KR101500528B1

KR101500528B1 - 새로운 비-선택적 소마토스타틴 유사체

Info

Publication number: KR101500528B1
Application number: KR1020107010880A
Authority: KR
Inventors: 안드레아 비탈리; 마시모 피노리; 파올로 마스카니
Original assignee: 이탈파마코 에스.피.에이.
Priority date: 2007-12-03
Filing date: 2008-11-24
Publication date: 2015-03-09
Also published as: BRPI0818978A2; KR20100103464A; WO2009071460A2; CA2702940A1; SI2225271T1; HRP20130948T1; EP2225271B1; CN101883785A; PL2225271T3; US8937152B2; JP2011505345A; WO2009071460A3; JP5331817B2; BRPI0818978B1; ES2431573T3; DK2225271T3; PT2225271E; BRPI0818978B8; CY1114490T1; US20100323964A1

Abstract

본 발명은 소마토스타틴의 비-선택적 기능성 유사체인, 새로운 종류의 화학식 1의 사이클로펩티드에 관련된다.
[화학식 1]

Description

새로운 비-선택적 소마토스타틴 유사체 {NEW NON-SELECTIVE SOMATOSTATIN ANALOGUES}

본 발명은 소마토스타틴(somatostatin)의 새로운 비-선택적 기능성 유사체(analogue) 사이클로펩티드, 이의 접합체(conjugate) 및 복합체(complex), 이의 제조 방법, 이를 함유하는 제형 및 약학 분야에서 이의 용도에 관련된다.

소마토스타틴의 고리형 펩티드 아고니스트(agonist)는 오랫동안 알려져 왔다[J Pept Res 58 (2), 91 (2001)]: 특히, 이 중 2개, 옥트레오타이드(octreotide) 및 란레오타이드(lanreotide)는 말단 비대증(acromegaly)의 치료 및 암의 대증요법(symptomatic treatment)에 임상적으로 사용된다.

소마토스타틴은 5개의 수용체 아류형(receptor subtype)(SSTR1, 2, 3, 4 및 5)과 상호작용을 통해 작용한다: 그러나 지금까지 치료에 이용된 유사체는 그럼에도 불구하고 단일 수용체 SSTR2에 대해 본질적으로 선택적이다.

이미 알려진 아고니스트의 대부분은 펩티드 구조에서 단편 -DTrp-Lys-의 존재를 특징으로 한다; 따라서 이 단편은 유사체의 활성에 필수적인 것으로 보이고 사실상 옥트레오타이드 및 란레오타이드에도 존재한다.

최근에, 덜-선택적인, 즉 다른 수용체 아류형과도 상호작용할 수 있는 유사체가 치료 용도의 관점에서 이점을 제공할 수 있다는 가설이 제시되었다[Nature Rev. Drug Discovery 2, 999 (2003)].

특허 출원 WO2002010192에서, 수용체 SSTR5에 대해 강한 친화력(affinity), SSTR2 및 SSTR3에 대해서는 낮은 친화력 그리고 SSTR4에 대해서는 거의 0의 친화력을 갖는 사이클로펩티드가 기술되어 있다. SSTR1에 대해서는, 친화력이 SSTR5보다 약 60배 낮은 것으로 기술되어 있다.

WO2002010192의 동일 발명자는 이후 간행물[Nature Rev. Drug Discovery 2, 999 (2003)]에서, 소마토스타틴의 항분비(antisecretory) 활성을 위해 수용체 SSTR1, 2 및 5의 중요성을 입증하지만, 상기 특허 출원에 기술된 동일한 사이클로펩티드에 대해서는, SSTR1에 대한 친화력이 SSTR5보다 약 300배 낮은 것으로 보고하고 있다.

이 경우에서 명백하듯이, 수용체 SSTR1과의 상호작용에 의해 매개되는 가능한 치료 활성은 SSTR5와의 상호작용에 의해 매개되는 작용에 비해 상당한 과다 복용일 경우에만 달성될 수 있다.

따라서, 수용체 SSTR4에 대한 아고니스트의 가능한 치료 역할은 명확하지 않지만, 다른 4개의 수용체 모두와 필적하는 친화력을 갖는 새로운 소마토스타틴 유사체에 대한 필요 및 가능한 용도는 명백히 있다.

특히, SSTR1과 상호작용할 수 있는 아고니스트의 잠재적인 치료적 이점이 문헌에 보고되어 있다: M. C. Zatelli 및 동료들은 생체외에서 인간 뇌하수체 선종(pituitary adenoma)에 미치는 SSTR1에 대한 아고니스트의 효과를, 분비[J Clin End&Met 88, 2797 (2003)] 및 임상적으로 비기능성[J Clin End&Met 89, 5181 (2004)] 양 측면에서 연구하였다; 두 경우 모두에서 SSTR1 수용체의 자극은 분비 활성 및 세포 활력의 감소를 초래한다. 다른 한편, (수용체 SSTR 1, 2, 3 및 5와 상호작용할 수 있는) 소마토스타틴의 다능성(pluripotent) 유사체의 사용에서 파생될 수 있는 잠재적인 치료적 이점이 최근 리뷰 논문[Curr. Pharm. Design 11, 1573 (2005)]에서 J. van der Hoek 및 동료들에 의해 또한 밝혀졌다; 사실상 뇌하수체 및 위장관췌장(GEP)에 대해, 여러가지 종양이 세포 표면에 얼마만큼 발현되는지가 나타나는데, 모든 4개의 수용체의 경우 가변적이지만 현저한 비율인 반면에, 수용체 SSTR4는 훨씬 적게 존재한다.

WO2005014624 출원은 소마토스타틴의 고리형 유사체의 제조 및 이 제조에 사용된 중간체를 기술한다. 이 헥사사이클릭 유사체는 3 위치에 트립토판을 갖는다.

WO2006066868 출원은 소마토스타틴 유사체의 몇 가지 염의 비경구 투여용 약학 조성물을 기술하는데, 이는 체액과 접촉하여 주사 후 침전 겔(deposit gel)을 형성한다. 소마토스타틴 유사체로, 소마토스타틴에서 유도되는 선형 또는 고리형 펩티드가 사용되는데, 이는 트립토판을 포함하는 아미노산의 서열을 포함한다.

Regulatory Peptides, 1 (1980) 97-113에서, 소마토스타틴 활성을 위한 인돌 NH 기의 중요성이 입증된다: 나프틸알라닌(naphthylalanine)을 이용한 Trp⁸의 치환은 사실상 활성의 손실을 야기한다.

이 논문에서 바인딩 데이터는 보고되지 않지만, 생체내 위액 분비의 억제 활성이 평가된다. 그 결과는 위장 활성에 대해, 할로겐, 메틸화된 또는 메톡시화된 유사체(표 2)를 이용한 Trp⁸의 치환은 생물학적 효능에 적은 영향을 갖지만, 그 효능은 트립토판보다는 펜타메틸-페닐알라닌(Pmp) 또는 나프틸알라닌(표 3)을 함유하는 유사체에서 대신 거의 상쇄됨을 나타낸다. D-Trp의 할로겐 유도 화합물은 대신 GH 분비(표 4)의 억제 활성을 상당히 개선하는 것 같다. Merck S&D 연구원들(Veber D.F. in Proceedings of the 12th Am. Pep. Symp.; Smith, J.A. & Rivier J.E. editors, ESCOM 1992, pp 3-14 참조)은 고리형 헥사펩티드에서 다른 방향족 아미노산을 이용한 트립토판의 치환은 GH 분비의 억제에서 생체외 활성의 상당한 손실을 초래한다고 보고한다.

J Med Chem (2005) 48, 507에서, SSTR1에 대한 선택적 유사체가 아고니스트의 가능한 치료적 역할과 함께 기술된다. 여기에서 분석된 구조도 또한 트립토판을 갖는다.

이 논문은 두 사이클로펩티드에서 유도되는 두 계열의 유사체를 기술한다: 하나는 D-Trp를 함유하고 다른 하나는 D-Nal을 함유한다; 모체처럼 모든 유사체는 SSTR1에 대한 친화력만 갖는다; D-Nal 계열은 D-Trp보다 약 10배 덜 강력하다. 모든 다른 수용체 아류형에 불활성인, 이 펩티드에 대해 한가지 특별한 점은 p-아민-페닐알라닌을 이용한 라이신의 치환이다.

따라서 상술한 바로부터 명백하듯이, SSTR1, SSTR2, SSTR3 및 SSTR5를 자극할 수 있는 소마토스타틴의 다능성 아고니스트는 그 활성 기능이 더 적은 수의 소마토스타틴 서브-수용체로 제한되는 아고니스트에 비해 신경내분비(neuroendocrine) 종양을 갖는 환자에서 양성 반응의 가능성을 증가시킬 것이다.

본 출원인은 놀랍게도 많은 공지된 유사체에 존재하는 트립토판 잔기가 다른 적합한 방향족 잔기로 유용하게 치환되어 대부분의 소마토스타틴 수용체에 대한 친화력을 유지할 수 있다는 것을 발견했다.

특히, 트립토판 잔기의 치환에서, 충분히 전자로 풍부한 방향족 기를 갖는 아미노산(예를 들어 전자-공여기로 치환된 것)을 이용함으로써, SSTR2, SSTR3 및 SSTR5 수용체와의 결합에 필요한 것과 유사한 농도 값에서, SSTR1 수용체에 대한 양호한 친화력을 나타내는 펩티드가 얻어진다는 것이 발견되었다.

따라서 본 발명의 목적은 화학식 1의 소마토스타틴 유사체 사이클로헥사펩티드를 제공하는 것이고, 여기서 소마토스타틴 유사체 사이클로헥사펩티드로 6개의 알파-아미노산 잔기를 갖는 펩티드가 사용되는데, 이때 직접 펩티드 결합은 적어도 하나의 공지된 소마토스타틴 수용체에 대해 나노몰 농도에서 결합 친화력을 갖는 제6잔기의 알파-카르복실기 및 제1잔기의 알파-아민기 사이에 존재한다:

[화학식 1]

화학식 1에서:

m = 0, 1 또는 2이고 n = 1, 2 또는 3; 바람직하게는 m은 1이고 n은 1 또는 2이며; 더욱 더 바람직하게는 n은 1이다.

R1은 인돌을 제외한 방향족 기를 나타내는데, 이것은 바람직하게는 하나 이상의 위치에서 선택적으로 치환된, 페닐, 나프틸, 벤즈하이드릴, 플루오레닐, 스티레닐, 안트라닐 또는 비페닐이다. 바람직한 치환기는 알킬, 알킬옥실, 하이드록실, 알킬아민, 아실아민, 설파이드 또는 알킬설파이드와 같은 전자-공여체이다.

R1 기는 바람직하게는 하나 이상의 메틸옥시기, 바람직하게는 2개의 메틸옥시기로 치환된 나프탈렌기이다; 본 발명의 더욱 더 바람직한 태양에서, R1은 3,8-디메톡시-나프탈렌-2-일이다.

R4는 선택적으로 치환된 방향족 기를 나타낸다. R4 기는 바람직하게는 하이드록실기, C₁-C₄ 알콕실, C₁-C₄ 알킬, 할로겐 또는 니트로로 가능하게 치환된 페닐기이다.

R2 및 R3은 독립적으로 H 또는 C₁-C₄ 알킬기이고, 또는 함께 이들은 고리형 구조를 형성하도록 질소 원자에 결합된 C₄-C₅ 알킬렌 사슬을 나타낸다.

선택적으로는, R3은 양이온 또는 금속 킬레이팅 기(chelating group)일 수 있고, 아민기에 직접 결합하거나 스페이서(spacer)를 통해 결합한다.

가능한 스페이서는 이 분야에서 이미 공지된 것들 중 하나일 수 있는데, 예를 들어 여기에서 참고문헌으로 인용되는 GB-A-2,225,579 또는 WO9701579에 기술된 것들이다; 이들은 예를 들어 식 -Z-R5-CO-의 기일 수 있는데, 여기서 R5는 C_1-11 알킬렌, C_1-11 알케닐렌 또는 -CH(R6)-이며, 여기서 R6은 알파 아미노산의 측쇄이고, Z는 킬레이팅 기와 공유 결합을 형성할 수 있는 기능기이다; Z는 예를 들어 킬레이팅 기의 또 다른 기능기(예를 들어 하이드록실, 카르복실 또는 아민)와 에테르, 에스터 또는 아미드 결합을 형성할 수 있는 기능기일 수 있다. Z는 바람직하게는 산소 원자, 황 원자, 카르보닐 라디칼(또는 CO) 또는 아미노 라디칼(또는 NH)이다.

Z 기는 더욱 더 바람직하게는 아미노 라디칼이고 식 -Z-R5-CO-의 기는 예를 들어 베타-알라닌(또는 -NH-(CH₂)₂-CO-), 6-아미노 헥사노산(또는 -NH-(CH₂)₅-CO-) 등과 같은 카르복실-아미노산에서 유도되는 2가 잔기일 것이다.

킬레이팅 기는 항-종양 방사선치료용 이온 또는 다른 검출가능하거나 유용한 원소를 복합체화시킬 수 있는, 생리적으로 허용가능한 기이고, 바람직하게는 친수성을 갖는다.

킬레이팅 기와 이온 및 다른 복합체화 원소는 예를 들어 여기에서 참고문헌으로 인용되는 Okarvi S.M. in Med. Res. Rev. 24 (3), 357 (2004), Weiner R.E. and Thakur M.L. BioDrugs 19(3), 145 (2005) 또는 WO2002010192에 이미 공지되고 기술된 것 중에서 유용하게 선택될 수 있다.

킬레이팅 기는 유리 형태로, 이온 또는 다른 원소와 염화 또는 복합체화될 수 있고, 방사능(방사성 핵종(radionuclide)) 또는 다른 수단으로 검출가능하며, 또는 방사선치료 목적으로 사용가능하다.

바람직하게는, 킬레이팅 기는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N',N",N'"-테트라아세트산(DOTA) 또는 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)에서 유도될 것이고 이온은 상자성 이온(Gd³⁺, Fe³⁺ 등), 형광성(Eu³⁺) 또는 방사성 핵종 방사 α,β 또는 γ 방사능(¹¹¹In, ⁹⁹mTc, ¹⁶⁹Yb, ¹⁷⁷Lu, ^9OY, ²¹³Bi 등)일 것이다.

X1은 화학식 2의 (a), (b) 또는 (c)의 아미노아실 잔기이다.

[화학식 2]

X1은 바람직하게는 화학식 2의 (c)의 아미노아실 잔기이다.

화학식 1의 사이클로헥사펩티드에 존재하는 아미노아실 잔기는 L-구조 또는 D-구조를 가질 수 있다; 바람직하게는 잔기 1, 2, 및 4-6은 L체이고, 잔기 3은 바람직하게는 D체이다.

화학식 1의 사이클로헥사펩티드는 유리 염기 형태로 또는 염으로서 존재할 수 있다. 염은 유기산(예를 들어 아세테이트, 락테이트, 벤조에이트, 아스파르테이트, 파모에이트 등), 고분자 산(예를 들어 폴리메타크릴산, 폴리스티렌설폰산 등) 또는 무기산(예를 들어 하이드로클로라이드, 설페이트, 니트레이트 등)과 첨가 염을 포함한다.

본 발명의 화합물은 생체내에서 소마토스타틴의 유사체 사이클로디설파이드(옥트레오타이드, 란레오타이드 등)와 비교하여 분해 메커니즘에 훨씬 더 저항적이고 그 결과 더 긴 작용 기간을 갖는다. 어떤 경우에는, 안정한 소마토스타틴 아고니스트인 것으로 이미 공지된 것들을 포함하여, 다른 사이클로펩티드에 비해 안정성 및 작용 기간이 또한 개선된다.

또한, 본 발명은 이제부터 본 발명의 화합물로 불리는 화학식 1 화합물의 제조 방법을 포함한다.

본 발명의 화합물은 다른 펩티드에 대해 이미 공지된 방법과 유사한, 여러가지 합성 방법을 이용함으로써 제조될 수 있다.

a) N-말단 알파-아미노기 및 C-말단 알파-카르복실기 모두를 유리시키도록, 부분적으로 보호된 대응 선형 헥사펩티드는 고상(solid phase) 합성에 의해 제조될 수 있다; 2개의 유리기는 적절한 축합제에 의해 용액에서 반응하게 될 것이고 측쇄의 보호기는 최종적으로 제거되어 원하는 사이클로헥사펩티드를 얻을 것이다.

b) 선택적으로는, 고상 합성은 라이신 측쇄로 수지에 펩티드를 결합시킴으로써 수행될 수 있다; 이 경우에, N-말단 및 C-말단기로부터 보호기를 선택적으로 제거한 후, 고리화 반응은 고상에서 여전히 수행될 수 있고 본 발명의 화합물은 수지로부터 탈보호 및 분리의 단일 처리로 얻어질 수 있다.

c) 또 다른 대체예에서, 보호된 선형 펩티드는 용액에서의 합성에 의해 제조될 수 있고, N-말단 및 C-말단기로부터 보호기를 선택적으로 제거한 후, a)에 기술된 바와 같이 진행될 수 있다.

고리화될 선형 펩티드는 본 발명의 화합물에 존재하는 6개의 펩티드 결합 중 어느 하나의 개방에 의해 가상적으로 얻을 수 있는 6개의 펩티드 중에서 선택될 수 있다. 선택은 펩티드 합성 전문가에게 공지된 합성 적합성의 고려에 의해 안내될 것이지만, 최종 산물의 성질에 최소한으로 영향을 미치지는 않고, 어떤 경우에는 선형 펩티드의 선택된 서열이 무엇이든지간에 동일할 것이다; 바람직하게는, C-말단 아미노산이 라이신인 펩티드가 선택된다.

펩티드의 합성에 필요한 많은 아미노산 유도체는 공지되고 상업적으로 이용가능하다.

하이드록시프롤린 유도체는 여기에서 참고문헌으로 인용되는 WO9701579에 기술된 바와 같이, 또는 다른 유사한 절차로 제조될 수 있다; 선택적으로는, 부분적으로 보호된 선형 펩티드는 비-변성 하이드록시프롤린 잔기를 함유할 수 있고, 측쇄의 도입은 탈보호 전에, 또는 고리화 반응 이후, 최종 탈보호 전에, 선형 펩티드에 직접 수행될 수 있다.

본 발명 화합물의 킬레이팅 유도체에 대해, 하이드록시프롤린에 결합된 사슬의 보호기는 이를 선택적으로 제거 가능하여 라이신 측쇄의 보호기를 변경시키지 않도록 적절히 선택될 수 있다; 이런 방식으로, 최종 탈보호 전에, 직접 또는 스페이서에 의해, 유리 아미노기에 킬레이팅 기를 결합시키는 것이 가능할 것이다.

화학식 1의 3 위치에 사용되는 일부 아미노산은 그 유도체처럼 새롭고 본 발명의 다른 태양을 형성한다. 특히, 인용하는 아미노산은:

화학식 3의 (e), (f) 및 (g)에 해당하는

3-(3,8-디메톡시-나프탈렌-2-일)-알라닌,

3-(1,4-디메톡시-나프탈렌-2-일)-알라닌 및

2,5-디메톡시-호모페닐알라닌

및 이들의 완전 또는 부분적으로 보호된 유도체이다:

[화학식 3]

식 (e), (g) 및 (f)에서, G는 수소 원자, 또는 플루오렌-9-일-메틸옥시-카르보닐, 터트-부틸옥시-카르보닐 또는 벤질옥시-카르보닐과 같이, 이 분야의 당업자에게 공지된 것들 중에서 선택되는 보호기일 수 있다; W는 하이드록실기, 또는 이 분야의 당업자에게 공지된 것들, 예를 들어 메틸옥시, 터트-부틸옥시 또는 벤질옥시 중에서 선택되는 보호기일 수 있다. 부분적으로 보호된 유도체로, G 및 W 중에서 하나만 보호기를 갖는 유도체가 사용된다.

이들은 문헌에 이미 공지된 방법을 채택함으로써 제조될 수 있다(예를 들어 [J Org Chem 55, 2913 (1990)], [Org. Lett. 2, 1089 (2000) 및 [Synthesis (1983), 38] 참조); 예를 들어, 원하는 측쇄에 대응하는 알데히드에서 출발하여, 반응식 1에 기술된 방법이 사용될 수 있다.

[반응식 1]

상술한 유도체는 라세믹 거울상 이성질체(racemic enantiomer) 혼합물(D/L)로서 제조될 수 있고, 또는 입체선택적 합성 또는 키랄 분할 방법에 의해, 이들은 단일 거울상 이성질체 D 또는 L로 얻어질 수 있다.

키랄 분할 방법 중에서, (예를 들어 여기에서 참고문헌으로 인용되는 US2001021519에 기술된 바와 같은) 효소적 탈라세미화(deracemisation) 방법이 사용될 수 있는데, 여기서 효소(예를 들어 L 또는 D 아미노산-산화효소)의 입체선택성은 2개의 거울상 이성질체 중 하나만의 라세미화를 유도하고, 이후 반복 처리를 통해 고순도 거울상 이성질체를 얻는다.

또한, 본 발명의 목적은 본 발명의 화합물을 함유하는 약학 제형이다.

본 발명의 화합물은 유리 형태로 또는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 또는 복합체로서 투여될 수 있다. 이러한 염 및 복합체는 통상적인 방법으로 제조될 수 있고 유리 화합물과 동일한 활성 순서를 나타낸다. 또한, 본 발명은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 희석제와 함께, 화학식 1의 화합물을 유리 염기 형태 또는 약학적으로 허용가능한 염 형태로 포함하는 약학 화합물을 제공한다. 이러한 조성물은 통상적인 방법으로 제형화될 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 예를 들어 생분해성 고분자 또는 공중합체를 포함하는, 예를 들어 임플란트, 마이크로캡슐, 마이크로스피어(microsphere) 또는 나노스피어(nanosphere)와 같은 조절 방출(modified release) 형태로, 리포솜 제형 형태로, 또는 오토겔(autogel) 형태로, 예를 들어 환자의 체액과 상호작용 후 겔을 형성할 수 있는 고체 또는 반고체 조성물로 투여될 수 있다.

본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 복합체는 통상적인 경로에 의해, 예를 들어 비경구적으로(parenterally), 주사 가능한 용액 또는 현탁액의 형태(또한 상술한 조절 방출 형태를 포함)로, 경구적으로, 통상적인 흡수 촉진제를 이용하여, 비강내(nasally) 또는 좌약(suppository)으로 또는 국소적으로(topically), 예를 들어 점안액(ophthalmic liquid), 겔, 조제(preparation)의 형태로, 연고(unguent)로 또는 현탁액으로, 예를 들어 리포솜 현탁액, 마이크로스피어 또는 나노스피어 제형으로, 예를 들어 결막하(subconjunctival) 또는 내부 또는 눈주위(periocular) 점적주입(instillation) 또는 주사로 투여될 수 있다.

본 발명의 다른 태양에 따르면, 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 희석제와 함께, 본 발명 화합물의 접합체 또는 복합체를 포함하는 약학 조성물이 또한 제공된다. 이러한 조성물은 통상적인 방법으로 제조될 수 있고 예를 들어 진단 영상용으로, 하나는 방사성 핵종이고 다른 하나는 본 발명 화합물의 접합체인, 2개의 별도 처방과 이들의 혼합에 대한 설명서를 포함하는 키트(kit)로서 제공될 수 있다. 방사선치료용으로, 복합체화된 형태의 본 발명 화합물의 접합체는 바람직하게는 고온 액체 제형 형태일 수 있다.

다음 실시예는 본 발명의 목적을 예시하려는 것이고 어떤 식으로든 그의 한정으로 간주되어서는 아니된다.

본 실시예에서, 다음의 약어가 사용될 것이다:

1,4MNal 3-(1,4-디메톡시-나프탈렌-2-일)-알라닌

2,5MhPhe 2,5-디메톡시-호모페닐알라닌

3,8MNal 3-(3,8-디메톡시-나프탈렌-2-일)-알라닌

ACN 아세토니트릴

Bn 벤질

Boc 터트-부틸옥시-카르보닐

DIPEA 디이소프로필에틸아민

DMF N,N-디메틸포름아미드

DPPA 디페닐포스포릴아지드

DSC N,N-디석신이미딜카보네이트

Fmoc 플루오렌-9-일-메틸옥시-카르보닐

Fmoc-OSu 플루오렌-9-일-메틸, N-석신이미딜 카보네이트

HATU O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-

테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트

hPhe 호모페닐알라닌; 2-아미노-4-페닐-부티르산

Hyp 4,하이드록시-프롤린

Nal 3-(나프탈렌-2-일)-알라닌; 2-아미노-3-

나프탈렌-2-일-프로피온산

NMM N-메틸 모르폴린

Pd/C 탄소 상 금속 팔라듐

Phg 페닐글리신; 2-아미노-2-페닐-아세트산

PVDF 폴리비닐리덴플루오라이드

Sty 스티릴-알라닌; 2-아미노-5-페닐-펜트-4-에노산

Tfa 트리플루오로아세틸

THF 테트라하이드로푸란

-Trt(Cl)-DVB 수지, (2-클로로) 트리틸-디비닐벤젠

Z 벤질옥시-카르보닐

달리 표시한 경우를 제외하고, 아미노산은 L-구조이다; 라세믹 아미노산은 (D/L)로 표시되고, 불확정 키랄성(chirality)의 단일 거울상 이성질체는 (D,L)로 표시된다.

일반 정제 방법

달리 표시하지 않는 한, 모든 최종 정제는 Waters ZQ 질량 분석계(mass spectrometer)를 구비한, Waters Symmetry C18 5 mm 19×50 mm 칼럼을 갖는 Waters 제작 HPLC/MS 시스템으로 수행하였다.

실시 조건:

ES⁺ 중심 이온화(centroid ionisation), 15분 스캐닝 시간, 120-1000 m/z 스캐닝, 15V 콘 전압(cone voltage), 120℃ 소스(source) 온도, 250℃ 용매화(solvation) 온도

HPLC 용리액(eluent):

A=H₂O, B=ACN, C= 1% CF₃COOH 수용액

정제될 미정제 생성물(raw product)의 분액(aliquot)을 MeOH에 용해시키고 ACN/H₂O(1:1; v/v) 혼합물로 희석하였다. 0.45 mm PVDF 막에서 여과한 용액을 상술한 시스템에 주입하였다. 매 실시마다, 예상한 분자 이온([M+H]⁺)과 관련된 피크에 대응하는 분획을 모으고, 합치고 건조상태까지 농축하였다. 동일한 분자 이온(이성질체)과 관련하여 부가적인 피크가 존재할 경우, 이들을 별도로 수집하였다.

중간체의 제조

실시예 1

Fmoc-(D/L) 3-(3,8-디메톡시-나프탈렌-2-일)-알라닌

a) 3,8-디메톡시-2-나프트알데히드(1 eq), 2,2-디메틸-1,3-디옥산-4,6-디온(1.35 eq) 및 피페리딘(0.12 eq)을 CHCl₃에 용해시키고 용액을 2.5시간 동안 가열 및 환류시켰다. 수성 세척 후, 생성물을 용매의 증발에 의해 회수하고 THF 및 메탄올의 혼합물에 재용해시킨 후, NaBH₄(5.4 eq)를 용액에 첨가하였다. 약 10분 후, 물을 첨가하고 혼합물을 pH=3으로 산성화시켰다. 부분적으로 증발시킴으로써, 고체를 분리하여 회수하고 에탄올에 재용해시킨 후, 피리딘을 첨가하고 초기 생성물이 완전히 사라질 때까지 혼합물을 환류 가열하였다(TLC 제어).

b) 에탄올을 증발시킨 후, 생성물(2-(3,8-디메톡시-나프탈렌-2-일-메틸)-말론산의 모노-에틸 에스터)을 클로로포름에 용해시키고 산성수로 세척하였다. 티오닐 클로라이드(1.3 eq)를 건조된 용액에 첨가하고, 혼합물을 약 1시간 동안 환류 가열하였다. 클로로포름의 반복 증발 후, 잔류물을 디클로로메탄에 용해시키고 용액을 얼음조(ice bath)에서 냉각시켰다. 테트라부틸암모늄 브로마이드(촉매)를 첨가하고 NaN₃(1.2 eq)을 물에 용해시키고, 0℃에서 2시간 후, 유기상을 회수하고, 이를 물로 세척하고 무수 Na₂SO₄로 건조시켰다; 무수 Na₂SO₄의 존재 하에 용액을 실온에서 밤새동안 두었다. 트리플루오로아세트산(1.5 eq)을 여과된 용액에 첨가하고, 혼합물을 약 6시간 동안 환류 가열하였다. 5% NaHCO₃로 세척한 후, 용매를 증발시키고 얻어진 오일을 실리카 겔 칼럼에서 정제하였다.

c) 얻어진 생성물(Tfa-(D/L)3,8MNal-OEt)을 K₂CO₃(2 eq)을 함유하는, THF, 메탄올 및 물의 혼합물에 용해시키고 하루 밤 동안 환류 가열하였다. 용액을 부분적으로 증발시키고 THF에 용해시킨 Fmoc-OSu(1 eq)를 첨가하였다. 반응을 완료하자마자(TLC 제어), THF를 증발시키고 에틸 아세테이트로 수용액을 추출함으로써 생성물을 회수하였다. n-헥산의 첨가로, 생성물(Fmoc-(D/L)3,8MNal-OH)의 침전물을 얻고 이를 여과하고 건조시켰다(HPLC 순도: 98.5%; m/z= 498 amu([M+H]⁺)).

실시예 2

Fmoc-[4-(2-아미노에틸)카바모일]프롤린

a) Z-Hyp-OBn 및 DSC(1 당량)를 아세토니트릴에 용해시키고 트리에틸아민(1.2 eq)으로 처리하였다. 실온에서 하루 밤 후에, N-Boc-디아민에탄(1.2 eq)을 첨가하고 혼합물을 3.5시간 동안 반응하도록 두었다. 용매의 증발 후, 에틸 아세테이트로 회수한 잔류물을 차례로 2.5% KHSO₄, NaHCO₃ 및 NaCl로 세척하였다. 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 유기 용액을 건조상태까지 증발시키고, 생성물을 회수하였다.

b) 생성물을 메탄올에 용해시키고 10% Pd/C의 존재 하에 촉매적 수소 첨가에 의해 보호기(Z 및 벤질 에스터)를 제거하였다. 촉매의 여과 후에, 용매를 증발시킴으로써 아미노산을 회수하고, K₂CO₃(1 eq)을 함유하는 물 및 THF의 혼합물에 용해시키고, 0℃로 냉각시킨 후 THF에 용해시킨 Fmoc-OSu(2 eq)를 첨가하였다. 반응을 완료하자마자(TLC 제어), THF를 증발시키고 에틸 아세테이트로 수용액을 추출함으로써 생성물을 회수하였다. n-헥산의 첨가로, 생성물의 침전물을 얻고, 이를 여과하고 건조시켰다(HPLC 순도: 99.9%; m/z= 540 amu([M+H]⁺)).

실시예 3

Fmoc-(D/L) 2,5-디메톡시-호모페닐알라닌

a) 얼음조에서 냉각시킨, DMF(50 mL)에 녹인 2,2-디메틸-1,3-디옥산-4,6-디온(1.3 eq)의 현탁액에, NaCNBH₃(1.8 eq) 및 2.5-디메톡시페닐아세트알데히드(1.1 eq)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 5시간 동안 RT에서 교반하였다. H₂O를 첨가함으로써, 고체를 분리하여 여과하고, 이소프로판올로부터 결정화에 의해 정제하고 최종적으로 EtOH에 용해시키고 6시간 동안 피리딘으로 환류 처리하였다.

b) 실시예 1의 b)에 기술한 바와 같이 실시하여, 얻어진 생성물(2-(2,5-디메톡시-페닐-에틸)-말론산의 모노-에틸 에스터)로부터, 부분적으로 보호된 아미노산 Fmoc-(D/L)2,5MhPhe-OH를 제조하였다(HPLC 순도: 96%; m/z= 462 amu([M+H]⁺)).

실시예 4

Fmoc-(D/L) 3-(1,4-디메톡시-나프탈렌-2-일)-알라닌

1,4-디메톡시-2-나프트알데히드에서 출발하여 실시예 1에 기술한 바와 같이 실시함으로써, 보호된 아미노산 Fmoc-(D/L)1,4MNal-OH를 얻었다(HPLC 순도: 96.9%; m/z([M+H]⁺)= 498 amu).

사이클로펩티드의 제조:

실시예에서 기술한 펩티드의 순도는 HPLC 역상 크로마토그래피(Agilent 1100 크로마토그래프)에 의해 다음의 방법을 이용하여 분석하였다:

용리액: A) 아세토니트릴/물(5:95; v/v)에 녹인 0.1% TFA

B) 아세토니트릴에 녹인 0.1% TFA

용리액 B 구배: 30분간 20% 내지 80%

유속: 1.O ml/분

칼럼: Jupiter 4 μ(4 × 250 mm)

실시예 5

사이클로[Tyr(Bn)-Phe-Pro(4-OCONH(CH₂)₂NH₂)-Phe-(D,L)3,8MNal-Lys] 이성질체 B

a) H-Tyr(Bn)-Phe-Pro(4-OCONH(CH₂)₂NHBoc)-Phe-(D/L)3,8MNal-Lys(Boc)-OH

원하는 헥사펩티드를 얻기 위해, 수지 Fmoc-Lys(Boc)-Trt(Cl)-DVB에서 출발하여, 다양한 사이클의 고상 펩티드 합성을 수행하였다; 제1사이클에서, Fmoc-(D/L)3,8Mnal-OH(실시예 1 참조)를 이용하고 제3사이클에서는 Fmoc-Pro(4-OCONH(CH₂)₂NHBoc)-OH(실시예 2 참조)를 이용하였다; 모든 사이클에 대해, DMF에 녹인 20% 피페리딘으로 Fmoc 기를 제거하고 이후 Fmoc처럼 보호된 아미노산을 HATU로 활성화시키고 수지에 존재하는 아미노기와 반응하도록 하였다.

마지막으로, DMF에 녹인 20% 피페리딘으로 Fmoc 기를 제거하고 부분적으로 보호된 펩티드를 실온에서 30분 동안 아세트산, 트리플루오로에탄올 및 디클로로메탄의 혼합물(1:2:7 비율)로 처리하여 수지로부터 제거하였다. 용매를 증발시킨 후, 잔류물을 에틸 아세테이트 및 5% NaHCO₃ 사이에서 분할하고, 유기상을 회수하고 증발시켜 고체 잔류물을 얻었다.

b) 사이클로[Tyr(Bn)-Phe-Pro(4-OCONH(CH₂)₂NH)-Phe-(D,L)3,8-MNal-Lys]

c)에서 얻은 펩티드를 (1.6 mM) DMF에 용해시키고 -10℃로 냉각시켰다; DIPEA(2 eq) 및 DPPA(1.3 eq)를 첨가하고 혼합물을 +4℃에서 60시간 동안 두었다. DMF를 제거한 후, 잔류물을 에틸 아세테이트로 회수하고 5% NAHCO₃으로 세척하였다. 유기상을 증발시킴으로써, 고체 잔류물을 얻고 이를 0℃에서 1시간 동안 TFA(95% in H₂O)로 처리한 후 증발시켰다; 여러가지 종류의 이성질체가 잔류물에 존재하는데, 이를 역상 크로마토그래피(칼럼 C18)에 의해 분리하였다. HPLC 칼럼으로부터 용리 순서로 제2이성질체(이성질체 B)를 순수하게 수집하였다.

HPLC: RT 14.74분; 99.1% 순도

MS: m/z = 1133 amu([M+H]⁺) 및 567 amu([M+2H]²⁺)

실시예 6

사이클로[Tyr(Bn)-Phe-Pro(4-OCONH(CH₂)₂NH₂)-Phe-(D,L)2,5MhPhe-Lys] 이성질체 B

a) H-Tyr(Bn)-Phe-Pro(4-OCONH(CH₂)₂NHBoc)-Phe-(D/L)2,5-MhPhe-Lys(Boc)-OH

제1사이클에서 Fmoc-(D/L)2,5MhPhe-OH(실시예 3) 및 제3사이클에서는 Fmoc-Hyp-OH를 이용하여, 실시예 5의 a)에서 기술한 바와 같이 실시하였다. 말단 Fmoc 기의 제거 전에, NMM(5 eq)의 존재 하에 p-니트로페닐클로로포르미에이트(5 eq)로 수지를 처리하였다; 3시간 후에, 수지를 DCM으로 세척하고 또 다른 3시간 동안 N-Boc-디아민에탄(5 eq)으로 처리한 후, 여과하고 세척하였다. 이후 실시예 5의 a)에서 기술한 바와 같이 진행하였다.

b) 사이클로[Tyr(Bn)-Phe-Pro(4-OCONH(CH₂)₂NH)-Phe-(D,L)2,5-MhPhe-Lys]

a)에서 얻은 펩티드를 실시예 5의 b)에서 기술한 바와 같이 처리하였다. 또한 이 경우에서, 여러가지 이성질체를 얻고, 이를 역상 크로마토그래피(칼럼 C18)에 의해 분리하였다. HPLC 칼럼으로부터 용리 순서로 제2이성질체(이성질체 B)를 순수하게 수집하였다.

HPLC: RT 13.82분; 순도 99.0%

MS: m/z = 549 amu([M+2H]²⁺)

실시예 7

사이클로[Tyr(Bn)-Phe-Pro(4-OCONH(CH₂)₂NHCH₃)-Phe-(D,L)3,8MNal-Lys] 이성질체 B

제1사이클에서 Fmoc-(D/L)3,8MNal-OH(실시예 1) 그리고 하이드록시프롤린의 측쇄를 변경하기 위해 Boc-N(CH₃)-(CH₂)₂-NH₂)를 이용하여, 실시예 6에서 기술한 바와 같이 실시하였다. 여러가지 이성질체를 얻고, 이를 역상 크로마토그래피(칼럼 C18)에 의해 분리하였다. HPLC 칼럼으로부터 용리 순서로 제2이성질체(이성질체 B)를 순수하게 수집하였다.

HPLC: RT 15.07분; 순도 94.5%

MS: m/z = 1147 amu([M+H]⁺) 및 574 amu([M+2H]²⁺)

실시예 8

사이클로[Tyr(Bn)-Phe-Pro(4-OCONH(CH₂)₂NH₂)-Phe-(D,L)1,4-MNal-Lys] 이성질체 A

제1사이클에서 Fmoc-(D/L)1,4MNal-OH(실시예 4)를 이용하여, 실시예 6에서 기술한 바와 같이 실시하였다. 여러가지 이성질체를 얻고, 이를 역상 크로마토그래피(칼럼 C18)에 의해 분리하였다. 적은 체류 시간을 갖는 이성질체(이성질체 A)는 표제의 생성물에 해당한다.

HPLC: RT 13.71분; 순도 80.6%

MS: m/z = 1133 amu([M+H]⁺) 및 567 amu([M+2H]²⁺)

실시예 9

사이클로[Tyr(Bn)-Phe-Pro(4-OCONH(CH₂)₂NH₂)-Phe-(D,L)1,4-MNal-Lys] 이성질체 B

이전 실시예에서 기술한 제조물로부터, HPLC 칼럼에서 용리 순서로 두번째인 이성질체 B를 또한 순수하게 수집하였다.

HPLC: RT 14.71분; 순도 97.7%

MS: m/z = 1133 amu([M+H]⁺) 및 567 amu([M+2H]²⁺)

실시예 10

사이클로[Tyr(Bn)-Phe-Pro(4-OCONH(CH₂)₂NH₂)-Phe-(D)Nal-Lys]

사이클에서 Fmoc-(D)Nal-OH를 이용하여, 실시예 6에서 기술한 절차에 따라 화합물을 합성하였다.

HPLC: RT 14.14분; 순도 99.5%

MS: m/z= 1073 amu([M+H]⁺) 및 537 amu ([M+2H]²⁺)

실시예 11

사이클로[Tyr(Bn)-Phe-Pro(4-OCONH(CH₂)₂NH₂)-Phe-(D)hPhe-Lys]

제1사이클에서 Fmoc-(D)hPhe-OH를 이용하여, 실시예 6에서 기술한 절차에 따라 화합물을 합성하였다.

HPLC: RT 13.81분; 순도 94.5%

MS: m/z= 1037 amu([M+H]⁺) 및 519 amu([M+2H]²⁺)

실시예 12

사이클로[Tyr(Bn)-Phe-Pro(4-OCONH(CH₂)₂NHCH₃)-Phg-(D)Sty-Lys]

제1사이클에서 Fmoc-(D)Sty-OH 그리고 제2사이클에서는 Fmoc-Phg-OH를 이용하여, 실시예 7에서 기술한 절차에 따라 화합물을 합성하였다.

HPLC: RT 13.62분; 순도 97.8%

MS: m/z= 1049 amu([M+H]⁺) 및 525 amu([M+2H]²⁺)

실시예 13

사이클로[Tyr(Bn)-Phe-Pro(4-OCONH(CH₂)₂NH₂)-Phg-(D)hPhe-Lys]

제1사이클에서 Fmoc-(D)hPhe-OH 그리고 제2사이클에서는 Fmoc-Phg-OH를 이용하여, 실시예 6에서 기술한 절차에 따라 화합물을 합성하였다.

HPLC: RT 12.78분; 순도 98.8%

MS: m/z=512 amu([M+2H]²⁺)

실시예 14

사이클로[Tyr(Bn)-Phe-Pro(4-OCONH(CH₂)₂NH₂)-Tyr-(D,L)3,8MNal-Lys] 이성질체 B

제2사이클에서 Fmoc-Tyr(tBu)-OH를 이용하여, 실시예 5에서 기술한 바와 같이 실시하였다.

HPLC: RT 13.13분; 순도 95.4%

MS: m/z = 1149 amu([M+H]⁺) 및 575 amu([M+2H]²⁺)

실시예 15

사이클로[Ser(Bn)-Phe-Pro(4-OCONH(CH₂)₂NH₂)-Phe-(D,L)3,8MNal-Lys] 이성질체 B

제5사이클에서 Fmoc-Ser(Bn)-OH를 이용하여, 실시예 5에서 기술한 바와 같이 실시하였다.

HPLC: RT 12.26분; 순도 98.2%

MS: m/z = 1057 amu([M+H]⁺) 및 529 amu([M+2H]²⁺)

시험예

본 발명의 화합물은 몇가지 생체외 및 생체내 시험에서 나타난 바와 같이, 중요한 약리적 특성을 나타냈다.

특히, 본 발명의 화합물은 적어도 하나의 소마토스타틴 수용체의 아류형과 양호한 친화력으로 결합하였다.

바인딩 시험

바인딩 시험은 표준 방법에 따라 세포로 감염시킨(transfected) 세포막(예를 들어 CHO)으로부터 얻은 재조합 인간 수용체 hSSTR1, hSSTR2, hSSTR3 및 hSSTR5의 조제를 이용하여, 이하 설명하는 바와 같이 수행하였다.

방사성 리간드(radioligand)로서 3-[125I]이오도티로실11소마토스타틴-14(Amersham, IM161, 2000 Ci/mmol)를 이용하고, 5 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 10 ㎍/ml의 사포닌, 0.5% BSA를 함유하는 25 mM Hepes(pH 7.4) 버퍼에서 검사 대상 화합물의 농도를 증가시키면서, 막을 25℃에서 60분 동안 2번 배양하였다. GF/B 필터를 통해 Filtermate Harvester(Perkin Elmer)로 여과하여 배양을 종결한 후, 이를 버퍼(25 mM Hepes pH 7.4, 5 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂)로 6번 세척하였다. 필터의 방사능은 Microscint 20 액체 섬광(Packard)을 첨가하고 오비탈 교반기(orbital stirrer)에서 15분 동안 배양한 후, TopCountTM 또는 MicroBetaTM 리더에서 1분/웰(well) 동안 측정하였다. 그 결과는 검사 대상 화합물의 농도 증가가 있을 때, 방사능-표시된(radio-marked) 리간드의 비결합율(specific binding percentage)로서 표시하였다. IC50 값은 "GraphPad Prism" 소프트웨어를 이용하여 계산하였다(IC50 = 상술한 경쟁적 바인딩 테스트에서 최대 억제율의 절반을 얻는데 필요한 화합물의 농도).

본 발명 화합물의 IC50 값은 나노몰 농도 범위에 있으며, 바람직하게는 0.1 및 50 nM 사이에 있다.

	IC50(nM)
화합물	hSSTR1	hSSTR2	hSSTR3	hSSTR5
실시예 5	10.8	9.3	0.31	0.42
실시예 6	10.0	25.8	0.52	0.64
실시예 7	5.8	9.2	1.33	0.97
실시예 8	19.1	26.6	2.92	9.78
실시예 9	32.4	9.9	2.34	1.90
실시예 10	113.8	1.7	1.22	0.52
실시예 11	26.9	21.3	1.34	1.18
실시예 12	39.3	3.3	4.03	4.86
실시예 13	84.7	31.9	3.02	0.54
실시예 14	21.7	1.8	0.35	0.36
실시예 15	1.0	7.0	1.80	1.62

쥐 뇌하수체 세포에 대한 성장 호르몬 방출 억제 시험

또한, 본 발명의 화합물은 쥐 뇌하수체 세포에 대하여 생체외에서 수행한 시험에서 나타난 바와 같이, 성장 호르몬(GH) 방출의 억제 활성을 나타냈다. 성체 수컷 쥐(CD1-SD, 175-200 g)로부터 빼낸 뇌하수체를 작은 조각으로 절단하고 1% BSA, 2O mM Hepes, 항생제를 함유하는 Hank 버퍼에서 콜라겐 분해효소(collagenase)(1 mg/ml)와 함께 37℃에서 20분 동안 배양하였다. 버퍼로 여러번 세착한 후, 분산된 세포를 48 웰 플레이트에 20000 세포/웰로 분배하고 6-7일 동안 배양을 유지하였다(5% 소 태아 혈청(foetal bovine serum), 5% 말 혈청, 1% 비-필수 아미노산을 함유하는 DMEM). 실험하는 날에, 세포를 Hank 버퍼로 세척한 후 0.1% BSA 및 20 mM HEPES를 첨가한 Hank 버퍼에서 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이후 버퍼를 역시 0.1% BSA 및 20 mM HEPES가 존재하는 새로운 버퍼로 교체하였다. 이후 세포를 다양한 농도의 검사 대상 생성물 및 3×10^-9 M GHRH와 함께 CO₂ 배양기에서 3시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배지에서 방출된 GH는 Kit ELISA Rat Growth Hormone Biotrack Enzymeimmunoassay(Amersham RPN2561) 또는 Kit Mouse/Rat GH ELISA(DSL-10-72100)를 이용하여 공급자 지시에 따라 측정하였다. 본 발명의 화합물은 10^-11 내지 10^-6 M의 농도 범위에서 GH의 방출을 억제하였다; 실시예 5의 화합물은 1.3 nM의 IC50 값을 가졌다.

인간 GH-분비 뇌하수체 선종 세포에 대한 성장 호르몬 방출 억제 시험

또한, 본 발명의 화합물은 임상 종양 보고를 위한 생체외 시험에서 나타난 바와 같이, 인간 GH-분비 뇌하수체 선종 세포로부터 GH 방출의 억제 활성을 나타냈다. 시험은 인간 종양 생체검사(biopsy)를 이용하여 실시하였다; 비-자극 세포에서 생산된 GH를, 가변량의 검사 대상 화합물의 존재 하에서, Kit ELISA hGH-EASIA(biosource KAP 1081)를 이용하여 공급자의 지시에 따라 측정하였다. 소마토스타틴 및 유사체의 작용에 민감한 종양에서, 본 발명의 화합물은 10^-10 내지 10^-6 M의 농도 범위에서, 바람직하게는 1O nM의 농도에서 GH 생산을 반감시켰다.

바비투레이트(barbiturate)로 자극된, GH 생산의 생체내 억제 시험

본 발명의 화합물은 넴부탈(Nembutal)의 투여에 의해 자극된 GH 방출을 생체내에서 억제하였다. 화합물을 여러가지 투여량으로 수컷 쥐(CD, Harlan Italy)에 피하로(subcutaneously) 투여하였다. 넴부탈(60 mg/kg)의 복강내(intraperitoneal) 투여에 의해 동물을 마취시킨 1시간 후에, 혈액 샘플을 각기 다른 시간에서 수집하였다; 호르몬 농도는 ELISA 시험에 의해 측정하였다. 본 발명의 화합물을 5 내지 250 ㎍/kg 투여하여 처리한 동물에서, 생산된 GH 농도의 감소가 있었다. 실시예 1의 화합물을 5 ㎍/kg 투여할 경우, 투여 6시간 후에 측정한 GH 방출이 55%로 감소하였다; 125 ㎍/kg 투여할 경우 GH 감소가 투여 24시간 후에 여전히 측정가능하였다.

약물 동력학적 프로파일(pharmacokinetic profile) 시험

또한, 본 발명의 화합물은 쥐에서 매우 유리한 약물 동력학적 프로파일을 나타냈다. 약물 동력학적 프로파일은 화합물을 수컷 쥐(CD, Sprague Dawley; 200-25O g)에 피하로 1 mg/kg의 투여량으로 투여함으로써 측정하였다. 혈액 샘플을 투여 후 72시간까지 각기 다른 시간에서 수집하였다. 검사 대상 화합물의 농도는 분리된 혈장 샘플에서 LC-MS/MS 분석 방법에 의해 측정하고 측정값을 "Kinetica" 소프트웨어를 이용한 비-구획 모델(non-compartmental model)에 따라 처리하였다. 다음의 표에서, 실시예 1의 화합물에 대해 얻어진 주요 약물 동력학적 파라미터를, 현재 임상 개발 단계에 있는 또 다른 안정한 소마토스타틴 유사체인 파시레오타이드(PASIREOTIDE)(파시레오타이드는 WO2002010192에 기술된 방법에 따라 제조하였다)에 대해 얻어진 것과 비교하여 보고하였다.

		실시예 5	파시레오타이드
투여량	(mg/kg)	1	1
Cmax	(ng/mL)	224.02	667.88
tmax	(h)	4	2
t1/2	(h)	31.3	24.4
AUC0-t	(ng/mL*h)	2728.50	2781.40
AUCtot	(ng/mL*h)	2883.06	2795.85
MRT	(h)	18.96	4.87

실시예 5의 화합물은 반감기 및 평균 체류 시간(MRT)에서 모두 파시레오타이드보다 더 나았다; 옥트레오타이드(OCTREOTIDE)의 경우, t1/2 값은 약 2시간이었다.

결과적으로, 본 발명의 화합물은 말단 비대증의 치료에서, 타입 I 또는 타입 II 당뇨병의 치료에서, 특히 예를 들어 혈관병증(angiopathy), 증식성 당뇨성 망막병증(proliferative diabetic retinopathy), 당뇨성 황반 부종(diabetic macular edema), 신장병(nephropathy) 및 일어날 때 고혈당(hyperglycaemic) 현상과 같은 그 합병증에서와 같이, 과량의 GH 분비 및/또는 과량의 IGF-1을 포함하거나 이와 관련된 원인으로 인한 장애, 그리고 예를 들어 병적 비만(morbid obesity) 또는 시상하부성(hypothalamic) 비만 또는 고인슐린성(hyperinsulenimic) 비만과 같이, 인슐린 또는 글루카곤(glucagon)의 방출과 관련된 다른 대사 장애의 예방 또는 치료에 유용하다. 또한, 본 발명의 화합물은 장피(enterocutaneous) 및 췌장 피부 누공(pancreatic cutaneous fistula), 과민성 장관 증후군(irritable intestine syndrome), 예를 들어 그레이브즈 병(Grave's disease), 과민성 장관 질환, 건선(psoriasis) 또는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)과 같은 염증성 질환, 다낭성 신장 질환(polycystic kidney disease), 급속 위장 배출 질환(rapid gastric emptying disease), 물 설사 증후군(aqueous diarrhoea syndrome), AIDS 관련 설사, 화학요법(chemotherapy) 유발 설사, 급성 또는 만성 췌장염(pancreatitis), 위장관 호르몬-분비 종양(gastrointestinal hormone-secreting tumour)(예를 들어 VIP종(vipoma), 글루코노마(gluconoma), 인슐린종(insulinoma), 암양종(carcinoid) 등과 같은 GEO 종양), 림프종(lymphoma) 또는 백혈병과 같은 악성 림프종, 위장관 출혈(gastrointestinal bleeding), 식도 정맥류 출혈(esophageal varicose bleeding)과 같은 간세포 암(hepatocellular carcinoma)의 치료에 유용하다.

또한, 본 발명의 화합물은 소마토스타틴 수용체를 발현하는 다양한 암 세포계(cell line)에 대한 증식 시험에서 나타난 바와 같이, 예를 들어 수용체 SSTR1, SSTR2, SSTR3 및/또는 SSTR5를 갖는 종양과 같이, 소마토스타틴 수용체에 양성인 종양의 치료에 유용하다.

상술한 모든 경우에 대해, 필요한 투여량은 당연히 예를 들어 치료해야 할 환자, 투여 방식 및 병의 경중에 따라 다를 것이다. 그러나, 일반적으로 본 발명의 화합물을 1 ㎍ 내지 0.7 mg/kg/일까지 투여할 경우 만족할만한 결과를 얻는다. 환자에게 권고되는 1일 투여량은 예를 들어 약 0.5 ㎍ 내지 약 25 mg, 예를 들어 약 2 ㎍ 내지 약 20 mg, 예를 들어 약 2 ㎍ 내지 약 1.5 mg의 본 발명 화합물을 함유하는 단일 투여 형태로, 하루에 3번까지, 분할된 투여량으로 편리하게 투여되는 화합물의 약 2 ㎍ 내지 50 mg까지, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 40 mg, 예를 들어 약 0.001 내지 약 3 mg의 순서이다.

본 발명 화합물의 접합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 예를 들어 ¹¹¹In, ¹⁶¹Tb, ¹⁷⁷Lu, ⁶⁸Ga, Eu³⁺, Gd³⁺, Fe³⁺, Mn²⁺ 또는 Cr²⁺와 같은, γ 핵종(nuclide) 또는 방사성 양전자(emitting positron), 형광성 금속 이온 또는 상자성 이온과 같은 검출가능한 원소와 복합체화될 때, 진단 영상을 위한, 예를 들어 소마토스타틴 수용체에 양성인 종양 및 전이(metastasis)와 같은, 소마토스타틴 수용체에 양성인 조직 및 세포의 표시를 위한, 그리고 소마토스타틴 수용체를 나타내는 염증성 또는 자가면역 질환(autoimmune disorder), 결핵(tuberculosis) 또는 이식 후 장기 거부반응을 위한 제제로서, 또는 오제 전자 캐스케이드(Auger electron cascade)를 갖는 α- 또는 β-방사 핵종, 예를 들어 ^9OY, ¹⁶¹Tb, ¹⁷⁷Lu, ²¹¹At, ²¹³Bi 또는 ²⁰¹Tl과 복합체화될 때, 소마토스타틴 수용체에 양성인 종양 및 전이의 생체내 치료를 위한, 류마티스 관절염, 및 중증 염증병(severe inflammation condition)을 위한 방사성 약물(radio-drug)로서 모두 유용하다.

진단 영상에서 사용을 위한 복합체화된 형태의 본 발명 화합물의 접합체는 정맥으로(intravenously), 예를 들어 주사가능한 용액 또는 현탁액 형태로, 바람직하게는 단일 주사 형태로 투여될 수 있다. 방사성 트레이서(radiotracer)는 바람직하게는 환자 투여 직전에 만들어질 수 있다.

동물에서, 권고 투여량 범위는 0.02 내지 0.5 mCi의 γ-방출 방사성 핵종과 복합체화된, 본 발명 화합물의 접합체에 대해 0.01 내지 1 ㎍/kg일 수 있다. 인간과 같은 큰 포유동물에서, 권고 투여량 범위는 예를 들어 1 내지 100 mCi/㎡의 ¹¹¹In, ⁸⁶Y 또는 ¹⁷⁷Lu와 같은 검출가능한 원소와 복합체화된 본 발명 화합물의 접합체에 대해 1 내지 100 ㎍/㎡일 수 있다.

본 발명의 방사선치료 용도로 사용되는 투여량은 물론 치료해야 할 특정 조건, 예를 들어 소마토스타틴 수용체를 발현하는 건강한 장기에 대한 공지된 방사독성(radiotoxicity), 종양 덩어리의 크기 및 원하는 치료법에 따라 다를 것이다. 일반적으로, 투여량은 건강한 장기로부터 얻어지는 방사능의 약물 동력학 자료 및 분포 자료에 근거하여 그리고 표적에서 관찰된 섭취량에 근거하여 계산하였다. 본 발명 화합물의 β-방사 복합체 또는 접합체는 예를 들어 1 내지 3개월의 기간 동안 반복적으로 투여될 수 있다.

동물에서, 권고 투여량 범위는 15 내지 70 mCi의 예를 들어 ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu 또는 ¹⁶¹Tb와 같은 α- 또는 β-방사 핵종, 또는 오제 전자 캐스케이드를 갖는 핵종과 복합체화된 본 발명 화합물의 접합체에 대해 20 내지 100 ㎍/kg일 수 있다. 인간과 같은 큰 포유동물에서, 권고 투여량 범위는 예를 들어 1 내지 100 mCi/㎡의 α- 또는 β-방사 핵종 또는 오제 전자 캐스케이드를 갖는 핵종, 예를 들어 ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu 또는 ¹⁶¹Tb와 복합체화된 본 발명 화합물의 접합체에 대해 1 내지 100 ㎍/㎡일 수 있다.

방사선치료제로서 사용을 위한 복합체화된 형태의 본 발명 화합물의 접합체는 통상적인 경로를 통해, 예를 들어 정맥으로, 예를 들어 주사가능한 용액 형태로 투여될 수 있다. 이들은 주입, 예를 들어 15 내지 60분 주입에 의해 유리하게 주사될 수 있다. 종양 위치에 따라 다르지만, 이것은 예를 들어 카테터(catheter)를 통해 종양 위치에 가능한 가깝게 투여될 수 있다. 또한, 본 발명은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 희석제와 함께, 본 발명 화합물의 접합체를 유리 염기 형태로 또는 약학적으로 허용가능한 염으로서 또는 검출가능한 방사선치료제와 복합체로서 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 화합물 또는 이의 복합체화된 형태의 접합체는 자가면역 또는 염증성 질환, 예를 들어 류마티스 관절염, 그레이브즈 병 또는 눈의 다른 염증성 질환과 함께, 뇌하수체 종양, 위-장-췌장 종양, 암양종, 중추신경계의 종양, 유방 종양, (진행성 호르몬-불응성(advanced hormone-refractory) 전립선암을 포함하는) 전립선(prostate) 종양, 난소(ovarian) 또는 결장(colon) 종양, 소세포 폐(small cell lung) 종양, 악성 장관 폐색(malignant intestinal occlusion), 부신경절종(paraganglioma), 신장암, 피부암, 신경아세포종(neuroblastoma), 크롬 친화성 세포종(pheochromocytoma), 갑상선(thyroid)의 수질암(medullary carcinoma), 골수종(myeloma), 림프종, 호지킨 림프종(Hodgkins lymphoma) 및 비-호지킨 림프종(non-Hodgkins lymphoma), 골 종양 및 이들의 전이와 같이, 수용체를 발현하거나 축적하는 종양을 맵핑(mapping) 또는 치료하는데 유용하다.

본 발명의 화합물 또는 이의 복합체화된 접합체는 단일 활성 성분으로 투여될 수 있고, 또는 이들은 예를 들어 보조제(adjuvant)로서 다른 활성 성분과 병용 투여될 수 있다. 예를 들어, 이들은 면역억제제(immunosuppressive agent), 예를 들어 사이클로스포린(cyclosporine) A 또는 FK506과 같은 칼시뉴린(calcineurin)의 억제제; 라파마이신(rapamycin)과 같은 면역억제 특성을 갖는 거대고리형(macrocyclic) 락톤; 면역억제 특성을 갖는 단일클론 항체 또는 소염제(antiinflammatory agent)와 병용할 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물 또는 이의 복합체화된 접합체는 항-증식성 제제(anti-proliferative agent), 예를 들어 파클리탁셀(paclitaxel), 젬시타빈(gemcitabine), 시스플라틴(cisplatin), 독소루비신(doxorubicin), 5-플루오로우라실(fluorouracyl) 또는 택솔(taxol)과 같은 화학요법적 활성 성분, 호르몬 또는 길항제(antagonist agent), 예를 들어 항-안드로겐(anti-androgen) 또는 미톡산트론(mitoxantrone)(특히 전립선암의 경우) 또는 레트로졸(letrozole)(특히 유방암의 경우)과 같은 항-에스트로겐(anti-estrogen), 대사길항제(antimetabolite), 식물 알칼로이드(alkaloid), 생물학적 반응 조절제, 바람직하게는 인터페론(interferon) 또는 림포카인(lymphokine), 단백질 타이로신 키나아제(tyrosine kinase) 억제제 및/또는 세린/트레오닌(serine/threonine) 키나아제, 히스톤-디아세틸라제(histone-deacetylase)의 효소 억제제 또는 예를 들어 안에포틸론(anepothilone) 또는 에포틸론(epothilone) 유도체와 같은 다르거나 비공지된 작용 메커니즘을 갖는 제제, 또는 예를 들어 라파마이신, RAD 또는 CCI779와 같은 거대고리형 락톤과 병용할 수 있다.

본 발명 화합물 또는 이의 복합체화된 형태의 접합체가 또 다른 약물과 병용 투여될 때, 공-투여된 약물의 투여량은 물론 치료할 병의 기능 등에 따라 다를 것이다. "공-투여(co-administration)" 또는 "병용 투여(combined administration)" 등과 같은 용어는 여기에서 단일 환자에게 선택된 치료제의 투여를 의미하는데 사용되고, 제제가 동일한 투여 경로로 또는 동일한 시간에 반드시 투여되지 않는 치료 처방 계획(treatment regime)을 포함시키려고 사용된다.

본 발명의 특정 병용은 질환 또는 장애가 예방 또는 치료되어야 하는지 여부에 따라 선택될 것이다; 예를 들어 만성 이식 거부반응의 예방 또는 치료를 위한 면역억제제와의 병용, 당뇨병 및 그 합병증의 치료에서 인슐린 분비촉진제(secretagogue), 인슐린 분비의 촉진제(promoter), 인슐린 감작제(sensitiser) 또는 적은 인슐린 투여와의 병용, 염증성 질환 또는 장애의 예방 및 치료를 위한 소염제와의 병용, 예를 들어 황반 부종 또는 퇴화(degeneration) 또는 암의 예방 또는 치료를 위한 항-혈관신생(anti-angiogenic) 효과를 갖는 제제와의 병용, 암에서 사용할 화학요법제(chemotherapy agent)와의 병용이다.

Claims

화학식 1의 화합물:
[화학식 1]

여기서 m은 0 내지 2이고; n은 1 내지 3이며; R1은 인돌을 제외한 방향족 기이고; R4는 방향족 기이며; R2 및 R3은 독립적으로 H 또는 C₁-C₄ 알킬기이고, 또는 함께 이들은 고리형 구조를 형성하도록 질소 원자에 결합된 C₄-C₅ 알킬렌 사슬이며; 또는 R3은 양이온 또는 금속 킬레이팅 기이고;
X1은
식(a)
,
식(b)
, 또는
식(c)

인 아미노아실 잔기이다.
제1항에 있어서,
이온 또는 금속 킬레이팅 기는 아미노기에 직접 결합하거나, 식 -Z-R5-CO-의 기를 통해서 결합하고, 여기서 R5는 C_1-11 알킬렌, C_1-11 알케닐렌 -CH(R6)-이며, 여기서 R6은 알파 아미노산의 측쇄이고, Z는 킬레이팅 기에 존재하는 기능기와 에테르 결합, 에스터 결합 또는 아미드 결합을 형성할 수 있는 기능기인 화합물.
제1항에 있어서,
m은 1이고, n은 1 내지 2인 화합물.
제1항에 있어서,
R1은 페닐, 나프틸, 벤즈하이드릴, 플루오레닐, 스티레닐, 안트라닐 또는 비페닐인 화합물.
제1항에 있어서,
R1은 하나 이상의 메틸옥시기로 치환된 나프탈렌기인 화합물.
제1항에 있어서,
R1은 3,8-디메톡시-나프탈렌-2-일인 화합물.
제1항에 있어서,
R4는 페닐, 또는 하이드록실, C₁-C₄ 알콕실, C₁-C₄ 알킬, 할로겐 또는 니트로기로 치환된 페닐인 화합물.
제1항에 있어서,
R4는 4-하이드록시페닐인 화합물.
제1항에 있어서,
R3기는 친수성 킬레이트 시약인 화합물.
제1항에 있어서,
X1은 식 (c)의 아미노아실 잔기인 화합물.
제1항에 있어서,
화학식 1의 사이클로헥사펩티드의 아미노아실 잔기는 L- 또는 D-구조를 갖는 화합물.
제1항에 있어서,
아미노기 중 하나는 선택적으로 보호된 형태, 또는 염화되거나 복합체화된 형태일 수 있는 것인 화합물.
제12항에 있어서,
염은 아세테이트, 락테이트, 벤조에이트, 아스파르테이트, 파모에이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리스티렌설포네이트, 하이드로클로라이드, 설페이트 또는 니트레이트 중에서 선택되는 것인 화합물.
제1항에 있어서,
-사이클로[Tyr(Bn)-Phe-[4-(2-아미노에틸)카바모일]Pro-Phe-(D,L)[3-(3,8-디메톡시-나프탈렌-2-일)]Ala-Lys] 이성질체 B,
-사이클로[Tyr(Bn)-Phe-[4-(2-아미노에틸)카바모일]Pro-Phe-(D,L)(2,5-디메톡시)hPhe-Lys] 이성질체 B,
-사이클로[Tyr(Bn)-Phe-[4-(2-메틸아미노에틸)카바모일]Pro-Phe-(D,L)[3-(3,8-디메톡시-나프탈렌-2-일)]Ala-Lys] 이성질체 B,
-사이클로[Tyr(Bn)-Phe-[4-(2-아미노에틸)카바모일]Pro-Phe-(D,L)[3-(1,4-디메톡시-나프탈렌-2-일)]Ala-Lys] 이성질체 A,
-사이클로[Tyr(Bn)-Phe-[4-(2-아미노에틸)카바모일]Pro-Phe-(D,L)[3-(1,4-디메톡시-나프탈렌-2-일)]Ala-Lys] 이성질체 B,
-사이클로[Tyr(Bn)-Phe-[4-(2-아미노에틸)카바모일]Pro-Phe-(D)[3-(나프탈렌-2-일)]-Ala-Lys],
-사이클로[Tyr(Bn)-Phe-[4-(2-아미노에틸)카바모일]Pro-Phe-(D)hPhe-Lys],
-사이클로[Tyr(Bn)-Phe-[4-(2-메틸아미노에틸)카바모일]Pro-Phg-(D)스티릴Ala-Lys],
-사이클로[Tyr(Bn)-Phe-[4-(2-아미노에틸)카바모일]Pro-Phg-(D)hPhe-Lys],
-사이클로[Tyr(Bn)-Phe-[4-(2-아미노에틸)카바모일]Pro-Tyr-(D,L)[3-(3,8-디메톡시-나프탈렌-2-일)]Ala-Lys] 이성질체 B, 및
-사이클로[Ser(Bn)-Phe-[4-(2-아미노에틸)카바모일]Pro-Phe-(D,L)[3-(3,8-디메톡시-나프탈렌-2-일)]Ala-Lys] 이성질체 B,
그리고 이들의 염 및 약학적으로 허용가능한 복합체로 구성되는 군에서 선택되는 것인 화합물.
a) 아미노산 측쇄에 존재하는 선택적 기능기가 선택적으로 보호된 형태로 있는 선형 헥사펩티드를 제조하는 단계;
b) 하나 이상의 축합제에 의해 상기 헥사펩티드를 고리화하는 단계;
c) 선택적 보호기를 선택적으로 제거하는 단계;
d) 이렇게 얻어지는 사이클로펩티드를 최종적으로 정제하는 단계;
를 포함하는 제1항의 사이클로헥사펩티드를 제조하는 방법.
제15항에 있어서,
a) 단계에서 얻어지는 선형 펩티드의 C-말단 아미노산은 라이신인 방법.
적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께, 제1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 혈관신생(angiogenesis), 증식성 망막병증(proliferative retinopathy), 황반 부종(macular edema), 맥락막 신혈관형성(choroidal neovascularisation) 질환 관련 장애, 혈관 이식 질환(vessel graft disease), 정맥 이식 협착(vein graft stenosis), 재협착(restenosis) 및 혈관 손상에 따른 혈관 폐색(vascular occlusion), 장피(enterocutaneous) 및 췌장 피부 누공(pancreatic cutaneous fistula), 과민성 장관 증후군(irritable intestine syndrome), 염증성 질환 및 장애, 다낭성 신장 질환(polycystic kidney disease), 급속 위장 배출 증후군(rapid gastric emptying syndrome), 물 설사 증후군(aqueous diarrhoea syndrome), AIDS 관련 설사, 화학요법(chemotherapy) 유발 설사, 급성 또는 만성 췌장염(pancreatitis), 위장관 출혈(gastrointestinal bleeding), 종양, 악성 종양, 말단 비대증(acromegaly) 또는 위장관 호르몬-분비 종양(gastrointestinal hormone-secreting tumour)의 치료용 약학 조성물.
제17항에 있어서,
조절 방출 또는 국소 방출용 제형인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
혈관신생(angiogenesis), 증식성 망막병증(proliferative retinopathy), 황반 부종(macular edema), 맥락막 신혈관형성(choroidal neovascularisation) 질환 관련 장애, 혈관 이식 질환(vessel graft disease), 정맥 이식 협착(vein graft stenosis), 재협착(restenosis) 및 혈관 손상에 따른 혈관 폐색(vascular occlusion), 장피(enterocutaneous) 및 췌장 피부 누공(pancreatic cutaneous fistula), 과민성 장관 증후군(irritable intestine syndrome), 염증성 질환 및 장애, 다낭성 신장 질환(polycystic kidney disease), 급속 위장 배출 증후군(rapid gastric emptying syndrome), 물 설사 증후군(aqueous diarrhoea syndrome), AIDS 관련 설사, 화학요법(chemotherapy) 유발 설사, 급성 또는 만성 췌장염(pancreatitis), 위장관 출혈(gastrointestinal bleeding), 종양 및 악성 종양의 치료용인 화합물.
제1항에 있어서,
말단 비대증(acromegaly)의 치료용인 화합물.
제1항에 있어서,
위장관 호르몬-분비 종양(gastrointestinal hormone-secreting tumour)의 치료용인 화합물.
제1항에 있어서,
화학식 1의 사이클로헥사펩티드의 아미노아실 잔기 1, 2, 및 4-6은 L-구조를 갖는 화합물.
제1항에 있어서,
화학식 1의 사이클로헥사펩티드의 아미노아실 잔기 3은 D-구조를 갖는 화합물.
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