JP2001508290A - 新形成の治療及び予防のための細胞変性ウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ウイルスベースの療法により新生物状態を治療するための方法及び組成物が供される。ｐ53又はRBに結合し及び／又はそれを不活性化するウイルスタンパク質を欠如する変異体ウイルスは、ｐ53及び／又はRB機能を欠如する細胞を含む新生物を有する患者に投与される。その変異体ウイルスは、本質的に正常なｐ53及び／又はRB機能を有する非複製性非新生物細胞内で複製表現型を実質的に作り出すことができない。新生物細胞における複製表現型の優先的な形成は、直接に、又はウイルス複製表現型を発現する細胞内での細胞毒性遺伝子の発現により、新生物細胞を優先的に殺す。

Description

【発明の詳細な説明】 新形成の治療及び予防のための細胞変性ウイルス 技術分野 本発明は、新生物哺乳動物細胞において後期領域遺伝子の複製及び／又は発現 を行うことができるが、非新生物細胞において本質的に複製できない組換え細胞 変性ウイルスの組成物、これら組換えウイルスを作製し及び増殖させるための方 法、これら組換えウイルスで新生物病を治療するための方法、並びにこれら組換 えウイルスを含む治療用組成物を供する。 背景 正常な細胞の増殖は、増殖抑制腫瘍抑制遺伝子と釣り合う増殖促進プロトオン コジーンにより制御されると考えられる。プロトオンコジーンの活性を強化する 変異は新生物細胞の増殖を強化するオンコジーンを作り出す。逆に、一般に不活 性化腫瘍サプレッサー対立遺伝子についてホモ接合である細胞を導く変異による 、腫瘍サプレッサー遺伝子を不活性化する遺伝子障害は、これらの遺伝子により 課せられる正常な複製制限から細胞を解放し得る。通常、活性化オンコジーン（ 即ち活性化構造又は制御変異を含むプロトオンコジーン）の形成と組み合わされ た不活性化腫瘍サプレッサー遺伝子(例えばｐ53，RB，DCC，NF-1)は、本質的に 非制限性の増殖を行うことができる新生物細胞（即ち形質転換細胞）を作り出し 得る。 細胞のオンコジーンの形質転換は、細胞の代謝、生理及び形態にいくつかの変 化を導く。オンコジーンを形質転換された細胞の１つの特徴的な変化は細胞増殖 制御遺伝子の適切な発現により正常に行 われる細胞増殖及び分化への制限に対する応答の喪失である。 遺伝子変化の異なる型の全てが細胞増殖制御遺伝子の発現又は機能を変化させ 、異常な増殖を導くが、正常な細胞の悪性のものへの新生物形質転換を導くため に１超の出来事が要求される（Landら（1983）Nature 304：596;Weinberg RA（ 1989）Cancer Res．49:3713）。ほとんどの細胞型について悪性形質転換を導く 正確な分子の経路及び二次的変化は明らかでない。細胞周期制御機能を有するい くつかのタンパク質及び／又は機能的な転写複合体、例えばｐ53及びRBの形成に 関連するいくつかのタンパク質の発現又は活性を変えることは、細胞において増 殖制御を失わせ得る(Ullrichら（1992）J.Biol.Chem. 267：15259;Hollsteinら （1991）Science 253：49;Sager R（1992）Curr.Opin.Cell.Biol．4:155;Levin eら（1991）Nature 351：453)。 いくつかのオンコジーンが特定の癌の重要な画分において特徴的な活性化変異 を有することが見い出されている。例えば、ras^H 及びras^Kコーディング領域(例 えばコドン12、コドン61；Paradaら（1984）Nature 312：649)並びにAPC遺伝子 (Powellら（1992）Nature 359：235)における特定の変異は培養細胞のオンコジ ーンの形質転換に関連し、著しい割合の特定のヒトの癌に存在する（例えば結腸 腺癌、膀胱癌、肺癌及び腺癌、肝臓癌）。これらの発見は、このようなオンコジ ーンの活性化形態を特異的に認識する診断及び治療剤（例えばポリヌクレオチド プローブ及び抗体）の開発を導いた（米国特許4,798,787号及び4,762,706号）。 他のオンコジーン、例えばmyc，erbB-2及びpim-1の過剰な又は不適切な発現は 、そのコーディング領域において活性化変異の存在を必ずしも要求することなく オンコジーンの形質転換を強化することができるようである。erbB-2の過剰発現 は前胸部、胃、及び卵巣 の腺癌において頻繁に見い出され、これらの細胞型におけるerbB-2レベルは新形 成のための診断マーカーとして機能し得るであろうし、及び／又は特定の腫瘍表 現型（例えば特定の薬剤、増殖率、分化状態）と相関し得るであろう。 種々のオンコジーン（米国特許4,736,866及び米国特許5,087,571）又は機能的 に破壊されたサプレッサー遺伝子Donehowerら（1992）Nature 356：215)を有す るトランスジェニック動物が、他の潜在的な使用の中でも発癌物質スクリーニン グアッセイにおける使用について記載されている。 この形質転換された表現型及び新形成の基となる分子メカニズムのより規定さ れたモデルを開発することの進行にかかわらず、結果の出る慣用的な化学療法を 超える癌を治療するのに適用できる有用な治療方法はほとんどない。多くの慣用 的な化学療法剤は、低い治療示数を有し、治療投与レベルは毒性である投与レベ ルであるか又はそれに近い。ほとんどの慣用的な化学療法剤の毒性の副作用は喜 ばしくなく、他の副作用の中でも生命をおびやかす骨髄抑制を導く。 先天性の病気、例えば嚢胞性繊維症を引きおこす欠損対立遺伝子を正す又はそ れを補給するために遺伝子療法を行うための現在のアプローチは、限られた最初 の成功例の報告と共に試みられてきた。いくつかの遺伝子治療アプローチは、複 製欠損組換えアデノウイルスを用いて、欠損対立遺伝子の機能的複製を発現する ことができるポリヌクレオチド配列を生体内の細胞に形質導入することに関する (Rosenfeldら（1992）Cell 68:143)。これらの遺伝子療法のいくつかはポリヌ クレオチドを、患者から外植された単離された細胞に形質導入することにおいて 効能があるが、生体内で極めて効能があることが示されていない。腫瘍壊死因子 (TNF)及びインターロイキ ン−２（IL-2）をコードするポリヌクレオチドでの外植された腫瘍細胞の形質導 入に依存する癌への治療的試みが記述されている(Pardoll D（1992）Curr.Opin. Oncol ．4 ：1124）。 遺伝子療法が、生体内の形質転換された細胞においてオンコジーン又は腫瘍サ プレッサー遺伝子の欠損対立遺伝子を正すのに適合することが可能であるといつ か判明するかもしれないが、現在の遺伝子療法は、その場で新形成の実際の遺伝 子療法のための十分な割合の新生物細胞を（例えば相同的組換えにより）有効に 形質導入し、及び正確に標的化することができると報告されていない。癌の生物 学の性質は、新生物細胞の実質的な画分、好ましくは形質転換された細胞のクロ ーン化子孫の全てが有効な治療効果のために除去されることを要求する。更に、 遺伝子療法のための現在の方法は極めて高価であり、患者への再導入の前に外植 された細胞の生体外培養を要求する。このような方法の広範囲の適用は、それら が有効であるとしても、禁止的に高価であろう。 これにより、新形成病の診断及び治療のための方法及び組成物、特に慣用的な 抗新生物化学療法の典型である非新生物細胞の不必要な殺害なく新生物細胞を選 択的に排除する方法についての必要性が当該技術においてある。 本明細書で議論される引例は、もっぱら本出願の出願日前のそれらの開示のた めに供される。本発明者らが、先行技術の発明に関してそれらの開示に先立つ資 格はないという許可として本明細書で解釈されるべきものはない。 発明の概要 本発明は、非新生物細胞において実質的に複製欠損であり、新生物細胞におい て少くとも部分的に複製表現型を示す組換えアデノウ イルスを、新生物細胞に感染させることにより、新生物細胞を排除するためのい くつかの新規な方法及び組成物を供する。新生物及び非新生物細胞における本発 明のアデノウイルス構成物の複製表現型の差は、癌のウイルスベースの治療につ いての生物学的基礎を供する、アデノウイルスの細胞変性効果の発現、及び負− 選択性薬剤遺伝子（例えばHSV tk）の任意の発現は、本発明の組換えアデノウイ ルス構成物が感染した新生物細胞の特徴的なアデノウイルス複製表現型と相関し 、これにより新生物細胞と非新生物細胞とを識別し、新生物細胞の選択的な毒性 を供する。本方法は特にアデノウイルス構成物について詳述されるが、本方法は 、有効な複製が非新生物細胞中に存在するが、新生物細胞中に実質的に欠如し又 は非機能的である宿主細胞タンパク質（例えばｐ53，RB）の結合及び／又は隔離 及び／又は不活性化を要求する。 アデノウイルスが細胞内で有効に複製するために、アデノウイルスE1b遺伝子 産物ｐ55は宿主細胞ｐ53タンパク質との複合体を形成し、それによりｐ53を隔離 及び／又は不活性化し、ｐ53機能が欠損した細胞を作り出す。このように作られ たｐ53機能が欠損した細胞はアデノウイルスの複製を支持し得る。この方法にお いて、野生型アデノウイルスは、アデノウイルスｐ55タンパク質が宿主細胞ｐ53 タンパク質を不活性化及び／又は隔離するので、ｐ53を含む細胞において複製す ることができる。本発明の一実施形態において、感染した細胞において実質的にｐ53 タンパク質との機能的複合体を形成することができない変異ｐ55タンパク質 をコードするE1b座を含む組換えアデノウイルスは、組換えアデノウイルスによ って感染され得る新生物細胞を含む個体又は細胞集団に投与される。組換えアデ ノウイルスが感染した非新生物細胞においてｐ53タンパク質を実質的に有効に隔 離できないことは、形質導入された組換えアデノウイ ルスポリヌクレオチドが非新生物細胞において複製表現型を発現できないことに なる。対照的に、機能的ｐ53タンパク質を欠く新生物細胞は、アデノウイルスの 細胞毒性効果及び／又は複製表現型につながる負の選択遺伝子の発現により新生 物細胞の除去を導く形質導入された組換えアデノウイルスによる複製表現型の発 現を支持する。これらの実施形態の好ましいバリエーションにおいて、組換えア デノウイルスは、実質的にｐ53に結合できない変異ｐ55をコードするE1b座を含 み、任意に、（E1aポリペプチドの存在下でアデノウイルス初期領域遺伝子の発 現を阻害することができない）機能的なｐ19タンパク質も欠如し得る。本発明の 組換えアデノウイルスは、増強された細胞変性効果を作り出す変異ｐ19遺伝子を 更に含み得る；当該技術で周知のこのような変異体はp19 cyt変異体遺伝子であ る。しかしながら、感染の間のウイルスDNAの一体性を維持するためにいくつか の変異体において機能的ｐ19を保持することが好ましい。 他の本発明の実施形態において、感染した細胞においてRBタンパク質との複合 体を形成することが実質的にできないE1aタンパク質(例えばp289R又はp243R)を コードするE1a座を含む組換えアデノウイルスは、組換えアデノウイルスにより 感染され得る新生物細胞を含む個体又は細胞集団に投与される。組換えアデノウ イルスが感染した非新生物細胞においてRBタンパク質を実質的に有効に隔離でき ないことは、形質導入された組換えアデノウイルスポリヌクレオチドが非新生物 細胞において複製表現型を発現できないことになる。対照的に、機能的なRBタン パク質を欠如する新生物細胞は、アデノウイルス細胞変性効果及び／又は複製表 現型につながった負の選択遺伝子の発現により新生物細胞の排除を導く形質導入 された組換えアデノウイルスにより複製表現型の発現を支持する。これらの実 施形態の好ましいバリエーションにおいて、組換えアデノウイルスは、RB（及び ／又は300kDポリペプチド及び／又は107kDポリペプチド）に結合することができ るCR１及び／又はCR２ドメインを欠如するが、アデノウイルス初期遺伝子のトラ ンスアクチベーションを行うことができる機能的CR３ドメインを含む変異E1aタ ンパク質(例えばp289R)をコードするE1a座を含む。これらの実施形態の更なるバ リエーションは、結合してRBを不活性化するタンパク質を実質的に発現すること ができない非機能的E1a座を含み、そして任意に、（E1a機能の欠如下でアデノウ イルス初期領域遺伝子の発現を刺激することができきる）機能的ｐ19タンパク質 も含み得る。本発明の組換えアデノウイルスは、増強された細胞変性効果を作り 出す変異ｐ19遺伝子を更に含み得；このような当該技術で周知の変異体はp19 cy t 変異遺伝子である。 本発明は、非新生物細胞中で複製欠損であるが、機能的ｐ53及び／又はRBを欠 く新生物細胞中で複製表現型を発現することができる新規の組換えアデノウイル ス構成物を供する。新規な組換えアデノウイルス構成物は、E1a及び／又はE1b遺 伝子領域中に、特にE1bp55タンパク質並びにE1a p289R又はp243Rタンパク質のCR １及びCR２ドメインをコードする配列中に、欠失又は点変異のような変異を含む 。特定の実施形態において、負の選択遺伝子、例えばHSV tk遺伝子は負の選択遺 伝子が複製表現型を発現する感染した細胞（即ち新生物細胞）において優先的に 転写されるように、E1a又はE1b変異も含み組換えアデノウイルス構成物において 、初期領域（例えばＥ２，E1a，E1b）エンハンサー／プロモーター、後期領域遺 伝子エンハンサー／プロモーター（例えば主要後期プロモーター）、又はCMVエ ンハンサーを伴う初期もしくは後期領域プロモーターに作用可能に連結され、有 効量の負の選択剤（例えばガンシクロビル、 FIAV）の投与により細胞の負の選択を供する。負の選択遺伝子は、E1a^(-)複製欠 損変異体、E1b^(-)複製欠損変異体、又はE1a／E1b二重変異体を各々同時に形成す るために、E1a及び／又はE1b構造配列の場所に挿入され得る。 生体内の新生物細胞集団へのデリバリーのための医薬として許容される形態に おいて上述の組換えアデノウイルスを含む抗新生物組成物も供する。 本発明は、ｐ53及び／又はRBに結合し及び／又はそれらを不活性化するための 機能的タンパク質を欠如する組換えパポーバウイルス、例えばヒトパピローマウ イルス(HPV)、ポリオーマウイルス（例えばBK，JC）及びSV40も供する。機能的 なＥ６タンパク質の発現を欠如するヒトパピローマウイルス変異体は、ｐ53を有 効に分解する能力を実質的に欠如し、これによりp53^(-)細胞中で複製表現型を示 すことができるが、機能的ｐ53の十分なレベルを含む細胞ではそうでないであろ う。機能的Ｅ７タンパク質の発現を欠如するヒトパピローマウイルス変異体は、RB に有効に結合する能力を実質的に欠如し、これによりRB^(-)細胞中で複製表現 型を示すことができるが、機能的RBの十分なレベルを含む細胞内ではそうでない であろう。機能的Ｅ６タンパク質及び機能的Ｅ７タンパク質の両方の発現を欠如 するヒトパピローマウイルス変異体は、RB及びｐ53に有効に結合する能力を実質 的に欠如し、これにより、p53^(-)RB^(-)細胞中で複製表現型を示すことができる が機能的RB及び／又はｐ53の十分なレベルを含む細胞ではそうでないであろう。 本発明は、非新生物細胞集団における発現と比べて新生物細胞集団において複 製表現型を及び／又は細胞変性効果を優先的に発現することができる組換えウイ ルスを患者に投与するステップを含む新形成病を治療するための新規方法も供す る。 図面の簡単な記載 図１は、アデノウイルスE1a-289Rポリペプチドのドメイン構造及びタンパク質 −タンパク質相互作用の概略図を示す。 図２は、プラスミドp019，p020、及びp021の作製を概略図で示す。 定義 他に定義されなければ、本明細書に用いる全ての技術的及び科学的用語は、本 発明の属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。 本明細書に記載されるものと同様のいずれの方法及び材料も本発明の実施又はテ ストに用いることができるが、好ましい方法及び材料が記載される。本発明の目 的のため、次の用語を以下に定義する。 対象に適用する時に本明細書に用いる用語“天然”とは、対象が天然に見い出 され得ることをいう。例えば、天然のソースから単離することができる（ウイル スを含む）生物中に存在し、研究室においてヒトにより意図的に改変されていな いポリペプチド又はポリヌクレオチド配列が天然である。本明細書に用いる場合 、用語“組換え体”とは、ポリヌクレオチド構成物（例えばアデノウイルスゲノ ム）が、部分的にヒトによる意図的な改変により形成されていることを示す。 本明細書に用いる場合、用語“複製欠損ウイルス”とは、ウイルス複製表現型 の発現を支持し、非複製非形質転換細胞の特徴的な正常なｐ53及びRB機能を含む 細胞において実質的に、細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導し、又は複製表 現型を発現できない所定の細胞集団（例えばｐ53及び／又はRB機能を実質的に欠 如する細胞）において優先的に、細胞増殖を阻害し又はアポトーシスを誘導する ウイルスをいう。典型的には、複製欠損ウイルスは、正常なRB及び／又はｐ53機 能を含む細胞へのプラーク効率の実質的な減少を示す。 本明細書に用いる場合、用語“ｐ53機能”とは、ｐ53遺伝子によりコードされ るポリペプチドであって、そのｐ53ポリペプチドが野生型アデノウイルス２又は ５のE1b p55タンパク質に結合することができるポリペプチドの（同じ組織型の 非新生物細胞に対して）本質的に正常なレベルを有する特性をいう。例えば、ｐ 53 機能は、ｐ53の不活性（即ち変異）形態の生産により又はｐ53ポリペプチドの 発現の実質的な減少もしくは完全な損失により失われ得る。また、ｐ53機能は、 野生型ｐ53タンパク質をコードするｐ53対立遺伝子を含む新生物細胞において実 質的に欠如し得る；例えば、ｐ53の異常な亜細胞プロセッシング又は局在化を生 じる変異（例えば核より細胞質において主にｐ53の局在化を生じる変異）のよう なｐ53座の外側の遺伝子変異がｐ53機能を失わせ得る。 本明細書に用いる場合、用語“RB機能”とは、RB遺伝子によりコードされるポ リペプチドであって、そのRBポリペプチドが野生型アデノウイルス２又は５のE1 bタンパク質に結合することができるポリペプチドの（同じ組織型の非新生物細 胞に対して）本質的に正常なレベルを有する特性をいう。例えば、RB機能は、RB の不活性（即ち変異）形態の生産により又はRBポリペプチドの発現の実質的な減 少もしくは完全な損失により失われ得る。また、RB機能は、野生型RBタンパク質 をコードするRB対立遺伝子を含む新生物細胞において実質的に欠如し得る；例え ば、RBの異常な亜細胞プロセッシング又は局在化を生じる変異のようなRB座の外 側の遺伝子変異がRB機能を失わせ得る。 本明細書に用いる場合、用語“複製表現型”とは、複製欠損アデ ノウイルスのようなウイルスが感染した細胞の１又は複数の以下の表現型特性を いう：（１）キャプシドタンパク質（例えばアデノウイルスのペントンベースポ リペプチド）のような後期遺伝子産物又はウイルスの後期遺伝子プロモーターか ら開始するRNA転写物の実質的な発現、（２）ウイルスゲノムの複製又は複製中 間体の形成、（３）ウイルス粒子又はパッケージングされたビリオン粒子のアセ ンブリー、（４）感染した細胞における細胞変性効果(CPE)の出現、（５）ウイ ルス溶解サイクルの完了、及び（６）機能的オンコプロテインをコードする野生 型複製コンピテントDNAウイルスが感染した非新生物細胞におけるｐ53又はRB機 能の廃止を典型的に条件とする他の表現型変化。複製表現型は、先に列記された 表現型特性のうちの少くとも１つ、好ましくは表現型特性の１超を含む。 用語“抗新生物複製欠損ウイルス”とは、本明細書において、同じ組織的細胞 型の感染した非複製非新生物細胞に対する感染した新生物細胞の優先的な細胞殺 害により、ヒトにおける新形成の発達又は進行を阻害する機能的特性を有する組 換えウイルスをいうのに用いられる。 本明細書に用いる場合、“新生物細胞”及び“新形成”とは、それらが細胞増 殖の制御の大きな損失を特徴とする異常な増殖表現型を示すように、比較的自主 的な増殖を示す細胞をいう。新生物細胞は、活性的に複製し得る、又は一時的な 非複製の休止状態(Ｇ₁又はＧ₀)にある細胞を含み；同様に、新生物細胞は、十分 に分化した表現型、ほとんど分化していない表現型を有する細胞、又は両方の細 胞型の混合物を含み得る。これにより、必ずしも全ての新生物細胞が所定の時点 で細胞を複製することは必要でない。新生物細胞として定義されるセットは、良 性の新生物の細胞及び悪性（又は明らかな）新生物の細胞からなる。明らかな新 生物細胞は、頻繁に、癌 と呼ばれ、典型的には、内胚葉もしくは外胚葉組織起源の細胞由来なら癌腫、又 は中胚葉由来の細胞型起源なら肉腫と呼ばれる。 本明細書に用いる場合、用語“作用可能に連結”とは、機能的関係でのポリヌ クレオチド要素の連結をいう。核酸は、それが他の核酸配列と機能的関係がある ように配置されるなら、“作用可能に連結”される。例えば、プロモーター又は エンハンサーは、それがコーディング配列の転写に影響を与えるなら、コーディ ング配列に作用可能に連結される。DNA配列が作用可能に連結される手段は、典 型的には連続的であり、必要なら、２つのタンパク質コーディング領域を、連続 的かつ読み枠内に連結する。しかしながら、エンハンサーは、数キロベース、プ ロモーターから離れた場合に機能し、イントロン配列は種々の長さであり得るの で、特定のポリヌクレオチド要素は連続的でなくとも作用可能に連結され得る。 本明細書に用いる場合、“生理条件”とは、完全な哺乳動物細胞又は生きてい る哺乳動物の組織空間又は器官における条件と実質的に同様のイオン強度、pH、 及び温度を有する水性環境をいう。典型的には、生理条件は、約150mMのNaCl(又 は任意にKCl)、pH6.5〜8.1、及び約20〜45℃の温度を有する水溶液を含む。一般 に、生理条件は、生物高分子の分子間会合のための適切な結合条件である。例え ば、150mM NaCl、pH7.4、37℃の生理条件が一般に適切である。 詳細な記載 一般に、以後用いる命名法及び以下に記載される細胞培養、分子遺伝学、及び 分子ウイルス学における研究手順は公知かつ当該技術に一般に用いられるもので ある。組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、ポリペプチド合成、（複製欠損ウ イルスストックをトランス コンプリメンテーション可能な細胞系を含む）ウイルスストックの形成及び増殖 、及び細胞培養等のために標準的な技術が用いられる。一般的な酵素反応及びス テップは、製造元の説明に従って行われる。それら技術及び手順は、当該技術に おける慣用的な方法及び本文献全体を通して供される種々の一般的な引用文献（ 一般に引用により本明細書に組み込まれるSambrookらMolecular Cloning:A Labo ratory Manual，2d ed.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spr ing Harbor，N.Y.；Virology，Second edition，eds．Fields BN及びKnipe DM， （1990）Raven Press，New York，NYを参照のこと）に従って一般に行われる。 それらの手順は当該技術で公知であると思われ、読者の便利さのために供される 。ここに含まれる全ての情報は引用により本明細書に組み込まれる。 新形成は、部分的に、変異体遺伝子型及び表現型を有する新生物細胞の形成を 特徴とする病理的状態である。特定の腫瘍は、RB機能を欠くがｐ53機能を有する 細胞の集団を含み；これら細胞はRB^(-)で示される。特定の腫瘍細胞はｐ53機能 を欠如し、RB機能を有し得る；このような細胞をp53^(-)で示す。特定の腫瘍はｐ 53 及びRBの両方を欠如する細胞を含み得、これをp53^(-)RB^(-)で示す。細胞系SAO S2(以下の実験例を参照のこと)は、p53^(-)RB^(-)である新生物細胞型の例である 。また、ｐ53及びRBの本質的に正常なレベルを含む新生物細胞も存在し得る；こ のような正常なｐ53及び正常なRBの両方を有する細胞は、このような新生物細胞 中で複製表現型を優先的に示し得る抗新生物ウイルス構成物のための基礎を供し 得る他のオンコプロテイン（例えばｐ53又はRB以外の腫瘍サプレッサー遺伝子産 物）を欠如し得る。 本発明の基礎は、哺乳動物細胞に感染するいくつかのDNAウイルス（例えばア デノウイルス；パポーバウイルス、例えばBK及びJC, SV40、及びパピローマウイルス、例えばHPV等）が、ウイルス複製サイクルを通 しての有効な進行のために本質的であるウイルスタンパク質をコードし；これら のウイルスタンパク質のうちのいくつかは、有効なウイルス複製のための必要条 件として、細胞のタンパク質、例えは転写複合体の細胞サイクル制御及び／又は 形成に関連するものを隔離する。ｐ53及びRBのような細胞タンパク質に結合し、 それを隔離し、又はそれを分解するウイルスタンパク質の欠如下において、ウイ ルス複製が実質的に阻害される。ｐ53及び／又はRBを隔離し又は分解する能力を 欠如する変異ウイルスが感染した正常な（即ち非新生物）細胞は、一般に変異ウ イルスの複製を支持することができず、従ってこのような変異ウイルスは複製欠 損であると考えられる。しかしながら、ｐ53又はRBの隔離又は分解は、機能的なｐ53 又はRBを欠如する細胞（これらの細胞を各々p53^(-)及びRB^(-)で示す）にお けるウイルス複製のために必要でないので、ｐ53及び／又はRB隔離又は分解につ いて欠損している複製欠損変異ウイルスは、本質的に正常なｐ53及び／又はRB機 能を有する細胞におけるよりかなりの程度、これらp53^(-)又はRB^(-)において複 製表現型を発現し得ることが可能である。新生物細胞は、頻繁に、ｐ53機能（p5 3^(-)細胞）、RB機能（RB^(-)細胞）、又は両方の機能(p53^(-)RB^(-)細胞)を欠如す る。従って、いくつかの複製欠損ウイルス変異体は、新生物細胞において複製表 現型を優先的に示し得る。 機能的なRB不活性化タンパク質（例えばアデノウイルスE1a，HPV E7タンパク 質）を発現する能力を欠如するウイルス変異体は、RB^(-)細胞及びPB^(-)p53^(-)細 胞において複製表現型を示すであろう。機能的なｐ53不活性化タンパク質（例え ばアデノウイルスE1bp55，HPV E6タンパク質）を発現する能力を欠如するウイル ス変異体は、p53^(-)細胞及びRB^(-)p53^(-)細胞において複製表現型を 示すであろう。機能的なｐ53不活性化タンパク質（例えばアデノウイルスE1b p5 5，HPV E6タンパク質）及び機能的なRB不活性化タンパク質（例えばアデノウイ ルスE1a，HPV E7タンパク質）の両方を発現する能力を欠如するウイルス変異体 は、RB^(-)p53^(-)細胞において複製表現型を示すであろう。それゆえ、複製表現 型の発現につながる細胞毒性は、PB^(-)，p53^(-)、又はPB^(-)p53^(-)表現型を有す る新生物細胞を優先的に殺すための基礎として用いることができる。いくつかの 複製非新生物細胞は細胞周期を通して進行する間、一時的にRB^(-)表現型、p53^{(- )} 表現型、又はRB^(-)p53^(-)表現型を示し得るが、本発明のウイルス変異体は、た とえ新生物細胞の完全な選択的な殺害が必ずしもなくても、単独で又は他の治療 のモダリティーと組み合わせて用いるべき有用な抗新形成治療モダリティーを有 利に構成するのに用いることができる。HPV E7ポリペプチドの37アミノ末端残基 における欠失（又は他の不活性化変異）は、これらの残基はRB結合のために重要 であるので、RB^(-)細胞への適用のための好ましいHPV変異体である。 以下に供される方法及び組成物は複製欠損アデノウイルス構成物に関する方法 について詳しく記載されるが、本発明は、ｐ53タンパク質又はRBタンパク質の分 解を隔離し又は増強するオンコプロテインをコードする他のDNAウイルス、例え ば各々ｐ53及び／又はRB機能を実質的に廃止するＥ６及び／又はＥ７遺伝子中に 変異を含む複製欠損パピローマウイルス種（例えばHPV 16，18，33型の変異体） で実施することができる。Adenoviridae科のメンバー（特にMastadenovirus属） に加えて、ｐ53又はRBを隔離及び／又は不活性化するウイルスタンパク質をコー ドするPapovaviridae科のメンバー、特にパピローマウイルス及びポリオウイル スが本発明の方法に適すると思われる。 アデノウイルス及びパポーバウイルスの生物学の一般的な記載について、引用 により本明細書に組み込まれるVirology、第２版、eds．Fields BN and Knipe D M，Vol.2，pp.1651〜1740が導入のために言及され得る。以下の特定の記載は、 これらに限らないが、アデノウイルス抗原型５及びアデノウイルス抗原型２に言 及する。他のアデノウイルス抗原型を用いることができると思われるが、アデノ ウイルス５型が、E1aウイルス遺伝子領域のウイルスによりコードされたポリペ プチドのウイルスヌクレオチド及びアミノ酸ナンバリングのヌクレオチドナンバ リング変換、及び他のウイルス遺伝子のための便利な引用を供する。当業者は、 他のアデノウイルス抗原型における対応する位置を直ちに同定するであろう。ヒ トパピローマウイルスへの引用は、一般に、新形成に関連する型（例えば16，18 又は23型）に言及する。但し、非オンコジーン型も用いることができる。 E1b 変異体 細胞ホスホプロテインｐ53の機能は、細胞周期を通じての哺乳動物細胞の進行 を阻害することである。野生型アデノウイルスE1b p55タンパク質は、ｐ53を有 する感染した細胞内でｐ53に結合し、おそらく不活性形態においてｐ53を隔離す ることにより、ｐ53機能の実質的不活性化をおこす。機能的E1b p55タンパク質 は機能的ｐ53を含む細胞における有効なアデノウイルス複製に本質的である。従 って、ｐ53に結合する能力を実質的に欠如するアデノウイルスは機能的ｐ53の正 常なレベルを有する非複製非新生物細胞において複製欠損である。 ヒト腫瘍細胞は、頻繁に、変異した（例えば置換、欠失、フレームシフト変異 体）ｐ53対立遺伝子についてホモ接合又はヘテロ接合であり、細胞周期の正常な 制御のために必要なｐ53機能を欠如する （Hollsteinら（1991）Science 253：49;Levineら（1991）前掲、引用により本 明細書に組み込まれる）。これにより、多くの新生物細胞はp53^(-)である。なぜ ならそれらは十分なレベルのｐ53タンパク質を欠如するから及び／又はそれらは 、実質的なｐ53機能を行うことができず、（例えば機能的な多量体の形成を阻害 することにより）野生型ｐ53が存在し得る場合でさえ実質的にｐ53機能を排除し 得るｐ53の変異体形態を発現するからである。いくつかの新生物細胞は本質的に 野生型のｐ53タンパク質をコードする対立遺伝子を含み得るが、ｐ53機能を実質 的に廃止する第２の部位変異、例えば核でなく細胞質に局在化するｐ53タンパク 質を生ずる変異を含み得る；このような第２の部位変異も実質的にｐ53機能を欠 如する。 ｐ53と複合体形成する能力を欠如するが、他の本質的なウイルス複製機能を実 質的に保持する複製欠損アデノウイルス種は、ｐ53機能を欠損する細胞（例えば 、実質的に削除されたｐ53対立遺伝子についてホモ接合である細胞、本質的に非 機能性である変異ｐ53タンパク質を含む細胞）中で複製表現型を示すであろうが 、非複製非新生物細胞中では複製表現型を示さないであろう。このような複製欠 損アデノウイルス種は、本明細書において、E1b-p53^(-)複製欠損アデノウイルス として便利のため言及される。 ｐ53機能を欠如する新生物細胞の副次集団及び本質的に正常なｐ53機能を発現 する非新生物細胞の副次集団を含む細胞集団（例えば細胞培養混合物又はヒト癌 患者）は、感染条件（例えば細胞集団のアデノウイルス感染に適した条件、典型 的には生理的条件）下で、E1b-p53^(-)複製欠損アデノウイルスの感染投与量を含 む組成物と接触させることができる。このような接触は、E1b-p53^(-)複製欠損ア デノウイルスの細胞集団への感染を引きおこす。その感染は、ｐ53機能を欠如す る新生物細胞の副次集団を含む細胞の重大な画分 において複製表現型の優位な発現を引きおこすが、本質的に正常なｐ53機能を有 する非新生物細胞の副次集団において複製表現型の実質的な発現を引きおこさな い。感染したp53^(-)細胞における複製表現型の発現は、例えば細胞変性効果(CPE )、細胞溶解、アポトーシス等により、細胞を殺し、これによりその細胞集団か ら新生物ｐ53^(-)細胞を選択的に排除する。 典型的には、p53^(-)新生物細胞の選択的殺害に適したE1b-p53^(-)複製欠損アデ ノウイルス構成物は、E1b p55ポリペプチドがｐ53タンパク質に有効に結合する 能力を不活性化する変異（例えば欠失、置換、フレームシフト）を含む。このよ うな不活性化変異は、典型的には、ｐ53に結合するｐ55の領域内でおこる。任意 に、変異体E1b領域は、E1b領域の残りによりコードされ、E1aポリペプチドの欠 如下でアデノウイルス初期遺伝子のトランスアクチベーションにおいて機能する 機能的ｐ19タンパク質をコードし、発現する。 本発明の方法及び組成物に用いるための適切なE1b-p53^(-)複製欠損アデノウイ ルス構成物は、以下の例に限らないが、（１）ｐ55タンパク質の翻訳の開始のた めに用いたAUGコドンの３アミノ酸下流に停止コドンを作り出すヌクレオチド位 置2022におけるＣからＴへの変異並びにヌクレオチド3336に第２の停止コドンを 作り出す小さなリンカー挿入で置換されたヌクレオチド2496と3323との間の欠失 を含むアデノウイルスタイプ２ dI 1520(p19タンパク質の発現は本質的に影響を 受けない)(引用により本明細書に組み込まれるBarker及びBerk（1987）Virology 156：107)、並びに（２）少くとも位置2022の変異及び／又は2496〜3323欠失 変異を含むアデノウイルスタイプ２ dI 1520、又はその実質的な部分、並びにp1 9 cyt変異体を作り出すｐ19における更なる変異を含む複合アデノウイルス構成 物（ここで、その複合ウイルス構成物はｐ55を欠如し、p19 cyt 変異の増強された細胞変性効果を含む）を含む。Ad2 dI 1520はDr.A.Berk(Vnive rsity of California at Los Angeles，Los Angeles，CA)から利用でき、引用に より本明細書に組み込まれるBarker及びBerk(1987)(Virology 156：107)に記載 される。 さもなければE1b-p53^(-)変異体の複製を支持するであろう新生物細胞において 感染性ビリオンの形成を阻害するために、これらのアデノウイルスに更なる変異 を組み込むことが好ましい。このような更なる不活性化変異は、隣接する細胞に 広がり及びそれに感染することができる感染性ウイルスを形成する完全なウイル ス複製が不要である治療モダリティーに好ましいであろう。これらの十分に不活 性化された変異体は、非複製性E1b-p53^(-)変異体として言及される。このような 非複製性変異体は、p53^(-)RB^(-)細胞中でさえ感染性ビリオンの形成を防ぐ変異 を含み；このような変異は、典型的には、本質的なビリオンタンパク質又はプロ テアーゼにおける構造的変異である。 しかしながら、多くのモダリティーにおいて、変異体ウイルスが複製し、他の 細胞に広がって感染し得る変異体ウイルスゲノムを含む感染性ビリオンを形成し 、これにより変異体ウイルスの最初の投与の抗新生物作用を増幅させることが要 求される。 ｐ53に結合する能力を欠如する更なるE1b^(-)変異体は、ｐ55ポリペプチドをコ ードするE1b遺伝子領域中に変異を形成し、変異体ｐ55ポリペプチドを発現させ 、その変異体ｐ55ポリペプチドを水性結合条件下でｐ53又はｐ53の結合フラグメ ントに接触させ、そして本発明に用いるのに適した候補E1b^(-)変異体であるとし てｐ53に特異的に結合しない変異体E1bポリペプチドを同定することにより当業 者により作られ得る。 より典型的には、候補E1b^(-)変異体を同定するために機能的ア ッセイが用いられよう。例えば、ｐ53機能の決定のためのFriendアッセイは、本 質的に引用により本明細書に組み込まれるFrebourgら(1992)(Cancer Res ．52:69 77 )に記載されるように行われよう。ｐ53を不活性化する能力を欠如するE1b変異 体は、候補E1b^(-)複製欠損変異体として同定されよう。 E1a ／E1b二重変異体 いくつかのヒト腫瘍細胞は、一方又は両方のタンパク質種の変異による不活性 化及び欠失のいずれかにより、ｐ53機能及びRB機能の両方を欠如する。このよう な細胞はp53^(-)RB^(-)細胞と呼ぶ。 ｐ53に結合する能力を欠如し、RBに結合する能力も欠如するが、他の本質的な ウイルス複製機能を実質的に保持する複製欠損アデノウイルス種はp53^(-)RB^(-) 細胞において複製表現型を優先的に示すであろう。このような複製欠損アデノウ イルス種は本明細書において便利のため、E1a-RB^(-)／E1b-p53^(-)複製欠損アデ ノウイルス、又は単純にE1a／E1b二重変異体と呼ぶ。このようなE1a／E1b二重変 異体は、E1a領域内の少くとも１のE1a-RB^(-)変異及びｐ55をコードするE1b領域 内の少くとも１のE1b-p53^(-)変異を組み合わせてE1a／E1b二重変異体アデノウイ ルスを形成することにより当業者により作製され得る。このような複製欠損二重 変異体アデノウイルスは、ｐ53及びRB機能の両方に欠損がある細胞において複製 表現型を示すであろうが、非複製非形質転換細胞又はｐ53もしくはRB機能に欠損 があり両方の機能がない細胞において複製表現型を実質的に示さないであろう。 例えば、Ad5 dI 434変異体（Grodzickerら（1980）Cell 21：454、引用により本 明細書に組み込まれる）は、E1a座の欠失及びE1b座の部分的欠失を含み、機能的 なE1a及びE1b p55タンパク質をコードする能力を実質的に欠如する。 ｐ53及びRB機能を欠如する新生物細胞の副次集団及び本質的に正 常なｐ53機能及び／又はRB機能を発現する非新生物細胞の副次集団を含む細胞集 団（例えば細胞培養混合物又はヒト癌患者）は、感染条件（例えば細胞集団のア デノウイルス感染に適した条件、典型的には生理的条件）下で、複製欠損E1a／E 1b二重変異体アデノウイルスの感染投与量を含む組成物と接触させることができ る。このような接触は、E1a／E1b二重変異体複製欠損アデノウイルスの細胞集団 への感染を引きおこす。その感染は、ｐ53機能及びRB機能を欠如する新生物細胞 の副次集団を含む細胞の重大な画分において複製表現型の優位な発現を引きおこ すが、本質的に正常なｐ53機能及び／又はRB機能を有する非新生物細胞の副次集 団において複製表現型の実質的な発現を引きおこさない。感染したp53^(-)RB^(-) 細胞における複製表現型の発現は、例えば細胞変性効果(CPE)、細胞溶解等によ り、細胞を殺し、これによりその細胞集団から新生物p53^(-)RB^(-)細胞を選択的 に排除する。 さもなければE1a／E1b二重変異体の複製を支持するであろう新生物細胞におい て感染性ビリオンの形成を阻害するために、これらのアデノウイルスに更なる変 異を組み込むことが好ましい。このような更なる不活性化変異は、隣接する細胞 に広がり及びそれに感染することができる感染性ウイルスを形成する完全なウイ ルス複製が不要である治療モダリティーに好ましいであろう。これらの十分に不 活性化された変異体は、非複製性E1a／E1b二重変異体として言及される。このよ うな非複製性変異体は、p53^(-)RB^(-)細胞中でさえ感染性ビリオンの形成を防ぐ 変異を含み；このような変異は、典型的には、本質的なビリオンタンパク質又は プロテアーゼにおける構造的変異である。 しかしながら、多くのモダリティーにおいて、変異体ウイルスが複製し、他の 細胞に広がって感染し得る変異体ウイルスゲノムを含 む感染性ビリオンを形成し、これにより変異体ウイルスの最初の投与の抗新生物 作用を増幅させることが要求される。 負の選択のウイルス構成物 感染した細胞におけるアデノウイルス複製表現型の発現は、一般に細胞溶解、 細胞変性効果(CPE)、アポトーシス、又は他の細胞死のメカニズムによりウイル ス誘導性の細胞毒性と相関するが、しばしば、抗新生物治療のために用いるべき 組換えアデノウイルスの細胞毒性を増加させることが好まれる。このような増強 は、典型的には複製表現型を発現する細胞中で正の転写調節を示すアデノウイル スプロモーターに作用可能に連結された。組換えアデノウイルス中の負の選択遺 伝子を含む形態をとり得る。例えば、HSV tk遺伝子カセットは、Ad5 NT dI 1110 のような複製欠損アデノウイルスのＥ３プロモーターの直下に作用可能に連結さ れ得る。頻繁に、負の選択カセットを適合させるためにアデノウイルスゲノムの （例えばウイルス複製及びパッケージングのための）非本質的部分を削除するこ とが要求され；これによりＥ３遺伝子領域の実質的な部分が削除され、Ｅ２プロ モーター（及びエンハンサー）又は他の適切なプロモーター／エンハンサーに作 用可能に連結されたHSV tk遺伝子のような負の選択カセットで置換され得る。あ るいは、負の選択遺伝子は、後期遺伝子プロモーターからの転写を特徴とする複 製表現型を発現する細胞において負の選択遺伝子産物の有効な発現を許容するた めにアデノウイルス後期領域プロモーターに作用可能に連結され得る。 生体内で感染性ビリオンを形成するウイルス複製が不要である実施形態のため に、非複製性であるアデノウイルス複製欠損構成物が用いられる。このような非 複製性変異体は、E1a^(-)及び／又はE1b^(-)変異を含み、適切な新生物細胞（例え ばp53^(-)細胞、PB^{(- )} 細胞、又はp53^(-)PB^(-)細胞）において複製表現型を作り出すのに必要な全ての 遺伝子機能を含むが、構造的コートタンパク質等のような感染性ビリオンの形成 に必要な少くとも１の本質的な遺伝子機能を欠失している。あるいは、ウイルス により誘発された顕在化された免疫応答は、感染性ビリオンを中和し、ウイルス 感染の広がりを調節することができる。E1a及び／又はE1b変異に加えて補足性の トランス作用機能を欠如する非複製性変異体は、欠失したトランス作用機能を供 することができる補足性ヘルパーウイルス又はヘルパー細胞系と合わせて増殖さ せることができる。例えば、トランスにおいてE1a及びE1b機能を供する293細胞 系(ATCC # CRL1573;Grahamら（1977）J.Gen.Virol ．36：59、引用により本明細 書に組み込まれる）は、ウイルスストックを発達させるための“非複製性”変異 体の増殖を許容するために、ビリオンコートタンパク質等のようなトランスにお いて更なる機能を供するように改変され得る。 細胞におけるHSV tk遺伝子の発現は、その細胞がガンシクロビル又はFIAVのよ うな負の選択剤に露出されなければ、その細胞に対して直接、毒性ではない。負 の選択遺伝子が実質的に発現される複製表現型を発現する感染した細胞は、tk遺 伝子を発現する感染した細胞が選択的に排除される時に、負の選択剤（例えばガ ンシクロビル）が有効な選択的投与量で投与されるまで、本質的に更なる毒性を 作り出さない；これにより、負の選択は、細胞変性での殺害のため、及び／又は 複製表現型を示す細胞を殺すことにより更なるウイルス複製を減衰させるために 用いることができる。更に、負の選択剤の投与量及び／又は投与スケジュールを 調節することにより、負の選択遺伝子を発現する感染した細胞集団の部分的排除 のみを行うことが可能である。一般に、ガンシクロビルの投与量は、標準投与量 −応答曲線を作り、感染した新生物細胞の要求されるレベルが観察される投与レ ベルを決定することにより較正される。ガンシクロビル（GANC）の動物への投与 に関する情報は、パッケージ挿入物からヒトが指示する説明書を含む当該技術に おける種々のソースにおいて利用できる。細胞培養に用いる場合、ガンシクロビ ルの選択的濃度は、典型的には、0.05mM〜50mMの範囲、典型的には１mMであり、 試験管内適用のために約0.2mMが用いられ、生体内適用のために約１〜５mMが投 与される（典型的には、水溶液中125mg／mlのガンシクロビルが充填された浸透 ポンプからの連続注入により約24時間にわたって投与される）。生体内投与のた めの投与スケジュールは、７日間、静脈内への５mg／kg体重B.I.D.の投与量のガ ンシクロビルを含み得る。 負の選択遺伝子は、E1a-RB^(-)複製欠損アデノウイルス構成物、E1ba-p53^(-)複 製欠損アデノウイルス構成物、E1a／E1b二重変異体複製欠損ウイルス構成物等に 組み込むことができる。好ましい実施形態は、tk発現カセットを形成するために ポリアデニル化部位と共にAd5 NT dI 1110のＥ２プロモーターもしくは他のプロ モーター及び／又はエンハンサー（例えば主要後期ブロモーター、E1aプロモー ター／エンハンサー、E1bプロモーター／エンハンサー）に作用可能に連結したH SV tk遺伝子カセット（引用により本明細書に組み込まれる（Zjilstraら（1989 ）Nature 342：435;Mansourら（1988）Nature 336：348;Johnsonら（1989）Sc ience 245：1234:Adairら（1989）Proc.Natl.Acad.Sci （U.S.A.）86:4574;Cape cchi，M．（1989）Science 244:1288）。tk発現カセット（又は他の負の選択発 現カセット）は、例えばＥ３遺伝子の実質的欠失のための置換として、アデノウ イルスゲノムに挿入される。他の負の選択遺伝子及び複製欠損アデノウイルス構 成物は当業者に明らか であろう。Ｅ２プロモーターに作用可能に連結された負の選択遺伝子は、Ｅ２プ ロモーターが多重のE2F部位を含むので、E1a^(-)複製欠損アデノウイルス変異体 への組込みのための特に好ましい実施形態であり、RB機能を欠如するRB^(-)及びp 53^(-)RB^(-)は、おそらく、Ｅ２プロモーターからのより有効な転写を示すであろ う。 診断及び試験管内での使用 本発明の複製欠損アデノウイルスは、ｐ53及び／又はRB機能を欠如する細胞の 存在を検出するのに用いることができる。例えば、ｐ53及び／又はRBを欠損する 新生物細胞の副次集団を含む細胞サンプルは、適切な複製欠損アデノウイルス種 が感染し得る。適切なインキュベーション期間の後、複製表現型（例えばトリプ トファン・ブルーを排除する能力の喪失、ビリオン形成、ウイルスDNAへの¹Ｈ− チミジン組込み）を発現する細胞サンプル中の細胞は、その細胞サンプル中の複 製性及び／又は新生物細胞の数又は集団の基準を供するために定量することがで きる。このような方法は、外植された細胞サンプル（例えばリンパ球の白血病の ための化学療法の基礎となる患者からのリンパ球サンプル）に基づいて患者にお ける化学療法に従い、新生物を診断し、及び／又は腫瘍細胞量を評価するために 用いることができる。 他の診断的使用及びバリエーションは明らかである；例えばリポーター遺伝子 （例えばルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ）は、複製欠損アデノウイルス において負の選択遺伝子のかわりに置換することができ；形質転換された細胞は 、細胞においてｐ53及び／又はRBの欠如を示す複製表現型の発現と相関するリポ ーター遺伝子の発現により、（細胞サンプル又は形質転換アッセイのように）評 価することができる。 治療方法 新生物病の治療は、E1a-RB^(-)複製欠損アデノウイルス、E1b-p53^(-)複製欠損 アデノウイルス、E1a／E1b二重変異体、及び負の選択遺伝子を更に含む複製欠損 アデノウイルスを含む、本発明の複製欠損アデノウイルスを含む組成物を患者に 投与することにより供され得る。 ｐ53及び／又はRB機能を欠如する細胞を含む種々のヒト新生物は、複製欠損ア デノウイルスで処理することができる。例えばこれらに限らないが、気管支癌、 鼻咽腔癌、喉頭癌、小細胞及び非小細胞肺癌、肺腺癌、肝臓癌、膵臓癌、膀胱癌 、結腸癌、乳癌、頸部癌、卵巣癌、又はリンパ性白血病を有するヒト患者又は非 ヒト哺乳動物は、適切な複製欠損アデノウイルスの有効な抗新生物投与量を投与 することにより治療することができる。感染性アデノウイルス粒子の懸濁液は、 静脈内、腹腔内、筋内、皮下及び局所を含む種々の経路により新生物組織に適用 することができる。１ml当り約10³〜10¹²又はそれ超のビリオン粒子は、（例え ば気管支癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、又は喉頭癌を治療するための 肺デリバリーのために）霧として吸入しても、腫瘍（例えば気管支癌、鼻咽腔癌 、喉頭癌、頸部癌）を治療するために腫瘍部位に直接ぬってもよく、又は（例え ば卵巣癌を治療するために腹腔内に、肝臓癌又は他の非肝臓一次腫瘍からの肝臓 転移を治療するため門脈に）注入又は他の適切な経路、例えば腫瘍塊（例えば乳 腫瘍）、浣腸（例えば直腸癌）、又はカテーテル（例えば膀胱癌）により投与し てもよい。 候補の抗新生物アデノウイルス変異体は、新生物細胞の等価の移植を有する未 処理のマウスと比べて、ｐ53及び／又はRB機能を欠如する新生物細胞の移植を有 するnu／nuマウスにおいて腫瘍形成又は新生物細胞荷を減少させる能力により更 に評価することができる。 抗新生物複製欠損アデノウイルス変異体は、新生物病を有する患 者への治療及び診断的投与のために製剤化され得る。 治療又は予防的使用のために、１又は複数の種の抗新生物複製欠損アデノウイ ルス変異体の医薬的に有効な投与量を含む滅菌組成物は、新生物状態の治療のた めにヒト患者又は獣医学的非ヒト被検体に投与される。一般に、本組成物は、水 性懸濁液中に約10³〜10¹⁵又はそれ超のアデノウイルス粒子を含むであろう。医 薬として許容される担体又は賦形剤は、しばしばこのような滅菌組成物に用いら れる。種々の水溶液、例えば水、緩衝水、0.4％塩類溶液、0.3％グリシン等を用 いることができる。これらの溶液は滅菌状態であり、一般に要求されるアデノウ イルスビリオン以外の粒状物を含まない。本組成物は、適切な生理条件に必要と される医薬として許容される補助物質、例えばpH調節及び緩衝剤、毒性調節剤等 、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳 酸ナトリウム等を含み得る。アデノウイルスによる細胞の感染を増強する賦形剤 が含まれ得る。 複製欠損ウイルスは、リポソーム又はイムノリポソームにより新生物細胞にデ リバリーしてもよい：このようなデリバリーは、新生物細胞上に存在する細胞毒 面特性（例えばイムノリポソーム内のイムノグロブリンに結合する細胞表面タン パク質の存在）に基づいて新生物細胞を選択的に標的にすることができる。典型 的には、ビリオンを含む水性懸濁液は、リポソーム又はイムノリポソームにカプ セル化される。例えば、複製欠損アデノウイルスビリオンの懸濁液は、慣用的な 方法（引用により本明細書に組み込まれる米国特許5,043,164、米国特許4,957,7 35、米国特許4,925,661；Connor及びHuang(1985)J.Cell Biol. 101：582;Lasic DD(1992)Nature 355：279;Novel Drug Delivery(eds．Prescott LF and Nimmo WS:Wiley，New York，1989);Reddyら（1992）J.Immunol. 148 ：1585）によりイムノリポソームを形成するようにミセル内にカプセル化するこ とができる。個体の癌細胞上に存在する癌抗原（例えばCALLA，CEA）に特異的に 結合する抗体を含むイムノリポソームは、ビリオンをこれらの細胞に標的化する のに用いることができる。 本抗新生物複製欠損アデノウイルス又はその混合物を含む組成物は、新生物病 の予防及び／又は治療への適用のために投与することができる。治療への適用の ために、組成物は、その条件及びその合併症を治癒し又は少くとも部分的に制限 するのに十分の量で、特定の新生物病に既にかかっている患者に投与される。こ れを達成するのに適した量は、“治療して有効な投与量”又は“有効な投与量” として定義される。この使用のために有効な量は、その状態の激しさ、患者の一 般的状態、及び投与の経路によるであろう。 予防への適用において、抗新生物複製欠損アデノウイルス又はそれらの混合物 を含む組成物は、新生物の再発に対する患者の耐性を増強するため又は寛解時間 を長くするために新生物病状態にない患者に投与される。このような量は、“予 防に有効な量”として定義される。この使用においても、正確な量は、患者の健 康状態及び免疫の全般的なレベルによる。 本組成物の一回の又は複数の投与は、治療する医師が投与レベル及びパターン を選択して行うことができる。いずれの場合でも、医薬製剤は、患者を有効に治 療するのに十分な量の本発明の抗新生物複製欠損アデノウイルスを供するであろ う。 本発明の抗新生物複製欠損アデノウイルス治療は、他の抗新生物プロトコル、 例えば慣用的な化学療法及び／又は免疫抑制法と組み合わせることができる。免 疫抑制のための手順は、WO 96／12406に本質的に記載されるものからなるであろ う。一般に、複製欠損アデノウイルスは、単独で、又は免疫抑制剤との混合物で 投与される であろう。好ましい免疫抑制化合物の例は、シクロホスホアミド、シクロスポリ ン、又はデキサメタゾンである。要求される免疫抑制のレベルを実現するための これらの化合物の投与量は、当該技術で周知である。例えば、シクロホスホアミ ドは、好ましくは、100〜300mg／kgで投与され、デキサメタゾンは、好ましくは 、約２〜６mg／kgで投与される。 変異体アデノウイルスの増殖 本発明のアデノウイルス変異体（例えばE1a-RB^(-)複製欠損アデノウイルス、E 1b-p53^(-)複製欠損アデノウイルス、及びE1a／E1b二重変異体）は、典型的には 、感染性変異体ウイルスの複製及び形成を支持するために、トランスにおいて、 各々E1a機能、E1b機能、又はE1a及びE1b機能の両方を供し得る細胞系(例えば、2 93細胞系ATCC # CRL157)、American Type Culture Collection，Rockville，MD; Grahamら（1977）J.Gen.Virol ．36：59）においてウイルスストックとして増殖 される。 以下の実施例は、例として供され、限定を意図したものではない。バリエーシ ョン及びかわりの実施形態は当業者に明らかであろう。 実験例 複製欠損組換えアデノウイルスの、ｐ53及び／又はRbを欠如する新生物細胞へ の効果 以下の実験例は、ｐ53及び／又はRb機能を欠如する新生物細胞への複製欠損組 換えアデノウイルス調製物の投与が、新生物細胞を有効に殺すことができること を証明する。その例は、ｐ53及びRb機能を含む非新生物細胞が、複製欠損組換え アデノウイルス調製物による殺害に対して比較的耐性であることも示す。それゆ え、以下に供するデータは、複製欠損組換えアデノウイルスの投与が新生物細胞 を選択的に殺すのに用いることができることの実験的確認を供する。その選択的 殺害は、変異体アデノウイルスが新生物細胞において複製表現型を誘導するが、 非新生物細胞においては複製表現型（又は関連する細胞変性効果）を実質的に誘 導しない異なる能力を利用することにより供される。 対照非新生物細胞及び種々の新生物細胞型を示す細胞系を10％胎児ウシ血清を 含むDMEM（高グルコース量）中で集落になるまで又はその近くまで６ウエル培養 皿中にプレートし、標準培養条件下で37℃、５％ CO₂でインキュベートした。細 胞を５×10⁵細胞／ウエルの密度でプレートしてスクリーニングした。テストし た新生物細胞系は、ヒト一次骨原肉腫由来のSAOS-2（ATCC HTB85）；ヒト骨原肉 腫由来のU-20S(ATCC HTB96)；膵臓又は腸起源のヒト転移性腺癌由来のHS700T(AT CC HTB147)；形質転換したヒト胎芽性腎臓である293(ATCC CRL1573)；及びヒト 直腸腺癌由来のDLD-1（ATCC CCL221）であった。それら各々の細胞系は、Americ an Type Culture Collection，Rockville，MDから利用できる。対照非新生物細 胞はIMR90（ATCC CCL186）及びWI-38(ATCC CCL75)(両方とも二倍体ヒト肺繊維芽 細胞系である)であった。 次にこれらの細胞培養物に、平行して、野生型アデノウイルスタイプ２、及び 複製欠損組換えアデノウイルス変異体dI 1010，dI 434及びdI 1520を感染させた 。余分な培養皿を、計数目的のためにプレートした。これらの細胞はウイルス感 染のために用いた同じ細胞の懸濁液からのものであった。要求される感染の多重 度(MOI)のために細胞培養物に加えるためにウイルスのプラーク形成単位(PFU)の 数を決定するために細胞を計数した。野生型アデノウイルスタイプ２及び変異体 アデノウイルスを、0.1，1.0，10、及び100のMOIで平行の細胞培養物に加えた。 PBSに懸濁したウイルスを、１ml の容量で細胞ウエルに加えた。その接種した皿を、接種及び37℃、５％ CO₂で約 １時間の吸着時間の中間点後すぐにＸ−及びＹ−軸の両方に振動させた。１時間 の吸着期間後、高グルコース及び２％胎児ウシ血清を含むDMEM ２mlを加え、そ の培養物を標準培養条件下で37℃、５％ CO₂でインキュベートした。感染後種々 の時間で、ウイルス調製物による細胞殺害の効能を決定するため、細胞培養物を 、20％メタノール中0.5％クリスタル・バイオレットで染色した。死んだ細胞を 引き離し、ウエルからそそぎ出し、生きている細胞をウエルに残して染料で染色 した。その結果は、複製欠損組換えアデノウイルス調製物は、非新生物細胞と比 べて新生物細胞を優先的に殺したのに対し、野生型アデノウイルスタイプ２は新 生物細胞及び非新生物細胞の両方をほぼ等しく十分に殺したことを証明する。よ り詳しくは、その結果は、dI 1010変異体は新生物細胞を殺すことにおいて特に 有効であり、dI 1520変異体及びdI 434変異体も有効であることを示した。野生 型アデノウイルス２は、各々のウエルの少くともいくつかの細胞染色において種 々の効能及び不完全性であったが、感染後４〜７日に培養ウエルの各々において 細胞を殺すことができた。WI-38及びSAOS-2系はアデノウイルス感染のための優 れた宿主でなく、以下に議論されるように、IMR90はヒト二倍体繊維芽細胞のた めのかわりの対照細胞として機能することに注意せよ。dI 1010変異体は、８〜1 2日にわたり、感染耐性SAOS-2を除いて新生物細胞系の全てを有効に殺すことが できた。DI 1010は、感染後12日までに、293，U20S，HS700T、及びDLD-1系を殺 し、二倍体ヒト肺繊維芽細胞(WI-38)を殺さなかった。dI 1520変異体は、感染後 14〜20日までに、５の新生物細胞系のうち３つ(293，HS700T及びDLD-1)を有効に 殺すことができ、二倍体ヒト肺繊維芽細胞(WI-38)を実質的に殺さなかった。dI 1520はE1B^(-)変異体であり、細 胞系U20SはこのようなE1B^(-)変異体ウイルスが複製するのを許容せず、このこと は予想されるように、変異体組換え欠損アデノウイルスによる感染のための異な る形質転換された細胞系の特異性を示す。dI 434変異体（二重変異体：E1A^(-)E1 B^(-)）は、感染後14〜20日までに、５の新生物細胞系のうち３つ(293，HS700T及 びDLD-1)を有効に殺すことができ、二倍体ヒト肺繊維芽細胞(WI-38)を実質的に 殺さなかった。DLD-1及びU20S系は、dI 434の複製について部分的な耐性表現型 を示した。各々の細胞系に、生存能についての対照として、PBSのみを偽感染さ せた。 以下の実験も、IMR90細胞(ATCC CCL186)並びに野生型及び変異体アデノウイル スを用いて行った。IMR90細胞に、0.1，1.0，10、及び100に対応するMOIで、示 されるウイルスを感染させた。感染後９日目に、細胞をPBSで洗い、クリスタル ・バイオレットで染色した。ウイルス感染についての陽性対照として供するため 、各々の６ウエル皿中の１つのウエルに293細胞を種つけした。その結果は、IMR 90ヒト二倍体肺繊維芽細胞が、野生型、Ad2，dI 1010、及びdI 1520により差別 的に殺されることを示した。野生型Ad２は10又は100のMOIでIMR90細胞を有効に 殺した。DI 1010は、上述のように、新生物細胞系293，U20S，HS700T、及びDLD- 1を殺したのにかかわらず、テストした最も高いMOIでもIMR90細胞内で複製でき なかった。DI 1520ウイルスは、100のMOIでのみ有効にIMR90細胞を殺すことがで き；この高いウイルスの投与量において、複製でなくウイルスのオーバーロード の結果として細胞が死んだ可能性は除外することができない。 これにより、データは、複製欠損組換えアデノウイルス変異体は、予測される 通り、ｐ53及び／又はRb機能を欠如する新生物細胞を選択的に殺すのに用いるこ とができることを示す。複製欠損組換えアデノウイルスの作製 以下の段落は、ｐ53欠損細胞中で選択的に複製するE1B 55kDにおいて欠損を有 する改良されたアデノウイルス株であるONYX-019，ONYX-020、及びONYX-021の形 成及びテストを記述する。これらの株をdI 1520(以後、ONYX-015と呼ぶ)と比較 した。これらの株は、ウイルスCPEアッセイにおいてONYX-015を超える大きな改 良を示す。 本発明のこの態様の実施は、他に示さない限り、当該技術の範囲内である分子 生物学、微生物学、組換えDNA操作及び生産、並びに免疫学の慣用的な技術を用 いるであろう。このような技術は、文献に十分に説明される。例えば、Sambrook ，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Second Edition(1989);DNA Cloni ng，Volumes Ｉ and II(D.N.Glover，Ed．1985);Oligonucleotide Synthesis(M. J.Gait，Ed．1984);Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames and S.J.Higgins， Eds．1984);Transcription and Translation (B.D.Hames and S.J.Higgins，Eds ．1984);Animal Cell Culture(R.I.Freshney，Ed．1986);Immobilized Cells an d Enzymes(IRL Press，1986);B.Perbal，A Practical Guide to Molecular Clon ing(1984);the series，Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.);Gene T ransfer Vectors for Mammalian Cell(J.H.Miller and M.P.Calos，Eds．1987， Cold Spring Harbor Laboratory),Methods in Enzymology，Volumes 154 and 15 5(各々Wu and Grossman，and Wu，Eds.)，(Mayer and Walker，Eds.)(1987);Imm unochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press，London )，Scopes，(1987);Protein Purification:Principles and Practice，Second Edition(Springer-Verlag，N.Y.);並びにHandbook of Experimental Immunology ，VolumesI-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，Eds 1986)を参照のこと。上述さ れ及び後述さ れる本明細書に言及される全ての特許、特許出願及び出版物は、引用により本明 細書に組み込まれる。 DNA 構成物：Microbix Biosystemsから得たAd5 pXC1プラスミドから、XbaＩ 及びBgl2制限酵素を用いて、ヌクレオチド1339〜3328を切り出した。pXC1は塩基 対22〜5790からのAd５配列を含む。ヌクレオチド1339〜3328は、E1B 55kD遺伝子 のほとんどを含み；それは最後のＣ末端178塩基対を含まない。そのゲル精製し たDNAフラグメントをHindIII部位をBgl2で置換した改良Bluescript（Stratagene Corporation）ベクター(pBS Bg1 ΔHin)にクローン化した。 1339〜3328フラグメントの両端及び内部にオリゴヌクレオチドを作った（図２ を参照のこと）。それらオリゴは次の通りである。 これらのオリゴをPCRのために用いて、Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤで示す異なるフラグ メントを作った。 次のフラグメントの対：Ａ及びＢ、Ａ及びＣ、Ａ及びＤを、各々ゲル精製した pXC1のBgl2／Xba1 7.9kbフラグメントに連結した。DH５α細胞への形質転換の後 、陽性を探すためオリゴ：A5XBAT及びA5BGLBを用いてPCRによりスクリーニング した。米国特許5,008,182及びHedrum(PCR Methods and Applications 2:167〜71 （1992）を参照のこと)。 これらの構成物は、E1B 55kD遺伝子内に以下のアミノ酸の欠失をコードするDN A配列を含む。 p019(pXC1-AB) フラグメントＡ及びＢから作ったもの AA 218-275の欠失 p020(pXC1-AC) フラグメントＡ及びＣから作ったもの AA 218-300の欠失 p021(pXC1-AD) フラグメントＡ及びＤから作ったもの AA 218-354の欠失 図２は、上述のフラグメントを示す。 各々の構成物の１つの陽性物に基づいてDNAmaxi prep（Qiagen）を行った。そ のDNAを配列決定して欠失を確認した。プラスミドp019，p020及びp021は大腸菌 に入れ、American Type Culture Collectionに寄託し、各々JN019，JN020、及び JN021で示す。American Type Culture Collection受託番号は、JN019についてAT CC No.98286;JN020についてATCC No.98287;及びJN021についてATCC No.98288で ある。 ウイルス構成物：HEK293細胞に、Microbixから得たpBHGE3プラスミド、並びに プラスミドp019，p020及びp021の各々を同時トランスフェクトした。pBHGE3プラ スミドは、塩基対188〜1339からのAd5E1配列の欠失を含み、初期領域１内に挿入 又は変異を有するAd５ベクターを作製するのに用いる。プラークを取り、部分的 に欠失したE1B 55kD遺伝子の存在を確認するためにオリゴA5XBAT及びA5BGLBを用 いて第１のプラグに基づいてPCR分析を行った。PCR法は、標的遺伝子材料を増幅 するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブの使用を示す ことが当該技術で公知である。例えば、米国特許4,683,202，4,683,195；5,091, 310；5,008,182及び5,168,039を参照のこと。プラークを広げて、Qiagen QIAamp Bloodを用いてウイルスDNAを作った。欠失を確認するためにその欠失の上流及 び下流でDNAを配列決定した。 免疫沈降データ：溶解したC33A細胞からのウイルスを用いる免疫沈降データは 、（先のp019，p020及びp021に対応する）ウイルスONYX-019，ONYX-020及びONYX -021が、(ａ)Oncogene Sciencesからの 抗19kD抗体を用いて、ONYX-015よりやや多くの19kDタンパク質を作るようであり ；(ｂ)Oncogene Sciencesからの抗55kD抗体を用いて野生型55kDより低い分子量 である55kD抗体を作り出し（ONYX-015は検出可能な55kDを作らないことに注意の こと）；及び(ｃ)abV Immune Responseからの抗アデノウイルス抗体を用いて、 アデノウイルスに対する抗体と予想通り反応することを示した。CPE データ：ONYX-015をONYX-019，ONYX-020及びONYX-021と比較するC33Aを 用いるCPEアッセイからのデータは、それら新しい株が、等価のCPE効果を得るの に必要なMOIにより測定して、ONYX-015より約２〜10倍大きい能力を有すること を示した。 これらの実験は上述の通り行った。要約すると、野生型アデノウイルスタイプ ２及び変異アデノウイルスONYX-015からONYX-019，ONYX-020及びONYX-021を、0. 1，1.0，10、及び100のMOIで平行細胞培養物に加えた。PBSに懸濁したウイルス を１mlの容量で細胞ウエルに加えた。その接種した培養皿を、接種及び37℃、５ ％ CO₂で約１時間の吸着時間の中間点の直接にＸ−及びＹ軸の両方で振動させた 。１時間の吸着時間の後、高グルコース及び２％胎児ウシ血清を含むDMEM ２ml を加え、その培養物を標準培養条件下で37℃、５％ CO₂でインキュベートした。 感染後７日に、細胞培養物を、そのウイルス調製物による細胞殺害の効能を決定 するために、20％メタノール中0.5％クリスタル・バイオレットで染色した。死 んだ細胞を引き離し、ウエルからそそぎ出し、生きている細胞をウエル内に残し 、染料で染色した。結果は、複製欠損組換えアデノウイルス調製物ONYX-015，ON YX-019，ONYX-020及びONYX-021が、非新生物細胞と比べて新生物細胞を優先的に 殺すことができること、並びに野生型アデノウイルスタイプ２が、新生物及び非 新生物細胞の両方をほぼ等しく十分に殺したことを示した。 その結果は、更に、ONYX-019，ONYX-020及びONYX-021が、等価のCPE効果を作 り出すために必要とされるMOIにより測定して、ONYX-015よりC33A細胞を殺す能 力が２〜10倍大きいことを示した。10,1.0，0.1及び0.01のMOI域にわたって実験 を行い、ONYX-019，ONYX-020及びONYX-021は、0.1〜O.01のMOIにおいて増強され た殺害を示した。 腫瘍細胞殺害への複製欠損組換えアデノウイルス及び化学療法の効果 我々は、次に、単独で、及び化学療法と組み合わせて、静脈内（IV）投与した ONYX-015(dI 1521)の効能を研究した。ヒト腫瘍異種移植片（結腸、頸部）を、 ５〜７mmの大きさまで、ヌードマウスの皮下で増殖させ、この時に10⁹の総pfuを 投与を分割してIV注入した（１〜５日）。化学療法グループのマウスに、５日目 に腹腔内（IP）注入で、最大許容投与量を５FU又はシスプラチヌムを与えた。対 照には、同一の様式でIV及びIPビヒクル注入した。IV投与後の腫瘍内ウイルス複 製に注目した。シスプラチヌム及び5-FUは生存率を大きく改善せず、又は腫瘍増 殖を阻害しなかったが、ONYX-015単独では腫瘍増殖を大きく阻害し（40％〜60％ ）、生存率を改善した（ｐ＝0.05）。ONYX-015及び5-FU又はシスプラチヌムのい ずれかでの組合せ療法は、いずれの単独の剤よりも生存率を大きく改善させた。 これにより、ONYX-015は、化学療法で改善され得る、IV投与した時に選択的抗腫 瘍活性を有する。 本発明は、理解を明快にする目的のために実例によりいくらか詳細に記述され るが、本請求の範囲内で特定の変換及び改良を実施することができることが明ら かであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 5/10 7/00 7/00 Ａ６１Ｋ 35/76 // Ａ６１Ｋ 35/76 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:93） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 レリア，ヌグ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94553, マルティネス，ヒラー レーン 5025 (72)発明者 ホーン，シャロン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94533, フェアフィールド，パイン バレー ドラ イブ 3163 (72)発明者 ウィリアムズ，アンジェリカ アメリカ合衆国，コロラド 80403，ゴー ルデン，ワイオミング ストリート 1261 (72)発明者 キーン，デビッド アメリカ合衆国，カリフォルニア 94941, ミル バレー，スターリン ロード 359

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細胞集団内の新生物細胞を除去するための方法であって、 感染条件下において、（１）機能的な腫瘍サプレッサー遺伝子産物に結合する ことができる発現されたウイルスオンコプロテインを欠如する組換え複製欠損ア デノウイルスであって、Onyx 019，Onyx 020、又はOnyx 021からなる群から選択 されるアデノウイルスの特性を有するアデノウイルスを、（２）ウイルスオンコ プロテインと結合した複合体を形成することができる前記機能的な腫瘍サプレッ サー遺伝子産物を含む非新生物細胞、及び該機能的な腫瘍サプレッサー遺伝子産 物を欠如する新生物細胞に接触させ、それにより感染した細胞集団を作り出すこ とを含む方法。 ２．前記ウイルスオンコプロテインがアデノウイルスE1bポリペプチドである ことを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．前記腫瘍サプレッサー遺伝子産物がｐ53であることを特徴とする請求項１ に記載の方法。 ４．前記新生物細胞がp53^(-)であることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ５．前記組換え複製欠損アデノウイルスが、ｐ53と結合することができるE1b p55ポリペプチドをコードしないことを特徴とする請求項４に記載の方法。 ６．前記組換え複製欠損アデノウイルスが、Onyx 019，Onyx 020、又はOnyx 0 21からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ７．前記新生物細胞及び非新生物細胞を含む細胞集団が、哺乳動物中に存在し 、前記接触させるステップが、前記組換え複製欠損アデノウイルスを個体に投与 することにより生体内で行われることを 特徴とする請求項１に記載の方法。 ８．前記哺乳動物がヒトであることを特徴とする請求項７に記載の方法。 ９．前記組換え複製欠損アデノウイルスが、ｐ53機能を欠如する新生物細胞内 で複製して感染性ビリオンを形成することができることを特徴とする請求項７に 記載の方法。 10．前記新生物細胞内で形成された感染性ビリオンが、広がって、被検体内で 生体内の隣接細胞に感染することができることを特徴とする請求項９に記載の方 法。 11．前記組換え複製欠損アデノウイルスが、ヒト患者の新生物細胞内で感染性 ビリオンを形成することについて非複製性であることを特徴とする請求項１に記 載の方法。 12．前記組換え複製欠損アデノウイルスが、腫瘍サプレッサーRbへの結合を防 ぐE1a内の遺伝子改変を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。 13．ヒトにおける新生物状態を治療するための方法であって、Onyx 019，Onyx 020、又はOnyx 021からなる群から選択されるアデノウイルスの特性を有する組 換え複製欠損アデノウイルスの治療に有効な量を含む組成物を、機能的な腫瘍サ プレッサー遺伝子産物を欠如する新生物細胞を含む新形成を有するヒト患者に投 与することを含む方法。 14．前記腫瘍サプレッサー遺伝子産物がｐ53であることを特徴とする請求項13 に記載の方法。 15．前記組換え複製欠損アデノウイルスを含む組成物が、前記複製欠損アデノ ウイルスのE1a領域への遺伝子改変を更に含むことを特徴とする請求項13に記載 の方法。 16．前記複製欠損アデノウイルスのE1a領域への遺伝子改変が、 RB腫瘍サプレッサー遺伝子産物への結合を実質的に防ぐことを特徴とする請求項 15に記載の方法。 17．前記新生物が、腫瘍サプレッサーRbもしくは腫瘍サプレッサーｐ53のいず れか又は両方の腫瘍サプレッサーを欠如する新生物細胞を含むことを特徴とする 請求項16に記載の方法。 18．前記組換え複製欠損アデノウイルスを含む組成物が、作用可能に連結した 負の選択遺伝子を更に含むことを特徴とする請求項13又は15に記載の方法。 19．前記ウイルスが、Onyx 019，Onyx 020、又はOnyx 021からなる群から選択 されることを特徴とする請求項18に記載の方法。 20．新生物病の治療のための抗新生物組成物であって、医薬としてデリバリー 可能な形態において、Onyx 019，Onyx 020、又はOnyx 021からなる群から選択さ れるアデノウイルスの特性を有する組換え複製欠損アデノウイルスの治療に有効 な量を含む抗新生物組成物。 21．ATCC受託番号98286で寄託した組換えプラスミドJN019。 22．ATCC受託番号98287で寄託した組換えプラスミドJN020。 23．ATCC受託番号98288で寄託した組換えプラスミドJN021。 24．Onyx 019，Onyx 020、又はOnyx 021からなる群から選択されるアデノウイ ルスの特性を有する複製欠損アデノウイルス。 25．複製欠損アデノウイルスOnyx 019。 26．複製欠損アデノウイルスOnyx 020。 27．複製欠損アデノウイルスOnyx 021。 28．ATCCに受託番号98286で寄託した組換えプラスミドJN019内に存在する単離 された核酸配列であって、該核酸配列が、アデノウイルスのE1B領域内に欠失を 含み、該欠失がアミノ酸218〜275をコードすることを特徴とする核酸配列。 29．ATCCに受託番号98287で寄託した組換えプラスミドJN020内に存在する単離 された核酸配列であって、該核酸配列が、アデノウイルスのE1B領域内に欠失を 含み、該欠失がアミノ酸218〜300をコードすることを特徴とする核酸配列。 30．ATCCに受託番号98288で寄託した組換えプラスミドJN021内に存在する単離 された核酸配列であって、該核酸配列が、アデノウイルスのE1B領域内に欠失を 含み、該欠失がアミノ酸218〜354をコードすることを特徴とする核酸配列。 31．前記新生物細胞を、免疫抑制又は化学療法化合物に接触させることを更に 含む請求項１又は12に記載の方法。 32．Onyx 019，Onyx 020、又はOnyx 021からなる群から選択される組換え複製 欠損アデノウイルスと、化学療法化合物と、を含む組成物。 33．Onyx 019，Onyx 020、又はOnyx 021からなる群から選択されるアデノウイ ルスの特性を有する組換え複製欠損アデノウイルスと、化学療法化合物と、を含 む組成物。 34．Onyx 019，Onyx 020、又はOnyx 021からなる群から選択される組換え複製 欠損アデノウイルスと、免疫抑制化合物と、を含む組成物。 35．Onyx 019，Onyx 020、又はOnyx 021からなる群から選択されるアデノウイ ルスの特性を有する組換え複製欠損アデノウイルスと、免疫抑制化合物と、を含 む組成物。 36．JN019，JN020、及びJN021からなる群から選択されるプラスミドを含む宿 主細胞。