KR19990071795A - 암 진단 및 치료를 위한 방법과 조성물 - Google Patents

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Abstract

p53-발현시키는 바이러스 벡터를 이용하여 편평상피암을 치료하는 방법이 개시되어 있다. 특정한 실시예에서, 벡터는 복제-결함 바이러스이다. 또한 후-수술 환경의 관계 및 체강내에서 현미경적 잔여 질환의 발병을 검사 및 치료하는 방법이 제공된다.

Description

암 진단 및 치료를 위한 방법과 조성물
세포 증식 및 세포 사멸의 균형은 정상적인 조직 항상성을 유지하는데 중요하다. 이 균형의 붕괴는 종양 형성의 다단계 과정에서 중요한 인자가 될 수 있으며, 세포소멸(apoptosis) 또는 예정된 세포 사멸의 저해는 이 붕괴의 한 원인이 된다. 이러한 것들의 영향은 미국에서만 매년 50만 이상을 죽음에 이르게 할 정도로 치명적인 것이다.
많은 인간에 발생하는 암에 대한 병원학에서, 암 서프레서(suppressor)인 p53 유전자의 돌연변이가 이에 관련된 것이라는 것이 유력하다. 보고서들은 결장암, 교아종, 유방암, 골육종 및 폐암을 포함하는 몇몇 다른 인간 암 세포의 성장을 야생형 p53 유전자의 바이러스-매개된 전달에 의해 기능적으로 억제할 수 있다는 것을 보고하고 있다. 야생형 p53의 외생성 p53 발현 유도는 결장암 세포 및 인간 폐암 구상체에서 세포소멸을 유도하는 것으로 보여져 왔으며, 이것은 예정된 세포 사멸에서 p53의 역할을 암시하는 것이다.
머리 및 목의 편평상피세포암(squamous cell carcinoma of the head and neck: SCCHN)이 발생한 환자들은 종종 말하기, 삼키기 및 코스메시스(cosmesis)에 심한 영향을 받는 질병을 앓는다. 더욱이 이들 환자들 중 생존율은 현대의 외과 기술 및 방사선 치료가 실시된 이후로 거의 30년 동안 50%로 변동이 없다. 재발은 전신에 발생하기보다는 주로 국부적, 지엽적으로 일어나며, 이것은 첫 번째 종양 위치에서 현미경적 잔여 암이 사망의 주요 원인이라는 것을 가리킨다. 이러한 사실들로 보아, SCCHN에서 현미경적 잔여 질병을 효과적으로 공격하는 능력이 암 치료의 효과를 향상시킬 수 있다는 것을 알 수 있다.
본 발명은 1995년 11월 30일에 출원된 미국 예비 특허출원 제60/007,810호의 부분 계속 출원이다. 상기 언급한 출원에서 개시한 내용 전부를 본 출원에 원용한다.
본 발명은 암 생물학에 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 편평상피세포암(squamous cell carcinoma)을 치료하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또한 현미경적 잔여 종양 및 체강내로의 종양 시딩(seeding)을 검사하기 위한 동물 모델 및 이를 치료하는 방법을 제공한다.
하기한 도면은 본 명세서의 일부이며, 본 발명의 양태를 더욱 잘 설명하기 위해 포함된 것이다. 본 발명은 실시예에 대한 상세한 설명 및 도면을 참조함으로써 더욱 잘 이해될 수 있다.
도 1. SCCHN 세포주 Tu-138(폐쇄된 삼각형) 및 Tu177(폐쇄된 사각형)의 트랜스덕션(transduction) 효율. 재조합 β-gal 아데노바이러스가 10-100의 다른 MOI에서 세포를 감염시키기 위해 사용되었다. β-gal-양성 세포의 퍼센트 비율은 복제 디쉬상에 각각 500 세포를 세어봄으로써 알 수 있다.
도 2. 생체외 SCCHN 세포 성장의 저해. (도 2a) 모의(mock)-감염된 Tu-138 (폐쇄된 원형) 세포, d1312-감염된 세포(폐쇄된 삼각형) 및 Ad5CMV-p53-감염된 세포(폐쇄된 사각형)의 성장 곡선. (도 2b) 모의-감염된 Tu-177 세포(열린 원형), d1312-감염된 세포(열린 삼각형) 및 Ad5CMV-p53-감염된 세포(열린 사각형)의 성장 곡선. 각각 지정된 시간에 세포들의 3개의 디쉬를 트립신 처리하고, 세어 보았다. 감염에 따른 트리플리케이트 웰(well)당 세포 숫자의 평균±SEM을 감염 후 경과일의 숫자에 대해 플롯하였다.
도 3a, 도 3b, 도 3c 및 도 3d. 네 개의 SCCHN 세포의 복합 성장 곡선. (도 3a) Tu-138. (도 3b) Tu-177. (도 3c) MDA 686-LN. (도 3d) MDA 886. 모의 감염된 세포(폐쇄된 환형), d1312-감염된 세포(폐쇄된 삼각형), 및 Ad5CMV-p53-감염된 세포(폐쇄된 사각형). 감염에 따른 트리플리케이트 웰당 세포 숫자의 평균을 감염 후 경과일의 숫자에 대해 플롯하였다; 막대, SEM.
도 4. 보통 섬유아세포의 성장 곡선. 모의-감염된 세포(폐쇄된 환형), d1312-감염된 세포(폐쇄된 삼각형) 및 Ad5CMV-p53-감염된 세포(폐쇄된 사각형).
도 5a 및 도 5b. SCCHN 세포의 복합 성장 곡선. 도 5a: Tu-138; 도 5b: MDA 686LN; 모의 감염된 세포(열린 사각형), d1312 감염된 세포(열린 삼각형), Ad5CMV-p53 감염된 세포(열린 환형). 각각 지정된 시간에 세포들의 3개의 디쉬를 트립신 처리하고, 세어 보았다. 감염에 따른 트리플리케이트 웰당 세포 숫자의 평균을 감염 후 경과일의 숫자에 대해 플롯하였다; 막대, SEM.
도 6a 및 도 6b. DNA의 레이블링(labeling)은 TUNEL 방법에 의해 비오티닐레이티드-dUTP와 함께 소멸 세포에서 깨어진다. 감염에 따른 세포소멸에 대한 유세포 측정(flow cytometric) 분석을 시간의 경과에 따라 실시했다. 도 6a. 복제-결함 아데노바이러스인 d1312로 감염시킨 Tu-138 세포(패널 1-패널 4). 야생형 p53 아데노바이러스로 감염시킨 Tu-138 세포(패널 5-패널 8). 도 6b. 복제-결함 아데노바이러스인 d1312로 감염시킨 MDA 686LN(A-D). 야생형 p53 아데노바이러스로 감염된 MDA 686LN 세포(E-H). Ap는 세포소멸을 나타낸다.
도 7a 및 도 7b. SCCHN 세포의 복합 성장 곡선. 도 7a: Tu-138; 도 7b: MD686LN; 모의 감염된 세포(열린 환형), d1312 감염된 세포(폐쇄된 삼각형), Ad5CMV-p53-FLAG 감염된 세포(폐쇄된 사각형). 각각 지정된 시간에 세포들의 3개의 디쉬를 트립신 처리하고, 세어 보았다. 감염에 따른 트리플리케이트 웰당 세포 숫자의 평균을 감염 후 경과시간 수에 대해 플롯하였다; 막대, SEM.
그러므로, 본 발명의 목적은 편평상피세포암을 인 비보에서 치료하는 향상된 방법을 제공하기 위한 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은, 체강의 현미경적 종양 시딩 및 현미경적 잔여 암 발전 및 치료를 평가하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
이러한 목적을 달성하기 위하여, (a) 진핵세포에서 기능적인 프로모터 및 p53을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 구조물을 제공하는 공정으로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 프로모터의 조절하에 그리고 이를 감지하게 위치시키는 공정; 및 (b) 상기 발현 구조물을 인 비보에서 종양 세포와 접촉시키는 공정;을 포함하는 편평상피세포암을 가진 피검체의 치료 방법을 제공한다.
편평상피세포암(squamous cell carcinoma)은 머리 및 목의 암종일 수 있다. 상기 편평상피세포암의 내생성 p53은 돌연변이되거나 되지 않을 수도 있다. 상기 발현 구조물은 레트로바이러스성 벡터, 아데노바이러스성 벡터 및 아데노-결합 바이러스성 벡터와 같은 바이러스성 벡터인 것이 바람직하며, 복제-결함 아데노바이러스성 벡터인 것이 가장 바람직하다. 특정한 실시예에서, p53 유전자는 발현 벡터로부터 p53의 발현이 검출될 수 있도록 표식된다. 바람직한 표식은 연속적인 항체 에피토프와 같은 면역학적인 것이다.
본 방법은 절제 후에 종양 베드 즉 "인공 체강"을 발현 구조물과 부가접촉하는 종양의 수술적인 절제를 더욱 포함한다. 종양 베드를 접촉시키는 데에 사용되는 부피는 약 3㎖ 내지 약 10㎖이다. 아데노바이러스 벡터가 사용될 때, 각 접촉시 투여된 아데노바이러스의 양은 약 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012pfu이다.
발현 구조물의 연속적인 관류도 또한 예상된다. 연속적인 관류로 전달되는 구조물의 양은 연속적인 관류를 이용하여 총 용량보다 약간 많은 양이 성취될 수 있다해도, 주어진 시간동안 총 용량에 동일하게 접근하도록 주사에 의하여 전달된 양으로부터 결정될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 발현 구조물을 입, 인두(pharynx), 식도(esophagus), 후두(larynx), 기관(trachea), 흉강(pleural cavity), 복강(peritoneal cavity), 또는 방광(bladder), 결장(colon), 또는 다른 내장 기관을 포함하는 중공기관강(hollow organ cavities)과 같은 자연 체강내로 주입될 수 있다.
또한 본 발명은 (a) 설치류에게 피하 조직으로 절개부를 제공하는 공정; (b) 상기 절개부에 종양 세포를 시딩하는 공정; (c) 상기 설치류를 치료 양생법으로 처리하는 공정; 및 (d) 종양의 발전에 대한 상기 양생법의 효과를 평가하는 공정을 포함하는 현미경적 잔여 암에 대한 치료요법의 유효성을 결정하는 방법을 제공한다. 상기 절개부는 (b) 공정 후 및 (c) 공정 전에 밀봉될 수 있다. 또한, 상기 치료 양생법은 상기 절개부로의 치료 조성물의 도입을 포함하고, 상기 절개부는 밀봉 후에 재개방되고 상기 치료 조성물의 도입 후에 재밀봉된다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 하기한 상세한 설명에서 기술될 것이다. 그러나 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한 상세한 기술 및 특정 실시예는 본 발명의 진의 및 범위내에서 이루어진 다양한 변화 및 수정이 이 상세한 기술로부터 본 기술의 당업자에게 명백하기 때문에, 예시로서 이해되어야 한다.
최근 정보는 SCCHN을 위한 치료의 첫 번째 단점 중의 하나가 첫 번째 종양 위치에서 또는 인접한 국부 또는 지엽적인 조직에서 질병을 완전히 근절시키는 것이 불가능하다는 것이다. 그러므로, 본 발명은 현미경적 잔여 암을 공격함에 의해 SCCHN의 완전하고도 효과적인 치료를 가능하게하는 유전자 치료 방법을 제공하도록 디자인된다. 이 방법은 화학적 또는 방사선 치료 또는 외과적 개입같은 종래의 치료와 연계하여 사용되거나 단독으로 사용될 수 있다. 더욱이, 체강의 미시적인 종양 시딩 뿐만 아니라 현미경적 잔여 암을 검사하기 위해 특이적으로 디자인된 동물 모델을 사용하여 본 발명자는 이들 방법의 효과를 설명한다. 이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
더욱 일반적으로, 암세포의 p53의 상태에 관계 없이 암에 대해 p53 유전자의 치료가 효과적이라는 것이 관찰되어 왔다. 놀랍게도, 야생형 p53 유전자를 운반하는 바이러스 벡터가 종양을 치료하기 위해 사용될 때 치료 효과가 관찰되었으며, 이 종양의 세포는 기능적인 p53 분자를 발현한다. 이 결과는 종양 서프레서 기능이 어떤지에 대한 현재의 이해도를 근거로 할 때 이는 예상하기 힘든 것이다. 또한, 기능적인 p53 분자를 발현하는 보통 세포들이 바이러스 구조물로부터의 p53의 높은 수준의 발현에 의해 명백히 영향받지 않는다는 것은 놀라운 것이다. 이것은 p53 유전자 치료법이 초기에 생각했던 것보다 암치료에 넓게 적용될 수 있다는 가능성을 높인다.
A. p53 단백질 및 폴리뉴클레오티드
본 출원을 통하여, “p53”이라는 용어는 다른 종들로부터의 모든 p53 동족체 뿐만 아니라 예시된 p53 분자들을 언급하는 것이다. “야생형”및 “돌연변이”p53는 각각 p53 유전자를 발현하는 보통 종양 서프레서 활성 및 p53 유전자 결핍 또는 감소된 서프레서 활성 및/또는 변형된 활성을 언급하는 것이다. 이와 같이 “돌연변이”p53는 단순한 서열 변이체가 아니라 오히려 변경된 기능적 요소를 보여주는 변이체이다.
p53는 현재 종양 서프레서 유전자로 알려져 있다(Montenarh, 1992). 이것은 화학적인 암 유발, 자외선 조사 및 SV40를 포함하는 몇몇의 바이러스에 의해 형질변형된(transformed) 많은 세포들에서 높은 수준으로 발견되고 있다. p53 유전자는 종종 다양한 인간 종양에서 돌연변이적 불활성화의 타겟이 되었으며, 통상의 인간 암에서 가장 빈번하게 돌연변이되는 유전자로 이미 기록되고 있다(Mercer, 1992). 이것은 인간 NSCLC의 50% 이상에서 그리고 다른 종양의 넓은 스펙트럼에서 돌연변이되어진다(Hollestein et al., 1991).
본 발명에 따른 돌연변이된 p53 유전자를 함유하는 종양이 바람직한 타겟인 반면, 청구된 p53 발현 벡터의 사용은 야생형 또는 기능적인 p53을 포함하는 종양의 치료에까지 확장된다. 비록 메카니즘이 완전히 밝혀지지는 않았지만, 본 발명자는 p53 발현이 기능적인 p53 생성물을 발현하는 종양의 성장을 제한할 수 있으며, 심지어 이러한 세포의 소멸을 유도할 수 있다. 이와 같이, 종양의 p53 상태는 진단에 있어서는 잠재적으로 유용할지라도 본 발명의 실시를 위해서 필수적이지 않다. 이 현상은 SCCHN 종양에 제한된 것이 아니라, 신경 교종, 육종, 암, 백혈병, 림프종 및 흑색종을 포함하며, 피부암, 간암, 고환암, 뇌암, 췌장암, 뇌 및 목암, 위암, 간암, 폐암, 유방암, 결장암, 전립선암 및 방광암을 포함하는 다양한 악성 질병에 적용될 수 있다.
p53 폴리펩티드
p53 유전자는 대형-T 항원 및 E1B와 같은 바이러스성 단백질과의 복합체를 형성할 수 있는 375-아미노산 인단백질을 엔코딩한다. 이 단백질은 많은 형질변형된 세포 또는 종양 조직과 비교했을 때 그 농도가 미소하지만 정상 조직 및 세포에서도 발견된다. 흥미롭게도 야생형 p53은 세포 성장 및 분열을 조절하는데 있어서 중요한 것으로 보여진다. 야생형 p53의 과발현은 인간 종양 세포에서 항-세포분열이 되려는 몇몇의 경우에서 보여졌다. 이와 같이 p53은 세포 성장의 음성 조절자로 작용할 수 있으며(Weinberg, 1991), 직접적으로 비조절된 세포 성장을 억제하거나, 간접적으로 이 성장을 억제하는 유전자를 활성화시킨다. 이와같이, 야생형 p53의 부재 또는 불활성화는 형질변형에 기여할 수 있다. 그러나, 몇몇 연구는 돌연변이 p53의 존재는 유전자의 형질변형 가능성의 완전한 발현에 필수적일 수 있다는 것을 지적하고 있다.
비록 야생형 p53이 많은 세포 타입에서 중요한 성장 조절자로서 인식되더라도, 이것의 유전적, 생화학적인 특성 역시 그 역할을 갖고 있음을 나타낸다. 미스-센스(mis-sense) 돌연변이는 p53 유전자에 있어서는 일반적인 것이며, 종양 유전자의 변형 능력을 위해서는 필수적인 것이다. 점 돌연변이(point mutation)에 의해 일어나는 단일 유전자 변화는 발암성의 p53를 만들 수 있다. 다른 종양유전자와는 달리, p53 점 돌연변이는 적어도 30개의 다른 코돈에서 발생하는 것으로 알려져 있으며, 종종 동형접합성(homozygosity)으로의 감소없이 세포의 표현형으로 전달을 만드는 우성 대립 유전자를 만들기도 한다. 게다가, 이들 우성 음성 대립유전자의 다수는 생물체에서 내성을 나타내며, 미생물로 옮겨진다. 다양한 돌연변이 대립 유전자는 최소의 기능 장애로부터 우성 음성 대립 유전자의 강한 침투성까지 나타낸다(Weinberg, 1991).
Casey 등은 인간의 두 개의 유방암 세포주에 야생형 p53를 엔코딩하는 DNA의 트랜스펙션(transfection)이 이들 세포들에서 성장 억제 조절을 회복시킨다는 것을 보고했다(Casey et al., 1991). 이와 유사한 효과가 돌연변이가 아닌 야생형 p53의 인간 폐암 세포로의 트랜스펙션에서 또한 설명된다(Takahasi et al., 1992). p53 야생형은 돌연변이 유전자에 대해 우성을 나타내며, 돌연변이 유전자를 세포에 트랜스펙션시켰을 때 세포분열에 대항하여 선택할 것이다. 트랜스펙션된 p53의 발현은 내생성 p53와 함께 정상 세포들의 성장에 영향을 주지 않는다. 이와 같이, 그러한 구조물은 역효과 없이 정상 세포에 의해 흡수될 수 있다.
p53-엔코딩 폴리뉴클레오티드
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 전체 p53 유전자, 기능적인 p53 도메인, 또는 어떤 p53 폴리펩티드를 엔코딩할 수 있다. “상보성”폴리뉴클레오티드는 표준 왓슨-크릭 상보성 규칙에 의해 염기-결합을 할 수 있는 것들이다. 즉, 시토신과 결합한 구아닌(G:C) 및 DNA의 경우에는 티민과 결합한 아데닌(A:T), RNA의 경우에는 우라실과 결합한 아데닌(A:U)의 조합을 이루기 위해 많은 양의 퓨린은 작은 양의 피리미딘과 결합할 것이다. 혼성 서열에서 이노신, 5-메틸시토신, 6-메틸아데닌, 하이포잔틴 등의 일반적이지 않은 염기의 포함이 염기 결합을 방해하지는 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어로서, “상보적 서열”은 실질적으로 이들의 전체 길이에 대해 상보적이며 염기 미스매치(mismatch)가 거의 없는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 예를 들면, 13 또는 14 위치에서 상보적인 뉴클레오티드를 가질 때, 길이에 있어서 15 염기의 서열을 상보적이라고 할 수 있다. 자연적으로, “완전 상보”서열은 그들의 전체 길이에 있어서 완전히 상보적이며, 미스매치된 염기가 없는 서열일 것이다.
또한 낮은 정도의 상동성을 가진 다른 서열들이 고려될 수 있다. 예를 들면, 비-상동성의 부위(예를 들면, 리보자임) 뿐만 아니라 높은 상동성의 부위에 제한된 안티센스 구조물이 디자인될 수 있다. 50% 이하의 상동성을 가지더라도 이들 분자들은 적당한 조건아래에서 타겟 서열에 결합되려고 한다.
폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있으며, 즉 특정 생물의 게놈으로부터 직접적으로 클론될 수 있다. 그러나 다른 실시예에서 폴리뉴클레오티드 상보적인 DNA(cDNA)일 수 있다. cDNA는 주형으로서 메신저 RNA(mRNA)를 사용하여 제조된 DNA이다. 이와 같이, cDNA는 어떤 중단된 코딩 서열을 함유하지 않으며, 일반적으로 거의 배타적으로 해당 단백질을 코딩하는 부위를 함유한다. 다른 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 합성적으로 생산될 수 있다.
게놈 DNA의 부위들을 cDNA 또는 특이 구조물을 생성하는 합성 서열들과 결합하는 것이 유리할 것이다. 예를 들면, 최종 구조물에서 인트론(intron)이 요청되는 곳에서는 게놈 클론이 사용될 필요가 있다. 인트론은 p53에 부가하여 다른 유전자로부터 유래될 수 있다. cDNA 또는 합성 폴리뉴클레오티드는 구조물의 부분을 잔존시키기 위한 편리한 제한 부위들을 제공할 수 있으며, 그러므로 여분의 서열을 위해서 사용되어진다.
p53에 대한 인간 및 마우스 DNA 서열은 각각 SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:4에 제공된 해당 아미노산과 함께 각각 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:3에 제공된다.
p53의 자연 변이체는 본 명세서에서 개시된 것보다 더 다른 서열을 가지는 것으로 여겨진다. 이와같이, 본 발명은 제공된 p53의 폴리뉴클레오티드 서열의 사용에 제한되는 것이 아니라, 오히려 어떤 자연적으로 발생한 변이체의 사용을 포함한다. 본 발명은 또한 이들 서열들의 화학적 합성 돌연변이들을 망라한다.
또 다른 서열 변이체는 코돈 변이로부터 얻어진다. 왜냐하면 20개의 정상 아미노산의 대부분에 대한 몇몇의 코돈이 있으므로 많은 다른 DNA는 p53을 엔코딩할 수 있다. 하기한 표를 참조하여 그러한 변이체를 설명한다.
아미노산 코돈
알라닌 Ala A GCA GCC GCG GCU
시스테인 Cys C UGC UGU
아스파틱산 Asp D GAC GAU
글루타믹산 Glu E GAA GAG
페닐알라닌 Phe F UUC UUU
글리신 Gly G GGA GGC GGG GGU
히스티딘 His H CAC CAU
이소류신 Ile I AUA AUC AUU
라이신 Lys K AAA AAG
류신 Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU
메티오닌 Met M AUG
아스파라긴 Asn N AAC AAU
프롤린 Pro P CCA CCC CCG CCU
글루타민 Gln Q CAA CAG
아르기닌 Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU
세린 Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU
트레오닌 Thr T ACA ACC ACG ACU
발린 Val V GUA GUC GUG GUU
트립토판 Trp W UGG
티로신 Tyr Y UAC UAU
유전적 코드의 축퇴(degeneracy)를 고려한다면, 본 명세서에서 개시한 뉴클레오티드와 동일한 것으로 이 뉴클레오티드의 약 50% 내지 약 70% 사이 또는 약 76% 내지 약 99%를 가지는 서열이 바람직할 것이다. “p53-엔코딩 폴리뉴클레오티드”의 범위 내에서의 서열은 상기 세포내 조건에서 설명하는 폴리뉴클레오티드 부위와 함께 염기-결합을 할 수 있는 것이다.
상기한 바와 같이, p53 엔코딩 서열은 전체 길이의 게놈 또는 cDNA 카피일수 있거나 이들의 큰 조각일 수 있다. 본 발명은 또한 더 짧은 올리고뉴클레오티드 p53을 사용할 수도 있다. 17개 염기 길이의 서열은 단지 인간 게놈에서만 발생되므로 유일한 타겟 서열을 상술하는데 충분하다. 더 짧은 올리고머가 만들기는 더 쉽고 생체 내에서의 접근능을 증가시킬 수 있으나, 무수한 다른 인자들이 염기-결합의 특이성을 결정하는데 관련된다. 상보적 타겟에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합 친화도 및 서열 특이성은 모두 길이가 증가할수록 증가한다. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 염기쌍은 예를 들면 p53 돌연변이의 제조 및 PCR 반응에서 사용될 수 있을 것이다.
17개 염기 길이의 서열은 인간 게놈에서만 발생하며, 그러므로 유일한 타겟 서열을 특정하기에 충분하다. 더 짧은 올리고머가 만들기가 더 쉽고 생체내 접근성을 증가시킬수 있지만, 수많은 다른 인자들이 혼성화의 특이성을 결정하는데 관련되어 있다. 상보적 타겟에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합 친화도 및 서열 특이성은 길이가 증가할수록 증가한다.
어떤 실시예에서, 예를 들면, C-5 프로핀 피리미딘을 포함하는 것과 같이, 다른 요소들을 포함하는 구조물을 사용할 수 있을 것이다. 유리딘 및 시티딘의 C-5 프로핀 아날로그를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 높은 친화도를 가지고 RNA에 결합하였다(Wagner et al., 1993).
생물학적으로 기능적인 등가의 단백질 또는 펩티드란 분자의 정의된 부분내에서 만들어질 수 있으며, 여전히 생물학적 활성의 허용가능한 수준을 가진 분자가 될 수 있는 것을 의미한다. 본 명세서에서는 생물학적으로 기능적인 등가의 펩티드란 아미노산의 전부 또는 대부분이 아닌 어느 것이 치환된 것으로 정의한다. 특히, p16 단백질의 N-말단이 관련된 경우, 약 16개 아미노산 또는 더욱 바람직하게는 5개 아미노산이 펩티드 내에서 변형된 것으로 생각된다. 물론 다른 치환을 가진 다수의 다른 단백질/펩티드라도 본 발명에 부합하여 쉽게 만들어질 수 있으며, 사용될 수 있다.
아미노산 치환은 일반적으로 상대적인 아미노산 사이드-체인 치환의 유사성 예를 들면, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 근거한다. 아미노산 사이드-체인 치환의 크기, 모양, 타입에 대한 분석은 아르기닌, 라이신, 히스티딘은 모두 양전하를 띠는 잔기이며; 알라닌, 글리신 및 세린은 모두 유사한 크기이며; 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 모두 일반적으로 유사한 모양이다. 그러므로 이런 사항들에 근거하여 아르기닌, 라이신 및 히스티딘; 알라닌, 글리신 및 세린; 페닐알라닌, 트립토판, 티로신은 생물학적으로 기능적인 등가로 정의된다.
이들 변형을 제조함에 있어서, 아미노산의 하이드로패틱(hydropathic) 인덱스가 참고될 수 있다. 각각의 아미노산의 소수성 및 전하 특성에 근거하여 하이드로패틱 인덱스를 부여하는 것으로, 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
단백질의 상호간 생물학적 기능을 언급하는데 있어서 하이드로패틱 아미노산 인덱스의 중요성은 본 분야에서는 일반적으로 이해되고 있다(Kyte 및 Doolittle, 1982, 인용). 유사한 하이드로패틱 인덱스 또는 점수를 가지는 다른 아미노산으로 어떤 아미노산을 치환할 수 있으며, 이것은 여전히 동일한 생물학적 활성을 보유할 것이라는 것은 공지된 것이다. 하이드로패틱 인덱스에 근거한 변이 제조에서, 하이드로패틱 인덱스의 아미노산 치환은 ±2가 바람직하다. 더욱 바람직하게는 ±1이내인 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 ±0.5 이내이다.
유사한 친수성 값을 가지는 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며, 여전히 생물학적으로 등가인 단백질을 얻을 수 있는 것으로 이해된다. 미국 특허 제4,554,101호에서는 아미노산 잔기에 하기한 친수성이 부여되는 것을 밝히고 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스파르테이트 (+3.0±1); 글루타메이트 (+3.0±1); 세린 (+3.0); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신(-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).
B. 발현 벡터
이 출원을 통해, “발현 벡터”라는 용어는 유전자 산물을 코딩하는 핵산을 포함하는 유전적인 구조물의 어느 형태를 포함하는 것을 의미하는 것으로 이 발현 벡터에 존재하는 핵산 엔코딩 서열의 일부 또는 전부가 전사될 수 있다. 전사된 것은 단백질로 번역되지만, 이것이 반드시 필요한 것은 아니다. 이와 같이, 어떤 실시예에서 발현은 p53 유전자의 전사 및 p53 mRNA의 p53 단백질 산물로의 번역 둘다를 포함한다. 다른 실시예에서, 발현은 단지 p53 및 이것의 상보적인 것을 엔코딩하는 핵산의 전사를 포함한다.
구조물이 적어도 p53 전사를 발현하기 위해서는 p53 폴리뉴클레오티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터의 전사적인 조절하에서 이루어질 것이다. “프로모터”는 숙주 세포의 합성기 또는 유전자의 특이적 전사를 개시하기를 요구하는 도입 합성기에 의해 인식되는 DNA 서열을 언급한다.
여기서, 사용되는 프로모터라는 용어는 전사적인 조절 모듈의 그룹을 의미하는 것으로 이것은 RNA 폴리머라제 Ⅱ를 위한 개시 부위 주위에 군을 이룬다. 프로머터가 어떻게 조직화되는가에 대한 많은 연구는 HSV 티미딘 키네이즈(tk) 및 SV40 초기 전사 단위를 위한 프로모터들을 포함하는 몇몇 바이러스 프로모터들에 대한 분석으로부터 이루어진다. 최근에 이루어진 연구에서 프로모터는 별개의 기능적인 모듈들로 이루어지며, 이들 각각은 약 7-20 염기쌍의 DNA로 이루어지며, 전사 액티베이터(transcriptional activator) 또는 리프레서 단백질을 위한 하나 또는 그 이상의 인식 부위를 포함한다.
각각의 프로모터 내의 적어도 하나의 모듈은 RNA 합성을 위한 개시 부위를 위치시키기 위한 기능을 한다. 이들의 가장 잘 알려진 예는 TATA 박스이지만, 포유동물의 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼레이즈 유전자를 위한 프로모터 및 SV40 후기 유전자를 위한 프로모터 등의 TATA 박스가 결핍된 몇몇의 프로모터에서는 개시 부위 그 자체를 덮는 별개의 요소가 개시 위치를 고정시키는 것을 돕는다.
부가적인 프로모터 요소들은 전사적인 개시의 빈도를 조절한다. 최근 다수의 프로모터들이 개시 부위의 다운스트림에도 기능적인 요소를 포함하는 것으로 알려지고 있지만 일반적으로 개시 부위의 30-110 염기쌍 업스트림의 부위에 기능적인 요소들이 위치한다. 프로모터 요소들 빈도간의 스페이싱(spacing)은 유동적이라서 요소들이 전화(invert)하거나 상대적으로 다른 것으로 전달될 때에도 프로모터 기능이 유지된다. tk 프로모터에서 프로모터 요소들간의 스페이싱은 활성의 감소가 시작되기 전에 50 염기쌍 분리까지 증가될 수 있다. 이 프로모터에 의해 개개의 요소들은 전사를 활성화시키기 위해 상호 협조적으로 또는 독립적으로 기능한다.
p53 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하기 위한 사용되는 특이적인 프로모터는 타겟 세포에서 폴리뉴클레오티드를 충분한 수준으로 발현할 수 있기만 하면 된다. 이와 같이 인간 세포가 타겟이 될 때, 인간 세포내에서 발현할 수 있는 프로모터의 조절하에 및 인접하여 폴리뉴클레오티드 코딩 부위를 위치시키는 것이 바람직하다. 일반적으로 이러한 프로모터는 인간 또는 바이러스 프로모터를 포함할 수 있담.
다양한 실시예에서, 인간 사이토메가로바이러스(CMV) 매개 초기 유전자 프로모터, SV40 초기 프로모터 및 로우스(Rous) 육종 바이러스 긴 말단 반복은 p53 폴리뉴클레오티드의 고-수준의 발현을 얻기 위해서 사용될 수 있다. 발현의 수준이 성장 저해 효과를 생산하기에 충분할 정도로 제공되는 것으로서, 폴리뉴클레오티드의 발현을 얻기 위해 본 분야에서 사용되는 다른 바이러스 또는 포유동물 세포 또는 박테리아의 파지 프로모터들의 사용 또한 고려될 수 있다.
공지된 특성을 가진 프로모터를 사용함에 의해 트랜스펙션을 동반하는 폴리뉴클레오티드의 발현 수준 및 패턴이 적정화될 수 있다. 예를 들면, 티로시네이즈(멜라노마), 알파-페토프로테인(alpha-fetoprotein) 및 알부민(간 종양), CC10(허파 종양) 및 전립선-특이적인 항원(전립선 암)등의 특이적인 세포에서 활성이 있는 프로모터의 선택이 p53 폴리뉴클레오티드의 조직-특이적인 발현을 허여할 것이다. 표 2는 본 발명에서 사용될 수 있는 것으로서 p53 구조물의 발현을 조절하는 몇몇의 요소/프로모터들을 나열한다. 이 표는 p53 발현의 프로모션에서 관련된 가능한 모든 요소들을 나열하려고 한 것이 아니라 단지 예를 든 것이다.
DNA의 동일 분자내에서 거리를 두고 위치한 프로모터로부터 전사를 증가시키는 유전적인 요소로서 인핸서가 검출되었다. 떨어진 거리에까지 활동할 수 있는 이러한 능력은 원핵생물의 전사적인 조절의 고전적인 연구에서는 거의 선행되지 않았다. 잇따른 연구에서 인핸서 활성을 가진 DNA의 부위가 프로모터와 매우 유사하게 조직된다는 것을 보였다. 즉, 이들은 많은 개개의 요소들로 이루어지며, 이들 각각은 하나 또는 그 이상의 전사적인 단백질에 결합한다.
인핸서 및 프로모터간의 가장 큰 차이점은 작동이다. 전체적으로 인핸서 부위는 거리를 두고 전사를 자극할 수 있다; 이것은 프로모터 부위 또는 프로모터 부위의 구성 요소들에 해당될 필요는 없다. 다른 한편, 프로모터는 특이적인 부위 및 특이적인 방향에서 RNA 합성의 개시를 명령하는 하나 또는 그 이상의 요소들을 가지는 반면, 인핸서는 이들 특이성이 부족하다. 프로모터 및 인핸서는 종종 겹치며 접촉하며, 종종 매우 유사한 모듈 조직을 가지는 것 같다.
부가적으로 어느 프로모터/인핸서 조합(진핵 생물 프로모터 데이터 베이스 EPDB)은 p53 구조물의 발현을 이끌어내기 위해 사용될 수 있다. T3, T7 또는 SP6 세포질 발현 시스템의 사용은 또 다른 가능한 실시예이다. 운반체의 부분 또는 부가적인 유전적 발현 벡터로서 적당한 박테리오파지 폴리머레이즈가 제공된다면 진핵 세포는 어떤 박테리오파지 프로모터로부터 세포질 전사를 뒷받침할 수 있다.
인핸서
면역글로불린 중쇄(Immunoglobulin Heavy Chain)
면역글로불린 경쇄(Immunoglobulin Light Chain)
T-세포 수용체(T-Cell Receptor)
HLA DQ α및 DQ β
β-인터페론(β-Interferon)
인터류킨-2(Interleukin-2)
인터류킨-2 수용체(Interleukin-2 Receptor)
MHC 클래스 Ⅱ 5
MHC 클래스 Ⅱ HLA-DRα
β-액틴(β-Actin)
근육 크레아틴 키나제(Muscle Creatine Kinase)
프리알부민(트랜스티레틴) Prealbumin(Transthyretin)
엘라스타제 Ⅰ(Elastase Ⅰ)
메탈로티오네인 (Metallothionein)
콜라게나제(Collagenase)
알부민 유전자(Albumin Gene)
α-페토프로테인(α-Fetoprotein)
τ-글로빈(τ-Globin)
β-글로빈(β-Globin)
c-fos
c-HA-ras
인슐린(Insulin)
신경계 세포 점착 분자(Neural Cell Adhesion Molecule, NCAM)
α1-안티트립신(Antitrypsin)
H2B(TH2B)히스톤(Histone)
마우스 또는 Ⅰ형 콜라겐
인핸서
글루코즈 조절 단백질(GRP94 및 GRP78)
랫 성장 호르몬(Rat Growth Hormone)
인간 혈청 아밀로이드 A(SAA)
트로포닌(Troponin) Ⅰ(TN Ⅰ)
혈소판-유래 성장인자(Platelet-Derived Growth Factor)
듀센형 근 위축증(Duchenne Muscular Dystrophy)
SV40
폴리오마(Polyoma)
레트로바이러스(Retrovirus)
유두종 바이러스(Papilloma Virus)
B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus)
인간 면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus)
세포확대바이러스(Cytomegalovirus)
긴팔원숭이 백혈병 바이러스(Gibbon Ape Leukemia Virus)
더욱이, 특이적인 생리학적인 신호에 반응하여 조절되는 프로모터의 선택은 p53 구조물의 유도적 발현을 허여할 수 있다. 예를 들면, 인간 PAI-1 프로모터의 조절하에서 폴리뉴클레오티드를 사용한 발현이 종양 괴저 인자에 의해 유도된다. 표 3은 몇몇 프로모터/인듀서 조합을 나타낸다.
요소 인듀서
MT Ⅱ Phorbol Ester(TFA) Heavy metals
MMTV(마우스 유방 종양 세포) 글루코코티코이드(Glucocorticoids)
β-인터페론 폴리(rI)X폴리(rC)
아데노바이러스 5 E2 엘라(Ela)
c-jun 폴볼 에스테르(Phorbol Ester)(TPA), H2O2
콜라게나제(Collagenase) 폴볼 에스테르(TPA)
스트로멜리신(Stromelysin) 폴볼 에스테르(TPA), IL-1
SV40 폴볼 에스테르(TPA)
쥐과(Murine) MX 유전자 인터페론, 뉴캐슬 질병 바이러스
GRP78 유전자 A23187
α-2-매크로글로불린 IL-6
비멘틴(Vimentin) 혈청
MHC 클래스 Ⅰ 유전자 H-2kB 인터페론
HSP70 엘라, SV40 거대 T 항원
프롤리페린(Proliferin) 폴볼 에스테르-TPA
종양 괴저 인자(Tumor Necrosis Factor) FMA
티로이드 자극 호르몬 α 유전자(Thyroid Stimulating Hormone αGene) 티로이드 호르몬(Thyroid Hormone)
본 발명의 어떤 실시예에서 세포내에 있는 발현 벡터의 전달은 발현 벡터에 존재하는 마커를 포함시키는 것에 의해 생체내 또는 생체외에서 확인할 수 있다. 이 마커는 트랜스펙션된 세포에 인식가능한 변화를 일으켜서 발현의 용이한 확인을 가능하게 한다. 다른 방법으로는 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 키네이즈(tk) (진핵생물의) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼레이즈(CAT)(원핵생물의) 등의 효소를 사용할 수 있다. 면역학적 마커 또한 사용될 수 있다. 사용된 선택가능한 마커는 폴리뉴클레오티드 엔코딩 p53와 함께 발현될수 있는한 중요하지 않다. 선택가능한 마커의 예들은 본 분야의 당업자에게는 잘 알려져 있다.
일반적으로 전사의 올바른 폴리아데닐화를 발생시키기 위해 폴리아데닐화 시그널을 사용할 것이다. 폴리아데닐화 시그널 그 자체는 본 발명의 성공적인 실시에 있어서 중요하지는 않으며, 이러한 어떤 서열도 사용될 수 있다. 발명자들은 이것이 편리하고 사용된 타겟 세포에서 기능을 원활히 수행하는 것으로 알려져 있는 SV40 폴리아데닐화 시그널을 사용했다. 또한 발현 구조물의 요소로서 고려되는 것이 터미네이터(terminator)이다. 이들 요소들은 메세지 레벨을 향상시키고, 구조물로부터 다른 서열로 읽는 것을 최소화하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 발현 구조물은 바이러스 게놈으로부터 유래된 바이러스 또는 설계된 구조물을 포함한다. 리셉터-매개된 엔도사이토시스를 경유하여 세포로 들어가는 어느 바이러스의 능력 및 몇몇의 경우에 있어서 숙주 세포 염색체로의 통합은 포유동물 세포로의 유전자 전달을 위한 관심을 끄는 후보이다. 그러나, DNA 복합체의 리셉터-매개된 업테이크(uptake) 뿐만 아니라, 네이키드(naked) DNA의 직접적인 흡수를 설명했기 때문에 발현 벡터는 바이러스적일 필요는 없지만, 대신에 포유 동물 세포에서 엔코딩된 유전자의 발현을 뒷받침할 수 있는 pUC 또는 Bluescript™ 플라스미드 시리즈와 같은 어느 플라스미드, 코스미드 또는 파지 구조물을 사용할 수 있다.
레트로바이러스
레트로바이러스는 역-전사 과정에 의해 감염된 세포에서 이들의 RNA를 이중 가닥 DNA로 전환시키는 능력을 가지는 단일 가닥의 RNA 바이러스 군이다(Coffin, 1990). 결과물인 DNA는 프로바이러스(provirus)로서 안정하게 세포 염색체내로 통합(integration)되고 바이러스 단백질의 합성을 명령한다. 통합은 수용체 세포 및 이들의 자손들이 바이러스 유전자 서열을 가지도록 한다. 이 레트로바이러스 게놈은 각각 캡시드 단백질, 폴리머라제 효소, 엔벨로프 성분을 코딩하는 유전자인 gag, pol, env를 포함한다. gag 유전자의 업스트림에서 발견되는 서열인 Ψ은 비리온으로의 게놈 패키징의 시그널로서 작용한다. 두 개의 긴 말단 반복(LTR) 서열은 바이러스 게놈의 5′ 및 3′말단에 존재한다. 이들은 강력한 프로모터 및 인핸서 서열을 포함하며 또한 숙주 세포 게놈에서 통합을 위해 요구된다(Coffin, 1990).
레트로바이러스 벡터를 구성하기 위해 p53를 엔코딩하는 핵산이 어느 바이러스 서열에 위치한 바이러스 게놈에 삽입되어 복제-결함인 바이러스를 생산한다. 비리온을 생산하기 위해 LTR 및 Ψ 성분없이 gag, pol, env 유전자를 포함하는 패키징 세포주가 구성된다(Mann et al., 1983). 레트로바이러스 LTR 및 Ψ 서열과 함께 인간 cDNA를 포함하는 재조합 플라스미드가 이 세포에 도입될 때(예를 들면, 칼슘 포스페이트 침강에 의해) Ψ 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사가 바이러스 입자로 패키징되게 하며, 이어서 이 바이러스 입자는 배양 배지로 분비된다(Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). 다음으로 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집한 후 농축하거나 그대로 이를 유전자 전달을 위해 사용한다. 레트로바이러스 벡터는 다양한 세포 타입을 감염시키기 위해 사용될 수 있다. 그러나 통합 및 안전한 발현은 숙주 세포의 분할을 요구한다(Paskin et al., 1975).
레트로바이러스의 특이적인 타겟팅을 허여하기 위해 디자인된 것으로서 바이러스의 엔벨로프에 락토오즈 잔기를 화학적으로 부가함에 의해 레트로바이러스의 화학적인 변형에 근거한 새로운 시도가 최근 개발되었다. 이러한 변형은 시알로글리코프로테인 리셉터(sialoglycoprotein receptors)를 경유하여 간실질세포(hepatocyte)의 특이적인 감염을 허여할 수 있다.
재조합 레트로바이러스의 타겟팅을 위한 다른 시도로서 레트로바이러스 엔벨로프 단백질 및 특이적인 세포 리셉터에 대항하는 비오틴화(biotinylated) 항체를 사용하는 것이 디자인되었다. 이 항체는 스트렙타비딘(streptavidin)을 사용하여 비오틴 성분을 매개로 결합되었다(Roux et al., 1989). 주요한 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex) 복합체 클래스 Ⅰ 및 클래스 Ⅱ 항원에 대항하는 항체를 사용함에 의해, 다양한 인간 세포의 감염이 생체외에서 에코트로픽 바이러스(ecotropic virus)와 함께 이들의 표면 항원을 전달시킨다는 것을 설명하였다(Roux et al., 1989).
아데노바이러스
인간 아데노바이러스는 약 36kb의 게놈 크기를 가진 이중-가닥 DNA 종양바이러스이다(Tooze, 1981). 진핵 생물의 유전자 발현을 위한 모델 시스템으로서 아데노바이러스는 광범위하게 연구되었으며 양호하게 특징이 밝혀져서 유전자 전달 시스템으로서 아데노바이러스는 매우 주목받는 시스템이다. 이 그룹의 바이러스는 성장 및 증식이 용이하고, 생체내외에서 광범위한 숙주 범위를 나타낸다. 용균적으로(lytically) 감염된 세포에서 아데노바이러스는 숙주 단백질 합성을 차단할 수 있으며, 세포 기구가 다량의 바이러스 단백질을 합성하도록 명령할 수 있으며, 다량의 바이러스를 생산하게끔 한다.
게놈의 E1 부위는 몇몇 세포 유전자 뿐만 아니라 바이러스 게놈의 전사 조절을 담당하는 단백질을 엔코딩하는 E1A 및 E1B를 포함한다. E2A 및 E2B를 포함하는 E2 발현은 바이러스의 복제 기능의 합성, 예를 들면 DNA-결합 단백질, DNA 폴리머라제 및 복제를 시작하는 말단 단백질의 합성을 가능하게 한다. E3 유전자 산물은 사이토톡신(cytotoxic) T 세포에 의한 사이토리시스(cytolysis) 및 종양 괴저 인자를 저해하며 바이러스의 증식에 중요한 것으로 보인다. E4 단백질에 관련된 기능은 DNA 복제, 후기 유전자 발현 및 숙주 세포 차단(shutoff)을 포함한다. 이 후기 유전자 산물은 대부분의 비리온 캡시드 단백질을 포함하며, 이들은 메이저(major) 후기 프로모터로부터 대부분의 단일 일차 전사 공정이 발생한 후에만 발현된다. 메이저 후기 프로모터(MLP)는 감염의 후기 상(late phase) 동안 고효율을 나타낸다(Stratford-Perricaudet 및 Perricaudet, 1991a).
바이러스 게놈의 작은 부분만이 시스 상태로(in cis) 요구되는 것으로 보여지며(Tooze, 1981), 293 세포 등의 세포와 연계하여 사용될 때 아데노바이러스 유래의 벡터는 다량의 DNA 조각의 치환을 위해 탁월한 가능성을 제공한다. Ad5-형질변형된 인간 배성(embryonic) 신장 세포는 트랜스 상태로(in trans) 실질적인 바이러스 단백질을 제공하기 위하여 개발되었다(Graham et al., 1977). 이와 같이 발명자들은 아데노바이러스의 특성이 생체내에서 암세포를 타겟팅하는데 사용되기에 적합한 것으로 판단하였다(Grunhaus & Horwitz, 1992).
세포로 외부 단백질을 운반하기 위한 아데노바이러스의 특별한 장점은 (ⅰ) 외부 DNA에 의해 상대적으로 많은 수의 바이러스 DNA를 치환하는 능력, (ⅱ) 재조합 아데노바이러스의 구조적인 안정성, (ⅲ) 인간으로 아데노바이러스의 투여의 안정성, (ⅳ) 아데노바이러스 감염과 종양 또는 악성 질병과의 어느 알려진 관련성의 부족, (ⅴ) 재조합 바이러스의 높은 역가를 얻는 능력 및 (ⅵ) 아데노바이러스의 높은 감염도를 포함한다.
레트로바이러스에 대한 아데노바이러스 벡터의 장점은 높은 수준의 유전자 발현을 포함한다. 부가적으로 아데노바이러스 복제는 레트로바이러스 서열과는 달리, 숙주 유전자 복제와는 독립적이다. E1 부위에 존재하는 아데노바이러스의 형질전환 유전자가 쉽게 결실될 수 있으며 여전히 충분한 발현 벡터를 제공할 수 있기 때문에 아데노바이러스 벡터로부터의 발암 위험은 거의 무시할 수 있다(Grunhaus & Horwitz, 1992).
일반적으로 아데노바이러스 유전자 전달 시스템은 E1 같은 게놈의 부분을 결실시킴에 의해 복제-무능력이 된 재조합 설계된 아데노바이러스에 근거하며, 여전히 이들은 감염 능력을 보유한다. 부가적인 결실이 아데노바이러스 게놈에 발생할때 상대적으로 큰 외부 단백질을 엔코딩하는 서열이 발현될수 있다. 예를 들면, E1 및 E3 부위 둘다에서 결실된 아데노바이러스는 10Kb의 외부 DNA를 운반할 수 있으며, 293 세포들에서 높은 역가로 성장될 수 있다(Straford-Perricaudet 및 Perricaudet, 1991a). 또한 아데노바이러스 감염을 동반하는 트랜스진(transgene)의 놀라울 정도의 영속적인 발현이 보고되고 있다.
아데노바이러스-매개된 유전자 전달은 최근 진핵 생물 세포 및 모든 동물 세포로 유전자 전달을 매개하는 수단으로서 연구되고 있다. 예를 들면, 희박한 역행성 유전자 무질서 오르니틴 트랜스카바밀레이즈(OTC) 결핍된 마우스를 처리했을때 아데노바이러스 구조물이 정상의 OTC 효소를 공급하기 위해 사용될수 있음을 발견하였다. 불행하게도 정상 수준의 OTC 발현은 17 경우 중에서 4개에서 이루어졌다(Straford-Perricaudet et al., 1991b). 그러므로 이러한 결점이 단지 부분적으로 대부분의 마우스에서 고쳐졌으며 어떤 생리학적 또는 표현형적인 변화를 수반하지는 않았다. 이러한 결과는 암 치료에서 아데노바이러스 벡터의 사용을 거의 고무시키지 못하는 것이다.
낭포성 섬유종(cystic fibrosis) 트랜스멤브레인 컨덕턴스 조절자(CFTR) 유전자를 코튼 랫(cotton rat)의 폐포 상피세포로 전달시키는데 아데노바이러스를 사용하는 시도는 부분적으로 성공적이었으나, 동물 상피 세포로 전달된 세포의 생물학적 활성을 측정하는 것이 불가능하였다(Rosenfeld et al., 1992). 또한 이들 연구는 허파 기도 세포로 유전자 전달 및 CFTR 단백질의 발현이 거의 생리학적 효과를 나타내지 않는다는 것을 설명하였다. 1991년 Science 기사에서 Rosenfeld 등은 a1-안티트립신 단백질의 허파 발현을 보였주었지만, 역시 생리학적 효과는 보여주지 못하였다. 사실상, 관찰되는 발현의 수준은 단지 인간에서 허파의 보호를 위해 요구되는 수준의 단지 약 2%, 즉 생리학적 효과를 나타내기에 필요한 것에 아주 못미치는 것으로 관찰되었다.
인트라포탈(intraportal) 주입에 의해 인간 α1-안티트립신 유전자가 정상 랫의 간에 도입되었으며, 이것이 발현되었고 이들 랫의 플라스마에 도입된 인간 단백질의 분비가 이루어졌다(Jaffe et al., 1992). 그러나, 실망스럽게도 얻어진 수준은 치료 가치를 나타낼 정도로 높은 것이 아니었다.
이런한 결과는 아데노바이러스는 생리학적으로 적절한 효과를 달성하기 위해 재조합 세포에서 충분한 단백질의 발현을 명령할 수 있다는 것을 설명할 수 없는 것이며, 그러므로 암 치료에 아데노바이러스 시스템을 사용하는 것이 유용하지 못하다는 것을 암시한다. 더욱이, 본 발명에 앞서 독성때문에 아데노바이러스를 제조하기 위해 사용되는 패키징 세포로 p53를 혼성화할 수 없는 것으로 생각되었다. E1B 아데노바이러스가 p53에 결합했을 때 아데노바이러스와 p53 기술이 결합될 수 없는 것이 또 다른 이유로 여겨졌다.
발현 구조물로서 다른 바이러스 벡터
본 발명에서 발현 벡터로서 다른 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 백시니아 바이러스(Ridgeway, 1988; Baichwal 및 Sugden, 1986; Couper et al., 1986), 아데노-관련 바이러스(AAV)(Ridgeway, 1988; Baichwal 및 Sugden, 1986; Hermonat 및 Muzycska, 1984) 및 허피스바이러스 등으로부터 유래된 벡터들이 사용될 수 있다. 이들은 다양한 포유동물 세포를 위한 몇가지의 관심을 끄는 특징을 제공한다(Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal 및 Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).
최근 불완전 B형 간염 바이러스에 대한 인식으로 다른 바이러스 서열에 대한 구조적-기능적인 관련으로 새로운 시야를 가지게 되었다. 생체외 연구들은 이들 바이러스가 헬퍼-의존적 패키징 능력을 보유할 수 있으며, 이들 게놈의 약 80%에 달하는 결실에도 불구하고 역전사가 가능한 것을 보여주고 있다(Horwich et al., 1990). 이것은 게놈의 많은 부분이 외부 유전적 물질로 치환될 수 있음을 암시하는 것이다. 헤파토트로피즘(hepatotropism) 및 영속성(통합)은 간-방향성(liver-directed) 유전자 전달을 위해 특히 주목할 만한 성질이었다. Chang 등은 최근 폴리머레이즈, 표면 및 전-표면 코딩 서열에 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼레이즈(CAT) 유전자를 오리 B형 간염 바이러스 게놈에 도입하였다. 이것은 야생형 바이러스를 조류의 간암(hepatoma) 세포로 코트랜스펙션한(cotransfect) 것이었다. 재조합 바이러스의 높은 역가를 포함하는 배양 배지를 원시 새끼 오리 간실질 세포를 감염시키기 위해 사용하였다. 안정한 CAT 유전자 발현은 트랜스펙션후 적어도 24일 후에는 검출가능하였다(Chang et al., 1991).
C. 유전자 전달을 위한 다른 방법들
p53 구조물의 발현을 효과적으로 이루기 위해 발현 벡터가 세포로 전달되어져야만 한다. 상기한 바와 같이, 전달을 위한 바람직한 메카니즘은 감염성의 아데노바이러스 입자에서 캡시데이션된 발현 벡터를 가지는 바이러스 감염을 통한 것이다.
배양된 포유동물 세포로의 발현 벡터의 전달을 위한 몇가지 비-바이러스적 방법을 본 발명에서는 고려하고 있다. 이런 것들로는 칼슘 포스페이트 침강(Graham 및 Van Der Eb, 1973; Chen 및 Okayama, 1987; Rippe et al., 1990), DEAE-덱스트란(Gopal, 1985), 일렉트로포레이션(Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), 직접 마이크로인젝션(Harland 및 Weintraub, 1985), DNA-함유한 리포좀(Nicolau 및 Sene, 1982; Fraley et al., 1979) 및 리포펙타민-DNA 복합체, 세포 고주파분해(Fechheimer et al., 1987), 고속 미세투사를 사용한 세포충격(Yang et al., 1987), 폴리캐사이온(Boussif et al., 1995) 및 리셉터-매개된 트랜스펙션(Wu 및 Wu, 1987; Wu 및 Wu, 1988) 등이 있다. 이들 기술 중 몇몇은 생체내외에서 성공적으로 적용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 아데노바이러스 발현 벡터는 단수힌 네이키드 재조합 벡터로 이루어질 수 있다. 이 구조물의 전달은 생리학적으로 또는 화학적으로 투과성인 세포막에 상기한 방법들 중의 어느 하나의 방법에 의해 실시될 수 있다. 예를 들면, 성인 및 갓태어난 마우스의 간 및 비장에 CaPO4침전물의 형태로 폴리마바이러스 DNA를 성공적으로 주입시킨 Dubensky 등(1984)은 활성 바이러스 복제 및 정확한 감염을 설명한다. Benvenisty 및 Neshif(1986) 또한 CaPO4침전된 플라스미드의 직접 복강내 주입이 트랜스펙션된 유전자의 발현을 일으키는 것을 설명한다.
이것은 p53 구조물을 엔코딩하는 DNA가 유사한 방법으로 생체 내로 전달될수 있음을 시사한다.
세포로 네이키드 DNA 발현 벡터를 전달시키기 위한 본 발명의 또 다른 실시예는 입자 충격에 관련된 것이다. 이 방법은 미세투사(microprojectiles) 코팅된 DNA를 가속하여 고속으로 세포막을 찔러서 세포를 죽이지 않으면서 세포로 들어가게끔하는 능력에 의존한다(Klein et al., 1987). 작은 입자를 가속화하기 위한 몇몇의 장치가 개발되고 있다. 그러한 장치 중의 하나는 전류를 생성하기 위해 고전압 방전에 의존하는 장치로서 회전시 동력을 제공한다(Yang et al., 1990). 사용되는 미세투사는 텅스텐 또는 골드 비드(bead) 등의 생물학적으로 불활성인 물질로 이루어져 있다.
랫 및 마우스의 간, 피부, 근육 세포 조직을 포함하는 선택된 기관이 생체내 충격에 이용되어 왔다(Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991). 이것들은 총과 타겟 기관사이에 어떤 방해 조직을 제거하기 위해 조직 또는 세포의 외과적인 노출을 필요로 할 수 있다. p53 구조물을 엔코딩하는 DNA는 이 방법을 통해 전달될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 발현 벡터는 리포좀에 함침될 수 있다. 리포좀은 인지질의 이중층 막 및 내부 수용성 배지의 특징을 가진 소포 구조이다. 다층라멜라 리포좀은 수용성 배지에 의해 분리되는 다수의 지질층을 가진다. 이것들은 인지질이 과도한 수용액에서 부유할때 자연적으로 형성된다. 이 지질 성분은 폐쇄된 구조를 형성하기 전에 자기배열을 거치고 물을 함침하고 지질 이중층간에 용질을 용해시킨다(Ghosh 및 Bachhawat, 1991). 또한 리포펙타민-DNA 복합체(lipofectamine-DNA complexes)를 사용할 수도 있다.
리포솜-조절된 폴리뉴클레오티드 전달 및 외래 DNA in vitro 발현은 매우 성공적이었다. 웽 등(Wong et al., 1980)은 배양된 닭태아, HeLa 및 간암 세포에서 리포솜-조절된 전달 및 외래 DNA의 발현의 가능성을 논증하였다. 니콜라우 등(Nicolau et al., 1987)은 정맥내 주사 후에 랫에서의 성공적인 리포솜-조절된 유전자 전이를 성취하였다.
본 발명의 어떤 실시예에서, 리포솜은 적혈구응집 바이러스 (hemagglutinating virus, HVJ)와 복합체를 이룰 수 있다. 이는 세포막과의 융합을 용이하게 하고 리포솜-캡슐화된 DNA의 세포 도입을 촉진시키는 것으로 나타났다(Kaneda et al., 1989). 다른 실시예에서, 리포솜은 핵의 비-히스톤 염색체 단백질(HMG-1)과 함께 복합체를 이루거나 사용될 수 있다. 그러나 또 다른 실시예에서, 리포솜은 HVJ 및 HMG-1 둘 다와 함께 복합체를 이루거나 사용될 수 있다. 이러한 발현 벡터는 in vitro 및 in vivo에서 폴리뉴클레오티드의 전이 및 발현에 성공적으로 사용되었다. 박테리오파지 프로모터가 DNA 구조물에 사용되는 경우에도, 리포솜 내에 적절한 박테리오파지 폴리머라제를 포함하는 것이 바람직할 것이다.
세포내로 발현 벡터를 전이시키는 다른 메카니즘은 수용체-조정된 전달이다. 이 접근법은 거의 모든 진핵세포에서 수용체-조정된 세포 이물 흡수(endocytosis)에 의한 거대분자의 선택적인 업테이크의 장점을 가진다. 다양한 수용체의 세포형-특이적 분포 때문에, 전달은 매우 특이적이다(Wu and Wu, 1993). 비이클을 타겟으로 하는 수용체-조정된 유전자는 일반적으로 2개의 성분으로 구성된다: 세포 수용체-특이성 리간드 및 DNA-결합 제제. 몇몇 리간드는 수용체-조정된 유전자 전이를 위하여 사용되었었다. 가장 광범위하게 특징 지워진 리간드는 아시알로오로소뮤코이드(asialoorosomucoid, ASOR, Wu and Wu, 1987) 및 트랜스페린(Wagner et al., 1993)이다. 최근에, ASOR과 동일한 수용체를 인식하는 합성 네오글리코프로테인(neoglycoprotein)는 유전자 전달 비이클(Ferkol et al., 1993; Perales et al., 1994)로서 사용되었고 상피성장인자(EGF)도 편평상피암에 유전자를 전달하는 데에 사용되었다(Myers, EPO 0273085).
또 다른 실시예에서, 전달 비이클은 리간드 및 리포솜을 포함할 수 있다. 예를 들면, 니콜라우 등(Nicolau et al., 1987)은 락토실-세라미드, 갈락토즈-말단 아시알갱글리오사이드를 사용하였고 리포솜내로 합체시켰으며, 헵파토사이트에 의한 인슐린 유전자의 업테이크의 증가를 관찰하였다. 그리하여, 아데노바이러스 발현 벡터도 폐, 상피(epithelial) 또는 종양 세포와 같은 세포형태로 특이적으로 리포솜을 가지거나 가지지 않는 일정한 수의 수용체-리간드 시스템에 의하여 전달될 수 있다. 예를 들면, 상피성장인자(epidermal growth factor, EGF)는 EGF 수용체의 상향조정을 보여주는 많은 종양 세포내로 p53 구조물의 조정된 전달을 위한 수용체로서 사용될 수 있다. 만노스는 간장 세포 상의 만노스 수용체를 타겟팅하기 위하여 사용될 수 있다. 또한, CD5(CLL), CD22(림프종), CD25(T-세포 백혈병) 및 MAA(흑색종)에 대한 항체는 유사하게 부분을 타겟팅시키는 데에 사용될 수 있다.
어떤 실시예에서, 유전자 전이는 ex vivo 조건하에서 더욱 용이하게 실시될 수 있다. Ex vivo 유전자요법는 동물로부터 세포의 분리, 세포내로 폴리뉴클레오티드의 in vitro 전달, 및 그 후 동물내로 변형된 세포의 회복을 가리킨다. 이는 동물로부터 조직/기관의 수술적인 제거 또는 세포 및 조직의 우선적인 배양을 포함할 수 있다. 전부가 여기에 원용되고 있는 앤더슨 등(Anderson et al.)의 미국특허 제5,399,346호는 ex vivo 치료 방법을 개시하고 있다. ex vivo 배양시, 발현 벡터는 p53 구조물을 발현시킬 수 있다. 최종적으로 세포는 원래의 동물내로 재도입되거나 별개의 동물내로 하기에 기술된 수단 중 어느 하나에 의하여 약학적으로 허용가능한 형태로 투입될 수 있다.
D. 약학 조성물 및 투여 루트
본 발명에 의한 아데노바이러스 발현 벡터의 임상적인 응용이 고려될 때, 의도된 적용에 적합한 약학 조성물로서 복합체를 제조하는 것이 필요할 것이다. 일반적으로 이것은 본질적으로 인간 또는 동물에게 해로울 수 있는 다른 어떠한 불순물 뿐만 아니라 발열원(pyrogen)이 없는 약학 조성물을 제조하는 것을 수반할 것이다. 또한 일반적으로 복합체가 안정하게 되고 타겟 세포에 의하여 복합체 업테이크가 가능하게 되는 적절한 염 및 버퍼를 사용하는 것이 요구될 것이다.
본 발명의 수용성 조성물은 약학적으로 허용가능한 캐리어 또는 수용성 배지내에 용해되거나 분산된 발현 벡터의 효과적인 양을 포함한다. 또한 이러한 조성물도 접종물(inocula)이라 한다. "약학적으로 또는 약물학적으로 허용가능한"이라는 구는 적절하게 인간 또는 동물에 투여될 때, 반대의, 알레르기의 또는 다른 유해반응을 일으키지 않는 분자적 실재물 및 조성물을 가리킨다. 여기에서 사용된 것처럼, "약학적으로 허용가능한 캐리어"는 어떠한 및 모든 용매, 분산 배지, 코팅물, 항박테리아 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 이러한 약학적으로 활성인 물질에 대한 배지 및 제제는 기술상 잘 알려져 있다. 종래의 배지 또는 제제가 활성인 성분과 양립할 수 없는 것에 있어서를 제외하고는 치료 조성물에서의 그 사용은 고려되어진다. 추가의 활성 성분도 또한 조성물내로 합체될 수 있다.
자유 염기 또는 약물학적으로 허용가능한 염으로서의 활성 화합물의 용액은 히드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적절하게 혼합된 물 내에서 제조될 수 있다. 분산물 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌글리콜, 그 혼합물 및 오일 속에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용에 대한 통상의 조건하에서, 이들 조제물은 미생물의 성장을 방지하기 위하여 방부제를 포함한다.
본 발명의 발현 벡터 및 전달 비이클은 전형적인 약학 조제물을 포함한다. 본 발명에 따른 치료 조성물은 타겟 조직이 그 루트를 통하여 가능한 한 어떠한 일반적인 루트를 통하여 투여될 수 있다. 이는 경구, 코, 뺨(buccal), 직장(rectal), 질(vaginal) 또는 국부를 포함한다. 선택적으로, 정상위(orthotopic), 피내(intradermal), 눈내(intraocular), 피하, 근육내, 복강내(intraperitoneal) 또는 정맥내 주사에 의하여 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 보통은 생리학적으로 허용가능한 캐리어, 버퍼 또는 다른 의약품첨가물을 포함하는 약학적으로 허용가능한 조성물로서 투여될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 액체 용액 또는 현탁액 중의 하나로서 주사가능한 조성물의 형태로 유리하게 투여된다: 용액내 또는 현탁액내에서 적절한 고체 형태, 주사전의 액체로 또한 제조될 수 있다. 이들 조제물은 또한 에멸젼화될 수 있다. 이러한 목적을 위한 전형적인 조성물은 약학적으로 허용가능한 캐리어를 포함한다. 예를 들면, 조성물은 인산염 완충 생리식염수 밀리리터당 인간 혈청 알부민을 10㎎, 25㎎, 50㎎또는 약 100㎎까지 포함할 수 있다. 다른 약학적으로 허용가능한 캐리어는 염, 방부제, 버퍼 등을 포함하는 수용성 용액, 비독성 의약품 첨가물을 포함한다. 비수용성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 야채기름 및 에틸올레에이트와 같은 주사가능한 유기에스테르가 있다. 수용성 캐리어는 물, 알코올성/수용성 용액, 생리식염수 용액, 염화나트륨과 같은 장관외(parenteral) 비이클, 링거즈 덱스트로스(Ringer's dextrose) 등을 포함한다. 정맥내 비이클은 유체 및 영양 보충제(nutrient replenisher)를 포함한다. 방부제는 항미생물제, 항산화제, 킬레이팅제 및 불활성 가스를 포함한다. 약학조성물의 다양한 성분의 pH 및 정확한 농도는 잘 알려진 파라미터에 따라 조절된다.
부가의 제형은 경구 투여에 적합하다. 경구 제형은 상기한 전형적인 의약품 첨가물, 예를 들면 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 녹말, 마그네슘 스테아레이트, 소디움 사카린, 셀룰로오스, 마그네슘 카보네이트 등을 포함한다. 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 지속된 방출 제형 또는 파우더의 형태를 가진다. 루트가 국소일 때, 형태는 크림, 연고, 살브, 액체 또는 분무 형태일 수 있다.
제약 제제의 효과적인 양은 의도된 목적, 예를 들면 (ⅰ) 종양 세포 증식의 저해 또는 (ⅱ) 종양 세포의 제거에 따라 결정된다. "유니트 용량"이라는 용어는 피검체에서의 용도에 적절한 물리적으로 분리된 유니트를 가리키는데, 각 유니트는 상기에 기술된 그 투여, 곧 적절한 루트 및 치료 양생법과 관련된 원하는 반응을 얻기 위하여 계산되어 미리 결정된-양의 제약 조성물을 포함한다. 치료자의 수 및 유니트 용량 모두에 따른 투여될 양은 치료될 피검체, 피검체의 상태 및 원하는 보호에 의존한다. 제약 조성물의 정확한 양도 의사의 판단에 의존하며 각 개체에 따라 다르다.
어떤 실시예에서 환자에게 제약 조성물을 연속적으로 공급하는 것이 바람직할 수 있다. 정맥내 또는 동맥내 루트에 있어서 점적(drip) 시스템으로 인하여 이루어진다. 국소 적용에 있어서, 반복적으로 적용된다. 다양한 접근에 있어서, 지연된 방출 제형이 사용되어 일정한 시간에 넘어 연장된 시간동안 제한되지만 일정한 양의 제약 제제가 공급될 수 있다. 내부 적용에 있어서, 관심이 있는 영역의 연속적인 관류가 바람직할 수 있다. 이것은 몇몇 경우에서 수술 후에 이루어지는, 제약 제제의 연속적인 투여가 뒤이어 실시되는 카테테르법에 의하여 이루어진다. 관류를 위한 시간은 특정한 환자에 대한 임상의 및 상황에 의하여 선택되나, 시간은 약 1-2시간으로부터 2-6시간, 약 6-10시간, 약 10-24시간, 약 1-2일, 약 1-2주 또는 그 이상까지의 범위일 수 있다. 일반적으로 연속적인 관류를 통한 제약 조성물의 용량은 주사가 투여된 시간동안 조정된, 단일 또는 다중 주사된 것과 동일할 것이다. 그러나 더 많은 용량이 관류를 통하여 이루어질 수 있을 것으로 생각된다.
SCCHN에 대한 임상적 프로토콜
하기의 실시예에서 기술된 아데노바이러스 구조물을 사용하여 SCCHN 질환의 치료를 용이하게 하게 위하여 임상적 프로토콜이 개발되었다. 이 프로토콜에 따라, 머리 및 목 편평상피세포암의 조직학적 증거를 가진 환자가 선택된다. 그러나 환자들은 이전의 화학-, 방사선- 또는 유전자 요법을 받을 필요가 없다. 긍정적으로, 환자들은 적절한 골수 기능(> 2,000/㎣의 순수한 말초 과립백혈구 총수 및 100,000/㎣의 혈소판 총수), 적절한 간장 기능(≤ 1.5㎎/㎗의 빌리루빈) 및 적절한 신장 기능(< 1.5㎎/㎗의 크레아틴)을 가질 것이다.
프로토콜은 106내지 109의 p53 아데노바이러스 발현 구조물의 전염성 입자를 포함하는 제약 조성물의 종양내 주사를 통한 단일 용량 투여를 요구한다. ≥ 4㎝의 종양에 대하여, 투여된 부피는 4-10㎖(바람직하게는 10㎖)이고, 반면에 < 4㎝의 종양에 대하여는 1-3㎖의 부피(바람직하게는 3㎖)가 사용될 것이다. 다중 주사로 하여 약 1㎝ 또는 그 이상의 간격을 두고 0.1-0.5㎖ 부피의 단일 용량이 전달될 것이다.
치료 과정은 2주에 걸쳐서 전달되는 약 6회의 용량으로 구성된다. 임상의에 의한 선택으로 각 2주에 6회, 또는 덜 자주(매달, 격월, 한해에 네 번 등) 양생법이 계속될 수 있다.
환자가 절제 수술에 적격이라면, 종양은 적어도 2주 연속적인 치료 과정에 적어도 2번 상기에 기술된 대로 치료될 것이다. 2번째 (또는 그 이상, 예를 들면, 3번째, 4번째, 5번째, 6번째, 7번째, 8번째 등) 과정이 완료되는 1주 내에, 환자는 절제 수술을 받을 것이다. 절개를 폐쇄시키기 전에, p53 아데노바이러스 발현 구조물(106-109전염성 입자)을 포함하는 10㎖의 제약 조성물은 수술 부위(수술 베드)에 전달되고 적어도 60분동안 접촉되어 유지될 것이다. 상처가 닫히고 유출관 또는 카테테르가 그 안에 위치된다. 수술 후 3일째 되는 날 부가의 제약 조성물의 10㎖가 유출관을 통하여 투여되고 적어도 2시간동안 수술 베드와 접촉된 채로 유지된다. 그리고 나서 흡입에 의하여 제거가 이루어지고 임상적으로 적절한 시기에 유출관이 제거된다.
인공 및 자연 체강의 치료
근래의 SCCHN의 주요 발생원 중의 하나는 종양의 절제 이후에 국부적으로 발생할 뿐만 아니라 제1기의 종양 부위에 남아있는 잔여성의 현미경적 질병이다. 또한 신체의 강이 현미경적 종양 세포에 의해 시딩되는 유사한 경우들도 있다. 이러한 미세 질병들의 효과적인 치료는 치료학적 양생법에 있어서 큰 진전을 나타낸다.
따라서 임의의 실시예에서, "강"을 생성하는 절제 수술에 의해 악성 종양을 제거한다. 수술 당시 및 그 이후에 (주기적으로 또는 계속적으로) 본 발명의 치료용 조성물을 투여한다. 본질적으로 이것은 강 표면을 "국부적"으로 치료하는 것이다. 조성물의 양을 충분히 하여 강의 전체 표면이 발현 구조물과 접촉하도록 해야 한다.
하나의 실시예에서, 투여라는 것은 치료용 조성물을 종양 절제에 의해 형성된 강에 주사하는 것을 의미한다. 다른 실시예에서는, 살균 거즈, 면봉 또는 다른 도구를 사용하여 기계적으로 응용하는 것도 가능하다. 이들 방법은 초기 수술 동안뿐만이 아니라 종양 제거의 이후에도 사용할 수 있다. 또 다른 실시예에서는 수술 부위를 밀봉하기 전에 카테테르를 강에 삽입한다. 원하는 시간 동안 계속하여 강에 살포할 수 있다.
이러한 치료법의 다른 형태로서, 구강, 인두, 식도, 후두, 기관, 흉강, 복강, 또는 방광, 결장 또는 다른 내장 기관을 포함하는 중공기관강과 같은 체강에 대하여 치료용 조성물을 "국부적"으로 적용한다. 이러한 경우에 심각한 제1기의 종양이 존재할 수도, 존재하지 않을 수도 있다. 이러한 치료는 강 내부의 현미경적 질병을 치료하는 것을 목표로 하지만, 부수적으로 미리 제거되지 않은 제1기의 종양 매스에 영향을 미칠 수 있으며, 또는 이 강 내부에 존재할 가능성이 있는 신생물 발생 전(pre-neoplastic) 장애에 영향을 미친다. 다시 말해, 다양한 방법을 사용하여 이들 내장 기관 또는 강 표면에 대한 "국부적" 적용에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어. 단순히 구강 내를 용액으로 스위싱(swishing) 및 가글링(gargling)함으로써 인두 내에 있는 구강에 영향을 미칠 수 있다. 그러나 후두 및 기관 내부를 국부적으로 치료하는 것은 내시경에 의한 시각화 및 치료용 조성물의 국부적 전달을 필요로 한다. 방광 또는 결장 점막과 같은 내장 기관은 주입을 통해 카테테르를 내재시키거나 또는 방광경 또는 다른 내시경 기구를 사용하여 직접적으로 시각화할 것을 요구할 수 있다. 흉강 및 복강과 같은 강에 대한 접근을 제공하는 내재하는 카테테르 또는 외과적 방법에 의해 이들 부위에 접근할 수 있다.
투여 후의 p53 발현 모니터링
본 발명의 다른 태양은 치료용 조성물을 투여한 후의 p53 발현을 모니터링하는 것과 관련되어 있다. 현미경적 종양 세포가 파괴되는 것을 관찰할 수 없기 때문에, 목표 부위가 발현 구조물과 효과적으로 접촉하고 있는 가를 결정하는 것이 중요하다. 발현 구조물이 p53 생산물을 활발히 생성하고 있는 세포를 식별함으로써 이것을 구현할 수 있다. 그러나 외생성 p53과 치료 부위의 종양 및 비종양 세포에 존재하는 p53을 구별할 수 있다는 것이 중요하다. 이 외생성 p53에 추적기 요소를 표식함으로써 소량의 그리고 비내생적인 변형에 대한 명확한 증거를 제공하게 된다.
FLAG 바이오시스템(Hopp et al., 1988)에 의해 이러한 하나의 추적기가 제공된다. FLAG 폴리펩티드는 옥타펩티드(AspTyrLysAspAspAspAspLys)이며, 작은 크기가 전달된 유전자 치료 단백질의 발현을 방해하지는 않는다. FLAG의 공동 발현 및 주요 단백질은 FLAG 단백질에 대항하여 생성된 항체의 사용을 통해 추적된다.
또한 6XHis 시스템(Qiagen)과 같은 다른 면역 마커 시스템(immunologic marker systems)을 사용할 수 있다. 이를 위해 ⅰ) 항원 에피토프의 면역성 보전이 용융에 의해 손상되지 않으며, ⅱ) p53의 기능성 보전이 용융에 의해 손상되지 않는 한, 모든 선형 항원 에피토프를 사용하여 p53을 가지는 용융 단백질을 생성시킨다.
E. 결합된 치료 프로토콜
DNA 손상 제제에 대한 종양 세포의 저항은 임상 종양학에 있어서 중요한 문제점을 표현한다. 현재의 암에 대한 연구의 하나의 목표는 이것을 유전자 치료와 결합하여 화학적 요법 및 방사선 요법의 효능을 개선하는 방법을 찾는 것이다. 예를 들어 단순 포진 티미딘 키나제(herpes simplex-thymidine kinase; HS-tK) 유전자가 레트로바이러스 벡터 시스템에 의해 뇌종양에 전달되는 경우에, 이것은 항바이러스성 제제 강시클로버(antiviral agent ganciclovir)에 대한 감응성을 성공적으로 유발한다. 본 발명의 내용에서는 p53 치료법을 유사하게 화학요법 및 방사선 요법적 중재와 결합하여 사용할 수 있다는 것을 고려한다.
악성 또는 준안정 세포와 같은 세포를 죽이기 위해, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 발현 벡터 및 적어도 하나의 DNA 손상 제제를 사용하여 "타겟" 세포와 일반적으로 접촉할 수 있다. 이들 조성물은 세포를 죽이거나 또는 분열 증식을 막는데 효과적인 결합된 양으로 제공될 것이다. 이러한 과정은 발현 벡터 및 DNA 손상 제제 또는 인자를 동시에 사용하여 세포와 접촉하는 것과 관련이 있다. 단일 조성물 또는 양 제제를 포함하는 약학적 공식을 사용하여 세포와 접촉함으로써, 또는 2개의 개별적인 조성물 또는 공식을 동시에 사용하여 세포와 접촉함으로써 이것을 구현할 수 있으며, 상기 하나의 조성물은 p53 발현 벡터를 포함하며, 다른 조성물은 DNA 손상 제제를 포함한다.
그렇지 않으면, DNA 손상 제재를 치료하기 전에 또는 치료 후에 수 분에서 수 주까지에 이르는 간격으로 p53 치료를 실시할 수 있다. 이 DNA 손상 인자 및 p53 발현 벡터를 세포에 개별적으로 인가하는 실시예에서는, 중요한 시간 주기가 각 전달 시간 사이에 완료되지 않도록 하여, DNA 손상 제제 및 발현 벡터가 셀 상에서 결합된 효과를 발휘할 수 있도록 한다. 이러한 경우에, 양 제제를 사용하여 서로 6시간 내지 1주일 내에, 더 바람직하게는 서로 24-72 시간 내에, 가장 바람직하게는 48시간의 지연 시간을 가지고 세포와 접촉하는 것을 고려한다. 그러나 몇몇의 경우에서는, 각각의 투여 시간 사이에 며칠(2,3,4,5,6 또는 7) 내지 수 주(1,2,3,4,5,6,7 또는 8)가 경과하도록 치료를 위한 시간 주기를 크게 연장하는 것이 바람직할 수 있다.
p53 구조물 또는 DNA 손상 제제 중의 하나를 한번 이상 투여하는 것이 바람직하다고 생각할 수 있다. 다음과 같이 다양한 조성물을 사용할 수 있으며, 여기에서 p53은 "A"이며, DNA 손상 제제는 "B"이다.
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B A/B/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/B
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A B/A/A/B
세포를 죽이기 위하여, 두 제제 모두 세포를 죽이기에 효과적인 조합된 양으로 세포로 전달된다.
DNA 손상 제제 또는 인자는 여기에서는 세포에 적용될 때 DNA 손상을 유도하는 화학적 화합물 또는 치료 방법으로 정의된다. 상기한 제제 및 인자는 γ-조사, X-선, UV-조사, 마이크로파, 전자적 방사 등과 같은 DNA 손상을 유도하는 방사능 및 전파를 포함한다. "화학치료 제제"로도 기재된 다양한 화학적 화합물은 DNA 손상을 유도하는 기능을 하며, 그들 모두는 여기에 기술된 치료법을 조합하여 사용되는 것으로 의도된다. 화학치료 제제는 예를 들면, 아드리아마이신, 5-플루오로우라실(5FU), 에토포시드(etoposide, VP-16), 캄프토테신(camptothecin), 악티노마이신-D, 미토마이신 C, 시스플라틴(CDDP) 및 과산화수소도 포함되어 사용되는 것이 고려된다. 본 발명은 또한 방사능계 또는 실제적인 화합물이건 시스플라틴을 가진 X-선을 사용하거나 에피토시드를 가진 시스플라틴을 사용하는 것처럼 하나 또는 그 이상의 DNA 손상 제제가 조합되어 사용되는 것을 포함한다. 어떤 실시예에서, p53 발현 벡터와 조합하여 시스플라틴을 사용하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명에 따라 암을 치료하는 데에 있어서, 종양 세포를 발현 벡터에 더하여 DNA 손상 제제와 접촉시킨다. 이는 X-선, UV-광, g-선 또는 마이크로파까지와 같은 DNA를 손상시키는 방사능으로 국부에 제한된 종양 부위를 조사시킴으로써 이루어진다. 선택적으로, 피검체에 치료적으로 효과적인 양의 아드리아마이신, 5-플루오로우라실, 에토포시드, 캄프토테신, 악티노마이신-D, 미토마이신 C, 또는 더욱 바람직하게는 시스플라틴과 같은 DNA 손상 화합물을 포함하는 제약 조성물을 투여함으로써 종양 세포는 DNA 손상 제제와 접촉될 수 있다. DNA 손상 제제를 제조하고 상기와 같이, p53 발현 벡터에 결합시켜 혼합된 치료 조성물, 또는 키트로 사용될 수 있다.
폴리뉴클레오티드, 특정하게는 DNA에 직접 교차결합하는 제제가 상승효과의 항종양 결합물을 유도하는 DNA 손상을 얻도록 하기 위하여 여기에서 관찰되고 보여진다. 시스플라틴 및 다른 DNA 알킬화제와 같은 제제가 사용될 수 있다. 시스플라틴은 임상응용시 총 3개의 과정에서 3주마다 5일동안 사용된 20㎎/㎡의 효과 있는 양으로 암을 치료하기 위하여 일반적으로 사용되어왔다. 시스플라틴은 경구적으로 흡수되지 않아서 정맥내, 피하, 종양내 또는 복강내 주사에 의하여 전달되어야 한다.
DNA를 손상시키는 제제도 DNA 복제, 유사분열 및 염색체 분리를 방해하는 화합물을 포함한다. 이러한 화학요법 화합물은 독소루비신으로도 알려진 아드리아마이신, 에토포시드, 베라파밀, 포도필로톡신 등을 포함한다. 네오플라즘의 치료를 위한 임상 셋팅에 널리 사용되는 이들 화합물은 아드리아마이신에 대해서는 21일 간격으로 25-75㎎/㎡의 양에서 에토포시드에 대해서는 정맥내에 35-50㎎/㎡의 양으로 또는 경구로 정맥내 용량의 2배의 양까지의 거환제 주사를 통하여 정맥내로 투여된다.
폴리뉴클레오티드 전구체 및 서브유니트의 합성 및 적합도를 파괴시키는 제제도 DNA 손상을 가져온다. 그러한 것으로서, 많은 폴리뉴클레오티드 전구체가 개발되었다. 광범위한 시험을 거친, 특히 유용한 제제가 쉽게 이용될 수 있다. 그러한 것으로서, 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 제제는, 이 제제를 종양 세포로 타겟팅하는 것을 특히 유용하게 함으로써, 종양 조직에 우선적으로 사용된다. 매우 독성인 5-FU가 국소적인 것을 포함하여 광범위한 범위의 캐리어에 사용된다고 하더라고, 3 내지 15㎎/㎏/일 범위의 용량으로 정맥내에 주사하는 것이 일반적으로 사용된다.
DNA 손상을 일으키고 널리 사용되는 다른 요인은 γ-선, X-선, 및/또는 종양 세포에 방사선 동위원소의 유도된 전달로 일반적으로 알려진 것을 포함한다. DNA를 손상시키는 요인의 다른 형태로는 마이크로파 및 UV-조사와 같은 것도 예상된다. 이들 모든 요인들은 넓은 범위의 DNA 손상 또는 DNA 전구체, DNA의 복제 및 회복 및 염색체의 집합 및 유지에 영향을 미치는 것으로 보인다. X-선의 용량 범위는 연장된 시간(3 내지 4주)에 대한 50 내지 200뢴트겐의 매일의 용량에서 2000 내지 6000뢴트겐의 1회 용량까지이다. 방사성 동위원소의 용량 범위는 광범위하게 변하고, 동위원소의 반감기, 방사된 조사선의 세기와 형태, 및 종양 세포에 의한 업테이크에 의존한다.
당업자는 "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, chapter 33, 특히 624-652페이지를 참고할 수 있다. 용량의 어떤 변화는 처리될 피검체의 상태에 따라서 반드시 일어날 것이다. 어쨌든, 투여하는 사람은 개별 피검체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다. 또한, 인간 투여시의 조제는 FDA 사무국의 생물학 기준으로 요구되는 불임, 발열성, 일반적인 안전 및 순도 기준에 충족되어야 한다.
본 발명자들은 p53-결합된 암 환자로의 p53 발현 벡터의 국부적인 전달은 임상 질환을 중화시키는 치료학적으로 효과적인 유전자를 전달하기 위한 매우 유효한 방법일 것이라고 제안한다. 이와 유사하게 화학 또는 방사선 요법은 피검체 몸체의 특정한 침범 영역에 사용될 수 있다. 선택적으로 발현 벡터 또는 DNA를 손상시키는 제제의 전신의 전달은 어떤 상황에서는, 예를 들면 광범위한 전이가 발생했을 경우에 적절한 수 있다.
시토킨 요법도 결합된 치료 양생법에 대한 효과적인 파트너라는 증명되었다. 다양한 시토킨은 상기한 결합된 접근법으로 사용될 수 있다. 시토킨의 예로는 IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, TGF-β, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNFα, TNFβ, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-α, IFN-β, IFN-γ을 포함한다. 시토킨은 하기에 기술된 바와 같이, 환자의 상태 및 시토킨의 상대적인 독성과 같은 임상적인 징후와 일관하여 표준 양생법에 따라서 투여된다.
p53이 타겟팅된 요법과 화학-, 방사선 및 시토킨 요법을 결합하는 것에 더하여, 다른 유전자 요법과의 결합이 유익할 것으로 생각된다. 예를 들면, 동시에 K-ras 및 p53 돌연변이의 타겟팅은 향상된 항암 치료법을 얻을 수 있다. 이 같은 방식으로 다른 종양-관련된 유전자를 타겟팅하는 것, 예를 들면, p21, p16, p27, E2F, Dp계 유전자, Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-Ⅰ, MEN-Ⅱ, BRCA1, VHL, FCC, MCC, 다른 ras 분자, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun, trk, ret, gsp, hst, bcl, 및 abl을 생각해 볼 수 있다. 또한 p53 요법을, 항체가 상기한 분자 중의 하나에 결합하는 단쇄 항체 구조물의 이용을 포함하거나 또는 상기에 기재된 하나 또는 그 이상의 시토킨을 엔코딩하는 유전자와 결합시키는, 항체를 기초로 하는 유전자 요법 치료와 결합하는 것도 바람직할 수 있다. p53을 세포소멸 과정에 관련되었던 다른 유전자, 예들 들면, 아데노바이러스 ElA, Bax, Bcl-Xs, 등과 결합하는 것도 유리할 수 있다.
F. 키트
종양 세포 증식을 저해하는 데에 필요한 모든 필수적인 물질 및 시약은 키트내에서 함께 조립될 수 있다. 이것은 일반적으로 선택된 아데노바이러스 발현 벡터를 포함할 것이다. 또한 발현 벡터의 복제 및 이 복제를 위한 호스트 세포를 위한 다양한 배지도 포함될 수 있다. 이러한 키트는 각 개별 시약을 위한 별개의 용기를 포함할 것이다.
키트의 성분이 하나 또는 그 이상의 액체 용액에 제공된다면, 바람직하게는 액체 용액은 수용액이고, 살균된 수용액이 특히 바람직하다. 인 비보의 용도로서, 발현 벡터는 약학적으로 허용가능한 주사가능한 조성물로 제형화될 수 있다. 이 경우에 용기 수단은 그 자체가 폐와 같은 신체의 감염된 부위에 적용될 수 있고, 동물에 주사할 수 있고, 또는 키트의 다른 성분에 적용도 하고 혼합할 수 있는 제형의 유입기(inhalent), 주사기, 피펫, 점안기(eye dropper), 또는 다른 이와 같은 기구로 사용될 수 있다.
키트의 성분도 건조 또는 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 시약 또는 성분이 건조된 형태로 제공될 때, 일반적으로 적절한 용매를 첨가함으로써 재구성이 이루어진다. 용매도 다른 용기 수단에 의하여 제공될 수 있는 것으로 생각된다.
본 발명의 키트도 전형적으로 예를 들면, 그 안에 원하는 바이알(vial)을 가진 주사 또는 흡입성형된(blow-molded) 플라스틱 용기와 같은 상업적인 판매를 위한 폐쇄하여 유폐된 바이알을 포함하는 수단을 포함한다. 용기의 수 또는 형태에 관계없이, 본 발명의 키트는 또한 최종의 복합체 조성물의 동물의 신체 내로 주사/투여 또는 배치시키는 것을 도와주는 기구를 포함하거나 패키지화할 수 있다. 이러한 기구는 유입기, 주사기, 피펫, 핀셋(forceps), 측정 스푼, 점안기 또는 이와 같은 의학적으로 증명된 전달 비이클이 될 수 있다.
G. 현미경적 종양 시딩 및 잔여 질환을 위한 동물 모델
본 발명의 다른 양상은 현미경적 잔여 암종 및 체강의 현미경적 시딩의 분석을 위한 동물 모델의 발병을 포함한다. 여기에 기재된 "암종"은 단일 세포 또는 다세포 종양 매스를 가리킨다. 현미경적 질환에서, "종양"은 육안으로는 관찰할 수 없는 하나 또는 적은 수의 암종 세포로 구성되어 있다.
여기에 기술된 동물 모델은 (ⅰ) 특히 질환이 경과된 단계에서 머리 및 목 암환자의 수술후 환경 및 (ⅱ) 현미경적 암종이 자리 잡은 병에 걸린 피검체의 체강을 모방하는 데에 특히 유리하다. 암을 위한 다른 동물 모델과 유사한 모델은 종양 세포를 동물내로 접종함으로써 얻는다. 그러나 자연적인 체강 또는 종양 매스의 절제에 의하여 생긴 수술후 구강의 생리학적인 동등물인 포우치(pouch)의 피하적인 산물로 구별된다.
본 발명은 모델 유기체로서 누드 마우스를 예로 든다. 실질적으로 어떤 동물도 본 발명에 의한 용도를 위하여 사용될 수 있다. 동물로는 실험 프로토콜에 일상적으로 사용되는 작은 동물이 특히 바람직하다. 마우스, 랫, 모르모트(guinea pig) 및 햄스터와 같은 설치류가 더욱 바람직하다. 토끼 또한 바람직한 종이다. 동물을 선택하는 기준은 대개 연구자의 특정한 선택에 의존한다.
첫 단계는 실험 동물의 조직 플랩(flap)을 얻는 것이다. "조직 플랩"이라는 용어는 타겟 조직을 노출시킨 동물의 살의 어떠한 절개를 의미한다. 용이하게 접근할 수 있는 부위인 동물의 등부분의 옆구리에 절개하는 것이 일반적으로 바람직하다. 그러나 동물의 다른 부분이 절개될 수 있으며, 조직 부위의 선택은 검사할 치료술의 특정 형태와 같이 다양한 요인에 의존할 수 있을 것으로 이해된다.
일단, 타겟 조직 부위가 노출되면, 암종 세포, 개별적으로 또는 현미경적인 종양 중에 하나는 조직 부위와 접촉된다. 암 세포를 조직 부위내로 시딩하는 가장 간편한 방식은 세포를 포함하는 조직 배양 배지의 현탁액을 노출된 조직에 적용시키는 것이다. 암 세포 적용은 살균 피펫 또는 어떤 다른 편리한 적용기를 사용하여 간단히 이루어질 수 있다. 즉, 이 과정은 살균 조건에서 실시될 것이다.
한 실시예에서, 2.5×106SCCHN 세포는 누드 마우스의 노출된 조직 플랩내로 접종된다. 본 기술의 당업자는 주어진 목적을 위한 적절한 세포수를 용이하게 결정할 수 있다. 세포의 수는 동물의 크기, 절개 부위, 종양 세포 그 자체의 증식능, 종양 성장을 위한 시간, 테스트될 잠재적인 항종양 치료 등과 같은 다양한 요인에 의존될 것이다. 어떤 특정한 형태의 종양을 위한 최적의 모델 시스템의 확인에 투여될 세포 수의 일정한 조절이 요구된다고 할지라도, 과도한 양의 실험을 나타낼 방법이 없다. 이 분야에서의 동물 시험의 당업자는 이러한 최적화가 필요하다고 생각할 것이다.
이는, 예를 들면 동물에 전달될 세포수를 다르게 하고 조직 플랩의 재밀봉에 이어 세포성장을 모니터하는 예비조사를 실시함으로써 성취될 수 있다. 물론, 더 많은 수의 세포를 투여하는 것은 더 많은 수의 현미경적 잔여 종양 세포를 얻을 것이다.
본 연구에서, 플랩은 매트리스 봉합선(suture)을 이용하게 효과적으로 밀봉되었다. 그러나 본 분야의 당업자는 접착제, 클램프, 바늘, 봉합선 등의 사용과 같은 절개부를 밀봉하는 데에 일상적으로 사용된 다양한 방법 중 어떠한 방법도 사용할 수 있다.
H. 실시예
하기한 실시예는 단지 어떤 특정한 실시예를 예시하기 위하여 제공되며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.
실시예 1
재조합 아데노바이러스를 통한 야생형 p53 유전자의
도입으로 인간 머리 및 목 암세포의 성장 억제
물질 및 방법
세포주 및 배양 조건. 인간 SCCHN 세포주 Tu-138 및 Tu-177은 모두 머리 및 목 외과 M.D. 앤더슨 암센터에서 확인되었다. Tu-138 및 Tu-177은 각각 균육진측(gingivo-labial)의 적당하게 분화된 편평상피암 및 후두(larynx)의 덜 분화된 편평상피암으로부터 확인되었다. 두 세포주 모두 초기 외식 기술을 통하여 개발되었으며, 시토케라틴 양성이고 무흉선 누드 및 SCID 마우스에서 발암성이다. 이들 세포는 페니실린/스트렙토마이신을 가진 10%의 열-불활성된 소태아혈청(FBS)으로 보충된 DMEM/F12 배지에서 성장하였다.
재조합 아데노바이러스 제조 및 감염. 재조합 p53 아데노바이러스(Ad5CMV-p53)(Zhang et al., 1994)는 시토메가로바이러스(CMV) 프로모터, 야생형 p53 cDNA, 및 변형된 아데노바이러스 5형(Ad5)의 E1-결실된 영역내로 삽입된 미니-유전자 카세트의 SV40 폴리아데닐레이션 신호를 포함한다. 바이러스 스톡은 293세포로 증식되었다. 세포를 감염 36-40시간 후에 수확, 펠렛화시키고 인산염-완충 생리식염수내에서 재현탁, 용해시키고 세포 부스러기를 CsCl 구배 정제에 적용시켜 제거시켰다. 농축 바이러스는 투석시키고 나누어서 -80℃에 저장하였다. 세포 단층에 DMEM/F12 배지 및 2% FBS내의 바이러스를 첨가함으로써 감염시키고, 세포를 일정하게 교반시키면서 60분동안 37℃에서 인큐베이션시키고, 그 후에 완전 배지(DMEM/F12/10% FBS)를 첨가시키고 세포를 원하는 시간동안 37℃에서 인큐베이션시켰다.
노던 블롯 분석. 총 RNA를 산-구아니디늄 티오시아네이트 방법(Chomczynski and Sacchi, 1987)에 의하여 분리시켰다. 총 RNA의 20㎍에서 노던 분석을 실시하였다. 멤브레인을 랜덤 프라이머 방법에 의하여 라벨링된 p53 cDNA 프루브로 5×SSC/5X 덴하르트 용액/0.5% SDS/변성된 연어 정액(20㎍/㎖)에서 하이브리다이제이션시켰다. 멤브레인을 떼어버리고 RNA 로딩 대조군을 위하여 GAPDH cDNA로 재프루빙시켰다. 발현된 p53의 상대적인 양은 농도계(densitometer, Molecular Dynamics Inc., Sunnyvale, CA)에 의하여 결정되었다.
웨스턴 블롯 분석. 총 세포 용해산물을 RIPA 버퍼(150mM NaCl, 1.0% NP-40, 0.5% DOC, 0.1% SDS, 50mM, Tris, pH 8.0)에서 24시간 후감염처리한 세포를 5초동안 음파처리시킴으로써 제조하였다. 시료 단백질의 50마이크로그램을 10% SDS-PAGE에 적용시키고 Hybond-ECL 멤브레인(Amersham)으로 전달시켰다. 멤브레인을 Blotto/Tween(5% 탈지 건조 우유, 0.2% Tween20, 0.02% 인산염-완충 생리식염수내의 소듐 아지드)으로 블록킹시키고 일차 항체, 마우스 항-인간 p53 단클론성 항체 PAb1801 및 마우스 항-인간 β-악틴 단클론성 항체(Amersham), 및 이차 항체, 양고추냉이 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)으로 프루빙시켰다. 멤브레인을 가공시키고 제조업자의 지시대로 현상시켰다.
면역조직화학적 분석. 감염된 세포 단층을 3.8% 포르말린으로 고정시키고 메탄올내의 3% H2O2로 5분동안 처리하였다. 벡타스테인 엘리트 키트(Vectastain Elite kit, Vector, Vurlingame, CA)를 이용하여 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 사용된 일차 항체 항-p53 항체 PAb1801이었고, 이차 항체는 아비딘-라벨링된 항-마우스 IgG(Vector)이었다. 비오틴화된 양고추냉이 퍼옥시다제 ABC 복합체 시약은 항-항체 복합체를 검출하기 위하여 사용되었다. 전흡착 대조군은 각 면역염색 실험에서 사용되었다. 그리고 나서 세포를 해리스 헤마톡실린(Harris hematoxylin, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)으로 대비염색(counterstain)시켰다.
세포 성장 시험. 세포를 6개의 웰 플레이트에 2×104세포/㎖의 비중으로 3중으로 플레이팅시켰다. 세포를 대조군으로서 야생형(Ad5CMV-p53) 또는 복제-결함 아데노바이러스 중의 하나로 감염시켰다. 세포를 2일마다 수확하고, 계산하고 그 생존력은 트립판 블루 배제법(trypan blue exclusion)을 이용하여 결정되었다.
인 비보에서 종양 성장의 저해. 자리 잡은 피하 종양 결절 상에 미치는 Ad5CMV-p53의 효과를 병원균이 없는 한정된 환경에 있는 누드 마우스에서 결정되었다. 실험을 재조사하고 동물 관리 및 이용, 및 재조합 DNA 연구를 위한 기관 위원회에 의하여 입증되었다. 간단히, 아세프로마진/케타민(acepromazine/ketamine) 마취(anesthesia)의 유도 후에, 3개의 개별 피하 플랩을 각 동물 위에 올리고 완전 배지 150㎖내의 5×106세포를 굵은 바늘을 이용하여 각 플랩내로 피하적으로 주사하고, 세포를 수평적인 매트리스 봉합선의 포켓내에 보관하였다. 4마리의 동물은 각 세포주에 대하여 사용하였다. 4일 후에, 동물을 재마취시키고 플랩을 1) 우전방 플랩내의 Ad5CMV-p53(50MOI); 2) 우전방 플랩내의 복제-결함 바이러스(50MOI); 및 3) 좌후방 측면의 수송 배지만의 100㎖의 전달을 위하여 플랩을 다시 올렸다. 처리물이 투여되기 전에 모든 주사 부위는 가시적이고 촉진가능한 피하 결절을 발병시켰다. 동물을 매일 관찰하고 20일에 희생시켰다. 인 비보 종양 부피를 횡단면 직경의 적의 제곱근으로 계산된 평균 종양 직경을 가진 구형으로 추정하여 계산하였다. 희생시킨 후에, 절단된 종양을 마이크로캘리퍼스에 의하여 3차원적으로 측정하여 종양 부피를 결정하였다. 비파라메트릭한 프리드만의 2-방식 ANOVA 테스트를 사용하여 시료 수단 사이의 차이의 중요성을 테스트하고, SPSS/PC+ 소프트웨어 패키지(SPSS Inc., Chicago, I1)가 사용되었다.
결과
SCCHN 세포의 아데노바이러스 감염. Tu-138 및 Tu-177 세포의 최적의 아데노바이러스 형질도입을 위한 조건은 이들 세포를 아데노바이러스를 발현시키는 E. coli β-gal 유전자로 감염시킴으로써 결정되었다. 형질도입 효율은 X-gal 염색 후에 푸른색의 세포의 수를 계산함으로써 평가되었다. 감염된 세포의 수와 사용된 아데노바이러스 입자의 수 사이에는 직선 관계인 것으로 보인다. 100MOI β-gal 아데노바이러스의 1회 분량이 접종된 세포는 60%의 푸른색의 세포를 나타내었고(도 1), 이는 다중 감염에 의하여 100%로 향상되었다. 이 벡터의 SCCHN 세포 내의 형질도입 효율은 이전에 검사한 다른 세포주의 그것과 매우 다르며, HeLa, HepG2, LM2, 인간 비소형의 세포 폐암 세포주는 30 내지 50MOI β-gal 아데노바이러스와의 인큐베이션 후에 97% 내지 100%의 감염 효율을 보여주었다(Zhang et al., 1994).
SCCHN 세포로 감염된 아데노바이러스 내에서 내생성 p53 mRNA의 발현. 2개의 인간 SCCHN 세포가 본 실험을 위하여 선택되었다: 두 세포주 Tu-138 및 Tu-177은 돌연변이 p53 유전자를 포함한다. 최근에 생성된 재조합 야생형 p53 아데노바이러스, Ad5CMV-p53이 Tu-138 및 Tu-177 세포를 감염시키기 위하여 사용되었다. 감염 24시간 후에, 총 RNA를 분리시키고 노던 분석을 실시하였다. p53 유전자 생성물의 높은 수준의 발현 때문에, 형질전환된 일차 인간 태아성 신장 세포주 293이 양성 대조군으로 사용되었으며, 반면에, p53 유전자의 동형접합 결실된 림포아구종(lymphoblastoma) 세포주인 K562가 음성 대조군이었다. 모의-감염된 세포 및 복제-결함 아데노바이러스로 감염된 세포인 d1312에서 분리시킨 시료에서 검출된 2.8kb의 내생성 p53 mRNA의 수준은 유사하였다. 10배까지 높은 수준의 외생성 1.9Kb p53 cDNA가 Ad5CMV-p53으로 감염된 세포내에 존재하였는데, 이것은 외생성 p53 cDNA가 성공적으로 이들 세포내로 형질도입되고 효과적으로 전사되었음을 나타낸다. 흥미롭게도, 이들 세포내의 내생성 p53 mRNA의 수준은 실험 대조군에서 보다 5배 높았다. 노던 블롯은 RNA가 오염된 Ad5CMV-p53(DNA)에 대한 증거를 보여주지 않았다.
아데노바이러스-감염된 SCCHN 세포내에서 p53 단백질의 발현. 생성된 p53 단백질의 양에 대한 p53 mRNA의 수준을 비교하기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다. p53 밴드는 단특이성(monospecific) 항-p53 항체에 의하여 인식되었다. PAb1801은 K562 세포를 제외한 모든 시료로부터 분리된 세포 추출물내에서 관찰되었다. 세포주 293은 높은 수준의 p53 단백질을 보여주었다. 모의-감염된 Tu-138 및 Tu-177 세포로부터 분리된 시료는 낮은 수준의 p53 단백질을 보여주었다. p53 발현 수준은 d1312 아데노바이러스로 감염된 그 세포와 유사하게 유지되었다. Ad5CMV-p53-감염된 세포내에서 검출된 p53 항원은 두 세포주에서 내생성 돌연변이 단백질 수준보다 상당히 높았다. 이 결과는 Ad5CMV-p53으로 감염된 세포로부터 생성된 외생성 p53 mRNA가 효과적으로 면역반응성 p53 단백질내로 번역된다는 것을 논증하였다. 또한 Ad5CMV-p53으로 감염된 세포의 면역조직화학적 분석은 p53 단백질의 특징적인 핵염색을 나타내었으며, 모의-감염된 세포는 이들 세포내에 p53 단백질이 존재함에도 불구하고 유사한 염색을 보여주지 못했다. 단백질을 검출하지 못하는 것은 검사의 둔감함에서 기인될 수 있다.
인 비트로 SCCHN 세포 성장에 대한 외생성 p53의 효과. 대조군 바이러스 d1312로 감염된 세포는 모의-감염된 세포(도 2a 및 도 2b)와 유사한 성장속도를 가진 반면에, Ad5CMV-p53-감염된 Tu-138(도 2a) 및 Tu-177(도 2b)의 성장은 매우 억제되었다. 감염 24시간 후에, 세포 집단의 부분이 모아지고 그 외부 멤브레인이 수포(bleb)를 형성하면서 외견상 형태학상의 변화가 일어났다. 이들은 연장된 세포의 사망을 구성하는 조직학적으로 예측가능한 일련의 현상의 한 부분이다. 효과는 Tu-177 세포에 대한 것보다 Tu-138에 대한 것이 보다 탁월하였다. 복제-결함 아데노바이러스로 감염된 세포 d1312는 조직형태학적인 이상 없이 정상적인 성장을 보여주었다. 성장 시험은 4번의 반복된 실험에서 재현되었다.
인 비보 종양 성장의 저해. 4마리의 동물이 각 세포주에 대하여 테스트되었다. Tu-177 그룹에서 동물 1마리가 이차 플랩 수술 및 치료 개입물의 전달 후에 죽었는데, 이것은 깊은 마취 및 케이지 메이트에 의한 부가의 손상으로 인한 것으로 생각된다. 검시(nectropsy)는 전이 또는 전신의 효과에 대한 아무 증거도 보여주지 않았다. 상당히 큰 종양이 동물의 양 후방 플랩상(즉 Ad5CMV-p53을 얻지 않는 부위)에 분명하게 나타난다. 종양 진행이 Ad5CMV-p53(p<.04)을 얻는 동물의 우전방 플랩에서 상당히 결여되었다. Tu-177 세포가 더 느린 성장 속도를 가진다는 것은 이전에 이들 동물에서 확인되었다. Tu-138 그룹에서 2마리의 동물은 그들이 빠르게 성장하며 대조군 종양 부위의 궤양화(ulceration)를 겪었기 때문에 초기에 죽었다. 모든 수술 부위는 개입 전에 적어도 9㎣의 병변을 발병시켰다. 검시상의 종양 부피는 표 4에 나타내었다. 제한된 시료 크기가 반영될 수 있는 Tu-177 그룹에서 부피의 차이는 통계적으로 중요하지 않았다.
누드 마우스의 종양 성장에 대한 Ad5CMV-p53의 효과a
처리 평균 부피[㎣±SEM]
Tu-138(4) Tu-177(3)
Ad5CMV-p53 36.0±23.5 19±14.9
Ad5(d1312) 1187.5±419.0 226±84.0
중간 1909.3±776.8 454±276.8
중요성 p값 p값
p53b: d1312 0.04 0.09
p53: 중간 0.05 0.09
a세포를 5×106세포/플랩으로 피하주사하였다. 종양 크기는 처리 20일 후에 결정하였다. 괄호 안의 수는 평가 동물의 수를 나타낸다.bAd5CMV-p53은 p53으로 줄여 쓰고 Ad5(d1312)에 대한 약어로 d1312를 사용하였다.
실시예 2
현미경적 잔여 머리 및 목 편평상피암에 대한
p53 아데노바이러스의 인 비보 분자적 치료요법
물질 및 방법
세포주 및 배양 조건. 모두 확인된 인간 SCCHN 세포주 Tu-138, Tu-177, MDA 686-LN, 및 MDA 886은 미리 특징화하였다(Clayman et al., 1993; Sacks et al., 1988). 이들 세포는 페니실린/스트렙토마이신을 가진 10%의 열-불활성된 소태아혈청(FBS)으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM/F12) 성장하였다.
재조합 아데노바이러스 제조 및 감염; 세포 성장 시험; 노던 블롯 분석. 모든 과정은 실시예 1에 기술하였다. 세포 성장 시험은 모두 3번 실시되었다.
β-갈락토시다제 아데노바이러스로 인 비보 형질도입. 조직 표본의 X-gal 염색을 O.C.T. 냉동 조직 섹션 상에서 실시하여 형질도입 효율을 결정하였다. 8마이크로미터 두께의 표본을 냉 PBS에서 세척시키고 상온의 0.5% 글루탈알데히드내에서 5분동안 고정시켰다. 그리고 나서 슬라이드를 4℃의 PBS로 2회 세척시키고 X-gal 용액(1.3mM MgCl2; 15mM, NaCl; 44mM Hepes 버퍼 pH7.4; 3mM 포타슘 페리시아나이드; 3mM 포타슘 페로시아나이드; DMF의 2% X-gal)내에서 4시간동안 인큐베이션시켰다. 슬라이드를 헤마톡실린 및 에오신으로 대비염색시켰다.
면역조직화학적 분석. 포르말린으로 고정되고 파라핀으로 포매된 인 비보 동물 실험적 조직을 4-5㎛으로 절단시키고 60℃에서 건조시키고, 파라핀을 벗기고, 증류수로 수화시켰다. 그리고 나서 섹션을 증류수의 0.5% 사포닌으로 처리하고 증류수를 수회 교환하면서 씻어내고, 그 후에 메탄올의 3% 과산화수소로 내생성 퍼옥시다제 활성을 블록킹시키고, 증류수를 수회 교환하면서 씻어내었다. 섹션을 증류수내에서 마이크로파로 3분동안 700와트에서 2450MHz의 주파수로 작동하는 샤프 모델 R9H81 마이크로파 오븐을 사용하여 조사하였다. 냉각시킨 후에, 섹션을 증류수를 수회 교환하면서 세척시키고 PBS내에 두고, 하기와 같은 Hsu et al.,(1981)의 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 복합체(ABC) 방법을 이용하여 면역화학적 조사가 실시되었다: 섹션을 정상 말 혈청으로 블록킹시키고 4℃의 토끼 항-인간 p53 다클론성 항체와 클론 OM-1, 1:80(Signet Lanoratories, Denham, MA)으로 밤새도록 인큐베이션시켰다. 그리고 나서 항-토끼 IgG 엘리트 키트(Vector Lanoratories, Burlingame, CA)를 사용하여 비오틴화된 항-토끼 IgG 및 ABC 복합체에 적용시키고, 이것을 각각 45분동안 인큐베이션시켰다. 0.01% 과산화수소(pH 7.6)를 포함하는 PBS의 0.5% DAB를 이용하여 면역염색 반응을 가시화시키고, 0.01% 톨루이딘 블루로 대비염색시키고, 탈수시키고 깨끗하게 한 후에 퍼마운트(Permount)에 설치하였다. 면역염색 반응의 특이성을 확인하기 위하여 테스트 시료 상에서와 같은 방법을 사용하여, 음성 토끼 단클론성 항체 대조군 상에서 뿐만 아니라 편평상피암 세포주의 조직 배양의 알려진 양성 시토스핀(cytospin) 상에서 면역퍼옥시다제 염색이 실시되었다.
인 비보 종양 성장의 저해. 이 과정은 실시예 1에 기술한 것과 같이 실시되었다. 모든 수술 부위는 전신 독성에 대한 검시 분석뿐만 아니라 병리학적으로 평가되었다.
결과
인 비트로 SCCHN 세포 성장에 대한 외생성 p53의 효과. 실시예 1은 내생적으로 돌연변이된 p53을 가진 SCCHN 세포주내에서 Ad5CMV-p53에 의한 세포 성장의 인 비트로 저해를 기술하였다. 본 실시예는 내생성 야생형 p53을 가진 SCCHN 세포주가 유사하게 영향을 미칠지의 여부를 결정하기 위한 것이다. 비악성 섬유아세포 상에 미치는 Ad5CMV-p53의 효과 또한 조사되었다.
4개의 인간 SCCHN 세포주가 본 실험을 위하여 선택되었다: Tu-138 및 Tu-177은 돌연변이 p53 유전자를 포함하는 반면에, MDA 686-LN 및 886은 모두 야생형 p53유전자에 대하여 동형접합된 것이다. 핵학적으로 정상이고 비발암성인 정상적인 섬유아세포 증식물(outgrowth)로부터 유래된 섬유아세포주가 비악성 대조군 세포주로서 사용되었다. 대조군 바이러스에 감염된 세포인 d1312는 모의-감염된 세포와 유사한 성장 속도를 가진 반면에, Ad5CMV-p53으로 감염된 종양 세포의 성장은 매우 억제되었다(도 3a, 도 3b, 도 3c 및 도 3d). 감염 24시간 내지 48시간 후에, 세포 집단의 부분이 모아지고 그 외부 멤브레인이 수포를 형성하면서 외견상 형태학상의 변화가 일어났다. 이들은 연장된 세포의 사망을 구성하는 조직학적으로 예측가능한 일련의 현상의 한 부분이다. 야생형 p53을 가진 것보다 내생성 돌연변이 p53을 가진 세포내에서 더 빨리 효과가 나타났다. 복제-결함 아데노바이러스로 감염된 세포 d1312는 조직형태학적인 이상 없이 정상적인 성장을 보여주었다. 성장 시험은 4번의 반복된 실험에서 재현되었다.
정상 섬유아세포로 감염된 아데노바이러스 내의 외생성 p53 단백질의 발현 및 성장 속도에 대한 그 효과. 또한 핵학적으로 정상이고 비발암성인 섬유아세포주에 대한 Ad5CMV-p53의 효과도 검사하였다. 이들 세포는 초기 종양 세포주를 확인하는 동안에 분리되었다. 감염 24시간 후에, 웨스턴 블롯 분석을 실시하여 다른 감염된 세포 형에 의하여 생산된 단백질의 수준을 비교하였다. p53 밴드는 단특이성 항-p53 항체에 의하여 인식되었고, PAb1801은 Ad5CMV-p53으로 감염된 모든 시료로부터 분리된 세포 추출물내에서 관찰되었다. 실시예 1에서와 같이, p53 아데노바이러스로 감염된 세포주 Tu-138은 형질도입 후에 높은 수준의 p53 단백질을 보여주었다. p53 발현 수준은 모의-감염된 것과 d1312로 감염된 세포에서 유사하게 유지되었다. Ad5CMV-p53 감염된 섬유아세포는 대조군 세포보다 높은 수준의 p53 단백질을 보여주었다. 이 결과는 면역반응성 p53 단백질의 생성에 의하여 증명된 바와 같이, Ad5CMV-p53으로 감염된 정상 섬유아세포내로 효과적으로 번역된다는 것을 가리킨다. 섬유아세포로 감염된 Ad5CMV-p53의 시토스핀의 단백질 발현 및 형질도입 효율은 면역조직화학적 분석에 의하여 확인되었다. 이 섬유아세포주는 개입물(모의, 복제-결함 바이러스, 또는 Ad5CMV-p53)에 독립적으로 정상적인 성장 속도 및 형태를 보여주었다(도 4). 이들 실험을 2회 반복되었고 다른 정상적인 인간 섬유아세포주에서도 확인되었다.
인 비보 형질전환 효율. 인 비보 유전자 전이 효율을 측정하기 위하여 피하 플랩 부위를 분자적 또는 대조군 개입 72시간 후에 절단시켰다. 아데노바이러스 β-갈락토시다제 마커 벡터로 하는 용량-반응 실험으로 이 모델에서의 용량-반응 형질도입 효율을 증명하였다. 이것은 Ad5CMV-p53으로 감염시키고 4일 후에 실시한 면역조직화학적 분석으로 확인되었다. 실험의 두 그룹은 인 비트로(실시예 1)에서 기술한 인 비보 용량 반응을 보여주었다. 뇌, 간장, 폐, 심장, 복부 내장 기관, 및 피부를 포함하는 다른 기관계에서 p53의 발현에 1010PFU를 초과하는 용량의 바이러스가 영향을 미치는 예는 없었다. 이들 실험은 원하는 수술 모델 필드내에서 형질도입된 유전자의 광범위한 일시적 발현을 이루는 가능성뿐만 아니라 바이러스 역가와 형질도입 효율 사이의 용량-반응 관계를 설명하였다.
인 비보 종양 성장의 저해. 인 비보 Ad5CMV-p53 조정된 유전자 전이가 피하 플랩으로 이식된 SCCHN 세포의 확인 또는 성장에 영향을 미치는지의 여부를 결정하기 위하여 조사가 계획되었다. 이 목적을 달성하기 위하여 현미경적 잔여 질환 모델을 제조하였다. 이 모델에서, 3개의 피하 플랩을 무흉선 누드 암컷 마우스 상에 올리고 종양 세포 2.5×106을 피펫팅으로 시딩하였다. 종양 세포가 결절을 형성하도록 하는 대신에(일반적으로 4일내에 일어남), 1회 용량의 분자적 개입이 종양 세포 시딩 48시간 후에 실시되었다. 이와 같은 방식으로, 거대한 종양이 존재하지 않더라도, 모든 거대한 종양의 수술 절제의 임상적인 딜레마를 모방하는 수술 부위내에 현미경적 종양 세포가 있었다. 종양의 발병은 종양 세포의 수, 이식에 할당된 시간, 및 Ad5CMV-p53의 용량에 직접 관련된다. 현미경적으로 이식된 종양 세포(2.5×106)를 얻고 108플라크 형성 유니트(PFU) 또는 그 이상의 Ad5CMV-p53로처리된 마우스 중에서, 야생형 p53 세포주(MDA 886-LN)로 이식된 2마리에게만 종양을 발병시켰다. 다른 모든 세포주는 종양 발병의 부재를 보여주었다(표 5). 이들 실험들은 현미경적인 종양 세포의 성장이 Ad5CMV-p53에 노출된다면 인 비보에서 효과적으로 억제될 수 있다는 것을 논증하였다. 종양 형성은 12주 기간의 끝(초기 동물 희생은 과도한 종양 적재의 상황에 있음)에 수술 부위의 전체적이고 조직적인 분석에 의하여 평가되었다.
SCCHN의 현미경적 잔여 질환 모델내에서 발암성에 대한 Ad5CMV-p53의 효과
세포주 처리
종양 발병 마우스/전체 마우스
비이클
PBS d1312 Ad5CMV-p53
Tu-138(동형접합 돌연변이 p53) 8/8 8/8 0/8
Tu-177(동형접합 돌연변이 p53) 8/8 8/8 0/8
686-LN(동형접합 야생형 p53) 5/8 5/8 0/8
886(동형접합 야생형 p53) 6/6 6/6 2/6
면역조직화학 분석이 실험 동물의 종양 섹션상에서 실시되었다. 이 세포주는 야생형 내생성 p53 유전자를 포함한다. MDA 686-LN(모의-감염)의 생존가능한 종양으로의 중요한 기초 면역염색이 부족하였다. 107PFU의 Ad5CMV-p53은 종양의 더 중앙 부분에 면역염색시킨 말초의 종양 괴저를 보여준다. 108PFU의 Ad5CMV-p53은 간질 및 표면상 근육층을 포함하는 단백질을 발현시키는 다중층을 가진 전체 수술 포켓내에서 발견된 면역염색시킨 종양의 전체 괴저를 보여준다. 109PFU의 Ad5CMV-p53은 108PFU의 Ad5CMV-p53의 것과 유사한 결과를 보여주나, 수술 부위 및 부종의 도처에 증가된 외생성 p53 발현이 현저하다.
그 자신의 내부 대조군으로 공급되는 동물을 이용하여, 4.0×106또는 그 이상의 세포 이식편(implant)은 접종 48시간 후에 Ad5CMV-p53을 가진 수술 부위에서 처리될 때 조차도, 2.5×106세포(P<0.01)의 종양 이식과 비교하여 확인된 피하 이식편이 상당히 증가되었다. Ad5CMV-p53 개입 전에 이식된 세포를 72 또는 96시간동안 확인시키는 것도 유사하게 종양 획득을 증가시켰다. 용량-반응 실험은 Ad5CMV-p53 108및 109PFU이 균일하게 48시간동안 이식된 2.5×106세포의 종양 적재를 저해시키는 데에 효과적이라는 것을 확인시켜 주었다(도 6). 이식된 종양 세포주의 내생성 p53 상태(동형접합 돌연변이된 또는 야생형 p53인지의 여부)는 종양 발병의 중지에서 Ad5CMV-p53의 유효성에 대한 영향이 거의 없었다.
실시예 3
머리 및 목의 편평상피암 전이 야생형 p53
아데노바이러스 유전자에 의하여 조정된 세포소멸 유도
물질 및 방법
세포주 및 배양 조건; 재조합 아데노바이러스 제조 및 감염. 실시예 1 및 2에 기재된대로 모든 과정이 실시되었고 세포주는 유지되었다.
DNA 분절화 분석. 다양한 시간 간격으로 복제 결함 아데노바이러스 대조군뿐만 아니라 야생형 p53 아데노바이러스로 인큐베이션시킨 후에 세포를 수확시키고, 추출 버퍼(10mM Tris, pH 8.0, 0.01M EDTA, 20㎍/㎖ RNAse, 0.5% SDS)의 3㎖를 첨가시킨 PBS 300㎕에서 재현탁시키고, 37℃에서 1-2시간동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션의 끝에, 프로테인아제 K를 첨가하여 최종 농도가 100㎍/㎖가 되게 하고 용액을 50℃의 수조내에서 최소한 3시간동안 방치시켰다. DNA를 동량의 페놀이 포화된 0.5M의 Tris(pH 8.0)로 1회 추출시키고 페놀/클로로포름으로 반복하여 추출시켰다. 침전을 형성한 DNA를 1% 아가로즈 겔에서 분석하였다.
세포 고정. TUNEL 방법에 의하여, 세포를 얼음 위의 PBS내 1% 포름알데히드(pH 7.4)에서 30분동안 고정시켰다. 그리고 나서 세포를 PBS 3㎖으로 세척시키고 70%의 얼음으로 냉각시킨 에탄올내에서 재현탁시키고 -20℃에서 저장시키고 사용하였다. 세포-사이클 분석을 위하여 세포를 70%의 얼음으로 냉각시킨 에탄올만에서 고정시켰다.
말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 시험. 시험은 Gorczyca 등의 방법(Gorczyca et al., 1993)에 따라서 실시되었다. 간단히 말하면, 고정 및 세척 후에, 세포를 0.2M 소디움 카코딜레이트(sodirm cacodylate, pH 7.0), 2.5mM Tris-HCl, 2.5mM C0Cl2(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), 0.1mM DTT(Sigma Chemical Company), 0.25㎎/㎖ BSA(Sigma Chemical Company), 5유니트의 말단 트랜스퍼라제(Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN), 및 20μM 농도의 dATP, dGTP 및 dCTP와 함께 0.5nmoles의 비오틴-16dUTP를 포함하는 50㎕의 TdT 버퍼내에서 재현탁시켰다. 대조군은 d-UTP 없이 각 테스트 시료의 별개의 수적을 인큐베이션시킴으로써 제조하였다. 세포를 37℃의 용액내에서 30분동안 인큐베이션시키고 PBS에서 씻기고, 4×SSC, 0.1% Triton X-100 및 2.5㎍/㎖의 플루오로세인(fluorescenined) 아비딘(Vector Labs. Inc., Burlingame, CA)을 포함하는 100㎕의 FITC 염색 용액내에서 재현탁시켰다. 튜브를 30분동안 상온온도의 어두운 곳에서 인큐베이션시켰다. 세포를 0.1% Triton X-100을 포함하는 PBS에서 씻기고 프로피듐 이오다이드(propidium iodide, 5㎍/㎖) 및 70㎕(1㎎/㎖) RNAse를 포함하는 0.5㎖의 PBS내에서 재현탁시켰다. 튜브를 유세포 측정 분석을 하기 전에 어두운 곳의 얼음 상에서 30분동안 인큐베이션시켰다.
유세포 측정 분석. 모든 시료는 표준 광학 구조로 되어있는 EFICS Profile Ⅱ 유세포 측정기(Coulter Corp., Hialeah, FL)를 이용하여 분석되었다. 각 시료에 대하여 적어도 5,000의 결과를 수집하였다. 엘리트 워크스테이션 소프트웨어(Coulter Corp., Hialeah, FL)의 이뮤노-4 프로그램을 이용하여 테스트 막대그래프로부터 대조군 막대그래프를 감수하여 TdT 말단-라벨링을 위한 양성을 결정하였다.
세포 성장 시험. 세포를 플레이팅시키고 실시예 1에 기재된 바와 같이 성장을 모니터하였다.
세포소멸을 위한 인 비보 분석. SCCHN의 현미경적 잔여 질환 모델내에서의 유전자 요법은 상기 실시예 2에 기술되었다.
인 시튜 말단-라벨링. 과정은 이전에 기술된대로(Wijsman et al., 1993) 실시되었다. 간단히 말하면, 크실렌에서 5분동안 각 3회 파라핀 섹션의 왁스를 제거하고, 슬라이드를 100%, 90%, 705 및 30% 에탄올 용액내에서 각각 3분동안 침적시킴으로써 점차적으로 수화시켰다. 슬라이드를 100% 메탄올내의 0.75% H2O2v/v에서 20분동안 침적시킴으로써 내생성 퍼옥시다제를 불활성화시켰다. 슬라이드를 PBS내에서 세척시킨 후에, 섹션을 37℃의 0.1N HCl내 0.1% 펩신(Fisher Scentific, Houston, TX) w/v으로 5분동안 소화시키고 PBS 내에서 광범위하게 세척시켰다. 그리고 나서 섹션을 37℃의 습한 챔버내에서 1시간동안 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 0.5유니트/㎕; 비오티닐화된 dUTP, 0.06mM; 5X tdt 버퍼, 10㎕; 이중-증류수 50㎕까지를 포함하는 말단-라벨링 칵테일과 함께 1시간동안 인큐베이션시켰다. 슬라이드를 이중-증류수내의 300mM NaCl 및 30mM Na시트레이트를 포함하는 버퍼내에 침적시킴으로써 반응을 종결시켰다. 슬라이드를 PBS 내에서 세척시킨 후에, 섹션을 37℃의 습한 챔버내에서 양고추냉이 퍼옥시드-콘쥬게이션된 아비딘과 함께 인큐베이션시켰다. 3,3'-디아미노벤지딘을 이용하여 염색을 현상시키고 메틸그린으로 섹션을 대비염색시켰다.
결과
p53 아데노바이러스에 의한 SCCHN 세포주의 성장 억제. 상기의 실시예들은 야생형 p53 유전자가 재조합 아데노바이러스 벡터에 의하여 SCCHN 세포주내로 효과적으로 형질도입될 수 있다는 것을 논증하였다. 결과적으로 손상된 종양 세포는 인 비보 뿐만 아니라 인 비트로에서 그 증식능을 상실한다. 억제 효과는 세포주의 내생성 p53의 상태에 의존하지 않는다. 이전의 성장 속도 분석은 1주 동안 실시되었다. 본 실시예에서는 SCCHN 세포 성장에 미치는 야생형 p53의 초기 효과(즉, 초기시간 간격, 시간)를 조사한다.
2개의 대표적인 세포주가 본 실험에 사용되었다. 세포주 Tu-138는 돌연변이 p53 유전자를 지닌 반면에, 세포주 MDA 686LN는 야생형 p53 유전자를 포함한다. 복제-결함 아데노바이러스로 감염된 세포인 d1312는 모의-감염된 세포의 것과 유사한 성장 속도를 가졌다(도 5a 및 도 5b). 한편, Tu138(도 5a) 및 MDA 686LN(도 5b) 세포로 감염된 Ad5CMV-p53의 성장은 상당히 억제되었다. 외생성 p53 단백질은 MDA 686LN과 비교해 볼 때, Tu138에서 더 빠르고 심한 성장 억제를 보였다. 세포 집단의 부분이 모아지고 그 외부 멤브레인이 수포를 형성하면서, 세포소멸과 닮은 외견상 형태학상의 변화가 일어났는데, 이것은 성장 억제의 개시와 함께 일어났다. 복제-결함 아데노바이러스로 감염된 세포 d1312는 조직형태학적인 이상 없이 정상적인 성장을 보여주었다. 중요하게는 이들 효과는 상기 실시예 2에서 기술한 바대로 인간 경구 표피세포(keratinocyte)(불멸이나 비발암성임) 뿐만 아니라 핵학적으로 정상인 섬유아세포의 p53 아데노바이러스 감염 이후에는 발견되지 않았다.
DNA 분절화 분석. 괴저와 구별이 되는 세포소멸의 특성적인 마커 중의 하나는 DNA 분절 래더의 생화학적으로 관찰가능한 외양이다. 세포가 p53 아데노바이러스 감염 후에 세포소멸을 겪었다는 의견을 확인하기 위하여, 실시된 DNA 분절화 분석이 실시되었다. 복제-결함 또는 야생형 p53 아데노바이러스 감염 후의 생존가능한 세포로부터 추출된 염색체 DNA를 아가로즈 겔 전기영동에 적용시켰다. 약 200bp에 상당하는 DNA 분절의 외양 및 그 다중성이 두 세포주 모두에서 나타났다. Tu-138 세포주에서는 p53 아데노바이러스 감염 22시간 후에 분절화된 DNA가 나타난 반면에, MDA 686LN 세포주에서는 분절화된 DNA는 야생형 p53 아데노바이러스 감염 30시간 후에 가시화되었으며, 48시간후에 더욱 뚜렸해졌다. 검출가능한 분절화된 DNA는 모의-감염된 것 및 d1312-감염된 세포로부터 나타나지 않았다.
인 비트로 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 시험. 세포소멸의 다른 특성적인 마커는 형태학상의 변화 및 염색사(chromatin) 축합을 일으키는 핵의 구조조직의 파괴이다. 이러한 구조적인 변화를 극도로 검출하기 위하여 전자 현미경이 괌범위하게 사용되었다. 그러나 최근에 세포소멸의 세포를 확인하기 위한 유세포 측정 방법이 전자 현미경과 비교하여 볼 때 세포 집단을 정밀조사하고 분석하는 능력으로 인하여 좋은 호응을 얻었다(Gorczyca et al., 1993). 본 발명자들은 세포소멸의 세포를 확인하기 위하여 광범위한 DNA 분열의 검출을 기초로 하는 TUNEL(말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제-조정된 dUTP-비오틴 닉 말단-라벨링) 방법(Gorczyca et al., 1993)을 사용하였다. p53 아데노바이러스 감염 15시간 후에, 세포소멸 단계에 있는 생존가능한 Tu-138 세포 집단의 4.4%는 MDA 686LN의 0%와 비교된다(도 6a 및 도 6b). 관찰기간에 따라 비례적으로 증가하는 세포소멸 세포의 수도 역시 p53 아데노바이러스 인큐베이션 후에 증가하였다. 거의 Tu-138 세포의 31%가 22시간 후에 세포소멸을 겪었다. 세포소멸의 초기 도입이 지연되더라도, MDA 686LN 세포의 약 60%가 p53 아데노바이러스 감염 48시간 후에 세포소멸 단계에 있었다. 주목할만한 것은 튜넬 방법에 의하여 결정된 세포소멸 세포의 퍼센트는 생존가능한 세포가 분석에 적용될 때 이후로만 상당히 과소 평가되었다. 이들 데이터는 성장 속도 및 DNA 분절화 분석과 서로 잘 관련된다. 복제 결함 바이러스 대조군(100 M.O.I.) 뿐만 아니라 모의 감염을 이용한 대조군 실험에서 세포소멸을 겪는 검출가능한 세포 집단은 없었다. 그러므로, 세포소멸은 형질도입된 아데노바이러스 유전자 생성물 그 자체의기능은 아니었다.
세포소멸을 위한 인 비보 분석. 상기한 실시예는 p53 아데노바이러스가 인 비보에서 종양 형성을 억제한다는 것을 보여주었다. 이 실시예는 인 비보에서 종양 성장의 억제가 세포소멸의 결과이었는지의 여부를 보여주기 위한 것이다. 실시예 2로부터 얻은 파라핀으로 포매된 섹션의 세포소멸 세포를 검출하기 위하여 인 시튜 말단-라벨링 분석이 실시되었다. 명료하게 대조군으로 PBS 처리된 MDA 686LN을 지닌 동물으로부터 분리된 조직 섹션에서는 아무런 염색도 관찰되지 않았다. 한편, MDA 686LN을 지닌 야생형 p53 아데노바이러스로 처리된 마우스로부터 분리된 조직 섹션은 강한 양성 염색을 보여주었으며, 이는 세포소멸이 사실상 인 비보에서의 종양 성장의 억제와 관련된다는 것을 논증해 주었다.
이들 실험에 더하여 본 발명자들은 성장 억제가 부분적으로 유도된 p21 단백질 또는 우선적으로 세포소멸의 결과에 의하여 세포 사이클 정지에 의한 것인지의 여부를 결정하고자 하였다. 웨스턴 블롯팅은 p21 단백질이 SCCHN 세포로 감염된 야생형 p53 아데노바이러스내에서 유도되었다는 것을 보여주었다. 그러나 세포 사이클 분석은 p53 아데노바이러스 감염된 세포내에서 상승된 수준의 p21 단백질에도 불구하고, S상과 비교할 때 G1단계에서 세포의 현저한 축적이 없었다는 것을 나타내었다.
실시예 4
p53-FLAG에 의한 머리 및 목 편평상피세포의 성장 억제:
유전자요법을 위한 효과적인 마커
물질 및 방법.
세포주 및 배양 조건. 재조합 아데노바이러스 제조 및 감염; 노던 블롯 분석; 웨스턴 블롯 분석; 세포 성장 시험; 인 비트로 세포층의 면역조직화학적 염색. 실시예 1에 기술된대로 모든 과정은 실시되었고 세포주는 유지되었다.
p53-FLAG 아데노바이러스의 생성. pC53-SN을 BamHⅠ으로 소화시킴으로써 p53 cDNA 서열을 절제시키고, pGEM7Z의 BamHⅠ으로 클론시켰다. 그리고 나서 적절한 인서트 방향을 가진 재조합 플라스미드를 Acc1 및 Kpn1으로 소화시켜 22개의 아미노산을 p53 cDNA으로부터 제거시켰다. 그리고 나서 종결 코돈을 포함하는 FLAG 펩티드 서열을 포함하는 Acc1-Kpn1 양립가능한 말단을 가진 링커를 소화된 플라스미드내로 결찰시키고 p53-FLAG 융합 유전자를 얻었다. 그리고 나서 얻은 p53-FLAG 융합 유전자를 인간 CMV 프로모터 및 SV 폴리아데닐레이션 신호를 가진 발현 벡터내로 클론시켰다. 최종 구조물을 피하적으로 셔틀 벡터 pXCJL.1내로 삽입시켜 (Zhang et al., 1994) 재조합 p53-FLAG 아데노바이러스를 얻었다.
인 비보 현미경적 잔여 질환 실험. 실시예 1에서 기술한 무흉선 누드 모델 시스템을 이용하여 병원균이 없는 한정된 환경에서 실시되었다. 2개의 다른 셋트로 실험이 반복 실시되었다. 첫 번째는 감소하는 농도에서(1010pfu, 109pfu, 108pfu)에서의 플랩 3개에서의 AdCMV-p53-FLAG 바이러스를 이용한 용량-반응 실험이었다. 4번째 플랩은 대조군으로 제공되고 PBS 또는 복제 결합 아데노바이러스(DL312) 중의 하나에 무작위화한 것이다. 두 번째 실험은 3개의 별개 플랩에서 1010pfu의 AdCMV-p53-FLAG, AdCMV-p53 및 복제 결함 아데노바이러스를 이용하여 실시되었다. 4번째 플랩은 살균된 PBS의 동량의 부피로(100㎕) 접종되었다. 처리 48시간 후에, 이들 동물 중 2마리를 희생시키고 플랩을 면역조직화학적 분석을 위하여 수확시켰다. 남은 동물을 21일동안 관찰하고 희생시켰다. 종양 부피를 비교하기 위하여 캘리퍼스를 이용하여 측정하였다.
결과
AdCMV-p53 및 AdCMV-p53-FLAG 바이러스로의 감염 후에 mRNA의 발현. Tu-138 및 MDA 686-LN 모두 p53 mRNA의 발현을 위하여 검사하였다. 아데노바이러스 감염 후에 총 RNA를 분리시켰다. 노던 블롯 분석이 실시되었다. 유사한 수준의 외생성 AdCMV-p53 mRNA이 AdCMV-p53 및 AdCMV-p53-FLAG으로 감염된 세포사이에서 검출되었다. AdCMV-p53 및 AdCMV-p53-FLAG으로의 감염 후의 p53 mRNA 발현의 수준은 Tu-138 및 MDA 686-LN과 비교할만하다. 강도의 변화는 로딩 용량에 관계되는 것으로 생각된다. p53 mRNA의 내생성 발현은 돌연변이 p53 세포주, Tu-138의 레인 2 및 3에서 나타난다. p53 유전자의 야생형인, MDA 686-LN 세포주에서의 현저한 내생성 p53 mRNA 발현은 없었다. 이들 데이터는 AdCMV-p53 바이러스와 같이, AdCMV-p53-FLAG 바이러스가 성공적으로 형질도입되고 효율적으로 전사되었다는 것을 시사한다. 노던 블롯 분석은 AdCMV-p53 DNA 오염의 아무 증거도 보여주지 않았다.
AdCMV-p53 및 AdCMV-p53-FLAG로 감염된 SCCHN 세포주내에서 외생성 p53 단백질의 발현. AdCMV-p53으로 감염되고 AdCMV-p53-FLAG으로 감염된 세포에 의하여 발현된 단백질의 양을 비교하기 위하여 웨스턴 블롯 분석이 실시되었다. 2개의 동시에 실시되는 겔 상에서의 단특이성 p53 항체(PAb1801) 및 항-FLAG M2 항체(IB13025)를 이용하여 단백질 밴드가 확인되었다. AdCMV-p53으로 감염된 Tu-138 및 MDA 686-LN 세포도 또한 테스트되었다. 복제 결함 아데노바이러스로 감염된 세포 또는 모의 감염 그룹 중 하나에서 p53 단백질 발현에 있어서 아무 변화도 나타나지 않았다. p53-FLAG 단백질 발현의 수준은 p53 항체 프루빙 후의 발현된 것과 유사한 것으로 나타나나, AdCMV-p53 바이러스로 감염된 그 세포에서 검출가능한 밴드가 나타나지 않았다. 모의 및 DL312 감염된 세포는 세포주 중 하나에서 검출가능한 수준의 면역반응성 p53 또는 FLAG 단백질을 나타내지 않았다.
SCCHN의 인 비트로 세포 성장에 대한 AdCMV-p53 및 AdCMV-p53-FLAG의 효과. Tu-138 및 MDA 686-LN 세포주에서 야생형 p53 치료요법의 세포상해효과(cytotoxic effect)를 상기에 기술하였다. Tu-138 세포주 내생적으로 돌연변이된 p53 유전자를 가지며 MDA 686-LN 세포주는 야생형 p53 유전자를 가진다. 이 실험으로 FLAG 서열을 삽입시킴으로써 AdCMV-p53 바이러스의 재조합 후에 효능의 차이가 있는 지를 결정하였다.
복제 결함 아데노바이러스로 감염된 세포는 모의 감염 세포와 유사한 성장 속도를 가졌다. 복제 결함 아데노바이러스에서 가벼운 세포상해효과가 나타날 수 있다(도 7a). 이와 반대로, AdCMV-p53 또는 AdCMV-p53-FLAG 중의 하나로 감염된 세포는 3일까지 실질적인 전체 종양 세포가 죽었다. 조직학적 검사는 세포소멸의 특성이고 AdCMV-p53으로 감염된 SCCHN 세포주에서의 세포 죽음의 메카니즘으로서, 특징화된 플라스마 멤브레인에 의한 수포 형성을 보여주었다(실시예 1). 상기에 나타낸 바와 같이, MDA 686-LN 세포주(야생형 p53)에 대해서 보다 Tu-138 세포주(돌연변이 p53)에 대해서 더욱 현저한 효과를 보였다. 성장 곡선 시험은 AdCMV-p53 및 AdCMV-p53-FLAG 바이러스의 효과 사이에 있어서 큰 변화 없이 3번의 실험을 반복하여 재현하였는데, 이는 세포 성장을 억제하는 p53의 능력에 FLAG 펩티드의 첨가가 영향을 미치는 않는다는 것을 시사한다.
아데노바이러스로 감염된 SCCHN 세포주의 면역조직화학적 염색. p53 및 p53-FLAG 단백질의 발현을 위하여, 표준 면역조직화학적 기술을 이용하여 감염된 세포 단층들이 비교되었다. p53 및 FLAG 단백질 모두 MDA 686-LN 세포주내에서 DL312로 감염된 세포의 모의 감염에서 명확하게 확인될 수 없었다. 그러나 돌연변이된 p53 유전자를 가진 Tu-138에서 p53을 위한 내생성 염색은 양성이었다. 세포가 AdCMV-p53 바이러스로 감염되었을 때, 강한 염색이 두 세포주 모두에서 나타났다. AdCMV-p53-FLAG 바이러스로 감염된 이들 세포의 가시적인 검사는 AdCMV-p53 바이러스로 감염된 세포와 비교하여 볼 때, 항체에 대한 PAb1801와 동일한 세기의 염색 및 양성 세포수를 보여주었다. AdCMV-p53-FLAG 바이러스로 감염된 세포도 역시 M2 FLAG 항체와 강한 면역조직화학적 양성을 보여주었다. 염색의 질은 다르더라도 둘다 핵내에 있으며 적은 정도는 세포질에 있었다.
인 비보 성장 억제. 108, 109및 1010플라크 형성 유니트(pfu)의 AdCMV-p53-FLAG 바이러스를 이용하여 PBS 또는 DL312 중의 하나인 대조군 플랩과 비교하는 용량 반응 실험은 Tu-138 세포주 상에서 실시예 1에 기술된 현미경적 모델 방법을 사용하여 실시되었다. 모의 감염에 대한 평균 종양 크기는 1205 +/- 205㎣이었다. 종양 크기는 분자적 개입에 사용되는 바이러스의 농도가 증가함에 따라 직선형태로 감소되었다. 108, 109및 1010pfu의 AdCMV-p53-FLAG 각각으로 처리된 플랩에 대한 평균 종양 크기는 637 +/- 113㎣, 392 +/- 109㎣, 및 193 +/- 74㎣이었다. 각 동물을 짝지워진 테스트를 이용하여 그 자체에 대하여 비교하고 109및 1010pfu로 처리된 플랩 사이를 제외하는 모든 비교에서 p<0.05에서 현저한 용량 반응 효과를 보여주었다. 확실히 바이러스의 양이 많을수록 종양 성장 저해가 많이 가시화되었다. 또 다른 실험에서 AdCMV-p53와 AdCMV-p53-FLAG의 효과가 비교되었다. 활성의 큰 차이점은 발견되지 않았다.
현미경적 잔여 질환 동물 모델에서의 외생성 종양 억제 효과에 대한 면역조직화학적 논증. AdCMV-p53 및 AdCMV-p53-FLAG의 인 비트로 및 인 비보 활성을 비교한 후에, 본 발명자들은 인 비보에서 p53-FLAG 융합 단백질 생성물을 논증하는 면역조직화학적 기술을 응용하였다. Tu-138 및 MDA 686-LN 세포주를 이용하여, 처리 48시간 후에 현미경적 잔여 질환 플랩을 수확, 포르말린에서 고정시키고 파라핀으로 포매시켰다. AdCMV-p53-FLAG 바이러스로 처리된 종양 세포의 이웃하는 섹션 상에서 p53 및 FLAG 단백질 모두에 대한 염색을 실시하였다. 염색 세기 및 양성으로 염색하는 세포의 수는 감염에 사용된 바이러스의 양에 직접 비례된다. 대조군은 MDA 686-LN 세포에서 p53 및 FLAG 항체 모두에 대하여 음성으로 염색된다. p53에 대한 내생성 염색은 Tu-138 종양 세포내에 현저하게 나타났다. 조직학적 표본이 헤마톡실린(Hematoxylin) 및 에오신(Eosin), p53 항체 및 FLAG 항체로 염색되었다. FLAG M2 항체로의 특징적인 세포질 염색은 p53 항체의 핵내 염색과 대조되었다. FLAG M2 항체가 파라핀으로 포매된 고정 조직 상에서 효과적으로 나타난 것은 처음이다. 염색으로 종양 억제 효과가 외생성 치료요법에 의한 것이고, 인 비보 모델내에서 응용 FLAG 시스템을 이용하여 외생성 치료요법을 확인할 수 있다는 것을 논증시켜 주었다.
결론적으로, 원하는 유전자요법과 함께 FLAG 단백질의 공동전달(co-delivery)은 유전자요법의 마커로서의 잠재적인 유용성을 제공한다는 것은 명백하다. 본 발명은 p53 유전자와 함께 동시에 촉진되며 메신저 RNA 및 단백질의 발현이 감소되지 않는다는 것을 명백하게 보여준다. 보다 중요하게는, 전달된 종양 억제물질의 생물학적 활성이 변하지 않는다. 처음에는 포르말린으로 고정되고 파라핀으로 포매된 조직 상에서 면역조직화학적 분석이 실시될 때, FLAG 항체가 효과적인 것으로 증명되었다. 이들 요인들은 다른 유전자요법 실험에서 추적자로서 이 신규한 단백질의 유용성을 시사한다.
실시예 5
p53-아데노바이러스를 이용한 머리 및 목의 편평상피암의 치료
환자 A
53세의 남성 환자로 머리에 수술불가능한 SCCHN 종양을 가지고 있다. 종양 매스의 직경은 약 6.5㎝이다. 골수 기능, 혈소판 수 및 신장 기능 검사 후에, 살균된 인산염 완충 생리식염수로 희석된 아데노바이러스-p53 발현 구조물의 108감염성 입자의 8회의 별개의 종양내 주사(총 부피 10㎖)에 의하여 1차 처리하였다. 3일마다 치료 횟수가 총 6회에 이르기까지 환자에게 동일한 치료를 하였다.
6회의 치료 3일 후에 종양을 검사하였고 그 직경이 > 4.0㎝으로 나타났다. 조직학적 검사는 종양 가장자리에서 상당한 세포 분절화가 일어난 것을 보여주었다. 종양의 직경이 > 2.0㎝이고 괴저된 후에 6회의 치료 중 2번째 과정이 실시되었다. 환자는 계속하여 3달동안 1주에 한 번 치료를 받았으며, 종양은 더 이상 분명히 나타나지 않았다.
환자 B
44세의 여성 환자로 목에 수술불가능한 SCCHN 종양을 가지고 있다. 종양 매스의 직경은 약 2.5㎝이다. 골수 기능, 혈소판 수 및 신장 기능 검사 후에, 살균된 인산염 완충 생리식염수로 희석된 아데노바이러스-p53 발현 구조물의 5×107감염성 입자의 3회의 별개의 종양내 주사(총 부피 3㎖)에 의하여 1차 처리하였다. 3일마다 치료 횟수가 총 6회에 이르기까지 환자에게 동일한 치료를 하였다.
6회의 치료 3일 후에, 종양을 절제시켰다. 종양 베드를 6㎖의 살균된 인산염 완충 생리식염수에서 60분동안 씻겼다. 접종물을 제거시키고, 상처를 봉하고, 유출관(drain)을 종양 베드에 남겼다. 수술 4, 7, 10 및 14일 후에, 살균된 인산염 완충 생리식염수로 희석된 아데노바이러스-p53 발현 구조물의 5×107감염성 입자(총 부피 3㎖)를 유출관을 통하여 주입시켰다. 종양 베드에 2시간동안 접촉시킨 후에, 접종물을 흡입하여 제거시켰다. 치료를 종결하고 6개월 후에 아무런 초기의, 국부 및 국부적인 종양이 발견되지 않았다.
실시예 6
진행 재발성 머리 및 목 편평상피암환자의 Ⅰ상 실험에서
아데노바이러스 벡터를 통한 야생형 p53 유전자 전이
정상 "야생형" p53 유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터는 생체검사로 머리 및 목의 편평상피암의 재발이 확인된 환자에서 대수적으로 증가하는 용량으로부터 유래되었다. 직접적인 종양의 주사는 2주 계속하여 매주 3회 실시되었다. 환자를 2그룹으로 추출하였다: 1) 절제가능한 재발성 질환, 2) 절제불가능한 재발성 질환.
절제가능한 질환 그룹으로 추출된 이들 환자들은 2주간에 걸친 6번째 유전자 전이 72시간 후에 그들의 재발성 종양의 전체적인 큰 절제 수술을 받았다. 아데노바이러스 벡터도 수술 중 및 역행하는 카테테르 주입을 통한 수술 과정 72시간 후에 전달되었다. 절제불가능한 환자들은 질환 환자의 실행 상태에서 질환의 진행 또는 퇴화가 관찰되기까지 2주의 사이클에 걸쳐서 매달 직접적인 종양의 투여를 통한 유전자 전이 시도를 반복하였다. 이 치료의 안정성은 정밀한 병원 검사, 유전자 전이의 효율을 평가하기 위한 생체검사, 세드(shed) 벡터를 위한 신체 유체 검사 및 검시 분석에 의하여 모니터되었다.
방법
실험 피검자. 이스턴 코오퍼러티브 온콜로지 그룹(Eastern Cooperative Oncology Group) 실행상태 2의 환자인 21명의 진행된 재발성 편평상피암환자를 절제가능한(그룹 1) 또는 절제불가능한(그룹 2) 재발성 악성 질병환자로 구성된 두 실험군 중 하나로 나누었다. 실험 피검자의 특성 및 아데노바이러스 벡터의 용량은 표 6 및 7에 각각 나타내었다. 모든 여성은 음성 임신 테스트를 받았고 모든 환자는 피임법을 사용하였다. 실험에 들어가기에 앞서 모든 환자들로부터 자세한 정보에 입각한 동의를 얻었다.
유전자 전이 벡터. 본 실험에서는 Ad5CMVp53로 기재된 인핸서 (시토메갈로바이러스)-프로모터를 가진 복제-결함 아데노바이러스 혈청형(serotype) 5 벡터를 사용하였다. 109내지 1011범위의 플라크-형성 유니트(PFU)를 가진 아데노바이러스 벡터 3벌은 Magenta, Inc. 및 Introgen Therapeutics, Inc.에 의해 실시된 우수한 제조 실험에서 생산되고 냉동으로(-70℃) 하여 텍사스 대학 M.D. 앤더슨 암센터(University of Texas, M.D. Anderson Cancer Center)에 보내졌다. 각 벌은 인 비트로 종양 세포 억제 성장 시험 뿐만 아니라 웨스턴 블롯팅을 유용하게 하는 형질전환에 효과적이었다. 벡터를 녹이고 유전자 전이 바로 전에 인산염-완충 생리식염수(비이클)로 희석시키고 4℃의 방에서 환자에게 운반시켰다.
환자 특성
Pt. No. 나이 성 일차암 병리 p53유전자형 실패한 이전 요법 유전자전이 부위 실험수
1 31 F 입바닥 적당히분화. SCC MAA 수술,xrt,화학 얼굴 매스 1
2 58 M 후두 적당히 분화. SCC WT 수술,xrt 이하 매스, (submental mass)비인두(nasopharynx) 1
3 56 M 배상함요(Pyriform Sunus) 잘 분화되지 않음 MAA 수술,xrt 왼쪽 목 매스 2
4 42 F 설근 잘 분화되지 않음 SCC WT 수술,xrt 오른쪽 목 매스 2
5 71 M 알려지지 않음 잘 분화되지 않음 SCC WT 수술,xrt,화학 왼쪽 목 매스 1
6 43 M 경부,식도 잘 분화되지 않음 SCC MAA 수술,xrt,화학 주구 매스 (peristomal mass) 2
Pt. No. 나이 성 일차암 병리 p53유전자형 실패한 이전 요법 유전자전이 부위 실험수
7 63 M 편도선 적당히분화. SCC WT 수술,xrt,화학 왼쪽 목 매스 2
8 46 M 설근 적당히 분화. SCC MAA xrt, 화학 설근 1
9 57 M 후두 잘 분화됨.SCC WTT 수술,xrt 주구에 재발 2
10 58 M 후두 적당히 분화.SCC MAA 수술,xrt 하인두(Hypopharyngeal) 매스 1
11 46 M 설근 잘 분화되지 않음 SCC MAA xrt,화학 설근 1
12 57 F 입바닥 적당히 분화. SCC WT 수술,xrt 왼쪽 구후삼각(retromolar trigone) 2
Pt. No. 나이 성 일차암 병리 p53유전자형 실패한 이전 요법 유전자전이 부위 실험수
13 66 M 설근 적당히분화. SCC WT 수술,xrt, 후방 입의 혀 & 설근 2
14 48 F 입바닥 잘 분화되지않음. SCC WT 수술,xrt 입바닥 2
15 63 M 하악골 균조제(Mandible alveolar ridg) 적당히분화.SCC WT 수술,xrt,화학 얼굴 매스 2
16 76 F 후두 잘 분화되지 않음.SCC MAA xrt 상쇄골 매스(Supraclavicularmass) 1
17 56 M 후두 적당히 분화. SCC WT 수술,xrt,화학 설근, 편도와(tonsillar fossa) 2
Pt. No. 나이 성 일차암 병리 p53유전자형 실패한 이전 요법 유전자전이 부위 실험수
18 56 M 좌측 인두벽(pharyngeal wall) 적당히분화. SCC WT 화학 얼굴 목 매스 2
19 53 M 알려지지 않음 잘 분화되지 않음. SCC WT 수술,xrt, 화학 이하 매스 1
20 55 M 혀 잘 분화되지 않음.SCC WT 수술,xrt,화학 목 매스 2
21 66 M 설근 잘 분화됨.SCC WT 화학,xrt 목 매스 2
치료 중 혈청 또는 뇨에서의 벡터 복용 및 아데노바이러스 벡터 뉴클레오티드의 존재 및 부재
환자 PFU/전이 투여부피 유전자 전이 사이클 투여 부위
1 106 6cc 2 얼굴 매스
2 106 3cc 2 이하 매스, 신인두(neophrynx)
3 106 3cc, 4cc 1 왼쪽 목 매스
4 106 3cc, 5cc 1 + 3 오른쪽 목 매스
5 106 1.5cc 1 왼쪽 목 매스
6 106 3cc 1 주구 매스
7 107 2cc 4 + 2 왼쪽 목 매스
8 107 3cc 1 설근 매스
9 107 1.5cc 1 주구 재발
10 108 1.5cc 1 하인두 매스
11 108 3cc 1 설근
12 108 1.5cc 3 왼쪽 구후삼각
13 109 1.5cc 6 좌후방 혀 및 설근
14 109 1.5cc 1 + 1 입바닥
15 109 3cc 1 왼쪽 얼굴 매스
16 109 1.5cc 1 왼쪽 상쇄골 매스
17 109 1.5cc 1 설근, 편도와
18 109 3cc 4 왼쪽 얼굴 매스
19 109.5 1.5cc 1 이하 매스
20 109.5 3cc 3 왼쪽 목 매스
21 109.5 1.5cc 3 오른쪽 목 매스
용량. 아데노바이러스 벡터를 다섯 집단의 환자 각각에 대수적으로 증가시키는 용량으로 투여시켰다. 이전에 투여하여 치료한 환자를 2주동안 관찰한 후에 용량을 증가시켰다. 처음 6명의 환자에 대한 연구에 착수한 후에, 3명의 환자들은 희생되었던 절제가능하거나 절제불가능한 그룹에 관계 없는 각 용량 수준으로 시작하였다. 생물학적 벡터의 용량은 총 용량(플라크-형성 유니트로)으로 처방되었다. 악성 상피세포 당 투여된 견적 벡터수에 접근하지 않았다. 투여되는 총 부피는 표 7에 나타내었다. 고형의 악성 질병으로 주입된 아데노바이러스 벡터의 부피는 임상적 및 방사선 사진술 견적 종양 부피에 의하여 결정되었다. 벡터를 직접적인 시야 및 수동의 촉진하에서 재발된 편평상피암으로 주입시켰다. 주사는 집단을 가로질러 1센티미터의 증가분으로 하였다. 유전자 전이 후에, 피검체를 적어도 1-½시간동안 정밀하게 관찰하였다. 벡터의 최종적인 유전자 전이 후에 72시간동안 호흡 및 전신 분비물의 분리를 유지시켰다.
벡터의 검출. 소변 및 혈청 시료는 벡터에 특이적인 아데노바이러스의 E1b 영역 및 야생형 p53 유전자의 5' 말단을 증폭시키는 프라이머를 사용하는 폴리머라제 체인 리액션(PCR) 뿐만 아니라 293 세포의 바이러스 배양을 유용하게 하는 산재성 아데노바이러스 벡터를 위하여 모니터되었다. 그리고 나서 PCR 생성물을 특이적으로 검증할 뿐만 아니라 1-5 바이러스 입자에 대한 바이러스 검출을 향상시키기 위하여 PCR 생성물을 서던 전이시켰다. 양성 및 음성 대조군을 각 반응에서 검사하였다.
안전성. 징후, 생명징후, 혈구수가 모니터되고, 환자들은 물리적으로 검사되고 매일 사진술을 이용하여 기록되었다. 흉곽 방사선 사진술, 혈액 화학 테스트, 및 동작상태 분석이 각 치료 사이클을 시작할 때에 실시하였다. 아데노바이러스 항체의 혈청 역가를 유전자 전이의 각 사이클의 전 후에 측정하였다. 첫 사이클의 6번째 유전자 전이 3일 후에 종양 검시(또는 수술 절제)를 하였다. 표본은 매 단계에서 포르말린으로 고정된 표분 뿐만 아니라 스냅-동결, 병리적으로 포매된 표본으로 저장되었다.
혈청 또는 소변으로부터 핵산의 추출. Ad5CMV-p53 아데노바이러스 DNA가 컨닝햄 등(Cunningham et al., 1995)에 의하여 수정된 방법으로 혈청 또는 소변의 0.5㎖의 수적으로부터 추출되었다. 간단하게 말하면, 증류수를 첨가하여 1㎖로 만들고 그들을 30% 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 침전시켰다. SDS 단독으로는 그 입자로부터 바이러스 DNA를 방출시키는 것이 충분하지 않기 때문에, 프로테인아제 K를 PEG 침전 후에 50℃에서 2-16시간동안 SDS에 첨가시켰다(Norder et al., 1990). 시료를 페놀로 추출시키고 바이러스 DNA를 글리코겐의 존재하에서 에탄올로 침전시켰다(Cunningham et al., 1995). 침전된 DNA를 4℃에서 10분동안 14000g에서 원심분리시킴으로서 회수하고, 0.3㎖의 증류수에서 재현탁시키고 에탄올로 재침전시켰다. DNA 펠렛을 70% 에탄올로 씻어내고, 진공-건조시키고 10㎕의 증류수에서 용해시켰다. 시료를 즉시 분석하거나 사용될 때까지 -20에 저장시켰다. 표본의 가능한 상호오염을 방지하기 위하여 핵산의 추출은 생물학적 안전성 캐비넷 후드에서 실시되었다.
혈청 시료로부터 분리된 DNA 상의 PCR 반응. 프라이머는 아데노바이러스 벡터로부터의 p53 유전자의 특이적인 증폭을 위하여 디자인되었다. 상위 프라이머 (5'-CACTGCCCAACAACACCA-3', SEQ ID NO:5)는 p53 유전자의 3' 말단에 해당하고, 하위 프라이머(5'-GCCACGCCCACACATTT-3' SEQ ID NO:6)는 아데노바이러스 5형의 E1B 영역(야생형 서열의 뉴클레오티드 3517 내지 3533)에 해당한다. 각 PCR 반응 튜브는 각 올리고뉴클레오티드 0.2mM, 0.4mM dNTPs, 1X TaqPlus Long 저염 버퍼(Stratagene), 0.6㎕ TaqPlus Long(5U/㎖)(Stratagene), 및 5㎕의 테스트 DNA를 포함한다. 시료를 3단계 프로필: 93℃에서 30초, 65℃에서 45초 및 72℃에서 45초동안 총 30 또는 35사이클 후에 93℃에서 3분동안으로 프로그램된 MJ 리서치 펠티어 열사이클러(Research Peltier Thermal Cycler, PTCc-200)에 두었다. 6X 로딩 버퍼(0.25% 브로모페놀 블루, 0.25% 크실렌 시아놀 FF 및 물내의 15% 피콜(400형; Pharmacia)) 5㎕를 PCR 실험 끝에 각 튜브에 첨가시키고 1% 아가로즈, 에티듐 브로마이드(.6㎍/㎖)를 포함하는 1X TBE 겔상에서 로딩시켰다. 시료를 100V에서 1-1.5시간동안 전기영동시키고 나서 UV광 하에서 사진을 찍었다.
폴리머라제 체인 리액션(PCR). 단지 5㎕의 제조된 DNA만 한 번의 폴리머라제 체인 리액션에 사용될 수 있다. 혈청에 대하여, PCR은 2mM의 MgCl2, 50mM의 KCl, 0.1% Triton X-100, 각각 200μM의 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트(dNTP), 10mM의 Tris-HCl(pH 9.0), 각각 5μM의 프라이머, 그리고 1.7유니트의 Taq DNA 폴리머라제(Promega)를 함유하는 20㎕ 체적으로 실행된다. 상기 반응은 94℃에서 30초간, 58℃에서 30초간, 58℃에서 30초간, 그리고 72℃에서 60초간 35사이클이 실행된 후, 72℃에서 10분간 연장이 실시되었다. PCR 프라이머는 센스프라이머(sense primer)가 p53 cDNA(5'-GCCTGTCCTGGGAGAGACCG-3', SEQ ID NO:7)의 3'단에 위치한 상태에서 Ad5CMV-p53의 서열로부터 선택되었고, 안티센스 프라이머는 아데노바이러스 타입 5(5'-CCCTTAAGCCACGCCCACAC-3', SEQ ID NO:8)의 EIB 영역으로부터 선택되었다. PCR 산물(838-bp 단편)은 1%의 아가로즈겔 상에서 분리되었다. 동일한 PCR 산물을 pCR-Script 벡터(Stratagene)내에서 서브클론하고, 시퀀싱하고, 정제된 겔 인서트를 PCR산물을 검출하는 프루브로 사용하였다. 소변에 대하여, PCR은 2mM의 MgSO4, 10mM의 (NH4)2SO4, 10mM의 KCl, 0.1%의 Triton X-100, 20mM의 Tris-HCl(pH 8.8), 0.1㎎/㎖의 소 혈청 알부민, 각각 200μM의 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트(dNT P), 각각 5μM의 프라이머, 그리고 2.5유니트의 TaqPlus long DNA 폴리머라제(Stratagene)를 함유하는 20㎕ 체적으로 실행되었다. 상기 반응은 93℃에서 60초간, 다음에 93℃에서 30초간, 65℃에서 45초간, 그리고 72℃에서 45초간 35사이클이 실행된 후, 72℃에서 10분간 연장이 실시되었다. 상기 PCR 프라이머는 센서 프라이머가 p53 cDNA(5'-CACTGCCCAACAACACCA-3', SEQ ID NO:9)의 3'단에 위치한 상태에서 Ad5CMV-p53의 서열로부터 선택되었고, 안티센스프라이머는 아데노바이러스 타입 5(5'-GCCACGCCCACACATTT-3', SEQ ID NO:10)의 EIB 영역으로부터 선택되었다. PCR 산물(724-bp 단편)은 1% 아가로즈겔 상에서 분리되었다.
서던 블롯(Southern Blot) 분석. PCR 산물의 특이성을 입증하기 위해 사용되는 서던 블롯에서, 겔 중에 있는 DNA는 변성되고 모세관흡수에 의해 나일론 멤브레인(하이본드-N+, Amersham사)에 블로팅하기 전에 중화되었다. 상기 멤브레인은 Rapid-hyb버퍼(Amersham사)중 65℃에서 15분간 예비혼성(prehybridize)시키고, 32P-labeled 프루브를 포함하는 동일한 버퍼 중에 1∼2시간동안 혼성시켰다. 상기 멤브레인을 실온의 0.1 x SSC 및 0.1% SDS 중에서 2회 세척하고, 65℃에서 다시 2회 세척(1회 세척당 15분)하였다. 세척된 멤브레인을 강화스크린을 사용하여 -70℃에서 1∼16시간동안 x선 필름에 노출시켰다.
시료의 대조군 및 평점(scoring). 이하의 대조군은 모든 시료의 배치(batch)마다에 포함되었다. DNA 분리단계에서, 2개의 "음성" 혈청 대조군(Introgen 직원들로부터 수집 및 분리된 혈청)과, 10pfu 또는 100pfu의 AdCMV-p53 바이러스를 가한 음성 혈청으로 이루어진 2개의 양성 혈청이 사용되었다. 이것은 10(및 100)pfu 대조군이 양성 민감성의 윈도우를 얻기 위해 실행되었으나, 음성 대조군은 음성이었다. 음성 대조군이 양성인 경우는, 상기 PCR은 30사이클만 반복되었다. 10pfu 대조군이 음성인 경우는, DNA를 추가의 에탄올침전으로써 더 정제하고, PCR을 반복하였다. 상기 두 가지 단계는 적절한 민감성 윈도우에 항상 실험상의 변수를 제공하였다.
상기 PCR 단계에서, 1ng의 AdCMV-p53 DNA(임상용 로트에서 분리한 것)의 양성 대조군과 음성(H2O)대조군이 사용되었다. 상기 대조군중의 어느 하나라도 잘못된 경우 상기 배치의 PCR은 반복되었다. 실패한 음성 대조군은 없었다.
추정의 양성을 확인하기 위해서, 상기 DNA를 혈청으로부터 재분리하고(여러 개의 일시적 인접시료와 함께), 이 DNA의 PCR을 반복하였다. 시료들은 상기 결과가 재현될 수 있을 경우에 한하여 양성으로 평가되었다. 2개의 시료분석중 하나에서 양성인 시료들은 보고목적으로 음성으로 간주되었다. 재현될 수 없는(더 이상의 미처리 표본이 부족하기 때문) 추정상의 양성은 데이터베이스로부터 제외되었다.
유전자 전이의 유효성측정. 수술적으로 제거된 조직표본을 저온병에 넣고 즉시 급냉한 후, 사용할 때까지 액화질소저장조에 보관하였다. 냉동시료는 액화질소중에 담가 예냉시킨 스텐레스제 베스만(Bessman) 티슈 펄버라이저(미국 텍사스 휴스턴소재 Spectrum사제)의 오리피스로 분액하였다. 시료는 철제해머로 베스만 절구공이에 5∼10회 두드려서 미분말로 만들었다. 분말화된 조직은 조직 50mg당 1㎖의 TRI 시약(미국 오하이오주 신시내티소재 Molecular Research사제)을 함유하는 유리로 된 조직균질화제(미국 팬실바니아주 피츠버그소재 Fisher Scientific사제)에 옮기고, 테플론 절구공이로 5∼10회 상하 스트로크로 균질화하였다.
균질화 후, RNA는 TRI시약에 제공된 지시에 따라 분리되었다. 요약하면, 균질화물은 폴리프로필렌 원심분리관(Molecular Research사제)에 옮겨져서 실온에서 5분간 방치된 후 클로로폼(TRI시약 1㎖당 0.2㎖)을 가한다. 다음에, 시료는 격렬히 혼합되고, 실온에서 15분간 추가로 배양되고, 4℃에서 15분간 12,000 ×g 에서 원심분리하여 페놀-클로로포름 상으로부터 수층을 함유하는 RNA를 분리하였다. 그 수층에 이소프로판올을 가하고, 실온에서 15분간 배양하여 RNA를 침전시켰다. 4℃에서 15분동안 12,000×g에서 원심분리하여 RNA 펠렛을 회수하고, 75% 에탄올로 세척하고, 공기로 건조 후 디에틸 파이로카보네이트(DEPC)-처리된 물에 녹이고, 260㎚에서 흡수를 측정하여 정량하였다. DNA의 오염물은 총 반응용량 260㎕로 60 U DNase I(미국 뉴저지주 피스캐터웨이소재 Pharmacia사제)로 37℃에서 25분간 50㎍까지의 RNA로 배양하여 제거하였다. 다음에 RNA는 페놀:클로로포름으로 추출하고, 에탄올로 침전시킨 후, 75% 에탄올로 1회 세척하고, 4℃에 15분간 마이크로퓨지(microfuge)에서 최대속도로 원심분리하여 펠렛화시키고, 공기 건조하고, DEPC-물 중에 다시 현탁시키고, -80℃에서 저장하였다. 시료를 통상적인 비변성인 0.8% 아가로즈겔 상에 시료를 보내고, 에티듐 브롬화물 스테이닝에 의해 28S 및 18S 리보솜 밴드를 가시화하여 RNA의 질을 평가하였다. 시료들 사이의 교차 오염을 배제하고 RNase 활성을 최소화하기 위해, RNA 분리에 사용되는 모든 재사용 기구는 2%의 Liqui-Nox(Fisher Scientific사제) 세척용액에 5분간 침적시키고, 찌꺼기를 없애고, 10% 표백제에 3분간 옮긴 후 순수로 철저히 세척하고, 100% 에탄올을 분무하여, 건조하고, 클로로포름 중에 침지하고, 사용하기 전에 다시 한번 건조하였다.
111ng의 임의 헥사머(뉴욕 그랜드아일랜드소재 Gibco BRL사)와 40유니트의 RNase 억제제(인디아나폴리스 소재 Boehringer Mannheim사제), 0.4mM의 dNTP(캘리포니아주 포스터시소재 Perkin Elmer사제)와, 1xRT 버퍼(50mM의 Tris pH 8.3, 75mM의 염화캄륨, 3mM 염화마그네슘, 20mM의 디티오트레이톨)중에 300유니트의 Supercript Ⅱ RNase H- 역트랜스크립타제(Gibco BRL)를 함유하는 반응혼합물 23.5㎕중에 1.5㎍의 총 세포질 DNA를 사용하여 역전사(reverse transcription)를 실시하였다. RNA와 임의 헥사머를 70℃에서 10분간 가열하고, 얼음으로 냉각 후, 반응혼합물의 잔량을 가하였다. 반응물을 200유니트의 역전사제(reverse transcriptase)와 함께 25℃에서 5분간 배양하고, 100유니트의 역전사제를 추가한 후 다시 25℃에서 10분간 배양하여 프라이머 어닐링을 촉진하고 42℃에서 50분간 배양하였다. 상기 RT반응은 70℃에서 15분간 가열하여 역전사제를 비활성화함으로써 종료되었다. cDNA에 보완적인 RNA는 1유니트의 RNase H(Boehringer Mannheim)를 사용하여 37℃에서 20분간 동화시킴으로써 제거하였다. 재조합형 아데노바이러스 Ad5CMB-p53(100:1의 다중감염)에 감염된 머리와 목 편평상피암(HNSCC) 라인 TU167로부터의 RNA를 바이러스 복사된 p53을 검출하는 양성 대조군으로 사용하였고, p53 전사를 함유하지 않은 다양한 아데노바이러스 벡터 d1312(1)에 감염된 TU167 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
Ad5CMB-p53 전사를 검출하기 위해, 0.2mM의 각 NT P, 1.5mM의 염화마그네슘, 1유니트의 taq 폴리머라제(위스콘신주 매디슨소재 Promega사) 및 1xPCR 버퍼(50mM 염화칼륨, 10mM의 Tris pH 9.0, 0.1%의 Triton X-100)중에 있는 0.5mM의 각각의 프라이머 CMV2(5'-GGTGCATTGGAACGCGGATT, SEQ ID NO: 11) 및 P53EX3 (5'GGGGACAGAACGTTGTTTTC, SEQ ID NO: 12)를 함유하는 30μl의 반응체적 중에서 PCR을 실시하였다. 프라이머 CMV2 및 P53EX3은 아데노바이러스 유도 p53전사에 특이적인 295-베이스 단편을 증폭한다. Ad5CMB-p53 전사를 검출하기 위한 PCR조건은 다음과 같았다:
94℃에서 1분간경과 후, 94℃에서 30초, 58℃에서 40초, 70℃에서 1분간 35사이클, 그리고 70℃에서 10분간 연장.
PCR이 실시되는 동안 증폭된 산물이 mRNA를 검출하고 RNA 제조에서 DNA를 오염하지 않았음을 확인하기 위해서, PCR은 또한 역전사제가 첨가되지 않은 병행반응으로부터의 RT산물을 사용하여 실시되었다.
RT반응의 완전함을 검사하기 위해, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로제나제(GAPDH)에 대해 특정적인 RT-PCR이 실시되었다. RT반응의 3μl 체적을 0.2mM의 각각의 DNTP, 2mM의 염화마그네슘, 1유니트의 taq 폴리머라제 및 0.5mM의 각각의 프라이머 GAPDHI(5' ACGGATTTGGTCGTATTGGG, SEQ ID NO:13) 및 GAPDH2(5' TGATTTTGGAGGGATCTCGC, SEQ ID NO:14)을 함유하는 30μl의 PCR혼합물을 1 x PCR 버퍼 중에 희석하였다. 상기 GAPDH 프라이머는 사람의 GAPDH 유전자내에 3 엑손(exon)에 이르고 mRNA에 대하여 특이한 231-베이스 산물을 증폭한다. GAPDH를 검출하기 위한 PCR조건은 다음과 같았다:
94℃에서 1분간경과 후, 94℃에서 30초, 60℃에서 12초, 72℃에서 1분간 35사이클, 그리고 72℃에서 7분간 연장.
PCR은 Perkin Elmer Gene Amp 9600을 사용하여 실시되었고, 모든 프라이머는 상업적으로 합성된 것이었다(텍사스 우드랜드소재 Genosys사제).
종양내 유전자의 면역조직화학적 정량. 포르말린-고정, 파라핀-삽입된 조직상에서 아비딘-비오틴-과산화효소 복합체(ABC)방법(1)을 사용하여 면역과산화효소 연구를 행하였다. 표본은 3∼4㎛ 두께로 절단하고, 자일렌중에서 탈파라핀화하고, 하강등급(100-70%)의 에탄올 중에서 재수화시켰다. 내생성 과산화효소활성을 메탄올중의 3% 과산화수소로 차단하였다. 증류수 및 포스페이트를 버퍼로 한 염수(PBS)로 수차례 세척한 후, 배경염색을 최소화하기 위해 정상 말혈청의 1:10 희석액을 사용하여 조직을 배양하였다. 이어서, p53(뉴욕주 유니온데일소재 Oncogene Science, Inc.사 DO-1 1:80 희석액) 및 p21(Oncogene Science, Inc., 1:100)에 대한 단클론성 항체를 사용하여 4℃에서 철야 배양하였다. 과산화효소 염색공정을 ABC 엘리트 키트(캘리포니아주 벌링게임소재, Vector Laboratories사제)를 사용하여 행하였다. 면역염색반응은 0.05% 3.3'-디아미노벤지덴을 사용하여 pH 7.6, 0.01% 과산화수소를 함유하는 Tris-HCl 버퍼 중에서 가시화되었다. 섹션은 0.01% 톨루이딘 블루를 사용하여 대비염색되고 퍼마운트내에 장입되었다. 10개의 연속하는 하이파우어 필드의 200세포내의 양성 핵염색을 카운트함으로써 2회의 독립적인 관찰로 평점을 실시하였다.
DNA 분절화에 대한 TUNEL 정량. ApoptagTMPLUS kit(매리랜드주 헤이터스버그소재 Oncor사제)를 사용하여 제조사가 제공한 지침에 따라 TUNEL 정량을 실시하였다. 슬라이드는 0.4% 메텔렌 그린을 사용하여 대비염색되었다. 대응하는 헤마톡실린 및 에오신 염색된 슬라이드를 염증성세포 침윤물의 존재여부에 대해 평가하고 1∼4의 스케일로 등급을 매겼다.
세포변성효과 정량순서. 또한 환자의 소변시료도, 시료중의 어떤 바이러스라도 수용세포 단층(monolayer)을 감염시키는 Ad5p53의 존재를 정량에 의해 모니터하였다. 이들 세포는 세포변성효과(CPE)의 발현에 대해 모니터되었다: 즉, 세포를 포획하여 표면으로부터 분리하였다. CPE에 대하여 정량된 환자의 소변시료는 제1 치료과정의 제2주중, 그리고 제0일 또는 제1일(전처리)에 수집한 아침 첫소변으로 하였다. 각각 약 15㎖의 시료를 15㎖의 원추형 멸균튜브내에 -80℃ 하에 사용할 때까지 저장하였다. 이 정량에서 수용 세포 단층을 형성하는 IT293 세포를 37℃의 가습한 10% CO2배양기내에서 DMEM 플러스 10% RBS에 유지시켰다. 환자시료를 테스트하기 2일전에, 상기 세포를 12-웰 플레이트의 웰 당 2 x 105에 놓았다.
정량할 때, 소변시료를 얼음통에서 해동하고, 일정부분을 DMEM을 가하여 1:1 혼합한 후 0.22㎛ 시린지 여과기를 사용하여 멸균여과하였다. 이 1:1 혼합물의 350㎕ 부분을 성장배지를 제거한 후, 각 웰에 천천히 가하였다. 상기 플레이트를 15분 후 부드럽게 흔들어 주었다. 30분 후, 2.0mis의 DMEM 플러스 10% FBS를 각 웰에 가하여 시료를 희석하였다. 정량 후 제3일차(72시간 후) 및 6일차에, 새 배지의 0.5㎖ 부분을 각 웰에 첨가하여, 최대 6∼7일동안 세포단층의 유지를 보조하였다.
환자의 시료는 3중으로 정량하였다. 희석된 전처리 시료는 그 자체로 정량하고, 또한 웰당 105pfu의 Ad5p53으로 스파이크하여 본 순서에 의한 바이러스의 검출에 장애가 될 수 있는 어떠한 소변성분도 검출하였다. 대조군 웰을 DMEM 만으로 웰당 105, 104, 103, 102, 또는 101pfu로 스파이크한 DMEM만으로 각각 2중으로 접종하였다. 105pfu 스파이크가 이러한 조건하에 정량 제2일차에 CPE를 야기하였다; 후속하는 각각의 일자에 그 다음 스파이크 대조군이 CPE를 나타낼 것이다. 따라서, 각 환자시료에서 CPE가 검출되는 시간은 그 시료에서의 Ad5p53 수준을 나타낸다.
재조합성분 아데노바이러스. 임상시험에 사용된 아데노바이러스형 p53을 Microbiological Associates, Inc.(매릴랜드 록빌소재)사의 생물공학 서비스부에 의한 A549 세포를 사용하여 RCA의 존재를 검사하였다.
통계적 분석. 싱글암(single-arm) 스터디 설계가 사용되었다. 과도한 독성의 시험상 필요로 하는 이상의 환자를 등록하는 것을 방지하기 위해, Bayesian 조기정지법이 실시되었다. 처리전 후의 TUNEL 및 면역조직화학적 염색을 나타내는 세포의 퍼센트 사이의 비교를 위해 WILCOXON 표시 등급시험 및 위탁시험이 사용되었다. Survpac SPSS-통계적 패키지를 사용하여 통계적 분석을 실시하였다.
응답 및 독성. 본 임시분석을 통해 생존 및 응답을 평가하였으나, 본 분석의 목적으로 간주되지는 않았다. 이 임시분석을 유전자전이 계획의 형질도입잠재성을 판정하기 위한 것이었다. 환자들은 유전자전이 1사이클 후 30일 관찰을 거쳐 응답 및 독성에 대하여 평가되었다. 치료의 독성효과는 국립암학회의 공통독성기준에 따라 평가되었다(Xref.). 치료에 대한 응답은 각각의 치료과정 이전에 CT 스캔 또는 목의 초음파에 의해 평가되었다. 환자들이 최소한 하나의 치료과정을 받은 경우, 이어서 적절한 응답의 문서화에 의해 응답에 대하여 평가하였다. 재발성 종양의 외과적 절제술을 받는 환자들은 외과술이 관찰기간 30일 전에 실시되기 때문에 응답에 대한 평가를 할 수 없었다. 모든 CT 스캔은 방사선의(放射線醫) 및 초음파에 의해 평가되었다. 측정가능한 종양의 산물의 직경합이 50% 이상 감소한 것을 부분응답으로 정의하였다; 측정가능한 손상부의 산물의 직경 합이 25% 내지 50%까지를 소응답으로 정의하였다. 산물직경의 합의 25% 이상의 증가를 질환의 진전으로 정의하였다.
생존기간은 프로토콜 유입시로부터 만료시까지 측정되었다. 각 환자의 응답은 머리 및 목 외과종양학자, 방사선의, 그리고 내과종양학자로 구성된 데이터관리위원회에 의해 검토되었다.
결과
벡터의 검출. 아데노바이러스성 벡터 DNA는 혈청과 유전자전이 후 48시간까지 경과한 환자의 소변시료중의 PCR에 의해 검출되었다. 벡터에 대한 검출한계는 1∼5 바이러스성 입자이다. 각 바이러스 투여량에서 유전자전이를 겪는 환자들 중의 소변에서 바이러스성 DNA를 분리하였으나, 유전자전이에 이어 48시간 경과후에는 검출되지 않았다. 바이러스성 DNA의 혈청검출은 107PFU 이상으로 바이러스 투여량을 증가함에 따라 증가하였으나, 마찬가지로 유전자전이에 이어 48시간에는 검출되지 않았다.
소변시료는 우선 감염성 바이러스에 대하여 분석하고, PCR 뉴클레오타이드 분석이전에 세포단층상의 CPE를 측정하였다. 소변 중에 존재하는 바이러스는 페트리디쉬로부터 라운드업 및 적응된 세포로 관착되는 CPE를 모니터하기 위해, 앞에서 설명한 293 세포에 적용되었다. 표본 중에서는 CPE가 거의 식별되지 않았다. CP E는 중첩된 배양균중에서 후에(6일 이상) 발견되고, 이 결과는 확실치 않은 것으로 간주되었다. 어떠한 경우에도 CPE는 검출된 아데노바이러스성 뉴클레오타이드를 위한 동일한 소변시료의 PCR 및 서던블롯 전이에 의해 확인되지 못하였다.
다른 기관계의 바이러스성 DNA 분석. PCR 분석은 조직간 교차오염을 막기 위해 주의 깊게 채취된 스냅 냉동 검시표본 상태로 피부, 심근, 폐 및 고환조직에서의 109Ad5CMVp53 유전자전이 후 2개월 이상인 바이러스성 DNA를 나타냈다. 신장의 편평조직, 부신 및 췌장조직은 이 벡터에 특정적인 바이러스성 DNA 서열을 나타내지 않았다. 이러한 검시표본의 면역조직학적 분석은 야생형 p53 단백질산물의 과다발현의 증거를 나타내지 않았다.
유전자전이의 평가. 모든 분석은 조직이 벡터에 노출된 후 최소한 1시간 경과후 실시되었다. mRNA 산물은 RT-PCR을 거쳐 4시간 및 48시간에 검출되었다. 대조적으로, 1시간 이내의 노출 후 냉동시킨 생체검사표본은 p53 mRNA를 나타내지 않았다. 추가로, 유전자전이가 되지 않은 수술부위로부터 취한 음성 대조군시료도 PCR 산물에 대해 음성을 나타냈다. 4명의 환자로부터의 비형질도입 및 형질도입 생체검사표본을 Ad5CMVp53 전사된 mRNA의 존재에 대하여 RT-PCR로 분석하였다. 2명의 환자로부터의 형질도입표본은 에틸브로마이드(EtBr)염색 겔상에서 양성이었으나, Ad5CMVp53 산물은, GAPDH는 모든 표본에서 확장될 수 있다는 사실에도 불구하고, 어떠한 비형질도입 표본에서도 검출되지 않았다. 2명의 양성환자로부터의 295bp PCR 산물의 특성은 서던 블로팅에 의해 확인되었다. RT반응으로부터 역 전사가 생략될 때 PCR 산물은 관찰되지 않으므로, 수치상으로 검출된 295bp 산물은 오염 DNA보다는 mRNA로부터 생성되었어야 했다.
면역조직화학적 분석. 모든 환자의 예비 및 사후 유전자전이 표본은 각 실험에서 양성 및 음성 대조군과 함께 동시에 분석되었다. 각 표본의 다중섹션이 분석되고, 헤마톡실린 및 에오신염색 그리고 TDT 말단표시(end-labeled) 표본과 비교되었다. 포스트벡터 인젝션 생체검사표본은, 예비전이 생체검사표본이 내생적으로 과다발현된 p53 단백질을 나타내지 않은 3명의 환자에서 유전자전이를 확인해 주었다. 21명중 5명의 환자(27%)에서, p21(CIP/WAF1)은 별로 내생적으로 발현되지 않았다; 이것은 환자 사후 유전자전이 생체검사표본에서의 유전자전이에 대하여 유익한 것으로 입증되었다. 또한 p53 뉴클리어 단백질 과발현이, 기질성 종양세포 뿐 아니라 종양관련 임파구에서 관찰되었는데, 이는 또한 비종양성 세포 형질도입을 가리키는 것이다.
혈청항체 응답. 벡터를 반복적으로 인젝션한 후, 아데노바이러스 혈청형 5 항체를 모든 환자에게 유발시켰다. 그러나, 형질도입효율은 초기의 유전자전이 사이클 및 그 뒤의 사이클에 비교하여 현저한 변화는 발견되지 않았다. 3 x 109PFU에서 심하지 않은 종양 인젝션위치의 홍반이 시작되는 것으로 확인되었으나, 이러한 국부적 반응이 벡터 내성을 제한하는 것은 아니었다. 109PFU 처리환자에서 6개월간의 계속적인 바이러스의 반복투여에도 불구하고 어떠한 환자에게서도 전신의 과민성을 입증할 만한 것이 발견되지 않았다.
병리학적 관찰. 대부분의 생체검사표본에서 니들트랙이 확인되었고, 유전자산물 발현이 인젝션위치를 벗어나서 더 깊은 조직내에 나타났다. 유사하게, 형질도입 영역내의 말단표시 세포에서 발견된 사실들은 종양세포에서의 세포소멸의 유발을 암시하나 기질세포 또는 염증세포에서는 세포소멸이 없음을 의미한다. 염증세포가 환자들에게서 발견되었고 109PFU 이상의 투여량을 수용한 환자들 중에서 현저한 조직학적 발견이 되었다. 흥미로운 것은, 환자번호 7, 즉 시료가 내생성 야생형 p53을 발현한 환자가, 1사이클의 유전자전이 후에 재발성 2㎝ 목의 연속적으로 채취한 외과술표본에서 생존가능한 종양의 흔적 없이 출혈성 괴사를 나타냈다. 세포소멸유도 뿐 아니라 괴사의 병리학적 발견이 표본에서 흔히 관찰되었다.
임상적 관찰. 환자들은 가장 흔한 부작용으로 인젝션위치의 불편이었고, 벡터의 직접 종양성 인젝션에 내성을 보였다. 국부적 인젝션위치 홍반의 증거가 109PFU의 벡터에서 관찰되었고, 전신성 항체 역가 증가가 입증되었지만, 과민성반응의 더 높은 전신성 증거는 보이지 않았다. 환자번호 5, 10 및 16은 7개월간 추적에서 중동맥에서 질환의 징표 없이 유지되었다. 환자 7 및 13은 지표 병발영역에서 각각 3개월 및 5개월동안 안정적인 질환을 나타냈다. 환자번호 20은 CAT 스캔 및 초음파에 의해 입증된 바와 같이 부분응답을 나타냈으나, 질환의 진행으로 인하여 연구에서 제외될 필요가 있는 척수 및 흉막전이로 발전하였다.
결론적으로, 머리 및 목의 재발성 편평상피암종이 있는 환자들에서, 아데노바이러스성으로 전달된 야생형 p53의 유전자전이는 안전하고, 직접 종양성인젝션 또는 벡터의 수술성 점적에 의해 효과적으로 암세포 및 정상세포의 형질도입이 가능하다. 벡터투약 또는 투여량증가를 제한할 수 있는 독성을 나타낸 환자는 없었다. 트랜스진(transgene) 산물발현은 전신항체응답의 발전에도 불구하고 변함이 없었다. 절제된 종양표본내에서 병리학적으로 발견된 국부적 염증성 반응이, 사실상, 유익할 수 있다.
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전형적인 절차상 또는 여기에 제시된 것에 보충적인 다른 세부 사항을 제공하는 정도로 하여 하기한 문헌을 참고로 여기에서 특히 제공한다.
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Claims (25)

  1. (a) 진핵세포에서 기능적인 프로모터, p53을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 구조물을 제공하는 공정으로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 프로모터의 조절하에 그리고 이를 감지하게 위치시키는 공정; 및
    (b) 상기 발현 구조물을 인 비보에서 종양 세포와 접촉시키는 공정을;
    포함하는 악성 질병을 가진 피검체의 치료 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 편평상피세포암은 머리 및 목의 암종인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 종양 세포의 내생성 p53은 돌연변이된 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 종양 세포의 내생성 p53은 야생형인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 발현 구조물은 바이러스성 벡터인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 바이러스성 벡터는 레트로바이러스성 벡터, 아데노바이러스성 벡터 및 아데노-결합 바이러스성 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 바이러스성 벡터는 복제-결함 아데노바이러스성 벡터인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 복제-결함 아데노바이러스 벡터는 E1-영역의 적어도 한 부분이 부족한 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 프로모터는 CMV IE 프로모터인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 피검체는 인간인 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 (b) 공정은 적어도 한 번 반복되는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 종양은 반복된 접촉 후에 절제시키고, 부가의 접촉은 절제에 이어 이루어지는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 발현 벡터는 약 3㎖ 내지 약 10㎖의 부피내에서 접촉되는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 각 접촉시 투여된 아데노바이러스의 양은 약 107과 1012pfu의 사이인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 접촉은 종양내 주사에 의한 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 접촉은 자연 또는 인공 체강내로의 주사에 의한 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 주사는 상기 자연 또는 인공 체강의 연속적인 관류를 포함하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 접촉은 종양 절제로 생긴 인공 체강으로의 주사에 의한 방법.
  19. 제1항에 있어서, p53-엔코딩 폴리뉴클레오티드는 상기 발현 벡터로부터 p53의 발현이 검출될 수 있도록 표식된 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 표식은 연속적인 에피토프인 방법.
  21. (a) 설치류에 피하 조직으로 절개부를 제공하는 공정;
    (b) 상기 절개부에 종양 세포를 시딩하는 공정;
    (c) 상기 설치류를 치료 양생법으로 처리하는 공정; 및
    (d) 종양의 발전에 대한 상기 양생법의 효과를 평가하는 공정;
    을 포함하는 현미경적 잔여 암에 대한 치료요법의 유효성을 결정하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 절개부는 (b) 공정 후 및 (c) 공정 전에 밀봉되는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 치료 양생법은 상기 절개부로의 치료 조성물의 도입을 포함하고, 상기 절개부는 밀봉 후에 재개방되고 상기 치료 조성물의 도입 후에 재밀봉되는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 치료 조성물은 진핵세포에서 기능적인 프로모터, p53을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 구조물을 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 프로모터의 조절하에 그리고 이를 감지하게 위치되는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 발현 구조물은 복제-결함 아데노바이러스이고 상기 프로모터는 CMV IE 프로모터인 방법.
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