JP2003503008A - Ｒｎａ分子をターゲティングする方法 - Google Patents

Ｒｎａ分子をターゲティングする方法

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ビンセント ピー．ジュニア スタントン
ジェイムス ピー． バシリオン
リン シェン
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Abstract

(57)【要約】 異なる対立遺伝子型間の配列不一致に関連したRNA二次構造の違いに基づく、RNA分子における標的を同定する方法を記載する。また、タンパク質-小分子-RNA複合体の形成によって標的RNAを調節するために用いることができる小分子を同定または開発する方法と同様、そのような小分子を含む組成物ならびにそれらの小分子および組成物を用いる方法についても記載する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】関連出願 本出願は、図面を含めてその全文が参照として本明細書に組み入れられる、19
99年３月１日に提出された「RNA分子をターゲティングする方法（Methods for T
argeting RNA Molecules）」と題するシェン（Shen）らの米国特許仮出願番号第
60/122,199号の恩典を主張する。
【０００２】背景 本出願は、RNAに対して活性である化合物、およびRNA上の標的部位を同定する
分野に関する。
【０００３】 ヒトゲノムの研究から得られた多量の情報によって、その不適切な発現の結果
として疾患が起こる多くの遺伝子が同定された。この情報を利用するために、遺
伝子発現を特異的にターゲティングするいくつかの技術が開発されている。その
ような遺伝子の発現を調節することによって、疾患の調節が可能となる。特に、
RNAをターゲティングすることによって遺伝子発現を調節する方法から、合理的
に設計されたいくつかの新しいクラスの治療（例えば、リボザイム、DNAザイム
、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド）が生まれた。しかし、今日まで、こ
れらの技術の臨床での成功例は非常に限られていた。成功が限られた理由の一つ
は、これらの巨大分子が克服しなければならない難しい薬理学的障壁による。
【０００４】 疾患の薬理学的治療は、20世紀における医学のめざましい進歩の一つである。
現代の小分子開発方法はまた、獣医学のような同類の分野および農業におけるペ
スト撲滅において非常に有用であることが判明した。なおも増加し続ける疾患は
、適当な薬物治療によって改善することができるが、このことは疾患の病理生理
学に対する知識が増加したことと、臨床研究を実施する方法が改善されたことを
反映している。ヒト（およびその他の）ゲノムの配列が解読されて、疾患の分子
的理解が進むにつれて、治療的攻撃のための最適な標的を選択することがますま
す可能となるであろう。このように、現行の多くの薬物治療は、未知の機構によ
って作用するか、および/または症状の軽減を提供するに過ぎないが、今後、疾
患の病理生理学を逆転させ、より特異的および強力な治療軽減を提供することが
ますます可能となるはずである。しかし、この目標に達するためには、薬物開発
方法の改善が必要であろう。特に、選択された遺伝子または遺伝子産物を非常に
特異的にターゲティングすることができる薬物ターゲティング方法が開発されれ
ば、非常に有用となるであろう。
【０００５】 本明細書において提供された情報および引用された参考文献は、読者の理解を
助けるためのみに提供されるのであって、本発明の先行技術であることを認めた
わけではない。
【０００６】発明の概要 本発明は、生物学的に活性な分子を開発する特定の便利な方法を提供する。本
発明は、小分子が細胞タンパク質と細胞RNAの双方と接触する、小分子によってR
NAをターゲティングする新しい方法を含む。3つに分かれた複合体の作用は、小
分子とRNAのみで得られた場合より複合体の親和性を増加させることである。こ
れは、小分子によってRNAをターゲティングする現行の試みの主な制限であると
考えられている問題、すなわちタンパク質よりはるかに柔軟であるRNAと小分子
との特異的高親和性結合の欠如に取り組む。これは、本開示に記載されたように
、対立遺伝子型のあいだで二次構造が異なる場合にRNA二次構造の同定された領
域に対するターゲティングに基づく対立遺伝子特異的阻害または阻害を含むが、
これらに限定しない、任意の細胞RNAを阻害するための一般的な方法である。
【０００７】 本発明はまた、対立遺伝子特異的治療のためにRNA標的を同定する方法を提供
する。これらの方法は、少なくとも2つの主な領域において応用を有する：（1）
１つのmRNAの消失（しかし両方ではない）が治療効果を有する、常染色体優性疾
患、または過剰な遺伝子量の疾患；および（2）対立遺伝子特異的治療が正常組
織と比較して疾患組織に対して異なる作用を提供する、LOHを有する癌および他
の疾患。対立遺伝子特異的治療をそのように使用することは、図面を含めてその
全文が参照として本明細書に組み入れられる、1997年12月30日に公表されたハウ
スマン（Housman）の米国特許第5,702,890号および1998年3月19日に提出された
ハウスマン（Housman）らの米国特許出願番号第09/045,053号に記載されている
。異なる対立遺伝子のターゲティングは、例えば、下記のようなタンパク質小分
子複合体を用いることを含みうるが、そのような複合体に限定されない。例えば
、異なる対立遺伝子を、小分子またはオリゴヌクレオチド阻害剤によってターゲ
ティングすることができる。
【０００８】 本発明は、細胞RNAをターゲティングする独自の方法を提供する。この新しい
方法は、親和性および特異性に関して現在のアプローチの問題を克服している。
本発明は、標的RNA、小分子、および細胞タンパク質を含む三分子複合体の形成
を必要とする。RNA-小分子複合体に対して特異的細胞タンパク質を集合させれば
、タンパク質とRNAとの接触によって結合領域が実質的に増加し、そのため、静
電的水素結合および疎水性相互作用を一般的に含む協同的結合によって、小分子
とRNAのみの結合の場合に得られる親和性以上に、複合体の親和性が増加すると
いう長所を有する。これらの都合のよい結合相互作用によって、複合体の親和性
は、小分子とRNAの場合に得ることができる親和性以上に増加するであろう。
【０００９】 本発明はまた、小分子による阻害、例えば対立遺伝子特異的阻害の基礎となる
新しいクラスのRNA治療標的を提供し、そして候補RNAにおけるそのような標的を
同定する方法を提供する。本発明の基礎は、mRNAにおける単ヌクレオチド多型性
が、二次構造の変化に関連しているという新規知見である。これらの構造的な差
は、これまで通常の対立遺伝子変動に関連していることがわかっていなかったが
、RNAの対立遺伝子特異的小分子阻害の見通しを提供する。同様に、RNAの小分子
阻害剤を産生および同定する方法も記載する。
【００１０】 このように、第一の局面において、本発明は、阻害が細胞RNA、小分子阻害剤
、および細胞タンパク質の複合体形成を誘導することを含む、潜在的な小分子阻
害剤を同定する方法を提供する。潜在的な小分子阻害剤は、リンカーによって連
結された第一および第二の部分を含む。方法は、選択された細胞タンパク質の少
なくとも一部に結合する第一の部分を同定する段階、および細胞RNAの少なくと
も断片に結合する第二の部分を同定する段階を含む。そのような連結結合が存在
すれば、小分子が、潜在的な上記の小分子阻害剤であることが示される。小分子
の阻害能は、標準的な方法、例えば標的mRNAからのタンパク質合成レベルを試験
することによって調べることができる。明らかに、部分の同定はいずれの順で行
うこともできる。方法はまた、リンカーを選択すること、または、例えばこれま
でのスクリーニングに基づいて標準的なリンカーを供給することを含みうる。特
定の場合、リンカーは、第一または第二の部分から離れている必要はないが、一
つまたは双方の部分の一部であってもよい。
【００１１】 この意味において、「潜在的な小分子阻害剤」という用語は、選択されたタン
パク質と標的RNAの双方に結合するが、RNAの生物活性の阻害能（例えば、mRNAか
らのタンパク質翻訳の速度または量を減少させる）はまだ調べられていない小分
子を意味する。そのような阻害特徴を確認した後、小分子は「小分子阻害剤」、
または「阻害剤」と呼ぶことができる。
【００１２】 「小分子」という用語は、分子量が5000ダルトン（5kD）に等しい、またはそ
れ未満である、好ましくは３ kd未満、なおより好ましくは２ kd未満、および最
も好ましくは１ kd未満である化合物を意味する。場合によっては、小分子は、
分子量が700 Daに等しいまたはそれ未満であることが非常に好ましい。
【００１３】 「阻害剤」という用語は、基準化合物の少なくとも１つの活性を統計学的に有
意な程度に減少させる化合物を意味する。本発明の意味において、阻害剤は一般
的に、RNAの活性を減少させ、最も一般的にmRNAの翻訳の速度および/または程度
を減少もしくは消失させる、前mRNAが成熟RNAを生じるプロセシングを減少もし
くは消失させる；mRNAの核から細胞質への輸送を減少もしくは消失させるが、こ
れらに限定しない。好ましくは、活性の減少は、細胞特性の肉眼的観察、例えば
増殖速度、生存、形態に基づいて検出するために十分であり、好ましくは、標的
遺伝子の発現を減少させることが有用となる患者において、治療反応を生じるた
めに十分であってそのような性質を有する。
【００１４】 本発明の意味において、「複合体形成の誘導」という句は、多数の分子、特に
タンパク質-小分子-RNA複合体を含む構造を生じる小分子の特性を意味し、小分
子以外の成分は互いに会合せず、または小分子もしくは複合体の形成を誘導する
他の成分の非存在下では、如何なる認識可能な程度にも同じ物理的関係で互いに
関連しない。場合によっては、他の分子が複合体に存在してもよい。
【００１５】 本発明の意味において、「三分子複合体」という用語は、選択されたタンパク
質、小分子、および標的RNAを含む会合または複合体を意味する。その他の成分
、例えば、さらなるタンパク質またはポリペプチド、小イオン、または水も同様
に存在してもよい。しかし、好ましくは、選択されたタンパク質および標的RNA
が、複合体に存在する唯一の巨大分子である。好ましくは、安定に会合した複合
体は、特定のタイプの分子から本質的になる、またはそれらからなる。
【００１６】 好ましい態様において、第一の部分を同定することは、細胞タンパク質の既知
の小分子リガンドを同定することを含む。既知の小分子リガンド（タンパク質と
の結合を保持する類似体を含む）を利用することによって、結合部分を調べる必
要がなくなり、リガンドがリンカーと第二の部分とに結合している場合、選択さ
れたタンパク質に結合が起こっていることを確認するだけでよい。
【００１７】 好ましい態様において、本発明は、可変の第二の部分に結合した第一の部分と
リンカーとを含む、または本質的にそれらからなる化合物を含む小分子ライブラ
リを提供する段階、およびライブラリをスクリーニングして、第二の部分が標的
RNAに結合するように一つまたは複数の分子を同定する段階を含む。好ましくは
、第二の部分を同定する段階は、化合物が、上記の選択された細胞タンパク質に
結合する第一の部分、リンカー、および可変の第二の部分を有する小分子ライブ
ラリを提供する段階；ならびにライブラリの化合物をスクリーニングして、標的
RNAまたはその断片に結合する化合物を同定する段階を含む。断片は、そのよう
な分子と無傷のRNA、例えば局所二次構造との結合に利用される特徴を保持する
ために十分な配列を含む。
【００１８】 第一の部分および第二の部分をそれぞれ結合する選択されたタンパク質および
標的RNAに関連して、「断片」および「一部」という用語は、結合を選択するた
めに重要な分子の特性を保持している無傷のタンパク質またはRNAの配列の一部
を意味する。好ましくは断片または一部は、無傷の分子におけるような局所二次
構造を保持する。タンパク質に関して、一部は、好ましくは長さが少なくともア
ミノ酸10残基、より好ましくは少なくとも20残基、およびさらにより好ましくは
少なくともアミノ酸40残基である。RNA断片は好ましくは長さが少なくとも20ヌ
クレオチド、より好ましくは長さが少なくとも50ヌクレオチド、およびさらによ
り好ましくは長さが少なくとも100ヌクレオチドである。
【００１９】 複数の化合物もしくは分子、またはそのような化合物のライブラリにおける「
可変」部分またはリンカーという用語は、群における異なる分子が、明記された
ように異なる部分またはリンカーを有することを意味する。
【００２０】 逆に、複数の化合物（ライブラリ、例えば組合せライブラリを含む）における
部分またはリンカーに関連して「固定された」という用語は、複数の化合物が同
じ明記された部分またはリンカーを有することを意味する。
【００２１】 好ましい態様において、方法は、可変の第一の部分、リンカー、および固定さ
れた第二の部分を有する化合物の小分子ライブラリを提供することによって第一
の部分を同定する段階、ならびにライブラリの化合物をスクリーニングして、選
択された細胞タンパク質またはその一部に結合する化合物を同定する段階を含む
。
【００２２】 選択されたタンパク質に関して既知のリガンドを用いる場合、好ましくはタン
パク質およびそのリガンドは、一つまたは複数の細胞ATPaseを隔離することがで
きるアデノシン三リン酸類似体；フラビンアデニンジヌクレオチドまたはFAD類
似体；ニコチンアミドまたはニコチンアミド類似体；ジヒドロ葉酸レダクターゼ
、チミジレートシンターゼ、または共因子として葉酸を必要とする他の豊富なタ
ンパク質のような、タンパク質を隔離することができる葉酸塩または葉酸塩類似
体、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、およびFK506結合タンパク質（FKBP
）に結合するクーママイシンまたはその合成類似体から選択される。
【００２３】 好ましい態様において、第一もしくは第二の部分またはリンカーを同定するプ
ロセスは、少なくとも一つの同定段階を二回またはそれ以上繰り返すことを含む
。これは、小分子の特徴、例えば選択されたタンパク質もしくは標的RNAのいず
れかまたは双方に対する結合親和性を改善するために、または全体的な複合体の
安定性を改善するために実施することができる。
【００２４】 好ましい態様において、三分子複合体のタンパク質構成成分は、標的RNAが存
在する細胞区画（複数）に存在する細胞タンパク質である。
【００２５】 好ましくは、三分子複合体のタンパク質構成成分は、既知のRNA結合活性を有
するタンパク質である。そのような選択は、タンパク質がRNAと安定な相互作用
を可能にする特性を有し、所望の複合体の形成にその相互作用を利用できること
が既知であるために、有利となりうる。
【００２６】 好ましくは、三分子複合体のタンパク質構成成分は、RNase、例えば、RNaseH
1型、RNaseH 2型、およびRNaseLのクラスの一つからのRNase；またはRNAヘリカ
ーゼである。
【００２７】 好ましい態様において、三分子複合体はDNA結合タンパク質である。そのよう
な分子はまた、有利な核酸結合特性を有する。
【００２８】 好ましい態様において、三分子複合体のタンパク質構成成分は、小分子結合部
位の10オングストローム以内に二つまたはそれ以上の塩基残基を有し、それによ
って標的RNAとの都合のよい電荷相互作用を提供する。
【００２９】 示されたように、分子は、好ましくは分子量が4000ダルトンを超えない、より
好ましくは3000ダルトンを超えない、さらにより好ましくは2000ダルトンを超え
ない、およびさらにより好ましくは1000ダルトンを超えない、または700ダルト
ンでさえある小分子である。
【００３０】 好ましい態様において、標的細胞RNAは、前mRNAまたはmRNAである。「mRNA」
という用語は当業者によって理解されるその通常の意味で用いられる。「前mRNA
」という用語は、プロセシングを受けてmRNAとなるRNA転写物を意味する。一般
的に、前mRNAは、除去されて成熟mRNAを形成するさらなるRNA配列を含む。
【００３１】 好ましい態様において、標的細胞RNAは、その結果二次構造が変化して、二次
構造の変化が上記の小分子のRNA結合部分の標的となる、少なくとも１つの多型
性を有する。
【００３２】 RNAに関連して、「配列多型性」または「多型性」とは、特定の遺伝子の異な
る対立遺伝子型から転写されたRNAにおけるヌクレオチド配列の差である。最も
しばしば、多型性は単ヌクレオチド置換である。多型性は、単独で、または一つ
または複数の他の多型性と共に、RNA二次構造の変化、例えば様々なRNaseによる
消化の変化によって示される変化を引き起こしうる。
【００３３】 好ましくは、標的細胞RNAは、RNAの二次構造を変化させる、またはRNAの二次
構造を変化させる変異のもう一つの部位と同じ対立遺伝子上に存在する変異を有
するRNAである。
【００３４】 「対立遺伝子」という用語は、細胞または集団内の遺伝子の一つの特定の型、
遺伝子の配列内の少なくとも一つ、しばしば一つ以上の変異部位の配列における
同じ遺伝子の他の型とは異なる特定の型を意味する。異なる対立遺伝子のあいだ
で異なるこれらの変異部位での配列は、「不一致」、「多型性」、または「変異
」と呼ばれる。「もう一つの対立遺伝子」、「もう一つの型」、または「対立遺
伝子型」という用語は、遺伝子配列内の少なくとも一つ、およびしばしば一つ以
上の変異部位で明確な不一致を有することによって他の対立遺伝子と区別するこ
とができる対立遺伝子を意味する。
【００３５】 好ましい態様において、方法は、異なる複数のリンカーと、上記のように同定
された第一の部分、または上記のように同定された第二の部分、またはその双方
を含む複数の小分子を提供する段階、および複数の小分子をスクリーニングして
、有利な結合または薬理学的特徴を有する、潜在的な小分子阻害剤を同定する段
階をさらに含む。リンカーを変化させるさらなる段階によって、タンパク質とRN
Aのより有用な提示または会合を可能にするリンカーを選択することができる。
【００３６】 好ましい態様において、第二の部分の同定は、固定された第一の部分と可変の
第二の部分に結合したリンカーとを含む化合物を含む小分子ライブラリを提供す
る段階；およびライブラリをスクリーニングして、第二の部分が標的RNAに結合
する一つまたは複数の分子を同定する段階を含む。好ましくは、第一の部分の同
定は、可変の第一の部分、リンカー、および上記のように同定された固定された
第二の部分を含む化合物の小分子ライブラリを提供する段階；およびライブラリ
の化合物をスクリーニングして、選択された細胞タンパク質またはその一部に結
合する化合物を同定する段階を含む。
【００３７】 第二の局面において、本発明は、関心対象の集団におけるRNA標的において少
なくとも一つの配列不一致を同定すること、同定された如何なる配列変異のRNA
二次構造も変異対立遺伝子のあいだで異なるか否かを決定することによって、対
立遺伝子特異的治療的小分子、例えば阻害剤のRNA標的を同定する方法を提供す
る。RNA二次構造の違いは、配列不一致が対立遺伝子特異的治療的小分子の潜在
的な標的であることを示している。
【００３８】 「対立遺伝子特異的阻害剤」または「不一致特異的阻害剤」とは、少なくとも
１つの他の代わりの対立遺伝子より大きい程度に遺伝子のもう一つの対立遺伝子
の活性を阻害する薬剤または阻害剤である。活性の差は、阻害の定量的程度を得
るために必要な薬剤の用量またはレベルによって一般的に決定される。一般的に
用いられる活性手段は、IC50、または標的遺伝子の測定された活性の50％減少を
得るために必要な薬剤濃度である。
【００３９】 好ましくは、対立遺伝子特異的阻害剤は、非標的対立遺伝子型に対する場合よ
り標的対立遺伝子型に対して少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、
さらにより好ましくは少なくとも10倍、およびさらにより好ましくは少なくとも
50倍、および最も好ましくは少なくとも100倍の活性を有するであろう。これは
また、阻害剤に対する異なる対立遺伝子型の感受性として表記することができる
。このように、例えば、標的対立遺伝子型は最も好ましくは、非標的対立遺伝子
型と比較して、阻害剤に対する感受性が少なくとも100倍であると言うのと同じ
意味である。阻害剤の活性は、インビトロまたはインビボのいずれで測定するこ
ともでき、インビボ系を再構成するアッセイ系または完全な生態系の選択した要
素を組み入れる系において測定することができる。少なくとも一つの非標的対立
遺伝子型を含む細胞よりむしろ標的対立遺伝子型のみを含む細胞の阻害に用いる
ために、活性の差は、好ましくは標的対立遺伝子型のみを有する細胞の増殖速度
または生存速度を、少なくとも１つの非標的対立遺伝子型を有する細胞の増殖速
度または生存速度のわずか半分に減少させれば十分である。より好ましくは、分
画は１/５または１/10に過ぎず、さらにより好ましくは１/20、１/50、1/100に
過ぎない、またはさらにそれ以下である。
【００４０】 この意味において、「集団」という用語は、他の群と区別することができる個
体群（一般的にヒトの群）を意味する。区別の根拠は例えば、地理、家族の関係
、人種的背景、年齢、性別、およびこれらの要因の組合せを含みうる。このよう
に、「関心対象の集団」という用語は、標的の同定、治療物質または複合体形成
物質、またはそのような物質を用いるもしくは作製する方法、または本発明の他
の局面、例えば患者が属する群、に関連する個体群を意味し、ほとんどの場合、
集団は好ましくは少なくとも１万人、10万人、100万人、1000万人、またはそれ
以上で、より大きい数がより好ましい個体群である。特殊な状況において、疾患
は、特定の地理的地域または特定の家族的、人種、または文化的群に高頻度で発
生し、関連する集団はより小さい群であると有用に見なされる可能性がある。
【００４１】 好ましくは、標的とされる配列不一致は、関心対象の集団において0.1：0.9〜
0.5：0.5の範囲の対立遺伝子頻度で起こる。
【００４２】 「対立遺伝子頻度」という用語は、集団における全ての対立遺伝子と比較した
特定の対立遺伝子の分画（または発生頻度）を意味する。ヘテロ接合者の頻度と
対立遺伝子頻度は関連しており、特定の対立遺伝子に関しては、ハーディ・ワイ
ンベルグの平衡計算によって記述することができると当技術分野において認識さ
れている。同様に、集団において高頻度で発生する配列不一致は一般的に、これ
らの遺伝子を有する個体の健康にとって有害ではなく、一般的に疾患遺伝子また
は疾患に関連した変異ではないとも認識されている。
【００４３】 好ましい態様において、RNA二次構造の決定は、一つもしくはそれ以上の構造
特異的酵素、例えばヌクレアーゼ、好ましくはT1、T2、S1、U2、CL3、V1、A、Ph
yM、N.c.ヌクレアーゼ、またはRNaseから選択されるヌクレアーゼを用いて、ま
たはジメチル硫酸、ジエチルピロカーボネート、CMCT、ケトキサール、亜硫酸水
素塩、エチルニトロソ尿素、MPE-Fe(II)、およびFe(II)-EDTAからなる群より選
択される化学物質による化学的プロービングによって行われる。
【００４４】 対立遺伝子特異的ターゲティングは、標的RNAが、量を減少させれば、疾患状
態を少なくとも改善する対立遺伝子である場合には、都合よく適用することがで
きる。例えば、改善は、症状の軽減、疾患の一つもしくはそれ以上の有害な作用
の現象もしくは消失、または疾患の治癒にさえなりうる。
【００４５】 同様に、標的RNAは、ハンチントン病、または表１に示すその他の疾患のよう
な常染色体優性疾患に関連する対立遺伝子となりうる。
【００４６】 標的RNAはまた、増殖性疾患、例えば癌におけるヘテロ接合性の喪失を受ける
本質的な遺伝子の対立遺伝子となりうる。例えば、本明細書の方法によって同定
された標的は、上記のハウスマン（Housman）に記載される治療アプローチにお
いて都合よく利用されうる。
【００４７】 「増殖性疾患」という用語は、異常な増殖を示し、その結果その増殖が正常組
織の増殖を超えて、それらと協調できない組織の異常な塊に至る体細胞の異常な
増殖を特徴とする様々な癌および疾患を意味する。細胞の異常な塊は、「腫瘍」
と呼ばれ、この場合、腫瘍という用語には、局所細胞塊と分散した細胞の双方を
含みうる。「癌」という用語は新生物増殖を意味し、「悪性物」または「悪性腫
瘍」という用語と同義である。癌の治療および抗癌剤の特定は、本発明の局面の
特定の好ましい態様の懸念である。その他の異常な増殖疾患には、平滑筋腫、子
宮内膜症、良性前立腺過形成、アテローム斑、および肺、乳房、子宮頚部、また
はその他の組織の上皮形成異常を含むが、これらに限定しない「非悪性腫瘍」お
よび「形成異常」病態が含まれる。癌および他の癌以外の増殖性疾患の治療に用
いられる薬剤は、一般的に細胞の増殖を阻害することをねらいとし、一般的に抗
増殖剤と呼ばれる。
【００４８】 好ましい態様において、対立遺伝子特異的小分子は、小分子阻害剤が、選択さ
れた細胞タンパク質および標的細胞RNAに結合して複合体を形成しうる、選択さ
れた細胞タンパク質またはその一部に結合する第一の部分；標的細胞RNAまたは
その断片に結合する第二の部分、および第一の部分と第二の部分に結合するリン
カーを含む小分子阻害剤である。分子は、上記の第一の局面において同定された
分子および対応する薬学的組成物と複合体形成分子に関してさらに記述すること
ができる。
【００４９】 第三の局面において、本発明は、変異対立遺伝子のあいだで異なる二次構造を
有する関心対象の集団におけるRNA標的において少なくとも１つの配列不一致を
同定する段階、複数の小分子との結合、またはそれらによる阻害に関して、上記
の一つまたは複数の不一致の２つのRNA構造をスクリーニングする段階、および
上記のRNAの一つに選択的に結合する、または阻害する化合物を同定する段階を
含み、結合または阻害を認めれば、化合物が対立遺伝子特異的RNA結合小分子で
あることが示される、標的RNAに対して対立遺伝子特異的なRNA結合小分子を同定
する方法を提供する。好ましくは、複数の小分子は、小分子組合せライブラリの
要素である。
【００５０】 好ましくは、方法は、標的RNAを産生する細胞を対立遺伝子特異的RNA結合小分
子と接触させる段階、および小分子が細胞活性の変化を生じるか否かを決定する
段階によって、対立遺伝子特異的RNA結合小分子が細胞活性を提供するか否かを
決定することを含む。このように、方法は、細胞作用を同定する細胞アッセイ法
を利用する。好ましくは、細胞作用または活性は、標的RNAまたは翻訳産物の発
現の減少である。
【００５１】 先行局面と同様に、標的RNAは好ましくは前mRNAまたはmRNAである。
【００５２】 好ましい態様において、複数の小分子は、同じもしくは異なっていてもよい第
一の部分、複数の小分子のあいだで異なる第二の部分、および第一の部分と第二
の部分とを連結するリンカーをそれぞれが含む、潜在的な複数の小分子阻害剤で
ある。第一の部分は、選択された細胞タンパク質またはその一部に結合するよう
に選択される；および第二の部分は、標的細胞RNAまたはその断片に結合して、
それによって３分子複合体を形成するように選択される。
【００５３】 さらに好ましい態様は、上記の第一の局面に関して記述した通りである。
【００５４】 第四の局面において、本発明は、阻害剤が、選択された細胞タンパク質または
その一部に結合する第一の部分；標的細胞RNAまたはその断片に結合する第二の
部分、および上記の部分と第二の部分とを結合させるリンカーを含む、小分子阻
害剤を含む薬学的組成物であって、小分子阻害剤が、選択された細胞タンパク質
および標的細胞RNAに結合して複合体を形成することができる薬学的組成物を提
供する。組成物はまた、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む
。一般的に、阻害剤は合成分子であろう。
【００５５】 本発明の阻害剤または結合成分の意味において、「合成」という用語は、化合
物が、ヒトの介入によって全体または一部が調製され、天然に存在する生物によ
って天然に生成された化合物ではないことを示す。合成分子の一部またはそのほ
とんどでさえ、生物によって産生することが可能であり、合成方法によって改変
することができる。または、分子のほとんどまたは全てを合成方法によって調製
することが可能であり、得られた分子を「完全に合成物」であると呼ぶ。
【００５６】 特定の場合において、記述の複合体形成特性を有する天然に存在する分子が発
見される可能性がある。そのような分子は、RNAを阻害もしくは結合する化合物
を用いることに関して本明細書に記載した方法において用いることができる、ま
たはその結合および/または活性特徴を変化させるように改変することができる
。
【００５７】 好ましくは、選択されたタンパク質はヒトタンパク質である；好ましくは標的
RNAはヒトRNAである。
【００５８】 好ましくは小分子阻害剤は、上記の標的RNAの発現を阻害する。
【００５９】 好ましい態様において、小分子阻害剤は、二次構造が異なるRNAの変異型に対
して異なる活性を有し、二次構造の違いは、少なくとも１つの配列不一致に関連
している。好ましくは標的細胞RNAは、その結果二次構造の変化が起こる多型性
を有し、そして変化した二次構造は上記の小分子のRNA結合部分の標的である。
【００６０】 同様に、好ましい態様において、阻害剤は、上記の第一の局面において同定さ
れた化合物であり、および/または標的は第二の局面において同定されたとおり
である。
【００６１】 第五の局面において、本発明は、mRNAの発現を阻害する方法を提供する。方法
は、mRNAを通常発現する細胞を小分子阻害剤に接触させることを含む。阻害剤は
、選択された細胞タンパク質またはその一部に結合する第一の部分、標的細胞mR
NAに結合する第二の部分、および第一の部分と第二の部分を連結するリンカーを
有する。小分子阻害剤は、選択された細胞タンパク質および標的細胞mRNAに結合
して複合体を形成することができる。
【００６２】 好ましい態様において、分子および/または標的は上記の局面の態様に関して
記述した通りである。
【００６３】 第六の局面において、本発明は、そのような疾患を有する患者に、その中で少
なくとも一つの配列不一致が二次構造の違いを提供し、対立遺伝子特異性が二次
構造の違いを含む、標的RNAの対立遺伝子型に対して選択的に活性な対立遺伝子
特異的RNA阻害剤の治療的有効量を投与することによって、常染色体優性または
遺伝子量疾患を治療する方法を提供する。
【００６４】 好ましい態様において、疾患は常染色体優性疾患であり、患者は標的RNAに対
応する遺伝子に関してヘテロ接合である。
【００６５】 同様に、好ましい態様において、疾患は遺伝子量疾患であり、上記の投与は、
遺伝子の発現を減少させるが、消失させないように調節される。好ましくは、患
者は遺伝子に関してヘテロ接合であり、阻害剤は１つのみの対立遺伝子の発現を
選択的に減少または消失させる。
【００６６】 「遺伝子量疾患」という用語は、遺伝子の産物の過剰反応性、例えば遺伝子の
過剰発現に基づく原因を少なくとも部分的に有する疾患を意味する。
【００６７】 「治療効果」は、その結果、治療した疾患または病態における測定可能な反応
がある程度起こる。このように、治療効果は例えば、腫瘍のような病変の増殖速
度もしくはサイズの治癒もしくは減少、または対照と比較して治療した患者の生
存期間の増加、有害な症状の緩和、または他の潜在的な作用の中でも、疾患の進
行を遅らせることを含みうる。
【００６８】 「治療量」という用語は、疾患または病態を有する患者、例えば哺乳類、例え
ばヒトに適切に投与した場合、治療効果を生じる量を意味する。
【００６９】 好ましい態様において、分子および/または標的は、上記の局面および態様に
関して記述されたとおりである。
【００７０】 第七の局面において、本発明は、対立遺伝子特異性が少なくとも一つの配列不
一致に関連した二次構造における差を含む、標的RNAの対立遺伝子特異的阻害剤
を患者に投与することによって、疾患または病態を有する患者を治療する方法を
提供する。
【００７１】 好ましい態様において、方法は、患者において少なくとも一つの配列不一致の
有無を決定する段階を含む。
【００７２】 好ましい態様において、阻害剤および/または標的は上記の局面または態様に
関して記述した通りである。
【００７３】 第八の局面において、本発明は、細胞RNAの小分子阻害剤を同定することによ
って、薬剤を生成する方法を提供する。阻害剤は、細胞タンパク質との複合体形
成を誘導し、阻害剤は第一の部分、第二の部分、および第一の部分と第二の部分
とを連結するリンカーを含む。方法は、選択された細胞タンパク質またはその一
部に結合する第一の部分を同定する段階、標的細胞RNAまたはその断片に結合す
る第二の部分を同定する段階、および患者に投与した場合に治療反応を提供する
ために十分量で小分子阻害剤を合成する段階を含む。同定は、都合のよい複合体
形成を可能にするリンカーを選択する段階も含みうる。
【００７４】 好ましい態様において、阻害剤は、少なくとも一つの配列不一致がRNA二次構
造における差を提供するmRNAの対立遺伝子型に対して選択的に活性である。
【００７５】 さらに好ましい態様は、第一および/または第二の局面において明記した態様
を含む。
【００７６】 RNAを阻害する方法および/または患者を治療する方法において、化合物は、様
々な方法で用いてもよく、例えば、化合物は単独で、または薬学的組成物の一部
として用いてもよい。
【００７７】 第九の局面において、本発明は、選択された細胞タンパク質またはその一部に
結合する第一の部分；標的細胞RNAまたはその断片に結合する第二の部分、およ
び上記の第一の部分と上記の第二の部分とを連結するリンカーを含む複合体形成
分子を提供する。小分子阻害剤は、選択された細胞タンパク質および標的細胞RN
Aに結合して複合体を形成しうる。
【００７８】 好ましい態様において、分子は、翻訳条件において標的mRNAの発現を阻害する
であろう。
【００７９】 「翻訳条件」とは、翻訳の阻害剤の非存在下で、特定の選択されたmRNAから翻
訳が起こる条件を意味する。このように、そのような条件は、インビトロ翻訳系
がインビボ条件と共に存在する場合を含みうる。
【００８０】 好ましい態様において、選択した細胞タンパク質はRNA結合タンパク質または
その誘導体である。
【００８１】 さらに好ましい態様は、本明細書に記載の薬学的組成物における阻害剤に関し
て記載した通りであり、および/または本明細書においてそれ以外で記載されて
いるように、成分、特性、標的または結合対を有する。
【００８２】 「含む」という用語は、「含む」という用語の後に続く如何なるものも含むが
これらに限定しないことを意味する。このように、「含む」という用語の使用は
、記載の要素が必要または必須であるが、その他の要素は選択的であるか、また
は存在してもしなくてもよいことを意味する。「からなる」という用語は、「か
らなる」の句の後に続く如何なるものも含むがこれらに限定しないことを意味す
る。このように、「からなる」という句は、記載の要素が必要または必須であっ
て、それ以外の要素が存在しなくてもよいことを意味する。「本質的にからなる
」という句は、その句の後に記載された如何なる要素も含み、記載の要素に関す
る開示において明記した活性または作用を妨害しない、または貢献するその他の
要素に限定されることを意味する。このように、「本質的にからなる」という句
は、記載の要素が必要または必須であるが、他の要素は、記載の要素の活性また
は作用に影響を及ぼすか否かによらず、選択的であって存在してもしなくてもよ
いことを意味する。
【００８３】 その他の特徴、長所、および態様は、好ましい態様に関する以下の詳細な説明
および請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００８４】好ましい態様の詳細な説明 治療化合物の開発が行われており、当分の間、成功率がごく控えめな、高価で
時間を浪費する方法であり続けると考えられる。現行の薬物のかなりの大多数、
並びに開発中の薬物の大多数は、タンパク質標的のための小分子である。小分子
は、治療化合物の他のクラスと比較して多くの魅力的な治療的特性を持ち、高い
有効性、経口使用可能なこと、ほとんどの細胞区画への有効な接近方法、経済的
な製造と製剤費用および安定性を含む。しかしながら、小分子薬物の開発のいく
つかの限界は以下のようである：(1)いくつかの病気においては、最も望まれる
治療目的が特定のタンパク質を全部除去することであるということにも関わらず
、現在の技術がタンパク質標的に最も適合している；(2)タンパク質標的は、多
くの場合優れた小分子結合部位が特徴となる疎水性ポケットを欠失しているため
に、小分子調節に影響を受けにくいものもある；(3)標的を除いた細胞の高分子
との小分子化合物の交差反応が意図されたものでないものに至り、多くの場合臨
床的に許容されない効果をもたらす可能性がある。
【００８５】 特定のRNAの阻害剤の開発のための方法は、上記の小分子治療の限界の問題を
扱う際に非常に有用であると考えられる。この事実に注目しないわけにはいかず
、RNAを標的とする治療化合物を開発するための多様な試みがある。多くの試み
は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、リボザイム、DNAザイム
および同様の核酸が元となる化合物のような非小分子化合物に焦点を合わせてい
る。これらの重合体化合物は、小分子の都合よい薬学的特性の多くを持たない。
哺乳類のmRNAとの小分子の相互作用についての予備的な報告がいくつかあるが、
これらの相互作用は、マイクロモルからミリモルまでの親和性によって特徴づけ
られ、一般化されているようには見えない。
【００８６】 病気の進行について分子遺伝学的に説明する場合、治療化合物から望まれる特
異性レベルは、同様に増加している。現在の方法は、おおくの疾病を治療するた
めに必要とされる特異的な遺伝子または対立遺伝子の阻害レベルについては提供
されていない。識別問題の限界は、1ヌクレオチドまたは1アミノ酸と同じぐらい
わずかなヌクレオチドまたはアミノ酸によって異なっている可能性があるRNAま
たはタンパク質の対立遺伝的形態を区別することが必要である。例えば、1つのm
RNAの除去（しかし両方ではない）が治療的に効果がある、常染色体優性の疾病
または過剰な遺伝子量が原因の疾病を考慮する場合には、対立遺伝子の違いを区
別することができる意義は、明らかである。
【００８７】 対立遺伝子の違いの識別が非常に有用である疾病の1つのよい例がハンチント
ン舞踏病で、ハンチントンの対立遺伝子の1コピー（拡張した3重の繰返しを持つ
）が存在することで神経病的機能不全、神経病的変性に関連する機能獲得の表現
型を与える。ヒトと動物の多様なデータは、異常なタンパク質の除去が疾病を除
去すると考えられるという見解を支持する。しかしながら、一旦タンパク質が合
成されると、小分子はその迅速な破壊を効率よく誘導できるということは明らか
ではない。従って、より実際的な方法は、異常対立遺伝子をコードするRNAの除
去であり、それによって異常タンパク質の合成を妨げることである。そのような
合成の防止は、例えば、RNAの迅速な破壊を促進することによって、未熟mRNAの
成熟mRNAへのプロセシングを妨げることによって、核から細胞質へのmRNAの輸送
を妨げることによって、またはmRNAを翻訳し、タンパク質の形成することを妨げ
ることによって、RNAレベルで有利に行われる。
【００８８】 更なる例示的な常染色体優性の疾病の多くを以下の表に示す。情報は、例えば
表の下に示された電子的アドレスなど、他の供給源から入手することも可能であ
る。
【００８９】
【表１】 常染色体優性疾患の表 1http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Omin/
【００９０】 対立遺伝子阻害が治療的利益を提供すると考えられる第二の一組の疾病は、LO
Hに関する癌と他の疾病を含む。これらの疾病において、正常な体の組織と疾病
組織間の遺伝的な相違があり、その相違の活用が正常組織と比較して疾病組織へ
特異的な有害な影響を提供すると考えられる。本発明によって提供される阻害分
子を、そのような領域において、並びにRNA阻害剤が有益であると考えられる、
特に対立遺伝子特異的な阻害剤が有利である他の適用において用いられることも
できる。
【００９１】 上記の説明によって、多くの場合、小分子はポリヌクレオチド療法よりすぐれ
た薬理学的特性を持つので、小分子を用いた特定RNA配列および構造を標的とす
る方法を見い出す方法にかなりの関心がある。限られた数例において、天然の抗
生物質、例えば、アミノグリコシド抗生物質は、リボヌクレオタンパク質複合体
のRNA構成成分を結合することによって作用することが見出されている（Fourmy
ら （1996）Scienece 274：1367-1371）。そのような分子は、遺伝子発現の特異
的な抑制よりむしろ全体的な抑制の原因となるので、それらの使用は抗細菌治療
および抗菌治療に対してほとんど排他的に制限される。より力強く幅広いRNAタ
ーゲティングの適用は、特定のmRNAまたは未熟なmRNAに特異的に結合し、それら
の作用を、例えば翻訳またはスプライシングを阻害もしくは活性化することによ
って調節する小分子の発見を必要とすると考えられる。タンパク質はmRNAからの
最も強く結合するリガンド以外のすべてを置き換え、かつ平衡解離定数（Kd）が
100 nM以下で任意の小分子がmRNAと結合することが周知である場合にはほとんど
を置き換えないと考えられているので、これは特に挑戦的なものである（Chow
＆ Bogdan(1997）Chem. Rev. 97:1489-1513）。それにもかかわらず、マイクロ
モルのRNA結合剤でさえも細胞中のmRNAの発現を特異的に阻害することができる
ことを証明するための例が少なくとも1つある（Meiら（1998）Biochemisry 34:1
4204-14212）。さらに、ミリモル濃度の色素を遺伝子工学的に作成されたmRNAを
含む哺乳類細胞に添加することによって、遺伝子工学で作成されたHoechst社 色
素結合アプタマーを含むmRNAの発現が抑制されることが見出された（Werstuck
＆ Green（1998）Science 282:296-298）。これらの例にも関わらず、過去10年
以上製薬産業の中ではすべて行われていた高処理量スクリーニングの試みにおい
て、合法的な手がかりを発見するための多くの失敗から判断すると、RNAは小分
子を用いて標的にするためのとりわけ難しい種であることが広く認識されている
。小分子に関するRNAを標的とする際の難しさが、高次構造化されたRNAにはほと
んど疎水性ポケットが見出されないという事実から生じている可能性がかなり高
い。タンパク質において、そのようなポケットは、ほとんど例外なく小分子のた
めの結合部位である。
【００９２】 高分子に結合する小分子の最新の理解は、大部分が小分子-タンパク質相互作
用の研究によるものである。そのような相互作用の特徴は以下を含む：(1)かな
りの結合エネルギーは疎水性接触による水の排除に関連し、典型的には小分子の
リガンドが収まるタンパク質表面（疎水性結合ポケット）の陥入を含む；(2)結
合は、多くの場合（適合を導入された）ポケットを構成するアミノ酸の配向にお
けるあるの変化を必要とする；(3)電荷の相互作用は、一般的に高い親和性のタ
ンパク質-小分子相互作用の1要素ではない。
【００９３】 RNAは小分子を結合するためのタンパク質を引きつけさせるタンパク質の多く
の特性を共有しているので、小分子-タンパク質の相互作用のこれらの特性は、R
NAが小分子によってもなお目標を定められることができるということを示す。第
一に、RNAは、かなり多くの場合小分子を結合するタンパク質に類似した形にな
る。第二に、RNAの表面には糖および塩基がある傾向があり、それによって小分
子とのこれらの基の相互作用を促す。そのような相互作用は、水素結合、ファン
デルワールス相互作用、および静電気相互作用、並びに特定の配向における疎水
性相互作用を含むことができる。第三に、タンパク質のようにRNA構造は可塑性
であり、それらをリガンドの形に形成すること（適合を誘導された）を可能にす
る。第四に、RNAの配列の複雑さ、特により高次のRNA構造の複雑さは、高い特異
性で標的を定めることができる特定のRNAにおける特有の3次元構造を形成する。
【００９４】 RNAについてのこれらの魅力的な特性にも関わらず、RNAの小分子の阻害剤の開
発は、原核生物のリボソームRNAに結合し、かつタンパク質の翻訳を阻害するい
くつかの天然生成物（アミノグリコシド抗生物質）の同定以外は進展していない
。この理由には以下が含まれる。RNAの疎水性表面は、疎水性部分に反発する極
性の基（塩基の端、糖の2'-OH基）および電荷を持つ基（リン酸部分）がかなり
集中しているところの真ん中に存在する。このようにRNAを結合するほとんどの
小分子は、疎水性表面に加えて電荷を持つ官能基を有することは驚くべきことで
はない。これらは、例えばアミノグリコシド抗生物質の特徴である。そのような
分子における電荷は、細胞膜貫通を妨ぎ、かつ一般的にはそのような分子の乏し
い薬理学的特性を与える（例えば、乏しい腸管吸収、担体として作用する血清タ
ンパク質への乏しい結合）。
【００９５】 本発明の重要な局面は、RNA、タンパク質および小分子間の3分子複合体の形成
が小分子-RNA相互作用の制限についての問題をいくらか処理することができるこ
とである。特に、タンパク質とRNA間の良好な静電気的接触は電荷を放散するこ
とができ、それによって小分子のRNA結合部分とその標的RNA間の疎水的相互作用
のための改良された局所的な周囲の環境をつくることができる。小分子の2つの
部分の相互作用を介したRNAとタンパク質を連結する、(1)RNAとタンパク質間；
および(2)本発明の小分子間の結合相互作用に対する協同的な特性もまた存在す
る。
【００９６】 本発明の1つの局面であるタンパク質とRNA間の良好な静電気的相互作用は、標
的RNAおよび標的タンパク質の特有の化学的特徴に依存すると考えられる。その
ような相互作用は、当業者によって理解されている。しかしながら、ほとんどの
タンパク質は極性であり電荷を有する多数の残基をその表面にもち、かつ比例し
てより少ない疎水基をもつということを留意するのは価値がある。さらに、多く
のタンパク質は、それらのリガンドの結合部位の付近の塩基性残基の部分（3次
元空間における）を有する。そのようなタンパク質は、本発明の小分子のための
好ましいタンパク質のパートナーの1群を構成すると考えられる。
【００９７】 このように、本明細書に示される説明は、特徴となる小分子とRNA間の弱い相
互作用を打ち負かすための1つの方法を提供し、特異的に標的とされるRNAに結合
し、このRNAの生物学的性質を改変するための小分子についての作用機構を提供
する。上記にように、一般的な局面において、本発明は、RNA標的、細胞性タン
パク質、およびRNAとタンパク質を密接させるこれら両方ともに同時に相互作用
する小分子を含む。本発明の重要な局面は、タンパク質とRNAはまた、密接する
が、小分子を介して共に伴う場合にのみ相互作用もする。すなわち、RNAとタン
パク質は小分子非存在下で測定できるほどには相互作用しない。小分子によって
誘発され、結果的に生じた3分子複合体(タンパク質-小分子-RNA)は、続いて起こ
るタンパク質-RNAの接触が複合体全体を安定するので、小分子のみでは達するこ
とが難しいと思われるとの安定性のレベルを提供する。細胞性タンパク質の加入
による「付加的な」RNA結合親和性を利用することは、標的とされるRNAについて
の親和性が増加した結合複合体を生じうる。複合体形成の結果、翻訳を阻害し、
mRNAの半減期を短くし、またはmRNA切断を誘導し、それによって標的とされる遺
伝子の発現を抑制することができる。
【００９８】 従って、タンパク質とRNAの密接した近位は、別の方法では生じないRNA-タン
パク質相互作用を制御すると考えられる。これによって、RNA結合複合体を形成
するための小分子によって補充されるタンパク質は、RNA結合タンパク質に必ず
しも限定される必要はない。RNAを結合することが未知であり、高い親和性また
は高い特異性を持つタンパク質さえも含むRNA-タンパク質相互作用は、近接によ
って誘導されることもまた可能である。RNAとの相互作用は、タンパク質-タンパ
ク質相互作用に通常関連するアミノ酸またはRNAに密接した位置にある塩基性残
基を活用することによって生じうる。結果的に生じる3分子複合体は特異性（小
分子のために）および高い親和性(小分子とタンパク質の両方についてのRNAとの
多様な相乗的結合相互作用のために）を有する。本発明における使用について有
利であると考えられるタンパク質は以下を含む： 豊富なタンパク質（複合体のタンパク質構成成分は制限されないと考えられるた
め）； 至る所に発現するタンパク質（すべての標的組織に方法を適用できるため）； 既知の小分子リガンドを持つタンパク質（方法を簡単にし、かつ3量体複合体の
タンパク質-RNA相互作用の構成成分の親和性を高くすることを提供する可能性が
高い）； DNA結合タンパク質； リボヌクレアーゼ（RNase）（翻訳と遺伝子発現を抑制する標的化RNAの半減期を
短縮し、翻訳を妨げるための立体的相互作用に依存しない）； 細胞透過性小分子リガンドを結合するタンパク質。
【００９９】 RNA結合性小分子の生物活性を上げるための方法が記載されている。本方法は
、以下に基づいている：(1)近傍で用いる場合、RNAと相互作用するための有利な
特性を有する細胞性タンパク質の同定；(2)同定されたタンパク質と相互作用す
る一端における不変性のリガンドおよびもう一端における可変性の構造（例えば
組み合わせ化学的性質によって生じる）を有する2つの部分に分かれた小分子の
合成；および(3)標的とされるRNAへのタンパク質-小分子複合体表面の特異的結
合が検出可能なアッセイ法。
【０１００】 細胞中のタンパク質の近接と配向を制御するための一般的な技術が開発され（
Schereiber ＆ Crabtree(1996）Trends Biochem. Sci. 21:418-422）、本発明に
直接関連し、かつ有用である。小分子の二量体化化学的誘導物質(CIDs)は、同時
に2つのタンパク質に結合し、いくつかの特異的な細胞性タンパク質相互作用の
活性を調節するために使用され（開発された（Schereiber ＆ Crebtree(1996）T
rends Biochem. Sci. 21:418-422;Spencerら、(1993)Science 262:1019-1024;Pr
uschyら、(1994)Chem. Biol. 1:163-172;Spencerら、(1996)Curr. Biol. 6:839-
847;Belshawら、(1996)Chem. Biol. 3:731-738; Spencerら、(1996）Proc. Acad
. Sci. USA 92:9810-9814; Luoら、(1996) Nature (London) 383:181-185; Farr
arら、(1996) Nature (London) 383:178-181; Belshawら、(1996) Proc. Nat. A
cad. Sci. USA 93:4604-4607; Hardingら、(1989) Nature (London) 341:758-76
0)、かつ生理学的変化に影響をもたらす非生理学的相互作用を得る可能性を示す
。
【０１０１】 そのような1つのCIDであるラパマイシンは、FK506結合タンパク質（FKBP12）
およびFKB12-ラファマイシン関連タンパク質（FRAP）の2つともを同時に結合し
、三量体複合体を形成する。複合体形成は、FRAPのキナーゼ活性を阻害し、結果
として細胞周期におけるG1期を阻止する。おもしろいことに、それは、FRAPとの
複合体の相互作用を仲介するラパマイシンとFKBP12の両方に起因する複合体表面
である。この三量体構造についてのX線結晶構造が解析された（Choiら、(1996)
Science 273:239-242）。構造は、ラファマイシンが各タンパク質における疎水
性ポケットと相互作用する2つの部分に分かれた分子であることを示す。ラファ
マイシンの各々の端は、アライメントさせ、かつ2つの結合したタンパク質に対
するタンパク質-タンパク質相互作用を生じることを可能にする各々のタンパク
質に収まる。ラパマイシンは両タンパク質のパートナーと広範囲にわたって相互
作用するが、タンパク質の相互作用の程度は制限される。FRBP12およびFRAP間の
相互作用において、3H結合だけが接触し、溶媒が接近可能な表面領域の400Å2だ
けが相互作用に関係するので、構造は、相互作用が広範囲のタンパク質相互作用
を必要としないことを示唆する。
【０１０２】 本発明は、mRNA配列、mRNA変化、または小分子とともにヌクレオチドの変化に
係る構造的異型物を標的とすることを含む。これは、比較的低い親和性のRNA結
合性小分子を用いて達成されることができ、小分子の結合はタンパク質との複合
体としてRNAに差し出されることによって増強される。高い親和性を持つRNAとの
複合体を形成するために、一般的には2つの部分に分かれた小分子は、リンカー
によって連結される一端における不変的なタンパク質特異的なリガンドともう一
端に組み合わされた小分子ライブラリー因子を含むように設計される。2つの部
分に分かれた小分子は、そのタンパク質と結合し、RNAと相互作用すると考えら
れる複合物の結合表面を作成することができる。結合部分と適当に選択されたリ
ンカーに関して、小分子による「タンパク質ハイジャック」は、別の方法では起
こらないタンパク質-RNA結合の形成を誘導し、結果として標的RNAへの高い親和
性の結合を生じると考えられる。複合体の安定性（mRNA、小分子、およびタンパ
ク質）は、標的mRNAへの構成成分のいずれかの個別の結合より高いと考えられ、
標的mRNAの生物学性質を改変することができる。
【０１０３】 ある特定の適用において、タンパク質-小分子複合体は、2つの部分に分かれた
小分子の一端における不変的特異的リガンドへの特定のタンパク質の結合によっ
て形成される。好ましくは、このタンパク質は、核酸との相互作用に好都合であ
る塩基性残基に取り囲まれた疎水性ポケットにおける小分子を結合すると考えら
れる。結合は、特徴が局所的なアミノ酸残基と小分子の可変性の端と考えられる
。その際に、二量体複合体はRNA結合についてアッセイされ、可能なタンパク質-
RNA二量体化の化学的誘導物質を同定する。CIDについて記述された系との類推に
よって、小分子による両高分子の並置がRNA-タンパク質相互作用を誘導し、高い
親和性の3分子複合体を生じると考えられる。高い親和性の複合体形成は、mRNA
の生物学的性質を改変し、遺伝子発現を抑制することができる。これは、少なく
とも2つの方法で生じうる： 1）複合体が5'UTR、3'UTR、mRNAのスプライシング連結部、またはmRNAのコード
領域において形成する場合には、複合体の安定性は成熟化、プロセシング、また
はmRNAの翻訳を阻害することができる； 2）「ハイジャック」RNA結合タンパク質もまたヌクレアーゼ活性（例えばRNaseL
）を含む場合には、その後三量体化は標的mRNAの特異的切断を指向することがで
きる。
【０１０４】 RNaseLは潜在的な候補ヌクレアーゼの1つであり、その結合は適当な小分子の
存在下において強くされることができる。RNaseLは、その活性がリガンド依存性
であるという点において、ヌクレアーゼの中では特有である。リガンド結合ドメ
インは、このヌクレアーゼのアミノ末端領域において同定され、この領域がリガ
ンドに結合する場合には、タンパク質のヌクレアーゼ活性を活性化する。このド
メインとその特徴づけられたリガンドである2'-5'オリゴアデニル酸（2-5A）は
、青写真を提示し、その青写真を元にRNaseLに結合することができる2つの部分
に別れた小分子を設計し、そのヌクレアーゼ活性を活性化し、また同時に特異的
なRNAに対してそれを標的とする。この適用のために、特異的な2つに分かれた小
分子は一端に2-5Aリガンド疑似体、かつもう一端に組み合わせのライブラリーの
エレメントとともに合成される。改変された小分子の作用は2つの段階において
起こりうる：1）RNaseLの認識とそれへの結合；2）標的mRNAを除去するためのRN
aseLの補充と局所的活性化。
【０１０５】 他のRNaseは、リガンド依存性ヌクレアーゼ活性、並びに他のRNA結合タンパク
質の遺伝子工学によって改変し、または改変することなく使用することもできる
。そのようなタンパク質は、構造がRNAとの安定な複合体を形成するために適し
ていると知られているという利点を有し、それによって特定のタンパク質-小分
子-RNA複合体を形成する際に活用することができる可能性がかなり高い。非特異
性RNA結合の適当に低いレベルを提供することが望まれる場合には、構造は改変
されうる。当業者は、改変とタンパク質構造の改変と結果として生じるRNA結合
特性の評価に有用な改変方法、および突然変異方法について熟知しており、さら
に小分子非存在下のRNA結合と複合体の安定化の間の適当な均衡状態を提供する
方法について熟知している。
【０１０６】 当業者は、選択されるタンパク質と標的RNAに同時に結合することができる結
合する小分子、および特定の結合部分の同定は様々な方法で行われることができ
、これらの方法の全ては本発明の範囲内であることもまた理解している。好まし
くは、第一および第二の可能な結合部分、およびその2つをつなぐリンカーを含
む小分子に関する結合のためのスクリーニングは存在するが、結合する分子は最
初の結合分子から作成されることによって構築されることもできる。このように
、例えば、選択されるタンパク質に結合する小分子が同定されうる（例えば、既
知のリガンドまたは結合の混合物のスクリーニングによってもしくは同定によっ
て）。この分子は、最初の部分として用いられ、かつ多様なリンカーへ接着され
、かつ/または様々な化学的性質または接着位置を持つリンカーに接着されるこ
とができる。組み合わされた最初の部分とリンカー分子は、その後選抜され、結
合力を保持するものを同定することができる。そのうえ、結合を保持するものは
、結合するタンパク質存在下または非存在下のどちらかにおいて、可能なRNA結
合部分へ接着することができ、かつ標的RNAへの結合に関して選抜されることが
できる。同様に、持続的発達はRNA結合部分から進行める、かつ/またはリンカー
に接着する1つの部分から始めることができる。任意のアプローチのおいては、
リンカーを変え（例えば、異なるリンカー分子かつ/または異なる長さのリンカ
ー）、よりよい特性を持つ分子（例えば、より堅い結合）を同定することは有益
であることができる。
【０１０７】 小分子のライブラリーの構築と1番目と2番目の部分の選抜と記載の複合体を形
成する化合物リンカーについての更なる情報を以下に示す。
【０１０８】タンパク質結合部分-部分1 本発明の1つの態様において、タンパク質結合部分（部分1）の選抜はスクリー
ニング過程によってなされる。スクリーニング過程の目的は、既知の小分子リガ
ンドを持たないタンパク質についてのリガンドを同定し、または既知のリガンド
を最大限に活用するしてもよい。例えば、タンパク質RNaseLは既知のリガンドで
ある2'-5'オリゴアデニル酸（2-5A）を有すが、RNaseLの2-5A結合部位と相互作
用する、より小さいまたはより電荷の少ない分子を同定することが望ましい可能
性がある。そのような分子は、スクリーニングアッセイ法によって同定されるこ
とができ、そのアッセイ法においては、RNaseLは、マイクロタイタープレートの
ウェルに固定され、一連の2-5A類似体による結合（かつ、選択的にRNase活性の
活性化）について試験される。当業者は、ヌクレオチド類似体、またはオリゴマ
ー化されたヌクレオチド類似体（リン酸ジエステル結合の修飾、糖、塩基、また
はこれらの基のいくつかの組み合わせを持つ）は、そのようなライブラリーのた
めに有用な出発点となると考えられるが、2'-5'ポリヌクレオチドの構造的エレ
メントのいくつかを模写した非ヌクレオチド構造のような別のアプローチもまた
有用である。または、合成生成物または天然生成物のライブラリーは、天然のリ
ガンド構造に関わりなくスクリーニングされうる。
【０１０９】 一般的に結合部分1を選択することは、タンパク質標的のための小分子ライブ
ラリーの設計を導く原理によって進められるできである。そのようなライブラリ
ーの構築の手引きは、以下に含まれる最近の多くのテキストにおいて提供される
。テレット（Terrett）、N. K.およびテレット（Terret）、N.、(1998）「組み
合わせの化学的性質（Combinatorial Chemstry）」（Oxford Chemistry Masters
）Oxford Univ Press、ISBN:0198502192。テレット（Terrett）、ニコラス（Nic
holas） K.（1998）「組み合わせの化学的性質（Combinatorial Chemstry）」（
Oxford Chemistry Masters2）、Oxford Univ Press、ISBN:0198502206。Wilson
、Stephen R.(編集者)、およびアンソニー（Anthony） W. カザニック（Czarnik
）(寄稿者)（1997）「組み合わせの化学的性質（Combinatorial Chemstry）:合
成と適用（Synthesis and Application）」、John ＆ Sons、ISBN:047112687X。
バーニン（Bunin）、バリー（Barry）A.(編集者)（1998）「組み合わせの索引（ Combinatorial Index） 」、アカデミー出版社、ISBN:0121413403。オブレクト（
Obrecht）、ダニエル（Daniel）およびジョセ（Jose）M．ビラルゴード（Villal
gordo）（1998）「小分子量化合物ライブラリーの固体支持された組み合わせお
よび同時並行の合成(Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries) 」（四面体有機化学シリーズ
（Tetrahedron Organic Chemistry Sereies)、V. 17）、ペルガモン出版社、ISB
N:0080432581。
【０１１０】 本発明の別の局面において、タンパク質結合部分は、既知の細胞性タンパク質
の小分子のリガンドまたはそのようなリガンドの類似体である。部分1に有用で
ある潜在的な特定の小分子の例は以下を含む：1つまたはそれ以上の細胞質ATPas
eを引き離すことができるアデノシン三リン酸類似体；フラビンアデニンジヌク
レオチドまたはFAD類似体；ニコチンアミドまたはニコチンアミド類似体；ジヒ
ドロ葉酸還元酵素、チミジル酸合成酵素または補因子として葉酸を必要とする他
の豊富なタンパク質にようなタンパク質を引き離すことができるのような葉酸ま
たは葉酸類似体；FK506結合タンパク質（FKBP）に結合する、シクロスポリン、F
K506、ラパマイシン、およびコーメルマイシンまたはそれらの合成類似体。後者
4つの天然生成物を元にした二量体化の概要を記載する。最近完全に合成された
これらの化合物の細胞透過性類似体は、優れた薬学的特性を持ち、生産されてい
る。（Amara、J.F.、Clackson、T.、Rivera、V.M.、Guo、T.、Keenan、T.、Nate
san、S.、Pollock、R.、Yang、W.、Couarge、N.L.、Holt、D.A.およびM．Gilman
(1997）Proc. Natl. Acad．Sci. U.S.A.94（20):10618-23。）アマラ（Amara）
らの化合物も本発明に有用な化合物である。
【０１１１】 細胞性タンパク質の既知のリガンドの別のクラスは、核タンパク質のためのリ
ガンドである。そのようなリガンドは、核に閉じこめられている未熟mRNAへの接
触を提供するという利点を持つ。未熟なmRNAは、イントロン含有遺伝子のイント
ロンを含み、多くの場合プロセシングされたmRNAより大きく、そのためにより潜
在的な標的となりうる構造を含む。核タンパク質のリガンドは、特定のDNA修復
タンパク質へ結合するヌクレオチド類似体を含む。そのようなリガンドの例は、
DNAメチル転位酵素を結合する5'フルオロシチジンを含み；メチルグアニンDNAメ
チル転位酵素へ結合する；6O-ベンジルグアニン；およびアルキルアデニンDNAグ
ルコシラーゼに結合するアルキル化エタノグアニンを含む。
【０１１２】 細胞性タンパク質を結合するリガンドの別のクラスは、アミノ酸代謝またはタ
ンパク質翻訳に関連するタンパク質を結合するアミノ酸類似体である。そのよう
な分子の例は、ヒスチジル化tRNA合成酵素を結合するボレリジン、およびヒスチ
ジル化tRNA合成酵素を結合するヒスチジノール、並びにL-グルタミン拮抗物質ア
シビシン、DONおよびアザセリン；アスパラギン酸類似体PALAおよびL-アラノシ
ン、並びにブチオニン硫酸オキシミンおよびジフルオロミチルオルニチンのよう
な化合物である。
【０１１３】 列挙された任意のリガンド、並びに他のものは、化合物とともにライブラリー
を作成するための出発点となりうる：部分1（固定化されたリガンド）+部分2(ラ
イブラリー)または化合物：部分1（固定化されたリガンド）+リンカー（固定化
されたまたライブラリー）+部分2（ライブラリー）。または、記載の任意のリガ
ンドは、選択された細胞性タンパク質にとってより良好なリガンドを同定するた
めに、制限された多様性のあるライブラリー構築するための基礎として用いられ
ることができる。
【０１１４】 本発明の別の局面においては、部分1にとって好ましい大きさは1,500 Daより
小さく、さらにより好ましい大きさは1,200 Daより小さく、さらにより好ましい
大きさは900 Daより小さく、もっとも好ましい大きさは600 Daより小さい。
【０１１５】RNA結合部分-部分2 RNA結合部分は、一般的には高い親和性を持つ特定の標的RNAに結合する、所望
の化学的性質と薬学的特性を持つ任意の部分である。このような部分は組み合わ
せ小分子ライブラリーからまたは下述の種類のスクリーニングアッセイ法によっ
て天然生成物のライブラリーから同定されてもよい。好ましい部分2は、RNAとの
疎水的相互作用に関連することができる分子である。
【０１１６】 本発明の別の局面においては、部分2の好ましい大きさは、1,500 Daより小さ
く、さらにより好ましい大きさは1,200 Daより小さく、さらにより好ましい大き
さは900 Daより小さく、最も好ましい大きさは600 Daより小さい。
【０１１７】リンカー部分 上に示したように、リンカー部分は任意である。しかしながら、特定の場合に
おいてリンカー部分は、小分子ライブラリーの必須のエレメントであると考えら
れ、特に最適の方向または最適の間隔で標的mRNAと標的タンパク質と共に伴うた
めに重要である可能性がある。部分1および部分2の構造、および3分子複合体の
ために最適な結合構造に依存する、部分1および部分2を連結する1つ、2つまたは
それ以上のリンカーであってもよい。好ましい態様においては、1つのリンカー
である。有用なリンカーの化学的性質の例を制限することなく図5に提供する。
【０１１８】 リンカー基は、部分1および部分2の間の異なる方向または異なる距離を達成す
るために変えてもよい。例えば、リンカー基は例えばベンゼン環のような平面の
芳香環系（図参照）を含んでもよい。部分1および部分2は、可能な任意の方向に
おいてその環または複数の環に接着してもよい。または、リンカーは、様々な長
さと化学合成物の炭化水素鎖から構成されてもよい。部分1および部分2のための
可能ないくつかの接着点と共に、いくつかの例示的な炭化水素鎖を図に示す。別
の可能なリンカー部分は、置換された糖または多糖である。部分1および部分2を
接着するためのいくつかの可能な部分と共に、例示的な糖を図に示す。別の可能
なリンカー部分は、β-ラクタムまたはセファム環である。部分1および部分2を
接着するためのいくつかの可能な部位と共に、そのような例を図に示す。さらに
、別の可能なリンカーはアミノ酸、アミノ酸類似体またはアミノ酸類似体の短い
鎖である。当業者は、例示的な提供されているリンカー構造が包括的でないこと
、および示される構造における追加的な変化、並びに同様の大きさの別の有機化
学基の使用が別の配向または部分1および部分2の間の距離を達成するために有用
でありうることを理解すると考えられる。
【０１１９】 1つ以上の部位においてある部位1および部位2を連結することは有用でありう
る；すなわち、1つ以上のリンカーを用いるいくつかの場合において有用であり
うる。そのような場合には、2つのリンカーまたはすべてのリンカー のどちらか
は同じ種類のものであってもよく、または1つのリンカーは1種類のリンカーであ
ってもよく、かつ別のリンカーまたはそれ以上のリンカーが別の1種類または別
の複数の種類であってもよい。リンカーの種類は、上記に列挙されたものだけで
なく、当業者にとって明らかであると思われる他の構造も含む。
【０１２０】 リンカー部分は部分1および部分2を連結させるものであるが、本発明の別の局
面は、部分1または部分2のどちらかの接触におけるリンカーに関連する。例えば
、糖はRNAを結合することができことが知られている。従って、いくつかの場合
において置換された糖および部分1または2のどちらかの間の接触は、3分子複合
体の親和性または安定性を担う可能性がある。
【０１２１】 本発明の別の局面において、部分2についての好ましい大きさは、700 Daより
小さく、さらにより好ましい大きさは500 Daより小さく、さらにより好ましい大
きさは400 Daより小さく、最も好ましい大きさは300 Daより小さい。
【０１２２】スクリーニングアッセイ法 本発明の小分子ライブラリーをスクリーニングすることは、いくつかの方法で
行うことができる。例えば、第一は、部分1の化合物とリンカーを一定に保つこ
とができ、かつ部分2においてのみ変わるライブラリーを作成することができる
。またもう1つは、部分1だけを固定し、リンカーおよび部分2を変えることでラ
イブラリーを作成する。これらの同様の2つのアプローチは、逆にされた部分1お
よび部分2を用いて行われうる。一度リガンドが部分2というような1つの部分に
おいて選択されると、（部分1があらかじめ選択されるとしても）部分1の結合に
おいて選択される部分2の影響を調査するために、部分2および固定されたリンカ
ーおよび制限された程度までだけ変化する部分1を含む強制的ライブラリーを作
成することは有用でありうる。リンカーと部分1の両方を変える同様の実験を行
うことができる。同じライブラリーとスクリーニングを逆にされた部分1および
部分2を用いて行うことができる。
【０１２３】 本発明の1つの局面において、リンカーは部分1および部分2を選択することを
変えるライブラリーの好ましい構成成分である。最適な空間的関係においてタン
パク質の並置とRNA表面が可能な最大の結合親和性に達するために重要であると
考えられる。この最適な関係は、タンパク質によって最大限の疎水性接触が可能
な間は、引きつけられる静電気的相互作用を最大限にすることが必要であると考
えられる。当業者は、リンカー合成物の変更と上に列挙された構造は、部分1お
よび部分2を最適にアライメントするために用いることができる構造のほんの一
部分のみである。
【０１２４】 ライブラリーは一度作成されると、いくつかの方法でスクリーニングされうる
。第一に、ライブラリーは、その意図される標的へ結合することにスクリーニン
グされうる。例えば、部分1が変化しているライブラリーは、標的タンパク質へ
結合することにスクリーニングされることができ、または部分2が変化している
ライブラリーは、標的RNAへ結合することにスクリーニングされることができる
。そのようなスクリーニングのための1つの便利なアッセイ法はシンチレーショ
ン近接アッセイ（SPA）である。このアッセイ法において、放射性同位体とシン
チラント(scintillant)が特異的結合相互作用によって近接し、ラジオエミッタ
ーがシンチラントを励起でき、その後そのシンチラントは高感度検出器で検出さ
れる。この組み合わせ方は、結合化合物が混じることなく分離することが不要で
あり、かつ即時に結合相互作用のモニターが可能である。SPAは、結合反応をモ
ニターするために用いられる他のほとんどの方法より迅速に行うことができる。
方法は、自動化に適している。（SPAの総説については以下を参照：Udenfriend
、S.、Gerber、L.およびNelson、N.（1987）「シンチレーション近接アッセイ（
Scintillation proximity assay）：リガンド/受容体および抗原/抗体の相互作
用をモニターするための高感度持続的同位体の方法(a sensitive and continuou
s isotopic method for monitoring ligand/receptor and antigen/antibody in
teractions」Anal Biochem 161(2):494-500。自動化高処理量スクリーニングの
最新の総説については以下を参照のこと：Fernandes、P.B.（1998）「高処理量
スクリーニングにおける技術的進歩（Technological advances in high-throuhp
ut screening）」Curr Opin Biol 2(5):597-603。）
【０１２５】 別のアッセイ法の形式は、標的RNAと標的タンパク質の両方が存在する条件下
でライブラリーをスクリーニングすることである。これは、最終的な複合体の親
和性を評価することができる。
【０１２６】 別の有用なアッセイ法は、標的RNA、標的タンパク質または小分子に相互作用
できるすべての他の細胞構成物を実質的にすべて含む細胞抽出物に存在する、標
的RNAと標的タンパク質の両方が存在する条件下で、ライブラリーをスクリーニ
ングすることである。
【０１２７】 最後の重要なアッセイ法は、標的RNAと標的タンパク質の両方を発現する細胞
の存在下でライブラリーをスクリーニングすることであり、この条件においてRN
A作用を除去するためのアッセイである。
【０１２８】 特定の細胞のRNA分子についての1つの活性または複数の活性を阻害するために
用いられうる特に都合のよい分子の提供に加え、本発明は、ある特定の遺伝子に
相当するRNAの活性の対立遺伝子特異的な阻害に特に有用である、RNA配列内の標
的とRNA配列の同定および使用にも関連している。一般的に、これらの標的は、R
NAにおける1つまたはそれ以上の配列の多型の存在の結果生じるRNA種の二次構造
における変化に関連している（すなわち、RNAの対立遺伝子的形態、特にmRNAま
たは未熟mRNA間の二次構造の違い）。一般に、配列の多型は一塩基多型（SNP）
である。
【０１２９】 SNPは、外部の遺伝子内に起こる一塩基対置換である（1-3）。SNPが疾病の感
受性または抵抗性(4,5)、または薬物反応(6,7)を担う遺伝子を同定するための遺
伝的マーカーとして用いることができるという認識が大きくなっているために、
SNPの発見は過去2年間以上著しく進んでいる。イントロンとエキソンから成る遺
伝子内領域において、SNP出現の平均的頻度は500塩基対ごとにおよそ1つである
。エキソン内のSNPはタンパク質コード領域と5'-UTRまたは3'-UTR領域の両方に
おいて出現し、コード領域におけるSNPは必ずしもアミノ酸変化を引き起こすわ
けではない。
【０１３０】 1つまたはそれ以上のSNPを含む遺伝子は、mRNAについての2つまたはそれ以上
の対立遺伝的形態を生じうる。mRNAの様々な対立遺伝的形態に関連するSNPは、m
RNAの合成、成熟化、輸送、翻訳または分解に関わる細胞構成物とのmRNAの相互
作用における対立遺伝子変化を説明することができる。多くの一塩基対置換はス
プライシング、プロセシングまたはヒトmRNAの翻訳のための必須の配列エレメン
トを改変し、または生成するということを詳細に記述されている(1)。これらのS
NPは、細胞質mRNAの改変された長さおよび/または定常状態レベルを含む表現型
的な結果を示す。一方、SNPはRNA共通配列とタンパク質配列に影響を与えないSN
Pは、詳細には解析されていない。そのようなSNPは、おそらく非共通配列依存的
機構によって様々な表現型的影響につながると考えられる。
【０１３１】 mRNAの折りたたみはmRNAのスプライシング(8,9)とプロセシング(10-12)、およ
び翻訳の制御(13-16)と調節(17-19)のような多種の範囲にわたる生物現象に影響
を及ぼすという証拠の実体が大きく現れだしている。mRNAの構造はその塩基配列
と環境によって決定されるので、本発明者らはmRNAの折りたたみがSNPの存在に
よって影響を及ぼされているかどうか調べることに関心があった。本明細書にお
いて、コード領域における以前同定された2つのSNPの解析について記述している
（V.P.Stanton、Jr.、未公開結果):ヒトアラニルtRNA合成酵素の1013番目のヌク
レオチドにおけるU/C変化（AARS、ゲンバンク受託番号#D32050）およびヒト複製
タンパク質Aの70kDaサブユニットの1674番目のヌクレオチドにおけるU/C変化（R
PA70、ゲンバンク受託番号#M63488)。両SNPは、各々のタンパク質のアミノ酸配
列に影響を及ぼさない。36人の関係のない個体からのリンパ芽球の最初のスクリ
ーニング（V. P. Stanton、Jr.、未発表結果）により、U対立遺伝子とC対立遺伝
子の両方を保有するヘテロ接合体と2つの対立遺伝子のうち1つだけを保有するホ
モ接合体がAARS mRNAについて各々57％と43％；およびRPA70 mRNAについては各
々31％、69％の頻度で生じることが明らかになった。構造的マッピングと構造に
基づいたターゲティング戦略を用いて、SNPがmRNAの構造的折りたたみに甚大な
影響を持つことを示す。mRNAの構造的多様性に対する共通の遺伝的変化の貢献に
ついてのそのゆな発見は以前には記述されていなかった。これらの結果は、SNP
の表現型結果がmRNAにおける対立遺伝子特異的な構造モチーフを含む機構から生
じることができるということを示唆する。
【０１３２】 配列の多型に相当する場合に同定される標的は、本明細書に記載の複合体形成
分子を用いたターゲティング（スクリーニングと阻害物質の使用を含む）に有用
である。しかしながら、これらの標的の使用はそのような分子を用いたターゲテ
ィングに対しては限定されないが、むしろ任意の種類の対立遺伝子特異的な阻害
剤を用いて標的を定めることができる（例として前記のHousmanら、参照のこと
）。
【０１３３】 また、本明細書に記載の複合体形成分子はRNA二次構造に対応する標的に対し
てのターゲティングに有用であるが、それらの使用はこれらのターゲットに限定
されない。その代わりとして、そのような分子は特異的結合分子が明らかにされ
ているRNAにおいて任意の標的のために用いられることができる。
【０１３４】 したがって、本発明は、特定のRNAの阻害が有益な疾病、例えば、常染色体優
性疾病、癌のような増殖疾患、および遺伝子発現の低下が有用な疾病の治療に幅
広く適用できる標的と阻害分子を提供する。
【０１３５】 当業者によって理解されているように、疾病および伝達または投与される分子
の特定の特徴にある程度したがって、RNAまたは患者における疾病の治療が多く
の様々な方法で行なわれうる。治療化合物の調製と投与についての手引きを以下
の項において提供される。
【０１３６】薬学的組成物の調製と投与 RNAの阻害または他の調節が望ましい、疾病または他の好ましくない健康状態
にある患者の治療について、調製または投与の好ましい方法は、一般的に使用さ
れる化合物の種類によって変更することができる。このように、当業者は当技術
分野において既知の投与方法がまた本発明の化合物に適切であると理解している
と考えられる。
【０１３７】 標的RNAに活性を示す特定の化合物は、それだけで、またはそれが適当な担体
または賦形剤と混合される薬学的組成物の状態で患者へ投与されることができる
。関心対象の疾患または好ましくない健康状態を示す患者を治療する場合、治療
的に有効な量の1つの薬剤または複数の薬剤が投与される。治療的に有効な用量
は、患者における1つまたはそれ以上の症状を改善するまたは寿命を延長する化
合物の量を指す。
【０１３８】 そのような化合物の毒性と治療効果は、細胞培養物中のおよび/または、例え
ばLD50（集団の50％が致死となる用量）とED50（集団の50％において治療的に有
効な用量）を測定するための細胞培養物および/または実験動物における標準的
な薬学的処置によって測定されることができる。毒性と治療的効果間の用量比は
、治療的指標であり、LD50/ED50比として表わすことができる。広範囲の治療的
指標を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイと動物調査から得られ
るデータは、ヒトにおける使用のための用量範囲を処方する際に用いることがで
きる。好ましくは、そのような化合物の用量は、毒性がほとんどないまたは全く
ないED50を含む循環濃度範囲内にある。用量は、使用される用量の形態と活用さ
れる投与方法によってこの範囲内において変更してもよい。
【０１３９】 本発明の方法で用いられた任意の化合物については、治療的に有効な用量を、
細胞培養アッセイから最初に評価することができる。そのような情報は、ヒトに
おいて有効な用量をより正確に測定するために用いられることができる。血漿中
のレベルを、例えばHPLCまたは特定の化合物の検出に適当な他の方法によって測
定することができる。
【０１４０】 正確な調剤、投与方法および用量は、患者の状態を考慮して個別の医師によっ
て選択されることができる（例として、Finglら、「治療の薬理学基礎（The Pha rmacological Basis of Therapeutics 」、1975、第1章、p.1）。
【０１４１】 主治医は、毒性または器官の機能不全によって投与を終了、中断、または調節
する方法と時期を知ることが留意されるべきである。反対に、主治医はまた、臨
床反応が十分でない場合には（毒性を排除すること）、より高いレベルまで治療
を調整することを知っていると考えられる。関心対象の疾患治療技術における投
与量の大きさは、治療される厳しい病状および投与方法を変えると考えられる。
例えば、標準的な予後評価方法によって病状の厳しさを、ある程度は評価できる
。さらに、用量ことによると用量頻度は、年齢、体重、および個々の患者の反応
によって変更もすることができる。上で考察されたものに匹敵するプログラムを
獣医学においても用いてもよい。
【０１４２】 治療される特定の病状と選択されるターゲティング方法によって、そのような
薬剤は処方され、全身にまたは局所的に投与されてもよい。処方と投与の技術は
、アルフォンソ（Alfonso）とゲナロ（Gennaro）（1995）において見出された。
適当な方法は、例えば経口、直腸、経皮、膣、粘膜を通して、または腸管の注入
；筋肉注射、皮下注射または皮内注射のような腸管外放出、並びに髄膜、静脈、
または腹膜内の注入を含む。
【０１４３】 注入については、本発明の薬剤は、水溶液中、好ましくはハンクス溶液、リン
ガー溶液、または生理的食塩緩衝液ような生理学に適合性のある緩衝液中で製剤
されてもよい。粘膜を通した投与については、浸透される障壁に適当な浸透剤が
製剤に用いられる。そのような浸透剤は、一般的に糖技術分野において周知であ
る。
【０１４４】 本発明の実施のために本明細書で公開された化合物を全身投与に適した投薬へ
処方するための薬学的に許容される担体の使用は、本発明の範囲内である。担体
の適切な選択と適当な製造実施で、本発明の組成物、特に溶液として製剤される
これらのものは、静脈注射などによって非経口的に投与されてもよい。適当な化
合物は、当技術分野において十分に知られている薬学的に許容される担体を用い
て、たやすく経口投与に適した投薬に製剤化されることができる。そのような担
体は、治療中の患者による経口摂取用の錠剤、丸剤、カプセル、液体、ゲル、シ
ロップ、スラリー、懸濁液などとして、本発明の化合物を製剤化することができ
る。
【０１４５】 細胞内に投与される予定の薬剤は、一般的な当業者によく知られている技術を
用いて投与されてもよい。例えば、そのような薬剤を、リポソームへ閉じこめて
もよく、その後上記のように投与してもよい。リポソームは、内部が水を含んだ
球状の脂質二分子層である。リポソーム形成の際に水溶液中に存在するすべての
分子は、水性の内部へ組み込まれる。リポソーム内容物は、外部のミクロの環境
から両方とも保護され、かつ、リポソームが細胞膜と融合するので、リポソーム
内容物は細胞質へ効率よく輸送される。さらに、それらの疎水性のために、小さ
い有機分子は細胞内へ直接投与されてもよい。
【０１４６】 本発明における使用に適した薬学的組成物は、活性成分が意図する目的を達成
するために有効な量に含まれる組成物を含む。有効量の決定は、特に本明細書に
おいて提供される詳細な開示を考慮すると、当業者の能力の十分な範囲内である
。
【０１４７】 活性成分に加えて、これらの薬学的組成物は、これらの薬学的に使用されうる
調製物に活性化合物を加工することを容易にする、賦形剤と補助薬を含む適当な
薬学的に許容される担体を含む。経口投与用に製剤化された調製物は、調合薬が
小腸または大腸に到達した場合には、放出を遅らせるように、または放出される
ためだけに製剤化されたものを含む、錠剤、糖衣錠、または溶液の形態であって
もよい。
【０１４８】 本発明の薬学的組成物は、例えば、組み合わされた混合、溶解、顆粒状、糖衣
錠製造、浮揚、乳状化、カプセル化、閉じこめまたは凍結乾燥の過程によってそ
れ自体が知られている方法で製造されてもよい。
【０１４９】 非経口的投与用の薬学的製剤は、水溶性の形態で活性化合物の水溶液を含む。
さらに、活性化合物の懸濁液は、適当な油性注入懸濁液として調製されてもよい
。適当な脂肪親和性溶媒または賦形剤は、ゴマ油、もしくはエチルオレイン酸塩
またはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、もしくはリポソームのよう
な脂肪油を含む。水様性注入懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム
、ソルビトール、またはデキストランのような懸濁液の粘性を増加する物質を含
んでもよい。選択的に、懸濁液は、適当な安定剤または高濃縮溶液の調製を可能
とするための化合物の溶解度を増加させる薬剤を含んでもよい。
【０１５０】 活性化合物を固形賦形剤と混合させることによって、選択的には結果的に生じ
た混合物をすりつぶし、必要に応じて適当な補助剤を添加した後で、錠剤または
糖衣錠内殻を得ることによって、経口使用のための薬学的調製物を得ることがで
きる。適当な賦形剤は、特に、乳糖、ショ糖、マンニトール、またはソルビトー
ルを含む糖のような添加剤である；例えば、トウモロコシデンプン、コムギデン
プン、イネデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチ
ルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロ
ースナトリウム、および/かつポリビリルピロリドン（PVP）のようなセルロース
調製物。必要に応じて、分解薬剤は、架橋したポリビニルピロリドン、寒天、ま
たはアルギニン酸またはアルギニン酸ナトリウムのようなその塩のようなものを
添加してもよい。
【０１５１】 糖衣錠の内殻を適当な被覆剤とともに提供してもよい。この目的のために、選
択的にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエ
チレングリコール、および/または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な
有機溶媒または溶媒混合物を含んでもよく、濃縮糖溶液を使用してもよい。染料
または色素を、異なる組み合わせの活性化合物用量を同定するためにまたはこれ
を特徴づけるための錠剤または糖衣錠の被覆剤へ添加してもよい。
【０１５２】 経口で用いられることができる薬学的調製物は、ゼラチンで作られた押しばめ
式カプセル、並びにゼラチン、グリセロールまたはソルビトールのような可塑剤
で作られた封入されたソフトカプセルを含む。押しばめ式カプセルは乳糖のよう
な添加剤、デンプンのようなつなぎ、および/またはタルクまたはステアリン酸
マグネシウムのような潤滑剤および、選択的に安定剤との混合物中の活性成分を
含むことができる。ソフトカプセルにおいては、脂肪油、液体パラフィン、また
はポリエチレングリコールのような適当な液体中に、活性化合物を溶解または懸
濁してもよい。
【０１５３】実施例 以下の実施例において記述するように、一塩基多型はヒトmRNAの対立遺伝的形
態における劇的な構造変化を起こすことができる。SNPの近傍領域において、お
よびその領域内での両方に、構造的相違が生じる。構造的相違は、多型部位にお
いて一塩基識別と無関係な最大限に特定の構造の接近可能部位に相補的なオリゴ
ヌクレオチドに関してmRNAの対立遺伝子特異的な切断を可能とする。これらの発
見は、いくつかの点において特に興味深い。一番目に、結果は、SNPがどうよう
にしてmRNA構造に影響を及ぼすことができるかを明らかにし、およびSNPが対立
遺伝子特異的な生化学的結果を引き起こすことができるmRNA構造依存的な作用機
構を示唆する。さらに、mRNAの構造的かつ機能的多様性に対して共通の遺伝的変
化の貢献についての説明は、ヒト表現型変化の基本的な作用機構に洞察を与え、
かつ疾病感受性と薬物反応の調査と容易にすると考えられる(4-7)。二番目に、
本明細書に記載の結果は、治療標的としてのRNAの特徴の遺伝的変化の影響を考
慮することを研究者に警告する。最後に、対立遺伝子構造に基づいたmRNAターゲ
ティングの本発明者らの新規のストラテジーは、好ましくは5'-UTRと3'-UTRにお
いて、細胞内への取り込みの増加と対立遺伝子の識別を可能にするための他の種
類の特異的なRNA結合物を用いて、治療の対立遺伝子特異的なRNAの抑制に適用さ
れてもよい。
【０１５４】実施例1 mRNAのインビトロ合成と生成 転写鋳型であるPCR合成のためのヒトcDNAは、リンパ球芽を形質転換されたエ
スプタイン-バーウイルス（EBV）（Coreiell研究所）または腫瘍細胞系 NCI-H29
2（American Type Culture コレクション）の全RNAから調製された。cDNAは、配
列決定、または制限断片長多型（RFLP）解析のどちらかによってヒトAARSとRPA7
0においてSNPについての遺伝子型に分けられた。2回目の配列決定は、AARSとRPA
70のcDNAの塩基配列を確認するために行なわれた。一塩基が変化したヒトmRNAの
対立遺伝子の断片（113〜1000 mer）が、MegashortcriptまたはMegacript T7キ
ット（Ambion社）を用いて、DNA鋳型由来のPCRからインビトロ転写によって得ら
れた。無傷転写物を、8％変性ポリアクリルアミドゲルまたはG-50 セファデック
ススピンカラム（Boehringer Manheim社）のどちらかで精製し、続いて精製mRNA
をウシ腸管アルカリホスファターゼ（Pharmacia社）を使用し脱リン酸化し、[γ
-32P]ATP（DuPont社）とT4 ポリヌクレオチドキナーゼ（Pharmacia社）を用いて 32 Pで5'末端標識した。
【０１５５】実施例2 対立遺伝子のmRNA構造の酵素マッピング S1ヌクレアーゼとRNase T1（Pharmacia社）によって32Pで5'末端標識された1
pmolの対立遺伝子のmRNAの部分分解を、10 mM Tris-HCl（pH=7.5）、100 mM KCl
、5 mM MgCl2、およびフェノール抽出した5 μgのグリコーゲンを含む10μlの緩
衝液中で5分間、37℃で行なった。S1またはT1の添加前に、RNAを45秒間85℃で加
熱し、次に5分間室温で冷やし、その後10分37℃で置くことによってアッセイ用
緩衝液中で復元した。分解産物は、4％、6％または8％の変性ポリアクリルアミ
ドゲルのいずれかで分画し、オートラジオグラフィーによって分解パターンを可
視化した。55℃でのRNaseT1分解と85℃でのアルカリ加水分解は、切断部位の同
定のための連続的ラダーを生じさせるために行なわれた。55℃におけるRNase T1
分解を、25mM 酢酸ナトリウム（pH=5.2）、25mM KCl、および3μgの酵母tRNAを
含む15 μlの緩衝液中で1分間行なった。50mM 重炭酸ナトリウム（pH=9.2）、1m
M EDTAおよび10μg フェノール抽出したグリコーゲンを含む15μLの緩衝液中で1
5分間、アルカリ加水分解した。
【０１５６】実施例3 大腸菌（E. coli）RNase H分解アッセイ法 ホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチド（PS-オリゴ）は、ヌク
レアーゼに対する安定性が高いために本発明者らの研究において用いられた（20
)。PS-オリゴは化学合成され、Synthetic Genetics社製C-18カートリッジを用い
て脱塩された。32Pで5'末端標識された1 pmolのmRNAを12μLのRNA H 緩衝液（20
mM Tris-HCl（pH=7.5）、10mM KCl、5mM MgCl2、0.1mM ジチオスレイトール（DT
T)、5％グリセロール、および10μgのフェノール抽出したグリコーゲン）中で、
85℃で1分間加熱し、次に室温で5分間冷却し、その後37℃で10分間置くことによ
って復元した。その後、大腸菌（E. coli）RNase H（0.6ユニット、Pharmacia社
）を復元したmRNAへ添加し、37℃で5分間インキュベートした。PS-オリゴ（RNas
e H 緩衝液中の5pmol）を続いて添加し、反応混合物（全量15μL）を37℃で20分
間インキュベートした。分解産物を、4％変性ポリアクリルアミドゲルで分離し
、分解パターンをオートラジオグラフィーによって可視化した。RNAレベルをホ
スホイメイザー（Fujifilm社 モデルFLA-2000）を用いて定量した。
【０１５７】実施例4 ヒト細胞抽出物における内因性 RPA mRNA のオリゴヌクレオチド制御切断 ヒト腫瘍細胞系統HeLaとCalu-1（American Type Culture コレクション）を、
RFLP解析によって、かつ配列決定によってRPA70 cDNAにおけるSNPについての遺
伝子型で分類した。遺伝子型分類は、HeLaとCalu-1が、1674U/Cの多型において
各々U塩基またはC塩基だけを示すことを示した。HeLa細胞を、最小必須培地（Gi
bco BRL社）の単層中で培養し、Calu-1細胞をマッコイ5A培地（Sigma社）の単層
中で培養した。両培地に10％の熱不活性化したウシ胎児血清（JRH Biosciences
社）、100 ユニット/mL ペニシリン・100μg/mL ストレプトマイシン（Gibco BR
L社）、および2mM L-グルタミン（Giboco BRL社）を追加した。両細胞系統は、3
7℃の加湿インキュベーター中で5％CO2/95％エア下で増殖させた。細胞抽出物の
調製については、細胞は80％〜90％の集密度になるまで増殖させ、トリプシン処
理され、上記で特定されたような完全培地で2回洗い、リン酸緩衝食塩水（Giboc
o BRL社）で2回洗った。およそ5×107個の細胞を1.5mL 溶解緩衝液（20mM Tris-
HCl（pH=7.5）、420mM NaCl、2mM MgCl2、0.2mM EDTA、1mM DTT、0.5mM フェニ
ルメチルフッ化硫酸（PMSF）、および25％グリセロール）存在下でテフロンペッ
ソル（Wheaton社）で15mL 組織破砕機で溶解した。ナトリウム塩濃度を、RNase
Hを核から離すための核膜の破裂を容易にするように選択した(21)。血球計を用
いて確認した場合、細胞を完全に溶解するためには200ストロークまで必要とさ
れる。細胞溶解物を4℃で10分間、14,000rpmで遠心分離し、上清を取り除いて遠
心管をきれいにし、すぐに-80℃で凍結させることによって細胞抽出物が得られ
た。細胞抽出物の全タンパク質濃度をブラッドフォードアッセイ（Bio-Rad社）
を用いて測定した。内因性mRNA反応のオリゴヌクレオチド制御の切断のために、
細胞抽出物は溶解緩衝液で全タンパク質濃度が3mg/mLになるように希釈された。
10×PS-オリゴ溶液を希釈した細胞抽出物へ添加した後、反応混合物を37℃で40
分間インキュベートした。無傷RPA70 mRNAレベルを全RNAの単離と以前記述され
たノーザンハイブリダイゼーション（22、23）とその後フォスフォイメイザー解
析によって測定した。RPA70 mRNA特異的なノーザンプローブを、ヒトRPA70 mRNA
の1519番目から2080番目のヌクレオチドに対応するcDNAプローブのランダムプラ
イムド[α-32P]dCTP標識によって合成した。ノーザン解析のために個々のゲルの
ウェルへ載せられた全RNA量についての変動性を説明するために、RPA70 mRNAプ
ローブを最初に除去し、その後ヒトGAPDH（Stratagene社）の600塩基配列に対応
するcDNAプローブのランダムプライムド[α-32P]dCTP標識を用いて同様のノーザ
ンブロットを再び行なうことによっても、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロ
ゲナーゼ（GAPDH）mRNAレベルを測定した。
【０１５８】実施例5 SNP含有mRNA構造の特徴 ヒトmRNAのコード領域における2つのSNPを本研究で解析した：ヒトアラルtRNA
合成酵素（AARS、ゲンバンク受託番号#D32050）の1013番目のヌクレオチドにお
けるU/C変化およびヒト複製タンパク質Aの70kDaサブユニット（AARS、ゲンバン
ク受託番号#M63488）の1674番目のヌクレオチドにおけるU/C変化。mRNA構造にお
けるこれらのSNPの影響を調査するために、インビトロ転写による2つのmRNAの両
対立遺伝子のSNP含有断片を合成し、その後構造特異的な酵素RNase T1および/ま
たはヌクレアーゼ S1を用いてmRNAの構造マッピングを行なった。
【０１５９】 ヌクレアーゼ S1は一本鎖領域のDNAとRNAの両方を切断する（24,25)。それは
、RNAにおける多くの対をなさない接近可能な領域（>4塩基）を同定するために
有用な構造的プローブである。図1aは、AARS mRNAの113塩基の断片(951番目から
1063番目のヌクレオチド)のヌクレアーゼ S1マッピングを示す。S1切断断片パタ
ーンにおける相違は、U対立遺伝子とC対立遺伝子間で観察された。U対立遺伝子
の999番目のヌクレオチドに集中する強い切断は、SNPのおよそ14塩基上流の一本
鎖領域の存在を明らかにした。同じ領域内の強い切断バンドが無いということに
よって示される場合、C対立遺伝子の大部分の種類は、そのような一本鎖領域を
欠失している。S1 が接近できるということにおける対立遺伝的相違は、980の領
域と1032の領域を含むいくつかの他の部位においても観察される(図1a)。より高
いS1濃度においては、両対立遺伝子が980番目の部位と1032番目の部位において
同様の切断パターンを示し、C対立遺伝子中のこれらの部位におけるより強い切
断強度が、999番目の位置において大きい不対領域が無いということにある程度
係る可能性があることを示唆する。RNase T1による構造的マッピング（データ示
さず）は、不対のグアニジン残基を同定し（25)、SNPの±14塩基内の実質的な対
立遺伝的構造の相違の発調査結果を確証した。酵素マッピング実験はAARS mRNA
の1000塩基の断片（529番目から1528番目のヌクレオチド）においても行なわれ
た。図1aの980番目、999番目、1032番目の部位における場合と同一である、2つ
の対立遺伝子の特異的なS1分解パターンは、1000merのmRNA配列に関して観察さ
れた(データ示さず）。
【０１６０】 mRNA配列中の一塩基変化によって生じた明白な対立遺伝的構造の相違は、RPA7
0 mRNAの544塩基の断片においても検出された(図1b)。1378番目から1921番目の
ヌクレオチドからなる断片は、1674U/C多型に集中していた。強いS1切断は、165
6番目のヌクレオチドのあたりのU対立遺伝子において検出され、SNPのおよそ18
塩基上流の一本鎖領域の存在を示した。反対に、バックグラウンド強度以上の切
断は、C対立遺伝子の同様の部位において検出されなかった。2つの対立遺伝子間
の特異的なS1分解は、C対立遺伝子より弱く切断されるU対立遺伝子がある1664番
目のヌクレオチドにおいても観察された。従って、これらのデータは、1656番目
のヌクレオチド領域においてS1が接近可能であることについての対立遺伝的相違
が最大である、RPA70 mRNAの2つの対立遺伝的形態間の特異的な構造モチーフを
明らかにした。さらに、RPA70とAARS mRNAの両方の構造的マッピングデータによ
り、多型部位が一本鎖特異的ヌクレアーゼ S1によって比較的接近できないこと
を明らかになった。提唱されたmRNA対立遺伝子の対となっている多型領域の二次
元構造モデルを図2に示す。
【０１６１】 上述したSNP依存性対立遺伝子の構造的相違が精製系においてmRNA断片を用い
て同定されたので、対立遺伝子特異的な構造の特徴についての本発明者らの発見
が、細胞中の生理学的コンディションに模倣したタンパク質豊富な環境下で、完
全長mRNAの内容物に存在するかどうか調べることが重要である。この問題につい
て取り組むために、本発明者らは、構造に基づくmRNAターゲティングストラテジ
ーを用いて、2つの異なるアッセイ系においてRPA70 mRNAの対立遺伝子構造の接
近可能なことをモニターした：mRNA断片を含む精製系と内因性ヒトRPA70 mRNAを
含む細胞模倣系。本発明者らは、S1マッピングによって同定される場合の構造的
接近可能における対立遺伝的な最大の相違を持つRPA70 mRNAの1656領域に相補的
な一連のホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチド(PS-オリゴ）を設
計した。1656領域の標的部位は1674U/C多型を含まない20塩基または15塩基に及
ぶよう選択された。従って、標的部位は、U対立遺伝子とC対立遺伝子間の塩基配
列において同一であり、U対立遺伝子においてのPS-オリゴ結合に接近可能であり
、かつC対立遺伝子においては接近不可能であるというS1マッピングの結果に基
づいて推測された。RNA・DNAハイブリッド(26)においてRNAを切断する外因性ま
たは内因性のRNase Hを用い、RPA70 mRNAの2つの対立遺伝子に対するPS-オリゴ
のターゲティング効率をモニターした。
【０１６２】実施例6 精製系におけるRPA70 mRNAの対立遺伝子特異的な切断 本発明者らは、大腸菌(E. coli) RNase Hとインビトロ転写された544merのRPA
70 mRNA断片を用いたインビトロアッセイ法を用い、1974U/C多型についての直接
的ターゲティングと比較し、構造に基づいたターゲティングの効率と対立遺伝子
特異性を調べた。図3aは、RPA70多型（1、U対立遺伝子特異的；2、C対立遺伝子
特異的)または1656領域における最大限に異なる構造的接近可能部位（3-6）を標
的とするように設計されたPS-オリゴの塩基配列を示す。SNP標的オリゴ1と2は、
細胞のトランスフェクションアッセイ法において対立遺伝的識別において、あら
かじめ最適化された（J. P. Basillion、未発表データ）各々のSNP標的オリゴは
、好ましくは2つの対立遺伝子のうち1つにマッチし；それは他の対立遺伝子につ
いては、1つだけミスマッチとなる。SNP標的オリゴとそれらの各々の非標的対立
遺伝子間に形成される一塩基ミスマッチは、以前に観察された対立遺伝子の区別
に役立つ。好ましくは、構造標的となるオリゴ3と6は、両対立遺伝子と完全にマ
ッチし、U対立遺伝子の一本鎖1656領域で最大限にハイブリダイスするが、両対
立遺伝子においてわずかに接近可能な1664領域を避けるように設計された(図1b)
。付加的な4ヌクレオチドと6ヌクレオチドを、各々オリゴ3の5'末端に付加し、
対立遺伝子をさらに区別するためのヘアピン構造への折りたたみを容易にするよ
うなオリゴ4とオリゴ5を作成した(27)。
【０１６３】 大腸菌(E. coli) RNase Hによる544merのU対立遺伝子とC対立遺伝子のオリゴ
制御された部位特異的切断の結果を図3bから図3cに示す。予測されるように、16
56領域中のC対立遺伝子よりS1切断に対して感受性であるU対立遺伝子は、構造標
的とするPS-オリゴの存在下において大腸菌(E. coli) RNase Hによってより10倍
以上効率的に切断される。また予想されるように、1674番目の位置においてSNP
を標的とするPS-オリゴ1とPS-オリゴ2を持ちいた切断効率は、ミスマッチ対立遺
伝子についてのものより、それらの各々が一致する対立遺伝子についてのものは
効率がよかった。さらに、多型を標的とするオリゴは、U対立遺伝子の一本鎖構
造部位を標的とするオリゴよりも標的切断を誘導する際に、効率はかなり低かっ
た：切断効率においておよそ14倍から25倍の低下が観察された。これは、S1マッ
ピングによって同定される場合、U対立遺伝子における一本鎖1656領域よりも接
近できない多型部位に一致する。
【０１６４】 予測されたヘアピン構造を持つオリゴ4及びオリゴ5は、両対立遺伝子の切断に
おいて、それの元となるオリゴ3と比較すると各々23％または36％の低下を示し
た。従って、オリゴ4とオリゴ5を用いた実験条件においては対立遺伝子がさらに
区別されなかった。
【０１６５】実施例7 ヒト細胞における内因性RPA70 mRNAの対立遺伝子特異的な切断 次に、本発明者らは、2つの遺伝子型のヒト細胞系統であるHeLa(1674U）とCal
u-1（1674C）から調製したヒト細胞抽出物中の完全長内因性RPA70 mRNAのオリゴ
制御切断を行なった。無傷の細胞性タンパク質と核酸に有害な変性剤非存在下で
、原形質と核膜の両方を破壊できるような細胞溶解条件を選択した。2つの異な
る細胞型の間の変化を評価するために、非対立遺伝子特異的な20merのPS-オリゴ
7をアッセイ法に導入した。オリゴ7は、ヒトRPA70 mRNAの3'UTRの2230番目から2
249番目までの配列に相補し；細胞トランスフェクションアッセイと同じ高い効
率で1674U対立遺伝子と1674C対立遺伝子を標的とすることが以前に示された（J.
P. Basilion、未発表結果）。
【０１６６】 図4は、U対立遺伝子またはC対立遺伝子のどちらかに特異的なオリゴ1、オリゴ
2、オリゴ3または両対立遺伝子を標的とするオリゴ7が100nM、300nM、600nM存在
する条件下で内因性ヒトRPA70 mRNAの1674U対立遺伝子と1674C対立遺伝子の部位
特異的な切断の程度を比較している。完全長もしくは1箇所または2箇所の切断産
物の両方とも、[α-32P]dCTP標識された、RPA70 mRNAの1519番目から2080番目ま
でのヌクレオチドに相補するcDNAプローブを用いたノーザンブロットハイブリダ
イゼーションによって検出された。大腸菌(E. coli) RNase Hを反応混合物に添
加しないので、mRNAの部位特異的な切断は、細胞抽出物中の内因性ヒトRNase H
の存在に起因する。mRNA切断の程度の定量的解析が切断産物の代わりに完全長mR
NAのシグナルを統合することによって行なわれた。後者は、プローブの設計のた
めにある程度までプローブとハイブリダイズせず、かつ細胞抽出物中のRNaseに
よって均質でない分解をより受けやすい可能性があった。ロードした試料におけ
る変化を、同様のノーザンブロットにおける標的としないメッセージであるグリ
セルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）をプローブとすることによ
って説明した。
【０１６７】 2つの細胞型は、100nMから600nMまで濃度範囲以上に対照オリゴ7を添加した場
合と同様に反応した(図4）。反対に、オリゴ1、オリゴ2、オリゴ3およびオリゴ6
は、精製系において得られた結果と質的に同様な対立遺伝子特異的パターンにお
けるターゲティング効率について様々な程度を示した。1674U/C多型を標的とす
る300nMの20merのオリゴ1またはそれより18merのオリゴ2の存在下では、1つだけ
一致する対立遺伝子の大多数が切断されないままであり、かつ一致する対立遺伝
子は一致しない対立遺伝子と同程度またはわずかに切断されていた(図4a)。これ
らの結果は、インビトロ構造的マッピングによって、および一致するヘテロ二本
鎖と一つだけ一致しないヘテロ二本鎖間の二本形成（1〜2 kcal モル-の場合)(2
8,29)のΔG0における予測されるわずかな相違によって同定される場合、1674U/C
多型部位が接近不可能であることによって説明されうる。一方、U対立遺伝子の
一本鎖構造的モチーフを標的とする300nMの20merのオリゴ3の存在下で、U対立遺
伝子のうち15％だけが切断されないままであるが、非標的C他律遺伝子の90％以
上は無傷であった（図4b）。オリゴ3によるU対立遺伝子ターゲティングのこのよ
うな高い効率は、U対立遺伝子の1656領域における接近可能な一本鎖構造とC対立
遺伝子同様の領域におけるの接近不可能な構造と一致する（図1b、2bを参照のこ
と）。本発明者らは、図4におけるデータに基づいて、無傷のmRNAの割合を求め
る場合には、実験条件下で20merのオリゴ3を用いてRPA70 mRNAの異なる対立遺伝
子構造を標的とすることによって得られた対立遺伝子の識別力は、20merのオリ
ゴ1を用いて多型を直接的に標的とすることによって得られたものより、2倍から
6倍高いと結論する。15merのオリゴ6は、20merのオリゴ3よりも顕著に区別でき
なかったが、すべてのオリゴ濃度においてSNPが標的とするオリゴ1とオリゴ2よ
りも対立遺伝子をより区別することも示した。
【０１６８】 一致するヘテロ二本鎖間と1つだけ一致しないヘテロ二本鎖間の二本鎖形成の
ΔG0における相違、並びに一致する二本鎖と1つだけ一致しない二本鎖に関連す
る様々なRNase H活性に起因するSNPが標的とするオリゴに関して、対立遺伝子の
識別力がより小さいことが観察されたということに注目することが重要である。
反対に、標的部位が多型を含まないために、標的部位配列を持つ構造標的となる
オリゴの完全な相補性は、標的対立遺伝子と非標的対立遺伝子の両方について予
測される。従って、構造標的となるオリゴによって対立遺伝子のより高い識別力
は、2つの対立遺伝子間の標的部位接近可能における有意な相違を反映する。こ
の接近可能についての相違は、内因性RPA70 mRNAの2つの対立遺伝子の異なる構
造的折りたたみのどちらかによって、または細胞構成成分との様々な接触によっ
て、またはその両方の影響によって生じると考えられる。精製系における結果と
細胞抽出物における結果の間で観察される明確な相互関係は、2つの内因性RPA70
mRNA対立遺伝子間の構造的相違によって主に引き起こされる構造標的となるオ
リゴに関して対立遺伝子を明白に識別できるという主張を強く支持する。
【０１６９】 本明細書に記述されるすべての特許と刊行物は、発明が属する当技術分野の当
業者の技術レベルを示す。本開示において引用したすべての参照文献は、各々の
参照文献が完全に個別に参照に組み入れられる場合には、同程度に参照文献とし
て組み入れられる。
【０１７０】 当業者は、本発明が目的を成し遂げ、記述された結末と利点、並びに本質的に
その中に存在するそれらのものを得るために十分にて適用されることを高く評価
すると考えられる。現在の好ましい態様の典型として本明細書に記述される方法
、変化、および組成物は、例示的なものであり、本発明の範囲を限定するもので
はない。当業者により、本発明の精神に含まれる、その範囲内の変化と他の使用
が想起されると考えられるが、それらの変化と他の使用は特許請求の範囲によっ
て限定されている。
【０１７１】 本発明の範囲と精神を逸脱することなく、本明細書に開示された発明に対して
代用と改変を変えてもよいということを、当業者は容易に明確に理解できると考
えられる。例えば、他の組成物、および/または処理方法を使用することは、全
て本発明の範囲内である。従って、このような付加的な態様は本発明と添付の特
許請求の範囲内である。
【０１７２】 本明細書に例示的に示された発明は、本明細書において詳細に開示されていな
い任意の1つまたは複数の要素、1つまたは複数の限定なしで、適当に実行されて
もよい。従って、例えば、本明細書の例において各々の「含有すること」、「本
質的に構成すること」および「構成すること」という用語のいずれかは、のこり
の2つの用語のどちらと置き換えてもよい。使用された用語と表現は、説明のた
めの用語および限定のためではない用語として用いられ、かつこのような用語お
よび任意の同意義である、示され、記述された特徴またはそれの一部を除外する
ための表現の使用において意図するものではないが、様々な改変は特許請求され
た発明の範囲内で可能である。従って、本発明は好ましい態様と選択的な特徴に
よって詳細に開示されているが、本明細書で開示されている概念の改変と変化は
、当業者によって慣習的に行なわれてもよく、しかも、このような改変と変化は
追記されている特許請求によって限定されるような本明細書の範囲内であると考
えられる。
【０１７３】 さらに、本発明の特徴または局面がマルクス（Markush）のグループまたはそ
れ以外の別のグループの見地から記述されているところでは、当業者は発明が、
マルクスのグループまたは別のグループの任意の個別のメンバーまたはメンバー
のサブグループの見地から記載されていることを理解すると考えられる。
【０１７４】 従って、更なる態様は本発明の範囲内であり添付の特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 対立遺伝的mRNA構造のヌクレアーゼS1マッピング。-S1、S1無添
加の対照反応；+S1、増加したS1濃度に関する37℃におけるS1による部分分解；+
OH-、アルカリ加水分解反応；+T1（Δ）、Gラダーを作成し、切断部位を決定さ
せるような55℃におけるT1による部分分解；-T1（Δ）、T1無添加の対照反応。a
、AARS mRNAの113merの断片（951番目から1063番目のヌクレオチド）のU対立遺
伝子とC対立遺伝子。b、RPA70 mRNAの544merの断片（1378番目から1921番目のヌ
クレオチド）のU対立遺伝子とC対立遺伝子の接近可能な一本鎖領域のマッピング
。多型位置を太字で示し、SNP標識した。
【図２】 mRNA対立遺伝子の対における多型領域についての提唱された二次
構造モデル。多型を持つ塩基は、太字で示し、SNP標識された。モデルの構築は
、コンピュータープログラム MFOLD（M. Zucker、ワシントン大学、セントルイ
ス、ミズーリ州）の使用によって助力された。構造的マッピングデータによって
確認されるモデルとなる領域だけを示す。a、AARS mRNAの多型領域の提唱された
対立遺伝的構造。モデルは、ヌクレアーゼS1とRNase T1による構造的マッピング
に関するデータと一致する。黒い棒は、U対立遺伝子の999番目のヌクレオチドの
あたりの一本鎖領域を強調している。b、RPA70 mRNAの多型領域の提唱される対
立遺伝子構造。モデルは、ヌクレアーゼS1によって構造的マッピングに関するデ
ータと一致する。黒い棒は、U対立遺伝子の1656番目のヌクレオチドのあたりの
一本鎖領域を強調している。
【図３】 RPA70-1674U/C mRNAの544merの断片の両対立遺伝子に関する大腸
菌（E. coli）RNase H 分解。a、アッセイ法において用いられたPSオリゴの塩基
配列。オリゴ1および2は、多型部位を標的とする；mRNAにおける多型と反対の塩
基を太字で示す。オリゴ3および6は、1656番目のヌクレオチドのあたりの異なる
対立遺伝的構造部位を標的とする。オリゴ1、2、3およびオリゴ6は、RPA70 mRNA
における相補的ヌクレオチドの位置に従って標識される。オリゴ4および5は、オ
リゴ3と同様の標的となるハイブリダイゼーション配列を共有しているが、加え
られた付加的なヌクレオチド（下線で示される）とともに共有することで、意図
的に対立遺伝子をより識別できるヘアピン構造にフォールディングすることを容
易にする。b、aにおけるオリゴにハイブリダイズする5'-32Pで標識されたU対立
遺伝子おびC対立遺伝子についての大腸菌（E. coli）RNase H分解パターン。切
断部位は、2つの対立遺伝子のためのRNase T1分解ラダーを同じゲルで泳動する
ことによって確認された（示さず）：それらは、オリゴ1および2に関して1674番
目、オリゴ6に関して1654番目の位置に集まっている。c、bから予測されたU対立
遺伝子おおびC対立遺伝子の切断のパーセントの比較。オリゴ依存的切断バンド
は、差し引かれたバックグラウンドの重複している切断バンドとともに各々のレ
ーンにおける全RNAの割合として統合された。それぞれのレーンに載せている試
料における変量は、絶対的なバンド強度の代わりに切断パーセントを測定するこ
とによって内部補正された。
【図４】 ヒトの細胞抽出物における内因性RPA70 mRNAのオリゴヌクレオチ
ド制御切断についてのノーザンブロット解析。抽出物は、RPA70 mRNAの1674U対
立遺伝子または1674C対立遺伝子のみをそれぞれ発現するHeLa細胞とCalu-1細胞
から調製された。図3に図示されるPS-オリゴ1、2、3および6に加えて、オリゴ7
（5'TGGTCTGCAGTTAGGGTCAG 3'）は、RPA70mRNAの3'-UTRについての2230番目から
2249番目のヌクレオチドを標的とする対立遺伝子非特異的対照オリゴとしてアッ
セイで用いられた。a、オリゴ1および2による1674U/C多型部位を標的とすること
。b、オリゴ3および6による1656番目のヌクレオチドのあたりの異なる対立遺伝
子構造の部位を標的とすること。反応は複製物において行われた。複製物の平均
したデータポイントを、エラーバーとして標準偏差とともにプロットし、かつ対
応するノーザンブロットの下に示す。無傷のRPA70 mRNAレベルは、GAPDHレベル
に標準化され、各実験についての非オリゴ対照の割合として示された。
【図５Ａ及び図５Ｂ】 本発明のリンカーとして用いることができるある特
定の種の一般的構造を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 21/00 Ａ６１Ｐ 25/16 25/16 25/28 25/28 27/02 27/02 35/00 35/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 シェン リン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 マ ルボロ ロイヤル クレスト ドライヴ ２ アパートメント ８ (72)発明者 ヴァーダイン グレゴリー アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 レ キシントン ベニントン ロード ７ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B024 AA20 CA11 EA04 FA18 HA17 HA19 4B063 QA07 QA08 QQ52 QR32 QR35 QR55 QS26 QS32 4C084 AA06 AA07 AA13 AA17 CA56 CA59 MA52 MA55 NA14 ZA021 ZA161 ZA331 ZA941 ZA961 ZB261 ZC781

Claims (97)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 潜在的な小分子阻害剤が、第一の部分、第二の部分、ならび
    に該第一の部分と該第二の部分を連結するリンカーを含む、RNAと細胞タンパク
    質との複合体形成の誘導によって細胞RNAの活性を阻害するような潜在的な該小
    分子阻害剤を同定する方法であって、以下の段階を含む方法： 該第一の部分及び該第二の部分、ならびに該第一の部分および第二の部分を連結
    する該リンカーを本質的に含む小分子が、該潜在的な小分子阻害剤であるような
    、 a）選択された細胞タンパク質の少なくとも一部に結合する該第一の部分を同定
    する段階；および b）標的細胞RNAの少なくとも断片に結合する該第二の部分を同定する段階。
  2. 【請求項２】 第一の部分を同定する段階が、細胞タンパク質の既知の小分
    子リガンドを同定する段階を含む、請求項1記載の方法。
  3. 【請求項３】 以下の段階をさらに含む、請求項2記載の方法： 第一の部分及び、可変の第二の部分に結合したリンカーとから本質的になる化合
    物を含む小分子ライブラリを提供する段階；ならびに 該第二の部分が標的RNAに結合するような、一つまたは複数の分子を同定するた
    めに該ライブラリをスクリーニングする段階。
  4. 【請求項４】 第一の部分を同定する段階が以下の段階を含む、請求項1記
    載の方法： 可変の第一の部分、リンカー、および固定された第二の部分から本質的になる化
    合物の小分子ライブラリを提供する段階；ならびに 選択された細胞タンパク質の少なくとも一部に結合する化合物を同定するために
    、該ライブラリの化合物をスクリーニングする段階。
  5. 【請求項５】 第二の部分を同定する段階が以下を含む、請求項4記載の方
    法： 選択された細胞タンパク質に結合する第一の部分、リンカー、および可変の第二
    の部分から本質的になる小分子ライブラリを提供する段階；ならびに 標的RNAに結合する化合物を同定するために、該ライブラリの化合物をスクリー
    ニングする段階。
  6. 【請求項６】 選択された細胞タンパク質およびそのリガンドが、アデノシ
    ン三リン酸類似体および細胞ATPase；フラビンアデニンジヌクレオチドまたはFA
    D類似体；ニコチンアミドまたはニコチンアミド類似体；葉酸または葉酸類似体
    、およびジヒドロ葉酸レダクターゼ、チミジル酸シンターゼ、または葉酸を共因
    子として必要とする他の豊富なタンパク質；シクロスポリン、FK506、ラパマイ
    シン、クーママイシンまたはその合成類似体およびFK506結合タンパク質からな
    る群より選択される、請求項2記載の方法。
  7. 【請求項７】 小分子の特性を改善するために、少なくとも一回の同定の二
    回またはそれ以上の繰り返しが行われる、請求項1記載の方法。
  8. 【請求項８】 複合体のタンパク質構成成分が、標的RNAが存在する（複数
    の）細胞区画内に存在する細胞タンパク質である、請求項1記載の方法。
  9. 【請求項９】 複合体のタンパク質構成成分が、既知のRNA結合活性を有す
    るタンパク質である、請求項1記載の方法。
  10. 【請求項１０】 複合体のタンパク質構成成分がRNaseである、請求項1記載
    の方法。
  11. 【請求項１１】 複合体のタンパク質構成成分が、RNaseH 1型、RNaseH 2型
    、およびRNaseLの種類由来のRNaseである、請求項1記載の方法。
  12. 【請求項１２】 複合体のタンパク質構成成分がRNAヘリカーゼである、請
    求項1記載の方法。
  13. 【請求項１３】 複合体のタンパク質構成成分がDNA結合タンパク質である
    、請求項1記載の方法。
  14. 【請求項１４】 複合体のタンパク質構成成分が小分子結合部位の10Å以内
    に二つまたはそれ以上の塩基性残基を有し、それにより、標的RNAとの良好な電
    荷相互作用を提供する、請求項1記載の方法。
  15. 【請求項１５】 小分子が4000ダルトンを超えない、請求項1記載の方法。
  16. 【請求項１６】 小分子が2000ダルトンを超えない、請求項1記載の方法。
  17. 【請求項１７】 小分子が1000ダルトンを超えない、請求項1記載の方法。
  18. 【請求項１８】 標的細胞RNAが前mRNA（pre-mRNA）である、請求項1記載の
    方法。
  19. 【請求項１９】 標的細胞RNAがmRNAである、請求項1記載の方法。
  20. 【請求項２０】 標的細胞RNAが二次構造の変化をもたらす多型性を有し、
    二次構造の変化が小分子のRNA結合部分の標的である、請求項1記載の方法。
  21. 【請求項２１】 標的細胞RNAが、該RNAの二次構造を変化させるか、または
    該RNAの二次構造を変化させる別の変異の部位と同じ対立遺伝子上に存在するよ
    うな変異を有するRNAである、請求項1記載の方法。
  22. 【請求項２２】 以下の段階をさらに含む、請求項1記載の方法： 複数の異なるリンカー及び、a）において同定された第一の部分、b）において同
    定された第二の部分、またはその両方を含む、複数の小分子を提供する段階；な
    らびに 都合のよい結合または薬理学的特性を有する潜在的な小分子阻害剤を同定するた
    めに、該複数の小分子をスクリーニングする段階。
  23. 【請求項２３】 第二の部分を同定する段階が以下の段階を含む、請求項1
    記載の方法： 固定された第一の部分および、可変の第二の部分に結合したリンカーから本質的
    になる化合物を含む小分子ライブラリを提供する段階；ならびに 該第二の部分が標的RNAに結合するような、一つまたは複数の分子を同定するた
    めに該ライブラリをスクリーニングする段階。
  24. 【請求項２４】 第一の部分を同定する段階が以下の段階を含む、請求項23
    記載の方法： 請求項23において同定された可変の第一の部分、リンカー、および固定された第
    二の部分を本質的に含む化合物の小分子ライブラリを提供する段階；ならびに 選択された細胞タンパク質またはその一部に結合する化合物を同定するために、
    該ライブラリの化合物をスクリーニングする段階。
  25. 【請求項２５】 RNA二次構造における差により、該配列不一致が、該対立
    遺伝子特異的治療の小分子に対する潜在的な標的であることが示されるような、
    以下の段階を含む、対立遺伝子特異的治療の小分子に対するRNA標的を同定する
    方法： a）関心対象の集団内の該RNA標的における少なくとも一つの配列不一致（varian
    ce）を同定する段階： b）同定された任意の配列変異体のRNA二次構造が、変異対立遺伝子間で異なるか
    否かを決定する段階。
  26. 【請求項２６】 標的とされた配列不一致が、関心対象の集団において0.1
    ：0.9〜0.5：0.5の範囲の頻度で発生する、請求項25記載の方法。
  27. 【請求項２７】 RNA二次構造の決定が、T1、T2、S1、U2、CL3、V1、A、Phy
    M、N.c.ヌクレアーゼ、もしくはRNaseからなる群より選択されるヌクレアーゼを
    用いて、またはジメチル硫酸、ジエチルピロカーボネート、CMCT、ケトキサール
    、亜硫酸水素塩、エチルニトロソ尿素、MPE-Fe(II)、およびFe(II)-EDTAからな
    る群より選択された化学物質による化学プロービング（probing）によって実施
    される、請求項25記載の方法。
  28. 【請求項２８】 量を減少させれば、標的RNAが疾患状態を少なくとも改善
    する対立遺伝子を含む、請求項25記載の方法。
  29. 【請求項２９】 標的RNAが常染色体優性疾患に関連した対立遺伝子を含む
    、請求項25記載の方法。
  30. 【請求項３０】 常染色体優性疾患が、ハンチントン病、頚椎融合、角膜炎
    -魚鱗癬-難聴症候群、進行性外眼筋麻痺3型、進行性外眼筋麻痺2型、痙性対麻痺
    6、進行性外眼筋麻痺、単離された成長ホルモン単独欠損による下垂体性小人症
    、遠位尿細管アシドーシス、ビタミンD耐性くる病、心臓疾患を伴う肩甲骨腸骨
    腓骨萎縮、痙性対麻痺4、痙性対麻痺3、II型大理石骨病、層状魚鱗癬、非症候性
    感音性3難聴、虹彩隅角形成不全2型、脊髄小脳失調7、小頭症、ねじれ失調症1、
    遺伝性多発脳梗塞性痴呆、弾性繊維仮黄色腫、パーキンソン病における常染色体
    優性レーヴィ小体、常染色体優性非症候性感音性2難聴、食道異常と尿道下裂を
    伴う隔離症、脈絡膜網膜症を伴う小頭症、ダイヤモンド-ブラックファン貧血、
    高インスリン症、外胚葉異形成3、非症候性感音性8難聴、ラーセン症候群、発育
    不全性局所エナメル質形成不全2、腎嚢胞3、先天性眼振2、エーラース-ダンロス
    症候群IV型、核変異に二次的なミトコンドリアDNA切断症候群、および網膜錐体
    ジストロフィー2からなる群より選択される、請求項29記載の方法。
  31. 【請求項３１】 標的RNAが増殖性疾患におけるヘテロ接合性の喪失を受け
    る本質的な遺伝子の対立遺伝子を含む、請求項25記載の方法。
  32. 【請求項３２】 タンパク質-小分子-RNA複合体を形成するために、小分子
    阻害剤が該選択された細胞タンパク質および該標的細胞RNAに結合できるような
    、対立遺伝子特異的小分子が、選択された細胞タンパク質またはその一部に結合
    する第一の部分、標的細胞RNAまたはその断片に結合する第二の部分、ならびに
    該第一の部分及び該第二の部分を連結するリンカーからなる小分子阻害剤を含む
    、請求項25記載の方法。
  33. 【請求項３３】 以下の段階を含む、標的RNAに対する対立遺伝子特異的RNA
    結合小分子を同定する方法： a）変異対立遺伝子間で二次構造の違いを有する関心対象の集団内の該RNA標的に
    おける少なくとも１つの配列不一致を同定する段階； b）複数の小分子による結合または阻害のための一つまたは複数の該不一致に対
    する二つのRNA構造をスクリーニングする段階；および c）該結合または阻害により該化合物が該対立遺伝子特異的RNA結合小分子である
    ことが示されるような、該RNA構造の一つを選択的に結合または阻害する化合物
    を同定する段階。
  34. 【請求項３４】 複数の小分子が小分子組合せ（combinatorial）ライブラ
    リの因子である、請求項33記載の方法。
  35. 【請求項３５】 対立遺伝子特異的RNA結合小分子が細胞活性を提供するか
    否かを決定する段階をさらに含む、請求項33記載の方法であり、以下の段階を含
    む方法： 標的RNAを産生する細胞を、該対立遺伝子特異的RNA結合小分子に接触させる段階
    ；および 該小分子が細胞機能の変化を生じるか否かを決定する段階。
  36. 【請求項３６】 細胞機能が標的RNAの発現の減少である、請求項35記載の
    方法。
  37. 【請求項３７】 標的RNAが前mRNAまたはmRNAである、請求項33記載の方法
    。
  38. 【請求項３８】 複数の小分子が、同じまたは異なっていてもよい第一の部
    分、複数の小分子間で異なる第二の部分、および該第一の部分と該第二の部分と
    を連結するリンカーをそれぞれ含む、複数の潜在的な小分子阻害剤を含み、該第
    一の部分が、選択された細胞タンパク質に結合するように選択され、該第二の部
    分が標的細胞RNAに結合するように選択され、それによって三分子複合体を形成
    する、請求項33記載の方法。
  39. 【請求項３９】 第一の部分が、細胞タンパク質またはその類似体もしくは
    誘導体の既知の小分子リガンドである、請求項38記載の方法。
  40. 【請求項４０】 選択された細胞タンパク質およびそのリガンドが、アデノ
    シン三リン酸類似体および細胞ATPase；フラビンアデニンジヌクレオチドまたは
    FAD類似体；ニコチンアミドまたはニコチンアミド類似体；葉酸または葉酸類似
    体、およびジヒドロ葉酸レダクターゼ、チミジル酸シンターゼ、または葉酸を共
    因子として必要とする他の豊富なタンパク質；シクロスポリン、FK506、ラパマ
    イシン、クーママイシンまたはその合成類似体およびFK506結合タンパク質から
    なる群より選択される、請求項39記載の方法。
  41. 【請求項４１】 三分子複合体のタンパク質構成成分が、標的RNAが存在す
    る（複数の）細胞区画内に存在する細胞タンパク質である、請求項38記載の方法
    。
  42. 【請求項４２】 三分子複合体のタンパク質構成成分が、既知のRNA結合活
    性を有するタンパク質である、請求項38記載の方法。
  43. 【請求項４３】 三分子複合体のタンパク質構成成分がRNaseである、請求
    項38記載の方法。
  44. 【請求項４４】 三分子複合体のタンパク質構成成分が、RNaseH 1型、RNas
    eH 2型、およびRNaseLの種類由来のRNaseである、請求項43記載の方法。
  45. 【請求項４５】 三分子複合体のタンパク質構成成分がRNAヘリカーゼであ
    る、請求項38記載の方法。
  46. 【請求項４６】 三分子複合体のタンパク質構成成分がDNA結合タンパク質
    である、請求項38記載の方法。
  47. 【請求項４７】 三分子複合体のタンパク質構成成分が小分子結合部位の10
    Å以内に二つまたはそれ以上の塩基性残基を有し、それにより、標的RNAとの良
    好な電荷相互作用を提供する、請求項38記載の方法。
  48. 【請求項４８】 標的細胞RNAが前mRNAである、請求項38記載の方法。
  49. 【請求項４９】 標的細胞RNAがmRNAである、請求項38記載の方法。
  50. 【請求項５０】 複合体を形成するために小分子阻害剤が選択された細胞タ
    ンパク質および標的RNAに結合することができ、それによって該標的RNAの活性を
    阻害するような、選択された細胞タンパク質に結合する第一の部分、標的細胞RN
    Aに結合する第二の部分、および該第一の部分と該第二の部分とを連結するリン
    カーを含む合成小分子阻害剤；ならびに 薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤 を含む、薬学的組成物。
  51. 【請求項５１】 選択されたタンパク質がヒトタンパク質である、請求項50
    記載の組成物。
  52. 【請求項５２】 標的RNAがヒトRNAである、請求項50記載の組成物。
  53. 【請求項５３】 小分子阻害剤が標的RNAの発現を阻害する、請求項50記載
    の組成物。
  54. 【請求項５４】 第一の部分が、選択されたタンパク質またはその類似体の
    天然のリガンドである、請求項50記載の組成物。
  55. 【請求項５５】 小分子阻害剤が、二次構造が異なるRNAの変異型に対して
    異なる活性を有し、二次構造の違いが少なくとも一つの配列不一致に関連するよ
    うな、請求項50記載の組成物。
  56. 【請求項５６】 複合体のタンパク質構成成分が、標的RNAが存在する（複
    数の）細胞区画内に存在する細胞タンパク質である、請求項50記載の組成物。
  57. 【請求項５７】 複合体のタンパク質成分が既知のRNA結合活性を有するタ
    ンパク質である、請求項50記載の組成物。
  58. 【請求項５８】 複合体のタンパク質構成成分がRNaseである、請求項50記
    載の組成物。
  59. 【請求項５９】 複合体のタンパク質構成成分が、RNaseH 1型、RNaseH 2型
    、およびRNaseLの種類由来のRNaseである、請求項50記載の組成物。
  60. 【請求項６０】 複合体のタンパク質構成成分がRNAヘリカーゼである、請
    求項50記載の組成物。
  61. 【請求項６１】 複合体のタンパク質構成成分がDNA結合タンパク質である
    、請求項50記載の組成物。
  62. 【請求項６２】 複合体のタンパク質構成成分が小分子結合部位の10Å以内
    に二つまたはそれ以上の塩基性残基を有し、それにより、標的RNAとの良好な電
    荷相互作用を提供する、請求項50記載の組成物。
  63. 【請求項６３】 小分子が4000ダルトンを超えない、請求項50記載の組成物
    。
  64. 【請求項６４】 標的細胞RNAが前mRNAである、請求項50記載の組成物。
  65. 【請求項６５】 標的細胞RNAがmRNAである、請求項50記載の組成物。
  66. 【請求項６６】 標的細胞RNAが、二次構造の変化をもたらす多型性を有し
    、二次構造の変化が小分子のRNA結合部分の標的となる、請求項50記載の組成物
    。
  67. 【請求項６７】 標的細胞RNAが、該RNAの二次構造を変化させるか、または
    該RNAの二次構造を変化させる別の変異の部位と同じ対立遺伝子上に存在するよ
    うな変異を有するRNAである、請求項50記載の組成物。
  68. 【請求項６８】 以下の段階を含む、mRNAの発現を阻害する方法： a）通常該mRNAを発現する細胞を小分子阻害剤と接触させる段階であり、阻害剤
    が以下を含む段階： 複合体を形成するために該小分子阻害剤が該選択された細胞タンパク質および該
    標的細胞mRNAに結合でき、それによって該標的RNAの活性を阻害するような、選
    択された細胞タンパク質またはその一部に結合する第一の部分；標的細胞mRNAに
    結合する第二の部分；および該第一の部分と該第二の部分とを連結するリンカー
    。
  69. 【請求項６９】 選択されたタンパク質がヒトタンパク質である、請求項68
    記載の方法。
  70. 【請求項７０】 標的RNAがヒトRNAである、請求項68記載の方法。
  71. 【請求項７１】 小分子阻害剤が標的RNAの発現を阻害する、請求項68記載
    の方法。
  72. 【請求項７２】 第一の部分が選択されたタンパク質またはその類似体の天
    然のリガンドである、請求項68記載の方法。
  73. 【請求項７３】 小分子阻害剤が、二次構造が異なるRNAの変異型に対して
    異なる活性を示し、二次構造における違いが、少なくとも一つの配列不一致に関
    連する、請求項68記載の方法。
  74. 【請求項７４】 複合体のタンパク質構成成分が、標的RNAが存在する（複
    数の）細胞区画に存在する細胞タンパク質である、請求項68記載の方法。
  75. 【請求項７５】 複合体のタンパク質構成成分が既知のRNA結合活性を有す
    るタンパク質である、請求項68記載の方法。
  76. 【請求項７６】 複合体のタンパク質構成成分がRNaseである、請求項68記
    載の方法。
  77. 【請求項７７】 複合体のタンパク質構成成分が、RNaseH 1型、RNaseH 2型
    、およびRNaseLの種類由来のRNaseである、請求項68記載の方法。
  78. 【請求項７８】 複合体のタンパク質構成成分がRNAヘリカーゼである、請
    求項68記載の方法。
  79. 【請求項７９】 複合体のタンパク質構成成分がDNA結合タンパク質である
    、請求項68記載の方法。
  80. 【請求項８０】 複合体のタンパク質構成成分が小分子結合部位の10オング
    ストローム以内に二つまたはそれ以上の塩基性残基を有し、それにより、標的RN
    Aとの良好な電荷相互作用を提供するような、請求項68記載の方法。
  81. 【請求項８１】 小分子が4000ダルトンを超えない、請求項68記載の方法。
  82. 【請求項８２】 標的細胞RNAが前mRNAである、請求項68記載の方法。
  83. 【請求項８３】 標的細胞RNAがmRNAである、請求項68記載の方法。
  84. 【請求項８４】 標的細胞RNAが二次構造の変化をもたらす多型性を有し、
    二次構造の変化が小分子のRNA結合部分の標的である、請求項68記載の方法。
  85. 【請求項８５】 標的細胞RNAが該RNAの二次構造を変化させるか、または該
    RNAの二次構造を変化させる別の変異の部位と同じ対立遺伝子上に存在するよう
    な変異を有するRNAである、請求項68記載の方法。
  86. 【請求項８６】 常染色体優性または遺伝子量疾患を治療する方法であり、
    以下の段階を含む方法： 対立遺伝子特異性が二次構造における上記の違いを含む、少なくとも１つの配列
    不一致が二次構造の違いを提供するような、標的RNAの対立遺伝子型に対して選
    択的に活性である対立遺伝子特異的RNA阻害剤の治療的有効量を該疾患に罹患し
    た患者に投与する段階。
  87. 【請求項８７】 疾患が常染色体優性疾患であり、患者が標的RNAに対応す
    る遺伝子に対してヘテロ接合性である、請求項86記載の方法。
  88. 【請求項８８】 疾患が遺伝子量疾患であり、投与が上記の遺伝子の発現を
    減少させるが消失させないように調節される、請求項86記載の方法。
  89. 【請求項８９】 患者が上記の遺伝子に関してヘテロ接合性であり、阻害剤
    がたった一つの対立遺伝子の発現を選択的に減少または消失させる、請求項88記
    載の方法。
  90. 【請求項９０】 阻害剤が以下を含む小分子である、請求項86記載の方法：
    複合体を形成するために、該小分子阻害剤が選択された細胞タンパク質および標
    的RNAに結合でき、それによって該標的RNAの活性を阻害するような、選択された
    細胞タンパク質またはその一部に結合する第一の部分；標的細胞RNAまたはその
    断片に結合する第二の部分；および該第一の部分と該第二の部分を連結するリン
    カー。
  91. 【請求項９１】 疾患もしくは症状に罹患した患者を治療する方法であり、
    以下の段階を含む方法： 対立遺伝子特異性が、少なくとも１つの配列不一致に関連する二次構造の違いを
    含むような、標的RNAの対立遺伝子特異的阻害剤を該患者に投与する段階。
  92. 【請求項９２】 小分子阻害剤が、第一の部分、第二の部分、および該第一
    の部分と該第二の部分とを連結するリンカーを含み、該阻害剤が該第一の部分と
    該細胞RNAに結合する選択された細胞タンパク質と複合体を形成すると考えられ
    るような、細胞RNAの小分子阻害剤を同定する段階 を含む、薬剤を生成する方法であり、 a）選択された細胞タンパク質またはその一部に結合する該第一の部分を同定す
    る段階；および b）標的細胞RNAまたはその断片に結合する該第二の部分を同定する段階； c）患者において治療反応を提供するのに十分な量の該小分子阻害剤を合成する
    段階 を含む方法。
  93. 【請求項９３】 便利な複合体形成を可能にするリンカーを選択する段階を
    さらに含む、請求項92記載の方法。
  94. 【請求項９４】 阻害剤が、少なくとも一つの配列不一致がRNA二次構造の
    違いを提供するようなmRNAの対立遺伝子型に対して選択的に活性である、請求項
    92記載の方法。
  95. 【請求項９５】 以下を含む、合成複合体形成分子： 複合体を形成するために、小分子阻害剤が選択された細胞タンパク質及び標的細
    胞RNAに結合するような、選択された細胞タンパク質に結合する第一の部分；標
    的細胞RNAに結合する第二の部分；および該第一の部分と該第二の部分を連結す
    るリンカー。
  96. 【請求項９６】 分子が翻訳条件下で標的mRNAの発現を阻害すると考えられ
    る、請求項95記載の分子。
  97. 【請求項９７】 選択された細胞タンパク質がRNA結合タンパク質またはそ
    の誘導体である、請求項95記載の分子。
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