CZ295144B6 - Terapeutické přípravky pro usmrcování nádorových buněk - Google Patents

Abstract

Použití p53 supresorového proteinu nebo genu v kombinaci s prostředkem poškozujícím DNA pro získání terapeutického přípravku pro usmrcování nádorové buňky. Supresorový gen p53 byl přenosem zprostředkovaným rekombinačním adenovirem aplikován in vitro i in vivo v kombinaci s chemoterapeutikem. U ošetřených buněk došlo k apoptose se specifickou fragmentací DNA. Přímá injekce konstruktu p53-adenovirus subkutánně do nádorů s následnou intraperitoneální aplikací cisplatiny jako prostředku poškozujícího DNA vyvolala masivní apoptotickou destrukci nádorů. Klinická aplikace režimu kombinujícího náhradu genů s použitím replikačně deficitního standardního adenoviru p53 a prostředky poškozující DNA pro léčbu lidské rakoviny.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká obecně oblasti nových strategií pro zlepšení chemoterapeutické intervence.

V dalších aspektech poskytuje vynález nové způsoby a přípravky, které kombinují schopnost prostředků poškozujících DNA s kombinovaným uvolňováním prostředku potlačujícího nádory. Kombinace faktorů poškozujících DNA s heterologní expresí supresurového genu vede k výrazné synergii oproti účinkům jednotlivých složek.

Dosavadní stav techniky

Je známo, že současné metody léčby rakoviny, zahrnující ozařování, chirurgické metody a chemoterapii, mezí omezenou účinnost. Samotná rakovina plic zabíjí ročně ve Spojených státech více než 140 000 lidí. V poslední době překročila úmrtnost na rakovinu plic, upravená na věk, úmrtnost na rakovinu prsu u žen. Přestože uskutečňované programy omezování kouření snížily obecné rozšíření kouření, zůstane úmrtnost na rakovinu plic vysoká až do 21. století. Racionální vývoj nových terapií pro rakovinu plic bude závist na pochopení biologické rakoviny plic na molekulární úrovni.

V současnosti je zjištěno, že různé druhy rakoviny jsou alespoň částečně způsobovány genetickými abnormalitami, které vedou buď k hyperexpresi jednoho nebo více genů, nebo expresi abnormálního nebo mutantního genu nebo genů. Je například známo, že exprese onkogenů v mnoha případech vede k rozvinutí rakoviny. „Onkogeny“jsou geneticky změněné geny, jejichž mutovaný expresní produkt určitým způsobem narušuje normální funkci nebo kontrolu buněk (Spandidos a d., 1989).

Bylo zjištěno, že většina dosud studovaných onkogenů je „aktivována“ v důsledku mutace, často bodové mutace, v kódující oblasti normálního buněčného genu, tj. „protoonkogenu“, což vede k substituci aminokyselin v exprimovaném proteinovém produktu. Tento změněný produkt exprese vykazuje abnormální biologickou funkci, která se účastní neoplastického procesu (Travali a d., 1990). Původní mutace mohou být vyvolány různým způsobem, například chemickou mutagenesí nebo ionizačním zářením. Dosud byl identifikován a do různého stupně charakterizován větší počet onkogenů a skupin onkogenů včetně ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun a abl (Travali a d., 1990; Bishop, 1987).

Má se za to, že během normálního růstu buněk jsou protoonkogeny, podporující růst, vyrovnávány supresorovými geny, omezujícími růst nádorů. K nerovnováze těchto dvou sil, vedoucí k neoplastickému stavu, může přispívat několik faktorů. Jedním z těchto faktorů jsou mutace v supresorových genech nádorů (Weinberg, 1991).

Významným supresorovým genem je gen kódující buněčný protein p53, což je jaderný fosfoprotein o 53 000, kontrolující buněčnou proliferaci. Mutace genu p53 a ztráta alely na chromosomu 17p, kde je tento gen umístěn, patří mezi nejčastější změny identifikované v lidském zhoubném bujení. Protein p53 je během vývoje vysoce konzervován a je exprimován ve většině normálních tkání. Bylo zjištěno, že standardní p53 se účastní kontroly buněčného cyklu (Mercer, 1992), regulace transkripce (Fields a d., 1990, a Mietz a d„ 1992), replikace DNA (Wilcock a Lané, 1991, a Bargonetti a d., 1991) a indukce apoptosy (Yonish-Rouach a d„ 1991, a Shaw a d„ 1992).

Jsou známy různé mutantní alely p53, v nichž substituce jediné báze vede k syntéze proteinů, které mají zcela odlišné vlastnosti při regulaci růstu, a v konečném důsledku vedou ke zhoubnému bujení (Hollstein a d„ 1991). Bylo totiž zjištěno, že gen P53 je nejčastěji mutovaným genem v případě běžných typů lidské rakoviny (Hollstein ad., 1991; Weinberg, 1991) a je spojen zejména s rakovinami souvisejícími s cigaretovým kouřem (Hollstein a d., 1991, Zakut-Houri a d., 1985). Byla rovněž dokumentována hyperexprese p53 v nádorech prsu (Casey a d., 1991).

Jeden z nejpodnětnějších aspektů genové terapie rakoviny souvisí s použitím supresorových genů, jako je p53. Bylo zaznamenáno, že transfekcí standardního p53 do buněk určitých typů rakoviny prsu a plic je možno v buněčných liniích obnovit funkci potlačování růstu (Casey a d., 1991; Takahasi a dl, 1992). I když transfekce DNA není schůdným prostředkem zavádění DNA do buněk pacienta, slouží tyto výsledky k demonstraci tohoto, že dodání standardního p53 do rakovinných buněk, obsahujících mutovaný gen p53, může být účinnou léčebnou metodou, budeli moci být vyvinut zlepšený způsob dodávání genu p53.

Systémy dodávání genů, použitelné v genové terapii pro potlačování nádorů, jsou ve stadiu výzkumu a vývoje. Zvlášť zajímavé jsou genové přenosové prostředky na bázi virů z důvodu účinnosti virů při infekci skutečných živých buněk, přičemž tímto procesem je přenášen samotný virový genetický materiál. V tomto ohledu byl učiněn určitý pokrok, například v sestavování retrovirálních vektorů pro dodávání různých genů. Hlavní problémy však souvisejí s používáním retrovirálních vektorů pro genovou terapii, protože jejich infekčnost závisí na dostupnosti retrovirálních receptorů na cílových buňkách, obtížně se koncentrují a čistí a účinně se integrují pouze do replikujících se buněk.

Rezistence nádorové buňky vůči chemoterapeutickým léčivům představuje velký problém v klinické onkologii. Alespoň 80 % případů rakoviny plic je přičítáno NSCLC; pacienti s NSCLC však obecně nereagují na chemoterapii (Doyle, 1993). Jedním z cílů současného výzkumu rakoviny je nalézt způsoby, jak zlepšit účinnost terapie rakoviny náhradou genů zjišťováním interakce mezi genovým produktem a chemoterapeutiky. Byl-li do mozkových nádorů dodán retrovirálním vektorovým systémem gen thymidin kinasy herpes simplex (HS-tK), účinně vyvolával citlivost vůči antivirálnímu prostředku gancicloviru (Culver a d., 1992). Genový produkt HS-tK je exogenní virální enzym, zatímco protein wt-p53 je exprimován v normálních tkáních, z čehož vyplývá, že modulace chemorezistence změnila exprese wt-p53 by mohla být alternativním přístupem, používajícím dráhu zprostředkovanou endogenním genetickým programem.

Adenovirový systém má potenciální výhody pro podávání genu in vivo, jako je snadnost produkce viru s vysokým titrem, vysoká účinnost infekce a infektivita pro mnoho typů buněk. Stabilita a doba exprese zavedeného genu je však stále kontroverzní. Ke zvýšení hladiny p53 v buňkách, které jsou citlivé na chemoterapeutika, může dojít během 6 h po stimulu poškozujících DNA (Fritsche a d., 1993, Zhan a d., 1993), avšak zvýšenou vazebnou aktivitu DNA p53 je možno zvrátit v průběhu 4 h, je-li stimul odstraněn (Tishler a d., 1993). Proto je možno vysokou hladinu exprese p53 udržet i po přerušení expozice léčivu. Exprese proteinu wt-p53 prostřednictvím Ad-p53 vrcholí 3. den po infekci (14násobek endogenního standardu) a do 9. dne klesá na nízkou hladinu (Zhang a d., 1993). To by znamenalo, že přechodně vysoká hladina exprese wt-p53 je dostatečná pro iniciaci cytotoxického programu v rakovinné buňce.

p53 má významnou roli jako determinanta chemosenzitivity v lidských plicních rakovinných buňkách. Pro lidskou rakovinu NSCLC byly vyzkoušeny různé léčebné postupy, zahrnující chirurgii, chemoterapii a radioterapii, ale hodnoty dlouhodobého přežití zůstávají neuspokojivé. Je tedy zapotřebí kombinační terapie, používaná samostatně nebo jako účinná pomocná léčba k prevenci lokálních recidiv po primární resekci nádoru, nebo jako léčba, která může být aplikována intralesionálními injekcemi při primárních, metastatických nebo lokálně recidivujících plicních nádorech, rezistentních vůči léčivům. Je rovněž třeba vyvíjet přípravky a postupy, zkoumat a zdokonalovat klinickou aplikaci nových přípravků pro léčbu rakoviny. Tyto postupy a přípravky navíc musejí prokázat svou hodnotu při nasazení in vivo.

-2CZ 295144 B6

Podstata vynálezu

Vynález řeší potřebu zdokonalených terapeutických přípravků pro použití při usmrcování buněk kombinací účinku supresorového genu nebo proteinu a prostředku nebo faktoru poškozujícího DNA. Vynález rovněž poskytuje přípravky a postupy, včetně těch, které používají virálně zprostředkovaný genový přenos, k podpoře exprese standardního supresorového genu, jako je p53, v cílových buňkách a pro uvolňování prostředku nebo faktoru, který vyvolává poškození DNA. Původci překvapivě zjistili, že pomocí přípravků podle vynálezu jsou schopny vyvolat programovou smrt buněk, známo rovněž jako apoptosis, ve velmi značném počtu cílových buněk.

Podstatou vynálezu je použití P53 supresorového proteinu nebo genu v kombinaci s prostředkem poškozujícím DNA pro získávání terapeutického přípravku pro usmrcování nádorové buňky.

S použitím vynálezu demonstrovali původci pozoruhodný účinek na potlačování růstu buněk a zejména růstu nádorových buněk. Vznik a růst nádorových buněk, známý rovněž jako „transformace“ spočívá ve vytvoření a proliferaci buněk, které ztratily schopnost kontrolovat buněčné dělení, tzn. že jsou rakovinné. Předpokládá se, že potenciálním cílem přípravků podle vynálezu jsou četné různé typy transformovaných buněk, jako jsou sarkomy, melanomy, lymfomy a různorodé pevné nádory apod. Ačkoliv může být cílem jakékoli tkáň s maligním růstem buněk, preferovanými cíli jsou tkáně plic a prsu. Původci objevili, že rekombinační vektor pro expresi P53 je při použití ve spojení s prostředkem poškozujícím DNA schopen výrazně snižovat rychlost růstu buněk.

Vynález poskytuje v určitých provedeních přípravky pro usmrcování buňky nebo buněk, jako je maligní buňka nebo buňky, určené k uvádění buňky nebo populace buněk do styku s proteinem nebo genem p53 a sjedním nebo více prostředky poškozujícími DNA, kombinovanými v množství účinném pro usmrcení buňky nebo buněk nebo jejich vystavením působení kombinace. Buňky, které je možno usmrcovat pomocí vynálezu, zahrnují například nežádoucí, avšak benigní buňky, jako jsou benigní buňky zbytnění prostaty nebo hyperaktivní buňky štítné žlázy; buňky zbytnění prostaty nebo hyperaktivní buňky štítné žlázy; buňky související s autoimunitními onemocněními, jako jsou buňky B, které produkují protilátky účastnící se artritidy, lupus, myastenie gravis, skvamózní metaplasie, dysplasie apod. Vynález, přestože je obecně použitelný pro usmrcování všech nežádoucích buněk, je zvlášť vhodný pro usmrcování maligních buněk. „Maligní buňky“ jsou definovány jako buňky, které ztratily schopnost kontrolovat cyklus buněčného dělení, což vede k „transformovanému“ nebo „rakovinnému“ fenotypu.

Za účelem usmrcování buněk, například maligních nebo metastatických, pomocí přípravků podle vynálezu, se obvykle „cílová“ buňka uvádí do styku s proteinem nebo genem p53 a alespoň jedním prostředkem poškozujícím DNA, kombinovanými v množství účinném pro usmrcení buňky. Tento způsob může zahrnovat uvedení buněk do styku s proteinem nebo genem p53 a prostředkem nebo faktorem nebo prostředky nebo faktory poškozujícími DNA současně. Toho je možno dosáhnout tak, že se buňka uvádí do styku s jediným přípravkem nebo farmakologickou formulací, obsahující oba prostředky, nebo uvedením buňky do styku s dvěma různými přípravky nebo formulacemi současně, přičemž jeden přípravek zahrnuje protein nebo gen p53 a druhý zahrnuje prostředek poškozující DNA.

Přirozeně se rovněž předpokládá, že cílová buňka může být nejprve vystavena prostředku nebo prostředkům poškozujícím DNA a pak uvedena do styku s proteinem nebo genem p53, nebo naopak. V provedeních, kdy se faktor poškozující DNA a p53 aplikují na buňky odděleně, je obecně nutno zajistit, aby neuplynula mezi obojím podáním významná doba, tak, aby prostředek poškozující DNA a p53 byly ještě schopny vyvozovat na buňku výhodný kombinační účinek. V takových případech se předpokládá, že buňka se uvede do styku s oběma prostředky navzájem v rozmezí asi 12 až 24 h, výhodně asi 6 až 12 h, přičemž nejvýhodnější je doba prodlení pouze asi 12 h.

Výrazy „uvedení do styku“ a „vystavení“ v souvislosti s buňkou se zde vztahují na způsob, jímž se supresorový gen nebo protein, jako je p53, a prostředek nebo faktor poškozující DNA dodávají do cílové buňky nebo se umísťují do přímého styku s cílovou buňkou. K dosažení usmrcení buňky se oba prostředky dodávají do buňky v kombinaci v množství účinném pro usmrcení buňky, tj. k vyvolání programované smrti buňky nebo apoptosy. Výrazy „usmrcení“, „programovaná smrt“ a „apoptosis“ se zde používají navzájem zaměnitelně a popisují řadu intracelulámích jevů, které vedou ke smrti cílové buňky. Proces smrti buňky zahrnuje aktivaci itracelulámích proteas a nukleas, která vede například k involuci buněčného jádra a fragmentaci jaderné DNA. Pochopení přesného mechanismu, jímž interagují různé intracelulámí molekuly za účelem dosažení smrti buňky, není pro provádění vynálezu nezbytné.

Prostředky nebo faktory poškozující DNA jsou podle vynálezu definovány jako jakákoli chemická sloučenina nebo způsob léčby, které vyvolávají při aplikaci na buňku poškození DNA. Takovéto prostředky a faktory zahrnují záření a vlny, které vyvolávají poškození DNA, jako je například γ-záření, rentgenové záření, UV záření, mikrovlnné záření, elektronové emise apod. Poškození DNA vyvolává různé chemické sloučeniny, označované rovněž jako „chemoterapeutika“, které jsou všechny použitelné v kombinovaném způsobu léčby podle vynálezu. Použitelná chemoterapeutika zahrnují například adriamycin, 5-fluorouracil (5-FU), etoposid (VP-16), kamptothecin, aktinomycin-D, mytomycin C, cisplatinu (CDDP) a dokonce peroxid vodíku. Vynález rovněž zahrnuje použití kombinace jednoho nebo více prostředků poškozujících DNA, buď na bázi ozařování, nebo přímo sloučenin, jako je použití rentgenových paprsků s cisplatinou nebo použití cisplatiny s etoposidem. V určitých provedeních je zvlášť výhodné použití cisplatiny v kombinaci s proteinem nebo genem p53 jako této sloučeniny.

Je možno rovněž použít jakýkoliv způsob uvádění buňky do styku s proteinem p53, pokud tento způsob vede ke zvýšené hladině funkčního proteinu p53 v buňce. Takový způsob zahrnuje jak přímé dodávání proteinu p53 do buňky, tak dodávání genu nebo segmentu DNA, který kóduje p53, který bude řídit expresi a produkci p53 v buňce. Protože podávání proteinu má nevýhody, jako je degradace proteinu a nízká absorpce buňko, předpokládá se, že zvlášť výhodné bude použití rekombinačního vektoru, který exprimuje protein p53.

Metodami inženýrství je možno konstruovat různé rekombinační plasmidy a vektory pro expresi proteinu p53 a pro dodávání p53 do buňky. Patří sem například použití plasmidů z nahé DNA ap53 pro přímý přenos genetického materiálu do buňky Wolfe a d., 1990), formulace DNA kódující p53, zachycené v liposomech (Ledley a d., 1987) nebo v proteiliposomech, které obsahují receptorové proteiny virálního obalu (Nicolau a d., 1983) a DNA kódující p53 navázané na komplex polylysin - glykoproteinový nosič.

Předpokládá se rovněž použití rekombinačních virů, konstruovaných tak, aby exprimovaly p53. Mohou být použity různé virální vektory, jako jsou retrovirální vektory, virus herpes simplex (patent US 5 288 641, zahrnut zde jako odkaz), cytomegalovirus apod., jak uvádí Miller (Miller, 1992); rovněž tak rekombinanční adeno-asociované viry (vektory AAV), například popsané v patentu US 5 132 941, zahrnutém zde jako odkaz, a zejména rekombinační adenovirální vektory. Metody přípravy replikačně defektních infekčních virů jsou v oboru známy, viz například citace Ghosh-Choudhury & Graham (1987), McGrory a d., (1988) a Gluzman a d., (1982), zde zahrnuté jako odkaz.

K usmrcení buňky podle vynálezu se obecně buňka uvádí do styku s proteinem nebo genem p53 a prostředkem poškozujícím DNA, kombinovanými v množství účinném pro usmrcení buňky. Výraz „kombinovanými v množství účinném pro usmrcené buňky“ znamená, že množství p53 a prostředku poškozujícího DNA jsou dostatečná k tomu, aby, jsou-li v kombinaci v buňce, byla v buňce vyvolána apoptosis. I když to není nutné ve všech provedeních, je spojené účinné množství p53 a prostředku poškozujícího DNA přednostně takové, které vyvolá významně více úmrtí buněk než použití jednotlivých prvků samotných, a přednostně se jedná o takové množství,

-4CZ 295144 B6 které vyvolává synergícké úmrtí buněk ve srovnání s účinky pozorovanými pro každý prvek samostatně.

Ke stanovení účinků, vyvolávaných přípravky podle vynálezu, je možno použít různých parametrů in vitro. tyto parametry zahrnují například pozorování čistého počtu buněk před vystavením přípravkům podle vynálezu a po něm, stejně jako velikosti vzniklých vícebuněčných nádorových sféroidů, jako jsou kolonie vzniklé ve tkáňové kultuře. Usmrcování buněk in vitro je popsáno zejména v dále uvedeném příkladu 7. Alternativně je možno měřit parametry, které indikují buňku, která prodělala programovou smrt, jako je fragmentace buněčné DNA na fragmenty velikosti nukleosomů, obecně identifikované dělením fragmentů elektroforézou na agarózovém gelu, barvením DNA a porovnáváním DNA se žebříčkem velikostí DNA. Fragmenty velikosti nukleosomů jsou identifikovány jako postupné stupně žebříčku monomerů a multimerů se základní jednotkou asi 200 párů bází.

Podobně „terapeuticky účinné množství“ je množství proteinu nebo genu p53 a prostředku poškozujícího DNA, které, je-li podáno v kombinaci živočichovi, účinně v něm usmrcuje buňky. Důkazem toho je zejména usmrcování rakovinných buněk, jako jsou buňky rakoviny plic, prsu nebo tlustého střeva, ve zvířecím nebo lidském subjektu, který má nádor. „Terapeuticky účinná kombinace“ je tedy obecně spojené množství p53 a prostředku poškozujícího DNA, které funguje tak, že usmrcuje více buněk než každý prvek samostatně, a přednostně se jedná o spojení množství, které přináší synergické snížení nádorové zátěže.

Studium určitých in vivo a ex vivo parametrů buněčné smrti je tedy rovněž účinným prostředkem zajišťování účinnosti přípravků podle vynálezu. Například pozorování vlivu na inhibici tumorigenicity, měřenou expresí TdT zmrazených řezů tkáně nebo pomocí jiných metod barvení a cílových antigenů, známých zkušenému patologovi. Přirozeně je možno z hodnocení usmrcování buněk použít i jiných prostředků ke stanovení hmoty, růstu a životnosti nádoru. Zejména je možno hodnotit účinky na různých systémech zvířecích modelů rakoviny včetně těch, při nichž jsou lidské rakovinné buňky lokalizovány ve zvířeti. Je známo, že zvířecí modely rakoviny jsou na rozdíl od AIDS vysoce použitelné pro stanovení režimu léčby u lidí (Roth a d., ed., 1989). Jedním příkladem takového zvířecího modelu je subkutánní kultivace lidských buněk malobuněčné rakoviny plic (buňky H358). Pomocí tohoto systému původci prokázali, že adenovirus nesoucí p53, aplikovaný intratumorálně se současným podáváním chemoterapeutika, vede k překvapivě účinné redukci nádoru.

Zvlášť výhodnou metodou dodávání proteinu p53 do buňky je uvádění buňky do styku s rekombinančním adenovirovým virionem nebo částicí, která zahrnuje rekombinanční adenovirový vektor obsahující oblast exprese p53, umístěnou pod kontrolou promotoru schopného řídit expresi p53 v daném buněčném typu.

Oblast exprese p53 ve vektoru může zahrnovat genomickou sekvenci, ale pro jednoduchost se předpokládá, že obecně bude výhodné používat sekvence cDNA p53, protože jsou v oboru snadno dostupné a snadněji se s nimi manipuluje. Kromě expresní jednotky p53 a promotorové oblasti vektor rovněž obvykle obsahuje polyadenylační signál, jako je časný polyadenylační signál genu SV40 nebo protaminového genu apod.

Ve výhodných provedeních se předpokládá, že bude žádoucí umístit oblast exprese p53 pod kontrolu silného konstitutivního promotoru, jako je promotor CMV, virální LTR, RSV nebo SV40, nebo promotor asociovaný s geny, které jsou exprimovány ve vysoké hladině v savčích buňkách, jako je promotor elogačního faktoru-1 nebo aktinový promotor. Všechny tyto varianty se pokládají za použitelné podle vynálezu. V současnosti je zvlášť výhodným promotorem promotor IE cytomegaloviru (CMV).

Gen nebo cDNA p53 mohou být zaváděny do rekombinančního adenovirů podle vynálezu prostě vložením nebo přidáním kódující sekvence P53 do virálního genomu. Přednostními adenoviry

-5CZ 295144 B6 však jsou replikačně defektní viry, u nichž byl virální gen, nezbytný pro replikaci a/nebo obalování, vypuštěn z konstruktu adenovirálního vektoru, což umožňuje na jeho místo zavést expresní oblast p53. Vypustit a nahradit p53 je možno jakýkoliv gen, ať je nezbytný (například E1A, E1B, E2 a E4) nebo není nezbytný (například E3) pro replikaci. Zvlášť výhodné jsou ty vektory a viriony, v nichž byly vypuštěny oblasti E1A a E1B adenovirového vektoru a na jejich místo byla zavedena oblast exprese p53, jejichž příkladem je genomová struktura na obr. 1.

Metody přípravy replikačně defektních adenovirů jsou známy, například Ghosh-Chodhury a Graham (1987), McGrory a d., (1988) a Gluzman a d., zde zahrnuto jako odkazy. Je rovněž známo, že k propagaci rekombinačních adenovirů je možno použít různých buněčných linií, pokud doplňují jakýkoliv replikační defekt, který může být přítomen. Výhodná buněčná linie je lidská linie buněk 293, ale je možno použít jakoukoli jinou buněčnou linii, slibnou z hlediska replikace, tj. ve výhodném případě takovou, která exprimuje E1A a E1B. Dále mohou být buňky za účelem získání zásobních virů propagovány buď na plastových discích, nebo v suspenzní kultuře.

Vynález není omezen pouze na viry s chybějícím El a na buňky exprimující El. V souvislosti s vynálezem je možno použít dalších komplementárních kombinací virů a hostitelských buněk. Mohou být použity viry s chybějícím funkčním E2 a buňky exprimující E2, stejně jako viry s chybějícím E4 a buňky exprimující E4 apod. Jestliže se vypustí a nahradí gen, který není nezbytný pro replikaci, jako je například gen E3, tento defekt nemusí být specificky doplňován hostitelskou buňkou.

Kromě požadavku, aby byly adenovirové vektory konstruovány tak, aby exprimovaly p53, se charakter počátečního adenovirů nepovažuje za rozhodující pro úspěšné provedení vynálezu. Adenovirus může představovat kterýkoli ze 42 různých známých sérotypů nebo podskupin A až F. Typ 5 adenovirů podskupiny C je výhodným výchozím materiálem pro získání podmíněného replikačně defektního adenovirového vektoru pro použití způsobem podle vynálezu. Důvodem je, že adenovirus typu 5 je lidský adenovirus, o němž je známo významné množství biochemických a genetických informací a který se historicky používá pro většinu konstrukcí s použitím adenoviru jako vektoru.

Přípravky podle vynálezu jsou rovněž vhodné pro usmrcování buňky nebo buněk, jak in vitro, tak in vivo. Jsou-li buňky, které se mají usmrtit, umístěny v živočichovi, například buňky rakoviny plic, mléčné žlázy nebo tlustého střeva nebo jiné buňky s mutací p53, podává se živočichovi jak protein nebo gen p53, tak prostředek poškozující DNA ve farmaceuticky přijatelné formě. Zde používaný výraz „farmakologicky přijatelná forma“ se vztahuje jak na formu jakéhokoli přípravku, který může být podáván živočichovi, tak na formu uvádění živočicha do styku s ozařováním, tj. na způsob, jímž je ozařována určitá oblast těla živočicha, například γ-zářením, rentgenovým zářením, UV zářením, mikrovlnami, elektronovými emisemi apod. Použití záření a vln poškozujících DNA je známo odborníkům na ozařovací terapii.

Přípravky podle vynálezu jsou aplikovatelné ve výhodných metodách léčby rakoviny, které obecně zahrnují podávání terapeuticky účinné kombinace proteinu nebo genu p53 a prostředku poškozujícího DNA zvířecímu nebo lidskému pacientovi s rakovinou. Je to možno provádět s použitím rekombinančního viru, zejména adenovirů, který nese vektor schopný exprimovat p53 v buňkách nádoru. Přípravek dodávající gen p53 se obvykle podává živočichovi, často v těsném kontaktu s nádorem, ve formě farmaceuticky přijatelného přípravku. Jednou z výhodných metod je přímá intralesionální injekce terapeuticky účinného množství genu p53, například uloženého v rekombinačním viru, do místa nádoru. Předpokládají se ovšem rovněž i jiné parenterální cesty podávání, například intravenózní, perkutánní, endoskopická nebo subkutánní injekce.

Při léčbě rakoviny prostředky podle vynálezu se rakovinné buňky kromě proteinu nebo genu p53 uvádějí do styku s prostředkem poškozujícím DNA. Je to možno provádět ozařováním místa lokalizovaného nádoru zářením poškozujícím DNA, jako je rentgenové záření, UV záření,

-6CZ 295144 B6 γ-paprsky nebo mikrovlny. Alternativně je možno nádorové buňky uvádět do styku s prostředkem poškozujícím DNA podáváním terapeuticky účinného množství farmaceutického přípravku zahrnujícího sloučeninu poškozující DNA, jako je adriamycin, 5-fluorouracil, etoposid, kamptothecin, aktinomycin-D, mitomycin C nebo výhodně cisplatina, živočichovi. Prostředek poškozující DNA může být připraven a použit jako kombinovaný terapeutický přípravek nebo kit ve spojení s proteinem, genem nebo systémem dodávání genu p53, popsaným výše.

Překvapující úspěch vynálezu je potvrzen zjištěním, že použití viru Ad5CMV-p53 v kombinaci s cisplatinou vedlo k pronikavým výsledkům ve studiích s použitím modelu nahé myši.

Terapeutický režim spojující viry a poškozování DNA významně inhiboval tumorigenicitu buněk H358, které normálně produkují významnou nádorovou hmotu. Tumorigenicita buněk rakoviny plic byla inhibována při ošetření Ad5CMV-p53, ale nikoli kontrolním virem exprimujícím luciferasu, což ukazuje, že protein p53 v kombinaci s prostředkem poškozujícím DNA má vysokou terapeutickou účinnost.

Odborníkům jsou známy různé metody dodávání chemoterapeutických formulacím, zahrnujících expresní konstrukty DNA, do eukaryotických buněk. Se znalostí vynálezu bude odborník schopen dodávat do buněk současně prostředky poškozující DNA a protein nebo geny p53 mnoha různými účinnými způsoby.

Pro dodávání DNA in vivo předpokládají původci použití jakéhokoli systému dodávání genů, jako je virálně a liposomově zprostředkovaná transfekce. Výraz „transfekce“ je zde používán pro popis cíleného dodávání DNA do eukaryotických buněk pomocí dodávacích systémů, jako jsou metody přenosu genů pomocí adenovirů, AAV, retrovirů nebo plasmidu. Specificita dodávání virálního genu může být volena tak, aby byl gen přednostně směrován na určitou cílovou buňku, například s použitím virů, které jsou schopny infikovat konkrétní typy buněk. Virus zvolený pro genový přenos, stejně jako pravděpodobný supresorový gen, který má být exprimován pro usmrcení daného typu maligní buňky, bude přirozeně diktován různými rozsahy virálního hostitele.

Předpokládá se rovněž, že chemoterapeutický prostředek poškozující DNA je možno dodávat různými způsoby, například metodami parenterálního dodávání, jako je intravenózní a subkutánní injekce apod. Tyto metody jsou známy odborníkům na dodávání léčiv a jsou popsány dále v oddílech týkajících se farmaceutických přípravků a léčby.

Pro dodávání genů in vitro je možno použít různých metod, jako je například transfekce zprostředkovaná fosfátem vápenatým nebo dextrasulfátem, elektroporace, zaměřování skleněných projektilů apod. Tyto metody jsou odborníkům známy a přesné přípravky a provedení jsou v souvislosti s vynálezem zřejmé.

Další provedení se týkají přípravků, zahrnujících farmaceutické formulace, obsahujících protein nebo gen p53 v kombinaci s prostředkem poškozujícím DNA, jako je cisplatina. V těchto přípravcích může být p53 ve formě segmentu DNA, rekombinančního vektoru nebo rekombinančního viru, který je schopen exprimovat protein p53 v živočišné buňce. Tyto přípravky, včetně těch, které obsahují systém dodávání rekombinančních virálních genů, jako je adenovirová částice, mohou být formulovány pro podávání in vivo dispergováním ve farmakologicky přijatelném roztoku nebo pufru. Výhodné farmakologicky přijatelné roztoky zahrnují neutrální salinické roztoky pufrované fosfátem, laktárem, Tris apod.

Při použití virálních podávačích systémů je ovšem žádoucí virion dostatečně přečistit, aby byl v podstatě prostý nežádoucích nečistot, jako jsou defektní interferující virální částice nebo endotoxiny a další pyrogeny, aby nevyvolával nečekané reakce v buňce, živočichovi nebo jedinci, přijímajícím vektorový konstrukt. Výhodný způsob čištění vektoru spočívá v použití gradientů hustoty, například centrifugování s gradientem chloridu česného.

-7 CZ 295144 B6

Výhodné farmaceutické přípravky podle vynálezu zahrnují ve farmakologicky přijatelném roztoku nebo pufru protein p53 nebo výhodněji gen p53 v kombinaci s chemoterapeutickým prostředkem poškozujícím DNA. Příklady chemoterapeutických prostředků jsou adriamycin, 5-fluorouracil, komptothecin, aktinomycin-D, peroxid vodíku, mitomycin C, cisplatina (CDDP) a atopesid (VP-16), přičemž zvlášť výhodné je použití cisplatiny.

Další provedení vynálezu představují kitu pro použití při usmrcování buněk, jako jsou maligní buňky, které mohou být formulovány do terapeutických kitů pro použití při léčbě rakoviny. Kity podle vynálezu obecně obsahují ve vhodném obalu farmaceutickou formulaci rekombinačního vektoru, schopného exprimovat protein p53 v živočišné buňce, a farmaceutickou formulaci prostředku poškozujícího DNA. Rekombinační vektor a prostředek poškozující DNA mohou být přítomny současně v jednom obalu nebo v oddělených obalech. Ve výhodném provedení je rekombinačním vektorem rekombinační adenovirální vektor exprimující p53, přítomný v adenovirové částici, a prostředkem poškozujícím DAN je cisplatina.

Složky kitu jsou přednostně ve formě kapalného roztoku nebo suchého prášku. Pokud jsou složky ve formě kapalného roztoku, jedná se o vodný roztok, zejména sterilní vodný roztok. Jsou-li složky ve formě suchého prášku, může být prášek rekonstituován přídavkem vhodného rozpouštědla. Předpokládá se, že rozpouštědlo může být rovněž dodáváno v samostatném obalu.

Přehled obrázků na výkresech

K dalšímu osvětlení některých aspektů vynálezu slouží výkresy, které tvoří součást popisu. Vynález je možno dále osvětlit odkazem na jeden nebo více obrázků ve spojení s podrobným popisem konkrétních provedení.

Obr. 1 představuje schéma vytvoření rekombinačního adenoviru p53. Expresní kazeta p53 byla vložena mezi místa Xba I a Cla I vpXCJL.l. Expresní vektor p53 (pEC53) a rekombinační plasmid pJM17 byly kontransfíkovány do buněk 293. Transfikované buňky byly udržovány v médiu do nástupu cytopatického efektu. Nově vytvořené rekombinační adenoviry p53 (Ad5CMV-p53) byly identifikovány PCR analýzou DNA s použitím DNA templátů, připravených ze supernatantů CPE ošetřených Proteinasou K a extrakcí fenolem.

Obr. 2A představuje mapu použitou pro strukturní analýzu DNA Ad5CMV-p53. Jedná se o mapu genomové DNA Ad5CMV-p53 s umístěním expresní kazety p53, primerů PCR a restrikčních míst. Velikost genomu je asi 35,4 kb a je rozdělen do 100 mapových jednotek m.u. (1 m.u. = 0,35 kb). Expresní kazeta p53 nahradila oblast El (1,3 až 9,2 m.u.) genomu Ad5. Primer 1 je umístěn v prvním intronu za hlavním promotorem genu IE lidského CMV. Primer 2 je umístěn v časném polyadenylačním signálu SV40. Oba primery ve vzdálenosti na obou koncích 15 až 20 bp od insertu cDNA p53E definují produkt pCR 1,40 kb. Primery 3 a 4 jsou umístěny v místech 11 m.u., resp. 3,4 m.u. genomu Ad5, která definují produkt PCR 0,86 kb, specifický pro virální genom.

Obr. 2B znázorňuje výsledky analýzy produktů PCR na agarózovém gelu. V každé reakci byly použity dva páry primerů, které definují fragmenty DNA 1,4 kb (p53) a 0,86 kb (Ad5). Jako templáty DNA byly v jednotlivých reakcích použity: plasmid pEC53 (pruh 1), DNA Ad5/RSV/GL2 (pruh 2), žádná DNA (pruh 3) a DNA Ad5CMV-p53 (pruh 4). Pruh označený M odpovídá markérům molekulové hmotnosti.

Obr. 2C znázorňuje restrikční mapování DNA Ad5CMV-p53. Vzorky DNA Ad5CMV-p53, čištěné gradientem CsCl, byly digerovány bez enzymu (U), s Hind III (H), Bam (B), Eco RI (E) a Cla I (C) a analyzovány na 1% agarózovém gelu. Pruhy označené M jsou markéry molekulové hmotnosti.

-8CZ 295144 B6

Obr. 3A, 3B, 3C a 3D znázorňují výsledky pozorování cytopatických efektů (CPE) na buňku 293 vlivem rekombinančního adenovirů. Tyto obrázky představují sérii mikroskopických snímků s fázovým rozhraním (x 400) buněk 293. Jedná se o čtyři panely jednoho obrázku. Obr. 3A zobrazuje stav před transfekci, obr. 3B negativní kontrolu v den 12 po transfekci, obr. 3C nástup CPE v den 12 po transfekci a obr. 3D úplný CPE v den 14 po transfekci.

Obr. 4A, 4B, 4C a 4D znázorňují imunohistologii buněk infikovaných rekombinačními adenoviry. Tyto obrázky představují sérii imunohistologických snímků buněk H358. Jedná se o čtyři panely obrázku, znázorňujícího neúčinnost Ad5CMV-p53 v buňkách H358. Buňky H358 byly infikovány po dobu 24 h pomocí Ad5CMV-p53 nebo Ad5/RSV/GL2 v množství 50 PFU (jednotek tvořících plaky)/buňku. Jako simulace byla použita infekce pouze médiem. Infikované buňky byly analyzovány imunobarvením. Obr. 4A představuje simulovanou infekci, sondovanou protilátkou proti p53. Obr. 4B představuje buňky infikované kontrolou Ad5/RSV/GL2 a sondované protilátkou proti p53. Obr. 4C představuje buňky infikované Ad5CMV-p53, sondované nepříbuznou protilátkou (MOPC-21). Obr. 4D představuje buňky infikované Ad5CMV-p53, sondované protilátkou proti p53. Jako protilátka proti p53 byla použita Pab 1801 a pro barvení byla použita metoda avidin-biotin.

Obr. 5A znázorňuje gen SDS-PAGE, barvený Coomasie blue, porovnávající relativní úroveň exprese exogenního p53 v buňkách H358. Po 24 a 72 h od infekce byly připraveny vzorky buněk H358, které byly infikovány 30 PFU/buňku Ad5CMV-p53 nebo Ad5/RSV/GL2. Obrázek představuje barvení výsledků analýzy SDS-PAGE pomocí Coomasia blue, znázorňující relativní množství nanesených vzorků proteinů. Pruhy 1 a 4 obsahují vzorky buněk infikovaných Ad5/RSV/GL2. Pruhy 2 a 3 obsahují vzorky buněk, infikovaných 24 h po infekci dvěma jednotlivými kulturami Ad5CMV-p53. Pruhy 5 a 6 představují vzorky buněk, infikovaných Ad5CMV-p53, odebrané po 72 h od infekce. Pruh 7 představuje simulované infikovaný vzorek H358 72 h po infekci. Pruh M představuje předem zbarvené markéry molekulové hmotnosti v kDa (GIBCO-BRL).

Obr. 5B představuje analýzu westernovým přenosem u stejných pruhů gelu jako v případě SDS-PAGE na obr. 5A. Relativní úrovně exprese p53 byly analyzovány westernovým přenosem pomocí anti-p53. Jako primární protilátky byly použity monoklonální protilátky proti proteinu p53 (PAb 1801, Oncogene Science Inc.) a β-aktinu (Amersham Inc.). Druhá protilátka, konjugovaná s HRP (křenovou peroxidasou), a vyvíječ ECL byly od Amersham Inc. Virálně infikované buňky H358 byly analyzovány westernovým přenosem. Westernový blot na obr. 5B má ekvivalentní schéma a řád jako na obr. 5A.

Obr. 6A a 6B představují časový průběh exprese p53, stanovený westernovým přenosem. Několik misek buněk H358 byly infikováno 10 PFU/buňku Ad5CMV-p53. V označených časových bodech od infekce byly připraveny buněčné lyzáty. Westernový přenos byl sondován současně s protilátkou proti p53 a proti aktinu. Pruhy označené „C“ znázorňují negativní kontroly. Histogram představuje relativní množství p53, zjištěná densitometrem.

Obr. 7A znázorňuje křivku růstu virálně infikovaných buněk lidské rakoviny plic buněčných linií H358. Buňky byly inokulovány na misky v množství 10⁵ buněk na misku (60 mm) a 6 misek na buněčnou linii. Po 24 h byly buňky infikovány Ad5CMV-p53 nebo Ad5/RSV/GL2 v množství 10 m.o.i. (četnost infekce, multiplicity of infection, tj. PFU/buňku). Po infekci byly buňky po dobu 6 dní denně sčítány. Křivky růstu představují údaje získané ze čtyř jednotlivých studií.

Obr. 7B znázorňuje křivku růstu virálně infikovaných buněk lidské rakoviny plic buněčné linie h322. Buňky byly inokulovány na misky v množství 10⁵ buněk na misku (60 mm) a 6 misek na buněčnou linii. Po 24 h byly buňky infikovány Ad5CMV-p53 nebo As5/RSV/GL2 v množství 10 m.o.i. (četnost infekce, multiplicity of infection, tj. PFU/buňku). Po infekci byl buňky po dobu 6 dní denně sčítány. Křivky růstu představují údaje získané ze čtyř jednotlivých studií.

-9CZ 295144 B6

Obr. 7C znázorňuje křivku růstu virálně infikovaných buněk lidské rakoviny plic buněčné linie H460. Buňky byly inokulovány na misky v množství 10⁵ buněk na misku (60 mm) a 6 misek na buněčnou linii. Po 24 h byly buňky infikovány Ad5CMV-p53 nebo Ar5/RSV/GL2 v množství 10 m.o.i. (četnost infekce, multilicity of infection, tj. PFU/buňku). Po infekci byly buňky po dobu 6 dní denně sčítány. Křivky růstu představují údaje získané ze čtyř jednotlivých studií.

Obr. 8 představuje vývojový diagram testů Ad5CMV-p53 v modelu orthotopické rakoviny plic. V diagramu je shrnuto dávkování a schéma ošetření nahé myši, inokulované buňkami H22Br a viry.

Obr. 9A, 9B, 9C a 9D představují vzorky řezů plic a mezihrudí ošetřených a kontrolních myší. Obr. 9A, 9B, 9C a 9D jsou čtyři panely jednoho obrázku. Myši byly usmrceny na konci šestitýdenního období, následujícího po ošetření. Byla vyříznuta plicní a mediastinální tkáň pro hodnocení vzniku nádorů. Obr. 9A představuje vzorek mediastinálního bloku z normální nahé myši, obr. 9B představuje vzorek mediastinálního bloku z myši ošetřené vehikulem (PBS), obr. 9C představuje vzorek mediastinálního bloku z myši ošetřené Ad5CMV-p53 a obr. 9D představuje vzorek mediastinálního bloku z myši ošetřené Ad5/RSV/GL2. Šipky označují hmoty nádorů.

Obr. 10A znázorňuje vliv trvalého vystavení účinků CDDP na rychlost růstu rodičovských buněk H358 a buněk H358 infikovaných Ad-Luc a Ad-p53. Buňky h358 (1,5.10⁵ buněk/jamku) byly duplicitně nasazeny na 24jamkovou plotnu. Po 24 h bylo přidáno 100 μΐ média, zásobního viru Ad-Luc (10⁸ PFU/ml) nebo zásobního viru Ad-p53 (10⁸ PFU/ml). Po dalších 24 h inkubace bylo médiu, obsahující virus, nahrazeno čerstvým médiem, obsahujícím 10 μg/ml CDDP.

Obr. 10B znázorňuje výsledky 24 h vystavení účinkům CDDP na rychlost růstu rodičovských buněk H358 a buněk H358 infikovaných Ad-Luc a Ad-p53. Buňky byly vystaveny účinkům CDDP trvale (obr. 10A) nebo po dobu 24 h s následným zotavením v médiu neobsahujícím léčivo (obr. 10B). Buňky, které zůstaly jako ulpívající monovrstva, byly po dobu 5 dní hodnoceny z hlediska životaschopnosti měřením absorpce trystanové modři. Je uvedena střední hodnota +/- SE. Počet buněk skupiny Ad-p53:CDDP v den 5 se v případě obr. 10A i 10B významně liší ode všech ostatních skupin (p < 0,05 podle Studentova t-testu).

Obr. 10C zobrazuje vliv různých koncentrací CDDP na životaschopnost buněk H358, infikovaných Ad-p53. Po 24 h vystavení účinkům viru Ad-Luc a Ad-p53 byly buňky podrobeny na 24 h působení 0, 10 nebo 100 pg/ml CDDP a pak byla hodnocena životaschopnost.

Obr. 11A znázorňuje nukleosomální fragmentaci DNA v buňkách H358, infikovaných Ad-p53, vystavených účinku CDDP. Buňky, byly infikovány a ošetřovány 24 h CDDP, jak je popsáno pro obr. 10.

Obr. 11B, 11C, 11D, 11E, 11F a 11G znázorňují buňky H358, kultivované na komorových sklíčkách, infikované po dobu 24 h Ad-p53, dalších 24 h ošetřované CDDP a fixované pro označení fragmentace DNA in šitu. Jsou znázorněny rodičovské buňky H358 bez CDDP (obr. 11B), rodičovské buňky H358 s CDDP (obr. 11C), buňky infikované Ad-Luc bez CDDP (obr. 1 ID), buňky infikované Ad-Luc s CDDP (obr. 11E), buňky infikované Ad-p53 bez CDDP (obr. 11F) a buňky infikované Ad-p53 sCDDP (obr. 11G). Šipka označuje příklad tmavě barvených nukleárních fragmentů. Úsečka = 100 pm.

Obr. 12A znázorňuje vliv kombinace infekce Ad-p53 a působení CDDP na sféroidy nádorů H358. Vícebuněčné nádorové sféroidy buněk H358 byly připraveny dříve popsaným postupem (Takahashi a d., 1989). V den 0 byly sféroidy o průměru 150 až 200 pm umístěny na 24 jamkovou plotnu, povlečenou agarem, a vystaveny po dobu 24 h působení Ad-p53 nebo

-10CZ 295144 B6

Ad-Luc. V den 1 bylo po odstranění média, obsahujícího virus, přidáno médium s 10pg/ml CDDP. V den 2 po 24h inkubaci byl překryv nahrazen 1 ml čerstvého média bez léčiva. Pomocí inverzního mikroskopu byly změřeny kolmé průměry. Relativní změna objemu byla vypočtena podle vzorce a² x b/ai² x b_b kde a, resp. b je nejmenší, resp. největší průměr sféroidu a ai a bi jsou tyto průměry v den 1. Pouze relativní objem sféroidů Ad-p53/CDDP je významně menší (p < 0,05 podle Studentova t-testu) než u kontrolní skupiny Cti).

Obr. 12B, 12C, 12D a 12E zobrazují značení dUTP in šitu pomocí TdT pro detekci apoptosy. Sféroidy h358 byly v den 3 fixovány a barveny způsobem popsaným v odstavci Materiály a metody v příkladu 7. Obr. 12B znázorňuje kontrolní neošetřený sféroid, obr. 12C sféroid ošetřený CDDP, obr. 12D sféroid infikovaný Ad-p53 a obr. 12E sféroid infikovaný Ad-p53 a ošetřený CDDP. Úsečka = 100 pm.

Obr. 13A znázorňuje indukci apoptosy účinkem CDDP po infekci in vivo pomocí Ad-p53, měřeno změnami objemu nádoru. Buňky h358 (5.10⁶) v 0,1 ml Hankova vyváženého roztoku soli byly injekčně subkutánně vpraveny do pravého boku myších samic BALB/c nu/nu. Po třiceti dnech bylo do nádorů s průměrem 5 až 6 mm injekčně vpraveno 200 μΐ samotného média nebo média obsahujícího Ad-Luc (10⁸ PFU/ml) nebo Ad-p53 (10⁸ PFU/ml). Byla provedena intratumorální infekce (100 μΐ) a peritumorální injekce na dvou protilehlých místech (po 50 μΐ). CDDP (3 mg/kg) nebo kontrolní fyziologický roztok byl podáván intraperitoneálně. Nádory byly měřeny kaliperem ve dvou kolmých průměrech bez znalosti ošetřovaných skupin a objem nádoru byl vypočten za předpokladu kulového tvaru a výpočtem středního průměru nádoru jako druhé odmocniny součinu příčných průměr. V každé ošetřované skupině bylo použito pět myší a je uvedena střední hodnota +/- SE. Data byla analyzována pomocí Studentova t-testu. Šipky ukazují den ošetření. Jsou uvedeny dvě nezávislá stanovení (test 1 na obr. 13A-1, test 2 na obr. 13A-2). V testu 1 bylo p < 0,05 ode dne 5 a v testu 2 bylo p < 0,05 ode dne 7.

Obr. 13B, 13C, 13D a 13E znázorňují histologické studie s použitím techniky značení biotindUTP pomocí TdT. Nádory byly odebrány 5 dní po zahájení léčby a okamžitě uloženy do směsi O.C.T. Zmrazené tkáně byly nařezány v kryostatu na tloušťku 5 pm. Řezy byly ošetřeny 1 pg/ml proteiny Ka barveny způsobem popsaným pro obr. 12. Zobrazeny jsou nádory H358 ošetřené samostatným CDDP (obr. 13B), samotným Ad-p53 (obr. 13C) a Ad-p53 v kombinaci s CDDP (obr. 13D, 13E). Úsečku = 0,5 mm. Všechna péče o zvířata probíhala v souladu sUTM.D. Anderson Institutional Animal Care and Use Committee.

Nyní budou podrobněji popsány výhodná provedení vynálezu.

A. Molekulární děje ve vývoji rakoviny plic

Studie, prováděné průvodci, objevily kritické molekulární děje, vedoucí k vývoji a postupu rakoviny. To umožnilo původcům vyvinout nové metody obnovování určitých normálních proteinových funkcí, aby mohl být maligní fenotyp potlačen in vivo.

Nejběžnější histologie rakoviny plic (80 %) se zahrnuje pod název „nemalobuněčná rakovina plic“ (non-small-cell lung cancer, NSCLR) a zahrnuje ploché, adenokarcinomové a nediferencované velké buňky. Velká část současných údajů ohledně molekulární biologie rakoviny plic pochází ze studia méně běžné malobuněčné rakoviny plic (SCLC). SCLR je možno odlišit od NSCLC pomocí neuroendokrinních charakteristik buněk; SCLC silně reaguje na chemoterapii, ale po skončení léčby se rychle obnovuje. NSCLC může sloužit také jako model pro jiné typy epitheliální rakoviny, vyvolané karcinogeny. Přístupy a pozorování, vyvinuté v této studii, mohou být použitelné na jiné typy epitheliální rakoviny.

Byl shromážděn dostatek důkazů o tom, že proces maligní transformace je zprostředkován genetickým paradigmatem. Hlavní lese, detekované v rakovinných buňkách, se vyskytují v dominantních onkogenech a supresorových genech. Dominantní onkogeny mají změny ve skupině

-11 CZ 295144 B6 genů, nazývané protoonkogeny, které se účastní kritických funkcí normální buňky včetně transdukce a transkripce signálu. Primární modifikace dominantních onkogenů, které dodávají schopnost transformace, zahrnují bodové mutace, translokace, přeskupení a amplifíkaci. Zdá se, že supresorové geny vyžadují k tomu, aby došlo k transformaci, homozygní ztrátu funkce mutací, delecí nebo jejich kombinací. Některé supresorové geny se jeví jako hrající roli v ovládání proliferace regulací transkripce. Modifikace exprese dominantních onkogenů a supresorových onkogenů pravděpodobně ovlivňuje určité charakteristiky buněk, které přispívají k malignímu fenotypu.

Navzdory rostoucím znalostem mechanismů, účastnících se transformace zprostředkované onkogeny, došlo k malému pokroku ve vývoji terapeutických strategií, specificky cílených na onkogeny a jejich produkty. Původně byl význam v této oblasti zaměřen na dominantní onkogeny, poněvadž ty byly nejdříve charakterizovány. Studie přenosu genů zprostředkovaného DNA ukázaly, že po přenosu DNA z maligních lidských nádorů získají normální buňky maligní fenotyp.

B. p53 a mutace p53 při rakovině

V současné době se p53 uznává jako supresorový gen (Montenarh, 1992). Jeho vysoké hladiny byly nalezeny v mnoha buňkách, transformovaných chemickou karcinogenesí, ultrafialovým zářením a některými viry včetně SV40. Gen p53 je častým cílem mutační inaktivace v nejrůznějších lidských nádorech a již bylo detekováno, zeje nejčastěji mutovaným genem u běžných lidských rakovin (Mercer, 1992). Je mutován zvíce než 50% v případě lidské NSCLC (Hollestein ad., 1991) a v širokém spektru dalších nádorů.

Gen p53 kóduje fosfoprotein o 375 aminokyselinách, který může tvořit komplexy s hostitelskými proteiny, jako je velký T antigen a E1B. Tento protein se nachází v normálních tkáních a buňkách, avšak v koncentracích, které jsou ve srovnání s transformovanými buňkami nebo s nádorovou tkání nepatrné. Je zajímavé, že standardní p53 se jeví jako významný při regulaci růstu a dělení buněk. Hyperexprese standardního p53 se v některých případech projevila jako antiproliferativní v buněčných liniích lidských nádorů. Tak může p53 fungovat jako negativní regulátor buněčného růstu (Weinberg, 1991) a může přímo potlačovat nekontrolovaný růst buněk nebo nepřímo aktivovat geny, které tento růst potlačují. Absence nebo inaktivace standardního p53 tedy může přispět k transformaci. Některé studie však ukazují, že pro plné uplatnění transformačního potenciálu genu může být nutná přítomnost mutantního p53.

I když se standardní p53 uznává jako centrálně významný regulátor růstu v mnoha typech buněk, zdá se, že roli hrají i jeho genetické a biochemické rysy. Pro gen p53 jsou obvyklé mutace s chybným smyslem, které jsou podstatné pro transformační schopnost onkogenů. Karcinogenní p53 může vzniknout v důsledku jediné genetické změny způsobené bodovou mutací. Je však známo, že na rozdíl od jiných onkogenů se bodové mutace p53 vyskytují v alespoň 30 rozdílných kodonech, často tvořících dominantní alely, které vyvolávají posuny ve fenotypu buňky bez poklesu homozygosity. Navíc se zdá, že mnoho těchto dominantních negativních alel je v organismu tolerováno a předává se v zárodečné linii. Různé mutantní alely se jeví v rozmezí od minimálně dysfunkčních po silně penetrující dominantní negativní alely (Weinberg, 1991).

Casey a kolegové uvádějí, že transfekce DNA, kódující standardní p53, do dvou buněčných linií lidské rakoviny prsu obnoví v těchto buňkách supresivní kontrolu růstu (Casey a d., 1991). Podobný účinek byl demonstrován také na transfekci standardního, avšak nikoli mutantního p53 do buněčných linií lidské rakoviny plic (Takahasi a d., 1992). p53 se jeví jako dominantní nad mutantním genem a při transfekci do buněk s mutantním genem bude selektovat proti proliferaci. Normální exprese transfikovaného p53 neovlivňuje růst buněk s endogenním p53. Takové konstrukty tedy mohou být přijaty normálními buňkami bez nepříznivých účinků.

- 12CZ 295144 B6

Je tedy možné, že léčba rakoviny spojených s p53 pomocí standardního p53 může snížit počet maligních buněk. Studie, jako jsou ty výše popsané, však mají k dosažení takového cíle daleko, v nemalé míře proto, že transfekci DNA nelze použít k zavádění DNA do rakovinných buněk uvnitř pacientova těla.

C. Techniky genové terapie

Do současnosti existuje pro genovou terapii několik experimentálních přístupů, ale každý má své nevýhody (Mulligan, 1993). Jak uvedeno výše, existují základní metody transfekce, při nichž se DNA, obsahující příslušný gen, zavádí do buněk nebiologicky, například fyzikální nebo chemickou permeabilizací buněčné membrány. Tento přístup je přirozeně omezen na buňky, které mohou být dočasně vyjmuty z těla a mohou tolerovat cytotoxicitu takového ošetření, tj. lymfocyty. Pro transfekci mohou být použity liposomy nebo proteinové konjugáty, tvořené s některými lipidy a amfofílními peptidy, ale účinnost integrace genu je stále velmi nízká a dosahuje řádově jednoho případu integrace na 1000 až 100 000 buněk a exprese transfíkovaných buněk je často omezen na dny v proliferujících buňkách nebo týdny v neproliferujících buňkách. Transfekce DNA tedy zcela zřejmě není vhodnou metodou léčby rakoviny.

Druhý přístup těží z přirozené schopnosti virů vstupovat do buněk a přinášet s sebou vlastní genetický materiál. Retroviry jsou slibné jako vektory pro podávání genů v důsledku své schopnosti integrovat své geny do genomu hostitele, přenášet velké množství cizího genetického materiálu, infikovat široké spektrum druhů a buněčných typů a být obalovány ve speciálních buněčných liniích. Praktickému využití retrovirových vektorů však brání tři hlavní problémy. Za prvé, infektivita retroviru závisí na dostupnosti virálních receptorů na cílovém povrchu. Za druhé, retroviry se účinně integrují pouze do replikujících buněk. A konečně, retroviry se obtížně koncentrují a čistí.

D. Adenovirové konstrukty pro použití v genomové terapii

Lidské adenoviry jsou nádorové viry s dvouvláknovou DNA s velikostmi genomu přibližně 36 kb (Tooza, 1991). Jako modelový systém pro eukaryotickou expresi genů byly adenoviry široce studovány a důkladně charakterizovány, což z nich činí přitažlivý systém pro vývoj adenoviru jako systému přenosu genů. Tato skupina virů se snadno kultivuje, snadno se s ní manipuluje a vykazuje široké rozmezí hostitelů in vitro i in vivo. V lyticky infikovaných buňkách jsou adenoviry schopny ukončit syntézu hostitelského proteinu, usměrnit buněčný aparát tak, aby syntetizoval velká množství virálních proteinů, a produkoval velká množství viru.

Oblast El genomu zahrnuje E1A a E1B, které kódují proteiny odpovědné za regulaci transkripce virálního genomu a rovněž několika buněčných genů. Exprese E2 včetně E2A a E2B umožňuje syntézu virových replikačních funkcí, například vazebného proteinu DNA, polymerasy DNA a terminálního proteinu, který je primerem replikace. Genové produkty E3 brání cytolýze cytotoxickými buňkami T a faktorem tumorové nekrosy a zdají se důležité pro virální propagaci. Funkce spojené s proteiny E4 zahrnují replikaci DNA, expresi pozdního genu a zastavení hostitelské buňky. Produkty pozdního genu zahrnují většinu virionových kapsidových proteinů a ty jsou exprimovány až poté, co proběhne větší část zpracování jediného primárního transkriptu z většího pozdního promotoru. Větší pozdní promotor (major latě promotor, MLP) vykazuje vysokou účinnost během pozdní fáze infekce (Stratford-Perricaudet a Perricaudet, 1991a).

Protože se zdá, že in cis je vyžadována pouze malá část virálního genomu (Tooza, 1981), nabízejí vektory odvozené od adenoviru vynikající potenciál pro substituci velkých fragmentů DNA při použití ve spojení s buněčnými liniemi, jako jsou buňky 293. K získání esenciálních virálních proteinů in trans byla vyvinuta lidská embiyonální ledvinná buněčná linie transformovaná Ad5 (Graham a d., 1977). Z toho původci vyvozují, že charakteristiky adenovirů je činí vhodnými pro použití při cílení na rakovinné buňky in vivo (Grunhaus & Horwitz, 1992).

-13 CZ 295144 B6

Zvláštní výhody adenovirového systému pro dodávání cizích proteinů do buňky zahrnují (i) schopnost nahrazovat relativně velké úseky virální DNA cizí DNA, (ii) strukturní stabilitu rekombinačních adenovirů, (iii) bezpečnost podávání adenovirů člověku a (iv) neexistencí známého spojení adenovirální infekce s rakovinou nebo zhoubným bujením, (v) schopnost dosáhnout vysokých titrů rekombinačního viru a (vi) vysokou infektivitu adenoviru.

Další výhody adenovirových vektorů oproti retrovirům zahrnují vyšší hladiny genové exprese. Replikace adenoviru je navíc nezávislá na replikaci hostitelského genu, na rozdíl od retrovirálních sekvencí. Protože mohou být snadno vypuštěny geny transformující adenoviru v oblasti El, a přesto mohou být získány účinné expresní vektory, má se za to, že onkogenní riziko z adenovirových vektorů je zanedbatelné (Grunhaus & Horwitz, 1992).

Přenosové systémy genu adenovirem jsou obecně založeny na rekombinačním adenoviru, získaném inženýrstvím, který je učiněn replikačně inkompetentním vypuštěném části svého genomu, jako je El, a přesto si zachovává kompetenci pro infekci. Provedou-li se v genomu adenoviru další delece, mohou být exprimovány relativně velké cizí proteiny. Například adenoviru s delecemi jak v oblasti El, tak E3 jsou schopny nést až 10 kb cizí DNA a mohou být pěstovány do vysokých titrů v buňkách 293 (Stratford-Parricauded a Perricaudet, 1991a). Překvapivě byla zaznamenána také přetrvávající exprese transgenů po adenovirální infekci.

Genový přenos zprostředkovaný adenovirem byl v nedávné době zkoumán jako prostředek zprostředkování přenosu genů do eukaryotických buněk a do celých živočichů. Například při ošetřování myší se vzácnou recesivní genetickou poruchou nedostatku omithin transkarbamylasy (OTC) bylo zjištěno, že je možno použít adenovirálních konstruktů k dodávání normálního enzymu OTC. Exprese normální hladiny OTC však bylo bohužel dosaženo pouze ve 4 ze 17 případů (Stratfored-Perricauded a d., 1991b). U většiny myší tedy došlo pouze k částečné nápravě defektu a ošetření nevedlo k fyziologické nebo fenotypické změně. Výsledky tohoto typu jsou tedy malým povzbuzením pro používání adenovirálních vektorů v terapii rakoviny.

Pokusy použít adenovirus k přenosu genu pro regulátor transmembránového vedení cystické fíbrosy (CFTR) do pulmonálního epithelu bavlníkových krys byly rovněž částečně úspěšné, i když nebylo možno zhodnotit biologickou aktivitu přeneseného genu v epithelu zvířat (Rosenfeld a d., 1992). Tyto studie opět demonstrují genový přenos a expresi proteinu CFTF v buňkách plicních dýchacích cest, avšak neprokázaly fyziologický účinek. V článku v Science 1991 prokázali Rosenfeld a d., expresi proteinu cd-antitrypsinu v plicích, ale opět neprokázali fyziologický účinek. Odhadli totiž, že úroveň exprese, kterou pozorovali, činila pouze asi 2 % úrovně nutné pro ochranu plic u člověka, tj. byla daleko pod úrovní nutnou pro fyziologický účinek.

Gen pro lidský ai-antitrypsin byl zaveden intraportální injekcí do jater normálních krys, kde byl exprimován a vyvolal sekreci zavedeného lidského proteinu do plasmy těchto krys (Jaffe a d., 1992). Dosažené hladiny však bohužel nebyly dost vysoké, aby měly terapeutickou hodnotu.

Výsledky tohoto typu nedemonstrují, že by byl adenovirus schopen řídit expresi dostatečného množství proteinu v rekombinačních buňkách k dosažení fyziologicky relevantního účinku, a nevyplývá žních tedy vhodnost adenovirového systému pro použití ve spojení s terapií rakoviny. Kromě toho se před vznikem vynálezu mělo za to, že p53 nemůže být zabudován do obalové buňky, jaké se například používají k přípravě adenoviru, protože by byla toxická. Protože se E1B adenoviru váže na p53, mělo se za to, že to je další důvod, proč nelze kombinovat technologii adenoviru p p53.

E. Konstrukty p53-adenovirus a potlačování nádorů

Vynález umožňuje genovou terapii rakoviny s novým a účinnějším supresorovým vektorem. Tento rekombinační virus využívá výhody adenovirálních vektorů, jako je vysoký titr, široké

-14CZ 295144 B6 rozmezí cílů, účinná transdukce a neintegrace do cílových buněk. V jednom provedení vynálezu je vytvořen replikačně defektní adenoviru nezávislý na pomocném prostředku, který exprimuje standardní p53 (Ad5CMV-p53) pod kontrolou promotoru lidského cytomegaloviru.

Je-li požadována exprese v savčích buňkách, jsou kontrolní funkce na expresních vektorech často odvozeny od virů. Například obvykle užívané promotory jsou odvozeny od polyomu, adenoviru 2 a opičího viru 40 (SV40). Zvlášť výhodné jsou časný a pozdní promotor viru SV40, protože oba se snadno z viru získávají jako fragment, který tedy obsahuje virový počátek replikace SV40. Je možno použít i menší nebo vetší fragmenty SV40, pokud obsahují sekvenci o přibližně 250 bp, sahající od místa Hind\\[ k místu Bgll, umístěného ve virálním počátku replikace. Kromě toho je rovněž možné a často žádoucí používat promotorové nebo kontrolní sekvence normálně asociované se zahrnutou genovou sekvencí, pokud jsou tyto kontrolní sekvence kompatibilní se systémem hostitelské buňky.

Počátek replikace může být vytvořen takovou konstrukcí vektoru, aby zahrnovala exogenní počátek, jaký může být například odvozen z SV40 nebo jiného virového zdroje (například polyomového, adeno, VSV, BPV), nebo může být vytvořen chromosomálním replikačním mechanismem hostitelské buňky. Je-li vektor integrován do chromosomu hostitelské buňky, obvykle postačuje druhá možnost.

Konstrukce a propagace výhodného adenoviru p53 je schematicky znázorněna na obr. 1.

V souvislosti s tím byl vyvinut zlepšený postup propagace a identifikace rekombinačního adenoviru (diskutován dále). Po identifikaci byl rekombinační virus p53 strukturně potvrzen analýzou PCR, jak znázorňuje obr. 2. Po izolaci a potvrzení jeho struktury byl adenovirus p53 použit k infikování buněčné linii H358 lidské rakoviny plic, která má homozygní deleci genu p53. Westernové bloky ukázaly, že exogenní protein p53 byl exprimován s vysokou hladinou (obr. 4 a obr. 5) a s vrcholem 3 dny po infekci (obr. 6A a 6B).

V buněčné linii H322 s bodovou mutací p53 bylo dále prokázáno, že mutantní p53 byl regulačně oslabován expresí exogenního p53. Jako experimentální kontrola byl použit virion (Ad5/RSV/GL2), který měl strukturní podobnost sAd5CMV-p53. Tento virion obsahoval v expresní kazetě virion cDNA luciferasy, řízenou promotorem LTR viru Rousova sarkomu.

V buňkách infikovaných virionem Ad5/RSV/GL2 nebyla detekována ani exprese p53, ani změna exprese aktinu. Růst buněk H358, infikovaných Ad5CMV-p53, byl značně inhibován oproti neinfikovaným buňkám nebo buňkám infikovaným kontrolním virionem (obr. 7A). Růst buněk H322 byl rovněž silně inhibován virionem p53 (obr. 7B), zatímco růst buněk H460 lidské rakoviny plic, obsahujících standardní p53, byl ovlivněn méně (obr. 7C).

Ad5CM-p53 zprostředkováván silný inhibiční účinek na růst buněk rakoviny plic in vitro. Inhibice růstu nebyla tak evidentní, pokud byly buňky infikovány Ad5CMV-p53 s četností infekce (multiplicity of infection, MOI) nižší než 1 PFU/buňku, zatímco při MOI vyšší než 100 PFU/buňku byla cytotoxicita pozorována i u kontrolního viru Ad5/RSV/GL2. Při našich studiích byla optimální dávka pro testy rychlosti růstu 10 až 50 PFU/buňku. V tomto rozmezí dávek bylo možno inhibici růstu buněk přisoudit exprimovanému proteinu p53.

Testy na nahé myši demonstrovaly, že tumorigenicita buněk H358, ošetřených Ad5CMV-p53, byla silně inhibována. V myším modelu lidské orthotopické rakoviny plic byly tumorigenní buňky H226Br s bodovou mutací v p53 intratracheálně inokulovány 3 dny před ošetřením virem. Intratracheálním vpravením Ad5CMV-p53 bylo v tomto modelovém systému zabráněno tvorbě nádoru, z čehož vyplývá, že modifikovaný adenovirus je účinným vektorem pro zprostředkování přenosu a exprese supresorových genů v lidských rakovinných buňkách a že virus Ad5CMV-p53 může být dále vyvíjen na terapeutický prostředek pro použití v genové terapii rakoviny.

Jak je demonstrováno analýzou westernovým přínosem, zprostředkoval Ad5CMV-p53 vysokou úroveň exprese genu p53 v buňkách lidské rakoviny plic. Exogenní protein p53 byl v buňkách

-15CZ 295144 B6

H460 přibližně 14krát hojnější než exogenní standardní p53 a v buňkách H358 asi dva- až čtyřikrát hojnější než β-aktin jako vnitřní kontrola. Vysokou úroveň exprese je možno přisoudit (1) vysoce účinnému přenosu genů, (2) řízení cDNA p53 silným promotorem CMV a (3) zesilování transkripce cDNA p53 adenovirálním zesilovačem El. Doba exprese p53 po infekci činila v buňkách H358 více než 15 dní. Po 5. postinfekčním dni však došlo k rychlému snížení exprese. Analýza vzorků DNA z infikovaných buněk H358 pomocí PCR ukázala pokles hladiny virální DNA se sníženou hladinou proteinu, což ukazuje na úbytek virální DNA během trvajícího růstu rakovinných buněk in vitro.

Pokles exprese p53 mohl být způsoben rovněž buněčnou atenuací promotoru CMV, který kontroluje expresi p53, poněvadž již dříve byl zaznamenán jev zastavení promotoru CMV zprostředkované hostitelskou buňkou (Dai a d., 1992). Adenovirální vektory jsou neintegrativní vektory přenosu genů, v trvání genové exprese tedy závisí na velkém počtu faktorů, zahrnujících hostitelské buňky, přenesené geny a relevantní promotor. Crystal a spolupracovníci prokázali, že 6 týdnů po infekci je v epitheliálních buňkách bavlníkové krysy detekovatelná nízká úroveň exprese genu CFTR (Rosenfeld a d., 1992). Perricaudetova laboratoř demonstrovala minimální trvání exprese genu minidystrofínu v mdx myším svalu po dobu více než 3 měsíců po infekci. Krátkodobá vysoká úroveň exprese standardního proteinu p53, pozorovaná v této studii, může mít po ošetření Ad5CMV-p53 in vivo příznivý účinek snižování možných vedlejších účinků na normální buňky.

Zde popsané studie naznačují, že rekombinační adenovirus p53 má vlastnost potlačování nádorů, působící, jak se zdá, obnovováním funkce proteinu p53 v nádorových buňkách. Tyto výsledky poskytují podporu pro použití virionu Ad5CMV-p53 jako terapeutického prostředku pro léčbu rakoviny.

F. Prostředky poškozující DNA

Podle vynálezu je možné používat různé prostředky poškozující DNA, například prostředky, které přímo DNA síťují, prostředky, které se do DNA zabudovávají interkalací a prostředky, které vedou k chromosomálních a mitotickým anomáliím ovlivňováním systému nukleové kyseliny.

Předpokládá se, že zde popisované prostředky, které přímo síťují nukleové kyseliny, konkrétně DNA, vyvolávají poškození DNA, vedoucí k synergické antineoplastické kombinaci. Mohou být používány prostředky jako dysplatina a jiné prostředky alkylace DNA. Cisplatina se široce používá pro léčení rakoviny v klinické aplikaci s použitím účinných dávek 20 mg/m² po dobu 5 dní každé tři týdny celkem po tři cykly. Cisplatina není absorbována orálně, a musí být proto podávána intravenózní, subkutánní, intratumorální nebo intraperitoneální injekcí.

Prostředky, které poškozují DNA, zahrnují rovněž sloučeniny, které interferují s replikací DNA, mitosou a chromosomální segregací. Příklady těchto sloučenin zahrnující adriamycin, známý rovněž jako doxorubicin, etoposid, verapamil, podofyllotoxin apod. Při klinické terapii neoplasmů se tyto sloučeniny podávají intravenózně v bolusových injekcích v dávkách v rozmezí 25 až 75 mg/m² v 21denních intervalech pro adriamycin, 35 až 50 mg/m² intravenózně pro etoposid nebo orálně ve dvojnásobné dávce.

Prostředky, které narušují syntézu a věrnost prekursorů nukleových kyselin a podjednotek, také vedou k poškození DNA. Jako takové byly vyvinuty četné prekursory nukleových kyselin. Zvlášť výhodné jsou prostředky, které byly podrobeny rozsáhlým testům ajsou snadno dostupné. Mezi nimi jsou neoplastickou tkání přednostně využívány takové látky, jako je 5-fluorouracil (5-FU), který je tedy zvlášť vhodný pro cílení na neoplastické buňky. I když je značně toxický, je 5-FU použitelný v širokém rozmezí nosičů, včetně topických, avšak obvykle se používá intravenózní aplikace s dávkami v rozmezí 3 až 15 mg/kg/den.

-16CZ 295144 B6

Další faktory, které způsobují poškození DNA a široce se používají, zahrnují prostředky, obecně známé jako γ paprsky, paprsky X a/nebo řízené dodávání radioisotopů do nádorových buněk. Předpokládají se rovněž další formy faktorů poškozujících DNA, jak jsou mikrovlny a UV záření. Je velmi pravděpodobné, že všechny tyto faktory vyvolávají v širokém rozsahu poškození prekursorů DNA, replikace a oprav DNA a sestavování a udržování chromosomů. Dávkování paprsků X se pohybuje od denních dávek 50 až 200 roentgen po určitou dobu (3 až 4 týdny) do jednorázové dávky 2000 až 6000 roentgen. Rozmezí dávek radioisotopů je velmi proměnlivé a závisí na poločasu rozpadu isotopu, síle a typu vysílaného záření a na příjmu neoplastickými buňkami.

Zkušený odborník se odkazuje na „Remingtonů Pharmaceutical Sciences“, 15. vyd. kapitola 33, zejména stránky 624 až 652. K určité obměně dávkování nutně dochází v závislosti na stavu ošetřovaného subjektu. Osoba odpovědná za podávání prostředku by měla v každém případě stanovit příslušnou dávku pro individuální subjekt. Při podávání lidem by preparáty navíc měly vyhovovat standardům ohledně sterility, perogenicity, všeobecné bezpečnosti a čistoty, vyžadovaných FDA Office of Biologics standards.

G. Ošetření p53 a cisplatinou

Za účelem stanovení účinnosti kombinace terapie náhrady genů a chemoterapie u lidské rakoviny původci zjišťovali, zda může postupné podávání Ad-p53 a CDDP vyvolat apoptosu in vivo. Po 3 dnech přímého intratumorálního injekčního podávání Ad-p53 nebo intraperitoneálního podávání CDDP vykazovaly nádory H358, implantované subkutánně myším nu/nu, mírné zpomalení růstu. Jestliže však byly Ad-p53 a CDDP podávány současně, došlo k částečné regresi nádorů a velikosti nádorů zůstala statisticky významně menší než ve kterékoli jiné ošetřované skupině. Inhibiční účinek na růst byl ještě výraznější po dvou cyklech ošetření (obr. 13A). Histologickým vyšetřením byla zjištěna masivní destrukce nádorových buněk v oblasti, kde yl Ad-p53 injekčně vpravován myším ošetřovaným CDDP. Barvením in šitu bylo demonstrováno mnoho apoptotických buněk kolem acelulámích prostorů (obr. 13B až 13E). Naproti tomu nádory ošetřované samotným CDDP nebo samotným Ad-p53 nevykazovaly ani acelularitu, ani apoprotické oblasti.

Vynález popisuje novou strategii lidské genové terapie v kombinaci s konvenční chemoterapií s použitím prostředku síťujícího DNA. Rezistence nádorových buněk vůči chemoterapeutikům představuje velký problém klinické onkologie. Alespoň 80 % případů rakoviny plic má na svědomí NSCLC; pacienti sNSCLC však obecně na nereagují na chemoterapii (Doyle, 1993). Jedním z cílů současného výzkumu rakoviny je nalézt způsoby, jak zlepšit účinnost terapie rakoviny náhradou genů, zkoumáním interakce mezi genovým produktem a chemoterapeutiky. Gen thymidin kinasy herpes simplex (HS-tK), dodávaný do mozkových nádorů retrovirálním vektorovým systémem, úspěšně vyvolávat vnímavost vůči antivirálnímu prostředku gancicloviru (Culver a d., 1992). Genový produkt HS-tK je exogenní viráiní enzym, zatímco v normálních tkáních je exprimován protein wt-p53, z čehož by vyplývalo, že modulace chemorezistence změnami v expresi wt-p53 by mohla být alternativním přístupem, používajícím dráhu, zprostředkovanou endogenním genetickým programem.

Adenovirový systém má potenciální výhody pro podávání genu in vivo, jako je snadnost produkce viru s vysokým titrem, vysoká účinnost infekce a infektivita pro mnoho typů buněk. Stabilita a doba exprese zavedeného genu jsou však stále kontroverzní. Pro chemo-genovou terapii může být vysoká hladina exprese a vysoká infektivita významnější než doba exprese, poněvadž infikované buňky je možno pomocí léčiv usmrtit za několik dní. Ke zvýšení hladiny p53 v buňkách, které jsou citlivé na chemoterapeutika, může dojít do 6h po stimulu poškozujícím DNA (Fritshe a d., 1993, Zhan a d„ 1993), ačkoli zvýšenou aktivitu p53 pro navázání DNA je možno zvrátit v průběhu 4 h, odstraní-li se stimul (Tishler a d., 1993). V modelu podle vynálezu je exprese genu wt-p53 řízena nezávisle cytomegalovirovým promotorem obsaženým ve vektoru Ad-p53. Je tedy možno udržet vysokou hladinu exprese p53 i po přerušení expozice léčivu. Exprese proteinu wt-p53 pomocí Ad-p53 kulminuje v den 3 po infekci

- 17CZ 295144 B6 (14krát více než u endogenního standardního typu) a do dne 9 klesá na nízkou hodnotu (Zhang a d., 1993). Z toho vyplývá, že přechodně vysoká hladina exprese p53 je dostatečná k iniciaci cytotoxického programu v rakovinné buňce.

H. Pacienti a postup léčby

Původci soudí, že regionální dodání adenovirálních konstruktů genu p53 do buněk rakoviny plic u pacientů s rakovinami souvisejícími s p53, jako jsou neresektovatelné obstruktivní endobronchiální rakoviny, bude velmi účinnou metodou dodávání terapeuticky účinného genu, působícího proti klinickému onemocnění. Dodávání genu p53 má probíhat v kombinaci s prostředky nebo faktory, které vedou k poškození DNA. Tento kombinovaný přístup je významným zlepšením z hlediska současných terapií rakoviny, například ztráty citlivosti vůči samotné cisplatině, které spočívají ve snaze usmrtit nebo odstranit poslední rakovinnou buňku vyvoláním poškození DNA. Jelikož je potvrzeným jevem klidové stadium nádorových buněk, je účinné usmrcování vysoce nepravděpodobné.

Předpokládá se, že absorpce adenovirových konstruktů buňkami NSCLC sníží rychlost proliferace těchto buněk, avšak příklady provedení demonstrují, že kombinované použití prostředku nebo faktoru poškozujícího DNA s adenovirem p53 vede k výraznému snížení růstu buněk a velikosti nádorů, které se neprojevuje u žádného z těchto faktorů samotného. Přípravky a způsoby podle vynálezu silně přispívají k prodloužení doby, po kterou zůstane napadená plíce expandovaná, zabrání se opětnému růstu nádoru a dělení nádorových buněk a prodlouží se přežití pacienta.

Pro tento kombinovaný postup se předpokládají pacienti s recidivujícím neresektovatelným endobronchiálním nádorem, který částečně nebo úplně ucpává dýchací cesty, u kterých selhává nebo nejsou schopni přijetí externí radioterapie. Současné terapie tohoto stavu nabízejí pouze krátkodobou úlevu. Většina pacientů navzdory externí radioterapii recidivuje. Někdy je možné zavést brachyterapeutický katétr a aplikovat další radioterapii, intravenózní aplikaci prostředků poškozujících DNA. Pacienti ošetřovaní současnými metodami mají střední přežití 6 měsíců. Pacienti, u nichž brachyterapie selhala, by mohli být rovněž vhodní pro genovou terapii. Nádor je možno z dýchacích cest odstranit laserem nebo bioptickou pinzetou. To je možno provádět ve spojení s injekcí adenovirálních konstruktů, čímž se sníží objem, který musí být vstříknut. Podávání virálních konstruktů nebrání, aby pacient přijímal jinou paliativní terapii, jestliže nádor postupuje.

I. Jiné metody přenosu genů

Účinná genová terapie obecně vyžaduje integraci genu, schopného opravit genetickou poruchu, do hostitelského genomu, kde koexistuje a replikuje se s hostitelskou DNA a je exprimován v hladině, která kompenzuje defektní gen. Ideálně se choroba vyléčí jedním nebo několika málo ošetřeními bez vážných vedlejších účinků. Dosud bylo navrženo několik přístupů ke genové terapii, které je možno použít podle vynálezu.

První přístup spočívá v transfekci DNA obsahující příslušný gen do buněk, například chemickou nebo fyzikální permeabilizací buněčné membrány. Tento přístup je obecně omezen na buňky, které mohou být dočasně vyjmuty z těla a mohou tolerovat cytotoxicitu ošetření (tj. lymfocyty). Pro transfekci in vivo mohou být použity liposomy nebo bílkovinné konjugáty s určitými lipidy a amfofilními peptidy (Stewart a d., 1992, Torchilin a d., 1992, Zhu a d., 1993), avšak současná účinnost genové integrace je velmi nízká. Odhaduje se, že daný gen se integruje do genomu pouze jedné buňky s 1000 až 100 000. Při absenci integrace je exprese transfíkovaného genu omezena na několik dní v proliferujících buňkách nebo několik týdnů v neproliferujících buňkách v důsledku degradace neintegrovaných DNA.

- 18CZ 295144 B6

Druhý přístup využívá přirozenou schopnost virů vstupovat do buněk a přinášet s sebou vlastní genetický materiál. Slibnými vektory pro dodávání genů jsou retroviry v důsledku své schopnosti integrovat své geny do hostitelského genomu za současného přenosu velkého množství cizího genetického materiálu, infikovat široké spektrum druhů a typů buněk a být obalovány ve speciálních buněčných liniích (Miller, 1992).

Třetí metoda využití jiné viry, jako je adenovirus, viry herpes simplex (HSV), cytomegalovirus (CMV) a adeno-asociovaný virus (AAV), které jsou konstruovány tak, aby sloužily jako vektory pro genový přenos. I když některé viry, které mohou přijímat cizí genetický materiál, mají omezený počet nukleotidů, mohou se přizpůsobit a v rozmezí buněk, které infikují, prokazují tyto viry úspěšný průběh genové exprese. Adenoviry však svůj genetický materiál do hostitelského genomu neintegrují, a tudíž pro genovou expresi nevyžadují replikaci hostitele, takže se ideálně hodí pro rychlou, účinnou expresi heterologních genů.

Přestože je vynález popsán do určité míry konkrétně, je zřejmé, že odborník může na základě výše uvedeného popisu provádět různé alternativy, modifikace a obměny. Vynález je koncipován tak, že všechny tyto alternativy, modifikace a obměny, které jsou součástí myšlenky vynálezu, spadají do rozsahu připojených patentových nároků.

Příklady provedení vynálezu

K demonstraci výhodných provedení vynálezu jsou uvedeny příklady. Odborníkovi je zřejmé, že metody, popsané v následujících příkladech, představují metody, ověřené původci jako vhodné k provádění vynálezu, a tudíž je možno je považovat za výhodné provedení vynálezu. Na základě popisu vynálezu však je odborníkovi zřejmé, že konkrétní popsaná provedení je možno s podobnými nebo analogickými výsledky různě obměňovat, aniž by se překročila myšlenka a rozsah vynálezu.

Příklad 1

Konstrukce expresního vektoru p53b

Tento příklad popisuje konstrukci expresního vektoru p53. Tento vektor je konstruován popsaným způsobem a používá se k nahrazení oblasti El (1,3 až 9,2 m.u.) genomem kmene Ad5 adenoviru a ke konstrukci adenovirového virionu podle příkladu 2.

Expresní kazeta p53, znázorněná na obr. 1, která obsahuje promotor lidského cytomegaloviru (CMV) (Boshart a d., 1985), cDNA p53 a časný polyadenylační signál SV40, byla vložena do pXCJLl (poskytnut Dr. Frankem L. Grahamem, McMaster University, Kanada) mezi místa Xba I a Cla I.

Velikost genomu je asi 35,4 kb a je rozdělena na 100 mapových jednotek (m.u., 1 m.u. = 0,35 kb). Expresní kazeta p53 nahradila oblast El (1,3 až 9,2 m.u.) genomu Ad5.

Primer 1 má sekvenci 5'-GGCCCACCCCCTTGGCTTC-3' (SEQ ID NO: 1) a je umístěn v prvním intronů za hlavním promotorem genu IE lidského CMV (Boshart a d., 1985). Primer 2 má sekvenci 5-TTGTAACCATTATAAGCTGC-3' (SEQ ID NO: 2) a je umístěn v časném polyadenylačním signálu SV40. Oba tyto primery, na obou koncích ve vzdálenosti 15 až 20 bp od insertu cDNA p53, definují produkt PCR o velikosti 1,40 kb. Primer 3 má sekvenci 5'-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3' (SEQ ID NO: 3) a primer 4 sekvenci 5-CATCTGAACTCAAAGCGTGG-3' (SEQ ID NO: 4) a jsou umístěny ve vzdálenosti 11, resp. 13,4 m.u. genomu Ad5, takže definují produkt PCR, specifický pro virální genom, o velikosti 0,86 kb.

-19CZ 295144 B6

Příklad 2

Tvorba a propagace rekombinačního adenoviru p53

Tento příklad popisuje jednu z metod, vhodných pro vytvoření rekombinačních adenovirů, nezávislých na pomocném prostředku, exprimujících p53. Molekulární strategie, použitá k produkci rekombinačního adenoviru, je založena na skutečnosti, že vzhledem k obalovému limitu adenoviru pJM17 sám o sobě nemůže tvořit virus. Homologní rekombinace musí plasmidem expresního vektoru p53 a pJM17 v transfíkované buňce tedy vede k životaschopnému viru, který může být obalován pouze v buňkách, které exprimují potřebné adenovirální proteiny.

Postup podle tohoto příkladu používá buňky 293 jako hostitelské buňky k propagaci virů, které obsahují substituce expresních kazet heterologní DNA v oblastech El nebo E3. Tento postup vyžaduje konstransfekci DNA do buněk 293. Transfekce do značné míry určuje účinnost virální propagace. Před vznikem vynálezu se pro transfekci DNA do buněk 293 obvykle používala koprecipitace fosforečnan vápenatý/DNA (Graham a van der Eb, 1973). Tato metoda spolu s plakovým testem je však poměrně obtížná a často má za následek nízkou účinnost virální propagace. Jak je vysvětleno v tomto příkladu, transfekce a následná identifikace infikovaných buněk byly významně zlepšeny použitím liposomy zprostředkované transfekce, jestliže byly transfíkované buňky identifikovány podle cytopatického efektu (CPE).

Buněčná linie 293 byla uchovávána v Dulbeccově modifikovaném minimálním esenciálním médiu, doplněném 10 % teplem inaktivovaného koňského séra. Expresní vektor p53 a plasmid pJM17 (McGrory a d., 1988) pro homologní rekombinací byly kontransfikovány do buněk 293 DOTAP-zprostředkovanou transfekci podle výrobního protokolu (Boehringer Mannheim Biochemicals, 1992). Schematicky je to znázorněno na obr. 1.

Buňky 293 (pasáž 35, 60 % konfluence) byly inokulovány 24h před transfekci buď na miskách 60 mm, nebo na 24jamkových plotnách. Buňky v každé jamce byly transfíkovány 30 μΐ DOTAP, pg expresního vektoru p53 a 3 pg plasmidu pJM17. Po transfekci bylo buňkám každé 2 až dny doplňováno médium MEM do nástupu CPE.

Příklad 3

Potvrzení identity rekombinačního adenoviru

Tento příklad osvětluje nový test pomocí polymerasové reakce (PCR) k potvrzení identity rekombinačních virionů po kotransfekci příslušné buněčné linie.

Alikvoty supernatantů buněčné kultury (50 až 370 pl) byly odebrány z testovacích ploten, ošetřeny po dobu 1 h při 56 °C proteinasou K (50 pg/ml s 0,5 % SDS a 20 mM EDTA), extrahovány směsí fenol-chloroform a nukleové kyseliny byly vysráženy ethanolem. Pelety DNA byly resuspendovány ve 20 pl dH₂O a použity jako templát pro amplifikaci PCR. Relativní polohy primerů PCR jsou znázorněny na obr. 1, kde jsou také uvedeny jejich sekvence jako SEQ ID NO: 1, 2, 3 a 4. Primery specifické pro insert cDNA definují produkt PCR o velikosti 1,4 kb a primery specifické pro virální genom definují produkt PCR o velikosti 0,86 kb. Reakce byly prováděny v objemu 50 pl, obsahujících 4 mM MgCl₂, 50 mM KCL, 0,1% tritonu X-100, 200 pM každého dNTP, lOmM Tris-CL (pH 9,0), 2 pM každého primeru a 1,0 jednotky polymerasy Taq (Promega). Reakce byly prováděny 0,5 min při 94 °C, 0,5 min při 56 °C a 1 min při 72 °C po dobu 30 cyklů.

-20CZ 295144 B6

Pro zjednodušení postupu identifikace nově propagovaných rekombinačních virů byl vyvinut přímý test PCR vzorků DNA za supematantu buněčné kultury. Alikvoty (50 nebo 370 μΐ) supernatantu prostředí buněčné kultury s CPE byly ošetřeny proteinasou K a extrakcí směsí fenol/chloroform. Po vysrážení ethanolem byly vzorky DNA analyzovány pomocí PCR s použitím dvou párů primerů pro amplifikaci sekvencí, specifických pro insert a specifických pro virální genom. Cíle primerů PCR a jejich sekvence jsou znázorněny na obr. 1. Primerům 1, 2, 3 a 4 náležejí sekvence s označením SEQ ID NO: 1, 2, 3 a 4.

Jako výsledek byl amplifíkován insert cDNA o velikosti 1,4 kb a fragment virálního genomu o velikosti 0,86 kb z expresního vektoru (pozitivní kontrola) a vzorků DNA pozitivní buněčné kultury (obr. 2B, pruh 1, resp. 4). Ze vzorku DNA viru Ad5/RSV/G12 byl amplifíkován pouze fragment 0,86 kb (negativní kontrola, pruh 2). V případě PCR reakcí s použitím supematantu kultivačního média obou neošetřených pozitivních buněčných kultur nebyly získány amplifikované pásy (pruh 3).

Tyto výsledky naznačily, že adenoviry, vylučované do kultivačního média buněk, jsou detekovatelné pomocí PCR již s použitím pouze 50 μΐ supematantu kultivačního média pro přípravu templátů DNA. Tento výsledky umožní vývoj kvantitativní metody pro použití této techniky ke stanovování titrů adenovirů, tradičně prováděnému pomocí plakových testů.

Sekvence cDNA standardního p53 ve vru Ad5CMV-p53 byla potvrzena sekvenováním dideoxy DNA na virální DNA, čištěné gradientem CcCl. Kontrolní virus Ad5/RSV/GL2, vytvořený podobným způsobem, má strukturu podobnou jako Ad5CMV-p53 s výjimkou toho, že v jeho expresní kazetě byl použit virální promotor Rousova sarkomu a cDNA luciferasy. Rekombinační adenovirus, který nese β-galaktosidasový gen E. coli (LacZ), Ad5CMV-LacZ, má rovněž podobnou strukturu jako Ad5CMV-p53 a je možno jej získat postupem popsaným v Zhang a d., a od Dr. Franka L. Grahama (viz Graham a d., 1991).

Zásoba virů, titr a infekce. Jednotlivé klony virů Ad5CMV-p53, Ad5CMV/RSV/GL2 aAd5CMV-LacZ byly získány čištěním plaků způsobem podle Gahama a Prevece (1991). Jednotlivé virální klony byly propagovány v buňkách 293. Kultivační médium buněk 293, vykazující úplný cytopatický efekt, bylo odebráno a odstředěno po dobu 10 min při 1000 g. Shromážděné supernatanty byly rozděleny na alikvoty a skladovány jako zásoba virů při -20 °C. Virální titry byly stanoveny plakovými testy (Graham a Prevec, 1991). Infekce buněčných linií byla prováděna přídavkem roztoků virů (0,5 ml na misku 60 mm) k buněčným monovrstvám a inkubací při teplotě místnosti po dobu 30 min s krátkým zamícháním každých 5 minut. Pak následoval přídavek kultivačního média a návrat infikovaných buněk do inkubátoru o teplotě 37 °C.

Účinnost přenosu genů pomocí rekombinančních adenovirů byla hodnocena rovněž s použitím Ad5CMV-LacZ v různých buněčných liniích, jako je H226Br, H322, H460, HeLa, Hep G2, LM2 a Věro. Při barvení s použitím X-gal se všechny buněčné linie po infekci Ad5CMV-LacZ v množství MOI 30 PFU/buňku zbarvily z 97 až 100 % modře.

Příklad 4

Exprese genu p53 řízená Ad5CMV-p53 v buňkách lidské rakoviny plic

Tento příklad popisuje použití rekombinačního adenovirů p53 k infekci buněk lidské rakoviny plic s homozygní delecí genu p53. Výsledky ukazují, že růst těchto buněk a exprese mutantního p53 byly potlačeny, což ukazují, že virion Ad5CMV-p53 může být vhodným prostředkem pro kontrolu metastatických buněk.

-21 CZ 295144 B6

Imunohistochemie byla provedena na monovrstvách infikovaných buněk, které byly fixovány 3,8 % formalinu a na 5 min podrobeny působení 3 % H₂O₂ v methanolu. Imunohistochemická analýza byla provedena s použitím soupravy Vectastain Elitě (Vector Burlingame, CA). Jako primární protilátka byla použita protilátka proti p53 PAb 1801 (Oncogene Science, Manhasset, NY); MOPC-21 (Organon Teknika Corp., West Chester, PA) byl použit jako negativní kontrola. Druhou protilátkou byl avidinem značený proti-myší InG (Vector). Komplexní činidlo ABC s biotinylovou křenovou pexodasou bylo použito k detekci komplexu antigen-protilátka. Nakonec byly buňky dobarveny Harrisovým hematoxylinem (Sigma) a zality Cytosealem 60 (Stephens Scientific, Riverdale, NJ).

Byla provedena imunohistochemická analýza infikovaných buněčných linií ke zjišťování in šitu exprese p53 řízené promotorem CMV viru Ad5CMV-53. V buněčné linii H358, která má homozygní deleci p53, bylo imunohistochemickou analýzou zjištěno, že gen p53 byl přenesen s 97 až 100% účinností, jestliže byly buňky infikovány Ad5CMV-p53 s MOI 30 až 50 jednotek tvořících plaky na buňku (PFU/buňku; obr. 4).

Vysoká účinnost přenosu rekombinačního adenovirů byla potvrzena pomocí viru Ad5CMVLacZ, který nese gen LacZ, přepsaný promotorem IE lidského CMV. Při hodnotě MOI 30 až 50 PFU/buňku byly všechny zkoumané buňky, zahrnující buněčné linie HeLa, Hep G2, LM2 a lidské rakoviny NSCLC, při barvení X-gal z 97 až 100% pozitivní na b-galaktosidasovou aktivitou. Tyto výsledky naznačují, že adenovirální vektory jsou účinným prostředkem přenosu genů do lidských rakovinných buněk.

Analýza westernovým přenosem byla prováděna na totálních buněčných lyzátech, připravených lyžováním monovrstvy buněk v miskách vzorkovým pufrem SDS-PAGE (0,5 ml na misku 60 mm) po promytí buněk fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (PBS). Pro analýzu SDS-PAGE byla na pruhy naneseny buněčné lyzáty ekvivalentní 5.10⁴ buněk (10 až 15 ml). Proteiny v gelu byly přeneseny na membránu Hybond™-ECL (Amersham, Arlington Heights, IL). Membrány byly blokovány PBS s 0,5 % sušeného mléka a sondovány s primárními protilátkami: monoklonální myší protilátkou proti lidskému p53 PAb 1801 a monoklonální myší protilátkou proti lidskému β-aktinu (Amersham), promyty a sondovány se sekundární protilátkou: králičím proti-myším IgG, konjugovaným s křenovou peroxidasou (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Membrány byly vyvíjeny podle zlepšeného chemiluminiscenčního promotoru fy Amersham. Relativní množství exprimovaného exogenního p53 byla stanovena densitometrem (Molecular Dynamics lne., Sunnyvale, CA).

Westernový přenos ukázal, že exogenní protein p53 byl exprimován s vysokou úrovní (obr. 5A, pruhy 2, 3 a 5, 6). Protein kulminoval 3 dny po infekci (obr. 6A a 6B, insert, den 0,5 až 3). Jako kontrola byl konstruován virion s podobnou strukturou jako rekombinanční Ad5CMV-p53 podle příkladu 1. Tento virion obsahuje luciferasou cDNA, řízenou v expresní kazetě virionu promotoru LTR viru Rousova sarkomu. V buňkách infikovaných virionem Ad5/RSV/GL2 nebyla detekována ani exprese p53, ani změna exprese aktinu.

Rekombinační adenovirus p53 byl použit k infekci tří buněčných linií NSCLC lidských plic L buněčné linie H3578, která má homozygní deleci genu p53, buněčné linie H322, která má bodovou mutaci genu p53 v kodonu 248 (G na T) a buněčné linie H460, která má gen standardního p53. Rychlost růstu lidských buněk NSCLC byla stanovena po inokulaci H322 a H460 (1.10⁵) nebo H358 (2.10⁵) v 60mm kultivačních miskách 24 h před virální infekcí. Buňky byly infikovány pomocí virů s četností infekce (MOI) 10 PFU/buňku. Kultivační médium bylo použito jako simulovaná kontrola infekce. 1. až 6. den po infekci byly odečítány trojí kultury pro každou buněčnou linii s různým ošetřením.

Růst buněk H358, infikovaných Ad5CMV-p53, byl silně inhibován oproti neinfikovaným buňkám nebo buňkám infikovaným kontrolním virionem (obr. 7A). Růst buněk H322 byl rovněž silně inhibován virionem p53 (obr. 7B), zatímco u buněk H460 lidské rakoviny plic obsahujících

-22CZ 295144 B6 standardní p53 byl ovlivněn do nižšího stupně (obr. 7C). Růst buněk H358 infikovaných virem Ad5CMV-p53 byl inhibován ze 79 %, zatímco u neinfíkovaných buněk nebo buněk infikovaných kontrolním virem nebyl inhibován. Růst buněčné linie H322, která má bodovou mutaci v p53, byl pomocí Ad5CMV-p53 inhibován ze 72 %, zatímco u buněčné linie H460, obsahující standardní p53, byl ovlivněn méně (28 % inhibice).

Tyto výsledky ukazují, že kombinační adenoviru p53 vykazuje potlačování nádorů prostřednictvím obnovování funkce proteinu p53 v nádorových buňkách.

Příklad 5

Ad5CMV-p53 při léčbě p53-deficitních buněk

Tento příklad se týká použití rekombinačního adenoviru p53 k obnovování potlačování růstu nádorových buněk in vitro, a tedy k léčbě maligního nebo metastatického růstu buněk. Popisuje některé předpokládané způsoby pro použití vynálezu při léčbě rakoviny genovou terapií zprostředkovanou adenovirem.

Buňky H358 byly infikovány pomocí Ad5CMV-p53 a Ad5/RSV/GL2 v množství MOI 10 PFU/buňku. Stejné množství buněk bylo ošetřeno médiem jako simulovaná infekce. 24 h po infekci byly ošetřené buňky odebrány a promyty dvakrát PBS. Při každém ošetření bylo každé nahé myši (Harlen Co., Houston, TX) injekčně s.c. vpraveno 3.10⁶ buněk v objemu 0,1 ml. Pro každé ošetření bylo použito pět myší. Myši byly před injekcí ozařovány (300 cGy, ⁶⁰Co) a po injekci každý týden vyšetřovány. Tvorba nádorů byla hodnocena po skončení šestitýdenní doby a objem nádoru byl vypočten za předpokladu kulového tvaru se středním průměrem nádoru vypočteným jako druhá odmocnina součinu průřezových průměrů.

Ke stanovení inhibičního účinku na tumorigenicitu, zprostředkovaného Ad5CMV-p53, byly nahým myším injekčně s.c. vpraveny buňky H358 (buňka typu lidské NSCLC) k vyvolání neoplastického růstu. Každá myš obdržela jednu injekci buněk, které byly infikovány po dobu 24 h pomocí Ad5CMV-p53 nebo Ad5/RSV/GL2 v množství 10 PFU/buňku. Jako kontroly simulované infekce byly použity buňky H358 ošetřené pouze médiem. Nádory, hmatné teprve 14. den po injekci, byly vyvolány pouze buňkami, infikovanými simulovaným nebo kontrolním virem, jak ukazuje tabulka I:

Tabulka I. Účinek Ad5CMV-p53 na tumorigenicitu H358 u nahých myší^a

ošetření	počet nádorů/počet myší (%)	střední objem (mm3± SD)
médium	4/5 (80)	37 ± 12
Ad5/RSV/GL2	3/4 (75)	30 ± 14
Ad5CMV-p53	0/4 (0)	-

^a Ošetřené buňky H358 byly injekčně s.c. vpraveny v množství 2.10⁶ buněk/myš. Velikosti nádorů byly stanoveny po skončení 6 týdnů.

-23 CZ 295144 B6

Jak je patrné z tabulky I, myši, které dostaly buňky ošetřené Ad5CMV-p53, nevyvinuly nádory. Nádory měly po uplynutí 6 týdnů průměr 4 až 10 mm. Tento pokus byl zahájen s pěti myšmi ve skupině; po jedné myši v obou skupinách Ad5CMV-p53 i Ad5/RSV/GL2 pokus nedokončilo. Předčasná smrt byla pravděpodobně důsledkem nosokomiální infekce.

Příklad 6

Ad5CMV-p53 při léčbě rakoviny plic

Tento příklad se týká použití rekombinačního adenovirů p53 k obnovení potlačování růstu nádorových buněk in vivo, a tedy pro léčbu rakoviny u živočichů. Popisuje některé způsoby, jimiž se předpokládá použití vynálezu pří léčbě rakoviny pomocí genové terapie zprostředkované adenovirem.

Účinnost Ad5CMV-p53 při inhibici tumorigenicity byla dále hodnocena na myším modelu orthotopické lidské rakoviny plic. Protože buňky H358 a H322 v tomto modelu neprodukovaly nádory, byla použita buněčná linie H226Br. Tato buněčná linie má původ v rakovině plic plochých buněk a metastázovala z plic do mozku. H226Br má bodovou mutaci (ATC na GTC) na exonu 7, kodonu 254 genu p53 a je pro myši tumorigenní.

Postup testů na myším modelu orthotopické lidské rakoviny plic byl popsán dříve (Georges a d., 1993). Stručně lze říci, že nahé myši, ošetřené ozařováním (300 cGy, ⁶⁰Co) byly inokulovány buňkami H226Br intratracheálním podáním. Každá myš obdržela 2.10⁶ buněk v objemu 0,1 ml PBS. Po 3 dnech od inokulace bylo 10 myší na skupinu ošetřeno intratracheálním podáním 0,1 ml virů nebo vehikula (PBS) jednou denně po dobu dvou dní. Bylo použito dávkování 5.10⁷ virů Ad5CMV-p53 nebo Ar5/RSV/GL2 na myš. Myši byly usmrceny po uplynutí 6 týdnů. Tvorba nádorů byla hodnocena vyříznutím plicní a mediastinální tkáně a měřením velikosti nádoru. Nádory byly potvrzeny histologickou analýzou řezů nádorové hmoty.

Ozářené nahé myši byly inokulovány 2.10⁶ buněk H226Br na myš intratracheálním podáním. Od třetího dne po inokulaci byla každá z myší (8 až 10 myší na skupinu) ošetřovaná dva dny jednou denně intratracheálním podáním 0,1 ml buď Ad5CMV-p53 nebo Ad5/RSV/GL2, nebo vehikula (PBS). Použitá dávka viru byla 5.10⁷ PFU/myš. Tvorba nádoru byla hodnocena po uplynutí 6 týdnů vyříznutím plicní a mediastinální tkáně a měřením velikosti nádoru. Proudové schéma postupu je znázorněno na obr. 7 a reprezentativní vzorky řezů jsou uvedeny na obr. 8. Detekované nádory byly potvrzeny histologickou analýzou. Údaje o měření nádorů jsou shrnuty v tabulce II.

Tabulka II. Účinek Ad5CMV-p53 na tumorigenicitu H226Br v myším modelu orthotopické lidské rakoviny plic³

ošetření	počet myší s nádory/ celkový počet myší (%)	střední objem (mm1 ± SD)
vehikulum	7/10 (70)	30 ± 8,4
Ad5/RSV/GL2	8/10 (80)	25 ± 6,9
Ad5CMV-p53	2/8 (25)	8 ± 3,3b

-24CZ 295144 B6 ^a Myši byly inokulovány intratracheálně 2.10⁶ buněk H226Br na myš. Od 3. dne po inokulaci bylo myším po dobu 2 dnů jednou denně intratracheálně podáno vehikulum nebo viry (každého 5.10⁷ v 0,1 ml). Tvorba nádoru byla hodnocena po uplynutí 6 týdnů.

^b p < 0,05 dvoustupňovou analýzou odchylek oproti skupinám které dostávaly vehikulum (PBS) nebo kontrolní virus

Pouze 25 % myší, ošetřených pomocí Ad5CMV-p53, vytvořilo nádory, zatímco v kontrolní skupině s ošetřením vehikulum nebo Ad5/RSV/GL2 vytvořilo nádory 70 až 80 % ošetřených myší. Průměrná velikosti nádoru ve skupině s Ad5CMV-p53 byla významně menší než v kontrolních skupinách. Tyto výsledky ukazují, že Ad5CMV-p53 může bránit buňkám H226Br vytvářet nádory v myším modelu orthotopické lidské rakoviny plic.

Příklad 7

Synergie mezi p53 a poškozením DNA

Biochemické znaky programové smrti buněk (apoptosy) vykazují charakteristické schéma fragmentace DNA, vznikající štěpením jaderné DNA. Nedávné studie demonstrovaly, že vyvolání apoptosy chemoterapeutiky nebo ionizačním zářením může mít vztah ke statusu genu p53 a že stimuly poškozující DNA jsou schopny zvyšovat intracelulámí hladinu proteinu p53 v buňkách, které se nacházejí v procesu apoptosy (Lowe a d., 1993, Clarke a d., 1993, Fritsche a d., 1993, Harper a d., 1993, El-Deiry a d., 1993). Inhibice buněčného cyklu ve fázi Gi zvýšenými hladinami standardními proteiny p53 (wt-p53) poskytuje více času pro opravy DNA; není-li možná optimální oprava, může p53 spustit programovou smrt buňky. p53 tedy může přispívat k vyvolání apoptotického usmrcování nádorových buněk chemoterapeutiky.

Inaktivace genu p53 mutací měnící smysl nebo delecí je nejběžnější genetickou změnou u lidských rakovin (Levine ad., 1991, Hollstein a d., 1991). Bylo zaznamenáno, že ztráta funkce p53 zvyšuje rezistenci buněk vůči různým chemoterapeutikům (Lowe a d., 1993). Studie původců ukázaly, že buňky H358 lidské nemalobuněčné rakoviny plic (NSCLC), v nichž jsou vypuštěny obě alely p53, byly rezistentní vůči chemoterapeutikům, zatímco buněčná linie WTH336b, která má endogenní wt-p53, snadno vykazovala apoptotickou smrt buněk 16 h po ošetření cisplatinou (CDDP) a etoposidem (VP-16). Proto se původci snažili stanovit, zda je zavedením genu wt-p53 do buněk H358 adenovirálním vektorem možno zvýšit citlivost buňky vůči CDDP jako prostředku síťujícímu DNA in vitro a in vivo.

Materiály a metody

Buňky H357 byla laskavě poskytnuty A. Gazdarem a J. Minnou (Takahashi a d., 1989).

Adenovirové vektory

Konstrukce a identifikace rekombinačního adenovirového vektoru, který obsahuje cDNA, kódující lidský wt-p53 (Ad-p53) nebo luciferasu (Ad-Luc), byla popsána dříve (Zhang a d., 1993). Stručně lze říci, že expresní kazeta p53, která obsahuje lidský cytomegalovirový promotor, cDNA wt-p53 a časný polyadenylační signál SV40, byla vložena do pXCJL.l mezi místa Xbal a Clal. Kyvadlový vektor p53 a rekombinační plasmid pJM17 byly kotransfíkovány do buněk 293 (Ad5-transformovaná lidská zárodečná ledvinová buněčná linie) metodou zprostředkování liposomy. Supematant kultury buněk 293, vykazující úplný cytopatický efekt, byl shromážděn a použit pro následnou infekci. Kontrolní virus Ad-Luc byl generován podobným způsobem. Viry Ad-p53 a Ad-Luc byl generován podobným způsobem. Viry Ad-p53 a Ad-Luc byly propagovány v buňkách 293. Přítomnost replikačně kompetentního viru

-25 CZ 295144 B6 byla vyloučena testy buněk HeLa. Virové titry byl stanoveny testy na plotnách (Graham a d., 1991).

Detekce fragmentace nukleosomální DNA

DNA byla izolována z rodičovských buněk, buněk infikovaných Ad-Luc a buněk infikovaných Ad-p53, které byly nebo nebyly ošetřeny pomocí CDDP, inkubací buněk po dobu 6 h při 55 °C v lýzním pufru (50 mM Tris-HCL, pH 8,0, 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 % SCS a 50 pg/ml proteinásy K). DNA byla extrahována dvakrát stejným objemem fenolu a jednou směsí chloroform-isoamylalkohol (24:1) a pak vysrážena v ethanolu. Vzorky byly podrobeny elektroforéze na 1,5% agarózovém gelu a vizualizovány barvením ethidiumbromidem.

TdT-zprostředkované značení zlomového konce dUTP bylo provedeno dříve popsaným postupem (Gavrieli a d., 1992). Buňky vmonovrstvě byly ošetřeny 0,01 % NP-40. Podložní sklíčka byla ponořena do pufru TdT (30 mM Tris-HCl, pH 7,2, 140 mM kakodylát sodný, 1 mM chlorid kobaltu) a inkubována 45 min při 37 °C s biotinylovaným dUTP (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) a TdT. Sklíčka byla na 10 min překryta 2 % bovinního sérového albuminu a inkubována 30 min s avidin-biotinovým komplexem (vectastain Elitě Kit; Vector Laboratořies, Burlingame, CA). Kolorimetrická detekce byla provedena s použitím diaminobenzidinu.

Výsledky

Buňky H358 byly podrobeny transtrukci in vitro c DNA lidského wt-p53 vystavením účinkům Ad-p53. Analýza westernových blottingem ukázala vysokou hladinu exprese proteinu wt-p53 již 24 h po infekci Ad-p53, avšak v rodičovských (neinfikovaných) buňkách nebo kontrolních buňkách infikovaných Ad-Luc nebyl detekován žádný wt-p53 (data neznázoměna). Souběžně imunohistochemické hodnocení ukázalo detekovatelný protein wt-53 ve více než 80 % infikovaných buněk, z čehož vyplývá, že přenos a exprese p53 pomocí Ad-p53 byly vysoce účinné (data neznázoměna).

Trvalé vystavení buněk H358 infikovaných Ad-p53 účinkům CDDP rychle snížilo jejich životaschopnost, zatímco k významné smrti u rodičovských buněk a buněk infikovaných Ad-Luc došlo až po 72 h vystavení CDDP (obr. 10A). Ztráta životaschopnosti byla silně podpořena u buněk transdukovaných Ad-p53. Navíc bylo možno pozorovat snížení životaschopnosti, i když byly buňky uchovávány v prostředí bez léčiva po 24 h vystavení jeho účinkům, z čehož vyplývá, že letální poškození je možno vyvolat během 24 h (obr. 10B). Citlivost buněk H358 transdukovaných wt-p53 vůči CDDP byla závislá na dávce (obr. 10C).

Internukleosomální žebříček DNA, ukazující na fragmentaci DNA, byl u buněk exprimujících wt-p53 patrný po 24 h vystavení účinkům CDDP; rodičovské buňky a buňky infikované Ad-Luc však fragmentaci DNA nevykazovaly (obr. 11A). Značení zlomového konce 2'-deoxyuridin-5'trifosfátem (dUTP) a biotinem, zprostředkované terminální deoxynukleotidyltransferasou (TdT), které detekuje fragmentaci DNA charakteristickou pro apoptosu in šitu, vykázalo mnoho apoptických buněk v případě buněk infikovaných Ad-p53, ošetřovaných po dobu 24 h CDDP, jak znázorňuje obr. 11G, který ukazuje tmavě se barvicí jádra a fragmenty jader, nevyskytující se na obr. 11B až 11F.

Je známo, že zavedení wt-p53 vyvolává apoptosu u některých typů nádorových buněčných linií s vypuštěným nebo mutovaným p53 (Yonish-Rouach a d., 1991, Shaw a d., 1992, Ramqvist a d., 1993). Samotná hyperexprese wt-p53 však nemohla podporovat fragmentaci DNA v p53-negativní buněčné linii H358 (obr. 11), i když byl její růst potlačován působením Ad-p53 (obr. 10). To souhlasí s předchozím pozorováním původců, že po přenosu wt-p53 zprostředkovaném retroviry je možno získat stabilní klony H358 a že tyto klony rostou pomaleji než rodičovské buňky (Cai a d., 1993).

-26CZ 295144 B6

Potenciální terapeutická účinnost kombinace Ad-p53 a CDDP byla hodnocena z hlediska relativní změny objemu sféroidů H358. Multicelulární model nádorového sféroidu vykazuje in vitro histologickou strukturu podobnou jako u primárních nádorů a mikrometastáz. Ošetření CDDP vyvolalo zmenšení relativního objemu Ad-p53-infikovaných sféroidů H358, ale nemělo významný vliv na rodičovské sféroidy nebo sféroidy infikované Ad-Luc (obr. 12A). TdTzprostředkované značení dUTP in šitu ukázalo mnoho buněk v procesu apoptosy na povrchu sféroidů infikovaných Ad-p53, zatímco na sféroidech neinfíkovaných Ad-p53 nebyly patrné žádné apoptotické buňky (obr. 12B až 12E). Původci dříve uvedli, že retrovirálně zprostředkovaná exprese wt-p53 inhibovala růst sféroidů H322a, vyvolávaný transformujícím růstovým faktorem α (TGF-α) (Fujiwara a d., 1993). Retrovirální vektor však nemohl infikovat sfériidy H358, protože buňky v těchto sféroidech v reakci na exogenní TGF-α rychle neproliferovaly. Zjištění, že vystavení účinkům CDDP zmenšilo velikost sféroidů H358, infikovaných AD-p53, vyvoláním apoptosy na povrchu, ukazuje na to, že Ad-p53 infikuje neproliferující buňky a že CDDP iniciuje apoptotický proces v klidových buňkách.

Příklad 8

Použití p53 a prostředků poškozujících DNA v léčebných režimech

Jako součást preklinických testů jsou použity zvířecí modely, popsané dále a v příkladech 5, 6 a 7. Poté je možno provést u pacientů, u nichž byla stanovena indikace léčby přenosem genů zprostředkovaným adenovirem, test na přítomnost protilátek zaměřených proti adenoviru. Jsou-li protilátky přítomny a pacient má v anamnéze alergii buď na farmakologické, nebo přirozeně se vyskytující látky, je indikována aplikace zkušební dávky řádově 10³ až 10⁶ rekombinačních adenovirů za přísného klinického dohledu.

Pro léčbu rakoviny pomocí Ad5CMV-p53 se rekombinační adenoviru exprimující p53 pod kontrolou vhodného promotoru/zesilovače transkripce, jako je promotor CMV, připraví a čistí metodou, přijatelnou pro Úřad potravin a léčiv (FDA) z hlediska podávání lidským subjektům. Takové metody zahrnují, avšak neomezují se na ně, odstřeďování s gradientem, hustoty chloridu česného s následujícím testováním účinnosti a čistoty.

Jako vhodné pro léčbu pomocí adenoviru p53 se považují dvě základní metody, přímá nebo místní aplikace a celkovější aplikace. Metody podle vynálezu jsou vhodné pro léčbu jakéhokoli z různých druhů rakovin, o nichž je známo, že souvisejí s mutacemi p53. Pokud se týká celkové aplikace, ukázalo se, že jedna intravenózní injekce adenoviru je dostačující k vyvolání virální infekce tkání na místech vzdálených od místa injekce (Atratford-Perricaudet a d., 1991b), a je tedy vhodná k léčbě všech zhoubných bujení, souvisejících s p53. Virus může být pacientům podáván intravenózně v jakémkoli farmakologicky přijatelném roztoku nebo infuzně po určitou dobu. Obecně se má za to, že účinný počet funkčních částic viru, který se má aplikovat, pohybuje od 1.10¹⁰ do5.10¹².

Dále je možno, zejména jde-li o rakovinu plic, použít, jeli to žádoucí, přímější cílenou fyzickou aplikaci rekombinančního adenoviru, analogicky k intratracheální aplikaci CFTR (Rosenfeld a d., 1992). Dochází tak k uvolňování rekombinačního adenoviru p53 blíže k místu cílových buněk.

Metody

Značení dUTP in šitu sTdT pro detekci apoptosy. Sféroidy H358 byly fixovány v den 3 a barveny, jak je uvedeno v příkladu 7. Stručně řečeno byla značené sondy TdT uvedeny do styku se sklíčky ponořenými v pufru TdT a inkubovány s biotinylovaným dUTP a TdT 45 min při 37 °C. Sklíčka byla na 10 min překryta 2 % bovinního sérového albuminu a 30 min inkubována s komplexem avidin-biotin. Kolorimetrická detekce provedena s použitím diaminobenzidinu.

-27CZ 295144 B6

Indukce apoptosy působením CDDP po infekci Ad-p53 in vivo. Buňky H358 (5.10⁶) v 0,1 ml Hankova vyváženého solného roztoku byly subkutánně injekčně vpraveny do pravého boku samice myši nu/nu BALB/c. Po 30 dnech bylo 200 μΐ média samotného nebo média obsahujícího Ad-Luc (10⁸ PFU/ml) nebo Ad-p53 (10⁸ PFU/ml) injekčně vpraveno do nádorů u průměru 5 až 6 mm. Byla provedena intratumorální injekce (100 μΐ) a peritumorální injekce na dvou protilehlých stranách (po 50 μΐ). Intraperitoneálně byl podán CDDP (3 mg/kg) nebo kontrolní fyziologický roztok. (A) Změny objemu nádorů. Nádory byly měřeny kaliperem ve svou kolmých průměrech bez znalosti ošetřovaných skupin a objem nádoru byl vypočten za předpokladu kulového tvaru a výpočtem středního průměru nádoru jako druhé odmocniny součinu příčných průměrů. V každé ošetřované skupině bylo použito pět myší a je uvedena střední hodnota +/- SE. Data byla analyzována pomocí Studentova t-testu. Šipky ukazují den ošetření. Jsou uvedena dvě nezávislá stanovení. V testu 1 bylo p < 0,05 ode dne 5 a v testu 2 bylo p < 0,05 ode dne 7. Histologické studie s použitím techniky značení biotin-dUTP pomocí TdT. Nádory byly odebrány 5 dní po zahájení léčby a okamžitě uloženy do směsi O.C.T. Zmrazené tkáně byly nařezány v kryostatu na tloušťku 5 pm. Řezy byly ošetřeny 1 pg/ml proteinasy K a barveny výše popsaným způsobem. Všechny péče o zvířata probíhala v souladu s UT M.D. Andersn Instituonal Animal Care and Use Committee.

Výsledky

Za účelem demonstrace in vivo účinnosti způsobů a přípravků na základě kombinace terapie genové náhrady a chemoterapie u lidské rakoviny původci zkoumali, zda dostupné podání Ad-p53 a CDDP může vyvolat apoptosu in vivo. 3 dny po přímé intratumorální injekci Ad-p53 nebo intraperitoneálním podání CDDP vykazovaly nádory H358, implantované subkutánně myším nu/nu, mírné zpomalení růstu. Když však byly Ad-p53 a CDDP podány současně, nádory částečně ustoupily a velikost nádorů zůstala statisticky významně menší než u kterékoli jiné ošetřené skupiny. Inhibiční účinek na růst byl ještě výraznější po dvou cyklech ošetření (obr. 13A). Histologické vyšetření ukázalo masivní destrukci nádorových buněk, v oblasti, kde byl Ad-p53 vpraven myším, ošetřeným CDDP. Barvení in šitu ukázalo mnoho apoptických buněk kolem acelulárních prostorů (obr. 13B a 13E). Naproti tomu nádory ošetřené samotným CDDP nebo samotným Ad-p53 nevykazovaly ani acelularitu, ani apoptotické oblasti.

Podrobněji je možno uvést, že výhodné postupy léčby je možno vyvíjet podle následujících kritérií. Nejprve je možno pacienta podrobit bronchoskopii ke zjištění stupně obstrukce. Endoskopicky by měla být vyříznuta co největší makroskopická část nádoru. Bronchoskopie by měla být přednostně prováděna s místním nebo celkovým umrtvením. Bioptickým kanálem bronchoskopu se provlékne transbronchiální aspirační jehla Stifcor^tm (21 g). Do místa zbytkového nádoru se pak vstříkne adenovirus p53 v malém objemu, například asi 10 ml nebo méně.

Protože použitý adenovirus je replikačně inkompetentní, v žádném případě nepřipadá v úvahu škodlivý vliv viru samotného na zdravotní stav subjektu. Pacienti však zůstanou během léčby hospitalizováni alespoň po dobu 48 h, aby bylo možno monitorovat akutní a zpožděné nepříznivé reakce. Bezpečnostní hlediska používání replikačně deficitního adenovirů jako vehikula pro genový přenos u člověka byla řešena v minulosti (Rosenfeld a d., 1992, Jaffe a d., 1992), ale za účelem minimalizace nepříznivých vedlejších účinků by měla být aplikovaná dávka adenovirů příslušně monitorována.

Existují různá kritéria která je třeba považovat za indikaci existence potřeby odpovědi nebo existence toxicity. Jako pomocné stanovení existence toxicity by před zahájením terapie nebo v jejím průběhu mělo být vyfotografováno lože nádoru. Změří se nejdelší a na něm kolmý průměr. Velikost je zaznamená jako součin těchto průměrů. Z těchto údajů je možno vypočíst rychlost opětného růstu nádoru.

Je možno rovněž měřit dobu do progrese od prvního pozorování se sníženým objemu nádoru do objevení důkazu progresivní choroby. Progresivní choroba je definována jako zvýšení součtu

-28CZ 295144 B6 součinů průměrů měřené léze o > 25 %. Předtím, než se stav označí jako progrese, museli pacienti obdržet alespoň dva terapeutické cykly. Přežití pacientů se měří od nástupu protokolu.

Následná vyšetření zahrnují všechny metody, rutinně používané v terapii rakoviny, včetně monitorování klinických příznaků a odebírání biopsie pro standardní a molekulární biologickou analýzu, jíž je možno zjistit schéma exprese různých genů p53. Získají se tak rovněž informace o počtu buněk, které absorbovaly přenesený gen, a o relativní síle promotoru in vivo. Na základě získaných údajů může být žádoucí upravit terapii. Tyto úpravy mohou zahrnovat konstrukty adenoviru s použitím různých promotorů nebo změny počtu PFU v injekci pro zajištění infekce většího množství nebo všech nádorových buněk bez nefyziologické hyperexprese rekombinačních genů.

Předpokládá se, že exprese exogenních genů, přenesených in vivo adenovirem, může přetrvávat po dlouhou dobu. Terapeuticky účinná dlouhodobá exprese virálně přenášených exogenních genů bude muset být určována případ od případ. Markerové geny mají pro stanovení terapeuticky relevantního přetrvání genové exprese omezenou použitelnost, poněvadž úroveň exprese, vyžadované ke zlepšení jakékoli dané genetické poruchy, se mohou značně lišit od úrovně nutné k úplnému vyléčení jiné choroby.

Přestože byly přípravky a způsoby podle vynálezu popsány formou výhodných provedení, je odborníkovi zřejmé, že složení, postupy a jednotlivé stupně postupů nebo jejich sled je možno různě obměňovat bez překročení myšlenky, ducha a rozsahu vynálezu. Konkrétně je zřejmé, že zde popisovaná činidla je možno se stejnými nebo podobnými výsledky nahradit chemicky a fyziologicky příbuznými látkami. Všechny tyto analogické náhrady a modifikace, zřejmé odborníkovi, se považují za spadající do myšlenky, ducha a rozsahu vynálezu, jak je definován v připojených patentových nárocích. Všechny nárokované látky a způsoby je možno vyrábět a realizovat bez nadbytečného experimentování.

Literatura:

Následující práce jsou v rozsahu, v němž poskytují příklady postupů nebo dalších podrobností navíc oproti výše uvedeným, zde konkrétně zahrnuty formou odkazu.

Bargonetti et al., (1991) Cell 65: 1083-1091.

Bishop (1987), Science 235:305-311.

Boehringer Mannheim Bichemicals (1992). DOTAP for high efficiency transfections, BMBiochemica 9 (1):17.

Boshart, M. et al. (1985). A very stront enhancer is located upstream of an immediate early gene ofhuman cytomegalovirus. Cell, 41:521-530.

Cai, D.W., Mukhopadhyay, T., Liu, T., Fujiwara, T. a Roth, J. A. Stable expression of the witd-type p53 gene in human lung cancer cells after retrovírus-mediated gene transfer. Human Gene Ther.. 4:617-624, 1993.

Culver, K.W., Ram, Z., Wallbridge, S., Ishii, H., Oldfield, E.H. a Blease, R.M. In vivo gene transfer with retroviral vector-producer cells for treatment of experimental brain tumors. Science 256:1550-1552, 1992.

Casey, G. Lo-Huen, M., Lopez, Μ. E., Vogelstein, B. a Stanbridge, E. J. (1991). Growth suppression ofhuman breast cancer cells by the introduction of a witd-type p53 gene. Oncogene 6:1791-1797.

-29CZ 295144 B6

Clarke, A.R., Puride, C.A., Harrison, D.J., Morris, R.G., Bird. C.C., Hoouper, M.L., a Wyllie, A.H., Thymocyte apoptosis induced by p53-dependent and independent pathways. Nátuře 362:849-852, 1993.

Doyle, L.A. Mechanismus of drug resistance in human lung cancer cells. Semin Oncol. 20:326-337, 1993.

El-Deiry, W.S., Tokino, T., Velculescu, V.E. Levý, D.B., Parsons, R., Trent, J. M., Lin, D., Mercer, E., Kinzler, K.W., a Wogelstein, B. WAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression. Cell 75: 817-825, 1993.

Fritsche, M., Haessler, C., a Brandner, G. Induction of nuclear accumulation of the 15 tumor-suppressor protein p53 by DNA-damaging agents. Oncogene 8:307-318, 1993.

Fields et al. (1990) Science 249:1046-1049.

Fujiwara, T., Grimm, E.A., Mukhopadhyay, T., Cai, D.W., Owen-Schaub, L.B., a Roth, J. A., A 20 retroviral wild-type p53 expression vector penetrates human lung cancer spheroids and inhibits growth by inducing apoptosis. Cancer Res. 53: 4129-4133, 1993.

Gavrieli, Y., Sherman, Y., a Ben-Sasson, S.A., Identifícation of programmed cell death in šitu via specific labelling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119:493-501, 1992.

Georges e/«/. (1993) Cancer Res 53:1743-1746.

Ghosh-Choudhury a Graham (1987) Biochem. Biophys. Res. Comm. 147:964-973.

Gluzman et al., (1982) in Eukaryotic Viral Vector, (Gluzman, Y., ed.) str. 187-192, Cold Spring harbor Press, Cold Spring harbor, New York.

Graham, F.L., a A. J. van der Eg (1973). A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 52:456-467.

Graham, F.L. a Prevec, L. Manipulation of adenovirus vectors. In: Murray, E.J. (ed.). Methods in Molecular Biology, Gene Transfer and Expression Protocols, str. 109-128. New Jersey: The Humana Press lne., 1991.

Graham, F.L., J. Smilex, W. C. Russell a R. Nairn (1977). Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J. Gen. Virol. 36:59-72.

Grunhaus, A. a HJorwitx, M.S. (1992). Adenoviruses as cloning vectors. Semin. Virology 3:237-2542.

Harper, J.E., Adami, G.R., Wei, N., Keyomarsi, K., a Elledge, S.J. The p21 Cdk-interacting protein Cipl is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell 75:805-816, 1993.

Hollstein, M., Sidransky, D., Vogelstein, B., a Harris, C. (1991). p53 mutations in human 50 cancers. Science 253: 49-53.

Jaffe et al. (1992), Nátuře Genetics 1:372-378.

Le Gal ptal H993Y Science 259:988-990

Ledley, J. (1987). J. Pediatrics 110, 1.

Levine, A.J., Momand, J., a Finlay, C.A. The p53 tumour suppressor gene. Nátuře 351:453-456, 1919.

Lowe, S.W., Ruley, H.E., Jacks, T., a Eíousman, D.E. p53-dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of nticayncer agents. Cell 74:957-967, 1993.

Lowe, S.W., Schmitt, E.M., Smith, S.W., Osbome, B.A., a Jacks, T. p53 is required for radiation-inducer apoptosis in mouše thymocytes. Nátuře 362:847-849, 1993.

McGrory, W.J. et al. (1988). A simple technique for the rescue of early region I mutations into infectious human adenovirus type 5. Virology 163:614-617.

Mercer, W.E. (1992). Cell cycle regulation and the p53 tumor suppressor protein. Critic. Rev. Eukar. Gene Express. 2:251-263.

Meitz et al. (1992) EMBO 11:5013-5020.

Miller 1929, Curr. Top Microbiol. Immunol. 158:1.

Montenarh, M., (1992). Biochemical, immunological, and functional aspects fo the growthsuppressor/oncoprotein p53. Critic. Rev. Onco. 3:233-256.

Mulligan (1993), Science 260:926.

Nicolau, C. et al. (1983). Prc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80, 1068.

Ragot et al. (1993). Nátuře 361:647-650.

Ramqvist, T., Magnuson, K.P., Wang, Y., Szekeley, L., a Klein, G. Wild-type p53 induces apoptosis in a Burkitt lymphoma (BL) line that carries mutant p53. Oncogene 8:1495-1500, 1993.

Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155.

Rosenfeld et al. (1991) Science 232:431-434.

Roth, J., Ruckdeschel, Weisenburger, ed., Thoracis Oncology, 1. vyd. kap. 49, str. 711-721. Sanders, New York, 1989.

Shaw, P., Bovey, R., Tardy, S., Sáhli, R., Sordat, B. a Costa J. Induction of apoptosis by wild-type 53 in a human colon tumor-derived cell line. Proč Nati. Acad Sci USA 89:4495-4499, 1992.

Spandidoc et al. (1989), J. Pathol. 157:1-10.

Stewert et al., 1992, Hum. Gene. Ther. 3:267.

Statford-Perricaudet, L. a M. Perricandet (1991a). Gene Transfer into animals: the promise of acenovirus. str. 51-61, in: O. Cohen-Haguenauer a M. Boiron (ed.), Human Gene Transfer, vyd. John Libbey Eurotext, Francie.

Statford-Perricaudet et al. (1991b), Hum. Gene Ther., 1:241-256.

-31 CZ 295144 B6

Takahashi, T., Nau, M.M., Chiba, I., Birrer, M.J. Rosenberg, R.K., Vinocour, M., Lewitt, M., Pass, H., Gazdar, A.F., a Minna, J.D., p53: a frequet tanget for genetic abnormalities in lung cancer.S cience 246:491-494, 1989.

Takahaski, T., Carbone, D., Takahashi, T., Nau, M.M., Hida, T., Linnoila, I., Ueda, R., a Minna J.D. (1992). Wild-type but not mutant p53 suppresses the growth of human lung cancer cells bearing multiple genetic lesions. 1992. Cancer Res. 52:2340-2342.

Tishler, R.B., Canderwood, S.K., Coleman, C.N., a Price, B.D., Increase in sequence specifíc DNA binding by p53 following treatment with chemotherapeutic and DNA demaging agents. Cancer Res. 53:2212-2216, 1939.

Tooza, J., (1981). Molecular biology of DNA Tumor viruses, 2. vyd. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

Torchilin et al., 1992, Faseb J. 6:2716.

Travali et al. (1990), FASEB 4: 3209-3214.

Weinberg, R.A. (1991). Tumor suppressor gene. Science 254: 1138-1145.

Wilcock et al. (1991) Nátuře 349:429-431.

Wolff, J.A., Malone, R. W., Williams, P., Chong, W., Adcadi, G., Jáni, A., a Felgner, P-L. (1990) Direct gene transfer into mouše muscle in vivo. Science 247:1465-1468.

Yonish-Rouach, E., Resnitzky, D., Rotem, J., Sachs, L. Kimchi, A., a Oren, M. Wild-type p53 induces apoptosis of myeloid leukemie cells that is inhibited by interleukin-6. Nátuře 352:345-347, 1991.

Zakut-Houri et al. (1985), EMBOJ., 4:1251-1255.

Zhan, W., Carrier, F., a Foumace Jr., A.J. Induction of cellular p53 activity by DNA-dmenaging agents and growth arrest. Mol. Cell. Biol. 13:4242-4250,1993.

Zhang, W.W., Fang, X., Branch, C.D., Mazur, W., French, B.A., a Roth, J.A., Generation and identifícation of recombinant adenovirus by liposome-mediated trasnfection and PCR analysis. BioTechniques, 1993.

Zhang, W.W., Fang, X., Mazur, W., French, B.A., Georges, R.N., a Roth, J.A., Hing-effíciency gene transfer and high-level expression of wilt-type p53 in human lung cancer cells mediated by recombinant adenovirus. Cancer Gene Therapy, 1939.

Zhue/a/., 1993, Science 261:209-211.

-32CZ 295144 B6

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE (i) PŘIHLAŠOVATEL:

(A) JMÉNO: BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY

OF TEXAS SYSTÉM (B) ULICE: 201 West 7^th Street (C) MĚSTO: Austin (D) STÁT: Texas (E) ZEMĚ: Spojené státy americké (F) POŠTOVNÍ KÓD: 78701 (G) Č. TELEFONU: (512) 499-4462 (H) TELEFAX: (512) 449-4523 (ii) PŮVODCI: ROTH, Jack A.

FUJIWARA, Toshiyoshi

GRIM, Elizabeth A. MUKHOPADHYAY, Tapas ZHANG, Wei-Wei a OWEN-SCAHUB, Laurie B.

(iii) NÁZEV VYNÁLEZU: ZPŮSOBY A PŘÍPRAVKY OBSAHUJÍCÍ

PROSTŘEDKY POŠKOZUJÍCÍ DNA A p53 (iv) POČET SEKVENCÍ: 4 (v) KORESPONDENČNÍ ADRESA:

(A) ADRESÁT: ARNOLD, WHITE & DURKEE (B) ULICE: P.O. BOX 4433 (C) MĚSTO: HOUSTON (D) STÁT: TEXAS (E) ZEMĚ: SPOJENÉ STÁTY AMERICKÉ (F) ZIP: 77210 (vi) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) MEDIUM: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC Kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS/ASCII (D) SOFTWARE: Patentln Release # 1.0, verse #1.30 (vii) ÚDAJE O SOUČASNÉ PŘIHLÁŠCE:

(A) Č. PŘIHLÁŠKY: PCT/US95/04898 (B) DATUM PODÁNÍ: 24. DUBNA 1995 (C) KLASIFIKACE: NEZNÁMÁ (viii) ÚDAJE O PRIROTNÍ PŘIHLÁŠCE:

(A) Č. PŘIHLÁŠKY: USSN 08/233,002 (B) DATUM PODÁNÍ: 25. DUBEN 1994

-33 CZ 295144 B6 (C) KLASIFIKACE: NEZNÁMÁ (ix) INFORMACE O ZÁSTUPCI/AGENTOVI:

(A) JMÉNO: HIGHLANDER, STEVEN L.

(B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 37,642 (C) REFERENCE/Č. SPISU: UTFC403P—/HYL (x) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:

(A) TELEFON: (512) 418-3000 (B) TELEFAX: (713) 789-2679 (C) TELEX: 79-0924 (2) INFORMACE PRO SEQ IN NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

GGCCCACCCC CTTGGCTTC 19 (2) INFORMACE PRO SEQ IN NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:

TTGTAACCAT TATAAGCTGC 20

-34CZ 295144 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ IN NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:

TCGTTTCTCA GCAGCTGTTG 20 (2) INFORMACE PRO SEQ IN NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: další nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „DNA“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:

CATCTGAACT CAAAGCGTGG 20

Claims (92)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití p53 supresorového proteinu nebo genu v kombinaci s prostředkem poškozujícím DNA pro získání terapeutického přípravku pro usmrcování nádorové buňky.
2. 2. Použití podle nároku 1, kde prostředkem poškozujícím DNA je ozařování.
3. 3. Použití podle nároku 2, kde terapeutický přípravek je určen k podávání potřebnému pacientovi alespoň ve dvou bězích.
4. 4. Použití podle nároku 2, kde ozařování je rentgenové záření, UV záření, γ záření, mikrovlnné záření nebo emise elektronů.
5. 5. Použití podle nároku 1, kde prostředky poškozujícím DNA je chemoterapeutikum.

   -35CZ 295144 B6
6. 6. Použití podle nároku 5, kde chemoterapeutikum je kamptothecin, aktinomycin-D, mitomycin C, adriamycin, 5-floururacil nebo etoposid.
7. 7. Použití podle nároku 5, kde terapeutický přípravek je určen k podávání potřebnému pacientovi alespoň ve dvou bězích.
8. 8. Použití podle nároku 5, kde chemoterapeutikem je činidlo, kde zesíťuje DNA.
9. 9. Použití podle nároku 8, kde činidlo zesíťujícím DNA je mitomycin C.
10. 10. Použití podle nároku 8, kde zesíťujícím činidlem je činidlo, které alkyluje DNA.
11. 11. Použití podle nároku 5, kde chemoterapeutikem je činidlo, které interkaluje DNA.
12. 12. Použití podle nároku 5, kde chemoterapeutikem je činidlo, které vede k chromosomálním a mitotickým aberacím ovlivněním syntézy nukleových kyselin.
13. 13. Použití podle nároku 12, kde činidlem vedoucím k chromosomálním a mitotickým aberacím ovlivněním syntézy nukleových kyselin je 5-fluoruracil.
14. 14. Použití podle nároku 5, kde chemoterapeutikem je činidlo, které ovlivňuje replikaci DNA, mitózu nebo chromosomální segregaci.
15. 15. Použití podle nároku 14, kde činidlem ovlivňujícím replikaci DNA, mitózu nebo chromosomální segregaci je adriamycin, doxorubicin, verapamil, etoposid nebo podofyllotoxin.
16. 16. Použití podle nároku 5, kde pro získání terapeutického přípravku je použit p53 protein nebo gen v kombinaci s cisplatinou.
17. 17. Použití podle nároku 1, kde pro získání terapeutického přípravku je použit rekombinantní vektor, který v uvedené buňce exprimuje protein p53, v kombinaci s prostředkem poškozujícím DNA.
18. 18. Použití podle nároku 17, kde pro získání terapeutického přípravku je jako rekombinantní vektor, exprimující p53, použit plasmid z nahé DNA, plasmid uvnitř liposomů, retrovirální vektor, vektor AAV nebo rekombinantní adenovirální vektor.
19. 19. Použití podle nároku 18, kde rekombinantním vektorem exprimujícím p53 je rekombinantní adenovirální vektor.
20. 20. Použití podle nároku 19, kde rekombinantním vektorem exprimujícím p53 je rekombinantní adenovirální vektor, zahrnující oblast exprese p53, umístěnou pod kontrolou cytomegalovirového promotoru IE.
21. 21. Použití podle nároku 19, kde rekombinantní adenovirální vektor zahrnuje oblast exprese p53, cytomegalovirový promotor IE a časný polyadenylační signál opičího viru SV40.
22. 22. Použití podle nároku 19, kde je použit adenovirální vektorový konstrukt, z něhož je vypuštěn alespoň jeden gen nezbytný pro replikaci adenoviru a na jeho místo je zavedena oblast exprese p53.
23. 23. Použití podle nároku 19, kde je použit adenovirální vektor, jehož oblasti E1A a E1B jsou vypouštěny a na jejich místo je zavedena oblast exprese p53.

    -36CZ 295144 B6
24. 24. Použití podle nároku 19, kde je použit rekombinační adenovirální vektor, který je přítomen uvnitř rekombinačního adenoviru.
25. 25. Použití podle nároku 1, kde terapeutický přípravek je dispergován ve farmakologicky přijatelné formulaci.
26. 26. Použití podle nároku 1, kde terapeutický přípravek je určen k usmrcování lidské buňky.
27. 27. Použití podle nároku 1, kde terapeutický přípravek je určen k usmrcování maligní buňky.
28. 28. Použití podle nároku 1, kde terapeutický přípravek je určen k usmrcování buňky rakoviny plic.
29. 29. Použití podle nároku 1, kde terapeutický přípravek je určen k usmrcování rakoviny prsu.
30. 30. Použití podle nároku 1, kde terapeutický přípravek je určen k usmrcování buňky mající mutaci v genu p53.
31. 31. Použití podle nároku 1, kde prostředkem poškozujícím DNA je cisplatina.
32. 32. Použití podle nároku 1, kde prostředkem poškozujícím DNA je doxorubicin.
33. 33. Použití podle nároku 1, kde prostředkem poškozujícím DNA je etoposid.
34. 34. Použití podle nároku 1, kde prostředkem poškozujícím DNA je verapamil.
35. 35. Použití podle nároku 1, kde prostředkem poškozujícím DNA je podofyllotoxin.
36. 36. Použití podle nároku 1, kde prostředkem poškozujícím DNA je 5-fluoruracil.
37. 37. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že zahrnuje p53 supresorový protein nebo gen v kombinaci s prostředkem poškozujícím DNA.
38. 38. Farmaceutický přípravek podle nároku 37, vyznačující se tím, že prostředkem poškozujícím DNA je chemoterapeutikum.
39. 39. Farmaceutický přípravek podle nároku 38, vyznačující se tím, že chemoterapeutikem je činidlo, které přímo zesíťuje DNA.
40. 40. Farmaceutický přípravek podle nároku 39, vyznačující se tím, že činidlem přímo zesíťujícím DNA je mytomycin C.
41. 41. Farmaceutický přípravek podle nároku 39, vyznačující se tím, že zesíťujícím činidlem je činidlo, které alkyluje DNA.
42. 42. Farmaceutický přípravek podle nároku 37, vy z n a č uj í c í se tím, že chemoterapeutikem je činidlo, které interkaluje DNA.
43. 43. Farmaceutický přípravek podle nároku 38, vy z n ač u j í c í se tím, že chemoterapeutikem je činidlo, které vede k chromosomálním a mitotickým aberacím ovlivňováním syntézy nukleových kyselin.
44. 44. Farmaceutický přípravek podle nároku 43, vyznačující se tím, že činidlem vedoucím k chromosomálním a mitotickým aberacím ovlivňováním syntézy nukleových kyselin je 5-fluoruracil.

    -37CZ 295144 B6
45. 45. Farmaceutický přípravek podle nároku 44, vyznačující se tím, že chemoterapeutikem je činidlo, které ovlivňuje replikaci DNA, mitózu nebo chromosomální segregaci.
46. 46. Farmaceutický přípravek podle nároku 45, vyznačující se tím, že činidlem ovlivňujícím replikaci DNA, mitózu nebo chromosomální segregaci je adriamicin, doxorubicin, verapamil, etoposid, aktinomycin-D nebo podofyllotoxin.
47. 47. Farmaceutický přípravek podle nároku 38, vyznačující se tím, že chemoterapeutikem je adriamycin, 5-fluoruracil, etoposid, kamptothecin, aktinomycin-D nebo mitomycin C.
48. 48. Farmaceutický přípravek podle nároku 37, v y z n a č u j í c í se tím, že zahrnuje p53 protein nebo gen v kombinaci s cisplatinou.
49. 49. Farmaceutický přípravek podle nároku 37, vyznačující se tím, že zahrnuje rekombinantní vektor, exprimující v živočišné buňce protein p53, v kombinaci s prostředkem poškozujícím DNA.
50. 50. Farmaceutický přípravek podle nároku 49, vyznačující se tím, že rekombinantním vektorem je plasmid z nahé DNA, plasmid uvnitř liposomu, retrovirální vektor, vektor AAV nebo rekombinantní adenovirální vektor.
51. 51. Farmaceutický přípravek podle nároku 50, vyznačující se tím, že rekombinantním vektorem je rekombinantní adenovirální vektor.
52. 52. Farmaceutický přípravek podle nároku 51, vyznačující se tím, že rekombinantním vektorem je rekombinantní adenovirální vektor přítomný uvnitř částice rekombinantního adenovirů.
53. 53. Farmaceutický přípravek podle nároku 37, vyznačující se tím, že zahrnuje rekombinantní adenovirální vektor přítomný uvnitř částice rekombinantního adenovirů v kombinaci s cisplatinou.
54. 54. Farmaceutický přípravek podle nároku 37, vy z n a č uj í c í se tím, že je dispergován ve farmakologicky přijatelné formě.
55. 55. Farmaceutický přípravek podle nároku 54, vyznačující se tím, že je ve formě pro intralesionální aplikaci.
56. 56. Terapeutický kit, vyznačující se tím, že zahrnuje ve vhodném obalu farmaceutickou formu rekombinantního vektoru, exprimujícího v živočišné buňce protein p53, a farmaceutickou formu prostředku poškozujícího DNA.
57. 57. Kit podle nároku 56, vyznač u j í cí se tím, že uvedený rekombinantní vektor a uvedený prostředek poškozující DNA jsou přítomny v jednom obalu.
58. 58. Kit podle nároku 56, vyznačující se tím, že uvedený rekombinantní vektor a uvedený prostředek poškozující DNA jsou přítomny v rozdílných obalech.
59. 59. Kit podle nároku 56, vyznačující se tím, že zahrnuje farmaceutickou formu rekombinantního adenovirů, zahrnujícího rekombinantní vektor, exprimující v živočišné buňce protein p53, a farmaceutickou formu cisplatiny.

    -38CZ 295144 B6
60. 60. Použití účinné kombinace p53 supresorového proteinu nebo genu a prostředku poškozujícího DNA pro přípravu léčiva pro léčení nádorových onemocnění, kde léčivo je určeno k podávání pacientům alespoň ve dvou bězích léčby.
61. 61. Použití podle nároku 60, kde léčivo je upraveno pro podávání p53 genu nebo proteinu současně s prostředkem poškozujícím DNA.
62. 62. Použití podle nároku 60, kde léčivo je upraveno pro podávání p53 genu nebo proteinu před prostředkem poškozujícím DNA.
63. 63. Použití podle nároku 60, kde léčivo je upraveno pro podávání p53 genu nebo proteinu po prostředku poškozujícím DNA.
64. 64. Použití podle nároku 60, kde účinná kombinace je upravena pro injekční upravení do místa nádoru v terapeuticky účinném množství a zahrnuje rekombinantní adenovirus obsahující rekombinantní vektor exprimující p53 v nádorové buňce, přičemž je uváděn do kontaktu s prostředkem poškozujícím DNA.
65. 65. Použití podle nároku 60, kde prostředkem poškozujícím DNA je ozařování.
66. 66. Použití podle nároku 65, kde ozařování je rentgenové záření, UV záření, γ záření, mikrovlnné záření nebo emise elektronů.
67. 67. Použití podle nároku 60, kde prostředkem poškozujícím DNA je chemoterapeutikum.
68. 68. Použití podle nároku 67, kde chemoterapeutikem je adriamycin, 5-fluoruracil, etoposid, kamptothecin, aktinomycin-D nebo mitomycin C.
69. 69. Použití podle nároku 67, kde chemoterapeutikem je činidlo, které zesíťuje DNA.
70. 70. Použití podle nároku 69, kde činidlem zesíťujícím DNA je mytomycin C.
71. 71. Použití podle nároku 69, kde zesíťujícím činidlem je činidlo, které alkyluje DNA.
72. 72. Použití podle nároku 67, kde chemoterapeutikem je činidlo, které interkaluje DNA.
73. 73. Použití podle nároku 72, kde chemoterapeutikem je činidlo, které vede k chromosomálním a mitotickým aberacím ovlivněním syntézy nukleových kyselin.
74. 74. Použití podle nároku 73, kde činidlem vedoucím k chromosomálním a mitotickým aberacím ovlivněním syntézy nukleových kyselin je 5-fluoruracil.
75. 75. Použití podle nároku 68, kde chemoterapeutikem je činidlo, které ovlivňuje replikaci DNA, mitózu nebo chromosomální segregaci.
76. 76. Použití podle nároku 75, kde činidlem ovlivňujícím replikaci DNA, mitózu nebo chromosomální segregaci je adriamycin, doxorubicin, verapamil, etoposid nebo podofyllotoxin.
77. 77. Použití p53 proteinu nebo genu a prostředku poškozujícího DNA ve farmaceuticky přijatelné formě pro přípravu léčiva k usmrcování nežádoucí buňky nebo buněk umístěných v pacientovi, kde pacient obdrží alespoň dva běhy léčby.
78. 78. Použití podle nároku 77, kde léčivo je upraveno pro podávání p53 genu nebo proteinu současně s prostředkem poškozujícím DNA.

    -39CZ 295144 B6
79. 79. Použití podle nároku 77, kde léčivo je upraveno pro podávání p53 genu nebo proteinu před prostředkem poškozujícím DNA.
80. 80. Použití podle nároku 77, kde léčivo je upraveno pro podávání p53 genu nebo proteinu po prostředku poškozujícím DNA.
81. 81. Použití podle nároku 77, kde prostředkem poškozujícím DNA je ozařováním.
82. 82. Použití podle nároku 81, kde ozařování je rentgenové záření, UV záření, γ záření, mikrovlnné záření nebo emise elektronů.
83. 83. Použití podle nároku 77, kde prostředkem poškozujícím DNA je chemoterapeutikum.
84. 84. Použití podle nároku 83, kde chemoterapeutikem je adriamycin, 5-fluoruracil, etoposid, kamptothecin, aktinomycin-D nebo mitomycin C.
85. 85. Použití podle nároku 83, kde chemoterapeutikem je činidlo, které zesíťuje DNA.
86. 86. Použití podle nároku 85, kde činidlem zesíťujícím DNA je mitomycin C.
87. 87. Použití podle nároku 85, kde zesíťujícím činidlem je činidlo, které alkyluje DNA.
88. 88. Použití podle nároku 83, kde chemoterapeutikem je činidlo, které interkaluje DNA.
89. 89. Použití podle nároku 88, kde chemoterapeutikem je činidlo, které vede k chromosomálním a mitotickým aberacím ovlivněním syntézy nukleových kyselin.
90. 90. Použití podle nároku 89, kde činidlem vedoucím k chromosomálním a mitotickým aberacím ovlivněním syntézy nukleových kyselin je 5-fluoruracil.
91. 91. Použití podle nároku 83, kde chemoterapeutikem je činidlo, které ovlivňuje replikaci DNA, mitózu nebo chromosomální segregaci.
92. 92. Použití podle nároku 91, kde činidlem ovlivňujícím replikaci DNA, mitózu nebo chromosomální segregaci je adriamycin, doxorubicin, verapamil, etoposid nebo podofyllotoxin.

    22 výkresů