ES2233995T3 - Composiciones que contienen un detergente y un gen supresor de tumores, codificado por un vector adenovirico. - Google Patents
Composiciones que contienen un detergente y un gen supresor de tumores, codificado por un vector adenovirico.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO Y UNA COMPOSICION FARMACEUTICA PARA EL TRATAMIENTO DEL CANCER UTILIZANDO UN SISTEMA DE TRANSPORTE DE GENES, TAL COMO UN SISTEMA DE TRANSPORTE DE VECTOR VIRICO, QUE INCLUYE UN GEN TERAPEUTICO TAL COMO P53, O UN GEN SUPRESOR DEL TUMOR DE RETINOBLASTOMA, EN LOS CUALES EL SISTEMA DE TRANSPORTE DE GENES SE FORMULA EN UN TAMPON QUE INCLUYE UN AGENTE POTENCIADOR DEL TRANSPORTE TAL COMO ETANOL O UN DETERGENTE.
Description
Composiciones que contienen un detergente y un
gen supresor de tumores, codificado por un vector adenovírico.
La presente invención se refiere a composiciones
y métodos de tratamiento del cáncer con una terapia genética
empleando un gen terapéutico, por ejemplo un gen supresor de tumores
suministrado por un sistema de entrega de genes, por ejemplo un
sistema de entrega de vectores víricos recombinantes, formulado en
un tampón que contiene un agente que facilita la entrega. La
invención se refiere en particular a la entrega de un gen supresor
de tumores (p.ej. el p53 o el retinoblastoma (RB)) a los tejidos
epiteliales y a los órganos cancerosos, por ejemplo la vejiga,
empleando un sistema de entrega de vector adenovírico recombinante,
formulado en un tampón que contiene un agente que mejora o facilita
la entrega.
El cáncer de vejiga representa una fuente
significativa de morbilidad y de mortalidad. Dentro de la mortalidad
atribuible al cáncer, el cáncer de vejiga se sitúa en el 10º lugar
en los varones y en 12º lugar en las mujeres (Cancer Facts and
Figures, Amer. Can. Soc. 5, 11, 1995). Las terapias
disponibles para el tratamiento del cáncer de vejiga incluyen la
quimioterapia o inmunoterapia adyuvantes, la resección transuretral
de la enfermedad superficial, la cistectomía radical o la
radioterapia que se combina con frecuencia con la quimioterapia
sistémica. A pesar de estas opciones terapéuticas, la cuota global
de supervivencia no ha variado de forma apreciable (loc. cit.). Por
lo tanto, se tienen que desarrollar nuevas modalidades terapéuticas
para el tratamiento del cáncer de vejiga.
Las estrategias de terapia genética se han
desarrollado como estrategia terapéutica alternativa (ver por
ejemplo: Brewster y col., Eur. Urol. 25,
177-182, 1994; Takahashi y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88, 5257-5261, 1991; Rosenberg,
S.A., J. Clin. Oncol. 10, 180-199, 1992).
Se han desarrollado diversas estrategias para
tratar los neoplasmas, basadas en métodos de transferencia genética.
Se han desarrollado métodos para corregir lesiones específicas en
lugares genéticos definidos, que dan pie a la transformación y
progresión neoplásicas (Spandidos y col., Anticancer Res. 10,
1543-1554, 1990; Banerjee y col., Cancer Res.
52, 6297-6304, 1992). La sobreexpresión de
oncogenes dominantes puede dirigirse mediante técnicas para que
inhiba al gen transformante o al producto genético. La pérdida de la
función genética supresora de tumores puede abordarse empleando
métodos que reconstituyan la función genética supresora de tumores
de tipo salvaje (Goodrich y col., Cancer Res. 52,
1968-1973, 1992). Aparte de estos métodos para
lograr la compensación de la mutación se han desarrollado técnicas
genéticas para erradicar de forma específica y selectiva las células
tumorales. Estas estrategias de quimioterapia celular se basan en la
expresión específica de genes de toxina en células neoplásicas (Abe
y col., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 203,
354-359, 1993). Se han utilizado finalmente métodos
de transferencia genética para conseguir la inmunización
antitumoral. Estos métodos de inmunopotenciación genética aplican
técnicas de inmunorregulación genética para mejorar el
reconocimiento inmune de los tumores. Se ha desarrollado en
consecuencia un abanico de diversas estrategias para poner en
práctica la terapia genética del cáncer.
Se ha observado una gran incidencia de las
mutaciones en los genes supresores de tumores, por ejemplo el p53 y
el RB, en el caso del cáncer de vejiga (Fujimoto y col., Cancer Res.
52, 1393-1398, 1992; Cairns y col., Oncogene
6, 2305-2309, 1991). En el caso de tales
lesiones genéticas de los genes supresores de tumores, la reversión
del fenotipo neoplásico puede demostrarse mediante el reemplazo de
los correspondientes genes supresores de tumores de tipo salvaje
(Spandidos, loc. cit.; Banerjee, loc. cit.).
Los estudios "in vitro" empleando
líneas celulares derivadas de tejidos de vejiga humana han puesto de
manifiesto la eficacia de la expresión transgénica después de una
infección con adenovirus recombinantes (Bass y col., Cancer Gene
Therapy 2, 2, 97-104, 1994). Los ensayos
"in vivo" han puesto también de manifiesto la expresión
transgénica de adenovirus en la vejiga urinaria de roedores después
de una administración intravesical (loc. cit.; Morris y col., J.
Urology 152, 506-50, 1994). Los ensayos
"in vitro" con los adenovirus de tipo salvaje han puesto
de manifiesto que con el alcohol bencílico no se influye en la
fijación y la internalización de los virus, pero sí se demuestra un
mayor destape del virión (Blixt y col., Arch. Virol. 129,
265-277, 1993). Los esfuerzos "in vivo"
con agentes (p.ej. acetona, DMSO, sulfato de prolamina) pueden
romper la capa protectora de "mucina" que protege el epitelio
de la vejiga contra las bacterias, virus y otros patógenos (Monson y
col., J. Urol. 145, 842-845, 1992; Parsons y
col., J. Urol. 143, 139-142, 1990). Ninguno
de los métodos ensayados hasta el presente mejora la entrega de un
gen terapéutico supresor de tumores a la vejiga para el tratamiento
del cáncer de vejiga. Con el fin de llevar a cabo una terapia
genética para el tratamiento del cáncer de vejiga, los métodos de
terapia genética tienen que desarrollarse para efectuar una entrega
directa y óptima del gen supresor de tumores "in vivo"
al epitelio de la vejiga.
Estas necesidades y otras se abordan con la
presente invención.
En los artículos "Transferencia genética
mediada por adenovirus recombinante al epitelio genitourinario
"in vitro" e "in vivo" " de Bass y col.
(1995), "Expresión del producto genético de retinoblastoma en
células de cáncer de vejiga asociadas con una frecuencia baja de
formación tumoral" de Goodrich y col. (1992) y "El gen de
retinoblastoma funciona como supresor de crecimiento y de tumores en
las células del cáncer de vejiga humano" de Takahashi y col.
(1991) se debate el tratamiento del cáncer de vejiga empleando la
transferencia genética.
En el artículo de Wills y col. titulado
"Desarrollo y caracterización de adenovirus recombinantes que
codifican al p53 humano para la terapia genética del cáncer" se
debate el uso de los adenovirus como vectores para genes. En el
artículo "La transferencia del gen p53 mediada por adenovirus
inhibe el crecimiento de células tumorales humanas que expresan la
proteína mutante p53" de Harris y col. se debaten también los
vectores adenovíricos.
Además de los artículos técnicos recién
mencionados existe un gran número de documentos patentarios
relevantes que contienen información técnica anterior a la presente
invención.
En la solicitud de patente internacional nº WO
95/10265 se describen varios ejemplos de entrega de composiciones
terapéuticas. En otra patente internacional, nº WO 97/11682, se
describe el uso de emulsiones que contienen sustancias
biológicamente activas, por ejemplo el DNA, para entregar dichas
sustancias a las células. También la patente nº WO 93/00052 describe
métodos de entrega de genes a las células.
Un aspecto de la invención es el uso de una
cantidad terapéuticamente eficaz de un gen supresor tumoral
contenido dentro de un sistema de entrega de vectores adenovíricos
recombinantes que se formula en un tampón que contiene un detergente
para la fabricación de un medicamento farmacéutico destinado a la
administración de dicho gen supresor de tumores a un tejido que
tenga una membrana epitelial.
Otro aspecto de la invención es una composición
farmacéutica que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un
gen supresor de tumores contenido dentro de un sistema de entrega de
vectores adenovíricos recombinantes que se formula en un tampón que
contiene un detergente.
Otro aspecto de la invención es el uso de una
cantidad terapéuticamente eficaz de un gen supresor tumoral
contenido dentro de un sistema de entrega de vectores adenovíricos
recombinantes que se formula en un tampón que contiene un detergente
para la fabricación de un medicamento farmacéutico destinado a la
administración para el tratamiento del cáncer de vejiga.
Otro aspecto de la invención es un formulación
farmacéutica para la administración de un adenovirus recombinante
que contiene de 10^{9} a 10^{11} partículas (PN)/ml de
adenovirus recombinante, Big CHAP de 2 a 10 mM o detergente TRITON®
X-100 de 0,1 a 1,0 mM, solución salina tamponada con
fosfato (PBS), del 2 al 3% de sucrosa (p/v) y MgCl_{2} de 1 a 3
mM, de pH entre 6,4 y 8,4.
En la figura 1 se representa la influencia de la
formulación en la transferencia y expresión genética mediada por
adenovirus en el epitelio de vejiga de rata después de la
administración intravesical.
En la figura 2 se representa la expresión
transgénica de adenovirus a las células epiteliales de la vejiga
después de la administración intravesical.
En la figura 3 se representa la expresión
transgénica de adenovirus dependiente de la dosis en la vejiga de la
rata después de una administración intravesical.
En la figura 4 se representa un análisis mediante
reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa
(RT-PCR) de la expresión transgénica de un
adenovirus recombinante en la vejiga de un ratón después de la
administración intravesical.
En la figura 5 se representa el curso temporal de
la expresión transgénica de adenovirus recombinante en los tejidos
de la vejiga, los riñones y el hígado después de la administración
intravesical del virus.
En la figura 6 se representa el DNA transgénico
de adenovirus recombinante de materiales homogeneizados de vejiga y
de riñones después de la administración intravesical.
En la figura 7 se representa la mejora de la
transferencia genética al epitelio de la vejiga empleando una
formulación de Big CHAP
(N,N-bis(3-D-gluconamidropropil)-colamida,
de CALBIOCHEM® Biochemicals).
En la figura 8 se representa la mejora de la
transferencia genética al epitelio de la vejiga empleando diferentes
concentraciones de adenovirus recombinante en una formulación 7 mM
de Big CHAP.
En la figura 9 se representa la mejora de la
expresión transgénica de adenovirus recombinantes en el tejido de la
vejiga empleando una formulación de etanol (EtOH) o de Big CHAP.
En la figura 10 se representa la transferencia
genética a tumores empleando una formulación 4 mM de Big CHAP.
En la figura 11 se representa la transferencia
genética al epitelio de la vejiga de cerdo.
En la figura 12 se representa la expresión del
gen p53 en el tejido tumoral.
En la figura 13 se representa la transferencia
genética a la mucosa del íleo de una rata.
Tal como se emplea en la descripción, "un
sistema de entrega genética" se refiere a cualquier medio de
entrega de un gen terapéutico a un tejido epitelial o a un órgano
concretos, incluidos por ejemplo los vectores recombinantes y los
sistemas no vectoriales. Los ejemplos de sistemas no vectoriales
incluyen pero no se limitan a cualquier DNA de base lípida,
encapsulado en lípidos o cualquier complejo DNA/lípido catiónico.
Los ejemplos de vectores víricos recombinantes incluyen pero no se
limitan al herpes virus, retrovirus, virus de vacunas, adenovirus y
virus adenoasociados. "Recombinante" significa ácidos nucleicos
y proteínas codificadas por ellos, dichos ácidos nucleicos se
construyen por métodos de la tecnología del DNA recombinante,
también llamada "ingeniería genética". Un vector vírico
recombinante preferido es el sistema de entrega de vector
adenovírico que tiene una deleción en el gen IX de proteína (ver la
solicitud de patente internacional WO 95/11984). El sistema de
entrega de vector recombinante, que contiene un gen terapéutico, por
ejemplo un gen supresor de tumores, se formula en un tampón que
contiene un agente que mejora la entrega. Un "agente que mejora la
entrega" significa cualquier agente que mejora la entrega de un
gen terapéutico, por ejemplo un gen supresor de tumores, a un tejido
o a un órgano cancerosos. Dicha entrega mejorada puede lograrse por
diversos mecanismos. Uno de dichos mecanismos supone la disrupción
de la capa protectora de glucosaminoglucano de la superficie
epitelial de la vejiga. Son ejemplos de tales agentes que mejoran la
entrega los detergentes, los alcoholes, los glicoles, los
tensioactivos, las sales biliares, los antagonistas de heparina, los
inhibidores de ciclooxigenasas, las soluciones salinas hipertónicas
y los acetatos. Los alcoholes incluyen por ejemplo los alcoholes
alifáticos, por ejemplo el etanol, el n-propanol, el
isopropanol, el alcohol butílico, el acetilalcohol. Los glicoles
incluyen a la glicerina, el propilenglicol, el polietilenglicol y
otros glicoles de peso molecular bajo, por ejemplo la glicerina y la
tioglicerina. Otros ejemplos de agentes que mejoran la entrega son
los acetatos, tales como el ácido acético, el acetato de gluconol y
el acetato sódico. Las soluciones salinas hipertónicas, por ejemplo
NaCl 1M, son también ejemplos de agentes que mejoran la entrega. Son
ejemplos de tensioactivos el dodecil-sulfato sódico
(SDS) y la lisolecitina, el polisorbato 80, el
nonilfenoxipolioxietileno, la lisofosfatidilcolina, el
polietilenglicol 400, el polisorbato 80, los éteres de poli(óxido de
etileno), los tensioactivos de éteres de poliglicol y el DMSO.
Pueden utilizarse sales biliares, por ejemplo taurocolatos,
tuarodesoxicolato sódico, quenodesoxicolatos, ácido glicocólico,
ácido glucoquenodesoxicólico y otros compuestos astringentes, por
ejemplo el nitrato de plata. Pueden utilizarse también los
antagonistas de heparina, tales como las aminas cuaternarias del
tipo sulfato de prolamina. Pueden utilizarse también los inhibidores
de ciclooxigenasa, por ejemplo el salicilato sódico, el ácido
salicílico y los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAIDS),
por ejemplo la indometacina, el naproxeno o el diclofenac.
Los detergentes incluyen los detergentes
aniónicos, catiónicos, zwitteriónicos y no iónicos. Los ejemplos de
detergentes incluyen pero no se limitan al taurocolato,
desoxicolato, taurodesoxicolato, cetilpiridinio, cloruro de
benalconio, el detergente ZWITTER-GENT®
3-14, CHAPS (1-propanosulfonato de
3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]
hidratado, de Aldrich), Big CHAP, desoxi-Big CHAP,
el detergente TRITON® X-100, C12E8,
octil-B-D-glucopiranósido,
el detergente PLURONIC® F68, el detergente TWEEN® 20 y el detergente
TWEEN® 80 (CALBIOCHEM® Biochemicals).
En una forma de ejecución, el agente que mejora
la entrega se incluye en el tampón en el que se formula el sistema
de entrega del vector adenovírico recombinante. El agente de mejora
de la entrega puede administrarse antes que el virus recombinante o
bien simultáneamente con el virus. En algunas formas de ejecución,
el agente que mejora la entrega se proporciona junto con el virus
por mezclado de una preparación de virus con la formulación del
agente que mejora la entrega inmediatamente antes de la
administración al paciente. En otras formas de ejecución se
proporcionan para la administración al paciente el agente que mejora
la entrega y el virus en un vial único.
En el caso de una formulación farmacéutica que
contiene un gen supresor tumoral dentro de un sistema de entrega de
vector adenovírico recombinante formulado en un tampón que contiene
un agente que mejora la entrega, la composición farmacéutica puede
administrarse durante un período de tiempo comprendido entre 5
minutos y 3 horas, con preferencia entre 10 minutos y 120 minutos y
con preferencia especial entre 15 minutos y 90 minutos. En otra
forma de ejecución, el agente de mejora de la entrega puede
administrarse antes de la administración del sistema de entrega de
vector adenovírico recombinante que contiene el gen supresor de
tumores. La administración previa del agente que mejora la entrega
puede efectuarse dentro de un período de tiempo comprendido entre 30
segundos y 1 hora, con preferencia entre 1 minutos y 10 minutos y
con preferencia especial entre 1 minuto y 5 minutos antes de la
administración del sistema de entrega del vector adenovírico que
contiene el gen supresor de tumores.
La concentración del agente que mejora la entrega
dependerá de un gran número de factores, ya conocidos por el experto
en la materia, por ejemplo el agente concreto mejorador de la
entrega que se vaya a utilizar, el tampón, el pH, el tejido u órgano
a tratar y el modo de administración. La concentración del agente
que mejora la entrega se situará en el intervalo comprendido entre
el 1% y el 50% (v/v), con preferencia entre el 10% y el 40% (v/v) y
con preferencia especial entre el 15% y el 30% (v/v). La
concentración del detergente dentro de la formulación final
administrada al paciente se situará con preferencia entre 0,5 y 2
veces la concentración crítica de micelación (CMC). La concentración
preferida de Big CHAP se sitúa entre 2 y 20 mM, con mayor
preferencia entre 3,5 y 7 mM.
El tampón que contiene el agente mejorador de la
entrega puede ser cualquier tampón farmacéutico, por ejemplo una
solución salina tamponada con fosfato o una solución de fosfato
sódico/sulfato sódico, el tampón Tris, el tampón de glicina, el agua
esterilizada y otros tampones ya conocidos de los expertos en la
materia, por ejemplo los descritos por Good y col., Biochemistry
5, 467, 1966. El pH del tampón de la composición farmacéutica
que contiene el gen supresor de tumores que forma parte del sistema
de entrega de vector adenovírico puede situarse dentro del intervalo
comprendido entre 6,4 y 8,4, con preferencia entre 7 y 7,5 y con
preferencia especial entre 6,2 y 7,4.
Una formulación preferida para la administración
de un adenovirus recombinante contiene de 10^{9} a 10^{11} PN/ml
de virus, Big CHAP de 2 a 10 mM o detergente TRITON®
X-100 de 0,1 a 1,0 mM, en una solución salina
tamponada con fosfato (PBS) y además del 2 al 3% de sucrosa (p/v) y
MgCl_{2} de 1 a 3 mM, en un pH entre 6,4 y 8,4.
El término "mejorado" indica una mayor
entrega del gen terapéutico, por ejemplo un gen supresor tumoral, al
tejido o al órgano canceroso. Una mayor entrega de un gen
terapéutico, por ejemplo un gen supresor tumoral, pueden medirse de
varias maneras, por ejemplo determinando la expresión del gen
supresor tumoral y comparándola con los niveles de expresión cuando
el gen supresor tumoral se entrega en un sistema de entrega de
vector adenovírico en un tampón que carece del agente mejorador de
la entrega. Son ejemplos de genes terapéuticos los genes supresores
de tumores y la timidina-cinasa de genes suicidas.
Los ejemplos de genes supresores tumorales incluyen pero no se
limitan al p53, al gen de retinoblastoma, ya sea de longitud
completa (p110^{RB}), ya sean fragmentos del mismo, tales como el
p94^{RB} o el p56^{RB} y el p16. Otros genes terapéuticos
incluyen pero no se limitan a: el CFTR, los genes que codifican a
las citocinas (tales como las interferonas \alpha, \beta,
\gamma, \delta; las interleucinas (p.ej. la
IL-4, la IL-10, la
IL-2), el GM-CSF y otros genes que
codifican a proteínas que tienen potencial terapéutico para el
tratamiento de enfermedades no cancerosas de la vejiga, tales como
la cistitis. En algunas formas de ejecución de la invención, el gen
terapéutico codifica a un RNA antisentido.
En algunas formas de ejecución, las composiciones
de la invención contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de un
gen terapéutico, por ejemplo un gen supresor tumoral contenido en un
sistema de entrega de vectores víricos recombinantes en un tampón
que contiene un agente mejorador de la entrega. El término
"terapéuticamente eficaz" empleado en la presente descripción
indica la prevención de, la reducción de o la curación de los
síntomas asociados a un estado patológico.
Se administrarán las cantidades terapéuticamente
eficaces de la composición farmacéutica que contiene un gen
terapéutico, por ejemplo el p53 o el gen supresor del tumor
retinoblastoma, en un sistema de entrega de vectores víricos
recombinantes formado en un tampón que contiene un agente mejorador
de la entrega. Por ejemplo, las cantidades terapéuticamente eficaces
del gen supresor del tumor retinoblastoma en el sistema de entre de
vectores adenovíricos recombinantes formulado en un tampón que
contiene un agente mejorador de la entrega se sitúan en el intervalo
comprendido entre 1 x 10^{8} partículas/ml y 1 x 10^{12}
partículas/ml, con preferencia entre 1 x 10^{8} partículas/ml y 1
x 10^{11} partículas/ml, con preferencia especial entre 1 x
10^{9} partículas/ml y 1 x 10^{11} partículas/ml (PN/ml).
Las composiciones de esta invención pueden
contener además un estabilizador, un mejorador u otros excipientes o
vehículos farmacéuticamente aceptables. Un excipiente
farmacéuticamente aceptable puede contener un compuesto
fisiológicamente aceptable que actúa por ejemplo estabilizando el
sistema de entrega de vectores adenovíricos recombinantes que
contiene el gen supresor tumoral. Un compuesto fisiológicamente
aceptable puede incluir, por ejemplo, hidratos de carbono, tales
como la glucosa, la sucrosa o dextranos, antioxidantes, tales como
el ácido ascórbico o la glutationa, agentes quelantes, proteínas de
peso molecular bajo y otros estabilizantes o excipientes. Otros
compuestos fisiológicamente aceptables incluyen agentes humectantes,
agentes emulsionantes, agentes dispersantes o conservantes, que son
particularmente útiles para prevenir la propagación o la acción de
los microorganismos. Se conocen perfectamente diversos conservantes
que incluyen, por ejemplo, al fenol y al ácido ascórbico. Los
expertos en la materia entenderán que la elección del excipiente
farmacéuticamente aceptable dependerá de la vía de administración y
de las características físico-químicas particulares
del sistema de entrega del vector adenovírico recombinante y del gen
supresor tumoral particular contenido en dicho sistema. Se
encontrarán ejemplos de excipientes, estabilizantes o adyuvantes en
la obra de Martin, Remington's Pharm. Sci., 15ª ed. (Mack Publ. Co.,
Easton, PA 1975), que se incorpora a la presente como
referencia.
El sistema de entrega de vector vírico
recombinante que contiene un gen terapéutico, formulado en un tampón
que contiene un agente mejorador de la entrega, puede aplicarse a
cualquier tejido u órgano canceroso empleando los métodos de entrega
ya conocidos de los expertos en la materia, por ejemplo por
administración intratumoral o intravesical. Los tejidos y órganos
cancerosos incluyen cualquier tipo de tejido u órgano que tenga una
membrana epitelial, tales como el tracto gastrointestinal, la
vejiga, el tracto respiratorio, la vulva, el cérvix, la vagina o los
bronquios; los tumores metastásicos locales del peritoneo; el cáncer
bronquio-alveolar; el cáncer metastásico pleural; el
cáncer de la boca y de las amígdalas; el cáncer nasofaríngeo, de
nariz, de laringe, de esófago, de estómago, de colon y de recto, de
la vesícula biliar, de la miel; o el melanoma.
Los agentes mejoradores de la entrega de la
invención pueden utilizarse también para formular otros agentes
farmacéuticos, tales como proteínas, ácidos nucleicos, RNA
antisentido, moléculas pequeñas, etc., que se vayan a administrar a
cualquier tejido u órgano que tiene una membrana epitelial.
Los ejemplos siguientes ilustran la invención,
pero no se pretende que limiten su alcance.
Los ensayos iniciales han puesto de manifiesto
que diversos factores, incluidos la concentración del virus, el
tiempo de administración y el volumen a dosificar, pueden influir en
la transferencia genética al epitelio de la vejiga después de una
administración intravesical a las ratas. Debido que se puede lograr
una mejor penetración de los colorantes por administración
intravesical de diferentes disolventes, puede investigarse también
la modificación de la formulación de adenovirus como estrategia
alternativa para mejorar la expresión transgénica de adenovirus en
la vejiga (Monson y col., Urology 145,
842-845, 1991). Los ensayos presentes se dirigen al
uso del etanol para mejorar la expresión transgénica de adenovirus
en la vejiga.
Se anestesian nueve ratas búfalo (Harlan Sprague
Dawley) hembras con isoflurano y reciben una administración
intravesical única de un adenovirus recombinante humano que codifica
al gen lacZ (rAd-\beta-gal). El
vector adenovírico recombinante humano que contiene al gen lacZ
(rAd-\betagal) se ha descrito en Wills y col.,
Human Gene Therapy 5, 1079-1088, 1994. Antes
de la instilación se enjuagan las vejigas con PBS y se vacían.
Después se diluye el rAd-\betagal para lograr una
concentración final de 1,7x10^{11} PN/ml en 1) VPBS (2% (p/v) de
sucrosa y MgCl_{2} 2 mM en PBS); 2) etanol del 30% (v/v); o 3)
DMSO del 50% (v/v) y se instilan en un volumen de 250 \mul (N = 3
animales/grupo). Se retine el material administrado en la vejiga
durante 45 minutos. A continuación se enjuaga la vejiga con PBS y se
permite que los animales se recuperen después del ensayo. Dos días
después de la administración se sacrifican las ratas, se recolectan
las vejigas, se fijan y se tiñen los órganos en su totalidad con una
solución de Xgal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido)
para evaluar la transferencia del gen informante (reporter). A
continuación se sumergen en parafina los tejidos teñidos con Xgal,
se seccionan y vuelven a teñir con hematoxilina y eosina. La
hidrólisis del Xgal con la \beta-galactosidasa da
lugar a un color azul que se localiza en el epitelio superficial
luminal de la vejiga.
La expresión transgénica, posterior a la entrega
efectuada por el vector adenovírico, se detecta en las vejigas de
todos los animales tratados con rAd-\betagal, pero
no en los animales de control (= sin tratamiento). La expresión
transgénica es similar a los resultados publicados con anterioridad
empleando una formulación de PBS/sucrosa (Bass y col., Cancer Gene
Therapy 2, 2, 97-104, 1995). Contrasta en
gran manera que la expresión de la
\beta-galactosidasa en la superficie epitelial
luminal haya aumentado mucho en los animales que han recibido el
rAd-\betagal diluido etanol del 30% (figura 1).
Las muestras de vejiga descritas en la figura 1 se sumergen, se
seccionan y se tiñen de nuevo con hematoxilina y eosina. La
evaluación histológica del tejido de la vejiga pone de manifiesto
una mayor expresión de la \beta-galactosidasa del
epitelio transicional de la vejiga cuando se añade etanol a la
formulación de adenovirus (figura 2). La interacción del etanol y la
capa protectora de glucosaminoglucano (GAG) en la superficie del
epitelio proporciona un mecanismo para el incremento de expresión
transgénica observado. La disrupción de esta capa puede facilitar la
interacción entre virus y célula en la superficie y mejorar
potencialmente la penetración en la submucosa.
En otro ensayo se anestesian 18 ratas
Sprague-Dawley hembras con isoflurano y reciben un
bolo único de 0,5 ml por vía intravesical de
rAd-\betagal en concentraciones de 2x10^{7},
2x10^{8}, 2x10^{9}, 2x10^{10} y 2x10^{11} PN/ml en una
formulación de etanol del 22,5% (v/v). Pasada una incubación de 45
minutos se enjuagan las vejigas con PBS y se permite que los
animales se recuperen de la anestesia. Dos días después se
sacrifican los animales y se recolectan sus vejigas, se fijan y se
tiñen los órganos en su totalidad con una solución de Xgal para
evaluar la expresión transgénica de adenovirus. La expresión de la
\beta-galactosidasa en el epitelio luminal de la
vejiga guarda relación directa con la concentración del adenovirus
recombinante administrado (figura 3). No se observan diferencias
notorias entre los animales que han recibido 2x10^{10} o
2x10^{11} PN/ml, lo cual sugiere que existe una saturación de la
expresión transgénica en este modelo. El análisis del volumen
vaciado después de la instilación indica solamente una reducción
mínima de la concentración infecciosa del material aplicado en estas
dosis elevadas. La expresión de la
\beta-galactosidasa disminuye en concentraciones
bajas. No se detectan indicios de expresión de la
\beta-galactosidasa en animales que reciben dosis
de una concentración de 1x10^{7} PN/ml ni en animales de control
que no reciben tratamiento.
Se realiza un estudio piloto para evaluar
específicamente la expresión del transgén RB aplicando un ensayo
RT-PCR. El adenovirus recombinante que se emplea en
este estudio se basa en adenovirus humano de serotipo 5, del que se
ha suprimido la región vírica inicial 1 que codifica a las proteínas
Ela, E1b y pIX. Este adenovirus se limita a la propagación en 293
células que generan productos genéticos Ad5E1, requeridos para la
replicación. Los plásmidos de transferencia, que codifican ya sea Rb
de longitud completa, ya sea Rb truncados, se generan a partir del
pACN (Wills y col., Cancer Gene Therapy 2,
191-197, 1995) y se utilizan a su vez para construir
los adenovirus recombinantes. Tanto el cDNA de RB de longitud
completa (1-928 aminoácidos), subclonado en forma de
fragmento XbaI-BamHI de 2,8 Kb a partir de los
plásmidos pETRbc (Huang y col, Nature 350,
160-162, 1991) como el fragmento truncado
(381-392 aminoácidos), subclonado en forma de
fragmento XbaI-BamHI de cDNA de 1,7 KB, se colocan
en dirección al extremo final (downstream) después del promotor
CMV/mejorador y del cDNA guía tripartito Ad 2 del plásmido pACN. A
continuación se linearizan estos plásmidos con EcoRI y se
cotransfectan (CaPO_{4}, Stratagene) ya sea con el fragmento
grande de H5ilE4 aislado y digerido con ClA l (Hemstrom y col., J.
Virol. 62, 3258-3264, 1988) para obtener el
Ad-RB56 (ACN56) que contiene una deleción parcial
E4, ya sea con el fragmento grande procedente de un virus híbrido de
d1327 (Ginsberg y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86,
3823-3827, 1989) y H5ilE4 para generar el
Ad-Rb110 (ACNRB) que contiene deleciones tanto en la
región E3 como en la región E4 del vector.
Se anestesian ocho ratones ICR hembras (Charles
River Laboratories) con avertina y cada uno de ellos recibe una
administración intravesical única de 80 \mul de (ACNRB). Se diluye
el ACNRB (4x10^{11} PN/ml) y se prepara una solución en PBS o una
solución en etanol del 30% (v/v). Después de retener el virus en la
vejiga durante 45 minutos se permite que los animales recuperen y
evacúen. Se sacrifican los ratones 2 días o 14 días después de la
administración del ACNRB y se recolectan las vejigas, los hígados y
los riñones de cada animal, se homogeneízan y se procesan para el
análisis (N = 2 animales/grupo). Se determina la expresión
transgénica empleando la RT-PCR con un cebador
específico del ACNRB. Más en concreto, los cebadores se generan para
identificar al ACNRB y amplificar la región desde el extremo 3' de
la secuencia CMV y hacia el extremo 5' de la secuencia RB. Después
de la amplificación (30 ciclos) se separan los productos de la
RT-PCR a través de un gel de poliacrilamida del 10%,
se tiñen con bromuro de etidio y se fotografían. Se detecta un
aumento de la expresión del ACNRB después del tratamiento con ACNRB
en etanol del 30% (v/v) y se compara con la expresión muy baja
después del tratamiento con ACNRB en VPBS. Los controles positivos
del ensayo incluyen muestras de células de cáncer de vejiga humana
5637 infectadas con ACNRB (CONTROL). Las muestras de RNA de vejiga
de animales infectados con ACNRB que se han amplificado con
cebadores específicos de beta-actina proporcionan un
control interno de la calidad del RNA. Las muestras sin tratar y las
muestras de vejiga sin transcriptasa inversa (RT) proporcionan un
control del DNA contaminante. Dos días después de la dosificación se
detectan los niveles de expresión de ACNRB en los materiales
homogeneizados de vejiga de animales que han recibido el ACNRB
preparado en etanol del 30% (figura 4). No se observan indicios de
expresión en tejido no vesicular ni en otras muestras recogidas 14
días después de la administración.
Para investigar el curso de la expresión después
de la administración intravesical se anestesian 40 ratones hembras
(Charles River Laboratories) con avertina y reciben un bolo único de
80 \mul de ACNRB (4x10^{11} PN/ml en etanol del 22% (v/v)).
Después de retener el material instilado en la vejiga durante 45
minutos se permite que los animales recuperen del ensayo. Para el
análisis se sacrifican los ratones en los días 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y
14 después de la administración (N = 4 cada vez). Se recolectan las
vejigas, los hígados y los riñones y se congelan de repente en
nitrógeno líquido para el posterior análisis. Para la detección de
la expresión ACNRB se homogeneízan muestras de tejido y se extrae el
RNA total empleando el TRI-Reagent®. Se amplifica
una parte alícuota del RNA total mediante un ensayo
RT-PCR empleando cebadores específicos del ACNRB
para distinguir entre la expresión transgénica y la expresión RB
endógena. Para la detección del DNA del ACNRB se emplea un kit de
extracción de DNA (Stratagene) empleando materiales homogeneizados
de tejidos. Se realiza la PCR con cebadores específicos de la ACNRB,
del modo descrito anteriormente para el análisis
RT-PCR.
Se detecta la expresión transgénica del ACNRB en
homogeneizados de vejiga únicamente en las muestras recolectadas en
los días 1-6, disminuyendo con el tiempo la
expresión relativa al p53 endógeno (figura 5, panel superior). No se
detecta expresión en las muestras recolectadas entre el día 7 y 14
después de la administración. Es interesante constatar que se
detecta algo de expresión del ACNRB en los riñones en las muestras
de los días 1, 2 y 3, pero no se observa expresión en el hígado
(figura 5, paneles inferiores).
Se detecta el DNA del ACNRB en el tejido de
vejiga de todos los animales que han recibido el ACNRB, incluidos
aquellos cuyas vejigas se han recolectado 14 días después de la
administración (figura 6, panel izquierdo). Se recoge también el DNA
de los homogeneizados de riñones, consistente con la expresión del
ACNRB detectada en este tejido (figura 6, panel derecho). No se
detectan indicios de DNA de ACNRB en las muestras de hígado
recogidas durante el estudio (no se representan los datos). Las
muestras de animales sin tratamiento (U) y el DNA de ACNRB
purificado (PC) se utilizan como controles negativos y 25 positivos,
respectivamente.
Dado que la administración sistémica de los
adenovirus recombinantes se traduce primariamente en una expresión
transgénica en el hígado (Li y col., Human Gene Therapy 4,
403-409, 1993), la ausencia del DNA de ACNRB y la
expresión en nuestras de hígado (figuras 5 y 6) indica la expresión
sistémica despreciable del ACNRB después de la administración
intravesical. El flujo retrógrado a través de los uréteres puede
haber contribuido a la detección del ACNRB en los riñones.
Los datos presentados antes demuestran la
expresión transgénica en la vejiga de los roedores después de una
administración intravesical del ACNRB. Estos estudios indican además
que la transferencia genética mediada por adenovirus al epitelio de
la vejiga puede aumentarse con la presencia de un agente que
facilite la entrega en la formulación, por ejemplo el etanol. Un
mecanismo para una mayor transferencia genética puede ser la
disrupción de la capa protectora de glucosaminoglucano existente en
la superficie epitelial de la vejiga. Una administración
intravesical única del ACNRB en una formulación de etanol del
20-30% (v/v) se traduce en la expresión transgénica
en la vejiga, que persiste durante aproximadamente una semana. El
flujo retrógrado por los uréteres constituye una explicación
verosímil de la expresión transitoria del ACNRB que se ha detectado
en el riñón. La ausencia de expresión del ACNRB y del DNA del ACNRB
en el hígado indica una exposición sistémica limitada después de
efectuada una administración intravesical.
Para minimizar los efectos secundarios sin
pérdida de la eficacia de la transferencia genética se ensayan otros
excipientes. Se sabe que los detergentes interaccionan con las
membranas celulares y forman poros grandes, sin dañar las células.
En modelos de transferencia genética en ratas y ratones se estudia
la eficacia del adenovirus recombinante formulado en detergentes
menos tóxicos.
Se formula el rAd-\betagal en
diferentes detergentes en sus concentraciones críticas de
micelización para evaluar la eficacia de la transferencia genética
al epitelio de la vejiga. Se anestesian ratas hembras (de unos 200 g
de peso corporal, Harlan Sprague Dawley) con isoflurano y reciben
una administración intravesical única de
rAd-\betagal (1x10^{11} PN/ml) en diferentes
formulaciones de detergentes (ver tabla I). Antes de la instilación
se enjuagan las vejigas con PBS y después se vacían. A continuación
se instila el rAd-\betagal en un volumen de 0,5
ml. Se retiene la solución instilada en la vejiga durante 45
minutos. Después se enjuagan las vejigas con PBS y se deja que los
animales se recuperen de la prueba. Se sacrifican las ratas 48 horas
después de la administración, se recolectan las vejigas y se fijan
en formalina. Después de la fijación se abren las vejigas en sentido
longitudinal, de modo que el uretolio quede expuesto al cromógeno
(Xgal), que se convierte en color azul, se ha ocurrido la expresión
del gen informante (reporter)
(\beta-galactosidasa). Se ha fotografiado la
totalidad de la superficie epitelial luminal y se puntúa la
intensidad de su coloración azul: + (coloración mínima), ++
(coloración moderada), +++ (coloración intensa que cubre la
totalidad de la superficie epitelial de la vejiga). Los resultados
se recogen en la tabla I. Algunos de los detergentes aniónicos
(taurodesoxicolato), de los detergentes zwitteriónicos (CHAPS,
ZWITTERGENT®) y de los detergentes no iónicos (Big CHAP, TRITON®
X-100) aumentan enormemente la transferencia
genética. Los detergentes catiónicos y algunos de los detergentes no
iónicos (PLURONIC® F68, TWEEN®) no tienen efectos similares. En
general, las mejoras de la transferencia genética van acompañadas de
cistitis. Los detergentes zwitteriónicos facilitan la formación de
cálculos en la vejiga.
Las posibles manifestaciones de cistitis,
observadas en el caso del etanol, se evalúan en ratones empleando
una formulación de Big CHAP 7 mM (2x CMC) o de detergente TRITON®
X-100 (CMC). Se administran las formulaciones por
vía intravesical en un volumen de 80 \mul y se observan los
animales en un lapso de tiempo de 7 días. Después del sacrificio se
sumergen las vejigas en parafina, se seccionan y se tiñen con
hematoxilina y eosina para la evaluación patológica. Se observa
únicamente una ligera infiltración de macrófagos en el tejido de la
vejiga de los ratones tratados con Big CHAP. Los macrófagos se
infiltran de forma más notable (de ligera a moderada) cuando se
hallan inducidos por el detergente TRITON® X-100. En
fuerte contraste, se detecta una cistitis importante en los animales
tratados con etanol del 22%.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Además de los ensayos con el gen informante
(reporter) se ha efectuado una serie de estudios para evaluar
específicamente la transferencia genética del ACNRB. Se anestesian
ratones ICR hembras con avertina y cada ratón reciba una
administración intravesical única de 80 \mul de ACNRB. Se formula
el ACNRB (4x10^{10} PN/ml) en VPBS, etanol del 22% (v/v) o Big
CHAP 3 mM. Se retiene el virus en la vejiga durante 45 minutos y se
deja que los animales se recuperen. Se sacrifican los ratones 48
horas después de la administración de ACNRB y se congelan las
vejigas bruscamente en nitrógeno líquido. Se determina la expresión
transgénica mediante la RT-PCR. Se enjuagan los
tejidos en agua exenta de RNA, se homogeneízan, se digieren en
Tri-Reagent (Molecular Research Center) y se extrae
el RNA celular total. Se insertan sondas en el ACNRB empleando un
cebador 5' situado en la región CMV del vector ACNRB y un cebador 3'
residente en extremo 5' del genoma de Rb. Se realiza una
RT-PCR en el sistema 9600 Gene-Amp
PCR de Perkin Elmer. Las condiciones del ciclo son 10 min a 65ºC, 8
min a 50ºC, 5 min a 95ºC. El ciclo nº 32 incluye una etapa de
alargamiento de 10 min a 72ºC para garantizar la plena extensión de
los fragmentos incompletos de DNA. Se tiñen las bandas de
AC-NRB-RNA con bromuro de etidio. En
la figura 9 se presentan los resultados, la expresión ampliada
empleando una formulación de etanol o de Big CHAP.
Dado que el Big CHAP mejora la transferencia
genética con un mínimo de cistitis, se elige esta formulación para
la evaluación ulterior, incluida la concentración y la dependencia
de la dosis en los estudios de modo similar a los descritos
anteriormente. En resumen, se anestesian ratas hembras y se les
administra el rAd-\betagal (1x10^{10} PN/ml) en
la vejiga mediante un catéter intravesical. Se formula el
rAd-\betagal en diferentes concentraciones en Big
CHAP. Se inyecta un volumen de 0,5 ml y el resto se instila en la
vejiga durante un período de 45 minutos. Se sacrifican los animales
al cabo de 48 horas, se fijan las vejigas en formalina al 4% en
glutaraldehído, se abren en sentido longitudinal y se determina la
actividad de la enzima \beta-galactosidasa
empleando un sustrato Xgal. La intensidad de la coloración azul
guarda una relación directa con la expresión transgénica de la
\beta-gal. En la figura se representa la
superficie epitelial de las vejigas teñidas con Xgal. Los resultados
indican un aumento, dependiente de la concentración, de la
transferencia genética al epitelio. La concentración de 3,5 a 7 mM
de Big CHAP mejora de forma significativa la transferencia genética.
La formulación sola (figura 7, panel inferior) no induce un color
azul en el sustrato de Xgal. Una concentración más elevada (17,5 mM)
no mejora de forma notable la transferencia genética ni la
expresión, pero induce cistitis en algunos de los animales sometidos
al ensayo.
Se verifican además los efectos de
concentraciones elevadas de adenovirus recombinantes. En resumen, se
anestesian ratas hembras y se les administran diferentes
concentraciones de rAD-\betagal, formulada en Big
CHAP 7 mM, que se introducen en la vejiga mediante un catéter
intravesical. Se sacrifican los animales al cabo de 48 horas, se
fijan las vejigas con formalina al 4% en glutaraldehído, se abren en
sentido longitudinal y se tiñen con Xgal. En la figura 8 se
representa un aumento, dependiente de la concentración, de la
transferencia genética al epitelio. Una concentración de
1,3x10^{11} PN/ml induce la transferencia genética máxima. Una
concentración más elevada (6,5x10^{11} PN/ml) no aumenta de forma
notable la coloración azul. En concentraciones bajas de
rAd-\betagal, 1,3x10^{10} PN/ml o 1,3x10^{9}
PN/ml, se reduce considerablemente la expresión transgénica en
función de la dosis. Cuando se comparan las formulaciones 3,5 mM y 7
mM, la expresión de la \beta-galactosidasa es
similar, a pesar que se el efecto aumentado aparece de forma más
reproducible en los animales tratados con la formulación 7 mM de Big
CHAP.
Dado que las investigaciones iniciales se
centraron en animales de epitelio vesicular intacto, ahora se
estudia también la transferencia genética medicada de adenovirus en
un modelo animal de carcinoma celular transicional. Se inducen los
tumores en ratas Fisher machos por adición de BBN del 0,05% en el
agua de beber durante seis meses. Se instila
rAd-\betagal (1x10^{11} PN/ml), formulado en Big
CHAP 4 mM o en VPBS, en la vejiga durante 45 minutos mediante
inyección directa. Se evalúa la expresión de
\beta-gal 48 h después del tratamiento. De modo
consistente con los ensayos anteriores, en los que se utilizaban
animales no afectados por tumores, la transferencia genética al
tejido tumoral se mejora con la formulación Big CHAP, si se compara
con la formulación VPBS (figura 10).
Se ensaya también la transferencia genética de
rAd que lleva el gen p53 (rAd-p53) (Wills y col.,
Human Gene Therapy 5, 1079-1088, 1994) en un
modelo animal de cáncer de vejiga. En resumen, se inducen tumores de
vejiga en ratas Fisher hembras (Charles River) por adición de BBN al
0,05%
(N-butil-N-(4-hidroxibutil)nitrosamina)
al agua de beber durante tres meses. Se formula el
rAD-p53 (1x10^{11} PN/ml) en Big CHAP 7 mM. Se
anestesian con isoflurano y se les inserta un catéter (24G) en la
vejiga para la administración. Se instila el rAD-p53
en la vejiga durante 45 minutos. Se deja que los animales se
recuperen de la anestesia. Veinticuatro horas después se sacrifican
los animales y se fija la vejiga en formalina. Se sumerge en
parafina y se secciona, después se ensaya la expresión del p53 por
inminohistoquímica empleando el kit p53ES (Oncogene), empleando AEC
(kit AEC, Vector Labs) como sustrato. Se tiñen de nuevo los tejidos
con hematoxilina. En la figura 12 se representa la expresión
genética en la zona superficial del epitelio proliferante (panel
izquierdo) y tintura nuclear para la expresión del p53 con una
ampliación de más aumentos (panel derecho). No se detecta tinción en
el tejido tumoral de los animales no tratados.
Para simular los volúmenes esperados de la
investigación clínica se ensaya la formulación 7 mM de Big CHAP en
un modelo de cerdo adulto cateterizado crónicamente en colaboración
con SPRI Drug Safety and Metabolism. Se formula el
rAd-\betagal (1x10^{11} PN/ml) en VPBS o en Big
CHAP 7 mM. Mediante un catéter se inyecta un volumen de 50 ml en la
vejiga de los animales conscientes. Se retiene el material instilado
durante 2 h. Se sacrifican los animales 48 h después y se recolecta
la sección central de la vejiga y se tiñe para la expresión de la
\beta-galactosidasa. Se observa un aumento en la
intensidad de la expresión genética en el cerdo tratado con Big CHAP
7 mM por comparación con el cerdo tratado con VPBS (figura 11). La
evaluación histológica pone de manifiesto la transducción de
diversas capas epiteliales empleando el Big CHAP (panel izquierdo),
pero solo se observa una transducción superficial en el caso del
tampón VPBS (panel derecho).
Se emplea una ligera modificación del método de
Sandberg y col. (Human Gene Therapy 5,
323-329, 1994) para preparar segmentos de íleo de
ratas con vistas a los estudios de transferencia genética. En
resumen, se anestesian ratas Sprague-Dawley hembras,
con isoflurano. Se abre la cavidad abdominal y se aísla un segmento
de íleo en posición rostral con respecto al último emplasto de
Peyer. Se limpia cuidadosamente el segmento (unos 3 cm) de restos de
comida y se cierran ambos extremos con pinzas vasculares no
traumáticas. Se inyecta el rAd-\betagal
(1x10^{11} PN/ml), en un volumen de 0,5 ml, directamente al
segmento con una aguja 24 G y se mantiene en incubación durante 45
minutos. Se formula el rAd-\betagal en ácido
taurodesoxicólico 10 mM (en agua destilada, esterilizada y filtrada)
(grupo de tratamiento 1) o en VPBS (grupo de tratamiento 2). Un
tercer grupo está formado por los animales tratados con ácido
taurodesoxicólico 10 mM. A continuación se retiran las pinzas y se
aplica una sutura suelta con hilo de seda anclada en ambos extremos
para el reconocimiento del tiempo de necropsia. Se cierra la
incisión abdominal y se deja que los animales se recuperen en sus
jaulas. Se sacrifican los animales al cabo de 48 horas. Se
recolectan los segmentos infectados y un segmento de control en
fijador para la tinción del órgano completo con Xgal.
Los resultados se recogen en la figura 13. La
extensión de la tintura azul de Xgal demuestran la expresión
transgénica en las secciones del íleo. Se observa mayor
transferencia genética en la formulación de detergente (panel
central).
Todas las publicaciones y solicitudes de patente
citadas en esta descripción se incorporan a la misma en su totalidad
como referencias, como si cada publicación o solicitud de patente
individual se indicara que se incorpora como referencia a título
específico e individual.
Claims (27)
1. Uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de
un gen supresor tumoral contenido en un sistema de entrega de
vectores adenovíricos recombinantes, que se formula en un tampón que
consta de un detergente, para la fabricación de un medicamento
farmacéutico destinado a la administración de dicho gen supresor
tumoral a un tejido que tenga una membrana epitelial.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que el
detergente es el Big CHAP.
3. Uso según la reivindicación 1, en el que el
detergente es TRITON® X-100.
4. Uso según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el
que el gen supresor tumoral es el p53.
5. Uso según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el
que el gen supresor tumoral es un gen de retinoblastoma.
6. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la concentración del
detergente se sitúa entre 0,5 veces y 2 veces la concentración
crítica de micelización.
7. Una composición farmacéutica que contiene una
cantidad terapéuticamente eficaz de un gen supresor de tumores
contenido en un sistema de entrega de vectores adenovíricos
recombinantes que se formula en un tampón que contiene un
detergente.
8. La composición según la reivindicación 7, en
la que el gen supresor de tumores es el p53.
9. La composición según la reivindicación 7, en
la que el gen supresor de tumores es un gen de retinoblastoma.
10. La composición según la reivindicación 7, 8 ó
9, en la que el detergente es el Big CHAP.
11. La composición según la reivindicación 7, 8 ó
9, en la que el detergente es el TRITON® X-100.
12. La composición según una cualquiera de las
reivindicaciones de 7 a 11, en la que la concentración del
detergente se sitúa entre 0,5 veces y 2 veces la concentración
crítica de micelización.
13. Una composición que contiene un adenovirus
recombinante, dicha composición contiene 10^{9} a 10^{11} PN/ml
de adenovirus recombinante, Big CHAP de 2 a 10 mM u
octilfenoxipolietoxietanol de 0,1 a 1,0 mM, solución salina
tamponada con fosfato (PBS) (pH entre 6,4 y 8,4), del 2 al 3% de
sucrosa (p/v) y MgCl_{2} de 1 a 3 mM.
14. Uso de una cantidad terapéuticamente eficaz
de un gen supresor tumoral contenido en un sistema de entrega de
vectores adenovíricos recombinantes que se formula en un tampón que
contiene un detergente para la fabricación de un medicamento
farmacéutico destinado a la administración para el tratamiento del
cáncer de vejiga.
15. Uso según la reivindicación 14, en el que el
gen supresor de tumores es el p53.
16. Uso según la reivindicación 14, en el que el
gen supresor de tumores es el gen supresor del tumor
retinoblastoma.
17. Uso según la reivindicación 14, 15 ó 16, en
el que el detergente es el Big CHAP.
18. Uso según la reivindicación 14, 15 ó 16, en
el que el detergente es el TRITON® X-100.
19. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones de 14 a 18, en el que la administración es una
administración intravesical.
20. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones de 14 a 19, en el que la cantidad terapéuticamente
eficaz de un gen supresor de tumores contenido en un sistema de
entrega de vectores adenovíricos recombinantes se sitúa en un
intervalo comprendido entre 1x10^{8} partículas/ml y 5x10^{11}
partículas/ml del adenovirus recombinante.
21. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones de 14 a 20, en el que la cantidad terapéuticamente
eficaz de un gen supresor de tumores contenido en un sistema de
entrega de vectores adenovíricos recombinantes se sitúa en un
intervalo comprendido entre 1x10^{9} partículas/ml y 1x10^{11}
partículas/ml del adenovirus recombinante.
22. Uso según la reivindicación 16, en el que el
gen supresor del tumor retinoblastoma codifica una proteína RB de
longitud completa.
23. Uso según la reivindicación 16, en el que el
gen supresor del tumor retinoblastoma codifica el p56^{RB}.
24. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones de 14 a 23, en el que el detergente se administra
antes de la administración del sistema de entrega de vectores
adenovíricos recombinantes que contiene el gen supresor de
tumores.
25. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones de 14 a 23, en el que el detergente se administra
junto con el sistema de entrega de vectores adenovíricos
recombinantes que contiene el gen supresor de tumores.
26. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones de 14 a 25, en el que la concentración del
detergente se sitúa entre 0,5 veces y 2 veces la concentración
crítica de micelización.
27. Una formulación farmacéutica para la
administración de un adenovirus recombinantes que contiene 10^{9}
a 10^{11} PN/ml de adenovirus recombinante, Big CHAP de 2 a 10 mM
o detergente TRITON® X-100 de 0,1 a 1,0 mM, solución
salina tamponada con fosfato (PBS), del 2 al 3% de sucrosa (p/v) y
MgCl_{2} de 1 a 3 mM, pH entre 6,4 y 8,4.
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