CN105316380B - 泥螺多肽在抗肺癌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种泥螺多肽在抗肺癌中的应用，尤其涉及泥螺多肽在抗肺癌H1299细胞药物的应用。利用胰蛋白酶酶解法获取泥螺多肽粗提物，并且通过超滤法、凝胶柱分离法以及反相高效液相色谱技术等分离纯化手段获得各泥螺多肽组分，分别研究各分离组分对肺癌H1299细胞的增殖抑制性，研究发现各组分均能显著抑制肺癌H1299细胞增殖，对H1299细胞的增殖抑制指数可达44.6％以上。本发明原料成本低，提取条件简单温和，提取的泥螺多肽对肺癌H1299细胞增殖抑制效果显著，为开发以泥螺多肽为原料的抗肺癌药物提供理论依据。

Description

泥螺多肽在抗肺癌中的应用

技术领域

本发明涉及泥螺酶解多肽的应用，具体涉及泥螺多肽在抗肺癌中的应用。

背景技术

泥螺(Bullacta exarata)，俗称“吐铁”、“黄泥螺”、“梅螺”等，属软体动物门、腹足纲、后鳃亚纲、头楯目、阿地螺科、泥螺属，为太平洋西岸海水及咸淡水特产的种类，由贝壳和软体两部分组成，含有丰富的蛋白质、钙、磷、铁和维生素等成分，多肽物质丰富，在我国广泛分布于东海和黄海两侧的长江，是一种常见的水产品。

恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康和生命的疾病，发病率越来越高，目前已有的化疗药物虽对大多数肿瘤有一定的疗效，但选择性差、毒副反应大、耐药性等问题依然非常明显。因此，寻找高效、低毒、特异强的抗肿瘤药物仍势在必行。多肽因其分子量小、无免疫原性、活性高、副作用小，尤其是对多药抗性的肿瘤细胞系也有很好的抑制活性。海洋生物多肽是目前海洋生物活性物质研究的一个重要领域，一些生物活性多肽常以非活性状态存在于蛋白质中，这些蛋白质经过蛋白酶的水解作用，使得隐藏于其中的活性肽释放出来，有可能发挥出比蛋白质更多的生物活性。例如：如邓伟等发现藻蓝蛋白酶解多肽对人宫颈癌HeLa细胞株的体外生长有明显的抑制作用；杨永芳等酶解紫贻贝所得的紫贻贝多肽对前列腺癌PC-3细胞和DU-145细胞有特异性的增殖抑制作用，并且对DU-145细胞的抑制作用强于对PC-3细胞的增殖抑制作用；姚如永等研究泥蚶多肽在0.25-1.0g·L^-1范围内，多肽能明显的抑制肺癌细胞A549和Ketr-3细胞的增殖，同时还能抑制细胞蛋白质的合成，并呈明显的剂量依赖性。

肺癌是对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，近年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。因此，研究泥螺酶解多肽在抗肺癌中的作用，做治疗和预防肺癌具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术而提供一种泥螺酶解多肽在抗肺癌中的应用，尤其是提供对肺癌H1299细胞增殖抑制的影响。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种泥螺多肽在抗肺癌H1299细胞药物中的应用，其中药物的具体实现形态可为片剂、胶囊剂、颗粒剂或丸剂等。

前述泥螺多肽通过以下步骤制得：新鲜泥螺洗净去壳，取泥螺组织捣碎，加入蒸馏水匀浆，料液比为1:(3～4)，匀浆后调节匀浆液的pH值为8～9，加入0.4～0.5％匀浆液体积的胰蛋白酶，40～50℃保温水解7～9h，水解完成后于95～100℃、10～15min进行灭酶，4℃下水解液于9500～10000r/min离心15～20min，取上清液浓缩干燥得酶解粗提物，将酶解粗提物溶于蒸馏水，分离纯化得各泥螺多肽组分。

所述酶解粗提物的浓度在5～25mg/ml时，对H1299细胞增殖抑制指数为35.3～70.5％，且增殖抑制指数与酶解粗提物的浓度呈正相关。

作为优选，所述分离纯化步骤为超滤或依次为超滤和凝胶层析或依次为超滤、凝胶层析及反相高效液相色谱。

进一步，所述超滤步骤中分别使用10kd、5kd及3kd超滤膜，对应获得分子量为10～5kd的组分A1，分子量为5～3kd的组分A2以及分子量小于3kd的组分A3，20～25mg/ml组分A3作用于H1299细胞36h后的增殖抑制率为70～75％，且增殖抑制指数与组分A3的浓度呈正相关。

进一步，所述凝胶层析中选用Sephadex G-25柱对组分A3进行洗脱，分别获得H1组分、H2组分和H3组分，其中5～20mg/ml组分H2作用于H1299细胞24h后的增殖抑制指数为为44～83％，且增殖抑制指数与组分H2的浓度呈正相关；凝胶层析条件：选用Sephadex G-25凝胶层析，装柱后用去离子水平衡，浓度为50mg/mL、上样量为4mL、速度为3ml/min，流动相为超纯水，280nm紫外检测。

进一步，采用反相高效液相色谱分离所述H2组分，分离获得组分F1和F2，其中2.5～3mg/ml组分F1和组分F2分别作用H1299细胞24h后，对H1299细胞的增殖抑制指数分别为29～30.04％和36～37.08％；反相高效液相色谱条件：选用Zorbax SB-C18(4.6×250，5um)；柱温为20℃；流动相为1％TFA和乙腈；梯度洗脱：从开始到30min结束，乙腈浓度从0变化到40％，洗脱速度为1.0mL/min；进样体积为50ul紫外检测波长分别为214nm、280nm。

所述组分F1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述，组分F2的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所述。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明选用泥螺为原料，泥螺是一种在我国海域常见的低值贝类，原材料成本低。利用胰蛋白酶酶解的方法获取泥螺多肽，反应条件温和，工艺简化，时间较短，并且通过超滤法、凝胶柱分离法以及反相高效液相色谱技术等分离纯化手段获得各泥螺多肽组分，各组分均能显著抑制肺癌H1299细胞增殖，对H1299细胞的增殖抑制指数可达44.6％以上，为开发以泥螺多肽为原料的抗肺癌药物提供理论依据。

附图说明

图1为实施例4中泥螺酶解粗提物对肺癌H1299细胞的抑制率；

图2为实施例4中膜分离组分对H1299细胞的抑制率；

图3为实施例4中A3组分经Sephadex G-25柱层析曲线；

图4为实施例4中凝胶层析组分对H1299细胞的抑制率的折线图；

图5为实施例4中凝胶层析组分对H1299细胞的抑制率的柱状图；

图6为实施例4中H2组分的反相高效液相图谱；

图7反相高效液相色谱纯化的组分对H1299细胞的抑制率。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1：泥螺多肽的制备

(1.1)原料处理

取新鲜泥螺，将泥螺去壳、沥干后备用。

(1.2)泥螺酶解工艺

用高速组织捣碎机将泥螺组织捣碎，加入蒸馏水匀浆，料液比1:4，精密称取匀浆液，用0.1mol/L的盐酸溶液和0.1mol/L的NaOH溶液调节匀浆液pH值，加入胰蛋白酶酶解数小时，酶解条件为：酶解温度45℃，pH为8.7，酶解时间8h，加酶量0.48％。100℃下灭酶15min，4℃下离心15min(10000r/min)，取上清液浓缩备用。

实施例2：H1299细胞的培养和传代

(2.1)细胞复苏

从液氮罐中取出存放的H1299细胞株，快速的放入37℃恒温水浴锅中进行融化，待融化后进入无菌工作室进行操作，用灭菌好的吸管将细胞株吸入离心管，加入2mL的F12营养液或RPMI1640营养液，1000rpm离心10min，去上清液，加入4ml的营养液，反复吹打使细胞成为单个细胞。然后用吸管将细胞均匀的吸入到2个25mL的培养瓶中，放入5％CO₂、37℃的恒温培养箱培养，次日换液倒掉未贴壁的死亡细胞。

(2.2)细胞培养

将人肺癌细胞H1299接种到分别含有10％胎牛血清(体积分数)FBS和双抗(青霉素G100IU/mL、链霉素100IU/mL)的F12和1640营养液中，放置于37℃、5％CO₂的恒温培养箱中培养，细胞贴壁生长，每1天换液一次，待细胞长满培养瓶的80％左右时进行传代。按照1∶2的比例进行传代，收集对数生长期细胞进行实验。

(2.3)细胞传代

先将长满细胞的培养瓶从恒温培养箱中取出放到无菌操作台上。传代时，先倒掉瓶中的营养液，去除不贴壁生长的死细胞，用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化液混合消化，不同细胞消化的时间不同，一般消化时间为3-5min；显微镜下观察细胞，当细胞间隙明显变大且细胞变圆变亮时，说明细胞已经消化完毕，去掉消化酶液。在培养瓶中加入2.5mL左右的营养液，反复吹打消化好的贴壁细胞使之成为单个细胞，一般情况下一瓶细胞传2瓶，将传代好的细胞置于37℃、5％CO₂的培养箱中进行培养。

(2.4)细胞冻存

显微镜下观察，当细胞长到培养瓶的80％左右，选细胞形态好的进行冻存，倒去培养液，加入消化液对细胞进行消化，镜下观察细胞间隙明显时倒掉消化酶，再向培养瓶中加入3mL左右的营养液，反复吹打使之成为单个细胞，吸入离心管内，1000rpm，离心10min，小心的吸弃培养液，加入含有10％DMSO胎牛血清1mL，用吸管反复吹打细胞均匀后，吸入到无菌冻存管中。先放入4℃冰箱中30min后，再放入液氮瓶口位置2h，最后放入液氮瓶中进行冻存。

:实施例3：酶解粗提物的分离纯化

首先选用超滤法对泥螺多肽酶解粗提液进行分离，超滤膜分别选用10kd，5kd，3kd，分别截留到分子量10-5kd、5-3kd和小于3kd三个组分，冷冻干燥后分别配成20mg/mL的浓度，用MTT法测定各个组分对肺癌H1299的抑制率。选出活性最高的一个组分，选用Sephadex G-25凝胶层析，装柱后用去离子水平衡，浓度为50mg/mL、上样量为4mL、速度为3ml/min，流动相为超纯水，280nm紫外检测。收集洗脱峰冷冻干燥成粉末，检测对H1299细胞的增殖抑制率，并绘制曲线得出IC₅₀(半数抑制浓度)，将活性最高的大量收集冷冻干燥进行高效液相色谱分析。

将冷冻干燥好的泥螺样品用0.06％TFA的水溶解到0.6ml的离心管中，在12000rpm，离心10min取上清液。高效液相条件：选用Zorbax SB-C18(4.6×250，5um)；柱温为20℃；流动相为1％TFA和乙腈；梯度洗脱：从开始到30min结束，乙腈浓度从0变化到40％，洗脱速度为1.0mL/min；进样体积为50ul紫外检测波长分别为214nm、280nm。

实施例4：MTT法探索泥螺多肽抗肿瘤活性

取对数生长期的细胞制成悬液，接种至96孔板，每孔200μL，设5个平行孔，于5％CO₂，37℃贴壁16-48h，倒置显微镜下观察，弃去培养液，同时将待测样品以不同浓度分别溶于培养液中。然后分别加入每个孔，同时设不加样品的对照组，置5％CO₂，37℃培养箱中孵育36h，用PBS冲洗2遍，加入含有MTT的营养液，继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。加入二甲基亚枫，置摇床上低速振荡10min，采用酶联免疫检测仪于490nm测吸光度值(OD值)。计算细胞增殖抑制指数(IR，Inhibition rate)，即增殖抑制率，按下列公式计算：

(4.1)泥螺酶解粗提物抗肿瘤活性研究

将匀浆好的泥螺用胰蛋白酶进行酶解，离心取上清液进行冷冻干燥，得到泥螺多肽粗提物，采用MTT法观察其诱导肺癌H1299细胞株体外凋亡的影响。结果表明：随着多肽浓度的增加抑制率逐渐增大，当浓度为5mg.mL^-1时，增殖抑制率为35.3％，当浓度为20mg.mL^-1时，抑制率达到68.7％，这说明此多肽具有一定的抗肺癌活性。如表1和图1所示。

表1 对肺癌细胞的抑制率(x±s,n＝5)

注：*与每个组分的最小的细胞抑制率相比，P<0.05；与细胞共同培育36h后泥螺多肽对H1299细胞增殖抑制的IC₅₀2.922mg/ml。

(4.2)泥螺酶解多肽的膜分离组分抗肿瘤活性研究

如实施例3所述步骤得到三个组分，分别是分子量10-5kd(A1)、5-3kd(A2)、小于3kd(A3)，分别将各个组分进行冷冻干燥，并配制成20mg/mL的浓度进行MTT实验，作用36h后，对H1299细胞的增殖抑制率为44.6％、59.5％、73.4％。如图2所示，其中A3组分对H1299细胞的抑制作用效果比其他两个组分要好。

(4.3)凝胶层析组分的抗肿瘤活性研究

经过超滤之后得到三个组分，由4.2实验知A3组分对H1299细胞的抑制效果最好，对A3组分大量收集，浓缩后进行冷冻干燥，选用凝胶Sephadex G-25层析按实施例3的实验条件洗脱，得到三个组分H1、H2、H3，如图3所示。

将各峰组分分别配成5.0mg/mL、10.0mg/mL、15.0mg/mL、20.0mg/mL的浓度，用MTT法分别检测对肺癌H1299肿瘤细胞的增殖抑制作用，培养细胞24h后，把配好浓度的样品加入细胞，设置空白对照组，通过SPSS软件对独立样本T检验分析，其它浓度组和该组有无显著性差异，P<0.05表明与空白对照组存在显著性差异。由表2绘制曲线图如图4、5所示，其中图5中每个剂量组的柱条从左至右依次为H1、H2和H3。综合图表分析可得出，3种组分对H1299肿瘤细胞有一定的抑制效果，且呈现出了量效关系，其中H2的抗肿瘤活性最高。在20.0mg/mL时，对肺癌H1299细胞的抑制率为73.1％，如表2所示。

表2 各组分对H1299细胞的增殖抑制率(

)(n＝3)

注：﹡与每个组分的最小的细胞抑制率相比，P<0.05

(4.4)反相高效液相色谱纯化组分的抗肿瘤活性研究

经过4.3实验可知H2组分的抗肿瘤活性最好，对H2组分进行进一步分离，经高效液相色谱分别在214nm和280nm紫外波长检测比对，如图6所示标记，即依次得到F1和F2。

经过凝胶层析分离得到的组分H2的活性最高，经过HPLC分离得到2个组分在浓度为3mg/mL，作用24h后，对H1299细胞的增殖抑制率分别30.04％和37.08％，并绘制柱状图，见图7。

由图7中可以看出，组分F2对H1299肿瘤细胞的增殖抑制作用，强于F1组分的肿瘤细胞抑制作用，将F1、F2组分进行收集并用PPSQ-31A对其进行结构检测，经检测F1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述，F2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。

上述各实施例所用实验材料和实验仪器如下：

实验材料

新鲜泥螺采集自浙江舟山近海海域；

木瓜蛋白酶；胰蛋白酶(国药集团化学试剂有限公司)；

甲醛(37.0％-40.0％)；国药集团化学试剂有限公司；

盐酸(36％-38％)；国药集团化学试剂有限公司优级纯；

氢氧化钠；无锡市晶科化工有限公司分析纯；

四甲基偶氮唑蓝(MTT)，美国SIGMA公司；

F12粉末培养基，美国SIGMA公司；

RPMI1640培养基，Gibco公司；

二甲基亚砜(DMSO)，美国SIGMA公司；

乙腈，(CAN，Fisher Scientific公司)

三氟乙酸，(TFA，Merck公司)

聚凝胺，(Polybrene，Shimadzu Corporation)；

PTH-氨基酸标品，(PTH-AA，Shimadzu Corporation)；

实验仪器

BSZ-40-LCD自动部分收集器，上海琪特分析仪器有限公司；

Agilent1260(Agilent.USA)

超滤杯、超滤膜，上海摩速科学器材有限公司；

G-25凝胶分子筛，北京亚太恒信生物科技有限公司；

FD-1000冷冻干燥机，上海爱朗仪器有限公司；

CF16RXII高速冷冻离心机，日本HITACHI公司；

UV1100紫外分光光度计，上海美谱达公司；

BSA124S型电子天平，德国Sartorious AG公司；

VPWS-T-20L超纯水器，杭州永洁达净化科技有限公司；

ZHJH-C1209C型超净工作台，上海智诚分析仪器制造有限公司；

酶标仪，美国Bio-Rad公司产品；

Forma3111型CO₂培养箱，美国Thermo公司；

倒置显微镜，日本OLYMPUS公司；

PPSQ-31A，(Shimadzu Corporation，日本)；

PTFE滤膜，(PTFE filter，Shimadzu Corporation)；

玻璃纤维膜，(Glass Fiber Disk，Shimadzu Corporation)；

细胞株

人肺癌细胞H-1299购于中国科学院上海细胞生物学细胞库。

Claims (2)

1.一种泥螺多肽在制备抗肺癌H1299细胞药物中的应用，

其特征在于所述泥螺多肽通过以下步骤制得：新鲜泥螺洗净去壳，取泥螺组织捣碎，加入蒸馏水匀浆，料液比为1:(3~4），匀浆后调节匀浆液的 pH值为8~9，加入0.4~0.5%匀浆液质量的胰蛋白酶， 40~50℃保温水解7~9h，水解完成后于95~100 ℃、10~15min 进行灭酶，4℃下水解液于 9500~10000 r/min 离心 15~20min ，取上清液浓缩干燥得酶解粗提物，将酶解粗提物溶于蒸馏水，经超滤、凝胶层析以及反相高效液相色谱分离纯化得各泥螺多肽组分，

所述超滤步骤中分别使用10kd、5kd及3kd超滤膜，对应获得分子量为10~5 kd的组分A1，分子量为5~3 kd的组分A2以及分子量小于3kd的组分A3， 20~25mg/ml组分A3作用于H1299细胞36h后的增殖抑制率为70~75%，且增殖抑制指数与组分A3的浓度呈正相关，

所述凝胶层析中对组分A3进行洗脱，分别获得H1组分、H2组分和H3组分，其中5~20 mg/ml组分H2作用于H1299细胞24h后的增殖抑制指数为44~83%，且增殖抑制指数与组分H2的浓度呈正相关；

前述凝胶层析条件：选用Sephadex G-25凝胶层析，装柱后用去离子水平衡，浓度为50mg/mL、上样量为4mL、速度为3ml/min，流动相为超纯水，280nm紫外检测，

采用反相高效液相色谱分离所述H2组分，分离获得组分F1和F2，其中2.5~3 mg/ml组分F1和组分F2分别作用H1299细胞24h后，对H1299细胞的增殖抑制指数分别为29~30.04%和36~37.08%，所述组分F1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述，组分F2的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所述；

前述反相高效液相色谱条件：选用Zorbax SB-C18，4.6×250，5um；柱温为20℃；流动相为1%TFA和乙腈；梯度洗脱：从开始到30min结束，乙腈浓度从0变化到40%，洗脱速度为1.0mL/min；进样体积为50ul；紫外检测波长分别为214nm、280nm。

2.如权利要求1所述的泥螺多肽在制备抗肺癌H1299细胞药物中的应用，其特征在于：所述酶解粗提物的浓度在5~25mg/ml时，对H1299细胞增殖抑制指数为35.3~70.5%，且增殖抑制指数与酶解粗提物的浓度呈正相关。

Images