CN101396555A - 用于干扰素治疗的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供将蛋白质或基因治疗施用至具有上皮细胞层的组织或器官的方法和药物组合物。蛋白质或编码蛋白质的核酸施用至靶组织或器官联合传递增强试剂治疗,该传递增强试剂增加干扰素或核酸传递至靶组织或器官的细胞。该方法和组合在治疗癌症或其它对干扰素治疗有应答的疾病中尤其有用。示范性的方法包括经尿道膀胱内施用治疗有效量的药物组合物至膀胱,该药物组合物含有α-干扰素或编码干扰素的基因传递系统与SYN3或SYN3同系物或类似物。与相同干扰素蛋白或干扰素基因传递系统的PBS制剂相比,使用SYN3制剂在膀胱内观察到干扰素水平与活性增加了10到1000倍。
Description
本发明专利申请是国际申请号为PCT/US2004/017788,国际申请日为2004年6月4日,进入中国国家阶段的申请号为“200480019098.X”,发明名称为“用于干扰素治疗的方法和组合物”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉参考
本申请是2003年6月4日提交的美国专利申请号10/455,215的后续部分,该申请是2002年1月22日提交的美国专利申请号10/055,863的后续部分,该申请是1998年7月8日提交的美国专利申请号09/112,074(2002年5月21日出版的美国专利号6,392,069)的后续部分,该申请是1997年7月8日提交的美国专利申请号08/889,355的后续部分,该申请是1996年1月8日提交的美国专利申请号08/584,077(1998年8月4日出版的美国专利号5,789,244)的后续部分;本申请也是2003年6月3日提交的有待授权的美国专利申请号(Townsend & Townsend &Crew LLP律师事务所代理人审理号016930-000815)的后续部分,该申请是2000年8月28日提交的美国专利申请号09/650,359的后续部分,该申请是1997年1月7日提交的美国专利申请号08/779,627(2000年12月26日出版的美国专利号6,165,779)的后续部分,该申请是1996年1月8日提交的美国专利申请号08/584,077的后续部分;本申请要求2004年6月4日提交的有待授权的美国专利申请号(Townsend & Townsend & Crew LLP律师事务所代理人审理号016930-000831US)的优先权,该申请要求2003年6月4日提交的美国专利申请号60475926的权益。本申请含有2002年12月20日提交的美国专利申请号1029,043的相关主题,该申请要求2001年12月20日提交的美国专利申请号60/342329的权益。出于所有目的,这些优先权申请的内容纳入文中作为参考。
发明背景
美国每年诊断出超过45,000例浅表性膀胱癌(“癌症事实与数据”(Cancer Factsand Figures)2002)。浅表性疾病通常局限于表面粘膜(Ta)或以原位癌(CIS)(一种平坦表面扩散变体)存在。虽然一些类型的疾病最初可通过经尿道膀胱肿瘤切除(TURBT来)除去,但是仍维持高的新肿瘤形成趋势,可能是因为可见肿瘤的宏观去除会遗留最终导致肿瘤复发的微观病灶。此外,手术介入不能用于治疗原位癌(CIS)。因此,开发了作为手术的辅佐手段的膀胱内治疗来防止肿瘤复发,或消除小的残留疾病和/或无法接近的疾病,例如CIS。
现在用于浅表性膀胱癌治疗的两种常规类型的膀胱内治疗是:化疗和BCG免疫治疗。仅有3种化疗药物经由膀胱内施用有效:塞替哌、阿霉素(及其衍生物:表柔比星和戊柔比星)和丝裂霉素。比较单用这些化疗药物对TURBT的多重随机试验表明肿瘤复发净降低12-15%(即TURBT的60%复发率对TURBT加上化疗的45%复发率)并且一种药物对另一种药物没有明显优势(Traynelis等.,“用于膀胱癌的膀胱内治疗的现状”(Current status of intravesical therapy for bladdercancer),S.N.Rous编,《泌尿外科学年鉴》(Urology Annual),第8卷,113-143页,纽约:WW Norton和Co,1994)。更重要的是,尽管在复发率上有统计学显著的降低,没有证据表明化疗降低了最终疾病进展的概率或改善了存活率(Lamm等.,J Urol,153:1444-50(1995))。
免疫治疗通常包括膀胱内施用牛分枝杆菌卡介苗(“BCG”)的活疫苗株。TURBT后使用BCG将肿瘤复发率降低约30%(或约是膀胱内化疗的两倍)(O′Donnell MA,“在浅表性膀胱癌的治疗中使用膀胱内BCG”(Use ofIntravesical BCG in Treatment of Superficial Bladder Cancer),刊于《膀胱癌:当前的诊断和治疗》(Bladder Cancer:Current Diagnosis and Treatment),浅表性Droller编,Totowa NJ:Humana Press Inc.,2001)。当前,55-60%小乳头瘤(<2cm)可实现消融,对CIS多达75%(Kavoussi等.,J Urol.,139:935(1988))。膀胱内BCG已成为具有高危险性的复发或疾病进展的浅表性膀胱癌患者的治疗标准。在这方面,BCG的膀胱内治疗可提供一定程度的疾病控制和保留膀胱功能,这是每位浅表性膀胱癌的患者所希望的。然而,虽然这种BCG-介导使高危性浅表性膀胱癌的早期治疗获益,但约50%的患者在两年内复发。这种复发通常用BCG再治疗。然而,观察到用多次膀胱内BCG滴注法治疗的患者会经受剂量-限制的毒性,例如膀胱炎、排尿困难、发热和偶尔的BCG败血症。因此,需要耐受性好且有效的BCG治疗的替代方法。
近来,研究者评价了用于浅表性膀胱癌治疗的重组干扰素α2b蛋白治疗。人II期临床研究表明,将Intron A作为单一药物以50-100MIU剂量进行膀胱内滴注在40%患有浅表性膀胱癌的患者中导致完全应答(O′Donnell等.,J Urol.,2001年10月,166(4):1300-5)。
鉴于上述,改善治疗性蛋白、多肽(例如,干扰素,Intron A)或基因传递系统或核酸传递至上皮细胞(特别是尿路上皮)的方法是有利的。
发明简述
本发明的一个方面提供了用于向具有上皮细胞层的组织或器官施用蛋白质治疗的方法和药物组合物。一方面,向靶组织或器官施用蛋白质治疗联合使用蛋白质治疗传递增强试剂治疗,后者通过载体增加靶组织或器官细胞的转导。该方法和组合在治疗癌症和其它对使用生物活性蛋白治疗有应答的疾病中有用。在优选的实施方案中,传递增强试剂是SYN3。
在一些实施方案中,蛋白质治疗通过施用干扰素蛋白自身或通过施用干扰素基因传递系统来提供干扰素蛋白,其中基因编码要在转导的上皮细胞或尿路上皮细胞中表达的干扰素蛋白。在一个示范性实施方案中,该方法包括将治疗有效量的药物组合物经尿道膀胱内施用至膀胱,该药物组合物含有SYN3或SYN3同系物或类似物与干扰素或编码干扰素的腺病毒载体。在另一个实施方案中,干扰素是α-干扰素。
在另一个方面,本发明提供了提高核酸传递至上皮组织的组合物和方法。在一个实施方案中,该方法使得组织或器官的细胞与结合了传递增强试剂的基因传递系统接触,其中基因编码干扰素。在另一个实施方案中,本发明提供含有编码干扰素基因的重组腺病毒和传递增强试剂的药物制剂。在一个示范性实施方案中,传递增强试剂是SYN3,并且该系统含有编码生物活性人干扰素多肽的腺病毒载体。
在又一个方面,本发明提供通过提高治疗性蛋白或具有编码蛋白的基因的基因传递系统传递到膀胱上皮来治疗膀胱癌的组合物和方法,而提高传递的方法是通过膀胱内施用传递增强试剂和治疗性蛋白。在一些实施方案中,治疗性蛋白是干扰素。在还有的实施方案中,治疗性蛋白是干扰素α2b或干扰素α2α1。又在其它实施方案中,传递增强试剂是SYN3或SYN3同系物。在一个示范性实施方案中,传递增强试剂是SYN3并且蛋白是干扰素(例如,生物活性人干扰素多肽)。在其它实施方案中,蛋白可作为蛋白或通过编码高蛋白的基因传递系统施用。还有在其它实施方案中,蛋白是抗体或抗体片段。在其它实施方案中,抗体定向于细胞因子。
在另一方面,本发明提供一种用于施用治疗性蛋白和传递增强试剂的药物组合物。在一些实施方案中,蛋白是干扰素并且传递增强试剂是SYN3或SYN3同系物。在一个示范性实施方案中,传递增强试剂是SYN3并且蛋白是生物活性人干扰素多肽。在其它实施方案中,干扰素是干扰素α2b或干扰素α2α1。
在一些方面,本发明的方法包括通过膀胱内施用传递增强试剂和治疗性蛋白或编码治疗性蛋白的核酸来处理确定了内部空间、窦、心室、通路、体积、腔、空隙或排列有或含有上皮膜的腔的任何器官或组织。确定这种器官或组织的表面或壁用于保留或延迟或限制大量液体流动或药物组合物向身体另一部分的转移并且允许上皮膜与药物组合物接触更长时间。该器官或组织可是在内表面具有上皮膜的囊(例如,膀胱)。在一些实施方案中,器官是胃、子宫、肠、食道、口、结肠、上或下GI道、上或下呼吸道。在一些实施方案中,器官或组织确定了如腹膜腔的空间,并且上皮表面位于能与腹膜腔内空间进行液体接触的上皮表面。在一些实施方案中,器官或组织具有癌症、增生性疾病或感染性疾病,治疗性蛋白是干扰素并且传递增强试剂是SYN3或SYN3类似物。
附图简述
图1是文中所述实验中使用的复制缺陷型重组腺病毒基因传递系统的示意图,这些实验证实传递增强试剂在肿瘤细胞内提高基因表达的作用。
图2描述了含有重组腺病毒干扰素基因传递系统和SYN3的药物组合物在皮下异种移植肿瘤模型中的抗肿瘤效力。在携带有得自成胶质细胞瘤(LN229,U87MG)、肝细胞瘤(HEP3B)和CML(K562)的肿瘤的裸鼠中肿瘤内施用rAd-IFN后观察对肿瘤生长的抑制作用。通过肿瘤内施用抑制皮下异种移植肿瘤的生长。5只小鼠的各组3天/周注射载体、rAd-对照或rADd-IFN(1×1010颗粒/剂量;总剂量为6×1010个颗粒),共进行两周。
图3显示了SYN3在大鼠中提高重组腺病毒基因传递系统的传递能力。雌性Sprague-Dawley大鼠接受45分钟的膀胱内施用SYN3制剂(载体配制成1mg/ml)配制的或单用载体(0.1%吐温-80)的rAd-β-gal(7.6×1010P/ml)。48小时后处死大鼠,收集其膀胱,固定并用X-gal染色用于lacZ表达。
图4显示了含有干扰素基因传递系统和SYN3的药物组合物在小鼠膀胱肿瘤模型中对肿瘤的作用。雌性裸鼠经尿道插入导尿管并接受100ml胰蛋白酶-EDTA(0.25%)30分钟,然后接受UMUC-3细胞(1×107;100ml)3小时。6天后,通过膀胱内施用对动物给药2×(24小时间隔,第6天、第7天)rAd-IFN或rAd-对照(1×1011/100μl)或仅是SYN3(1mg/ml)。肿瘤细胞植入21天后,处死动物,将其膀胱收集入福尔马林进行宏观检查并对肿瘤荷载评分。肿瘤按以下标准评分:0=无肿瘤;1=<25%的膀胱腔封闭;2=25-50%的膀胱腔封闭;3=>50%的膀胱腔封闭。
图5提供了有关于基因传递提高系统结合的SYN3在浅表性膀胱癌的常位肿瘤模型中的效力的数据,其中浅表性肿瘤是通过胰蛋白酶预处理后膀胱内施用绿色荧光蛋白(GFP)稳定转染的人KU-7膀胱癌细胞在无胸腺小鼠的膀胱中建立的。通过手术暴露与照射膀胱来激活GFP荧光,其后对肿瘤大小的评价可不处死动物而在体内监测。允许肿瘤细胞生长10天,在此基础上利用手术暴露膀胱并照射,拍下每只动物的荧光肿瘤荷载的照片。处理前后含有肿瘤细胞的膀胱的面积相对于膀胱总面积的百分率也用图形分析软件确定。小鼠连续两天接受膀胱内施用100μl
rAd(1×1011P/ml),1小时。比较4个处理组:rAd-IFN/SYN3、rAd-β-gall/SYN3、单用rAd-IFN或单用SYN3。处理21天(引发肿瘤生长后第31天)后,再次使膀胱膨胀,手术暴露并再次按照上述方法测量GFP肿瘤荷载。接受rAd-IFN/SYN3的动物在一段时间后肿瘤荷载显著缩小。
图6显示了含有SYN3和干扰素基因传递系统的药物组合物对血液、尿液和膀胱组织中干扰素水平的作用。小鼠接受膀胱内施用SYN3制剂(1mg/ml)配制的rAd-IFN(IACB)或rAd-对照(ZZCB)(100μl;7.4×1010P/ml)。处理两天后,从每只动物中获取尿液和血清,然后在此基础上处死动物并收集其膀胱,匀浆化并分析IFN的水平。该数据表明干扰素的表达水平可通过尿液测定来确定并且在膀胱内施用编码干扰素的基因传递系统后未观察到动物系统性暴露于干扰素蛋白。
图7描述了一种合成SYN3的方法,
图8显示了与PBS相比,各种时间点的SYN3制剂在大鼠中对通过膀胱上皮摄取干扰素的作用。由于杂交IFN蛋白的供应有限,基本上使用IFNα2b(Intron A)。出于比较目的,时间t=0的时间点处也包括杂交蛋白。
图9显示了与PBS相比,SYN3制剂在大鼠中对2′,5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)的干扰素表达的作用。
图10显示了与PBS相比,SYN3制剂在大鼠中对干扰素诱导的MX1表达的作用。
图11显示了与PBS相比,SYN3制剂在大鼠中对干扰素诱导的IRF1表达的作用。
图12显示了与PBS相比,SYN3制剂在大鼠中对INFγ的干扰素表达的作用。
发明详述
除非另有说明,文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。文中引用的每种出版物、专利申请、专利和其它参考文献在不与本发明内容冲突的程度上全文纳入作为参考。
如本说明书和附加的权利要求中所用,除非另有明确指出,单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数形式。
在一方面,本发明提供提高蛋白或核酸传递到具有上皮层或尿路上皮的组织的组合物和方法。在一个实施方案中,该方法使得组织或器官的细胞与结合了传递增强试剂的干扰素或编码干扰素的基因传递系统接触。
在一些实施方案中,本发明提供通过使上皮与传递增强试剂(例如,SYN3)接触来提高蛋白(例如,干扰素)传递至上皮的组合物和方法。在一个实施方案中,该方法使得膀胱的尿路上皮与1)干扰素或干扰素基因传递系统和2)SYN3或SYN3同系物接触。本发明涉及以下发现,即SYN3提高基因传递系统和蛋白传递至膀胱是高度有效的传递蛋白(例如,干扰素)生物活性的方法,其量和那些使用SYN3通过重组腺病毒基因治疗获得的量相当。这些结果特别表明SYN3提高干扰素的传递可用于治疗膀胱癌。这些结果也表明,总体上,SYN3及其同系物在穿过上皮障碍传递其它治疗性蛋白到上皮组织的细胞中也是有效的,特别是与尿路上皮相关的组织。
基因传递系统:
“基因传递系统”包括编码生物活性蛋白的重组多核苷酸,该多核苷酸操作性连接于表达控制序列来实现细胞中蛋白基因的表达。干扰素基因传递系统包括编码干扰素的重组多核苷酸,该多核苷酸操作性连接于表达控制序列来实现细胞中蛋白基因的表达。
术语多核苷酸指由核苷酸单体组成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸,例如脱氧核糖核苷酸(“DNA”)和核糖核酸(“RNA”)以及核酸类似物。核酸类似物包括那些非天然存在的碱基,通过非天然存在的磷酸二酯键与其它核苷酸相连的核苷酸或包括通过非磷酸二酯键相连的碱基的核苷酸。所以,核苷酸类似物包括,例如(但不限于)硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、亚磷酰胺、硼并磷酸盐、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)等。这种多核苷酸可合成,例如使用自动DNA合成仪。术语“核酸”通常指大的多核苷酸。术语“寡核苷酸”通常指短的多核苷酸,一般是少于50个核苷酸。应该理解的是,当核苷酸序列是DNA序列(即A、T、G、C)时,该核苷酸序列也包括RNA序列(即A、U、G、C),其中“U”取代“T”。“重组多核苷酸”指具有未天然连接在一起的序列的多核苷酸。扩增或装配的重组多核苷酸可包含在合适的载体中,并且该载体可用于转化对象的合适宿主细胞。含有重组多核苷酸的宿主细胞指“重组宿主细胞”。然后该基因在重组宿主细胞内表达来生产,例如“重组干扰素多肽”。
术语“编码”指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中特定的核苷酸序列的固有特性,所述多核苷酸是在生物过程中用作合成具有确定核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或氨基酸序列以及从中获得的生物特性的其它聚合物和大分子的模板。所以,如果转录并翻译基因产生的mRNA,则该基因在细胞或其它生物系统中编码蛋白质。一个基因或cDNA的编码链(与mRNA序列相同和一般提供于序列列表中的核苷酸序列)和非编码链(用作转录的模板)可涉及编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。除非另有说明,“编码干扰素氨基酸序列或多肽的核苷酸序列”包括相互的简并变体以及编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可含有内含子。
“表达控制序列”指调节操作性与其连接的核苷酸序列表达(转录和/或翻译)的多核苷酸中的核苷酸序列。“操作性连接的”指两部分之间的功能性关系,其中一部分的活性(例如,调节转录的能力)导致对另一部分起作用(例如,序列的转录)。表达控制序列可含有,例如(但不限于)启动子(例如,可诱导的或组成型的)、增强子、转录终止子、起始密码子(即,ATG)、内含子的剪接信号和终止密码子的序列。
表达载体含有用于表达的足够的顺式-作用元件;其它用于表达的元件可由宿主细胞的表达系统提供。表达载体包括所有本领域已知的载体,例如引入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如,裸露或包含于脂质体中)和病毒。
在一个实施方案中,通过使用启动子和/或感兴趣的组织优选使用的其它表达元件来利用特定的表达控制序列在特定类型的组织中提供干扰素基因的选择性表达。已知的组织特异性启动子的例子包括用于指导抗肌萎缩蛋白cDNA在肌肉和心脏组织中表达的肌酸激酶的启动子(Cox等.,Nature,364:725-729(1993));用于在B细胞中表达基因的免疫球蛋白重链和轻链启动子;分别靶向肝脏谱系细胞和肝细胞瘤细胞的白蛋白或α胎蛋白启动子。用于肝脏的示范性组织特异性表达元件包括(但不限于)HMG-CoA还原酶启动子(Luskey,Mol.Cell.Biol.,7(5):1881-1893(1987))甾醇调节元件1(SRE-1;Smith等.,J.Biol.Chem.,265(4):2306-2310(1990));烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PEPCK)启动子(Eisenberger等.,Mol.Cell.Biol.,12(3):1396-1403(1992));人C反应蛋白(CRP)启动子(Li等.,J.Biol.Chem.,265(7):4136-4142(1990));人葡糖激酶启动子(Tanizawa等.,Mol.Endocrinology,6(7):1070-81(1992));胆固醇7-α羟化酶(CYP-7)启动子(Lee等.,J.Biol.Chem.,269(20):14681-9(1994));β-半乳糖苷酶α-2,6唾液酸转移酶启动子(Svensson等.,J.Biol.Chem.,265(34):20863-8(1990));胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP-1)启动子(Babajko等.,BiochemBiophys.Res.Comm.,196(1):480-6(1993));醛缩酶B启动子(Bingle等.,BiochemJ.,294(Pt2):473-9(1993));人转铁蛋白启动子(Mendelzon等.,Nucl.Acids Res.,18(19):5717-21(1990));I型胶原启动子(Houglum等.,J.Clin.Invest.,94(2):808-14(1994))。用于前列腺的示范性组织特异性表达元件包括(但不限于)前列腺酸磷酸酶(PAP)启动子(Banas等.,Biochim.Biophys.Acta.,1217(2):188-94(1994));94前列腺分泌蛋白(PSP94)启动子(Nolet等.,Biochim.Biophys.ACTA,1098(2):247-9(1991));前列腺特异性抗原复合物启动子(Casper等.,J.SteroidBiochem.Mol.Biol.,47(1-6):127-35(1993));人腺体激肽释放酶基因启动子(hgt-1)(Lilja等.,World J.Urology,11(4):188-91(1993))。用于胃组织的示范性组织特异性表达元件包括(但不限于)人H+/K+-ATP酶α亚基启动子(Tanura等.,FEBS Letters,298:(2-3):137-41(1992))。用于胰腺的示范性组织特异性表达元件包括(但不限于)胰腺炎相关蛋白启动子(PAP)(Dusetti等.,J.Biol.Chem.,268(19):14470-5(1993));弹性蛋白酶1转录增强子(Kruse等.,Genes andDevelopment,7(5):774-86(1993));胰腺特异性淀粉酶和弹性蛋白酶增强子启动子(Wu等.,Mol.Cell.Biol.,11(9):4423-30(1991);Keller等.,Genes&Dev.,4(8):1316-21(1990));胰腺胆固醇酯酶基因启动子(Fontaine等.,Biochemistry,30(28):7008-14(1991))。用于子宫内膜的示范性组织特异性表达元件包括(但不限于)子宫球蛋白启动子(Helftenbein等.,Annal.NY Acad.Sci.,622:69-79(1991))。用于肾上腺细胞的示范性组织特异性表达元件包括(但不限于)胆固醇侧链切割(SCC)启动子(Rice等.,J.Biol.Chem.,265:11713-20(1990))。用于常规神经系统的示范性组织特异性表达元件包括(但不限于)γ-γ烯醇化酶(神经元特异性烯醇化酶,NSE)启动子(Forss-Petter等.,Neuron,5(2):187-97(1990))。用于大脑的示范性组织特异性表达元件包括(但不限于)神经丝重链(NF-H)启动子(Schwartz等.,J.Biol.Chem.,269(18):13444-50(1994))。用于淋巴细胞的示范性组织特异性表达元件包括(但不限于)人CGL-1/粒酶B启动子(Hanson等.,J.Biol.Chem.,266(36):24433-8(1991));末端脱氧转移酶(TdT)、λ5、VpreB和1ck(淋巴细胞特异性酪蛋白激酶p561ck)启动子(Lo等.,Mol.Cell.Biol.,11(10):5229-43(1991));人CD2启动子及其3′转录增强子(Lake等.,EMBO J.,9(10):3129-36(1990))与人NK和T细胞特异性激活(NKG5)启动子(Houchins等.,Immunogenetics,37(2):102-7(1993))。用于结肠的示范性组织特异性表达元件包括(但不限于)pp60c-src酪氨酸激酶启动子(Talamonti等.,J Clin.Invest,91(1):53-60(1993));器官特异性新抗原(OSNs)、分子量40kDa(p40)启动子(Ilantzis等.,Microbiol.Imnmunol.,37(2):119-28(1993));结肠特异性抗原-P启动子(Sharkey等.,Cancer,73(3增刊)864-77(1994))。用于乳房细胞的示范性组织特异性表达元件包括(但不限于)人α-乳白蛋白启动子(Thean等.,BritishJ.Cancer.,61(5):773-5(1990))。
术语“干扰素基因”用于指指导干扰素表达的基因。
文中使用的术语“基因”是指编码多肽的核酸序列。该定义包括各种序列多态性、突变和/或序列变体,其中这种改变不影响基因产物的功能。术语“基因”不仅包括编码序列,也包括调节区域,例如启动子、增强子和终止区域。该术语还包括所有内含子和剪接自mRNA转录物的其它DNA序列以及得自其它剪接位点的变体。编码多肽的核酸序列可是指导特定蛋白质或肽表达的DNA或RNA。这些核酸序列可是转录为RNA的DNA链序列或翻译为蛋白质的RNA序列。核酸序列包括全长核酸序列以及得自全长蛋白质的非全长序列。还要理解的是,序列包括天然序列的简并密码子或引入特定的宿主细胞来提供密码子优先选择的序列。
一方面,本发明提供通过使上皮细胞与传递增强试剂(例如,SYN3或SYN3同系物)接触来提高蛋白质(例如,干扰素)传递至上皮的一种组合物和方法。蛋白质可是细胞因子(例如,白介素、干扰素、集落刺激因子)、抗转移因子或肿瘤抑制蛋白质。在一些实施方案中,蛋白质是任何一种或多种巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、粒细胞集落刺激因子(MCSF)、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、白介素-9(IL-9)、白介素-11(IL-11)、白介素-12(IL-12)、白介素-13(IL-13)、白介素-18(IL-18)、热激蛋白(HSP)、p53和抗血管生成因子(抗血管内皮细胞生长因子(VEGF)的血管生成作用的蛋白质药物)、抗转移因子(例如,金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP))与增加BCG活性的因子。
在一些实施方案中,蛋白质治疗的蛋白质是抗体,该抗体可是单克隆抗体或多克隆抗体或Fab片段。抗体可是嵌合的或人源化的。这些抗体包括(但不限于)细胞因子与I型及和II型干扰素(例如,抗干扰素-α、抗干扰素-β、抗干扰素-δ、抗干扰素-γ)的抗体,和抗白介素的抗体(例如,抗IL-1、抗IL-2、抗IL-4、抗IL-6、抗IL-7和抗IL-10)。在本发明的内容中,抗体应理解为包括,例如单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如,Fab和F(ab’)2)与重组产生的结合配偶体。抗体应理解为如果Ka大于或等于10-7M,可对靶反应。
本领域的普通技术人员可容易地从各种温血动物生产多克隆抗体。使用常规技术也可容易地生产单克隆抗体(参见,例如美国专利号RE 32,011;4,902,614;4,543,439和4,411,993;也参见,Kennett,McKearn和Bechtol编,《单克隆抗体,杂交瘤:生物分析的新量纲》(Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A NewDimension in Biological Analyses),Plenum Press,(1980);与Harlow和Lane编,《抗体:实验室手册》(Antibodies:A Laboratory Manual),冷泉港实验室出版社,(1988))。一些实施例中将进一步描述优选抗体的制备。
文中使用的术语干扰素是指包括所有类型和亚类的干扰素多肽以及缺失、插入或取代变体,包括其保守的氨基酸取代、生物活性多肽片段和等基因形式。本领域的普通技术人员已知各种合适的干扰素多肽。在一些实施方案中,干扰素多肽是I型或II型干扰素,包括通常命名为alpha-干扰素、beta-干扰素、gamma-干扰素和omega-干扰素(例如,α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素和ω-干扰素)及其组合(包括α-干扰素的共有序列)。在一些实施方案中,α-干扰素是α或α2-干扰素。在一些实施方案中,基因编码干扰素α-2b。
在一些实施方案中,干扰素蛋白质(以蛋白质施用或由基因传递系统编码)是野生型干扰素多肽。在其它实施方案中,干扰素是与野生型干扰素多肽基本上相同或是其融合蛋白。在两条或多条多核苷酸或多肽序列的上下文中的术语“相同”或“同一性”百分率指当比较或比对最大一致性时,两条或多条序列是相同的或具有特定百分率的核苷酸或氨基酸残基相同。在两条核酸或多肽的上下文中的术语“基本上相同”指如同使用BLAST算法(如Altschul等所述,J.Mol.Biol.,215:403-410(1990))测量到的,当比较或比对最大一致性时,两条或多条序列具有至少70%的核苷酸或氨基酸残基同一型。用于进行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/))为公众可用。除了计算序列同一性百分率,BLAST算法也用于在两条序列之间进行统计学分析(参见,例如,Karlin&Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.美国,90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小概率总和(P(N)),该总和说明在两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的可能性。例如,如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小概率总和小于约0.1、更优选小于约0.01、最优选小于约0.001,则该核酸被认为与参考核酸相似。
在其它实施方案中,干扰素多肽(以蛋白质施用或由基因传递系统编码)基本上与天然或野生型多肽在跨越50个氨基酸、100个氨基酸、150个氨基酸的延伸段序列相同或与全长天然多肽的序列相同。在一些实施方案中,干扰素多肽(以蛋白质施用或由基因传递系统编码)与野生型干扰素多肽在跨越50个氨基酸、100个氨基酸的延伸段或与全长天然多肽序列的99%、98%、95%或90%相同。在一些实施方案中,干扰素多肽(以蛋白质施用或由基因传递系统编码)与人野生型α-干扰素多肽在跨越50个氨基酸、100个氨基酸的延伸段或与全长天然多肽序列基本相同。在一些实施方案中,基因传递系统编码的干扰素多肽(以蛋白质施用或由基因传递系统编码)与人野生型多肽在跨越50个氨基酸、100个氨基酸、150个氨基酸的延伸段或与全长天然多肽序列的99%、98%、95%或90%相同。
在一些实施方案中,干扰素(以蛋白质施用或由基因传递系统编码)是杂交干扰素。含有不同的干扰素亚型序列的杂交α-干扰素基因的构建披露于美国专利号4,414,150;4,456,748和4,678,751。美国专利号4,695,623;4,897,471和5,831,062披露了新颖的人白细胞干扰素多肽,该多肽具有的氨基酸序列含有在天然存在的α干扰素亚型多肽中各位置发现的普通或主要氨基酸并涉及共有人白细胞干扰素。在本发明的一个实施方案中,杂交干扰素是干扰素α2α1。
在一些实施方案中,干扰素(以蛋白质施用或由基因传递系统编码)是干扰素-α。例如,重组干扰素α在大肠杆菌中克隆或表达(例如,Weissmann等.,Science,209:1343-1349(1980);Sreuli等.,Science,209:1343-1347(1980);Goeddel等.,Nature,290:20-26(1981);Henco等.,J.Mol.Biol.,185:227-260(1985))。在一些这样的实施方案中,干扰素是人干扰素α。在一些实施方案中,干扰素α是干扰素2a或2b(参见,例如WO91/18927)。在一些实施方案中,蛋白质是具有抗癌、抗感染或免疫系统调制生物活性的干扰素。在一些实施方案中,施用的干扰素蛋白是半合成的蛋白质-聚合物偶联物(例如,PEG化的干扰素)。在一些示范性实施方案中,干扰素是具有抗感染和抗肿瘤活性的I型干扰素-α(IFN-α)或PEG化的IFN-α2b。可连接上12,000-Da的单甲氧基聚乙二醇(PEG-12000)聚合物。PEG偶联被认为增加了血清半衰期并藉此延长了患者与
IFN-α2b的接触而不改变该蛋白的生物效力。
术语“多肽”指由氨基酸残基、相关的天然存在的结构变体、通过肽键相连的其非天然存在的合成类似物、相关的天然存在的结构类似物及其非天然存在的合成类似物组成的聚合物。合成的多肽可例如使用自动多肽合成仪合成。术语“蛋白质”一般指大的多肽。术语“肽”一般指短的多肽。术语“保守取代”指在多肽中用功能或结构类似的氨基酸取代某氨基酸。以下6组各含有可互相保守取代的氨基酸:
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T);
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
文中使用的术语“生物活性”指通过本领域熟知的技术测量的任何抗病毒或抗增生或抗癌症活性(参见,例如,Openakker等,同上;Mossman,J.Immunol.Methods,65:55(1983))。
“等位基因形式”指占据同一遗传座的多肽的两种或多种多态性形式中的任一种。等位基因变体可通过突变天然发生,并且可在群体内导致表型多态性。基因突变可是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。“等位基因形式”也指得自遗传等位基因变体的mRNA转录物的cDNA多肽。在一些实施方案中,干扰素是等位基因形式的。
文中使用的术语“烷基”表示具有指定碳原子数(即,C1-C10指1到10个碳原子)的支链、非支链或环状的烃取代基或其组合,这些烃类取代基可是完全饱和的、单或多不饱和的并可含有二和多价取代基。饱和的烃取代基的例子包括(但不限于)甲基、乙基、正-丙基、异-丙基、正-丁基、仲-丁基、异-丁基、叔-丁基、十八烷基、2-甲基戊基、环己基、(环己基)甲基、环戊基甲基。这些取代基可任选用一种或多种通常连接到这种链上的官能团取代(例如羟基、溴、氟、氯、碘、巯基、或硫代、氰基、硫代烷基、芳基、杂芳基、羧基、硝基、氨基、烷氧基、酰氨基等)来形成烷基取代基,例如羧甲基、三氟甲基、3-羟基己基、2-羧基丙基等。未饱和的烷基取代基具有一个或多个双键或三键。未饱和烷基基团的例子包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基和更高的同系物和异构体。取代基可用通常连接到所述用于饱和烃类的这种链上的一种或多种官能团取代。
术语“芳基”指多不饱和的(通常是芳香的)烃取代基,所述取代基是融合在一起或共价连接的单环或多环(达3个环)。
术语“杂芳基”指含有0到4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环),其中N和S原子可任选被氧化,并且氮原子可任选被季胺化。杂芳基可通过杂原子连接到分子的剩余部分。芳基和杂芳基的非限制性例子包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。以上芳基和杂芳基环系统还可被一种或多种通常连接于这种环系统的官能团取代,所述的官能团例如羟基、溴、氟、氯、碘、巯基、硫代、氰基、硫代烷基、羧基、硝基、氨基、烷氧基或酰氨基。
术语“酰基”表示-C(O)R-取代基,其中R是如上定义的烷基或芳基,例如(但不限于)苯甲酰基、琥珀酰基、乙酰基、丙酰基或丁酰基。
术语“羟基”表示取代基-OH-。
术语“烷氧基”表示取代基-OR-,其中R是烷基。
术语“氨基”表示胺键(-NRR′),其中R和R’独立地是氢取代基、烷基取代基或芳基取代基。
术语“羧酸酯”表示取代基-OC(O)R-,其中R是任选取代的烷基或芳基。
术语“酰氧基”表示取代基-(CRR’)mC(O)OR”-,其中R和R’独立地选自烷基取代基、芳基取代基或氢取代基,R”是氢或烷基取代基,m是1-8之间包括1和8的整数。
术语“卤素”或“卤代”指取代基F、Cl、Br或I。
术语“糖残基”指包括连接有多个作为同源-寡糖取代基(含有一种类型的单糖的寡糖)或异源寡糖取代基(含有多种类型的单糖的寡糖)的单糖取代基的单糖取代基。在一个优选的实施方案中,同源和异源-寡糖取代基由2到10个单糖单元组成。单糖可含有戊糖或己糖残基,并且这些残基可以环化或未环化(开链)形式存在。当单糖呈开链形式时,羰基碳的氧原子可被-RR’-取代,其中R和R’独立地选自烷基取代基、卤素取代基、羟基取代基、氢取代基、氨基取代基或烷氧基取代基。优选的寡糖包括戊糖-戊糖二糖基团,己糖-己糖二糖基团、戊糖-己糖二糖基团和己糖-戊糖二糖基团。单糖可选自核糖、阿拉伯糖、木糖和来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖或塔罗糖,藉此单糖上的一个或多个羟基可被氢、卤素、烷基取代基、烷氧基取代基、氨基取代基或酰基取代基取代。
膀胱上皮或“尿路上皮”排列于膀胱内表面并接近其内含物。尿路上皮也排列在肾盂、输尿管和膀胱的内表面并形成保留尿液的牢固屏障,同时防止离子、溶质和有毒代谢物穿过上皮屏障的未调节运动。当器官在压力下随着其注入和清空经历循环变化时,通常该渗透性屏障必须维持均匀。大多数膀胱癌发生于这种上皮细胞。由于尿路、输尿管和肾盂也排列有这种过渡上皮,在这些位点也可发生膀胱中相同类型的癌症。在一些实施方案中,方法和组合物可用于治疗位于尿路、输尿管和肾盂的这些位点的癌症。
基因传递系统一般以能在真核细胞中指导干扰素基因表达的真核表达载体的形式提供。真核表达载体的例子包括病毒和非病毒载体。术语“真核表达载体”指通过常规重组DNA技术制备的含有干扰素表达盒的病毒或非病毒载体。文中使用术语“表达盒”来定义能指导干扰素编码序列转录和翻译的核苷酸序列,而该核苷酸序列含有操作性连接于干扰素编码序列的表达控制元件来使得干扰素序列在转导的哺乳动物细胞中转录和翻译。用于实现核苷酸序列在转导细胞中表达的各种病毒和非病毒传递载体是本领域已知的。参见,例如Boulikas,T在《基因治疗和分子生物学》(Gene Therapy and Molecular Biology),卷1(Boulikas,T.编)1998Gene Therapy Press,Palo Alto,CA1-172页。
用于将干扰素基因引入靶细胞的非病毒传递系统的例子包括能指导干扰素表达的表达质粒。表达质粒是自发复制的、染色体外的环状DNA分子,其不同于常规基因组,在非选择性条件下对细胞生存不重要,并且在靶细胞中可实现DNA序列的表达。表达质粒也含有启动子、增强子或者帮助治疗性基因表达和/或分泌的其它序列也可包括于表达载体中。可包括额外基因,例如编码药物抗性的基因来选择或筛选重组载体。这种额外基因可含有,例如编码新霉素抗性、多药抗性、胸腺嘧啶激酶、β-半乳糖苷酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)和氯霉素乙酰转移酶的基因。
含有干扰素基因的表达质粒可包囊在脂质体中。脂质体包括乳剂、泡沫、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、薄片层等。使用脂质体载体将核酸传递至细胞是本领域熟知的。如Szoka等.,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980),Szoka等.,1983年7月19日出版的美国专利号4,394,448以及美国专利号4,235,871,4,501,728,4,837,028和5,019,369所述,各种方法可用于制备脂质体。在实践本发明中有用的脂质体可从一种或多种标准的成泡脂质形成,该脂质通常含有中性和带负电荷的磷脂和甾醇,例如胆固醇。这种成泡脂质的例子包括美国专利号5,650,096中披露的DC-chol、DOGS、DOTMA、DOPE、DOSPA、DMRIE、DOPC、DOTAP、DORIE、DMRIE-HP、正-亚精胺胆固醇氨基甲酸酯和其它阳离子脂质。一般考虑到,例如脂质体大小、酸不稳定性和脂质体在血流中的稳定性来指导选择脂质。其它成分可加入脂质体制剂来增加血清半衰期,例如于1991年5月7日出版的美国专利号5,013,556和1993年5月25日出版的美国专利号5,213,804中所述的聚乙二醇包膜(称为“PEG化”)。
为将非病毒干扰素基因传递系统直接传递至特定的细胞,把有助于细胞靶向的元件掺入非病毒传递系统是有利的。例如,包囊表达质粒的脂质可含有修饰的细胞表面受体配体来帮助靶向。虽然可施用简单的脂质体制剂,注入或修饰有所需的本发明组合物的脂质体可系统传递或导向感兴趣的组织,然后脂质体在该处传递选择的治疗性/免疫原性肽组合物。这种配体的例子包括抗体、单克隆抗体、人源化抗体、单链抗体、嵌合抗体或其功能片段(Fv、Fab、Fab’)。此外,如Wu等.,1992年11月24日出版的美国专利号5,166,320和Wu等.,1997年6月3日出版的美国专利号5,635,383中所述,本发明的DNA构建物可通过聚赖氨酸部分连接于靶向部分。
如本发明的一个实施方案说明的,载体是病毒载体。文中使用的术语病毒和病毒载体可互换。在实践本发明中有用的病毒包括重组修饰的包被或非包被DNA和RNA病毒,优选选自杆状病毒科、细小病毒科、picornoviridiae、疱疹病毒科、痘病毒科、腺病毒科或小RNA病毒科。病毒基因组可通过常规重组DNA技术修饰来提供干扰素的表达并且可改造成复制缺陷的、有条件地复制或具有复制能力。利用每种亲本载体性能的有利元件的嵌合病毒载体(参见,例如,Feng等.,(1997)Nature Biotechnology15:866-870)也可用于实践本发明。最小载体系统也可用于实践本发明,该系统中的病毒骨架仅含有包装病毒载体所需的序列,可任选含有干扰素表达盒。在一些实例中,使用衍生自有待处理的不同种类的载体是有利的,这些载体具有有利的致病性特征,例如避免先存在的免疫应答。例如,1998年8月5日公布的WO98/27216中描述的用于人基因治疗的马疱疹病毒载体。由于马疱疹病毒对人没有致病性,这些载体描述为可用于治疗人。类似地,由于据称羊腺病毒可避免抗人腺病毒载体的抗体,它可用于人基因治疗。这种载体描述于1997年4月10日公布的WO 97/06826。
许多病毒表现出感染广范围的细胞类型的能力。然而,在一些应用中可能需要仅感染某些细胞的亚群。因此,开发了各种技术来帮助选择性或“靶向”载体以导致特定细胞类型的成熟病毒颗粒的优先感染性。细胞类型特异性或细胞类型靶向也可通过修饰病毒包被蛋白质从具有广泛感染性特征的病毒衍生的载体来实现,例如腺病毒。例如,可通过选择性修饰病毒基因组染色质结和纤维编码序列来表达修饰染色质结和具有与独特的细胞表面受体相互作用的纤维结构域,从而用腺病毒载体实现细胞靶向。这种修饰的例子描述于Wickham等,(1997)J.Virol.71(11):8221-8229,“将RGD肽掺入腺病毒纤维蛋白中”(incorporation of RGD peptides into adenoviral fiber proteins);Arnberg等,(1997)Virology227:239-244,“修饰腺病毒纤维基因来实现对眼睛和生殖道的趋向性”(modification of adenoviral fiber genes to achieve tropism to the eye andgenital tract);Harris和Lemoine,(1996)TIG12(10):400-405;Stevenson等,(1997)J.Virol.71(6):4782-4790;Michael等,(1995)gene therapy 2:660-668,“将胃泌素释放肽片段掺入腺病毒纤维蛋白”(incorporation of gastrin releasing peptidefragment into adenovirus fiber protein)和Ohno等,(1997)Nature Biotechnology15:763-767,“将蛋白质A-IgG结合结构域掺辛德毕斯病毒”(incorporation ofProteinA-IgG binding domain into Sindbis virus)。其它细胞特异性靶向的方法通过将抗体或抗体片段偶联至包被蛋白来实现(参见,例如Michael等,(1993)J.Biol.Chem.268:6866-6869;Watkins等,(1997)Gene Therapy4:1004-1012;Douglas等,(1996)Nature Biotechnology 14:1574-1578)。含有一个或多个这种靶向修饰的病毒载体可任选用于实践本发明来提高选择性感染和干扰素在肺组织中表达,特别是肺的上皮组织。
如本发明的一个实施方案所说明的,载体是腺病毒载体。术语腺病毒载体总体指乳腺腺病毒属的动物腺病毒,包括(但不限于)人、牛、羊、马、犬、猪、鼠和猿腺病毒亚属。特别是,人腺病毒包括A-F亚属及其独立的血清型、独立的血清型和A-F亚属,包括(但不限于)人腺病毒类型1、2、3、4、4a、5、6、7、8、9、10、11(Ad11A和Ad11P)、12、13、14、15、16、17、18、19、19a、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34a、35、35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48和91。术语牛腺病毒包括(但不限于)牛腺病毒类型1、2、3、4、7和10。术语犬腺病毒包括(但不限于)犬类型1(毒株CLL,Glaxo,RI261,Utrect,Toronto26-61)和2。术语马腺病毒包括(但不限于)马类型1和2。术语猪腺病毒包括(但不限于)猪类型3和4。腺病毒用于传递外源性转基因是本领域熟知的。参见,例如Zhang,W-W,(1999)Cancer Gene Therapy6:113-138。在一个实施方案中,表达干扰素序列的腺病毒载体是血清亚型2或5的复制缺陷型人腺病毒,该病毒通过消除腺病毒E1基因产生得到基本上在靶组织中不能复制的病毒并任选包括缺失蛋白质IX功能。优选的重组病毒载体是缺失蛋白质IX基因的腺病毒载体传递系统。这种系统参见美国专利号6,210,939所披露的,该专利转让给与本发明相同的受让人并出于所有的目的全文纳入作为参考。
优选的载体衍生自腺病毒、腺相关病毒和逆转录病毒基因组。在最优选的本发明实践中,载体衍生自人腺病毒基因组。优选的载体衍生自人腺病毒血清型2或5。可通过在E1 a和/或E1 b编码区域修饰或缺失来减弱这种载体的复制能力(到被认为是“复制缺陷型”的程度)。实现特定的表达特性或允许反复施用或降低免疫应答的对病毒基因组的其它修饰是优选的。
此外,病毒基因组可是有条件复制或具有复制能力。有条件复制的病毒载体用于实现在特定细胞类型中选择性表达而避免难对付的广谱感染。可修饰病毒基因组使之含有仅在某些条件下复制或表达的可诱导启动子。可诱导启动子的例子是本领域已知的(参见,例如Yoshida和Hamada(1997)Biochem.Biophys.Res.Comm.230:426-430;Iida等,(1996)J.Virol.70(9):6054-6059;Hwang等,(1997)J.Virol71(9):7128-7131;Lee等,(1997)Mol.Cell.Biol.17(9):5097-5105和Dreher等,(1997)J.Biol.Chem.272(46):29364-29371)。这些病毒也可被设计为选择性复制病毒,例如描述于Ramachandra等,PCT国际公布号WO 00/22137、2000年4月20日公布的国际申请号PCT/US99/21452和Howe,J.,PCT国际公布号WO WO0022136、2000年4月20日公布的国际申请号PCT/US99/21451中的那些病毒。这些病毒也可被修饰为减弱其在某些细胞类型中的复制。例如在E1b55K基因中含有特定缺失的腺病毒d11520(Barkerh Berk(1987)Virology156:107)在人类中使用具有疗效。这种载体也描述于McCormick(1997年10月14日出版的美国专利号5,677,178)和McCormick,1998年12月8日出版的美国专利号5,846,945。
修饰本发明的载体通过使用IRES元件或通过独立地调节启动子以串联形式将额外的转基因编码进干扰素基因。
本发明提供传递增强化合物,当其与蛋白质(例如干扰素)或核酸配制时可提高蛋白质或核酸传递至靶组织或器官的上皮。“一种传递增强化合物”或“传递增强试剂”包括膀胱内施用时可提高蛋白质或核酸传递至上皮或尿路上皮的任何化合物。就蛋白质而言,提高的传递可通过与靶组织或器官的上皮细胞接触或进入上皮细胞(例如,尿路上皮)的蛋白质量的增加来确定。测定特定化合物在提高蛋白质传递中是否有效可容易地被本领域的普通技术人员确定。尿路上皮对蛋白质的滞留可通过任何方法测量,例如ELISA、检测荧光标记、调制包括基因表达在内的细胞活性。
就基因传递系统而言,本发明提供一种传递增强化合物,该化合物提高干扰素基因传递至靶细胞、组织或器官。提高的传递可通过干扰素基因的拷贝数或进入每个细胞的基因传递系统数的增加或摄取干扰素基因或干扰素基因传递系统的细胞群体在,例如组织或器官中比例的增加来确定。相对于当无传递增强化合物的情况下施用时在细胞中传递和表达的基因量,结合了传递增强化合物的干扰素基因传递系统施用至组织或器官导致细胞内传递和表达的干扰素基因量的增加。特定化合物在提高核酸传递系统的传递中是否有效可通过本领域技术人员已知的任何方法来确定。为评价翻译和蛋白质表达,可将报道基因,例如β-半乳糖苷酶或绿色荧光蛋白渗入核酸传递系统来产生容易分析的信号以评价提高基因表达的水平。为评价转录和复制,可通过PCR分析评价DNA拷贝的存在。
某些传递增强化合物可具有不对称的碳原子(光学中心)或双键;外消旋体、非对映异构体、几何异构体和独立的异构体均包括在本发明的范围内。成双对映异构体的单一非对映异构体,例如可通过分部结晶从合适的溶剂中获得,例如甲醇或乙酸乙酯或其混合物。如此获得的成双对映异构体可通过常规方法分为单独的立体异构体,例如通过使用光学活性酸作为拆分试剂。此外,本发明化合物的任何对映异构体可使用已知构型的光学纯的起始材料或试剂通过立体特异性合成获得。
传递增强化合物可有不同的氢连接位点,称为互变异构体。例如称为酮-烯醇互变异构体的酮与其烯醇形式。单独的互变异构体及其混合物包括在本发明的分子式中。
传递增强化合物可在一个或多个其原子中含有非天然比例的原子同位素。例如,化合物可用同位素进行放射性标记,例如氚或碳-14。本发明的化合物的所有同位素变化,无论是否具有放射性均包括在本发明的范围内。当在化合物的分子式中描述到一个“基团”或“部分”连接于该化合物的另一部分时,应理解为对应于“基团”或“部分”的基团的一个氢原子被除去以形成该基团。传递增强化合物可以其药学上可接受的酸加成盐的形式分离,例如使用无机或有机酸得到的盐。这种酸可包括盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、马来酸、琥珀酸、丙二酸等。此外,含有酸性功能的某些化合物可是其无机盐的形式,其中平衡离子可选自钠、钾、锂、钙、镁等,以及选自有机碱。术语“药学上可接受的盐”指从药学上可接受的非毒性碱或酸制备的盐,包括无机碱或酸和有机碱或酸。
示范性的传递增强化合物见美国专利号6,165,779和1997年7月8日提交的美国专利申请号08/889,355和2000年8月28日提交的美国专利申请号09/650,359,这些专利均转让给与本申请相同的受让人并全文纳入作为参考。这种化合物包括(但不限于)洗涤剂、醇类、乙二醇、表面活性剂、胆汁盐、肝素拮抗剂、环加氧酶抑制剂、高渗盐溶液和乙酸盐。醇类包括(但不限于),例如脂肪族醇,如乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇、乙酰醇(acetyl alcohol)。乙二醇包括,例如甘油、丙二醇、聚乙二醇和其它低分子量的二醇(例如甘油和硫甘油)。乙酸盐(例如乙酸、葡糖酸)和乙酸钠还是传递增强化合物的例子。高渗盐溶液(例如1M NaCl)也是传递增强化合物的例子。表面活性剂的例子包括十二烷基硫酸钠(SDS)和溶血卵磷脂、聚山梨酯80、壬基苯氧基-聚氧乙烯、溶血磷脂酰胆碱、聚乙二醇400、聚山梨酯80、聚氧乙烯醚、聚乙二醇醚表面活性剂和DMSO。也可使用胆汁盐,例如牛磺胆酸盐、牛磺脱氧胆酸钠、脱氧胆酸盐、鹅脱氧胆酸盐、甘氨胆酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸(glycochenodeoxycholic acid)和其它收敛剂(如硝酸银)。可使用的肝素-拮抗剂是季胺类,例如鱼精蛋白硫酸盐。环加氧酶抑制剂,例如水杨酸钠、水杨酸和非甾体消炎药(NSAID),例如吲哚美辛、萘普生和双氯芬酸也是合适的。
可用作传递增强化合物的洗涤剂包括,例如阴离子、阳离子、两性离子和非离子洗涤剂。示范性的洗涤剂包括(但不限于)牛磺胆酸盐、脱氧胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、十六烷基吡啶鎓、苯扎氯铵、3-14洗涤剂、CHAPS(3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸酯水合物,Aldrich)、BigCHAP、脱氧Big CHAP、-X-100洗涤剂、C12E8、辛基-B-D-吡喃葡糖苷、洗涤剂、20洗涤剂和80洗涤剂(Biochemicals)。
优选的传递增强化合物的例子是,胆酸盐衍生物的Big CHAP(参见,例如,Helenius等.,(1979)“洗涤剂的性能”(Properties of Detergents),Methods inEnzymology,66卷,734-749。特别优选的传递增强化合物是式I、II、III、VI和VII所示的化合物及其药学上可接受的盐。
在其它的实施方案中,本发明提供含有干扰素和至少一种如式I所示的传递增强化合物的组合物:
其中X1和X2选自
并且X3是糖类基团,其中糖类基团可选自戊糖单糖基团、己糖单糖基团、戊糖-戊糖二糖基团、己糖-己糖二糖基团、戊糖-己糖二糖基团和己糖-戊糖二糖基团。其它糖类基团可包括连接为同源寡糖或异源寡糖的多个单糖。优选的单糖包括戊糖和/或己糖残基。例如,糖类基团可选自戊糖单糖基团、己糖单糖基团、戊糖-戊糖二糖基团、己糖-己糖二糖基团、戊糖-己糖二糖基团和己糖-戊糖二糖基团。X3的优选糖类基团的一个实例是乳糖。
在一些实施方案中,式I所示的传递增强化合物具有由3个或更多个单糖组成的X3糖类基团。糖类基团优选具有1个到8个之间的单糖,更优选1个到4个之间的单糖,最优选约2到3个之间的单糖。使用三糖,例如可提供具有增加溶解性的化合物。
在其它实施方案中,X1和X2均是
并且X3是葡萄糖基团。
本发明使用的示范性传递增强化合物包括式II所示的化合物:
其中R1和R2各自独立地选自氢和羟基基团;m和n各自独立地选自约0-2;R3选自-NR4R5,其中R4和R5各自独立地选自氢、糖类残基、任选取代的烷基、任选取代的酰基、任选取代的酰氧基、和季胺盐-NR6R7R8X,其中R6、R7和R8独立地选自氢和C1-C4烷基并且X是选自药学上可接受的平衡离子的带负电荷的离子结合平衡离子。在一些实施方案中,平衡离子是卤素或任选取代的酸酸酯。
在一个实施方案中,式II所示的示范性化合物具有均为羟基基团的R1和R2。在另一个实施方案中,式II所示化合物的m和n各自等于1。在另一个实施方案中,式II所示化合物的R4是氢;R5选自氢、糖类残基、任选取代的烷基、任选取代的酰基、任选取代的酰氧基。
在一个实施方案中,传递增强化合物如式VI所示:
在另一个实施方案中,传递增强化合物如式VII(SYN3)所示:
在另一个实施方案中,R4或R5中至少一个是琥珀酰基或乙酰基。在另一个实施方案中,R3是三甲基铵盐。
在另一个实施方案中,R4和R5各自独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的酰基、任选取代的酰氧基、和季胺盐-NR6R7R8X,其中R6、R7和R8独立地选自氢和C1-C4烷基并且X是选自药学上可接受的平衡离子的带负电荷的离子结合的平衡离子。
用于本发明方法和组合物的优选的传递增强化合物的一个例子是式VII所示的SYN3。生产SYN3及其同系物的方法见美国专利号6,392,069,该专利转让给本申请相同的受让人并且全文纳入作为参考。
对于一些应用,需要使用相比于其它化合物其水溶解性和/或传递增强活性增加的本发明方法和组合物中的传递增强化合物。示范性传递增强化合物如式I所示,其中R是阳离子基团。合适的阳离子基团包括,例如四甲基和铵部分及其盐。
在另一方面,本发明提供用于将蛋白质膀胱内施用至膀胱的药物组合物,该组合物含有蛋白质和传递增强试剂。在一些实施方案中,传递增强试剂含有SYN3或SYN3同系物。在一些实施方案中,传递增强试剂是SYN3或SYN3同系物。在一些实施方案中,传递增强试剂是SYN3而蛋白质是干扰素。在一些实施方案中,该组合物含有干扰素和SYN3(例如,一种干扰素,约0.1到10mg/ml SYN3,一种SYN3增溶剂(例如,一种表面活性剂,包括Big CHAP或羟丙基β环糊精(HPβCG)或TRITONTM-X-100洗涤剂/一种辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)),缓冲液和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中,干扰素是α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素或ω-干扰素或其融合体。在一个实施方案中,制剂中SYN3的量是1-10mg/ml。组合物可冻干并在使用前用合适的药学载体稀释。
在一些实施方案中,本发明也提供一种含有蛋白质和传递增强化合物的药物组合物。制剂中传递增强化合物的浓度取决于许多因素,例如使用的具体蛋白质和传递增强化合物、缓冲液、pH和施用方案。传递增强化合物的浓度基本上取决于蛋白质及其溶解性。就在较高浓度有效的试剂而言,浓度范围通常在1%到50%(v/v),优选10%到40%(v/v),最优选15%到30%(v/v)。就在较低浓度有效的传递增强试剂而言,本发明具体的传递增强化合物在本发明试剂中使用的优选范围约为0.002到2mg/ml,更优选约0.02到2mg/ml,最优选约0.1到1mg/ml。含有SYN3或其同系物或类似物的本发明的传递增强化合物在本发明试剂中的优选使用范围约是0.002到20mg/ml,更优选约0.02到2mg/ml,最优选约0.1到1mg/ml。
在另一方面,本发明提供用于施用编码干扰素基因的重组腺病毒和传递增强试剂的药物制剂。在一些实施方案中,传递增强试剂含有SYN3或SYN3同系物。在一些实施方案中,基因传递系统含有编码干扰素基因的约109-1012个颗粒(PN)/ml重组腺病毒,约0.1到10mg/ml SYN3,一种SYN3增溶剂(例如,一种表面活性剂,包括Big CHAP或羟丙基β环糊精(HP β CG)或TRITONTM-X-100洗涤剂/一种辛基苯氧基聚乙氧基乙醇),一种缓冲液和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中,干扰素基因是α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素或ω-干扰素基因或其融合体或编码具有干扰素的抗癌症、抗感染或免疫系统调制生物活性的多肽的一部分。在一个实施方案中,制剂中SYN3的量是1-10mg/ml。组合物可冻干并在使用前用合适的药学载体稀释。
在一些实施方案中,本发明也提供含有干扰素基因传递系统和传递增强化合物的制剂。传递增强化合物的浓度取决于许多因素,例如使用的具体基因传递系统和传递增强化合物、缓冲液、pH、靶组织或器官和施用方式。传递增强化合物的浓度基本上取决于所使用的试剂。就在较高浓度有效的试剂而言,浓度范围通常在1%到50%(v/v),优选10%到40%(v/v),最优选15%到30%(v/v)。就在较低浓度有效的传递增强试剂而言,本发明具体的传递增强化合物在本发明试剂中使用的优选范围约为0.002到2mg/ml,更优选约0.02到2mg/ml,最优选约0.1到1mg/ml。含有SYN3或其同系物或类似物的本发明的传递增强化合物在本发明试剂中的优选使用范围约是0.002到20mg/ml,更优选约0.02到2mg/ml,最优选约0.1到1mg/ml。
用于本发明的方法和组合物的传递增强化合物通常在化合物可溶的溶剂中配制,尽管化合物仅是部分溶解的制剂也是合适的。磷酸缓冲盐水(PBS)是这些化合物合适的增溶剂的例子之一,并且其它增溶剂是本领域的技术人员已知的。人们可认识到需要某些的额外赋形剂和添加剂来实现用于各种药物制剂的这些试剂的溶解性特征。例如,熟知的增溶剂(例如洗涤剂、脂肪酸酯和表面活性剂)可以适当的浓度加入来帮助所使用的各种溶剂中化合物的溶解。当制剂中含有洗涤剂时,在施用于患者的最终制剂中洗涤剂的浓度优选约是0.5-2×临界胶束浓度(CMC)。合适的洗涤剂包括以上所列出的。对使用的合适洗涤剂及其合适的浓度的鉴定可如文中所述测定。用于化合物(例如SYN3及相关化合物)的增溶剂的一个例子是吐温80,其浓度约为0.05%到0.3%,更优选约为0.10%到0.15%。Big CHAP也是SYN3和相关化合物的增溶剂。
当用于制药目的时,本发明的制剂包括含有传递增强化合物的缓冲液。缓冲液可是任何药学上可接受的缓冲液,例如磷酸缓冲盐水或磷酸钠/硫酸钠,Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、无菌水和其它本领域的普通技术人员已知的缓冲液,例如描述于Good等.,Biochemistry,(1966)5:467的那些缓冲液。含有调制的治疗性蛋白质的药物组合物中缓冲液的pH,例如通常是6.4到8.4,优选7到7.5,最优选7.2到7.4。
本发明的组合物可额外含有蛋白质稳定剂或增溶剂、增强剂或其它药学上可接受的载体或赋形剂。生理上可接受的化合物包括,例如糖类(葡萄糖、蔗糖或右旋糖)、抗氧化剂(例如抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白质或其它稳定剂或赋形剂。其它生理上可接受的化合物包括湿润剂、乳化剂、分散剂或防腐剂,这些化合物在防止微生物的生长或作用中尤其有用。各种防腐剂是熟知的并且包括,例如苯酚和抗坏血酸。本领域的技术人员知道选择药学上可接受的载体取决于施用的途径和治疗性蛋白质的具体理化性质。载体、稳定剂或佐剂的例子见Martin,《雷明顿:制药科学》(Remington′s Pharm.Sci.),第15版,(Mack Publ.Co.,Easton,PA 1975)和《雷明顿:药剂学科学与实践》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy),第19版,(Lippincott,Williams & Wilkins Publisher,1995年12月),这些文献纳入文中作为参考。
本发明的另一方面是含有干扰素和SYN3的药物组合物,该组合物联合药学上可接受的水性载体、至少一种药学上可接受的增溶剂和至少一种药学上可接受的膨胀剂。这种药物组合物还可含有联合药学上可接受的载体和蛋白质的SYN3。参见2002年12月20日提交并转让给与本申请相同的受让人的美国专利申请号10/329,043[题为“SYN3组合物及方法”(SYN3 COMPOSITIONS ANDMETHODS),代理人审理号016930-000841US],并且全文纳入作为参考。
用于施用重组腺病毒的一种示范性制剂是以磷酸缓冲盐水(PBS)配制的约含109-1011PN/ml病毒,约0.1到1.0mg/ml SYN3与合适的SYN3增溶剂(例如,约2-10mM Big CHAP或约0.1-1.0mMX-100洗涤剂),加上约2-3%蔗糖(w/v)和约1-3mM MgCl2,pH约为6.4-8.4。
本发明的另一方面是含有干扰素基因传递系统和SYN3的药物组合物,该组合物联合药学上可接受的水性载体、至少一种药学上可接受的增溶剂和至少一种药学上可接受的膨胀剂。这种药物组合物还可含有SYN3联合药学上可接受的载体和表达载体或含有插入载体中的干扰素DNA序列的基因传递系统,该干扰素DNA序列是外源性的。在一些实施方案中,干扰素的核酸序列在对象的预期靶组织或器官中是外源性的或者未显著表达。序列参见2002年12月20日提交并转让给与本申请相同的受让人的美国专利申请号10/329,043[题为“SYN3组合物及方法”(SYN3 COMPOSITIONS AND METHODS),代理人审理号016930-000841US],并且全文纳入作为参考。
本发明的制剂中可用的溶剂包括优选按照USP标准制备的,例如水性溶剂,如注射用水;和/或非水性溶剂,如DMSO和N,N-二甲基乙酰胺(也称为DMF);和共溶剂混合物,例如甘油和水。
这些制剂优选含有聚山梨酯或聚氧乙烯山梨醇酯(一类非离子表面活性剂),其中包括例如聚山梨酯80和聚山梨酯20、普朗尼克或聚乙烯聚丙二醇嵌段共聚物(一类非离子表面活性剂),其中包括例如普朗尼克L68和L92,和羟丙基-β-环糊精,多取代的羟烷基-β-环糊精(一类非离子的络合剂),包括例如HP β CD和Big CHAP。优选作为加溶剂的是HP β CD、Big CHAP、聚山梨酯80、聚山梨酯20、普朗尼克L64和普朗尼克L92。增溶剂可,例如单独使用或组合使用。增溶剂的浓度列于下文。HP β CD的浓度约是50到500mg/ml,Big CHAP的浓度约是20到360mg/ml,聚山梨酯80的浓度约是1到36mg/ml,普朗尼克的浓度约是1到150mg/ml,并且其它成分可存在的浓度列于下文。
冻干的SYN3制剂优选含有柠檬酸盐缓冲系统。更优选柠檬酸盐缓冲系统含有至少一种柠檬酸缓冲液,例如柠檬酸单水合物USP或柠檬酸钠二水合物USP。更优选柠檬酸盐缓冲液系统含有柠檬酸一水合物USP和柠檬酸钠二水合物USP的组合。当组合使用时,柠檬酸一水合物USP存在量的浓度约为0.005到约2mg/ml,更优选0.016到约1.35mg/ml,优选0.016到约0.72mg/ml,优选约0.005到约1.35,并且柠檬酸钠二水合物USP存在量的浓度约为0.02到约5.37mg/ml,优选0.05到3.00mg/ml,优选0.05到2.31mg/ml。其它合适的缓冲系统包括,例如磷酸盐、甘氨酸,这些缓冲系统可替代柠檬酸盐缓冲系统或与其组合使用,并且是以上各不相同的组合。
缓冲系统可提供冻干制剂的pH,从而提高了稳定性。pH优选在约5到约6。SYN3的混合水性制剂优选缓冲在pH约7到约8.5,更优选约7.4,并且40℃时SYN3在脱水粉末中可维持稳定至少3个月。
冻干的制剂优选含有甘氨酸或甘露醇作为冻干膨胀剂。其它可用的合适冻干膨胀剂包括,例如乳糖、重组明胶和甲基纤维素。当冻干膨胀剂是甘露醇时,其浓度从约5到100mg/ml,而当试剂是甘氨酸时,其浓度从约10到200mg/ml。
冻干制剂优选含有抗坏血酸作为抗氧化剂。其它可用的合适抗氧化剂包括,例如柠檬酸。当抗坏血酸是抗氧化剂时,其浓度是约0.001到约0.6mg/ml。
本发明的组合物可额外含有,例如稳定剂、增强剂或其它药学上可接受的载体或赋形剂。药学上可接受的载体可含有生理上可接受的化合物,这些化合物的作用是,例如稳定含有肿瘤抑制基因的重组腺病毒载体传递系统。生理上可接受的化合物包括,例如糖类,如葡萄糖、蔗糖或右旋糖,羟丙基-β-环糊精,抗氧化剂,例如抗坏血酸或谷胱甘肽,鳌合剂,低分子量蛋白质或其它稳定剂或赋型剂。
其它生理上可接受的化合物包括,例如润湿剂、乳化剂、分散剂或防腐剂,这些化合物在防止微生物生长或作用中尤其有用。各种防腐剂是熟知的并且包括,例如苯酚和抗坏血酸。本领域的技术人员知道选择药学上可接受的载体取决于施用的途径和治疗性蛋白质的具体理化性质。载体、稳定剂或佐剂的例子见Gennaro,《雷明顿:药剂学的科学与实践》(Remington’s:The Science andPractice of Pharmacy),第19版,(Mack Publishing.Co.,Easton,Pa.1995),这些文献纳入文中作为参考。
本发明的对象是哺乳动物,包括(但不限于)小鼠、大鼠、灵长类、特别是人。
用于核酸和蛋白质传递的示范性传递增强化合物包括本发明使用的SYN3的同系物,包括式II所示的化合物。
在一些实施方案中,本发明的组合物含有一种缓冲液配制的“治疗有效”量的治疗剂(例如,蛋白质或蛋白质的基因传递系统),该试剂中含有传递增强化合物。文中使用的“治疗有效”指防止、减少或治愈疾病状态,例如癌症或病毒感染或其症状。
传递增强化合物可单独使用或与干扰素或干扰素基因传递系统联合使用或与额外的试剂联合使用。例如,制剂在治疗疾病和病症中有用,包括癌症、细胞增生性疾病和慢性感染。“癌症”通常涉及组织或器官内细胞不受限制的增生。这要包括其中一种或多种细胞被分类为癌性、恶性、肿瘤性的、癌前期的、转化的,或分类为腺瘤或癌的疾病,或是通常在这些疾病领域使用的任何其它同义词。
含有干扰素基因的治疗有效量药物组合物可按照本发明的指导施用,所述基因在含有传递增强试剂的缓冲系统配制的重组病毒载体传递系统中。例如,在含有传递增强试剂的缓冲系统配制的重组腺病毒载体传递系统中治疗有效量的干扰素基因约为108个颗粒/ml到1012个颗粒/ml,更常见的约是108个颗粒/ml到5×1011个颗粒/ml,最常见的是109个颗粒/ml到1011个颗粒/ml(PN/ml)或1010个颗粒/ml到1011个颗粒/ml(PN/ml)。上述剂量一般以对象能耐受的频率施用。肿瘤学领域中常见的实践以最大耐受剂量或接近最大耐受剂量提供剂量是。
根据本发明所述,可施用在含有传递增强剂的缓冲液中配制的含有蛋白质(如干扰素)的治疗有效量的药物组合物。例如,治疗有效量的干扰素或干扰素传递系统容易由本领域的普通技术人员确定。一般施用的剂量是对象通常耐受的。如上所述,在肿瘤学领域中常见的实践是以最大耐受剂量或接近最大耐受剂量提供剂量。
在本发明的一个用于治疗膀胱癌的实施方案中,干扰素结合作为多进程治疗方案的一部分的传递增强试剂提供,该方案由3周的治疗周期组成,每个周期在第1天或任选每个周期的第1天和第2天提供一次膀胱内施用。典型的治疗膀胱癌的方式,医师将导尿管插入尿道使对象排尿。制备含有配制的传递增强试剂和治疗性干扰素蛋白或干扰素基因传递系统的溶液并将其滴注入膀胱。夹住导尿管使溶液维持于膀胱中约1小时。应该注意的是,需要较长时间的接触以提高试剂传递至上皮,但是实际情况往往限制了这种实践。例如,1小时一般是对象感到要排尿的时刻。传递增强试剂的作用已证实产生了延长作用,因此,膀胱在滴注蛋白质之前与传递增强试剂预接触可提高传递。这可在考虑蛋白质制剂与传递增强试剂之间的相容性时使用。所需的接触之后,去除导尿管夹并允许对象排尿。以上过程在患者耐受的情况下可重复多次来达到治疗作用。通过常规方法可容易地评价治疗作用,例如插入膀胱的膀胱镜检查。
这些制剂可以对应于有待注入的空腔或有待治疗的器官或组织的大小施用。就人膀胱而言,合适的施用体积取决于对象的年龄和身材,特别是其膀胱的大小。施用体积一般从50到500ml,更常见的是从50到250ml或从100到200ml。在一些施用方法中,可通过以下方式经济地节约施用量,将球囊导管插入有待治疗的膀胱或囊并膨胀导管的球囊部分来减少被施用的组合物占据的空腔体积。
此外,上述治疗方案可用其它治疗方案补充或与其结合使用来提高治疗效果。本发明的方法可用,例如常规BCG和/或化疗治疗方案来补充。向个体提供多种治疗方案以达到最大的效果是肿瘤学领域的标准实践方式。
在另一方面,本发明提供一种试剂盒,该试剂盒在第一容器中有传递增强化合物并且在第二容器中有蛋白质或基因传递系统。在一个实施方案中,结合容器的内含物以制备含有传递增强试剂和蛋白质或基因传递系统的制剂,然后将该制剂施用于对象。在另一个实施方案中,容器中的内含物作为独立的制剂施用于患者。传递增强试剂可在施用蛋白质或基因传递系统之前、期间或之后施用。在一示范性实施方案中,二者同时施用或几乎同时施用。任一个容器或两个容器中的制剂可是配制于药学上可接受的液体载体中的冻干粉末。
在另一个实施方案中,试剂盒提供含有能提高蛋白质或基因传递系统的SYN3或SYN3同系物或类似物的第一容器以及含有蛋白质或基因传递系统的第二容器。在其它实施方案中,第一容器含有SYN3或SYN3同系物或类似物的冻干制剂。在另一个实施方案中,第二容器含有蛋白质的冻干制剂。在其它实施方案中,第一个和第二容器均含有其各自内含物的冻干制剂。在其它示范性实施方案中,蛋白质是基本上与人α-干扰素多肽相同的多肽或是人α-干扰素多肽,或基因传递系统相同编码这样的蛋白质。
在一些实施方案中,本发明的方法和组合物可在不同的时间间隔重复施用,从而增加治疗效果。这些间隔可以大约是天、周或月。施用的次数可依治疗方案及其持续时间而变。通常,本发明的施用可每半周、一周、两周、一月或两月进行两个月、四个月、六个月或甚至更长的时间。通过检测对象中干扰素的生产或释放或评价患者的临床应答(例如,如果治疗的疾病是癌症,则检测肿瘤的减少)来设计个体对象的施用频率。
在另一个实施方案中,当有待治疗的疾病是膀胱癌并且膀胱内施用治疗性蛋白质(例如,干扰素)或基因传递系统(例如,用于编码干扰素的基因)时,通过检测膀胱中肿瘤块的大小和数量来评价患者对本发明的治疗方法以及组合物的应答。这种检测可通过直接成像方法(例如MRI或放射性同位素成像技术)来检测体液(例如血液或尿液)中的肿瘤特异性抗原或产物来进行。
用传递增强试剂和干扰素或编码干扰素的基因配制的组合物可用于向细胞提供干扰素,包括(特别是)器官和组织的上皮细胞。干扰素的治疗作用和用途是本领域的普通技术人员已知的。例如,本发明的组合物在治疗癌症中有用。适用于本发明的治疗方法和组合物的癌性组织和器官包括任何具有上皮膜的组织或器官,例如胃肠道、膀胱、呼吸道和肺。例子包括(但不限于)膀胱和上呼吸道、女阴、子宫颈、阴道、子宫或支气管癌;腹膜的局部转移性肿瘤;细支气管肺泡癌、转移性胸膜癌;口腔和扁桃体癌;鼻咽、鼻、喉、食道、胃、结肠和直肠、胆囊或皮肤癌或黑色素瘤。
本发明的方法和组合物在治疗哺乳动物(更尤其是人)膀胱癌中特别有用。在一个实施方案中,本发明的方法和组合物用于治疗的患者已用各种膀胱癌疗法治疗过并且通过未能减少膀胱肿瘤块的大小或数量或通过该肿瘤之后的复发或再生或重现测定未能产生满意的应答。在一个实施方案中,本发明的方法或组合物施用至对BCG治疗未产生满意应答的对象。在一些实施方案中,本发明的方法和组合物与另一种癌症疗法(例如BCG治疗)结合治疗膀胱癌。在这种实施方案中,对象可在其BCG治疗之前、之后或期间接受本发明的方法和组合物。
在一些实施方案中,可通过细胞检查或更优选测量尿液中的微卫星DNA来评价膀胱癌的重现或治疗效果。参见Steiner G,Schoenberg MP,Linn JF,Mao L,Sidransky D,“通过尿液的微卫星分析检测膀胱癌重现”(Detection ofbladder cancer recurrence by microsatellite analysis of urine),Nat Med.,1997 6月;3(6):621-4。在一个治疗膀胱癌的实施方案中,通过球囊导管施用治疗组合物。导管具有可通过尿道插入膀胱空腔的球囊,球囊在空腔中膨胀占据空腔的一部分,优选绝大部分,从而给施用的本发明组合物留下有待占据的最小空间。导管有将组合物转移入膀胱的另一部分以便与膀胱空腔接触。球囊导管是本领域的普通技术人员已知的。
在一些实施方案中,本发明的组合物可以减少或避免稀释传递增强试剂,或者考虑到预计的稀释体积可增加制剂中传递增强试剂的量的方式施用。避免稀释的方式包括通过生理方法(例如,排尿、禁食)或药物介入(例如,泄药)或医疗介入(通过导管引流)清空靶空间。球囊导管或其它方式可用于分离腔内空间的体积或组合物要占据的通道。在一些实施方案中,球囊导管也可用于部分占据有待注入的空间,从而减少组合物要占据的空间。在其它实施方案中,制剂自身配制为制剂的储器或粘附在靶空间的表面并因此避免了大量混合导致的即刻稀释或大量流动导致的损失。
膀胱内施用至膀胱时传递增强试剂和干扰素或干扰素基因疗剂之间的协同作用有助于减少或避免通常与干扰素治疗相关的副作用。
可通过本领域已知的任何方式施用合适量的组合物,例如表面、局部、口服或直肠、胃肠外、腹膜内、静脉内、皮下、真皮下、真皮、鼻内、眼部、肺部、透皮或经尿道、膀胱内、肌肉内、或经尿道和膀胱内施用。在一些实施方案中是透皮施用。如本领域已知的,合适量或剂量的组合物可凭经验确定。
药学或生理学上可接受的盐包括(但不限于)金属盐,例如钠盐、钾盐、锂盐等;碱土金属盐,例如钙盐。镁盐等;有机胺盐,例如三乙胺盐、乙醇胺盐、三乙醇胺盐、二环己胺盐等;无机酸盐,例如盐酸盐、氢溴化物、硫酸盐、磷酸盐等;有机酸盐,例如甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐等;磺酸盐,例如甲基酸盐、苯磺酸盐、对-甲苯磺酸盐等;氨基酸盐,例如精氨酸盐、天冬氨酸盐、谷氨酸盐等。
实施例
提供以下实施例仅是说明性目的,并非要限制文中要求的本发明的范围。技术人员在举出的实例和/方法中做出的任何改变要包括在本发明的范围内。
实施例1
美国专利号6,312,681披露了传递含有针对膀胱上皮膜中癌细胞的转基因的腺病毒载体的方法,所述方法包括向上皮膜施用腺病毒载体和1%和50%(v/v)之间的乙醇或另一种传递增强试剂,其中腺病毒载体感染细胞并且在感染的细胞中表达转基因。美国专利号6,312,681转让给与本申请相同的受让人,并全文纳入作为参考。
实施例2
下表显示了本发明的非水性液体SYN3制剂的成分的示范性范围。施用之前(例如,用于膀胱癌),SYN3溶液按1:50v/v的比例与重组腺病毒制剂结合来形成要施用于患者的混合物。
为制备组合物,称取约75%DMA到玻璃烧杯。向另一个烧杯中装入表面活性剂(聚山梨酯80、聚山梨酯20、普朗尼克L64或普朗尼克L92)并溶解在小体积(约是10%的终体积)的DMA中。恒速搅拌的同时将DMA/表面活性剂溶液加入DMA。预先在另一个烧杯中称取SYN3。搅拌的同时缓慢地将SYN3加入溶液。一旦SYN3溶解,加入足够的DMA至最终的重量体积比(25℃时密度=0.962g/ml)。使用与装有非乳胶活塞的注射器相连的0.22滤器过滤溶液并于4℃将溶液保存在牢固密封的容器内。
以下其它的组合物可按照类似于实施例1的方式制备。
成分 | mg/ml |
SYN3 | 51 |
聚山梨酯 20 | 50 |
N,N-二甲基乙酰胺,适量加 | 1ml |
成分 | mg/ml |
SYN3 | 51 |
聚山梨酯 80 | 50 |
N,N-二甲基乙酰胺,适量加成分 | 1mlmg/ml |
SYN3 | 51 |
普朗尼克 L64 | 25 |
N,N-二甲基乙酰胺,适量加 | 1ml |
成分 | mg/ml |
SYN3 | 51 |
普朗尼克 L92 | 25 |
N,N-二甲基乙酰胺,适量加 | 1ml |
按照相同的方法制备以下25ml的批次。
成分 | mg/ml |
SYN3 | 1.275 |
聚山梨酯 20 | 1.250 |
N,N-二甲基乙酰胺,适量加 | 25ml |
成分 | mg/ml |
SYN3 | 1.275 |
聚山梨酯 80 | 1.250 |
N,N-二甲基乙酰胺,适量加 | 25ml |
成分 | mg/ml |
SYN3 | 1.275 |
普朗尼克 L64 | 0.625 |
N,N-二甲基乙酰胺,适量加 | 25ml |
成分 | mg/ml |
SYN3 | 1.275 |
普朗尼克 L92 | 0.625 |
N,N-二甲基乙酰胺,适量加 | 25ml |
实施例3
下表显示了本发明的冻干SYN3制剂的成分的示范性范围。所示的复合溶液注入容积为20ml的II型玻璃小瓶中并冻干。用于施用的制剂需要向含有冻干饼状物的小瓶中加入20ml WFI来再溶解SYN3。SYN3溶液按照1∶5v/v的比例与p53或任何重组腺病毒制剂结合。然后将混合物施用于患者,例如膀胱癌的患者。
以下实施例是制备冻干制剂的方法。
实施例4
成分 | 克/升 |
SYN3 | 24 |
柠檬酸一水合物 USP | 0.24 |
柠檬酸钠二水合物 USP | 0.77 |
Big CHAP | 120 |
甘氨酸 USP | 50 |
抗坏血酸 USP | 0.25 |
注射用水 USP,适量加 | 1000ml |
SYN3的实际用量使用下式按照每批药物的纯度调整:
克,SYN3=24.0×100/(%纯度)。
例如,SYN3药物=97.0%纯。
24.0×100/97.0=每批1升要用24.7克SYN3。
因此,按照下式确定每批的SYN3用量:
克SYN3/升=24.0克/升×[100/(%SYN3批纯度)]。
按照下式确定每批使用的注射用水体积:
注射用水体积(升)=批体积(升)×0.5。
将使用上式计算的注射用水的体积装入装配有搅拌器的配衡的复合容器。一边搅拌一边加入并溶解Big CHAP。可使用注射无菌水来冲洗称重容器以回收所有物质。完全溶解Big CHAP可能需要以中等搅拌速率继续搅拌约30-60分钟。一边搅拌(中等搅拌速率)一边向Big CHAP溶液中加入并溶解SYN3。可使用注射用水来冲洗称重容器以回收所有物质。完全溶解SYN3可能需要搅拌1小时。一边搅拌一边向含有Big CHAP和SYN3的溶液中依次加入并溶解甘氨酸、抗坏血酸、柠檬酸一水合物和柠檬酸钠二水合物。可使用注射用水来冲洗称重容器以回收所有物质。加入注射用水使该批次至终体积(25℃时,溶液的密度约是1.051g/ml)。溶液至少搅拌15分钟。
取出少许溶液样品(<5ml)来测量pH。pH应在5.0和6.0之间。无需调节pH。本领域的普通技术人员可容易地确定所得产物的pH。
无菌过滤溶液以完成混合。如果需要,在注入小瓶之前,混合的批次可在2℃到8℃保存于密封、无菌、不锈钢压力容器内达24小时。批料可多次过滤以保持无菌。
向已清洗并灭菌的20-ml I型火石玻璃小瓶中注入5.3±0.1ml溶液。给冻干状态的小瓶中无菌装上已清洗、硅化和灭菌的20-mm West4416/50lyo-形橡胶塞。
冻干机搁板预冷至4±2℃。将装有小瓶的托盘无菌放置于冻干机搁板上。放好所有的托盘后,在1小时内使搁板冷至-40℃并使产品在处理前维持于-35℃或更低至少4小时。开始冷却冷凝机。当冷凝机温度为-45℃或更低时,开始抽空小室。当到达50-70mm Hg的真空压时,在0.5小时期间将搁板的温度升至-20℃。在压力约是150mm Hg(100到200mm Hg压力)条件下维持搁板的温度在-20℃,36小时。产品在处理之前必须维持于或高于-20℃至少6小时。在1小时内使搁板温度升至25℃并降低压力至约50mm Hg压力。约50mm Hg压力下,搁板温度于25℃维持14小时。使用无菌过滤的氮气对小室通气至约950mm Hg。在冻干机内给小瓶塞上塞子。从冻干机中取出小瓶并用20-mm铝密封条绕住小瓶。小瓶应保存于2℃到8℃直至检查完毕。
产品是白色至灰白色的饼状物。检查后小瓶应保存于2℃到8℃之间。出于标记和检查的目的,小瓶应暴露于19℃-25℃,6小时。
实施例5
以下实施例按照以上实施例4列出的批次制剂制备。
成分 | mg/ml |
SYN3 | 24 |
柠檬酸一水合物 USP | 0.24 |
柠檬酸钠二水合物 USP | 0.77 |
Big CHAP | 120 |
甘氨酸 USP | 50 |
抗坏血酸 USP | 0.25 |
注射用水 USP,适量加 | 1ml |
所得产品的pH是5.34。
成分 | mg/ml |
SYN3 | 24 |
柠檬酸一水合物 USP | 0.32 |
柠檬酸钠二水合物 USP | 1.02 |
HP β CD | 200 |
聚山梨酯 80 | 12 |
抗坏血酸 USP | 0.25 |
注射用水 USP,适量加 | 1ml |
所得产品的pH是5.45。
成分 | mg/ml |
SYN3 | 24 |
柠檬酸一水合物 USP | 0.45 |
柠檬酸钠二水合物 USP | 1.79 |
甘露醇 | 30 |
聚山梨酯 80 | 72 |
注射用水 USP,适量加 | 1000ml |
所得产品的pH是5.76。
得到的冻干产品的稳定性测试显示这些产品相对于SYN3是高度稳定。稳定性测试通过HPLC完成。
冻干制剂用19.5ml WFI重建(再溶解):样品置于所示温度条件,孵育特定的时间,并通过HPLC测定浓度并与初始浓度相比较。
实施例6
成分 | mg/ml |
SYN3 | 24.0 |
柠檬酸一水合物 USP | 0.32 |
柠檬酸钠二水合物 USP | 1.02 |
羟丙基-β-环糊精 | 200 |
聚山梨酯 80 | 12.0 |
抗坏血酸 USP | 0.25 |
注射用水 USP,适量加 | 1000ml |
SYN3的实际用量使用下式按照每批药物的纯度调整:
克,SYN3=24.0×100/(%纯度)。
样品计算
SYN3药物=97.0%纯。
24.0×100/97.0=每批1升要用24.7克SYN3。
以下实施例如此制备:
首先,按照下式确定每批的SYN3用量:
克SYN3/升=24.0克/升×[100/(%SYN3批纯度)]。
接着,按照下式确定每批使用的注射用水体积:
注射用水体积(升)=批体积(升)×0.5。
将注射用水的体积装入装配有搅拌器的配衡的复合容器。一边搅拌一边加入并溶解羟丙基-β-环糊精。注意,完全溶解羟丙基-β-环糊精可能需要以中等搅拌速率继续搅拌约30-45分钟。可使用注射用水来冲洗称重容器以回收所有物质。向溶液中加入并溶解聚山梨酯80。聚山梨酯80可预先溶解于0.1×总批次体积的注射用水(升)并加入溶液。
一边搅拌一边向溶液中加入并溶解SYN3。完全溶解SYN3可能需要搅拌1小时。可使用注射用水来冲洗称重容器以回收所有物质。
一边搅拌一边向溶液中依次加入并溶解抗坏血酸、柠檬酸一水合物和柠檬酸钠二水合物。可使用注射用水来冲洗称重容器以回收所有物质。加入注射用水使该批次至终体积(25℃时,溶液的密度是1.058g/ml)。溶液至少搅拌15分钟。
取出少许溶液样品(<5ml)来测量pH。pH应在5.0和6.0之间。无需调节pH。将已洗涤和测试过完整性的溶液无菌过滤进无菌、不锈钢压力容器或应使用的等价物。如果需要,在注入小瓶之前,混合的批次可在2℃到8℃保存于密封、无菌、不锈钢压力容器内达24小时。该批料可过滤多次以保证无菌。
向已清洗并灭菌的20-ml I型火石玻璃小瓶中注入5.3±0.1ml溶液。给冻干状态的小瓶中无菌装上已清洗、硅化和灭菌的lyo-形橡胶塞。
为进行冻干,冻干机搁板预冷至4±2℃。将装有小瓶的托盘无菌放置于冻干机搁板上。放好所有的托盘后,在1小时内使搁板冷至-40℃并使产品在处理前维持于-35℃或更低至少4小时。开始冷却冷凝机。当冷凝机温度为-45℃或更低时,开始抽空小室。当到达50-70mm Hg的真空压时,在0.5小时期间将搁板的温度升至-20℃。在压力约是150mm Hg(100到200mm Hg压力)条件下维持搁板的温度在-20℃,36小时。产品在处理之前必须维持于或高于-20℃至少6小时。在1小时内使搁板温度升至25℃并降低压力至约50mm Hg压力。在约50mm Hg压力下,搁板温度于25℃维持14小时。使用无菌过滤的氮气对小室通气至约950mm Hg。在冻干机内给小瓶塞上塞子。从冻干机中取出小瓶并用20-mm铝密封条绕住小瓶。小瓶应保存于2℃到8℃直至检查完毕。
产品是白色至灰白色的饼状物。检查后小瓶应保存于2℃到8℃之间。出于标记和检查的目的,小瓶应暴露于19℃-25℃,6小时。
当重组腺病毒载体(例如,p53(rAD/p53))结合SYN3的冻干制剂时,它在37℃至少可维持2小时稳定、在25℃至少可维持24小时稳定。当p53结合SYN3的水溶液制剂时,它在37℃至少可维持4小时稳定、在25℃至少可维持24小时稳定。
实施例7.合成化合物A-LB
在以下实施例中,“g”指克、“ml”指毫升、“mol”指摩尔、“℃”指摄氏度、“min”指分钟、“DMF”指二甲基甲酰胺,“PN”指颗粒数目。除非另有说明,所有的温度是摄氏度。
下文涉及在合成化合物VII(也称为A-LB)中使用的方法。以下提供了化合物5-6的合成细节和纯化所需的步骤。
使用的方法和试剂
N-(3-氨丙基)-1,3-二氨基丙烷
胆酸
二环己基碳二亚胺(DCC)
氯甲酸异丁酯
三乙胺
乳糖酸
实验
合成化合物A-LB
下文涉及在合成化合物VII(也称为A-LB)中使用的方法。以下提供了化合物5-6的合成细节和纯化所需的步骤。
使用的方法和试剂
N-(3-氨丙基)-1,3-二氨基丙烷
胆酸
二环己基碳二亚胺(DCC)
氯甲酸异丁酯
三乙胺
乳糖酸
化合物5:甲醇(60ml)配制的乳糖酸(716mg,2毫摩尔)溶液加热回流。向溶液中加入DCC(500mg,2.5毫摩尔)并在回流时搅拌得到的溶液。2小时后,加入N-(3-氨丙基)-1,3-二氨基丙烷(800ml,5.7毫摩尔)并继续搅拌得到的溶液1小时。反应溶液冷至室温并浓缩以获得粗产物5。用和二氯甲烷捣碎时纯化粗酰胺化合物5,得到粘性吸湿性固体5(2.72g,5.7毫摩尔)。
化合物6:DMF(60ml)配制的胆酸(4.1g,10毫摩尔)溶液冷至0℃。向该溶液中加入氯甲酸异丁酯(1.2ml,10.2毫摩尔)和三乙胺(1.4ml,10.4毫摩尔)并搅拌得到的溶液10分钟,然后加入DMF(40ml)配制的5(2.5g,5.3毫摩尔)。反应溶液搅拌72小时,然后浓缩得到粗产物6。柱层析纯化粗产物得到纯的6(A-LB)。
实施例8
膀胱癌的干扰素治疗
在本实施例中,含有人干扰素α转基因的腺病毒载体的用途在临床前动物模型中进行评价。接受膀胱内施用SYN3制剂配制的rAd-IFN的动物在其尿液中具有非常高的局部浓度和最低的全身性干扰素水平。我们也使用无胸腺小鼠在常位肿瘤模型中测试了rAd-IFN/SYN3对浅表性膀胱癌的效果。与对照相比,接受rAd-IFN/SYN3的小鼠的膀胱肿瘤的大小显著降低。基于这些结果,rAd-IFN/SYN3代表了用于浅表性膀胱癌的新替代疗法。
实施例8A.rAd-IFN的抗肿瘤活性
构建编码人干扰素(IFN)(rAd-IFN)的E1-区域缺失的腺病毒。为进行体内膀胱内传递研究,我们使用编码人α2b干扰素基因(IACB)的腺病毒载体。用这种载体转导细胞产生了一级氨基酸序列相同于INTRON A的人α2b干扰素蛋白。该蛋白含有连接于165个氨基酸的干扰素蛋白的23个氨基酸分泌前导肽。N-末端氨基酸测序证实分泌前导肽在翻译后修饰过程中被适当地切除。与大肠杆菌(E.Coli)产生的重组INTRON A相反,从rAd-IFN转导生产的干扰素蛋白是糖基化的。IFN明显的糖基化不影响通过免疫测定或抗病毒生物测定来检测rAd-IFN介导的IFN表达。使用电化学发光免疫测定开发了生物分析方法来检测血清和尿液中的IFN。
α种类的干扰素通常在其生物性能中表现出高水平的种类特异性。为在含有人肿瘤异种移植物的小鼠肿瘤模型中评价干扰素α的抗肿瘤效力,最好具有能结合人和小鼠干扰素受体的α种类干扰素。为进行使用小鼠肿瘤模型的体内效力实验,我们利用了含有杂种形式的干扰素(α2/α1)的腺病毒载体。杂种干扰素蛋白具有针对人肿瘤细胞以及小鼠肿瘤细胞的抗肿瘤活性(Rehberg等,J Biol Chem.,257(19):11497-502(1982))。既然杂交干扰素对小鼠细胞和人细胞有活性(Rehberg等.,J Biol Chem.,257(19):11497-502(1982)),杂交干扰素的构象必须能结合并激活小鼠IFN受体。因此,据信杂交IFN蛋白可在人中更密切地模拟干扰素α2b的抗肿瘤效力。
干扰素转基因掺入和美国专利号6,210,939描述的A/C/N 53载体相同的腺病毒骨架中,该专利引作参考。图1描述了该载体的示意图。通过rAd-IFN在细胞培养物和动物中证实了IFN表达和IFN的生物活性后,评价了rAd-IFN在皮下异种移植肿瘤模型中的抗肿瘤活性(图2)。在携带有得自成胶质细胞瘤(LN229,U87MG)、肝细胞瘤(HEP3B)和CML(K562)的肿瘤的裸鼠中肿瘤内施用rAd-IFN后观察对肿瘤生长的抑制作用。
在K562模型中,5只小鼠中的3只无肿瘤,U87MG模型中,5只小鼠的4只无肿瘤。基于这些结果,在各种肿瘤亚型的皮下固体肿瘤模型中rAd-IFN明显具有强有力的抗肿瘤活性。参见图2。
实施例8B.
SYN3提高腺病毒基因表达
在本实施例中,膀胱内施用重组腺病毒可局部应用进膀胱腔而仅有极少的全身性暴露。然而,在早期研究中,单独膀胱内施用人重组复制缺陷型腺病毒(rAd)仅表现出有限的基因转移和表达(Bass等.,Cancer Gene Ther.,2(2):97-104(1995))。据信,膀胱的结构造成病毒载体不能转导。膀胱必须作为抵御致病性细菌和病毒的初级天然防御系统,同时也起着容纳尿液的作用。膀胱腔上皮覆盖有阻止尿液从膀胱腔进入组织的亲水性糖胺聚糖(GAG)层。相比于其它上皮保护性机制(例如,胃肠道),GAG层抵御细菌粘附(Parsons CL,World J Urol.,12(1):38-42(1994))。人们致力于鉴定能修饰该层来提高腺病毒连接和转导的试剂。尽管乙醇首先鉴定为能增加腺病毒基因转移的试剂(Engler等.,Urology,53(5):1049-53(1999)),但施用后也发现了出血性膀胱炎并且该制剂被视为不合适。在Canji进行了筛选替代制剂的其它研究来鉴定能提高腺病毒基因转移至膀胱而无乙醇副作用的试剂。评价各种洗涤剂(阳离子、阴离子、两性离子和非离子)提高腺病毒传递的能力。发现非离子洗涤剂Big CHAP能强烈提高用腺病毒载体转导膀胱上皮而无膀胱炎。Big CHAP以浓度依赖的方式改善基因转移,Big CHAP浓度为30mg/ml(34mM)达到最高转导和基因表达的饱和。
对Big CHAP的提高活性的其它鉴定显示出在不同市售可得的制剂之间有易变性,说明洗涤剂的组成中有异质性。事实上,一些Big CHAP制剂未能完全提高病毒转基因表达。当通过薄层层析比较有生物活性的一批Big CHAP与无生物活性的一批时,在有生物活性的一批中至少存在三个额外的化合物。MALDI-MS、1H-NMR和13C-NMR结构分析显示这三个额外的化合物最可能是Big CHAP生产过程中的副产物。分离每个杂质并通过与rAd-β-gal杂志#2共施用来测定其在膀胱中提高病毒转基因表达的能力。杂质#2是最强有力的化合物,但也是极端难溶的。参见全文纳入作为参考的美国专利号6,392,069。
测试了SYN3在膀胱上皮中提高rAd基因转导的能力。大鼠接受膀胱内施用SYN3制剂或载体制剂(0.1%吐温-80)配制的rAd-β-gal(0.5ml;7.6×1010P/ml)。45分钟后取出测试物品,并允许动物恢复。2天后,处死动物,收集其膀胱并进行X-gal染色来测定rAd基因表达的程度。与在载体制剂中传递相同病毒相比,接受SYN3制剂配制的rAd-β-gal的大鼠的1acZ基因表达得到显著提高(图3)。
实施例8C.
联合治疗对膀胱中干扰素表达的影响
用SYN3和含有干扰素基因的重组腺病毒载体联合治疗膀胱出乎意料地增加了转基因干扰素的表达。临床前测试证实,SYN3能显著提高各种重组腺病毒载体到膀胱上皮的传递和表达。在小鼠中进行研究来定量使用SYN3制剂导致基因转移至膀胱上皮的增加情况。小鼠膀胱内施用SYN3或载体制剂配制的rAd-IFN。治疗两天后,处死小鼠,收集其膀胱并在干冰上快速冷冻。然后从每个膀胱中提取核酸,并分别使用PCR和RT-PCR测定存在的rAd-IFN DNA和RNA的水平。接受SYN3制剂配制的rAd-IFN的小鼠相比于接受运载体制剂配制的rAd-IFN的小鼠,其rAd-IFN DNA拷贝数高了约一千倍(图4a),其在膀胱匀浆中检测到的RNA比接受载体制剂配制的rAd-IFN的小鼠至少高了一万倍。
表1.小鼠接受45分钟的膀胱内施用SYN3制剂(100μl;7.4×l010P/ml)或载体制剂配制的rAd-IFN。治疗两天后,处死小鼠,收集其膀胱并在干冰上快速冷冻。然后从每个膀胱中提取核酸,并分别使用PCR和RT-PCR测定存在的rAd-IFN DNA和RNA的水平。BQL:低于定量水平;DNA:10拷贝/mg组织;RNA:1000MEQ/mg组织。为进行比较,也显示了单独施用SYN3获得的水平。基于这些结果,可明显看出,需要SYN3制剂在膀胱上皮中提高rAd-IFN的传递和表达。
实施例8D.
rAd-IFN/SYN3用于浅表性膀胱癌的效力
使用原位肿瘤模型评价rAd-IFN/SYN3的效力(Watanabe等.,Cancer GeneTher.,7(12):1575-80(2000))。在简单的胰蛋白酶预处理来提高肿瘤细胞附着后,通过膀胱内施用人UNUC-3移行癌细胞(TCC)在无胸腺小鼠的膀胱中建立浅表性肿瘤。治疗开始前,小鼠生长6天使肿瘤形成。然后小鼠接受膀胱内施用rAd-IFN/SYN3、rAd-对照/SYN3或单独施用SYN3-载体。既然rAd-IFN产生一种分泌的基因产物,在这些研究中使用两种不同的对照腺病毒构建物进行比较,一种不含转基因(ZZCB),而一种含有人分泌碱性磷酸酶基因(APCB)。连续两天对小鼠施用100μl SYN3制剂配制的rAd(1.1×1011P/ml),1小时。治疗14天后(肿瘤起始20天后),处死小鼠,收集其膀胱,固定于福尔马林中,并通过目测检查其肿瘤荷载。对具有肿瘤的膀胱总百分率以及肿瘤的相对大小进行评分。基于膀胱腔被肿瘤封闭的百分率按0-4比例对肿瘤评分。rAd-IFN/SYN3治疗组的肿瘤总发病率显著低于仅用rAd-对照或SYN3组的肿瘤发病率(图4)。要注意的是,与对照相比,rAd-IFN的治疗动物少数还有肿瘤的例子中肿瘤大小显著减少。这些结果表明,rAd-IFN/SYN3在原位肿瘤模型中极大降低了浅表性膀胱肿瘤的生长。
其它研究中也使用了原位肿瘤模型,其中浅表性肿瘤是在胰蛋白酶预处理后,通过膀胱内施用绿色荧光蛋白(GFP)稳定转染的人KU-7膀胱癌细胞在无胸腺小鼠的膀胱中建立的。通过手术暴露并用光照射膀胱来激发GFP荧光,对肿瘤大小的顺序评价可在体内监测而无需处死小鼠。肿瘤细胞生长10天,随后手术暴露并照射膀胱,拍下每只小鼠荧光肿瘤载荷的照片。使用图形分析软件确定治疗前后含有肿瘤细胞的膀胱的面积相对于膀胱总面积的百分率。连续两天小鼠接受膀胱内施用100μl rAd(1×1011P/ml),1小时。比较4组治疗组:rAd-IFN/SYN3、rAd-β-gall/SYN3、仅用rAd-IFN或仅用SYN3。治疗后21天(肿瘤生长起始31天后),按上述方法再次使膀胱膨胀,手术暴露并再次测量GFP肿瘤的荷载。
过了一段时间后,接受rAd-IFN/SYN3的小鼠的肿瘤荷载有显著降低(图5)。相反,在所有其它治疗组中肿瘤的大小继续增加。仅施用rAd-IFN未导致肿瘤生长显著降低,这表明制剂中需要包括增强试剂SYN3。既然在rAd-p-gal/SYN3组中未观察到肿瘤生长的降低,在rAd-IFN/SYN3组中观察到肿瘤生长的降低肯定是干扰素转基因表达的结果,并且不仅是由于施用腺病毒载体的非特异性作用。总之,在该原位肿瘤模型中rAd-IFN/SYN3似乎显著降低浅表性膀胱肿瘤。为目测使用SYN3/rAd-IFN相比于对照所实现的肿瘤边界降低,提供了每个治疗组的每只小鼠在治疗前后的肿瘤荷载的照片。
实施例8E.测定大鼠膀胱中rAd-IFN的表达
当用rAd-IFN转导细胞时,产生了分泌的蛋白质产物。因此,假设通过分泌到尿液中的干扰素的量可估计在膀胱上皮中得到的病毒转基因表达的水平。最初实验比较了接受膀胱内施用SYN3制剂配制的rAd-IFN或rAd-对照(ZZCB)的雌性Sprague-Dawley大鼠尿液中的干扰素水平。大鼠接受膀胱内施用SYN3(1mg/ml)配制的rAd(5×1010P/ml),45分钟并且允许大鼠恢复。治疗48小时后使用代谢笼收集每只小鼠的尿液(4小时收集)。接受SYN3制剂配制的rAd-IFN的大鼠在其尿液中具有极高水平的干扰素蛋白(~25ng/ml),而在其血清中仅有微量水平的干扰素(图5)。相反,接受SYN3制剂配制的rAd-对照的大鼠在其尿液或血清中无干扰素蛋白。48小时后,处死大鼠,收集其膀胱并匀浆来测定其干扰素水平。在接受SYN3/rAd-IFN的大鼠的膀胱匀浆物中检测到显著高水平的IFN蛋白。在接受SYN3/rAd-对照的大鼠的膀胱匀浆物中未检测到干扰素。这些结果与PCR/RT-PCR结果一致,并且说明尿液可用作检测膀胱中病毒转基因表达的水平和持续时间的工具。
实施例9
部分1:合成化合物3
SYN3的合成路线示于图7,该路线采纳美国专利号6,392,069。通过将1g(2.8毫摩尔)乳糖酸(1)溶解于50ml甲醇,在旋转蒸发仪上蒸干并重复该过程6次来合成乳糖酸内酯(2)。为得到化合物3,将得到的残留物(2)加热至50℃溶解于50ml异丙醇。向该溶液加入1.2ml(8.4毫摩尔)N-(3-氨丙基)-1,2-丙二胺。温度增加至100℃并搅拌该溶液3小时。旋转蒸发除去溶剂,用氯仿洗涤所得残留物数次以除去多余未反应的N-(3-氨丙基)-1,2-丙二胺。剩下的残留物(3)用于以下部分3中。
部分2;合成化合物4
将2.28g胆酸(5.6毫摩尔)加热至60℃溶解于N,N-二甲基甲酰胺来合成化合物4。加入三乙胺(0.78ml,5.6毫摩尔)并将溶液在冰浴中冷却。然后加入氯甲酸异丙酯(0.73ml,5.6毫摩尔)并且随着继续搅拌10分钟形成一种白色的沉淀物。
部分3:合成SYN3(化合物5)
化合物III溶解于N,N-二甲基甲酰胺,在冰浴中冷却并搅拌。从化合物4合成获得的悬浮液过滤进含有化合物3的溶液。得到的溶液于室温搅拌6小时。使用高真空旋转蒸发除去溶剂并将残留物溶解于100ml氯仿/甲醇(50/50)。25ml该溶液通过使用氯仿/甲醇(60/40)作为洗脱溶剂的硅胶急骤层析纯化。通过使用由氯仿/甲醇/水/浓氨水(100/80/10/5)组成的流动相的硅胶薄层层析分析从柱上洗下的组分。用乙醇硫酸(ethanolic sulfric acid)喷雾炭化化合物来目测。使用急骤层析和氯仿/甲醇/水/浓氨水(100/80/10/5)作为洗脱溶剂来固定和再纯化含有产物的组分。含有产物的组分被固定并蒸干至白色粉末(300mg化合物5)。1H-NMR和MALDI质谱光谱分析与所示结构一致。
实施例11
优选的传递增强化合物列于下表。虽然该表举出了具有胆酸取代基的化合物,本领域的技术人员可容易地意识到其它甾体取代基可取代胆酸而不影响化合物的传递增强性能。制备这种化合物的方法见2003年6月4日提交的临时申请,Townsend&Townsend&Crew LLP代理人审理号016930-000830US,该申请转让给与本申请相同的受让人,该申请全文纳入作为参考并且尤其是参考文中披露的转染试剂和传递增强试剂及其制备方法和用途。
实施例12
膀胱内施用SYN3制剂后IFN蛋白的摄取
本实施例通过测定当施用SYN3制剂时,SYN3是否增加了干扰素蛋白的组织水平来检测SYN3是否提高干扰素蛋白的摄取。
方法.由于杂交IFN蛋白的供应有限,主要使用IFBα2b蛋白(IntronA)。出于比较目的,杂交蛋白也包括于时间t=0的时间点。使用异氟烷麻醉杂交HSD大鼠。收集治疗前的尿液。使用导管和润滑剂经尿道插入导管至膀胱。测试物施用至膀胱,用2.0G缝合线结扎尿道而不取出导尿管。45分钟(0小时)后,取出测试物并允许大鼠在笼中恢复。处死之前立即从大鼠获得尿液样品。尿液收集后,收集该日大鼠的膀胱。冷冻组织并测定IFN应答基因的上调节。
组 | 大鼠识别号 | 处死时间 | 尿液体积 | 处理 |
1 | 888,889 | tx后0小时 | --- | PBS配制的IFNα2b蛋白 |
2 | 876,877 | tx后4小时 | 876:1.8ml877:2.3ml | PBS配制的IFNα2b蛋白 |
3 | 882,883 | tx后1天 | 882:2.8ml883:2.9ml | PBS配制的IFNα2b蛋白 |
4 | 890,891,892 | tx后0小时 | --- | SYN3配制的IFNα2b蛋白:1mg/ml |
5 | 878,879 | tx后4小时 | 878:1.3ml879:1.2ml | SYN3配制的IFNα2b蛋白:1mg/ml |
6 | 884,885 | tx后1天 | 884:0.8ml885:0.8ml | SYN3配制的IFNα2b蛋白:1mg/ml |
7 | 880,881 | tx后4小时 | 880:1.9ml881:2.2ml | LACB:SYN3配制的1×1011P/ml:1mg/ml |
8 | 886,887 | tx后1天 | 886:0.8ml887:1.5ml | LACB:SYN3配制的1×1011P/ml:1mg/ml |
组 | 大鼠识别号 | 处死时间 | 处理 |
1 | 893,894 | tx后0小时 | PBS配制的IFNα2α1蛋白 |
4 | 895,896 | tx后0小时 | SYN3配制的IFNα2α1蛋白:1mg/ml |
材料:
38只雌性Harlan Sprague-Dawley大鼠;
IACB: Tris-甘油制剂7.57×1011P/ml
IHCB: vPBS制剂1.10×1012P/ml
SYN3: 6×原液(6mg/ml)
IntronA:使用的参考小瓶:用3,008μl PBS(2.4MIU/ml)稀释的950μl IntronA在1ml无菌纳纯(nanopure)蒸馏水中水合(10MIU/ml)
IFNα2α1蛋白:105μg/ml=105×106pg/ml
1.34×107IU/ml
1.28×108IU/mg
IACB是用于干扰素α2b的重组腺病毒载体并具有CMV启动子和E1-缺失区域。IHCB也是具有CMV启动子和E1缺失区域的用于杂交干扰素α2α1的重组腺病毒载体。
制备测试物:
制备终浓度为2.4MIU/ml的IFNα2b(一个参考小瓶水合于1ml注射用无菌水)
950μl Intron A浓缩液
3,008μl PBS
制备PBS配制的IFNα2b:
625μl Intron A@2.4MIU/ml
125μl PBS
制备SYN3配制的IFNα2b:
625μl Intron A@2.4MIU/ml
125μl SYN3
制备SYN3配制的rAd-IFNα2b(IACB):
66μl IACB
250μl SYN3
1184μl Tris-甘油缓冲液
制备IFNα2α1蛋白浓缩液(2.2ml):
243μl IFNα2α1蛋白
1957μl PBS
IFNα2αl/PBS:
625μl IFNα2α1蛋白
125μl PBS
IFNα2α1/SYN3:
625μl IFNα2α1蛋白
125μl SYN3
成分 | 量(mg/小瓶) |
(SYN3) | 120 |
柠檬酸一水合物USP/EP/超纯或USP | 1.6 |
柠檬酸二水合物USP/EP/超纯或USP | 5.1 |
羟丙基-β-环糊精(高取代度) | 1000 |
聚山梨酯80 USP | 60 |
所以,赋形剂的终浓度是:
SYN3:(120mg/20ml)/6=1mg/ml
柠檬酸一水合物:(1.6mg/20ml)/6=0.01333mg/ml
柠檬酸钠二水合物:(5.1mg/20ml)/6=0.0425mg/ml
羟基-环糊精:(1000mg/20ml)/6=8.33mg/ml
聚山梨酯80(吐温-80):(60mg/20ml)/6=0.5mg/ml
使用ELISA测定(PBL)确定存在于组织匀浆中的IFNα2b量。使用Bradford蛋白质测定测量蛋白质的浓度。组织中蛋白质的水平以pg IFN/mg组织表示(见图8)。如图8所示,处理24小时后,SYN3制剂配制的IFNα2b的传递导致可检测的IFNα2b蛋白的量增加约15倍。SYN3制剂传递也提高了杂交IFN蛋白(IFNα2α1)的传递并且检测到类似于IFNα2b蛋白的组织浓度水平。
实施例13
分析施用SYN3制剂配制的IFN蛋白后干扰素对膀胱上皮的生物作用
本实施例检测了IFN组织浓度增加是否导致可测量的生物应答。为评价生物活性,我们使用RT-PCR来检测用IFN蛋白(Intron A和“通用”干扰素(IFNA/D;IFNα2α1))处理后IFN应答基因在大鼠膀胱匀浆中的表达。测定了以下大鼠基因:2′,5′-寡腺苷酸合成酶(2′,5′-OAS);编码干扰素诱导的p78蛋白质(MxAMX1)(MX1)的基因;干扰素调节因子(IRF-1)和干扰素γ(IFNγ)。(通常不认为IFNγ是IFN应答基因,但通常在接触病原体(例如BCG)后表达并且用于确定重组腺病毒是否诱导了类似的IFNγ应答)。方法一般如实施例12所述。1小时后,取出测试物并允许动物在笼中恢复。在指示时间(0小时=处理后立即)处死大鼠,在液氮中快速冷冻样品并交付RT-PCR分析。
组 | 动物识别号 | 处死时间 | 处理 |
1 | 193,194 | tx后0小时 | PBS配制的IFNα2b蛋白 |
2 | 176,177 | tx后4小时 | PBS配制的IFNα2b蛋白 |
3 | 185,186 | tx后1天 | PBS配制的IFNα2b蛋白 |
4 | 190,191,192 | tx后0小时 | SYN3配制的IFNα2b蛋白1mg/ml |
5 | 178,179,180 | tx后4小时 | SYN3配制的IFNα2b蛋白1mg/ml |
6 | 187,188,189 | tx后1天 | SYN3配制的IFNα2b蛋白1mg/ml |
7 | 181,182 | tx后4小时 | LACB:SYN3配制的1×1011P/ml:1mg/ml |
8 | 183,184 | tx后1天 | LACB:SYN3配制的1×1011P/ml:1mg/ml |
组 | 大鼠识别号 | 处死时间 | 处理 |
1 | 293,294 | tx后0小时 | PBS配制的IFNα2α1蛋白 |
2 | 276,277 | tx后4小时 | PBS配制的IFNα2α1蛋白 |
3 | 285,286 | tx后1天 | PBS配制的IFNα2α1蛋白 |
4 | 290,291,292 | tx后0小时 | SYN3配制的IFNα2α1蛋白:1mg/ml |
5 | 278,279,280 | tx后4小时 | SYN3配制的IFNα2α1蛋白:1mg/ml |
6 | 287,288,289 | tx后1天 | SYN3配制的IFNα2α1蛋白:1mg/ml |
7 | 281,282 | tx后4小时 | IHCB:SYN3配制的1×1011P/ml:1mg/ml |
8 | 283,284 | tx后1天 | IHCB:SYN3配制的1×1011P/ml:1mg/ml |
所需材料:
38只雌性Harlan Sprague-Dawley大鼠;从方案04-634转移
IACB: Tris-甘油制剂7.57×1011P/ml
IHCB: vPBS制剂1.10×1012P/ml
SYN3: 6×原液(6mg/ml)
D-PBS
Tris-甘油缓冲液:
无菌WFI
IFNα2α1蛋白: 105μg/ml=105×106pg/ml
1.34×107IU/ml
1.28×108IU/mg
制备测试物:
1)IFNα2b/PBS:5ml@2MIU/ml终浓度
·在1ml注射用无菌水中水合一个参考小瓶(10MIU/小瓶)
1,000μl IntronA浓缩液
4,000μl PBS
2)IFNα2b/SYN3:10ml@2MIU/ml终浓度
·在2ml注射用无菌水中水合两个参考小瓶(10MIU/小瓶)
2,000μl IntronA浓缩液
6,334μl PBS
1,666μl SYN3
IACB/SYN3:SYN3配制的4.5ml@1.0×10
11
P/ml
660μl IACB
750μl SYN3
3,090μl Tris-甘油缓冲液
IFNα2α/PBS:4ml@1MIU/ml终浓度
298μl IFNα2α1蛋白
3,702μl PBS
IFNα2α1/SYN3:6ml@1MIU/ml终浓度
444μl IFNα2α1蛋白
4,556μl PBS
1,000μl SYN3
IHCB/SYN3SYN3配制的4.0ml@1.0×101P/ml
364μl IHCB
667μl SYN3
2,969μl Tris-甘油缓冲液
在指示时间(见图9-11)处死动物并在液氮上收集其膀胱用于RT-PCR分析。初步分析用于比较上述基因的mRNA水平与Intron A/PBS传递后观察到的水平。因此,在提供的附图中,基因激活的水平被标准化至Intron A/PBS组(1.0)。
如图9-12所示,与传递相同量的PBS制剂配制的蛋白质相比,加入SYN3增加了已知下游IFN-激活的基因(2′-5′OAS,MX1)的表达。即使以1MIU/ml剂量替代2MIU/ml的IFNα2b,SYN3配制的杂交蛋白(BS:IFNα2α1/SYN3)似乎提供更强有力的生物应答。尽管施用SYN3制剂配制的Intron A(IFNα2b)和杂交IFN(IFNα2α1)增加了大鼠OAS和MX1基因表达,二者有点低于施用rAd-IFNα2b或rAd-IFNα2α1后得到的水平。
应该理解的是,文中所述的实施例和实施方案仅是说明性目的,本领域的技术人员可做出各种改进或变化,并且这些改进或变化也包括于本申请的精神和范围以及附加的权利要求的范围内。如同每个单独出版物或专利申请被具体且独立地纳入参考,本说明书中引用的所有出版物和专利申请均出于所有目的全文纳入作为参考。
Claims (23)
1.一种药物组合物,所述药物组合物含有:
1)下式的传递增强试剂
式中,
R1和R2各自独立地选自氢和羟基;
m和n各自独立地选自约0-2;
R3选自:-NR4R5,其中R4和R5各自独立地选自氢、糖类残基、任选取代的烷基、任选取代的酰基、任选取代的酰氧基,和季铵盐-NR6R7R8X,其中R6、R7和R8独立地选自氢和C1-C4烷基,X是选自卤素或任选取代的羧酸根的带负电荷的离子结合平衡离子;和
2)干扰素蛋白或干扰素基因传递系统,其中所述基因传递系统含有干扰素基因,并且所述干扰素基因可操作连接于调制该基因表达的遗传调节元件,所述干扰素选自干扰素α-2b、融合干扰素α-/2α-1和干扰素α-2e。
2.如权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述组合物含有药学上可接受的载体。
3.如权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述组合物是冻干的。
4.如权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述试剂是SYN3并且所述干扰素是人干扰素。
5.如权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述干扰素是人干扰素α-2b。
7.如权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述R1和R2均是羟基。
8.如权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述m和n各自是1。
10.如权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,R4是氢;并且R5选自氢、糖类残基、任选取代的烷基、任选取代的酰基和任选取代的酰氧基。
12.如权利要求6所述的药物组合物,其特征在于,R4是琥珀酰基。
13.如权利要求6所述的药物组合物,其特征在于,R4是乙酰基。
14.如权利要求6所述的药物组合物,其特征在于,R3是三甲铵盐。
15.如权利要求6所述的组合物,其特征在于,R3是三乙铵盐。
16.如权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述基因传递系统含有人干扰素α-2b基因。
17.如权利要求11所述的药物组合物,其特征在于,所述基因传递系统含有人干扰素α-2b基因。
18.如权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述基因传递系统含有重组病毒载体。
19.如权利要求18所述的药物组合物,其特征在于,所述重组病毒载体选自疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘病毒载体和腺病毒载体。
20.如权利要求17所述的药物组合物,其特征在于,所述重组病毒载体是腺病毒载体。
21.一种试剂盒,其包含:
含有下式的传递增强试剂的第一容器:
式中,
R1和R2各自独立地选自氢和羟基;
m和n各自独立地选自约0-2;
R3选自:-NR4R5,其中R4和R5各自独立地选自氢、糖类残基、任选取代的烷基、任选取代的酰基、任选取代的酰氧基,和季铵盐-NR6R7R8X,其中R6、R7和R8独立地选自氢和C1-C4烷基,X是选自卤素或任选取代的羧酸根的带负电荷的离子结合平衡离子;和
含有干扰素蛋白或干扰素基因传递系统的第二容器,其中所述基因传递系统含有干扰素基因,并且所述干扰素基因可操作连接于调制该基因表达的遗传调节元件,所述干扰素选自干扰素α-2b、融合干扰素α-/2α-1和干扰素αα-2e。
22.如权利要求21所述的试剂盒,其特征在于,所述第一容器含有SYN3的冻干制剂。
23.如权利要求22所述的试剂盒,其特征在于,所述第二容器含有干扰素或基因传递系统的冻干制剂。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US47592603P | 2003-06-04 | 2003-06-04 | |
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