CN1147768A - 含dna损伤剂和p53的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肿瘤抑制基团和DNA损伤剂或因子在用于杀细胞，尤其是杀癌细胞中的应用。肿瘤抑制基团p53通过重组腺病毒介导的体内和体外基因转移和化疗剂传递。被处理的细胞进行有特异性DNA断裂的编程性细胞死亡。将p53-腺病毒构建体经皮下直接注射到肿瘤中，然后经腹膜内施用DNA损伤剂顺铂，诱导大量的肿瘤编程性细胞死亡性破坏。本发明还提供了利用复制缺陷的野生型p53腺病毒和用于治疗人类癌症的DNA损伤药物相结合的基因替代方案的临床应用。

Description

含DNA损伤剂和p53的组合物
本发明总的说来涉及的领域是改善化学治疗性干预作用的新策略。从另外的方面讲，本发明提供了将DNA损伤剂的效力与肿瘤抑制基因的联合传递相结合的新方法和组合物。DNA损伤因子和肿瘤抑制基因异源表达的结合将产生优于单个组分之作用的显著协同作用。
当前，已知包括放射疗法、外科手术和化学疗法在内的癌症治疗方法的疗效都是有限的。在美国，仅死于肺癌的人数每年都在140,000以上。最近，随着年龄的变化而变化的肺癌死亡率在妇女中已超过了乳癌死亡率。尽管减少吸烟计划的施行已降低了吸烟的盛行，但较高的肺癌死亡率将持续到21世纪。合理地开发新的肺癌疗法将有赖于在分子水平上对肺癌生物学的了解。
目前已经明确，各种癌症至少部分是由于遗传异常所致，所述遗传异常或者引起一种或多种基因的过度表达，或者引起异常或突变基因的表达。例如，在许多情况下，已知癌基因的表达会引起癌症。“癌基因”是在遗传上发生了改变的基因，其突变的表达产物以某种方式破坏正常的细胞功能或调控(Spandidos et al.，1989)。
已经发现，至今为止所研究的大多数癌基因被“激活”是突变的结果，所说突变通常是发生于正常细胞基因编码区(即“原癌基因”)的点突变，导致被表达蛋白质产物中氨基酸的替换。这一被改变的表达产物表现出参予致癌过程的异常功能(Travali et al.，1990)。潜在的突变可以通过多种途径引起，例如化学诱变或电离辐射。目前已鉴定了大量的癌基因和癌基因家族，包括ras、myc、Beu、raf、erb、src、fms、jun和abl，并在不同程度上对其特征进行了描述(Travali etal.，1990；Bishop，1987)。
在正常的细胞生长过程中，据认为促生长原癌基因和抑生长的肿瘤抑制基因两者是平衡的。数种因素可以引起这两种力量失衡，从而导致形成致癌状态。所述的因素之一就是肿瘤抑制基因的突变(Weinberg，1991)。
编码细胞蛋白p53的基因是一种重要的肿瘤抑制基因，该p53蛋白是调控细胞增殖的53kD核磷蛋白。p53基因突变和等位基因从该基因所在的染色体17p上丧失是在人恶性肿瘤中最多见的改变。p53蛋白在进化过程中高度保宁，并在多数的正常组织中表达。已经证明野生型p53涉及细胞周期的调控(Mercer，1992)、转录调节(Fields etal.，1990；Mietz et al.，1992)、DNA复制(Wilcock andLane，1991；Bargonetti et al.，1991)和诱导编程性细胞死亡(Yonish-Rouach et al.，1991；Shaw et al.，1992)。
已经知道多种突变的p53等位基因，其中单个碱基的替换导致合成具有十分不同的生长调节特性之蛋白质，最终引起恶性肿瘤(Hollsteinet al.，1991)。事实上，已经发现p53基因是常见的人类癌症中最常见的突变基因(Hollstein et al.，1991；Weinberg，1991)，并且与和吸烟有关的癌症特别相关联(Hollstein et al.，1991；Zakut-Houri et al.，1985)。已有文献记载了p53在乳癌中的过度表达(Casey et al.，1991)。
对于癌症的基因疗法的最具挑战性方面之一是涉及利用肿瘤抑制基因，如p53。已有报道说明，将野生型p53转染至某些类型的乳癌和肺癌细胞中能够在细胞系中恢复生长抑制调控作用(Casey etal.，1991；Takahasi et al.，1992)。虽然DNA转染并不是将DNA导入病人细胞中的一种可行手段，但如果能开发传递p53基因的改善方法，那么上述结果就证明将野生型p53用于存在突变p53基因的癌细胞可能是一种有效的治疗方法。
目前，人们正在研究和开发能够用于肿瘤抑制之基因疗法的基因传递系统。以病毒为基础的基因转移载体特别引人注意，这是因为病毒具有感染活细胞的效力，在这一感染过程中，病毒遗传物质本身得以转移。在这方面已经取得一些进展，例如，已经用遗传工程方法生产了用于传递各种基因的逆转录病毒载体。然而，因为逆转录病毒的感染性取决于靶细胞上逆转录病毒受体的可获得性，所以主要的问题还与用于基因疗法的逆转录病毒载体有关，所述受体难以浓缩和纯化，而且它们只能有效地整合到正在复制的细胞中。
肿瘤细胞对化疗药物的抗性代表了临床肿瘤学中存在的主要问题。NSCLC占肺癌病例的至少80％，而具有NSCLC的病人通常对化疗是不具反应性的(Doyle，1993)。目前的癌症研究目标之一是通过研究基因产物和化疗药物之间的相互作用来寻找改善癌症的基因替代疗法效力的途径。当单纯疱疹胸苷激酶(HS-tK)基因通过逆转录病毒载体系统传递至脑肿瘤细胞时，成功地诱导对抗病毒剂9-(1，3-二-羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤的敏感性(Culver，et al.，1992)。HS-tK基因产物是外源病毒酶，而wt-p53蛋白在正常组织中表达，这说明通过改变wt-p53的表达所进行的化学抗性调节可能是利用内源性遗传设计所介导之途径的另一种手段。
腺病毒系统对于体内的基因传递具有很大的优势，如产生高滴度病毒、高感染力和对许多类型细胞的感染性。然而，被导入基因表达的稳定性和持续性仍然是一个有争议的问题。在给予DNA损伤刺激后的6小时内能在对化疗药物敏感的细胞中出现p53水平升高(Fritsche，etal.，1993；Zhan，et al.，1993)，尽管如果去除所述刺激，升高的D53 DNA结合性在4小时过程中会逆转(Tishler，et al.，1993)。因此，即使在中止与药物的接触后高水平的p53表达仍可以维持。通过Ad-p53进行的Wt-p53表达在感染后第3天达到峰值(比内源野生型高14倍)，并在第9天降至较低水平(Zhang，et al，1993)。这表明短暂的wt-p53高水平表达足以在癌细胞中启动细胞毒性程序。
p53具有在人肺癌细胞中作为化学敏感性决定子的重要作用。包括外科手术、化学疗法和放射疗法在内的各种治疗方案都曾被试验性用于人NSCLC，但长期的存活率仍不令人满意。所需要的是一种联合疗法，它可以单独使用，或者作为有效的辅助治疗以防止原发肿瘤切除后的局部复发，或者作为对于产生了抗药性的原发、转移或局部复发肺癌通过损害内注射所能给予的一种治疗方法。还需要开发、研究和改善用于癌症治疗的新组合物之临床适用性的组合物和方法。而且，必须证明这些方法和组合物在体内环境中的应用价值。
本发明阐述了对于通过将肿瘤抑制基因或蛋白与DNA损伤剂或因子的作用相结合用于制备杀伤细胞之经改善的治疗剂的需要。本发明还提供了组合物和方法，包括利用病毒介导的基因转移在靶细胞中促进野生型肿瘤抑制基因的表达(例如p53)和传递诱导DNA损伤的制剂或因子。本发明人意外地发现，利用本文所公开的组合物可以在极大数量的靶细胞中诱导程序化的细胞死亡，也称为编程性细胞死亡。
利用本发明，本发明人已经证明了在调控细胞生长，特别是肿瘤细胞生长方面的显著作用。肿瘤细胞的形成和生长也称为“转化”，它描述了已丧失其控制细胞分裂能力的细胞的形成和增生，这些细胞即为癌细胞。已经预料到大量不同类型的转化细胞都是本发明方法和组合物可能的靶，如肉瘤、黑瘤、淋巴瘤和非常广泛的实体瘤等。尽管存在恶性细胞生长的任何组织都可能成为靶，但肺和乳腺组织是优选的靶。本发明人在本文公开，当表达p53的重组传递载体与DNA损伤剂结合使用时能够显著降低细胞生长速率。
本发明人在一些实施方案中提供了杀伤细胞(如恶性细胞)的方法和组合物，方法是将细胞或细胞群与能有效杀死细胞之结合量的p53蛋白或基因和一种或多种DNA损伤剂相接触。能用本发明杀死的细胞可以包括例如不需要的良性细胞，如良性的前列腺增生细胞或超活性的甲状腺细胞；涉及自身免疫疾病的细胞，如产生与关节炎、狼疮、重症肌无力、鳞状转化、营养不良等有关的抗体的B细胞。虽然一般可用于杀死所有不需要的细胞，但本发明特别适用于杀死恶性细胞。“恶性细胞”被定义为已丧失了控制细胞分裂周期能力、导致“转化的”或“癌性”表型的细胞。
为了利用本发明的方法和组合物杀死象恶性或转移细胞这样的细胞，一般可以将“靶细胞”与能有效杀死所述细胞之结合量的p53蛋白或基因和至少一种DNA损伤剂相接触。该方法可以包括将所述细胞与p53蛋白或基因和DNA损伤剂或因子同时接触。所述过程的完成可以通过将所述细胞与单个组合物或包括两种药剂的药物配方接触，或者通过将所述细胞与两种不同的组合物或配方同时接触，其中的一种组合物包括p53蛋白或基因，而另一种组合物包括DNA损伤剂。
当然可以想到，靶细胞可以首先与DNA损伤剂接触，然后再与p53蛋白或基因接触，或者反之。然而，在DNA损伤剂和p53被分别应用于细胞的情况下，通常应该保证传递每种物质时间之间的有效时期不能失效，这样的话，DNA损伤剂和p53将仍然能够对所述细胞产生有利的联合作用。在这种情况下，可以认为应该将所述细胞与两种制剂接触，彼此间隔大约12-24小时，更优选的是间隔大约6-12小时，延迟时间仅大约12小时为最优选。
术语“接触”和“暴露”在用于细胞时所描述的是肿瘤抑制基因或蛋白(如p53)和DNA损伤剂或因子传递给靶细胞或与靶细胞直接一起放置的过程。为了能够杀死细胞，两种制剂要以能有效杀死细胞(即诱导程序化细胞死亡或编程性细胞死亡)的结合量传递给细胞。术语“杀死”、“程序化细胞死亡”和“编程性细胞死亡”在本文中相互交换着使用，以描述导致靶细胞死亡的一系列胞内过程。细胞的死亡过程包括胞内蛋白酶和核酸酶的激活，这导致例如细胞核退化和核DNA断裂。理解由各种胞内分子相互作用所产生的细胞死亡的精确机理并不是实施本发明所必需的。
DNA损伤剂或因子在本文被定义为当在应用于细胞时可诱导DNA损伤的任何化学物质或处理方法。这类损伤剂或因素包括诱导DNA损伤的辐射和波，如γ-射线、X-射线、紫外线照射、微波、电子发射等。多种化学物质(也描述为“化疗剂”)具有诱导DNA损伤的作用，它们都可以用于本文所公开的联合治疗方法。被认为适用的化疗剂包括如阿霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、依托泊甙(VP-16)、喜树碱、放线菌素D、丝裂霉素C、顺铂(CDDP)和过氧化氢。本发明也包括一种或多种DNA损伤剂的联合应用，所述损伤剂无论是以辐射为基础还是为实在的化合物，例如，将X射线与顺铂联用，或将顺铂与依托泊甙联用。在某些实施方案中，顺铂与p53基因或蛋白的联合应用作为所述化合物是特别优选的。
只要能够引起细胞中功能性p53蛋白的水平升高，任何方法都可用于使细胞与p53蛋白接触。这包括直接将p53蛋白传递给细胞，也包括传递编码p53的基因或DNA片段，所述基因将在细胞中指导p53的表达和产生。在蛋白质的传递中存在如蛋白降解和较低的细胞摄取之缺陷，据认为应用能表达p53蛋白的重组载体将提供特别的益处。
大量的重组质粒和载体可以在经遗传工程方法处理后来表达p53蛋白，从而用于向细胞传递p53。这些包括例如用裸DNA和p53质粒直接将遗传物质转入细胞(Wolfe et al.，1990)；将编码p53的DNA收入脂质体(Ledley et al.，1987)或收入含病毒包膜受体蛋白的蛋白脂质体中(Nicolau et al.，1983)和与聚赖氨酸-糖蛋白载体复合物偶联的编码p53的DNA。
遗传工程方法获得的表达p53的重组病毒的应用也进行了研究。如Miller(Miller，1992)所述，各种病毒载体，如逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒(美国专利5,288,641，并入本文作为参考)、巨细胞病毒等都可以使用；可以使用的还可以是重组的腺伴随病毒(AAV载体)，如美国专利5,139,941所述(并入本文作为参考)以及特别是重组的腺病毒载体。现有技术已熟知制备复制缺陷型感染性病毒的技术，其例证如Ghosh-Choudhury&Graham(1987)；McGrory et al.，(1988)和Gluzman et al.，(1982)，上述文献都并入本文作为参考。
为了根据本发明杀死细胞，通常应该将所述细胞与能有效杀死细胞的结合量的p53蛋白或基因和DNA损伤剂相接触。术语“有效杀死细胞的结合量”是指p53和DNA损伤剂的量是足够的，以致于当其联合用于细胞中时，该细胞被诱导进行编程性细胞死亡。尽管不是在所有的实施方案中都需要，但p53和DNA损伤剂的结合有效量将优选地是能够诱导比单独使用各成分时多得多的细胞死亡的剂量，最优选的是，结合有效量是指与单用各种成分所观察到的作用相比能诱导增效性细胞死亡的量。
许多的体外参数可用于确定本发明组合物和方法所产生的效果。这些参数包括例如观察与本发明所述组合物接触前后的净细胞数以及所形成的多细胞肿瘤球体的大小，如在组织培养中形成的集落。在本文的实施例7中特别表明了体外的杀细胞作用。另外，还可以检测表明细胞正在进行编程性细胞死亡的参数，如细胞基因组DNA断裂成核小体大小的片段，这通常是通过用琼脂糖凝胶电泳分离片断、将DNA染色并将该DNA与DNA大小梯度相比较来鉴定。核小体大小片段是以具有约200bp碱基单位的单体和多体之渐进性梯度来鉴定的。
类似地，“治疗有效量”是指p53蛋白或基因和DNA损伤剂在联合施用于动物时能在动物中有效杀死细胞的量。这尤其是以杀死癌细胞为证明，所述癌细胞例如是存在于患肿瘤之动物或人体中的肺癌、乳癌或结肠癌细胞。“治疗有效性联合”因此而通常指能够比任意单一成分杀死更多细胞的p53和DNA损伤剂之结合量，优选地是指能产生协同性肿瘤负荷减轻的结合量。
对细胞死亡的某些体内和间接体内参数进行研究也是有效的手段，借此可以评估本发明组合物和方法的有效性。例如，借助有经验的病理学家已知的冰冻组织切片的TdT表达或利用其它的染色方法和靶抗原的检测，可以观察对致癌性生长抑制作用的影响。当然，确定肿瘤包块、生长和存活力的其它手段也可用于评估对靶细胞的杀伤作用。特别是可以在癌症的各种动物模型系统中评定这些影响，包括将人的癌细胞定位于动物中的那些模型。已知肿瘤动物模型与AIDS病的不同，它对于人的治疗方案有很高的预见性(Roth et al.，editors(1989))。一个预测性动物模型的例证方案为其中有人的小细胞肺癌细胞(H358细胞)在皮下生长的方案。利用这个系统本发明人已证明，在将含p53的腺病毒输入肿瘤内时还同时施用化疗剂，产生了几乎意外有效的肿瘤缩小。
将p53蛋白传递给细胞所特别优选的方法是将所述细胞与重组的腺病毒病毒体或病毒颗粒接触，后者包括了含p53表达区的重组腺病毒载体，该表达区位于能够指导p53在所指定细胞类型中表达的启动子之调控下。
载体中的p53表达区含有一段基因组序列，但为了简便起见，可以认为一般宁愿使用p53 cDNA序列，因为其在现有技术中易于获取，而且更易于操作。除了含有p53表达区和启动子区之外，该载体通常还含有聚腺苷酸化信号，如SV40早期基因，或鱼精蛋白基因，聚腺苷酸化信号等。
在优选的实施方案中，可以考虑希望将p53表达区定位于较强的组成型启动子的调控之下，所述启动子如CMV启动子、病毒LTR、RSV或SV40启动子，或与能在哺乳动物细胞中高水平表达的基因相关的启动子，如延伸因子1或肌动蛋白启动子。所有这类变异体都被认为适用于本发明。目前，特别优选的启动子是巨细胞病毒(CMV)IE启动子。
p53基因或cDNA可以简单地借助将p53编码序列插入或加入到病毒基因组中而得以被导入本发明的重组腺病毒中。然而，优选的腺病毒将是复制缺陷型病毒，其中复制和/或包装所必需的病毒基因已从腺病毒载体构建体中去除，使得p53表达区被导入该位置。无论是复制所必需的基因(如E1A、E1B、E2和E4)还是非必需的基因(如E3)，任何基因都可以被去除而代以p53。特别优选的是那些其中腺病毒载体的E1A和E1B区已被去除，而p53表达区导入到其位置上的载体和病毒体，这可由图1的基因组结构来举证说明。
如Ghosh-Choudhury和Graham(1987)、McGrory等人(1988)以及Gluzman等人所说明(每篇文献均引入本文作为参考)，制备复制缺陷型腺病毒的技术是现有技术中熟知的。人们也已了解各种细胞系可用于繁殖重组腺病毒，只要其能与所存在的复制缺陷互补。优选的细胞系是人293细胞系，但任何允许进行复制(即在优选的情况下能够表达E1A和E1B)的细胞系都可以使用。而且，所述细胞能够在塑料平皿或悬浮培养中繁殖，以获得其病毒贮备物。
本发明并不仅仅局限于缺乏E1的病毒和表达E1的细胞。实际上，病毒与宿主细胞的其它互补性联合也可以与本发明相联系应用。可以使用缺乏功能性E2的病毒和表达E2的细胞，正如可以使用缺乏功能性E4的病毒和表达E4的细胞等一样。当复制所非必需的一个基因被去除和取代，例如E3基因，这一缺陷不必由宿主细胞所专门互补。
除了要求腺病毒载体经遗传工程处理以表达p53外，并不认为原腺病毒的性质是成功实施本发明的关键。腺病毒可以是42种不同的已知血清型或亚群A-F中的任意一种。C亚群中的5型腺病毒是为了获得用于本发明方法的条件性复制缺陷型腺病毒载体的优选起始材料。这是因为5型腺病毒是一种人腺病毒，现已了解了有关的大量生化和遗传学信息，并且在历史上已被用于以腺病毒作载体的大多数构建物中。
本发明的方法和组合物同样地适用于在体外和在体内杀死细胞。当待杀细胞位于动物体内时，例如肺癌、乳癌或结肠癌细胞或其它具有p53突变的细胞，就可将p53蛋白或基因和DNA损伤剂以药物学上可接受的形式施用于动物。本文所用术语“药物学上可接受的形式”是指可施用于动物的任何组合物形式和将动物与辐射相接触的形式，即动物体的某个区域被例如γ射线、X射线、紫外线、微波、电子发射等照射的方式。DNA损伤性辐射和波的应用是放射治疗领域中技术人员已知的。
本发明还提供了治疗癌症的有利方法，通常包括给患癌症的动物或病人施用治疗有效量的p53蛋白或基因和DNA损伤剂。利用携带了能在肿瘤细胞中表达p53之载体的重组病毒，特别是腺病毒即可以达到上述目的。传递p53基因的组合物通常是以药物学上可以接受的组合物形式在密切接触肿瘤的情况下施用于动物。将治疗有效量的p53基因(如位于重组病毒内)经直接的损害内注射至肿瘤部位是一种优选的方法。然而，也可以考虑其它的胃肠外施用途径，如静脉内、经皮、内窥镜和皮下注射。
在根据本发明治疗癌症时，将肿瘤细胞与除了p53蛋白或基因外的DNA损伤剂接触。通过利用DNA损害性照射，如用X-射线、紫外线、γ-射线或者微波照射所在的肿瘤部位即可达到上述目的。另外，肿瘤细胞可以通过给动物施用治疗有效量的含DNA损伤化合物的药物组合物而与DNA损伤剂接触，所述DNA损伤化合物例如有阿霉素、5-氟尿嘧啶、依托泊甙、喜树碱、放线菌素D、丝裂霉素C或更优选的顺铂。该DNA损伤剂可以通过与如上所述的p53蛋白、基因或基因传递系统相结合而加以制备，并以结合的治疗组合物或试剂盒形式使用。
本发明的意外成功通过发现在用裸鼠模型所进行的研究中Ad5CMV-p53病毒与顺铂的联用产生了意义深远的结果而得以证明。病毒-DNA损伤疗法的结合显著地抑制了H358细胞的致癌性，该细胞正常情况下能产生明显的肿瘤包块。通过Ad5CMV-p53的治疗，肺癌细胞的致癌性受到抑制，但不受表达荧光素酶之对照病毒的抑制，这表明p53蛋白与DNA损伤剂相结合具有极大的治疗效力。
本领域技术人员已经知道一些用来把包括DNA表达构建体的化疗配方传递到真核细胞的方法。就本文而言，有经验的人员能用各种不同的有效方式把DNA损伤剂和p53蛋白或基因传递到细胞中。
对于体内的DNA传递而言，本发明人考虑了各种基因传递系统的应用，如病毒介导的和脂质体介导的转染。本文所用术语“转染”描述的是利用传递系统，如腺病毒、AAV、逆转录病毒或质粒传递基因转移法将DNA定向地传递给真核细胞。可以选择病毒基因传递的特异性，以优先地指导所述基因到达特定的靶细胞，例如这可以通过使用能够感染特定细胞类型的病毒来实现。当然，不同的病毒宿主范围将指定选来用于基因传递的病毒，以及可能的肿瘤抑制基因，后者被表达用于杀死指定的恶性细胞类型。
还要看到，可以通过各种途径提供DNA损伤化疗剂，如通过利用静脉内和皮下注射等胃肠道外传递方法进行。这类方法是药物传递领域中的技术人员已知的，并且在本文的药物制备及处理部分还有更进一步的描述。
对于体外的基因传递而言，可以使用多种方法，例如磷酸钙或葡聚糖硫酸酯介导的转染；电穿孔法；玻璃导弹击靶法等。根据本发明的公开而显而易见的确切组合物和实施过程，上述方法都是本领域技术人员已知的。
其它的实施方案涉及包括药物配方的组合物，含有p53蛋白或基因和DNA损伤剂，如顺铂。在这类组合物中，p53可以是能够在一种动物细胞中表达p53蛋白的DNA片段、重组载体或重组病毒的形式。通过分散于药物学上可接受的溶液或缓冲液中，可以配制包括含有重组病毒基因传递系统(如腺病毒颗粒)的所述组合物以供体内施用。优选的药物学上可接受的溶液包括用磷酸、乳酸、Tris等缓冲的中性盐溶液。
当然，在利用病毒传递系统过程中，希望纯化病毒体，以致其能够基本不含不需要的污染物质，如缺损干扰病毒颗粒或内毒素和其它的致热原，这样就不会在接受载体构建体的细胞、动物或人体中引起任何不利反应。优选的载体纯化方法包括应用浮力密度梯度，如氯化铯梯度离心法。
本发明优选的药物组合物是那些包括分散于药物学上可接受溶液或缓冲液中的p53蛋白或更优选的p53基因和化疗DNA损伤剂。列举的化疗剂是阿霉素、5-氟尿嘧啶、喜树碱、放线菌素D、过氧化氢、丝裂霉素C、顺铂(CDDP)和依托泊甙(VP-16)，其中选用顺铂是特别优选的。
本发明还有更进一步的实施方案是用于杀死细胞(如恶性细胞)的试剂盒，可以配制成治疗性试剂盒用于癌症治疗。本发明的试剂盒通常是在合适的容器工具中含有能够在动物细胞中表达p53蛋白的重组载体的药物配方和DNA损伤剂的药物配方。重组载体和DNA损伤剂可以存在于单个容器中，或者这些成分分别存在于不同的或分开的容器工具中。在优选的实施方案中，重组载体是存在于腺病毒颗粒上的、表达p53的重组腺病毒载体，而DNA损伤剂为顺铂。
所述试剂盒的成分优选的是以液体溶液提供，或者为干粉。当各成分以液体溶液提供时，该溶液为水溶液，特别优选的是无菌水溶液。当试剂或组分为干粉时，该粉末可通过加入适当的溶剂来重新配制。可以认识到，所述溶剂也可以在另一容器工具中提供。
下文的附图是本说明书的一部分，并包括了对本发明某些方面更进一步的说明。通过参考一个或多个附图，并结合本文特定实施例的详细描述，将可以更好地理解本发明。
图1.产生重组p53腺病毒的方案。p53表达盒被插入到pXCJL.1的XbaI和ClaI位点之间。用p53表达载体(pEC53)和重组质粒pJM17共同转染到293细胞中。使被转染的细胞维持在培养基中直到开始出现细胞病变效应。通过对DNA的PCR分析来鉴定新产生的p53重组腺病毒(Ad5CMV-p53)，其中的PCR分析法利用了从经蛋白酶K和酚提取处理的CPE上清液中制备的DNA模板。
图2A.用于对Ad5CMV-p53 DNA进行结构分析的图谱。该图表示了p53表达盒位于其上的Ad5CMV-p53基因组DNA、PCR引物和限制性酶切位点。基因组大小约为35.4kb，被分成100个图单位(1m.u.＝0.35kb)。p53表达盒取代了Ad5基因组上的E1区(1.3-9.2m.u.)。引物1位于人CMV主要IE基因启动子下游的第一个内含子。引物2位于SV40早期聚腺苷酸化信号中。距p53 cDNA插入段两端15-20bp的两个引物定义了一段1.40kb的PCR产物。引物3和4分别定位于Ad5基因组的11m.u.和13.4m.u.，其它义了一段0.86kb的病毒基因组特异性PCR产物。
图2B.PCR产物的琼脂糖凝胶分析。将定义1.4kb(p53)和0.86kb(Ad5)DNA片段的两对引物用于每一反应。用于每一反应中的DNA模板为pEC53质粒(泳道1)、Ad5/RSV/GL2DNA(泳道2)、无DNA(泳道3)和Ad5CMV-p53 DNA(泳道4)。被标示的泳道(M)对应于分子量标准物。
图2C.Ad5CMV-p53 DNA的限制性酶切图谱。分别用无酶(U)、HindIII(H)、BamHI(B)、EcoRI(E)和ClaI(C)消化经CsCl梯度纯化的Ad5CMV-p53 DNA样品，并在1％琼脂糖凝胶电泳上进行分析。所标示的泳道(M)是分子量标准物。
图3A、图3B、图3C和图3D。利用重组腺病毒对293细胞产生细胞病变效应的观察。图3A、图3B、图3C和图3D是293细胞的一系列相差成象(×400)。图3A、图3B、图3C和图3D是单页图的4个分图。图3A，转染前；图3B，转染后12天的阴性对照；图3C，转染后12天开始的CPE；图3D，转染后14天CPE完成。
图4A、图4B、图4C和图4D。用重组腺病毒感染的细胞的免疫组织学。图4A、图4B、图4C和图4D是H358细胞的一系列免疫组织学图像。图4A、图4B、图4C和图4D是单页图的4个分图。Ad5CMV-p53在H358细胞中的感染性。用Ad5CMV-p53或Ad5/RSV/GL2以50PFU/细胞感染H358细胞共24小时。单用培养基作为模拟感染。经免疫染色法分析被感染的细胞。图4A是用抗p53抗体探查的模拟感染。图4B是用Ad5/RSV/GL2对照感染并用抗p53抗体探测的感染细胞。图4C是用不相关抗体(MOPC-21)探测的Ad5 CMV-p53感染细胞。图4D是用抗p53抗体探测的Ad5CMV-p53感染的细胞。所用抗p53抗体为Pab1801，亲和素-生物素法用于染色。
图5A.考马斯兰染色的SDS-PAGE凝胶，比较在H358细胞中表达的外源p53的相对水平。在感染后24小时和72小时制备用30PFU/细胞的Ad5 CMV-p53或Ad5/RSV/GL2感染的H358细胞样品。考马斯兰染色的SDS-PAGE分析表明了所载蛋白样品的相对含量。泳道1和4含有Ad5/RSV/GL2感染细胞的样品。泳道2和3含有用Ad5CMV-p53的两种单独的贮备物感染24小时后的细胞样品。泳道5和6是在感染后72小时收集的Ad5CMV-p53感染细胞的样品。泳道7是感染后72小时的模拟感染H358的样品。泳道M为预染的分子量标准物(KDa)(GIBCO-BRL)。
图5B。图5A所示SDS-PAGE对等泳道设置凝胶的Western印迹分析。通过利用抗p53抗体的Western印迹方法分析p53表达的相对水平。所用的第一抗体是抗p53蛋白的单克隆抗体(PAb1801，Oncogene Science Inc.)和抗β-肌动蛋白的单克隆抗体(AmershamInc.)。HRP连接的第二抗体和ECL developer得自Amersham Inc.。用Western印迹法分析病毒感染的H358细胞。图5B的Western印迹与图5A中的有相同的顺序和构成。
图6.用Western印迹法确定的p53表达时间过程。用10PFU/细胞的Ad5CMV-p53感染多个平皿的H358细胞。在感染后的指定时间点制备细胞裂解物。同时用抗p53抗体和抗肌动蛋白抗体探测Western印迹。命名为“C”的泳道代表阴性对照。直方图表示由光密度计确定的p53相对含量。
图7A.细胞系H358的病毒感染人肺癌细胞的生长曲线。按照105细胞/平皿(60mm)和6个平皿/细胞系的量接种细胞。24小时后，以10m.o.i(感染复数，即PFU/细胞)的Ad5 CMV-p53或Ad5/RSV/GL2感染细胞。感染后，每天对细胞计数，共计六天。生长曲线表示从4个不同的研究中得到的数据。
图7B.细胞系H322的病毒感染人肺癌细胞的生长曲线。按105细胞/平皿(60mm)和6个平皿/细胞系的量接种细胞。24小时后，以10m.o.i.(感染复数，即PFU/细胞)的Ad5CMV-p53或Ad5/RSV/GL2感染细胞。感染后，每天对细胞计数，共计六天。生长曲线表示从4个不同的研究中得到的数据。
图7C.细胞系H460的病毒感染人肺癌细胞的生长曲线。按105细胞/平皿(60mm)和6个平皿/细胞系的量接种细胞。24小时后，以10m.o.i.(感染复数，即PFU/细胞)的Ad5 CMV-p53或Ad5/RSV/GL2感染细胞。感染后，每天对细胞计数，共计六天。生长曲线表示从4个不同研究中所获得的数据。
图8.Ad5CMV-p53在常位(orthotopic)肺癌模型中试验的流程图。该图中总结了用H226Br细胞和病毒接种处理裸鼠的剂量与方案。
图9A、图9B、图9C和图9D。从被处理和对照小鼠剖离的肺和纵隔样品。图9A、图9B、图9C和图9D。是一个图的4个分图。在处理后的六周末将小鼠处死。分离肺及纵隔组织用于评估肿瘤的形成。图9A是从正常裸鼠得到的纵隔段样品；图9B是从载体(PBS)处理的小鼠得到的纵隔段样品；图9C是从Ad5 CMV-p53处理的小鼠得到的纵隔段样品；图9D是从Ad5/RSV/GL2处理的小鼠得到的纵隔段样品。箭头表示肿瘤块。
图10A.连续接触CDDP对亲代、Ad-Luc感染的和Ad-p53感染的H358细胞生长速率的影响。H358细胞(1.5×105细胞/孔)按双份置于24孔板中。24小时后，加入100μl培养基、Ad-Luc病毒贮液(108PFU/ml)或Ad-p53病毒贮液(108 PFU/ml)。再经过24小时的培养后，用含10μg/ml CDDP的新鲜培养基更换含病毒的培养基。
图10B.接触CDDP24小时对亲代、Ad-Luc感染的和Ad-p53感染的H358细胞生长速率的影响。细胞与CDDP连续接触(图10A)或接触24小时(图10B)，然后在不含药物的培养基中回收。保持为附着单层的细胞通过检测台盼兰摄入来评估5天中的存活情况。图中示出了均值+/-标准误差。第5天的Ad-p53：CDDP组细胞数与其它的A和B组有显著性差异(p＜0.05，Student t检验)。
图10C.不同浓度的CDDP对Ad-p53感染的H358细胞的存活力的影响。与Ad-Luc或Ad-p53病毒接触24小时后，用0、10或100μg/ml的CDDP处理细胞，然后评估存活力。
图11A.与CDDP接触的Ad-p53感染的H358细胞中的核小体DNA断裂。如图10的说明对细胞进行感染并用CDDP处理24小时。
图11B、图11C、图11D、图11E、图11F和图11G。用Ad-p53对生长于箱式玻片上的H358细胞感染24小时，再用CDDP处理24小时，固定后用于原位标记DNA断裂。所示图为无(B)或有(D)CDDP的亲代H358细胞；无(D)或有(E)CDDP的Ad-Luc感染细胞；无(F)或有(G)CDDP的Ad-p53感染细胞。箭头表示深染的核片段的例子。短线＝100μm。
图12A.  Ad-p53感染和CDDP处理对H358肿瘤球体的联合影响。如前所述(Takahashi et al.，1989)制备H358细胞的多细胞肿瘤球体。在第0天，将直径为150-200μm的球状物置于24孔琼脂包被板中，与Ad-p53或Ad-Luc接触24小时。第1天，在除去含病毒的培养基后加入含10μg/ml CDDP的培养基。第2天，保温24小时后，用1ml新鲜的不含药物培养基代替覆盖物。用倒置显微镜检测垂直直径。根据公式a2×b/a1 2×b1计算体积的相对改变，公式中a和b分别是球状物的最小和最大直径，而a1和b1是第1天的直径。只有Ad-p53/CDDP球状物的相对体积比对照组(Ctl)有显著性缩小(p＜0.05，student t-检验)。
图12B、图12C、图12D和图12E。用TdT进行原位dUTP标记以检测编程性细胞死亡。如实施例7的材料与方法所述，在第3天将H358细胞球状物固定并染色。(B)对照的未处理球状物；(C)用CDDP处理的球状物；(D)用Ad-p53感染的球状物和(E)Ad-p53感染的经CDDP处理的球状物。短线＝100μm。
图13A.通过肿瘤体积的改变检测用Ad-p53进行体内感染后由CDDP诱导的编程性细胞死亡。悬于0.1ml Hank平衡盐溶液中的H358细胞(5×106)经皮下注射到BALB/C雌性nu/nu小鼠的右胁腹。30天后，再将200μl培养基本身或含Ad-Luc(108pFU/ml)或Ad-p53(108PFU/ml的培养基注射到直径为5-6mm的肿瘤中。进行肿瘤内注射(100μl)和在两个相对的位置进行肿瘤周围注射(各50μl)。经腹膜内给予CDDP(3mg/kg)或生理盐水对照。在不了解何为处理组的情况下，用测径器在两个垂直直径上检测肿瘤的大小，并通过一个假设具有以横切面直径之积的平方根为平均肿瘤直径的球形来计算肿瘤的体体。每个处理组用5只小鼠，已给出了均值±标准误差。用Student t-检验来分析数据。箭头表示处理的天数。图中显示了两个独立的检测结果。试验1中从第5天开始p＜0.05；试验2中从第7天开始p＜0.05(B-E)。
图13B、图13C、图13D和图13E。利用TdT介导的生物素-dUTP标记技术进行的组织学研究。在处理开始5天后收集肿瘤，并立即包入O.C.T.化合物中。在低温控制器中以5μm厚度切冷冻组织。如图12的说明所述，用1μg/ml蛋白酶K处理切片并染色。所示图为单用CDDP处理的H358肿瘤(B)、单用Ad-p53处理(C)或用Ad-p53与CDDP联合处理的肿瘤(D，E)。短线＝0.5mm。所有的动物护理都是根据UT M.D.Anderson Institutional Animal Care and UseCommittee的要求进行。A.肺癌发展中的分子学过程
本发明人进行的研究已经证实了导致癌症发生和进展的重要分子过程。这使得本发明人能够开发恢复某些正常蛋白质功能从而使恶性表型能在体内得以抑制的新方法。
大多数常见肺癌的组织学(80％)都归于术语非小细胞肺癌(NSCLC)，其包括了鳞状癌、腺癌和大细胞未分化癌。许多有关肺癌分子生物学的现有资料都源于对罕见的小细胞肺癌(SCLC)的研究。SCLC与NSCLC的区别在于细胞的神经内分泌特征；SCLC对化疗具有很好的反应性，但在治疗之后很快复发。NSCLC还可以作为其它致癌物诱导的上皮癌模型。本研究中所得到的方法和观察资料可用于其它类型的上皮癌。
已经积累的充足的证据说明恶性转化过程是由遗传学改变所介导的。在癌细胞中检测到的主要损害出现在显性癌基因和肿瘤抑制基因。显性癌基因在一类称为原癌基因的基因中发生了改变，原癌基因参予重要的正常细胞功能，包括信号转导和转录。发生于具有转化能力的显性癌基因的初级修饰作用包括点突变、转位、重排和扩增。肿瘤抑制基因可能需要通过突变、缺失或两者的结合使纯合子的功能丧失而发生转化。一些肿瘤抑制基因可能通过调节转录而在控制增生方面起作用。对显性及肿瘤抑制癌基因的表达进行修饰可能影响与恶性表型有关的某些细胞特征。
尽管对涉及癌基因介导的转化机理的了解不断增多，但在开发特异性地针对癌基因及其产物的治疗策略方面没有取得多大进展。起初，这一领域的研究集中在显性癌基因上，因为这些基因是首先被鉴定特征的。DNA介导的基因转移研究表明了通过转移了恶性人肿瘤DNA后的正常细胞获得恶性表型。B.癌症中的p53和p53突变
p53在目前被认为是肿瘤抑制基因(Montenarh，1992)。在因化疗致癌剂、紫外线照射和多种病毒(包括SV40)转化的许多细胞中都已发现存在高水平的p53。p53基因是大量人肿瘤中常见的突变失活靶，并已被描述成多发人癌中最常见的突变基因(Mercer，1992)。在50％以上的人NSCLC(Hollestein，et al.，1991)和其它的广谱肿瘤中都有突变。
p53基因编码375个氨基酸的磷蛋白，后者能与宿主蛋白(如大T抗原和E1B)形成复合物。该蛋白质见于正常组织和细胞，但与转化细胞或肿瘤组织相比其浓度甚微。令人感兴趣的是，野生型p53似乎在调节细胞生长和分裂中很重要。已经证明野生型p53的过度表达在某些情况下对人肿瘤细胞系有抗增生作用。因此，p53可以作为细胞生长的负调节剂(Weinberg，1991)，可以直接抑制失控的细胞生长或间接地活化抑制所述生长作用的基因。所以，野生型p53失活或缺乏可以产生转化作用。然而，一些研究表明，突变p53的存在可能是完全表达所述基因转化潜力所必需的。
尽管野生型p53被认为是许多细胞类型的很重要的生长调节剂，但其遗传学和生化学特性似乎也具有作用。错义突变对于p53而言是常见的，并且对于癌基因的转化力是必需的。由点突变所引起的单一遗传学变化可产生致癌性p53。但与其它癌基因不同，已知p53点突变发生在至少30个不同的密码子，常常构成能在细胞表型中产生位移的显性等位基因而不降低纯合性。另外，许多这些显性负等位基因可能在生物体中有耐受性，并在种系中传递。各种突变的等位基因可能包括从最弱的功能失调性显性负等位基因到较强外显的显性负等位基因(Weinberg，1991)。
据Casey及其同事报道，将编码野生型p53的DNA转染到人乳癌细胞系中可在这类细胞中恢复生长抑制的调控(Casey et al.，1991)。也已证实了对野生型p53而非突变p53转染至人肺癌细胞系中的类似作用(Takahasi et al.，1992)。p53在突变基因上呈显性，当被转染至有该突变基因的细胞中时，将筛选抗增生作用。被转染p53的正常表达并不影响具有内源p53的细胞的生长。因此，这类构建体能被正常细胞摄入而没有不利影响。
因此，用野生型p53治疗p53相关性癌症有可能减少恶性肿瘤细胞数目。然而，如上所述的研究还远未达到这一目标，这较多的是因为DNA转染法并不能用于将DNA导入病人体内的癌细胞中。C.基因治疗技术
至今已提出了数种基因治疗的实验手段，但每种都有其特定的缺点(Mulligan，1993)。如上所述，基本的转染方法在于通过例如穿透细胞膜的物理方法或化学方法而非生物学方法将含目的基因的DNA导入细胞中。正常情况下，这种方法局限于能够从机体暂时取出，并能耐受治疗的细胞毒性的细胞，即淋巴细胞。与某些脂类和两亲的肽形成的脂质体或蛋白质结合物可用于转染，但基因的整合效率仍然很低，大约每1,000-100,000个细胞发生一次整合，并且转染基因的表达在增生细胞中限于数天，或在非增生细胞中限于数周。因此，DNA转染对于癌症治疗而言显然不是一种适宜的方法。
第二种方法利用病毒的天然能力进入细胞，带入其遗传物质。逆转录病毒有希望作为基因传递载体，因为其能将其基因整合到宿主基因组中，转移大量外源遗传物质，感染广谱的物种和细胞类型，并能够在特定细胞系中包装。然而，有三个主要问题妨碍了逆转录病毒载体的实际应用。首先，逆转录病毒的感染性依赖于靶表面上病毒受体的可获得性。其次，逆转录病毒只能有效地整合到复制细胞中。最后，逆转录病毒难以浓缩和纯化。D.用于基因治疗的腺病毒构建体
人类腺病毒是双链DNA肿瘤病毒，基因组大小约为36kb(Tooza，1981)。作为真核基因表达的模式系统，腺病毒已被广泛地研究并进行了清楚的特征鉴定，这就使其成为开发作为基因转移系统的腺病毒的有吸引力系统。这组病毒易于生长和操作，而且其在体内和体外显示了广泛的宿主。在裂解性感染的细胞中，腺病毒能够关闭宿主的蛋白质合成，指导细胞器合成大量病毒蛋白和产生大量病毒。
基因组的E1区包括编码负责病毒基因组转录调节的蛋白质的E1A和E1B以及少数的细胞基因。包括E2A和E2B的E2表达使得合成病毒复制性功能，如DNA结合蛋白、DNA聚合酶和引导复制的终止蛋白。E3基因产物防止由细胞毒性T细胞和肿瘤坏死因子引起的细胞溶解，并且对于病毒的繁殖似乎很重要。与E4蛋白质相关的功能包括DNA复制、晚期基因表达和宿主细胞关闭。晚期基因产物包括大多数的病毒粒子衣壳蛋白，并且其只在来自主要晚期启动子的单个初级转录物的大部分加工过程出现后才表达。主要的晚期启动子(MLP)在感染晚期表现出高效率(Stratford-Perricaudet and Perricaudet，1991a)。
因为只有小部分的病毒基因组似乎需要为顺式(Tooza，1981)，所以腺病毒来源的载体在用于有关的细胞系(如293细胞)时能提供取代大DNA片段的良好潜力。已开发出了Ad5转化的人胚胎肾细胞系(Graham，et al.，1977)来提供反式的必需病毒蛋白。本发明人因此推测，腺病毒的特征使之成为用于体内击中癌细胞的优良候选物(Grunhaus&Horwitz，1992)。
用于将外源蛋白质传递给细胞的腺病毒系统的特别的优点包括(i)能够用外源DNA取代比较大的病毒DNA片段；(ii)重组腺病毒的结构稳定性；(iii)腺病毒施用于人体的安全性；以及(iv)不存在任何已知与腺病毒感染有关的癌症或恶性肿瘤；(v)能够获得高滴度的重组病毒和(vi)腺病毒的高感染性。
腺病毒优于逆转录病毒的进一步的特性包括高水平的基因表达。另外，与逆转录病毒序列不同，它不依赖于宿主基因的复制。因为E1区的腺病毒转化基因易于缺失并仍然提供有效的表达载体，所以，由腺病毒载体所产生的致癌危险性被认为是微不足道的(Grunhaus&Horwitz，1992)。
总之，腺病毒基因转移系统是基于重组的工程化腺病毒，该病毒因其基因组的一部分缺失(如E1铁失)而不能复制，但仍然保留其感染力。当在腺病毒基因组中发生另外的缺失时可表达比较大的外源蛋白质。例如，E1和E3两个区缺失的腺病毒能够携带达10kb的外源DNA，并能在293细胞中生长成高滴度(Stratford-Perricaudet and Perricaudet，1991a)。还有在腺病毒感染后出现转基因预料之外的持续性表达的报道。
腺病毒介导的基因转移目前已作为介导基因转入真核细胞和整体动物中的手段进行研究。例如，在治疗有罕见的隐性遗传学疾病鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC)缺陷的小鼠时，发现腺病毒构建体可用于提供正常的OTC酶。不幸的是，在17个病例中只有4例的OTC达到了正常水平的表达(Stratford-Perricaudet et al.，1991b)。因此，该缺陷在大多数小鼠中仅得到部分的纠正，而且没有引起生理学或表型的改变。这类结果因而就没有对腺病毒载体用于癌症治疗产生多大促进作用。
试图用腺病毒将囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的基因转移到Cotton大鼠肺上皮中的努力已获部分成功，尽管还不可能评价被转移的基因在动物上皮中的生物活性(Rosenfeld et al.，1992)。而且，这些结果证明了基因的转移和CFTR蛋白在肺气管细胞中的表达，但未显示生理学作用。在1991年的Science文章中，Rosenfeld等人表明了α1抗胰蛋白酶蛋白的肺表达，但同样未显示生理作用。事实上，他们估计所观察到的表达水平仅为人体中达到肺保护作用所需水平的2％，即远低于生理作用所需量。
人α1抗胰蛋白酶基因已通过门静脉内注射而导入正常大鼠的肝脏中，该基因被表达并导致被转入的人蛋白质分泌到所述小鼠的血浆中(Jaffe et al.，1992)。然而，令人失望的是，所得量不足以具有治疗价值。
这类结果并未证明腺病毒能够指导足够的蛋白质在重组细胞中表达以达到生理学上有关的作用，因此也未表明腺病毒系统在有关癌症治疗中的用途。而且，在本发明之前，p53被认为不能被掺入包装细胞中，如那些用于制备腺病毒的细胞，因为它是有毒性的。又因为腺病毒的E1B与p53结合，所以这被认为是腺病毒为什么和p53技术不能联合的进一步原因。E.p53-腺病毒构建体和肿瘤抑制
本发明提供了具有新颖且更有效的肿瘤抑制基因载体的癌症基因疗法。该重组病毒开发了腺病毒载体的优点，如高滴度、较宽的靶范围、有效转导和在靶细胞中的非整合作用。在本发明的一个实施方案中，创建了一种复制缺陷、不依赖辅助因子的腺病毒，其在人巨细胞病毒启动子的控制下表达野生型p53(Ad5 CMV-p53)。
当需要在哺乳动物细胞中进行表达时，对表达载体的调控功能通常由病毒提供。例如，常用的启动子源于多瘤病毒、2型腺病毒和猴病毒40(SV40)。SV40病毒的早期和晚期启动子特别有用，因为两者都易于从所述病毒中以还含有SV40病毒复制起点的片段而获得。更小或更大的SV40片段也可以使用，只要其包括从HindIII位点向位于病毒的复制起点的BglI位点延伸的大约250bp序列。而且，也有可能并常常希望利用正常情况下与所包括的基因序列相关的启动子或调控序列，只要这类调控序列与宿主细胞系统具有相容性。
复制起点可以由载体构建体提供，以包括一个外源起点，如可以来源于SV40或其它的病毒(如多瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV)，或者可以由宿主细胞染色体复制机理提供。如果载体被整合到细胞染色体上，后者通常就足够了。
优选的p53腺病毒的设计和繁殖在图1中用图解表示。与此相关，已开发了改善的方案用于繁殖和鉴定重组腺病毒(讨论如下)。鉴定之后，如图2所示用PCR分析法对p53重组腺病毒从结构上进行证实。在分离并证实结构后，用p53腺病毒感染具有纯合性p53基因缺失的人肺癌细胞系H358。Western印迹法表明外源p53蛋白以高水平表达(图4和图5)，并在感染后的第3天达到峰值(图6)。
在p53点突变的细胞系H322中还表明，突变的p53受到外源p53表达的下调作用。作为实验对照，使用了与Ad5CMV-p53具有结构相似性的病毒体(Ad5/RSV/GL2)。该病毒体在病毒体的表达盒中含有由劳氏肉瘤病毒LTR启动子驱动的荧光素酶cDNA。在受病毒体Ad5/RSV/GL2感染的细胞中既未检测到p53表达也未有检测到肌动蛋白表达的变化。与未感染的细胞或用对照病毒体感染的细胞相比，由Ad5CMV-p53感染的H358细胞的生长受到极大抑制(图7A)。H322细胞的生长也受到p53病毒体的显著抑制(图7B)，而含有野生型p53的人肺癌H460细胞的生长受到较小的影响(图7C)。
Ad5CMV-p53介导了对肺癌细胞体外生长的强抑制作用。当用MOI低于1PFU/细胞的Ad5CMV-p53感染细胞时没有生长抑制作用产生，而当MOI高于100PFU/细胞时，甚至用对照病毒Ad5/RSV/GL2也能观察到细胞毒性。在我们的研究中，对于生长速率研究的理想剂量是10-50PFU/细胞。在该剂量范围内，细胞生长的抑制作用归因于所表达的p53蛋白。
裸鼠中的试验证明，用Ad5CMV-p53处理的H358细胞其致癌性被极大地抑制。在常位的人肺癌小鼠模型中，将有p53点突变的致癌性H226Br细胞在病毒处理前3天经气管内接种。Ad5CMV-p53的气管内灌注在该模型系统中防止肿瘤形成，这表明修饰的腺病毒是介导肿瘤抑制基因在人癌细胞中转移和表达的有效载体，并且，Ad5CMV-p53病毒可被进一步开发成为用于癌症基因疗法的治疗剂。
如Western印迹分析法所证实，Ad5CMV-p53在人肺癌细胞中介导了高水平的p53基因表达。外源p53蛋白比H460细胞中的内源野生型p53多大约14倍，并且比H358细胞中β-肌动蛋白内对照多大约2-4倍。高水平的表达可以归因于(1)高效的基因转移，(2)强CMV启动子驱动p53 cDMA，和(3)增强p53 cDNA转录的腺病毒E1增强子。在H358细胞中，感染后p53表达的持续时间长于15天。然而，在感染第5天后表达水平迅速下降。对来自感染的H358细胞的DNA样品进行PCR分析表明了病毒DNA水平随着降低的蛋白质水平而降低，这说明在癌细胞的体外连续生长过程中丧失了病毒DNA。
p53表达水平的降低还因为控制p53表达的CMV启动子的细胞弱化作用，因为以前已经报道过宿主细胞介导的CMV启动子关闭的现象(Dai，et al.，1992)。腺病毒载体是非整合性基因转移载体，因而基因表达的持续时间取决于多种因素，包括宿主细胞、所转移的基因和有关的启动子。Crystal及其同事证明，在感染后的6周可在Cotton大鼠上皮细胞中检测到囊性纤维化跨膜传导调节蛋白基因的低水平表达(Rosenfeld et al.，1992)。Perricaudet的实验室证明微营养不良蛋白(minidystrophin)基因在mdx小鼠肌肉中的最小表达在感染后持续3月以上。在本研究中所观察到的野生型p53蛋白的短期高水平表达对用Ad5CMV-p53进行体内治疗后的正常细胞具有减少可能有的副作用的有利影响。
本文公开的研究表明，p53重组腺病毒具有肿瘤抑制特性，该特性可能是通过恢复p53蛋白质在肿瘤细胞中的功能而起作用。这些结果提供了将Ad5CMV-p53病毒体作为治疗剂用于癌症治疗的证据。F.DNA损伤剂
多种DNA损伤剂可用于本发明，如可直接交联DNA的试剂、可嵌入DNA的试剂以及通过影响核酸合成导致染色体和有丝分裂畸变的试剂。
可以想出直接交联核酸尤其是DNA的试剂并示于本文中，以产生导致协同的抗肿瘤联合作用的DNA损伤。可用如顺铂的试剂和其它DNA烷化剂。顺铂已广泛用于治疗癌症，其临床应用的有效量是20mg/m2每三周用5天，总共3个疗程。顺铂口服不吸收，因此必须经静脉、皮下、肿瘤内或腹膜内注射应用。
可损伤DNA的试剂也包括干扰DNA复制、有丝分裂和染色体分离的化合物。这些化合物的例子包括亚德里亚霉素(也称为阿霉素)、依托泊甙、维拉帕来、鬼臼毒素等等。这些化合物在广泛用于治疗肿瘤的临床过程中是以静脉推注施用的，亚德里亚霉素剂量为25-75mg/m2，以21天为间隔；依托泊甙静脉内给药35-50mg/m2或口服给药为静脉内药量加倍。
破坏核酸前体合成及精度的试剂和亚单位也可造成DNA损伤。由此开发了大量的核酸前体。尤其有用的是那些经过广泛测试并容易得到的试剂。由此，如5-氟尿嘧啶(5-FU)的试剂优选用于肿瘤组织，使其在击靶肿瘤细胞方面尤其有用。尽管毒性很大，5-FU仍可用在大范围的载体中，包括局部应用，然而常用的静脉施用的剂量范围为3-15mg/kg/天。
其它引起DNA损伤并已广泛使用的因素包括通常称为γ-射线、X-射线和/或放射性同位素直接传递至肿瘤细胞。其它DNA损伤因素的形式也可考虑，如微波和UV照射。很可能所有的这些因素对DNA前体、DNA复制与修复和染色体组装及维持造成损伤。X-射线的剂量范围从在较长时间(3-4周)内每天为50-200伦琴至单次照射2000到6000伦琴。放射性同位素的剂量范围很宽，并依赖于同位素的半衰期、射出射线的强度与类型以及肿瘤细胞摄取情况。
有经验的人员可参见“Remington′s Pharmaceuticel Sciences”15版，第33章，尤其是624-652页。剂量的改变必须依所治疗对象的状况进行。负责用药的人员在任何情况下决定单个受试者的适宜剂量。进一步来讲，人用的制剂应符合无菌、无致病原、总体安全性以及纯度标准等FDA Office of Biologics的标准。G.p53与顺铂治疗
在一项测定将基因替换疗法与化疗结合起来治疗人类癌症效果的尝试中，发明者检测了是否顺序应用Ad-p53和CDDP可以引起体内程序化细胞死亡。在直接肿瘤内注射Ad-p53或腹膜内施用CDDP3天后，皮下植入至nu/nu小鼠的H358肿瘤显示出轻度生长缓慢。然而，如果同时应用Ad-p53和CDDP，肿瘤部分复归且肿瘤大小仍然统计学上显著小于其它任何治疗组肿瘤。经过两个治疗周期，生长抑制作用更为显著(图13A)。组织学检查显示在以CDDP治疗小鼠的Ad-D53注射区域肿瘤细胞大量破坏。原位染色表明在非细胞区域周围有大量程序化死亡细胞(图13B-E)。相反，单独以CDDP或Ad-p53治疗的肿瘤既无非细胞构成，也无程序化细胞死亡区域。
本发明描述了结合了用DNA交联剂的常规化疗的一种新的人类基因治疗方法。肿瘤细胞对化疗药物产生抗性是临床肿瘤学上主要的问题。NSCLC是至少80％肺癌病人的原因；然而患NSCLC的病人一般对化疗不反应(Doyle，1993)。目前癌症研究的一个目的是通过研究基因产物与化疗药物间相互作用找到改善基因替换疗法的效果。单纯性疱疹-胸苷激酶(HS-tK)基因在由逆转录病毒载体系统传至脑肿瘤时成功地引起对抗病毒剂9-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤的易感性(Culver，et al.，1992)。HS-tK基因产物是一外源性病毒酶，而wt-p53蛋白在正常组织内表达，这表明由wt-p53表达改变引起的化学抗性的调节可能是采用由外源遗传程序介导之途径的另一种路径。
腺病毒系统对于体内基因传递有潜在的优势，如容易产生高滴度病毒、高感染效率和对多种类型细胞有感染性。然而对所导入基因表达的稳定性及持久性仍有争议。对于化学-基因疗法，表达的水平及高感染性可能比表达的持久性更有意义，因为药物可在几天内杀死受染细胞。对化疗药物敏感的细胞内p53水平的升高可在DNA损伤刺激6小时后产生(Fritsche，et al.，1993，Zhan，et al.，1993)，尽管如果去除刺激物增加的p53 DNA结合活性可在4小时内被送转(Tishler，et al.，1993)。在本模型中，wt-p53基因的表达是由包含于Ad-p53载体中的巨细胞病毒启动子独立驱动的。因此，即使在停止暴露给药物之后，p53表达的高水平仍可维持。由Ad-p53引起的wt-p53蛋白表达在感染后第3天达到高峰(比内源性野生型大14倍)并至第9天降至低水平(Zhang，etal.，1993)。这表明wt-p53表达的短暂高水平足以启动癌症细胞内的细胞毒程序。H.病人与治疗方案
发明者建议对患p53相关联癌症如不可切除阻塞性支气管内癌的病人将腺病毒-p53基因构建体局部传送至肺癌细胞将是传递治疗有效基因抵抗临床疾病的非常有效的方法。p53基因的传递是结合DNA损伤剂或因子产生的。这种联合的方法对目前癌症治疗是一明显的改进，如对单用顺铂敏感性的丧失，它依赖于试图通过影响DNA损伤杀死或去除最后一个癌细胞。由于肿瘤细胞休眠是一已存在的现象，这使有效杀死癌细胞很不可能。
据估计NSCLC细胞对腺病毒构建体摄取将降低这些细胞的增殖速率，然而本发明实施例显示将p53腺病毒与DNA损伤剂或因子联合应用可导致细胞生长和肿瘤大小的极度减小，这种现象单用任何因素时均未出现。本文公开的组合物及方法强有力地预示影响肺时间的增加将仍不断扩展、可防止肿瘤再生长及肿瘤细胞分化和延长病人存活时间。
部分或完全气道阻塞且外部光束放疗失败或不能接受外部光束放疗的不能切除支气管内肿瘤复发患者被考虑接受本联合治疗方案。对此病的现有治疗仅是短期的治标治疗。尽管进行外部光束放疗，大多数病人仍有复发。有可能插入短期治疗导管且施用另外的放疗、静脉内施用DNA损伤剂。接受目前治疗之病人的生存期中值为6个月。短期治疗失败的病人也适合接受基因治疗。用激光或活检钳可从气道去除肿瘤。这可以与注射腺病毒构建体联合，这样就减少了必须注射的体积，施用病毒构建体不排除接受其它治标治疗的病人，如果肿瘤进行性生长的话。I.其它基因转移技术
成功的基因治疗一般要求把能够改正遗传疾病的基因整合至宿主基因组中，在那里它可与宿主DNA共同存在并复制，且能以补偿缺陷基因的水平进行表达。理想地用一种或几种治疗治愈疾病而无严重副作用。到目前为止已有几条基因治疗途径，它们可以与本发明一起应用。
第一种途径是例如通过化学或物理法穿透细胞膜将含目的基因的DNA转染至细胞内。这一方法通常局限于可暂时从体内取出且能耐受治疗的细胞毒的细胞(即淋巴细胞)。以某些脂质及两亲性肽形成的脂质体或蛋白结合物可用于体内转染(Stewart et al.，1992；Torchilin，etal.，1992；Zhu，et al.，1993)，然而存在的基因整合效率很低。据估计目的基因只能整合至1,000-100,000个细胞中的一个细胞的基因组中。无整合存在时，转染基因的表达限于在增殖细胞中几天或在非增殖细胞中数周，因为非整合DNAs的分解。
第二种途径利用病毒的自然属性进入细胞，携带其自身的遗传物质。逆转录病毒由于其将其基因整合入宿主基因组中的能力有希望作为基因传递载体转移大量的外源遗传物质、感染广谱的种属和细胞类型并可在特殊细胞系中组装(Miller，1992)。
第三种途径采用其它的病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)和腺病毒伴随病毒AAV，这些病毒经过工程处理可作为基因转移的载体。尽管某些可接受外源遗传物质的病毒在其可容纳的核苷酸数目及它们所感染细胞的范围上受限，但这些病毒已经显示出成功地影响基因表达。然而，腺病毒不将其遗传物质整合至宿主基因组中并因此不需要为基因表达宿主的复制，这使其理想地适于快速、有效、异源基因表达。
即使本发明已描述了某种程度的特殊性，但很明显，根据以前的公开对于本领域技术人员而言多种变化、修改及改变均是显而易见的。因此，打算将所有落入本发明精神及范围的这类变化、修改和改变包含在限定的权利要求中。
下面的实施例包括进来以阐述本发明的优选实施方案。本领域技术人员应意识到，下文公开的技术代表了由发明者发现并在发明的实施中很好发挥功能的技术，并因此可被认为组成了本发明实施中的优选方式。然而，根据本发明公开，本领域技术人员应意识到可以在已公开的特殊实施方案中进行许多改变并仍获得相似的结果而不离开本发明的精神与范围。
                    实施例1p53表达载体的构建
本实施例描述了p53表达载体的构建。如所指示构建该载体并用其替代腺病毒株Ad5基因组的E1区(1.3～9.2m.u.)，且用于构建实施例2所述的腺病毒病毒体。
图1所示的p53表达盒插入至pXCJL1(Dr.Frank L.Graham，McMaster University，Canada提供)的XbaI和ClaI位点之前，该表达盒含有人巨细胞病毒(CMV)启动子(Boshart，et al.，1985)、p53cDNA和SV40早期聚腺苷酸化信号。
基因组大小约35.4kb，分成100个图谱单位(1m.u.＝0.35kb)。p53表达盒取代了Ad5基因组的E1区(1.3-9.2m.u.)。
引物1序列为5′-GGCCCACCCCCTTGGCTTC-3′(SEQ IDNO：1)，并位于人CMV主要IE基因启动子(Boshart，et al.，1985)下游的第一内含子中。引物2序列为5′-TTGTAACCATTATAAGCTGC-3′(SEQ ID NO：2)，且位于SV40早期聚腺苷酸化信号中。两个引物距p53 cDNA插入子两端15-20bp，限定了1.40kb PCR产物。引物3序列为5′-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3′(SEQ IDNO：3)且引物4序列为5′-CATCTGAACTCAAAGCGTGG-3′(SEQ ID NO：4)，分别位于Ad5基因组的11m.u.和13.4m.u.处，它们限定了0.86kb病毒基因组特异性PCR产物。
               实施例2重组p53腺病毒的产生和增殖
本实施例描述了适于产生表达p53的辅助非依赖性重组腺病毒的一种方法。所用的产生重组腺病毒的分子方法是基于这样的事实，即由于腺病毒装配的限制，pJM17不能在自身上形成病毒。因此，转染细胞内p53表达载体质粒和pJM17之间的同源重组产生了仅可在表达必需腺病毒蛋白的细胞内装配的活病毒。
本实施例的方法应用293细胞作为宿主细胞以增殖在E1或E3区域含异源性DNA表达盒取代物的病毒。该过程需要DNA共转染至293细胞中。转染很大程度上决定了病毒增殖的效率。在本发明之前，将DNA转染至293细胞中的方法通常是磷酸钙/DNA共沉淀法(Graham andran der Eb，1973)。然而，该方法和噬菌斑测定法均相对较难且典型地造成病毒增殖效率低。如本实施例所示，在用细胞病变效应(CPE)鉴定转染细胞时，用脂质体介导的转染可显著改善转染及随后的受染细胞的鉴定。
将293细胞系保存在加有10％热失活马血清的Dulbecco改良极限必需培养基中。按照生产者的方法(Boehringer Mannheim Biochemicals，1992)以DOTAP介导的共转染将进行同源重组的p53表达载体和质粒pJM17(McGrory，et al.，1988)共转染至293细胞中。这一过程图示于图1中。
于转染前24小时将293细胞(传代35，60％融合)在60mm培养皿或24孔平板中接种。每孔中的细胞以30μl DOTAP、2μg p53表达载体和3μg质粒pJM17转染。转染后每2-3天更换MEM培养基直至进行EP。
              实施例3重组腺病毒的确认鉴定
本实施例说明一种确认鉴定在合适细胞系共转染后的重组病毒体的新聚合酶链反应(PCR)测定法。
从测试板上收集等份的细胞培养上清液(50-370μl)，于56℃用蛋白酶K(50μg/ml，含0.5％SDS和20mM EDTA)处理1小时，用苯酚-氯仿提取，并用乙醇沉淀核酸。将DNA沉淀物再悬浮于20μl dH2O中用作PCR扩增的模板。PCR引物及其序列的相对位置示于图1中，分别为SEQ ID NOS：1、2、3和4。cDNA插入段特异性引物限定了一个1.4kb PCR产物，且病毒基因组特异性引物限定了一个0.8kb PCR产物。于含4mM MgCl2、50mM Kcl、0.1％triton X-100、200μM各dNTPs、10mM Tris-Cl(pH9.0)、2μM各引物以及1.0单位Taq聚合酶(Promega)共50μl的反应液中进行PCR反应。反应于94℃进行0.5分钟、56℃下0.5分钟和72℃下1分钟，共30次循环。
为了简化新增殖重组病毒的鉴定过程，开发了对细胞培养上清液DNA样品的直接PCR测定法。用蛋白酶K处理等份(50或370μl)的有CPE之细胞培养上清液且以苯酚/氯仿提取。乙醇沉淀后，用使用两对引物以扩增插入段特异性及病毒-基因组-特异性序列的PCR分析DNA样品。PCR引物靶及其序列示于图1中。引物1、2、3和4分别由SEQ ID NO：1、2、3和4代表。
结果，从表达载体(阳性对照)及阳性细胞培养物的DNA样品中扩增了1.4kb cDNA插入段和0.86kb病毒基因组片段(图2B，分别为1道和4道)。仅0.86kb片段从Ad5/RSV/GL2病毒的DNA样品中扩增出(阴性对照，2道)。从用两种之一的未处理阳性细胞培养基上清液的PCR反应中未出现扩增条带(3道)。
这些结果表明，用少至50μl的细胞培养基上清液制备DNA模板即可通过PCR检测出释入细胞培养基中的腺病毒。根据这些结果将开发出用这一技术测定腺病毒滴度(常规上用噬菌斑检测法测定)的定量方法。
于CsCl梯度纯化的病毒DNA上通过双脱氧DNA测序证实了Ad5CMV-p53病毒中p53 cDNA的野生型序列。以相似方法产生的对照病毒Ad5/RSV/GL2具有除Rous肉瘤病毒启动子外的相似于Ad5 CMV-p53的结构，而且将荧光素酶cDNA用于其表达盒中。携带大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(LacZ)、Ad5CMV-Laz的重组腺病毒也与Ad5CMV-p53具有相似的结构，且如Zhang et al.所公开的及从Dr.FrankL.Graham(参见Graham，et al.1991)处获得。
病毒的贮存、效价和感染。根据Graham和Prevec(1991)的方法用噬菌斑纯化法得到Ad5CMV-p53、Ad5/RSV/GL2和Ad5CMV-Lacz病毒的单一克隆。于293细胞中增殖单一病毒克隆。收集显示完全细胞病变效应之293细胞培养基并于1000×g离心10分钟。等分收集上清液并作为病毒贮存物贮于-20℃。用噬菌斑测定法(Graham andPrevec，1991)测定病毒效价。通过将病毒溶液加至细胞单层中(0.5ml每60mm培养皿)以及室温温育30分钟并且每5分钟稍加搅拌的过程进行细胞系感染。然后加入培养基，将受染细胞放回到37℃温箱中。
在多种细胞系如H226Br、H322、H460、Hela、HepG2、LM2和Vero中用Ad5 CMV-LacZ也评估了重组腺病毒的基因转移效率。用X-gal染色，在以MOI为30PFU/细胞的Ad5CMV-Lacz感染后，所有细胞系均有97-100％染成蓝色。
          实施例4于人肺癌细胞中的Ad5CMV-p53导向的p53基因的表达
本实施例描述了用重组p53腺病毒感染有纯合子p53基因缺失的人肺癌细胞。结果表明这些细胞的生长和突变体p53的表达受到抑制，这说明将Ad5CMV-p53病毒体作为用于转移细胞控制的有用物的潜在能力。
在经3.8％福尔马林固定并以溶于甲醇的3％H2O2处理5分钟的受染细胞单层上进行免疫组化测定。免疫组化分析是用Vectastain Elite试剂盒(Vector，Burlingame，CA)进行的。所用第一抗体为抗-p53抗体PAb1801(Oncogene Science，Manhasset，NY)；MOPC-21(Organon Teknika Corp.，West Chester，PA)用作阴性对照。第二抗体为亲和素标记的抗小鼠IgG(Vector)。用亲和素化辣根过氧化物酶ABC复合试剂检测抗原抗体复合物。最后用Harris苏木精(Sigma)复染并以Cytoseal60(Stephens Scientific，Riverdale，NJ)上片。
进行受染细胞系的免疫组化分析以检查由Ad5CMV-p53病毒CMV启动子驱动的p53表达的原位表达。在H358细胞系(该细胞系具有纯合子p53缺失)中，当用Ad5CMV-p53以30-50噬菌斑形成单位(PFU)/细胞多重感染细胞时，经免疫组化分析p53基因转移效率达97-100％(图4)。
由Ad5CMV-LacZ(一种携带由人CMV IE启动子转录的LacZ基因的病毒)证实了重组腺病毒的高效转移。以X-gal染色，在MOI为30-50PFU/细胞下所有受检细胞(包括Hela、HepG2、LM2和人NSCLC癌细胞系)为97-100％β-半乳糖苷酶活性阳性。这些结果表明腺病毒载体是将基因转移入人癌细胞中的有效载体。
在以磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞后在培养皿中以SDS-PAGE样品缓冲液(每60mm培养皿0.5ml)裂解单层细胞，这样制备出全细胞裂解液，对其进行Western印迹分析。为进行SDS-PAGE分析，每道载有相当于5×104细胞(10-15ml)的细胞裂解物。将凝胶中的蛋白质转移至HybondrTM-ECL膜(Amersham，Arlington Heights，IL)上。以溶于PBS中0.5％干燥奶断薄膜且以第一抗体探查：小鼠抗人p53单克隆抗体PAb1801和小鼠抗人β-肌动蛋白单克隆抗体(Amersham)，冲洗并以第二抗体探查：辣根过氧化物酶连接的兔抗小鼠IgG(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)。根据Amersham的增强化学荧光法使膜显影。用光密度计(Mokcular DynamicsInc.，Sunnyvale，CA)测定表达的外源p53的相对量。
Western印迹显示，外源p53蛋白表达水平高(图5A、2、3道和5、6道)。感染后第3天蛋白量达到高峰(图6，插入段，0.5天-3天)。作为对照，构建与实施例1的重组Ad5CMV-p53结构相似的病毒体。该病毒体含有由存在于病毒表达盒中的Rous肉瘤病毒LTR启动子驱动的荧光素酶cDNA。在由病毒体Ad5/RSV/GL2感染的细胞中既未发现p53表达也无肌动蛋白表达的改变。
用重组p53腺病毒感染3种人肺NSCLC细胞系：细胞系H358(它具有纯合子p53基因缺失)、细胞系H322(它具有在密码子248处p53基因的点突变(G至T))和细胞系H460(它具有野生型p53基因)。在病毒感染前，将H322和H460(1×105)或H358(2×105)接种于60mm培养皿中培养24小时，然后测定人NSCLC细胞的生长率。用病毒以感染的多重性(MOI)为10PFU/细胞感染的细胞。培养基用作模拟感染对照。对经不同处理的每种细胞系的三组培养物于感染后第1-6天每天计数。
相比于未感染细胞或用对照病毒体感染的细胞，以Ad5CMV-p53感染的H358细胞的生长受到显著抑制(图7A)。H322细胞的生长也被p53病毒体显著抑制(图7B)，而含野生型p53的人肺癌H460细胞的生长受影响程度较小(图7C)。Ad5CMV-p53病毒感染H358细胞的生长抑制79％，而未感染细胞或以对照病毒感染的细胞的生长未受抑制。H322细胞系(它具有p53的点突变)的生长被Ad5CMV-p53抑制72％，而含野生型p53的H460细胞系的生长受影响较小(28％抑制)。
结果显示p53重组腺病毒具有抑制肿瘤性质，它是通过在肿瘤细胞中恢复p53蛋白功能实现其作用的。
          实施例5Ad5CMV-p53对p53缺失细胞的治疗
本实施例涉及用重组p53腺病毒在体外重建对肿瘤细胞的生长抑制并因此用于治疗细胞的恶性或转移性生长。本实施例描述了某些方式，以这些方式本发明可预期用于通过腺病毒介导的基因疗法治疗癌症。
以MOI10PFU/细胞用Ad5CMV-p53和Ad5/RSV/GL2感染H358细胞。以培养基作为模拟感染处理等量的细胞。感染后24小时，收获经处理的细胞并以PBS冲洗两次。对于每种处理，将3百万(3×106)细胞(体积为0.1ml)皮下注射至每只裸鼠(Harlan，Co.，Houston，TX)。每种处理用5只小鼠。注射前对小鼠进行放射(300cGy，60Co)，注射后每周检查。于6周末评估肿瘤形成情况并计算肿瘤体积，其方法是假设肿瘤为一球体，以其十字交叉的直径乘积之平方根作为肿瘤的平均直径计算。
为测定Ad5CMV-p53介导的对肿瘤生成的抑制作用，以H358细胞(人NSCLC型细胞)对裸鼠皮下注射致使致癌生长。将已用Ad5CMV-p53或Ad5/RSV/GL2以10PFU/细胞感染24小时的细胞对每只小鼠注射一次。只用培养基处理的H358细胞用作模拟感染的对照。于注射后第14天首先可能知的肿瘤仅由模拟或对照病毒感染细胞引起，如表I所示：
 表I    Ad5CMV-p53对裸鼠中H358肿瘤生长性的作用a
处理    肿瘤数  /小鼠数(％)     平均体积(mm3±SD)
培养基     4/5(80)     37±12
Ad5/RSV/GL2     3/4(75)     30±14
Ad5CMV-p53     0/4(0)       -
a  以2×106细胞/小鼠的量将经处理的H358细胞皮下注射
   6周末测定肿瘤的大小。
如表I所示，接受Ad5CMV-p53处理细胞的小鼠未发生肿瘤。6周末肿瘤的直径为4-10mm。该研究开始时每组5只小鼠；在Ad5CMV-p53或Ad5/RSV/GL2组的各组中均有一只未完成实验。早期的死亡被认为是院内感染引起的。
         实施例6Ad5CMV-p53对肺癌的治疗
本实施例涉及用重组p53腺病毒体内重建对肿瘤细胞的生长抑制作用并因此用于治疗动物的癌症。本实施例描述了某些方式，以这些方式本发明可预期用于通过腺病毒介导的基因疗法治疗癌症。
在常位人肺癌小鼠模型中进一步评价Ad5CMV-p53抑制肿瘤生长性的效力。由于H358和H322细胞在该模型中不能产生肿瘤，故用H226Br细胞系。该细胞系起源于鳞状肺癌并从肺转移至脑。H226Br在p53基因的外显子7(密码子254)处有点突变(ATC变成GTC)，且在小鼠中具有肿瘤生长性。
以前已描述了在常位人肺癌小鼠模型中进行试验的步骤(Georges，et al.，1993)。简而言之，通过气管内滴注，将H226Br细胞接种至已经放射照射处理(300cGy，60Co)的裸鼠上。每只小鼠接受含2×106细胞的0.1ml PBS。接种三天后，通过气管内滴注0.1ml病毒或载体(PBS)(一天一次，共两天)处理每组10只小鼠。所用病毒剂量为每只小鼠5×107Ad5CMV-p53或Ad5/RSV/GL2。6周末无痛苦处死小鼠。通过分解肺及纵膈组织并测量肿瘤的大小来评估肿瘤的形成。通过肿瘤块部分的组织学分析证实了肿瘤。
用气管内滴注的形式以2×106H226Br细胞/鼠的量给经照射处理的裸鼠接种。接种三天后，通过气管内滴注0.1ml Ad5CMV-p53或Ad5/RSV/GL2或载体(PBS)(一天一次，共2天)处理每只小鼠(每组8～10只小鼠)。所用病毒剂量为5×107PFU/小鼠。通过分解肺及纵膈组织并测量肿瘤的大小来评估肿瘤的形成。此过程的流程图示于图7中，分解的有代表性的样本示于图8中。以组织学分析证实所测的肿瘤。肿瘤测量之数据总结于表II中：
表II    Ad5CMV-p53对常位人肺癌小鼠模型
        中H226Br肿瘤生长性的作用a
处理     患肿瘤小鼠数/总小鼠数(％)    平均体积(mm3±SD)
    载体     7/10(70)     30±8.4
 Ad5/RSV/GL2     8/10(80)     25±6.9
 Ad5CMV-p53     2/8(25)     8±3.3b
a.气管内给小鼠接种2×106H226Br细胞/小鼠。接种后第3天，气管内给小鼠施用载体或病毒(每只0.1ml，5×107)，一天一次共两天。6周末评估肿瘤形成。b.P＜0.05，与接受载体PBS或病毒对照相比时变异的双向(two-way)分析。
仅有25％的Ad5CMV-p53处理的小鼠生成肿瘤，而在载体或Ad5/RSV/GL2对照组中，70-80％的受处理小鼠生成肿瘤。Ad5CMV-p53组的肿瘤平均大小显著小于对照组肿瘤。这些结果表明，在常位人肺癌小鼠模型中Ad5CMV-p53可阻止H226Br形成肿瘤。
             实施例7p53与DNA损伤间的协同
编程性细胞死亡(程序化细胞死亡)的生化特征显示由于核DNA裂解的DNA断裂之特征形式。近期的研究已显示由化疗药物或离子化放射引起的编程性细胞死亡可能与p53基因的状态有关，而且DNA损伤刺激因素可以升高处于编程性细胞死亡过程中的细胞的胞内p53蛋白水平(Lowe，et al.，1993，Clarke，et al.，1993，Fritsche，et al.，1993，Harper，etal.，1993，El-Deiry，et al.，1993)。由野生型p53(wt-p53)蛋白水平的增加导致的细胞周期于G1期的抑制可使DNA修复有更多的时间；如不可能达到理想的修复，p53可激发程序化细胞死亡。因此，p53可以对由化疗剂引起的编程性肿瘤细胞死亡作出贡献。
由错义突变或缺失引起的p53基因失活是人类癌症患者最常见的遗传改变(Levine，et al.，1991，Hollstein，et al.，1991)。已有报导p53功能丧失增强了细胞对多种化疗药物的抗性(Lowe，et al.，1993)。发明者的研究显示其p53两等位基因均缺失的人非小细胞肺癌(NSCLC)H358细胞对化疗药物有抗性，而有内源性wt-p53的WTH 226b细胞系容易地显示以顺铂(CDDP)和依托泊甙(VP-16)治疗16小时后的程序化细胞死亡(T.Fujiwara，E.A.Grimm，T.Mukhopadhyay，J.A.Roth，未发表的数据)。因此，发明者试图测定以腺病毒载体将wt-p53基因导入H358是否可以增强细胞体外和体内对DNA交联剂CDDP的敏感性。材料与方法
H358细胞由A.Gazdar和J.Minna友好地提供(Takahashi，etal.，1989)。腺病毒载体
以前报导了含编码人wt-p53(Ad-p53)或荧光素酶(Ad-Luc)的cDNA之重组腺病毒载体的构建与鉴定(Zhang，et al.，1993)。简而言之，将含人巨细胞病毒启动子、wt-p53 cDNA和SV40早期聚腺苷酸化信号的p53表达盒插至pXCJ L.1的XbaI和ClaI位点之间。以脂质体介导技术将p53穿梭载体和重组质粒pJM17共转染入293细胞(Ad5转化的人胚胎肾细胞系)。收集显示完整的细胞病变效应之293细胞培养上清液并用于随后的感染。以相似方法生产对照Ad-Luc病毒。于293细胞中增殖Ad-p53和Ad-Luc病毒。以Hela细胞检测排除可复制病毒的存在。用噬菌斑检测法测定病毒滴度(Graham，etal.，1991)。核小体DNA断裂的检测
通过在裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.0，100mM EDTA，100mM NaCl，1％SDS和50μg/ml蛋白酶K)中于55℃温育6小时，从接受或不接受CDDP处理的亲本、Ad-Luc感染以及Ad-p53感染细胞中分离DNA。以等量体积的苯酚提取DNA两次，以氯仿-异戊醇(24∶1)提取一次，然后在乙醇中沉淀。在1.5％琼脂糖凝胶上对样品电泳，并用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色识别。
根据以前报告的方法(Gavrieli，et al.，1992)进行TdT介导的dUTP缺口末端标记。以0.01％NP-40处理单层细胞。玻片浸入TdT缓冲液(30mM Tris-HCl，pH7.2；140mM卡可酸钠；1mM氯化钴)中并与生物素化dUTP(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)和TdT于37℃温育45分钟。玻片覆以2％牛血清白蛋白10分钟且与亲和素-生物素复合物(Vectastain Elite Kit；Vector Laboratories，Burlingame，CA)温育30分钟。用二氨基联苯胺进行比色检测。结果
用人wt-p53 cDNA通过暴露给Ad-p53体外转导H358细胞。Western印迹显示早在用Ad-p53感染24小时后即有高水平的wt-p53蛋白表达，但在亲本(未感染)细胞或Ad-LUC感染的对照细胞中未测出wt-p53(数据未显示)。同时进行的免疫组化评价显示，在80％以上的受染细胞中可检测到wt-p53蛋白质，这表明由Ad-p53的p53转移和表达具有高效(数据未显示)。
持续将Ad-p53受染H358细胞暴露给CDDP很快减小了其活力，而亲本及Ad-Luc受染细胞的显著细胞死亡仅发生于暴露给CDDP72小时后(图10A)。以Ad-p53转导的细胞中活性的丧失极大地增强。而且，即使当细胞在暴露24小时后维持在无药的培养基中时，也可观察到活性的降低，这提示在24小时内可产生致死性的损伤(图10B)。wt-p53转录的H358细胞对CDDP的敏感性有剂量依赖性(图10C)。
在暴露于CDDP24小时后表达wt-p53的细胞中明显看到表明DNA断裂的核小体间DNA梯；而亲本及Ad-Luc受染细胞未显示出DNA断裂(图11A)。检测原位程序化细胞死亡之DNA断裂特征的终末脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸(dUTP)-生物素缺口末端标记显示在以CDDP处理24小时的Ad-p53受染细胞中的许多程序化死亡细胞，如图11G所示，它显示了未出现于图11B-F中的染成黑色的核及核片段。
已知wt-p53的导入会导致某些含缺失或突变p53的肿瘤细胞系中的程序化细胞死亡(Yonish-Rovach，et al.，1991，Shaw，et al，1992，Ramqvist，et al.，1993)。然而，单一的wt-p53的过度表达不能促进p53阴性H358细胞系中的DNA断裂(图11)，尽管Ad-p53抑制了其生长(图10)。这与发明者以前的表明在逆转录病毒介导的wt-p53转移后可得到稳定的H358克隆及这些克隆比亲本细胞生长更慢的观察结果(Cai，et al.，1993)相符。
以H358球形体体积的相对变化为指标评价将Ad-p53和CDDP联合应用的潜在治疗效果。多细胞肿瘤球体模型在体外显示出与原发性肿瘤和微小转移瘤相似的结构。以CDDP治疗可使Ad-p53受染H358球形体相对体积减小，但对亲本或Ad-Luc受染球形体无显著作用(图12A)。原位TdT介导的dUTP标记显示在Ad-p53受染球形体表面有许多细胞处于程序化细胞死亡过程中，而在未被Ad-p53感染的球形体上未看见程序化死亡的细胞(图12B-E)。发明者以前报告过逆转录病毒介导的wt-p53表达抑制了通过转化生长因子α(TGF-α)导致的H322a球形体的生长(Fujiwara，et al.，1993)。然而，逆转录病毒载体不能感染H358球形体，因为这些球形体中的细胞对外源TGF-α不能产生快速增殖。暴露于CDDP通过诱导表面的程序化细胞死亡能减小Ad-p53受染H358球形体的大小，这一发现提示，Ad-p53感染非增殖细胞且CDDP启动了静态细胞的程序化死亡过程。
            实施例8治疗方案中p53和DNA损伤剂的应用
如本文下文及实施例5、6和7所描述，已用一种动物模型作为临床前试验的一部分。对已建立符合腺病毒介导的基因转移治疗适应症的病人检测其抗腺病毒抗体的存在。如果抗体存在且该病人有对药物或天然物质过敏史，则提示可在严密的临床观察下以大约103至106的试验剂量应用重组腺病毒。
为了用Ad5CMV-p53对瘤症进行治疗，应根据可被美国食品与药物管理局(FDA)接受的可对人体进行施用的方法制备和纯化在适宜启动子/增强子元件如CMV启动子调控之下表达p53的重组腺病毒。这些方法包括但不限于氯化铯密度梯度离心，接着测试效力及纯度。
有2种方法被认为是适于进行p53腺病毒治疗方法的，一是直接或局部施用，另一种是全身应用。本方法适于治疗任何已知与p53突变相联系的不同的癌症。至于全身施用，已显示简单的腺病毒静脉注射足以引起远离注射部位处组织的病毒感染(Stratford-Perricaudet et al.，1991b)，因而它适于所有p53相关恶性病的治疗。可以以任何药理学可接受的溶液静脉注射或于一段时间内滴注的方法给病人施用病毒。总的来说，据信施用的功能病毒颗粒的有效量从1×1010至5×1012。
特别是考虑到肿瘤，如果愿意，可以以类似于气管内应用囊性纤维化透膜传导调节蛋白的方式更直接进行重组腺病毒的物理击靶(Rosenfeld et al.，1992)。这将会使重组p53腺病毒输送到最接近靶细胞的部位。方法
原位以TdT进行dUTP标记以检测程序化细胞死亡。第三天固定H358球形体并如实施例7所描述染色。简言之，将标记的TdT探针接触浸入TdT缓冲液中的载玻片且于37℃与生物素化dUTP和TdT温育45分钟。以2％牛血清白蛋白覆涂玻片10分钟并与亲和素-生物素复合物温育30分钟。用二氨基联苯胺进行比色检测。
体内Ad-p53感染后由CDDP导致的程序化细胞死亡。将溶于0.1ml Hank′s平衡盐溶液中的H358细胞(5×106)皮下注射至BALB/c雌性nu/nu小鼠的右胁侧。30天后，将200μl培养基或者含Ad-Luc(108PFU/ml)或Ad-p53(108pFU/ml)的培养基注射到5-6mm直径的肿瘤中。在两个相反的位点进行瘤内(100μl)和瘤周(每侧50μl)注射。腹膜内给予CDDP(3mg/kg)或对照生理盐液。(A)肿瘤体积改变。在不知道治疗组的情况下用测径器以两个互相垂直的方向测量肿瘤的直径，并且假设肿瘤为一球形体，以交叉垂直测量的直径之积的平方根作为平均直径计算肿瘤体积。每治疗组用5只小鼠，均值+/-SE如所示。用Student t-检验分析数据。箭头表示治疗日。两次独立的检测如所示。检测1中自第5天p＜0.05；检测2中自第7天p＜0.05。
用TdT介导的生物素-dUTP标记技术的组织学研究。治疗开始5天后收获肿瘤并立即浸入O.C.T.化合物中。以5μm厚度于低温恒温器中对冷冻组织进行切片。切片用1μg/ml蛋白酶K处理并如上文所述染色。对动物所做的处理符合UT M.D.Anderson Institutional Animal Careand Use Committee的要求。结果
为显示联合应用基因替换疗法和化疗治疗人类癌症的方法之体内效果及组合物的效力，发明人检测了顺序施周Ad-p53和CDDP是否可在体内产生程序化细胞死亡。在3天直接肿瘤内注射Ad-p53或腹膜内施用CDDP后，皮下植入于nu/nu小鼠的H358肿瘤显示轻度生长减缓。然而，如果同时施用Ad-p53和CDDP，肿瘤部分复归且肿瘤大小仍然统计学上显著小于其他任何治疗组肿瘤。经过两个治疗周期，生长抑制作用更为显著(图13A)。组织学检查显示在以CDDP治疗小鼠的Ad-p53注射部位肿瘤细胞大量破坏。原位染色表明在非细胞区域周围有大量程序化死亡细胞(图13B-E)。相反，单独以CDDP或Ad-p53治疗的肿瘤既无非细胞构成，也无程序化细胞死亡区域。
更详尽地说，可按下述程序开发优选的治疗方案。病人首先进行支气管镜检查以评价阻塞程度。在内窥镜下尽可能地切除肿瘤。较好地是病人在局部或全身麻醉下进行支气管镜检查。从支气管镜活检通道穿过StifcorTM透支气管穿刺针(21g)。然后用小体积如约10ml或更少的p53腺病毒注射至残留肿瘤部位。
在任何情况下，由于所用腺病毒不能复制，因此估计病毒本身对受试者健康不会有损害作用。然而，在治疗期间病人仍应住院至少48小时以监测急性或延迟的不良反应。过去已强调了对作为人用基因转移载体的复制缺陷腺病毒之应用的安全性方面的关注(Rosenfeld et al.，1992；Jaffe et al.，1992)，但应适宜地监测施用的腺病毒的剂量以进一步减少不希望有的副作用的机会。
人们应考虑提出反应需求存在或毒性存在的标准有多种。为帮助测定毒性的存在，在进行治疗前应对肿瘤床拍照。将测量其最长直径和与之垂直之直径。以这些数据可以计算出肿瘤重新生长的速度。
进行性的时间也可从第一次观察到肿瘤体积的减小至有进行性疾病的证据时。进行性疾病定义为所测病变直径的乘积相加增加≥25％。在确定进行性之前病人必须至少接受2个疗程。以进入本方案的病人数计算存活率。
随访检查应包括所有进行癌症治疗的常规检查，包括监测临床体征以及取活检用以评价不同p53基因表达情况的标准及分子生物学分析。这也可提供已摄取转移的基因之细胞数以及体内相对启动子强度的信息。基于所获数据，即可对治疗进行调整。这些调整可包括用不同启动子的腺病毒构建体或注射pfu数的改变以保证更多或所有的肿瘤细胞感染无重组基因的非生理性过度表达。
可以设想由腺病毒体内转移外源基因的表达可以在更长的时间内延续。病毒转移外源基因的治疗有效的长期表达应随个例不同而不同。标志基因受限于评价基因表达的治疗相关持续方面，因为对任何所给的遗传疾病有改善作用所需的表达水平可与完全治愈另一种疾病所需的水平有很大差别。
本发明的组合物及方法已在优选实施方案中进行了描述，但很明显对于本领域技术人员而言可以对组合物、方法和本文所述方法的步骤或步骤的顺序上作某些变化而不离开本发明的构思、精神和范围。更具体地说，很明显某些化学或生理学上相关的试剂可以替代本文所述的试剂而得到相同或相似的结果。所有对本领域技术人员来说明显相似替代和修改均被认为在如所附权利要求所限定的本发明之精神、范围和构思内。所要求的所有物质和方法均可在无不适当实验条件下制得及进行。
                 参考文献
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                    序列表(1)一般情况
(i)申请人：
 姓名：BOARD OF REGENTS，THE UNIVERSITY OF
       TEXAS SYSTEM
   街：201West 7th Street
 城市：Austin
   州：Texas
 国家：United States of America
     邮编：78701
     电话：(512)499-4462
 传真：(512)499-4523
(ii)发明人
       ROTH，Jack A.
       FUJIWARA，Toshiyoshi
       GRIMM，Elizabeth A.
       MUKHOPADHYAY，Tapas
       ZHANG，Wei-Wei
       and
       OWEN-SCHAUB，Laurie B.
(iii)发明名称：含DNA损
             伤剂和p53的
             方法和组合物
(iv)序列数目：4
(v)通讯地址
   (A)地址：ARNOLD，WHITE&DURKEE
   (B)街道：P.O.BOX4433
   (C)城市：HOUSTON
   (D)州：TEXAS
    (E)国家：USA
    (F)邮编：77210
(vi)计算机可读形式：
    (A)媒质类型：软盘/ASCII
    (B)计算机：IBM PC兼容
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：WORDPERFECT5.1
(vii)现有申请数据：
    (A)申请号：未知
    (B)申请：CONCURRENTLY HEREWITH
    (C)分类：未知
(viii)优先申请日：
    (A)申请号：USSN08/233,002
    (B)申请日：25APRIL1994
    (C)分类：未知
(ix)律师/机构信息：
    (A)姓名：HIGHLANDER，STEVEN L.
    (B)注册号：37，642
    (C)参考/备案号：UTFC403PCT
(x)通讯信息：
    (A)电话：(512)418-3000
    (B)传真：(713)789-2679
    (C)用户电报：79-0924(2)SEQ ID NO：1：的信息
(i)序列特征：
   (A)长度：20碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)序列描述：SEQ ID NO：1：
GGCCCACCC CCTTGGCTTC                      20(2)SEQ ID NO：2的信息
(iii)序列特征：
    (A)长度：20碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(iv)序列描述：：SEQ ID NO：2：
TTGTAACCAT TATAAGCTGC                     20(2)SEQ ID NO：3的信息
(v)序列特征
   (A)长度：20碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：线性
(vi)序列描述：SEQ ID NO：3：
TCGTTTCTCA GCAGCTGTTG                     20(2)SEQ ID NO：4的信息
(vii)序列特征
     (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性(viii)序列描述：SEQ ID NO：4：CATCTGAACT CAAAGCGTGG                  20

Claims (45)

1.一种杀细胞方法，包括将细胞与能杀死所述细胞之结合量的p53蛋白或基因和DNA损伤剂接触。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞与p53蛋白或基因和X射线、紫外射线、γ射线、微波、阿霉素、5-氟尿嘧啶、依托泊甙、喜树碱、放线菌素D、丝裂霉素C或顺铂接触。
3.权利要求2的方法，其中所述细胞与p53蛋白或基因和顺铂接触。
4.权利要求1的方法，其中所述细胞与在所述细胞中表达p53蛋白的重组载体和DNA损伤剂接触。
5.权利要求4的方法，其中所述表达p53的重组载体是裸DNA质粒、脂质体中的质粒、逆转录病毒载体、AAV载体或重组腺病毒载体。
6.权利要求5的方法，其中所述表达p53的重组载体是重组腺病毒载体。
7.权利要求6的方法，其中所述表达p53的重组载体是含有位于巨细胞病毒IE启动子控制之下的p53表达区的重组腺病毒载体。
8.权利要求6的方法，其中所述重组腺病毒载体含有p53表达区、巨细胞病毒IE启动子和SV40早期聚腺苷酸化信号。
9.权利要求6的方法，其中至少一个腺病毒复制所必需的基因从所述腺病毒载体构建体中缺失，并p53表达区被导入其位置上。
10.权利要求9的方法，其中腺病毒载体的E1A和E1B区缺失，而在其位置上导入p53表达区。
11.权利要求6的方法，其中所述重组腺病毒载体存在于重组的腺病毒内。
12.权利要求1的方法，其中所述细胞首先与p53蛋白或基因接触，继而再与DNA损伤剂接触。
13.权利要求1的方法，其中所述细胞首先与DNA损伤剂接触，继而再与p53蛋白或基因接触。
14.权利要求1的方法，其中所述细胞同时与p53蛋白或基因和DNA损伤剂接触。
15.权利要求1的方法，其中所述细胞与含有p53蛋白或基因的第一组合物和含有DNA损伤剂的第二组合物接触。
16.权利要求15的方法，其中所述第一或第二组合物分散于药物学上可接受的配方中。
17.权利要求1的方法，其中所述细胞与含有p53蛋白或基因和DNA损伤剂的单一组合物相接触。
18.权利要求17的方法，其中所述组合物分散在药物学上可接受的配方中。
19.权利要求17的方法，其中所述细胞与含有能在所述细胞中表达p53的重组载体和DNA损伤剂的单一组合物相接触。
20.权利要求19的方法，其中所述细胞与含有包括了能在所述细胞中表达p53之重组载体的重组腺病毒和DNA损伤剂的单一组合物相接触。
21.权利要求1的方法，其中所述细胞是人细胞。
22.权利要求1的方法，其中所述细胞是恶性肿瘤细胞。
23.权利要求22的方法，其中所述细胞是肺癌细胞。
24.权利要求22的方法，其中所述细胞是乳癌细胞。
25.权利要求22的方法，其中所述细胞在p53基因有突变。
26.权利要求1的方法，其中所述细胞是动物体内的细胞，所述p53蛋白或基因和DNA损伤剂以药物学上可接受的形式施用于动物。
27.一种治疗癌症的方法，包括给癌症动物施用治疗有效组合的p53蛋白或基因和DNA损伤剂。
28.权利要求27的方法，包括将治疗有效量的药物组合物注射到肿瘤部位，并将所述肿瘤与DNA损伤剂接触，其中的组合物含有包括能在肿瘤细胞中表达p53的重组载体的重组腺病毒。
29.权利要求28的方法，其中的肿瘤通过用X射线、紫外射线、γ射线或微波照射肿瘤部位而与DNA损伤剂接触。
30.权利要求28的方法，其中的肿瘤是通过给动物施用治疗有效量的含DNA损伤化合物的药物组合物而与DNA损伤剂接触。
31.权利要求28的方法，其中的DNA损伤剂是顺铂。
32.含p53蛋白或基因和DNA损伤剂的组合物。
33.权利要求32的组合物，含有p53蛋白或基因和阿霉素、5-氟尿嘧啶、依托泊甙、喜树碱、放线菌素D、丝裂霉素C或顺铂。
34.权利要求33的组合物，含有p53蛋白或基因和顺铂。
35.权利要求32的组合物，含有能在动物细胞中表达p53蛋白的重组载体和DNA损伤剂。
36.权利要求35的组合物，其中所述重组载体是裸DNA质粒、脂质体中的质粒、逆转录病毒载体、AAV载体或重组的腺病毒载体。
37.权利要求36的组合物，其中所述重组载体是重组腺病毒载体。
38.权利要求37的组合物，其中所述重组载体是存在于重组腺病毒颗粒中的重组腺病毒载体。
39.权利要求32的组合物，含有存在于重组腺病毒颗粒中的重组腺病毒载体和顺铂。
40.权利要求32的组合物，分散于药物学上可接受的配方中。
41.权利要求40的组合物，配制成损害部位内施用。
42.一种治疗试剂盒，在适当的容器工具中含有能在动物细胞中表达p53蛋白的重组载体的药物配方和DNA损伤剂的药物配方。
43.权利要求42的试剂盒，其中所述重组载体和所述DNA损伤剂存在于单一容器工具内。
44.权利要求42的试剂盒，其中所述重组载体和所述DNA损伤剂存在于不同的容器工具内。
45.权利要求42的试剂盒，含有包括能在动物细胞中表达p53蛋白的重组载体的重组腺病毒的药物配方和顺铂的药物配方。
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