DE60219142T2

DE60219142T2 - Verfahren zum erhöhen der zuführung einer therapeutischen nukleinsäure

Info

Publication number: DE60219142T2
Application number: DE60219142T
Authority: DE
Inventors: James G. Lexington BARSOUM; Michael Cambridge PARR; Stephen E. Framingham FAWELL
Original assignee: Biogen Idec Inc; Biogen Idec MA Inc
Current assignee: Biogen Inc; Biogen MA Inc
Priority date: 2001-01-22
Filing date: 2002-01-22
Publication date: 2007-12-13
Anticipated expiration: 2022-01-23
Also published as: EP1363676B1; CY1106676T1; ES2283524T3; JP2005502585A; DE60219142D1; US20040086486A1; WO2002056918A2; AU2002237910B2; WO2002056918B1; DK1363676T3; CA2435443A1; US7534424B2; NZ527645A; EP1363676A2; AU2002237910C1; ATE357935T1; WO2002056918A3; PT1363676E

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen zur Erhöhung der Zuführung von Nucleinsäuren an einen Wirt und spezifischer Zusammensetzungen zur Erhöhung der Zuführung und Expression von viral codierten Transgenen an einen bzw. in einem Wirt.
HINTERGRUND
Adenovirale Vektoren, einschließlich replikationsdefekte adenovirale Vektoren, werden als Gen-Zuführungsvehikel für einen weiten Bereich von Transgenen in vorklinischen und klinischen Untersuchungen quer durch viele pathologische Indikationen verwendet. Eine intravenöse Verabreichung von rekombinanten adenoviralen Vektoren resultiert in der Transduktion von Hepatocyten, der Expression der codierten Transgene und nachweisbaren zirkulierenden Spiegeln der sezernierten Transgenprodukte.
Die Zuführung von niedrigen Mengen von rekombinanten adenoviralen Partikeln kann zu niedrigen oder nicht nachweisbaren Spiegeln eines codierten Transgenprodukts führen. Die Zuführung von großen Mengen von adenoviralen Partikeln, die eine therapeutische Nucleinsäure enthalten, kann in hohen Spiegeln des exprimierten Transgens resultieren. Hohe Expressionsspiegel der Adenovirus-Partikel, die ein therapeutisches Transgen enthalten, können zu Komplikationen wie eine Leber-Toxizität führen. Daher gibt es auf dem Fachgebiet einen Bedarf für eine bessere Kontrolle der Transgen-Expression in Individuen, die mit rekombinanten viralen Vektoren behandelt werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung basiert zum Teil auf der Entdeckung, dass kleine Erhöhungen in der Dosis eines Adenovirus, das menschliches Interferon-beta („IFN-β") codiert, zu großen, d.h. nicht linearen, Erhöhungen in der Menge des codierten menschlichen IFN-β führen können. Im Gegensatz dazu wird die Transgen-Expression nach der Verabreichung einer einzelnen niedrigen Dosis eines Adenovirus, das menschliches IFN-β codiert, in Mäusen durch die gemeinsame Verabreichung eines rekombinanten Adenovirus, dem menschliches IFN-β fehlt, im Vergleich zu derselben viralen Dosis ohne gemeinsam verabreichtes „leeres" rekombinantes Virus dramatisch erhöht. Die Erhöhung der IFN-β-Transgen-Expression wird auch in Mäusen beobachtet, die mit liposomalem Doxorubicin behandelt worden sind, von dem bekannt ist, dass es Leber-Makrophagen, die als Kupfferzellen bekannt sind, dezimiert. Dementsprechend liefert die Erfindung Zusammensetzungen zum Optimieren der Dosierung einer therapeutischen Nucleinsäure wie einer therapeutischen Nucleinsäure, die in einem viralen Vektor wie einem Adenovirus-Vektor bereitgestellt wird.
Während es nicht gewünscht wird, an eine Theorie gebunden zu sein; wird angenommen, dass die Zuführung von niedrigen Dosen von Adenoviren in einem Individuum in einer bevorzugten Aufnahme der Adenoviren durch die Kupfferzellen des Individuums resultiert. Die Kupfferzellen sequestrieren die niedrigen Dosen der Viren, ohne das Transgen zu exprimieren, und stellen eine Blockade für virale Transduktion dar. Sobald diese Blockade gesättigt ist, kann eine wirksame Genzuführung eines viral codierten therapeutischen Genprodukts (wie IFN-β) an das Individuum erreicht werden. Daher kann eine therapeutische Nucleinsäure, die z.B. in einem viralen Vektor wie einem Adenovirus-Vektor bereit gestellt wird, an das Individuum wirksam abgegeben werden, wenn sie mit einem Mittel verabreicht wird, das die virale Aufnahmekapazität der Kupfferzellen sättigt, oder durch Erniedrigen der Spiegel der Kupfferzellen. In einer Ausführungsform ist die Zuführung eine intravenöse Zuführung. Zusätzlich umfasst das Individuum Zellen, die zum Exprimieren des Transgens in der Lage sind.
Dementsprechend bietet die Erfindung in einem Aspekt durch Verabreichen einer therapeutischen Nucleinsäure, die das therapeutische Genprodukt codiert, und eines Mittels, das die Kupfferzellfunktion in dem Individuum reduziert, an das Individuum ein Steigen des Spiegels eines viral codierten therapeutischen Genprodukts in einem Individuum; ein viraler Vektor wie ein Adenovirus-Vektor umfasst die therapeutische Nucleinsäure; in manchen Ausführungsformen wird der virale Vektor, der die therapeutische Nucleinsäure umfasst, in viralen Partikeln wie einem Adenovirus-Partikel bereit gestellt.
In einer Ausführungsform ist das sättigende Mittel ein rekombinantes virales Partikel. Das Mittel moduliert (reduziert) die Kupfferzellfunktion durch Erniedrigen der Spiegel der Kupfferzellen in dem Individuum.
In manchen Ausführungsformen ist die Kupfferzellfunktion, die durch das Mittel reduziert wird, Aufnahme, z.B. Phagocytose, eines Partikels, das die therapeutische Nucleinsäure einschließt, durch eine Kupfferzelle. In anderen Ausführungsformen ist die Kupfferzellfunktion, die durch das Mittel reduziert wird, eine Rezeptor-vermittelte Aufnahme eines Partikels, das die therapeutische Nucleinsäure einschließt, durch eine Kupfferzelle. Ein Mittel, das durch eine Kupfferzelle aufgenommen wird, ist ein virales Partikel, das nicht die therapeutische Nucleinsäure einschließt.
Das Mittel wird als eine virale Nucleinsäure, z.B. eine virale Nucleinsäure, der die therapeutische Nucleinsäure fehlt oder der eine Nucleinsäure fehlt, die eine funktionelle Kopie der therapeutischen Nucleinsäure codiert, bereit gestellt. In anderen Ausführungsformen ist das Mittel von einer Größe, die für eine phagocytische Aufnahme durch die Kupfferzellen eines Individuums geeignet ist.
In manchen Ausführungsformen ist das Mittel vor der Verabreichung der therapeutischen Nucleinsäure zu verabreichen. Zum Beispiel kann das Mittel weniger als 24 Stunden, weniger als 10 Stunden, weniger als 8 Stunden, weniger als 4 Stunden, weniger als 2 Stunden, weniger als 1 Stunde und weniger als 10 Minuten vor der Verabreichung der therapeutischen Nucleinsäure verabreicht werden. In anderen Ausführungsformen ist das Mittel weniger als 5 Minuten vor der Verabreichung der therapeutischen Nucleinsäure zu verabreichen. Ein viraler Vektor wie ein Adenovirus-Vektor umfasst die therapeutische Nucleinsäure; in manchen Ausführungsformen wird der virale Vektor, der die therapeutische Nucleinsäure umfasst, in einem viralen Partikel wie einem Adenovirus-Partikel bereit gestellt.
In anderen Ausführungsformen ist das Mittel gleichzeitig mit der therapeutischen Nucleinsäure zu verabreichen. In manchen Ausführungsformen umfasst ein viraler Vektor wie ein Adenovirus-Vektor die therapeutische Nucleinsäure; in manchen Ausführungsformen wird der virale Vektor, der die therapeutische Nucleinsäure umfasst, in einem viralen Partikel wie einem Adenovirus-Partikel bereitgestellt.
In anderen Ausführungsformen ist das Mittel gleichzeitig mit der therapeutischen Nucleinsäure oder vor der Verabreichung der therapeutischen Nucleinsäure, aber nicht nach der Verabreichung der therapeutischen Nucleinsäure zu verabreichen. In manchen Ausführungsformen umfasst ein viraler Vektor wie ein Adenovirus-Vektor die therapeutische Nucleinsäure; in manchen Ausführungsformen wird der virale Vektor, der die therapeutische Nucleinsäure umfasst, in einem viralen Partikel wie einem Adenovirus-Partikel bereit gestellt.
Die therapeutische Nucleinsäure oder das Mittel oder beide können an das Individuum über jede Route, die auf dem Fachgebiet bekannt ist, verabreicht werden. Zum Beispiel können die therapeutische Nucleinsäure und das Mittel über orale, nasale, parenterale, transdermale, topische, intraokulare, intratracheale, intraperitoneale, direkte Einspritzung in Zellen, ein Gewebe, ein Organ oder einen Tumor, intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Zuführung verabreicht werden. In bestimmten Ausführungsformen schließt die intravenöse Verabreichung eine Verabreichung über die Pfortader oder durch Leberarterien-Infusion ein.
In bestimmten Ausführungsformen wird die viral codierte Nucleinsäure in einem Adenovirus bereitgestellt.
In einem anderen Aspekt bietet die Erfindung steigende Spiegel eines viral codierten therapeutischen Genprodukts in einer Hepatocyten-Zellpopulation. Dies schließt Inkontaktbringen der Hepatocyten-Zellpopulation mit einer therapeutischen Nucleinsäure, die das therapeutische Genprodukt codiert, und eines Mittels, das die Kupfferzellfunktion in dem Individuum moduliert, ein. Eine der Kupfferzellfunktionen, die reduziert wird, ist die Aufnahme des Mittels. Die Aufnahme des Mittels kann nicht-spezifisch sein, wie Phagocytose, oder kann spezifisch sein, wie eine Rezeptor-vermittelte Aufnahme.
In einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zum Modulieren der Toxizität (z.B. Hepatotoxizität), die mit einem viral codierten Transgen assoziiert ist, durch das Verabreichen eines Mittels, das eine Kupfferzellfunktion in dem Individuum reduziert, an ein Individuum, das das Transgen benötigt. In manchen Ausführungsformen ist das Mittel vor der Verabreichung einer therapeutischen Nucleinsäure, die das therapeutische Genprodukt codiert, zu verabreichen. In anderen Ausführungsformen ist das Mittel gleichzeitig mit der Verabreichung einer therapeutischen Nucleinsäure, die das therapeutische Genprodukt codiert, zu verabreichen. Ein therapeutisches Genprodukt, das durch die Nucleinsäure codiert wird, kann ein Polypeptid, eine Antisense-Nucleinsäure oder ein Antikörper sein.
Durch die Erfindung wird auch das Modulieren der Expression von hohen Spiegeln (z.B. toxischen Spiegeln) eines therapeutischen Proteins in der Leber durch Verabreichen von mindestens einer Dosis eines viralen Vektors, dem ein Polynucleotid für die Expression des therapeutischen Genprodukts fehlt, an ein Individuum, das eine Gentherapie benötigt, entweder vor oder gleichzeitig mit dem Verabreichen von mindestens einer Dosis eines viralen Vektors, der ein Polynucleotid für die Expression des therapeutischen Genprodukts enthält, bereit gestellt. In manchen Ausführungsformen entsprechen die Spiegel des therapeutischen Genprodukts den Spiegeln der so verabreichten therapeutischen Nucleinsäure.
Durch die Erfindung wird auch ein Arzneimittel, das eine virale Nucleinsäure, die ein therapeutisches Genprodukt codiert; ein Mittel, das eine Kupfferzellfunktion reduziert, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst, bereit gestellt.
Die Erfindung liefert Zusammensetzungen, die eine nahezu lineare Korrelation zwischen der viralen Dosis und der Expression eines therapeutischen Genprodukts, das durch die Nucleinsäure codiert wird, ermöglichen. Die Zusammensetzungen der Erfindung ermöglichen auch die Minimierung der toxischen Wirkungen, die mit den viralen Proteinen oder der Expression des codierten therapeutischen Genprodukts assoziiert sind.
Außer wenn es anderweitig definiert ist, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, wie allgemein von einem Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden. Obwohl Verfahren und Materialien, die ähnlich oder äquivalent wie jene sind, die hierin beschrieben werden, in der Ausübung oder Testung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden geeignete Verfahren und Materialien unten beschrieben. Im Fall eines Widerspruchs wird die vorliegende Beschreibung, einschließlich der Definitionen, vorherrschen. Zusätzlich sind die Materialien, Verfahren und Beispiele nur veranschaulichend und sollen nicht limitierend sein.
Andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung und den Ansprüchen offensichtlich sein.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine graphische Darstellung, die die nicht lineare Dosis-Antwort der hINF-β-Expression nach intravenöser Verabreichung eines E1-deletierten, E-2a-temperaturempfindlichen adenoviralen Vektors, der menschliches Interferon-β exprimiert („H5.110CMVhIFN-β"), zeigt.
2A ist eine graphische Darstellung, die zeigt, dass die gemeinsame Verabreichung von H5.110CMVlacZ mit niedrigen Dosen von H5.110CMVhINF-β die INF-β-Expression erhöht.
2B ist eine graphische Darstellung, die die nicht lineare Dosis-Antwort mit H5.010CMVhα1AT als das Reporter-Virus zeigt.
2C ist eine graphische Darstellung, die die lineare Dosis-Antwort von H5.110CMVlacZ zeigt, wenn es Huh7-Zellen in vitro mit entweder H5.110CMVlacZ alleine oder mit einem Gemisch von H5.110CMVlacZ und H5.110CMVhINF-β in der angezeigten Multiplizität der Infektion („MOI") infiziert.
3 ist eine graphische Darstellung, die die verstärkte Expression zeigt, die gesehen wird, wenn Balb/c-Nacktmäuse mit niedrigen Dosen von H5.110CMVhINF-β vor der Verabreichung, aber nicht nach der Verabreichung von H5.110CMVlacZ vorbehandelt werden.
4 ist eine graphische Darstellung, die das lineare Verhältnis zwischen H5.110CMVhINF-β und Serum-INF-β nach einem Vordosieren mit H5.110CMVlacZ zeigt.
5 ist eine graphische Darstellung, die zeigt, dass die Dezimierung von Leber-Kupfferzellen die Transgen-hINF-β-Expression erhöht.
6 ist eine graphische Darstellung, die Mausstamm-spezifische Unterschiede in der Transgen-Expression nach der Zuführung von H5.010CMVhα1AT zeigt. Die angezeigten Mausstämme wurden intravenös mit einer niedrigen Dosis (1 × 10¹⁰ Partikel) H5.010CMVhα1AT-Reporter-Vektor alleine (a), einer hohen Dosis (8 × 10¹⁰ Partikel) H5.010CMVhα1AT-Reporter-Vektor alleine (b), 1 × 10¹⁰ Partikeln H5.010CMVhα1AT, zusammen verabreicht mit 8 × 10¹⁰ Partikeln H5.110CMVlacZ (c) oder dem H5.110CMVlacZ-Virus, das 30 Minuten vor (d) oder 30 Minuten nach (e) dem H5.010CMVhα1AT-Reporter verabreicht wurde, injiziert. Die Serumkonzentration von menschlichem α1AT wurde 24 h nach der viralen Dosierung durch ELISA bestimmt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die Erfindung liefert eine Verbesserung der Zuführung von Nucleinsäuren, die therapeutische Genprodukte (viral codierte therapeutische Genprodukte) codieren, durch Zuführung der Nucleinsäuren in Verbindung mit einem Mittel, das die Kupfferzellfunktion in dem Individuum negativ beeinflusst.
Im Allgemeinen kann die Zusammensetzung verwendet werden, um jegliche therapeutische Nucleinsäure dem Individuum zuzuführen. Beispiele von therapeutischen Nucleinsäuren schließen Nucleinsäuren, die Polypeptide codieren, Antisense-Nucleinsäuren, Nucleinsäuren, die Ribozyme codieren, und Nucleinsäuren ein, die Komponenten eines Spliceosoms codieren. Wenn therapeutische Nucleinsäuren Polypeptide codieren, kann das codierte Polypeptid z.B. ein Cytokin wie Interferon-alpha, Interferon-beta oder Interferon-gamma, Interleukine, Wachstumsfaktoren wie Erythropoietin, menschliches Wachstumshormon, Insulin, Granulocytenkolonie-stimulierender Faktor („G-CSF"), Granulocyten-Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor („GM-CSF") und Gerinnungsfaktoren wie Faktor VIII und Faktor IX sein.
In bestimmten Ausführungsformen wird die therapeutische Nucleinsäure in einem Vektor bereitgestellt, der das Verkapseln des Gens für das codierte therapeutische Produkt in ein Partikel ermöglicht. In bestimmten Ausführungsformen kann das Partikel durch eine Kupfferzelle aufgenommen werden. Ein geeignetes Partikel ist ein virales Partikel, z.B. ein Adenovirus-Partikel.
Jedes auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren für die Insertion von Polynucleotidsequenzen in einen Vektor kann verwendet werden. Solche Verfahren sind z.B. in Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. und Ausubel et al., 1992 Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY, beschrieben. Die Vektoren können geeignete transkriptionelle und translationelle Kontrollsignale, die funktionell mit der Polynucleotidsequenz für ein bestimmtes therapeutisches Gen verknüpft sind, einschließen. Promotoren und Enhancer können auch verwendet werden, um die Expression der therapeutischen Proteine oder Genprodukte zu steuern. Die Promotor-Aktivierung kann Gewebe-spezifisch oder durch ein metabolisches Produkt oder eine verabreichte Substanz induzierbar sein. Solche Promotoren und Enhancer schließen den natürlichen E2F-Promotor, den sehr frühen Promotor und Enhancer des Cytomegalievirus (Karasuyama et al., 1989 J. Exp. Med., 169: 13); den menschlichen beta-Actin-Promotor (Gunning et al., 1987 Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84: 4831); den Glucocorticoid-induzierbaren Promotor, der in der langen terminalen Wiederholung im Maus-Brustdrüsentumor-Virus (MMTV-LTR) vorhanden ist (Klessig et al., 1984 Mol. Cell. Biol., 4: 1354); die langen terminalen Wiederholungssequenzen des murinen Moloney-Leukämievirus (MuLV-LTR) (Weiss et al., 1985 RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.); den SV40-Promotor der frühen Region (Bernoist und Chambon, 1981 Nature, 290: 304); den Promotor des Rous-Sarkoma-Virus (RSV) (Yamamoto et al., 1980 Cell, 22: 787); den Herpes simplex-Virus (HSV)-Thymidin-Kinase-Promotor (Wagner et al., 1981 Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78: 1441); den Adenovirus-Promotor (Yamada et al., 1985 Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82: 3567) ein, sind aber nicht darauf limitiert.
Spezifische virale Vektoren für die Verwendung in Gentransfer-Systemen sind jetzt gut etabliert. Siehe zum Beispiel: Madzak et al., J. Gen. Virol., 73: 1533-36 (1992: Papovavirus SV40); Moss et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 25-38 (1992: Vacciniavirus); Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 67-93 (1992: Herpes simplex-Virus (HSV) und Epstein-Barr-Virus (EBV)); Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 1-24 (1992: Retrovirus); Brandyopadhyay et al., Mol. Cell. Biol., 4: 749-754 (1984: Retrovirus); Miller et al., Nature, 357: 455-450 (1992: Retrovirus); Anderson, Science, 256: 808-813 (1992: Retrovirus), Herpes-Viren (zum Beispiel auf Herpes simplex-Virus-basierende Vektoren) und Parvoviren (zum Beispiel auf „defektem" oder nicht autonomem Parvovirus-basierende Vektoren). In verschiedenen Ausführungsformen werden rekombinante virale Vektoren, die für die Verwendung in einer Gentherapie gestaltet sind, in der Erfindung verwendet. Siehe z.B. Hu und Pathak 2000 Pharmacol. Rev. 52: 493-512; Somia und Verma 2000 Nature Rev. 1: 91-99; van Beusechem et al., 2000 Gene Ther. 7: 1940-1946; Glorioso et al., 2001 Nature Med. 7: 33-40. Zusätzlich können virale Vektoren in Kombination mit transienten immunsuppressiven oder immunmodulierenden Therapien verabreicht werden. Siehe z.B. Jooss et al., 1996 Hum. Gene Ther. 7: 1555-1566; Kay et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94: 4686-4691.
In bestimmten Ausführungsformen ist der verwendete spezifische virale Typ derselbe für sowohl den viralen Vektor, der das therapeutische Genprodukt enthält, als auch für das virale Vektor-Mittel, das das therapeutische Genprodukt nicht enthält. Jeder oder alle der viralen Vektoren können replikationsdefekt sein.
In anderen Ausführungsformen können virale Serotypen, z.B. die allgemeinen Adenovirus-Typen 2 und 5 (Ad2 beziehungsweise Ad5) in einem alternierenden Dosierungszeitplan verabreicht werden, bei dem mehrfache Behandlungen verabreicht werden. Spezifische Dosierungsschemata können im Verlauf von einigen Tagen verabreicht werden, wenn eine Immunantwort gegen den viralen Vektor angenommen wird. In nicht limitierenden Beispielen von spezifischen Ausführungsformen können Ad5-basierende virale Vektoren am Tag 1 verwendet werden, Ad2-basierende virale Vektoren können am Tag 2 verwendet werden oder umgekehrt.
In machen Ausführungsformen werden die therapeutischen Nucleinsäuren zusätzlich in replikationsdefekten rekombinanten Viren oder viralen Vektoren bereitgestellt. Diese können in Verpackungs-Zelllinien hergestellt werden, die nur replikationsdefekte Viren produzieren. Siehe z.B. Current Protocols in Molecular Biology: Abschnitte 9.10-9.14 Hrsg. Ausubel et al., 1989 Greene Publishing Associates.
Adenovirus-Vektoren
In manchen Ausführungsformen ist ein Vektor für die Zuführung einer therapeutischen Nucleinsäure ein Adenovirus-basierter Vektor. Siehe z.B. Berkner et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 39-61 (1992). In manchen Ausführungsformen ist der Adenovirus-basierter Vektor ein Ad-2- oder Ad-5-basierter Vektor. Siehe z.B. Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 97-123, 1992; Ali et al., 1994 Gene Therapy 1: 367-384; US Pat.-Nr. 4,797,368 und 5,399,346.
Adenoviren können modifiziert werden, um ein therapeutisches oder Reporter-Transgen einer Vielzahl von Zelltypen wirksam zuzuführen. Zum Beispiel werden die allgemeinen Adenovirus-Typen 2 und 5 (Ad2 beziehungsweise Ad5), die eine respiratorische Krankheit bei Menschen verursachen, derzeit für klinische Versuche, einschließlich der Behandlung von Krebs oder anderen Zellproliferations-Krankheiten und -Störungen, und für eine Gentherapie der Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) und der Cystischen Fibrose (CF) entwickelt. Sowohl Ad2 als auch Ad5 gehören zu einer Unterklasse von Adenoviren, die nicht mit menschlichen Malignitäten assoziiert ist. Adenovirus-Vektoren sind zum Bereitstellen von hohen Spiegeln einer Transgen-Zuführung an verschiedene Zelltypen unabhängig vom mitotischen Status der Zelle in der Lage. Hohe Titer (10¹³ Plaque-bildende Einheiten/ml) des rekombinanten Virus können leicht in 293-Zellen (eine Adenovirus-transformierte menschliche embryonale Komplementierungs-Nierenzelllinie: ATCC Nr. CRL1573) hergestellt und für ausgedehnte Zeiträume ohne nennenswerte Verluste gefriergelagert werden. Die Wirksamkeit dieses Systems bei der Zuführung eines therapeutischen Transgens in vivo, das ein genetisches Ungleichgewicht komplementiert, ist in Tiermodellen von verschiedenen Störungen gezeigt worden. Siehe z.B. Watanabe, 1986 Atherosclerosis, 36: 261-268; Tanzawa et al., 1980 FEBS Letters, 118(1): 81-84; Golasten et al., 1983 New Engl. J. Med., 309: 288-296; Ishibashi et al., 1993 J. Clin. Invest., 92: 883-893; Ishibashi et al., 1994 J. Clin. Invest., 93: 1889-1893, wobei alle davon hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind. Ein rekombinantes replikationsdefektes Adenovirus, das eine cDNA für das Genprodukt des cystischen Fibrose-Transmembran-Regulators (CFTR) codiert, ist für die Verwendung in mindestens zwei menschlichen klinischen CF-Versuchen zugelassen worden. Siehe z.B. Wilson, 1993 Nature, 365: 691-692.
Manche replikationsdefekte Adenoviren, die für klinische Versuche entwickelt worden sind, enthalten Deletionen der gesamten E1a- und eines Teils der E1b-Regionen. Dieses replikationsdefekte Virus wird in 293-Zellen gezüchtet, die ein funktionelles Adenovirus-E1a-Gen enthalten, das ein trans-wirkendes E1a-Protein bereitstellt. E1-deletierte Viren sind zum Replizieren und Produzieren eines infektiösen Virus in den bestimmten Zellen (z.B. 293-Zellen) in der Lage, die Genprodukte in trans der E1a- und E1b-Region bereitstellen. Das resultierende Virus ist in der Lage, viele Zelltypen zu infizieren, und kann das eingebrachte Gen exprimieren (vorausgesetzt, dass es seinen eigenen Promotor trägt). Dennoch kann das Virus in einer Zelle, die nicht die DNA der E1-Region enthält, nicht replizieren, außer wenn die Zelle in einer sehr hohen Multiplizität der Infektion infiziert wird. Andere adenovirale Vektoren, die für klinische Versuche entwickelt wurden, können in der Erfindung verwendet werden. Beispiele schließen Ad-Vektoren mit rekombinanten Faserproteinen für einen modizifierten Tropismus (z.B. van Beusechem et al., 2000 Gene Ther. 7: 1940-1946), Protease-vorbehandelte virale Vektoren (z.B. Kuriyama et al., 2000 Hum. Gene Ther. 11: 2219-2230), E2a-temperatursensitive mutierte Ad-Vektoren (z.B. Engelhardt et al., 1994 Hum. Gene Ther. 5: 1217-1229) und „gutless" Ad-Vektoren (z.B. Armentano et al., 1997 J. Virol. 71: 2408-2416; Chen et al., 1997 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94: 1645-1650; Schieder et al., 1998 Nature Genetics 18: 180-183) ein.
Adenoviren haben ein breites Wirtsspektrum, können im Ruhestadium befindliche oder endgültig differenzierte Zellen wie Neuronen infizieren und scheinen im Wesentlichen nicht oncogen zu sein. Zusätzlich scheint es nicht, dass Adenoviren in das Wirtsgenom integrieren. Weil sie extrachromosomal existieren, ist das Risiko einer Insertionsmutagenese deutlich reduziert. Siehe z.B. Ali et al. 1994, vorstehend, auf 373. Rekombinante Adenoviren (rAdV) produzieren sehr hohe Titer, die viralen Partikel sind mäßig stabil, die Expressionsspiegel sind hoch, und ein weites Spektrum von Zellen kann infiziert werden.
Adeno-assoziierte Viren (AAV) sind auch als Vektoren für eine somatische Gentherapie verwendet worden. AAV ist ein kleines, einzelsträngiges (ss) DNA-Virus mit einer einfachen genomischen Organisation (4,7 kb), die es ein ideales Substrat für die Gentechnologie macht. Zwei offene Leserahmen codieren eine Reihe von rep- und cap-Polypeptiden. Rep-Polypeptide (rep78, rep68, rep62 und rep40) sind in Replikation, Rettung und Integration des AAV-Genoms involviert. Die cap-Proteine (VP1, VP2 und VP3) bilden das Virion-Kapsid. Die offenen Leserahmen von rep und cap an den 5'- und 3'-Enden werden von invertierten terminalen 145 bp-Wiederholungen (ITRs) flankiert, wobei die ersten 125 bp davon zum Bilden von Y- oder T-förmigen Duplex-Strukturen in der Lage sind. Von Wichtigkeit für die Entwicklung von AAV-Vektoren ist, dass die gesamten rep- und cap-Domänen ausgeschnitten und mit einem therapeutischen oder Reporter-Transgen ersetzt werden können. Siehe z.B. Carter, in Handbook of Parvoviruses, Hrsg., Tijsser, CRC Press, S. 155-168 (1990). Es ist gezeigt worden, dass die ITRs die minimale Sequenz darstellen, die für die Replikation, Rettung, das Verpacken und die Integration des AAV-Genoms nötig ist.
In alternativen Ausführungsformen reduziert das Mittel die Kupfferzellfunktion durch Senken der Spiegel der Kupfferzellen in dem Individuum. Ein Beispiel dieses Typs von Mittel ist liposomales Doxorubicin (nicht Teil der Erfindung).
In manchen Ausführungsformen wird die Kupfferzellfunktion durch ein Mittel reduziert, das anstelle eines viralen Partikels, das die therapeutische Nucleinsäure enthält, durch die Kupfferzelle aufgenommen wird. Ein Mittel, das durch eine Kupfferzelle phagocytiert wird, ist ein virales Partikel (wie ein Adenovirus-Partikel), dem die therapeutische Nucleinsäure fehlt. Dem viralen Partikel kann die therapeutische Nucleinsäure vollkommen fehlen, oder es kann alternativ eine Variante der therapeutischen Nucleinsäure einschließen, die kein funktionelles Protein codiert. In manchen Ausführungsformen ist es wünschenswert, ein virales Transgen einzuschließen, das ein leicht nachweisbares Markerprotein wie die β-Galactosidase codiert.
Ein weiteres Beispiel eines Mittels, das durch eine Kupfferzelle phagocytiert wird, schließt Partikel ein, die einen Durchmesser von etwa 10 nm bis etwa 1000 nm haben. In bestimmten Ausführungsformen haben die Partikel etwa denselben Durchmesser wie der virale Vektor, der an ein Individuum verabreicht wird und der das therapeutische Transgenprodukt codiert. In manchen Ausführungsformen können Partikel aus einer organischen Komponente, einer anorganischen Komponente oder einer Kombination von beiden zusammengesetzt sein. In weiteren Ausführungsformen können die Komponentenpartikel entweder biologisch abbaubar oder resistent gegen einen in vivo-Abbau sein. In manchen Ausführungsformen rufen die Komponentenpartikel selbst eine geringe oder keine biologische Aktivität im Individuum, das behandelt wird, hervor. Die Verwendung von jeglichem Typ und jeglicher Zusammensetzung von Materialien, die durch Fachleute für die Aufnahme durch Kupfferzellen angewendet werden, wird durch die Erfindung in Betracht gezogen.
Die Nucleinsäure, die das therapeutische Genprodukt codiert, wird als Teil eines viralen Partikels bereitgestellt. Daher können eine Nucleinsäure, die virale regulatorische Regionen enthält und strukturelle Proteine codiert, so wie die therapeutische Nucleinsäure verwendet werden, um Viruspartikel zu produzieren, die dann in das Individuum eingebracht werden.
Im Allgemeinen ist das Mittel vor der Zuführung der therapeutischen Nucleinsäure zu verabreichen. Alternativ ist das Mittel gleichzeitig mit der therapeutischen Nucleinsäure zu verabreichen. Zum Beispiel kann das Mittel weniger als 24 Stunden, weniger als 10 Stunden, weniger als 8 Stunden, weniger als 4 Stunden, weniger als 2 Stunden, weniger als 1 Stunde, weniger als 10 Minuten und sogar weniger als 5 Minuten vor dem Verabreichen der therapeutischen Nucleinsäure verabreicht werden. In anderen Ausführungsformen ist das Mittel weniger als fünf Minuten vor dem Verabreichen der therapeutischen Nucleinsäure zu verabreichen.
Das Individuum in den oben erwähnten Verwendungen kann jedes Tier sein, für das das Einbringen einer fremden Nucleinsäure erwünscht ist. Daher kann das Individuum z.B. Säuger, Reptilien oder Vögel einschließen. Spezifische Beispiele schließen einen Menschen, eine Maus, eine Ratte, einen Hund, eine Katze, ein Pferd, eine Kuh, ein Schwein oder einen nicht-menschlichen Primaten ein. Die Verabreichung kann systemisch oder topisch sein und kann prophylaktisch oder therapeutisch sein.
Durch die Erfindung wird auch das Modulieren der Zuführung eines viral codierten Transgens an ein Individuum bereitgestellt. In dem Verfahren wird ein Dosierungs-Beugungspunkt für ein Virus, das das viral codierte Transgen enthält, in dem Individuum identifiziert. Wie hierin verwendet, ist ein „Dosierungs-Beugungspunkt" ein Punkt, an dem eine kleine schrittweise Änderung in der Menge des an das Individuum zugeführten Virus in einer wesentlichen Änderung in der Menge des viralen Genprodukts resultiert. Der Beugungspunkt wird mit Spiegeln des viral codierten Genprodukts in dem Individuum verglichen. Die Dosis des Virus, das das Transgen enthält, wird dann wenn nötig angepasst, um eine geeignete Menge der viralen Nucleinsäure zuzuführen, die in der erwünschten Dosis des viral codierten Transgens resultiert.
Arzneimittel
Die Erfindung schließt auch mindestens ein Arzneimittel ein, das eine virale Nucleinsäure, die ein therapeutischen Genprodukt codiert, ein Mittel, das die Kupfferzellfunktion reduziert, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Die virale Nucleinsäure kann, wenn gewünscht, als Teil eines viralen Partikels bereitgestellt werden. In machen Ausführungsformen wird das Arzneimittel in einer pharmazeutisch wirksamen Menge bereitgestellt. Der Begriff „pharmakologisch oder pharmazeutisch wirksame Menge" bedeutet jene Menge eines Arzneistoffs oder eines pharmazeutischen Mittels, die die biologische oder medizinische Antwort eines Gewebes, Systems, Tiers oder Menschen hervorrufen wird, die von einem Forscher oder Kliniker gesucht wird.
In manchen Ausführungsformen sind die Zusammensetzungen geeignet für eine interne Verwendung und schließen eine wirksame Menge einer pharmakologisch aktiven Verbindung der Erfindung alleine oder in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern ein. Die Verbindungen sind besonders nützlich dadurch, dass sie, wenn überhaupt, eine sehr niedrige Toxizität aufweisen.
Die hierin beschriebenen Verbindungen können den aktiven Bestandteil eines Arzneimittels bilden und werden typischerweise in einer Zumischung mit geeigneten pharmazeutischen Verdünnungsmitteln, Excipienten oder Trägern (hierin gemeinsam als „Träger"-Materialien bezeichnet) verabreicht, die geeigneterweise in Bezug auf die beabsichtigte Form der Verabreichung ausgewählt werden, das heißt orale Tabletten, Kapseln, Elixiere, Sirupe und dergleichen. Die Zusammensetzungen werden typischerweise eine wirksame Menge einer aktiven Verbindung oder des pharmazeutisch verträglichen Salzes davon einschließen und können zusätzlich auch jegliche Trägermaterialien einschließen, die in der pharmazeutischen Wissenschaft üblicherweise verwendet werden. Abhängig von der beabsichtigten Art der Verabreichung können die Zusammensetzungen in fester, halbfester oder flüssiger Dosierungsform wie zum Beispiel injizibaren Zusammensetzungen, Tabletten, Zäpfchen, Pillen, Depot-Kapseln, Pulvern, Flüssigkeiten, Suspensionen oder dergleichen zum Beispiel in Einheitsdosierungen vorliegen.
Die Verabreichung der hierin beschriebenen aktiven Verbindungen und Salze kann über jede der anerkannten Arten der Verabreichung für therapeutische Mittel erfolgen. Diese Arten schließen systemische oder lokale Verabreichung wie orale, nasale, parenterale, transdermale, subkutane oder topische Verabreichungsarten ein.
Zum Beispiel kann für die orale Verabreichung in der Form einer Tablette oder Kapsel (z.B. einer Gelatine-Kapsel) die aktive Arzneistoff-Komponente mit einem oralen, nicht toxischen pharmazeutisch verträglichen inerten Träger wie Ethanol, Glycerin, Wasser und dergleichen kombiniert werden. Darüber hinaus können, wenn es erwünscht oder notwendig ist, auch geeignete Bindemittel, Gleitmittel, Zerfallsmittel und Färbemittel in das Gemisch eingebracht werden. Geeignete Bindemittel schließen Stärke, Magnesiumaluminiumsilikat, Stärkepaste, Gelatine, Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon, natürliche Zucker wie Glucose oder beta-Lactose, Mais-Süßstoffe, natürliche und synthetische Gummi wie Akaziengummi, Tragant oder Natriumalginat, Polyethylenglycol, Wachse und dergleichen ein. Gleitmittel, die in diesen Dosierungsformen verwendet werden, schließen Natriumoleat, Natriumstearat, Magnesiumstearat, Natriumbenzoat, Natriumacetat, Natriumchlorid, Kieselerde, Talk, Stearinsäure, ihre Magnesium- oder Calciumsalze und/oder Polyethylenglycol und dergleichen ein. Zerfallsmittel schließen ohne Einschränkung Stärke, Methylcellulose, Agar, Bentonit, Xanthan-Gummistärken, Alginsäure oder ihr Natriumsalz oder schäumende Gemische und dergleichen ein. Verdünnungsmittel schließen z.B. Lactose, Dextrose, Saccharose, Mannit, Sorbit, Cellulose und/oder Glycin ein.
Die Verbindungen der Erfindung können auch in solchen oralen Dosierungsformen wie in zeitlich festgelegten freisetzenden und fortwährend freisetzenden Tabletten oder Kapseln, Pillen, Pulvern, Granulaten, Elixieren, Tinkturen, Suspensionen, Sirupen und Emulsionen verabreicht werden.
Flüssige, insbesondere injizierbare Zusammensetzungen können zum Beispiel durch Auflösen, Dispergieren usw. hergestellt werden. Die aktive Verbindung wird in einem pharmazeutisch reinen Lösungsmittel wie zum Beispiel Wasser, Kochsalzlösung, wässriger Dextrose, Glycerin, Ethanol und dergleichen gelöst oder damit gemischt, um dadurch die injizierbare Lösung oder Suspension zu bilden. Zusätzlich können feste Formen, die zum Auflösen in einer Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind, formuliert werden. Injizierbare Zusammensetzungen sind zum Beispiel wässrige isotonische Lösungen oder Suspensionen. Die Zusammensetzungen können sterilisiert werden und/oder Adjuvanzien wie Konservierungsmittel, Stabilisierer, Netz- oder emulgierende Mittel, Lösungspromotoren, Salze zum Regulieren des osmotischen Drucks und/oder Puffer enthalten. Zusätzlich können sie auch andere therapeutisch wertvolle Substanzen enthalten.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in intravenöser (sowohl Bolus als auch Infusion), intraperitonealer, subkutaner oder intramuskulärer Form verabreicht werden, wobei alle Formen verwenden, die pharmazeutischen Fachleuten wohlbekannt sind. Injizierbare Zusammensetzungen können in konventionellen Formen entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen hergestellt werden.
Die parenterale injizierbare Verabreichung wird im Allgemeinen für subcutane, intramusculäre oder intravenöse Injektionen und Infusionen verwendet. Zusätzlich verwendet ein Ansatz zur parenteralen Verabreichung die Implantation eines langsam freisetzenden oder anhaltend freisetzenden Systems, das sicherstellt, dass gemäß US-Pat. Nr. 3,710,795 ein konstanter Spiegel einer Dosierung beibehalten wird.
Darüber hinaus können bestimmte Verbindungen für die vorliegende Erfindung in intranasaler Form über die topische Verwendung von geeigneten intranasalen Vehikeln oder über transdermale Routen unter Verwendung jener Formen von transdermalen Hautpflastern verabreicht werden, die Fachleuten wohlbekannt sind. Um in der Form eines transdermalen Zuführungssystems verabreicht zu werden, wird die Dosierungsverabreichung natürlich eher kontinuierlich als unterbrochen über den Verlauf des Dosierungsschemas sein. In manchen Ausführungsformen schließen andere topische Präparate Cremen, Salben, Lotionen, Aerosolsprays und Gele ein, in denen die Konzentration des aktiven Bestandteils im Bereich von 0,1% bis 15% Gew./Gew. oder Gew./V. liegen würde.
Für feste Zusammensetzungen können Excipienten, die pharmazeutische Grade von Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Cellulose, Glucose, Saccharose, Magnesiumcarbonat und dergleichen einschließen, verwendet werden. Die oben definierte aktive Verbindung kann auch als Zäpfchen unter Verwendung von zum Beispiel Polyalkylenglycolen, zum Beispiel Propylenglycol, als der Träger formuliert werden. In machen Ausführungsformen werden Zäpfchen vorteilhafterweise aus Fettemulsionen oder -suspensionen hergestellt.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch in der Form von Liposomen-Zuführungssystemen wie kleinen unilamellaren Vesikeln, großen unilamellaren Vesikeln und multilamellaren Vesikeln verabreicht werden. Liposomen können aus einer Vielzahl von Phospholipiden, die Cholesterin, Stearylamin oder Phosphatidylcholin enthalten, gebildet werden. In manchen Ausführungsformen wird ein Film von Lipid-Komponenten mit einer wässrigen Lösung eines Arzneistoffs hydratisiert, um eine Lipidschicht zu bilden, die den Arzneistoff verkapselt, wie in US-Pat. Nr. 5,262,564 beschrieben.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch durch die Verwendung von monoclonalen Antikörpern als individuelle Träger zugeführt werden, an die die Verbindungsmoleküle gekoppelt sind. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch mit löslichen Polymeren als anzielbare Arzneistoffträger gekoppelt werden. Solche Polymere können Polyvinylpyrrolidon, Pyran-Copolymer, Polyhydroxypropylmethacrylamidphenol, Polyhydroxyethylaspanamidphenol oder Polyethylenoxidpolylysin, das mit Palmitoyl-Resten substituiert ist, einschließen. Darüber hinaus können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung an eine Klasse von biologisch abbaubaren Polymeren gekoppelt sein, die für das Erzielen einer kontrollierten Freisetzung eines Arzneistoffs nützlich sind, zum Beispiel Poly-Milchsäure, Polyepsilon-Caprolacton, Polyhydroxy-Buttersäure, Polyorthoester, Polyacetale, Polydihydropyrane, Polycyanoacrylate und quervernetzte oder amphipathische Block-Copolymere von Hydrogelen.
Wenn erwünscht, kann das zu verabreichende Arzneimittel auch geringe Mengen von nicht toxischen Hilfssubstanzen wie Netz- oder emulgierenden Mitteln, pH-puffernden Mitteln und anderen Substanzen wie zum Beispiel Natriumacetat, Triethanolaminoleat usw. enthalten.
Das Dosierungsschema, das die Verbindungen anwendet, wird gemäß einer Vielzahl von Faktoren, einschließlich Typ, Spezies, Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischer Zustand des Patienten; der Schwere des zu behandelnden Zustands; der Route der Verabreichung; der Nieren- und Leberfunktion des Patienten; und der bestimmten angewendeten Verbindung oder des Salzes davon ausgewählt. Ein gewöhnlich ausgebildeter Arzt oder Tierarzt kann leicht die wirksame Menge des Arzneistoffs, die benötigt wird, um das Fortschreiten des Zustandes zu verhindern, ihm entgegenzutreten oder zu stoppen, bestimmen und verschreiben.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in einer einzelnen Dosis verabreicht werden. Alternativ können die Verbindungen der Erfindung in einer einzelnen täglichen Dosis verabreicht werden oder die gesamte täglichen Dosierung kann in zwei-, drei- oder viermalige tägliche Dosen geteilt verabreicht werden. Zusätzlich können die Verbindungen der Erfindung über den Verlauf von einigen Tagen oder Wochen verabreicht werden. Dosierungsschemata für die Verabreichung von Therapeutika sind Fachleuten wohlbekannt.
Jedes der obigen Arzneimittel kann 0,1-99%, 1-70% oder 1-50% der aktiven Verbindungen der Erfindung als aktive Bestandteile enthalten.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können mit einem anderen therapeutischen Mittel als ein oder mehrere Arzneimittel verabreicht werden. Das andere therapeutische Mittel kann vor, gleichzeitig mit oder nach der Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung verabreicht werden. Das andere therapeutische Mittel kann zum Beispiel ein therapeutisches Mittel sein, das auf dem Fachgebiet für jene bestimmte Indikation bekannt ist.
Im Verlauf dieser Beschreibung und der Ansprüche werden das Wort „umfassen" oder Variationen wie „umfasst" oder „umfassend" verstanden werden, dass sie den Einschluss einer angegebenen Ganzzahl oder Gruppe von Ganzzahlen, aber nicht den Einschluss von irgendeiner anderen Ganzzahl oder Gruppe von Ganzzahlen bedeuten.
Beispiele
Die Erfindung wird in den folgenden nicht-limitierenden Beispielen veranschaulicht werden.
Beispiel 1: Die Injektion von Adenovirus-Partikeln, die eine Reporter-Nucleinsäure enthalten, zusammen mit Adenovirus-Partikeln, die menschliche Interferon-beta-Nucleinsäure enthalten, in Mäuse resultiert in erhöhter Expression von menschlichem Interferon-beta.
Die Wirkung der Verabreichung von Adenovirus-Partikeln, die eine Reporter-Nucleinsäure enthalten, zusammen mit adenoviralen Partikeln, die menschliche Interferon-beta-Nucleinsäure enthalten, auf die zirkulierenden IFN-β-Spiegel wurde untersucht.
Adenovirale Vektoren
Die E1-deletierten, E2a-temperaturempfindlichen Adenoviren H5.110CMVhIFN-β und H5.110CMVlacZ codieren menschliches IFN-β beziehungsweise β-Galactosidase, gesteuert durch den frühen Promotor des Cytomegalievirus (CMV). Siehe z.B. Qin, et al. 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 14411-14416. Die E1-, E3-deletierten Adenoviren H5.010CMVhα1AT und H5.010CMVlacZ codieren menschliches α1-Antitrypsin („α1AT") beziehungsweise β-Galactosidase („lacZ"), auch durch den frühen Promotor von CMV gesteuert. Siehe z.B. Jooss, et al. 1998 Gene Ther. 5: 309-319. Alle Virus-Präparationen wurden durch zwei Runden von Cäsiumchlorid-Bandierung hochgradig gereinigt, und die Partikeltiter wurden bestimmt, wie früher beschrieben. Siehe z.B. Nyberg-Hoffman, et al. 1997 Nat. Med. 3: 808-811; Chardonnet und Dales, 1970 Virology 40: 462-477.
Gruppen von fünf Mäusen (C57BL/6, Balb/c, C3H, NCR-nackt, C57BL/J6 rag-1-Mäuse oder Balb/c nu/nu, wie angegeben) wurden in allen Experimenten intravenös („i.v.") über die Schwanzvene verschiedene Dosen von rekombinanten Adenoviren in 100 μl phosphatgepufferter Salzlösung („PBS") injiziert. Die Dosen und Viruskonstrukte waren, wie unten beschrieben. Blut wurde am Tag 1 für α1AT- und am Tag 3 für hIFN-β-Tests durch Schwanzvenen-Bluten oder Herzpunktion erhalten, die Seren wurden hergestellt, und die Proben wurden bei –80°C gelagert. Um die biologische Verteilung von Adenovirus nach der Schwanzvenen-Injektion zu untersuchen, wurden 1 × 10¹⁰, 3 × 10¹⁰, 10 × 10¹⁰ und 30 × 10¹⁰ Partikel von Cy3-markiertem H5.010CMVeGFP-Virus in neun C57BL/6-Mäuse pro Gruppe injiziert. Als eine Kontrolle wurden 100 μl des Fluorophors Cy3 (2 × 10¹³) in zwei Tiere injiziert. Die Tiere wurden 30 Minuten, 4 Stunden und 24 Stunden nach der Vektorinjektion getötet, um Leber-, Milz-, Lungen- und Nierengewebe zu gewinnen. Die Tiere von der Kontrollgruppe wurden nur nach 30 Minuten getötet.
Für die Tier-Untersuchung unter Verwendung von β-Galactosidase als den Reporter wurden die Mäuse 3 Tage nach der Verabreichung von H5.110CMVlacZ getötet und die Lebern in ganzen Lappen extrahiert. Das Lebergewebe wurde kurz in PBS gewaschen, dann für 4 Stunden in 4% Paraformaldehyd/PBS, enthaltend 2 mM Magnesiumchlorid (MgCl₂), bei 4°C fixiert. Die Gewebe wurde über Nacht in PBS/2 mM MgCl₂ bei 4°C gewaschen, dann in 2 mm-dicke Schnitte geschnitten. Diese dicken Schnitte wurden dann wieder über Nacht in PBS/2 mM MgCl₂ bei 4°C gewaschen, dann mit X-Gal (1 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid in je 5 mM Kaliumferricyanid und Kaliumferrocyanid in obigem Waschpuffer) für 4 Stunden bei 37°C gefärbt. Die Gewebe wurde wieder kurz gewaschen, fotografiert, dann in Paraffin eingebettet, geschnitten (10 μm) und unter Verwendung des F4-80-Antikörpers auf Kupfferzellen gefärbt, wie unten beschrieben. Die Schnitte wurden mit nuklearem Schnellrot gegengefärbt.
Die Interferon-beta-Spiegel wurden durch Verwendung eines ELISA-Tests quantifiziert. Platten mit 96 Vertiefungen wurden über Nacht bei 4°C mit einem anti-Mensch-IFN-β-Antikörper (BO-2; Summit Pharmaceuticals, Fort Lee, NJ) beschichtet. Der Antikörper wurde zu 10 μg/ml in dem Beschichtungspuffer, enthaltend 50 mM Natriumbicarbonat/Carbonat, 0,2 mM MgCl₂ und 0,2 mM CaCl₂ (pH 9,6) verwendet. Nachdem die Platten mit 0,5% Magermilchpulver in PBS für 1 h bei Zimmertemperatur blockiert worden waren, wurden dann IFN-β-Proben oder IFN-β-Proteinstandards (AVONEX^TM, Biogen), verdünnt in 10% normalem Mausserum, 0,5% Magermilch, 0,05% Tween-20 in PBS, zugefügt. Nach dem Abfangen für 1,5 h bei Zimmertemperatur wurden die Platten gewaschen und nacheinander bei Zimmertemperatur für 1 h mit einem anti-IFN-β-Kaninchenserum (Biogen Probe #447, 1:2000-Verdünnung) inkubiert, wieder gewaschen und dann 1 h mit Meerrettich-Peroxidase („HRP")-konjugiertem Esel-anti-Kaninchen-Antikörper (Jackson ImmunoResearch-, 1:5000-Verdünnung) inkubiert. Nach einem endgültigen Waschschritt wurde dann die Substratlösung (4,2 mM Tetramethylbenzidin, 0,1 M Natriumacetat-Zitronensäure, pH 4,9) zugefügt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 2 M Hydrogenpersulfat („H₂SO₄") gestoppt, und das Absorptionsvermögen wurde bei 450 nm gemessen.
Der E1-deletierte, E2a-temperaturempfindliche adenovirale Vektor, der menschliches IFN-β exprimiert (H5.110CMVhIFN-β), wurde i.v. über die Schwanzvene in weibliche Balb/c-Nacktmäuse injiziert (n = 5/Gruppe). Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Die Konzentration von hIFN-β sowohl in Seren (∎, schwarzes Quadrat, gezeigt als ng/ml) als auch Leberhomogenaten (•, schwarze Kreise, gezeigt als ng/g Leber-Nassgewicht) wurde durch ELISA am Tag 7 bestimmt. Die durchschnittlichen Serum-hIFN-β-Spiegel sind ± SEM gezeigt.
Eine nicht lineare Dosis-Antwort der hIFN-β-Expression wurde nach der i.v.-Verabreichung von H5.110CMVhIFN-β alleine beobachtet. Hohe Dosen des Vektors (1 × 10¹¹ Partikel pro Maus) zeigten überproportionale Expressionsspiegel von hIFN-β im Vergleich zu niedrigen Dosen (1 × 10¹⁰ Partikel). Bei relativ niedrigen Spiegeln von Virus, nämlich 1-3 × 10¹⁰ viralen H5.110CMVhIFN-β-Partikeln pro Maus, konnten nur sehr niedrige Spiegel von IFN-β im Serum und in der Leber von Mäusen nachgewiesen werden, mit der höchsten Expression typischerweise zwischen 3 und 7 Tage nach der Injektion.
Das Erhöhen der Dosis auf 1 × 10¹¹ Partikel resultierte jedoch in einem überproportionalen Anstieg der IFN-β-Spiegel, typischerweise mit einem 10-100-fachen Anstieg der IFN-β-Spiegel bei einem nur 3-fachen Anstieg der viralen Dosis. Diese nicht lineare Dosis-Antwort war nicht auf eine Zurückerhaltung von IFN-β in der Leber bei niedrigen IFN-β-Expressionsspiegeln und der Sekretion in den Kreislauf bei nur hohen Spiegeln der Expression zurückzuführen, weil die nicht lineare Dosis-Antwort sowohl bei IFN-β-Spiegeln im Serum als auch in Lebergewebe-Extrakten gesehen wurde. Eine ähnliche, nicht lineare Dosis-Antwort wurde früher beobachtet; die Grundlage dafür wurde jedoch nicht bestimmt. Siehe z.B. Morral, et al., 1998 Hum. Gene Ther. 9: 2709-2716; Shirley, et al. 1998 Blood 92: 296a.
In Mäuse wurde auch entweder eine hohe Dosis (1 × 10¹¹ Partikeln) oder eine niedrige Dosis (2 × 10¹⁰ Partikeln) von H5.110CMVhIFN-β oder eine Dosis, umfassend ein Gemisch von 2 × 10¹⁰ Partikeln von H5.110CMVhIFN-β mit variierenden Mengen von H5.110CMVlacZ (ein äquivalentes Adenovirus, das das β-Galactosidase-Gen codiert), injiziert. Die Ergebnisse sind in 2A gezeigt. Der Unterschied in den IFN-β-Expressionsspiegeln zwischen den hohen (Serum-IFN-β-Spiegel über 500 ng/ml) und niedrigen Dosis-Gruppen (Serum-IFN-β-Spiegel von 3,8 ng/ml) war weit größer als der Unterschied in der viralen Dosis. Bemerkenswerterweise verstärkte jedoch die gemeinsame Verabreichung des lacZ-codierenden Adenovirus die resultierenden IFN-β-Expressionsspiegel dramatisch. Das H5.110CMVlacZ-Helfer-Adenovirus wurde titriert, um die optimale Dosis zu bestimmen, die nötig war, um eine maximale Expression der festgesetzten niedrigen Dosis von 2 × 10¹⁰ Partikeln Reporter-H5.110CMVhIFN-β zu geben. Eine verstärkte IFN-β-Expression wurde bei allen H5.110CMVlacZ-Dosen gesehen, wobei eine 10-fache Verstärkung (40 ng/ml IFN-β) mit so wenig wie 2 × 10¹⁰ Partikeln H5.110CMVlacZ beobachtet wurde. Die IFN-β-Expression erreichte ein Plateau bei ungefähr 130 ng/ml mit 4 × 10¹⁰ Partikeln H5.110CMVlacZ. Daher war die Dosis-Antwort bei einer angemessenen Behandlung mit 4 × 10¹⁰ Partikeln oder mehr H5.110CMVlacZ mehr proportional, wobei eine H5.110CMVhIFN-β-Dosis von 2 × 10¹⁰ Partikeln (ein Fünftel der hohen Dosis) in ungefähr einem Viertel des Spiegels an IFN-β, der bei der Dosis von 1 × 10¹¹ Partikel H5.110CMVhIFN-β beobachtet wurde, resultierte.
Diese Ergebnisse zeigen, dass ein nicht lineares Verhältnis zwischen der viralen Dosis und einem codierten Protein, das durch das Virus produziert wird, besteht. Diese Ergebnisse zeigen auch, dass ein grob lineares Verhältnis zwischen der viralen Dosis und einem codierten Protein, das durch das Virus produziert wird, durch die Verabreichung eines Adenovirus-Vektors, der das Protein nicht codiert, zusammen mit einem Virus, das das Protein codiert, erzielt werden kann.
Beispiel 2. Die in Mäusen beobachtete Dosierungs-Antwort mit menschlichem IFN-β ist nicht auf eine biologische Wirkung von menschlichem IFN-β in Mäusen zurückzuführen.
Da menschliches IFN-β keine nachweisbare Kreuz-Spezies-Aktivität in Mäusen hat, ist es unwahrscheinlich, dass menschliches IFN-β im Maussystem eine biologische Wirkung hat. Siehe z.B. Joklik, 1991 in Fundamental Virology, Hrsg. Fields & Knipe (Raven Press, New York), S. 281-307. Um jedoch diese Möglichkeit und die Möglichkeit, dass die Pharmakokinetik von menschlichem IFN-β teilweise für diese Phänomene verantwortlich sein könnte, auszuschließen, wurde das Experiment in Beispiel 1 unter Verwendung von H5.010CMVhα1AT, einem E1- und E3-deletierten Adenovirus, das die menschliche α1AT-cDNA („hα1AT") exprimiert, anstelle von H5.110CMVhIFN-β wiederholt.
Die Spiegel von α1AT wurden durch die Verwendung eines ELISA-Tests quantifiziert. Platten mit 96 Vertiefungen wurden über Nacht bei 4°C mit einem Kaninchen-anti-Mensch-α1-Antitrypsin („α1-AT")-Antikörper (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), der zu 10 mg/ml in Beschichtungspuffer, enthaltend 50 mM Natriumbicarbonat/Carbonat, pH 9,5, verwendet wurde, beschichtet. Die Platten wurden mit 3% BSA für 1 h bei Zimmertemperatur blockiert, gewaschen und mit α1-AT-Proteinstandards (Sigma Chemical Co.) oder Serumproben, die in 0,5% BSA und 0,05% Tween 20 in PBS verdünnt wurden, inkubiert. Nach einer Inkubation für 2 h bei 37°C oder über Nacht bei 4°C wurden die Platten bei Zimmertemperatur für 2 h mit einer 1:5000-Verdünnung von Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Ziege-anti-Mensch-α1-AT-Antikörper (EY Laboratories, San Mateo, KA) inkubiert. Die Platten wurden dann bei Zimmertemperatur mit Peroxidase-Substrat (Kirkegaard und Perry Laboratories, Gaithersburg, MA) inkubiert, und die Absorptionsfähigkeit wurde bei 450 nm innerhalb von 30 min gemessen.
Wieder wurde eine nicht lineare Dosis-Antwort beobachtet. Die Ergebnisse sind in 2B gezeigt. Die niedrige Dosis von 1 × 10¹⁰ Partikeln resultierte in Serumspiegeln von 2,8 μg/ml α1-AT, während 8 × 10¹⁰ Partikel in Serumspiegeln von 152 μg/ml α1-Antitrypsin resultierten. Eine niedrige Dosis von 1 × 10¹⁰ Partikeln H5.010CMVhα1AT, gemischt mit 8 × 10¹⁰ Partikeln H5.000CBLacZ, resultierte in Spiegeln von 23,8 μg/ml α1-Antitrypsin, was wieder einen Spiegel erzielte, der nahe an der linearen Dosis-Antwort liegt. Daher sind die nicht lineare Dosis-Antwort und die Verstärkung durch die Behandlung mit einem anderen Adenovirus nicht spezifisch für das IFN-β-Reporterprotein. Eine Reihe von anderen Experimenten verglich verschiedene adenovirale Konstrukte, die unterschiedliche Replikationsdefekte (z.B. E1-deletierte, E1-deletierte und E2a-temperaturempfindliche sowie E1- und E4-deletierte) entweder als das Reportervirus oder das nicht-Reportervirus trugen. Die nicht lineare Dosis-Antwort und die Verstärkung durch das nicht-Reporter-Adenovirus wurde mit allen drei Generationen des Virus beobachtet, was darauf hinweist, dass der Grad des Defekts dieser Viren kein kritischer Parameter ist, der diesem Phänomen unterliegt. Dieselben Ergebnisse wurden auch erhalten, wenn unterschiedliche Promotoren, die die Expression des Reporter-Gens steuern, bewertet wurden.
Beispiel 3. Adenoviren, die lacZ codieren, verstärken die adenovirale IFN-β-Genexpression, wenn sie vor oder gleichzeitig mit dem Adenovirus, das IFN-β codiert, verabreicht werden
Die Wirkung des Variierens der Dosis eines Adenovirus, das lacZ codiert, und die Wirkung der Zugabe des Reportergen-Adenovirus vor oder nach dem Adenovirus, das hIFN-β codiert, wurden bestimmt.
Dosis-Antwort-Experimente und gemeinsame Verabreichungsuntersuchungen wurden anfänglich an Gewebekulturzellen durchgeführt. Die Experimente wurden in Huh7-Zellen unter Verwendung von H5.110CMVlacZ als das Reportervirus, H5.110CMVhIFN-β als das nicht-Reportervirus und unter Verwendung eines Luminiszenz-Tests für die lacZ-Aktivität durchgeführt, um die Expressionsspiegel des Transgens zu bestimmen.
Die menschliche Hepatom-Zelllinie Huh7 (ATCC) wurde in Platten mit 24 Vertiefungen zu 7 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung plattiert. Die Zellen wurden 6-8 h später mit entweder H5.110CMVlacZ in einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 30, 10, 3 und 1 oder mit Gemischen von H5.110CMVlacZ und H5.110CMVhIFN-β, wie angezeigt, infiziert. 24 Stunden später wurden die Zellen in Reporter-Lysepuffer (Promega) lysiert, und die Zelltrümmer wurden durch kurze Zentrifugation entfernt. Die Zelllysate wurden mit Reaktionspuffer (Clontech) für eine Stunde bei Zimmertemperatur in Platten mit 96 Vertiefungen inkubiert, und die β-Galactosidase-Aktivitäten wurden dann durch einen Luminometer gemessen. Die Ergebnisse sind in 2C gezeigt.
In allen diesen in vitro-Experimenten wurden annähernd lineare Dosis-Antworten beobachtet, und durch die nicht-Reportervirus-Zugabe wurde keine Erhöhung beobachtet. Dies weist darauf hin, dass die nicht lineare Dosis-Antwort ein in vivo-Phänomen ist.
Der Zeitablauf der Verabreichung der Adenoviren wurde als Nächstes in vivo untersucht. Die zwei viralen Präparationen, die in Beispiel 1 beschrieben sind, wurden vor der intravenösen Injektion gemischt. Das Verabreichen des nicht-Reportervirus vor oder nach der Injektion des Reportervirus wurde verglichen. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Eine Injektion von H5.110CMVlacZ so wenig wie 5 Minuten nach H5.110CMVhIFN-β ergab keine Erhöhung der IFN-β-Serumspiegel (3-8 ng/ml). Wenn das lacZ-Virus die IFN-β-Expression durch Bereitstellen von Funktionen, die für die Replikation des Reportervirus nötig sind, erhöht hat, würde keine dramatische Wirkung dieser sehr kurzen zeitlichen Trennung erwartet werden. Übereinstimmend mit früheren Daten resultierte die gemeinsame Adenovirus-Verabreichung in einem ungefähr 10-fach höheren IFN-β-Spiegel (42 ng/ml). Überraschenderweise hatten die Tiere, denen H5.110CMVlacZ vor H5.110CMVhIFN-β verabreicht wurde, eine noch höhere IFN-β-Expression als die Mäuse mit der gemeinsamen Verabreichung, wobei eine 4-8 h-Vordosierung als optimal erscheint und in ungefähr 300 ng/ml Serum-IFN-β in diesem Experiment resultierte. Erhöhte IFN-β-Spiegel wurden nicht beobachtet, wenn H5.110CMVlacZ 24-48 h vor H5.110CMVhIFN-β verabreicht wurde (Daten nicht gezeigt).
Diese Experimente würden ausgedehnt, um vollständige Dosis-Antwort-Kurven von Tieren mit oder ohne Vordosierung mit H5.110CMVlacZ abzudecken. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. In Balb/c-Nacktmäuse wurde H5.110CMVhIFN-β in Dosen zwischen 0,3 × 10¹⁰ und 10 × 10¹⁰ Partikeln entweder alleine (schwarze Kreise) injiziert oder vier Stunden nach der Injektion einer sättigenden Dosis (8 × 10¹⁰ Partikel) von H5.110CMVlacZ (schwarze Quadrate) injiziert. Die Serumkonzentrationen von hIFN-β (n = 5/Gruppe, Durchschnitt ± SEM ist gezeigt) wurden am Tag 3 durch ELISA bestimmt. Wie früher gesehen, wurde, während sehr niedrige Dosen von H5.110CMVhIFN-β (0,3-3,0 × 10¹⁰ Partikel) in der Abwesenheit einer H5.110CMVlacZ-Vorbehandlung zu nicht nachweisbaren bis sehr niedrigen Serumspiegeln von IFN-β führten, bei 4 × 10¹⁰ Partikeln und darüber ein nicht linearer Anstieg im Serum-IFN-β gesehen. Wenn eine H5.110CMVlacZ-Vordosierung durchgeführt wurde, wurden signifikante IFN-β-Serumspiegel nach der Verabreichung von sehr niedrigen Dosen von H5.110CMVhIFN-β beobachtet, und das Verhältnis zwischen der Virusdosis und Serum-IFN-β war grob linear.
Beispiel 4. Die Modulierung der Dosis-Antwort ist nicht Promotor-abhängig
Ein anderer möglicher Mechanismus, um diese Daten zu erklären, ist eine Cytokin-vermittelte Aktivierung des viralen Promotors, der verwendet wird, um die Expression des Reporter-Transgens zu steuern. Zum Beispiel kann der pro-Entzündungsfaktor NF-κB Promotoren stimulieren, die NF-κB-Bindungsstellen haben. Siehe z.B. Lieber, et al. 1997 J. Virol. 71: 8798-8807; Lieber, et al. 1998 J. Virol. 72: 9267-9277. Es wurden jedoch ähnliche Ergebnisse erhalten, unabhängig davon, ob der verwendete Promotor entweder die NF-κB-Bindungsstellen enthielt oder ob sie ihm fehlten (d.h. der CMV-IE-Promotor beziehungsweise der α1AT-Promotor). Zusammen mit dem Fehlen dieser Wirkung in vitro genommen vermitteln wahrscheinlich komplexere Komponenten der Wirtsphysiologie oder des Immunsystems des Wirts die hier gezeigten Wirkungen.
Beispiel 5. Behandlung von Mäusen mit Doxorubicin/Liposomen erhöht die Expression eines danach verabreichten Adenovirus-hIFN-β-Transgens (Nicht Teil der Erfindung)
Für die intravenöse Verabreichung von verschiedenen viralen Gentherapie-Vektoren und besonders für Adenovirus ist berichtet worden, dass sie die Leber anzielen, was in einer wirksamen Injektion von Hepatocyten und nachfolgender Transgen-Expression resultiert. Für die intravenöse Verabreichung ist auch berichtet worden, dass sie in einer Aufnahme in die Kupfferzellen in der Leber resultiert.
Um diese Beobachtung zu bestätigen, wurden fluoreszierend markierte Adenovirus-Partikel hergestellt und in Mäuse eingebracht. Um das Adenovirus mit dem Cy3-Carbocyanin-Farbstoff, der kovalent an seine Kapsidproteine konjugiert ist, herzustellen, wurde ein Cy3-Markierungskit von Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL, gekauft. Siehe z.B. Leopold, et al. 1998 Hum. Gene Ther. 9: 367-378. Ein hochgradig gereinigter rekombinanter Adenovirus H5.010CMVEGFP-Bestand in PBS wurde auf eine Konzentration von 5 × 10¹² Partikel/ml eingestellt. Ein ml des Virusbestands wurde für die Markierungsreaktion gemäß der Anweisung des Herstellers verwendet. Der freie Cy3-Farbstoff wurde durch Dialysieren des Reaktionsgemisches in einer Dialysekammer (6000-8000 MG-Ausschlußwert, Slide-a-lyser, Pierce Chem. Co., Rockford, IL) gegen 4 Liter PBS bei 4°C über Nacht entfernt. Die Cy3-Farbstoffkonzentration wurde getestet, wie vom Hersteller angewiesen.
Kupfferzellen wurden immunhistochemisch unter Verwendung des Anti-Makrophagen-F4/80-Antikörpers markiert. Paraffinschnitte von 5 μm wurden geschnitten, auf beschichtete Objektträger gegeben, geklärt und rehydratisiert. Nach einer Äquilibrierung in PBS wurden die Schnitte mit 1% Wasserstoffperoxid („H₂O₂") in Methanol behandelt, in PBS gespült und blockiert, um eine nicht-spezifische Bindung zu verhindern (SuperBlock, Pierce). Die Kupfferzellen wurden mit polyclonalem Anti-Makrophagen-F4/80-Antikörper (Serotec) und einem sekundären biotinylierten Ziege-anti-Ratte-Antikörper (Ventana Medical Systems) markiert. Die Nachweise von sekundäre Antikörper und Avidin-HRP (DAB-Substrat) wurden unter Verwendung eines automatisierten NexES-Immunfärbers (Ventana Medical Systems) durchgeführt.
Um die Aufnahme des Cy3-markierten Vektors und die gemeinsame Färbung von Makrophagen sichtbar zu machen, wurden Blöcke von Lebergewebe 30 Minuten nach der Pfortader-Injektion entfernt. Das Gewebe wurde gefroren und für das Schneiden in OCT-Verbindung (Sakura) eingebettet. Acht μm dicke Gefrierschnitte wurden auf Objektträger platziert, in Aceton bei –20°C für 15 Minuten fixiert und lufttrocknen gelassen. Die Schnitte wurden in 1 × Morpho-Save (Ventana Medical Systems) für 15 Minuten nachfixiert und in PBS gewaschen. Makrophagen wurden mit dem anti-Makrophagen-Antikörper (Serotec, Ratte-anti-Maus, Clon F4/80) für 1 Stunde bei Zimmertemperatur nachgewiesen. Objektträger wurden in PBS gewaschen, mit 10% SuperBlock (Pierce) für 15 Minuten bei Zimmertemperatur blockiert. Nach dem Waschen in PBS wurde der primäre Antikörper mit dem Ziege-anti-Ratte-Antikörper AlexaFluor 488 (Molecular Probes) fluoreszierend markiert. Bilder wurden mit einem Leitz-DMR-Fluoreszenzmikroskop und einer SPOT-RT-CCD-Kamera aufgenommen und in Image-Pro (Media Cybernetics) kombiniert.
Bei der intravenösen Injektion des fluoreszierend markierten Adenovirus wurde beobachtet, dass es die Leber-Kupfferzellen anzielt, wie durch positive Immunfärbung in behandelten Leberschnitten gezeigt. Niedrige Spiegel der Färbung wurden auch in der Milz und der Lunge beobachtet. Trotz der vorwiegenden Kupfferzell-Aufnahme können hohe virale Dosen in einer Zuführung zu nahezu allen Zellen in der Leber und einer Transgen-Expression in einem sehr hohen Anteil (annähernd 100%) der Hepatocyten resultieren (Daten nicht gezeigt). Leber-, Milz-, Lungen- und Nierengewebe wurden durch zwei Verfahren behandelt. Die Hälfte jedes Gewebes wurde schockgefroren und unter Verwendung eines Kryostats geschnitten. Die andere Hälfte des Gewebes wurde in 4% Paraformaldehyd in 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) bei Zimmertemperatur für 4 Stunden fixiert, dann in 70% Ethanol überführt, um die Fixierung zu stoppen, in Paraffin eingebettet und geschnitten.
Die mögliche Involvierung von Kupfferzellen in die Limitierung einer wirksamen Transduktion von Hepatocyten wurde als Nächstes mit Doxorubicin-enthaltenden Liposomen („liposomales Doxorubicin") untersucht. Von diesen Liposomen ist berichtet worden, dass sie die Kupfferzellen in der Leber dezimieren. Siehe Daemen et al., Int. J. Cancer 61: 716-21, 1995; Longman et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 275: 1177-1184, 1995; Parr et al., Biochim. Biophys. Acta. 1168: 249-252. Dieses Phänomen wurde aus Gründen, die zur Zeit nicht verstanden werden, nicht in Rag-1-Mäusen beobachtet.
Intravenöse Injektionen von 0,132 μMol/0,1 ml und 0,246 μMol/0,2 ml von Liposomen-eingefangenem Doxorubicin (100 nm unilamellare Liposomen, zusammengesetzt aus Distearoylphosphatidylcholin/Cholesterin 55/45 in einem molaren Arzneistoff zu Lipid-Verhältnis von 0,2, ein Geschenk von Dr. Marcel B. Bally, BC Cancer Agency) wurden 24 Stunden vor der Injektion einer niedrigen Dosis von H5.110CMVhIFN-β für die temporäre Dezimierung von Kupfferzellen verabreicht. Wie in 5 gezeigt, wurde die hIFN-β-Expression in Balb/c-Nacktmäusen unter Vergleichen der Injektionen von (a) 2 × 10¹⁰ Partikeln H5.110CMVhIFN-β alleine, (b) 2 × 10¹⁰ Partikeln H5.110CMVhIFN-β, injiziert 24 h nach der Dezimierung von Kupfferzellen durch die Injektion von 0,132 mMol Liposomen-eingefangenem Doxorubicin oder (c) nach der Dezimierung mit 0,264 mMol Liposomen-eingefangenem Doxorubicin; oder (d) vier Stunden nach dem Vordosieren mit 8 × 10¹⁰ H5.110CMVlacZ bewertet. In jeden Mausstamm wurden die adenoviralen Konstrukte injiziert, wie angezeigt, und die Seren wurden 24 Stunden später durch terminales Bluten gewonnen. Die Behandlung der Mäuse mit Doxorubicin/Liposomen vor der Verabreichung von 2 × 10¹⁰ Partikeln H5.110CMVhIFN-β führte zu dramatisch höheren IFN-β-Expressionsspiegeln und war beinahe äquivalent zu der Wirkung einer hohen Dosis einer H5.110CMVlacZ-Vorbehandlung. Die Ergebnisse. sind in 4 und 5 gezeigt.
Weil fluoreszierend markiertes Virus durch die Milz aufgenommen wurde und in Anbetracht des Potenzials von Milz-Makrophagen, das Virus zu sequestrieren, wurde die Dosis-Antwort in Mäusen, denen die Milz entfernt worden war, untersucht. Es wurde kein Effekt des Entfernens der Milz auf die Reporter-Expression beobachtet.
Um zu bestätigen, dass die beobachtete erhöhte Transgen-Expression von den Hepatocyten stammte und um zu bestimmen, ob die Kupfferzellen selbst signifikante Spiegel des Transgens exprimierten, wurde das H5.110CMVlacZ-Reportervirus verwendet. In Mäuse wurde dieses Virus in einem Bereich von Konzentrationen mit oder ohne Vordosierung mit dem H5.110CMVhIFN-β-Virus injiziert. Nach 3 Tagen wurden die Lebern entfernt und auf lacZ-Aktivität gefärbt.
Wie bei der Untersuchung der resultierenden Gewebeschnitte gesehen wird, waren die Gewebefärbungsspiegel visuell konsistent mit früheren Experimenten und zeigten sogar bei der niedrigsten (1 × 10¹⁰ Partikel) Dosis eine verstärkte lacZ-Färbung nach der Vordosierung. Wenn dünne Schnitte untersucht wurden, war es offensichtlich, dass die Kupfferzellen trotz ihrer wirksamen viralen Aufnahme keine nachweisbare lacZ-Aktivität exprimierten und dass die Vordosierung tatsächlich in einer dramatisch erhöhten Hepatocyten-Expression resultierte.
Die nicht lineare Dosis-Antwort und die Wirkung einer gemeinsamen Verabreichung, Vorbehandlung oder Nachbehandlung mit einem Kontroll-Adenovirus wurden in fünf verschiedenen Mausstämmen unter Verwendung eines Adenovirus, das menschliches α1-Antitrypsin exprimiert (H5.010CMVhα1AT), getestet. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Vier der fünf Mausstämme ergaben im Wesentlichen ähnliche Ergebnisse mit einer nicht linearen Dosierungskinetik und einer Erhöhung durch gemeinsame oder Vorverabreichung eines nicht-Reportervirus. Ein achtfacher Anstieg der Adenovirus-Dosis resultierte in einem 102-fachen (NCR-nackt), 228-fachen (Balb/c), 160-fachen (CH) und 26-fachen (C57BL/6) Anstieg der Serum-α1AT-Spiegel. In allen vieren dieser Mausstämme erhöhte die gemeinsame Verabreichung von H5.010CMVlacZ zusammen mit einer niedrigen Dosis von H5.010CMVhα1AT die resultierenden α1AT-Serumspiegel, und die Vorbehandlung mit H5.010CMVlacZ ergab in NCR-Nackt-, C3H- und C57BL/6-Mäusen höhere α1AT-Spiegel als die gemeinsame Behandlung. In allen vier Mausstämmen hatte die Verabreichung von H5.010CMVlacZ nach H5.010CMVhα1AT eine minimale Wirkung. Es gab feine, aber reproduzierbare Unterschiede zwischen den Stämmen, wobei C57BL/6 konsistent höhere Expressionsspiegel bei niedrigen Dosen als Balb/c- oder die Nacktmäuse ergaben.
Beispiel 6: Eine nicht lineare Dosis-abhängige adenovirale hIFN-β-Transgenexpression wird auch in Primaten beobachtet
Es wurden auch Untersuchungen durchgeführt, die die Expression eines Adenovirus-hIFN-β-Transgens in Rhesusaffen messen. Die Dosen wurden durch Berechnen der viralen Partikel pro Körpergewicht bestimmt. Die Antworten wurden in diesen Experimenten auch in Mäusen gemessen.
Die Dosierungen in Bezug auf die viralen Partikel pro Körpergewicht (Partikel pro kg) wurden unter der Annahme einer Masse von 20 Gramm pro Maus berechnet.
Eine sehr niedrige bis nicht nachweisbare Expression eines viral codierten Transgens wurde beobachtet, wenn 2 × 10¹⁰ Partikel (Enddosis von 1 × 10¹² P/kg) an Mäuse verabreicht wurden. Ein ungefährer Beugungspunkt (d.h. ein Punkt, an dem ein nicht linearer Anstieg nachgewiesen wird) wurde beobachtet, wenn 4-5 × 10¹⁰ Partikel verabreicht wurden (2-2,5 × 10¹² P/kg). Sehr hohe Expressionen wurden in allen Mäusen nach Verabreichungen von 1 × 10¹¹ Partikeln (5 × 10¹² P/kg) beobachtet.
Ähnliche Experimente wurden auch in Rhesusaffen (n = 3) durchgeführt. Ein ungefährer Beugungspunkt wurde bei mittleren viralen Dosen von 2 × 10¹² P/kg bis 4 × 10¹² P/kg beobachtet. Nach der Verabreichung einer mittleren viralen Dosis zeigten manche Affen eine sehr niedrige Expression, während andere, die mit derselben Dosis behandelt wurden, sehr hohe Expressionsspiegel zeigten, die nicht linear waren. Im Gegensatz zu den Ergebnissen in diesen mittleren Dosis-Gruppen zeigten alle Affen in der niedrigen-Dosis-Gruppe (1 × 10¹² P/kg) eine sehr niedrige bis nicht nachweisbare IFN-β-Expression, und alle Affen in der hohen Dosis-Gruppe (1 × 10¹³ P/kg) hatten eine sehr hohe Expression, die weit größer als ein 10-facher Anstieg über die Expressionsspiegel in der niedrigen Dosis-Gruppe war. Dies weist darauf hin, dass in diesen Untersuchungen: (1) sich der Beugungspunkt in Affen irgendwo um die mittlere Dosis befindet und (2) es eine Variabilität zwischen einzelnen Affen genau im Punkt des Anstiegs gibt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass nicht lineare Antworten auf virale Vektoren, die durch die Expression eines Genprodukts überwacht wurden, in Primaten wie auch in Mäusen beobachtet werden.
Äquivalente
Aus der vorhergehenden detaillierten Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen der Erfindung sollte es offensichtlich sein, dass neue Zusammensetzungen und Verfahren, die Nucleinsäuren, Polypeptide und eine Gentherapie involvieren, und eine Behandlung beschrieben worden sind. Obwohl diese bestimmten Ausführungsformen hierin im Detail offenbart worden sind, ist dies nur beispielhaft zum Zweck der Veranschaulichung gemacht worden und soll in Bezug auf den Rahmen der angefügten Ansprüche, die folgen, nicht limitierend sein. Insbesondere wird durch die Erfinder in Betracht gezogen, dass für einen Fachmann routinemäßig verschiedene Austausche, Änderungen und Modifikationen an der Erfindung gemacht werden können, ohne vom Rahmen der Erfindung, wie sie durch die Ansprüche definiert ist, abzuweichen. In der Tat werden verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu jenen, die hierin beschrieben sind, für Fachleute aus der vorhergehenden Beschreibung und den begleitenden Figuren offensichtlich werden.

Claims

Verwendung (a) eines ersten viralen Vektors, der eine therapeutische Nucleinsäure umfasst, die ein therapeutisches Genprodukt codiert; und (b) eines Wirkstoffes, der die Kupfferzellfunktion in einem Individuum reduziert, wobei der Wirkstoff ein zweiter viraler Vektor ist, der keine therapeutische Nucleinsäure umfasst, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Erhöhung des Spiegels eines therapeutischen Genprodukts in dem Individuum.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Wirkstoff weniger als 1 Stunde vor dem Verabreichen des viralen Vektors zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei der Wirkstoff weniger als 5 Minuten vor dem Verabreichen des viralen Vektors zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei der Wirkstoff gleichzeitig mit dem viralen Vektor zu verabreichen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der erste virale Vektor ein Adenovirusvektor ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der zweite virale Vektor ein Adenovirusvektor ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Individuum ein Nager ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Individuum ein Primat ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei der Primat ein Mensch ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der erste virale Vektor über eine Route zu verabreichen ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oraler Verabreichung, nasaler Verabreichung, parenteraler Verabreichung, transdermaler Verabreichung, topischer Verabreichung, intraokularer Verabreichung, intrabronchialer Verabreichung, intraperitonealer Verabreichung, direktem Einspritzen in Zellen, einem Gewebe, einem Organ oder Tumor, intravenöser Verabreichung, subkutaner Verabreichung und intramuskulärer Zuführung.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Wirkstoff über eine Route zu verabreichen ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oraler Verabreichung, nasaler Verabreichung, parenteraler Verabreichung, transdermaler Verabreichung, topischer Verabreichung, intraokularer Verabreichung, intrabronchialer Verabreichung, intraperitonealer Verabreichung, direktem Einspritzen in Zellen, einem Gewebe, einem Organ oder Tumor, intravenöser Verabreichung, subkutaner Verabreichung und intramuskulärer Zuführung.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der erste und/oder zweite virale Vektor ein replikationsdefekter viraler Vektor ist.
Arzneimittel, umfassend (a) eine virale Nucleinsäure, die ein therapeutisches Genprodukt codiert; (b) einen Wirkstoff, der die Kupfferzellfunktion reduziert, wobei der Wirkstoff ein virales Partikel ist; und (c) einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Arzneimittel nach Anspruch 13, wobei die virale Nucleinsäure in einem viralen Partikel bereitgestellt wird.
Erster viraler Vektor, der eine therapeutische Nucleinsäure umfasst, die ein therapeutisches Genprodukt codiert, und zweiter viraler Vektor, der keine therapeutische Nucleinsäure umfasst, zur gleichzeitigen, getrennten oder aufeinanderfolgenden Verwendung als Medikament.