PT1131457E - Sistema de transferência génica sistémica de vírus/ligandos e de terapia génica - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"SISTEMA DE TRANSFERENCIA GENICA SISTÉMICA DE VÍRUS/LIGANDOS E DE TERAPIA GENICA" ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Campo Técnico A presente invenção refere-se a melhoramentos de tecnologia de transferência génica e terapia génica. Mais especificamente, a invenção proporciona composições e métodos para transferência virai direccionada in vitro e in vivo de ácidos nucleicos para humanos e outros animais a um órgão, tecido ou tumor específicos. A utilização desta invenção para transferir um gene terapêutico, e. g., wtp53, pode resultar num aumento da sensibilidade a radiação e guimioterapias convencionais. 2. Descrição da Técnica Anterior 0 documento W098/40508 descreve vectores adenovirais com tropismo modificado.

Miller e Vile (1998) divulgam vectores direccionados para terapia génica.

Snitkovsky e Young divulgam o direccionamento virai específica para células mediado por uma proteína de fusão de receptor viral-ligando solúvel. 1 A transferência génica e a terapia génica utilizando vectores virais têm sido objecto de investigação considerável. Um objectivo de longa data na terapia génica para o cancro é um sistema de transferência sistémica que direcciona selectivamente para células tumorais alvo, incluindo metástases. Os ácidos nucleicos podem ser introduzidos em células através de vectores virais, de modo a produzir um efeito terapêutico desejado nessas células. Por exemplo, pode ser introduzido um gene para substituir um gene deficiente que interfere com a função celular, e. g., p53. Os ácidos nucleicos também podem ser introduzidos nas células de modo a produzir um efeito terapêutico desejado no animal hospedeiro, e. g., para vacinação, imunoterapia ou expressão anti-sentido.

Foram desenvolvidos vectores virais para tirar vantagem dos mecanismos de entrada na célula utilizados pelos virus para transferir os seus ácidos nucleicos para as células hospedeiras. Foram construídos vectores retrovirais e adenovirais recombinantes utilizando esta estratégia para alcançar a transferência génica in vitro e in vivo. Aproximadamente 80% dos protocolos de terapia que foram aprovados para ensaios clínicos utilizam vectores virais (Wivel e Wilson, 1998). Os vectores adenovirais oferecem vantagens para algumas formas de terapia génica porque podem penetrar em células que não estão em divisão e transportar uma carga relativamente grande (>8 kb) de ADN estranho (Berkner, 1988) . Além disso, as partículas adenovirais podem ser purificadas e produzidas em títulos superiores a 1011 PFU/mL (Wivel e Wilson, 1998) . Uma desvantagem destes sistemas, todavia, é o tropismo celular limitado dos vírus e o problema significativo de direccionar as partículas virais ainda não foi solucionado para qualquer um dos vírus terapêuticos que são actualmente utilizados em ensaios clínicos para o cancro. 2

Consequentemente, os métodos para alterar o tropismo celular foram desenvolvidos e continuam a ser procurados.

Foi descrito um sistema que altera o tropismo dos retrovirus por meio de um conjugado bifuncional (Roux et al., 1989) . 0 conjugado bifuncional contém um anticorpo dirigido contra a cápside virai e, por outro lado, um anticorpo dirigido para um marcador de membrana celular especifico para a célula alvo.

Goud et al. (1988) descreveram conjugados bifuncionais que consistem em dois anticorpos monoclonais (MAb) . Os MAb foram dirigidos contra a proteína da cápside gpVO do retrovirus Moloney e o receptor da transferrina humana. Estes conjugados permitiram que o retrovirus penetre nas células alvo que, de outro modo, não são permissivas. 0 documento WO 92/06180 (Wu et al., 1992) descreve um método para alterar o tropismo de um vírus proporcionando a superfície de um vírus com uma molécula que se liga ao receptor de superfície da uma célula alvo, produzindo um vírus com uma especificidade para as células com o receptor de superfície celular. Na descrição, um retrovirus ou vírus da hepatite B é modificado quimicamente com moléculas de hidratos de carbono que se ligam ao receptor de asialoglicoproteína. Wu et al. divulgam apenas métodos in vitro para a introdução de genes estranhos nas células.

Os vectores adenovirais oferecem vantagens para algumas formas de terapia génica porque podem penetrar em células que não estão em divisão e podem transportar uma sequência de ADN estranho de cerca de 8 kb. As partículas de adenovírus podem ser purificadas e produzidas em títulos superiores a 1011 PFU/mL. 3

Uma restrição na utilização de adenovírus recombinantes é a sua capacidade limitada para direccionar tipos de células específicos. Vários estudos descreveram transferência génica utilizando adenovírus não recombinantes com complexos de ADN através de endocitose mediada pelo receptor, com o adenovírus a proporcionar a capacidade para libertar os conteúdos dos endossomas (Cotten et al., 1992; Wagner et al., 1992). Estes processos utilizam complexos transferrina-polilisina/ADN para internalizar os adenovírus ligados ou não ligados. Wagner et al. (1992) modificaram um vector adenoviral conjugando com polilisina e complexando isto com conjugados de transferrina-polilisina/ADN, produzindo complexos ternários de transferrina-polilisina/adenovírus-polilisina/ADN. Uma abordagem semelhante ao direccionamento é a ligação da transferrina (Tf) às partículas de adenovírus para tirar vantagem do facto de o receptor da transferrina (TfR) ser elevado em muitos tipos de tumor (Miyamoto et al., 1994; Baselga e Mendelsohn, 1994). Schwarzenberger et al. (1997) descrevem vectores de conjugados moleculares (MCV). Os MCV são construídos condensando um plasmídeo que contém o gene de interesse com polilisina (PL), PL ligado a um adenovírus incompetente para replicação (agente endosomolítico) e PL ligado a estreptavidina para direccionamento com ligandos biotinilados. Contudo, foi descrito (Cotten et al., 1992; Wagner et al., 1992; Schwarzenberger et al., 1997) que os presentes métodos de acoplamento covalente de

Tf ao adenovírus ou a criação de conjugados Tf-polilisina-adenovírus, resulta frequentemente numa diminuição da infecciosidade, possivelmente devido às condições severas necessárias para produzir os vírus modificados em Tf.

Outra abordagem implica a ligação reticulada do fragmento

Fab de um anticorpo monoclonal neutralizante anti-fibra ou 4 anti-protuberância a um ligando, tal como folato ou FGF2 (Rogers et al., 1997; Douglas et al. 1996). Os vectores adenovirais complexados com o ligando quimérico Fab demonstraram ser promissores na localização tumoral e apresentam toxicidade reduzida para o fígado in vivo, em comparação com adenovírus nativos.

Curiel et al. (Patente US N2 5521291 e 5547932) apresentam conjugados múltiplos adenoviral-policatião para a internalização de ácidos nucleicos em células eucarióticas. Alguns destes conjugados utilizam a transferrina que é ligada a uma substância que possui uma afinidade para ácido nucleico como um factor de internalização.

Cotten et al. (Patente US N2 5693509) divulgam adenovírus com a capacidade descrita para penetrar eficientemente nas células nas quais eles não podem normalmente penetrar, embora retenham a sua capacidade para expressão génica e/ou as suas propriedades endossomolíticas. A transferrina é ligada covalentemente a partículas de adenovírus de modo a que elas sofram endocitose mediada pelo receptor. O método oxida a transferrina numa forma que contém grupos aldeído na unidade de hidrato de carbono e acopla a transferrina oxidada ao adenovírus em condições redutoras. É também divulgado que é imprevisível se a infectividade é mantida após modificação.

Low et al. (Patente US N2 5108921; 5416016; e 5635382) divulgam métodos para aumentar o transporte transmembranar de moléculas exógenas utilizando ligandos, tais como folato, biotina, tiamina, e seus análogos. Os métodos também podem empregar anticorpos anti-idiotípicos ou outras moléculas capazes de se ligarem aos receptores de ligando. Outros ligandos aqui 5 divulgados incluem niacina piridoxal e ácido ascórbico. ácido pantoténico riboflavina

Xu et al. (1997) e Xu et al. (1999) verificaram que a adição de Tf a um lipossoma catiónico foi capaz de aumentar significativamente a capacidade dos lipossomas para transferir genes exógenos, incluindo o gene p53 normal, tanto in vitro como in vivo. Mais significativamente, eles alcançaram um direccionamento altamente selectivo para uma casta variedade de células tumorais humanas que cresceram como xenoenxertos em murganhos nude.

As publicações e outros materiais aqui utilizados para ilustrar os antecedentes da invenção ou fornecer detalhes adicionais que respeitam a prática, são incorporados por referência, e, por conveniência, são respectivamente agrupados na Lista de Referências em apêndice.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona melhoramentos na administração de vectores virais para, por exemplo, transferência génica mediada por vírus a células alvo.

Num aspecto, a invenção proporciona um complexo ligando-vírus de direccionamento celular para transferência de um vírus a uma célula alvo num animal hospedeiro, em que o referido complexo ligando-virus consiste num ligando e um vírus, e em que o ligando é ligado não covalentemente ao vírus, e é transferrina, um anticorpo de receptor de transferrina, um 6 fragmento de um anticorpo de receptor de transferrina, EGF ou VEGF.

Além disso, a presente invenção proporciona um vector para a transferência sistémica de um virus para uma célula alvo, compreendendo o referido vector um ligando de direccionamento celular ligado não covalentemente ao referido virus, em que o referido vector é preparado misturando uma composição que consiste num ligando de direccionamento celular com um virus num meio aquoso e em que o referido ligando consiste em transferrina, um anticorpo de receptor de transferrina, um fragmento de um anticorpo de receptor de transferrina, EGF ou VEGF.

Ainda adicionalmente, a presente invenção proporciona um método para preparar um vector para a transferência sistémica de um virus para uma célula alvo, compreendendo o referido vector um ligando de direccionamento celular não covalentemente ligado ao referido virus, compreendendo misturar uma composição consistindo no referido ligando de direccionamento celular com o referido virus num meio aquoso, através do qual o referido ligando não se liga covalentemente ao referido virus, em que o referido ligando consiste em transferrina, um anticorpo de receptor de transferrina, um fragmento de um anticorpo de receptor de transferrina, EGF ou VEGF. 0 método divulgado de produzir a mistura evita a inactivação de partículas virais que pode, de outra forma, ser provocada por processamento químico severo. A mistura é preparada de um modo simples e é adequada para administração sistémica (e. g., parentérica) a um doente humano. 7

Noutro aspecto, a invenção proporciona um complexo ligando-vírus de direccionamento celular ou vector como descrito acima para utilização como um medicamento.

Além disso, a presente invenção proporciona um vector para utilização na transferência de um vírus a uma célula alvo num animal, em que o vector compreende um complexo ligando-vírus de direccionamento celular, em que o referido complexo ligando-vírus consiste num ligando e um vírus, e em que o ligando não está ligado covalentemente ao vírus, e é transferrina, um anticorpo de receptor de transferrina, um fragmento de um anticorpo de receptor de transferrina, EGF ou VEGF.

Estes são adequados para administrar sistemicamente in vivo a um humano ou outro animal, de modo a realizar a transferência direccionada dos conteúdos da partícula virai. A presente invenção proporciona ainda a utilização de um vírus para o fabrico de um agente terapêutico compreendendo um vector que compreende um complexo ligando-vírus de direccionamento celular, para transferência do referido vírus a uma célula alvo num animal, em que o referido complexo ligando-vírus consiste num ligando e um vírus, e em que o ligando não está ligado covalentemente ao vírus, e é transferrina, um anticorpo de receptor de transferrina, um fragmento de um anticorpo de receptor de transferrina, EGF ou VEGF.

Num aspecto preferido, o referido vector codifica p53 de tipo selvagem e o referido agente terapêutico deve ser administrado a um animal que recebe tratamento de radiação ou 8 quimioterapia adicionalmente ao referido agente terapêutico. Neste aspecto, a utilização da invenção para transferir um gene terapêutico, p53 selvagem, conduzirá à sensibilização à radiação e a agentes quimioterapêuticos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figuras 2A-F. Análise histoquimica de transferência sistémica adenoviral dirigida para Tf do gene repórter da β-galactosidase num modelo de xenoenxerto em murganho. Murganhos nude atimicos contendo tumores de xenoenxerto DU 145 foram injectados i.v. uma vez com Tf-AdLacZ. Três dias após a injecção, os animais foram sacrificados e os tecidos tumorais e normais foram excisados e corados com X-gal. A Figura 2A apresenta tumor de um animal tratado sistemicamente com Tf-Adp53 a uma proporção de 1,5 x 105 moléculas de Tf/virião. A Figura 2B apresenta o fígado correspondente à Figura 2A. A Figura 2C apresenta o tumor de um animal tratado sistemicamente com Tf-Adp53 a uma proporção de 2,9 x 105 moléculas de Tf/virião. A Figura 2D apresenta o fígado correspondente à Figura 2C. A Figura 2E apresenta o tumor de um animal tratado sistemicamente com Tf-Adp53 a uma proporção de 5,8 x 105 moléculas de Tf/virião. A Figura 2F apresenta o fígado correspondente à Figura 2E. Barra = 50 pm.

Figura 3. Expressão de wtp53 exógeno em tumores de xenoenxerto de DU145 após injecção i.v. de Tf-Adp53. Murganhos nude atimicos contendo tumores de xenoenxerto DU145 foram injectados i.v. com Tf-Adp53 ou Adp53 não direccionado. Os animais foram sacrificados 48 horas mais tarde, os tecidos tumorais e normais foram excisados e a proteína foi isolada para análise de transferência de Western. A proteína isolada do tumor e os órgãos de um murganho não tratado, assim como as células parentais DU145, foram incluídos como controlos. Foram aplicados 100 pg de proteína total de cada destas amostras em cada pista. Foi também incluído 2,5 pg de proteína total de células DU145 infectadas in vitro com Adp53. As bandas de proteína p53 foram detectadas utilizando o anticorpo monoclonal anti-p53 Ab-2 e o ECL Western blot kit. Banda 1 = wtp53 exógena humana; Banda 10 2 DU145 p53 endógena humana; Banda 3 p53 endógena de murganho.

Figura 4. Efeito da combinação de tratamento transferido sistemicamente, p53 adenoviral dirigido ao tumor e radiação em tumores de xenoenxerto de JSQ-3 in vivo. Foi produzido Tf-Adp53 a uma proporção de 1 x 105 moléculas de Tf/virião. Foram injectadas 1 x IO10 partículas virais/murganho/injecção (equivalente a 3 x 108 pfu) de Tf-Adp53 ou Adp53 não direccionado, na veia da cauda de murganhos nude atímicos contendo tumores de xenoenxerto de JSQ-3 de 100-200 mm3. No início do dia após a primeira injecção i.v., foi administrado 30 Gy de radiação ionizante aos animais no sítio do tumor em doses fraccionadas de 2 Gy diariamente. Não foi observado novo desenvolvimento tumoral nos animais que receberam o tratamento de combinação 8 meses após a finalização do tratamento. Como o erro era demasiado pequeno para ser visualizado, não estão presentes barras de erro no grupo de Radiação Tf-Adp53 ( + ) . A barra representa a duração do tratamento (aproximadamente 3 semanas). Todas as experiências com animais foram realizadas de acordo com os regulamentos institucionais da Universidade de Georgetown para os cuidados e utilização de animais de laboratório.

Figuras 5A-H. Quimiossensibilização de metástases do pulmão de murganho B16 à cisplatina (CDDP) através de p53 adenoviral direccionado ao tumor distribuído sistemicamente. As metástases foram induzidas em murganhos singeneicos C57/B1/6 normais, por injecção intravenosa de 1 x 105 células. Quatro dias mais tarde, o tratamento teve início. Foram produzidas Tf-Adp53 e Tf-AdLacZ de controlo numa proporção de 1,5 x 105 moléculas de Tf/virião.

Foram administradas 1 x 1010 partículas virais/murganho/injecção 11 (equivalente a 3 x 108 pfu) de Adp53, Tf-Adp53 ou Tf-AdLacZ, i.v. 3 vezes/semana para um total de 12-13 doses. Foi injectado CDDP intraperitonealmente a 3-5 mg/kg a cada 2-4 dias para um total de 8-13 doses. Os pulmões foram excisados dos animais após uma ronda de tratamento. Os pulmões do animal tratado com: Sem tratamento (Figuras 5A e 5E) ; apenas CDDP (Figura 5B) ; Ad-p53 não direccionado mais CDDP (Figura 5C); Tf-LacZ mais CDDP (Figura 5F) ; apenas Tf-Adp53 (Figura 5G) ; Tf-Adp53 mais CDDP (Figuras 5D e 5H).

Figura 6. Efeito da combinação de p53 adenoviral direccionado ao tumor transferido sistemicamente e quimioterapia em tumores de xenoenxerto MDA-MB-435 in vivo.

Figura 7. Expressão de β-galactosidase em células DU145 injectadas intratumoralmente que foram injectadas com adenovirus não direccionado com um LacZ ou com adenovirus direccionado com transferrina com LacZ.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 0 desenvolvimento normal de murganhos sem wtp53 e as observações de uma pós-irradiação G1 bloco em células que expressam p53 sugerem que wtp53 funciona na regulação da célula após lesão de ADN ou stresse, em vez de durante a proliferação e desenvolvimento. Uma vez que parece que muitas terapias anti-cancerosas convencionais (quimioterapêuticos e radiação) induzem a lesão de ADN e parecem funcionar na indução de apoptose, as alterações na via de p53 podem conduzir, de uma maneira concebível, à falência de regimes terapêuticos. 12 A falha da função wtp53 também foi associada a um aumento na resistência à radiação. A presença de mtp53 e a ausência consequente de um bloco G1 também demonstrou estar correlacionada com o aumento de resistência à radiação em alguns tumores humanos e linhas celulares. Estes incluem linhas celulares de tumores humanos representativos de cancro da cabeça de pescoço, linfoma, bexiga, mama, tiróide, ovários e cérebro.

Com base nestas considerações, a terapia génica para restaurar a função de wtp53 nas células tumorais deve restabelecer os pontos de controlo do ciclo celular dependentes de p53 e a via apoptótica conduzindo, assim, à inversão dos fenótipos quimio/radio-resistentes. Consistente com este modelo, a quimiossensibilidade, juntamente com a apoptose, foi restaurada por expressão de wtp53 em xenoenxertos de murganho de cancros do pulmão de célula não pequena comportando mtp53. A quimiossensibilidade de xenoenxertos que envolvem a linha de células tumoral de pulmão p53 nulo H1299 e células de glioblastoma T98G e sensibilidade de cancro de xenoenxertos de cancro do cólon WiDr à cisplatina foi demonstrada. 0 aumento da célula aumentado por doxorrubicina ou mitomicina C foi também demonstrado em células de tumor da mama SK-Br-3 por transdução adenoviral de wtp53. Contudo, alguns relatos contraditórios indicam que a relação entre a expressão de p53 e quimiorresistência pode possuir um tecido ou componente especifico para o tipo de célula. A transfecção de wtp53 por um vector adenoviral também demonstrou sensibilizar células de tumor ovárico e colorrectal à radiação. Também foi relatado que a distribuição de wtp53 mediada por adenovirus não restaurou a apoptose funcional num carcinoma da linha tumoral de célula escamosa resistente à radiação da cabeça e pescoço (SCCHN) resultando na radiossensibilização destas células in vitro. Mais 13 significativamente, a combinação de adeno-wtp53 injectado intratumoralmente e a radiação conduziram à regressão tumoral completa e de longo termo de tumores de xenoenxerto estabelecidos SCCHN. A presente invenção diverge da utilização convencional de injecção intratumoral de vectores virais não direccionados ou mesmo transferência sistémica de vectores não direccionados, para a transferência de moléculas terapêuticas para terapia génica, por exemplo, como divulgado por Roth et al. (Patente U.S. N2 5747469) .

Os dados aqui apresentados demonstram a capacidade superior desses complexos para direccionar especificamente e sensibilizar as células tumorais (devido à expressão do gene wtp53), tanto tumores primários como metastáticos, à radiação e/ou quimioterapia tanto in vitro como in vivo. A presente invenção debruça-se sobre a necessidade de transferir moléculas terapêuticas sistemicamente com um grau elevado de especificidade para as células alvo e elevada eficiência. Quando administrado sistemicamente, este sistema de transferência é capaz de alcançar, e direccionar especificamente, doença metastática, assim como primária, quando as células alvo são células de cancro humanas. Como um resultado da distribuição da versão normal, de tipo selvagem ao gene supressor tumoral p53 através deste sistema, as Requerentes demonstraram que os tumores são sensíveis à radioterapia e/ou quimioterapia. A elevada eficiência de transfecção deste sistema resulta num tal grau elevado de sensibilização que não só existe inibição do crescimento do cancro mas os tumores e metástases 14 pré-existentes são completamente eliminados durante um período de tempo extenso.

As formas de realização específicas da descrição proporcionam composições farmaceuticamente aceitáveis compreendendo uma mistura de ligando de transferrina e partículas de vector virai capazes de transferir um ácido nucleico a células hospedeiras alvo. Simplesmente misturar vectores virais (e. g., vectores retroviral ou adenovirais) com um ligando de direccionamento celular num veículo adequado, tal como água-estéril-para-injecção, aumenta a eficiência de transfecção em relação à obtida apenas com o vector virai. Uma mistura simples de vector virai e transferrina, por exemplo, aumenta a transfecção de células, e. g., células de cancro humanas, expressando o receptor da transferrina. A utilização de transferrina é especialmente vantajosa em ligação com transferência génica para, ou terapia génica para, uma vasta variedade de cancros humanos. Uma vasta variedade de células de cancro humanas contêm receptores de transferrina. A presença de transferrina nos complexos e vectores da presente invenção permite aos vectores virais que se direccionem eficientemente e especificamente para essas células de cancro.

Outros ligandos, tais como proteínas, péptidos, hormonas, anticorpos e fragmentos de anticorpo serão úteis para direccionar especificamente os vectores virais para as células que contêm receptores para esses ligandos ou que podem internalizar o ligando através de endocitose mediada pelo receptor. 0 ligando, por exemplo, pode ser uma proteína nativa ou recombinante que funciona para aumentar a ligação do vector virai à célula alvo. Exemplos de ligandos incluem insulina, 15 outras proteínas toxinas, EGF, VEGF, FGF, IGF, heregulina, virais ou bacterianas, estrogénio e progesterona.

Os ligandos de direccionamento celular, de acordo com a presente invenção, são transferrina, um anticorpo de receptor de transferrina, um fragmento de um anticorpo de receptor de transferrina, EGF ou VEGF.

Embora a descrição contemple a utilização de um ligando de direccionamento celular que ocorre naturalmente em um tipo de vírus quando este ligando é misturado com um segundo tipo de vírus, a descrição não contempla a utilização de um ligando de direccionamento celular na sua associação que ocorre naturalmente com o vírus que o codifica. A descrição contempla a mistura de um ligando de direccionamento celular codificado por um vírus em associação com o tipo de vírus que codifica o referido ligando quando o ligando está presente numa quantidade superior à que se encontra normalmente em associação com o vírus que ocorre naturalmente. 0 método através do qual se forma um complexo entre o ligando e a partícula virai é tal que um grande número de moléculas de ligando revestem a superfície da partícula virai e aumentam a sua estabilidade à medida que passa através da corrente sanguínea. Além disso, o número elevado de moléculas de ligando na superfície pode também servir para diminuir a imunogenicidade do vírus através do bloqueamento de antigénios virais. A invenção inclui a utilização de vírus de expressão recombinante. Os vectores virais, tais como adenovírus recombinantes, vectores AAV (Pat. U.S. N2 5139941), 16 u.s. retrovectores virais, vírus de herpes simplex (Pat. N2 5288641), citomegalovírus (CMV), vírus vaccinia, vírus da varíola aviária (FPV), vírus da varíola de canários (CPV) (Pat. U.S. N2 5833975; 5762938; e 5378457), vírus Sindbis, vírus quiméricos ou híbridos e semelhantes podem ser utilizados de acordo com a invenção. Também podem ser utilizados vírus competentes para a replicação ou oncolíticos de acordo com a invenção. A invenção também proporciona métodos para preparar uma mistura de vector viral-transferrina que evita, vantajosamente, os produtos químicos severos e passos de processamento complicados que foram descritos em ligação com métodos previamente utilizados, utilizando MAb, ligandos, polilisina, etc., para ligar a transferrina aos vectores virais.

De acordo com a invenção, as misturas ligando-viral podem ser preparadas em qualquer transportador ou veículo (tipicamente um veículo aquoso) de modo a proporcionar uma composição que é farmaceuticamente adequada para administração in vitro ou in vivo. A composição irá tipicamente ser tamponada com um pH adequado e pode conter componentes auxiliares adequados, tais como agentes de ajuste de osmolaridade, antibióticos, etc.

As quantidades de partículas virais utilizadas nas misturas e, em último caso, administradas ao animal hospedeiro (ou administrados às células in vitro) serão determinadas pelos especialistas com base em princípios de transferência génica e terapia génica bem conhecidos, descritos na literatura científica. As misturas da invenção são administradas através de métodos análogos aqueles previamente descritos para a administração de vectores virais de modo a realizar 17 transferência génica in vitro ou in vivo ou terapia génica. A invenção melhora com a tecnologia existente para proporcionar composições e métodos para a administração sistémica de vectores virais. A administração parentérica (especialmente administração intravenosa ou intra-arterial) das misturas é preferida.

Antecipa-se que, em alguns casos, doses substancialmente inferiores (por exemplo, 30 vezes) de partículas virais podem ser administradas devido à eficiência melhorada trazida pela invenção. Alternativamente, noutros casos, as doses conhecidas podem ser utilizadas, resultando num aumento de transferência genética. Concentrações de partículas virais, ligando e agentes auxiliares dentro das composições da invenção também serão adequadamente seleccionadas.

Formas de realização específicas da invenção proporcionam a utilização das composições da invenção em conjunção com tratamento de radiação e/ou quimioterapia. A invenção não está limitada a qualquer vector virai particular ou a qualquer via particular ou modo de administração das composições de mistura ligando-viral. A dose total desejada pode ser determinada experimentalmente e pode ser proporcionada a um doente em necessidade de terapia génica numa administração única ou múltipla(s).

Os dados apresentados nos Exemplos indicam que os complexos Tf-adenovírus são capazes de produzir níveis de expressão génica notoriamente mais elevados em tumores do que os observados com vectores adenovirais não direccionados. O método de transferência génica aqui descrito baseia-se no método relativamente simples de produzir o vírus direccionado para Tf. O acoplamento é não covalente e não envolve reacções químicas 18 capazes de produzir produtos indesejáveis e talvez tóxicos e evita a conjugação de produtos químicos severos e passos de processamento complicados que foram descritos em ligação com métodos previamente utilizados, utilizando MAb, ligandos, polilisina, etc., para ligar Tf a vectores virais. Estas modificações químicas de vírus baixam inevitavelmente a infectividade do vírus e podem produzir agregados possivelmente demasiado grandes para penetrar as capilaridades tumorais. Embora os vectores de terapia génica virais injectados intratumoralmente incluindo vírus oncolíticos estejam em ensaios clínicos, não há vírus direccionados sem modificações covalentes presentemente em estudo clínico.

Embora se esteja a tornar evidente que a terapia génica apenas com o agente p53 não seja suficiente para eliminar completamente tumores a longo termo, a combinação presentemente descrita de adenovírus direccionados para Tf e radiação/quimioterapia convencional foi capaz de alcançar, não apenas inibição de crescimento, mas regressão tumoral, demonstrando um efeito sinergístico.

Os estudos in vivo aqui descritos demonstram que a combinação de terapia génica sistémica de Tf-Adp53 e radioterapia e/ou quimioterapia convencional é marcadamente mais eficaz do que qualquer um dos tratamentos isoladamente. Nas instalações clínicas, as doses de radiação de 65 até 75 Gy para o grosso do tumor e 45 até 50 Gy para a doença microscópica são normalmente empregues no tratamento de cancro da cabeça e do pescoço. Dados os efeitos colaterais adversos conhecidos associados com doses de radiação ou quimioterapia elevadas, a sensibilização de tumores de modo a permitir uma dose eficaz mais baixa do tratamento convencional seria de um benefício 19 clínico imenso. Além disso, no caso de radiação, a restauração sistémica da função de wtp53, resulta numa diminuição na dose de tratamento de radiação que se descobriu ser eficaz, iria permitir posterior intervenção terapêutica para tumores que ocorreram de novo. A sensibilização de tumores à quimioterapia e radiação irá resultar em eficácia aumentada de modalidades de tratamento presentes. Além disso, o potencial também existe para este tratamento de combinação específico para o tumor para baixar a dose necessária de ambos os tipos de modalidades anticancro convencionais diminuindo, desse modo, os qraves efeitos colaterais frequentemente associados com estes tratamentos. Nos estudos in vivo descritos nos Exemplos, a administração sistémica de Tf-Adp53 em combinação com a radiação resultou em regressão de tumor total e a longo termo utilizando tão pouco como 3 x 108 pfu do vírus de direccionamento para o tumor. Esta dose é aproximadamente equivalente à empregue por Kataoka et al. (1998) utilizando Adp53 e 2-Me não direccionados. Neste estudo, foi observada uma inibição parcial do desenvolvimento tumoral (dois terços de redução na contagem de colónias no pulmão).

Embora este sistema possa eliminar com sucesso a necessidade de injecção intratumoral de vectores de terapia génica, no caso de cancros muito agressivos pode ser também benéfico utilizar ambos os tratamentos sistémicos e intratumorais. Este sistema também pode ser adaptado para assistir na transferência de outros tratamentos de cancro virai. Por exemplo, os presentes ensaios de vírus oncolíticos de Onyx não suportam transferência sistémica. ONYX-015 é um adenovírus geneticamente modificado que replica eficientemente e mata células tumorais deficientes na actividade de supressor tumoral de wtp53 (células "deficientes 20 para p53") e não em células normais. A modificação especifica do virus previne-o de replicar eficientemente em células normais. Os estudos clínicos com ONYX-015 estão presentemente a decorrer para o cancro da cabeça e do pescoço, cancro pancreático e carcinoma ovárico (Heise et al., 1997; Hall et ai., 1998; Linke, 1998; Kirn et al., 1998). A nossa capacidade para direccionar os vírus para tumores pode melhorar significativamente a eficácia de outros tratamentos de cancro com base virai, tais como ONYX-015.

Mais significativamente, a administração sistémica significa que, tanto o tumor primário como as metástases distantes, podem ser alcançados com genes terapêuticos. Isto está em forte contraste com aquele que pode ser alcançado com injecção intratumoral. 0 método aqui descrito é adaptável ao direccionamento de qualquer vírus recombinante existente. É também independente do gene a ser transferido. Adicionalmente, este sistema pode, como mencionado acima, também ser utilizado com vírus oncolíticos. A utilização de Tf para direccionamento é especialmente atractiva em ligação com terapia génica de p53 para cancros humanos em que um largo espectro de cancros expressa níveis elevados de TfR e em mais de 50% dos cancros, o gene p53 foi implicado. Por isso, estas constatações demonstram o potencial clínico deste sistema de transferência adenoviral direccionada para Tf como uma forma nova, mais eficiente e eficaz de terapia génica para o cancro, uma que irá auxiliar a cumprir a promessa inicial de terapia génica na luta contra esta doença.

Formas de realização específicas, ilustrativas da presente invenção, são proporcionadas nos Exemplos seguintes. 21

Exemplo 1 A transferrina aumenta a eficiência de transdução adenoviral A. Preparação de Mistura de Transferrina-Adenovírus

Holo-transferrina (Tf, saturado com ferro, Sigma) foi dissolvido em água estéril a 5 mg/mL. Neste estudo foi utilizada a replicação deficiente do adenovirus serotipo 5, designado Ad5LacZ (Ad5CMVntbeta-gal, Gene Transfer Vector Core, University of Iowa) , contendo o gene LacZ de E. coli, sob o controlo do promotor CMV, a uma concentração de 1,1 x 1012 partículas (pt) /mL (que continha 5,5 x 109 unidades de formação de placas, pfu/mL) em PBS mais sacarose a 3%. A Tf foi primeiro diluída para 0,5 mg/mL em tampão HEPES a 10 mM, pH 7,4, depois foi adicionado Tf a 50 pL de tampão HEPES numa diluição em série de 10 vezes. Foi depois adicionado Ad5LacZ aos tubos, de modo a que as proporções de Tf para vírus variaram desde 1 x 102 até 1 x 106 moléculas de Tf/virião. Os tubos foram incubados à temperatura ambiente, durante 10-15 minutos, com agitação (rodando os tubos de dois em dois minutos) e, depois, foi adicionado 150 pL de EMEM sem soro a cada tubo. B. Transdução in vitro utilizando mistura de adenovírus/Tf

As Requerentes empregaram um adenovirus de serotipo 5 deficiente para replicação denominado AdLacZ (contendo o gene LacZ de E. coli sob o controlo do promotor de CMV) e a forma deste vírus modificada em Tf (Tf-AdLacZ). Para optimizar a capacidade de Tf-AdLacZ para transferir o gene repórter, as culturas da linha celular JSQ-3 (Weichselbaum et al.r 1988), 22 derivada de um carcinoma de célula escamosa humano da cabeça e do pescoço (SCCHN), foram infectadas (Bischoff et al., 1996) com

AdLacZ ou com Tf-AdLacZ produzido utilizando diferentes proporções de Tf para virus e partículas virais para a célula.

Foram plaqueadas 5 x 104 JSQ-3 células/poço numa placa de 24 poços. 24 horas mais tarde, as células foram lavadas uma vez com EMEM sem soro, foi adicionado 0,3 mL de EMEM sem soro ou antibióticos a cada poço. Os complexos AdõLacZ ou Tf-Ad5LacZ a diferentes proporções de transferrina para o vírus em 200 pL de EMEM foram adicionados em poços em duplicado. A proporção de vírus para células variou desde 20 até 2000 partículas virais/célula (pt/célula). Após 4 horas de incubação a 37 °C, a C02 a 5%, com agitação ocasional, foi adicionado às células 0,5 mL de EMEM com 20% soro. Após 2 dias em cultura, as células foram lavadas uma vez com PBS e lisadas em tampão de lise repórter a IX (Promega). Os lisados celulares foram tratados com 100 pL de 0-nitrofenil-3-galactopiranósido a 150 pM, em Tris a 20 mM (pH 7,5) contendo MgCl2 a 1 mM e β-mercaptoetanol a 450 pM a 37 °C durante 30 minutos. A reacção foi parada através da adição de 150 pL/poço de Na2C03 a 1 Μ. A absorvência foi medida a 405 nm. Foi utilizada β-galactosidase purificada (Boehringer) para produzir uma curva padrão. Os resultados foram expressos como miliUnidades (mU) de equivalente de β-galactosidase por mg de proteína total. C. Coloração histoquímica

Para estudos histoquímicos de transdução de Tf-Ad5LacZ, foram transfectadas células 60% confluentes em placas de 24 poços, durante 5 horas, com soluções de transfecção como 23

descrito acima. Após 2 dias adicionais em cultura, as células foram fixadas e coradas com X-gal (Xu et al., 1997) . A eficiência de transfecção foi calculada como a percentagem de células coradas de azul. D. Resultados e Discussão A certas proporções de Tf para vírus ou de vírus para células, a expressão com Tf-AdLacZ era entre 3- a 4-vezes superior do que as observadas com o AdLacZ não direccionado (ver Figura 1). Numa dose virai de 500 pt/célula ou 2,5 MOÍ (multiplicidade de infecção ou pfu/célula), foi expresso 10 mU/mg de proteína de produto do gene repórter β-galactosidase por Ad5LacZ isoladamente. A transdução com a mistura transferrina-virus Tf-Ad5LacZ (500 moléculas de Tf/pt) produziu 25 mU/mg de proteína de expressão génica do repórter, Tf-Ad5LacZ (5000 moléculas de Tf/pt) produziu 30 mU/mg de expressão e Tf-Ad5LacZ (50000 moléculas Tf/pt) produziu 38,8 mU/mg de expressão, que representa 2,5, 3, e 3,8 vezes, respectivamente,

mais transdução do gene do que a obtida com Ad5LacZ isoladamente. A uma dose de 1000 pt/célula ou 5 MOI, Tf-Ad5LacZ (500 moléculas de Tf/pt) produziu 2,4 vezes mais expressão génica do repórter e Tf-Ad5LacZ (5000 moléculas de Tf/pt) produziu 3,3 vezes mais expressão génica do que Ad5LacZ isoladamente. Tf-Ad5LacZ (50000 moléculas de Tf/pt) produziu 2,6 vezes mais expressão, parecendo alcançar a saturação. Por isso, a proporção óptima do complexo Tf-Ad5LacZ pareceu ser de cerca de 500-50000 moléculas de Tf/pt, de um modo preferido, cerca de 5000 moléculas de Tf/pt. Pensa-se que o número elevado de moléculas de transferrina utilizados para revestir a superfície das partículas virais aumentou a sua estabilidade à medida que 24 viaja através da corrente sanguínea. 0 grande número de moléculas de transferrina na superfície do virião pode também servir para diminuir a imunogenicidade do vírus por bloqueamento da exposição ao antigénio virai. A coloração histoquímica demonstrou que o Ad5LacZ isoladamente produziu 20-30% de eficiência de transdução enquanto a transferrina complexou Tf-Ad5LacZ de adenovírus (5000 moléculas de Tf/pt) produziu 70-90% de eficiência.

Os resultados acima demonstraram que as misturas adenoviral-transferrina podem aumentar substancialmente a transdução do gene adenoviral.

Exemplo 2

Transferência génica Adenoviral Sistémica direccionada por Transferrina em Modelo de Xenoenxerto JSQ-3 de Murganhos Nude A. Preparação do complexo transferrina-adenovírus O complexo transferrina-Ad5LacZ foi preparado por meios semelhantes aos utilizados para a preparação descrita no Exemplo 1. Foi misturado 1 x 109 - 1 x 1010 pt de Ad5LacZ (lxlO12 pt/mL em PBS mais sacarose a 3%) foi misturado com diferentes quantidades de Tf (4 a 5 mg/mL em água) a proporções que variam desde 1 pg até 1 mg de Tf/lxlO10 pt, ou 7,5x102-7,5x105 moléculas de Tf/virião. As misturas foram incubadas à temperatura ambiente, durante 5-10 minutos, com agitação (rotação dos tubos uma vez a cada dois minutos) para permitir que o complexo 25

Tf-Ad5LacZ se forme. Foi adicionado PBS (pH 7,4) a cada tubo para diluir para Ixl09-lxl010 pt/0,2-0,3 mL/injecção de murganho.

Foram estabelecidos dois tipos de tumores humanos como xenoenxertos em murganhos nude por injecção subcutânea da linha celular SCCHN utilizada nas experiências de cultura acima (JSQ-3) ou a linha celular do cancro da próstata humano DU 145 (Isaacs et al., 1991; Asgari et al., 1997) . 0 modelo de tumor de murganho sem pêlo foi estabelecido por injecção subcutânea de células JSQ-3 ou células DU 145 num flanco de murganhos nude de fêmeas de 4-6 semanas de idade (Xu et al., 1997) . Os tumores foram deixados cultivar até um tamanho de 1-2 cm3. 1 x 109 - 1 x IO10 pt de Ad5LacZ complexadas com diferentes quantidades de Tf em 200-300 pL foram injectadas, em cada murganho, através da veia da cauda com uma seringa de 1 cc e uma agulha de 30 G. No grupo de controlo, foi injectado Ad5LacZ. Três dias após injecção, foram excisados os tumores assim como os órgãos do murganho, cortados em secções de 1 mm, lavados uma vez com PBS e fixados com formaldeído a 2%/glutaraldeído a 0,2% durante 4 horas à temperatura ambiente. As secções de tumor fixadas foram lavadas 4 vezes, cada durante 1 hora e coradas com solução X-Gal mais NP-40 a 0,1% (pH 8,5) a 37 °C durante a noite. As secções de tumor coradas foram embebidas e seccionadas utilizando processos histológicos normais e contracorados com vermelho rápido nuclear. Foram examinadas quatro secções por tumor para avaliar a expressão génica da β-galactosidase, como indicado pelas células coradas de azul.

Foi utilizada outra secção de tumor para ensaio quantitativo da β-galactosidase. Os tecidos foram homogeneizados e lisados em tampão de lise repórter a 1 X (Promega) . Os lisados foram adicionados a uma placa de 96 poços e foi realizado um ensaio 26 quantitativo da β-galactosidase como descrito no Exemplo 1. Em algumas experiências, o ensaio quantitativo da β-galactosidase foi também realizado utilizando um Luminescent β-galactosidase Detection Kit II (Clontech). B. Resultados e Discussão

Para testar a transferência génica sistémica, virai direccionada, foram injectados vectores virais i.v. em modelos de tumor sólido bem estabelecidos. Foram utilizados dois modelos de xenoenxerto de tumor sólido para testar o sistema de transferência génica virai direccionada. Foram injectadas i.v. 1 x IO10 pt AdóLacZ isoladamente ou complexadas com diferentes quantidades de Tf, em murganhos nude contendo xenoenxertos de tumor humano de 1-2 cm3 de tamanho de células JSQ-3 e DU145. Três dias mais tarde, os tumores injectados com Tf-Ad5LacZ apresentaram células azuis coradas com X-Gal aumentadas, em comparação com Ad5LacZ isoladamente (<1%) . A eficiência aumentou como resultado de proporções de Tf/pt, desde 5% até >35% (0,01 mg - 0,6 mg/1010 pt) . A eficiência começou a diminuir com proporções de Tf/pt de >0,6-1 mg/1010 pt (cerca de 4,5 até 6 x 105 moléculas de Tf por virião). Isto é apresentado nas Figuras 2A, 2C e 2E em que a percentagem de células que expressam β-galactosidase (como indicado por coloração X-gal) na verdade diminui à medida que as moléculas de Tf/virião aumentam de 2,9 x 105 de Tf/virião para 5,8 x 105 Tf/virião (Figuras 2C e 2E) . Além disso, numa proporção de 1,5 x 105 Tf/virião na expressão de β-galactosidase foi evidente no fígado (Figura 2B) ou outros órgãos incluindo baço e pulmão, enquanto que existia uma expressão mínima, mas claramente detectável, a expressão da β-galactosidase no fígado numa proporção de 2,9 x 105 moléculas 27 de Tf/virião (Figura 2D) . Em contraste, a injecção de Tf-AdLacZ produzida com proporções elevadas de Tf/virião - resultou numa coloração no fígado significativa (Figura 2F) . Por isso, com base nestas descobertas, a proporção das moléculas 1,5 x 105 de Tf/virião, que demonstraram eficiência de transfecção de tumor significativa, embora mantendo o grau mais elevado de especificidade do tumor foi determinada como sendo óptima para os estudos. As condições óptimas pareceram ser de cerca de 0,01-0,2 mg/1010 pt (7,5xl03-l, 5xl05 moléculas de Tf por virião) para JSQ-3 e cerca de 0,03-0,5 mg/1010 pt para DU 145. Por isso, as proporções de Tf/pt podem ser optimizadas in vivo em modelos tumorais diferentes. Deve ser salientado que as proporções de Tf/pt óptima in vitro são muito mais pequenas do que as in vivo, de modo a que possa ser necessária mais transferrina in vivo para estabilizar o virus para melhorar o direccionamento. A proporção de 0,2 mg Tf/1010 pt (1,5 x 105 moléculas de Tf por virião) foi utilizada em experiências subsequentes de terapia génica in vivo para os tumores JSQ-3.

Os ensaios de β-galactosidase quantitativos também confirmaram o aumento substancial de expressão génica em tumores de murganhos injectados i.v. com adenovirus de direccionamento de transferrina, em comparação com a dos adenovirus isoladamente. A transferência de virus direccionada para os órgãos foi também observada em fígados de murganhos com complexo Tf-Ad5LacZ injectado i.v., mas a distribuição para o fígado possui uma proporção de Tf/pt diferente preferida, e. g., cerca de 0,5 mg-1,3 mg de Tf/1010 pt (3,75xlOs-9,75xl05 moléculas de Tf por virião). Em Ad5LacZ isoladamente, os murganhos injectados i.v., apenas um número limitado de hepatócitos corados de azul 28 com (<l-5%), enquanto que os murqanhos injectados i.v. Tf-Ad5LacZ apresentaram um aumento de hepatócitos azuis (10%_40%) . A diferença de proporções preferidas de Tf/pt entre direccionamento ao tumor e direccionamento ao figado ilustra que os sistemas de transferência virais sistémicos de acordo com a presente invenção podem ser optimizados de modo a serem selectivos para diferentes alvos.

Exemplo 3

Transferência Génica Mediada por Adenovírus direccionado por Transferrina e Expressão da Proteína de p53 In vivo num Modelo de Murganho Nude de Xenoenxerto de DU 145

Foi examinada a capacidade do vector adenoviral de direccionamento de transferrina para transferir o gene p53 selectivamente a tumores. O adenovírus deficiente para replicação de serotipo 5, comportando o gene p53 humano normal foi utilizado nestes estudos. Este vírus, denominado Adp53, foi utilizado para produzir Tf-Adp53. Foi produzido Tf-Adp53 misturando Holo-Transferrina com Adp53 em HEPES a 10 mM, pH 7,4, a uma proporção de 1,5 x 105 moléculas de Tf/virião. Após incubação durante 10 minutos a 4 °C, foi adicionado soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS), pH 7,4, para perfazer o volume final em 300 pL/murganho e produzido para uma concentração final de dextrose a 5%. Três dias após injecção i.v. destes vírus em murganhos nude comportando tumores subcutâneos DU 145, os murganhos foram sacrificados, os tumores e os órgãos foram excisados e a análise da transferência de Western para a expressão da proteína p53 realizada (ver

Figura 3) . O anticorpo utilizado nestes estudos reage com ambas 29 as formas normal e mutada de p53 humano e faz reacção cruzada com p53 de murganho. A banda de p53 que representa p53 de tipo selvagem transduzido viralmente migra no gel acima da forma mutada de p53 que se encontra nas células DU145. Isto pode ser observado nas duas pistas da esquerda da Figura 3 nas quais as células DU145 são comparadas com células DU145 infectadas em cultura com Adp53. Uma banda superior, representando a wtp53 codificado viralmente, foi evidente nas células DU 145 infectadas in vitro com Adp53. Deve ser salientado que a primeira pista (DU145 + Adp53) contém apenas 2,5 pg de proteína, enquanto que todas as outras pistas da Figura 3 contêm 100 pg de proteína total. A análise de transferência de Western de tumores de murganhos que receberam o Adp53 direccionado (i. e., Tf-Adp53) revelou uma banda superior (p53 exógeno) e uma banda inferior (p53 endógena de DU 145) que se funde naquilo que parece ser uma banda larga única. É claro que existe significativamente mais p53 exógena nos tumores de murganhos que recebem Tf Adp53 do que os tumores dos murganhos tratados com o Adp53 não direccionado. O fígado e outros órgãos vitais dos murganhos tratados com o Tf-Adp53 direccionado apresentaram pouco ou nenhum wtp53 exógeno. Em contraste, o tratamento com Adp53 não direccionado, resultou num nível elevado de p53 exógeno no fígado. Como seria esperado, os tumores de murganhos não tratados continham apenas 0 p53 endógeno de DU 145 e os órgãos destes animais continham apenas p53 de murganho endógeno. Estes resultados confirmam ainda que o Tf-Adp53, e não o Adp53 não direccionado, pode direccionar selectivamente tumores alvo in vivo e que p53 é expresso eficientemente no tecido tumoral após administração 1 . v. . 30

Exemplo 4

Transferência génica Mediada por Adenovírus Sistémica Direccionada por Transferrina In vivo num Modelo de Murganho Nude de Xenoenxerto de SCCHN em Conjunção com Tratamento por Radiação 0 último teste da utilidade de um sistema de transferência de adenovírus direccionado em terapia génica é a sua eficácia no tratamento de tumores quando administrados sistemicamente. Foi estabelecido que a perda de p53 funcional pode contribuir para o fenótipo de resistência à radiação (Bristow et ai., 1996) . As Requerentes demonstraram previamente que a combinação de wtp53 e o tratamento de radiação convencional foi capaz de eliminar tumores de xenoenxerto estabelecidos a longo termo (Xu et al., 1999; Pirollo et al., 1997). Os resultados neste exemplo apresentam a capacidade de Tf-Adp53 para sensibilizar xenoenxertos de células tumorais humanas para a radioterapia.

Os xenoenxertos foram induzidos em murganhos nude atímicos fêmeas de 4-6 semanas de idade (NCr nu-nu) pela injecção subcutânea de 4 x 106 células JSQ-3 (em Matrigel™, uma matriz de

colagénio) no dorso inferior acima da cauda de cada animal. A linha de células JSQ-3 foi derivada de um SCCHN recorrente e é conhecida por ser altamente radiorresistente. Os tumores foram deixados desenvolver para um tamanho de 100-200 mm3. O adenovírus direccionado, designado Ad-p53 Direccionado, foi preparado misturando transferrina com adenovírus contendo ADN que codifica wt p53 como descrito no Exemplo 1. As partículas de adenovírus (pt) por unidade de formação de placa (pfu) foi calculada para esta experiência. Os animais foram divididos em quatro grupos: (i) Não tratados (-) Radiação; (ii) Não tratados Ad-p53 (+) 31

Radiação; (iii) Ad-p53 Direccionado (-) Radiação; (iv) Ad-p53 Direccionado (+) Radiação. Os murganhos (nos grupos ii, iii e iv) foram injectados i.v., através da veia da cauda, a cada três a quatro dias, com 1 x IO10 pt/murganho/injecção (equivalente a aproximadamente 3 x 108 pfu) de As-p53 quer direccionado (foi injectada uma mistura de Tf ligando e virus) ou Ad-p53 não direccionado (sem ligando). Foi administrado um total de 6 injecções. 0 dia após a injecção i.v. inicial, os animais (nos grupos ii e iv) foram segurados num suporte de chumbo, que permitiu apenas a . área tumoral a ser irradiada r e a primeira dose fraccionada de 2,0 Gy de radiação ionizante 137Cs administrada utilizando um irradiador J.L. Shepard and Associates Mark I . Posteriormente, os animais foram administrados com 2,0 Gy/dia durante 5 dias consecutivos, seguido por 2 dias sem tratamento de radiação. O ciclo foi repetido até um total de 30 Gy ter sido administrado. Os tamanhos do tumor foram medidos semanalmente de um modo cego.

Os animais não tratados e os que receberam Ad-p53 Direccionado sem radiação foram sacrificados devido à carga tumoral no dia 52 (ver Figura 4) . O tratamento com Ad-p53 Não Direccionado mais radiação retardou o crescimento tumoral durante o decurso do tratamento. Todavia, uma vez que o tratamento cessou, os tumores nestes animais começaram a aumentar em tamanho, de modo a que, pelo dia 121 eles também tinham sido sacrificados devido à carga tumoral. Em contraste, os tumores nos animais receberam Ad-p53 Direccionado por Tf em combinação com a radiação regrediu completamente, durante e mesmo após a finalização do tratamento, de modo a que mais de 8 meses pós tratamento não existia recorrência aos tumores nestes animais. 32

Estes resultados, juntamente com os da Figura 3, demonstram que os adenovírus direccionados para Tf administrados sistemicamente podem transferir wt-p53 selectivamente aos tumores resultando na sua sensibilização à radioterapia convencional. Mais importante, o tratamento combinatório de Tf-Adp53 mais a radiação resultou na erradicação de tumores a longo termo. Recentemente, Kataoka et al. (1998) descreveram que a combinação de 2-metoxiestradiol (2-Me) e transferência sistémica de Adp53 não direccionado num modelo de murganho utilizando células A549 inibe parcialmente o crescimento de tumor do pulmão metastático. Este tratamento de combinação resultou numa redução de dois terços em contagem de colónias no pulmão. Embora certamente promissor, as células tumorais permanecem após este tratamento vão muito certamente crescer e eventualmente matar o animal. Em contraste, os resultados das Requerentes com Adp53 direccionado para Tf produziram aparentemente regressão total, a longo termo (presentemente com exclusão de 8 meses) de tumores SCCHN subcutâneos.

Exemplo 5

Transferência génica Mediada por Adenovírus Direccionado por Transferrina In vivo num Modelo de Murganho Nude de Xenoenxerto SCCHN em Conjunção com Tratamento de Radiação

Foram induzidos xenoenxertos JSQ-3 em murganhos NCr nu-nu como no Exemplo 4. Os tumores foram deixados desenvolver até um tamanho de 50-60 mm3. Os adenovírus direccionados, com (Ad-p53 Direccionado) ou sem (Ad Direccionado) ADN codificando wt p53 humano, foi preparado misturando transferrina com adenovírus como descrito no Exemplo 1. Foram calculadas as partículas de 33 adenovírus (pt) por unidade de formação de placas (pfu) . Os animais foram divididos em cinco grupos: (i) Não tratado (-) Radiação; (ii) Ad-p53 não Direccionado (+) Radiação; (iii) Ad Direccionado (+) Radiação; (iv) Ad-p53 Direccionado (-)

Radiação; (v) Ad-p53 Direccionado (+) Radiação. Os murganhos foram injectados i.v. através da veia da cauda, a cada três a quatro dias, com 3 x 109 pt /murganho/in jecção. Foi injectado um total de 5 injecções. Três dias após a injecção i.v. inicial, os animais foram seguros num suporte de chumbo, que permitiu apenas a área tumoral a ser irradiada e a primeira dose fraccionada de 2,0 Gy de radiação ionizante 137Cs foi administrada utilizando um irradiador J.L. Shepard e Associates Mark I. Posteriormente, os animais foram administrados com 2,0 Gy/dia durante 5 dias consecutivos, seguido por 2 dias sem tratamento de radiação. O ciclo foi repetido até ter sido administrado um total de 26 Gy. Os tamanhos tumorais foram medidos semanalmente de um modo cego. Como no Exemplo 4, os tumores nos animais não tratados e aqueles que receberam Ad-p53 Direccionado sem radiação demonstraram o crescimento contínuo, de modo a que, pelo dia 50 os animais foram sacrificados devido à carga tumoral. Os tumores no grupo tratado com radiação e sem wt p53 Direccionado por AD demonstraram alguma inibição de radiação mínima de crescimento durante o tratamento, mas os tumores aumentaram em volume assim que o tratamento foi terminado. Ocorreu um recrescimento semelhante mas ainda mais dramático pós-tratamento no grupo de animais que recebeu o p53 Direccionado por AD mas sem radiação. Isto está em acentuado contraste com os murganhos que receberam o p53 Direccionado por Ad em combinação com radiação. Como observado no Exemplo 4, a regressão tumoral continuou nesses animais mais do que oito meses após o final de todos os tratamentos. Oito meses na esperança de vida de um murganho é o equivalente a 30 anos na esperança de vida de um humano. 34

Exemplo 6

Transdução Génica Retroviral Direccionada por Transferrina

Os retrovectores virais são um dos vectores de terapia génica mais vastamente utilizados em ensaios clínicos. Como com vectores adenovirais, os retrovectores virais apresentam baixa especificidade e imunogenicidade significativa.

Foi empregue neste estudo retrovírus deficientes para a replicação contendo o gene LacZ de E. coli, RvLacZ (Vector de Transferência Génica de um Lac Z, Universidade de Iowa), a 1 x IO10 partículas (pt)/mL contendo 3 x 107 unidades de transformação (TU)/mL. Foi preparado Transferrina e o complexo de Tf-RvLacZ de um modo semelhante ao descrito no Exemplo 1. Resumidamente, a Tf foi primeiro diluída para 0,5 mg/mL em tampão HEPES a 10 mM, pH 7,4, quando foram adicionadas diferentes quantidades de Tf a tampão HEPES a 50 μΜ numa diluição em série. Foi então adicionado RvLacZ aos tubos de modo a que as proporções de Tf para vírus variassem desde 1 x 102 até 1 x 106 moléculas de Tf/virião. Os tubos foram incubados à temperatura ambiente durante 10-15 minutos com agitação a cada dois minutos, depois foi adicionado 150 pL de EMEM sem soro a cada tubo. Foi realizada a transdução retroviral in vitro como descrito no Exemplo 1. A proporção de vírus para células variou desde 100 até 2000 pt virais/célula. A uma dose virai de 500 pt/célula ou 1,5 MOI (ou TU/célula), 3,4 mU/mg de proteína de β-galactosidase foi expressa pelo retrovírus RvLacZ isoladamente. Com vírus complexado com transferrina, a administração de Tf-RvLacZ (500 moléculas de Tf/pt) produziu 6, 8 mU/mg de 35 proteína de expressão de β-galactosidase, enquanto que a administração de Tf-RvLacZ (5000 moléculas de Tf/pt) produziu 9 mU/mg de expressão, que representa transdução génica 2- e 3- vezes superior à produzida através da administração de RvLacZ isoladamente. O aumento da transdução génica estabilizou a uma proporção de 50000 moléculas de Tf/pt. A uma dose de 1000 pt/célula ou 3 MOI, Tf-RvLacZ (5000 moléculas de Tf/pt) produziu 2,1-vezes mais expressão génica repórter e Tf-RvLacZ (50000 moléculas de Tf/pt) produziu 3 vezes mais expressão do que RvLacZ isoladamente. A coloração histoquimica demonstrou que RvLacZ, isoladamente, tinha uma eficiência de transdução de 20-30% enquanto que o retrovirus Tf-RvLacZ complexado com transferrina (5000 moléculas de Tf/pt) tinha uma eficiência de transdução de 60-80%. Os resultados demonstraram que a administração de uma mistura de transferrina e retrovirus pode aumentar substancialmente a transdução génica retroviral.

Exemplo 7

Transferência génica Mediada por Adenovírus Direccionada por Transferrina In vivo num Modelo de Murganho Singeneico em Conjunção com Quimioterapia

Foi examinada a capacidade do sistema de distribuição de p53 virai direccionado para o ligando, para sensibilizar as células tumorais à quimioterapia num modelo animal imune competente. O modelo escolhido para estes estudos foi o modelo de metástases de pulmão do melanoma de murganho BI 6. Em experiências múltiplas, as células B16 foram injectadas, através da veia da cauda em murganhos imuno-competentes C57/BL/6. Neste modelo, as colónias tumorais no pulmão são facilmente visíveis no espaço de 36 duas a três semanas, devido à expressão de melanina pelas células tumorais. Quatro dias após a injecção das células B16, o tratamento com a combinação de Adp53, Tf-Adp53 e/ou cisplatina (CDDP) começou. Foram administradas 1 x IO10 pt virais/murganho/injecção (equivalente a 3 x 108 pfu), a uma proporção de 1,5 x 105 moléculas de Tf/virião, sistemicamente através de uma injecção i.v. na veia da cauda, três vezes por semana, para um total de 12-13 tratamentos virais. Foi administrado CDDP intraperitoneal (3-5 mg/kg), a cada 2-4 dias com um total de 8-13 doses de CDDP administradas. Um dia após todos os tratamentos (cinco semanas após a injecção de células B16 inicial), os pulmões foram excisados dos animais e perfundidos com formaldeido a 10%.

Como apresentado nas Figuras 5A-H, existe uma diferença dramática nos pulmões obtidos a partir dos animais que receberam o tratamento de combinação e aqueles dos outros grupos em duas experiências separadas. Embora a CDDP isoladamente e a Tf-Adp53 isoladamente tenham demonstrado algum efeito em comparação com os pulmões dos animais não tratados, um número significativo de colónias tumorais ainda são evidentes. De um modo semelhante, os pulmões dos animais tratados com o vírus controlo de Tf-AdLacZ mais CDDP evidencia o que é apenas um efeito do fármaco. Mais significativamente, os animais que receberam a Adp53 não direccionada juntamente com CDDP também presente com múltiplas colónias de tumor grandes indicando um efeito mínimo de Adp53 não direccionado quando transferido sistemicamente. Em contraste, todavia, os pulmões dos animais que receberam p53 adenoviral direccionado por transferrina (Tf-Adp53), em combinação com CDDP, são virtualmente isentos de metástases tumorais óbvias. Estas descobertas demonstram que o Adp53 dirigido a Tf transferido sistemicamente, pode sensibilizar as 37 células tumorais para quimioterapia convencional em adição à radioterapia convencional. Além disso, o Tf-Adp53 pode também funcionar eficazmente num modelo de murganho singeneico adicionalmente aos modelos de murganho sem pêlo utilizados previamente. A molécula Tf empregue em todas as experiências das

Requerentes é Tf humana. É conhecido que a TfR de uma dada espécie pode ligar a Tf de uma variedade de outras espécies (Aisen, 1998). Contudo, as Requerentes estavam inicialmente preocupadas que a selectividade observada com tumores humanos em murganhos nude pudesse ser atribuível à Tf humana que estava a ser utilizada sendo reconhecida pelo tumor TfR em preferência com a TfR de murganho nos tecidos normais do hospedeiro. 0 sistema de modelo singeneico envolvendo células de melanoma de murganho B16 que cresceram em murganhos C57/BL/6 é tranquilizador a este respeito. Neste modelo, a TfR no tumor e a TfR nos tecidos normais são ambas TfR de murganho. Não obstante, as Requerentes são capazes de demonstrar que o adenovirus complexado com Tf humana incorporam os tumores que possuem níveis elevados de TfR de murganho. Esta verificação sugere que é o nível de expressão de TfR mais do que um fenómeno relacionado com a espécie que é responsável pelo direccionamento aos tumores de xenoenxerto humanos nos modelos de murganho nude descritos acima e reforça a probabilidade de se poder alcançar o objectivo último de tratar tumores humanos que se desenvolvem em humanos. 38

Exemplo 8

Transdução de Vírus de Herpes Simplex Direccionado por Transferrina 0 vírus herpes simplex (HSV) é um vector virai competente para a replicação, largamente utilizado em terapia génica, especialmente no sistema nervoso central (Walker, 1999) . Tal como com vectores adenovirais ou retrovirais, o HSV apresenta especificidade fraca e imunogenicidade significativa.

Para explorar a viabilidade da utilização da estratégia de direccionamento de transferrina para direccionar os vectores virais competentes para a replicação, G207, o HSV com um gene repórter LacZ (Walker, 1999), foi complexado com transferrina humana. G207 (1,1 x 109 pfu/mL, NeuroVir, Inc., in PBS) foi misturado com holo-transferrina humana (Sigma, 5 mg/mL em água) a diferentes proporções do mesmo modo que para o Tf-AdLacZ, como descrito no Exemplo 1. Num conjunto de experiências, os HSV foi aquecido por incubação a 37 °C durante 10 minutos, antes de misturar com Tf. O tratamento com calor foi relatado como podendo inactivar o HSV.

Para experiências de transdução, foram plaqueadas 8 x 104 células JSQ-3/poço numa placa de 24 poços. As células foram lavadas 24 horas mais tarde uma vez com EMEM sem soro, depois foi adicionado 0,3 mL de EMEM sem soro ou antibióticos a cada poço. O HSV ou complexos Tf-HSV a diferentes proporções de transferrina para vírus em 200 pL de EMEM foram adicionados aos poços, a uma MOI=l. Após 4 horas de incubação a 37 °C, C02 a 5%, com mistura rodando o tubo de ensaio a cada 2 minutos, foi adicionado 0,5 mL de EMEM com 20% de soro aos poços. Após 2 dias 39 em cultura, as células foram lavadas uma vez com PBS e Usadas em tampão de lise de repórter a IX (Promega). Os lisados celulares foram tratados com 100 pL de 0-nitrofenil-β-galactopiranósido a 150 μΜ em Tris a 20 mM (pH 7,5) contendo MgCl2 a 1 mM e β-mercaptoetanol a 450 mM a 37 °C durante 30 minutos. A reacção foi parada pela adição de 150 pL/poço de Na2C03 a 1 Μ. A absorvência foi medida a 405 nm. Foi utilizada β-galactosidase purificada (Boehringer) para produzir uma curva padrão. Os resultados foram expressos como miliUnidades (mU) de β-galactosidase equivalente por mg de proteina total. Os resultados são apresentados na Tabela 1.

Tabela 1

A Transferrina Aumenta a Eficiência de Transdução de HSV

Tf/virião 0 500 1500 5000 15000 50000 Não tratado1 318 448 463 483 405 675 Tratado com calor1 286 410 436 455 386 640 40 1

Actividade de β-galactosidase, mU/mg de proteina A Transferrina aumenta a eficiência de transdução de HSV, um vector virai competente para a replicação. Quando o HSV foi inactivado pelo calor, a formação de complexos com Tf ainda apresentou eficiência de transdução aumentada. A uma proporção de Tf/virião de 50000 e uma M0I=1, o Tf-HSV produziu mais do que duas vezes mais expressão génica repórter do que o fez HSV sem direccionamento de Tf. Os resultados demonstram que a estratégia de direccionamento de transferrina pode ser utilizada para replicação de vectores virais competentes, tais como HSV.

Exemplo 9

Transferência génica Mediada por Adenovirus Sistémica Direccionada por Transferrina In vivo num Modelo de Murganhos nude no Xenoenxerto MDA-MB-435 em Conjunção com o Agente

Quimioterapêutico Docetaxel (Taxotere)

Para ilustrar ainda mais a utilidade deste sistema de transferência adenoviral direccionado, foi empregue um segundo modelo tumoral, a linha celular derivada do cancro da mama humano MDA-MB-435. Adicionalmente, uma vez gue a guimioterapia é, frequentemente, o tratamento de escolha para cancro da mama, esta experiência testou a capacidade do sistema de transferência desta invenção para sensibilizar tumores de xenoenxerto de cancro da mama humano estabelecidos ao quimioagente utilizado mais normalmente, docetaxel (Taxotere). Os xenoenxertos foram induzidos em murganhos nude atimicos fêmeas de 4-6 semanas de idade (NCr nu-nu) por injecção subcutânea de 2,5 x 106 células MDA-MB-435 na almofada de gordura mamária de cada animal. Os tumores foram deixados a desenvolver até um tamanho de 40-50 mm3. O adenovirus direccionado, designado Tf Adp53, foi preparado misturando a transferrina com adenovirus contendo ADN que codifica wt p53 como descrito no Exemplo 1. Os animais foram divididos em cinco grupos: (i) Não tratado (-) Taxotere; (ii) Taxotere isoladamente, (iii) Adp53 Não direccionado (+) Taxotere; (iv) Adp53 direcccionado (-) Taxotere; (v) Adp53 direccionado (+) Taxotere. Os murganhos foram injectados i.v., através da veia da cauda, a cada três ou quatro dias com 5 x IO10 pt/murganho/injecção de Adp53 quer tratado (foi injectada uma mistura de ligando Tf e virus) ou Adp53 não direccionado (sem ligando) . Foi administrado um total de 12 injecções. No dia após a injecção virai inicial, o tratamento 41 com o fármaco foi iniciado. Os animais foram administrados com Taxotere i.v. a uma dose de 7,5 mg/kg a cada três ou quatro dias, para um total de 11 injecções. Os tamanhos do tumor foram medidos semanalmente de um modo cego, num total de 6-8 tumores/grupo. A média dos volumes do tumor por grupo (mm3) ± Desvio Padrão vs. Tempo (Dias) foi representada graficamente (Figura 6) . Embora o tratamento com o Tf Adp53 isoladamente não tivesse tido efeito, o tratamento com Taxotere isoladamente ou o Adp53 não direccionado mais Taxotere induziu alguma inibição de crescimento indicando um efeito do fármaco. Contudo, havia um nivel de inibição de crescimento ainda mais dramático observado nos tumores dos animais que receberam Ad-p53 direccionado com Tf em combinação com taxotere. Estas verificações demonstram o efeito sinergistico do tratamento de combinação e demonstram não apenas que o complexo Adp53 direccionado por transferrina da invenção é eficaz em múltiplos modelos de tumor humanos, mas que também pode ser utilizado para sensibilizar tumores para agentes quimioterapêuticos.

Exemplo 10

Expressão génica Mediada por Adenovírus Direccionada por Transferrina In Vivo num Modelo de Murganho Nude de Xenoenxerto DU145

Uma linha celular derivada do cancro da próstata, DU 145, demonstrou expressão melhorada em injecções intratumorais. O adenovírus de serotipo 5 deficiente para replicação, que comporta o gene LacZ, foi utilizado neste exemplo. Os murganhos nude atímicos (nu/nu) foram injectados subcutaneamente utilizando Matrigel™ para produzir tumores. Foi preparado 42

Tf-Ad-LacZ como no Exemplo 1. A proporção de Tf/pt foi de 0,1-0,2 mg/1010 pt como descrito no Exemplo 2. Os murganhos tinham 2 tumores cada, mas apenas um foi injectado.

Vinte e quatro horas após a injecção intratumoral de 3 x IO10 particulas/tumor, os tumores foram excisados, cortados em pedaços, congelados rapidamente em azoto liquido e foram pulverizados num pulverizador de tecido Bessman. A actividade enzimática da β-Galactosidase foi medida utilizando o sistema de ensaio quimioluminescente da β-Galactosidase Glacto-Star™ de Tropix, Inc., de acordo com o protocolo do fabricante. Os resultados são apresentados na Figura 7. Tf-Ad-LacZ produziu um aumento de mais de 3,4 vezes na expressão da β-galactosidase em comparação com Ad-LacZ. Os resultados demonstram que a estratégia de direccionamento por transferrina pode ser utilizado para aumentar a expressão em injecções intratumorais.

LISTA DE REFERÊNCIAS

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Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. Patente U.S. 44

Patente U.S. N2 5693509

Patente U.S. N2 5762938 Patente U.S. N2 5833975 document o WO 92/06180 document o WO 98/40508

Lisboa, 11 de Novembro de 2010 45

Claims (46)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Complexo ligando-vírus de direccionamento celular para transferência de um vírus a uma célula alvo num animal hospedeiro, em que o referido complexo ligando-vírus consiste num ligando e um vírus, e em que o ligando não está ligado covalentemente ao vírus, e é transferrina, um receptor de anticorpo de transferrina, um fragmento de um anticorpo de receptor de transferrina, EGF ou VEGF.
2. 2. Complexo ligando-vírus de direccionamento celular de acordo com a reivindicação 1, em que o referido vírus e o referido ligando não estão naturalmente associados um com o outro.
3. 3. Complexo ligando-vírus de direccionamento celular de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o referido vírus é compreendido por um ácido nucleico terapêutico.
4. 4. Complexo ligando-vírus de direccionamento celular de acordo com a reivindicação 3, em que o referido ácido nucleico terapêutico codifica um péptido ou proteína terapêuticos.
5. 5. Complexo ligando-vírus de direccionamento celular de acordo com a reivindicação 4, em que o referido ácido nucleico terapêutico codifica p53 de tipo selvagem.
6. 6. Complexo ligando-vírus de direccionamento celular de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido vírus é um retrovírus ou um adenovírus. 1
7. 7. Complexo ligando-vírus de direccionamento celular de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 5, em que o referido vírus é seleccionado do grupo consistindo em vírus adeno-associados, vírus herpes simplex, citomegalovírus, vírus vaccinia, vírus da varíola aviária, vírus da varíola de canários e vírus Sindbis.
8. 8. Complexo ligando-vírus de direccionamento celular de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido vírus é um vírus quimérico, um vírus híbrido ou um vírus recombinante.
9. 9. Complexo ligando-vírus de direccionamento celular de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido ligando de direccionamento celular é uma proteína nativa ou uma proteína recombinante.
10. 10. Complexo ligando-vírus de direccionamento celular de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido ligando de direccionamento celular e o referido vírus estão presentes numa proporção no intervalo desde 100 até 1000000 de moléculas de ligando por virião.
11. 11. Complexo ligando-vírus de direccionamento celular de acordo com a reivindicação 10, em que o referido ligando de direccionamento celular e o referido vírus estão presentes numa proporção no intervalo de 6700 até 400000 moléculas de ligando por virião.
12. 12. Complexo ligando-vírus de direccionamento celular de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido ligando de direccionamento celular e o referido 2 vírus estão presentes numa proporção no intervalo desde 1 pg até 10 mg do referido ligando por IO10 viriões.
13. 13. Complexo ligando-vírus de direccionamento celular de acordo com a reivindicação 12, em que o referido ligando de direccionamento celular e o referido virus estão presentes numa proporção no intervalo desde 10 pg até 600 pg do referido ligando por IO10 viriões.
14. 14. Vector para a transferência sistémica de um vírus a uma célula alvo, compreendendo, o referido vector, um ligando de direccionamento celular não ligado covalentemente ao referido vírus, em que o referido vector se pode preparar misturando uma composição consistindo num ligando de direccionamento celular com um vírus num meio aquoso e em que o referido ligando consiste em transferrina, um anticorpo de receptor de transferrina, um fragmento de um anticorpo de receptor de transferrina, EGF ou VEGF.
15. 15. Vector de acordo com a reivindicação 14, em que o referido vírus e o referido ligando não estão associados naturalmente um com o outro.
16. 16. Vector de acordo com a reivindicação 14 ou reivindicação 15, em que o referido vírus é compreendido por um ácido nucleico terapêutico.
17. 17. Vector de acordo com a reivindicação 16, em que o referido ácido nucleico terapêutico codifica um péptido ou proteína terapêuticos. 3
18. 18. Vector de acordo com a reivindicação 17, em que o referido ácido nucleico terapêutico codifica p53 de tipo selvagem.
19. 19. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 até 18, em que o referido virus é um retrovirus ou um adenovirus.
20. 20. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 até 18, em que o referido virus é seleccionado do grupo consistindo em virus adenoassociado, virus herpes simplex, citomegalovirus, virus vaccinia, virus da varíola aviária, vírus da varíola de canários e vírus Sindbis.
21. 21. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 até 20, em que o referido vírus é um vírus quimérico, um vírus híbrido ou um vírus recombinante.
22. 22. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 até 21, em que o referido ligando de direccionamento celular é uma proteína nativa ou uma proteína recombinante.
23. 23. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 até 22, em que o referido ligando de direccionamento celular e o referido vírus estão presentes numa proporção no intervalo desde 100 até 1000000 moléculas de ligando por virião.
24. 24. Vector de acordo com a reivindicação 23, em que o referido ligando de direccionamento celular e o referido vírus estão presentes numa proporção no intervalo desde 6700 até 400000 moléculas de ligando por virião. 4
25. 25. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 até 24, em que o referido ligando de direccionamento celular e o referido virus estão presentes numa proporção no intervalo desde 1 pg até 10 mg do referido ligando por IO10 viriões.
26. 26. Vector de acordo com a reivindicação 25, em que o referido ligando de direccionamento celular e o referido virus estão presentes numa proporção no intervalo desde 10 pg até 600 pg do referido ligando por IO10 viriões.
27. 27. Método para preparar um vector para a transferência sistémica de um virus a uma célula alvo, compreendendo, o referido vector, um ligando de direccionamento celular ligado não covalentemente ao referido virus, compreendendo misturar uma composição consistindo no referido ligando de direccionamento celular com o referido virus num meio aquoso, através do qual o referido ligando se liga não covalentemente ao referido virus, em que o referido ligando consiste em transferrina, a anticorpo de receptor de transferrina, um fragmento de um anticorpo de receptor de transferrina, EGF ou VEGF.
28. 28. Método da reivindicação 27, em que a referida solução aquosa inclui um ou mais de um agente tamponante, um agente de ajuste de osmolaridade ou um antibiótico.
29. 29. Complexo ligando-virus de direccionamento celular de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 13, para utilização como um medicamento.
30. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 até 28, para utilização como um medicamento. 5 30.
31. 31. Utilização de um virus para o fabrico de um agente terapêutico compreendendo um vector que compreende um complexo ligando-virus para direccionamento celular, para transferir o referido virus a uma célula alvo num animal, em que o referido complexo ligando-virus consiste num ligando e um virus, e em que o ligando está ligado não covalentemente ao virus, e é transferrina, um anticorpo de receptor de transferrina, um fragmento de um anticorpo de receptor de transferrina, EGF ou VEGF.
32. 32. Utilização de acordo com a reivindicação 31, em que o referido animal é um humano.
33. 33. Utilização de acordo com a reivindicação 31 ou reivindicação 32, em que o referido agente terapêutico é administrado sistemicamente.
34. 34. Utilização de acordo com a reivindicação 31 ou reivindicação 32, em que o referido agente terapêutico é administrado parentericamente.
35. 35. Utilização de acordo com a reivindicação 31 ou reivindicação 32, em que o referido agente terapêutico é administrado intravenosamente ou intra-arterialmente.
36. 36. Utilização de acordo com a reivindicação 31 ou reivindicação 32, em que o referido agente terapêutico é administrado intratumoralmente.
37. 37. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 até 36, em que o referido vector codifica p53 de tipo selvagem. 6
38. 38. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 até 37, em que o referido agente terapêutico é administrado a um animal que recebe quimioterapia adicionalmente ao referido agente terapêutico.
39. 39. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 até 37, em que o referido agente terapêutico é administrado a um animal que recebe tratamento de radiação adicionalmente ao referido agente terapêutico.
40. 40. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 até 39, em que o referido animal possui cancro da cabeça e pescoço, bexiga, mama, tiróide, ovário, cérebro, próstata, um melanoma ou um linfoma.
41. 41. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 até 33 e reivindicações 37 até 40, em que o referido vírus é compreendido por um ácido nucleico que codifica p53 de tipo selvagem, além disso em que o referido ligando de direccionamento celular é transferrina e, ainda, em que o referido agente terapêutico é administrado sistemicamente.
42. 42. Utilização de acordo com a reivindicação 33 ou a reivindicação 36, em que a célula alvo é uma célula de cancro seleccionada de um cancro da cabeça e pescoço, cancro da bexiga, cancro da mama, cancro da tiróide, cancro dos ovários, cancro da próstata, melanoma e linfoma; e o vector consiste essencialmente no vírus e se liga directamente a um receptor que é sobreexpresso na célula cancerosa. 7
43. 43. Utilização de acordo com a reivindicação 42, em que o virus sensibiliza a célula cancerosa para a radiação ou quimioterapia.
44. 44. Utilização de acordo com a reivindicação 43, em que o virus compreende um ácido nucleico de interesse, cuja expressão na célula cancerosa sensibiliza a célula cancerosa para a radiação ou quimioterapia.
45. 45. Utilização de acordo com a reivindicação 40, em que o virus compreende um ácido nucleico que, quando expresso em células cancerosas, sensibiliza a célula à radiação ou quimioterapia; o ligando liga-se directamente a um receptor na célula cancerosa; e o vector consiste essencialmente no virus e no ligando.
46. 46. Vector para utilização na transferência de um virus a uma célula alvo num animal, em que o vector compreende um complexo ligando-vírus de direccionamento celular, em que o referido complexo ligando-virus consiste num ligando e um virus, e em que o ligando está ligado não covalentemente ao virus, e é transferrina, um anticorpo de receptor de transferrina, um fragmento de um anticorpo de receptor de transferrina, EGF ou VEGF. Lisboa, 11 de Novembro de 2010