PT2225271E

PT2225271E - Novos análogos não selectivos de somatostatina

Info

Publication number: PT2225271E
Application number: PT88565197T
Authority: PT
Inventors: Massimo Pinori; Paolo Mascagni; Andrea Vitali
Original assignee: Italfarmaco Spa
Priority date: 2007-12-03
Filing date: 2008-11-24
Publication date: 2013-09-27
Also published as: WO2009071460A2; HRP20130948T1; US8937152B2; PL2225271T3; CN101883785A; CA2702940A1; BRPI0818978B1; EP2225271A2; US20100323964A1; KR20100103464A; BRPI0818978A2; JP2011505345A; ES2431573T3; JP5331817B2; KR101500528B1; EP2225271B1; WO2009071460A3; CA2702940C; BRPI0818978B8; DK2225271T3

Description

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DESCRIÇÃO "Novos análogos não selectivos de somatostatina" Descrição 0 presente invento refere-se a novos ciclopéptidos análogos funcionais não selectivos de somatostatina, aos seus conjugados e complexos, aos processos para a sua produção, às formulações que os contêm e às suas utilizações no campo farmacêutico.

Estado da Técnica

Conhecem-se os agonistas do péptido cíclico de somatostatina há já algum tempo [J. Pept. Res., 58(2), 91, (2001)]: em particular, dois destes, a octreotida e a lanreotida, são utilizados clinicamente no tratamento da acromegalia e no tratamento sintomático de carcinomas. A somatostatina actua através da interacção com 5 subtipos de receptores (SSTR1, 2, 3, 4 e 5) ; mas os análogos até agora empregues em terapia são, no entanto, essencialmente selectivos para o único receptor SSTR2. A grande maioria dos agonistas já conhecidos é caracterizada pela presença, na estrutura do péptido, do fragmento -DTrp-Lys-; por esse motivo, este fragmento parece ser essencial para a actividade dos análogos e está de facto também presente na octreotida e na lanreotida.

Recentemente, avançou-se com a hipótese de que análogos menos selectivos, ou seja, capazes de interagir também com os outros subtipos de receptor, podem oferecer uma vantagem do ponto de vista de utilização terapêutica [Nature Rev. Drug Discovery, 2, 999, (2003)].

No pedido de patente W02002010192, descreve-se um ciclopéptido que possui uma forte afinidade com o receptor SSTR5, uma menor afinidade com SSTR2 e SSTR3 e uma afinidade perto de zero com SSTR4. Para SSTR1, descreve-se uma afinidade cerca de 60 vezes menor do que com SSTR5. 2

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Os mesmos inventores de W02002010192, numa publicação posterior [Nature Rev. Drug Discovery, 2, 999, (2003)], sustentam a importância dos receptores SSTR1, 2 e 5 na actividade antissecretora da somatostatina, mas relatam, para o mesmo ciclopéptido descrito no pedido de patente acima referido, uma afinidade com SSTR1 de cerca de 300 vezes menor do que com SSTR5. É claro que, neste caso, uma possível actividade terapêutica mediada através da interacção com o receptor SSTRl só se pode conseguir na presença de uma sobredosagem considerável no que diz respeito às acções mediadas através da interacção com SSTR5.

Por esse motivo, enquanto que o possível papel terapêutico de agonistas com o receptor de SSTR4 não for claro, existe claramente a necessidade, e a sua possível utilização, de novos análogos de somatostatina com um nível de afinidade comparável com todos os outros quatro receptores.

Em particular, relatam-se na literatura as potenciais vantagens terapêuticas dos agonistas capazes de interagir com SSTRl: M. C. Zatelli e seus colegas estudaram, in vitro, o efeito de agonistas para SSTRl em adenomas hipofisários humanos, tanto segregando [J. Clin. End. & Met., 88, 2797, (2003)] como clinicamente não funcionando [J. Clin. End. & Met., 89, 5181, (2004)]; em ambos os casos o estímulo dos receptores SSTRl conduziu a uma redução da actividade secretora e à vitalidade celular. Por outro lado, também se demonstrou a potencial vantagem terapêutica que pode derivar da utilização de análogos pluripotentes de somatostatina (capazes de interagir com os receptores SSTR 1, 2, 3 e 5) por J. van der Hoek e seus colegas numa recente revisão [Curr. Pharm. Design, 11, 1573, (2005)]; mostrou-se, de facto, como diferentes tumores, tanto da hipófise como gastroenteropancreáticos (GEP), expressam, na superfície da célula, percentagens variáveis mas significativas de todos os quatro receptores, enquanto que o receptor SSTR4 está muito menos presente. 3 ΕΡ 2 225 271/ΡΤ Ο pedido W02005014624 descreve a preparação de análogos cíclicos da somatostatina e os intermediários utilizados na sua preparação. Estes análogos hexacíclicos possuem o resíduo de triptofano na posição 3. 0 pedido W02006066868 descreve as composições farmacêuticas para a administração parentérica de vários sais de análogos de somatostatina, que formam um gel de depósito após a injecção em contacto com os fluidos corporais. Por análogos de somatostatina, entendem-se os péptidos lineares ou cíclicos derivados de somatostatina, que compreendem uma sequência de aminoácidos compreendendo o triptofano.

Em Regulatory Peptides, 1, 97-113, (1980), mantém-se a importância do grupo NH do índole para a actividade da somatostatina: a substituição de Trp8 com naftilalanina, de facto, causa a perda de actividade.

Os dados da ligação não são relatados no artigo, enquanto que se avalia a actividade da inibição da secreção gástrica in vivo. Os resultados indicam que, para a actividade gástrica, a substituição de Trp8 com halogéneo, análogos metilados ou metoxilados (Tabela II), tem pouca influência na potência biológica, potência a qual é quase cancelada nos análogos contendo pentametilfenilalanina (PMP) ou naftilalanina (Tabela III), em vez de triptofano. Por seu lado, os compostos de halogéneo derivados de D-Trp parecem aumentar consideravelmente a actividade de inibição da secreção de GH (Tabela V) . Os investigadores de Ciência e Desenvolvimento da Merck (ver Veber D. F. em Proceedings of the 12th Am. Pep. Symp., editores Smith, J. A. & Rivier J. E., ESCOM 1992, páginas 3-14) relatam que a substituição do triptofano em hexapéptidos cíclicos com outros aminoácidos aromáticos conduz a uma perda considerável in vitro da actividade na inibição da secreção de GH.

Em J. Med. Chem., 48, 507, (2005), descrevem-se os análogos selectivos para SSTR1, juntamente com o seu possível papel terapêutico de agonistas. As estruturas aqui analisadas também possuem triptofano. 4 ΕΡ 2 225 271/ΡΤ Ο artigo descreve duas séries de análogos de derivados a partir de dois ciclopéptidos: uma contendo D-Trp e a outra D-Nal; todos os análogos, assim como os que lhe deram origem, só possuem afinidade com SSTRl; a série com D-Nal é cerca de 10 vezes menos potente do que com o D-Trp. Um detalhe especifico destes peptídeos, que são inactivos em todos os outros subtipos de receptores, é a substituição de lisina com o p-aminofenilalanina. A partir desse conjunto referido acima, é por esse motivo evidente que um agonista pluripotente de somatostatina, ou seja, capaz de estimular SSTRl, SSTR2, SSTR3 e SSTR5, aumentará a possibilidade de respostas positivas em pacientes afectados por tumores neuroendócrinos com relação aos agonistas cuja função activadora é restrita a um número menor de sub-receptores da somatostatina.

Descrição do Invento O requerente descobriu surpreendentemente que o resíduo de triptofano, presente em muitos análogos conhecidos, pode ser substituído de um modo útil por outros resíduos aromáticos adequados, mantendo a afinidade para a maioria dos receptores de somatostatina.

Em particular, descobriu-se que, usando aminoácidos cujo grupo aromático é suficientemente rico em electrões (sendo, por exemplo, substituído com grupos doadores de electrões) em substituição do resíduo de triptofano, os péptidos obtidos mostram uma boa afinidade com o receptor SSTRl, em valores de concentração semelhantes aos necessários para a ligação aos receptores SSTR2, SSTR3 e SSTR5. O que constitui o objecto do presente invento são, por esse motivo, os ciclo-hexapéptidos análogos da somatostatina, possuindo a fórmula (I), onde se entende por ciclo-hexapéptidos análogos de somatostatina os péptidos com seis resíduos de aminoácido alfa, em que está presente uma ligação peptídica directa entre o grupo carboxilico alfa do sexto resíduo e o grupo amina alfa do primeiro resíduo, com uma afinidade de ligação a concentrações nanomolares, para pelo menos um dos receptores de somatostatina conhecidos: 5 ΕΡ 2 225 271/ΡΤ

Fórmula (I) em que : m = Ο, 1 ou 2 e η = 1, 2 ou 3; de preferência m é igual a 1 e n é igual a 1 ou 2; ainda em maior preferência n é igual a 1. O grupo RI representa um grupo aromático, excluindo indole, que é de preferência fenilo, naftilo, benzidrilo, fluorenilo, estirenilo, antranilo ou bifenilo, opcionalmente substituído numa ou mais posições. Os grupos de substituição preferidos são os grupos doadores de electrões tais como alquilo, alquiloxilo, hidroxilo, alquilamina, acilamina, sulfureto ou alquilsulfureto. 0 grupo RI é de preferência um grupo naftaleno, substituído com um ou mais grupos metiloxi, de preferência com dois grupos metiloxi; num aspecto ainda de maior preferência do invento, RI é 3,8-dimetoxinaftaleno-2-ilo. 0 grupo R4 representa um grupo aromático, opcionalmente substituído. 0 grupo R4 é de preferência um grupo fenilo, possivelmente substituído com um grupo hidroxilo, alcoxilo Ci-C4, alquilo C1-C4, halogéneo ou nitro.

Os grupos R2 e R3 são, independentemente, H ou um grupo alquilo C1-C4, ou, em conjunto, representam uma cadeia alquilena C4-C5, ligada ao átomo de azoto para formar uma estrutura cíclica. 6 ΕΡ 2 225 271/ΡΤ

Alternativamente, R3 pode ser um catião ou grupo quelante de metal, directamente ligado ao grupo amina ou unido através de um espaçador. 0 possível espaçador pode ser um dos já conhecidos na arte, por exemplo, aqueles descritos na Patente GB-A-2225579 ou na Patente WO9701579; os espaçadores podem, por exemplo, ser um grupo de fórmula -Z-R5-C0-, em que R5 é um alquileno Ci-n, alcenileno Ci_u ou -CH(R6)-, em que R6 é a cadeia lateral de um aminoácido alfa, e Z é uma função capaz de formar uma ligação covalente com o grupo quelante; Z pode ser por exemplo, um grupo funcional capaz de formar um éter, um éster ou uma ligação peptídica com um outro grupo funcional do grupo quelante (por exemplo, hidroxilo, carboxilo ou amina). Z é de preferência um átomo de oxigénio, um átomo de enxofre, um radical carbonilo (ou CO) , ou um radical amino (ou NH) . 0 grupo Z é ainda em maior preferência um radical amino e o grupo de fórmula -Z-R5-C0- será um resíduo bivalente derivado a partir de um ácido aminocarboxílico, tal como, por exemplo, beta-Alanina (ou -NH-(CH2) 2-C0-), ácido 6-amino-hexanóico (ou -NH-(CH2) 5-CO-) ou outros. 0 grupo quelante é um grupo fisiologicamente aceitável, capaz de complexar iões ou outros elementos detectáveis ou úteis para radioterapia anti-tumoral e, de preferência, possuindo um carácter hidrofílico.

Podem-se escolher convenientemente os grupos quelantes e os iões, e os outros elementos de complexação, de entre aqueles já conhecidos e descritos, por exemplo, através de Okarvi, S. M. em Med. Res. Rev., 24(3), 357, (2004), através de Weiner, R. E. e Thakur, M. L., Biodrugs, 19(3), 145, (2005) ou através da Patente W02002010192. O grupo quelante pode estar na forma livre, na forma de sal ou complexado com iões ou outros elementos, detectável através de radioactividade (radionuclídeos) ou com outros meios, ou utilizáveis para fins rádioterapêuticos. 7 ΕΡ 2 225 271/ΡΤ

De preferência, ο grupo quelante será derivado a partir do ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-N,Ν',Ν'',Ν' '' -tetra-acético (DOTA) ou do ácido dietilenotriaminopenta-acético (DTPA) e o ião será um ião paramagnético (Gd3+, Fe3+, ou outros), fluorescente (Eu3+) ou um radionuclideo emitindo radiações α, β ou γ (ηιΙη, 99mTc, 169Yb, 177Lu, 90Y, 213Bi ou outros). XI é um resíduo aminoacilo de fórmula (a), (b) ou (c) (a) (b) —CO—GH—NH—

I CH-ChL I 3 0~CH2Ph -GO-ÇH-NH- CH2 0-CH2Ph

XI é de preferência um resíduo aminoacilo de fórmula (c) .

Os resíduos de aminoacilo, presentes nos ciclo-hexapéptidos de fórmula (I), podem ter a configuração L ou D; de preferência os resíduos 1, 2 e 4-6 são L, e o resíduo 3 é de preferência D.

Os ciclo-hexapéptidos de fórmula (I) podem existir na forma de base livre ou como sais. Os sais incluem sais de adição com ácidos orgânicos (por exemplo, acetatos, lactatos, benzoatos, aspartatos, pamoatos, etc.), ácidos poliméricos (por exemplo, ácido polimetacrílico, ácido 8 ΕΡ 2 225 271/ΡΤ poliestirenossulfónico, etc.) ou com ácidos inorgânicos (por exemplo, cloridratos, sulfatos, nitratos, etc.).

Os compostos do invento são, in vivo, muito mais resistentes aos mecanismos de degradação em comparação com os análogos de ciclodissulfuretos de somatostatina (octreotida, lanreotida, etc.) e, consequentemente, possuem uma duração de acção mais prolongada. Em alguns casos, a estabilidade e a duração da acção são também melhoradas em relação a outros ciclopéptidos, incluindo aqueles já conhecidos por serem agonistas estáveis da somatostatina. 0 presente invento também inclui os processos para a produção de compostos de fórmula (I), daqui em diante chamados de compostos do invento.

Podem-se produzir os compostos do invento através de diferentes métodos sintéticos, análogos aos métodos já conhecidos para outros péptidos. a) Pode-se produzir um hexapéptido linear correspondente, parcialmente protegido, por meio de síntese de fase sólida, de modo a deixar ambos o grupo amino alfa do N terminal e o grupo carboxílico alfa do C terminal livres; os dois grupos livres irão reagir, em solução, por meio de agentes de condensação adequados e as protecções das cadeias laterais irão finalmente ser removidas, obtendo-se o desejado ciclo-hexapéptido. b) Em alternativa, pode-se realizar a síntese em fase sólida através da ancoragem do péptido à resina por meio da cadeia lateral de lisina; neste caso, depois de se remover selectivamente as protecções dos grupos N-terminal e C-terminal, pode ainda se realizar a ciclização em fase sólida e pode-se obter os compostos do invento com um único tratamento de desprotecção e separação a partir da resina. c) Numa outra alternativa, pode-se preparar o péptido linear protegido por meio da síntese em solução e em seguida, depois de se ter removido selectivamente as protecções dos grupos N-terminal e do C-terminal, pode-se continuar como descrito em a) . 9 ΕΡ 2 225 271/ΡΤ

Pode-se escolher ο péptido linear a se ciclizar de entre os seis péptidos hipoteticamente obtidos por meio da abertura de qualquer uma das seis liqações peptidicas presentes nos compostos do invento. A escolha será guiada através de considerações de adequação sintética, conhecidas pelos especialistas da sintese de péptidos, mas não influencia minimamente a natureza do produto final, o qual será em qualquer caso idêntico a qualquer sequência escolhida do péptido linear; de preferência, escolhem-se os péptidos em que o aminoácido do C-terminal é a lisina.

Muitos dos derivados de aminoácidos, necessários para a sintese dos péptidos, são conhecidos e estão disponíveis comercialmente.

Podem-se preparar os derivados de hidroxiprolina como descrito na Patente WO9701579, ou com outros procedimentos semelhantes; em alternativa, os péptidos lineares parcialmente protegidos podem conter um resíduo de hidroxiprolina não modificado, e pode-se efectuar a introdução da cadeia lateral directamente nos péptidos lineares, antes da desprotecção, ou após a ciclização, antes da desprotecção final.

Para os derivados de quelantes dos compostos do invento, pode-se escolher adequadamente o grupo protector da cadeia ligada à hidroxiprolina de tal modo que é possível removê-lo selectivamente, deixando a protecção da cadeia lateral de lisina inalterada; desta maneira, será possível ligar o grupo quelante no grupo amino livre, directamente ou por meio de um espaçador, antes da desprotecção final.

Alguns aminoácidos utilizados na posição 3 de fórmula geral (I), assim como os seus derivados, são novos e formam um outro aspecto do presente invento. Em particular, referimo-nos aos aminoácidos: 3-(3,8-dimetoxinaftaleno-2-il)-alanina, 3-(1,4-dimetoxinaftaleno-2-il)-alanina e 2,5-dimetoxi-homofenilalanina 10

ΕΡ 2 225 271/PT e aos seus derivados total ou parcialmente protegidos, correspondentes à fórmula (e), (f) e (g):

(e) w 3-(3,8-dimetoxinaftaleno-2-il)-alanina e derivados

3-(1,4-dimetoxinaftaleno-2-il)-alanina e derivados

(g) W 2,5-dimetoxi-homofenilalanina e derivados

Nas fórmulas (e) , (g) e (f) , G pode ser um átomo de hidrogénio ou um grupo protector escolhido de entre os conhecidos pelos peritos na arte, tais como fluoreno-9-il-metiloxicarbonilo, terc-butiloxicarbonilo ou benziloxicar- 11 ΕΡ 2 225 271/ΡΤ bonilo; W pode ser um grupo hidroxilo ou um grupo protector escolhido de entre os que são conhecidos pelos peritos na arte, por exemplo, metiloxi, terc-butiloxi, ou benziloxi. Por derivados parcialmente protegidos, entende-se aqueles derivados em que apenas um de entre G e W, representa um grupo protector.

Estes podem-se preparar através de métodos de adaptação já conhecidos na literatura (ver, por exemplo, [J. Org. Chem., 55, 2913, (1990)], [Org. Chem. Lett., 2, 1089, (2000)] e [Synthesis, 38, (1983)]); por exemplo, a partir do aldeído correspondente à cadeia lateral desejada, pode-se utilizar o método descrito no esquema 1.

Esquema 1

Podem-se preparar os derivados atrás referidos como misturas racémicas de enantiómeros (D/L) ou, podem-se obter por meio de síntese estereosselectiva ou métodos de resolução quirais como enantiómeros únicos D ou L.

De entre os métodos de resolução quirais, podem-se utilizar os métodos de desracemização enzimáticos (tal como, 12 ΕΡ 2 225 271/ΡΤ por exemplo, ο descrito na Patente US2001021519), no qual a estereosselectividade da enzima (por exemplo, L- ou D-aminoácido oxidase) permite induzir a racemização de apenas um dos dois enantiómeros, o que após repetidos ciclos de tratamento, permite a obtenção de uma pureza elevada do enantiómero.

Também um objecto do presente invento são as formulações farmacêuticas que contêm os compostos do invento.

Podem-se administrar os compostos do invento na forma livre ou na forma de sais farmaceuticamente aceitáveis ou na forma de complexos. Podem-se preparar tais sais e complexos de um modo convencional e apresentam a mesma ordem de actividade que os compostos livres. 0 presente invento também proporciona compostos farmacêuticos que compreendem os compostos de fórmula (I) na forma de base livre ou na forma de sal farmaceuticamente aceitável, juntamente com um ou mais excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. Podem-se formular tais composições de uma maneira convencional. Também se podem administrar os compostos do invento numa forma de libertação modificada, por exemplo, como implantes, microcápsulas, microesferas ou nanoesferas compreendendo, por exemplo, polímeros ou copolímeros biodegradáveis, na forma de formulação de lipossomas, ou sob a forma de autogel, por exemplo, composições sólidas ou semi-sólidas capazes de formar um gel após a interacção com os fluidos do corpo do paciente.

Podem-se administrar os compostos do invento ou os seus sais ou complexos farmaceuticamente aceitáveis por meio de qualquer via convencional, por exemplo, de um modo parentérico, na forma de uma solução ou suspensão injectável (incluindo também as formas de libertação modificada supra mencionadas), por via oral, usando um promotor da absorção convencional, por via nasal ou na forma de supositórios ou por via tópica, por exemplo sob a forma de um liquido oftálmico, um qel, uma preparação como unguento ou como uma suspensão, por exemplo, uma suspensão de lipossomas, tal como uma formulação de microesferas ou de nanoesferas, por exemplo, para instilação subconjuntival, ou intra, ou periocular ou injecção. 13 ΕΡ 2 225 271/ΡΤ

De acordo com um outro aspecto do invento, também se proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um conjugado ou um complexo de compostos do invento juntamente com excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. Podem-se produzir tais composições de um modo convencional e podem-se apresentar, por exemplo, para imagiologia de diagnóstico, como um conjunto compreendendo duas doses separadas, sendo uma delas o radionuclideo e a outra o conjugado dos compostos do invento, com instruções para a sua mistura. Para a radioterapia, o conjugado dos compostos do invento numa forma complexada pode estar de preferência numa forma de formulação liquida quente.

Os exemplos seguintes pretendem ilustrar os objectos do presente invento e não devem em caso algum ser considerados limitativos do mesmo.

Nos exemplos, serão utilizadas as seguintes abreviaturas: 1,4MNal 3-(1,4-dimetoxinaftaleno-2-il)-alanina 2,5MhPhe 2,5-dimetoxi-homofenilalanina 3,8MNal 3-(3,8-dimetoxinaftaleno-2-il)-alanina ACN Acetonitrilo Bn Benzilo Boc terc-butiloxicarbonilo DIPEA Di-isopropiletilamina DMF N,N-dimetilformamida DPPA Difenilfosforilazida DSC N,N-Dissuccinimidilcarbonato Fmoc Fluoreno-9-il-metiloxicarbonilo Fmoc-OSu Fluoreno-9-il-metilo, carbonato de N-succinimidilo HATU Hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazole-l-il)-Ν,Ν,Ν',Ν'-tetrametilurónio hPhe homofenilalanina; ácido 2-amino-4-fenilbutirico Hyp 4-hidroxiprolina 14

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Nal 3-(naftaleno-2-il)-alanina, ácido 2-amino-3-naftaleno-2-il-propiónico NMM N-metilmorfolina Pd/C Paládio metálico em carbono Phg Fenilglicina, ácido 2-amino-2-fenilacético PVDF Fluoreto de polivinilideno Sty estiril-alanina; ácido 2-amino-5-fenil-pent-4-enóico Tf a Trifluoroacetilo THF Tetra-hidrofurano -Trt(Cl)-DVB Resina, (2-cloro)-tritil-divinilbenzeno Z Benziloxicarbonilo

Excepto quando indicado de modo contrário, os aminoácidos estão na configuração L; indicam-se como (D/L) os aminoácidos racémicos, enquanto que se indicam como (D,L) os enantiómeros individuais de quiralidade indefinida. Método geral de purificação

Se não for indicado de outra forma, todas as purificações finais realizaram-se por meio de um sistema de HPLC/MS de preparação da Waters com colunas Waters Symmetry C18 com 5 milímetros de 19x50 mm, equipado com espectrómetro de massa Waters ZQ.

Condições de operação: ES+ ionização centroide, 15 minutos de tempo de varrimento, varrimento de 120-1000 m/z, 15V tensão de cone, temperatura da fonte de 120°C, temperatura de solvatação de 250 °C.

Eluentes de HPLC: A = H20, B = ACN, C = CF3COOH a 1% em H20

Dissolveu-se uma alíquota do produto em bruto a ser purificado em MeOH e dilui-se com uma mistura ACN/H20, (1:1, v/v). Filtrou-se a solução através de uma membrana de PVDF de 0,45 mm, e injectou-se no sistema de preparação previamente 15 ΕΡ 2 225 271/ΡΤ descrito. Para cada ensaio, recolheram-se as fracções correspondentes ao pico relacionado com o ião molecular esperado ([M+H]+), combinaram-se e concentraram-se até à secura. Se o cromatograma apresentar picos adicionais associados com o mesmo ião molecular (isómeros), recolhem-se estes separadamente.

Preparação dos intermediários:

Exemplo 1

Fmoc-(D/L)-3-(3,8-dimetoxinaftaleno-2-il)-alanina a) Dissolveram-se 3,8-dimetoxi-2-naftaldeido (1 equivalente), 2,2-dimetil-l,3-dioxano-4,6-diona (1,35 equivalentes) e piperidina (0,12 equivalentes) em CHCI3 e aqueceu-se a solução e submeteu-se a refluxo durante 2,5 horas. Após lavagens aquosas, recuperou-se o produto através da evaporação do solvente e dissolveu-se novamente numa mistura de THF e metanol, e adicionou-se NaBH4 (5,4 equivalentes) à solução. Após cerca de 10 minutos, adicionou-se água e acidificou-se a mistura a pH=3. Através de uma evaporação parcial, separa-se um sólido que se recupera e é novamente dissolvido em etanol, adiciona-se piridina e aquece-se a mistura ao refluxo até que o produto inicial tenha desaparecido por completo (controlo por TLC). b) Depois de se evaporar o etanol, dissolve-se o produto (éster monoetilico do ácido 2-(3,8-dimetoxinaftaleno-2-il-metil)-malónico) em clorofórmio e lava-se com água acidica. Adiciona-se cloreto de tionilo (1,3 equivalentes) à solução seca, e aquece-se a mistura em refluxo durante cerca de uma hora. Depois de repetidas evaporações do clorofórmio, dissolve-se o resíduo em diclorometano e arrefece-se a solução num banho de gelo. Adiciona-se brometo de tetrabutilamónio (catalisador) e dissolve-se NaN3 (1,2 equivalentes) em água, e depois de duas horas a 0°C, recupera-se a fase orgânica, a qual se lava com água e seca-se com Na2S04 anidro; deixa-se a solução à temperatura ambiente, na presença de Na2S04 anidro durante toda a noite. Adiciona-se ácido trifluoroacético (1,5 equivalentes) à solução filtrada, e aquece-se a mistura em refluxo durante cerca de 6 horas. Depois de ter lavado com NaHC03 a 5%, 16 ΕΡ 2 225 271/ΡΤ evapora-se ο solvente e purifica-se o óleo obtido numa coluna de sílica gel. c) Dissolve-se o produto obtido (Tfa-(D/L)3,8MNal-0Et) numa mistura de THF, metanol e água, contendo K2CO3 (2 equivalentes) e aqueceu-se em refluxo durante uma noite. A solução foi parcialmente evaporada e adicionou-se Fmoc-OSu (1 equivalente) dissolvido em THF. Após a reacção estar completa (controlo por TLC), evapora-se o THF e recupera-se o produto através de extracção da solução aquosa com acetato de etilo. Com a adição de n-hexano, obtém-se a precipitação do produto (Fmoc-(D/L)3,8MNal-0H) o qual é filtrado e seco (pureza por HPLC: 98,5%, m/z = 498 uma (unidades de massa atómica) ([M+H]+)) .

Exemplo 2

Fmoc-[4-(2-aminoetil)carbamoílo]prolina a) Dissolvem-se Z-Hyp-OBn e DSC (1 equivalente) em acetonitrilo e tratam-se com trietilamina (1,2 equivalentes). Depois de uma noite à temperatura ambiente, adiciona-se N-Boc-diaminoetano (1,2 equivalentes) e deixa-se a mistura a reagir durante 3,5 horas. Após evaporação do solvente, lavou-se o resíduo recuperado com acetato de etilo, por esta ordem, com 2,5% de KHSO4, NaHCC>3 e NaCl. Secou-se a solução orgânica com Na2S04 anidro, evaporou-se até à secura, recuperando-se o produto. b) Dissolve-se o produto em metanol e removem-se os grupos protectores (Z e éster benzílico) por meio de hidrogenação catalítica na presença de Pd/C a 10%. Após a filtração do catalisador, recupera-se o aminoácido através da evaporação do solvente, e dissolve-se numa mistura de água e THF contendo K2CO3 (1 equivalente), e depois de arrefecida a 0°C, adiciona-se Fmoc-OSu (2 equivalentes) dissolvido em THF. Após a reacção completa (controlo por TLC), evapora-se o THF e recupera-se o produto através da extracção da solução aquosa com acetato de etilo. Com a adição de n-hexano, obtém-se a precipitação do produto, o qual é filtrado e seco (Pureza por HPLC: 99,9%; m/z = 540 uma ([M+H]+)). 17 ΕΡ 2 225 271/ΡΤ

Exemplo 3

Fmoc-(D/L)-2,5-dimetoxi-homofenilalanina a) A uma suspensão de 2,2-dimetil-l,3-dioxano-4,6-diona (1,3 equivalentes) em DMF (50 mL) , arrefecida num banho de gelo, adicionaram-se NaCNBH3 (1,8 equivalentes) e 2,5-dimetoxifenilacetaldeído (1,1 equivalentes). Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 5 horas. Ao se adicionar H2Ó, separa-se um sólido o qual é filtrado, purificado através de cristalização a partir de isopropanol e finalmente dissolvido em EtOH e tratado com piridina em refluxo durante seis horas. b) Operando tal como descrito na alínea b) do exemplo 1, a partir do produto obtido (éster monoetílico de ácido 2-(2,5-dimetoxifeniletil)-malónico), prepara-se o aminoácido parcialmente protegido Fmoc-(D/L)2,5MhPhe-OH (pureza por HPLC: 96%, m/z = 462 uma ([M+H]+) ) .

Exemplo 4

Fmoc-(D/L)-3-(1,4-dimetoxinaftaleno-2-il)-alanina A partir de 1,4-dimetoxi-2-naftaldeído e operando como descrito no exemplo 1, obtém-se o aminoácido protegido Fmoc-(D/L)1,4MNal-0H. (Pureza por HPLC: 96,9%, m/z ([M+H]+) = 498 uma) .

Preparação dos ciclopéptidos:

Analisou-se a pureza dos péptidos descritos nos exemplos por meio de cromatograf ia de fase reversa de HPLC (cromatógrafo Agilent 1100), utilizando o método seguinte:

Eluentes: A) TF A a 0,1% em acetonitrilo / água (5:95, v/v) B) TF A a 0,1% em acetonitrilo

Gradiente de eluente B: a partir de 20% até 80% em 30 minutos.

Fluxo: 1,0 mL/min.

Coluna: Júpiter 4 μ (4 x 250 mm). 18

ΕΡ 2 225 271/PT

Exemplo 5

Isómero B do ciclo[Tyr(Bn)-Phe-Pro(4-OCONH(CH2) 2NH2)-Phe-(D,L)3,8MNal—Lys]

a) Η-Tyr (Bn) -Phe-Pro (4-0C0NH (CH2) 2NHBoc) -Phe- (D/L) 3,8MNal— Lys(Boc)-OH

Começando a partir da resina Fmoc-Lys(Boc)-Trt(Cl)-DVB, realizaram-se vários ciclos de síntese de péptidos em fase sólida, de modo a obter o hexapéptido desejado; no primeiro ciclo, utiliza-se Fmoc-(D/L)3,8 MNal-OH (ver exemplo 1) e no terceiro ciclo utiliza-se Fmoc-Pro(4-0C0NH(CH2) 2NHB0C)-OH (ver exemplo 2); para cada ciclo, remove-se o grupo Fmoc com piperidina a 20% em DMF e activa-se o aminoácido subsequente, protegido como Fmoc, com HATU e fez-se reagir com os grupos amino presentes na resina.

No final, remove-se o grupo Fmoc com piperidina a 20% em DMF e remove-se o péptido parcialmente protegido da resina por meio de um tratamento com uma mistura de ácido acético, trifluoroetanol e diclorometano (numa proporção de 1:2:7) para 30 minutos à temperatura ambiente. Após se ter evaporado o solvente, divide-se o resíduo entre acetato de etilo e NaHC03 a 5%, recupera-se e evapora-se a fase orgânica, obtendo-se um resíduo sólido. b) ciclo [Tyr (Bn) -Phe-Pro (4-OCONH (CH2) 2NH) -Phe- (D, L) 3, 8-MNal-Lys]

Dissolveu-se o péptido obtido em c) em DMF (1,6 mM) e arrefeceu-se até -10°C; adicionaram-se DIPEA (2 equivalentes) e DPPA (1,3 equivalentes) e deixou-se a mistura a +4°C durante 60 horas. Depois de se ter removido o DMF, recuperou-se o resíduo com acetato de etilo e lavou-se com NaHCCg a 5%. Por evaporação da fase orgânica, obtém-se um resíduo sólido que se tratou com TFA (95% em H20) a 0°C durante 1 hora e, em seguida, evaporou-se; as diferentes espécies de isómeros estão presentes no resíduo, as quais se separam por meio de cromatografia de fase reversa (coluna C18). 0 segundo isómero, na ordem de eluição da coluna de HPLC, (isómero B) , é recolhido puro. 19 ΕΡ 2 225 271/ΡΤ HPLC: temperatura ambiente, 14,74 minutos; 99,1% de pureza EM: m/z = 1133 uma ([M+H]+) e 567 uma ([M+2H]2+)

Exemplo 6

Isómero B do ciclo [Tyr (Bn)-Phe-Pro (4-OCONH (CH2) 2NH2)-Phe-(D,L)2,5MhPhe-Lys]

a) Η-Tyr (Bn) -Phe-Pro (4-0C0NH (CH2) 2NHBoc) -Phe- (D/L) 2,5-MhPhe-Lys(Boc)-OH

Opera-se como descrito na alínea a) do exemplo 5, utilizando Fmoc-(D/L)2,5MhPhe-0H (exemplo 3) no primeiro ciclo e Fmoc-Hyp-OH no terceiro ciclo. Antes da remoção do grupo terminal Fmoc, trata-se a resina com p- nitrofenilcloroformiato (5 equivalentes) na presença de NMM (5 equivalentes); depois de três horas, lavou-se a resina com DCM e tratou-se com N-Boc-diaminoetano (5 equivalentes) por mais três horas, e em seguida filtrou-se e lavou-se. Procedeu-se então como descrito na alínea a) do exemplo 5. b) ciclo [Tyr (Bn) -Phe-Pro (4-OCONH (CH2) 2NH) -Phe- (D, L) 2,5-MhPhe-Lys]

Tratou-se o péptido obtido em a) como descrito na alínea b) do exemplo 5. Também neste caso, obtêm-se diferentes isómeros, os quais se separam por meio de cromatografia de fase reversa (coluna C18). 0 segundo isómero, na ordem de eluição da coluna de HPLC, (isómero B), é recolhido puro. HPLC: temperatura ambiente, 13,82 minutos; pureza de 99,0%. EM: m/z = 549 uma ([M+2H]2+)

Exemplo 7

Isómero B do ciclo [Tyr (Bn)-Phe-Pro (4-OCONH (CH2) 2NHCH3)-Phe-(D,L)3,8MNal-Lys]

Opera-se como descrito no exemplo 6, utilizando Fmoc-(D/L)3,8MNal-OH (exemplo 1) no primeiro ciclo e Boc-N(CH3)-(CH2) 2_NH2) para se modificar a cadeia lateral de hidroxiprolina. Obtêm-se diferentes isómeros, os quais se separam por meio de cromatografia de fase reversa (Coluna C18) . O segundo isómero, na ordem de eluição da coluna de HPLC, (isómero B), é recolhido puro. 20 ΕΡ 2 225 271/ΡΤ HPLC: temperatura ambiente, 15,07 minutos; pureza de 94,5%. EM: m/z = 1147 uma ([M+H]+) e 574 uma ([M+2H]2+

Exemplo 8

Isómero A do ciclo [Tyr (Bn)-Phe-Pro (4-OCONH (CH2) 2NH2)-Phe- (D,L)1,4-MNal-Lys]

Opera-se como descrito no exemplo 6, utilizando Fmoc-(D/L)1,4MNal-OH (exemplo 4) no primeiro ciclo. Obtêm-se diferentes isómeros, os quais se separam por meio de cromatografia de fase reversa (coluna C18). 0 isómero com o menor tempo de retenção (isómero A) corresponde ao produto do titulo. HPLC: temperatura ambiente, 13,71 minutos; pureza de 80,6%. EM: m/z = 1133 uma ([M+H]+) e 567 uma ([M+2H]2+))

Exemplo 9

Isómero B do ciclo [Tyr (Bn)-Phe-Pro (4-OCONH (CH2)2NH2)-Phe- (D,L)1,4-MNal-Lys] A partir da preparação descrita no exemplo anterior, também se recolhe o isómero B puro, o segundo na ordem de eluição da coluna de HPLC. HPLC: temperatura ambiente, 14,71 minutos; pureza de 97,7%. EM: m/z = 1133 uma ([M+H]+) e 567 uma ([M+2H]2+)

Exemplo 10 ciclo[Tyr(Bn)-Phe-Pro(4-OCONH(CH2) 2NH2)-Phe-(D)Nal-Lys]

Sintetiza-se o composto seguindo o procedimento descrito no exemplo 6, utilizando Fmoc-(D)Nal-OH no ciclo. HPLC: temperatura ambiente, 14,14 minutos; pureza de 99,5%. EM: m/z = 1073 uma ([M+H]+) e 537 uma ([M+2H]2+)

Exemplo 11 ciclo[Tyr(Bn)-Phe-Pro(4-OCONH(CH2) 2NH2)-Phe-(D)hPhe-Lys]

Sintetiza-se o composto seguindo o procedimento descrito no exemplo 6, utilizando Fmoc-(D)hPhe-OH no primeiro ciclo. HPLC: temperatura ambiente, 13,81 minutos; pureza de 94,5%. EM: m/z = 1037 uma ([M+H]+) e 519 uma ([M+2H]2+) 21 ΕΡ 2 225 271/ΡΤ

Exemplo 12 ciclo[Tyr(Bn)-Phe-Pro(4-0C0NH(CH2) 2NHCH3)-Phg-(D)Sty-Lys]

Sintetiza-se o composto seguindo o procedimento descrito no exemplo 7, utilizando Fmoc-(D)Sty-OH no primeiro ciclo e Fmoc-Phg-OH no segundo ciclo. HPLC: temperatura ambiente, 13,62 minutos; pureza de 97,8%. EM: m/z = 1049 uma ([M+H]+) e 525 uma ([M+2H]2+)

Exemplo 13 ciclo[Tyr(Bn)-Phe-Pro(4-OCONH(CH2) 2NH2)-Phg-(D)hPhe-Lys]

Sintetiza-se o composto seguindo o procedimento descrito no exemplo 6, utilizando Fmoc-(D)hPhe-OH no primeiro ciclo e Fmoc-Phg-OH no segundo ciclo. HPLC: temperatura ambiente, 12,78 minutos; pureza de 98,8%. EM: m/z = 512 uma ([M+2H]2+)

Exemplo 14

Isómero B do ciclo[Tyr(Bn)-Phe-Pro(4-OCONH(CH2) 2NH2)-Tyr- (D,L)3,8MNal-Lys]

Opera-se como descrito no exemplo 5, utilizando Fmoc-Tyr(tBu)-OH no segundo ciclo. HPLC: temperatura ambiente, 13,13 minutos; pureza de 95,4%. EM: m/z = 1149 uma ([M+H]+) e 575 uma ([M+2H]2+)

Exemplo 15

Isómero B do ciclo [Ser (Bn)-Phe-Pro (4-OCONH (CH2)2NH2)-Phe- (D,L)3,8MNal—Lys]

Opera-se como descrito no exemplo 5, utilizando Fmoc-Ser(Bn)-OH no quinto ciclo. HPLC: temperatura ambiente, 12,26 minutos; pureza de 98,2%. EM: m/z = 1057 uma ([M+H]+) e 529 uma ([M+2H]2+)

PARTE EXPERIMENTAL

Os compostos do invento apresentam propriedades farmacológicas importantes, como indicado em vários testes in vitro e in vivo. 22 ΕΡ 2 225 271/ΡΤ

Em particular, os compostos do invento ligam-se, com uma boa afinidade, a pelo menos um dos subtipos dos receptores da somatostatina.

Ensaios de ligação

Realizaram-se os ensaios de ligação, como se explica a seguir, através da utilização de preparações de receptores humanos recombinantes, hSSTRl, hSSTR2, hSSTR3 e hSSTR5, obtidos a partir de membranas de células (por exemplo CHO) transfectadas de acordo com métodos padrão.

Incubam-se as membranas em duplicado durante 60 minutos a 25°C com 3-[1251]iodotirosilll-somatostatina-14 (Amersham, IM161, 2000 Ci/mmol) como um ligando radioactivo e com concentrações crescentes do composto em estudo, em tampão de 25 mM de Hepes (pH 7, 4) , contendo 5 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2, 10 μρ/ιηΐ, de saponina, 0,5% de BSA. A incubação termina por meio de filtração com uma Harvester Filtermate (Perkin Elmer) através de filtros GF/B, os quais são então lavados 6 vezes com tampão (Hepes a 25 mM a pH 7,4, 5 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2) . Mediu-se a radioactividade dos filtros num leitor TopCountTM ou num MicroBetaTM para 1 min/poço depois de se ter adicionado o liquido de cintilação Microscint 20 (Packard) e incubou-se durante 15 minutos num agitador orbital. Expressam-se os resultados como percentagem de ligação específica do ligando marcado radioactivamente, na presença de concentrações crescentes do composto em análise. Calculam-se os valores de IC50 através da utilização do software "GraphPad Prism" (IC50 = concentração do composto necessária para se obter metade da inibição máxima, no teste de ligação competitiva descrito acima).

Os valores de IC50 dos compostos do invento situam-se na gama de concentração nanomolar, de preferência compreendida entre 0,1 e 50 nM. 23 ΕΡ 2 225 271/ΡΤ IC50 (nM) Composto hSSTRl hSSTR2 hSSTR3 hSSTR5 Exemplo 5 10,8 9,3 0,31 0, 42 Exemplo 6 10,0 25,8 0,52 0,64 Exemplo 7 5, 8 9,2 1,33 0, 97 Exemplo 8 19,1 26,6 2, 92 9, 78 Exemplo 9 32,4 9,9 2,34 1, 90 Exemplo 10 113, 8 1,7 1,22 0, 52 Exemplo 11 26,9 21,3 1,34 1, 18 Exemplo 12 39,3 3,3 4, 03 4, 86 Exemplo 13 84, 7 31,9 3, 02 0, 54 Exemplo 14 21, 7 1,8 0,35 0, 36 Exemplo 15 1,0 7,0 1, 80 1, 62

Ensaio para a inibição da libertação da hormona de crescimento em células de pituitária de rato

Os compostos do invento também apresentam uma actividade de inibição da libertação da hormona de crescimento (GH) , conforme mostrado a partir de ensaios realizados in vitro em células de pituitária de rato. Cortaram-se as hipófises extraídas de ratos machos adultos (CD1-SD, 175-200 g) em pequenos pedaços e incubaram-se com colagenase (1 mg/mL) em tampão de Hank contendo BSA a 1%, Hepes a 20 mM, antibióticos, durante 20 minutos a 37°C. As células dispersas, depois de terem sido lavadas várias vezes com tampão, distribuem-se em placas de 48 poços com 20000 células / poço, e mantêm-se em cultura durante 6-7 dias (meio DMEM contendo soro fetal bovino a 5%, soro de cavalo a 5%, 1% de aminoácidos não essenciais). No dia da experiência, lavam-se as células com tampão de Hank e depois incubam-se a 3 7°C durante 1 hora na presença de tampão de Hank adicionado com 0,1% de BSA e HEPES a 20 mM. Substitui-se então o tampão por tampão fresco, ainda na presença de 0,1% de BSA e de HEPES a 20 mM. Incubam-se então as células durante 3 horas a 37°C numa incubadora de CO2 com várias concentrações dos produtos em análise e com 3xlCT9 M de GHRH. Mede-se a GH libertada no meio usando o Kit de ensaio imunológico enzimático de 24 ΕΡ 2 225 271/ΡΤ biodetecção da hormona de crescimento de rato ELISA (Amersham RPN2561) ou o kit Mouse/Rat GH ELISA (DSL-10-72100) de acordo com as indicações do fornecedor. Os compostos do invento inibem a libertação da hormona de crescimento em concentrações na gama de IO-11 a 1CT6 Μ; o composto do exemplo 5 possui um valor de IC50 de 1,3 nM.

Ensaio para a inibição da libertação da hormona de crescimento em humanos, em células de adenoma hipofisária secretoras da hormona de crescimento

Os compostos do invento também apresentam uma actividade de inibição da libertação da GH em humanos, células de adenoma hipofisária secretoras de GH, tal como indicado a partir de ensaios in vitro em relatórios tumorais clínicos. Executa-se o teste através da utilização de biópsias de tumores humanos; mede-se a GH produzida a partir das células não estimuladas, na presença de quantidades variáveis do composto em estudo, através do uso do kit ELISA hGH - EASIA (origem biológica KAP1081) de acordo com as indicações do fornecedor. Nos tumores sensíveis à acção da somatostatina e seus análogos, os compostos do presente invento reduzem para metade a produção de GH em concentrações na gama de 1(T10 a IO-6 M; de preferência na concentração de 10 nM.

Ensaio para a inibição in vivo da produção de GH estimulada por barbitúricos

Os compostos do invento inibem, in vivo, a libertação de GH estimulada através da administração de Nembutal. Administram-se os compostos por via subcutânea, em doses diferentes, em ratos machos (CD, Harlan Italy). Recolhem-se as amostras de sangue em diferentes momentos, uma hora depois dos animais terem sido anestesiados através da administração intraperitoneal de Nembutal (60 mg/kg); medem-se os níveis de hormona por meio do teste ELISA. Nos animais tratados com os compostos do invento, em doses de 5 a 250 μg/kg, existe uma diminuição dos níveis de produção de GH. O composto do exemplo 1, na dose de 5 μρ/kg, reduz de 55% a libertação de GH medida seis horas após a administração; com a dose de 125 μρ/kg, a redução da GH é ainda mensurável 24 horas após a administração. 25 ΕΡ 2 225 271/ΡΤ

Ensaio para ο perfil farmacocinético

Os compostos do invento também mostram, em ratos, um perfil farmacocinético muito favorável. Mediu-se o perfil farmacocinético através da administração dos compostos a ratos machos, por via subcutânea, a uma dose de 1 mg/kg (CD, Sprague Dawley, 200-250 g) . Recolheram-se as amostras de sangue, a diferentes tempos, até 72 horas após a administração. Mediram-se as concentrações do composto em estudo nas amostras do plasma separado, por meio de um método de análise de LC-MS/MS e processaram-se os valores de acordo com um modelo não compartimentai usando o software "Kinetica". Na tabela seguinte, apresentam-se os principais parâmetros farmacocinéticos obtidos com o composto do exemplo 1, e comparam-se com aqueles obtidos com pasireotida, outro análogo estável de somatostatina, actualmente em fase de desenvolvimento clinico (preparou-se o pasireotida seguindo o processo descrito na Patente W02002010192).

Exemplo 5 Pasireotida Dose (mg/kg) 1 1 Cmax (ng/mL) 224,02 667,88 tmax (h) 4 2 tl/2 (h) 31,3 24, 4 AUCO-t (ng/mL*h) 2728,50 2781,40 AUCtot (ng/mL*h) 2883,06 2795,85 MRT (h) 18,96 4, 87 O composto do exemplo 5 é melhor do que o pasireotida tanto em termos de tempo de meia-vida como no tempo médio de residência (MRT) ; no caso da octreotida, o valor de tl/2 é cerca de 2 horas.

Os compostos do invento são, consequentemente, úteis para a prevenção ou o tratamento de desordens com uma origem que compreende ou está associada com um excesso de secreção de GH e/ou um excesso de IGF-1, tal como no tratamento da acromegalia, no tratamento dos diabetes mellitus do tipo I ou 26

ΕΡ 2 225 271/PT do tipo II, especialmente nas suas complicações, tais como por exemplo, angiopatia, retinopatia diabética proliferativa, edema macular diabético, nefropatia e o fenómeno hiperglicémico da vigilia ou de outras desordens metabólicas relacionadas com a libertação de insulina ou do glucagão, tais como por exemplo, a obesidade mórbida ou a obesidade hipotalâmica ou a obesidade hiperinsulenimica. Os compostos do invento são também úteis no tratamento de fistulas enterocutâneas e de fistulas cutâneas pancreáticas, do sindrome do intestino irritável, de doenças inflamatórias, tais como por exemplo, a doença de Grave, doença do intestino irritável, psoriase ou artrite reumatóide, doença poliquistica do rim, doença de esvaziamento gástrico rápido, sindrome de diarreia aquosa, diarreia relacionada com SIDA, diarreia induzida por quimioterapia, pancreatite aguda ou crónica, tumores secretores de hormonas gastrointestinais (por exemplo, tumores GEO, tais como vipomas, gluconomas, insulinomas, carcinóides), linfócitos malignos, tais como linfomas ou leucemias, carcinomas hepatocelulares como sangramento gastrointestinal, como sangramento de varizes esofágicas.

Os compostos do invento também são úteis no tratamento de tumores positivos para receptores de somatostatina, tais como por exemplo, os tumores que contenham os receptores SSTR1, SSTR2, SSTR3 e/ou SSTR5, como indicado nos testes de proliferação com várias linhas celulares de cancro que expressam os receptores para a somatostatina.

Para todas as indicações acima referidas, a dosagem necessária variará naturalmente em relação, por exemplo, ao paciente, ao modo de administração e à gravidade das condições as quais necessitam de tratamento. Geralmente, no entanto, obtêm-se resultados satisfatórios com as administrações de 1 μg até 0,7 mg/kg/dia dos compostos do invento. Uma dose diária recomendada para os doentes é da ordem de cerca de 2 μg até 50 mg, de preferência a partir de cerca de 0,01 até cerca de 40 mg, por exemplo desde cerca de 0,001 até cerca de 3 mg por via subcutânea do composto convenientemente administrada em doses divididas, até 3 vezes por dia, em formas de dosagem única contendo, por exemplo, desde cerca de 0,5 μg até cerca de 25 mg, por exemplo desde 27 ΕΡ 2 225 271/ΡΤ cerca de 2 μ-g até cerca de 20 mg, por exemplo desde cerca de 2 μρ até cerca de 1,5 mg dos compostos do invento. Os conjugados dos compostos do invento ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis são úteis tanto como agentes para o imagiologia de diagnóstico, por exemplo, para a visualização de tecidos e células positivas para os receptores de somatostatina, tais como os tumores e metástases positivas para os receptores de somatostatina, como para as desordens inflamatórias ou autoimunes, as quais mostram os receptores da somatostatina, tuberculose ou a rejeição de órgãos após transplante, quando complexados com um elemento detectável, tal como por exemplo os nuclideos γ ou emissores de positrões, um ião de metal fluorescente ou um ião paramagnético, tal como por exemplo 113Ιη, 161Tb, 177Lu, 68Ga, Eu3+, Gd3+, Fe3+, Mn2+ ou Cr2+, ou como fármacos radioactivos para o tratamento in vivo de tumores e metástases positivas para os receptores da somatostatina, para a artrite reumatóide, e condições de inflamação mais graves, quando complexados com um nuclídeo emitindo partículas α ou β com uma cascata de electrões Auger, por exemplo 90Y, 161Tb, 177Lu, 211At, 213Bi ou 201T1.

Podem-se administrar os conjugados dos compostos do invento na forma complexada para utilização em imagiologia de diagnóstico por via intravenosa, por exemplo na forma de uma solução ou suspensão injectável, de preferência sob a forma de injecção única. Podem-se fazer preferencialmente as detecções dos radioisótopos mesmo antes da administração ao paciente.

Em animais, uma gama de dosagem recomendada pode variar entre 0,01 e 1 μρ/kg de conjugado dos compostos do invento, complexado com 0,02-0,5 mCi de um radionuclídeo emitindo radiação γ. Em mamíferos maiores, tais como os humanos, uma gama de dosagem recomendada pode ser de 1 a 100 μρ/ιη2 de conjugado dos compostos do invento complexado com, por exemplo, 1-100 mCi/m2 do elemento detectável, tal como niIn, 86Y ou 177Lu.

As doses utilizadas na prática do uso radioterapêutico do presente invento irão depender, obviamente, das condições 28 ΕΡ 2 225 271/ΡΤ particulares que necessitam de ser tratadas, por exemplo, a conhecida radiotoxicidade para os órgãos saudáveis que expressam os receptores de somatostatina, o tamanho da massa tumoral e a terapia desejada. Em geral, calcula-se a dose com base nos dados farmacocinéticos e nos dados de distribuição da radioactividade obtidos a partir dos órgãos saudáveis e com base na absorção observada no alvo. Pode-se administrar repetidamente um complexo emissor de radiação β ou um conjugado dos compostos do invento, por exemplo, durante um período de 1-3 meses.

Em animais, uma gama de dosagem recomendada pode ser de 20 a 100 μρ/kg de conjugado dos compostos do invento complexado com 15-70 mCi de um nuclídeo emitindo radiação α ou β, ou um nuclídeo com a cascata de electrões Auger, tais como por exemplo 90Y, 177Lu ou 161Tb. Em mamíferos maiores, tais como os seres humanos, uma gama de dosagem recomendada pode ser de 1-100 μ/m2 de um composto conjugado complexado do invento, por exemplo, desde 1-100 mCi/m2 de um nuclídeo emitindo radiação α ou β ou de um nuclídeo com uma cascata de electrões Auger, por exemplo 90Y, 177Lu ou 161Tb.

Podem-se administrar os conjugados dos compostos do invento na forma complexada para o uso como agentes de radioterapia através de qualquer via convencional, por exemplo por via intravenosa, por exemplo na forma de solução injectável. Podem ser vantajosamente injectados por infusão, por exemplo, com uma infusão de 15-60 minutos. Dependendo do local do tumor, pode-se administrar tão próximo quanto possível do local do tumor, por exemplo através de um cateter. O presente invento também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um conjugado dos compostos do invento na forma de base livre ou como um sal farmaceuticamente aceitável ou como um complexo com um agente detectável ou radioterapêutico, em conjunto com um ou mais excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

Os compostos do invento ou os seus conjugados na forma complexada são úteis para o mapeamento ou o tratamento dos tumores que expressam ou acumulam os receptores, como os tumores hipofisários, tumores gastro-entero-pancreáticos, carcinóides, tumores do sistema nervoso central, tumores da 29 ΕΡ 2 225 271/ΡΤ mama, tumores da próstata (incluindo o cancro da próstata de hormona refractária avançado), tumores do ovário ou do cólon, tumor pulmonar de pequenas células, oclusão intestinal maligna, paragangliomas, cancro de rim, cancro de pele, neuroblastomas, feocromocitoma, carcinoma medular da tiróide, mielomas, linfomas, linfomas de Hodgkin e linfomas não-Hodgkin, tumores ósseos e suas metástases, juntamente com desordens autoimunes ou inflamatórias, por exemplo artrite reumatóide, doença de Grave ou outras doenças inflamatórias do olho.

Podem-se administrar os compostos do invento ou os seus conjugados complexados como um único ingrediente activo ou podem-se administrar em combinação, por exemplo, como adjuvantes, com outros ingredientes activos. Por exemplo, podem-se usar em combinação com um agente imunossupressor, por exemplo um inibidor da calcineurina, tal como a ciclosporina A ou FK506; com uma lactona macrociclica possuindo propriedades imunossupressoras, como a rapamicina; com um anticorpo monoclonal com propriedades imunossupressoras ou com um agente anti-inflamatório.

Podem também usar-se os compostos do invento ou os seus conjugados complexados em combinação com um agente antiproliferativo, por exemplo um ingrediente activo quimioterapêutico, tal como o paclitaxel, gemcitabina, cisplatina, doxorubicina, 5-fluorouracilo ou taxol, com um agente hormonal ou antagonista, por exemplo, um antiandrogénio ou mitoxantrona (especialmente no caso de cancro da próstata) ou com um antiestrogénio, como letrozole (especialmente nos casos de cancro da mama), com um antimetabolito, com um alcaloide de uma planta, com um modificador de resposta biológica, de preferência, um interferão ou uma linfoquina, com um inibidor de proteína tirosina cinase e/ou com as serina/treonina cinases, com um inibidor enzimático de desacetilase histónica, ou com um agente com outros mecanismos de acção ou com mecanismos de acção desconhecidos, como por exemplo derivados de anepotilona ou de epotilona, ou com uma lactona macrociclica, tal como por exemplo rapamicina, RAD ou CCI779. 30

ΕΡ 2 225 271/PT

Quando se administram os compostos do invento ou os seus conjugados na forma complexada em combinação com uma outra droga, as doses dos medicamentos co-administrados irão variar, naturalmente, em função das condições a tratar e assim por diante. Os termos "co-administração" ou "administração combinada" são aqui utilizados para significar uma administração dos agentes terapêuticos seleccionados para um paciente individual, e pretendem incluir regimes de tratamento nos quais não se administram os agentes necessariamente através da mesma via de administração ou ao mesmo tempo. A combinação particular do invento será seleccionada dependendo ou da doença ou da desordem que se deve prevenir ou tratar; por exemplo, uma combinação com um agente imunossupressor, por exemplo para a prevenção ou o tratamento da rejeição crónica de transplante, uma combinação com um secretagogo de insulina, com um promotor da secreção de insulina, com um sensibilizador de insulina ou com uma dose baixa de insulina no tratamento da diabetes e nas suas complicações, em combinação com um agente anti-inflamatório para a prevenção e o tratamento de doenças ou desordens inflamatórias, uma combinação com um agente com efeitos anti-angiogénicos para a prevenção ou o tratamento, por exemplo, de edema macular ou de degeneração ou de cancro, uma combinação com um agente quimioterapêutico para o uso em cancro.

Lisboa, 2013-09-20

Claims

ΕΡ 2 225 271/PT 1/6 REIVINDICAÇÕES 1. Compostos de fórmula (I):

Fórmula (I) em que m varia de 0 a 2; n varia de 1 a 3; Ri é um grupo aromático, excluindo indole, opcionalmente substituído em uma ou mais posições; R4 é um grupo aromático, opcionalmente substituído; R2 e R3 são, independentemente, H ou um grupo alquilo C1-C4, ou, em conjunto, são uma cadeia de alquileno C4-C5, ligado ao átomo de azoto a fim de formar uma estrutura cíclica; ou R3 é um catião ou um grupo quelante de metal; XI é um resíduo de aminoacilo de fórmula (a), (b) ou (c) (a) (b) -CO-CH-NH- I CH—CHg I 3 0“CH2Ph-CO-CH-NH- I CH, I 2o—CH2Ph (C) -CO-CH-NH- I

O-CHnPh ΕΡ 2 225 271/ΡΤ 2/6
2. Compostos de acordo com a reivindicação 1, em que o ião ou o grupo quelante de metal está directamente ligado ao grupo amino, ou é unido através de um espaçador, e em que o referido espaçador é de preferência um grupo de fórmula -Z-R5-C0-, em que R5 é um alquileno Ci_n, um alcenileno Ci_n ou -CH(R6)-, em que R6 é a cadeia lateral de um aminoácido alfa, e Z é um grupo funcional capaz de formar uma ligação éter, uma ligação éster ou uma ligação peptídica com um grupo funcional presente no grupo quelante, de preferência um átomo de oxigénio, um átomo de enxofre, um radical carbonilo ou um radical amino.
3. Compostos de acordo com a reivindicação 1, em que m é igual a 1 e n varia de 1 a 2, e de preferência n é igual a 1.
4. Compostos de acordo com a reivindicação 1, em que RI é fenilo, naftilo, benzidrilo, fluorenilo, estirenilo, antranilo ou bifenilo, opcionalmente substituído numa ou em mais posições por grupos doadores de electrões, de preferência, escolhidos de entre alquilos, alquiloxilos, hidroxilos, alquilaminas, acilaminas, sulfuretos ou alquilsulfuretos.
5. Compostos de acordo com a reivindicação 1, em que RI é um grupo naftaleno substituído com um ou mais grupos metiloxi, de preferência com dois grupos metiloxi, e, em maior preferência, RI é 3,8-dimetoxinaftaleno-2-ilo.
6. Compostos de acordo com a reivindicação 1, em que R4 é fenilo, opcionalmente substituído por hidroxilos, alcoxilos Ci-C4, alquilos C1-C4, halogéneos ou grupos nitro, e de preferência, R4 é 4-hidroxifenilo.
7. Compostos de acordo com a reivindicação 1, em que o grupo R3 é um agente quelante hidrofílico, de preferência derivado do ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-N,Ν',N'',N'''-tetra-acético (DOTA) ou do ácido dietilenotriaminopenta-acético (DTPA).
8. Compostos de acordo com a reivindicação 1, em que o grupo quelante R3 é um grupo quelante na forma livre, na forma de sal ou complexado com catiões ou elementos ΕΡ 2 225 271/ΡΤ 3/6 radioactivos (radionuclídeos) , de preferência complexado com um ião paramagnético, tal como Gd3+, Fe3+, ou um ião fluorescente, tal como Eu3+ ou um radionuclideo emissor de radiação α, β ou γ, tais como lxlIn, 99mTc, 169Yb, 177Lu, 90Y ou
9. Compostos de acordo com a reivindicação 1, em que XI é um residuo de aminoacilo de fórmula geral (c).
10. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que os resíduos de aminoacilo do ciclo-hexapéptido na fórmula (I), possuem a configuração L ou D; de preferência, os resíduos 1, 2 e 4-6 são L, e o resíduo 3é de preferência D.
11. Compostos de acordo com a reivindicação 1, em que um dos grupos amino pode estar opcionalmente na forma protegida, ou na sua forma de sal ou na forma complexada, de preferência na forma de mono-sal ou de di-sal, em maior preferência em que o sal é um sal de adição com ácidos orgânicos, ácidos poliméricos ou ácidos inorgânicos.
12. Compostos de acordo com a reivindicação 11, em que se escolhem os sais de entre acetatos, lactatos, benzoatos, aspartatos, pamoatos, polimetacrilatos, poliestirenossulfonatos, cloridratos, sulfatos ou nitratos.
13. Composto de acordo com a reivindicação 1, escolhido a partir do grupo constituído por - isómero B do ciclo[Tyr(Bn)-Phe-[4-(2- aminoetil)carbamoil]Pro-Phe-(D,L)[3-(3,8-dimetoxinaftaleno-2-il)]Ala-Lys], - isómero B do ciclo[Tyr(Bn)-Phe-[4-(2- aminoetil)carbamoil]Pro-Phe-(D,L)(2,5-dimetoxi)hPhe-Lys], - isómero B do ciclo[Tyr(Bn)-Phe-[4-(2- metilaminoetil)carbamoil]Pro-Phe-(D,L)[3-(3,8-dimetoxinaftaleno-2-il)]Ala-Lys], - isómero A do ciclo [Tyr(Bn)-Phe-[4-(2- aminoetil)carbamoil]Pro-Phe-(D,L)[3-(1,4-dimetoxinaftaleno-2-il)]Ala-Lys], - isómero B do ciclo[Tyr(Bn)-Phe-[4-(2-aminoetil)carbamoil]-Pro-Phe-(D,L)[3-(1,4-dimetoxinaftaleno-2-il)]Ala-Lys], ΕΡ 2 225 271/ΡΤ 4/6 - ciclo[Tyr(Βη)-Phe-[4-(2-aminoetil)carbamoil]Pro-Phe-(D)[3-(naftaleno-2-il)]Ala-Lys], - ciclo[Tyr(Bn)-Phe-[4-(2-aminoetil)carbamoil]Pro-Phe-(D)hPhe-Lys], - ciclo[Tyr(Bn)-Phe-[4-(2-metilaminoetil)carbamoil]Pro-Phg-(D)estiril-Ala-Lys], - ciclo[Tyr(Bn)-Phe-[4-(2-aminoetil)carbamoil]Pro-Phg-(D)hPhe-Lys], - isómero B do ciclo [Tyr(Bn)-Phe-[ 4-(2- aminoetil)carbamoil]Pro-Tyr-(D,L)[3-(3,8-dimetoxinaftaleno-2-il)]-Ala-Lys], e - isómero B do ciclo[Ser(Bn)-Phe-[4-(2- aminoetil)carbamoil]Pro-Phe-(D,L)[3-(3,8-dimetoxinaftaleno-2-il)]-Ala-Lys], e os seus sais e complexos farmaceuticamente aceitáveis
14. Processo para a preparação dos ciclo-hexapéptidos da reivindicação 1, que compreende os passos seguintes: a) Preparação de um hexapéptido linear, em que os grupos funcionais opcionais, presentes nas cadeias laterais dos aminoácidos, estão opcionalmente na forma protegida; b) ciclização dos referidos hexapéptidos por meio de um ou mais agentes de condensação; c) remoção opcional dos grupos protectores opcionais; d) purificação final do ciclopéptido assim obtido.
15. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que o aminoácido do C-terminal do péptido linear obtido na alínea a) é a lisina.
16. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que um dos resíduos de aminoácidos do péptido linear obtido na alínea a) é a 4-(2-aminoetilcarbamoil-oxi)-prolina, protegida no grupo amino da cadeia lateral, de preferência a 4-hidroxiprolina com o grupo 4-hidroxilo desprotegido, em maior preferência em que o grupo 2-aminoetilcarbamoil está ligado ao grupo hidroxilo da 4-hidroxiprolina, após o passo de ciclização b) , mas antes da possível remoção dos grupos de protecção opcionais do passo c). ΕΡ 2 225 271/ΡΤ 5/6 uma das complexo como um
17. Compostos de acordo com qualquer reivindicações 1-16, ou um seu sal ou farmaceuticamente aceitável para utilização medicamento.
18. Composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em associação com pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
19. Composição de acordo com a reivindicação 18, caracterizada por estar numa forma para libertação modificada ou libertação tópica.
20. Compostos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, para uso no tratamento da angiogénese, retinopatia proliferativa, edema macular, desordens relacionadas com doenças de neovascularização coroidal, doenças de enxerto vascular, estenoses de enxerto vascular, restenoses e oclusões vasculares após lesão vascular, fistulas enterocutâneas e fistulas cutâneas pancreáticas, sindrome do intestino irritável, doenças e desordens inflamatórias, doença poliquística do rim, síndroma de esvaziamento gástrico rápido, sindrome de diarreia aquosa, diarreia relacionada com SIDA, diarreia induzida por quimioterapia, pancreatite aguda ou crónica, hemorragia gastrointestinal, tumores e tumores malignos.
21. Compostos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, para uso no tratamento de acromegalia.
22. Compostos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, para uso no tratamento de tumores gastrointestinais secretores de hormona, de preferência de tumores carcinóides.
23. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, para utilização em combinação com um agente imunossupressor, com um agente anti-inflamatório, com um agente modulador do receptor secretagogo de GH, com um antagonista do receptor de GH, com um secretagogo da insulina, com um promotor da secreção de insulina, com um ΕΡ 2 225 271/PT 6/6 sensibilizador de insulina, com com um agente possuindo efeitos agente de quimioterapia. Lisboa, 2013-09-20 uma dose baixa de anti-angiogénicos insulina, ou com um