PL185749B1 - Kompozycja farmaceutyczna i zestaw terapeutyczny do uśmiercania komórki chorobowo zmienionej - Google Patents

Kompozycja farmaceutyczna i zestaw terapeutyczny do uśmiercania komórki chorobowo zmienionej

Info

Publication number
PL185749B1
PL185749B1 PL95317105A PL31710595A PL185749B1 PL 185749 B1 PL185749 B1 PL 185749B1 PL 95317105 A PL95317105 A PL 95317105A PL 31710595 A PL31710595 A PL 31710595A PL 185749 B1 PL185749 B1 PL 185749B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
cells
gene
cell
dna
expression
Prior art date
Application number
PL95317105A
Other languages
English (en)
Other versions
PL317105A1 (en
Inventor
Jack A. Roth
Toshiyoshi Fujiwara
Elizabeth A. Grimm
Tapas Mukhopadhyay
Wei-Wei Zhang
Laurie B. Owen-Schaub
Original Assignee
Univ Texas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22875472&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL185749(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Univ Texas filed Critical Univ Texas
Publication of PL317105A1 publication Critical patent/PL317105A1/xx
Publication of PL185749B1 publication Critical patent/PL185749B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A61K31/7072—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid having two oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. uridine, uridylic acid, thymidine, zidovudine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/243—Platinum; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4746—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used p53
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus

Abstract

1. Kompozycja farmaceutyczna do usmiercania komórki chorobowo zmienionej, zwla- szcza komórki raka pluc, komórki raka piersi, komórki majacej mutacje w genie p53, za- wierajaca srodek uszkadzajacy DNA, znamienna tyra, ze zawiera lacznie srodek uszkadza- jacy DNA i bialko lub gen p53. 18. Zestaw terapeutyczny do usmiercania komórki chorobowo zmienionej, zwlaszcza komórki raka pluc, komórki raka piersi, komórki majacej mutacje w genie p53, znamienny tym, ze zawiera w odpowiednim pojemniku preparat farmaceutyczny zrekombinowanego wektora zawierajacego fragment DNA kodujacy p53, polaczony funkcjonalnie z promotorem eukariotycznym oraz preparat farmaceutyczny srodka uszkadzajacego DNA. PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest terapia genowa raka za pomocą nowego i skuteczniejszego wektora tłumienia nowotworu. Taki zrekombinowany wirus wykorzystuje zalety wektorów adeno wirusowych, takie jak wysokie miano, szeroki zakres celów, wydajna transdukcja oraz nie integrowanie się w komórkach docelowych. W jednym wykonaniu według wynalazku wytwarza się niezależny od pomocnika adenowirus o zdefektowanej replikacji, który wytwarza w wyniku ekspresji dzikiego typu p53 (Ad5CMV-p53) pod kontrolą promotora ludzkiego wirusa cytomegalii.
Funkcje kontrolne na wektorach ekspresji często pochodzą z wirusów w przypadku, gdy pożądana jest ekspresja w komórkach ssaków. Tak np. powszechnie wykorzystywane promotory pochodzą z poliomy, adenowirusa 2 i wirusa małpiego 40 (SV40). Wczesne i późne pro motory wirusa SV40 są szczególnie przydatne, gdyż obydwa można łatwo otrzymać z wirusa jako fragment zawierający również początek replikacji wirusa SV40. Mniejsze lub większe fragmenty SV40 można również wykorzystywać, pod warunkiem, że włączy się sekwencję o około 250 bp, rozciągającą się od miejsca Hindlll w kierunku miejsca Bgll zlokalizowanego w wirusowym początku replikacji. Możliwe jest również, a często pożądane, stosowanie promotora lub sekwencji kontrolnych normalnie zasocjcwanych z genu, zawartą sekwencją pod warunkiem, ze takie sekwencje kontrolne są kompatybilne z układami komórek gospodarza
Początek replikacji może być dostarczany przez konstrukcję wektora, tak że zawiera początek egzogenny, który może pochodzić z SV40 lub innego źródła wirusowego (np. poliomy, adeno, VSV, BPV), albo też może być dostarczany przez mechanizm replikacji chromosomowej komórki gospodarza. Jeśli wektor jest zintegrowany w chromosomie komórki gospodarza, ten ostatni wariant zwykle wystarcza.
Konstrukcję i reprodukcję korzystnego adenowirusa p53 przedstawiono schematycznie na fig. 1. W nawiązaniu do tego opracowano ulepszoną procedurę do reprodukcji i identyfikacji zrekombinowanego adenowirusa (opisaną poniżej). Po identyfikacji strukturę zrekombinowanego adenowirusa p53 można potwierdzić na podstawie analizy PCR, co pokazano na fig. 2. Po wydzieleniu i potwierdzeniu struktury adenowirus p53 zastosowano do infekcji linii ludzkich komórek raka płuc H358, zawierającej delecję homozygotycznego genu p53. Blotting Westema wykazał, ze wystąpiła z wysokim poziomem ekspresja egzogennego białka p53 (fig. 4 i fig. 5), która osiągnęła szczyt w 3 dniu po infekcji (fig. 6).
Wykazano także, że w linii komórek H322 z mutacją punktową p53 następuje regulacja w dół mutanta p53 w wyniku ekspresji egzogennego p53. W eksperymentach zastosowano kontrolny wirion (Ad5/RSV/GL2) o podobieństwie strukturalnym zAd5CMV-p53. Wirion ten zawierał cDNA lucyferazy kierowany przez promotor LTR wirusa mięsaka Rousa w kasecie ekspresji winonu. W komórkach zainfekowanych przez wirion (Ad5/RSV/GL2) nie wykryto ani ekspresji p53, ani tez zmiany w ekspresji aktyny. Wzrost komórek H358 zainfekowanych Ad5CMV-p53 był silnie zahamowany w porównaniu z komórkami nie zainfekowanymi lub komórkami zainfekowanymi kontrolnym wirionem (fig. 7A). Wzrost komórek H322 był również silnie hamowany przez wirion p53 (fig. 7B), natomiast wpływ na komórki ludzkiego raka płuc H460, zawierające dzikiego typu p53, był znacznie mniejszy.
185 749
Ad5CMV-p53 uczestniczy w silnym działaniu hamującym wzrost komórek raka płuc in vitro. Zahamowanie wzrostu nie jest widoczne, gdy komórki są zainfekowane Ad5CMVp53 przy MOI poniżej 1 PFU/komórkę, natomiast przy MOI ponad 100 PFU/komórkę można było zaobserwować cytotoksyczność, nawet w przypadku kontrolnego wirusa (Ad5/RSV/GL2). W badaniach optymalna dawka w pomiarach szybkości wzrostu wynosiła 10-50 PFU/komórkę. W tym zakresie dawki hamowanie wzrostu komórek przypisywano ekspresji białka p53.
Testy na nagich myszach wykazały, że onkogeniczność komórek H358 potraktowanych Ad5CMV-p53 została znacząco zahamowana. W przypadku mysiego modelu ortotopowego ludzkiego raka płuc onkogeniczne komórki H226Br z punktową mutacją w p53 zaszczepiono dotchawiczo na 3 dni przed zastosowanie wirusa. Wewnątrztchawicze wprowadzenie Ad5CMV-p53 zapobiegające powstawaniu nowotworu w takim modelu sugeruje, że zmodyfikowany adenowirus jest skutecznym wektorem uczestniczącym w przenoszeniu i ekspresji genów tłumiących nowotwór w ludzkich komórkach rakowych, oraz że na podstawie wirusa Ad5CMV-p53 opracować można środek terapeutyczny do stosowania w genowej terapii raka.
Uczestniczenie Ad5CMV-p53 w wysokim poziomie ekspresji genu p53 w ludzkich komórkach raka płuc wykazała analiza metodą blottingu Westema. Egzogenne białko p53 występowało w około 14 razy większej ilości niż endogenne p53 dzikiego typu w komórkach H460 i około 2-4 większej ilości niż β-aktyna, wewnętrzny wzorzec w komórkach H358. Wysoki poziom ekspresji można przypisać (1) wysoce wydajnemu przenoszeniu genu, (2) sile promotora CMV kierującego cDNA p53 oraz (3) adenowirusowemu enhancerowi El wzmacniającemu transkrypcję cDNA p53. Ekspresja p53 po infekcji przebiegała przez ponad 15 dni w komórkach H358. Jednakże po upływie 5 dni od infekcji następował szybki spadek ekspresji. Analiza PCR próbek DNA z zainfekowanych komórek H358 wykazała spadek poziomu wirusowego DNA wraz ze spadkiem poziomu białka, co świadczy o ubywaniu wirusowego DNA przy ciągłym wzroście komórek rakowych in vitro.
Spadek ekspresji p53 może być również spowodowany komórkową attenuacjąpromotora CMV, który kontroluje ekspresję p53, gdyż zjawisko wyłączania promotora CMV z udziałem komórki gospodarza zostało juz opisane (Dai i inni, 1992). Wektory adenowirusowe są wektorami przenoszącymi gen nie ulegający integracji, tak że czas trwania ekspresji genu zalezy od wielu czynników takich jak komórka gospodarza, przenoszone geny oraz stosowny promotor. Crystal i współpracownicy donieśli o niskim poziomie ekspresji genu regulatora konduktancji przezbłonowej mukowiscydozy w komórkach nabłonka szczura bawełnianego w 6 tygodni po infekcji (Rosenfeld i inni, 1992). Laboratorium Perricaudet'fa wykazało minimalną ekspresję genu minidystrofiny w mięśniach myszy mdx, trwającą przez ponad 3 miesiące od infekcji. Krótkotrwały wysoki poziom ekspresji dzikiego typu białka p53 zaobserwowany w prowadzonych badaniach jest korzystny, gdyż zmniejsza prawdopodobieństwo wystąpienia działań ubocznych na normalne komórki po leczeniu in vivo za pomocą Ad5 CMV-p53.
Przedstawione badania wskazują, że zrekombinowany adenowirus p53 wykazuje zdolność tłumienia nowotworu i działa przez odtworzenie działania białka p53 w komórkach nowotworowych. Wyniki te stanowią podstawę do zastosowania wiriony Ad5CMV-p53 jako środka terapeutycznego w leczeniu raka.
F. Środki uszkadzające DNA
Według wynalazku wykorzystać można wiele różnych środków uszkadzających DNA, takich jak środki bezpośrednio sieciujące DNA, środki wstawiające się w DNA oraz środki powodujące chromosomowe i mitotyczne aberracje przez wpływanie na syntezę kwasu nukleinowego
Środki, które bezpośrednio sieciują kwasy nukleinowe, zwłaszcza DNA, są uwzględniane i, jak to wykazano, powodują uszkodzenie DNA, co prowadzi do uzyskania synergistycznej kombinacji przeciwnowotworowej. Stosować można cisplatynę i inne środki alkilujące DNA. Cisplatyna jest powszechnie stosowania w leczeniu raka, przy skutecznych dawkach wykorzystywanych w zastosowaniach klinicznych 20 mg/m2, prze 5 dni co 3 tygodnie, łącznie przez 3 cykle. Cisplatyna nie jest wchłaniana przy podawaniu doustnym, tak że musi być stosowana przez iniekcję dożylną, podskórną, donowotworową lub dootrzewnową.
185 749
Do środków uszkadzających DNA należą również związki, które zakłócają replikację, mitozę i segregację DNA w chromosomach. Do związków takich przykładowo należy adriamycyną określana również jako doksorubicyna, etopozyd, werapamil, podofilotoksyna itp. Powszechnie wykorzystywane w zastosowaniach klinicznych do leczenia nowotworów związki te podaje się w postaci uderzeniowych iniekcji dożylnych w dawkach w zakresie od 25-75 mg/m2 z21-dniowymi przerwami w przypadku adriamycyny do 35-50 mg/m2 w przypadku etopozydu, dożylnie lub, w dwukrotnie większej dawce, doustnie.
Środki, które dezorganizują syntezę i prawidłowość prekursorów kwasu nukleinowego i podjednostki, także prowadzą do uszkodzenia DNA. Wynaleziono szereg tego typu prekursorów kwasu nukleinowego. Szczególnie przydatne są związki, które zostały obszernie przebadane i są łatwo dostępne. Środki takie, np. 5-fluorouracyl (5-FU), są wybiórczo wykorzystywane przez tkankę nowotworową co powoduje, że mogą one łatwo docierać do komórek nowotworowych. Jakkolwiek stosunkowo toksyczny 5-FU jest stosowany w wielu różnych nośnikach, w tym miejscowo, choć powszechnie stosuje się podawanie dożylne w dawkach w zakresie od 3 do 15 mg/kg/dzień.
Do innych czynników, które powodują uszkodzenie DNA i są powszechnie wykorzystywane, należą promienie y, promienie rentgenowskie oraz bezpośrednie wprowadzanie radioizotopów do komórek nowotworowych. Można także wymienić inne czynniki uszkadzające DNA, takie jak mikrofale i promieniowanie UV. Najprawdopodobniej wszystkie te czynniki wywołują w szerokim zakresie uszkodzenie prekursorów DNA, replikacji i naprawy DNA oraz zestawiania i utrzymywania chromosomów. W przypadku promieni rentgenowskich dzienne dawki wynoszą od 50 do 200 R, przy dłuższych okresach (3-4 tygodnie), a przy stosowaniu jednorazowym 2000-6000 R. Zakres dawek w przypadku radioizotopów waha się w szerokich granicach i zależy od okresu półtrwania izotopu, natężenia i typu emitowanego promieniowania oraz od wchłaniania przez komórki nowotworowe.
Specjalistów kieruje się do „Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 15 Ed., rozdział 33, zwłaszcza strony 624-652. Oczywiście występują pewne wahania w dawkach, w zależności od stanu leczonego osobnika. Osoba odpowiedzialna za stosowanie w każdym przypadku ustala odpowiednią dawkę dla konkretnego osobnika. Ponadto przy podawaniu ludziom preparaty muszą spełniać normy dotyczące sterylności, pirogeniczności, ogólnego bezpieczeństwa oraz czystości, wymagane przez normy FDA Office for Biologics.
G. Leczenie p53 i cisplatyną
Próbując ustalić skuteczność kombinacji terapii z zastępowaniem genu i chemioterapii w przypadku raka u ludzi zbadano, czy sekwencyjne podawanie Ad-p53 i CDDP może wywołać apoptozę in vivo. Po 3 dniach bezpośredniego donowotworowego wstrzykiwania Adp53 lub dootrzewnowego podawania CDDP w przypadku nowotworów H358 wszczepionych podskórnie myszom nu/nu stwierdzono umiarkowane spowolnienie wzrostu. Natomiast przy równoczesnym podawaniu Ad-p53 i CDDP następowała częściowa regresja nowotworów, a wielkość nowotworu pozostała statystycznie znacząco mniejsza niż dla jakiejkolwiek innej z leczonych grup. Działanie hamujące wzrost było jeszcze bardziej znaczące po dwóch cyklach leczenia (fig. 13A). Badania histologiczne potwierdziły masową destrukcję komórek nowotworowych w obszarze, w którym wstrzyknięto Ad-p53 u myszy, którym podawano CDDP. Barwienie in situ wykazało obecność licznych komórek apoptotycznych wokół obszarów bezkomórkowych (fig. 13B-E). Natomiast w przypadku nowotworów leczonych samą CDDP lub samym Ad-p53 nie stwierdzono obszarów bezkomórkowych ani apoptotycznych.
Wynalazek ujawnia nową strategię terapii genowej ludzi w połączeniu z konwencjonalną chemioterapią z wykorzystaniem środka sieciującego DNA. Odporność komórek nowotworowych na leki chemioterapeutyczne stanowi poważny problem w onkologii klinicznej. Uważa się, ze NSCLC stanowi co najmniej 80% przypadków raka płuc; jednakże pacjenci z NSCLC zasadniczo nie reagują na chemioterapię (Doyle, 1993). Jednym z celów współczesnych badaczy raka jest znalezienie sposobów poprawy skuteczności terapii związanej z zastępowaniem genów w przypadku raka poprzez badanie oddziaływań między produktem genowym i lekami chemioterapeutycznymi. Gen kinazy tymidynowej zherpes simplex (HS-tK) po wprowadzeniu do nowotworów mózgowych przez układ wektora retro wirusowego z powodzeniem wywołuje podatność na środek
185 749 przeciwwirusowy, ganciclovir (Culver i inni, 1992). Produkt genowy HS-tK jest egzogennym enzymem wirusowym, natomiast białko wt-p53 powstaje w wyniku ekspresji w normalnych komórkach, co sugeruje, że modulowanie odporności na chemioterapię poprzez zmiany w ekspresji wt-p53 może stanowić wariantowe podejście poprzez wykorzystanie drogi z udziałem endogennego programu genetycznego.
Układ adenowirusowy wykazuje potencjalne zalety w odniesieniu do dostarczania genów in vivo, takie jak łatwość wytwarzania wirusów o wysokim mianie, wysoka skuteczność infekcji oraz infekcyjność w stosunku do wielu typów komórek. Jednakże stabilność i trwałość ekspresji wprowadzonego genu są w dalszym ciągu kontrowersyjne. W terapii chemo-genowej poziomy ekspresji oraz wysoka infekcyjność mogą mieć większe znaczenie niż trwałość ekspresji, gdyż lek może uśmiercać komórki przez kilka dni. Wzrost poziomów p53 w komórkach wrażliwych na leki chemioterapeutyczne może nastąpić w ciągu 6 godzin po pobudzaniu uszkadzającym DNA (Fritsche i inni, 1993, Zhan i inni, 1993), choć wzrost aktywności wiązania DNA p53 można odwrócić w ciągu 4 godzin, jeśli bodziec usunie się (Tishler i inni, 1993). W przypadku modelu według wynalazku ekspresja genu wt-p53 jest napędzana niezależnie przez promotor wirusa cytomegalii zawarty w wektorze Ad-p53. Z tego względu wysoki poziom ekspresji p53 można utrzymać nawet po zaniku ekspozycji na lek. Ekspresja białka wt-p53 przez Ad-p53 osiąga szczyt w 3 dniu po infekcji (14-krotnie wyższa niż dla endogennego dzikiego typu) i spada do niskiego poziomu w dniu 9 (Zhang i inni, 1993). Sugeruje to, że przejściowy wysoki poziom ekspresji wt-p53 wystarcza do zainicjowania programu cytotoksycznego w komórkach rakowych.
H. Pacjenci i procedury leczenia
Sugeruje się, że umiejscowione podawanie konstruktów adenowirus-gen p53 do komórek rakowych płuc u pacjentów z rakiem związanym zp-53, takim jak nie nadający się do resekcji czopujący rak wewnątrzoskrzelowy, stanowić będzie bardzo skuteczną metodę doprowadzania terapeutycznie skutecznego genu, aby przeciwdziałać chorobie. Dostarczanie genu p53 przeprowadza się w kombinacji ze środkami lub czynnikami, które powodują uszkodzenie DNA. Takie kombinowane podejście stanowi znaczące usprawnienie współczesnych terapii rakowych, np. w przypadku utraty wrażliwości na samą cisplatynę, opartych na usiłowaniu uśmiercenia lub usunięcia ostatniej komórki rakowej przez doprowadzenie do uszkodzenia DNA Z uwagi na to, ze uśpienie komórek nowotworowych jest zaakceptowanym zjawiskiem, skuteczne uśmiercanie jest wysoce nieprawdopodobne.
Oczekuje się, ze przejmowanie konstruktów adenowirusowych przez komórki NSCLC spowoduje obniżenie szybkości proliferacji tych komórek, z tym ze przykłady wykazują iż kombinowane zastosowanie środka lub czynnika uszkadzającego DNA z adenowirusem p53 prowadzi do znaczącego zmniejszenia wzrostu komórek i wielkości nowotworu, nie obserwowanego przy samodzielnym stosowaniu poszczególnych czynników. Ujawnione kompozycje i sposoby stwarzają wyraźną nadzieję na wydłużenie okresu, w którym zaatakowane płuca będą w dalszym ciągu rozszerzać się, zapobiegać ponownemu wzrostowi nowotworu i dzieleniu się komórek nowotworowych oraz przedłużają życie pacjenta.
Pacjentów z nawrotami nadającego się do resekcji czopującego raka wewnątrzoskrzełowego, powodującego częściowe lub całkowite zaczopowanie dróg oddechowych, w przypadku których radioterapia zewnętrzną wiązką zawiodła lub nie może być stosowana, uważa się za odpowiednich do poddania takiej kombinowanej procedurze. U większości pacjentów występują nawroty pomimo radioterapii zewnętrzną wiązką. Można wstawić krótki cewnik i stosować dodatkowo radioterapię, dożylne podawanie środków uszkadzających DNA. W przypadku obecnych sposobów leczenia średni czas przeżycia pacjentów wynosi 6 miesięcy. Pacjentom, w przypadku których wstawianie cewnika zawiodło, można również zastosować terapię genową. Nowotwór można usunąć z dróg oddechowych za pomocą lasera lub kleszczy do biopsji. Można to przeprowadzić w połączeniu z iniekcją konstruktów adenowirusowych, obniżając w ten sposób objętość leku, którą należy wstrzyknąć. Podawanie konstruktów wirusowych nie ustrzeże pacjentów przed zastosowaniem innego leczenia łagodzącego objawy, jeśli nowotwór będzie powiększać się.
185 749
I. Inne techniki przenoszenia genu
Powodzenie terapii genowej wymaga zazwyczaj integracji genu zdolnego do korygowania zaburzenia genetycznego w genomie gospodarza, gdzie będzie on współwystępować i ulegać replikacji z DNA gospodarza, a ponadto ulegać ekspresji w stopniu kompensującym zdefektowany gen. Idealnie choroba powinna zostać wyleczona po jednym lub kilku etapach leczenia, bez znaczących skutków ubocznych. Dotychczas zaproponowano szereg podejść do terapii genowej, w których można wykorzystać wynalazek.
Pierwsze podejście obejmuje transferowanie DNA zawierającego interesujący gen w komórkach, np. przez przenikanie błony komórkowej na drodze fizycznej lub chemicznej. Takie rozwiązanie ogranicza się zasadniczo do komórek, które można przejściowo usunąć z organizmu i które mogą tolerować cytotoksyczność obróbki (np. do limfocytów).
Liposomy lub koniugaty białkowe powstałe z pewnymi lipidami i amfifilowymi peptydami można zastosować do transfekcji (Stewart i inni, 1992; Torchilin i inni, 1992; Zhu i inni, 1993), z tym ze wydajność integracji genu jest w dalszym ciągu bardzo nikła. Ocenia się, ze interesujący gen integruje się w genomie tylko jednej komórki na 1 000-100 000. Jeśli nie następuje integracja, ekspresja transfekowanego genu ogranicza się do kilku dni w przypadku komórek ulegających proliferacji lub kilku tygodni w przypadku komórek nie ulegających proliferacji, z uwagi na degradację nie zintegrowanych DNA.
Drugie rozwiązanie wynika z naturalnej zdolności wirusów do wnikania do komórek, przy czym przenoszą one ze sobą własny materiał genetyczny. Retrowirusy są obiecujące jako wektory dostarczające gen z uwagi na ich zdolność do integrowania się ich genów w genomie gospodarza, przenoszenie znacznej ilości obcego materiału genetycznego, infekowanie wielu różnych gatunków i typów komórek oraz upakowanie w specjalnych liniach komórek (Miller, 1992).
W trzecim sposobie wykorzystuje się inne wirusy takie jak adenowirus, wirusy herpes simplex (RSV), wirus cytomegalii (CMV) oraz adenozasocjowany wirus (AAV), które przekształca się tak, aby służyły jako wektory do przenoszenia genu. Jakkolwiek w przypadku pewnych wirusów, które mogą przyjmować obcy materiał genetyczny, występują ograniczenia odnośnie liczby nukleotydów, które mogą przyjąć, oraz rodzaju komórek, które mogą infekować, wykazano, że wirusy te z powodzeniem zapewniają ekspresję genu. Jednakże adenowirusy nie integrują swojego materiału genetycznego w genomie gospodarza i z tego względu ekspresja genu w ich przypadku nie wymaga replikacji gospodarza, co powoduje, że nadają się one idealnie do osiągnięcia szybkiej, wydajnej, heterologicznej ekspresji genu.
Nawet mimo iż wynalazek został opisany z pewnym stopniem szczegółowości, zrozumiałe jest, że na podstawie powyższego opisu dla specjalisty oczywiste będą liczne zmiany, modyfikacje i warianty. W związku z tym uważa się, że wszystkie takie zmiany, modyfikacje i warianty wchodzące w istotę i zakres wynalazku objęte są określonymi zastrzeżeniami.
Poniższe przykłady zamieszczono w celu przedstawienia korzystnych rozwiązań wynalazku. Dla specjalisty zrozumiałe jest, że techniki ujawnione w poniższych przykładach stanowią techniki opracowane w tym celu, aby prawidłowo zrealizować wynalazek, tak że można je uważać za korzystne sposoby jego realizacji. Jednakże specjalista po zapoznaniu się z opisem powinien dojść do wniosku, ze w konkretnych ujawnionych rozwiązaniach dokonać można wielu zmian, uzyskując takie same lub podobne wyniki, bez wychodzenia poza zakres i istotę wynalazku.
Przykład 1
Konstrukcja wektora ekspresji p53
W tym przykładzie opisano konstrukcję wektora ekspresji p53. Wektor ten skonstruowano w sposób pokazany i zastosowano do zastąpienia obszaru El (1,3-9,2 m.u.) genomu szczepu adenowirusa Ad5 i wykorzystano do skonstruowania wirionu adenowirusowego, opisanego w przykładzie 2.
Kasetę ekspresji p53 pokazaną na fig. 1, która zawiera promotor ludzkiego wirusa cytomegaln (CMV) (Boshart i inni, 1985), p53 cDNA i wczesny sygnał poliadenylowania SV40, wstawiono między miejsca Xba I i Cla I pXCJLl (dostarczonego przez dr Franka L. Grahama, McMaster Umversity, Kanada).
185 749
Genom o wielkości około 35,4 kb podzielono na 100 jednostek mapowych (1 m.u. = 0,35 kb). Kaseta ekspresji p53 zastąpiła obszar El (1,3-9,2 m.u.) genomu Ad5.
Starter 1 o sekwencji 5'-GGCCCACCCCĆTTGGCTTC-3' (SEQ ID NO:1) i zlokalizowany jest w pierwszym intronie w dół od promotora głównego genu IE ludzkiego CMV (Boshart i inni, 1985). Starter 2 o sekwencji 5'-TTGTAACCATTATAAGCTGC-3' (SEQ ID N):2) zlokalizowany jest we wczesnym sygnale poliadenylowania SV40. Obydwa startery, 15-20 bp od insertu p53 cDNA na obydwu końcach, określają produkt PCR o 1,40 kb.
Starter 3 o sekwencji 5'-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3' (SEQ ID N3:3) i starter 4 o sekwencji 5'-CATCTGAACTCAAAGCGTGG-3'(SEQ ID NO:4), zlokalizowane są odpowiednio przy 11 m.u. 13,4 m.u. genomu Ad5, który określa specyficzny dla genomu wirusowego produkt PCR o 0,86 kb.
Przykład 2
Wytwarzanie i reprodukcja zrekombinowanego adenowirusa p53
W tym przykładzie opisano jeden sposób wytwarzania niezależnych od pomocnika zrekombinowanych adeno wirusów wytwarzających w wyniku ekspresji p53. Strategia molekularna wykorzystana do wytwarzania zrekombinowanego adeno wirusa oparta jest na tym, że z uwagi ograniczenia wpakowaniu adenowirusa, pJM17 nie może sam tworzyć wirusa. Z tego względu w wyniku homologicznej rekombinacji pomiędzy plazmidem wektora ekspresji p53 i pJNtl7 transfekowanej komórki uzyskuje się żywy wirus, który można zapakować tylko w komórkach, w których zachodzi ekspresja niezbędnych białek adeno wirusowych.
Zgodnie ze sposobem według tego przykładu wykorzystuje się komórki 293 jako komórki gospodarze, które zawierają podstawienia heterologicznych kaset ekspresji DNA w obszarze El lub E3. Sposób ten wymaga współtransfekcji DNA w komórkach 293. Transfekcja w znacznym stopniu determinuje wydajność reprodukcji wirusa. Sposób wykorzystywany do transfekcji DNA do komórek 293 przed opracowaniem wynalazku stanowiło zazwyczaj współstrącanie fosforanu wapnia/DNA (Graham i van der Eb, 1973). Jednakże sposób ten, wraz z oceną łysinek, jest zazwyczaj trudny i prowadzi do niskiej wydajności reprodukcji wirusów. Jak to pokazano w tym przykładzie, transfekcję i wykonywaną następnie identyfikację zainfekowanych komórek znacząco usprawniono stosując transfekcję z udziałem liposomów, oraz identyfikując transfekowane komórki na podstawie efektu cytopatycznego (CPE).
Linię komórek 293 utrzymywano w zmodyfikowanym minimalnym, podstawowym ośrodku Dulbecco, uzupełnionyn 10% surowicy końskiej zdezaktywowanej termicznie, wektor ekspresji p53 i plazmid pJM17 (McGrory i inni, 1988) do homologicznej rekombinacji współtransfekowano w komórkach 293 metodą transfekcji z udziałem DOTAP, zgodnie z procedurą producenta (Boehrmger Mannheim Biochemicals, 1992). Przedstawiono to schematycznie na fig. 1.
Komórki 293 (pasaż 35, 60% zlania) naniesiono na 24 godziny przed transfekcją na 60 mm szalkach lub płytkach z 24 studzienkami. Komórki w każdej studzience transfekowano : 30 μΐ DOTAP, 2 pg wektora ekspresji p53 i 3 pg plazmidu pJM17. Po transfekcji komórki zasilano ośrodkiem MEM co 2-3 dni aż do wystąpienia CPE.
Przykład 3
Potwierdzenie identyczności zrekombinowanego adenowirusa
W przykładzie tym zilustrowano nowy test polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR) do potwierdzania identyczności zrekombinowanych wirionów po współtransfekcji odpowiedniej linii komórek.
Próbki supematantów z hodowli komórek (50 - 370 pl) zebrano z płytek testowych, zadano proteinazą K (50 pg/ml z 0,5% SDS i 20 mM EDTA) w 56°C na 1 godzinę, wyekstrahowano mieszaniną fenol-chloroform i kwasy nukleinowe wytrącono etanolem. Pastylkę DNA zawieszono w 20 pl H2O i zastosowano jako matrycę w amplifikacji PCR. Względne lokalizacje starterów PCR i ich sekwencje zaznaczono na fig. 1, przy czym były to odpowiednio SEQ ID NO: 1, 2, 3 i 4. Startery specyficzne względem insertu cDNA określają produkt PCR o 1,4 kb, a startery specyficzne względem genomu wirusowego określają produkt PCR o 0,86 kb. Reakcje PCR prowadzono w mieszaninie o objętości 50 pl zawierającej 4 mM
185 749
MgCl2, 50 mM KC1, 0,1% triton Χ-100, po 200 uM dNTPs, 10 mM Tris-Cl (pH 9,0), pó 2 μΜ każdego startera i 1,0 jednostek polimerazy Taq (Promega). Reakcję prowadzono w 94°C, 0,5 minuty, 56 °C, 0,5 minuty i 72°C, 1 minuta, wykonując 30 cykli.
W celu uproszczenia procedury identyfikacji nowo zreprodukowanego zrekombinowanego wirusa opracowano bezpośredni test PCR dla próbek DNA z supematantu hodowli komórek. Próbki (50 lub 370 μΐ) supematantu hodowli komórek z PCR zadano proteinazą K i wyekstrahowano mieszaniną fenol-chloroform. Po wytrąceniu etanolem próbki DNA analizowano metodą PCR z wykorzystanie 2 par starterów w celu wykonania amplifikacji sekwencji specyficznych względem insertu i specyficznych względem genomu wirusowego. Cele starterów PCR i ich sekwencje pokazano na fig. 1. Startery 1, 2, 3 i 4 są przedstawione odpowiednio jako SEQ ID NO: 1, 2, 3 i 4.
W efekcie insert cDNA o 1,4 kb i fragment genomu wirusowego o 0,86 kb zostały zamplifikowane w przypadku wektora ekspresji (dodatnia próba kontrolna) i próbek DNA dodatniej hodowli komórek (fig. 2B, odpowiednio ścieżka 1 i 4). Tylko fragment 0,86 kb został zamplifikowany z próbki DNA wirusa Ad5/RSV/GL2 (ujemna próba kontrolna, ścieżka 2). Nie stwierdzono zamplifikowanych pasm z reakcji PCR, w których zastosowano którykolwiek z supematantów ośrodka hodowli komórek dodatnich (ścieżka 3).
Wyniki te wskazują ze adenowirusy uwolnione do ośrodka hodowli komórek są wykrywane przez PCR przy zastosowaniu zaledwie 50 μΐ supematantu ośrodka hodowli komórek do wytwarzania matryc DNA. Wyniki te umożliwią również opracowanie ilościowej metody do wykorzystania tej techniki w oznaczaniu mian adenowirusów, co tradycyjnie wykonywano na podstawie testów z łysinkami.
Dzikiego typu sekwencję cDNA p53 w wirusie Ad5CMV-p53 potwierdzono przez sekw encjonowanie didezoksy DNA z oczyszczonym na gradiencie CsCl wirusowym DNA. Kontrolny wirus Ad5/RSV/GL2, wytworzony w podobny sposób był pod względem struktury podobny do Ad5CMV-p53, z tym ze w jako kasecie ekspresji wykorzystano promotor wirusowy mięsaka Rousa oraz cDNA lucyferazy. Zrekombinowany adenowirus, który przenosi gen β-galaktozydazy E. coli (LacZ), AdSCMV-LacZ, jest również pod względem struktury podobny do Ad5CMV-p53, i można go otrzymać w sposób opisany przez Zhanga i innych oraz od dr Franka L. Grahama (patrz Graham i inni, 1991).
Bazy wirusowe, miano i infekcja. Poszczególne klony wirusów Ad5CMV-p53, Ad5/RSV/GL2 i Ad5CMV-LacZ otrzymano przez oczyszczanie łysinek, zgodnie z metodą Grahama i Preveca (1991). Poszczególne klony reprodukowano w komórkach 293. Ośrodek hodowli komórek 293 wykazujących pełny efekt cytopatyczny zebrano i odwirowano przy 1000 x g przez 10 minut. Połączone supematanty podzielono na porcje i przechowywano w-20°C jako bazy wirusowe. Miana wirusa oznaczano metodą testów łysinkowych (Graham i Prevec, 1991). Infekcje linii komórek przeprowadzano dodając roztwory wirusowe (0,5 ml na 60 mm szalkę) do monowarstw komórek i prowadząc inkubację w temperaturze pokojowej przez 30 minut z krótkim mieszaniem co 5 minut. Następnie dodano ośrodek hodowli i zainfekowane komórki przeniesiono do inkubatora w 37°C.
Skuteczność przenoszenia genów przez zrekombinowane adenowirusy oceniano także stosując Ad5CMV-LacZ w różnych liniach komórek, takich jak H226Br, H322, H460, HeLą Hep G2, LM2 i Vero. Stosując barwienie X-gal wszystkie linie komórek zabarwiły się w 97-100% na niebiesko po infekcji Ad5CMV-LacZ przy MOI 30 PFU/komórkę.
Przykład 4
Kierowana przez AdSCMV-p53 ekspresja w ludzkich komórkach raka płuc
W tym przykładzie opisano zastosowanie zrekombinowanego adenowirusa p53 do infekowania ludzkich komórek raka płuc z homozygotyczną delecją genu p53. Wyniki te wskazują ze wzrost tych komórek i ekspresja mutanta p53 ulegają zahamowaniu, co świadczy o możliwości zastosowania wiriona Ad5CMV-p53 jako użytecznego środka do kontroli metastatycznych komórek.
Immunohistochemię wykonano na zainfekowanych komórkach w monowarstwach, utrwalonych 3,8% formaliną i poddanych obróbce 3% H2O2 w metanolu przez 5 minut. Analizę immunohistochemiczną wykonano stosując zestaw Yectastain Elitę Yector, Burlingame, CA).
185 749
Jako podstawowe przeciwciało zastosowano przeciw-p53 przeciwciało PAb 1801 (Oncogene Science, Manhasset, NY); MOPC-21 (Organon Teknika Corp., West Chester, P A) zastosowano jako ujemną próbkę kontrolną. Drugim przeciwciałem był znaczony awidyną przeciwmysi IgG (Vector). Odczynnik w postaci kompleksu biotynylowanej peroksydazy chrzanowej ABC zastosowano do wykrywania kompleksu antygen-przeciwciało. Na koniec komórki odbarwiono hematoksyliną Harrisa (Sigma) i unieruchomiono środkiem Cytoseal 60 (Stephens Scientific, Riverdale, NJ).
Analizę immunohistochemiczną linii zainfekowanych komórek przeprowadzono w celu zbadania in situ ekspresji p53 pod kontrolą promotora CMY wirusa Ad5CMV-p53. W linii komórek H358, która zawiera homozygotyczną delecję p53, gen p53 przeniesiono z wydajnością 97-100%, co potwierdziła analiza immunohistochemiczną, gdy komórki zostały zainfekowane Ad5CMV-p53 z krotnością infekcji 30-50 jednostek tworzących łysinki (PFU)/komórkę (fig. 4).
Najwyższą skuteczność przenoszenia zrekombinowanego adenowirusa potwierdzono dla Ad5CMV-LacZ, wirusa, który przenosi gen LacZ transkrybowany przez ludzki promotor CMY IE. Przy MOI 30-50 PFU/komórkę wszystkie zbadane komórki, w tym HeLa, Hep G2, LM2 i linie komórek ludzkiego raka NSCLC dały w 97-100% dodatni wynik w odniesieniu do aktywności β-galaktozydazy przy barwieniu X-gal. Wyniki te wskazują, że wektory adenowirusowe stanowią skuteczny nośnik dla przenoszenia genu do ludzkich komórek rakowych.
Analizę metodą blottingu Westema przeprowadzono dla pełnych lizatów komórek otrzymanych przez lizę monowarstwy komórek na szalkach z buforem próbki SDS-PAGE (0,5 ml na 60 mm szalkę) po przemyciu komórek roztworem soli buforowanym fosforanem (PBS). Do analizy SDS-PAGE na ścieżki wprowadzono lizaty komórek w ilości odpowiadającej 5 χ 104 komórek (10-15 ml). Białka w żelu przeniesiono na membranę Hybond™-ECL (Amersham, Arlington Heights, 1L). Membrany zablokowano 0,5% mleka w proszku w PBS i sondowano podstawowymi przeciwciałami: mysie przeciw-ludzkie p53 monoklonalne przeciwciało PAb 1801 i mysie przeciw-ludzkie (β-aktynowe monoklonalne przeciwciało (Amersham), przemyto i sondowano drugim przeciwciałem: skoniugowanym z peroksydazą chrzanową króliczym przeciw-mysim IgG (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Membrany wywoływano zgodnie z procedurą wzmocnionej chemiluminescencji Amersham. Względne ilości egzogennego p53 wytworzonego w wyniku ekspresji oznaczano za pomocą densytometru (Molecular Dynamics Inc., Sunnyvale, CA).
Blotting Westema wykazał, że egzogenne białko p53 powstaje przy wysokim poziomie ekspresji (fig. 5A ścieżki 2, 3 i 5, 6). Białko osiąga szczyt w 3 dniu po infekcji (fig. 6, insert, 0,5 do 3 dni). W celach kontrolnych skonstruowano wirion o strukturze podobnej do zrekombinowanego Ad5CMV-p53 z przykładu 1. Wirion zawiera cDNA lucyferazy pod kontrolą promotora wirusa mięsaka Rousa w kasecie ekspresji wirionu. W komórkach zainfekowanych wirionem Ad5/RSV/GL2 nie wykryto ani ekspresji p53, ani też zmian w ekspresji aktyny.
Zrekombinowany adenowirus p53 zastosowano do infekowania 3 ludzkich linii komórek płuc NSCLC: linii komórek H358, zawierającej homozygotyczną delecję genu p53, linii komórek H322, zawierającej punktową mutację genu p53 przy kodonie 248 (G na T) i linii komórek H460, zawierającej dzikiego typu gen p53. Szybkość wzrostu ludzkich komórek NSCLC oznaczano po zaszczepieniu H322 i H460 (1 χ 105) lub H358 (2 χ 105) na 60 mm szalkach do hodowli na 24 godziny przed infekcją wirusową. Komórki zainfekowano wirusami z krotnością infekcji (MOI) 10 PFU/komórkę. Ośrodek hodowli zastosowano w kontrolnej infekcji pozornej. Potrójne hodowle każdej linii komórek z różnymi sposobami traktowania zliczano codziennie w dniach 1-6 po infekcji.
Wzrost komórek H358 zainfekowanych Ad5CMV-p53 został znacznie zahamowany w porównaniu z komórkami nie zainfekowanymi lub komórkami zainfekowanymi wirionem kontrolnym (fig. 7A). Wzrost komórek H358 został również silnie zahamowany przez wirion p53 (fig. 7B), podczas gdy wpływ na komórki ludzkiego raka płuc H460, zawierające dziki typ p53 był znacznie mniejszy (fig. 7C). Wzrost komórek H358 zainfekowanych wirusem Ad5CMV-p53 został zahamowany w 79%, podczas gdy wzrost me zainfekowanych komórek lub komórek zainfekowanych wirusem kontrolnym nie został zahamowany. Wzrost komórek linii H322, która zawiera punktową mutację w p53, został zahamowany
185 749 w 72% przez Ad5CMV-p53, podczas gdy wpływ na H460 zawierające p53 dzikiego typu był znacznie mniejszy (zahamowanie w 28%).
Wyniki te wskazują ze zrekombinowany adenowirus p53 wykazuje zdolność tłumienia nowotworu, działając przez odtworzenie funkcji białka p53 w komórkach nowotworowych.
Przykład 5
Działanie Ad5CMV-p53 na komórki z deficytem p53
Przykład ten dotyczy zastosowania zrekombinowanego adenowirusa p53 do odtwarzania tłumienia wzrostu komórek nowotworowych in vitro, a więc do leczenia złośliwego i metastatycznego wzrostu komórek. Przedstawiono pewne sposoby, jakimi można wykorzystać wynalazek do leczenia raka na drodze terapii genowej z udziałem adenowirusa.
Komórki H358 zainfekowano Ad5CMV-p53 i Ad5/RSV/GL2 przy MOI 10 PFU/komórkę. Taką samą ilość komórek zadano ośrodkiem (infekcja pozorna). W 24 godziny po infekcji komórki zebrano i przemyto dwukrotnie PBS. W przypadku każdej obróbki 3 miliony (3 χ 106) komórek w objętości 0,1 ml wstrzyknięto podskórnie każdej z nagich myszy (Harlan Co., Houston, TX). W każdej obróbce zastosowano 5 myszy. Myszy napromieniowano (300 cGy, “Co) przed iniekcją i badano co tydzień po iniekcji. Powstanie nowotworu oceniano pod koniec 6 tygodnia i objętość nowotworu wyliczano przy założeniu kulistego kształtu, przy czym przeciętną średnicę nowotworu wyliczano jako pierwiastek kwadratowy z ilorazu średnic przekroju.
W celu ustalenia hamującego wpływu na onkogeniczność z udziałem Ad5CMV-p53 nagim myszom wstrzyknięto podskórnie komórki H358 (ludzkie komórki typu NSCLC) w celu wywołania wzrostu nowotworu. Każdej myszy wstrzyknięto jeden raz komórki zainfekowane Ad5CMV-p53 lub Ad5/RSV/GL2 przy 10 PFU/komórkę dla 24 godzin. Komórki H358, który poddano obróbce samym ośrodkiem, zastosowano jako pozornie komórki kontrolne. Nowotwory, wyczuwalne po raz pierwszy w 14 dniu po iniekcji, zostały wywołane tylko w przypadku komórek z pozorną infekcją lub zainfekowanych wirusem kontrolnym, jak to wynika z tabeli I:
Tabela I
Wpływ Ad5CMV-p53 na onkogeniczność H358 u nagich myszy3
Obióbka Liczba nowotworów/ liczbę myszy (%) Średnia objętość (mm3 ± SD)
Ośrodek 4/5 (80) 37 ± 12
Ad5/RSV/GL2 3/4 (75) 30 ± 14
Ad5CMV-p53 0/4 (0)
a Komórki H358 poddane obróbce wstrzyknięto podskórnie w dawce 2 χ 106 komórek/mysz. Wielkości nowotworów oznaczano pod koniec 6-tygodmowego okresu
Jako to wynika z tabeli 1, u myszy, którym podano komórki po obróbce Ad5CMV-p53, nowotwory nie rozwinęły się. Średnica nowotworów pod koniec okresu 6-tygodniowego wynosiła 4-10 mm. Badania przeprowadzono na grupach złożonych z 5 myszy; po jednej myszy z grupy Ad5CMV-p53 i Ad5/RSV/GL2 nie dożyło do końca badań. Wczesna śmierć była prawdopodobnie spowodowana infekcją szpitalną.
Przykład 6
Ad5CMV-p53 w leczeniu raka płuc
Przykład dotyczy zastosowania zrekombinowanego adenowirusa p53 do odtwarzania tłumienia wzrostu komórek nowotworowych in vivo, a w związku z tym leczenia raka u zwierząt. Przedstawiono pewne sposoby, jakimi można wykorzystać wynalazek do leczenia raka na drodze terapii genowej z udziałem adenowirusa.
Skuteczność Ad5CMV-p53 w hamowaniu onkogeniczności oceniono również na mysim modelu ortotopowego ludzkiego raka płuc. W związku z tym, że komórki H358 i H322 nie tworzą nowotworów w tym modelu, zastosowano linię komórek H226Br. Linia ta pochodzi z łuskowatego raka płuc i przerzuca się z płuc do mózgu. H226Br zawiera punktową mutację (ATC na GTC) w egzonie 7, kodonie 254 genu p53 i jest onkogeniczna u myszy.
185 749
Procedura testów ortotopowego ludzkiego raka płuc w modelu mysim została opisana uprzednio (Georges i inni, 1993). W skrócie napromieniowane nagie myszy (300 cGy, “Co) zaszczepiono komórkami H226Br przez wprowadzenie do tchawicy. Każdej myszy podano 2 χ 106 komórek w objętości 0,1 ml PBS. W 3 dni po zaszczepieniu grupom złożonym z 10 myszy podano 0,1 ml wirusów lub nośnika (PBS) wprowadzając je do tchawicy raz dziennie przez dwa dni. Dawka wirusów wynosiła 5 χ 107 Ad5CMV-p53 lub Ad5/RSV/GL2 na mysz. Myszy uśpiono pod koniec 6-tygodniowego okresu. Powstawanie nowotworu oceniono wycinając tkankę płucną i śródpiersia i mierząc wielkość nowotworu. Obecność nowotworów potwierdzono na podstawie analizy histologicznej sekcji masy nowotworu.
Napromieniowane nagie myszy zaszczepiono dawką 2 χ 106 komórek H226Br/mysz przez wprowadzenie do tchawicy. W 3 dni po zaszczepieniu każdej myszy podano 0,1 ml Ad5CMVp53 lub Ad5/RSV/GL2 albo nośnika (PBS) wprowadzając je do tchawicy raz dziennie przez dwa dni. Dawka wirusów wynosiła 5 χ 107 PFU/mysz. Powstawanie nowotworu oceniono pod koniec 6-tygodniowego okresu wycinając tkankę płucną i śródpiersia i mierząc wielkość nowotworu. Schemat ideowy procedury przedstawiono na fig. 7, a reprezentatywne próbki wycinków pokazano na fig. 8. Obecność nowotworów potwierdzono na podstawie analizy histologicznej. Wyniki pomiarów nowotworu zestawiono w tabeli Π.
Tabela II
Wpływ Ad5CMV-p53 na onkogeniczność H226Br w mysim modelu ortotopowego ludzkiego raka płuc
Obróbka Liczba nowotworów/ liczbę myszy (%) Średnia objętość (mm3 ± SD)
Ośrodek 7/10(70) 30 ± 8,4
Ad5/RSV/GL2 8/10(80) 25 ± 6,9
Ad5CMV-p53 2/8 (25) 8 ± 3,3b
a Myszy zaszczepiono dotchawiczo stosując 2 χ 106 komórek H226Br/mysz. W 3 dmu po zaszczepieniu myszom podano dotchawiczo nośnik lub wirusy (po 5 χ 10'7 w 0,1 ml), raz dziennie przez 2 dni. Powstawanie nowotworu oceniano pod koniec 6-tygodmowego okresu b p < 0,05 na podstawie dwukierunkowej analizy wanancyjnej przy porównaniu z grupami, którym podawano nośnik (PBC) lub wirus kontrolny
Tylko u 25% myszy, którym podano Ad5CMV-p53, utworzyły się nowotwory, podczas gdy dla grup kontrolnych, którym podawano nośnik lub Ad5/RSV/GL2, nowotwory utworzyły się u 70-80% myszy. Średnia wielkość nowotworu dla grupy z Ad5CMV-p53 była znacząco nizsza w porównaniu z grupami kontrolnymi. Wyniki te wskazują, że Ad5CMV-p53 może zapobiegać tworzeniu przez H226Br nowotworów w mysim modelu ortotopowego ludzkiego raka płuc.
Przykład 7
Synergizm pomiędzy 53 i uszkadzaniem DNA
Cechy biochemiczne zaprogramowanej śmierci komórek (apoptozy) wykazują charakterystyczny układ fragmentacji DNA wynikający z rozszczepienia jądrowego DNA. Ostatnie badania wykazały, że wywoływanie apoptozy przez leki chemioterapeutyczne lub promieniowanie jonizujące można powiązać ze stanem genu p53, oraz że bodźce uszkadzające DNA są zdolne do podwyższania wewnątrzkomórkowych poziomów białka p53 w komórkach będących w procesie apoptozy (Lowe i inni, 1993, Ciarkę i inni, 1993, Fritsche i inni, 1993, Harper i inni, 1993, El-Deiry i inni, 1993). Inhibitowanie cyklu komórkowego w fazie G] przez podwyższenie poziomów białka p53 dzikiego typu (wt-p53) zapewnia więcej czasu na naprawę DNA; gdy optymalna naprawa nie jest możliwa, p53 może uruchomić zaprogramowaną śmierć komórki. W związku z tym p53 może przyczyniać się do inicjowania apoptotycznej śmierci komórek nowotworowych przez środki chemioterapeutyczne.
Materiały i metody
Komórki H358 zostały dostarczone grzecznościowo przez A. Gazdara i J. Minna (Takahashi i inni, 1989).
185 749
Wektory adenowirusowe
Konstrukcja i identyfikacja zrekombinowanego wektora adenowirusowego, który zawiera cDNA kodujący ludzkie wt-p53 (Ad-p53) lub lucyferazę (Ad-Luc) zostały opisane uprzednio (Zhang i inni, 1993). W skrócie kasetę ekspresji p53, która zawiera promotor ludzkiego wirusa cytomegalii, cDNA wt-p53 oraz wczesny sygnał poliadenylowania SV40, wstawiono między miejsca Xbal i Ciał w pXCJL.l. Dwufunkcjonalny wektor p53 oraz zrekombinowany plazmid pJM17 zastosowano do współtransfekcji w komórkach 293 (linia ludzkich embrionalnych komórek nerki transformowana Ad5) techniką z udziałem liposomów. Supematan hodowli komórek 293 wykazujący pełny efekt cytopatyczny zebrano i zastosowano do infekcji. W podobny sposób wygenerowano kontrolny wirus Ad-Luc.
Wirusy Ad-p53 i Ad-Luc reprodukowano w komórkach 293. Obecność wirusa kompetentnego w replikacji wykluczono na podstawie testów s komórką HeLa. Miana wirusa oznaczano metodą testów łysinkowych (Graham i inni, 1991).
Wykrywanie fragmentacji nukleosomalnego
DNA wydzielono z macierzystych komórek zainfekowanych przez Ad-Luc i zainfekowanych przez Ad-p53 poddanych lub nie poddanych działaniu CDDP, inkubując komórki w 55°C przez 6 godzin in w buforze lizy (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% SDS i 50 pg/ml proteinazy K). DNA wyekstrahowano dwukrotnie równymi objętościami fenolu i raz mieszaniną chloroform-alkohol izoamylowy (24:1), po czym wytrącono w etanolu. Próbki poddano elektroforezie na 1,5% żelu agarozowym i wizualizowano prze barwienie bromkiem etydiowym.
Nick-znakownie dUTP końców z udziałem TdT przeprowadzono zgodnie z procedurą podaną uprzednio (Gavieli i inni, 1992). Do komórek w monowarstwie dodano 0,01% NP-40. Ścinki zanurzono w buforze TdT (30 mM Tris-HCl, pH 7,2; 140 mM kakodylan sodu, 1 mM chlorek kobaltu) i inkubowano z biotynylowanądUTP (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) i TdT w 37°C przez 45 minut. Ścinki przykryto 2% albuminą z surowicy bydlęcej na 10 minut i inkubowano z kompleksem awidyna-biotyna (Vectastain Elitę Kit; Vector Laboratories, Burlingame, CA) przez 30 minut. Oznaczanie kolorymetryczne wykonano stosując diaminobenzydynę.
Wyniki
Komórki H358 transdukowano in vitro ludzkim cDNA wt-p53 cDNA przez wystawienie na działanie Ad-p53. Analiza metodą blottingu Westema wykazała wysoki poziom ekspresji białka wt-p53 już w 24 godziny po infekcji Ad-p53, natomiast wt-p53 nie wykryto w macierzystych (me zainfekowanych) komórkach łub w komórkach kontrolnych zainfekowanych Ad-Luc (wyników nie pokazano). Równocześnie wykonana ocena immunohistochemiczna wykazała wykrywalne białko wt-p53 u ponad 80% zainfekowanych komórek, co sugeruje, ze przenoszenie i ekspresja p53 przez AD-p53 jest bardzo wydajna (wyników nie pokazano).
Ciągłe wystawienie Ad-p53-zainfekowanych komórek H358 na CDDP znacząco zmniejsza ich żywotność, podczas gdy znacząca śmierć macierzystych i Ad-Luc-zainfekowanych komórek występuje dopiero po 72 godzinach wystawienia na działanie CDDP (fig. 10A). Utrata żywotności jest wyraźniejsza w przypadku komórek transdukowanych Ad-p53. Ponadto zmniejszenie żywotności można zaobserwować nawet wtedy, gdy komórki trzymano w ośrodku bez leku po 24 godzinach ekspozycji, co sugeruje, że śmiertelne uszkodzenie zostało zainicjowane wciągu 24 godzin (fig. 10B). Wrażliwość komórek H358 transdukowanych wt-p53 na CDDP była zależna od dawki (fig. 10C).
Wewnątrznukleosomowa drabinka DNA świadcząca o fragmentacji DNA została potwierdzono w komórkach, w których zachodzi ekspresja wp-53 po 24 godzinach wystawienia na działanie CDDP; natomiast komórki macierzyste i infekowane Ad-Luc nie wykazują fragmentacji DNA (fig. 11 A). Nick-końcowe znaczenie 2'-dezoksyurydyno-5'-trifosforanem (dUTP)biotyną z udziałem terminalne transferazy dezoksynukleotydylowej (TdT), które wykrywa fragmentację DNA charakterystyczną dla apoptozy in situ, wykazało obecność wielu apoptotycznych komórek w przypadku komórek zainfekowanych Ad-p53, poddanych działaniu CDDP przez 24 godziny, co pokazano na fig. 11 G, na którym widoczne są ciemno zabarwione jądra i fragment} jąder, nieobecne na fig. 11B-F.
185 749
Potencjalną skuteczność terapeutyczną kombinacji Ad-p53 i CDDP oceniono mierząc względne zmiany objętości sferoid H358. Wielokomórkowy sferoidowy model nowotworu wykazuje in vitro strukturę histologiczną podobną do struktury pierwotnych nowotworów i mikroprzerzutów. Leczenie CDDP spowodowało zmniejszenie względem objętości sferoid H358 zainfekowanych Ad-p53, natomiast nie wywarło znaczącego wpływu na sferoidy macierzyste lub zainfekowane Ad-Luc (fig 12A). Znakowanie in situ dUTP z udziałem TdT wykazało obecność wielu komórek w procesie apoptozy na powierzchni sferoid zainfekowanych Ad-p53, podczas gdy żadnych apoptotycznych komórek nie zaobserwowano na sferoidach nie zainfekowanych Ad-p53 (fig. 12B-E). Uprzednio stwierdzono, że ekspresja wt-p53 z udziałem retrowirusa hamuje wzrost sferoid H322a wywołany przez transformowanie czynnikiem wzrostu a(TGF-a) (Fujiwara i inni, 1993). Jednak retrowirusowy wektor nie może infekować sferoid H358, gdyż komórki w tych sferoidach nie dzielą się szybko w reakcji na egzogenny TGF-α. Odkrycie, że wystawienie na działanie CDDP powoduje zmniejszenie wielkości sferoid H358 zainfekowanych Ad-p53 przez zainicjowanie apoptozy na powierzchni sugeruje, ze Ad-p53 infekuje komórki nie ulegające proliferacji, oraz że CDDP inicjuje proces apoptozy w komórkach będących w spoczynku.
Przykład 8
Zastosowanie 53 i środków uszkadzających DNA w trybach leczenia
Modele zwierzęce zastosowano jako część prób przedklinicznych, jak to opisano powyżej w przykładach 5, 6 i 7. Pacjentów, u których stwierdzono wskazania medyczne dla leczenia obejmującego przenoszenie genu z udziałem adenowirusa, można zbadać na obecność przeciwciał skierowanych przeciw adenowirusowi. Jeśli przeciwciała występują, a u pacjenta występowały w przeszłości uczulenia na substancje farmakologiczne lub naturalne, można zalecić podanie testowej dawki rzędu 103-106 zrekombinowanych adenowirusów pod ścisłą kontrolą kliniczną.
Do stosowania w leczeniu raka przy wykorzystaniu Ad5CMV-p53 zrekombinowany adenowirus, w którym zachodzi ekspresja p53 pod kontrolą odpowiednich elementów promotor/enhancer, takich jak promotor CMV, należy otrzymać i oczyścić zgodnie z metodą, która może być zaakceptowana przez Food i Drug Adminietration (FDA) do podawania ludziom. Do metod takich należy, ale nie wyłącznie, wirowanie z gradientem gęstości chlorku cezu, a następnie określanie skuteczności i czystości.
Uważa się, ze dwie podstawowe metody mogą być przydatne jako metody leczenia za pomocą adenowirusa p53, podawanie bezpośrednie lub miejscowe, oraz podawanie bardziej uogólnione. Sposoby te są przydatne w leczeniu dowolnego z wielu różnych raków, które związane są z mutacjami p53. W odniesieniu do podawania ogólnego stwierdzono, ze proste dożylne iniekcje adenowirusa wystarczają do osiągnięcia infekcji wirusowej tkanek lub miejsc odległych od miejsca iniekcji (Stratford-Perricaudet i mni, 1991b), i jako takie jest przydatne w leczeniu wszystkich stanów złośliwych związanych zp53. Wirus można podawać pacjentom dożylnie w postaci dowolnego farmakologicznie dopuszczalnego roztworu, albo na drodze infuzji w pewnym okresie czasu. Ogólnie uważa się, ze podawana skuteczna liczba funkcjonalnych cząstek wirusa powinna wynosić do 1010 do 1012.
Ponadto, zwłaszcza w przypadku raka płuc, w razie potrzeby można zastosować bardziej bezpośrednie ukierunkowanie fizyczne, w sposób analogiczny do podawania dotchawiczego regulatora konduktancji przezbłonowej mukowiscydozy (Rosenfeld i inni, 1992). Mogłoby to spowodować doprowadzenie zrekombinowanego adenowirusa p53 bliżej miejsca komórek docelowych.
Metody
In situ znakowanie dUTP z TdT w celu wykrycia apoptozy
Sferoidy H358 utrwalono w dniu 3 i zabarwiono w sposób podany w przykładzie 7. W skrócie znakowane sondy TpT kontaktowano ze ścinkami zanurzonymi w buforze TdT i inkubowano z biotynylowanym dUTP i TdT w 37°C przez 45 minut. Ścinki przykryto kompleksem awidyna-biotyna na 30 minut. Wykrywanie kolorymetryczne przeprowadzono z zastosowaniem diaminobenzydyny.
185 749
Indukcja apoptozy przez CDDP po in vivo infekcji Ad-p53
Komórki H358 (5 χ 106) w zrównoważonym roztworze soli Hanka wstrzyknięto podskórnie w prawy bok samic Balb/c myszy nu/nu. Po 30 dniach do nowotworów o średnicy 5-6 mm wstrzyknięto 200 μΐ samego ośrodka lub ośrodka zawierającego Ad-Luc (108PFU/ml) lub Ad-p53 (108 PFU/ml). Wykonano iniekcję donowotworową (100 μΐ) i około-nowotworową iniekcję w dwóch przeciwległych miejscach (po 50 μΐ). CDDP (3 mg/kg) lub kontrolną sól fizjologiczną podano dootrzewnowe. Nowotwory mierzono za pomocą cyrkla nie znając grup traktowanych, po czym objętość nowotworu wyliczano przy założeniu kulistego kształtu, przy czym przeciętną średnicę nowotworu wyliczano jako pierwiastek kwadratowy z ilorazu średnic przekroju. Każda grupa traktowana liczyła 5 myszy. Podano wielkości średnie +/- SE. Wyniki analizowano z wykorzystaniem testu t Studenta. Strzałka oznacza dzień traktowania. Przedstawiono dwa niezależne oznaczenia, p < 0,05 z dnia 5 w teście 1; p < 0,05 z dnia 7 w teście 2. Badania histologiczne z wykorzystaniem techniki znaczenia biotyną/dUTP z udziałem TdT. Nowotwory zbierano w 5 dni po rozpoczęciu leczenia i natychmiast osadzano w związku O.C.T. Zamrożone tkanki pocięto w kriostacie na sekcje o grubości 5 pm. Do sekcji dodano 1 pg/ml proteinazy K i barwiono w sposób podany powyżej. Wszystkie zwierzęta hodowano zgodnie z zaleceniami UT M.D. Anderson Institutional Animal Care and Use Committee.
Wyniki
W celu wykazania skuteczności sposobów i kompozycji kombinacji terapii z zastępowaniem genu i chemioterapii w przypadku raka u ludzi zbadano, czy sekwencyjne podawanie Ad-p53 i CDDP może wywołać apoptozę in vivo. Po 3 dniach bezpośredniego donowotworowego wstrzykiwania Ad-p53 lub dootrzewnowego podawania CDDP, w przypadku nowotworów H358 wszczepionych podskórnie myszom nu/nu stwierdzono umiarkowane spowolnienie wzrostu. Natomiast przy równoczesnym podawaniu Ad-p53 i CDDP następowała częściowa regresja nowotworów, a wielkość nowotworu pozostała statystycznie znacząco mniejsza niż dla jakiejkolwiek innej z leczonych grup. Działanie hamujące wzrost było jeszcze bardziej znaczące po dwóch cyklach leczenia (fig. 13 A). Badania histologiczne potwierdziły masową destrukcję komórek nowotworowych w obszarze, w którym wstrzyknięto Ad-p53 u myszy, którym podawano CDDP. Barwienie in situ wykazało obecność licznych komórek apoptotycznych wokół obszarów bezkomórkowych (fig. 13B-E). Natomiast w przypadku nowotworów leczonych samą CDDP lub samym Ad-p53 nie stwierdzono obszarów bezkomórkowych ani apoptotycznych.
Bardziej szczegółowo opracować można korzystnych procedurach leczenia uwzględniające następujące wskazania. Pacjentom można na wstępie wykonać bronchoskopię, aby ustalić stopień zaczopowania. Możliwie jak najwięcej nowotworu należy wyciąć endoskopowo. Pacjentom powinno się wykonywać bronchoskopię w warunkach miejscowego lub ogólnego znieczulenia. Przezoskrzelową igłę aspiracyjną Stifcor™ wprowadza się przez kanał biopsyjny w bronchoskopię. Do pozostałości miejsca nowotworu można następnie wstrzyknąć adenowirus p53 w niewielkiej objętości, około 10 ml lub poniżej.
W każdym przypadku z uwagi na to, że stosowany adenowirus jest replikacyjnie niekompetentny, nie oczekuje się szkodliwego działania samego wirusa na zdrowie pacjenta. Jednakże pacjent powinien być hospitalizowany w czasie leczenia przez co najmniej 48 godzin, aby można było śledzić ostre lub opóźnione niepożądane reakcje. Obawy związane z bezpieczeństwem przy stosowaniu adenowirusa z deficytem replikacji jako nośnika przenoszenia genu u ludzi, zostały wyjaśnione w przeszłości (Rosenfeld i inni, 1992; Jaffe i inni, 1992), z tym ze dawkę podawanego adenowirusa należy odpowiednio monitorować, aby jeszcze bardziej zminimalizować ewentualność wystąpienia niepożądanych skutków ubocznych.
Istnieją różne kryteria, które należy rozważyć jako świadczące o występowaniu potrzeby interwencji lub występowaniu toksyczności. Aby ułatwić określenie występowania toksyczności, należy wykonać zdjęcie nowotworu przed rozpoczęciem terapii. Mierzy się średnicę najdłuższą oraz prostopadłą do niej. Wielkość można podawać jako iloczyn średnic. Na podstawie tych liczb można wyliczyć szybkość ponownego wzrostu nowotworu.
Można także mierzyć czas postępu od pierwszej obserwacji przy zmniejszaniu masy nowotworu az do potwierdzenia postępującej choroby. Postępującą chorobę określa się jako
185 749 wzrost o > 25% sumy iloczynów średnic zmierzonego ogniska. Pacjent musi przejść co najmniej dwa cykle terapii przed uznaniem choroby za postępującą. Przeżycie pacjenta mierzy się od rozpoczęcia procedury.
Badania po terapii powinny obejmować wszystkie badania rutynowo przeprowadzane w terapii rakowej, obejmujące monitorowanie objawów klinicznych i pobieranie biopsji do analizy molekularnej i biologicznej, w której ocenić można charakter ekspresji różnych genów p53. Może to także dostarczyć informacji odnośnie liczby komórek, które przejęły przeniesiony gen i odnośnie względne siły działania promotora in vivo. Na podstawie uzyskanych danych pożądane mogą okazać się zmiany w terapii. Zmiany te mogą obejmować stosowanie konstruktów adenowirusowych, które wykorzystują różne promotory, albo zmianę liczby wstrzykiwanych PFU, aby zapewnić zainfekowanie większej liczby lub wszystkich komórek nowotworowych bez niefizjologicznej nadekspresji zrekombinowanych genów.
Uważa się, że ekspresja egzogennych genów przeniesionych in vivo przez adenowirus może utrzymywać się przez dłuższy okres czasu. Terapeutycznie skuteczną, długotrwałą ekspresję przeniesionych przez wirusy egzogennych genów należy odnosić do konkretnych przypadków. Geny markerowe są ograniczone pod względem przydatności w określaniu terapeutycznie potwierdzonej trwałości ekspresji genu, gdyż poziomy ekspresji wymagane do osiągnięcia poprawy jakiegokolwiek określonego zaburzenia genetycznego mogą różnić się znacznie od poziomu wymaganego do całkowitego wyleczenia innej choroby.
Jakkolwiek kompozycje i sposoby według wynalazku zostały opisane w oparciu o korzystne rozwiązania, dla specjalisty zrozumiałe jest, że wprowadzić można warianty w kompozycji, sposobach i w etapach lub w kolejności etapów opisanego sposobu bez wychodzenia poza koncepcję, istotę i zakres wynalazku. W szczególności oczywiste jest, ze pewne środki, które są chemicznie i fizjologicznie zbliżone, można zastosować zamiast środków opisanych, uzyskując takie same lub podobne rezultaty. Wszystkie takie podobne zamienniki i modyfikacje oczywiste dla specjalisty uważa się za objęte istotą, zakresem i koncepcją wynalazku określonego w załączonych zastrzeżeniach. Całą zastrzeżoną materię i sposoby można wykonać i zrealizować bez zbędnego eksperymentowania.
Odsyłacze
Następujące pozycje w stopniu, w jakim dostarczają one przykładowych procedur lub innych szczegółów uzupełniających dane przedstawione w opisie, wprowadza się jako źródło literaturowe.
185 749
Odsyłacze
Bishop (1987) Science 235:305-311.
Boeheringer Mannheim Biochemicals (1992). DOTAP for high efficiency transfections, BMBiochemica 9(1):17.
Boshart, M. et al. (1985). A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Celi, 41:521-530.
Cai, D.W., Mukhopadhyay, T., Liu, T., Fujiwara, T., and Roth, J.A. Stable expression of the wild-type p53 gene in human lung cancer cells after retrovirus-mediated gene transfer. Human Gene Ther, 4: 617-624, 1993.
Culver, K.W., Ram, Z., Wallbridge, S., Ishii, H., Oldfield, E.H., and Blaese, R.M. In νινο gene transfer with retroviral vector-producer cells for treatment of experimental brain tumors. Science, 256: S50-1552, 1992.
Casey, G. Lo-Hueh, M., Lopez, Μ. E., Vogelstein, B., and Stanbridge, E. J. (1991). Growth suppression of human breast cancer cells by the introduction of a wild-type p53 gene. Oncogene 6:1791-1797.
Ciarkę, A.R., Purdie, C.A., Harrison, D.J., Morris, R.G., Bird, C.C., Hooper, M.L., and Wylhe, A.H. Thymocyte apoptosis induced by p53-dependent and independent pathways. Naturę, 352: 849-852, 1993.
Dai, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:10892-10895.
Doyle, L.A. Mechanisms of drug resistance in human lung cancer cells. Semin Oncol, 20- 326-337, 1993.
El-Deiry, W.S., Tokino, T., Velculescu, V.E., Levy, D.B., Parsons, R., Trent, J.M., Lin, D., Mercer, E., Kinzler, K.W., and Vogelstein, B. WAF1, apotential mediator of p53 tumor suppression. Celi, 75: 817-825, 1993.
Fritsche, M., Haessler, C., and Brandner, G. Induction of nuclear accumulation of the tumor-suppressor protein p53 by DNA-damaging agents. Oncogene, 8: 307-318, 1993.
Fields et al (1990) Science 249:1046-1049.
Fujiwara, T., Grimm, E.A., Mukhopadhyay, T., Cai, D.W., Owen-Schaub, L.B., and Roth, J.A. A retroviral wild-type V p53 expression vector penetrates human lung cancer spheroids and mhibits growth by inducing apoptosis. Cancer Res, 53: 4129-4133, 1993.
Gavrieli, Y., Sherraan, Y., and Ben-Sasson, S.A. Identification of programmed celi death in situ via specific labelling of nuclear DNA fragmentation. J Celi Biol, 119: 493-501, 1992.si
Georges et al (1993) Cancer Res 53:1743-174.6.
Ghosh-Choudhury and Graham (1987) Biochem. Biophys. Res. Comm. 147:964-973.
Gluzman et al, (1982) in Eukaryotic Viral Fedora Ej (Gluzman, Y., Ed.) pp. 187-192, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York.
Graham, F.L. and A.J. van der Eb. (1973). A new techniąue for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Yirology 52:456-467.
Graham, F.L. and Prevec, L. Manipulation of adenovirus vectors. In: Murray E.J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128. New Jersey: The Humana Press Inc, 1991.
185 749
Graham, F.L., J. Smiley, W.C. Russell and R. Naim (1977). Characteristics of ahuman celi linę transformed by DNA from human adenovirus type 5. J. Gen Yirol. 36:59-72.
Grunhaus, A. and Horwitx, M. S. (1992). Adenoviruses as cloning vectors. Semin. Virology 3:237-2542.
Harper, J. E., Adami, G. R. , Wei, N., Keyomarsi, K., and Elledge, S. J. The p21 Cdkinteracting protein Cipl is apotent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Celi, 75: 805816, 1993.
Hollstein, M., Sidransky, D., Vogelstein, B., and Harris, C. (1991). p53 mutations in human cancers. Ściance 253:49-53.
Jaffe et al., (1992) Naturę Genetics 1:372-378.
Le Gal et al., (1993) Science 259:988-990.
Ledley, J. (1987). J. Pediatrics 110,1.
Levine, A. J., Momand, J., and Finlay, C. A. The p53 tumour suppressor gene. Naturę, 351: 453-456, 1991.
Lowe, S. W., Ruley, Η. E., Jacks, T., and Housman, D. E. p53-dependent apoptosis modulates the cycotoxicity of anticancer agents. Celi, 74: 957-967, 1993.
Lowe, S. W., Schmitt, E. M., Smith, S. W., Osbome, B. A., and Jacks, T. p53 is required for radiation -mduced apoptosis in mouse thymocytes. Naturę, 362: 847-849, 1993.
McGrory, W. J. et al. (1988). A simple technique for the rescue of early reqion I mutations into infectious human adenovirus type 5. Yirology 163:614-617.
Mercer, W. E. (1992). Celi cycle regulation and the p53 tumor suppressor protein. Critic. Rev. Eukar Gene Express. 2:251-263.
Mietz, et al. (1992) EMBO 11:5013-5020.
Miller 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:1.
Montenarh, M. (1992). Biochemical, immunological, and functional aspects of the growth-suppressor/oncoprotein p53. Critic. Rev. Onco. 3:233-256.
Mulhgan, (1993), Science 260:926.
Nicolau, C., et al. (1983). Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A. 80, 1068.
Ragot et al., (1993) Naturę, 361:647-650.
Ramqvist, T., Magnusson, K. P., Wang, Y., Szekeley, L., and Klein, G. Wild-type p53 induces apoptosis m a Burkitt lymphoma (BL) linę that carries mutant p53. Oncogene, 8: 1495-1500, 1993.
Rosenfeld et al., (1992) Celi 68:143-155.
Rosenfeld et al., (1991) Science, 232:431-434.
Roth, J., Ruckdeschel, Weisenburger, Editors, Thoracic Oncology, First Edition, Chapter 49, pgs 711-721, Sanders, New York, 1989.
Shaw, P., Bovey, R., Tardy, S., Sahli, R., Sordat, B., and Costa, J. Induction of apoptosis by wild-type 53 in a human colon tumor-derived celi linę. Proc Natl Acad Sci USA, 89: 4495-4499, 1992.
Spandidos, et al. (1989), J. Pathol., 757:1-10.
Stewart et al., 1992, Hum. Gene Ther. 3:267.
185 749
Stratford-Perricaudet, L. and M. Perricaudet. (1991a). Gene transfer into animals: the promise of adenovirus. p. 51-61, In O. Cohen-Haguenauer and M. Boiron (Eds.), Humań Gene Transfer, Editions John Libbey Eurotext, France.
Stratford-Perricaudet et al., (199Ib) Hum. Gene. Ther. 1:241-256.
Takahashi, T., Nau, M.M., Chiba, L, Birrer, M.J., Rosenberg, R.K., Vinocour, M., Levitt, M., Pass, H., Gazdar, A.F., and Minna, J.D. p53: a freąuent target for genetic abnormahties in lung cancer. Science, 246: 491-494,1989.
Takahashi, T., Carbone, D., Takahashi, T., Nau, M.M., Hida, T., Linnoila, L, Ueda, R., and Minna, J. D. (1992). Wild-type but not mutant p53 suppresses the growth of human lung cancer cells bearing multiple genetic lesions. 1992. Cancer Res. 52:2340-2342.
Tishler, R.B., Calderwood, S.K., Coleman, C.N., and Price, B.D. Increases in seguence specific DNA binding by p53 following treatment with chemotherapeutic and DNA damaging agents. Cancer Res, 53: 2212-2216, 1993.
Tooza, J. (1981). Molecular biology of DNA Tumor viruses, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
Torchilin et al., 1992, Faseb J. 6:2716.
Travali, et al. (1990), FASEB, 4:3209-3214.
Weinberg, R.A. (1991). Tumor suppressor gene. Science 254:1138-1145.
Wilcock, et al. (1991) Naturę 349:429-431.
Wolff, J.A., Malone, R.W., Williams, P., Chong, W., Acsadi, G., Jani, A., and Felgner, P.L. (1990) Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science 247,1465-1468.
Yonish-Rouach, E., Resnitzky, D., Rotem, J., Sachs, L., Kimchi, A., and Oren, M. Wild-type p53 induces apoptosis of myeloid leukemie cells that is inhibited by interleukin-6. Naturę, 352: 345-347, 1991.
Zakut-Houri et al. (1985), EMBO J, 4:1251-1255.
Zhan, Q., Carrier, F., and Fomace Jr., A.J. Induction of cellular p53 activity by DNAdamaging agenta and growth arrest. Mol Celi Biol, 13: 4242-4250, 1993.
Zhang, W.W., Fang, X., Branch, C.D., Mazur, W., French, B.A., and Roth, J.A. Generation and Identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis. BioTechniąues, 1993.
Zhang, W.W., Fang, X., Mazur, W., French, B.A., Georges, R.N., and Roth, J.A. Highefficiency gene transfer and high-level expression of wild-type p53 in human lung cancer cells mediated by recombinant adenovirus. Cancer Gene Therapy, 1993.
Zhu, et al., 1993, Science 261:209-211.
185 749
ZESTAWIENIE SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:
(i) ZGŁASZAJĄCY:
NAZWA: BOARD OF REGENTS, THE UNWERSITY OF TEXAS SYSTEM
ULICA: 201 West 7th Street
MIASTO: Austin
STAN: Texas
PAŃSTWO: Stany Zjednoczone Ameryki
KOD POCZTOWY: 78701
TELEFON NR: (512)499-4462
TELEFAX: (512)499-4523 (ii) TWÓRCY: ROTH, Jack A.
FUJIWARA, Toshiyoshi
GRIMM, Elizabeth A.
MUKHOPADHYAY, Tapas
ZHANG, Wei-Wei
OWEN-SCHAUB, Laurie B.
(iii) TYTUŁ WYNALAZKU: Kompozycja farmaceutyczna i zestaw terapeutyczny do uśmiercania komórki chorobowo zmienionej
185 749 (iv) LICZBA SEKWENCJI: 4 (v) ADRES DO KORESPONDENCJI:
(A) ADRESAT: ARNOLD, WHITE & DURKEE (B) ULICA: P.O. ΒΟΧ 4433 (C) MIASTO: HOUSTON (D) STAN: TEXAS (E) PAŃSTWO: STANY ZJEDNOCZONE AMERYKI (F) KOD: 72210 (vi) POSTAĆ ODCZYTYWANA KOMPUTEROWO:
(A) MEDIUM ΤΥΡΕ: Floppy disk (B) KOMPUTER: KOMPATYBILNY Z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS/ASCII (D) OPROGRAMOWANIE:PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (vii) DANE DOTYCZĄCE BIEŻĄCEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: PCT/US95/04898 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 24-APR-1995 (C) KLASYFIKACJA: NIEZNANA (viii) DANE DOTYCZĄCE WCZEŚNIEJSZYCH ZGŁOSZEŃ:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: USSN 08/233,002 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 25-APR-1994 (C) KLASYFIKACJA: NIEZNANA
185 749 (ix) INFORMACJA DOTYCZĄCA RZECZNIKA/PEŁNOMOCNIKA:
(A) NAZWISKO: HIGHLANDER, STEVEN L.
(B) NUMER REJESTRACYJNY: 37,642 (C) NUMER REJESTRACYJNY WEWNĘTRZNY: UTFC403P—/HYL (x) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:
(A) TELEFON: (512) 418-3000 (B) TELEFAX: (713) 789-2679 (C) TELEX: 79-0924 (2) INFORMACJA DOTYCZĄCA SEQ ID NO:1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ:pojedyncza (D) TOPOLOGIA:liniowa (ii) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:1 GGCCCACCCC CTTGGCTTC 20 (2) INFORMACJA DOTYCZĄCA SEQ ID NO:2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad
185 749 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ pojedyncza (D) TOPOLOGIA:liniowa (iv) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:2:
TTGTAACCAT TATAAGCTGC (2) INFORMACJA DOTYCZĄCA SEQ ID NO:3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:3:
TCGTTTCTCA GCAGCTGTTG 20 (2) INFORMACJA DOTYCZĄCA SEQ ID NO:4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆpojedyncza (D) TOPOLOGIA.limowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO4:
CATCTGAACT CAAAGCGTGG
185 749
185 749
FIG.2B FIG.2C
185 749
FIG.3A_______________________FIG.3B
185 749
FIG.3C FIG.3D
185 749
FIG.4A
FIG.4B
185 749
FIG.4C
FIG.4D
185 749
2 3 4 5 6 7 M (kDo)
FIG.5A
2 3 4 5 6 7
FIG.5B
-ρ53
- Actin
185 749
Wszględny poziom ekspresji (100%)
FIG. 6A
Ad5CMV-p53 Cl-----------------------------IC
0.5 0.5 1 3 5 9 15 15 (Dni po infekcji)
FIG.6B
185 749
3.0
2.0
1.0
Dni po infekcji
FIG. 7A
185 749
1 2 3 4 5 6
Dni po infekcji
FIG. 7B
185 749
1 2 3 4 5 6
Dni po infekcji
FIG. 7C
185 749
Dzień 1
Tydzień 6
Nagie mysze (napromieniowane 300 cGy, θθΟ)
Znieczulanie metoksyfluranem x 10$ komórek H226Br (objętość 0,1 ml)
Wprowadzanie do tchawicy techniką tracheotomii
Dzień 4 i
Dzień 5
Znieczulanie (Metoksyfluran)
Wprowadzanie do tchawicy (0,1 ml/mysz) c
x 10 PFU zrekombinowanych Nośnik kontrolny adenowirusów I
AdCMV-p53 mysz/H226Br
Ad/RSV/GL2 mysz/H226Br mysz/H226Br i' Stan konania l
Eutanazja (wdychaanie CO2)
Autopsja i wycinanie bloku śródpiersia
Pomiar wielkości nowotworu i badania histologiczne
185 749
FIG.9A « k
FIG.9B
FIG.90
FIG.9D
cm|llll|llll|llll|llll|llll|llll|
2 3
185 749
2 3 4 5
Liczba komórek (10$) Liczba komórek (10 • Ctl: CDDP (-)
O Ctl: CDDP (+)
Ad-Luc: CDDP (-) □ Ad-Luc: CDDP (+) ▲ Ad-p53: CDDP (-) ▼ Ad-p53: CDDP (+)
Dni
FIG. 10A
FIG. 10B
185 749 %
No CDDP
FIG. 10C
Φ
N
Et
O nl
Ό 'W o -P
FIG. 12A
185 749 cn
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Objętość nowotworu (mm ) Objętość nowotworu
Dni
FIG. 13A-1
e Ctl
-Θ- Ctl/CDDP
Ad-Luc
-Θ- Ad-Luc/CDDP
-T- Ad-p53
-Ar- Ad-p53/CDDP
FIG. 13A-2
185 749
FIG.11A
185 749
FIG.11B FIG.11C
FIG.11D FIG.11E
FIG.11F
FIG.11G
185 749
FIG.12E
FIG.12D
185 749
IG.13D
185 749
O mu
(Wsplótransfekcja w komórkach 293)
Homologiczna rekombinacja
Zrekombinowane adenowirusy
Oczyszczanie łysinek
Baza wirusowa Ad5CMV-p53
FIG. 1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (23)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Kompozycja farmaceutyczna do uśmiercania komórki chorobowo zmienionej, zwłaszcza, komórki raka płuc, komórki raka piersi, komórki mającej mutacje w genie p53, zawieiająca środek uszkadzający DNA, znamienna tym, że zawiera łącznie środek uszkadzający DNA i białko lub gen p53.
  2. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jako środek uszkadzający DNA zawiera adriamycynę, 5-fluorouracyl, etopozyd, kaptotecynę, aktymomycynę-D, mitomycynę C lub cisplatynę.
  3. 3. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że jako środek uszkadzający DNA zawiera cisplatynę.
  4. 4. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że jako środek uszkadzający DNA zawiera doksorubicynę.
  5. 5. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że jako środek uszkadzający DNA zawiera werapamil.
  6. 6. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że jako środek uszkadzający DNA zawiera podofilotoksynę.
  7. 7. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że jako środek uszkadzający DNA zawiera FU-5.
  8. 8. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera zrekombinowany wektor wywołujący ekspresję białka p53 w komórce zwierzęcej.
  9. 9. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że jako zrekombinowany wektor zawiera goły plazmid DNA, plazmid z liposomem, wektor retrowirusowy, wektor AAV lub zrekombinowany wektor adenowirusowy.
  10. 10. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że jako zrekombinowany wektor zawiera zrekombinowany wektor adenowirusowy.
  11. 11. Kompozycja według zastrz. 10, znamienna tym, że jako zrekombinowany wektor zawiera zrekombinowany wektor adenowirusowy znajdujący się w cząstce zrekombinowanego wirusa.
  12. 12. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że zrekombinowany wektor wywołujący ekspresję p53 zawiera fragment DNA kodujący p54 pod kontrolą promotora IE wirusa cytomegalii.
  13. 13. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że zrekombinowany wektor adenowirusowy zawiera fragment DNA kodujący p53, promotor IG wirusa cytomegalii i wczesny sygnał poliadenylacji SV40.
  14. 14. Kompozycja według zastrz. 8, znamienny tym, że zrekombinowany wektor zawiera fragment DNA kodujący p53 wprowadzony w miejsce co najmniej jednego genu koniecznego do replikacji adenowirusa.
  15. 15. Kompozycja według zastrz. 14, znamienna tym, że zrekombinowany wektor adenowirusowego zawiera fragment DNA kodujący p53 wprowadzony w miejsce regionów El A i El B.
  16. 16. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera zrekombinowany wektor adenowirusowy znajdujący się w cząstce zrekombinowanego wirusa, a jako środek uszkadzający DNA zawiera cisplatynę.
  17. 17. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jest w postaci dyspersji.
  18. 18. Zestaw terapeutyczny do uśmiercania komórki chorobowo zmienionej, zwłaszcza komórki raka płuc, komórki raka piersi, komórki mającej mutacje w genie p53, znamienny tym, ze zawiera w odpowiednim pojemniku preparat farmaceutyczny zrekombinowanego wektora zawierającego fragment DNA kodujący p53, połączony funkcjonalnie z promotorem eukariotycznym oraz preparat farmaceutyczny środka uszkadzającego DNA.
    185 749
  19. 19. Zestaw według zastrz. 18, znamienny tym, że zrekombinowany wektor i środek uszkadzający DNA znajdują się w jednym pojemniku.
  20. 20. Zestaw według zastrz. 18, znamienny tym, że zrekombinowany wektor i środek uszkadzający DNA znajdują się w różnych pojemnikach.
  21. 21. Zestaw według zastrz. 18, znamienny tym, że zawiera farmaceutyczny preparat zrekombinowanego adeno wirusa zawierający zrekombinowany wektor zawierający fragment DNA kodujący p53 połączony funkcjonalnie z promotorem eukariotycznym oraz farmaceutyczny preparat cisplatyny.
  22. 22. Zestaw wedhig zastrz. 19, znamienny tym, że preparat farmaceutyczny jest w postaci zawiesiny.
  23. 23. Zestaw według zastrz. 20, znamienny tym, że przynajmniej jeden preparat farmaceutyczny jest w postaci zawiesiny.
    * * *
    Wynalazek dotyczy nowych kompozycji zawierających środki uszkadzające DNA, stosowanych do usprawnienia interwencji chemioterapeutycznej. W innej odmianie przedmiotem wynalazku są nowe kompozycje i zestawy łączące skuteczność środków uszkadzających DNA połączone z podawaniem supresora nowotworu. Połączenie czynników uszkadzających DNA z heterogeniczną ekspresją genu supresora nowotworu prowadzi do znaczącego synergizmu, zdecydowanie przewyższającego działanie poszczególnych składników.
    Wiadomo, że stosowane obecnie sposoby leczenia raka obejmujące radioterapię, operacje chirurgiczne i chemioterapię, wykazują ograniczoną skuteczność. Jedynie z powodu raka płuc umiera rocznie w Stanach Zjednoczonych ponad 140 000 ludzi. Ostatnio przy uwzględnieniu poprawki na wiek, śmiertelność związana z rakiem płuc przekroczyła śmiertelność związaną z rakiem piersi u kobiet. Choć w wyniku wdrożenia programów ograniczających palenie, rozpowszechnienie palenia zmalało, to śmiertelność związana z rakiem płuc pozostanie na wysokim poziomie jeszcze długo w XXI wieku. Rozumne opracowywanie nowych terapii w przypadku raka płuc będzie zależało od zrozumienia biologii raka płuc na poziomie molekularnym.
    Obecnie dobrze wiadomo, że szereg nowotworów spowodowanych jest, co najmniej częściowo, nieprawidłościami genetycznymi, powodującymi nadekspresję jednego lub więcej genów, albo ekspresję jednego lub więcej nienormalnych lub zmutowanych genów. Wiadomo np., że w wielu przypadkach ekspresja onkogenów powoduje rozwój raka. „Onkogeny” są genetycznie zmodyfikowanymi genami, których zmutowany produkt ekspresji w pewien sposób zmienia normalne funkcje komórki lub kontrolę cyklu komórkowego (Spandidos i inni, 1989).
    Stwierdzono, że większość zbadanych do tej pory onkogenów „uaktywnia” się w wyniku mutacji, często mutacji punktowej, w obszarze kodującym normalnego genu komórkowego czyli „proto-onkogenu”, co prowadzi do podstawień reszt aminokwasowych w białkowym produkcie ekspresji. Taki zmieniony produkt ekspresji wykazuje nienormalne działanie biologiczne, co stanowi część procesu nowotworzenia (Travali i inni, 1990). Przyczyny leżące u podstaw mutacji mogą być różne, na przykład mutageneza chemiczna lub promieniowanie jonizujące. Obecnie zidentyfikowano i w różnym stopniu scharakteryzowano szereg onkogenów i grup onkogenów, w tym ras, myc, neu, raf, erb, src, fins, jun oraz abl (Travali i inni, 1990; Bishop, 1987).
    Uważa się, ze przy normalnym wzroście komórki działanie proto-onkogenów jako promotorów wzrostu jest równoważone przez hamujące wzrost geny będące supresorami nowotworu. Szereg czynników może przyczyniać się do powstania braku równowagi między tymi siłami, prowadząc do stanu nowotworowego. Jeden z takich czynników stanowią mutacje w genie będącym supresorem nowotworu (Weinberg, 1991).
    Ważnym genem będącym supresorem nowotworu jest gen kodujący białko komórkowe p53, będące fosfoproteiną jądrową o 53 kD, które reguluje proliferację komórek. Mutacje w genie p53 oraz utrata allelu w chromosomie 17p, w którym ten gen jest zlokalizowany, należą do najczęstszych modyfikacji zidentyfikowanych w stanach nowotworów złośliwych u ludzi. Białko p53 jest
    185 749 w znacznym stopniu konserwowane w takcie ewolucji i powstaje w wyniku ekspresji w większości normalnych tkanek. Wykazano, ze p53 typu dzikiego odgrywa rolę w regulacji cyklu komórkowego (Mercer, 1992), regulacji transkrypcji (Fields i inni, 1990 oraz Mietz i inni, 1992), w replikacji DNA (Wilcock i Lane, 1991 oraz Bargonetti i inni, 1991) oraz w indukowaniu apoptozy (Yonish-Rouach i inni, 1991 oraz Shaw i inni, 1992).
    Znane są różne mutacje allelowe p53, w których pojedyncze podstawienie zasady prowadzi do syntezy białek o zupełnie odmiennej zdolności regulowania wzrostu, a w ostateczności do stanów nowotworów złośliwych (Hollstein i inni, 1991). Stwierdzono bowiem, że gen p53 najczęściej ulega mutacji w przypadku nowotworu u ludzi (Hollstein i inni, 1991, Weinberg, 1991), przy czym jest on szczególnie związany z nowotworami spowodowanymi paleniem papierosów (Hollstein i inni, 1991, Zakut-Houri i inni, 1985). Udokumentowano także nadekspresję p53 w przypadku nowotworów piersi (Casey i inni, 1991).
    Odkryto również, że dezaktywacja genu p53 na skutek mutacji missense lub delecji stanowi najczęściej występującą zmianę w przypadku raka u ludzi (Levine i inni, 1991, Hollstein i inni, 1991). Doniesiono, że utrata działania p53 zwiększa odporność komórek na różne środki chemioterapeutyczne (Lowe i inni, 1993). Badania wykazały, że komórki ludzkiego raka płuc nie małych komórek (NSCLC) H358, w których obydwa allele p53 zostały wycięte, są odporne na leki chemioterapeutyczne, natomiast w przypadku linii komórek WTH226b, która zawiera endogenny wt-p53, łatwo następowała apoptopowa śmierć komórek w 16 godzin po zastosowaniu cisplatyny (CDDP) i etopozydu (VP-16) (T. Fujiwara, E. A. Grimm, T. Mukhopadhyay, J. A. Roth, dane nie opublikowane). Z tego względu starano się sprawdzić, czy wprowadzenie genu wt-p53 do komórek H358 przez wektor adenowirusowy może zwiększyć wrażliwość komórek na DCCP, środek sieciujący DNA, in vitro oraz in vivo.
    Wiadomo (R. Petti i inni BBRC 199 (1) 02.1994 str. 264-270), że czynnik uszkadzający DNA (wywołujący śmierć komórek) i egzogenne białko p53 dostarczone do leczonych komórek (przeciwdziałające replikacji uszkodzonego DNA) wykazują działanie przeciwstawne i w połączeniu mogłyby znieść efekt terapeutyczny, a nie spowodować wzmocnienie tego efektu. Przeciwnie, w kompozycjach i zestawach będących przedmiotem wynalazku, zastosowane składniki nie tylko nie znoszą efektu terapeutycznego jak to wynikałoby ze stanu techniki, ale w znaczącym stopniu wzmacniają skuteczność znanych środków uszkadzających DNA, zwłaszcza cis-platyny.
    Zatem otrzymano (R. Petti i inni) wnioski przeciwstawne, do ujawnionych w opisie patentowym. Na stronie, 264 tejże publikacji, w ostatnim zdaniu podsumowania przedstawiono wnioski: „Wyniki wskazują że dezaktywacja lub mutacja p53 (to jest uszkodzenie genu p53) powoduje wzrost wrażliwości komórek na te leki cytotoksyczne, których pierwotny mechanizm działania polega na uszkadzaniu DNA”. Zatem z zacytowanego zdania jasno wynika, ze to uszkodzenie genu p53, a nie sama obecność tego genu prowadzi do zwiększenia wrażliwości DNA na środki uszkadzające. Ponadto doświadczenia opisywane na stronie 266-269 omawianego artykułu wyraźnie wykazują ze rozpad jednej lub większej ilości alleli p53 powodował uwrażliwienie komórek na czynniki uszkadzające DNA, przy czym komórki poddawane działaniu antysensowych oligonukleotydów p53 były bardziej wrażliwe na czynniki uszkadzające DNA, niż komórki poddane działaniu nukleotydów sensowych, a także komórki mające wyższy poziom zmutowanego białka p53 były bardziej wrażliwe na chemoterapię, niż komórki zawierające niższe stężenie tego białka. Zgodnie z powyższym to nieprawidłowe funkcjonowanie genu p53 jest przyczyną zwiększenia wrażliwości DNA na środki uszkadzające.
    Podczas gdy nieuszkodzony gen p53 indukuje naprawę DNA komórki, który to proces, jak się można spodziewać prowadzi raczej do utrzymania komórki przy życiu, a nie jej śmierci, czyli nie powoduje jej uwrażliwiania na uszkodzenie, to opisane zjawisko wskazuje na działanie wprost przeciwne do efektu osiąganego przy pomocy kompozycji według niniejszego wynalazku.
    Stąd wskazówki przedstawione w omawianej publikacji, dotyczące zmutowanych (uszkodzonych) białek p53 lub braku białek p53 i czynników uszkadzających DNA uśmiercających komórki jasno i wyraźnie stoją w sprzeczności do sposobów i kompozycji uśmiercających komórkę przy pomocy białka lub genu kodującego p53 (nieuszkodzonego) i czynnika uszkadzającego DNA Publikacja Pettiego i wsp. wskazuje, że aktywność czynnika uszkadzającego DNA i p53 są skierowane przeciwko sobie.
    185 749
    Wiadomo, że wprowadzanie wt-p53 wywołuje apoptozę w pewnych typach linii komórek nowotworowych z p53, w których nastąpiła delecja lub mutacja (Yonish-Rouach i inni, 1991, Shaw i inni, 1992, Ramqvist i inni, 1993). Jednakże nadekspresja samego wt-p53 może nie zainicjować fragmentacji DNA w ρ-53-ujemnej linii komórek H358 (fig. 11), choć ich wzrost został zahamowany przez wektor adenowirusowy wywołujący ekspresję p53. Jest to zgodne z wcześniejszymi obserwacjami, na podstawie których stwierdzono, że trwałe klony H358 uzyskać można po przeniesieniu wt-p53 z udziałem retro wirusa, oraz że klony takie rosną wolniej niż komórki macierzyste (Cai i inni, 1993).
    Jednym z najśmielszych aspektów terapii genowej w przypadku raka jest wykorzystanie genów będących supresorami nowotworu, takich jak p53. Doniesiono, że transfekcja dzikiego typu p53 w pewnego typu komórkach raka piersi i płuc może odtworzyć regulację hamowania wzrostu w tych liniach komórek (Casey i inni, 1991; Takahashi i inni, 1992). Choć transfekcja DNA nie stanowi dającego się zrealizować sposobu wprowadzania DNA do komórek pacjenta, to wyniki te wykazują iż jeśli opracowane zostaną ulepszone środki dostarczania genu p53, doprowadzenie dzikiego typu p53 do komórek rakowych zawierających zmutowany gen p53 może stanowić skuteczny sposób leczenia.
    Obecnie badane i opracowywane są układy dostarczania genu przydatne w terapii genowej do hamowania wzrostu nowotworu. Szczególnie interesujące są nośniki przenoszące gen oparte na wirusach z uwagi na skuteczność wirusów w infekowaniu żywych komórek, w procesie tym przenoszony jest jedynie wirusowy materiał genetyczny. W zakresie tym dokonano pewnego postępu, np. w wytwarzaniu wektorów retrowirusowych skonstruowanych tak, aby dostarczały różne geny. Jednakże z wykorzystaniem wektorów retrowirusowych w terapii genowej związane są poważne problemy, gdyż ich infekcyjność zalezy od dostępności receptorów retrowirusów na docelowych komórkach, są one trudne do zatężania i oczyszczania, a ponadto ich skuteczna integracja następuje jedynie w komórkach ulegających replikacji.
    Odporność komórek nowotworowych na leki chemioterapeutyczne stanowi poważny problem w onkologii klinicznej. Uważa się, że NSCLC stanowi co najmniej 80% przypadków raka płuc; jednakże pacjenci z NSCLC zasadniczo nie reagują na chemioterapię (Doyle, 1993). Jednym z celów współczesnych badaczy raka jest znalezienie sposobów poprawy skuteczności terapii związanej z zastępowaniem genów w przypadku raka poprzez badanie oddziaływań między produktem genowym a lekami chemioterapeutycznymi. Gen kinazy tymidynowej z herpes simplex (HS-tK) po wprowadzeniu do nowotworów mózgowych z wykorzystaniem układu wektorów retrowirusowych z powodzeniem wywołuje podatność na środek przeciwwirusowy, ganciclovir (Culver i inni, 1992). Produkt genowy HS-tK jest egzogennym enzymem wirusowym, natomiast białko wt-p53 powstaje w wyniku ekspresji w normalnych komórkach, co sugeruje, że modulowanie odporności na chemioterapię poprzez zmiany w ekspresji wt-p53 może stanowić wariantowe podejście poprzez wykorzystanie drogi z udziałem endogennego programu genetycznego.
    Układ adenowirusowy wykazuje potencjalne zalety w odniesieniu do dostarczania genów in vivo, takie jak łatwość wytwarzania wirusów o wysokim mianie, wysoka skuteczność infekcji oraz infekcyjność w stosunku do wielu typów komórek. Jednakże stabilność i czas trwania ekspresji wprowadzonego genu są w dalszym ciągu kontrowersyjne. Wzrost poziomów p53 w komórkach wrażliwych na leki chemioterapeutyczne może nastąpić w ciągu 6 godzin po pobudzaniu uszkadzającym DNA (Fritsche i inni, 1993, Zhan i inni, 1993), choć wzrost aktywności wiązania DNA p53 można odwrócić w ciągu 4 godzin, jeśli bodziec usunie się (Tishler i inni, 1993). Z tego względu wysoki poziom ekspresji p53 można utrzymać nawet po zaniku ekspozycji na lek. Ekspresja białka wt-p53 przez Ad-p53 osiąga szczyt w 3 dniu po infekcji (14-krotnie wyższa niż dla endogennego dzikiego typu) i spada do niskiego poziomu w dniu 9 (Zhang i inni, 1993). Sugeruje to, ze przejściowy wysoki poziom ekspresji wt-p53 wystarcza do zainicjowania programu cytotoksycznego w komórkach rakowych.
    Białko p53 odgrywa istotną rolę jako determinanta wrażliwości na chemioterapię ludzkich komórek raka płuc. Szereg sposobów leczenia, obejmujących operacje chirurgiczne, chemioterapię i radioterapię wypróbowano w przypadku ludzkiego NSCLC, z tym że stopień
    185 749 długotrwałego przeżycia pozostaje na niezadowalającym poziomie. Istnieje zapotrzebowanie na terapię łączoną wykorzystywaną samodzielnie lub jako skuteczna terapia wspomagająca do zapobiegania miejscowym nawrotom po resekcji nowotworu pierwotnego, albo jako sposób leczenia, który można zastosować poprzez doogniskowe iniekcje w przypadku odpornego na leki pierwotnego, przerzutowego lub miejscowo powracającego raka płuc. Istnieje także zapotrzebowanie na kompozycje i sposoby w celu opracowania, rozwinięcia i usprawnienia klinicznej przydatności nowych kompozycji do leczenia raka. Ponadto takie sposoby i kompozycje muszą potwierdzić swą przydatność w testach in vivo.
    Wynalazek odnosi się do zapotrzebowania na ulepszone preparaty terapeutyczne stosowane do uśmiercania komórek w wyniku połączonego działania genu lub białka będącego supresorem nowotworu oraz środka lub czynnika uszkadzającego DNA. Przedmiotem wynalazku są również kompozycje i sposoby, w tym obejmujące zastosowanie przenoszenia genu z udziałem wirusów, do wspomagania ekspresji w docelowych komórkach, genu typu dzikiego będącego supresorem nowotworu, takiego jak p53, oraz do doprowadzania środka lub czynnika, który inicjuje uszkadzanie DNA. Nieoczekiwanie stwierdzono, że dzięki zastosowaniu ujawnionych kompozycji można było zainicjować zaprogramowane uśmiercanie komórek, określane także jako apoptoza, w znaczącej liczbie komórek docelowych.
    Wykorzystując wynalazek wykazano znaczący jego wpływ na regulację wzrostu komórek, zwłaszcza wzrostu komórek nowotworowych. Powstawanie i wzrost komórek nowotworowych, określane również jako „transformacja”, opisuje powstawanie i rozwój komórek, które utraciły zdolność do kontrolowania podziału komórkowego, tak że stały się komórkami rakowymi. Przewiduje się, ze szereg różnych typów transformowanych komórek, takich jak mięsaki, czerniaki, chłoniaki oraz wiele różnych stałych nowotworów itp., może stanowić potencjały cel zastosowania sposobów i kompozycji według wynalazku. Jakkolwiek dowolna tkanka wykazująca wzrost złośliwych komórek może stanowić cel, korzystnymi celami są tkanki płuc i piersi. Wykazano, że zrekombinowany wektor, wprowadzenie którego prowadzi do ekspresji p53, jest zdolny do znaczącego zmniejszania szybkości wzrostu komórek, jeśli zostanie zastosowany w połączeniu ze środkiem uszkadzającym DNA.
    Jedna odmiana wynalazku dotyczy kompozycji farmaceutycznych uśmiercających komórki chorobowo zmienione zawierająca białko lub gen p53 w kombinacji ze środkiem uszkadzającym DNA. Do komórek, które można uśmiercać przy pomocy kompozycji według wynalazku należą np. niepożądane, ale łagodne komórki, takie jak komórki łagodnego przerostu gruczołu krokowego lub nadaktywne komórki tarczycy; komórek związanych z chorobami autoimmunizacyjnymi, takich jak komórki B, które wytwarzają przeciwciała mające znaczenie w przypadku zapalenia stawów, toczenia, miastenii, metaplazji, dysplazji itp. Jakkolwiek ogólnie możliwy do stosowania w uśmiercaniu wszystkich niepożądanych komórek, wynalazek jest szczególnie przydatny w uśmiercaniu komórek złośliwych. „Komórki złośliwe” określa się jako komórki, które utraciły zdolność do regulowania cyklu podziału komórkowego, co prowadzi do fenotypu „transformowanego” lub „rakowatego”.
    Korzystnie kompozycję farmaceutyczną stosuje się do komórek raka płuc, komórek raka piersi, komórek mających mutacje w genie p53.
    W celu uśmiercenia komórek, takich jak komórki złośliwe lub przerzutowe, z wykorzystaniem kompozycji i zestawów według wynalazku należy ogólnie skontaktować komórkę „docelową” z białkiem lub genem p-53 oraz co najmniej jednym środkiem uszkadzającym DNA, w łącznej ilości skutecznie uśmiercającej komórki. Komórki mogą być kontaktowane z białkiem lub genem p53 i jednym lub więcej środkami albo czynnikami uszkadzającymi DNA w tym samym czasie. Można to osiągnąć kontaktując komórkę z pojedynczą kompozycją lub preparatem farmakologicznym, który zawiera obydwa środki, albo też kontaktując komórkę z dwoma różnymi kompozycjami w tym samym czasie, przy czym jedna kompozycja zawiera białko lub gen p53, a druga zawiera środek uszkadzający DNA.
    Możliwa jest oczywiście również sytuacją gdy komórka docelowa jest najpierw wystawiana na działanie jednego lub więcej środków uszkadzających DNA, a następnie kontaktowana z białkiem lub genem p53, albo tez sytuacja odwrotna. Jednakże w tych rozwiązaniach, w których czynnik uszkadzający DNA i p53 wprowadza się osobno do komórki, należy zazwyczaj zapewnić,
    185 749 aby nie upłynął znaczący okres czasu pomiędzy momentem każdego podawania, tak aby środek uszkadzający DNA i p53 mogły w dalszym ciągu wywierać korzystne łączne działanie na komórkę. W takich przypadkach uważa się, ze należy kontaktować komórkę z obydwoma środkami w odstępie czasu wciągu około 12-24 godzin, a jeszcze korzystniej w odstępie czasu wciągu około 6-12 godzin, przy czym czas opóźnienia wynoszący zaledwie około 12 godzin jest najkorzystniejszy.
    W użytym znaczeniu określenia „kontaktowanie” i „wystawianie na działanie” w odniesieniu do komórki opisuje proces, zgodnie z którym gen lub białko będące supresorem nowotworu, takie jak p53, oraz środek lub czynnik uszkadzający DNA, doprowadza się do komórki docelowej lub umieszcza w bezpośrednim sąsiedztwie komórki docelowej. Aby osiągnąć uśmiercenie komórki obydwa środki doprowadza się do komórki w łącznej ilości skutecznie uśmiercającej komórkę czyli inicjującej programowaną śmierć komórki lub apoptozę. Określenia „Uśmiercanie”, „programowane uśmiercanie komórki” oraz „apoptoza” wykorzystywane są wymiennie w opisie do opisania szeregu zjawisk wewnątrzkomórkowych prowadzących do śmierci komórki docelowej. Proces śmierci komórki obejmuje uaktywnianie wewnątrzkomórkowych proteaz i nukleaz, co prowadzi np. do zaniku jądra komórkowego i fragmentacji jądrowego DNA. Zrozumienie dokładnego mechanizmu, zgodnie z którym różne wewnątrzkomókowe cząsteczki oddziały wują w celu doprowadzenia do śmierci komórki, nie jest niezbędne do realizacji wynalazku.
    Jako środki lub czynniki uszkadzające DNA określa się dowolny związek chemiczny lub sposób uszkadzania DNA, który po zadziałaniu na komórkę wywołuje uszkodzenie DNA. Do takich środków i czynników należy promieniowanie o długościach fali, które inicjują uszkodzenie DNA, takich jak promieniowanie γ, promienie rentgenowskie, promieniowanie UV, mikrofale, emisje elektronów itp. Wiele związków chemicznych, określanych jako „środki chemioterapeutyczne” działa w ten sposób, że inicjuje uszkodzenie DNA, przy czym wszystkie one uważa się za możliwe do stosowania w kombinowanych sposobach leczenia według wynalazku. Za przydatne środki chemioterapeutyczne uważa się np. adriamycynę, 5-fluorouracyl (5FU), etopozyd (VP-16), kaptotecynę, aktynomycynę-D, mitiomycynę C, cisplatynę (CDDP), a nawet nadtlenek wodoru. Wynalazek obejmuje również zastosowanie kombinacji jednego lub więcej środków uszkadzających DNA, opartych na promieniowaniu lub rzeczywistych związków, takich jak zastosowanie promieni rentgenowskich wraz zcisplatyną lub zastosowanie cisplatyny z etopozydem. W pewnych rozwiązaniach zastosowanie cisplatyny w kombinacji z białkiem lub genem p53 stanowi szczególnie korzystne rozwiązanie.
    Skonstruować można wiele różnych zrekombinowanych plazmidów i wektorów w celu osiągnięcia ekspresji białka p53 i wykorzystać je do wprowadzania p53 do komórki. Należy do nich np. zastosowanie gołego DNA i plazmidów p53 do bezpośredniego przenoszenia materiału genetycznego do komórki (Wolfe i inni, 1990); preparaty DNA kodującego p53 uwięzionego w liposomach (Ledley i inni, 1987) lub w proteoliposomach zawierających białka receptorowe koperty wirusa (Nicolau i inni, 1983); oraz kodujący p53 DNA sprzężony z kompleksem polilizynowo-glikoproteinowym jako nośnikiem.
    Można także uwzględnić zastosowanie zrekombinowanych wirusów zmodyfikowanych tak, aby wytwarzały p53 w wyniku ekspresji. Zastosować można szereg wektorów wirusowych, takich jak wektory retrowirusów, wirusa opryszczki (patent USA nr 5 288 641, który wprowadza się jako źródło literaturowe), wirusa cytomegalii itp., jak to opisał Miller (Miller, 1992); a także zrekombinowanego adenozasocjowanego wirusa (wektory AAV), tak jak to opisano w patencie USA nr 5 139 941, który wprowadza się jako źródło literaturowe; a zwłaszcza zrekombinowane wektory adenowirusowe. Techniki wytwarzania infekcyjnych wirusów ze zdefektowaną replikacją są dobrze znane, patrz np. Ghosh-Choudhury i Graham (1987), McGrory i inni (1988) oraz Gluzman i inni (1982), przy czym wszystkie te publikacje wprowadza się jako źródła literaturowe.
    Szereg parametrów in vitro można wykorzystać do ustalania efektu zapewnianego przez kompozycje i zestawy według wynalazku. Do parametrów tych należy np. obserwacja liczby komórek netto przed i po wystawieniu na działanie opisanych kompozycji, a także średnicy powstałych wielokomórkowych sferoidów nowotworowych, takich jak kolonie powstałe w hodowli
    185 749 tkankowej. Uśmiercanie komórek in vitro jest szczegółowo przedstawione w przykładzie 7 opisu. Można także mierzyć parametry, które są charakterystyczne dla komórek ulegających zaprogramowanemu uśmiercaniu, takich jak fragmentacja komórkowego genomowego DNA na fragmenty o wielkości nukleosomów, ogólnie obserwowana jako rozdzielanie się fragmentów w elektroforezie na żelu agarozowym, barwienie DNA, oraz porównanie DNA z drabinką wielkości DNA. Fragmenty nukleosomów identyfikuje się jako postępujące stopnie lub szczebelki monomerów i multimerów o podstawowej jednostce wynoszącej około 200 par zasad.
    Podobnie „terapeutycznie skuteczna ilość” stanowi taka ilość białka lub genu p53 oraz środka uszkadzającego DNA, która po podaniu zwierzęciu w kombinacji skutecznie uśmierca komórki tego zwierzęcia. Odnosi się to w szczególności do uśmiercania komórek rakowych takich jak komórki raka płuc, piersi i okrężnicy u zawierającego nowotwór osobnika będącego zwierzęciem lub człowiekiem. W związku z tym „terapeutycznie skuteczne kombinacje” stanowią zasadniczo łączne ilości p53 i środków uszkadzających DNA, które powodują uśmiercenie większej ilości komórek niż każdy z elementów stosowanych odrębnie, a korzystnie łączne ilości, które wywołują synergistyczne zmniejszenie wielkości nowotworu.
    Badanie in vivo i ex vivo pewnych parametrów śmierci komórek stanowi w związku z tym skuteczny środek oceny efektywności działania kompozycji i zestawów według wynalazku. Tak np. obserwowanie wpływów na inhibitowanie rozwoju nowotworu, określanie na podstawie ekspresji TdT zamrożonych sekcji tkanek, albo wykorzystanie innych metod barwienia oraz docelowych antygenów, jest znane specjalistom w dziedzinie patologii. Oczywiście inne środki oznaczania masy, rozwoju i żywotności nowotworu można także wykorzystać do oceny uśmiercania docelowych komórek. W szczególności można oceniać efekty na różnych zwierzęcych modelach raka, w tym również takich, w których ludzkie komórki rakowe są zlokalizowane wewnątrz zwierzęcia. W przeciwieństwie do AIDS wiadomo, że zwierzęce modele raka umożliwiają przewidywanie z dużym prawdopodobieństwem sposoby leczenia ludzi (Roth i inni, redakcja (1989)). Jedno z przykładowych rozwiązań modelu zwierzęcego umożliwiającego takie przewidywanie stanowi model, w którym ludzkie komórki raka małych komórek płucnych (komórki H358) hoduje się podskórnie. Wykorzystując taki układ wykazano, ze adenowirus przenoszący p53, wprowadzony do nowotworu, wraz z równoczesnym podawaniem środka chemioterapeutycznego, powoduje nieoczekiwane skuteczne zmniejszenie wielkości nowotworu.
    Szczególnie korzystna kompozycja obejmuje zrekombinowany adenowirus lub cząstkę, która zawiera zrekombinowany wektor adenowirusowy zawierający fragment DNA kodujący p53, funkcjonalnie połączony z promotorem zdolnym do kierowania ekspresją p53 w danym typie komórek.
    Fragment DNA kodujący p53 w wektorze może stanowić sekwencja genomowa, z tym, ze dla uproszczenia przyjmuje się, iż zazwyczaj korzystnie stosuje się sekwencję cDNA p53, gdyż sekwencje takie są łatwo dostępne i o wiele łatwiejsze w manipulowaniu. Oprócz jednostki ekspresji p53 i obszaru promotora wektor zazwyczaj zawiera również sygnał poliadenylacji, taki jak wczesny gen SV40, albo gen protaminy, sygnał poliadenylacji itp.
    W korzystnych wykonaniach uważa się, że pożądane byłoby usytuowanie obszaru ekspresji p53 pod kontrolą silnego konstytutywnego promotora takiego jak promotor CMV, wirusowy promotor LTR, RSV lub SV40, albo promotor zasocjowany z genami, w przypadku których występuje wysoki poziom ekspresji w komórkach ssaków, taki jak promotory czynnika 1 wydłużenia lub aktyny. Wszystkie takie warianty uważa się za przydatne w realizacji wynalazku. Obecnie szczególnie korzystnym promotorem jest promotor IE wirusa cytomegalii (CMV).
    Według wynalazku gen p53 lub cDNA wprowadzić można do zrekombinowanego adenowirusa po prostu przez insercję lub dodanie sekwencji kodującej p53 do genomu wirusowego. Jednakże korzystnymi adenowirusami są wirusy ze zdefektowaną replikacją, w których wirusowy gen odgrywający decydującą rolę w replikacji i/lub pakowaniu, został wycięty z adenowirusowego konstruktu wektorowego, co umożliwia wprowadzenie obszaru ekspresji p53 na jego miejsce. Dowolny gen, zarówno decydujący (np. El A, E1B, E2 i E4) jak i nie decydujący (np. E3) dla replikacji, można wyciąć i zastąpić p53. Szczególnie korzystne są te
    185 749 wektory i wiriony, w których wykonano delecję obszarów El A i E1B wektora adenowirusowego, a na ich miejsce wprowadzono obszar ekspresji p53, jak to przedstawia przykładowo struktura genomu na fig. 1.
    Techniki wytwarzania adenowirusów ze zdefektowaną replikacją są dobrze znane; patrz np Ghosh-Choudhury i Graham (1987), McGrory i inni (1988) oraz Gluzman i inni, przy czym wszystkie te publikacje wprowadza się jako źródła literaturowe. Wiadomo także, że różne linie komórkowe wykorzystać można do reprodukcji adenowirusów, pod warunkiem, ze pasują one do jakiegokolwiek defektu replikacji, który może występować. Korzystną linię komórek stanowi linia ludzkich komórek 293, z tym stosować można również dowolną inną linię komórek, w których możliwa jest replikacją, np. w korzystnym przypadku takich, w których zachodzi ekspresja El A i E1B. Komórki można rozmnażać na szalkach plastikowych lub w hodowli w zawiesinie, aby uzyskać bazę wirusową.
    Wynalazek nie ogranicza się wyłącznie do wirusa pozbawionego El i komórek, w których następuje ekspresja El. Zgodnie z wynalazkiem można również wykorzystać inne komplementarne kombinacje wirusów i komórek gospodarzy. Stosować można wirusy pozbawione funkcyjnego E2 oraz komórki, w których zachodzi ekspresja E2, a także wirusy pozbawione funkcyjnego E4 oraz komórki, w których zachodzi ekspresja E4. Gdy wykona się delecję genu, który nie jest istotny dla replikacji i zastąpi się go np. genem E3, defekt taki nie musi być specyficznie uzupełniany przez komórkę gospodarza.
    Uważa się, ze poza wymaganiem, aby wektory adenowirusowe zostały przekonstruowane tak, aby zachodziła ekspresja p53, charakter wyjściowego adenowirusa nie ma decydującego znaczenia dla powodzenia w realizacji wynalazku. Zastosować można dowolny adenowirus spośród 42 różnych znanych serotypów lub podgrup A-F. Adenowirus typu 5 z podgrupy C stanowi korzystny materiał wyjściowy do uzyskiwania wektora adenowirusa z warunkowo zdefektowaną replikacją do stosowania do uśmiercania komórek. Jest to związane z tym, ze adenowirus 5 jest ludzkim adenowirusem, w przypadku którego istnieje znacząca informacja biochemiczna i genetyczna, a ponadto historycznie został on wykorzystany w największej ilości konstrukcji, w których wykorzystano adenowirus jako wektor.
    Kompozycje i zestawy według wynalazku w równym stopniu są przydatne do uśmiercania komórki lub komórek in vitro jak i in vivo. Gdy komórki, które mają być uśmiercone, znajdują się w zwierzęciu, jak to jest w przypadku komórek raka płuc, piersi lub okrężnicy, albo innych komórek przenoszących mutację p53, zarówno białko lub gen p53, jak i środek uszkadzający DNA, będzie się podawać zwierzęciu w farmakologicznie dopuszczalnej formie. W użytym znaczeniu określenie „farmakologicznie dopuszczalna forma” odnosi się zarówno do formy dowolnej kompozycji, którą można podawać zwierzęciu, jak i do postaci kontaktowania zwierzęcia z promieniowaniem, np. do sposobu, w jaki obszar ciała zwierzęcia napromieniowuje się stosując np. promieniowanie y, promienie rentgenowskie, promieniowanie UV, mikrofale, emisje elektronów itp. Zastosowanie promieniowania i fal uszkadzających DNA jest znane specjalistom w dziedzinie radioterapii.
    Potwierdzeniem zaskakującego powodzenia wynalazku jest stwierdzenie, że zastosowanie wirusa Ad5CMV-p53 w kombinacji z cisplatynąuzyskuje się znaczące wyniki w badaniach modelowych na nagiej małpie. Łączona terapia wirusem ze środkiem uszkadzającym DNA znacząco hamuje onkogenezę komórek H358, czyli komórek, które zazwyczaj tworzą nowotwory o znacznej masie. Onkogenezę komórek raka piersi jest hamowana przez zastosowanie Ad5CMV-p53, ale nie przez wirus kontrolny, w którym zachodzi ekspresja lucyferazy, co świadczy o tym, ze białko p53 w kombinacji ze środkiem uszkadzającym DNA wykazuje wysoką skuteczność terapeutyczną.
    Przy dostarczaniu DNA in vivo zaleca się stosowanie dowolnego układu dostarczania genu, takiego jak układu dostarczania genu, takiego jak transfekcja z udziałem wirusa i liposomu. W użytym znaczeniu określenie „transfekcja” oznacza docelowe dostarczanie DNA do komórek eukariotycznych z wykorzystaniem układów doprowadzających, takich jak sposoby przenoszenia w wykorzystaniem adenowirusa, AAV, retrowirusa lub plazmidu dostarczającego gen. Specyficzność wirusowego dostarczania genu można dobrać tak, aby preferencyjnie skierować gen do konkretnej komórki docelowej, np. przez zastosowanie wirusów, które są zdolne do infekowania
    185 749 konkretnych typów komórek. Oczywiście różne rodzaje gospodarzy wirusów będą decydować o doborze wirusa do przenoszenia genu, a także prawdopodobnego genu będącego supresorem nowotworu, którego ekspresja spowoduje uśmiercenie danego typu złośliwych komórek.
    Przewiduje się również, że można dostarczać środek chemioterapeutyczny uszkadzający DNA różnymi sposobami, np. wykorzystując pozajelitowe sposoby wprowadzania takie jak iniekcja dożylna i podskórna, itp. Sposoby takie są znane specjalistom w dziedzinie podawania leków, a ponadto są opisane w sekcjach dotyczących preparatów farmaceutycznych i sposobów leczenia.
    Przy dostarczaniu genu in vit.ro zastosować można szereg sposobów takich jak np. transfekcja z udziałem fosforanu wapnia lub siarczanu dekstranu; elektroporacja; ostrzeliwanie pociskami szklanymi itp. Sposoby takie są znane specjalistom, przy czym dokładne kompozycje i sposoby realizacji staną się oczywiste po zapoznaniu się z opisem.
    Jeden z wariantów dotyczy kompozycji, w tym preparatów farmaceutycznych zawierających białko lub gen p53 w kombinacji ze środkiem uszkadzającym DNA takim jak cisplatyna. W kompozycjach takich p53 może być w postaci segmentu DNA, zrekombinowanego wektora lub zrekombinowanego wirusa, który jest zdolny do ekspresji białka p53 w komórce zwierzęcia. Kompozycje takie, w tym kompozycje zawierające układ doprowadzania genu oparty na zrekombinowanym wirusie, taki jak cząstka adenowirusa, można przyrządzać do podawania in vivo przez zdyspergowanie w farmakologicznie dopuszczalnym roztworze lub buforze. Do korzystnych farmakologicznie dopuszczalnych roztworów należą obojętne roztwory soli buforowane fosforanem, mleczanem, Tris itp.
    Oczywiście przy stosowaniu wirusowych układów doprowadzania należy zasadniczo oczyścić wirion, tak aby zasadniczo uwolnić go od niepożądanych zanieczyszczeń, takich jak zdefektowane zakłócające cząstki wirusowe albo endotoksyny, a także inne pirogeny, tak aby nie wywołać niepomyślnych reakcji w komórce, zwierzęciu lub osobniku, któremu podaje się konstrukt wektorowy. Korzystne sposoby oczyszczania wektora obejmują wykorzystanie wyporowych gradientów gęstości, takie jak wirowanie z gradientem chlorku cezu.
    Do korzystnych kompozycji farmaceutycznych według wynalazku należą te, które zawierają, w farmakologicznie dopuszczalnym roztworze lub buforze, białko p53, albo jeszcze korzystniej gen p53, w kombinacji z chemioterapeutycznym środkiem uszkadzającym DNA. Do przykładowych środków chemioterapeutycznych należy adriamycyna, 5-fluorouracyl, kaptotecyna, aktynomycyna-D, nadtlenek wodoru, mitiomycyna C, cisplatyna (CDDP) i etopozyd (VP-16), przy czym szczególnie korzystne jest stosowanie cisplatyny.
    Kolejne korzystne wykonania według wynalazku stanowią zestawy do stosowania w uśmiercaniu komórek, takich jak złośliwe komórki, które można przyrządzać w postaci zestawów terapeutycznych do stosowania w leczeniu raka. Zestawy według wynalazku będą zazwyczaj zawierać w odpowiednich pojemnikach preparat farmaceutyczny zrekombinowanego wektora zdolnego do ekspresji białka p53 w komórce zwierzęcia, oraz preparat farmaceutyczny środka uszkadzającego DNA. Zrekombinowane wektory i środki uszkadzające DNA mogą znajdować się w jednym pojemniku, albo też składniki te można dostarczać w różniących się lub odrębnych pojemnikach. W korzystnym wykonaniu zrekombinowany wektor będzie stanowić zrekombinowany wektor adenowirusowy, wytwarzający w wyniku ekspresji p53, znajdujący się w cząstce adenowirusa, a środkiem uszkadzającym DNA jest cisplatyna.
    Składniki zestawu korzystnie dostarcza się w postaci ciekłego roztworu lub jako wysuszony proszek. Gdy składniki dostarcza się w postaci ciekłego roztworu, ciekły roztwór stanowi roztwór wodny, przy czym szczególnie korzystny jest sterylny roztwór wodny. Gdy odczynniki lub składniki dostarcza się w postaci suchego proszku, proszek można odtworzyć przez dodanie odpowiedniego rozpuszczalnika. Przewiduje się, ze rozpuszczalnik można również dostarczać w innym pojemniku.
    Krótki opis rysunków
    Załączone rysunki stanowią część opisu i zostały załączone, aby dokładniej przedstawić pewne aspekty wynalazku. Wynalazek może stać się bardziej zrozumiały dzięki jednemu lub więcej z tych rysunków w połączeniu ze szczegółowym opisem konkretnych rozwiązań.
    185 749
    Figura 1. Schemat wytwarzania zrekombinowanego adenowirusa p53. Kasetę ekspresji p53 wstawiono między miejsca Xba I i Cla I pXCJL.l. Wektor ekspresji p53 (pEC53) zrekombinowany plazmid pJM17 współtransfekowano w komórkach 293. Transfekowane komórki utrzymywano na pożywce aż do wystąpienia efektu cytopatycznego. Identyfikacji nowych wytworzonych zrekombinowanych adenowirusów p53 (Ad5CMV-p53) wykonano na podstawie analizy PCR DNA stosując matryce DNA uzyskane z supematantów CPE poddanych obróbce proteinazą K i ekstrakcji fenolem.
    Figura 2A. Mapa wykorzystana w analizie strukturalnej DNA Ad5CMV-p53. Mapa genomowego DNA Ad5CMV-p53 z lokalizacją kasety ekspresji p53, starterami PCR i miejscami restrykcji. Genom, którego wielkość wynosi około 35,4 kb, podzielono na 100 jednostek mapowych (1 m.u. = 0.35 kb). Kasetę ekspresji p53 podstawiono w obszarze El (1,3-9,2 m.u.) genomu Ad5. Starter 1 zlokalizowany jest w pierwszym intronie w dół od promotora głównego genu IE ludzkiego CMV. Starter 2 jest zlokalizowany w sygnale wczesnego poliadenylowania SV40. Obydwa startery, 15-20 bp od insertu cDNA na obydwu końcach, określają produkt PCR o 1,40 kb. Startery 3 i 4 są zlokalizowane odpowiednio w 11 m.u. i 13.4 m.u. genomu Ad5, który określa specyficzny względem genomu wirusowego produkt PCR o 0.86 kb.
    Figura 2B. Analiza na żelu agarozowym produktów PCR. Dwie pary starterów, które określają fragmenty DNA 1,4-kb (p53) i 0,86-kb (Ad5), zastosowano w każdej reakcji. Jako matryce DNA w każdej reakcji zastosowano plazmid pEC53 (ścieżka 1), Ad5/RSV/GL2 DNA (ścieżka 2), bez DNA (ścieżka 3) i Ad5CMV-p53 DNA (ścieżka 4). Ścieżka zaznaczona jako (M) odpowiada markerom ciężaru cząsteczkowego.
    Figura 2C. Mapowanie restrykcyjne DNA Ad5CMV-p53. Próbki DNA Ad5CMV-p53 oczyszczonego metodą gradientu CsCl strawiono odpowiednio bez enzymu (U), Hind III (H), Barn HI (B), Eco RI (E), i Cla I (C) analizowano na 1% żelu agarozowym. Ścieżki zaznaczone jako (M) odpowiadają markerom ciężaru cząsteczkowego.
    Figura 3A, fig. 3B, fig. 3C i fig. 3D.
    Działania cytopatycznego na 293 zrekombinowa-nych adenowirusów. Fig. 3A, fig. 3B, fig. 3C i fig. 3D stanowią serię obrazów z kontrastem fazowym (x 400) komórek 293. Na fig. 3A, fig. 3B, fig. 3C i fig. 3D pokazano 4 fazy pojedynczego obrazu. Figura 2A, przed transfekcją; fig. 3E, ujemna próba kontrolna w dniu 12 po transfekcji; fig. 3C, wystąpienie CPE w dniu 12 po transfekcji; fig. 3D, dopełnienie CPE w dniu 14 po transfekcji.
    Figury 4A, fig. 4B, fig. 4C i fig. 4D. Immunohistologia komórek zainfekowanych zrekombinowanymi adenowirusami. Figury 4A, fig. 4B, fig. 4C i fig. 4D stanowią serię irnmunohistologicznych obrazów komórek H358. Na fig. 4A, fig. 4B, fig. 4C i fig. 4D pokazano 4 zdjęcia pojedynczego obrazu. Infekcyjność Ad5CMV-p53 w komórkach H358. Komórki H358 infekowano Ad5CMV-p53 lub Ad5/RSV/GL2 przy 50 PFU/komórkę przez 24 godziny. Sam ośrodek zastosowano jako infekcję pozorną. Zainfekowane komórki analizowano metodą immunobarwienia. Na fig. 4A przedstawiono infekcję pozorną sondowaną przeciwciałem przeciw-p53. Na fig. 4B pokazano komórki zainfekowane kontrolnym Ad5/RSV/GL2 i sondowaną przeciwciałem przeciw-p53. Na fig. 4C pokazano komórki zainfekowane Ad5CMVp53 nie spokrewnionym przeciwciałem (MOPC-21). Na fig 4D pokazano komórki po infekcji Ad5CMV-p53 sondowaną przeciwciałem przeciw-p53. Jako przeciwciało przeciw-p53 użyto Pab 1801, a do barwienia wykorzystano metodę awidynobiotynową.
    Figura 5A. SDS-PAGE zel zabarwiony błękitem Coomassie w celu porównania względnych poziomów ekspresji egzogennego p53 w komórkach H358. Próbki komórek H358 zainfekowanych Ad5CMV-p53 lub Ad5/RSV/GL2 przy 30 PFU/komórkę przygotowano w 24 i 72 godziny po infekcji. Barwienie błękitem Coomassie wyników analizy SDS-PAGE, wykazujące względne ilości wprowadzonych próbek białka. Ścieżki 1 i 4 zawierają próbki komórek zainfekowane Ad5/RSV/GL2. Ścieżki 2 i 3 zawierają próbki komórek zainfekowanych dwoma odrębnymi zbiorami Ad5CMV-p53, w 24 godziny po infekcji. Ścieżki 5 i 6 zawierają próbki komórek zainfekowanych dwoma odrębnymi zbiorami Ad5CMV-p53, w 72 godziny po infekcji. Ścieżka 7 przedstawia pozornie zainfekowaną próbkę H358 w 72 godziny po infekcji. Ścieżka M, wstępnie barwione markery ciężaru cząsteczkowego w kDa (GIBCO-BRL).
    185 749
    Figura 5B. Analiza metodą blottingu Westema identycznego zestalonego żelu, jak z SDS-PAGE na fig. 5A. Względne poziomy ekspresji p53 analizowano metodą blottingu Westema stosując przeciw-p53. Jako pierwotne przeciwciała zastosowano monoklonalne przeciwciała przeciw białku p53 (PAb 1801, Oncogene Science Inc.) i β-aktynę (Amersham Inc.). Skoniugowane z HRP drugie przeciwciało oraz wywoływacz ECL otrzymano z Amersham Inc. Wirusowo zainfekowane komórki H358 analizowano metodą blottingu Westema. Start i kierunek błotu Westema z fig. 5B są takie same jak na fig. 5 A.
    Figura 6. Przebieg czasowy ekspresji p53 oznaczony metodą blottingu Westema. Szereg szalek z komórkami H358 zainfekowano Ad5CMV-p53 przy 10 PFU/komórkę. Lizaty komórek wykonano w określonych odstępach czasu po infekcji. Bioty Westema sondowano równocześnie przeciwciałami przeciw-p53 i przeciw-aktynie. Ścieżki oznaczone jako „C” reprezentują ujemne próby kontrolne. Histogram przedstawia względne ilości p53 oznaczone densytometrycznie.
    Figura 7A. Krzywa wzrostu wirusowo zainfekowanych ludzkich komórek raka płuc z linii komórek H358. Komórki zaszczepiono w ilości 105 (P komórkek/szalkę (60 mm) i 6 szalek/linię komórek. Po 24 godzinach komórki zainfekowano Ad5CMV-p53 lub Ad5/RSV/GL2 przy 10 m.o.i. (krotność infekcji czyli PFU/komórkę). Po infekcji komórki zliczano codziennie przez 6 dni. Krzywe wzrostu reprezentują wyniki uzyskane z 4 odrębnych badań.
    Figura 7B. Krzywa wzrostu wirusowo zainfekowanych ludzkich komórek raka płuc z linii komórek H322. Komórki zaszczepiono w ilości 105 komórek/szalkę (60 mm) i 6 szalek/linię komórek. Po 24 godzinach komórki zainfekowano Ad5CMV-p53 lub Ad5/RSV/GL2 przy 10 m.o.i. (krotność infekcji czyli PFU/komórkę). Po infekcji komórki zliczano codziennie przez 6 dni. Krzywe wzrostu reprezentują wyniki uzyskane z 4 odrębnych badań.
    Figura 7C. Krzywa wzrostu wirusowo zainfekowanych ludzkich komórek raka płuc z linii komórek H460. Komórki zaszczepiono w ilości 105 komórkek/szalkę (60 mm) i 6 szalek/linię komórek. Po 24 godzinach komórki zainfekowano Ad5CMV-p53 lub Ad5/RSV/GL2 przy 10 m.o.i. (krotność infekcji czyli PFU/komórkę). Po infekcji komórki zliczano codziennie przez 6 dni. Krzywe wzrostu reprezentują wyniki uzyskane z 4 odrębnych badań.
    Figura 8. Schemat ideowy testów Ad5CMV-p53 w ortotopowym modelu raka płuc. Na schemacie ideowym zestawiono dawki i sposoby traktowania nagich myszy zaszczepionych komórkami H226Br i wirusami.
    Figury 9A, fig. 9B, fig. 9C i fig. 9D. Wycinków płuc i śródpiersia leczonych i kontrolnych myszy. Na fig. 9A, fig. 9B, fig. 9C i fig. 9D pokazano 4 zdjęcia pojedynczego obrazu. Myszy uśmiercono na końcu 6-tygodniowego okresu leczenia. Tkanki płuc i śródpiersia wycięto, aby ocenić rozwój nowotworu. Na fig. 9A pokazano próbkę bloku śródpiersia zwykłych nagich myszy; na fig. 9B pokazano próbkę bloku śródpiersia myszy, którym podawano nośnik (PBS); na fig. 9C pokazano próbkę bloku śródpiersia myszy, którym podawano Ad5CMV-p53; na fig. 9D pokazano próbkę bloku śródpiersia myszy, którym podawano Ad5/RSV/GL2. Strzałki oznaczają masę nowotworu.
    Figura 10 A. Wpływ ciągłej ekspozycji na CDDP na szybkość wzrostu komórek macierzystych H358, Ad-Luc-zainfekowanych i Ad-p53-zainfekowanych. Komórki H358 (1,5 χ 105 komórek/studzienkę) osadzono z dublowaniem na płytce z 24 studzienkami. Po 24 godzinach dodano 100 pl ośrodką bazy wirusowej Ad-Luc (108 PFU/ml), albo bazy wirusowej Ad-p53 (105 PFU/ml). Po inkubacji przez 24 godziny ośrodek zawierający wirusy zastąpiono świeżym ośrodkiem zawierającym 10 pg/ml CDDP.
    Figura 10B. Wpływ 24-godzinnej ekspozycja na CDDP na szybkość wzrostu komórek macierzystych H358, Ad-Luc-zainfekowanych i Ad-p53-zainfekowanych. Komórki wystawiano na działanie CDDP (fig. 10A) w sposób ciągły lub (fig. 10B) przez 24 godziny, po czym wprowadzano ośrodek nie zawierający leku. Komórki, które pozostały w postaci przyczepionej mono warstwy, oceniano pod względem przeżycia w ciągu 5 dni, mierząc wchłanianie błękitu tryptanowego. Pokazano wielkość średnią+/- SE (błąd standardowy). W dniu 5 liczba komórek dla grupy Ad-p53:CDDP różni się znacząco od wszystkich pozostałych grup, zarówno dla A jak i B (p < 0,05 metodą testu t Studenta).
    185 749
    Figura 10C. Wpływ różnych stężeń CDDP na żywotność komórek H358 zainfekowanych Ad-p53. Po 24-godzinnej ekspozycji na wirus Ad-Luc lub Ad-p53 komórki poddano działaniu 0, 10 lub 100 (pg/mł CDDP przez 24 godziny, po czym oceniano ich żywotność.
    Figura 11 A. Nukleosomalna fragmentacja DNA w komórkach H358 zainfekowanych Ad-p53, wystawionych na działanie CDDP. Komórki infekowano i traktowano CDDP przez 24 godziny w sposób podany w opisie do fig. 10.
    Figura 1 IB, fig. 11C, fig. 1 ID, fig. 11E, fig. 11F i fig. 1 IG. Komórki H358 hodowane na szkiełkach zainfekowano Ad-p53 ma 24 godziny, zadano CDDP na kolejne 24 godziny i utrwalono do znakowania in situ fragmentacji DNA. Pokazano macierzyste komórki H358 (B) bez lub (C) z CDDP; Ad-Luc-zainfekowane komórki (D) bez lub (E) z CDDP; oraz Ad-p53zainfekowane komórki (F) bez lub (G) z CDDP. Strzałka pokazuje przykład ciemno zabarwionych fragmentów jądra. Słupek = 100 pm.
    Figura 12A. Wpływ kombinacji infekcji Ad-p53 i obróbki CDDP na sferoidy nowotworu H358. Wielokomórkowe sferoidy nowotworowe komórek H358 przygotowano w sposób opisany uprzednio (Takahashi i inni (1989)). W dniu 0 sferoidy o średnicy 150 - 200 pm umieszczono na powleczonej agarem płytce z 24 studzienkami i wystawiono na działanie Ad-p53 lub Ad-Luc na 24 godziny. W dniu 1 dodano ośrodek zawierający 10 pg/ml CDDP po usunięciu ośrodka zawierającego wirus. W dniu 2, po 24-godzinnej inkubacji, wierzchnią warstwę zastąpiono 1 ml świeżego ośrodka nie zawierającego leku. Prostopadłe średnice zmierzono za pomocą odwróconego mikroskopu. Względne zmiany objętości wyliczano z wzoru a2 x b/a, x b15 gdzie a i b stanowią odpowiednio najmniejszą i największą średnicę sferoidy, natomiast a] i b] stanowią średnice w dniu 1. Tylko względna objętość sferoid Ad-p53/CDDP jest znacząco niniejsza (p < 0,05 metodą testu t Studenta) niż w przypadku grupy kontrolnej (Ctl).
    Figura 12B, fig. 12C, fig. 12D i fig. 12E. In situ znakowanie dUTp za pomocą TdT w celu wykrycia apoptozy. Sferoidy H358 utrwalono w dniu 3 i zabarwiono w sposób podany w dziale materiały i metody przykładu 7. (B) Kontrolny sferoid nie poddany obróbce, (C) sferoid poddany obróbce CDDP, (D) sferoid zainfekowany Ad-p53 oraz (E) sferoid zainfekowany Ad-p53 i poddany obróbce CDDP. Słupek = 100 pm.
    Figura 13A. Indukowanie apoptozy przez CDDP po in vivo infekcji Ad-p53, oznaczane na podstawie zmian objętości nowotworu. Komórki H358 (5 χ 106) w zrównoważonym roztworze soli Hanka wstrzyknięto podskórnie w prawy bok samic Balb/c myszy nu/nu. Po 30 dniach do nowotworów o średnicy 5-6 mm wstrzyknięto 200 μΐ samego ośrodka lub ośrodka zawierającego Ad-Luc (108 PFU/ml) lub Ad-p53 (108 PFU/ml). Wykonano iniekcję donowotworową (100 pl) i okolonowotworową iniekcję w dwóch przeciwległych miejscach (po 50 pl). CDDP (3 mg/kg) lub kontrolną sól fizjologiczną podano dootrzewnowo. Nowotwory mierzono za pomocą cyrkla nie znając grup traktowanych, po czym objętość nowotworu wyliczano przy założeniu kulistego kształtu, przy czym przeciętną średnicę nowotworu wyliczano jako pierwiastek kwadratowy z iloczynu średnic przekroju. Każda grupa traktowana liczyła 5 myszy. Podano wielkości średnie +/- SE. Wyniki analizowano z wykorzystaniem testu t Studenta. Strzałka oznacza dzień traktowania. Przedstawiono dwa niezależne oznaczenia, p < 0,05 z dnia 5 w teście 1; p < 0,05 z dnia 7 w teście 2. (B-E)
    Figura 13B, fig. 13C, fig. 13D i fig. 13E. Badania histologiczne z wykorzystaniem techniki znaczenia biotyną/dUTP z udziałem TdT. Nowotwory zbierano w 5 dni po rozpoczęciu leczenia i natychmiast osadzano w związku O.C.T. Zamrożone tkanki pocięto w kriostacie na sekcje o grubości 5 pm. Do sekcji dodano 1 pg/ml proteinazy K i barwiono w sposób podany w opisie do fig. 12. Pokazano nowotwory H358 traktowane (B) samym CDDP, (C) samym Ad-p53 oraz (D, E) Ad-p53 w kombinacji z CDDP. Słupek = 0.5 mm. Wszystkie zwierzęta hodowano zgodnie z zaleceniami UT M.D. Anderson Institutional Animal Care and Use Committee.
    Szczegółowy opis wynalazku
    A. Zjawiska molekularne w rozwoju nowotworu płuc
    W przeprowadzonych badaniach zidentyfikowano krytyczne zjawiska molekularne prowadzące do pojawienia się i postępu raka. Umożliwiło to rozwinięcie nowych metod odtwarzania pewnych normalnych funkcji białka, tak że osiągnąć można powstrzymanie złośliwego fenotypu in vivo.
    185 749
    Najbardziej rozpowszechnione histologie raka płuc (80%) zgrupowane są pod nazwą rak niemałych komórek płuc (NSCLC), obejmujący rak płaskokomórkowy, gruczola-korak i rak nie zróżnicowanych dużych komórek. Wiele dostępnych obecnie danych dotyczących biologii molekularnej raka płuc pochodzi z badań mniej rozpowszechnionego raka małych komórek płuc (SCLC). SCLC można odróżnić od NSCLC na podstawie neuroen-dokrynologicznych cech komórek; SCLC silnie reaguje na chemioterapię, ale szybko powraca po zaprzestaniu leczenia. NSCLC może także służyć jako model innych raków nabłonkowych wywołanych przez czynniki rakotwórcze. Rozwiązania i obserwacje rozwinięte w tym badaniu mogąbyć przydatne w przypadku innych typów raków nabłonkowych.
    Nagromadziło się wiele dowodów na to, że proces złośliwej transformacji przebiega z udziałem paradygmatu genetycznego, główne ogniska wykryte w komórkach rakowych występują w dominujących onkogenach i genach będących supresorami nowotworu. Onkogeny dominujące zmieniają się w klasę genów określanych jako proto-onkogeny, które uczestniczą w decydujących funkcjach normalnych komórek, takich jak przenoszenie sygnału i transkrypcja. Do pierwotnych modyfikacji w dominujących onkogenach, które zaburzają ich zdolność do transformowania, należą mutacje punktowe, translokacje, przegrupowania i amplifikacja. Okazało się, ze geny będące supresorami nowotworu wymagają homozygotycznej utraty funkcjonowania w wyniku zajścia mutacji, delecji lub kombinacji takich transformacji. Okazało się, że pewne geny będące supresorami nowotworów odgrywają rolę w zarządzaniu proliferacją poprzez regulowanie transkrypcji. Modyfikacja ekspresji onkogenów dominujących i będących supresorami nowotworu prawdopodobnie wpływa na pewne charakterystyki komórek należących do złośliwego fenotypu.
    Pomimo wzrastającej wiedzy odnośnie mechanizmów odgrywających rolę w transformacji z udziałem onkogenu niewielki postęp nastąpił w opracowywaniu strategii terapeutycznych skierowanych specyficznie na onkogeny lich produkty. Początkowo badania w tej dziedzinie ogniskowały się na onkogenach dominujących, które jako pierwsze zostały scharakteryzowane. Badania przenoszenia genu z udziałem DNA wykazały przejmowanie złośliwego fenotypu przez normalne komórki, po przeniesieniu DNA ze złośliwych ludzkich nowotworów.
    B. p53 i mutacje p53 w przypadku raka p53 jest obecnie uznawany za gen będący supresorem nowotworu (Montenarch, 1992). Wysokie jego poziomy znaleziono w wielu komórkach transformowanych chemicznymi środkami rakotwórczymi, promieniowaniem nadfioletowym oraz różnymi wirusami, w tym SV40. Gen p53 jest częstym celem mutacyjnej dezaktywacji w wielu różnych nowotworach u ludzi, a ponadto wykazano, że jest on najczęściej ulegającym mutacji genem w przypadku zwykłych raków u ludzi (Mercer, 1992). Jest on zmutowany u ponad 50% ludzi z NSCLC (Hollesteri i inni, 1991) i w wielu innych nowotworach.
    Gen p53 koduje fosfoproteinę o 375 aminokwasach, która może tworzyć kompleksy z białkami macierzystymi takimi jak wielki antygen Tl i El B. Białko znajduje się w normalnych tkankach i komórkach, z tym ze w stężeniach znikomych w porównaniu ze stężeniami w komórkach transformowanych lub tkance nowotworowej. Należy zaznaczyć, że okazało się iz dzikiego typu p53 odgrywa ważną rolę w regulowaniu wzrostu i podziału komórek. Wykazano, że nadekspresja dzikiego typu p53 w pewnych przypadkach wykazuje działanie przeciwproliferacyjne w liniach ludzkich komórek nowotworowych. W związku z tym p53 może działać jako ujemny regulator wzrostu komórek (Weinberg, 1991) i może bezpośrednio tłumić niekontrolowany wzrost komórek, albo pośrednio uaktywniać geny, które tłumią ten wzrost. W związku z tym brak lub dezaktywacja dzikiego typu p53 może przyczyniać się do transformowania. Jednakże pewne badania wskazują, że obecność mutanta p53 może być niezbędna do pełnej ekspresji potencjału transformującego genu.
    Jakkolwiek dzikiego typu p53 jest uznawany za kluczowo istotny regulator wzrostu w wielu typach komórek, to okazało się, że jego cechy genetyczne i biochemiczne również odgrywają pewną rolę. Mutacje typu missense występują powszechnie w genie p53 i mają decydujące znaczenie dla zdolności transformujących onkogenu. Pojedyncza zmiana genetyczna wprowadzona przez mutację punktową może doprowadzić do powstania rakotwórczego p53. Jednakże w przeciwieństwie do innych onkogenów wiadomo, ze mutacje punktowe
    185 749 w p53 występują w co najmniej 30 różnych kodonach i często tworzą dominujące allele, które wywołują przesunięcia w fenotypie komórki bez zmniejszenia homozygotyczności. Okazało się ponadto, że wiele z tych dominujących ujemnych alleli jest tolerowana w organizmie i przenoszona jest na linię potomną. Różne mutantowe allele leżą w zakresie od minimalnie dysfunkcyjnych do penetrujących, dominująco ujemnych alleli (Weinberg, 1991).
    Casey i współpracownicy donieśli, że transfekcja DNA kodującego dziki typ p53 w dwóch liniach komórek ludzkiego raka piersi odtwarza regulację tłumienia wzrostu w tych komórkach (Casey i inni, 1991). Podobnego typu działanie wykazano także w przypadku transfekcji dzikiego typu, ale nie mutantowego p53 liniach komórek ludzkiego raka płuc (Takahashi i inni, 1992). Okazało się, ze p53 dominuje nad genem mutantowym i będzie działał selekcyjnie przeciw proliferacji przy transfekcji w komórkach z genem mutantowym. Normalna ekspresja transfekowanego p53 nie wpływa na wzrost komórek z endogennym p53. W związku z tym konstrukty takie mogą być przyjmowane przez normalne komórki bez ujemnych skutków.
    Istnieje w związku z tym możliwość, że leczenie raków związanych z p53 za pomocą dzikiego typu p53 może doprowadzić do zmniejszenia ilości komórek złośliwych. Jednakże badania takie, jak opisane powyżej, są dalekie od osiągnięcia tego celu, nie tylko z tego względu, ze transfekcji DNA nie można wykorzystać do wprowadzania DNA do komórek rakowych w organizmie pacjenta.
    C. Techniki terapii genowej
    Dotychczas zaproponowano szereg eksperymentalnych rozwiązań terapii genowej, z tym ze każde z nich wykazuje pewne konkretne wady (Mulligan, 1993). Jak to wspomnia no wyżej, istnieją podstawowe metody transfekcji, w których DNA zawierający interesujący gen wprowadza się do komórek nie na drodze biologicznej, np. przez przenikanie błony komórkowej na drodze fizycznej lub chemicznej. Oczywiście takie rozwiązanie ogranicza się do komórek, które można przejściowo usunąć z organizmu i które mogą tolerować cytotoksyczność obróbki, np. do limfocytów. Liposomy lub koniugaty białkowe powstałe z pewnymi lipidami i amfifilowymi peptydami można zastosować do transfekcji, z tym że wydajność integracji genu jest w dalszym ciągu bardzo nikła, rzędu jednego przypadku integracji na 1 000-100 000 komórek, a ekspresja transfekowanych genów często ogranicza się do dni w przypadku komórek ulegających proliferacji lub tygodni w przypadku komórek nie ulegających proliferacji. W związku z tym transfekcja DNA wyraźnie nie jest odpowiednim sposobem leczenia nowotworów.
    Drugie rozwiązanie wynika z naturalnej zdolności wirusów do wnikania do komórek, przy czym przenoszą one ze sobą własny materiał genetyczny. Retrowirusy są obiecujące jako wektory dostarczające gen z uwagi na ich zdolność do integrowania się ich genów w genomie gospodarza, przenoszenie znacznej ilości obcego materiału genetycznego, infekowanie wielu różnych gatunków i typów komórek oraz upakowanie w specjalnych liniach komórek. Jednakże 3 główne problemy hamują praktyczne wykorzystanie wektorów retrowirusowych. Po pierwsze infekcyjność retrowirusów zależy od dostępności receptorów wirusowych na docelowej powierzchni. Po drugie wydajnie integrują się tylko w komórkach ulegających replikacji. Ponadto występują trudności w zatężaniu i oczyszczaniu retrowirusów.
    D. Konstrukty adenowirusowe do stosowania w terapii genowej
    Ludzkie adenowirusy są wirusami nowotworowymi z dwuniciowym DNA, z genomem o wielkości około 36 kb (Tooza, 1981). Jako układ modelowy ekspresji genu eukariotycznego adenowirusy zostały obszernie przebadane i scharakteryzowane, co powoduje, że stanowią one atrakcyjny układ do zastosowania adenowirusów jako układu przenoszenia genów. Ta grupa wirusów daje się łatwo hodować i manipulować, a ponadto wykazują one szeroki zakres gospodarzy in vitro oraz in vivo. W lityczne zainfekowanych komórkach adenowirusy są zdolne do wyłączenia syntezy białka gospodarza, kierowania mechanizmami komórkowymi w kierunku syntezy dużych ilości białek wirusowych, oraz produkowania wirusów w obfitych ilościach.
    Obszar El genomu obejmuje El A i E1B, które kodują białka odpowiedzialne za regulację transkrypcji genomu wirusowego, a także kilka genów komórkowych. Ekspresja E2, obejmującego E2A i E2B, umożliwia syntezę wirusowych funkcji replikacyjnych, np. białka wiążącego DNA, polimerazy DNA, oraz białka końcowego, które rozpoczyna replikację. Produkty genu E3
    185 749 zapobiegają cytolizie przez cytolityczne komórki T i czynnik martwicy nowotworu, a ponadto okazało się, że odgrywają ważną rolę w reprodukcji wirusa. Do funkcji związanych z białkami E4 należy replikacja DNA, późna ekspresja genowa, oraz wyłączanie komórki gospodarza. Późne produkty genowe obejmują większość wirionowych białek kapsydowych, które powstają w wyniku ekspresji dopiero po zajściu większości procesów przetwarzania pojedynczego pierwotnego transkryptu z głównego pełnego promotora. Główny późny promotor (MLP) wykazuje wysoką skuteczność w późnej fazie infekcji (Stratford-Perricaudet i Perricaudet, 1991 a).
    W związku z tym, że okazało się iż tylko niewielka część genomu wirusowego jest niezbędna w cis (Tooza, 1981), wektory pochodzące z adenowirusów stanowią doskonały potencjalny materiał do podstawiania dużych fragmentów DNA, gdy zastosuje się je w połączeniu z takimi limami komórek jak komórki 293. Otrzymano linię ludzkich embrionalnych komórek nerki transformowaną Ad5 (Graham i inni, 1977) uzyskując podstawowe białka wirusowe in trans. W związku z tym twórcy wynalazku doszli do wniosku, ze charakterystyki adenowirusów stwarzają z nich dobrych kandydatów do zastosowania w ukierunkowywaniu na komórki rakowe in vivo (Grunhaus i Horwits, 1992).
    Do konkretnych zalet układu adenowirusowego przy doprowadzaniu obcych białek do komórki należą: (i) zdolność zastępowania stosunkowo dużych fragmentów wirusowego DBA przez obcy DNA; (ii) strukturalna stabilność zrekombinowanych adenowirusów; (iii) bezpieczeństwo związane z podawaniem adenowirusów ludziom; oraz (iv) brak jakiegokolwiek znanego powiązania infekcji adenowirusowych z rakiem lub złośliwością; (v) możliwość uzyskiwania wysokich mian zrekombinowanych wirusów; oraz (vi) wysoka infekcyjność adenowirusa.
    Kolejną zaletę wektorów adenowirusowych w porównaniu z retrowirusami stanowi wysokim poziom ekspresji. Ponadto replikacja adenowirusa jest niezależna od replikacji genu gospodarza, w przeciwieństwie do sekwencji retrowirusowych. W związku z tym, że geny transformujące adenowirus w obszarze El można łatwo wyciąć przy zachowaniu w dalszym ciągu skuteczności wektorów ekspresji, ryzyko onkogenetyczne związane z wektorami adenowirusowymi uważa się za znikome (Grunhaus i Horwits, 1992).
    Adenowirusowe układy przenoszenie genów są zasadniczo oparte na zrekombinowanym, przekonstruowanym adeno wirusie, któremu nadano niezależność od replikacji poprzez delecję części jego genomu, takiej jak El, z tym że zachowuje on w dalszym ciągu zdolność do infekowania. Stosunkowo duże obce białka mogą powstawać w wyniku ekspresji w przypadku, gdy wykona się dodatkowe delecję w genomie adenowirusa. Tak np. adenowirusy z delecjązarówno obszaru El jak i E3 są zdolne do przenoszenia do 10 Kb obcego DNA i mogą rosnąć osiągając wysokie miano w komórkach 293 (Stratford-Perricaudet i Perricaudet, 1991 a). Nieoczekiwanie doniesiono również o trwałej ekspresji transgenów po infekcji adenowirusowej.
    Przenoszenie genu z udziałem adenowirusów zbadano ostatnio jako środek pośredniczący w przenoszeniu genu do komórek euklariotycznych i do całych zwierząt. Tak np. przy leczeniu myszy z rzadkim recesyjnym zaburzeniem genetycznym, deficytem transkarbamylazy ornitynowej (OTC), stwierdzono ze konstrukty adenowirusowe można zastosować do dostarczania normalnego enzymu OTC. Niestety ekspresję normalnych poziomów OTC osiągnięto tylko w 4 z 17 przypadków (Stratford-Perricaudet i inni, 1991b). Z tego względu defekt został tylko częściowo skorygowany u większości myszy i nie doprowadzono do zmiany fizjologicznej lub fenotypowej. Z tego względu tego typu wyniki nie stwarzają większej zachęty do stosowania wektorów adenowirusowych w leczeniu raka.
    Próby zastosowania adenowirusów do przenoszenia genu regulatora konduktancji przezbłonowej mukowiscydozy (CFTR) do nabłonka płucnego szczura bawełnianego również zakończyły się tylko częściowym powodzeniem, choć nie można było ocenić aktywności biologicznej przeniesionego genu w nabłonku zwierząt (Rosenfeld i inni, 1992). W badaniach tych również wykazano przenoszenie genu i ekspresję białka CFTR w komórkach płucnych dróg oddechowych, z tym ze nie wykazano działania fizjologicznego. W artykule w Science, 1991, Rosenfeld i inni donieśli o ekspresji w płucach białka arantytrypsyny, z tym że również nie wykazano działania fizjologicznego. W rzeczywistości autorzy oceniają, że zaobserwowane poziomy ekspresji stanowiły zaledwie 2% poziomu niezbędnego do chronienia płuc u ludzi, czyli były znacznie nizsze od wymaganych do osiągnięcia efektu fizjologicznego.
    185 749
    Gen ludzkiej α,-antytrypsyny wprowadzono do wątroby normalnych szczurów na drodze iniekcji międzykomorowej, gdzie zaszła ekspresja i w efekcie wydzielenie wprowadzonego ludzkiego białka do surowicy szczurów (Jaffe i inni, 1992). Jednakże, co stanowiło rozczarowanie, uzyskane poziomy nie były na tyle wysokie, aby mieć znaczenie terapeutyczne.
    Tego typu wyniki nie wykazują, że adenowirus jest zdolny do kierowania ekspresją wystarczającej ilości białka w zrekombinowanych komórkach, tak aby osiągnąć fizjologicznie znaczący efekt, w związku z czym nie sugerowały one przydatności układu adenowirusowego do stosowania w terapii rakowej. Ponadto przed mniejszym wynalazkiem sądzono, ze p53 nie można wprowadzić do komórki pakującej, takiej jak komórka wykorzystywana do wytwarzania adenowirusów, gdyż może być on toksyczny. E1B adenowirusa wiąże się zp53, co jak sądzono, stanowi dodatkowy powód, dlaczego nie można połączyć adenowirusów i technologii p53.
    E. Konstrukty adenowirusa p53 i tłumienie nowotworu
PL95317105A 1994-04-25 1995-04-24 Kompozycja farmaceutyczna i zestaw terapeutyczny do uśmiercania komórki chorobowo zmienionej PL185749B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/233,002 US5747469A (en) 1991-03-06 1994-04-25 Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53
PCT/US1995/004898 WO1995028948A1 (en) 1994-04-25 1995-04-24 Compositions comprising dna damaging agents and p53

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL317105A1 PL317105A1 (en) 1997-03-17
PL185749B1 true PL185749B1 (pl) 2003-07-31

Family

ID=22875472

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL95317105A PL185749B1 (pl) 1994-04-25 1995-04-24 Kompozycja farmaceutyczna i zestaw terapeutyczny do uśmiercania komórki chorobowo zmienionej

Country Status (20)

Country Link
US (5) US5747469A (pl)
EP (2) EP0760675B2 (pl)
JP (2) JP3847334B2 (pl)
KR (1) KR100379174B1 (pl)
CN (1) CN1209164C (pl)
AT (2) ATE383167T1 (pl)
AU (1) AU694216B2 (pl)
BR (1) BR9507506A (pl)
CA (1) CA2188560C (pl)
CZ (1) CZ295144B6 (pl)
DE (2) DE69521994T3 (pl)
ES (2) ES2160707T5 (pl)
HU (1) HU221279B1 (pl)
NO (2) NO325560B1 (pl)
NZ (1) NZ284709A (pl)
PL (1) PL185749B1 (pl)
RU (1) RU2146149C1 (pl)
SK (1) SK283364B6 (pl)
UA (1) UA43917C2 (pl)
WO (1) WO1995028948A1 (pl)

Families Citing this family (254)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5705334A (en) 1988-09-22 1998-01-06 Massachusetts Institute Of Technology Uses for DNA structure-specific recognition protein
WO1992015680A1 (en) 1991-03-06 1992-09-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression
US5747469A (en) * 1991-03-06 1998-05-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53
US6410010B1 (en) * 1992-10-13 2002-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant P53 adenovirus compositions
US6524812B1 (en) 1993-10-07 2003-02-25 Regents Of The University Of Minnesota Genes encoding resistance to DNA alkylating agents
US6495348B1 (en) * 1993-10-07 2002-12-17 Regents Of The University Of Minnesota Mitomycin biosynthetic gene cluster
US20010006629A1 (en) * 1993-10-25 2001-07-05 Richard J. Gregory Recombinant adenoviral vector and methods of use
ATE437232T1 (de) * 1993-10-25 2009-08-15 Canji Inc Rekombinanter adenoviren-vektor und verfahren zur verwendung
US20060275261A1 (en) * 1993-10-25 2006-12-07 Canji, Inc. Adenoviral vectors having a protein IX deletion
US20050031590A9 (en) * 1993-10-25 2005-02-10 Richard Gregory Adenoviral vectors having a protein IX deletion
US20020010144A1 (en) * 1994-04-29 2002-01-24 Robert Sobol Enhancing the sensitivity of tumor cells to therapies
US5998205A (en) 1994-11-28 1999-12-07 Genetic Therapy, Inc. Vectors for tissue-specific replication
US6638762B1 (en) 1994-11-28 2003-10-28 Genetic Therapy, Inc. Tissue-vectors specific replication and gene expression
FR2729295A1 (fr) * 1995-01-17 1996-07-19 Rhone Poulenc Rorer Sa Traitement therapeutique combine des pathologies hyperproliferatives
US20020068049A1 (en) * 1998-09-10 2002-06-06 Henderson Daniel R. Tissue specific adenoviral vectors
WO1997003635A2 (en) 1995-07-17 1997-02-06 Board Of Regents, The University Of Texas System p16 EXPRESSION CONSTRUCTS AND THEIR APPLICATION IN CANCER THERAPY
US7163925B1 (en) 1995-07-17 2007-01-16 Board Of Regents, The University Of Texas System p16 expression constructs and their application in cancer therapy
US5763415A (en) * 1995-08-03 1998-06-09 John Hopkins University School Of Medicine Destruction of the epithelium of an exocrine gland in the prophylactic and therapeutic treatment of cancer
WO1997007828A1 (en) * 1995-08-30 1997-03-06 The Regents Of The University Of California Therapy for cellular accumulation in chronic inflammatory diseases
WO1997012623A1 (en) * 1995-10-06 1997-04-10 Arch Development Corporation Methods and compositions for viral enhancement of cell killing
EP1724350A1 (en) * 1995-11-30 2006-11-22 The Board Of Regents, The University Of Texas System Method and compositions for the diagnosis and treatment of cancer
KR19990071795A (ko) * 1995-11-30 1999-09-27 파라비 레이 암 진단 및 치료를 위한 방법과 조성물
US5952221A (en) 1996-03-06 1999-09-14 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors comprising a first and second nucleic acid sequence
WO1997039135A1 (en) 1996-04-17 1997-10-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Enhanced expression of transgenes
US6054467A (en) * 1996-07-05 2000-04-25 Sidney Kimmel Cancer Center Down-regulation of DNA repair to enhance sensitivity to P53-mediated apoptosis
US5728541A (en) * 1996-07-12 1998-03-17 Precision Therapeutics, Inc. Method for preparing cell cultures from biologial specimens for chemotherapeutic and other assays
US20040023375A1 (en) * 2002-07-30 2004-02-05 Precision Therapeutics, Inc. Method for preparing cell cultures from biological specimens for chemotherapeutic and other assays
WO1998003195A1 (en) * 1996-07-18 1998-01-29 Arch Development Corporation Methods and compositions for modulation of growth response
US5958892A (en) 1996-07-30 1999-09-28 Board Of Regents, The University Of Texas System 2-methoxyestradiol-induced apoptosis in cancer cells
US6060247A (en) * 1996-11-18 2000-05-09 Mcgill University Post-mitotic neurons containing adenovirus vectors that modulate apoptosis and growth
US6183752B1 (en) * 1997-02-05 2001-02-06 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Restenosis/atherosclerosis diagnosis, prophylaxis and therapy
US20030064949A1 (en) * 1998-02-17 2003-04-03 Loretta Nielsen Combined tumor suppressor gene therapy and chemotherapy in the treatment of neoplasms
US20030060434A1 (en) * 1997-02-18 2003-03-27 Loretta Nielsen Combined tumor suppressor gene therapy and chemotherapy in the treatment of neoplasms
IL131447A0 (en) * 1997-02-18 2001-01-28 Canji Inc Combined tumor supressor gene therapy and chemotherapy in the treatment of neoplasms
US6020191A (en) * 1997-04-14 2000-02-01 Genzyme Corporation Adenoviral vectors capable of facilitating increased persistence of transgene expression
US6642045B1 (en) 1997-04-14 2003-11-04 Breonics, Inc. System for exsanguinous metabolic support of an organ or tissue
KR19980077401A (ko) * 1997-04-18 1998-11-16 문우철 와일드타입 p53 유전자벡터와 양이온성 리포솜을 함유하는 암의 유전자 치료제
US20050096288A1 (en) * 1997-06-13 2005-05-05 Aragene, Inc. Lipoproteins as nucleic acid vectors
US6635623B1 (en) * 1997-06-13 2003-10-21 Baylor College Of Medicine Lipoproteins as nucleic acid vectors
US6749863B1 (en) * 1997-11-19 2004-06-15 Georgetown University Targeted liposome gene delivery
US6841538B1 (en) 1998-04-22 2005-01-11 Inex Pharmaceuticals Corporation Combination therapy using nucleic acids and radio therapy
US6841537B1 (en) * 1998-04-22 2005-01-11 Protiva Biotherapeutics Inc. Combination therapy using nucleic acids and conventional drugs
US5972640A (en) * 1998-05-12 1999-10-26 The Regents Of The University Of California Methods for identifying antimitotic agents
CA2333147C (en) 1998-07-13 2012-02-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment methods using antibodies to aminophospholipids
AU5817299A (en) * 1998-09-10 2000-04-03 Uab Research Foundation, The Adenoviral vector encoding pro-apoptotic bax gene and uses thereof
US6649158B1 (en) * 1998-10-15 2003-11-18 Canji, Inc. Methods and compositions to induce antitumor response
US7094533B1 (en) * 1999-01-21 2006-08-22 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Therapeutic and diagnostic applications of prostatic acid phosphatase in prostate cancer
ATE511543T1 (de) * 1999-02-22 2011-06-15 Univ Georgetown Immunoliposome mit einem targeting- antikörperfragment zur systemischen genverabreichung
WO2000050584A2 (en) * 1999-02-24 2000-08-31 University Of Iowa Research Foundation Methods and compositions for enhancing in vivo gene delivery/expression
AU3755800A (en) * 1999-03-15 2000-10-04 Introgen Therapeutics, Inc. Dendritic cells transduced with a wild-type self gene elicit potent antitumor immune responses
US20070166292A1 (en) * 1999-04-14 2007-07-19 Breonics, Inc. System for exsanguinous metabolic support of an organ or tissue
US20040038193A1 (en) * 1999-04-14 2004-02-26 Breonics, Inc. System for exsanguinous metabolic support of an organ or tissue
EP1181032A4 (en) * 1999-04-14 2004-08-25 Breonics Inc SYSTEM FOR EXSANGUARY METABOLIC SUPPORT OF AN ORGAN OR TISSUE
EP1916258B1 (en) 1999-08-09 2014-04-23 Targeted Genetics Corporation Enhancement of expression of a single-stranded, heterologous nucleotide sequence from recombinant viral vectors by designing the sequence such that it forms intrastrand base pairs
US6734192B1 (en) * 1999-08-23 2004-05-11 Mp-1 Inc. Treatment of viral infections
ATE392210T1 (de) * 1999-10-07 2008-05-15 Aguilar Cordova Carlos Estuard Methoden zur behandlung von festen tumoren und metastasen mit gentherapie
US20040266834A1 (en) * 1999-10-14 2004-12-30 Copland John A. Thiazolidinediones alone or in cabination with other therapeutic agents for cancer therapy
US6511676B1 (en) 1999-11-05 2003-01-28 Teni Boulikas Therapy for human cancers using cisplatin and other drugs or genes encapsulated into liposomes
US7048920B2 (en) * 2000-03-24 2006-05-23 Cell Genesys, Inc. Recombinant oncolytic adenovirus for human melanoma
US6911200B2 (en) * 2000-03-24 2005-06-28 Cell Genesys, Inc. Methods of treating neoplasia with combination of target-cell specific adenovirus, chemotherapy and radiation
US7306902B2 (en) * 2002-06-28 2007-12-11 Oncolyties Biotech Inc. Oncolytic viruses as phenotyping agents for neoplasms
US10293056B1 (en) * 2000-05-24 2019-05-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for non-viral gene therapy for treatment of hyperproliferative diseases
PL363618A1 (pl) 2000-11-09 2004-11-29 Neopharm, Inc. Kompleksy lipidowe SN-38 i sposoby ich stosowania
CA2429769C (en) * 2000-12-07 2016-04-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of treatment involving human mda-7
US20030138405A1 (en) * 2001-04-17 2003-07-24 Juan Fueyo Conditionally replicative adenovirus to target the Rb and Rb-related pathways
WO2003030864A1 (en) * 2001-05-29 2003-04-17 Neopharm, Inc. Liposomal formulation of irinotecan
US20040086888A1 (en) * 2001-10-18 2004-05-06 Kornblith Paul L Method for tandem genomic/proteomic analysis of proliferating cells
AU2003216283A1 (en) * 2002-02-14 2003-09-04 Research Development Foundation Inhibition of lung metastases by aerosol delivery of p53 gene and anti-cancer compounds
US20040009939A1 (en) * 2002-03-05 2004-01-15 Board Of Regent, The University Of Texas System Methods of enhancing immune induction involving MDA-7
KR100492016B1 (ko) * 2002-04-11 2005-05-30 학교법인고려중앙학원 안티센스 텔로머라제 생산하는 아데노바이러스 Ad-OA 와항암제 시스플라틴을 이용한 항암 치료 방법
WO2003086395A1 (en) 2002-04-12 2003-10-23 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
AU2003226051A1 (en) * 2002-04-16 2003-11-03 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Solid forms of salts with tyrosine kinase activity
KR20030085421A (ko) * 2002-04-30 2003-11-05 신득용 ｐ53 또는 ｐ21 유전자 변이에 의해 ｐ53 또는 ｐ21유전자 기능을 상실한 암의 치료를 위한 액틴 저해제를포함하는 약학 조성물
US20030219421A1 (en) * 2002-05-23 2003-11-27 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Calbindin-D28k protection against glucocorticoid induced cell death
ES2358730T3 (es) 2002-07-15 2011-05-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Anticuerpos seleccionados y péptidos de duramicina que se enlazan a fosfolípidos aniónicos y aminofosfolípidos y sus usos en el tratamiento de infecciones virales y del cáncer.
US7364727B2 (en) * 2002-07-22 2008-04-29 Cell Genesys, Inc. Metastatic colon cancer specific promoter and uses thereof
AU2003250701A1 (en) * 2002-07-31 2004-02-16 Wayne R. Danter Protein tyrosine kinase inhibitors
AU2003296897A1 (en) * 2002-08-20 2004-05-04 Neopharm, Inc. Pharmaceutical formulations of camptothecine derivatives
US20060030578A1 (en) * 2002-08-20 2006-02-09 Neopharm, Inc. Pharmaceutically active lipid based formulation of irinotecan
ES2298563T3 (es) * 2002-10-09 2008-05-16 Critical Outcome Technologies, Inc. Inhibidores de proteinas tirosina cinasas.
US20050032728A1 (en) * 2002-12-17 2005-02-10 Sidney Kimmel Cancer Center Tumor suppression through bicistronic co-expression of p53 and p14ARF
CA2518150C (en) * 2003-03-03 2015-08-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions involving mda-7
WO2004092396A2 (en) * 2003-04-15 2004-10-28 Novartis Ag Flap endonuclease 1 (fen1) regulatory sequences and uses thereof
US20070275915A1 (en) * 2003-04-15 2007-11-29 Cell Genesys, Inc. Tmprss2 Regulatory Sequences and Uses Thereof
MXPA05013983A (es) * 2003-06-30 2006-03-02 Canji Inc Encapsulacion polimerica de adenovirus.
US20070054274A1 (en) 2003-09-30 2007-03-08 Antonio Giordano Gene modulation by rb2/p130 expression
DE10354060A1 (de) 2003-11-19 2005-06-02 Merck Patent Gmbh Pyrrolderivate
DE10355904A1 (de) 2003-11-29 2005-06-30 Merck Patent Gmbh Feste Formen von anti-EGFR-Antikörpern
US8034790B2 (en) * 2003-12-01 2011-10-11 Introgen Therapeutics Use of MDA-7 to inhibit pathogenic infectious organisms
DE10356579A1 (de) 2003-12-04 2005-07-07 Merck Patent Gmbh Aminderivate
CA3031283A1 (en) 2004-01-22 2005-08-04 University Of Miami Topical co-enzyme q10 formulations and methods of use
WO2005082422A1 (en) * 2004-02-24 2005-09-09 Introgen Therapeutics, Inc. Combination of ad-p53 and chemotherapy for the treatment of tumours
US20070281041A1 (en) * 2004-03-02 2007-12-06 Introgen Therapeutics, Inc. Compositions and Methods Involving MDA-7 for the Treatment of Cancer
WO2005107474A2 (en) * 2004-04-30 2005-11-17 Introgen Therapeutics, Inc. Oncolytic adenovirus armed with therapeutic genes
JP4433918B2 (ja) * 2004-07-15 2010-03-17 コニカミノルタエムジー株式会社 画像形成方法
US20060246124A1 (en) * 2004-11-08 2006-11-02 Pilkiewicz Frank G Methods of treating cancer with lipid-based platinum compound formulations administered intraperitoneally
KR100651728B1 (ko) * 2004-11-10 2006-12-06 한국전자통신연구원 정착기를 갖는 전자 소자용 화합물 및 이를 포함하는 전자소자와 이들의 제조 방법
US20060153808A1 (en) * 2004-11-17 2006-07-13 Board Of Regents, The Universtiy Of Texas System Cancer immunotherapy incorporating p53
CA2597329C (en) * 2005-02-08 2016-10-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods involving mda-7 for the treatment of cancer
DE102005016634A1 (de) 2005-04-12 2006-10-19 Merck Patent Gmbh Neuartige Aza-Hetercyclen als Kinase-Inhibitoren
JP5033119B2 (ja) 2005-04-25 2012-09-26 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング キナーゼ阻害剤としての新規アザ複素環化合物
WO2006124700A2 (en) * 2005-05-12 2006-11-23 Introgen Therapeutics, Inc. P53 vaccines for the treatment of cancers
ATE550019T1 (de) 2005-05-17 2012-04-15 Merck Sharp & Dohme Cis-4-ä(4-chlorophenyl)sulfonylü-4-(2,5- difluorophenyl)cyclohexanepropansäure zur behandlug von krebs
DE102005027169A1 (de) 2005-06-13 2006-12-14 Merck Patent Gmbh Tetrahydrochinolinderivate
WO2007028146A2 (en) * 2005-09-01 2007-03-08 Precision Therapeutics, Inc. Chemo-sensitivity assays using tumor cells exhibiting persistent phenotypic characteristics
US9107824B2 (en) 2005-11-08 2015-08-18 Insmed Incorporated Methods of treating cancer with high potency lipid-based platinum compound formulations administered intraperitoneally
DE102005061840A1 (de) 2005-12-23 2007-06-28 Merck Patent Gmbh Triazolderivate
US20070231304A1 (en) * 2006-01-30 2007-10-04 Introgen Therapeutics, Inc. Prognostic factors for anti-hyperproliferative disease gene therapy
WO2007092944A2 (en) * 2006-02-08 2007-08-16 Introgen Therapeutics, Inc. Compositions and methods involving gene therapy and proteasome modulation
GB0603041D0 (en) 2006-02-15 2006-03-29 Angeletti P Ist Richerche Bio Therapeutic compounds
DK1991303T3 (da) 2006-03-03 2021-06-07 Oncosec Medical Inc Fremgangsmåde og anordning til behandling af mikroskopiske resttumorer i væv, der er tilbage efter kirurgisk resektion
US8426387B2 (en) * 2006-03-31 2013-04-23 Stephen Carper Treatments for cancer
US20110218176A1 (en) 2006-11-01 2011-09-08 Barbara Brooke Jennings-Spring Compounds, methods, and treatments for abnormal signaling pathways for prenatal and postnatal development
EP2109608B1 (en) 2007-01-10 2011-03-23 Istituto di Richerche di Biologia Molecolare P. Angeletti S.p.A. Amide substituted indazoles as poly(adp-ribose)polymerase (parp) inhibitors
US8034815B2 (en) 2007-01-11 2011-10-11 Critical Outcome Technologies, Inc. Compounds and method for treatment of cancer
PT2118123E (pt) 2007-01-31 2016-02-10 Harvard College Péptidos de p53 estabilizados e suas utilizações
DE102007008419A1 (de) 2007-02-21 2008-08-28 Merck Patent Gmbh 4-(Pyrrolopyridinyl)-pyrimidinyl-2-amin-derivate
EP2136831B1 (en) 2007-03-02 2012-09-12 The Cleveland Clinic Foundation Anti-angiogenic peptides
DE102007013855A1 (de) 2007-03-20 2008-09-25 Merck Patent Gmbh Substituierte Tetrahydrochinoline
DE102007013854A1 (de) 2007-03-20 2008-09-25 Merck Patent Gmbh Tetrahydrochinoline
DE102007013856A1 (de) 2007-03-20 2008-09-25 Merck Patent Gmbh Substituierte Tetrahydropyrrolochinoline
WO2008121767A2 (en) 2007-03-28 2008-10-09 President And Fellows Of Harvard College Stitched polypeptides
DE102007028515A1 (de) 2007-06-21 2008-12-24 Merck Patent Gmbh 6-(Pyrrolopyridinyl)-pyrimidinyl-2-amin-derivate
US8389553B2 (en) 2007-06-27 2013-03-05 Merck Sharp & Dohme Corp. 4-carboxybenzylamino derivatives as histone deacetylase inhibitors
DE102007047735A1 (de) 2007-10-05 2009-04-09 Merck Patent Gmbh Thiazolderivate
DE102007047738A1 (de) 2007-10-05 2009-04-09 Merck Patent Gmbh Imidazolderivate
DE102007047737A1 (de) 2007-10-05 2009-04-30 Merck Patent Gmbh Piperidin- und Piperazinderivate
DE102007049451A1 (de) 2007-10-16 2009-04-23 Merck Patent Gmbh 5-Cyano-thienopyridine
WO2009060198A1 (en) 2007-11-09 2009-05-14 Peregrine Pharmaceuticals, Inc. Anti-vegf antibody compositions and methods
EP2225226B1 (en) 2007-12-26 2016-08-17 Critical Outcome Technologies, Inc. Compounds and their use in a method for treatment of cancer
DE102008005493A1 (de) 2008-01-22 2009-07-23 Merck Patent Gmbh 4-(Pyrrolo[2,3-c] pyridine-3-yl)-pyrimidin-2-yl-amin-derivate
DK2245464T3 (en) 2008-01-25 2017-02-20 Multivir Inc P53 BIOMARKETS
DE102008017853A1 (de) 2008-04-09 2009-10-15 Merck Patent Gmbh Thienopyrimidine
US8466193B2 (en) 2008-04-15 2013-06-18 Pharmacyclics, Inc. Selective inhibitors of histone deacetylase
DE102008025751A1 (de) 2008-05-29 2009-12-03 Merck Patent Gmbh 4-(1H-Pyrrolo[2,3-b]pyridin-3-yl)-pyridin-2-ylamin-derivate
DE102008027574A1 (de) 2008-06-10 2009-12-17 Merck Patent Gmbh Neue Pyrrolidinderivate als MetAP-2 Inhibitoren
DE102008031517A1 (de) 2008-07-03 2010-01-07 Merck Patent Gmbh Pyrrolopyridinyl-pyrimidin-2-yl-amin-derivate
CA2730890C (en) 2008-07-17 2018-05-15 Critical Outcome Technologies Inc. Thiosemicarbazone inhibitor compounds and cancer treatment methods
DE102008059578A1 (de) 2008-11-28 2010-06-10 Merck Patent Gmbh Benzo-Naphtyridin Verbindungen
DE102009005193A1 (de) 2009-01-20 2010-07-22 Merck Patent Gmbh Neue heterocyclische Verbindungen als MetAP-2 Inhibitoren
EP2413932A4 (en) 2009-04-01 2012-09-19 Merck Sharp & Dohme INHIBITORS OF AKT ACTIVITY
EA201101399A1 (ru) 2009-04-02 2012-08-30 Мерк Патент Гмбх Гетероциклические соединения в качестве ингибиторов аутотаксина
WO2010129021A1 (en) 2009-05-02 2010-11-11 Genzyme Corporation Gene therapy for neurodegenerative disorders
DE102009019962A1 (de) 2009-05-05 2010-11-11 Merck Patent Gmbh 3-([1,2,3]Triazol-4-yl)-pyrrolo[2,3-b]pyridinderivate
US9050276B2 (en) 2009-06-16 2015-06-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Autism-associated biomarkers and uses thereof
DE102009033208A1 (de) 2009-07-15 2011-01-20 Merck Patent Gmbh Aminopyridinderivate
DE102009033392A1 (de) 2009-07-16 2011-01-20 Merck Patent Gmbh Heterocyclische Verbindungen als Autotaxin-Inhibitoren II
JP2013502441A (ja) 2009-08-26 2013-01-24 アルバータ・ヘルス・サービシーズ 新規コルヒチン誘導体、方法、およびその使用
DE102009049211A1 (de) 2009-10-13 2011-04-28 Merck Patent Gmbh Sulfoxide
EP2488028B1 (en) 2009-10-14 2020-08-19 Merck Sharp & Dohme Corp. Substituted piperidines that increase p53 activity and the uses thereof
WO2011054433A1 (en) 2009-11-07 2011-05-12 Merck Patent Gmbh Heteroarylaminoquinolines as tgf-beta receptor kinase inhibitors
DE102009060175A1 (de) 2009-12-23 2011-06-30 Merck Patent GmbH, 64293 Pyrrolo[2,3-d] pyrazin-7-yl-pyrimidin-Verbindungen
DE102009060174A1 (de) 2009-12-23 2011-06-30 Merck Patent GmbH, 64293 Pyrrolopyridinyl-pyrimidin-2-yl-amin-derivate
EP2519517B1 (en) 2009-12-29 2015-03-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Type ii raf kinase inhibitors
BR112012023021A2 (pt) 2010-03-16 2016-05-31 Dana Farber Cancer Inst Inc compostos de indazol e seus usos
EP2552947A4 (en) 2010-03-26 2013-11-13 Dartmouth College VISTA REGULATORY T CELL MEDIATOR PROTEIN, VISTA BINDING ACTIVE SUBSTANCES AND USE THEREOF
US20150231215A1 (en) 2012-06-22 2015-08-20 Randolph J. Noelle VISTA Antagonist and Methods of Use
US10745467B2 (en) 2010-03-26 2020-08-18 The Trustees Of Dartmouth College VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders
EP3235818A3 (en) 2010-04-01 2018-03-14 Critical Outcome Technologies, Inc. Compounds for the treatment of hiv
WO2011163330A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel heterocyclic compounds as erk inhibitors
CN103068980B (zh) 2010-08-02 2017-04-05 瑟纳治疗公司 使用短干扰核酸（siNA）的RNA干扰介导的联蛋白（钙粘蛋白关联蛋白质），β1（CTNNB1）基因表达的抑制
RU2582678C2 (ru) 2010-08-13 2016-04-27 Эйлерон Терапьютикс, Инк. Пептидомиметические макроциклы
KR102072631B1 (ko) 2010-08-17 2020-02-03 시르나 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 짧은 간섭 핵산 （ｓｉＮＡ）을 사용한 Ｂ형 간염 바이러스 （ＨＢＶ） 유전자 발현의 ＲＮＡ 간섭 매개 억제
US8883801B2 (en) 2010-08-23 2014-11-11 Merck Sharp & Dohme Corp. Substituted pyrazolo[1,5-a]pyrimidines as mTOR inhibitors
WO2012030685A2 (en) 2010-09-01 2012-03-08 Schering Corporation Indazole derivatives useful as erk inhibitors
US9242981B2 (en) 2010-09-16 2016-01-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Fused pyrazole derivatives as novel ERK inhibitors
DE102010048374A1 (de) 2010-10-13 2012-04-19 Merck Patent Gmbh Pyrrolidinone als MetAP-2 Inhibitoren
ES2564358T3 (es) 2010-10-15 2016-03-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Genes relacionados con la obesidad y sus proteínas y usos de los mismos
EP3766975A1 (en) 2010-10-29 2021-01-20 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
DE102010049877A1 (de) 2010-11-01 2012-05-03 Merck Patent Gmbh 7-((1,2,3)Triazol-4-yl)-pyrrolo(2,3) pyrazinderivate
WO2012061537A2 (en) 2010-11-02 2012-05-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for treating hair loss disorders
DE102010050558A1 (de) 2010-11-05 2012-05-10 Merck Patent Gmbh 1H-Pyrrolo[2,3-b]pyridinderivate
DE102010053347A1 (de) 2010-12-03 2012-06-06 Merck Patent Gmbh 3-Hetaryl-substituierte Pyrrolo[2,3-b] pyridin-derivative als PDK1-Inhibitoren
WO2012087772A1 (en) 2010-12-21 2012-06-28 Schering Corporation Indazole derivatives useful as erk inhibitors
DE102011008352A1 (de) 2011-01-12 2012-07-12 Merck Patent Gmbh 5-([1,2,3]Triazol-4-yl)-7H-pyrrolo-[2,3-d]pyrimidinderivate
DE102011009961A1 (de) 2011-02-01 2012-08-02 Merck Patent Gmbh 7-Azaindolderivate
US20140046059A1 (en) 2011-04-21 2014-02-13 Piramal Enterprises Limited Process for the preparation of morpholino sulfonyl indole derivatives
ES2699256T3 (es) 2011-05-23 2019-02-08 Merck Patent Gmbh Piridina y derivados de pirazina
DE102011105469A1 (de) 2011-06-24 2012-12-27 Merck Patent Gmbh 7-Azaindolderivate
CN103717600B (zh) 2011-08-10 2016-06-22 默克专利股份公司 吡啶并嘧啶衍生物
DE102011112978A1 (de) 2011-09-09 2013-03-14 Merck Patent Gmbh Benzonitrilderivate
US20130189754A1 (en) 2011-09-12 2013-07-25 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
TWI643868B (zh) 2011-10-18 2018-12-11 艾利倫治療公司 擬肽巨環化合物
US9023865B2 (en) 2011-10-27 2015-05-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Compounds that are ERK inhibitors
US9402894B2 (en) 2011-10-27 2016-08-02 International Aids Vaccine Initiative Viral particles derived from an enveloped virus
EP2822935B1 (en) 2011-11-17 2019-05-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Inhibitors of c-jun-n-terminal kinase (jnk)
DE102011119127A1 (de) 2011-11-22 2013-05-23 Merck Patent Gmbh 3-Cyanaryl-1H-pyrrolo[2.3-b]pyridin-Derivate
SI2812337T1 (sl) 2012-02-09 2017-01-31 Merck Patent Gmbh Furo (3,2-b) in tieno (3,2-b) piridinski derivati kot zaviralci tbk1 in ikk
EP2819688A4 (en) 2012-02-15 2015-10-28 Aileron Therapeutics Inc TRIAZOL AND THIOETHER-COUPLED PEPTIDOMIMETIC MACROCYCLES
JP6450191B2 (ja) 2012-02-15 2019-01-09 エイルロン セラピューティクス，インコーポレイテッド ペプチドミメティック大環状化合物
US10039777B2 (en) 2012-03-20 2018-08-07 Neuro-Lm Sas Methods and pharmaceutical compositions of the treatment of autistic syndrome disorders
US9347065B2 (en) 2012-03-29 2016-05-24 International Aids Vaccine Initiative Methods to improve vector expression and genetic stability
SI2830662T1 (sl) 2012-03-29 2019-01-31 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Postopki zdravljenja motenj izgube las
WO2013152230A1 (en) 2012-04-04 2013-10-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Smooth muscle specific inhibition for anti-restenotic therapy
DE102012006884A1 (de) 2012-04-04 2013-10-10 Merck Patent Gmbh Cyclische Amide als MetAP-2 Inhibitoren
US20150299696A1 (en) 2012-05-02 2015-10-22 Sirna Therapeutics, Inc. SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) COMPOSITIONS
US9890215B2 (en) 2012-06-22 2018-02-13 King's College London Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer
CN105025904A (zh) 2012-09-04 2015-11-04 埃莱森制药有限责任公司 用顺铂脂质复合物预防癌症的肺部复发
AU2013312211B2 (en) 2012-09-07 2018-03-29 King's College London VISTA modulators for diagnosis and treatment of cancer
WO2014052563A2 (en) 2012-09-28 2014-04-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel compounds that are erk inhibitors
DE102012019369A1 (de) 2012-10-02 2014-04-03 Merck Patent Gmbh 7-Azaindolderivat
MX366163B (es) 2012-10-17 2019-07-01 Vascular Biogenics Ltd Composiciones de adenovirus.
EP2909194A1 (en) 2012-10-18 2015-08-26 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Inhibitors of cyclin-dependent kinase 7 (cdk7)
WO2014063061A1 (en) 2012-10-19 2014-04-24 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Hydrophobically tagged small molecules as inducers of protein degradation
US10000483B2 (en) 2012-10-19 2018-06-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Bone marrow on X chromosome kinase (BMX) inhibitors and uses thereof
WO2014071241A1 (en) 2012-11-01 2014-05-08 Aileron Therapeutics, Inc. Disubstituted amino acids and methods of preparation and use thereof
ES2651347T3 (es) 2012-11-28 2018-01-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Composiciones y métodos para el tratamiento del cáncer
CA2895504A1 (en) 2012-12-20 2014-06-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Substituted imidazopyridines as hdm2 inhibitors
US9540377B2 (en) 2013-01-30 2017-01-10 Merck Sharp & Dohme Corp. 2,6,7,8 substituted purines as HDM2 inhibitors
KR102089121B1 (ko) 2013-03-14 2020-03-13 더 솔크 인스티튜트 포 바이올로지칼 스터디즈 종양살상형 아데노바이러스 조성물
JP2016515508A (ja) 2013-03-15 2016-05-30 ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク 融合タンパク質及びその方法
AU2014277262B2 (en) 2013-06-06 2019-10-03 Lead Discovery Center Gmbh A quinoline inhibitor of the macrophage stimulating 1 receptor MST1 R
RU2527148C1 (ru) * 2013-08-01 2014-08-27 Александр Николаевич Гребенюк Способ моделирования сочетанных радиационных поражений, включающих общее гамма- и местное рентгеновское облучение
RU2534802C1 (ru) * 2013-08-01 2014-12-10 Александр Николаевич Гребенюк Способ моделирования сочетанных радиационных поражений, включающих общее гамма-и местное бета-облучение
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
EP3057956B1 (en) 2013-10-18 2021-05-05 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Polycyclic inhibitors of cyclin-dependent kinase 7 (cdk7)
US20160264551A1 (en) 2013-10-18 2016-09-15 Syros Pharmaceuticals, Inc. Heteroaromatic compounds useful for the treatment of prolferative diseases
US9682123B2 (en) 2013-12-20 2017-06-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of treating metabolic disease
US11014987B2 (en) 2013-12-24 2021-05-25 Janssen Pharmaceutics Nv Anti-vista antibodies and fragments, uses thereof, and methods of identifying same
WO2015097536A2 (en) 2013-12-24 2015-07-02 Janssen Pharmaceutical Nv Anti-vista antibodies and fragments
WO2015164614A1 (en) 2014-04-23 2015-10-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Janus kinase inhibitors and uses thereof
WO2015164604A1 (en) 2014-04-23 2015-10-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Hydrophobically tagged janus kinase inhibitors and uses thereof
AU2015274504B2 (en) 2014-06-11 2021-02-04 Kathy A. Green Use of VISTA agonists and antagonists to suppress or enhance humoral immunity
CA2955250A1 (en) 2014-07-16 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
KR20170058424A (ko) 2014-09-24 2017-05-26 에일러론 테라퓨틱스 인코포레이티드 펩티드모방 거대고리 및 이의 용도
KR102570210B1 (ko) 2014-09-24 2023-08-23 에일러론 테라퓨틱스 인코포레이티드 펩티드모방 거대고리 및 이의 제제
AU2015357463B2 (en) 2014-12-05 2021-10-07 Immunext, Inc. Identification of VSIG8 as the putative vista receptor and its use thereof to produce vista/VSIG8 modulators
EP3778644A3 (en) 2014-12-23 2021-06-02 The Trustees of Columbia University in the City of New York Fgfr-tacc fusion proteins and methods thereof
WO2016105528A2 (en) 2014-12-23 2016-06-30 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Inhibitors of cyclin-dependent kinase 7 (cdk7)
JP2018516844A (ja) 2015-03-20 2018-06-28 エルロン・セラピューティクス・インコーポレイテッドＡｉｌｅｒｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． ペプチド模倣大環状分子およびその使用
US10550121B2 (en) 2015-03-27 2020-02-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Inhibitors of cyclin-dependent kinases
WO2016201370A1 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Combination therapy of transcription inhibitors and kinase inhibitors
BR112017027870A2 (pt) 2015-06-24 2018-08-28 Janssen Pharmaceutica Nv anticorpos e fragmentos anti-vista
AU2016321298A1 (en) 2015-09-09 2018-03-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Reduction of ER-MAM localized APP-C99 and methods of treating Alzheimer's Disease
EP4019515A1 (en) 2015-09-09 2022-06-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Inhibitors of cyclin-dependent kinases
US10023613B2 (en) 2015-09-10 2018-07-17 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles as modulators of MCL-1
US10188750B1 (en) 2015-10-23 2019-01-29 University Of South Florida Self-replicating cell selective gene delivery compositions, methods, and uses thereof
US10899836B2 (en) 2016-02-12 2021-01-26 Janssen Pharmaceutica Nv Method of identifying anti-VISTA antibodies
CN108699566B (zh) 2016-02-23 2023-06-30 萨克生物研究学院 对病毒动力学影响最小的治疗性腺病毒中的外源基因表达
CA3013637A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
CA3020848A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Anti-human vista antibodies and use thereof
US11066396B2 (en) 2016-06-23 2021-07-20 Merck Sharp & Dohme Corp. 3-aryl- heteroaryl substituted 5-trifluoromethyl oxadiazoles as histonedeacetylase 6 (HDAC6) inhibitors
US11154591B2 (en) 2016-10-14 2021-10-26 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of treating alcohol abuse disorder
CA3045892A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
CN110996958B (zh) 2017-08-16 2023-05-12 默克专利股份有限公司 包含5,10-亚甲基-(6r)-四氢叶酸以及二羧酸的稳定的冻干物
US10947234B2 (en) 2017-11-08 2021-03-16 Merck Sharp & Dohme Corp. PRMT5 inhibitors
WO2019207167A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Fondazione Telethon Therapy of sulfatase deficiencies
WO2020033282A1 (en) 2018-08-07 2020-02-13 Merck Sharp & Dohme Corp. Prmt5 inhibitors
WO2020033284A1 (en) 2018-08-07 2020-02-13 Merck Sharp & Dohme Corp. Prmt5 inhibitors
CN110055227A (zh) * 2019-03-13 2019-07-26 中国人民解放军第四军医大学 用于增生性瘢痕治疗的野生型p53腺病毒及纯化的制备方法
WO2021041532A1 (en) 2019-08-26 2021-03-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Use of heparin to promote type 1 interferon signaling
WO2021126731A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Merck Sharp & Dohme Corp. Prmt5 inhibitors
US20240116945A1 (en) 2022-09-02 2024-04-11 Merck Sharp & Dohme Llc Exatecan-derived topoisomerase-1 inhibitors pharmaceutical compositions, and uses thereof
WO2024091437A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Merck Sharp & Dohme Llc Exatecan-derived adc linker-payloads, pharmaceutical compositions, and uses thereof

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4740463A (en) * 1984-04-13 1988-04-26 Massachusetts Institute Of Technology Methods and artificial genes for antagonizing the function of an oncogene
EP0174608A1 (en) * 1984-09-13 1986-03-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Beta-actin gene and regulatory elements, preparation and use
ZA858044B (en) 1984-11-01 1987-05-27 American Home Prod Oral vaccines
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5055400A (en) * 1986-11-26 1991-10-08 University Of Guelph Leukotoxin gene of pasteurella haemolytica
US5166320A (en) * 1987-04-22 1992-11-24 University Of Connecticut Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells
US4980289A (en) * 1987-04-27 1990-12-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Promoter deficient retroviral vector
US5532220A (en) * 1987-08-31 1996-07-02 The Regents Of The University Of California Genetic mechanisms of tumor suppression
CA1339413C (en) * 1988-06-24 1997-09-02 Junichi Miyazaki Exogenous gene expression vector containing chick .beta.-actin gene promoter
AU638954B2 (en) 1988-10-31 1993-07-15 Regents Of The University Of California, The Products and methods for controlling the suppression of the neoplastic phenotype
DE69008521T2 (de) * 1989-03-07 1994-10-20 Genentech Inc Kovalente konjugate von lipiden und oligonukleotiden.
US5362623A (en) 1991-06-14 1994-11-08 The John Hopkins University Sequence specific DNA binding by p53
US5527676A (en) 1989-03-29 1996-06-18 The Johns Hopkins University Detection of loss of the wild-type P53 gene and kits therefor
EP0390323B2 (en) * 1989-03-29 2012-08-08 Johns Hopkins University Detection of loss of the wild-type p53 gene
US5328470A (en) * 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
IT1238231B (it) 1989-12-18 1993-07-12 Consiglio Nazionale Ricerche Impiego di immunomodulanti come agenti sinergici di chemioterapici nella terapia dei tumori
IE911115A1 (en) 1990-04-10 1991-10-23 Canji Inc Gene therapy for cell proliferative diseases
NO312681B1 (no) * 1990-08-24 2002-06-17 Univ California Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasöytisk blanding med suppresiv virkning/aktivitet
US5747469A (en) * 1991-03-06 1998-05-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53
US6410010B1 (en) 1992-10-13 2002-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant P53 adenovirus compositions
CA2067031C (en) 1991-04-26 2003-02-18 Shigekazu Nagata Dna coding for human cell surface antigen
WO1993003769A1 (en) * 1991-08-20 1993-03-04 THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE SECRETARY, DEPARTEMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Adenovirus mediated transfer of genes to the gastrointestinal tract
US5252479A (en) * 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
EP0615453B1 (en) 1991-11-29 1997-05-14 Chiron Viagene, Inc. Anti-cancer immunotherapeutic vector constructs
FR2688514A1 (fr) * 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
AU4115693A (en) 1992-04-24 1993-11-29 Sri International In vivo homologous sequence targeting in eukaryotic cells
US5428011A (en) 1992-06-16 1995-06-27 Procyon Biopharma, Inc. Pharmaceutical preparations for inhibiting tumours associated with prostate adenocarcinoma
AU676204B2 (en) 1992-09-18 1997-03-06 Canji, Inc. Gene therapy by retroviral vector with tumor suppressive gene
DE69334238D1 (de) * 1992-09-25 2008-09-25 Aventis Pharma Sa Adenovirus vektoren für die übertragung fremder gene in zellen des zentralen nervensystems, insbesondere im gehirn
GB9223084D0 (en) * 1992-11-04 1992-12-16 Imp Cancer Res Tech Compounds to target cells
DE69417734T2 (de) 1993-02-16 1999-10-07 Onyx Pharma Inc Cytopathische viren zur therapie und prophylaxe der neoplasie
US5496731A (en) 1993-03-25 1996-03-05 Xu; Hong-Ji Broad-spectrum tumor suppressor genes, gene products and methods for tumor suppressor gene therapy
FR2704234B1 (fr) * 1993-04-22 1995-07-21 Centre Nat Rech Scient Virus recombinants, preparation et utilisation en therapie genique.
FR2705361B1 (fr) 1993-05-18 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
CA2144040A1 (fr) * 1993-07-13 1995-01-26 Michel Perricaudet Vecteurs adenoviraux defectifs et utilisation en therapie genique
AU7983294A (en) 1993-10-19 1995-05-08 Regents Of The University Of Michigan, The P53-mediated apoptosis
ATE437232T1 (de) 1993-10-25 2009-08-15 Canji Inc Rekombinanter adenoviren-vektor und verfahren zur verwendung
TW442569B (en) 1993-10-25 2001-06-23 Canji Inc Recombinant adenoviral vector
FR2712602B1 (fr) 1993-11-18 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
FR2712603B1 (fr) 1993-11-18 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
FR2716893B1 (fr) 1994-03-03 1996-04-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Virus recombinants, leur préparation et leur utilisation thérapeutique.
KR970702915A (ko) 1994-04-29 1997-06-10 린다 버겐 종양 세포의 치료 감응성 향상 방법(Enhancing The Sensitivity of Tumor Cells to Therapies)

Also Published As

Publication number Publication date
HU221279B1 (en) 2002-09-28
CN1147768A (zh) 1997-04-16
US20060182718A1 (en) 2006-08-17
CA2188560C (en) 2011-07-19
BR9507506A (pt) 1997-09-02
CN1209164C (zh) 2005-07-06
JP3847334B2 (ja) 2006-11-22
US6069134A (en) 2000-05-30
NO964527D0 (no) 1996-10-24
DE69535684D1 (de) 2008-02-21
AU2392495A (en) 1995-11-16
SK136796A3 (en) 1997-07-09
EP0760675B2 (en) 2007-12-05
KR970702060A (ko) 1997-05-13
ES2160707T3 (es) 2001-11-16
ES2298174T3 (es) 2008-05-16
EP0760675B1 (en) 2001-08-01
UA43917C2 (uk) 2002-01-15
US6797702B1 (en) 2004-09-28
DE69521994D1 (de) 2001-09-06
JP2003277272A (ja) 2003-10-02
US5747469A (en) 1998-05-05
NO964527L (no) 1996-12-17
CZ295144B6 (cs) 2005-06-15
NO325560B1 (no) 2008-06-16
AU694216B2 (en) 1998-07-16
NZ284709A (en) 1998-08-26
JPH10503476A (ja) 1998-03-31
RU2146149C1 (ru) 2000-03-10
DE69521994T3 (de) 2008-06-26
SK283364B6 (sk) 2003-06-03
EP0760675A1 (en) 1997-03-12
EP1157702B1 (en) 2008-01-09
ATE383167T1 (de) 2008-01-15
DE69535684T2 (de) 2009-01-08
US7109179B2 (en) 2006-09-19
ES2160707T5 (es) 2008-05-16
HUT76258A (en) 1997-07-28
HU9602937D0 (en) 1996-12-30
EP1157702A1 (en) 2001-11-28
KR100379174B1 (ko) 2003-08-02
US20050089511A1 (en) 2005-04-28
ATE203675T1 (de) 2001-08-15
NO20074774L (no) 1996-12-17
DE69521994T2 (de) 2002-04-04
WO1995028948A1 (en) 1995-11-02
CA2188560A1 (en) 1995-11-02
CZ312196A3 (en) 1997-08-13
PL317105A1 (en) 1997-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6069134A (en) Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53
US7033750B2 (en) Recombinant P53 adenovirus methods and compositions

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20120424