ES2283524T3 - Metodo para mejorar el suministro de un acido nucleico terapeutico. - Google Patents

Abstract

El uso de (a) un primer vector viral que comprende un ácido nucleico terapéutico que codifica un producto génico terapéutico; y (b) un agente que reduce la función de las células de Kupffer en un sujeto, en el que dicho agente es un segundo vector viral que no comprende dicho ácido nucleico terapéutico, para la preparación de una composición farmacéutica para aumentar el nivel de un producto génico terapéutico en dicho sujeto.

Description

Método para mejorar el suministro de un ácido nucleico terapéutico.

Campo de la invención

La invención se refiere a composiciones para mejorar el suministro de ácidos nucleicos a un hospedador y, más específicamente, a composiciones para mejorar el suministro y la expresión de transgenes codificados viralmente a un hospedador.

Fundamento

Los vectores adenovirales, incluyendo vectores adenovirales defectuosos en replicación, están siendo usados como vehículos para el suministro de genes para una amplia gama de transgenes en estudios preclínicos y clínicos sobre muchas indicaciones patológicas. La administración intravenosa de vectores adenovirales recombinantes tiene por resultado la transducción de hepatocitos, la expresión de los transgenes codificados y niveles en circulación detectables de productos transgénicos segregados.

El suministro de pequeñas cantidades de partículas adenovirales recombinantes puede conducir a niveles bajos o indetectables de un producto transgénico codificado. El suministro de grandes cantidades de partículas adenovirales que contienen un ácido nucleico terapéutico puede tener como resultado niveles altos del transgén expresado. Unos niveles elevados de expresión de partículas de adenovirus que contienen un transgén terapéutico pueden conducir a complicaciones tales como la toxicidad hepática. Por tanto, en la técnica existe la necesidad de un mejor control de la expresión transgénica en sujetos tratados con vectores virales recombinantes.

Sumario de la invención

La invención se basa en parte en el descubrimiento de que pequeños aumentos de la dosis de un adenovirus que codifica interferón beta humano ("IFN-\beta") puede conducir a aumentos grandes, es decir no lineales, de la cantidad de IFN-\beta codificado. En cambio, la expresión del transgén después de administrar una única dosis baja de un adenovirus que codifica IFN-\beta humano en ratones aumenta drásticamente administrando conjuntamente (coadministrando) un adenovirus recombinante que carece de IFN-\beta humano, si se la compara con la misma dosis viral con virus recombinante "vacío" no coadministrado. La mejora de la expresión del transgén de IFN-\beta se observa también en ratones que han sido tratados con doxorrubicina liposomal, que se sabe que reduce los macrófagos hepáticos conocidos como células Kupffer. En consecuencia, la presente invención proporciona composiciones para optimizar la dosificación de un ácido nucleico terapéutico tal como un ácido nucleico terapéutico proporcionado en un vector viral, tal como un vector de adenovirus.

Aunque no se desea la vinculación con ninguna teoría, se cree que el suministro de dosis bajas de adenovirus en un sujeto tiene por resultado la absorción preferente de los adenovirus por las células de Kupffer del sujeto. Las células de Kupffer secuestran las dosis bajas de virus sin expresar el transgén y presentan un bloqueo para la transducción viral. Una vez que este bloqueo es saturado, puede lograrse el eficiente suministro génico de un producto génico terapéutico codificado viralmente (tal como IFN-\beta) al sujeto. Por consiguiente, un ácido nucleico terapéutico proporcionado, p. ej., en un vector viral, tal como un vector de adenovirus, puede ser eficientemente suministrado al sujeto si se le administra con un agente que sature la capacidad de absorción viral de las células de Kupffer, o reduciendo los niveles de células de Kupffer. En una realización, el suministro es suministro intravenoso. Además, el sujeto comprende células capaces de expresar el transgén.

En consecuencia, en un aspecto la presente invención se refiere a aumentar en un sujeto el nivel de un producto génico terapéutico codificado viralmente administrando al sujeto un ácido nucleico terapéutico que codifica el producto génico terapéutico y un agente que reduce la función de las células de Kupffer en el sujeto; un vector viral tal como un vector de adenovirus comprende dicho ácido nucleico terapéutico; en algunas realizaciones, dicho vector viral que comprende dicho ácido nucleico terapéutico es proporcionado en una partícula viral, tal como una partícula de adenovirus.

En una realización, el agente saturante es una partícula viral recombinante. El agente reduce la función de las células de Kupffer disminuyendo los niveles de células de Kupffer en el sujeto.

En algunas realizaciones, la función de las células de Kupffer reducida por el agente es la absorción, p. ej. la fagocitosis, de una partícula que incluye el ácido nucleico terapéutico por una célula de Kupffer. En otras realizaciones, la función de las células de Kupffer que es reducida por el agente es la absorción mediada por un receptor por una célula de Kupffer, de una partícula que incluye el ácido nucleico terapéutico. Un agente que es absorbido por una célula de Kupffer es una partícula viral que no incluye el ácido nucleico terapéutico.

El agente es proporcionado como ácido nucleico viral, p. ej. un ácido nucleico viral que carece del ácido nucleico terapéutico, o carece de un ácido nucleico que codifica una copia funcional del ácido nucleico terapéutico. En otras realizaciones, el agente es de un tamaño que es adecuado para la absorción fagocítica por las células de Kupffer de un sujeto.

En algunas realizaciones, el agente se ha de administrar antes de la administración del ácido nucleico terapéutico. Por ejemplo, el agente puede ser administrado menos de 24 horas, menos de 10 horas, menos de 8 horas, menos de 4 horas, menos de 2 horas, menos de 1 hora, y menos de 10 minutos, antes de administrar el ácido nucleico terapéutico. En otras realizaciones, el agente se ha de administrar menos de 5 minutos antes de la administración del ácido nucleico terapéutico. Un vector viral, tal como un vector de adenovirus, comprende dicho ácido nucleico terapéutico; en algunas realizaciones, dicho vector viral que comprende dicho ácido nucleico terapéutico es proporcionado en una partícula viral, tal como una partícula de adenovirus.

En otras realizaciones, el agente se ha de administrar al mismo tiempo que el ácido nucleico terapéutico. En algunas realizaciones, un vector viral tal como un vector de adenovirus comprende dicho ácido nucleico terapéutico; en algunas realizaciones, dicho vector viral que comprende dicho ácido nucleico terapéutico es proporcionado en una partícula viral, tal como una partícula de adenovirus.

En otras realizaciones, el agente se ha de administrar al mismo tiempo que el ácido nucleico terapéutico o antes de la administración del ácido nucleico terapéutico, pero no después de la administración del ácido nucleico terapéutico. En algunas realizaciones, un vector viral tal como un vector de adenovirus comprende dicho ácido nucleico terapéutico; en algunas realizaciones, dicho vector viral que comprende dicho ácido nucleico terapéutico es proporcionado en una partícula viral, tal como una partícula de adenovirus.

El ácido nucleico terapéutico, o el agente, o ambos, pueden administrarse al sujeto por cualquier vía conocida en la técnica. Por ejemplo, el ácido nucleico terapéutico y el agente pueden ser administrados por medio de un suministro por vía oral, nasal, parenteral, transdérmica, tópica, intraocular, intratraqueal, intraperitoneal, por inyección directa en las células, tejido, órgano o tumor, intravenosa, subcutánea o intramuscular. En ciertas realizaciones, la administración intravenosa incluye administración a través de la vena porta o por infusión en la arteria hepática.

En ciertas realizaciones, el ácido nucleico codificado viralmente es proporcionado en un adenovirus.

En otro aspecto, la invención se refiere a al aumento de lo niveles de un producto génico terapéutico codificado viralmente en una población de hepatocitos. Esto incluye poner en contacto la población de hepatocitos con un ácido nucleico terapéutico que codifica el producto génico terapéutico y un agente que modula la función de las células de Kupffer en el sujeto. Una de las funciones de las células de Kupffer que se reduce es la absorción del agente. La absorción del agente puede ser no específica, tal como la fagocitosis, o puede ser específica, tal como la absorción mediada por un receptor.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para modular la toxicidad (p. ej. hepatotoxicidad) asociada con un transgén codificado viralmente, administrando a un sujeto en necesidad del mismo un agente que reduce la función de las células de Kupffer en el sujeto. En algunas realizaciones, el agente se ha de administrar antes de la administración de un ácido nucleico terapéutico que codifica el producto génico terapéutico. En otras realizaciones, el agente se ha de administrar al mismo tiempo que la administración de un ácido nucleico terapéutico que codifica el producto génico terapéutico. Un producto génico terapéutico codificado por el ácido nucleico puede ser un polipéptido, un ácido nucleico antisentido, o un anticuerpo.

También se proporciona mediante la invención la expresión modulada en el hígado de niveles elevados (p. ej. niveles tóxicos) de una proteína terapéutica administrando a un sujeto en necesidad de terapia génica al menos una dosis de un vector viral que carece de un polinucleótido para la expresión del producto génico terapéutico bien sea antes o al mismo tiempo que la administración de al menos una dosis de un vector viral que contiene un polinucleótido para la expresión del producto génico terapéutico. En algunas realizaciones, los niveles del producto génico terapéutico corresponden a los niveles de ácido nucleico terapéutico así administrado.

También se proporciona mediante la presente invención una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico viral que codifica un producto génico terapéutico, un agente que reduce la función de las células de Kupffer y un vehículo aceptable farmacéuticamente.

La invención proporciona composiciones que permiten una correlación casi lineal entre dosis viral y expresión de un producto génico terapéutico codificado por el ácido nucleico. Las composiciones de la presente invención permiten también la minimización de los efectos tóxicos asociados con las proteínas virales o la expresión del producto génico terapéutico codificado.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente texto tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente texto en la práctica o las pruebas de la presente invención, más adelante se describen métodos y materiales adecuados. En caso de discrepancia, decidirá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales y los métodos, así como los ejemplos, son solamente ilustrativos y se entiende que no son limitantes.

Otros aspectos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción detallada y reivindicaciones que siguen.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una gráfica que representa la respuesta no lineal a la dosis de la expresión de hIFN-\beta después de la administración intravenosa de un vector adenoviral que contiene una deleción en E1, mutación E2a sensible a la temperatura, que expresa interferón \beta humano ("H5.110CMVhIFN-\beta").

La Fig. 2A es una gráfica que muestra que la administración conjunta de H5.110CMVlacZ con dosis bajas de H5.110CMVhIFN-\beta mejora la expresión de IFN-\beta.

La Fig. 2B es una gráfica que representa la respuesta no lineal a la dosis con H5.010CMVh\alpha1-AT como virus informador.

La Fig. 2C es una gráfica que representa la respuesta lineal a la dosis de H5.110CMVlacZ cuando se infectan células Huh7 in vitro, bien sea con H5.110CMVlacZ solo o bien con una mezcla de H5.110CMVlacZ y H5.110CMVhIFN-\beta a la multiplicidad de infección ("MOI": Multiplicity Of Infection) que se indica.

La Fig. 3 es una gráfica que representa la expresión mejorada que se observa cuando ratones atímicos o "nude mice" Balb/c son pretratados con dosis bajas de H5.110CMVhIFN-\beta pre-administración, pero no post-administración, de H5.110CMVlacZ.

La Fig. 4 es una gráfica que representa la relación lineal entre H5.110CMVhIFN-\beta y hIFN-\beta en suero después de predosificación con H5.110CMVlacZ.

La Fig. 5 es una gráfica que muestra que la reducción de las células de Kupffer del hígado mejora la expresión de hIFN-transgénico.

La Fig. 6 es una gráfica que representa diferencias de expresión transgénica específicas de la cepa de los ratones después del suministro de H5.010CMVh\alpha1/AT. A las cepas de ratones indicadas se les inyectó por vía intravenosa una dosis baja (1 x 10^{10} partículas) de vector informador H5.010/CMVh\alpha1AT solo (a), una dosis elevada (8 x 10^{10} partículas) de vector informador H5.010/CMVh\alpha1AT solo (b), 1 x 10^{10} partículas de H5.010/CMVh\alpha1AT coadministradas con 8 x 10^{10} partículas de H5.110/CMVlacZ (c), o el virus H5.110/CMVlacZ administrado 30 minutos antes (d) o 30 minutos después (e) del informador H5.010/CMVh\alpha1AT. La concentración en el suero de \alpha1AT humana 24 h después de la dosificación viral fue determinada mediante ELISA.

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Descripción detallada

La invención proporciona la mejora del suministro de ácidos nucleicos que codifican productos génicos terapéuticos (productos génicos terapéuticos codificados viralmente) suministrando los ácidos nucleicos junto con un agente que afecta negativamente a la función de las células de Kupffer del sujeto.

En general, la composición puede usarse para suministrar cualquier ácido nucleico terapéutico al sujeto. Los ejemplos de ácidos nucleicos terapéuticos incluyen ácidos nucleicos que codifican polipéptidos, ácidos nucleicos antisentido, ácidos nucleicos que codifican ribozimas, y ácidos nucleicos que codifican componentes de un espliceosoma. Cuando los ácidos nucleicos terapéuticos codifican polipéptidos, el polipéptido codificado puede ser, p. ej., una citocina tal como interferón alfa, interferón beta o interferón gamma, interleucinas, factores de crecimiento tales como eritropoyetina, hormona del crecimiento humana, insulina, factor estimulador de colonias de granulocitos ("G-CSF"), factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos ("GM-CSF"), y factores de coagulación tales como el factor VIII y el factor IX.

En ciertas realizaciones, el ácido nucleico terapéutico es proporcionado en un vector que permite la encapsulación en una partícula del gen para el producto terapéutico codificado. En ciertas realizaciones, la partícula puede ser captada por una célula de Kupffer. Una partícula adecuada es una partícula viral, p. ej. una partícula de adenovirus.

Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para la inserción de secuencias de polinucleótidos en un vector. Tales métodos se describen, p. ej., en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., y en Ausubel et al., 1992, Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, NY. Los vectores pueden incluir señales apropiadas de control de la transcripción y de la traducción unidas operativamente a la secuencia de polinucleótido para un gen terapéutico en particular. También pueden usarse promotores y potenciadores para controlar la expresión de proteínas o productos génicos terapéuticos. La activación del promotor puede ser específica del tejido o inducible por un producto metabólico o una sustancia administrada. Tales promotores y potenciadores incluyen, pero sin limitarse a ellos, el promotor E2F nativo, el promotor y potenciador inmediato-temprano de citomegalovirus (Karasuyama et al., 1989, J. Exp. Med., 169: 13); el promotor de beta-actina humana (Gunning et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84: 4831); el promotor inducible por glucocorticoide presente en la repetición terminal larga del virus del tumor mamario de ratón (MMTV LTR: Mouse Mammary Tumor Virus Long Terminal Repeat) (Klessig et al., 1984, Mol. Cell. Biol., 4: 1354); las secuencias de la repetición terminal larga del virus de la leucemia murina de Moloney (MuLV LTR) (Weiss et al., 1985, RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.); el promotor de la región temprana de SV40 (Bernoist y Chambon, 1981, Nature, 290: 304); el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) (Yamamoto et al., 1980, Cell, 22: 787); el promotor de timidina cinasa del virus del herpes simplex (HSV) (Wagner et al., 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78: 1441); el promotor de adenovirus (Yamada et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA,
82: 3567).

Los vectores virales específicos que pueden ser usados en sistemas de transferencia de genes, están ahora bien establecidos. Véanse, por ejemplo: Madzak et al., J. Gen. Virol., 73: 1533-36 (1992: papovavirus SV40); Moss et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 25-38 (1992: virus de la vaccinia); Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 67-93 (1992: virus del herpes simplex (HSV) y virus Epstein-Barr (EBV)); Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 1-24 (1992: retrovirus); Brandyopadhyay et al., Mol. Cell. Biol., 4: 749-754 (1984: retrovirus); Miller et al., Nature, 357: 455-450 (1992: retrovirus); Anderson, Science, 256: 808-813 (1992: retrovirus); virus del herpes (por ejemplo, vectores basados en el virus del herpes simplex), y parvovirus (por ejemplo, vectores basados en parvovirus "defectuosos" o no autónomos). En varias realizaciones, se usan en la invención vectores virales recombinantes diseñados para ser usados en terapia génica. Véanse, p. ej., Hu y Pathak 2000 Pharmacol. Rev. 52: 493-512; Somia y Verma 2000 Nature Rev. 1: 91-99; van Beusechem et al., 2000 Gene Ther. 7: 1940-1946; Glorioso et al., 2001 Nature Med. 7: 33-40. Adicionalmente, pueden administrarse vectores virales en combinación con terapias inmunosupresoras o inmunomoduladoras transitorias. Véanse, p. ej., Joos et al., 1996, Hum. Gene Ther. 7: 1555-1556; Kay et al., Pro. Nat. Acad. Sci. USA 94: 4686-4691.

En ciertas realizaciones, el tipo viral específico usado es el mismo para los dos vectores virales que contienen el producto génico terapéutico y para el agente del vector viral que no contiene el producto génico terapéutico. Cualquiera, o todos ellos, de los vectores virales puede ser defectuoso en replicación.

En otras realizaciones, pueden administrarse serotipos virales, p. ej. los tipos generales de adenovirus 2 y 5 (Ad2 y Ad5, respectivamente), en un programa de dosificación alternante cuando se van a administrar tratamientos múltiples. Pueden administrarse regímenes de dosificación específicos en el curso de varios días, cuando se prevé una respuesta inmunitaria contra el vector viral. En ejemplos no limitantes de realizaciones específicas, los vectores virales basados en Ad5 pueden usarse el día 1, y los vectores virales basados en Ad2 pueden usarse el día 2, o viceversa.

En algunas realizaciones, se proporcionan adicionalmente ácidos nucleicos terapéuticos en virus recombinantes defectuosos en replicación o vectores virales. Estos pueden ser generados en líneas de células empaquetadoras que producen solamente virus defectuosos en replicación. Véase, p. ej., Current Protocols in Molecular Biology: secciones 9.10-9.14 eds. Ausubel et al., 1989 Green Publishing Associates.

Vectores de adenovirus

En algunas realizaciones, un vector para suministrar un ácido nucleico terapéutico es un vector basado en adenovirus. Véase, p. ej., Berkner et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 38-61 (1992). En algunas realizaciones, el vector basado en adenovirus es un vector basado en Ad-2 o en Ad-5. Véanse, p. ej., Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 97-123, 1992; Ali et al., 1994, Gene Therapy 1: 367-384; patentes de EE.UU. nº 4.797.368 y nº 5.399.346.

Los adenovirus pueden ser modificados para que suministren eficazmente un transgén terapéutico o informador a una diversidad de tipos de células. Por ejemplo, los tipos generales de adenovirus 2 y 5 (Ad2 y Ad5, respectivamente), que provocan enfermedades respiratorias en las personas, se están desarrollando actualmente para ensayos clínicos, incluyendo el tratamiento del cáncer u otras enfermedades y trastornos de la proliferación celular, y para terapia génica de la distrofia muscular de Duchenne (DMD) y la fibrosis quística (CF). Ambos tipos Ad2 y Ad5 pertenecen a una subclase de adenovirus que no está asociada con enfermedades malignas humanas. Los vectores de adenovirus son capaces de proporcionar niveles elevados de suministro transgénico a diversos tipos de células, al margen del estado mitótico de la célula. Pueden generarse fácilmente títulos elevados (10^{13} unidades formadoras de placas/ml) de virus recombinante en células 293 (una línea de células de riñón embrionario humano de complementación, transformadas por adenovirus: ATCC No. CRL1573) y crioalmacenarse durante periodos prolongados sin pérdidas apreciables. La eficacia de este sistema en el suministro de un trasgén terapéutico in vivo que complementa un desequilibrio genético ha sido demostrada en modelos animales de varios trastornos. Véanse, p. ej., Watanabe, 1986, Atherosclerosis, 36: 261-268; Tanzawa et al., 1980, FEBS Letters, 118 (1): 81-84; Golasten et al., 1983, New England J. Med., 309: 288-296; Ishibashi et al., 1993, J. Clin. Invest., 92: 883-893; Ishibashi et al., 1994, J. Clin. Invest., 93: 1889-1893, todas las cuales se incorporan al presente texto como referencia. El adenovirus recombinante defectuoso en replicación que codifica un cDNA para el producto génico regulador transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) ha sido aprobado para ser usado en al menos dos experimentos clínicos de CF humana. Véase, p. ej., Wilson, 1993, Nature,
365: 691-692.

Algunos adenovirus defectuosos en replicación que han sido desarrollados para experimentos clínicos contienen deleciones de E1a completa y parte de las regiones E1b. Este virus defectuoso en replicación se desarrolla en células 293 que contienen un gen funcional E1a de adenovirus que proporciona una proteína E1a de transacción. Los virus con deleción de E1 son capaces de replicarse y producir virus infecciosos en ciertas células (p. ej. las células 293), que proporcionan productos génicos de la región E1b en trans. El virus resultante es capaz de infectar muchos tipos de células y puede expresar el gen introducido (siempre y cuando lleve su propio promotor). Sin embargo, el virus no puede replicarse en una célula que no lleve el DNA de la región E1 a menos que la célula sea infectada a una multiplicidad de infección muy alta. Otros vectores de adenovirus desarrollados para ensayos clínicos pueden ser usados en la presente invención. Los ejemplos incluyen vectores Ad con proteínas fibrosas recombinantes para tropismo modificado (p. ej. van Beusechem et al., 2000 Gene Ther. 7: 1940-1946), vectores virales pretratados con proteasa (p. ej. Kuriyama et al., 2000 Hum. Gene Ther. 11: 2219-2230), vectores de Ad mutantes sensibles a la temperatura E2a (p. ej. Engelhardt et al., 1994 Hum. Gene Ther. 5: 1217-1229) y vectores de Ad "gutless" (p. ej. Armentano et al., 1997 J. Virol. 71: 2408-2416; Chen et al., 1997 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94: 1645-1650: Schieder et al., 1998 Nature Genetics 18: 180-183).

Los adenovirus tienen una amplia gama de hospedadores, pueden infectar células en reposo o terminalmente diferenciadas tales como neuronas, y parecen ser esencialmente no oncogénicos. Adicionalmente los adenovirus no parecen integrarse en el genoma hospedador. Dado que existen extracromosómicamente, el riesgo de mutagénesis insercional se reduce en gran medida. Véase, p. ej., Ali et al., 1994, supra, en 373. Los adenovirus recombinantes (rAdV) producen títulos muy altos, las partículas virales son moderadamente estables, los niveles de expresión son altos, y puede infectarse una amplia gama de células.

Los virus adenoasociados (AAV) han sido usados también como vectores para terapia génica somática. El AAV es un pequeño virus de DNA monocatenario o de cordón simple (ss: Single Stranded) con una organización genómica sencilla (4,7 kb) que los convierten en un sustrato ideal para ingeniería genética. Dos marcos de lectura abiertos codifican una serie de polipéptidos rep y cap. Los polipéptidos rep (rep78, rep68, rep62 y rep40) están implicados en la replicación, rescate e integración del genoma de AAV. Las proteínas cap (VP1, VP2 y VP3) forman la cápsida del virión. Flanqueando los marcos de lectura abiertos de rep y cap en los extremos 5' y 3' están repeticiones terminales invertidas (ITRs) de 145 pb, de las cuales las primeras 125 pb son capaces de formar estructuras dúplex con forma de Y o de T. Es de importancia para el desarrollo de vectores AAV el hecho de que los dominios rep y cap completos pueden ser cortados y reemplazados con un transgén terapéutico o informador. Véase, p. ej., Carter en Handbook of Parvoviruses, ed., Tijsser, CRC Press, p. 155-168 (1990). Se ha demostrado que las ITRs representan la secuencia mínima requerida para la replicación, el rescate, el empaquetamiento y la integración del genoma de AAV.

En realizaciones alternativas, el agente reduce la función de las células de Kupffer haciendo descender los niveles de células de Kupffer en el sujeto. Un ejemplo de este tipo de agente es la doxorrubicina liposomal (no es parte de la presente invención).

En algunas realizaciones, la función de las células de Kupffer es reducida por un agente que es captado por las células de Kupffer en vez de captar una partícula viral que contiene el ácido nucleico terapéutico. Un agente que es fagocitado por una célula de Kupffer es una partícula viral (tal como una partícula de adenovirus) que carece del ácido nucleico terapéutico. La partícula viral puede carecer del ácido nucleico terapéutico de forma completa, o, alternativamente, puede incluir una variante del ácido nucleico terapéutico que no codifique una proteína funcional. En algunas realizaciones, es deseable incluir un transgén viral que codifique una proteína marcadora fácilmente detectable, tal como \beta-galactosidasa.

Otro ejemplo de agente que es fagocitado por una célula de Kupffer incluye partículas que tienen un diámetro de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 1000 nm. En realizaciones concretas, las partículas son de aproximadamente el mismo diámetro que el vector viral que se administra a un sujeto y que codifica el producto transgénico terapéutico. En algunas realizaciones, las partículas pueden estar compuestas de un componente orgánico, un componente inorgánico o una combinación de ambos. En otras realizaciones, las partículas componentes pueden ser biodegradables o bien resistentes a la degradación in vivo. En algunas realizaciones, las propias partículas componentes provocan una escasa o nula actividad biológica en el sujeto sometido a tratamiento. El uso de cualquier tipo y composición de materiales utilizados por personas expertas en la técnica para su absorción por las células de Kupffer está contemplado por la presente invención.

El ácido nucleico que codifica el producto génico terapéutico es proporcionado como parte de una partícula viral. Así, un ácido nucleico que contiene regiones reguladoras virales y que codifica proteínas estructurales, así como el ácido nucleico terapéutico, puede ser usado para producir partículas de virus, que después son introducidas en el sujeto.

En general, el agente se ha de administrar antes del suministro del ácido nucleico terapéutico. Alternativamente, el agente se ha de administrar al mismo tiempo que el ácido nucleico terapéutico. Por ejemplo, el agente puede ser administrado menos de 24 horas, menos de 10 horas, menos de 8 horas, menos de 4 horas, menos de 2 horas, menos de 1 hora, menos de 10 minutos, e incluso menos de 5 minutos antes de la administración del ácido nucleico terapéutico. En otras realizaciones, el agente ha de ser administrado menos de 5 minutos antes de la administración del ácido nucleico terapéutico.

El sujeto en los usos anteriormente mencionados puede ser cualquier animal para el que se desea la introducción de un ácido nucleico extraño. Así, el sujeto puede incluir, p. ej., mamíferos, reptiles o aves. Los ejemplos específicos pueden incluir, p. ej., una persona, un ratón, una rata, un perro, un gato, un caballo, una vaca, un cerdo o un primate no humano. La administración puede ser sistémica o tópica, y puede ser profiláctica o terapéutica.

La invención proporciona también un método para modular el suministro a un sujeto de un transgén codificado viralmente. En el método se identifica un punto de inflexión de la dosificación para un virus que contiene el transgén codificado viralmente en el sujeto. Como se usa en el presente texto, un "punto de inflexión de la dosificación" es un punto en el que un pequeño cambio de incremento de la cantidad de virus suministrado al sujeto tiene por resultado un cambio sustancial en la cantidad de producto génico viral. El punto de inflexión se compara con los niveles de producto génico codificado viralmente en el sujeto. La dosis de virus que contiene el transgén es después ajustada, si es necesario, para suministrar la cantidad apropiada de ácido nucleico viral que tiene por resultado la dosis deseada de transgén codificado viralmente.

Composiciones farmacéuticas

La invención incluye también al menos una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico viral que codifica un producto génico terapéutico, un agente que reduce la función de las células de Kupffer, y un vehículo aceptable farmacéuticamente. El ácido nucleico viral puede ser proporcionado como parte de una partícula viral, si se desea. En algunas realizaciones, se proporciona la composición farmacéutica en una cantidad farmacéuticamente eficaz. La expresión "cantidad farmacológicamente o farmacéuticamente eficaz" significa la cantidad de un fármaco o agente farmacéutico que provoque la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o persona que está buscando el investigador o el clínico.

En algunas realizaciones, las composiciones son adecuadas para uso interno e incluyen una cantidad eficaz de un compuesto activo farmacológicamente de la invención, solo o en combinación, con uno o más vehículos aceptables farmacéuticamente. Los compuestos son especialmente útiles por cuanto tienen una toxicidad muy baja, si es que tienen alguna.

Los compuestos descritos en el presente texto pueden formar el ingrediente activo de una composición farmacéutica, y típicamente se administran mezclados con diluyentes, excipientes o vehículos farmacéuticos adecuados (llamados colectivamente en el presente texto materiales "vehículos") elegidos adecuadamente en relación con la forma de administración que se pretende, esto es, comprimidos orales, cápsulas, elixires, jarabes, y similares. Las composiciones incluirán típicamente una cantidad eficaz de compuesto activo o de su sal aceptable farmacéuticamente y, además, pueden incluir también cualquier material vehículo que se use habitualmente en la práctica farmacéutica. Dependiendo del modo de administración que se pretenda, las composiciones pueden estar en una forma de dosificación sólida, semisólida o líquida, tales como, por ejemplo, inyectables, comprimidos, supositorios, píldoras, cápsulas de liberación retardada, polvos, líquidos, suspensiones o similares, por ejemplo en dosificaciones unitarias.

La administración de los compuestos activos y sales descritos en el presente texto puede ser a través de cualquiera de los modos de administración aceptados para agentes terapéuticos. Estos modos incluyen administración sistémica o local, tales como los modos de administración oral, nasal, parenteral, transdérmica, subcutánea o tópica.

Por ejemplo, para administración oral en forma de un comprimido o cápsula (p. ej., una cápsula de gelatina), el componente activo del fármaco puede ser combinado con un vehículo oral inerte no tóxico aceptable farmacéuticamente, tal como etanol, glicerol, agua y similares. Además, cuando se desea, o en caso necesario, también se pueden incorporar a la mezcla los adecuados aglutinantes, lubricantes, agentes desintegrantes y agentes colorantes. Los aglutinantes adecuados incluyen almidón, silicato de aluminio y magnesio, pasta de almidón, gelatina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona, azúcares naturales tales como glucosa o beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales o sintéticas tales como acacia, tragacanto o alginato sódico, polietilenglicol, ceras y similares. Los lubricantes usados en estas formas de dosificación incluyen oleato sódico, estearato sódico, estearato de magnesio, benzoato sódico, acetato sódico, cloruro sódico, sílice, talco, ácido esteárico, su sal magnésica o cálcica y/o polietilenglicol, y similares. Los agentes desintegrantes incluyen, sin que sean limitantes, almidón, metil celulosa, agar, bentonita, almidones de goma xantano, ácido algínico o su sal sódica, o mezclas efervescentes, y similares. Los diluyentes incluyen, p. ej., lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa y/o glicina.

Los compuestos de la presente invención pueden también ser administrados en formas de dosificación orales tales como comprimidos o cápsulas de liberación programada y de liberación retardada, píldoras, polvos, gránulos, elixires, tinturas, suspensiones, jarabes y emulsiones.

Las composiciones líquidas, en particular las composiciones inyectables, pueden prepararse por ejemplo mediante disolución, dispersión, etc. El compuesto activo se disuelve o se mezcla con un disolvente farmacéuticamente puro, tal como, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol, etanol y similares, para formar así la solución o suspensión inyectable. Adicionalmente, pueden formularse formas sólidas adecuadas para disolverlas en un líquido antes de la inyección. Las composiciones inyectables son, por ejemplo, soluciones o suspensiones acuosas isotónicas. Las composiciones pueden esterilizarse y/o contener coadyuvantes tales como agentes conservantes, estabilizantes, humectantes o emulsionantes, promotores de solución, sales para regular la presión osmótica y/o tampones. Además, también pueden contener otras sustancias valiosas terapéuticamente.

Los compuestos de la presente invención pueden ser administrados en forma intravenosa (tanto en bolo como en infusión), intraperitoneal, subcutánea o intramuscular, todas ellas usando formas bien conocidas por los profesionales con una experiencia normal en la técnica farmacéutica. Los inyectables pueden prepararse en formas convencionales, bien sea como soluciones o como suspensiones líquidas.

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La administración parenteral por inyectable se usa generalmente para inyecciones e infusiones subcutáneas, intramusculares o intravenosas. Adicionalmente, un método de administración parenteral emplea el implante de sistemas de liberación lenta o de liberación sostenida, que asegura el mantenimiento de un nivel de dosificación constante, de acuerdo con la patente de EE.UU. nº 3.710.795.

Además, ciertos compuestos para la presente invención pueden ser administrados en forma intranasal por medio del uso tópico de vehículos intranasales adecuados, o por medio de vías transdérmicas, usando las formas de parches cutáneos transdérmicos bien conocidos por los profesionales con una experiencia normal en la técnica. Para ser administrada en forma de sistema de suministro transdérmico, la administración de la dosis será evidentemente continua y no intermitente, a lo largo del régimen de dosificación. En algunas realizaciones, otros preparados tópicos incluyen cremas, pomadas, lociones, pulverizadores de aerosol y geles, en los que la concentración de ingrediente activo estaría entre 0,1% y 15%, p/p o p/v.

Para las composiciones sólidas, pueden usarse excipientes entre los que se incluyen calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. El compuesto activo definido anteriormente puede también formularse en forma de supositorio usando, por ejemplo, polialquilenglicoles, por ejemplo propilenglicol, como vehículo. En algunas realizaciones, los supositorios se preparan ventajosamente a partir de emulsiones o suspensiones grasas.

Los compuestos de la presente invención pueden también ser administrados en forma de sistemas de suministro en liposomas, tales como pequeñas vesículas unilamelares, grandes vesículas unilamelares y vesículas multilamelares. Los liposomas pueden formarse a partir de una diversidad de fosfolípidos, que contienen colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas. En algunas realizaciones, una película de componentes lipídicos se hidrata con una solución acuosa de fármaco para formar una capa de lípido que encapsula al fármaco, como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.262.564.

Los compuestos de la presente invención pueden también ser suministrados usando anticuerpos monoclonales como vehículos individuales a los que se acoplan las moléculas de compuesto. Los compuestos de la presente invención pueden también acoplarse con polímeros solubles como vehículos de fármacos dirigibles. Tales polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropil-metacrilamida-fenol, polihidroxietilaspanamidafenol o poli(óxido de etileno)polilisina sustituida con restos palmitoílo. Además, los compuestos de la presente invención pueden acoplarse a una clase de polímeros biodegradables útiles para lograr la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo poli(ácido láctico), poli(epsilon caprolactona), poli(ácido hidroxibutírico), poliortoesteres, poliacetales, polidihidropiranos, policianoacrilatos y copolímeros de bloques entrecruzados o anfipáticos de
hidrogeles.

Si se desea, la composición farmacéutica a administrar puede contener también cantidades minoritarias de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes amortiguadores de pH y otras sustancias y otras sustancias tales como, por ejemplo, acetato sódico, oleato de trietanolamina, etc.

El régimen de dosificación que utiliza los compuestos se elige de acuerdo con una diversidad de factores entre los que se incluye el tipo, la especie, edad, peso, sexo y condición médica del paciente; la gravedad de la condición a tratar; la vía de administración; la función renal y hepática del paciente; y el compuesto que se utiliza en concreto, o la sal del mismo. Un profesional médico o veterinario con una experiencia normal en la técnica puede fácilmente determinar y prescribir la cantidad eficaz de fármaco que se requiere para prevenir, afrontar o detener el progreso de la enfermedad.

Los compuestos de la presente invención pueden ser administrados en una dosis única. Alternativamente, los compuestos de la presente invención pueden ser administrados en una dosis diaria individual, o la dosis diaria total puede ser administrada en dosis divididas en dos, tres o cuatro veces al día. Adicionalmente, los compuestos de la presente invención pueden ser administrados en el curso de varios días o semanas. Los regímenes de dosificación para la administración de productos terapéuticos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Cualquiera de las anteriores composiciones farmacéuticas puede contener de 0,1 a 99%, de 1 a 70% o de 1 a 50% de compuestos activos de la presente invención como ingredientes activos.

Los compuestos de la presente invención pueden ser administrados con otro agente terapéutico, como una o más composiciones farmacéuticas. El otro agente terapéutico puede ser administrado antes, al mismo tiempo o después de la administración de los compuestos de la presente invención. El otro agente terapéutico puede ser, por ejemplo, un agente terapéutico conocido en la técnica para esa indicación en particular.

A lo largo de esta memoria y reivindicaciones, se entenderá que el término "comprender", o variaciones del mismo tales como "comprende" o "que comprende", implica la inclusión de un número entero o un grupo de números enteros establecidos, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros.

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Ejemplos

La invención se ilustrará en los ejemplos no militantes que siguen.

Ejemplo 1

La inyección en ratones de partículas de adenovirus que contienen un ácido nucleico informador junto con partículas de adenovirus que contienen ácido nucleico de interferón-beta humano tiene por resultado la potenciación de la expresión de interferón-beta humano.

Se examinó el efecto de la administración de partículas de adenovirus que contienen un ácido nucleico informador junto con partículas adenovirales que contienen ácido nucleico de interferón-beta humano sobre los niveles de IFN-\beta en la circulación.

Vectores adenovirales

Los adenovirus con deleción E1, sensibles a la temperatura-E2a H5.110CMVhIFN-\beta y H5.110CMVlacZ codifican IFN-\beta humana y \beta-galactosidasa, respectivamente, conducidos por el promotor temprano de citomegalovirus (CMV). Véase, p. ej., Qin et al., 1998 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 95: 14411-14416. Los adenovirus con deleción en E1, E3 H5.010CMVh-\alpha1AT y H5.010CMVlacZ codifican \alpha 1-antitripsina ("\alpha1AT") humana y \beta-galactosidasa ("lacZ"), respectivamente, también conducidos por el promotor temprano de CMV. Véase, p. ej., Joos, et al., 1998 Gene Ther. 5: 309-319. Todos los preparados de virus fueron muy purificados mediante dos rondas de formación de bandas ("banding") con cloruro de cesio, y los títulos de las partículas se determinaron como se describió anteriormente. Véanse, p. ej., Nyberg-Hoffman et al., 1997, Nat. Med. 3; 808-811; Chardoneet y Dales, 1970 Virology 40: 462-477.

Grupos de cinco ratones (C57BL/6, Balb/c, C3H, NCR atímico, ratones c57BL/J6 rag-1 o Balb/c nu/nu según se especifique) fueron inyectados por vía intravenosa ("i.v.") a través de la vena de la cola con varias dosis de adenovirus recombinantes en 100 \mul de solución salina tamponada con fosfato ("PBS") en todos los experimentos. Las dosis y las construcciones de virus fueron como se describe más adelante. Se obtuvo la sangre el día 1 para los ensayos de \alpha1AT y el día 3 para los ensayos de hIFN-\beta mediante sangrado de la vena de la cola o punción cardíaca, se prepararon los sueros y las muestras se almacenaron a -80ºC. Para estudiar la distribución del adenovirus después de la inyección en la vena de la cola, se inyectaron 1 x 10^{10}, 3 x 10^{10}, 10 x 10^{10} y 30 x 10^{10} partículas de virus H5.010CMVeGFP marcadas con Cy3 en nueve ratones c57BL/6 por grupo. Como testigos, se inyectaron 100 \mul de Cy3 fluoróforo (2 x 10^{13}) en dos animales. Los animales fueron sacrificados para recoger los tejidos del hígado, bazo, pulmón y riñón a los 30 minutos, 4 horas y 24 horas después de la inyección del vector. Los animales del grupo testigo fueron sacrificados a solamente los 30 minutos.

Para el estudio con animales usando \beta-galactosidasa como informador, los ratones fueron sacrificados 3 días después de la administración de H5.110CMVlacZ y los hígados se extrajeron en lóbulos enteros. El tejido hepático se lavó brevemente en PBS, y después se fijó durante 4 horas en 4% de paraformaldehído/PBS que contiene cloruro de magnesio (MgCl_{2}) 2 mM a 4ºC. Los tejidos se lavaron durante la noche en PBS/MgCl_{2} 2 mM a 4ºC, y después se cortaron en rodajas en secciones de 2 mm de grosor. Estas secciones gruesas se lavaron después de nuevo durante la noche en PBS/MgCl_{2} 2 mM a 4ºC, y después se tiñeron con X-gal (1 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido en ferricianuro potásico y ferrocianuro potásico, ambos 5 mM, en el tampón para lavado anterior) durante 4 horas a 37ºC. Los tejidos se lavaron de nuevo brevemente, se fotografiaron y se embebieron en parafina, se seccionaron (10 \mum) y se tiñeron para células de Kupffer usando el anticuerpo F4-80, como se describe más adelante. Las secciones se contratiñeron con rojo rápido nuclear.

Los niveles de interferón beta se determinaron cuantitativamente usando un ensayo ELISA. Placas de 96 pocillos fueron recubiertas durante la noche a 4ºC con un anticuerpo anti IFN-\beta humano (BO-2; Summit Pharmaceuticals, Fort Lee, NJ). El anticuerpo se usó a 10 \mug/ml en el tampón para recubrimiento que contiene carbonato/bicarbonato sódico 50 mM, MgCl_{2} 0,2 mM y CaCl_{2} mM (pH 9,6). Después de que las placas fueran bloqueadas con 0,5% de leche seca desengrasada en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente, se añadieron muestras con IFN-\beta o patrones de proteína IFN-\beta (AVONEX^{TM}, Biogen), diluidas en 10% de suero de ratón normal, 0,5% de leche seca desengrasada, 0,05% de Tween-20 en PBS. Después de la captura durante 1,5 horas a temperatura ambiente, las placas se lavaron y se incubaron sucesivamente a temperatura ambiente durante 1 hora con un suero de conejo anti-IFN-\beta (Biogen muestra nº 447, dilución 1:2.000), se lavaron de nuevo y después se incubaron durante 1 hora con anticuerpo anti-conejo de asno conjugado con peroxidasa de rábano picante "HRP: Horse Radish Peroxidase") (Jackson Immunoresearch, dilución 1:5.000). Después de un lavado final se añadió solución sustrato (tetrametilbencidina 4,2 mM, 0,1 M acetato sódico-ácido cítrico, pH 4,9). La reacción se detuvo mediante la adición de persulfato de hidrógeno ("H_{2}SO_{4}") 2 M y se midió la absorbancia a 450 nm.

El vector adenoviral con deleción en E1, sensible a la temperatura E2a, que expresa IFN \beta humano (H5.110CMV
hIFN-\beta) fue inyectado i.v., a través de la vena de la cola, en ratones atímicos Balb/c hembras (n = 5 por grupo). los resultados se muestran en la Fig. 1. La concentración de hIFN-\beta en ambos sueros (\blacksquare, cuadrado negro, indicado como ng/ml) y homogeneizados hepáticos (\medbullet, círculo negro, indicado como ng/g de peso húmedo de hígado) fue determinada mediante ELISA el día 7. Se muestran los niveles medios de hIFN-\beta en suero \pm SEM.

Se observó una respuesta a la dosis no lineal de la expresión de hIFN-\beta después de la administración i.v. de H5.110CMVhIFN-\beta solo. Las dosis elevadas de vector (1 x 10^{11} partículas por ratón) mostraron unos niveles de expresión de hIFN-\beta desproporcionadamente elevados en comparación con las dosis bajas (1 x 10^{10} partículas). A niveles de virus relativamente bajos, concretamente de 1 a 3 x 10^{10} partículas virales de H5.110CMVhIFN-\beta por ratón, solamente pudieron detectarse niveles muy bajos de IFN-\beta en el suero e hígado de los ratones, con la expresión máxima típicamente entre 3 y 7 días después de la inyección.

Sin embargo, el aumento de la dosis a 1 x 10^{11} partículas, tuvo por resultado un aumento desproporcionadamente grande en los niveles de IFN-\beta, típicamente con un aumento de 10 a 100 veces en los niveles de IFN-\beta a partir de un aumento de la dosis viral de solamente 3 veces. Esta respuesta a la dosis no lineal no era debida a la retención de
IFN-\beta en el hígado a niveles de expresión de IFN-\beta bajos y secreción en la circulación solamente a niveles de expresión elevados, porque la respuesta a la dosis no lineal se observó tanto en los niveles de IFN-\beta en suero como dentro de los extractos de tejido hepático. Una respuesta a la dosis no lineal similar se había observado con anterioridad; sin embargo, la base para ello no fue determinada. Véanse, p. ej., Morral et al., 1998, Hum. Gene Ther. 9: 2709-2716; Shirley et al., 1998, Blood 92: 296a.

Los ratones fueron también inyectados con una dosis elevada (1 x 10^{11} partículas) o bien con una dosis baja (2 x 10^{10} partículas) de H5.110CMVhIFN-\beta, o una dosis que comprende una mezcla de 2 x 10^{10} partículas de H5.110CMVhIFN-\beta con cantidades variables de H5.110CMVlacZ (un adenovirus equivalente que codifica el gen de \beta-galactosidasa). Los resultados se muestran en la Fig. 2A. De nuevo las diferencias en los niveles de expresión de IFN-\beta entre los grupos de dosis alta (nivel de IFN-\beta en suero por encima de 500 ng/ml) y baja (nivel de IFN-\beta en suero 3,8 ng/ml) era mucho mayor que la diferencia de dosis viral. Sin embargo, es notable que la administración conjunta del adenovirus que codifica lacZ potenció drásticamente los niveles de expresión de IFN-\beta resultantes. Se tituló el adenovirus colaborador H5.110CMVlacZ para determinar la dosis óptima necesaria para dar la máxima expresión de la dosis baja fijada de 2 x 10^{10} partículas de H5.110CMVhIFN-\beta informador. La expresión potenciada de IFN-\beta se observó a todas las dosis de H5.110CMVlacZ con un aumento de 10 veces (40 ng/ml de IFN-\beta) observado con una cantidad tan baja como 2 x 10^{10} partículas de H5.110CMVlacZ. La expresión de IFN-\beta alcanzó una meseta a aproximadamente 130 ng/ml con 4 x 10^{10} partículas de H5.110CMVlacZ. Así, con un co-tratamiento con 4 x 10^{10} partículas, o más, de H5.110CMVlacZ, la respuesta a la dosis fue más proporcionada, y una dosis de H5.110CMVhIFN-\beta de 2 x 10^{10} partículas (un quinto de la dosis elevada) tiene por resultado aproximadamente un cuarto del nivel de IFN-\beta observado con la dosis de 1 x 10^{11} partículas de H5.110CMVhIFN-\beta.

Estos resultados demuestran que existe una relación no lineal entre la dosis viral y la proteína codificada producida por el virus. Estos resultados demuestran también que puede conseguirse una relación más o menos lineal entre la dosis viral y la proteína codificada producida por el virus, mediante la administración de un vector de adenovirus que no codifica la proteína junto con el virus que codifica la proteína.

Ejemplo 2

La respuesta a la dosificación observada en ratones con IFN-\beta no se debe a un efecto biológico del IFN-\beta humano en los ratones.

Como el IFN-\beta humano no tiene actividad en especies cruzadas detectable en los ratones, es improbable que el IFN-\beta humano tenga un efecto biológico en el sistema ratón. Véase, p. ej., Fields y Knipe (Raven Press, Nueva York), p. 281-307. Sin embargo, para excluir esta posibilidad y la posibilidad de que la farmacocinética del IFN-\beta humano pueda ser en parte responsable de estos fenómenos, se repitió el experimento del Ejemplo 1 usando H5.010CMVh\alpha1AT, y adenovirus con deleción en E1 y E3 que expresa cDNA de \alpha1AT humana ("h\alpha1AT"), en vez de H5.110CMVhIFN-\beta.

Los niveles de \alpha1-AT fueron establecidos cuantitativamente mediante el empleo de un ensayo ELISA. Placas de 96 pocillos fueron recubiertas durante la noche a 4ºC con anticuerpo anti \alpha1-antripsina humana ("\alpha1-AT") de conejo (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) usado a 10 \mug/ml en tampón para recubrimiento que contiene carbonato/bicarbonato sódico 50 mM, pH 9,5. Las placas fueron bloqueadas con 3% de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron y se incubaron con patrones de proteína \alpha1AT (Sigma Chemical Co.) o muestras de suero diluidas en 0,5% de BSA y 0,05% de Tween-20 en PBS. Después de la incubación durante 2 horas a 37ºC o durante la noche a 4ºC, las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas con una dilución 1:5000 de anticuerpo anti-\alpha1-AT humana de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (EY Laboratories, San mateo, CA). Las placas se incubaron después a temperatura ambiente con sustrato de peroxidasa (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MA) y se midió la absorbancia a 450 nm dentro del plazo de 30 min.

De nuevo se observó una respuesta no lineal a la dosis. Los resultados se muestran en la Fig. 2B. La dosis baja de 1 x 10^{10} partículas tuvo por resultado niveles en suero de 2,8 \mug/ml de \alpha1-AT, mientras que 8 x 10^{10} partículas dieron lugar a niveles en suero de 152 \mug/ml de \alpha1-antitripsina. Una dosis baja de 1 x 10^{10} partículas de H5.010CMVh\alpha1AT mezclada con 8 x 10^{10} partículas de H5.000CBLacZ tuvo por resultado niveles de 23,8 \mug/ml de \alpha1-antitripsina, logrando de nuevo un nivel próximo a una respuesta lineal a la dosis. Así, la respuesta no lineal a la dosis y la mejora mediante el tratamiento con otro adenovirus no son específicos para la proteína informadora IFN-\beta. Otra serie de experimentos comparó varias construcciones adenovirales que llevan diferentes defectos de replicación (p. ej., con deleción E1, deleción E1 y sensible a la temperatura E2a, y deleción E1 y E4) como virus informador o bien como virus no informador. La respuesta no lineal a la dosis y la mejora por el adenovirus no informador fue observada con las tres generaciones de virus, lo que indica que el grado de la condición defectuosa de estos virus no es un parámetro crítico subyacente a este fenómeno. Los mismos resultados se obtuvieron también cuando se evaluaron distintos promotores que dirigen la expresión del gen informador.

Ejemplo 3

Adenovirus que codifican lacZ potencian la expresión de gel adenoviral de IFN-\beta si se administran antes o al mismo tiempo que el adenovirus que codifica IFN-\beta.

Se determinó el efecto de la variación de la dosis de un adenovirus que codifica lacZ, y el efecto de añadir el adenovirus con gen informador antes o después del adenovirus que codifica hIFN-\beta.

Los experimentos de respuesta a la dosis y estudios de administración conjunta fueron llevados a cabo inicialmente en células de cultivos de tejidos. Los experimentos se realizaron en células Huh7 usando H5.110CMVlacZ como virus informador, H5.110CMVhIFN-\beta como virus no informador, y usando un ensayo de luminiscencia para la actividad de lacZ para determinar los niveles de expresión del trasgén.

La línea de células de hepatoma humano Huh7 (ATCC) se puso en placas de 24 pocillos a razón de 7 x 10^{4} células por pocillo. Las células fueron infectadas de 6 a 8 horas más tarde con H5.110CMVlacZ a una multiplicidad de infección (MOI) de 30, 10, 3 y 1, o bien con mezclas de H5.110CMVlacZ y H5.110CMVhIFN-\beta, según se indica. Veinticuatro horas más tarde, las células fueron lisadas en tampón para lisis de informador (Promega) y los restos celulares se eliminaron mediante una breve centrifugación. Los lisados celulares se incubaron con tampón para reacción (Clontech) durante una hora a temperatura ambiente en placas de 96 pocillos, y después se midió la actividad de la \beta-galactosidasa mediante luminometría. Los resultados se muestran en la Fig. 2C.

En todos estos experimentos in vitro, se observaron respuestas a la dosis aproximadamente lineales, y no se observó ningún aumento por la adición de virus no informador. Esto indica que la respuesta lineal a la dosis es un fenómeno in vivo.

La relación con el tiempo de la administración de los adenovirus se examinó a continuación in vivo. Los dos preparados virales descritos en el Ejemplo 1 fueron mezclados antes de la inyección intravenosa. Se comparó la administración del virus no informador, antes o después de la inyección de virus informador. Los resultados se muestran en la Fig. 3. La inyección de H5.110CMVlacZ al cabo de un tiempo tan breve como tan solo 5 minutos después de H5.110CMVhIFN-\beta, no produjo ningún aumento de los niveles en suero de IFN-\beta (3-8 ng/ml). Si el virus lacZ aumentaba la expresión de IFN-\beta proporcionando funciones necesarias para la replicación del virus informador, no sería de esperar un efecto drástico de esta brevísima separación en el tiempo. De forma consistente con datos anteriores, la administración conjunta de adenovirus tuvo por resultado un nivel de IFN-\beta aproximadamente 10 veces más alto (42 ng/ml). Sorprendentemente, los animales a los que se administró H5.110CMVlacZ antes de H5.110CMVhIFN-\beta, tenían una expresión de IFN-\beta incluso más alta que los ratones de administración conjunta, pareciendo óptima 4-8 horas de predosificación y resultando aproximadamente 300 ng/ml de IFN-\beta en suero en este experimento. No se observaron niveles de IFN-\beta más altos cuando se administró H5.110CMVlacZ 24-48 horas antes que H5.110CMVhIFN-\beta (datos no mostrados).

Estos experimentos se ampliaron para cubrir curvas dosis-respuesta completas de animales con o sin predosificación con H5.110CMVlacZ. Los resultados se muestran en la Fig. 4. Ratones atímicos Balb/c fueron inyectados con H5.110CMVhIFN-\beta a dosis entre 0,3 x 10^{10} y 10 x 10^{10} partículas, bien sea solas (círculos negros) o inyectadas cuatro horas después de la inyección de una dosis saturante (8 x 10^{10} partículas) de H5.110CMVlacZ (cuadrados negros). Las concentraciones en suero de hIFN-\beta (n = 5 por grupo, se indica la media \pm SEM) se determinaron el día 3 mediante un ELISA. Como se vio anteriormente, aunque dosis muy bajas de H5.110CMVhIFN-\beta (0,3-3,0 x 10^{10} partículas) en ausencia de pretratamiento con H5.110CMVlacZ condujeron a niveles de IFN-\beta en suero muy bajos, se observó un aumento no lineal en el IFN-\beta en suero para 4 x 10^{10} partículas y más. Cuando se realizó la predosificación de H5.110CMVlacZ, se observaron niveles en suero de IFN-\beta significativos después de la administración de dosis muy bajas de H5.110CMVhIFN-\beta, y la relación entre la dosis de virus y el IFN-\beta en el suero era más o menos lineal.

Ejemplo 4

La modulación de la dosis-respuesta no es dependiente del promotor.

Otro posible mecanismo para explicar estos datos es la activación mediada por citocina del promotor viral usado para dirigir la expresión del transgén informador. Por ejemplo, el factor pro-inflamatorio NF-kB puede estimular promotores que tienen sitios de unión de NF-kB. Véase, p. ej., Lieber et al., 1997, J. Virol. 71: 8798-8807; Lieber et al., 1998, J. Virol. 72: 9267-9277. Sin embargo, se obtuvieron resultados similares tanto si el promotor usado contenía como si carecía de sitios de unión de NF-kB (esto es, el promotor CMV IE y el promotor \alpha1AT, respectivamente). Tomados juntos con la falta de este efecto in vitro, componentes más complejos de la fisiología o el sistema inmunitario del hospedador median los efectos mostrados aquí.

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Ejemplo 5

El tratamiento de ratones con doxorrubicina/liposomas mejora la expresión de un transgén de hIFN-\beta de adenovirus administrado a continuación (no es parte de la invención).

Se ha publicado que la administración intravenosa de varios vectores virales de terapia génica, y de adenovirus en particular, se dirige al hígado, con el resultado de una eficaz inyección de hepatocitos y subsiguiente expresión transgénica. También se ha publicado que la administración intravenosa tiene por resultado la absorción en las células de Kupffer en el hígado.

Para comprobar esta observación, se prepararon partículas de adenovirus marcadas fluorescentemente y se introdujeron en ratones. Para preparar adenovirus con el colorante de Cy3 carbocianina conjugado covalentemente con sus proteínas de la cápsida, se adquirió un kit de marcaje con Cy3 de Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL. Véase, p. ej., Leopold et al., 1998, Hum. Gene Ther. 9: 367-378. Un material de partida de adenovirus recombinante H5.010CMVEGFP altamente purificado en PBS se ajustó a una concentración de 5 x 10^{12} partículas7 ml. Un ml del material de partida de virus fue usado para la reacción de marcaje de acuerdo con las instrucciones de fabricante. El colorante Cy3 libre se eliminó dializando la mezcla de reacción en una cámara de diálisis (peso molecular de 6.000 a 8.000 como valor de corte, Slide-a-lyser, Pierce Chem. Co., Rockford, IL) frente a 4 litros de PBS a 4ºC durante la noche. La concentración de colorante Cy3 se ensayó de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las células de Kupffer se marcaron inmunohistoquimicamente usando el anticuerpo F4/80 anti-macrófago. Se cortaron secciones de parafina de 5 \mum, se pusieron en portaobjetos recubiertos, se limpiaron y se rehidrataron. Después de equilibrar en PBS, las secciones se trataron con 1% de peróxido de hidrógeno ("H_{2}O_{2}") en metanol, se aclararon en PBS y se bloquearon para prevenir la unión no específica (SuperBlock, Pierce). Las células de Kupffer se marcaron con anticuerpo policlonal F4/80 anti-macrófago (Serotec) y un anticuerpo secundario biotinilado anti-rata de cabra (Ventana Medical Systems). La detección del anticuerpo secundario y de avidina-HRP (sustrato de DAB) fue llevada a cabo usando un inmunoteñidor automático NexEs (Ventana Medical Systems).

Para visualizar la absorción de vector marcado con Cy3 y la tinción conjunta de macrófagos, se retiraron bloques de tejido del hígado 30 minutos después de la inyección en la vena porta. El tejido se congeló y se incluyó en compuesto OCT (Sakura) para seccionamiento. Se pusieron criosecciones de 8 \mum de espesor en portaobjetos, se fijaron en acetona a -20ºC durante 15 minutos y se dejaron secar al aire. Las secciones fueron post-fijadas en 1 x Morpho-Save (Ventana Medical Systems) durante 15 minutos y se lavaron en PBS. Los macrófagos se detectaron con el anticuerpo anti-macrófago (Serotec, anti-ratón de rata, clon F4/80) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron en PBS, y se bloquearon con 10% de SuperBlock (Pierce) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar en PBS, el anticuerpo primario se marcó fluorescentemente con anticuerpo anti-rata de cabra AlexaFluor 488 (Molecular Probes). Las imágenes se tomaron con un microscopio fluorescente DMR Leitz y una cámara SPOT-RT CCD, y se combinaron en Image-Pro (Media Cybernetics).

Se observó que la inyección intravenosa de adenovirus marcado fluorescentemente se dirigía a células de Kupffer hepáticas, como se demuestra por la inmunotinción positiva en secciones tratadas del hígado. También se observaron bajos niveles de tinción en el bazo y pulmón. A pesar de la absorción predominante en las células de Kupffer, dosis virales elevadas pueden tener por resultado el suministro a virtualmente todas las células del hígado y la expresión transgénica en una proporción muy alta (próxima al 100%) de los hepatocitos (datos no mostrados). Los tejidos del hígado, bazo, pulmón y riñón fueron tratados por dos métodos. La mitad de cada tejido fue congelado fresco y seccionado usando un criostato. La otra mitad del tejido se fijó en paraformaldehído al 4% en tampón de fosfato 100 mM (pH 7,4) a temperatura ambiente durante 4 horas, y después se transfirió a etanol al 70% para detener la fijación, se incluyó en parafina y se seccionó.

La implicación potencial de las células de Kupffer en la limitación de la transducción efectiva de los hepatocitos se examinó a continuación con liposomas que contienen doxorrubina ("doxorrubina liposomal"). Se ha publicado que estos liposomas reducen las células de Kupffer en el hígado. Véanse Daemen et al., Int. J. Cancer 61: 716-21, 1995; Longman et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 275: 1177-1184, 1995; Parr et al., Biochim. Biophys. Acta 1168: 249-252. Este fenómeno no fue observado en ratones Rag-1 por razones no comprensibles hasta el momento.

Se administraron inyecciones intravenosas de 0,132 \mumol/0,1 ml y 0,264 \mumol/0,2 ml de doxorrubicina atrapada en liposomas (100 nm de liposomas unilamelares compuestos de diestearoil-fosfatidilcolina/colesterol 55/45 a una relación molar de fármaco a lípido de 0,2, obsequio del Dr. Marcel B. Bally, BC Cancer Agency) 24 horas antes de la inyección de una dosis baja de H5.110CMVhIFN-\beta para la reducción temporal de células de Kupffer. Como se muestra en la Fig. 5, la expresión de hIFN-\beta en ratones atímicos Balb/c se evaluó comparando las inyecciones de (a) 2 x 10^{10} partículas de H5.110CMVhIFN-\beta solo, (b) 2 x 10^{10} partículas de H5.110CMVhIFN-\beta inyectadas 24 h después de la reducción de las células de Kupffer por la inyección de 0,132 mmoles de doxorrubicina atrapada en liposomas, o (c) después de la reducción con 0,264 mmoles de doxorrubicina atrapada en liposomas; o (d) cuatro horas después de la predosificación con 8 x 10^{10} partículas de H5.110CMVlacZ. Cada cepa de ratones fue inyectada con las construcciones adenovirales como se ha indicado, y se recogieron los sueros 24 horas más tarde por sangrado terminal. El tratamiento de los ratones con doxorrubicina/liposomas antes de la administración de 2 x 10^{10} partículas de H5.110CMVhIFN-\beta dio lugar a unos niveles de expresión de IFN-\beta drásticamente más altos y fue casi equivalente al efecto del pretratamiento con dosis altas de H5.110CMVlacZ. Los resultados se muestran en las Fig. 4 y 5.

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Dado que el virus marcado con fluorescencia fue absorbido por el bazo, y teniendo en cuenta el potencial de los macrófagos esplénicos para secuestrar virus, se examinó la respuesta a la dosis en ratones esplenectomizados. No se observó ningún efecto de la eliminación del bazo sobre la expresión del informador.

Para confirmar que la expresión transgénica mejorada era a partir de hepatocitos y para determinar si las propias células de Kupffer expresaban niveles significativos del transgén, se usó el virus informador H5.110CMVlacZ. Los ratones fueron inyectados con un intervalo de concentraciones de este virus, con o sin predosificación con el virus H5.110CMVhIFN-\beta. AL cabo de 3 días se extrajeron los hígados y se tiñeron para observar la actividad de lacZ.

Como se vio al examinar las secciones de tejido resultantes, los niveles de tinción del tejido eran visualmente consistentes con experimentos previos y mostraron un aumento en la tinción de lacZ incluso a la dosis más baja (1 x 10^{10} partículas) después de la predosificación. Cuando se examinaron secciones delgadas, se puso de evidencia que las células de Kupffer no expresaban una actividad detectable de lacZ, a pesar de su eficiente absorción viral, y que en realidad la predosificación no tuvo por resultado el drástico aumento de la expresión de los hepatocitos.

La respuesta no lineal a la dosis y el efecto de la administración conjunta, el pre-tratamiento o el post-tratamiento con un adenovirus testigo fueron ensayados en cinco cepas diferentes de ratones usando un adenovirus que expresa antitripsina \alpha 1 humana (H5.010CMVh/\alpha1AT). Los resultados se muestran en la Fig. 6. Cuatro de las cinco cepas de ratones dieron resultados esencialmente similares con cinética de dosificación no lineal y mejora por administración conjunta o pre-administración de un virus no informador. Un aumento de 8 veces en la dosis de adenovirus produjo un aumento de 102 veces (NCR atímico), 228 veces (Balb/c), 160 veces (C3H) y 26 veces (C57BL/6) en los niveles de \alpha1AT en suero. En estas cuatro cepas de ratones, la coadministración de H5.010CMVlacZ junto con una dosis baja de H5.010CMVh\alpha1AT hizo aumentar los niveles de \alpha1AT en suero resultantes, y el pretratamiento con H5.010CMVlacZ dio niveles de \alpha1AT más altos que el co-tratamiento en ratones NCR atímicos, C3H y C57BL/6. En las cuatro cepas de ratones, la administración de H5.010CMVlacZ después de H5.010CMVh\alpha1AT tuvo un efecto mínimo. Hubo diferencias sutiles pero reproducibles entre las cepas, dando la C57BL/6 consistentemente niveles de expresión a dosis bajas más elevados que los ratones Balb/c o los atímicos.

Ejemplo 6

La expresión transgénica adenoviral de hIFN-\beta dependiente de la dosis de forma no lineal se observa también en primates.

También se realizaron estudios midiendo la expresión de un transgén de hIFN-\beta de adenovirus en monos rhesus. Las dosis se determinaron calculando las partículas virales por unidad de peso corporal. En estos experimentos también se midieron las respuestas en estos ratones.

Las dosificaciones en términos de partículas virales por unidad de peso corporal (partículas por kg) se calcularon suponiendo una masa de 20 gramos por ratón.

Se observó una expresión entre muy baja e indetectable de un transgén codificado viralmente cuando se administraron a ratones 2 x 10^{10} partículas (dosis final de 1 x 10^{12} p/kg). Se observó un punto de inflexión aproximado (es decir, un punto en el que se detecta aumento no lineal) cuando se administraron 4-5 x 10^{10} partículas (2-2,5 x 10^{12} p/kg). Se observaron expresiones muy altas en todos los ratones después de administraciones de 1 x 10^{11} partículas (5 x 10^{12} p/kg).

También se llevaron a cabo experimentos similares en monos rhesus (n = 3). Se observó un punto de inflexión aproximado a dosis virales moderadas de 2 x 10^{12} p/kg a 4 x 10^{12} p/kg. Después de la administración de una dosis viral moderada, algunos monos mostraron una expresión muy baja mientras que otros tratados con la misma dosis mostraron niveles de expresión muy altos que eran no lineales. Al contrario que con los resultados en estos grupos de dosis moderada, todos los monos del grupo de dosis baja (1 x 10^{12} p/kg) mostraron una expresión de IFN-\beta entre muy baja e indetectable, y todos los monos del grupo de dosis alta (1 x 10^{13} p/kg) tenían una expresión muy alta que era mucho mayor que el aumento de 10 veces sobre los niveles de expresión del grupo de dosis baja. Esto indica que, en estos estudios: (1) el punto de inflexión en los monos está alrededor de la dosis moderada, y (2) hay una variabilidad entre unos monos y otros en el punto exacto del aumento.

Estos resultados demuestran que las respuestas no lineales a vectores virales, determinadas por la expresión de un producto génico, se observan en primates al igual que en ratones.

Equivalentes

De la descripción detallada que precede, de las realizaciones específicas de la presente invención, debe ser evidente que se han descrito nuevas composiciones y métodos que implican ácidos nucleicos, polipéptidos y terapia y tratamiento génicos. Aunque estas realizaciones particulares han sido descritas con detalle en el presente texto, se ha hecho a título de ejemplo solamente con fines ilustrativos, y se entiende que no son limitantes en relación con el alcance de las reivindicaciones anexas que siguen. En particular, los inventores contemplan que los expertos en la técnica con un conocimiento normal de la misma pueden hacer diversas sustituciones, alteraciones y modificaciones como cuestión de rutina, sin apartarse del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones. Efectivamente, varias modificaciones de la presente invención, además de las descritas en el presente texto, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción que antecede y de las figuras anexas.

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Claims (15)

1. El uso de

(a)

un primer vector viral que comprende un ácido nucleico terapéutico que codifica un producto génico terapéutico; y

(b)

un agente que reduce la función de las células de Kupffer en un sujeto, en el que dicho agente es un segundo vector viral que no comprende dicho ácido nucleico terapéutico, para la preparación de una composición farmacéutica para aumentar el nivel de un producto génico terapéutico en dicho sujeto.

2. El uso según la reivindicación 1ª, en el que dicho agente se ha de administrar menos de 1 hora antes de administrar dicho vector viral.

3. El uso según la reivindicación 2ª, en el que dicho agente se ha de administrar menos de 5 minutos antes de administrar dicho vector viral.

4. El uso según la reivindicación 2ª, en el que dicho agente se ha de administrar al mismo tiempo que el vector viral.

5. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª, en el que dicho primer vector viral es un vector de adenovirus.

6. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª, en el que dicho segundo vector viral es un vector de adenovirus.

7. El uso según la reivindicación 1ª, en el que dicho sujeto es un roedor.

8. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 6ª, en el que dicho sujeto es un primate.

9. El uso según la reivindicación 8ª, en el que dicho primate es un ser humano.

10. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho primer vector viral se ha de administrar por una vía elegida entre el grupo consistente en administración oral, administración nasal, administración parenteral, administración transdérmica, administración tópica, administración intraocular, administración intrabronquial, administración intraperitoneal, inyección directa en las células, tejido, órgano o tumor, administración intravenosa, administración subcutánea y suministro intramuscular.

11. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho agente se ha de administrar por una vía elegida entre el grupo consistente en administración oral, administración nasal, administración parenteral, administración transdérmica, administración tópica, administración intraocular, administración intrabronquial, administración intraperitoneal, inyección directa en las células, tejido, órgano o tumor, administración intravenosa, administración subcutánea y suministro intramuscular.

12. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho primer y/o dicho segundo vector viral es un vector viral defectuoso en replicación.

13. Una composición farmacéutica que comprende

(a)

un ácido nucleico viral que codifica un producto génico terapéutico;

(b)

un agente que reduce la función de las células de Kupffer, en donde dicho agente es una partícula viral; y

(c)

un vehículo aceptable farmacéuticamente.

14. La composición farmacéutica según la reivindicación 13ª, en la que dicho ácido nucleico viral es proporcionado por una partícula viral.

15. Un primer vector viral que comprende un ácido nucleico terapéutico que codifica un producto génico terapéutico y un segundo vector viral que no comprende dicho ácido nucleico terapéutico, para su uso simultáneo, separado o secuencial como medicamento.