SK283364B6 - Použitie proteínu alebo génu p53 a prostriedku poškodzujúceho DNA, prípravky a kity ich obsahujúce - Google Patents

Použitie proteínu alebo génu p53 a prostriedku poškodzujúceho DNA, prípravky a kity ich obsahujúce Download PDF

Info

Publication number
SK283364B6
SK283364B6 SK1367-96A SK136796A SK283364B6 SK 283364 B6 SK283364 B6 SK 283364B6 SK 136796 A SK136796 A SK 136796A SK 283364 B6 SK283364 B6 SK 283364B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
cells
gene
cell
recombinant
dna
Prior art date
Application number
SK1367-96A
Other languages
English (en)
Other versions
SK136796A3 (en
Inventor
Jack A. Roth
Toshiyoshi Fujiwara
Elizabeth A. Grimm
Tapas Mukhopadhyay
Wei-Wei Zhang
Laurie B. Owen-Schaub
Original Assignee
Board Of Regents, The University Of Texas System
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22875472&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK283364(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Board Of Regents, The University Of Texas System filed Critical Board Of Regents, The University Of Texas System
Publication of SK136796A3 publication Critical patent/SK136796A3/sk
Publication of SK283364B6 publication Critical patent/SK283364B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A61K31/7072—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid having two oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. uridine, uridylic acid, thymidine, zidovudine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/243—Platinum; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4746—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used p53
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

Je opísané použitie proteínu alebo génu p53 a prostriedku poškodzujúceho DNA na získanie terapeutického prípravku na usmrcovanie bunky, kde proteín alebo gén p53 a prostriedok poškodzujúci DNA sú kombinované v množstve účinnom na usmrtenie bunky, zodpovedajúce terapeutické prípravky a kity.ŕ

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka všeobecne oblasti nových stratégií na zlepšenie chemoterapeutickej intervencie. V ďalších aspektoch poskytuje vynález nové použitia a prípravky, ktoré kombinujú schopnosť prostriedkov poškodzujúcich DNA s kombinovaným uvoľňovaním prostriedku potlačujúceho nádory. Kombinácia faktorov poškodzujúcich DNA s heterológnou expresiou supresorového génu vedie k výraznej synergii oproti účinkom jednotlivých zložiek.
Doterajší stav techniky
Je známe, že súčasné metódy liečby rakoviny, zahrnujúce ožarovania, chirurgické metódy a chemoterapiu, majú obmedzenú účinnosť. Samotná rakovina pľúc zabíja ročne v Spojených štátoch viac než 140 000 ľudí. V poslednom čase prekročila úmrtnosť na rakovinu pľúc, upravená na vek, úmrtnosť na rakovinu prsníka u žien. Aj keď uskutočňované programy obmedzovania fajčenia znížili všeobecné rozšírenie fajčenia, zostane úmrtnosť na rakovinu pľúc vysoká až do 21. storočia. Racionálny vývoj nových terapii pre rakovinu pľúc bude závisieť od pochopenia biológie rakoviny pľúc na molekulárnej úrovni.
V súčasnosti je zistené, že rôzne druhy rakoviny sú aspoň čiastočne spôsobované genetickými abnormalitami, ktoré vedú buď k hyperexpresii jedného alebo viac génov alebo expresii abnormálneho alebo mutantného génu alebo génov. Je napríklad známe, že expresia onkogénov v mnohých prípadoch vedie k rozvinutiu rakoviny. „Onkogény“ sú geneticky zmenené gény, ktorých mutovaný expresný produkt určitým spôsobom narušuje normálnu funkciu alebo kontrolu buniek (Spandidos a d., 1989).
Bolo zistené, že väčšina dosiaľ študovaných onkogénov je „aktivovaná“ v dôsledku mutácie, často bodovej mutácie, v kódujúcej oblasti normálneho bunkového génu, t. j. „protoonkogénu“, čo vedie k substitúcii aminokyselín v exprimovanom proteínovom produkte. Tento zmenený produkt expresie má abnormálnu biologickú funkciu, ktorá sa zúčastňuje neoplastického procesu (Travali a d., 1990). Pôvodné mutácie môžu byť vyvolané rôznym spôsobom, napríklad chemickou mutagenézou alebo ionizačným žiarením. Dosiaľ bol identifikovaný a do rôzneho stupňa charakterizovaný väčší počet onkogénov a skupín onkogénov vrátane ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun a abl (Travali a d., 1990; Bishop, 1987).
Predpokladá sa, že počas normálneho rastu buniek sú pretoonkogény, podporujúce rast, vyrovnávané supresorovými génmi, obmedzujúcimi rast nádorov. K nerovnováhe týchto dvoch síl, vedúcej k neoplastickému stavu, môže prispievať niekoľko faktorov. Jedným z týchto faktorov sú mutácie v supresorových génoch nádorov (Weinberg,
1991) .
Významným supresorovým génom je gén kódujúci bunkový proteín p53, čo je jadrový fosfoproteín o 53 kD, kontrolujúci bunkovú proliferáciu. Mutácie génu p53 a strata alely na chromozóme 17p, kde je tento gén umiestnený, patrí medzi najčastejšie zmeny identifikované v ľudskom zhubnom bujnení. Proteín p53 je počas vývoja vysoko konzervovaný a je exprimovaný vo väčšine normálnych tkanív. Bolo zistené, že štandardný p53 sa zúčastňuje na kontrole bunkového cyklu (Mercer, 1992), regulácii transkripcie (Fields a d., 1990, a Mietz a d., 1992), replikácii DNA (Wilcock a Lane, 1991, a Bargonetti ad., 1991) a indukcii apoptózy (Yonish-Rouach a d., 1991, a Shavv a d.,
1992) .
Sú známe rôzne mutantné alely p53, v ktorých substitúcia jedinej bázy vedie k syntéze proteínov, ktoré majú úplne odlišné vlastnosti pri regulácii rastu, a v konečnom dôsledku vedú k zhubnému bujneniu (Hollstein a d., 1991). Bolo totiž zistené, že gén p53 je najčastejšie mutovaným génom v prípade bežných typov ľudskej rakoviny (Hollstein a d., 1991; Weinberg, 1991) aje spojený predovšetkým s rakovinami súvisiacimi s cigaretovým dymom (Hollstein a d., 1991, Zakut-Houri a d., 1985). Bola tiež dokumentovaná hyperexpresia p53 v nádoroch prsníka (Caseyad., 1991).
Jeden z najpodnetnejších aspektov génovej terapie rakoviny súvisí s použitím supresorových génov, ako je p53. Bolo zaznamenané, že transfekciou štandardného p53 do buniek určitých typov rakoviny prsníka a pľúc je možné v bunkových líniách obnoviť funkciu potlačovania rastu (Casey ad., 1991; Takahasi a d., 1992). Aj keď transfekcia DNA nie je schodným prostriedkom zavádzania DNA do buniek pacienta, slúžia tieto výsledky na demonštráciu toho, že dodanie štandardného p53 do rakovinových buniek, obsahujúcich mutovaný gén p53, môže byť účinnou liečebnou metódou, ak bude môcť byť vyvinutý zlepšený spôsob dodávania génu p53.
Systémy dodávania génov, použiteľné v génovej terapii na potlačovanie nádorov, sú v štádiu výskumu a vývoja. Zvlášť zaujímavé sú génové prenosové prostriedky na báze vírusov z dôvodu účinnosti vírusov pri infekcii skutočných živých buniek, procesom ktorým je prenášaný samotný vírusový genetický materiál. V tomto ohľade bol urobený určitý pokrok, napríklad v zostavovaní retrovirusových vektorov na dodávanie rôznych génov. Hlavné problémy ale súvisia s používaním retrovirusových vektorov na génovú terapiu, pretože ich infekčnosť závisí od dostupnosti retrovírusových receptorov na cieľových bunkách, ťažko sa koncentrujú a čistia a účinne sa integrujú len do replikujúcich sa buniek.
Rezistencia nádorovej bunky proti chemoterapeutickým liečivám predstavuje veľký problém v klinickej onkológii. Aspoň 80 % prípadov rakoviny pľúc je pričítané NSCLC; pacienti s NSCLC však všeobecne nereagujú na chemoterapiu (Doyle, 1993). Jedným z cieľov súčasného výskumu rakoviny je nájsť spôsoby, ako zlepšiť účinnosť terapie rakoviny náhradou génov zisťovaním interakcie medzi génovým produktom a chemoterapeutikami. Ak bol do mozgových nádorov dodaný retrovírusovým vektorovým systémom gén thymidin kinázy herpes simplex (HS-tK), účinne vyvolával citlivosť voči antivírusovému prostriedku ganciclovirusu (Culver a d., 1992). Génový produkt HS-tK je exogénny vírusový enzým, zatiaľ čo proteín wt-p53 je exprimovaný v normálnych tkanivách, z čoho vyplýva, že modulácia chemorezistencie zmenami expresie wt-p53 by mohla byť alternatívnym prístupom, používajúcim dráhu sprostredkovanú endogénnym genetickým programom.
Adenovírusový systém má potenciálne výhody na dodávanie génu in vivo, ako je jednoduchosť produkcie vírusu s vysokým titrom, vysoká účinnosť infekcie a infektivita pre mnoho typov buniek. Stabilita a čas expresie zavedeného génu je však stále kontroverzná. K zvýšeniu hladiny p53 v bunkách, ktoré sú citlivé na chemoterapeutiká, môže dôjsť počas 6 hod. po stimule poškodzujúcom DNA (Fritsche a d., 1993, Zhan a d., 1993), ale zvýšenú väzbovú aktivitu DNA p53 je možné zvrátiť počas 4 hod., ak je stimul odstránený (Tishler a d., 1993). Preto je možné vysokú hladinu expresie p53 udržať aj po prerušení expozície liečiva. Expresia proteínu wt-p53 prostredníctvom Ad-p53 vrcholí 3. deň po infekcii (14-násobok endogénneho štandardu) a do 9. dňa klesá na nízku hladinu (Zhang a d., 1993). To by znamenalo, že prechodne vysoká hladina expresie wt-p53 je dostatočná na iniciáciu cytotoxického programu v rakovinovej bunke.
p53 má významnú rolu ako determinant chemosenzitivity v ľudských pľúcnych rakovinových bunkách. Pre ľudskú rakovinu NSCLC boli vyskúšané rôzne liečebné postupy, zahrnujúce chirurgiu, chemoterapiu a rádioterapiu, ale hodnoty dlhodobého prežitia zostávajú neuspokojivé. Je teda potrebná kombinačná terapia, používaná samostatne alebo ako účinná pomocná liečba na prevenciu lokálnych recidív po primárnej resekcii nádoru, alebo ako liečba, ktorá môže byť aplikovaná intralezionálnymi injekciami pri primárnych, metastatických alebo lokálne recidivujúcich pľúcnych nádoroch, rezistentných k liečivám. Treba tiež vyvíjať prípravky a postupy, skúmať a zdokonaľovať klinickú aplikáciu nových prípravkov na liečbu rakoviny. Tieto postupy a prípravky navyše musia preukázať svoju hodnotu pri nasadení in vivo.
Podstata vynálezu
Vynález rieši potrebu zdokonalených terapeutických prípravkov na použitie pri usmrcovaní buniek kombináciou účinku supresorového génu alebo proteínu a prostriedku alebo faktora poškodzujúceho DNA. Vynález tiež poskytuje prípravky a postupy, vrátane tých, ktoré používajú vírusovo sprostredkovaný génový prenos, na podporu expresie štandardného supresorového génu, ako je p53, v cieľových bunkách a na uvoľňovanie prostriedku alebo faktora, ktorý vyvoláva poškodenie DNA. Pôvodcovia prekvapujúco zistili, že pomocou prípravkov podľa vynálezu sú schopní vyvolať programovanú smrť buniek, známu tiež ako apoptóza, vo veľmi značnom počte cieľových buniek.
S použitím vynálezu demonštrovali pôvodcovia pozoruhodný účinok na potlačovanie rastu buniek a predovšetkým rastu nádorových buniek. Vznik a rast nádorových buniek, známy tiež ako „transformácia“, spočíva vo vytvorení a proliferácii buniek, ktoré stratili schopnosť kontrolovať bunkové delenie, tzn. že sú rakovinové. Predpokladá sa, že potenciálnym cieľom postupov a prípravkov podľa vynálezu sú početné rôzne typy transformovaných buniek, ako sú sarkómy, melanómy, lymfómy a rôznorodé pevné nádory a pod. Aj keď môže byť cieľom akékoľvek tkanivo s malígnym rastom buniek, preferovanými cieľmi sú tkanivá pľúc a prsníka. Pôvodcovia objavili, že rekombinačný vektor pre expresiu p53 je pri použití v spojení s prostriedkom poškodzujúcim DNA schopný výrazne znižovať rýchlosť rastu buniek.
Predmetom vynálezu je použitie proteínu alebo génu p53 a prostriedku poškodzujúceho DNA na získanie terapeutického prípravku na usmrcovanie bunky, kde proteín alebo gén p53 a prostriedok poškodzujúci DNA sú kombinované v množstve účinnom na usmrtenie bunky.
Vynález poskytuje v určitých uskutočneniach použitia prípravky na usmrcovanie bunky alebo buniek, ako je malígna bunka alebo bunky, uvádzaním bunky alebo populácie buniek do styku s proteínom alebo génom p53 a s jedným alebo viac prostriedkami poškodzujúcimi DNA, kombinovanými v množstve účinnom na usmrtenie bunky alebo buniek alebo ich vystavením pôsobeniu takej kombinácie. Bunky, ktoré je možné usmrcovať pomocou vynálezu, zahrnujú napríklad nežiaduce, ale benígne bunky, ako sú benígne bunky zhrubnutia prostaty alebo hyperaktívne bunky štítnej žľazy; bunky súvisiace s autoimunitnými ochoreniami, ako sú bunky B, ktoré produkujú protilátky zúčastňujúce sa artritídy, lupus, myastenie gravis, skvamóznej metaplázie, dysplázie a pod. Vynález, aj keď je všeobecne použiteľný na usmrcovanie všetkých nežiaducich buniek, je zvlášť vhodný na usmrcovanie malígnych buniek. „Malígne bunky“ sú definované ako bunky, ktoré stratili schopnosť kontrolovať cyklus bunkového delenia, čo vedie k „transformovanému“ alebo „rakovinovému“ fenotypu.
Na účely usmrcovania buniek, napríklad malígnych alebo metastatických, pomocou postupov a prípravkov podľa vynálezu, sa obvykle „cieľová“ bunka uvádza do styku s proteínom alebo génom p53 a aspoň jedným prostriedkom poškodzujúcim DNA, kombinovanými v množstve účinnom na usmrtenie bunky. To môže zahrnovať uvedenie buniek do styku s proteínom alebo génom p53 a prostriedkom alebo faktorom, alebo prostriedkami, alebo faktormi poškodzujúcimi DNA súčasne. To je možné dosiahnuť tak, že sa bunka uvádza do styku s jediným prípravkom alebo farmakologickou formuláciou, obsahujúcou oba prostriedky, alebo uvedením bunky do styku s dvoma rôznymi prípravkami alebo formuláciami súčasne, pričom jeden prípravok zahrnuje proteín alebo gén p53 a druhý zahrnuje prostriedok poškodzujúci DNA.
Prirodzene sa tiež predpokladá, že cieľová bunka môže byť najprv vystavená prostriedku alebo prostriedkom poškodzujúcim DNA a potom uvedená do styku s proteínom alebo génom p53, alebo naopak. V uskutočneniach, keď sa faktor poškodzujúci DNA a p53 aplikujú na bunku oddelene, je všeobecne nutné zaistiť, aby neuplynula medzi oboma podaniami významná doba, tak, aby prostriedok poškodzujúci DNA a p53 boli ešte schopné vyvodzovať na bunku výhodný kombinačný účinok. V takých prípadoch sa predpokladá, že bunka sa uvedie do styku s oboma prostriedkami navzájom v rozmedzí asi 12 až 24 hod., výhodne asi 6 až 12 hod., pričom najvýhodnejší je čas oneskorenia len asi 12 hod.
Výrazy „uvedenie do styku“ a „vystavenie“ v súvislosti s bunkou sa tu vzťahujú na spôsob, ktorým sa supresorový gén alebo proteín, ako je p53, a prostriedok alebo faktor poškodzujúci DNA dodávajú do cieľovej bunky alebo sa umiestňujú do priameho styku s cieľovou bunkou. Na dosiahnutie usmrtenia bunky sa oba prostriedky dodávajú do bunky v kombinácii v množstve účinnom na usmrtenie bunky, t. j. na vyvolanie programovanej smrti bunky alebo apoptózy. Výrazy „usmrtenie“, „programovaná smrť “ a „apoptóza“ sa tu používajú navzájom zameniteľné a opisujú rad intracelulámych javov, ktoré vedú k smrti cieľovej bunky. Proces smrti bunky zahrnuje aktiváciu intracelulárnych proteáz a nukleáz, ktorá vedie napríklad k involúcii bunkového jadra a fragmentácii jadrovej DNA. Pochopenie presného mechanizmu, ktorým interagujú rôzne intracelulárne molekuly s cieľom dosiahnuť smrť bunky, nie je na uskutočňovanie vynálezu nevyhnutné.
Prostriedky alebo faktory poškodzujúce DNA sú podľa vynálezu definované ako akákoľvek chemická zlúčenina alebo spôsob liečby, ktoré vyvolávajú pri aplikácii na bunku poškodenie DNA. Takéto prostriedky a faktory zahrnujú žiarenie a vlny, ktoré vyvolávajú poškodenie DNA, ako je napríklad γ-žiarenie, rontgenové žiarenie, UV žiarenie, mikrovlnné žiarenie, elektrónové emisie a pod. Poškodenie DNA vyvolávajú rôzne chemické zlúčeniny, označované tiež ako „chemoterapeutiká“, ktoré sú všetky použiteľné v kombinovaných prípravkoch podľa vynálezu. Použiteľné chemoterapeutiká zahrnujú napríklad adriamycín, 5-fluorouracil (5-FU), etopozid (VP-16), kamptotecín, aktinomycín-D, mitomycín C, cisplatinu (CDDP) a dokonca peroxid vodíka. Vynález tiež zahrnuje použitie kombinácie jedného alebo viac prostriedkov poškodzujúcich DNA, buď na báze ožarovania alebo priamo zlúčenín, ako je použitie rôntge nových lúčov s cisplatinou alebo použitie cisplatiny s etopozidom. V určitých uskutočneniach je zvlášť výhodné použitie cisplatiny v kombinácii s proteínom alebo génom p53 ako tejto zlúčeniny.
Je možné tiež použiť akýkoľvek spôsob uvádzania bunky do styku s proteínom p53, pokiaľ tento spôsob vedie k zvýšenej hladine funkčného proteínu p53 v bunke. Taký spôsob zahrnuje tak priame dodávanie proteínu p53 do bunky, ako aj dodávanie génu alebo segmentu DNA, ktorý kóduje p53, ktorý bude riadiť expresiu a produkciu p53 v bunke. Pretože dodávanie proteínu má nevýhody, ako je degradácia proteínu a nízka absorpcia bunkou, predpokladá sa, že zvlášť výhodné bude použitie rekombinačného vektora, ktorý exprimuje proteín p5 3.
Metódami inžinierstva je možné konštruovať rôzne rekombinačné plazmidy a vektory na expresiu proteínu p53 a na dodávanie p53 do bunky. Patrí sem napríklad použitie plazmidov z holej DNA a p53 na priamy prenos genetického materiálu do bunky (Wolfe a d., 1990), formulácie DNA kódujúce p53, zachytené v lipozómoch (Ledley a d., 1987) alebo v proteolipozómoch, ktoré obsahujú receptorové proteíny vírusového obalu (Nicolau a d, 1983) a DNA kódujúce p53 naviazané na komplex polylyzín-glykoproteínový nosič.
Predpokladá sa tiež použitie rekombinačných vírusov, konštruovaných tak, aby exprimovali p53. Môžu byť použité rôzne vírusové vektory, ako sú retrovírusové vektory, vírus herpes simplex (patent US 5 288 641, zahrnutý tu ako odkaz), cytomegalovírus a pod., ako uvádza Miller (Miller, 1992); tiež tak rekombinačné adeno-asociované vírusy (vektory AAV), napríklad opísané v patente US 5 139 941, zahrnutom tu ako odkaz, a predovšetkým rekombinačné adenovírusové vektory. Metódy prípravy replikačne defektných infekčných vírusov sú v odbore známe, pozri napríklad citácie Ghosh-Choudhury & Graham (1987), McGrory a d. (1988) a Gluzman a d. (1982), tu zahrnuté ako odkaz.
Na usmrtenie bunky podľa vynálezu sa všeobecne bunka uvádza do styku s proteínom alebo génom p53 a prostriedkom poškodzujúcim DNA, kombinovanými v množstve účinnom na usmrtenie bunky. Výraz „kombinovanými v množstve účinnom na usmrtenie bunky“ znamená, že množstvá p53 a prostriedku poškodzujúceho DNA sú dostatočné na to, aby, ak sú v kombinácii v bunke, bola v bunke vyvolaná apoptóza. Aj keď to nie je nutné vo všetkých uskutočneniach, je spojené účinné množstvo p53 a prostriedku poškodzujúceho DNA prednostne také, ktoré vyvolá významne viac úmrtí buniek než použitie jednotlivých prvkov samotných, a prednostne ide o také množstvo, ktoré vyvoláva synergické úmrtie buniek v porovnaní s účinkami pozorovanými pre každý prvok samostatne.
Na stanovenie účinkov, vyvolávaných prípravkami a použitím podľa vynálezu, je možné použiť rôzne parametre in vitro. Tieto parametre zahrnujú napríklad pozorovania čistého počtu buniek pred vystavením prípravkom podľa vynálezu a po ňom, rovnako ako veľkosti vzniknutých viacbunkových nádorových sféroidov, ako sú kolónie vzniknuté v tkanivovej kultúre. Usmrcovanie buniek in vitro je opisané predovšetkým v uvedenom príklade 7. Alternatívne je možné merať parametre, ktoré indikujú bunku, v ktorej prebieha programovaná smrť, ako je fragmentácia bunkovej DNA na fragmenty veľkosti nukleozómov, všeobecne identifikované delením fragmentov elektroforézou na agarózovom géli, farbením DNA a porovnávaním DNA s rebríčkom veľkosti DNA. Fragmenty veľkosti nukleozómov sú identifikované ako postupné stupne rebríčka mo nomérov a multimérov so základnou jednotkou asi 200 párov báz.
Podobne „terapeuticky účinné množstvo“ je množstvo proteínu alebo génu p53 a prostriedku poškodzujúceho DNA, ktoré, ak je podané v kombinácii živočíchovi, účinne v ňom usmrcuje bunky. Dôkazom toho je predovšetkým usmrcovanie rakovinových buniek, ako sú bunky rakoviny pľúc, prsníka alebo hrubého čreva, vo zvieracom alebo ľudskom subjekte, ktorý má nádor. „Terapeuticky účinná kombinácia“ je teda všeobecne spojené množstvo p53 a prostriedku poškodzujúceho DNA, ktoré funguje tak, že usmrcuje viac buniek než každý prvok samostatne, a prednostne ide o spojené množstvo, ktoré prináša synergické zníženie nádorovej záťaže.
Štúdium určitých in vivo a ex vivo parametrov bunkovej smrti je teda tiež účinným prostriedkom zisťovania účinnosti prípravkov podľa vynálezu. Napríklad pozorovania vplyvu na inhibíciu tumorigenicity, meranou expresiou TdT zmrazených rezov tkaniva alebo pomocou iných metód farbenia a cieľových antigénov, známych skúsenému patológovi. Prirodzene je možné na hodnotenie usmrcovania buniek použiť aj iné prostriedky na stanovenie hmoty, rastu a životnosti nádoru. Predovšetkým je možné hodnotiť účinky na rôznych systémoch zvieracích modelov rakoviny vrátane tých, pri ktorých sú ľudské rakovinové bunky lokalizované vo zvierati. Je známe, že zvieracie modely rakoviny sú na rozdiel od AIDS vysoko použiteľné na stanovenie režimu liečby u ľudí (Roth a d., ed., 1989). Jedným príkladom takého zvieracieho modelu je subkutánna kultivácia ľudských buniek malobunkovej rakoviny pľúc (bunky H358). Pomocou tohto systému pôvodcovia preukázali, že adenovírus nesúci p53, aplikovaný intratumorálne so súčasným podávaním chemoterapeutika. vedie k prekvapivo účinnej redukcii nádoru.
Zvlášť výhodnou metódou dodávania proteínu p53 do bunky je uvádzanie bunky do styku s rekombinačným adcnovírusovým virionom alebo časticou, ktorá zahrnuje rekombinačný adenovírusový vektor obsahujúci oblasť expresie p53, umiestnenú pod kontrolou promótora schopného riadiť expresiu p53 v danom bunkovom type.
Oblasť expresie p53 vo vektore môže zahrnovať genómickú sekvenciu, ale pre jednoduchosť sa predpokladá, že všeobecne bude výhodné používať sekvencie cDNA p53, pretože sú v odbore jednoducho dostupné a ľahšie sa s nimi manipuluje. Okrem expresnej jednotky p53 a promótorovej oblasti vektor tiež obvykle obsahuje polyadenylačný signál, ako je polyadenylačný signál skorého génu SV40 alebo protaminového génu a pod.
Vo výhodných uskutočneniach sa predpokladá, že bude žiaduce umiestniť oblasť expresie p53 pod kontrolu silného konštitutívneho promótora, ako je promótor CMV, vírusový LTR, RSV alebo SV40, alebo promótor asociovaný s génmi, ktoré sú exprimované vo vysokej hladine v cicavčích bunkách, ako je promótor elongačného faktora-1 alebo aktinový promótor. Všetky tieto varianty sa pokladajú za použiteľné podľa vynálezu. V súčasnosti je zvlášť výhodným promótorom promótor IE cytomegalovirusu (CMV).
Gén alebo cDNA p53 môžu byť zavádzané do rekombinačného adenovírusu podľa vynálezu proste vložením alebo pridaním kódujúcej sekvencie p53 do vírusového genómu. Prednostnými adenovírusmi však sú replikačne defektné vírusy, pri ktorých bol vírusový gén, nevyhnutný na replikáciu a/alebo obaľovanie, vypustený z konštruktu adenovírusového vektora, čo umožňuje na jeho miesto zaviesť expresnú oblasť p53. Vypustiť a nahradiť p53 je možné akýmkoľvek génom, či už je nevyhnutný (napríklad E1A, E1B, E2 a E4) alebo nie je nevyhnutný (napríklad E3) na replikáciu. Zvlášť výhodné sú tie vektory a virióny, v ktorých boli vypustené oblasti E1A a E1B adenovírusového vektora a na ich miesto bola zavedená oblasť expresie p53, ktorý ch príkladom je genómová štruktúra na obr. 1.
Metódy prípravy replikačne defektných adenovírusov sú známe, napríklad Ghosh-Choudhury a Graham (1987), McGrory a d. (1988) a Gluzman a d., tu zahrnuté ako odkazy. Je tiež známe, že na propagáciu rekombinačných adenovírusov je možné použiť rôzne bunkové línie, pokiaľ doplňujú akýkoľvek replikačný defekt, ktorý môže byť prítomný. Výhodná bunková línia je ľudská línia buniek 293, aleje možné použiť akúkoľvek inú bunkovú líniu, sľubnú z hľadiska replikácie, t. j. vo výhodnom prípade takú, ktorá exprimuje E1A a E1B. Ďalej môžu byť bunky na účely získania zásobných vírusov propagované buď na plastových diskoch alebo v suspenznej kultúre.
Vynález nie je obmedzený len na vírusy s chýbajúcim El a na bunky exprimujúce El. V súvislosti s vynálezom je možné použiť ďalšie komplementárne kombinácie vírusov a hostiteľských buniek. Môžu byť použité vírusy s chýbajúcim funkčným E2 a bunky exprimujúce E2, rovnako ako vírusy s chýbajúcim E4 a bunky exprimujúce E4 a pod. Ak sa vypusti a nahradí gén, ktorý nie je nevyhnutný na replikáciu, ako je napríklad gén E3, tento defekt nemusí byť špecificky doplňovaný hostiteľskou bunkou.
Okrem požiadavky, aby boli adenovírusové vektory konštruované tak, aby exprimovali p53, sa charakter počiatočného adenovírusu nepovažuje za rozhodujúci na úspešné uskutočnenie vynálezu. Adenovírus môže predstavovať ktorýkoľvek zo 42 rôznych známych sérotypov alebo podskupín A až F. Typ 5 adenovírusu podskupiny C je výhodným východiskovým materiálom na získanie podmieneného replikačne defektného adenovírusového vektora na použitie podľa vynálezu. Dôvodom je, že adenovírus typu 5 je ľudský adenovírus, o ktorom je známe významné množstvo biochemických a genetických informácií a ktorý sa historicky používa na väčšinu konštrukcií s použitím adenovírusu ako vektora.
Použitie a prípravky podľa vynálezu sú tiež vhodné na usmrcovanie bunky alebo buniek, tak in vitro, ako aj in vivo. Ak sú bunky, ktoré sa majú usmrtiť, umiestnené v živočíchovi, napríklad bunky rakoviny pľúc, mliečnej žľazy alebo hrubého čreva, alebo iné bunky s mutáciou p53, podáva sa živočíchovi tak proteín alebo gén p53, ako aj prostriedok poškodzujúci ĎNA vo farmakologicky prijateľnej forme. Tu používaný výraz „farmakologicky prijateľná forma“ sa vzťahuje tak na formu akéhokoľvek prípravku, ktorý môže byť podávaný živočíchovi, ako aj na formu uvádzania živočícha do styku s ožarovaním, t. j. na spôsob, ktorým je ožarovaná určitá oblasť tela živočícha, napríklad γ-žiare-ním, rôntgenovým žiarením, UV žiarením, mikrovlnami, elektrónovými emisiami a pod. Použitie žiarenia a vín poškodzujúcich DNA je známe odborníkom na ožarovaciu terapiu.
Vynález je tiež použiteľný na metódy liečby rakoviny, ktoré všeobecne zahrnujú podávanie terapeuticky účinnej kombinácie proteínu alebo génu p53 a prostriedku poškodzujúceho DNA zvieraciemu alebo ľudskému pacientovi s rakovinou. Je to možné uskutočňovať s použitím rekombinačného vírusu, predovšetkým adenovírusu, ktorý nesie vektor schopný exprimovať p53 v bunkách nádoru. Prípravok dodávajúci gén p53 sa obvykle podáva živočíchovi, často v tesnom kontakte s nádorom, vo forme farmaceutický prijateľného prípravku. Jednou z výhodných metód je priama intralezionálna injekcia terapeuticky účinného množstva génu p53, napríklad uloženého v rekombinačnom víruse, do miesta nádoru. Predpokladajú sa však tiež aj iné parenterálne cesty podávania, napríklad intravenózna, perkutánna, endoskopická alebo subkutánna injekcia.
Pri liečbe rakoviny sa rakovinové bunky okrem proteínu alebo génu p53 uvádzajú do styku s prostriedkom poškodzujúcim DNA. Je to možné uskutočňovať ožarovaním miesta lokalizovaného nádoru žiarením poškodzujúcim DNA, ako je rôntgenové žiarenie, UV žiarenie, γ-lúče alebo mikrovlny. Alternatívne je možné nádorové bunky uvádzať do styku s prostriedkom poškodzujúcim DNA podávaním terapeuticky účinného množstva farmaceutického prípravku zahrnujúceho zlúčeninu poškodzujúcu DNA, ako je adriamycín, 5-fluorouracil, etopozid, kamptotecín, aktinomycín-D, mitomycín C alebo výhodne cisplatina, živočíchovi. Prostriedok poškodzujúci DNA môže byť pripravený a použitý ako kombinovaný terapeutický prípravok alebo kit v spojení s proteínom, génom alebo systémom dodávania génu p53, opísaným skôr.
Prekvapujúci úspech vynálezu je potvrdený zistením, že použitie vírusu Ad5CMV-p53 v kombinácii s cisplatinou viedlo k prenikavým výsledkom v štúdiách s použitím modelu holej myši. Terapeutický režim spájajúci vírusy a poškodzovanie DNA významne inhiboval tumorigenicitu buniek H358, ktoré normálne produkujú významnú nádorovú hmotu. Tumorigenicita buniek rakoviny pľúc bola inhibovaná pri ošetrení Ad5CMV-p53, ale nie kontrolným vírusom exprimujúcim luciferázu, čo ukazuje, že proteín p53 v kombinácii s prostriedkom poškodzujúcim DNA má vysokú terapeutickú účinnosť.
Odborníkom sú známe rôzne metódy dodávania chemoterapeutických formulácií, zahrnujúcich expresné konštrukty DNA, do eukaryotických buniek. So znalosťou vynálezu bude odborník schopný dodávať do buniek súčasne prostriedky poškodzujúce DNA a proteín alebo gény p53 mnohými rôznymi účinnými spôsobmi.
Pre dodávanie DNA in vivo predpokladajú pôvodcovia použitie akéhokoľvek systému dodávania génov, ako je vírusovo a lipozómovo sprostredkovaná transfekcia. Výraz „transfekcia“ je tu používaný na opis cieleného dodávania DNA do eukaryotických buniek pomocou dodávacích systémov, ako sú metódy prenosu génov pomocou adenovírusov, AAV, retrovírusov alebo plazmidov. Špecificita dodávania vírusového génu môže byť volená tak, aby bol gén prednostne smerovaný na určitú cieľovú bunku, napríklad s použitím vírusov, ktoré sú schopné infikovať konkrétne typy buniek. Vírus zvolený na génový prenos, rovnako ako pravdepodobný supresorový gén, ktorý má byť exprimovaný na usmrtenie daného typu malígnej bunky, bude prirodzene diktovaný rôznymi rozsahmi vírusového hostiteľa.
Predpokladá sa tiež, že chemoterapeutický prostriedok poškodzujúci DNA je možné dodávať rôznymi spôsobmi, napríklad metódami parenterálneho dodávania, ako je intravenózna a subkutánna injekcia a pod. Tieto metódy sú známe odborníkom na dodávame liečiv a sú opísané ďalej v oddieloch týkajúcich sa farmaceutických prípravkov a liečby.
Na dodávanie génov in vitro je možné použiť rôzne metódy, ako je napríklad transfekcia sprostredkovaná fosfátom vápenatým alebo dextránsulfátom, elektroporáciu, zamerovanie sklenených projektilov a pod. Tieto metódy sú odborníkom známe a presné prípravky a uskutočnenia sú v súvislosti s vynálezom zrejmé.
Ďalšie uskutočnenia sa týkajú prípravkov, zahrnujúcich farmaceutické formulácie, obsahujúcich proteín alebo gén p53 v kombinácii s prostriedkom poškodzujúcim DNA, ako je cisplatina. V týchto prípravkoch môže byť p53 vo forme segmentu DNA, rekombinačného vektora alebo rekombinačného vírusu, ktorý je schopný exprimovať proteín p53 v živočíšnej bunke. Tieto prípravky, vrátane tých, ktoré obsahujú systém dodávania rekombinačných vírusových génov, ako je adenovírusová častica, môžu byť formulované na podávanie in vivo dispergovaním vo farmakologicky prijateľnom roztoku alebo pufri. Výhodné farmakologicky prijateľné roztoky zahrnujú neutrálne salinické roztoky pufrované fosfátom, laktátom, Tris a pod.
Pri použití vírusových dodávacích systémov je však žiaduce virión dostatočne prečistiť, aby bol v podstate bez nežiaducich nečistôt, ako sú defektné interferujúce vírusové častice alebo endotoxíny a ďalšie pyrogény, aby nevyvolával nečakané reakcie v bunke, živočíchovi alebo jedincovi, prijímajúcom vektorový konštrukt. Výhodný spôsob čistenia vektora spočíva v použití gradientov hustoty, napríklad v centrifugovaní s gradientom chloridu cézneho.
Výhodné farmaceutické prípravky podľa vynálezu zahrnujú vo farmakologicky prijateľnom roztoku alebo pufri proteín p53 alebo výhodnejšie gén p53 v kombinácii s chemoterapeutickým prostriedkom poškodzujúcim DNA. Príklady chemoterapeutických prostriedkov sú adriamycín, 5-fluorouracil, kamptotecín, aktinomycín-D, peroxid vodíka, mitomycín C, cisplatina (CDDP) a etopozid (VP-16), pričom zvlášť výhodné je použitie cisplatiny.
Ďalšie uskutočnenia vynálezu predstavujú kity na použitie pri usmrcovaní buniek, ako sú maligne bunky, ktoré môžu byť formulované do terapeutických kitov na použitie pri liečbe rakoviny. Kity podľa vynálezu všeobecne obsahujú vo vhodnom obale farmaceutickú formuláciu rekombinačného vektora, schopného exprimovať proteín p53 v živočíšnej bunke, a farmaceutickú formuláciu prostriedku poškodzujúceho DNA. Rekombinačný vektor a prostriedok poškodzujúci DNA môžu byť prítomné súčasne v jednom obale alebo v oddelených obaloch. Vo výhodnom uskutočnení je rekombinačným vektorom rekombinačný adenovírusový vektor exprimujúci p53, prítomný v adenovírusovej častici, a prostriedkom poškodzujúcim DNA je cisplatina.
Zložky kitu sú prednostne vo forme kvapalného roztoku alebo suchého prášku. Pokiaľ sú zložky vo forme kvapalného roztoku, ide o vodný roztok, predovšetkým sterilný vodný roztok. Ak sú zložky vo forme suchého prášku, môže byť prášok rckonštituovaný prídavkom vhodného rozpúšťadla. Predpokladá sa, že rozpúšťadlo môže byť tiež dodávané v samostatnom obale.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na ďalšie osvetlenie niektorých aspektov vynálezu slúžia výkresy, ktoré tvoria súčasť opisu. Vynález je možné ďalej osvetliť odkazom na jeden alebo viac obrázkov v spojení s podrobným opisom konkrétnych uskutočnení.
Obr. 1 predstavuje schému vytvorenia rekombinačného adenovírusu p53. Expresná kazeta p53 bola vložená medzi miesta Xba I a Cla I v pXCJL.l. Expresný vektor p53 (pEC53) a rekombinačný plazmid pJM17 boli kotransfikované do buniek 293. Transfekované bunky boli udržované v médiu do nástupu cytopatického efektu. Novovytvorené rekombinačné adenovírusy p53 (Ad5CMV-p53) boli identifikované PCR analýzou DNA s použitím DNA templátov, pripravených zo supematantov CPE ošetrených proteinázou K a extrakciou fenolom.
Obr. 2A predstavuje mapu použitú na štruktúrnu analýzu DNA Ad5CMV-p53. Ide o mapu genómovej DNA Ad5CMV-p53 s umiestnením expresnej kazety p53, printerov PCR a reštrikčných miest. Veľkosť genómu je asi 35,4 kb aje rozdelený do 100 mapových jednotiek - m.u. (1 m.u. = = 0,35 kb). Expresná kazeta p53 nahradila oblasť E1 (1,3 až
9,2 m.u.) genómu Ad5. Printer 1 je umiestnený v prvom introne za hlavným promótorom génu IE ľudského CMV. Printer 2 je umiestnený v skorom polyadenylačnom signáli SV40. Oba priméry vo vzdialenosti na oboch koncoch 15 až 20 bp od insertu cDNA p53 definujú produkt PCR 1,40 kb. Priméry 3 a 4 sú umiestnené v miestach 11 m.u., resp. 13,4 m.u. genómu Ad5, ktoré definujú produkt PCR 0,86 kb, špecifický pre vírusový génom.
Obr. 2B znázorňuje výsledky analýzy produktov PCR na agarózovom géli. V každej reakcii boli použité dva páry primérov, ktoré definujú fragmenty DNA 1,4 kb (p53) a 0,86 kb (Ad5). Ako templáty DNA boli v jednotlivých reakciách použité: plazmid pEC53 (pruh 1), DNA Ad5/RSV/GL2 (pruh 2), žiadna DNA (pruh 3) a DNA Ad5CMV-p53 (pruh 4). Pruh označený M zodpovedá markerom molekulovej hmotnosti.
Obr. 2C znázorňuje reštrikčné mapovanie DNA Ad5CMV-p53. Vzorky DNA Ad5CMV-p53, čistené gradientom CsCl, boli digerované bez enzýmu (U), s Hind III (H), Bam III (B), Eco RI (E) a Cla I (C) a analyzované na 1 % agarózovom géli. Pruhy označené M sú markery molekulovej hmotnosti.
Obr. 3A, 3B, 3C a 3D znázorňujú výsledky pozorovania cytopatických efektov (CPE) na bunky 293 vplyvom rekombinačného adenovírusu. Tieto obrázky predstavujú sériu mikroskopických snímok s fázovým rozhraním (x 400) buniek 293. Ide o štyri panely jedného obrázka. Obr. 3A zobrazuje stav pred transfekciou, obr. 3B negatívnu kontrolu v deň 12 po transfekcii, obr. 3C nástup CPE v deň 12 po transfekcii a obr. 3D úplný CPE v deň 14 po transfekcii.
Obr. 4A, 4B, 4C a 4D znázorňujú imunohistológiu buniek infikovaných rekombinačnými adenovírusmi. Tieto obrázky predstavujú sériu imunohistologických snímok buniek H358. Ide o štyri panely obrázka, znázorňujúceho neúčinnosť Ad5CMV-p53 v bunkách H358. Bunky H358 boli infikované počas 24 hod. pomocou Ad5CMV-p53 alebo Ad5/RSV/GL2 v množstve 50 PFU (jednotiek tvoriacich plaky)/bunku. Ako simulácia bola použitá infekcia len médiom. Infikované bunky boli analyzované imunofarbením. Obr. 4A predstavuje simulovanú infekciu, sondovanú protilátkou proti p53. Obr. 4B predstavuje bunky infikované kontrolou Ad5/RSV/GL2 a sondované protilátkou proti p53. Obr. 4C predstavuje bunky infikované Ad5CMV-p53, sondované nepríbuznou protilátkou (MOPC-21). Obr. 4D predstavuje bunky infikované Ad5CMV-p53, sondované protilátkou proti p53. Ako protilátka proti p53 bola použitá Pab 1801 a na farbenie bola použitá metóda avidin-biotin.
Obr. 5A znázorňuje gél SDS-PAGE, farbený Coomasie blue, porovnávajúci relatívnu úroveň expresie exogénneho p53 v bunkách H358. Po 24 a 72 h od infekcie boli pripravené vzorky buniek H358, ktoré boli infikované 30 PFU/bunku Ad5CMV-p53 alebo Ad5/RSV/GL2. Obrázok predstavuje farbenie výsledkov analýzy SDS-PAGE pomocou Coomasie blue, znázorňujúci relatívne množstvo nanesených vzoriek proteínov. Pruhy 1 a 4 obsahujú vzorky buniek infikovaných Ad5/RSV/GL2. Pruhy 2 a 3 obsahujú vzorky buniek, infikovaných 24 hod. po infekcii dvoma jednotlivými kultúrami Ad5CMV-p53. Pruhy 5 a 6 predstavujú vzorky buniek, infikovaných Ad5CMV-p53, odobrané po 72 hod. od infekcie. Pruh 7 predstavuje simulovane infikovanú vzorku H358 72 hod. po infekcii. Pruh M predstavuje vopred sfarbené markery molekulovej hmotnosti v kDa (G1BCO-BRL).
Obr. 5B predstavuje analýzu westemovým prenosom pri rovnakých pruhoch gélu ako v prípade SDS-PAGE na obr. 5A. Relatívne úrovne expresie p53 boli analyzované
SK 283364 Β6 westemovým prenosom pomocou anti-p53. Ako primárne protilátky boli použité monoklonálne protilátky proti proteínu p53 (PAb 1801, Oncogene Science Inc.) a β-aktínu (Amersham Inc.). Druhá protilátka, konjugovaná s HRP (chrenovou peroxidázou), a vyvíjač ECL boli od Amersham Inc. Vírusovo infikované bunky H358 boli analyzované westernovým prenosom. Westernový blot na obr. 5B má ekvivalentnú schému a poriadok ako na obr. 5A.
Obr. 6A a 6B predstavujú časový· priebeh expresie p53, stanovený westemovým prenosom. Niekoľko misiek buniek H358 bolo infikovaných 10 PFU/bunku Ad5CMVp53. V označených časových bodoch od infekcie boli pripravené bunkové lyzáty. Westernový prenos bol sondovaný súčasne s protilátkou proti p53 a proti aktínu. Pruhy označené „C“ znázorňujú negatívne kontroly. Histogram predstavuje relatívne množstvá p53, zistené denzitometrom.
Obr. 7A znázorňuje krivku rastu vírusovo infikovaných buniek ľudskej rakoviny pľúc bunkových línii H358. Bunky boli inokulované na misky v množstve 105 buniek na misku (60 mm) a 6 misiek na bunkovú líniu. Po 24 h boli bunky infikované Ad5CMV-p53 alebo Ad5/RSV/GL2 v množstve 10 m.o.i. (početnosť infekcie, multiplicity of infection, t. j. PFU/bunku). Po infekcii boli bunky počas 6 dní denne sčítané. Krivky rastu predstavujú údaje získané zo štyroch jednotlivých štúdií.
Obr. 7B znázorňuje krivku rastu vírusovo infikovaných buniek ľudskej rakoviny pľúc bunková línia H322. Bunky boli inokulované na misky v množstve 105 buniek na misku (60 mm) a 6 misiek na bunkovú líniu. Po 24 hod. boli bunky infikované Ad5CMV-p53 alebo Ad5/RSV/GL2 v množstve 10 m.o.i. (početnosť infekcie, multiplicity of infection, t. j. PFU/bunku). Po infekcii boli bunky počas 6 dní denne sčítané. Krivky rastu predstavujú údaje získané zo štyroch jednotlivých štúdií.
Obr. 7 C znázorňuje krivku rastu vírusovo infikovaných buniek ľudskej rakoviny pľúc bunková línia H460. Bunky boli inokulované na misky v množstve 105 buniek na misku (60 mm) a 6 misiek na bunkovú líniu. Po 24 hod. boli bunky infikované Ad5CMV-p53 alebo Ad5/RSV/GL2 v množstve 10 m.o.i. (početnosť infekcie, multiplicity of infection, t. j. PFU/bunku). Po infekcii boli bunky počas 6 dní denne sčítané. Krivky rastu predstavujú údaje získané zo štyroch jednotlivých štúdií.
Obr. 8 predstavuje vývojový diagram testov Ad5CMVp53 v modeli ortotopickej rakoviny pľúc. V diagrame je zhrnuté dávkovanie a schéma ošetrenia holej myši, inokulovancj bunkami H226Br a vírusmi.
Obr. 9A, 9B, 9C a 9D predstavujú vzorky rezov pľúc a mezihrudí ošetrených a kontrolných myší. Obr. 9A, 9B, 9C a 9D sú štyri panely jedného obrázka. Myši boli usmrtené na konci šesťtýždňového obdobia, nasledujúceho po ošetrení. Bolo vyrezané pľúcne a mediastinálne tkanivo na hodnotenie vzniku nádorov. Obr. 9A predstavuje vzorku mediastinálneho bloku z normálnej holej myši, obr. 9B predstavuje vzorku mediastinálneho bloku z myši ošetrenej vehikulom (PBS), obr. 9C predstavuje vzorku mediastinálneho bloku z myši ošetrenej AdSCMV-p53 a obr. 9D predstavuje vzorku mediastinálneho bloku z myši ošetrenej Ad5/RSV/GL2. Šípky označujú hmoty nádorov.
Obr. 10A znázorňuje vplyv trvalého vystavenia účinkom CDDP na rýchlosť rastu rodičovských buniek H358 a buniek H358 infikovaných Ad-Luc a Ad-p53. Bunky H358 (1,5.103 buniek/jamku) boli duplicitne nasadené na 24jamkovú platňu. Po 24 hod. bolo pridaných 100 μΐ média, zásobného vírusu Ad-Luc (08 PFU/ml) alebo zásobného vírusu Ad-p53 (108 PFU/ml). Po ďalších 24 hod. inkubácie bolo médium, obsahujúce vírus, nahradené čerstvým médiom, obsahujúcim 10 pg/ml CDDP.
Obr. 10B znázorňuje výsledky 24 hod. vystavenia účinkom CDDP na rýchlosť rastu rodičovských buniek H358 a buniek H358 infikovaných Ad-Luc a Ad-p53. Bunky boli vystavené účinkom CDDP trvalo (obr. 10A) alebo počas 24 hod. s následným zotavením v médiu neobsahujúcom liečivo (obr. 10B). Bunky, ktoré zostali ako prilípajpca monovrstva, boli počas 5 dní hodnotené z hľadiska životaschopnosti meraním absorpcie tryptanovej modrej. Je uvedená stredná hodnota +/- SA. Počet buniek skupiny Ad-p53:CDDP v deň 5 sa v prípade obr. 10A i 10B významne líši od všetkých ostatných skupín (p < 0,05 podľa Študentovho t-testu).
Obr. 10C zobrazuje vplyv rôznych koncentrácií CDDP na životaschopnosť buniek H358, infikovaných Ad-p53. Po 24 hod. vystavení účinkom vírusu Ad-Luc a Ad-p53 boli bunky podrobené na 24 hod. pôsobeniu 0,10 alebo 100 (pg/ml CDDP a potom bola hodnotená životaschopnosť.
Obr. IIA znázorňuje nukleozomálnu fragmentárnu DNA v bunkách H358, infikovaných Ad-p53, vystavených účinku CDDP. Bunky boli infikované a ošetrované 24 hod. CDDP, ako je opísané pre obr. 10.
Obr. 11B, 1 IC, 1 ID, 1 ΙΕ, 11F a 1 IG znázorňujú bunky H358, kultivované na komorových sklíčkach, infikované počas 24 hod. Ad-p53, ďalších 24 hod. ošetrované CDDP a fixované na značenie fragmentácie DNA in situ. Sú znázornené rodičovské bunky H358 bez CDDP (obr. 11B), rodičovské bunky H358 s CDDP (obr. 1 IC), bunky infikované Ad-Luc bez CDDP (obr. 11 D), bunky infikované Ad-Luc s CDDP (obr. 11 E), bunky infikované Ad-p53 bez CDDP (obr. 11 F) a bunky infikované Ad-p53 s CDDP (obr. 11 G). Šípka označuje príklad tmavo farbených nukleárnych fragmentov. Úsečka = 100 pm.
Obr. 12A znázorňuje vplyv kombinácie infekcie Ad-p53 a pôsobenia CDDP na sféroidy nádorov H358. Viacbunkové nádorové sféroidy buniek H358 boli pripravené skôr opísaným postupom (Takahashi a d., 1989). V deň 0 boli sféroidy s priemerom 150 až 200 pm umiestnené na 24-jamkovú platňu, povlečenú agarom, a vystavené počas 24 hod. pôsobeniu Ad-p53 alebo Ad-Luc. V deň 1 bolo po odstránení média, obsahujúceho vírus, pridané médium s 10 pg/ml CDDP. V deň 2 po 24 hod. inkubácii bol prekryv nahradený 1 ml čerstvého média bez liečiva. Pomocou inverzného mikroskopu boli zmerané kolmé priemery. Relatívna zmena objemu bola vypočítaná podľa vzorca a2 x x b/a|’ x bb kde a, resp. b je najmenší, resp. najväčší priemer sféroidu a ai a b, sú tieto priemery v deň 1. Len relatívny objem sféroidov Ad-p53/CDDP je významne menší (p < 0,05 podľa Študentovho t-testu) než pri kontrolnej skupine Cti).
Obr. 12B, 12C, 12D a 12E zobrazujú značenie dUIP in situ pomocou TdT na detekciu apoptózy. Sféroidy H358 boli v deň 3 fixované a farbené spôsobom opísaným v odseku Materiály a metódy v príklade 7. Obr. 12B znázorňuje kontrolný neošetrený sféroid, obr. 12C sféroid ošetrený CDDP, obr. 12D sféroid infikovaný Ad-p53 a obr. 12E sféroid infikovaný Ad-p53 a ošetrený CDDP. Úsečka = 100 pm.
Obr. 13A znázorňuje indukciu apoptózy účinkom CDDP po infekcii in vivo pomocou Ad-p53, merané zmenami objemu nádoru. Bunky H358 (5.106) v 0,1 ml Hankovho vyváženého roztoku soli boli injekčné subkutánne zavedené do pravého boku myších samíc BALB/c nu/nu. Po tridsiatich dňoch bolo do nádorov s priemerom 5 až 6 mm injekčné zavedené 200 pl samotného média alebo média obsahujúceho Ad-Luc (108 PFU/ml) alebo Ad-p53(108
PFU/ml). Bola vykonaná intratumorálna injekcia (100 μΐ) a peritumorálna injekcia na dvoch protiľahlých miestach (po 50 μΐ). CDDP (3 mg/kg) alebo kontrolný fyziologický roztok bol podávaný intraperitoneálne. Nádory boli merané kaliperom v dvoch kolmých priemeroch bez znalosti ošetrovaných skupín a objem nádoru bol vypočítaný za predpokladu guľového tvaru a výpočtom stredného priemeru nádoru ako druhej odmocniny súčinu priečnych priemerov. V každej ošetrovanej skupine bolo použitých päť myší a je uvedená stredná hodnota +/- SA. Dáta boli analyzované pomocou Študentovho t-testu. Šípky ukazujú deň ošetrenia. Sú uvedené dve nezávislé stanovenia (test 1 na obr. 13A-1, test 2 na obr. 13A-2). V teste 1 bolo p < 0,05 odo dňa 5 a v teste 2 bolo p < 0,05 odo dňa 7.
Obr. 13B, 13C, 13D a 13E znázorňujú histologické štúdie s použitím techniky značenia biotin-dUTP pomocou TdT. Nádory boli odobraté 5 dní po začatí liečby a okamžite uložené do zmesi O.C.T. Zmrazené tkanivá boli narezané v kryostate na hrúbku 5 pm. Rezy boli ošetrené 1 pg/ml proteinázy K a farbené spôsobom opísaným pre obr. 12. Zobrazené sú nádory H358 ošetrené samotným CDDP (obr. 13B), samotným Ad-p53 (obr. 13C) a Ad-p53 v kombinácii s CDDP (obr. 13D, 13E). Úsečky = 0,5 mm. Všetka starostlivosť o zvieratá sa vykonávala v súlade s UT M.D. Anderson Institutional Animal Čare and Use Committee.
Teraz budú podrobnejšie opísané výhodné uskutočnenia vynálezu.
A. Molekulárne deje vo vývoji rakoviny pľúc
Štúdie uskutočňované pôvodcami objavili kritické molekulárne deje, vedúce k vývoju a postupu rakoviny. To umožnilo pôvodcom vyvinúť nové metódy obnovovania určitých normálnych proteínových funkcií, aby mohol byť malígny fenotyp potlačený in vivo.
Najbežnejšia histológia rakoviny pľúc (80 %) sa zahrnuje pod názov „nemalobunková rakovina pľúc“ (nonsmall-cell lung cancer, NSCLC) a zahrnuje ploché, adenokarcinómové a nediferencované veľké bunky. Veľká časť súčasných údajov ohľadne molekulárnej biológie rakoviny pľúc pochádza zo štúdia menej bežnej malobunkovej rakoviny pľúc (SCLC). SCLC je možné odlíšiť od NSCLC pomocou neuroendokrinných charakteristík buniek; SCLC silne reaguje na chemoterapiu, ale po skončení liečby sa rýchle obnovuje. NSCLC môže slúžiť tiež ako model pre iné typy epiteliálnej rakoviny, vyvolanej karcinogénmi. Prístupy a pozorovania, vyvinuté v tejto štúdii, môžu byť použiteľné na iné typy epiteliálnej rakoviny.
Bol zhromaždený dostatok dôkazov o tom, že proces malígnej transformácie je sprostredkovaný genetickým paradigmatom. Hlavné lézie, detegované v rakovinových bunkách, sa vyskytujú v dominantných onkogénoch a supresorových génoch. Dominantné onkogény majú zmeny v skupine génov, nazývanej pretoonkogény, ktoré sa zúčastňujú kritických funkcií normálnej bunky vrátane transdukcie a transkripcie signálu. Primáme modifikácie dominantných onkogénov, ktoré dodávajú schopnosť transformácie, zahrnujú bodové mutácie, translokácie, preskupenia a amplifikáciu. Zdá sa, že supresorové gény vyžadujú na to, aby došlo k transformácii, homozygnú stratu funkcie mutácii, delécií alebo ich kombinácií. Niektoré supresorové gény sa javia ako hrajúce rolu v ovládaní proliferácie reguláciou transkripcie. Modifikácia expresie dominantných onkogénov a supresorových onkogénov pravdepodobne ovplyvňuje určité charakteristiky buniek, ktoré prispievajú k malígnemu fenotypu.
Navzdory rastúcim znalostiam mechanizmov, zúčastňujúcich sa transformácie sprostredkovanej onkogénmi, do šlo k malému pokroku vo vývoji terapeutických stratégií, špecificky cielených na onkogény a ich produkty. Pôvodne bol výskum v tejto oblasti zameraný na dominantné onkogény, pretože tie boli najskôr charakterizované. Štúdie prenosu génov sprostredkovaného DNA ukázali, že po prenose DNA z malígnych ľudských nádorov získajú normálne bunky malígny fenotyp.
B. p53 a mutácie p53 pri rakovine
V súčasnosti sa p53 uznáva ako supresorový gén (Montcnarh, 1992). Jeho vysoké hladiny boli nájdené v mnohých bunkách, transformovaných chemickou karcinogenézou, ultrafialovým žiarením a niektorými vírusmi vrátane SV40. Gén p53 je častým cieľom mutačnej inaktivácie v najrôznejších ľudských nádoroch a už bolo dokumentované, že je najčastejšie mutovaným génom pri bežných ľudských rakovinách (Mercer, 1992). Je mutovaný z viac než 50 % v prípade ľudskej NSCLC (Hollestein a d., 1991) a v širokom spektre ďalších nádorov.
Gén p53 kóduje fosfoproteín s 375 aminokyselinami, ktorý môže tvoriť komplexy s hostiteľskými proteínmi, ako je veľký T antigén a E1B. Tento proteín sa nachádza v normálnych tkanivách a bunkách, ale v koncentráciách, ktoré sú v porovnaní s transformovanými bunkami alebo s nádorovým tkanivom nepatrné. Je zaujímavé, že štandardný p53 sa javí ako významný pri regulácii rastu a delenia buniek. Hyperexpresia štandardného p53 sa v niektorých prípadoch prejavila ako antiproliferatívna v bunkových líniách ľudských nádorov. Tak môže p53 fungovať ako negatívny regulátor bunkového rastu (Weinberg, 1991) a môže priamo potlačovať nekontrolovaný rast buniek alebo nepriamo aktivovať gény, ktoré tento rast potlačujú. Absencia alebo inaktivácia štandardného p53 teda môže prispieť k transformácii. Niektoré štúdie však ukazujú, že na plné uplatnenie transformačného potenciálu génu môže byť nutná prítomnosť mutantného p53.
Aj keď sa štandardný p53 uznáva ako centrálne významný regulátor rastu v mnohých typoch buniek, zdá sa, že rolu hrajú i jeho genetické a biochemické rysy. Pre gén p53 sú obvyklé mutácie s chybným zmyslom, ktoré sú podstatné pre transformačnú schopnosť onkogénu. Karcinogénny p53 môže vzniknúť v dôsledku jedinej genetickej zmeny spôsobenej bodovou mutáciou. Je však známe, že na rozdiel od iných onkogénov sa bodové mutácie p53 vyskytujú v aspoň 30 rozdielnych kodónoch, často tvoriacich dominantne alely, ktoré vyvolávajú posuny vo fenotype bunky bez poklesu homozygozity. Navyše sa zdá, že mnoho týchto dominantných negatívnych alel je v organizme tolerovaných a odovzdáva sa v zárodkovej línii. Rôzne mutantné alely sa javia v rozmedzí od minimálne dysfunkčných po silne penetrujúce dominantné negatívne alely (Weinberg, 1991).
Casey a kolegovia uvádzajú, že transfekcia DNA. kódujúcej štandardný p53, do dvoch bunkových línií ľudskej rakoviny prsníka obnoví v týchto bunkách supresnú kontrolu rastu (Casey a d., 1991). Podobný účinok bol demonštrovaný tiež na transfekcii štandardného, ale nie mutantného p53 do bunkových línií ľudskej rakoviny pľúc (Takahasi a d., 1992). p53 sa javí ako dominantný nad mutantným génom a pri transfekcii do buniek s mutantným génom bude selektovať proti proliferácii. Normálna expresia transfikovaného p53 neovplyvňuje rast buniek s endogénnym p53. Také konštrukty teda môžu byť prijaté normálnymi bunkami bez nepriaznivých účinkov.
Je teda možné, že liečba rakovín spojených s p53 pomocou štandardného p53 môže znížiť počet malígnych buniek. Štúdie, ako sú opísané, však majú na dosiahnutie ta kého cieľa ďaleko, v nemalej miere preto, že transfekciu DNA nie je možné použiť na zavádzanie DNA do rakovinových buniek vnútri pacientovho tela.
C. Techniky génovej terapie
Doteraz existuje pre génovú terapiu niekoľko experimentálnych prístupov, ale každý má svoje nevýhody (Mulligan, 1993). Ako je uvedené skôr, existujú základné metódy transfekcie, pri ktorých sa DNA, obsahujúca príslušný gén, zavádza do buniek nebiologický, napríklad fyzikálnou alebo chemickou permeabilizáciou bunkovej membrány. Tento prístup je prirodzene obmedzený na bunky, ktoré môžu byť dočasne vyňaté z tela a môžu tolerovať cytotoxicitu takého ošetrenia, t. j. lymfocyty. Na transfekciu môžu byť použité lipozómy alebo proteínové konjugáty, tvorené s niektorými lipidmi a amfofilnými peptidmi, ale účinnosť integrácie génu je stále veľmi nízka a dosahuje rádovo jeden prípad integrácie na 1 000 až 100 000 buniek a expresia transfikovaných buniek je často obmedzená na dni v proliferujúcich bunkách alebo týždne v neproliferujúcich bunkách. Transfekcia DNA teda úplne zjavne nie je vhodnou metódou liečby rakoviny.
Druhý prístup ťaží z prirodzenej schopnosti vírusov vstupovať do buniek a prinášať so sebou vlastný genetický materiál. Retrovírusy sú sľubné ako vektory na dodávanie génov v dôsledku svojej schopnosti integrovať svoje gény do genómu hostiteľa, prenášať veľké množstvo cudzieho genetického materiálu, infikovať široké spektrum druhov a bunkových typov a byť obaľované v špeciálnych bunkových líniách. Praktickému využitiu retrovírusových vektorov však bránia tri hlavné problémy. Po prvé, infektivita retrovírusu závisí od dostupnosti vírusových receptorov na cieľovom povrchu. Po druhé, retrovírusy sa účinne integrujú len do replikujúcich sa buniek. A konečne, retrovírusy sa ťažko koncentrujú a čistia.
D. Adenovírusové konštrukty na použitie v génovej terapii
Ľudské adenovírusy sú nádorové vírusy s dvojvláknovou DNA s veľkosťami genómu približne 36 kb (Tooza, 1981). Ako modelový systém na eukaryotickú expresiu génov boli adenovírusy široko študované a dôkladne charakterizované, čo z nich robí príťažlivý systém na vývoj adenovírusu ako systému prenosu génov. Táto skupina vírusov sa jednoducho kultivuje, jednoducho sa s ňou manipuluje a vykazuje široké rozmedzie hostiteľov in vitro i in vivo. V lyticky infikovaných bunkách sú adenovírusy schopné ukončiť syntézu hostiteľského proteínu, usmerniť bunkový aparát tak, aby syntetizoval veľké množstvá vírusových proteínov, a produkovať veľké množstvá vírusu.
Oblasť El genómu zahrnuje E1A a E1B, ktoré kódujú proteíny zodpovedajúce za reguláciu transkripcie vírusového genómu a tiež niekoľkých bunkových génov. Expresia E2 vrátane E2A a E2B umožňuje syntézu vírusových replikačných funkcií, napríklad väzbového proteínu DNA, polymerázy DNA a terminálneho proteínu, ktorý je primerom replikácie. Génové produkty E3 bránia cytolýze cytotoxickými bunkami T a faktorom tumorovej nekrózy a zdajú sa dôležité na vírusovú propagáciu. Funkcie spojené s proteínmi E4 zahrnujú repiikáciu DNA, expresiu neskorého génu a zastavenie hostiteľskej bunky. Produkty' neskorého génu zahrnujú väčšinu virionových kapsidových proteínov a tie sú exprimované až potom, čo prebehne väčšia časť spracovania jediného primárneho transkriptu z väčšieho neskorého promótora. Väčší neskorý promótor (major late promótor, MLP) má vysokú účinnosť počas neskorej fázy infekcie (Stratford-Perricaudet a Perricaudet, 1991a).
Pretože sa zdá, že in cis je vyžadovaná len malá časť vírusového genómu (Tooza, 1981), ponúkajú vektory odvodené od adenovírusu vynikajúci potenciál na substitúciu veľkých fragmentov DNA pri použití v spojení s bunkovými líniami, ako sú bunky 293. Na získanie esenciálnych vírusových proteínov in trans bola vyvinutá ľudská embryonálna ľadvinová bunková línia transformovaná Ad5 (Graham a d., 1977). Z toho pôvodcovia usudzujú, že charakteristiky adenovírusov ich robia vhodnými na použitie pri cielení na rakovinové bunky in vivo (Grunhaus & Horwitz, 1992).
Zvláštne výhody adenovírusového systému na dodávanie cudzích proteínov do bunky zahrnujú (i) schopnosť nahradzovať relatívne veľké úseky vírusovej DNA cudzou DNA, (ii) štruktúrna stabilita rekombinačných adenovírusov, (iii) bezpečnosť podávania adenovírusov človeku a (iv) neexistencia známeho spojenia adenovírusovej infekcie s rakovinou alebo zhubným bujnením, (v) schopnosť dosiahnuť vysoké titre rekombinačného vírusu a (vi) vysokú infektivitu adenovírusu.
Ďalšie výhody adenovirusových vektorov oproti retrovírusom zahrnujú vyššie hladiny génovej expresie. Replikácia adenovírusu je navyše nezávislá od replikácie hostiteľského génu, na rozdiel od retrovírusových sekvencií. Pretože môžu byť jednoducho vypustené gény transformujúce adenovírus v oblasti El, a napriek tomu môžu byť získané účinné expresné vektory, predpokladá sa, že onkogénne riziko z adenovirusových vektorov je zanedbateľné (Grunhaus & Horwitz, 1992).
Prenosové systémy génu adenovirusom sú všeobecne založené na rekombinačnom adenovíruse, získanom inžinierstvom, ktorý je urobený replikačne inkompetentným vypustením časti svojho genómu, ako je El, a napriek tomu si zachováva kompetenciu pre infekciu. Ak sa v genóme adenovírusu vykonajú ďalšie delécie, môžu byť exprimované relatívne veľké cudzie proteíny. Napríklad adenovírusy s deléciami tak v oblasti El, ako aj E3 sú schopné niesť až 10 kb cudzej DNA a môžu byť pestované do vysokých titrov v bunkách 293 (Stratford-Perricaudeť a Perricaudet, 1991a). Prekvapujúco bola zaznamenaná tiež pretrvávajúca expresia transgénov po adenovírusovej infekcii.
Génový prenos sprostredkovaný adenovirusom bol nedávno skúmaný ako prostriedok sprostredkovania prenosu génov do eukaryotických buniek a do celých živočíchov. Napríklad pri ošetrovaní myší so vzácnou recesívnou genetickou poruchou nedostatku omitin transkarbamylázy (OTC) bolo zistené, že je možné použiť adenovírusové konštrukty na dodávanie normálneho enzýmu OTC. Expresia normálnej hladiny OTC však bola, žiaľ, dosiahnutá len v 4 zo 17 prípadov (Stratford-Perricaudeť a d., 1991 b). Pri väčšine myší teda došlo len k čiastočnej náprave defektu a ošetrenie neviedlo k fyziologickej alebo fenotypickej zmene. Výsledky tohto typu sú teda malým povzbudením na používanie adenovirusových vektorov v terapii rakoviny.
Pokusy použiť adenovírus na prenos génu na regulátor transmembránového vedenia cystickej fibrózy (CFTR) do pulmonálneho epitelu bavlníkových krýs boli tiež čiastočne úspešné, aj keď nebolo možné zhodnotiť biologickú aktivitu preneseného génu v epiteli zvierat (Rosenfeld a d., 1992). Tieto štúdie opäť demonštrujú génový prenos a expresiu proteínu CFTR v bunkách pľúcnych dýchacích ciest, ale nepreukázali fyziologický účinok. V článku v Science 1991 preukázali Rosenfeld a d. expresiu proteínu alantitrypsinu v pľúcach, ale opäť nepreukázali fyziologický účinok. Odhadli totiž, že úroveň expresie, ktorú pozorovali, bola len asi 2 % úrovne nutnej na ochranu pľúc u človeka,
t. j. bola ďaleko pod úrovňou nutnou pre fyziologický účinok.
Gén pre ľudský arantitrypsin bol zavedený intraportálnou injekciou do pečene normálnych krýs, kde bol exprimovaný a vyvolal sekréciu zavedeného ľudského proteínu do plazmy týchto krýs (Jaffe a d., 1992). Dosiahnuté hladiny však, žiaľ, neboli dosť vysoké, aby mali terapeutickú hodnotu.
Výsledky tohto typu nedemonštrujú, že by bol adenovírus schopný riadiť expresiu dostatočného množstva proteínu v rekombinačných bunkách na dosiahnutie fyziologicky relevantného účinku, a nevyplýva z nich teda vhodnosť adenovírusového systému na použitie v spojení s terapiou rakoviny. Okrem toho sa pred vznikom vynálezu usudzovalo, že p53 nemôže byť zabudovaný do obalovej bunky, aké sa napríklad používajú na prípravu adenovírusu, pretože by bola toxická. Pretože sa E1B adenovírusu viaže na p53, usudzovalo sa, že to je ďalší dôvod, prečo nie je možné kombinovať technológiu adenovírusu a p53.
E. Konštrukty p53-adenovírus a potlačovania nádorov
Vynález umožňuje génovú terapiu rakoviny s novým a účinnejším supresorovým vektorom. Tento rekombinačný vírus využíva výhody adenovírusových vektorov, ako je vysoký titer, široké rozmedzie cieľov, účinná transdukcia a neintegrácia do cieľových buniek. V jednom uskutočnení vynálezu je vytvorený replikačne defektný adenovírus nezávislý od pomocného prostriedku, ktorý exprimuje štandardný p53 (Ad5CMV-p53) pod kontrolou promótora ľudského cytomegalovírusu.
Ak je požadovaná expresia v cicavčích bunkách, sú kontrolné funkcie na expresných vektoroch často odvodené od vírusov. Napríklad obvykle používané promótory sú odvodené od polyomu, adenovírusu 2 a opičieho vírusu 40 (SV40). Zvlášť výhodné sú skorý a neskorý promótor vírusu SV40, pretože oba sa jednoducho z vírusu získavajú ako fragment, ktorý tiež obsahuje vírusový počiatok replikácie SV40. Je možné použiť i menšie alebo väčšie fragmenty SV40, pokiaľ obsahujú sekvenciu s približne 250 bp, siahajúcu od miesta Hind\\\ k miestu Bgl\, umiestnenému vo vírusovom počiatku replikácie. Okrem toho je tiež možné a často žiaduce používať promótorové alebo kontrolné sekvencie normálne asociované so zahrnutou génovou sekvenciou, pokiaľ sú tieto kontrolné sekvencie kompatibilné so systémami hostiteľskej bunky.
Počiatok replikácie môže byť vytvorený takou konštrukciou vektora, aby zahrnovala exogénny počiatok, aký môže byť napríklad odvodený z SV40 alebo iného vírusového zdroja (napríklad polyomového, adeno, VSV, BPV), alebo môže byť vytvorený chromozomálnym replikačným mechanizmom hostiteľskej bunky. Ak je vektor integrovaný do chromozómu hostiteľskej bunky, obvykle postačuje druhá možnosť.
Konštrukcia a propagácia výhodného adenovírusu p53 je schematicky znázornená na obr. 1. V súvislosti s tým bol vyvinutý zlepšený postup propagácie a identifikácie rekombinačného adenovírusu (diskutovaný ďalej). Po identifikácii bol rekombinačný vírus p53 štruktúrne potvrdený analýzou PCR, ako znázorňuje obr. 2. Po izolácii a potvrdení jeho štruktúry bol adenovírus p53 použitý na infikovanie bunkovej línie H358 ľudskej rakoviny pľúc, ktorá má homozygnú deléciu génu p53. Westemové bloty ukázali, že exogénny proteín p53 bol exprimovaný s vysokou hladinou (obr. 4 a obr. 5) a s vrcholom 3 dni po infekcii (obr. 6A a 6B).
V bunkovej línii H322 s bodovou mutáciou p53 bolo ďalej preukázané, že mutantný p53 bol regulačné oslabo vaný expresiou exogénneho p53. Ako experimentálna kontrola bol použitý virion (Ad5/RSV/GL2), ktorý mal štruktúrnu podobnosť s Ad5CMV-p53. Tento virion obsahoval v expresnej kazete virionu cDNA luciferázy, riadenú promótorom LTR vírusu Rousovho sarkómu. V bunkách infikovaných virionom Ad5/RSV/GL2 nebola detegovaná ani expresia p53, ani zmena expresie aktinu. Rast buniek H358, infikovaných Ad5CMV-p53, bol značne inhibovaný oproti neinfikovaným bunkám alebo bunkám infikovaným kontrolným virionom (obr. 7A). Rast buniek H322 bol tiež silne inhibovaný virionom p53 (obr. 7B), zatiaľ čo rast buniek H460 ľudskej rakoviny pľúc, obsahujúcich štandardný p53, bol ovplyvnený menej (obr. 7C).
Ad5CMV-p53 sprostredkovával silný inhibičný účinok na rast buniek rakoviny pľúc in vitro. Inhibícia rastu nebola taká evidentná, pokiaľ boli bunky infikované Ad5CMVp53 s početnosťou infekcie (multiplicity of infection, MOI) nižšou než 1 PFU/bunku, zatiaľ čo pri MOI vyššom než 100 PFU/bunku bola cytotoxicita pozorovaná i pri kontrolnom víruse Ad5/RSV/GL2. Pri našich štúdiách bola optimálna dávka na testy rýchlosti rastu 10 až 50 PFU/bunku. V tomto rozmedzí dávok bolo možné inhibíciu rastu buniek prisúdiť exprimovanému proteínu p53.
Testy na holej myši demonštrovali, že tumorigenicita buniek H358, ošetrených Ad5CMV-p53, bola silne inhibovaná. V myšom modeli ľudskej ortotopickej rakoviny pľúc boli tumorigénne bunky H226Br s bodovou mutáciou v p53 intratracheálne inokulované 3 dni pred ošetrením vírusom. Intratracheálnym zavedením Ad5CMV-p53 bolo v tomto modelovom systéme zabránené tvorbe nádoru, z čoho vyplýva, že modifikovaný adenovírus je účinným vektorom na sprostredkovanie prenosu a expresiu supresorových génov v ľudských rakovinových bunkách a že vírus Ad5CMV-p53 môže byť ďalej vyvíjaný na terapeutický prostriedok na použitie v génovej terapii rakoviny.
Ako je demonštrované analýzou westernovým prenosom, sprostredkovával AdSCMV-p53 vysokú úroveň expresie génu p53 v bunkách ľudskej rakoviny pľúc. Exogénny proteín p53 bol v bunkách H460 približne 14-krát hojnejší než exogénny štandardný p53 a v bunkách H358 asi dva- až štyrikrát hojnejší než β-aktin ako vnútorná kontrola. Vysokú úroveň expresie je možné prisúdiť (1) vysoko účinnemu prenosu génov, (2) riadeniu cDNA p53 silným promótorom CMV a (3) zosilňovaniu transkripcie cDNA p53 adenovírusovým zosilňovačom El. Čas expresie p53 po infekcii bol v bunkách H358 viac než 15 dní. Po 5. Postinfekčnom dni však došlo k rýchlemu zníženiu expresie. Analýza vzoriek DNA z infikovaných buniek H358 pomocou PCR ukázala pokles hladiny vírusovej DNA so zníženou hladinou proteínu, čo ukazuje na úbytok vírusovej DNA počas trvajúceho rastu rakovinových buniek in vitro.
Pokles expresie p53 mohol byť spôsobený tiež bunkovou atenuáciou promótora CMV, ktorý kontroluje expresiu p53, pretože už skôr bol zaznamenaný jav zastavenia promótora CMV sprostredkovaného hostiteľskou bunkou (Dai a d., 1992). Adenovírusové vektory sú neintegratívne vektory prenosu génov, a trvanie génovej expresie teda závisí od veľkého počtu faktorov, zahrnujúcich hostiteľské bunky, prenesené gény a relevantný promótor. Crystal a spolupracovníci preukázali, že 6 týždňov po infekcii je v epiteliálnych bunkách bavlníkovej krysy detegovateľná nízka úroveň expresie génu CFTR (Rosenfeld a d., 1992). Perricaudetovo laboratórium demonštrovalo minimálne trvanie expresie génu mmidystrofmu v mdx myšom svale počas viac než 3 mesiacov po infekcii. Krátkodobá vysoká úroveň expresie štandardného proteínu p53, pozorovaná v tejto štúdii, môže mať po ošetrení Ad5CMV-p53 in vivo priaznivý úči
SK 283364 Β6 nok znižovania možných vedľajších účinkov na normálne bunky.
Tu opísané štúdie naznačujú, že rekombinačný adenovírus p53 má vlastnosť potlačovania nádorov, pôsobiacu, ako sa zdá, obnovovaním funkcie proteínu p53 v nádorových bunkách. Tieto výsledky poskytujú podporu na použitie virionu Ad5CMV-p53 ako terapeutického prostriedku na liečbu rakoviny.
F. Prostriedky poškodzujúce DNA
Podľa vynálezu je možné používať rôzne prostriedky poškodzujúce DNA, napríklad prostriedky, ktoré priamo DNA sieťujú, prostriedky, ktoré sa do DNA zabudovávajú interkaláciou a prostriedky, ktoré vedú k chromozomálnym a mitotickým anomáliám ovplyvňovaním syntézy nukleovej kyseliny.
Predpokladá sa, že tu opisované prostriedky, ktoré priamo sieťujú nukleové kyseliny, konkrétne DNA, vyvolávajú poškodenie DNA, vedúce k synergickej antineoplastickej kombinácii. Môžu byť používané prostriedky ako cisplatina a iné prostriedky alkylácie DNA. Cisplatina sa široko používa na liečenie rakoviny v klinickej aplikácii s použitím účinných dávok 20 mg/m2 počas 5 dní každé tri týždne celkom po tri cykly. Cisplatina nie je absorbovaná orálne, a musí byť preto podávaná intravenóznou, subkutánnou, intratumorálnou alebo intraperitoneálnou injekciou.
Prostriedky, ktoré poškodzujú DNA, zahrnujú tiež zlúčeniny, ktoré interferujú s replikáciou DNA, mitózou a chromozomálnou segregáciou. Príklady týchto zlúčenín zahrnujú adriamycín, známy tiež ako doxorubicin, etoposid, verapamil, podofyllotoxín a pod. Pri klinickej terapii neoplazmov sa tieto zlúčeniny podávajú intravenózne v bolusových injekciách v dávkach v rozmedzí 25 až 75 mg/m* v 21-denných intervaloch pre adriamycín, 35 až 50 mg/m2 intravenózne pre etoposid alebo orálne v dvojnásobnej dávke.
Prostriedky, ktoré narušujú syntézu a vernosť prekurzorov nukleových kyselín a podjednotiek, tiež vedú k poškodeniu DNA. Ako také boli vyvinuté početné prekurzory nukleových kyselín. Zvlášť výhodné sú prostriedky, ktoré boli podrobené rozsiahlym testom a sú ľahko dostupné. Medzi nimi sú neoplastickým tkanivom prednostne využívané také látky, ako je 5-fluorouracil (5-FU), ktorý je teda zvlášť vhodný na delenie na neoplastické bunky. Aj keď je značne toxický, je 5-FU použiteľný v širokom rozmedzí nosičov, vrátane topických, ale obvykle sa používa intravenózna aplikácia s dávkami v rozmedzí 3 až 15 mg/kg/deň.
Ďalšie faktory, ktoré spôsobujú poškodenie DNA a široko sa používajú, zahrnujú prostriedky všeobecne známe ako γ-lúče, lúče X a/alebo riadené dodávanie rádioizotopov do nádorových buniek. Predpokladajú sa tiež ďalšie formy faktorov poškodzujúcich DNA, ako sú mikrovlny a UV žiarenie. Je veľmi pravdepodobné, že všetky tieto faktory vyvolávajú v širokom rozsahu poškodenie prekurzorov DNA, replikácie a opravy DNA a zostavovanie a udržiavanie chromozómov. Dávkovanie lúčov X sa pohybuje od denných dávok 50 až 200 rontgenov po určitý čas (3 až 4 týždne) do jednorazovej dávky 2 000 až 6 000 rontgenov. Rozmedzie dávok rádioizotopov je veľmi premenlivé a závisí od polčasu rozpadu izotopu, sily a typu vysielaného žiarenia a od príjmu neoplastickými bunkami.
Skúsený odborník sa odkazuje na „Remington's Pharmaceutical Sciences“, 15. vyd., kapitola 33, predovšetkým stránky 624 až 652. K určitej obmene dávkovania nutne dochádza v závislosti od stavu ošetrovaného subjektu. Osoba zodpovedná za podávanie prostriedku by mala v každom prípade stanoviť príslušnú dávku pre individuálny subjekt.
Pri podávaní ľuďom by preparáty navyše mali vyhovovať štandardom ohľadne sterility, pyrogenicity, všeobecnej bezpečnosti a čistoty, vyžadovaným FDA Office of Biologics standards.
G. Ošetrenie p53 a cisplatinou
S cieľom stanovenia účinnosti kombinácie terapie náhrady génov a chemoterapie pri ľudskej rakovine pôvodcovia zisťovali, či môže postupné podávanie Ad-p53 a CDDP vyvolať apoptózu in vivo. Po 3 dňoch priameho intratumorálneho injekčného podávania Ad-p53 alebo intraperitoneálneho podávania CDDP vykazovali nádory H358, implantované subkutánne myšiam nu/nu, mierne spomalenie rastu. Ak ale boli Ad-p53 a CDDP podávané súčasne, došlo k čiastočnej regresii nádorov a veľkosť nádorov zostala štatisticky významne menšia než v ktorejkoľvek inej ošetrovanej skupine. Inhibičný účinok na rast bol ešte výraznejší po dvoch cykloch ošetrení (obr. 13A). Histologickým vyšetrením bola zistená masívna deštrukcia nádorových buniek v oblasti, kde bol Ad-p53 injekčné zavádzaný myšiam ošetrovaným CDDP. Farbením in situ bolo demonštrovaných mnoho apoptotických buniek okolo acelulámych priestorov (obr. 13B až 13E). Naproti tomu nádory ošetrované samotným CDDP alebo samotným Ad-p53 nevykazovali ani acelularitu, ani apoptotické oblasti.
Vynález opisuje novú stratégiu ľudskej génovej terapie v kombinácii s konvenčnou chemoterapiou s použitím prostriedku sieťujúceho DNA. Rezistencia nádorových buniek proti chemoterapeutikám predstavuje veľký problém klinickej onkológie. Aspoň 80 % prípadov rakoviny pľúc má na svedomí NSCLC; pacienti s NSCLC však všeobecne nereagujú na chemoterapiu (Doyle, 1993). Jedným z cieľov súčasného výskumu rakoviny je nájsť spôsoby, ako zlepšiť účinnosť terapie rakoviny náhradou génov, skúmaním interakcie medzi génovým produktom a chemoterapeutikami. Gén tymidin kinázy herpes simplex (HS-tK), dodávaný do mozgových nádorov retrovírusovým vektorovým systémom, úspešne vyvolával vnímavosť proti antivirusovému prostriedku ganciclovírusu (Culver a d., 1992). Génový produkt HS-tK je exogénny vírusový enzým, zatiaľ čo v normálnych tkanivách je exprimovaný proteín wt-p53, z čoho by vyplývalo, že modulácia chemorezistencie zmenami v expresii wt-p53 by mohla byť alternatívnym prístupom, používajúcim dráhu, sprostredkovanú endogénnym genetickým programom.
Adenovírusový systém má potenciálnu výhodu pre dodávanie génu in vivo, ako je jednoduchosť produkcie vírusu s vysokým titrom, vysoká účinnosť infekcie a infektivita pre mnoho typov buniek. Stabilita a doba expresie zavedeného génu sú však stále kontroverzné. Na chemogénovú terapiu môže byť vysoká hladina expresie a vysoká infektivita významnejšia než doba expresie, pretože infikované bunky je možné pomocou liečiv usmrtiť za niekoľko dní. K zvýšeniu hladiny p53 v bunkách, ktoré sú citlivé na chemoterapeutiká, môže dôjsť do 6 hod. po stimule poškodzujúcom DNA (Fritsche a d., 1993, Zhan a d., 1993), aj keď zvýšenú aktivitu p53 na viazanie DNA je možné zvrátiť počas 4 hod., ak sa odstráni stimul (Tishler a d., 1993). V modeli podľa vynálezu je expresia génu wt-p53 riadená nezávisle cytomegalovírusovým promótorom obsiahnutým vo vektore Ad-p53. Je teda možné udržať vysokú hladinu expresie p53 aj po prerušení expozície liečiva. Expresia proteínu wt-p53 pomocou Ad-p53 kulminuje v deň 3 po infekcii (14-krát viac než pri endogénnom štandardnom type) a do dňa 9 klesá na nízku hodnotu (Zhang a d., 1993). Z toho vyplýva, že prechodne vysoká hladina expresie p53 je dostatočná na iniciáciu cytotoxického programu v rakovinovej bunke.
H. Pacienti a postup liečby
Pôvodcovia usudzujú, že regionálne dodanie adenovírusových konštruktov génu p53 do buniek rakoviny pľúc pri pacientoch s rakovinami súvisiacimi s p53, ako sú neresektovateľné obštruktívne endobronchiálne rakoviny, bude veľmi účinnou metódou dodávania terapeuticky účinného génu, pôsobiaceho proti klinickému ochoreniu. Dodávanie génu p53 má prebiehať v kombinácii s prostriedkami alebo faktormi, ktoré vedú k poškodeniu DNA. Tento kombinovaný prístup je významným zlepšením z hľadiska súčasných terapií rakoviny, napríklad straty citlivosti na samotnú cisplatinu, ktoré spočívajú v snahe usmrtiť alebo odstrániť poslednú rakovinovú bunku vyvolaním poškodenia DNA. Keďže je potvrdeným javom pokojové štádium nádorových buniek, je účinné usmrcovanie vysoko nepravdepodobné.
Predpokladá sa, že absorpcia adenovírusových konštruktov bunkami NSCLC zníži rýchlosť proliferácie týchto buniek, ale príklady uskutočnenia demonštrujú, že kombinované použitie prostriedku alebo faktora poškodzujúceho DNA s adenovírusom p53 vedie k výraznému zníženiu rastu buniek a veľkosti nádorov, ktoré sa neprejavuje pri žiadnom z týchto faktorov samotné. Prípravky a spôsoby podľa vynálezu silne prispievajú k predĺženiu času, počas ktorého zostanú napadnuté pľúca expandované, zabráni sa opätovnému rastu nádoru a deleniu nádorových buniek a predĺži sa prežitie pacienta.
Pre tento kombinovaný postup sa predpokladajú pacienti s recidivujúcim neresektovateľným endobronchiálnym nádorom, ktorý čiastočne alebo úplne upcháva dýchacie cesty, pri ktorých zlyháva alebo nie sú schopní prijať externú rádioterapiu. Súčasné terapie tohto stavu ponúkajú len krátkodobú úľavu. Väčšina pacientov navzdory externej rádioterapii recidivuje. Niekedy je možné zaviesť brachyterapeutický katéter a aplikovať ďalšiu rádioterapiu, intravenóznu aplikáciu prostriedkov poškodzujúcich DNA. Pacienti ošetrovaní súčasnými metódami majú stredné prežitie 6 mesiacov. Pacienti, pri ktorých brachyterapia zlyhala, by mohli byť tiež vhodní na génovú terapiu. Nádor je možné z dýchacích ciest odstrániť laserom alebo bioptickou pinzetou. To je možné uskutočňovať v spojení s injekciou adenovírusových konštruktov, čím sa zníži objem, ktorý’ musí byť vstreknutý. Podávanie vírusových konštruktov nebráni, aby pacient prijímal inú paliatívnu terapiu, ak nádor postupuje.
I. Iné metódy prenosu génov
Účinná génová terapia všeobecne vyžaduje integráciu génu, schopného opraviť genetickú poruchu, do hostiteľského genómu, kde koexistuje a replikuje sa s hostiteľskou DNA a je exprimovaný v hladine, ktorá kompenzuje defektný gén. Ideálne sa choroba vylieči jedným alebo niekoľko málo ošetreniami bez vážnych vedľajších účinkov. Dosiaľ bolo navrhnutých niekoľko prístupov ku génovej terapii, ktoré je možné použiť podľa vynálezu.
Prvý prístup spočíva v transfekcii DNA obsahujúcej príslušný gén do buniek, napríklad chemickou alebo fyzikálnou pcrmeabilizáciou bunkovej membrány. Tento prístup je všeobecne obmedzený na bunky, ktoré môžu byť dočasne vyňaté z tela a môžu tolerovať cytotoxicitu ošetrení (t. j. lymfocyty). Na transfekciu in vivo môžu byť použité lipozómy alebo bielkovinové konjugáty s určitými lipidmi a amfofilnými peptidmi (Stewart a d., 1992, Torchilin a d., 1992, Zhu a d., 1993), ale súčasná účinnosť génovej integrácie je veľmi nízka. Odhaduje sa, že daný gén sa inte gruje do genómu len jednej bunky z 11 000 až 100 000. Pri absencii integrácie je expresia transfikovaného génu obmedzená na niekoľko dní v proliferujúcich bunkách alebo niekoľko týždňov v neproliferujúcich bunkách v dôsledku degradácie neintegrovaných DNA.
Druhý prístup využíva prirodzenou schopnosť vírusov vstupovať do buniek a prinášať so sebou vlastný genetický materiál. Sľubnými vektormi pre dodávanie génov sú retrovírusy v dôsledku svojej schopnosti integrovať svoje gény do hostiteľského genómu za súčasného prenosu veľkého množstva cudzieho genetického materiálu, infikovať široké spektrum druhov a typov buniek a byť obaľované v špeciálnych bunkových líniách (Miller, 1992).
Tretia metóda využíva iné vírusy, ako je adenovírus, vírusy herpes simplex (HSV), cytomegalovírus (CMV) a adeno-asociovaný vírus (AAV), ktoré sú konštruované tak, aby slúžili ako vektory na génový prenos. Aj keď niektoré vírusy, ktoré môžu prijímať cudzí genetický materiál, majú obmedzený počet nukleotidov, môžu sa prispôsobiť a v rozmedzí buniek, ktoré infikujú, preukazujú tieto vírusy úspešný priebeh génovej expresie. Adenovírusy však svoj genetický materiál do hostiteľského genómu neintegrujú, a teda na génovú expresiu nevyžadujú replikáciu hostiteľa, takže sa ideálne hodia na rýchlu, účinnú expresiu heterológnych génov.
Aj keď je vynález opísaný do určitej miery konkrétne, je zrejmé, že odborník môže na základe uvedeného opisu uskutočňovať rôzne alternatívy, modifikácie a obmeny. Vynález je koncipovaný tak, že všetky tieto alternatívy, modifikácie a obmeny, ktoré sú súčasťou myšlienky vynálezu, patria do rozsahu pripojených patentových nárokov.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Na demonštráciu výhodných uskutočnení vynálezu sú uvedené príklady. Odborníkovi je zrejmé, že metódy opísané v nasledujúcich príkladoch, predstavujú metódy overené pôvodcami ako vhodné na uskutočňovanie vynálezu, a teda je možné ich považovať za výhodné uskutočnenia vynálezu. Na základe opisu vynálezu však je odborníkovi zrejmé, že konkrétne opísané uskutočnenia je možné s podobnými alebo analogickými výsledkami rôzne obmieňať bez toho, aby sa prekročila myšlienka a rozsah vynálezu.
Príklad 1
Konštrukcia expresného vektora p53
Tento príklad opisuje konštrukciu expresného vektora p53. Tento vektor je konštruovaný opísaným spôsobom a používa sa na nahradenie oblasti El (1,3 až 9,2 m.u.) genómom kmeňa Ad5 adenovírusu a na konštrukciu adenovírusového virionu podľa príkladu 2.
Expresná kazeta p53, znázornená na obr. 1, ktorá obsahuje promótor ľudského cytomegalovírusu (CMV) (Boshart a d., 1985), cDNA p53 a skorý polyadenylačný signál SV40, bola vložená do pXCJLl (poskytnutý Dr. Frankom L. Grahamom, McMaster University, Kanada) medzi miesta Xba I a Cla 1.
Veľkosť genómu je asi 35,4 kb a je rozdelený na 100 mapových jednotiek (m.u., 1 m.u. = 0,35 kb). Expresná kazeta p53 nahradila oblasť El (1,3 až 9,2 m.u.) genómu Ad5.
Primer 1 má sekvenciu 5'-GGCCCACCCCCTTGGCTTC-3' (SEQ ID NO:1) a je umiestnený v prvom introne za hlavným promótorom génu IE ľudského CMV (Boshart a d., 1985). Primer 2 má sekvenciu 5’-TTGTAACCATTATAAGCTGC-3' (SEQ ID NO:2) a je umiestnený v skorom polyadenylačnom signáli SV40. Oba tieto primery, na oboch koncoch vo vzdialenosti 15 až 20 bp od insertu cDNA p53, definujú produkt PCR s veľkosťou 1,40 kb. Primér 3 má sekvenciu 5'-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3' (SEQ ID NO:3) a primér 4 sekvenciu 5'-CATCTGAACTCAAAGCGTGG-3' (SEQ ID NO:4) a sú umiestnené vo vzdialenosti 11, resp. 13,4 m.u. genómu Ad5, takže definujú produkt PCR, špecifický pre vírusový genóm, s veľkosťou 0,86 kb.
Príklad 2
Tvorba a propagácia rekombinačného adenovírusu p53
Tento príklad opisuje jednu z metód, vhodných na vytvorenie rekombinačných adenovírusov, nezávislých od pomocného prostriedku, exprimujúcich p53. Molekulárna stratégia, použitá na produkciu rekombinačného adenovírusu, je založená na skutočnosti, že vzhľadom na obalový limit adenovírusu pJM17 sám osebe nemôže tvoriť vírus. Homológne rekombinácie medzi plazmidom expresného vektora p53 a pJM17 v transfikovanej bunke teda vedú k životaschopnému vírusu, ktorý môže byť obaľovaný len v bunkách, ktoré exprimujú potrebné adenovírusové proteíny.
Postup podľa tohto príkladu používa bunky 293 ako hostiteľské bunky na propagáciu vírusov, ktoré obsahujú substitúcie expresných kaziet heterológnej DNA v oblastiach EI alebo E3. Tento postup vyžaduje kotransfekciu DNA do buniek 293. Transfekcia do značnej miery určuje účinnosť vírusovej propagácie. Pred vznikom vynálezu sa na transfekciu DNA do buniek 293 obvykle používala koprecipitácia fosforečnan vápenatý/DNA (Graham a van der Eb, 1973). Táto metóda spolu s plakovým testom je ale pomerne náročná a často má za následok nízku účinnosť vírusovej propagácie. Ako je vysvetlené v tomto príklade, transfekcia a následná identifikácia infikovaných buniek boli významne zlepšené použitím lipozómami sprostredkovanej transfekcie, ak boli transfikované bunky identifikované podľa cytopatického efektu (CPE).
Bunková línia 293 bola uchovávaná v Dulbeccovom modifikovanom minimálnom esenciálnom médiu, doplnenom 10 % teplom inaktivovaného konského séra. Expresný vektor p53 a plazmid pJM17 (McGrory a d., 1988) na homológnu rekombináciu boli kotransfikované do buniek 293 DOTAP-sprostredkovanou transfekciou podľa výrobného protokolu (Boehringer Mannheim Biochemicals, 1992). Schematicky je to znázornené na obr. 1.
Bunky 293 (pasáž 35, 60 % konfluencie) boli inokulované 24 hod. pred transfekciou buď na miskách 60 mm alebo na 24-jamkových platniach. Bunky v každej jamke boli transfikované 30 μΐ DOTAP, 2 pg expresného vektora p53 a 3 pg plazmidu pJM17. Po transfekcii bolo bunkám každé 2 až 3 dni doplňované médium MEM do nástupu CPE.
Príklad 3
Potvrdenie identity rekombinačného adenovírusu
Tento príklad osvetľuje nový test pomocou polymerázovej reakcie (PCR) na potvrdenie identity rekombinačných virionov po kotransfekcii príslušnej bunkovej línie.
Alikvoty supernatantov bunkovej kultúry (50 až 370 μΐ) boli odobraté z testovacích platní, ošetrené počas 1 h pri 56 °C proteinázou K (50 pg/ml s 0,5 % SDS a 20 mM EDTA), extrahované zmesou fenol-chloroform a nukleové kyseliny boli vyzrážané etanolom. Pelety DNA boli resuspendované vo 20 μΐ dH2O a použité ako templát na amplifikáciu PCR. Relatívne polohy primérov PCR sú znázornené na obr. 1, kde sú tiež uvedené ich sekvencie ako SEQ ID NO: 1, 2, 3 a 4. Priméry špecifické pre insert cDNA definujú produkt PCR s veľkosťou 1,4 kb a priméry špecifické pre vírusový génom definujú produkt PCR s veľkosťou 0,86 kb. Reakcie
PCR boli uskutočňované v objeme 50 μΐ, obsahujúcom 4 mM MgCl2, 50 mM KC1, 0,1 % tritonu
X-100, 200 uM každého dNTP, 10 mM Tris-Cl (pH 9,0), 2 μΜ každého priméru a 1,0 jednotky polymerázy Taq (Promega). Reakcie boli uskutočňované 0,5 min pri 94 “C, 0,5 min. pri 56 °C a 1 min. pri 72 °C počas 30 cyklov.
Na zjednodušenie postupu identifikácie novopropagovaných rekombinačných vírusov bol vyvinutý priamy test PCR vzoriek DNA zo supematantu bunkovej kultúry. Alikvoty (50 alebo 370 μΐ) supematantu prostredia bunkovej kultúry' s CPE boli ošetrené proteinázou K a extrakciou zmesou fenol/chloroform. Po vyzrážaní etanolom boli vzorky DNA analyzované pomocou PCR s použitím dvoch párov primérov pre amplifikáciu sekvencii, špecifických pre insert a špecifických pre vírusový genóm. Ciele primerov PCR a ich sekvencie sú znázornené na obr. 1. Primerom 1, 2, 3 a 4 prislúchajú sekvencie s označením SEQ ID NO: 1,2, 3 a 4.
Ako výsledok bol amplifikovaný insert cDNA s veľkosťou 1,4 kb a fragment vírusového genómu s veľkosťou 0,86 kb z expresného vektora (pozitívna kontrola) a vzorka DNA pozitívnej bunkovej kultúry (obr. 2B, pruh 1, resp. 4). Zo vzorky DNA vírusu Ad5/RSV/GL2 bol amplifikovaný len fragment 0,86 kb (negatívna kontrola, pruh 2). V prípade PCR reakcií s použitím supematantu kultivačného média oboch neošetrených pozitívnych bunkových kultúr neboli získané amplifíkované pásy (pruh 3).
Tieto výsledky naznačili, že adenovírusy, vylučované do kultivačného média buniek, sú detegovateľné pomocou PCR už s použitím len 50 μΐ supematantu kultivačného média na prípravu templátov DNA. Tieto výsledky umožnia vývoj kvantitatívnej metódy na použitie tejto techniky na stanovovanie titrov adenovírusu, tradične uskutočňovanému pomocou plakových testov.
Sekvencia cDNA štandardného p53 vo víruse Ad5CMV-p53 bola potvrdená sekvenovaním dideoxy DNA na vírusový DNA, čistenej gradientom CsCl. Kontrolný vírus Ad5/RSV/GL2, vytvorený podobným spôsobom, má štruktúru podobnú ako Ad5CMV-p53 s výnimkou toho, že v jeho expresnej kazete bol použitý vírusový promótor Rousovho sarkómu a cDNA luciferázy. Rekombinačný adenovírus, ktorý nesie (3-galaktosidázový gén E. coli (LacZ), Ad5CMV-LacZ, má tiež podobnú štruktúru ako Ad5CMVp53 a je možné ho získať postupom opísaným v Zhang a d., a od Dr. Franka L. Grahama (pozri Graham ad., 1991).
Zásoba vírusov, titer a infekcie. Jednotlivé klony vírusov Ad5CMV-p53, Ad5CMV/RSV/GL2 a Ad5CMV-LacZ boli získané čistením plakov spôsobom podľa Grahama a Preveca (1991). Jednotlivé vírusové klony boli propagované v bunkách 293. Kultivačné médium buniek 293, vykazujúce úplný cytopatický efekt, bolo odobraté a odstredené počas 10 min. pri 1 000 g. Zhromaždené supernatanty boli rozdelené na alikvoty a skladované ako zásoba vírusov pri 20 °C. Vírusové titry boli stanovené platovými testmi (Graham a Prevec, 1991). Infekcia bunkových línií bola uskutočňovaná prídavkom roztokov vírusov (0,5 ml na misku 60 mm) k bunkovým monovrstvám a inkubáciou pri teplote miestnosti počas 30 min. s krátkym zamiešaním každých 5 min. Potom nasledoval prídavok kultivačného média a návrat infikovaných buniek do inkubátora s teplotou 37 °C.
Účinnosť prenosu génov pomocou rekombinačných adenovírusov bola hodnotená tiež s použitím Ad5CMV-LacZ v rôznych bunkových líniách, ako je H226Br, H322, H460, HeLa, Hep G2, LM2 a Vero. Pri farbení s použitím X-gal sa všetky bunkové línie po infekcii Ad5CMV-LacZ v množstve MOI 30 PFU/bunku sfarbili z 97 až 100 % modro.
Príklad 4
Expresia génu p53 riadená Ad5CMV-p53 v bunkách ľudskej rakoviny pľúc
Tento príklad opisuje použitie rekombinačného adenovírusu p53 na infekciu buniek ľudskej rakoviny pľúc s homozygnou deléciou génu p53. Výsledky ukazujú, že rast týchto buniek a expresia mutantného p53 boli potlačené, čo ukazuje, že virion Ad5CMV-p53 môže byť vhodným prostriedkom na kontrolu metastatických buniek.
Imunohistochémia bola vykonaná na monovrstvách infikovaných buniek, ktoré boli fixované 3,8 % formalínu a na 5 min. podrobený pôsobeniu 3 % H2C2 v metanole. Imunohistochemická analýza bola vykonaná pomocou súpravy Vectastain Elite (Vector, Burlingame, C A). Ako primárna protilátka bola použitá protilátka proti p53 PAb 1801 (Oncogene Science, Manhasset, NY); MOPC-21 (Organon Teknika Corp., West Chester, PÁ) bol použitý ako negatívna kontrola. Druhou protilátkou bol avidinom značený proti-myší IgG (Vector). Komplexné činidlo ABC s biotinylovanou chrenovou peroxidázou bolo použité na detekciu komplexu antigén-protilátka. Nakoniec boli bunky dofarbené Harrisovým hematoxylinom (Sigma) a zaliate Cytosealom 60 (Stephens Scientiflc, Riverdale, NJ).
Bola vykonaná imunohistochemická analýza infikovaných bunkových línií na zistenie in situ expresie p53 riadenej promótorom CMV vírusu Ad5CMV-53. V bunkovej línii H358, ktorá má homozygnú deléciu p53, bolo imunohistochemickou analýzou zistené, že gén p53 bol prenesený s 97 až 100 % účinnosťou, ak boli bunky infikované Ad5CMV-p53 s MOI 30 až 50 jednotiek tvoriacich plaky na bunku (PFU/bunku; obr. 4).
Vysoká účinnosť prenosu rekombinačného adenovírusu bola potvrdená pomocou vírusu Ad5CMV-LacZ, ktoiý nesie gén LacZ prepísaný promótorom IE ľudského CMV. Pri hodnote MOI 30 až 50 PFU/bunku boli všetky skúmané bunky, zahrnujúce bunkové línie HeLa, Hep G2, LM2 a ľudskej rakoviny NSCLC, pri farbení X-gal z 97 až 100 % pozitívne na b-galaktosidázovú aktivitu. Tieto výsledky naznačujú, že adenovírusové vektory sú účinným prostriedkom prenosu génov do ľudských rakovinových buniek.
Analýza westernovým prenosom bola uskutočňovaná na totálnych bunkových lyzátoch, pripravených lyžovaním monovrstvy buniek v miskách vzorkovým pufrom SDSPAGE (0,5 ml na misku 60 mm) po premytí buniek fosfátom pufrovaným salinickým roztokom (PBS). Na analýzu SDS-PAGE boli na pruhy nanesené bunkové lyzáty ekvivalentné 5.104 buniek (10 až 15 ml). Proteíny v géli boli prenesené na membránu Hybond™-ECL (Amersham, Arlington Heights, IL). Membrány boli blokované PBS s 0,5 % sušeného mlieka a sondované s primárnymi protilátkami: monoklonálnou myšou protilátkou proti ľudskému p53 PAb 1801 a monoklonálnou myšou protilátkou proti ľudskému β-aktinu (Amersham), premyté a sondované so sekundárnou protilátkou: králičím proti-myším IgG, konjugovaným s chrenovou peroxidázou (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Membrány boli vyvíjané podľa zlepšeného chemiluminiscenčného protokolu fy Amersham. Relatívne množstvá exprimovaného exogénneho p53 boli stanovené densitometrom (Molecular Dynamics Inc., Sunnyvale, CA).
Westernový prenos ukázal, že exogénny proteín p53 bol exprimovaný s vysokou úrovňou (obr. 5A, pruhy 2, 3 a 5, 6). Proteín kulminoval 3 dni po infekcii (obr. 6A a 6B, insert, deň 0,5 až 3). Ako kontrola bol konštruovaný virion s podobnou štruktúrou ako rekombinačný Ad5CMV-p53 podľa príkladu 1. Tento virion obsahuje luciferázovú cDNA, riadenú v expresnej kazete virionu promótorom LTR vírusu Rousovho sarkómu. V bunkách infikovaných virionom Ad5/RSV/GL2 nebola detegovaná ani expresia p53, ani zmena expresie aktinu.
Rekombinačný adenovirus p53 bol použitý na infekciu troch bunkových línií NSCLC ľudských pľúc: bunková línia H358, ktorá má homozygnú deléciu génu p53, bunková línia H322, ktorá má bodovú mutáciu génu p53 v kodóne 248 (G na T) a bunková línia H460, ktorá má gén štandardného p53. Rýchlosť rastu ľudských buniek NSCLC bola stanovená po inokulácii II322 a IT460 (1.105) alebo H358 (2.105) v 60mm kultivačných miskách 24 hod. pred vírusovou infekciou. Bunky boli infikované pomocou vírusov s početnosťou infekcie (MOI) 10 PFU/bunku. Kultivačné médium bolo použité ako simulovaná kontrola infekcie. 1. až 6. deň po infekcii boli odčítané tri kultúry pre každú bunkovú líniu s rôznym ošetrením.
Rast buniek H358, infikovaných Ad5CMV-p53, bol silne inhibovaný oproti neinfikovaným bunkám alebo bunkám infikovaným kontrolným virionom (obr. 7A). Rast buniek H322 bol tiež silne inhibovaný virionom p53 (obr. 7B), zatiaľ čo pri bunkách H460 ľudskej rakoviny pľúc obsahujúcich štandardný p53 bol ovplyvnený do nižšieho stupňa (obr. 7C). Rast buniek H358 infikovaných vírusom Ad5CMV-p53 bol inhibovaný zo 79 %, zatiaľ čo pri neinfikovaných bunkách alebo bunkách infikovaných kontrolným vírusom nebol inhibovaný. Rast bunkovej línie H322, ktorá má bodovú mutáciu v p53, bol pomocou Ad5CMVp53 inhibovaný zo 72 %, zatiaľ čo pri bunkovej línii H460, obsahujúcej štandardný p53, bol ovplyvnený menej (28 % inhibícia).
Tieto výsledky ukazujú, že rekombinačný adenovirus p53 má potlačovanie nádorov prostredníctvom obnovovania funkcie proteínu p53 v nádorových bunkách.
Príklad 5
Ad5CMV-p53 pri liečbe p53-deficitných buniek
Tento príklad sa týka použitia rekombinačného adenovírusu p53 na obnovovanie potlačovania rastu nádorových buniek in vitro, a teda na liečbu malígneho alebo metastatického rastu buniek. Opisuje niektoré predpokladané spôsoby použitia vynálezu pri liečbe rakoviny génovou terapiou sprostredkovanou adenovírusom.
Bunky H358 boli infikované pomocou Ad5CMV-p53 a Ad5/RSV/GL2 v množstve MOI 10 PFU/bunku. Rovnaké množstvo buniek bolo ošetrené médiom ako simulovaná infekcia. 24 hod. po infekcii boli ošetrené bunky odobraté a premyté dvakrát PBS. Pri každom ošetrení bolo každej holej myši (Harlan Co., Houston, TX) injekčné s.c. zavedené 3.105 buniek v objeme 0,1 ml. Na každé ošetrenie bolo použitých päť myší. Myši boli pred injekciou ožarované (300 cGy, 60Co) a po injekcii každý týždeň vyšetrované. Tvorba nádorov bola hodnotená po skončení šesťtýždňovej doby a objem nádoru bol vypočítaný za predpokladu guľového tvaru so stredným priemerom nádoru vypočítaným ako druhá odmocnina súčinu prierezových priemerov.
Na stanovenie inhibičného účinku na tumorigenicitu, sprostredkovaného Ad5CMV-p53, boli nahým myšiam injekčné s.c. zavedené bunky H358 (bunka typu ľudské NSCLC) na vyvolanie neoplastického rastu. Každá myš dostala jednu injekciu buniek, ktoré boli infikované počas 24 hod. pomocou Ad5CMV-p53 alebo Ad5/RSV/GL2 v množstve 10 PFU/bunku. Ako kontrola simulovanej infekcie boli použité bunky H358 ošetrené len médiom. Nádory, hmatateľné až 14. deň po injekcii, boli vyvolané len bun kami, infikovanými simulovaným alebo kontrolným vírusom, ako ukazuje tabuľka 1.
Tabuľka 1
Účinok Ad5CMV-p53 na tumorigenicitu H358 pri nahých myšiach3
ošetrenie počet nádorov/počel myší (%) stredný objem (mm3 ± SD)
médium 4/5 (80) 37 ± 12
Ad5/RSV/GL2 3/4 (75) 30114
Ad5CMV-p53 0/4 (0) -
3 - Ošetrené bunky H358 boli injekčné s.c. zavedené v množstve 2.106 buniek/myš. Veľkosti nádorov boli stanovené po skončení 6 týždňov.
Ako je zrejmé z tabuľky 1, myši, ktoré dostali bunky, ošetrené Ad5CMV-p53, nevyvinuli nádory. Nádory mali po uplynutí 6 týždňov priemer 4 až 10 mm. Tento pokus bol začatý s piatimi myšami v skupine; po jednej myši v oboch skupinách Ad5CMV-p53 i Ad5/RSV/GL2 pokus nedokončilo. Predčasná smrť bola pravdepodobne dôsledkom nosokomiálnej infekcie.
Príklad 6
Ad5CMV-p53 pri liečbe rakoviny pľúc
Tento príklad sa týka použitia rekombinačného adenovírusu p53 na obnovu potlačovania rastu nádorových buniek in vivo, a teda na liečbu rakoviny živočíchov. Opisuje niektoré spôsoby, ktorými sa predpokladá použitie vynálezu pri liečbe rakoviny pomocou génovej terapie sprostredkovanej adenovírusom.
Účinnosť Ad5CMV-p53 pri inhibícii tumorigenicity bola ďalej hodnotená na myšom modeli ortotopickej ľudskej rakoviny pľúc. Pretože bunky H358 a H322 v tomto modeli neprodukovali nádory, bola použitá bunková línia H226Br. Tato bunková línia má pôvod v rakovine pľúc plochých buniek a metastázovala z pľúc do mozgu. H226Br má bodovú mutáciu (ATC na GTC) na exone 7, kodóne 254 génu p53 a je pre myši tumorigénny.
Postup testov na myšom modeli ortotopickej ľudskej rakoviny pľúc bol opísaný skôr (Georges a d., 1993). Stručne je možné povedať, že holé myši, ošetrené ožarovaním (300 cGy, 60Co) boli inokulované bunkami H226Br intratracheálnym podaním. Každá myš dostala 2.106 buniek v objeme 0,1 ml PBS. Po 3 dňoch od inokulácie bolo 10 myší na skupinu ošetrených intratracheálnym podaním 0,1 ml vírusov alebo vehikulá (PBS) raz denne počas dvoch dní. Bolo použité dávkovanie 5.107 vírusov Ad5CMV-p53 alebo Ad5/RSV/GL2 na myš. Myši boli usmrtené po uplynutí 6 týždňov. Tvorba nádorov bola hodnotená vyrezaním pľúcneho a mediastinálneho tkaniva a meraním veľkosti nádoru. Nádory boli potvrdené histologickou analýzou rezov nádorovej hmoty.
Ožiarené holé myši boli inokulované 2.106 buniek H226Br na myš intratracheálnym podaním. Od tretieho dňa po inokulácii bola každá z myši (8 až 10 myší na skupinu) ošetrovaná dva dni raz denne intratracheálnym podaním 0,1 ml buď Ad5CMV-p53 alebo Ad5/RSV/GL2 alebo vehikulá (PBS). Použitá dávka vírusu bola 5.107 PFU/myš. Tvorba nádoru bola hodnotená po uplynutí 6 týždňov vyrezaním pľúcneho a mediastinálneho tkaniva a meraním veľkosti nádoru. Prúdová schéma postupu je znázornená na obr. 7 a reprezentatívne vzorky rezov sú uvedené na obr. 8. Dctcgované nádory boli potvrdené histologickou analýzou. Údaje o meraní nádorov sú zhrnuté v tabuľke 2.
Tabuľka 2
Účinok Ad5CMV-p53 na tumorigenicitu H226Br v myšom modeli ortotopickej ľudskej rakoviny pľúc3
ošetrenie počet myší s nádormi/celkový počet myší (%) stredný objem (mm3 ± SD)
vehikulum 7/10(70) 3018,4
AÓ5/RSV/GL2 8/10(80) 2516,9
Ad5CMV.p53 2/8 (25) 8 ± 33*
3 - Myši boli inokulované intratracheálne 2.106 buniek H226Br na myš. Od 3. dňa po inokulácii bolo myšiam počas 2 dní raz denne intratracheálne podané vehikulum alebo vírusy (každého 5.107 v 0,1 ml). Tvorba nádoru bola hodnotená po uplynutí 6 týždňov.
b - p < 0,05 dvojstupňovou analýzou odchýlok oproti skupinám, ktoré dostávali vehikulum (PBS) aiebo kontrolný vírus
Len 25 % myši, ošetrených pomocou Ad5CMV-p53, vytvorilo nádory, zatiaľ čo v kontrolnej skupine s ošetrením vehikulom alebo Ad5/RSV/GL2 vytvorilo nádory 70 až 80 % ošetrených myší. Priemerná veľkosť nádoru v skupine s Ad5CMV-p53 bola významne menšia než v kontrolných skupinách. Tieto výsledky ukazujú, že Ad5CMV-p53 môže brániť bunkám H226Br vytvárať nádory v myšom modeli ortotopickej ľudskej rakoviny pľúc.
Príklad 7
Synergia medzi p53 a poškodením DNA
Biochemické znaky programovanej smrti buniek (apoptózy) majú charakteristickú schému ffagmentácie DNA, vznikajúcej štiepením jadrovej DNA. Nedávne štúdie demonštrovali, že vyvolanie apoptózy chemoterapeutikami alebo ionizačným žiarením môže mať vzťah k statusu génu p53 a že stimuly poškodzujúce DNA sú schopné zvyšovať intracelulárnu hladinu proteínu p53 v bunkách, ktoré sa nachádzajú v procese apoptózy (Lowe a d., 1993, Čiarke a d., 1993, Fritsche a d., 1993, Harper a d., 1993, El-Deiry a d., 1993). Inhibícia bunkového cyklu vo fáze Gj zvýšenými hladinami štandardného proteínu p53 (wt-p53) poskytuje viac času na opravy DNA; ak nie je možná optimálna oprava, môže p53 spustiť programovanú smrť bunky. p53 teda môže prispievať k vyvolaniu apoptotického usmrcovania nádorových buniek chemoterapeutikami.
Inaktivácia génu p53 mutáciou meniacou zmysel alebo deléciou je najbežnejšou genetickou zmenou u ľudských rakovín (Levine a d., 1991, Hollstein a d., 1991). Bolo zaznamenané, že strata funkcie p53 zvyšuje rezistenciu buniek voči rôznym chemoterapeutikám (Lowe a d., 1993). Štúdie pôvodcov ukázali, že bunky H358 ľudskej nemalobunkovej rakoviny pľúc (NSCLC), v ktorých sú vypustené obe alely p53, boli rezistentné voči chemoterapeutikám, zatiaľ čo bunková línia WTH226b, ktorá má endogénny wtp53, jednoducho mala apoptotickú smrť buniek 16 hod. po ošetrení cisplatinou (CDDP) a etoposidom (VP-16) (T. Fujiwara, E.A. Grimm. T. Mukhopadhyay, J.A. Roth, nepublikované údaje). Preto sa pôvodcovia snažili stanoviť, Či je zavedením génu wt-p53 do buniek H358 adenovírusovým vektorom možné zvýšiť citlivosť bunky voči CDDP ako prostriedku sieťujúcemu DNA in vitro a in vivo.
Materiály a metódy
Bunky H358 boli láskavo poskytnuté A. Gazdarom a J. Minnou (Takahashi a d., 1989).
Adenovírusové vektory
Konštrukcia a identifikácia rekombinačného adenovírusového vektora, ktorý obsahuje cDNA, kódujúcu ľudský wt-p53 (Ad-p53) alebo luciferázu (Ad-Luc), bola opísaná skôr (Zhang a d., 1993). Stručne je možné povedať, že expresná kazeta p53, ktorá obsahuje ľudský cytomegalovírusový promótor, cDNA wt-p53 a skorý polyadenylačný signál SV40, bola vložená do pXCJL. 1 medzi miesta Xba 1 a Cla 1. Kyvadlový vektor p53 a rekombinačný plazmid pJM17 boli kotransfikované do buniek 293 (Ad5-transformovaná ľudská zárodočná ľadvinová bunková línia) metódou sprostredkovania lipozómami. Supematant kultúry buniek 293, majúci úplný cytopatický efekt, bol zhromaždený a použitý pre následnú infekciu. Kontrolný vírus Ad-Luc bol generovaný podobným spôsobom. Vírusy Ad-p53 a Ad-Luc boli propagované v bunkách 293. Prítomnosť replikačne kompetentného vírusu bola vylúčená testmi buniek HeLa. Vírusové titre boli stanovené testmi na platniach (Grahamad., 1991).
Detekcia fragmentácie nukleozomálnej DNA
DNA bola izolovaná z rodičovských buniek, buniek infikovaných Ad-Luc a buniek infikovaných Ad-p53, ktoré boli alebo neboli ošetrené pomocou CDDP, inkubáciou buniek počas 6 hod. pri 55 °C v lýznom pufri (50 mM Tris-HC1, pH 8,0, 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 % SDS a 50 pg/ml proteinázy K). DNA bola extrahovaná dvakrát rovnakým objemom fenolu a raz zmesou chloroformizoamylalkohol (24 : 1) a potom vyzrážaná v etanole. Vzorky boli podrobené elektroforéze na 1,5 % agarózovom géli a vizualizované farbením etidiumbromidom.
TdT-sprostredkované značenie zlomového konca dUTP bolo vykonané skôr opísaným postupom (Gavrieli a d., 1992). Bunky v monovrstvc boli ošetrené 0,01 % NP-40. Podložné sklíčka bola ponorené do pufra TdT (30 mM TrisHCl, pH 7,2, 140 mM kakodylát sodný, 1 mM chlorid kobaltu) a inkubované 45 min pri 37 °C s biotinylovaným dUTP (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) a TdT. Sklíčka boli na 10 min prekryté 2 % bovinneho sérového albumínu a inkubované 30 min s avidin-biotinovým komplexom (Vectastain Elite Kit; Vector Laboratories, Burlingame, CA). Kolorimetrická detekcia bola vykonaná s použitím diaminobenzidinu.
Výsledky
Bunky H358 boli podrobené transdukcii in vitro cDNA ľudského wt-p53 vystavením účinkom Ad-p53. Analýza westernovým blottingom ukázala vysokú hladinu expresie proteínu wt-p53 už 24 h po infekcii Ad-p53, ale v rodičovských (neinfikovaných) bunkách alebo kontrolných bunkách infikovaných Ad-Luc nebol detegovaný žiadny wtp53 (dáta neznázornené). Súbežné imunohistochemické hodnotenie ukázalo detegovateľný proteín wt-p53 vo viac než 80 % infikovaných buniek, z čoho vyplýva, že prenos a expresia p53 pomocou Ad-p53 boli vysoko účinné (dáta neznázornené).
Trvalé vystavenie buniek H358 infikovaných Ad-p53 účinkom CDDP rýchle znížilo ich životaschopnosť, zatiaľ čo k významnej smrti u rodičovských buniek a buniek infikovaných Ad-Luc došlo až po 72 hod. vystavení CDDP (obr. 10A). Strata životaschopnosti bola silne podporená pri bunkách transdukovaných Ad-p53. Navyše bolo možné pozorovať zníženie životaschopnosti, aj keď boli bunky uchovávané v prostredí bez liečiva po 24 hod. vystavení jeho účinkom, z čoho vyplýva, že letálne poškodenie je možné vyvolať počas 24 hod. (obr. 10B). Citlivosť buniek H358 transdukovaných wt-p53 voči CDDP bola závislá od dávky (obr. 10C).
Internukleozomálny rebríček DNA, ukazujúci na fragmentáciu DNA, bol pri bunkách exprimujúcich wt-p53 zrejmý po 24 hod. vystavení účinkom CDDP; rodičovské bunky a bunky infikované Ad-Luc však fragmentáciu DNA nevykazovali (obr. 11 A). Značenie zlomového konca 2'-deoxyuridin-5’-trifosfátom (dUTP) a biotinom, sprostredkované terminálnou deoxynukleotidyltransferázou (TdT), ktoré deteguje fragmentáciu DNA charakteristickú pre apoptózu in situ, vykázalo mnoho apoptotických buniek v prípade buniek infikovaných Ad-p53, ošetrovaných počas 24 hod. CDDP, ako znázorňuje obr. 11 G, ktotý ukazuje tmavo sa farbiace jadrá a fragmenty jadier, nevyskytujúci sa na obr. 1 IB až 11 F.
Je známe, že zavedenie wt-p53 vyvoláva apoptózu pri niektorých typoch nádorových bunkových línií s vypusteným alebo mutovaným p53 (Yonish-Rouach ad., 1991, Shaw a d., 1992, Ramqvist a d., 1993). Samotná hypercxpresia wt-p53 však nemohla podporovať fragmentáciu DNA v p53-negatívnej bunkovej línii H358 (obr. 11), aj keď bol jej rast potlačovaný pôsobením Ad-p53 (obr. 10). To súhlasí s predchádzajúcim pozorovaním pôvodcov, že po prenose wt-p53 sprostredkovanom retrovírusmi je možné získať stabilné klony H358 a že tieto klony rastú pomalšie než rodičovské bunky (Cai a d., 1993).
Potenciálna terapeutická účinnosť kombinácie Ad-p53 a CDDP bola hodnotená z hľadiska relatívnej zmeny objemu sféroidov H358. Multicelulámy model nádorového sféroidu vykazuje in vitro histologickú štruktúru podobnú ako pri primárnych nádoroch a mikrometastáz. Ošetrenie CDDP vyvolalo zmenšenie relatívneho objemu Ad-p53-infíkovaných sféroidov H358, ale nemalo významný vplyv na rodičovské sféroidy alebo sféroidy infikované Ad-Luc (obr. 12A). TdT-sprostredkované značenie dUTP in situ ukázalo mnoho buniek v procese apoptózy na povrchu sféroidov infikovaných Ad-p53, zatiaľ čo na sféroidoch neinfikovaných Ad-p53 neboli zrejmé žiadne apoptotické bunky (obr. 12B až 12E). Pôvodcovia skôr uviedli, že retrovirálne sprostredkovaná expresia wt-p53 inhibovala rast sféroidov H322a, vyvolávaný transformujúcim rastovým faktorom a (TGF-a) (Fujiwara a d., 1993). Retrovírusový vektor však nemohol infikovať sféroidy H358, pretože bunky v týchto sféroidoch v reakcii na exogénny TGF-α rýchle neproliferovali. Zistenie, že vystavenie účinkom CDDP zmenšilo veľkosť sféroidov H358, infikovaných Ad-p53, vyvolaním apoptózy na povrchu, ukazuje na to, že Ad-p53 infikuje neproliferujúce bunky a že CDDP iniciuje apoptotický proces v pokojových bunkách.
Príklad 8
Použitie p53 a prostriedkov poškodzujúcich DNA v liečebných režimoch
Ako súčasť preklinických testov sú použité zvieracie modely, opísané ďalej a v príkladoch 5, 6 a 7. Potom je možné vykonať u pacientov, u ktorých bola stanovená indikácia liečby prenosom génov sprostredkovaným adenovírusom, test na prítomnosť protilátok zameraných proti adenovírusu. Ak sú protilátky prítomné a pacient má v anamnéze alergiu buď na farmakologické alebo prirodzene sa vyskytujúce látky, je indikovaná aplikácia skúšobnej dávky rádovo 103 až 106 rekombinačných adenovírusov za prísneho klinického dohľadu.
Na liečbu rakoviny pomocou Ad5CMV-p53 sa rekombinačný adenovírus exprimujúci p53 pod kontrolou vhodného promótora/zosilňovača transkripcie, ako je promótor CMV, pripraví a Čistí metódou, prijateľnou pre Úrad potra vín a liečiv (FDA) z hľadiska podávania ľudským subjektom. Také metódy zahrnujú, ale neobmedzujú sa na ne, odstreďovanie s gradientom hustoty chloridu cézneho s nasledujúcim testovaním účinnosti a čistoty.
Ako vhodné na liečbu pomocou adenovírusu p53 sa považujú dve základné metódy, priama alebo miestna aplikácia a celkovejšia aplikácia. Metódy podľa vynálezu sú vhodne na liečbu akéhokoľvek z rôznych druhov rakovín, o ktorých je známe, že súvisia s mutáciami p53. Pokiaľ sa týka celkovej aplikácie, ukázalo sa, že jedna intravenózna injekcia adenovírusu je postačujúca na vyvolanie vírusovej infekcie tkanív na miestach vzdialených od miesta injekcie (Stratford-Perricaudet a d., 1991 b), a je teda vhodná na liečbu všetkých zhubných bujnení súvisiacich s p53. Vírus môže byť pacientom podávaný intravenózne v akomkoľvek farmakologicky prijateľnom roztoku alebo infúzne po určitý čas. Všeobecne sa usudzuje, že účinný počet funkčných častíc vírusu, ktorý sa má aplikovať, sa pohybuje od 1.10‘°do5.1012.
Ďalej je možné, predovšetkým ak ide o rakovinu pľúc, použiť, ak je to žiaduce, priamejšie cielenú fyzickú aplikáciu rekombinačného adenovírusu, analogicky k intratracheálnej aplikácii CFTR (Rosenfeld a d., 1992). Dochádza tak k uvoľňovaniu rekombinačného adenovírusu p53 bližšie k miestu cieľových buniek.
Metódy
Značenie dUTP in situ s TdT na detekciu apoptózy
Sféroidy H358 boli fixované v deň 3 a farbené, ako je uvedené v príklade 7. Stručne povedané značené sondy TdT boli uvedené do styku so sklíčkami ponorenými v pufri TdT a inkubovaná s biotinylovaným dUTP a TdT 45 min pri 37 °C. Sklíčka boli na 10 min. prekryté 2 % bovinného sérového albumínu a 30 min. inkubovaná s komplexom avidin-biotin. Kolorimetrická detekcia bola vykonaná s použitím diaminobenzidinu.
Indukcia apoptózy pôsobením CDDP po infekcii Ad-p53 in vivo
Bunky H358 (5.106) v 0,1 ml Hankovho vyváženého soľného roztoku boli subkutánne injekčné zavedené do pravého boku samice myši nu/nu BALB/c. Po 30 dňoch bolo 200 ul média samotného alebo média obsahujúceho Ad-Luc (108 PFU/ml) alebo Ad-p53 (10 PFU/ml) injekčné zavedené do nádorov s priemerom 5 až 6 mm. Bola vykonaná intratumorálna injekcia (100 μΐ) a peritumorálna injekcia na dvoch protiľahlých stranách (po 50 pl). Intraperitoneálne bol podaný CDDP (3 mg/kg) alebo kontrolný fyziologický roztok. (A) Zmeny objemu nádorov. Nádory boli merané kaliperom vo svojich kolmých priemeroch bez znalosti ošetrovaných skupín a objem nádoru bol vypočítaný za predpokladu guľového tvaru a výpočtom stredného priemeru nádoru ako druhej odmocniny súčinu priečnych priemerov. V každej ošetrovanej skupine bolo použitých päť myší a je uvedená stredná hodnota +/- SA. Dáta boli analyzované pomocou Študentovho t-testu. Šípky ukazujú deň ošetrenia. Sú uvedené dve nezávislé stanovenia. V teste 1 bolo p < 0,05 odo dňa 5 a v teste 2 bolo p < 0,05 odo dňa
7. Histologické štúdie s použitím techniky značenia biotin-dLITP pomocou TdT. Nádory boli odobraté 5 dní po začatí liečby a okamžite uložené do zmesi O.C.T. Zmrazené tkanivá boli narezané v kryostate na hrúbku 5 pm. Rezy boli ošetrené 1 pg/ml proteinázy K a farbené opísaným spôsobom. Všetka starostlivosť o zvieratá sa vykonávala v súlade s UT M.D. Anderson Institutional Animal Čare and Use Committee.
Výsledky
S cieľom demonštrácie in vivo účinnosti spôsobov a prípravkov na základe kombinácie terapie génovej náhrady a chemoterapie pri ľudskej rakovine pôvodcovia skúmali, či postupné podanie Ad-p53 a CDDP môže vyvolať apoptózu in vivo. 3 dni po priamej intratumorálnej injekcii Ad-p53 alebo intraperitoneálnom podaní CDDP mali nádory H358, implantované subkutánne myšiam nu/nu, mierne spomalenie rastu. Keď však boli Ad-p53 a CDDP podané súčasne, nádory čiastočne ustúpili a veľkosť nádorov zostala štatisticky významne menšia než pri ktorejkoľvek inej ošetrovanej skupine. Inhibičný účinok na rast bol ešte výraznejší po dvoch cykloch ošetrenia (obr. 13A). Histologické vyšetrenie ukázalo masívnu deštrukciu nádorových buniek v oblasti, kde bol Ad-p53 zavedený myšiam ošetreným CDDP. Farbenie in situ ukázalo mnoho apoptotických buniek okolo acclulámych priestorov (obr. 13B až 13E). Naproti tomu nádory ošetrené samotným CDDP alebo samotným Ad-p53 nevykazovali ani acelularitu, ani apoptotické oblasti.
Podrobnejšie je možné uviesť, že výhodné postupy liečby je možné vyvíjať podľa nasledujúcich kritérií, najprv je možné pacienta podrobiť bronchoskopii na zistenie stupňa obštrukcie. Endoskopicky by mala byť vyrezaná čo najväčšia makroskopická časť nádoru. Bronchoskopia by mala byť prednostne uskutočňovaná s miestnym alebo celkovým umŕtvením. Bioptickým kanálom bronchoskopu sa prevlečie transbronchiálna aspiračná ihla Stifcortm (21 g). Do miesta zvyškového nádoru sa potom vstriekne adenovírus p53 v malom objeme, napríklad asi 10 ml alebo menej.
Pretože použitý adenovírus je replikačne inkompetentný, v žiadnom prípade neprichádza do úvahy škodlivý vplyv vírusu samotného na zdravotný stav subjektu. Pacienti však zostanú počas liečby hospitalizovaní aspoň počas 48 hod., aby bolo možné monitorovať akútne a oneskorené nepriaznivé reakcie. Bezpečnostné hľadiská používania replikačne deficitného adenovírusu ako vehikula pre génový prenos u človeka boli riešené v minulosti (Rosenfeld a d., 1992, Jaffe a d., 1992), ale s cieľom minimalizovať nepriaznivé vedľajšie účinky by mala byť aplikovaná dávka adenovírusu príslušne monitorovaná.
Existujú rôzne kritériá, ktoré treba považovať za indikáciu existencie potreby odpovede alebo existencie toxicity. Ako pomocné stanovenie existencie toxicity by pred začatím terapie alebo v jej priebehu malo byť vyfotografované lôžko nádoru. Zmena sa najdlhší a naň kolmý priemer. Veľkosť sa zaznamená ako súčin týchto priemerov. Z týchto údajov jc možné vypočítať rýchlosť opätovného rastu nádoru.
Je možné tiež merať dobu do progresie od prvého pozorovania so zníženým objemom nádoru do objavenia dôkazu progresívnej choroby. Progresívna choroba je definovaná ako zvýšenie súčtu súčinov priemerov meranej lezie o > 25 %. Predtým, než sa stav označí ako progresia, museli pacienti dostať aspoň dva terapeutické cykly. Prežitie pacientov sa meria od nástupu protokolu.
Následné vyšetrenia zahrnujú všetky metódy, rutinne používané v terapii rakoviny, vrátane monitorovania klinických príznakov a odoberania biopsie pre štandardnú a molekulárne biologickú analýzu, ktorou je možné zistiť schému expresie rôznych génov p53. Získajú sa tak tiež informácie o počte buniek, ktoré absorbovali prenesený gén, a o relatívnej sile promótora in vivo. Na základe získaných údajov môže byť žiaduce upraviť terapiu. Tieto úpravy môžu zahrnovať konštrukty adenovírusu s použitím rôznych promótorov alebo zmeny počtu PFU v injekcii na zaistenie infekcie väčšieho množstva alebo všetkých nádorových bu niek bez nefyziologickej hyperexpresie rekombinačných génov.
Predpokladá sa, že expresia exogénnych génov, prenesených in vivo adenovírusom, môže pretrvávať po dlhý čas. Terapeuticky účinná dlhodobá expresia vírusovo prenášaných exogénnych génov bude musieť byť určovaná prípad od prípadu. Markerové gény majú pre stanovenie terapeuticky relevantného pretrvávania génovej expresie obmedzenú použiteľnosť, pretože úrovne expresie, vyžadované na zlepšenie akejkoľvek danej genetickej poruchy, sa môžu značne líšiť od úrovne nutnej na úplné vyliečenie inej choroby.
Aj keď boli prípravky a spôsoby podľa vynálezu opísané formou výhodných uskutočnení, je odborníkovi zrejmé, že zloženie, postupy a jednotlivé stupne postupov alebo ich sled je možné rôzne obmieňať bez prekročenia myšlienky, ducha a rozsahu vynálezu. Konkrétne je zrejmé, že tu opisované činidlá je možné s rovnakými alebo podobnými výsledkami nahradiť chemicky a fyziologicky príbuznými látkami. Všetky tieto analogické náhrady a modifikácie, zrejmé odborníkovi, sa považujú za patriace do myšlienky, ducha a rozsahu vynálezu, ako je definovaný v pripojených patentových nárokoch. Všetky nárokované látky a spôsoby je možné vyrábať a realizovať bez zbytočného experimentovania.
Literatúra:
Nasledujúce práce sú v rozsahu, v ktorom poskytujú príklady postupov alebo ďalších podrobností navyše oproti už uvedeným, tu konkrétne zahrnuté formou odkazu.
Bargonetti et al, (1991) Celí 65:1083 - 1091. Bishop (1987) Science 235:305 -311.
Boehringer Mannheim Biochemicals (1992). DOTAP for high efficiency transfections, BMBiochemica 9(1): 17.
Boshart, M. et al. (1985). A very strong enhancer is located upstream of any immediate early gene of humany cytomegalovírus. Celí, 41: 521 - 530.
Cai, D. W., Mukhopadhyay, T., Liu, T., Fujiwara, T. a Roth, J.A. Stable expression of the wild-type p53 gene in humany lung cancer cells after retrovirus-mediated gene transfer. Humany Gene Ther. 4: 617 - 624,1993.
Culver, K. W., Ram, Z., Wallbridge, S., Ishii, H., Oldfield, E. H. a Blease, R.M. In vivo gene transfer with retroviral vector-producer cells for treatment of experimental brain tumors. Science 256:1550 - 1552, 1992.
Casey, G. Lo-Hueh, M., Lopez, M. E., Vogelstein, B. a Stanbridge, E. J. (1991). Growth suppression of human breast cancer cells by the introduction of a wild-type p53 gene. Oncogene6: 1791 - 1797.
Čiarke, A. R., Puride, C. A., Harrison, D. J., Morris, R. G., Bird, C. C., Hooper, M. L., a Wyllie, A. H., Thymocyte apoptosis induced by p53-dependent and independent pathways. Náture 362: 849 - 852,1993.
Dai et al. (1992) Proc. Nall. Acad. Sci. 89: 10892 - 10895.
Doyle, L. A. Mechanizms of drug resistance in Human lung cancer cells. Semin Oncol. 20: 326 - 337, 1993.
El-Deiry, W. S., Tokino, T., Velculescu, V. E., Levy, D. B., Parsons, R., Trent, J. M., Lin, D., Mercer, E., Kinzler, K. W., a Vogelstein, B. WAFI, a potential mediator of p53 tumor suppression. Celí 75: 817 - 825, 1993.
Fritsche, M., Haessler, C., a Brandner, G. Induction of nuclear accumulation of the tumorsuppressor proteín p53 by DNA-damaging agents. Oncogene 8: 307 - 318,1993.
Fields etal (1990) Science 249: 1046 - 1049.
Fujiwara, T., Grimm, E. A., Mukhopadhyay, T., Cai, D. W., Owen-Schaub, L. B., a Roth, J.A. A retroviral wild
-type p53 expression vector penetrates human lung cancer spheroids and inhibits growth by inducing apoptosis. Cancer Res. 53:4129 -4133, 1993.
Gavrieli, Y., Sherman, Y., a Ben-Sasson, S.A. Identification of programmed celí death in situ via specific Iabelling of nuclear DNA fragmentation. J. Celí Biol. 119: 493 -
- 501, 1992.
Georges etal. (1993) Cancer Res 53: 1743 - 1746.
Ghosh-Choudhury a Graham (1987) Biochem. Biophys. Res. Comm. 147: 964 - 973.
Gluzman etal. (1982) in Eukaryotic Viral Vectors (Gluzman, Y., ed.) str. 187 - 192, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York.
Graham, F. L., a AJ. van der Eb (1973). A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 52: 456 - 467.
Graham, F. L. a Prevec, L. Manipulation of adenovirus vectors. In: Murray, E. J. (ed.). Methods in Molecular Biology, Gene Transfer and Expression Protocols, str. 109 -
- 128. New Jcrsey: The Humana Press Inc., 1991.
Graham, F. L., J. Smiley, W. C. Russell a R. Naim (1977). Characteristics of a human celí line transformed by DNA from humany adenovirus type 5. J. Gén. Virol. 36: 59 -72.
Grunhaus, A. aHorxvitx, M.S. (1992). Adenoviruses as cloning vectors. Semin. Virology 3: 237 - 2542.
Harper, J. E., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., a Elledge, S. J. The p21 Cdk-interacting proteín Cipl is a potent inhibítor of G1 cyclin-dependent kinases. Celí 75 : 805
- 816, 1993.
Hollstein, M., Sidransky, D., Vogelstein, B., a Harris, C. (1991). p53 mutations in humany cancers. Science 253: 49-53.
Jaffe etal. (1992), Náture Genetics 1: 372 - 378. Le Gal et al. (1993), Science 259: 988 - 990. Ledley, J. (1987). J. Pediatrics 110, L
Levine, A.J., Momand, J., a Finlay, C. A. The p53 tumour suppressor gene. Náture 351: 453 - 456, 1991.
Lowe, S. W., Ruley, H. E., Jacks, T., a Housman, D. E. p53-dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents. Celí 74: 957 - 967, 1993.
Lowe, S. W., Schmitt, E. M., Smith, S. W., Osbome, B. A., a Jacks, T. p53 is required for radiation-induced apoptosis in mouse thymocytes. Náture 362: 847 - 849, 1993.
McGrory, W. J. et al. (1988). A simple technique for the rescue of early región 1 mutations into infectious human adenovirus type 5. Virology 163: 614 - 617.
Mercer, W. E. (1992). Celí cycle regulation and the p53 tumor suppressor proteín. Critic. Rev. Eukar. Gene Express. 2: 251 - 263.
Mietzelal. (1992) EMBO 11: 5013 - 5020.
Miller 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158 : L
Montenarh, M. (1992). Biochemical, immunological, and funetional aspects of the growth-suppressor/oncoprotein p53. Critic. Rev. Onco. 3: 233 - 256.
Mulligan (1993), Science 260 : 926.
Nicolau, C. etal. (1983). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 80, 1068.
Ragot et al. (1993). Náture 361: 647 - 650.
Ramqvist, T., Magnusson, K.P., Wang, Y., Szekeley, L., a Klein, G. Wild-type p53 induces apoptosis in a Burkitt lymphoma (BL) line that carries mutant p53. Oncogene 8: 1495 - 1500, 1993.
Rosenfeld et al. (1992) Celí 68: 143 - 155. Rosenfeld et al. (1991) Science 232: 431 -434.
Roth, J., Ruckdeschel, Weisenburger, ed., Thoracic Oncology, 1. vyd. kap. 49, str. 711 - 721, Sanders, New York, 1989.
Shaw, P., Bovey, R., Tardy, S., Sahli, R., Sordat, B. a Costa, J. Induction of apoptosis by wild-typc 53 in a human colon tumor-derived celí íine. Proc Natl Acad Sci USA 89: 4495 - 4499, 1992.
Spandidos et al. (1989), J. Pathol. 157: 1 - 10. Stewart et al., 1992, Huni. Gene Ther. 3 : 267.
Stratford-Perricaudet, L. a M. Perricaudet (1991a). Gene transfer into animals: the promise of adenovírus. Str. 51 -
- 61, in: O. Cohen-Haguenauer a M. Boiron (ed.), Human Gene Transfer, vyd. John Libbey Eurotext, Francie.
Stratford-Perricaudet et al. (1991b), Hum. Gene Ther. 1: 241 -256
Takahashi, T., Nau, M. M., Chiba, L, Birrer, M. J., Rosenberg, R. K., Vinocour, M., Lewitt, M., Pass, H., Gazdar, A. F., a Minna, J. D. p53: a frequent target for genetic abnormalities in lung cancer. Science 246: 491 - 494,1989.
Takahashi, T., Carbone, D., Takahashi, T., Nau, MM., Hida, T., Linnoila, L, Ueda, R., a Minna J. D. (1992). Wild-type but not mutant p53 suppresses the growth of humany lung cancer cells bearing multiple genetic lesions. 1992. Cancer Res. 52: 2340 - 2342.
Tishler, R.B., Calderwood, S.K., Coleman, C.N., a Price, B.D. Increase in sequence specific DNA binding by p53 following treatment with chemotherapeutic and DNA damaging agents. Cancer Res. 53: 2212 - 2216, 1993.
Tooza, J., (1981). Molecular biology of DNA Tumor viruses, 2. vyd. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
Torchilin et al., 1992, Faseb J. 6 : 2716
Travali et al. (1990), FASEB 4: 3209 - 3214.
Weinberg, R.A. (1991). Tumor suppressor gene. Science 254: 1138 - 1145.
Wilcock et al. (1991) Náture 349: 429 - 431.
Wolff, J. A., Malone, R. W., Williams, P., Chong, W., Ascadi, G., Jani, A., a Felgner, P-L. (1990) Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science 247: 1465 -
- 1468.
Yonish-Rouach, E., Resnitzky, D., Rotem, J., Sachs, L., Kimchi, A., a Oren, M. Wild-type p53 induces apoptosis of myeloid leukemie cells that is inhibited by interleukin-6. Náture 352: 345 -347, 1991.
Zakut-Houri et el. (1985), EMBOJ., 4: 1251 - 1255.
Zhan, Q., Carrier, F., a Fomace Jr., AJ. Induction of cellular p53 activity by DNA-damaging agents and growth arrest. Mol. Celí Biol. 13: 4242 - 4250, 1993.
Zhang, W. W., Fang, X., Branch, C. D., Mazur, W., French, B. A., a Roth, J. A. Generation and identification of recombinant adenovírus by liposome-mediated transfection and PCR analysis. BioTechniques, 1993.
Zhang, W. W., Fang, X., Mazur, W., French, B. A., Georges, R. N., a Roth, J. A. High-effíciency gene transfer and high-level expression of wild-type p53 in human lung cancer cells mediated by recombinant adenovírus. Cancer Gene Therapy, 1993.
Zhu et al., 1993, Science 261: 209 - 211.
ZOZNAM SEKVENCII (1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE:
(i) PRIHLASOVATEĽ:
(A) MENO: BOARD OF REGENTS, THE
UNIVERSITY OF TEXAS SYSTÉM (B) ULICA: 201 West 7th Street (C) MESTO: Austin (D) ŠTÁT: Texas (E) ŠTÁT: Spojené štáty americké (F) POŠTOVÝ KÓD :78701 (G) Č. TELEFÓNU: (512)499-4462 (H) TELEFAX: (512)499-4523 (ii) PÔVODCOVIA: ROTH, Jack A.
FUJIWARA, Toshiyoshi GRIM, Elizabeth A. MUKHOPADHYAY, Tapas ZHANG, Wei-Wei a OWEN-SCAHUB, Laurie B.
(iii) NÁZOV VYNÁLEZU: SPÔSOBY A PRÍPRAVKY OBSAHUJÚCE PROSTRIEDKY POŠKODZUJÚCE DNA A p53 (iv) POČET SEKVENCII; 4 (v) KOREŠPONDENČNÁ ADRESA:
(A) ADRESÁT: ARNOLD, WHITE & DURKEE (B) ULICA: P.O. BOX 4433 (C) MESTO: HOUSTON (D) ŠTÁT: TEXAS (E) ŠTÁT: SPOJENÉ ŠTÁTY AMERICKÉ (F) ZIP:77210 (vi) STROJOVO ČITATEĽNÁ FORMA:
(A) MÉDIUM: Floppydisk (B) POČÍTAČ: IBM PC Kompatibilný (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS/ASCII (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, verzia #1.30 (vii) ÚDAJE O SÚČASNEJ PRIHLÁŠKE:
(A) Č. PRIHLÁŠKY: PCT/US95/04898 (B) DÁTUM PODANIA: 24. APRÍL 1995 (C) KLASIFIKÁCIA: NEZNÁMA (viii) ÚDAJE O PRIORITNEJ PRIHLÁŠKE:
(A) Č. PRIHLÁŠKY; USSN 08/233,002 (B) DÁTUM PODANIA: 25. APRÍL 1994 (C) KLASIFIKÁCIA: NEZNÁMA (ix) INFORMÁCIA O ZÁSTUPCI/AGENTOVI:
(A) MENO: HIGHLANDER, STEVEN L.
(B) REGISTRAČNÉ ČÍSLO: 37,642 (C) REFERENCIE/Č. SPISU: UTFC403P-/HYL (x) TELEKOMUNIKAČNÉ INFORMÁCIE:
(A) TELEFÓN: (512) 418-3000 (B) TELEFAX: (713) 789-2679 (C) TELEX: 79-0924 (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 19 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (A)OPIS:/desc = „DNA“ (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 1:
GGCCCACCCC CTTGGCTTC 19 (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO:2:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (A)OPIS:/desc = „DNA“ (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:2:
TTGTAACCAT TATAAGCTGC 20 (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO:3:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (A)OPIS:/desc = „DNA“ (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:3:
TCGTTTCTCA GCAGCTGTTG 20 (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO:4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: ďalšia nukleová kyselina (A) OPIS: /dese = „DNA“ (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:4:
CATCTGAACTCAAAGCGTGG 20

Claims (36)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Použitie proteínu alebo génu p53 a prostriedku poškodzujúceho DNA na získanie terapeutického prípravku na usmrcovanie bunky, kde proteín alebo gén p53 a prostriedok poškodzujúci DNA sú kombinované v množstve účinnom na usmrtenie bunky.
  2. 2. Použitie podľa nároku 1, kde na získame terapeutického prípravku je použitý proteín alebo gén p53 v kombinácii s rontgenovým žiarením, UV žiarením, γ-žiarením, mikrovlnným žiarením, adriamycínom, 5-fluorouracilom, etoposidom, kamptotecínom, aktinomycínom-D, mitomycínom C alebo cisplatinou.
  3. 3. Použitie podľa nároku 2, kde na získanie terapeutického prípravku je použitý proteín alebo gén p53 v kombinácii s cisplatinou.
  4. 4. Použitie podľa nároku 1, kde na získanie terapeutického prípravku je použitý rekombinačný vektor, ktorý v uvedenej bunke exprimuje proteín p53, v kombinácii s prostriedkom poškodzujúcim DNA.
  5. 5. Použitie podľa nároku 4, kde na získanie terapeutického prípravku je ako rekombinačný vektor, exprimujúci p53, použitý plazmid z nahej DNA, plazmid vnútri lipozómu, retrovirusový vektor, vektor AAV alebo rekombinačný adenovírusový vektor.
  6. 6. Použitie podľa nároku 5, kde na získanie terapeutického prípravku je ako rekombinačný vektor, exprimujúci p53, použitý rekombinačný adenovírusový vektor.
  7. 7. Použitie podľa nároku 6, kde na získanie terapeutického prípravku je ako rekombinačný vektor, exprimujúci p53, použitý rekombinačný adenovírusový vektor, zahrnujúci oblasť expresie p53, umiestnenú pod kontrolou cytomegalovírusového promótora 1E.
  8. 8. Použitie podľa nároku 6, kde na získanie terapeutického prípravku je použitý rekombinačný adenovírusový vektor, ktorý zahrnuje oblasť expresie p53, cytomegalovírusový promótor IE a skorý polyadenylačný signál SV40.
  9. 9. Použitie podľa nároku 6, kde na získame terapeutického prípravku je použitý adenovírusový vektorový konštrukt, z ktorého je vypustený aspoň jeden gén nevyhnutný na replikáciu adenovírusu a na jeho miesto je zavedená oblasť expresie p53.
  10. 10. Použitie podľa nároku 9, kde na získanie terapeutického prípravku je použitý adenovírusový vektor, ktorého oblasti E1A a E1B sú vypustené a na ich miesto je zavedená oblasť expresie p53.
  11. 11. Použitie podľa nároku 6, kde na získanie terapeutického prípravku je použitý rekombinačný adenovírusový vektor, ktorý je prítomný vnútri rekombinačného adenovírusu.
  12. 12. Použitie podľa nároku 1, kde terapeutický prípravok, na získanie ktorého sú uvedené látky použité, je dispergovaný vo farmakologicky prijateľnej formulácii.
  13. 13. Použitie podľa nároku 1, kde získaný terapeutický prípravok je určený na usmrcovanie ľudskej bunky.
  14. 14. Použitie podľa nároku 1, kde získaný terapeutický prípravok je určený na usmrcovanie malígnej bunky.
  15. 15. Použitie podľa nároku 14, kde získaný terapeutický prípravok je určený na usmrcovanie bunky rakoviny pľúc.
  16. 16. Použitie podľa nároku 14, kde získaný terapeutický prípravok je určený na usmrcovanie bunky rakoviny prsníka.
  17. 17. Použitie podľa nároku 14, kde získaný terapeutický prípravok je určený na usmrcovanie bunky majúcej mutáciu v géne p53.
  18. 18. Použitie podľa nároku 1, kde na získanie terapeutického prípravku sa ako zlúčenina poškodzujúca DNA použije cisplatina.
  19. 19. Prípravok, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje proteín alebo gén p53 v kombinácii s prostriedkom poškodzujúcim DNA.
  20. 20. Prípravok podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje proteín alebo gén p53 v kombinácii s adriamycínom, 5-fluorouracilom, etoposidom, kamptotecínom, aktinomycínom-D, mitomycínom C alebo cisplatinou.
  21. 21. Prípravok podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje proteín alebo gén p53 v kombinácii s cisplatinou.
  22. 22. Prípravok podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, žc zahrnuje rekombinačný vektor, exprimujúci v živočíšnej bunke proteín p53, v kombinácii s prostriedkom poškodzujúcim DNA.
  23. 23. Prípravok podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že rekombinačným vektorom je plazmid z nahej DNA, plazmid vnútri lipozómu, retrovirusový vektor, vektor AAV alebo rekombinačný adenovírusový vektor.
  24. 24. Prípravok podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že rekombinačným vektorom je rekombinačný adenovírusový vektor.
  25. 25. Prípravok podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že rekombinačným vektorom je rekombi20
    SK 283364 Β6 načný adenovírusový vektor prítomný vnútri častice rekombinačného adenovírusu.
  26. 26. Prípravok podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje rekombinačný adenovírusový vektor prítomný vnútri častice rekombinačného adenovírusu v kombinácii s cisplatinou.
  27. 27. Prípravok podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že je dispcrgovaný vo farmakologicky prijateľnej formulácii.
  28. 28. Prípravok podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že je formulovaný na intralezionálnu aplikáciu.
  29. 29. Terapeutický kit, vyznačujúci sa tým, že obsahuje rekombinačný vektor, exprimujúci v živočíšnej bunke proteín p53, a prostriedok poškodzujúci DNA, na simultánne, oddelené alebo postupné podávanie.
  30. 30. Kit podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje farmaceutickú formuláciu rekombinačného adenovírusu, zahrnujúceho rekombinačný vektor, exprimujúci v živočíšnej bunke proteín p53, a farmaceutickú formuláciu cisplatiny.
  31. 31. Použitie podľa nároku 1, kde na získanie terapeutického prípravku sa ako prostriedok poškodzujúci DNA použije cisplatina.
  32. 32. Použitie podľa nároku 1, kde na získanie terapeutického prípravku sa ako prostriedok poškodzujúci DNA použije doxorubicín.
  33. 33. Použitie podľa nároku 1, kde na získanie terapeutického prípravku sa ako prostriedok poškodzujúci DNA použije etoposid.
  34. 34. Použitie podľa nároku 1, kde na získanie terapeutického prípravku sa ako prostriedok poškodzujúci DNA použije verapamil.
  35. 35. Použitie podľa nároku 1, kde na získanie terapeutického prípravku sa ako prostriedok poškodzujúci DNA použije podofyllotoxin.
  36. 36. Použitie podľa nároku 1, kde na získanie terapeutického prípravku sa ako prostriedok poškodzujúci DNA použije 5-FU.
SK1367-96A 1994-04-25 1995-04-24 Použitie proteínu alebo génu p53 a prostriedku poškodzujúceho DNA, prípravky a kity ich obsahujúce SK283364B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/233,002 US5747469A (en) 1991-03-06 1994-04-25 Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53
PCT/US1995/004898 WO1995028948A1 (en) 1994-04-25 1995-04-24 Compositions comprising dna damaging agents and p53

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK136796A3 SK136796A3 (en) 1997-07-09
SK283364B6 true SK283364B6 (sk) 2003-06-03

Family

ID=22875472

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1367-96A SK283364B6 (sk) 1994-04-25 1995-04-24 Použitie proteínu alebo génu p53 a prostriedku poškodzujúceho DNA, prípravky a kity ich obsahujúce

Country Status (20)

Country Link
US (5) US5747469A (sk)
EP (2) EP0760675B2 (sk)
JP (2) JP3847334B2 (sk)
KR (1) KR100379174B1 (sk)
CN (1) CN1209164C (sk)
AT (2) ATE383167T1 (sk)
AU (1) AU694216B2 (sk)
BR (1) BR9507506A (sk)
CA (1) CA2188560C (sk)
CZ (1) CZ295144B6 (sk)
DE (2) DE69521994T3 (sk)
ES (2) ES2160707T5 (sk)
HU (1) HU221279B1 (sk)
NO (2) NO325560B1 (sk)
NZ (1) NZ284709A (sk)
PL (1) PL185749B1 (sk)
RU (1) RU2146149C1 (sk)
SK (1) SK283364B6 (sk)
UA (1) UA43917C2 (sk)
WO (1) WO1995028948A1 (sk)

Families Citing this family (254)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5705334A (en) 1988-09-22 1998-01-06 Massachusetts Institute Of Technology Uses for DNA structure-specific recognition protein
WO1992015680A1 (en) 1991-03-06 1992-09-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression
US5747469A (en) * 1991-03-06 1998-05-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53
US6410010B1 (en) * 1992-10-13 2002-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant P53 adenovirus compositions
US6524812B1 (en) 1993-10-07 2003-02-25 Regents Of The University Of Minnesota Genes encoding resistance to DNA alkylating agents
US6495348B1 (en) * 1993-10-07 2002-12-17 Regents Of The University Of Minnesota Mitomycin biosynthetic gene cluster
US20010006629A1 (en) * 1993-10-25 2001-07-05 Richard J. Gregory Recombinant adenoviral vector and methods of use
ATE437232T1 (de) * 1993-10-25 2009-08-15 Canji Inc Rekombinanter adenoviren-vektor und verfahren zur verwendung
US20060275261A1 (en) * 1993-10-25 2006-12-07 Canji, Inc. Adenoviral vectors having a protein IX deletion
US20050031590A9 (en) * 1993-10-25 2005-02-10 Richard Gregory Adenoviral vectors having a protein IX deletion
US20020010144A1 (en) * 1994-04-29 2002-01-24 Robert Sobol Enhancing the sensitivity of tumor cells to therapies
US5998205A (en) 1994-11-28 1999-12-07 Genetic Therapy, Inc. Vectors for tissue-specific replication
US6638762B1 (en) 1994-11-28 2003-10-28 Genetic Therapy, Inc. Tissue-vectors specific replication and gene expression
FR2729295A1 (fr) * 1995-01-17 1996-07-19 Rhone Poulenc Rorer Sa Traitement therapeutique combine des pathologies hyperproliferatives
US20020068049A1 (en) * 1998-09-10 2002-06-06 Henderson Daniel R. Tissue specific adenoviral vectors
WO1997003635A2 (en) 1995-07-17 1997-02-06 Board Of Regents, The University Of Texas System p16 EXPRESSION CONSTRUCTS AND THEIR APPLICATION IN CANCER THERAPY
US7163925B1 (en) 1995-07-17 2007-01-16 Board Of Regents, The University Of Texas System p16 expression constructs and their application in cancer therapy
US5763415A (en) * 1995-08-03 1998-06-09 John Hopkins University School Of Medicine Destruction of the epithelium of an exocrine gland in the prophylactic and therapeutic treatment of cancer
WO1997007828A1 (en) * 1995-08-30 1997-03-06 The Regents Of The University Of California Therapy for cellular accumulation in chronic inflammatory diseases
WO1997012623A1 (en) * 1995-10-06 1997-04-10 Arch Development Corporation Methods and compositions for viral enhancement of cell killing
EP1724350A1 (en) * 1995-11-30 2006-11-22 The Board Of Regents, The University Of Texas System Method and compositions for the diagnosis and treatment of cancer
KR19990071795A (ko) * 1995-11-30 1999-09-27 파라비 레이 암 진단 및 치료를 위한 방법과 조성물
US5952221A (en) 1996-03-06 1999-09-14 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors comprising a first and second nucleic acid sequence
WO1997039135A1 (en) 1996-04-17 1997-10-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Enhanced expression of transgenes
US6054467A (en) * 1996-07-05 2000-04-25 Sidney Kimmel Cancer Center Down-regulation of DNA repair to enhance sensitivity to P53-mediated apoptosis
US5728541A (en) * 1996-07-12 1998-03-17 Precision Therapeutics, Inc. Method for preparing cell cultures from biologial specimens for chemotherapeutic and other assays
US20040023375A1 (en) * 2002-07-30 2004-02-05 Precision Therapeutics, Inc. Method for preparing cell cultures from biological specimens for chemotherapeutic and other assays
WO1998003195A1 (en) * 1996-07-18 1998-01-29 Arch Development Corporation Methods and compositions for modulation of growth response
US5958892A (en) 1996-07-30 1999-09-28 Board Of Regents, The University Of Texas System 2-methoxyestradiol-induced apoptosis in cancer cells
US6060247A (en) * 1996-11-18 2000-05-09 Mcgill University Post-mitotic neurons containing adenovirus vectors that modulate apoptosis and growth
US6183752B1 (en) * 1997-02-05 2001-02-06 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Restenosis/atherosclerosis diagnosis, prophylaxis and therapy
US20030064949A1 (en) * 1998-02-17 2003-04-03 Loretta Nielsen Combined tumor suppressor gene therapy and chemotherapy in the treatment of neoplasms
US20030060434A1 (en) * 1997-02-18 2003-03-27 Loretta Nielsen Combined tumor suppressor gene therapy and chemotherapy in the treatment of neoplasms
IL131447A0 (en) * 1997-02-18 2001-01-28 Canji Inc Combined tumor supressor gene therapy and chemotherapy in the treatment of neoplasms
US6020191A (en) * 1997-04-14 2000-02-01 Genzyme Corporation Adenoviral vectors capable of facilitating increased persistence of transgene expression
US6642045B1 (en) 1997-04-14 2003-11-04 Breonics, Inc. System for exsanguinous metabolic support of an organ or tissue
KR19980077401A (ko) * 1997-04-18 1998-11-16 문우철 와일드타입 p53 유전자벡터와 양이온성 리포솜을 함유하는 암의 유전자 치료제
US20050096288A1 (en) * 1997-06-13 2005-05-05 Aragene, Inc. Lipoproteins as nucleic acid vectors
US6635623B1 (en) * 1997-06-13 2003-10-21 Baylor College Of Medicine Lipoproteins as nucleic acid vectors
US6749863B1 (en) * 1997-11-19 2004-06-15 Georgetown University Targeted liposome gene delivery
US6841538B1 (en) 1998-04-22 2005-01-11 Inex Pharmaceuticals Corporation Combination therapy using nucleic acids and radio therapy
US6841537B1 (en) * 1998-04-22 2005-01-11 Protiva Biotherapeutics Inc. Combination therapy using nucleic acids and conventional drugs
US5972640A (en) * 1998-05-12 1999-10-26 The Regents Of The University Of California Methods for identifying antimitotic agents
CA2333147C (en) 1998-07-13 2012-02-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment methods using antibodies to aminophospholipids
AU5817299A (en) * 1998-09-10 2000-04-03 Uab Research Foundation, The Adenoviral vector encoding pro-apoptotic bax gene and uses thereof
US6649158B1 (en) * 1998-10-15 2003-11-18 Canji, Inc. Methods and compositions to induce antitumor response
US7094533B1 (en) * 1999-01-21 2006-08-22 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Therapeutic and diagnostic applications of prostatic acid phosphatase in prostate cancer
ATE511543T1 (de) * 1999-02-22 2011-06-15 Univ Georgetown Immunoliposome mit einem targeting- antikörperfragment zur systemischen genverabreichung
WO2000050584A2 (en) * 1999-02-24 2000-08-31 University Of Iowa Research Foundation Methods and compositions for enhancing in vivo gene delivery/expression
AU3755800A (en) * 1999-03-15 2000-10-04 Introgen Therapeutics, Inc. Dendritic cells transduced with a wild-type self gene elicit potent antitumor immune responses
US20070166292A1 (en) * 1999-04-14 2007-07-19 Breonics, Inc. System for exsanguinous metabolic support of an organ or tissue
US20040038193A1 (en) * 1999-04-14 2004-02-26 Breonics, Inc. System for exsanguinous metabolic support of an organ or tissue
EP1181032A4 (en) * 1999-04-14 2004-08-25 Breonics Inc SYSTEM FOR EXSANGUARY METABOLIC SUPPORT OF AN ORGAN OR TISSUE
EP1916258B1 (en) 1999-08-09 2014-04-23 Targeted Genetics Corporation Enhancement of expression of a single-stranded, heterologous nucleotide sequence from recombinant viral vectors by designing the sequence such that it forms intrastrand base pairs
US6734192B1 (en) * 1999-08-23 2004-05-11 Mp-1 Inc. Treatment of viral infections
ATE392210T1 (de) * 1999-10-07 2008-05-15 Aguilar Cordova Carlos Estuard Methoden zur behandlung von festen tumoren und metastasen mit gentherapie
US20040266834A1 (en) * 1999-10-14 2004-12-30 Copland John A. Thiazolidinediones alone or in cabination with other therapeutic agents for cancer therapy
US6511676B1 (en) 1999-11-05 2003-01-28 Teni Boulikas Therapy for human cancers using cisplatin and other drugs or genes encapsulated into liposomes
US7048920B2 (en) * 2000-03-24 2006-05-23 Cell Genesys, Inc. Recombinant oncolytic adenovirus for human melanoma
US6911200B2 (en) * 2000-03-24 2005-06-28 Cell Genesys, Inc. Methods of treating neoplasia with combination of target-cell specific adenovirus, chemotherapy and radiation
US7306902B2 (en) * 2002-06-28 2007-12-11 Oncolyties Biotech Inc. Oncolytic viruses as phenotyping agents for neoplasms
US10293056B1 (en) * 2000-05-24 2019-05-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for non-viral gene therapy for treatment of hyperproliferative diseases
PL363618A1 (en) 2000-11-09 2004-11-29 Neopharm, Inc. Sn-38 lipid complexes and methods of use
CA2429769C (en) * 2000-12-07 2016-04-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of treatment involving human mda-7
US20030138405A1 (en) * 2001-04-17 2003-07-24 Juan Fueyo Conditionally replicative adenovirus to target the Rb and Rb-related pathways
WO2003030864A1 (en) * 2001-05-29 2003-04-17 Neopharm, Inc. Liposomal formulation of irinotecan
US20040086888A1 (en) * 2001-10-18 2004-05-06 Kornblith Paul L Method for tandem genomic/proteomic analysis of proliferating cells
AU2003216283A1 (en) * 2002-02-14 2003-09-04 Research Development Foundation Inhibition of lung metastases by aerosol delivery of p53 gene and anti-cancer compounds
US20040009939A1 (en) * 2002-03-05 2004-01-15 Board Of Regent, The University Of Texas System Methods of enhancing immune induction involving MDA-7
KR100492016B1 (ko) * 2002-04-11 2005-05-30 학교법인고려중앙학원 안티센스 텔로머라제 생산하는 아데노바이러스 Ad-OA 와항암제 시스플라틴을 이용한 항암 치료 방법
WO2003086395A1 (en) 2002-04-12 2003-10-23 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
AU2003226051A1 (en) * 2002-04-16 2003-11-03 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Solid forms of salts with tyrosine kinase activity
KR20030085421A (ko) * 2002-04-30 2003-11-05 신득용 ｐ53 또는 ｐ21 유전자 변이에 의해 ｐ53 또는 ｐ21유전자 기능을 상실한 암의 치료를 위한 액틴 저해제를포함하는 약학 조성물
US20030219421A1 (en) * 2002-05-23 2003-11-27 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Calbindin-D28k protection against glucocorticoid induced cell death
ES2358730T3 (es) 2002-07-15 2011-05-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Anticuerpos seleccionados y péptidos de duramicina que se enlazan a fosfolípidos aniónicos y aminofosfolípidos y sus usos en el tratamiento de infecciones virales y del cáncer.
US7364727B2 (en) * 2002-07-22 2008-04-29 Cell Genesys, Inc. Metastatic colon cancer specific promoter and uses thereof
AU2003250701A1 (en) * 2002-07-31 2004-02-16 Wayne R. Danter Protein tyrosine kinase inhibitors
AU2003296897A1 (en) * 2002-08-20 2004-05-04 Neopharm, Inc. Pharmaceutical formulations of camptothecine derivatives
US20060030578A1 (en) * 2002-08-20 2006-02-09 Neopharm, Inc. Pharmaceutically active lipid based formulation of irinotecan
ES2298563T3 (es) * 2002-10-09 2008-05-16 Critical Outcome Technologies, Inc. Inhibidores de proteinas tirosina cinasas.
US20050032728A1 (en) * 2002-12-17 2005-02-10 Sidney Kimmel Cancer Center Tumor suppression through bicistronic co-expression of p53 and p14ARF
CA2518150C (en) * 2003-03-03 2015-08-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions involving mda-7
WO2004092396A2 (en) * 2003-04-15 2004-10-28 Novartis Ag Flap endonuclease 1 (fen1) regulatory sequences and uses thereof
US20070275915A1 (en) * 2003-04-15 2007-11-29 Cell Genesys, Inc. Tmprss2 Regulatory Sequences and Uses Thereof
MXPA05013983A (es) * 2003-06-30 2006-03-02 Canji Inc Encapsulacion polimerica de adenovirus.
US20070054274A1 (en) 2003-09-30 2007-03-08 Antonio Giordano Gene modulation by rb2/p130 expression
DE10354060A1 (de) 2003-11-19 2005-06-02 Merck Patent Gmbh Pyrrolderivate
DE10355904A1 (de) 2003-11-29 2005-06-30 Merck Patent Gmbh Feste Formen von anti-EGFR-Antikörpern
US8034790B2 (en) * 2003-12-01 2011-10-11 Introgen Therapeutics Use of MDA-7 to inhibit pathogenic infectious organisms
DE10356579A1 (de) 2003-12-04 2005-07-07 Merck Patent Gmbh Aminderivate
CA3031283A1 (en) 2004-01-22 2005-08-04 University Of Miami Topical co-enzyme q10 formulations and methods of use
WO2005082422A1 (en) * 2004-02-24 2005-09-09 Introgen Therapeutics, Inc. Combination of ad-p53 and chemotherapy for the treatment of tumours
US20070281041A1 (en) * 2004-03-02 2007-12-06 Introgen Therapeutics, Inc. Compositions and Methods Involving MDA-7 for the Treatment of Cancer
WO2005107474A2 (en) * 2004-04-30 2005-11-17 Introgen Therapeutics, Inc. Oncolytic adenovirus armed with therapeutic genes
JP4433918B2 (ja) * 2004-07-15 2010-03-17 コニカミノルタエムジー株式会社 画像形成方法
US20060246124A1 (en) * 2004-11-08 2006-11-02 Pilkiewicz Frank G Methods of treating cancer with lipid-based platinum compound formulations administered intraperitoneally
KR100651728B1 (ko) * 2004-11-10 2006-12-06 한국전자통신연구원 정착기를 갖는 전자 소자용 화합물 및 이를 포함하는 전자소자와 이들의 제조 방법
US20060153808A1 (en) * 2004-11-17 2006-07-13 Board Of Regents, The Universtiy Of Texas System Cancer immunotherapy incorporating p53
CA2597329C (en) * 2005-02-08 2016-10-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods involving mda-7 for the treatment of cancer
DE102005016634A1 (de) 2005-04-12 2006-10-19 Merck Patent Gmbh Neuartige Aza-Hetercyclen als Kinase-Inhibitoren
JP5033119B2 (ja) 2005-04-25 2012-09-26 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング キナーゼ阻害剤としての新規アザ複素環化合物
WO2006124700A2 (en) * 2005-05-12 2006-11-23 Introgen Therapeutics, Inc. P53 vaccines for the treatment of cancers
ATE550019T1 (de) 2005-05-17 2012-04-15 Merck Sharp & Dohme Cis-4-ä(4-chlorophenyl)sulfonylü-4-(2,5- difluorophenyl)cyclohexanepropansäure zur behandlug von krebs
DE102005027169A1 (de) 2005-06-13 2006-12-14 Merck Patent Gmbh Tetrahydrochinolinderivate
WO2007028146A2 (en) * 2005-09-01 2007-03-08 Precision Therapeutics, Inc. Chemo-sensitivity assays using tumor cells exhibiting persistent phenotypic characteristics
US9107824B2 (en) 2005-11-08 2015-08-18 Insmed Incorporated Methods of treating cancer with high potency lipid-based platinum compound formulations administered intraperitoneally
DE102005061840A1 (de) 2005-12-23 2007-06-28 Merck Patent Gmbh Triazolderivate
US20070231304A1 (en) * 2006-01-30 2007-10-04 Introgen Therapeutics, Inc. Prognostic factors for anti-hyperproliferative disease gene therapy
WO2007092944A2 (en) * 2006-02-08 2007-08-16 Introgen Therapeutics, Inc. Compositions and methods involving gene therapy and proteasome modulation
GB0603041D0 (en) 2006-02-15 2006-03-29 Angeletti P Ist Richerche Bio Therapeutic compounds
DK1991303T3 (da) 2006-03-03 2021-06-07 Oncosec Medical Inc Fremgangsmåde og anordning til behandling af mikroskopiske resttumorer i væv, der er tilbage efter kirurgisk resektion
US8426387B2 (en) * 2006-03-31 2013-04-23 Stephen Carper Treatments for cancer
US20110218176A1 (en) 2006-11-01 2011-09-08 Barbara Brooke Jennings-Spring Compounds, methods, and treatments for abnormal signaling pathways for prenatal and postnatal development
EP2109608B1 (en) 2007-01-10 2011-03-23 Istituto di Richerche di Biologia Molecolare P. Angeletti S.p.A. Amide substituted indazoles as poly(adp-ribose)polymerase (parp) inhibitors
US8034815B2 (en) 2007-01-11 2011-10-11 Critical Outcome Technologies, Inc. Compounds and method for treatment of cancer
PT2118123E (pt) 2007-01-31 2016-02-10 Harvard College Péptidos de p53 estabilizados e suas utilizações
DE102007008419A1 (de) 2007-02-21 2008-08-28 Merck Patent Gmbh 4-(Pyrrolopyridinyl)-pyrimidinyl-2-amin-derivate
EP2136831B1 (en) 2007-03-02 2012-09-12 The Cleveland Clinic Foundation Anti-angiogenic peptides
DE102007013855A1 (de) 2007-03-20 2008-09-25 Merck Patent Gmbh Substituierte Tetrahydrochinoline
DE102007013854A1 (de) 2007-03-20 2008-09-25 Merck Patent Gmbh Tetrahydrochinoline
DE102007013856A1 (de) 2007-03-20 2008-09-25 Merck Patent Gmbh Substituierte Tetrahydropyrrolochinoline
WO2008121767A2 (en) 2007-03-28 2008-10-09 President And Fellows Of Harvard College Stitched polypeptides
DE102007028515A1 (de) 2007-06-21 2008-12-24 Merck Patent Gmbh 6-(Pyrrolopyridinyl)-pyrimidinyl-2-amin-derivate
US8389553B2 (en) 2007-06-27 2013-03-05 Merck Sharp & Dohme Corp. 4-carboxybenzylamino derivatives as histone deacetylase inhibitors
DE102007047735A1 (de) 2007-10-05 2009-04-09 Merck Patent Gmbh Thiazolderivate
DE102007047738A1 (de) 2007-10-05 2009-04-09 Merck Patent Gmbh Imidazolderivate
DE102007047737A1 (de) 2007-10-05 2009-04-30 Merck Patent Gmbh Piperidin- und Piperazinderivate
DE102007049451A1 (de) 2007-10-16 2009-04-23 Merck Patent Gmbh 5-Cyano-thienopyridine
WO2009060198A1 (en) 2007-11-09 2009-05-14 Peregrine Pharmaceuticals, Inc. Anti-vegf antibody compositions and methods
EP2225226B1 (en) 2007-12-26 2016-08-17 Critical Outcome Technologies, Inc. Compounds and their use in a method for treatment of cancer
DE102008005493A1 (de) 2008-01-22 2009-07-23 Merck Patent Gmbh 4-(Pyrrolo[2,3-c] pyridine-3-yl)-pyrimidin-2-yl-amin-derivate
DK2245464T3 (en) 2008-01-25 2017-02-20 Multivir Inc P53 BIOMARKETS
DE102008017853A1 (de) 2008-04-09 2009-10-15 Merck Patent Gmbh Thienopyrimidine
US8466193B2 (en) 2008-04-15 2013-06-18 Pharmacyclics, Inc. Selective inhibitors of histone deacetylase
DE102008025751A1 (de) 2008-05-29 2009-12-03 Merck Patent Gmbh 4-(1H-Pyrrolo[2,3-b]pyridin-3-yl)-pyridin-2-ylamin-derivate
DE102008027574A1 (de) 2008-06-10 2009-12-17 Merck Patent Gmbh Neue Pyrrolidinderivate als MetAP-2 Inhibitoren
DE102008031517A1 (de) 2008-07-03 2010-01-07 Merck Patent Gmbh Pyrrolopyridinyl-pyrimidin-2-yl-amin-derivate
CA2730890C (en) 2008-07-17 2018-05-15 Critical Outcome Technologies Inc. Thiosemicarbazone inhibitor compounds and cancer treatment methods
DE102008059578A1 (de) 2008-11-28 2010-06-10 Merck Patent Gmbh Benzo-Naphtyridin Verbindungen
DE102009005193A1 (de) 2009-01-20 2010-07-22 Merck Patent Gmbh Neue heterocyclische Verbindungen als MetAP-2 Inhibitoren
EP2413932A4 (en) 2009-04-01 2012-09-19 Merck Sharp & Dohme INHIBITORS OF AKT ACTIVITY
EA201101399A1 (ru) 2009-04-02 2012-08-30 Мерк Патент Гмбх Гетероциклические соединения в качестве ингибиторов аутотаксина
WO2010129021A1 (en) 2009-05-02 2010-11-11 Genzyme Corporation Gene therapy for neurodegenerative disorders
DE102009019962A1 (de) 2009-05-05 2010-11-11 Merck Patent Gmbh 3-([1,2,3]Triazol-4-yl)-pyrrolo[2,3-b]pyridinderivate
US9050276B2 (en) 2009-06-16 2015-06-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Autism-associated biomarkers and uses thereof
DE102009033208A1 (de) 2009-07-15 2011-01-20 Merck Patent Gmbh Aminopyridinderivate
DE102009033392A1 (de) 2009-07-16 2011-01-20 Merck Patent Gmbh Heterocyclische Verbindungen als Autotaxin-Inhibitoren II
JP2013502441A (ja) 2009-08-26 2013-01-24 アルバータ・ヘルス・サービシーズ 新規コルヒチン誘導体、方法、およびその使用
DE102009049211A1 (de) 2009-10-13 2011-04-28 Merck Patent Gmbh Sulfoxide
EP2488028B1 (en) 2009-10-14 2020-08-19 Merck Sharp & Dohme Corp. Substituted piperidines that increase p53 activity and the uses thereof
WO2011054433A1 (en) 2009-11-07 2011-05-12 Merck Patent Gmbh Heteroarylaminoquinolines as tgf-beta receptor kinase inhibitors
DE102009060175A1 (de) 2009-12-23 2011-06-30 Merck Patent GmbH, 64293 Pyrrolo[2,3-d] pyrazin-7-yl-pyrimidin-Verbindungen
DE102009060174A1 (de) 2009-12-23 2011-06-30 Merck Patent GmbH, 64293 Pyrrolopyridinyl-pyrimidin-2-yl-amin-derivate
EP2519517B1 (en) 2009-12-29 2015-03-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Type ii raf kinase inhibitors
BR112012023021A2 (pt) 2010-03-16 2016-05-31 Dana Farber Cancer Inst Inc compostos de indazol e seus usos
EP2552947A4 (en) 2010-03-26 2013-11-13 Dartmouth College VISTA REGULATORY T CELL MEDIATOR PROTEIN, VISTA BINDING ACTIVE SUBSTANCES AND USE THEREOF
US20150231215A1 (en) 2012-06-22 2015-08-20 Randolph J. Noelle VISTA Antagonist and Methods of Use
US10745467B2 (en) 2010-03-26 2020-08-18 The Trustees Of Dartmouth College VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders
EP3235818A3 (en) 2010-04-01 2018-03-14 Critical Outcome Technologies, Inc. Compounds for the treatment of hiv
WO2011163330A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel heterocyclic compounds as erk inhibitors
CN103068980B (zh) 2010-08-02 2017-04-05 瑟纳治疗公司 使用短干扰核酸（siNA）的RNA干扰介导的联蛋白（钙粘蛋白关联蛋白质），β1（CTNNB1）基因表达的抑制
RU2582678C2 (ru) 2010-08-13 2016-04-27 Эйлерон Терапьютикс, Инк. Пептидомиметические макроциклы
KR102072631B1 (ko) 2010-08-17 2020-02-03 시르나 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 짧은 간섭 핵산 （ｓｉＮＡ）을 사용한 Ｂ형 간염 바이러스 （ＨＢＶ） 유전자 발현의 ＲＮＡ 간섭 매개 억제
US8883801B2 (en) 2010-08-23 2014-11-11 Merck Sharp & Dohme Corp. Substituted pyrazolo[1,5-a]pyrimidines as mTOR inhibitors
WO2012030685A2 (en) 2010-09-01 2012-03-08 Schering Corporation Indazole derivatives useful as erk inhibitors
US9242981B2 (en) 2010-09-16 2016-01-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Fused pyrazole derivatives as novel ERK inhibitors
DE102010048374A1 (de) 2010-10-13 2012-04-19 Merck Patent Gmbh Pyrrolidinone als MetAP-2 Inhibitoren
ES2564358T3 (es) 2010-10-15 2016-03-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Genes relacionados con la obesidad y sus proteínas y usos de los mismos
EP3766975A1 (en) 2010-10-29 2021-01-20 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
DE102010049877A1 (de) 2010-11-01 2012-05-03 Merck Patent Gmbh 7-((1,2,3)Triazol-4-yl)-pyrrolo(2,3) pyrazinderivate
WO2012061537A2 (en) 2010-11-02 2012-05-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for treating hair loss disorders
DE102010050558A1 (de) 2010-11-05 2012-05-10 Merck Patent Gmbh 1H-Pyrrolo[2,3-b]pyridinderivate
DE102010053347A1 (de) 2010-12-03 2012-06-06 Merck Patent Gmbh 3-Hetaryl-substituierte Pyrrolo[2,3-b] pyridin-derivative als PDK1-Inhibitoren
WO2012087772A1 (en) 2010-12-21 2012-06-28 Schering Corporation Indazole derivatives useful as erk inhibitors
DE102011008352A1 (de) 2011-01-12 2012-07-12 Merck Patent Gmbh 5-([1,2,3]Triazol-4-yl)-7H-pyrrolo-[2,3-d]pyrimidinderivate
DE102011009961A1 (de) 2011-02-01 2012-08-02 Merck Patent Gmbh 7-Azaindolderivate
US20140046059A1 (en) 2011-04-21 2014-02-13 Piramal Enterprises Limited Process for the preparation of morpholino sulfonyl indole derivatives
ES2699256T3 (es) 2011-05-23 2019-02-08 Merck Patent Gmbh Piridina y derivados de pirazina
DE102011105469A1 (de) 2011-06-24 2012-12-27 Merck Patent Gmbh 7-Azaindolderivate
CN103717600B (zh) 2011-08-10 2016-06-22 默克专利股份公司 吡啶并嘧啶衍生物
DE102011112978A1 (de) 2011-09-09 2013-03-14 Merck Patent Gmbh Benzonitrilderivate
US20130189754A1 (en) 2011-09-12 2013-07-25 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
TWI643868B (zh) 2011-10-18 2018-12-11 艾利倫治療公司 擬肽巨環化合物
US9023865B2 (en) 2011-10-27 2015-05-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Compounds that are ERK inhibitors
US9402894B2 (en) 2011-10-27 2016-08-02 International Aids Vaccine Initiative Viral particles derived from an enveloped virus
EP2822935B1 (en) 2011-11-17 2019-05-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Inhibitors of c-jun-n-terminal kinase (jnk)
DE102011119127A1 (de) 2011-11-22 2013-05-23 Merck Patent Gmbh 3-Cyanaryl-1H-pyrrolo[2.3-b]pyridin-Derivate
SI2812337T1 (sl) 2012-02-09 2017-01-31 Merck Patent Gmbh Furo (3,2-b) in tieno (3,2-b) piridinski derivati kot zaviralci tbk1 in ikk
EP2819688A4 (en) 2012-02-15 2015-10-28 Aileron Therapeutics Inc TRIAZOL AND THIOETHER-COUPLED PEPTIDOMIMETIC MACROCYCLES
JP6450191B2 (ja) 2012-02-15 2019-01-09 エイルロン セラピューティクス，インコーポレイテッド ペプチドミメティック大環状化合物
US10039777B2 (en) 2012-03-20 2018-08-07 Neuro-Lm Sas Methods and pharmaceutical compositions of the treatment of autistic syndrome disorders
US9347065B2 (en) 2012-03-29 2016-05-24 International Aids Vaccine Initiative Methods to improve vector expression and genetic stability
SI2830662T1 (sl) 2012-03-29 2019-01-31 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Postopki zdravljenja motenj izgube las
WO2013152230A1 (en) 2012-04-04 2013-10-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Smooth muscle specific inhibition for anti-restenotic therapy
DE102012006884A1 (de) 2012-04-04 2013-10-10 Merck Patent Gmbh Cyclische Amide als MetAP-2 Inhibitoren
US20150299696A1 (en) 2012-05-02 2015-10-22 Sirna Therapeutics, Inc. SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) COMPOSITIONS
US9890215B2 (en) 2012-06-22 2018-02-13 King's College London Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer
CN105025904A (zh) 2012-09-04 2015-11-04 埃莱森制药有限责任公司 用顺铂脂质复合物预防癌症的肺部复发
AU2013312211B2 (en) 2012-09-07 2018-03-29 King's College London VISTA modulators for diagnosis and treatment of cancer
WO2014052563A2 (en) 2012-09-28 2014-04-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel compounds that are erk inhibitors
DE102012019369A1 (de) 2012-10-02 2014-04-03 Merck Patent Gmbh 7-Azaindolderivat
MX366163B (es) 2012-10-17 2019-07-01 Vascular Biogenics Ltd Composiciones de adenovirus.
EP2909194A1 (en) 2012-10-18 2015-08-26 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Inhibitors of cyclin-dependent kinase 7 (cdk7)
WO2014063061A1 (en) 2012-10-19 2014-04-24 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Hydrophobically tagged small molecules as inducers of protein degradation
US10000483B2 (en) 2012-10-19 2018-06-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Bone marrow on X chromosome kinase (BMX) inhibitors and uses thereof
WO2014071241A1 (en) 2012-11-01 2014-05-08 Aileron Therapeutics, Inc. Disubstituted amino acids and methods of preparation and use thereof
ES2651347T3 (es) 2012-11-28 2018-01-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Composiciones y métodos para el tratamiento del cáncer
CA2895504A1 (en) 2012-12-20 2014-06-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Substituted imidazopyridines as hdm2 inhibitors
US9540377B2 (en) 2013-01-30 2017-01-10 Merck Sharp & Dohme Corp. 2,6,7,8 substituted purines as HDM2 inhibitors
KR102089121B1 (ko) 2013-03-14 2020-03-13 더 솔크 인스티튜트 포 바이올로지칼 스터디즈 종양살상형 아데노바이러스 조성물
JP2016515508A (ja) 2013-03-15 2016-05-30 ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク 融合タンパク質及びその方法
AU2014277262B2 (en) 2013-06-06 2019-10-03 Lead Discovery Center Gmbh A quinoline inhibitor of the macrophage stimulating 1 receptor MST1 R
RU2527148C1 (ru) * 2013-08-01 2014-08-27 Александр Николаевич Гребенюк Способ моделирования сочетанных радиационных поражений, включающих общее гамма- и местное рентгеновское облучение
RU2534802C1 (ru) * 2013-08-01 2014-12-10 Александр Николаевич Гребенюк Способ моделирования сочетанных радиационных поражений, включающих общее гамма-и местное бета-облучение
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
EP3057956B1 (en) 2013-10-18 2021-05-05 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Polycyclic inhibitors of cyclin-dependent kinase 7 (cdk7)
US20160264551A1 (en) 2013-10-18 2016-09-15 Syros Pharmaceuticals, Inc. Heteroaromatic compounds useful for the treatment of prolferative diseases
US9682123B2 (en) 2013-12-20 2017-06-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of treating metabolic disease
US11014987B2 (en) 2013-12-24 2021-05-25 Janssen Pharmaceutics Nv Anti-vista antibodies and fragments, uses thereof, and methods of identifying same
WO2015097536A2 (en) 2013-12-24 2015-07-02 Janssen Pharmaceutical Nv Anti-vista antibodies and fragments
WO2015164614A1 (en) 2014-04-23 2015-10-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Janus kinase inhibitors and uses thereof
WO2015164604A1 (en) 2014-04-23 2015-10-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Hydrophobically tagged janus kinase inhibitors and uses thereof
AU2015274504B2 (en) 2014-06-11 2021-02-04 Kathy A. Green Use of VISTA agonists and antagonists to suppress or enhance humoral immunity
CA2955250A1 (en) 2014-07-16 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
KR20170058424A (ko) 2014-09-24 2017-05-26 에일러론 테라퓨틱스 인코포레이티드 펩티드모방 거대고리 및 이의 용도
KR102570210B1 (ko) 2014-09-24 2023-08-23 에일러론 테라퓨틱스 인코포레이티드 펩티드모방 거대고리 및 이의 제제
AU2015357463B2 (en) 2014-12-05 2021-10-07 Immunext, Inc. Identification of VSIG8 as the putative vista receptor and its use thereof to produce vista/VSIG8 modulators
EP3778644A3 (en) 2014-12-23 2021-06-02 The Trustees of Columbia University in the City of New York Fgfr-tacc fusion proteins and methods thereof
WO2016105528A2 (en) 2014-12-23 2016-06-30 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Inhibitors of cyclin-dependent kinase 7 (cdk7)
JP2018516844A (ja) 2015-03-20 2018-06-28 エルロン・セラピューティクス・インコーポレイテッドＡｉｌｅｒｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． ペプチド模倣大環状分子およびその使用
US10550121B2 (en) 2015-03-27 2020-02-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Inhibitors of cyclin-dependent kinases
WO2016201370A1 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Combination therapy of transcription inhibitors and kinase inhibitors
BR112017027870A2 (pt) 2015-06-24 2018-08-28 Janssen Pharmaceutica Nv anticorpos e fragmentos anti-vista
AU2016321298A1 (en) 2015-09-09 2018-03-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Reduction of ER-MAM localized APP-C99 and methods of treating Alzheimer's Disease
EP4019515A1 (en) 2015-09-09 2022-06-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Inhibitors of cyclin-dependent kinases
US10023613B2 (en) 2015-09-10 2018-07-17 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles as modulators of MCL-1
US10188750B1 (en) 2015-10-23 2019-01-29 University Of South Florida Self-replicating cell selective gene delivery compositions, methods, and uses thereof
US10899836B2 (en) 2016-02-12 2021-01-26 Janssen Pharmaceutica Nv Method of identifying anti-VISTA antibodies
CN108699566B (zh) 2016-02-23 2023-06-30 萨克生物研究学院 对病毒动力学影响最小的治疗性腺病毒中的外源基因表达
CA3013637A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
CA3020848A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Anti-human vista antibodies and use thereof
US11066396B2 (en) 2016-06-23 2021-07-20 Merck Sharp & Dohme Corp. 3-aryl- heteroaryl substituted 5-trifluoromethyl oxadiazoles as histonedeacetylase 6 (HDAC6) inhibitors
US11154591B2 (en) 2016-10-14 2021-10-26 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of treating alcohol abuse disorder
CA3045892A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
CN110996958B (zh) 2017-08-16 2023-05-12 默克专利股份有限公司 包含5,10-亚甲基-(6r)-四氢叶酸以及二羧酸的稳定的冻干物
US10947234B2 (en) 2017-11-08 2021-03-16 Merck Sharp & Dohme Corp. PRMT5 inhibitors
WO2019207167A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Fondazione Telethon Therapy of sulfatase deficiencies
WO2020033282A1 (en) 2018-08-07 2020-02-13 Merck Sharp & Dohme Corp. Prmt5 inhibitors
WO2020033284A1 (en) 2018-08-07 2020-02-13 Merck Sharp & Dohme Corp. Prmt5 inhibitors
CN110055227A (zh) * 2019-03-13 2019-07-26 中国人民解放军第四军医大学 用于增生性瘢痕治疗的野生型p53腺病毒及纯化的制备方法
WO2021041532A1 (en) 2019-08-26 2021-03-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Use of heparin to promote type 1 interferon signaling
WO2021126731A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Merck Sharp & Dohme Corp. Prmt5 inhibitors
US20240116945A1 (en) 2022-09-02 2024-04-11 Merck Sharp & Dohme Llc Exatecan-derived topoisomerase-1 inhibitors pharmaceutical compositions, and uses thereof
WO2024091437A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Merck Sharp & Dohme Llc Exatecan-derived adc linker-payloads, pharmaceutical compositions, and uses thereof

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4740463A (en) * 1984-04-13 1988-04-26 Massachusetts Institute Of Technology Methods and artificial genes for antagonizing the function of an oncogene
EP0174608A1 (en) * 1984-09-13 1986-03-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Beta-actin gene and regulatory elements, preparation and use
ZA858044B (en) 1984-11-01 1987-05-27 American Home Prod Oral vaccines
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5055400A (en) * 1986-11-26 1991-10-08 University Of Guelph Leukotoxin gene of pasteurella haemolytica
US5166320A (en) * 1987-04-22 1992-11-24 University Of Connecticut Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells
US4980289A (en) * 1987-04-27 1990-12-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Promoter deficient retroviral vector
US5532220A (en) * 1987-08-31 1996-07-02 The Regents Of The University Of California Genetic mechanisms of tumor suppression
CA1339413C (en) * 1988-06-24 1997-09-02 Junichi Miyazaki Exogenous gene expression vector containing chick .beta.-actin gene promoter
AU638954B2 (en) 1988-10-31 1993-07-15 Regents Of The University Of California, The Products and methods for controlling the suppression of the neoplastic phenotype
DE69008521T2 (de) * 1989-03-07 1994-10-20 Genentech Inc Kovalente konjugate von lipiden und oligonukleotiden.
US5362623A (en) 1991-06-14 1994-11-08 The John Hopkins University Sequence specific DNA binding by p53
US5527676A (en) 1989-03-29 1996-06-18 The Johns Hopkins University Detection of loss of the wild-type P53 gene and kits therefor
EP0390323B2 (en) * 1989-03-29 2012-08-08 Johns Hopkins University Detection of loss of the wild-type p53 gene
US5328470A (en) * 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
IT1238231B (it) 1989-12-18 1993-07-12 Consiglio Nazionale Ricerche Impiego di immunomodulanti come agenti sinergici di chemioterapici nella terapia dei tumori
IE911115A1 (en) 1990-04-10 1991-10-23 Canji Inc Gene therapy for cell proliferative diseases
NO312681B1 (no) * 1990-08-24 2002-06-17 Univ California Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasöytisk blanding med suppresiv virkning/aktivitet
US5747469A (en) * 1991-03-06 1998-05-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53
US6410010B1 (en) 1992-10-13 2002-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant P53 adenovirus compositions
CA2067031C (en) 1991-04-26 2003-02-18 Shigekazu Nagata Dna coding for human cell surface antigen
WO1993003769A1 (en) * 1991-08-20 1993-03-04 THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE SECRETARY, DEPARTEMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Adenovirus mediated transfer of genes to the gastrointestinal tract
US5252479A (en) * 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
EP0615453B1 (en) 1991-11-29 1997-05-14 Chiron Viagene, Inc. Anti-cancer immunotherapeutic vector constructs
FR2688514A1 (fr) * 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
AU4115693A (en) 1992-04-24 1993-11-29 Sri International In vivo homologous sequence targeting in eukaryotic cells
US5428011A (en) 1992-06-16 1995-06-27 Procyon Biopharma, Inc. Pharmaceutical preparations for inhibiting tumours associated with prostate adenocarcinoma
AU676204B2 (en) 1992-09-18 1997-03-06 Canji, Inc. Gene therapy by retroviral vector with tumor suppressive gene
DE69334238D1 (de) * 1992-09-25 2008-09-25 Aventis Pharma Sa Adenovirus vektoren für die übertragung fremder gene in zellen des zentralen nervensystems, insbesondere im gehirn
GB9223084D0 (en) * 1992-11-04 1992-12-16 Imp Cancer Res Tech Compounds to target cells
DE69417734T2 (de) 1993-02-16 1999-10-07 Onyx Pharma Inc Cytopathische viren zur therapie und prophylaxe der neoplasie
US5496731A (en) 1993-03-25 1996-03-05 Xu; Hong-Ji Broad-spectrum tumor suppressor genes, gene products and methods for tumor suppressor gene therapy
FR2704234B1 (fr) * 1993-04-22 1995-07-21 Centre Nat Rech Scient Virus recombinants, preparation et utilisation en therapie genique.
FR2705361B1 (fr) 1993-05-18 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
CA2144040A1 (fr) * 1993-07-13 1995-01-26 Michel Perricaudet Vecteurs adenoviraux defectifs et utilisation en therapie genique
AU7983294A (en) 1993-10-19 1995-05-08 Regents Of The University Of Michigan, The P53-mediated apoptosis
ATE437232T1 (de) 1993-10-25 2009-08-15 Canji Inc Rekombinanter adenoviren-vektor und verfahren zur verwendung
TW442569B (en) 1993-10-25 2001-06-23 Canji Inc Recombinant adenoviral vector
FR2712602B1 (fr) 1993-11-18 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
FR2712603B1 (fr) 1993-11-18 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
FR2716893B1 (fr) 1994-03-03 1996-04-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Virus recombinants, leur préparation et leur utilisation thérapeutique.
KR970702915A (ko) 1994-04-29 1997-06-10 린다 버겐 종양 세포의 치료 감응성 향상 방법(Enhancing The Sensitivity of Tumor Cells to Therapies)

Also Published As

Publication number Publication date
HU221279B1 (en) 2002-09-28
CN1147768A (zh) 1997-04-16
US20060182718A1 (en) 2006-08-17
CA2188560C (en) 2011-07-19
BR9507506A (pt) 1997-09-02
CN1209164C (zh) 2005-07-06
JP3847334B2 (ja) 2006-11-22
US6069134A (en) 2000-05-30
NO964527D0 (no) 1996-10-24
DE69535684D1 (de) 2008-02-21
AU2392495A (en) 1995-11-16
SK136796A3 (en) 1997-07-09
EP0760675B2 (en) 2007-12-05
KR970702060A (ko) 1997-05-13
ES2160707T3 (es) 2001-11-16
ES2298174T3 (es) 2008-05-16
EP0760675B1 (en) 2001-08-01
UA43917C2 (uk) 2002-01-15
US6797702B1 (en) 2004-09-28
DE69521994D1 (de) 2001-09-06
JP2003277272A (ja) 2003-10-02
US5747469A (en) 1998-05-05
NO964527L (no) 1996-12-17
CZ295144B6 (cs) 2005-06-15
NO325560B1 (no) 2008-06-16
AU694216B2 (en) 1998-07-16
NZ284709A (en) 1998-08-26
JPH10503476A (ja) 1998-03-31
RU2146149C1 (ru) 2000-03-10
DE69521994T3 (de) 2008-06-26
EP0760675A1 (en) 1997-03-12
EP1157702B1 (en) 2008-01-09
ATE383167T1 (de) 2008-01-15
DE69535684T2 (de) 2009-01-08
US7109179B2 (en) 2006-09-19
ES2160707T5 (es) 2008-05-16
HUT76258A (en) 1997-07-28
HU9602937D0 (en) 1996-12-30
EP1157702A1 (en) 2001-11-28
KR100379174B1 (ko) 2003-08-02
US20050089511A1 (en) 2005-04-28
ATE203675T1 (de) 2001-08-15
NO20074774L (no) 1996-12-17
PL185749B1 (pl) 2003-07-31
DE69521994T2 (de) 2002-04-04
WO1995028948A1 (en) 1995-11-02
CA2188560A1 (en) 1995-11-02
CZ312196A3 (en) 1997-08-13
PL317105A1 (en) 1997-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK283364B6 (sk) Použitie proteínu alebo génu p53 a prostriedku poškodzujúceho DNA, prípravky a kity ich obsahujúce
US7033750B2 (en) Recombinant P53 adenovirus methods and compositions

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20090424