ES2264145T3

ES2264145T3 - Metodos y composiciones para el tratamiento de cancer.

Info

Publication number: ES2264145T3
Application number: ES96942100T
Authority: ES
Inventors: Gary L. Clayman
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1995-11-30
Filing date: 1996-11-27
Publication date: 2006-12-16
Anticipated expiration: 2016-11-27
Also published as: SK70598A3; AU722042B2; HUP9902068A3; AU1126397A; US20030166603A1; NZ324168A; NO982481D0; DK0863984T3; WO1997020047A1; EP0863984A1; CN1308450C; KR19990071795A; DE69636120T2; CZ165798A3; CN1207771A; RU2174409C2; JP2000501394A; PL186018B1; NO982481L; CA2238829A1

Abstract

SE DESCRIBEN METODOS PARA EL TRATAMIENTO DEL CARCINOMA DE CELULAS ESCAMOSAS UTILIZANDO UN VECTOR VIRAL QUE EXPRESA P53. EN REALIZACIONES PARTICULARES, EL VECTOR ES UN ADENOVIRUS DEFICIENTE EN LA REPLICACION. ADEMAS, SE PROPORCIONAN METODOS PARA EXAMINAR EL DESARROLLO Y EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDAD MICROSCOPICA RESIDUAL EN EL CONTEXTO DE ENTORNOS POST-QUIRURGICOS Y EN CAVIDADES CORPORALES.

Description

Métodos y composiciones para el tratamiento del cáncer.

A. Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente al campo de la biología del cáncer. En particular, la invención se refiere a composiciones y métodos de tratamiento para el carcinoma espinocelular. También se proporciona un modelo animal para el examen de tumores residuales microscópicos y la siembra de tumores en las cavidades corporales, así como métodos para el tratamiento de los mismos.

B. Técnica relacionada

El equilibrar las velocidades de la proliferación celular y muerte celular es importante en el mantenimiento de la homeostasis tisular normal. La perturbación de este equilibrio puede ser un factor principal en el proceso de múltiples etapas de la génesis de tumores, y la inhibición de apoptosis, o muerte celular programada, es una causa de dicha perturbación. Los efectos de tales defectos son catastróficos, produciendo más de medio millón de muertes anualmente sólo en los Estados Unidos.

Existe una evidencia considerable que implica las mutaciones del gen p53, un supresor tumoral, en la etiología de muchos cánceres humanos. Los informes han demostrado que el crecimiento de diversas líneas celulares de cáncer humano distintas, incluyendo representativas de cáncer de colon, glioblastoma, cáncer de mama, osteosarcoma y cáncer de pulmón puede inhibirse funcionalmente mediante la transferencia mediada por virus de un gen p53 de tipo natural. La inducción de la expresión de p53 exógeno del p53 de tipo natural ha demostrado inducir apoptosis en las líneas celulares del cáncer de colon y en microesferas de cáncer de pulmón humano, sugiriendo un papel del p53 en la muerte celular programada.

Los pacientes con carcinoma espinocelular de la cabeza y el cuello (SCCHN) experimentan una enfermedad que, con frecuencia, tiene unos profundos efectos sobre el habla, la deglución y la estética. Además, la tasa global de supervivencia entre estos pacientes, aproximadamente el 50%, ha permanecido invariable durante casi 30 años desde que se estableció la terapia de radiación y la cirugía contemporáneas. Las recurrencias son predominantemente locales y regionales en contraposición a las sistémicas, lo que indica que un carcinoma residual microscópico en el sitio del tumor primario es la causa principal de mortalidad. Dados estos hechos, la capacidad para atacar de manera eficaz la enfermedad residual microscópica en SCCHN es un esfuerzo que podría mejorar la eficacia terapéutica de los tratamientos de cáncer.

Por ejemplo, Liu, T.-J. et al. (1995), Cancer Research, 55, 3117-3122, describen la inducción de apoptosis en el carcinoma espinocelular de la cabeza y el cuello mediante la transferencia génica adenoviral de p53 de tipo natural.

Sumario de la invención

Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar métodos mejorados para el tratamiento in vivo del carcinoma espinocelular. También se proporciona un método para valorar el desarrollo y el tratamiento de un carcinoma residual microscópico y la siembra de tumores en las cavidades corporales.

Por consiguiente, la presente invención se refiere al uso de un constructo de expresión, en particular un constructo de expresión viral, que comprende un promotor funcional en células eucariotas y un polinucleótido que codifica para un polipéptido p53 funcional, en el que dicho polinucleótido está en posición de sentido y bajo el control de dicho promotor para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto humano con un tumor sólido, en el que dicho tumor comprende células que expresan un polipéptido p53 funcional.

Para cumplir estos objetivos, se proporciona un método para tratar un sujeto con carcinoma espinocelular que comprende las etapas de (a) proporcionar un constructo de expresión que comprende un promotor funcional en células eucariotas, y un polinucleótido que codifica para p53, en el que el polinucleótido está en posición de sentido y bajo el control del promotor;

y (b) poner en contacto el constructo de expresión con el carcinoma espinocelular in *vivo.

El carcinoma espinocelular puede ser un carcinoma de cabeza y cuello. El p53 endógeno del carcinoma espinocelular puede o no estar mutado. El constructo de expresión, preferiblemente, es un vector viral, tal como un vector retroviral, un vector adenoviral y un vector viral adenoasociado, siendo lo más preferido un vector adenoviral defectuoso para la replicación. En una realización particular, el gen p53 está marcado de manera que puede detectarse la expresión de p53 a partir del vector de expresión. La marca preferida es una inmunológica, tal como un epítopo de anticuerpo continuo.

El método puede comprender además una resección quirúrgica del tumor, con la puesta en contacto adicional del lecho tumoral o "cavidad corporal artificial", con el constructo de expresión tras la resección. El volumen utilizado para poner en contacto el lecho tumoral es aproximadamente de 3 ml a aproximadamente 10 ml. Cuando se emplea un vector de adenovirus, la cantidad de adenovirus administrado en cada contacto es de aproximadamente 10^{7}, 10^{8}, 10^{9}, 10^{10}, 10^{11} o 10^{12} ufp.

También se contempla la perfusión continua del constructo de expresión. La cantidad del constructo administrado en perfusión continua se determinará a partir de la cantidad administrada a través de las inyecciones, con el fin de aproximarse a la misma dosis total dada a lo largo de un periodo de tiempo dado, aunque utilizando la perfusión continua pueden alcanzarse dosis totales superiores.

En otra realización, el constructo de expresión se inyecta en una cavidad corporal natural tal como la boca, la faringe, el esófago, laringe, tráquea, cavidad pleural, cavidad peritoneal, o cavidades orgánicas huecas incluyendo la vejiga, el colon u otros órganos viscerales.

También se proporciona un método para determinar la eficacia de una terapia sobre cáncer residual microscópico que comprende (a) practicar a un roedor una incisión en el tejido subcutáneo; (b) sembrar la incisión con células tumorales; (c) tratar el roedor con un régimen terapéutico; y (d) valorar el impacto del régimen en el desarrollo de tumores. La incisión puede sellarse tras la etapa (b) y antes de la etapa (c). Además, el régimen puede comprender la introducción de una composición terapéutica en la incisión, volviéndose a abrir la incisión tras el sellado y volviéndola a cerrar tras la introducción de dicha composición terapéutica.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, debe comprenderse que la descripción detallada y los ejemplos específicos indican realizaciones preferidas de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede comprenderse mejor mediante la referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en el presente documento:

Figura 1. Eficiencia de transducción de líneas celulares de Tu-138 (triángulos rellenos) y Tu177 (cuadrados rellenos). Se utilizó un adenovirus recombinante con \beta-gal para infectar las células a diferentes MOI que oscilan desde 10 hasta 100. Los porcentajes de células positivas para \beta-gal se obtuvieron a partir de la puntuación de 500 células en placas por duplicado.

Figura 2A y figura 2B. Inhibición del crecimiento celular de SCCHN in vitro. (Figura 2A) Curva de crecimiento de células Tu-138 con infección simulada (círculos rellenos), células infectadas con d1312 (triángulos rellenos), y células infectadas con Ad5CMV-p53 (cuadrados rellenos). (Figura 2B) Curva de crecimiento de células Tu-177 con infección simulada (círculos en blanco), células infectadas con d1312 (triángulos en blanco), y células infectadas con Ad5CMV-p53 (cuadrados en blanco). En cada punto de tiempo indicado, se digirieron con tripsina tres placas de células y se contaron. La media \pm EEM de los recuentos celulares por los pocillos por triplicado se representó frente al número de días desde la infección.

Figura 3A, figura 3B, figura 3C y figura 3D. Curva de crecimiento compuesto de cuatro líneas celulares de SCCHN. (Figura 3A) Tu-138. (Figura 3B) Tu-177. (Figura 3C) MDA 686-LN. (Figura 3D) MDA 886. Células con infección simulada (círculos rellenos), células infectadas con dl312 (triángulo relleno), y células infectadas con Ad5CMV-p53 (cuadrado relleno). Se representó gráficamente la media de los recuentos celulares por los pocillos por triplicado tras la infección frente al número de días desde la infección; barras, EEM.

Figura 4. Curva de crecimiento de línea celular de fibroblastos normales. Células con infección simulada (círculo relleno), células infectadas con d1312 (triángulo relleno), y células infectadas con Ad5CMV-p53 (cuadrado relleno).

Figura 5A y figura 5B. Curva de crecimiento compuesto de líneas celulares de SCCHN. Figura 5A: Tu-138; figura 5B: MDA 686LN; células con infección simulada (círculo en blanco), células infectadas con dl312 (triángulo en blanco), y células infectadas con Ad5CMV-p53 (círculo en blanco). En cada punto de tiempo indicado, se digirieron con tripsina tres placas de células y se contaron. La media de los recuentos celulares por las placas por triplicado se representaron gráficamente frente al número de horas tras la infección; barras, EEM.

Figura 6A y figura 6B. Marcaje de los cortes de ADN en células apoptóticas con dUTP biotinilado mediante el método de TUNEL. Tras la infección, se llevó a cabo un análisis de citometría de flujo para determinar la apoptosis en un estudio a lo largo del tiempo. Figura 6A. Células Tu-138 que están infectadas con dl312, un adenovirus defectuoso para la replicación (panel 1-panel 4), células Tu-138 infectadas con el adenovirus p53 de tipo natural (panel 5- panel 8). Figura 6B. Células MDA 686LN que están infectadas con d1312, un adenovirus defectuoso para la replicación (A-D), células MDA 686LN infectadas con el adenovirus p53 de tipo natural (E-H). Ap significa apoptosis.

Figura 7A y figura 7B. Curva de crecimiento compuesto de la línea celular SCCHN. Figura 7A: Tu-138; figura 7B: MD686LN; células con infección simulada (círculos en blanco), células infectadas con dl312 (triángulos rellenos), células infectadas con Ad5CMV-p53 (cuadrados en blanco) y células infectadas con Ad5CMV-p53-FLAG (cuadrados rellenos). En cada punto de tiempo indicado, se digirieron con tripsina tres placas de células y se contaron. La media de los recuentos celulares por las placas por triplicado se representaron gráficamente frente al número de horas tras la infección; barras, EEM.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La información disponible hasta la fecha sugiere que uno de los principales inconvenientes de los tratamientos para SCCHN es la incapacidad de erradicar completamente la enfermedad en el sitio de tumor primario, o en los tejidos locales o regionales inmediatos. Por lo tanto, la presente invención está diseñada para proporcionar metodologías terapéuticas génicas que permitan un tratamiento de SCCHN más completo y eficaz, específicamente, atacando el carcinoma residual microscópico. Esta metodología puede utilizarse sola o como complemento para tratamientos más convencionales tales como quimio o radioterapia o intervención quirúrgica. Además, utilizando un modelo animal específicamente diseñado para dirigirse al carcinoma residual microscópico, el presente inventor ha demostrado la eficacia de estos métodos. Los detalles de la invención se describen de manera más completa a continuación.

Más generalmente, ahora se ha observado que la terapia génica con p53 de cánceres puede ser más eficaz independientemente del estado de p53 de la célula tumoral. De manera sorprendente, se han observado efectos terapéuticos cuando se utiliza un vector viral que porta el gen p53 de tipo natural para tratar un tumor, cuyas células expresan una molécula de p53 funcional. Este resultado no se habría previsto basándose en la comprensión actual de cómo funcionan los supresores tumorales. También es sorprendente, dado que las células normales, que también expresan una molécula de p53 funcional, aparentemente no resultan afectadas por la expresión de altos niveles de p53 a partir de un constructo viral. Esto plantea la posibilidad de que la terapia génica con p53 puede aplicarse de manera más amplia al tratamiento de los cánceres a lo que inicialmente se sospechaba.

A. Proteínas y polinucleótidos de p53

En toda esta solicitud, el término "p53" pretende referirse a las moléculas p53 a modo de ejemplo, así como a todos los homólogos de p53 de otras especies. p53 de "tipo natural" y "mutante" se refieren, respectivamente a un gen p53 que expresa una actividad inhibidora de tumor normal o que ha reducido su actividad inhibidora y/o tiene actividad transformante. Por tanto p53 "mutantes" no son únicamente variantes de secuencia sino más bien, son aquellas variantes que muestran perfiles funcionales alterados.

Actualmente, se reconoce a p53 como un gen supresor de tumor (Montenarh, 1992). Se han encontrado altos niveles en muchas células transformadas mediante carcinogénesis química, radiación ultravioleta, y diversos virus, incluyendo SV40. El gen p53 es una diana frecuente de inactivación mutacional en una gran variedad de tumores humanos y ya se ha documentado que es el gen más frecuentemente mutado en los cánceres humanos comunes (Mercer, 1992). Está mutado en más del 50% de NSCLC humanos (Hollestein et al., 1991) y en una amplia variedad de otros tumores.

Aunque los tumores que contienen un gen p53 mutado son una diana preferida, la utilidad de los vectores de expresión de p53 reivindicados se amplía al tratamiento de tumores que tienen un p53 de tipo natural o funcional. Aunque no se comprende completamente el mecanismo, el presente inventor ha determinado que la expresión de p53 puede limitar el crecimiento de los tumores que expresan un producto de p53 funcional, e incluso induce la apoptosis en tales células. Por tanto, el estado de p53 de un tumor, aunque potencialmente útil en un contexto diagnóstico, no es esencial para la puesta en práctica de la presente invención. Este fenómeno no se limita a los tumores de SCCHN, sino que puede aplicarse a una gran variedad de tumores malignos incluyendo gliomas, sarcomas, carcinomas, leucemias, linfomas y melanoma, incluyendo tumores de la piel, hígado, testículos, hueso, cerebro, páncreas, cabeza y cuello, estómago, hígado, pulmón, ovario, mama, colon, próstata y vejiga.

Polipéptidos de p53

El gen p53 codifica para una fosfoproteína de 375 aminoácidos que puede formar complejos con proteínas virales tales como el antígeno T grande y E1B. La proteína se halla en tejidos y células normales, pero en concentraciones mínimas en comparación con muchos tejidos tumorales o células transformadas. De manera interesante, el p53 de tipo natural parece ser importante en la regulación del crecimiento y división celular. Una sobreexpresión de p53 de tipo natural ha demostrado, en algunos casos, ser antiproliferativa en líneas celulares tumorales humanas. Por tanto, p53 puede actuar como un regulador negativo del crecimiento celular (Weinberg, 1991) y puede inhibir directamente el crecimiento celular sin control o activar de manera indirecta activar genes que suprimen este crecimiento. Por tanto, la ausencia o inactivación del p53 de tipo natural puede contribuir a la transformación. Sin embargo, algunos estudios indican que la presencia de p53 mutante puede ser necesaria para la expresión completa del potencial transformante del gen.

Aunque se reconoce el p53 de tipo natural como un regulador del crecimiento de importancia central en muchos tipos celulares, sus características genéticas y bioquímicas también parecen desempeñar un papel. Las mutaciones de cambio de sentido son frecuentes para el gen p53 y son esenciales para la capacidad transformante del oncogén. Un único cambio genético provocado por una mutación puntual puede crear p53 carcinogénico. Sin embargo, al contrario que otros oncogenes, se sabe que se producen mutaciones puntuales de p53 en al menos 30 codones distintos, creando a menudo alelos dominantes que producen cambios en el fenotipo celular sin una reducción a homocigosidad. Adicionalmente, parece que muchos de estos alelos negativos dominantes se toleran en el organismo y pasan en la línea germinal. Diversos alelos mutantes parecen oscilar desde mínimamente disfuncionales a alelos negativos dominantes, fuertemente penetrantes (Weinberg, 1991).

Casey y colegas han notificado que la transfección de ADN que codifica para p53 de tipo natural en dos líneas celulares de cáncer de mama humano restablece el control de la inhibición del crecimiento en tales células (Casey et al., 1991). También se ha demostrado un efecto similar en la transfección de p53 de tipo natural, pero no mutante, en líneas celulares de cáncer de pulmón humano (Takahasi et al., 1992). El p53 de tipo natural parece ser dominante sobre el gen mutante y se seleccionará en la proliferación cuando se transfecta en células con el gen mutante. La expresión de p53 transfectado no afecta al crecimiento de las células normales con p53 endógeno. Por tanto, tales constructos podrían captarse por parte de células normales sin efectos adversos.

Por tanto, es posible que el tratamiento de cánceres asociados a p53 con p53 de tipo natural pueda reducir el número de células malignas. Sin embargo, estudios como los descritos anteriormente están lejos de lograr tal objetivo, sobre todo porque la transfección de ADN no puede emplearse para introducir ADN en células de cáncer en el cuerpo de un paciente.

Polinucleótidos que codifican para p53

Los polinucleótidos según la presente invención pueden codificar para un gen p53 entero, un dominio de proteína de p53 funcional, o cualquier polipéptido de p53. Polinucleótidos "complementarios" son los que pueden emparejar las bases según las reglas de complementariedad de Watson-Crick convencionales. Es decir, las purinas más grandes realizarán emparejamientos de bases con las pirimidinas más pequeñas para formar combinaciones de guanina emparejada con citosina (G:C) y adenina emparejada o bien con timina (A:T) en el caso del ADN, o bien adenina emparejada con uracilo (A:U) en el caso del ARN. La inclusión de bases menos comunes tales como inosina, 5-metilcitosina, 6-metiladenina, hipoxantina y otras en las secuencias de hibridación no interfiere en el emparejamiento.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "secuencias complementarias" significa secuencias de polinucleótido que son sustancialmente complementarias a lo largo de toda su longitud y que tienen muy pocos apareamientos erróneos de bases. Por ejemplo, secuencias de quince bases de longitud pueden denominarse complementarias cuando tienen un nucleótido complementario en trece o catorce posiciones. Naturalmente, las secuencias que son "completamente complementarias" serán secuencias que son enteramente complementarias a lo largo de toda su longitud y no tienen apareamientos erróneos de bases.

También se contemplan otras secuencias con menores grados de homología. Por ejemplo, podría diseñarse un constructo antisentido que tiene regiones limitadas de alta homología, pero también contiene una región no homóloga (por ejemplo, un ribozima). Estas moléculas, aunque tienen menos de un 50% de homología, se unirían a secuencias diana en condiciones apropiadas.

Los polinucleótidos pueden derivarse de ADN genómico, es decir, clonarse directamente del genoma de un organismo particular. En otras realizaciones, sin embargo, los polinucleótidos pueden ser ADN complementario (ADNc). El ADNc es ADN preparado utilizando como molde ARN mensajero (ARNm). Por tanto, un ADNc no contiene ninguna secuencia codificante interrumpida y normalmente contiene casi exclusivamente la(s) región(es) codificante(s) para la proteína correspondiente. En otras realizaciones, el polinucleótido puede producirse sintéticamente.

Puede ser ventajoso combinar partes del ADN genómico con secuencias sintéticas o ADNc para generar constructos específicos. Por ejemplo, cuando se desee un intrón en el constructo final, se tendrá que utilizar un clon genómico. Los intrones pueden derivarse de otros genes además de p53. El ADNc o un polinucleótido sintetizado pueden proporcionar sitios de restricción más convenientes para la parte del constructo que queda y, por tanto, podrían utilizarse para el resto de la secuencia.

La secuencia de ADN de ratón y de ser humano para p53 se proporcionan en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3 respectivamente, proporcionándose los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, respectivamente.

Se contempla que existen variantes naturales de p53 que tienen secuencias diferentes de las descritas en el presente documento. Por tanto, la presente invención no se limita al uso de la secuencia de polinucleótido para p53 sino que, más bien, incluye el uso de cualquiera de las variantes que se producen en la naturaleza. La presente invención también abarca el uso de mutantes de estas secuencias sintetizadas químicamente.

Otro tipo de variante de secuencia resulta de la variación de codones. Debido a que existen varios codones para la mayoría de los 20 aminoácidos normales, muchos ADN diferentes pueden codificar para p53. La referencia a la siguiente tabla permitirá identificar tales variantes.

TABLA 1

Aminoácidos					Codones
Alanina	Ala	A	GCA	GCC	GCG	GCU
Cisteína	Cys	C	UGC	UGU
Ácido aspártico	Asp	D	GAC	GAU
Ácido glutámico	Glu	E	GAA	GAG
Fenilalanina	Phe	F	UUC	UUU
Glicina	Gly	G	GGA	GGC	GGG	GGU
Histidina	His	H	CAC	CAU
Isoleucina	Ile	I	AUA	AUC	AUU
Lisina	Lys	K	AAA	AAG
Leucina	Leu	L	UUA	UUG	CUA	CUC	CUG	CUU
Metionina	Met	M	AUG
Asparagina	Asn	N	AAC	AAU
Prolina	Pro	P	CCA	CCC	CCG	CCU
Glutamina	Gln	Q	CAA	CAG
Arginina	Arg	R	AGA	AGG	CGA	CGC	CGG	CGU
Serina	Ser	S	AGC	AGU	UCA	UCC	UCG	UCU
Treonina	Thr	T	ACA	ACC	ACG	ACU
Valina	Val	V	GUA	GUC	GUG	GUU
Triptófano	Trp	W	UGG
Tirosina	Tyr	Y	UAC	UAU

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Permitiendo la degeneración del código genético, se preferirán secuencias que tienen entre aproximadamente el 50% y aproximadamente el 75%, o entre aproximadamente el 76% y aproximadamente el 99% de nucleótidos que son idénticos a los nucleótidos descritos en el presente documento. Las secuencias que están dentro del alcance de un "polinucleótido que codifica para p53" son las que son capaces de emparejar bases con un segmento de polinucleótido expuesto anteriormente en condiciones intracelulares.

Tal como se estableció anteriormente, aunque las secuencias que codifican para p53 pueden ser una molécula genómica completa o copias de ADNc, o fragmentos grandes de los mismos, la presente invención también puede emplear oligonucleótidos de p53 más cortos. Las secuencias de 17 bases de longitud sólo deben aparecer una vez en el genoma humano y, por lo tanto, es suficiente especificar una secuencia diana única. Aunque los oligómeros más cortos son más fáciles de preparar y aumentan la accesibilidad in vivo, muchos otros factores están implicados en la determinación de la especificad del emparejamiento de bases. Tanto la afinidad de unión, como la especificidad de secuencia de un oligonucleótido frente a su diana complementaria aumentan con el aumento de la longitud. Se contempla que se utilizarán oligonucleótidos de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 pares de bases, por ejemplo, en la preparación de mutantes de p53 y en reacciones de PCR.

Cualquier secuencia de 17 bases de longitud debe aparecer solo una vez en el genoma humano y, por lo tanto es suficiente especificar una secuencia diana única. Aunque oligómeros más cortos son más fáciles de preparar y aumentar la accesibilidad in vivo, muchos otros factores están implicados en la determinación de la especificad de hibridación. Tanto la afinidad de unión, como la especificidad de secuencia de un oligonucleótido frente a su diana complementaria aumentan con el aumento de la longitud.

En ciertas realizaciones, se puede desear emplear constructos que incluyan otros elementos, por ejemplo, los que incluyen propino pirimidinas C-5. Se ha demostrado que los oligonucleótidos que contienen análogos de propino C-5 de uridina y citidina se unen al ARN con una alta afinidad (Wagner et al., 1993).

Un experto en la técnica comprenderá bien que, inherente a la definición de una proteína o péptido equivalente biológicamente funcional, está el concepto de que existe un límite al número de cambios que pueden hacerse dentro de una parte definida de la molécula y que todavía dan como resultado una molécula con un nivel aceptable de actividad biológica equivalente. Por tanto, péptidos equivalentes biológicamente funcionales se definen en el presente documento como los péptidos en los que ciertos aminoácidos, no casi todos ni todos, pueden sustituirse. En particular, en lo que respecta al extremo N-terminal de la proteína p16, se contempla que sólo aproximadamente 16 o más, preferiblemente aproximadamente 5 aminoácidos pueden cambiarse dentro del péptido dado. Por supuesto, pueden prepararse y utilizarse fácilmente según la invención una pluralidad de proteínas/péptidos distintos con diferentes sustituciones.

Generalmente, las sustituciones de aminoácidos se basan en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similar. Un análisis del tamaño, la forma y el tipo de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos revela que la arginina, la lisina y la histidina son todos residuos cargados positivamente; que la alanina, la glicina y la serina son todos de un tamaño similar; y que la fenilalanina, el triptófano y la tirosina tienen todos una forma generalmente similar. Por lo tanto, basándose en estas consideraciones arginina, lisina e histidina; alanina, glicina y serina; y fenilalanina, triptófano y tirosina; se definen en el presente documento como equivalente biológicamente funcionales.

A la hora de hacer cambios, debe considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basándose en sus características de hidrofobicidad y carga, éstos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina
(-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

La importancia del índice hidropático del aminoácido a la hora de conferir una función biológica interactiva en la proteína se comprende generalmente en la técnica (Kyte & Doolittle, 1982,). Se sabe que ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros que tienen un índice o puntuación hidropática similar y todavía conservan una actividad biológica similar. A la hora de hacer cambios basándose en el índice hidropático, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de \pm 2, se prefieren particularmente los que están dentro de \pm 1, y se prefieren incluso más particularmente los que están dentro de \pm 0,5.

Se entiende que un aminoácido puede sustituirse por otro que tiene un valor de hidrofilicidad similar y todavía se obtiene una proteína biológicamente equivalente. Tal como se detalla en la patente de los EE.UU. número 4.554.101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los residuos de aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 \pm 1); glutamato (+3,0 \pm 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 \pm 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4).

A la hora de hacer cambios basándose en valores de hidrofilicidad similares, se prefieren la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de \pm 2, se prefieren particularmente los que están dentro de \pm 1, y se prefieren incluso más particularmente los que están dentro de \pm 0,5.

B. Vectores de expresión

A lo largo de esta solicitud, el término "constructo de expresión" pretende incluir cualquier tipo de constructo genético que contiene un ácido nucleico que codifica para un producto génico en el que puede transcribirse parte o toda la secuencia que codifica para el ácido nucleico. El transcrito puede traducirse en una proteína, pero no es necesario que lo haga. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la expresión incluye tanto la transcripción de un gen p53 como la traducción de un ARNm de p53 en un producto proteico de p53. En otras realizaciones, la expresión sólo incluye la transcripción del ácido nucleico que codifica para p53 o su complemento.

Con el fin de que el constructo efectúe la expresión de al menos un transcrito de p53, el polinucleótido que codifica para el polinucleótido de p53 estará bajo el control transcripcional de un promotor. Un "promotor" se refiere a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula huésped, o una maquinaria sintética introducida, que se requiere para iniciar la transcripción específica de un gen. La frase "bajo control transcripcional" significa que el promotor está en la ubicación correcta con respecto al polinucleótido para controlar la iniciación de la ARN polimerasa y la expresión del polinucleótido.

El término promotor se utilizará aquí para referirse a un grupo de módulos de control transcripcional que se agrupan alrededor del sitio de iniciación para la ARN polimerasa II. Mucho de lo que se piensa sobre cómo están organizados los promotores se deriva del análisis de diversos promotores virales, incluyendo aquellos para la timidina cinasa (tk) de HSV y las unidades de transcripción temprana de SV40. Estos estudios, ampliados por trabajos más recientes, han demostrado que los promotores se componen de módulos funcionales diferenciados, consistiendo cada uno en aproximadamente de 7-20 pb de ADN, y conteniendo uno o más sitios de reconocimiento para proteínas represoras o activadoras transcripcionales.

Al menos un modulo en cada promotor funciona para ubicar el sitio de iniciación para la síntesis de ARN. El ejemplo mejor conocido es la caja TATA, pero algunos promotores que carecen de la caja TATA, tales como el promotor para el gen de la desoxinucleotidil transferasa terminal de mamíferos y el promotor para genes tardíos de SV40, un elemento diferenciado que recubre el sitio de iniciación por sí mismo ayuda a fijar el lugar de inicia-
ción.

Elementos de promotor adicionales regulan la frecuencia de iniciación de la transcripción. Normalmente, se localizan en la región de 30-110 pb en sentido de 5' del sitio de iniciación, aunque recientemente se ha demostrado que ciertos promotores también contienen elementos funcionales en sentido de 3' del sitio de iniciación. Normalmente, la separación entre los elementos de promotor es flexible, de manera que la función del promotor se conserva cuando los elementos se invierten o se mueven en relación los unos con los otros. En el promotor de tk, la separación entre los elementos del promotor puede aumentarse hasta 50 pb antes de que comience a declinar la actividad. Dependiendo del promotor, parece que elementos individuales pueden funcionar o bien cooperativa o independientemente para activar la transcripción.

Se cree que el promotor particular que se emplea para controlar la expresión de un polinucleótido de p53 no es crítico, siempre que sea capaz de expresar el polinucleótido en la célula seleccionada como diana en unos niveles suficientes. Por lo tanto, cuando se selecciona como diana una célula humana, es preferible posicionar la región codificante de polinucleótido adyacente a y bajo el control de un promotor que se capaz de expresarse en una célula humana. Por lo general, un promotor de este tipo podría incluir o bien un promotor humano o bien uno viral.

En diversas realizaciones, pueden utilizarse el promotor de gen temprano inmediato de citomegalovirus (CMV) humano, el promotor temprano de SV40 y la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous para obtener un nivel de expresión elevado del polinucleótido de p53. También se contempla el uso de otros promotores de fago bacteriano o de célula viral o de mamífero que se conocen bien en la técnica para lograr la expresión de polinucleótidos, siempre que los niveles de expresión sean suficientes para producir un efecto inhibidor del crecimiento.

Empleando un promotor con propiedades bien conocidas, puede optimizarse el nivel y el patrón de expresión de un polinucleótido tras la transfección. Por ejemplo, la selección de un promotor que es activo en células específicas, tales como tirosinasa (melanoma), alfa-fetoproteína y albúmina (tumores de hígado), CC10 (tumor de pulmón) y antígeno específico de próstata (tumor de próstata) permitirá la expresión específica de tejido de los polinucleótidos de p53. La tabla 2 enumera diversos elementos/promotores que pueden emplearse, en el contexto de la presente invención, para regular la expresión de los constructos de p53. Esta lista no pretende ser exhaustiva de todos los posibles elementos implicados en la promoción de la expresión de p53 sino, simplemente, servir a modo de ejemplo de los mismos.

Los potenciadores se detectaron originalmente como elementos genéticos que aumentaban la transcripción a partir de un promotor localizado en una posición alejada en la misma molécula de ADN. Esta capacidad de actuar a larga distancia tenía pocos precedentes en los estudios clásicos de regulación transcripcional en procariotas. Trabajos posteriores demostraron que las regiones de ADN con actividad potenciadora se organizan de manera muy parecida a los promotores. Es decir, se componen de muchos elementos individuales, cada uno de los cuales se une a una o más proteínas transcripcionales.

La distinción básica entre potenciadores y promotores es funcional. Una región potenciadora como unidad debe poder estimular la transcripción a distancia; esto ha de ser verdad para una región promotora o sus elementos componentes. Por otra parte, un promotor debe tener uno o más elementos que dirijan la iniciación de la síntesis de ARN en un sitio particular y en una orientación particular, mientras que los potenciadores carecen de estas especificidades. Con frecuencia los promotores y potenciadores se superponen y son contiguos, pareciendo a menudo que tienen una organización modular muy similar.

Adicionalmente también podría utilizarse cualquier combinación de promotor/potenciador (de acuerdo con la base de datos de promotores eucariotas EPDB) para conducir la expresión de un constructo de p53. El uso de un sistema de expresión citoplásmica T3, T7 o SP6 es otra posible realización. Las células eucariotas pueden admitir la transcripción citoplásmica de ciertos promotores bacteriófagos si se proporciona la polimerasa de bacteriófago apropiada, o bien como parte del complejo de administración o bien como un vector de expresión genética adicional.

TABLA 2

Potenciador

Cadena pesada de inmunoglobulina

Cadena ligera de inmunoglobulina

Receptor de células T

HLA DQ \alpha y DQ \beta

\beta-interferón

Interleucina-2

Receptor de interleucina-2

CMH de clase II 5

CMH de clase II HLA-DR\alpha

\beta-actina

TABLA 2 (continuación)

Potenciador

Creatina cinasa muscular

Prealbúmina (Transtiretina)

Elastasa I

Metalotioneína

Colagenasa

Gen de albúmina

\alpha-fetoproteína

\tau-globina

\beta-globina

c-fos

c-HA-ras

Insulina

Molécula de Adhesión Celular Neuronal (NCAM)

\alpha1-Antitripsina

Histona H2B (TH2B)

Colágeno de tipo I o de ratón

Proteínas reguladas por glucosa (GRP94 y GRP78)

Hormona de crecimiento de rata

Amiloide A de suero humano (SAA)

Troponina I (TN I)

Factor de crecimiento derivado de plaquetas

Distrofia muscular de Duchenne

SV40

Polioma

Retrovirus

Virus de papiloma

Virus de hepatitis B

Virus de la inmunodeficiencia humana

Citomegalovirus

Virus de la leucemia del gibón

\newpage

Además, una selección de un promotor que se regula en respuesta a señales fisiológicas específicas puede permitir una expresión inducible del constructo de p53. Por ejemplo, con el polinucleótido bajo el control del promotor PAI-1 humano, la expresión puede inducirse mediante el factor de necrosis tumoral. La tabla 3 ilustra diversas combinaciones de promotor/inductor:

TABLA 3

Elemento	Inductor
MT II	Éster de forbol (TFA) Metales pesados
MMTV (virus del tumor mamario de ratón)	Glucocorticoides
\beta-interferón	poli(rI)X poli(rc)
Adenovirus 5 E2	Ela
c-jun	Éster de forbol (TPA), H_{2}O_{2}
Colagenasa	Éster de forbol (TPA)
Estromelisina	Éster de forbol (TPA), IL-1
SV40	Éster de forbol (TPA)
Gen MX murino	Interferón, virus de la enfermedad de Newcastle
Gen GRP78	A23187
\alpha-2-macroglobulina	IL-6
Vimentina	Suero
Gen de CMH Clase I H-2kB	Interferón
HSP70	Ela, antígeno T grande de SV40
Proliferina	Éster de forbol-TPA
Factor de necrosis tumoral	FMA
Gen \alpha de hormona estimulante de tiroides	Hormona tiroidea

En ciertas realizaciones de la invención, la administración de un vector de expresión en una célula puede identificarse in vitro o in vivo incluyendo un marcador en el vector de expresión. El marcador daría como resultado un cambio identificable en la célula transfectada permitiendo una sencilla identificación de la expresión. Normalmente, la inclusión de un marcador de selección de fármaco ayuda en la clonación y en la selección de los transformantes. De manera alternativa, pueden emplearse enzimas tales como la timidina cinasa (tk) de virus herpes simplex (eucariota) o cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) (procariota). También pueden emplearse marcadores inmunológicos. No se cree que el marcador seleccionable empleado sea importante, siempre que sea capaz de expresarse junto con el polinucleótido que codifica para p53. Ejemplos adicionales de marcadores seleccionables los conoce bien un experto en la técnica.

Normalmente, se incluirá una señal de poliadenilación para efectuar una poliadenilación apropiada del transcrito. No se cree que la naturaleza de la señal de poliadenilación sea crucial para una puesta en práctica de la invención con éxito, y puede emplearse cualquier secuencia de este tipo. El inventor ha empleado la señal de poliadenilación de SV40 porque era conveniente y se sabía que funciona bien en las células diana empleadas. También se contemplaba como un elemento del constructo de expresión un terminador. Estos elementos pueden servir para potenciar los niveles del mensaje y minimizar la ultralectura del constructo en otras secuencias.

En realizaciones preferidas de la presente invención, el constructo de expresión comprende un virus o un constructo obtenido por ingeniería genética derivado a partir de un genoma viral. La capacidad de ciertos virus para entrar en células por medio de endocitosis mediada por receptor y, en algunos casos, integrarse en los cromosomas de la célula huésped les ha convertido en candidatos atractivos para la transferencia génica en células mamíferas. Sin embargo, como se ha demostrado que la captación directa de ADN desnudo, así como la captación mediada por receptor de complejos de ADN (tratada a continuación), los vectores no necesitan ser virales sino que, en vez de eso, puede ser cualquier constructo de plásmido, cósmido o fago que pueda admitir la expresión de genes codificados en células mamíferas, tales como las series de plásmido pUC o Bluescript™.

Retrovirus

Los retrovirus son un grupo de virus con ARN de cadena simple caracterizado por una capacidad de convertir su ARN en ADN de cadena doble en las células infectadas mediante un procedimiento de transcripción inversa (Coffin, 1990). El ADN resultante se integra entonces de manera estable en los cromosomas celulares como un provirus y dirige la síntesis de proteínas virales. La integración da como resultado la conservación de las secuencias génicas virales en la célula receptora y sus descendientes. El genoma retroviral contiene tres genes -gag, pol, y env- que codifican para las proteínas de cápside, la enzima polimerasa, y componentes de la envuelta, respectivamente. Una secuencia hallada en sentido de 5' desde el gen gag, denominada \Psi, funciona como una señal para el empaquetamietno del genoma en los viriones. Dos secuencias de repeticiones terminales largas (LTR) están presentes en los extremos 5' y 3' del genoma viral. Estos contienen secuencias promotoras y potenciadoras fuertes y también se requieren para la integración en el genoma de la célula huésped (Coffin, 1990).

Con el fin de construir un vector retroviral, se inserta un ácido nucleico que codifica para p53 en el genoma viral en el lugar de ciertas secuencias virales para producir un virus que sea defectuoso para la replicación. Con el fin de producir viriones, se construye una línea celular que contiene los genes gag, pol y env pero sin los componentes LTR y \Psi (Mann et al., 1983). Cuando se introduce en esta línea celular un plásmido recombinante que contiene un ADN_{c} humano, junto con las secuencias LTR e \Psi retrovirales (mediante una precipitación en fosfato de calcio, por ejemplo), la secuencia \Psi permite que el transcrito de ARN del plásmido recombinante se empaquete en partículas virales, que se secretan entonces en los medios de cultivo (Nicolas y Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). Entonces, se recogen los medios que contienen los retrovirus recombinantes, opcionalmente se concentra, y se utiliza para la transferencia génica. Los vectores retrovirales pueden infectar una gran variedad de tipos celulares. Sin embargo, la integración y la expresión estable requieren la división de las células huésped (Paskind et al., 1975).

Recientemente, se desarrolló un enfoque novedoso diseñado para permitir la selección como diana específica de los vectores de retrovirus en base a la modificación química de un retrovirus mediante la adición química de residuos de lactosa a la envuelta viral. Esta modificación permitiría la infección específica de hepatocitos a través de receptores de sialoglicoproteínas.

Se diseñó un enfoque diferente para la selección como diana de los retrovirus recombinantes en el que se utilizaron anticuerpos biotinilados frente a una proteína de envuelta retroviral y frente a un receptor celular específico. Los anticuerpos se acoplaron mediante componentes de biotina utilizando estreptavidina (Roux et al., 1989). Utilizando anticuerpos frente a los antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I y clase II, se demostró la infección in vitro de una variedad de células humanas que portaban estos antígenos de superficie con un virus ecotrópico (Roux et al., 1989).

Adenovirus

Los adenovirus humanos son virus tumorales de ADN de doble cadena con tamaños de genoma de aproximadamente 36 kb (Tooze, 1981). Los adenovirus se han estudiado mucho y se han caracterizado bien como un sistema de modelo para la expresión génica eucariota, lo que les convierte en un sistema atractivo para el desarrollo de adenovirus como sistema de transferencia génica. Este grupo de virus es fácil de cultivar y manipular, y muestran una gran variedad de huéspedes in vitro e in vivo. En células infectadas de manera lítica, los adenovirus pueden desconectar la síntesis de proteínas del huésped, dirigiendo las maquinarias celulares para sintetizar grandes cantidades de proteínas virales, y producir cantidades copiosas de virus.

La región E1 región del genoma incluye E1A y E1B que codifican para proteínas responsables de la regulación de la transcripción del genoma viral, así como unos pocos genes celulares. La expresión de E2, incluyendo E2A y E2B, permite la síntesis de funciones de replicación virales, por ejemplo, la proteína de unión a ADN, la ADN polimerasa y una proteína terminal que ceba la replicación. Los productos génicos de E3 evitan la citolisis por parte de las células T citotóxicas y el factor de necrosis tumoral y parece ser importante para la propagación vírica. Las funciones asociadas con las proteínas de E4 incluyen la replicación de ADN, la expresión génica tardía, y la desconexión de la célula huésped. Los productos génicos tardíos incluyen la mayoría de las proteínas de cápside de virión, y éstas se expresan sólo después de que ha tenido lugar la mayoría del tratamiento de un transcrito primario único del promotor tardío mayor (major late promoter). El promotor tardío mayor (MLP) muestra una alta eficacia durante la última fase de la infección (Stratford-Perricaudet y Perricaudet, 1991a).

Como solo parece requerirse una pequeña parte del genoma viral en cis (Tooze, 1981), los vectores derivados de adenovirus ofrecen un potencial excelente para la sustitución de grandes fragmentos de ADN cuando se utiliza en conexión con líneas celulares tales como células 293. Se han desarrollado líneas celulares de riñón embrionario humano transformadas con Ad5 (Graham, et al., 1977) para proporcionar las proteínas virales esenciales en trans. El inventor ha razonado por tanto que las características de los adenovirus les convertía en unos buenos candidatos para el uso en la selección como diana de células de cáncer in vivo (Grunhaus & Horwitz, 1992).

Las ventajas particulares de un sistema de adenovirus para administrar proteínas foráneas a una célula incluyen (i) la capacidad para sustituir piezas relativamente grandes de ADN viral por ADN foráneo; (ii) la estabilidad estructural de los adenovirus recombinantes; (iii) la seguridad de la administración adenoviral a los humanos; y (iv) la falta de cualquier asociación conocida de una infección adenoviral con cáncer o tumores malignos; (v) la capacidad para obtener títulos elevados del virus recombinante; y (vi) la elevada infecacia de los Adenovirus.

Otras ventajas de los vectores de adenovirus frente a los retrovirus incluyen los niveles más elevados de expresión génica. Además, la replicación de los adenovirus es independiente de la replicación génica del huésped, al contrario de las secuencias retrovirales. Debido a que los genes transformantes de adenovirus en la región E1 pueden delecionarse fácilmente y seguir proporcionando vectores de expresión eficaces, se piensa que el riesgo oncogénico de los vectores de adenovirus es insignificante (Grunhaus & Horwitz, 1992).

En general, los sistemas de transferencia génica de adenovirus se basan en adenovirus obtenidos por ingeniería genética, recombinantes que se convierten en incapaces de replicarse mediante la deleción de una parte de su genoma, tal como E1, y todavía mantienen su capacidad para la infección. Pueden expresarse secuencias que codifican para proteínas foráneas relativamente grandes cuando se realizan deleciones adicionales en el genoma de adenovirus Por ejemplo, los adenovirus con deleción tanto en la región E1, como en la E3 pueden llevar hasta 10 Kb de ADN foráneo y pueden cultivarse hasta títulos elevados en células 293 (Stratford-Perricaudet y Perricaudet, 1991a). También se ha notificado la expresión sorprendentemente persistente de transgenes tras la infección adenoviral.

Recientemente, se ha investigado la transferencia génica mediada por adenovirus como medio para actuar como mediador de la transferencia génica en células eucariotas y en animales completos. Por ejemplo, a la hora de tratar ratones con el trastorno genético recesivo poco frecuente de la deficiencia de ornitina transcarbamilasa (OTC), se halló que podrían emplearse constructos adenovirales para aportar la enzima OTC normal. Desafortunadamente, la expresión de unos niveles normales de OTC sólo se alcanzó en 4 casos de 17 (Stratford-Perricaudet et al., 1991b). Por tanto, el defecto sólo se corrigió parcialmente en la mayoría de los ratones y no condujo a ningún cambio fisiológico o fenotípico. Este tipo de resultados, por tanto, animan poco al uso de los vectores adenovirales en la terapia de
cáncer.

También han tenido un éxito parcial los intentos para utilizar adenovirus en la transferencia del gen para el regulador de la conductancia de transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) en el epitelio pulmonar de Sigmodon hispidus (cotton rats), aunque no ha sido posible valorar la actividad biológica del gen transferido en el epitelio de los animales (Rosenfeld et al., 1992). De nuevo, estos estudios demostraron la transferencia génica y la expresión de la proteína CFTR en las células de las vías aéreas del pulmón pero no demostraron ningún efecto fisiológico. En el artículo de Science de 1991, Rosenfeld et al. demostraron la expresión pulmonar de la proteína \alpha1-antitripsina pero, de nuevo, no demostraron ningún efecto fisiológico. De hecho, estimaron que los niveles de expresión que observaron sólo fueron de aproximadamente el 2% del nivel requerido para la protección del pulmón en seres humanos, es decir, muy por debajo del necesario para un efecto fisiológico.

El gen para la \alpha1-antitripsina se ha introducido en el hígado de ratas normales mediante inyección intraportal, en las que se expresó y dio como resultado la secreción de la proteína humana introducida hacia el plasma de estas ratas (Jaffe et al., 1992). Sin embargo, y de manera decepcionante, los niveles que se obtuvieron no fueron suficientemente elevados para tener un valor terapéutico

Este tipo de resultados no demuestran que el adenovirus sea capaz de dirigir la expresión de proteína suficiente en células recombinantes para lograr un efecto fisiológicamente relevante, y, por lo tanto, no sugieren una utilidad del sistema de adenovirus para el uso en relación a la terapia de cáncer. Es más, antes de la presente invención, se pensaba que no podría incorporarse p53 a una célula de empaquetamiento, tales como las utilizadas para preparar adenovirus, ya que sería tóxica. Como E1B de adenovirus se une a p53, se pensó que sería otra razón por la cual la tecnología de p53 y adenovirus no podrían combinarse.

Otros vectores virales como constructos de expresión

Pueden emplearse otros vectores virales como constructos de expresión en la presente invención. Pueden emplearse vectores derivados de virus tales como el virus vaccinia (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar et al., 1988), virus adenoasociado (AAV) (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Hermonat y Muzycska, 1984) y virus de herpes. Ofrecen diversas características atractivas para diversas células mamíferas (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).

Con el reciente reconocimiento de virus de hepatitis B defectuosos, se obtuvo una mayor comprensión sobre la relación estructura - función de las diferentes secuencias virales. Estudios in vitro demostraron que el virus podría conservar la capacidad para el empaquetamiento dependiente de auxiliar y la transcripción inversa a pesar de la deleción de hasta un 80% de su genoma (Horwich et al., 1990). Esto sugirió que podrían sustituirse partes grandes del genoma con material genético foráneo. El hepatotropismo y la persistencia (integración) eran propiedades particularmente atractivas para una transferencia génica dirigida al hígado. Chang et al. introdujeron recientemente el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) en el genoma del virus de la hepatitis B del pato en lugar de las secuencias codificantes para la polimerasa, y la superficie y pre-superficie. Se cotransfectó con el virus de tipo natural en una línea celular de hepatoma aviar. Se utilizaron los medios que contenían los títulos elevados de virus recombinante para infectar hepatocitos de patito primarios. Se detectó la expresión estable del gen de CAT durante al menos 24 días tras la transfección (Chang et al., 1991).

C. Métodos alternativos para la administración génica

Con el fin de efectuar la expresión de los constructos de p53, debe administrarse el vector de expresión a una célula. Tal como se describe anteriormente, el mecanismo preferido para la administración es a través de la infección viral en la que se encapsida el vector de expresión en una partícula de adenovirus infeccioso.

La presente invención también contempla diversos métodos no virales para la transferencia de vectores de expresión en células mamíferas cultivadas. Estos incluyen precipitación con fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe et al., 1990) DEAE-dextrano (Gopal, 1985), electroporación (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), microinyección directa (Harland y Weintraub, 1985), liposomas cargados con ADN (Nicolau y Sene, 1982; Fraley et al., 1979) y complejos de lipofectamina-ADN, sonicación celular (Fechheimer et al., 1987), bombardeo génico que utiliza microproyectiles de alta velocidad (Yang et al., 1990), policationes (Boussif et al., 1995) y transfección mediada por receptor (Wu y Wu, 1987; Wu y Wu, 1988). Algunas de estas técnicas pueden adaptarse con éxito para el uso in vivo o ex vivo.

En una realización de la invención, el vector de expresión adenoviral puede consistir simplemente en un vector de recombinante desnudo. La transferencia del constructo puede llevarse a cabo mediante cualquiera de los métodos mencionados anteriormente que permeabilizan física o químicamente la membrana celular. Por ejemplo, Dubensky et al. (1984) inyectaron con éxito ADN de poliomavirus en la forma de precipitados de CaPO_{4} en el hígado y bazo de ratones adultos y recién neonatos demostrando la replicación vírica activa y la infección aguda. Benvenisty y Neshif (1986) también demostraron que la inyección por vía intraperitoneal de plásmidos precipitados con CaPO_{4} da como resultado la expresión de genes transfectados. Se prevé que el ADN que codifica para un constructo de p53 también pueda transferirse de manera similar in vivo.

Otra realización de la invención para transferir un vector de expresión de ADN desnudo a células puede implicar un bombardeo de partículas. Este método depende de la capacidad para acelerar microproyectiles recubiertos de ADN a una velocidad elevada permitiéndoles perforar las membranas celulares y entrar en las células sin matarlas (Klein et al., 1987). Se han desarrollado diversos dispositivos para acelerar pequeñas partículas. Un dispositivo de este tipo se basa en una descarga de alto voltaje para generar una corriente eléctrica, que a su vez proporciona la fuerza motriz (Yang et al., 1990). Los microproyectiles utilizados han consistido en sustancias biológicamente inertes tales como perlas de tungsteno u oro.

Se han bombardeado in vivo órganos seleccionados que incluyen el tejido de hígado, piel y muscular de ratas y ratones (Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991). Esto puede requerir una exposición quirúrgica del tejido o las células, para eliminar cualquier tejido que interfiera entre la pistola y el órgano diana. A través de este método puede administrarse el ADN que codifica para un constructo de p53.

En una realización adicional de la invención, el vector de expresión puede quedar atrapado en un liposoma. Los liposomas son estructuras vesiculares caracterizadas por una membrana bicapa fosfolipídica y un medio acuoso interno. Los liposomas multilamelares tienen múltiples capas de lípido separadas mediante un medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando se suspenden fosfolípidos en un exceso de disolución acuosa. Los componentes de lípido pueden experimentar una auto-reorganización antes de la formación de estructuras cerradas y atrapar agua y solutos disueltos entre las bicapas de lípido (Ghosh y Bachhawat, 1991). También se contemplan complejos de lipofectamina-ADN.

La administración de polinucleótidos mediada por liposomas y la expresión de ADN foráneo in vitro ha tenido mucho éxito. Wong et al. (1980) demostraron la viabilidad de la administración mediada por liposomas y la expresión de ADN foráneo en células de hepatoma, HeLa, y de embrión de pollo cultivadas. Nicolau et al. (1987) llevaron a cabo con éxito una transferencia génica mediada por liposomas en ratas tras una inyección intravenosa.

En ciertas realizaciones de la invención, el liposoma puede formar complejos con virus hemoaglutinante (HVJ). Esto ha demostrado que facilita la fusión con la membrana celular y promover la entrada celular del ADN encapsulado en liposomas (Kaneda et al., 1989). En otras realizaciones, el liposoma puede formar complejos o emplearse junto con proteínas cromosómicas nucleares no histónicas (HMG-1) (Kato et al., 1991). Aún en otras realizaciones, el liposoma puede formar complejos o emplearse junto tanto HVJ como con HMG-1. Debido a que los vectores de expresión de este tipo se han empleado con éxito en la transferencia y expresión de un polinucleótido in vitro e in vivo, luego pueden aplicarse en la presente invención. Cuando se emplea un promotor de bacteriófago en el constructo de ADN, también será deseable incluir en el liposoma una polimerasa de bacteriófago apropiada.

Otro mecanismo para transferir vectores de expresión en células es la administración mediada por receptor. Este enfoque se aprovecha de la captación selectiva de macromoléculas mediante endocitosis mediada por receptor en la mayoría de todas las células eucariotas. Debido a la distribución específica de tipo celular de diversos receptores, la administración puede ser altamente específica (Wu y Wu, 1993). Los vehículos de selección como diana génica mediados por receptor consisten en dos componentes: un ligando específico de receptor celular y un agente de unión a ADN. Se han utilizado diversos ligandos para la transferencia génica mediada por receptor. Los ligandos caracterizados de manera más extensiva son asialoorosomucoide (ASOR) (Wu y Wu, 1987) y transferrina (Wagner et al., 1993). Recientemente, se ha utilizado una neoglucoproteína sintética, que reconoce el mismo receptor que ASOR, como vehículo de administración génica (Ferkol et al., 1993; Perales et al., 1994) y también se ha utilizado factor de crecimiento epidérmico (EGF) para administrar genes a células de carcinoma espinocelular (Myers, EPO 0273085).

En otras realizaciones, el vehículo de administración puede comprender un ligando y un liposoma. Por ejemplo, Nicolau et al. (1987) emplearon lactosil-ceramida, un asialgangliósido galactosa-terminal, incorporada en liposomas y observaron un aumento en la captación del gen de insulina por parte de los hepatocitos. Por tanto, es viable que también pueda administrarse de manera específica un vector de expresión adenoviral en un tipo celular tal como células tumorales, epiteliales o de pulmón, mediante cualquier número de sistemas receptor-ligando, con o sin liposomas. Por ejemplo, puede utilizarse el factor de crecimiento epidérmico (EGF) como el receptor para la administración mediada del constructo de p53 en muchas células tumorales que muestran una regulación por incremento del receptor de EGF. Puede utilizarse manosa para seleccionar el receptor de manosa en células de hígado. Además, también pueden utilizarse de manera similar anticuerpos frente a CD5 (CLL), CD22 (linfoma), CD25 (leucemia de células T) y MAA (melanoma) como restos de selección como diana.

En ciertas realizaciones, la transferencia génica puede llevarse a cabo más fácilmente en condiciones ex vivo. La terapia génica ex vivo se refiere al aislamiento de células de un animal, la administración de un polinucleótido a las células, in vitro, y luego la devolución de las células modificadas de nuevo a un animal. Esto puede implicar la eliminación quirúrgica de tejido/órganos de un animal o de un cultivo primario de células y tejidos. La patente de los EE.UU. nº 5.399.346 de Anderson et al., describe métodos terapéuticos ex vivo. Durante el cultivo ex vivo, el vector de expresión puede expresar el constructo de p53. Finalmente, las células pueden reintroducirse en el animal original, o administrarse a un animal distinto, en una forma farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los medios descritos a continuación.

D. Composiciones farmacéuticas y vías de administración

Cuando se contempla la aplicación clínica de un vector de expresión adenoviral según la presente invención, será necesario preparar el complejo como una composición farmacéutica apropiada para la aplicación que se pretende. Generalmente esto supondrá la preparación de una composición farmacéutica que está esencialmente libre de pirógenos, así como de cualquier otra impureza que pudiera ser dañina para seres humanos o animales. También se deseará generalmente emplear sales apropiadas y tampones para convertir el complejo en estable y permitir la captación del complejo por parte de las células diana.

Composiciones acuosas utilizadas en la presente invención comprenden una cantidad eficaz del vector de expresión, disuelto o disperso en un medio acuoso o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones también se denominan inóculos. Las frases "farmacéuticamente o farmacológicamente aceptables" se refieren a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción perjudicial cuando se administra a un animal, o a un ser humano, según sea apropiado. Tal como se utiliza en el presente documento, "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimiento, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos y similares. El uso de tales medios y agentes para principios activos farmacéuticos es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional es incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. En las composiciones también puede incorporarse principios activos complementarios.

Pueden prepararse en agua disoluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables mezcladas de manera adecuada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles, mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Los vectores de expresión y los vehículos de administración de la presente invención pueden incluir preparaciones farmacéuticas clásicas. La administración de composiciones terapéuticas según la presente invención será a través de cualquier vía siempre que el tejido diana esté disponible a través de esa vía. Esto incluye la vía oral, nasal, bucal, rectal, vaginal o tópica. Alternativamente, la administración será mediante inyección ortotópica, intradérmica, intraocular, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa. Tales composiciones se administrarían normalmente como composiciones farmacéuticamente aceptables que incluyen excipientes, tampones u otros excipientes fisiológicamente a aceptables.

Las composiciones terapéuticas utilizadas en la presente invención se administran de manera ventajosa en la forma de composiciones inyectables o bien como suspensiones o disoluciones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para disolución en, o suspensión en, líquido antes de la inyección. Estas preparaciones también pueden emulsionarse. Una composición típica para tal fin puede comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la composición puede contener 10 mg, 25 mg, 50 mg o hasta aproximadamente 100 mg de albúmina sérica humana por mililitro de solución salina tamponada con fosfato. Otros excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen disoluciones acuosas, excipientes no tóxicos, incluyendo sales, conservantes, tampones y similares. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Excipientes acuosos incluyen agua, disoluciones alcohólicas/acuosas, soluciones salinas, vehículos parenterales tales como cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, etc. Vehículos intravenosos incluyen regeneradores de nutrientes y fluidos. Los conservantes incluyen agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes. El pH y la concentración exacta de los diversos componentes de la composición farmacéutica se ajustan según parámetros bien conocidos.

Formulaciones adicionales son adecuadas para la administración oral. Las formulaciones orales incluyen aquellos excipientes típicos tales como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Las composiciones toman la forma de disoluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación prolongada o polvos. Cuando la vía es tópica, la forma puede ser una crema, pomada, ungüento, líquido o pulverización.

Se determina una cantidad eficaz del agente terapéutico en base al objetivo que se pretende, por ejemplo (i) la inhibición de la proliferación de células tumorales o (ii) la eliminación de células tumorales. El término "dosis unitaria" se refiere a las unidades diferenciadas físicamente adecuadas para el uso en un sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de la composición terapéutica calculada para producir las respuestas deseadas, tratadas anteriormente, en asociación con su administración, es decir, la vía y el régimen de tratamiento apropiados. La cantidad que va a administrarse, tanto según el número de tratamientos como la dosis unitaria, depende del sujeto que va a tratarse, del estado del sujeto y de la protección deseada. Las cantidades precisas de la composición terapéutica también dependen del juicio del médico y son características de cada individuo.

En ciertas realizaciones, puede ser deseable proporcionar un suministro continuo de las composiciones terapéuticas al paciente. Para las vías intravenosa e intraarterial, esto se lleva a cabo mediante un sistema por goteo. Para las aplicaciones tópicas, se emplearía una aplicación repetida. Para varios enfoques, podrían utilizarse formulaciones de liberación retardada que proporcionaran cantidades constantes pero limitadas del agente terapéutico a lo largo de un periodo de tiempo prolongado. Para la aplicación interna, puede preferirse una perfusión continua de la región de interés. Esto podría llevarse a cabo mediante sondaje, de manera postoperatoria en algunos casos, seguido de la administración continua del agente terapéutico. El periodo de tiempo para la perfusión se seleccionaría por parte del clínico para el paciente y la situación particular, pero los tiempos podrían oscilar desde aproximadamente 1-2 horas, hasta 2-6 horas, hasta aproximadamente 6-10 horas, hasta aproximadamente 10-24 horas, hasta aproximadamente 1-2 días, hasta aproximadamente 1-2 semanas o más. Generalmente, la dosis de la composición terapéutica a través de perfusión continua será equivalente a la dada mediante inyecciones únicas o múltiples, ajustadas para el periodo de tiempo a lo largo del cual se administran las inyecciones. Sin embargo, se cree que las dosis más elevadas pueden alcanzarse a través de la perfusión.

Protocolo clínico para SCCHN

Se ha desarrollado un protocolo clínico para facilitar el tratamiento de la enfermedad de SCCHN utilizando los constructor adenovirales tratados a continuación en los ejemplos. De acuerdo con este protocolo, se seleccionarán los pacientes que tienen una prueba histológica de carcinoma espinocelular de la cabeza y el cuello. Los pacientes pueden, pero no necesitan haber recibido radioterapia, quimioterapia o terapias génicas previas. De manera óptima, los pacientes tendrán una función de médula ósea adecuada (definida como recuento de granulocitos absoluto periférico > 2.000/mm^{3} y recuento de plaquetas de 100.000/mm^{3}), función hepática adecuada (bilirrubina \leq 1,5 mg/dl) y función renal adecuada (creatinina < 1,5 mg/dl).

El protocolo requiere una única dosis de administración, a través de inyección intratumoral, de una composición farmacéutica que contiene de entre 10^{6} y 16^{9} partículas infecciosas de un constructo de expresión de adenovirus de p53. Para tumores de \geq 4 cm, el volumen administrado será de 4-10 ml (preferiblemente 10 ml), mientras que para tumores < 4 cm, se utilizará un volumen de 1-3 ml (preferiblemente 3 ml). Se administrarán inyecciones múltiples para una dosis única, en volúmenes de 0,1-0,5 ml, con una separación de aproximadamente 1 cm o más.

El curso de tratamiento consiste en aproximadamente seis dosis, administradas a lo largo de dos semanas. Bajo elección del médico puede continuarse el régimen, seis dosis cada dos semanas, o en una base menos frecuente (mensual, bimensual, cuatrimestralmente, etc.).

Cuando los pacientes son idóneos para la resección quirúrgica, el tumor se tratará tal como se describió anteriormente durante al menos dos cursos de tratamiento de dos semanas consecutivos. En un plazo de una semana de la finalización del segundo (o más, por ejemplo, tercero, cuarto, quinto, sexto, séptimo, octavo, etc.) curso, se le aplicará al paciente una resección quirúrgica. Antes del cierre de la incisión se administrarán 10 ml de una composición farmacéutica que contiene el constructo de expresión de adenovirus de p53 (10^{6}-10^{9} partículas infecciosas) en el sitio quirúrgico (lecho operatorio) y se dejarán permanecer en contacto durante al menos 60 minutos. La herida se cierra y en la misma se sitúa un drenaje o catéter. Al tercer día postoperatorio, se administran 10 ml adicionales de la composición farmacéutica a través del drenaje y se deja que permanezcan en contacto con el lecho operatorio durante al menos dos horas. Luego se lleva a cabo la eliminación mediante succión y el drenaje se elimina en un tiempo clínicamente apropiado.

Tratamiento de cavidades corporales artificiales y naturales

Una de las principales fuentes de la SCCHN recurrente es la enfermedad microscópica residual que permanece en el sitio de tumor primario, así como local y regionalmente, tras la escisión tumoral. Además existen situaciones análogas en las que las cavidades corporales naturales se siembran con células tumorales microscópicas. El tratamiento eficaz de tal enfermedad microscópica presentaría un avance significativo en los regímenes terapéuticos.

Por tanto, en ciertas realizaciones, un cáncer puede eliminarse mediante escisión quirúrgica, creando una "cavidad". Tanto en el momento de la cirugía, como a partir de entonces (de manera periódica o continua), la composición terapéutica utilizada en la presente invención se administra en la cavidad corporal. Esto es, en esencia un tratamiento "tópico" de la superficie de la cavidad. El volumen de la composición debe ser suficiente para garantizar que toda la superficie de la cavidad se pone en contacto mediante el constructo de expresión.

En una realización, la administración simplemente supondrá la inyección de la composición terapéutica en la cavidad formada por la escisión tumoral. En otra realización, puede desearse la aplicación mecánica a través de una esponja, un hisopo u otro dispositivo. Puede utilizarse cualquiera de estos enfoques posteriores a la eliminación del tumor así como también durante la cirugía inicial. Además en otra realización, se inserta un catéter en la cavidad antes del cierre del sitio de entrada quirúrgico. La cavidad puede prefundirse de manera continua durante un periodo de tiempo deseado.

En otra forma de este tratamiento, la aplicación "tópica" de la composición terapéutica se dirige a una cavidad corporal natural tal como la boca, faringe, esófago, laringe, tráquea, cavidad pleural, cavidad peritoneal o cavidades de órgano hueco incluyendo la vejiga, colon u otros órganos viscerales. En esta situación, puede haber o no un tumor primario significativo en la cavidad. El tratamiento selecciona como diana la enfermedad microscópica de la cavidad, pero por casualidad también puede afectar a una masa tumoral primaria si no se ha eliminado previamente o a una lesión pre-neoplásica que puede estar presente en esta cavidad. De nuevo, pueden emplearse una variedad de métodos para afectar la aplicación "tópica" en estos órganos o superficies de cavidades viscerales. Por ejemplo, la cavidad oral en la faringe puede afectarse simplemente mediante el borboteo y gargarismo oral con disoluciones. Sin embargo, el tratamiento tópico dentro de la laringe y la tráquea puede requerir visualización endoscópica y la administración tópica de la composición terapéutica. Órganos viscerales tales como la mucosa colónica o de la vejiga puede requerir catéteres in situ con infusión o de nuevo la visualización directa con un cistoscopio u otro instrumento endoscópico. Puede accederse a cavidades tales como las cavidades pleural y peritoneal mediante catéteres in situ o enfoques quirúrgicos que proporcionen acceso a esas áreas.

Monitorización de la expresión de p53 tras la administración

Otro aspecto de la presente invención implica la monitorización de la expresión de p53 tras la administración de la composición terapéutica. Debido a que no puede observarse la destrucción de las células tumorales microscópicas, es importante determinar si el sitio diana se ha puesto en contacto de manera eficaz con el constructo de expresión. Esto puede llevarse a cabo identificando las células en las que el constructo de expresión está produciendo activamente el producto de p53. Es importante, sin embargo, poder distinguir entre el p53 exógeno y el presente en las células tumorales y no tumorales en el área de tratamiento.

El marcado del p53 exógeno con un elemento trazador proporcionaría una evidencia definitiva de la expresión de esa molécula y no una versión endógena de la misma.

Un trazador de este tipo lo proporciona el biosistema FLAG (Hopp et al., 1988). El polipéptido FLAG es un octapéptido (AspTyrLysAspAspAspAspLys) y su pequeño tamaño no perturba la expresión de la proteína de terapia génica administrada. La coexpresión de FLAG y la proteína de interés se traza mediante el uso de anticuerpos preparados frente a la proteína FLAG.

También pueden emplearse otros sistemas de marcadores inmunológicos, tales como el sistema 6XHis (Qiagen). Para ello, podría utilizarse cualquier epítopo lineal para generar una proteína de fusión con p53 siempre que (i) no se vea comprometida la integridad inmunológica del epítopo por la fusión y (ii) no se vea comprometida la integridad funcional de p53 por la fusión.

E. Protocolos de terapia combinada

La resistencia de las células tumorales a agentes que dañan el ADN representa un gran problema en la oncología clínica. Un objetivo de la investigación actual sobre el cáncer es encontrar maneras de mejorar la eficacia de la quimioterapia y la radioterapia combinándolas con la terapia génica. Por ejemplo, cuando se administró el gen de la timidina cinasa del virus del herpes simple (HS-tK) a tumores cerebrales mediante un sistema de vector retroviral, se indujo con éxito la susceptibilidad frente al agente antiviral ganciclovir (Culver, et al., 1992). En el contexto de la presente invención, se contempla que la terapia de p53 podría utilizarse de manera similar en conjunción con la intervención quimio o radioterapéutica.

Para matar células, tales como células de tumor maligno o metastásicas, utilizando los métodos de la presente invención, se pondría en contacto generalmente una célula "diana" con un vector de expresión y al menos un agente que daña el ADN. Estas composiciones se proporcionarían en una cantidad combinada eficaz para matar o inhibir la proliferación de la célula. Este procedimiento puede implicar la puesta en contacto de las células con el vector de expresión y el (los) agente(s) que daña(n) el ADN al mismo tiempo. Esto puede lograrse poniendo en contacto la célula con una composición o formulación farmacológica única que incluya ambos agentes, o poniendo en contacto la células con dos composiciones o formulaciones distintas, al mismo tiempo, en la que una composición incluye el vector de expresión de p53 y la otra incluye el agente que daña el ADN.

Alternativamente, el tratamiento con p53 puede preceder o seguir el tratamiento con el agente que daña el ADN en intervalos que oscilan desde los minutos hasta las semanas. En realizaciones en las que el agente que daña el ADN y el vector de expresión de p53 se aplican de manera separada a la célula, generalmente debe garantizarse que no pasó un periodo de tiempo significativo entre el momento de cada administración, de manera que el agente que daña el ADN y el vector de expresión seguirían siendo capaces de ejercer un efecto combinado de manera ventajosa sobre la células. En tales casos, se contempla que se pondría en contacto la célula con ambos agentes dentro de un plazo de aproximadamente 6 horas hasta una semana entre uno y otro, y más preferiblemente, dentro de un plazo de 24-72 horas entre uno y otro, siendo un tiempo de retraso de sólo aproximadamente 48 horas el más preferido. Sin embargo, en algunas situaciones, puede ser deseable prolongar el periodo de tiempo para el tratamiento de manera significativa, en las que trans-
curren de varios días (2, 3, 4, 5, 6 ó 7) a varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ó 8) entre las administraciones respectivas.

También puede concebirse que podrá desearse más de una administración de o bien el constructo de p53 o bien el agente que daña el ADN. Pueden emplearse diversas combinaciones, en las que p53 es "A" y el agente que daña el ADN es "B":

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 A/B/A \+ B/A/B \+ B/B/A \+ A/A/B \+ B/A/A \+ A/B/B \+ A/B/BB\cr 
B/B/B/A \+ BB/AB \+ A/A/B/B \+ A/B/AB \+ A/B/B/A \+ B/B/A/A \+
B/A/B/B\cr  B/AB/A \+ B/A/A/B \+ A/A/A/B \+ B/A/A/A \+ A/B/A/A \+
A/AB/A \+
B/A/A/B\cr}

Para lograr matar las células, ambos agentes se administran a una célula en una cantidad combinada eficaz para matar a la célula.

Agentes o factores que dañan el ADN se definen en el presente documento como cualquier compuesto o método de tratamiento químico que induce daño en el ADN cuando se aplica a una célula. Tales agentes y factores incluyen radiación y ondas que inducen el daño en el ADN tales como \gamma-irradiación, rayos X, irradiación-UV, microondas, emisiones electrónicas y similares. También funcionan para inducir daño en el ADN diversos compuestos químicos, también descritos como "agentes quimioterápicos", todos los cuales se pretenden utilizar en los métodos de tratamiento combinados descritos en el presente documento. Los agentes quimioterápicos contemplados para utilizarse, incluyen, por ejemplo, adriamicina, 5-fluorouracilo (5FU), etopósido (VP-16), camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C, cisplatino (CDDP) e incluso peróxido de hidrógeno. La invención también engloba el uso de una combinación de uno o más agentes que dañan el ADN, ya se basen en la radiación o sean compuestos reales, tales como el uso de rayos X con cisplatino o el uso de cisplatino con etopósido. En ciertas realizaciones, se prefiere particularmente el uso de cisplatino en combinación con vector de expresión de p53.

En el tratamiento del cáncer según la invención, se pondrían en contacto las células tumorales con un agente que daña el ADN además de con vector de expresión. Esto puede lograrse irradiando el sitio de tumor localizado con una radiación que daña el ADN tal como los rayos-X, la luz-UV, rayos-\gamma o incluso microondas. Alternativamente, las células tumorales pueden ponerse en contacto con el agente que daña el ADN mediante la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un compuesto que daña el ADN tal como, adriamicina, 5-fluorouracilo, etopósido, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C, o más preferiblemente, cisplatino. El agente que daña el ADN puede prepararse y utilizarse como una composición terapéutica combinada, o un kit, combinándolo con un vector de expresión de p53, tal como se describió anteriormente.

Se prevén y se muestran en el presente documento, agentes que se entrecruzan directamente con polinucleótidos, para que se produzca el daño en el ADN que conduzca a una combinación antineoplásica sinérgica. Pueden utilizarse agentes tales como el cisplatino, y otros agentes alquilantes de ADN. El cisplatino se ha utilizado mucho para tratar el cáncer, con dosis eficaces utilizadas en aplicaciones clínicas de 20 mg/m^{2} durante 5 días cada tres semanas durante un total de tres cursos. El cisplatino no se absorbe por vía oral y, por lo tanto, debe administrarse mediante inyección por vía intravenosa, subcutánea, intratumoral o intraperitoneal.

Los agentes que dañan el ADN también incluyen compuestos que interfieren con la replicación del ADN, la mitosis y la segregación cromosómica. Tales compuestos quimioterápicos incluyen adriamicina, también conocida como doxorrubicina, etopósido, verapamilo, podofilotoxina y similares. Utilizados mucho en el entorno clínico para el tratamiento de neoplasias, se administran estos compuestos mediante inyecciones en bolo por vía intravenosa a dosis que oscilan desde 25-75 mg/m^{2} a intervalos de 21 días para la adriamicina, hasta 35-50 mg/m^{2} para etopósido por vía intravenosa o el doble de la dosis intravenosa por vía oral.

Los agentes que perturban la síntesis y fidelidad de los precursores y subunidades de polinucleótido también conducen al daño del ADN. Como tales se han desarrollado diversos precursores de polinucleótido. Particularmente útiles son los agentes que han experimentado pruebas exhaustivas y están fácilmente disponibles. Como tales, agentes tales como 5-fluorouracilo (5-FU), se utilizan de manera preferente por parte del tejido neoplásico, haciendo este agente particularmente útil para seleccionar como diana a las células neoplásicas. Aunque bastante tóxico, el 5-FU, puede aplicarse en una amplia gama de excipientes, incluyendo la administración por vía tópica, utilizándose más frecuentemente, sin embargo, la administración por vía intravenosa con dosis que oscilan desde 3 hasta 15 mg/kg/día.

Otros factores que producen daño en el ADN y que se han utilizado ampliamente incluyen lo que comúnmente se conoce como rayos-\gamma, rayos-X, y/o la administración dirigida de radioisótopos a las células tumorales. Otras formas de factores que dañan el ADN también se contemplan tales como microondas y la irradiación-UV. Es más probable que todos estos factores efectúen un daño del ADN, o de los precursores del ADN, la replicación y reparación del ADN, y el montaje y mantenimiento de los cromosomas. Los intervalos de dosis para los rayos-X oscilan desde dosis diarias de 50 a 200 roentgens durante periodos prolongados de tiempo (de 3 a 4 semanas), hasta dosis únicas de 2000 a 6000 roentgens. Los intervalos de dosis para radioisótopos varían ampliamente, y depende de la semivida del isótopo, la fuerza y el tipo de radiación emitida, y la captación por parte de las células neoplásicas.

Se dirige al experto en la técnica a "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15 edición, capítulo 33, en particular páginas 624-652. Se producirá alguna variación en la dosis dependiendo del estado del sujeto que se está tratando. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para la administración humana, las preparaciones deben cumplir unos criterios de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza tal como lo requiere la oficina de la FDA de criterios biológicos.

El inventor propone que la administración regional de los vectores de expresión de p53 a los pacientes con cánceres relacionados con p53 será un método muy eficaz para administrar un gen terapéuticamente eficaz para contrarrestar la enfermedad clínica. De manera similar, la quimioterapia o radioterapia puede dirigirse a una región afectada particular del cuerpo del sujeto. Alternativamente, la administración sistémica del vector de expresión o del agente que daña el ADN puede ser apropiada en ciertas circunstancias, por ejemplo, en las que se ha producido una metástasis extensa.

La terapia con citocinas también ha demostrado ser un socio eficaz para regímenes terapéuticos combinados. Pueden emplearse diversas citocinas en tales enfoques combinados. Ejemplos de citocinas incluyen IL-1\alpha IL-1\beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, TGF-\beta, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF\alpha, TNF\beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-\alpha, IFN-\beta, IFN-\gamma. Las citocinas se administran según regímenes estándar, tal como se describe a continuación, compatibles con las indicaciones clínicas tales como el estado del paciente y la toxicidad relativa de la citocina.

Además de combinar las terapias de selección de diana con quimioterapia, radioterapia y terapias con citocinas, también se contempla que la combinación con otras terapias génicas será ventajosa. Por ejemplo, la selección de diana de K-ras y las mutaciones de p53 al mismo tiempo pueden producir un tratamiento mejorado anti-cáncer. Cabe la posibilidad de seleccionar como diana cualquier otro gen relacionado con tumores de esta manera, por ejemplo, p21, p16, p27, E_{2}F, familias de genes Dp, Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL, FCC, MCC, otras moléculas ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun, trk, ret, gsp, hst, bcl, y abl. También puede ser deseable combinar la terapia con p53 con un tratamiento de terapia génica basado en anticuerpos que implique el uso de un constructo de anticuerpo de cadena única en el que el anticuerpo se une a cualquiera de las moléculas anteriores, o en combinación con genes que codifican para una o más de las citocinas enumeradas anteriormente. También puede ser ventajoso combinar p53 con otros genes que se han implicado en los procesos apoptóticos, por ejemplo, E1A de adenovirus, Bax, Bcl-X_{S}, etc.

F. Kits

Todos los materiales y reactivos necesarios para inhibir la proliferación de células tumorales pueden reunirse en un kit. Éste generalmente comprenderá vectores de expresión adenoviral seleccionados. También pueden incluirse diversos medios para la replicación de los vectores de expresión y las células huésped para tal replicación. Tales kits comprenderán distintos envases para cada reactivo individual.

Cuando los componentes del kit se proporcionan en una o más disoluciones líquidas, la disolución líquida es, preferiblemente, una disolución acuosa, siendo particularmente preferida una disolución acuosa estéril. Para el uso in vivo, el vector de expresión puede formularse en una composición farmacéuticamente aceptable que puede aplicarse con una jeringuilla. En este caso los medios de envase pueden ser por sí mismos un inhalador, una jeringuilla, una pipeta, un cuentagotas ocular, u otro aparato como tal, a partir del cual puede aplicarse la formulación a un área infectada del cuerpo, tal como los pulmones, inyectarse en un animal, o incluso aplicarse a y mezclarse con los otros componentes del kit.

Los componentes del kit también pueden proporcionarse en formas secadas o liofilizadas. Cuando los reactivos o componentes se proporcionan como una forma secada, la reconstitución generalmente es mediante la adición de un disolvente adecuado. Se prevé que el disolvente también puede proporcionar en otros medios de envase.

Los kits, normalmente, también incluirán medios para contener los viales en un confinamiento cerrado para la venta comercial tal como, por ejemplo, envases moldeados por soplado o inyección en los que se contienen los viales deseados. Independientemente del número o tipo de envases, los kits también pueden comprender, o empaquetarse con, un instrumento para asistir en la inyección/administración o colocación de la composición compleja final en el cuerpo de un animal. Un instrumento de este tipo puede ser un inhalador, jeringuilla, pipeta, fórceps, cuchara con medición, cuentagotas ocular, o cualquier vehículo de administración médicamente aprobado.

G. Modelo animal para la siembra de tumores microscópicos y enfermedad residual

Otro aspecto de la presente invención implica el desarrollo de un modelo animal para el análisis de carcinomas residuales microscópicos y la siembra microscópica de las cavidades corporales. "Carcinoma", tal como se utiliza en el presente documento, puede referirse a una única célula o a una masa tumoral de múltiples células. En la enfermedad microscópica, el "tumor" consistirá en una o unas pocas células de carcinoma que no pueden observarse a simple
vista.

El modelo animal descrito en el presente documento es particularmente ventajoso en simular (i) el medio postquirúrgico de los pacientes de cáncer de cabeza y cuello, particularmente en fases avanzadas de la enfermedad y (ii) la cavidad corporal de un sujeto afectado en el que se ha establecido un carcinoma microscópico. El modelo, similar a otros modelos animales para el cáncer, deriva de la inoculación de células tumorales en un animal. Sin embargo, una diferencia radica en la creación, de manera subcutánea, de una bolsa que es fisiológicamente equivalente a una cavidad corporal natural o una cavidad posquirúrgica creada por la escisión de una masa tumoral.

Las invenciones instantáneas ilustran a modo de ejemplo ratones desnudos como el organismo modelo. Sin embargo, puede emplearse prácticamente cualquier animal, para el uso según la presente invención. Animales particularmente preferidos son pequeños mamíferos que se usan de manera rutinaria en protocolos de laboratorios. Aún más preferidos son los animales del grupo de los roedores, tales como ratones, ratas, cobayas y hámsters. Los conejos también son una especie preferida. Los criterios de selección de un animal pueden depender mucho de las preferencias particulares de un investigador.

La primera etapa es crear un colgajo de tejido en el animal experimental. El término "colgajo de tejido" significa cualquier incisión en la carne del animal que expone el tejido diana. Generalmente se prefiere hacer una incisión en el flanco dorsal de un animal, ya que éste representa un sitio fácilmente accesible. Sin embargo, se comprenderá que una incisión bien podría hacerse en otros puntos del animal, y la elección de los sitios de tejido puede depender de diversos factores tales como el tipo particular de terapéuticos que se está investigando.

Una vez que se expone un tejido diana, se ponen en contacto células de carcinoma, bien individualmente o bien en tumores microscópicos, con el sitio de tejido. La manera más conveniente para la siembra de las células de cáncer en el sitio de tejido es aplicar al tejido expuesto una suspensión del medio de cultivo tisular que contiene las células. La aplicación de la célula de cáncer puede lograrse utilizando simplemente una pipeta estéril o cualquier otro aplicador conveniente. Naturalmente, este procedimiento se llevará a cabo en condiciones estériles.

En una realización, se inoculan 2,5 x 10^{6} células en el colgajo de tejido expuesto de un ratón desnudo. Los expertos en la técnica podrán determinar fácilmente cuál será el número apropiado de células, para un fin dado. El número de células dependerá de diversos factores, tales como el tamaño del animal, el sitio de incisión, la capacidad de replicación de las células tumorales por sí mismas, el tiempo que se pretende para el crecimiento tumoral, el potencial del terapéutico anti-tumoral probado, y similares. Aunque establecer un sistema de modelo óptimo para cualquier tipo de tumor puede requerir un cierto ajuste en el número de células administradas, éste no representa de ninguna manera una cantidad excesiva de experimentación. Los expertos en el área de las pruebas en animales apreciarán que tal optimización es necesaria.

Esto puede llevarse a cabo, por ejemplo, realizando estudios preliminares en los que se administran diferentes números de células al animal, y se monitoriza el crecimiento celular tras volver a sellar el colgajo de tejido. Naturalmente, la administración de un número mayor de células dará como resultado una mayor población de células tumorales residuales microscópicas.

En el presente estudio los colgajos se sellaron de manera eficaz utilizando suturas de colchón (mattress sutures). Sin embargo, se prevé que los expertos en la técnica puedan utilizar cualquier variedad de métodos utilizados de manera rutinaria para sellar la incisión tal como el uso de adhesivos, pinzas, puntos, suturas, etc., dependiendo del uso particular que se contemple.

H. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan simplemente para ilustrar ciertas realizaciones específicas y no deben considerarse, de ninguna manera, como limitantes del alcance de la invención.

Ejemplo 1 Supresión del crecimiento de las células de cáncer de cabeza y cuello humano mediante la introducción de gen p53 de tipo natural a través de un adenovirus recombinante Materiales y métodos

Líneas celulares y condiciones de cultivo. Las líneas celulares de SCCHN humano Tu-138 y Tu-177 se establecieron ambas en el departamento de cirugía de cabeza y cuello, del centro de cáncer M.D. Anderson. Tu-138 y Tu-177 se establecieron a partir de un carcinoma espinocelular moderadamente diferenciado gingivo-labial y un carcinoma espinocelular escasamente diferenciado de laringe, respectivamente. Ambas líneas celulares se desarrollaron mediante una técnica de explante primario y son citoqueratina-positivas y tumorogénicas en ratones SCID y desnudos atímicos. Estas células se cultivaron en medio DMEM/F12 complementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% inactivado por calor con penicilina/estreptomicina.

Preparación de adenovirus recombinante e infección. El adenovirus p53 recombinante (Ad5CMV-p53) (Zhang et al., 1994) contiene el promotor de citomegalovirus (CMV), ADNc de p53 de tipo natural, y señal de poliadenilación de SV40 en un casete de mini-gen insertado en la región delecionada de E1 de adenovirus modificado de tipo 5 (Ad5). Las reservas virales se propagaron en células 293. Se recolectaron células a las 36-40 h de la infección, se formaron sedimentos, se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato, se lisaron y se eliminaron los restos celulares sometiéndolas a una purificación mediante gradiente de CsCl. Se dializó el virus concentrado, se tomó una alícuota y se guardó a -80ºC. Se llevó a cabo la infección mediante la adición del virus en el medio DMEM/F12 y de FBS al 2% a las monocapas de células, las células se incubaron a 37ºC durante 60 minutos con agitación constante, después se añadió medio completo (DMEM/F12/ FBS al 10%) y las células se incubaron a 37ºC durante la duración de tiempo deseada.

Análisis de inmunotransferencia de tipo Northern. Se aisló ARN total mediante el método de tiocianato de guanidi-
nio-ácido (Chomczynski y Sacchi, 1987). Los análisis de tipo Northern se llevaron a cabo en 20 \mug de ARN total. La membrana se sometió a hibridación con una sonda de ADN_{c} de p53 marcada mediante el método de cebador aleatorio en SSC 5 x/solución de Denhardt 5X/SDS al 0,5%/ADN de esperma de salmón desnaturalizado (20 \mug/ml). Además la membrana se desmontó y se volvió a unir a sonda de ADN_{c} de GAPDH para el control de carga de ARN. Las cantidades relativas de p53 expresado se determinaron mediante densitómetro (Molecular Dynamics Inc., Sunnyvale, CA).

Análisis de inmunotransferencia de tipo Western Blot. Se prepararon lisados de células totales mediante la sonicación de las células a las 24-h postinfección en tampón RIPA (150 mM NaCl, NP-40 al 1,0%, DOC al 0,5%, SDS al 0,1%, 50 mM Tris, pH 8,0) durante 5 s. Se sometieron cincuenta microgramos de proteína de las muestras a SDS-
PAGE al 10% y se transfirieron a una membrana Hybond-ECL (Amersham). Se bloqueó la membrana con Blotto/
Tween (leche en polvo desnatada al 5%, Tween 20 al 0,2%, azida de sodio al 0,02% en solución salina tamponada con fosfato) y se exploraron con anticuerpos primarios, anticuerpo monoclonal anti-p53 humano de ratón PAb1801 y un anticuerpo monoclonal anti-\beta-actina humana de ratón (Amersham), y el anticuerpo secundario, IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). La membrana se procesó y se desarrolló como el fabricante sugería.

Análisis inmunohistoquímico. Se fijaron las monocapas de células infectadas con formalina al 3,8% y se trataron con H_{2}O_{2} al 3% en metanol durante 5 min. Se llevó a cabo una tinción inmunohistoquímica utilizado el kit Vectastain Elite (Vector, Burlingame, CA). El anticuerpo primario utilizado fue el anticuerpo PAb1801 anti-p53, y el anticuerpo secundario fue una IgG anti-ratón marcada con avidina (Vector). Se utilizó el reactivo complejo ABC de peroxidasa de rábano biotinilada. Se utilizaron controles de preadsorción en cada experimento de inmunotinción. Luego se hizo una tinción de contraste con hematoxilina de Harris (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).

Ensayo de crecimiento celular. Se cultivaron las células en placa a una densidad de 2 x 10^{4} células/ml en placas de 6 pocillos por triplicado. Las células se infectaron o bien con adenovirus de tipo natural (Ad5CMV-p53) o de replicación defectuosa como control. Las células se recolectaron cada 2 días, se contaron y se determinó su viabilidad mediante exclusión por azul de tripan.

Inhibición del crecimiento tumoral in vivo . Se determinó el efecto de Ad5CMV -p53 sobre nódulos tumorales subcutáneos establecidos en ratones desnudos en un medio libre de patógenos. Los experimentos se revisaron y aprobaron por comités institucionales tanto para el cuidado y la utilización de los animales como para la investigación con ADN recombinante. Brevemente, tras la inducción de anestesia con acepromazina/ketamina, se levantaron tres colgajos subcutáneos separados en cada animal y se inyectaron por vía subcutánea 5 x 10^{6} células en 150 ml de medio completo en cada colgajo utilizando una aguja roma; la células se mantuvieron en el bolsillo (pocket) con una sutura de colchón horizontal. Se utilizaron cuatro animales para cada línea celular. A los 4 días, los animales se volvieron a anestesiar y se volvieron a levantar los colgajos para la administración de 100 ml de 1) AdSCMV -p53 (50 MOI) en el colgajo anterior derecho; 2) virus de replicación defectuosa (50 MOI) en el colgajo posterior derecho; y 3) medio de transporte solo, en el flanco posterior izquierdo. Todos los sitios de inyección habían desarrollado nódulos subcutáneos palpables y visibles antes de que se administrara el tratamiento. Se observaron a los animales diariamente y se sacrificaron en el día 20. Se calculó el volumen tumoral in vivo suponiendo una forma esférica con un diámetro tumoral promedio calculado como la raíz cuadrada del producto de los diámetros transversales. Tras el sacrificio, se midieron los tumores escindidos en las tres dimensiones mediante microcalibradores para determinar el volumen tumoral. Se utilizó una prueba de ANOVA de dos vías de Friedman para probar la importancia de la diferencia entre los promedios de las muestras; se utilizó el paquete de software SPSS/PC+ software (SPSS Inc., Chicago, Il).

Resultados

Infección adenoviral de células de SCCHN. Se determinaron las condiciones para la transducción adenoviral óptima de células Tu-138 y Tu-177 mediante la infección de estas células con adenovirus que expresan el gen \beta-gal de E. coli. Se valoró la eficacia de transducción contando el número de células azules tras la tinción de X-gal. Pareció que había una relación lineal entre el número de células infectadas y el número de partículas de adenovirus utilizadas. Las células inoculadas con una única dosis de 100 MOI de adenovirus \beta-gal mostraron un 60% de células azules (figura 1), y esto se mejoró hasta el 100% mediante infecciones múltiples. La eficacia de transducción de este vector en las células de SCCHN es bastante diferente de la de otras líneas celulares previamente examinadas: las líneas celulares HeLa, HepG2, LM2 y de cáncer de pulmón de células no-pequeñas mostraron de un 97% a un 100% de eficacias de infección tras la incubación con de 30 a 50 MOI de adenovirus \beta-gal(Zhang et al., 1994).

Expresión de ARNm de p53 exógeno en células de SCCHN infectadas con adenovirus. Se seleccionaron dos líneas celulares de SCCHN humano para este estudio: ambas líneas celulares de Tu-138 y Tu-177 poseen un gen p53 mutado. El adenovirus p53 de tipo natural recombinante, Ad5CMV-p53, se utilizó para infectar células Tu-138 y Tu-177. A las veinticuatro horas de la infección, se aisló ARN total y se llevó a cabo un análisis de inmunotransferencia de tipo Northern. La línea celular 293 de riñón embrionario humano primario transformado se utilizó como un control positivo debido a su elevado nivel de expresión del producto de gen p53, mientras que K562, una línea celular de linfoblastoma con una deleción homocigota del gen p53, fue el control negativo. Los niveles del ARNm de p53 endógeno de 2,8 kb detectados en las muestras aisladas de células infectadas de manera falsa y de las células infectadas con un adenovirus de replicación defectuosa, dl312 fueron similares. Niveles superiores hasta en 10 veces de ARNm de p53 exógeno de 1,9 kb estuvieron presentes en las células infectadas con Ad5CMV-p53, indicando que el ADNc de p53 exógeno se transdujo con éxito en estas células y se transcribió eficazmente. De manera interesante, el nivel de ARNm p53 endógeno en estas células fue 5 veces superior que en los controles experimentales. Las inmunotransferencias de tipo Northern no mostraron evidencias de contaminación con Ad5CMV-p53 (ADN) del
ARN.

Expresión de la proteína p53 en células de SCCHN infectadas con adenovirus. Se llevó a cabo un análisis de inmunotransferencia de tipo Western para comparar los niveles de ARNm de p53 con la cantidad de proteína de p53 producida. Se observó una banda de p53, reconocida por el anticuerpo anti-p53 monoespecífico, PAb1801, en los extractos celulares aislados de todas las muestras excepto de las células K562. La línea celular 293 mostró altos niveles de proteína de p53. Las muestras aisladas a partir de células Tu-138 y Tu-177 infectadas de manera falsa mostraron unos niveles bajos de proteína de p53. El nivel de expresión de p53 permaneció similar en las células infectadas con el adenovirus d1312. Los niveles de antígeno de p53 detectados en células infectadas con Ad5CMV-p53 fueron significativamente más elevados que los niveles de las proteínas mutadas endógenas en ambas líneas celulares. Este resultado demuestra que el ARNm de p53 exógeno producido a partir de células infectadas con Ad5CMV-p53 se traduce eficazmente en proteína de p53 inmunoreactiva. Además, el análisis inmunohistoquímico de las células infectadas con AdSCMV-p53 reveló la tinción nuclear característica de la proteína de p53, mientras que las células infectadas de manera falsa no mostraron una tinción similar a pesar de la presencia de la proteína de p53 en estas células. Esta incapacidad de detectar la proteína puede atribuirse a la insensibilidad del
ensayo.

Efecto del p53 exógeno sobre el crecimiento celular de SCCHN in vitro . Las células infectadas con virus d1312 de control tuvieron velocidades de crecimiento similares a las de las células infectadas de manera falsa (figuras 2A y 2B), mientras que, el crecimiento de las células Tu-138 (figura 2A) y Tu-177 (figura 2B) infectadas con Ad5CMV-p53 se suprimió en gran medida. A las veinticuatro horas de la infección, se produjo un cambio morfológico aparente, con partes de la población celular redondeándose y sus membranas externas formando ampollas. Estos son parte de una serie de eventos histológicamente predecibles que constituyen la muerte celular programada. El efecto fue más prominente para las células Tu-138 que para las células Tu-177. Las células infectadas con el adenovirus de replicación defectuosa, d1312, mostraron características de crecimiento normales sin anomalías histomorfológicas. Los ensayos de crecimiento fueron reproducibles en cuatro experimentos repetidos.

Inhibición del crecimiento tumoral in vivo . Se probaron cuatro animales para cada una de las líneas celulares. Un animal en el grupo de Tu-177 murió tras la segunda cirugía de colgajo y la administración de las intervenciones terapéuticas, presumiblemente debido a una anestesia profunda y la posterior mutilación por parte de sus compañeros de jaula. La necropsia no reveló evidencias de efectos de metástasis o sistémicos. Tumores considerables son evidentes en ambos colgajos posteriores de los animales (es decir, los sitios que no recibieron Ad5CMV-p53). La falta de progresión tumoral es significativa en el colgajo anterior derecho de los animales, que recibieron Ad5CMV-p53 (p < 0,04) El que las células Tu-177 tengan una velocidad de crecimiento más lenta ya se ha establecido previamente en estos animales. Dos animales en el grupo de Tu-138 se sacrificaron de manera temprana porque experimentaron un crecimiento y ulceración rápidos de los sitios de tumor control. Todos los sitios quirúrgicos habían desarrollado lesiones de al menos 9 mm^{3} antes de la intervención. Los volúmenes tumorales en la necropsia se muestran en la tabla 4. Las diferencias en volumen no fueron estadísticamente significativas en el grupo de Tu-177 lo que puede ser un reflejo del limitado tamaño de muestra.

TABLA 4 Efecto de Ad5CMV-p53 sobre el crecimiento tumoral en ratones desnudos^{a}

Tratamiento		Volumen promedio [mm^{3} \pm EEM]
		TU-138(4)	Tu-177(3)
	Ad5CMV-p53	36,0 \pm 23,5	19 \pm 14,9
	Ad5(dl312)	1187,5 \pm 419,0	226 \pm 84,0
	Medio	1909,3 \pm 776,8	454 \pm 276,8
	Significancia	valor p	valor p
	p53b : d1312	0,04	0,09
	p53: Medio	0,05	0,09
^{a} \begin{minipage}[t]{155mm} Las células se inyectaron de manera subcutánea a 5 x 10^{6} células/colgajo. Los tamaños tumorales se determinaron en el día 20 tras el tratamiento. Los números entre paréntesis representan el número de animales evaluados. bAd5CMV-p53 se abrevia como p53; dl312 es una abreviatura de Ad5(dl312).\end{minipage}

Ejemplo 2 Terapia molecular in vivo con adenovirus p53 para carcinoma espinocelular de cuello y cabeza residual microscópico Materiales y métodos

Líneas celulares y condiciones de cultivo. Se establecieron líneas celulares de SCCHN humanas Tu-138, Tu-177, MDA-686-LN, y MDA 886, y se han caracterizado previamente (Clayman et al., 1993; Sacks et al., 1988). Se hicieron crecer estas células en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM/F12) complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% inactivado por calor y penicilina/estreptomicina.

Preparación de adenovirus recombinante e infección; ensayo de crecimiento celular, análisis de inmunotransferencia de tipo western. Todos los procedimientos se han descrito anteriormente en el ejemplo 1. Todos los ensayos de crecimiento celular se realizaron por triplicado.

Transducción in vivo con adenovirus \beta-galactosidasa. Se realizó tinción con X-gal de muestras tisulares sobre secciones de tejidos congelados en OCT para determinar la eficacia de transducción. Se lavaron muestras de ocho micrómetros de espesor en PBS (solución salina tamponada con fosfato) fría y se fijaron en glutaraldehído al 0,5% a temperatura ambiente durante 5 minutos. Entonces se lavaron las muestras dos veces con PBS a 4ºC y se incubaron durante 4 h en una disolución de X-gal (MgCl_{2} 1,3 mM, NaCl 15 mM, tampón Hepes 44 mM pH 7,4; ferricianuro de potasio 3 mM; ferrocianuro de potasio 3 mM; X-gal al 2% en DMF). Se contratiñeron las muestras con hematoxilina y eosina.

Análisis inmunohistoquímico. Se cortaron tejidos experimentales animales in vivo embedidos en parafina, fijados con formalina, a 4-5 \mum, se secaron a 60ºC, se eliminó la parafina, y se hidrataron con agua destilada. Entonces se trataron las secciones con saponina al 0,5% en agua destilada y se aclararon en varios cambios de agua destilada; se bloqueó la actividad de peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno al 3% en metanol, seguido del aclarado en varios cambios de agua destilada. Se irradiaron por microondas las secciones en agua destilada durante 3 min usando un horno microondas Sharp modelo R9H81 que funcionaba a una frecuencia de 2450 MHz a 700 vatios. Tras enfriarlas, se lavaron las secciones en varios cambios de agua destilada y se colocaron en PBS; se realizaron estudios inmunoquímicos usando el método de avidina-biotina-complejo de peroxidasa (ABC) de Hsu et al., (1981) de la siguiente manera: se bloquearon secciones con suero de caballo normal y se incubaron durante la noche a 4ºC con anticuerpo policlonal de conejo anti-p53 humano, clon OM-1, 1:80 (Signet Laboratories, Denham, MA). Entonces se usó un kit Elite anti-IgG de conejo (Vector Laboratories, Burlingame, CA) para aplicar complejos ABC y anti-IgG de conejo biotinilados, que se incubaron durante 45 min cada uno. Se visualizó la reacción de inmunotinción usando DAB al 0,5% en PBS que contenía peróxido de hidrógeno al 0,01% (pH 7,6), se contratiñó con azul de toluidina al 0,01%, se deshidrató, se aclaró y se montó en Permount. Para verificar la especificidad de la reacción de inmunotinción, se realizó una tinción por inmunoperoxidasa, usando el mismo método que en las muestras de prueba, sobre una citospina positiva conocida de un cultivo tisular de una línea celular de carcinoma espinocelular así como un control de anticuerpo monoclonal de conejo negativo.

Inhibición de crecimiento tumoral in vivo . Se realizó este procedimiento tal como se describió en el ejemplo 1. Se evaluaron todos los sitios quirúrgicos patológicamente así como mediante análisis de necropsia para determinar una toxicidad sistémica.

Resultados

Efecto de p53 sobre el crecimiento celular de SCCHN in vitro . EL ejemplo 1 describió la inhibición in vitro del crecimiento celular por Ad5CMV-p53 en líneas celulares de SCCHN con p53 mutado endógenamente. Este ejemplo presente es para determinar si las líneas celulares de SCCHN con p53 de tipo natural endógeno se verán afectadas de manera similar. También se investiga el efecto de Ad5CMV-p53 sobre fibroblastos no malignos.

Se eligieron cuatro líneas celulares de SCCHN humanas para este estudio: Tu-138 y Tu-177 poseen un gen p53 mutado, mientras que MDA 686-LN y 886 son ambas homocigóticas para el gen p53 de tipo natural. Se usó una línea celular de fibroblasto de excrecencia de fibroblasto normal, que es cariotípicamente normal y no tumoral, como línea celular de control no maligna. Las células infectadas con el virus control dl312, tuvieron tasas de crecimiento similares a las de células con infección simulada, mientras que se inhibió significativamente el crecimiento de células tumorales infectadas con Ad5CMV-p53 (Fig. 3A, Fig. 3B, Fig. 3C Y Fig. 3D). De veinticuatro horas a cuarenta y ocho horas tras la infección, se produjo un cambio morfológico aparente en todas las células tumorales, reuniéndose partes de la población celular formando vesículas en sus membranas. Éstos son parte de una serie de acontecimientos histológicos predecibles que constituyen la muerte celular programada. El efecto se produjo antes en células con p53 mutado endógeno que en aquellas con p53 de tipo natural. Las células infectadas con adenovirus dl312 defectuoso para la replicación mostraron características de crecimiento normal sin anomalías histomorfológicas. Los ensayos de crecimiento fueron reproducibles en cuatro experimentos repetidos.

Expresión de proteína de p53 exógena en fibroblastos normales infectados por adenovirus y su efecto sobre la tasa de crecimiento. Adicionalmente, también se investigó el efecto del Ad5CMV -p53 sobre líneas celulares de fibroblastos no tumorales y cariotípicamente normales. Se aislaron estas células durante el establecimiento de las líneas celulares tumorales primarias. Veinticuatro horas tras la infección, se realizó un análisis de inmunotransferencia de tipo western para comparar los niveles de proteína producidos por los diferentes tipos de células infectadas. Se observó una banda de p53, reconocida por el anticuerpo monoespecífico anti-p53, PAb1801, en extractos celulares aislados a partir de todas las muestras infectadas con el Ad5CMV-p53. Al igual que en el ejemplo 1, la línea celular Tu-138 infectada con el adenovirus p53 mostró altos niveles de proteína p53 tras la transducción y sirvió como control. El nivel de expresión de p53 permaneció similar en las líneas celulares tanto con infección simulada como dl312. Los fibroblastos infectados con AdSCMV-p53 mostraron niveles mayores de proteína p53 que los de las células control. Este resultado indica que el gen p53 se traduce eficazmente en fibroblastos normales infectados con Ad5CMV-p53 tal como se pone en evidencia por la producción de proteína p53 inmunorreactiva. Se verificó la expresión de proteína y la eficacia de transducción de fibroblastos infectados con citospinas de Ad5CMV-p53 mediante análisis inmunohistoquímico. Esta línea celular de fibroblastos mostró una morfología y tasa de crecimiento normal, independientemente de la intervención (simulada, virus defectuoso para la replicación, o Ad5CMV-p53) (Fig. 4). Estos experimentos se repitieron dos veces y también se verificaron en otras líneas celulares de fibroblastos humanos normales.

Eficacia de transducción in vivo . Para medir la eficacia de la transferencia de genes in vivo, se reseccionó el sitio de colgajo subcutáneo 72 horas tras la intervención molecular o de control. Los experimentos de respuesta a la dosis con el marcador de \beta-galactosidasa de adenovirus muestran una eficacia de la transducción respuesta ala dosis en este modelo. Esto se confirmó con el análisis inmunohistoquímico 4 días tras la infección con Ad5CMV-p53. Ambos grupos de experimentos mostraron una respuesta a la dosis in vivo que se había descrito anteriormente in vitro (ejemplo 1). En ningún caso afectaron las dosis de virus que superaban los 10^{10} UFP a la expresión de p53 en otros sistemas de órganos, incluyendo el cerebro, hígado, pulmón, corazón, órganos viscerales abdominales, y piel. Estos experimentos ilustraron una relación dosis-respuesta entre el título viral y la eficacia de transducción así como la posibilidad de lograr una expresión transitoria extensa para el gen transducido dentro del campo del modelo quirúrgico deseado.

Inhibición de crecimiento tumoral in vivo . Se diseñaron estudios para determinar si la transferencia del gen mediada por Ad5CMV-p53 in vivo podía afectar al establecimiento o crecimiento de células SCCHN implantadas en un colgajo subcutáneo. Para lograr este objetivo, se creó un modelo de enfermedad residual microscópica. En este modelo, se elevaron tres colgajos subcutáneos sobre ratones hembra desnudos atímicos y se inocularon 2,5 x 10^{6} células tumorales mediante succión. En lugar de dejar que las células tumorales formasen nódulos (que se produce normalmente en 4 días), se realizó una única dosis de intervención molecular a las 48 horas tras la inoculación con células tumorales. De esta manera, aunque no había grandes tumores presentes, las células de tumores microscópicos estaban dentro del sitio quirúrgico imitando el dilema clínico de la escisión quirúrgica de todos los tumores grandes. El desarrollo de los tumores estaba directamente relacionado con el número de células tumorales, el momento asignado para la implantación, y la dosis de Ad5CMV-p53. De los ratones que recibieron células tumorales implantadas microscópicamente (2,5 x 10^{6}) y se trataron con Ad5CMV-p53 con 10^{8} unidades formadoras de placas (UFP) o más, sólo dos desarrollaron tumores, ambos implantados con la línea celular de p53 de tipo natural (MDA 886-LN). Todas las otras líneas celulares mostraron ausencia de desarrollo tumoral (tabla 5). Estos experimentos mostraron claramente que puede inhibirse eficazmente el crecimiento de células tumorales microscópicas in vivo si se exponen a Ad5CMV-p53. Se evaluó la formación de tumores al final de un periodo de 12 semanas (sacrificio más temprano del animal en circunstancias de carga tumoral excesiva) mediante análisis macroscópico e histológico de los sitios quirúrgicos. Los datos de establecimiento tumoral se resumen en la tabla 5.

TABLA 5 Efecto de Ad5CMV-p53 sobre la tumorigenicidad en un modelo de enfermedad residual microscópica de SCCHN

Línea celular	Nº de ratones que desarrollan tumores/vehículo total en ratones
	en tratamiento
	PBS	D1312	Ad5CMV-p53
Tu-138 (p53 con mutación homocigótica)	8/8	8/8	0/8
Tu-177 (p53 con mutación homocigótica)	8/8	8/8	0/8
686-LN (p53 de tipo natural homocigótico)	5/8	5/8	0/8
866 (p53 de tipo natural homocigótico)	6/6	6/6	2/6

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Se realizó un análisis inmunohistoquímico en las secciones del tumor de animales de experimentación. Esta línea celular posee el gen p53 endógeno de tipo natural. Hubo una falta de inmunotinción basal significativa con el tumor viable de MDA 688-LN (infección simulada). 10^{7} UFP de Ad5CMV-p53 muestran necrosis tumoral periférica con inmunotinción en la parte más central del tumor. 10^{8} UFP de Ad5CMV-p53 revelan necrosis total del tumor encontrándose inmunotinción en la totalidad del bolsillo quirúrgico con múltiples capas que expresan proteínas, incluyendo las capas musculares superficiales y del estroma. 10^{9} UFP de Ad5CMV-p53) muestran resultados similares a los de las 10^{8} UFP de Ad5CMV-p53, sin embargo, aumentó la expresión de p53 exógeno en todo el sitio quirúrgico y los edemas son prominentes.

Utilizando animales, que sirvieron como sus propios controles internos, implantes de 4,0 x 10^{6} o más células aumentaron significativamente el establecimiento de implantes subcutáneos, en comparación con la implantación tumoral de 2,5 x 10^{6} células (P < 0,01), incluso cuando se trataron en el sitio quirúrgico con Ad5CMV-p53 48 h tras la inoculación. Al permitir que las células implantadas se establecieran durante 72 ó 96 h antes de la intervención con Ad5CMV-p53, se aumentó de manera similar el asentamiento del tumor. Los experimentos de respuesta a la dosis establecieron que 10^{8} y 10^{9} UFP de Ad5CMV-p53 fueron igualmente eficaces en la inhibición de las cargas tumorales de 2,5 x 10^{6} células implantadas durante 48 h (figura 6). El estado de p53 endógeno de las líneas celulares tumorales implantadas (ya fuera p53 de tipo natural u homocigoto mutado) tubo poco impacto sobre la eficacia de Ad5CMV-p53 en el cese del desarrollo del tumor.

Ejemplo 3 Inducción de apoptosis mediada por la transferencia del gen de adenovirus p53 de tipo natural en carcinoma de células espinocelulares de la cabeza y el cuello Materiales y métodos

Líneas celulares y condiciones de cultivo; preparación de adenovirus recombinantes e infección. Todos los procedimientos se llevaron a cabo y las líneas celulares se mantuvieron tal como se describió anteriormente en los ejemplos 1 y 2.

Análisis de fragmentación de ADN. Tras la incubación con adenovirus p53 de tipo natural, así como con controles de adenovirus defectuosos para la replicación en varios intervalos de tiempo, se recogieron las células, se resuspendieron en 300 \mul de PBS con la adición de 3 ml de tampón de extracción (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 M, ARNasa 20 \mug/ml, SDS al 0,5%) y se incubaron a 37ºC durante 1-2 h. Al final de la incubación, se añadió proteinasa K hasta una concentración final de 100 \mug/ml y la disolución se colocó en un baño de agua a 50ºC durante al menos 3 h. El ADN se extrajo una vez con un volumen igual de Tris 0,5 M (pH 8,0) con fenol saturado, después se repitió la extracción con fenol/cloroformo. El ADN precipitado se analizó en un gel de agarosa al 1%.

Fijación celular. Para el método TUNEL, las células se fijaron en formaldehído al 1% en PBS (pH 7,4) durante 30 min en hielo. Las células se lavaron entonces con 3 ml de PBS, se resuspendieron en etanol helado al 70% y se conservaron a -20ºC hasta su uso. Para el análisis del ciclo celular, las células se fijaron únicamente en etanol helado al 70%.

Ensayo de la desoxinucleotidil transferasa terminal. El ensayo se realizó según el procedimiento de Gorczyca et al., (Gorczyca et al., 1993). En resumen, tras la fijación y el lavado, las células se resuspendieron en 50 \mul de tampón TdT que contenía cacodilato de sodio 0,2 M (pH 7,0), Tris-HCl 2,5 mM, C_{0}Cl_{2} 2,5 mM (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), DTT 0,1 mM (Sigma Chemical Company), BSA 0,25 mg/ml (Sigma Chemical Company), 5 unidades de transferasa terminal (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN), y 0,5 nmoles de biotina-16-dUTP junto con dATP, dGTP y dCTP a una concentración de 20 \muM. Los controles se prepararon mediante la incubación de una alícuota separada de cada muestra de prueba sin d-UTP. Las células se incubaron en la disolución a 37ºC durante 30 min, se aclararon en PBS, y se resuspendieron en 100 \mul de FITC, la disolución de tinción que contenía 4X SSC, Triton X-100 al 0,1% y avidina con fluoresceína 2,5 \mug/ml (Vector Labs. Inc., Burlingame, CA). Los tubos se incubaron durante 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Las células se aclararon en PBS con Triton X-100 al 0,1% y se resuspendieron en 0,5 ml de PBS que contenía yoduro de propidio (5 \mug/ml) y 70 \mul (1 mg/ml) de ARNasa. Los tubos se incubaron en la oscuridad en hielo durante 30 min antes del análisis de citometría de
flujo.

Análisis de citometría de flujo. Todas las muestras se analizaron utilizando un citómetro de flujo EPICS Profile II (Coulter Corp., Hialeah, FL) con la configuración óptica habitual. Al menos se recogieron 5.000 acontecimientos por cada muestra. Se determinó la positividad para el marcaje en extremo con TdT sustrayendo el histograma control de los histogramas de prueba, utilizando el programa inmuno-4 del software de la terminal de trabajo Elite (Coulter Corp., Hialeah, FL).

Ensayo de crecimiento celular. Las células se sembraron en placa y el crecimiento se monitorizó tal como se describió en el ejemplo 1.

Análisis in vivo para apoptosis. La terapia génica en un modelo de enfermedad residual microscópica de SCCHN se ha descrito anteriormente en el ejemplo 2.

Marcaje de extremo in situ . El procedimiento se realizó tal como se describió anteriormente (Wijsman et al., 1993). En resumen, se eliminó la cera de secciones de parafina en xileno durante 5 min tres veces cada una, y se hidrató progresivamente sumergiendo las muestras durante 3 min cada una en disoluciones de etanol al 100%, 90%, 70% y 30%. La peroxidasa endógena se inactivó sumergiendo las muestras durante 20 min en H_{2}O_{2} al 0,75% v/v en metanol al 100%. Tras lavar las muestras en PBS, las secciones se digirieron con pepsina al 0,1% p/v (Fisher Scientific, Houston, TX) en HCl 0,1 N durante 5 min a 37ºC y se lavaron ampliamente en PBS. Las secciones se incubaron entonces en una cámara de humedad a 37ºC durante 1 h con un cóctel de marcaje de extremo que incluía lo siguiente: desoxinucleotidil transferasa terminal 0,5 unidades/\mul; dUTP biotinilado, 0,06 mM; 5X tampón TdT, 10 \mul; agua doblemente destilada hasta 50 \mul. La reacción se terminó sumergiendo las muestras en un tampón que contenía NaCl 300 mM y citrato de Na 30 mM en agua doblemente destilada. Una vez lavadas las muestras en PBS, se incubaron las secciones con avidina conjugada con peroxidasa de rábano durante 1 h a 37ºC en una cámara de humedad. La tinción se desarrolló utilizando 3,3'-diaminobencidina y las secciones se contratiñeron con verde de metilo.

Resultados

Inhibición del crecimiento de las líneas celulares de SCCHN por adenovirus p53. Los ejemplos anteriores demuestran que el gen p53 de tipo natural puede transducirse eficazmente en las líneas celulares de SCCHN mediante un vector adenoviral recombinante. En consecuencia, las células tumorales atacadas pierden su capacidad para proliferar in vitro, así como in vivo. El efecto de inhibición es independiente del estado de p53 endógeno de las líneas celulares. Se llevaron a cabo análisis previos de la tasa de crecimiento durante un periodo de una semana. El presente ejemplo investiga los efectos tempranos de p53 de tipo natural sobre el crecimiento de las células SCCHN (es decir, intervalos de tiempo anteriores, horas).

En este estudio se utilizaron dos líneas celulares representativas. La línea celular Tu-138, alberga un gen p53 mutado, mientras que la línea celular, MDA 686LN, posee un gen p53 de tipo natural. Las células infectadas con el virus defectuoso para la replicación, d1312, tuvieron tasas de crecimiento similares a las células con infección simulada (figura 5A y figura 5B). Por otra parte, el crecimiento de las células Tu138 (figura 5A) y MDA 686LN (figura 5B) infectadas con Ad5CMV-p53 se inhibió significativamente. Pareció que la proteína p53 exógena tenía una inhibición del crecimiento anterior y más profunda de Tu138, en comparación con MDA 686LN. Se observó un cambio morfológico aparente más profundo, con partes de poblaciones celulares reuniéndose y con sus membranas exteriores formando vesículas, asemejándose a la apoptosis, que se producía concomitantemente con la iniciación de la inhibición del crecimiento. Las células infectadas con el adenovirus defectuoso para la replicación, d1312, mostraron características de crecimiento normal sin anomalías histomorfológicas. De manera importante, estos efectos no se observaron tras la infección con el adenovirus p53 de fibroblastos cariotípicamente normales, tal como se detalló en el ejemplo 2 anterior, así como con queratinocitos orales humanos (inmortalizados pero no tumorigé-
nicos).

Análisis de fragmentación de ADN. Uno de los marcadores característicos en la apoptosis que los distingue de la necrosis es el aspecto bioquímicamente observable de la estructura en escalera de los fragmentos de ADN. Para confirmar la noción de que las células habían experimentado apoptosis tras la infección con el adenovirus p53, se realizó un análisis de fragmentación del ADN. El ADN cromosómico extraído de las células viables tras la infección con el adenovirus p53 defectuoso para la replicación o de tipo natural se sometió a electroforesis en gel de agarosa. El aspecto de los fragmentos de ADN equivalentes a aproximadamente 200 pb y sus múltiplos se observó en ambas líneas celulares. El ADN fragmentado apareció a las 22 h tras la infección por el adenovirus p53 en la línea celular Tu-138, mientras que en la línea celular MDA 686LN, el ADN fragmentado fue visible a las 30 h y más evidente a las 48 h tras la infección por el adenovirus p53 de tipo natural. No surgió ADN fragmentado detectable de las células infectadas con dl312 y con infección simulada.

Ensayo de la desoxinucleotidil transferasa terminal in vitro . Otro marcador característico de la apoptosis es el cambio morfológico y la destrucción en la organización estructural del núcleo, que da como resultado la condensación de la cromatina. La microscopía electrónica se ha utilizado ampliamente para detectar tal alteración ultraestructural. Sin embargo, recientemente, los métodos de citometría de flujo para identificar células apoptóticas han ganado aceptación debido a la capacidad para explorar y analizar poblaciones celulares, en comparación con la microscopía electrónica (Gorczyca et al., 1993). El inventor empleó en el presente documento el método de TUNEL (marcaje de extremo con formación de mella con dUTP-biotina mediado por la desoxinucleotidil transferasa terminal) (Gorczyca et al., 1993) que se basa en la detección de una amplia rotura en el ADN para identificar las células apoptóticas. Quince h tras la infección por el adenovirus p53, el 4,4% de la población de células Tu-138 viables estaban en fases apoptóticas, en comparación con ninguna en las MDA 686LN (figura 6A y figura 6B). El número de células apoptóticas aumentó proporcionalmente a medida que aumentaba también la duración de la observación tras la incubación con el adenovirus p53. Cerca del 31% de las células Tu-138 habían experimentado apoptosis a las 22 h. Aunque con retraso en la inducción inicial de apoptosis, aproximadamente el 60% de las células MDA 686LN estaban en fases apoptóticas a las 48 h tras la infección con el adenovirus p53. Resulta de interés que el porcentaje de células apoptóticas tal como se determina por el método de Tunel, puede calcularse significativamente por debajo de lo que corresponde, puesto que sólo se sometieron al análisis las células viables. Estos datos se correlacionan bien con los análisis de tasa de crecimiento y de fragmentación de ADN. No hubo poblaciones celulares detectables que experimentaran apoptosis en los experimentos control utilizando infección simulada, así como controles de virus defectuosos en la replicación (100 M.O.I.). Por tanto, la apoptosis no fue la función de los productos génicos adenovirales transducidos por
sí mismos.

Análisis in vivo para la apoptosis. Los ejemplos anteriores muestran que el adenovirus p53 inhibe la formación de tumores in vivo. Este ejemplo se diseñó para demostrar si la inhibición del crecimiento tumoral in vivo era consecuencia de la apoptosis. Se realizaron análisis de marcaje de extremo in situ para detectar células apoptóticas en secciones embebidas en parafina obtenidas del ejemplo 2. Claramente, no se observó tinción en las secciones de tejido aisladas a partir de los animales que llevaban MDA 686LN que habían recibido tratamiento con PBS como control. Por otra parte, secciones de tejido aisladas de ratones que llevaban MDA 686LN tratados con adenovirus p53 de tipo natural mostraron tinción altamente positiva, lo que demuestra que la apoptosis, de hecho, fue el acontecimiento implicado en la inhibición del crecimiento tumoral in vivo.

Además de estos estudios, el inventor buscó determinar si la inhibición del crecimiento se debe, en parte, a la detención del ciclo celular por la proteína p21 inducida o principalmente como resultado de la apoptosis. La inmunotransferencia de tipo Western demostró que la proteína p21 se inducía en las células SCCHN infectadas con el adenovirus p53 de tipo natural. Sin embargo, los análisis del ciclo celular indicaron que, pese al nivel elevado de proteína p21 en las células infectadas con el adenovirus p53, no hubo acumulación significativa de células en la fase G_{1}, cuando se comparaba con la fase S.

Ejemplo 4 Inhibición del crecimiento de las células espinocelulares de cabeza y cuello por p53-FLAG: un marcador eficaz para rastrear la terapia génica Materiales y métodos

Líneas celulares y condiciones de cultivo. Preparación de adenovirus recombinantes e infección; análisis de inmunotransferencia de tipo Northern; análisis de inmunotransferencia de tipo Western; ensayo de crecimiento celular; tinción inmunohistoquímica en capas de células in vitro . Todos los procedimientos se llevaron a cabo y las líneas celulares se mantuvieron tal como se describió en el ejemplo 1.

Generación de adenovirus p53-FLAG. La secuencia de ADNc de p53 se escindió de pC53-SN mediante digestión con BamHl y se clonó en el sitio BamHl de pGEM7Z. Entonces se digirió un plásmido recombinante con la orientación apropiada del inserto con Accl y Kpn1 para eliminar 22 aminoácidos del extremo 3' del ADNc de p53. Un ligador con extremos compatibles con Acc1-Kpn1 que contenía la secuencia del péptido FLAG incluyendo un codón de terminación, se ligó entonces en el plásmido digerido para crear el gen de fusión p53-FLAG. El gen de fusión p53-FLAG resultante se clonó entonces en un vector de expresión con el promotor de CMV humano y la señal de poliadenilación de SV. El constructo final se insertó posteriormente en un vector lanzadera pXCJL.1 (Zhang et al., 1994) para generar un adenovirus p53-FLAG recombinante.

Experimentos de enfermedad residual microscópica in vivo . Los estudios se llevaron a cabo en un entorno definido libre de patógenos utilizando el sistema de modelo desnudo atímico descrito en el ejemplo 1. Se realizaron dos conjuntos diferentes de experimentos repetidos. El primero fue un experimento de respuesta a la dosis utilizando el virus AdCMV-p53-FLAG en tres de los colgajos a concentraciones decrecientes (10^{10} UFP, 10^{9} UFP, 10^{8} UFP). El cuarto colgajo sirvió como control y se aleatorizó o bien a PBS o bien al adenovirus defectuoso para la replicación (DL312). El segundo estudio se realizó utilizando 10^{10} UFP de AdCMV-p53-FLAG, AdCMV-p53, y adenovirus defectuoso para la replicación en tres colgajos separados. El cuarto colgajo se inoculó con el mismo volumen (100 \mul) de PBS estéril. Cuarenta y ocho horas tras el tratamiento, se sacrificaron dos de estos animales y los colgajos se recogieron para el análisis inmunohistoquímico. Los animales restantes se observaron durante 21 días y después se sacrificaron. Los volúmenes tumorales se midieron para comparación utilizando calibradores.

Resultados

Expresión de ARNm tras la infección con virus AdCMV-p53 y AdCMV-p53-FLAG. Se examinaron tanto Tu-138 como MDA 686-LN para determinar la expresión del ARNm de p53. El ARN total se aisló tras la infección por adenovirus. Se realizó un análisis de inmunotransferencia de tipo Northern. Se detectaron niveles similares de ARNm exógeno de AdCMV-p53 entre las células infectadas con AdCMV-p53 y AdCMV-p53-FLAG. El nivel de expresión del ARNm de p53 tras la infección con AdCMV-p53 y AdCMV-p53-FLAG fue comparable para Tu-138 y para MDA 686-LN. Se cree que la variación de la intensidad está relacionada con la dosis de carga. La expresión endógena del ARNm de p53 se observa en los carriles 2 y 3 en la línea celular con p53 mutado, Tu-138. No hubo expresión de ARNm de p53 endógeno significativa en la línea celular MDA 686-LN, que es de tipo natural para el gen p53. Estos datos sugieren que el virus AdCMV-p53-FLAG, al igual que el virus AdCMV-p53, se transduce satisfactoriamente y se transcribe eficazmente. El análisis de inmunotransferencia de tipo Northern no reveló evidencia de contaminación con ADN de AdCMV-p53.

Expresión de la proteína p53 exógena en líneas celulares de SCCHN infectadas con AdCMV-p53 y AdCMV-p53-FLAG. Se realizó análisis de inmunotransferencia de tipo Western para comparar la cantidad de proteína expresada por las células infectadas con AdCMV-p53 y AdCMV-p53-FLAG. Las bandas de proteínas se identificaron utilizando el anticuerpo frente a p53 monoespecífico (PAb1801) y el anticuerpo anti-FLAG M2 (IB13025) en dos geles ejecutados simultáneamente. Al utilizar el anticuerpo frente a p53 (pAB1801), hubo un nivel alto similar de la expresión de proteína p53 en ambas líneas celulares que se infectaron con AdCMV-p53 y AdCMV-p53-FLAG. Las células Tu-138 y MDA 686-LN infectadas con AdCMV-p53, también se probaron. No se observó ningún cambio en la expresión de la proteína p53 ni en las células infectadas con el adenovirus defectuoso para la replicación ni con el grupo de infección simulada. Cuando se utilizó como sonda un gel ejecutado de manera similar con el anticuerpo de ratón anti-FLAG M2, el nivel de expresión de la proteína p53-FLAG pareció ser similar al expresado tras utilizar como sonda el anticuerpo frente a p53, pero no se observó ninguna banda detectable en las células infectadas con el virus AdCMV-p53. Las células con infección simulada e infectadas con DL312 no mostraron un nivel detectable de proteína FLAG o p53 inmunorreactiva en cualquiera de las líneas celulares.

Efecto de AdCMV-p53 y AdCMV-p53-FLAG sobre el crecimiento de las células SCCHN in vitro . El efecto citotóxico del tratamiento con p53 de tipo natural en las líneas celulares Tu-138 y MDA 686-LN se ha detallado anteriormente. La línea celular Tu-138 tiene un gen p53 mutado endógenamente y la línea celular MDA 686-LN posee el gen p53 de tipo natural. Este estudio busca determinar si se observaría alguna diferencia en la eficacia tras la recombinación del virus AdCMV-p53 insertando la secuencia FLAG.

Las células infectadas con el adenovirus defectuoso para la replicación tuvieron una tasa de crecimiento similar a las células con infección simulada. Puede observarse un efecto citotóxico leve con el adenovirus defectuoso para la replicación (figura 7A). Por el contrario, las células infectadas o bien con AdCMV-p53 o con AdCMV-p53-FLAG experimentaron la muerte prácticamente total de las células tumorales hacia el día tres. El examen histológico reveló formación de vesículas mediante la membrana plasmática que es el rasgo característico de la apoptosis y se ha caracterizado como el mecanismo de muerte celular en las líneas celulares de SCCHN infectadas con AdCMV-p53 (ejemplo 1). Tal como se observó anteriormente, el efecto fue más prominente para la línea celular Tu-138 (p53 mutado) que para la línea celular MDA 686-LN (p53 de tipo natural). Los ensayos de curva de crecimiento fueron reproducibles en tres estudios repetidos sin observarse una diferencia significativa entre el efecto de los virus AdCMV-p53 y AdCMV-p53-FLAG, lo que sugiere que la adición del péptido FLAG no afectó a la capacidad de p53 en la inhibición del crecimiento celular.

Tinción inmunohistoquímica de las líneas celulares de SCCHN infectadas con adenovirus. Se compararon monocapas de células infectadas para la expresión de la proteína p53 y p53-FLAG utilizando técnicas inmunohistoquímicas convencionales. Ni la proteína p53 ni FLAG pudieron identificarse claramente en la infección simulada de las células infectadas con DL312 en la línea celular MDA 686-LN. Sin embargo, en Tu-138, que tiene un gen p53 mutado, la tinción endógena para p53 fue positiva. Cuando las células se infectaron con el virus AdCMV-p53, se observó una fuente tinción en ambas líneas celulares. La inspección visual de estas células infectadas con el virus AdCMV-p53-FLAG mostró una intensidad de tinción y un número de células positivas idénticos con PAb1801 para el anticuerpo, en comparación con las células infectadas con el virus AdCMV-p53. Las células infectadas con el virus AdCMV-p53-FLAG también mostró fuerte positividad inmunohistoqímica con el anticuerpo frente a M2 FLAG. Sin embargo, la calidad de la tinción fue diferente, tanto dentro del núcleo como, en un menor grado, en el citoplasma.

Inhibición in vivo del crecimiento. Los estudios de respuesta a la dosis usando 10^{8}, 10^{9}, y 10^{10} unidades formadoras de placa (UFP) de virus AdCMV-p53-FLAG, en comparación con un colgajo control que era o bien PBS o bien DL312, se realizaron utilizando el método de modelo microscópico descrito en el ejemplo 1 en la línea celular Tu-138. El tamaño medio del tumor para la infección simulada fue de 1205 +/- 205 mm^{3}. El tamaño del tumor disminuyó de una manera lineal con la concentración creciente de virus utilizada en la intervención molecular. El tamaño medio del tumor fue de 637 +/- 113 mm^{3}, 392 +/- 109 mm^{3}, y 193 +/- 74 mm^{3} para los colgajos tratados con 10^{8}, 10^{9}, y 10^{10} UFP de AdCMV-p53-FLAG, respectivamente. Cada animal se comparó frente a sí mismo utilizando una prueba de la t apareada y se observó un efecto de respuesta a la dosis significativo a p < 0,05 en todas las comparaciones, excepto entre el colgajo tratado con 10^{9} y 10^{10} UFP. Claramente, cuanto mayor es la cantidad de virus, mayor inhibición del crecimiento del tumor se visualiza. En un estudio adicional se compararon los efectos de AdCMV-p53 con los de AdCMV-p53-FLAG. No se observó diferencia significativa en la actividad.

Demostración inmunohistoquímica del efecto inhibidor del tumor exógeno en el modelo animal de enfermedad residual microscópica. Tras demostrar una actividad comparable in vitro e in vivo de AdCMV-p53 y AdCMV-p53-FLAG, el inventor aplicó técnicas inmunohistoquímicas para demostrar el producto de proteína de fusión p53-FLAG in vivo. Utilizando las líneas celulares Tu-138 y MDA 686-LN, se recogieron colgajos de la enfermedad residual microscópica 48 horas tras el tratamiento, se fijaron en formalina y se embebieron en parafina. En las secciones colindantes de las células tumorales tratadas con el virus AdCMV-p53-FLAG, se aplicó la tinción para las proteínas tanto p53 como FLAG. La intensidad de la tinción y el número de células con tinción positivamente, fue directamente proporcional a la cantidad de virus utilizada en la infección. Los controles fueron negativos para la tinción tanto con anticuerpos frente a p53 como frente a FLAG en las células MDA 686-LN. Se observó tinción endógena para p53 en las células tumorales Tu-138. Una muestra histológica se tiñó con hematoxilina y eosina, el anticuerpo frente a p53, y el anticuerpo frente a FLAG. La tinción citoplasmática característica con el anticuerpo frente a FLAG M2 contrastó con la tinción intranuclear del anticuerpo frente a p53. Esta es la primera vez que se ha demostrado que el anticuerpo frente a FLAG M2 es eficaz en tejido fijado embebido en parafina. La tinción demuestra que el efecto de inhibición del tumor está dirigido por la terapia endógena, y que en un modelo in vivo puede identificarse la terapia exógena utilizando el sistema FLAG aplicado.

En conclusión, está claro que la coadministración de la proteína FLAG, junto con la terapia génica deseada ofrece una posible utilidad como marcador de terapia génica. La invención muestra claramente que se potenció simultáneamente junto con el gen p53 y que la expresión del ARN mensajero y la proteína no disminuyeron. Y lo que es más importante, la actividad biológica del gen inhibidor del tumor administrado no se alteró. Por primera vez, se demostró que el anticuerpo frente a FLAG era eficaz cuando se realizó el análisis inmunohistoquímico con tejido embebido en parafina fijado con formalina. Estos factores sugieren la utilidad de esta proteína novedosa como indicador en estudios adicionales de terapia génica.

Ejemplo 5 Tratamiento de carcinoma de células espinocelulares de cabeza y cuello usando adenovirus p53

Paciente A

Un paciente varón de 53 años de edad presenta un tumor de SCCHN inoperable en la cabeza. La masa tumoral es de aproximadamente 6,5 cm de diámetro. Tras la exploración de la función de la médula ósea, recuento de placetas y función renal, el paciente recibe un primer tratamiento con 10^{8} partículas infecciosas de un constructo de expresión de adenovirus-p53, diluido en solución salina tamponada con fosfato estéril, mediante ocho inyecciones intratumorales distintas (volumen total de 10 ml). Cada tres días, el paciente recibe un tratamiento idéntico, hasta que se han administrado un total de seis tratamientos.

Tres días tras el sexto tratamiento, se examina el tumor y se encuentra que tiene > 4,0 cm de diámetro. La exploración histológica muestra una fragmentación celular considerable en el margen tumoral. Se emprende un segundo transcurso de seis tratamientos, tras lo cual se encuentra que el tumor tiene > 2,0 cm de diámetro y es necrótico. El paciente sigue recibiendo tratamientos una vez al mes durante tres meses, momento en el cual el tumor ya no es evidente.

Paciente B

Una paciente mujer de 44 años de edad presenta un tumor de SCCHN operable en el cuello. La masa tumoral es de aproximadamente 2,5 cm de diámetro. Tras la exploración de la función de la médula ósea, recuento de plaquetas y función renal, el paciente recibe un primer tratamiento con 5 x 10^{7} partículas infecciosas de un constructo de expresión de adenovirus-p53, diluido en solución salina tamponada con fosfato estéril, mediante tres inyecciones intratumorales distintas (volumen total de 3 ml). Cada tres días, el paciente recibe un tratamiento idéntico, hasta que se han administrado un total de seis tratamientos.

Tres días tras el sexto tratamiento, se escinde el tumor. El lecho tumoral se baña en 6 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril durante 60 min. Se retira el inóculo, se cierra la herida, y se deja un tubo de drenado en el lecho tumoral. Los días 4, 7, 10 y 14 tras la cirugía, se introducen en infusión 5 X 10^{7} partículas infecciosas de un constructo de expresión de adenovirus-p53, diluido en solución salina tamponada con fosfato estéril (volumen total de 3 ml), a través del tubo de drenado. Tras poner en contacto el lecho tumoral durante dos horas, se retira el inóculo mediante succión. Seis meses tras finalizar el tratamiento, no se observa ningún tumor primario, local o regional.

Ejemplo 6 Transferencia de gen p53 de tipo natural mediante un vector adenoviral en un ensayo en fase I de pacientes con carcinoma espinocelular en cuello y cabeza avanzado, recurrente

Se administró un vector adenoviral que contenía el gen p53 de "tipo natural" normal en dosis que aumentaban logarítmicamente a pacientes con carcinoma espinocelular recurrente confirmado por biopsia en la cabeza y el cuello. Se realizaron inyecciones tumorales directas tres veces por semana durante dos semanas consecutivas. Se estratificaron los pacientes en dos grupos: 1) enfermedad recurrente reseccionable, 2) enfermedad recurrente no reseccionable.

Aquellos pacientes estratificados en el grupo de enfermedad reseccionable se sometieron a una resección macroscópica quirúrgica de su neoplasma recurrente 72 horas tras el sexto caso de transferencia génica a lo largo de un periodo de 2 semanas. También se administró el vector adenoviral de manera intraoperatoria y 72 horas tras el procedimiento quirúrgico mediante una infusión en catéter retrógrado. Los pacientes no reseccionable se sometieron a intentos repetidos de transferencia génica mediante inyecciones tumorales directas una vez al mes a lo largo de ciclos de dos semanas hasta que se observó progresión de la enfermedad o deterioro del estado general del paciente. Se monitorizó la seguridad de este tratamiento mediante observación hospitalaria de cerca, biopsias para evaluar la eficacia de la transferencia génica, análisis de líquidos corporales para detectar vectores eliminados y análisis de
necropsia.

Métodos

Sujetos de estudio. Se introdujeron veintiún pacientes con carcinomas espinocelulares recurrentes avanzados de las vías aerodigestivas superiores con un estado general 2 del Eastern Cooperative Oncology Group en una de las dos ramas del estudio que consistían en pacientes con cánceres recurrentes reseccionables (grupo 1) o no reseccionables (grupo 2). Las características de los sujetos del estudio y dosis de vector adenoviral se muestran en las tablas 6 y 7, respectivamente. Las mujeres tenían todas pruebas de embarazo negativas y todos los pacientes usaron métodos anticonceptivos. Se obtuvo consentimiento informado de todos los pacientes antes de entrar en el estudio.

Vector de transferencia génica. El presente estudio empleó un vector de adenovirus defectuoso para la replicación de serotipo 5 con un potenciador (citomegalovirus) - promotor denominado Ad5CMVp53. Se produjeron tres lotes de vector adenoviral con unidades formadoras de placas (UFP) que oscilaban desde 10^{9} hasta 10^{11} mediante buenas prácticas de fabricación en Magenta, Inc. y Introgen Therapeutics, Inc. y se enviaron congelados (-70ºC) a University of Texas, M.D. Anderson Cancer Center. Cada lote fue eficaz para la transducción usando inmunotransferencia de tipo western así como ensayos de inhibición del crecimiento de células tumorales in vitro. Se descongeló el vector y se diluyó en solución salina tamponada con fosfato (vehículo) inmediatamente antes de la transferencia génica y se transportó a las habitaciones de los pacientes a 4ºC.

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(Tabla pasa a página siguiente)

1

2

3

4

TABLA 7 Dosis de vector y presencia y ausencia de nucleótidos de vector adenoviral en suero o en orina durante el tratamiento

Paciente	UFP/	Volumen	Ciclos de	Sitios de
	Transferencia	Inyectado	Transferencia	Inyecciones
			del Gen
1	10^{6}	6 cc	2	Masa facial
2	10^{6}	3 cc	2	Masa
				submentoniana,
				neofaringe
3	10^{6}	3 cc, 4 cc	1	Masa del cuello
				izquierda
4	10^{6}	3 cc, 5 cc	1 + 3	Masa del cuello
				derecha
5	10^{6}	1,5 cc	1	Masa del cuello
				izquierda
6	10^{6}	3 cc	1	Masa perioral
7	10^{7}	2 cc	4 + 2	Masa del cuello
				izquierda
8	10^{7}	3 cc	1	Masa de la base
				de la Lengua
9	10^{7}	1,5 cc	1	Recurrencia perioral
10	10^{8}	1,5 cc	1	Masa hipofaríngea
11	10^{8}	3 cc	1	Base de la Lengua
12	10^{8}	1,5 cc	3	Triángulo
				retromolar
				izquierdo
13	10^{9}	1,5 cc	6	R. Lengua
				Posterior y Base
				de la Lengua
14	10^{9}	1,5 cc	1 + 1	Suelo de la Boca
15	10^{9}	3 cc	1	Masa facial
				izquierda
16	10^{9}	1,5 cc	1	Masa
				Supraclavicular i.
17	10^{9}	1,5 cc	1	Base de la
				Lengua, fosa
				tonsilar
18	10^{9}	3 cc	4	Masa facial
				izquierda
19	10^{9,5}	1,5 cc	1	Masa
				submentoniana
20	10^{9,5}	3 cc	3	Masa del cuello
				izquierda
21	10^{9,5}	1,5 cc	3	Masa del cuello
				derecha

Dosis. Se administró el vector adenoviral a cinco cohortes de cada uno de los pacientes, y dosis crecientes logarítmicamente. Se establecieron los incrementos de dosis tras dos semanas de observación del último paciente tratado con la dosis anterior. Tras la entrada de los seis primeros pacientes en el estudio, entraron tres pacientes en cada nivel de dosis independientemente del grupo que puede reseccionarse o no puede reseccionarse al que se estratificó el paciente. Se describe la dosis del vector biológico en términos de la dosis total (en unidades formadoras de placas). El número estimado de vectores administrados por células epiteliales malignas no fue aproximado. El volumen total de administración se muestra en la tabla 7. El clínico determinó el volumen de vector adenoviral inyectado en los tumores malignos sólidos y estimó radiográficamente el volumen del tumor. Se inyectó directamente el vector en los carcinomas espinocelulares recurrentes bajo la visión directa y por palpación manual. Se espaciaron las inyecciones a incrementos de 1 centímetro a través de las masas. Tras la transferencia génica, se retuvo al sujeto en observación próxima durante al menos 1-1/2 horas. Se mantuvo el aislamiento de la secreción corporal y respiratoria durante 72 horas tras la transferencia génica final del vector.

Detección del vector. Se monitorizaron las muestras de suero y orina para determinar el vector adenoviral diseminado utilizando cultivo viral de células 293 así como también reacciones en cadena de polimerasa (PCR) utilizando cebadores que amplifican la región E1b del adenovirus y el extremo 5' del gen p53 de tipo natural que eran específicos para el vector. Entonces se transfirieron mediante Southern los productos de PCR para mejorar la detección viral a de 1-5 partículas virales así como también verificar la especificidad del producto de PCR. Se ensayaron controles positivos y negativos en cada reacción.

Seguridad. Se monitorizaron los síntomas, las señales vitales, los recuentos sanguíneos, y se examinaron físicamente los pacientes y se documentaron fotográficamente a diario. Se realizaron radiografías de tórax, pruebas químicas de sangre, y análisis de estados de rendimiento al principio de cada ciclo de tratamiento. Se midieron titulaciones de suero de anticuerpo adenoviral antes y a continuación de cada ciclo de transferencia génica. Tres días después de la sexta transferencia génica del primer ciclo, se obtuvieron biopsias tumorales (o resección quirúrgica). En cada caso se almacenaron muestras como muestras incluidas patológicamente, congelados de manera instantánea, así como también muestras fijadas en formalina.

Extracción de ácidos nucleicos a partir de suero u orina. Se extrajo ADN adenoviral de AdSCMV-p53 a partir de alícuotas de 0,5 ml de suero u orina mediante un método modificado de Cunningham et al., (1995). Brevemente, se añadió agua destilada para preparar 1 ml, y se precipitaron con polietileneglicol al 30% (PEG). Ya que no fue suficiente SDS solo para liberar el ADN viral a partir de su partícula, se añadió proteinasa K al SDS a 50ºC durante de 2-16 horas tras la precipitación con PEG (Norder et al., 1990). Se extrajeron las muestras con fenol, y se precipitó el ADN viral con etanol en presencia de glucógeno (Cunningham et al., 1995). Se recuperó el ADN precipitado mediante centrifugación a 14000 g durante 10 minutos a 4ºC, se resuspendió en 0,3 ml de agua destilada, y se volvió a precipitar con etanol. Se enjuagó el sedimento de ADN con etanol al 70%, se secó a vacío, y se disolvió en 10 \mul de agua destilada. Las muestras o bien se analizaron inmediatamente o se almacenaron a -20 hasta que se utilizaron. Se llevo a cabo la extracción de ácidos nucleicos en campanas de cabina de seguridad biológica para evitar posible contaminación cruzada de las muestras.

Reacciones de PCR sobre ADN aislado a partir de muestras de suero. Se diseñaron cebadores para la amplificación específica del gen p53 del vector adenoviral. El cebador superior (5'-CACTGCCCAACAACACCA-3', SEQ ID NO: 5) se corresponde con el extremo 3' del gen p53 y el cebador inferior (5'-GCCACGCCCACACATTT-3' SEQ ID NO: 6) se corresponde con la región E1B del adenovirus tipo 5 (nucleótidos 3517 a 3533 de la secuencia de tipo natural). Cada tubo de reacción de PCR contiene 0,2 mM de cada oligonucleótido, dNTPs 0,4 mM, tampón de sal inferior TaqPlus Long 1X (de Stratagene), 0,6 \mul de TaqPlus Long (5 U/ml) (de Stratagene), y 5 \mul de ADN de prueba. Se colocaron las muestras en un termociclador MJ Research Peltier (PTC-200) programado para 93ºC durante 3 minutos, con los siguientes perfiles de tres etapas: 93ºC durante 30 segundos, 65ºC durante 45 segundos y 72ºC durante 45 segundos para un total de 30 ó 35 ciclos. Se añadieron 5 \mul de tampón de carga 6X (0,25% de azul de bromofenol, 0,25% de xilenocianol FF y 15% de Ficoll (Tipo 400; Pharmacia) en agua) a cada tubo al final del periodo de PCR y se cargó en agarosa al 1%, gel de TBE 1X que contiene bromuro de etidio (0,6 \mug/ml). Se sometieron a electroforesis las muestras a 100 V durante de 1-1,5 horas y entonces se fotografiaron en luz UV.

Reacción en cadena de polimerasa (PCR). Sólo pudieron utilizarse 5 \mul de ADN preparado en una única reacción en cadena de polimerasa. Para el suero, se realizó la PCR en un volumen de 20-\mul conteniendo MgCl_{2} 2 mM, KCl 50 mM, Triton X-100 al 0,1%, desoxirribonucleosido trifosfatos (dNTP) 200 \muM cada uno, Tris-HCl (pH 9,0) 10 mM, cebadores 5 \muM cada uno, y 1,7 unidades de ADN polimerasa Taq (Promega). Se llevaron a cabo las reacciones a 94ºC durante 30 seg, 58ºC durante 30 seg, y 72ºC durante 60 seg para 35 ciclos, seguido de una extensión de 10-min a 72ºC. Se seleccionaron los cebadores de PCR a partir de la secuencia del Ad5CMV-p53 con el cebador sentido situado en el extremo 3' del ADNc de p53 (5'-GCCTGTCCTGGGAGAGACCG-3', SEQ ID NO: 7), y se seleccionó el cebador antisentido de la región E1B del adenovirus de tipo 5 (5'-CCCTTAAGCCACGCCCACAC-3', SEQ ID NO: 8). Se separó el producto de PCR (un fragmento de 838-pb) en gel de agarosa al 1%. Se subclonó el mismo producto de PCR en el vector pCR-Script (Stratagene), se secuenció, y se utilizó el inserto purificado en gel como una sonda para detectar el producto de PCR. Para la orina, se realizó la PCR en un volumen de 20-\mul que contiene MgSO_{4} 2 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 10 mM, KCl 10 mM, Triton X-100 al 0,1%, Tris-HCl 20 mM (pH 8,8), albúmina sérica bovina 0,1 mg/ml, desoxiribonucleosido trifosfatos (dNTP) 200 \muM cada uno, cebadores 5 \muM cada uno, y 2,5 unidades de ADN polimerasa TaqPlus long (Stratagene). Se llevaron a cabo las reacciones a 93ºC durante 60 seg, y entonces a 93ºC durante 30 seg, a 65ºC durante 45 seg, y a 72ºC durante 45 seg para 35 ciclos, seguido por una extensión de 10-min a 72ºC. Se seleccionaron los cebadores de PCR a partir de la secuencia del Ad5CMV-p53 con el cebador sentido situado en el extremo 3' del ADNc de p53 (5'-CACTGCCCAACAACACCA-3', SEQ ID NO: 9), y el cebador antisentido se seleccionó de la región E1B del adenovirus de tipo 5 (5'-GCCACGCCCACACATTT-3', SEQ ID NO: 10). Se separó el producto de PCR (un fragmento de 724-pb) en gel de agarosa al 1%.

Análisis de inmunotransferencia de tipo Southern. Se desnaturalizó el ADN en el gel en la inmunotransferencia de tipo Southern utilizada para verificar la especificidad del producto de PCR y se neutralizó antes de la inmunotransferencia a una membrana de nylon (Hybond-N+, Amersham) por absorción capilar. Se hibridó previamente la membrana durante 15 min a 65ºC en un tampón Rapid-hyb (Amersham) y se hibridó en el mismo tampón conteniendo sonda marcada con ^{32}P durante 1-2 h. Se lavó dos veces la membrana en SSC 0,1 x y SDS al 0,1% a temperatura ambiente, y de nuevo dos veces a 65ºC (15 min por lavado). Se expuso la membrana lavada a una película de rayos-X a -70ºC durante de 1-16 h con una pantalla intensificadora.

Controles y puntuación de las muestras de prueba. Se incluyeron los siguientes controles con cada serie de muestras. En la etapa de aislamiento de ADN, se emplearon dos controles de suero "negativo" (suero agrupado y alicuotado de empleados de Introgen), y dos controles "positivos" que consisten en suero negativo espigado con 10 ufp o 100 ufp del virus AdCMV-p53. Se hizo esto para obtener un intervalo de sensibilidad en el que fueron positivos los controles de 10 (y 100) ufp, pero fueron negativos los controles negativos. Si los controles negativos eran positivos, la PCR se repitió con sólo 30 ciclos. Si el control de 10 ufp era negativo, el ADN se purificó adicionalmente con una precipitación con etanol adicional, y se repitió la PCR. Las dos etapas anteriores colocaron siempre los parámetros experimentales dentro del intervalo de sensibilidad adecuado.

En la fase de PCR, se emplearon un control positivo de 1 ng de ADN de AdCMV-p53 (aislado a partir de un lote clínico), y un control negativo (H_{2}O). Se repetía la PCR de la serie si uno de los controles era falso. No hubo controles de PCR negativos fallidos.

Para la confirmación de los supuestos positivos, se volvió a aislar el ADN del suero (con varias muestras adyacentes de manera temporal), y se repitió la PCR para este ADN. Se puntuaron las muestras como positivas solo si los resultados se podían reproducir. Se consideraron negativas aquellas muestras que fueron positivas en uno de los dos análisis de muestras con fines de notificación. Se omitieron de la base de datos los supuestos positivos que no pudieron repetirse (debido a la falta de muestra sin procesar adicional).

Eficacia para medir la transferencia génica. Se colocaron en crioviales las muestras de tejido eliminadas quirúrgicamente, se congelaron de manera inmediata, y se conservaron entonces en almacenamiento con nitrógeno líquido hasta su uso. Se decantaron las muestras congeladas en el orificio del pulverizador de tejidos de acero inoxidable de Bessman (Spectrum, Houston, TX) que se había enfriado previamente por inmersión en nitrógeno líquido. Se trituró el tejido hasta un polvo fino golpeando la mano de mortero de Bessman con un martillo de acero de cinco a diez veces. Se transfirió el tejido pulverizado a un homogeneizador de tejido de vidrio (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) conteniendo 1 ml de reactivo TRI (Molecular Research, Cincinnati, OH) por 50 mg de tejido, y se homogeneizó con de 5 a 10 golpes hacia arriba y hacia abajo con una mano de mortero de teflón.

Tras la homogeneización, se aisló ARN según las instrucciones proporcionadas con el reactivo TRI. Brevemente, se transfirieron los homogeneizados a tubos de centrifugación de polipropileno (Molecular Research) y se almacenaron durante 5 min a temperatura ambiente antes de la adición de cloroformo (0,2 ml por 1 ml de reactivo TRI). Entonces se mezclaron las muestras vigorosamente, se incubaron 15 min adicionales a temperatura ambiente, y se centrifugaron a 12.000 x g durante 15 min a 4ºC para separar el ARN que contiene la capa acuosa de la fase fenol-cloroformo. Se añadió isopropanol a la fase acuosa y se precipitó el ARN mediante incubación a temperatura ambiente durante 15 min. Se recuperaron los sedimentos de ARN mediante centrifugación a 12.000 x g durante 15 min a 4ºC, se lavaron una vez con etanol al 75%, se secaron con aire, se disolvieron en agua tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC) y se cuantificaron midiendo la absorbancia a 260 nm. Se eliminó el ADN contaminante incubando hasta 50 \mug de ARN con 60 U de ADNasa I (Pharmacia, Piscataway, NJ) durante 25 min a 37ºC en un volumen de reacción total de 260 \mul. Entonces se extrajo el ARN con fenol : cloroformo, se precipitó con etanol, se lavó una vez con etanol al 75%, se formó sedimento mediante centrifugación a máxima velocidad en una microcentrífuga durante 15 min a 4ºC, se secó con aire, se resuspendió en DEPC-agua, y se almacenó a -80ºC. Se valoró la calidad del ARN corriendo las muestras en un gel de agarosa al 0,8% no desnaturalizado ordinario y visualizando las bandas ribosómicas de 28S y 18S mediante la tinción con bromuro de etidio. Para eliminar la contaminación cruzada entre las muestras y para minimizar la actividad de la ARNasa, se empaparon todos los instrumentos reutilizables empleados en el aislamiento de ARN en una disolución detergente Liqui-Nox (Fisher Scientific) al 2% durante un mínimo de 5 minutos, se lavaron hasta quedar libres de restos, se transfirieron a una disolución de lejía al 10% durante 3 minutos, se enjuagaron meticulosamente con agua desionizada, se pulverizaron con etanol al 100%, se secaron, se sumergieron en cloroformo, y se secaron de nuevo antes de su uso.

Se realizó la transcripción inversa utilizando 1,5 \mug de ARN celular total en 23,5 \mul de mezcla de reacción que contiene 111 ng de hexámeros aleatorios (Gibco BRL, Grand Island, NY), 40 unidades de inhibidor de ARNasa (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), dNTP 0,4 mM de cada uno (Perkin Elmer, Foster City, CA), y 300 unidades de transcriptasa inversa Superscript II ARNasa H- (Gibco BRL) en un tampón RT 1 x (Tris 50 mM, pH 8,3, cloruro de potasio 75 mM, cloruro de magnesio 3 mM, y ditiotreitol 20 mM). Se calentaron el ARN y los hexámeros aleatorios a 70ºC durante 10 min y se enfriaron en hielo antes de que se añadiera el resto de la mezcla de reacción. Se incubó la reacción a 25ºC durante 5 min con 200 unidades de transcriptasa inversa, y después 10 min adicionales a 25ºC tras la adición de otras 100 unidades de transcriptasa inversa, para facilitar la hibridación de los cebadores, antes de la incubación a 42ºC durante 50 min. Se terminaron las reacciones de RT inactivando con calor la transcriptasa inversa durante 15 min a 70ºC. Se eliminó el ARN complementario al ADNc mediante digestión con 1 unidad de ARNasa H (Boehringer Mannheim) durante 20 min a 37ºC. Se utilizó como control positivo el ARN de la línea TU167 de carcinoma espinocelular de cuello y cabeza (HNSCC) infectada con adenovirus Ad5CMV-p53 recombinante (multiplicidad de la infección de 100:1) para detectar p53 transcrito viralmente, y se utilizó como control negativo las células TU167 infectadas con el vector d1312 (1) de adenovirus variante que no contiene la unidad transcripcional de p53.

Para detectar el transcrito de Ad5CMV-p53, se realizó una PCR en un volumen de reacción de 30 \mul que contiene dNTP 0,2 mM de cada uno, cloruro de magnesio 1,5 mM, 1 unidad de taq polimerasa (Promega, Madison, WI), y cebadores CMV2 (5' GGTGCATTGGAACGCGGATT, SEQ ID NO: 11) y P53EX3 (5' GGGGACAGAACGTTGTTTTC, SEQ ID NO: 12) 0,5 mM de cada uno en tampón de PCR 1 x (cloruro de potasio 50 mM, Tris 10 mM a pH 9,0, Triton X-100 al 0,1%). Los cebadores CMV2 y P53EX3 amplifican un fragmento de 295-bases específico para el transcrito de p53 derivado de adenovirus. Las condiciones de PCR para detectar los transcritos de Ad5CMV-p53 fueron tal como sigue:

94ºC durante 1 min, seguido de 94ºC durante 30 seg, 58ºC durante 40 seg, 70ºC durante 1 min para 35 ciclos, y 70ºC durante un tiempo de extensión de 10 min.

Para garantizar que el producto amplificado durante la PCR estaba detectando ARNm y no contaminando con ADN en la preparación de ARN, se realizó también la PCR utilizando productos de RT a partir de reacciones paralelas en las cuales no se añadió transcriptasa inversa.

Se realizó una RT-PCR específica para gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) con el fin de verificar la integridad de las reacciones de RT. Se diluyó un volumen de 3 \mul de la reacción de RT en 30 \mul de mezcla de PCR que contiene DNTP 0,2 mM de cada uno, cloruro de magnesio 2 mM, 1 unidad de taq polimerasa, y cebador GAPDH1 (5' ACGGATTTGGTCGTATTGGG, SEQ ID NO: 13) y cebador GAPDH2 (5'TGATTTTGGAGGGATCTCGC, SEQ ID NO: 14) 0,5 mM de cada uno en tampón de PCR 1 x. Los cebadores GAPDH abarcan 3 exones en el gen de GAPDH humano y amplifican un producto de 231-bases específico para ARNm. Las condiciones de PCR para detectar GAPDH fueron tal como sigue:

94ºC durante 1 min, seguido de 94ºC durante 30 seg, 60ºC durante 12 seg, 72ºC durante 1 min para 35 ciclos, y 72ºC durante un tiempo de extensión de 7 min.

Se realizó la PCR utilizando un termociclador Perkin Elmer Gene Amp 9600, y se sintetizaron de manera comercial todos los cebadores (Genosys, Woodlands, TX).

Determinación inmunohistoquímica de gen intratumoral. Se realizaron estudios de inmunoperoxidasa en secciones de tejido fijados en formalina, y embebidos en parafina utilizando el método (1) de complejo de avidina-biotina-peroxidasa (ABC). Se cortaron las muestras con espesor de 3-4 \mum, se desparafinizaron en xileno, y se volvieron a hidratar en etanol en grados descendientes (100-70%). Se bloqueó la actividad peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno al 3% en metanol. Tras varios lavados en agua destilada y solución salina tamponada de fosfato (PBS), se incubaron las secciones con una dilución 1:10 de suero de caballo normal para minimizar la tinción de fondo. Esto se siguió con incubación durante la noche a 4ºC con anticuerpos monoclonales frente a p53 (DO-1, Oncogene Science, Inc., Uniondale, NY; dilución 1:80) y p21 (Oncogene Science, Inc., 1:100). Se realizó el procedimiento de tinción de peroxidasa utilizando kits de ABC Elite (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Se visualizó la reacción de inmunotinción utilizando 3,3'-diaminobencideno al 0:05% en tampón Tris-HCl que contiene peróxido de hidrógeno al 0,01%, pH 7,6. Se contratiñeron las secciones con azul de toluidino al 0,01% y se montaron en permount (solución de un polímero naftalénico en tolueno). Se realizó la puntuación contando la tinción nuclear positiva en 200 células de 10 campos de alta potencia consecutivos por dos observadores independientes.

Ensayo de TUNEL para determinar la fragmentación de ADN. Se realizó el ensayo de TUNEL utilizando el kit Apoptag™ PLUS (Oncor, Gaithersburg, M.D.) según las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Se contratiñeron las muestras con verde de metileno al 4%. Se evaluaron las muestras teñidas de eosina y hematoxilina corres-
pondientes para determinar la presencia de infiltrados de células inflamatorios y se graduaron en una escala de 1-4.

Procedimiento de ensayo de efecto citopático. Se monitorizaron también muestras de orina de los pacientes para determinar la presencia de Ad5p53 mediante un ensayo en el que cualquier virus en la muestra se deja infectar a una monocapa de células receptoras. Aquellas células se monitorizan para determinar la aparición de un efecto citopático (CPE): las células se reunieron y se separaron de la superficie. Se recogieron las muestras de orina de los pacientes sometidas a ensayo para la determinación de CPE a partir de la primera orina de la mañana durante la segunda semana del primer curso de tratamiento, y en el día 0 ó 1 (previo al tratamiento). Se guardaron muestras de aproximadamente 15 ml cada una en tubos cónicos estériles de 15 ml a -80ºC hasta su uso. Las células IT293, que forman la monocapa de células receptoras de este ensayo, se mantienen en FBS al 10% DMEM plus, en un incubador de CO_{2} al 10% humidificado a 37ºC. Dos días antes de que se probaran las muestras de los pacientes, las células se colocaron en una placa a 2 \times 10^{5} por pocillo en placas de 12 pocillos.

En el momento de ensayo, se descongelaron las muestras de orina en un baño de hielo, y se mezcló una alícuota 1:1 con DMEM y se filtró de manera estéril utilizando un filtro de jeringa de 0,22 \mum. Se añadió despacio a cada pocillo una alícuota de 350 \mul de esta mezcla 1:1 tras eliminar el medio de crecimiento. Se balanceó suavemente la placa 15 minutos más tarde. Tras 30 minutos, se añadió a cada pocillo 2,0 ml de FBS al 10% DMEM plus para diluir la muestra. En el día 3 (72 horas más tarde) y el día 6 del ensayo, se añadieron a cada pocillo alícuotas de 0,5 ml de medio nuevo, para ayudar a mantener la monocapa de células durante un máximo de 6-7 días.

Se sometieron a ensayo por triplicado las muestras de los pacientes. Se sometió a ensayo la muestra previa al tratamiento diluida tal como está, y también con adición de 10^{5} de UFP de Ad5p53 por pocillo para detectar cualquier componente de la orina que pueda interferir con la detección del virus mediante este procedimiento. Se inocularon los pocillos control con DMEM solo, con adición de 10^{5}, 10^{4}, 10^{3}, 10^{2}, ó 10^{1} ufp por pocillo, cada uno por duplicado. La adición de 10^{5} ufp provoca CPE en estas condiciones en el día 2 del ensayo; en cada día sucesivo, el control adicionado siguiente mostrará CPE. Por tanto, el momento en el que se detecta CPE en cada muestra de paciente indica el nivel de Ad5p53 en esa muestra.

Adenovirus competente recombinante. Se probó el p53 adenoviral utilizado en el ensayo clínico para determinar la presencia de RCA utilizando células A549 por la Biotechnology Services Division of Microbiological Associates, Inc., (Rockville, Maryland).

Análisis estadísticos. Se utilizó un diseño de estudio de una sola rama. Para evitar introducir más pacientes de los necesarios en un ensayo que se encontró de toxicidad excesiva, se implementó un criterio de parada temprana bayesiana. Se utilizaron la prueba de grado de señales de WILCOXON y la prueba asignada para las comparaciones entre antes y después del porcentaje de células que muestran tinciones de TUNEL e inmunohistoquímicas, respectivamente. Se realizaron análisis estadísticos utilizando el paquete Survpac SPSS-Statistical.

Respuesta y toxicidad. Se valoraron la supervivencia y la respuesta en este análisis intermedio, pero no se consideraron objetivos de este análisis. El propósito de este análisis intermedio fue determinar el potencial de transducción de esta estrategia de transferencia génica. Los pacientes fueron evaluables para determinar las respuesta y toxicidad tras una observación de 30 días tras un ciclo de transferencia génica. Se evaluaron los efectos tóxicos de la terapia según el criterio de toxicidad común del instituto nacional contra el cáncer (Xref.). Se evaluó la respuesta a la terapia mediante ultrasonido o exploración TAC del cuello antes de cada curso de tratamiento. Los pacientes fueron evaluables para determinar la respuesta si reciben al menos un curso de terapia seguido de una documentación apropiada de respuesta. No pudieron ser evaluados aquellos pacientes que iban a someterse a una resección quirúrgica de sus tumores recurrentes para determinar la respuesta ya que la operación se realizó antes de un periodo de observación de 30. Se evaluaron todas las exploraciones TAC por un radiólogo y los ultrasonidos por otro. Se definió la respuesta parcial como una reducción en un 50 por ciento o superior en la suma de los productos de los diámetros del tumor medible; se definió una respuesta menor como una reducción en de un 25 por ciento a inferior a un 50 por ciento en la suma de los productos de los diámetros de la lesión medible. Se definió la progresión de la enfermedad como un aumento en un 25 por ciento o superior en la suma de los productos de los diámetros.

Se midió la duración de supervivencia desde el momento de entrada del protocolo hasta la expiración. Se revisó cada respuesta de los pacientes por un comité de gestión de datos que consiste en oncólogos médicos, radiólogos, y oncólogos quirúrgicos de cuello y cabeza.

Resultados

Detección del vector. Se detectó ADN del vector adenoviral mediante PCR en muestras de suero así como también de orina de pacientes hasta 48 horas tras la transferencia génica. El límite de detección para el vector 1-5 partículas virales. Se aisló el ADN viral en orina entre los pacientes que se sometían a transferencia génica a cada dosis viral, pero no se detecto tras las 48 horas tras la transferencia génica. La detección en suero de ADN viral aumentó con el aumento de la dosis viral por encima de 10^{7} UFP, pero tampoco fue detectable 48 horas tras la transferencia génica.

Se analizaron primero las muestras de orina para detectar virus infecciosos, CPE medidas en monocapas de células, antes del análisis de nucleótidos por PCR. Se aplicó el virus presente en la orina a las células 293 tal como se describió anteriormente, con el fin de monitorizar la CPE, que se observa como las células se reúnen y se vuelven desde la placa petri. En pocas ocasiones se identificó CPE en las muestras. Se encontró CPE tarde en cultivos de revestimiento (mayor a seis días) y se consideraron ambiguos estos resultados. En ningún caso se confirmó CPE mediante PCR e inmunotransferencia de tipo Southern de la misma muestra de orina para nucleótidos adenovirales
detectados.

Análisis de ADN viral de otros sistemas de órganos. Análisis de PCR demostraron ADN viral mayor de dos meses tras la transferencia génica de AdSCMVp53 de 10^{9} en la piel, músculo cardiaco, pulmón, y tejidos testiculares en muestras de autopsia congeladas repentinamente muestreadas con cuidado para evitar la contaminación cruzada entre los tejidos. Parenquima renal, glándulas adrenales y tejidos pancreáticos no mostraron secuencias de ADN viral específicas para este vector. Análisis inmunohistoquímicos de estas muestras de autopsia (no revelaron evidencia de la sobreexpresión del producto de proteína de p53 de tipo natural).

Valoración de la transferencia génica. Se realizaron todos los análisis tras al menos 1 hora de exposición de los tejidos al vector. Se detectó el producto de ARNm a las 4 horas y a las 48 horas por medio de RT-PCR. Por lo contrario, las muestras de biopsia congeladas tras 1 hora de exposición o menos no mostraron ARNm de p53. Además, las muestras de control negativo obtenidas de un sitio operatorio que no se ha sometido a la transferencia génica, también fueron negativas para el producto de PCR. Se analizaron muestras de biopsias transducidas y no transducidas de cuatro pacientes mediante RT-PCR para determinar la presencia de ARNm transcrito por Ad5CMVp53. Muestras transducidas de dos pacientes fueron positivas en geles teñidos con EtBr, mientras que no se detectó producto de Ad5CMVp53 en ninguna de las muestras no transducidas a pesar del hecho de que podían amplificarse GAPDH a partir de todas las muestras. Se confirmó la especificidad de los productos de PCR de 295 pb de los dos pacientes positivos mediante inmunotransferencia de tipo Southern. Debido a que no se observó el producto de PCR cuando se omitió la transcriptasa inversa de las reacciones de RT, tenía que haberse generado el producto de 295 pb detectado en la figura a partir de ARNm, más que el ADN contaminante.

Análisis inmunohistoquímicos. Se analizaron de manera simultánea todas las muestras previas y posteriores a la transferencia génica de los pacientes con controles positivos y negativos en cada experimento. Se analizaron las secciones múltiples de cada muestra y se compararon con muestras teñidas de eosina y hematoxilina así como también muestras marcadas en el extremo con TDT. Las muestras de biopsia tras la inyección del vector confirmaron la transferencia génica en tres pacientes cuyas muestras de biopsia de previas a la transferencia no mostraron proteína p53 sobreexpresada de manera endógena. En 5 de los 21 pacientes (27%), no se expresó de manera endógena significativamente p21 (CIP/WAF1); esto probó información para la transferencia génica en las muestras de biopsia tras la transferencia génica del paciente. Se observó también sobrexpresión de proteína nuclear de p53 en linfocitos asociados a tumor así como también células tumorales de estroma, indicando así también tansducción de células no tumorales.

Respuesta de anticuerpos serológica. Se indujeron anticuerpos de serotipo 5 de adenovirus en todos los pacientes seguido de inyecciones de repetición del vector. Sin embrago, no se encontró que eficacia de transducción se alterase de manera significativa comparando el ciclo inicial de la transferencia génica y los ciclos posteriores. Se reconoció eritema en el sitio de inyección del tumor leve empezando en 3 x 10^{9} UFP, sin embargo estas reacciones locales no limitaron la tolerancia al vector. No se encontró evidencia de hipersensibilidad sistémica en ningún paciente a pesar de de la dosis viral repetida durante hasta 6 meses consecutivos en un paciente tratado con 10^{9} UFP.

Observaciones patológicas. Se han identificado en la mayoría de las muestras de biopsia marcas de agujas, y se demostró la expresión de producto de gen en tejidos profundos más allá de los sitios de inyección. De manera similar, el hallazgo de las células marcadas en el extremo en áreas de transducción sugirió la inducción de apoptosis en células de tumor pero la ausencia de apoptosis en células inflamatorias o de estroma. Se observaron células inflamatorias en los pacientes y volvieron hallazgos histológicos prominentes entre los pacientes que recibieron dosis de 10^{9} UFP o superiores. De manera interesante, el paciente numero 7, cuya muestra expresó p53 de tipo natural endógeno, demostró necrosis hemorrágica sin evidencia de tumor viable en las muestras quirúrgicas seccionadas serialmente en su masa recurrente del cuello de 2 cm tras un ciclo de transferencia génica. Hallazgos patológicos de necrosis así como también inducción de apoptosis fueron observaciones frecuentes en las muestras.

Observaciones clínicas. Los pacientes han tolerado las inyecciones tumorales directas del vector siendo los efectos adversos más frecuentes molestia en el sitio de inyección. Se han observado evidencias de eritemas en el sitio de inyección local a 10^{9} UFP del vector y superiores aunque no se ha visto evidencia sistémica de hipersensibilidad superior a pesar de la evidencia de elevaciones sistémicas de titulación de anticuerpos. Los pacientes número 5, 10, y 16 se mantiene sin evidencias de enfermedad con un seguimiento medio de siete meses. Los pacientes 7 y 13 mostraron enfermedad estable durante 3 y 5 meses, respectivamente en sus áreas de lesión de indicador. El paciente número 20 mostró una respuesta parcial tal como se verificó mediante exploración TAC y ultrasonido, pero desarrolló metástasis espinal y pleural requiriendo la retirada del estudio debido a la progresión de la enfermedad.

En conclusión, en pacientes con carcinomas escamosos recurrentes del cuello y cabeza, es segura la transferencia génica mediada adenoviralmente de p53 de tipo natural y pueden transducir eficazmente células normales y de cáncer por medio de inyecciones tumorales directas o instalación intraoperatoria del vector. Ninguno de los pacientes mostró toxicidad que pudiera limitar la administración del vector o aumento de la dosis. La expresión de producto transgénico no se alteró a pesar del desarrollo de una respuesta de anticuerpos sistémica. Las respuestas inflamatorias locales encontradas patológicamente dentro de las muestras de tumor reseccionadas patológicamente pueden ser de hecho beneficiosas.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: JUNTA DEL CONSEJO DE RECTORES, UNIVERSIDAD DE TEXAS SYSTEM

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 201 WEST 7TH STREET

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: AUSTIN

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(D): ESTADO: TEJAS

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(E): PAÍS: ESTADOS UNIDOS

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 78701

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODO Y COMPOSICIONES PARA EL TRATAMIENTO DE CÁNCER

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 14

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(iv): FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B): ORDENADOR: IBM compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)

\vskip0.800000\baselineskip

(v): DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: DESCONOCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: ACTUALMENTE ADJUNTO

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(C): CLASIFICACIÓN: DESCONOCIDO

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(vi): DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/007,810

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 30-NOV-1995

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2066 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

6

60

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 293 amino ácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: amino ácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

7

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8

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2066 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 293 amino ácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: amino ácido

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(C): TIPO DE CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTGCCCAAC AACACCA

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCACGCCCA CACATTT

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCTGTCCTG GGAGAGACCG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCTTAAGCC ACGCCCACAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACTGCCCAA CAACACCA

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCACGCCCA CACATTT

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTGCATTGG AACGCGGATT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGACAGAA CGTTGTTTTC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGGATTTGG TCGTATTGGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGATTTTGGA GGGATCTCGC

\hfill

20

Claims

1. Uso de un constructo de expresión, en particular un constructo de expresión viral, que comprende un promotor funcional en células eucariotas y un polinucleótido que codifica para un polipéptido de p53 funcional, en el que dicho polinucleótido está en posición de sentido y bajo el control de dicho promotor para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto humano con un tumor sólido, en el que dicho tumor comprende células que expresan un polipéptido de p53 funcional.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que el medicamento es para administrarse a dicho tumor in vivo, dando como resultado la administración la expresión de dicho polipéptido de p53 funcional en las células de dicho tumor y la inhibición del crecimiento de las células tumorales.

3. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho tumor se selecciona del grupo que consiste en un carcinoma, un glioma, un sarcoma, y un melanoma.

4. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha célula tumoral es maligna.

5. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha célula tumoral es benigna.

6. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho tumor es un tumor de pulmón, piel, próstata, hígado, testículos, hueso, cerebro, colon, páncreas, cabeza y cuello, estómago, ovario, mama o vejiga.

7. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho constructo de expresión viral se selecciona del grupo que consiste en un vector retroviral, un vector adenoviral y un vector viral adenoasociado.

8. Uso según la reivindicación 7, en el que dicho vector viral es un vector adenoviral deficiente en la replicación.

9. Uso según la reivindicación 8, en el que dicho vector adenoviral deficiente en la replicación carece de al menos una parte de la región E1.

10. Uso según la reivindicación 9, en el que dicho promotor es un promotor de CMV IE.

11. Uso según la reivindicación 8, en el que el vector de expresión es para administrarse a dicho tumor al menos una segunda vez.

12. Uso según la reivindicación 11, en el que dicho tumor se resecciona tras al menos una segunda administración y se efectúa una administración adicional tras dicha resección.

13. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho constructo de expresión es para administrarse en un volumen de aproximadamente 3 ml a aproximadamente 10 ml.

14. Uso según la reivindicación 11, en el que la cantidad de adenovirus que va a administrarse en cada puesta en contacto es de entre aproximadamente 10^{7} y 10^{12} ufp.

15. Uso según la reivindicación 1, en el que el medicamento es para inyectarse en una cavidad corporal natural o artificial.

16. Uso según la reivindicación 15, en el que dicha inyección comprende la perfusión continua de dicha cavidad corporal natural o artificial.

17. Uso según la reivindicación 15, en el que dicho medicamento es para inyectarse en una cavidad corporal artificial que resulta de la escisión del tumor.

18. Uso según la reivindicación 1, en el que el polinucleótido que codifica para p53 está marcado de manera que pueda detectarse la expresión de p53 a partir de dicho constructo de expresión.

19. Uso según la reivindicación 18, en el que el marcador es un epítopo continuo.

20. Uso según la reivindicación 2, en el que dicho tumor es para ponerse en contacto con dicho constructo de expresión al menos dos veces.

21. Uso según la reivindicación 20, en el que dichas inyecciones múltiples comprenden aproximadamente 0,1-0,5 ml volúmenes separados aproximadamente 1 cm.

22. Uso según la reivindicación 2, en el que la administración del medicamento comprende además poner en contacto dicho tumor con un agente que daña el ADN.

23. Uso según la reivindicación 22, en el que dicho agente que daña el ADN es un agente radioterápico.

24. Uso según la reivindicación 23, en el que dicho agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en irradiación \gamma, irradiación x, irradiación uv y microondas.

25. Uso según la reivindicación 22, en el que dicho agente que daña el ADN es un agente quimioterápico.

26. Uso según la reivindicación 25, en el que dicho agente quimioterápico se selecciona del grupo que consiste en adriamicina, 5-fluorouracilo, etopósido, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C, verapamilo, doxorrubicina, podofilotoxina y cisplatino.

27. Uso según la reivindicación 2, en el que la administración del medicamento comprende además poner en contacto dicho tumor con una citocina.

28. Uso según la reivindicación 2, en el que la administración del medicamento comprende además poner en contacto dicho tumor con un segundo gen terapéutico distinto del gen que codifica para un polipéptido de p53.

29. Uso según la reivindicación 28, en el que dicho segundo gen terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un gen Dp, p21, p16, p27, E_{2}F, Rb, APC, DC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL, FCC, MCC, ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun, trk, ret, gsp, hst, bcl, abl, Bax, Bcl-X_{s} y EIA.

30. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho tumor está situado en una cavidad corporal seleccionada del grupo que consiste en la boca, faringe, esófago, laringe, tráquea, cavidad pleural, cavidad peritoneal, interior de la vejiga y luz del colon.

31. Uso según la reivindicación 11, en el que dicho tumor es para ponerse en contacto con dicho constructo de expresión al menos seis veces dentro de un régimen de tratamiento de dos semanas.

32. Uso según la reivindicación 1, en el que el medicamento es para administrarse a un lecho tumoral revelado mediante la resección del tumor, dando como resultado la administración la expresión de dicho polipéptido de p53 funcional en dichas células tumorales y la inhibición de su crecimiento.

33. Uso según la reivindicación 32, en el que se inhibe el crecimiento de las células tumorales residuales microscópicas en un sujeto humano.

34. Uso según la reivindicación 32, en el que dicho tumor que se puede reseccionar es un carcinoma espinocelular.

35. Uso según la reivindicación 32, en el que el p53 endógeno de dicho tumor que se puede reseccionar es de tipo natural.

36. Uso según la reivindicación 32, en el que dicho tumor es un tumor de pulmón, piel, próstata, hígado, testículos, hueso, cerebro, colon, páncreas, cabeza y cuello, estómago, ovario, mama o vejiga.

37. Uso según la reivindicación 32, en el que dicho constructo de expresión viral se selecciona del grupo que consiste en un vector retroviral, y vector adenoviral y un vector viral adenoasociado.

38. Uso según la reivindicación 37, en el que dicho vector adenoviral es un vector adenoviral deficiente en la replicación.

39. Uso según la reivindicación 38, en el que dicho vector adenoviral deficiente en la replicación carece de al menos una parte de la región E1.

40. Uso según la reivindicación 32, en el que dicho promotor es un promotor de CMV IE.

41. Uso según la reivindicación 32, en el que el lecho tumoral resultante es para ponerse en contacto con dicho constructo de expresión al menos dos veces.

42. Uso según la reivindicación 32, en el que dicho constructo de expresión es para ponerse en contacto con dicho lecho tumoral antes de cerrar la incisión.

43. Uso según la reivindicación 38, en el que dicho lecho tumoral es para ponerse en contacto con desde aproximadamente 10^{6} hasta aproximadamente 10^{9} partículas adenovirales infecciosas.

44. Uso según la reivindicación 41, en el que la administración del medicamento comprende además poner en contacto dicho tumor con dicho constructo de expresión antes de la resección de dicho tumor.

45. Uso según la reivindicación 44, en el que dicho tumor es para inyectarse con dicho constructo de expresión.

46. Uso según la reivindicación 45, en el que dicho tumor es para inyectarse con aproximadamente de 10^{6} a aproximadamente 10^{9} partículas adenovirales infecciosas.

47. Uso según la reivindicación 45, en el que dicho tumor es para inyectarse con un total de aproximadamente 1 ml a aproximadamente 10 ml.

48. Uso según la reivindicación 45, en el que dicho tumor es para inyectarse al menos dos veces.

49. Uso según la reivindicación 48, en el que cada una de dichas inyecciones comprende aproximadamente de 0,1 ml a aproximadamente 0,5 ml volúmenes separados aproximadamente 1 cm.

50. Uso según la reivindicación 32, en el que el lecho tumoral resultante es para ponerse en contacto con dicho constructo de expresión a través de un catéter.

51. Uso según la reivindicación 48, en el que dicha puesta en contacto comprende de aproximadamente 10^{6} a aproximadamente 10^{9} partículas adenovirales infecciosas.

52. Uso según la reivindicación 48, en el que dicho constructo de expresión es para ponerse en contacto con dicho tumor un total de aproximadamente 3 ml a aproximadamente 10 ml.

53. Uso según la reivindicación 32, en el que el polinucleótido de p53 se marca de manera que pueda detectarse la expresión de un polipéptido de p53.

54. Uso según la reivindicación 53, en el que el marcador es un epítopo continuo.

55. Uso según la reivindicación 32, en el que la administración del medicamento comprende además poner en contacto dicho tumor con un agente que daña el ADN.

56. Uso según la reivindicación 55, en el que dicho agente que daña el ADN es para ponerse en contacto antes de la resección.

57. Uso según la reivindicación 55, en el que dicho agente que daña el ADN es para ponerse en contacto después de la resección.

58. Uso según la reivindicación 55, en el que dicho agente que daña el ADN es para ponerse en contacto antes y después de la resección.

59. Uso según la reivindicación 55, en el que dicho agente que daña el ADN es un agente radioterápico.

60. Uso según la reivindicación 59, en el que dicho agente radioterápico se selecciona del grupo que consiste en irradiación \gamma, irradiación x, irradiación uv y microondas.

61. Uso según la reivindicación 55, en el que dicho agente que daña el ADN es un agente quimioterápico.

62. Uso según la reivindicación 61, en el que dicho agente quimioterápico se selecciona del grupo que consiste en adriamicina, 5-fluorouracilo, etopósido, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C, verapamilo, doxorrubicina, podofilotoxina y cisplatino.

63. Uso según la reivindicación 32, en el que la administración del medicamento comprende además poner en contacto dicho tumor con una citocina.

64. Uso según la reivindicación 63, en el que dicha citocina se selecciona del grupo que consiste en IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-2, IL-3, EL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, TGF-\beta, GM-CSF, M-CSF, TNF\alpha, TNF\beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-\alpha, IFN-\beta y IFN-\gamma.

65. Uso según la reivindicación 32, en el que la administración del medicamento comprende además poner en contacto dicho tumor con un segundo gen terapéutico distinto del gen que codifica para un polipéptido de p53.

66. Uso según la reivindicación 65, en el que dicho segundo gen terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un gen Dp, p21, p16, p27, E_{2}F, Rb, APC, DC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL, FCC, MCC, ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun, trk, ret, gsp, hst, bcl, abl, Bax, Bcl-X_{s} y ElA.

67. Uso según la reivindicación 32, en el que dicho tumor está situado en una cavidad corporal seleccionada del grupo que consiste en la boca, faringe, esófago, laringe, tráquea, cavidad pleural, cavidad peritoneal, interior de la vejiga y luz del colon.

\newpage

68. Uso según la reivindicación 1, en el que el medicamento es para administrarse directamente a un tumor sólido revelado quirúrgicamente, dando como resultado la administración la expresión de dicho polipéptido de p53 funcional en dichas células tumorales y la inhibición de su crecimiento.

69. Uso según la reivindicación 68, en el que dicho tumor es maligno.

70. Uso según la reivindicación 68, en el que dicho tumor es un carcinoma espinocelular.

71. Uso según la reivindicación 68, en el que dicho tumor es benigno.

72. Uso según la reivindicación 68, en el que dicho tumor es un tumor de pulmón, piel, próstata, hígado, testículos, hueso, cerebro, colon, páncreas, cabeza y cuello, estómago, ovario, mama o vejiga.

73. Uso según la reivindicación 68, en el que dicho constructo de expresión viral se selecciona del grupo que consiste en un vector retroviral, un vector adenoviral y un vector viral adenoasociado.

74. Uso según la reivindicación 73, en el que dicho vector adenoviral es un vector adenoviral deficiente en la replicación.

75. Uso según la reivindicación 74, en el que dicho vector adenoviral deficiente en la replicación carece de al menos una parte de la región E1.

76. Uso según la reivindicación 68, en el que dicho promotor es un promotor de CMV IE.

77. Uso según la reivindicación 68, en el que dicho tumor es para ponerse en contacto con dicho constructo de expresión al menos dos veces.

78. Uso según la reivindicación 68, en el que dicho constructo de expresión es para ponerse en contacto con dicho tumor antes de cerrar la incisión.

79. Uso según la reivindicación 74, en el que dicho tumor es para ponerse en contacto con desde aproximadamente 10^{6} hasta aproximadamente 10^{9} partículas adenovirales infecciosas.

80. Uso según la reivindicación 68, en el que dicho tumor es para ponerse en contacto con dicho constructo de expresión en un total de aproximadamente 1 ml a aproximadamente 10 ml.

81. Uso según la reivindicación 68, en el que dicho tumor es para inyectarse al menos dos veces.

82. Uso según la reivindicación 81, en el que cada una de dichas inyecciones comprende aproximadamente de 0,1 ml a aproximadamente 0,5 ml volúmenes separados aproximadamente 1 cm.

83. Uso según la reivindicación 68, en el que dicho tumor es para ponerse en contacto con dicho constructo de expresión a través de un catéter.

84. Uso según la reivindicación 83, en el que dicho tumor es para ponerse en contacto con aproximadamente de 10^{6} a aproximadamente 10^{9} partículas adenovirales infecciosas.

85. Uso según la reivindicación 83, en el que dicho tumor es para ponerse en contacto con un constructo de expresión en un total de aproximadamente 3 ml a aproximadamente 10 ml.

86. Uso según la reivindicación 68, en el que el polinucleótido de p53 se marca de manera que pueda detectarse la expresión de un polipéptido de p53.

87. Uso según la reivindicación 86, en el que el marcador es un epítopo continuo.

88. Uso según la reivindicación 68, en el que la administración del medicamento comprende además poner en contacto dicho tumor con un agente que daña el ADN.

89. Uso según la reivindicación 88, en el que dicho agente que daña el ADN es para ponerse en contacto con dicho tumor antes de la resección.

90. Uso según la reivindicación 88, en el que dicho agente que daña el ADN es para ponerse en contacto con dicho tumor después de la resección.

91. Uso según la reivindicación 88, en el que dicho agente que daña el ADN es para ponerse en contacto con dicho tumor antes y después de la resección.

92. Uso según la reivindicación 88, en el que dicho agente que daña el ADN es un agente radioterápico.

93. Uso según la reivindicación 92, en el que dicho agente radioterápico se selecciona del grupo que consiste en irradiación \gamma, irradiación x, irradiación uv y microondas.

94. Uso según la reivindicación 88, en el que dicho agente que daña el ADN es un agente quimioterápico.

95. Uso según la reivindicación 94, en el que dicho agente quimioterápico se selecciona del grupo que consiste en adriamicina, 5-fluorouracilo, etopósido, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C, verapamilo, doxorrubicina, podofilotoxina y cisplatino.

96. Uso según la reivindicación 68, en el que la administración del medicamento comprende además poner en contacto dicho tumor con una citocina.

97. Uso según la reivindicación 96, en el que dicha citocina se selecciona del grupo que consiste en IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, TGF-\beta, GM-CSF, M-CSF, TNF\alpha, TNF\beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-\alpha, IFN-\beta y IFN-\gamma.

98. Uso según la reivindicación 68, en el que la administración del medicamento comprende además poner en contacto dicho tumor con un segundo gen terapéutico distinto del gen que codifica para un polipéptido de p53.

99. Uso según la reivindicación 98, en el que dicho segundo gen terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un gen Dp, p21, p16, p27, E2F, Rb, APC, DC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL, FCC, MCC, ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun, trk, ret, gsp, hst, bcl, abl, Bax, Bcl-X_{s} y E1A.

100. Uso según la reivindicación 68, en el que dicho tumor está situado en una cavidad corporal seleccionada del grupo que consiste en la boca, faringe, esófago, laringe, tráquea, cavidad pleural, cavidad peritoneal, interior de la vejiga y luz del colon.

101. Uso según la reivindicación 68, que comprende además la etapa de perfundir continuamente un sitio de tumor en dicho paciente con el constructo de expresión, en particular con dicho constructo de expresión viral.

102. Uso según la reivindicación 101, en el que dicho tumor es maligno.

103. Uso según la reivindicación 101, en el que dicho tumor es un carcinoma espinocelular.

104. Uso según la reivindicación 101, en el que dicho tumor es benigno.

105. Uso según la reivindicación 101, en el que el p53 endógeno de dicho tumor es de tipo natural.

106. Uso según la reivindicación 101, en el que dicho tumor es un tumor de pulmón, piel, próstata, hígado, testículos, hueso, cerebro, colon, páncreas, cabeza y cuello, estómago, ovario, mama o vejiga.

107. Uso según la reivindicación 101, en el que dicho constructo de expresión viral se selecciona del grupo que consiste en un vector retroviral, un vector adenoviral y un vector viral adenoasociado.

108. Uso según la reivindicación 107, en el que dicho vector adenoviral es un vector adenoviral deficiente en la replicación.

109. Uso según la reivindicación 108, en el que dicho vector adenoviral deficiente en la replicación carece de al menos una parte de la región E1.

110. Uso según la reivindicación 101, en el que dicho promotor es un promotor de CMV IE.

111. Uso según la reivindicación 101, en el que dicho sitio de tumor es para prefundirse desde aproximadamente una a dos horas.

112. Uso según la reivindicación 101, en el que dicho sitio de tumor es para ponerse en contacto con dicho vector de expresión a través de un catéter.

113. Uso según la reivindicación 101, en el que el polinucleótido p53 está marcado de manera que pueda detectarse la expresión de un polipéptido de p53.

114. Uso según la reivindicación 113, en el que el marcador es un epítopo continuo.

115. Uso según la reivindicación 101, en el que la administración del medicamento comprende además poner en contacto dicho tumor con un agente que daña el ADN.

116. Uso según la reivindicación 115, en el que dicho sitio de tumor es para ponerse en contacto con dicho agente que daña el ADN antes de la resección.

117. Uso según la reivindicación 115, en el que dicho sitio de tumor es para ponerse en contacto con dicho agente que daña el ADN después de la resección.

118. Uso según la reivindicación 115, en el que dicho sitio de tumor es para ponerse en contacto con dicho agente que daña el ADN antes y después de la resección.

119. Uso según la reivindicación 115, en el que dicho agente que daña el ADN es un agente radioterápico.

120. Uso según la reivindicación 119, en el que dicho agente radioterápico se selecciona del grupo que consiste en irradiación \gamma, irradiación x, irradiación uv y microondas.

121. Uso según la reivindicación 115, en el que dicho agente que daña el ADN es un agente quimioterápico.

122. Uso según la reivindicación 121, en el que dicho agente quimioterápico se selecciona del grupo que consiste en adriamicina, 5-fluorouracilo, etopósido, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C, verapamilo, doxorrubicina, podofilotoxina y cisplatino.

123. Uso según la reivindicación 101, en el que la administración del medicamento comprende además poner en contacto dicho tumor con una citocina.

124. Uso según la reivindicación 123, en el que dicha citocina se selecciona del grupo que consiste en IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, EL- 11, IL-12, IL-13, TGF-\beta, GM-CSF, M-CSF, TNF\alpha, TNF\beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-\alpha, IFN-\beta y IFN-\gamma.

125. Uso según la reivindicación 68, en el que la administración del medicamento comprende además poner en contacto dicho tumor con un segundo gen terapéutico distinto del gen que codifica para un polipéptido de p53.

126. Uso según la reivindicación 125, en el que dicho segundo gen terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un gen Dp, p21, p16, p27, E2F, Rb, APC, DC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL, FCC, MCC, ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun, trk, ret, gsp, hst, bcl, abl, Bax, Bcl-X_{s} y E1A.

127. Uso según la reivindicación 101, en el que dicho tumor está situado en una cavidad corporal seleccionada del grupo que consiste en la boca, faringe, esófago, laringe, tráquea, cavidad pleural, cavidad peritoneal, interior de la vejiga y luz del colon.

128. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho constructo de expresión es para administrarse por vía tópica.

129. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho constructo de expresión es para administrarse por vía intratumoral.

130. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho constructo de expresión es para administrarse por vía intravenosa.

131. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho constructo de expresión es para administrarse por vía oral.

132. Uso según la reivindicación 68, en el que dicho constructo de expresión es para administrarse por vía tópica.

133. Uso según la reivindicación 68, en el que dicho constructo de expresión es para administrarse por vía intratumoral.

134. Uso según la reivindicación 68, en el que dicho constructo de expresión es para administrarse por vía intravenosa.

135. Uso según la reivindicación 68, en el que dicho constructo de expresión es para administrarse por vía oral.