HU221279B1 - Compositions comprising dna damaging agents and p53 for killing cells - Google Patents

Compositions comprising dna damaging agents and p53 for killing cells Download PDF

Info

Publication number
HU221279B1
HU221279B1 HU9602937A HU9602937A HU221279B1 HU 221279 B1 HU221279 B1 HU 221279B1 HU 9602937 A HU9602937 A HU 9602937A HU 9602937 A HU9602937 A HU 9602937A HU 221279 B1 HU221279 B1 HU 221279B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
combination
gene
dna damaging
damaging agent
protein
Prior art date
Application number
HU9602937A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT76258A (en
HU9602937D0 (en
Inventor
Toshiyoshi Fujiwara
Elizabeth A Grimm
Tapas Mukhopadhyay
Laurie B Owenschaub
Jack A Roth
Wei-Wei Zhang
Original Assignee
Univ Texas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22875472&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU221279(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Univ Texas filed Critical Univ Texas
Publication of HU9602937D0 publication Critical patent/HU9602937D0/hu
Publication of HUT76258A publication Critical patent/HUT76258A/hu
Publication of HU221279B1 publication Critical patent/HU221279B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A61K31/7072—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid having two oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. uridine, uridylic acid, thymidine, zidovudine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/243—Platinum; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4746—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used p53
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus

Abstract

A találmány tárgyát ráksejtek elpusztítására alkalmas készítményekképezik, amelyekben DNS-károsító ágensek tu- morszuppresszorgénekkelvannak kombinálva. A találmány tárgyát képezik továbbá akészítményeket tartalmazó terá- piás reagenskészletek, valamint atalálmány szerinti készítmények alkalmazása rák kezelésére. A DNS-károsító faktorok alkalmazásának, valamint a tumorszuppresszor-génekheterológ expresszáltatásának kombinálása jelentős szinergizmusteredményez, amely a DNS-károsító faktorok, illetve atumorszuppresszorgének külön-külön megfigyelhető hatásánál lényegesenjobb eredményeket biztosít. ŕ

Description

KIVONAT
A találmány tárgyát ráksejtek elpusztítására alkalmas készítmények képezik, amelyekben DNS-károsító ágensek tumorszuppresszorgénekkel vannak kombinálva. A találmány tárgyát képezik továbbá a készítményeket tartalmazó terápiás reagenskészletek, valamint a találmány szerinti készítmények alkalmazása rák kezelésére. A DNS-károsító faktorok alkalmazásának, valamint a tumorszuppresszor-gének heterológ expresszáltatásának kombinálása jelentős szinergizmust eredményez, amely a DNS-károsító faktorok, illetve a tumorszuppresszorgének külön-külön megfigyelhető hatásánál lényegesen jobb eredményeket biztosít.
ül leírás terjedelme 48 oldal (ezen belül 21 lap ábra)
HU 221 279 B1
HU 221 279 Β1
A találmány a kemoterápia tárgykörébe tartozik. A találmány tárgyát ráksejtek elpusztítására alkalmas készítmények képezik, amelyekben DNS-károsító ágensek tumorszuppresszor-génekkel vannak kombinálva. Szintén a találmány tárgyát képezik a készítményeket tartalmazó terápiás reagenskészletek, valamint a készítmények alkalmazása rák kezelésére. A DNS-károsító faktorok alkalmazásának, valamint a tumorszuppresszorgének heterológ expresszáltatásának kombinálása jelentős szinergizmust eredményez, amely a DNS-károsító faktorok, illetve a tumorszuppresszor-gének különkülön megfigyelhető hatásánál lényegesen jobb eredményeket biztosít.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható sejtek, elsősorban tumorsejtek szelektív elpusztítására, és ezáltal a tumorok kialakulásának gátlására, illetve a tumorok méretének csökkentésére.
Ismeretes, hogy a rák jelenlegi kezelési eljárásainak (beleértve a sugárkezelést, sebészeti beavatkozást és a kemoterápiát) hatékonysága korlátozott. Az Egyesült Államokban csak tüdőrákban évente több, mint 140 000 ember hal meg. Napjainkban az életkorhoz arányosított, tüdőrákból eredő elhalálozások száma nőknél felülmúlja az emlőrák okozta elhalálozások számát. Bár a dohányzás mérséklésére irányuló programok bevezetése csökkentette a dohányzás gyakoriságát, a tüdőrákból eredő elhalálozási gyakoriság a XXI. században is igen magas szinten marad. A tüdőrák esetében alkalmazható új terápiák kifejlesztésének sikere a tüdőrák molekuláris szintű biológiájának megértésén múlik.
Jól ismert, hogy számos különböző rákot - legalábbis részben - genetikai rendellenességek okoznak, melyek egy vagy több gén túlexpresszálását, illetve abnormális vagy mutáns gén (vagy gének) expresszióját eredményezik. Sok esetben például, az onkogének expressziója okozza a rák kifejlődését. Az „onkogének” olyan - genetikailag módosított - gének, amelyek mutáns expressziós termékei valamilyen módon károsítják a normális celluláris működéseket, illetve a celluláris szabályozást [Spandidos és munkatársai (1989)].
Az eddig tanulmányozott legtöbb onkogénről megállapították, hogy egy normális celluláris gén (azaz egy „proto-onkogén”) kódolórégiójában lévő mutáció gyakran pontmutáció - eredményeként kerül „aktivált” állapotba. Az ilyen mutáció az expresszált proteintermékben aminosav-szubsztitúciókat eredményez. A módosított expressziós termék abnormális biológiai működést fejt ki, amely részt vesz a daganatos folyamatban [Travali és munkatársai (1990)]. Az alapvető mutációk különböző módon, például kémiai mutagenezissel vagy ionizálósugárzás eredményeként jönnek létre. A közelmúltban számos onkogént és onkogéncsaládot (mint például ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun és abl) azonosítottak és karakterizáltak [Travali és munkatársai (1990); Bishop (1987)].
Úgy gondoljuk, hogy a normális sejtnövekedés során a növekedést elősegítő proto-onkogéneket ellensúlyozzák a növekedést gátló tumorszuppresszor-gének. E két erő egyensúlyát több faktor befolyásolhatja, ami daganatos állapotot eredményezhet. Az egyik ilyen tényezőt a tumorszuppresszor-gének mutációi képezik [Weinberg (1991)].
Az egyik lényeges tumorszuppresszorgének a p53 celluláris proteint (amely sejtproliferációt szabályozó, 53 kD-os sejtmagi foszfoprotein) kódoló gén. A p53-gén mutációi és a 17p-kromoszómakaron (amelyen a p53-gén található) lévő allélvesztés az emberi rosszindulatú betegségek esetében azonosított leggyakoribb változások. A p53-protein az evolúció során nagymértékben konzerválódott, s a legtöbb normális szövetben expresszálódik. A vad típusú p53-proteinről kimutatták, hogy szerepet játszik a sejtciklus szabályozásában [Mercer (1992)], a transzkripciós szabályozásban [Fields és munkatársai (1990); és Mietz és munkatársai (1992)], a DNS-replikációban [Wilcock és Lane (1991); Bargonetti és munkatársai (1991)], valamint az apoptózis indukciójában [Yonis-Rouach és munkatársai (1991)], Shaw és munkatársai (1992)].
Ismeretesek különböző p53-allélok, amelyekben egyetlen bázis szubsztitúciója olyan proteinek expresszióját eredményezi, amelyek a p53-proteintől teljesen eltérő növekedésszabályozó tulajdonságokat mutatnak, ami végül is rosszindulatú betegségekhez vezet [Hollstein és munkatársai (1991)]. A gyakori emberi rákbetegségek esetében a leggyakrabban mutáción átesett génként a p53-gént azonosították [Hollstein és munkatársai (1991); Weinberg (1991)], és azt találták, hogy nagymértékben összefügg a cigarettafüsttel kapcsolatos rákokkal [Hollstein és munkatársai (1991); Zakut-Houri és munkatársai (1985)]. A p53 túlexpresszálását emlőtumorokban szintén leírták [Casey és munkatársai (1991)].
A rákos betegségek génterápiájának egyik leginkább érdeklődésre számot tartó módja a tumorszuppresszor-gének (mint például a p53) alkalmazását foglalja magában. Beszámoltak arról, hogy a vad típusú p53gén bizonyos típusú emlőrák- vagy tüdőráksejtekbe történő transzfektálása helyreállíthatja a növekedésgátló kontrollt [Casey és munkatársai (1991); Takahasi és munkatársai (1992)]. Bár a DNS-transzfekció a páciensek sejtjeibe történő DNS-bevitel céljára nem alkalmazható, ezek az eredmények azt mutatják, hogy a vad típusú p53-gén - mutáción átesett p53-gént tartalmazó - ráksejtekbe történő bevitele a rák hatásos kezelési eljárása lehet, ha sikerül kifejleszteni a p53-gén bevitelének javított eljárását.
A tumorszuppresszió céljára alkalmas génterápiában alkalmazható génbeviteli rendszerek vizsgálata és kifejlesztése jelenleg is folyamatban van. A víruson alapuló génbeviteli hordozók különösen jelentősek, mivel a vírusok hatékonyan képesek megfertőzni az élő sejteket, mely folyamat során maga a virális genetikai anyag kerül be a sejtekbe. Ezen a területen tapasztalható némi fejlődés; például, különböző gének bevitele céljából - génsebészeti eljárásokkal - retrovírusvektorokat alakítottak ki. A retrovírusvektorok génterápiában történő alkalmazásával kapcsolatban jelentős problémák merülnek fel, mivel fertőzőképességük a célsejtekben a retrovírus-receptorok hozzáférhetőségétől függ; koncentrálásuk és tisztításuk bonyolult; és csak a replikációt mutató sejtekbe épülnek be hatékonyan.
HU 221 279 Β1
A klinikai onkológia egyik fő problémáját a tumorsejtek kemoterápiás gyógyszerekkel szembeni rezisztenciája képezi. A nem kissejtes tüdőrák („non-smallcell lung cancer”; NSCLC) a tüdőrákos esetek legalább 80%-át teszi ki; az ilyen tüdőrákban szenvedő betegek azonban nem fogékonyak a kemoterápiára [Doyle (1993)]. Jelenleg a rákkutatás egyik célja a génhelyettesítéses terápia (rákos betegségekre vonatkozó) hatékonysága javítási lehetőségeinek feltárása a géntermék és a kemoterápiás hatóanyag közötti kölcsönhatás vizsgálatával. A herpes simplex-timidin-kináz (HS-tK.) gén
- retrovirális vektorrendszer alkalmazásával - agytumorba történő bevitelével sikeresen indukálták a tumorsejtek „ganciclovir” nevű antivirális szerre vonatkozó érzékenységét [Culver és munkatársai (1992)]. A HstK-géntermék egy exogén virális enzim, míg a wt-p53protein [vad típusú („wild type”) p-53-protein] normális szövetekben expresszálódik, ami azt sugallja, hogy a kemorezisztencia - wt-p53-expresszió megváltoztatásával történő - módosítása (az endogén genetikai program közvetítette reakcióutat felhasználó) alternatív megoldást képezhet.
Az in vivő génbevitel terén az adenovírusrendszerek potenciális előnyöket (például nagy vírustitert, nagy fertőzési hatékonyságot) biztosítanak, és számos sejttípus megfertőzésére képesek. A bevitt gén expressziójának stabilitása és időtartama azonban továbbra is kérdéses. A kemoterápiás szerekre érzékeny sejtekben a p53-szint növekedése a DNS-károsító stimulusok megjelenését követő hat órán belül bekövetkezik [Fritsche és munkatársai (1993); Zhan és munkatársai (1993)], bár a fokozott p53-DNS-kötődési aktivitás a stimulusok megszűnése után négy óra alatt lecsökkenhet [Tishler és munkatársai (1993)]. Ilyenformán, a p53-expresszió magas szintje még a gyógyszer adagolásának befejezése után is fenntartható. A wt-p53-protein
- p53-adenovírus által történő - expresszálódása a fertőzés utáni 3. napon éri el maximumát (amely 14-szer nagyobb, mint az endogén vad típusé), és a 9. napon csökken alacsony szintre [Zhang és munkatársai (1993)]. Ez arra utal, hogy ráksejtekben a wt-p53-expresszió ideiglenes, magas szintje elégséges a citotoxikus program beindítására.
A p53 - kemoszenzitivitási determinánsként - fontos szerepet játszik az emberi tüdőráksejtekben. Az emberi nem kissejtes tüdőrák (NSCLC) esetében számos kezelési eljárást alkalmaztak, beleértve a sebészeti beavatkozást, kemoterápiát és sugárkezelést, de hosszú időtartamú túlélési rátát nem sikerült elérni. Olyan kombinált terápiára van szükség, amely - önmagában vagy kiegészítő kezelésként - a primer tumor eltávolítása utáni helyi kiújulás megakadályozására vagy a gyógyszerrezisztens primer, metasztázisos vagy helyileg kiújult tüdőrákban a károsodott szövetbe történő injektálás formájában alkalmazható. A készítmények és eljárások szintén fejlesztésre szorulnak, hogy feltárjuk és javítsuk a rák kezelésére alkalmas új készítmények klinikai alkalmazhatóságát. Ezenfelül, ezeknek az eljárásoknak és készítményeknek értéküket in vivő alkalmazás során kell bizonyítaniuk.
Felismertük, hogy olyan javított terápiás készítményekre van szükség, amelyek - egy tumorszuppresszorgén vagy -protein és egy DNS-károsító ágens vagy faktor hatásainak kombinálása révén - sejtek elpusztítására alkalmazhatók. A találmány kidolgozása során célul tűztük ki olyan készítmények és eljárások kifejlesztését, amelyek - vírus közvetítette génbevitel felhasználásával - vad típusú tumorszuppresszorgén (mint például a p53) expresszálódásának célsejtekben történő elősegítésére és DNS-károsító ágens vagy faktor bejuttatására alkalmazhatók. Váratlan módon azt találtuk, hogy a találmány szerinti készítmények alkalmazásával - a célsejtek igen jelentős hányadában - programozott sejtpusztulást (apoptózist) indukálhatunk.
A találmány szerinti megoldás alkalmazásával a sejtek - és különösen a tumorsejtek - növekedésének kontrollálásában figyelemre méltó hatásokat mutattunk ki. A tumorsejtképződés és -növekedés (ami „transzformáció” néven is ismert) a sejtosztódást kontrolláló képességüket elvesztett - vagyis rákos - sejtek képződését és proliferációját jelenti. A találmány szerinti eljárások és készítmények potenciális célpontját képezi számos, különböző típusú transzformált sejt, mint például a szarkómák, melanomák, limfómák, a különböző típusú kemény tumorok és hasonlók. Célszövetként bármilyen - rosszindulatú sejtnövekedést mutató - szövet alkalmazható, de a találmány szerinti megoldás előnyösen tüdő- és emlőszövet esetén hatásos. A találmány leírásában feltárjuk, hogy egy p5 3-expresszáló rekombináns bejuttató vektor - DNS-károsító ágenssel együtt alkalmazva - jelentős mértékben csökkentette a sejtek növekedési sebességét.
A találmány tárgyát eljárások képezik sejt vagy sejtek - például malignus sejt vagy sejtek - elpusztítására, melyek során egy sejtet vagy sejtpopulációt p53-proteinnel vagy -génnel, valamint egy vagy több DNSkárosító ágens - sejt(ek) elpusztítására hatásos, kombinált mennyiségben - érintkeztetünk vagy a sejtet vagy sejtpopulációt ilyen anyagok hatásának teszünk ki. Szintén a találmány tárgyát képezik az ilyen eljárásokban alkalmazható készítmények. A találmány szerinti megoldás alkalmazásával elpusztítható sejtek közé tartoznak, például, a nem kívánatos, de jóindulatú sejtek, mint például a jóindulatú prosztatahiperplázia-sejtek vagy a túlzott aktivitású pajzsmirigysejtek; az autoimmun betegségekben szerepet játszó sejtek, mint például - az artritis, lupus, myasthenia gravis, pikkelyes metaplázia, diszplázia és hasonló betegségek kialakulásában szerepet játszó - B-sejtek. Bár a találmány szerinti megoldás általánosan valamennyi nemkívánatos sejt elpusztítására alkalmas, elsősorban a malignus sejtek elpusztítására alkalmazható. A „malignus sejtek” kifejezésen olyan sejteket értünk, amelyek elvesztették sejtosztódási ciklusuk irányítási képességét, ami „transzformáit” vagy „rákos” fenotípust eredményez.
A sejtek - mint például a malignus vagy metasztázisos sejtek - találmány szerinti eljárások és készítmények alkalmazásával történő elpusztítása céljából rendszerint egy „célsejtet” p53-protein vagy -gén, valamint legalább egy DNS-károsító ágens - sejt elpusztítá3
HU 221 279 Bl sára hatásos - kombinált mennyiségével érintkeztetünk. Az eljárás során a sejteket a p53-proteinnel vagy -génnel és a DNS-károsító ágenssel (ágensekkel) vagy faktorral (faktorokkal) egyszerre érintkeztetjük. Ezt úgy valósíthatjuk meg, hogy a sejteket egyetlen készítménnyel vagy gyógyászati készítménnyel érintkeztetjük, amely mindkét ágenst tartalmazza, vagy más módon, a sejteket egyszerre két független készítménnyel vagy gyógyászati készítménnyel érintkeztetjük, mely készítmények közül az egyik a p53-proteint vagy -gént, a másik pedig a DNS-károsító anyagot tartalmazza.
Természetesen szintén a találmány tárgyát képezi az olyan eljárás, melynek során a célsejtet először a DNS-károsító ágens(ek) hatásának vetjük alá, majd a p53-proteinnel vagy -génnel érintkeztetjük (vagy fordítva). A találmány olyan megvalósítási módjai értelmében, melyek során a DNS-károsító ágenst és a p53-proteint vagy -gént egymástól függetlenül juttatjuk el a sejthez, biztosítani kell azt, hogy az egyes anyagok bevitele között ne teljen el túl sok idő, hogy a DNS-károsító ágens és a p53 ki tudja fejteni együttes, kombinált hatását a sejtre. Ilyen esetekben a sejtet körülbelül 12-24 órán belül, előnyösen 6-12 órán belül kell érintkeztetni a két különböző ágenssel; legelőnyösebb a körülbelül 12 órás eltérés.
Az „érintkeztetjük” és „hatásának vetjük alá” kifejezések - amennyiben egy sejttel összefüggésben alkalmazzuk - arra a folyamatra vonatkoznak, amellyel a tumorszuppresszorgént vagy -proteint (például p53) és a DNS-károsító ágenst vagy faktort a célsejtbe juttatjuk vagy a célsejttel közvetlen érintkezésbe hozzuk. A sejt elpusztításának megvalósítása érdekében mindkét ágenst olyan kombinált mennyiségben juttatjuk a sejtbe, amely hatásos annak elpusztítására, vagyis programozott sejtpusztulás vagy apoptózis indukálást eredményez. Az „elpusztítás”, „programozott sejtpusztulás” és „apoptózis” kifejezéseket a találmány leírásában egymás szinonimáiként, olyan intracelluláris események leírásaként alkalmazzuk, amelyek a célsejt pusztulásához vezetnek. A sejtpusztulás folyamata intracelluláris proteázok és nukleázok aktiválását foglalja magában, ami például a sejtmag visszafejlődését és a sejtmagi DNS fragmentálódását eredményezi. A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításához nem szükséges a különböző intracelluláris molekulák - sejtpusztulás eredményező - kölcsönhatásai pontos mechanizmusának ismerete.
A DNS-károsító ágensek vagy faktorok - a találmány értelmében - olyan kémiai vegyületek vagy kezelési eljárások, amelyek egy sejtben alkalmazva DNSkárosodást okoznak. Az ilyen ágensek és faktorok közé tartoznak a DNS-károsodást eredményező sugárzások és hullámok, mint például a γ-sugárzás, röntgensugarak, UV-fény, mikrohullámok, elektronemisszió és hasonlók. Számos kémiai vegyület létezik (melyeket kemoterápiás szereknek is nevezünk), amelyek DNSkárosodást indukálnak. A találmány szerinti kombinált kezelési eljárásokban az ilyen vegyületek mindegyike alkalmazható. A találmány értelmében alkalmazható kemoterápiás szerek közé tartozik, például, az adriamicin,
5-fluor-uracil (5FU), etoposid (VP-16), camptothecin, aktinomicin-D, mitomicin-C, cisplatin (CDDP), sőt, a hidrogén-peroxid. Szintén a találmány tárgyát képezik az egy vagy több DNS-károsító ágens (függetlenül attól, hogy azok sugárzáson alapuló faktorok vagy tényleges vegyületek) kombinációjának alkalmazásával - például, a röntgensugárzás cisplatinnal vagy a cisplatin etoposiddal együttes alkalmazásával - végzett eljárások. A találmány bizonyos megvalósítási módjai szerint, DNS-károsító anyagként különösen előnyös a cisplatin - p53-proteinnel vagy -génnel együttes - alkalmazása.
Egy sejt p53-proteinnel történő érintkeztetésére bármilyen eljárás alkalmazható, azzal a feltétellel, hogy az alkalmazott eljárás a sejten belül fokozott mennyiségű, funkcionális p53-protein jelenlétét biztosítja. Amennyiben a protein bejuttatását olyan tényezők hátráltatják, mint a protein lebomlása vagy alacsony szintű celluláris felvétele, előnyösen olyan rekombináns vektor alkalmazható, amely p53-proteint expresszál.
A p53-protein expresszáltatása céljából számos különböző rekombináns plazmid és vektor állítható elő, melyek a p53-protein sejtbe történő bevitelére alkalmazhatók. Az ilyen plazmidok és vektorok közé tartoznak a genetikai anyag sejtbe történő, közvetlen bevitelére alkalmazható csupasz DNS-ek és p53-plazmidok [Wolfe és munkatársai (1990)]; a liposzómákba [Ledley és munkatársai (1987)] vagy virális „envelope”-receptorproteineket tartalmazó proteoliposzómákba [Nicolau és munkatársai (1983)] zárt - p53-at kódoló - DNS; valamint a polilizin-glikoprotein hordozókomplexhez kapcsolt - p53-at kódoló - DNS.
A találmány bizonyos megvalósítási módjai szerint a találmány szerinti eljárásokban - a p53 expresszálása érdekében manipulált - rekombináns vírusokat alkalmazunk. Számos különböző vírusvektor, mint például a retrovírusvektorok, a herpes simplex vírus [5,288,641 számú egyesült államokbeli közzétételi irat, melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni], citomegalovírus, stb, alkalmazható [ld. Miller (1992)], alkalmazhatók továbbá rekombináns adenoasszociált vírusok (AAV-vektorok) [ld. 5,139,941 egyesült államokbeli közzétételi irat, melyet teljes terjedelmében a ki tanítás részének kell tekinteni], és előnyösen rekombináns adenovírusvektorok. A hibás replikációjú, fertőzőképes vírusok előállítási eljárásai szakember számára jól ismertek [ld. például Ghosh-Choudhury és Graham (1987); McGrory és munkatársai (1988); és Gluzman és munkatársai (1982), melyek források mindegyikét teljes terjedelmükben a kitanítás részének kell tekinteni],
A találmány szerinti megoldás értelmében, egy sejt elpusztítása céljából a sejtet általában p53-protein vagy -gén és egy DNS-károsító ágens - sejt elpusztítására hatásos - kombinált mennyiségével érintkeztetjük. A „sejt elpusztítására hatásos, kombinált mennyiség” kifejezésen azt értjük, hogy a p53 és a DNS-károsító ágensek mennyisége elégséges ahhoz, hogy a sejten belül összekeveredve a sejt apoptózisát indukálják. Bár nem mindegyik megvalósítási módban szükséges, a
HU 221 279 Β1 p53 és a DNS-károsító ágens kombinált, hatásos mennyisége előnyösen olyan mennyiség, amely lényegesen nagyobb mennyiségű sejtpusztulást eredményez, mint akármelyik, önmagában alkalmazott komponens, és legelőnyösebben, a kombinált, hatásos mennyiség olyan mennyiség, amely - az önmagukban alkalmazott komponensekkel összehasonlítva - szinergikus sejtpusztulást indukál.
A találmány szerinti készítmények és eljárások által kifejtett hatás meghatározására számos in vitro paraméter alkalmazható. E paraméterek közé tartozik, például, a nettó sejtszám megfigyelése a készítménnyel végzett kezelés előtt és után, valamint a kialakult, soksejtes tumorszferoidok (például tumortenyészetben képződött telepek) méretének megfigyelése. Az in vitro sejtpusztítást részletesen a 7. példában mutatjuk be. Más lehetőség szerint, mérhetünk olyan paramétereket is, amelyek a programozott sejtpusztulás folyamatában lévő sejtre utalnak [pl. a celluláris genomiális DNS nukleoszóma méretű fragmensekké történő darabolódása, amit általában a ffagmensek agarózgél-elektroforézises elválasztásával, a DNS festésével és a DNS-molekulatömeg-markerrel (DNS-méretlétra) történő - összehasonlításával azonosítunk]. A nukleoszóma méretű fragmenseket a körülbelül 200 bázispáros monomerek és a monomerekből álló multimerek által képzett „méretlétra” fokainak megfelelő sávokkal összehasonlítva azonosítottuk.
Hasonlóan, a „gyógykezelési szempontból hatásos mennyiség” a p53-protein vagy -gén és a DNS-károsító ágens olyan mennyisége, amely - egy állatnak együttesen beadva - az állatban hatásos bizonyos sejtek elpusztítására. Ennek egyik jó bizonyítéka a tumort hordozó állatban vagy emberben lévő ráksejtek (például tüdőrák-, emlőrák- vagy vastagbélráksejtek) elpusztítása. A „gyógykezelési szempontból hatásos kombinációk” kifejezés általában a p53 és a DNS-károsító ágensek olyan kombinált mennyiségére vonatkozik, amely több sejtet pusztít el, mint az egyes komponensek különkülön; a kifejezés előnyösen olyan kombinált mennyiségre vonatkozik, amely a tumorterheltség szinergikus csökkentését eredményezi.
Ilyenformán, a sejtpusztulás bizonyos in vivő és ex vivő paramétereinek tanulmányozása hatásos módszert biztosít a találmány szerinti készítmény és eljárások hatékonyságának értékelésére. Ilyen módszer például a tumorképző képesség gátlására kifejtett hatások megfigyelése fagyasztott szövetmetszetek TdT (terminális dezoxinukleotidil-transzferáz)-expressziója alapján vagy más - patológus számára ismert - festési eljárások és célantigének alkalmazásával. A célsejtek pusztulásának értékelésére természetesen más - tumortömeg, tumomövekedés és -életképesség meghatározásán alapuló - módszerek is alkalmazhatók. A sejtpusztító hatások a rák különböző állatmodelljeiben (köztük olyanokban, amelyekben emberi ráksejtek vannak elhelyezve az állatban) is értékelhetők. Ismert, hogy a rák állatmodelljeiben kapott eredményekből (eltérően az AIDS állatmodelljeitől) jó következtetések vonhatók le az emberi kezelési rendszerekre vonatkozóan [Roth és munkatársai (szerkesztők, 1989)]. A következtetések levonására alkalmas állatmodellek egyik példája az az állatmodell, amelyben emberi kissejtes tüdőráksejteket (H358-sejteket) szubkután szaporítunk. Kimutattuk, hogy e rendszer alkalmazásával a - kemoterápiás szerrel együtt „inrtatumorálisan” beadott -, p53-at hordozó adenovírus a tumor méretének meglepően hatásos csökkentését eredményezi.
Egy p53-protein sejtbe történő bevitelének különösen előnyös eljárása során a sejtet rekombináns adenovírus virionjával vagy vírusrészecskéjével érintkeztetjük, amely - az adott sejttípusban az expresszió irányítására képes promoter szabályozása alá helyezett - p53expressziós régiót tartalmazó rekombináns adenovírusvektort tartalmaz.
A vektorban lévő p53-expressziós régió tartalmazhat genomiális szekvenciát, de az egyszerűség kedvéért előnyösen p53-cDNS-szekvenciát alkalmazhatunk, mivel az könnyen hozzáférhető, és könnyebben manipulálható. A vektor - a p53-expressziós régió és a promoterrégió mellett - általában poliadenilációs szignált is tartalmaz (például SV40-gén vagy protamingén korai poliadenilációs szignálját, stb.).
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a p53-expressziós régiót erős konstitutív promoter [pl. CMV-promoter, virális hosszú terminális ismétlődés (LTR), RSV- vagy SV40-promoter] vagy emlősejtekben magas szinten expresszálódó génekkel asszociált promoterek (például elongációs faktor-1 vagy aktin-promoter) irányítása alá helyezzük. A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításában valamennyi ilyen változat alkalmazható. Jelenleg különösen előnyösen alkalmazható a citomegalovírus (CMV) IE-promotere.
A p53-gént vagy -cDNS-t - a találmány szerinti megoldás értelmében - úgy vihetjük be rekombináns adenovírusba, hogy a p53-kódolószekvenciát egyszerűen a vírusgenomba inszertáljuk. Előnyösen hibás replikációjú adenovírusokat alkalmazunk, amelyekben a replikációhoz és/vagy a csomagolódáshoz („packaging”) nélkülözhetetlen vírusgén hiányzik, lehetővé téve, hogy a p53-expressziós régiót a helyére inszertáljuk. Az adenovírus-vektorkonstrukcióból delécióval bármilyen gén - függetlenül attól, hogy a replikációhoz nélkülözhetetlen (például El A, E1B, E2 és E4) vagy sem (például E3) - eltávolítható, és p53-expressziós régióval helyettesíthető. Különösen előnyösek azok a vektorok és virionok, amelyekből az adenovírus-vektor El A- és ElB-régiója van eltávolítva, és helyükön p53-expressziós régiót tartalmaznak (ld. 1. ábra).
A hibás replikációjú adenovírusok előállítási eljárásai jól ismertek [ld. például Ghosh-Choudhury és Graham (1987): McGrory és munkatársai (1988); Gluzman és munkatársai, mely forrásokat teljes terjedelmükben a kitanítás részének kell tekinteni]. Szintén jól ismert, hogy a rekombináns adenovírusok szaporítása céljából különböző sejtvonalak alkalmazhatók, feltéve, hogy kijavítják az esetlegesen előforduló replikációs hiányosságot. Előnyösen alkalmazható az emberi 293-sejtvonal, de a replikációt elősegítő (azaz, előnyös esetben ElA-t vagy ElB-t expresszáló) bármilyen más sejtvonal is alkalmazható. A sejtek - a vírustörzsek ki5
HU 221 279 Β1 nyerése érdekében - műanyag csészékben vagy szuszpenziós tenyészetben egyaránt tenyészthetők.
A találmány szerinti megoldás nem korlátozódik kizárólag az El-hiányos vírus és az El-expresszáló sejtek alkalmazására; a találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósítása során a vírusok és gazdasejtek bármilyen kiegészítő kombinációi alkalmazhatók. A funkcionális E2-gént nem tartalmazó vírus E2-gént expresszáló sejtekkel együtt, a funkcionális E4-gént nem tartalmazó vírus E4-gént expresszáló sejtekkel együtt, stb. alkalmazható. Amennyiben olyan gént távolítunk el, illetve helyettesítünk, amely a replikációhoz nem nélkülözhetetlen (ilyen például az E3-gén), nincs szükség arra, hogy ezt a hiányosságot a gazdasejt specifikusan kompenzálja.
A találmány szerinti megoldás sikeres gyakorlati megvalósítása szempontjából - az adenovírus-vektorok azon tulajdonságán kívül, hogy a p53-gén expresszáltatása érdekében manipulálhatók legyenek - a kiindulási adenovírus természete nem kulcsfontosságú tényező. Kiindulási adenovírusként a 42 különböző szerotípus vagy az Α-Εψ alcsoportok bármelyikébe tartozó vírus alkalmazható. A találmány szerinti eljárásban történő alkalmazás szempontjából - feltételesen hibás replikációjú adenovírus-vektor előállítása érdekében - kiindulási vírusként előnyösen a C-alcsoport 5. típusába tartozó adenovírust alkalmazzuk, mivel az 5. típusba tartozó adenovírus egy emberi adenovírus, amelyről jelentős mennyiségű biokémiai és genetikai információk ismeretesek, és korábban ezt a típust alkalmazták leggyakrabban a vektorként adenovírust tartalmazó konstrukciók előállítására.
A találmány szerinti eljárások és készítmények sejt vagy sejtek elpusztítására in vitro és in vivő egyaránt alkalmasak. Amennyiben az elpusztítani kívánt sejtek egy állaton belül találhatók, például tüdőrák-, emlőrák-, vagy vastagbélráksejtekben vagy más - p53-mutációt hordozó - sejtekben, a p53-proteint vagy -gént és a DNS-károsító ágenst egyaránt gyógyászati szempontból elfogadható alakban adjuk be az állatnak. A „gyógyászati szempontból elfogadható alak” kifejezésen, ahogy itt használjuk, valamilyen készítmény állatoknak beadható alakját, valamint az állat sugárzással történő érintkeztetésének módját, vagyis azt a módot értjük, amellyel egy állat testének bizonyos területét - például γ-sugárzással, röntgensugárzással, UV-fénnyel, mikrohullámokkal, elektronemisszióval, stb. - sugározzuk be. A DNSkárosító sugárzások és hullámok alkalmazása sugárterápiában jártas szakember számára ismert.
A találmány tárgyát képezik a rák kezelésének előnyös eljárásai is, amelyek rendszerint abból állnak, hogy egy állatot vagy embert egy p53-protein vagy -gén és egy DNS-károsító ágens terápiás szempontból hatásos kombinációját adjuk be, amit olyan rekombináns vírus - előnyösen adenovírus - alkalmazásával hajthatunk végre, amely a tumorsejtekben p53-at expresszálni képes vektort hordoz. A p53-gént bejuttató készítményt általában - gyakran a tumorral közeli kontaktusban - gyógyászati szempontból elfogadható alakban adhatjuk be az állatnak. Az egyik előnyös eljárás szerint a (például rekombináns vírusba foglalt) p53-gén gyógykezelési szempontból hatásos mennyiségét közvetlenül a tumor helyére injektáljuk. A találmány szerinti megoldás értelmében egyéb parenterális beadási módok (például intravénás, perkután, endoszkópos vagy szubkután injektálásos beadás) is alkalmazhatók.
A rák találmány szerinti megoldás szerinti kezelése során a tumorsejteket - a p53-proteinen vagy -génen kívül - DNS-károsító ágenssel hozzuk érintkezésbe. Ezt úgy valósíthatjuk meg, hogy a lokalizált tumort DNSkárosító sugárzással (például röntgensugarakkal, UVfénnyel, γ-sugárzással vagy mikrohullámokkal) sugározzuk be. Más lehetőség szerint, a tumorsejteket úgy érintkeztethetjük a DNS-károsító ágenssel, hogy az állatnak - DNS-károsító vegyületet, például adriamicint, 5-fluor-uracilt, etoposidot, camptothecint, aktinomicinD-t, mitomicin-C-t vagy előnyösebben, cisplatint tartalmazó - gyógyászati készítmény gyógykezelési szempontból hatásos mennyiségét adjuk be. A DNS-károsító ágenst - p53-proteinnel, -génnel vagy génbeviteli rendszerrel kombinálva - kombinált gyógyászati készítményként vagy reagenskészletként alkalmazhatjuk.
A találmány szerinti megoldás meglepő sikerét bizonyítja, hogy az Ad5CMV-p53-vírus cisplatinnal együttes alkalmazásával - csupasz egér modellel végzett vizsgálatokban - jó eredményeket kaptunk. A vírus DNS-károsító ágenssel együttes alkalmazásával végzett terápia jelentős mértékben gátolta a H358-sejtek (melyek normális esetben nagymértékű tumomövekedést eredményeznek) tumorképző sajátosságát. A tüdőráksejtek tumorképző sajátságát az Ad5CMV-p53-vírussal végzett kezelés gátolta, a luciferázt expresszáló kontrolivírussal végzett kezelés azonban nem, ami arra utal, hogy a DNS-károsító ágenssel együttesen alkalmazott p53-protein jelentős terápiás hatékonyságú.
A kemoterápiás készítmények (beleértve a DNSexpressziós konstrukciókat) eukarióta sejtekbe történő bevitelére számos eljárás ismert. A találmány leírása alapján a DNS-károsító ágensek és a p53-proteinek vagy -gének - különböző, hatásos módszerekkel - bejuttathatok a sejtekbe.
A DNS in vivő bevitele céljából bármilyen génbeviteli rendszer (például vírus és liposzóma közvetítette transzfekció) alkalmazható. Ahogy itt használjuk, a „transzfekció” kifejezésen a DNS - beviteli rendszerek (például, adenovirális, AAV, retrovirális rendszerek vagy plazmidok) alkalmazásával - eukarióta sejtekbe történő, irányított bejuttatását értjük. A virális génbevitel specifitása úgy választható meg, hogy a gént specifikusan egy adott célsejtbe irányítsa, például olyan vírusok alkalmazásával, amelyek adott sejttípusok megfertőzésére képesek. Természetesen a különböző vírusgazdák határozzák meg a génbevitelhez kiválasztandó vírust, illetve az adott malignus sejttípus elpusztítása érdekében expresszáltatni szükséges tumorszuppresszorgén kiválasztását.
A DNS-károsító kemoterápiás szer számos különböző módon adható be, például, parenterális módszerekkel (intravénás és szubkután injekciókkal) és hasonlókkal. Az ilyen eljárások szakember számára ismertek;
HU 221 279 Bl részletesebb leírásukat a gyógyászati készítményekre és kezelésre vonatkozó részben ismertetjük.
Az in vitro génbevitel céljára számos különféle eljárás alkalmazható, mint például a kalcium-foszfát vagy dextrán-szulfát közvetítette transzfekció; elektroporáció; üveglövedékes célbajuttatás; és hasonlók. Ezek az eljárások szakember számára ismertek; az eljárásokban alkalmazott készítmények pontos összetétele és az eljárások végrehajtása a találmány leírása alapján kézenfekvő.
A találmány egyéb megvalósítási módjait olyan készítmények - köztük gyógyászati készítményeket - képezik, amelyek DNS-károsító ágenssel (például cisplatinnal) kombinálva p53-proteint vagy -gént tartalmaznak. Az ilyen készítmények a p53-at DNS-szegmens, rekombináns vektor vagy rekombináns vírus alakjában tartalmazhatják, melyek állati sejtben képesek a p53-protein expresszálására. Ezek a készítmények (beleértve a rekombináns génbeviteli rendszert, például adenovírus-részecskéket tartalmazó készítményeket is) az in vivő beadáshoz - farmakológiai szempontból elfogadható - oldatban vagy pufferben diszpergálva állíthatók elő. Az előnyös farmakológiai szempontból elfogadható - oldatok közé tartoznak a foszfát-, laktát-, Tris-pufferrel vagy hasonló anyagokkal puffereit semleges sóoldatok.
A virális génbeviteli rendszerek alkalmazásakor természetesen szükség van a virion olyan mértékű tisztítására, amely a nem kívánatos szennyezésektől (például a hibás, zavaró vírusrészecskéktől vagy endotoxinoktól és más pirogénektől) mentessé teszi, hogy a vektorkonstrukcióval kezelt sejtben, állatban vagy emberben ne alakuljanak ki kellemetlen mellékreakciók. A vektor tisztításának egyik előnyös módja sűrűséggradiens alkalmazását foglalja magában (például cézium-klorid sűrűséggradiens-centrifugálás).
A találmány szerinti előnyös gyógyászati készítmények közé azok a készítmények tartoznak, amelyek farmakológiai szempontból elfogadható - oldatban vagy pufferben p53-proteint (vagy előnyösebben p53gént), valamint kemoterápiás DNS-károsító ágenst tartalmaznak. Az alkalmazható kemoterápiás ágensek példái közé tartozik az adriamicin, 5-fluor-uracil, camptothecin, aktinomicin-D, hidrogén-peroxid, mitomicinC, cisplatin (CDDP) és etoposid (VP-16), melyek közül különösen előnyös a cisplatin alkalmazása.
A találmány további megvalósítási módjait sejtek (például malignus sejtek) elpusztítására alkalmas reagenskészletek képezik, amelyek terápiás reagenskészletekként előállítva rákbetegségek kezelésére alkalmazhatók. A találmány szerinti reagenskészletek rendszerint - megfelelő tartályokban - (állati sejtben egy p53proteint expresszálni képes) rekombináns vektort tartalmazó gyógyászati készítményt, valamint egy DNS-károsító ágenst tartalmazó gyógyászati készítményt tartalmaznak. A rekombináns vektorok és a DNS-károsító ágensek elhelyezhetők egy közös tartályban, illetve különálló vagy elkülönített tartályokban. A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint rekombináns vektorként egy p53-proteint expresszáló - adenovírus-részecskében lévő - adenovírus-vektort, DNS-károsító ágensként pedig cisplatint alkalmazunk.
A reagenskészlet komponenseit előnyösen folyékony oldatként vagy száraz porként prezentáljuk. Amennyiben a komponensek folyékony oldatban vannak, oldatként vizes oldatot, előnyösen steril vizes oldatot alkalmazunk. Ha a reagensek vagy komponensek száraz por alakúak, a porból megfelelő oldószer hozzáadásával állíthatunk elő oldatot; ilyen esetben az oldatot egy másik tartályban helyezhetjük el.
A következőkben a mellékelt ábrák rövid leírását ismertetjük. Ezek az ábrák a találmány leírásának részét képezik, és - a specifikus megoldási módok részletes leírásával együttesen - a találmány szerinti megoldás jobb megértését teszik lehetővé.
Az 1. ábrán a rekombináns p53-adenovírus előállításának vázlatát mutatjuk be. A p53 expressziós kazettát a pXCJL.l-vektor Xbal- és Clal-helyei közé inszertáltuk. A p53 expressziós vektort (pEC53) és a rekombináns pJM17-plazmidot együttesen 293-sejtekbe transzfektáltuk. A transzfektált sejteket a citopátiás hatás megjelenéséig a tápközegben tartottuk. Az újonnan képződött, rekombináns p53-adenovírusok (Ad5CMV-p53) azonosítását a DNS PCR-analízisével végeztük, amihez a proteináz-K-val kezelt és fenollal extrahált CPE-felülúszókból kivont DNS-templátokat alkalmaztuk.
A 2A. ábrán az Ad5CMV-p53-DNS strukturális analíziséhez alkalmazott térképet mutatjuk be, amelyen feltüntettük a p53 expressziós kazetta, a PCR-láncindítók és a restrikciós helyek elhelyezkedését. A genom mérete körülbelül 35,4 kb, melyet 100 térképegységre osztottunk (egy térképegység=0,35 kb). Az Ad5-genom Elrégióját (1,3-9,2 térképegység) a p53 expressziós kazetta helyettesíti. Az 1. láncindító a humán CMV fő IEgénjének promoterétől 3’-irányban lévő első intronban helyezkedik el, míg a 2. láncinditó az SV40 korai poliadenilációs szignálban található. Mindkét láncindító
- a p53-cDNS mindkét végétől 15-20 bp távolságban
- 1,40 bp-os PCR-terméket határoz meg. A 3. és 4. láncindító az Ad5-genom 11-es, illetve 13,4-es térképegységénél helyezkedik el, s egy 0,86 kb-os vírusgenom-specifikus PCR-terméket határoznak meg.
A 2B. ábrán a PCR-termékek agarózgél-analízisének eredményeit mutatjuk be. Valamennyi reakcióban az 1,4 kb-os (p53), illetve 0,86 kb-os (Ad5) DNSfragmenst meghatározó két láncindító párt alkalmaztuk. Az egyes reakciókban templát-DNS-ként pEC53plazmidot (1. oszlop), Ad5/RSV/GL2-DNS-t (2. oszlop) és Ad5CMV-p53-DNS-t (4. oszlop) alkalmaztunk. Az „M” jelű oszlop a molekulatömeg-markereket tartalmazza.
A 2C. ábrán az AdCMV-p53-DNS restrikciós térképezésének eredményét mutatjuk be. A CsCl-gradiens alkalmazásával tisztított Ad5CMV-p53-DNS-mintákat enzim nélkül (U), HindlII-mal (H), BamHI-gyel (B), EcoRl-gyel (E) és Clal-gyel (C) emésztettük, és az emésztett mintákat 1%-os agarózgélen analizáltuk. Az M jelű oszlopok a molekulatömeg-markereket tartalmazzák.
A 3A., 3B., 3C. és 3D. ábrákon a 293-sejteken megfigyelt, rekombináns adenovírus okozta, citopátiás hatásokat (CPE) mutatjuk be (400-szoros nagyítású
HU 221 279 Bl fáziskontraszt-mikroszkópos képek). A 3A. ábrán a transzfekció előtti állapot; a 3B. ábrán a negatív kontroll (a transzfekció utáni 12. napon); a 3D. ábrán pedig a CPE kiteljesedése (a transzfekció utáni 14. napon) látható.
A 4A., 4B., 4C. és 4D. ábrán rekombináns adenovírussal fertőzött H358-sejtek immunhisztológiai képeit mutatjuk be (az Ad5CMV-p53-vírus H358-sejtekben mutatott fertőzőképessége). A H358-sejteket 24 óra hosszat, 50 PFU/sejt (PFU: plakk-képző egység) mennyiségben Ad5CMV-p53- vagy Ad5/RSV/GL2vírussal fertőztük. Az álfertőzéshez csak tápközeget alkalmaztunk. A fertőzött sejteket immunfestéssel vizsgáltuk. Az 4A. ábrán az álfertőzéssel kapott eredmény látható, amihez próbaként anti-p53-antitestet alkalmaztunk. A 4B. ábrán a kontroll Ad5/RSV/GL2-vírussal fertőzött sejtek immunhisztológiai képe látható (próbaként anti-p53-antitestet alkalmaztunk). A 4C. ábrán Ad5CMV-p53-vírussal fertőzött sejtek képe látható, melyekhez próbaként MOPC-21-antitestet alkalmaztunk. A 4D. ábrán az Ad5CMV-p53-vírussal fertőzött, próbaként anti-p53-antitesttel tesztelt sejteket mutatjuk be. Az anti-p53-antitest a Pab-1801-antitest volt; a festéshez az avidin-biotin eljárást alkalmaztuk.
Az 5A. ábrán „Coomassie-blue”-val festett SDSPAGE-gélt mutatunk be, amelyen - H358-sejtekben az exogén p53 expressziójának relatív szintjét hasonlítjuk össze. Az Ad5CMV-p53- vagy Ad5/RSV/GL2vírussal 30 PFU/sejt mennyiségben fertőzött H358sejtmintákat a fertőzés után 24 és 72 órával készítettük. Az SDS-poliakrilamid-gél „Coomassie-blue”-festése megmutatja a felvitt proteinminták relatív mennyiségét. Az 1. és 4. oszlop az Ad5/RSV/GL2-vírussal fertőzött sejtek mintáit, a 2. és 3. oszlop a két különböző Ad5CMV-p53-állománnyal fertőzött sejtek (fertőzés után 24 órával készített) mintáit, az 5. és 6. oszlop pedig az AdCMV-p53-vírussal fertőzött sejtek (fertőzés után 72 órával készített) mintáit tartalmazza. A 7. oszlop az álfertőzött H358-sejtek (fertőzés után 72 órával készített) mintáját tartalmazza. Az M oszlop az előre megfestett (kD-ban megadott) molekulatömeg markereket (GIBCO-BRL) tartalmazza.
Az 5B. ábrán az 5A. ábrán bemutatott SDS-PAGEgél oszlopbeosztásával megegyező gél „westem-blot”analízisét mutatjuk be. A p53-expresszió relatív szintjét anti-p53-antitest alkalmazásával végzett „westem-blot”analízissel vizsgáltuk. Primer antitestekként a p53-protein elleni monoklonális antitesteket (Pab-1801; Oncogene Science Inc.), illetve β-aktin elleni monoklonális antitesteket (Amersham Inc.) alkalmaztunk. A tormaperoxidázzal konjugált második antitestet és az ECLelőhívót az Amersham Inc.-tői szereztük be.
A 6. ábrán a p53-expresszió - „westem-blot”-analízissel meghatározott - időbeli lefutását mutatjuk be. Több csészében H358-sejteket Ad5CMV-p53-vírussal fertőztünk (10 PFU/sejt mennyiségben). A sejtlizátumokat a fertőzés után a megjelölt időpontokban állítottuk elő. A „westem-blot”-okat egyidejűleg anti-p53és anti-aktin-antitesttel teszteltük. A 6B. ábrán látható „C” jelzésű oszlopok a negatív kontrollokat reprezentálják. A 6A. ábrán látható hisztogram a p53 (denzitométer alkalmazásával meghatározott) relatív mennyiségét mutatja.
A 7A. ábrán vírussal fertőzött, H358-sejtvonalba tartozó humán tüdőráksejtek növekedési görbéit mutatjuk be. A sejteket 105 sejt/csésze mennyiségben 60 mm-es csészékbe helyeztük, és sejtvonalanként hat ilyen csészét készítettünk. 24 óra elteltével a sejteket 10-es fertőzési multiplicitás (m.o.i.; „multiplicity of infection”, azaz PFU/sejt) mennyiségben Ad5CMV-p53- vagy Ad5/RSV/GL2-vírussal fertőztük. A fertőzés után a sejteket hat napig naponta megszámoltuk. A növekedési görbék négy független kísérlet eredményeinek átlagát reprezentálják.
A 7B. ábrán a H322-sejtvonalba tartozó humán tüdőráksejtek növekedési görbéit mutatjuk be. A sejteket 105 sejt/csésze mennyiségben 60 mm-es csészékbe helyeztük, és sejtvonalanként hat ilyen csészét készítettünk. 24 óra elteltével a sejteket 10-es fertőzési multiplicitás (MOI; „multiplicity of infection”, azaz PFU/sejt) mennyiségben Ad5CMV-p53- vagy Ad5/RSV/GL2-vírussal fertőztük. A fertőzés után a sejteket hat napig naponta megszámoltuk. A növekedési görbék négy független kísérlet eredményeinek átlagát reprezentálják.
A 7C. ábrán a H460-sejtvonalba tartozó humán tüdőráksejtek növekedési görbéit mutatjuk be. A sejteket 105 sejt/csésze mennyiségben 60 mm-es csészékbe helyeztük, és sejtvonalanként hat ilyen csészét készítettünk. 24 óra elteltével a sejteket 10-es fertőzési multiplicitás (MOI; „multiplicity of infection”, azaz PFU/sejt) mennyiségben Ad5CMV-p53- vagy Ad5/RSV/GL2vírussal fertőztük. A fertőzés után a sejteket hat napig naponta megszámoltuk. A növekedési görbék négy független kísérlet eredményeinek átlagát reprezentálják.
A 8. ábrán az Ad5CMV-p53 vírus ortotópiás tüdőrákmodellben végzett tesztelésének folyamatábráját mutatjuk be. A H226Br-sejtekkel és vírusokkal beoltott egerek adagolási és a kezelés rendjét a folyamatábrán foglaltuk össze.
A 9A., 9B., 9C. és 9D. ábrákon a kezelt és kontroliegerekből kimetszett tüdő- és mediastinum-mintákat mutatjuk be. Az egereket a kezelés után hat héttel öltük le. A tüdő- és mediastinumszöveteket a tumorképződés értékelése érdekében metszettük ki. A 9A. ábrán normális csupasz egerek mediasztinális blokkjának mintája; a 9B. ábrán hordozóval (PBS) kezelt egerek mediasztinális blokkjának mintája; a 9C. ábrán Ad5CMV-p53vírussal fertőzött egerek mediasztinális blokkjának mintája; a 9D. ábrán pedig Ad5/RSV/GL2-vírussal fertőzött egerek mediasztinális blokkjának mintája látható. A nyilak a tumortömegeket mutatják.
A 10A. ábrán a folyamatosan végzett CDDP-kezelés - eredeti (nem fertőzött), illetve Ad-Luc-vírussal vagy Ad-p53-vírussal fertőzött - H358-sejtek szaporodási sebességére gyakorolt hatását mutatjuk be. A H358sejteket (üregenként 1,5 χ 105 sejt mennyiségben) 24 üregű tálcákra helyeztük (két példányban). 24 óra elteltével a sejtekhez - 100 μΐ tápközegben - Ad-Luc-vírusokat (108 PFU/ml), illetve Ad-p53-vírusokat (108 PFU/ml) adtunk. További 24 órás inkubálás után a vírusokat tar8
HU 221 279 Bl talmazó tápközeget - 10 gg/ml CDDP-t tartalmazó friss tápközeggel helyettesítettük.
A 10B. ábrán a 24 órán át végzett CDDP-kezelés eredeti (nem fertőzött), illetve Ad-Luc-vírussal vagy Ad-p53-vírussal fertőzött - H358-sejtek szaporodási sebességére gyakorolt hatását mutatjuk be. A sejteket 24 óra hosszat CDDP hatásának vetettük alá, majd CDDP-t nem tartalmazó tápközegben regeneráltuk. Az egy sejtrétegként megmaradt, összetapadt sejtek életképességét öt nap elteltével, „trypan-blue” felvételük alapján értékeltük. Az ábrán átlagiszórás értékeket mutatunk be. Az 5. napon az Ad-p53:CDDP csoportban a sejtszám lényegesen eltér a többi csoportban megfigyelt sejtszámtól (mind a 10A., mind a 10B. ábrán; p<0,05, Student-féle t-teszt).
A 10C. ábrán a CDDP különböző koncentrációinak - Ad-p53-vírussal, illetve Ad-Luc-vírussal fertőzött sejtekre gyakorolt hatásait mutatjuk be. A sejteket 24 órás vírusfertőzés után 24 óra hosszat CDDP nélkül, illetve 10 gg/ml vagy 100 gg/ml koncentrációjú CDDPvel kezeltük, majd vizsgáltuk életképességüket.
A 11 A. ábrán - Ad-p53-vírussal fertőzött és CDDPvel kezelt - H358-sejtekben megfigyelhető nukleoszomális DNS-fragmentálódást mutatjuk be. A sejteket a 10. ábra ismertetésében leírtak szerint 24 óra hosszat fertőztük a vírussal, illetve kezeltük a CDDP-vel.
A 11B-11F. ábrákon üreges tárgylemezeken szaporított - 24 órán át Ad-p53-vírussal fertőzött és további 24 órán át CDDP-vel kezelt - H358-sejteket mutatunk be. A sejteket a DNS-fragmentálódás in situ jelölése érdekében rögzítettük. A 11B. ábrán CDDP-vel nem kezelt eredeti (nem fertőzött) H358 sejtek; a 1 IC. ábrán CDDP-vel kezelt eredeti (nem fertőzött) H358-sejtek; a 11D. ábrán Ad-Luc-vírussal fertőzött, CDDP-vel nem kezelt sejtek; a 11E. ábrán Ad-Luc-vírussal fertőzött, CDDP-vel kezelt sejtek; a 11F. ábrán Ad-p5 3-vírussal fertőzött, CDDP-vel nem kezelt sejtek; a 11G. ábrán pedig Ad-p53-vírussal fertőzött, CDDP-vel kezelt sejtek láthatók. A nyílhegy egy sötéten festődött, sejtmagi fragmenst mutat. A méretarányt jelző vonal 100 ginnek felel meg.
A 12A. ábrán az Ad-p53-fertőzés és a CDDPkezelés kombinációjának H358-tumorszferoidok kezelésében kifejtett hatását mutatjuk be. A H358-sejtekből képződött soksejtes tumorszferoidokat korábbi leírás szerint állítottuk elő [ld. Takahashi és munkatársai (1989)]. A 0. napon a 150-200 gm átmérőjű szferiodokat agarral bevont, 24 üregű tálcára helyeztük, és 24 óra hosszat Ad-p53- vagy Ad-Luc-vírussal fertőztük. Az 1. napon - a vírustartalmú tápközeg eltávolítása után - a sejtekhez - 10 gg/ml CDDP-t tartalmazó tápközeget adtunk. A 2. napon (24 órás inkubálás után) a fedőréteget 1 ml friss (CDDP nélküli) tápközeggel helyettesítettük. A szferoidok átmérőjét inverziós mikroszkóp alkalmazásával mértük. A relatív térfogatváltozást a következő képlet szerint számítottuk: a2b/ai2bb ahol „a” a szferoid legkisebb, „b” pedig legnagyobb átmérője, míg „af’ és „bi” az 1. napon mért legkisebb, illetve legnagyobb átmérő. Csak az Ad-p53C.DDP csoportba tartozó szferoidok relatív térfogata kisebb jelentősen a kontroll csoportba tartozó szferoidokénál (p<0,05; Student-féle t-teszt).
A 12B-12E. ábrákon az apoptózis detektálása céljából - TdT-vel végzett - in situ dUTP-jelölés eredményeit mutatjuk be. A H358-szferoidokat a 3. napon rögzítettük, és a 7. példában leírtak szerint festettük. A 12B. ábrán kezeletlen kontrollszferoid; a 12C. ábrán CDDP-vel kezelt szferoid; a 12D. ábrán Ad-p53-vírussal fertőzött szferoid; a 12E. ábrán pedig Ad-p53-vírussal fertőzött és CDDP-vel fertőzött szferoid látható. A méretarányt mutató vonal 100 gm-nek felel meg.
A 13A. ábrán - Ad-p53-vírussal végzett fertőzést követően - az apoptózis CDDP-vel történő indukálását (amit a tumortérfogat változása alapján mértünk) mutatjuk be. 0,1 ml „Hank”-féle egyensúlyi sóoldatban lévő H358-sejteket (5xl06) szubkután nőstény nu/nuBALB/c-egerek jobb oldali lágyékába injektáltunk. Harminc nappal később az 5-6 mm-es átmérőjű tumorokba szubkután 200 gl sóoldatot önmagában, illetve 200 gl - Ad-Luc-vírust (108 PFU/ml) tartalmazó sóoldatot injektáltunk. Az injekciókat közvetlenül a tumorba (100 gl) vagy a tumor két egymással szemközti oldala mellé (50-50 gl) adtuk. Az egerekbe intraperitoneálisan CDDP-t (3 mg/kg), illetve kontroll fiziológiás sóoldatot injektáltunk. A tumorok két, egymásra merőleges átmérőjét (a kezelési csoport ismerete nélkül) mérőkörzővel mértük, és a tumortérfogatot - gömbalakot feltételezve - a keresztmetszeti átmérők szorzatának négyzetgyökeként számítottuk. Mindegyik kísérleti csoportban öt egeret alkalmaztunk, és a grafikonokon átlag ± szórás értékeket mutatunk be. Az adatokat a „Student”-féle t-teszt alkalmazásával analizáltuk. A nyilak a kezelés napját jelölik (az 1. tesztben, az 5. naptól p<0,05; a 2. tesztben a 7. naptól p<0,05).
A 13B-13E. ábrákon a TdT-közvetítette biotindUTP jelölési technika alkalmazásával végzett szövettani vizsgálat eredményeit mutatjuk be. A tumorokat a kezelés kezdete után 5 nappal gyűjtöttük össze, és azonnal „O.C.T.” vegyületbe ágyaztuk. Hidegtermosztátban 5 gm vastagságú fagyasztott metszeteket készítettünk. A metszeteket 1 gg/ml koncentrációjú proteináz-K-val kezeltük, és a 12. ábrával kapcsolatban leírt módon festettük. A 13B. ábrán a csak CDDP-vel kezelt H358-tumor képe; a 13C. ábrán a csak Ad-p53-vírussal kezelt H358-tumor képe; a 13D. és 13E. ábrán pedig a CDDP és Ad-p53-vírus kombinációjával kezelt H358-tumor képe látható (a méretarányt jelző vonalak 0,5 mm-nek felelnek meg. Az állatokról a „UT M. D. Anderson Institutional Animál Care and Use Committee” által meghatározott irányelvek szerint gondoskodtunk.
A) A tüdőrák kifejlődésének molekuláris szintű eseményei
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során végzett vizsgálatainkkal olyan kulcsfontosságú molekuláris eseményeket azonosítottunk, amelyek a rák kifejlődéséhez és előrehaladásához vezetnek. E felismerések olyan eljárások kifejlesztését tették lehetővé, amelyekkel helyreállíthatok bizonyos normális proteinfunkciók, miáltal a malignus fenotípus in vivő gátolható.
HU 221 279 Bl
A leggyakoribb előfordulású tüdőrák (az esetek 80%-a) szövettanilag a nem kissejtes tüdőrák („nonsmall-cell lung cancer”; NSCLC) kategóriába sorolható, s ide tartozik a pikkelyes, az adenokarcinomás és a nagysejtes, differenciálatlan tüdőrák. A tüdőrák molekuláris biológiájáról jelenleg rendelkezésre álló adatok közül sok a ritkább kissejtes tüdőrák („small-cell lung cancer”; SCLC) tanulmányozásából származik. Az SCLC a sejtek neuroendokrin sajátságai alapján különböztethető meg az NSCLC-től; az SCLC nagyon érzékeny a kemoterápiára, de a kezelés után gyorsan kiújul. Az NSCLC más, karcinogénindukálta epiteliális rákok modelljeként is szolgál. A vizsgálatunk során kapott eredmények más típusú epiteliális rákok esetében is felhasználhatók.
Sok bizonyíték áll rendelkezésre arra vonatkozóan, hogy a rosszindulatú átalakulást (transzformációt) genetikai paradigma közvetíti. A ráksejtekben kimutatott fő károsodások a domináns onkogénekben és tumorszuppresszorgénekben fordulnak elő. A domináns onkogének a proto-onkogéneknek nevezett gének csoportjában (melyek a kulcsfontosságú, normális sejtfünkciókban, például a szignáltranszdukcióban és transzkripcióban vesznek részt) módosításokat mutatnak. A domináns onkogének - transzformációs képességet biztosító - elsődleges módosításai közé tartoznak a pontmutációk, transzlokációk, átrendeződések és az amplifikáció. A transzformáció bekövetkezéséhez a tumorszuppresszorgének (mutáció, deléció vagy ezek kombinációjának eredményeként bekövetkező) homozigóta fünkcióvesztésére van szükség. Úgy tűnik, néhány tumorszuppresszorgének - a transzkripció szabályozása révén - szerepet játszik a proliferáció irányításában. A domináns és tumorszuppresszor-onkogének expressziójának módosítása valószínűleg befolyásolja sejtek bizonyos jellemzőit, ami hozzájárul a malignus fenotípus kialakulásához.
Annak ellenére, hogy az onkogén közvetítette transzformációról egyre több ismeretanyag áll rendelkezésre, az onkogéneket és termékeiket specifikusan megcélzó terápiás stratégiák kifejlesztése terén kevés előrehaladás tapasztalható. Kezdetben ezen a területen a kutatás a domináns onkogénekre koncentrálódott, mivel ezeket sikerült elsőként karakterizálni. A DNS közvetítette génátvitel vizsgálatai kimutatták, hogy a rosszindulatú emberi daganatokból származó DNS bevitelét követően a normális sejtek malignus fenotípusúak lesznek.
B) A p53-gén és a p53-mutációk jelentősége a rákban
A p53 jelenleg tumorszuppresszorgénként ismeretes [Montenarh (1992)]. Sok - kémiai karcinogenezissel, ultraibolya-sugárzással és különböző vírusokkal, például SV40-nel - transzformált sejtben nagy mennyiségű a p53-gént találtak. A p53-gén a különböző emberi tumorok mutációs inaktiválásának gyakori célpontja, s beszámoltak arról, hogy ez a gén az általános emberi rákok esetében a leggyakrabban mutált gén [Mercer (1992)]. Ez a gén a humán nem kissejtes tüdőrák (NSCLC) eseteinek több, mint felében [Hollestein és munkatársai (1991)], valamint számos más tumorban mutált.
A p53-gén egy 375 aminosavas foszforproteint kódol, amely komplexet képezhet a gazdaproteinekkel (mint például a nagy T-antigénnel és az ElB-vel). A p53-protein megtalálható a normális szövetekben és sejtekben, de olyan koncentrációban, amely a transzformáit sejtekben vagy a tumorszövetben megfigyelhetőhöz képest elhanyagolható.
Érdekes módon, a vad típusú p53 lényeges szerepet tölt be a sejtnövekedés és -osztódás szabályozásában. A vad típusú p53 túlexpresszálásáról kimutatták, hogy emberi tumorsejtvonalakban néhány esetben antiproliferációs hatású. Ilyenformán, a p53 a sejtnövekedés negatív regulátoraként funkcionálhat [Weinberg (1991)], és közvetlenül gátolhatja a kontrollálatlan sejtnövekedést vagy közvetett módon, aktiválhatja az ilyen sejtnövekedést gátló géneket. Következésképpen, a vad típusú p53 hiánya vagy inaktiválása elősegítheti a transzformációt. Néhány vizsgálat eredményei azonban azt mutatják, hogy a gén transzformáló potenciáljának teljes kifejeződéséhez szükség lehet a mutáns p53 jelenlétére.
Bár a vad típusú p53 - az elfogadott álláspont szerint - sok sejttípusban központi jelentőségű növekedésregulátor, úgy tűnik, genetikai és biokémiai jellemzői szintén betöltenek valamilyen szerepet. A p53-gén esetében a „missense” mutációk gyakoriak, és az onkogén transzformációs képessége szempontjából kulcsfontosságúak. Egyetlen - pontmutációk okozta - genetikai változás karcinogén p53-gént eredményezhet. Más onkogénektől eltérően, a p53 pontmutációiról ismert, hogy legalább 30 különböző kodonban fordulnak elő, gyakran domináns allélokat létrehozva, melyek a sejt fenotípusában eltolódásokat okoznak, a homozigótaság felé mutató redukció nélkül. Az organizmusok sok ilyen domináns alléllal szemben toleránsak, s ezek az allétok a csíravonalban továbbadódnak. A különböző mutáns allétok természete a minimális hibás működéstől az erősen penetráns, domináns negatív allétokig terjed [Weinberg (1991)].
Casey és munkatársai beszámoltak arról, hogy a vad típusú p53-at kódoló DNS emberi emlőráksejtvonalba történő transzfektálása helyreállítja a sejtekben a növekedés gátlási kontrollját [Casey és munkatársai (1991)]. A vad típusú, de nem mutáns p53-gén emberi tüdőráksejtvonalakba történő transzfekciójával kapcsolatban hasonló hatást mutattak ki [Takahasi és munkatársai (1992)]. Úgy tűnik, a p53-gén domináns a mutáns génnel szemben, és a mutáns gént tartalmazó sejtekbe transzfektálva gátolja a proliferációt. A transzfektált p53-gén normális expressziója nem befolyásolja az endogén p53-at tartalmazó sejtek növekedését, így az ilyen konstrukciókat a normális sejtek zavaró hatások fellépése nélkül vehetik fel.
A fentiek alapján lehetséges, hogy a p53-génnel kapcsolatos rákok vad típusú p53-génnel történő kezelése csökkenti a rosszindulatú sejtek számát. A fentebb említett és más, hasonló vizsgálatok azonban e cél megvalósításától távol állnak, mivel a DNS-transzfekció nem alkalmazható a DNS - beteg testében lévő ráksejtekbe történő - bejuttatására.
HU 221 279 Β1
C) Génterápiás eljárások
Napjainkig a génterápia számos kísérleti megközelítését ajánlották, de mindegyiknek megvan a maga hátránya [Mulligan (1993)]. Amint azt korábban említettük, léteznek alapvető transzfekciós eljárások, melyek során a kérdéses gént tartalmazó DNS-t nem biológiai módszerrel (például a sejtmembrán átjárhatóságának fizikai vagy kémiai módszerekkel történő biztosításával) juttatjuk be a sejtbe. Ez az eljárás természetesen csak olyan sejtek esetében alkalmazható, amelyek ideiglenesen eltávolíthatók a testből, s képesek tolerálni a kezelés citotoxicitását (ilyenek például a limfociták). A transzfekcióhoz alkalmazhatók liposzómák vagy bizonyos lipidekből és amfofil peptidekből kialakított proteinkonjugátumok, de ilyen esetekben a gén beépülésének (integrálódásának) hatékonysága még mindig nagyon alacsony (1000-100 000 sejtre egy integrációs esemény nagyságrend), és a transzfektált gének expressziója a proliferálódó sejtekben csupán napokra, a nem proliferálódó sejtekben pedig hetekre korlátozódik. Ennek megfelelően, a rákterápiában a DNS-transzfekció egyértelműen alkalmatlan eljárás.
Egy másik eljárás a vírusok sejtekbe jutásának természetes képességét használja ki, melynek során a vírusok saját genetikai anyagukat magukkal viszik a sejtbe. A retrovírusok génbevivő vektorokként történő alkalmazása ígéretes, mivel képesek génjeik gazdasejt-genomba történő integrálására, nagy mennyiségű idegen genetikai anyag bevitelére, igen különböző fajok és sejttípusok megfertőzésére, továbbá speciális sejtvonalakban történő „csomagolódásra” („packaging”). Mindezek ellenére, a retrovírusvektorok gyakorlati alkalmazását három fő probléma akadályozza. Először; a retrovírus fertőzőképessége a célsejt felületén a vírusreceptorok hozzáférhetőségétől függ. Másodszor; a retrovírusok csak replikációt mutató sejtekbe integrálódnak hatásosan. Végül, a retrovírusok koncentrálása és tisztítása bonyolult.
D) Génterápiában alkalmazható adenovírus-konstrukciók
A humán adenovírusok kétszálú DNS-tumorvírusok, genomjuk mérete hozzávetőleg 36 kb [Tooza (1981)]. Az adenovírusokat - az eukarióta génexpresszió modelljeként - széleskörűen tanulmányozták és részletesen karakterizálták, ami az adenovírusokat vonzóvá teszi a génbeviteli rendszerként történő kifejlesztés céljára. Az adenovírusok növesztése és manipulálása egyszerű, és ín vitro,, illetve in vivő egyaránt széles gazdaspektrumot mutatnak. A litikus mértékben fertőzött sejtekben az adenovírusok képesek a gazda proteinszintézisét kikapcsolni, és a celluláris gépezetet úgy irányítani, hogy nagy mennyiségű vírusprotein, illetve a vírus bőséges mennyisége termelődjön.
A genom El-régiója El A- és ElB-gént tartalmaz, melyek a vírusgenom - és néhány celluláris gén transzkripciós szabályozásáért felelős proteineket kódolják. Az E2A- és E2B-gént tartalmazó E2-régió expressziója a virális replikációs funkciók (például DNSkötő protein, DNS-polimeráz, valamint a replikációt beindító terminális protein) szintézisét teszi lehetővé. Az
E3-géntermékek megakadályozzák a citotoxikus Tsejtek és a tumomekrózis-faktor által kiváltott citolízist, s ezáltal a vírus szaporodása szempontjából lényegesek. Az E4-proteinekkel kapcsolatos fünkciók közé tartozik a DNS-replikáció, a kései génexpresszió és a gazdasejt kikapcsolása. A kései géntermékek közé tartozik a legtöbb virion-kapszidprotein, és ezek csak akkor expresszálódnak, ha a fő kései promoterből származó primer transzkriptum érési folyamatának („Processing”) nagyobb része már lezajlott. A fő kései promoter („major laté promoter”; MLP) a fertőzés kései stádiumában nagy hatékonyságot mutat [Stratford-Perricaudet és Perricaudet (1991/a)].
Mivel úgy tűnik, hogy a vírusgenomnak csak kis részére van szükség in cis [Tooza (1981)], az adenovíruseredetű vektorok - ha olyan sejtvonalakkal összefüggésben alkalmazzuk őket, mint a 293-sejtek - kiváló lehetőséget nyújtanak a nagy DNS-fragmensek szubsztitúciójára. Az Ad5-tel transzformált humán embrionális vesesejtvonalat [Graham és munkatársai (1977)] azért fejlesztették ki, hogy az esszenciális vírusproteineket in trans biztosítsa. Arra a következtetésre jutottunk, hogy az adenovírusok - tulajdonságaiknak köszönhetően - a ráksejtek in vivő megcélzásában történő alkalmazás tekintetében előnyös eszközként szolgálhatnak [Grunhaus és Horwitz (1992)].
Az idegen proteinek sejtbe történő bevitele szempontjából az adenovírus-rendszer előnyei a következők: (1) képesek arra, hogy viszonylag nagy vírus-DNS-darabokat idegen DNS-sel helyettesítsenek; (2) a rekombináns adenovírusok szerkezetileg stabilak; (3) az adenovírusok biztonságosan adhatók be az embereknek; (4) jelenlegi ismereteink szerint az adenovírus-fertőzés rákkal vagy rosszindulatú betegséggel nem áll összefüggésben; (5) a rekombináns vírus nagy titerei érhetők el; és (6) az adenovírus nagyon fertőzőképes.
A retrovírusokkal szemben az adenovírusok további előnyei közé tartozik a magas szintű génexpresszió. Ezenkívül, a retrovírusokkal ellentétben, az adenovírusreplikáció független a gazda génreplikációjától. Mivel az adenovírus El-régiójában elhelyezkedő transzformáló gének könnyen deletálhatók, és még így is hatásos expressziós vektorokat biztosítanak, az adenovírusvektorok onkogén kockázata elhanyagolható [Grunhaus és Horwitz (1992)].
Az adenovírust alkalmazó génbeviteli rendszerek általában rekombináns, genetikailag manipulált adenovíruson alapulnak, amelyet - genomjának egy részének (például El régiójának) deléciójával - replikációra alkalmatlanná tesznek, miközben fertőzőképessége megmarad. Az adenovírus genomjának további deléciói révén viszonylag nagy mennyiségű idegen protein expresszálható. Például, az El- és E3-régióban deletált adenovírusok 10 kb hosszúságú idegen DNS-t is képesek hordozni, és 293-sejtekben nagy mennyiségben szaporíthatok [Stratford-Pemcaudet és Perricaudet (1991/a)]. Leírták azt is, hogy az adenovírus-fertőzés után, meglepő módon, a transzgének tartós expressziója figyelhető meg.
Az adenovírus közvetítette génbevitelt az utóbbi időben a gének eukarióta sejtekbe és élő állatokba törté11
HU 221 279 BI nő bevitelének eszközeként tanulmányozták. A ritka recesszív genetikai rendellenességben, az ornitintranszkarbamiláz (OTC)-hiányban szenvedő egerek kezelésekor azt találták, hogy az adenovírus-konstrukciók felhasználhatók a normális OTC-enzim biztosítására. Az OTC normális szintű expresszióját sajnos 17 eset közül csak négyben sikerült elérni [Stratford-Perricaudet és Perricaudet (1991/b)]. Következésképpen, a defektust a legtöbb egérben csak részlegesen sikerült kijavítani, ami nem vezetett fiziológiai vagy fenotípusos változáshoz. Az ilyen eredmények kevés ösztönzést nyújtanak az adenovírus-vektorok rákterápiában történő alkalmazásához.
Azok a kísérletek, melyek során a húgyhólyagfibrózis transzmembrán-konduktanciaregulátorát (CFTR) kódoló gén patkány tüdőhámjába történő bevitelére adenovírust alkalmaztak, csak részben voltak sikeresek, bár az állatok hámjában nem volt lehetőség a bevitt gén biológiai aktivitásának értékelésére [Rosenfeld és munkatársai (1992)]. Ezek a vizsgálatok azt mutatták, hogy tüdő légúti sejtjeiben a génbevitel és a CFTR-protein expressziója sikeres volt, de fiziológiai hatást nem sikerült kimutatni. Rosenfeld és munkatársai [Science (1991)] leírták, hogy az al-antitripszin-protein expresszióját kimutatták a tüdőben, de nekik sem sikerült fiziológiai hatást megfigyelniük. Az expresszió szintjét az emberi tüdő védelméhez szükséges szint körülbelül 2%-ának becsülték, ami messze a fiziológiai hatás kifejtéséhez szükséges szint alatt marad.
A humán arantitripszin génjét intraportális injekcióval normális patkányok májába vitték be. A májban a gén expresszálódott, és a patkányokban a bevitt humán protein vérplazmába történő szekrécióját eredményezte [Jaffe és munkatársai (1992)], azonban a kapott protein-szint nem volt elég a terápiás hatás kifejtéséhez.
Ezek az eredmények nem bizonyítják azt, hogy a rekombináns sejtekben az adenovírus képes lenne a megfelelő protein - fiziológiailag releváns hatást biztosító - expresszióját irányítani, következésképpen arra sem utalnak, hogy az adenovírus-rendszer hasznos lenne a rákterápiában. A találmány szerinti megoldás kidolgozása előtt úgy gondoltuk, hogy a p53 nem foglalható - például az adenovírus előállításához alkalmazott - „csomagolósejtbe” („packaging cell”), mivel toxikus hatású lehet. Mivel az adenovírus ElB-proteinje kötődik a p53-hoz, úgy véltük, hogy ez további okát képezi annak, hogy az adenovírus nem kombinálható a p53-technológiával.
E) p53-adenovírus-konstrukciók és a tumorszuppresszió
A találmány szerinti megoldás értelmében feltárunk egy rák-génterápiás eljárást, melyet egy új és az eddigieknél hatásosabb tumorszuppresszor-vektor alkalmazásával végzünk. Ezzel a rekombináns vírussal kihasználhatók az adenovírus-vektorok előnyei, úgymint a nagy titer, a széles célsejtspektrum, a hatékony transzdukció és a célsejtek genomjába való beépülés hiánya. A találmány egyik megvalósítási módja szerint egy hibás replikációjú, „helper”-független adenovírust állítunk elő, amely humán citomegalovírus-promoter szabályozása alatt vad típusú p53-at (Ad5CMV-p53) expresszál.
Ha az expressziót emlőssejtekben kívánjuk végrehajtani, az expressziós vektorok szabályozóelemeiként gyakran vírusokból származó elemeket alkalmazunk. Például, az általánosan alkalmazott promoterek poliomavírusból, adenovírus-2-ből és SV40-ből származnak. Az SV40-vírus korai és kései promoterei különösen előnyösek, mivel mindkettő olyan fragmensként nyerhető ki a vírusból, amely SV40 replikációs kezdőhelyet is tartalmaz. Kisebb vagy nagyobb SV40-fragmensek szintén alkalmazhatók, feltéve, hogy tartalmazzák a HindlII-helytől a - virális replikációs kezdőhelynél lévő - BglI-helyig terjedő, hozzávetőleg 250 bp-os szekvenciát. Olyan promoterek és szabályozószekvenciák alkalmazása is lehetséges - és gyakran kívánatos -, amelyek normális esetben kapcsolatban állnak a vektorba foglalt génszekvenciával, feltéve, hogy az ilyen szabályozószekvenciák kompatibilisek a gazdasejttel.
A replikációs kezdőhely biztosítható oly módon, hogy a vektorba exogén kezdőhelyet, például SV40-ből vagy más vírusból (poliomavírusból, adenovírusból, VSV-ből, BPV-ből) származó kezdőhelyet foglalunk, illetve biztosítható a gazdasejt kromoszomális replikációs mechanizmusa révén is. Amennyiben a vektor integrálódik a gazdasejt kromoszómájába, az utóbbi lehetőség gyakran megfelelő.
Az előnyös p53-adenovírus kialakításának és szaporításának menetét az 1. ábrán mutatjuk be. A rekombináns adenovírus szaporításához és azonosításához javított eljárást fejlesztettünk ki (ld. később). Azonosítás után a rekombináns p53-adenovírus szerkezetét PCRanalízissel igazoltuk (ld. 2. ábra). A p53-adenovírust izolálása és szerkezetének igazolása után - a (p53-gén homozigóta delécióját hordozó) H358 humán tüdőráksejtvonal fertőzésére alkalmaztuk. „Westem-blot”-analízissel kimutattuk, hogy az exogén p53-protein magas szinten expresszálódott (4. és 5. ábra), és expressziója a fertőzés utáni 3. napon érte el csúcsát (6. ábra).
Egy p53-pontmutációt hordozó H322-sejtvonalban kimutattuk azt is, hogy a mutáns p53-at az exogén p53 expressziója leszabályozta. A kísérlethez kontrollként az Ad5/RSV/GL2-viriont alkalmaztuk, amely szerkezetileg hasonló az Ad5CMV-p53-vírushoz. Ez a virion - expressziós kazettájában - a Rous-szarkómavírus LTR-promotere által irányított luciferáz-cDNS-t tartalmazott. Az Ad5/RSV/GL2-virionnal fertőzött sejtekben sem p53-expressziót, sem az aktin-expresszió változását nem tapasztaltuk. Az Ad5CMV-p53-vírussal fertőzött H358-sejtek szaporodása nagymértékben gátolt volt, szemben a nem fertőzött, illetve a kontroll virionnal fertőzött sejtek szaporodásával (7A. ábra). A H322sejtek szaporodását a p53-virion szintén nagymértékben gátolta (7B. ábra), míg a vad típusú p53-at tartalmazó humán H460-tüdőráksejtek szaporodása kevésbé volt gátolt (7C. ábra).
Az Ad5CMV-p53-vírus a tüdőráksejtek szaporodására in vitro erős gátló hatást gyakorolt. A szaporodás gátlása nem volt egyértelmű abban az esetben, ha a sejteket 1 PFU/sejt-nél kisebb fertőzési multiplicitással fertőztük az Ad5CMV-p53-vírussal, míg a 100 PFU/sejt12
HU 221 279 Β1 nél nagyobb fertőzési multiplicitásnál még a kontroll Ad5/RSV/GL2-vírus esetében is citotoxicitás figyelhető meg. Kísérleteink során a növekedési sebesség vizsgálatához optimális dózis 10-50 PFU/sejt volt. E dózistartományon belül a sejtszaporodás gátlása az expresszált p53-protein hatásának tudható be.
A csupasz egerekkel végzett tesztek bizonyították, hogy az Ad5CMV-p53-vírussal kezelt H358-sejtek tumorképző hajlama nagymértékben gátolt volt. Az ortotópiás tüdőrák egérmodelljében a tumorképző sajátságú H226Br-sejteket (melyek a p53-génben pontmutációt tartalmaznak) a vírussal végzett kezelés előtt három nappal, légcsövön keresztül adtuk be az egereknek. Az Ad5CMV-p53-vírus légcsövön keresztül történő (intratracheális) becseppentése e modellben megakadályozta a tumorképződést, ami arra utal, hogy a módosított adenovírus hatásos vektor a tumorszuppresszorgének humán ráksejtekbe történő beviteléhez és expresszálásához, és az Ad5CMV-p53-vírusból rák elleni génterápiában alkalmazható terápiás szer fejleszthető ki.
Amint azt „westem-blof’-analízissel kimutattuk, az Ad5CMV-p53-vírus a humán tüdőráksejtekben a p53gén magas szintű expresszióját biztosította. Az exogén p53-protein H460-sejtekben az endogén, vad típusú p53-protein mennyiségéhez viszonyítva hozzávetőleg 14-szeres, H358-sejtekben a β-aktin belső kontrolimennyiségéhez viszonyítva pedig körülbelül 2-4-szeres mennyiségben volt jelen. A magas szintű expresszió (1) a rendkívül hatékony génbevitelnek; (2) a p53cDNS-t irányító erős CMV-promotemek; és (3) a p53cDNS transzkripcióját fokozó adenovirális El-erősítőszekvenciának („enhancer”) tudható be. H358-sejtekben a p53-expresszió a fertőzés után több, mint 15 napig folytatódott, azonban a fertőzés utáni 5. napon az expresszió gyors csökkenése volt megfigyelhető. A fertőzött H358-sejtekből származó DNS-minták PCRanalízise azt mutatta, hogy a vírus-DNS szintje a csökkenő proteinszintnek megfelelően csökkent, ami azt jelzi, hogy a vírus-DNS a ráksejtek folyamatos in vitro szaporodása során elvész.
A p53-expresszió csökkenését a - p53-expressziót irányító - CMV-promoter celluláris csillapítása is eredményezheti, hiszen a CMV-promoter gazdasejt közvetítette kikapcsolását korábban leírták [Dai és munkatársai (1992)]. Az adenovírus-vektorok nem integrálódó génbevivő vektorok, így a génexpresszió időtartama számos tényezőtől - köztük a gazdasejtektől, a bevitt génektől és a releváns promotertől - függ. Crystal és munkatársai kimutatták, hogy patkány hámsejtekben a húgyhólyagfibrózis transzmembrán-konduktancia-regulátorgén alacsony szintű expressziója a fertőzést követően hat héttel volt detektálható [Rosenfeld és munkatársai (1992)]. Perricaudet laboratóriumában kimutatták, hogy mdx-egér izmában a minidystrophin-gén minimális szintű expressziója a fertőzés után három hónapig tartott. Az általunk végzett vizsgálatban a vad típusú p53protein rövid ideig tartó, magas szintű expressziójának az lehet az előnyös hatása, hogy az Ad5CMV-p53-vírussal végzett in vivő kezelést követően csökkenti a normális sejteket károsító esetleges mellékhatásokat.
Az itt leírt vizsgálatok eredményei azt jelzik, hogy a rekombináns p53-adenovírus tumorszuppresszív tulajdonságokat hordoz, ami valószínűleg a tumorsejtekben a p53-protein működésének helyreállításával fejti ki hatását.
F) DNS-károsító ágensek
A találmány szerinti megoldás értelmében számos különböző DNS-károsító ágens alkalmazható, például, a DNS-sel közvetlenül keresztkötést képző ágensek; a DNS-be beépülő ágensek; valamint, a nukleinsa v-szintézis befolyásolása révén kromoszómális és mitózisos rendellenességeket okozó ágensek.
A nukleinsavakkal - specifikusan a DNS-sel - közvetlenül keresztkötést képző ágensek (szinergikus daganatképződés elleni kombinációt eredményező) DNSkárosítást okoznak. Ilyen ágensként alkalmazható, például, a cisplatin vagy egyéb DNS-alkilező szerek. A cisplatint széles körben alkalmazzák rák kezelésére; klinikai alkalmazás esetén hatásos adagolása három hetenként (összesen háromszor) öt napig 20 mg/m2. A cisplatin orálisan nem szívódik fel, ezért intravénás, szubkután, intratumorális vagy intraperitoneális injekcióval adható be.
A DNS-t károsító anyagok közé tartoznak az olyan vegyületek is, amelyek a DNS-replikációt, a mitózist vagy a kromoszómális szegregációt befolyásolják. Az ilyen vegyületek példáiként említhető az adriamicin (más néven doxorubicin), az etoposid, verapamil, podophyllotoxin és hasonlók. E vegyületeket dózistartománya - daganatok kezelésére alkalmazva - intravénás „bolus” injekciókkal, 21 naponként 25-75 mg/m2től (az adriamicin esetében) 35-50 mg/m2-ig (az etoposid esetében, intravénás beadásnál) terjed (az etoposid orális beadásakor az intravénás dózis dupláját kell alkalmazni).
A nukleinsavprekurzorok és alegységek szintézisét akadályozó ágensek szintén DNS-károsító hatásúak. Mint ilyet, számos nukleinsavprekurzort fejlesztettek ki. Különösen alkalmasak az olyan ágensek, amelyek részletes tesztelésen estek át, s könnyen hozzáférhetők. Az olyan ágenseket, mint az 5-fluor-uracil (5-FU), különösen előnyösek a daganatos sejtek megcélzására. Az 5-fluor-uracil - bár igen toxikus - számos hordozóval alkalmazható; beadható helyileg is, de általában a naponta 3-15 mg/kg-os dózisokkal végzett intravénás beadás az előnyös.
A DNS károsodását okozó - és széles körben alkalmazott - egyéb faktorok közé tartoznak a γ-sugarak, a röntgensugarak, és/vagy a radioaktív izotópok. A DNSkárosító faktorok egyéb formái (mint például a mikrohullámok és az UV-fény) szintén alkalmazhatók. E faktorok mindegyike nagy valószínűséggel jelentős károsodást okoz a DNS-prekurzorokban, a DNS-replikációban és -,,repair”-ben, valamint a kromoszómák szerveződésében és fennmaradásában. A röntgensugárzás esetében a dózistartomány hosszú ideig (3-4 hétig) alkalmazott napi 50-200 röntgen dózistól egy dózisban alkalmazott 2000-6000 röntgenig terjed. A radioaktív izotópok dózisa - az izotóp felezési idejétől, a kibocsátott sugárzás erősségétől és típusától, valamint a daga13
HU 221 279 Β1 natos sejtek izotópfelvételétől függően - széles tartományban változik.
Az adagolás kérdésében szakember számára a „Remington’s Pharmaceutical Sciences” 15. kiadásának 33. fejezete (elsősorban a 624-652. oldalon) nyújthat további felvilágosítást. Az adagolásban - a kezelt páciens állapotától függően - bizonyos mértékű változások szükségszerűen előfordulnak. Minden egyes páciens esetében az adagolásért felelős személynek kell a megfelelő dózist meghatározni. Emberek kezelése esetén a készítményeknek eleget kell tenniük az „FDA Office of Biologics” standardok által meghatározott sterilitási, pirogenitási, illetve általános biztonsági és tisztasági követelményeknek.
G) p53-vírussal és cisplatinnal végzett kezelés
A génhelyettesítéses terápia és a kemoterápia kombinációjának emberi rákbetegség kezelésében kifejtett hatékonyságának meghatározása érdekében azt vizsgáltuk, hogy az Ad-p53-vírus és a CDDP egymás utáni beadásával indukálható-e in vivő apoptózis. Az Adp53 közvetlenül tumorba végzett injektálása, illetve a CDDP intraperitoneális beadása után három nappal az nu/nu-egerekbe szubkután beültetett H358-tumorok növekedése mérsékelt csökkenést mutatott. Ha azonban az Ad-p53-vírust és a CDDP-t egyszerre adagoltuk, a tumorok részlegesen visszafejlődtek, és a tumorok mérete statisztikailag lényegesen kisebb maradt, mint bármelyik kezelési csoportban. A növekedést gátló hatás két kezelési ciklus után még kifejezettebb volt (13A. ábra). A tumorok szövettani vizsgálata a CDDPvel kezelt egerekben az Ad-p53 injektálása helyén lévő tumorsejtek nagymértékű elpusztítását mutatta. In situ festéssel a sejtmentes terek környékén sok apoptózisos sejtet mutattunk ki (13B.-13E. ábrák). Ezzel szemben, a csak CDDP-vel vagy csak Ad-p53-vírussal kezelt tumorok esetében sem sejtmentes, sem apoptózisos területeket nem észleltünk.
A találmány leírásában feltárunk egy új eljárást, amelyben a humán génterápiát - DNS-keresztkötő ágens alkalmazásával - hagyományos kemoterápiával kombináljuk. A kemoterápiás hatóanyagokra rezisztens tumorsejtek a klinikai onkológia egyik fő problémáját képezik. A nem kissejtes tüdőrák („non-small-cell lung cancer”; NSCLC) a tüdőrákos esetek legalább 80%-át teszi ki; az ilyen tüdőrákban szenvedő betegek azonban nem fogékonyak a kemoterápiára [Doyle (1993)]. Jelenleg a rákkutatás egyik célja a génhelyettesítéses terápia (rákos betegségekre vonatkozó) hatékonysága javítási lehetőségeinek feltárása a géntermék és a kemoterápiás hatóanyag közötti kölcsönhatás vizsgálatával. A herpes simplex-timidinkináz (HS-tK) gén - retrovirális vektorrendszer alkalmazásával - agytumorba történő bevitelével sikeresen indukálták a tumorsejtek „ganciclovir” nevű antivirális szerre vonatkozó érzékenységét [Culver és munkatársai (1992)]. A Hs-tK-géntermék egy exogén virális enzim, míg a wt-p53-protein normális szövetekben expresszálódik, ami azt sugallja, hogy a kemorezisztencia wt-p53-expresszió megváltoztatásával történő - módosítása (az endogén genetikai program közvetítette reakcióutat felhasználó) alternatív megoldást képezhet.
Az in vivő génbevitel terén az adenovírus-rendszerek potenciális előnyöket (például nagy vírustitert, nagy fertőzési hatékonyságot) biztosítanak, és számos sejttípus megfertőzésére képesek. A bevitt gén expressziójának stabilitása és időtartama azonban továbbra is kérdéses. A „kemo-génterápia” esetében az expressziós szintek és a nagy fertőzőképesség jelentősebb tényezők, mint az expresszió időtartama, mivel a kemoterápiás hatóanyagok a megfertőzött sejteket néhány napon belül képesek elpusztítani. A kemoterápiás szerekre érzékeny sejtekben a p53-szint növekedése a DNS-károsító stimulusok megjelenését követő hat órán belül bekövetkezik [Fritsche és munkatársai (1993); Zhan és munkatársai (1993)], bár a fokozott p53-DNS-kötődési aktivitás a stimulusok megszűnése után négy óra alatt lecsökkenhet [Tishler és munkatársai (1993)]. A jelenlegi modellben a wt-p53-gén expresszióját az Ad-p53vektorban lévő citomegalovírus-promoter függetlenül irányítja. Ilyenformán, a p53-expresszió magas szintje még a gyógyszer adagolásának befejezése után is fenntartható. A wt-p53-protein - Ad-p53-adenovírus által történő - expresszálódása a fertőzés utáni 3. napon éri el maximumát (amely 14-szer nagyobb, mint az endogén vad típusé), és a 9. napon csökken alacsony szintre [Zhang és munkatársai (1993)]. Ez arra utal, hogy ráksejtekben a wt-p53-expresszió ideiglenes, magas szintje elégséges a citotoxikus program beindítására.
H) Páciensek és kezelési eljárások
Úgy tartjuk, hogy a p53-mal kapcsolatos rákos betegségben (például műtéti úton el nem távolítható, a légutakat eltömítő endobronchiális rákban) szenvedő betegek esetében az adenovirális p53-génkonstrukciók tüdőráksejtekbe történő helyi bevitele nagyon hatásos eljárása a terápiás szempontból hatásos gén - betegséget leküzdő célú - bevitelének. A p53-gén bejuttatását DNS-károsító ágensek vagy faktorok beadásával kombinálva végezzük. E kombinált megoldást jelentős fejlesztésnek tartjuk azokhoz a jelenlegi rákterápiákhoz képest, amelyek (DNS-károsodás előidézésével) a rákos sejtek legutolsó darabig történő elpusztításán vagy eltávolításán alapulnak. Mivel a tumorsejtek nyugalmi állapota ismert jelenség, ez nagyon valószínűtlenné teszi hatékony elpusztításukat.
Az adenovírus-konstrukciók nem kissejtes tüdőráksejtek (NSCLC) által történő felvétele csökkenti az ilyen sejtek proliferációjának sebességét, a találmány leírásában bemutatott példák azonban azt bizonyítják, hogy egy DNS-károsító ágens vagy faktor p53-adenovírussal együttes alkalmazása a sejtszaporodás és a tumorméret jelentős csökkenését eredményezi, amely egyik komponens önmagában történő alkalmazása esetében sem tapasztalható. A találmány szerinti készítmények és eljárások alkalmazásával megnövelhető az az időtartam, amíg az érintett tüdő feszes marad, megakadályozható az endobronchiális (hörgőn belüli) tumor újbóli növekedése és a tumorsejtek osztódása, és meghosszabbítható a beteg túlélési ideje.
A kombinált eljárást azon betegek számára tartjuk előnyösnek, akikben a műtéti úton el nem távolítható (a légutakat részlegesen vagy teljesen elzáró) endobron14
HU 221 279 Β1 chiális tumor kiújult, és akik nem kaphatnak külső sugárkezelést. Az ilyen betegség jelenlegi terápiái csak rövid idejű, átmeneti javulást eredményeznek; a legtöbb betegben a külső sugárkezelés ellenére is kiújul a rák. Behelyezhetünk brachyterápiás katétert is, alkalmazhatunk további sugárkezelést, és a DNS-károsító ágenseket intravénásán is adagolhatjuk. Az ilyen kezelésen átesett betegek átlagos túlélési ideje hat hónap. A sikertelen brachyterápián átesett betegek szintén alkalmasak lehetnek a génterápiára. A légutakból a tumor lézerrel vagy biopsziacsipesszel távolítható el. Ez az adenovírus-konstrukciók injektálásával együtt végezhető, ami csökkenti az injektáláshoz szükséges térfogatot. A víruskonstrukciók beadása nem zárja ki annak lehetőségét, hogy - a tumor előrehaladása esetén - a beteg tüneti kezelést is kapjon.
I) Egyéb génbeviteli technikák
A sikeres génterápiához általában arra van szükség, hogy a gazda genomjába - genetikai rendellenességet kijavítani képes - gén integrálódjon, amely a gazda DNS-ével együtt létezhet és replikálódhat, és a hibás gén kompenzálásához megfelelő szinten expresszálódhat. Ideális esetben a betegség egy vagy néhány kezeléssel gyógyítható, melyeknek nincs komoly mellékhatása. Napjainkig számos olyan génterápiás eljárást kidolgoztak, amelyek alkalmazhatók a találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításában.
Az egyik ilyen eljárás a kérdéses gént tartalmazó DNS sejtekbe történő transzfektálása, amely DNS-t például a sejtmembrán átjárhatóságának fizikai vagy kémiai módszerekkel történő biztosításával - juttatjuk be a sejtbe. Ez az eljárás általában csak olyan sejtek esetében alkalmazható, amelyek ideiglenesen eltávolíthatók a testből, s képesek tolerálni a kezelés citotoxicitását (ilyenek például a limfociták). A transzfekcióhoz alkalmazhatók liposzómák vagy bizonyos lipidekből és amfofil peptidekből kialakított proteinkonjugátumok, de ilyen esetekben a gén beépülésének (integrálódásának) hatékonysága még mindig nagyon alacsony (1000-100 000 sejtre egy integrációs esemény). A gén genomba történő integrálódásának hiányában - a nem integrálódott DNS-ek lebomlásának köszönhetően - a transzfektált gének expressziója a proliferálódó sejtekben csupán napokra, a nem proliferálódó sejtekben pedig hetekre korlátozódik.
Egy másik eljárás a vírusok sejtekbe jutásának természetes képességét használja ki, melynek során a vírusok saját genetikai anyagukat magukkal viszik a sejtbe. A retrovírusok génbevivő vektorokként történő alkalmazása ígéretes, mivel képesek génjeik gazdasejt-genomba történő integrálására, nagy mennyiségű idegen genetikai anyag bevitelére, igen különböző fajok és sejttípusok megfertőzésére, továbbá speciális sejtvonalakban történő „csomagolódásra” („packaging”) [Miller, (1992)].
Egy másik eljárás egyéb vírusok, mint például az adenovírus, herpes simplex vírusok (HSV), citomegalovírus (CMV) és adenoasszociált vírusok (AAV) alkalmazásán alapul, mely vírusokat úgy manipulálnak, hogy génbevitelre alkalmas vektorokként funkcionáljanak. Bár az idegen genetikai anyagot befogadni képes vírusok némelyike esetében korlátozott a felhalmozható nukleotidok, illetve a megfertőzhető sejttípusok száma, az ilyen vírusokról bebizonyították, hogy sikeresen alkalmazhatók a génexpresszió megvalósítására. Az adenovírusok saját genetikai anyagukat nem építik be a gazda genomjába, ezáltal a génexpresszióhoz nincs szükségük a gazda replikációjára, és ez ideálissá teszi őket a gyors, hatékony heterológ génexpresszióra.
Az alábbiakban a találmány előnyös megvalósítási módjait kísérleti példákon keresztül fogjuk szemléltetni. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a példákban leírt eljárások, melyek az általunk kidolgozott eljárásokat reprezentálják, a találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósítása során jól működnek, s ilyenformán a találmány előnyös megvalósítási módjainak tekinthetők. A találmány leírása alapján szakember számára kézenfekvő, hogy az általunk feltárt speciális megvalósítási módokban számos olyan változtatás hajtható végre, melyekkel továbbra is azonos vagy hasonló eredmények nyerhetők. Nyilvánvaló, hogy az ilyen megoldások nem térnek el a találmányi gondolat lényegétől és az igényelt oltalmi körön belül maradnak.
1. példa p53 expressziós vektor előállítása
Ebben a példában egy p53 expressziós vektor előállítási eljárását írjuk le. Ezt a vektort a megadott módon állítjuk elő, és az Ad5-adenovírustörzs genomja El-régiójának (1,3-9,2 térképegység) helyettesítésére, valamint a 2. példában leírt adenovírus-virion előállítására alkalmazzuk.
Az 1. ábrán bemutatott p53 expressziós kazettát amely humán citomegalovírus-promotert [Boshart és munkatársai (1985)], p53-cDNS-t és SV40 korai poliadenilációs szignált tartalmaz - a pXCJLl-vektor [melyet Dr. Frank L. Graham-től („McMaster University”, Kanada) kaptunk] Xbal- és Clal-helyei közé inszertáltuk.
A genom mérete körülbelül 35,4 kb, melyet 100 térképegységre osztottunk (1 térképegység=0,35 kb). A p53 expressziós kazetta az Ad5-genom El-régióját (1,3-9,2 térképegység) helyettesítette.
Az 1. láncindító (5’-GGCCCACCCCCTTGGCTTC-3’; 1. azonosítószámú szekvencia) a humán CMV fő IE-génjének promoterétől [Boshart és munkatársai (1985)] 3’-irányban helyezkedik el. A 2. láncindító (5’TTGTAACCATTATAAGCTGC-3’; 2. azonosítószámú szekvencia) az SV40 korai poliadenilációs szignálban helyezkedik el. A két láncindító a p53-cDNS mindkét végétől 15-20 bp távolságban 1,40 kb-os PCRterméket határoz meg. A 3. láncindító (5’-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3; 3. azonosítószámú szekvencia) és a 4. láncindító (5’-CATCTGAACTCAAAGCGTGG-3’; 4. azonosítószámú szekvencia) az Ad5-genom 11-es, illetve 13,4-es térképegységénél helyezkedik el, és egy 0,86 kb-os, vírusgenom-specifikus PCRterméket határoznak meg.
HU 221 279 Β1
2. példa
A rekombináns p53-adenovírus előállítása és szaporítása
Ebben a példában a p53-at expresszáló, „helper”független rekombináns adenovírusok előállítási eljárását írjuk le. A rekombináns adenovírus előállításához alkalmazott molekuláris stratégia azon a tényen alapul, hogy a pJM17-plazmid - az adenovírus csomagolási („packaging”) korlátja miatt - önmaga nem képes vírust képezni. A transzfektált sejten belül a p53 expressziós plazmidvektor és a pJM17-plazmid közötti homológ rekombináció életképes vírust eredményez, amely csak olyan sejtekben csomagolható, amelyek expresszálják a szükséges adenovírus-proteineket.
Az eljárás során - az El - vagy E3-régiókban a heterológ DNS-expressziós kazetták szubsztitúcióit tartalmazó - vírusok szaporításához gazdasejtként 293-sejteket alkalmazunk. Az eljáráshoz a DNS 293-sejtekbe történő együttes transzfekciójára van szükség. A transzfekció nagymértékben meghatározza a vírusszaporítás hatékonyságát. A találmány szerinti megoldás megszületése előtt a DNS 293-sejtekbe történő transzfektálásához rendszerint a kalcium-foszfát DNS együttes kicsapási eljárást [Graham és van dér Eb (1973)] alkalmazták, azonban ez az eljárás - a plakk-analízissel együtt - viszonylag bonyolult, és jellemzően alacsony hatékonyságú vírusszaporítást eredményez. Ahogy azt ebben a példában is leírjuk, a transzfekció és a fertőzött sejtek későbbi azonosításának hatékonyságát - liposzóma-közvetí tette transzfekció val és a transzfektált sejtek citopátiás hatás (CPE) alapján történő azonosításával - jelentős mértékben javítottuk.
A 293-as sejtvonalat - 10% hővel inaktivált lószérummal kiegészített - „Dulbecco”-féle módosított minimális esszenciális tápközegben tartottuk. A homológ rekombináció érdekében a p53 expressziós vektort és a pJM17-plazmidot [McGrory és munkatársai (1988)] DOTAP-közvetítette transzfekcióval - melyet a gyártó (Boehringer Mannheim Biochemicals, 1992) útmutatásai szerint végeztünk - együttesen 293sejtekbe transzfektáltuk. Ennek menetét vázlatosan az
1. ábrán mutatjuk be.
A 293-sejteket (35 passzálás, 60%-os konfluens állapot) a transzfektálás előtt 24 órával, 60 mm-es csészékbe vagy 24 üregű tálcákra helyeztük. Az egyes üregekben lévő sejteket 30 pl DOTAP, 2 pg p53 expressziós vektor és 3 pg pJM17-plazmid elegy ével transzfektáltuk. A transzfektálás után a sejteken - a citopátiás hatás megjelenéséig - két-három naponként kicseréltük a MEM-tápközeget.
3. példa
A rekombináns adenovírusok azonosságának igazolása
Ebben a példában a rekombináns virionok azonosságának - a megfelelő sejtvonal transzfektálását követő - új, polimeráz-láncreakciós (PCR) vizsgálatát mutatjuk be.
A sejttenyészeti felülúszók aliquotjait (50 370 pl) összegyűjtöttük a tesztelőtálcákról, 56 °C-on egy óra hosszat (0,5% SDS-t és 20 mM EDTA-t tartalmazó) 50 pg/ml koncentrációjú proteináz-K-val kezeltük, fenol/kloroform eleggyel extraháltuk, majd a nukleinsavakat etanollal kicsaptuk. A DNS-üledéket 20 pl desztillált vízben újraszuszpendáltuk, s az így kapott szuszpenziót a PCR-amplifikációhoz templátként alkalmaztuk. A PCR-láncindítók egymáshoz viszonyított elhelyezkedését, illetve szekvenciáikat az 1. ábrán, illetve a szekvencialista 1., 2., 3. és 4. azonosítószámú szekvenciájában mutatjuk be. A cDNS-inszert-specifikus láncindítók 1,4 kb-os PCR-terméket, a vírusgenomspecifikus láncindítók pedig 0,86 kb-os PCR-terméket határoznak meg. A polimeráz-láncreakciókat 4 mM MgCl2-t, 50 mM KCl-ot, 0,1% „Triton-X-100”-at, mindegyik dNTP-ből 200 pM-t, 10 mM Tris-Cl-puffert (pH=9,0), mindegyik láncindítóból 2 pM-t és 1,0 egység Taq-polimerázt (Promega) tartalmazó, 50 pl térfogatú reakcióelegyben végeztük. A reakciókat 30 ciklussal (94 °C-on 0,5 percig, 56 °C-on 0,5 percig és 72 °Con 1 percig) végeztük.
Az újonnan tenyésztett vírusok azonosítási eljárásának egyszerűsítése érdekében sejttenyészeti felülúszóból származó DNS-mintákon végzett közvetlen PCRanalízist fejlesztettünk ki. A citopátiás hatást mutató sejtek tápközege felülúszójának aliquotjait (50 pl vagy 370 pl) proteináz-K-val kezeltük, majd fenol/kloroform eleggyel extraháltuk. Etanolos kicsapást követően a DNS-mintákat - inszertspecifikus és vírusgenomspecifikus szekvenciák ampliftkálása céljából két láncindító pár alkalmazásával - polimeráz-láncreakcióval analizáltuk. Azokat a szekvenciákat, amelyekhez a PCR-láncindítók hibridizálódnak, az 1. ábrán mutatjuk be. Az 1., 2., 3. és 4. láncindítót a szekvencialista 1., 2., 3., illetve 4. azonosító számú szekvenciájaként mutatjuk be.
A polimeráz-láncreakció eredményeként az expressziós vektorból (pozitív kontroll) és a pozitív sejttenyészetből származó DNS-mintákból egy 1,4 kb-os cDNS-inszertet és egy 0,86 kb-os vírusgenom-fragmenst amplifikáltunk (2B. ábra, 1., illetve 4. oszlop). Az Ad5/RSV/GL2-vírusból származó DNS-mintából (negatív kontroll) csak a 0,86 kb-os ffagmenst sikerült amplifikálni (2B. ábra, 2. oszlop). A kezeletlen pozitív sejtek tenyésztő tápközegének felülúszójának polimeráz-láncreakciójával amplifikált sávokat nem kaptunk (2B. ábra, 3. oszlop).
Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a sejttenyésztő tápközegbe kiszabadult adenovírusok - a DNStemplátok előállításához mindössze 50 pl tápközeg-felülúszó alkalmazásával végzett - polimeráz-láncreakcióval kimutathatók. Ezek az eredmények lehetővé teszik egy kvantitatív eljárás kifejlesztését, amellyel e technika felhasználható az adenovírus-titerek - hagyományosan plakk-analízissel végzett - meghatározásához.
Az Ad5CMV-p53-vírus p53-cDNS-ének vad típusú szekvenciáját a CsCl-gradiens alkalmazásával tisztított vírus-DNS szekvenálásával ellenőriztük. A hasonló módon előállított, kontroll Ad5/RTSV/GL2-vírus szerkezete hasonlít az Ad5CMV-p53-vírus szerkezetéhez, azzal
HU 221 279 Β1 a különbséggel, hogy expressziós kazettájában Rousszarkóma-vírus-promotert és luciferáz-cDNS-t alkalmaztunk. Az E. coli β-galaktozidázgént (LacZ) hordozó rekombináns Ad5CMV-LacZ-adenovírus [amely Zhang és munkatársai leírása szerint állítható elő, és amelyet Dr. Frank L. Graham-től kaptunk; Graham és munkatársai (1991)] szerkezete szintén hasonló az Ad5CMV-p53-víruséhoz.
Az Ad5CMV-p53-, Ad5/RSV/GL2- és Ad5CMVLacZ-vírusok egyedi kiónjait Graham és Prevec (1991) eljárása szerint végzett plakktisztítással kaptuk. Az egyes vírusklónokat 293-sejtekben szaporítottuk. A kiteljesedett citopátiás hatást mutató 293-sejtek tenyésztő tápközegét összegyűjtöttük, és 1000xg-vei 10 percig centrifugáltuk. Az összeöntött felülúszókat aliquotokra osztottuk, és -20 °C-on vírustörzsoldatokként tároltuk. A vírustitereket plakkanalízissel határoztuk meg [Graham és Prevec (1991)]. A sejtvonalak fertőzése érdekében a 60 mm-es csészékben egy rétegben elhelyezett sejtekhez szobahőmérsékleten, 30 percre - csészénként 0,5 ml - vírusoldatot adtunk, és öt percenként rövid keverést végeztünk. A sejtekhez ezután hozzáadtuk a tenyészető tápközeget, és a fertőzött sejteket 37 °C-os inkubátorba helyeztük.
A rekombináns adenovírusok génbeviteli hatékonyságát különböző sejtvonalakban (például H226Br, H332, H460, HeLa, Hep-G2, LM2 és Verő) Ad5CMVLacZ-vírus alkalmazásával is értékeltük. E vírus 30 PFU/sejt dózisával végzett fertőzés után a sejtvonalak - „X-gal”-festéssel - 97-100%-os kék festődést mutattak.
4. példa
Ad5CMV-p53 irányította p53-génexpresszió emberi tüdőráksejtekben
Ebben a példában a rekombináns p53-adenovírus homozigóta p53-deléciót hordozó - emberi tüdőráksejtek fertőzésére történő alkalmazását írjuk le. Az eredmények azt mutatják, hogy az ilyen sejtek szaporodása és a mutáns p53 expressziója gátlás alá került, ami arra utal, hogy az Ad5CMV-p53-virion a metasztázisos sejtek kontrollálásának hatásos eszköze lehet.
A 3,8%-os formáimnál fixált és metanolban 3%-os hidrogén-peroxiddal 5 percig kezelt egyrétegű, fertőzött sejtekkel immunhisztokémiai vizsgálatot végeztünk, amihez „Vectastatin Elité” reagenskészletet (Vector, Burlingame, CA) alkalmaztunk. Primer antitestként a Pab-1801 anti-p53-antitestet (Oncogene Science, Manhasset, NY) alkalmaztuk. Negatív kontrollként MO PC-21-antitestet (Organon Teknika Corp., West Chester, PA) használtunk. Második antitestként avidinnal jelölt antiegér-IgG-t (Vector) alkalmaztunk. Az antigén-antitestkomplex kimutatásához biotinilált tormaperoxidázABC-komplex reagenst alkalmaztunk. A sejteket végül „Harris hematoxilin”-nal (Sigma) utánfestettük, és „Cytoseal 60”-nal (Stephens Scientific, Riverdale, NJ) tárgylemezre rögzítettük.
A fertőzött sejtek immunhisztokémiai vizsgálatát a p53 - Ad5CMV-p53-vírus CMV-promotere által irányított - in situ expressziójának vizsgálata érdekében végeztük. A H358-sejtvonalban - amely homozigóta p53-deléciót hordoz - a p53-gén bevitele 97-100%-os hatékonyságú volt, ha a sejteket 30-50 plakk-képző egység/sejt (PFU/sejt) fertőzési multiplicitással fertőztük (4. ábra).
A rekombináns adenovírus nagy génbeviteli hatékonyságát Ad5CMV-LacZ-vírussal is igazoltuk. Ez a vírus a LacZ-gént hordozza, melynek transzkripcióját a humán CMV-IE-promoter irányítja. 30-50 PFU/sejt fertőzési multiplicitásnál valamennyi vizsgált sejtvonal (HeLa, Hep-G2, LM2 és a humán NSCLC-sejtvonal) „X-gal”-festéssel vizsgálva 97-100%-ban pozitív volt a galaktozidázaktivitásra. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az adenovírus-vektorok hatásos hordozókként alkalmazhatók a gének emberi ráksejtekbe történő bevitelében.
A csészékben lévő egyrétegű sejttenyészet foszfátpufferelt sóoldattal (PBS) végzett mosását követően a sejtek SDS-PAGE-pufferel (0,5 ml/60 mm-es csésze) történő lízisével készített teljes sejtlizátumokkal „westem-blot”-analízist végeztünk. Az SDS-poliakrilamid-gélekre 5xl04 sejtnek megfelelő mennyiségű (10-15 ml) sejtlizátumot vittünk fel. A gélen lévő proteineket Hybond™-ECL-membránra (Amersham, Arlington Heights, IL) másoltuk. A membránokat PBSben 0,5% tejporral blokkoltuk, és próbaként a primer antitestekkel [Pab-1801 monoklonális antihumán-p53antitest és monoklonális egér antihumán^-aktin-antitest (Amersham)] teszteltük, mostuk, majd próbaként tormaperoxidázzal konjugált nyúl antiegér-IgG másodlagos antitesttel (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) teszteltük. A membránokat az Amersham-féle erősített kemilumineszcencia eljárással hívtuk elő. Az expresszált exogén p53 relatív mennyiségét denzitométerrel (Molecular Dynamics Inc., Sunnyvale, CA) határoztuk meg.
A „westem-blot”-analízis eredménye azt mutatta, hogy az exogén p53-protein magas szinten expresszálódott (5A. ábra; 2., 3., 5. és 6. oszlop). Az expresszált protein mennyisége a 3. napon érte el a maximumát (6. ábra, 0,5-3 napig). Kontrollként az 1. példában leírt rekombináns Ad5CMV-p53-víruséhoz hasonló szerkezetű viriont állítottunk elő, amely expressziós kazettájában Rous-szarkómavírus-LTR-promoter irányítása alatt álló luciferáz-cDNS-t tartalmaz. Az Ad5/RSV/GL2-virionnal fertőzött sejtekben sem p53expressziót, sem az aktinexpresszió változását nem tapasztaltuk.
A rekombináns p53-adenovírust három emberi NSCLC-sejtvonal - H358 (amely a p53-gén homozigóta delécióját hordozza), H322 (amely a 248. kodonnál a p53-gén pontmutációját [G—>T] hordozza) és H460 (amely vad típusú p53-gént tartalmaz) - fertőzésére alkalmaztuk. Az emberi NSCLC-sejtek növekedési sebességének meghatározásához a H322- és H460-sejteket lxlO5 mennyiségben, a H358-sejteket pedig 2xl05 mennyiségben 60 mm-es csészékbe helyeztük (a vírusfertőzés előtt 24 órával). A sejteket 10 PFU/sejt fertőzési multiplicitással fertőztük meg. Az álfertőzött kontroll esetében tenyésztő tápközeget alkalmaztunk.
HU 221 279 Β1
Mindegyik sejtvonal esetében három tenyészetet készítettünk, melyeket a két vírussal, illetve tápközeggel kezeltünk, és a sejteket a fertőzést követő első hat napon naponta számoltuk.
Az Ad5CMV-p53-virionnal fertőzött H358-sejtek növekedése - az álfertőzött sejtekéhez és a kontroll virionnal fertőzött sejtekéhez képest - nagymértékben gátolt volt (7A. ábra). A H322-sejtek növekedését a p53-virion szintén nagymértékben gátolta (7B. ábra), míg a vad típusú p53-gént tartalmazó H460-sejtek növekedését csak kisebb mértékben (7C. ábra). Az Ad5CMV-p53-vírussal fertőzött H358-sejtek növekedésének gátlása 79%-os volt, míg a nem fertőzött, illetve a kontrolivírussal fertőzött sejtek növekedése nem volt gátolt. Az Ad5CMV-p53-vírus a - p53-pontmutációt hordozó - H322-sejtek növekedését 72%-os arányban, míg a - vad típusú p53-at hordozó - H460-sejtek növekedését csak 28%-os arányban gátolta.
Az eredmények azt jelzik, hogy a rekombináns p53adenovírus tumorszuppresszív tulajdonságot mutat, mely hatást a tumorsejtekben a p53-protein funkciójának helyreállításával fejt ki.
5. példa
Az Ad5CMV-p53-virus alkalmazása p53-hiányos sejtek kezelésére
Ebben a példában a rekombináns p53-adenovírus tumorsejtek növekedésgátlásának in vitro helyreállítására, és ezáltal a sejtek rosszindulatú vagy metasztázisos növekedésének kezelésére történő alkalmazását mutatjuk be. Néhány olyan megvalósítási módot írunk le, amelyek felhasználhatók a rákadenovírus közvetítette génterápiás kezelésére.
H358-sejteket - 10 PFU/sejt fertőzési multiplicitással - Ad5CMV-p53- és Ad5/RSV/GL2-vírussal fertőztünk. Azonos mennyiségű sejtet csak tápközeggel kezeltünk (álfertőzött kontroll). A fertőzés után 24 órával a kezelt sejteket betakarítottuk és PBS-sel kétszer öblítettük. Mindegyik kezeléshez 0,1 ml térfogatban 3 χ 106 sejtet szubkután csupasz egerekbe (Harlan Co., Houston, TX) injektáltunk (kezelésenként öt egeret alkalmaztunk). Az egereket az injektálás előtt besugároztuk (300 cGy, 60Co), és az injektálás után hetente vizsgáltuk. A tumorképződést a hathetes periódus végén értékeltük, és a tumortérfogatot - gömbszerű alakot feltételezve, az átlagos tumorátmérőt a keresztmetszeti átmérők szorzatának négyzetgyökének tekintve - számítottuk.
Az Ad5CMV-p53-vírus által közvetített, tumorképző sajátságot gátló hatás meghatározása érdekében a csupasz egereket - daganatos növekedés indukálása céljából - szubkután H358-sejtekkel (humán NSCLCsejttípus) oltottuk be. Mindegyik egérbe olyan sejteket injektáltunk, amelyeket előzetesen 24 óra hosszat 10 PFU/sejt dózisban Ad5CMV-p53- vagy Ad5/RSV/GL2-vírussal fertőztünk. A csak tápközeggel kezelt H358-sejteket álfertőzött kontrollként alkalmaztuk. Az - először a 14. napon kitapintható - tumorokat csak az álfertőzött, illetve a kontroll vírussal fertőzött sejtek indukálták (ld. 1. táblázat).
1. táblázat
Az Ad5CMV-p53-vírus hatása a H358-sejtek tumorképzésére csupasz egerekben3
Kezelés Tumorok száma/egerek száma (%) Átlagos térfogat (mm3±SD)
Tápközeg 4/5 (80) 37±12
Ad5/RSV/GL2 3/4 (75) 30±14
Ad5CMV-p53 0/4 (0) -
3 A kezelt H358-sejteket szubkután, egerenként 2χ 106 dózisban adtuk be. A tumorok méretét a 6. hét végén határoztuk meg.
Ahogy az 1. táblázatban látható, az Ad5CMV-p53vírussal kezelt sejtek nem képeztek tumorokat. A 6. hét végén a tumorok átmérője 4-10 mm volt. Ezt a kísérletet csoportonként öt egérrel kezdtük; az Ad5CMVp53 és az Ad5/RSV/GL2 csoportban egy-egy egér a kísérlet befejezése előtt elpusztult, amit feltehetően keresztfertőzés okozott.
6. példa
Az AdCMV-p53 alkalmazása tüdőrák kezelésében
Ebben a példában a rekombináns p53-adenovírus tumorsejtek növekedésgátlásának in vivő helyreállítására, s ezáltal állatokban rákok kezelésére történő alkalmazását mutatjuk be. Néhány olyan megvalósítási módot írunk le, amelyek felhasználhatók a rák adenovírusközvetítette génterápiás kezelésében.
Az Ad5CMV-p53-vírus tumorképzést gátló hatékonyságát az ortotópiás emberi tüdőrák egérmodelljében teszteltük. Mivel ebben a modellben a H358- és H322-sejtek nem képeznek tumorokat, a H226Brsejtvonalat alkalmaztuk. Ez a sejtvonal a pikkelyes (squamosus) tüdőrákból származik, és a tüdőből az agyba tevődik át. A H226Br-sejtek a p53-gén 7, exonjában, a 254. kodonnál pontmutációt hordoznak (ATC—>GTC), s egerekben tumorképző sajátságúak.
Az ortotópiás humán tüdőrák egérmodellben történő tesztelésének eljárását korábban leírták [Georges és munkatársai (1993)]. Röviden; sugárkezelt (300 cGy, 60Co) csupasz egereknek - légcsövén keresztül történő (intratracheális) becseppentéssel - H226Br-sejteket adtunk be. Minden egyes egérnek 0,1 ml PBS-ben 2 χ 106 sejtet adtunk be. Három nappal a beadás után, csoportonként tíz egeret - két napig, naponta egyszer, intratracheális becseppentéssel - 0,1 ml vírusoldattal vagy hordozóval (PBS) kezeltünk. Egerenként 5xl07 Ad5CMV-p53- vagy Ad5/RSV/GL2-vírust adtunk be. Az egereket a hathetes periódus végén leöltük. A tumorképződés értékeléséhez az egerek tüdejét és mediastinumát kivágtuk, és megmértük a tumor méretét. A tumorokat a tumortömeg metszeteinek szövettani vizsgálatával ellenőriztük.
A sugárkezelt csupasz egereknek intratracheális becseppentéssel 2xl06 H226Br-sejtet adtunk be. Három nappal később valamennyi egérnek (csoportonként 8-10-nek) - két napig naponta egyszer - intratracheá18
HU 221 279 B l lis becseppentéssel 0,1 ml Ad5CMV-p53-vírusoldatot, Ad5/RSV/GL2-vírusoldatot, illetve hordozót (PBS-t) adtunk be. Egerenként 5 χ 107 vírust adtunk be. Az egereket a hathetes periódus végén leöltük. A tumorképződés értékeléséhez az egerek tüdejét és mediastinumát kivágtuk, és megmértük a tumor méretét. Az eljárás folyamatábráját a 7. ábrán, a kimetszett szervek jellemző példáit pedig a 8. ábrán mutatjuk be. A detektált tumorokat szövettani vizsgálattal ellenőriztük. A tumorok mérésének eredményeit a 2. táblázatban mutatjuk be.
2. táblázat
Az Ad5CMV-p53-vírus hatása a H226Br-sejtek tumorképzésére az ortotópiás humán tüdőrák egérmodelljébena
Kezelés Tumort hordozó egerek száma/összes egér (%) Átlagos térfogat (mm5±SD)
Hordozó 7/10 (70) 30±8,4
Ad5/RSV/GL2 8/10 (80) 25±6,9
Ad5CMV-p53 2/8 (25) 8±3,3b
a Az egereknek intratracheálisan 2 χ 106 H226Br-sejtct adtunk be.
A beadás után három nappal az egereknek - szinten intratracheálisan - két napig naponta hordozót vagy vírusokat (0,1 ml térfogatban 5 χ 107 vírust) adtunk be. A tumorképződest a hathetes időszak végén értékeltük.
b Az Ad5CMV-p53-virussal kezelt csoportot a hordozóval (PBS), illetve a kontroll vírussal kezelt csoporttal összehasonlítva p<0,05 (kéttényezős szórásnégyzet-elemzéssel).
Az Ad5CMV-p53-vírussal kezelt egerek csupán 25%-ában, míg a hordozóval vagy az Ad5/RSV/GL2vírussal kezelt egerek 70-80%-ában képződtek tumorok. Az Ad5CMV-p53 csoportban az átlagos tumorméret lényegesen kisebb volt, mint a kontroll csoportokban. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az Ad5CMV-p53 az ortotópiás humán tüdőrák egérmodelljében képes megakadályozni a H226Br-sejtek tumorképzését.
7. példa
A p53 és a DNS-károsító ágens közötti szinergizmus
A programozott sejtpusztulásra (apoptózis) sajátos DNS-fragmentálódási mintázat jellemző, ami a sejtmagi DNS fragmentálódásából származik. Az újabb vizsgálatokban kimutatták, hogy az apoptózis kemoterápiás hatóanyagokkal vagy ionizáló sugárzással történő indukálásának köze lehet a p53-gén állapotához, és a DNSkárosító stimulusok az apoptózis állapotában lévő sejtekben képesek növelni az intracelluláris p53-protein szintjét [Lowe és munkatársai (1993); Clarké és munkatársai (1993); Fritsche és munkatársai (1993); Harper és munkatársai (1993); El-Deiry és munkatársai (1993)]. A sejtciklus - vad típusú p53-protein (wt-p53) szintjének növelésével - Gj-fázisban történő gátlása több időt hagy a DNS-„repair” bekövetkezésére; ha az optimális „repair” nem lehetséges, a p53 programozott sejtpusztulást válthat ki. Ilyenformán, a p53 hozzájárulhat a kemoterápiás hatóanyagok által kiváltott apoptózisos tumorsejtpusztulás indukálásához.
A p53-gén „missense” mutációval vagy delécióval történő inaktiválása az emberi rákok esetében a legáltalánosabb genetikai módosítás [Levine és munkatársai (1991); Hollstein és munkatársai (1991)]. Beszámoltak arról, hogy a p53-fünkció elvesztése növeli a különféle kemoterápiás hatóanyagokra vonatkozó rezisztenciát [Lowe és munkatársai (1993)]. Vizsgálataink azt mutatták, hogy a H358 jelzésű emberi nem kissejtes tüdőráksejtek (NSCLC) - melyekben deléció miatt a p53 mindkét allélja hiányzik - rezisztensek voltak a kemoterápiás hatóanyagokra, míg a WTH226b-sejtvonal (amely endogén wt-p53-at tartalmazott) a cisplatinnal (CDDP) és etoposiddal (VP-16) végzett kezelés után 16 órával apoptózisos sejtpusztulás jelentkezett [T. Fujiwara, E. A. Grimm, T. Mukhopadhyay, J. A. Roth; nem publikált forrás], A fentiek alapján azt kívánjuk meghatározni, hogy a wt-p53-gén - adenovírusvektor alkalmazásával - H358-sejtekbe történő bevitele fokozza-e a sejt CDDP-re vonatkozó in vitro és in vivő érzékenységét.
A H358-sejteket A. Gazdar és J. Minna adományaként kaptuk [Takahashi és munkatársai (1989)]. Adenovírus-vektorok
Az emberi wt-p53-proteint, illetve luciferázt kódoló cDNS-t tartalmazó rekombináns adenovírus-vektort (Ad-p53, illetve Ad-Luc) Zhang és munkatársai (1993) írták le. Röviden; az - emberi citomegalovírus-promotert, wt-p53-DNS-t és SV40 korai poliadenilációs szignált tartalmazó - p53-expressziós kazettát a pXCJL.lplazmid Xbal- és Clal-helye közé inszertáltuk. A p53ingázóvektort („shuttle vector”) és a rekombináns pJM17-plazmidot - liposzóma közvetítésével végzett eljárással - együttesen 293-sejtekbe (Ad5-vírussal transzformált emberi embrionális vesesejtvonal) transzfektáltuk. A teljes citopátiás hatást mutató 293-sejtek tenyészeti felülúszóját összegyűjtöttük, és a későbbi fertőzésekhez használtuk. A kontroll Ad-Luc-vírust hasonló módon állítottuk elő. Az Ad-p53- és Ad-Luc-vírust 293-sejtekben szaporítottuk. Az ép replikációjú vírusokat „HeLa”-sejtvizsgálattal vontuk ki. A vírustitert plakkanalízissel határoztuk meg [Graham és munkatársai (1991)].
A nukleoszomális DNS-fragmentálódás kimutatása
Az eredeti (nem fertőzött kontroll), illetve Ad-Lucvírussal vagy Ad-P53-vírussal fertőzött, CDDP-vel nem kezelt sejtekből DNS-t izoláltunk, oly módon, hogy a sejteket 55 °C-on, hat óra hosszat lizáló pufferben (50 mM Tris-HCl, pH=8,0; 100 mM EDTA; 100 mM NaCl; 1% SDS; és 50 pg/ml proteináz-K) inkubáltuk, és a DNS-t azonos térfogatú fenollal kétszer, és kloroform/izoamil-alkohol 24:1 arányú elegyével egyszer extraháltuk. A DNS-t ezután etanolban kicsaptuk. 1,5%-os agarózgélen DNS-mintákat elektroforizáltunk, melyeket etídium-bromidos festéssel tettünk láthatóvá.
Korábban leírt eljárás szerint [Gavrieli és munkatársai (1992)] TdT közvetítette dUTP „nick”-végjelölést
HU 221 279 Β1 végeztünk. Az egy rétegben elhelyezkedő sejteket 0,01 %-os ΝΡ-40-nel kezeltük. A tárgylemezeket TdTpufferbe (30 mM Tris-HCl, pH=7,2; 140 mM nátriumkakodilát; 1 mM kobalt-klorid) merítettük, majd 37 °Con 45 percig biotinilált dUTP-vel (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) és TdT-vel inkubáltuk. A tárgylemezeket 10 percre 2%-os szarvasmarha-szérumalbuminnal vontuk be, és avidin-biotin-komplexszel („Vectastain Elité Kit”; Vector Laboratories, Burlingame, CA) 30 percig inkubáltuk. A kolorimetriás detektálást diamino-benzidin alkalmazásával végeztük.
A H358-sejteket - Ad-p53-vírussal végzett fertőzéssel - in vitro emberi wt-p53-cDNS-sel transzdukáltuk. „Westem-blot”-analízissel már az Ad-p53-vírussal végzett fertőzés után 24 órával magas szintű wt-p53-expressziót mutattunk ki, míg az eredeti (nem fertőzött), és az Ad-Luc-vírussal fertőzött kontrolisejtekben wt-p53expressziót nem detektáltunk (az adatokat nem mutatjuk be). A párhuzamosan végzett immunhisztokémiai vizsgálat eredménye azt mutatta, hogy a wt-p53-protein a fertőzött sejtek több, mint 80%-ában kimutatható, ami arra utal, hogy a p53 Ad-p53-vírus alkalmazásával történő bevitele és expresszáltatása igen hatékony (az adatokat nem mutatjuk be).
Az Ad-p53-vírussal fertőzött H358-sejtek CDDPvel végzett folyamatos kezelése gyorsan csökkentette életképességüket, míg a nem fertőzött, illetve az AdLuc-vírussal fertőzött sejteknél jelentős mértékű sejtpusztulást csak a CDDP-vel végzett kezelés megkezdése után 72 órával tapasztaltunk (10A. ábra). Az Adp53-vírussal transzdukált sejtekben az életképesség rohamosan csökkent, sőt, a csökkenés akkor is megfigyelhető volt, ha a sejteket 24 órás CDDP-kezelés után hatóanyagmentes tápközegben tartottuk. Ez arra utal, hogy 24 órán belül letális károsodás indukálható (10B. ábra). A wt-p53-gént hordozó vírussal transzdukált H358sejtek CDDP-re vonatkozó érzékenysége dózisfuggő volt (10C. ábra).
A 24 órás CDDP-kezelés után a wt-p53-proteint expresszáló sejtekben intranukleoszomális DNS-fragmentációt figyeltünk meg; ezzel szemben, az eredeti (nem fertőzött), illetve az Ad-Luc-vírussal fertőzött sejtek nem mutattak DNS-fragmentációt (11 A. ábra). A terminális dezoxinukleotidil-transzferáz (TdT) közvetítésével végzett 2’-dezoxiuridin-5’-trifoszfát (dUTP)biotin „nick-end” jelöléssel (ami az apoptózis DNSfragmentálódási jellemzőit in situ mutatja ki) a 24 óra hosszat CDDP-vel kezelt - Ad-p53-vírussal fertőzött sejtek között sok apoptózisos sejtet detektáltunk (ld. 11G. ábra, amelyen sötét festődésű sejtmagok és sejtmagi fragmensek láthatók, amelyek a 11B-11F. ábrákon nincsenek jelen).
Ismert, hogy a wt-p53-gén bevitele apoptózist okoz néhány olyan tumorsejtvonalban, amelyben a p53-gén deléciót vagy mutációt szenvedett [Yonish-Rouach és munkatársai (1991); Shaw és munkatársai (1992); Ramqvist és munkatársai (1993)]. Önmagában a wtp53 - p53-negatív H358-sejtvonalban végzett túlexpresszáltatása - nem képes DNS-fragmentálódást előidézni (11. ábra), bár az ilyen sejtek szaporodását az
Ad-p53-vírus gátolta (10. ábra). Ez összhangban áll korábbi megfigyeléseinkkel, melyek azt mutatják, hogy a retrovírus közvetítette wt-p53-bevitel után stabil H358klónok nyerhetők, és az ilyen kiónok lassabban szaporodnak, mint az eredeti sejtek [Cai és munkatársai (1993)].
Az Ad-p53 és a CDDP kombinációjának potenciális terápiás hatékonyságát a H358-szferoidok térfogatának relatív változása alapján értékeltük. A soksejtes tumorszferoid-modell in vitro olyan szövettani struktúrát mutat, amely hasonló a primer tumorok és a mikrometasztázisok szerkezetéhez. A CDDP-vel végzett kezelés az Ad-p53-vírussal fertőzött H358-szferoidok relatív térfogatának csökkenését eredményezte, de a nem fertőzött, illetve az Ad-Luc-vírussal fertőzött szferoidokra nem gyakorolt jelentős hatást (12A. ábra). Az in situ TdT-közvetítette dUTP-jelölés az Ad-p53-vírussal fertőzött szferoidok felületén sok apoptózisos sejtet mutatott ki, azonban az Ad-p53-vírussal nem fertőzött szferoidokon apoptózisos sejteket nem találtunk (12B-12E. ábrák). Korábban beszámoltunk arról, hogy a retrovírus közvetítette wt-p53-expresszió gátolta a - TGF-a-val (transzformáló növekedési faktor-α) indukált - H322aszferoidok növekedését [Fujiwara és munkatársai (1993)]. A retrovírusvektorok azonban nem képesek megfertőzni a H358-szferoidokat, mivel az ilyen szferoidokban lévő sejtek exogén TGF-α hatására nem mutatnak gyors proliferációt. Az a felismerés, hogy az Ad-p53-vírussal fertőzött H358-szferoidok méretét a CDDP - a felületi sejtek apoptózisának indukálásával - csökkentette, arra utal, hogy az Ad-p53-vírus nem proliferálódó sejteket fertőz meg, és a CDDP a nyugvó sejtekben apoptózisos folyamatot indít be.
8. példa
A p53 és a DNS-károsító ágensek alkalmazása kezelési eljárásokban
Az 5., 6. és 7. példában, illetve a következőkben leírt állatmodelleket a preklinikai vizsgálatok részeként alkalmazzuk. Azokat a betegeket, akik számára orvosilag javallott az adenovírus közvetítette génbeviteli kezelés, adenovírus elleni antitestek jelenlétére vizsgáljuk. Amennyiben ilyen antitestek jelen vannak, és a beteg allergiás a gyógyszerészeti vagy a természetben előforduló anyagokra, fokozott klinikai megfigyelés mellett 103—106 rekombináns adenovírus nagyságrendű tesztelő dózis beadását javasolhatjuk.
A rák Ad5CMV-p53-vírus alkalmazásával végzett kezelése érdekében, a „Food and Drug Administration” (FDA) által elfogadható eljárás szerint - megfelelő promoter- és erősítő- („enhancer”)-elemek (például CMVpromoter) irányítása alatt - p53-at expresszáló rekombináns adenovírust állíthatunk elő és tisztíthatunk. Az ilyen eljárások közé tartozik - nem kizárólagosan - a cézium-klorid-sűrűséggradiens centrifugálás, amely után a rekombináns vírust hatékonyságra és tisztaságra teszteljük.
A p53-adenovírus alkalmazásával végzett kezelésre két alapvető eljárást tartunk alkalmasnak; egy közvetlen vagy helyi beadást, illetve egy általánosabb be20
HU 221 279 Β1 adást. Az ilyen eljárások bármilyen - p53-mutációkkal kapcsolatos - rák kezelésére alkalmasak. Az általános beadást illetően, kimutatták, hogy az adenovírus egyszerű intravénás injektálása elégséges az injektálás helyétől távoli szövetek virális fertőzéséhez [Stratford-Perricaudet és munkatársai (1991b)], és ezáltal alkalmas valamennyi - p53-mal kapcsolatos - rosszindulatú betegség kezelésére. A vírust bármilyen - gyógyászati szempontból elfogadható - oldatban, intravénás injektálással vagy megfelelő ideig adagolt infúzióval adhatjuk be a betegnek. Általánosan, úgy tartjuk, hogy a funkcionális vírusrészecskék beadandó, hatásos mennyisége 1 χ 1 O*°-től 5 χ 1012-ig terjed.
Kívánt esetben, különösen tüdőrák esetén - a húgyhólyagfibrózis transzmembrán-konduktancia-regulátorának intratracheális beadásához [Rosenfeld és munkatársai (1992)] hasonló módon - a rekombináns adenovírus közvetlenebb fizikai célbajuttatása alkalmazható, melynek eredményeként a rekombináns p53-adenovírus a célsejtekhez közelebbi helyre vihető be.
Az apoptózis detektálása érdekében TdT alkalmazásával végzett in situ dUTP-jelölés
A H358-szferoidokat a 3. napon rögzítettük, és - a
7. példában leírtak szerint - festettük. Röviden; ajelölt TdT-próbákat TdT-pufferbe merített tárgylemezekkel hoztuk érintkezésbe, majd 37 °C-on 45 percig biotinilált dUTP-vel és TdT-vel inkubáltuk. A tárgylemezeket 10 percre 2%-os szarvasmarha-szérumalbuminnal vontuk be, és avidin-biotin-komplexszel 30 percig inkubáltuk. A kolorimetriás detektálást diamino-benzidin alkalmazásával végeztük.
Apoptózis indukálása CDDP-vel (Ad-p53-vírussal végzett in vivő fertőzés után)
0,1 ml „Hank”-féle egyensúlyi sóoldatban lévő H358-sejteket (5 χ 106) - szubkután - nőstény nu/nuBALB/c-egerek jobb oldali lágyékába injektáltunk. Harminc nappal később az 5-6 mm-es átmérőjű tumorokba szubkután 200 μΐ sóoldatot önmagában, illetve 200 μΐ - Ad-Luc-vírust (108 PFU/ml) tartalmazó sóoldatot injektáltunk. Az injekciókat közvetlenül a tumorba (100 μΐ) vagy a tumor két egymással szemközti oldala mellé (50-50 μΐ) adtuk. Az egerekbe intraperitoneálisan CDDP-t (3 mg/kg), illetve kontroll fiziológiás sóoldatot injektáltunk. A tumortérfogat változásának meghatározása érdekében a tumorok két, egymásra merőleges átmérőjét (a kezelési csoport ismerete nélkül) mérőkörzővel megmértük, és a tumortérfogatot - gömbalakot feltételezve - a keresztmetszeti átmérők szorzatának négyzetgyökeként számítottuk. Mindegyik kísérleti csoportban öt egeret alkalmaztunk, és a 12A. ábrán átlag± szórás értékeket mutatunk be. Az adatokat a „Studenf’-féle t-teszt alkalmazásával analizáltuk. A nyíl a kezelés napját jelöli (az 1. tesztben, az 5. naptól p<0,05; a 2. tesztben a 7. naptól p<0,05).
A TdT közvetítette biotin-dUTP jelölési technika alkalmazásával végzett szövettani vizsgálat céljából a tumorokat a kezelés kezdete után 5 nappal gyűjtöttük össze, és azonnal „O.C.T.” vegyületbe ágyaztuk. Hidegtermosztátban 5 μιη vastagságú fagyasztott metszeteket készítettünk. A metszeteket 1 μg/ml koncentrációjú proteináz-K-val kezeltük, és a fentebb leírt módon festettük. Az állatokról a „UT M. D. Anderson Institutional Animál Care and Use Committee” által meghatározott irányelvek szerint gondoskodtunk.
A találmány szerinti - génhelyettesítéses terápia és kemoterápia kombinációján alapuló - eljárások és készítmények emberi rák kezelésében mutatott in vivő hatékonyságának bizonyítása érdekében azt vizsgáltuk, hogy az Ad-p53-vírus és a CDDP egymás utáni beadása in vivő indukál-e apoptózist. Az Ad-p53 (három napos) közvetlen intratumorális injektálása, illetve a CDDP intraperitoneális beadása után a nu/nu-egerekbe szubkután beültetett H358-tumorok növekedése mérsékelten lassult. Ha azonban az Ad-p53-vírust és a CDDP-t egyszerre adagoltuk, a tumorok részlegesen visszafejlődtek, és a tumorok mérete statisztikailag lényegesen kisebb maradt, mint bármelyik kezelési csoportban. A növekedést gátló hatás két kezelési ciklus után még kifejezettebb volt (13A. ábra). A tumorok szövettani vizsgálata a CDDP-vel kezelt egerekben az Ad-p53 injektálása helyén lévő tumorsejtek nagymértékű elpusztítását mutatta. In situ festéssel a sejtmentes terek környékén sok apoptózisos sejtet mutattunk ki (13B.-13E. ábrák). Ezzel szemben, a csak CDDP-vel vagy csak Ad-p53vírussal kezelt tumorok esetében sem sejtmentes, sem apoptózisos területeket nem észleltünk.
A következőkben az előnyös kezelési eljárásokat írjuk le részletesebben. A betegeket először - az légutak elzáródásának értékelése céljából - bronchoszkóppal vizsgáljuk. Az endoszkópiás vizsgálat segítségével a lehető legtöbb nagy tumort ki kell vágni. A betegek bronchoszkópiás vizsgálatát előnyösen helyi vagy általános érzéstelenítés mellett kell végezni. A bronchoszkóp biopsziavezetékébe egy transzbronchiális Stifcor™ aspuirációs tűt (2lg) vezetünk be. A kivágott tumor helyére - kis, például 10 ml-es térfogatban - injektáljuk a p53-adenovírust.
A vírus által kiváltott, a beteg egészségére káros hatások semmilyen körülmények között nem várhatók, mivel az alkalmazott adenovírus replikációra képtelen. Ennek ellenére, a betegeket - az akut és késői zavaró reakciók ellenőrzése érdekében - legalább 48 órára kórházban kell tartani. A replikációra képtelen adenovírus génbeviteli hordozóként történő alkalmazásának biztonsági vonatkozásait korábban már leírták [Rosenfeld és munkatársai (1982); Jaffe és munkatársai (1992)], az adenovírus beadandó dózisát azonban úgy kell megválasztani, hogy a nem kívánt mellékhatások kialakulásának esélye minimális legyen.
A reakció szükségessége létezésének vagy a toxicitás létezésének megállapításakor különböző kritériumokat kell figyelembe venni. A toxicitás létezése meghatározásának elősegítése érdekében a tumorágyat a terápia megkezdése előtt le kell fényképezni, és meg kell mérni legnagyobb átmérőjét és annak merőlegesét. A tumor méretét az átmérők szorzataként kell megadni. Ezen adatok alapján, ezekből a számokból kiszámíthatjuk a tumor kiújulásának mértékét.
A betegség előrehaladásának idejét a tumortömeg csökkenésének első észlelésétől az előrehaladó beteg21
HU 221 279 Bl ség bizonyítékának megjelenéséig mérhetjük. Az előrehaladó (súlyosbodó) betegség definíció szerint a mért lézió átmérőinek szorzatai összegének 25%-os vagy nagyobb növekedése. Mielőtt a betegség előrehaladását minősítenénk, a betegeknek legalább két kezelésen kell átesniük. A páciensek életbenmaradását az eljárás kezdetétől mérjük.
A későbbi vizsgálatok közé a rákterápiában általánosan alkalmazott vizsgálatok tartoznak, beleértve a klinikai tünetek megfigyelését és a standard és molekuláris biológiai analízisek (melyekkel meghatározható a különböző p53-gének expressziós mintázata) céljából történő biopsziákat. Az ilyen vizsgálatok információt nyújthatnak a bevitt gént felvevő sejtek számáról és a relatív in vivő promoterhatékonyságról. A kapott adatok alapján kívánatos lehet a kezelés finomítása. Az ilyen finomítások közé tartozhat az eltérő promotereket tartalmazó adenovírus-konstrukciók alkalmazása vagy - több vagy valamennyi tumorsejt megfertőzésének (a rekombináns gének fiziológiástól eltérő túlexpresszálása nélküli) biztosítása érdekében - a vírus injektált PFU-dózisának megváltoztatása.
Az adenovírus alkalmazásával in vivő bevitt exogén gének expressziója hosszabb ideig folytonos lehet. A vírus közvetítésével bevitt exogén gének terápiás szempontból hatásos, hosszú időtartamú expresszióját minden egyes esetre külön kell meghatározni. A markergének haszna a génexpresszió terápiás szempontból megfelelő szintjének megállapítására korlátozódik, mivel egy adott, bármilyen genetikai rendellenesség javításához szükséges expressziós szint jelentős mértékben különbözhet egy másik betegség gyógyításához szükséges szinttől.
Bár a találmány szerinti készítményeket és eljárásokat a találmány előnyös megvalósítási módjain keresztül szemléltettük, szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti készítmények, eljárások és azok lépéseinek gyakorlati megvalósításában, valamint azok sorrendjében különböző változtatások hajthatók végre, anélkül, hogy eltérnénk a találmányi gondolattól. Az ilyen megoldások az igényelt oltalmi körön belül maradnak. Közelebbről, kézenfekvő, hogy az itt leírt anyagok helyett alkalmazhatók bizonyos olyan anyagok, amelyek kémiai vagy fiziológiai szempontból hasonlóak az általunk alkalmazottakhoz, és azonos vagy hasonló eredmények elérését teszik lehetővé. Valamennyi ilyen - szakember számára nyilvánvaló - helyettesítést a találmány tárgyához tartozónak tekintünk. Az igénypontokban említett valamennyi anyag és eljárás elvárható mennyiségű kísérleti munkával előállítható, illetve megvalósítható.
Az alábbi hivatkozásokat - amennyiben azok a találmány leírását a példákban ismertetett módszerek vagy más részletek tekintetében kiegészítik - teljes terjedelmükben a kitanítás részének kell tekinteni. Hivatkozások jegyzéke
Bargonetti, et al. (1991) Ce//65: 1083-1091.
Bishop (1987) Science 235: 305-311.
Boeheringer Mannheim Biochemicals (1992). DOTAP fór high efficiency transfections, BMBiochemica 9 (1): 17.
Boshart, M. et al. (1985). A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of humán cyitomegalovirus. Cell, 41: 521-530.
Cai, D. W., Mukhopadhyay, T., Liu, T., Fujiwara, T., and Roth, J. A. Stable expression of the wild-type p53 gene in humán lung cancer cells after retrovirusmediated gene transfer. Humán Gene Ther, 4: 617-624,1993.
Culver, K. W., Ram, Z., Wallbridge, S., Ishii, H., Oldfield, E. H., and Blaese, R. M. In vivő gene transfer with retroviral vector-producer cells fór treatment of experimental brain tumors. Science, 256: 1550-1552, 1992.
Casey, G. Lo-Hueh, M., Lopez, Μ. E., Vogelstein, B., and Stanbridge, E. J. (1991). Growth suppression of humán breast cancer cells by the introduction of a wildtype p53 gene. Oncogene 6: 1791-1797.
Clarké, A. R., Purdie, C. A., Harrison, D. J., Morris, R. G„ Bírd, C. C„ Hooper, M. L„ and Wyllie, A. H. Thymocyte apoptosis induced by p53-dependent and independent pathways. Natúré, 362: 849-852, 1993. Dai, eí al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 10892-10895.
Doyle, L. A. Mechanisms of drug resistance in humán lung cancer cells. Sémin Oncol, 20: 326-337, 1993. El-Deiry, W. S. Tokino, T., Velculescu, V. E., Levy, D. B., Parsons, R., Trent, J. M., Lin, D., Mercer, E., Kinzler, K. W., and Vogelstein, B. WAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression. Cell, 75: 817-825, 1993.
Fritsche, M., Haessler, C., and Brandner, G. Induction of nuclear accumulation of the tumor-suppressor protein p53 by DNA-damaging agents. Oncogene, 8: 307-318, 1993.
Fieldseia/. (1990) Science 249: 1046-1049.
Fujiwara, T., Grimm, E. A., Mukhopadhyay, T., Cai, D. W., Owen-Schaub, L. B., and Roth, J. A. A retroviral wild-type p53 expression vector penetrates humán lung cancer spheroids and inhibits growth by inducing apoptosis. Cancer Rés, 53: 4129-4133,1993. Gavrieli, Y., Sherman, Y., and Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labelling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Bioi, 119: 493-501, 1992.
Georges et al. (1993) Cancer Rés 53: 1743-1746. Ghosh-Choudhury and Graham (1987) Biochem. Biophys. Rés. Comm. 147: 964-973.
Gluzman et al., (1982) in Eukaryotic Viral Vectors (Gluzman, Y., Ed.) pp. 187-192, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York.
Graham, F. L. and A. J. van dér Eb. (1973). A new technique fór the assay of infectivity of humán adenovírus 5 DNA. Virology 52: 456-467.
Graham, F. L. and Prevec, L. Manipulation of adenovírus vectors. In: Murray E. J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128. New Jersey: The Humana Press Inc, 1991.
Graham, F. L., J. Smiley, W. C. Russel and R. Naim (1977). Characteristics of a humán cell line
HU 221 279 Β1 transformed by DNA írom humán adenovírus type 5. J. Gén Virol. 36: 59-72.
Grunhaus, A. and Horwitx, M. S. (1992). Adenoviruses as cloning vectors. Sémin. Virology 3 : 237-2542. Harper, J. E., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., and Elledge, S., The p21 Cdk-interacting protein Cipl is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell, 75: 805-816, 1993.
Hollstein, M., Sidransky, D., Vogelstein, B., and Harris, C. (1991). p53 mutations in humán cancers. Science 253: 49-53.
Jaffe et al., (1992) Natúré Genetics 1: 372-378.
Le Gál et al., (1993) Science 259: 988-990.
Ledley, J. (1987). J. Pediatrics 110, 1.
Levine, A. J., Momand, J., and Finlay, C. A. The p53 tumour suppressor gene. Natúré, 351: 453-456, 1991. Lowe, S. W., Ruley, Η. E., Jacks, T., and Housman, D. E. p53-dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents. Cell, 74: 957-967, 1993.
Lowe, S. W., Schmitt, Ε. M., Smith, S. W., Osbome, B. A., and Jacks, T. p53 is required fór radiation-induced apoptosis in mouse thymocytes. Natúré, 362: 847-849,1993.
McGrory, W. J. et al. (1988). A simple technique fór the rescue of early region I mutations intő infectious humán adenovírus type 5. Virology 163: 614-617. Mercer, W. E. (1992). Cell cycle regulation and the p53 tumor suppressor protein. Critic. Rév. Eukar. Gene Express. 2: 251-263.
Mietz, et al. (1992) EMBO 11: 5013-5020.
Miller 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunoi. 158:1 Montenarh, M. (1992). Biochemical, immunological, and functional aspects of the growth-suppressor/oncoproteinp53. Critic. Rév. Onco. 3: 233-256.
Mulligan, (1993), Science 260: 926.
Nicolau, C., et al. (1983). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 1068.
Ragot et al., (1993) Natúré, 361: 647-650.
Ramqvist, T., Magnusson, K. P., Wang, Y., Szekeley, L., and Klein, G. Wild-type p53 induces apoptosis in a Burkitt lymphoma (BL) line that carries mutant p53. Oncogene, 8: 1495-1500, 1993.
Rosenfeld et al., (1992) Ce//68: 143-155.
Rosenfeld et al., (1991) Science, 232: 431-434.
Roth, J., Ruckdeschel, Weisenburger, Editors, Thoracic Oncology, First Edition, Chapter 49, pgs 711-721, Sanders, New York, 1989.
Shaw, P., Bovey, R., Tardy, S., Sahli, R., Sordat, B., and Costa, J. Induction of apoptosis by wild-type 53 in a humán colon tumor-derived cell line. Proc Natl Acad Sci USA, 89: 4495-4499, 1992.
Spandidos, etal. (1989),7. Pathol., 157: 1 — 10.
Stewart et al., 1992, Hűm. Gene Ther. 3:267 Stratford-Perricaudet, L. and M. Perricaudet. (1991a). Gene transfer intő animals: the promise of adenovírus. p. 51-61, In O. Cohen-Haguenauer and M. Boiron (Eds.), Humán Gene Transfer, Editions John Libbey Eurotext, Francé.
Stratford-Perricaudet et al., (1991b) Hűm. Gene. Ther. 1: 241-256
Takahashi, T., Nau, Μ. M., Chiba, I., Birrer, M. J., Rosenberg, R. K., Vinocour, M., Levitt, M., Pass, H., Gazdar, A. F., and Minna, J. D. p53: a ffequent target fór genetic abnormalities in lung cancer. Science, 246: 491-494, 1989.
Takahashi, T., Carbone, D., Takahashi, T., Nau, M. M., Hida, T., Linnoila, I., Ueda, R., and Minna, J. D. (1992). Wild-type bút nőt mutant p53 suppresses the growth of humán lung cancer cells bearing multiple genetic lesions. 1992. Cancer Rés. 52: 2340-2342.
Tishler, R. B., Calderwood, S. K, Coleman, C. N., and Price, B. D. Increases in sequence specific DNA binding by p53 following treatment with chemotherapeutic and DNA damaging agents. Cancer Rés, 53: 2212-2216, 1993.
Tooza, J. (1981). Molecular biology of DNA Tumor viruses, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
Torchilin et al., 1992, Faseb J. 6: 2716
Travali, etal. (1990), FASEB, 4: 3209-3214. Weinberg, R. A. (1991). Tumor suppressor gene. Science 254: 1138-1145.
Wilcock, etal. (1991) Natúré 349: 429-431.
Wolff, J. A., Malone, R. W., Williams, P., Chong, W., Acsadi, G., Jani, A., and Felgner, P. L. (1990) Direct gene transfer intő mouse muscle in vivő. Science 247, 1465-1468.
Yonish-Rouach, E., Resnitzky, D., Rőtem, J., Sachs, L., Kimchi, A., and Oren, M. Wild-type p53 induces apoptosis of myeloid leukemic cells that is inhibited by interleukin-6. Natúré, 352: 345-347, 1991. Zakut-Houri et al. (1985), EMBOJ., 4: 1251-1255. Zhan, Q., Carrier, F., and Fomace Jr., A. J. Induction of cellular p53 activity by DNA-damaging agents and growth árrést. Mól Cell Bioi, 13: 4242-4250, 1993. Zhang, W. W., Fang, X., Branch, C. D., Mazur, W., French, B. A., and Roth, J. A. Generation and Identification of recombinant adenovírus by liposome-mediated transfection and PCR analysis. BioTechniques, 1993.
Zhang, W. W., Fang, X., Mazur, W., French, B. A., Georges, R. N., and Roth, J. A. High-efficiency gene transfer and high-level expression of wild-type p53 in humán lung cancer cells mediated by recombinant adenovírus. Cancer Gene Therapy, 1993.
Zhu, etal., 1993, Science 261: 209-211.
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 19 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULA TÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁSA: /desc=„DNA”
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGCCCACCCC CTTGGCTTC 1 9
HU 221 279 Β1
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULA TÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁSA: /desc=„DNA”
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTGTAACCAT TATAAGCTGC 2 0
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULA TÍPUS: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁSA: /desc=„DNA”
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCGTTTCTCA GCAGCTGTTG 20
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULA TÍPUS : egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁSA: /desc=„DNA„
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CATCTGAACT CAAAGCGTGG 20

Claims (74)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Egy p53-protein vagy p53-gén és DNS-károsító ágens kombinációja, sejt elpusztítására történő alkalmazásra.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens röntgensugárzás, UV-fény, γ-sugárzás, mikrohullám, adriamicin, 5-fluor-uracil, etoposid, camptothecin, aktinomicin-D, mitomicin-C vagy cisplatin.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNSkárosító ágens cisplatin.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti kombináció, ahol a protein vagy gén a sejtben p53-proteint expresszáló rekombináns vektorból származik.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti kombináció, ahol a protein vagy gén csupasz DNS-plazmidból, liposzómába foglalt plazmidból, retrovírusvektorból, AAV-vektorból vagy rekombináns adenovírus-vektorból származik.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti kombináció, ahol a protein vagy gén rekombináns adenovírus-vektorból származik.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti kombináció, ahol protein vagy gén citomegalovírus-IE-promoter irányítása alatt álló p53-expressziós régiót tartalmazó rekombináns adenovírus-vektorból származik.
  8. 8. A 6. igénypont szerinti kombináció, ahol a protein vagy gén p53-expressziós régiót, citomegalovírus-IEpromotert és SV40 korai poliadenilációs szignált tartalmazó rekombináns adenovírus-vektorból származik.
  9. 9. A 6. igénypont szerinti kombináció, ahol a protein vagy gén legalább egy, adenovírus-replikációhoz nélkülözhetetlen deletált gén helyett p53-expressziós régiót tartalmazó adenovírus-vektorkonstrukcióból származik.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti kombináció, ahol a protein vagy gén az E1A- és ElB-régiók helyett p53-expressziós régiót tartalmazó adenovírus-vektorkonstrukcióból származik.
  11. 11. A 6. igénypont szerinti kombináció, ahol a protein vagy gén rekombináns adenovírus-vektorként rekombináns adenovírusba épített vektorból származik.
  12. 12. Az 1. igénypont szerinti kombináció, ahol a protein vagy gén alkalmazása a DNS-károsító ágenssel nem egyidejűleg, hanem azt megelőzően történik.
  13. 13. Az 1. igénypont szerinti kombináció, ahol a protein vagy gén alkalmazása a DNS-károsító ágenssel nem egyidejűleg, hanem azt követően történik.
  14. 14. Az 1. igénypont szerinti kombináció, ahol a protein vagy gén alkalmazása a DNS-károsító ágenssel egyidejűleg történik.
  15. 15. Az 1. igénypont szerinti kombináció, ahol a protein vagy gén alkalmazása készítmény formájában, a DNS-károsító ágenssel - melyet szintén készítmény tartalmaz - nem egyidejűleg, hanem azt megelőzően történik.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti kombináció, ahol a kombináció bármely tagjának alkalmazása farmakológiái szempontból elfogadhatóan formázott, diszpergált készítmény formájában történik.
  17. 17. Az 1. igénypont szerinti kombináció, egyetlen készítmény formájában történő alkalmazásra.
  18. 18. A 17. igénypont szerinti kombináció, ahol a protein vagy gén alkalmazása farmakológiai szempontból elfogadhatóan formázott, diszpergált készítmény formájában történik.
  19. 19. A 17. igénypont szerinti kombináció, ahol a protein vagy gén alkalmazása a sejtben p53-proteint expresszáló rekombináns vektorként, egyetlen - a DNSkárosító ágenst is tartalmazó - készítmény formájában történik.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti kombináció, ahol a protein vagy gén alkalmazása a sejtben p53-proteint expresszáló rekombináns vektort hordozó rekombináns adenovírusként, egyetlen - a DNS-károsító ágenst is tartalmazó - készítmény formájában történik.
  21. 21. Az 1. igénypont szerinti kombináció, emberi sejt elpusztítására történő alkalmazásra.
  22. 22. Az 1. igénypont szerinti kombináció, malignus sejt elpusztítására történő alkalmazásra.
  23. 23. A 22. igénypont szerinti kombináció, tüdőráksejt elpusztítására történő alkalmazásra.
  24. 24. A 22. igénypont szerinti kombináció, emlőráksejt elpusztítására történő alkalmazásra.
    HU 221 279 Β1
  25. 25. A 22. igénypont szerinti kombináció, a p53génben mutációt hordozó sejt elpusztítására történő alkalmazásra.
  26. 26. Az 1. igénypont szerinti kombináció, farmakológiái szempontból elfogadható formában beadva, egy állat testében lévő sejt elpusztítására történő alkalmazásra.
  27. 27. A 26. igénypont szerinti kombináció, ahol a protein vagy gén alkalmazása a tumorsejtben p53-proteint expresszáló rekombináns vektort hordozó rekombináns adenovírust tartalmazó gyógyászati készítmény formájában, tumorba injektálva történik.
  28. 28. A 27. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens röntgensugárzás, UV-fény, γ-sugárzás vagy mikrohullám.
  29. 29. A 28. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens röntgensugárzás.
  30. 30. A 28. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens UV-fény.
  31. 31. A 28. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens γ-sugárzás.
  32. 32. A 28. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens mikrohullám.
  33. 33. A 27. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens alkalmazása DNS-károsító vegyületet tartalmazó gyógyászati készítmény formájában történik.
  34. 34. A 33. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens cisplatin.
  35. 35. A 33. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens doxorubicin.
  36. 36. A 33. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens etoposid.
  37. 37. A 33. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens verapamil.
  38. 38. A 33. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens podophyllotoxin.
  39. 39. A 33. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens 5-fluor-uracil.
  40. 40. A 33. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens 5-fluor-uracil.
  41. 41. A 26. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens alkalmazása DNS-károsító vegyületet tartalmazó gyógyászati készítmény formájában történik.
  42. 42. A 26. igénypont szerinti kombináció, ahol a protein vagy gén alkalmazása a DNS-károsító ágenssel nem egyidejűleg, hanem azt megelőzően történik.
  43. 43. A 26. igénypont szerinti kombináció, ahol a protein vagy gén alkalmazása a DNS-károsító ágenssel nem egyidejűleg, hanem azt követően történik.
  44. 44. A 26. igénypont szerinti kombináció, ahol a protein vagy gén alkalmazása a DNS-károsító ágenssel egyidejűleg történik.
  45. 45. Egy p53-protein vagy p53-gén és DNS-károsító ágens kombinációja, rák kezelésére történő alkalmazásra.
  46. 46. A 45. igénypont szerinti kombináció, ahol a protein vagy gén alkalmazása a DNS-károsító ágenssel nem egyidejűleg, hanem azt megelőzően történik.
  47. 47. A 45. igénypont szerinti kombináció, ahol a protein vagy gén alkalmazása a DNS-károsító ágenssel nem egyidejűleg, hanem azt követően történik.
  48. 48. A 45. igénypont szerinti kombináció, ahol a protein vagy gén alkalmazása a DNS-károsító ágenssel egyidejűleg történik.
  49. 49. A 45. igénypont szerinti kombináció, ahol a protein vagy gén alkalmazása a tumorsejtben p53-proteint expresszáló rekombináns vektort hordozó rekombináns adenovírust tartalmazó gyógyászati készítmény formájában, tumorba injektálva történik.
  50. 50. A 49. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens alkalmazása gyógyászati készítmény formájában történik.
  51. 51. A 49. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens cisplatin.
  52. 52. A 49. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens doxorubicin.
  53. 53. A 49. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens etoposid.
  54. 54. A 49. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens verapamil.
  55. 55. A 49. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens podophyllotoxin.
  56. 56. A 49. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens röntgensugárzás, UV-fény, γsugárzás vagy mikrohullám.
  57. 57. Az 56. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens röntgensugárzás.
  58. 58. Az 56. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens UV-fény.
  59. 59. Az 56. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens γ-sugárzás.
  60. 60. Az 56. igénypont szerinti kombináció, ahol a DNS-károsító ágens mikrohullám.
  61. 61. Készítmény, amely DNS-károsító ágenssel együtt p53-proteint vagy -gént tartalmaz.
  62. 62. A 61. igénypont szerinti készítmény, amely a p53-proteint vagy -gént adriamicinnel, 5-fluor-uracillal, etoposiddal, camptothecinnel, aktinomicin-D-vel, mitomicin-C-vel vagy cisplatinnal együtt tartalmazza.
  63. 63. A 62. igénypont szerinti készítmény, amely a p53-proteint vagy -gént cisplatinnal együtt tartalmazza.
  64. 64. A 61. igénypont szerinti készítmény, amely a DNS-károsító ágenssel együtt olyan rekombináns vektort tartalmaz, amely állati sejtben p53-proteint expresszál.
  65. 65. A 64. igénypont szerinti készítmény, amely rekombináns vektorként csupasz DNS-plazmidot, liposzómába foglalt plazmidot, retrovírusvektort, AAV-vektort vagy rekombináns adenovírus-vektort tartalmaz.
  66. 66. A 65. igénypont szerinti készítmény, amely rekombináns vektorként rekombináns adenovírus-vektort tartalmaz.
  67. 67. A 66. igénypont szerinti készítmény, amely rekombináns adenovírus-részecskében lévő rekombináns adenovírus-vektort tartalmaz.
  68. 68. A 61. igénypont szerinti készítmény, amely rekombináns adenovírus-részecskében lévő rekombináns adenovírus-vektorral együtt cisplatint tartalmaz.
    i
    HU 221 279 Bl
  69. 69. A 61. igénypont szerinti készítmény, amely farmakológiai szempontból elfogadhatóan, diszpergáltan van formázva.
  70. 70. A 69. igénypont szerinti készítmény, amely a károsodás helyére történő beadásra alkalmas módon van formázva.
  71. 71. Terápiás reagenskészlet, amely alkalmas edényekben egy - állati sejtben p53-proteint expresszáló - rekombináns vektort tartalmazó gyógyászati készítményt és egy DNS-károsító ágenst tartalmazó gyógyászati készítményt tartalmaz.
  72. 72. A 71. igénypont szerinti reagenskészlet, amely a rekombináns vektort és a DNS-károsító ágenst egy edényben tartalmazza.
  73. 73. A 71. igénypont szerinti reagenskészlet, amely a 5 rekombináns vektort és a DNS-károsító ágenst két külön edényben tartalmazza.
  74. 74. A 71. igénypont szerinti reagenskészlet, amely - állati sejtben p53-proteint expresszáló rekombináns vektort hordozó - rekombináns adenovírust tartalmazó
    10 gyógyászati készítményt, valamint cisplatint tartalmazó gyógyászati készítményt tartalmaz.
HU9602937A 1994-04-25 1995-04-24 Compositions comprising dna damaging agents and p53 for killing cells HU221279B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/233,002 US5747469A (en) 1991-03-06 1994-04-25 Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53
PCT/US1995/004898 WO1995028948A1 (en) 1994-04-25 1995-04-24 Compositions comprising dna damaging agents and p53

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9602937D0 HU9602937D0 (en) 1996-12-30
HUT76258A HUT76258A (en) 1997-07-28
HU221279B1 true HU221279B1 (en) 2002-09-28

Family

ID=22875472

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9602937A HU221279B1 (en) 1994-04-25 1995-04-24 Compositions comprising dna damaging agents and p53 for killing cells

Country Status (20)

Country Link
US (5) US5747469A (hu)
EP (2) EP0760675B2 (hu)
JP (2) JP3847334B2 (hu)
KR (1) KR100379174B1 (hu)
CN (1) CN1209164C (hu)
AT (2) ATE383167T1 (hu)
AU (1) AU694216B2 (hu)
BR (1) BR9507506A (hu)
CA (1) CA2188560C (hu)
CZ (1) CZ295144B6 (hu)
DE (2) DE69521994T3 (hu)
ES (2) ES2160707T5 (hu)
HU (1) HU221279B1 (hu)
NO (2) NO325560B1 (hu)
NZ (1) NZ284709A (hu)
PL (1) PL185749B1 (hu)
RU (1) RU2146149C1 (hu)
SK (1) SK283364B6 (hu)
UA (1) UA43917C2 (hu)
WO (1) WO1995028948A1 (hu)

Families Citing this family (254)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5705334A (en) 1988-09-22 1998-01-06 Massachusetts Institute Of Technology Uses for DNA structure-specific recognition protein
WO1992015680A1 (en) 1991-03-06 1992-09-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression
US5747469A (en) * 1991-03-06 1998-05-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53
US6410010B1 (en) * 1992-10-13 2002-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant P53 adenovirus compositions
US6524812B1 (en) 1993-10-07 2003-02-25 Regents Of The University Of Minnesota Genes encoding resistance to DNA alkylating agents
US6495348B1 (en) * 1993-10-07 2002-12-17 Regents Of The University Of Minnesota Mitomycin biosynthetic gene cluster
US20010006629A1 (en) * 1993-10-25 2001-07-05 Richard J. Gregory Recombinant adenoviral vector and methods of use
ATE437232T1 (de) * 1993-10-25 2009-08-15 Canji Inc Rekombinanter adenoviren-vektor und verfahren zur verwendung
US20060275261A1 (en) * 1993-10-25 2006-12-07 Canji, Inc. Adenoviral vectors having a protein IX deletion
US20050031590A9 (en) * 1993-10-25 2005-02-10 Richard Gregory Adenoviral vectors having a protein IX deletion
US20020010144A1 (en) * 1994-04-29 2002-01-24 Robert Sobol Enhancing the sensitivity of tumor cells to therapies
US5998205A (en) 1994-11-28 1999-12-07 Genetic Therapy, Inc. Vectors for tissue-specific replication
US6638762B1 (en) 1994-11-28 2003-10-28 Genetic Therapy, Inc. Tissue-vectors specific replication and gene expression
FR2729295A1 (fr) * 1995-01-17 1996-07-19 Rhone Poulenc Rorer Sa Traitement therapeutique combine des pathologies hyperproliferatives
US20020068049A1 (en) * 1998-09-10 2002-06-06 Henderson Daniel R. Tissue specific adenoviral vectors
WO1997003635A2 (en) 1995-07-17 1997-02-06 Board Of Regents, The University Of Texas System p16 EXPRESSION CONSTRUCTS AND THEIR APPLICATION IN CANCER THERAPY
US7163925B1 (en) 1995-07-17 2007-01-16 Board Of Regents, The University Of Texas System p16 expression constructs and their application in cancer therapy
US5763415A (en) * 1995-08-03 1998-06-09 John Hopkins University School Of Medicine Destruction of the epithelium of an exocrine gland in the prophylactic and therapeutic treatment of cancer
WO1997007828A1 (en) * 1995-08-30 1997-03-06 The Regents Of The University Of California Therapy for cellular accumulation in chronic inflammatory diseases
WO1997012623A1 (en) * 1995-10-06 1997-04-10 Arch Development Corporation Methods and compositions for viral enhancement of cell killing
EP1724350A1 (en) * 1995-11-30 2006-11-22 The Board Of Regents, The University Of Texas System Method and compositions for the diagnosis and treatment of cancer
KR19990071795A (ko) * 1995-11-30 1999-09-27 파라비 레이 암 진단 및 치료를 위한 방법과 조성물
US5952221A (en) 1996-03-06 1999-09-14 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors comprising a first and second nucleic acid sequence
WO1997039135A1 (en) 1996-04-17 1997-10-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Enhanced expression of transgenes
US6054467A (en) * 1996-07-05 2000-04-25 Sidney Kimmel Cancer Center Down-regulation of DNA repair to enhance sensitivity to P53-mediated apoptosis
US5728541A (en) * 1996-07-12 1998-03-17 Precision Therapeutics, Inc. Method for preparing cell cultures from biologial specimens for chemotherapeutic and other assays
US20040023375A1 (en) * 2002-07-30 2004-02-05 Precision Therapeutics, Inc. Method for preparing cell cultures from biological specimens for chemotherapeutic and other assays
WO1998003195A1 (en) * 1996-07-18 1998-01-29 Arch Development Corporation Methods and compositions for modulation of growth response
US5958892A (en) 1996-07-30 1999-09-28 Board Of Regents, The University Of Texas System 2-methoxyestradiol-induced apoptosis in cancer cells
US6060247A (en) * 1996-11-18 2000-05-09 Mcgill University Post-mitotic neurons containing adenovirus vectors that modulate apoptosis and growth
US6183752B1 (en) * 1997-02-05 2001-02-06 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Restenosis/atherosclerosis diagnosis, prophylaxis and therapy
US20030064949A1 (en) * 1998-02-17 2003-04-03 Loretta Nielsen Combined tumor suppressor gene therapy and chemotherapy in the treatment of neoplasms
US20030060434A1 (en) * 1997-02-18 2003-03-27 Loretta Nielsen Combined tumor suppressor gene therapy and chemotherapy in the treatment of neoplasms
IL131447A0 (en) * 1997-02-18 2001-01-28 Canji Inc Combined tumor supressor gene therapy and chemotherapy in the treatment of neoplasms
US6020191A (en) * 1997-04-14 2000-02-01 Genzyme Corporation Adenoviral vectors capable of facilitating increased persistence of transgene expression
US6642045B1 (en) 1997-04-14 2003-11-04 Breonics, Inc. System for exsanguinous metabolic support of an organ or tissue
KR19980077401A (ko) * 1997-04-18 1998-11-16 문우철 와일드타입 p53 유전자벡터와 양이온성 리포솜을 함유하는 암의 유전자 치료제
US20050096288A1 (en) * 1997-06-13 2005-05-05 Aragene, Inc. Lipoproteins as nucleic acid vectors
US6635623B1 (en) * 1997-06-13 2003-10-21 Baylor College Of Medicine Lipoproteins as nucleic acid vectors
US6749863B1 (en) * 1997-11-19 2004-06-15 Georgetown University Targeted liposome gene delivery
US6841538B1 (en) 1998-04-22 2005-01-11 Inex Pharmaceuticals Corporation Combination therapy using nucleic acids and radio therapy
US6841537B1 (en) * 1998-04-22 2005-01-11 Protiva Biotherapeutics Inc. Combination therapy using nucleic acids and conventional drugs
US5972640A (en) * 1998-05-12 1999-10-26 The Regents Of The University Of California Methods for identifying antimitotic agents
CA2333147C (en) 1998-07-13 2012-02-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment methods using antibodies to aminophospholipids
AU5817299A (en) * 1998-09-10 2000-04-03 Uab Research Foundation, The Adenoviral vector encoding pro-apoptotic bax gene and uses thereof
US6649158B1 (en) * 1998-10-15 2003-11-18 Canji, Inc. Methods and compositions to induce antitumor response
US7094533B1 (en) * 1999-01-21 2006-08-22 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Therapeutic and diagnostic applications of prostatic acid phosphatase in prostate cancer
ATE511543T1 (de) * 1999-02-22 2011-06-15 Univ Georgetown Immunoliposome mit einem targeting- antikörperfragment zur systemischen genverabreichung
WO2000050584A2 (en) * 1999-02-24 2000-08-31 University Of Iowa Research Foundation Methods and compositions for enhancing in vivo gene delivery/expression
AU3755800A (en) * 1999-03-15 2000-10-04 Introgen Therapeutics, Inc. Dendritic cells transduced with a wild-type self gene elicit potent antitumor immune responses
US20070166292A1 (en) * 1999-04-14 2007-07-19 Breonics, Inc. System for exsanguinous metabolic support of an organ or tissue
US20040038193A1 (en) * 1999-04-14 2004-02-26 Breonics, Inc. System for exsanguinous metabolic support of an organ or tissue
EP1181032A4 (en) * 1999-04-14 2004-08-25 Breonics Inc SYSTEM FOR EXSANGUARY METABOLIC SUPPORT OF AN ORGAN OR TISSUE
EP1916258B1 (en) 1999-08-09 2014-04-23 Targeted Genetics Corporation Enhancement of expression of a single-stranded, heterologous nucleotide sequence from recombinant viral vectors by designing the sequence such that it forms intrastrand base pairs
US6734192B1 (en) * 1999-08-23 2004-05-11 Mp-1 Inc. Treatment of viral infections
ATE392210T1 (de) * 1999-10-07 2008-05-15 Aguilar Cordova Carlos Estuard Methoden zur behandlung von festen tumoren und metastasen mit gentherapie
US20040266834A1 (en) * 1999-10-14 2004-12-30 Copland John A. Thiazolidinediones alone or in cabination with other therapeutic agents for cancer therapy
US6511676B1 (en) 1999-11-05 2003-01-28 Teni Boulikas Therapy for human cancers using cisplatin and other drugs or genes encapsulated into liposomes
US7048920B2 (en) * 2000-03-24 2006-05-23 Cell Genesys, Inc. Recombinant oncolytic adenovirus for human melanoma
US6911200B2 (en) * 2000-03-24 2005-06-28 Cell Genesys, Inc. Methods of treating neoplasia with combination of target-cell specific adenovirus, chemotherapy and radiation
US7306902B2 (en) * 2002-06-28 2007-12-11 Oncolyties Biotech Inc. Oncolytic viruses as phenotyping agents for neoplasms
US10293056B1 (en) * 2000-05-24 2019-05-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for non-viral gene therapy for treatment of hyperproliferative diseases
PL363618A1 (en) 2000-11-09 2004-11-29 Neopharm, Inc. Sn-38 lipid complexes and methods of use
CA2429769C (en) * 2000-12-07 2016-04-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of treatment involving human mda-7
US20030138405A1 (en) * 2001-04-17 2003-07-24 Juan Fueyo Conditionally replicative adenovirus to target the Rb and Rb-related pathways
WO2003030864A1 (en) * 2001-05-29 2003-04-17 Neopharm, Inc. Liposomal formulation of irinotecan
US20040086888A1 (en) * 2001-10-18 2004-05-06 Kornblith Paul L Method for tandem genomic/proteomic analysis of proliferating cells
AU2003216283A1 (en) * 2002-02-14 2003-09-04 Research Development Foundation Inhibition of lung metastases by aerosol delivery of p53 gene and anti-cancer compounds
US20040009939A1 (en) * 2002-03-05 2004-01-15 Board Of Regent, The University Of Texas System Methods of enhancing immune induction involving MDA-7
KR100492016B1 (ko) * 2002-04-11 2005-05-30 학교법인고려중앙학원 안티센스 텔로머라제 생산하는 아데노바이러스 Ad-OA 와항암제 시스플라틴을 이용한 항암 치료 방법
WO2003086395A1 (en) 2002-04-12 2003-10-23 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
AU2003226051A1 (en) * 2002-04-16 2003-11-03 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Solid forms of salts with tyrosine kinase activity
KR20030085421A (ko) * 2002-04-30 2003-11-05 신득용 ｐ53 또는 ｐ21 유전자 변이에 의해 ｐ53 또는 ｐ21유전자 기능을 상실한 암의 치료를 위한 액틴 저해제를포함하는 약학 조성물
US20030219421A1 (en) * 2002-05-23 2003-11-27 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Calbindin-D28k protection against glucocorticoid induced cell death
ES2358730T3 (es) 2002-07-15 2011-05-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Anticuerpos seleccionados y péptidos de duramicina que se enlazan a fosfolípidos aniónicos y aminofosfolípidos y sus usos en el tratamiento de infecciones virales y del cáncer.
US7364727B2 (en) * 2002-07-22 2008-04-29 Cell Genesys, Inc. Metastatic colon cancer specific promoter and uses thereof
AU2003250701A1 (en) * 2002-07-31 2004-02-16 Wayne R. Danter Protein tyrosine kinase inhibitors
AU2003296897A1 (en) * 2002-08-20 2004-05-04 Neopharm, Inc. Pharmaceutical formulations of camptothecine derivatives
US20060030578A1 (en) * 2002-08-20 2006-02-09 Neopharm, Inc. Pharmaceutically active lipid based formulation of irinotecan
ES2298563T3 (es) * 2002-10-09 2008-05-16 Critical Outcome Technologies, Inc. Inhibidores de proteinas tirosina cinasas.
US20050032728A1 (en) * 2002-12-17 2005-02-10 Sidney Kimmel Cancer Center Tumor suppression through bicistronic co-expression of p53 and p14ARF
CA2518150C (en) * 2003-03-03 2015-08-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions involving mda-7
WO2004092396A2 (en) * 2003-04-15 2004-10-28 Novartis Ag Flap endonuclease 1 (fen1) regulatory sequences and uses thereof
US20070275915A1 (en) * 2003-04-15 2007-11-29 Cell Genesys, Inc. Tmprss2 Regulatory Sequences and Uses Thereof
MXPA05013983A (es) * 2003-06-30 2006-03-02 Canji Inc Encapsulacion polimerica de adenovirus.
US20070054274A1 (en) 2003-09-30 2007-03-08 Antonio Giordano Gene modulation by rb2/p130 expression
DE10354060A1 (de) 2003-11-19 2005-06-02 Merck Patent Gmbh Pyrrolderivate
DE10355904A1 (de) 2003-11-29 2005-06-30 Merck Patent Gmbh Feste Formen von anti-EGFR-Antikörpern
US8034790B2 (en) * 2003-12-01 2011-10-11 Introgen Therapeutics Use of MDA-7 to inhibit pathogenic infectious organisms
DE10356579A1 (de) 2003-12-04 2005-07-07 Merck Patent Gmbh Aminderivate
CA3031283A1 (en) 2004-01-22 2005-08-04 University Of Miami Topical co-enzyme q10 formulations and methods of use
WO2005082422A1 (en) * 2004-02-24 2005-09-09 Introgen Therapeutics, Inc. Combination of ad-p53 and chemotherapy for the treatment of tumours
US20070281041A1 (en) * 2004-03-02 2007-12-06 Introgen Therapeutics, Inc. Compositions and Methods Involving MDA-7 for the Treatment of Cancer
WO2005107474A2 (en) * 2004-04-30 2005-11-17 Introgen Therapeutics, Inc. Oncolytic adenovirus armed with therapeutic genes
JP4433918B2 (ja) * 2004-07-15 2010-03-17 コニカミノルタエムジー株式会社 画像形成方法
US20060246124A1 (en) * 2004-11-08 2006-11-02 Pilkiewicz Frank G Methods of treating cancer with lipid-based platinum compound formulations administered intraperitoneally
KR100651728B1 (ko) * 2004-11-10 2006-12-06 한국전자통신연구원 정착기를 갖는 전자 소자용 화합물 및 이를 포함하는 전자소자와 이들의 제조 방법
US20060153808A1 (en) * 2004-11-17 2006-07-13 Board Of Regents, The Universtiy Of Texas System Cancer immunotherapy incorporating p53
CA2597329C (en) * 2005-02-08 2016-10-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods involving mda-7 for the treatment of cancer
DE102005016634A1 (de) 2005-04-12 2006-10-19 Merck Patent Gmbh Neuartige Aza-Hetercyclen als Kinase-Inhibitoren
JP5033119B2 (ja) 2005-04-25 2012-09-26 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング キナーゼ阻害剤としての新規アザ複素環化合物
WO2006124700A2 (en) * 2005-05-12 2006-11-23 Introgen Therapeutics, Inc. P53 vaccines for the treatment of cancers
ATE550019T1 (de) 2005-05-17 2012-04-15 Merck Sharp & Dohme Cis-4-ä(4-chlorophenyl)sulfonylü-4-(2,5- difluorophenyl)cyclohexanepropansäure zur behandlug von krebs
DE102005027169A1 (de) 2005-06-13 2006-12-14 Merck Patent Gmbh Tetrahydrochinolinderivate
WO2007028146A2 (en) * 2005-09-01 2007-03-08 Precision Therapeutics, Inc. Chemo-sensitivity assays using tumor cells exhibiting persistent phenotypic characteristics
US9107824B2 (en) 2005-11-08 2015-08-18 Insmed Incorporated Methods of treating cancer with high potency lipid-based platinum compound formulations administered intraperitoneally
DE102005061840A1 (de) 2005-12-23 2007-06-28 Merck Patent Gmbh Triazolderivate
US20070231304A1 (en) * 2006-01-30 2007-10-04 Introgen Therapeutics, Inc. Prognostic factors for anti-hyperproliferative disease gene therapy
WO2007092944A2 (en) * 2006-02-08 2007-08-16 Introgen Therapeutics, Inc. Compositions and methods involving gene therapy and proteasome modulation
GB0603041D0 (en) 2006-02-15 2006-03-29 Angeletti P Ist Richerche Bio Therapeutic compounds
DK1991303T3 (da) 2006-03-03 2021-06-07 Oncosec Medical Inc Fremgangsmåde og anordning til behandling af mikroskopiske resttumorer i væv, der er tilbage efter kirurgisk resektion
US8426387B2 (en) * 2006-03-31 2013-04-23 Stephen Carper Treatments for cancer
US20110218176A1 (en) 2006-11-01 2011-09-08 Barbara Brooke Jennings-Spring Compounds, methods, and treatments for abnormal signaling pathways for prenatal and postnatal development
EP2109608B1 (en) 2007-01-10 2011-03-23 Istituto di Richerche di Biologia Molecolare P. Angeletti S.p.A. Amide substituted indazoles as poly(adp-ribose)polymerase (parp) inhibitors
US8034815B2 (en) 2007-01-11 2011-10-11 Critical Outcome Technologies, Inc. Compounds and method for treatment of cancer
PT2118123E (pt) 2007-01-31 2016-02-10 Harvard College Péptidos de p53 estabilizados e suas utilizações
DE102007008419A1 (de) 2007-02-21 2008-08-28 Merck Patent Gmbh 4-(Pyrrolopyridinyl)-pyrimidinyl-2-amin-derivate
EP2136831B1 (en) 2007-03-02 2012-09-12 The Cleveland Clinic Foundation Anti-angiogenic peptides
DE102007013855A1 (de) 2007-03-20 2008-09-25 Merck Patent Gmbh Substituierte Tetrahydrochinoline
DE102007013854A1 (de) 2007-03-20 2008-09-25 Merck Patent Gmbh Tetrahydrochinoline
DE102007013856A1 (de) 2007-03-20 2008-09-25 Merck Patent Gmbh Substituierte Tetrahydropyrrolochinoline
WO2008121767A2 (en) 2007-03-28 2008-10-09 President And Fellows Of Harvard College Stitched polypeptides
DE102007028515A1 (de) 2007-06-21 2008-12-24 Merck Patent Gmbh 6-(Pyrrolopyridinyl)-pyrimidinyl-2-amin-derivate
US8389553B2 (en) 2007-06-27 2013-03-05 Merck Sharp & Dohme Corp. 4-carboxybenzylamino derivatives as histone deacetylase inhibitors
DE102007047735A1 (de) 2007-10-05 2009-04-09 Merck Patent Gmbh Thiazolderivate
DE102007047738A1 (de) 2007-10-05 2009-04-09 Merck Patent Gmbh Imidazolderivate
DE102007047737A1 (de) 2007-10-05 2009-04-30 Merck Patent Gmbh Piperidin- und Piperazinderivate
DE102007049451A1 (de) 2007-10-16 2009-04-23 Merck Patent Gmbh 5-Cyano-thienopyridine
WO2009060198A1 (en) 2007-11-09 2009-05-14 Peregrine Pharmaceuticals, Inc. Anti-vegf antibody compositions and methods
EP2225226B1 (en) 2007-12-26 2016-08-17 Critical Outcome Technologies, Inc. Compounds and their use in a method for treatment of cancer
DE102008005493A1 (de) 2008-01-22 2009-07-23 Merck Patent Gmbh 4-(Pyrrolo[2,3-c] pyridine-3-yl)-pyrimidin-2-yl-amin-derivate
DK2245464T3 (en) 2008-01-25 2017-02-20 Multivir Inc P53 BIOMARKETS
DE102008017853A1 (de) 2008-04-09 2009-10-15 Merck Patent Gmbh Thienopyrimidine
US8466193B2 (en) 2008-04-15 2013-06-18 Pharmacyclics, Inc. Selective inhibitors of histone deacetylase
DE102008025751A1 (de) 2008-05-29 2009-12-03 Merck Patent Gmbh 4-(1H-Pyrrolo[2,3-b]pyridin-3-yl)-pyridin-2-ylamin-derivate
DE102008027574A1 (de) 2008-06-10 2009-12-17 Merck Patent Gmbh Neue Pyrrolidinderivate als MetAP-2 Inhibitoren
DE102008031517A1 (de) 2008-07-03 2010-01-07 Merck Patent Gmbh Pyrrolopyridinyl-pyrimidin-2-yl-amin-derivate
CA2730890C (en) 2008-07-17 2018-05-15 Critical Outcome Technologies Inc. Thiosemicarbazone inhibitor compounds and cancer treatment methods
DE102008059578A1 (de) 2008-11-28 2010-06-10 Merck Patent Gmbh Benzo-Naphtyridin Verbindungen
DE102009005193A1 (de) 2009-01-20 2010-07-22 Merck Patent Gmbh Neue heterocyclische Verbindungen als MetAP-2 Inhibitoren
EP2413932A4 (en) 2009-04-01 2012-09-19 Merck Sharp & Dohme INHIBITORS OF AKT ACTIVITY
EA201101399A1 (ru) 2009-04-02 2012-08-30 Мерк Патент Гмбх Гетероциклические соединения в качестве ингибиторов аутотаксина
WO2010129021A1 (en) 2009-05-02 2010-11-11 Genzyme Corporation Gene therapy for neurodegenerative disorders
DE102009019962A1 (de) 2009-05-05 2010-11-11 Merck Patent Gmbh 3-([1,2,3]Triazol-4-yl)-pyrrolo[2,3-b]pyridinderivate
US9050276B2 (en) 2009-06-16 2015-06-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Autism-associated biomarkers and uses thereof
DE102009033208A1 (de) 2009-07-15 2011-01-20 Merck Patent Gmbh Aminopyridinderivate
DE102009033392A1 (de) 2009-07-16 2011-01-20 Merck Patent Gmbh Heterocyclische Verbindungen als Autotaxin-Inhibitoren II
JP2013502441A (ja) 2009-08-26 2013-01-24 アルバータ・ヘルス・サービシーズ 新規コルヒチン誘導体、方法、およびその使用
DE102009049211A1 (de) 2009-10-13 2011-04-28 Merck Patent Gmbh Sulfoxide
EP2488028B1 (en) 2009-10-14 2020-08-19 Merck Sharp & Dohme Corp. Substituted piperidines that increase p53 activity and the uses thereof
WO2011054433A1 (en) 2009-11-07 2011-05-12 Merck Patent Gmbh Heteroarylaminoquinolines as tgf-beta receptor kinase inhibitors
DE102009060175A1 (de) 2009-12-23 2011-06-30 Merck Patent GmbH, 64293 Pyrrolo[2,3-d] pyrazin-7-yl-pyrimidin-Verbindungen
DE102009060174A1 (de) 2009-12-23 2011-06-30 Merck Patent GmbH, 64293 Pyrrolopyridinyl-pyrimidin-2-yl-amin-derivate
EP2519517B1 (en) 2009-12-29 2015-03-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Type ii raf kinase inhibitors
BR112012023021A2 (pt) 2010-03-16 2016-05-31 Dana Farber Cancer Inst Inc compostos de indazol e seus usos
EP2552947A4 (en) 2010-03-26 2013-11-13 Dartmouth College VISTA REGULATORY T CELL MEDIATOR PROTEIN, VISTA BINDING ACTIVE SUBSTANCES AND USE THEREOF
US20150231215A1 (en) 2012-06-22 2015-08-20 Randolph J. Noelle VISTA Antagonist and Methods of Use
US10745467B2 (en) 2010-03-26 2020-08-18 The Trustees Of Dartmouth College VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders
EP3235818A3 (en) 2010-04-01 2018-03-14 Critical Outcome Technologies, Inc. Compounds for the treatment of hiv
WO2011163330A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel heterocyclic compounds as erk inhibitors
CN103068980B (zh) 2010-08-02 2017-04-05 瑟纳治疗公司 使用短干扰核酸（siNA）的RNA干扰介导的联蛋白（钙粘蛋白关联蛋白质），β1（CTNNB1）基因表达的抑制
RU2582678C2 (ru) 2010-08-13 2016-04-27 Эйлерон Терапьютикс, Инк. Пептидомиметические макроциклы
KR102072631B1 (ko) 2010-08-17 2020-02-03 시르나 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 짧은 간섭 핵산 （ｓｉＮＡ）을 사용한 Ｂ형 간염 바이러스 （ＨＢＶ） 유전자 발현의 ＲＮＡ 간섭 매개 억제
US8883801B2 (en) 2010-08-23 2014-11-11 Merck Sharp & Dohme Corp. Substituted pyrazolo[1,5-a]pyrimidines as mTOR inhibitors
WO2012030685A2 (en) 2010-09-01 2012-03-08 Schering Corporation Indazole derivatives useful as erk inhibitors
US9242981B2 (en) 2010-09-16 2016-01-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Fused pyrazole derivatives as novel ERK inhibitors
DE102010048374A1 (de) 2010-10-13 2012-04-19 Merck Patent Gmbh Pyrrolidinone als MetAP-2 Inhibitoren
ES2564358T3 (es) 2010-10-15 2016-03-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Genes relacionados con la obesidad y sus proteínas y usos de los mismos
EP3766975A1 (en) 2010-10-29 2021-01-20 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
DE102010049877A1 (de) 2010-11-01 2012-05-03 Merck Patent Gmbh 7-((1,2,3)Triazol-4-yl)-pyrrolo(2,3) pyrazinderivate
WO2012061537A2 (en) 2010-11-02 2012-05-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for treating hair loss disorders
DE102010050558A1 (de) 2010-11-05 2012-05-10 Merck Patent Gmbh 1H-Pyrrolo[2,3-b]pyridinderivate
DE102010053347A1 (de) 2010-12-03 2012-06-06 Merck Patent Gmbh 3-Hetaryl-substituierte Pyrrolo[2,3-b] pyridin-derivative als PDK1-Inhibitoren
WO2012087772A1 (en) 2010-12-21 2012-06-28 Schering Corporation Indazole derivatives useful as erk inhibitors
DE102011008352A1 (de) 2011-01-12 2012-07-12 Merck Patent Gmbh 5-([1,2,3]Triazol-4-yl)-7H-pyrrolo-[2,3-d]pyrimidinderivate
DE102011009961A1 (de) 2011-02-01 2012-08-02 Merck Patent Gmbh 7-Azaindolderivate
US20140046059A1 (en) 2011-04-21 2014-02-13 Piramal Enterprises Limited Process for the preparation of morpholino sulfonyl indole derivatives
ES2699256T3 (es) 2011-05-23 2019-02-08 Merck Patent Gmbh Piridina y derivados de pirazina
DE102011105469A1 (de) 2011-06-24 2012-12-27 Merck Patent Gmbh 7-Azaindolderivate
CN103717600B (zh) 2011-08-10 2016-06-22 默克专利股份公司 吡啶并嘧啶衍生物
DE102011112978A1 (de) 2011-09-09 2013-03-14 Merck Patent Gmbh Benzonitrilderivate
US20130189754A1 (en) 2011-09-12 2013-07-25 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
TWI643868B (zh) 2011-10-18 2018-12-11 艾利倫治療公司 擬肽巨環化合物
US9023865B2 (en) 2011-10-27 2015-05-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Compounds that are ERK inhibitors
US9402894B2 (en) 2011-10-27 2016-08-02 International Aids Vaccine Initiative Viral particles derived from an enveloped virus
EP2822935B1 (en) 2011-11-17 2019-05-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Inhibitors of c-jun-n-terminal kinase (jnk)
DE102011119127A1 (de) 2011-11-22 2013-05-23 Merck Patent Gmbh 3-Cyanaryl-1H-pyrrolo[2.3-b]pyridin-Derivate
SI2812337T1 (sl) 2012-02-09 2017-01-31 Merck Patent Gmbh Furo (3,2-b) in tieno (3,2-b) piridinski derivati kot zaviralci tbk1 in ikk
EP2819688A4 (en) 2012-02-15 2015-10-28 Aileron Therapeutics Inc TRIAZOL AND THIOETHER-COUPLED PEPTIDOMIMETIC MACROCYCLES
JP6450191B2 (ja) 2012-02-15 2019-01-09 エイルロン セラピューティクス，インコーポレイテッド ペプチドミメティック大環状化合物
US10039777B2 (en) 2012-03-20 2018-08-07 Neuro-Lm Sas Methods and pharmaceutical compositions of the treatment of autistic syndrome disorders
US9347065B2 (en) 2012-03-29 2016-05-24 International Aids Vaccine Initiative Methods to improve vector expression and genetic stability
SI2830662T1 (sl) 2012-03-29 2019-01-31 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Postopki zdravljenja motenj izgube las
WO2013152230A1 (en) 2012-04-04 2013-10-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Smooth muscle specific inhibition for anti-restenotic therapy
DE102012006884A1 (de) 2012-04-04 2013-10-10 Merck Patent Gmbh Cyclische Amide als MetAP-2 Inhibitoren
US20150299696A1 (en) 2012-05-02 2015-10-22 Sirna Therapeutics, Inc. SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) COMPOSITIONS
US9890215B2 (en) 2012-06-22 2018-02-13 King's College London Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer
CN105025904A (zh) 2012-09-04 2015-11-04 埃莱森制药有限责任公司 用顺铂脂质复合物预防癌症的肺部复发
AU2013312211B2 (en) 2012-09-07 2018-03-29 King's College London VISTA modulators for diagnosis and treatment of cancer
WO2014052563A2 (en) 2012-09-28 2014-04-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel compounds that are erk inhibitors
DE102012019369A1 (de) 2012-10-02 2014-04-03 Merck Patent Gmbh 7-Azaindolderivat
MX366163B (es) 2012-10-17 2019-07-01 Vascular Biogenics Ltd Composiciones de adenovirus.
EP2909194A1 (en) 2012-10-18 2015-08-26 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Inhibitors of cyclin-dependent kinase 7 (cdk7)
WO2014063061A1 (en) 2012-10-19 2014-04-24 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Hydrophobically tagged small molecules as inducers of protein degradation
US10000483B2 (en) 2012-10-19 2018-06-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Bone marrow on X chromosome kinase (BMX) inhibitors and uses thereof
WO2014071241A1 (en) 2012-11-01 2014-05-08 Aileron Therapeutics, Inc. Disubstituted amino acids and methods of preparation and use thereof
ES2651347T3 (es) 2012-11-28 2018-01-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Composiciones y métodos para el tratamiento del cáncer
CA2895504A1 (en) 2012-12-20 2014-06-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Substituted imidazopyridines as hdm2 inhibitors
US9540377B2 (en) 2013-01-30 2017-01-10 Merck Sharp & Dohme Corp. 2,6,7,8 substituted purines as HDM2 inhibitors
KR102089121B1 (ko) 2013-03-14 2020-03-13 더 솔크 인스티튜트 포 바이올로지칼 스터디즈 종양살상형 아데노바이러스 조성물
JP2016515508A (ja) 2013-03-15 2016-05-30 ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク 融合タンパク質及びその方法
AU2014277262B2 (en) 2013-06-06 2019-10-03 Lead Discovery Center Gmbh A quinoline inhibitor of the macrophage stimulating 1 receptor MST1 R
RU2527148C1 (ru) * 2013-08-01 2014-08-27 Александр Николаевич Гребенюк Способ моделирования сочетанных радиационных поражений, включающих общее гамма- и местное рентгеновское облучение
RU2534802C1 (ru) * 2013-08-01 2014-12-10 Александр Николаевич Гребенюк Способ моделирования сочетанных радиационных поражений, включающих общее гамма-и местное бета-облучение
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
EP3057956B1 (en) 2013-10-18 2021-05-05 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Polycyclic inhibitors of cyclin-dependent kinase 7 (cdk7)
US20160264551A1 (en) 2013-10-18 2016-09-15 Syros Pharmaceuticals, Inc. Heteroaromatic compounds useful for the treatment of prolferative diseases
US9682123B2 (en) 2013-12-20 2017-06-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of treating metabolic disease
US11014987B2 (en) 2013-12-24 2021-05-25 Janssen Pharmaceutics Nv Anti-vista antibodies and fragments, uses thereof, and methods of identifying same
WO2015097536A2 (en) 2013-12-24 2015-07-02 Janssen Pharmaceutical Nv Anti-vista antibodies and fragments
WO2015164614A1 (en) 2014-04-23 2015-10-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Janus kinase inhibitors and uses thereof
WO2015164604A1 (en) 2014-04-23 2015-10-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Hydrophobically tagged janus kinase inhibitors and uses thereof
AU2015274504B2 (en) 2014-06-11 2021-02-04 Kathy A. Green Use of VISTA agonists and antagonists to suppress or enhance humoral immunity
CA2955250A1 (en) 2014-07-16 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
KR20170058424A (ko) 2014-09-24 2017-05-26 에일러론 테라퓨틱스 인코포레이티드 펩티드모방 거대고리 및 이의 용도
KR102570210B1 (ko) 2014-09-24 2023-08-23 에일러론 테라퓨틱스 인코포레이티드 펩티드모방 거대고리 및 이의 제제
AU2015357463B2 (en) 2014-12-05 2021-10-07 Immunext, Inc. Identification of VSIG8 as the putative vista receptor and its use thereof to produce vista/VSIG8 modulators
EP3778644A3 (en) 2014-12-23 2021-06-02 The Trustees of Columbia University in the City of New York Fgfr-tacc fusion proteins and methods thereof
WO2016105528A2 (en) 2014-12-23 2016-06-30 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Inhibitors of cyclin-dependent kinase 7 (cdk7)
JP2018516844A (ja) 2015-03-20 2018-06-28 エルロン・セラピューティクス・インコーポレイテッドＡｉｌｅｒｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． ペプチド模倣大環状分子およびその使用
US10550121B2 (en) 2015-03-27 2020-02-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Inhibitors of cyclin-dependent kinases
WO2016201370A1 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Combination therapy of transcription inhibitors and kinase inhibitors
BR112017027870A2 (pt) 2015-06-24 2018-08-28 Janssen Pharmaceutica Nv anticorpos e fragmentos anti-vista
AU2016321298A1 (en) 2015-09-09 2018-03-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Reduction of ER-MAM localized APP-C99 and methods of treating Alzheimer's Disease
EP4019515A1 (en) 2015-09-09 2022-06-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Inhibitors of cyclin-dependent kinases
US10023613B2 (en) 2015-09-10 2018-07-17 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles as modulators of MCL-1
US10188750B1 (en) 2015-10-23 2019-01-29 University Of South Florida Self-replicating cell selective gene delivery compositions, methods, and uses thereof
US10899836B2 (en) 2016-02-12 2021-01-26 Janssen Pharmaceutica Nv Method of identifying anti-VISTA antibodies
CN108699566B (zh) 2016-02-23 2023-06-30 萨克生物研究学院 对病毒动力学影响最小的治疗性腺病毒中的外源基因表达
CA3013637A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
CA3020848A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Anti-human vista antibodies and use thereof
US11066396B2 (en) 2016-06-23 2021-07-20 Merck Sharp & Dohme Corp. 3-aryl- heteroaryl substituted 5-trifluoromethyl oxadiazoles as histonedeacetylase 6 (HDAC6) inhibitors
US11154591B2 (en) 2016-10-14 2021-10-26 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of treating alcohol abuse disorder
CA3045892A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
CN110996958B (zh) 2017-08-16 2023-05-12 默克专利股份有限公司 包含5,10-亚甲基-(6r)-四氢叶酸以及二羧酸的稳定的冻干物
US10947234B2 (en) 2017-11-08 2021-03-16 Merck Sharp & Dohme Corp. PRMT5 inhibitors
WO2019207167A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Fondazione Telethon Therapy of sulfatase deficiencies
WO2020033282A1 (en) 2018-08-07 2020-02-13 Merck Sharp & Dohme Corp. Prmt5 inhibitors
WO2020033284A1 (en) 2018-08-07 2020-02-13 Merck Sharp & Dohme Corp. Prmt5 inhibitors
CN110055227A (zh) * 2019-03-13 2019-07-26 中国人民解放军第四军医大学 用于增生性瘢痕治疗的野生型p53腺病毒及纯化的制备方法
WO2021041532A1 (en) 2019-08-26 2021-03-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Use of heparin to promote type 1 interferon signaling
WO2021126731A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Merck Sharp & Dohme Corp. Prmt5 inhibitors
US20240116945A1 (en) 2022-09-02 2024-04-11 Merck Sharp & Dohme Llc Exatecan-derived topoisomerase-1 inhibitors pharmaceutical compositions, and uses thereof
WO2024091437A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Merck Sharp & Dohme Llc Exatecan-derived adc linker-payloads, pharmaceutical compositions, and uses thereof

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4740463A (en) * 1984-04-13 1988-04-26 Massachusetts Institute Of Technology Methods and artificial genes for antagonizing the function of an oncogene
EP0174608A1 (en) * 1984-09-13 1986-03-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Beta-actin gene and regulatory elements, preparation and use
ZA858044B (en) 1984-11-01 1987-05-27 American Home Prod Oral vaccines
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5055400A (en) * 1986-11-26 1991-10-08 University Of Guelph Leukotoxin gene of pasteurella haemolytica
US5166320A (en) * 1987-04-22 1992-11-24 University Of Connecticut Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells
US4980289A (en) * 1987-04-27 1990-12-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Promoter deficient retroviral vector
US5532220A (en) * 1987-08-31 1996-07-02 The Regents Of The University Of California Genetic mechanisms of tumor suppression
CA1339413C (en) * 1988-06-24 1997-09-02 Junichi Miyazaki Exogenous gene expression vector containing chick .beta.-actin gene promoter
AU638954B2 (en) 1988-10-31 1993-07-15 Regents Of The University Of California, The Products and methods for controlling the suppression of the neoplastic phenotype
DE69008521T2 (de) * 1989-03-07 1994-10-20 Genentech Inc Kovalente konjugate von lipiden und oligonukleotiden.
US5362623A (en) 1991-06-14 1994-11-08 The John Hopkins University Sequence specific DNA binding by p53
US5527676A (en) 1989-03-29 1996-06-18 The Johns Hopkins University Detection of loss of the wild-type P53 gene and kits therefor
EP0390323B2 (en) * 1989-03-29 2012-08-08 Johns Hopkins University Detection of loss of the wild-type p53 gene
US5328470A (en) * 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
IT1238231B (it) 1989-12-18 1993-07-12 Consiglio Nazionale Ricerche Impiego di immunomodulanti come agenti sinergici di chemioterapici nella terapia dei tumori
IE911115A1 (en) 1990-04-10 1991-10-23 Canji Inc Gene therapy for cell proliferative diseases
NO312681B1 (no) * 1990-08-24 2002-06-17 Univ California Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasöytisk blanding med suppresiv virkning/aktivitet
US5747469A (en) * 1991-03-06 1998-05-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53
US6410010B1 (en) 1992-10-13 2002-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant P53 adenovirus compositions
CA2067031C (en) 1991-04-26 2003-02-18 Shigekazu Nagata Dna coding for human cell surface antigen
WO1993003769A1 (en) * 1991-08-20 1993-03-04 THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE SECRETARY, DEPARTEMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Adenovirus mediated transfer of genes to the gastrointestinal tract
US5252479A (en) * 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
EP0615453B1 (en) 1991-11-29 1997-05-14 Chiron Viagene, Inc. Anti-cancer immunotherapeutic vector constructs
FR2688514A1 (fr) * 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
AU4115693A (en) 1992-04-24 1993-11-29 Sri International In vivo homologous sequence targeting in eukaryotic cells
US5428011A (en) 1992-06-16 1995-06-27 Procyon Biopharma, Inc. Pharmaceutical preparations for inhibiting tumours associated with prostate adenocarcinoma
AU676204B2 (en) 1992-09-18 1997-03-06 Canji, Inc. Gene therapy by retroviral vector with tumor suppressive gene
DE69334238D1 (de) * 1992-09-25 2008-09-25 Aventis Pharma Sa Adenovirus vektoren für die übertragung fremder gene in zellen des zentralen nervensystems, insbesondere im gehirn
GB9223084D0 (en) * 1992-11-04 1992-12-16 Imp Cancer Res Tech Compounds to target cells
DE69417734T2 (de) 1993-02-16 1999-10-07 Onyx Pharma Inc Cytopathische viren zur therapie und prophylaxe der neoplasie
US5496731A (en) 1993-03-25 1996-03-05 Xu; Hong-Ji Broad-spectrum tumor suppressor genes, gene products and methods for tumor suppressor gene therapy
FR2704234B1 (fr) * 1993-04-22 1995-07-21 Centre Nat Rech Scient Virus recombinants, preparation et utilisation en therapie genique.
FR2705361B1 (fr) 1993-05-18 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
CA2144040A1 (fr) * 1993-07-13 1995-01-26 Michel Perricaudet Vecteurs adenoviraux defectifs et utilisation en therapie genique
AU7983294A (en) 1993-10-19 1995-05-08 Regents Of The University Of Michigan, The P53-mediated apoptosis
ATE437232T1 (de) 1993-10-25 2009-08-15 Canji Inc Rekombinanter adenoviren-vektor und verfahren zur verwendung
TW442569B (en) 1993-10-25 2001-06-23 Canji Inc Recombinant adenoviral vector
FR2712602B1 (fr) 1993-11-18 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
FR2712603B1 (fr) 1993-11-18 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
FR2716893B1 (fr) 1994-03-03 1996-04-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Virus recombinants, leur préparation et leur utilisation thérapeutique.
KR970702915A (ko) 1994-04-29 1997-06-10 린다 버겐 종양 세포의 치료 감응성 향상 방법(Enhancing The Sensitivity of Tumor Cells to Therapies)

Also Published As

Publication number Publication date
CN1147768A (zh) 1997-04-16
US20060182718A1 (en) 2006-08-17
CA2188560C (en) 2011-07-19
BR9507506A (pt) 1997-09-02
CN1209164C (zh) 2005-07-06
JP3847334B2 (ja) 2006-11-22
US6069134A (en) 2000-05-30
NO964527D0 (no) 1996-10-24
DE69535684D1 (de) 2008-02-21
AU2392495A (en) 1995-11-16
SK136796A3 (en) 1997-07-09
EP0760675B2 (en) 2007-12-05
KR970702060A (ko) 1997-05-13
ES2160707T3 (es) 2001-11-16
ES2298174T3 (es) 2008-05-16
EP0760675B1 (en) 2001-08-01
UA43917C2 (uk) 2002-01-15
US6797702B1 (en) 2004-09-28
DE69521994D1 (de) 2001-09-06
JP2003277272A (ja) 2003-10-02
US5747469A (en) 1998-05-05
NO964527L (no) 1996-12-17
CZ295144B6 (cs) 2005-06-15
NO325560B1 (no) 2008-06-16
AU694216B2 (en) 1998-07-16
NZ284709A (en) 1998-08-26
JPH10503476A (ja) 1998-03-31
RU2146149C1 (ru) 2000-03-10
DE69521994T3 (de) 2008-06-26
SK283364B6 (sk) 2003-06-03
EP0760675A1 (en) 1997-03-12
EP1157702B1 (en) 2008-01-09
ATE383167T1 (de) 2008-01-15
DE69535684T2 (de) 2009-01-08
US7109179B2 (en) 2006-09-19
ES2160707T5 (es) 2008-05-16
HUT76258A (en) 1997-07-28
HU9602937D0 (en) 1996-12-30
EP1157702A1 (en) 2001-11-28
KR100379174B1 (ko) 2003-08-02
US20050089511A1 (en) 2005-04-28
ATE203675T1 (de) 2001-08-15
NO20074774L (no) 1996-12-17
PL185749B1 (pl) 2003-07-31
DE69521994T2 (de) 2002-04-04
WO1995028948A1 (en) 1995-11-02
CA2188560A1 (en) 1995-11-02
CZ312196A3 (en) 1997-08-13
PL317105A1 (en) 1997-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6797702B1 (en) Methods and compositions comprising DNA damaging agents and P53
US7033750B2 (en) Recombinant P53 adenovirus methods and compositions

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees