PL186018B1

PL186018B1 - Sposoby i kompozycje do diagnozowania i leczenia nowotworu

Info

Publication number: PL186018B1
Application number: PL96327009A
Authority: PL
Inventors: Gary L. Clayman
Original assignee: Regents Board Of
Priority date: 1995-11-30
Filing date: 1996-11-27
Publication date: 2003-09-30
Also published as: RU2174409C2; ES2264145T3; CA2238829A1; PL327009A1; SK70598A3; US20020077313A1; HUP9902068A2; CN1308450C; NO982481L; CZ296810B6; CN101028523A; WO1997020047A1; US20030166603A1; US20060035857A1; JP2000501394A; CZ165798A3; EP0863984A1; CN1207771A; KR19990071795A; AU1126397A

Abstract

1. Zastosowanie konstruktu ekspresyjnego obejmujacego promotor dzialajacy w komórkach eukariotycz- nych i polinukleotyd kodujacy p53, przy czym polinukleotyd jest ustawiony sensownie i znajduje sie pod kon- trola promotora, do wytwarzania leku do leczenia osobnika z nowotworem, charakteryzujacym sie ekspresja funkcjonalnej czasteczki p53, przez kontaktowanie leku z komórka nowotworowa in vivo. 2. Zastosowanie wedlug zastrz. 2, znamienne tym, ze nowotwór jest wybrany z grupy skladajacej sie z raka, glejaka, miesaka oraz czerniaka. 3. Zastosowanie wedlug zastrz. 1, znamienne tym, ze nowotwór jest rakiem plaskokomórkowym. 14. Zastosowanie konstruktu ekspresyjnego obejmujacego promotor dzialajacy w komórkach eukariotycz- nych i polinukleotyd kodujacy p53, przy czym polinukleotyd jest ustawiony sensownie i znajduje sie pod kon- trola promotora, do wytwarzania leku do terapii osobnika z nadajacym sie do resekcji nowotworem, charakte- ryzujacym sie ekspresja funkcjonalnej czasteczki p53, przez kontaktowanie leku z miejscem wyciecia guza. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Niniejsze zgłoszenie jest kontynuacją w części warunkowego zgłoszenia patentowego nr 60/007,810 zgłoszonego 30 listopada 1995. Cały tekst wymienionego wyżej ujawnienia jest w szczególności włączony tu jako odnośnik bez wyjątków.

A. Dziedzina wynalazku

Wynalazek dotyczy ogólnie dziedziny biologii nowotworu. W szczególności, wynalazek dotyczy kompozycji i sposobów do leczenia raka łuskowatokomórkowego. Dostarczony jest również model zwierzęcy do badania mikroskopowych guzów resztkowych i zasiedlania nowotworu w jamach ciała, jak również do jego leczenia.

B. Dziedzina pokrewna

Równowaga proliferacji i śmierci komórek jest istotna dla zachowania normalnej homeostazy tkanki. Zniszczenie tej równowagi może stanowić główny czynnik w wieloetapowym procesie nowotworzenia, zaś zahamowanie apoptozy albo zaprogramowanej śmierci komórek jest jedną z przyczyn tego zniszczenia. Wpływ takich zjawisk jest katastroficzny, powodując rocznie w samych tylko Stanach Zjednoczonych ponad pół miliona zgonów.

Istnieją wiarygodne dowody wiążące mutacje w genie p53, supresorze nowotworzenia, z etiologią wielu ludzkich nowotworów. Doniesienia wykazały, że wzrost kilku różnych ludzkich linii nowotworowych, w tym reprezentatywnych raka okrężnicy, glejaka zarodkowego, raka sutka, mięsaka kości i raka płuc można istotnie zahamować przez przeniesienie za pomocą wirusa genu p53 typu dzikiego. Wykazano, że indukcja egzogennej ekspresji p53 typu dzikiego wywołuje apoptoze w liniach komórkowych raka okrężnicy i sferoidach ludzkiego raka płuc, wskazując na rolę p53 w programowanej śmierci komórek.

Pacjenci z łuskowatokomórkowym rakiem głowy i szyi (SCCHN) są dotknięci chorobą mającą często głęboki wpływ na czynności mowy, połykania i wygląd. Ponadto, całkowity odsetek przeżywalności u tych pacjentów, około 50%, nie zmienił się przez prawie 30 lat, od momentu wdrożenia współczesnej chirurgii i radioterapii. Nawroty są głównie miejscowe i regionalne w przeciwieństwie do uogólnionych, co wskazuje że mikroskopowe nowotwory resztkowe w pierwotnym miejscu guza stanowią główną przyczynę śmiertelności. Z uwagi na te fakty, zdolność do skutecznego atakowania mikroskopowej choroby resztkowej w SCCHN stanowi podejście, które może polepszyć skuteczność terapeutyczną leczenia raka.

Streszczenie wynalazku

Celem wynalazku jest dostarczenie ulepszonych sposobów leczenia in vivo raka łuskowatokomórkowego. Innym celem wynalazku jest dostarczenie sposobu oceny rozwoju i leczenia mikroskopowego raka resztkowego i mikroskopowego zasiedlania jam ciała.

W celu spełnienia tych celów, dostarczono sposobu leczenia osobnika z rakiem łuskowatokomórkowym, obejmującego etapy (a) dostarczenia konstruktu ekspresyjnego obejmującego promotor działający w komórkach eukariotycznych oraz polinukleotyd kodujący p53, przy czym polinukleotyd jest umiejscowiony w ustawieniu sensownym i pod kontrolą promotora; i (b) doprowadzenie do kontaktu konstruktu ekspresyjnego z rakiem łuskowatokomórkowym in vivo.

186 018

Rak łuskowatokomórkowy może być rakiem głowy i szyi. Endogenny p53 raka łuskowatokomórkowego może być albo może nie być zmutowany. Konstrukt ekspresyjny jest korzystnie wektorem wirusowym, takim jak wektor retrowirusowy, wektor adenowirusowy i wektor wirusa towarzyszącego adenowirusom, przy czym najkorzystniejszy jest wektor adenowirusowy pozbawiony zdolności replikacji. W konkretnym wykonaniu, gen p53 znakuje się w sposób umożliwiający wykrycie ekspresji p53 z wektora ekspresyjnego. Korzystnym znacznikiem jest znacznik immunologiczny taki jak ciągły epitop przeciwciała.

Sposób może dalej obejmować chirurgiczne wycięcie nowotworu, z dodatkowym doprowadzeniem do kontaktu niszy guza, albo „sztucznej jamy ciała” z wektorem ekspresyjnym po resekcji. Objętość zastosowana do skontaktowania z niszą nowotworu wynosi około 3 ml do około 10 ml. Gdy stosuje się wektor adenowirusowy, ilość podawanego adenowirusa przy każdorazowym kontaktowaniu wynosi około 10⁷, 10⁸, l0⁹, 10, 10¹¹ albo 10^pfu.

Rozważana jest również ciągła perfuzja konstruktem ekspresyjnym. Ilość dostarczonego konstruktu w perfuzji ciągłej określa się z ilości dostarczonej przez wstrzyknięcie, w taki sposób aby osiągnąć tę samą dawkę całkowitą w ciągu danego czasu, jakkolwiek możliwe jest uzyskanie przy zastosowaniu perfuzji ciągłej nieco wyższych dawek.

W innym wykonaniu, konstrukt ekspresyjny wstrzykuje się do naturalnej jamy ciała takiej jak usta, gardło, przełyk, krtań, tchawica, jama opłucna, jama otrzewna albo jamy narządów pustych takich jaik pęcherz, okrężnica albo inne narządy trzewne.

Dostarczony jest również sposób określania skuteczności terapii mikroskopowego raka resztkowego obejmujący (a) dostarczenie gryzonia z nacięciem w tkance podskórnej; (b) zasiedlenie nacięcia komórkami nowotworowymi; (c) leczenie gryzonia według schematu leczenia; i (d) ocenę wpływu schematu leczenia na rozwój nowotworu. Nacięcie można zamknąć po etapie (b) albo przed etapem (c). Dalej, schemat może obejmować wprowadzenie kompozycji terapeutycznej do nacięcia, nacięcie można ponownie otworzyć po zamknięciu i ponownie zamknąć po wprowadzeniu kompozycji terapeutycznej.

Inne cele, cechy i zalety wynalazku staną się oczywiste w oparciu o poniższy opis. Należy rozumieć jednakże, że szczegółowy opis i konkretne przykłady, jakkolwiek wskazują korzystne wykonania wynalazku, podane są jedynie w celu ilustracji, ponieważ różne zmiany i modyfikacje w duchu i zakresie wynalazku staną się oczywiste dla specjalisty w oparciu o szczegółowy opis.

Krótki opis rysunków

Poniższe rysunki stanowią cześć niniejszego opisu i są załączone w celu dalszego zademonstrowania konkretnych aspektów wynalazku. Wynalazek może być lepiej zrozumiany przez odniesienie do jednego albo wielu rysunków w połączeniu ze szczegółowym opisem zaprezentowanych tu konkretnych wykonań:

Figura 1. Skuteczność transdukcji linii komórkowej SCCHN Tu-138 (wypełnione trójkąty) i Tu-177 (wypełnione kwadraty). Rekombinowany β-gal adenowirus zastosowano do zakażenia komórek różnych MOI w zakresie od 10 do 100. Procenty komórek β-galpozytywnych uzyskano z policzenia 500 komórek na każdej z szalek do replikacji.

Figura 2A i Fig. 2B. Zahamowanie wzrostu komórek SCCHN in vitro. (Fig. 2A) Krzywa wzrostu pozornie zakażonych komórek Tu-138 (wypełnione kółka), komórek zakażonych dl312 (wypełnione trójkąty) i komórek zakażonych Ad5CMV-p53 (wypełnione kwadraty). (Fig. 2B) Krzywa wzrostu pozornie zakażonych komórek Tu-177 (puste kółka), komórek zakażonych dl312 (puste trójkąty) i komórek zakażonych Ad5CMV-p53 (puste kwadraty). W każdym wskazanym punkcie czasowym trzy szalki komórek trypsynizowano i liczono. Średnią ± SEM liczby komórek w potrójnie powtórzonych studzienkach po zakażeniu wykreślono wobec liczby dni od zakażenia.

Figura 3A, Fig. 3B, Fig. 3C i Fig. 3D. Skojarzona krzywa wzrostu dla czterech linii komórkowych SCCHN. (Fig. 3A) Tu-138. (Fig. 3B) Tu-177. (Fig. 3C) MDA 686-LN. (Fig. 3D) MDA 886. Komórki zakażone pozornie (wypełnione kółka), komórki zakażone dl312 (wypełnione trójkąty) i komórki zakażone Ad5CMV-p53 (wypełnione kwadraty). Średnią liczby komórek w powtórzonych potrójnie studzienkach po zakażeniu wykreślono wobec liczby dni od zakażenia; słupki, SEM.

186 018

Figura 4. Krzywa wzrostu normalnej linii komórkowej fibroblastów. Komórki zakażone pozornie (wypełnione kółka), komórki zakażone dl312 (wypełnione trójkąty) i komórki zakażone Ad5CMV-p53 (wypełnione kwadraty).

Figura 5A i Fig. 5B. Skojarzona krzywa wzrostu dla linii komórkowych SCCHN. (Fig. 5A) Tu-138. (Fig. 5B) MDA 886. Komórki zakażone pozornie (puste kółka), komórki zakażone dl312 (puste trójkąty) i komórki zakażone Ad5CMV-p53 (puste kwadraty). W każdym wskazanym punkcie czasowym trzy szalki komórek trypsynizowano i liczono. Średnią liczby komórek w powtórzonych potrójnie studzienkach po zakażeniu wykreślono wobec liczby godzin od zakażenia; słupki, SEM.

Figura 6A i Fig. 6B. Znakowanie przełamań DNA w komórkach apoptotycznych biotynowaną dUTP metodą TUNEL. Po zakażeniu, wykonywano analizę cytometrią przepływową w badaniu przebiegu w czasie. Fig. 6A. Komórki Tu-138, które zakażone dl3l2, adenowirusem niezdolnym do replikacji (panel 1-panel 4), komórki Tu-138 zakażone adenowirusem z p53 typu dzikiego (panel 5-panel 8). Fig. 6B. Komórki MDA 686LN zakażone adenowirusem z p53 typu dzikiego (E-H). Ap oznacza apoptozę.

Figura 7A i Fig. 7B. Skojarzona krzywa wzrostu dla linii komórkowych SCCHN. (Fig. 7A) Tu-138. (Fig. 7B) MDA 886LN. Komórki zakażone pozornie (puste kółka), komórki zakażone dl312 (wypełnione trójkąty), komórki zakażone Ad5CMV-p53 (puste kwadraty) i komórki zakażone Ad5CMV-p53-FLAG (wypełnione kwadraty). W każdym wskazanym punkcie czasowym. trzy szalki komórek trypsynizowano i liczono. Średnią liczby komórek w powtórzonych potrójnie studzienkach po zakażeniu wykreślono wobec liczby godzin od zakażenia; słupki, SEM.

Szczegółowy opis najkorzystniejszych wykonań

Dostępne obecnie informacje wskazują, że jedną z głównych przeszkód w leczeniu SCCHN jest niezdolność do całkowitej eradykacji choroby w pierwotnym miejscu nowotworu, albo w bezpośrednio sąsiadujących tkankach lokalnych i regionalnych. Stąd wynalazek ma na celu dostarczenie metodyki terapii genowej, które umożliwią bardziej skuteczne i skuteczne leczenie SCCHN, szczególnie przez zaatakowanie mikroskopowego raka resztkowego. Metodyka może być zastosowana osobno albo jako wspomaganie bardziej konwencjonalnego leczenia takiego jak chemio- albo radioterapia albo zabieg chirurgiczny. Ponadto, przy użyciu modeli zwierzęcych specjalnie przeznaczonych dla mikroskopowego raka resztkowego jak również mikroskopowego zasiedlania przez nowotwór jam ciała, wynalazcy zademonstrowali skuteczność tych sposobów. Szczegóły wynalazku są opisane bardziej kompletnie poniżej.

Bardziej ogólnie, zaobserwowano, że terapia nowotworów genem p53 może być skuteczna niezależnie od stanu p53 w komórce nowotworowej. Nieoczekiwanie, obserwowano efekty terapeutyczne gdy wektor wirusowy niosący gen p53 typu dzikiego zastosowano do leczenia nowotworu, komórek które wyrażają funkcjonalną cząsteczkę p53. Nie można było tego przewidzieć w oparciu o współczesne rozumienie działania supresorów nowo-tworzenia. Nieoczekiwanie również stwierdzono, że normalne komórki, które również wyrażają funkcjonalną cząsteczkę p53 nie są zaburzone ekspresją wysokich poziomów p53 z konstruktu wirusowego. Powoduje to możliwość, że terapia genem p53 może być szerzej stosowana do leczenia nowotworów niż to wcześniej podejrzewano.

A. Białka i polinukleotydy p53

W niniejszym zgłoszeniu określenie „p53” w zamierzeniach dotyczy przykładowych cząsteczek p53 jak również wszystkich homologów pochodzących z innych gatunków. p53 „typu dzikiego” oraz p53 „zmutowane” oznaczają, odpowiednio gen p53 wykazujący normalną aktywność supresora nowotworzenia i gen p53 pozbawiony albo o zmniejszonej aktywności supresora nowotworzenia i/lub wykazujący aktywność transformującą. Te „zmutowane” p53 nie są wyłącznie odmianami sekwencji ale raczej odmianami wykazującymi zmieniony profil działania.

p53 jest obecnie uważany za gen supresorowy nowotworzenia (Montenarh, 1992). Wysoki poziom spotykano w wielu komórkach transformowanych kancerogenezą chemiczną, promieniowaniem ultrafioletowym i niektórymi wirusami, w tym SV40. gen p53 jest częstym

186 018 celem inaktywacji mutacyjnej w wielu nowotworach ludzkich i udokumentowano, że jest najczęściej zmutowanym genem w powszechnych nowotworach ludzkich (Mercer, 1992). Jest on zmutowany w ponad 50% ludzkich NSCLC (Hollestein i in., 1991) i w wielu innych nowotworach.

O ile nowotwory zawierające zmutowany gen p53 są korzystnym celem według wynalazku, przydatność zastrzeganych wektorów ekspresyjnych p53 rozciąga się na leczenie nowotworów wykazujących p53 typu dzikiego albo funkcjonalny p53. Ponieważ mechanizm ten nie jest całkowicie zrozumiały, wynalazcy stwierdzili, że ekspresja p53 może ograniczyć wzrost nowotworu wyrażającego funkcjonalny produkt p53, a nawet wywołać apoptozę w takich komórkach. Tak więc, stan p53 w nowotworze, jakkolwiek potencjalnie użyteczny w kontekście diagnostycznym, nie jest istotny w wykonywaniu wynalazku. Zjawisko to nie jest ograniczone do nowotworów SCCHN, ale może być zastosowane do szerokiej gamy nowotworów takich jak glejaki, mięsaki, raki, białaczki, chłoniaki i czerniaki, w tym nowotwory skóry, wątroby, jąder, kości, mózgu, głowy i szyi, żołądka, wątroby, płuc, jajnika, sutka, okrężnicy, stercza i pęcherza.

Polipeptydy p53 gen p53 koduje fosfoproteinę o 375 aminokwasach, która może tworzyć kompleksy z białkami wirusowymi takim jak wielki antygen T albo E1B. Białko spotyka się w normalnych tkankach i komórkach, ale w stężeniach, które są niewielkie w porównaniu z wieloma transformowanymi komórkami albo tkankami nowotworowymi. Co ciekawe, p53 typu dzikiego wydaje się być istotnym w regulacji wzrostu i podziałów komórek. Wykazano, że nadekspresja p53 typu dzikiego w niektórych przypadkach działa antyproliferacyjnie na linie komórkowe nowotworów ludzkich. Tak więc, p53 może działać jako ujemny regulator wzrostu komórek (Weinberg, 1991) i może bezpośrednio hamować niekontrolowany wzrost komórek albo pośrednio aktywuje geny hamujące ten wzrost. Tak więc, niektóre badania wykazały, że obecność zmutowanego p53 może być konieczna do pełnej ekspresji potencjału transformującego genu.

Jakkolwiek p53 typu dzikiego jest uważane za kluczowy regulator wzrostu w wielu rodzajach komórek, jego genetyczne i biochemiczne cechy odgrywają również rolę. Mutacje nonsensowne są częste dla genu p53 i są istotne dla zdolności transformującej onkogenu. Pojedyncza zmiana genetyczna spowodowana mutacją punktową może spowodować powstanie kancerogennego p53. Jednakże, w przeciwieństwie do innych onkogenów mutacje punktowe p53 występują w przynajmniej 30 różnych kodonach, tworząc często allele dominujące, które powodują przesunięcie w fenotypie komórki bez redukcji do homozygotyczności. Oprócz tego, wiele z tych dominujących negatywnie alleli wydaje się być tolerowanymi w organizmie i przechodzą one do linii zarodkowej. Różne zmutowane allele zawierają się w zakresie od minimalnego zaburzenia funkcji do silnie penetrujących, ujemnie dominujących alleli (Weinberg, 1991).

Casey i współpracownicy donieśli, że transfekcja DNA kodującego p53 typu dzikiego do dwóch linii komórkowych ludzkiego raka sutka przywróciła w tych komórkach kontrolę zahamowania wzrostu (Casey i in., 1991). Podobny efekt uzyskano przy transfekcji p53 typu dzikiego, ale nie zmutowanego, do linii komórkowej ludzkiego raka płuca (Takahashi i in., 1992). p53 typu dzikiego wydaje się dominować nad zmutowanym genem i po transfekowaniu do komórek ze zmutowanym genem selekcjonuje przeciwko proliferacji. Ekspresja transfekowanego p53 nie wpływa negatywnie na komórki normalne z endogennym p53. Tak więc, konstrukty takie mogą być wychwytywane przez komórki normalne bez szkodliwych efektów.

Jest więc możliwe, że leczenie nowotworów związanych z p53 przy użyciu p53 typu dzikiego może zmniejszyć liczbę komórek nowotworowych. Jednakże, badania takie jak opisane wyżej, są dalekie od osiągnięcia tego celu, nie tylko z tego powodu, że transfekcja DNA nie może być zastosowana do wprowadzania DNA do komórek nowotworowych w organizmie człowieka.

Polinukleotydy kodujące p53

Polinukleotydy według wynalazku mogą kodować cały gen p53, domenę czynnościową białka p53 albo dowolny polipeptyd p53. Polinukleotydami „komplementarnymi” są takie,

186 018 które są zdolne do parowania zasad według standardowej reguły komplementamości Watsona i Cricka. Oznacza to, że większe puryny będą się parowały z mniejszymi pirymidynami tworząc kombinacje guaniny sparowanej zcytozyną (G:C) i adeniny sparowanej z tymidyną (A:T) w przypadku DNA i adeniny sparowanej z uracylem (A:U) w przypadku RNA. Włączenie do sekwencji hybrydyzujących mniej powszechnych zasad takich jak inozyna, 5-metylocytozyna, 6-metyloadenina, hipoksantyna i inne nie wpływa na parowanie.

W znaczeniu tu użytym, określenie „sekwencje komplementarne” oznacza sekwencje polinukleotydowe, które są zasadniczo komplementarne na ich całej długości i mają bardzo niewiele błędnych zasad. Przykładowo, sekwencje długości 15 zasad można określić jako komplementarne jeżeli mają komplementarne nukleotydy w czternastu albo trzynastu nukleotydach. Naturalnie, sekwencje, które są „całkowicie komplementarne” są sekwencjami, które są całkowicie komplementarne na ich całej długości i nie mają błędnych zasad.

Inne sekwencje o niższym stopniu homologii są również uwzględnione. Przykładowo, można zaprojektować konstrukt antysensowny, który ma ograniczone regiony wysokiej homologii, ale również zawiera region nie homologiczny (np. rybozym). Cząsteczki te, jakkolwiek mają mniej niż 50% homologię, wiążą się z sekwencjami docelowymi w odpowiednich warunkach.

Polinukleotydy mogą pochodzić z genomowego DNA, tj. klonowanego bezpośrednio z genomu konkretnego organizmu. Jednakże winnych wykonaniach, polinukleotydy mogą być komplementarnym DNA (cDNA). cDNA jest DNA wytworzonym przy użyciu przekaźnikowego RNA (mRNA) jako matrycy. Tak więc cDNA nie zawiera żadnych przerywających sekwencji kodujących i zwykle zawiera niemal wyłącznie region(y) kodujący(e) odpowiedniego białka. W innych wykonaniach, polinukleotyd można wytworzyć syntetycznie.

Może być korzystne połączenie części genomowego DNA z cDNA albo sekwencjami syntetycznymi w celu wytworzenia konstruktów. Przykładowo, gdy w konstrukcie końcowym pożądany jest intron należy zastosować klon genomowy. Introny mogą pochodzić z innych niż p53 genów. cDNA albo polinukleotyd syntetyzowany może zapewnić korzystniejsze miejsca restrykcyjne dla pozostałej części konstruktu i stąd, będzie zastosowany do reszty sekwencji.

Ludzkie i mysie sekwencje DNA dla p53 dostarczono jako, odpowiednio Identyfikator Sekw. nr 1 i Identyfikator Sekw. nr 3, zaś odpowiednią sekwencję aminokwasową jako, odpowiednio Identyfikator Sekw. nr 2 i Identyfikator Sekw. nr 4.

Uwzględnia się, że występują naturalne warianty p53, wykazujące sekwencje różne od ujawnionych tu. Tak więc, wynalazek nie jest ograniczony do zastosowania dostarczonej sekwencji polinukleotydowej dla p53, ale obejmuje zastosowanie dowolnego naturalnie występującego wariantu.

Inny rodzaj odmiany sekwencji wynika ze zmienności kodonów. Ponieważ istnieje kilka kodonów dla większości spośród 20 normalnych aminokwasów, wiele różnych DNA może kodować p53. Odniesienie do poniższej tablicy umożliwi identyfikację takich odmian.

186 018

Tablica 1

Aminokwas			Kodony
Alanina	Ala	A	GCA GCC GCG GCU
Cysteina	Cys	C	UGC UGU
Kwas asparginowy	Asp	D	GAC GAU
Kwas glutaminowy	Glu	E	GAA GAG
Fenyloalanina	Phe	F	UUC UUU
Glicyna	Gly	G	GGA GGC GGG GGU
Histydyna	His	H	CAC CAU
Izoleucyna	Ile	I	AUA AUC AUU
' Lizyna	Lys	K	AAA AAG
Leucyna	Leu	L	UUA UUG CUA CUC CUG CUU
Metionina	Met	M	AUG
Aspargina	Asp	N	AAC AAU
Prolina	Pro	P	CCA CCC CCG CCU
Glutamina.	Glu	Q	CAA CAG
Arginina	Arg	R	AGA AGG CGA CGC CGG CGU
Seryna	Ser	s	AGC AGU UCA UCC UCG UCU
Treonina	Thr	T	ACA ACC ACG ACU
Walina	Val	V	GUA GUC GUG GUU
Tryptofan	^Trp	W	UGG
Tyrozyna	Tyr	Y	UAC UAU

Dopuszczając degenerację kodu genetycznego, korzystne są sekwencje wykazujące od około 50% do około 75%, albo od około 76% do około 90% nukleotydów identycznych z ujawnionymi tu. Sekwencjami w zakresie „polinukleotydów kodujących p53” są takie, które są zdolne do parowania zasad z segmentem polinukleotydowym podanym powyżej w warunkach wewnątrz panujących komórki.

Jak stwierdzono powyżej, sekwencje kodujące p53 mogą być genomowymi DNA pełnej długości albo kopiami cDNA albo ich dużymi fragmentami. Wynalazek wykorzystuje również krótsze oligonukleotydy p53. Sekwencje długości 17 zasad powinny wystąpić tylko raz w ludzkim genomie, stąd wystarcza to do zapewnienia swoistości sekwencji docelowej. Jakkolwiek krótsze oligomery są łatwiejsze do wykonania i zwiększają dostępność in vivo, w określeniu swoistości parowania zasad bierze udział wiele innych czynników. Zarówno powinowactwo wiązania jak i swoistość sekwencji oligonukleotydu wobec komplementarnego celu zwiększa się wraz z długością. Uwzględnia się, że będą stosowane oligonukleotydy o długości 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15,16,17, 18, 19 albo 20 par zasad, przykładowo, w wytwarzaniu mutantów p53 oraz w reakcjach PCR.

Dowolna sekwencja długości 17 zasad powinna wystąpić tylko raz w ludzkim genomie, stąd wystarcza to do zapewnienia swoistości sekwencji docelowej. Jakkolwiek krótsze oligomery są łatwiejsze do wykonania i zwiększają dostępność in vivo, w określeniu swoistości parowania zasad bierze udział wiele innych czynników. Zarówno powinowactwo wiązania jak i swoistość sekwencji oligonukleotydu wobec komplementarnego celu zwiększa się wraz z długością.

186 018

W niektórych wykonaniach, można wykorzystać konstrukty które obejmują inne elementy, przykładowo, takie które obejmują C-5 propino pirymidyny. Wykazano, że oligonukleotydy, które zawierają analogi propinowe C-5 urydyny i cytydyny wiążą się z RNA z wyższym powinowactwem (Wagner i in., 1993).

Specjalista zrozumie również, że zgodnie z definicją zamiennika czynności biologicznych białka albo peptydu, istnieje koncepcja, że istnieje ograniczona liczba zmian, których można dokonać w określonej części cząsteczki wciąż otrzymując cząsteczkę o dopuszczalnym poziomie równoważnej aktywności biologicznej. Peptydy będące zamiennikami czynności biologicznej są więc zdefiniowane jako takie, w których pewne aminokwasy, ale nie ich większość albo całość, można zastąpić. W szczególności, jeżeli chodzi o koniec N białka p 16, uwzględnia się, że tylko około 16, albo korzystniej około 5 aminokwasów można zastąpić w danym peptydzie. Oczywiście, wiele różnych bialek/peptydów z różnymi zastąpieniami można łatwo wykonać i zastosować zgodnie z wynalazkiem.

Zastąpienia aminokwasowe oparte są ogólnie na względnym podobieństwie podstawników łańcuchów bocznych aminokwasów, przykładowo, hydrofobowości, hydrofilności, ładunku, wielkości itp. Analiza wielkości, kształtu i rodzaju podstawników łańcuchów bocznych aminokwasów wykazała, że arginina, lizyna i histydyna są resztami naładowanymi dodatnio; że alanina, glicyna i seryna są małych rozmiarów; oraz, że fenyloalanina, tryptofan i tyrozyna mają ogólnie ten sam kształt. Stąd, w oparciu o te rozważania, arginina, lizyna i histydyna; alanina, glicyna i seryna; oraz fenyloalanina, tryptofan i tyrozyna określone są tu jako biologicznie czynne zamienniki. Przy dokonywaniu takich zamian, można uwzględnić wskaźnik hydropatyczności. Każdemu aminokwasowi przyporządkowano wskaźnik hydropatyczności na podstawie jego charakterystyki hydrofobowości i ładunku, i tak: izoleucyna (+4,5); walina (+4,2); leucyna (+3,8); fenyloalanina (+2,8); cysteina/cystyna (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicyna (-0,4); treonina (-0,7); seryna (-0,8); tryptofan (-0,9); tyrozyna (-1,3); prolina (-1,6); histydyna (-3,2); glutaminian (-3,5); glutamina (-3,5); asparaginian (-3,5); asparagina (-3,5); lizyna (-3,9) i arginina (-4,5).

Istotność wskaźnika hydropatyczności aminokwasu w zapewnianiu interaktywnych funkcji biologicznych białku jest ogólnie doceniana w stanie techniki (Kyte i Doolittle, 1982, zamieszczone tu jako odnośnik). Wiadomo, że pewne aminokwasy można zastąpić innymi aminokwasami wykazującymi podobny wskaźnik hydropatyczności i wciąż zachować aktywność biologiczną. Przy dokonywaniu zmian na podstawie wskaźnika hydropatyczności, zastępowanie aminokwasów, których wskaźniki hydropatyczności leżą w zakresie ±2 jest korzystne, zaś w zakresie ±1 jest szczególnie korzystne zaś najkorzystniejsze w zakresie ±0,5.

Jest zrozumiałe, że aminokwas można zastąpić innym posiadającym podobną wartość hydrofilności i uzyskać białko zamienne biologicznie. Jak to szczegółowo opisano w patencie USA 4,554,101, poniższym aminokwasom przypisano następujące wartości hydrofilności: arginina (+3,5); lizyna (+3,0); asparaginian (+3,0±1); glutaminian (+3,0±1); seryna (+3,0); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicyna (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5+1); alanina (0,5); histydyna (-0,5); cysteina (-1,0); metionina (-1,3); walina (-1,5); leucyna (-1,8); izoleucyna (-1,8); tyrozyna (-2,3); fenyloalanina (-2,5) i tryptofan (-3,4).

Przy dokonywaniu zmian na podstawie hydrofobowości, zastępowanie aminokwasów, których hydrofobowości leżą w zakresie ±2 jest korzystne, zaś w zakresie ±1 jest szczególnie korzystne, zaś najkorzystniejsze w zakresie ±0,5.

B. Wektory ekspresyjne

W niniejszej publikacji określenie „konstrukt ekspresyjny” oznacza w założeniu dowolny rodzaj konstruktu genetycznego, zawierającego kwas nukleinowy kodujący produkt genowy, w, którym część albo całość kwasu nukleinowego kodującego sekwencję jest możliwa do transkrypcji. Transkrypt może ulec translacji na białko, ale nie musi. Tak więc, w pewnych wykonaniach, ekspresja obejmuje zarówno transkrypcję genu p53 i translację mRNA p53 w produkt białkowy p53. Winnych wykonaniach, ekspresja obejmuje jedynie transkrypcję kwasu nukleinowego kodującego p53 albo jego sekwencji komplementarnej.

W celu wywołania z konstruktu ekspresji przynajmniej transkryptu p53, polinukleotyd kodujący polinukleotyd p53 powinien być pod kontrolą transkrypcyjną promotora. „Promotor” do10

186 018 tyczy sekwencji DNA rozpoznawanej przez syntetyzującą maszynerię komórki gospodarza albo wprowadzoną która jest wymagana do zapoczątkowania swoistej transkrypcji genu. Określenie „pod kontrolą transkiypcyjną” oznacza, że promotor znajduje się w prawidłowym położeniu względem polinukleotydu, aby móc kontrolować inicjację polimerazy RNA i ekspresję polinukleotydu.

Określenie promotor będzie tu stosowane w celu określenia grupy modułów kontroli transkrypcyjnej, które są zgrupowane wokół miejsca inicjacji polimerazy Π RNA. Większość wiedzy o tym, jak zorganizowane są promotory pochodzi z analiz kilku promotorów wirusowych, w tym kinazy tymidynowej HSV (tk) i jednostek wczesnej transkrypcji SV40. Badania te, wsparte nowszymi pracami wykazały, że promotory zbudowane są z osobnych modułów funkcjonalnych, z których każdy obejmuje około 7-20 bp DNA i zawiera jedno lub wiele miejsc rozpoznawczych dla białek aktywujących albo represjonujących transkrypcję.

Przynajmniej jeden moduł w każdym promotorze działa jako miejsce startu syntezy RNA. Najlepiej znanym przykładem jest kaseta TATA, ale w niektórych promotorach pozbawionych kasety TATA, takich jak promotory ssaczego genu końcowej transferazy dezoksynukleotydylowej i promotory późnych genów SV40, osobny element nakładający się na miejsce startu pomaga umiejscowić miejsce inicjacji.

Dodatkowe elementy promotora regulują częstość inicjacji transkrypcji. Zwykle, położone są one w regionie 30110 bp powyżej miejsca startu, jakkolwiek ostatnio wykazano, że liczne promotory zawierają funkcjonalne elementy również poniżej miejsca startu. Odstęp pomiędzy elementami promotora jest często zmienny, w taki sposób, że funkcja promotora jest zachowana gdy elementy są odwrócone albo odsunięte od siebie. W promotorze tk, odstęp pomiędzy elementami promotora może się zwiększyć do 50 bp zanim aktywność zacznie się zmniejszać. Zależnie od promotorą wydaje się, że poszczególne elementy mogą działać aktywując transkrypcję w powiązaniu albo niezależnie.

Nie wydaje się aby było istotne jaki konkretny promotor zostanie zastosowany do kontrolowania ekspresji polinukleotydu p53, o ile jest on zdolny do ekspresji polinukleotydu w komórce docelowej na odpowiednim poziomie. Tak więc, gdy celem jest komórka ludzka, korzystne jest położenie regionu kodującego polinukleotydu stycznie i pod kontrolą promotora, który jest zdolny do ekspresji w komórce ludzkiej. Mówiąc ogólnie, taki promotor może obejmować promotor ludzki albo wirusowy.

W różnych wykonaniach w celu uzyskania ekspresji polinukleotydu p53 na wysokim poziomie można zastosować bezpośredni wczesny promotor genu ludzkiego wirusa cytomegalii (CMV), wczesny promotor SV40 i długie końcowe powtórzenia wirusa mięsaka Rousa. Zastosowanie innych promotorów wirusowych, komórek ssaków albo fagów bakterii, które są dobrze znane w celu uzyskania ekspresji polinukleotydów jest również uwzględniane, przy założeniu, że poziom ekspresji jest wystarczający do wywołania efektu hamującego wzrost.

Przez wykorzystanie promotora o dobrze znanych właściwościach, można optymalizować poziom i wzorzec ekspresji polinukleotydu po transfekcji. Przykładowo, wybór promotorą który jest aktywny w konkretnych komórkach, takiego jak tyrozynazy (czerniak), alfa-fetoproteiny i albuminy (nowotwory wątroby), CC 10 (nowotwór płuc) i antygenu swoistego dla prostaty (nowotwoiy stercza) umożliwiają ekspresję swoistą tkankowo polinukleotydów p53. Tabela 2 podaje kilka elementów/promotorów, które można wykorzystać w kontekście niniejszego wynalazku, do regulacji ekspresji konstruktów p53. W zamierzeniach, lista nie wyczerpuje wszystkich możliwych elementów związanych z promowaniem ekspresji p53, ale służy jedynie przykładowo.

Wzmacniacze wykryto początkowo jako elementy genetyczne zwiększające transkrypcje z promotorów położonych w oddaleniu na tych samych cząsteczkach DNA. Ta zdolność do działania na znaczną odległość nie mą wielu precedensów w klasycznych badaniach nad regulacją transkrypcji u prokaryota. Kolejne prace wykazały, że regiony DNA o aktywności wzmacniaczy są zorganizowane podobnie do promotorów. Oznacza to, że są zbudowane z wielu osobnych elementów, z których każdy wiąże się z jednym albo wieloma białkami transkrypcyj nymi.

Podstawowe rozróżnienie pomiędzy wzmacniaczami i promotorami jest czynnościowe. Region wzmacniacza jako całość musi być zdolny do pobudzania transkrypcji na odległość;

186 018 nie musi być to prawdą dla regionu promotora albo jego elementów składowych. Z drugiej strony, promotor musi mieć jeden albo wiele elementów, które kierują inicjację syntezy RNA na konkretne miejsce i w konkretnym kierunku, podczas gdy wzmacniacze pozbawione są tych właściwości. Promotory i wzmacniacze często nakładają się na siebie i są ciągłe, często mając bardzo podobna budowę modułową.

Dodatkowo, do napędzania ekspresji konstruktu p53 można również zastosować dowolną, kombinację promotor/wzmacniacz (jak np. przez Eucaiyotic Promotor Data Base EPDB). Zastosowanie układów ekspresji cytolazmatycznej T3, T7 albo SP6 jest kolejnym możliwym wykonaniem. Komórki eukariotyczne mogą podtrzymywać transkrypcję cytoplazmatyczną z niektórych promotorów bakteriofagów, jeżeli dostarczona zostanie odpowiednia bakteriofagowa polimeraza, jako część kompleksu dostarczania albo jako dodatkowy wektor ekspresji genów.

Tabela 2

WZMACNIACZ

Łańcuch ciężki immunoglobuliny

Łańcuch lekki immunoglobuliny

Receptor limfocytów T

HLA DQ α i DQ β

Interferon β

Interleukina^

Receptor fnterloukiny-2

MHC klasy II 5

MHC klasy II HLA-DRa

Aktyna β

Kinaza kreatyninowa mięśni

Prealbumina (transerytryna)

Elastaza I

Metalotioneina

Kolagenaza

Gen albuminy

FotopΓOtoina α

Globina τ

Globina β

c-fos

c-HA-ras

Insulina

Cząsteczka adhezyjna neuronów (NCAM)

Antytrypsyna-a1

Histon H2B (TH2B)

Kolagen mysi albo typu II

Białka regulowane przez glukozę (GRP94 i GRP78)

Szczyrzy hormon wzrostu

Amyloid A ludzkiej surowicy (SAA)

Troponina I (TN I)

Płytkowopochodny czynnik wzrostowy

Dystrofia mięśniowa Duchenne^

SV40

Polioma

Retrowirusy

Wirusy brodawczaków

Wirus zapalenia wątroby typu B

Wirus cytomegalii

Wirus białaczki gibbonów

186 018

Dalej, wybór promotora ulegającego regulacji w reakcji na swoiste sygnały fizjologiczne umożliwia indukowalną ekspresję konstruktu p53. Przykładowo, w przypadku polinukleotydu pod kontrolą ludzkiego promotora PAI-1, można indukować ekspresję czynnikiem martwicy nowotworu. Tabela 3 pokazuje kilka kombinacji promotor/induktor.

Tabela 3

ELEMENT	INDUKTOR
MTII	Ester forbolu (TFA) metale ciężkie
MMTV (wirus mysiego guza sutka)	Glikokortykoidy
β-interferon	poli(rI)X poli(rc)
Adenowirus 5 E2	Ela
c-jun	Ester forbolu (TPA) H2O2
Kolagenaza	Ester forbolu (TPA)
Stromelizyna	Ester forbolu (TPA) IL-1
SV40	Ester forbolu (TPA)
Mysi gen MX	Interferon, Wirus choroby New-castle
Gen GRP78	A23187
α-2-makroglobulina	IL-6
Wimentyna	Surowica
Gen MHC klasy I H-2kB	Interferon
HSP70	Ela, wielki antygen T SV40
Proliferyna	Ester forbolu (TPA)
Czynnik martwicy nowotworu	FMA
Gen hormonu stymulującego tarczycę	Hormon tarczycy

W pewnych wykonaniach wynalazku, dostarczenie wektora ekspresyjnego do komórki można zidentyfikować in vitro albo in vivo przez indukcję znacznika w wektorze ekspresyjnym. Znacznik powoduje możliwą do identyfikacji zmianę komórki transfekowanej, umożliwiając łatwą identyfikację ekspresji. Zwykle, włączenie znacznika selekcji lekiem ułatwia klonowanie i selekcję transformantów. Alternatywnie, można zastosować enzymy takie jak kinazy tymidynowa (kt) wirusa opryszczki pospolitej (eukariotyczna) albo acetylotransferaza chloramfenikolu (CAT) (prokariotyczna). Można również zastosować znaczniki immunologiczne. Nie jest istotne, jaki znacznik umożliwiający selekcję zostanie zastosowany, jak długo jest zdolny do ekspresji wraz z polinukleotydem kodującym p53. Dalsze przykłady znaczników umożliwiających selekcję są znane specjalistom.

Jeden z typowych obejmuje sygnał poliadenylacji, umożliwiający prawidłową poliadenylację transkiyptu. Natura sygnału poliadenylacji nie jest istotna dla pomyślnego wykonywania wynalazku i może być zastosowana dowolna sekwencja tego rodzaju. Wynalazcy zastosowali sygnał poliadenylacji SV40, ponieważ jest on wygodny i znany z działania w zastosowanych komórkach docelowych. Uwzględniany jest również, jako element konstruktu ekspresyjnego, terminator. Elementy te mogą służyć w celu zwiększania poziomu sygnału oraz w celu minimalizacji zjawiska „read through” z konstruktu do innych sekwencji.

W korzystnym wykonaniu wynalazku, konstrukt ekspresyjny obejmuje wirus albo konstrukt pochodzący z genomu wirusowego. Zdolność niektórych wirusów do wnikania do komórek drogą endocytozy za pośrednictwem receptora i, w niektórych przypadkach integracji

186 018 z chromosomami komórki gospodarza, uczyniła z nich atrakcyjnych kandydatów do transferu genów do komórek ssaków. Jednakże, ponieważ wykazano, że bezpośredni wychwyt nagiego DNA, jak również wychwyt za pośrednictwem receptora kompleksów DNA (dyskutowane poniżej), wektory ekspresyjne nie muszą być wirusowe, ale mogą być konstruktem plazmidowym, kosmidowym albo fagowym, który jest zdolny do podtrzymywania ekspresji kodowanych genów w komórkach ssaków, takim jak szereg plazmidów pUC albo pBluescript™.

Retrowirusy

Retrowirusy są grupą wirusów o pojedynczej nici RNA, charakteryzującą się zdolnością do przekształcenia ich RNa w dwuniciowy DNA w zakażonych komórkach w procesie odwrotnej transkrypcji (Coffin, 1990). Następnie, powstały DNA stabilnie integruje się z chromosomami komórki jako prowirus i kieruje syntezą białek wirusowych. Integracja powoduje zachowanie sekwencji genów wirusowych w komórce nosiciela i jej potomstwie. Genom retrowirusowy zawiera trzy geny - gag, poli i env, które kodują, odpowiednio, białka kapsydu, enzym polimerazę i składniki otoczki. Sekwencja spotykana powyżej genu gag, określana jako Ψ, działa jako sygnał upakowywania genomu do wirionów. Dwie sekwencje długich końcowych powtórzeń (LTR) obecne są na końcu 5' i 3' genomu wirusa. Zawierają one sekwencje silnego promotora i wzmacniacza, jak również są niezbędne do integracji w genomie komórki gospodarza (Coffin, 1990).

W celu skonstruowania wektora retrowirusowego, kwas nukleinowy kodujący p53 wprowadza się do genomu wirusowego w miejsce pewnych sekwencji wirusowych, tworząc wirus niezdolny do replikacji. W celu wytworzenia wirionów, konstruuje się linię komórkową upakowującą, zawierającą geny gag, poi i env, ale bez składników LTR i Ψ (Mann i in., 1983). Gdy rekombinowany plazmid zawierający ludzki cDNA wraz z wirusowymi sekwencjami LTR i Ψ wprowadzi się do tej linii komórkowej (przykładowo, metodą precypitacji fosforanem wapnia), sekwencja Ψ umożliwia upakowanie transkryptu RNA rekombinowanego plazmidu w cząstkach wirusa, które są następnie wydzielane do pożywki hodowlanej (Nicolas i Rubinstein, 1988; Temin, 1986; Mann i in., 1983). Następnie zbiera się pożywkę zawierająca wirusa, ewentualnie zatęża i stosuje do transferu genu. Wektory retrowirusowe są zdolne do zakażania różnych rodzajów komórek. Jednakże, integracja i stabilna ekspresja wymaga podziałów komórki gospodarza (Paskind i in., 1975).

Ostatnio opracowano nowe podejście umożliwiające swoiste ukierunkowanie wektorów retrowirusowych, oparte na chemicznej modyfikacji retrowirusa przez chemiczne dodanie reszt laktozowych do otoczki wirusowej. Modyfikacja ta umożliwia swoiste zakażenie hepatocytów przez receptor sialylowy.

Inne podejście do kierowania rekombinowanych retrowirusów polega na zastosowaniu biotynowanych przeciwciał przeciwko białku otoczki retrowirusa i przeciwko swoistemu receptorowi. Przeciwciała są sprzęgnięte przez składnik biotynowy przy użyciu streptawidyny (Roux i in., 1989). Stosując przeciwciała przeciwko antygenom głównego układu zgodności tkankowej klasy I i II wykazano zakażenie wirusem ekotropowym in vitro różnych komórek ludzkich niosących te antygeny powierzchniowe.

Adenowirusy

Ludzkie adenowirusy są wirusami onkogennymi zawierającymi dwuniciowy DNA, z genomem o wielkości około 36 kb (Tooze, 1981). Adenowirusy szeroko badano i scharakteryzowano jako modelowy układ ekspresji genów eukariotycznych, co czyni je atrakcyjnym układem do opracowania adenowirusa jako układu przenoszenia genów. Ta grupa wirusów jest łatwa w hodowli i manipulacji, i wykazuje szeroki zakres gospodarzy in vitro i in vivo. W komórkach zakażonych litycznie adenowirusy są zdolne do wyłączania syntezy białek gospodarza, skierowania maszynerii komórkowej na syntezę wielkich ilości białek wirusowych i wytwarzanie wielkich ilości wirusa.

Region El genomu obejmuje E1A i E1B, które kodują białka odpowiedzialne za regulację transkrypcji genomu wirusowego, jak również kilku genów wirusa. Ekaspresja E2, obejmującego E2A i E2B, umożliwia syntezę replikacyjnych funkcji wirusa, np. białek wiążących DNA, polimerazy DNA i białka końcowego, zapoczątkowującego replikację. Produkty genu E3 zapobiegają cytolizie przez limfocyty T cytotoksyczne i czynnik martwicy

186 018 nowotworu i wydają się być istotne dla rozsiewu wirusa. Czynności związane z białkami E4 obejmują replikację DNA, ekspresję genów późnych i wyłączenie komórki gospodarza. Produkty genów późnych obejmują większość białek kapsydu wirionu i ulegają ekspresji tylko po tym, gdy nastąpi większość przetwarzania pojedynczego transkryptu pierwotnego z głównego późnego promotora. Główny późny promotor (MPL) wykazuje wysoką skuteczność podczas fazy późnej zakażenia (Stratford-Perricaudet i Perricaudet, 1991a).

Ponieważ tylko niewielka część genomu jest niezbędna in cis (Tooze, 1981) wektory pochodzące z adenowirusów oferują niezwykły potencjał dla zastępowania wielkich fragmentów DNA, w połączeniu z liniami komórkowymi takimi jak komórki 293. Opracowano linie komórkowe ludzkiej nerki płodowej transformowane Ad5 (Graham i in., 1977) zapewniające istotne białka wirusowe in trans. Wynalazcy stwierdzili, że charakterystyka adenowirusów czyni je dobrymi kandydatami do zastosowania w ukierunkowaniu na nowotwór in vivo (Grunhaus i Horvitz, 1992).

Szczególne zalety układu adenowirusowego w dostarczaniu obcych białek do komórki obejmują (i) zdolność do zastępowania względnie dużych fragmentów wirusowego DNA przez obcy DNA, (ii) stabilność strukturalną rekombinowanych adenowirusów, (iii) bezpieczeństwo podawania adenowirusów ludziom, i (iv) brak jakichkolwiek znanych powiązań zakażeń adenowirusami z nowotworami, (v) możliwość uzyskania wysokich mian rekombinowanego wirusa; i (vi) wysoka zakaźność adenowirusa.

Dalsze zalety wektorów adenowirusowych nad retrowirusowymi obejmują wysoki poziom ekspresji genu. Oprócz tego, replikacja adenowirusa jest niezależna od replikacji genu gospodarza, w przeciwieństwie do sekwencji retrowirusa. Ponieważ geny transformujące adenowirusa w regionie E1 można łatwo usunąć, wciąż zachowując skuteczny wektor ekspresyjny, ryzyko onkogenne wektorów adenowirusowych jest znikome (Grunhaus i Horvitz, 1992).

Ogólnie, adenowirusowe układy przenoszenia genów oparte są na rekombinowanym, konstruowanym adenowirusie, który uczyniono niezdolnym do replikacji przez usunięcie części jego genomu, takiej jak E1, przy zachowaniu jego zdolności do zakażania. Sekwencje kodujące względnie duże obce białka mogą ulegać ekspresji, gdy w genomie adenowirusowym dokona się dodatkowych delecji. Przykładowo, adenowirusy z delecjami w regionach E1 i E3 są zdolne do przeniesienia do 10 kb obcego DNA i można je namnażać w wysokim mianie w komórkach 293 (Stratford-Perricaudet i Perricaudet, 1991a). Doniesiono również o nieoczekiwanym przetrwaniu ekspresji transgenu po zakażeniu adenowirusem.

Transfer genów za pośrednictwem adenowirusa był ostatnio badany jako sposób transferu genów do komórek eukariotycznych i w organizmach zwierząt. Przykładowo, podczas leczenia myszy z rzadkim recesywnym zaburzeniem genetycznym niedoboru enzymu transkarbamylacy ornitynowej (OTC) stwierdzono, że konstrukty adenowirusowe można zastosować do dostarczania normalnego enzymu OTC. Niestety, ekspresję normalnego poziomu OTC uzyskano jedynie w 4 spośród 17 przypadków (Stratford-Perricaudet i in., 1991b). Stąd, defekt był jedynie częściowo korygowany u większości myszy, prowadząc do zmiany fizjologicznej i fenotypowej. Ten rodzaj wyników stanowi słabą zachętę do zastosowania wektorów adenowirusowych w terapii raka.

Próby zastosowania adenowirusa do transferu genu regulatora przewodnictwa śródbłonowego w mukowiscydozie (CFTR) do nabłonka płuc szczurów były również częściowo pomyślne, jakkolwiek nie można było ocenić aktywności biologicznej przenoszonego genu w nabłonku zwierząt (Rosenfeld i in., 1992). Ponownie, badania te pokazały transfer genu i ekspresję białka CFTR w komórkach dróg oddechowych, ale nie wykazały efektu fizjologicznego. W artykule do Science z 1991, Rosenfeld i in., wykazali ekspresję białka 1a-antytrypsyny w płucach, ale nie wykazali efektu fizjologicznego. W rzeczywistości, oceniono, że obserwowany poziom ekspresji wynosił jedynie 2% poziomu koniecznego do ochrony płuc u człowieka, tj. dużo poniżej niezbędnego dla efektu fizjologicznego.

Gen dla ludzkiej a1-antytrypsyny wprowadzono do wątroby szczurów przez wstrzyknięcie do żyły wrotnej, gdzie uległ ekspresji i spowodował wydzielanie wprowadzonego ludzkiego białka do osocza tych szczurów (Jaffe i in., 1992). Jednakże ku rozczarowaniu, uzyskane poziomy nie były odpowiednio wysokie aby przedstawiać wartość terapeutyczną..

186 018

Ten rodzaj wyników nie pokazuje, że adenowirusy są zdolne do kierowania w rekombinowanych komórkach ekspresji białka w ilości odpowiedniej do uzyskania odpowiednich efektów fizjologicznych, stąd nie sugerują przydatności układu adenowirusowego w zastosowaniu w leczeniu raka. Ponadto, przed dokonaniem niniejszego wynalazku, uważano, że p53 nie można wprowadzić do komórek upakowujących, takich jak stosowane do wytwarzania adenowiusów, ponieważ będzie ono toksyczne. Ponieważ E1B adenowirusa wiąże się zp53, uważano, że jest to kolejna przyczyna dla której adenowirusy i p53 nie można powiązać wspólną technologią.

Inne wektory wirusowe jako konstrukty ekspresyjne

Jako konstrukty ekspresyjne w niniejszym wynalazku można zastosować inne wektory wirusowe. Można wykorzystać wektory pochodzące z wirusów takich jak wirus krowianki (Ridgeway, 1988; Baichwal i Sugden, 1986; Coupar i in., 1988), wirus towarzyszący adenowirusom (AAV) (Ridgeway, 1988; Baichwal i Sugden, 1986; Hermonat iMuzycska, 1984) oraz wirus opryszczki. Oferują one cechy atrakcyjne dla wielu komórek ssaczych (Friedman, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal i Sugden, 1986; Coupar i in., 1988; Horwich i in., 1990).

Wraz z wykryciem defektywnych wirusów zapalenia wątroby typu B, nowe światło padło na zależność budowy i funkcji różnych sekwencji wirusowych. Badania in vitro wykazały, że wirus może zachować swoją zdolność do upakowywania zależnego od pomocy i odwrotną transkrypcję mimo usunięcia ponad 80% jego genomu (Horwich i in., 1990). Sugeruje to, że znaczne części genomu można zastąpić obcym materiałem genetycznym. Hepato-tropizm i przetrwanie (integracja) były szczególnie atrakcyjnymi właściwościami ukierunkowanego na wątrobę transferu genów. Ostatnio, Chang i in., wprowadzili gen acetylotransferazy chloramfenikolu (CAT) do genomu kaczego wirusa zapalenia wątroby typu B w miejsce sekwencji kodujących polimerazę, białka powierzchniowe iprebiałka powierzchniowe. Transfekowano je wraz z wirusem typu dzikiego do linii komórkowej wątrobiaka ptasiego. Pożywką hodowlaną zawierającą wysokie miana rekombinowanego wirusa zastosowano do zakażenia hepatocytów kacząt. Stabilną ekspresję CAT wykrywano przez przynajmniej 24 dni po zakażeniu (Chang i in., 1991).

C. Alternatywne metody dostarczania genu

W celu wywołania ekspresji konstruktu p53, wektor ekspresyjny należy dostarczyć do komórki. Jak to opisano wyżej, korzystnym mechanizmem dla dostarczenia drogą zakażenia wirusowego było zamknięcie wektora ekspresyjnego w zakaźnej cząstce adenowirusa.

Niniejszy wynalazek uwzględnia kilka innych nie wirusowych sposobów dostarczenia wektorów ekspresyjnych do hodowanych komórek ssaczych. Obejmują one precypitację fosforanem wapnia (Graham i Van Der Erb, 1973; Chen i Okayama, 1987; Rippe i in., 1990), dekstran-DEAE (Gopal, 1985), elektroporację (Tur-Kaspa i in., 1986; Potter i in., 1984) bezpośrednie mikroiniekcjo (Harland i Weintraub, 1985), liposomy napełnione DNA (Nicolau i Sene, 1982; Fraley i in., 1979) i kompleksy lipofoctammo z DNA, sonikację komórek (Fechheimer i in., 1987), bombardowanie przy użyciu mikropocisków o dużej prędkości (Yang i in., 1990), polikationy (Boussif i in., 1995) oraz transfekcję za pośrednictwem receptora (Wu i Wu, 1987; Wu i Wu, 1988). Niektóre z tych technik można zaadaptować z powodzeniem do zastosowań in vivo albo ex vivo.

W jednym wykonaniu wynalazku, adenowirusowy wektor ekspresyjny może być po prostu nagim wektorem rekombinowanym. Przeniesienie konstruktu można wykonać dowolną z metod wspomnianych powyżej, które w sposób fizyczny albo chemiczny zwiększają przenikalność błony komórkowej. Przykładowo, Dubinsky i in., (1984) pomyślnie wstrzyknęli DNA wirusa polyoma w postaci precypitatów CaPO4 do wątroby i śledziony noworodków i dorosłych myszy, wykazując aktywną replikację wirusa i aktywne zakażenie. Bovenisty iNeshif (1986) również wykazali, że bezpośrednie wstrzyknięcie dootrzewnowe plazmidów pręcypitowanych CaPO4 powoduje ekspresję transfekowąnego genu. Przewiduje się, że DNA kodujący konstrukt p53 można również przenosić w podobny sposób in vivo.

Inne wykonanie wynalazku do przenoszenia DNA nagiego wektora ekspresyjnego do komórek może obejmować bombardowanie cząstkami. Metoda ta zależy od zdolności do przyspieszenia mikropocisków pokrytych DNA do wielkich prędkości, umożliwiając im przebicie

186 018 błon komórkowych i wniknięcie do komórki bez niszczenia jej (Klein i in., 1987). Opracowano kilka przyrządów do przyspieszania małych cząstek. Jeden z takich przyrządów wykorzystuje wyładowanie o wysokim napięciu do wytworzenia prądu elektrycznego, który zapewnia siłę napędową (Yang i in., 1990). zastosowane mikropociski zbudowane są z substancji obojętnej biologicznie takiej jak perełki wolframowe albo złote.

Bombardowano in vivo wybrane narządy obejmujące wątrobę, skórę i tkankę mięśniową szczurów i myszy (Yang i in., 1990; Zelenin i in., 1991). Może to wymagać chirurgicznego odsłonięcia tkanki albo komórek, w celu usunięcia tkanki rozdzielającej działo i docelowy narząd. Tym sposobem można dostarczyć DNA kodujący konstrukt p53.

W dalszym wykonaniu wynalazku, wektor ekspresyjny można zamknąć w liposomach. Liposomy są pęcherzykowatymi strukturami charakteryzującymi się dwuwarstwową błoną fosfolipidową i obojętnym wodnym wnętrzem. Liposomy wielobłonowe posiadają liczne warstwy lipidowe rozdzielone ośrodkiem wodnym. Tworzą się one spontanicznie gdy fosfolipidy rozpuszczane są w nadmiarze roztworu wodnego. Składnik lipidowy ulega samoorganizacji, po czym tworzy zamknięte struktury, które zamykają wodę i rozpuszczone w niej substancję pomiędzy dwuwarstwami lipidowymi (Ghosh iBachhawat, 1991). Uwzględniane są również kompleksy lipofectamine z DNA.

Dostarczanie polinukleotydy za pomocą liposomów i ekspresja obcego DNA in vitro odbywa się pomyślnie. Wong i in., (1980) wykazali możliwość dostarczenia za pośrednictwem liposomów i ekspresję obcego DNA w hodowanych komórkach zarodków kurzych, HeLa iwątrobiaka. Nicolau i in., (1987) uzyskali pomyślny transfer genu u szczurów po wstrzyknięciu dożylnym.

W pewnych wykonaniach wynalazku, liposomy można skompleksować z wirusem hemaglutynującym (HVJ). Wykazano, że ułatwia to fuzję z błoną komórkową i ułatwia wejście do komórek DNA zamkniętego w liposomach (Kaneda i in., 1989). W innych wykonaniach, liposomy można kompleksować albo zastosować w połączeniu z chromosomalnymi białkami niehistonowymi (HMG-1) (Kato i in., 1991). W jeszcze dalszym wykonaniu, liposomy można kompleksować albo zastosować do w połączeniu HVj i HMG-1. W taki sposób wektory ekspresyjne pomyślnie zastosowano do przeniesienia i ekspresji polinukleotydu in vitro i in vivo, w sposób umożliwiający zastosowanie w niniejszym wynalazku. Gdy wkonstrukcie DNA stosuje się promotor bakteriofagowy, pożądane jest również, aby w liposomach zamknąć odpowiednią polimerazę bakteriofagów.

Inny mechanizm przenoszenia wektorów ekspresyjnych do komórek obejmuje dostarczanie zależne od receptora. To podejście ma zalety wybiórczego wychwytu makrocząsteczek przez endocytozę zależną od receptora do prawie wszystkich komórek eukariotycznych. Z powodu zależnego od rodzaju komórek rozmieszczenia różnych receptorów-, dostarczanie może być bardzo swoiste (Wu i Wu, 1993). Nośniki do zależnego od receptora dostarczania genu obejmują zasadniczo dwa składniki: ligand dwoisty dla receptora komórki i czynnik wiążący DNA. Do transferu genów zależnego od receptora zastosowano kilka ligandów. Najintensywniej badanymi ligandami są: asialoorozomukoid (ASOR) (Wu i Wu, 1987) i transferryna (Wagner i in., 1993). Ostatnio, jako nośnik do dostarczania genu zastosowano syntetycznąneogiikoproteinę, która rozpoznaje ten sam receptor co ASOR (Ferkol i in., 1993; Perales i in., 1994) oraz naskórkowy czynnik wzrostowy (EGF) zastosowano do dostarczania genów do komórek raka łuskowatokomórkowego (Myers, EPO 0273085).

W innym wykonaniu, nośnik może obejmować ligand i liposom. Przykładowo, Nicolau i in., (1987) zastosowali laktozyloceramid, gaiaktozo-asiaiogangliozyd, wbudowany do liposomów i obserwowali wzrost wychwytu genu insuliny przez hepatocyty. Tak więc, możliwe jest, że adenowirusowy wektor ekspresyjny może być również dostarczany swoiście do takiego rodzaju komórek jak komórki płuc, nabłonka czy nowotworu, dowolną liczbą układów receptor-ligand, z liposomami albo bez. Przykładowo, naskórkowy czynnik wzrostowy (EGF) można zastosować jako receptor do dostarczania konstruktu p53 do wielu komórek nowotworowych wykazujących nadmierną ekspresję receptora EGF. Mannozę można zastosować w ukierunkowaniu na receptor mannozy w komórkach wątroby. Również przeciwciała prze186 018 ciwko CD5 (CLL), CD22 (chłoniak), CD25 (białaczka z limfocytów T) i MAA (czerniak) można podobnie zastosować jako cząsteczki kierujące.

W pewnych wykonaniach, można łatwo uzyskać przeniesienie genów w warunkach ex vivo. Terapia genowa ex vivo odnosi się do izolacji komórek od zwierzęcia, dostarczania polinukleotydu do komórek in vitro i ponownego wprowadzania zmodyfikowanych komórek do organizmu zwierzęcia. Może to obejmować chirurgiczne pobranie tkanki/narządu od zwierzęcia albo hodowlę pierwotną komórek i tkanek, anderson i in., patent USA 5,399,346, załączony tu w całości, ujawnia metody terapii ex vivo. Podczas hodowli ex vivo, wektor ekspresyjny może wyrażać konstrukt p53. Na koniec, komórki można ponownie wprowadzić do organizmu zwierzęcia albo podać innemu zwierzęciu, w postaci dopuszczalnej farmaceutycznie dowolnym opisanym poniżej sposobem.

D. Kompozycje farmaceutyczne i drogi podawania

Jeżeli uwzględnia się zastosowanie kliniczne adenowirusowego wektora ekspresyjnego według wynalazku, konieczne będzie wytworzenie kompleksu w postaci kompozycji farmaceutycznej odpowiedniej dla zamierzonego zastosowania. Ogólnie, będzie to wymagało wytworzenia kompozycji farmaceutycznej zasadniczo wolnej od pirogenów, jak również jakichkolwiek innych zanieczyszczeń, które mogą być szkodliwe dla ludzi albo zwierząt. Może być pożądane zastosowanie odpowiednich soli i buforów, w celu stabilizacji kompleksu i umożliwienia jego wychwytu przez komórki docelowe.

Kompozycje wodne według wynalazku obejmują skuteczną ilość wektora ekspresyjnego, rozpuszczoną albo rozproszoną w nośniku dopuszczalnym fizjologicznie albo ośrodku wodnym. Kompozycje takie określane są również jako inocula. Określenie „farmaceutycznie albo farmakologicznie dopuszczalne” dotyczy cząsteczek i kompozycji, które nie wywołują reakcji niepożądanych, alergicznych albo w inny sposób niewłaściwych, po podaniu zwierzęciu albo człowiekowi. W znaczeniu tu użytym „nośnik dopuszczalny farmaceutycznie” obejmuje dowolny i każdy rozpuszczalnik, ośrodek dyspersyjny, powłokę, środek przeciwbakteryjny i przeciwgrzybiczy, środki izotoniczne i opóźniające wchłanianie itp. Zastosowanie takich ośrodków i czynników do substancji aktywnych farmaceutycznie jest znane w stanie techniki. O ile jakikolwiek konwencjonalny ośrodek albo czynnik nie jest niezgodny z substancją czynną, uwzględniane jest jego zastosowanie w kompozycjach terapeutycznych. Dodatkowe składniki czynne można również włączyć do kompozycji.

Roztwory składników czynnych w postaci wolnej zasady albo soli dopuszczalnej farmakologicznie, można wytworzyć w wodzie odpowiednio zmieszanej z surfaktantem, takim jak hydroksypropyloceluloza. Można również wytworzyć zawiesinę w glicerynie, płynnych poliglikolach etylenowych, ich mieszaninach oraz wolejach. W warunkach standardowych przechowywania i zastosowania, preparaty te zawierają środki zapobiegające rozwojowi mikroorganizmów.

Wektory ekspresyjne i nośniki według wynalazku mogą obejmować klasyczne preparaty farmaceutyczne. Podawanie kompozycji terapeutycznych według wynalazku można wykonać dowolną konwencjonalną drogą o ile tkanka docelowa jest dostępna tą drogą. Obejmuje to podawanie doustne, donosowe, podpoliczkowe, doodbytnicze, dopochwowe albo miejscowe. Alternatywnie, podawanie można wykonać przez wstrzyknięcie ortotopowe, śródskórne, dooczne, podskórne, domięśniowe, dootrzewnowe albo dożylne. Kompozycje takie powinny być normalnie podawane jako kompozycje dopuszczalne farmaceutycznie, zawierające dopuszczalne fizjologicznie nośniki, bufory albo inne zarobki.

Kompozycje terapeutyczne według wynalazku są korzystnie podawane w postaci kompozycji do wstrzyknięć, w roztworach wodnych albo zawiesinach; można również wytworzyć je w postaci stałej przydatnej do rozpuszczenia albo zawieszenia w płynie przed podaniem. Preparaty te można również emulgować. Typowa kompozycje służąca w tym celu zawiera nośnik dopuszczalny farmaceutycznie. Przykładowo, kompozycja może zawierać 10 mg, 25 mg, 50 mg albo do około 100 mg albuminy surowicy ludzkiej na ml roztworu soli buforowanego fosforanem. Inne dopuszczalne farmaceutycznie nośniki obejmują roztwory wodne, nie toksyczne zarobki, w tym sole, konserwanty, bufory itp. Przykłady bezwodnych rozpuszczalników obejmują poliglikol propylenowy, poliglikol etylenowy, olej roślinny i możliwe do wstrzyknięcia estry

186 018 organiczne takie jak ester oleinowy etylu. Nośniki wodne obejmują wodę, wodne roztwory alkoholu, roztwory soli, nośniki pozajelitowe takie jak chlorek sodu, dekstroza Ringera itp. Nośniki dożylne obejmują dożylne środki nawadniające i odżywcze. Konserwanty obejmują środki przeciwko drobnoustrojom, środki przeciwutleniające, środki chelatujące i gazy obojętne. pH i stężenie różnych składników ustala się według znanych parametrów.

Dodatkowe kompozycje są przydatne do podawania doustnego. Kompozycje doustne obejmują takie typowe zarobki jak, przykładowo, farmaceutycznie dopuszczalny mannitol, laktoza, skrobia, stearynian magnezu, sól sodowa sacharyny, celuloza, węglan magnezu itp. Kompozycje takie przybierają postać roztworów, zawiesin, tabletek, pigułek, kapsułek, kompozycji do opóźnionego uwalniania albo proszku. Gdy wybrana jest miejscowa droga podawania mogą przybierać postać kremu, mazidła, maści, płynu albo rozpylacza.

Skuteczna ilość środka terapeutycznego określana jest na podstawie zamierzonego celu, przykładowo (i) zahamowania proliferacji komórek nowotworowych albo (ii)usuwania komórek nowotworowych. Określenie „dawka jednostkowa” dotyczy fizycznie oddzielonych jednostek przydatnych do zastosowania u osobnika, przy czym każda zawiera uprzednio określoną ilość kompozycji terapeutycznej obliczonej na wywołanie pożądanej reakcji, opisanej powyżej, w powiązaniu z jej podawaniem, tj. odpowiednia drogą i schematem podawania. Podawana ilość, zależnie od liczby podań i dawki jednostkowej, zależy od leczonego osobnika, jego stanu i pożądanej ochrony. Konkretne ilości kompozycji terapeutycznej również zależą od oceny praktyka i dla każdego osobnika są ściśle określone.

W pewnych wykonaniach, może być pożądane zapewnienie pacjentowi ciągłego dostarczania kompozycji terapeutycznej. Dla dróg podania dożylnego albo dotętniczego zapewnia się to stosując podawanie kroplowe. Dla zastosowań miejscowych, należy zastosować kolejne podania. Dla różnych podejść można zastosować kompozycje o opóźnionym uwalnianiu, które zapewniają ograniczone ale stałe ilości środka terapeutycznego w ciągu długiego czasu. Do zastosowań wewnętrznych korzystne może być zastosowanie ciągłej perfuzji określonego regionu. Można to osiągnąć przez cewnikowanie, w niektórych przypadkach pooperacyjne, poprzedzającym ciągłe podawanie środka terapeutycznego. Czas perfuzji powinien być dobrany prze klinicystę dla konkretnego pacjenta i sytuacji, ale może zawierać się od o koło 1-2 godzin do 2-6 godzin, do około 6-10 godzin, do około 10-24 godzin, do około 1-2 dni, do około 1-2 tygodni albo dłużej. Ogólnie, dawka kompozycji terapeutycznej drogą ciągłej perfuzji powinna być równoważna dawce podawanej we wstrzyknięciu pojedynczym albo w licznych wstrzyknięciach, dostosowana do okresu czasu w którym podawane są wstrzyknięcia. Uważa się, że drogą perfuzji można uzyskać wyższe dawki.

Protokół kliniczny SCCHN

Opracowano protokół kliniczny w celu ułatwienia leczenia choroby SCCHN, przy użyciu opisanych wyżej przykładowo konstruktów adenowirusowych. Zgodnie z tym protokołem, wyselekcjonowano pacjentów z histologicznym potwierdzeniem raka łuskowatokomórkowego głowy i szyi. Pacjenci mogli, choć nie musieli otrzymać uprzedniego leczenia w postaci chemio- albo radioterapii albo terapii genowej. Optymalnie, pacjenci powinni mieć odpowiednią czynność szpiku (określoną na podstawie całkowitej liczby granulocytów obwodowych rzędu > 2000/mm³ i liczbę płytek rzędu 100000/mm³), odpowiednią czynność wątroby (bilirubina <1,5 mg/dl) i odpowiednią czynność nerek (kreatynina <1,5 mg/dl).

Protokół wymagał jednorazowej dawki, podanej drogą wstrzyknięcia doguzowego, kompozycji farmaceutycznej obejmującej od 10⁶ do 10⁹ cząstek zakaźnych adenowirusowego konstruktu ekspresyjnego p53. Dla guzów o średnicy > 4 cm, podawana objętość wynosiła

4-10 ml (korzystnie 10 ml), podczas gdy dla guzów < 4 cm, objętość wynosiła 1-3 ml (korzystnie 3 ml). Dla pojedynczej dawki wykonywano wstrzyknięcia wielokrotne podawane w objętościach 0,1-0,5 ml, w odstępach 1 cm albo więcej.

Kurs leczenia obejmował około sześciu dawek, podawanych w trakcie dwóch tygodni. W przypadku decyzji klinicysty schemat mógł być kontynuowany przy zastosowaniu sześciu dawek co dwa tygodnie albo rzadziej (co miesiąc, co dwa miesiące, co trzy miesiące itd.).

W przypadku gdy pacjent kwalifikował się do usunięcia chirurgicznego, guz leczono w opisany wyżej sposób przez co najmniej dwa kolejne dwutygodniowe kursy. W ciągu tygo186 018 dnia od zakończenia drugiego (albo np. trzeciego, czwartego, piątego, szóstego, siódmego, ósmego itd.) kursu pacjenta poddawano zabiegowi chirurgicznemu. Przed zamknięciem nacięcia, do miejsca operacji (nisza operacyjna) wprowadzano 10 ml kompozycji farmaceutycznej zawierającej adenowirusowy konstrukt ekspresyjny p53 (10⁶-10⁹ cząstek zakaźnych) i pozostawiano w kontakcie przez 60 minut. Ranę zamykano i pozostawiając dren albo cewnik. Trzeciego dnia po operacji podawano przez dren dodatkowe 10 ml kompozycji farmaceutycznej i pozostawiano w niszy operacyjnej przez co najmniej dwie godziny. Następnie usuwano zawartość przez odsysanie i usuwano dren w odpowiednim czasie.

Leczenie sztucznych i naturalnych jam ciała

Jednym z głównych źródeł nawrotów SCCHN jest resztkowa, mikroskopowa choroba, pozostająca w pierwotnym miejscu guza, jak również lokalnie i regionalnie. Oprócz tego, analogiczna sytuacja występuje, gdy naturalne jamy ciała zasiedlane są przez komórki mikroskopowych guzów. Skuteczne leczenie takiej choroby mikroskopowej powinno stanowić istotny postęp w schematach leczenia.

Tak więc, w pewnych wykonaniach, raka można usunąć przez wycięcie chirurgiczne, z wytworzeniem jamy”. W czasie zabiegu i później (okresowo albo ciągle) do jamy podawana jest kompozycja terapeutyczna według wynalazku. Jest to zasadniczo podawanie „miejscowe” na powierzchnię jamy. Objętość kompozycji powinna być wystarczająca do zapewnienia kontaktu całej powierzchni jamy z konstruktem ekspresyjnym.

W jednym wykonaniu, podawanie obejmuje po prostu wstrzyknięcie kompozycji terapeutycznej do jamy wytworzonej przez wycięcie guza. W innym wykonaniu, może być pożądane podawanie mechaniczne w postaci gąbki, sączka albo innego urządzenia. Każde z tych podejść można zastosować po usunięciu guza, jak również podczas początkowego zabiegu. W jeszcze innym wykonaniu, cewnik wprowadza się do jamy przed zamknięciem rany operacyjnej. Następnie jama może być perfundowana przez pożądany okres czasu.

W innej postaci tego leczenia, stosuje się „miejscowe” zastosowanie kompozycji terapeutycznej w naturalnej jamie ciała takiej jak usta, gardło, przełyk, krtań, tchawica, jama opłucna, jama otrzewna albo jamy narządów pustych takich jak pęcherz, okrężnica albo inne narządy trzewne. Leczenie jest ukierunkowane na chorobę mikroskopową w jamie, ale przypadkowo może również wpłynąć na masę guza pierwotnego, jeżeli nie został uprzednio usunięty albo na ubytek przednowotworowy, obecny w jamie. Ponownie, w celu „miejscowego” zastosowania wobec narządów trzewnych albo powierzchni jamy można zastosować różne sposoby. Przykładowo, jama ustna w gardle może być osiągnięta przez zwykłe przepłukanie albo gulgotanie roztworem. Jednakże, leczenie miejscowe krtani i tchawicy może wymagać obrazowania endoskopowego i miejscowego dostarczania kompozycji terapeutycznej. Narządy trzewne takie jak pęcherz albo śluzówka mogą wymagać cewników do infuzji albo bezpośredniej wizualizacji przy użyciu cystoskopu albo innego urządzenia endoskopowego. Jamy takie jak jama opłucna albo otrzewna mogą być dostępne dzięki cewnikom albo z dojścia chirurgicznego zapewniającego dostęp do tych obszarów.

Śledzenie ekspresji p53 po podaniu

Inny aspekt wynalazku obejmuje śledzenie ekspresji p53 po podaniu kompozycji terapeutycznej. Ponieważ nie można obserwować zniszczenia komórek mikroskopowych guzów ważne jest, aby określić czy miejsce docelowe skutecznie skontaktowało się z konstruktem ekspresyjnym. Można to osiągnąć przez identyfikację komórek, w których wytworzony został produkt konstruktu ekspresyjnego p53. Ważne jest jednakże, aby rozróżnić pomiędzy endogennym p53 i tym obecnym w komórkach nowotworowych i nienowotworowych w obszarze leczonym. Znakowanie egzogennego p53 pierwiastkiem śladowym powinno dostarczyć ostatecznych dowodów na ekspresję tej cząsteczki i wykluczyć jej endogenna wersje.

Jeden z takich znaczników dostarcza układ FLAG (Hopp i in., 1988). Polipeptyd FLAG jest oktapeptydem (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lvs), zaś jego małe wymiary nie zakłócają ekspresji białka dostarczonego terapią genową. Równoczesna ekspresja FLAG i interesującego białka śledzona jest przez zastosowanie przeciwciał wywołanych przeciwko białku FLAG.

186 018

Można również zastosować inny układ znacznika immunologicznego, taki jak układ 6XHis (Qiagen). W tym celu dowolny liniowy, epitop można zastosować w celu wytworzenia białka fuzyjnego z p53 o ile (i) integralność immunologiczna epitopu nie jest zakłócona przez fuzję i (ii) integralność funkcjonalna p53 nie jest przez nią zakłócona.

E. Protokoły leczenia skojarzonego

Oporność komórek nowotworowych na środki uszkadzające DNA stanowi główny problem w onkologii klinicznej. Jednym z celów współczesnych badań nad nowotworami jest znalezienie sposobu poprawy skuteczności chemio- i radioterapii przez skojarzenie z terapią genową. Przykładowo, gen kinazy tymidynowej wirusa opryszczki (HS-tK) po dostarczeniu do nowotworów mózgu przez układ wektora retrowirusowego z powodzeniem wywołał wrażliwość na przeciwwirusowy lek - gancyklovir (Culver i in., 1992). W kontekście niniejszego wynalazku uwzględnia się, że terapia p53 może być stosowana podobnie w skojarzeniu z interwencją chemio- albo radioterapeutyczną.

W celu niszczenia komórek takich jak komórki nowotworowe albo komórki przerzutów, przy użyciu sposobów i kompozycji według wynalazku, można ogólnie doprowadzić do kontaktu komórki „docelowej” z wektorem ekspresyjnym i przynajmniej jednym środkiem uszkadzającym DNA. Takie kompozycje powinny być dostarczone w ilości skutecznej do zniszczenia albo zahamowania proliferacji komórek. Proces ten może obejmować doprowadzenie do kontaktu pomiędzy komórkami i wektorem ekspresyjnym oraz środkiem albo czynnikiem uszkadzającym DNA w tym samym czasie. Można to osiągnąć przez doprowadzenie do kontaktu komórki z pojedynczą kompozycją albo formulacją farmakologiczną, zawierającą oba czynniki, albo przez doprowadzenie do kontaktu komórki z dwiema różnymi kompozycjami albo formulacjami w tym samym czasie podczas gdy jedna kompozycja zawiera wektor ekspresyjny p53 zaś druga zawiera środek uszkadzający DNA.

Alternatywnie, leczenie p53 może poprzedzą albo następować po leczeniu środkiem uszkadzającym DNA w odstępie od minut do tygodni. W wykonaniu gdzie czynnik uszkadzający DNA i wektor ekspresyjny p53 są stosowane osobno, należy się upewnić, że nie upłynął istotny czas pomiędzy oboma podaniami, tak, że środek uszkadzający DNA i wektor ekspresyjny wciąż są zdolne do wywierania korzystnego skojarzonego wpływu na komórkę. W takich warunkach uwzględnia się, że można doprowadzić do kontaktu komórki z oboma czynnikami w ciągu około 6 godzin do tygodnia, korzystnie w ciągu 24-72 godzin, najkorzystniej z odstępem tylko około 48 godzin. W niektórych sytuacjach jednakże, może być pożądane rozszerzenie okresu czasu leczenia, gdzie odstępy kilkudniowe (2, 3, 4, 5, 6 albo 7) do kilkutygodniowych (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 albo 8) oddzielają kolejne podania.

Jest również przekonywujące, że może być pożądane więcej niż jedno podanie konstruktu p53 albo środka uszkadzającego DNA. Można wykorzystać różne kombinacje, w których „A” oznacza p53, zaś „B” środek uszkadzający DNA.

A/B/A	B/AB	BB/A	A.WB	H/AJA	ABB	A/BB/B
B/B/B/A	B/B/A/B	A/ABB	AB/AB	ABB/A	BB/A/A	B/ABB
B/A/B/A		A/A/AB	B/A/A/A	AJB//AJA	A/AB/A	B/A/AB

W celu uzyskania niszczenia komórek oba czynniki dostarczane są do komórki w skojarzonej ilości skutecznej do zniszczenia komórki.

Środki albo czynniki uszkadzające DNA określone tu są jako dowolny związek chemiczny albo metoda leczenia wywołująca uszkodzenie DNA po zastosowaniu wobec komórki. Czynniki i środki takie obejmują promieniowanie i fale wywołujące uszkodzenie DNA, takie jak promieniowanie y, promieniowanie rentgenowskie, promieniowanie UV, mikrofale, emisja elektronów itp. Różne związki chemiczne, opisane również jako „środki chemloterapeutyczne” działają w sposób uszkadzający DNA, przy czym mogą być one zastosowane w ujawnionych tu sposobach skojarzonego leczenia. Środki chemioterapeutyczne uwzględniane jako przydatne obejmują, np. adriamycynę, 5-fluorouracyl (5FU), etopozyd (VP-16), kamptotecynę, aktynomycynę D, mitomycynę C, cisplatynę (CDDP), a nawet nadtlenek wodoru. Wynalazek obejmuje również zastosowanie kombinacji jednego albo wielu środków uszkadzających DNA, opartych na promieniowaniu albo związków chemicznych, takie jak

186 018 zastosowanie promieniowania rentgenowskiego i cisplatyny, albo zastosowanie cisplatyny i etopozydu. W pewnych wykonaniach, zastosowanie cisplatyny w kombinacji z wektorem ekspresyjnym p53 jest szczególnie korzystne.

Podczas leczenia raka, według wynalazku, doprowadza się do kontaktu pomiędzy komórkami nowotworowymi i środkiem uszkadzającym DNA oraz wektorem ekspresyjnym. Można to osiągnąć przez napromieniowanie miejsca nowotworu promieniowaniem uszkadzającym DNA, takim jak promienie rentgenowskie, światło UV, promienie y albo nawet mikrofale. Alternatywnie, komórki nowotworowe można doprowadzić do kontaktu ze środkiem uszkadzającym DNA przez podanie osobnikowi ilości skutecznej terapeutycznie kompozycji farmaceutycznej zawierającej związek uszkadzający DNA taki jak, adriamycyna, 5-fluoro-uracyl, etopozyd, kamptotecyna, aktynomycyna D, mitomycyna C albo korzystnie cisplatyna. Środek uszkadzający DNA można wytworzyć i zastosować w skojarzonej kompozycji terapeutycznej albo zastawie przez połączenie jej z wektorem ekspresyjnym p53, jak to opisano wyżej.

Środki, które bezpośrednio sieciują polinukleotydy, zwłaszcza DNA, jak się przewiduje i jak tu wykazano, prowadzą do uszkodzenia DNA dając synergistyczną kombinację przeciwnowotworową Można zastosować środki takie jak cisplatyna i inne środki alkilujące DNA. Cisplatynę stosuje się powszechnie do leczenia raka, w skutecznych dawkach stosowanych w praktyce klinicznej rzędu 20 mg/m² przez 5 dni co trzy tygodnie przez trzy kursy. Cisplatyna nie wchłania się po podaniu doustnym i musi być podawana przez wstrzyknięcie dożylne, podskórne, doguzowe albo dootrzewnowe.

Środki, które uszkadzają DNA obejmują również związki zakłócające replikację DNA, mitozę i segregację chromosomów. Takie środki chemioterapeutyczne obejmują adriamycynę, znaną również jako doksorubicyna, etopozyd, werapamil, podofilotoksynę itp. Szeroko stosowane w klinice do leczenia nowotworów; związki te są podawane we wstrzyknięciach typu bolus, dożylnie w dawkach od 25 do 27 mg/m2 w odstępach 21-dniowych dla adriamycyny i 33-50 mg/m2 dla etopozydu, dożylnie albo doustnie w podwnjonej dawce dożylnej.

Środki zakłócające syntezę i czułość prekursorów polinukleotydowych oraz podjednostek również prowadzą do uszkodzenia DNA. W tym celu opracowano wiele prekursorów polinukleotydowych. Szczególnie przydatne są środki, które poddano intensywnym badaniom i są łatwo dostępne. Środki takie jak 5-fluorouracyl (5-FU) są szczególnie wykorzystywane przez tkankę nowotworową, czyniąc ten środek szczególnie przydatnym do kierowania na komórki nowotworowe. Mimo iż dość toksyczny, 5-FU można stosować w szerokim zakresie nośników, w tym miejscowo, przy czym podawanie dożylne w dawkach od 3 do 15 mg/kg/dzień jest najszerzej stosowane. .

Inne czynniki, które powodują uszkodzenie DNA i są szeroko stosowane obejmują tzw; promienie y, promienie rentgenowskie i/lub ukierunkowane dostarczanie radioizotopów do komórek nowotworowych. Uwzględniane są również inne postaci czynników uszkadzających DNA takie jak mikrofale i promieniowanie UV. Najprawdopodobniej wszystkie te czynniki wpływają na szeroki zakres uszkodzeń DNA, albo prekursorów DNA, replikację i naprawę DNA, łączenie się i utrzymywanie chromosomów. Zakres dawek dla promieniowania rentgenowskiego zawiera się w zakresie od codziennych dawek 50-200 rentgenów przez czas dłuższy (3-4 tygodnie), do pojedynczych dawek po 2000 do 6000 rentgenów. Dawkowanie zawiera się dla radioizotopów w bardzo szerokim zakresie i zależy od okresu półtrwania izotopu, siły i rodzaju emitowanego promieniowania i wychwytu przez komórki nowotworowe.

Specjalista jest kierowany do, ,Remmgton's Pharmaceutical Sciences” wyd. 15, rozdział 33, w szczególności str. 624-652. Pewne odmiany dawkowania wystąpią z pewnością zależnie od stanu leczonego osobnika. Specjalista odpowiedzialny za dawkowanie powinien w każdym przypadku określić odpowiednią dawkę dla konkretnego osobnika. Ponadto, przy podawaniu ludziom, preparaty powinny spełniać standardy dotyczące sterylności, pirogenności, bezpieczeństwa i czystości wymagane przez FDA Office of Biologies.

Wynalazcy proponują, że regionalne dostarczanie wektorów ekspresyjnych p53 pacjentowi z nowotworem związanym z p53 powinno być bardzo skutecznym sposobem dostarczania skutecznego terapeutycznie genu w celu przeciwdziałania klinicznej chorobie. Podobnie, chemio- i radioterapia może być ukierunkowana na konkretny zajęty region ciała osobnika.

186 018

Alternatywnie, dostarczanie układowe wektora ekspresyjnego albo czynnika uszkadzającego DNA może być odpowiednie w pewnych okolicznościach, przykładowo, gdy nastąpiły masywne przerzuty.

Terapia cytokinami okazała się być skutecznym partnerem w skojarzonych schematach terapeutycznych. Różne cytokiny można zastosować w takich skojarzonych podejściach. Przykłady cytokin obejmują IL-1a, IL-I,, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6,. IL-7, IL-8, IL-9, IL10, IL-11, IL-12, IL-13, TGF-β, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-a, TNF-β, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-α, IFN-β-, IFN-γ. Cytokiny podaje się według standardowych schematów, jak to opisano poniżej, zgodnie ze wskazaniami klinicznymi takimi jak stan pacjenta i względna toksyczność cytokiny.

Oprócz tego, w celu skojarzenia terapii ukierunkowanych na p53 z chemio-, radioterapią i leczeniem cytokinami uwzględnia się również, że może być korzystne skojarzenie z innymi terapiami genowymi. Przykładowo, ukierunkowanie na mutacje K-ras i p53 w tym samym czasie może spowodować ulepszone leczenie przeciwnowotworowe. Ten sposób może być ukierunkowany na dowolny gen związany z nowotworem, np. p21, p16, p27, E₂F, rodzina genów Dp, Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, vHl, FCC, MCC, inne cząsteczki ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun, trk, ret, gsp, hst, bel i abl. Może być również pożądane skojarzenie terapii p53 z terapią genową opartą na przeciwciałach obejmującą zastosowanie konstruktu przeciwciała jednołańcuchowego w którym przeciwciało wiąże się z dowolną poprzedzających cząsteczek albo w kombinacji z genami kodującymi jedną albo wiele cytokin wymienionych powyżej. Może być również korzystne skojarzenie p53 z innym genem, związanym z procesami apoptozy, np. adenowirusowym E1A, Bax, Bcl-X_s itp.

F. Zestawy

Wszystkie niezbędne materiały i odczynniki konieczne do hamowania proliferacji komórek nowotworowych mogą być połączone w jednym zestawie. Obejmuje to ogólnie wybrane adenowirusowe wektory ekspresyjne. Mogą również występować różne pożywki do replikacji wektorów ekspresyjnych i komórek gospodarza do takich replikacji. Takie zestawy obejmują osobne pojemniki dla każdego poszczególnego reagenta.

Gdy składniki zestawu dostarczone są w jednym albo wielu roztworach, roztwór jest korzystnie wodnym roztworem, przy czym sterylny roztwór wodny jest szczególnie korzystny. Do zastosowania in vitro wektor ekspresyjny można wytwarzać w dopuszczalnej farmaceutycznie kompozycji do strzykawek. W tym przypadku, pojemnik sam może być inhalatorem, strzykawką, pipetą, wkraplaczem albo innym urządzeniem tego rodzaju, z którego kompozycja może być podawana do zajętego rejonu ciała, takiego jak płuca, wstrzykiwana do organizmu zwierzęcia, albo nawet podawana i mieszana z innymi składnikami zestawu.

Składniki zestawu mogą również być w postaci wysuszonej albo liofilizowanej. Gdy reagenty albo składniki dostarczone są w postaci wysuszonej, rekonstytucja zachodzi ogólnie przez dodanie odpowiedniego rozpuszczalnika. Przewiduje się, że rozpuszczalnik może być dostarczony w innym zbiorniku. Zestawy według wynalazku obejmują również zwykle zasobniki utrzymujące fiolki ze sobą, do celów handlowych, takie jak wtryskiwane albo wydmuchiwane plastikowe zasobniki, w których trzymane są fiolki. Niezależnie od liczby i rodzaju zasobników, zestawy według wynalazku mogą również zawierać, albo być pakowane razem z urządzeniem do wstrzykiwania/podawania albo umieszczania kompozycji kompleksu w organizmie zwierzęcia. Urządzeniem takim może być inhalator, strzykawka, pipeta, szczypce, łyżka miarowa, wkraplacz albo jakikolwiek zatwierdzony w medycynie nośnik do podawania.

G. Model zwierzęcy zasiedlania przez mikroskopowe nowotwory i choroby resztkowej

Inny aspekt wynalazku dotyczy opracowania modelu zwierzęcego do analizy mikroskopowego nowotworu resztkowego i mikroskopowego zasiedlania jam ciała. „Rak” w znaczeniu tu użytym może oznaczać pojedynczą komórkę albo wielokomórkową masę nowotworową. W chorobie mikroskopowej, „guz” zawiera jedną albo kilka komórek raka, których nie można obserwować gołym okiem.

Model zwierzęcy opisany tu szczególnie korzystnie naśladuje (i) środowisko po zabiegu chirurgicznym pacjentów z rakiem głowy i szyi, w szczególności w stadium zaawansowanym

186 018 i (ii) jamę ciała dotkniętego osobnika, w której umiejscowił się rak mikroskopowy. Model, podobny do innych modeli zwierzęcych raka, pochodzi z wszczepionych zwierzęciu komórek nowotworowych. Różnica, jednakże, polega na wytworzeniu podskórnie kieszonki, która stanowi fizjologiczny zamiennik naturalnej jamy ciała albo jamy po zabiegu chirurgicznym wytworzonej przez wycięcie masy nowotworu.

Niniejszy wynalazek przykładowo wykorzystuje jako modelowy organizm myszy nagie. Praktycznie dowolne zwierzę może być zastosowane, jednakże, zastosowane według wynalazku. Szczególnie korzystnymi zwierzętami są małe ssaki, stosowane rutynowo w laboratoriach. Jeszcze bardziej korzystnymi zwierzętami są gryzonie, takie jak myszy, szczury, świnki morskie i chomiki. Króliki są również korzystnym gatunkiem. Kryteria doboru zwierzęcia zależą w większości od szczególnych upodobań badacza.

Pierwszym etapem jest wytworzenie u zwierzęcia doświadczalnego płata tkanki. Określenie „płat tkanki” oznacza nacięcie w ciele zwierzęcia, które eksponuje tkankę docelową. Korzystne jest, żeby nacięcie było wykonane na grzbiecie zwierzęcia, co stanowi łatwo dostępne miejsce. Jednakże, należy rozumieć, że nacięcie może być wykonane w dowolnym miejscu zwierzęcia, zaś wybór tkanki zależy od różnych czynników takich jak konkretny rodzaj leku, który ma być zbadany.

Gdy tkanka docelowa jest odsłonięta, komórki raka pojedynczo albo w guzach mikroskopowych poddane są kontaktowi z tkanką. Najwygodniejszy sposób zasiedlenia komórkami nowotworowymi polega na wprowadzeniu zawiesiny pożywki hodowlanej zawierającej komórki na odsłoniętą tkankę. Nałożenie komórek nowotworowych można osiągnąć przez zastosowanie sterylnej pipety albo dowolnego wygodnego aplikatora. Naturalnie tę procedurę przeprowadza się w warunkach jałowych.

W jednym wykonaniu, 2,5x10° komórek SCCHN wszczepia się do eksponowanego płata tkanki myszy nagiej. Specjalista może określić, dla danego zastosowania, jaka jest odpowiednia liczba komórek. Liczba komórek zależy od różnych czynników, takich jak wielkość zwierzęcia, miejsce nacięcia, zdolność replikacyjna samych komórek nowotworowych, czasu przeznaczonego na wzrost nowotworu, siły badanego środka przeciwnowotworowego itp. Jakkolwiek, ustalenie optymalnego układu modelowego dla konkretnego rodzaju nowotworu może wymagać pewnego dostrojenia liczby podawanych komórek, nie stanowi to niepotrzebnego doświadczenia. Specjalista w dziedzinie doświadczeń na zwierzętach zauważy, że konieczna jest taka optymalizacja.

Można to osiągnąć, przykładowo, przez przeprowadzenie wstępnych badań różniących się liczbą podawanych komórek, zaś wzrost nowotworu śledzony jest po zamknięciu płata tkanki.

Naturalnie, podanie większej liczby komórek powoduje większą populację komórek mikroskopowych nowotworów resztkowych.

W niniejszym badaniu, płaty zostały skutecznie przyszyte szwem materacowym. Jednakże, przewiduje się, że specjalista może zastosować dowolny spośród różnych sposobów rutynowo stosowanych do zamykania nacięć, takich jak zastosowanie klejów, klamer, szwów itp., zależnie od uwzględnianego zastosowania.

H. Przykłady

Poniższe przykłady dostarczono jedynie w celu zilustrowania pewnych konkretnych wykonań i nie powinny być uważane za ograniczające w żaden sposób zakres wynalazku.

Przykład 1

Zahamowanie wzrostu komórek ludzkiego raka głowy i szyi przez wprowadzenie genu p53 typu dzikiego drogą rekombinowanego adenowirusa

Materiały i metody

Linie komórkowe i warunki hodowli. Ludzkie linie komórkowe SCCHN Tu-138 i Tu-177 zostały ustalone w Department of Head and Neck Surgery, M.D. Anderson Cancer Center. Tu-138 i Tu-177 ustalono z, odpowiednio, umiarkowanie zróżnicowanego raka łuskowatokomórkowego wargi i policzka i słabo zróżnicowanego raka łuskowatokomórkowego gardzieli. Obie linie komórkowe opracowano techniką pierwotnego eksplantu i były one cytokeratyno-pozytywne oraz tworzyły guzy na myszach bezgrasiczych oraz myszach SCID. Komórki te hodowano

186 018 w pożywce DMEM/F12 z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej inaktywowanej ciepłem (FBS) z penicyliną/streptomycyną.

Wytwarzanie rekombinowanego adenowirusa i zakażenie. Rekombinowany adenowirus p53 (Ad5CMV-p53) (Zhang i in., 1994) zawiera promotor wirusa cytomegalii (CMV), cDNA p53 typu dzikiego oraz sygnał poliadenylacji SV40 w kasecie minigenu wprowadzonej w miejsce usuniętego regionu E1 w modyfikowanym adenowirusie typu 5 (Ad5).

Roztwory wyjściowe wirusa namnażano na komórkach 293. Komórki zbierano 36-40 godzin po zakażeniu, wirowano, zawieszano w roztworze soli buforowanym fosforanem, poddawano Lizie i usuwano resztki komórkowe przez oczyszczenie na gradiencie CsCl. Stężony wirus dializowano, porcjowano i przechowywano w-80°C. Zakażenie przeprowadzano przez dodanie wirusa w pożywce DMEM/F12 i 2% FBS do jednowarstw komórkowych, komórki inkubowano w37°C przez 60 minut wytrząsając, następnie dodawano kompletnej pożywki (DMEM/F12/10% FBS) i inkubowano komórki w 37°C przez pożądany czas.

Analiza metodą Northern. Całkowity RNA wyizolowano metodą z izotiocyjanianem guanidyny (Chomczynski i Sacchi, 1987). Analizy Northern wykonywano na 20 pg całkowitego RNA. Membranę hybrydyzowano z sondą cDNA p53, znakowaną starterami losowymi w roztworze 5xSSC/5x roztwór Denhardta /0,5% SDS/ denturowany DNA spermy łosia (20 pg/ml). Membranę również „zdzierano” i ponownie hybrydyzowano z cDNA GAPDH w celu skontrolowania ilości RNA. Względne ilości ekspresjonowanego p53 określano densytometrią (Molecular Dynamics Inc., Sunnyvale, CA).

Analizy metoda Western. Lizaty komórek wytworzono przez sonikację komórek w 24 godziny po zakażeniu, w buforze RIPA (150 mM NaCl, 1,0% NP.-40, 0,5% DOC, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) przez 5 s. 50 pg białka z próbki poddano SDS-PAGE na 10% żelu i przeniesiono na membranę Hybond-ECL (Amersham). Membrane zablokowano Blotto/Tween (5% odtłuszczone mleko w proszku, 0,2% Tween 20, 0,02% azydek sodu w roztworze soli buforowanym fosforanem) i sondowano przeciwciałami pierwotnymi, mysimi przeciwciałami monoklonałnymi pAb1801 przeciwko ludzkiemu p53 i mysimi przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko ludzkiej β-aktynie (Amersham) oraz wtórnym przeciwciałem, kozim przeciwciałem sprzęgniętym z peroksydazą chrzanową przeciwko mysim IgG (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Membranę obrabiano i wywoływano według wskazań producenta.

Analiza immunohistochemiczna. Zakażone jednowarstwy komórkowe utrwalono 3,8% formaliną i traktowano 3% H2O 2 w metanolu przez 5 minut. Barwienie immunohistochemiczne wykonano przez zastosowanie zestawu Vectastain Elite (Vector, Burlin-game, CA). Zastosowanym przeciwciałem pierwotnym było przeciwciało przeciwko p53 - PAb1801, zaś przeciwciałem wtórnym było przeciwciało przeciwko mysim IgG znakowane awidyną (Vector). Reagent kompleksu biotynowanej peroksydazy chrzanowej ABC zastosowano do wykrywania kompleksu antygenu z przeciwciałem. Kontrole preadsorpcji zastosowano w każdym znakowaniu. Komórki podbarwiono hematoksyliną Harris'a (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).

Test wzrostu komórek. Komórki wysiano w gęstości 2x10⁴ komórek/ml w6-studzienkowych płytkach w potrójnych powtórzeniach. Komórki zakażono adenowirusem typu dzikiego (Ad5CMV-p53) albo niezdolnym do replikacji jako kontrola. Komórki zbierano co 2 dni, liczono i określano ich żywotność metodą z błękitem trypanu.

Zahamowanie wzrostu guza in vivo. Wpływ Ad5CMV-p53 na ustalone podskórne guzy nowotworowe określano na myszach nagich w określonym środowisku pozbawionym patogenów. Doświadczenia zostały ocenione i zatwierdzone przez komitety opieki nad zwierzętami jak również wykorzystania badań nad rekombinowanym DNA. Pokrótce, po indukcji znieczulenia acepromazyną/ketaminą, wykonano trzy osobne fałdy podskórne i każdemu ze zwierząt wstrzyknięto podskórnie w każdy z płatów po 5x10⁶ komórek w 150 ml kompletnej pożywki przy użyciu tępej igły, komórki utrzymywano w kieszonce horyzontalnym szwem materacowym. Dla każdej z linii komórkowych zastosowano cztery zwierzęta. Po 4 dniach zwierzęta ponownie znieczulono i ponownie uniesiono płaty w celu dostarczenia 100 ml 1) Ad5CMV-p53 (50 MOI) w prawy płat przedni; 2) wirusa niezdolnego do replikacji (50 MOI) w prawy tylny płat i 3) samo podłoże transportowe w lewy tylny płat. Wszystkie miejsca wstrzyknięcia rozwinęły podskórne widoczne i wyczuwalne guzki przed podaniem leczenia.

186 018

Zwierzęta obserwowano codziennie i zabito dnia 20. Objętość guza in vivo obliczono przez założenie kulistego kształtu o przeciętnej średnicy wyliczonej jako pierwiastek kwadratowy średnicy przekroju. Po zabiciu, wycięte guzy mierzono w trzech wymiarach mikrometrycznie w celu określenia objętości guza. W celu zbadania istotności różnic pomiędzy średnimi w próbce zastosowano nieparametryczny dwuodnogowy test Friedman'a ANOVA, przy użyciu pakietu oprogramowania SPSS/PC+ (SPSS Inc., Chicago, II).

Wyniki

Zakażenie adenowirusem komórek SCCHN. Warunki do optymalnego zakażenia adenowirusem komórek Tu-138 i Tu-177 określono przez zakażenie tych komórek adenowirusem wyrażającym gen β-gal E. coli. Skuteczność transdukcji oceniono przez policzenie liczby błękitnych komórek po zabarwieniu X-gal. Okazało się, że istnieje liniowa zależność pomiędzy liczbą komórek zakażonych i liczbą zastosowanych cząstek wirusowych. Komórki zakażone pojedynczą dawką 100 MOI adenowirusa β-gal wykazywały 60% zakażonych komórek (Fig. 1) i wynik ten poprawiał się do 100% przez wielokrotne zakażenia. Skuteczność transdukcji tego wektora w komórkach SCCHN jest nieco różna od obserwowanej na innych liniach komórkowych badanych uprzednio: linie HeLa, HepG2, LM2 i ludzkiego nie drobnokomórkowego raka płuc wykazywały 97 do 100% skuteczności zakażenia po inkubacji z 30-50 MOI adenowirusa β-gal (Zhang i in., 1994).

Ekspresja egzogennego mRNA p53 w komórkach SCCHN zakażonych adenowirusem. Do badania wybrano dwie ludzkie linie komórkowe SCCHN: obie linie komórkowe Tu-138 i Tu-177 posiadały zmutowany gen p53. Ostatnio wytworzony rekombinowany adenowirus p53 typu dzikiego, Ad5CMV-p53, zastosowano do zakażenia komórek Tu-138 i Tu-177. 24 godziny po zakażeniu, wyizolowano całkowity RNA i wykonano badanie Northern. Transformowaną pierwotną linię komórkową ludzkiej nerki płodowej 293 zastosowano jako kontrole pozytywną z powodu jej wysokiego poziomu ekspresji produktu genu p53, podczas gdy K562, linia komórkowa limfoblastyczna z homologiczną delecją genu p53 stanowiła kontrolę negatywną. Poziomy mRNA endogennego p53 wielkości 2,8 kb wykrytego w próbce wyizolowanej z pozornie zakażonych komórek i z komórek zakażonych adenowirusem niezdolnym do replikacji dl312 były podobne. Ponad 10-krotnie wyższe poziomy egzogennego mRNA p53 wielkości 1,9 kb obecne były w komórkach zakażonych Ad5CMV-p53, wskazując, że egzogenny cDNA p53 pomyślnie transdukowano do tych komórek gdzie ulegał skutecznej transkrypcji. Co ciekawe, poziom endogenego mRNA p53 w tych komórkach był 5-krotnie wyższym, niż w doświadczeniach kontrolnych. Badanie Northem nie wykazało dowodów zanieczyszczenia RNA przez DNA Ad5CMV-p53.

Ekspresja białka p53 w komórkach SCCHN zakażonych adenowirusem. Analizę metodą Western wykonano w celu porównania poziomów mRNA p53 z ilością wytworzonego białka p53. Prążek p53, rozpoznawany przez monoswoiste przeciwciało przeciwko p53, Pab1801, obserwowano w ekstraktach komórkowych izolowanych ze wszystkich próbek z wyjątkiem komórek K562. Linia komórkowa 293 wykazała wysoki poziom białka p53. Próbki izolowane z pozornie zakażonych komórek Tu-138 i Tu-177 wykazały niski poziom białka p53. Poziom ekspresji p53 pozostawał podobny w tych komórkach zakażonych adenowirusem d1312. Poziomy antygenu p53 wykrywane w komórkach zakażonych Ad5CMV-p53 były istotnie wyższe niż endogennych zmutowanych białek w obu liniach. Wyniki te pokazują, że egzogenny mRNA p53 wytworzony przez komórki zakażone Ad5CMV-p53 ulega skutecznej translacji na immunoaktywne białko p53. Ponadto, analiza immunohistochemiczna komórek zakażonych Ad5CMV-p53 wykazała charakterystyczne zabarwienie jąder białkiem p53, podczas gdy komórki zakażone pozornie nie wykazały tego wzorca zabarwienia mimo obecności białka p53 w tych komórkach. Ta niemożność wykrycia białka może być przypisana słabej czułości testu.

Wpływ egzogennego p53 na wzrost komórek SCCHN in vitro. Komórki zakażone kontrolnym wirusem dl312 wykazywały tempo wzrostu podobne do komórek zakażonych pozornie (Fig. 2A i 2B), podczas gdy wzrost Tu-138 zakażonych Ad5CMV-p53 (Fig. 2A) i Tu-177 (Fig. 2B) był istotnie zahamowany. Dwadzieścia cztery godziny po zakażeniu wystąpiła wyraźna zmiana morfologiczna, gdzie część populacji komórek uległo zaokrągleniu, zaś ich bło26

186 018 ny zewnętrzne utworzyły pęcherzyki. Była to część szeregu zjawisk możliwych do przewidzenia histologicznie, stanowiących zaprogramowaną śmierć komórek. Efekt był bardziej widoczny w przypadku komórek Tu-138 niż Tu-177. Komórki zakażone adenowirusem niezdolnym do replikacji d1312 wykazywały normalną charakterystykę wzrostu bez anomalii histomorfologicznych. Testy wzrostu były powtarzalne w czterech powtórzonych doświadczeniach.

Zahamowanie wzrostu nowotworu in vivo. Cztery zwierzęta badano dla każdej linii komórkowej. Jedno zwierzę w grupie Tu-138 padło po operacji drugiego płata i dostarczeniu leczenia, prawdopodobnie z powodu głębokiego znieczulenia i przygniecenia przez inne zwierzęta w klatce. Sekcja nie wykazała śladów przerzutów albo efektów ogólnych. Znaczne guzy widoczne były na obu płatach tylnych zwierząt (tj. w miejscach, które nie otrzymały Ad5CMV-p53). Brak progresji nowotworu jest istotny w prawych płatach zwierząt, które otrzymały Ad5CMV-p53 (p<0,04). Komórki Tu-177 wykazywały wolniejsze tempo wzrostu co stwierdzono uprzednio na tych zwierzętach. Dwa zwierzęta w grupie Tu-138 zabito wcześniej, ponieważ ich guzy kontrolne uległy gwałtownemu wzrostowi i owrzodzeniu. Wszystkie miejsca chirurgiczne rozwinęły zmiany wielkości przynajmniej 9 mm³ przed interwencją. Objętości guzów podczas sekcji pokazano na tabeli 4. Różnice objętości nie były istotne statystycznie w grupie Tu-177, co może odzwierciedlać ograniczoną wielkość próbki.

Tabela 4

Wpływ Ad5CMV-p53 na wzrost guzów u myszy nagich³

Leczenie	Średnia objętość [mm3±SEM]
Tu-138 (4)	Tu-177 (3)
Ad5CMV-p53	36,0±23,5	19±14, 9
Ad5 (d1312)	1187,5±419,0	226±84,0
Pożywka	1909±776,8	454±276, 8
Istotność	wartość p	wartość P
p53b: d1312	0,04	0,09
p53 : pożywka	0,05	0,09

a komórki te wstrzyknięto podskórnie w ilości 5x10⁶ komórek/płat. Wielkości guzów oznaczano w dniu 20 po leczeniu. Liczby w nawiasach oznaczają liczbę badanych zwierząt.

^b Ad5CMV-p53 skrócono dop53; d1312 jako skrót od Ad5(dl312).

Przy kład 2

Terapia molekularna in vivo adenowirusem p53 mikroskopowego resztkowego raka łuskowatokomórkowego głowy i szyi

Materiały i metody

Linie komórkowe i warunki hodowli. Linie komórek ludzkich SCCHN Tu-138, Tu-177, MDA 686-LN i MDA 886 ustalono i uprzednio scharakteryzowano (Clayman i in., 1993; Sacks i in., 1988). Komórki te hodowano w modyfikowanej przez Dulbecco pożywce Eagle'a (DMEM/F12) z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydlęcej inaktywowanej ciepłem (FBS) i penicyliny/streptomycyny.

Wytwarzanie i zakażanie rekombinowanym adenowirusem: Test wzrostu komórek; Analiza metodą Western. Wszystkie te procedury opisano uprzednio w Przykładzie 1. Testy wzrostu komórek przeprowadzano w potrójnym powtórzeniu.

Transdukcja in vivo adenowirusem z genem β-galaktozydazy. Znakowanie X-gal próbek tkanki wykonano na skrawkach tkanki zamrożonych O.C.T. w celu stwierdzenia skuteczności transdukcji. Ośmiomikrometrowej grubości próbki płukano w zimnym PBS i utrwalano w 0,5% glutaraldehydzie w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie, skrawki płukano dwukrot186 018 nie w PBS 4°C i inkubowano przez 4 godziny w roztworze X-gal (1,3 mM MgCf, 15 mM NaCl, 44 mM bufor HEPES pH 7,4, 3 mM żelazicyjanek potasowy, 2% X-gal w DMF). Skrawki podbarwiano hematoksylinąi eozyną.

Analiza immunohistochemiczna. Utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie tkanki zwierzęce z doświadczeń in vivo cięto na skrawki 4-5 pm, suszono w 60°C, odparafinowano i uwodniono wodą destylowaną. Następnie, skrawki traktowano 0,5% saponiną w wodzie destylowanej; endogenną aktywność peroksydazową blokowano 3% nadtlenkiem wodoru w metanolu, a następnie płukano w kilku zmianach wody. Skrawki napromieniowano mikrofalami w wodzie destylowanej przez 3 minuty stosując kuchnię mikrofalową Sharp model R9H81 pracującą przy częstotliwości 2450 MHz i mocy 700 wat. Po schłodzeniu, skrawki płukano w kilku zmianach wody destylowanej i umieszczono w PBS; badania immunohistochemiczne wykonano przez zastosowanie kompleksu awidyna-biotyna-peroksydaza (ABC) metodą Hsu i in., (1981) w następujący sposób: skrawki zablokowano normalną surowicą końską i inkubowano przez noc w 4°C z króliczym przeciwciałem monoklonalnym przeciwko ludzkiemu p53, klon OM-1, 1:80 (Signet Laboratories, Denham, MA). Zestaw przeciw króliczym IgG Elite (Vector Laboratories, Burlingame, CA) zastosowano nakraplając biotynowane przeciwciała przeciwko króliczym IgG oraz kompleksy ABC i inkubowano po 45 minut. Reakcję znakowania immunologicznego wizualizowano przez zastosowanie 0,5% DAB w PBS zawierającym 0,01% nadtlenek wodoru (pH 7,6), podbarwiano 0,01% błękitem toluidyny, odwadniano, prześwietlano i utrwalano preparatem Permount. W celu potwierdzenia swoistości reakcji znakowania immunologicznego, wykonano takie znakowanie stosując tę samą metodę jak na próbkach badanych, na znanych pozytywnych preparatach cytospinowych hodowli komórkowych linii komórkowej raka łuskowatokomórkowego, jak również na negatywnej kontroli monoklonalnych przeciwciał króliczych.

Zahamowanie wzrostu nowotworu in vivo. Procedurę tę wykonano jak to opisano w Przykładzie 1. Wszystkie miejsca chirurgii badano patologicznie jak również przez badanie sekcyjne w kierunku toksyczności ogólnej.

Wyniki

Wpływ egzogennego p53 na wzrost komórek SCCHN in vitro. Przykład 1 opisuje zahamowanie wzrostu in vitro komórek linii SCCHN z endogennie zmutowanym p53 przy użyciu Ad5CMV-p53. Niniejszy Przykład pokazuje czy linie komórkowe SCCHN z endogennym p53 typu dzikiego będą podobnie zahamowane. Badano również wpływ Ad5CMV-p53 na nienowotworowe fibroblasty.

Do badania wybrano cztery linie komórkowe ludzkiego SCCHN: Tu-138 i Tu-177 posiadają zmutowany gen p53, podczas gdy MDA 686-LN i 886 są homozygotyczne pod względem genu p53 typu dzikiego. Jako nienowotworową kontrolną linię komórkową zastosowano linię komórkową fibroblastów z normalnego wzrostu fibroblastów, która była normalna pod względem kariotypu i nie wywoływała guzów. Komórki zakażone wirusem kontrolnym, d1312, miały podobne tempo wzrostu co komórki pozornie zakażone, podczas gdy wzrost komórek nowotworowych zakażonych Ad5CMV-p53 był istotnie zahamowany (Fig. 3A, 3B, 3C i 3D). 24-48 godzin po zakażeniu, w komórkach nowotworowych występowały wyraźne zmiany morfologiczne, przy czym część populacji komórek zaokrąglała się, zaś ich błony zewnętrzne tworzyły pęcherzyki. Była to część szeregu zjawisk możliwych do przewidzenia histologicznie, stanowiących zaprogramowaną śmierć komórek. Efekt występował wcześniej w komórkach z endogenną mutacją p53, niż w komórkach z p53 typu dzikiego. Komórki zakażone adenowirusem niezdolnym do replikacji d1312 wykazywały normalną charakterystykę wzrostu bez anomalii histomorfologicznych. Testy wzrostu były powtarzalne w czterech powtórzonych doświadczeniach.

Ekspresja egzogennego białka p53 w normalnych fibroblastach zakażonych adenowirusem i jego wpływ na tempo wzrostu. Oprócz tego, badano również wpływ Ad5CMV-p53 na linie komórkowe fibroblastów normalne pod względem kariotypowym i nie tworzące guzów. Komórki te wyizolowano podczas ustalania pierwotnych nowotworowych linii komórkowych. 24 godziny po zakażeniu, wykonano analizę Western w celu porównania poziomów białka wytworzonego przez różne zakażone rodzaje linii. Prążek p53 rozpoznawany przez

186 018 przeciwciało monoklonalne przeciwko p53, Pab1801 obserwowano w ekstraktach komórkowych z wszystkich próbek zakażonych Ad5CMV-p53, Podobnie jak w przykładzie 1, linia komórkowa Tu-138 zakażona adenowirusem p53 wykazywała wysokie poziomy białka p53 po transdukcji i służyła jako kontrola. Poziom ekspresji p53 pozostawał podobny w komórkach zakażonych pozornie jak również komórkach zakażonych d1312. Fibroblasty zakażone Ad5CMV-p53 wykazywały wyższy poziom białka p53, niż komórki kontrolne. Wyniki te sugerują, że gen p53 ulega skutecznej translacji w normalnych fibroblastach zakażonych Ad5CMV-p53 jak tego dowodzi wytwarzanie immunoaktywnego białka p53. Ekspresja białka i skuteczność transdukcji cytospinów fibroblastów zakażonych Ad5CMV-p53 potwierdzono analizą immunohistochemiczną. Ta linia komórkowa fibroblastów wykazywała normalne tempo wzrostu i morfologie, niezależnie od zabiegu (transdukcja pozorna, wirusem niezdolnym do replikacji albo Ad5CMV-p53) (Fig. 4). Doświadczenia te powtórzono dwukrotnie jak również potwierdzono na innych normalnych liniach fibroblastów ludzkich.

Skuteczność transdukcji in vivo. W celu zmierzenia skuteczności przenoszenia genu in vivo, podskórny płat wycięto 72 godziny po zabiegu cząsteczkowym albo kontrolnym. Doświadczenia zależności od dawki z adenowirusem ze znacznikiem β-galaktozydazy wykazały w tym modelu skuteczność transdukcji zależną od dawki. Potwierdzono to analizą immunohistochemiczną w 4 dni po zakażeniu Ad5CMV-p35. Obie grupy doświadczeń wykazały zależność od dawki in vivo, którą opisano uprzednio in vitro (Przykład 1). W żadnym wypadku dawki wirusa przekraczające 10‘° pfu nie wpłynęły na ekspresję p53 w innych narządach w tym mózgu, wątroby, płuc, serca, narządów trzewnych jamy brzusznej i skóry. Doświadczenia te ilustrowały zależność od dawki pomiędzy mianem wirusa i skutecznością transdukcji, jak również możliwością uzyskania intensywnej przejściowej ekspresji transdukowanego genu w pożądanej dziedzinie modelu chirurgicznego.

Zahamowanie wzrostu nowotworu in vivo. Zaprojektowano badanie w celu stwierdzenia czy transfer genu przez Ad5CMV-p53 in vivo wpłynie na ustalenie albo wzrost komórek SCCHN wszczepionych do płata podskórnego. W celu uzyskania tego celu stworzono model mikroskopowej choroby resztkowej. W tym modelu, u samic myszy nagich wytworzono trzy płaty podskórne i wysiano przez pipetowanie po 2,5x10⁶ komórek nowotworowych. Zamiast pozwolić komórkom nowotworowym utworzyć guzy (co następuje zwykle po 4 dniach), podano pojedynczą dawkę leczenia cząsteczkowego w 48 godzin po zasiedleniu przez komórki. W ten sposób, jakkolwiek nie wystąpił makroskopowy wzrost nowotworu, mikroskopowe komórki nowotworowe obecne były w miejscu zabiegu naśladując kliniczny dylemat wycięcia chirurgicznego wszystkich widocznych guzów. Rozwój nowotworów związany był bezpośrednio z liczbą komórek nowotworowych, czasem od wszczepienia oraz dawką Ad5CMV-p53. Wśród myszy, które otrzymały mikroskopowo wszczepione komórki nowotworowe (2,5x106) i leczenie Ad5CMV-p53 w ilości 10⁸ jednostek tworzących łysinki (pfu) albo większej, jedynie dwie rozwinęły nowotwór, przy czym obu wszczepiono linię komórkowa o p53 typu dzikiego (MDA 886-LN). Wszystkie inne linie komórkowe wykazywały brak rozwoju nowotworu (Tabela 5). Doświadczenia te jasno pokazały, że wzrost komórek guzów mikroskopowych można skutecznie zatrzymać in vivo przez ekspozycję na Ad5CMVp53. Tworzenie guza badano pod koniec ^-tygodniowego okresu (wcześniejsze zabicie zwierzęcia z powodu nadmiernego rozwoju guza) przez badanie sekcyjne i histologiczne miejsc zabiegu chirurgicznego. Dane dotyczące rozwoju guza pokazano w tabeli 5.

186 018

Tabela 5

Wpływ Ad5CMV-p53 na tworzenie guza w modelu mikroskopowej choroby resztkowej SCCHN

Linia komórkowa	Leczenie
liczba myszy rozwijających nowotwór/całkowita liczba myszy
		Nośnik
	PBS	d1312	Ad5CMV-p53
Tu-138 (homozygotyczna mutacja p53)	8/8	8/8	0/8
Tu-177 (homozygotyczna mutacja p53)	8/8	8/8	0/8
686-LN (homozygotyczny p53 typu dzikiego)	5/8.	5/8	0/8
886 (homozygotyczny p53 typu dzikiego)	6/6	6/6	2/6

Wykonano analizę immunohistochemiczną na skrawkach nowotworu zwierząt doświadczalnych. Ta linia komórkowa niosła endogenny gen p53 typu dzikiego. Nie występowało istotne znakowanie immunologiczne tła w żywych komórkach nowotworowych MDA 686LN (pozorne zakażenie). 107 pfu Ad5CMV-p53 wykazywało obwodową martwicę guza ze znakowaniem immunologicznym w centralnej części guza. 10⁸ pfu Ad5CMV-p53 wykazało całkowitą martwicę guza ze znakowaniem immunologicznym spotykanym w całej kieszonce wytworzonej chirurgicznie z licznymi warstwami wyrażającymi białko w tym zrąb i powierzchniowa warstwa mięśni. 10 pfu Ad5CMV-p53 wykazało podobny wynik do 10⁸ pfu Ad5CMV-p53, jednakże zwiększało endogenną ekspresję p53 w miejscu zabiegu i obrzęku.

Przy użyciu zwierząt, które służyły jako ich własna kontrola wewnętrzna, wszczepy po 4,0x106 albo więcej komórek zwiększały istotnie rozwój podskórnych wszczepów w porównaniu z wszczepieniem nowotworu w ilości 2,5x106 komórek (P<0,01), nawet po leczeniu miejsca zabiegu Ad5CMV-p53 48 godzin po zabiegu. Pozostawienie wszczepionym komórkom 72 albo 96 godzin przed zastosowaniem Ad5CMV-p53 podobnie zwiększało wielkość guza Doświadczenia odpowiedzi na dawkę wykazały, że dawki 10⁸ i 10⁹ pfu Ad5CMV-p53 były równie skuteczne w hamowaniu wielkości guza 2,5x106 komórek wszczepionych na 48 godzin (fig. 6).Stan endogennego p53 wszczepionych komórek nowotworowych (homozygotycznych zmutowanych albo p53 typu dzikiego) miał słaby wpływ na skuteczność Ad5CMV-p53 w hamowaniu rozwoju nowotworu.

Przykład 3

Indukcja apoptozy spowodowana transferem genu p53 typu dzikiego adenowirusem do komórek raka łuskowatokomórkowego głowy i szyi

Materiały i metody

Linie komórkowe i warunki hodowli; wytwarzanie i zakażanie rekombinowanym adenowirusem. Wszystkie procedury wykonano oraz komórki utrzymywano jak to uprzednio opisano w przykładach 1 i 2.

Analiza fragmentacji DNA. Po inkubacji z adenowirusem p53 typu dzikiego, jak również niezdolnego do replikacji adenowirusa kontrolnego przez różne okresy czasu, komórki pobrano, zawieszono w 300 pl PBS z dodatkiem 3 ml buforu do ekstrakcji (10 mM Tris, pH 8,0, 0,1 M EDTA, 20 pg/ml RNAzy, 0,5% SDS) i inkubowano w 37°C przez 1-2 godziny. Na zakończenie inkubacji, dodano proteinazę K w stężeniu końcowym równym 100 pg/ml i umieszczono roztwór w łaźni wodnej 50°C na co najmniej 3 godziny. DNA ekstrahowano jedną objętością fenolu wysyconego 0,5 M Tris (pH 8,0), a następnie ekstrakcję powtórzono z fenolem/chloroformem. Precypitowany DNA analizowano na 1% żelu agarozowym.

Utrwalanie komórek. Do metody TUNEL, komórki utrwalano w 1% formalinie w PBS (pH 7,4) przez 30 minut na lodzie. Komórki płukano 3 ml PBS, zawieszano w 70% lodowatym etanolu i przechowywano w -20°C do momentu zastosowania. Do analizy bezkomórkowej, komórki utrwalano tylko w 70% lodowatym etanolu.

186 018

Test terminalnej transferazy dezoksynuklotydylowej. Test wykonano według procedury Gorczyca i in., (Gorczyca i in., 1993). Pokrótce, po utrwaleniu i płukaniu, komórki zawieszono w 50 pl buforu TdT zawierającego 0,2 M kakodylan sodu (pH 7,0), 2,5 mM Tris-HCl,

2,5 mM CoCl₂ (Sigma Chemicd Company), 0,25 mg/ml BSA (Sigma), 5 jetdiostek teirninnlnej transferazy (Boehringer Mannheim Bislogic)ls, Indianapolis, IN) i 0,5 n-moli 1 i bistyns16-dUTP wraz z dATP, dGT i dCTP w stężeniu 20 pM. Kontrole wykonano przez inkubowanie osobnej porcji każdej z próbek bez dUTP. Komórki inkubowano w roztworze w37°C przez 30 minut, płukano PBS i zawieszano w 100 pl FITC, roztwór do barwienia zawierał 4XSSC, 0,1% Triton Χ-100 i 2,5 pg/ml fluoresceinowanej awidyny (Vector Labs., Burlingame, CA). Probówki inkubowano przez 30 minut w ciemni w temperaturze pokojowej. Komórki płukano PBS z 0,1% Triton Χ-100 i zawieszano w 0,5 ml PBS zawierającego jodek propidium (5 pg/ml) i 70 pl (1 mg/ml) RNAzy. Probówki inkubowano w ciemni na lodzie przez 30 minut, a następnie wykonywano analizę cytometrią przepływową.

Analiza cytometrią przepływową. Wszystkie próbki badano stosując cytometr przepływowy EPICS Profile II (Coulter Corp., Hialeah, fL) w standardowej konfiguracji optycznej. Dla każdej próbki analizowano przynajmniej 5000 komórek. Pozytywność znakowania końcowego TdT określano przez odjęcie histogramu kontrolnego od histogramu badanego przy użyciu programu immuno-4 oprogramowania stacji roboczej Elite (Coulter Corp., Hialeah, FL).

Test wzrostu komórek. Komórki wysiano i badano ich wzrost jak opisano w Przykładzie 1.

Analiza )asatozy in vivo. Terapię genową w modelu mikroskopowej choroby resztkowej SCCHN opisano w Przykładzie 2.

Znakowanie końcowe in situ. Procedurę wykonano w sposób opisany uprzednio (Wijsman i in., 1993). Pokrótce, skrawki parafinowe odparafinowano w ksylenie trzykrotnie po 5 minut, i stopniowo uwodniono przez zanurzenie po 3 minuty w 100%, 90%, 70% i 30% etanolu. Endogenną peroksydazę inaktywowano przez zanurzenie skrawków na 20 minut w 0,75% H2O2 w 100% metanolu. Po wypłukaniu skrawków w PBS, skrawki trawiono 0,1% pepsyną (Fischer Scientific, Houston, TX) w 0,1 N HCl przez 5 minut w 37°C i intensywnie płukano w PBS. Następnie, skrawki inkubowano w komorze wilgotnej w 37°C przez godzinę w mieszaninie do znakowania końcowego zawierającej: terminalną transferazę dezoksynukleotydylową 0,5 jednostki/pl; biotynowany dUTP, 0,06 mM; 5X bufor TdT, 10 pl; woda bidestylowana do 50 pl. Reakcję przerwano przez zanurzenie skrawków w buforze zawierającym 300 mM NaCl i 30 mM cytrynian sodu w wodzie bidestylowanej. Po wypłukaniu skrawków w PBS, inkubowano je z koniugatem peroksydazy chrźanowej-awidyny przez godzinę w 37°C w komorze wilgotnej. Znakowanie wywołano stosując 3,3'-diaminobenzydynę, po czym podbarwiono skrawki zielenią metylową.

Wyniki

Zahamowanie wzrostu linii komórkowych SCCHM przez adenowirus p53. Przykłady powyższe poka^ją że gen p53 typu dzikiego można skutecznie wprowadzać do linii komórkowych SCCHN przez rekombinowany wektor adenowirusowy. W następstwie, zaatakowane komórki nowotworowe tracą zdolność do proliferacji in vitro i in vivo. Efekt zahamowania jest niezależny od stanu endogennego p53 linii komórkowych. Uprzednie analizy prędkości wzrostu przeprowadzono w okresie tygodniowym. Niniejszy przykład bada wczesny wpływ p53 typu dzikiego na wzrost komórek SCCHN (tj. krótsze odstępy czasu, godziny).

Do badania zastosowano dwie reprezentatywne linie komórkowe. Linia komórkowa Tu-138 niesie zmutowany gen p53, podczas gdy linia MDA 686LN, posiada gen p53 typu dzikiego. Komórki zakażone wirusem niezdolnym do replikacji d1312, wykazywały tempo wzrostu podobne do komórek zakażonych pozornie (Fig. 5A i 5B). Z drugiej strony, wzrost Tu-138 zakażonych Ad5CMV-p53 (Fig. 5A) i MDA 686LN (Fig. 5B) był istotnie zahamowany. Wydaje się, że egzogenne białko p53 ma wcześniejszy i głębszy wpływ hamujący wzrost na Tu-138 w porównaniu z MDA 686LN. Obserwowano wyraźną zmianę morfologii, z częścią populacji komórek zaokrąglającą się i wytworzeniem pęcherzyków na błonach zewnętrznych, przypominającą apoptozę, co zachodziło równocześnie z zapoczątkowaniem hamowania wzrostu. Komórki zakażone adenowirusem niezdolnym do replikacji, d1312, wykazywały normalną charakterystykę wzrostu, bez anomalii eistomorfologicznyce. Co istotne,

186 018 efekty te nie były obserwowane po zakażeniu adenowirusem p53 fibroblastów normalnych pod względem kariotypowym, jak pokazano w Przykładzie 2, jak również ludzkich keratynocytówjamy ustnej (unieśmiertelnionych, ale nie wywołujących guzów).

Analiza fragmentacji DNA. Jednym z charakterystycznych znaczników apoptozy, który różni ją od martwicy, jest możliwe do obserwacji biochemicznej pojawienie się drabinki fragmentów DNA. W celu potwierdzenia obserwacji, że komórki uległy apoptozie po zakażeniu adenowirusem p53, wykonano analizę fragmentacji DNA. DNA chromosomalny ekstrahowany z żywych komórek po zakażeniu adenowirusem niezdolnym do replikacji albo zawierającym gen p53 typu dzikiego poddano elektroforezie na żelu agarozowym. Obecność fragmentów DNA równych około 200 bp i ich wielokrotnościom zaobserwowano w obu liniach komórkowych. Fragmentowany DNA pojawiał się w 22 godziny po zakażeniu wirusem p53 w linii komórkowej Tu-138, podczas gdy w linii komórkowej MDA 686LN, fragmentowany DNA obserwowany był po 30 godzinach, zaś bardziej wyraźny po 48 od zakażenia adenowirusem p53 typu dzikiego. Nie wykryto fragmentacji DNA w komórkach zakażonych pozornie i zakażonych d1312.

Test terminalnej transferazy dezoksynukleotydylowej in vitro. Innym charakterystycznym znacznikiem apoptozy są zmiany morfologiczne i zniszczenie organizacji strukturalnej jądra, co powoduje kondensację chromatyny. Mikroskopia elektronowa jest stosowana w celu wykrycia takich zmian ultrastrukturalnych. Jednakże, współczesne metody identyfikacji komórek apoptotycznych przy użyciu cytometrii przepływowej są przydatniejsze do przesiewania i identyfikacji populacji komórkowych w porównaniu z mikroskopią elektronową (Gorczyca i in., 1993). Wynalazcy zastosowali metodę TUNEL (końcowe znakowanie biotynodUTP przez terminalną transferazę dezoksynukleotydylową) (Gorczyca i in., 1993) opartą na wykrywaniu przełamań DNA w komórkach apopototycznych 15 godzin po zakażeniu adenowirusem p53, 4,4% żywotnej populacji Tu-138 było na etapie apoptozy, w porównaniu do 0% w MDA 686LN (Fig. 6A i 6B). Liczba komórek apoptotycznych zwiększała się proporcjonalnie do czasu trwania obserwacji, jak również zwiększała się po inkubacji z adenowirusem p53. Niemal 31% komórek Tu-138 uległo apoptozie po 22 godzinach. Mimo opóźnienia początku apoptozy, niemal 60% komórek MDA 686LN było na etapie apoptozy w 48 godzin po zakażeniu adenowirusem p53. Warte zauważenia jest, że procent komórek apoptotycznych określony metodą TUNEL może być oceniony jako istotny ponieważ tylko żywe komórki poddane są analizie. Dane te korelują z analizą tempa wzrostu i fragmentacji DNA. Nie wykryto populacji komórek ulegających apoptozie w doświadczeniach kontrolnych z wykorzystaniem zakażenia pozornego, jak również w kontroli wirusa niezdolnego do replikacji (100 MOI). Stąd, apoptoza nie była funkcją samego transdukowanego produktu genowego adenowirusa. Analiza apoptozy in vivo. Powyższy przykład pokazuje, że adenowirus p53 hamuje tworzenie nowotworu in vivo. Przykład ten jest przeznaczony dla pokazania czy zahamowanie wzrostu nowotworu in vivo było konsekwencją apoptozy. Analiza znakowania końcowego in situ została wykonana w celu wykrycia komórek apoptotycznych w skrawkach zatopionych w parafinie uzyskanych w przykładzie 2. Nie obserwowano znakowania w skrawkach tkanki izolowanych od zwierząt niosących nowotwór MDA 686LN, które otrzymały leczenie PBS jako kontrolę. Z drugiej strony, skrawki tkanek izolowane od myszy niosących guza MDA 686LN leczonych adenowirusem p53 typu dzikiego wykazywały silnie pozytywne znakowanie, wskazując, że apoptoza w rzeczywistości była zjawiskiem związanym z zahamowaniem wzrostu nowotworu in vivo.

Dalej, w następstwie tych doświadczeń wynalazcy poszukiwali odpowiedzi czy zahamowanie wzrostu jest częściowo spowodowane zatrzymaniem cyklu komórkowego przez indukowane białka p21 czy pierwotnym wynikiem apoptozy. Analiza Western wykazała, że białko p21 uległo indukcji w komórkach SCCHN zakażonych adenowirusem p53 typu dzikiego. Jednakże, analizy cyklu komórkowego wskazywały, że mimo podwyższonego poziomu białka p21 w komórkach zakażonych adenowirusem p53, nie występowała istotna akumulacja komórek na etapie G1 w porównaniu z fazą S.

186 018

Przykład 4

Zahamowanie wzrostu komórek raka łuskowatokomórkowego głowy i szyi przez p53FLAG: Skuteczny znacznik dla badań nad terapią genową

Materiały i metody

Linie komórkowe i warunki hodowli. Wytwarzanie i zakażanie rekombinowanym adenowirusem; analiza Northem; analiza Western; test wzrostu komórek; barwienie immunologiczne warstw komórek in vitro. Wszystkie procedury wykonano i utrzymywano komórki jak to opisano w przykładzie 1.

Wytwarzanie adenowirusa p53-FLAG. Sekwencję cDNA p53 wycięto z pC53-SN przez trawienie BamHI i klonowano w miejsce BamHI pGEM7Z. Rekombinowany plazmid w prawidłowej orientacji wstawki trawiono AccI i KpnI w celu usunięcia 22 aminokwasów z końca 3' cDNA p53. Łącznik o zgodnych końcach AccI-KpnI zawierający sekwencję peptydu FLAG zawierającą kodon stop poddano ligacji z trawionym plazmidem tworząc gen fuzyjny p53-FLAG. Powstały gen fuzyjny p53-FLAG klonowano do wektora ekspresyjnego z ludzkim promotorem CMV i sygnałem poliadenylacji SV. Końcowy konstrukt wprowadzono następnie do wektora wahadłowego pKCJL.1 (Zhang i in., 1994) tworząc rekombinowany adenowirus p53-FLAG.

Doświadczenia nad mikroskopową, chorobą resztkową in vivo. Badania przeprowadzono w zdefiniowanym środowisku wolnym od patogenów stosując model bezgrasiczych myszy nagich opisany w przykładzie 1. Wykonano dwa zestawy powtórzonych doświadczeń. W pierwszym doświadczeniu reakcji na dawkę, zastosowano wirus Ad5CMV-p53-FLAG w trzech płatach w malejącym stężeniu (101° pfu, 10⁹ pfu, 10⁸ pfu). Czwarty płat służył jako kontrola i losowo przydzielano tu PBS albo niezdolny do replikacji wirus (d1312). Drugie badanie wykonano przy użyciu 10^w pfu Ad5CMV-p53-FLAG, Ad5CMV-p53 i adenowirusa niezdolnego do replikacji w trzech osobnych fałdach. Czwarty płat zaszczepiono tą samą objętością (100 pl) sterylnego PBS. 48 godzin po leczeniu, dwa z tych zwierząt zabito i pobrano płaty do badania immunohistochemicznego. Pozostałe zwierzęta obserwowano przez 21 dni a następnie zabito. Objętości guzów mierzono przy użyciu mikrometru.

Wyniki

Ekspresja mRNA po zakażeniu wirusem Ad5CMV-p53 i Ad5CMV-p53-FLAG. Badano Tu-138 i MDA 686LN w kierunku ekspresji mRNA p53. Całkowity RNA wyizolowano po zakażeniu adenowirusem. Wykonano analizę Northem. Stwierdzono podobne poziomy egzogennego mRNA Ad5CMV-p53 w komórkach zakażonych Ad5CMV-p53 iAd5CMV-p53FLAG. Poziom ekspresji mRNA p53 po zakażeniu Ad5CMV-p53 i Ad5CMV-p53-FLAG był porównywalny z Tu-138 i MDA 686LN. Różnice natężenia nie zależała od dawki. Poziom ekspresji mRNA p53 widać w ścieżce 2 i 3 linii komórkowej o zmutowanym p53, TU-138. Nie występowała istotna endogenna ekspresja mRNA p53 w linii komórkowej MDA 686LN, która posiada p53 typu dzikiego. Dane te sugerują, że wirus Ad5CMV-p53-FLAG podobnie jak wirus Ad5CMV-p53 z powodzeniem ulega transdukcji i skutecznej translacji. Analiza Northem nie wykazała dowodów zanieczyszczenia DNA Ad5CMV-p53.

Ekspresja egzogennego białka p53 w liniach komórkowych SCCHN zakażonych Ad5CMV-p53 i Ad5CMV-p53-FLAG. Wykonano analizę Western w celu porównania białka wyrażanego przez komórki zakażone wirusem Ad5CMV-p53 i Ad5CMV-p53-FLAG. Prążki białka identyfikowano stosując przeciwciało monoklonalne przeciwko p53 (PAb1810) oraz przeciwciało M2 przeciwko FLAG (IB 13025) na dwóch równocześnie puszczonych żelach. Stosując przeciwciało przeciwko p53 (pAB1810), stwierdzono podobnie wysoki poziom ekspresji białka p53 w obu liniach komórkowych, co w zakażonych Ad5CMV-p53 i Ad5CMVp53-FLAG. Badano również komórki Tu-138 i MDA 686LN zakażone Ad5CMV-p53. Nie stwierdzono różnic w ekspresji białka p53 w komórkach zakażonych wirusem niezdolnym do replikacji oraz w komórkach zakażonych pozornie. Podobnie traktowane żele sondowano mysim przeciwciałem przeciwko FLAG M2. Poziom ekspresji p53-FLAG był podobny do sondowanego przeciwciałem przeciwko p53, ale nie stwierdzono istotnego prążka w komórkach zakażonych wirusem Ad5CMV-p53. Komórki zakażone pozornie i d1312 nie wykazy186 018 wały wykrywalnych poziomów immunoaktywnego białka p53 ani FLAG w żadnej z linii komórkowych.

Wpływ Ad5CMV-p53 i Ad5CMV-p53-FLAG na wzrost komórek SCCHN in vitro. Toksyczny wpływ terapii p53 typu dzikiego na linie komórkowe Tu-138 i MDA 686LN opisano szczegółowo powyżej. Linia Tu-138 ma endogenny zmutowany gen p53, zaś linia komórkowa MDA 686LN posiada gen p53 typu dzikiego. Badanie miało na celu stwierdzenie, czy będzie widoczna jakakolwiek różnica w skuteczności po rekombinacji wirusa Ad5CMVp53 przez wprowadzenie sekwencji FLAG.

Komórki zakażone adenowirusem niezdolnym do replikacji mają podobne tempo wzrostu co komórki zakażone pozornie. Wprzypadku adenowirusa niezdolnego do replikacji można obserwować łagodny efekt cytotoksyczny (Fig. 7A). W przeciwieństwie, komórki te zakażone Ad5CMV-p53 albo Ad5CMV-p53-FLAG doznają niemal całkowitej śmierci komórkowej w ciągu trzech dni. Badanie histologiczne wykazało tworzenie przez błonę plazmatyczną pęcherzyków, co jest charakterystyczną cechą apoptozy i co scharakteryzowano jako mechanizm śmierci komórkowej w liniach komórkowych SCCHn zakażonych Ad5CMV-p53. (Przykład 1). Jak zaznaczono wyżej, efekt był bardziej zaznaczony dla linii Tu-138 (zmutowane p53), niż dla linii MDA 686LN (p53 typu dzikiego). Testy krzywej wzrostu były powtarzalne w trzech kolejny badaniach bez istotnej różnicy pomiędzy wirusem Ad5CMV-p53 i Ad5CMV-p53-FLAG, wskazując, że dodanie peptydu FLAG nie wpływa na zdolność p53 do hamowania wzrostu komórek.

Znakowanie immunohistochemiczne linii komórkowych SCCHN zakażonych przez adenowirus. Zakażone jednowarstwy komórkowe porównywano pod względem ekspresji p53 i białka p53-FLAG stosując standardowe techniki immunohistochemiczne'. Ani p53 ani białka FLAG nie można było stwierdzić w komórkach zakażonych pozornie d1312 linii MDA 686LN. Jednakże w komórkach Tu-138, które zawierają zmutowany gen p53, endogenne znakowanie p53 było pozytywne. Gdy komórki zakażono wirusem Ad5CMV-p53 silne znakowanie stwierdzono w obu liniach komórkowych. W badaniu oglądaniem komórek zakażonych wirusem Ad5CMV-p53-FLAG stwierdzono identyczne natężenie barwienia i liczbę komórek pozytywnych pod względem przeciwciała Pab1810 w porównaniu z komórkami zakażonymi wirusem Ad5CMV-p53. Komórki zakażone wirusem Ad5CMV-p53-FLAG wykazywały silną pozytywność immunohistochemiczną z przeciwciałem M2 FLAG. Jakość barwienia była różna zarówno w jądrze, jak i w mniejszym stopniu w cytoplazmie.

Zahamowanie wzrostu in vivo. Wykonano badanie zależności od dawki przy użyciu 10⁸, 109 j u10 jednostek tworzących łysinki (pfu) wirusa Ad5CMV-p53-FLAG w porównaniu z płatami skórnymi kontrolnymi traktowanymi PBS albo d1312, stosując metodę modelu mikroskopowego według Przykładu 1 na komórkach Tu-138. Średnia wielkość guza dla zakażenia pozornego wynosiła 1205+205 mm³. Wielkość guza zmniejszała się w sposób liniowy ze wzrostem stężenia wirusa stosowanego do interwencji cząsteczkowej. Średnia wielkość guza wynosiła 637+113 mm3, 392+109 mm3 i 193±74 mm3 dla płatów leczonych, odpowiednio, przy użyciu 10⁸, 109 i 1θιθ pfu wirusa Ad5CMV-p53-FLAG. Każde ze zwierząt porównywano z innym stosując sparowany test t, zaś istotny efekt zależności od dawki oznaczono jako p<0,05 we wszystkich porównaniach z wyjątkiem płatów leczonych 109 i 10¹⁰ pfu. Im większa ilość wirusa, tym większe zahamowanie nowotworu. W dodatkowym badaniu, porównywano wpływ Ad5CMV-p53 z wpływem Ad5CMV-p53-FLAG. Nie stwierdzono istotnych różnic w aktywności.

Immunohistochemiczny dowód wpływu hamującego na nowotwór egzogenny w modelu zwierzęcym mikroskopowej choroby resztkowej. Po udowodnieniu porównywalnej aktywności in vivo i in vitro Ad5CMV-p53 i Ad5CMV-p53-FLAG, wynalazcy zastosowali techniki immunohisΐochomjczne w celu zademonstrowania produktu białka fuzyjnego p53-FLAG in vivo. Stosując linie komórkowe Tu-138 i MDA 686LN, płaty z mikroskopową chorobą resztkową pobrano w 48 godzin po leczeniu, utrwalono w formalinie i zatopiono w parafinie. Na sąsiadujących skrawkach komórek nowotworowych leczonych wirusem Ad5CMV-p53-FLAG zastosowano barwienie na p53 i białko FLAG. Intensywność barwienia i liczba komórek zabarwionych pozytywnie była wprost proporcjonalna do ilości wirusa zastosowanego do zakażenia. Kontrole były

186 018 negatywne pod względem barwienia przeciwciałem p53 i FLAG w komórkach MDA 686LN. Endogenne barwienie na p53 zaobserwowano w komórkach nowotworowych Tu-138. Skrawki histologiczne barwiono hematoksyliną i eozyną, przeciwciałem p53 i przeciwciałem FLAG. Charakterystyczne barwienie cytoplazmatyczne przeciwciałem FLAG M2 kontrastowało z wewnątrzjądrowym barwieniem p53. Po raz pierwszy pokazano skuteczność przeciwciała FLAG M2 w tkankach zatopionych w parafinie. Barwienie wykazało, że efekt hamujący nowotwór jest kierowany przez terapię egzogenną oraz, że w modelu in vivo można zidentyfikować terapię egzogenną stosując układ FLAG.

Podsumowując, okazało się, że równoczesne dostarczenie białka FLAG wraz z pożądaną terapią genową oferuje potencjalną przydatność jako znacznik terapii genowej. Wynalazek jasno pokazuje, że był on promowany równocześnie z genem p53 i że ekspresja mRNA i białka nie była zmniejszona. Co istotniejsze, aktywność biologiczna dostarczonego supresora nowotworzenia nie była zmniejszona. Po raz pierwszy przeciwciało FLAG okazało się przydatne w tkankach utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie. Czynniki te sugerują przydatność tego nowego białka jako znacznika w dalszych badaniach nad terapią genową.

Przykład 5

Leczenie raka łuskowatokomórkowego głowy i szyi przy użyciu adenowirusa p53

Pacjent A

53-letni pacjent z nieoperacyjnym nowotworem SCCHN głowy. Masa guza wynosiła około

6,5 cm średnicy. Po badaniu czynności szpiku, liczby płytek i czynności nerek, pacjent otrzymał pierwsze leczenie w postaci 10⁸ cząstek zakaźnych konstruktu ekspresyjnego p53 adenowirusa, rozcieńczonych w sterylnym roztworze soli buforowanym fosforanem, przez osiem osobnych wstrzyknięć doguzowych (objętość całkowita 10 ml). Co trzy dni, pacjent otrzymywał identyczne leczenie, do otrzymania sześciu podań.

Trzy dni po szóstym podaniu nowotwór badano i stwierdzono, że miał średnicę 4 cm. Badanie histologiczne wykazało istotną fragmentację komórek na obrzeżu guza. Rozpoczęto drugi kurs leczenia w postaci sześciu podań, po którym guz zmniejszył się do >2 cm średnicy i uległ martwicy. Pacjent otrzymywał cotygodniowe leczenie przez trzy miesiące, po czym guz stał się niewidoczny.

Pacjent B

44-letnia pacjentka z nieoperacyjnym guzem SCCHN szyi. Średnica guza wielkości około 2,5 cm. Po badaniu czynności szpiku, liczby płytek i czynności nerek, pacjentka otrzymała pierwsze leczenie w postaci 5x10⁷ cząstek zakaźnych konstruktu ekspresyjnego p53 adenowirusa, rozcieńczonych w sterylnym roztworze soli buforowanym fosforanem, przez trzy osobne wstrzyknięcia doguzowe (objętość całkowita 3 ml). Co trzy dni, pacjentka otrzymywała identyczne leczenie, do otrzymania sześciu podań.

Trzy dni po szóstym podaniu guz wycięto. Niszę po guzie płukano 6 ml sterylnego roztworu soli buforowanego fosforanem przez 60 minut. Płyn usunięto, ranę zamknięto z pozostawieniem drenu w niszy nowotworu. W dniach 4, 7, 10 i 14 po zabiegu, podawano przez dren 5x107 _Cząstek zakaźnych konstruktu ekspresyjnego p53 adenowirusa rozcieńczonych w sterylnym roztworze soli buforowanym fosforanem (objętość całkowita 3 ml). Po kontaktowaniu niszy po guzie z inokulum przez 2 godziny, usuwano je przez odsysanie. Sześć miesięcy po zakończeniu leczenia nie obserwowano pierwotnego, miejscowego ani regionalnego guza.

Przykład 6

Transfer genu p53 typu dzikiego przez wektor adenowirusowy w badaniu fazy I na pacjentach z zaawansowanym nawrotowym rakiem łuskowatokomórkowym głowy i szyi.

Wektor adenowirusowy zawierający normalny gen p53 „typu dzikiego” dostarczano w wykładniczo narastających dawkach pacjentom z potwierdzonym biopsją nawrotowym rakiem łuskowatokomórkowym głowy i szyi. Bezpośrednie wstrzyknięcia doguzowe wykonywano trzy razy w tygodniu przez dwa kolejne tygodnie. Pacjentów rozdzielono do dwóch grup: 1) operowalnej choroby nawrotowej i 2) nieoperacyjnej choroby nawrotowej.

186 018

Pacjenci przydzieleni do operowalnej choroby nawrotowej poddani zostali całkowitej resekcji chirurgicznej nawrotowego nowotworu w 72 godziny po sześciu epizodach transferu genu w ciągu okresu dwóch tygodni. Wektor adenowirusowy dostarczono również śródoperacyjnie i w 72 godziny po zabiegu drogą wstrzyknięcia przez dren. Pacjenci nieoperacyjni poddani zostali próbom powtarzanego transferu genu drogą wstrzyknięć doguzowych co miesiąc w dwutygodniowych cyklach do momentu zaobserwowania progresji choroby albo pogorszenia stanu wydolności pacjenta. Bezpieczeństwo tego badania śledzono przez ścisłą obserwację w warunkach szpitalnych, biopsje w celu oceny skuteczności transferu genu, analizy płynów ustrojowych w kierunku wydzielania wirusa i badań sekcyjnych.

Metody

Osobnicy badani. Dwudziestu jeden pacjentów z zaawansowanym nawrotowym rakiem łuskowatokomórkowym górnych dróg oddechowo-pokarmowych w stanie wydolności 2 według Eastern Cooperative Oncology Group, przydzielono do jednej z dwóch odnóg badania, obejmujących pacjentów z operowalnym (grupa 1) i nieoperowalnym (grupa 2) nowotworem nawrotowym. Charakterystykę osobników badanych oraz dawki wektora adenowirusowego pokazano, odpowiednio, na Tabeli 6 i 7. Wszystkie kobiety miały ujemny wynik testu ciążowego i wszyscy pacjenci stosowali środki antykoncepcyjne. Od wszystkich pacjentów przed włączeniem do badania otrzymano zgodę na włączenie do badania.

Wektor transferu genu. Niniejsze badanie wykorzystywało niezdolny do replikacji wektor adenowirusowy serotyp 5 ze wzmacniaczem-promotorem (wirusa cytomegalii) oznaczony Ad5CMV-p53. Wytworzono trzy partie wektora adenowirusowego o ilości jednostek tworzących łysinki (pfu) w zakresie od 10⁹ do 10¹¹, stosując dobrą praktykę produkcji w Magenta Inc. i Introgen Therapeutics Inc., po czym przechowywano w zamrożeniu (-70°C) w University of Texas, M.D. Anderson Cancer Center. Każda partia była skuteczna pod względem transdukcji w badaniu Western jak również w testach zahamowania wzrostu komórek nowotworowych in vitro. Wektor rozmrażano i rozcieńczano w roztworze soli buforowanym fosforanem (nośnik) bezpośrednio przed transferem genu i transportowano go do pokojów pacjentów w 4°C.

186 018

Γ3 oj

O§ r- CC -5 X £ Λ O x on

43* £

CL Λ „ i—

I« gO fi « s

OT ‘5 — CS CM CN CN fi ojo o

(SI

O s

ce £

o

X ^X >*

5“&§

OT >. OT rl>-§

Ii J-g o o. o Z. α.·=η o- S

-O 4?

ce ź	X 0 cu		Ξ cu		OT X 0	JD
3	ce	te	ce	ce	ce	ce
3	3	3	3	3	3	c
ce	ce	ce	ce	ce	ce	ce

te

CN — CN CN CN CN

O O ►. ¢0

S-&-0 i

rl o o c oN

-S ΐ3 λ o g S -+._ , S -£. o g ao fS o· o β Ό O % ¹ £·;?<% •8 gJ#-§

ΓΊ CN '3 ‘3 ’3 ’3 ‘3 X (Λ O X CU O

6¹

te te ε ε

43 -3 X O U op op on on on on

...______ on on on tetetetetecegceteteg ’Εή'οη δη'οή’δή δη o

......i «3 on on onj£

Ξ S Ξ S 5 2 2 2 T

X X X X O O O 43

43 £Px

43

X X 43 O ε

X

O on on on on Έ έ έ έ on on on on

L- U, Ui L£Px xxx

43 43 43 43 ε

X

O on ti .2 oh te e ε te te

Ε E

43 X X o o on oh t t OJ) .g .ce H eh'on 3 a es

..Λ·* os ··—« OJ £Px x x x x Έ 43 43 43 O 43

Charakterystyka pacjentów

Ί ·»

Cl

Γ*Ί O ir> S Cl 43 on ‘oh o

U U O O (Z) CZ) >> >·»

3 te te r ·>

O O U o u W

U O U U O U tzi cz) czi o

ε o

CU fi fi

X o fi fi tu o c

c3

S

O >·>.>, ccc « te ca =£ £ £ o o o u o o

U U υ υ

CZ) 00 >. >> § §ę £ £ o o u o fi fi o o ia ia o

u

CZ)

O 5 u g V> 5 c fi o ia

43 43 u o u ου u o u o u co CZ) CZ) CZ) CZ) >> >. fi fi fi fi x x fi fi

43

X ź i £ S o « Z cu

CU ,43 ’o^ ce

CU gl a<c ia fi o ’p fififi

X X X ia ia ia 000 XXX ce 3 3

TJ uJ te 3 § 1 3 3 s § § | la & $ o o

-ii -ϋ fi fi ε s

3 bS c § -2 5 s & | 8-g §

-a o ce o fi fi

X X fi fi o

O O O U U co CZ) CZ)

3 5 .3 43 4) fi 3 C '3 ’3 .fi

O _

-e -a fi fi g -S ·§ £ > x x fi P fi fi *

OT

OT ‘3 X X X 3 3-2-20 3 3 ot ot X

»— yj cc χ o χ ^S£^£££££££^£^£^£52£2 — oox<N*-«mmxr^ooxr*xoomxxx<*itnx — (NnTj-in^Or^OOO/O —

186 018

Tabela 7

Dawkowanie wektora i obecność lub nieobecność nukleotydów wektora adenowirusowego w surowicy lub moczu podczas leczenia.

Pacjent	PFU/transfer	Wstrzyknięta objętość	Cykle transferu genowego	Miejsce wstrzyknięcia
1	10⁶	6cc	2	zmiana twarzy
2	10⁶	3cc	2	zmiana podbródkowa,
				nosogardziel
3	106	3cc, 4cc	1	zmiana lewej połowy szyi
4	106	3cc, 5cc	1+3	zmiana prawej połowy szyi
5	10⁶	1,5cc	1	zmiana lewej połowy szyi
6	106	3cc	1	zmiana obszaru około jamy
				ustnej
7	10⁷	2cc	4 + 2	zmiana lewej połowy szyi
8	10⁷	3cc	1	podstawa języka
9	107	1,5cc	1.	obszar około jamy ustnej,
				nawrót
10	10⁸	1,5cc	1	dolna część gardła
11	10⁸	3cc	1	podstawa języka
12	10⁸	1,5cc	3	lewy trójkąt pozatrzonowy
13	10⁹	1,5cc	6	tylna część języka &
			4	podstawa języka
14	10⁹	1,5cc	1 + 1	dno jamy ustnej
15	109	3cc	1	zmiana twarzy
16	109	1,5cc	1	zmiana nadobojczykowa
17	109	1,5cc	1	podstawa języka, dół
				migdałkowy
18	109	3cc	4	zmiana twarzowoszyjna
19	1095	1,5 cc	1	zmiana podbrókowa
20	10⁹'⁵	3cc	3	zmiana szyi
2.1	10⁹'⁵	1,5cc	3	zmiana szyi

Dawkowanie. Wektor adenowirusowy podawano pięciu kohortom pacjentów w dawkach rosnących wykładniczo. Wzrost dawek ustalono po dwutygodniowej obserwacji ostatniego pacjenta leczonego poprzednią dawką. Po wejściu pierwszych sześciu pacjentów do badania, trzech pacjentów wchodziło na każdym poziomie dawki niezależnie od przyporządkowania do grupy operowalnej czy nieoperowalnej. Dawka wektora biologicznego opisana jest jako dawka całkowita (w jednostkach tworzących łysinki). Nie oceniano przybliżonej liczby wektorów podawanych na nowotworową komórkę nabłonkową. Całkowita objętość podania pokazana jest na tabeli 7. Objętość wektora adenowirusowego wstrzykiwanego do guza litego była określana

186 018 na podstawie ocenianej klinicznie i radiologiczne objętości guza. Wektor wstrzykiwano bezpośrednio do guzów nawrotowego raka łuskowatokomórkowego pod kontrolą wzroku i badania palpacyjnego. Wstrzyknięcia wykonywano w odstępach 1 cm. Po transferze genów, pacjent pozostawał pod ścisłą obserwacją przez co najmniej 1-1/2 godziny. Izolacja oddechowa i płynów wydzielniczych utrzymywana była przez 72 godziny po ostatnim transferze genów przez wektor.

Wykrywanie wektora. Próbki moczu u surowicy badano pod kątem rozsiewu wektora adenowirusowego stosując hodowlę wirusa na komórkach 293, jak również stosując reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) z użyciem starterów amplifikujących region Elb adenowirusa i koniec 5' genu p53 typu dzikiego, które były swoiste dla wektora. Produkty PCR przenoszono metodą Southerria w celu polepszenia wykrywania do 1-5 cząstek wirusa jak również w celu sprawdzenia swoistości produktu PCR. W każdej reakcji badano kontrole pozytywne i negatywne.

Bezpieczeństwo. Monitorowano objawy, oznaki życiowe i wyniki badań krwi, zaś pacjentów badano fizykalnie i dokumentowano fotograficznie codziennie. Prześwietlenia klatki piersiowej, badania biochemiczne krwi i analizę stanu wydolności wykonywano na początku każdego cyklu leczenia. Przed i po każdym cyklu transferu genów mierzono miana surowicze przeciwciał przeciwko adenowirusowi. Trzy dni po szóstym transferze genu w pierwszym cyklu, pobierano biopsję guza (albo wycinki chirurgicznie). Próbki przechowywano jako gwałtownie zamrożone próbki pobrane patologicznie, jak również jako próbki utrwalone w formalinie.

Ekstrakcja kwasów nukleinowych z surowicy albo moczu. DNA adenowirusa Ad5CMV-p53 ekstrahowano z 0,5-ml porcji surowicy albo moczu metodą zmodyfikowaną przez Cunninghama i in., (1995). Pokrótce, dodawano wody destylowanej do objętości 1 ml, a następnie precypitowano 30% poliglikolem etylenowym (PEG). Ponieważ SDS nie jest sam w stanie uwolnić wirusowy DNA z cząstek wirusowych, do SDS dodano proteinazy K w 50°C przez 2-16 godzin po precypitacji PEG (Norder iin., 1990). Próbki ekstrahowano fenolem, po czym precypitowano wirusowy DNA etanolem w obecności glikogenu (Cunningham i in., 1995). Precypitowany DNA odzyskiwano przez odwirowanie przy 14000 g przez 10 minut w 4°C, zawieszano w 0,3 ml wody destylowanej i ponownie precypitowano etanolem. Osad DNA płukano 70% etanolem, suszono pod próżnią i rozpuszczano w 10 μΐ wody destylowanej. Próbki analizowano natychmiast albo przechowywano do użycia w -20°C. Ekstrakcję kwasów nukleinowych przeprowadzano pod wyciągiem w warunkach bezpieczeństwa biologicznego w celu zapobieżenia ewentualnemu zanieczyszczeniu krzyżowemu próbek.

Reakcje PCR na DNA wyizolowanym z próbek surowicy. Zaprojektowano startery do swoistej amplifikacji genu p53 z wektora adenowirusowego, Starter górny (5'CACTGCCCAACAACACCA-3', Identyfikator Sekw. nr 5) odpowiadał końcowi 3' genu p53, zaś starter dolny (5'-GCCACGCCCACACATTT-3', Identyfikator Sekw. nr 6) odpowiadał regionowi Elb adenowirusa typu 5 (nukleotydy 3517-3533 sekwencji typu dzikiego). Każda z probówek PCR zawierała 0,2 mM każdego z oligonukleotydów, 0,4 mM dNTP, IX bufor TagPlus Long o niskiej zawartości soli (Stratagene), 0,6 μΐ TaąPlus Long (5 U/ml) (Stratagene) i 5 μΐ badanego DNA. Próbki umieszczono w urządzeniu MJ Research Peltier Thermal Cycler (PTC-200) zaprogramowanym na 93°C przez 3 minuty, z następującym trzyetapowym profilem cyklu: 93°C przez 30 sekund, 65°C przez 45 sekund i 72°C przez 45 sekund przez 30 albo 35 cykli. Do każdej z probówek pod koniec PCR dodano 5 μΐ 6X buforu do ładowania (0,25% błękit bromofenolowy, 0,25% cyjanol ksylenu FF i 15% Ficoll (typ 400, Pharmacia) w wodzie) i umieszczono na 1% żelu agarozowym, zawierającym IX TBE i bromek etydyny (0,6 pg/ml). Próbki poddano elektroforezie przy 100 V przez 1-1,5 godziny, a następnie fotografowano w świetle UV.

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR). Do pojedynczej reakcji łańcuchowej polimerazy można zastosować tylko 5 μΐ DNA. w przypadku surowicy, PCR wykonywano w objętości 20 μΐ, zawierających 2 mM MgCh, 50 mM KC1, 0,1% Triton Χ-100, 200 μΜ każdego z trifosforanów dezoksynukleotydów (dNTP), 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 5 μΜ każdego ze starterów i 1,7 jednostki polimerazy DNA Taq (Promega). Reakcje przeprowadzano w 94°C

186 018 przez 30 sekund, 58°C przez 30 sekund i 72°C przez 60 sekund w 35 cyklach, po których następowało 10-minutowe wydłużanie w 72°C. Startery PCR wybrano z sekwencji Ad5CMV-p53, ze starterem położonym w końcu 3' cDNA p53 (5'-GCCTGTCCTGGGAGAGACCG-3', Identyfikator Sekw. nr 7) i starterem antysensownym wybranym w regionie E1B adenowirusa typu 5 (5'-CCCTTAAGCCACGCCCACAC-3', Identyfikator Sekw. nr 8). Produkt PCR (fragment długości 838 bp) rozdzielono na 1% żelu agarozowym. Ten sam produkt PCR klonowano do wektora pCR-Script (Stratagene), sekwencjonowano i oczyszczoną na żelu wstawkę stosowano jako sondę do wykrywania produktu PCR. W przypadku moczu, PCR wykonywano w 20 pl objętości, zawierającej 2 mM MgSO4, 10 mM (NH^SCO, 10 mM KCl, 0,1% Triton Χ-100, 20 mM Tris-HCL (pH 8,8), 0,1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 200 pM każdego z trifosforanów dezoksynukleozydów (dNTP), 5 pM każdego ze starterów i 2,5 jednostki polimerazy DNA TagPlus Long. (Stratagene). Reakcje prowadzono w 93°C przez 60 sekund, a następnie w 93°C przez 30 sekund, 65°C przez 45 sekund i 72°C przez 45 sekund w 35 cyklach, po których następowało wydłużanie przez 10 minut w 72°C. Startery PCR wybrano z sekwencji Ad5CMV-p53 ze starterem położonym na końcu 3' cDNA p53 (5'CACTGCCCAACAACACCA-3', Identyfikator Sekw. nr 9) i starterem antysensownym wybranym z regionu E1B adenowirusa typu 5 (5'-GCCACGcCcACACATTT-3', Identyfikator Sekw. nr 10). Produkt PCR (fragment wielkości 724 bp) rozdzielono na 1% agarozie.

Analiza metodą Southern'a. W badaniu metodą Southern'a, zastosowanym w celu weryfikacji swoistości produktu, DNA w żelu denaturowano i zobojętniano przed przeniesieniem na membrane nylonową (Hybond-N+, Amersham) przez absorpcję kapilarną. Membranę prehybrydyzowano przez 15 minut w65°C w buforze Rapid-hyb (Amersham) i hybrydyzowano w tym samym buforze zawierającym sondę znakowaną ³²P przez 1-2 godziny. Membranę płukano w 0,1XSSC i 0,1% SDS w temperaturze pokojowej dwukrotnie i ponownie dwukrotnie w 65°C (15 minut na płukanie). Płukaną, membranę eksponowano na kliszę rentgenowską w -70°C przez 1-16 godzin z ekranem wzmacniającym.

Kontrola i ocena próbek badanych. Poniższe kontrole włączono do każdej partii próbek. Na etapie izolacji DNA zastosowano dwie „negatywne” kontrole surowicy (pulowane i porcjowane surowice od pracowników Introgen) oraz dwie pozytywne kontrole zawierające surowicę negatywną zakażoną 10 pfu albo 100 pfu Ad5CMV-p53. Wykonano to w celu uzyskania okienka czułości gdzie kontrole 10 (i 100) pfu były pozytywne, zaś kontrole negatywne były negatywne. Jeżeli kontrola negatywna była pozytywna, PCR powtarzano tylko przez 30 cykli. Jeżeli kontrola 10 pfu była negatywna, DNA oczyszczano dalej dodatkową precypitącją etanolem i powtarzano PCR. Powyższe dwa etapy zawsze umieszczały parametr doświadczalny w odpowiednim okienku czułości.

Na etapie PCR, zastosowano kontrolę pozytywną 1 ng DNA Ad5CMV-p53 (izolowaną z partii klinicznej) i negatywną (H2O). PCR partii powtarzano gdy którakolwiek z kontroli była błędna. Nie było fałszywie negatywnych kontroli PCR.

W celu potwierdzenia domniemanych wyników pozytywnych, DNA ponownie izolowano z surowicy (wraz z kilkoma próbkami zbliżonymi czasowo) i powtarzano PCR tego DNA. Próbki te oceniono jako pozytywne jedynie wtedy, gdy udało się powtórzyć wyniki. Te próbki, które były pozytywne w jednej z analiz uznawano dla celów raportu za negatywne. Domniemane próbki pożytywne, których nie udało się powtórzyć (z powodu braku próbek nie przetworzonych) pomijano w bazie danych.

Pomiar skuteczności transferu genu. Pobrane chirurgicznie próbki tkanek umieszczono w probówkach mrożeniowych, natychmiast zamrażano i przechowywano w płynnym azocie do momentu wykorzystania. Zamrożone próbki dekantowano na rozdrabniaczu do tkanek Bessman ze stali nierdzewnej (Spectrum, Houston, TX), który uprzednio schłodzono przez zanurzenie w ciekłym azocie. Tkankę rozkruszono na drobny proszek przez uderzanie tłuczka Bessmana stalowym młotkiem od pięciu do dziesięciu razy. Sproszkowaną tkankę przeniesiono do szklanego homogenizatora tkankowego (Fisher Scientific, Pittsgurgh, PA) zawierającego 1 ml reagentu TRI (Molecular Research, Cincinnati, OH) na 50 mg tkanki, i homogenizowano pięcioma posuwami teflonowego tłoka.

186 018

Po homogenizacji, RNA izolowano według instrukcji dostarczonej z reagentem TRI. Pokrótce, homogenaty przeniesiono do polipropylenowych probówek wirowniczych (Molecular Research) i przechowywano przez 5 minut w temperaturze pokojowej, po czym dodano chloroform (0,2 ml na 1 ml reagentu TRI). Próbki mieszano energicznie, inkubowano przez dodatkowe 15 minut w temperaturze pokojowej, i odwirowano przy 12000 g przez 15 minut w 4°C w celu oddzielenia warstwy wodnej zawierającej RNA od fazy fenol-chloroform. Do fazy wodnej dodano izopropanol i precypitowano rNa przez inkubację w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Osad RNA otrzymano przez odwirowanie w 12000 g przez 15 minut w 4°C, płukano raz 75% etanolem, suszono na powietrzu, rozpuszczono w wodzie traktowanej diotylopfrokarbonfanem (DEPC) i oznaczono ilościowo przez pomiar absorbancji przy długości fali 260 nm. Zanieczyszczający DNA usunięto przez inkubację 50 ng RNA z 60 U DNAZy I (Pharmacia, Piscataway, NJ) przez 25 minut w 37°C w objętości końcowej równej 260 pl. Następnie ekstrahowano RNA mieszaniną fenol:chloroform, precypitowano etanolem, płukano raz 75% etanolem, odwirowano przy maksymalnej prędkości w mikrowirówce przez 15 minut w 4°C, wysuszono na powietrzu i zawieszono w wodzie traktowanej DEPC i przechowywano w -80°C. Jakość RNA oceniano przez puszczenie próbek na zwykłym niedenaturującym żelu 0,8% agarozy i obrazowanie prążków rybosomalnego RNA 28S i 18S barwieniem bromkiem etydyny. W celu eliminacji zanieczyszczeń krzyżowych pomiędzy próbkami oraz w celu minimalizacji aktywności RNAz, wszystkie urządzenia nie jednorazowego użytku stosowane do izolacji RNA zanurzano w 2% roztworze de tergentu Liqui-Nox (Fisher Scientific) na minimum 5 minut, oczyszczano z resztek, przenoszono do 10% roztworu wybielacza na 3 minuty, spłukiwano wodą dejonizowaną, spryskiwano 100% etanolem, suszono, zanurzano w chloroformie i ponownie suszono przed użyciem. Odwrotną transkrypcję wykonywano stosując 1,5 pg całkowitego RNA w 23,5 pl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 111 ng losowych heksamerów (Gibco BRL, Grand Island, NY), 40 jednostek inhibitora RNAzy (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 0,4 mM każdego z dNTP (Perkin Elmer, Foster City, CAO i 300 jednostek odwrotnej transkryptazy Superscript II RNase H (Gibco BRL) w 1X buforze RT (50 mM TrispH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2 i 20 mM DTT). RNA i losowe heksamery ogrzano do 70°C przez 10 minut i schłodzono na lodzie przed dodaniem pozostałych składników mieszaniny reakcyjnej. Reakcje inkubowano w25°C przez 5 minut z 200 jednostkami odwrotnej transkryptazy, a następnie przez kolejne 10 minut w25°C po czym dodano kolejne 100 jednostek odwrotnej transkryptazy, w celu ułatwienia przyłączania starterów, po czym inkubowano w 42°C przez 50 minut. Reakcje RT przerwano przez inaktywację ciepłem przez 15 minut w70°C. RNA komplementarny do cDNA usunięto przez trawienie 1 jednostką RNAzy H (Boehringer Mannheim) przez 20 minut w 37°C. RNA z linii Tu-138 raka łuskowatokomórkowego głowy i szyi (HNSCC) zakażonej rekombinowanym adenowirusem Ad5CMV-p53 (wielokrotność zakażenia 100:1) zastosowano jako kontrolę pozytywną w celu wykrywania wirusowej transkrypcji p53 oraz komórki TU-167 zakażonej odmianą adenowirusa d1312(1), która nie zawierała jednostki transkrypcyjnej p53 jako kontrolę negatywną.

W celu wykrywania transkryptu Ad5CMV-p53 wykonano PCR w objętości 30 pl zawierających 0,2 mM każdego z dNTP, 1,5 mM MgCh, 1 jednostkę polimerazy Taq (Promega, Madison, WI) i 0,5 mM każdego ze starterów CMV2 (5'-GGTGCATTGGAACGCGGATT-3', Identyfikator Sekw. nr 11) iP53EK3 (5'-GGGGACAGAACGTTGTTTTC-3', Identyfikator Sekw. nr 12) w 1X buforze PCR (50 mM KCl, 10 mM Tris pH 9,0, 0,1% Triton Χ-100). Startery CMV2 i P53EX3 amplifikowały fragment wielkości 295 bp swoisty dla adenowirusowego transkryptu p53. Warunki pCr dla wykrywania tran-skryptów Ad5CMV-p53 jak niżej:

94°C przez 1 minutę, a następnie 94°C przez 30 sekund, 58°C przez 40 sekund, 70°C przez 1 minutę, 35 cykli i 70°C przez 10 minut okres wydłużania.

W celu zapewnienia, że produkt amplifikowany podczas PCR wykrywał mRNA, nie zaś zanieczyszczenia DNA w preparatach RNa, wykonano również PCR stosując produkt RT z równoległych reakcji, do których nie dodano odwrotnej transkryptazy.

186 018

RT-PCR swoistą dla dehydrogenazy glicerolo^-fosforanu (GAPDH) wykonano w celu sprawdzenia integralności reakcji RT. 3 pl objętość reakcji RT rozcieńczono w 30 pl mieszaniny reakcyjnej PCR zawierającej 0,2 mM każdego z dNTP, 2 mM MgCL, 1 jednostkę polimerazy Tag i 0,5 mM każdego ze starterów GAPDH1 (5'-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3', Identyfikator Sekw. nr 13 i GAPDH2 (5-TGATTTGGAGGGATCTCGC, Identyfikator Sekw. nr 14 w 1X buforze PCR. Startery GAPDH obejmowały 3 egzony ludzkiego genu GAPDH i amplifikowały produkt wielkości 231 bp swoisty dla mRNA. Warunki PCR dla wykrywania GAPDH były następujące:

94°C przez 1 minutę, a następnie 94°C przez 30 sekund, 60°C przez 12 sekund, 72°C przez 1 minutę, 35 cykli i 72°C przez 7 minut okresu wydłużania.

PCR wykonano na urządzeniu Perkin Elmer Gene Amp 9600 Thermocycler, zaś wszystkie startery zakupiono (Genosys, Woodlands, TX).

Immunoeistochemiczne określenie genu wewnątrznowotworowego. Badania immunoaeroksyd)zowe wykonano na utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawkach tkanki, stosując metodę kompleksu awldyna-biotyn)-aeroksydaza (ABC) (1). Próbki cięto na skrawki grubości 3-4 pm, odaar)fmow)ns w ksylenie, poczym uwodniono w malejących stężeniach etanolu (100-70%). Endogenną aktywność peroksydazową zablokowano 3% nadtlenkiem wodoru w metanolu. Po kilku płukaniach w wodzie destylowanej i roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS) skrawki inkubowano w rozcieńczeniu 1:10 normalnej surowicy końskiej w celu minimalizacji barwienia tła. Następnie, skrawki inkubowano przez noc w 4°C z przeciwciałem monoklinalnym przeciwko p53 (DO-1, Oncogene Science, Inc., Uniondale, NY; rozcieńczenie 1:80) i p21 (Oncogene Science, Inc., 1:100). Procedurę znakowania peroksydazą wykonano stosując zestaw ABC Elite (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Reakcję znakowania immunologicznego obrazowano przez zastosowanie 0,05% 3,3'-diaminobenzydyny w buforze Tris-HCl zawierającym 0,01% nadtlenek wodoru, pH 7,6. Skrawki podbarwiono 0,01% błękitem toluidyny i zatopiono wPermount. Ocenę wykonano przez zliczenie komórek wyznakowanych pozytywnie wśród 200 komórek w 10 kolejnych polach widzenia przez dwóch niezależnych obserwatorów. Test TUNEL na fragmentację DNA. Test TUNEL wykonano stosując zestaw Apoptag™ PLUS (Oncor, Gaithersburg, MD) według instrukcji producenta. Skrawki podbarwiono 0,4% zielenią metylenową. Odpowiednie skrawki barwione hematoksyliną i eozyną badano na obecność nacieków komórek zapalnych i oceniano je w skali od 1 do 4.

Procedura badania efektu cytopatycznego. Próbki moczu pacjentów śledzono również pod względem obecności Ad5CMV-p53 w teście, w którym ewentualnymi wirusami w próbce zakaża się jednowarstwę komórkową. Komórki te są obserwowane pod kątem wystąpienia efektu cytopatycznego (CPE): zaokrąglania się komórek i odłączania od podłoża. Próbki moczu pacjentów badane na CPE pochodziły z pierwszego badania moczu zebranego podczas drugiego tygodnia pierwszego kursu leczenia, oraz w dniu 0 albo 1 (przed leczeniem). Próbki około 15 ml przechowywano w sterylnych probówkach stożkowych w-80°C. Komórki IT293, stanowiące komórki biorcy w tym teście, utrzymywano wDMEM z dodatkiem 10% FBS, w inkubatorze CO 2 w 37°C i nawilżanej atmosferze. Dwa dni przed badaniem próbek od pacjentów, komórki wysiano w gęstości 2x10⁵ na studzienkę w płytkach 12-studzienkowych.

W momencie badania, próbki moczu rozmrożono w łaźni lodowej, i zmieszano 1:1 z DMEM, poczym przefiltrowano sterylnie stosując filtr strzykawkowy 0,22 pm. Porcje po 350 (pl tej mieszaniny 1:1 pomału dodano do każdej ze studzienek, po usunięciu pożywki. Płytkę delikatnie wytrząsano przez 15 minut. Po 30 minutach, do każdej studzienki dodano 20 ml DMEM z dodatkiem 10% FBS w celu rozcieńczenia próbki. W dniu 3 (72 godziny później) oraz 6, do każdej ze studzienek dodano 0,5 ml porcje świeżej pożywki w celu utrzymania komórek przez najwyżej 6-7 dni.

Próbki od pacjentów badano w potrójnym powtórzeniu. Rozcieńczoną próbkę z przed leczenia badano taką jaka jest, jak również po zakażeniu 10⁵ pfu Ad5CMV-p53 w celu wykrycia jakichkolwiek składników moczu, które mogłyby zakłócać wykrycie wirusa tą procedurą.. Studzienki kontrolne zakażono samym DMEM z dodatkiem 10⁵, 10⁴, 10³, 102 albo 101 pfti na studzienkę w potrójnym powtórzeniu. Zakażenie 10⁵ pfu powodowało w tych warunkach

186 018

CPE w 2 dniu badania; w każdym kolejnym dniu, kolejne rozcieńczenia zakażenia wykazywały CPE. Stąd, dzień w którym wykryto CPE w próbce pochodzącej od pacjenta wskazywał poziom Ad5CMV-p53 w tej próbce.

Rekombinowany adenowirus kompetentny. Adenowirusowy p53 zastosowany do badań klinicznych badano na obecność RCA stosując komórki A549 w Biotechnology Services Division of Microbiological Associates, Inc., (Rockville, MD).

Analiza statystyczna. Zastosowano jednoodnogowy protokół badania. W celu zapobieżenia włączenia do badania więcej pacjentów niż to konieczne, w przypadku badania obarczonego nadmierną toksycznością, zastosowano zasadę wczesnego zatrzymania Bayes'a. Do porównania pomiędzy stanem przed leczeniem i po leczeniu procenta komórek wykazujących pozytywność w teście TUNEL i znakujących się immunohistochemicznie zastosowano, odpowiednio test rangowania Wilcoxon'a i test przyporządkowania. Analizę statystyczną wykonano stosując pakiet oprogramowania statystycznego Survpac SPSS.

Reakcja i toksyczność. Przeżywalność i reakcję oceniano analizą wewnętrzną, ale nie było to celem tej analizy. Celem tej analizy wewnętrznej było określenie potencjału transdukcyjnego tej strategii transferu genu. Pacjenci byli gotowi do oceny reakcji i toksyczności po 30 dniach obserwacji po jednym cyklu transferu genu. Efekty toksyczne terapii badano według kryteriów toksyczności National Cancer Institute (Xref.). Reakcję na leczenie oceniano badaniem CT albo USG szyi przed każdym kursem leczenia. Pacjenci byli gotowi do oceny reakcji po przynajmniej jednym kursie leczenia przez wiarygodne udokumentowanie reakcji. Pacjenci poddani resekcji chirurgicznej ich guzów nawrotowych nie mogli być ocenieni pod względem reakcji, ponieważ zabieg wykonano przed 30 dniowym okresem obserwacji. Wszystkie badania CT badał jeden radiolog, zaś USG inny. Reakcja częściowa określona była jako 50 procentowe albo większe zmniejszenie sumy średnic mierzalnego guza; reakcja niniejsza określona była jako 25 procentowe, mniejsze niż 50 procentowe zmniejszenie sumy średnic mierzalnej zmiany. Postęp choroby określono jako 25 procentowe albo większe zwiększenie sumy średnic.

Okres przeżycia mierzono od momentu wejścia do protokołu do zejścia. Każdą reakcję pacjenta oceniał komitet zarządzający danymi składający się z chirurga-onkologa głowy i szyi, radiologa i onkologa.

Wyniki

Wykrywanie wektora. DNA wektora adenowirusowego wykrywano przez PCR w surowicy jak również w próbkach moczu od pacjentów w 48 godzin po transferze genu. Granica wykrywalności dla wektora wynosiła 1 -5 cząsteczek. Wirusowy DNA wyizolowano z moczu pacjentów poddanych transferowi genu w każdej dawce wirusa, ale nie wykryto w 48 godzin po transferze genu. Wykrywanie w surowicy wirusowego DNA wzrastało wraz ze wzrostem dawki wirusa powyżej 107 pfu, ale nie było wykrywalne w 48 godzin po transferze genu.

Próbki moczu analizowano pod kątem wirusa zakaźnego, mierząc CPE na jednowarstwach komórkowych, przed analizą PCR. Wirus obecny w moczu zastosowano wobec komórek 293, jak to opisano wyżej, w celu monitorowania CPE, który obserwowano jako zaokrąglanie się komórek i odklejanie od szalki Petri'ego. W próbkach stwierdzano rzadko CPE. CPE stwierdzano później w hodowlach nakładkowych (powyżej szóstego dnia) i wyniki te uznane zostały za równorzędne. Nigdy nie potwierdzono CPE przez PCR i badanie Southem'a tej samej próbki moczu.

Analiza wirusowego DNA w innych narządach. Analiza PCR wykazała wirusowy DNA w ponad dwa miesiące po transferze genu przez 10⁹ pfu Ad5CMV-p53 w skórze, mięśniu sercowym, płucach i tkankach jąder w zamrożonych próbkach z sekcji pobranych w sposób zapobiegając zanieczyszczeniu krzyżowemu pomiędzy tkankami. Śródmiąższ nerek, gruczoły nadnerczowe i tkanki trzustki nie wykazały sekwencji wirusowego DNA swoistego dla wektora. Analiza immunohistochemiczna próbek sekcyjnych nie wykazała śladów nadekspresji produktu białkowego p53 typu dzikiego.

Ocena transferu genu. Wszystkie badania przeprowadzono po co najmniej 1 godzinie od ekspozycji tkanek na wektor. Produkt mRNA wykrywano w 4 godziny i 48 godzin przez RT-PCR. W przeciwieństwie, próbki z biopsji zamrożone po 1 godzinie od ekspozycji albo

186 018 krócej nie wykazały mRNA p53. Oprócz tego, próbki kontroli negatywnej pobrane z pola operacyjnego, nie poddanego transferowi genu były również negatywne pod względem produktu RNA. Nie transdukowane i transdukowane próbki z biopsji od czterech pacjentów analizowano przez RT-PCR na obecność mRNA Ad5CMV-p53. Próbki transdukowane od dwóch pacjentów były pozytywne na żelu barwionym EtBr, podczas gdy nie stwierdzono produktu Ad5CMV-p53 w żadnej z nie transdukowanych próbkach, mimo że GAPDH amplifikowano we wszystkich próbkach. Swoistość produktu PCR wielkości 295 bp od dwóch pacjentów pozytywnych potwierdzono badaniem Southem'a. Ponieważ produkt PCR nie był obserwowany w reakcjach RT gdy pominięto odwrotną transkrypcję, produkt 295 bp wykrywany na Figurze wytworzono raczej z mRNA niż z zanieczyszczeń DNA.

Analiza immunohistochemiczna. Wszystkie próbki od pacjentów przed i po transferze genu analizowano równocześnie z pozytywnymi i negatywnymi kontrolami w każdym doświadczeniu. Analizowano wiele skrawków w każdej próbce i porównywano ze skrawkami barwionymi hematoksyliną i eozyną oraz znakowanymi końcowa TdT. Próbki tkanek po wstrzyknięciu wektora potwierdziły transfer genu u trzech pacjentów; których próbki przed transferem nie · wykazały endogennej nadekspresji białka p53. U 5 spośród 21 pacjentów (27%) p21 (CIP/WAF1) nie ulegał istotnej endogennej ekspresji; potwierdziło to informację o transferze genu u pacjentów w próbkach po transferze genu. Nadekspresję białka jądrowego p53 obserwowano również w limfocytach obecnych w nowotworze, jak również w komórkach zrębu nowotworowego, co wskazywało na równoczesną transdukcje komórek nienowotworowych.

Reakcja przeciwciał surowiczych. Przeciwciała przeciwko adenowirusowi serotypu 5 wywołano u wszystkich pacjentów po kolejnych wstrzyknięciach wektora. Jednakże, skuteczność transdukcji nie była istotnie zmieniona w porównaniu początkowego cyklu z póź-niejszymi cyklami transferu genu. Obserwowano niewielkie zaczerwienienie w miejscu wstrzyknięcia od dawki 3x10⁹ pfu, jednakże reakcje miejscowe nie ograniczały tolerancji na wektor. Nie stwierdzono ogólnoustrojowej nadwrażliwości u żadnego pacjenta, mimo kolejnych dawek wirusa dochodzących do sześciu kolejnych miesięcy u pacjenta leczonego dawką 10⁹ pfu.

Obserwacje histopatologiczne. W większości próbek z biopsji stwierdzono ślady po ukłuciach, oraz ekspresję produktu genu w tkankach głębszych poniżej miejsc wstrzyknięcia. Podobnie, stwierdzono komórek znakowanych końcowo w obszarach transdukowanych, co sugeruje wywołanie apoptozy w komórkach nowotworowych, ale brak apoptozy w komórkach zrębu albo komórkach zapalnych. Komórki zapalne stwierdzono u pacjentów i stają się one dominującym znaleziskiem histologicznym wśród pacjentów, którzy otrzymali dawki 10⁹ albo wyższe. Co ciekawe, u pacjenta nr 7, którego próbki wyrażały endogenny p53, wykazywały również martwicę krwotoczną bez śladów żywego nowotworu w seryjnie skrawanych wycinkach w nawrotowym guzie średnicy 2 cm na szyi, po jednym cyklu transferu genu. Znaleziska patologiczne martwicy jak również indukcja apoptozy były częstą obserwację w próbkach.

Obserwacje kliniczne. Pacjenci tolerowali bezpośrednie wstrzyknięcia doguzowe wektora, przy czym najczęstszym objawem niepożądanym był dyskomfort w miejscu wstrzyknięcia. Obecność zaczerwienienia w miejscu wstrzyknięcia zaobserwowano przy 109 pfu wektora i więcej, jakkolwiek nie były obserwowane objawy ogólne nadwrażliwości mimo dowodów wzrostu miana przeciwciał. Pacjenci nr 5, 10 i 16 pozostali bez śladów choroby w okresie obserwacji równym median siedem miesięcy. Pacjenci 7 i 13 wykazali stabilizację choroby przez, odpowiednio 3 i 5 miesięcy w miejscu zmiany. Pacjent nr 20 wykazał częściową reakcję, potwierdzoną badaniem CT i USG, ale doznał przerzutów do kręgosłupa i jamy opłucnej co spowodowało konieczność wyłączenia go z badania z powodu postępu choroby.

Podsumowując, u pacjentów z nawrotowym rakiem łuskowatokomórkowym głowy i szyi zastosowanie transferu genu p53 typu dzikiego za pośrednictwem adenowirusa jest bezpieczne i może skutecznie transdukować komórki nowotworowe i normalne przez bezpośrednie wstrzyknięcie doguzowe albo śródoperacyjne zakażenie wektorem. Żaden z pacjentów nie skarżył się na toksyczność, która ograniczałaby podawanie wektora albo wzrost dawki. Ekspresja produktu transgenu była nie zmieniona mimo rozwoju układowej reakcji przeciwciał. Miejscowe reakcje zapalne stwierdzane histopatologicznie w wyciętych próbkach guza mogą być w rzeczywistości korzystne.

186 018

LITERATURA

The following references, to the extent that they provide exemplary procedural or other details supplementary to those set forth herein, are specifieally incorporated herein by reference:

„Cancer facts and figures,” American Cancer Society, Washington, DC: ACS. (Publication no. 90-425 M. no. 5008-LE).1990.

Cancer Facts and Figures, Publication No 93-400, M No. 5008-93. Washington. DC: American Cancer Society, 1993.

Andersen et al. US 5,399,346, 1995.

Baichwal and Sugden, „Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes,” In: Kucherlapati R. ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, pp. 117-148, 1986.

Baker et al, „Suppression of human colorectal carcinoma celi growth by wild-type p53,” Science, 249:912-915, 1990.

Barbacid, M. ,,ras genes,” Ann. Rev. Biochem, 56:779-827, 1985.

Bartek et al, „Genetic and immunochemical analysis of mutant p53 in human breast cancer cell lines,” Oncogene, 5:893-899, 1990.

Benvenisty and Neshif, „Direction introduction of genes into rats and expression of the genes,” Proc. Nat'lAcad. Sci. USA., 83:9551-9555, 1986.

Berenson et al, „Frequent amplification of the bcl-1 locus in head and neck squamous celi carcinomas.” Oncogene.. 4:1111-1116, 1989.

Berges et al, „Cell proliferation, DNA repair, and p53 function are not required for programmed cell death of prostatic glandular cells induced by androgen ablation,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:8910-8914, 1993.

Berkner, „Development of adenovirus vectors for the expression of heterologous genes,” BioTechniąues, 6:616-629, 1988.

Bos, J., ,,ras oncogenes in human cancer: A review,” Cancer Res, 49:2682, 1989.

Boshart et al, „A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene ofhuman cytomegalovirus,” Cell. 41:521-530, 1985.

Boussif et al, „A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: Polyethylenimine,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7297-7301, 1993.

Boyle et al, „The Incidence of p53 Mutation Increases with Progression of Head and Neck Cancer,” Can Res, 53:4477-4480, 1993.

Brennan et al, „Molecular Assessment of Histopathological Staging in Squamous-Cell Carcinoma of the Head and Neck,” NEJM, 332(7):429-425, 1995.

Brown et al, „Modulation of ras Expression by Anti-sense, Nonionic Deoxyoligonucleotide Analogs,” Oncogene Res., 4:243-252,1989.

Cai et al.. „Stable expression of the wide-type p53 gene in human lung cancer cells after retrovirus-mediated gene transfer.” Human Gene Therapy. 4:617-624. 1993.

Calhoun et al, „Distant Metastases from Head and Neck Squamous Cell Carcinomas,” Laryngoscope, 104:1199-1205, 1994.

Campbell, in Monoclonal Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Vol. 13, Burden and Von Knippenberg, Eds. pp. 75-83, Amsterdam, Elseview, 1984

Chen et al, „Genetic meehanisms of tumor suppression by the human p53 gene.” Seience.250:1576-1580, 1990.

Chen and Okayama, „High-effieiency transfection of mammalian cells by plasmid DNA,” Mol. Cell Biol, 7:2745-2752, 1987.

Chomczynski and Sacchi, „Single-step method of RNA isolation by guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction,” Anal. Biochem., 162:156-159. 1987.

Chung et dl., „Discordant p53 gene mutations in primary head and neck cancers and corresponding second primary cancers of the upper aerodigestive tract.” 53:1676-1683, 1993.

186 018

Clarke et al, „Thymocyte apoptosis induced by p53-dependent and independent pathways,” Naturę, 362:849-852, 1993.

Clayman et al, „Regulation of Urokinase-Type Plasminogen Activator Expression in Squamous-Cell Carcinoma of the Oral Cavity.” Int J Cancer. 54:73-80, 1993.

Couch et al, „Immunization with types 4 and 7 adenovirus by sele^ke infection of the intestinal tract,” Am. Rev. Resp. Dis, 88:394-403, 1963.

Culver et al., „in vivo gene transfer with retroviral vector-producer cells for treatment of oxpoπmontal brain tumors,” Science, 256:1550-1552, 1992.

Debus et al, „Efects of Antisense Oligodeoxyribonuclootidos Complementary mRNA of the Human c-Harvey-ras Oncogene on Cell Proliferation,” J. Cancer Res. Clin. Oncol, 116 (Suppl. Part 1):S-162, 1990.

Derand Cooper, Cell, 32:201-8, 1983.

Diller et al, ,,p53 function as a cell cycle control protein in osteosarcomas.” Mol. Celi, Biol, 10:5772-5781, 1990.

Donehower et al, „Mice defieient forp53 are dovolopmentally normal but susceptible to spontaneous tumors,” Naturę, 356:215-221, 1992.

Dubensky et al., „Direct transfection of viral and plasmid DNA into the liver or spleen of mice,” Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81:7529-7533,1984...

El-Deiry et al., „WAF1/CIP1 is induced in p53-modiated G1 arrest and apoptosis.” Cancer Res, 54:1169-1174, 1994.

Fearon et al., Science, 247:49, 1990.

Fochheimor et al., „Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and somcation loading.” Proc. Nat’lAcad. Sci. USA.. 84:8463-8467. 1987.

Ferkol et al, FASEB J., 7:1081-1091, 1993.

Field et al., „Elevated oxprossjon of the c-myc oncoprotein correlates with poor prognosis in head and neck squamous cell carcinoma.” Oncogene. 4:1463-1468, 1989.

Field et al., „The Role of the p53 Tumor Suppressor Gene in Squamous Cell

Carcinoma of the Head and Neck, Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 119:1118-1122,

1993.

Fraley et al, „Entrapment of abacterial plasmid in phospholipid vesiclos: Potential foo gene transfer.” Proc. Nat’l Acad. Sci.. USA, 76:3348-3352. 1979.

Fridman et al, „The minimal fragments of c-Raf-1 and NF1 that can suppress avHaras-induced phenotype,” J. Biol. Chem, 269:30105-30108. 1994.

Friedmann, „Progress toward human gene therapy,” Science. 244:1275-1281. 1989.

Fujiwara et al, „T^rapeutic effect of a rotrovjral wild-typop53 expressfoe vector in an orthotopic lung cancer model,” JNCI, 86:1458-1462, 1994.

Fujiwara et al, „A retroviral wild-typop53 oxprossioe vector penetrates human lung cancer sphorojds and inhibits growth by inducing apoptosis.” Cancer Res.. 53:4129-4133,1993.

Ge^der et al., Somatic Cell Genet. 3:231 -236 (1977)

Georges et al, „Prevoetjoe of Orthotopic Human Lung Cancer Growth by Intratracheal Iestjllatjoe of a Reb^kal Antisense K-ras Construct.” Cancer Res, 53:1743-1746, 1993.

Ghosh-Choudhury et al, „Protein IX, a minor compoeoet of the human adeeovirus capsid, is essential for the packaging of full-length genomes,” EMBOJ.. 6:1733-1739, 1987.

Ghosh and Bachhawat, „Targeting of liposomes to hepatocytes,” In: Wu G. and C.

Wu ed. Livei' diseases, targeted diagnosis and therapy using spec^rc receptors and ligands. New York: Marcel Dekker, pp. 87-104. 1991.

Goding, 1986, in Monoclonal Aetibodios: Principles and Praetfeo, 2d ed.. Orlando. Fla., Academic Press, 1986, pp. 60-61, 65-66, 71 -74.

Gomez-Foix et al, „Adoeovirus-mediatod transfer of the muscle glycogen phosphorylase gene into hepatocytes confers altered regulation of glycogen.” J. Biol. Chem, 267:2512925134, 1992.

Gopal, „Gene transfer method for transie-nt gene oxpressioe, stable transOeetioe, and eotransOeetion of suspension cell cultures,” Mol. Cell Biol, 5:1177-1190. 1985.

186 018

Gorczyca et al, „Detection of DNA strand breaks in mdividual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays.” Cancer Res 55 -1945-1951 1993. ’ ’

Graham and Prevec. „Adenovirus-based expression vectors and recombinant vaccines,” Biotechnolog, 20:363-390, 1992.

Graham and Prevec, „Manipulation of adenovirus vector,” In: EJ. Murray (ed.). Methods in Molecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocol. Clifton, NJ: Humana Press, 7:109-128, 1991.

Graham et al, „Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5”, J. Gen. Viroi, 36:59-72. 1977.

Graham and van der Eb, „A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA”, Virology, 52:456-467, 1973.

Grunhaus and Horwitz, „Adenovirus as cloning vector.” Seminar in Virology-. 3:237252, 1992.,

Harland and Weintraub, „Translation of mammalian mRNA injected into Xenopus oocytes is specifically inhibited by antisense RNA,” J Cell Biol.. 101:1094-1099,1985.

Hartwell and Kastan, „Cell cycle Control and Cancer,” Science. 266:1821-1828,1994.

Hermonat and Muzycska, „Use of adenoassociated virus as a mammalian DNA cloning vector: Transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells,” Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81:6466-6470. 1984.

Herz and Gerard. „Adenovirus-mediated transfer of low density lipoprotein receptor gene acutely accelerates cholesterol clearance in normal mice.” Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:2812-2816. 1993.

Hoollstein et al., ,,p53 mutations in human cancers,” Science:, 253:49-53. 1991.

Hopp et al, „A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Identification and Purification of Recombinant Proteins,” BioTechnology. 7:1205-1210, 1988.

Hsu et al, „Use of Avidin-Biotin-Peroxidase Complex (ABC) in Immunoperoxidase Techniques: a Comparison Between ABC and Unlabeled Antibody (PAP) Procedures,” J Histochem. Cytochem, 29:577-580, 1981.

Jones and Shenk, „Isolation of deletion and substitution mutants of adenovirus type 5,” Celi, 13:181-188, 1978.

Kaneda et al, „Increased expression of DNA cointroduced with nuclear protein in adult rat liver,” Science, 243:375-378, 1989.

Karlsson et al, EMBOJ., 5:2377-2385,1986.

Kashani-Sabet et al, „Reversal of the malignant phenotype by an anti-ras ribozyme.” Antisense Res. Dev, 2:3-15, 1992.

Kastan et al, „A mammalian cell cycle checkpoint pathway utilizing p53 and GADD45 is defective in ataxia-telangiectasia,” Celi., 71:587-597. 1992.

Kato et al, „Expression of hepatitis B virus surface antigen in adult rat liver,” J. Biol. Chem., 266:3361-3364, 1991.

Klein et al.. „High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells,” Naturę, 327:70-73, 1987.

Kohler and Milstein, Eur. J Immunol, 6:511^-511^, 1976.

Kohler and Milstein, Naturę, 256:495-497,1975.

Kozarsky and Wilson, „Gene Therapy: Adenovirus Vectors,” Curr·. Opin. Genet. Dev.. 3:499-503, 1993.

Kyte and Doolittle, „A simple method for displaying the hydropathic character of a protein,” J. Mol. Biol, 157(1): 105-132, 1982.

Lane and Crawford, ,,T antigen is bound to a host protein in SV40-transformed cells.” Nature, 278:261-3, 1979.

Le Gal La Salle et al, „An adenovirus vector for gene transfer into neurons and glia in the brain,” Science:, 259:988-990, 1993.

Levrero et al, „Defective and nondefective adenovirus vectors for expressing foreign genes in vitro and in vivo, Gene:, 101: 195-202, 1991.

186 018

Li et al, „Assessment of recombinant adenoviral vectors for hepatic gene therapy,” Hum. Gene Ther., 4:403-409, 1993.

Linzer and Levine, „Characterization of a 54K dalton cellular SV40 tumor antigen present in SV40-transformed cells and uninfected embryonal carcinoma cells,” Cell, 17-43-52, 1979.

Lowe et al, ,,p53 is required for radiation-induced apoptosis in mouse thymocytes.” Nature, 362:847-849, 1993.

Maestro et al, „High frequency of p53 gene alterations associated with protein overexpression in human squamous cell carcinoma of the larynx,” Oncogene. 7:1159-1166,1992.

Mann et al., „Construction of a retrovirus packaging mutant and its use to produce helper-free defective retrovirus,” Cell, 33:153-159, 1983.

Markowitz et al, „A safe packaging linę for gene transfer: Separating viral genes on two different plasmids,” J. Virol, 62:1120-1124,1988.

Martinez et al, „Cellular localization and cell cycle regulation by a temperaturesensitive p53 protein.” Genes Dev., 5:151-159,1991.

Mara, „Learning how to suppress cancer,” Science, 261:1385-1387, 1993.

Mashal et al, „Rearrangement and expression of p53 in the chronic phase and blast crisis of chronić myelogenous leukemia,” Blood, 75:180-189, 1990.

Matlashewski et al, „Isolation and characterization of a human p53 cDNA clone: expression of the human p53 gene,” The EMBO Journal, 3(13):3257-3262. 1984.

Mercer et al.. „Negative growth regulation in a glioblastoma tumor cell line that conditionally expresses human wild-typep53” Proc. Natl. Acad Sci. USA. 87:6166-6170, 1990.

Merino et al, „An Analysis of Distant Metastasis From Squamous Cell Carcinoma of the Upper Respiratory and Digestive Tracts,” Cancer, 40:147-156. 1977.

Mietz et al, „The transcriptional transactivation function of wild-type p53 is inhibited by SV40 large T-antigen and by HPY-16 E6 oncoprotein,” EMBO J.. 11:5013-5020, 1992.

Mitsudomi et al, „p53 gene mutations in non-small-cell lung cancer cell lines and their correlation with the presence of ras mutations and clinical features.”

Oncogene. 7:171-180. 1992.

Mukhopadhyay et al. „Specific Inhibition of K-ras Expression and Tumorigenicity of Lung Cancer Cells by Antisense RNA,” Cancer Res. ,51:1744-1748. 1991.

Mulcahy et al, „Requirements for ras protoonogene function during serum-stimulated growth of NIH/3T3 cells.” Nature, 313:241-243, 1985.

Mulligan, „The Basie Science of Gene Therapy,” Science, 260:926-932. 1993. Myers, EPO 0273085

Nicolau et al, „Liposomes as carriers for in vivo gene transfer and expression.” MethodsEnzymol, 149:157-176, 1987.

Nicolau and Sene. „Liposome-mediated DNA transfer in eukaryotic cells.” Biochem. Biophys. Acta. 721:185-190, 1982.

Nylander et al., ,,p53 Expression and Cell Proliferation in Squamous Cell Carcinomas of the Head and Neck,” Cancer, 75:87-93,1995.

O'Malley, Jr. et al., „Adenovirus-mediated Gene Therapy for Human Head and Neck Seuamous Cell Cancer in a Nude Mouse Model,” Cancer Res, 55:1080-1085. 1995.

Ogiso et al., „Suppression of various human tumor cell lines by a dominant negative

H-ras mutant,” Gene Ther., 1:403-407, 1994.

Oren and Levine, „Molecular cloning of a cDNA specific for the murine p53 cellular tumor antigen,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:56-59, January 1983.

Pavelic et al., „Overexpression of p53 Protein is Common in Premalignant Head and Neck Lesions,” Anticancer Research. 14:2259-2266, 1994.

Perales et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4086-4090, 1994.

Potter et al, „Enhancer-dependent expression of human k immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation,” Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, 1984.

Racher et al, Biotechnology Techniques, 9:169-174, 1995.

186 018

Ragot et al., „Efficient adenovirus-mediated , transfer of a human minidystrophin gene to skeletal muscle of mdx mice,” Naturą, 361:647-650, 1993.

Ramqvist et al., „Wild-type p53 induces apoptosis in a Burkitt lymphoma (BL) linę that carries mutantp53,” Oncogene, 8:1495-1500. 1993.

Rao et al., „The adenovirus E1A proteins induce apoptosis which is inhibited by the E1B 19K and Bcl-2 proteins,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:7742-7746. 1992.

Renan, „Cancer genes: current status, future prospects, and applicants in radiotherapy/oncology,” Radiother Oncol, 19:197-218. 1990.

Rich et al, „Development and analysis of recombinant adenoviruses for gene therapy of cystic fibrosis,” Hum. Gene Ther., 4:461-476, 1993.

Ridgeway, „Mammalian expression vectors,” In: Rodriguez RL, Denhardt DT. ed. Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Stoneham: Butterworth, pp. 467-492,1988.

Rippe et al., ,,DNA-mediated gene transfer into adult rat hepatocytes in primary in culture,” Mol. Cell Biol, 10:689-695,1990.

Rodrigues et al., ,,p53 mutations in colorectal cancen” Proc. Natl.. Acad Sci. USA, 87:7555-7559, 1990.

Rosenfeld et al., „in vivo transfer of the human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene to the airway epithelium,” Cell, 68:143-155, 1992.

Rosenfeld et al, „Adenovirus-mediated transfer of a recombinant al-antitrypsin gene to the lung epithelium in vivo,'” Science, 252:431-434, 1991.

Roth et al.. U.S. Serial No. 07/987,235

Sacks et al., „Establishment and Characterization of Two New Squamous Cell Carcinoma Cell Lines Derived from Tumors of the Head and Neck,” Cancer Res, 48:2858-2866, 1988.

Shaulsky et al., „Nuclear accumulation of p53 protein is mediated by several nuclear localization signals and plays a role in tumorigenesis,” Mol Cell Biol 10(12):6565-6567, 1990.

Shaw et al., „Induction of apoptosis by wild-typep53 in a human colon tumor-derived cell line,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4495-4499. 1992.

Shirasawa et al,, „Altered Growth of Human Colon Cancer Cell Lines Disrupted at Activated Ki-ras,” Science:, 260:85-88, 1993.

Somers et al, „Amplification of the int-2 gene in human head and neck squamous cell carcinomas,” Oncogene, 5:915-920, 1990.

Southern and Berg, „Transformation of Mammalian Cells to Antibiotic Resistance with a Bacterial Gene Under Control of the SV40 Early Region Promoter.” J. Mol App. Gen., 1:327-341, 1982.

Stratford-Perricaudet and Perricaudet, „Gene transfer into animals: the promise of adenovirus,” p. 51-61, In: Human Gene Transfer, Eds, O. Cohen-Haguenauer and M. Boiron, Editions John Libbey Eurotext, France, 1991.

Stratford-Perricaudet et al.. „Evaluation of the transfer and expression in mice of an enzyme-encoding gene using a human adenovirus vector.” Hum. Gene Ther.. 1:241-256,1990.

Su et al., „Production of Recombinant Porcine Tumor Necrosis Factor Alpha in a Novel E.coli Expression System,” Biotechniąues, 13(5):756-761. 1992.

Tabin et al., Naturę, 300:143-149, 1982.

Takahashi et al., „The p53 gene is very frequently mutated in small-cell lung cancer with a distinct nucleotide substitution pattern,” Cancer Res.. 52:734-736. 1992.

Thawley and Panje, eds, „Comprehensive Management of Head and Neck Tumors.” Philadelphia: WB Saunders. 2:1158-1172,1987.

Top et al., „Immunization with live types 7 and 4 adenovirus vaccines. II. Antibody response and protective effect against acute respiratory disease due to adenovirus type 7,” J. Infect. Dis., 124:155-160, 1971.

Tur-Kaspa et al., „Use of electroporation to introduce biologically active foreign genes into primary rat hepatocytes,” Mol. Celi Biol., 6:716-718, 1986.

186 018 van der Riet et al., „Frequent loss of chromosome 9 early in head and neck cancer progression,” Cancer Res, 54:1156-1158, 1994.

Wagner ef al., Science, 260:1510-1513, 1993.

Wang et al.. „Apoptosis induced in human osteosarcoma cells is one of the mechanisms for the cytocidal effect of AdCMV-p53.” Cancer Gene Therapy. 2(1):1-9,1995.

Watling et al., „Overexpression of p53 in Head and Neck Cancer,” Head and Neck, 14:437-444, 1992.

Wijsman et al, „A new method to detect apoptosis in parriffm section: in situ endlabeling of fragmented DNA,” J. Histochem. Cytochem, 41:7-12, 1993.

Wilcock and Lane, „Localization ofp53, retinoblastoma, and host replication proteins at sites of viral replication in eeraes-infected cells.” Naturę, 349:429-43L 1991.

Wong et al, „Appearance of β-lactamase activity in animal cells upon liposome mediated gene transfer,” Gene:, 10:87-94, 1980.

Wu and Wu, „Receptor-mediated in vitro gene transfections by a soluble DNA carrier system,” J. Biol. Chem., 262:4429-4432,1987.

Wu and Wu, Adv. DrugDelivery Rev., 12:159-167, 1993.

Wu and Wu, „Evidence for targeted gene delivery to HepG2 hepatoma cells in vitro,” Biochemistry, 27:887-892, 1988.

Wu and Levine, ,,p53 and E2F-1 cooperate to mediate apoptosis,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3602-3606, 1994.

Yamamoto et al., „High incidence of )malific)tion of the epidermal growth factor receptor gene in human squamous carcinoma cell lines.” Cancer Rc.s.. 46:414-416. 1986.

Yang et al., „in vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particie bombardment,” Proc. Nat'lAcad. Sci. USA, 87:9568-9572, 1990.

Yonish-Rouach et al.. „Wild-type p53 induces apoptosis of myeloid leukaemic cells that is inhibited by interleukin-6,” Nature, 352:345-347. 1991.

Yuasa et al, Nature, 303:775-559, 1983.

Zelenin et al, „High-velocity mechanical DNA transfer of the chloramphenicol acetyltransferase gene into rodent liver, kidney and mammary gland cells in organ explants and in vivo,” FEBSLett., 280:94-96. 1991.

Zhang et al, U.S. Serial No. 08/423,573

Zhang and Roth, U.S. Serial No. 08/252,285

Zhang et al, „Generation and identification of recombinant adenovirus by liposomemediated transfection and PCR analysis,” Biotechniąues. 15:868-872, 1993.

Zhang et al, „High-efficiency gene transfer and high-level expression of wild-type p53 in human lung cancer cells mediated by recombinant adenovirus.” Cancer Gene Therapy,, 1:1-10, 1994.

186 018

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE (i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY

OF TEXAS SYSTEM (B) ULICA: 201 WEST 7TH STREET (C) MIASTO: AUSTIN (D) STAN: TEXAS (E) KRAJ: U.S.A.

(F) KOD POCZTOWY: 78701 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: METODY I KOMPOZYCJE

DO DIAGNOSTYKI NOWOTWORU (iii) LICZBA SEKWENCJI: 14 (iv) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:

(A) TYP NOŚNIKA: Floppy disk (B) KOMPUTER: IBM PC compatible (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: PatentIn Release #1.0,

Version #1.30 (EPO) (vi) DANE DOTYCZĄCE OBECNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZGŁOSZENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

(vii) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 60/007,810 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 30-LISTOPAD-1995 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2066 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (c) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 1:

186 018

TAAAAAACTC	ATGTTCAAGA	CAGAAGGGCC	TGACTCAGAC	TGACATTCTC	CACTTCTTGT	900
TCCCCACTGA	CAGCCTCCCA	CCCCCATCTC	TCCCTCCCCT	GCGATTTTGG	GTTTTGGGTC	960
TTTGAACCCT	TGCTTGCAAT	AGGTGTGCGT	CAGAAGCACC	CAGGACTTCC	ATTTGCTTTG	1020
TCCCGGGGCT	CCACTGAACA	AGTTGGCCTG	CACTGGTGTT	TTGTTGTGGG	GAGGAGGATG	1080
GGGAGTAGGA	CATACCAGCT	TAGATTTTAA	ggtttttact	GTGAGGGATG	TTTGGGAGAT	1140
GTAAGAAATG	TTCTTGCAGT	TAAGGGTTAG	TTTACAATCA	GCCACATTCT	AGGTAGGGGC	1200
CCACTTCACC	GTACTAACCA	GGGAAGCTGT	CCCTCACTGT	TGAATTTTCT	CTAACTTCAA	1260
GGCCCATATC	TGTGAAATGC	TGGCATTTGC	ACCTACCTCA	CAGAGTGCAT	TGTGAGGGTT	1320
AATGAAATAA	TGTACATCTG	GCCTTGAAAC	CACCTTTTAT	TACATGGGGT	CTAGAACTTG	1380
ACCCCCTTGA	GGGTGCTTGT	TCCCTCTCCC	TGTTGGTCGG	TGGGTTGGTA	GTTTCTACAG	1440
TTGGGCAGCT	GGTTAGGTAG	AGGGAGTTGT	CAAGTCTCTG	CTGGCCCAGC	CAAACCCTGT	1500
CTGACAACCT	CTTGGTGAAC	CTTAGATCCT	AAAAGGAAAT	GTCACCCCAT	CCCACACCCT	1560
CAAAACCTAC	CAGGGCAGCT	ACGGTTTCCG	TCTGGGCTTC	TTGCATTCTG	GGACAGCCAA	60
GTCTGTGACT	TGCACGTACT	CCCCTGCCCT	CAACAAGATG	TTTTGCCAAC	TGGCCAAGAC	120
CTGCCCTGTG	CAGCTGTGGG	TTGATTCCAC	ACCCCCGCCC	GGCACCCGCG	TCCGCGCCAT	180
GGCCATCTAC	AAGCAGTCAC	AGCACATGAC	GGAGGTTGTG	AGGCGCTGCC	CCCACCATGA	240
GCGCTGCTCA	GATAGCGATG	GTCTGGCCCC	TCCTCAGCAT	CTTATCCGAG	TGGAAGGAAA	300
TTTGCGTGTG	GAGTATTTGG	ATGACAGAAA	CACTTTTCGA	CATAGTGTGG	TGGTGCCCTA	360
TGAGCCGCCT	GAGGTTGGCT	CTGACTGTAC	CACCATCCAC	TACAACTACA	TGTGTAACAG	420
TTCCTGCATG	GGCGGCATGA	ACCGGAGGCC	CATCCTCACC	ATCATCACAC	TGGAAGACTC	480
CAGTGGTAAT	CTACTGGGAC	GGAACAGCTT	TGAGGTGCGT	GTTTGTGCCT	GTCCTGGGAG	540
AGACCGGCGC	ACAGAGGAAG	AGAATCTCCG	CAAGAAAGGG	GAGCCTCACC	ACGAGCTGCC	600
CCCAGGGAGC	ACTAAGCGAG	CACTGCCCAA	CAACACCAGC	TCCTCTCCCC	AGCCAAAGAA	660
GAAACCACTG	GATGGAGAAT	ATTTCACCCT	TCAGATCCGT	GGGCGTGAGC	GCTTCGAGAT	720
GTTCCGAGAG	CTGAATGAGG	CCTTGGAACT	CAAGGATGCC	CAGGCTGGGA	AGGAGCCAGG	780
GGGGAGCAGG	GCTCACTCCA	GCCACCTGAA	GTCCAAAAAG	GGTCAGTCTA	CCTCCCGCCA	840

186 018

GGAGGATYEJ	REHYHYYGYR	ERGREGREJY	GGATCHAJHA	AGAHEEGYYY	YRGHYHRGGG	1620
YHHARYYEHE	YYYYYHYEYE	^^7	EYYHYYEEYH	YYEGAGRHEG	GGTHYHEYYG	1680
EEGJJHHRGG	HEGGRGYGGR	GEGGHGEGRE	HYGGHYEAHY	G^^Gi^^TTTG	HJYHJHHGGJ	1740
EHGRGHAGEJ	HYGHHYHAGH	HYHHGGRGER	GJEGGGRHHR	HRGGTYHREG	HHRHHAEGGH	1800
HAGHHAAHYE	YEGHRYGYYE	EGERGRGREG	GGGTHYJAHR	GYGEEGHHHA	GGHEGGYHEJ	1860
RRAJYJHYGG	GHYHRGGHGR	EJJRJHYGEH	EHRGHHYHHJ	RGRGYGHEGG	GAYYAJRRYY	1920
GYGRGJHRJJ	AHGEHHAGHE	GGAAGGGTJA	AHAEHYYEER	HAYEHYGHRR	GHRJAEHYGJ	1980
AYEEEHAHHJ	HRHHHEEHHH	HEHEYHEHHJ	EEEEYAEAEH	HJA^,EEYYYAY	RYHGREHYHE	2040
EAEEEYAHAR	YAAAAHEEYG	HYGJHR				2066

(2) (i) (xi)

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:2:

CHARAKTERYSTYKA SEKKENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 293 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (H) NIHIOEOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

OPIS ERKEENC:JI: IDENTYFIKATOR ERKE. NR: 2:

Lys

Thr

Tyr

Gln

Gly

Ser

Tyr

Gly

Phe

Arg

Leu

Gly

Phe

Leu

Ais

Ser

1

5

10

15

Gly

TTe

Ala

Lys

Ser

vaa

Thr

Hys

Thr

TTr

Ser

Pro

Ala

Leu

Asn

Lys

20

25

30

Met PPe Hys Gin Leu Ala Lys Thr Hys Ppo Val Gin Leu Trp Val Asp 35 40 45

186 018

Ser

Thr 50

Ppo Pro

Pro Gly Thr Arg Val Arg ASa Mtt

ASa

Ile

Tir

Lys

55

60

Gln

Ser

Gin

Hii

Met

Thi?

Gly

Val

Arg

Cci

Pro

His

Glu

65

70

77

80

Arg

Cys

Ser

Asp

Ser

Asp

Gly

Leu

Al ći

Pro

Ppo

Gln

His

Leu

Ile

Arg

85

0 0

95

Val

Glu

Gly

A nn

Leu

Aru

Vrl

Lir

Tyr

Leu

Asp

Apa

Ann

Thr

POe

100

105

11.0

Arg

His

SeS

VV.

Val

Pro

Tyo

o lu

Pro

uoo

Olo

Val

Gly

Ser

Arp

115

120

125

Cys

Thr

TTh

Ile

Hi s

Asn

Syn

Met

Cys

Atn

Ser

nSe

Ser

Me^t

Gly

130

135

140

Gly

Met

Asn

Arg

Pro

Ile:

Leu

Thr

Ile

Ole

Thr

Leu

Glu

Asp

Ser

145

150

155

160

Ser

Gly

Asn

Leu

Gly

Arg

Asn

Ser

Phe

(Olu

vra

Arg

Vra

Ces

ASa

165

70 0

175

Cys

Pro

Gly

Arg

Lsp

Arp

Arg

Thr

Glu

Asu

LnL

ung

Lys

180

115

190

Gly

Glu

Pro

H is

His

Hl.u

Lgu

PrL

Pro

Gly

oir

Ser

hgs

.Arg

Ala

Leu

195

200

205

Pro

Asn

Thr

Seo

Ser

Peo

Gln

Pro

Lys

Lis

los

Asp

210

215

220

Gly

Glu

Tyr

PhP

ThT

LeA

Gln

I le

ArA

G ly

Arg

Glu

Arg

PPi

Glu

Mtt

225

230

2 25

220

Phe

Arg

G1g

Les

Asn

G1g

Air

LeL

G1g

L es

Lli

Asp

Aća

Gln

ASa

Gly

245

200

2 55

Lys

Glu

ro o

Gly

Ser

Arg

Ala

HHs

Ser

His

Lsu

Lys

Ser

Lys

260

225

2 70

Lys

Gly

Gln

Ser

Thr

Ser

Arg

His

Lys

Leu

Met

Phe

Lys

Thr

Hu

275

280

285

Gly Pro Asp Ser Asp 290

186 018 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 2066 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENOJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 3:

CAAAACTTAC	CAGGGCAACT	ATGGCTTCCA	CCTGGGCTTC	CTGCAGTCTG	GGACAGCCAA	60
GTCTGTTATG	TGCACGTACT	CTCCTCCCCT	CAATAAGCTA	TTCTGCCAGC	TGGCGAAGAC	120
GTGCCCTGTG	CAGTTGTGGG	TCAGCGCCAC	ACCTCCAGCT	GGGAGCCGTG	TCCGCGCCAT	180
GGCCATCCAC	AAGAAGTCAC	AGCACTTGAC	GGGGGTCGTG	AGACGCTGCC	CCCACCATGA	240
GCGCTGCTCC	GATGGTGATG	GCCTGGCTCC	TCCCCAGCAT	CTTATCCGGG	TGGAAGGAAA	300
TTTGTATCCC	GAGTATCTGG	AAGACAGGCA	GACTTTTCGC	CACAGCGTGG	TGGTACCTTA	360
TGAGCCACCC	GAGGCCGGCT	CTGAGTATAC	CACCATCCAC	TACAAGTACA	TTTGTAATAG	420
CTCCTGCATG	GGGGGCATGA	ACCGCCGACC	TATCCTTACC	ATCATCACAC	TGGAAGACTC	480
CAGTGGGAAC	CTTCTGGGAC	GGGACAGCTT	TGAGGTTCGT	GTTTGTGCCT	GCCCTGGGAG	540
AGACCGCCGT	ACAGAAGAAG	AAAATTTCCG	CAAAAAGGAA	GTCCTTTGCC	CTGAACTGCC	600
CCCAGGGAGC	GCAAAGAGAG	CGCTGCCCAC	CTGCACAAGC	GCCTCTCCCC	CGCAAAAGAA	660
AAAACCACTT	GATGGAGAGT	ATTTCACCCT	CAAGATCCGC	GGGCGTAAAC	GCTTCGAGAT	720
GTTCCGGGAG	CTGAATGAGG	CCTTAGAGTT	AAAGGATGCC	CATGCTACAG	AGGAGTCTGG	780
AGACAGCAGG	GCTCACTCCA	GCTACCTGAA	GACCAAGAAG	GGCCAGTCTA	CTTCCCGCCA	840
TAAAAAAACA	ATGGTCAAGA	AAGTGGGGCC	TGACTCAGAC	TGACATTCTC	CACTTCTTGT	900
TCCCCACTGA	CAGCCTCCCA	CCCCCATCTC	TCCCTCCCCT	GCCTTTTGGG	TTTTGGGTCT	960
TTGAACCCTT	GCTTGCAATA	GGTGTGCGTC	AGAAGCACCC	AGGACTTCCA	TTTGCTTTGT	1020

186 018

CCCGGGGCTC CACTGAACAA GTTGGCCTGC ACGGGGGGGG TGTTGTGGGG AGGAGGATGG 1080

GG.AGTAGGAC ATACCACCTT AGCATTT/AG GGGGGGACGG TGAGGGATGT TTGGGAGATG 1110

TAACAAATCT TCTTGCAGTT AAGGGCGGGC TTAC^TCAG CCACCATTCTA GGTAGGGGCC 1200

TACTTTGTTC GATGAGTCAC GCCGGlTGGC CCTCACTGTT GCGGTTTTCTC 'GGGCCTCAAG 1260

GCCCATAGTG GGGGGGTGCG GGCTGGGGlT CCTACCTCAC AGAGTGCATT GTGAGGGTTA 1320

ATGAGAGAGT GGGCAGTGCC C(^(r'^<^JAA^(^C AGTTTGTAG’T AGTGGCGGGT TAGΛ'ΓGAGCT 13 80

CCTTGAGCTC TGGGGGTCCG CTCCCTGTTG GC^CGC^C^GCiCJC’ TGCCGGCGTT TGGAGl'TGCG 114 0

TACCGGGTGA GGGGGGGGTA GTTGTCAGGT CCCTGCTGGC CCTGCCGGAG TCCATCCAGC 1500

CGGGGGGGGG GTTCGGGCAC CTCίAAGΓG7GG ATCTCACCCT ACCCCTCACC CTTGCGGC.GT 1560

TGGGCGTGGG GAGGCGGGAG CTGGATCCAC CTAGlGCTGT GTGAGCTCAG GGTCCTGTGG 1620

CTTTTTTCTT TTTTTTTTTT GGGGTCTTTT GTCGTGGCAC GGGCCCTCGG GGTTGCCCCA 168 0

CGCGGGGGGG GACGGGTGTG AGCGGGCGGA CTGCTGGCCTT TGCCGCCCCG GCTCGAGCAG 1740

GCCGCCTGTA GCTGTTGGGG TAGCTCGGAC CACAGGTTCA GGCCACCAGG 1800

TTTGCCAGGG GGGGTGGACG TGGGGTCTCA CAGTGTTGCC CAGGCGGGGC GC(AAGCTCCT 186 0

GGGTGCACGC GGGCCGTCGG TCTCACCCTC CCAGAGTGCT GOdCTAC/A TTGTGAGCCA 1920

TCGCCGTCGG TGCGAGGCCC CGACGGGCCG GCCAGGCGGC TAAAGCCCGGC GGCAGGGAGC 1900

CACC^A^C GCTATTCCGC TCCCTCTTTT TTTCTTACCC CGGGGGAGAG ATCA?\TTTCT 2740

GAGGGGGCGG GGGAATTTTC GGGGCG 2066 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 213 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 4:

186 018

Lys 1

Thr Tyr

Gin Gly Asn Tyr Gly Phe His

Leu

GLy

Phe Leu

dn 15

Ser

5

10

dy

Thr

Ala

Lys

Ser

Val

Met

Cys

Thr

Tyl

Ser

Pro

Leu

Asn

Lys

20

25

30

Leu

Phe

Cys

Gin

Leu

Ala

Lys

Thr

Cys

Pro

m

Gin

Leu

T!p

Val

SSr

35

40

45

Ala

Thr

Pro

Prro

Ala

Gly

Ser

Arg

Val

Arg

LLa

Me0

ASa

11(2

His

Lyy

50

55

00

Lys

Ser

Gin

His

Met

Mhr

dy

rai

Val

Arr

Arg

Cys

Pro

His

Giu

65

70

55

80

Arg

Cys

Ser

Asp

Gly

Asp

Gly

Leu

AL.a

Pro

Poo

Gin

His

Leu

Il€2

Asg

85

90

95

Val

GLu

Gly

An n

Leu

Tyr

Pro

du

Tyr

Leu

GLu

Asg

Arg

dn

Thr

PPh

100

105

111

Arg

His

SeS

V vl

Val

Pro

TyP

oiy

Pro

Gru

Glu

Ola

G0y

Ger

GLu

115

110

112

Tyr

Thr

Thh

Ile

Hi s

His

Lys

Lyr

He

Cci

Asn

Ser

SSr

Cys

Met

dy

130

135

114

Gly

Met

Asn

Asi

Arg

Pro

Ile

Leu

TTir

Ile

He

TTr

Leu

Glu

Asg

Ser

145

150

155

160

Ser

Gly

Asn

Leu

GLy

Arg

Asn

Ser

PPh

GLu

Vv1

Arg

Val

Cys

Ala

165

100

175

Cys

Pro

G1g

Asg

Asp

Arg

Asg

Ths

du

riu

Glu

Asn

Phe

Arg

Lys

LPh

180

185

110

GLu

Val

Leu

Cci

Pro

Glo

Lgu

PrL

Pro

Gly

Ser

Ala

Lys

Arg

Ala

Ley

195

200

225

Pro

Thr

Cys

Thr

Ser

Ala

Ser

Pro

Gin

Lys

Ly-y

Ly^s

Pro

Leu

Asg

210

215

220

Gly

GLu

Tyr

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

Arg

dy

Arg

Llu

Arg

Phr

Glu

Met

225

230

235

240

Phe

Arg

GLu

Leu

Asn

GLu

Ala

Leu

GLu

Leu

Lys

Asg

Ala

His

Ala

Thr

186 018

245 250 255

Glu

Ser

Gly 260

Asp

Ser

Arg Ala

His 265

Ser

Tyr

Leu

Lys 270

Ser

Lys

Gly

Gin 275

Ser

Thr

Ser

Arg His 280

Lys

Thr

Met

Val 285

Lys

Val

Gly

Pro

Asp

Ser

Asp

290 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 5:

ACTGCCCAAC AACACCA 17 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 6:

GCCACGCCCA CACATTT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

186 018 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 7:

GCCTGTCCTG GGAGAGACCG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 8:

CCCTTAAGCC ACGCCCACAC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 9:

CACTGCCCAA CAACACCA 18 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 10:

GCCACGCCCA CACATTT

186 018 (2) INFORMAC«IA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 11:

(i) HAAARAERYKEEYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (H) NIHIOEOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKE-NC:: JI: IDENTYFIKATOR SEKE. NR: 11:

GGTGJREEGG RAJGJGGAEE (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKEENCJI NR: 12:

(i) JAARAKTEYYSEKKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (H) NIHIOEOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS ERAEENCJI: IDENTYFIKATOR SEKE. NR: 12:

GGGGAJRGAR JGTTGTTEEJ (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKEENCJI NR:13:

(i) JAAYAKTERYSEYAR SEKEENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (H) NIHIOEOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKEE^i^C^ JI: IDENTYFIKATOR SEKE. NR: 13:

RHGGREEEGG EJGEREEGGG

186 018 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENOJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 14:

TGATTTTGGA GGGATCTCGC

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie konstruktu ekspresyjnego obejmującego promotor działający w komórkach eukariotycznych i polinukleotyd kodujący p53, przy czym polinukleotyd jest ustawiony sensownie i znajduje się pod kontrolą promotora, do wytwarzania leku do leczenia osobnika z nowotworem, charakteryzującym się ekspresją funkcjonalnej cząsteczki p53, przez kontaktowanie leku z komórką nowotworową in vivo.
2. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że nowotwór jest wybrany z grupy składającej się z raka, glejaka, mięsaka oraz czerniaka.
3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że nowotwór jest rakiem płaskokomórkowym.
4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że rak płaskokomórkowy jest rakiem głowy i szyi.
5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że komórka nowotworowa jest złośliwa.
6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że komórka nowotworowa jest łagodna.
7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że nowotwór jest nowotworem płuca, skóry, prostaty, wątroby, jąder, kości, mózgu, okrężnicy, trzustki, głowy i szyi, żołądka, jajnika, sutka albo pęcherza.
8. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że konstrukt ekspresyjny jest wektorem wirusowym.
9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że wektor wirusowy wybrany jest z grupy składającej się z wektora retrowirusowego, wektora adenowirusowego i wektora wirusa towarzyszącego adenowirusem.
10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że wektor wirusowy jest wektorem adenowirusowym.
11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że wektor adenowirusowy jest wektorem adenowirusowym niezdolnym do replikacji.
12. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że promotor jest promotorem CMVIE.
13. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że osobnikiem jest człowiek.
14. Zastosowanie konstruktu ekspresyjnego obejmującego promotor działający w komórkach eukariotycznych i polinukleotyd kodujący p53, przy czym polinukleotyd jest ustawiony sensownie i znajduje się pod kontrolą promotora, do wytwarzania leku do terapii osobnika z nadającym się do resekcji nowotworem, charakteryzującym się ekspresją funkcjonalnej cząsteczki p53, przez kontaktowanie leku z miejscem wycięcia guza.
15. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że nowotwór jest nowotworem płuca, skóry, prostaty, wątroby, jąder, kości, mózgu, okrężnicy, trzustki, głowy i szyi, żołądka, jajnika, sutka albo pęcherza.
16. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że konstrukt ekspresyjny jest wektorem wirusowym.
17. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że wektor wirusowy wybrany jest z grupy składającej się z wektora retrowirusowego, wektora adenowirusowego i wektora wirusa towarzyszącego adenowirusom.
18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że wektor adenowirusowy jest wektorem adenowirusowym niezdolnym do replikacji.
19. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że promotor jest promotorem CMV IE.

186 018
20. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 14, znamienne tym, że nowotwór znajduje się w jamie ciała takiej, jak usta, gardło, przełyk, krtań, tchawica, jama opłucna, jama otrzewna, wnętrze pęcherza albo światło okrężnicy.
21. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 14, znamienne tym, że lek jest podawany miejscowo.
22. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 14, znamienne tym, że lek jest podawany donowotworowo albo do wnętrza jamy powstałej po resekcji guza.
23. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 14, znamienne tym, że lek jest podawany dożylnie.
24. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 14, znamienne tym, że lek jest podawany doustnie.