KR20030085421A

KR20030085421A - ｐ53 또는 ｐ21 유전자 변이에 의해 ｐ53 또는 ｐ21유전자 기능을 상실한 암의 치료를 위한 액틴 저해제를포함하는 약학 조성물

Info

Publication number: KR20030085421A
Application number: KR1020020023835A
Authority: KR
Inventors: 신득용; 최태생; 채희돈
Original assignee: 신득용; 최태생; 채희돈
Priority date: 2002-04-30
Filing date: 2002-04-30
Publication date: 2003-11-05

Abstract

본 발명은 액틴 저해제 또는 이의 유도체를 약제학적으로 유효한 양으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하여 p53 또는 p21 유전자 변이로 인해 p53 또는 p21 유전자 기능을 상실한 암을 치료하는데 유용한 약학 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 정상세포에는 영향을 주지 않으면서 p53 또는 p21 유전자 변이로 인해 p53 또는 p21 유전자 기능을 상실한 암세포에 특이적으로 작용하여 세포질분열은 억제하면서 계속적인 DNA 합성 및 핵분열을 유도함으로써 세포가 사멸되도록 하는 효과가 있다.

Description

ｐ53 또는 ｐ21 유전자 변이에 의해 ｐ53 또는 ｐ21 유전자 기능을 상실한 암의 치료를 위한 액틴 저해제를 포함하는 약학 조성물{Pharmaceutical Composition Containing Actin Inhibitor For Treatment Of Cancer Lacking Functional p53 or p21 gene}

본 발명은 액틴 저해제의 항암제로서의 용도에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 액틴 저해제 또는 이의 유도체를 약제학적으로 유효한 양으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하여 p53 또는 p21 유전자 변이에 의한 암을 치료하는데 유용한 약학 조성물을 제공한다.

정상적인 조직의 항상성은 세포증식 속도와 세포사멸 속도간의 균형에 의해 이루어진다. 노화된 세포는 세포사멸(cell death, apoptosis)에 의해 몸 속에서 제거되도록 프로그램되어 있으며, DNA 손상, 저산소증, 암유발 유전자의 활성화에 따른 신호체계의 불균형, 생존인자의 부족 및 주변 조직의 변화 등에 따라 세포사멸을 촉진하는 방향으로 신호가 전달된다. 이러한 세포사멸이 억제될 경우에 정상적인 조직의 항상성이 깨어지면서 암이 발생할 수 있다.

세포사멸 억제로 인해 암이 발생되는 가장 대표적인 예로, p53 종양 억제 유전자의 변이를 들 수 있다. 정상적인 p53 유전자로부터 발현된 p53 단백질은 세포의 비정상적인 증식을 억제하여 세포의 암화(carcinogenesis)를 막는 능력을 가지고 있다. p53 단백질은 세포 주기의 체크포인트에 작용하여 세포분열을 억제하는 기능을 가지고 있으며 암이 유발되었을 때 목표 유전자의 프로모터(promoter)에 결합하여 유전자의 전사(transcription)를 유도함으로써 세포사멸을 유도한다. 또한, 정상세포에서 p53 유전자는 방사선이나 약제들과 같은 다양한 발암원으로부터 DNA 손상을 방지하는데 중추적인 역할을 담당한다(Lane, D. P., 358, 15-16 (1992); Kastan M. B et al., Cancer Res. 51, 6304-6311 (1991); Kuerbitz S. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 7491-7495 (1992)).

p21 단백질은 사이클린-의존성 키나제(cyclin-dependent kinase)를 억제함으로써 p53과 함께 세포주기를 G1 단계에 멈추게 하여 세포증식을 억제하는 종양 억제 단백질이다. p53 유전자의 활성 증가로 인해 효소단백질이 생성되면 이것이 p21 유전자의 효소생성을 자극한다. 그러면 p21 유전자에 의해 생긴 효소의 활성이 증가하여 세포의 분열이 억제된다.

p53 단백질의 불활성화 또는 부재는 종양형성의 중요한 원인이 되고 있다. 예컨대, p53 단백질은 암을 유발하는 바이러스의 발암 유전자 산물들, 즉 SV40 large T-항원, 아데노바이러스의 E1B 단백질, 파필로마 바이러스 유래의 E6 단백질, 엡스타인바 바이러스의 EBNA-5 등과 같은 DNA형 발암 바이러스의 암 단백질과 복합체를 형성하는 것으로 확인되었고 이러한 복합체 형성으로 인한 p53기능의 불활성화가 바이러스 유래의 암 단백질의 세포에 대한 암화에 깊이 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한, p53 단백질의 불활성화는 정상 p53 유전자의 돌연변이에 의해서도 나타날 수 있다. p53 유전자의 변이는 인체종양에서 약 50%-60%의 고빈도로 발견된다(Hostein et al., 1991).

발암 바이러스의 감염 또는 유전자 변이에 의해 p53 유전자가 정상적인 암 억제기능을 수행하지 못하는 암세포에 정상 p53 유전자를 발현시키면 암세포가 사멸되거나 세포의 증식 정지, 또는 세포노화가 일어남이 보고되었다. 이에 따라 p53 유전자를 이용한 유전자치료 및 항암제 개발이 활발하게 진행되고 있다. p53 유전자의 돌연변이가 있거나 결손이 있는 경우 p53 유전자를 삽입하여 정상적인 p53 단백질의 발현을 회복시켜 종양을 치료하는 방법은 대부분 아데노 바이러스를 매개로 하여 유전자를 종양에 직접 투여하는 방식이 사용되었다(Frank et al., Clin. Cancer Res., 4, 2521-2528 (1998); Yung et al., Proc. Am. Assoc. CancerRes., 36, 423 (1995); Liu et al., Cancer Res., 54, 3662-3667 (1994)). 이와 관련하여 미국특허 제6,143,290호에는 정상 p53 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 컨스트럭트를 이용하여 종양을 억제하는 방법이 개시된 바 있다. 미국특허 제6,017,524호에는 p53 유전자를 투여하여 p53 결손 암세포를 억제하는 방법이 개시되어 있으며 국제특허공개 제94/12202호에는 p53 단백질을 활성화하는 방법이 개시된 바 있다. 또한, 미국특허 제5,693,522호에는 p53 유전자를 포함하는 재조합 바이러스와 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 p53 결손 암세포의 치료를 위한 약학 조성물이 개시된 바 있다.

한편, 액틴은 실질적으로 모든 진핵세포에서 발견되는 구조단백질로서 세포형태, 분열, 운동성 및 부착에 관여한다(Bershadsky AD and Vasiliev JM, Cytoskeleton. New York, Plenum Press, 298 (1988)). 단일단위(Monomer)로 존재할 때를 G 액틴이라고 하며, 이들이 중합하였을 경우 긴 사슬을 형성하게 되는데 이를 F 액틴이라고 한다. 액틴 단백질은 세포 분열기의 최종단계인 세포질 분열에 관여한다고 알려져 있다.

액틴 저해제(actin inhibitor)는 세포골격을 형성하는데 중요한 액틴(actin) 단백질을 중합(polymerization)하거나 또는 탈중합(depolymerizat ion)하여 기능적으로 세포골격 또는 세포질 분열에 중요한 정상적인 섬유상 액틴(filametous actin) 형성을 방해 또는 저해하는 물질로 알려져 있다. 현재까지, 액틴 저해제는 신생물, 면역, 심혈관 관련 질병, 인슐린 대사 조절, 항암제, 항바이러스제 및 항진균제로서 연구되어 왔다(Jijakli H et al., Int J Mol Med 9(2), 165-72(2002); 국제특허공개 제WO88/00195호; 국제특허공개 제WO97/10242호; 대한민국특허 제135571호).

그러나, 상기 연구들은 액틴 저해제가 몇 가지 암세포주에 대해 세포독성을 나타냄을 확인한 것으로 액틴 저해제가 p53 또는 p21 유전자 변이 암세포에 대해 선택적으로 작용하여 세포사멸을 일으킨다는 사실은 보고된 바 없다.

본 발명자들은 p53 및 p21 유전자 변이 암세포의 세포주기 제어기전을 연구하던 중 액틴 저해제가 상기 암세포에 특이적으로 작용하여 선택적으로 세포사멸을 일으킨다는 새로운 사실을 발견하였다. 이러한 사실을 기초로 하여 본 발명자들은 유효량의 액틴 저해제 또는 이의 유도체와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하며 p53 및 p21 유전자 변이에 의한 암에 특이적으로 작용하는 약학 조성물을 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 액틴 저해제 또는 이의 유도체를 약제학적으로 유효한 양으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하여 p53 또는 p21 유전자 변이에 의한 암을 치료하는데 유용한 약학 조성물을 제공한다.

도 1은 액틴 저해제의 p53 또는 p21 유전자 변이 암세포에서의 세포사멸 유도 기작을 나타낸 것이다.

도 2a는 PTX-2, 사이토캘라신 D 및 싸이코신에 의한 야생형 HCT116 세포주에서의 p53 단백질, p21 단백질 및 액틴 단백질의 증가량을 웨스턴 블러팅으로 측정한 결과이다(A: PTX-2 처리, B: 싸이코신 처리, C: 사이토캘라신 D 처리).

도 2b는 p53 또는 p21 유전자 결손 HCT116 대장암 세포에서의 PTX-2에 의한 p53 단백질 및 p21 단백질의 변화를 웨스턴 블러팅으로 측정한 결과이다(A: 야생형 HCT116 세포주, B: p53이 결손된 HCT116 세포주(p53-/-), C: p21이 결손된 HCT116 세포주(p21-/-)).

도 3은 야생형 HCT116 세포주(A, D), p53 유전자 결손 HCT116세포주(B, E) 및 p21 유전자 결손 HCT116 세포주(C, F)에 PTX-2 및 사이토캘라신 D를 처리한 다음 세포핵을 염색하여 형광현미경으로 관찰하고 세포 당 핵의 수를 계산하여 그 결과를 나타낸 그래프이다(A, B, C: PTX-2 처리, D, E, F: 사이토캘라신 D처리).

도 4는 PTX-2, 사이토캘라신 D 및 싸이코신이 p53 또는 p21 유전자 결손 암세포에 처리하고 유세포 분석기를 이용하여 핵상을 분석한 결과이다(A: 대조군, B: PTX-2처리, C: 사이토캘라신 D 처리, D: 싸이코신 처리).

도 5는 p53 유전자 결손 암세포에서 PTX-2, 사이토캘라신 D 및 싸이코신의 처리에 따른 미토콘드리아 막전이의 변화를 측정한 결과이다(Control: 비처리, A: 스타우로스포린, B: PTX-2, C: 사이토캘라신 D, D: 싸이토신).

도 6은 p53 유전자 또는 p21 유전자 결손 암세포에서 PTX-2, 사이토캘라신 D 및 싸이코신처리에 따른 캐스패이즈-3 활성을 측정한 결과이다(A: 대조군, B: PTX-2 처리, C: 싸이코신, D: 사이토캘라신 D, E: 스타우로스포린).

도 7은 bclx/L을 과발현시킨 Saos-2 골육종 세포주(Saos-2/bclx/L)와 bclx/L을 발현시키지 않은 Saos-2 세포주(Saos-2)에서 PTX-2에 의한 세포사멸 정도를 비교한 그래프이다(A: Saos-2, B: Saos-2/blcx/L).

도 8은 야생형 HCT116 세포주 및 이의 p21 유전자 결손 세포주에 PTX-2를 처리한 후 각 세포에서 DNA 합성 변화를 측정한 그래프이다(A: 야생형 HCT116 세포주, B: p53 유전자 결손 HCT116 세포주).

도 9는 PTX-2 처리에 의한 암세포의 세포주기 조절 인산화 효소의 활성 변화를 면역침전 인산화 활성 측정법으로 측정한 결과이다(A: 야생형 HCT116 세포주, B: p53 유전자 결손 HCT116 세포주, C: p21 유전자 결손 HCT116 세포주).

도 10은 사이클린 의존성 키나제 저해제 및 DNA 합성 저해제가 PTX-2에 의한 암세포의 세포사멸에 미치는 영향을 트립판 블루 배제법으로 측정한 결과이다(A:대조군, B: 티미딘, C: 로스코보틴, D: 올로무신, E: 이소-올로무신).

도 11은 정상적으로 기능하는 p53 유전자를 포함하는 A549 및 H460 폐암 세포주 및 p53 유전자가 돌연변이된 H358, H596, H1299, SK-LU-1, A427, 및 HCC2108 폐암 세포주에서 PTX-2에 의한 세포사멸 정도를 트립판 블루 배제법으로 측정한 결과이다.

도 12는 야생형 HCT116 세포주, p53 유전자 또는 p21 유전자 결손 세포에 액틴 저해제 펙테노톡신-2(100ng/ml), 사이토캘라신 D(cytochalasin D)(10uM), 싸이코신(50uM), 래트룬쿨린 A(latrunculin A, Lat A)(1uM), 래트룬쿨린 B(latrunculin B, Lat B)(5uM), 재스파미드(jaspamides; jasplaki nolides)(1uM), 스윈홀리드(swinholide A)(100nM)를 각각 처리하고 세포사멸 정도를 조사한 결과를 나타낸 것이다.

도 13은 야생형 HCT116 세포주를 마우스에 주사하여 종양을 유도하고 PTX-2를 마우스에 주사하여 시간의 경과에 따른 종양의 크기를 조사한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명자들은 액틴 저해제를 p53 또는 p21 유전자 변이 암세포에 처리한 경우, p53 또는 p21 유전자 변이 암세포는 p53 또는 p21 단백질을 합성할 수 없어 계속적으로 DNA 합성 및 핵분열이 일어나 결과적으로 세포사멸을 유발한다는 것을 발견하였다(실시예 2). 액틴 저해제 처리 후 p53 또는 p21 유전자 결손 암세포의 계속적인 DNA 합성 및 핵분열은 DNA 염색, 유세포 분석, 브로모우라실 흡입반응 및 인산화효소 활성 측정을 통해 확인하였다(실시예 3, 실시예 7 및 실시예 8). 반면에, 액틴 저해제를 처리한 p53 유전자 정상 암세포(p53+/+)는 p53 및 p21이 유도되어 DNA 합성 및 핵분열이 억제되고 결과적으로 성장 정지(growth arrest)가 나타남을 관찰하였다.

이와 같은 실험 결과를 기초로 하여 본 발명자들은 p53 또는 p21 유전자 변이에 의한 암이 액틴 저해제 처리에 의해 선택적으로 사멸되는 기작을 도 1에 나타낸 바와 같이 추정할 수 있었다. 즉, 액틴 저해제를 p53 또는 p21 유전자 변이 암세포에 처리한 경우 액틴 활성이 저해됨으로써 세포주기 상의 세포질 분열이 정지되고 세포는 세포주기 M기를 빠져 나오지 못할 뿐 만 아니라, DNA 합성기인 S기에도 들어갈 수 없기 때문에 p53 또는 p21 결손 암세포는 세포질 분열 없이 DNA 합성이 계속되어 다핵상 및 다핵체의 세포가 되어 사멸하게 된다. 일반적으로 세포사멸은 미토콘드리아 외막 단백질인 사멸억제 단백질(bcl2)과 사멸 촉진 단백질(bax)의 상호작용에 의해 미토콘드리아 외막의 막전이가 감소하여 시토크롬 C가 세포질로 분비되고 이것이 캐스패이즈(caspase)로 불리는 단백질 분해효소를 활성화시킴으로써 개시된다. 본 발명자들은 p53 또는 p21 단백질의 불활성화 또는 부재 상태의 암세포주에 액틴 저해제를 처리한 다음 미토콘드리아 막전이 변화를 조사한 결과, 액틴 저해제를 처리하지 않은 경우에 비해 미토콘드리아 막전이가 감소했음을확인하였으며 캐스패이즈의 활성을 측정한 결과, 액틴 저해제의 처리에 의해 그 활성이 증가하였음을 확인하였다(실시예 4 및 실시예 5). 이러한 사실로부터 액틴 저해제가 p53 또는 p21 유전자 변이 암세포를 선택적으로 사멸시킴을 알 수 있었다. 또한, 세포 사멸억제 단백질(bcl2)의 과발현이 액틴 저해제에 의한 암세포의 선택적 사멸을 억제함을 확인 할 수 있었다(실시예 6).

"p53 또는 p21 유전자 변이에 의한 암"이란 정상적인 기능을 담당하는 p53 또는 p21 유전자가 유전자 변이 등에 의하여 기능을 상실한 상태의 암세포를 말한다. 정상적인 기능을 담당하는 p53 또는 p21 유전자가 염색체 상에서 결실(deletion)되거나 변이에 의하여 비정상적인(dominant-nega tive) 단백질을 만드는 암을 말한다. 예를 들어, 이에 한정되지는 않으나 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부 암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부근의 암, 결장암, 유방암, 부인과 종양(예, 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁 경부 암종, 질 암종 또는 외음부 암종), 식도암, 소장암, 내분비계 암(예, 갑상선, 부갑상선암), 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 유년기의 고상 종양, 분화 림프종, 방광암, 신장, 수뇨관암(예, 신장 세포 암종, 신장 골반 암종) 및 중추신경계의 종양(예, 제1 CNS 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 아데노마) 등을 포함한다.

암의 발생은 다양한 원인에 의하여 설명될 수 있다. 첫째는 세포가 분비하는 세포 성장인자와 세포막에 존재하는 성장인자의 수용체의 발현과 구조적 변이가 원인이 될 수 있다. 특정 세포성장인자 (PDGF, EGF, 등)가 유전자 변이에 의하여 다량 발현되거나 수용체와 결합력이 우수한 변이 단백질을 분비하여 성장인자의 수용체가 있는 세포가 필요이상의 성장을 계속함으로서 암화가 진행되는 것이다. 이와 유사하게 세포성장인자의 수용체가 유전자 변이 등에 의하여 과발현 되거나 지속적인 활성화형의 단백질이 만들어져서 세포성장인자가 없는 상태에서도 성장인자 없이도 세포성장 신호를 보낸다. 유방암에서 erbB2 유전자 과발현이 이 경우에 해당한다. 세포 성장 조절인자의 변이에 의한 암화가 대부분의 암에서 발견된다. 세포성장을 촉진하는 역할을 하는 유전자(ras, myc, bcl-abl, raf, 등)이 변이에 의하여 지속적인 활성을 나타내거나 과발현되어 불필요한 세포성장이 계속 일어난다. 다른 경우는 p53, Rb 등의 세포성장 억제인자가 변이에 의하여 정상적인 기능을 수행하지 못하여 암화가 일어나는 것이다. 종래에는 상기와 같은 유전자 변이에 의해 발생한 암을 치료하는 방법으로 결핍된 유전자나 전혀 새로운 기능의 유전자를 인체세포에 이입하는 방법이 많이 연구되어 왔다. 또한, 발암에 관여하는 것으로 알려진 유전자의 기능을 억제하거나 생체 내에 존재하는 종양억제 유전자의 기능을 강화시키거나 또는 암세포가 스스로 사멸될 수 있는 자살 유전자의 이입을 통한 암세포의 자살유도에 관한 연구가 진행되어 왔으며 간접적인 방법으로는 면역강화 유전자 치료 등이 연구되어 왔다. 그러나, 지금까지 p53 또는 p21 유전자 변이 암세포에 액틴 저해제를 처리한 경우에 상기 액틴 저해제가 특이적으로 암세포에 작용하여 암세포의 액틴 활성이 저해되고 세포주기 상의 세포질 분열이 정지되어 DNA 합성이 계속되고 다핵상 및 다핵체가 유도됨으로써 결과적으로 암세포의 사멸을 유도할 수 있다는 사실은 밝혀진 바가 없다.

본 발명에서 액틴 저해제는 세포골격을 형성하는데 중요한 액틴(actin) 단백질을 중합(polymerization)하거나 또는 탈중합하여 기능적으로 세포골격 또는 세포질 분열에 중요한 정상적인 섬유상 액틴(filametous actin) 형성을 방해 또는 저해하는 물질을 말한다. 액틴 저해제로는 예를 들어, 이에 한정되지는 않으나 펙테노톡신-2, 사이토캘라신 D(cytochalasin D), 싸이코신, 래트룬쿨린(latrunculins), 재스파미드(jaspamides;jasplak inolides), 스윈홀리드(swinholide A), 미사키놀리드(misakinolide A) 및 할리콘드라미드(halichondramides)를 포함한다. 이들은 해양 해면동물 유래의 매크로리드(macrolides) 물질로 각각 독특한 화학적 구조를 가지며, 액틴과 결합하여 액틴의 구조 및 분포양상을 변화시킴으로써 액틴-매개성 작용을 선택적으로 방해하거나 저해할 수 있는 특성이 있다.

본 발명에서 액틴 저해제는 천연으로부터 분리된 화합물, 화학적으로 합성된 화합물 또는 상업적으로 판매되는 것을 모두 사용할 수 있다. 액틴 저해제를 천연적으로 분리하는 방법은 공지되어 있다. 통상적으로는 동물, 식물, 세균, 곰팡이, 식물 및 해양생물 또는 이들의 배양액으로부터 용매추출, 크로마토그래피 및 분배 등의 공지된 분리 정제방법을 사용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, 이에 한정되지는 않으나 펙테노톡신-2는 해양 동물인 가리비(scallop; patin opectenyessoe nsis)로부터(T. Yasumoto et al., Tetrahedror., 41, 1019-1025 (1985)), 사이토캘라신은 진균류(molds and fugi)의 배양액으로부터 분리할 수 있으며(Aldridge, et al., J. Chem. Soc., Chem. Comm., 148-49(1972)), 래트룬쿨린은 해면동물인 래트룬쿨리아 마그니피카(Red Sea sponge Latrunculia magnifica)로부터(Spector I et al., Cell Motil Cytoskeleton 13(3), 127-44 (1989)); Spector I et al., Science 4, 219(4584), 493-5 (1983)), 재스파미드는 인도 해양 해면동물인 재스피스 존스토니(Jaspis johnstoni)로부터(Spector I. et al., Microscopy research and technique, 47, 18-37 (1999)), 스윈홀리드는 해면동물인 테오넬라 스윈홀(marien sponge Theonella swinhoei)로부터 분리할 수 있다(Carmely and Y. Kashman, Tetrahedron Letters. 26, 511-514 (1985); Bubb MR et al., J Biol Chem 24;270(8):3463-6(1995)).

또한, 액틴 저해제는 당 분야에 공지된 화학적 합성법에 의해서 수득할 수 있다(Stork, et a., J. Am. Chem. Soc., 100, 7775-77 (1978); Kim and Weinerb, Tet. Lett., 20, 576-82 (1979); Owen and Raphael, J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1, 1504-07 (1978); Steyn et al., J. Chem. Soc. Perkins Trans. 1, 541-44 (1982); Aldrige, et al., J. Chem. Soc. Chem. Comm., 551-52(1973)).

액틴 저해제의 유도체(derivative)란 천연형 액틴 저해제와 구조가 유사하며 생물학적 활성에 있어서 실질적으로 유사한 화합물을 말한다. 또한, 정상세포에 독성이 없고 약제로서 사용이 바람직하도록 물리화학적 및 생리학적 특성을 개선한화합물도 포함한다. 액틴 저해제의 유도체는 예를 들어, 이에 한정되지는 않으나 사이토캘라신 유도체로 알려진 캐토글로불린(Chaetoglobulins), 아스포캘라신 (Aspochalasins), 지고스포린(Zygosporins ) 및 포민스(Phomins), 재스파미드 유도체로 알려진 지오디아몰리드(geodiamolides) 및 콘드라미드(chondramides) 등이 있다.

본 발명에서 "약제학적으로 유효한 양"은 p53 또는 p21 유전자의 변이 암에 대해 호전 및/또는 완치효과를 나타내는 활성성분의 양을 말한다. 본 발명의 액틴 저해제 또는 이의 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 일일투여 량은 제제 형태, 투여 방법, 사용 목적 및 치료될 환자의 연령, 체중 및 증상에 의해 적절히 결정될 수 있다. 일반적으로는 약 0.05μM 내지 약 100μM, 바람직하게는 약 0.1μM 내지 약 50μM 이며 가장 바람직하게는 사이토캘라신 D(cytochalasin D)의 경우에는 5 μM 내지 15μM, 싸이코신의 경우에는 20μM 내지 60μM, 래트룬쿨린 A(latrunculin A, Lat A)의 경우에는 0.5μM 내지 2μM, 래트룬쿨린 B(latrunculin B, Lat B)의 경우에는 1μM 내지 10μM, 재스파미드(jaspamides; jasplaki nolides)의 경우에는 0.05μM 내지 5μM, 스윈홀리드(swinholide A)의 경우에는 50nM 내지 100nM이다.

"약제학적으로 허용되는 담체"는 약학적으로 허용가능한 액상 또는 고상 담체를 말하며 투여방식 및 제제 형태에 따라 선택 될 수 있다. 고형 경구 형태는 활성 화합물과 함께 희석제, 예를 들면, 유당, 포도당, 이당, 자당, 셀룰로오스, 옥수수 전분 또는 감자 전분; 윤활제, 예를 들면, 실리카, 활석, 스테아르산, 마그네슘 또는 칼슘 스테아르산염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜; 결합제, 예를 들면, 녹말, 아라비아 검, 젤라틴, 메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스 또는 폴리비닐 피롤리돈; 붕해제, 예를 들면, 녹말, 알긴산, 알긴산염 또는 나트륨 녹말 글리콜레이트; 기포성(effervescing) 혼합물; 염료; 감미료; 습윤제, 예를 들면, 레시틴,폴리소르베이트, 라우릴설페이트; 및 약제학적 조성물에 사용되는 일반적으로 독성이 없는 약제학적으로 불활성인 물질을 함유할 수 있다.

언급된 약제학적 제제는 공지된 방법, 예를 들면, 혼합, 과립화, 정제화, 당-피복 또는 필름-피복 공정에 의해 제조될 수 있다. 경구투여를 위한 액체 분산액은, 예를 들면, 시럽, 에멀션, 현탁액이 될 수 있다. 당해 시럽은 담체로서, 예를 들면, 이당류 또는 이당류와 글리세린 및/또는 만니톨 및/또는 소르비톨의 혼합물을 포함할 수 있다. 현탁액 및 에멀션은 담체, 예를 들면, 천연 고무질, 아가(agar), 나트륨 알기네이트, 펙틴, 메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스 또는 폴리비닐알코올을 포함할 수 있다. 근육주사용 용액은 활성 화합물과 함께 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 멸균수, 올리브유, 에틸 올레에이트, 글리콜, 예를 들면, 프로필렌 글리콜 및 경우에 따라, 적당한 양의 리도카인 염산염을 포함할 수 있다. 정맥내 주사 또는 주입을 위한 용액은 담체로서, 예를 들면, 멸균수를 함유할 수 있거나, 바람직하게는 이들은 멸균액, 수용액, 등장성 염수 형태일 수 있거나 담체로서 프로필렌 글리콜을 포함할 수 있다. 당해좌약은 활성 화합물과 함께 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르 계면활성제 또는 레시틴을 포함할 수있다.

본 발명의 약학 조성물은 제제의 형태에 따라 적절한 경로로 투여된다. 투여 방법에도 특별한 제한은 없고 경구용, 외용 및 주사 수단에 의해 투여될 수 있다. 주사제는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 피하, 피내 등으로 투여되지만 외용 제제는 좌약 등을 포함한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1

PTX-2, 사이토캘라신 D 및 싸이코신이 암세포의 p53 및 p21 유전자 발현에 미치는 영향

PTX-2, 사이토캘라신 D 및 싸이코신의 처리가 암세포의 p53 및 p21 유전자 발현에 미치는 영향을 조사하였다. HCT116 대장암 세포주(p53+/p21+)를 10% FBS(Fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM 배지(Dulbeccos Modification of Eagles Medium)에서 36시간 배양한 다음 PTX-2 100ng/㎖, 사이토캘라신 D 10μM, 싸이코신50μM을 첨가하여 각각 1일, 2일 및 3일간 배양하였다. 각 기간 동안 배양한 세포로부터 단백질을 추출하여 p53과 p21 단백질의 발현을 웨스턴 블러팅으로 확인하였다. 또한, p53 유전자 결손 HCT116 세포주(p53-/-) 및 p21 유전자가 결손된 HCT116 세포주(p21-/-)를 상기 DMEM 배지에서 36시간 배양한 후 PTX-2 100ng/㎖를 첨가하여 3일간 배양하고, p53 및 p21 단백질의 시간의 경과에 따른 양적 변화를 웨스턴 블러팅법으로 확인하였다. 웨스턴 블러팅은 상기에서 처리한 각각의 HCT116 대장암 세포주를 용해하여 버티컬 전기영동장치(Bio-Rad사)상의 SDS-폴리아크릴아미드 겔(SDS-poly acrylamide gel, 10%)에 용해액을 로딩(loading)하고 100V에서 전기영동한 후 PVDF 막에 옮기고 p53 또는 p21항체를 일차항체로 처리하였다. 그 다음으로, 과산화효소(Horse radish peroxidase)가 표지된 항 마우스 Ig-G항체를 처리한 후, 화학형광발광법을 시행하여 p53 단백질 및 p21 단백질을 동정하였다.

실험 결과, 야생형의 HCT116 세포주에 PTX-2, 사이토캘라신 D 및 싸이코신을 처리하면 p53 단백질 합성이 증가하였으며, p53에 의해 발현이 증가되는 p21 단백질의 합성도 증가함을 알 수 있었다(도 2a). 반면에 p53 유전자가 결손된 HCT116 세포주(HCT116 p53-/-)에서는 p53 및 p21 유전자의 발현이 증가되지 않았으며 p21 유전자가 결손된 HCT116 세포주(HCT116 p21-/-)에서는 p53 단백질은 발현이 유도되지만 p21 단백질은 발현되지 않았다(도 2b).

실시예 2

PTX-2, 사이토캘라신 D 및 싸이코신이 p53 또는 p21 유전자 결손 암세포에서 다핵체(multinucleate cell) 형성에 미치는 영향

HCT116 대장암 세포주(p53+/p21+), p53 유전자가 결손된 HCT116 (p53-/-) 및 p21 유전자가 결손된 HCT116(p21-/-) 세포주를 각각 10% FBS를 포함하는 DMEM배지에서 2일간 배양한 후 PTX-2 100ng/㎖ 및 사이토캘라신 D 10μM을 첨가하여 2일간 배양한 다음 각각의 세포주를 DAPI로 핵을 염색한 후 형광현미경으로 관찰하였다.

실험 결과, HCT116 대장암 세포주(p53+/p21+)에 PTX-2 및 사이토캘라신 D를 처리함에 따라 대부분의 세포가 2개의 핵을 가지고 있음이 관찰되었다. 반면에 p53 유전자 결손 (p53-/-) 또는 p21 유전자 결손 세포주(p21-/-)는 4개 이상의 핵을 가진 다핵 세포가 증가하였음이 관찰되었다(도 3). 이러한 결과는 HCT116 세포(p53+/p21+)에 PTX-2 및 사이토캘라신 D를 처리하면 세포질 분열이 저해되어 2개의 핵을 가진 세포가 증가한 것으로 생각된다. 이때, 더 이상의 핵분열이 일어나지 않는 것은 액틴 저해제의 처리에 따라 자극은 받은 p53 유전자 및 p21 유전자가 발현되어 DNA 합성 및 핵분열을 억제하기 때문이며 이로 인해 세포는 성장이 정지하게 된 것으로 추정된다. 반면에, p53 또는 p21 유전자가 결손된 세포의 경우에는 액틴 저해제의 처리에 따라 세포질 분열은 저해되었으나, p53 유전자 또는 p21 유전자의 결손으로 DNA 합성 및 핵분열이 계속적으로 일어남으로써 다핵체가 관찰된 것으로 생각된다.

실시예 3

PTX-2, 사이토캘라신 D 및 싸이코신이 p53 또는 p21 유전자 결손 암세포에서 다핵상(polyploidy) 형성에 미치는 영향

야생형 HCT116 대장암 세포주(p53+/p21+), p53 유전자가 결손된 HCT116 세포주(p53-/-) 및 p21 유전자가 결손된 HCT116 세포주(p21-/-)를 각각 10% FBS 이 포함된 DMEM 배지에서 2일간 배양하였다. 여기에 PTX-2 100ng/㎖, 사이토캘라신 D 10μM 및 싸이토신 50μM을 첨가하여 각각 1일, 2일 및 3일간 배양하였다. 배양이 완료된 후 인산 요오드(iodide phosphate)로 염색하고 유세포 분석기(FACScaliber)를 이용하여 핵상을 분석하였다. 유세포 측정은 상기 세포를 70% 에탄올을 이용하여 고정한 다음 PI용액을 50μg/㎕를 첨가하여 염색한 후 DNA 분열을 유세포 측정기(FACScaliber; BD Biosciences, SanJose, CA)로 측정하였다. 이때, 프로피디움(propidium)형광은 냉각된 아르곤(argon) 이온 레이저 15㎽ 사용하여 발색시켰고, 발색되는 빛을 617 롱 패스 광학 필터를 사용하여 수집하였다.

실험 결과, PTX-2, 사이토캘라신 D 및 싸이코신의 처리에 따라 HCT116 세포(p53+/p21+)의 대부분이 4N과 8N의 핵상이 형성되었으며 48시간 및 72시간 배양한 p53 유전자 결손 또는 p21 유전자 결손 세포의 대부분은 16N 및 32N의 다핵상이 형성되었다(도 4).

실시예 4

PTX-2, 사이토캘라신 D 및 싸이코신에 의한 p53 또는 p21 유전자 결손 암세포의 선택적 사멸유도 효과

상기 실시예 3의 결과에서 액틴 저해제를 처리한 p53 또는 p21 결손 암세포의 경우 2N 이하의 "sub-G1"에 속하는 세포수가 증가함을 볼 수 있었다. 유세포 분석에 의한 세포의 핵상 분석시 2N 이하의 "sub-G1"에 속하는 세포는 크로마좀 DNA가 엔도뉴클레아제에 의하여 잘라져서 분절되고 세포사멸이 일어난 세포이다. 따라서, 본 발명자들은 p53 유전자가 결손된 HCT116 대장암 세포주(p53-/-)가 액틴 저해제인 PTX-2, 사이토캘라신 D 및 싸이코신에 의하여 선택적으로 세포사멸이 유도되었는지를 조사하였다.

p53 유전자 결손 HCT116 대장암 세포주에 PTX-2 100ng/㎖, 사이토캘라신 D 10μM 및 싸이코신 50μM을 각각 첨가하여 2일간 배양한 다음 세포를 회수하여 PI(10μg/㎖)와 DiOC₆(3)(40nM)으로 30분간 형광염색한 후에 유세포 분석기로 분석하였다. 이때, 세포죽음을 유도하는 것으로 알려진 스타우로스포린(Staurosporin) 1μM를 12시간 동안 처리한 경우와 비교하였다. 유세포 분석은 냉각된 아르곤(argon) 이온 레이저 15mW를 사용하여 발색시켰으며 발색되는 빛을 530nm(DiOC6(3)), 600nm(PI)에서 수집하였다. 이때, 미토콘드리아 막 전이 변화(Δψm, mitochondrial transmem brane potential)는 DiOC₆(3)을 이용하여 측정하였으며, DNA의 양적 변화는 세포자살 초기 단계의 세포를 측정하고 말기단계의 세포와 괴사세포는 PI를 이용하여 측정하였다.

실험 결과, PTX-2, 사이토캘라신 D 및 싸이코신을 처리한 경우에 세포의 △ψm값이 감소함을 관찰할 수 있었다(도 5). 이는 PTX-2, 사이토캘라신 D 및 싸이코신에 의한 세포죽음이 세포사멸에 의한 것임을 보여주는 것이다.

실시예 5

PTX-2, 사이토캘라신 D 및 싸이코신의 p53 유전자 결손 암세포에서 캐스패이즈-3 활성 증가에 미치는 영향

세포사멸은 궁극적으로 단백질 분해효소인 캐스패이즈(caspase)의 활성화에 의하여 실행된다. 따라서, 액틴 저해제가 암세포의 세포죽음을 유도하는지를 확인하기 위해 캐스패이즈-3 활성을 측정하였다.

p53이 결손된 HCT116 대장암 세포주(p53-/-)에 PTX-2 100ng/㎖, 사이토캘라신 D 10μM 및 싸이코신 50μM를 각각 첨가하여 2일간 배양한 다음 상기 세포를 회수하여 캐스패이즈-3 활성을 측정하였다. 이때, 스타우로스포린(0.5μM, 12시간 처리)을 처리한 경우와 비교하였다. 캐스패이즈 활성 측정은 캐스패이즈-3 검정 킷트(BD Biosciences San Jose, CA사)를 사용하여 제작사의 방법을 따라 다음과 같이 시행하였다. 2백만개의 세포를 0.2㎖의 차가운 용해액(lysis buffer)에 현탁 시킨 후, 얼음 위에서 30분간 배양하였다. 96-웰 플레이트에 웰당 0.2㎖의 프로테아제 검정 완충액을 분주하고, 기질로서 5㎕의 Ac-DEVD-AMC를 첨가하였다. 여기에상기 세포 용해액을 50㎕씩 첨가한 다음 37℃에서 1시간 동안 배양하고 형광측정기(fmax 0200-1300, Molecular Devices)를 이용하여 측정하였다. 이때, 형광측정은 380nm의 빛으로 발양(excitation)시킨 후 440nm의 유출(emission) 파장을 측정하였다.

실험 결과, PTX-2, 사이토캘라신 D 및 싸이코신의 처리에 따라 캐스패이즈-3의 활성이 증가함을 알 수 있었다(도 6).

실시예 6

bclx/L의 PTX-2에 의한 세포사멸 억제 효과

bcl2 유전자군이 생산하는 단백질들은 세포사멸을 억제하는 기능을 수행함이 알려져 있다. 따라서 본 발명자들은 bcl2 유전자군의 하나인 bclx/L을 과발현시킨 Saos-2 골육종 세포주와 bclx/L을 발현시키지 않은 Saos-2 세포주에서 PTX-2에 의한 세포사멸 정도를 비교하였다.

Saos-2 세포주를 PTX-2 10ng/㎖를 함유한 배지에서 2일간 배양한 다음 세포사멸 정도를 트립판 블루 배제(tryphan blue exclusion)법으로 조사하였다. 트립판 블루염색시약을 사용하면 죽은 세포만이 염색되므로, 이를 혈구계 (hemocytometer)로 측정하였다. 즉, 혈구계를 이용하여 총세포수와 염색된 세포수를 측정하고 bclx/L 유전자의 발현에 의한 세포사멸 저해효과를 조사하였다.

실험 결과, PTX-2를 첨가함에 따라 사멸된 세포의 수가 증가함을 관찰할 수있었다. 한편, bclx/L이 과발현된 세포주의 경우에 bclx/L을 발현시키지 않은 세포주에 비해 사멸된 세포의 수가 현저히 감소함을 알 수 있었다(도 7).

상기와 같이 PTX-2, 사이토캘라신 D 및 싸이코신과 같은 액틴 저해제에 의한 p53 또는 p21 유전자가 결손된 암세포의 선택적 사멸이 미토콘드리아 막 전위를 감소시키며 그 세포사멸 효과가 bclx/L에 의해 저해되는 양상을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 액틴 저해제에 의한 세포의 선택적 사멸 기작은 액틴 저해제가 세포내 미토콘드리아의 기능을 변화시켜 세포사멸을 일으킨다고 추정할 수 있으며 이때, 캐스패이즈-3의 활성 증가를 동반함을 알 수 있었다.

실시예 7

PTX-2 처리 후 p53 결손 암세포에서의 DNA 합성 변화

PTX-2 처리 후 정상세포의 핵상은 8N에서 정지하는데 반하여 p53 또는 p21 결손 암세포주의 핵상은 32N까지 증가하며 동시에 세포죽음이 유발되는 것은 상기 실시예 3에서 입증한 바와 같다. 세포질 분열의 정지에 의하여 세포는 세포주기 M기를 빠져 나오지 못하므로 DNA 합성기인 S기에는 들어갈 수 없다. 따라서, p53 또는 p21 결손 암세포주에서 핵상의 증가는 세포질 분열 없이 DNA 합성이 계속되는 것으로 볼 수 있다. 이를 확인하기 위하여 p53 결손 암세포주에 PTX-2 처리하고 이들의 DNA 합성 변화를 측정하였다.

HCT116 대장암 세포주(p53+/p21+)와 p53 결손 세포주 HCT116(p53-/-)를 각각10% FBS를 포함하는 DMEM배지를 사용하여 커버 글라스 위에서 36시간 배양한 후 PTX-2 100ng/㎖를 첨가하여 배양하였다. 각 세포주의 DNA 합성 측정은 5-브로모-2'-디옥시-우리딘 표지 및 검출 킷트(5'-bromo-2'- deoxy-uridine labeling and detection kitII, Roche사)를 사용하였다. 즉, 1일, 2일 및 3일 후에 브로모우라실(BrdU)를 10μM이 되도록 첨가하여 1시간 배양하였다. 상기 세포를 70% 에탄올로 고정한 다음 항-BrdU 항체와 반응시키고, 이를 알칼라인 포스파타제가 표지된 항 마우스 IgG와 결합시켰다. NBT(nitroblue tetrazolium)와 X-포스페이트(X-phosphate)를 기질로 하여 발색반응을 시키고, 표지된 세포를 광학현미경으로 관찰하여 세포의 BrdU 흡입정도를 관찰하였다.

실험 결과, 세포주에 PTX-2를 처리한 후 HCT116세포는 브로모우라실을 흡입하지 않는 반면 p53 혹은 p21 유전자 결손 암세포는 계속해서 브로모우라실을 흡입함을 볼 수 있었으며 이는 DNA 합성이 계속적으로 일어나고 있음을 의미한다(도 8).

실시예 8

PTX-2에 의한 암세포의 세포주기 조절 인산화효소의 활성 변화

PTX-2 처리에 의한 암세포의 세포주기 조절 단백질의 발현 및 활성변화를 조사하기 위하여, HCT116 대장암 세포주(p53+/p21+)와 p21이 결손된 세포주(p21-/-)를 각각 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에서 36시간 배양한 후 PTX-2 100ng/㎖를 첨가하여 배양한 다음 세포주기 G1/S와 G2/M기의 전이상태에서 중요한 역할을 하는 사이클린-의존성 키나제(cyclin-dependent kinase)인 CDK2 및 CDK1의 활성을 측정하였다.

상기 CDK2와 CDK1의 활성은 히스톤 H1 단백질을 기질로 하여 당분야에 공지된 방법인 면역침전 인산화 활성 측정법으로 분석하였다(Misoon Park et al., Cancer Research, 60, 542-545 (2000)).

실험 결과, 야생형 HCT116 세포주는 PTX-2 처리 후 48시간부터 CDK2 및 CDK1의 활성이 감소하였다. 반면에 p21 유전자 결손 세포주는 PTX-2 처리 후 72시간까지 일정수준을 유지하였다(도 9). 이러한 결과로부터 p53 또는 p21 유전자가 정상적으로 기능하지 않은 세포는 PTX-2에 의한 세포질분열 저해를 인식하지 못함으로써 계속적인 DNA 합성이 일어나는 것임을 확인할 수 있었다.

실시예 9

사이클린 의존성 키나제 저해제 및 DNA 합성 저해제가 PTX-2에 의한 암세포의 세포사멸에 미치는 영향

세포주기 진행에 중요한 사이클린 의존성 키나제를 저해시키거나 DNA합성을 저해하는 경우에 PTX-2에 의한 암세포의 세포사멸 효과가 어떠한 영향을 받는지 조사하였다. p21 유전자가 결손된 HCT116(p21-/-) 세포에 CDK(cyclin-dependent kinase) 저해제인 올로무신(30μM), 로스코비틴(10μM) 및 DNA 합성 저해제인 티미딘(1mM) 각각을 PTX-2(100ng/ml)와 함께 2일간 처리 후 세포사멸 정도를 실시예 6에 따른 트립판 블루 배제법으로 조사하였다.

실험 결과, PTX-2에 의한 세포사멸은 CDK저해제 및 DNA 합성 저해제에 의해 감소하였다. 한편, 올로무신의 불활성화 유도체인 이소-올로무신(40μM)은 어떠한 영향도 주지 않았다(도 10). 이는 PTX-2에 의해 세포가 세포질 분열이 저해된 후, DNA 합성여부가 액틴 저해제에 의한 감수성을 결정하는 것임을 알 수 있었다.

실시예 10

PTX-2에 의한 p53 유전자가 변이된 폐암 세포주의 세포사멸 효과

정상적으로 기능하는 p53 유전자가 있는 A549 및 H460 폐암 세포주와 p53 유전자가 돌연변이된 H358, H596, H1299, SK-LU-1, A427, 및 HCC2108 폐암 세포주를 10% FBS를 함유한 RPMI배지에서 하루동안 배양하였다. 여기에 PTX-2를 30ng/㎖를 각각 첨가하고 3일간 배양하였다. 배양이 완료된 다음 세포사멸 정도를 실시예 6과 같이 트립판 블루 배제법으로 조사하였다.

실험 결과, p53 유전자가 변이 또는 소실에 의하여 그 기능을 상실한 세포주에서 PTX-2에 의한 세포사멸이 현저히 증가함을 알 수 있었다(도 11).

실시예 11

액틴저해제의 p53 유전자 결손 암세포에 대한 선택성 조사

본 실시예에서는 현재까지 알려진 액틴저해제들에 대하여 p53 유전자 또는 p21 유전자 결손에 대한 선택성을 조사하였다. HCT116세포주와 p53 또는 p21 유전자가 결손된 세포주에 액틴저해제로 알려진 펙테노톡신-2, 사이토캘라신 D (cytochalasin D), 싸이코신, 래트룬쿨린 A(latrunculin A, Lat A), 래트룬쿨린 B(latrunculin B, Lat B) 재스파미드(jaspamides; jasplaki nolides), 스윈홀리드(swinholide A)를 도12의 설명에 나타낸 양을 첨가하고 3일간 배양한 다음 세포사멸 정도를 트립판 블루 배제(tryphan blue exclusion)법으로 조사하였다.

실험 결과, 이들 액틴 저해제들은 야생형 HCT116보다 훨씬 높은 비율로 p53 혹은 p21결손 암세포의 세포죽음을 유도하였다(도 12).

실시예 12

PTX-2의 p21 결손암세포의 선택적 사멸에 대한 ex vivo실험

HCT116 대장암 세포주(p51+/21+) 및 p53이 결손된 HCT116(p53-/-) 세포주 5×10⁶을 각각 Balb/c 누드 마우스에 주사하여 종양을 형성시켰다. 1 주일 후, 생리 식염수 또는 PTX-2를 0.05mg/kg, 0.1mg/kg씩 1일 1회 복강주사(intraperitoneal injection)한 다음 체중 및 종양의 크기를 조사하여 종양의 성장비율을 구하였다. 종양크기는 베니어 캘리퍼(Venier caliper)를 이용하여 측정하였다.

실험 결과, PTX-2는 p53이 결손된 세포주의 종양성장을 억제하였으나, p53이결손되지 않은 세포주의 종양성장에는 영향을 주지 않았다(도 13). 이때의 PTX-2 처리는 마우스의 체중감소를 유발하지 않다. 이는 액틴 저해제인 PTX-2가 개체에 큰 손상을 주지 않으면서 p53이 결손된 암세포를 선택적으로 사멸시킴을 의미한다.

실시예 13

PTX-2를 유효량 함유하는 주사제의 제조

주사제의 제조(2㎖기준):

성분 첨가량

PTX-2 100㎎

소디움 클로라이드 18㎎

벤질 알콜 45㎎

주사용 증류수 2㎖

PTX-2를 상기에 기재된 바와 같은 용제에 녹인 다음 멤브레인 필터를 사용하여 투명하게 될 때까지 여과하였다. 여과 후 용액을 앰플에 충진한 다음 고압증기멸균에 의해 완전 멸균하였다.

본 발명은 액틴 저해제 포함하는 약학 조성물은 정상세포에는 영향을 주지않으면서 p53 또는 p21 유전자 변이 암세포에 특이적으로 작용함으로써 세포질분열은 억제하면서 계속적인 DNA 합성 및 핵분열을 유도하여 세포가 사멸되도록 하는 효과가 있다.

Claims

활성성분으로 액틴 저해제 또는 이의 유도체를 약제학적으로 유효한 양으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하며 p53 유전자 및 p21 유전자 변이에 의한 암의 치료를 위한 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유전자 변이가 유전자 결손임을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 액틴 저해제가 펙테노톡신-2, 사이토캘라신 D(cytochalasin D), 싸이코신, 래트룬쿨린(latrunculins), 재스파미드(jaspamides; jasplakinolides), 스윈홀리드(swinholide A), 미사키놀리드(misakinolide A) 및 할리콘드라미드(halichondramides) 중에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상임을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 암이 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부 암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부근의 암, 결장암, 유방암, 부인과 종양, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 유년기의 고상 종양, 분화 림프종, 방광암, 신장, 수뇨관암 및 중추신경계의 종양인 약학 조성물.
제4항에 있어서, 상기 부인과 종양이 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁 경부 암종, 질 암종 또는 외음부 암종인 약학 조성물.
제4항에 있어서, 상기 내분비계 암이 갑상선암 또는 부갑상선암인 약학 조성물.
제4항에 있어서, 상기 수뇨관 암이 신장 세포 암종 또는 신장 골반 암종인 약학 조성물.
제4항에 있어서, 상기 중추신경계 종양이 제1 CNS 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 아데노마인 약학 조성물.