CN104447962B

CN104447962B - 一种合成帕瑞肽的方法

Info

Publication number: CN104447962B
Application number: CN201410837093.3A
Authority: CN
Inventors: 郭德文; 曾德志; 董华建; 文永均
Original assignee: CHENGDU SHENGNUO BIOTEC Co Ltd
Current assignee: CHENGDU SHENGNUO BIOTEC Co Ltd
Priority date: 2014-12-29
Filing date: 2014-12-29
Publication date: 2018-07-17
Anticipated expiration: 2034-12-29
Also published as: CN104447962A

Abstract

本发明涉及医药合成领域，公开了一种合成帕瑞肽的方法。所述方法将N端和C端有保护基的赖氨酸在有机碱作用下与树脂偶联，得到肽树脂1；按照帕瑞肽线性C端到N端的氨基酸顺序，从肽树脂1出发，在缩合试剂和活化试剂作用下，将其余保护氨基酸进行逐一延伸偶联，每次延伸偶联后均得到对应肽树脂，完成偶联后去除保护基，在缩合试剂和活化试剂作用下进行环化，最终获得帕瑞肽树脂，然后酸解获得帕瑞肽粗品；帕瑞肽粗品纯化得到帕瑞肽纯品。本发明选择合适的合成方案，选择恰当原料直接完成羟脯氨酸的偶联环节，并优化了整个合成工艺，调整酸解液、偶联试剂以及树脂的组合搭配，大幅提高了帕瑞肽粗品的纯度，具有较高的总收率。

Description

一种合成帕瑞肽的方法

技术领域

本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种合成帕瑞肽的方法。

背景技术

帕瑞肽(Pasireotide)为一种生长激素抑制剂类似物，可通过与其受体结合抑制ACTH的释放从而减少皮质醇分泌。帕瑞肽为6环肽，结构中有6个氨基酸残基，氨基酸序列如下：

Cyclo[Tyr(Bzl)¹-Phe²-Hyp(2-aminoethylcarboxyl)³-Phg⁴-D-Trp⁵-Lys⁶]

帕瑞肽结构式为：

帕瑞肽由瑞士诺华制药有限公司制造。2012年4月25日，帕瑞肽已获欧洲药品管理署(EMA)下属人用药品委员会(CHMP)批准用于治疗无法手术或手术治疗失败的成人库欣病患者。

帕瑞肽的安全性和有效性是通过一项前瞻性、随机、双盲的Ⅲ期临床试验进行评估的，纳入162名尿游离皮质醇(UFC)水平为正常上限值的1.5倍且无法进行手术治疗的库欣病患者，患者随机接受帕瑞肽900μg或600μg皮下注射,6个月后，900μg治疗组患者UFC水平达到主要终点。结果显示，试验中接受帕瑞肽治疗的患者24小时尿量中皮质醇水平降低，这一降低在启动该药治疗后的一个月时即可见到，有20％的患者的皮质醇水平可降至正常范围。

国内外已有关于帕瑞肽制备方法的，中国专利CN 1446229A采用固相方法得到线性保护肽，在液相中环化，酸解去保护，但是液相环化收率低，严重地影响了产品总收率，大幅度增加了产品的生产成本。

中国专利CN 103641894A虽然改善了环化方法，但在制备线性保护肽过程中使用了侧链没有保护的羟脯氨酸，再用Boc-NH-C₂H₄-NH-COOH与羟脯氨酸的侧链羟基反应，其同样会产生侧链杂质而影响帕瑞肽的收率和品质。另外，该方案在其他合成步骤的设置不够合理也是造成收率和纯度不高的原因之一。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成帕瑞肽的方法，使得所述方法能够提高帕瑞肽粗品的纯度。

本发明的另一个目的在于提供一种合成帕瑞肽的方法，使得所述方法能够提高帕瑞肽的总收率。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种合成帕瑞肽的方法，包括以下步骤：

步骤1、N端和C端有保护基的赖氨酸在有机碱作用下与树脂进行偶联，得到肽树脂1；

步骤2、按照帕瑞肽线性肽氨基酸序列C端到N端的顺序，从肽树脂1出发，在缩合试剂和活化试剂作用下，将其余保护氨基酸进行逐一延伸偶联，每次延伸偶联后均得到对应的肽树脂，完成所有保护氨基酸的偶联后去除保护基，在缩合试剂和活化试剂作用下进行环化，最终获得帕瑞肽树脂，然后酸解获得帕瑞肽粗品；其中，所述其余保护氨基酸包含Fmoc-Hyp(Boc-(2-aminoethyl)carboxyl)；

步骤3、帕瑞肽粗品纯化得到帕瑞肽纯品。

本发明所述帕瑞肽线性肽的氨基酸序列为本领域技术人员所公知，具有如下结构：

Tyr(Bzl)¹-Phe²-Hyp(2-aminoethylcarboxyl)³-Phg⁴-D-Trp⁵-Lys⁶

本发明针对现有技术中采用的合成工艺易造成帕瑞肽总收率以及粗品纯度较低的缺陷，特别选择了Fmoc-Hyp(Boc-(2-aminoethyl)carboxyl)作为原料，并优化了整个合成工艺，调整酸解液、偶联试剂以及树脂的组合搭配，解决了技术问题。本发明所述方法既可以采用固相合成，也可以采用液相合成。

本发明所述保护基是在氨基酸合成领域常用的保护氨基酸主链以及侧链上氨基、羧基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基等在制备目标产物过程中发生反应，生成杂质，对于本发明中需要保护侧链的氨基酸来说，本领域技术人员公知其侧链结构以及知晓采用常用保护基来保护氨基酸侧链上的氨基、羧基等基团，例如，本发明通过Boc保护基保护D-Trp的侧链，通过All保护赖氨酸的C端(即羧基端)。此外，在本发明所述方法涉及的保护氨基酸中，N端均优选通过Fmoc保护基进行保护。被保护基保护的氨基酸称为保护氨基酸。作为优选，所述其余保护氨基酸为Fmoc-D-Trp(Boc)、Fmoc-Phg、Fmoc-Hyp(Boc-(2-aminoethyl)carboxyl)、Fmoc-Phe和Fmoc-Tyr(Bzl)。

作为优选，所述去除保护基为去除肽树脂N端、C端保护基。在除去C端All保护基时通过四三苯基膦钯和苯硅烷除去，两者摩尔比例为1:10。

作为优选，所述酸解采用由体积百分比为80-95％的TFA、体积百分比为1-10％的EDT、体积百分比为0-2％的Tis、余量为水组成的混合酸解液酸解。

作为优选，步骤1所述N端保护基为Fomc保护基，C端保护基为All保护基。

作为优选，所述树脂为2-CTC树脂。

作为优选，步骤1所述N端和C端有保护基的赖氨酸和树脂的摩尔比为1-6:1，更优选为2.5-3.5:1，最优选为3:1。

作为优选，所述树脂的取代值为0.2-1.2mmol/g树脂，更优选为0.4-0.6mmol/g树脂。

作为优选，所述缩合试剂优选为N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/有机碱(PyBOP/有机碱)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯/有机碱(HATU/有机碱)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐/有机碱(HBTU/有机碱)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯/有机碱(TBTU/有机碱)中的一种。所述缩合试剂的摩尔用量优选为肽树脂中氨基总摩尔数的1～6倍，更优选为2.5～3.5倍，最优选为3倍。

需要说明的是，所述PyBOP/有机碱、HATU/有机碱、HBTU/有机碱、TBTU/有机碱，在本发明中属于四种双体系的缩合试剂，即PyBOP、HATU、HBTU在使用时需要分别和有机碱组合在一起成为一种缩合试剂使用，其中所述有机碱和PyBOP、HATU、HBTU、TBTU的摩尔比优选为为1.3-3.0:1，更优选为1.3-2:1。

作为优选，所述有机碱为N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺(TEA)或N-甲基吗啡啉(NMM),更优选为DIPEA。

作为优选，所述活化试剂为1-羟基苯并三唑(HOBt)或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)。所述活化试剂的用量优选为肽树脂中氨基总摩尔数的1～6倍，更优选为2.5～3.5倍，最优选为3倍。

作为优选，所述环化和偶联的反应溶剂均采用DMF。

本发明所述延伸偶联是指在第一个氨基酸与氨基树脂偶联后，剩余氨基酸按照帕瑞肽线性肽氨基酸的C端到N端的顺序逐个和前一个偶联的氨基酸发生缩合反应(主链氨基和羧基的缩合反应)进行偶联。本发明偶联时，每次延伸偶联时所述保护氨基酸和对应肽树脂的摩尔比优选为1-6:1，更优选为2.5-3.5:1，最优选为3:1；所述偶联反应时间优选为60～300分钟，更优选为100～140分钟。所述对应的肽树脂是指Lys-OAll和树脂偶联形成的肽树脂1、D-Trp(Boc)和肽树脂1偶联形成的肽树脂2、Phg和肽树脂2偶联形成的肽树脂3、Hyp(Boc-(2-aminoethyl)carboxyl)和肽树脂3偶联形成的肽树脂4、Phe和肽树脂4偶联形成的肽树脂5、Tyr(Bzl)和肽树脂5偶联形成的肽树脂6。

在延伸偶联中，由于每个氨基酸N端都有保护基，因此需要先脱除N端保护基再偶联，这对本领域技术人员来说是公知常识。本发明优选用PIP/DMF(哌啶/N,N-二甲基甲酰胺)混合溶液脱除N端保护基，混合溶液中含哌啶为10～30％(V)，其余为DMF。去N端保护基时间优选为10～60分钟，优选的为15～25分钟。去N端保护基试剂的用量优选为每0.05mol肽树脂1000-1600mL。

需要说明的是，本发明所述肽树脂指任意个数氨基酸按照帕瑞肽线性肽氨基酸顺序和树脂相连接形成的肽树脂，这其中也包括肽树脂1。

作为优选，所述酸解采用由体积百分比为90％的TFA、体积百分比为5％的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解。所述混合酸解液用量优选为每克帕瑞肽树脂需要4～15mL，更优选为9～11mL。所述酸解的时间优选为室温条件下1～6小时，更优选为3～4小时。

作为优选，所述纯化具体为：

帕瑞肽粗品，0.1％TFA/水溶液溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用；

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为(0.05～0.2％TFA/水溶液)-(0.05～0.2％TFA/乙腈溶液)，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得帕瑞肽纯化中间体浓缩液；

取帕瑞肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到帕瑞肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得帕瑞肽纯品。

由本发明所述方法合成的帕瑞肽粗品纯度高达77.9％-85.1％，纯品纯度大于99％，最大单一杂质小于0.15％，总收率48.8％-52.6％，而现有技术CN103641894A的粗品纯度仅在50％左右，总收率根据其数据计算为30％左右。

由以上技术方案可知，本发明选择合适的合成方案，选择Fmoc-Hyp(Boc-(2-aminoethyl)carboxyl)原料直接完成羟脯氨酸的偶联环节，无需增加额外反应，并优化了整个合成工艺，调整酸解液、偶联试剂以及树脂的组合搭配，大幅提高了帕瑞肽粗品的纯度，具有较高的总收率。

具体实施方式

本发明公开了一种合成帕瑞肽的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明具体实施方式中，本发明中的氨基酸购自于成都晖蓉生物科技有限公司，所用树脂购自于上虞普尔树脂有限公司，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见表1。

表1英文缩写释义

英文缩写	中文名称	英文缩写	中文名称
				2-CTC树脂	2-氯三苯甲基氯树脂	Tyr	酪氨酸
Fmoc	9-芴甲氧羰基	Phe	苯丙氨酸
				Boc	叔丁氧羰酰基	Lys	赖氨酸
All	烯丙基	Hyp	羟脯氨酸
				Bzl	苄基	Phg	苯基甘氨酸
D-Trp	D-色氨酸

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：肽树脂1的合成(Fmoc-Lys-OAll的偶联)

取0.05mol的2-CTC树脂(取代值约0.3mmol/g)，用DMF洗涤3次；另取0.15molFmoc-Lys-OAll，用适量DMF溶解，加到上述树脂中，搅拌下加入0.3molDIPEA，室温搅拌反应3小时，抽掉反应液，DMF洗涤3次后，10％DIPEA/甲醇洗涤3次，DCM洗涤3次，每次洗涤时间为3min，得到Fmoc-Fmoc-Lys-OAll-CTC树脂，即肽树脂1。

实施例2：肽树脂2的合成(Fmoc-D-Trp(Boc)的偶联)

取0.15mol Fmoc-D-Trp(Boc)和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.15molDCC，搅拌下慢慢加入，于室温环境中搅拌反应30分钟，过滤后得到活化后的氨基酸溶液，备用；

取0.05mol实施例1的肽树脂1，采用1000mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的肽树脂1；

将活化后的氨基酸溶液加入到去Fmoc的肽树脂1中，偶联反应120～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤，得肽树脂2：

Fmoc-D-Trp(Boc)-Lys-OAll-CTC树脂。

实施例3：肽树脂3的合成(Fmoc-Phg的偶联)

取0.15mol Fmoc-Phg和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.15mol DCC，搅拌下慢慢加入，于室温环境中搅拌反应30分钟，过滤后得到活化后的氨基酸溶液，备用；

取0.05mol实施例2的肽树脂2，采用1100mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的肽树脂2；

将活化后的氨基酸溶液加入到去Fmoc的肽树脂2中，偶联反应120～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤，得肽树脂3：

Fmoc-Phg-D-Trp(Boc)-Lys-OAll-CTC树脂。

实施例4：肽树脂4的合成(Fmoc-Hyp(Boc-(2-aminoethyl)carboxyl)的偶联)

取0.15mol Fmoc-Hyp(Boc-(2-aminoethyl)carboxyl)和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.15mol DIC，搅拌下慢慢加入，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的氨基酸溶液，备用；

取0.05mol实施例3的肽树脂3，采用1200mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的肽树脂3；

将活化后的氨基酸溶液加入到去Fmoc的肽树脂3中，偶联反应120～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤，得肽树脂4：

Fmoc-Hyp(Boc-(2-aminoethyl)carboxyl)-Phg-D-Trp(Boc)-Lys-OAll-CTC树脂。

实施例5：肽树脂5的合成(Fmoc-Phe的偶联)

取0.15mol Fmoc-Phe和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.15mol DIC，搅拌下慢慢加入，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的氨基酸溶液，备用；

取0.05mol实施例4的肽树脂4，采用1300mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的肽树脂4；

将活化后的氨基酸溶液加入到去Fmoc的肽树脂4中，偶联反应120～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤，得肽树脂5：

Fmoc-Phe-Hyp(Boc-(2-aminoethyl)carboxyl)-Phg-D-Trp(Boc)-Lys-OAll-CTC树脂。

实施例6：肽树脂6的合成(Fmoc-Tyr(Bzl)的偶联)

取0.15mol Fmoc-Tyr(Bzl)和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.14mol HTBU，搅拌下慢慢加入，于室温环境中搅拌反应30分钟，再加入0.36molDIPEA，混合均匀，得到活化后的氨基酸溶液，备用；

取0.05mol实施例5的肽树脂5，采用1400mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的肽树脂5；

将活化后的氨基酸溶液加入到去Fmoc的肽树脂5中，偶联反应120～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤，得肽树脂6：

Fmoc-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp(Boc-(2-aminoethyl)carboxyl)-Phg-D-Trp(Boc)-Lys-OAll-CTC树脂。

实施例7：帕瑞肽树脂的合成

取0.0125mol四三苯基膦钯和0.125mol苯硅烷，用1400mlDCM溶解，加入到实施例6的肽树脂6中，室温搅拌反应时间240～360分钟，去除All保护基，反应完成后，分别用DCM、DMF洗涤3次

再用1400mL 20％PIP/DMF溶液去Fmoc保护基25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc和All保护基的肽树脂6；

取0.15mol DIC和0.15mol HOAt，用1400ml DMF溶解，搅拌下慢慢加入到上述去保护基的肽树脂6中，环化反应240～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，过滤洗涤，得帕瑞肽肽树脂：

Cyclo[Tyr(Bzl)-Phe-Hyp(Boc-(2-aminoethyl)carboxyl)-Phg-D-Trp(Boc)-Lys]-CTC树脂。

实施例8：帕瑞肽粗品的制备

取实施例7制得的帕瑞肽肽树脂，加入体积百分比为94％的TFA、体积百分比为2％的EDT、体积百分比为2％的Tis、余量为水组成的混合酸解液酸解(混合酸解液10mL/克帕瑞肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干、得类白色粉末即为帕瑞肽粗品，粗品纯度为85.1％。

实施例9：帕瑞肽粗品的制备

取0.015mol实施例7制得的帕瑞肽肽树脂，加入体积百分比为90％的TFA、体积百分比为5％的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解(混合酸解液10mL/克帕瑞肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干、得类白色粉末即为帕瑞肽粗品，粗品纯度为81.7％。

实施例10：帕瑞肽粗品的制备

取0.015mol实施例7制得的帕瑞肽肽树脂，加入体积百分比为95％的TFA、体积百分比为1％的EDT、余量为水组成的酸解液酸解(混合酸解液10mL/克帕瑞肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干、得类白色粉末即为帕瑞肽粗品，粗品纯度为77.9％。

实施例11：帕瑞肽粗品纯化

取0.015mol实施例8所得帕瑞肽粗品，用纯化流动相A溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用；

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.05％TFA/水溶液-0.05％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得帕瑞肽纯化中间体浓缩液；

取帕瑞肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到帕瑞肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得帕瑞肽纯品8.51g，总收率为51.2％，分子量：1108.6(100％M+1)，纯度：99.1％，最大单一杂质0.13％。

实施例12：帕瑞肽粗品纯化

取0.015mol实施例9所得帕瑞肽粗品，用纯化流动相A溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用；

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得帕瑞肽纯化中间体浓缩液；

取帕瑞肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到帕瑞肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得帕瑞肽纯品8.75g，总收率为52.6％，分子量：1108.4(100％M+1)，纯度：99.5％，最大单一杂质0.10％。

实施例13：帕瑞肽粗品纯化

取实施例10所得帕瑞肽粗品，用纯化流动相A溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用；

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.2％TFA/水溶液-0.2％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得帕瑞肽纯化中间体浓缩液；

取帕瑞肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为0.2％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到帕瑞肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得帕瑞肽纯品8.12g，总收率为48.8％，分子量：1108.4(100％M+1)，纯度：99.3％，最大单一杂质0.11％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种合成帕瑞肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤2、按照帕瑞肽线性肽氨基酸序列C端到N端的顺序，从肽树脂1出发，在缩合试剂和活化试剂作用下，将Fmoc-D-Trp(Boc)、Fmoc-Phg、Fmoc-Hyp(Boc-(2-aminoethyl)carboxyl)、Fmoc-Phe和Fmoc-Tyr(Bzl)进行逐一延伸偶联，每次延伸偶联后均得到对应的肽树脂，完成所有保护氨基酸的偶联后去除保护基，继续在缩合试剂和活化试剂作用下进行环化，最终获得帕瑞肽树脂，然后酸解获得帕瑞肽粗品；所述酸解采用由体积百分比为94％的TFA、体积百分比为2％的EDT、体积百分比为2％的Tis、余量为水组成的混合酸解液酸解；

步骤3、帕瑞肽粗品纯化得到帕瑞肽纯品。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述N端保护基为Fomc保护基，C端保护基为All保护基。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述树脂为2-CTC树脂。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述N端和C端有保护基的赖氨酸和树脂的摩尔比为1-6:1。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，每次延伸偶联时所述保护氨基酸和对应肽树脂的摩尔比为1-6:1。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述缩合试剂为N,N-二异丙基碳二亚胺、N,N-二环己基碳二亚胺，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/有机碱、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯/有机碱、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐/有机碱、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯/有机碱中的一种。

7.根据权利要求1或6所述方法，其特征在于，所述有机碱为N,N-二异丙基乙胺、三乙胺或N-甲基吗啡啉。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述活化试剂为1-羟基苯并三唑或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑。