KR20230140678A - Rbm15 억제제를 포함하는 유방암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

Rbm15 억제제를 포함하는 유방암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 RBM15(RNA Binding Motif Protein 15)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 유방암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, RBM15 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 예후 예측용 조성물, 유방암 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물, 예후 예측용 조성물, 예후 예측을 위한 정보제공 방법을 이용하는 경우, 유방암을 치료하거나 유방암의 예후를 예측함에 있어 기존에 활용된 바 없는 RNA-메틸화 조절 인자인 RBM15를 새로운 치료 및 예후 예측 마커로써 활용할 수 있다.

Description

RBM15 억제제를 포함하는 유방암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물{Pharmaceutical Composition for the Prevention or Treatment of Breast Cancer Comprising RBM15 inhibitors}
본 발명은 RBM15 억제제를 포함하는 유방암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
유방암은 여성에게 발생하는 가장 빈번한 암종으로, 전체 여성암의 24.2%를 차지한다.　세계보건기구(WHO) 산하 국제암연구기구(IARC)가 2019년 3월에 발표한 결과에 의하면, 유방암은 세계 2위로 신규 발병이 높아 환자가 2백만명을 넘으며 62만명이 사망해 사망률 4위에 이르는 암종이다. 최근에도 꾸준히 환자수가 증가하고 있으며 국내에서는 올해 들어 처음으로 전체 암종에서 발생률이 가장 높은 암으로 자리 잡게 되었다.
분자적인 수준에서 유방암을 구분하는 일반적인 방법은 ER(estrogen receptor), PR(progesterone receptor), Her2(Human epidermal growth factor receptor 2)와 같은 유전자의 유무에 따라 환자를 구분하는 방법으로, 이에 따라 그 치료법 또한 달라진다. 상기 3개 유전자의 유무에 따라 환자의 생존율 또한 영향을 받게 된다. 그러나 삼중음성유방암(triple negative breast cancer)은 ER, PR 및 HER2의 발현이 모두 음성인 유방암으로, 전체 유방암의 20% 내지 30%를 차지한다. 삼중음성유방암은 재발 위험도가 높고 예후가 불량한 암으로, 전이가 흔하게 발생하여 폐, 간 및 뇌로의 전이가 주를 이룬다. 또한 변이(Driver mutation) 유전자가 연구된 바 없어　삼중음성유방암　환자에 대한 치료는 전통적인 항암제(독소루비신, 탁솔 등)나 수술에 제한되어 있으며, 특이적인 치료제가 존재하지 않는다. 전통적인 항암제의 경우 약물의 특이성이 없기 때문에 치료효과가 떨어지며 부작용 또한 심하여 환자 치료에 한계가 있다. 따라서, 삼중음성유방암의 치료를 위한 새로운 분자적인 표적과 그를 활용한 기술의 개발이 시급한 실정이다.
RNA는 전사 과정을 통하여 최종 산물인 단백질로 발현이 되어 그 기능을 하게 된다. 그 과정에서 RNA는 여러 가지 변형을 거치게 되며, 지금까지 약 140 가지의 RNA의 변형이 알려져 있다. 그 중에서 가장 빈번한 RNA의 변형은 RNA-메틸화(RNA-methylation)으로, 변형이 생기는 부위에 따라 종류가 나뉘어진다. 이 중에서도 가장 빈번한 RNA 변형은 아데노신에서 메틸화가 발생하여 N6-Methyladenosine(m6A)으로 변형되는 것이다. m6A 변형은 최근 들어 시퀀싱 기법을 통하여 인체암과 여러 연관성이 있음이 규명되고 있으며, 암치료를 위한 표적으로써의 가능성이 제시되고 있다. 현재까지 m6A 변형에 관여하는 유전자로는 약 20 여종이 알려져 있다.
본 발명자들은 RNA-메틸화와 유방암과의 연관성을 규명하기 위하여 m6A 변형에 관여하는 RNA-메틸화 관련 유전자를 분석하였으며, 특히 삼중음성유방암에서 특이적으로 발현이 차이가 나는 유전자로서 RBM15(RNA Binding Motif Protein 15)를 발굴하였고, RBM15를 유방암의 치료, 진단 및 예후예측을 위한 표적 유전자로 활용하기 위한 기술을 제시하고자 한다.
대한민국 등록특허 제10-2269666호 (2021.06.21. 등록)
본 발명자들은 RNA-메틸화와 유방암의 연관성을 규명하고 이를 이용한 유방암 치료, 진단 및 예후 예측 기술을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, RNA의 N6-Methyladenosine(m6A) 변형 유전자 중 하나인 RBM15와 유방암의 연관성을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 유방암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 유방암 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유방암 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유방암의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 RBM15(RNA Binding Motif Protein 15)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 유방암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 RNA-메틸화와 유방암의 연관성을 규명하고 이를 이용한 유방암 치료, 진단 및 예후 예측 기술을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, RNA의 N-Methyladenosine(m6A) 변형 유전자 중 하나인 RBM15와 유방암의 연관성을 규명하였다.
본 발명의 조성물에 의한 예방, 치료 대상 질병인 유방암은 유방 밖으로 퍼져 생명을 위협할 수 있는 악성 종양을 의미하며, 본 발명은 조성물은 유전자 표적 치료의 일환으로서, RBM15 유전자를 표적으로 하는 유방암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 명세서 상의 "RBM15"는 RNA Binding Motif Protein 15으로, RBM15 유전자에 의하여 인코딩되는 단백질이다. RBM15 단백질은 RNA-결합 단백질으로서, RNA의 N6-Methyladenosine(m6A) 메틸화(methylation)의 주요 조절자로 알려져 있으나, RBM15의 발현 또는 활성 억제를 통한 유방암 치료에 대해서는 아직 보고된 바가 없다. 본 발명자들은 RBM15 유전자 발현이 높을수록 유방암 환자의 예후가 좋지 않고, RBM15의 발현이 높을수록 암세포의 성장이 증가함을 규명하였다.
본 명세서 상의 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여에 의해 유방암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서 상의 용어 "치료"란 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여에 의해 유방암에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서 상의 용어 "RBM15의 발현 억제제"는 RBM15 단백질의 발현을 조절하는 상기 RBM15 유전자의 발현을 억제하는 물질, 또는 이미 발현된 단백질을 분해하는 물질을 의미한다.
본 명세서 상의 용어 "단백질"은 '폴리펩타이드(polypeptide)' 또는 '펩타이드(peptide)'와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
본 명세서에서 "폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)" 또는 "핵산"은 단일 또는 이중 가닥의 형태로 된 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 또는 리보핵산(ribonucleic acid, RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오타이드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오타이드의 공지된 아날로그도 포함된다. 일반적으로 DNA는 아데닌(adenine, A), 구아닌(guanine, G), 시토신(cytosine, C), 티민(thymine, T) 등 네 가지 염기로 구성되어 있으며, RNA는 티민 대신 우라실(Uracil, U)을 가지고 있다. 핵산 이중 가닥에서 A는 T 또는 U, C는 G 염기와 수소결합을 이루는데, 이러한 염기의 관계를 '상보적(complementary)'이라고 한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 RBM15의 발현 억제제는 RBM15 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA(short interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), microRNA, 앱타머, 리보자임, 저분자 화합물, 유전자 가위(CRISPR/Cas-9), DNAzyme, 및 PNA(protein nucleic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 유전자의 발현을 억제시킬 수 있는 제제라면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "mRNA(messenger RNA 또는 전령 RNA)"는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자의 염기서열의 유전 정보를 리보솜(ribosome)으로 전달하여 폴리펩타이드 합성(단백질 번역, translation)의 청사진 역할을 하는 RNA를 의미한다. 유전자를 주형(template)으로 하여 단일 가닥의 mRNA가 전사(transcription) 과정을 통하여 합성된다.
본 명세서 상의 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense nucletide)"는 자연 발생적인 염기, 당 및 당간(intersugar) 연결로 이루어진 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오시드 단량체의 올리고머 또는 중합체를 지칭한다. 또한, 이 용어는 유사하게 기능하는 비-자연 발생적인 단량체 또는 그의 부분을 포함하는 변형된 또는 치환된 올리고머를 포함한다. 치환된 올리고머의 혼입은 세포 흡수 증대 또는 뉴클레아제 내성 증가를 비롯한 인자에 기초하며, 당업계에 공지된 바와 같이 선택될 수 있다. 전체 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 일부분이 치환된 올리고머를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이들의 표적에 대한 친화성을 증가시키고 표적 서열의 미스매치(mismatch)에 대한 내성을 제공하도록 당업계에 공지된 방법으로 변형된 올리고머 모방체, 예를 들어 펩타이드 핵산(PNA) 및 고정(locked) 핵산(LNA)을 포함할 수 있다. 또한, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 천연형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트형 올리고데옥시리보뉴클레오타이드, 포스포로디티오에이트형 올리고데옥시리보뉴클레오타이드, 메틸포스포네이트형 올리고데옥시리보뉴클레오타이드, 포스포르아미데이트형 올리고데옥시리보뉴클레오타이드, H-포스포네이트형 올리고데옥시리보뉴클레오타이드, 트리에스테르형 올리고데옥시리보뉴클레오타이드, 알파-아노머형 올리고데옥시리보뉴클레오타이드, 펩타이드 핵산, 그 외 인조 핵산 및 핵산-변형된 화합물을 포함한, 변형된 올리고뉴클레오타이드 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. RBM15 유전자 또는 RBM15 유전자의 mRNA 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고 뉴클레오타이드 분자는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "siRNA(short interfering RNA, 작은 간섭 RNA)"는 RBM15 유전자에 특이적으로 작용하여 RBM15 RNA를 절단(cleavage)하여 RNA 간섭(RNAi: RNA interference)현상을 유도할 수 있는 이중사슬 RNA를 말한다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knockdown) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공될 수 있다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다. RBM15 유전자에 대한 siRNA는 RBM15 유전자 핵산 서열의 일부 또는 전부와 상동인 서열을 포함하는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 RNA 가닥으로 구성되어 세포 내에서 RBM15 RNA에 혼성화될 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 상기 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치 즉 대응하는 염기가 상보적이지 않음, 벌지 즉 일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 10 내지 80 염기일 수 있고, 구체적으로는 10 내지 70 염기, 보다 구체적으로는 10 내지 30 염기일 수 있다. 상기 siRNA 분자는 자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열 예컨대, 약 5-15 nt이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프(stem and loop) 구조를 형성하게 될 수있다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.
본 명세서 상의 용어 "shRNA(짧은 헤어핀 RNA, short hairpin RNA"는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 침묵시키는데 사용될 수 있는 단단한 헤어핀 턴을 만드는 RNA 서열을 갖는 RNA 분자를 말한다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 기작에 의해 siRNA로 절단되고, 이는 이어서 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC)에 결합될 수 있다. 이 복합체는 그에 결합되는 siRNA에 매치되는 mRNA에 결합하여 절단될 수 있다. siRNA의 서열은 전장 표적 유전자 또는 그의 하위서열에 상응할 수 있다. siRNA는 유전자에 "표적화"되며, 여기서 siRNA의 듀플렉스 부분의 뉴클레오타이드 서열이 표적화된 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. siRNA 서열 듀플렉스는 상보적 염기-쌍형성 상호작용을 통해 함께 siRNA를 가져와 RNA를 표적화하기에 충분한 길이일 필요가 있으며, 다양한 길이일 수 있다. siRNA의 길이는 바람직하게는 10개 이상의 뉴클레오타이드고, 표적 RNA와 안정하게 상호작용하기에 충분한 길이; 구체적으로 10-30개 뉴클레오타이드; 보다 구체적으로 10 내지 30개 사이의 임의의 정수, 예컨대 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 및 30개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 상기 "충분한 길이"는 예상된 조건하에 목적하는 기능을 제공하기에 충분히 큰 길이인 10개 이상의 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드를 의미한다. shRNA는 재조합 DNA 기술을 이용하여 벡터에 클로닝될 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "앱타머(aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산 (DNA, RNA, 또는 변형 핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오타이드로 구성되어 있어, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "리보자임(ribozyme)"은 촉매 활성을 갖는 RNA 분자를 말한다. 다양한 활성을 갖는 리보자임이 공지되어 있으며, RBM15 유전자의 리보자임은 공지된 또는 인공적으로 생성된 리보자임을 포함하며, 선택적으로 표적 특이적 RNA 절단 활성을 갖는 리보자임이 공지의 표준 기법에 의해 제조될 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "저분자 화합물"은 생체에 존재하는 생체 고분자 이외의 천연 유래의 화학물질 또는 비천연 유래의 화학물질을 말하며, 표적 조직 특이적인 화합물 또는 비천연 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서 상의 용어 "유전자 가위(CRISPR/Cas-9)"는 가이드 RNA의 서열 및 CRISPR 효소의 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함하여 이의 발현 또는 활성 유도에 관여하는 모든 요소를 포함하는 것으로서, 상기 CRISPR-Cas-9 시스템은 가이드 RNA 및 CRISPR 효소가 복합체(complex)를 형성하는 RNP(ribonucleoprotein) 시스템일 수 있다. 이때, 상기 RNP는 단백질-RNA 복합체로, RNA와 RNA-결합(binding) 단백질의 상호작용에 의해 형성되는 복합체의 형태를 의미할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 발현 억제제는 서열번호 1 또는 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 shRNA일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 발현 억제제는 서열번호 3 또는 4의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 siRNA일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 RBM15의 활성 억제제는 RBM15 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩타이드, 펩타이드 유사체(mimetics), 앱타머, 단백질 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 유전자의 활성을 억제시킬 수 있는 제제라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "RBM15의 활성 억제제"는 RBM15 단백질의 활성 또는 작용을 감소시키는 물질을 말하며, RBM15 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩타이드, 펩타이드 유사체(mimetics), 앱타머, 항체, 천연추출물, 합성화합물 또는 이들의 조합일 수 있으며, 예를 들어, RBM15 단백질에 결합하는 다클론 항체, 단클론 항체, 또는 재조합 항체 등을 포함하는 항체일 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 유사체(mimetics)는 치료제로서 특정 폴리펩타이드의 구조 및 바람직한 특징을 모방하는 화합물을 지칭한다.
본 명세서 상의 용어 "항체(antibody)"는 당해 기술 분야에 공지된 용어로서, 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날(polyclonal) 항체, 모노클로날(monoclonal) 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 항체는 당 업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당 업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당 업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 활성 억제제는 리파부틴(Rifabutin), 오텐제파드(Otenzepad) 및 하이페로사이드(Hyperoside)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 상의 "리파부틴(Rifabutin)"은　면역기능저하환자의　MAC(Mycobacterium　avium　intracellulare　complex)　감염　억제, 비결핵성　마이코박테리아에　의한 감염증 치료나 폐결핵 치료에 주로 사용되는 살균성 항생제로서, RBM15 단백질과 직접적으로 결합할 수 있음이 알려진 바는 없다. 본 발명자들은 리파부틴이 RBM15 단밸질과 직접적으로 결합할 수 있음을 분자 도킹(Molecular docking) 방법을 활용하여 규명하였다.
본 명세서 상의 "오텐제파드(Otenzepad)"는 선택적 M2 수용체(Muscarinic receptor M2, 무스카린 수용체 M2) 길항제로서, 부정맥 치료제나 부교감신경억제제로 쓰이며, RBM15 단백질과 직접적으로 결합할 수 있음이 알려진 바는 없다. 본 발명자들은 오텐제파드가 RBM15 단백질과 직접적으로 결합할 수 있음을 분자 도킹 방법을 활용하여 규명하였다.
본 명세서 상의 "하이페로사이드(Hyperoside, quercetin-3-O-β-D-galactopyranoside)"는 플라보놀 배당체(flavonol glycoside)의 한 종류로서, 하이페리쿰 속(Hypericum) 및 크라태거스 속(Crataegus)에서 주로 발견된다. 하이페로사이드는 항산화효과, 항고지혈증 효과, 항염증 효과, 심장 보호 효과 등이 있음이 알려져 있으며, RBM15 단백질과 직접적으로 결합할 수 있음이 알려진 바는 없다. 본 발명자들은 하이페로사이드가 RBM15와 직접적으로 결합할 수 있음을 분자 도킹(Molecular docking) 방법을 활용하여 규명하였다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 활성 억제제는 독소루비신(Doxorubicin), 사이클로포스파마이드(Cyclophosphamide), 메토트렉세이트(Methotrexate), 에피루비신(Epirubicin), 5-FU(카페시타빈(capecitabine)), 파클리탁셀(Paclitaxel), 도세탁셀(Docetaxel), G-CSF(과립구 집락자극인자, granulocyte colony-stimulating factor) 등의 기존 항암제와 병용되어 사용될 수 있으며, 병용되어 사용됨으로써 유방암의 치료 효율을 높이고 환자의 예후를 개선할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유방암은 삼중음성유방암일 수 있다.
본 명세서 상의 "삼중음성유방암(triple negative breast cancer)"은 ER(estrogen receptor), PR(progesterone receptor) 및 Her2(Human epidermal growth factor receptor 2)의 발현이 모두 음성인 유방암으로, 전체 유방암의 20% 내지 30%를 차지한다. 삼중음성유방암은 재발 위험도가 높고 예후가 불량한 암으로, 전이가 흔하게 발생하여 폐, 간 및 뇌로의 전이가 주를 이룬다. 또한 변이(Driver mutation) 유전자가 연구된 바 없어　삼중음성유방암　환자에 대한 치료는 전통적인 항암제(독소루비신, 탁솔 등)나 수술에 제한되어 있으며, 특이적인 치료제가 존재하지 않는다. 전통적인 항암제의 경우 약물의 특이성이 없기 때문에 치료효과가 떨어지며 부작용 또한 심하여 환자 치료에 한계가 있다.
본 발명자들은 삼중음성유방암에서 특히 RBM15 유전자의 발현이 비-삼중음성유방암인 유방암에 비해 현저히 증가되어 있음을 확인하였고, 이에 따라 RBM15 유전자의 발현 및/또는 RBM15 단백질의 활성을 억제하는 경우, 삼중음성유방암에 대해서 특히 효과적인 항암 효능이 발휘될 수 있음을 확인하였다. 따라서, RBM15 유전자의 발현 및/또는 RBM15 단백질의 활성 억제는 삼중음성유방암에 대해 더욱 더 유의하게 상승된 치료 효과를 보일 수 있으며, 종래 알려진 치료제에 의해 치료가 어려운 삼중음성유방암의 치료를 위한 효과적인 대안이 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내 투여, 피하 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여 또는 국부 투여)할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효량은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 약제학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 RBM15(RNA Binding Motif Protein 15) 유전자의 mRNA 또는 RBM15 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서, "예후"란, 질병을 진단하여 판단된 장래의 증세 또는 경과에 대한 전망으로, 질병이 없는 상태 등의 긍정적　예후와 질병의 악화, 전이, 재발 등의 부정적　예후를 모두 포함할 수 있다.　예후의 예측은 유방암 환자의 치료 여부를 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하므로, 매우 중요한 임상적 과제이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제제는 RBM15 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브; 및 RBM15 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩타이드, 펩타이드 유사체(mimetics), 앱타머(aptamer), 단백질 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 상의 용어 "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxl group)를 가지는 핵산 서열로, 상보적인 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 시점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA polymerase 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오타이드 트리포스페이트(nucleotide triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 프라이머는 상기 유전자에 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산일 수 있고, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 한, 추가의 특징을 혼입할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "프로브(probe)"는 mRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는, 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링 되어있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현량을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 형성될 수 있다. 적절한 프로브 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, RBM15 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제인 RBM15 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물은 리파부틴(Rifabutin), 오텐제파드(Otenzepad) 및 하이페로사이드(Hyperoside)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 예후 예측용 조성물에 포함되는 RBM15 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제인 RBM15 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩타이드, 펩타이드 유사체(mimetics), 앱타머(aptamer), 단백질 및 항체에 관한 내용 및 리파부틴, 오텐제파드 및 하이페로사이드에 대한 내용은 상술한 본 발명의 다른 일 양태인 유방암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에서 설명된 내용과 같으므로, 중복되는 내용을 원용하며, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 중복 기재를 생략하도록 한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준은 중합효소반응(PCR), 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블랏(Northern blotting) 및 DNA 마이크로 어레이 칩으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)으로부터 선택되는 1종 이상의 방법으로 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유방암은 삼중음성유방암인 것이다.
본 발명의 예후 예측용 조성물의 예후 예측 대상인 삼중음성유방암에 관한 내용은 본 발명의 다른 일 양태인 유방암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에서 설명된 내용과 같으므로, 중복되는 내용을 원용하며, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 중복 기재를 생략하도록 한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 예후 예측용 조성물을 포함하는 유방암 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 명세서 상의 용어 "키트"는 바이오 마커 성분에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 항체를 검출 가능한 표지로 표지하여 바이오 마커의 발현 수준을 평가할 수 있는 도구를 말한다. 프로브 또는 항체 관련하여 검출 가능한 물질을 기질과의 반응에 의해서 직접적으로 표지하는 것뿐만 아니라, 직접적으로 표지된 다른 시약과의 반응성에 의한 발색하는 표지체가 접합된 간접적 표지도 포함한다. 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 기 타 다른 용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하여 제작될 수 있다. 본 발명에서 키트는 RT- PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있으며, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-중합효소, 역전사효소, DNase, RNase 억제제, 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 HPD 예후 예측용 유전자를 검출하기 위한 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 당 업계에 공지되어 있는 것이라면, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 "예후 예측용 키트"는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치 등을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 프라이머 키트, RT-PCR 키트, ELISA 키트, 래피드(rapid) 키트, DNA 칩 키트, 단백질 칩 키트, MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 키트는 기질, 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 더 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 발색 효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 FITC(Fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine B isothiocyanate) 등이 사용될 수 있으나, 이에 재한되는 것은 아니다. 또한, 상기 발색 기질액은 ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)), OPD(O-phenylene diamine), 또는 TMB(tetramethylbenzidin)가 사용될 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 대상(subject)으로부터 분리된 생물학적 시료의 RBM15(RNA Binding Motif Protein 15)의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는 유방암 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 명세서 상의 용어 "생물학적 시료"는 인간을 포함한 포유동물로부터 얻어지는, RBM15를 발현하는 세포를 포함하고 있는 모든 시료로서, 조직, 세포, 세포 배양액, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 상기 생물학적 시료는 유방 조직 또는 이로부터 유래된 세포를 포함하는 생물학적 시료이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 세포 배양액, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유방암은 삼중음성유방암일 수 있다.
본 발명의 상기 정보제공방법에 있어서, RBM15 유전자의 발현이나 RBM15 단백질의 활성이 상대적으로 높을수록 환자의 예후가 더 불량한 것으로 판단될 수 있다. 특히, 측정된 RBM15 유전자의 발현 정도 또는 RBM15 단백질의 활성 정도가 비-삼중음성유방암인 유방암 조직에서의 기준 값보다 유의하게 증가된 경우, 비-삼중음성유방암에서 종래 사용되는 치료방법에 의해서는 질병의 치료 및 증상의 호전이 용이하지 않고, 예후가 불량한 것으로 판단할 수 있다. 이러한 경우, 삼중음성유방암에 특이적인 치료 방법, 구체적으로 예를 들면, 본 발명의 다른 일 양태에 따른 삼중음성유방암 치료용 조성물을 치료에 적용함이 바람직하다고 판단될 수 있다.
본 발명의 정보 제공 방법에서 RBM15의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 방법, 측정에 필요한 제제 등에 관한 기재는 상술한 예후 예측용 조성물에 기재된 바와 중복되므로, 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 이하 그 자세한 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 유방암의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다: 유방암 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 후보물질을 처리하고, RBM15 유전자의 mRNA 또는 RBM15 단백질의 발현 또는 활성 수준이 감소하는지 여부를 측정하는 단계; RBM15 유전자의 mRNA 또는 RBM15 단백질의 발현 또는 활성 수준이 감소하는 경우, 유방암의 예방 또는 치료용 물질로 판단한다.
본 발명의 스크리닝 방법에서 "후보물질"은 본 발명의 RBM15 단백질 또는 RBM15 유전자의 mRNA 발현 또는 활성 수준에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 대상 물질은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 상의 용어 "생물학적 시료"는 인간을 포함한 포유동물로부터 얻어지는, RBM15를 발현하는 세포를 포함하고 있는 모든 시료로서, 조직, 세포, 세포 배양액, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 상기 생물학적 시료는 유방 조직 또는 이로부터 유래된 세포를 포함하는 생물학적 시료이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 세포 배양액, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유방암 환자는 삼중음성유방암 환자일 수 있다. 삼중음성유방암 환자의 경우, RBM15의 발현이 유의하게 증가되어 있는 바, 이의 발현 억제를 관찰하기에 용이하며, 효과적으로 유방암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는데 이용될 수 있다.
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 스크리닝 방법을 이용하여 발굴한 유방암의 예방 또는 치료용 물질의 경우, 특히 삼중음성유방암의 예방 또는 치료에 더욱 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 RBM15(RNA Binding Motif Protein 15)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 유방암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 RBM15(RNA Binding Motif Protein 15) 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 예후 예측용 조성물을 제공한다.
(c) 본 발명은 대상(subject)으로부터 분리된 생물학적 시료의 RBM15(RNA Binding Motif Protein 15)의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계를 포함하는 유방암 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물, 예후 예측용 조성물, 예후 예측을 위한 정보제공 방법을 이용하는 경우, 유방암을 치료하거나 유방암의 예후를 예측함에 있어 기존에 활용된 바 없는 RNA-메틸화 조절 인자인 RBM15를 새로운 치료 및 예후 예측 마커로써 활용할 수 있다.
도 1은 삼중음성유방암 및 비-삼중음성유방암에서의 RNA-메틸화 관련 유전자 발현을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 삼중음성유방암 및 비-삼중음성유방암에서의 RBM15 유전자 발현을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 RBM15 유전자의 발현과 유방암 환자 생존율의 연관성을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 삼중음성유방암세포에서 RBM15 유전자 발현과 암세포 성장과의 연관성을 나타낸 것이다.
도 5는 RBM15에 의한 암세포 신호전달 체계의 연관성을 조사한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 RBM15 발현 억제 시 RNA-메틸화 수준을 조사한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 유방암 환자 조직을 활용한 RBM15 발현을 면연 염색으로 조사한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 삼중음성유방암에서 RBM15의 발현이 증가함을 정상 암조직과 비교하여 나타낸 것이다.
도 9는 분자 도킹(Molecular docking)을 통하여 발굴한 RBM15 결합 화합물을 나타낸 것이다.
도 10은 리파부틴의 RBM15 단백질 발현 억제 효과를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: RBM15 유전자의 삼중음성유방암 특이적 발현 및 RBM15 유전자와 삼중음성유방암의 연관성 확인
실시예 1-1: RBM15 유전자의 삼중음성유방암 특이적 발현 확인
RNA-메틸화와 삼중음성유방암과의 연관성을 규명하기 위하여 여러 m6A의 변형에 관여하는 RNA 메틸화 관련 유전자를 분석하였다(도 1).
분석에 필요한 유전체 데이터는 NCBI(National Center for Biotechnology Information), GEO(Gene Expression Omnibus) 웹사이트에서 다운로드하였다. 유전체 데이터 정규화(normalization)를 수행한 후 분석에 사용하였다. 삼중음성유방암과 비-삼중음성유방암 환자에서 RNA 메틸화 효소 유전자의 발현의 차이가 있는지를 BRB Array tool의 Class comparison analysis를 통하여 분석하였고, p value가 0.001 이하인 유전자인 경우만 유의적인 차이가 있는 것으로 판단하여 유전자를 선별하였다. 그 결과 RBM15 유전자가 모든 환자 유래 유전체 데이터에서 삼중음성유방암에 특이적으로, 유의하게 발현의 차이가 남을 확인할 수 있었다.
추가적인 환자군에서도 RBM15 mRNA의 수준을 측정하고 RBM15의 발현을 T-TEST 기반 분석을 통하여 비교 그룹 간의 유의적인 차이가 있는지를 조사하였다. 그 결과, RBM15의 발현이 삼중음성유방암 환자에서 현저하게 증가해 있음을 확인할 수 있었다(도 2).
실시예 1-2: RBM15 유전자와 유방암의 연관성 확인
또한, RBM15 유전자의 발현과 유방암 환자 생존율과의 연관성을 조사하였다. 환자의 생존율은 Log-rank test 기반 Kaplan-meier plot을 이용하여 분석하였다.
그 결과, RBM15 유전자의 발현이 높을수록 환자의 예후가 좋지 않고, RBM15 유전자의 발현이 낮을수록 환자의 예후가 우수함을 확인할 수 있었으며(도 3), 이로써 RBM15는 그 발현이 환자의 생존율과 연관성이 높으며 암을 유도하는 발암 유전자임을 예측할 수 있었다.
RBM15가 유방암세포의 성장에 영향을 주는지를 조사하기 위하여, 삼중음성유방암 세포주에서 RBM15의 발현을 억제시킨 후 세포 성장을 관찰하였다. 삼중음성암 세포주인 MDA-MB-231과 Hs578T 세포에 shRNA를 형질감염시켰다. 사용된 shRNA의 서열은 표 1에 나타내었다. shRNA는 Sigma 사에 합성을 주문하여 사용하였다.
명칭 서열(5'→ 3') 서열번호
shRBM15 1 CGCGGAAUACAAGACUCUGAA 1
shRMB15 2 GAUCGUUACAACAGCGACAAU 2
약 1000 개의 세포를 6-웰 플레이트에 배양한 후 2 주 후에 세포를 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하였다. 염색된 세포 중에서 콜로니 형성이 된 세포를 골라 세포 수를 측정하고 정량화한 후 유의적인 차이가 있는지를 T-TEST를 통하여 분석하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, RBM15의 발현을 억제시킬 경우 암세포의 성장이 유의적으로 감소함을 확인할 수 있었다. 이로써 RBM15의 발현과 암세포의 성장 사이에 밀접한 연관성이 있음을 알 수 있었다.
RBM15가 어떠한 기전을 통하여 암세포의 성장에 관여하는지를 알아보기 위하여 RBM15에 의하여 영향을 받는 유전자들의 신호전달 체계를 IPA(Ingenuity Pathway Analysis) 분석법을 이용하여 조사하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, RBM15에 의하여 TCA cycle, 아미노산 대사. 콜레스테롤 합성 등 에너지 대사에 관여하는 신호전달 체계가 영향을 받는 것을 알 수 있었다. 이로써 RBM15에 의한 삼중음성유방암 세포의 성장에 대사 관련 유전자들이 연관되어 있음을 간접적으로 알 수 있었다.
실시예 1-3: RBM15와 RNA-메틸화의 연관성 확인
RBM15의 주된 기능은 RNA를 메틸화시켜 유전자의 발현을 조절하는 것이다. RBM15에 의하여 RNA-메틸화가 직접적으로 영향을 받는지를 확인하기 위하여, 삼중음성유방암세포주(MDA-MB-231, Hs578T)에서 RBM15의 발현을 억제시킨 후 RNA 메틸화가 영향을 받는지 조사하였다. MDA-MB-231, Hs578T에 siRNA를 Lipofectamie 300을 이용하여 형질감염시켰다. 사용한 siRNA는 표 2에 나타내었다. siRNA는 Sigma 사에 합성을 주문하여 사용하였다.
명칭 서열(5'→ 3') 서열번호
siRBM15 1 CUGUAACGGAGAGUGAUUU 3
siRMB15 2 CAAUGGUUAUGCCAUUCUU 4
3 일 후 RNA를 추출하고, 추출한 RNA 600 ng을 Epigentek 사의 RNA m6A 메틸화 정량 키트(EpiQuikTM, P-9005;)와 반응시키고 제조사의 프로토콜에 따라 m6A 함량을 측정하고, 최종적으로 얻어진 흡광도를 측정하여 m6A 비율을 정량화하였다.
그 결과, RBM15의 발현이 억제되었을 때 유의하게 RNA-메틸화가 감소함을 확인할 수 있었다(도 6). 이로써 RBM15가 직접적으로 RNA-메틸화에 영향을 주는 인자임을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 유방암 환자 TMA(Tissue Micro Array)를 이용한 RBM15 단백질 발현 확인
실제 환자 유래 조직을 활용한 TMA(Tissue Micro Array) 및 면역염색(IHC; Immunohistochemistry)을 통하여 RBM15의 발현을 확인하였다. 총 120 명의 환자 샘플이 장착된 TMA 슬라이드를 RBM15 항체와 반응시켜 면역염색을 수행하였으며, 통계 처리를 통하여 RBM15의 발현 양상 및 유방암 환자군 간의 유의성을 검증하였다. BioCoreUSA(B-120Bre-1)에서 구입한 파라핀 조직 절편을 사용하여 TMA를 사용한 IHC 분석을 수행하였다. RBM15의 발현은 66059-1-Ig 항체(Prointech)를 이용하여 VECTASTAIN Elite ABC 키트(Vector Laboratories)로 검출하였다. 조직 섹션을 3,3'-디아미노벤지딘(Vector Laboratories)과 함께 인큐베이션하고 핵을 헤마톡실린으로 염색하였다. 슬라이드 당 무작위로 선택된 6 개의 필드를 분석하고 평균처리하였다. 이전에 정의된 바에 따라 양성 세포의 백분율과 염색 강도에 따라 조직 섹션을 정량적으로 점수화하였다. 0, 음성; 1, 약함; 2, 보통; 및 3, 강함의 분류 체계를 이용하여 염색 정도를 비교하였다.
그 결과, 비-삼중음성 유방암(Non-TNBC) 환자와 비교하였을 때, 삼중음성 유방암 환자(TNBC)에서 유의적으로 RBM15의 발현이 증가해 있음을 확인할 수 있었다(도 7).
또한, 정상 암조직(Adjacent normal breast tissue)과 T-TEST를 통하여 그룹 간 발현의 유의한 차이가 있는지를 비교 분석하였다.
그 결과, 삼중음성유방암 환자 조직에서 RBM15의 발현이 유의적으로 증가해 있음을 확인할 수 있었다(도 8).
실시예 3: 분자 모델링을 통한 RBM15 억제제 발굴 및 발현 억제 효과 확인
실시예 1 내지 실시예 2에서 확인한 바와 같이, RBM15의 발현이 삼중음성유방암에서 증가해 있고, 암세포의 성장 및 증식에 중요한 역할을 하기 때문에 RBM15의 발현이나 기능을 억제하는 것이 삼중음성유방암 치료를 위한 방법이 될 수 있다. 따라서 RBM15의 발현을 억제할 수 있는 화합물을 조사하였다.
우선 Gene expression profile을 분석을 통하여 RBM15의 발현을 억제할 수 있는 화합물을 스크리닝하였다. Connectivity Map 소프트웨어를 이용하여 RBM15 발현을 억제할 수 있는 10 개의 화합물을 발굴하였다. 그 화합물들을 다시 In silico, 분자 도킹(Molecular docking) 방법을 활용하여 RBM15 단백질과 직접적인 결합이 있는지를 계산하였다. RBM15 상동성 기반 구조 모델링은 SWISS-MODEL 웹 서버(http://swissmodel.expasy.org)를 사용하여 수행하였고 분자 도킹 시뮬레이션은 소수성 선호 점수 체계를 사용하여 ClusPro 2.0으로 수행하였다. 분자 도킹 분석은 단백질-리간드 도킹에 가장 널리 사용되는 방법 중 하나인 AutoDock Vina(ver. 1.1.2)를 사용하여 수행하였으며 파일 형식은 AutoDock Tools(ver. 1.5.6)(Scripps Research Institute CA, USA)를 사용하여 결정하였다. 화합물에 대한 결합 친화도는 음의 Gibbs 자유 에너지(△G) 점수(kcal/mol)를 사용하여 평가하였으며, 도킹 구조의 그래픽 표현은 PyMOL(ver. 1.3; DeLanoScientific, San Carlos, CA, US)을 사용하여 구성하였다.
그 결과, 상기 10 개 화합물 중 3 개의 화합물(리파부틴(Rifabutin), 오텐제파드(Otenzepad) 및 하이페로사이드(Hyperoside))이 결합 친화도가 높아 RBM15와 직접적으로 결합할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 9).
또한, 추가적 실험을 통하여 리파부틴이 RBM15의 발현을 억제할 수 있는지 확인하였다. 삼중음성유방암 세포주 MDA-MB-231에 리파부틴 약물을 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 5 μM 및 10 μM의 농도로 3 일간 처리한 후 세포에서 단백질을 분리하여 RBM15 단백질 발현 양상을 웨스턴 블랏을 통하여 조사하였다. 분리된 단백질은 SDS-Page에 전기 영동 후 PVDF 맴브레인에 이동하고 후 RBM15 (E8Y8A) Rabbit mAb #60386 항체(Cell signaling)를 이용하여 발현 정도를 확인하였다. 그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 리파부틴 농도 의존적으로 RBM15 단백질 발현양이 감소함을 확인할 수 있었다. 이로써 RBM15의 표적 화합물로써 리파부틴 이 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical Composition for the Prevention or Treatment of Breast Cancer Comprising RBM15 inhibitors <130> PN220039 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRBM15 1 <400> 1 cgcggaauac aagacucuga a 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRBM15 2 <400> 2 gaucguuaca acagcgacaa u 21 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRBM15 1 <400> 3 cuguaacgga gagugauuu 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRBM15 2 <400> 4 caaugguuau gccauucuu 19

Claims (17)

  1. RBM15(RNA Binding Motif Protein 15)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 유방암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 RBM15의 발현 억제제는 RBM15 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA(short interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), microRNA, 앱타머(aptamer), 리보자임, 저분자 화합물, 유전자 가위(CRISPR/Cas-9), DNAzyme, 및 PNA(protein nucleic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 RBM15의 활성 억제제는 RBM15 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩타이드, 펩타이드 유사체(mimetics), 앱타머(aptamer), 단백질 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 약제학적 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 발현 억제제는 서열번호 1 또는 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 shRNA인, 약제학적 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 발현 억제제는 서열번호 3 또는 4의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 siRNA인, 약제학적 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 활성 억제제는 리파부틴(Rifabutin), 오텐제파드(Otenzepad) 및 하이페로사이드(Hyperoside)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 약제학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 유방암은 삼중음성유방암인, 약제학적 조성물.
  8. RBM15(RNA Binding Motif Protein 15) 유전자의 mRNA의 또는 RBM15 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 예후 예측용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제제는
    i) RBM15 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브; 및
    ii) RBM15 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩타이드, 펩타이드 유사체(mimetics), 앱타머(aptamer), 단백질 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 예후 예측용 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 유방암은 삼중음성유방암인, 예후 예측용 조성물.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 유방암 예후 예측용 키트.
  12. 대상(subject)으로부터 분리된 생물학적 시료의 RBM15(RNA Binding Motif Protein 15)유전자 또는 RBM15 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는 유방암 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 세포 배양액, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 유방암 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 유방암은 삼중음성유방암인, 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  15. 다음 단계를 포함하는 유방암의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:
    유방암 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 후보물질을 처리하고, RBM15 유전자의 mRNA 또는 RBM15 단백질의 발현 또는 활성 수준이 감소하는지 여부를 측정하는 단계; RBM15 유전자의 mRNA 또는 RBM15 단백질의 발현 또는 활성 수준이 감소하는 경우, 유방암의 예방 또는 치료용 물질로 판단함.
  16. 제15항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 세포 배양액, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 유방암의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 유방암 환자는 삼중음성유방암 환자인, 유방암의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법.
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