформирующей способности онкогена. Единственное генетическое )изменениє, подсказанное точечньми мутациями, может создать концерогенньй р53. Однако известно, что, в отличие от других онкогенов, точечнье мутации роЗ встречаются, по крайней мере, в 30 отдельньїх кодонах, часто создавая доминантнье аллельньсе гень, которье способствуют образованию смещений в фенотипе клетки без репозиции до гемозиготьі. Кроме того, многие из зтих доминантньїх негативньїх аллельньїх генов иногда переносятся в организме и передаются в линию зарождения инфекции. Различнье мутантнье аллельнье гень! могут переходить из минимально дисфункционального состояния в состояние чрезвьучайно проникающих, доминантньх негативньїх аллельньх генов (У/еіпрего, 1991).

Савеу и его коллеги показали, что трансформация ОМА, кодирующая природньй р53 в двух клеточньїх линиях рака груди человека, восстанавливаєт функцию управления подавлением роста в таких клетках (Сазеу еї а1.,1991). Подобньй зффект бьіл также продемонстрирован на трансфекции природного, но не мутантного, р53 в клеточньїх линиях рака легких человека (ТаКапазві єї аіІ.,1992). Р5З проявляет доминантнье признаки по сравнению с мутантньїм геном и может произвести отбор против пролифератии после трансфекции в клетке с мутантньмми генами. Нормальная зкспрессия подверженного трансфекции гена ро3 не воздействуєт на рост клеток с зндогенньім р53.Таким образом, такие структурь! могут восприниматься нормальньми клетками без побочньїх зффектов.

Исходя из изложенного, можно заключить о возникновений возможности лечения рака, имеющего отношение к роз, природньім р53 путем уменьшения количества раковьх клеток. Однако, исследования, приведеннье вьіше, далеки от практического применения, хотя бьі потому, что трансфекция ОМА не может бьіть использована для внедрения ОМА в раковье клетки в организме больного.

С. Методь! генной терапий

Разработано несколько зкспериментальньїх методов применения генной терапии, но они все имеют значительнье недостатки. (Миїїїдап, 1993). Как указьівалось вьіше, существует цельїй ряд основньїх методов трансфекции, в которьх

ОМА, содержащая интересующий нас ген, вводится в клетки не биологическим путем, а, например, путем физического или химического проникновения через клеточную оболочку. Естественно, такие методьі ограничень! клетками, которье могут бьіть временно извлеченьй из организма и в состояниий перенести цитотоксичность лечения, т.е. лимфоцить!.

Липосомь, или протеиновье коньюгатьії, образованнье определенньми липидами, амфофильньми пептидами, могут бьіть использованьї для трансфекции, но зффективность интегрирования гена остаєтся все еще низкой, порядка одного случая интеграции на 1000 - 1000000 клеток, а зкспрессия зараженного гена часто ограничивается днями в разрастающихся клетках и неделями в неразрастающихся клетках. Позтому совершенно очевидно, что метод трансфекции не может считаться подходящим для лечения рака.

Второй метод основьшваєтся на естественной способности вирусов проникать в клетки, внедряя в них свой собственньійй генетический материал. Ретровирусьь имеют преймущество в качестве векторов для переноса генов, благодаря своей способности внедрять свои геньії в геном-хозяин, перенося большое количество чужеродного генетического материала, инфицируя широкий спектр специфических групп клеток, которье вьістраийваются в специфические клеточнье линии. Однако, существуют три основнье проблемь), препятствующие практическому использованию ретровирусньїх векторов. Первое - ретровирусное инфицирование зависит от доступности вирусньх рецепторов на поверхности мишени. Второе - ретровирусьї зффективно интегрируют только в репликационньсе клетки.

Наконец, последнее - ретровирусь! трудно сконцентрировать и обеззаразить.

Ор. Аденовирусньсе структурьі, предназначенньсе для использования в генной терапий

Аденовирусь! человека - зто опухолевье вирусьі двунитевой ОМА с размерами генома около З6КЬ (ТОО27А,1981).

Аденовирусь! бьіли широко изучень и описань! в качестве модельной системь! для зквариотической генной зкспрессии, что заставляет воспринимать их как привлекательную систему для использования аденовирусов в качестве системь для переноса генов. Такую группу вирусов легко виіращивать и использовать, при зтом они проявляют широкий круг хозяев іп міїго и іп мімо. В литически инфицированньх клетках аденовирусь! способнь! отсечь синтез протейна - хозяина, направляя клеточнье механизмь на синтез большого количества вирусньїх протейнов и получение обильного количества вирусов.

Зона Е1 генома включаєт ЕТА и Е18, которье кодируют протейиньї, ответственнье за регулирование транскрипции вирусного генома и некоторьх клеточньїх генов. Зкспрессия Е2, включающая Е2А и Е2В, обеспечиваєт синтез вирусньїх репликационньїх функций, например ЮМА-связанного протеина, ОМА - полимеразьі и окончательного протеина, что создает почву для репликации. Продукть! гена ЕЗ предупреждают цитолиз, вьізьіваемьй цитотоксичньіми Т-клетками, и фактор некроза опухоли и играют важную роль для вирусного воспроизведения.

Функции, ассоциированнье с протеинами Е4, включают репликацию ОМА, зкспрессию последнего гена и отсечение клетки-хозяина. Продуктьі последнего гена включают большинство протеийнов капсида вириона, при зтом они проявляются только после того, как большая часть производства единственного главного транскрипта из основного последнего промотора будет вьіполнена. Последний основной промотор (МІ Р) проявляет вьісокую зффективность в процессе последней фазьї инициирования (5ігадюога Ре!тісацавєї апа Ре!тісацаеєї, 1991а).

Поскольку только небольшая часть вирусного генома требуется іп сів (Тоога,1981), аденовирусопроизводнье векторьї предлагают отличньійй потенциал для замещения обширньх фрагментов ОМА при использовании связи с такими клеточньіми линиями, как для клеток 293. АабЗ-трансформированная клеточная линия мезонефроса (первичной почки) (Стапат, єї аі.,1977) била создана для обеспечения основньїх вирусньх протейнов іп ігап5. Изобретатели, таким образом, показали, что даннье характеристики аденовирусов продемонстрировали хорошие предпосьлки для их использования, с целью прицельного попадания в раковньге клетки іп міо (Спипнаєив 5 Ногміа,1992).

Особье преимущества аденовирусной системь! для переноса инородньх протеинов в клетку включают: (|) способность к замещению относительно больших фрагментов вирусной ОМА с помощью чужеродной ОМА; (І) структурную стабильность аденовирусов - рекомбинантов; (І) безопасность аденовирусного назначения для человека; (ІМ) отсутствиє каких бь-то ни бьіло известньїх ассоциаций аденовирусной инфекции с раком или злокачественньіми образованиями; (М) способность к получению вьісоких титров при использований вируса рекомбинанта при лечении; (МІ) внісокую зффективность аденовируса.

Еще одним прейимуществом аденовирусньїх векторов, по сравнению с ретровирусами, являются вьісокие уровни зкспрессии гена. Кроме того, репликация аденовируса не зависит от репликации гена-хозяина, что вьігодно отличает его применение от применения ретровируса. Поскольку аденовируснье трансформирующие геньі в зоне Е! могут бьть свободно удалень и при зтом обеспечивать существование векторов зффективной зкспрессии, существует мнение, что онкогенньій риск от аденовирусньїх векторов сводится к минимуму и не принимаєется в расчет (Спиппайз 5 Ногпмя,

В основном, аденовируснье системьй переноса генов основьваются на рекомбинантном сконструированном аденовирусе, которьій представляєт собой репликацию, не укомплектованную за счет отсутствия части ее генома, например Еї1, но при зтом сохраняющую еще способность к инфицированию.Относительно большое количество чужеродньїх протеинов может бьіть проявлено, если в аденовирусном геноме осуществить дополнительнье удаления.

Например, аденовирусьї, неукомплектованньсе в обеих зонах Е1 и ЕЗ, способнь! переносить до 10 Ко чужеродной ОМА и могут бьіть виращень! до вьісоких титров в клетках 293 (5ігашога -Регісацаєї 5 Регісацаеєї, 1991а). Кроме того, била отмечена также удивительно продолжительная зкспрессия трансгенов, сопровождающая аденовирусноеє инфицирование.

Способ переноса гена с помощью аденовируса недавно бьл изучен в качестве средства переноса гена -посредника в звкариотические клетки живьїх организмов. Например, при лечений мьишей с редким рецессивньм генетическим растройством - орнитозньмм транскабамилаза -дефицитом (Огпійіпе ігапзсагбитуїазе (ОТО) - бьіло обнаружено, что аденовируснье структурь! могут бьіть использованьь для снабжения нормальньми (О0ТС)- знзимами. К сожалению, зкспрессия нормальньїх уровней (ОТС) бьіла достигнута только в 4-х из 17-и примерах (Зігашога - Регісацаеї еї аї., 1991р). Позтому дефект бьіл только частично исправлен у большинства мьішей, что не привело ни к физиологическим, ни к фенотипическим изменениям, а значит, такие результать! оставляют мало надеждь! на возможность использования аденовирусньх векторов в терапии рака.

Попьтки использовать аденовирус при переносе гена для регулятора трансмембранной проводимости при фиброзно-кистозной дегенерации (СЕТЕ) в легочньй зпителий хлопковьх крьіс также имели только частичньй успех без возможности получения биологической активности перенесенньїх генов в зпителии животньх (ВНезепгеїйа еї а1!.,1992). И опять -таки зти исследования продемонстрировали перенос гена и зкспрессию протеина СЕТА в клетках легочньх дьїхательньїх путей (воздуховодов), но не подтвердили никакого физиологического зффекта. В 1991г. научная статья авторов НезепієїЇй єї а. показала легочную зкспрессию /-ОЇ-антитпипсин - протеина, которая опять-таки не дала физиологического зффекта. Авторьі зтой статьи пришли к вьіводу, что уровни зкспрессии, которую они наблюдали, составляют всего 2 процента от того уровня, которьй требуется для защить! легкого человека, т.е. зти уровни намного ниже тех, которне способньі дать физиологический зффект.

Ген для человеческого Є ;-антитрипсина бьл введен в печень нормальньх крьс путем интрапортальной иньекции, где наблюдалась ею зкспрессия, результатом чего бьіло обнаружение секреции введенного человеческого протеина в плазме зтих крьіс (даїе еї а!.,1992). Однако, полученнье уровни не бьіли достаточно вьгсоки, чтобь! оказать какое-либо терапевтическое воздействие.

Итак, даннье результатьь не подтверждают того, что аденовирус в достаточной степени способен направить зкспрессию достаточного протеина в рекомбинантньх клетках на получение релевантного физиологического зффекта, и позтому они не вьісказьввают предположения об использований потенциальньхх возможностей аденовирусной системь! для лечения рака. Кроме того, в существовавшем до настоящего времени уровне техники биьтовало мнение, что р53 не может бьіть инкорпорирован в упакованную клетку, такую, которую они использовали для получения аденовируса, так как она могла бьїіть токсичной. То, что Е1В аденовируса присоединяется к р53, бьіло воспринято как еще оду причину того, что технология аденовируса и р53 не могут сочетаться.

Е. Структурьї аденовируса ро3 и подавление опухолевьїх новообразований

Настоящее изобретение предлагает генную терапию рака с новьім и более зффективньм вектором подавления опухолевьїх новообразований. Данньй рекомбинантньй вирус использует преимущества аденовирусньїх векторов, такие как внісокие титрьї, широкий диапазон поражения, зффективная трансдукция и неспособность интегрировать в клетки - мишени. В одном из примеров осуществления изобретения получают решшкационно-дефектньй, не требующий помощника независимьй аденовирус, которьій способствует проявлению зкспрессии природного р53 (дазхсСмм-роз) под управлением человеческого цитомегаловирусного промотора.

Контрольньюе функции на векторах зкспрессии часто обеспечиваются вирусами, когда хотят достичь зкспрессий в клетках млекопитающих.Например, обьчно используемье промоторьї являются опроизводньми от полиомь, аденовируса 2 и вакуолизирующего обезьяньего вируса 40 (5М40). Ранние и поздние промоторьі вируса 5М40 являются особенно часто применяемь/!ми, так как они оба легко получаются из вируса в виде фрагмента, которьій содержит 5МУ40- вирусньйй источник репликации. Меньшие или большие 5М40 -фрагменть! могут бьіть также использовань! при условии, что включено приблизительно 250 Бр последовательности, простирающейся от участка Ніпа ПШ по направлению к участку Ва ІІ, сосредоточенному в вирусном источнике репликации. Кроме того, возникает также возможность, и часто желаемая, использования промотора или контрольньїх последовательностей, нормально ассоциированньх с включенной генной последовательностью, при условии, что такие контрольнье последовательности совместимь! с системами клетки-хозяина.

Источник репликации может бьть обеспечен структурой вектора, чтобьії включить зкзогенньій источник, такой, например, которьій может бьть производньім от 540 или других (например, полиомь!, адено, М5М, ВРУ) вирусньх источников, или может бьіть снабжен механизмом хромосомной репликации клетки-хозяина. Если вектор интегрируется в хромосому клетки-хозяйна, зтого бьіваєт достаточно.

Структура и воспроизведение предпочтительного аденовируса ро53 представлень! в виде графической схемь! на фиг.1. В связи с зтим бьіл разработан улучшенньй протокол для воспроизведения и идентификации аденовируса- рекомбинанта (будет описано ниже). После идентификации аденовирус-рекомбинант р53 бьіл структурно подтвержден анализами цепной реакции полимеризации (РСР), как показано на фиг.2. После изоляции и подтверждения структурь! аденовирус ро5З3 бьіл использован для инфицирования клеточной линий НЗ58 рака легких человека, которая имела гомозигозное удаление гена р53.Отпечатки (реплики) УУезітп показали, что зкзогенньій протеин ро3 проявил зкспрессию на вьісоком уровне (фиг.4 и фиг.5), а -пик его зкспрессии пришелся на 3-й день после инфицирования (фиг.б).

Бьло также показано в клеточной линии НЗ22 точечной мутации р53, что мутант р53 бьіл отрегулирован с понижением уровней зкспрессией зкзогенного р53. В качестве зкспериментального контрольного злемента бьл использован вирион Ааб/н5М/с12, которьй имел структуру, похожую на структуру ДАБСММ-р53. Зтот вирус содержал с

ОМА - люциферазу. произведенную І ТА-промотором вируса Ной - саркомь в кассете зкспрессии вириона. Ни зкспрессии ро3, ни изменения в зкспрессии актина не бьіло обнаружено в клетках, инфицированньїх Ааз/АзмМ/аІ 2 вириона. Рост клеток НЗ58, инфицированньїх АЛЯЗСМУМ - р53, бьіл в большей степени подавлен, по сравнению с неинфицированньіми клетками, или клетками, инфицированньми контрольньім вирионом (фиг.7А). Рост клеток НЗ22 бьіл также в большой степени подавлен вирионом ро3 (фиг.7В), в то время как рост клеток Н4іб6О раковьїх опухолей человека, содержащих природньй роз, испьітьївал меньшее влияние (фиг.7 С).

давфсмум-ро3 оказал сильное подавляющее воздействиє на рост клетки рака легких іп міго. Подавление роста не бьіло столь очевидно, когда клетки били инфицированьї АЯ5СМУ-р5о3 при МОЇ (множественности инфицирования) ниже, чем 1 РЕШ/ клетка, а при МОЇ вьіше, чем 100 РЕШ/клетка цитотоксичность наблюдалась даже у контрольного вируса дав/5МУ/с12. В наших исследованиях оптимальной дозой для изучения возрастного состава популяции бьло значение 10-БОРЕРМШО/клетка. В диапазоне зтой дозьі подавление роста клетки бьіло показательно для протеина роЗ3 с проявленной зкспрессией роі3.

Испьтания, проведеннье на безволосьїх мьішах, продемонстрировали, что способность к образованию опухолей в клетках НЗ58, пролеченньх АЯа5СММУ-р5о3, бьла значительно снижена. В зкспериментальной модели с мьшами ортотопического рака легких человека онкогеннье клетки Н226Вг с точечной мутацией бьіли введень! внутритрахеально за три дня до начала лечения вирусом. Внутритрахеальная инсталляция АЯ5СММУ-р53 предупреждала формирование опухолей в данньїх модельньх системах, предполагающих, что модифицированньй аденовирус является зффективньм вектором для промежуточного переноса и зкспрессии генов супрессоров опухоли на уровне раковьх клеток человека и что вирус АЯЗБСМУ-ро53 впоследствий может бьіть усовершенствован до получения терапевтического средства, с целью использования его в генной терапии рака. давБсСмм-ро3 является посредником при получении вьісокого уровня зкспрессии гена ро53 в клетках рака легких человека, что продемонстрировано У/езієгп-блотированньіми анализами. Зкзогенньій протеин р53 бьл почти в 14 раз обильнее, чем зндогенньій природньій р53 в клетках Н4іб0, и почти в два - четьіре раза обильнее, чем В - активньй внутренний контроль в клетках НЗ58. Вьсокий уровень зкспрессии может бьть обьяснен присутствием: вьісокозффективного переносчика гена, сильного промотора цитомегаловируса (СМУ), приводящего в движение р53-

СОМА, и аденовирусного Е1-усилителя, активизирующего транскрипцию СОМА -р53. Продолжительность зкспрессии роз после инфицирования составила более 15 дней в клетках НЗ58. Однако, наблюдалось бьістрое затухание зкспрессии по истечений 5 дней после инфицирования. Анализьь цепной реакции полимеризации на образцах ОМА на инфицированньїх клетках НЗ58 показали снижение уровня вирусной ОМА с уменьшенньм уровнем протеийна, указьвающим на потерю вирусной ОМА в процессе непрерьвного роста раковьх клеток іп міо.

Понижение зкспрессии р53, также может явиться результатом клеточной аттенуации промотора цитомегаловируса, которьій контролируеєет степень зкспрессии ро53, поскольку явление отсечения промотора цитомегаловируса - промежуточной клетки -хозяина уже известно (ЮОаї єї а1.1992). Аденовируснье векторьї представляют собой неинтегрированньюе векторьї - переносчики генов и позтому длительность зкспрессии гена зависит от целого ряда факторов, включающих клетки - хозяева, перенесенньсе геньї и соответствующие промоторь. Кристалл и соисполнители показьвали низкий уровень зкспрессии гена -регулятора трансмембранной проводимости в фиброзно- кистозньх дегенерациях в клетках зпителия хлопковой крьісьї, что обнаруживало себя через 6 недель после инфицирования (Бозепієїа еї а!., 1992). Лаборатория Ре!їтісацаєї продемонстрировала минимальную зкспрессию гена-минидистрофина в тах мьішце мьіши, которая длилась более трех месяцев после инфицирования "Скоротечньюе зкспрессии вьсокого уровня природного протеина р53, наблюдавшиеся в настоящем исследований, могут иметь обнадеживающие результать!, вьізьиівающие снижение возможньіїх побочньїх влияний на нормальнье клетки, сопровождающие іп мімо лечение с помощью ДазсмуУ- роз.

Раскрьтьсе в данном описаний результать! указьівают на то, что аленовирус-рекомбинант р53 обладаєт свойствами подавления опухолей, при зтом он осуществляет зти действия за счет восстановления функции протеина ро53 в раковьсмх клетках. Зти результать дают возможность заявить об использований вириона АйЙБ5СММУ-р53 в качестве терапевтического средства для лечения рака.

Е. Поражающие ОМА агенть!.

В связи с настоящим изобретением, может бьїть использовано широкое многообразие поражающих ОМА агентов, например агентов, которье структурируют ОМА (образуют поперечнье связи), агентьї, которне внедряются в ОМА, и агентьії, которне ведут к хромосомньім имитотическим искажениям путем создания условий для синтеза нуклеийновой

КИСлОтТЬІ.

Агентьії, которне непосредственно структурируют (образуя поперечнье связи) нуклеиновье кислоть!, в частности

ОМА, предназначень в данной ситуации для поражения ОМА, что ведет к образованию синергического антибластомного (потивоопухолевого) соединения. Могут бьіть использовань! цисплатин и другие алкилирующие ОМА агентьі. Цисплатин широко используется для лечения рака. Зффективнье дозьі использовались в клинических назначениях 20мг/ме в течение каждьх трех недель для проведения полного курса лечения, состоящего из трех циклов. Цисплатин не усваиваєется орально, позтому должен вводиться внутривенно, подкожно, непосредственно в опухолевую ткань или интерперитонеально .

Агентьі, которне поражают ОМА, такюже включают компоненть!, которье интерферируют с ОМА - репликацией, митозисом и хромосомной сегрегацией. Примерами таких соединений могут служить адриамицин, известньій также под названием дексорубицина, зтопозид, верапамил, подофиллотоксин и т.п. Нашедшие широкое применение в клинических назначениях для лечения злокачественньїх новообразований, зти соединения вводятся с помощью иньекции ударной дозьї вещества внутривенно с использованиєм доз от 25 - 7мг/м2 с интервалами на 21 день для адриамицина, до 35 - 50мг/м? для зтопозида внутривенно или удвоенную внутривенную дозу -орально.

Агентьї, которне разрушают синтез и точность предшественников нуклеийновьїх кислот и подгруппьі, также ведут к разрушению ОМА. Бьл получен цельй ряд предшественников нуклейновой кислотью. В частности, заслуживают внимания агентьї, которне бьіли подвержень! зкстенсивному тестированию, и которне вполне поддаются оценке. В частности, полезньми могут оказаться такиє агентьї, как 5-флуороурацил (5-ЕО), которье предпочтительно используются неопластическими тканями, что делаеєт зтого агента особенно полезньім при переносе клетки опухолевьх новообразований. Несмотря на чрезвьчайную токсичность, 5-БО, может бьть использован для широкого диапазона "проводников" (переносчиков), включая локальньїх; обьчно используется внутривенное введение доз от З до 15мг/кг/день.

Существуют другие факторьі, виізьівающие поражение ОМА, которье широко используются и которне хорошо известнь как 7 -пучи, Х-лучи й/или управляемая доставка радиоизотопов в клетки опухоли. Могут применяться другие видьї поражающих ОМА факторов, например микроволновое и ультрафиолетовое излучениє. Наийболее вероятно предположить, что все зти факторьї оказььвают обширное поражающее воздействие на большой круг предвестников

ОМА, на репликацию, репарацию ОМА, а также на обьединениє и поддержание жизнеспособности хромосомь!.

Дозировка уровней для Х-лучей рассчитьшвалась от дневньх доз величиной от 50 до 200 рентгенов в течение продолжительного периода времени (от трех до четьтрех недель) до одной единственной дозьі величиной от 2000 до

6000 рентгенов. Дозировка для радиоизотопов изменяется в очень широких пределах и зависит от половинного срока жизни изотопа, силь! и типа излучаемой радиации, а также от степени поглощаемости клетками со злокачественньім новообразованием.

См. "Ветіпдіоп'є Ригптасеціїса! бсієпсев" 15-е издание, глава 33, стр.624-652. Допускаются некоторье варианть! в дозировке, в зависимости от условий, связанньх с особенностями пациентов. Лицо, ответственное за введение лекарства, в любом случає индивидуально определяеєет соответствующую дозу для отдельного больного. Кроме того, лекарство, предназначенное для приєма больньім, должно бьіть стерильньім, защищенньм от пирогенности, отвечать требованиям безопасности и обеззаражено в соответствии с требованиями стандартов ЕОА Онісе ої Віоіодієзв.

С. Лечение с применением роз и цисплатина.

Для определения зффективности комбинированньїх терапевтических методов, включающих перемещение гена и воздействие химиотерапевтических средств для лечения рака человека изобретатели исследовали вопрос, может ли возбудить апоптоз іп мімо непрерьвное ведение Ай-р53 и СООР. В последующие три дня после прямого внутриопухолевого введения Ай-р53 или интерперитонеального введения СОР опухолевье клетки НЗ58, имплантированнье подкожно в организм пи/пи (безволосьх мьшей), показали действительно обнадеживающие результать! замедления роста. Если Аа-ро3 и СООР бьли введеньї одновременно, опухоли регрессировали частично, а размер исследуемой опухоли оставался статистически значительно меньшим, чем те, которне участвовали в каких-либо других лечебньїх группах. Рост зффекта поглощения становился еще более ощутимьм после двух циклов лечения (фиг.13 А). Гистологические исследования обнаруживали массированное разрушение раковьїх клеток в той зоне, куда бьіл введен АЯ-р53 в организме мьіши, подверженной лечению СООР. Окрашивание по месту продемонстрировало большое количество умерщвленньїх клеток вокруг межклеточньїх пространств (фиг.13 В - Е). По контрасту, опухоли, обработаннье только СООР или только Аа-ро53, не показали ни зон насьіщенности, ни зон апоптоза.

Настоящее изобретение демонстрирует новое направление в генной терапии человека в сочетаний с традиционной химиотерапией, использующей структурирующий ОМА агент.

Сопротивляемость опухолевой клетки химиотерапевтическим лекарственньм средствам составляєт основную проблему клинической онкологии. Разновидность рака М5СІ С составляєт, по крайней мере, 8095 случаев рака легких; пациенть с М5СІ С, однако, в основном, невосприимчивь! к химиотерапевтическим лекарственньмм средствам (ЮОоуїе, 1993). Одной из задач современньїх исследований в области онкологии является поиск путей улучшения методик терапевтического лечения рака, в основе которьїх лежит принцип перемещения гена, в результате изучения механизмов взаймодействия между генньім продуктом и химиотерапевтическим лекарственньім средством. Ген герпес-симплекс- тимидин-киназа (Н5Б-К), будучи перенесеннььмм ретровирусной векторной системой в ткань опухоли мозга, успешно проявил чувствительность к антивирусному агенту дапсіЇсіоміг (Симег,еї аї.,1992). Продукт гена Н5-ІК представляєт собой зкзогенньй вирусньй знзим, и поскольку зкспрессия протеина уї-ро53 проявляется в нормальньх тканях, возникает предположениє, что модуляция устойчивости к воздействию химиотерапевтических средств, вьізванная альтерацией в озкспрессии уї-ро53, возможно явится альтернативньм подходом, использующим путь, которьй опосредствованно определен зндогенной генетической программой.

Аденовирусная система имеет потенциальнье преймущества при перемещениий гена іп мімо, например легкость получения вьісокого значения титра вируса, вьісокая степень инфекционной активности и невосприиймчивость для многих типов клеток. Однако стабильность и продолжительность существования зкспрессии внедренного гена все еще остаются проблематичньми. Рост уровней ро53З в клетках, которне отличаются чувствительностью /к химиотерапевтическим лекарственньм средствам, может наблюдаться в пределах б часов после воздействия ОМА- поражающих стимуляторов (Епіспе,еїа!., 1993, 2Нап, єї ашІ.,1993), хотя повьішенная активность, вьізванная действием

ОМА, может бьіть возвращена в первоначальное состояние в течение четьірех часов, если стимулятор удаляют (ТівПіег, еї аІ.,1993). Отсюда, вьісокий уровень зкспрессии ро53 может поддерживаться даже после прекращения воздействия на организм лекарственного средства. Обеспечение зкспрессии протеина м-ро3 с помощью Аа-ро3 достигаєет кульминации на третий день после инфицирования (14 - складкой больше, чем зндогенньій "дикого типа") и снижаєтся до низкого уровня к девятому дню (2Папа, єї аї!., 1993). Зто наводит на мьісль, что переменно вьісокого уровня зкспрессии мі-роз достаточно, чтобьї инициировать цитотоксическую программу в раковой клетке.

Н. Пациенть; и протоколь! лечения ( истории болезней).

Изобретатели предполагают, что региональная доставка аденовирусньх р53 сгенньїх структур, например неоперабельной закупоривающей зндобронхиальной формь! рака, окажется зффективньмм способом доставки терапевтически зффективного гена, способного противостоять клинике заболевания. Переносчик гена роЗ3 должен действовать в сочетаниий с агентами или факторами, которье ведут к разрушению ЮМА. Зтот обьединенньй подход представляєт собой значительное улучшение в современной терапий рака, например, изменяется отношение к цисплатину, которьій в существующих методиках один направляєт усилия на умерщвление или удаление последней раковой клетки с помощью зффективного разрушения ОМА. Но поскольку "спячка" опухолевой клетки является установленньім фактом, зто делает возможность такого умерщвления в вьісшей степени маловероятньм.

Существуєт мнениеє, что поглощение аденовирусньїх структур клетками МЗС. должно снизить степень разрастания зтих клеток, однако существующие образцьі показьявают, что обьединенное использование поражающих ОМА агентов или факторов совместно с аденовирусом ведет к глубокому подавлению роста клетки и размеров опухоли, чего не обнаруживаєеєт ни один из компонентов в отдельности. Композиции и способь, раскрьтье в данном описаний, в большой степени предопределяют повьішение на протяжений времени вероятности того, что больное легкое может оставаться в расширенном состояний, предотвращая возобновление роста и деление клеток опухоли, что может продлить жизнь больного.

Больнье с рецидивом неоперабельной зндобронхиальной опухоли, которая частично или полностью закрьваєт дьїхательнье пути и которая безуспешно подвергалась или не может бьіть подвергнута наружной радиотерапии, бьіли вьібраньї для протокола лечения предлагаеємьм комбинированньім способом. Существующие терапевтические способь! лечения в таких условиях предлагают только кратковременное облегчениє. Большинство пациентов получили рецидивьі, несмотря на наружную лучевую радиотерапию. Существует возможность введения брахитерапевтического катетера и назначения дополнительной радиотерапии, внутривенного введения поражающих ОМА агентов. Больньєе, получившие такое лечение,могли прожить, в среднем, 6 месяцев. Больньсе, для которьїх брахитерапевтическое лечение оказалось незффективньмм, также бьіли отобраньї для получения генной терапии. Опухоль может бьіть удалена из дьїхательньїх проходов с помощью лазера или биопсийньїх щипцов. Зто может бьіть виіполнено в сочетаний с вводом аденовирусньх структур, уменьшая таким образом обьем, которьй должен бьїіть введен. Назначениеє вирусньх: структур не должно препятствовать назначению пациентам других паллиативньх средств, если опухоль прогрессирует. 1. Другие средства переноса гена.

Успешное применение генной терапии зависит, в основном, от интеграции гена, способного корректировать генетические нарушения в геноме-хозяйине, где он мог бьї сосуществовать и воспроизводиться в ОМА-хозяйине, а также проявлять свою зкспрессию на уровне, способном компенсировать недостающие компонентьї дефектного гена.

Идеально, болезнь должна бьї излечиваться после проведения одного или нескольких курсов лечения без серьезньх побочньїх явлений. На настоящий момент бьло разработано и предложено несколько подходов генной терапии, которье могут бьіть применень с использованием настоящего изобретения.

Первьй подход заключаєтся в трансфекции ОМА, содержащей нужньй ген, в клетки, например путем проникновения через клеточную мембрану химическим или физическим путем. Зтот подход применим, в основном, по отношению к клеткам, которье могут бить временно удалень из организма и которье в состояниий вьіносить цитотоксичность лечения (а именно, лимфоцить). Липосомь), или протеиновье коньюгать,, образованнье определенньми липидами и амфофильньми пептидами, могут бьіть использовань! для трансфекции іп мімо (5іемаї! єї а1і.,1992; Тогепіїйп еї а1!.,1992; 2ли еї а1І.,1993), однако действительная зффективность интеграции гена очень низка. Установлено, что нужньй ген интегрирует в геном только одной клетки в 1,000 до 100,000. При отсутствийи интеграции зкспрессия привнесенного гена ограничивается несколькими днями в разрастающихся клетках или несколькими неделями в неразрастающихся клетках, из-за неинтегрированньїх ОМА.

Второй подход основан на природной способности вирусов проникать в клетки, привнося в них свой собственньй генетический материал.

Ретровирусь! проявили себя в качестве векторов, переносящих геньі, благодаря их способности интегрировать свои геньї в геном-хозяйн, перенося большое количество чужеродного генетического материала и инфицируя широкий спектр видов итипов клеток, образующих специфические клеточнье линии (МіПШег, 1992).

В основе третьего метода лежит использование других вирусов, таких например, какаденовирусь, герпес-симплекс- вирусь! (Н5М), вирус цитомегалийи (СМУ) и адено-ассоцированньй вирус (ААМ), которне разработань! для вьіполнения роли векторов, переносящих геньії Хотя некоторье вирусь), способнье воспринимать чужеродньій генетический материал, ограничень! в числе нуклеотидов, они могут аксомодировать, и в границах клеток, которне они инфицируют, на данньїх вирусах бьл успешно продемонстрирован зффект зкспрессии гена. Однако аденовирусь! не интегрируют свой генетический материал в геном-хозяин и позтому не требуют репликации хозяина для возникновения зкспрессий гена, что делает их идеально подходящими для возбуждения бьістрой и зффективной гетерогенной зкспрессии гена.

Хотя изобретение бьло описано с определенной степенью частньїх проявлений, совершенно очевидно, что многие альтернативнье решения, модификации и варианть! могут возникать у специалистов при изучении данного описания, раскрьивающего сущность изобретения. Важно, чтобьії все зти альтернативнье решения, модификации и варианть! находились в пределах круга признаков, очерченньїх пунктами формуль! изобретения.

Включеньії следующие примерь), демонстрирующие предпочтительнье вариантьй осуществления изобретения.

Специалистьї в данной области должньі принять к сведению, что технологические приемь!, показань в примерах, которье соответствуют способам, раскрьтьм изобретением, чтобьі дать представление об их осуществлений в соответствии с изобретением и, таким образом, показать осуществимость изобретения в его предпочтительньмх вариантах. Однако, исходя из принципов раскрьттия данного изобретения, специалисть! должнь! отдавать себе отчет в том, что на практике способьї по данному изобретению могут бьіть осуществленьі с использованием зквивалентной замень! некоторьїх признаков с достижением аналогичного результата, оставаясь при зтом в рамках сущности изобретения, виіраженной в изложений его формульі.

Пример!. Структура вектора зкспрессии роз.

Настоящий пример описьівает структуру вектора зкспрессии р53. Данньй вектор сконструирован и используется для замещения зонь Е1 (1,3 - 9,2т.и.) генома АЯа5 аденовирусного штамма и получения структурь! аденовирусного вириона, описанного в примерег.

Кассета зкспрессии р53, показанная на фиг.1, содержащая промотор цитомегаловируса (СМУ) человека (Возпаїї, єї а!., 1985), роЗ СсОМА и ранний сигнал полиаденилации 5М40, бьіла установлена между участками Хба І 5 СіаІ! рХхОЛ І (описано: Ог.Ргапк І.Стапат,Мсе Мавієг Опімегейу,Сапада).

Размер генома составляєт около 35,4КОЮ, разделеннье на 100 карточньїх ячеек (1т.и. (карточная ячейка) - 0,З35КБ.).Кассета зкспрессии р53 заместила зону Е1 (1,3 - 9,2т.и.) генома да.

Первичньй злемент 1 имеет последовательность 5-(4(аСССАСССССтТТаастто - З'ЇЗЕО ІЮ МО 1) и сосредоточен в первом интроне вниз по движению промотора главного гена ІЕ цитомегаловируса человека (Вознаїї еї аї.,1985).

Первичньй злемент 2 имеет последовательность 5' - ТТатТААССАТТАТААЛОСТасС - 3' (5ЕО ІЮ МО:2) и сосредоточен в раннем сигнале полиаденилации 5М40. Оба первичньїх злемента, 15-20бр от включения СОМА ро53 на обоих концах определяют продукт цепной реакции пролимеризации 1,40Кр. Первичньй злемент З имеет последовательность 5'-

ТСОаТТТСТСАсСАсСТОаТТОа - 3 (5БО 10 МО3) и опервичньй злемент 4 имеет опоследовательность 5

САТСТаААСТСААдАСаСаИатас -З (ЗЕО ІЮ МО:4) и расположень в 11т.и. и 13,4т.и. генома Ай5, соответственно, которье определяют продукт 0,86КЬ -вирусно-геном-специфической цепной реакции полимеризации.

Пример2. Образование и воспроизведение аденовируса-рекомбинанта роз.

Данньй пример описьшваеєт способ, применяємьй для образования помощник-независимого рекомбинантного аденовируса, проявляющего зкспрессию р5о3. Молекулярньй алгоритм, примененньйй для получения аденовируса- рекомбинанта основан на том факте, что, благодаря лимиту упаковки (дозировки) аденовируса, р/М17 не может формировать вирус самостоятельно. Позтому гомологические рекомбинации между векторньім плазмидом зкспрессий роЗ3 и руМ17 в инфицированной клетке позволит получить результат в виде жизнеспособного вируса, которьій может бьіть упакован только в клетках, в которьїх созданьі условия для зкспрессии протеинов. В данном примере клетки 293 используются в качестве клеток - хозяев для воспроизведения вирусов, которне содержат замещения кассет зкспрессий гетерологической ОМА в зонах Е!1 и ЕЗ3. Зтот процесс требует котрансфекции ОМА в клетках 293.Трансфекция широко определяет зффективность вирусного воспроизведения.

Способ, использованньй для трансфекции ОМА в клетках 293 до создания настоящего изобретения, обьічно включал использование фосфата кальция/копреципитации ОМА (Стапат 8 мап дег ЕБ,1973). Однако зтот способ совместно с розеткообразованием относительно трудноосуществим и обьічно заканчивается малой зффективностью воспроизведения вирусов. Как показано на зтом опримере, трансфекция и последующая идентификация инфицированньїх клеток бьіли значительно усовершенствованьі, благодаря использованию способа трансфекции с промежуточньмм перемещающим звеном липосомь, при идентификации зараженньїх клеток с помощью цитопатогенного зффекта (СРЕ).

Клеточнье линии 293 вьідерживались в несколько измененной питательной среде Оцірессо с 1095 инактивированной с помощью нагревания лошадиной сьівороткой. Вектор зкспрессии р53 и плазмид руМ17 (Ме Схгогу єї аім., 1988) для гемологической рекомбинации бьли подвергнутьіь котрансфекции в клетках 293 с помощью метода трансфекции с о промежуточньм звеном БОТАР, согласно протоколу исполнения (Воепіпдег Мапппеїт

Віоспетіса!5,1992). Схематически зто изображено на фиг.1.

Клетки 293 (проход 30, 6095 - пересечение) бьіли заражень! за 24 часа до трансфекции или в бо-миллиметровьмх чашках, или в 24-луночньїх чашках Петри. Клетки в каждой лунке бьіли подверженьі трансфекции с помощью зол

БСОТАР. 2 вектора зкспрессии ро и зи плазмида руОМ17. После трансфекции клетки получали питание в виде средьі! МЕМ каждьеє 2-3 дня до тех пор, пока не появлялся цитопатогенньій зффект.

Пример3. Подтверждение идентичности аденовируса -рекомбинанта.

Данньй опример иллюстрируєт новьій способ исследования цепной реакции полимеризации (РСА) для подтверждения идентичности рекомбинантньїх вирионов, сопровождающих процесс котрансфекции соответствующей клеточной линии.

Слои надосадочной жидкости клеточной культурь! (от 50 до зт л) бьли собраньй из участвовавших в исследованиях чашек Петри, обработань! протеиназой К (50 ум де 0,595 505 и 20 тМ ЕОТА) при 56"С в течение 1 часа с помощью фенолхлороформа, а нуклеийновьсе кислоть! бьіли вьіведеньї в осадок с помощью зтанола. Осадок ОМА бьл повторно суспендирован в ол ЯНг2О и использован в качестве матриць для усиления цепной реакции полимеризации (РСА). Относительнье локализации первичньїх злементов цепной реакции полимеризации (РСЕ) и их последовательности показань на фиг.1ї и обозначень: 5ЕО ІЮ МО:1,2,3 и 4 соответственно. Первичнье злементь! специфических включений ОМА определяют продукт 1,4КО цепной реакции полимеризации (РСВ), а вируснье геном- специфические первичнье злементьї определяют продукт 0,86КЬ цепной реакции полимеризации (РСЕ). Цепнье реакции полимеризации проводились в обьеме во л, содержащем 4тм Масі», 50тМ КСІ, 1,195 тритона Х-100, 200 м М каждой из аМТР, тм Тіїв-СІ (рно,о0), зи М каждого первичного злемента и 1,0 единица Тад-полимеразь (Рготеда). Реакции проводились при 94"С в течение 0,5мин.,56"С в течение 0,5мин., 72"С в течение 1мин. на протяжений 30 циклов.

Чтобьї упростить процесс идентификации вновь воспроизведенного рекомбинантного вируса, бьл разработан способ осуществления непосредственно цепной реакции полимеризации (РСА) на образцах ОМА, взятьїх из надосадочной жидкости клеточной культурь. Слои ( 50 или 3704 л) надосадочной жидкости клеточной средь с цитопатогенньм зффектом бьли обработаньі протеиназой К и фенол /хлороформ/ зкстрактом. После зтанолового осаждения образцьї ОМА бьіли проанализировань!ї с использованием цепной реакции полимеризации (РСР), в которой принимали участие две парь! первичньїх злементов, с целью усиления специфических последовательностей включений и вирусногеном-специфических последовательностей. Мишени первичньїх злементов цепной реакции полимеризации и их последовательности показань! на фиг.1 Первичньсе злементь 1,2,3, и 4 представленьії с помощью 5ЕО ІО МО: 1,2,9,4, соответственно.

В результате, включение СОМА 1,4КоБ и фрагмент вирусного генома 0,86КЬ бьіли усиленьі из вектора зкспрессий (положительньй результат) и образцов ОМА положительной клеточной культурь (фиг.28В, полоса 1 и 4, соответственно).

Только фрагмент 0,86Кр бьл усилен из образца ОМА вируса АабБ/А5М/с12 (отрицательньй результат, полоса 2 ).

Никаких усиленньїх полос, пучков волокон не било обнаружено при цепньїх реакциях полимеризации (РСР), которье использовали необработанньй положительньй надосадочньй слой клеточной культурь! (3-я полоса).

Зти результать! указьшвают на то, что аденовирусьі, секретированнье в клеточной культурной среде, могут бьть определень! цепной реакцией полимеризации (РСР), используя всего лишь 50

Цл надосадочной жидкости средьі клеточной культурьї для приготовления матриц ОМА. Полученнье результать должнь! позволить разработать количественньйй метод при использований данного способа, с целью определения аденовирусньх титров, что обьічно получают с помощью метода розеток.

Природная последовательность СОМА ро3 в вирусе ДЯБ5СМУ-р53 бьіла подтверждена посредством дидеокси ОМА- последовательности на С5Сі-дгадіепі - очищенной вирусной ОМА. Контрольньій вирус АаЙбБ/А5М/212, полученньй подобньім способом, имеет структуру, подобную ДабзСММ-р53, за исключением вирусного промотора Ноив-саркомь! и сОМА люциферазь, которье бьіли использовань! в его кассете зкспрессии.Аденовирус-рекомбинант,которьй несет ген

Е.соїї В -галактозидазь! (І ас), ЛазСМУ-І ас, имеет структуру, подобную АЯ5СММ-роіЗ3 и бьіл получен на оснований ис"педований Ог. Егапк Т., Сгапат ( См. Стапат, єї аї., 1991).

Вирусная биомасса, титр и инфицирование. Индивидуальнье клоньї АЯ5СММ-роз3, Аав/я5м/а12 и ДазсмуУ - І ас - вирусов бьіли полученьі путем обеззараживания бляшек (розеток) по методу Стапат 5 Ргемес (1991). Одиночнье вируснье клоньі бьіли воспроизведеньі в клетках 293. Культурная среда клеток 293, обнаруживающая законченньй цитопатогенньій зффект, бьіла собрана и центрифугирована при 1000 х д и течение 10мин. Собраннье надосадочнье массьї бьіли расслоеньі и размещень! для хранения при температуре -20"С в качестве штамма (биомассьї). Вирусньюе титрьі бьли определень в результате реакции розеткообразования (Стапйат апа Ргемгс,1991). Инфицирование клеточньїх линий бьіло произведено путем добавления вирусньїх растворов (0,5мл на 6бО0-миллиметровую чашку) к клеточньїм монослоям и создания условий инкубационного периода при комнатной температуре в течение 30 минут с кратковременньми встряхиваниями через каждье 5 минут. Зтот процесс сопровождался добавлением культурной средьі и возвращением инфицированньїх клеток в инкубатор при 3770.

Зффективность передачи гена аденовируса - рекомбинанта также бьіла исследована на примере использования

АазсмуУ - І ас7 в целом ряде клеточньїх линий, например Н226бВг, НЗ22, Нега, Нерсг, І М2 и Мею.С помощью окраски

Х-геля все клеточнье линии бьіли окрашень!: 97-10095 - в голубой цвет - после инфицирования АЯ5СМУ-Ї ас при МОЇ

ЗО РЕШ/клетка.

Примераі. Зкспрессия гена р53, направляемая ЛазсмуУ, в клетках рака легкого человека.

Зтот пример раскрьівает способ использования аденовируса - раком-бинанта ро53, с целью инфицирования клеток рака легких человека с помощью гомозигозного удаления гена р53. Результать! показьвают, что рост зтих клеток и зкспрессия мутанта р53 бьли подавленьі, обнаруживая потенциал вириона Аа;б5СмМУ-р5о3, проявляющего признаки агента, способного контролировать состояние метастатических клеток.

Монослои инфицированной клетки бьіли подвергнутьї иммуногистохимической обработке, которая заключалась в том, что зти слои бьіли зафиксировань 3,8- процентньмм формалином и обработань!ї З-процентньім НгО в метаноле в течение 5 минут. Иммуногистохимические анализьії били осуществленьі с использованием набора Месіавзіаіїп ЕЇйе (Месіог, Вигіпдате, СА). В качестве первичного антитела использовали антитело РАБ 1801 апії-р53 (Опсодепе 5сіепсе,

Маппаззеї, М4); МОРС-21 (Огдапоп Текпіса Согр., Мебзі СПевіеї, РА) использовался в качестве отрицательной контрольной группьі. В качестве второго антитела использовали амідіп - Іабеїед апіі-тоизе ІдСї (авидин-меченьй антимьшиньй иммуноглобулин С) (вектор). Віоїіпуїіагейд Погзегадізп регохідазе АВС сотрієх геадепі (комплексньй АВС реактив блотированной периксидазь! хрена) бьіл использован в качестве определителя антиген- антитело -комлекса.

Наконец, клетки после обесцвечивания препарата бьли докрашень! Наїтіз-гематоксилином (бідта) и установлень с помощью уплотняющего материала- Цитосила-60 (5іерпепв 5сієпійс, Вімегаа!є, МУ).

Иммуногистохимические анализьї инфицированньїх клеточньїх линий бьіли произведеньї с целью исследования зкспрессии іп віш зкспрессии р53, возбужденной промотором цитомегаловируса (СММ) вируса ДАБСММУ-р53.В клеточной линии НЗ58, которая имела гомозигозноє удаление р53, ген ро53 бьіл перенесен с зффективностью 97-100 90, как показали Иммуногистохимические анализьі, когда клетки били инфицированьі ЛЯАЗСМУМ - р53 при множественности инфицирования - 30-50 розетки-формирующих единиц ( РЕШ/клетка) (фиг.4).

Вьісокая зффективность переноса аденовируса-рекомбинанта бьла подтверждена АаЙ5СММ -іас2, вирусом, которьй несет ген І ас7, трансформированньй промотором ІЕ СММУ (цитомегаловируса) человека. При множественности инфицирования человека 30-50 РЕМШ/клетка все клетки подвергались исследованию, включая Неїа, Нер с2І/М2, и клеточнье линии рака М5СІ С человека показали 97-10095 позитивньій результат для БЬ-галактозидаза-активности, с помощью Х-гелевого окрашивания. Зти результать! указьівают на то, что аденовируснье векторь! представляют собой зффективное средство для доставки гена в раковне клетки человека.

МУезієт - блотирующие анализьї бьли осуществленьй на всех клеточньїх лизатах, приготовленньїх путем растворения клеток монослоев в чашках, с помощью буферного образца 505-РАСЕ (0,5мл на 6б0-миллиметровую чашку) после промьівания клеток фосфатно-солевь!м буферньїм раствором (РВ5). Для анализов 505-РАСЕ линии бьіли загружень! лизатами зквивалентно 5 х 107 клеткам (10-15мл). Протеинь! били перенесеньії к Нуропа ТМ-ЕСІ -мембране (Атеїтепат, Апіпдіоп Неїднів, І). Мембрань! бьіли заблокировань 0,595 сухим молоком в фосфатносолевом буферном растворе и проведеньй исследования с помощью первичньїх оантител: мьшиного античеловеческого р моноклонального антитела РАБЬ1801 и мьішиного античеловеческого -активного моноклонального антитела (Атегепат), промьїтьї и исследованьї с помощью вторичного антитела, а именно, кроличьего антимьішиного гаммаглобулина а, связанного пероксидазой хрена (Ппогзегадізпй регохідаєе- сопінайївй гаррії апітоизе Ідс) (Рієгсе СПпетіса!

Со. Росіїтога, и). Мембрань бьли разработаньй в соответствии с усиленньм хемилюминесцентньм протоколом.

Относительньюе количества зкзогенного р53 с вьураженной зкспрессией бьіли определеньі денситомером (МоіІесшаг

Ббупатісв Іпс.,иппумаїе, СА).

М/езіегп-блоть! показали что зкзогенньїй протейин р-53 проявил свою зкспрессию на вьісоких уровнях (Фиг.5А, полось 2,3 и 5,6).Пик протеина наблюдался на 3-й день после инфицирования(фиг.б6, внедрения от 0,5 дня до 3-х дней). В качестве контрольного злемента бьіл разработан вирион, структура которого напоминаєт рекомбинант АЯБСММ-роЗ3 по примеру 1. Вирион содержит СОМА-люциферазу, приведенную в активное состояние промотором ТА вируса Ноив- саркомь! в кассете зкспрессии вириона. Ни зкспрессии ро53, ни изменения в зкспрессии актина не бьіло обнаружено в клетках, инфицированньїх вирионом Ааз/А5М/І 2.

Аденовирус-рекомбинант бьіл использован для инфицирования трех линий рака легких МЗС С: - клеточной линии НЗ58, которая имеет гомозигозное удаление гена роз, - клеточной линии НЗ22, которая имеет точечную мутацию гена ро3 в кодоне 248 (от до Т), и - клеточной линии Н4бО, которая имеет природньй ген р53. Степень роста клеток М5СІС человека бьла определена, исходя из инокуляции НЗ22 и НАбО (1 х 105) или НЗ58 (2 х 1075) в 60-миллиметровьїх чашках за 24 часа до вирусного инфицирования. Клетки били инфицировань! вирусом при множественности инфицирования 10РЕШ//клетка.

Культурная среда бьла использована для контроля смоделированной инфекции. Матричнье культурь! каждой клеточной линии с различньіми видами обработки подсчитьівались ежедневно с 1-го по 6-й день после инфицирования.

Рост клеток НЗ58, инфицированньїх АЯ5СМУ-рзо3, бьіл значительно подавлен, по сравнению с неинфицированньіми клетками или с клетками, инфицированньіми контрольньім вирионом (фиг.7А). Рост клеток НЗ22 бьл также в большой степени подавлен вирионом роз (фиг.7В), тогда как клетки НібО рака легких человека, содержащие природньй рззЗ, бьіли подвергнуть! воздействию в меньшей степени (фиг.7С). Рост клеток НЗ58, инфицированньїх вирусом ЛЯЗСМУ-рзз, бьіл подавлен на 7995, в то время как неинфицированнье клетки или клетки, инфицированнье контрольньім вирусом, подавлень не бьіли. Рост клеточной линии НЗ22, которая имела точечную мутацию, бьіл подавлен на 7295 посредством давсму-р53, тогда как рост клеточной линии Н4іб60, содержащей природньй роі3, бьіл подавлен меньше (подавление роста составило 2895).Результать! указьвают на то, что аденовирус-рекомбинант обладает свойствами подавления роста злокачественньїх новообразований, благодаря восстановлению функций протеина р53 в клетках опрухолевьзх новообразований.

Пример5. Использование АЯБСММ-роз при лечений клеток с р5З-дефицитом.

Настоящий пример касается использования аденовируса-рекомбинанта р5о53 при восстановлениий функции подавления роста опухолевьх клеток іп міо и осуществления таким образом лечения заболеваний, связанньіх со злокачественньім или метастатическим ростом клеток.Он описьіваєт некоторье из способов по данному изобретению, которне предполагается использовать при лечениий рака с помощью аденовирусной генной терапии.

Клетки НЗ58 бьли инфицированьї Аа55СММ-ро3з и Ааб/А5мМИ12 при множественности инфицирования (т.о.1.) 1ОРЕШ/клетка. Одинаковое количество клеток било обработано средой, смоделированном п качестве инфекции. Через 24 часа после инфицирования обработанньсе клетки бьіли собраньі! и дваждь! промьітьї! фосфатно-солевьм буферньм раствором (РВ5). Для каждого из видов обработки три миллиона (3 х 102) клеток в обьеме 0,їмл бьли подкожно введеньї каждой из безволосьїх мьішей (Напап Со. Ноизюп ТХ). Для каждого из видов обработки бьіло использовано по особей. Мьіши бьли облученьі (З00с(су, Со) перед иньекцией и обследовались еженедельно после иньекции.

Опухолевье новообразования бьіли обнаружень! в конце шестинедельного периода, а обьем опухоли бьіл определен на основе использования модели сферь со средним диаметром опухоли, полученньм в виде корня квадратного из величиньї произведения диаметров поперечного сечения.

Чтобьі определить зффект подавления онкогенности с помощью да5сСммМ-ро53, безволосье мьши бьли инфицированьі подкожно клетками НЗ58 (клетка рака типа М5СІС человека), чтобь! вьзвать злокачественнье новообразования. Каждая мьшшь получила одну иньекцию клеток, которье бьіли инфицированьї АЯаб5 СММ-р53 или дабв/Ая5М/12 при 1О0РЕШ/клетка в течение 24 часов. Клетки НЗ58, обработаннье только средой, бьіли использовань в качестве контрольньїх с ложньим инфицированием. Опухоли, которье первоначально прощупьівались, на 14-й день после иньекции бьіли индуцированьї только смоделированньіми или контрольньіми вирус-инфицированньіми клетками, как показано в табл.1.

Таблица!.

Воздействие ЛЯСМУ-р53 на онкогенность НЗ58 в безволосьїх мьішах о о АЯБОММ-рІУ | 04077711 а Обработаннье клетки НЗ58 бьли введень! внутримьшечно в 2 х 109 клетки/одна особь. Размерь опухоли бьіли определень! в конце б-недельного периода.

Как показано в таблице1, у мьішей, которье получили клетки, обработаннье АазхсСмМУ-ро53, опухолевье новообразования не развивались. Опухоли в конце б-недельного периода имели 4-5 мм в диаметре. Зто исследование начиналось с 5-ю особями на группу. Одна мьішь в каждой из групп исследований с Да5СМУ- роЗ или АабБ/А5М/212 не участвовала и не смогла завершить цикл исследований. Ранние смерти наступили, предположительно, от нозокомиальной инфекции.

Примерб. Аа5СММ-р5з в лечениий рака легких.

Настоящий пример касаєтся использования аденовируса рекомбинанта р53 для восстановления функции подавления роста клеток новообразований іп умімо и лечения таким образом злокачественньїх опухолей у животньїх.На данном примере наблюдаются несколько путей осуществления изобретения, с целью его использования для лечения рака методом генной терапии, использующей аденовирус в качестве промежуточного звена - посредника.

Зффективность АЯБСММ-ро3 для подавления онкогенности бьіла повторно доказана на моішиной модели ортотопического рака легких человека"Поскольку клетки НЗ58 и НЗ22 в данной модели не вьізьівают опухолевьїх новообразований, в исследований использовалась клеточная линия Н226Вг. Зта клеточная линия имела происхождение от сквамозного рака легких и метастазировала от легкого до мозга.Н226Вг имеет точечную мутацию (от АТС до СТО) в зкзоне 7, кодона 254, гена р53 и является онкогенной в организме

МЬІшШИ.

Процедура тестирования в мьішиной модели ортотопического рака легких человека ранеє уже бьла описана (Согдев, єї аі.,1993).В двух словах, безволосье мьіши бьіли предварительно облученьі (300 с Су 60

Со), после зтого привить! внутритрахеальной инсталляцией клеток Н226Вг. Каждая мьішь получила 2 х 105 клеток в обьееме 0їмл РВ5 (фосфатно-солевого буферного раствора). Через три дня после прививки 10 мьшей на группу обрабатьвшались О,мл вируса или средь-носителя ( РВ5) путем внутритрахеальной инстилляции 1 раз в день в течение двух дней. Использовалась дозировка вируса Ааз5СмММ-ро3 или даБ/В5М/Иа - 5 х 107 на одну особь. Мьіши бьіли умерщвлень! в конце б-недельного периода. Опухолевье новообразования бьли изученьь следующим образом. Ткани легкого и средостения бьли иссечень! и определеньі размерь опухоли. Новообразования бьли подтверждень! гистологическими анализами иссечения опухолевой массь.

Облученнье безволосье мьши бьли привитьь клетками Н226Вг -2 х 106 на одну особь путем внутритрахеальной инстилляции. Через три дня после прививки каждая из мьішей (8-10 мьішей на группу) прививались 0,їмл или Дахз5СМУ-р5, или даз/А5М/с12, или носителем (РВ5) (фосфатно-солевьмм буферньім раствором) путем внутритрахеальной инстилляции один раз в день в течение двух дней. Дозировка вируса составляла 5 х 107 (РЕШУ/ на мьішь. Опухолевьсе новообразования бьіли исследовань! в конце б-недельного периода путем иссечения тканей легкого и средостения и определеньі размерь! опухолей. Схема процедурь! исследования показана на фиг.7 с представлением образцов иссечения на фиг.8. Обнаруженнье опухоли бьіли подтверждень гистологическими анализами. Даннье измерений опухолей представлень в таблицег.

Таблица?г.

Воздействие АЯ5СММУ-роЗ3 на онкогенность Н226Вг в мьшиной модели ортотопического рака легких человека" опухолями/общее число мьішей (90 а Мьіши бьгли привить 2х109 Н226Вг клетками/мьшь внутритрахеально.

На 3-й день после прививки мьішам внутритрахеально вводили или среду-носитель, или вирусь (5 х 107 каждого состава в 0,1мл) один раз в день в течение двух дней. Анализ опухолевого новообразования бьл проведен в конце б-недельного периода. ь При сравнениий с группами, получившими носитель (РВ5 -фосфатно-солевую буферную жидкость), или с контрольной группой вируса, двумя типами анализов бьіло установлено несоответствиє, равное р«е0,005.

Только 25 95 мьішей, обработанньх Даз5хСММ-ро3, получили сформировавшиеся опухоли, тогда как в группе мьішей, обработанньїх носителем или Ааз/А5М/а1 2 (контрольная группа) опухоли получили 70 - 8095 инфициованньх мьішей. Средний размер опухоли для группьї АЯ5СМУМ-р53 бьіл значительно меньше, чем для контрольньїх групп. Зти результатьі указьвают на то, что АДа5СММУ-ро53 может предохранить Н226Вг от формирования опухолевьх новообразований в мьішиной модели ортотопического рака легких человека.

Пример7. Синергизм между ро3 поражающим ОМА действием.

Биохимической характеристикой запрограммированного умерщвления (апоптоза) является появление характерного изображения фрагментов ОМА, полученньх в результате дробления я ядерной ОМА. Последние исследования продемонстрировали, что возникновениє оапоптоза в результате воздействия химиотерапевтических лекарственньїх средств и ионизирующей радиации может иметь отношение к статусу гена р53 и к тому факту, что поражающие ЮМА стимуляторь! способньі повьісить внутриклеточнье уровни протеина ро53 в клетках, что имеет место в процессе апоптоза (І омє, єї аі.,1993;Сіагке, еї а1і.,1993;Епївспе,еї аІ.,1993; Нагрег, еї а1!.,1993;Е!І-Овєїгу, єї аІ.,1993). Подавление цикла клетки в фазе С 1 за счет роста уровней природного протеина м-ро53 обеспечиваєет увеличение промежутка времени для ОМА-восстановления; если оптимальное восстановление невозможно, ро3 может инициировать программу умерщвления клетки. Таким образом, ро53З может способствовать возникновению апоптической гибели клетки, вьзванной химиотерапевтическими агентами.

Инактивация гена р53 за счет миссенс-мутации или дилеции является найболее распространенной генетической альтерацией при раковьїх заболеваниях человека (Іеміпе, єї аї.,1991;НоїЇвієїп, еї аї1.,1991).

Утрата р53 функции явилась результатом усиления устойчивости клетки к воздействию многообразия химиотерапевтических агентов (ІГоме еї аі!.,1993). Исследования изобретателей показали, что при М5СІ С- разновидности рака легких человека клетки НЗ58, в которьїх стираются оба аллельньїх гена ро53, бьли устойчивь! к воздействию химиотерапевтических лекарственньх средств, тогда как клеточная линия МТН 226

Ь, имеющая зндогенньй ул-ро3, продемонстрировала апоптическую гибель уже через 16 часов после лечения цисплатином (СОЮОР) и зтопозидом (МР-16) (Т.ЕРцімага, Е.Сітт, Т.Микпораадпуау, 9.А.Воїй, дата не публикуется). Позтому изобретатели поставили задачу определить, способно ли введение гена м-ро3 в клетку НЗ58, с помощью аденовирусного вектора, повьісить чувствительность клетки к агентам СООР, образующим поперечньсе связи с ОМА, іп мімо и іп міїго.

Материаль и способь!

Клетки НЗ58 бьіли поставлень А.Салгааг 8 9У.Міппа (Такапавні, єї аі.,1989).

Аденовирусньсе векторь

Структура и способ идентификации вектора аденовируса-рекомбинанта, содержащего сОМА, кодирующую человеческий уї-р53 (Аа-р53) или люциферазу (Ай- ис) бьли описаньі раНеє(7Ппапод, єї а!.,1993).Вкратце охарактеризуем способ получения.Кассета озкспрессии р53, содержащая промотор человеческого вируса цитомегалиий ул-р5З3 сОМА и ранний сигнал полиаденилации 5М40, бьіла вставлена в промежуток между Храі и Сіа! положениями рХС.І. Челночньій вектор р53 и рекомбинантньй плазмид рУМ17 бьли перенесеньй в клетки 293 (Адб-трансформиро ванная клеточная линия, взятая из почки человеческого змбриона) с помощью оспособа, включающего использование липосомь в качестве промежуточного звена. Культура надосадочньх клеток 293, демонстрирующая полньй цитопатический зффект, бьіла собрана и использована в последующем в качестве инфицирующего средства. Контрольньй вирус Ай-Гис бьл получен таким же способом. Вирусьї АЯ-р53 и Ай-їис бьли внедрень! в клетки 293.

Присутствие вируса, ответственного за репликацию, бьло исключено в результате опьтов на клетках

Неїа.Вирусньсе титрь бьіли определень! в результате реакции розеткообразования (Стгапат,. єї аї., 1991).

Обнаружение нуклеосомального разрушения ОМА

ОМА бьла изолирована от родительской, Аа-І ис-инфицированной и Аа-р5З-инфицированной клеток, которне подвергались или не подвергались обработке СООР, путем вьідерживания клеток при 55"С в течение б часов в лизисном буферном растворе (50мМ Триз-НСЇ, рН 8,0;100мМ ЕОТА, 100мМ Масі; 195505 и думл протеиназьі К).ОМА бьїла зкстрагирована дваждьі! с одинаковьиіми обьемами фенола и один раз с хлороформньм изоамиловьм спиртом (24:1), после чего осаждена в зтиноле. Образць! бьіли подвержень! обработке злектрофорезом на 1,5956-ном геле агарозьї, а затем проявленьі путем окрашивания бромидом зтильного соединения (еїпідійт рготіаде).

Пометка и маркировка ДОТР с промежуточньм звеном ТаТ бьли осуществлень! в соответствии с процессом, описанньїм ранее (Самгів!її єї аІ.,1992). Мономолекулярньсе клетки бьіли обработаньі 0,0195 МР-40.

Предметньсе стекла бьіли погружень! в буферньій раствор тат (з0мМ Триз-НСЇ, рн7, 2; 140мМ кокадилата натрия;їїмМ хлорида кобальта) и помещеньї в инкубатор с обработанньм ЯОТР витамином Н(биотином) (Военгіпдег Маппєїт, Іпаїіапароїїв, ІМ) и тат при 37"С на 45 минут. Предметнье стекла бьіли покрьїть! 295 бьічим сьівороточньмм альбумином на 1Омин. и помещеньі в инкубатор с авидино-биотиновьім комплексом (Месіазіаіп Еїйе Кії; Месіог І арогаюгіез, Випіпдате, С А) на 30 минут. Колорометрическое определение бьло вьіполнено с использованием диамино-бензидина.

Результать

Клетки НЗ58 бьіли преобразовань іп міго с помощью СОМА человеческого мі-р53 путем воздействия на них Аа-ро53.Анализь! УУезігп - блотирования показали вьісокий уровень зкспрессии протеина мі-ро3 сразу через 24 часа после инфицирования Айа-р53. Однако мі-р53 не бьл обнаружен ни в родительских клетках (необработанньх), ни в контрольньїх клетках, инфицированньх Аа-І ис (даннье не показаньї). Сопутствующая исследованиям иммунногистологическая зкспертиза продемонстрировала обнаруживаємьй протеин УЛ-5З3 более чем в 8095 инфицированньмх клеток, доказьівая, что перенос и проявление зкспрессии ро53 с помощью да-роз в вьісокой степени зффективнь! (данньсєе не показань).

Непрерьівная обработка клеток НЗ58, инфицированньїх Аа-р53, с помощью СОЮОР бьістро снижала их жизнеспособность, в то время, как гибель значительного количества родительских клеток и клеток, инфицированньїх Ай-Іис наступала после 72 часов обработки с помощью СООР (фиг10А). Потеря жизнеспособности очень возрастала в клетках, преобразованньїх с помощью Аа-р53. Более того, снижение жизнеспособности можно бьіло также наблюдать даже тогда, когда клетки находились в среде, свободной от лекарственньїх средств, после 24-часового на них воздействия, подтверждая тот факт, что летальное поражающее воздействие продолжалось в течение 24 часов (фиг.108). Чувствительность клеток НЗ58, преобразованньїх ум-ро3, к воздействию СОЮОР зависела от дозировки (фиг.10С).

Интернуклеосомальная лесенка ( по типу спустившейся петли) ОМА, указьвающая на разрушение ОМА, бьіла видна в клетках, обнаруживающих проявление зкспрессии м-роЗ после 24 часов воздействия СОЮР, однако родительские и Ай-І ис-инфицированньюе клетки разрушения ЮМА не показали (фиг.1А). Концевье метки ника (разрьіва одной внутренней фосфодизфирной связи в двунитевой ОМА) биотин-трифосфат (средняя соль ортофосфорной кислоть)( ЯОТР)-2 -деоксиридина - 5 с промежуточньм звеном концевой диоксинуклеотидил - трансферазь! (тат), которая (метка) указьіваєт на разрушение ОМА іп зіш в результате апоптоза, виявила много апоптических клеток среди Аа-р3З-инфицированньх клеток, обработанньїх СООР, в течение 24 часов, как показано на фиг. С, которая демонстрируєет окрашеннье в темньійй цвет ядра и ядернье-фрагменть, что отсутствует на фиг. 118 - Р.

Известньії способь! введения уї-ро3 с целью инициирования апоптоза в некоторьїх видах опухолевьх клеточньїх линий со стертьім или мутированньїм ро53 (Уопізп-Ноцасі еї а/.,1991;5Наму єї а/!.,1992; Ватаміві єї аі.,1993). Однако чрезмерная зкспрессия ул-ро3 сама по себе не может привести к разрушению ОМА в ро53- отрицательной клеточной линии НЗ58 (фиг.11), хотя их рост и подавляется Аа-ро3 фиг.10). Зто совместимо с предьддущими наблюдениями изобретателей, показьівающими, что стабильнье клоньї НЗ58 могут бьть полученьі после переноса мі-р53 с промежуточньвмм звеном ретровируса, и что зти клоньі растут гораздо медленнее, чем родительские клетки(Са!, еї аІ.,1993).

Потенциальная терапевтическая зффективность комбинаций Аа-р53 с. СООР бьіла обнаружена в сроки относительного изменения в обьеме сфероидов НЗ58. Модель сфероида многоклеточной опухоли показьювает іп міго гистологическую структуру, похожую на ту, которую имеет опухоль на первоначальной стадии и на стадиий микрометастазь. Лечение с помощью СООР вьїзьвшало уменьшение относительного обьема в количестве сферидов, инфицированньхх Аа-ро53, но не оказьвало ощутимого влияния на родительские или Аа-І ис -инфицированньое сфероидь! (фиг.12А). Іп вйш маркировка ФОТР с промежуточнь!м звеном ТаТ . показала множество клеток, находящихся в состояниий апоптоза на поверхности Аа-ро53- инфицированньїх сферидов, в то время как апоптические клетки отсутствовали на сфероидах, не инфицированньїх Аа-р53 (фиг.128-Е). Изобретатели и ранее сообщали о том, что зкспрессия мі-ро3 с промежуточньм звеном ретровируса подавляла рост сфероидов НЗ22а, благодаря трансформированию фактора роста (ТОв-У) (Риімага,єї а1І.,1993). Однако ретровирусньй вектор не может инфицировать сфероидьі НЗ58, так как клетки зтих сфероидов бьістро не разрастаются в ответ на зкзогенньій ТаБ- а «Обнаружение того факта, что воздействие СОР уменьшаєт размерь! сфероидов НЗ58, инфицированньйх Аа- розЗ,благодаря инициированию апоптоза,наводит на мьісль, что Аа-ро3 инфицирует неразрушающиеся клетки и что СООР инициирует процесс апоптоза в бессимптомньх (скрьітьзх) клетках.

Примерв. Использование р53 и поражающих ОМА агентов в лечебньх схемах.

Естественно, что модели лечения, разработаннье для животньїх, должньі применяться как часть исследований, предшествующих клиническим назначениям, как показано на примерах 5,6,7. Позтому больньюе, которьмм бьло установлено показание на лечение с помощью переноса гена посредством аденовируса, могут бьть исследованьі на присутствие антител, действие которьїх направлено против аденовируса. При наличии антител и при установившейся аллергической реакции больного на какие-либо фармакологические или естественнье средства, может бьіть назначено применение опьітньїх доз порядка от 103 до 106 аденовируса рекомбинанта под пристальнь!м клиническим наблюдениеєм.

Для назначения человеку при лечении рака с использованием Аа5СММ-ро3 аденовирус-рекомбинант, проявляющий зкспрессию р5оЗ под контролем соответствующих промоторов/усиливающих злементов, например промотора СММ(цитомегаловируса), должен бьіть приготовлен и обеззаражен, в соответствии с методикой, одобренной организацией по надзору за продуктами питания и лекарственньми средствами (ЕВА). Такая методика включаєт, но не ограничиваєтся, центрифугирование в градиенте плотности хлорида цезия с последующими испьттаниями на зффективность и чистоту.

Сложилось мнение, что существует два способа лечения с помощью аденовируса р53, непосредственное или локальное назначение или более общее лечение. Даннье методь! дают результать! только при лечений многообразия злокачественньїх опухолей, которье известньь как имеющие отношение к р5З-мутациям.Что касаєтся общего лечения, то, как бьло доказано на опьжтах, достаточно обькновенной внутривенной иньекции, чтобьї инфицировать введенньїм вирусом ткани, расположеннье на расстоянийи от места введения лекарства (Зігайога -Регпісацдеї еї а1.,19915). Таким образом, вирусное инфицирование с помощью внутривенной иньекции можно рассматривать как способ, удобньй для лечения всех злокачественньх опухолей, имеющих отношение к р53. Вирус может бьіть назначен больньїм как внутривенно в виде любого фармакологически допустимого раствора так и в виде инфузий в течение какого-то промежутка времени.

Откровенно говоря, существует глубокое убеждение в том, что для получения ожидаемого зффекта, количество назначенньїх действующих вирусньїх частиц должно бьіть порядка от 1 х 1019 до 5 х 1012,

Кроме того, там где речь идет о раке легких, при желании, может бьіть использован метод более прямого физического воздействия аденовирусарекомбинанта на клетки-мишени, аналогичньій внутритрахеальному назначению регулятора трансмембранной проводимости при фибрознокистозной дегенерации (Нозепієїй єї аі.,1992). Результатом такого метода может бьіть доставка аденовируса-рекомбинанта р53 поближе к тому месту, где концентрируются клетки мишени.

Методь!

Маркировка іп зйи ЯОТР с промежуточньїм звеном тат для определения апоптоза. Сфероидьі НЗ58 бьіли зафиксированьй на третий день и окрашень, как описано в примере 7. Маркированньюе пробь тат приводились в контакт с предметньім стеклом, погруженньмм в буферньій раствор тат и вьідерживались в инкубаторе с ДОТР и тат, обработанньми биотипом, при 37"С в течение 45 минут. Предметнье стекла покрьівались 295 бьічьим сьівороточньім альбумином на 10 минут и помещались в инкубатор (вниращивались) с авидин-биотиновьмм о раствором на 30 минут. Колорометрическое определениеє проводилось с использованием диамино-бензидина.

Инициирование апоптоза с помощью СОР после Аа-ро53 инфицирования іп мімо.

Клетки НЗ58 (5 х 105) в 0,1мл сбалансированного солевого раствора НапкК вводились в правьй бок ВАЇ В/с женской особи пи/пи безволосьх мьшей. Через тридцать дней 200 п однородной средь или среда, содержащая Аа-І ис(108 РЕШ/мл) или Аа-рб5З3 (108РЕШ/мл) бьіла введена в раковую опухоль диаметром от 5 до бмм. Внутриопухолевая иньекция (100 л ) и околоопухолевая иньекция в двух противоположньїх зонах

(Бо л каждая).СООР(Змг/кг) или контрольньій физиологический раствор бьіли введень интерперитонеально.

Обьем опухоли (А) меняется. Опухоли бьіли измереньі циркулем по двум перпендикулярньім диаметрам без учета отношения к лечебной группе, а обьем опухоли бьіл рассчитан по модели со сферической формой со средним диаметром опухоли, расчитанньім как корень квадратньйй из произведения диаметров поперечньх сечений. Пять особей мьішей бьіли использованьї для формирования каждой лечебной группьї, и показано среднее значение 4л/-5Е.Даннье бьли проанализированьй с использованием бішаєпів5 і-(еві. Стрелка указьіваєт на день лечения. Представлень! два независимьїх обозначения: р«е0,05 на 5-ьій день в опьте 1; р-е0,05 на 7-ой день в опьіте 2. Гистологическое исследование бьіло проведено с использованием технологий маркировки биотином-4ОТР с промежуточньм звеном ТатТ. Опухоли снимались через 5 дней от начала лечения и сразу же помещались в состав О.С.Т.. Образць! толщиной Б м иссекались в в замороженньмх тканях в криостате. Иссечения обрабатьівались 1 протеиназьі К и окрашивались по методике, описанной вьіше. Животнье содержались в соответствии с требованиями ОТ М.О. Апаєгзоп Іпзійшіопаї! Апітаї!

Саге 8 Озе Соттіцевє.

Результать

Чтобьї продемонстрировать іп мімо зффективность методов и композиций, а именно зффективность обьединения терапии, основанной на переносе гена, с химиотерапией при лечениий рака человека, изобретатели исследовали вопрос, может ли бьіть вьізван апоптоз іп мімо при последовательном введений да-рб53 и СООР. Через три дня после прямого внутриопухолевого введения Аа-ро53 или интерперитонеального введения СОЮОР опухолевье клетки бьіли имплантированьі подкожно в организм пи/пи мьішей и результать показали скромньсе результать! замедления роста. Однако, в тех случаях, когда Аа-р53 и СООР бьіли введень одновременно, раковье опухоли частично регрессировали, а размерь опухоли оставались статистически значительно меньше, чем размерь для любьх других лечебньїх групп. . Зффект подавления роста бьл даже более оощутим после двух лечебньх циклов (фиг.13А). Гистологические исследования вьявили массированное разрушение раковьїх клеток в зоне организма мьіши, пролеченной СООР, куда бьіл введен Аа- роЗз.Окрашивание іп зіш продемонстрировало много погибших клеток вкруг межклеточньїх пространств (фиг. 13А - Е). По контрасту с изложенньім, раковье клетки, обработаннье только СООР или только Аа-рз3, не показали ни апоптических зон, ни зон межклеточньїх пространств, окруженньїх погибшими клетками.

Более подробно предпочтительнье протокольй лечения могут бьть разработань в соответствии со следующим алгоритмом. Вначале больной может бьть подвергнут бронхоскопии для вьяснения степени поражения. Методом зндоскопии одолжна бьть извлечена как можно большая часть опухоли.

Предварительная бронхоскопия должна проводиться под местньі!м или общим наркозом. Трансбронхиальная аспирационная игла (219) ЗБшШсог" (с жестким сердечником) должна бьіть проделана в биопсийньійй канал бронхоскспа. К сохранившимся участкам опухоли затем может бьть подведен мальй обьем аденовируса ро53 в количестве 10мл или меньше.

В любом случає, если даже примененного аденовируса окажется недостаточно для возникновения репликационного зффекта, сам по себе вирус на организм человека никакого пагубного воздействия не окажет. Тем не менее, больньіе во время лечения должнь! находиться в стационаре, по меньшей мере, в течение 48 часов для наблюдения за возможньм возникновением острой или отдаленной во времени побочной реакции.Хотя вопросу зффективного и безопасного применения аденовируса с дефицитом репликации в качестве носителя при переносе гена в человеческом организме бьіло уделено внимание в прошлом (Розепгеїйа еї а!., 1992, УЧаНе еї аІ.,1992), дозировка аденовируса, назначаемая для ввода в организм должна серьезно исследоваться, с целью дальнейшего уменьшения возможностей возникновения побочньх зффектов.

Существуют различнье критерии, которне следует принимать во внимание при оценках существования необходимости в ответной реакции и существования токсичности. Для решения вопроса определения токсичности, прежде чем приступить к курсу терапевтического лечения, следует сфотографировать ложе опухоли, измерить ее наибольший диаметр и перпендикуляр. Размер опухоли определяєтся как произведение диаметров. Имея зти даннье, можно рассчитать степень рецедива опухоли.

Время до прогрессирования в развитий болезни может бьть также измерено, начиная от первого обследования с обнаружением уменьшения опухолевой массьй до появления очевидньїх признаков прогрессирования. Прогрессированиеє в развитиий болезни определяєтся как увеличение на 2 25 95 суммь произведений диаметров измеренньїх новообразований.Больной должен пройти, по крайней мере, два курса терапевтического лечения, прежде чем появятся показания на Прогрессирование болезни. Наблюдения над больньїми должнь оцениваться с момента занесения в протокол (историю болезни).

Последующие исследования должнь! включать все действия (назначения) терапевтического лечения рака, включая определениеє клинических анализов и взятие биопсий для стандартньх и молекулярньх биологических анализов, в которьїх может бьіть исследована структура зкспрессии различньх генов р53. Зти анализьі могут также представить даннье о количестве клеток, которние восприняли перенесенньй ген, а такюке об относительной зффективности просмотра іп мімо. Основьіваясь на полученньх данньмх, могут бьть внесеньії нужнье корректировки в ход лечения. Зти корректировки могут включать структурь! аденовируса, которье используют различнье промоторь или изменения в количестве РЕО (множественности инфицирования), введенньїх с целью обеспечения уверенности в том, что инфицировань все или большинство клеток опухолей без нефизиологической чрезмерной зкспрессии рекомбинантньх генов.

Установлено, что зкспрессия зкзогенньх генов, перенесенньх іп мімо аденовирусами, может существовать в течение продолжительного времени. Терапевтически зффективная, продолжительная во времени зкспрессия зкзогенньїх генов, переносимьїх вирусами, должна бьїть направлена на больного организмом (природой) самого больного. Геньі-маркерьї ограниченьь в своем влияниий определением терапевтически релевантной продолжительности зкспрессии гена, так как уровни зкспрессии, необходимьсе для исправления любого конкретного генетического нарушения, значительно отличаются от уровня, требуемого для комплексного лечения другого заболевания.

Хотя композиции и способьї по данному изобретению бьли описаньі, ссьлаясь на предпочтительнье примерь! осуществления, специалистам, имеющим опьїт в данной области знаний, совершенно очевидно, что возможнь вариантьй в композициях и способах, а также в приемах или в последовательности приемов способов, описанньїх вьіше, без отступления от сущности, изложенной в формуле изобретения. Более конкретно, из данного описания изобретения вьітекаєт, что определеннье агенть!, которье могут иметь как химическую, так и физиологическую природу, заменяются агентами, описанньми в данном изобретений и проявляющими идентичньїй или похожий зффект. Все подобнье замещения должнь! бьіть в рамках признаков формульі изобретения. Все защищеннье формулой изобретения композиции и способь могут бьть осуществлень без дополнительньїх зкспериментальньх исследований.

Перечень использованой литературь!.

Представленньій перечень ссьілок охватьяваєт технический уровень, использованньій изобретателями при созданий изобретения. Информация, представленная в перечне, приведена в качестве аргументации при обоснованиях существенности признаков изобретения.

Вагдопеїцї, єї а!. (1991) СеїІ 65:1083-1091. Візпор (1987) бсієпсе 235:305-311.

Военегіпдег Маппнєїп Віоспетісаїє (1992). Мспользование ООТАР для осуществления вьісокозффективньїх трансфекций. ВМВіоспетіса 9 (1):17.

Возпаїї, М.еї а! (1985). Очень зффективньй усилитель располагается вверх по ходу перемещения самого раннего гена цитомегаловируса человека. Сеї|, 41:521-530.

Саї,О.Му., Микпораднуау,Т., Піш,Т., Еціїмага, Воїй, 9У.А. Стабильная зкспрессия природного гена р53 в клетках рака легких человека после трансфекций гена, с промежуточньм звеном ретровируса.:Ншпап Сепе

Тнег, 4:617-624,1993.

Симег, КМУ., Ват,2., УМаїІргпаде, 5., Івпії,Н., Оіайейа, Е.Н., « Віаезе, В.М. Переносчик гена іп мімо с клетками ретровирусного вектора-генератора для лечения злокачественньїх опухолей мозга в условиях зксперимента.

Зсієпсе, 256:1550-1552,1992.

Сазеу, С. І о-Ниєй, М., Горе, М.Е.,Моде!5івїп,В,.5 апргідде, Е.Ц1991).

Подавление роста клеток рака груди путем внедрения природного гена р53.Опсодепе 6:1791-1797.

Сіагке, А.В., Ригаїє, С.А., Наїтізоп, О.9., Моїті5, В.С, Віга, С.С., Ноорег, М.Г., апа Умуїїє, А.Н. Тнутосуїє апоптоз, вьізванньій ро3-зависимьїм и независимь!м пробегами.Майшге,362:849-852, 1993. раї, еї аІ.(1992) Ргос. Май. Асад. 5сі.89:10892-10895.

Осуе,.А. Механизмь сопротивляемости клеток рака легких человека воздействию лекарственньмх средств. ЗХетіпОпсо!,20:326-337,1993.

ЕІ-Овігу, М.5.9УоКіпо, Т.,МеІсшезси,М.Е., І ему, О.В., Реггопв,К, Тгепі, У.М., ІП іп,О., Мегсег, Е.,

КіплЛег, К.МУ., апа Моде!вієїп, В.

МАНІ - потенциальньй посредник гена ро53 при подавлений раковьїх клеток.Се11,75: 817-825, 1993.

Епіспе, М., Наєзвзієг, С., апа Вгапаєг,й. Возбуждение процесса ядерного накапливания протеина роз - супрессора злокачественного новообразования - поражающими ОМА агентами. Опсодепе, 8 : 307-318,1993.

РієїЇдз єї аІ.(1990) 5сієпсе 249:1046-1049.

Ецімага, Т., Сгітт, Е.А., Микпорааднуау, Т., Саії, О.М. Омеп-5спаиб,!І.В..апа Воїй, 9.А. Ретровирусньй природньй вектор, вьіІзьвающий зкспрессию ро5з3, проникает в сфероидь! рака легких человека и подавляет их рост, инициируя апоптоз. Сапсег Нев, 53: 4129-4133,1993.

Самтгівєїїї, М., ЗПпегптап,м., 5 Веп-Завзвоп, 5.А. Идентификация запрограммированной гибели клетки іп 5іш посредством специального маркирования фрагментации ядерной ОМА. . Сеї| Вісоі,! 19:493-501,1992

Сеогдез сеї аІ(1993) Сапсег Нев 53:1743-1746. сови - Споцанпигу апа Стапат (1982) Віоспет.Віорнуз. Нез5.Сотт. 147:964-973.

СПи2тап и другие (1982) в разработке звкариотических вирусньїх векторов (Сій2тап,У.,Еа.) рр.!І87- 192, Соїа 5ргіпд Нартог Ргев5, Соїа 5ргіпд Нагброг, Мем МХогк.

Стапат, Р.Ї. 45 А). мап дег ЕБ.(1973) Новая технология проведения исследований способности к инфицированию ДНК -5 аденовируса человека. МігоІоду 52:456-467.

Стапат, РБ.Г., Ргемес,)ї. Манипулирование аденовирусньми векторами.Іп: Мигтау Е.).(е9.),Способрі в молекулярной биологии, перенос генов и протоколь! зкспрессии.стр. 109-128.Меж дегзеу:Тпе Нитапа Ргев5

Іпс, 1991.

Стапат, Р... У.Зтіїєу, УМ.Сб. А!йвзєї 4 В.Маїтп (1977).Характеристики клеточньїх линий человека, трансформированньх ДНК из человеческого аденовируса типа 5.).Сеп Міго!. 36:59-72.

Спиппацв, А. 5 Ногпміїх, М.5.(1992) Аденовирусьї, используемье в качестве клональньх векторов. бЗетіп.

Мігоїоду 3:237 - 2542.

Нагрег, 9.Е., Адаті, С.А., МУвї, М., Кеуотагві, К.,х ЕПедде, 5.уУ. Р21 Сак- взаимодействующий протеийн Сірі - потенциальное средство подавления СіІ-циклин-зависимой киназь!. Сеїї, 75: 805-806, 1993.

Ноїївієїп, М., бійгапеку, О., Модеївієїп, В.,5 Наїтії, С (1991).Мутации ро53 в человеческих раковьх новообразованиях. бсієпсе 253:49-53.

Уане еї а!..(1992) Нашге Сепеїйсз 1:372 - 378. І е Саї єї а!., (1993) бсієпсе 259:988-990. І едієу, 9. (1987).

Реадіанісв 110,1.

І еміпе, А.)., Мотапа, 9., апа Ріпіау, С.А. Ген р53- супрессор злокачественньїх новообразований.

Машге,351:453-456,1991.

ІГоме, 5.МУ., Виїеу, Н.Е., Ччаске, Т., 5 Ноизтап, О.Е. Р5З-зависимьйй апоптоз модулирует цитотоксичность противоопухолевьїх агентов. Се11,74:957-967,1993.

Гоме, 5.ММ., Зспптй, Е.М,, тій, 5.МУ., У5роге, В. А., 5 Часк, Т. Р5З требуется для того, чтобь! вьізвать радиационно-инициируєемьїй апоптоз в (путосуїез мьішей.КаШге,362:847-849,1993.

МесСгогу, УМ.У. еї а). (1988) Простой способ исправления ранних мутаций зонь инфекционньх человеческих аденовирусов типа 5. Мігоїоду 163:614-617.

Меггзег, М.Е.(1992). Регулирование клеточного цикла и протеин р53 - супрессор роста злокачественного новообразования. Стпійс.Нему.Еисаг. Сбепе Ехргев55.2:251-263.

Мівїт, еї аІ.(1992) ЕМВО 11:5013-5020. МіПег 1992,Сшт. Тор.Мосі) іоІ.Іттипої. 158:1

Мопіепагт, М.(1992). Биохимические, иммунологические и функциональнье аспектьї супрессоров роста/онкопротеинов р53.Стіс.гем.Опсо. 3:233-256.

Мипідап, (1993), Зсіепсе 260-926.

Місоїацч,С, еї аІ.(1993).Ргос. Маї). Асад.Зсі. О.5.А. 80,1068.

Вадої! єї а!., (1993)Машге,361:647-650.

Ватаміві, Т., Мадпивзоп, К.Р., ММапо, М., 52екКеїеу, І.., б Кієїп, О.

Природньй ро5З инициирует апоптоз в линии Вигкій (ВІ) - лимфомь!, которая несет мутированньй р53. Опсодепе, 8:1495-1500,1993.

Возепієїа еї а!., (1991) бсіеєпсе,232:431-434. Нозепієїа еї а1.. (1992) СеїІ 68:143-155.

Воїн, у, Вискаєзспеї, Мєізепригдег, Еаїйюгє, Тнпогасіс Опсоіоду, Первое издание, глава 49,стр.711-721,

ЗАпаеєгв, Мем Моїк, 1989.

Зпаму, єї аі., 89:4495-4499. -

Зрапаїдоз, еї а1.. (1989), У.Раїйпої., 157:1-10.

Земаї еї а!., 1992,Нит. Сепе Тег. 3:267.

Зіганога-Ре!тісацавеї, І. 5 Регпісацаєї (1991а) Перенос гена в организме животньїх: надеждь, связаннье с использованием аденовирусов.р.51-61.т О.Сопеп-Надиепацег 5 Воїгоп (Едз), Перенос человеческого гена,

Еайіоп5 Чопп Гірбеу Еигоїехі, Егапсе.

Зіганога - Регісацавеї еї а!..(19916) Нит.сСепе. Тег. 1:241-256

Такапавні, Т., Най, М.М., Співра,!., Вітег, М.9., Возепрего, А.К., Міпосоицг, М., І емійй, М., Равв, Н., Салааг,

А.Р., 5 Міппа, 9.0. РБ5З: -Часто встречающаяся "мишень " для генетических нарушений в раковьх клетках при раке легких у человека.бБіІепсе,246:491-494, 1989.

Такапавні, Т.,Сатбопе, О.,Таканазпі, Т.,Мацм, М.М., Ніда,Т., І Іппойа, І., Оеда, А. Міппа, 9.0. (1992)

Природньй рбі3, но не мутант рб53, подавляєт рост клеток рака легких, характеризующихся множественньіми генетическими дефектами. 1992.Сапсег Вев. 52:2340-2342.

Тоога, 1.(1981).Молекулярная биология вирусов ДНК новообразований, 2 - е доп.Соїй бргіпд Нагбог

І арогайогу, Соїй Зргіпд Наог, Мем Могк.

Тіспіег, ВА.В., Саідепмооа, 5.К., СоІєтап, С.М. Ріїсе, В.О. Усиления в специфических ОМА последовательностях со связями ро3, вьізваннье химиотерапевтическими и поражающими ОМА агентами.

Сапсег Вев, 53:2212-2216,1993.

Тогепіїїп еї аіІ.,1992,Разеб 9. 6:2716. Тгамаїї, еї аІ.(1990), ЕАБЕВ,4:3209-3214.

Мопізп-Варасі, Е., НезпіїКку, О., Ноїет, 4., Заспв,ї., Кітеспі,5., 5 Огеп,М. Природньій р5З3З инициирует апоптоз в миело-лейкемических клетках, которьій подавляєтся интерлейкином-6. (1991), Мате 352:345-347.

МУєїпрего, А.А. (1991).Ген - супрессор новообразований. бсієпсе 254:1138-1145. УМісосК, еї аІ.( 1991)

Майшге 349:429-431.

МОЇ, 9У.А., МаІопе, А.М/..УМПШатв, Р., Спопо, МУ., Асзадії,(.,У апі,А., 5 Еєідпег, Р.Ь..(1990).Прямой перенос гена іп мімо в мьішцу мьішей. бсієпсе 247,1465-1468. 7акці-Ноцшті єї аІ.(1985),ЕМВО .)., 4:1251-1255. 7пап 60).,Саїттієг, Е., й Еогпасе .)г., А.). Инициирование клеточной активности р53 с помощью поражающих

ОМА агентов и подавление роста. Мої! Сеї! Вісі, 13:4242-4250,1993. 7папд єї аі. Генерирование и идентификация аденовируса-рекомбинанта путем трансфекции с помощью промежуточногозвена липосомьї и РСК-анализов.(1993) Віо Тесппідпев. 7папод, еї аі. Способ внісокозффективной генной трансфекции и возбуждения вьісокого уровня зкспрессий роЗ в клетках рака легких человека с помощью аденовируса-рекомбинанта. Сапсег Сепе Тнегару, 1993. 7 пу. еїг аіІ.,1993,5сієпсе 261;209-211.

Перечень последотельностей. 1.Общая информация: (ї) Заявитель:

А. Имя: "БО ОВ РИДЖЕНТ, ДЗЕ ЮНИВЕРСИТИ ОВ ТЕКЗАС СИСТЕМ"

В. Стрит(Адрес): 201 Вест Севенс(7-я) Стрит

С. Сити (Город) Остин 0. Стейт (Штат) Техас

Е. Кантри (Страна) США

ЕР. Почтовьй индекс: (ЗИП) 78701 а. Телефон (512) 499-4462

Н. ТЕЛЕФАКС (512) 499-4523 (ї) Изобретатели: Рот, Джек А.

ФуживараДошийоши Гримм,Злизабет Зй МухопадиаийДапаз Занг,Вей - Вей и Оузн-Скоб,Лори Б. (її) Название изобретения:

СПОСОБЬІ И КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ПОРАЖАЮЩИЕ ОМА АГЕНТЬ И роз (м) КОЛИЧЕСТВО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 4 (м) Соответствующий адрес: (А) Адресат: Арнольд,Вайт є Деки (В) Адрес: А/Я 4433 (С) Город: Хьюстон (С) Штат: Техас (Е) Страна: США (Р) Почтовьй индекс: 77210

(мі) Форма,читаємая на компьютере:

А Тип носителя: Дискета/А5СІЇ

В Компьютер: ГВМ.РО-совместимьй

С Операционная система: РО-ВО8/М8-805

О Программное обеспечениеє М/ОБОРЕКЕЕСТ 5.1 (мії) Данньге о заявке находящейся на рассмотрении:

А Номер заявка: нейизвестен

В Дата подачи:в соответствий с витекающими обстоятельствами

С Классификация: нейизвестна (мії) Ранеєе поданная заявка:

А Номер заявки: О55ЕМ 08/233,002

В Дата подачи: 25 апреля 1994Гг.

С Классификация: нейизвестна (їх) Информация о патентном поверенном/агенте

А Имя:Хайлендер,Стивен Л.

В Регистрационньй номер: 37,642

С Ссьілка на документ об уплате пошлинь ? : ОТЕС40ЗРСЕ (хо) Информация о каналах связи:

А Телефон:(512)418-3000

В Телефакс:(713)789-2679

С Телекс: 79-0924 (2) Информация о последовательности 5ЕО ІЮ МО: 1: () Характеристики последовательности:

А. Длина 20 базовьїх пар (основньх пар)

В. Тип: Нуклеийновая кислота

С Цепь ДНК: Одиночная

О Топология: Линейная (ї) Описание последовательности: ФЕОІЮМО:!: аассСсАСсСсС ссттаастто 20 (2) Информация для последовательности 5ЕО Ш МО: 2: (її) Характеристики последовательности:

А. Длина :20 базовьїх пар (основньїх пар)

В. Тип: Нуклеийновая кислота

С. Цепь ДНК: Одиночная

О. Топология: Линейная (ім) Описание последовательности: 5ЕО ІЮ МО:2:

ТТатААССАТ ТАТАДОСТОаС 20 (2) Информация для последовательности 5ЕО ІЮ МО: 3: (м) Характеристики последовательности:

А. Длина 20 базовьїх пар(основньїх пар)

В. Тип: Нуклеиновая кислота

С. Цепь ДНК: Одиночная

О. Топология: Линейная (мії) Описание последовательности: ЗЕОЕОМО:3: театТТТсТСАССАССТатта 20 (2) Информация для последовательности 5ЕО Ш МО: 4 (мії) Характеристики последовательности:

А. Длина :20 базовьїх пар(основньх пар)

В. Тип: Нуклеийновая кислота

С. Цепь ДНК: Одиночная

О. Топология: Линейная (мії) Описание последовательности: 5ЕО ІЮ МО:4:

САТСТОААСТ СААДОСИ,ТОас 20

- Є О ти попилинкер промотор цитомегало- ранний сигнал шо «ОС . вируса полиаденилации

ДУ | рому 540 рА й (7.0 Кб) АНІ (1.3-9.2 ту)

А Тв вар он левая конечная зона Кассета зкспрессиий р 53 (925к5) генома 7. Кожух 16 ти ячеек карть! 37 ти ОЛО0О ти ячейки карть 0 ти РВАХ сю ж тр» зт ) ДУ о у рекомбинантнь плазмид тей (40.3 КБ) за, : з РЕС5З руМ17 що (9295К) (40.3 КБ) зол вектор зспрессий . 0 РХО . хо, ок) ра оса 16 ти (Контрафекция в клетках 293)

Гомологическая рекомбинация у. аденовирус-рекомбинат

І Обеззараживание ще Вируснье массь : аденовируса- рекомбинента

Фиг.1

Ватні! Ватні Ватні. ши ї 1.4 КЬ п! І0.86 КЬ- ) 10 20.30 40 50 60 70 80 90 00ти

ІТВ ББЖЖЗЙщЖЖЖ7щ 6 62 2 52 2 З25Б2ЙШ-6255БИБШ-И--- 5 6-5 5 ж5 6 ЬЩш ІТВ

ЕсоВІ (а! Ватні ЕсоВі (1.25) (9.2) (59.53 (76.0)

Фиг.2А (Кк) М1 2 5 4 12.0- КВ 4.0 - ще 1.6- пе - -рб3 Всуповка

Е Є - «-. Фрагмент 05-

Фиг2В Ії

М Ш НВ ЕЕ С М (Б) ірон р уки я -9.0 с, -6.0 ! -20

Фиг. 20 м а ак .-ьу5 цк че ман ие кА УТА їй . - НЕ клану Та. Фей, пи м лі че

РОН тА ОЙ ЛЕ М 7

ШИЯ -УТаТ - чйх й я Зх пил к- А М: Кл че че ли гом УМеУ й іт ТЕ

Ь, яд ап ци мг є ую Шк сл у м 8.

МУКИ МИ роя я ху шо КН, ти її с СХ ях схе й,

ХА зал й нн зи зе ля ой т О це йо їльаи е ле -і ча ; не їж аа ". не о нОонАеня

Мене МОН Я

ОКУ / СЕ п й о сах

СУ мі й 7 ах гади бо кю? пани с ЗАМ, Бе тА. т, -т ще 7» Ту хх м ой вже . Ал тії х а М ТЕ ти ув Я з пи кеВ че; М г жд: з і т, Є. ря Не ин

Ї , Кі г очетю я з Ки - и, но . їх ; ме Бас рт М мит, са в пен мя шт патІй

Ж Те ДК Ж А Яка

Ки ря у шк а" пу . ши

ХХ диня Ту шк хх й г ще й ще р ча 7, за а ;. х ї. ябле у яз п и То др ЖИМ, уломие 2 ху ву и 0 ж хи - ях

Ел Як . сну т ан я: 7 ро а кі - ЗУ 75 не,

А . - А ї и

І Бай - З . Що

Пд Я З бе тд, ай т р КУ - Са -4 3! й і. го тм з дк св. с обрана

Ф , иг. ЗА й ета см в Уболия касу а ері «р ля тує: а тм тет ре; лІза КК; НІ "а, р ВЕ ОНЕУ

Лв уся іт зраз, ТО тище

ВТ ко т тк «Й ТК ил Я, к-т нас си і ЧИ ей

Ми ТИН ї й ль ті т є я сік дн й хр: шо

КД А М, ОК ВН САДУ Я, вх ча у ри жо ни і ЩЕ с и іа КИ з Б жя гом - я о ван со щі; я рр ій " х й те Е Ул и

У по У Ву :й з мк 7 свв Й в У о

ОМ хи и др п оон они и ДК ни М

МЖК 2 т Данія тя пе с нят Я ги п гл о и о ра кс Ач у ЛЬ А я у в лиху Ко ння ях се зв ве . ов ча ВЛ пак й АЙ о и Ми о о ТДКй я хТя веТИ нору - о КЕ р й У, п. МВ со Є

ОСТИИ о фея и а с

І Ин д ' «СЕя г. кл . і алелі чі ні ІТ: х : ка ! СТБ код З т Нх Кот, що уж " ОВК Й - « вол, аг НУ НЯ Ах ай ие Я Ск Дим іх і; НУ УК хе, пил че «Те і дор ще сій жала Аве ль У; пи ї й и п СЯ крики и З Я КЕ Ми Я

Ста галку ей реле му. Квіт

Пт ра пов Бу І кв ик З іх МОЯ ти А лаві і, я -х У пови ад ва а

М и А ох ; ТЕЙ, й: Дис кий у иа МЕН 7 нт - Ка че о) кожй че я ах й ік Є Яд Ж їй савіЯ й Ех це перо вк те ол МАЯ урн ва ж А, я соб ЖктвА ; м ТУЩя сля АХ пуд АНА з ж -Я Пе -6 в ме як їй Я ід, тя У пр Аа,

ПОН хоп с й НІЙ . ), Й чт щі У, Хе мав Ж ан : і Есе вило п ку МИНЕ хх 15 ПокЕв екв й Бей . , рт вн Лич Рака КА - 4 «ни Ку п Ко т в ся і у пет око са е.. шо іх во діє о з ПИЛИ ело дтя пу Ка зе вий з ой ни в в ласти ТМ т кі 1 КАК гл че паче ва тА. бутя же яю сто см зл с. 7 ях й, й щу . нн и З та 2 '

З ів зх ж ї Туди хи, в ДО 4 т - "ж ді Арт СУ тії, т й т

Ех пу повне сті що 5 ца я, - а - З У у тр: пил м це ІК лиже З і сах КК сек т Кр чи, тд вЕкрмо Цих шкур ЯК Ат КАН 17 ди

Я Ї ха я й ОВК 14 ; і ШИ м ко ет АС чих у мя -клй Я т 4

ОБІДИ он ВИК -Х ВИ У пи й зу ду ОАЕ ; и. ; Є ; ; же й :

Бе ру т, і с :х Я і і зів бах 5 з мі а кА Й

У КИ й У муч (й гяу й. ! ее т мя ск ки се а дн зи т тй сли Є, : ' ; б й м. тх т пі ун пре . г.3С

Фиг. 38 Фи и шк

Ек а нн у у т ран А НН пи, и 1. киев п.

ТК лк, : Но ц пи хан г

ВЕ. що ВК тт ве в ні АН ИН : о зе

Уж жіно, и. зойк ми нн г. Й

НН: б. пт ! ! ная юн и

А ни хі: или п Й п ля сік ОДИН

Фиг. 30 ко о ї 5 кя я жжакосе В я а к

СОЛОофиу тк с р п рариуя с би й и Ж й Ко реч Я дк. ля ак йде я се 9 і Ж " дян Ко щх в я вм щи как й в. Ж одло ж ши зжи а ох в КНУ, г. К. Кб ЇВ з ши Й пот ПВ ей і : в ій ке во Ку ж Я в Олж ев - як т. щі Ку - ; Я о ВИ Бе Бе

Бе, дух МІ ва вв ов УР в й М дл В

ПЕ, КА уд укьсай Й іх кан ал но ик я. їй, а

Фиг4В ря - 7 й жи я "фра. Б Би ст : . г ма: "5 ЗИ А '/. за. «я, щ а? з. " ов - тя аж вояк м ИК х, в. - й бай В фФ Фев

А 7 М о. "/ ж хх тк, ге ку а ще. ту є 2 » де я 2. і -к о уяв, м Ще Я се т ви ча іх СЕ У

Ж -к - й. а щі в -д ь ок

Зла з «5 І іс м ті; 2 зи ТАН

ФигАС ,

В в ми адм ання Я,

В г. ВТ В: Лк "ав ; на. «і і у й й: 4 Вк хе ци. як во й и ль Ж -й іч і щи жк.

Фиг4ад щік з 4. ю 5 ще

І М НИ Й 7 М 1: ч ч - (КО рішидея «оте 0 » Де 0. нн «ду ше - фатину - фею й фс не в. в. . нт У й же

Тв деле і ЕЕ дУ-Вах. чи ки іди .

НУТИ нія раю: зт МК им ж . ча Кл Гаксй ков тиск аа Кк он Ж орви ІТ ті НА ня щи ак; а петух ді: ше ютшатт, убий іст - та ча пгт де их зуякиих жо ме зл, иа Аме ї -- км ен ла р лочанн лит ВХ тс т.к Зх Пенн Не ТЕ з мита ЕІ в ПпОоЖх оси диня пол о: ин РН ал чих ярі г й єї. ж Я "ТИХ б елітне -1 ма 7 - 97 да 7 нин - и м етос Вуса ех пк шу НТ ВОК ї От кт ЕММА ет ПОД тА титих я, г ми а и дл. Ж ИН ШО ря - 68

З побу 1 пе, че лк ж.н Й Й Кос ле ши ду т пен ВИ йони Е ЗЛ Кона ни Гея «дю КНЕ дк. . ко Ноти «дію ли. АВТ вл

ЯТІ ц ШЕ ШО пасти Ти

Й п. Ж. йизисаня пт вит, г ,« ЩА

ПО. ол 00 Ж и «ДС Вт ши

ЧИЮ до І: дя тив рю ин ДО чт ши не: рол Пили Й Алснатнй ен їй І як е ще : лан, шо ЛОЖЕ Е -

АК МИМО. я що Пен НИ й ЕЕ; й ' н Міс при Ну й пи шля! тай пл о о У овефу жи. таж -7 пре йтя лев - т. з пе г. т сере снискю о т -: 7 Шйні З . . 2 3 а 5 я лит - 7 ре м "й вол: - - па «щи ИН

Нет п т. війн, . з сольні а ання РМР ШИ --- дит вон шт За. найти ж ди, сур я КУРИ Я ШИ вла в; «варт ЩІ р

РЕЖ гри ит пр тя жи НА лиих вух, -.- і ие аа щ й т з ші изд фа тай т, ДА и Ве, одн МС сипннщнн гли А ,

Мо Доки ву ЧИНИ , «т т «ПИ «ЖЕ іже шт - 1. К-Т ти то тот поля чив ам, ї. ач -ч є чик - а тах Ж «о... роз г 7 я г -

Дктин х

Фиг. ЗВ

100 що що й о 85 що Д ' з и ше І щи щи

ЕЙ

8 еЙййЙ г ж їй й ил 29 еЙйЙ й й

Ей й й В. 0.5 1 З 5 г 45

Дки после инфицяровання.,

ФигбА аленовибрус-рекомбинат : дЯОСМУ-053 стИМУЖ8МРУТЄюВЯЧО.:.85ИбЛ/?.ШЧттзс щи НН нако 5». Годині бак, -, Дктик тетшф НЕ В Ан І 0.5 0.5.1 3 59 45 45

Дни после инфицированихя

Фиг.оВ о 1- НЯІБВ - клетка рака легких ! в'клеточной линяи і 4.0 о совдла і е даБ/АБМ/ВІ? . ох» даБСМУ»рБЗ ш їх Я ж І; -5 х » в ' 0125445 6

Дни после кнфиципования

Фиг7А.

"НЗ22 -клетка рака легких в клеточной линий 4.0 о сопела. е даБ/В5М/СІ? ще У АЯ5СМУ-роЗ іш вовог в.

Б. ії ; ре щу: 70 Й Ї

Бак зи ваш; ЗМ 0 1 щ2 345 56

Шни после мяфипирования

Ффиг.7В

НібО - клетка пака / легкого 40го среда є А(д5Б/А5У/Іе їі - У АЯ5ОМУ-рОЗ о 3.0 -Е : х , 0 Е 20 ще ; з | /

Ї

| у де 0 1234565

ШИ Дни посла мнфипирования

Фиг7о я 2 голна мими ( ойлученнце) : : , ! акестезия. с помопью

Лень 1 ' ; нетоксифлуранв - т Р. к-во клеткк В Фсме 2 х 105 Н2268г сеї (0.1 сс/мьлив интертоахигльная ннотиляння путем трахеотомни -- (Меїйохуйигале) анестезня

Лень 4 - | ! (0 сс/льишь х кнтертовдятьньх инстТилляция ХМ миожаственность клеток, Комтроль перемешения

День З І БХЯОР ну лиш і дековивустуєкохбннант м ; доЯБСММУ роя. АЯБЛЕМСІ? 0 нмаев/нодБВІ пн /НгеБВІ мииг пеебВІ . честад вгональнов состоянна неделя К ;Мнгаляпкя СО,

Аутодсчя ко рарсечанне меднастичального блока

ЩЕ йачерениг размзоа спухоляи гистрпогеческКов итолеуловакив ; Фиг.б6

В

. гЙ : й ши «й сан Ну шенні: с. НАЙ

Фиг.ЗА ФВ -. Фиг.УС сф ре рим рел риуині ши 2 З

Фа оЮ 7 контТ- кдеткк спла

ГІС: нн 10 о сб У - я я. 1111 Ал | м лешесооРО в' 2 о маєоворцу ен -ї шу аву 54 сита у Аефет СОРТ

Е ЩО аа слов ЗІ Акпеновивус 2 Ши: чи НО ДО пекомбкнант 1.2 З 4 (5

Днки .

ФИТЛОд

12 -- в се спор. яв4 1 4 же о свооорі

Бе в НИ ан й ш АО-Ціс: СОР (-) | АНЯ у одер х лиш ДИ ВИ о -- 2 зах ПИШИ

ТЯяв 108845 . ШЦни

ФитТ. В фиженне в, 1022 я 1021. 5028

Япя У 1 5 ЛО с шо

БО

ШИ й пи 1115

УА. У

НН Й Й с авекови я нверявц поко (7 10 ро/ті 100 ро/ті нет цисплатина кмевтея цисплатин. инмеевтея " . сяглОС плсплатяна

103 2146149 104 ж | і. о Ф й т х (М Сх

Коси коні ке 24п «вн писллатинїї ГТ - тт срр о - в шк ж 1353 : 2- . ема ШІ а. лк ! 1078 -- Р «Й ! чай 8727 ШИ й 310 ШИ шир нг ТА лено и ВОНИ ей

Кеш Ка ШЕ пу вних й тки о кА, дО й Ж | зх М й поря ши: иа я ВН вели меня БНО беж я ша ШЕ п ва х п. в, ЩЕ и тА и В су. ши кеди о г її їх ях пе щі в иЕ ЗЕ й Ще ій й і г ще 2 п з

Бе з Шен КК шо с ще хх Бе : мушу то ть м Кай ие

ФигІ1В Фиг1с гри чи т Же - - "Аа: К- (я є й ; й й з. 7 "Кк Х ка йщї тар че тя - х

Є 7 му ня ч це - 1 «е-

ХК ж МЕТ пп ана ВОД Се М 4 чих

Ме УА шо я бат уи ше и Аа ною -. б м, вола о -а м» б "в Я. жо сі мк Р ли шк ї і а т т лишь с; ша

Де м паж ут ч, Ве 07: до

Ву Мини сни мае маш п БО: Ин м но ШЕ . ;

І БА дать

Фиг. о Фиг. ПЕ

НЕ и М х і. Бе з ;-, й т й в а . живо ж ро 2 Ск бу я й 47 -й Те с: / я ори п у 1. йо ; Те фаза ИНА НИ й - в еру ТБкя ван я Те ГИ Ше сах ц іа чив Ши ут Й іс Ма

ОВО ше ШИК па я 1 од іо ; у 4 : ух я и ші Уж

АХ я о АН Я ей тьнюя Ви Я

Зх "- з, Фе ' жо Ки тк І п й ат" ж до

Фиг1Е - Фиг.110

ТТ 1 1747 контчольноє ко, - ше 12 ча вк 3, ; -- СПО ОР "гор нт та ранній те сля шелшЕ я с- с --ї вищ ази чу -- да-Цис - -" шк ж ов ШИК: ва з з св-лошеюою

БІ 06 з: ш--

ВН В В М В НОЯ ін пан е, їв са леевсоо» м ШІ М НОМ ОХ НО ВО ВА 0 і ! 123 4 85 6 7

Дяв

Фиг12А '

ОЕМ Шк і - и ж пли Шо ррт г 7 т кам й ом БА й и х ля. Шов

ПЕС ЛИІМ едтітин жя у пи ЕР

Тит ОПУЩЕНІ : и а ни МИ М ту и . 60 ік пе ТІЛІ ИН у пса: с . ям ЛНІЖлЕ

Шлж і ТЕ и по шо ОО Лех ж Інти тя тити їі Шк т, Що " тки й ПА ТТКІ доти я У дп тя с МИ и РЕНО ша свсоетк: ЙЙ ванни і ТЕ ати МЕМ я ет е х о и ЕН кн ся -Ффяг12В Фаиг.12С ' «й: У плеча я. ше 2, й х Ка

ГРА пути ет. не її я. -. І: и и М Кок ж 1. за - к ге - «ин у: НЯ ці й Ей сна Я 1х Кит Еч ї- - - - й м "2 «ЧЕ й се пре их ки шив

Шк: Я от 11. т ли дк ех

Кк шт 7 ах - Ту в" й ть 52. ра з ИН

РИН, ке. " Що щ 7 газ. 2 х

Фиг.120 о офн.12Е : : -ев- 08 й . а Шу. , т 20 бай --- Ав-і пс

І йти о , -7 1-4

ВС 2 у --- Ад1 пе/С00Р

Гак ПІ шо 15 - й у

Е Уй й А 5 --е- Ай-рз а . ри то ДЕ: й з 19 Уся -к- Айі-ра3/СВОР 5. БАК

З 5 ї о б в 810112 1234 5

Я "7

Фиг.13А-1

20 п -и- СУ м -- ССО? т зл,

Е 15 ря Ай-ЦІс , «ЕЕ . сольний г

З я | -2- АВ-Цос/СООР м 40 . р

Р: Е --5х- Ад-р5З3 о. а, рі ний ан и. чі є й - -ак- Ад-р5З/СООР

НУ, з с Ск й 2 1234557 8 9 101112

Йчи

Ех сиг 13А-2 ши

ОО ун живе я ув о в пек Ви Тай пн ЕЕ КК и вул кое о я зу я КТ ав Ки тус а ви ж А дк о А о и о им пли КЕ о ен и тд Іл о дже шен чо ЕН он я п тою ит Мне оАТЕйе за ее вв, ї у ни І ТТТХ пи ЕР а дн ни ок и я дітки (и т ІЕЕ НКВВ тен о во ТЕ ОН ох «Едем и ис ан ин и о нн ие пон в ка Тит НСС сте пек со не ен рони ченнн п св : ! плн они дн: тт, КИ дн крню арок кала кн тал М г и РЕЯ з она дав КЛІ керук в ях ПАННА пане й иа т тю п; гу о ня о ОНИ жди а.- тут АХ ож иЕ вно ОК, Енн і І шуй ж ри в ЕЕ . ши о о ЕК С кг

Фиг ЗВ Фиг.13 С

А ль в ад з ких іден и со т

ПО пт т ки ув б КІ ли акт м и а о ато Ж ,к тк шини а ее

ЩІ а « тв " ТД т - бик і ши т.к

Б де " АН ті Ше миши - ная Шк ій Зак -и 2 Й Ач ал . т, ще . и ати за т. 00 й пІЖА У а - за вх п т а НН. ву ША пит адльї «іти т терту яв я. я ще : т ши ух; "

Ще Шипи ори 1 й. 7 ко жи ле Е де СУ ли і-й тя ще ЗІТАКЙ ШО х т й. Й с соки Я жд Р и тий ВИ Нолич . Її їй и :ч яко їх ще "о "и з ше че " ее ни че ;

Ї БР. ов пуд ра ние А бом, МОТи я г в, ПА ут І Жх. целжК

Є тА Ак, ВИ рн етики пд ТК

НН и в В у Би тка хі кт рів : вот КЕКлЯдеиА ж В ам 7. мира: і й а Й -

Ма бетонне: 0 МА МАУ ср , в , Фиг.130 Фиг.13Е

Claims (115)

1. Способ разрушения пораженньїх, больньїх или тому подобньїх клеток, включающий обеспечение контакта клетки с протеином роЗ или геном и поражающим ДНК агентом в обьединенном количестве, достаточном для разрушения данной клетки.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что обеспечивают контакт клетки с протеином роз или геном в сочетаний с рентгеновским облучением, ультрафиолетовь!м облучением, У .облучением, микроволновьм излучением, адриамицином, 5-флуороурацилом, зтопозидом, камптотецином, актиномицином ОО, митомицином С или цисплатином.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что клетка является зпителиальной опухолевой клеткой.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что обеспечивают контакт клетки с протеином роз или геном в сочетаний с цисплатином.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что обеспечивают контакт клетки с рекомбинантньім вектором, которьй возбуждаєет зкспрессию протеина роз в данной клетке, в сочетаниий с поражающим ДНК агентом.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что рекомбинантньій вектор, вьізьівающий зкспрессию ро53, является "оголенной" плазмидой ДНК, плазмидой в определах липосомь, ретровирусньм вектором, вектором аденоассоциированного вируса (ААМХ), вектором герпесвируса или вектором аденовируса-рекомбинанта.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что рекомбинантньій вектор, вьізьівающий зкспрессию ро3, является вектором аденовируса-рекомбинанта.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что количество аденовирусного вектора составляєт от 1х105 до 1х1072 бляшкообразующих единиц (рій).

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что количество аденовирусного вектора составляєт 5х107 бляшкообразующих единиц.

10, Способ по п. 8, отличающийся тем, что количество аденовирусного вектора составляєт 2х107 бляшкообразующих единиц.

11. Способ по п. 6, отличающийся тем, что вирусньй вектор является герпесвирусньіїм вектором.

12. Способ по п. 6, отличающийся тем, что вирусньй вектор подаеєтся через зндоскоп, внутривенно, внутритрахеально, интралезионально, через кожу или подкожно.

13. Способ по п. 1, огличающийся тем, что опухоль находится в резецированной поддерживающей опухоль ткани.

14. Способ по п. 6, отличающийся тем, что вирусньй вектор вводится в количестве примерно 0,1 мл.

15. Способ по п. 6, отличающийся тем, что вирусньй вектор вводится в количестве примерно 10 мл.

16. Способ по п. 7, отличающийся тем, что рекомбинантньїй вектор, виізьівающий зкспрессию ро53, является вектором аденовируса-рекомбинанта, включающим зону зкспрессии р53, размещенную при контролирующем воздействий промотора цитомегаловируса ІЕ.

17. Способ по п. 7, отличающийся тем, что используют вектор аденовируса-рекомбинанта, включающий зону зкспрессии р53, промотор цитомегаловируса ІЕ и ранний сигнал полиаденилации 5М40.

18. Способ по п. 7, отличающийся тем, что, по крайней мере, один ген, ответственньйй за репликацию аденовируса, удаляют из структурьї вектора указанного аденовируса, а зону зкспрессии р53 внедряют на его место.

19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что зону зкспрессии р53 внедряют на место удаленньїх зон ЕІАи ЕІА аденовирусного вектора.

20. Способ по п. 7, отличающийся тем, что используют вектор аденовируса-рекомбинанта, которьй присутствует в пределах аденовируса-рекомбинанта.

21. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сначала обеспечивают контакт клетки с протеином ро или геном, а затем обеспечивают ее контакт с повреждающим ДНК агентом.

22. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сначала обеспечивают контакт клетки с повреждающим ДНК агентом, а затем обеспечивают ее контакт с протеином роз или геном.

23. Способ по п. 1, отличающийся тем, что одновременно обеспечивают контакт клетки с протеином ро3 или геном и с повреждающим ДНК агентом.

24. Способ по п. 1, отличающийся тем, что обеспечивают контакт клетки с первой композицией, содержащей протеин роЗ или ген, и со второй композицией, содержащей повреждающий ДНК агент.

25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что первую и вторую композицию диспергируют в фармакологически приемлемом виде.

26. Способ по п. 1, отличающийся тем, что обеспечивают контакт клетки с единственной композицией, содержащей протейин ро3 или ген в сочетаниий с повреждающим ДНК агентом.

27. Способ по п. 26, отличающийся тем, что композицию диспергируют в фармакологически приемлемом виде.

28. Способ по п. 26, отличающийся тем, что обеспечивают контакт клетки с единственной композицией, содержащей рекомбинантньй вектор, которьй возбуждаєт озкспрессию роЗ в клетке в сочетаний с повреждающим ДНК агентом.

29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что обеспечивают контакт клетки с единственной композицией, содержащей аденовирус-рекомбинант, включающий рекомбинантньій вектор, которьій возбуждаєт зкспрессию роЗ в клетке в сочетаний с повреждающим ДНК агентом.

30. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная клетка является человеческой клеткой.

31. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная клетка является гиперпролиферативной клеткой.

32. Способ по п. 31, отличающийся тем, что указанная клетка является клеткой рака легких.

33. Способ по п. 32, отличающийся тем, что клетка рака является клеткой немелкоклеточной карциномь легкого.

34. Способ по п. 33, отличающийся тем, что указанная клетка немелкоклеточной карциномь! легкого является клеткой плоскоклеточного рака.

35. Способ по п. 33, отличающийся тем, что клетка немелкоклеточной карциномь! легкого является клеткой аденокарциномь!.

36. Способ по п. 33, отличающийся тем, что клетка немелкоклеточной карциномь! легкого является клеткой крупноклеточной недифференцированной карциномьі.

37. Способ по п. 32, отличающийся тем, что клетка рака легкого является клеткой мелкоклеточной карциномь! легкого.

38. Способ по п. 31, отличающийся тем, что указанная клетка является клеткой рака груди.

39. Способ по п. 31, отличающийся тем, что указанная клетка является клеткой, имеющей мутацию в гене роз.

40. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная клетка расположена в организме животного, а протеин ро53 или ген и поражающий ДНК агент вводят в организм животного в фармакологически приемлемом виде.

41. Способ по п. 40, отличающийся тем, что включаєт впрьскивание в пораженное опухолью место терапевтически зффективного количества фармацевтической композиции, включающей аденовирус- рекомбинант, содержащий рекомбинантньй вектор, вьізьівающий зкспрессию ро5З3 в опухолевой клетке, и обеспечение контакта опухоли с поражающим ДНК агентом.

42. Способ по п. 41, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем радиоактивного облучения, ультрафиолетового облучения, у -облучения или микроволнового облучения.

43. Способ по п. 42, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем радисоактивного облучения места расположения опухоли.

44. Способ по п. 42, отличающийся тем, что опухолевая клетка приводится в контакт с поражающим ДНК агентом путем облучения опухолевой клетки рентгеновским облучением.

45. Способ по п. 44, отличающийся тем, что доза рентгеновского излучения составляет 2000-6000 рентген.

46. Способ по п. 44, отличающийся тем, что доза рентгеновского излучения составляет 50-200 рентген.

47. Способ по п. 42, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем ультрафиолетового облучения места расположения опухоли.

48. Способ по п. 42, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем 7 -облучения места расположения опухоли.

49. Способ по п. 42, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем микроволнового облучения места расположения опухоли.

50. Способ по п. 41, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем введения в организм животного терапевтически зффективного количества фармацевтической композиции, содержащей поражающее ДНК соединение.

51. Способ по п. 50, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является цисплатином.

52. Способ по п. 51, отличающийся тем, что указанньй цисплатин вводят в дозе 20 мг/м".

53. Способ по п. 50, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является доксорубицином.

54. Способ по п. 53, отличающийся тем, что указанньій доксорубицин вводят в дозе 25-75 мг/м".

55. Способ по п. 50, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является зтопозидом.

56. Способ по п. 55, отличающийся тем, что указанньй зтопозид вводят в дозе 35-50 мг/м".

57. Способ по п. 50, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является верапамилом.

58. Способ по п. 50, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является подофиллотоксином.

59. Способ по п. 50, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является 5-флуороурацилом.

60. Способ по п. 59, отличающийся тем, что указанньій 5-флуороурацил вводят в дозе 3-15 мг/кг.

61. Способ по п. 50, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является камптотецином.

62. Способ по п. 50, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является актиномицином О.

63. Способ по п. 50, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является митомицином С.

64. Способ по п. 40, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем введения в организм животного терапевтически зффективного количества фармацевтической композиции, содержащей поражающее ДНК соединение.

65. Способ по п. 40, отличающийся тем, что ген р53 или протеин вводят перед поражающим ДНК агентом.

66. Способ по п. 65, отличающийся тем, что период между вводом вирусного вектора и поражающего ДНК агента составляет 12-24 ч.

67. Способ по п. 65, отличающийся тем, что период между вводом вирусного вектора и поражающего ДНК агента составляєт 6-12 ч.

68. Способ по п. 65, отличающийся тем, что период между вводом вирусного вектора и поражающего ДНК агента составляет примерно 12 ч.

69. Способ по п. 40, отличающийся тем, что ген р5З3 или протеин вводят после поражающего ДНК агента.

70. Способ по п. 69, отличающийся тем, что период между вводом поражающего ДНК агента и вирусного вектора составляет 12-24 ч.

71. Способ по п. 69, отличающийся тем, что период между вводом поражающего ДНК агента и вирусного вектора составляет 6-12 ч.

72. Способ по п. 69, отличающийся тем, что период между вводом поражающего ДНК агента и вирусного вектора составляет примерно 12 ч.

73. Способ по п. 40, отличающийся тем, что ген р53 или протеин вводят одновременно с поражающим ДНК агентом.

74. Способ лечения рака, включающий введение в организм животного, больного раком, терапевтически зффективного сочетания протеина роЗ или гена с повреждающим ДНК агентом.

75. Способ по п. 74, отличающийся тем, что впрьіскивают в место, поврежденное опухолью, терапевтически зффективное количество фармацевтического соединения, содержащего аденовирус-рекомбинант, включающий рекомбинантньій вектор, которьій вьізь'ваєт зкспрессию ро53 в пораженной опухолью клетке, и обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом.

76. Способ по п. 75, отличающийся тем, что вирусньй вектор вводят в количестве примерно 0,1 мл.

77. Способ по п. 75, отличающийся тем, что вирусньїйй вектор вводят в количестве примерно 10 мл.

78. Способ по п. 75, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем облучения поврежденного опухолью места рентгеновскими лучами, ультрафиолетовьми лучами, у -лучами или путем микроволнового облучения.

79. Способ по п. 75, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем ввода в организм животного терапевтически зффективного количества фармацевтического соединения, содержащего поражающее ДНК соединение.

80. Способ по п. 75, отличающийся тем, что поражающим ДНК соединением является цисплатин.

81. Способ по п. 78, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем радисоактивного облучения места расположения опухоли.

82. Способ по п. 78, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем ультрафиолетового облучения места расположения опухоли.

83. Способ по п. 78, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем у -облучения места расположения опухоли.

84. Способ по п. 78, отличающийся тем, что обеспечивают контакт опухоли с поражающим ДНК агентом путем микроволнового облучения места расположения опухоли.

85. Способ по п. 75, отличающийся тем, что поражающим ДНК агентом является доксорубицин.

86. Способ по п. 75, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является зтопозидом.

87. Способ по п. 75, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является верапамилом.

88. Способ по п. 75, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является подофиллотоксином.

89. Способ по п. 75, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является 5-флуороуроцилом.

90. Способ по п. 75, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является камптотецином.

91. Способ по п. 75, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является актиномицином.

92. Способ по п. 75, отличающийся тем, что поражающий ДНК агент является митомицином С.

93. Способ по п. 74, отличающийся тем, что ген р53 или протеийн вводят перед поражающим ДНК агентом.

94. Способ по п. 93, отличающийся тем, что период между вводом вирусного вектора и поражающего ДНК агента составляет от 12 до 24 часов.

95. Способ по п. 93, отличающийся тем, что период между вводом вирусного вектора и поражающего ДНК агента составляет 6-12 ч.

96. Способ по п. 93, отличающийся тем, что период между вводом вирусного вектора и поражающего ДНК агента составляет примерно 12 ч.

97. Способ по п. 74, отличающийся тем, что ген р53 или протеин вводят после поражающего ДНК агента.

98. Способ по п. 97, отличающийся тем, что период между вводом поражающего ДНК агента и вирусного вектора составляет 12-24 ч.

99. Способ по п. 97, отличающийся тем, что период между вводом поражающего ДНК агента и вирусного вектора составляет 6-12 ч.

100. Способ по п. 97, отличающийся тем, что период между вводом поражающего ДНК агента и вирусного вектора составляет примерно 12 ч.

101. Способ по п. 74, отличающийся тем, что ген р53 или протеин вводят одновременно с поражающим ДНК агентом.

102. Композиция для разрушения пораженньмх, больньїх и тому подобньїх клеток, содержащая протеин ро3 или ген в сочетаниий с повреждающим ДНК агентом.

103. Композиция по п. 102, отличающаяся тем, что содержит протеин роЗ или ген в сочетаниий с адриамицином, Б5-флуороурацилом, зтопозидом, комптотецином, актиномицином 0, митомицином С или цисплатином.

104. Композиция по п. 103, отличающаяся тем, что содержит протеин роЗ или ген в сочетании с цисплатином.

105. Композиция по п. 102, отличающаяся тем, что содержит рекомбинантньй вектор, которьій обеспечивает зкспрессию протеина ро3 в клетке животного в сочетаний с поражающим ДНК агентом.

106. Композиция по п. 105, отличающаяся тем, что рекомбинантньій вектор является "оголенной" плазмидой ДНК, плазмидой в пределах липосомь!ї, ретровирусньмм вектором, вектором аденоассоциированного вируса (ААХ) или вектором аденовируса-рекомбинанта.

107. Композиция по п. 106, отличающаяся тем, что рекомбинантньй вектор является вектором аденовируса- рекомбинанта.

108. Композиция по п. 107, отличающаяся тем, что рекомбинантньй вектор является вектором аденовируса- рекомбинанта, локализованньї!м в пределах аденовирусной рекомбинантной частиць!.

109. Композиция по п. 102, отличающаяся тем, что содержит вектор аденовируса-рекомбинанта, локализованного в пределах аденовирусной рекомбинантной частиць, в сочетаний с цисплатином.

110. Композиция по п. 102, отличающаяся тем, что диспергирована в фармакологически приемлемой форме.

111. Композиция по п. 110, отличающаяся тем, что пригодна для введения внутрь пораженного места.

112. Терапевтический набор для разрушения пораженньх, больньх и тому подобньїх клеток, содержащий внутри соответствующей упаковки (оболочки) приготовленное фармакологическое средство рекомбинантного вектора, которое вьізьівает зкспрессию протейина р53 в клетке животного, и приготовленное фармацевтическое средство поражающего ДНК агента.

113. Терапевтический набор по п. 112, отличающийся тем, что рекомбинантньй вектор и поражающий ДНК агент находятся в одной упаковке.

114. Терапевтический набор по п. 112, отличающийся тем, что рекомбинантньй вектор и поражающий ДНК агент находятся в различньх отдельньх упаковках.

115. Терапевтический набор по п. 112, отличающийся тем, что содержит фармацевтическое средство аденовируса-рекомбинанта, включающего рекомбинантньй вектор, которьй вьізьіваєт зкспрессию протеина роз в клетке животного, и фармацевтическое средство - цисплатин.