JP2013540102A - アミド結合を介して修飾されたグルカゴンスーパーファミリーのペプチドプロドラッグ - Google Patents

アミド結合を介して修飾されたグルカゴンスーパーファミリーのペプチドプロドラッグ Download PDF

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Abstract

アミド結合を介してジペプチドをグルカゴンスーパーファミリーに結合することでグルカゴンスーパーファミリーのペプチドが修飾された、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドのプロドラッグ調製物が提供される。本明細書に開示のプロドラッグは、半減期が長くなり、化学的な不安定さによって押し進められた反応によって、生理的条件にて活性のある形態に変換される。

Description

＝＝関連出願へのクロスリファレンス＝＝
本出願は、２０１０年６月２４日にファイルされた、米国仮特許出願第６１／３５８，１８８号の優先権の利益を主張するものであり、その内容全体を本明細書に援用する。
＝＝電子的に提出する資料の援用＝＝
２０１０年６月２１日に作成した、ファイル名「Sequence_Listing_213134」のコンピューター読取り可能な塩基／アミノ酸配列リスト（９５７キロバイトのASCII（テキスト）ひとつ）を、本明細書と同時に提出し、その内容全体を本明細書に援用する。
ペプチド系薬剤は、作用時間が比較的短く、治療指数が変わりやすいという特性を持つ、非常に効果的な医薬剤である。本開示は、ペプチド系プロドラッグに関するものであり、そのプロドラッグ誘導体は、作用開始を遅らせて薬剤の半減期を延ばすよう設計されている。作用開始を遅らせることには、プロドラッグが活性化する前にこれを全身に行き渡らせることができるという意味で、利点がある。したがって、このプロドラッグの投与により、投与と同時に最大活性になることで生じる問題がなくなり、原薬の治療指数が高くなる。
受容体の認識と、それに続くペプチドアゴニストおよびタンパク質アゴニストのプロセシングが、多くのペプチド系薬剤やタンパク質系薬剤の主な分解経路である。このように、ペプチド薬がその受容体に結合すると生物学的な刺激が生じるが、その後に生じるペプチドまたはタンパク質の酵素分解によるペプチド／タンパク質誘導反応の不活性化も生じる。本開示によれば、対応する受容体によるプロドラッグの認識を阻害する戦略に基づいて、ペプチドまたはタンパク質の生物学的半減期を長くするプロドラッグを調製することが可能である。
本明細書に開示のプロドラッグは、最終的には受容体によって認識可能な構造に変換されることになるが、この化学変換の速度次第で、in vivoでの生物学的作用の開始タイミングと期間が決まる。本出願に開示した分子設計は、付加的な化学物質すなわち酵素に左右されない、分子内での化学反応を利用している。
プレプログルカゴンは、１５８アミノ酸からなる前駆体ポリペプチドであり、異なる組織でプロセシングされ、グルカゴン（配列番号７０１）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１；７〜３６番目のアミノ酸が配列番号７０３および配列番号７０４として提供される）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２；配列番号７０８）、オキシントモジュリン（ＯＸＭ；配列番号７０６）などの多数の異なるプレグルカゴン由来ペプチドを生成する。これらのペプチドは、グルコースホメオスタシス、インスリン分泌、胃排出、腸管形成ならびに、食物摂取の調節などのさまざまな生理的機能に関与している。
グルカゴンが、（プレプログルカゴンの３３番目から６１番目のアミノ酸に対応する２９アミノ酸からなるペプチドであるのに対し、ＧＬＰ−１は、プレプログルカゴンの７２番目から１０８番目のアミノ酸に対応する３７アミノ酸からなるペプチドとして形成される。ＧＬＰ−１（７−３６）アミド（配列番号７０４；Ｃ末端はアルギニンアミド）またはＧＬＰ−１（７−３７）酸（配列番号７０３；Ｃ末端はグリシン）は、ＧＬＰ−１の生物学的に活性の形態であり、ＧＬＰ−１受容体に対して実質的に同等の活性を示す。
グルカゴンは、重篤な低血糖症の緊急治療に用いられている救命薬である。オキシントモジュリンは、食欲を抑制し、体重を減らす薬理学的機能を有することが報告されている。ＧＬＰ−１受容体アゴニストまたは安定させたＧＬＰ−１類縁体を用いる臨床研究で、このファミリーのペプチドがＩＩ型糖尿病に対する有効な治療薬であることが証明されている。また、そのグルコース依存性の作用がゆえに、これはインスリン療法よりも本質的に安全であろう。このように、低血糖症になる可能性がなくなるのである。構造と活性との関連性についての研究で、完全な作用には、これら３種類のペプチド（グルカゴン、ＧＬＰ−１、オキシントモジュリン）各々のＮ末端のヒスチジンが特に重要であり、Ｎ末端側が伸長した形態では生物学的活性が大幅に低下することが示されている。
グルカゴンやＧＬＰ−１と構造が似ており、同様の活性を有する別のペプチドも知られている。たとえば、エキセンディン−４は、ＧＬＰ−１に構造が似ており、グルカゴンおよびＧＬＰ−１同様にインスリンの放出量を増す、アメリカドクトカゲの唾液に含まれるペプチドである。
また、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）も、グルコース依存性インスリン分泌刺激ペプチドであることが知られており、セクレチンファミリーのホルモンのメンバーである。ＧＩＰは、ＧＩＰ遺伝子にコードされる１５３アミノ酸のプロタンパク質から誘導され、生物学的に活性な４２アミノ酸のペプチド（配列番号７０７）として体内を循環する。ＧＩＰ遺伝子は、小腸ならびに唾液腺で発現される、胃酸分泌に対する弱い阻害因子である。ＧＩＰは、胃での阻害作用に加えて、グルコースが存在すると、生理的用量で投与されたときに膵島β細胞によるインスリンの放出を増す。ＧＩＰは、膵臓インスリンの放出を刺激し、グルコースホメオスタシスの維持に生理的な役割を果たすことのできる、腸内因子として機能すると考えられている。
オステオカルシン（配列番号７０９）は、骨および象牙質に見られる非コラーゲン性タンパク質である。これは骨芽細胞から分泌され、石灰化とカルシウムイオンホメオスタシスに何らかの役割を果たすと考えられている。オステオカルシンは、体内でホルモンとして機能し、膵臓のβ細胞に作用してさらにインスリンを放出させ、同時に、インスリン感受性を上昇させるアディポネクチンホルモンを脂肪細胞に放出させることも報告されている。
オステオカルシン、ＧＩＰ、グルカゴン、ＧＬＰ−１、オキシントモジュリンなどの生体活性ペプチドを治療に用いることに関連したひとつの問題として、これらのペプチドの血漿中での半減期が極めて短い（グルカゴンおよびＧＬＰ−１で約２分）ということがある。したがって、血糖を相応に制御するためには、天然のグルカゴン関連ペプチドを長期間にわたって継続投与しなければならない。グルカゴン関連ペプチドおよびＧＬＰ−１関連ペプチドの半減期が短いのは、２番目と３番目のアミノ酸の間を切断するジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）によって、ペプチドが短時間で分解されることによる。この切断は、天然のペプチドを不活性化するだけでなく、グルカゴンおよびＧＬＰ−１の場合、短縮型がそれぞれの受容体に対する機能的なアンタゴニストになり得る。したがって、薬剤のこうした作用のメカニズムが働いた時に生じる、１００％の治療活性を実現するために、ＧＩＰ、グルカゴン、ＧＬＰ−１、オキシントモジュリンならびに関連のペプチドの、一層長時間にわたって機能する変異種に需要がある。
いくつかの実施形態によれば、グルカゴン、エキセンディン−４、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、ＧＩＰ、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド２７（ＰＡＣＡＰ−２７）、ペプチドヒスチジンメチオニン（ＰＨＭ）、オキシントモジュリン、セクレチン、オステオカルシン、成長ホルモン放出ホルモンならびに、上記のものの類縁体、誘導体、結合体からなる群から選択される生体活性ポリペプチドのプロドラッグ誘導体が提供される。このプロドラッグ誘導体は、生体活性ポリペプチドの活性部位にアミド結合を介して共有結合しているジペプチドプロドラッグ要素を有する。いくつかの実施形態では、このジペプチドは、生体活性ポリペプチドの持つ、これに対応する受容体またはコファクターと相互作用する機能に干渉する位置で、生体活性ポリペプチドに共有結合している。いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、生体活性ペプチドのアミノ末端に結合している。続いて、生理的条件下かつ酵素活性のない中でジペプチドを除去すると、ポリペプチドの完全な活性が回復する。
いくつかの実施形態では、一般構造Ａ−Ｂ−Ｑで表されるプロドラッグが提供される。この実施形態では、Ｑは、グルカゴン関連ペプチド、オステオカルシンならびに、上記のものの類縁体、誘導体、結合体を含む、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドの群から選択される生体活性ペプチドであり、Ａ−Ｂは、アミド結合を介して生体活性ペプチドに結合したジペプチドプロドラッグを表す。特に、いくつかの実施形態では、Ａはアミノ酸またはヒドロキシ酸であり、Ｂは、（Ａ−Ｂの）ＢのカルボキシルとＱのアミンとの間のアミド結合の形成によってＱに結合した、Ｎ−アルキル化されたアミノ酸である。さらに、いくつかの実施形態では、Ａ、ＢまたはＡ−Ｂが結合しているＱのアミノ酸は、コードされていないアミノ酸であり、ＱからのＡ−Ｂの化学反応による切断は、ＰＢＳ中にて生理的条件下で、約１時間から約７２０時間以内に少なくとも約９０％完了する。もうひとつの実施形態では、ＱからのＡ−Ｂの化学反応による切断は、ＰＢＳ中にて生理的条件下で、約１時間または約１週間以内に少なくとも約５０％完了する。
いくつかの実施形態では、ＡおよびＢは、哺乳動物の血清に含まれる酵素によるＱからのＡ−Ｂジペプチドの酵素的な切断を阻害するよう選択される。いくつかの実施形態では、Ａおよび／またはＢは、ＰＢＳ中にて生理的条件下でＱからＡ−Ｂが切断される半減期が、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼを含む溶液中でのＱからＡ−Ｂが切断される半減期の２倍以下である（すなわち、ＱからのＡ−Ｂの切断が、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼの存在下、生理的条件で、酵素のない理想的な状態の２倍を超える速度では起こらない）ように選択される。いくつかの実施形態では、Ａおよび／またはＢは、Ｄ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸である。例示としてのいくつかの実施形態では、Ａは、Ｄ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸であり、Ｂは、Ｌ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸である。例示としてのいくつかの実施形態では、Ａは、Ｌ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸であり、Ｂは、Ｄ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸である。例示としてのいくつかの実施形態では、Ａは、Ｄ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸であり、Ｂは、Ｄ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素（Ａ−Ｂ）は、式Ｉの一般構造を有する化合物を含む。
Figure 2013540102

（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ８は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１は、Ｎ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルまたはアリールを形成し、あるいは、Ｒ４およびＲ８は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキルを形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、ＨおよびＯＨからなる群から選択される。）
Ｗ１がＮである場合、生理的条件下で、窒素原子がＨに結合するのは当業者には明らかである。
もうひとつの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素（Ａ−Ｂ）は、式Ｉの一般構造を有する化合物を含む。
Figure 2013540102

（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ８は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１は、Ｎ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成し、あるいは、Ｒ４およびＲ８は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキルを形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ１は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択される。）
上述したように、いくつかの態様では、一般構造Ａ−Ｂ−Ｑ（式中、Ｑは、グルカゴンスーパーファミリーのペプチド（たとえば、グルカゴン関連ペプチド、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ；配列番号７１９）、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ；配列番号７２０）、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド２７（ＰＡＣＡＰ−２７；配列番号７２１）、ペプチドヒスチジンメチオニン（ＰＨＭ；配列番号７２２）またはセクレチン（配列番号７２３）および／またはこれらの類縁体、誘導体、結合体など）である）を有するプロドラッグが提供される。グルカゴンスーパーファミリーのペプチドは、Ｎ末端のアミノ酸の相同性および／またはＣ末端領域のα螺旋構造を含むがこれに限定されるものではない、共通の構造的な特徴を有するものであってもよい。機能し、Ｎ末端は通常、受容体のシグナル伝達において機能すると考えられている。Ｎ末端部分およびＣ末端領域における数個のアミノ酸は、１番目のヒスチジン、４番目のグリシン、６番目のフェニルアラニン、２２番目のフェニルアラニン、２３番目のバリン、２５番目のスレオニン、２６番目のロイシンなどのグルカゴンスーパーファミリーのメンバー間で高度に保存され、これらの位置のアミノ酸が、アミノ酸側鎖で同一性、保存的な置換または類似性を示している。いくつかの実施形態では、Ｑは、グルカゴン関連ペプチド、たとえば、グルカゴン（配列番号７０１）、オキシントモジュリン（配列番号７０６）、エキセンディン−４（配列番号７１８）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）（配列番号７０３および７０７として提供されるアミノ酸７−３７）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）（配列番号７０８）、ＧＩＰ（配列番号７０７）または上記のものの類縁体、誘導体、結合体である。いくつかの実施形態では、グルカゴン関連ペプチドとしてのＱは、天然のペプチドの全長にわたって（あるいはグルカゴンに対応する位置全体にわたって；たとえば、図１０を参照のこと）、天然のグルカゴン、天然のオキシントモジュリン、天然のエキセンディン−４、天然の（７−３７）ＧＬＰ−１、天然のＧＬＰ−２または天然のＧＩＰ対応する配列と少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、グルカゴンスーパーファミリーのペプチド（Ｑ）は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸修飾を有する、天然のグルカゴン、天然のエキセンディン−４、天然の（７−３７）ＧＬＰ−１、天然のＧＬＰ−２、天然のＧＨＲＨ、天然のＶＩＰ、天然のＰＡＣＡＰ−２７、天然のＰＨＭ、天然のオキシントモジュリン、天然のセクレチンまたは天然のＧＩＰのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、Ｑは、２つまたは３つ以上の天然のグルカゴン関連ペプチド配列のキメラであるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｑは、配列番号７０１の１２番目から２９番目のアミノ酸に対応するアミノ酸のα螺旋構造を保持する、天然のグルカゴン（配列番号７０１）と少なくとも約５０％同一のアミノ酸配列を有する。
Ｑは、たとえば、当分野で知られたようなグルカゴン関連ペプチド（そのうちのいくつかを非限定的な例として本明細書に開示する）など、当分野で知られたどのようなグルカゴンスーパーファミリーのペプチドであってもよい。多岐にわたるＧＬＰ−１類縁体が当分野で知られており、本発明によるグルカゴン関連ペプチドである。たとえば、国際特許出願公開公報ＷＯ２００８０２３０５０、ＷＯ２００７０３０５１９、ＷＯ２００５０５８９５４、ＷＯ２００３０１１８９２、ＷＯ２００７０４６８３４、ＷＯ２００６１３４３４０、ＷＯ２００６１２４５２９、ＷＯ２００４０２２００４、ＷＯ２００３０１８５１６、ＷＯ２００７１２４４６１（ＧＬＰ−１類縁体または誘導体の配列または式の開示について、それぞれの内容全体を本明細書に援用する）を参照のこと。特定の実施形態では、Ｑは、本明細書で詳細に説明するような、クラス１、クラス２、クラス３、クラス４またはクラス５のグルカゴン関連ペプチドである。本明細書に記載のいずれの実施形態においても、Ｑは、配列番号１〜６８４、７０１〜７４２、８０１〜９１９、１００１〜１２６２、１３０１〜１３７１、１４０１〜１５１８、１７０１〜１７７６、１８０１〜１９０８のいずれかである。
Ａ−Ｂなどのジペプチドプロドラッグは、Ｑの活性に干渉するどの位置でＱに結合してもよいが、本明細書に開示の実施形態は、Ａ−Ｂの結合に適した位置の例を示すものである。位置の番号が、本明細書において天然のグルカゴン配列（配列番号７０１）の位置を参照して付けられている場合、グルカゴン類縁体または他のグルカゴンスーパーファミリーのペプチドの対応する位置を、アライメントによって求めることができる。たとえば、特定のグルカゴンスーパーファミリーのペプチドのアライメントを示す図１０を参照のこと。たとえば、天然のグルカゴンでの２４番目は、（７−３７）ＧＬＰ−１の２４番目に対応する。
特定の実施形態では、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、GPSSGAPPPS（配列番号７１０）、GPSSGAPPPS-CONH2（配列番号７１１）、オキシントモジュリンのカルボキシ末端延長部分、KRNRNNIA（配列番号７１４）またはKGKKNDWKHNITQ（配列番号７１３）を含むがこれらに限定されるものではない、Ｃ末端またはＣ末端のアミノ酸配列を含むものであってもよい。グルカゴンスーパーファミリーのペプチドの別のＣ末端のアミノ酸配列については、以下において詳細に説明する。
他の態様では、Ｑは、オステオカルシン（配列番号７０９）または天然のペプチドの全長にわたって、天然のオステオカルシンと少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％同一のアミノ酸配列を有する。Ｑは、天然のオステオカルシンと比べて、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸修飾を有する、オステオカルシンの類縁体を有するものであってもよい。さらに他の態様では、Ｑは、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）（配列番号７１９）または天然のペプチドの全長にわたって天然のＧＨＲＨと少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％同一のアミノ酸配列を有する。Ｑは、天然のＧＨＲＨと比較して最大１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸修飾を有するＧＨＲＨの類縁体を有するものであってもよい。いくつかの実施形態では、Ｑは、当分野で知られたオステオカルシンまたはＧＨＲＨのどのような類縁体であってもよい。
別の実施形態では、一般構造Ａ−Ｂ−Ｑ（式中、Ｑは、グルカゴンスーパーファミリーのペプチド、オステオカルシンまたはそれらの類縁体、誘導体または結合体であり、Ａ−Ｂは、以下の一般構造を有する）を有するプロドラッグが提供される。
Figure 2013540102

式中、Ｒ１およびＲ８は独立に、ＨおよびＣ１〜Ｃ８アルキルからなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ４は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、ＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキルを形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキルからなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６は、Ｈであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、ＨおよびＯＨからなる群から選択される。
ただし、Ｒ４およびＲ３が、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成する場合、Ｒ１およびＲ２はともに、Ｈ以外である。
他の実施形態では、一般構造Ａ−Ｂ−Ｑ（式中、Ｑはグルカゴンスーパーファミリーのペプチド、オステオカルシンまたはそれらの類縁体、誘導体または結合体であり、Ａ−Ｂは、以下の一般構造を有する）を有するプロドラッグが提供される。
Figure 2013540102

式中、
Ｒ１およびＲ８は独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキルであり、
Ｒ２およびＲ４は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、ＣＨ２（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキルからなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択されるが、
ただし、Ｒ４およびＲ３が、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成する場合、Ｒ１およびＲ２は、ともにＨではない。
いくつかの実施形態では、Ｑは、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ；配列番号７１９）、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ；配列番号７２０）、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド２７（ＰＡＣＡＰ−２７；配列番号７２１）、ペプチドヒスチジンメチオニン（ＰＨＭ；配列番号７２２）またはセクレチン（配列番号７２３）、グルカゴン（配列番号７０１）、エキセンディン−４（配列番号７１８）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）（配列番号７０３および７０４として提供されるアミノ酸７−３７）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）（配列番号７０８）、ＧＩＰ（配列番号７０７）または上記のものの類縁体、誘導体、結合体からなる群から選択されるペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｑは、グルカゴン関連ペプチドである。
もうひとつの実施形態では、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドまたはオステオカルシンまたはその類縁体、誘導体または結合体のプロドラッグ類縁体が提供される。ここで、プロドラッグ部分（Ａ−Ｂ）は、Ｑの配列における１つまたは２つ以上の末端以外のアミノ酸残基、たとえば、天然のグルカゴン（配列番号７０１）の１２番目、１６番目、１７番目、１８番目、２０番目、２８番目または２９番目に対応するＱの位置で、Ｑに共有結合している。たとえば、特定の実施形態では、プロドラッグ部分（Ａ−Ｂ）は、直接的にまたはリンカーを介して、Ｑの置換された２０番目のＬｙｓに結合している。このような実施形態では、Ｑは、（天然のグルカゴン配列の）２０番目に、以下の構造の置換を有するものであってもよい。
Figure 2013540102

他の実施形態では、プロドラッグ部分（Ａ−Ｂ）は、直接的にまたはリンカーを介して、２２番目で置換されたアミノフェニルアラニンに結合している。このような実施形態では、Ｑは、（天然のグルカゴン配列の）２２番目に、以下の構造の置換を有するものであってもよい。
Figure 2013540102

上記に代えてまたは上記に加えて、プロドラッグ部分（Ａ−Ｂ）は、直接的にまたはリンカーを介してＱのアミノ末端に結合し、ここで、Ａ−Ｂは、以下の構造を有する。
Figure 2013540102

式中、Ｒ１およびＲ８は独立に、ＨおよびＣ１〜Ｃ８アルキルからなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ４は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、ＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキルを形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキルからなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６は、Ｈであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、ＨおよびＯＨからなる群から選択されるが、
ただし、Ｒ４およびＲ３が、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成する場合、Ｒ１およびＲ２は各々Ｈ以外である。
他の実施形態では、プロドラッグ部分（Ａ−Ｂ）は、直接的にまたはリンカーを介してＱのアミノ末端に結合し、ここで、Ａ−Ｂは、以下の構造を有する。
Figure 2013540102

式中、
Ｒ１およびＲ８は独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキルであり、
Ｒ２およびＲ４は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、ＣＨ２（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキルからなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択されるが、
ただし、Ｒ４およびＲ３が、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成する場合、Ｒ１およびＲ２は、ともにＨではない。
いくつかの実施形態では、１つのプロドラッグ部分しかＱに結合しない。たとえば、このような実施形態では、プロドラッグ部分（Ａ−Ｂ）がＮ末端でＱに結合すると、Ｑの配列の末端以外のアミノ酸残基に結合するプロドラッグ部分（Ａ−Ｂ）は存在せず、逆もまた真である。いくつかの実施形態では、たとえばＮ末端と、１箇所または２箇所以上の末端以外の部位など、２つまたは３つのプロドラッグ部分がＱに結合する。
１週間分の用量である１５ｎｍｏｌ／ｋｇまたは７０ｎｍｏｌ／ｋｇのグルカゴン類縁体を１回で腹腔内注射した、食餌で誘導した肥満（ＤＩＯ）マウスの体重変化を示すグラフである。溶媒のみ▼、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドＡ（「ペプチドＡ」）を１５ｎｍｏｌ／ｋｇ（右方向白三角）または７０ｎｍｏｌ／ｋｇ（右方向黒三角）またはペプチドＡのプロドラッグ誘導体（ジペプチドは、アミド結合を介してペプチドＡのＮ末端に結合し、ジペプチドは、Ａｉｂ−１ Ｐｒｏ０（１５ｎｍｏｌ／ｋｇ（○）または７０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与（●））、Ａｉｂ−１ ｄＰｒｏ０（７０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与（◇））、Ｌｙｓ−１ Ｓａｒ０（７０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与（◆））、ｄＡｌａ−１ Ｐｒｏ０（７０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与（左方向黒三角））またはＡｃ−Ａｉｂ−１ Ｐｒｏ−１（７０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与（■））である）を初回注射後に、毎日マウスの体重を量った（Ｎ＝８）。 溶媒のみ（◆）、ペプチドＡ（▲０．５、右方向黒三角３、▼１５または左方向黒三角７０、単位はｎｍｏｌ／ｋｇ／日）またはＬｙｓ−１ Ｓａｒ０−ペプチドＡ（△０．５、右方向白三角３、▽１５または左方向白三角７０、単位はｎｍｏｌ／ｋｇ／日）を、１週間分の用量である０．５ｎｍｏｌ／ｋｇ、３ｎｍｏｌ／ｋｇ、１５ｎｍｏｌ／ｋｇまたは７０ｎｍｏｌ／ｋｇで１回で腹腔内注射した、食餌で誘導した肥満（ＤＩＯ）マウスの体重変化を示すグラフである。 最初にグルカゴン関連ペプチドを注射した後、グルコース溶液を注射したＤＩＯマウス（Ｎ＝８）の血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示すグラフである。マウスには、−６０分の時点で、用量１５ｎｍｏｌ／ｋｇまたは７０ｎｍｏｌ／ｋｇで以下のうちの１つを腹腔内注射するか、溶媒のみ（▲）を腹腔内注射した。 （Ａ）ペプチドＡ（左方向白三角１５または左方向黒三角７０、単位はｎｍｏｌ／ｋｇ／日） （Ｂ）Ｌｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（右方向白三角１５または右方向黒三角７０、単位はｎｍｏｌ／ｋｇ／日）または （Ｃ）ｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（□１５または■７０、単位はｎｍｏｌ／ｋｇ／日） ２５％（ｖ／ｖ）のグルコースを含有する生理食塩水を、０分の時点で、体重１ｋｇあたり１．５ｇの用量で注射した。−６０分、０分、１５分、３０分、６０分、１２０分の時点で、血中グルコース濃度を測定した。 最初にグルカゴン関連ペプチドを注射した後、グルコース溶液を注射したＤＩＯマウス（Ｎ＝８）の血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示すグラフである。マウスには、−１５分の時点で、溶媒のみ（▼）を腹腔内注射するか、用量２ｎｍｏｌ／ｋｇで以下の化合物のうちの１つを腹腔内注射した。 （Ａ）Ｌｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（■） （Ｂ）Ｌｙｓ−１（Ｘ）， Ｓａｒ０ペプチドＡ（▲）（Ｘは、Ｌｙｓ側鎖に結合した１ＫのＰＥＧ鎖を表す） （Ｃ）Ｌｙｓ−１（Ｙ）， Ｓａｒ０ペプチドＡ（◆）（Ｙは、Ｌｙｓ側鎖に結合したｔｅｒｔ−ブチルグリシンを表す） （Ｄ）ｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（右方向黒三角） ２５％（ｖ／ｖ）のグルコースを含有する生理食塩水を、０分の時点で、体重１ｋｇあたり１．５ｇの用量で注射した。−１５分、０分、１５分、３０分、６０分、１２０分の時点で、血中グルコース濃度を測定した。 最初にグルカゴン関連ペプチドを注射した後、グルコース溶液を注射したＤＩＯマウス（Ｎ＝８）の血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示すグラフである。マウスには、−１５分の時点で、溶媒（▼）、２０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量のｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（右方向黒三角）を腹腔内注射するか、あるいは、用量０．６７ｎｍｏｌ／ｋｇで以下の化合物のうちの１つを腹腔内注射した。 （Ａ）Ｌｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（■） （Ｂ）Ｌｙｓ−１（Ｘ）， Ｓａｒ０ペプチドＡ（▲）（Ｘは、Ｌｙｓ側鎖に結合した１ＫのＰＥＧ鎖を表す） （Ｃ） Ｌｙｓ−１（Ｙ）， Ｓａｒ０ペプチドＡ（◆）（Ｙは、Ｌｙｓ側鎖に結合したｔｅｒｔ−ブチルグリシンを表す） ２５％（ｖ／ｖ）のグルコースを含有する生理食塩水を、０分の時点で、体重１ｋｇあたり１．５ｇの用量で注射した。−１５分、０分、１５分、３０分、６０分、１２０分の時点で、血中グルコース濃度を測定した。 最初にグルカゴン関連ペプチドを注射した後、グルコース溶液を注射したＤＩＯマウス（Ｎ＝８）の血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示すグラフである。マウスには、−６０分の時点で、溶媒のみ（▼）を腹腔内注射するか、あるいは、用量１５ｎｍｏｌ／ｋｇまたは７０ｎｍｏｌ／ｋｇで以下の化合物のうちの１つ腹腔内注射した。 （Ａ）ペプチドＡ（△１５または▲７０、単位はｎｍｏｌ／ｋｇ／日） （Ｂ）ｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（□１５または■７０、単位はｎｍｏｌ／ｋｇ／日）または （Ｃ）Ｌｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（右方向白三角１５または右方向黒三角７０、単位はｎｍｏｌ／ｋｇ／日） ２５％（ｖ／ｖ）のグルコースを含有する生理食塩水を、０分の時点および２４時間後に、体重１ｋｇあたり１．５ｇの用量で注射した（図７参照）。図示の血中グルコース濃度は、グルコース溶液の初回投与時（すなわち０分の時点）を基準に、−６０分、０分、１５分、３０分、６０分、１２０分の時点で測定したものである。 −６０分の時点で、溶媒のみ（▼）を腹腔内注射するか、あるいは、用量１５ｎｍｏｌ／ｋｇまたは７０ｎｍｏｌ／ｋｇで以下の化合物のうちの１つを腹腔内注射したＤＩＯマウス（Ｎ＝８）の血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示すグラフである。 （Ａ）ペプチドＡ（△１５または▲７０、単位はｎｍｏｌ／ｋｇ／日） （Ｂ）ｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（◇１５または▽７０、単位はｎｍｏｌ／ｋｇ／日）または （Ｃ）Ｌｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（◆１５または■７０、単位はｎｍｏｌ／ｋｇ／日） ２５％（ｖ／ｖ）のグルコースを含有する生理食塩水を、０分の時点および２４時間後に、体重１ｋｇあたり１．５ｇの用量で注射した。図示の血中グルコース濃度は、２４時間後に投与した２回目のグルコース溶液を基準に、０分、１５分、３０分、６０分、１２０分の時点で測定したものである。 図示の化合物を、用量１５ｎｍｏｌ／ｋｇまたは７０ｎｍｏｌ／ｋｇのいずれかで腹腔内注射したＤＩＯマウス（Ｎ＝８）での体重減少を示すデータである。図示の体重は、化合物の投与後７日目に測定したものである。 ＤＩＯマウス（ｎ＝８）の血糖（ＢＧ）レベル（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを示す。マウスには、２５％グルコースを含む生理食塩水を体重１ｋｇあたり１．５ｇ注射して（図示のように）負荷をかける２４時間前、８時間前、４時間前または１時間前に、溶媒のみまたはプロドラッグペプチドを腹腔内注射した。図示の０分、１５分、３０分、６０分、１２０分の時点で、グルコース溶液での負荷を基準に血中グルコース濃度を測定した。図９Ａは、Ｌｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（すなわち、Ｌｙｓ−１−Ｓａｒ０プロドラッグ要素を含む）投与後の血中グルコース濃度を示す。 ＤＩＯマウス（ｎ＝８）の血糖（ＢＧ）レベル（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを示す。マウスには、２５％グルコースを含む生理食塩水を体重１ｋｇあたり１．５ｇ注射して（図示のように）負荷をかける２４時間前、８時間前、４時間前または１時間前に、溶媒のみまたはプロドラッグペプチドを腹腔内注射した。図示の０分、１５分、３０分、６０分、１２０分の時点で、グルコース溶液での負荷を基準に血中グルコース濃度を測定した。図９Ｂは、ｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（すなわち、Ｄ−Ｌｙｓ−１−Ｓａｒ０プロドラッグ要素を含む）投与後の血中グルコース濃度を示す。 さまざまなグルカゴンスーパーファミリーのペプチドまたはその関連断片のアミノ酸配列のアライメントを示す。図示のアミノ酸配列は、ＧＨＲＨ（配列番号７１９）、ＰＨＩ（配列番号７２２）、ＶＩＰ（配列番号７２０）、ＰＡＣＡＰ−２７（配列番号７２１）、エキセンディン−４（配列番号７１８）、ＧＬＰ−１（配列番号７０３）、グルカゴン（配列番号７０１）、オキシントモジュリン（配列番号７０６）、ＧＩＰ（配列番号７０７）、ＧＬＰ−２（配列番号７０８）、セクレチン（配列番号７２４）である。 溶媒のみあるいは、１０ｎｍｏｌ／ｋｇで以下のうちの１つを１回で皮下注射したＤＩＯマウス（マウス８匹ずつ９群）の血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）のグラフを示す。 （Ａ）グルカゴンスーパーファミリーペプチドＣ（「ペプチドＣ」） （Ｂ）ｄＫ−Ｓａｒ−ペプチドＣ （Ｃ）ｄＫ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）−グルカゴンスーパーファミリーペプチドＢ（「ペプチドＢ」）または （Ｄ）ｄＫ−Ｆ（Ｎ−Ｍｅ）−ペプチドＣマウスは５．５月齢であり、約２か月間にわたって、規定の高脂肪飼料を給餌された。注射後０時間、２時間、４時間、２４時間、７２時間の時点で、血中グルコース濃度を測定した。 溶媒のみあるいは、１０ｎｍｏｌ／ｋｇで以下のうちの１つを１回で皮下注射したＤＩＯマウス（マウス８匹ずつ９群）の体重変化のグラフを示す。 （Ａ）ペプチドＣ （Ｂ）ｄＫ−Ｓａｒ−ペプチドＣ （Ｃ）ｄＫ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）−ペプチドＢまたは （Ｄ）ｄＫ−Ｆ（Ｎ−Ｍｅ）−ペプチドＣマウスは５．５月齢であり、約２か月間にわたって、規定の高脂肪飼料を給餌された。１週間の研究の間、食物摂取量および体脂肪量も監視した。 ＧＬＰ−受容体ルシフェラーゼアッセイを基準に判断できる、２０％ヒト血漿におけるｄＫ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）−ペプチドＢ（図１３Ａ）の受容体結合活性を示す。 ＧＬＰ−受容体ルシフェラーゼアッセイを基準に判断できる、２０％ヒト血漿におけるｄＫ−Ｓａｒ−ペプチドＣ（図１３Ｂ）の受容体結合活性を示す。 ３ｎｍｏｌ／ｋｇ、１０ｎｍｏｌ／ｋｇまたは３０ｎｍｏｌ／ｋｇの溶媒のみまたは以下の化合物のうちの１つを１回で皮下注射したＤＩＯマウス（ｎ＝８）の体重変化のグラフを示す。 （Ａ）ペプチドＣ （Ｂ）ｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＣまたは （Ｃ）ｄＬｙｓ−１ Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）０ペプチドＢ研究の１日目、３日目、５日目、７日目に体重を測定した。マウスは、５月齢で初期平均体重３１．２ｇ、約５か月間にわたって定期的に固形飼料を給餌された。 ３ｎｍｏｌ／ｋｇ、１０ｎｍｏｌ／ｋｇまたは３０ｎｍｏｌ／ｋｇの溶媒のみまたは以下の化合物のうちの１つを１回で皮下注射したＤＩＯマウス（ｎ＝８）の血糖（ＢＧ）レベル（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。 （Ａ）ペプチドＣ （Ｂ）ｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＣまたは （Ｃ）ｄＬｙｓ−１ Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）０ペプチドＢ図示の血中グルコース濃度を１日目に腹腔内で測定した。マウスは５月齢で、約５か月間にわたって定期的に固形飼料を給餌された。 ３ｎｍｏｌ／ｋｇ、１０ｎｍｏｌ／ｋｇまたは３０ｎｍｏｌ／ｋｇの溶媒のみまたは以下の化合物のうちの１つを１回で皮下注射したＤＩＯマウス（ｎ＝８）の血糖（ＢＧ）レベル（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。 （Ａ）ペプチドＣ （Ｂ）ｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＣまたは （Ｃ）ｄＬｙｓ−１ Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）０ペプチドＢ図示の血中グルコース濃度を３日目に腹腔内で測定した。マウスは５月齢で、約５か月間にわたって定期的に固形飼料を給餌された。 ３ｎｍｏｌ／ｋｇ、１０ｎｍｏｌ／ｋｇまたは３０ｎｍｏｌ／ｋｇの溶媒のみまたは以下の化合物のうちの１つを１回で皮下注射したＤＩＯマウス（ｎ＝８）の血糖（ＢＧ）レベル（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。 （Ａ）ペプチドＣ （Ｂ）ｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＣまたは （Ｃ）ｄＬｙｓ−１ Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）０ペプチドＢ図示の血中グルコース濃度を５日目に腹腔内で測定した。マウスは５月齢で、約５か月間にわたって定期的に固形飼料を給餌された。 ＧＬＰ−受容体ルシフェラーゼアッセイを基準に判断できる、２０％ヒト血漿におけるｄＬｙｓ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）−ペプチドＣの受容体結合活性を示す。 ＧＬＰ−受容体ルシフェラーゼアッセイを基準に判断できる、２０％ヒト血漿におけるｄＬｙｓ−Ｓａｒ−ペプチドＣの受容体結合活性を示す。 ＧＬＰ−受容体ルシフェラーゼアッセイを基準に判断できる、２０％ヒト血漿におけるｄＬｙｓ−Ｐｈｅ（Ｎ−メチル）−ペプチドＣの受容体結合活性を示す。 ＧＬＰ−受容体ルシフェラーゼアッセイを基準に判断できる、２０％ヒト血漿におけるＡｉｂ−Ｓａｒ−ペプチドＤの受容体結合活性を示す。 ＧＬＰ−受容体ルシフェラーゼアッセイを基準に判断できる、２０％ヒト血漿におけるｄＬｙｓ−Ｓａｒ−ペプチドＤの受容体結合活性を示す。 ＧＬＰ−受容体ルシフェラーゼアッセイを基準に判断できる、２０％ヒト血漿におけるｄＫ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）−ペプチドＤの受容体結合活性を示す。 ＧＬＰ−受容体ルシフェラーゼアッセイを基準に判断できる、２０％ヒト血漿におけるｄＬｙｓ−Ｐｈｅ（Ｎ−メチル）−ペプチドＤの受容体結合活性を示す。 ７２時間の過程で単回皮下用量で投与した場合に、マウスに図示の濃度のペプチドＤおよびＡｉｂ−Ｓａｒ−ペプチドＤが血中グルコース濃度に対しておよぼす影響のグラフを示す。
定義
本発明について説明し、権利請求するにあたり、以下に示す定義に従って次のような技術用語を使用する。
本明細書で使用する場合、「プロドラッグ」という用語を、その完全な薬理作用を発揮する前に化学修飾がなされる化合物として定義する。
本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、アミノ官能基とカルボキシ官能基の両方を含む分子を包含し、ここでのアミノ基とカルボキシレート基は同一の炭素（α炭素）に結合している。α炭素は、任意に、１個または２個の別の有機置換基を有するものであってもよい。アミノ酸は、その３文字コード、１文字コードあるいは、場合によってはその側鎖の名称で表記可能なものである。たとえば、α炭素に結合したシクロヘキサン基を有する非天然のアミノ酸を、「シクロヘキサン」または「シクロヘキシル」と呼ぶ。本開示の目的で、異性体の型を明記しない場合のアミノ酸の表示は、アミノ酸のＬ型またはＤ型あるいは、ラセミ混合物を包含することを意図している。しかしながら、アミノ酸を３文字コードで表記し、そこに上付の数字を含む（すなわち、Ｌｙｓ−１）場合、その表示はアミノ酸の天然のＬ型を示すことを意図したものであるのに対し、Ｄ型については、３文字コードの前に半角のｄと、上付の数字を含めて示してある（すなわち、ｄＬｙｓ−１）。
本明細書で使用する場合、「ヒドロキシ酸」という用語は、α炭素のアミノ基をヒドロキシ基に入れ換える修飾がなされたアミノ酸を示す。
本明細書で使用する場合、「コードされていないアミノ酸」という表現は、以下の２０種類のアミノ酸すなわち、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、ＴｙｒのいずれのＬ異性体でもないアミノ酸を包含する。
「ジペプチド」は、α−アミノ酸またはα−ヒドロキシ酸が、ペプチド結合を介して別のアミノ酸と結合した結果である。
本明細書で使用する場合、「化学反応による切断」という表現は、他に何ら断りがなければ、化学的共有結合の切断につながる酵素によらない反応を包含する。
「生体活性ポリペプチド」とは、in vitroおよび／またはin vivoにて生物学的作用をおよぼすことのできるポリペプチドをいう。
本明細書で使用する場合、「アシル化された」アミノ酸は、それを製造する手段とは関係なく、天然のアミノ酸に対して非天然のアシル基を含むアミノ酸である。アシル化されたアミノ酸およびアシル化されたペプチドを製造する方法の例は、当分野で知られており、アミノ酸をアシル化した上でペプチドに含ませることや、ペプチド合成後にこのペプチドを化学的にアシル化することを含む。いくつかの実施形態では、アシル基が、ペプチドに、（ｉ）血中半減期を延ばすこと、（ｉｉ）作用開始を遅らせること、（ｉｉｉ）作用時間を延ばすこと、（ｉｖ）ＤＰＰ−ＩＶなどのプロテアーゼに対する耐性を改善すること、（ｖ）グルカゴンスーパーファミリーのペプチド受容体および／またはオステオカルシンペプチド受容体における作用を増強することのうちの１つまたは２つ以上をさせる。
本明細書で使用する場合、「アルキル化された」アミノ酸は、それを製造する手段とは関係なく、天然のアミノ酸に対して非天然のアルキル基を含むアミノ酸である。アルキル化されたアミノ酸およびアルキル化されたペプチドを製造する方法の例は、当分野で知られており、アミノ酸をアルキル化した上でペプチドに含ませることや、ペプチド合成後にこのペプチドを化学的にアルキル化することを含む。特定の理論に拘泥することなく、ペプチドのアルキル化によって、ペプチドのアシル化と同一でないにしても似たような作用、たとえば、血中半減期を延ばすこと、作用開始を遅らせること、作用時間を延ばすこと、ＤＰＰ−ＩＶなどのプロテアーゼに対する耐性を改善すること、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドおよび／またはオステオカルシンペプチド受容体における作用を増強することなどが達成されると考えられている。
本明細書で使用する場合、一般的にペプチドと言及すると、アミノ末端とカルボキシ末端が修飾されたペプチドを包含することを意図している。たとえば、標準的なアミノ酸を選定しているアミノ酸配列には、Ｎ末端およびＣ末端の標準的なアミノ酸のみならず、Ｎ末端の対応するヒドロキシ酸および／またはＣ末端のカルボン酸に代えてアミド基を含むように修飾された対応するＣ末端のアミノ酸を包含することを意図している。
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容されるキャリア」という表現は、リン酸緩衝生理食塩水、水、水中油滴型エマルションまたは油中水滴型エマルションなどのエマルションならびに、さまざまなタイプの湿潤剤といった、標準的な薬学的キャリアを含む。また、この表現は、ヒトをはじめとする動物での用途向けに米国連邦政府の規制当局によって承認された薬剤または米国薬局方に記載された薬剤も包含する。
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される塩」という表現は、親化合物の生物学的活性を保持し、かつ、生物学的にまたはそれ以外に望ましくない点のない化合物の塩を示す。本明細書に開示する化合物の多くは、アミノ基および／またはカルボキシ基またはこれらに類する基が存在することで、酸性塩および／または塩基性塩を形成可能である。
薬学的に許容される塩基付加塩は、無機塩基および有機塩基から調製可能なものである。無機塩基から誘導される塩としては、単なる一例として、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩があげられる。有機塩基から誘導される塩としては、第１級アミンの塩、第２級アミンの塩、第３級アミンの塩があげられるが、これらに限定されるものではない。
薬学的に許容される酸付加塩を、無機酸および有機酸から調製してもよい。無機酸から誘導される塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などがあげられる。有機酸から誘導される塩としては、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエン−スルホン酸、サリチル酸などがあげられる。
本明細書で使用する場合、「治療する」という表現は、特定の障害または状態の予防法あるいは、特定の障害または状態に関連する症状の軽減および／またはこれらの症状を予防または解消することを含む。たとえば、本明細書で使用する場合、「糖尿病を治療する」という表現は、概して、血中グルコース濃度を正常なレベル付近に維持することを示し、個々の状況に応じて血中グルコース濃度を上昇させるか低下させることを含む場合もある。
本明細書で使用する場合、プロドラッグの「有効」量または「治療有効量」とは、無毒であるが、望ましい効果を得るのに十分なプロドラッグの量を示す。たとえば、ひとつの望ましい効果として、高血糖症を予防または治療できることがあろう。「有効な」量は、個人の年齢や全身状態、投与モードなどに応じて、治療対象者ごとに変わってくる。このため、常に正確な「有効量」を規定できるわけではない。しかしながら、個々の症例における適切な「有効」量については、当業者がルーチンな実験を用いて判断できる。
「非経口」という用語は、消化管を経由せず、皮下、筋肉内、脊髄内または静脈内など、他の何らかの経路によることを意味する。
「同一性」という用語は、本明細書で使用する場合、２つまたは３つ以上の配列間の類似性と関連している。同一性は、同一残基数を残基の総数で割り、その結果に１００を掛けてパーセンテージを得ることで求められる。このため、完全に同じ配列の２つのコピーは同一性が１００％であるのに対し、比較したときにアミノ酸の欠失、付加または置換のある２つの配列の同一性の度合いは、それよりも低くなる。BLAST（Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410）などのアルゴリズムを用いたものなどのいくつかのコンピュータープログラムを利用して配列の同一性を求められることは、当業者にはわかるであろう。
「グルカゴン関連ペプチド」という表現は、グルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体、ＧＬＰ−２受容体、ＧＩＰ受容体のうちの１つまたは２つ以上に対して（アゴニストまたはアンタゴニストとしての）生物学的活性を有し、天然のグルカゴン、天然のオキシントモジュリン、天然のエキセンディン−４、天然のＧＬＰ−１、天然のＧＬＰ−２または天然のＧＩＰのうちの少なくとも１つとの配列同一性が少なくとも４０％（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％など）であるアミノ酸配列を含むペプチドを示す。他に述べなければ、（プロドラッグ部分の結合、橋渡し部分の結合、親水性ポリマーの結合、アシル化またはアルキル化などについて）グルカゴン関連ペプチドにおけるアミノ酸の位置に言及する場合、天然グルカゴンのアミノ酸配列（配列番号７０１）に対する位置を示す。
「グルカゴンスーパーファミリーのペプチド」という表現は、Ｎ末端領域およびＣ末端領域における構造が関連する一群のペプチドを示す（たとえば、Sherwood et al., Endocrine Reviews 21: 619-670 (2000)を参照のこと）。この群に含まれるメンバーは、すべてのグルカゴン関連ペプチド、さらには成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ；配列番号７１９）、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ；配列番号７２０）、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド２７（ＰＡＣＡＰ−２７；配列番号７２１）、ペプチドヒスチジンイソロイシン（ＰＨＩ）、ペプチドヒスチジンメチオニン（ＰＨＭ；配列番号７２２）、セクレチン（配列番号７２３）ならびに、天然のペプチドと比較した場合に最大１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸修飾を有する類縁体、誘導体または結合体を含む。このようなペプチド（アゴニストまたはアンタゴニスト）は、グルカゴン受容体スーパーファミリーの受容体と相互作用する能力を保持していると好ましい。他に述べなければ、（プロドラッグ部分の結合、橋渡し部分の結合、親水性ポリマーの結合、アシル化またはアルキル化などについて）グルカゴンスーパーファミリーのペプチドにおけるアミノ酸の位置に言及する場合、天然グルカゴンのアミノ酸配列（配列番号７０１）に対する位置を示す。代表的なグルカゴンスーパーファミリーのペプチドのアライメントに関しては、図１０を参照のこと。
「ＧＬＰ−１アゴニスト」という用語は、２００７年５月１８日に公開された国際特許出願公開公報ＷＯ２００７／０５６３６２（その開示内容を明示的に本出願に援用する）の実施例１３に説明されているように、確立されたin vitroモデルでのアッセイを用いてｃＡＭＰの産生を基準に判断できる、ＧＬＰ−１受容体の活性を刺激する化合物を示す。
本明細書で使用する場合、「天然のＧＬＰ−１」という用語は、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド（配列番号７０４の配列からなる）、ＧＬＰ−１（７−３７）酸（配列番号７０３の配列からなる）またはこれら２種類の化合物の混合物を示す一般的な用語である。本明細書で使用する場合、他に何ら指定なく一般的に「ＧＬＰ−１」と言及されると、天然のＧＬＰ−１を意味することを意図している。
本明細書で使用する場合、「グルカゴンペプチド」という用語は、配列番号７０１の天然のグルカゴンペプチドのみならず、天然のグルカゴン配列と比較して、１個または２個以上のアミノ酸修飾（任意に、１番目、２番目、５番目、７番目、８番目、１０番目、１２番目、１３番目、１４番目、１６番目、１７番目、１８番目、２４番目、２８番目、２９番目のアミノ酸の置換を含むがこれらに限定されるものではない）を有する修飾された誘導体を示す一般的な用語である。通常、特定のアミノ酸の位置を数字で参照する場合（２８番目の位置など）はいずれも、天然のグルカゴン（配列番号７０１）におけるその位置のアミノ酸またはその類縁体における対応するアミノ酸の位置を示す。たとえば、「２８番目の位置」といえば、配列番号７０１の最初のアミノ酸が欠失したグルカゴン類縁体であれば対応する２７番目の位置を意味する。同様に、「２８番目の位置」といえば、配列番号７０１のＮ末端より前に１個のアミノ酸が付加されたグルカゴン類縁体であれば、対応する２９番目の位置を意味する。
本明細書で使用する場合、「ＧＬＰ−１ペプチド」という用語は、天然のＧＬＰ−１ならびに、天然のＧＬＰ−１配列と比較して１個または２個以上のアミノ酸修飾を有する修飾された誘導体を示す一般的な用語である。
本明細書で使用する場合、アミノ酸の「修飾」とは、アミノ酸の置換、付加または欠失をいい、ヒトタンパク質に一般的に見られる２０種類のアミノ酸のみならず、典型的ではないアミノ酸または非天然のアミノ酸との置換またはこれらのアミノ酸の付加を含む。典型的ではないアミノ酸の商業的な入手先として、Sigma-Aldrich（Milwaukee, WI）、ChemPep Inc.（Miami, FL）、Genzyme Pharmaceuticals（Cambridge, MA）があげられる。典型的ではないアミノ酸については、商業的な提供元から購入してもよいし、天然のアミノ酸から新たに合成あるいは、化学的に修飾または誘導体化してもよい。アミノ酸修飾には、親水性ポリマーなどの橋渡し部分に対するアミノ酸の結合、アミノ酸のアシル化、アルキル化および／または他の化学的な誘導体化を含む。
本明細書で使用する場合、アミノ酸の「置換」とは、１つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基と入れ換わることをいう。
本明細書で使用する場合、「保存的なアミノ酸置換」という表現は、本明細書では、以下の５群のうちの１つの範囲内での交換として定義される。
Ｉ．脂肪族、非極性またはわずかに極性の小さな残基
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ
ＩＩ．極性を有し、負の電荷を持つ残基およびそのアミド
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
ＩＩＩ．極性を有し、正の電荷を持つ残基
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）
ＩＶ．脂肪族で非極性の大きな残基
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン
Ｖ．大きな芳香族残基
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン
本明細書で使用する場合、「キメラ２」という用語は、天然のグルカゴンのアミノ酸配列（配列番号７０１）が、以下の修飾すなわち、１７番目のＧｌｎ、１８番目のＡｌａ、２０番目のＬｙｓ、２１番目のＧｌｕ、２３番目のＩｌｅ、２４番目のＡｌａならびにＣ末端アミドを含む、グルカゴンペプチドをいう。
本明細書で使用する場合、一般的な用語である「ポリエチレングリコール鎖」または「ＰＥＧ鎖」とは、一般式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｋＯＨ（式中、ｋは少なくとも９である）で表される、エチレンオキシドと水との縮合ポリマー（分岐状または直鎖状）の混合物をいう。それ以上の特徴がなければ、この用語には、平均総分子量が５００〜８０，０００ダルトンの範囲から選択されるエチレングリコールのポリマーを含むことを意図している。「ポリエチレングリコール鎖」または「ＰＥＧ鎖」は、その概算の平均分子量を示すのに、数字の接尾辞と組み合わせて用いられる。たとえば、ＰＥＧ−５，０００（５ｋ ＰＥＧ）は、総分子量の平均が約５，０００ダルトンのポリエチレングリコール鎖を示す。
本明細書で使用する場合、「ＰＥＧ化」およびこれと同様の用語は、化合物にポリエチレングリコール鎖を結合することで、その天然の状態から修飾された化合物をいう。「ＰＥＧ化ポリペプチド」とは、ポリペプチドに共有結合しているＰＥＧ鎖を有するポリペプチドのことである。
本明細書で使用する場合、「リンカー」とは、２つの別々のものを互いに結合する、結合、分子または分子群である。リンカーは、２つのものの間に最適な間隔を提供するものであってもよいし、あるいは、２つのものを互いに分離できるようにする不安定な結合をさらに提供するものであってもよい。不安定な結合としては、光切断可能な基、酸感受性部分、塩基感受性部分、酵素切断可能な基があげられる。
本明細書で使用する場合、「ダイマー」は、リンカーを介して互いに共有結合している２つのサブユニットを有する複合体である。ダイマーという用語は、他に何ら限定的な言い回しを伴わずに用いられる場合、ホモダイマーとヘテロダイマーの両方を包含する。ホモダイマーが同一のサブユニットを２つ含むのに対し、ヘテロダイマーは、互いに実質的に同様ではあるが同一ではない２つのサブユニットを含む。
ｎが１〜６であり得る、「Ｃ１〜Ｃｎアルキル」という表現は、本明細書で使用する場合、１個から指定数までの炭素原子を有する分岐状または直鎖状のアルキル基を表す。一般的なＣ１〜Ｃ６アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。
ｎが２〜６であり得る、「Ｃ２〜Ｃｎアルケニル」という表現は、本明細書で使用する場合、２個から指定数までの炭素原子と、少なくとも１個の二重結合とを有する、分岐状または直鎖状のオレフィン系不飽和基を表す。このような基の例としては、１−プロペニル、２−プロペニル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、１，３−ブタジエニル、（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ２）、１−ブテニル（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ３）、ヘキセニル、ペンテニルなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。
ｎが２〜６であり得る「Ｃ２〜Ｃｎアルキニル」という表現は、２個からｎ個までの炭素原子と、少なくとも１個の三重結合とを有する分岐状または直鎖状の不飽和基を示す。このような基の例としては、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニルなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。
本明細書で使用する場合、「アリール」という用語は、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニルなどであるがこれらに限定されるものではない、１つまたは２つの芳香環を有する単環式または二環式の炭素環系をいう。アリール環の大きさと置換基または結合基の存在については、存在する炭素の数で表示する。たとえば、「（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）」という表現は、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル鎖を介して親部分（parent moiety）に結合しているＣ６〜Ｃ１０のアリールを示す。
「ヘテロアリール」という用語は、本明細書で使用する場合、１個または２個の芳香環を含有し、この芳香環に、窒素原子、酸素原子または硫黄原子を少なくとも１個含有する、単環式または二環式の環系を示す。ヘテロアリール環の大きさと、置換基または結合基の存在については、存在する炭素の数で表示する。たとえば、「（Ｃ１〜Ｃｎアルキル）（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）」という表現は、１〜「ｎ」個の炭素からなるアルキル鎖を介して親部分に結合しているＣ５〜Ｃ６のヘテロアリールを示す。
本明細書で使用する場合、「ヘテロアルキル」という用語は、構造の骨格に、表記の数の炭素原子と、少なくとも１個のヘテロ原子とを含む直鎖状または分岐状の炭化水素を示す。本明細書の目的で適したヘテロ原子としては、Ｎ、Ｓ、Ｏがあげられるが、これらに限定されるものではない。
本明細書で使用する場合、「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素からなる群の１つまたは２つ以上の構成要素を示す。
本明細書で使用する場合、「電荷を持つアミノ酸」という表現は、生理的ｐＨの水溶液中で負の電荷を持つ（すなわち、脱プロトン化された）または正の電荷を持つ（すなわち、プロトン化された）側鎖を有するアミノ酸を示す。たとえば、負の電荷を持つアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸、ホモグルタミン酸があげられるのに対し、正の電荷を持つアミノ酸としては、アルギニン、リジン、ヒスチジンがあげられる。電荷を持つアミノ酸としては、ヒトタンパク質に一般的に見られる２０種類のアミノ酸ならびに、典型的ではないアミノ酸または非天然のアミノ酸のうち、電荷を持つアミノ酸があげられる。
本明細書で使用する場合、「酸性アミノ酸」という用語は、第２の酸性部分（すなわち、すべてのアミノ酸が有するαカルボキシル基以外）を含むアミノ酸を示し、たとえば、カルボン酸基またはスルホン酸基があげられる。
本明細書で使用する場合、「患者」という用語は、他に指定のないかぎり、飼いならされた温血脊椎動物（たとえば、家畜、ウマ、ネコ、イヌ、その他のペットを含むがこれらに限定されるものではない）、哺乳動物、ヒトを包含することを意図している。
実施形態
本開示は、糖尿病、肥満などの疾患を治療するのに有用な生体活性ポリペプチドのプロドラッグ誘導体の処方について説明するものである。特に、本明細書に開示のプロドラッグは、親の生体活性ペプチドまたはタンパク質の半減期を延ばすとともに、あとで酵素によらない分解メカニズムでプロドラッグを活性化できるように処方される。理想的なプロドラッグは、生理的条件（たとえば、ｐＨ７．２で３７℃）にて水溶性でなければならず、長期間の保存用に、粉末形態で安定していなければならない。また、免疫反応を起こさず、原薬に比して活性が低いものではなければならない。いくつかの実施形態では、プロドラッグは、活性が原薬の１０％以下である。いくつかの実施形態では、プロドラッグは、活性が、原薬の約１０％未満、約５％未満、約１％または約１％未満である。さらに、プロドラッグは、体内に注射されると、規定の時間内に活性のある薬物に定量的に変換されるものでなければならない。本明細書で開示するように、本出願人らは、上記の目的の各々を達成する、グルカゴンスーパーファミリーのペプチド（グルカゴン関連ペプチドおよびオステオカルシンならびに、このようなポリペプチドの類縁体、誘導体、結合体を含む）からなる群から選択される、既知の生体活性ポリペプチドのプロドラッグを製造するための汎用的な技術を提供した。
特に、アミド結合を介してペプチドに共有結合するジペプチドプロドラッグ要素を含むように修飾された、たとえば、グルカゴン関連ペプチドまたはオステオカルシンまたはその類縁体、誘導体または結合体などのグルカゴンスーパーファミリーのペプチドの配列を有する化学的に逆反応の可能なプロドラッグが提供される。ジペプチドプロドラッグ要素がグルカゴンスーパーファミリーのペプチドの活性部位に共有結合すると、このジペプチドプロドラッグ要素が切断されるまで、ポリペプチドの活性が阻害される。いくつかの実施形態では、「酵素によらない活性化の半減期」（ｔ１／２）が、生理的条件下で約１時間から約７２０時間のプロドラッグが提供される。本明細書で開示するような生理的条件は、温度約３５〜約４０℃、ｐＨ約７．０〜約７．４を含むことを意図し、一般にはｐＨ、７．２〜７．４、温度３６〜３８℃を含むことを意図している。
好都合なことに、切断速度ならびに、これに伴うプロドラッグの活性化は、ジペプチドプロドラッグ要素の構造および立体異性に左右される。本明細書に開示のプロドラッグは、最終的には薬剤の天然の受容体によって認識される構造に化学的に変換されることになるが、この化学変換の速度次第で、in vivoでの生物学的作用の開示タイミングと期間が決まる。本出願に開示した分子設計は、付加的な化学物質すなわち酵素に左右されない、分子内での化学反応を利用している。変換速度は、生理的条件下でのジペプチド置換基の化学的な性質と、その切断とに制御される。生理的なｐＨおよび温度は、非常に限定された範囲内で厳密に調節されるため、プロドラッグから薬剤への変換速度は、一人の患者においても、患者間においても、高い再現性を示す。
本明細書で開示するように、少なくとも約１時間、いくつかの実施形態では約２０時間を超えてプロドラッグ形態にあるおかげで、半減期が長くなったプロドラッグが提供される。いくつかの実施形態では、プロドラッグの半減期は、約１時間、約６時間、約８時間、約１２時間、約２０時間、約２４時間、約４８時間または約７２時間である。いくつかの実施形態では、プロドラッグの半減期は、約１００時間またはそれよりも長く最長で約１６８時間、約３３６時間、約５０４時間、約６７２時間または約７２０時間の半減期を含み、生理的条件で、固有の化学的不安定性がゆえに生じる酵素によらない反応によって活性のある形態に変換される。いくつかの実施形態では、プロドラッグの酵素によらない活性化のｔ１／２時間は１〜１００時間であり、より一般的には１２時間〜７２時間、たとえば、１２時間〜４８時間および４８時間〜７２時間であり、いくつかの実施形態では、リン酸バッファー（ＰＢＳなど）にて３７℃、ｐＨ７．２でプロドラッグをインキュベートすることで判断できる、ｔ１／２は、２４〜４８時間である。もうひとつの実施形態では、プロドラッグの酵素によらない活性化のｔ１／２時間は、１時間〜６時間、たとえば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間または約６時間である。もうひとつの実施形態では、プロドラッグの酵素によらない活性化のｔ１／２時間は、６時間〜２４時間である。さまざまなプロドラッグの半減期は、式ｔ１／２＝０．６９３／ｋを用いて算出される（ここで、「ｋ」はプロドラッグの分解の一次速度定数である）。いくつかの実施形態では、プロドラッグの活性化は、アミド結合で結合したジペプチドの切断、ジケトピペラジンまたはジケトモルホリンの形成、活性のあるポリペプチド薬の放出後に生じる。活性のあるポリペプチドを放出するための生理的条件下での分子内での分解を容易にする、天然のコードされていないアミノ酸および／または合成のアミノ酸からなる特定のジペプチドが、同定されている。
いくつかの実施形態によれば、構造Ａ−Ｂ−Ｑを有する、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドまたはオステオカルシンまたはその類縁体、誘導体または結合体のプロドラッグが提供される。この実施形態では、Ｑはペプチドであり、Ａはアミノ酸またはヒドロキシ酸であり、ＢはＮ−アルキル化されたアミノ酸である。いくつかの実施形態では、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドは、グルカゴン関連ペプチドである。ＡおよびＢは、一緒になって、Ａ−ＢとＱのアミンとの間のアミド結合の形成によってＱに結合するジペプチドプロドラッグ要素を表す。いくつかの実施形態では、Ａ、ＢまたはＡ−Ｂが結合しているＱのアミノ酸のうちの少なくとも１つは、コードされていないアミノ酸である。さらに、いくつかの実施形態では、ＱからのＡ−Ｂの化学反応による切断が、ＰＢＳ中にて生理的条件下で、約１時間から約７２０時間以内に少なくとも約９０％完了する、ジペプチドプロドラッグ要素が選択される。別の実施形態では、ＰＢＳ中にて生理的条件下でＱからＡ−Ｂが切断される半減期が、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ（たとえば、ヒト血清を含む）を含む溶液中でのＱからＡ−Ｂが切断される半減期の２〜５倍以下である、ジペプチドのアミノ酸が選択される。
いくつかの実施形態によれば、たとえばＮ末端アミンまたはアミノ酸側鎖のアミノ基を含むＱの脂肪族アミノ基（一級アミンなど）を、アミド結合を介したジペプチドプロドラッグ要素の共有結合によって修飾する。いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、直接的にあるいは、橋渡し部分を介して、Ｑに存在するアミノ酸の側鎖アミノ基に結合する。いくつかの実施形態では、橋渡し部分は、アシル基またはアルキル基を持つアミンを有する。いくつかの実施形態では、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドの１０番目または２０番目でアミノ酸に共有結合しているアシル基またはアルキル基を有するグルカゴンスーパーファミリーのペプチド、たとえば、グルカゴン関連ペプチドが提供され、ここで、アシル基またはアルキル基は、アミド結合を介してアシル基またはアルキル基に結合したジペプチドプロドラッグ要素をさらに有する。たとえば、実施形態では、直接的にあるいは結合基を介してＱのアミノ基にプロドラッグが結合し、アシル基またはアルキル基が、直接的にあるいは橋渡し部分を介してプロドラッグに結合することが考えられている。
いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、アミノ酸側鎖に直接的に結合し、ここで、アミノ酸は以下の一般構造を有する。
Figure 2013540102

（式中、ｎは１〜４の整数である。）
あるいは、ジペプチドプロドラッグ要素は、たとえば、アミノフェニルアラニン、アミノナフチルアラニン、アミノトリプトファン、アミノフェニルグリシン、アミノホモフェニルアラニン、アミノチロシンからなる群から選択される芳香族アミノ酸などの芳香族アミノ酸のアリール環に存在するアミノ置換基に結合可能なものである。いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、以下の一般構造を有するアミノ酸の芳香族アミノ基に結合する。
Figure 2013540102

（式中、ｍは０〜３の整数である。）いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、以下の一般構造を有するアミノ酸の４−アミノ基に結合する。
Figure 2013540102

（式中、ｍは０〜３の整数である。）いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、リジンアミノ酸の側鎖アミノ基または４−アミノフェニルアラニン（生体活性ペプチドの天然のフェニルアラニンまたはチロシン残基を置換）の芳香族アミノ基に結合する。いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、グルカゴンスーパーファミリーのペプチド（グルカゴン関連ペプチドまたはオステオカルシンを含む）またはその類縁体、誘導体または結合体の末端以外のアミノ酸に存在する第１級アミンに結合する。
いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、一般構造Ａ−Ｂを有し、ここで、Ａは、アミノ酸またはヒドロキシ酸であり、Ｂは、アミド結合を介してこのようなペプチドの第１級アミノ基に結合して、ペプチドの対応するプロドラッグを生成することになるＮ−アルキル化されたアミノ酸である。いくつかの実施形態では、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドは、グルカゴン関連ペプチドである。いくつかの実施形態では、ＡおよびＢは、Ａ−Ｂジペプチドがアミド結合を介してこのようなペプチドの第１級アミンに結合すると、ペプチドからのＡ−Ｂの化学反応による切断が、ＰＢＳ中にて生理的条件下で、約１時間から約７２０時間以内に少なくとも約９０％完全であるように、選択される。いくつかの実施形態では、Ａおよび／またはＢは、Ｄ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸である。例示としてのいくつかの実施形態では、Ａは、Ｄ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸であり、Ｂは、Ｌ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸である。例示としてのいくつかの実施形態では、Ａは、Ｌ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸であり、Ｂは、Ｄ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸である。例示としてのいくつかの実施形態では、Ａは、Ｄ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸であり、Ｂは、Ｄ型立体異性体の立体配置をとるアミノ酸である。
いくつかの実施形態によれば、ジペプチドプロドラッグ要素は、親水体を有するようにさらに修飾されていてもよい。いくつかの実施形態では、親水体は、ポリエチレングリコール鎖である。いくつかの実施形態によれば、４０ｋまたはそれよりも大きいポリエチレングリコール鎖が、ジペプチドプロドラッグ要素のＡまたはＢのアミノ酸の側鎖に共有結合している。もうひとつの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、上記に加えてあるいは上記に代えて、たとえばＣ４〜Ｃ３０脂肪酸、Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸、コール酸、Ｃ４〜Ｃ３０アルキル、Ｃ８〜Ｃ２４アルキルまたは胆汁酸のステロイド部分を有するアルキルなどの脂肪酸または胆汁酸またはその塩でアシル化またはアルキル化されている。ジペプチドプロドラッグ要素の「Ａ」アミノ酸は、たとえば、その側鎖アミノ基を介してアシル基またはアルキル基に共有結合しているｄ−リジンあるいは、その側鎖スルフヒドリル基を介してＰＥＧ分子に共有結合しているｄ−システインを有するものであってもよい。ジペプチドプロドラッグ要素は、親水体、アシル基またはアルキル基に直接的に結合可能であってもよいし、親水体、アシル基またはアルキル基に、本明細書に記載するようなスペーサーを介して結合可能であってもよい。あるいは、ジペプチドプロドラッグ要素は、ジペプチドの切断によって活性のある生体活性ペプチドが放出されるまで、プロドラッグを注射部位につなぎとめる役割を果たす、デキストランまたは大きなＰＥＧ分子（８０，０００ダルトン以上）などのデポータンパク質に結合可能である。ジペプチドプロドラッグのさらに別の修飾については、グルカゴン関連ペプチドに関連するセクションで後述する。
ジペプチドプロドラッグ要素は、付加的な化学物質すなわち酵素に左右されない、分子内での化学反応を利用して切断されるよう設計されている。特に、いくつかの実施形態では、ジペプチド構造は、たとえば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）など、哺乳動物の血清中に存在するペプチダーゼによる切断に耐えるように選択される。したがって、いくつかの実施形態では、生理的条件を用いて血清プロテアーゼの存在下で反応を実施すると、プロテアーゼが存在しない反応の場合と比較して、生体活性ペプチドからのジペプチドプロドラッグ要素の切断速度は実質的に（たとえば２倍より大きく）高められない。よって、ＰＢＳ中にて生理的条件下で生体活性ペプチドからＡ−Ｂが切断される半減期は、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼを含む溶液中で生体活性タンパク質からＡ−Ｂが切断される半減期の２倍、３倍、４倍または５倍以下である。いくつかの実施形態では、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼを含む溶液は、血清、特に哺乳動物の血清（ヒト血清を含む）である。
いくつかの実施形態によれば、ジペプチドプロドラッグ要素のＡまたはＢあるいは、Ａ−Ｂが結合しているグルカゴンスーパーファミリーのペプチドのアミノ酸は、コードされていないアミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸「Ｂ」は、Ｎ−アルキル化されているが、プロリンではない。いくつかの実施形態では、アミノ酸ＢのＮ−アルキル化された基は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、いくつかの実施形態では、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。
いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示のジペプチドプロドラッグ要素を有する、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドのプロドラッグ誘導体を、プロドラッグの活性化を遅らせる手段としての特異的なＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（Januvia（登録商標）、Merck & Co, Incなど）をはじめとするプロテアーゼ阻害剤と同時投与することが可能である。この実施形態では、ジペプチドがＤＰＰ−ＩＶ切断の許容可能な基質であるようにプロドラッグ要素のアミノ酸が選択される。いくつかの実施形態では、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドは、グルカゴン関連ペプチドである。プロテアーゼ阻害剤を、別々の組成物またはプロドラッグで投与してもよいし、プロテアーゼ阻害剤を単一の組成物として処方してもよい。別々の組成物として投与される場合、プロテアーゼ阻害剤は一般に、プロドラッグの投与後１〜５時間以内、１〜２時間以内、３０分間以内または１０分間以内に投与される。いくつかの実施形態では、２つの別の組成物を、互いに間隔をあけずに続けて投与する。
いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、式Ｉの一般構造を有する。
Figure 2013540102

式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ８は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ａ）（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１は、Ｎ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルまたはアリールを形成するか、あるいは、Ｒ４およびＲ８は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキルを形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、ＨおよびＯＨからなる群から選択される。
Ｗ１がＮである場合、生理的条件下で窒素原子がＨに結合することは、当業者には自明である。
他の実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、式Ｉの一般構造を有する。
Figure 2013540102

式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ８は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１は、Ｎ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成するか、あるいは、Ｒ４およびＲ８は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキルを形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ１は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ８はＨであり、Ｒ５はＮＨＲ６である。
いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、式Ｉの構造を有し、式中、
Ｒ１およびＲ８は独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキルであり、
Ｒ２およびＲ４は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、ＣＨ２（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルまたはアリール形成し、
Ｒ５は、ＮＨＲ６であり、
Ｒ６は、ＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキルである。
他の実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、式Ｉの構造を有し、式中、
Ｒ１およびＲ８は独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキルであり、
Ｒ２およびＲ４は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、ＣＨ２（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｒ５は、ＮＨＲ６であり、
Ｒ６は、ＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキルであり、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択される。
本開示に基づいて形成されるプロドラッグの半減期は、ジペプチドプロドラッグ要素の置換基、ジペプチドプロドラッグ要素の位置、これが結合するアミノ酸によって判断される。たとえば、プロドラッグは、ジペプチドプロドラッグ要素が、グルカゴンスーパーファミリータンパク質のＮ末端のアミノ酸のαアミノ基を介して結合されているグルカゴンスーパーファミリーのペプチドを有するものであってもよい。この実施形態では、ｔ１／２が、たとえば約１時間のプロドラッグは、以下の構造のジペプチドプロドラッグ要素を有する。

Figure 2013540102

式中、
Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルまたはアリールであるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、−（ＣＨ２）ｐ（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｒ４およびＲ８は、各々水素であり、
Ｒ５は、アミンである。
他の実施形態では、ｔ１／２が、たとえば約１時間のプロドラッグは、以下の構造のジペプチドプロドラッグ要素を有する。
Figure 2013540102

式中、
Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルまたは（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７であるか、Ｒ１およびＲ２は、−（ＣＨ２）ｐ（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｒ４およびＲ８は、各々水素であり、
Ｒ５は、ＮＨ２であり、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択される。
さらに、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドのＮ末端αアミノ酸に結合したジペプチドプロドラッグ要素を有し、ｔ１／２が、たとえば約６〜約２４時間のプロドラッグは、以下の構造のジペプチドプロドラッグ要素を有する。
Figure 2013540102

式中、Ｒ１およびＲ２は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、アリールからなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、（ＣＨ２）ｐ（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜１２員環の複素環を形成し、
Ｒ４およびＲ８は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリールからなる群から選択され、Ｒ５は、アミンであるが、
ただし、Ｒ１およびＲ２が水素ではなく、かつ、Ｒ４またはＲ８のうちの一方が水素であるものとする。
いくつかの実施形態では、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドのＮ末端αアミノ酸に結合したジペプチドプロドラッグ要素を有し、ｔ１／２が、たとえば約１２〜約７２時間あるいは、いくつかの実施形態では約１２〜約４８時間のプロドラッグは、以下の構造のジペプチドプロドラッグ要素を有する。
Figure 2013540102

式中、Ｒ１およびＲ２は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、（ＣＨ２）ｐ（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜１２員環の複素環を形成し、
Ｒ４およびＲ８は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７からなる群から選択され、
Ｒ５は、ＮＨ２であり、
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択されるが、
ただし、Ｒ１およびＲ２が水素ではなく、かつ、Ｒ４またはＲ８のうちの少なくとも１つが水素であるものとする。
いくつかの実施形態では、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドのＮ末端のアミノ酸に結合したジペプチドプロドラッグ要素を有し、ｔ１／２が、たとえば約１２〜約７２時間あるいは、いくつかの実施形態では、約１２〜約４８時間であるプロドラッグは、以下の構造のジペプチドプロドラッグ要素を有する。
Figure 2013540102

式中、Ｒ１およびＲ２は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、（ＣＨ２）ｐ（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜６員環の複素環を形成し、
Ｒ４は、水素およびＣ１〜Ｃ８アルキルからなる群から選択され、
Ｒ５は、ＮＨ２であるが、
ただし、Ｒ１とＲ２はともに水素ではない。
他の実施形態では、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドのＮ末端のアミノ酸に結合したジペプチドプロドラッグ要素を有し、ｔ１／２が、たとえば約１２〜約７２時間あるいは、いくつかの実施形態では、約１２〜約４８時間であるプロドラッグは、以下の構造のジペプチドプロドラッグ要素を有する。
Figure 2013540102

式中、
Ｒ１およびＲ２は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２からなる群から選択され、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ４は、水素であり、
Ｒ５は、ＮＨ２であるが、
ただし、Ｒ１とＲ２はともに水素ではない。
いくつかの実施形態では、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドのＮ末端のアミノ酸に結合したジペプチドプロドラッグ要素を有し、ｔ１／２が、たとえば約１２〜約７２時間あるいは、いくつかの実施形態では、約１２〜約４８時間であるプロドラッグは、以下の構造のジペプチドプロドラッグ要素を有する。
Figure 2013540102

式中、
Ｒ１およびＲ２は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、（ＣＨ２）ｐ（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ８アルキルであり、
Ｒ４は、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７であり、
Ｒ５は、ＮＨ２であり、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨからなる群から選択されるが、
ただし、Ｒ１とＲ２はともに水素ではない。
いくつかの実施形態では、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドは、グルカゴン関連ペプチドである。これらの実施形態のいずれにおいても、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドは、配列番号１〜６８４、７０１〜７３１、８０１〜９１９、１００１〜１２６２、１３０１〜１３７１、１４０１〜１５１８、１７０１〜１７７６、１８０１〜１９０８のうちのいずれかである。
また、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドのＮ末端αアミノ酸に結合したジペプチドプロドラッグ要素を有し、ｔ１／２が、たとえば約７２〜約１６８時間であるプロドラッグが提供され、ここで、ジペプチドプロドラッグ要素は、以下の構造を有する。
Figure 2013540102

式中、Ｒ１は、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリールからなる群から選択され、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｒ４およびＲ８は、各々水素であり、
Ｒ５は、アミンまたはＮ−置換アミンまたはヒドロキシルであるが、
ただし、Ｒ１がアルキルまたはアリールである場合、Ｒ１およびＲ５は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜１１員環の複素環を形成する。
いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、以下の構造を有する。
Figure 2013540102

式中、Ｒ１は、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７からなる群から選択され、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｒ４およびＲ８は、各々水素であり、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ１は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択され、
ただし、Ｒ１がアルキルまたは（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７である場合、Ｒ１およびＲ５は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜１１員環の複素環を形成する。いくつかの実施形態では、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドは、グルカゴン関連ペプチドである。
いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドの末端以外のアミノ酸の側鎖のアミンに結合している。この実施形態では、ｔ１／２がたとえば約１時間であるプロドラッグは、以下の構造を有する。
Figure 2013540102

式中、
Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｃ１〜Ｃ８アルキルまたはアリールであるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、（ＣＨ２）ｐ（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｒ４およびＲ８は、各々水素であり、Ｒ５は、アミンである。
いくつかの実施形態では、ｔ１／２がたとえば約１時間であるプロドラッグは、以下の構造を有する。
Figure 2013540102

式中、
Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｃ１〜Ｃ８アルキルまたは（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、−（ＣＨ２）ｐ（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｒ４およびＲ８は、各々水素であり、
Ｒ５は、ＮＨ２であり、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択される。
さらに、ｔ１／２がたとえば約６〜約２４時間であり、末端以外のアミノ酸側鎖に結合するジペプチドプロドラッグ要素を有するプロドラッグは、以下の構造のジペプチドプロドラッグ要素を有する。
Figure 2013540102

式中、Ｒ１およびＲ２は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリールからなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、−（ＣＨ２）ｐ（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜１２員環の複素環を形成し、
Ｒ４およびＲ８は独立に、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルまたはアリールであり、
Ｒ５は、アミンまたはＮ−置換アミンであるが、
ただし、Ｒ１およびＲ２が水素ではなく、かつ、Ｒ４またはＲ８のうちの一方が水素であるものとする。
いくつかの実施形態では、ｔ１／２がたとえば約１２〜約７２時間であるか、いくつかの実施形態では、約１２〜約４８時間であり、末端以外のアミノ酸側鎖に結合するジペプチドプロドラッグ要素を有するプロドラッグは、以下の構造のジペプチドプロドラッグ要素を有する。
Figure 2013540102

式中、Ｒ１およびＲ２は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、−（ＣＨ２）ｐ（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜１２員環の複素環を形成し、
Ｒ４およびＲ８は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルまたは（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７であり、
Ｒ５は、ＮＨＲ６であり、
Ｒ６は、ＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択されるが、
ただし、Ｒ１およびＲ２が水素ではなく、かつ、Ｒ４またはＲ８のうちの少なくとも１つが水素であるものとする。いくつかの実施形態では、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドは、グルカゴン関連ペプチドである。
また、ｔ１／２がたとえば約７２〜約１６８時間であり、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドの末端以外のアミノ酸側鎖に結合したジペプチドプロドラッグ要素を有するプロドラッグが提供され、ここで、ジペプチドプロドラッグ要素は、以下の構造を有する。
Figure 2013540102

式中、Ｒ１およびＲ２は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、アリールからなる群から選択され、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｒ４およびＲ８は、各々水素であり、
Ｒ５は、アミンまたはＮ−置換アミンまたはヒドロキシルであるが、
ただし、Ｒ１およびＲ２がともに独立にアルキルまたはアリールである場合、Ｒ１またはＲ２のいずれかが、（ＣＨ２）ｐを介してＲ５に結合し、式中、ｐは２〜９である。
いくつかの実施形態では、ｔ１／２がたとえば約７２〜約１６８時間であり、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドの末端以外のアミノ酸側鎖に結合したジペプチドプロドラッグ要素を有するプロドラッグが提供され、ここで、ジペプチドプロドラッグ要素は、以下の構造を有する。
Figure 2013540102

式中、Ｒ１は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７からなる群から選択され、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｒ４およびＲ８は、各々水素であり、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６は、ＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ１は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択されるが、
ただし、Ｒ１およびＲ２がともに独立にアルキルまたは（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７である場合、Ｒ１またはＲ２のいずれかが、（ＣＨ２）ｐを介してＲ５に結合し、式中、ｐは２〜９である。いくつかの実施形態では、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドは、グルカゴン関連ペプチドである。これらの実施形態のいずれにおいても、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドは、配列番号１〜６８４、７０１〜７３１、８０１〜９１９、１００１〜１２６２、１３０１〜１３７１、１４０１〜１５１８、１７０１〜１７７６、１８０１〜１９０８のうちのいずれかである。
いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドの末端以外のアミノ酸の側鎖のアミンに結合し、ここで、末端以外のアミノ酸は、以下の式ＩＩの構造を有する。
Figure 2013540102

式中、
ｎは、１〜４から選択される整数である。いくつかの実施形態では、ｎは３または４であり、いくつかの実施形態では、末端以外のアミノ酸はリジンである。いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドの１２番目、１６番目、１７番目、１８番目、２０番目、２８番目または２９番目に位置するアミノ酸の側鎖の第１級アミンに結合している。いくつかの実施形態では、１２番目、１６番目、１７番目、１８番目、２０番目、２８番目または２９番目のアミノ酸は、以下の式ＩＩの構造を有する。
Figure 2013540102

式中、ｎは、１〜４から選択される整数であり、ジペプチドプロドラッグ要素は、アミド結合を介してアミノ酸側鎖に結合している。いくつかの実施形態では、ｎは４であり、アミノ酸は２０番目に位置する。いくつかの実施形態では、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドは、グルカゴン関連ペプチドである。
別の実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、芳香族アミノ酸のアリール基に存在するアミンを介してグルカゴンスーパーファミリーのペプチドに結合している。いくつかの実施形態では、芳香族アミノ酸は、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドの末端以外のアミノ酸であるが、この芳香族アミノ酸はＮ末端のアミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態では、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドは、グルカゴン関連ペプチドである。いくつかの実施形態では、芳香族アミノ酸は、アミノフェニルアラニン、アミノナフチルアラニン、アミノトリプトファン、アミノ−フェニル−グリシン、アミノ−ホモフェニルアラニン、アミノチロシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素との間でアミド結合を形成する第１級アミンは、アリール基上でパラ位にある。いくつかの実施形態では、芳香族アミンは、以下の式ＩＩＩの構造を有する。
Figure 2013540102

式中、ｍは、１〜３の整数である。
ペプチドプロドラッグ要素が、芳香族アミノ酸のアリール基に存在するアミンを介してグルカゴンスーパーファミリーのペプチドに結合している実施形態では、ｔ１／２がたとえば約１時間のプロドラッグは、以下のジペプチド構造を有する。
Figure 2013540102

式中、Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルまたはアリールであり、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜１２員環の複素環を形成し、
Ｒ４およびＲ８は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、アリールからなる群から選択され、Ｒ５は、アミンまたはヒドロキシルである。
いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、芳香族アミノ酸のアリール基に存在するアミンを介してグルカゴンスーパーファミリーのペプチドに結合し、ｔ１／２がたとえば約１時間であるプロドラッグは、以下のジペプチド構造を有する。
Figure 2013540102

式中、Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルまたは（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７であり、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜１２員環の複素環を形成し、
Ｒ４およびＲ８は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７からなる群から選択され、
Ｒ５は、ＮＨ２またはＯＨであり、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドは、グルカゴン関連ペプチドである。さらに、芳香族アミノ酸を介して結合したジペプチドプロドラッグ要素を有し、ｔ１／２がたとえば約６〜約２４時間のプロドラッグが提供され、ここで、ジペプチドは、以下の構造を有する。
Figure 2013540102

式中、
Ｒ１は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、アリールからなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、−（ＣＨ２）ｐ（式中、ｐは２〜９である）を介して結合し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜６員環の複素環を形成し、
Ｒ４およびＲ８は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、アリールからなる群から選択され、Ｒ５は、アミンまたはＮ−置換アミンである。
いくつかの実施形態では、芳香族アミノ酸を介して結合したジペプチドプロドラッグ要素を有し、ｔ１／２がたとえば約６〜約２４時間であるプロドラッグが提供され、ここで、ジペプチドは、以下の構造を有する。
Figure 2013540102

式中、
Ｒ１は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７からなる群から選択され、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜６員環の複素環を形成し、
Ｒ４およびＲ８は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７からなる群から選択され、
Ｒ５は、ＮＨＲ６であり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ１は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択される。
また、芳香族アミノ酸を介して結合したペプチドプロドラッグ要素を有し、ｔ１／２がたとえば約７２〜約１６８時間であるプロドラッグが提供され、ここで、ジペプチドは、以下の構造を有する。
Figure 2013540102

式中、Ｒ１およびＲ２は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリールからなる群から選択され、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜６員環の複素環を形成し、
Ｒ４およびＲ８は、各々水素であり、
Ｒ５は、アミン、Ｎ−置換アミン、ヒドロキシルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、芳香族アミノ酸を介して結合されたジペプチドプロドラッグ要素を有し、ｔ１／２がたとえば約７２〜約１６８時間であるプロドラッグが提供され、ここで、ジペプチドは、以下の構造を有する。
Figure 2013540102

式中、Ｒ１およびＲ２は独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ５は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜１１員環の複素環を形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、４〜６員環の複素環を形成し、
Ｒ４は、水素であるか、あるいは、Ｒ３との間で４〜６員環の複素環を形成し、
Ｒ８は、水素であり、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６は、ＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキルであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ１は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、芳香族アミノ酸のアリール置換基として存在する第１級アミンを介して芳香族アミノ酸に結合し、ここで、芳香族アミノ酸は、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドの１０番目、１３番目、２２番目または２５番目（グルカゴンの番号を基準にし、たとえば、図１０参照）に位置する。いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素が結合した芳香族アミノ酸は、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドの２２番目に位置する。
いくつかの実施形態によれば、ジペプチドプロドラッグ要素は、たとえば、グルカゴン関連ペプチドまたはオステオカルシンのみならず、上記のものの類縁体、誘導体、結合体をはじめとして、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドのＮ末端のアミンに結合し、ここで、ジペプチドプロドラッグ要素は以下の構造を有する。
Figure 2013540102

式中、Ｒ１は、ＨおよびＣ１〜Ｃ８アルキルからなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ４は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、ＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキルを形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキルからなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６は、Ｈであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、ＨおよびＯＨからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、ＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキルであり、Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＣＨ２ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、ＣＨ２（Ｃ６アリール）Ｒ７からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ６およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環の複素環を形成し、Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６アリール）Ｒ７からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環の複素環を形成する。別の実施形態では、Ｒ３はＣＨ３であり、Ｒ５はＮＨＲ６であり、別の実施形態では、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環の複素環を形成し、Ｒ５はＮＨＲ６である。
もうひとつの実施形態によれば、ジペプチドプロドラッグ要素は、たとえばグルカゴン関連ペプチドまたはオステオカルシンのみならず、上記のものの類縁体、誘導体、結合体を含むグルカゴンスーパーファミリーのペプチドのＮ末端アミンで結合し、ここで、ジペプチドプロドラッグ要素は、以下の構造を有する。
Figure 2013540102

式中、Ｒ１は、ＨおよびＣ１〜Ｃ８アルキルからなる群から選択され、
Ｒ２およびＲ４は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、ＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキルを形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキルからなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ５は、ＮＨＲ６またはＯＨであり、
Ｒ６は、Ｈであるか、あるいは、Ｒ６およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ハロからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、ＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキルであり、Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＣＨ２ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、ＣＨ２（Ｃ６アリール）Ｒ７からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ６およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環の複素環を形成し、Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６アリール）Ｒ７からなる群から選択されるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環の複素環を形成する。別の実施形態では、Ｒ３はＣＨ３であり、Ｒ５はＮＨＲ６であり、別の実施形態では、Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している原子と一緒になって、５員環の複素環を形成し、Ｒ５はＮＨＲ６である。
いくつかの実施形態では、Ｑは、配列番号１〜６８４、７０１〜７３１、８０１〜９１９、１００１〜１２６２、１３０１〜１３７１、１４０１〜１５１８、１７０１〜１７７６、１８０１〜１９０８のいずれかである。
グルカゴン関連ペプチド
特定の態様では、本開示は（標記の基「Ｑ」の一部としての）グルカゴン関連ペプチドに関する。グルカゴン関連ペプチドという用語は、グルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体、ＧＬＰ−２受容体、ＧＩＰ受容体のうちの１つまたは２つ以上に対して（アゴニストまたはアンタゴニストとしての）生物学的活性を有し、天然のグルカゴン、天然のオキシントモジュリン、天然のエキセンディン−４、天然のＧＬＰ−１、天然のＧＬＰ−２または天然のＧＩＰのうちの少なくとも１つとの配列同一性が少なくとも４０％（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％など）であるアミノ酸配列を含むペプチドを示す。グルカゴン受容体またはＧＬＰ−１受容体またはＧＩＰ受容体のうちの１個または２個以上に対する生物学的活性（アゴニストまたはアンタゴニストとして）を有するペプチドなど、グルカゴン関連ペプチドの活性で分類された可能性のあるすべてのサブセットならびに、表記の天然ペプチドそれぞれに対する配列同一性で分類された可能性のあるサブセットが考えられ、たとえば、天然のグルカゴンの長さ全体にわたって天然のグルカゴンとの配列の同一性が少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のアミノ酸配列を含むことは理解されたい。本発明のいくつかの実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体アゴニスト活性、ＧＩＰ受容体アゴニスト活性、グルカゴン受容体／ＧＬＰ−１受容体コアゴニスト活性、グルカゴン受容体アンタゴニスト活性またはグルカゴン受容体アンタゴニスト＆ＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を有するペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、分子のＣ末端側の半分におけるα螺旋構造を保持している。いくつかの実施形態では、ペプチドは、グルカゴンの３番目あるいは、（１−３７）ＧＬＰ−１の７番目、１０番目、１２番目、１３番目、１５番目または１７番目など、受容体との相互作用またはシグナル伝達に関与する位置を保持している。したがって、グルカゴン関連ペプチドは、クラス１、クラス２、クラス３、クラス４および／またはクラス５のペプチドであってもよく、その各々について本明細書でさらに説明する。
いくつかの実施形態によれば、ジペプチドプロドラッグ要素は、アミド結合を介して、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８６０８（２００８年１月３日出願）、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５３８５７（２００８年２月１３日出願）、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４７４３７（２００９年６月１６日出願）、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４７４３８（２００９年６月１６日出願）、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４７４４７（２００９年６月１６日出願）、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０９７３（２００８年１０月２３日出願）、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１３３３（２００８年１０月２７日出願）（これらの開示内容を明示的に本出願に援用する）にすでに開示されている生体活性化合物に結合可能である。本明細書に開示のジペプチドプロドラッグ要素は、いくつかの例示としての実施形態では、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８６０８、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５３８５７、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４７４３７、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４７４３８、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４７４４７、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０９７、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１３３３に開示された生体活性ペプチドに結合可能であるか、Ｎ末端アミンを介して結合可能であり、開示されたいずれかの生体活性ペプチドの２０番目のリジンの側鎖アミノ基または２２番目のアミノ酸を置換した４−アミノフェニルアラニンの芳香族アミノ基に結合可能である。いくつかの例示としての実施形態では、本明細書に開示のジペプチドプロドラッグ要素は、アミド結合を介して、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８６０８、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５３８５７、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４７４３７、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４７４３８、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４７４４７、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０９７、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１３３３に開示された生体活性ペプチドのＮ末端アミンに結合する。いくつかの実施形態では、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドは、配列番号１〜６８４、７０１〜７３１、８０１〜９１９、１００１〜１２６２、１３０１〜１３７１、１４０１〜１５１８、１７０１〜１７７６、１８０１〜１９０８のうちのいずれかである。
修飾
グルカゴン関連ペプチドは、修飾がなされた天然のグルカゴンのアミノ酸配列（配列番号７０１）を有するものであってもよい。例示としての実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、天然のグルカゴン配列と比較して、保存的な置換または非保存的な置換などの合計で１個、最大２個、最大３個、最大４個、最大５個、最大６個、最大７個、最大８個、最大９個または最大１０個のアミノ酸修飾を有するものであってもよい。本明細書に記載の修飾および置換は、特定の態様において、グルカゴン関連ペプチドの特定の位置でなされるものであり、ここで、位置の番号はグルカゴン（配列番号７０１）の番号に対応する。いくつかの実施形態では、２番目、５番目、７番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２４番目、２７番目、２８番目または２９番目の任意の位置で、１個、２個、３個、４個または５個の非保存的な置換がなされ、これらの位置のいずれかで、さらに最大５個の保存的な置換がなされる。いくつかの実施形態では、１番目から１６番目のアミノ酸の範囲内で、１個、２個または３個のアミノ酸修飾がなされ、１７番目から２６番目のアミノ酸の範囲内で、１個、２個または３個のアミノ酸修飾がなされる。いくつかの実施形態では、このようなグルカゴン関連ペプチドは、天然のグルカゴンの対応する位置に、少なくとも２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個または２８個の天然アミノ酸を保持する（天然のグルカゴンと比較して、１〜７個、１〜５個または１〜３個の修飾を有するなど）。
ＤＰＰ−ＩＶ耐性
いくつかの実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を低減するための修飾を、１番目または２番目に有する。特に、いくつかの実施形態では、グルカゴン関連ペプチドの１番目（図１０に示すものから選択されるなど）は、Ｄ−ヒスチジン、α，α−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、α−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシルヒスチジン、アセチルヒスチジン、ホモヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸で置換される。特に、いくつかの実施形態では、グルカゴン関連ペプチドの２番目は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、アミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態では、グルカゴン関連ペプチドの２番目はＤ−セリンではない。
親水体
いくつかの実施形態では、グルカゴン関連ペプチド（クラス１のグルカゴン関連ペプチド、クラス２のグルカゴン関連ペプチド、クラス３のグルカゴン関連ペプチド、クラス４のグルカゴン関連ペプチドまたはクラス５のグルカゴン関連ペプチドなど）は、親水体に結合（共有結合）している。親水体は、タンパク質を活性化ポリマー分子と反応させるのに用いられる好適な条件下で、グルカゴン関連ペプチドに結合可能である。標的化合物（アルデヒド基、アミノ基、エステル基、チオール基、α−ハロアセチル基、マレイミド基またはヒドラジノ基など）の反応性基に、ＰＥＧ部分（アルデヒド基、アミノ基、エステル基、チオール基、α−ハロアセチル基、マレイミド基またはヒドラジノ基など）の反応性基を介して結合させる、アシル化、還元的アルキル化、マイケル付加、チオールアルキル化または他の化学選択的結合／ライゲーション方法をはじめとして、当分野で知られたどのような手段を用いてもよい。水溶性ポリマーを１つまたは２つ以上のタンパク質に結合するのに使用可能な活性化基として、限定することなく、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシラン、５−ピリジルがあげられる。還元的アルキル化によってペプチドに結合する場合、重合度を制御できるように、選択するポリマーは、単一の反応性アルデヒドを有するものでなければならない。たとえば、Kinstler et al., Adv. Drug. Delivery Rev. 54: 477-485 (2002)；Roberts et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002)；およびZalipsky et al., Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182 (1995)を参照のこと。
クラス１〜クラス３のグルカゴン関連ペプチドに関して、水溶性ポリマーを１つまたは２つ以上のタンパク質に結合するのに用いられる別の活性化基として、α−ハロゲン化アシル基（α−ヨード酢酸、α−ブロモ酢酸、α−クロロ酢酸など）があげられる。グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるいくつかの実施形態では、チオールを有するアミノ酸を、マイケル付加反応においてマレイミド活性化ＰＥＧで修飾し、以下に示すチオエーテル結合を有するＰＥＧ化ペプチドを得る。
Figure 2013540102

他の実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドのアミノ酸のチオールを、求核置換反応においてハロアセチル活性化ＰＥＧで修飾し、以下に示すチオエーテル結合を有するＰＥＧ化ペプチドを得る。
Figure 2013540102

好適な親水体としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＧなど）、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）、ポリオキシアルキレン、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、モノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリアセタール、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（β−アミノ酸）（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）および他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、コロン酸または他の多糖ポリマー、Ficollまたはデキストラン、これらの混合物があげられる。デキストランは、α１〜６結合によって優先的に結合するグルコースサブユニットの多糖ポリマーである。デキストランは、約１ｋＤ〜約１００ｋＤあるいは、約５、１０、１５または２０ｋＤから約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０ｋＤなど、多くの分子量範囲で入手可能である。
いくつかの実施形態では、親水体は、前記グルカゴン関連ペプチドの１６番目、１７番目、２１番目、２４番目、２９番目、４０番目、Ｃ末端の延長部分の範囲内またはＣ末端のアミノ酸のうちの１箇所または２箇所以上で、アミノ酸残基の側鎖に共有結合しているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖または他の水溶性ポリマーである。いくつかの実施形態では、その位置の天然のアミノ酸を、親水体との架橋に適した側鎖を有するアミノ酸で置換し、ペプチドに対する親水体の結合を容易にする。アミノ酸の例として、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチルフェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）があげられる。他の実施形態では、親水基を含むように修飾されたアミノ酸を、Ｃ末端でペプチドに付加する。
いくつかの実施形態によるポリエチレングリコール鎖などの親水体は、分子量が、約５００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、分子量が、約５００〜約５，０００ダルトンまたは約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される。もうひとつの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖などの親水体は、分子量が、約１０，０００〜約２０，０００ダルトンである。さらに他の例示としての実施形態では、ポリエチレングリコール鎖などの親水体は、分子量が約２０，０００〜約４０，０００ダルトンである。
直鎖状または分岐状の親水性ポリマーが考えられている。得られる結合体の調製物は、基本的に単分散であっても多分散であってもよく、ペプチド１つあたり約０．５個、０．７個、１個、１．２個、１．５個または２個のポリマー部分を有するものであってもよい。
アシル化
いくつかの実施形態では、グルカゴン関連ペプチド（クラス１のグルカゴン関連ペプチド、クラス２のグルカゴン関連ペプチド、クラス３のグルカゴン関連ペプチド、クラス４のグルカゴン関連ペプチド、クラス４のグルカゴン関連ペプチドまたはクラス５のグルカゴン関連ペプチドなど）は、アシル基を含むように修飾される。たとえば、グルカゴン関連ペプチドは、クラス１、クラス２またはクラス３のうちの１つであってもよいし、天然アミノ酸に対して非天然のアシル基を有するものであってもよい。アシル化は、アシル化されていないグルカゴン関連ペプチドの活性が、アシル化されても保持される限り、１番目から２９番目の任意の位置、Ｃ末端の延長部分の範囲内にある位置またはＣ末端のアミノ酸をはじめとして、グルカゴン関連ペプチドの範囲内のどの位置でなされてもよい。たとえば、アシル化されていないペプチドがグルカゴンアゴニスト活性を有する場合、アシル化されたペプチドは、グルカゴンアゴニスト活性を保持する。また、たとえば、アシル化されていないペプチドがグルカゴンアンタゴニスト活性を有する場合、アシル化されたペプチドは、グルカゴンアンタゴニスト活性を保持する。たとえば、アシル化されていないペプチドがＧＬＰ−１アゴニスト活性を有する場合、アシル化されたペプチドは、ＧＬＰ−１アゴニスト活性を保持する。非限定的な例として、（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）５番目、７番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２４番目、２７番目、２８番目または２９番目でのアシル化があげられる。クラス１、クラス２、クラス３のグルカゴン関連ペプチドについては、アシル化は、（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）５番目、７番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２４番目、２７番目、２８番目、２９番目、３０番目、３７番目、３８番目、３９番目、４０番目、４１番目、４２番目または４３番目のいずれかで起こり得る。アシル基は、グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸に直接的に共有結合していてもよいし、グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸にスペーサーを介して間接的に共有結合していてもよく、ここで、スペーサーは、グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸とアシル基との間に位置する。グルカゴン関連ペプチドは、親水体が結合している同一のアミノ酸の位置でアシル化されていてもよいし、異なるアミノ酸の位置でアシル化されていてもよい。非限定的な例として、（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１０番目でのアシル化およびグルカゴンペプチドのＣ末端領域の１箇所または２箇所以上、たとえば（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）２４番目、２８番目または２９番目、Ｃ末端の延長部分の範囲内またはＣ末端（Ｃ末端でのＣｙｓの付加によるなど）でのＰＥＧ化があげられる。
本発明の具体的な態様では、グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールの直接的なアシル化によって、アシル基を含むように修飾される。いくつかの実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、アミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールを介して、直接的にアシル化される。いくつかの実施形態では、アシル化は、（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１０番目、２０番目、２４番目または２９番目である。この点について、アシル化されたグルカゴン関連ペプチドは、配列番号７０１のアミノ酸配列を有するものであってもよいし、あるいは、本明細書に記載されたアミノ酸修飾の１個または２個以上を有する修飾されたアミノ酸配列であって、（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１０番目、２０番目、２４番目、２９番目のアミノ酸の少なくとも１つが、側鎖にアミン、ヒドロキシルまたはチオールを有するアミノ酸になるように修飾された配列であってもよい。本発明のいくつかの具体的な実施形態では、（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１０番目のアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールを介して、グルカゴン関連ペプチドの直接的なアシル化が起こる。
いくつかの実施形態では、側鎖のアミンを有するアミノ酸は、式Ｉのアミノ酸である。
Figure 2013540102
例示としてのいくつかの実施形態では、式Ｉのアミノ酸は、ｎが４（Ｌｙｓ）またはｎが３（Ｏｒｎ）のアミノ酸である。
他の実施形態では、側鎖のヒドロキシルを有するアミノ酸は、式ＩＩのアミノ酸である。
Figure 2013540102
例示としてのいくつかの実施形態では、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１（Ｓｅｒ）のアミノ酸である。
さらに他の実施形態では、側鎖のチオールを有するアミノ酸は、式ＩＩＩのアミノ酸である。
Figure 2013540102
例示としてのいくつかの実施形態では、式ＩＩＩのアミノ酸は、ｎが１（Ｃｙｓ）のアミノ酸である。
グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるさらに他の実施形態では、側鎖にアミン、ヒドロキシルまたはチオールを有するアミノ酸は、式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩのアミノ酸のα炭素に結合した水素が第２の側鎖で置換されていること以外は、式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩの同一の構造を有する二置換アミノ酸である。
本発明のいくつかの実施形態では、アシル化されたグルカゴン関連ペプチドは、ペプチドとアシル基との間にスペーサーを有する。いくつかの実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、スペーサーに共有結合し、これがアシル基に共有結合している。例示としてのいくつかの実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、スペーサーのアミン、ヒドロキシルまたはチオールのアシル化によって、アシル基を含むように修飾され、このスペーサーは、グルカゴン関連ペプチドの（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１０番目、２０番目、２４番目または２９番目あるいは、Ｃ末端のアミノ酸で、アミノ酸の側鎖に結合している。スペーサーが結合しているアミノ酸は、スペーサーとの結合を可能にする部分を有するものであれば、どのようなアミノ酸であってもよい。たとえば、側鎖に、−ＮＨ２、−ＯＨまたは−ＣＯＯＨを有するアミノ酸（Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕなど）が適している。また、クラス１、クラス２、クラス３のグルカゴン関連ペプチドについては、側鎖に、−ＮＨ２、−ＯＨまたは−ＣＯＯＨを有するアミノ酸（α一置換アミノ酸またはα二置換アミノ酸など）（Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕなど）が適している。この点において、アシル化されたグルカゴン関連ペプチドは、配列番号７０１のアミノ酸配列を有するものであってもよいし、あるいは、本明細書に記載されたアミノ酸修飾の１個または２個以上を有する修飾されたアミノ酸配列であって、（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１０番目、２０番目、２４番目、２９番目のアミノ酸の少なくとも１つが、側鎖にアミン、ヒドロキシルまたはカルボキシレートを有するアミノ酸になるように修飾された配列であってもよい。
いくつかの実施形態では、スペーサーは、側鎖にアミン、ヒドロキシルまたはチオールを有するアミノ酸であるか、側鎖にアミン、ヒドロキシルまたはチオールを有するアミノ酸を有するジペプチドまたはトリペプチドである。いくつかの実施形態では、アミノ酸スペーサーは、γ−Ｇｌｕではない。いくつかの実施形態では、ジペプチドスペーサーは、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕではない。
スペーサーのアミノ酸のアミン基を介してアシル化が起こる場合、このアシル化は、アミノ酸のαアミンまたは側鎖のアミンを介して起こり得る。αアミンがアシル化されている例では、スペーサーのアミノ酸は、どのようなアミノ酸であってもよい。たとえば、スペーサーのアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒなどの疎水性のアミノ酸であってもよい。グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるいくつかの実施形態では、スペーサーのアミノ酸は、たとえば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸などの疎水性のアミノ酸であってもよい。あるいは、スペーサーのアミノ酸は、ＡｓｐおよびＧｌｕなどの酸性残基であってもよい。スペーサーのアミノ酸の側鎖のアミンがアシル化されている例では、スペーサーのアミノ酸は、式Ｉのアミノ酸（ＬｙｓまたはＯｒｎなど）といった側鎖のアミンを有するアミノ酸である。この場合、グルカゴンペプチドがジアシル化されるように、スペーサーのアミノ酸のαアミンと側鎖のアミンのどちらも、アシル化が可能である。本発明の実施形態は、このようなジアシル化された分子を含む。
スペーサーのアミノ酸のヒドロキシ基を介してアシル化が起こる場合、アミノ酸あるいは、ジペプチドまたはトリペプチドのアミノ酸のうちの１つは、式ＩＩのアミノ酸であってもよい。一例としての具体的な実施形態では、アミノ酸はＳｅｒである。
スペーサーのアミノ酸のチオール基を介してアシル化が起こる場合、アミノ酸あるいは、ジペプチドまたはトリペプチドのアミノ酸のうちの１つは、式ＩＩＩのアミノ酸であってもよい。一例としての具体的な実施形態では、アミノ酸はＣｙｓである。
いくつかの実施形態では、スペーサーは、親水性の二官能性スペーサーであってもよい。具体的な実施形態では、スペーサーは、アミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレートを有する。この点について、スペーサーは、たとえば、ＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨを含むものであってもよく、式中、ｍは１〜６の任意の整数であり、ｎは２〜１２の任意の整数である。その一例として、Peptides International, Inc.（Louisville, KY）から市販されている８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸がある。
クラス１、クラス２、クラス３のグルカゴン関連ペプチドだけに関するいくつかの実施形態では、スペーサーは、親水性の二官能性スペーサーであってもよい。特定の実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合した親水性の二官能性スペーサーは、２個または３個以上の反応性基、たとえば、アミン、ヒドロキシル、チオール、カルボキシ基またはこれらの任意の組み合わせを有する。特定の実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合した親水性の二官能性スペーサーは、ヒドロキシ基とカルボキシレートとを有する。他の実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合した親水性の二官能性スペーサーは、アミン基とカルボキシレートとを有する。他の実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合した親水性の二官能性スペーサーは、チオール基とカルボキシレートとを有する。
グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるいくつかの実施形態では、スペーサーは、疎水性の二官能性スペーサーである。疎水性の二官能性スペーサーは、当分野で知られている。たとえば、Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996)（その内容全体を本明細書に援用する）を参照のこと。特定の実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合した疎水性の二官能性スペーサーは、２個または３個以上の反応性基、たとえば、アミン、ヒドロキシル、チオール、カルボキシ基またはこれらの任意の組み合わせを有する。特定の実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合した疎水性の二官能性スペーサーは、ヒドロキシ基とカルボキシレートとを有する。他の実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合した疎水性の二官能性スペーサーは、アミン基とカルボキシレートとを有する。他の実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合した疎水性の二官能性スペーサーは、チオール基とカルボキシレートとを有する。カルボキシレートとヒドロキシ基またはチオール基とを有する好適な疎水性の二官能性スペーサーは、当分野で知られており、たとえば、８−ヒドロキシオクタン酸および８−メルカプトオクタン酸があげられる。
いくつかの実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合した二官能性スペーサーは、カルボキシレート基の間に、メチレン基の炭素原子を直鎖状に１〜７個含むジカルボン酸ではない。いくつかの実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合した二官能性スペーサーは、カルボキシレート基の間にメチレン基の炭素原子を直鎖状に１〜７個含むジカルボン酸である。
グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである具体的な実施形態におけるスペーサー（アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサーまたは疎水性の二官能性スペーサーなど）は、原子３〜１０個（たとえば原子６〜１０個（原子６個、原子７個、原子８個、原子９個または原子１０個など））の長さである。グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるさらに具体的な実施形態では、スペーサーは、原子約３〜約１０個（原子６〜１０個など）の長さであり、アシル基は、スペーサーとアシル基とを合わせた全長が、原子１４〜２８個、たとえば、原子約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、約２０個、約２１個、約２２個、約２３個、約２４個、約２５個、約２６個、約２７個または約２８個になるように、Ｃ１２〜Ｃ１８の脂肪族アシル基、たとえば、Ｃ１４の脂肪族アシル基、Ｃ１６の脂肪族アシル基である。グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるいくつかの実施形態では、スペーサーとアシル基との長さは、原子１７〜２８個（１９〜２６個、１９〜２１個など）の長さである。
グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである特定の実施形態によれば、二官能性スペーサーは、原子３〜１０個の長さのアミノ酸骨格を有する合成のアミノ酸または天然のアミノ酸（本明細書に記載のものを含むが、これらに限定されるものではない）であってもよい（６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸など）。あるいは、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合しているスペーサーは、原子３〜１０個（原子６〜１０個など）の長さのペプチド骨格を有するジペプチドスペーサーまたはトリペプチドスペーサーであってもよい。クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合しているジペプチドスペーサーまたはトリペプチドスペーサーのそれぞれのアミノ酸は、このジペプチドまたはトリペプチドの他のアミノ酸（単数または複数）と同一であっても異なっていてもよく、独立に、たとえば、天然のアミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）の任意のＤ異性体またはＬ異性体あるいは、β−アラニン（β−Ａｌａ）、Ｎ−α−メチル−アラニン（Ｍｅ−Ａｌａ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、γ−アミノ酪酸（γ−Ａｂｕ）、アミノヘキサン酸（ε−Ａｈｘ）、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、アミノメチルピロールカルボン酸、アミノピペリジンカルボン酸、アミノセリン（Ａｍｓ）、アミノテトラヒドロピラン−４−カルボン酸、アルギニンＮ−メトキシ−Ｎ−メチルアミド、β−アスパラギン酸（β−Ａｓｐ）、アゼチジンカルボン酸、３−（２−ベンゾチアゾリル）アラニン、α−ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、２−アミノ−５−ウレイド−ｎ−吉草酸（シトルリン、Ｃｉｔ）、β−シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、アセトアミドメチル−システイン、ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）、ジメチルチアゾリジン（ＤＭＴＡ）、γ−グルタミン酸（γ−Ｇｌｕ）、ホモセリン（Ｈｓｅ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、イソロイシンＮ−メトキシ−Ｎ−メチルアミド、メチル−イソロイシン（ＭｅＩｌｅ）、イソニペコチン酸（Ｉｓｎ）、メチルロイシン（ＭｅＬｅｕ）、メチルリジン、ジメチルリジン、トリメチルリジン、メタノプロリン、メチオニン−スルホキシド（Ｍｅｔ（Ｏ））、メチオニン−スルホン（Ｍｅｔ（Ｏ２））、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、メチル−ノルロイシン（Ｍｅ−Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））、４−フロオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））、４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−ＮＯ２））、４−シアノフェニルアラニン（（Ｐｈｅ（４−ＣＮ））、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、ピペリジニルアラニン、ピペリジニルグリシン、３，４−デヒドロプロリン、ピロリジニルアラニン、サルコシン（Ｓａｒ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、Ｏ−ベンジル−ホスホセリン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸（Ｓｔａ）、４−アミノ−５−シクロヘキシル−３−ヒドロキシペンタン酸（ＡＣＨＰＡ）、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸（ＡＨＰＰＡ）、１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）、テトラヒドロピラングリシン、チエニルアラニン（Ｔｈｉ）、Ｏ−ベンジル−ホスホチロシン、Ｏ−ホスホチロシン、メトキシチロシン、エトキシチロシン、Ｏ−（ビス−ジメチルアミノ−ホスホノ）−チロシン、硫酸チロシンテトラブチルアミン、メチル−バリン（ＭｅＶａｌ）、アルキル化された３−メルカプトプロピオン酸からなる群から選択される非天然のアミノ酸のＤ異性体またはＬ異性体をはじめとする、天然および／または非天然のアミノ酸からなる群から選択可能である。
グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるいくつかの実施形態では、スペーサーは、たとえば１つまたは２つの負の電荷を持つアミノ酸を有するなど、全体として負の電荷を有する。グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるいくつかの実施形態では、ジペプチドは、一般構造Ａ−Ｂのジペプチドのいずれでもなく、ｌこの場合、Ａは、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏからなる群から選択され、Ｂは、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐからなる群から選択される。グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるいくつかの実施形態では、ジペプチドスペーサーは、Ａｌａ−Ａｌａ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γ−アミノ酪酸−γ−アミノ酪酸、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕからなる群から選択される。
グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである本発明のいくつかの実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン関連ペプチドによる長鎖アルカンのアシル化によって、アシル基を含むように修飾される。グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである特定の態様では、長鎖アルカンは、グルカゴン関連ペプチドのカルボキシ基またはその活性化形態と反応する、アミン、ヒドロキシルまたはチオール基を有する（オクタデシルアミン、テトラデカノール、ヘキサデカンチオールなど）。クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドのカルボキシ基またはその活性化形態は、グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸（グルタミン酸、アスパラギン酸など）の側鎖の一部であってもよいし、ペプチド骨格の一部であってもよい。
特定の実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴンペプチドに結合しているスペーサーによる長鎖アルカンのアシル化によって、アシル基を含むように修飾される。具体的な態様では、長鎖アルカンは、スペーサーのカルボキシ基またはその活性化形態と反応するアミン、ヒドロキシルまたはチオール基を有する。カルボキシ基またはその活性化形態を有する好適なスペーサーを本明細書に記載し、一例として、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサー、疎水性の二官能性スペーサーなどの二官能性スペーサーがあげられる。
本明細書で使用する場合、「カルボキシ基の活性化形態」という表現は、一般式Ｒ（Ｃ＝Ｏ）Ｘのカルボキシ基を示し、式中、Ｘは脱離基であり、Ｒはグルカゴン関連ペプチドまたはスペーサーである。たとえば、カルボキシ基の活性化形態としては、塩化アシル、無水物、エステルがあげられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、活性化したカルボキシ基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）脱離基を有するエステルである。
長鎖アルカンが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドまたはスペーサーによってアシル化される本発明の態様に関して、長鎖アルカンは、どのようなサイズであってもよく、どのような炭素鎖長であってもよい。長鎖アルカンは、直鎖状であっても分岐状であってもよい。グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである特定の態様では、長鎖アルカンは、Ｃ４〜Ｃ３０アルカンである。たとえば、長鎖アルカンは、Ｃ４アルカン、Ｃ６アルカン、Ｃ８アルカン、Ｃ１０アルカン、Ｃ１２アルカン、Ｃ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、Ｃ１８アルカン、Ｃ２０アルカン、Ｃ２２アルカン、Ｃ２４アルカン、Ｃ２６アルカン、Ｃ２８アルカンまたはＣ３０アルカンのいずれであってもよい。グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるいくつかの実施形態では、長鎖アルカンは、Ｃ８〜Ｃ２０アルカン、たとえばＣ１４アルカン、Ｃ１６アルカンまたはＣ１８アルカンであってもよい。
また、グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるいくつかの実施形態では、グルカゴン関連ペプチドのアミン、ヒドロキシルまたはチオール基は、コレステロール酸でアシル化される。具体的な実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、アルキル化されたデスアミノシステインスペーサー、すなわち、アルキル化された３−メルカプトプロピオン酸スペーサーを介して、コレステロール酸に結合している。
アミン、ヒドロキシル、チオールによってペプチドをアシル化する好適な方法は、当分野で知られている。たとえば、Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382 (1996)；Shimohigashi and Stammer, Int J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982)；およびPreviero et al., Biochim Biophys Acta 263: 7-13 (1972)（ヒドロキシルでアシル化する方法）；およびSan and Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005)（チオールでアシル化する方法）；Bioconjugate Chem. "Chemical Modifications of Proteins: History and Applications" pages 1, 2-12 (1990)；Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. "Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity" Vol. 6, No: 2 pp.171-176 (1989)を参照のこと。
アシル化されたグルカゴン関連ペプチドのアシル基は、どのような炭素鎖長であってもよいなど、どのようなサイズであってもよく、直鎖状であっても分岐状であってもよい。本発明のいくつかの具体的な実施形態では、アシル基は、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸である。たとえば、アシル基は、Ｃ４脂肪酸、Ｃ６脂肪酸、Ｃ８脂肪酸、Ｃ１０脂肪酸、Ｃ１２脂肪酸、Ｃ１４脂肪酸、Ｃ１６脂肪酸、Ｃ１８脂肪酸、Ｃ２０脂肪酸、Ｃ２２脂肪酸、Ｃ２４脂肪酸、Ｃ２６脂肪酸、Ｃ２８脂肪酸またはＣ３０脂肪酸のいずれであってもよい。いくつかの実施形態では、アシル基は、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸、たとえば、Ｃ１４脂肪酸またはＣ１６脂肪酸である。
別の実施形態では、アシル基は胆汁酸である。胆汁酸は、好適な胆汁酸であれば、どのようなものであってもよい。一例をあげると、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、コレステロール酸などであるが、これらに限定されるものではない。
アシル化されたグルカゴン関連本明細書に記載のペプチドは、親水体を有するようにさらに修飾されていてもよい。いくつかの具体的な実施形態では、親水体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を有するものであってもよい。親水体の取り込みについては、本明細書に記載の任意の方法など、好適な任意の手段で達成可能である。この点について、アシル化されたグルカゴン関連ペプチドは、（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１０番目、２０番目、２４番目、２９番目のアミノ酸の少なくとも１つがアシル基を有し、（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１６番目、１７番目、２１番目、２４番目または２９番目、Ｃ末端の延長部分の範囲内にある位置にあるアミノ酸またはＣ末端のアミノ酸の少なくとも１つが、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはＡｃ−Ｐｈｅになるように修飾され、アミノ酸の側鎖が親水体（ＰＥＧなど）に共有結合している、本明細書に記載のいずれかの修飾を含む、配列番号７０１を有するものであってもよい。いくつかの実施形態では、アシル基は、任意に、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはＡｃ−Ｐｈｅを有するスペーサーを介して、（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１０番目に結合し、親水体は、２４番目でＣｙｓ残基に取り込まれる。
あるいは、アシル化されたグルカゴン関連ペプチドは、アシル化され、なおかつ親水体を含むように修飾されたスペーサーを有するものであってもよい。好適なスペーサーの非限定的な例としては、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、Ａｃ−Ｐｈｅからなる群から選択される１個または２個以上のアミノ酸を有するスペーサーがあげられる。
アルキル化
いくつかの実施形態によれば、グルカゴン関連ペプチド、たとえば、クラス１のグルカゴン関連ペプチド、クラス２のグルカゴン関連ペプチド、クラス３のグルカゴン関連ペプチド、クラス４のグルカゴンペプチドまたはクラス５のグルカゴン関連ペプチドは、血中半減期を延ばすおよび／または作用開始を遅らせるおよび／または作用時間を延ばすおよび／またはＤＰＰ−ＩＶなどのプロテアーゼに対する耐性を改善する目的で、エーテル結合、チオエーテル結合またはアミノ結合を介して、グルカゴン関連ペプチドに結合したアルキル基を含むように修飾される。グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである例示としての実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、天然のアミノ酸に対して非天然のアルキル基を有する。
アルキル化は、グルカゴン、受容体ＧＬＰ−１受容体または他のグルカゴン関連ペプチド受容体に対するグルカゴン関連ペプチドのアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性が保持されるという条件で、１番目から２９番目の任意の位置、Ｃ末端の延長部分の範囲内にある位置またはＣ末端のアミノ酸を含むグルカゴン関連ペプチドの範囲内のどの位置でなされてもよい。いくつかの実施形態では、アルキル化されていないペプチドがグルカゴンアゴニスト活性を有する場合、アルキル化されたペプチドは、グルカゴンアゴニスト活性を保持する。他の実施形態では、アルキル化されていないペプチドがグルカゴンアンタゴニスト活性を有する場合、アルキル化されたペプチドは、グルカゴンアンタゴニスト活性を保持する。いくつかの実施形態では、アルキル化されていないペプチドがＧＬＰ−１アゴニスト活性を有する場合、アルキル化されたペプチドは、ＧＬＰ−１アゴニスト活性を保持する。非限定的な例として、（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）５番目、７番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２４番目、２７番目、２８番目または２９番目でのアルキル化があげられる。クラス１、クラス２、クラス３のグルカゴン関連ペプチドについては、アルキル化は、（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）５番目、７番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２４番目、２７番目、２８番目、２９番目、３０番目、３７番目、３８番目、３９番目、４０番目、４１番目、４２番目または４３番目で起こり得る。アルキル基は、グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸に直接的に共有結合していてもよいし、グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸にスペーサーを介して間接的に共有結合していてもよく、ここで、スペーサーは、グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸とアルキル基との間に位置する。グルカゴン関連ペプチドは、親水体が結合した同一のアミノ酸の位置でアルキル化されてもよいし、異なるアミノ酸の位置でアルキル化されてもよい。非限定的な例として、（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１０番目でのアルキル化およびグルカゴン関連ペプチドのＣ末端領域の１箇所または２箇所以上、たとえば（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）２４番目、２８番目または２９番目、Ｃ末端の延長部分の範囲内またはＣ末端（Ｃ末端でのＣｙｓの付加によるなど）でのＰＥＧ化があげられる。
本発明の具体的な態様では、グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールの直接的なアルキル化によって、アルキル基を含むように修飾される。いくつかの実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、アミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールを介して、直接的にアルキル化される。いくつかの実施形態では、アルキル化は、（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１０番目、２０番目、２４番目または２９番目である。この点について、アルキル化されたグルカゴン関連ペプチドは、配列番号７０１のアミノ酸配列を有するものであってもよいし、本明細書に記載されたアミノ酸修飾の１個または２個以上を有する修飾されたアミノ酸配列であって、（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１０番目、２０番目、２４番目、２９番目のアミノ酸の少なくとも１つが、側鎖にアミン、ヒドロキシルまたはチオールを有するアミノ酸になるように修飾された配列を有するものであってもよい。本発明のいくつかの具体的な実施形態では、グルカゴン関連ペプチドの直接的なアルキル化は、（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１０番目のアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールを介してなされる。
いくつかの実施形態では、側鎖のアミンを有するアミノ酸は、式Ｉのアミノ酸である。例示としてのいくつかの実施形態では、式Ｉのアミノ酸は、ｎが４（Ｌｙｓ）またはｎが３（Ｏｒｎ）のアミノ酸である。
他の実施形態では、側鎖のヒドロキシルを有するアミノ酸は、式ＩＩのアミノ酸である。例示としてのいくつかの実施形態では、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１（Ｓｅｒ）のアミノ酸である。
さらに他の実施形態では、側鎖のチオールを有するアミノ酸は、式ＩＩＩのアミノ酸である。例示としてのいくつかの実施形態では、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１（Ｃｙｓ）のアミノ酸である。
グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるさらに他の実施形態では、側鎖にアミン、ヒドロキシルまたはチオールを有するアミノ酸は、式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩのアミノ酸のα炭素に結合した水素が第２の側鎖で置換されていること以外は、式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩと同一の構造を有する二置換アミノ酸である。
本発明のいくつかの実施形態では、アルキル化されたグルカゴン関連ペプチドは、ペプチドとアルキル基との間にスペーサーを有する。いくつかの実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、スペーサーにに共有結合し、このスペーサーがアルキル基に共有結合している。例示としてのいくつかの実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、スペーサーのアミン、ヒドロキシルまたはチオールのアルキル化によって、アルキル基を含むように修飾され、このスペーサーは、グルカゴン関連ペプチドの（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１０番目、２０番目、２４番目または２９番目で、アミノ酸の側鎖に結合する。スペーサーが結合しているアミノ酸は、スペーサーとの結合を可能にする部分を有するものであれば、どのようなアミノ酸であってもよい。クラス１、クラス２、クラス３のグルカゴン関連ペプチドについては、スペーサーが結合しているアミノ酸は、スペーサーとの結合を可能にする部分を有するものであれば、どのようなアミノ酸（α一置換アミノ酸またはα，α−二置換されたアミノ酸など）であってもよい。たとえば、側鎖に、−ＮＨ２、−ＯＨまたは−ＣＯＯＨを有するアミノ酸（Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕなど）が適している。この点において、アルキル化されたグルカゴン関連ペプチドは、配列番号７０１のアミノ酸配列を有するものであってもよいし、あるいは、本明細書に記載されたアミノ酸修飾の１個または２個以上を有する修飾されたアミノ酸配列であって、（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１０番目、２０番目、２４番目、２９番目のアミノ酸の少なくとも１つが、側鎖にアミン、ヒドロキシルまたはカルボキシレートを有するアミノ酸になるように修飾された配列を有するものであってもよい。
いくつかの実施形態では、スペーサーは、側鎖にアミン、ヒドロキシルまたはチオールを有するアミノ酸あるいは、側鎖にアミン、ヒドロキシルまたはチオールを有するアミノ酸を有するジペプチドまたはトリペプチドである。いくつかの実施形態では、アミノ酸スペーサーは、γ−Ｇｌｕではない。いくつかの実施形態では、ジペプチドスペーサーは、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕではない。
スペーサーのアミノ酸のアミン基を介してアルキル化が起こる場合、このアルキル化は、アミノ酸のαアミンまたは側鎖のアミンを介して起こり得る。αアミンがアルキル化されている例では、スペーサーのアミノ酸は、どのようなアミノ酸であってもよい。たとえば、スペーサーのアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒなどの疎水性のアミノ酸であってもよい。あるいは、スペーサーのアミノ酸は、ＡｓｐおよびＧｌｕなどの酸性残基であってもよい。グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである例示としての実施形態では、スペーサーのアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸などの疎水性のアミノ酸であってもよい。あるいは、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合したスペーサーのアミノ酸は、アルキル化が酸性残基のαアミンで起こるかぎりにおいて、酸性残基、たとえば、ＡｓｐおよびＧｌｕであってもよい。スペーサーのアミノ酸の側鎖のアミンがアルキル化されている例では、スペーサーのアミノ酸は、式Ｉのアミノ酸（ＬｙｓまたはＯｒｎなど）といった側鎖のアミンを有するアミノ酸である。この場合、スペーサーのアミノ酸のαアミンおよび側鎖のアミンはどちらも、グルカゴンペプチドがジアルキル化されるようにアルキル化可能なものである。本発明の実施形態は、このようなジアルキル化された分子を含む。
スペーサーのアミノ酸のヒドロキシ基を介してアルキル化が起こる場合、スペーサーのアミノ酸またはアミノ酸のうちの１つは、式ＩＩのアミノ酸であってもよい。一例としての具体的な実施形態では、アミノ酸はＳｅｒである。
スペーサーのアミノ酸のチオール基を介してアルキル化が起こる場合、スペーサーのアミノ酸またはアミノ酸のうちの１つは、式ＩＩＩのアミノ酸であってもよい。一例としての具体的な実施形態では、アミノ酸はＣｙｓである。
いくつかの実施形態では、スペーサーは、親水性の二官能性スペーサーであってもよい。具体的な実施形態では、スペーサーは、アミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレートを有する。この点について、スペーサーは、たとえば、ＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨを含むものであってもよく、式中、ｍは１〜６の任意の整数であり、ｎは２〜１２の任意の整数である。その一例として、Peptides International, Inc.（Louisville, KY）から市販されている８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸がある。
グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるいくつかの実施形態では、スペーサーは、親水性の二官能性スペーサーである。特定の実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合した親水性の二官能性スペーサーは、２個または３個以上の反応性基、たとえば、アミン、ヒドロキシル、チオール、カルボキシ基またはこれらの任意の組み合わせを有する。特定の実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合した親水性の二官能性スペーサーは、ヒドロキシ基とカルボキシレートとを有する。他の実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合した親水性の二官能性スペーサーは、アミン基とカルボキシレートとを有する。他の実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合した親水性の二官能性スペーサーは、チオール基とカルボキシレートとを有する。
いくつかの実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合しているスペーサーは、疎水性の二官能性スペーサーである。特定の実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合した疎水性の二官能性スペーサーは、２個または３個以上の反応性基、たとえば、アミン、ヒドロキシル、チオール、カルボキシ基またはこれらの任意の組み合わせを有する。特定の実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合した疎水性の二官能性スペーサーは、ヒドロキシ基とカルボキシレートとを有する。他の実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合した疎水性の二官能性スペーサーは、アミン基とカルボキシレートとを有する。他の実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合した疎水性の二官能性スペーサーは、チオール基とカルボキシレートとを有する。カルボキシレートとヒドロキシ基またはチオール基とを有する好適な疎水性の二官能性スペーサーは、当分野で知られており、たとえば、８−ヒドロキシオクタン酸および８−メルカプトオクタン酸があげられる。
グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである具体的な実施形態におけるスペーサー（アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサーまたは疎水性の二官能性スペーサーなど）は、原子３〜１０個（たとえば原子６〜１０個（原子６個、原子７個、原子８個、原子９個または原子１０個など））の長さである。一層具体的な実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合しているスペーサーは、原子約３〜約１０個（原子６〜１０個など）の長さであり、アルキルは、スペーサーとアルキル基とを合わせた全長が、原子１４〜２８個、たとえば、原子約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、約２０個、約２１個、約２２個、約２３個、約２４個、約２５個、約２６個、約２７個または約２８個になるように、Ｃ１２〜Ｃ１８のアルキル基、たとえば、Ｃ１４アルキル基、Ｃ１６アルキル基である。グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるいくつかの実施形態では、スペーサーとアルキルとの長さは、原子１７〜２８個（１９〜２６個、１９〜２１個など）の長さである。
グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである上記の特定の実施形態では、二官能性スペーサーは、原子３〜１０個の長さのアミノ酸骨格を有する合成のアミノ酸または非天然のアミノ酸であってもよい（６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸など）。あるいは、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合しているスペーサーは、原子３〜１０個（原子６〜１０個など）の長さのペプチド骨格を有するジペプチドスペーサーまたはトリペプチドスペーサーであってもよい。クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合しているジペプチドスペーサーまたはトリペプチドスペーサーは、たとえば、本明細書にて教示する任意のアミノ酸をはじめとする、天然および／または非天然のアミノ酸からなるものであってもよい。グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるいくつかの実施形態では、スペーサーは、たとえば１つまたは２つの負の電荷を持つアミノ酸を有するなど、全体として負の電荷を有する。グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるいくつかの実施形態では、ジペプチドスペーサーは、Ａｌａ−Ａｌａ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γ−アミノ酪酸−γ−アミノ酪酸、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ジペプチドスペーサーは、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕではない。
アミン、ヒドロキシル、チオールを用いてペプチドをアルキル化する好適な方法は、当分野で知られている。たとえば、ウィリアムソンエーテル合成を使用して、グルカゴン関連ペプチドとアルキル基との間にエーテル結合を形成してもよい。また、ペプチドとハロゲン化アルキルとの求核置換反応では、エーテル結合、チオエーテル結合またはアミノ結合のいずれでも得ることができる。
アルキル化されたグルカゴン関連ペプチドのアルキル基は、どのような炭素鎖長であってもよいなど、どのようなサイズであってもよく、直鎖状であっても分岐状であってもよい。本発明のいくつかの実施形態では、アルキル基は、Ｃ４〜Ｃ３０アルキルである。たとえば、アルキル基は、Ｃ４アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ８アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１８アルキル、Ｃ２０アルキル、Ｃ２２アルキル、Ｃ２４アルキル、Ｃ２６アルキル、Ｃ２８アルキルまたはＣ３０アルキルのいずれであってもよい。いくつかの実施形態では、アルキル基は、Ｃ８〜Ｃ２０アルキル、たとえば、Ｃ１４アルキルまたはＣ１６アルキルである。
いくつかの具体的な実施形態では、アルキル基は、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、コレステロール酸などの胆汁酸のステロイド部分を有する。
グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである本発明のいくつかの実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、求核基である長鎖アルカンをグルカゴン関連ペプチドと反応させることによってアルキル基を含むように修飾され、この場合のグルカゴン関連ペプチドは、求核置換に適した脱離基を有する。グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである特定の態様では、長鎖アルカンの求核基は、アミン、ヒドロキシルまたはチオール基（オクタデシルアミン、テトラデカノール、ヘキサデカンチオールなど）であってもよい。クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドの脱離基は、アミノ酸の側鎖の一部であってもよいし、あるいは、ペプチド骨格の一部であってもよい。好適な脱離基としては、たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ハロゲン、スルホン酸エステルがあげられる。
特定の実施形態では、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、求核基である長鎖アルカンを、グルカゴン関連ペプチドに結合しているスペーサーと反応させることで、アルキル基を含むように修飾され、この場合のスペーサーは、脱離基を有する。グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである特定の態様では、長鎖アルカンは、アミン、ヒドロキシルまたはチオール基を有する。グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである特定の実施形態では、脱離基を有するスペーサーは、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサー、疎水性の二官能性スペーサー（好適な脱離基をさらに有する）など、本明細書で説明するどのようなスペーサーであってもよい。
グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであり、長鎖アルカンが、グルカゴン関連ペプチドまたはスペーサーによってアルキル化されている本発明のこれらの態様に関して、長鎖アルカンは、どのようなサイズであってもよく、どのような炭素鎖長であってもよい。長鎖アルカンは、直鎖状であっても分岐状であってもよい。特定の態様では、長鎖アルカンは、Ｃ４〜Ｃ３０アルカンである。たとえば、長鎖アルカンは、Ｃ４アルカン、Ｃ６アルカン、Ｃ８アルカン、Ｃ１０アルカン、Ｃ１２アルカン、Ｃ１４アルカン、Ｃ１６アルカン、Ｃ１８アルカン、Ｃ２０アルカン、Ｃ２２アルカン、Ｃ２４アルカン、Ｃ２６アルカン、Ｃ２８アルカンまたはＣ３０アルカンのいずれであってもよい。グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるいくつかの実施形態では、長鎖アルカンは、Ｃ８〜Ｃ２０アルカン、たとえばＣ１４アルカン、Ｃ１６アルカンまたはＣ１８アルカンであってもよい。
また、グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるいくつかの実施形態では、グルカゴン関連ペプチドとコレステロール部分との間で、アルキル化が起こり得る。たとえば、コレステロールのヒドロキシ基は、長鎖アルカンの脱離基を置換して、コレステロール−グルカゴンペプチド産物を形成することができる。
本明細書に記載のアルキル化されたグルカゴン関連ペプチドは、親水体を有するようにさらに修飾されていてもよい。いくつかの具体的な実施形態では、親水体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を有するものであってもよい。親水体の取り込みについては、本明細書に記載の任意の方法など、好適な任意の手段で達成可能である。この点について、アルキル化されたグルカゴン関連ペプチドは、配列番号７０１を有するものであってもよいし、あるいは、本明細書に記載されたアミノ酸修飾の１個または２個以上を有する修飾されたアミノ酸配列であって、（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１０番目、２０番目、２４番目、２９番目のアミノ酸の少なくとも１つがアルキル基を有し、１６番目、１７番目、２１番目、２４番目、２９番目、Ｃ末端の延長部分の範囲内にある位置のアミノ酸またはＣ末端のアミノ酸の少なくとも１つが、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはＡｃ−Ｐｈｅになるように修飾され、アミノ酸の側鎖が親水体（ＰＥＧなど）に共有結合している配列を有するものであってもよい。いくつかの実施形態では、アルキル基は、任意に、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはＡｃ−Ｐｈｅを有するスペーサーを介して（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１０番目に結合し、親水体は、２４番目でＣｙｓ残基に取り込まれる。
あるいは、アルキル化されたグルカゴン関連ペプチドは、アルキル化され、なおかつ親水体を含むように修飾されたスペーサーを有するものであってもよい。好適なスペーサーの非限定的な例としては、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、Ａｃ−Ｐｈｅからなる群から選択される１個または２個以上のアミノ酸を有するスペーサーがあげられる。
α螺旋構造の安定化
いくつかの実施形態では、２つのアミノ酸側鎖間に分子内架橋を形成して、グルカゴン関連ペプチドのカルボキシ末端部分（たとえば、（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１２番目〜２９番目のアミノ酸）の三次元構造を安定させる。２つのアミノ酸側鎖を、水素結合、塩結合の形成などのイオンの相互作用で、あるいは、共有結合によって、互いに結合することが可能である。
いくつかの実施形態では、ｉ番目とｉ＋４番目のアミノ酸など、アミノ酸を３個あけて離れた２つのアミノ酸の間に、分子内架橋を形成する。ここで、ｉは、野生型グルカゴンのアミノ酸番号で１２〜２５の整数（１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５など）である。特に、野生型グルカゴンのアミノ酸番号で、１２番目と１６番目、１６番目と２０番目、２０番目と２４番目または２４番目と２８番目のアミノ酸の対（ｉ＝１２、１６、２０または２４のアミノ酸の対）の側鎖は、互いに結合しているため、グルカゴンのα螺旋を安定させる。あるいは、ｉは１７であってもよい。
ｉ番目のアミノ酸とｉ＋４番目のアミノ酸とが分子内架橋によって結合しているいくつかの具体的な実施形態では、リンカーのサイズは、原子約８個または約７〜約９個である。
他の実施形態では、ｊ番目とｊ＋３番目のアミノ酸など、アミノ酸を２個あけて離れた２つのアミノ酸の間に、分子内架橋を形成する。ここで、ｊは、野生型グルカゴンのアミノ酸番号で１２〜２６の整数（１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６など）である。いくつかの具体的な実施形態では、ｊは１７である。
ｊ番目のアミノ酸とｊ＋３番目のアミノ酸とが分子内架橋によって結合しているいくつかの具体的な実施形態では、リンカーのサイズは、原子約６個または原子約５個〜約７個である。
さらに他の実施形態では、ｋ番目のアミノ酸とｋ＋７番目のアミノ酸など、アミノ酸を６個あけて離れた２つのアミノ酸の間に、分子内架橋を形成する。ここで、ｋは、野生型グルカゴンのアミノ酸番号で１２〜２２の整数（１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２など）である。いくつかの具体的な実施形態では、ｋは１２、１３または１７である。例示としての実施形態では、ｋは１７である。
共有結合して、６個の原子からなる架橋した構造を形成できるアミノ酸対形成の例として、ＯｒｎとＡｓｐ、Ｇｌｕと式Ｉのアミノ酸（ｎは２）、ホモグルタミン酸と式Ｉのアミノ酸（ｎは１）があげられ、式Ｉは以下のとおりである。
Figure 2013540102

共有結合して、７個の原子からなる架橋した構造を形成できるアミノ酸対形成の例として、Ｏｒｎ−Ｇｌｕ（ラクタム環）；Ｌｙｓ−Ａｓｐ（ラクタム）；またはホモセリン−ホモグルタミン酸（ラクトン）があげられる。８個の原子からなるリンカーを形成できるアミノ酸対形成の例として、Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（ラクタム）；ホモリジン−Ａｓｐ（ラクタム）；Ｏｒｎ−ホモグルタミン酸（ラクタム）；４−アミノフェニルアラニン−Ａｓｐ（ラクタム）；またはＴｙｒ−Ａｓｐ（ラクトン）があげられる。９個の原子からなるリンカーを形成できるアミノ酸対形成の例として、ホモリジン−Ｇｌｕ（ラクタム）；Ｌｙｓ−ホモグルタミン酸（ラクタム）；４−アミノフェニルアラニン−Ｇｌｕ（ラクタム）；またはＴｙｒ−Ｇｌｕ（ラクトン）があげられる。これらのアミノ酸の側鎖はいずれも、α螺旋の三次元構造が破壊されないかぎり、別の化学基でさらに置換されていてもよい。当業者であれば、同様のサイズと望ましい効果を持つ、安定させる構造を生成する化学的に修飾された誘導体をはじめとして、別の対形成または別のアミノ酸類縁体を想定することができる。たとえば、ホモシステイン−ホモシステインジスルフィド結合は原子６個の長さであるが、望ましい効果を得られるように、これをさらに修飾してもよい。共有結合がない場合ですら、上述したアミノ酸対形成または当業者が想定できる同様の対形成によって、塩結合の形成または水素結合の相互作用などの非共有結合で、α螺旋の安定性を高めることができる。
ラクタム環のサイズは、アミノ酸側鎖の長さに応じて可変であり、いくつかの実施形態では、リジンアミノ酸の側鎖をグルタミン酸の側鎖に結合することで、ラクタムを形成する。（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）さらに他の例示としての実施形態は、任意にラクタム架橋を有する、以下の対形成を含む。１２番目のＧｌｕと１６番目のＬｙｓ；１２番目の天然のＬｙｓと１６番目のＧｌｕ；１６番目のＧｌｕと２０番目のＬｙｓ；１６番目のＬｙｓと２０番目のＧｌｕ；２０番目のＧｌｕと２４番目のＬｙｓ；２０番目のＬｙｓと２４番目のＧｌｕ；２４番目のＧｌｕと２８番目のＬｙｓ；２４番目のＬｙｓと２８番目のＧｌｕ。あるいは、ラクタム環のアミド結合の順序を逆にしてもよい（ラクタム環を、１２番目のリジンと１６番目のグルタミン酸の側鎖間あるいは、１２番目のグルタミン酸と１６番目のリジンとの間に形成してもよいなど）。
ラクタム架橋以外の分子内架橋を利用して、グルカゴン関連ペプチドのα螺旋を安定させてもよい。いくつかの実施形態では、分子内架橋は、疎水性の架橋である。この場合、分子内架橋は、任意に、グルカゴン関連ペプチドのα螺旋の疎水性の側の一部である２つのアミノ酸の側鎖の間にある。たとえば、疎水結合によって結合したアミノ酸の１つが、（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１０番目、１４番目、１８番目のアミノ酸であってもよい。
具体的な一態様では、オレフィンメタセシスを使用して、全炭化水素架橋系でグルカゴン関連ペプチドのα螺旋の１回転分または２回転分を架橋させる。この場合のグルカゴン関連ペプチドは、さまざまな長さのオレフィン側鎖を持つα−メチル化アミノ酸を有するものであってもよく、ｉ番目およびｉ＋４番目またはｉ＋７番目で、ＲかＳの立体異性を有するように構成されている。たとえば、オレフィン側は、（ＣＨ２）ｎを有するものであってもよく、式中、ｎは１〜６の整数である。いくつかの実施形態では、原子８個の長さで架橋する場合、ｎは３である。このような分子内架橋を形成するための好適な方法は、従来技術において説明されている。たとえば、Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122: 5891-5892 (2000)およびWalensky et al., Science 305: 1466-1470 (2004)を参照のこと。あるいは、グルカゴンペプチドは、螺旋の隣接する回転部分にあるＯ−アリルセリル残基を含むものであってもよく、この回転部分は、ルテニウム触媒を用いた閉環メタセシスによって架橋されている。このような架橋の工程は、たとえば、Blackwell et al., Angew, Chem., Int. Ed. 37: 3281-3284 (1998)に記載されている。
もうひとつの具体的な態様では、非天然のチオジアラミンアミノ酸であるランチオニンは、シスチンの擬似ペプチドとして広く使われてきたが、α螺旋の１つの回転を架橋するのに用いられる。ランチオニンを基にした環化の好適な方法は、当分野で知られている。たとえば、Matteucci et al., Tetrahedron Letters 45: 1399-1401 (2004)；Mayer et al., J. Peptide Res. 51: 432-436 (1998)；Polinsky et al., J. Med. Chem. 35: 4185-4194 (1992)；Osapay et al., J. Med. Chem. 40: 2241-2251 (1997)；Fukase et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 65: 2227-2240 (1992)；Harpp et al., J. Org. Chem. 36: 73-80 (1971)；Goodman and Shao, Pure Appl. Chem. 68: 1303-1308 (1996)；およびOsapay and Goodman, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1599-1600 (1993)を参照のこと。
いくつかの実施形態では、ｉ番目とｉ＋７番目のＧｌｕ残基間を繋ぐα，ω−ジアミノアルカン（１，４−ジアミノプロパンおよび１，５−ジアミノペンタンなど）を利用して、グルカゴンペプチドのα螺旋を安定させる。このような繋ぎを用いると、ジアミノアルカンの繋ぎの長さに応じて、原子９個またはそれより長い架橋が形成される。このような繋ぎを用いて架橋したペプチドを生成する好適な方法は、従来技術において説明されている。たとえば、Phelan et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 455-460 (1997)を参照のこと。
本発明のさらにもうひとつの実施形態では、ジスルフィド結合を利用して、グルカゴン関連ペプチドのα螺旋の１回転分または２回転分を架橋させる。あるいは、一方または両方の硫黄原子がメチレン基で置換されて等配電子のマクロ環化が生じる修飾されたジスルフィド結合を利用して、グルカゴン関連ペプチドのα螺旋を安定させる。ジスルフィド結合または硫黄を基にした環化でペプチドを修飾する好適な方法は、たとえば、Jackson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 9391-9392 (1991)およびRudinger and Jost, Experientia 20: 570-571 (1964)に記載されている。
さらにもうひとつの実施形態では、ｉ番目とｉ＋４番目に位置する２つのＨｉｓ残基またはＨｉｓとＣｙｓとの対で金属原子を結合することによって、グルカゴン関連ペプチドのα螺旋を安定させる。金属原子は、たとえば、Ｒｕ（ＩＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）またはＣｄ（ＩＩ）であってもよい。このような金属結合を基にしたα螺旋安定化方法は、当分野で知られている。たとえば、Andrews and Tabor, Tetrahedron 55: 11711-11743 (1999)；Ghadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 1630-1632 (1990)；およびGhadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 9063-9064 (1997)を参照のこと。
グルカゴン関連ペプチドのα螺旋を、他のペプチド環化手段で安定させてもよく、この手段は、Davies, J. Peptide. Sci. 9: 471-501 (2003)に概説されている。α螺旋は、アミド結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、尿素結合、カルバメート結合、スルホンアミド結合などを形成することで安定させることが可能なものである。たとえば、Ｃｙｓ残基の側鎖とＣ末端との間に、チオエステル結合を形成すればよい。あるいは、チオール（Ｃｙｓ）とカルボン酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕなど）とを有するアミノ酸の側鎖によって、チオエステルを形成すればよい。もうひとつの方法では、スベリン酸（オクタン二酸）といったジカルボン酸などの架橋剤を用いることで、アミノ酸側鎖の２つの官能基間に、遊離アミノ基、ヒドロキシ基、チオール基、これらの組み合わせなどの結合を導入してもよい。
いくつかの実施形態によれば、グルカゴン関連ペプチドのα螺旋を、疎水性のアミノ酸をｉ番目とｉ＋４番目に取り込むことで安定させる。たとえば、ｉはＴｙｒであってもよく、ｉ＋４はＶａｌまたはＬｅｕであってもよい；ｉはＰｈｅであってもよく、ｉ＋４はＣｙｓまたはＭｅｔであってもよい；ＩはＣｙｓであってもよく、ｉ＋４はＭｅｔであってもよい；またはｉはＰｈｅであってもよく、ｉ＋４はＩｌｅであってもよい。本明細書の目的で、ここに示したｉ番目のアミノ酸をｉ＋４番目におくことができる一方、ｉ＋４番目のアミノ酸をｉ番目におけるという意味で、上記のアミノ酸対形成を逆にしてもよいことを理解されたい。
グルカゴン関連ペプチドが、グルカゴンアゴニスト活性、ＧＩＰアゴニスト活性、グルカゴンアンタゴニストおよびＧＬＰ−１活性を有するペプチドである本発明の他の実施形態によれば、
グルカゴン関連ペプチドのＣ末端領域（野生型グルカゴンのアミノ酸番号の番号付けで１２番目から２９番目のアミノ酸のあたり）で、１個または２個以上のα螺旋を安定させるアミノ酸を（アミノ酸置換または挿入のいずれかによって）取り込んで、α螺旋を安定させる。具体的な実施形態では、α螺旋を安定させるアミノ酸は、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）あるいは、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチルから選択される同一の基または異なる基で二置換されたアミノ酸またはシクロオクタンまたはシクロヘプタン（１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸など）で二置換されたアミノ酸を含むがこれらに限定されるものではない、α，α−二置換アミノ酸である。いくつかの実施形態では、グルカゴン関連ペプチドの１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２４番目または２９番目のうち１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ以上を、α，α−二置換アミノ酸で置換する。具体的な実施形態では、１６番目、２０番目、２１番目、２４番目のうち１つ、２つ、３つまたはすべてを、ＡＩＢで置換する。
結合体
本開示は、任意に共有結合を介し、任意にリンカーを介して、結合体部分にグルカゴン関連ペプチド（クラス１のグルカゴン関連ペプチド、クラス２のグルカゴン関連ペプチド、クラス３のグルカゴン関連ペプチド、クラス４のグルカゴン関連ペプチドまたはクラス５のグルカゴン関連ペプチドなど）が結合している結合体を包含する。結合については、化学的共有結合、静電相互作用、水素間相互作用、イオン間相互作用、ファンデルワルス相互作用または疎水性の相互作用または親水性の相互作用などの物理的な力によって実施すればよい。ビオチン−アビジン、リガンド／受容体、酵素／基質、核酸／核酸結合タンパク質、脂質／脂質結合タンパク質、細胞接着分子の結合相手あるいは、互いに親和性のある任意の結合相手またはそれらの断片をはじめとして、多岐にわたる非共有結合系を利用できる。
ペプチドの標的にされるアミノ酸残基と、これらの標的にされるアミノ酸の選択された側鎖あるいは、Ｎ末端またはＣ末端の残基と反応できる有機誘導体化剤とを反応させることによる直接的な共有結合で、グルカゴン関連ペプチドを結合体部分に結合してもよい。結合体部分またはペプチドの反応性基として、アルデヒド基、アミノ基、エステ基ル、チオール基、α−ハロアセチル基、マレイミド基またはヒドラジノ基があげられる。誘導体化剤として、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介した結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介して）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸または当分野で知られた他の薬剤があげられる。あるいは、多糖キャリアまたはポリペプチドキャリアなどの中間キャリアを使用して、結合体部分をペプチドに間接的に結合することも可能である。多糖キャリアの例として、アミノデキストランがあげられる。好適なポリペプチドキャリアの例として、結合させたキャリアに望ましい溶解特性を与えるための、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、これらのコポリマーならびに、これらのアミノ酸と他のアミノ酸、たとえばセリンの混合ポリマーがあげられる。
システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのα−ハロ酢酸（および対応するアミン）と反応し、カルボキシメチル誘導体またはカルボキシアミドメチル誘導体を生成する。システイニル残基も、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミダゾール）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀安息香酸、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
ヒスチジル残基は、比較的ヒスチジル側鎖に特異的であるため、ｐＨ５．５〜７．０でジエチルピロカルボネートとの反応によって誘導体化される。ｐ−ブロモフェナシルブロミドも有用である。この反応については、０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム中にてｐＨ６．０で実施すると好ましい。
リジニルおよびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応する。これらの薬剤を用いる誘導体化には、リジニル残基の電荷を逆にする作用がある。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬として、ピコリンイミダートなどのイミドエステル、リン酸ピリドキサール、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、グリオキシル酸とのトランスアミナーゼ触媒反応があげられる。
アルギニル残基は、１種類または複数種類の従来の試薬との反応によって修飾され、この試薬としては、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、ニンヒドリンがあげられる。グアニジン官能基のｐＫａが高いため、アルギニン残基の誘導体化には、アルカリ条件で反応を実施する必要がある。さらに、これらの試薬は、リジンの基ならびにアルギニンのε−アミノ基と反応することがある。
チロシル残基に対しては、独特の修飾をほどこすことができ、特に興味深いのが、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によって、スペクトル標識をチロシル残基に導入することである。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを用いて、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を生成する。
カルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって、カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）を選択的に修飾する。式中、ＲとＲ’は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどの異なるアルキル基である。さらに、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパルチル残基およびグルタミル残基を、アスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換する。
他の修飾として、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン側鎖、アルギニン側鎖、ヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)）、アスパラギンまたはグルタミンの脱アミド化、Ｎ末端アミンのアセチル化および／またはアミド化またはＣ末端のカルボン酸基のエステル化があげられる。
もうひとつのタイプの共有結合修飾では、グリコシドをペプチドに化学的または酵素的に結合する。（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシ基、（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシ基、（ｅ）チロシンまたはトリプトファンのものなどの芳香族残基または（ｆ）グルタミンのアミド基に、糖（単数または複数）を結合してもよい。これらの方法は、１９８７年９月１１日に公開された国際特許出願公開公報ＷＯ８７／０５３３０ならびに、Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
本明細書に記載のグルカゴン関連ペプチドのいずれにも結合可能な結合体部分の例として、異種ペプチドまたはポリペプチド（血漿タンパク質などを含む）、ターゲットするための薬剤、免疫グロブリンまたはその一部（可変領域、ＣＤＲまたはＦｃ領域など）、放射性同位元素、フルオロフォアまたは酵素標識などの診断用標識、水溶性ポリマーをはじめとするポリマーまたは他の治療薬または診断薬があげられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、本発明のグルカゴン関連ペプチドと血漿タンパク質とを含む結合体が提供され、ここで、血漿タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、フィブリノーゲン、グロブリンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、結合体の血漿タンパク質部分は、アルブミンまたはトランスフェリンである。いくつかの実施形態では、リンカーは、原子１〜約６０個または１〜３０個の長さまたはこれよりも長い、原子２〜５個、原子２〜１０個、原子５〜１０個または原子１０〜２０個の長さの原子鎖を有する。いくつかの実施形態では、鎖の原子はすべて炭素原子である。いくつかの実施形態では、リンカーの骨格における鎖の原子は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｓからなる群から選択される。鎖の原子およびリンカーは、さらに溶解性の高い結合体を提供するよう、想定される溶解性（親水性）に応じて選択できるものである。いくつかの実施形態では、リンカーは、標的となる組織または臓器または細胞に見られる酵素または他の触媒または加水分解状態によって切断される官能基を提供するものである。いくつかの実施形態では、リンカーの長さは、立体障害の可能性を低減できるだけの十分な長さである。リンカーが共有結合またはペプチジル結合であり、結合体がポリペプチドである場合、結合体全体が融合タンパク質であってもよい。このようなペプチジルリンカーは、どのような長さであってもよい。例示としてのリンカーは、約１〜約５０アミノ酸長、５〜５０、３〜５、５〜１０、５〜１５または１０〜３０アミノ酸長である。あるいは、このような融合タンパク質を、当業者に知られた組換え遺伝子工学法で製造してもよい。
上述したように、いくつかの実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、免疫グロブリンまたはその一部（可変領域、ＣＤＲまたはＦｃ領域など）に結合する（融合するなど）。周知のタイプの免疫グロブリン（Ｉｇ）には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭがある。Ｆｃ領域は、Ｉｇ重鎖のＣ末端領域であって、再利用（半減期の延長になる）、抗体依存性細胞介在性細胞障害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）などの作用を行うＦｃ受容体に結合する役割を担う。
たとえば、いくつかの定義によれば、ヒトＩｇＧの重鎖Ｆｃ領域は、重鎖の２２６番目のシステインからＣ末端までの範囲である。「ヒンジ領域」は通常、ヒトＩｇＧ１の２１６番目のグルタミン酸から２３０番目のプロリンまでの範囲である（他のＩｇＧイソタイプのヒンジ領域については、システイン結合に関与するシステインをアラインすることで、ＩｇＧ１配列とアラインすることができる）。ＩｇＧのＦｃ領域は、２つの定常ドメインであるＣＨ２とＣＨ３を有する。ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインは通常、２３１番目のアミノ酸から３４１番目のアミノ酸までの範囲である。ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ３ドメインは通常、３４２番目〜４４７番目のアミノ酸の範囲である。免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片または領域のアミノ酸番号の表記はいずれも、Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Mdに基づいている。関連の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＣＨ１以外に、免疫グロブリン重鎖の１つまたは２つ以上の天然の定常領域または修飾された定常領域（ＩｇＧおよびＩｇＡのＣＨ２領域およびＣＨ３領域あるいは、ＩｇＥのＣＨ３領域およびＣＨ４領域）を有するものであってもよい。
好適な結合体部分は、ＦｃＲｎ結合部位を含む免疫グロブリン配列の一部を有する。サルベージ受容体であるＦｃＲｎは、免疫グロブリンを再利用し、これを血液循環に戻す役割を担う。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶解析に基づいて説明されている（Burmeister et al. 1994, Nature 372:379）。ＦｃとＦｃＲｎとの主な接触領域は、ＣＨ２とメインとＣＨ３ドメインの接合部付近である。ＦｃとＦｃＲｎとの接点はいずれも、単一のＩｇ重鎖の範囲内にある。主要な接触部位は、ＣＨ２ドメインの２４８番目、２５０番目〜２５７番目、２７２番目、２８５番目、２８８番目、２９０番目〜２９１番目、３０８番目〜３１１番目、３１４番目のアミノ酸残基およびＣＨ３ドメインの３８５番目〜３８７番目、４２８番目、４３３番目〜４３６番目のアミノ酸残基を含む。
いくつかの結合体部分は、ＦｃγＲ結合部位（単数または複数）を有するものであってもよいし、そうでなくてもよい。ＦｃγＲは、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを担う。ＦｃγＲと直接接するＦｃ領域内の位置の例は、２３４番目〜２３９番目のアミノ酸（ヒンジ領域内の下側）、２６５番目〜２６９番目のアミノ酸（Ｂ／Ｃループ）、２９７番目〜２９９番目のアミノ酸（Ｃ’／Ｅループ）、３２７番目〜３３２番目のアミノ酸（Ｆ／Ｇ）ループである（Sondermann et al., Nature 406: 267-273, 2000）。ＩｇＥのヒンジ領域内の下側は、ＦｃＲＩ結合にも関与している（Henry, et al., Biochemistry 36, 15568-15578, 1997）。ＩｇＡ受容体結合に関与する残基が、Lewis et al., (J Immunol. 175:6694-701, 2005)に記載されている。ＩｇＥ受容体結合に関与するアミノ酸残基は、Sayers et al. (J Biol Chem. 279(34):35320-5, 2004)に記載されている。
アミノ酸修飾を、免疫グロブリンのＦｃ領域に対して実施してもよい。このような変異したＦｃ領域は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン（３４２番目〜４４７番目の残基）での少なくとも１つのアミノ酸修飾および／またはＦｃ領域のＣＨ２ドメイン（２３１番目〜３４１番目の残基）での少なくとも１つのアミノ酸修飾を有する。ＦｃＲｎに対する親和性を高めると考えられている変異として、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、Ｎ４３４Ａがあげられる（Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591）。他の変異が、ＦｃＲｎに対する親和性を有意に低下させることなく、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＡへのＦｃ領域の結合が低下する場合もある。たとえば、Ｆｃ領域の２９７番目のＡｓｎをＡｌａまたは他のアミノ酸で置換すると、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位がなくなり、Ｆｃ領域の半減期の延長を伴う免疫原性が低下して、ＦｃγＲに対する結合が低下する場合がある（Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847；Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632；Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591）。ＦｃγＲへの結合を低下させるＩｇＧ１の２３３番目〜２３６番目のアミノ酸修飾がなされている（Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77およびArmour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613）。いくつかのアミノ酸置換例が、米国特許第７，３５５，００８号および同第７，３８１，４０８号（各々の全体を本明細書に援用する）に記載されている。
ｒＰＥＧ
いくつかの実施形態では、本発明の結合体は、国際特許出願公開公報ＷＯ２００９／０２３２７０および米国特許出願公開公報ＵＳ２００８／０２８６８０８に記載されているような、化学的ＰＥＧ（たとえば、組換えＰＥＧ（ｒＰＥＧ）分子など）に類似の伸長した構造を形成できる補助ペプチドに融合したグルカゴン関連ペプチド、オステオカルシンのみならず、上記のものの類縁体、誘導体、結合体をはじめとする、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドを有する。ｒＰＥＧ分子は、ポリエチレングリコールではない。いくつかの態様におけるｒＰＥＧ分子は、グリシン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニンまたはプロリンのうちの１つまたは２つ以上を有するポリペプチドである。いくつかの態様では、ｒＰＥＧは、ポリグリシン、ポリセリン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリアラニンまたはポリプロリンなどのホモポリマーである。他の実施形態では、ｒＰＥＧは、ｐｏｌｙ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）、ｐｏｌｙ（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ）、ｐｏｌｙ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、ｐｏｌｙ（Ｇｌｙ−Ａｓｐ）、ｐｏｌｙ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、ｐｏｌｙ（Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）など、２つのアミノ酸の繰り返し構造を含む。いくつかの態様では、ｒＰＥＧは、ｐｏｌｙ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ）など、３つの異なるアミノ酸を含む。特定の態様では、ｒＰＥＧは、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドまたはオステオカルシンの半減期を長くする。いくつかの態様では、ｒＰＥＧは、全体として正の電荷または全体として負の電荷を有する。いくつかの態様におけるｒＰＥＧには、二次構造が欠けている。いくつかの実施形態では、ｒＰＥＧは、アミノ酸１０個以上の長さであり、いくつかの実施形態では、アミノ酸約４０〜約５０個の長さである。いくつかの態様における補助ペプチドは、ペプチド結合またはプロテイナーゼ切断部位を介して本発明のペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合されるか、本発明のペプチドのループに挿入される。いくつかの態様におけるｒＰＥＧは、親和性タグを有するか、５ｋＤａよりも大きいＰＥＧに結合する。いくつかの実施形態では、ｒＰＥＧは、本発明のペプチドの流体力学半径を大きくし、血清半減期を延ばし、プロテアーゼ耐性を高めるまたは溶解性を高め、いくつかの態様では、ペプチドの免疫原性を低下させる。
融合ペプチド−Ｃ末端の延長部分
特定の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、GPSSGAPPPS（配列番号７１０）、GPSSGAPPPS-CONH2（配列番号７１１）、オキシントモジュリンのカルボキシ末端延長部分、KRNRNNIA（配列番号７１４）またはKGKKNDWKHNITQ（配列番号７１３）を含むがこれらに限定されるものではない、Ｃ末端またはＣ末端のアミノ酸配列を有するものであってもよい。たとえば、エキセンディン−４の末端の１０個のアミノ酸（すなわち、配列番号７１０（GPSSGAPPPS）の配列）は、本開示のクラス１のグルカゴン関連ペプチド、クラス２のグルカゴン関連ペプチド、クラス３のグルカゴン関連ペプチド、クラス４のグルカゴン関連ペプチドまたはクラス５のグルカゴン関連ペプチドのカルボキシ末端に結合する。
体重減少を誘導するもうひとつの化合物が、オキシントモジュリンすなわち、小腸（Diabetes 2005; 54:2390-2395を参照のこと）に見られる天然の消化ホルモンである。オキシントモジュリンは、２９個のアミノ酸からなるグルカゴンの配列に、配列番号７１４（KRNRNNIA）の８個のアミノ酸からなるカルボキシ末端延長部分が続く、３７個のアミノ酸からなるペプチド（配列番号７０６）。したがって、いくつかの実施形態では、配列番号７１４の配列のカルボキシ末端延長部分あるいは、配列KRNRの４個のアミノ酸からなる延長部分をさらに有するグルカゴン関連ペプチドのプロドラッグ誘導体が提供される。
３番目でのグルカゴン修飾
本明細書に記載のクラス１〜クラス３のグルカゴン関連ペプチドを（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）３番目で修飾し、グルカゴン受容体に対する活性を維持または増大させてもよい。
グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドであるいくつかの実施形態では、３番目のグルタミンをグルタミン類縁体で修飾することによって、グルカゴン受容体に対する活性を維持または増強してもよい。たとえば、３番目にグルタミン類縁体を有する、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体に対して、天然のグルカゴン（配列番号７０１）の約５％、約１０％、約２０％、約５０％または約８５％またはそれより高い活性を示すものであってもよい。いくつかの実施形態では、３番目にグルタミン類縁体を有する、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体に対して、３番目の修飾されたアミノ酸以外はグルタミン類縁体を有するペプチドと同一のアミノ酸配列を有する対応のグルカゴンペプチドの約２０％、約５０％、約７５％、約１００％、約２００％または約５００％またはそれより高い活性を示すものであってもよい。いくつかの実施形態では、３番目にグルタミン類縁体を有する、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体に対する活性が増強しているが、その活性は、天然のグルカゴンまたは３番目の修飾されたアミノ酸以外はグルタミン類縁体を有するペプチドと同一のアミノ酸配列を有する対応のグルカゴン関連ペプチドの活性に対して最大で１０００％、１０，０００％、１００，０００％または１，０００，０００％になる。
いくつかの実施形態では、グルタミン類縁体は、構造Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの側鎖を有する天然または非天然のアミノ酸である。
Figure 2013540102

式中、Ｒ１は、Ｃ０〜３アルキルまたはＣ０〜３ヘテロアルキルであり、Ｒ２は、ＮＨＲ４またはＣ１〜３アルキルであり、Ｒ３はＣ１〜３アルキルであり、Ｒ４は、ＨまたはＣ１〜３アルキルであり、Ｘは、ＮＨ、ＯまたはＳであり、Ｙは、ＮＨＲ４、ＳＲ３またはＯＲ３である。いくつかの実施形態では、ＸがＮＨであるか、あるいは、ＹがＮＨＲ４である。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ０〜２アルキルまたはＣ１ヘテロアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、ＮＨＲ４またはＣ１アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、ＨまたはＣ１アルキルである。グルカゴン関連ペプチドが、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドである例示としての実施形態では、構造Ｉの側鎖を有するアミノ酸が提示され、式中、Ｒ１はＣＨ２−Ｓであり、ＸはＮＨであり、Ｒ２は、ＣＨ３（アセトアミドメチル−システイン、Ｃ（Ａｃｍ））である；Ｒ１はＣＨ２であり、ＸはＮＨであり、Ｒ２は、ＣＨ３（アセチルジアミノブタン酸、Ｄａｂ（Ａｃ））である；Ｒ１は、Ｃ０アルキルであり、ＸはＮＨであり、Ｒ２はＮＨＲ４であり、Ｒ４は、Ｈ（カルバモイルジアミノプロピオン酸、Ｄａｐ（ｕｒｅａ））である；またはＲ１はＣＨ２−ＣＨ２であり、ＸはＮＨであり、Ｒ２は、ＣＨ３（アセチルオルニチン、Ｏｒｎ（Ａｃ））である。例示としての実施形態では、構造ＩＩの側鎖を有するアミノ酸が提示され、式中、Ｒ１はＣＨ２であり、ＹはＮＨＲ４であり、Ｒ４は、ＣＨ３（メチルグルタミン、Ｑ（Ｍｅ））である；例示としての実施形態では、構造ＩＩＩＩの側鎖を有するアミノ酸が提示され、式中、Ｒ１はＣＨ２であり、Ｒ４はＨ（メチオニン−スルホキシド、Ｍ（Ｏ））である。具体的な実施形態では、３番目のアミノ酸を、Ｄａｂ（Ａｃ）で置換する。
ダイマー
クラス１、クラス２、クラス３のグルカゴン関連ペプチドに関して、グルカゴン関連ペプチドは、リンカーを介して結合した少なくとも２つ、３つまたは４つ以上のペプチドを含むダイマー、トリマーまたはさらに高次のマルチマーの一部であってもよく、ここで、少なくとも一方または両方のペプチドが、グルカゴン関連ペプチドである。ダイマーは、ホモダイマーであってもヘテロダイマーであってもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、二官能性チオールクロスリンカーおよび二官能性アミンクロスリンカーからなる群から選択される。特定の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧ、たとえば、５ｋＤａのＰＥＧ、２０ｋＤａのＰＥＧである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ジスルフィド結合である。たとえば、ダイマーの各モノマーは、Ｃｙｓ残基（末端または末端以外のＣｙｓなど）を含むものであってもよく、各Ｃｙｓ残基の硫黄原子は、ジスルフィド結合の形成に関与する。本発明のいくつかの態様では、末端のアミノ酸（Ｎ末端またはＣ末端など）、末端以外のアミノ酸あるいは、少なくとも１個のモノマーの末端のアミノ酸と少なくとも１個の他のモノマーの末端以外のアミノ酸とを介して、モノマー同士が結合する。具体的な態様では、モノマーは、Ｎ末端のアミノ酸を介して結合する。いくつかの態様では、マルチマーのモノマーは、各モノマーのＣ末端のアミノ酸が互いに結合する、「尾と尾」の向きで互いに結合している。結合体部分は、ダイマー、トリマーまたはさらに高次のマルチマーをはじめとして、本明細書に記載のどのグルカゴン関連ペプチドと共有結合していてもよい。
グルカゴン関連ペプチドの製造方法
本明細書に開示のグルカゴン関連ペプチド（およびプロドラッグ）は、標準的な合成方法、組換えＤＮＡ技術あるいは、ペプチドおよび融合タンパク質を調製する他の任意の方法で、調製できるものである。非天然のアミノ酸の中には標準的な組換えＤＮＡ技術では発現できないものもあるが、これらを調製するための技術は、当分野で知られている。非ペプチド部分を包含する本発明の化合物を、適切な場合は標準的なペプチド化学反応に加えて、標準的な有機化学反応で合成してもよい。
グルカゴン関連ペプチドのクラスについて、下記において詳細に説明する。クラス１、クラス２、クラス３、クラス４、クラス５のグルカゴン関連ペプチドに関して開示する各セクションでは、上述したプロドラッグ化合物のグルカゴン関連ペプチド部分（Ｑ）の修飾について説明する。よって、グルカゴン関連ペプチドのクラスに関して説明する構成要素は、上述したようなプロドラッグ化合物を生成するように後にさらに修飾されるＱの構成要素である。
クラス１のグルカゴン関連ペプチド
特定の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、クラス１のグルカゴン関連ペプチドであり、これは、本明細書および国際特許出願ＰＣＴ ＵＳ２００９／４７４３７（２００９年６月１６日出願）、国際特許出願公開公報ＷＯ２００８／０８６０８６、２００８年７月１７日公開、米国仮特許出願第６１／０９０，４１５号（その内容全体を本明細書に援用する）に記載されている。
クラス１のグルカゴン関連ペプチドに関する、以下のセクションに示す生物学的配列（配列番号８０１〜９１５）は、国際特許出願ＰＣＴ ＵＳ２００９／４７４３７における配列番号１〜１１５に対応する。
活性
クラス１のグルカゴンペプチドは、天然のグルカゴンペプチドに対するグルカゴン受容体の活性を保持する（配列番号８０１）。たとえば、グルカゴンペプチドは、天然のグルカゴンの活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％を保持できる（グルカゴンに対するグルカゴンペプチドのＥＣ５０の反比として算出され、たとえば、実施例５で概要を説明するアッセイを用いて、ｃＡＭＰの産生を基準に判断できる）。いくつかの実施形態では、クラス１のグルカゴン関連ペプチドは、活性（activity）（本明細書では、「活性（potency）」という用語と同義に用いられる）が、グルカゴンと同一またはそれよりも高い。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のグルカゴンペプチドは、天然のグルカゴンペプチドと比較して、活性が最大で約１００％、約１０００％、約１０，０００％、約１００，０００％または約１，０００，０００％である。
本明細書に記載のクラス１のグルカゴン関連ペプチドはいずれも、ヒトグルカゴン受容体に対するＥＣ５０が、実施例５に記載のアッセイなどを用いて、グルカゴン受容体を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞においてｃＡＭＰ誘導を試験すると、約１００ｎＭ、約７５ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭまたはそれ未満であってもよい。一般に、ＰＥＧ化ペプチドは、ＰＥＧ化されていないペプチドよりもＥＣ５０が高い。たとえば、本明細書に記載のクラス１のグルカゴン関連ペプチドは、ＰＥＧ化されていないとき、グルカゴン受容体に対する活性が、グルカゴン受容体に対する天然のグルカゴン（配列番号８０１）の活性と比較して、少なくとも２０％（少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、１００％、１５０％、２００％、４００％、５００％またはそれよりも高いなど）であり得る。特定の実施形態では、本明細書に記載のクラス１のグルカゴン関連ペプチドは、親水体がない場合にはグルカゴン受容体に対して天然のグルカゴンの表記の活性（％）を示すが、親水体を有するときは、グルカゴン受容体に対する天然のグルカゴンの活性（％）が低下する。たとえば、本明細書に記載のクラス１のグルカゴン関連ペプチド、ＰＥＧ化されているとき、は、グルカゴン受容体に対する活性が、天然のグルカゴンの活性と比較して、少なくとも２％（少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％または少なくとも１０％など）であってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のクラス１のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体に対して上述した活性のどれを示すものであってもよいが、最大で天然のグルカゴンの活性の１０００％、１０，０００％、１００，０００％または１，０００，０００％である。
いくつかの実施形態では、クラス１のグルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が、天然のＧＬＰ−１の約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満または約１％未満であるおよび／またはグルカゴン受容体に対する選択性が、ＧＬＰ−１受容体に対する選択性の約５倍より高い、約１０倍より高いまたは約１５倍より高い。たとえば、いくつかの実施形態では、クラス１のグルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が、天然のＧＬＰ−１の５％未満であり、グルカゴン受容体に対する選択性が、ＧＬＰ−１受容体に対する選択性の５倍より高い。
溶解性の改善
天然のグルカゴンは、特に生理的なｐＨで水溶液に対する溶解性が低く、時間が経過するにつれて凝集および沈殿しやすい。これとは対照的に、いくつかの実施形態におけるクラス１のグルカゴン関連ペプチドは、ｐＨ６〜８または６〜９、たとえばｐＨ７にて、２５℃で２４時間後に、天然のグルカゴンと比較して、溶解性が少なくとも２倍、５倍またはそれよりも高い。
したがって、いくつかの実施形態では、クラス１のグルカゴン関連ペプチドを、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ（配列番号８０１）の野生型ペプチドに比して修飾して、天然のペプチドの生物学的活性を維持したまま、特に約５．５〜約８．０の範囲のｐＨで、水溶液に対するペプチドの溶解性を改善してある。
たとえば、親水体をペプチドに結合することによって、本明細書に記載のクラス１のグルカゴン関連ペプチドの溶解性を、さらに改善することが可能である。このような基を導入すると、作用時間が長くなるが、これは血中半減期が延びることを基準に判断できるものである。親水体については、本明細書でさらに説明する。
電荷をもつ残基を用いた修飾
いくつかの実施形態では、天然の電荷を持たないアミノ酸を、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸からなる群から選択される電荷を持つアミノ酸で置換するか、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に、電荷を持つアミノ酸を付加することによって、クラス１のグルカゴン関連ペプチドに電荷を付加して溶解性を改善する。
いくつかの実施形態によれば、クラス１のグルカゴン関連ペプチドは、ペプチドが、アミノ酸置換および／または電荷を持つアミノ酸をペプチドのＣ末端領域に導入する付加ならびに、いくつかの実施形態では、配列番号８０１の２７番目よりＣ末端側の位置に導入する付加によって修飾されるという事実がゆえに、溶解性が改善されている。任意に、電荷を持つ、１個、２個または３個のアミノ酸を、Ｃ末端領域内に導入してもよく、いくつかの実施形態では、２７番目よりＣ末端側に導入してもよい。いくつかの実施形態によれば、２８番目および／または２９番目の天然のアミノ酸（単数または複数）を、電荷を持つアミノ酸で置換および／または電荷を持つ１〜３個のアミノ酸を、たとえば２７番目の後、２８番目の後または２９番目の後など、ペプチドのＣ末端に付加する。例示としての実施形態では、電荷を持つアミノ酸のうち、１個、２個、３個またはすべてが、負の電荷を持つ。他の実施形態では、電荷を持つアミノ酸のうち、１個、２個、３個またはすべてが、正の電荷を持つ。
一例としての具体的な実施形態では、クラス１のグルカゴン関連ペプチドは、以下の修飾のうち１つまたは２つを有するものであってもよい。２８番目のＮからＥへの置換、２８番目のＮからＤへの置換、２９番目のＴからＤへの置換、２９番目のＴからＥへの置換、２７番目、２８番目または２９番目の後ろにＥの挿入、２７番目、２８番目または２９番目の後ろにＤの挿入。たとえば、ＤＥ（２８番目と２９番目）、ＥＥ（２８番目と２９番目）、ＥＥ（２９番目と３０番目）、ＥＥ（２８番目と３０番目）、ＤＥ（２８番目と３０番目）。
一例としての一実施形態によれば、クラス１のグルカゴン関連ペプチドは、配列番号８１１のアミノ酸配列あるいは、天然のグルカゴンと比較して１〜３個のアミノ酸修飾（本明細書ではグルカゴンアゴニストに関連して説明）をさらに有する類縁体のアミノ酸配列またはそのグルカゴンアゴニスト類縁体。配列番号８１１は、天然タンパク質の２８番目のアスパラギン残基がアスパラギン酸で置換されている、修飾されたクラス１のグルカゴン関連ペプチドを表す。もうひとつの例示としての実施形態では、クラス１のグルカゴン関連ペプチドは、天然タンパク質の２８番目のアスパラギン残基がグルタミン酸で置換されている、配列番号８３８のアミノ酸配列を有する。他の例示としての実施形態は、配列番号８２４、８２５、８２６、８３３、８３５、８３６、８３７のクラス１のグルカゴン関連ペプチドを含む。
２８番目および／または２９番目の普通に生じるアミノ酸を、電荷を持つアミノ酸で置換することおよび／またはクラス１のグルカゴン関連ペプチドのカルボキシ末端に電荷を持つ１個または２個のアミノ酸を付加することで、生理的に関連するｐＨ（すなわち、ｐＨ約６．５〜約７．５）での水溶液に対するグルカゴンペプチドの溶解性および水溶液中での安定性が、少なくとも５倍高まり、３０倍になるほど高まる。したがって、いくつかの実施形態でのクラス１のグルカゴンペプチドは、グルカゴン活性を保持し、２５℃で２４時間後に測定すると、約５．５〜約８の特定のｐＨ、たとえばｐＨ７で、天然のグルカゴンと比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２５倍、３０倍またはそれよりも高い溶解性を示す。
グルカゴン活性を保つことのできる、保存的な置換などの追加の修飾（本明細書でさらに説明する）を、クラス１のグルカゴン関連ペプチドに対してほどこしてもよい。
安定性の改善
クラス１のグルカゴンペプチドはいずれも、安定性が改善および／または分解が低減されることがあり、たとえば、２５℃で２４時間後にもとのペプチドの少なくとも９５％を保持する。本明細書に開示のクラス１のグルカゴン関連ペプチドはいずれも、５．５〜８の範囲内のｐＨで安定性が改善されることがあり、たとえば、２５℃で２４時間後に、もとのペプチドの少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を保持する。いくつかの実施形態では、本発明のクラス１のグルカゴン関連ペプチドは、ペプチドの濃度の少なくとも７５％（少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９５％を超える、最大１００％など）または分解されたペプチドの約２５％未満（２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０％までなど）が、２８０ｎｍで紫外線（ＵＶ）検出器によって、約１週間または２週間以上（約２週間、約４週間、約１か月、約２か月、約４か月、約６か月、約８か月、約１０か月、約１２か月など）経過後に、少なくとも２０℃（２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、少なくとも２７．５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも４０℃、少なくとも５０℃など）かつ１００℃未満、８５℃未満、７５℃未満または７０℃未満の温度の溶液で検出可能であるように安定性が改善される。クラス１のグルカゴン関連ペプチドは、たとえば、活性の増大、血中半減期の延長、寿命の延長、沈殿または凝集の低減および／または分解の低減（保管後に切断または化学修飾が生じるのを低減するなど）といった、ペプチドの薬学的特性を変化させる追加の修飾を有するものであってもよい。
一例としてのさらに別の実施形態では、特に酸性バッファーまたはアルカリ性バッファーでの経時的なペプチドの分解を低減するように、配列番号８０１の１５番目のアミノ酸を修飾することによって、上記のクラス１のグルカゴン関連ペプチドのいずれかをさらに修飾して安定性を改善してもよい。例示としての実施形態では、１５番目のＡｓｐを、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、システイン酸またはホモシステイン酸で置換する。
あるいは、配列番号８０１の１６番目のアミノ酸を修飾することで、本明細書に記載のクラス１のグルカゴン関連ペプチドのいずれかをさらに修飾して安定性を改善してもよい。例示としての実施形態では、１６番目のＳｅｒを、ＴｈｒまたはＡＩＢで置換するか、グルカゴン受容体に対する活性を増強する、クラス１のグルカゴン関連ペプチドに関して本明細書に記載のいずれかのアミノ酸で置換する。このような修飾は、１５番目のアスパラギン酸と１６番目のセリンとの間のペプチド結合の切断を低減するものである。
いくつかの実施形態では、さまざまなアミノ酸位置での分解を低減するように、２０番目、２１番目、２４番目または２７番目のうちの１箇所、２箇所、３箇所または４箇所すべてを修飾することによって、本明細書に記載のクラス１のグルカゴン関連ペプチドのいずれかをさらに修飾してもよい。例示としての実施形態は、２０番目のグルタミンから、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＡＩＢへの置換、２１番目のＡｓｐから、Ｇｌｕへの置換、２４番目のグルタミンからＡｌａまたはＡＩＢへの置換、２７番目のＭｅｔからＬｅｕまたはＮｌｅへの置換を含む。メチオニンを除去または置換すると、メチオニンの酸化による分解が低減される。ＧｌｎまたはＡｓｎを除去または置換すると、ＧｌｎまたはＡｓｎの脱アミド化による分解が低減される。Ａｓｐを除去または置換すると、Ａｓｐが脱水し、環状スクシンイミド中間体を形成した後、イソアスパラギン酸へ異性体化することで生じる分解が低減される。
増強された活性
もうひとつの実施形態によれば、グルカゴン受容体に対する活性が増強された、天然のグルカゴン（配列番号８０１）の１６番目にアミノ酸修飾を有するクラス１のグルカゴン関連ペプチドが提示される。非限定的な例として、このような増強された活性は、１６番目の天然のセリンを、グルタミン酸で置換あるいは、原子４個の長さの側鎖を有する別の負の電荷を持つアミノ酸で置換あるいは、グルタミン、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸のうちの任意の１つで置換あるいは、少なくとも１個のヘテロ原子（Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐなど）を含有し、原子約４個（または３個〜５個）の長さの側鎖を有する電荷を持つアミノ酸で置換することによって、与えられるものである。１６番目のセリンをグルタミン酸で置換すると、グルカゴン受容体に対するグルカゴン活性が、少なくとも２倍、４倍、５倍、最大１０倍大きくなる。いくつかの実施形態では、クラス１のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体に対する選択性を、ＧＬＰ−１受容体に対し、たとえば、少なくとも５倍、１０倍または１５倍保持する。
ＤＰＰ−ＩＶ耐性
いくつかの実施形態では、本明細書に開示のクラス１のグルカゴンペプチドを１番目または２番目でさらに修飾し、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を低減する。特に、いくつかの実施形態では、クラス１のグルカゴン関連ペプチドの１番目および／または２番目を、本明細書に記載のＤＰＰ−ＩＶ耐性アミノ酸（単数または複数）で置換する。いくつかの実施形態では、類縁体ペプチドの２番目を、アミノイソ酪酸で置換する。いくつかの実施形態では、類縁体ペプチドの２番目を、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、ε−アミノ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換する。もうひとつの実施形態では、クラス１のグルカゴン関連ペプチドの２番目を、Ｄ−セリン、グリシン、アミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換する。いくつかの実施形態では、２番目のアミノ酸はＤ−セリンではない。
グルカゴンペプチドのＣ末端領域（アミノ酸１２番目〜２９番目のあたり）におけるα螺旋構造を安定化することで、グルカゴンペプチドの１番目および／または２番目のアミノ酸の修飾時におけるグルカゴン活性の低下を回復することが可能である。α螺旋構造については、本明細書にてさらに説明するように、１２番目〜２９番目のあたりでの共有結合または非共有結合の分子内架橋の形成（たとえば、「ｉ」番目と「ｉ＋４」番目のアミノ酸の側鎖間のラクタム架橋であって、この場合のｉは１２〜２５の整数である）、α螺旋を安定化するアミノ酸（α，α−二置換アミノ酸など）でのアミノ酸の置換および／またはその挿入などによって、安定させることが可能である。
３番目の修飾
３番目の天然のグルタミンから、酸性、塩基性または疎水性のアミノ酸への置換などの（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）３番目のアミノ酸修飾によって、グルカゴン受容体の活性を低減してもよい。たとえば、３番目をグルタミン酸、オルニチンまたはノルロイシンで置換すると、グルカゴン受容体の活性が実質的に低減または破壊される。
３番目のグルタミンを本明細書に記載のグルタミン類縁体で修飾することによって、グルカゴン受容体に対する活性を維持または増強してもよい。たとえば、グルカゴンアゴニストは、配列番号８６３、配列番号８６９、配列番号８７０、配列番号８７１、配列番号８７２、配列番号８７３、配列番号８７４のアミノ酸配列を含むものであってもよい。
Ｃ末端のアミドおよびエステルによるＧＬＰ−１活性の増強
Ｃ末端のアミノ酸のカルボン酸を、アミドまたはエステルなどの電荷が中性の基で置換することによって、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が増強される。逆に、ペプチドのＣ末端における天然のカルボン酸を保持すると、クラス１のグルカゴン関連ペプチドの、ＧＬＰ−１受容体に対するグルカゴン受容体の選択性が比較的高く維持される（約５倍より高い、約６倍より高い、約７倍より高い、約８倍より高い、約９倍より高い、約１０倍より高い、約１１倍より高い、約１２倍より高い、約１３倍より高い、約１４倍より高い、約１５倍より高い、約１６倍より高い、約１７倍より高い、約１８倍より高い、約１９倍または約２０倍など）。
別の修飾と組み合わせ
クラス１のグルカゴン関連ペプチドをさらに修飾してもよく、この修飾によって、溶解性および／または安定性および／またはグルカゴン活性が、さらに増大することがある。あるいは、クラス１のグルカゴン関連ペプチドは、溶解性または安定性に実質的に影響せず、グルカゴン活性を実質的に低下させない他の修飾を含むものであってもよい。例示としての実施形態では、クラス１のグルカゴン関連ペプチドは、天然のグルカゴン配列と比較して、合計で最大１１または最大１２または最大１３または最大１４のアミノ酸修飾を有するものであってもよい。たとえば、保存的または非保存的な置換、付加または欠失を、２番目、５番目、７番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２４番目、２７番目、２８番目または２９番目のいずれで実施してもよい。
クラス１のグルカゴン関連ペプチドの修飾の例として、以下のものがあげられるが、これらに限定されるものではない。
（ａ）少なくともグルカゴンアゴニストの部分活性を保持した状態での非保存的な置換、保存的な置換、付加または欠失、たとえば、２番目、５番目、７番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２４番目、２７番目、２８番目または２９番目のうちの１箇所または２箇所以上での保存的な置換、１０番目のＴｙｒからＶａｌまたはＰｈｅへの置換、１２番目のＬｙｓからＡｒｇへの置換、これらの位置の１個または２個以上のアミノ酸からＡｌａへの置換
（ｂ）少なくともグルカゴンアゴニストの部分活性を保持した状態での２９番目および／または２８番目ならびに、任意に２７番目のアミノ酸の欠失
（ｃ）グルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸またはホモシステイン酸で置換することなどによる１５番目のアスパラギン酸の修飾（この修飾が分解を低減することがある）；または１６番目のセリンの修飾、たとえば、スレオニン、ＡＩＢ、グルタミン酸の置換による修飾あるいは、原子４個の長さの側鎖を有する別の負の電荷を持つアミノ酸への置換あるいは、グルタミン、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸のうちの任意の１つへの置換による修飾（この修飾も同様に、１５番目のアスパラギン酸と１６番目のセリンとの間の結合の切断による分解を低減することがある）
（ｄ）たとえば１６番目、１７番目、２０番目、２１番目、２４番目、２９番目、４０番目またはＣ末端のアミノ酸における、本明細書に記載するような水溶性ポリマーであるポリエチレングリコールなどの親水体の付加（これによって、溶解性および／または半減期が増大することがある）
（ｅ）酸化による分解を低減するための、ロイシンまたはノルロイシンで置換することなどによる２７番目のメチオニンの修飾
（ｆ）Ｇｌｎの脱アミド化によって起こる分解を低減するための、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＡＩＢで置換することなどによる２０番目または２４番目のＧｌｎの修飾
（ｇ）Ａｓｐが脱水し、環状スクシンイミド中間体を形成した後、イソアスパラギン酸へ異性体化することで生じる分解を低減するための、Ｇｌｕで置換することなどによる２１番目のＡｓｐの修飾
（ｈ）任意に「ｉ」番目と「ｉ＋４」番目との間のラクタム架橋などの分子内架橋（式中、ｉは、１２、１６、２０、２４など、１２〜２５の整数である）との組み合わせで、ＤＰＰ−ＩＶによる切断に対する耐性を改善する、本明細書に記載するような１番目または２番目の修飾
（ｉ）血中半減期を延ばすおよび／または作用時間を長くするおよび／または作用開始を遅らせることで、グルカゴン受容体および／またはＧＬＰ−１受容体に対する活性を増強することがある、本明細書に記載するようなグルカゴンペプチドのアシル化またはアルキル化（このアシル化またはアルキル化に、任意に、親水体の付加を組み合わせてもよく、これに加えて、あるいはこれに代えて、任意にＧＬＰ−１ペプチドに対する活性を選択的に低減する修飾、たとえば、７番目のＴｈｒから、ヒドロキシ基を欠いたアミノ酸、たとえば、ＡｂｕまたはＩｌｅへの置換などの７番目でのＴｈｒの修飾と組み合わせてもよい）、２７番目のアミノ酸よりＣ末端側のアミノ酸の欠失（２８番目と２９番目のアミノ酸の一方または両方を欠失させ、アミノ酸２７個または２８個の長さのペプチドを得るなど）
（ｊ）本明細書に記載するようなＣ末端の延長部分
（ｋ）本明細書に記載するようなホモダイマー化またはヘテロダイマー化
（ａ）から（ｋ）の組み合わせ。
いくつかの実施形態では、クラス１のグルカゴン関連ペプチドの修飾の例として、Ａ群から選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾およびＢ群および／またはＣ群から選択される１つまたは２つ以上のアミノ酸修飾があげられる。
この場合のＡ群は、次のとおりである。
２８番目のＡｓｎから電荷を持つアミノ酸への置換
２８番目のＡｓｎから、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモシステイン酸からなる群から選択される電荷を持つアミノ酸への置換
２８番目でのＡｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕへの置換
２８番目でのＡｓｐへの置換
２８番目でのＧｌｕへの置換
２９番目のＴｈｒから電荷を持つアミノ酸への置換
２９番目のＴｈｒから、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモシステイン酸からなる群から選択される電荷を持つアミノ酸への置換
２９番目でのＡｓｐ、ＧｌｕまたはＬｙｓへの置換
２９番目でのＧｌｕへの置換
２９番目の後ろに電荷を持つ１〜３個のアミノ酸の挿入
２９番目の後ろにＧｌｕまたはＬｙｓの挿入
２９番目の後ろにＧｌｙ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−Ｌｙｓの挿入
またはこれらの組み合わせ。
また、この場合のＢ群は、次のとおりである。
１５番目のＡｓｐからＧｌｕへの置換
１６番目のＳｅｒからＴｈｒまたはＡＩＢへの置換。
さらに、この場合のＣ群は、次のとおりである。
１番目のヒスチジンからジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する非天然のアミノ酸への置換
２番目のＳｅｒからジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する非天然のアミノ酸への置換
１２番目のＬｙｓからＡｒｇへの置換
２０番目のＧｌｕからＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＡＩＢへの置換
２１番目のＡｓｐからＧｌｕへの置換
２４番目のＧｌｕから、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＡＩＢへの置換
２７番目のＭｅｔからＬｅｕまたはＮｌｅへの置換
２７〜２９番目のアミノ酸の欠失
２８番目〜２９番目のアミノ酸の欠失
２９番目のアミノ酸の欠失
またはこれらの組み合わせ。
例示としての実施形態では、１２番目のＬｙｓをＡｒｇで置換する。他の例示としての実施形態では、２９番目および／または２８番目のアミノ酸ならびに、任意に２７番目のアミノ酸が、欠失される。
いくつかの具体的な実施形態では、グルカゴンペプチドは、（ａ）ＤＰＰ−ＩＶ耐性を与える、１番目および／または２番目のアミノ酸修飾、たとえば、１番目でのＤＭＩＡまたは２番目でのＡＩＢへの置換、（ｂ）１６番目と２０番目など、１２番目〜２９番目の範囲内での分子内架橋あるいは、１６番目、２０番目、２１番目、２４番目のアミノ酸の１つまたは２つ以上から、α，α−二置換アミノ酸への置換、任意に（ｃ）２４番目、２９番目のＣｙｓを介するか、またはＣ末端のアミノ酸における、ＰＥＧなどの親水物への結合、任意に（ｄ）ＭｅｔからＮｌｅなどに置換する２７番目のアミノ酸修飾、任意に（ｅ）分解を低減する、２０番目、２１番目および２４番目のアミノ酸修飾ならびに、任意に（ｆ）配列番号８２０への結合を含む。グルカゴンペプチドが配列番号８２０に結合している場合、特定の実施形態における２９番目のアミノ酸はＴｈｒまたはＧｌｙである。他の具体的な実施形態では、グルカゴンペプチドは、（ａ）Ａｓｐ−Ｇｌｕ（２８番目と２９番目）またはＧｌｕ−Ｇｌｕ（２８番目と２９番目）またはＧｌｕ−Ｇｌｕ（２９番目と３０番目）またはＧｌｕ−Ｇｌｕ（２８番目と３０番目）またはＡｓｐ−Ｇｌｕ（２８番目と３０番目）ならびに、任意に（ｂ）ＳｅｒからＴｈｒまたはＡＩＢなどに置換する、１６番目のアミノ酸修飾、任意に（ｃ）ＭｅｔからＮｌｅなどに置換する、２７番目のアミノ酸修飾および任意に（ｄ）分解を低減させる、２０番目、２１番目および２４番目のアミノ酸修飾を含む。具体的な実施形態では、グルカゴンペプチドは、Ｔ１６、Ａ２０、Ｅ２１、Ａ２４、２７番目のＮｌｅ、Ｄ２８、Ｅ２９である。
いくつかの実施形態では、クラス１のグルカゴン関連ペプチドは、以下に示すアミノ酸配列を有する。
１〜３個のアミノ酸修飾がなされた、Ｘ１−Ｘ２−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｚ（配列番号８３９）
ここで、Ｘ１および／またはＸ２は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する（または耐性を高める）非天然のアミノ酸であり、
この場合のＺは、−ＣＯＯＨ（天然のＣ末端カルボキシレート）、−Ａｓｎ−ＣＯＯＨ、Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ、Ｙ−ＣＯＯＨからなる群から選択され、Ｙは、１〜２個のアミノ酸であり、
ここで、分子内架橋、好ましくは共有結合によって、ｉ番目のアミノ酸とｉ＋４番目のアミノ酸の側鎖同士を結合し、ここで、ｉは、１２、１６、２０または２４である。
いくつかの実施形態では、分子内架橋はラクタム架橋である。いくつかの実施形態では、配列番号８３９のｉ番目とｉ＋４番目のアミノ酸は、ＬｙｓとＧｌｕ、たとえば、１６番目のグルタミン酸および２０番目のリジンである。いくつかの実施形態では、Ｘ１は、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｎ−メチルヒスチジン、α−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシルヒスチジン、アセチルヒスチジン、ホモヒスチジン、α，α−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）からなる群から選択される。他の実施形態では、Ｘ２は、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチルセリン、Ｖａｌ、α−アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、グルカゴンペプチドは、１６番目、１７番目、２０番目、２１番目、２４番目、２９番目、４０番目のアミノ酸、Ｃ末端の延長部分の範囲内またはＣ末端のアミノ酸のいずれかで、親水体に共有結合している。例示としての実施形態では、この親水体は、これらの位置のいずれかで、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチル−フェニルアラニン残基に共有結合している。親水体の例として、分子量約１，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンまたは約２０，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンなどのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）があげられる。
他の実施形態では、クラスＩのグルカゴン関連ペプチドは、以下に示すアミノ酸配列を有する。
Ｘ１−Ｘ２−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｚ（配列番号８３９）
ここで、Ｘ１および／またはＸ２は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する（または耐性を高める）非天然のアミノ酸であり、
この場合のグルカゴンペプチドの１６番目、２０番目、２１番目、２４番目のうち１箇所、２箇所、３箇所、４箇所または５箇所以上が、α，α−二置換アミノ酸で置換され、
Ｚは、−ＣＯＯＨ（天然のＣ末端カルボキシレート）、−Ａｓｎ−ＣＯＯＨ、Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ、Ｙ−ＣＯＯＨからなる群から選択され、この場合のＹは、１〜２個のアミノ酸である。
上記のクラス１のグルカゴン関連ペプチドまたは類縁体に対するさらに他のアミノ酸修飾の例は、任意に（任意にスペーサーを介して）アシル基またはアルキル基（このアシル基またはアルキル基は、天然のアミノ酸に対して非天然である）に共有結合している側鎖を有するアミノ酸の置換または付加との組み合わせで、７番目のＴｈｒから、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、Ｉｌｅなどのヒドロキシ基を欠いたアミノ酸への置換、１２番目のＬｙｓからＡｒｇへの置換、１５番目のＡｓｐからＧｌｕへの置換、１６番目のＳｅｒからＴｈｒまたはＡＩＢへの置換、２０番目のＧｌｕから、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＡＩＢへの置換、２１番目のＡｓｐからＧｌｕへの置換、２４番目のＧｌｕから、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＡＩＢへの置換、２７番目のＭｅｔからＬｅｕまたはＮｌｅへの置換、２８番目のＡｓｎから電荷を持つアミノ酸への置換、２８番目のＡｓｎから、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモシステイン酸からなる群から選択される電荷を持つアミノ酸への置換、２８番目でのＡｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕへの置換、２８番目でのＡｓｐへの置換、２８番目でのＧｌｕへの置換、２９番目のＴｈｒから電荷を持つアミノ酸への置換、２９番目のＴｈｒから、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモシステイン酸からなる群から選択される電荷を持つアミノ酸への置換、２９番目でのＡｓｐ、ＧｌｕまたはＬｙｓへの置換、２９番目でのＧｌｕへの置換、２９番目の後ろに電荷を持つ１〜３個のアミノ酸の挿入、３０番目（すなわち、２９番目の後ろ）でのＧｌｕまたはＬｙｓの挿入（任意に３１番目にＬｙｓの挿入）、Ｃ末端に対する配列番号８２０の付加（任意に、２９番目のアミノ酸はＴｈｒまたはＧｌｙである）、親水体に共有結合しているアミノ酸の置換または付加またはこれらの組み合わせを含む。
グルカゴン受容体の活性を増強し、グルカゴン受容体の部分活性を保持し、溶解性を改善し、安定性を高め、あるいは分解を低減する、クラス１のグルカゴンアゴニストに関連して上述した修飾については、クラス１のグルカゴンペプチドに、個々に適用してもよいし、組み合わせで適用してもよい。よって、グルカゴン受容体に対する天然のグルカゴンの活性の少なくとも２０％を保持し、ｐＨ６〜８または６〜９（ｐＨ７など）にて、少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で可溶であり、任意に、２５℃で２４時間後にもとのペプチドの少なくとも９５％を保持する（たとえば、もとのペプチドの５％またはそれ未満しか分解または切断されない）、クラス１のグルカゴン関連ペプチドを調製可能である。あるいは、グルカゴン受容体に対する活性が天然のグルカゴンの少なくとも約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％、約２００％、約２５０％、約３００％、約３５０％、約４００％、約４５０％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％または約１０倍であるかそれより高く、任意に、ｐＨ６〜８または６〜９（ｐＨ７など）にて、少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で可溶であり、任意に、２５℃で２４時間後に、もとのペプチドの少なくとも９５％を保持する（たとえば、もとのペプチドの５％またはそれ未満しか分解または切断されない）高活性なクラス１のグルカゴンペプチドを調製可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のクラス１のグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対する活性の上述した相対レベルの少なくともいずれかを示すものであればよいが、グルカゴン受容体に対する活性が、天然のグルカゴンの場合と比較して、最大で１０，０００％、１００，０００％または１，０００，０００％である。
クラス１のグルカゴン関連ペプチドの実施形態の例
いくつかの実施形態によれば、２８番目および／または２９番目における天然のアミノ酸を、負の電荷を持つアミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸など）で置換し、任意に、負の電荷を持つアミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸など）を、ペプチドのカルボキシ末端に付加することによって、配列番号８０１の天然のグルカゴンペプチドを修飾する。別の実施形態では、２９番目における天然のアミノ酸を、正の電荷を持つアミノ酸（リジン、アルギニンまたはヒスチジンなど）で置換し、任意に、１個または２個の正の電荷を持つアミノ酸（リジン、アルギニンまたはヒスチジンなど）を、ペプチドのカルボキシ末端に付加することによって、配列番号８０１の天然のグルカゴンペプチドを修飾する。いくつかの実施形態によれば、配列番号８３４のアミノ酸配列を有する、溶解性と安定性が改善されたグルカゴン類縁体が提供されるが、ただし、２８番目または２９番目の少なくとも１個のアミノ酸が、酸性アミノ酸で置換されるおよび／または追加の酸性アミノ酸が、配列番号８３４のカルボキシ末端に付加される。いくつかの実施形態では、酸性アミノ酸は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモシステイン酸からなる群から独立に選択される。
いくつかの実施形態によれば、２７番目、２８番目または２９番目のアミノ酸のうちの少なくとも１つが、非天然のアミノ酸残基で置換されている配列番号８３３のアミノ酸配列を有する、溶解性と安定性が改善されたグルカゴンアゴニストが提供される（すなわち、類縁体の２７番目、２８番目または２９番目に存在する少なくとも１つのアミノ酸が、配列番号８０１の対応する位置に存在するアミノ酸とは異なる酸のアミノ酸である）。いくつかの実施形態によれば、配列番号８３３の配列を有するグルカゴンアゴニストが提供されるが、ただし、２８番目のアミノ酸がアスパラギンであり、２９番目のアミノ酸がスレオニンである場合、ペプチドは、このグルカゴンペプチドのカルボキシ末端に付加された、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕからなる群から独立に選択される１〜２個のアミノ酸をさらに含む。
親ペプチドの活性を少なくともいくらか維持しつつ、天然のグルカゴンペプチドの特定の位置を修飾可能であることが報告されている。したがって、本出願人らは、配列番号８１１のペプチドの２番目、５番目、７番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２４番目、２７番目、２８番目または２９番目の位置にあるアミノ酸のうち１つまたは２つ以上を、天然のグルカゴンペプチドに存在するものとは異なるアミノ酸で置換して、それでもなお親のグルカゴンペプチドの増強された活性、生理的なｐＨの安定性、生物学的活性を保つことが可能であると予想している。たとえば、いくつかの実施形態によれば、天然のペプチドの２７番目に存在するメチオニン残基をロイシンまたはノルロイシンに変更して、ペプチドの酸化による分解を防止する。
いくつかの実施形態では、配列番号８３３のグルカゴン類縁体であって、この類縁体の１番目、２番目、５番目、７番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目または２４番目から選択される１〜６個のアミノ酸が、配列番号８０１の対応するアミノ酸とは異なる、配列番号８３３のグルカゴン類縁体が提供される。もうひとつの実施形態によれば、配列番号８３３のグルカゴン類縁体であって、類縁体の１番目、２番目、５番目、７番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目または２４番目から選択される１〜３個のアミノ酸が、配列番号８０１の対応するアミノ酸とは異なる、配列番号８３３のグルカゴン類縁体が提供される。もうひとつの実施形態では、配列番号８０７、配列番号８０８または配列番号８３４のグルカゴン類縁体であって、類縁体の１番目、２番目、５番目、７番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目または２４番目から選択される１〜２個のアミノ酸が、配列番号８０１の対応するアミノ酸とは異なる、配列番号８０７、配列番号８０８または配列番号８３４のグルカゴン類縁体が提供され、別の実施形態では、これらの１〜２個の異なるアミノ酸が、天然の配列（配列番号８０１）に存在するアミノ酸と比較した場合に保存的なアミノ酸置換を表す。いくつかの実施形態では、２番目、５番目、７番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２４番目、２７番目または２９番目から選択される位置に、１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換をさらに有する、配列番号８１１または配列番号８１３のグルカゴンペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、２番目、５番目、７番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２７番目または２９番目での置換は、保存的なアミノ酸置換である。
いくつかの実施形態では、配列番号８０１の類縁体ペプチドを有するグルカゴンアゴニストが提供される。この類縁体は、セリン以外のアミノ酸を２番目に有すること、かつ、２８番目または２９番目に天然のアミノ酸に代えて酸性アミノ酸を有すること、または配列番号８０１のペプチドのカルボキシ末端に付加された酸性アミノ酸を有することが、配列番号８０１とは異なる。いくつかの実施形態では、酸性アミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、２番目の置換が親分子とは異なる、配列番号８０９、配列番号８１２、配列番号８１３または配列番号８３２のグルカゴン類縁体が提供される。特に、類縁体ペプチドの２番目は、Ｄ−セリン、アラニン、Ｄ−アラニン、グリシン、ｎ−メチルセリン、アミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。
もうひとつの実施形態では、配列番号８０１の類縁体ペプチドを有するグルカゴンアゴニストが提供される。この類縁体は、ヒスチジン以外のアミノ酸を１番目に有すること、かつ、２８番目または２９番目に天然のアミノ酸に代えて酸性アミノ酸を有するまたは配列番号８０１のペプチドのカルボキシ末端に付加された酸性アミノ酸を有することが、配列番号８０１とは異なる。いくつかの実施形態では、酸性アミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、１番目の置換が親分子とは異なる、配列番号８０９、配列番号８１２、配列番号８１３または配列番号８３２のグルカゴン類縁体が提供される。特に、類縁体ペプチドの１番目は、ＤＭＩＡ、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシルヒスチジン、アセチルヒスチジン、ホモヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。
いくつかの実施形態によれば、修飾されたグルカゴンペプチドは、配列番号８０９、配列番号８１２、配列番号８１３、配列番号８３２からなる群から選択される配列を有する。別の実施形態では、配列番号８０９、配列番号８１２、配列番号８１３または配列番号８３２のＣ末端に付加される１〜２個のアミノ酸をさらに有する、配列番号８０９、配列番号８１２、配列番号８１３または配列番号８３２の配列を有するグルカゴンペプチドが提供される。この場合、追加のアミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸またはホモシステイン酸からなる群から独立に選択される。いくつかの実施形態では、カルボキシ末端に付加される追加のアミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕからなる群から選択されるか、別の実施形態では、追加のアミノ酸は、ＡｓｐまたはＧｌｕである。
もうひとつの実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号７またはそのグルカゴンアゴニスト類縁体の配列を有する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号８０８、配列番号８１０、配列番号８１１、配列番号８１２、配列番号８１３からなる群から選択される配列を有する。もうひとつの実施形態では、ペプチドは、配列番号８０８、配列番号８１０、配列番号８１１からなる群から選択される配列を有する。いくつかの実施形態では、グルカゴンペプチドは、そのＣ末端に付加された、ＡｓｐおよびＧｌｕからなる群から選択される追加のアミノ酸をさらに含む、配列番号８０８、配列番号８１０、配列番号８１１の配列を有する。いくつかの実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号８１１または配列番号８１３の配列を有し、別の実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号８１１の配列を有する。
いくつかの実施形態によれば、
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号８３４）
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号８１１）
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号８１３）
からなる群から選択される修飾されたグルカゴンペプチドを有するグルカゴンアゴニストが提供される。
ここで、１５番目のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸であり、２８番目のＸａａはＡｓｎまたは酸性アミノ酸であり、２９番目のＸａａはＴｈｒまたは酸性アミノ酸であり、Ｒは、酸性アミノ酸、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２であり、ただし、２８番目、２９番目または３０番目のうちの１箇所に、酸性の酸残基が存在する。いくつかの実施形態では、ＲはＣＯＯＨであり、別の実施形態では、ＲはＣＯＮＨ２である。
また、本開示は、グルカゴンペプチドの安定性と溶解性を高めるために、第２のペプチドをグルカゴンペプチドのＣ末端に融合させたグルカゴン融合ペプチドも包含する。特に、融合グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号８３４）を有するグルカゴンアゴニスト類縁体を含むものであってもよく、ここで、Ｒは、酸性アミノ酸または結合およびグルカゴンペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸に結合する配列番号８２０（GPSSGAPPPS）、配列番号８２１（KRNRNNIA）または配列番号８２２（KRNR）のアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号８３３、配列番号８０７または配列番号８０８からなる群から選択され、さらに、そのカルボキシ末端のアミノ酸に結合している配列番号８２０（GPSSGAPPPS）、配列番号８２１（KRNRNNIA）または配列番号８２２（KRNR）のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、グルカゴン融合ペプチドは、配列番号８０２、配列番号８０３、配列番号８０４、配列番号８０５、配列番号８０６またはそのグルカゴンアゴニスト類縁体を含み、さらに、その２９番目のアミノ酸に結合した配列番号８２０（GPSSGAPPPS）、配列番号８２１（KRNRNNIA）または配列番号８２２（KRNR）のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態によれば、融合ペプチドは、１６番目、１７番目、２１番目、２４番目、２９番目、Ｃ末端の延長部分の範囲内またはＣ末端のアミノ酸で、アミノ酸に結合しているＰＥＧ鎖をさらに有し、この場合のＰＥＧ鎖は、５００〜４０，０００ダルトンの範囲から選択される。いくつかの実施形態では、配列番号８２０（GPSSGAPPPS）、配列番号８２１（KRNRNNIA）または配列番号８２２（KRNR）のアミノ酸配列は、ペプチド結合を介してグルカゴンペプチドの２９番目のアミノ酸に結合する。いくつかの実施形態では、グルカゴン融合ペプチドのグルカゴンペプチド部分は、配列番号８１０、配列番号８１１、配列番号８１３からなる群から選択される配列を有する。いくつかの実施形態では、グルカゴン融合ペプチドのグルカゴンペプチド部分は、配列番号８１１または配列番号８１３の配列を有し、この場合のＰＥＧ鎖は、２１番目、２４番目、２９番目、Ｃ末端の延長部分の範囲内またはＣ末端のアミノ酸に、それぞれ結合している。
もうひとつの実施形態では、融合ペプチドのグルカゴンペプチド配列は、配列番号８１１の配列を有し、さらに、その２９番目のアミノ酸に結合した配列番号８２０（GPSSGAPPPS）、配列番号８２１（KRNRNNIA）または配列番号８２２（KRNR）のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、グルカゴン融合ペプチドは、配列番号８２４、配列番号８２５、配列番号８２６からなる群から選択される配列を有する。一般に、本発明の融合ペプチドは、標準的なカルボン酸基を有するＣ末端のアミノ酸を含む。しかしながら、Ｃ末端のアミノ酸がカルボン酸に代えてアミドを有する、上記配列の類縁体も、実施形態として包含される。いくつかの実施形態によれば、融合グルカゴンペプチドは、配列番号８１０、配列番号８１１、配列番号８１３からなる群から選択され、さらに、その２９番目のアミノ酸に結合している配列番号８２３（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＣＯＮＨ２）のアミノ酸配列を有する、グルカゴンアゴニスト類縁体を含む。
本発明のグルカゴンアゴニストをさらに修飾して、グルカゴンペプチドの生物学的活性を保ちつつ、水溶液に対するペプチドの溶解性および水溶液中での安定性を改善することが可能である。いくつかの実施形態によれば、配列番号８１１のペプチドまたはそのグルカゴンアゴニスト類縁体の１６番目、１７番目、２０番目、２１番目、２４番目、２９番目から選択される１箇所または２箇所以上に親水体を導入すると、そのｐＨでの溶解性及び安定性が改善し、グルカゴン類縁体が安定化することが予想される。特に、いくつかの実施形態では、グルカゴンペプチドの２１番目および２４番目に存在するアミノ酸の側鎖に共有結合している１個または２個以上の親水基を含むように、配列番号８１０、配列番号８１１、配列番号８１３または配列番号８３２のグルカゴンペプチドを修飾する。
いくつかの実施形態によれば、１６番目、１７番目、２０番目、２１番目、２４番目および／または２９番目での１つまたは２つ以上のアミノ酸置換を含むように、配列番号８１１のグルカゴンペプチドを修飾する。この場合、天然のアミノ酸を、ＰＥＧなどをはじめとする親水体と架橋するのに適した側鎖を有するアミノ酸で置換する。この天然のペプチドについては、天然のアミノ酸で置換してもよいし、合成（非天然）のアミノ酸で置換してもよい。合成または非天然のアミノ酸は、in vivoでは天然に生じないが、本明細書に記載のペプチド構造に取り込むことは可能である。
いくつかの実施形態では、天然の配列の１６番目、１７番目、２１番目、２４番目、２９番目、Ｃ末端の延長部分の範囲内またはＣ末端のアミノ酸のうちの少なくとも１箇所で、天然または合成のアミノ酸を含むように天然のグルカゴンペプチド配列が修飾された、配列番号８１０、配列番号８１１または配列番号８１３のグルカゴンアゴニストが提供され、この場合の置換したアミノ酸は、親水体をさらに有する。いくつかの実施形態では、置換は２１番目または２４番目でなされ、別の実施形態では、親水体がＰＥＧ鎖である。いくつかの実施形態では、配列番号８１１のグルカゴンペプチドを、少なくとも１個のシステイン残基で置換し、この場合のシステイン残基の側鎖を、マレイミド、ビニルスルホン、２−ピリジルチオ、ハロアルキル、ハロアシルなどをはじめとするチオール反応性試薬でさらに修飾する。これらのチオール反応性試薬は、カルボキシ基、ケト基、ヒドロキシ基、エーテル基ならびに、ポリエチレングリコール単位などの他の親水体を含むものであってもよい。別の実施形態では、天然のグルカゴンペプチドをリジンで置換し、ポリエチレングリコールなどの親水体のアルデヒドまたはカルボン酸の活性エステル（スクシンイミド、無水物など）などのアミン反応性試薬を用いて、置換するリジン残基の側鎖をさらに修飾する。いくつかの実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号８１４、配列番号８１５、配列番号８１６、配列番号８１７、配列番号８１８、配列番号８１９からなる群から選択される。
いくつかの実施形態によれば、ＰＥＧ化グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドに共有結合している２つまたは３つ以上のポリエチレングリコール鎖を有し、この場合のグルカゴン鎖の合計の分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化グルカゴンアゴニストは、２１番目および２４番目でＰＥＧ鎖がアミノ酸残基に共有結合し、２つのＰＥＧ鎖の合算での分子量が約１，０００〜約５，０００ダルトンである、配列番号８０６のペプチドを含む。もうひとつの実施形態では、ＰＥＧ化グルカゴンアゴニストは、２１番目および２４番目でＰＥＧ鎖がアミノ酸残基に共有結合し、２つのＰＥＧ鎖の合算での分子量が約５，０００〜約２０，０００ダルトンである、配列番号８０６のペプチドを含む。
ポリエチレングリコール鎖は、直鎖状であってもよいし、分岐状であってもよい。いくつかの実施形態によれば、ポリエチレングリコール鎖は、平均分子量が、約５００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の分子量は、約５００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される。もうひとつの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、分子量が約２０，０００〜約４０，０００ダルトンである。
共有結合または非共有結合の分子内架橋またはα螺旋を安定化するアミノ酸を、グルカゴンペプチドのＣ末端領域（１２番目〜２９番目のアミノ酸）に含むように、上述したグルカゴンペプチドのいずれかを、さらに修飾してもよい。いくつかの実施形態によれば、グルカゴンペプチドは、１６番目、２０番目、２１番目または２４番目（またはこれらの組み合わせ）を、α，α−二置換アミノ酸、たとえば、ＡＩＢで置換するアミノ酸置換に加えて、上述した修飾のうちの１つまたは２つ以上を有する。もうひとつの実施形態によれば、グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドの１６番目と２０番目のアミノ酸の側鎖間での分子内架橋、たとえばラクタムに加えて、上述した修飾のうちの１つまたは２つ以上を有する。
いくつかの実施形態によれば、グルカゴンペプチドは、３番目のＸａａが、構造Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの側鎖を有するアミノ酸である、配列番号８７７のアミノ酸配列を有する。
Figure 2013540102

式中、Ｒ１は、Ｃ０〜３アルキルまたはＣ０〜３ヘテロアルキルであり、Ｒ２は、ＮＨＲ４またはＣ１〜３アルキルであり、Ｒ３はＣ１〜３アルキルであり、Ｒ４は、ＨまたはＣ１〜３アルキルであり、Ｘは、ＮＨ、ＯまたはＳであり、Ｙは、ＮＨＲ４、ＳＲ３またはＯＲ３である。いくつかの実施形態では、ＸがＮＨであるか、あるいは、ＹがＮＨＲ４である。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ０〜２アルキルまたはＣ１ヘテロアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、ＮＨＲ４またはＣ１アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、ＨまたはＣ１アルキルである。例示としての実施形態では、構造Ｉの側鎖を有するアミノ酸が得られ、式中、Ｒ１はＣＨ２−Ｓであり、ＸはＮＨであり、Ｒ２は、ＣＨ３（アセトアミドメチル−システイン、Ｃ（Ａｃｍ））である；Ｒ１はＣＨ２であり、ＸはＮＨであり、Ｒ２は、ＣＨ３（アセチルジアミノブタン酸、Ｄａｂ（Ａｃ））である；Ｒ１は、Ｃ０アルキルであり、ＸはＮＨであり、Ｒ２はＮＨＲ４であり、Ｒ４は、Ｈ（カルバモイルジアミノプロピオン酸、Ｄａｐ（ｕｒｅａ））である；またはＲ１はＣＨ２−ＣＨ２であり、ＸはＮＨであり、Ｒ２は、ＣＨ３（アセチルオルニチン、Ｏｒｎ（Ａｃ））である。例示としての実施形態では、構造ＩＩの側鎖を有するアミノ酸が得られ、式中、Ｒ１はＣＨ２であり、ＹはＮＨＲ４であり、Ｒ４は、ＣＨ３（メチルグルタミン、Ｑ（Ｍｅ））である；例示としての実施形態では、構造ＩＩＩの側鎖を有するアミノ酸が提示され、式中、Ｒ１はＣＨ２であり、Ｒ４はＨ（メチオニン−スルホキシド、Ｍ（Ｏ））である。具体的な実施形態では、３番目のアミノ酸を、Ｄａｂ（Ａｃ）で置換する。たとえば、グルカゴンアゴニストは、配列番号８６３、配列番号８６９、配列番号８７１、配列番号８７２、配列番号８７３、配列番号８７４のアミノ酸配列を有するものであってもよい。
特定の実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号８７７のグルカゴンペプチドの類縁体である。特定の態様では、類縁体は、２８番目のＡｓｎから電荷を持つアミノ酸への置換、２８番目のＡｓｎから、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモシステイン酸からなる群から選択される電荷を持つアミノ酸への置換、２８番目でのＡｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕへの置換、２８番目でのＡｓｐへの置換、２８番目でのＧｌｕへの置換、２９番目のＴｈｒから電荷を持つアミノ酸への置換、２９番目のＴｈｒから、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモシステイン酸からなる群から選択される電荷を持つアミノ酸への置換、２９番目でのＡｓｐ、ＧｌｕまたはＬｙｓへの置換、２９番目でのＧｌｕへの置換、２９番目の後ろに電荷を持つ１〜３個のアミノ酸の挿入、２９番目の後ろにＧｌｕまたはＬｙｓの挿入、２９番目の後ろにＧｌｙ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−Ｌｙｓの挿入、これらの組み合わせを含むがこれらに限定されるものではない、本明細書に記載のアミノ酸修飾を有する。
特定の実施形態では、配列番号８７７のグルカゴンペプチドの類縁体は、１６番目、２０番目、２１番目、２４番目のうちの１箇所、２箇所、３箇所またはすべてに、ＡＩＢなどのα，α−二置換アミノ酸を有する。
特定の実施形態では、配列番号８７７のグルカゴンペプチドの類縁体は、以下のうちの１つまたは２つ以上を有する。１番目のヒスチジンから、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する非天然のアミノ酸への置換、２番目のＳｅｒから、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する非天然のアミノ酸への置換、７番目のＴｈｒから、ヒドロキシ基を欠いたアミノ酸、たとえば、ＡｂｕまたはＩｌｅへの置換、１０番目のＴｙｒからＰｈｅまたはＶａｌへの置換、１２番目のＬｙｓからＡｒｇへの置換、１５番目のＡｓｐからＧｌｕへの置換、１６番目のＳｅｒからＴｈｒまたはＡＩＢへの置換、２０番目のＧｌｕからＡｌａまたはＡＩＢへの置換、２１番目のＡｓｐからＧｌｕへの置換、２４番目のＧｌｕからＡｌａまたはＡＩＢへの置換、２７番目のＭｅｔからＬｅｕまたはＮｌｅへの置換、２７〜２９番目のアミノ酸の欠失、２８番目〜２９番目のアミノ酸の欠失、２９番目のアミノ酸の欠失、Ｃ末端に対する、配列番号８２０のアミノ酸配列の付加（この場合、２９番目のアミノ酸はＴｈｒまたはＧｌｙである）またはこれらの組み合わせ。
具体的な実施形態によれば、グルカゴンペプチドは、配列番号８６２〜８６７および８６９〜８７４のいずれかのアミノ酸配列を有する。
特定の実施形態では、配列番号８７７を有するグルカゴンペプチドの類縁体は、１６番目、１７番目、２０番目、２１番目、２４番目、２９番目またはＣ末端のアミノ酸のいずれかでアミノ酸に共有結合している、ＰＥＧなどの親水体を有する。
特定の実施形態では、配列番号８７７を有するグルカゴンペプチドの類縁体は、任意にスペーサーを介してアシル基またはアルキル基に共有結合している側鎖を有するアミノ酸を有し、このアシル基またはアルキル基は、天然のアミノ酸に対して非天然である。いくつかの実施形態におけるアシル基は、Ｃ４〜Ｃ３０の脂肪族アシル基である。他の実施形態では、アルキル基は、Ｃ４〜Ｃ３０アルキルである。具体的な態様では、アシル基またはアルキル基は、１０番目のアミノ酸の側鎖に共有結合している。いくつかの実施形態では、７番目のアミノ酸は、ＩｌｅまたはＡｂｕである。
グルカゴンアゴニストは、配列番号８０１〜９１９のいずれかのアミノ酸配列を有し、さらに、グルカゴンアゴニスト活性を保持する修飾を、任意に最大１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ有するペプチドであってもよい。特定の実施形態では、グルカゴンアゴニストは、配列番号８５９〜９１９のいずれかのアミノ酸を有する。
クラス２のグルカゴン関連ペプチド
特定の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、クラス２のグルカゴン関連ペプチドであり、これは、本明細書および国際特許出願ＰＣＴ ＵＳ２００９／４７４４７（２００９年６月１６日出願）、米国仮特許出願第６１／０９０，４４８号、米国特許出願第６１／１５１，３４９号（その内容全体を本明細書に援用する）に記載されている。
クラス２のグルカゴン関連ペプチドに関する、以下のセクションに示す生物学的配列（配列番号１００１〜１２６２）は、国際特許出願ＰＣＴ ＵＳ２００９／４７４４７における配列番号１〜２６２に対応する。
活性
天然のグルカゴンは、ＧＩＰ受容体を活性化せず、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が通常は天然の−ＧＬＰ−１の約１％である。本明細医書に記載の天然のグルカゴン配列に対する修飾によって、天然のグルカゴン（配列番号１００１）の活性と同等またはそれよりも高いグルカゴン活性、天然のＧＩＰ（配列番号１００４）の活性と同等またはそれよりも高いＧＩＰ活性および／または天然のＧＬＰ−１の活性と同等またはそれよりも高いＧＬＰ−１活性を示すことのできるクラス２のグルカゴン関連ペプチドが生成される。この点について、クラス２のグルカゴン関連ペプチドは、本明細書にてさらに説明するように、グルカゴン／ＧＩＰコアゴニスト、グルカゴン／ＧＩＰ／ＧＬＰ−１トリアゴニスト、ＧＩＰ／ＧＬＰ−１コアゴニストまたはＧＩＰアゴニストグルカゴンペプチドのうちの１つであってもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のクラス２のグルカゴン関連ペプチドは、ＧＩＰ受容体の活性化の活性に対するＥＣ５０が、約１００ｎＭまたはそれ未満あるいは、約７５ｎＭ、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約８ｎＭ、約６ｎＭ、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３ｎＭ、約２ｎＭまたは約１ｎＭまたはそれ未満である。いくつかの実施形態では、クラス２のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体の活性化に対するＥＣ５０が、約１００ｎＭまたはそれ未満あるいは、約７５ｎＭ、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約８ｎＭ、約６ｎＭ、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３ｎＭ、約２ｎＭまたは約１ｎＭまたはそれ未満である。いくつかの実施形態では、クラス２のグルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体の活性化に対するＥＣ５０が、約１００ｎＭまたはそれ未満あるいは、約７５ｎＭ、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約８ｎＭ、約６ｎＭ、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３ｎＭ、約２ｎＭまたは約１ｎＭまたはそれ未満である。受容体の活性化は、受容体を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において、ｃＡＭＰ誘導を測定するin vitroのアッセイによって測定することができる。たとえば、実施例５で記載したように、受容体をコードするＤＮＡと、ｃＡＭＰ応答配列に結合させたルシフェラーゼ遺伝子とをコトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞をアッセイすればよい。
いくつかの実施形態では、クラス２のグルカゴン関連ペプチドは、天然のＧＩＰ（ＧＩＰ活性）と比較して、ＧＩＰ受容体に対する活性が、少なくとも約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７５％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％または約２００％またはそれよりも高い。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のグルカゴンペプチドは、天然のＧＩＰと比較して、ＧＩＰ受容体に対する活性が最大で１０００％、１０，０００％、１００，０００％または１，０００，０００％である。いくつかの実施形態では、クラス２のグルカゴン関連ペプチドは、天然のグルカゴン（グルカゴン活性）と比較して、グルカゴン受容体に対する活性が少なくとも約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７５％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％、約２００％、約２５０％、約３００％、約３５０％、約４００％、約４５０％または約５００％またはそれよりも高い。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のグルカゴンペプチドは、天然のグルカゴンと比較して、グルカゴン受容体に対する活性が、最大で１０００％、１０，０００％、１００，０００％または１，０００，０００％である。いくつかの実施形態では、クラス２のグルカゴン関連ペプチドは、天然のＧＬＰ−１（ＧＬＰ−１活性）と比較して、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が、少なくとも約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％または２００％またはそれよりも高い。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のグルカゴンペプチドは、天然のＧＬＰ−１と比較して、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が、最大で１０００％、１０，０００％、１００，０００％または１，０００，０００％である。受容体の天然のリガンドと比較した場合の受容体に対するクラス２のグルカゴン関連ペプチドの活性については、天然のリガンドのＥＣ５０に対するクラス２のグルカゴン関連ペプチドのＥＣ５０の反比として計算する。
いくつかの実施形態では、クラス２のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体およびＧＩＰ受容体の両方に対して活性を示す（「グルカゴン／ＧＩＰコアゴニスト」）。これらのクラス２のグルカゴン関連ペプチドは、ＧＩＰ受容体に対し、グルカゴン受容体に対する天然のグルカゴンの持つ選択性を失っている。いくつかの実施形態では、ＧＩＰ受容体に対するクラス２のグルカゴン関連ペプチドのＥＣ５０は、そのグルカゴン受容体に対するＥＣ５０と比較して、約５０倍未満、約４０倍未満、約３０倍未満または約２０倍未満で異なる（高いまたは低い）。いくつかの実施形態では、クラス２のグルカゴン関連ペプチドのＧＩＰ活性は、そのグルカゴン活性と比較して、約５００倍未満、約４５０倍未満、約４００倍未満、約３５０倍未満、約３００倍未満、約２５０倍未満、約２００倍未満、約１５０倍未満、約１００倍未満、約７５倍未満、約５０倍未満、約２５倍未満、約２０倍未満、約１５倍未満、約１０倍未満または約５倍未満で異なる（高いまたは低い）。いくつかの実施形態では、ＧＩＰ受容体に対するクラス２のグルカゴン関連ペプチドのＥＣ５０をグルカゴン受容体に対するクラス２のグルカゴン関連ペプチドのＥＣ５０で割った比は、約１００未満、約７５未満、約６０未満、約５０未満、約４０未満、約３０未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満または約５未満である。いくつかの実施形態では、ＧＩＰ受容体に対するＥＣ５０をグルカゴン受容体に対するＥＣ５０で割った比は、約１または約１未満（約０．０１、約０．０１３、約０．０１６７、約０．０２、約０．０２５、約０．０３、約０．０５、約０．０６７、約０．１、約０．２など）である。いくつかの実施形態では、クラス２のグルカゴン関連ペプチドのＧＩＰ活性をクラス２のグルカゴン関連ペプチドのグルカゴン活性と比較した比は、約５００未満、約４５０未満、約４００未満、約３５０未満、約３００未満、約２５０未満、約２００未満、約１５０未満、約１００未満、約７５未満、約６０未満、約５０未満、約４０未満、約３０未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満または約５未満である。いくつかの実施形態では、ＧＩＰ受容体に対する活性をグルカゴン受容体に対する活性で割った比は、約１または約１未満（約０．０１、約０．０１３、約０．０１６７、約０．０２、約０．０２５、約０．０３、約０．０５、約０．０６７、約０．１、約０．２など）である。いくつかの実施形態では、７番目のアミノ酸修飾、２７番目または２８番目のアミノ酸までのＣ末端でのアミノ酸（単数または複数）の欠失（アミノ酸２７個または２８個のペプチドを生じる）またはこれらの組み合わせなどによって、ＧＬＰ−１活性が有意に低減または破壊される。
もうひとつの態様では、クラス２のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体、ＧＩＰ受容体、ＧＬＰ−１受容体に対して活性を示す（「グルカゴン／ＧＩＰ／ＧＬＰ−１トリアゴニスト」）。これらのクラス２のグルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体とＧＩＰ受容体の両方に対し、グルカゴン受容体に対する天然のグルカゴンの選択性を失っている。いくつかの実施形態では、ＧＩＰ受容体に対するクラス２のグルカゴン関連ペプチドのＥＣ５０は、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体に対するそれぞれのＥＣ５０と比較して、約５０倍未満、約４０倍未満、約３０倍未満または約２０倍未満で異なる（高いまたは低い）。いくつかの実施形態では、クラス２のグルカゴン関連ペプチドのＧＩＰ活性は、そのグルカゴン活性およびＧＬＰ−１活性と比較して、約５００倍未満、約４５０倍未満、約４００倍未満、約３５０倍未満、約３００倍未満、約２５０倍未満、約２００倍未満、約１５０倍未満、約１００倍未満、約７５倍未満、約５０倍未満、約２５倍未満、約２０倍未満、約１５倍未満、約１０倍未満または約５倍未満で異なる（高いまたは低い）。いくつかの実施形態では、ＧＩＰ受容体に対するトリアゴニストのＥＣ５０をＧＬＰ−１受容体に対するトリアゴニストのＥＣ５０で割った比は、約１００未満、約７５未満、約６０未満、約５０未満、約４０未満、約３０未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満または約５未満である。いくつかの実施形態では、ＧＩＰ受容体に対するＥＣ５０をＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０で割った比は、約１または約１未満（約０．０１、約０．０１３、約０．０１６７、約０．０２、約０．０２５、約０．０３、約０．０５、約０．０６７、約０．１、約０．２など）である。いくつかの実施形態では、トリアゴニストのＧＩＰ活性をトリアゴニストのＧＬＰ−１活性と比較した比は、約１００未満、約７５未満、約６０未満、約５０未満、約４０未満、約３０未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満または約５未満である。いくつかの実施形態では、ＧＩＰ受容体に対する活性をＧＬＰ−１受容体に対する活性で割った比は、約１または約１未満（約０．０１、約０．０１３、約０．０１６７、約０．０２、約０．０２５、約０．０３、約０．０５、約０．０６７、約０．１、約０．２など）である。関連の実施形態では、ＧＩＰ受容体に対するトリアゴニストのＥＣ５０をグルカゴン受容体に対するトリアゴニストのＥＣ５０で割った比は、約１００未満、約７５未満、約６０未満、約５０未満、約４０未満、約３０未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満または約５未満である。いくつかの実施形態では、ＧＩＰ受容体に対するＥＣ５０をグルカゴン受容体に対するＥＣ５０で割った比は、約１または約１未満（約０．０１、約０．０１３、約０．０１６７、約０．０２、約０．０２５、約０．０３、約０．０５、約０．０６７、約０．１、約０．２など）である。いくつかの実施形態では、トリアゴニストのＧＩＰ活性をトリアゴニストのグルカゴン活性と比較した比は、約５００未満、約４５０未満、約４００未満、約３５０未満、約３００未満、約２５０未満、約２００未満、約１５０未満、約１００未満、約７５未満、約６０未満、約５０未満、約４０未満、約３０未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満または約５未満である。いくつかの実施形態では、ＧＩＰ受容体に対する活性をグルカゴン受容体に対する活性で割った比は、約１または約１未満（約０．０１、約０．０１３、約０．０１６７、約０．０２、約０．０２５、約０．０３、約０．０５、約０．０６７、約０．１、約０．２など）である。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ−１受容体に対するトリアゴニストのＥＣ５０をグルカゴン受容体に対するトリアゴニストのＥＣ５０で割った比は、約１００未満、約７５未満、約６０未満、約５０未満、約４０未満、約３０未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満または約５未満である。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０をグルカゴン受容体に対するＥＣ５０で割った比は、約１または約１未満（約０．０１、約０．０１３、約０．０１６７、約０．０２、約０．０２５、約０．０３、約０．０５、約０．０６７、約０．１、約０．２など）である。いくつかの実施形態では、トリアゴニストのＧＬＰ−１活性をトリアゴニストのグルカゴン活性と比較した比は、約１００未満、約７５未満、約６０未満、約５０未満、約４０未満、約３０未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満または約５未満である。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ−１受容体に対する活性をグルカゴン受容体に対する活性で割った比は、約１または約１未満（約０．０１、約０．０１３、約０．０１６７、約０．０２、約０．０２５、約０．０３、約０．０５、約０．０６７、約０．１、約０．２など）である。
さらに別の態様では、クラス２のグルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体およびＧＩＰ受容体に対する活性を示すが、グルカゴン活性は、３番目のアミノ酸修飾などによって、有意に低減または破壊されている（「ＧＩＰ／ＧＬＰ−１コアゴニスト」）。たとえば、この位置を、酸性、塩基性または疎水性のアミノ酸（グルタミン酸、オルニチン、ノルロイシン）で置換すると、グルカゴン活性が低減される。いくつかの実施形態では、ＧＩＰ受容体に対するグルカゴンペプチドのＥＣ５０は、そのＧＬＰ−１受容体に対するＥＣ５０と比較して、約５０倍未満、約４０倍未満、約３０倍未満または約２０倍未満で異なる（高いまたは低い）。いくつかの実施形態では、クラス２のグルカゴン関連ペプチドのＧＩＰ活性は、そのＧＬＰ−１活性と比較して、約２５倍未満、約２０倍未満、約１５倍未満、約１０倍未満または約５倍未満で異なる（高いまたは低い）。いくつかの実施形態では、これらのクラス２のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体に対する活性が、天然のグルカゴンの約１０％またはそれ未満、たとえば約１％〜約１０％あるいは、約０．１％〜約１０％あるいは、約０．１％を超えるが、約１０％未満である。いくつかの実施形態では、ＧＩＰ受容体に対するクラス２のグルカゴン関連ペプチドのＥＣ５０をＧＬＰ−１受容体に対するクラス２のグルカゴン関連ペプチドのＥＣ５０で割った比は、約１００未満、約７５未満、約６０未満、約５０未満、約４０未満、約３０未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満または約５未満で、１以上である。いくつかの実施形態では、クラス２のグルカゴン関連ペプチドのＧＩＰ活性をクラス２のグルカゴン関連ペプチドのＧＬＰ−１活性と比較した比は、約１００未満、約７５未満、約６０未満、約５０未満、約４０未満、約３０未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満または約５未満で、１以上である。
別の態様では、クラス２のグルカゴン関連ペプチドは、ＧＩＰ受容体に対する活性を示し、グルカゴン活性およびＧＬＰ−１活性は、３番目でのＧｌｕ、７番目でのＩｌｅによるアミノ酸修飾などによって、有意に低減または破壊される（「ＧＩＰアゴニストグルカゴンペプチド」）。いくつかの実施形態では、これらのクラス２のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体に対する活性が、天然のグルカゴンの約１０％またはそれ未満、たとえば約１％〜約１０％あるいは、約０．１％〜約１０％あるいは、約０．１％を超える、約０．５％を超えるまたは約１％を超えるが、約１％未満、約５％未満または約１０％未満である。いくつかの実施形態では、これらのクラス２のグルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が、天然のＧＬＰ−１の約１０％またはそれ未満、たとえば約１％〜約１０％あるいは、約０．１％〜約１０％あるいは、約０．１％を超える、約０．５％を超えるまたは約１％を超えるが、約１％未満、約５％未満または約１０％未満である。
いくつかの実施形態では、クラス２のグルカゴン関連ペプチドがＰＥＧ化されていない場合、ＧＩＰ受容体の活性化に対するクラス２のグルカゴン関連ペプチドのＥＣ５０が、約４ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭまたはそれ未満であるか、あるいは、ＧＩＰ受容体に対する類縁体の活性が、天然のＧＩＰの少なくとも約１％、約２％、約３％、約４％または約５％である。関連の実施形態では、ＧＬＰ−１受容体の活性化に対するＰＥＧ化されていないクラス２のグルカゴン関連ペプチドのＥＣ５０が、約４ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭまたはそれ未満であるか、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が、天然のＧＬＰ−１の少なくとも約１％、約２％、約３％、約４％または約５％である。さらに他の関連の実施形態では、ＰＥＧ化されていないクラス２のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体の活性化に対するＥＣ５０が、約４ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭまたはそれ未満であるか、あるいは、グルカゴン受容体に対する活性が、天然のグルカゴンの少なくとも約５％、約１０％、約１５％または約２０％である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化されていないクラス２のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体に対する活性が、天然のグルカゴンの約１％未満である。他の実施形態では、ＰＥＧ化されていないクラス２のグルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が、天然のＧＬＰ−１の約１０％未満、約５％未満または約１％未満である。
クラス２のグルカゴン関連ペプチドがＰＥＧなどの親水体に結合している実施形態では、１つまたは２つ以上の受容体に対する相対ＥＣ５０が、さらに高くなる（約１０倍高くなるなど）ことがある。たとえば、ＰＥＧ化した類縁体は、ＧＩＰ受容体の活性化に対するＥＣ５０が約１０ｎＭまたはそれ未満であるか、クラス２のグルカゴン関連ペプチドのＧＩＰ受容体に対する活性が、天然のＧＩＰの少なくとも約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％または約０．５％である。関連の実施形態では、ＰＥＧ化されたクラス２のグルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体の活性化に対するＥＣ５０が約１０ｎＭまたはそれ未満であるか、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が、天然のＧＬＰ−１の少なくとも約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％または約０．５％である。さらに他の関連の実施形態では、ＰＥＧ化されたクラス２のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体の活性化に対するＥＣ５０が約１０ｎＭまたはそれ未満であるか、グルカゴン受容体に対する活性が天然のグルカゴンの少なくとも約０．５％、約１％、約１．５％または約２％である。いくつかの実施形態では、クラス２のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体に対する活性が、天然のグルカゴンの約１％未満である。他の実施形態では、クラス２のグルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が、天然のＧＬＰ−１の約１０％、約５％または約１％である。
修飾
クラス２のグルカゴン関連ペプチドに関して本明細書に開示する修飾によって、ＧＩＰ活性、グルカゴン活性および／またはＧＬＰ−１活性が高められたグルカゴンペプチドを生成するようグルカゴン（配列番号１００１）を操作することができる。クラス２のグルカゴン関連ペプチドに関して本明細書に開示する他の修飾によって、得られるペプチドの半減期が延び、溶解性が高まり、あるいは、安定性が向上する。クラス２のグルカゴン関連ペプチドに関して本明細書に開示するさらに他の修飾は、活性に対しては何ら影響しないか、所望の活性（単数または複数）を破壊することなく生成可能なものである。同一の目的（ＧＩＰ活性を高めるなど）を果たすクラス２のグルカゴン関連ペプチドに関する組み合わせを、個々に適用してもよいし、組み合わせで適用してもよい。特性を増強するクラス２のグルカゴン関連ペプチド単体またはこれに関する一組の組み合わせを、個々に適用してもよいし、組み合わせで適用してもよく、たとえばＧＩＰ活性および／またはＧＬＰ−１活性を高めることを、半減期の延長と組み合わせてもよい。関連の実施形態では、アミノ酸修飾のうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つ以上が、非保存的な置換、付加または欠失であってもよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸修飾のうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つ以上が、保存的な置換であってもよい。
ＧＩＰ性に影響する修飾
１番目のアミノ酸修飾によって、ＧＩＰ受容体に対する活性が増強される。たとえば、１番目のヒスチジンを、高分子芳香族アミノ酸、任意に、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、アミノフェニルアラニン、ニトロフェニルアラニン、クロロフェニルアラニン、スルホフェニルアラニン、４−ピリジルアラニン、メチルチロシンまたは３−アミノチロシンで置換する。１番目のＴｙｒと１２番目〜２９番目のアミノ酸に対応する領域内でのα螺旋の安定化とを組み合わせると、ＧＩＰ受容体およびＧＬＰ−１受容体ならびにグルカゴン受容体を活性化するクラス２のグルカゴン関連ペプチドが提供された。α螺旋構造は、たとえば、共有結合または非共有結合の分子内架橋の形成あるいは、１２番目〜２９番目あたりで、α螺旋を安定化するアミノ酸（α，α−二置換アミノ酸など）で置換するアミノ酸置換および／またはこれを挿入することによって安定化可能なものである。
２７番目および／または２８のアミノ酸修飾、任意に２９番目のアミノ酸修飾によって、ＧＩＰ受容体に対する活性が増強される。たとえば、２７番目のＭｅｔを高分子脂肪族アミノ酸（任意にＬｅｕ）に置換し、２８番目のＡｓｎを低分子脂肪族アミノ酸（任意にＡｌａ）に置換し、２９番目のＴｈｒを低分子脂肪族アミノ酸（任意にＧｌｙ）に置換する。２７番目〜２９番目をＬＡＧに置換すると、これらの位置でのＧＩＰ活性が、天然のＭＮＴ配列よりも高くなる。
１２番目のアミノ酸修飾によって、ＧＩＰ受容体に対する活性が増強される。たとえば、１２番目を高分子非極性脂肪族アミノ酸（任意にＩｌｅ）に置換する。
１７番目および／または１８番目のアミノ酸修飾によって、ＧＩＰ受容体に対する活性が増強される。たとえば、１７番目を極性残基（任意にＧｌｎ）に置換し、１８番目を低分子脂肪族アミノ酸（任意にＡｌａ）に置換する。１７番目と１８番目をＱＡに置換すると、これらの位置でのＧＩＰ活性が、天然のＲＲ配列より高くなる。
１２番目から２９番目のアミノ酸側鎖間での分子内架橋の形成を可能にする修飾によって、ＧＩＰ受容体に対する活性が増加する。たとえば、ｉ番目とｉ＋４番目またはｊ番目とｊ＋３番目またはｋ番目とｋ＋７番目の２つのアミノ酸の側鎖間の共有結合によって、分子内架橋を形成してもよい。例示としての実施形態では、この架橋は、１２番目と１６番目の間、１６番目と２０番目の間、２０番目と２４番目の間、２４番目と２８番目の間または１７番目と２０番目の間である。他の実施形態では、これらの位置で、正の電荷を持つアミノ酸と負の電荷を持つアミノ酸との間に、塩結合などの非共有結合の相互作用を形成してもよい。
ＧＩＰ受容体の活性を高める上述した修飾を、個々に適用してもよいし、組み合わせで適用してもよい。ＧＩＰ受容体の活性を高める修飾の組み合わせを用いると、通常は、このような修飾のどれを単独で用いる場合よりも、ＧＩＰ活性が高くなる。
グルカゴン活性に影響する修飾
いくつかの実施形態では、天然のグルカゴン（配列番号１００１）の１６番目のアミノ酸修飾によって、グルカゴン活性が増強される。非限定的な例として、このような増強された活性は、１６番目の天然のセリンを、グルタミン酸で置換あるいは、原子４個の長さの側鎖を有する別の負の電荷を持つアミノ酸で置換あるいは、グルタミン、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸のうちの任意の１つで置換あるいは、少なくとも１個のヘテロ原子（Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐなど）を含有し、原子約４個（または３個〜５個）の長さの側鎖を有する電荷を持つアミノ酸で置換することによって、与えられるものである。いくつかの実施形態では、グルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対するもとの選択性を、ＧＬＰ−１受容体に対して保持する。
３番目の天然のグルタミンから、酸性、塩基性または疎水性のアミノ酸への置換などの３番目のアミノ酸修飾によって、グルカゴン受容体の活性を低減してもよい。たとえば、３番目をグルタミン酸、オルニチンまたはノルロイシンで置換すると、グルカゴン受容体の活性が実質的に低減または破壊される。
３番目のグルタミンを本明細書に記載するようなグルタミン類縁体で修正することによって、グルカゴン受容体に対する活性を維持または増強してもよい。たとえば、グルカゴンアゴニストは、配列番号１２４３〜１２４８、１２５０、１２５１、１２５３〜１２５６のうち、どのアミノ酸配列を含むものであってもよい。
グルカゴンペプチドまたはその類縁体のＣ末端領域（１２番目〜２９番目のアミノ酸）のα螺旋構造を安定化する修飾によって、１番目と２番目のアミノ酸修飾によって低下したグルカゴン活性が回復される。たとえば、ｉ番目とｉ＋４番目またはｊ番目とｊ＋３番目またはｋ番目とｋ＋７番目の２つのアミノ酸の側鎖間の共有結合によって、分子内架橋を形成してもよい。他の実施形態では、これらの位置で、正の電荷を持つアミノ酸と負の電荷を持つアミノ酸との間に、塩結合などの非共有結合の相互作用を形成してもよい。さらに他の実施形態では、所望の活性が保たれる位置で、このＣ末端領域（アミノ酸１２番目〜２９番目）に、１個または２個以上のα，α−二置換アミノ酸を挿入または置換する。たとえば、１６番目、２０番目、２１番目または２４番目のうちの１箇所、２箇所、３箇所またはすべてを、ＡＩＢなどのα，α−二置換アミノ酸に置換する。
ＧＬＰ−１活性に影響する修飾
Ｃ末端のアミノ酸のカルボン酸を、アミドまたはエステルなどの電荷が中性の基で置換することによって、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が増強される。
また、本明細書にてさらに説明するように、たとえば２つのアミノ酸の側鎖間での分子内架橋の形成あるいは、α螺旋を安定化するアミノ酸（α，α−二置換アミノ酸など）を有する１２番目〜２９番目あたりでの、アミノ酸の置換および／または挿入によって、グルカゴンのＣ末端領域（アミノ酸１２番目〜２９番目のあたり）におけるα螺旋構造を安定化することで、ＧＬＰ−１受容体に対する活性も増強される。例示としての実施形態では、１２番目と１６番目、１３番目と１７番目、１６番目と２０番目、１７番目と２１番目、２０番目と２４番目または２４番目と２８番目のアミノ酸の対の側鎖（ｉ＝１２、１６、２０または２４のアミノ酸の対）は、互いに結合しているため、グルカゴンのα螺旋を安定させる。いくつかの実施形態では、架橋またはリンカーは、特に架橋がｉ番目とｉ＋４番目の間にある場合、原子約８個（または約７個〜約９個）の長さである。いくつかの実施形態では、特に架橋がｊ番目とｊ＋３番目の間にある場合、架橋またはリンカーは、原子約６個（または約５個〜約７個）の長さである。
いくつかの実施形態では、（ａ）１６番目の天然のセリンを、グルタミン酸で置換あるいは、原子４個の長さの側鎖を有する別の負の電荷を持つアミノ酸で置換あるいは、グルタミン、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸のうちの任意の１つで置換あるいは、少なくとも１個のヘテロ原子（Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐなど）を含有し、原子約４個（または３個〜５個）の長さの側鎖を有する電荷を持つアミノ酸で置換すること、（ｂ）２０番目の天然のグルタミンを、電荷を持つか水素結合でき、かつ、少なくとも原子約５個（または約４個〜約６個）の長さの側鎖を有する別の親水性アミノ酸、たとえば、リジン、シトルリン、アルギニンまたはオルニチンで置換することによって、分子内架橋が形成される。１６番目と２０番目のこのようなアミノ酸の側鎖は、塩結合を形成可能であるか、共有結合可能である。いくつかの実施形態では、２つのアミノ酸が互いに結合して、ラクタム環が形成される。
いくつかの実施形態では、グルカゴンペプチドのＣ末端領域におけるα螺旋構造の安定化は、ラクタム架橋以外の分子内架橋の形成によって達成される。たとえば、好適な共有結合方法は、オレフィンメタセシス、ランチオニンを基にした環化、ジスルフィド結合または修飾された硫黄含有架橋の形成、α，ω−ジアミノアルカンでの繋ぎの使用、金属原子架橋の形成のうちの１つまたは２つ以上を含み、他のペプチド環化手段もα螺旋の安定化に用いられる。
さらに他の実施形態では、所望の活性が保たれる位置で、このＣ末端領域（アミノ酸１２番目〜２９番目）に、１個または２個以上のα，α−二置換アミノ酸を挿入または置換する。たとえば、１６番目、２０番目、２１番目または２４番目のうちの１箇所、２箇所、３箇所またはすべてを、ＡＩＢなどのα，α−二置換アミノ酸に置換する。
本明細書に記載するような２０番目のアミノ酸修飾によって、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が高められる。
GPSSGAPPPS（配列番号１０９５）またはXGPSSGAPPPS（配列番号１０９６）をＣ末端に付加することによって、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が高められる。本明細書に記載するように、１８番目、２８番目または２９番目のアミノ酸あるいは、１８番目と２９番目のアミノ酸を修飾することで、このような類縁体でのＧＬＰ−１活性を、さらに高めることが可能である。
１０番目のアミノ酸を修飾して高分子芳香族アミノ酸残基（任意にＴｒｐ）にすることで、ＧＬＰ−１活性が、さらに適度に高められる。
たとえば、本明細書に記載するような７番目のアミノ酸修飾によって、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が低下する。
１８番目を天然のアルギニンからアラニンに置換することによって、ＧＬＰ−１受容体に対する活性を、さらに増強することが可能である。
ＧＬＰ−１受容体の活性を高める、クラス２のグルカゴン関連ペプチドに関して上述したいずれかの修飾を、個々に適用してもよいし、組み合わせで適用してもよい。ＧＬＰ−１受容体の活性を高める修飾の組み合わせを用いると、通常は、このような修飾のどれを単独で用いる場合よりも、ＧＬＰ−１活性が高くなる。たとえば、本発明は、１６番目、２０番目、Ｃ末端のカルボン酸基に修飾を有し、任意に、１６番目と２０番目のアミノ酸の間に共有結合を有するグルカゴンペプチド；１６番目とＣ末端のカルボン酸基に修飾を有するグルカゴンペプチド；１６番目と２０番目に修飾を有し、任意に、１６番目と２０番目のアミノ酸の間に共有結合を有するグルカゴンペプチド；２０番目とＣ末端のカルボン酸基に修飾を有するグルカゴンペプチドを提供するものである。
ＤＰＰ−ＩＶ耐性を改善する修飾
１番目および／または２番目の修飾によって、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ ＩＶ）による切断に対するペプチドの耐性を高めることが可能である。たとえば、１番目および／または２番目を、本明細書に記載するようなＤＰＰ−ＩＶ耐性アミノ酸に置換してもよい。いくつかの実施形態では、２番目のアミノ酸をＮ−メチルアラニンに置換する。
２番目（２番目のＡＩＢなど）の修飾ならびに、場合によっては１番目（１番目のＤＭＩＡなど）の修飾によって、グルカゴン活性が、ときに大幅に低下することが観察された。驚くべきことに、本明細書に記載するように、グルカゴン（アミノ酸１２番目〜２９番目のあたり）のＣ末端領域のα螺旋構造を、たとえば２つのアミノ酸の側鎖間での共有結合の形成によって安定化することで、このグルカゴン活性の低下を回復可能である。いくつかの実施形態では、この共有結合は、「ｉ」番目と「ｉ＋４」番目のアミノ酸の間または「ｊ」番目と「ｊ＋３」番目のアミノ酸の間、たとえば、１２番目と１６番目、１６番目と２０番目、２０番目と２４番目、２４番目と２８番目または１７番目と２０番目のアミノ酸の間である。例示としての実施形態では、この共有結合は、１６番目のグルタミン酸と２０番目のリジンとの間のラクタム架橋である。いくつかの実施形態では、この共有結合は、本明細書に記載するようなラクタム架橋以外の分子内架橋である。
分解を低減する修飾
一例としてのさらに別の実施形態では、特に酸性バッファーまたはアルカリ性バッファーでの経時的なペプチドの分解を低減するように、配列番号１００１の１５番目および／または１６番目のアミノ酸を修飾することによって、クラス２のグルカゴン関連ペプチドのいずれかをさらに修飾して安定性を改善してもよい。このような修飾によって、１５番目のアスパラギン酸と１６番目のセリンとの間のペプチド結合の切断が低減される。例示としての実施形態では、１５番目のアミノ酸修飾が欠失であるか、Ａｓｐからグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸またはホモシステイン酸への置換である。他の例示としての実施形態では、１６番目のアミノ酸修飾が欠失であるか、ＳｅｒからＴｈｒまたはＡＩＢへの置換である。他の例示としての実施形態では、１６番目のＳｅｒをグルタミン酸に置換するか、原子４個の長さの側鎖を有する別の負の電荷を持つアミノ酸あるいは、グルタミン、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸のうちの任意の１つに置換する。
いくつかの実施形態では、天然のペプチドの２７番目に存在するメチオニン残基を、たとえば欠失または置換によって修飾する。このような修飾によって、ペプチドの酸化による分解が防止されることがある。いくつかの実施形態では、２７番目のＭｅｔを、ロイシン、イソロイシンまたはノルロイシンに置換する。いくつかの具体的な実施形態では、２７番目のＭｅｔをロイシンまたはノルロイシンに置換する。
いくつかの実施形態では、２０番目および／または２４番目のグルタミンを、たとえば欠失または置換によって修飾する。このような修飾によって、Ｇｌｎの脱アミド化によって生じる分解を低減することができる。いくつかの実施形態では、２０番目および／または２４番目のＧｌｎを、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＡＩＢに置換する。いくつかの実施形態では、２０番目および／または２４番目のＧｌｕを、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎまたはシトルリンに置換する。
いくつかの実施形態では、２１番目のＡｓｐを、たとえば欠失または置換によって修飾する。このような修飾によって、Ａｓｐが脱水し、環状スクシンイミド中間体を形成した後、イソアスパラギン酸へ異性体化することで生じる分解を低減することができる。いくつかの実施形態では、２１番目を、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸に置換する。いくつかの具体的な実施形態では、２１番目をＧｌｕで置換する。
α螺旋構造の安定化
クラス２のグルカゴン関連ペプチドのＣ末端領域（アミノ酸１２番目〜２９番目のあたり）でのα螺旋構造の安定化によって、ＧＬＰ−１活性および／またはＧＩＰ活性が増強され、１番目および／または２番目のアミノ酸修飾によって低下していたグルカゴン活性が回復する。α螺旋構造は、たとえば、共有結合または非共有結合の分子内架橋の形成あるいは、１２番目〜２９番目あたりで、α螺旋を安定化するアミノ酸（α，α−二置換アミノ酸など）で置換するアミノ酸置換および／またはこれを挿入することによって安定化可能なものである。ＧＩＰアゴニストのα螺旋構造の安定化については、本明細書に記載するようにして達成すればよい。
アシル化およびアルキル化
いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示のグルカゴンペプチドを、アシル基またはアルキル基、たとえば、本明細書に記載するような天然アミノ酸に対して非天然のアシル基またはアルキル基を含むように修飾する。アシル化またはアルキル化によって、グルカゴンペプチドの血中半減期を延ばすことが可能である。好都合なことに、アシル化またはアルキル化は、作用開始を遅らせるおよび／またはグルカゴン受容体および／またはＧＬＰ−１受容体での作用時間を延ばすおよび／またはＤＰＰ−ＩＶなどのプロテアーゼに対する耐性を改善するおよび／または溶解性を改善する。グルカゴンペプチドのグルカゴン受容体および／またはＧＬＰ−１受容体および／またはＧＩＰ受容体に対する活性を、アシル化後も維持してもよい。いくつかの実施形態では、アシル化されたグルカゴンペプチドの活性は、グルカゴンペプチドのアシル化されていないものの活性に匹敵する。本明細書に記載するように、クラス２のグルカゴン関連ペプチドを、親水体が結合した同一のアミノ酸の位置でアシル化またはアルキル化してもよいし、異なるアミノ酸の位置でアシル化またはアルキル化してもよい。
いくつかの実施形態では、本発明は、グルカゴンペプチドの１０番目のアミノ酸に共有結合しているアシル基またはアルキル基を有するように修飾されたグルカゴンペプチドを提供するものである。グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドの１０番目のアミノ酸とアシル基またはアルキル基との間に、スペーサーをさらに有するものであってもよい。いくつかの実施形態では、アシル基は、脂肪酸または胆汁酸あるいは、これらの塩、たとえば、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸、Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸、コール酸、Ｃ４〜Ｃ３０アルキル、Ｃ８〜Ｃ２４アルキルあるいは、胆汁酸のステロイド部分を有するアルキルである。スペーサーは、アシル基またはアルキル基を結合するための好適な反応性基を有する部分であれば、どの部分であってもよい。例示としての実施形態では、スペーサーは、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性または疎水性の二官能性スペーサーであってもよい。いくつかの実施形態では、スペーサーは、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｃｙｓならびに、ＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨを有するスペーサーからなる群から選択され、式中、ｍは１〜６の任意の整数であり、ｎは２〜１２の任意の整数である。このようなアシル化グルカゴンペプチドされたまたはアルキル化されたグルカゴンペプチドは、親水体、任意にポリエチレングリコールをさらに含むものであってもよい。上記のグルカゴンペプチドはいずれも、２個のアシル基または２個のアルキル基またはこれらの組み合わせを有するものであってもよい。
結合体と融合体
ＧＩＰアゴニストを、任意に共有結合を介して、また、任意にリンカーを介して、本明細書に記載するような結合体部分に結合することが可能である。
他の実施形態では、第２のペプチドは、XGPSSGAPPPS（配列番号１０９６）であり、ここで、Ｘは、２０種類の一般的なアミノ酸、たとえば、グルタミン酸、アスパラギン酸またはグリシンから選択される。いくつかの実施形態では、Ｘは、そのアミノ酸の側鎖に共有結合している親水体をさらに有するＣｙｓなどのアミノ酸を表す。このようなＣ末端の延長部分は、溶解性を改善し、ＧＩＰ活性またはＧＬＰ−１活性をも改善できることがある。グルカゴンペプチドがカルボキシ末端の延長部分をさらに有するいくつかの実施形態では、延長部分のカルボキシ末端のアミノ酸が、カルボン酸ではなくアミド基またはエステル基で終端する。
いくつかの実施形態では、たとえば、Ｃ末端の延長部分を有するグルカゴンペプチドにおいて、天然のグルカゴンペプチドの２９番目のスレオニンをグリシンに置換する。たとえば、２９番目をスレオニンからグリシンへと置換し、GPSSGAPPPS（配列番号１０９５）のＣ末端の延長部分を有するグルカゴンペプチドは、同一のＣ末端の延長部分を有するように修飾した天然のグルカゴンよりもＧＬＰ−１受容体に対する活性が４倍高い。このＴ２９Ｇ置換を本明細書に開示の他の修飾と併用して、ＧＬＰ−１受容体に対するグルカゴンペプチドの親和性を高めることが可能である。たとえば、Ｔ２９Ｇ置換を、Ｓ１６ＥおよびＮ２０Ｋのアミノ酸置換と組み合わせ、任意に１６番目と２０番目との間のラクタム架橋も組み合わせ、さらに任意に、本明細書に記載するようなＰＥＧ鎖の付加も組み合わせることが可能である。
いくつかの実施形態では、Ｃ末端にアミノ酸を付加し、この追加のアミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシンからなる群から選択される。
溶解性を高める修飾
もうひとつの実施形態では、好ましくは配列番号１００１の２７番目よりＣ末端側の位置でのアミノ酸置換および／または電荷を持つアミノ酸をペプチドのＣ末端領域に導入する付加によって、グルカゴンペプチドの溶解性を改善することが可能である。任意に、電荷を持つ、１個、２個または３個のアミノ酸を、Ｃ末端領域内、好ましくは２７番目よりＣ末端側に導入してもよい。いくつかの実施形態では、２８番目および／または２９番目の天然のアミノ酸（単数または複数）を、１個または２つ個電荷を持つアミノ酸に置換するおよび／または別の実施形態では、電荷を持つ１〜３個のアミノ酸をペプチドのＣ末端に付加する。例示としての実施形態では、電荷を持つアミノ酸のうちの１個、２個またはすべてが、負の電荷を持つ。いくつかの実施形態では、負の電荷を持つ（酸性アミノ酸）は、アスパラギン酸またはグルタミン酸である。
保存的な置換などの追加の修飾をグルカゴンペプチドにほどこしてもよく、このような修飾をしても、依然としてＧＩＰ活性（かつ任意にＧＬＰ−１活性および／またはグルカゴン活性）を保持できる。
他の修飾
ＧＩＰ活性を高めるまたは低下させ、グルカゴン受容体の活性を高めるまたは低下させ、ＧＬＰ−１受容体の活性を高めるクラス２のペプチドに関して上述した修飾を、個々に適用してもよいし、組み合わせで適用してもよい。クラス２のグルカゴン関連ペプチドに関して上述したどの修飾も、クラス２のグルカゴン関連ペプチドに関して本明細書に記載するような溶解性および／または安定性および／または作用時間の増大などの他の望ましい特性を与える、他の修飾と組み合わせることが可能である。あるいは、クラス２のグルカゴン関連ペプチドに関して上述したどの修飾も、溶解性または安定性または活性に実質的に影響しない、クラス２のグルカゴン関連ペプチドに関して本明細書に記載の他の修飾と組み合わせることが可能である。修飾の例として以下のものがあげられるが、これらに限定されるものではない。
（Ａ）１個、２個、３個または４個以上の電荷を持つアミノ酸（単数または複数）を、天然のグルカゴンのＣ末端領域、好ましくは２７番目よりＣ末端側の位置に導入することなどによる、溶解性の改善。このような電荷を持つアミノ酸は、２８番目または２９番目などで、天然のアミノ酸を電荷を持つアミノ酸で置換することあるいは、２７番目、２８番目または２９番目の後などに、電荷を持つアミノ酸を付加することによって導入可能なものである。例示としての実施形態では、電荷を持つアミノ酸のうち、１個、２個、３個またはすべてが、負の電荷を持つ。他の実施形態では、電荷を持つアミノ酸のうち、１個、２個、３個またはすべてが、正の電荷を持つ。このような修飾によって、２５℃で２４時間後に測定すると、約５．５〜約８の特定のｐＨ、たとえばｐＨ７で、天然のグルカゴンと比較して、溶解性が少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２５倍、３０倍またはそれより高くなるなど、溶解性が高まる。
（Ｂ）ペプチドの１６番目、１７番目、２０番目、２１番目、２４番目または２９番目、Ｃ末端の延長部分の範囲内またはＣ末端のアミノ酸などで、本明細書に記載するようなポリエチレングリコール鎖などの親水体を付加することによる、溶解性および作用時間または血中半減期の増大、
（Ｃ）本明細書に記載するようなグルカゴンペプチドのアシル化またはアルキル化による、溶解性の増大および／または作用時間または血中半減期の延長および／または作用開始を遅らせること、
（Ｄ）本明細書に記載するような１番目または２番目におけるアミノ酸の修飾による、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ ＩＶ）での切断に対する耐性を導入することによる、作用時間または血中半減期の延長。
（Ｅ）欠失あるいは、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸またはホモシステイン酸への置換などの１５番目のＡｓｐの修飾による、安定性の向上。このような修飾によって、２５℃で２４時間後に、もとのペプチドの少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、最大１００％が保持されるなど、ｐＨ５．５〜８の範囲内でのあるｐＨにおいて、分解または切断を低減することができる。このような修飾は、１５番目のアスパラギン酸と１６番目のセリンとの間のペプチド結合の切断を低減するものである。
（Ｆ）ＴｈｒまたはＡＩＢへの置換など、１６番目のＳｅｒの修飾による、安定性の向上。このような修飾によって、１５番目のアスパラギン酸と１６番目のセリンとの間のペプチド結合の切断も低減される。
（Ｇ）ロイシンまたはノルロイシンへの置換などによる、２７番目のメチオニンの修飾による安定性の向上。このような修飾によって、酸化による分解を低減することができる。また、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＡＩＢへの置換など、２０番目または２４番目のＧｌｕの修飾によって、安定性を向上させることも可能である。このような修飾によって、Ｇｌｎの脱アミド化によって生じる分解を低減することができる。Ｇｌｕへの置換など、２１番目のＡｓｐの修飾によって安定性を向上させることが可能である。このような修飾によって、Ａｓｐが脱水し、環状スクシンイミド中間体を形成した後、イソアスパラギン酸へ異性体化することで生じる分解を低減することができる。
（Ｈ）活性には実質的に影響しない非保存的なまたは保存的な置換、付加または欠失、たとえば、２番目、５番目、９番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１５番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２４番目、２７番目、２８番目または２９番目のうちの１箇所または２箇所以上における保存的な置換、これらの位置の１個または２個以上のアミノ酸からＡｌａへの置換、２７番目、２８番目または２９番目のうちの１箇所または２箇所以上におけるアミノ酸の欠失あるいは、２９番目のアミノ酸の欠失（任意に、Ｃ末端のカルボン酸基からＣ末端のアミドまたはエステルへの変更を組み合わせてもよい）、１２番目のＬｙｓからＡｒｇへの置換、１０番目のＴｙｒからＶａｌまたはＰｈｅへの置換、
GPSSGAPPPS（配列番号１０９５）をＣ末端に付加することで、ＰＥＧ化後も活性が保たれる。
天然のグルカゴンペプチドの位置には、親ペプチドの活性を少なくともいくらかは保ったままで修飾可能なものがある。したがって、本出願人らは、２番目、５番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２４番目、２７番目、２８番目または２９番目にある１個または２個以上のアミノ酸を、天然のグルカゴンペプチドに存在するものとは異なるアミノ酸で置換し、それでもなおグルカゴン受容体に対する活性を保持できると予想している。
いくつかの実施形態では、１８番目を、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸に置換する。いくつかの実施形態では、２０番目のアミノ酸を、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、シトルリンまたはＡＩＢに置換する。いくつかの実施形態では、２１番目を、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸に置換する。いくつかの実施形態では、グルカゴンペプチドは、１６番目、１７番目、１８番目、２０番目、２１番目、２３番目、２４番目、２７番目、２８番目、２９番目から選択される１〜１０個のアミノ酸修飾を有する。例示としての実施形態では、この修飾は、１７番目のグルタミン、１８番目のアラニン、２１番目のグルタミン酸、２３番目のイソロイシン、２４番目のアラニン、２７番目のバリン、２９番目のグリシンからなる群から選択される１個または２個以上のアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、１７番目〜２６番目から選択される１〜２個のアミノ酸が、親ペプチドと異なる。他の実施形態では、１７番目〜２２番目から選択される１〜２個のアミノ酸が、親ペプチドと異なる。さらに他の実施形態では、修飾は、１７番目のグルタミン、１８番目のアラニン、２１番目のグルタミン酸、２３番目のイソロイシン、２４番目のアラニンである。
いくつかの実施形態では、グルカゴンペプチドのカルボキシ末端に、１個または２個以上のアミノ酸を付加する。このアミノ酸は通常、２０種類の一般的なアミノ酸から選択され、いくつかの実施形態では、このアミノ酸は、天然のアミノ酸のカルボン酸に代えてアミド基を有する。例示としての実施形態では、付加されるアミノ酸は、グルタミン酸およびアスパラギン酸およびグリシンからなる群から選択される。
活性を破壊しない他の修飾は、Ｗ１０またはＲ２０を含む。
いくつかの実施形態では、１個または２個のアミノ酸残基でＣ末端を短縮することによって、本明細書に開示のクラス２のグルカゴン関連ペプチドを修飾するが、グルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体および／またはＧＩＰ受容体に対する同様の活性は保持されたままである。これに関して、２９番目および／または２８番目のアミノ酸を欠失させることが可能である。
例示としての実施形態
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴン（配列番号１００１）の類縁体は、（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を与える、１番目のアミノ酸修飾、（ｂ）類縁体のＣ末端領域（アミノ酸１２番目〜２９番目）のα螺旋構造を安定化する修飾、（ｃ）任意に、１〜１０個（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個など）のさらに別のアミノ酸修飾を伴う、配列番号１００１を有する。いくつかの実施形態では、類縁体は、本明細書に記載したＧＩＰ受容体に対する天然のＧＩＰの活性あるいは、ＧＩＰ受容体に対する他の任意の活性レベルの少なくとも約１％を示す。
特定の実施形態では、α螺旋構造を安定化する修飾は、分子内架橋を提供または導入するものであり、たとえば、本明細書に記載したものなどの共有結合の分子内架橋を含む。いくつかの実施形態における共有結合の分子内架橋は、ラクタム架橋である。これらの実施形態の類縁体のラクタム架橋は、本明細書に記載するようなラクタム架橋であってもよい。たとえば、「α螺旋構造の安定化」セクションのラクタム架橋についての教示内容を参照のこと。たとえば、ラクタム架橋は、ｉ番目のアミノ酸とｉ＋４番目のアミノ酸の側鎖間あるいは、ｊ番目のアミノ酸とｊ＋３番目のアミノ酸の側鎖間のものであってもよい（ｉは１２、１３、１６、１７、２０または２４であり、ｊは１７である）。特定の実施形態では、ラクタム架橋は、１６番目と２０番目のアミノ酸の間であってもよく、この場合、１６番目および２０番目のうちの一方のアミノ酸はＧｌｕに置換され、１６番目と２０番目の他方のアミノ酸はＬｙｓに置換される。
別の実施形態では、α螺旋構造を安定化する修飾は、類縁体の１６番目、２０番目、２１番目、２４番目における、１つ、２つ、３つまたは４つのα，α−二置換アミノ酸の導入である。いくつかの実施形態では、α，α−二置換アミノ酸はＡＩＢである。特定の態様では、α，α−二置換アミノ酸（ＡＩＢなど）は２０番目にあり、１６番目のアミノ酸を、本明細書に記載の式ＩＶのアミノ酸などの正の電荷を持つアミノ酸に置換する。式ＩＶのアミノ酸は、ホモリジン、Ｌｙｓ、Ｏｒｎまたは２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）であってもよい。
本発明の具体的な態様では、１番目でのアミノ酸修飾は、Ｈｉｓから、イミダゾール側鎖を欠いたアミノ酸（たとえば高分子芳香族アミノ酸（Ｔｙｒなど））への置換である。
特定の態様では、グルカゴンの類縁体は、２７番目、２８番目、２９番目のうちの１箇所、２箇所またはすべてにおけるアミノ酸修飾である。たとえば、２７番目のＭｅｔを高分子脂肪族アミノ酸（任意にＬｅｕ）に置換可能であり、２８番目のＡｓｎを低分子脂肪族アミノ酸（任意にＡｌａ）に置換可能であり、２９番目のＴｈｒを低分子脂肪族アミノ酸（任意にＧｌｙ）に置換可能であり、あるいは、上記の２つまたは３つを組み合わせてもよい。具体的な実施形態では、グルカゴンの類縁体は、２７番目のＬｅｕ、２８番目のＡｌａ、２９番目のＧｌｙまたはＴｈｒを有する。
本発明の特定の実施形態では、グルカゴンの類縁体は、２９番目のアミノ酸よりＣ末端側で１〜２１個のアミノ酸からなる延長部分を有する。延長部分は、配列番号１０９５または１０９６などのアミノ酸配列を有するものであってもよい。上記に加えてあるいは上記に代えて、グルカゴンの類縁体は、延長部分の１〜６個のアミノ酸が正の電荷を持つアミノ酸である、延長部分を有するものであってもよい。正の電荷を持つアミノ酸は、Ｌｙｓ、ホモリジン、Ｏｒｎ、Ｄａｂを含むがこれらに限定されるものではない、式ＩＶのアミノ酸であってもよい。
いくつかの実施形態におけるグルカゴンの類縁体は、本明細書に記載するようにアシル化されたまたはアルキル化されている。たとえば、アシル基またはアルキル基は、本明細書にてさらに説明するように、類縁体の１０番目または４０番目でスペーサーを介してあるいは介さずに、グルカゴンの類縁体に結合していてもよい。上記に加えてあるいは上記に代えて、本明細書にてさらに説明するような親水体を含むように類縁体を修飾してもよい。さらに、いくつかの実施形態では、類縁体は、以下の修飾のうちのいずれか１つまたはそれらの組み合わせを有する。
（ａ）２番目のＳｅｒにおける、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチルセリン、ＡＩＢ、Ｖａｌまたはα−アミノ−Ｎ−酪酸との置換、
（ｂ）１０番目のＴｙｒにおける、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、ＰｈｅまたはＶａｌとの置換、
（ｃ）１０番目のＬｙｓへのアシル基の結合、
（ｄ）１２番目のＬｙｓにおける、ＡｒｇまたはＩｌｅとの置換、
（ｅ）１６番目のＳｅｒにおける、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、ＧｌｙまたはＡＩＢとの置換、
（ｆ）１７番目のＡｒｇにおける、Ｇｌｎとの置換、
（ｇ）１８番目のＡｒｇにおける、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＧｌｙとの置換、
（ｈ）２０番目のＧｌｎにおける、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、ＯｒｎまたはＡＩＢとの置換、
（ｉ）２１番目のＡｓｐにおける、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸との置換、
（ｊ）２３番目のＶａｌにおける、Ｉｌｅとの置換、
（ｋ）２４番目のＧｌｎにおける、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＡＩＢとの置換、
（ｌ）２番目、５番目、９番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１５番目、１６番目、８ １９番目、２０番目、２１番目、２４番目、２７番目、２８番目、２９番目のいずれかにおける保存的な置換。
例示としての実施形態では、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴン（配列番号１００１）の類縁体は、以下の修飾を有する。
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を与える、１番目のアミノ酸修飾、
（ｂ）ｉ番目とｉ＋４番目のアミノ酸の側鎖間またはｊ番目とｊ＋３番目のアミノ酸の側鎖間でのラクタム架橋、（ｉは１２、１３、１６、１７、２０または２４であり、ｊは１７である）、
（ｃ）２７番目、２８番目および２９番目のうちの１箇所、２箇所またはすべてにおけるアミノ酸修飾、たとえば、２７番目および／または２８番目におけるアミノ酸修飾、
（ｄ）１〜９個または１〜６個のさらなるアミノ酸修飾、たとえば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個のさらなるアミノ酸修飾、
かつ、ＧＩＰ受容体の活性化に対する類縁体のＥＣ５０は、約１０ｎＭまたはそれ未満である。
これらの実施形態の類縁体のラクタム架橋は、本明細書に記載するようなラクタム架橋であってもよい。たとえば、「α螺旋構造の安定化」セクションのラクタム架橋についての教示内容を参照のこと。たとえば、ラクタム架橋は、１６番目と２０番目のアミノ酸の間であってもよく、この場合、１６番目および２０番目のうちの一方のアミノ酸はＧｌｕに置換され、１６番目と２０番目の他方のアミノ酸はＬｙｓに置換される。
これらの実施形態によれば、類縁体は、たとえば、配列番号１００５〜１０９４のいずれかのアミノ酸配列を有するものであってもよい。
他の例示としての実施形態では、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴン（配列番号１００１）の類縁体は、以下の修飾を有する。
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を与える、１番目のアミノ酸修飾、
（ｂ）類縁体の１６番目、２０番目、２１番目、２４番目における１個、２個、３個またはすべてのアミノ酸が、α，α−二置換アミノ酸で置換されていること、
（ｃ）２７番目、２８番目および２９番目のうちの１箇所、２箇所またはすべてにおけるアミノ酸修飾、たとえば、２７番目および／または２８番目におけるアミノ酸修飾、
（ｄ）１〜９個または１〜６個のさらなるアミノ酸修飾、たとえば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個のさらなるアミノ酸修飾、
かつ、ＧＩＰ受容体の活性化に対する類縁体のＥＣ５０は、約１０ｎＭまたはそれ未満である。
これらの実施形態の類縁体のα，α−二置換アミノ酸は、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）あるいは、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチルから選択される同一の基または異なる基で二置換されたアミノ酸またはシクロオクタンまたはシクロヘプタン（１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸など）で二置換されたアミノ酸を含むがこれらに限定されるものではない、どのようなα，α−二置換アミノ酸であってもよい。特定の実施形態では、α，α−二置換アミノ酸はＡＩＢである。特定の実施形態では、２０番目のアミノ酸が、ＡＩＢなどのα，α−二置換アミノ酸で置換されている。
これらの実施形態によれば、類縁体は、たとえば、配列番号１０９９〜１１４１、１１４４〜１１６４、１１６６〜１１６９、１１７３〜１１７８のいずれのアミノ酸配列を含むものであってもよい。
さらに他の例示としての実施形態では、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴン（配列番号１００１）の類縁体は、以下の修飾を有する。
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を与える、１番目のアミノ酸修飾
（ｂ）１６番目のＳｅｒにおける、式ＩＶのアミノ酸とのアミノ酸置換
Figure 2013540102

（式中、ｎは、１〜１６または１〜１０または１〜７または１〜６または２〜６であり、Ｒ１およびＲ２は各々独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択され、式中、Ｒ７は、ＨまたはＯＨであり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は、遊離アミノ基を有する）
（ｃ）２０番目におけるＧｌｎからα，α−二置換アミノ酸に置換するアミノ酸置換
（ｄ）２７番目、２８番目および２９番目のうちの１箇所、２箇所またはすべてにおけるアミノ酸修飾、たとえば、２７番目および／または２８番目におけるアミノ酸修飾
（ｅ）１〜９個または１〜６個のさらなるアミノ酸修飾、たとえば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個のさらなるアミノ酸修飾
かつ、ＧＩＰ受容体の活性化に対する類縁体のＥＣ５０は、約１０ｎＭまたはそれ未満である。
これらの実施形態の類縁体の式ＩＶのアミノ酸は、式ＩＶのアミノ酸など、どのようなアミノ酸であってもよく、式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６である。特定の実施形態では、ｎは、２、３、４または５であり、この場合、アミノ酸は、それぞれＤａｂ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓまたはホモリジンである。
これらの実施形態の類縁体のα，α−二置換アミノ酸は、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）あるいは、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチルから選択される同一の基または異なる基で二置換されたアミノ酸またはシクロオクタンまたはシクロヘプタン（１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸など）で二置換されたアミノ酸を含むがこれらに限定されるものではない、どのようなα，α−二置換アミノ酸であってもよい。特定の実施形態では、α，α−二置換アミノ酸はＡＩＢである。
これらの実施形態によれば、類縁体は、たとえば、配列番号１０９９〜１１６５のいずれかのアミノ酸配列を含むものであってもよい。
さらに他の例示としての実施形態では、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴン（配列番号１００１）の類縁体は、
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を与える、１番目のアミノ酸修飾と、
（ｂ）２９番目のアミノ酸よりＣ末端側で約１〜約２１個のアミノ酸からなる延長部分（この場合、延長部分のアミノ酸の少なくとも１個がアシル化されたまたはアルキル化されている）と、を有し、
この場合、ＧＩＰ受容体の活性化に対する類縁体のＥＣ５０は、約１０ｎＭまたはそれ未満である。
いくつかの実施形態では、アシル化されたアミノ酸またはアルキル化されたアミノ酸は、式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩのアミノ酸である。一層具体的な実施形態では、式Ｉのアミノ酸は、Ｄａｂ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓまたはホモリジンである。また、いくつかの実施形態では、約１〜約２１個のアミノ酸からなる延長部分は、GPSSGAPPPS（配列番号１０９５）またはXGPSSGAPPPS（配列番号１０９６）（Ｘは任意のアミノ酸である）またはGPSSGAPPPK（配列番号１１７０）またはXGPSSGAPPPK（配列番号１１７１）またはXGPSSGAPPPSK（配列番号１１７２）のアミノ酸配列を有し、ここで、Ｘは、Ｇｌｙまたは低分子脂肪族アミノ酸または非極性アミノ酸またはわずかに極性のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、約１〜約２１個のアミノ酸は、配列番号１０９５、１０９６、１１７０、１１７１または１１７２と比較して、１個または２個以上の保存的な置換を含む配列を有するものであってもよい。いくつかの実施形態では、アシル化されたアミノ酸またはアルキル化されたアミノ酸は、Ｃ末端が伸長した類縁体の３７番目、３８番目、３９番目、４０番目、４１番目、４２番目または４３番目にある。特定の実施形態では、アシル化されたアミノ酸またはアルキル化されたアミノ酸は、Ｃ末端が伸長した類縁体の４０番目にある。
いくつかの実施形態では、ＧＩＰアゴニスト活性を有する類縁体は、２７番目、２８番目および２９番目のうちの１箇所、２箇所またはすべてにおけるアミノ酸修飾、たとえば、２７番目および／または２８番目のアミノ酸修飾を有する。
上述した例示としての実施形態のいずれにおいても、ＧＩＰアゴニスト活性を与える、１番目のアミノ酸修飾は、Ｈｉｓから、イミダゾール側鎖を欠いているアミノ酸への置換であってもよい。１番目のアミノ酸修飾は、たとえば、Ｈｉｓから高分子芳香族アミノ酸への置換であってもよい。いくつかの実施形態では、高分子芳香族アミノ酸は、Ｔｙｒなどをはじめとして、本明細書に記載したうちのいずれであってもよい。
また、上記の例示としての実施形態に鑑みて、２７番目、２８番目および２９番目のうちの１箇所、２箇所またはすべてにおけるアミノ酸修飾は、本明細書に記載のこれらの位置でのどのような修飾であってもよい。たとえば、２７番目のＭｅｔを高分子脂肪族アミノ酸（任意にＬｅｕ）に置換可能であり、２８番目のＡｓｎを低分子脂肪族アミノ酸（任意にＡｌａ）に置換可能であるおよび／または２９番目のＴｈｒを低分子脂肪族アミノ酸（任意にＧｌｙ）に置換可能である。あるいは、類縁体は、このような２７番目および／または２８番目のアミノ酸修飾を有するものであってもよい。
上記の例示としての実施形態の類縁体は、１〜９個または１〜６個の追加のアミノ酸修飾、たとえば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個のさらなるアミノ酸修飾、たとえば、ＧＩＰ受容体、ＧＬＰ−１受容体、グルカゴン受容体のいずれかに対する活性を高めるまたは低下させる、溶解性を改善する、作用時間または血中半減期を改善する、作用開始を遅らせるまたは安定性を高める、本明細書に記載のいずれかの修飾などを、さらに含むものであってもよい。類縁体は、たとえば、１２番目のアミノ酸修飾、任意にＩｌｅへの置換および／または１７番目および１８番目のアミノ酸修飾、任意に１７番目におけるＱとの置換および１８番目におけるＡとの置換および／またはGPSSGAPPPS（配列番号１０９５）またはXGPSSGAPPPS（配列番号１０９６）あるいは、配列番号１０９５または１０９６と比較して１個または２個以上の保存的な置換を有する配列の、Ｃ末端への付加をさらに含むものであってもよい。類縁体は、以下の修飾のうちの１つまたは２つ以上を含むものであってもよい。
（ｉ）２番目のＳｅｒにおける、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチルセリン、ＡＩＢ、Ｖａｌまたはα−アミノ−Ｎ−酪酸との置換、
（ｉｉ）１０番目のＴｙｒにおける、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、ＰｈｅまたはＶａｌとの置換、
（ｉｉｉ）１０番目のＬｙｓへのアシル基の結合、
（ｉｖ）１２番目のＬｙｓにおける、Ａｒｇとの置換、
（ｖ）１６番目のＳｅｒにおける、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、ＧｌｙまたはＡＩＢとの置換、
（ｖｉ）１７番目のＡｒｇにおける、Ｇｌｎとの置換、
（ｖｉｉ）１８番目のＡｒｇにおける、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＧｌｙとの置換、
（ｖｉｉｉ）２０番目のＧｌｕにおける、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、ＯｒｎまたはＡＩＢとの置換、
（ｉｘ）２１番目のＡｓｐにおける、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸との置換、
（ｘ）２３番目のＶａｌにおける、Ｉｌｅとの置換、
（ｘｉ）２４番目のＧｌｎにおける、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡＩＢとの置換、
（ｘｉｉ）２番目、５番目、９番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１５番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２４番目、２７番目、２８番目、２９番目のいずれかにおける保存的な置換。
いくつかの実施形態における類縁体は、修飾（ｉ）から（ｘｉｉ）の組み合わせを有する。上記に代えてまたは上記に加えて、類縁体は、３番目のアミノ酸修飾（ＧｌｎからＧｌｕへのアミノ酸置換など）を有するものであってもよく、この場合、類縁体は、グルカゴン受容体に対する活性がグルカゴンの１％未満である。上記に代えてまたは上記に加えて、類縁体は、７番目にアミノ酸修飾（Ｔｈｒから、ヒドロキシ基を欠いたアミノ酸、たとえば、ＡｂｕまたはＩｌｅへのアミノ酸置換など）を有するものであってもよく、この場合、類縁体は、ＧＬＰ−１受容体に対する活性がＧＬＰ−１の約１０％未満である。
例示としての実施形態に関して、類縁体は、親水体と共有結合していてもよい。いくつかの実施形態では、類縁体は、アミノ酸の１６番目、１７番目、２０番目、２１番目、２４番目、２９番目、４０番目またはＣ末端のいずれかで親水体と共有結合している。特定の実施形態では、類縁体は、Ｃ末端の延長部分（配列番号１０９５のアミノ酸配列など）と、親水体が４０番目で類縁体に共有結合するように親水体を有するアミノ酸の付加と、を有する。
いくつかの実施形態では、親水体は、類縁体のＬｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチルフェニルアラニンと共有結合している。Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチルフェニルアラニンは、グルカゴン配列（配列番号１００１）に対して天然のアミノ酸であってもよいし、配列番号１００１の天然のアミノ酸を置換するアミノ酸であってもよい。親水体がＣｙｓと結合しているいくつかの実施形態では、親水体への結合は、以下の構造を含み得る。
Figure 2013540102

親水体を有する類縁体に関して、親水体は、本明細書に記載のどのようなものであってもよい。たとえば、「親水体の結合」セクションの教示内容を参照のこと。いくつかの実施形態では、親水体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。特定の実施形態におけるＰＥＧは、分子量が約１，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトン、たとえば、約２０，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンである。
例示としての実施形態に関して、類縁体は、側鎖がアシル基またはアルキル基（天然のアミノ酸に対して非天然のアシル基またはアルキル基など）に共有結合している、修飾されたアミノ酸を有するものであってもよい。アシル化された類縁体またはアルキル化された類縁体は、「アシル化およびアルキル化」のセクションで説明するアシル化されたペプチドまたはアルキル化されたペプチドに準じるものであってもよい。いくつかの実施形態では、アシル基は、たとえば、Ｃ１０の脂肪族アシル基またはアルキル基、Ｃ１２の脂肪族アシル基またはアルキル基、Ｃ１４の脂肪族アシル基またはアルキル基、Ｃ１６の脂肪族アシル基またはアルキル基、Ｃ１８の脂肪族アシル基またはアルキル基、Ｃ２０のアシル基またはアルキル基またはＣ２２のアシル基またはアルキル基など、Ｃ４からＣ３０の脂肪族アシル基である。アシル基またはアルキル基は、１０番目または４０番目のアミノ酸あるいは、Ｃ末端のアミノ酸を含むがこれらに限定されるものではない、類縁体のアミノ酸に共有結合していてもよい。特定の実施形態では、類縁体は、アシル基またはアルキル基が４０番目で類縁体に共有結合するような形で、Ｃ末端の延長部分（配列番号１０９５のアミノ酸配列など）と、アシル基またはアルキル基を有するアミノ酸の付加とを有する。いくつかの実施形態では、アシル基またはアルキル基は、式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩのアミノ酸、たとえば、Ｌｙｓ残基の側鎖に共有結合している。アシル基またはアルキル基を、グルカゴン配列（配列番号１００１）に対して天然のアミノ酸に共有結合してもよいし、配列番号１００１の配列あるいは配列番号１００１の配列に続いて配列番号１０９５の配列（Ｎ末端またはＣ末端で）に付加されるアミノ酸に結合してもよく、あるいは、天然のアミノ酸、たとえば、配列番号１００１の１０番目のＴｙｒを置換するアミノ酸に結合してもよい。
類縁体がアシル基またはアルキル基を有する上述した例示としての実施形態では、類縁体は、本明細書に記載するように、スペーサーを介してアシル基またはアルキル基と結合していてもよい。スペーサーは、たとえば、原子３〜１０個の長さであればよく、たとえば、アミノ酸（６−アミノヘキサン酸、本明細書に記載の任意のアミノ酸など）、ジペプチド（Ａｌａ−Ａｌａ、βＡｌａ−βＡｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γＧｌｕ−γＧｌｕなど）、トリペプチドまたは親水性のまたは疎水性の二官能性スペーサーであってもよい。特定の態様では、スペーサーとアシル基またはアルキル基とを合わせた全長が、原子約１４個〜約２８個の長さである。いくつかの実施形態では、アミノ酸スペーサーは、γ−Ｇｌｕではない。いくつかの実施形態では、ジペプチドスペーサーは、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕではない。
さらに別の例示としての実施形態では、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴンの類縁体は、配列番号１２２７、１２２８、１２２９または１２３０のいずれかによるアミノ酸配列を有し、この配列はさらに、以下の修飾を有する。
（ａ）任意に、ＧＩＰアゴニスト活性を与える、１番目のアミノ酸修飾、
（ｂ）２９番目のアミノ酸よりＣ末端側で約１〜約２１個のアミノ酸からなる延長部分（この場合、延長部分のアミノ酸の少なくとも１個がアシル化されたまたはアルキル化されている）、
（ｄ）最大６個のさらなるアミノ酸修飾、
この場合、ＧＩＰ受容体の活性化に対する類縁体のＥＣ５０は、約１０ｎＭまたはそれ未満である。
いくつかの態様では、アシル化されたアミノ酸またはアルキル化されたアミノ酸は、式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩのアミノ酸である。一層具体的な実施形態では、式Ｉのアミノ酸は、Ｄａｂ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓまたはホモリジンである。また、いくつかの実施形態では、約１個から約２１個のアミノ酸は、GPSSGAPPPS（配列番号１０９５）またはXGPSSGAPPPS（配列番号１０９６）（Ｘは任意のアミノ酸である）またはGPSSGAPPPK（配列番号１１７０）またはXGPSSGAPPPK（配列番号１１７１）またはXGPSSGAPPPSK（配列番号１１７２）のアミノ酸配列を有し、ここで、Ｘは、Ｇｌｙまたは低分子脂肪族アミノ酸または非極性アミノ酸またはわずかに極性のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、約１〜約２１個のアミノ酸は、配列番号１０９５、１０９６、１１７０、１１７１または１１７２と比較して、１個または２個以上の保存的な置換を含む配列を有するものであってもよい。いくつかの実施形態では、アシル化されたアミノ酸またはアルキル化されたアミノ酸は、Ｃ末端が伸長した類縁体の３７番目、３８番目、３９番目、４０番目、４１番目、４２番目または４３番目にある。特定の実施形態では、アシル化されたアミノ酸またはアルキル化されたアミノ酸は、Ｃ末端が伸長した類縁体の４０番目にある。
上述した例示としての実施形態のいずれにおいても、ＧＩＰアゴニスト活性を与える１番目のアミノ酸は、イミダゾール側鎖を欠いているアミノ酸であってもよい。１番目のアミノ酸は、たとえば、高分子芳香族アミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態では、高分子芳香族アミノ酸は、Ｔｙｒなどをはじめとして、本明細書に記載したうちのいずれであってもよい。
上記の例示としての実施形態の類縁体は、たとえば、ＧＩＰ受容体、ＧＬＰ−１受容体、グルカゴン受容体のいずれかに対する活性を高めるまたは低下させる、溶解性を改善する、作用時間または血中半減期を改善する、作用開始を遅らせるまたは安定性を高める、本明細書に記載のいずれかの修飾などの、１〜６個のさらなるアミノ酸修飾を含むものであってもよい。
特定の態様では、上記の例示としての実施形態で説明したグルカゴン類縁体は、２７番目、２８番目および２９番目のうちの１箇所、２箇所またはすべてにおけるアミノ酸修飾を有する。これらの位置での修飾は、これらの位置に関して本明細書で説明するいずれの修飾であってもよい。たとえば、配列番号１２２７、１２２８、１２２９または１２３０に関して、２７番目を高分子脂肪族アミノ酸（Ｌｅｕ、Ｉｌｅまたはノルロイシンなど）またはＭｅｔに置換することが可能であり、２８番目を別の低分子脂肪族アミノ酸（ＧｌｙまたはＡｌａなど）またはＡｓｎに置換することが可能であるおよび／または２９番目を別の低分子脂肪族アミノ酸（ＡｌａまたはＧｌｙなど）またはＴｈｒに置換することが可能である。あるいは、類縁体は、このような２７番目および／または２８番目のアミノ酸修飾を有するものであってもよい。
類縁体は、以下の追加の修飾のうち、１個または２個以上をさらに含むものであってもよい。
（ｉ）２番目のアミノ酸は、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチルセリン、ＡＩＢ、Ｖａｌまたはα−アミノ−Ｎ−酪酸のうちのいずれか１つであり、
（ｉｉ）１０番目のアミノ酸は、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、ＰｈｅまたはＶａｌであり、
（ｉｉｉ）１０番目のＬｙｓに対するアシル基の結合、
（ｉｖ）１２番目のアミノ酸は、Ｉｌｅ、ＬｙｓまたはＡｒｇであり、
（ｖ）１６番目のアミノ酸は、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、ＧｌｙまたはＡＩＢのうちのいずれか１つであり、
（ｖｉ）１７番目のアミノ酸は、ＧｌｎまたはＡｒｇであり、
（ｖｉｉ）１８番目のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＧｌｙのうちのどの１つでもよく、
（ｖｉｉｉ）２０番目のアミノ酸は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、ＯｒｎまたはＡＩＢまたは他のα，α−二置換アミノ酸のうちのいずれか１つであり、
（ｉｘ）２１番目のアミノ酸は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸のうちのどの１つでもよく、
（ｘ）２３番目のアミノ酸は、ＶａｌまたはＩｌｅであり、
（ｘｉ）２４番目のアミノ酸は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡＩＢのうちのいずれか１つであり、
（ｘｉｉ）２番目、５番目、９番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１５番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２４番目、２７番目、２８番目、２９番目のいずれかにおける１個または２個以上の保存的な置換。
いくつかの実施形態における類縁体は、修飾（ｉ）から（ｘｉｉ）の組み合わせを有する。上記に代えてまたは上記に加えて、類縁体は、３番目のアミノ酸修飾（ＧｌｎからＧｌｕへのアミノ酸置換など）を有するものであってもよく、この場合、類縁体は、グルカゴン受容体に対する活性がグルカゴンの１％未満である。上記に代えてまたは上記に加えて、類縁体は、７番目にアミノ酸修飾（Ｔｈｒから、ヒドロキシ基を欠いたアミノ酸、たとえば、ＡｂｕまたはＩｌｅへのアミノ酸置換など）を有するものであってもよく、この場合、類縁体は、ＧＬＰ−１受容体に対する活性がＧＬＰ−１の約１０％未満である。
例示としての実施形態に関して、類縁体は、親水体と共有結合していてもよい。いくつかの実施形態では、類縁体は、アミノ酸の１６番目、１７番目、２０番目、２１番目、２４番目、２９番目、４０番目またはＣ末端のいずれかで親水体と共有結合している。特定の実施形態では、類縁体の２４番目に、親水体が共有結合している。
いくつかの実施形態では、親水体は、類縁体のＬｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチルフェニルアラニンと共有結合している。Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチル−フェニルアラニンは、配列番号１００１、１２２７、１２２８、１２２９または１２３０に対して天然のアミノ酸であってもよいし、置換されたアミノ酸であってもよい。親水体がＣｙｓに結合したいくつかの実施形態では、この結合は、以下の構造を有するものであってもよい。
Figure 2013540102

親水体を有する類縁体に関して、親水体は、本明細書に記載のどのようなものであってもよい。たとえば、「親水体の結合」セクションの教示内容を参照のこと。いくつかの実施形態では、親水体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。特定の実施形態におけるＰＥＧは、分子量が約１，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトン、たとえば、約２０，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンである。
例示としての実施形態に関して、類縁体は、側鎖がアシル基またはアルキル基に共有結合しているＣ末端の延長部分内に、修飾されたアミノ酸を有するものであってもよい。アシル化された類縁体またはアルキル化された類縁体は、「アシル化およびアルキル化」のセクションで説明するアシル化されたペプチドまたはアルキル化されたペプチドに準じるものであってもよい。いくつかの実施形態では、アシル基は、たとえば、Ｃ１０の脂肪族アシル基またはアルキル基、Ｃ１２の脂肪族アシル基またはアルキル基、Ｃ１４の脂肪族アシル基またはアルキル基、Ｃ１６の脂肪族アシル基またはアルキル基、Ｃ１８の脂肪族アシル基またはアルキル基、Ｃ２０のアシル基またはアルキル基またはＣ２２のアシル基またはアルキル基など、Ｃ４からＣ３０の脂肪族アシル基である。アシル基またはアルキル基は、１０番目または４０番目のアミノ酸あるいは、Ｃ末端のアミノ酸を含むがこれらに限定されるものではない、類縁体のアミノ酸に共有結合していてもよい。いくつかの実施形態では、アシル基またはアルキル基は、式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩのアミノ酸、たとえば、Ｌｙｓ残基の側鎖に共有結合している。アシル基またはアルキル基は、配列番号１００１、１２２７、１２２８、１２２９または１２３０に対して天然のアミノ酸に共有結合しているか、置換されたアミノ酸に結合していてもよい。アシル基またはアルキル基は、配列番号１０９５、１０９６、１１７１または１１７２に対して天然のアミノ酸に共有結合しているか、置換されたアミノ酸に結合していてもよい。
類縁体がアシル基またはアルキル基を有する上述した例示としての実施形態では、類縁体は、本明細書に記載するように、スペーサーを介してアシル基またはアルキル基と結合していてもよい。スペーサーは、たとえば、原子３〜１０個の長さであればよく、たとえば、アミノ酸（６−アミノヘキサン酸、本明細書に記載の任意のアミノ酸など）、ジペプチド（Ａｌａ−Ａｌａ、βＡｌａ−βＡｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γＧｌｕ−γＧｌｕなど）、トリペプチドまたは親水性のまたは疎水性の二官能性スペーサーであってもよい。特定の態様では、スペーサーとアシル基またはアルキル基とを合わせた全長が、原子約１４個〜約２８個の長さである。いくつかの実施形態では、アミノ酸スペーサーは、γ−Ｇｌｕではない。いくつかの実施形態では、ジペプチドスペーサーは、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕではない。
いくつかの極めて具体的な実施形態では、本発明の類縁体は、配列番号１０９９〜１１４１、１１４４〜１１６４、１１６６、１１９２〜１２０７、１２０９〜１２２１、１２２３からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号１１６７〜１１６９、１１７３〜１１７８、１２２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
さらに、本発明の類縁体の具体例は、表１〜表３に示すものをいずれも含むが、これらに限定されるものではない。
さらに別の例示としての実施形態では、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴンの類縁体は、アシル基またはアルキル基（天然のアミノ酸に対して非天然のアシル基またはアルキル基など）を有し、ここで、アシル基またはアルキル基は、スペーサーに結合し、（ｉ）スペーサーは、類縁体の１０番目でアミノ酸の側鎖に結合している；または（ｉｉ）類縁体は、２９番目のアミノ酸よりＣ末端側で１〜２１個のアミノ酸からなる延長部分を有し、スペーサーは、配列番号１００１の３７番目〜４３番目の１つに対応するアミノ酸の側鎖に結合し、この場合、ＧＩＰ受容体の活性化に対する類縁体のＥＣ５０は、約１０ｎＭまたはそれ未満である。
このような実施形態では、類縁体は、（ｉ）ＧＩＰアゴニスト活性を与える、１番目のアミノ酸修飾、（ｉｉ）２７番目、２８番目および２９番目のうちの１箇所、２箇所またはすべてにおけるアミノ酸修飾、（ｉｉｉ）以下のうちの少なくとも１つ
（Ａ）類縁体は、ｉ番目とｉ＋４番目のアミノ酸の側鎖間またはｊ番目とｊ＋３番目のアミノ酸の側鎖間でのラクタム架橋、（ｉは１２、１３、１６、１７、２０または２４であり、ｊは１７である）を有し、
（Ｂ）類縁体の１６番目、２０番目、２１番目、２４番目における１個、２個、３個またはすべてのアミノ酸が、α，α−二置換アミノ酸で置換され、または
（Ｃ）類縁体は、（ｉ）１６番目のＳｅｒにおける、式ＩＶのアミノ酸とのアミノ酸置換を有し、
Figure 2013540102

式中、ｎは１〜７であり、Ｒ１およびＲ２は各々独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群から選択され、Ｒ７は、ＨまたはＯＨであり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は、遊離アミノ基を有する；および（ｉｉ）２０番目におけるＧｌｎからα，α−二置換アミノ酸に置換するアミノ酸置換。
かつ、（ｉｖ）最大６個のさらなるアミノ酸修飾を有する、配列番号１００１のアミノ酸配列を有するものであってもよい。
これらの実施形態の類縁体のα，α−二置換アミノ酸は、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）あるいは、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチルから選択される同一の基または異なる基で二置換されたアミノ酸またはシクロオクタンまたはシクロヘプタン（１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸など）で二置換されたアミノ酸を含むがこれらに限定されるものではない、どのようなα，α−二置換アミノ酸であってもよい。特定の実施形態では、α，α−二置換アミノ酸はＡＩＢである。
これらの実施形態の類縁体の式ＩＶのアミノ酸は、式ＩＶのアミノ酸など、どのようなアミノ酸であってもよく、式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６である。特定の実施形態では、ｎは、２、３、４または５であり、この場合、アミノ酸は、それぞれＤａｂ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓまたはホモリジンである。
上述した例示としての実施形態のいずれにおいても、ＧＩＰアゴニスト活性を与える、１番目のアミノ酸修飾は、Ｈｉｓから、イミダゾール側鎖を欠いているアミノ酸への置換であってもよい。１番目のアミノ酸修飾は、たとえば、Ｈｉｓから高分子芳香族アミノ酸への置換であってもよい。いくつかの実施形態では、高分子芳香族アミノ酸は、Ｔｙｒなどをはじめとして、本明細書に記載したうちのいずれであってもよい。
また、上記の例示としての実施形態に鑑みて、２７番目、２８番目および２９番目のうちの１箇所、２箇所またはすべてにおけるアミノ酸修飾は、本明細書に記載のこれらの位置でのどのような修飾であってもよい。たとえば、２７番目のＭｅｔを高分子脂肪族アミノ酸（任意にＬｅｕ）に置換可能であり、２８番目のＡｓｎを低分子脂肪族アミノ酸（任意にＡｌａ）に置換可能であるおよび／または２９番目のＴｈｒを低分子脂肪族アミノ酸（任意にＧｌｙ）に置換可能である。あるいは、類縁体は、このような２７番目および／または２８番目のアミノ酸修飾を有するものであってもよい。
上記の例示としての実施形態の類縁体は、１〜９個または１〜６個の追加のアミノ酸修飾、たとえば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個のさらなるアミノ酸修飾、たとえば、ＧＩＰ受容体、ＧＬＰ−１受容体、グルカゴン受容体のいずれかに対する活性を高めるまたは低下させる、溶解性を改善する、作用時間または血中半減期を改善する、作用開始を遅らせるまたは安定性を高める、本明細書に記載のいずれかの修飾などを、さらに含むものであってもよい。類縁体は、たとえば、１２番目のアミノ酸修飾、任意にＩｌｅへの置換および／または１７番目および１８番目のアミノ酸修飾、任意に１７番目におけるＱとの置換および１８番目におけるＡとの置換および／またはGPSSGAPPPS（配列番号１０９５）またはXGPSSGAPPPS（配列番号１０９６）あるいは、配列番号１０９５または１０９６と比較して１個または２個以上の保存的な置換を有する配列の、Ｃ末端への付加をさらに含むものであってもよい。類縁体は、以下の修飾のうちの１つまたは２つ以上を含むものであってもよい。
（ｉ）２番目のＳｅｒにおける、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチルセリン、ＡＩＢ、Ｖａｌまたはα−アミノ−Ｎ−酪酸との置換、
（ｉｉ）１０番目のＴｙｒにおける、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、ＰｈｅまたはＶａｌとの置換、
（ｉｉｉ）１０番目のＬｙｓへのアシル基の結合、
（ｉｖ）１２番目のＬｙｓにおける、Ａｒｇとの置換、
（ｖ）１６番目のＳｅｒにおける、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、ＬｙｓまたはＡＩＢとの置換、
（ｖｉ）１７番目のＡｒｇにおける、Ｇｌｎとの置換、
（ｖｉｉ）１８番目のＡｒｇにおける、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＧｌｙとの置換、
（ｖｉｉｉ）２０番目のＧｌｎにおける、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、ＯｒｎまたはＡＩＢとの置換、
（ｉｘ）２１番目のＡｓｐにおける、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸との置換、
（ｘ）２３番目のＶａｌにおける、Ｉｌｅとの置換、
（ｘｉ）２４番目のＧｌｎにおける、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡＩＢとの置換、
（ｘｉｉ）２番目、５番目、９番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１５番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２４番目、２７番目、２８番目、２９番目のいずれかにおける保存的な置換。
いくつかの実施形態における類縁体は、修飾（ｉ）から（ｘｉｉ）の組み合わせを有する。上記に代えてまたは上記に加えて、類縁体は、３番目のアミノ酸修飾（ＧｌｎからＧｌｕへのアミノ酸置換など）を有するものであってもよく、この場合、類縁体は、グルカゴン受容体に対する活性がグルカゴンの１％未満である。上記に代えてまたは上記に加えて、類縁体は、７番目のアミノ酸修飾（Ｔｈｒから、ヒドロキシ基を欠いたアミノ酸、たとえば、ＡｂｕまたはＩｌｅへのアミノ酸置換など）、２７個または２８個のアミノ酸からなるペプチドが得られる、２７番目または２８番目のアミノ酸よりＣ末端側でのアミノ酸（単数または複数）の欠失またはこれらの組み合わせを有するものであってもよく、この場合、類縁体は、ＧＬＰ−１受容体に対する活性がＧＬＰ−１の約１０％未満である。
例示としての実施形態に関して、類縁体は、親水体と共有結合していてもよい。いくつかの実施形態では、類縁体は、アミノ酸の１６番目、１７番目、２０番目、２１番目、２４番目、２９番目、４０番目またはＣ末端のいずれかで親水体と共有結合している。特定の実施形態では、類縁体は、Ｃ末端の延長部分（配列番号１０９５のアミノ酸配列など）と、親水体が４０番目で類縁体に共有結合するように親水体を有するアミノ酸の付加と、を有する。
いくつかの実施形態では、親水体は、類縁体のＬｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチルフェニルアラニンと共有結合している。Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチルフェニルアラニンは、グルカゴン配列（配列番号１００１）に対して天然のアミノ酸であってもよいし、配列番号１００１の天然のアミノ酸を置換するアミノ酸であってもよい。親水体がＣｙｓと結合しているいくつかの実施形態では、親水体への結合は、以下の構造を含み得る。
Figure 2013540102

親水体を有する類縁体に関して、親水体は、本明細書に記載のどのようなものであってもよい。たとえば、「親水体の結合」セクションの教示内容を参照のこと。いくつかの実施形態では、親水体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。特定の実施形態におけるＰＥＧは、分子量が約１，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトン、たとえば、約２０，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンである。
類縁体が、スペーサーを介して類縁体と結合しているアシル基またはアルキル基を有する例示としての実施形態では、スペーサーは、本明細書に記載するような、どのようなスペーサーであってもよい。スペーサーは、たとえば、原子３〜１０個の長さであればよく、たとえば、アミノ酸（６−アミノヘキサン酸、本明細書に記載の任意のアミノ酸など）、ジペプチド（Ａｌａ−Ａｌａ、βＡｌａ−βＡｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γＧｌｕ−γＧｌｕなど）、トリペプチドまたは親水性のまたは疎水性の二官能性スペーサーであってもよい。特定の態様では、スペーサーとアシル基またはアルキル基とを合わせた全長が、原子約１４個〜約２８個の長さである。いくつかの実施形態では、アミノ酸スペーサーは、γ−Ｇｌｕではない。いくつかの実施形態では、ジペプチドスペーサーは、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕではない。
アシル基またはアルキル基は、天然のアミノ酸に対して非天然のアシル基またはアルキル基など、本明細書に記載するようなどのようなアシル基またはアルキル基であってもよい。いくつかの実施形態におけるアシル基またはアルキル基は、たとえば、Ｃ１０の脂肪族アシル基またはアルキル基、Ｃ１２の脂肪族アシル基またはアルキル基、Ｃ１４の脂肪族アシル基またはアルキル基、Ｃ１６の脂肪族アシル基またはアルキル基、Ｃ１８の脂肪族アシル基またはアルキル基、Ｃ２０のアシル基またはアルキル基あるいは、Ｃ２２のアシル基またはアルキル基などのＣ４〜Ｃ３０の脂肪族アシル基またはＣ４〜Ｃ３０アルキル基である。具体的な実施形態では、アシル基は、Ｃ１２〜Ｃ１８の脂肪族アシル基（Ｃ１４またはＣ１６の脂肪族アシル基など）である。
いくつかの実施形態では、類縁体の２９番目のアミノ酸よりＣ末端側で約１〜約２１個のアミノ酸からなる延長部分は、GPSSGAPPPS（配列番号１０９５）またはXGPSSGAPPPS（配列番号１０９６）（Ｘは任意のアミノ酸である）またはGPSSGAPPPK（配列番号１１７０）またはXGPSSGAPPPK（配列番号１１７１）またはXGPSSGAPPPSK（配列番号１１７２）のアミノ酸配列を有し、ここで、Ｘは、Ｇｌｙまたは低分子脂肪族アミノ酸または非極性アミノ酸またはわずかに極性のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、約１〜約２１個のアミノ酸は、配列番号１０９５、１０９６、１１７０、１１７１または１１７２と比較して、１個または２個以上の保存的な置換を含む配列を有するものであってもよい。いくつかの実施形態では、アシル化されたアミノ酸またはアルキル化されたアミノ酸は、Ｃ末端が伸長した類縁体の３７番目、３８番目、３９番目、４０番目、４１番目、４２番目または４３番目にある。特定の実施形態では、アシル化されたアミノ酸またはアルキル化されたアミノ酸は、Ｃ末端が伸長した類縁体の４０番目にある。
ＧＩＰアゴニストは、任意にＧＩＰアゴニスト活性を保持する最大で１個、２個、３個、４個または５個のさらなる修飾を有する、配列番号１００５〜１０９４などのアミノ酸配列のいずれのアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。特定の実施形態では、ＧＩＰアゴニストは、配列番号１０９９〜１２６２のいずれかのアミノ酸を有する。
クラス３のグルカゴン関連ペプチド
特定の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、クラス３のグルカゴン関連ペプチドであり、これは、本明細書および国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４７４３８（２００９年６月１６日出願）、国際特許出願公開公報ＷＯ２００８／１０１０１７（２００８年８月２１日公開）、米国仮特許出願第６１／０９０，４１２号および米国特許出願第６１／１７７，４７６号（その内容全体を本明細書に援用する）に記載されている。
クラス３のグルカゴン関連ペプチドに関する、以下のセクションに示す生物学的配列（配列番号１〜６５６）のいくつかは、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４７４３８における配列番号１〜６５６に対応する。
活性
クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体に対する活性が高まったペプチドであってもよく、さらに他の実施形態では、生物物理学的安定性および／または水溶性が高まっている。また、いくつかの実施形態では、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対して、グルカゴン受容体に対する天然のグルカゴンの選択性を失っており、よって、これら２つの受容体のコアゴニストであることを示している。クラス３のグルカゴン関連ペプチド内の選択されたアミノ酸修飾によって、グルカゴン受容体に比してＧＬＰ−１受容体に対するペプチドの相対活性を制御することが可能である。よって、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に比してグルカゴン受容体に対する活性のほうが高いグルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニスト、両方の受容体に対する活性がほぼ等しいグルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニストまたはグルカゴン受容体に比してＧＬＰ−１受容体に対する活性のほうが高いグルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニストであり得る。後者のカテゴリのコアゴニストは、天然のＧＬＰ−１と同一またはこれよりも高い活性でＧＬＰ−１受容体を活性化する機能を保持したまま、グルカゴン受容体に対して活性をほとんど示さないかまったく示さないように操作可能なものである。これらのコアゴニストのいずれも、生物物理学的安定性および／または水溶性を高める修飾を含むものであってもよい。
天然のＧＬＰ−１と比較して、ＧＬＰ−１受容体に対して少なくとも約１％（少なくとも約１．５％、２％、５％、７％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％を含む）から約２００％のいずれかまたはそれより高い活性を有し、天然のグルカゴンと比較して、グルカゴン受容体に対して少なくとも約１％（約１．５％、２％、５％、７％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％を含む）から約５００％のいずれかまたはそれよりも高い活性を有するグルカゴンペプチドを得られるように、クラス３のグルカゴン関連ペプチドを修飾することが可能である。天然のグルカゴンのアミノ酸配列は配列番号１であり、ＧＬＰ−１（７−３６）アミドのアミノ酸配列は配列番号５２であり、ＧＬＰ−１（７−３７）酸のアミノ酸配列は配列番号５０である。例示としての実施形態では、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体に対する活性が天然のグルカゴンの少なくとも１０％かつ、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が天然のＧＬＰ−１の少なくとも５０％あるいは、グルカゴン受容体に対する活性が天然のグルカゴンの少なくとも４０％かつ、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が天然のＧＬＰ−１の少なくとも４０％あるいは、グルカゴン受容体に対する活性が天然のグルカゴンの少なくとも６０％かつ、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が天然のＧＬＰ−１の少なくとも６０％であってもよい。
クラス３のグルカゴン関連ペプチドの、ＧＬＰ−１受容体に対するグルカゴン受容体の選択性は、グルカゴン／ＧＬＰ−１活性の相対比（天然のグルカゴンの場合と比較したグルカゴン受容体に対するペプチドの活性を、天然のＧＬＰ−１の場合と比較したＧＬＰ−１受容体に対するペプチドの活性で割ったもの）で説明できる。たとえば、グルカゴン受容体に対する活性が天然のグルカゴンの６０％であり、かつ、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が天然のＧＬＰ−１の６０％であるクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン／ＧＬＰ−１活性の比が１：１である。グルカゴン／ＧＬＰ−１活性の比の例として、約１：１、約１．５：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１または約１０：１あるいは、約１：１０、約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２または約１：１．５があげられる。一例として、グルカゴン／ＧＬＰ−１活性の比が１０：１であるということは、ＧＬＰ−１受容体の選択性に対してグルカゴン受容体の選択性が１０倍であることを示す。同様に、ＧＬＰ−１／グルカゴン活性の比が１０：１であるということは、グルカゴン受容体の選択性に対してＧＬＰ−１受容体の選択性が１０倍であることを示す。
いくつかの実施形態では、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体に対する活性が、約１％〜約１０％あるいは、約０．１％〜約１０％あるいは、約０．１％を上回るが約１０％未満であるなど、天然のグルカゴンの約１０％またはそれ未満である一方で、ＧＬＰ−１受容体に対する活性はＧＬＰ−１の少なくとも２０％である。たとえば、本明細書に記載の例示としてのクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、活性が天然のグルカゴンの約０．５％、約１％または約７％である一方で、ＧＬＰ−１受容体に対する活性はＧＬＰ−１の少なくとも２０％である。
クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体またはＧＬＰ−１受容体またはその両方に対する活性が高まったまたは低下したグルカゴンペプチドであってもよい。クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対し、グルカゴン受容体に対する選択性が変化したグルカゴンペプチドであってもよい。
よって、本明細書にて開示するように、溶解性および／または安定性が改善された高活性なクラス３のグルカゴン関連ペプチドが提供される。例示としての高活性なクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体に対する活性が天然のグルカゴンの少なくとも約２００％であり、任意に、６〜８または６〜９または７〜９のｐＨ（ｐＨ７など）にて、少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で可溶であり、かつ、任意に、２５℃で２４時間後に、もとのペプチドの少なくとも９５％を保持する（たとえば、もとのペプチドの５％またはそれ未満しか分解または切断されない）。もうひとつの例として、例示としてのクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体およびＧＬＰ−１受容体の両方に対する活性が、約４０％より高いまたは約６０％より高く（約１：３〜３：１または約１：２〜２：１の比）、任意に、６〜８または６〜９または７〜９のｐＨ（ｐＨ７など）にて、少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で可溶であり、任意に、２５℃で２４時間後に、もとのペプチドの少なくとも９５％を保持する。もうひとつの例示としてのクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体に対する活性が天然のグルカゴンの約１７５％またはそれより高く、かつ、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が天然のＧＬＰ−１の約２０％またはそれ未満であり、任意に、６〜８または６〜９または７〜９のｐＨ（ｐＨ７など）にて、少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で可溶であり、任意に、２５℃で２４時間後に、もとのペプチドの少なくとも９５％を保持する。さらにもうひとつの例示としてのクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体に対する活性が天然のグルカゴンの約１０％またはそれ未満であり、かつ、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が天然のＧＬＰ−１の少なくとも約２０％であり、任意に、６〜８または６〜９または７〜９のｐＨ（ｐＨ７など）にて、少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で可溶であり、任意に、２５℃で２４時間後に、もとのペプチドの少なくとも９５％を保持する。さらにもうひとつの例示としてのクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体に対する活性が天然のグルカゴンの約１０％またはそれ未満であるが、０．１％、０．５％または１％よりは高く、かつ、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が、天然のＧＬＰ−１の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％またはそれよりも高く、任意に、６〜８または６〜９または７〜９のｐＨ（ｐＨ７など）にて、少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で可溶であり、任意に、２５℃で２４時間後に、もとのペプチドの少なくとも９５％を保持する。いくつかの実施形態では、このようなクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、天然のグルカゴンの対応する位置に、少なくとも２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個または２８個の天然アミノ酸を保持する（天然のグルカゴンと比較して、１〜７個、１〜５個または１〜３個の修飾を有するなど）。
グルカゴン活性に影響する修飾
天然のグルカゴン（配列番号１）の１６番目のアミノ酸修飾によって、グルカゴン受容体に対する活性が高まる。いくつかの実施形態では、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体に対するペプチドの活性を増強するために、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ（配列番号１）の野生型ペプチドの修飾したグルカゴンアゴニストである。天然のグルカゴン（配列番号１）の普通に生じる１６番目のセリンを、選択した酸性アミノ酸で置換し、ｃＡＭＰ合成を刺激する機能に関して、確立されたin vitroモデルでのアッセイでグルカゴンの活性を増強することが可能である（実施例５を参照のこと）。特に、この置換によって、グルカゴン受容体に対する類縁体の活性が、少なくとも２倍、４倍、５倍、最大で１０倍増強される。また、この置換によって、ＧＬＰ−１受容体に対する類縁体の活性が、天然のグルカゴンの少なくとも５倍、１０倍または１５倍に増強されるが、ＧＬＰ−１受容体に対し、グルカゴン受容体に対する選択性は維持される。
非限定的な例として、このような増強された活性は、１６番目の天然のセリンを、グルタミン酸で置換あるいは、原子４個の長さの側鎖を有する別の負の電荷を持つアミノ酸で置換あるいは、グルタミン、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸のうちの任意の１つで置換あるいは、少なくとも１個のヘテロ原子（Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐなど）を含有し、原子約４個（または３個〜５個）の長さの側鎖を有する電荷を持つアミノ酸で置換することによって、与えられるものである。いくつかの実施形態によれば、天然のグルカゴンの１６番目のセリン残基を、グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、スレオニンまたはグリシンからなる群から選択されるアミノ酸で置換する。いくつかの実施形態によれば、天然のグルカゴンの１６番目のセリン残基を、グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換し、いくつかの実施形態では、セリン残基をグルタミン酸で置換する。
いくつかの実施形態では、活性が増強されたクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７のペプチドあるいは、配列番号５のグルカゴンアゴニスト類縁体を有する。いくつかの実施形態によれば、グルカゴン受容体に対する活性が野生型グルカゴンに比して増強されたクラス３のグルカゴン関連ペプチドが提供され、この場合のペプチドは、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０の配列を有し、このグルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対し、グルカゴン受容体に対するその選択性を保持する。いくつかの実施形態では、グルカゴン受容体に対する特異性が増強されたクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０のペプチドまたはそのグルカゴンアゴニスト類縁体を有し、この場合、カルボキシ末端のアミノ酸は、その天然のカルボン酸基を保持する。いくつかの実施形態によれば、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ（配列番号１０）の配列を有し、ここで、ペプチドは、天然のグルカゴンよりも、グルカゴン受容体に対する活性がほぼ５倍に増強されている（実施例５のin vitroでのｃＡＭＰアッセイで測定）。
３番目のアミノ酸修飾、たとえば３番目の天然のグルタミンの置換などによって、グルカゴン受容体の活性を低減、維持または増強してもよい。いくつかの実施形態では、３番目のアミノ酸から、酸性、塩基性または疎水性のアミノ酸（グルタミン酸、オルニチン、ノルロイシン）に置換すると、グルカゴン受容体の活性が実質的に低減または破壊されることが明らかになっている。たとえば、グルタミン酸、オルニチンまたはノルロイシンで置換された類縁体は、グルカゴン受容体に対する活性が、天然のグルカゴンの約１０％またはそれ未満、約１％〜約１０％あるいは、約０．１％〜約１０％あるいは、約０．１％を上回るが約１０％未満である一方で、ＧＬＰ−１受容体に対する活性はＧＬＰ−１の少なくとも２０％である。たとえば、本明細書に記載の例示としての類縁体は、天然のグルカゴンに対する活性がＧＬＰ−１の約０．５％、約１％または約７％である一方で、ＧＬＰ−１受容体に対する活性はＧＬＰ−１の少なくとも２０％である。特に、本明細書に記載のグルカゴン類縁体、グルカゴンアゴニスト類縁体、グルカゴンコアゴニストおよびグルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニスト分子をはじめとする、クラス３のグルカゴン関連ペプチドのいずれも、たとえばＧｌｎをＧｌｕで置換するなど、３番目に修飾を含むように修飾して、グルカゴン受容体に対する選択性と比較した場合に、ＧＬＰ−１受容体に対する選択性が高い、たとえば選択性が１０倍のペプチドを生成できるものである。
もうひとつの実施形態では、どのクラス３のグルカゴンペプチドの３番目の天然のグルタミンでも、場合によっては、本明細書に記載するように、グルカゴン受容体の活性を増強しつつ、グルカゴン受容体に対する活性を実質的に損なうことなくグルタミン類縁体と置換可能である。具体的な実施形態では、３番目のアミノ酸をＤａｂ（Ａｃ）で置換する。たとえば、グルカゴンアゴニストは、配列番号５９５、配列番号６０１、配列番号６０３、配列番号６０４、配列番号６０５、配列番号６０６のアミノ酸配列を有するものであってもよい。
２番目（２番目のＡＩＢなど）の修飾ならびに、場合によっては１番目の修飾によって、グルカゴン活性が低下する場合があることが観察された。本明細書に記載の手段、「ｉ」番目と「ｉ＋４」番目のアミノ酸の側鎖間、たとえば１２番目と１６番目、１６番目と２０番目または２０番目と２４番目での共有結合によって、グルカゴンのＣ末端領域のα螺旋を安定化することで、このグルカゴン活性の低下を回復可能である。いくつかの実施形態では、この共有結合は、１６番目のグルタミン酸と２０番目のリジンとの間のラクタム架橋である。いくつかの実施形態では、この共有結合は、ラクタム架橋以外の分子内架橋である。たとえば、好適な共有結合方法は、オレフィンメタセシス、ランチオニンを基にした環化、ジスルフィド結合または修飾された硫黄含有架橋の形成、α，ω−ジアミノアルカンでの繋ぎの使用、金属原子架橋の形成、他のペプチド環化手段のうちの任意の１つまたは２つ以上を含む。
ＧＬＰ−１活性に影響する修飾
Ｃ末端のアミノ酸のカルボン酸を、アミドまたはエステルなどの電荷が中性の基で置換することによって、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が増強される。いくつかの実施形態では、これらのクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、配列番号２０の配列を有し、この場合のカルボキシ末端のアミノ酸は、天然のアミノ酸に見られるカルボン酸基に代えてアミド基を有する。これらのクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体とＧＬＰ−１受容体の両方に対して強い活性を有するため、両方の受容体に対するコアゴニストとして作用する。いくつかの実施形態によれば、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体コアゴニストであり、この場合のペプチドは、２８番目のアミノ酸がＡｓｎまたはＬｙｓであり、かつ、２９番目のアミノ酸がチロシンアミドである、配列番号２０の配列を有する。
グルカゴンのＣ末端領域（１２番目〜２９番目の残基のあたりなど）におけるα螺旋を安定化する修飾によって、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が高められる。
いくつかの実施形態では、このような修飾によって、あいだに介在するアミノ酸３個（すなわち、「ｉ」番目のアミノ酸と「ｉ＋４」番目のアミノ酸で、ｉは１２〜２５の任意の整数である）、アミノ酸２個（すなわち、「ｊ」番目のアミノ酸と「ｊ＋３」番目のアミノ酸で、ｊは１２〜２７の任意の整数である）またはアミノ酸６個（すなわち、「ｋ」番目のアミノ酸と「ｋ＋７」番目のアミノ酸で、ｋは１２〜２２の任意の整数である）だけ離れた２つのアミノ酸の側鎖間に分子内架橋を形成することが可能である。例示としての実施形態では、架橋またはリンカーは、原子約８個（または約７個〜約９個）の長さであり、１２番目と１６番目または１６番目と２０番目または２０番目と２４番目または２４番目と２８番目のアミノ酸の側鎖間に形成される。非共有結合、たとえば、水素結合、塩結合の形成などのイオンの相互作用または共有結合によって、２つのアミノ酸側鎖を互いに結合することが可能である。
いくつかの実施形態によれば、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニスト活性を示し、配列番号１１、４７、４８、４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、側鎖が互いに共有結合し、いくつかの実施形態では、２つのアミノ酸が互いに結合して、ラクタム環が形成される。
いくつかの実施形態によれば、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、１２番目と１６番目、１６場目と２０番目、２０番目と２４番目または２４番目と２８番目のアミノ酸の対からなる群から選択されるアミノ酸の対の側鎖間に少なくとも１個のラクタム環が形成される、配列番号４５を有する。いくつかの実施形態では、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、ペプチドの１２番目と１６番目のアミノ酸の間または１６番目と２０番目のアミノ酸の間に分子内ラクタム架橋が形成された、配列番号２０のグルカゴンペプチド類縁体を有する。いくつかの実施形態では、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、１２番目と１６番目のアミノ酸の間、１６番目と２０番目のアミノ酸の間番目または２０番目と２４番目のアミノ酸の間に分子内ラクタム架橋が形成され、２９番目のアミノ酸がグリシンである、配列番号２０の配列を有し、ここで、配列番号２０のＣ末端のアミノ酸には、配列番号２９の配列が結合している。別の実施形態では、２８番目のアミノ酸はアスパラギン酸である。
いくつかの具体的な実施形態では、クラス３のグルカゴン関連ペプチドのＣ末端領域でのα螺旋構造の安定化は、ラクタム架橋以外の分子内架橋の形成によって達成される。たとえば、好適な共有結合方法は、オレフィンメタセシス、ランチオニンを基にした環化、ジスルフィド結合または修飾された硫黄含有架橋の形成、α，ω−ジアミノアルカンでの繋ぎの使用、金属原子架橋の形成のうちの１つまたは２つ以上を含み、他のペプチド環化手段もα螺旋の安定化に用いられる。
さらに、１個または２個以上のα，α−二置換アミノ酸を、所望の活性を保持する位置に目的をもって導入することで、グルカゴンペプチドのＣ末端領域（アミノ酸１２番目〜２９番目のあたり）におけるα螺旋構造を安定化して、ＧＬＰ−１受容体に対する活性を増強してもよい。このようなペプチドは、本明細書では、分子内架橋を欠いたペプチドとみなすことができる。いくつかの態様では、塩結合または共有結合などの分子内架橋を導入することなく、このようにしてα螺旋を安定化する。いくつかの実施形態では、グルカゴンペプチドの１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２４番目または２９番目のうちの１箇所、２箇所、３箇所、４箇所またはそれより多くを、α，α−二置換アミノ酸で置換する。たとえば、クラス３のグルカゴン関連ペプチドの１６番目をアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）で置換すると、塩結合またはラクタムがなくても、ＧＬＰ−１活性が増強される。いくつかの実施形態では、１６番目、２０番目、２１番目または２４番目のうちの１箇所、２箇所、３箇所またはそれより多くを、ＡＩＢで置換する。
２０番目でのアミノ酸修飾によって、ＧＬＰ−１受容体に対する活性を増強してもよい。いくつかの実施形態では、２０番目のグルタミンを、電荷を持つか水素結合でき、かつ、少なくとも原子約５個（または約４個〜約６個）の長さの側鎖を有する別の親水性アミノ酸、たとえば、リジン、シトルリン、アルギニンまたはオルニチンで置換する。
ＧＬＰ−１受容体に対する活性の増大が、配列番号２６のＣ末端の延長部分を有するクラス３のグルカゴン関連ペプチドで認められる。本明細書に記載するように、配列番号２６を有するこのようなクラス３のグルカゴン関連ペプチドのＧＬＰ−１活性を、１８番目、２８番目または２９番目のアミノ酸を修飾するか、あるいは１８番目と２９番目のアミノ酸を修飾することによって、さらに高めることが可能である。
１０番目のアミノ酸をＴｒｐに修飾することで、ＧＬＰ−１活性を、さらに適度に高めることもできる。
ＧＬＰ−１受容体の活性を高める修飾を組み合わせると、このような修飾のどれを単独で用いる場合よりも、ＧＬＰ−１活性を高められることがある。たとえば、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、任意に、１２番目のアミノ酸がＡｒｇではないという条件で；または任意に９番目のアミノ酸がＧｌｕではないという条件で、１６番目、２０番目およびＣ末端のカルボン酸基に、任意に１６番目と２０番目のアミノ酸の間の共有結合によって、修飾を含むものであってもよい；１６番目とＣ末端のカルボン酸基に修飾を有するものであってもよい；１６番目と２０番目に、任意に、１６番目と２０番目のアミノ酸の間の共有結合によって、修飾を有するものであってもよい；または２０番目とＣ末端のカルボン酸基に修飾を有するものであってもよい。
溶解性に影響する修飾
親水体の付加
クラス３のグルカゴン関連ペプチドをさらに修飾し、天然のグルカゴンの高い生物学的活性を維持したまま、生理的なｐＨでの水溶液に対するペプチドの溶解性および水溶液中での安定性を改善してもよい。本明細書に記載の親水体は、本明細書でさらに論じるように、クラス３のグルカゴン関連ペプチドに結合可能なものである。
いくつかの実施形態によれば、配列番号９または配列番号１０を有するクラス３のグルカゴン関連ペプチドの１７番目、２１番目、２４番目に親水基を導入すると、生理的なｐＨの溶液に対する高活性なグルカゴン類縁体の溶解性と、このような溶液中での安定性が、改善されると予想される。このような基を導入すると、作用時間が長くなるが、これは血中半減期が延びることを基準に判断できるものである。
いくつかの実施形態では、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９からなる群から選択される配列を有し、この場合、前記クラス３のグルカゴン関連ペプチドの１６番目、１７番目、２１番目または２４番目のうちの１つのアミノ酸残基の側鎖が、約５００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される分子量のポリエチレングリコール鎖をさらに有する。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の分子量は、約５００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される。もうひとつの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の分子量は、約１０，０００〜約２０，０００ダルトンである。さらに他の例示としての実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の分子量は、約２０，０００〜約４０，０００ダルトンである。
好適な親水体としては、本明細書に記載の親水体、ＰＥＧのホモポリマーまたはコポリマー、ＰＥＧのモノメチル置換ポリマー（ｍＰＥＧ）をはじめとして、当分野で知られた水溶性ポリマーがあげられる。いくつかの実施形態によれば、親水基は、ポリエチレン（ＰＥＧ）鎖を有する。特に、いくつかの実施形態では、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、配列番号６または配列番号７の配列を有し、クラス３のグルカゴン関連ペプチドの２１番目および２４番目に存在するアミノ酸の側鎖にＰＥＧ鎖が共有結合し、クラス３のグルカゴン関連ペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸は、カルボン酸基を有する。いくつかの実施形態によれば、ポリエチレングリコール鎖は、平均分子量が、約５００〜約１０，０００ダルトンの範囲から選択される。
いくつかの実施形態によれば、ＰＥＧ化されたクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、クラス３のグルカゴン関連ペプチドに共有結合している２つまたは３つ以上のポリエチレングリコール鎖を有し、この場合のグルカゴン鎖の合計の分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化グルカゴンアゴニストは、ＰＥＧ鎖が２１番目および２４番目でアミノ酸残基に共有結合し、２つのＰＥＧ鎖の合算での分子量が約１，０００〜約５，０００ダルトンである、配列番号５からなるペプチドまたは配列番号５のグルカゴンアゴニスト類縁体を有する。
電荷を持つＣ末端
たとえば、１個、２個、３個または４個以上の電荷を持つアミノ酸（単数または複数）を、配列番号２０のグルカゴンペプチドのＣ末端領域、好ましくは２７番目よりＣ末端側の位置に導入することによって、配列番号２０を有するクラス３のグルカゴン関連ペプチドの溶解性を、さらに改善することが可能である。このような電荷を持つアミノ酸は、２８番目または２９番目などで、天然のアミノ酸を電荷を持つアミノ酸で置換することあるいは、２７番目、２８番目または２９番目の後などに、電荷を持つアミノ酸を付加することによって導入可能なものである。例示としての実施形態では、電荷を持つアミノ酸のうち、１個、２個、３個またはすべてが、負の電荷を持つ。クラス３のグルカゴン関連ペプチドに、修飾後もペプチドがグルカゴン活性を保持できる、保存的な置換などの追加の修飾をほどこしてもよい。いくつかの実施形態では、配列番号２０のクラス３のグルカゴン関連ペプチドの類縁体が提供され、この類縁体は、配列番号２０とは、１７番目から２６番目での１〜２個のアミノ酸置換が異なり、いくつかの実施形態では、類縁体は、配列番号２０のペプチドとは、２０番目のアミノ酸置換が異なる。
アシル化／アルキル化
いくつかの実施形態によれば、グルカゴンペプチドは、Ｃ４〜Ｃ３０アシル基またはアルキル基など、アシル基またはアルキル基を含むように修飾される。いくつかの態様では、このアシル基またはアルキル基は、アミノ酸に天然のものではない。特定の態様では、アシル基またはアルキル基は、天然のどのアミノ酸に対しても非天然である。アシル化またはアルキル化によって、血中半減期を延ばすおよび／または作用開始を遅らせるおよび／または作用時間を延ばすおよび／またはＤＰＰ−ＩＶなどのプロテアーゼに対する耐性を改善することが可能である。クラス３のグルカゴン関連ペプチドのグルカゴン受容体およびＧＬＰ−１受容体に対する活性は、アシル化後に実質的に増強されないまでも、維持される。さらに、アシル化された類縁体の活性は、実質的に増強されていないにしても、アシル化されていないクラス３のグルカゴン関連ペプチドに匹敵するものであった。
いくつかの実施形態では、本発明は、グルカゴンペプチドの１０番目のアミノ酸に共有結合しているアシル基またはアルキル基を有するように修飾された、クラス３のグルカゴン関連ペプチドを提供するものである。グルカゴンペプチドは、クラス３のグルカゴン関連ペプチドの１０番目のアミノ酸とアシル基またはアルキル基との間にスペーサーをさらに有するものであってもよい。上述したクラス３のグルカゴン関連ペプチドはいずれも、２個のアシル基または２個のアルキル基あるいはこれらの組み合わせを有するものであってもよい。
本発明の具体的な態様では、アシル化されたクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、配列番号５３４〜５４４および５４６〜５４９のいずれかのアミノ酸配列を有する。
Ｃ末端の短縮
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のクラス３のグルカゴン関連ペプチドを、グルカゴンペプチドのＣ末端の１個または２個のアミノ酸（すなわち、２９番目および／または２８番目）の短縮または欠失によって、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体に対する活性および／または活性に影響することなく、さらに修飾する。この点について、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、天然のグルカゴンペプチド（配列番号１）の１番目から２７番目または１番目から２８番目のアミノ酸を有するものであってもよく、任意に、本明細書に記載の１個または２個以上の修飾がなされている。
いくつかの実施形態では、短くされたクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、配列番号５５０または配列番号５５１を有する。もうひとつの実施形態では、短くされたグルカゴンアゴニストのペプチドは、配列番号５５２または配列番号５５３を有する。
Ｃ末端の延長部分
いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示のクラス３のグルカゴン関連ペプチドを、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８などのグルカゴンペプチドのカルボキシ末端に第２のペプチドを付加することによって、修飾する。いくつかの実施形態では、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９からなる群から選択される配列を有するクラス３のグルカゴン関連ペプチドが、ペプチド結合によって、第２のペプチドに共有結合し、この場合の第２のペプチドは、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８からなる群から選択される配列を有する。別の実施形態では、Ｃ末端の延長部分を有するクラス３のグルカゴン関連ペプチドにおいて、天然のグルカゴンペプチドの２９番目のスレオニンがグリシンに置換される。２９番目のスレオニンに代えてグリシン置換を有し、配列番号２６のカルボキシ末端の延長部分を有するクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、配列番号２６のカルボキシ末端の延長部分を有するように修飾された天然のグルカゴンよりも、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が４倍高い。１８番目を天然のアルギニンからアラニンに置換することによって、ＧＬＰ−１受容体に対する活性を、さらに増強することが可能である。
したがって、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、配列番号２７（KRNRNNIA）または配列番号２８のカルボキシ末端の延長部分を有するものであってもよい。いくつかの実施形態によれば、配列番号３３または配列番号２０を有するクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴンペプチドの２９番目のアミノ酸に結合した配列番号２７（KRNRNNIA）または配列番号２８のアミノ酸配列をさらに有する。特に、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５からなる群から選択される配列を有し、グルカゴンペプチドの２９番目に結合した、配列番号２７（KRNRNNIA）または配列番号２８のアミノ酸配列をさらに有する。特に、グルカゴンペプチドは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号５５、配列番号５６からなる群から選択される配列を有し、クラス３のグルカゴン関連ペプチドの２９番目のアミノ酸に結合した、配列番号２６（GPSSGAPPPS）または配列番号２９のアミノ酸配列をさらに有する。いくつかの実施形態では、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、配列番号６４の配列を有する。
他の修飾
グルカゴン受容体の活性を高めるまたは低下させ、かつ、ＧＬＰ−１受容体の活性を高める、クラス３のグルカゴン関連ペプチドに関して上述したいずれかの修飾を、個々に適用してもよいし、組み合わせで適用してもよい。ＧＬＰ−１受容体の活性を高める修飾の組み合わせを用いると、通常は、このような修飾のどれを単独で用いる場合よりも、ＧＬＰ−１活性が高くなる。上述したどの修飾も、溶解性および／または安定性および／または作用時間の増大などの他の望ましい特性を与える、クラス３のグルカゴン関連ペプチドに関する本明細書に記載の他の修飾と組み合わせることが可能である。あるいは、上述した修飾はいずれも、溶解性または安定性または活性に実質的に影響しない、クラス３のグルカゴン関連ペプチドに関して本明細書に記載の他の修飾と組み合わせることが可能である。修飾の例として以下のものがあげられるが、これらに限定されるものではない。
（Ａ）１個、２個、３個または４個以上の電荷を持つアミノ酸（単数または複数）を、天然のグルカゴンのＣ末端領域、好ましくは２７番目よりＣ末端側の位置に導入することなどによる、溶解性の改善。このような電荷を持つアミノ酸は、２８番目または２９番目などで、天然のアミノ酸を電荷を持つアミノ酸で置換することあるいは、２７番目、２８番目または２９番目の後などに、電荷を持つアミノ酸を付加することによって導入可能なものである。例示としての実施形態では、電荷を持つアミノ酸のうち、１個、２個、３個またはすべてが、負の電荷を持つ。他の実施形態では、電荷を持つアミノ酸のうち、１個、２個、３個またはすべてが、正の電荷を持つ。このような修飾によって、２５℃で２４時間後に測定すると、約５．５〜約８の特定のｐＨ、たとえばｐＨ７で、天然のグルカゴンと比較して、溶解性が少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２５倍、３０倍またはそれより高くなるなど、溶解性が高まる。
（Ｂ）ペプチドの１６番目、１７番目、２０番目、２１番目、２４番目または２９番目またはＣ末端のアミノ酸などで、本明細書に記載するようなポリエチレングリコール鎖などの親水体を付加することによる、溶解性および作用時間または血中半減期の増大。
（Ｃ）欠失あるいは、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸またはホモシステイン酸への置換などの１５番目のアスパラギン酸の修飾による、安定性の向上。このような修飾によって、このような修飾によって、２５℃で２４時間後に、もとのペプチドの少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、最大１００％が保持されるなど、特に酸性バッファーまたはアルカリ性バッファー中で、ｐＨ５．５〜８の範囲内でのあるｐＨにおいて、分解または切断を低減することができる。
（Ｄ）ロイシンまたはノルロイシンへの置換などによる、２７番目のメチオニンの修飾による安定性の向上。このような修飾によって、酸化による分解を低減することができる。また、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＡＩＢへの置換など、２０番目または２４番目のグルタミンの修飾によって、安定性を向上させることも可能である。このような修飾によって、Ｇｌｎの脱アミド化によって生じる分解を低減することができる。Ｇｌｕへの置換など、２１番目のＡｓｐの修飾によって安定性を向上させることが可能である。このような修飾によって、Ａｓｐが脱水し、環状スクシンイミド中間体を形成した後、イソアスパラギン酸へ異性体化することで生じる分解を低減することができる。
（Ｅ）１番目または２番目のアミノ酸を、本明細書に記載のＤＰＰ−ＩＶ耐性アミノ酸で修飾すること（２番目のアミノ酸をＮ−メチルアラニンで修飾することを含む）による、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ ＩＶ）での切断に対する耐性の向上。
（Ｆ）活性には影響しない保存的または非保存的な置換、付加または欠失、たとえば、２番目、５番目、７番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２４番目、２７番目、２８番目または２９番目のうちの１箇所または２箇所以上における保存的な置換、２７番目、２８番目または２９番目のうちの１箇所または２箇所以上におけるアミノ酸の欠失あるいは、２９番目のアミノ酸の欠失（任意に、Ｃ末端のカルボン酸基からＣ末端のアミドまたはエステルへの変更を組み合わせてもよい）。
（Ｇ）本明細書に記載するようなＣ末端の延長部分の付加。
（Ｈ）たとえば、本明細書に記載するようなグルカゴンペプチドのアシル化またはアルキル化によって、血中半減期を長くするおよび／または作用時間を延ばすおよび／または作用開始を遅らせること。
（Ｉ）本明細書に記載するようなホモダイマー化またはヘテロダイマー化。
他の修飾として、１番目のヒスチジンから高分子芳香族アミノ酸（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐまたはアミノフェニルアラニンなど）への置換、２番目のＳｅｒからＡｌａへの置換、１０番目のＴｙｒからＶａｌまたはＰｈｅへの置換、１２番目のＬｙｓからＡｒｇへの置換、１５番目のＡｓｐからＧｌｕへの置換、１６番目のＳｅｒからＴｈｒまたはＡＩＢへの置換があげられる。
１番目のヒスチジンから高分子芳香族アミノ酸（Ｔｙｒなど）への非保存的な置換を含むＧＬＰ−１活性を有する、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、本明細書に記載したものなどの分子内架橋によってα螺旋が安定化しているかぎり、ＧＬＰ−１活性を保持することができる。
結合体と融合体
クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、任意に共有結合を介し、かつ、任意にリンカーによって、結合体部分に結合可能なものである。
また、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、第２のペプチドまたはポリペプチドが、クラス３のグルカゴン関連ペプチドのカルボキシ末端などの末端に融合した、融合ペプチドまたはタンパク質の一部であってもよい。
特に、クラス３のグルカゴン関連融合ペプチドは、配列番号５５、配列番号９または配列番号１０のグルカゴンアゴニストを含むものであってもよく、さらに、配列番号２６（GPSSGAPPPS）、配列番号２７（KRNRNNIA）または配列番号２８（KRNR）のアミノ酸配列が、グルカゴンペプチドの２９番目のアミノ酸に結合している。いくつかの実施形態では、配列番号２６（GPSSGAPPPS）、配列番号２７（KRNRNNIA）または配列番号２８（KRNR）は、ペプチド結合を介して、クラス３のグルカゴン関連ペプチドの２９番目のアミノ酸に結合している。本出願人らは、発エキセンディン−４（配列番号２６または配列番号２９など）のＣ末端の延長部分ペプチドでは、２９番目の天然のスレオニン残基からグリシンへの置換を有するクラス３のグルカゴン関連ペプチド融合ペプチドが、ＧＬＰ−１受容体の活性を劇的に高めることを見した。このアミノ酸置換を、クラス３のグルカゴン関連ペプチドに関して本明細書に開示の他の修飾と一緒に利用して、ＧＬＰ−１受容体に対するグルカゴン類縁体の親和性を高めることが可能である。たとえば、Ｔ２９Ｇ置換を、Ｓ１６ＥおよびＮ２０Ｋのアミノ酸置換と組み合わせ、任意に１６番目と２０番目との間のラクタム架橋も組み合わせ、さらに任意に、本明細書に記載するようなＰＥＧ鎖の付加も組み合わせることが可能である。いくつかの実施形態では、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、配列番号６４の配列を有する。いくつかの実施形態では、グルカゴン融合ペプチドのクラス３のグルカゴン関連ペプチド部分は、配列番号５５、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５からなる群から選択され、ここで、ＰＥＧ鎖は、１７番目、２１番目、２４番目またはＣ末端のアミノ酸あるいは、２１番目と２４番目の両方に存在する場合、５００〜４０，０００ダルトンの範囲から選択される。特に、いくつかの実施形態では、クラス３のグルカゴン関連ペプチドセグメントは、配列番号７、配列番号８、配列番号６３からなる群から選択され、ＰＥＧ鎖は、５００〜５，０００の範囲から選択される。いくつかの実施形態では、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、配列番号５５および配列番号６５の配列を有する融合ペプチドであり、配列番号６５のペプチドは、配列番号５５のカルボキシ末端に結合している。
いくつかの実施形態によれば、配列番号１０のクラス３のグルカゴン関連ペプチドの追加の化学修飾によって、グルカゴン受容体とＧＬＰ−１受容体に対する相対活性が、事実上等しくなる点まで、ＧＬＰ−１受容体の活性が高められる。したがって、いくつかの実施形態では、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、天然のアミノ酸に存在するカルボン酸基に代えて、アミド基を有する末端のアミノ酸を有する。クラス３のグルカゴン関連ペプチドをさらに修飾することによって、グルカゴン受容体およびＧＬＰ−１受容体それぞれに対するクラス３のグルカゴン関連ペプチドの相対活性を調節し、グルカゴン受容体に対する活性が天然のグルカゴンの約４０％〜約５００％またはそれより高く、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が天然のＧＬＰ−１の約２０％〜約２００％またはそれより高い類縁体を生成することが可能である（たとえば、ＧＬＰ−１受容体に対するグルカゴンの通常の活性と比較して、５０倍、１００倍またはそれより高めるなど）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体に対する活性が、天然のグルカゴンの最大で約１００％、約１０００％、約１０，０００％、約１００，０００％または約１，０００，０００％である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のグルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が、天然のＧＬＰ−１の最大で約１００％、約１０００％、約１０，０００％、約１００，０００％または約１，０００，０００％である。
例示としての実施形態
いくつかの実施形態によれば、配列番号５５の配列を有するグルカゴン類縁体が提供され、ここで、上記の類縁体は、１番目、２番目、３番目、５番目、７番目、１０番目、１１番目、１３番目、１４番目、１７番目、１８番目、１９番目、２１番目、２４番目、２７番目、２８番目、２９番目から選択される１〜３個のアミノ酸が配列番号５５とは異なり、上記のグルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が天然のＧＬＰ−１の少なくとも２０％である。
いくつかの実施形態によれば、次の配列すなわち、
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号３３）を有するグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストが提供される。ここで、１５番目のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、１６番目のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、２０番目のＸａａは、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、２４番目のＸａａは、ＧｌｎまたはＧｌｕであり、２８番目のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓまたは酸性アミノ酸であり、２９番目のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙまたは酸性アミノ酸であり、Ｒは、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である。ただし、１６番目がセリンの場合、２０番目はＬｙｓであるか、あるいは、１６番目がセリンの場合、２４番目はＧｌｕであり、２０番目または２８番目のいずれかがＬｙｓである。いくつかの実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストは、配列番号３３の配列を有し、ここで、２８番目のアミノ酸はアスパラギン酸であり、２９番目のアミノ酸はグルタミン酸である。もうひとつの実施形態では、２８番目のアミノ酸は天然のアスパラギンであり、２９番目のアミノ酸はグリシンであり、配列番号２９または配列番号６５のアミノ酸配列は、配列番号３３のカルボキシ末端と共有結合している。
いくつかの実施形態では、追加の酸性アミノ酸がペプチドのカルボキシ末端に付加された、配列番号３３の配列を有するコアゴニストが提供される。別の実施形態では、グルカゴン類縁体のカルボキシ末端のアミノ酸は、天然のアミノ酸のカルボン酸基の代わりに、アミドを有する。いくつかの実施形態では、グルカゴン類縁体は、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４からなる群から選択される配列を有する。
いくつかの実施形態によれば、配列番号３３のグルカゴンペプチド類縁体が提供され、ここで、上記の類縁体は、１番目、２番目、３番目、５番目、７番目、１０番目、１１番目、１３番目、１４番目、１７番目、１８番目、１９番目、２１番目、２７番目から選択される１〜３個のアミノ酸が配列番号３３とは異なる。ただし、１６番目のアミノ酸がセリンの場合、２０番目がリジンであるか、あるいは、２４番目のアミノ酸と２０番目または２８番目のいずれかのアミノ酸との間に、ラクタム架橋が形成される。いくつかの実施形態によれば、この類縁体は、１番目、２番目、３番目、２１番目、２７番目から選択される１〜３個のアミノ酸が配列番号３３とは異なる。いくつかの実施形態では、配列番号３３のグルカゴンペプチド類縁体は、その配列と１〜２個のアミノ酸が異なるか、いくつかの実施形態では、１番目、２番目、３番目、５番目、７番目、１０番目、１１番目、１３番目、１４番目、１７番目、１８番目、１９番目、２１番目、２７番目から選択される単一のアミノ酸が異なる。ただし、１６番目のアミノ酸がセリンの場合、２０番目がリジンであるか、あるいは、２４番目のアミノ酸と２０番目または２８番目のいずれかのアミノ酸との間に、ラクタム架橋が形成される。
もうひとつの実施形態によれば、配列ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号５３）を含む、比較的選択性の高いＧＬＰ−１受容体アゴニストが提供され、ここで、３番目のＸａａは、Ｇｌｕ、ＯｒｎまたはＮｌｅからなるアミノ酸の群から選択され、１５番目のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、１６番目のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、２０番目のＸａａは、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、２４番目のＸａａは、ＧｌｎまたはＧｌｕであり、２８番目のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓまたは酸性アミノ酸であり、２９番目のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙまたは酸性アミノ酸であり、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、配列番号２６または配列番号２９である。ただし、１６番目がセリンの場合、２０番目はＬｙｓであるか、あるいは、１６番目がセリンの場合、２４番目はＧｌｕであり、２０番目または２８番目のいずれかがＬｙｓである。いくつかの実施形態では、３番目のアミノ酸はグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、２８番目および／または２９番目で置換される酸性アミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、コアゴニストのペプチドをはじめとするグルカゴンペプチドは、ペプチドのカルボキシ末端に付加された追加の酸性アミノ酸をさらに有する配列番号３３の配列を有する。別の実施形態では、グルカゴン類縁体のカルボキシ末端のアミノ酸は、天然のアミノ酸のカルボン酸基の代わりに、アミドを有する。
いくつかの実施形態によれば、以下からなる群から選択される、修飾されたグルカゴンペプチドを有するグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストが提供される。
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号３４）、ここで、１５番目のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、１６番目のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、２０番目のＸａａは、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、２４番目のＸａａは、ＧｌｎまたはＧｌｕであり、２８番目のＸａａは、Ａｓｎ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり、Ｒは、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２であり、２９番目のＸａａは、ＴｈｒまたはＧｌｙであり、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、配列番号２６または配列番号２９であり、ただし、１６番目がセリンの場合、２０番目はＬｙｓである、あるいは、１６番目がセリンの場合、２４番目はＧｌｕであり、２０番目または２８番目のいずれかがＬｙｓである。いくつかの実施形態では、ＲはＣＯＮＨ２であり、１５番目のＸａａはＡｓｐであり、１６番目のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、２０番目と２４番目のＸａａは各々Ｇｌｎであり、２８番目のＸａａはＡｓｎまたはＡｓｐであり、２９番目のＸａａはＴｈｒである。いくつかの実施形態では、１５番目と１６番目のＸａａは各々Ｇｌｕであり、２０番目と２４番目のＸａａは各々Ｇｌｎであり、２８番目のＸａａはＡｓｎまたはＡｓｐであり、２９番目のＸａａはＴｈｒであり、ＲはＣＯＮＨ２である。
親ペプチドの活性を少なくともいくらか維持しつつ、天然のグルカゴンペプチドの特定の位置を修飾可能であることが報告されている。したがって、本出願人らは、配列番号１１のペプチドの２番目、５番目、７番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２４番目、２７番目、２８番目または２９番目の位置にあるアミノ酸のうち１つまたは２つ以上を、天然のグルカゴンペプチドに存在するものとは異なるアミノ酸で置換して、それでもなおグルカゴン受容体に対する活性を保つことが可能であると予想している。いくつかの実施形態では、天然のペプチドの２７番目に存在するメチオニン残基をロイシンまたはノルロイシンに変更して、ペプチドの酸化による分解を防止する。もうひとつの実施形態では、２０番目のアミノ酸が、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎまたはシトルリンで置換されるおよび／または２１番目を、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸に置換する。
いくつかの実施形態では、配列番号２０のグルカゴン類縁体であって、この類縁体の１番目、２番目、５番目、７番目、１０番目、１１番目、１３番目、１４番目、１７番目、１８番目、１９番目、２１番目、２７番目、２８番目または２９番目から選択される１〜６個のアミノ酸が、配列番号１の対応するアミノ酸とは異なる、配列番号２０のグルカゴン類縁体が提供されるが、ただし、１６番目のアミノ酸がセリンの場合、２０番目はＬｙｓであるか、あるいは、１６番目がセリンの場合、２４番目はＧｌｕであり、２０番目または２８番目のいずれかがＬｙｓである。もうひとつの実施形態によれば、配列番号２０のグルカゴン類縁体であって、この類縁体の１番目、２番目、５番目、７番目、１０番目、１１番目、１３番目、１４番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２７番目、２８番目または２９番目から選択される１〜３個のアミノ酸が、配列番号１の対応するアミノ酸とは異なる、配列番号２０のグルカゴン類縁体が提供される。もうひとつの実施形態では、配列番号８、配列番号９または配列番号１１のグルカゴン類縁体であって、この類縁体の１番目、２番目、５番目、７番目、１０番目、１１番目、１３番目、１４番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目または２１番目から選択される１〜２個のアミノ酸が、配列番号１の対応するアミノ酸とは異なる、配列番号８、配列番号９または配列番号１１のグルカゴン類縁体が提供され、別の実施形態では、１〜２個の異なるアミノ酸が、天然のグルカゴン配列（配列番号１）に存在するアミノ酸に対する保存的なアミノ酸置換を表す。いくつかの実施形態では、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５のグルカゴンペプチドが提供され、この場合のグルカゴンペプチドは、２番目、５番目、７番目、１０番目、１１番目、１３番目、１４番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２７番目または２９番目から選択される１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換をさらに有する。いくつかの実施形態では、２番目、５番目、７番目、１０番目、１１番目、１３番目、１４番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２７番目または２９番目での置換は、保存的なアミノ酸置換である。
いくつかの実施形態によれば、配列番号３３の配列の変異種を有し、この変異種の１６番目、１７番目、１８番目、２０番目、２１番目、２３番目、２４番目、２７番目、２８番目、２９番目から選択される１〜１０個のアミノ酸が、配列番号１の対応するアミノ酸とは異なる、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストが提供される。いくつかの実施形態によれば、配列番号３３の配列の変異種であって、１７番目のグルタミン、１８番目のアラニン、２１番目のグルタミン酸、２３番目のイソロイシン、２４番目のアラニン、２７番目のバリン、２９番目のグリシンからなる群から選択される１個または２個以上のアミノ酸置換が、配列番号３３とは異なる、変異種が提供される。いくつかの実施形態によれば、配列番号３３の配列の変異種を有し、この変異種の１７番目〜２６番目から選択される１〜２個のアミノ酸が、配列番号１の対応するアミノ酸とは異なる、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストが提供される。いくつかの実施形態によれば、配列番号３３の配列の変異種が提供され、この場合の変異種は、１７番目のグルタミン、１８番目のアラニン、２１番目のグルタミン酸、２３番目のイソロイシン、２４番目のアラニンからなる群から選択されるアミノ酸置換が、配列番号３３とは異なる。いくつかの実施形態によれば、配列番号３３の配列の変異種が提供され、この場合の変異種は、１８番目のアミノ酸置換が、配列番号３３とは異なる。ここで、置換されたアミノ酸は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、配列番号３３の配列の変異種が提供され、この場合の変異種は、１８番目のＡｌａのアミノ酸置換が、配列番号３３とは異なる。このような変異は、配列番号５５に包含される。もうひとつの実施形態では、配列番号３３の配列の変異種を有し、この変異種の１７番目〜２２番目から選択される１〜２個のアミノ酸が、配列番号１の対応するアミノ酸とは異なる、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストが提供され、別の実施形態では、配列番号３３の変異種が提供され、この変異種は、２０番目および２１番目の１〜２個のアミノ酸置換が、配列番号３３とは異なる。いくつかの実施形態によれば、次の配列を有するグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストが提供される。
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号５１）。ここで、１５番目のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸であり、１６番目のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸であり、２０番目のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎまたはシトルリンであり、２１番目のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸であり、２４番目のＸａａは、ＧｌｎまたはＧｌｕであり、２８番目のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓまたは酸性アミノ酸であり、２９番目のＸａａは、Ｔｈｒまたは酸のアミノ酸であり、Ｒは、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である。いくつかの実施形態では、ＲはＣＯＮＨ２である。いくつかの実施形態によれば、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号４７、配列番号４８または配列番号４９の変異種を有するグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストが提供され、この場合の変異種は、２０番目のアミノ酸置換が前記配列とは異なる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、２０番目のＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎまたはシトルリンからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、配列番号３４の類縁体ペプチドを有し、この類縁体が、セリン以外のアミノ酸を２番目に有することで配列番号３４とは異なる、グルカゴンアゴニストが提供される。いくつかの実施形態では、セリン残基が、アミノイソ酪酸、Ｄ−アラニンで置換され、いくつかの実施形態では、セリン残基はアミノイソ酪酸で置換される。このような修飾は、親化合物の固有の活性を保持したまま、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断を抑制するものである（親化合物の活性の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれより高いなど）。いくつかの実施形態では、たとえば、１個、２個、３個または４個以上の電荷を持つアミノ酸（単数または複数）を、天然のグルカゴンのＣ末端領域、好ましくは２７番目よりＣ末端側の位置に導入することによって、類縁体の溶解性を高める。例示としての実施形態では、電荷を持つアミノ酸のうち、１個、２個、３個またはすべてが、負の電荷を持つ。もうひとつの実施形態では、この類縁体は、２８番目または２９番目で天然のアミノ酸を置換した酸性アミノ酸あるいは、配列番号３４のペプチドのカルボキシ末端に付加された酸性アミノ酸をさらに有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示のグルカゴン類縁体を１番目または２番目でさらに修飾し、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を低減する。いくつかの実施形態では、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５のグルカゴン類縁体が得られ、この類縁体は、２番目の置換が親分子とは異なり、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性（すなわち耐性）が低下している。特に、いくつかの実施形態では、類縁体ペプチドの２番目は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、アミノｎ−酪酸、グリシン、Ｎ−メチルセリン、アミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態では、類縁体ペプチドの２番目は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、アミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換される。もうひとつの実施形態では、類縁体ペプチドの２番目は、Ｄ−セリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、アミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態では、２番目のアミノ酸はＤ−セリンではない。いくつかの実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号２１または配列番号２２の配列を有する。
いくつかの実施形態では、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５のグルカゴン類縁体が得られ、この類縁体は、１番目の置換が親分子とは異なり、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性（すなわち耐性）が低下している。特に、類縁体ペプチドの１番目は、Ｄ−ヒスチジン、α，α−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、α−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシルヒスチジン、アセチルヒスチジン、ホモヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸で置換される。もうひとつの実施形態では、配列番号３４の類縁体ペプチドを有し、この類縁体が、１番目にヒスチジン以外のアミノ酸を有することが配列番号３４とは異なる、グルカゴンアゴニストが提供される。いくつかの実施形態では、たとえば、１個、２個、３個または４個以上の電荷を持つアミノ酸（単数または複数）を、天然のグルカゴンのＣ末端領域、好ましくは２７番目よりＣ末端側の位置に導入することによって、類縁体の溶解性を高める。例示としての実施形態では、電荷を持つアミノ酸のうち、１個、２個、３個またはすべてが、負の電荷を持つ。もうひとつの実施形態では、この類縁体は、２８番目または２９番目で天然のアミノ酸を置換した酸性アミノ酸あるいは、配列番号３４のペプチドのカルボキシ末端に付加された酸性アミノ酸をさらに有する。いくつかの実施形態では、酸性アミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸である。
いくつかの実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストは、配列番号２０の配列を有し、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８からなる群から選択される１つのアミノ酸またはペプチドの追加のカルボキシ末端延長部分をさらに有する。配列番号２０のカルボキシ末端に単一のアミノ酸が付加される実施形態では、このアミノ酸は通常、２０種類の一般的なアミノ酸から選択され、いくつかの実施形態では、追加のカルボキシ末端のアミノ酸は、天然のアミノ酸のカルボン酸に代えてアミド基を有する。いくつかの実施形態では、追加のアミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシンからなる群から選択される。
別の実施形態では、ペプチドが、グルタミン酸残基とリジン残基の側鎖間に形成される少なくとも１個のラクタム環を有する、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストが提供され、この場合のグルタミン酸残基とリジン残基とは、アミノ酸３個あけて離れている。いくつかの実施形態では、グルカゴンペプチドを持つラクタムのカルボキシ末端のアミノ酸は、天然のアミノ酸のカルボン酸に代えて、アミド基を有する。特に、いくつかの実施形態では、以下からなる群から選択される修飾されたグルカゴンペプチドを有する、グルカゴンおよびＧＬＰ−１コアゴニストが提供される。
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号６６）
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号６７）
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号６８）
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号６９）
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号１６）
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号１７）
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号１８）
ここで、４番目のＸａａ＝ＡｓｐまたはＡｓｎであり、２９番目のＸａａはＴｈｒまたはＧｌｙであり、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８からなる群から選択され、ラクタム架橋が、配列番号６６の場合は１２番目のＬｙｓと１６番目のＧｌｕとの間、配列番号６７の場合は１６番目のＧｌｕと２０番目のＬｙｓとの間、配列番号６８の場合は２０番目のＬｙｓと２４番目のＧｌｕとの間、配列番号６９の場合は２４番目のＧｌｕと２８番目のＬｙｓとの間、配列番号１６の場合は、１２番目のＬｙｓと１６番目のＧｌｕの間と、２０番目のＬｙｓと２４番目のＧｌｕとの間、配列番号１７の場合は、１２番目のＬｙｓと１６番目のＧｌｕとの間と、２４番目のＧｌｕと２８番目のＬｙｓとの間、配列番号１８の場合は、１６番目のＧｌｕと２０番目のＬｙｓとの間と、２４番目のＧｌｕと２８番目のＬｙｓとの間に形成される。いくつかの実施形態では、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシンからなる群から選択され、２８番目のアミノ酸はＡｓｎであり、２９番目のアミノ酸はスレオニンである。いくつかの実施形態では、ＲはＣＯＮＨ２であり、２８番目のアミノ酸はＡｓｎであり、２９番目のアミノ酸はスレオニンである。もうひとつの実施形態では、Ｒは、配列番号２６、配列番号２９、配列番号６５からなる群から選択され、２９番目のアミノ酸はグリシンである。
別の実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８からなる群から選択され、ここで、ペプチドは、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８からなる群から選択される１つのアミノ酸またはペプチドの追加のカルボキシ末端延長部分をさらに有する。いくつかの実施形態では、末端の延長部分は、配列番号２６、配列番号２９または配列番号６５の配列を有し、グルカゴンペプチドは、配列番号５５の配列を有する。いくつかの実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストは、配列番号３３の配列を有し、ここで、１６番目のアミノ酸はグルタミン酸であり、２０番目のアミノ酸はリジンであり、２８番目のアミノ酸はアスパラギンであり、配列番号２６または配列番号２９のアミノ酸配列は、配列番号３３のカルボキシ末端に結合している。
配列番号２０のカルボキシ末端に単一のアミノ酸が付加される実施形態では、このアミノ酸は通常、２０種類の一般的なアミノ酸から選択され、いくつかの実施形態では、このアミノ酸は、天然のアミノ酸のカルボン酸に代えてアミド基を有する。いくつかの実施形態では、追加のアミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシンからなる群から選択される。グルカゴンアゴニスト類縁体がカルボキシ末端延長部分をさらに有する実施形態では、いくつかの実施形態における延長部分のカルボキシ末端のアミノ酸は、カルボン酸ではなくアミド基またはエステル基で終端する。
もうひとつの実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストは、配列ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｘａａ−ＣＯＮＨ２（配列番号１９）を有し、ここで、３０番目のＸａａは任意のアミノ酸を表す。いくつかの実施形態では、Ｘａａは、２０種類の一般的なアミノ酸から選択され、いくつかの実施形態では、このアミノ酸が、グルタミン酸、アスパラギン酸またはグリシンである。配列番号１９の１７番目、２１、２４または３０で、ＰＥＧ鎖をアミノ酸の側鎖に共有結合することで、このペプチドの溶解性をさらに改善することが可能である。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８からなる群から選択されるペプチドの追加のカルボキシ末端延長部分を有する。いくつかの実施形態によれば、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストは、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２の配列を有する。
配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号６４のグルカゴン配列内部の別の部位特異的修飾をほどこして、さまざまな度合いのＧＬＰ−１活性化作用を持つ一組のグルカゴンアゴニストを生成することが可能である。したがって、それぞれの受容体に対して事実上同じin vitro活性を持つペプチドを調製し、特徴を調べた。同様に、２つの受容体それぞれに対して１０倍選択的に増強された活性を持つペプチドを同定し、特徴を調べた。上述したように、１６番目のセリン残基をグルタミン酸に置換すると、グルカゴン受容体とＧＬＰ−１受容体の両方に対する天然のグルカゴンの活性が増強されるが、グルカゴン受容体に対する約１０倍の選択性は維持される。また、３番目の天然のグルタミンをグルタミン酸（配列番号２２）に置換すると、ＧＬＰ−１受容体に対する選択性が約１０倍のグルカゴン類縁体が生成される。
ペプチドの１６番目、１７番目、２１番目、２４番目に親水基を導入することあるいは、グルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニストのペプチドのカルボキシ末端に、単一の修飾されたアミノ酸（すなわち、親水基を含むように修飾されたアミノ酸）を付加することで、天然のグルカゴンに対して高い生物学的活性を維持したまま、生理的なｐＨの水溶液中に対するグルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニストのペプチドの溶解性を、さらに高めることが可能である。いくつかの実施形態によれば、親水基は、ポリエチレン（ＰＥＧ）鎖を有する。特に、いくつかの実施形態では、グルカゴンペプチドは、このグルカゴンペプチドの１６番目、１７番目、２１番目、２４番目、２９番目またはＣ末端のアミノ酸で、アミノ酸の側鎖にＰＥＧ鎖が共有結合している、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８の配列を有し、ただし、ペプチドが配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３を有する場合、ポリエチレングリコール鎖は、１７番目、２１番目または２４番目でアミノ酸残基に共有結合し、ペプチドが配列番号１４または配列番号１５を有する場合、ポリエチレングリコール鎖は、１６番目、１７番目または２１番目のアミノ酸残基に共有結合し、ペプチドが配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８を有する場合、ポリエチレングリコール鎖は、１７番目または２１番目のアミノ酸残基に共有結合している。
いくつかの実施形態では、グルカゴンペプチドは、このグルカゴンペプチドの１７番目、２１番目、２４番目またはＣ末端のアミノ酸で、アミノ酸の側鎖にＰＥＧ鎖が共有結合し、ペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸が、天然のアミノ酸のカルボン酸基に代えてアミド基を有する、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３の配列を有する。いくつかの実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストのペプチドは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９からなる群から選択される配列を有し、ここで、グルカゴンペプチドの配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９の１７番目、２１番目または２４番目または配列番号１４および配列番号１５の１６番目、１７番目または２１番目あるいは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８の１７番目または２１番目で、アミノ酸の側鎖にＰＥＧ鎖が共有結合している。もうひとつの実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストのペプチドは、１７番目、２１番目または２４番目あるいは、グルカゴンペプチドのＣ末端のアミノ酸で、アミノ酸の側鎖にＰＥＧ鎖が共有結合している、配列番号１１または配列番号１９の配列を有する
いくつかの実施形態に従って、かつ、前述の段落に記載の但し書きされた条件を考慮して、１６番目、１７番目、２１番目、２４番目または２９番目またはＣ末端のアミノ酸に１個または２個以上のアミノ酸置換を含むように、グルカゴンコアゴニストのペプチドを修飾し、ここで、天然のアミノ酸を、ＰＥＧなどをはじめとする親水体と架橋させるのに適した側鎖を有するアミノ酸に置換する。この天然のペプチドについては、天然のアミノ酸で置換してもよいし、合成（非天然）のアミノ酸で置換してもよい。合成または非天然のアミノ酸は、in vivoでは天然に生じないが、本明細書に記載のペプチド構造に取り込むことは可能である。あるいは、ＰＥＧなどをはじめとする親水体と架橋するのに適した側鎖を有するアミノ酸を、本明細書に開示のどのグルカゴン類縁体のカルボキシ末端にも付加することが可能である。いくつかの実施形態によれば、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストのペプチドにおいて、１６番目、１７番目、２１番目、２４番目または２９番目からなる群から選択される位置で、天然のアミノ酸を、リジン、システイン、オルニチン、ホモシステイン、アセチルフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸に置換する、アミノ酸置換がなされ、ここで、置換しているアミノ酸は、アミノ酸の側鎖に共有結合しているＰＥＧ鎖をさらに有する。いくつかの実施形態では、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９からなる群から選択されるグルカゴンペプチドを、グルカゴンペプチドの１７番目または２１番目でアミノ酸の側鎖に共有結合しているＰＥＧ鎖を有するように、さらに修飾する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストは、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２９の配列をさらに有する。
もうひとつの実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号５５または配列番号５６の配列を有し、配列番号５５または配列番号５６のＣ末端のアミノ酸に結合した配列番号２６、配列番号２９または配列番号６５のＣ末端の延長部分をさらに含み、任意に、ペプチドの１７番目、１８番目、２１番目、２４番目または２９番目あるいは、Ｃ末端のアミノ酸で、アミノ酸の側鎖に共有結合しているＰＥＧ鎖をさらに有する。もうひとつの実施形態では、グルカゴンペプチドは、このグルカゴンペプチドの２１番目または２４番目で、アミノ酸の側鎖にＰＥＧ鎖が共有結合している、配列番号５５または配列番号５６の配列を有し、このペプチドは、配列番号２６または配列番号２９のＣ末端の延長部分をさらに有する。
もうひとつの実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号３３または配列番号３４のカルボキシ末端に、追加のアミノ酸が付加され、付加したアミノ酸の側鎖に、ＰＥＧ鎖が共有結合している、配列番号５５または配列番号３３または配列番号３４の配列を有する。別の実施形態では、配列番号３３または配列番号３４のＰＥＧ化グルカゴン類縁体は、Ｃ末端のアミノ酸に結合した配列番号２６または配列番号２９のＣ末端の延長部分をさらに有する。もうひとつの実施形態では、グルカゴンペプチドは、このグルカゴンペプチドの３０番目のアミノ酸の側鎖にＰＥＧ鎖が共有結合している配列番号１９の配列を有し、このペプチドは、配列番号１９のＣ末端のアミノ酸に結合した配列番号２６または配列番号２９のＣ末端の延長部分をさらに有する。
ポリエチレングリコール鎖は、直鎖状であってもよいし、分岐状であってもよい。いくつかの実施形態によれば、ポリエチレングリコール鎖は、平均分子量が、約５００〜約１０，０００ダルトンの範囲から選択される。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、平均分子量が、約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される。別の実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、平均分子量が、約１０，０００〜約２０，０００ダルトンの範囲から選択される。いくつかの実施形態によれば、ＰＥＧ化グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドに共有結合している２つまたは３つ以上のポリエチレングリコール鎖を有し、この場合のグルカゴン鎖の合計の分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化グルカゴンアゴニストは、ＰＥＧ鎖が２１番目および２４番目でアミノ酸残基に共有結合し、２つのＰＥＧ鎖の合算での分子量が約１，０００〜約５，０００ダルトンである、配列番号５からなるペプチドまたは配列番号５のグルカゴンアゴニスト類縁体を有する。
特定の例示としての実施形態では、グルカゴンペプチドは、最大１０個のアミノ酸修飾を含む配列番号１のアミノ酸配列を有し、１０番目に、アシル化されたまたはアルキル化されたアミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、１０番目のアミノ酸は、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸でアシル化またはアルキル化されている。特定の態様では、１０番目のアミノ酸は、天然のアミノ酸に対して非天然のアシル基またはアルキル基を有する。
特定の実施形態では、１０番目にアシル化またはアルキル化されたアミノ酸を有するグルカゴンペプチドは、安定化されたα螺旋を有する。したがって、特定の態様では、グルカゴンペプチドは、本明細書に記載するようなアシル基またはアルキル基と、ｉ番目のアミノ酸とｉ＋４番目のアミノ酸の側鎖間の分子内架橋、たとえば、共有結合の分子内架橋（ラクタム架橋など）と、を有し、ここで、ｉは、１２、１６、２０または２４である。上記に代えてまたは上記に加えて、グルカゴンペプチドは、本明細書に記載するようなアシル基またはアルキル基と、グルカゴンペプチドの１６番目、２０番目、２１番目および／または２４番目のうちの１箇所、２箇所、３箇所または４箇所以上を、ＡＩＢなどのα，α−二置換アミノ酸に置換する。場合によっては、非天然のグルカゴンペプチドは、１６番目のＧｌｕと２０番目のＬｙｓとを有し、ここで、任意に、ラクタム架橋がＧｌｕとＬｙｓとを結合し、任意に、グルカゴンペプチドは、１７番目のＧｌｎ、１８番目のＡｌａ、２１番目のＧｌｕ、２３番目のＩｌｅ、２４番目のＡｌａからなる群から選択される１個または２個以上の修飾をさらに有する。
また、グルカゴンペプチドが、１０番目に、アシル化されたまたはアルキル化されたアミノ酸を有するいずれの実施形態でも、グルカゴンペプチドは、Ｃ末端のαカルボキシレートに代えて、Ｃ末端のアミドをさらに含むものであってもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するようなアシル基またはアルキル基を有するグルカゴンペプチドは、１番目、２番目または１番目と２番目にアミノ酸置換をさらに有し、このアミノ酸置換（単数または複数）によって、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ耐性を達成する。たとえば、１番目のＨｉｓを、Ｄ−ヒスチジン、α，α−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、α−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシルヒスチジン、アセチルヒスチジン、ホモヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸で置換してもよい。上記に代えてまたは上記に加えて、２番目のＳｅｒを、Ｄ−セリン、アラニン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、アミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換してもよい。いくつかの実施形態では、２番目のアミノ酸はＤ−セリンではない。
本明細書に記載するようにアシル化またはアルキル化されている１０番目のアミノ酸を有するグルカゴンペプチドは、実質的に配列番号１と関連するアミノ酸配列を含むものであってもよい。たとえば、グルカゴンペプチドは、最大で１０個のアミノ酸修飾（０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個の修飾など）を含む、配列番号１を有する。特定の実施形態では、アシル化されたまたはアルキル化されたグルカゴンペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１と２５％を超えて同一である（配列番号１と比較して、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超えて同一であるか、ほぼ１００％同一であるなど）。特定の具体的な実施形態では、グルカゴンペプチドは、１０番目のアミノ酸が、本明細書に記載するようにアシル化またはアルキル化された、配列番号５５を有するものである。グルカゴンペプチドは、配列番号５５、１個または２個のアミノ酸修飾を有する配列番号５５、配列番号２〜４、９〜１８、２０、２３〜２５、３３、４０〜４４、５３、５６、６１、６２、６４、６６〜５１４、５３４のいずれであってもよい。
これらの実施形態のアシル基またはアルキル基は、本明細書に記載のどのアシル基またはアルキル基であってもよい。たとえば、アシル基は、Ｃ４〜Ｃ３０（Ｃ８〜Ｃ２４など）の脂肪族アシル基であってもよく、アルキル基は、Ｃ４〜Ｃ３０（Ｃ８〜Ｃ２４など）のアルキル基であってもよい。
アシル基またはアルキル基が結合しているアミノ酸は、たとえば、式Ｉ（Ｌｙｓなど）、式ＩＩ、式ＩＩＩのいずれかのアミノ酸など、本明細書に記載のどのアミノ酸であってもよい。
いくつかの実施形態では、アシル基またはアルキル基は、１０番目のアミノ酸に直接的に結合している。いくつかの実施形態では、アシル基またはアルキル基は、原子３〜１０個の長さのスペーサー、たとえば、アミノ酸またはジペプチドなどのスペーサーを介して１０番目のアミノ酸に結合している。アシル基またはアルキル基を結合するための好適なスペーサーについては、本明細書で説明する。
いくつかの実施形態によれば、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、本明細書に記載するような上記のクラス３のグルカゴン関連ペプチドのいずれかの類縁体であってもよく、この類縁体は、ＧＩＰ受容体に対するアゴニスト活性を示す。グルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体、ＧＩＰ受容体に対する類縁体の活性レベル、これらの受容体各々に対する活性、これらの受容体各々に対する選択性は、本明細書に記載したクラス２のグルカゴン関連ペプチドについての教示内容に従うものであってもよい。クラス２のグルカゴン関連ペプチドのセクションで「活性」というタイトルのついたサブセクションの教示内容を参照のこと。
本発明のいくつかの実施形態では、ＧＩＰ受容体に対するアゴニスト活性を示すグルカゴンペプチドの類縁体が提供される。特定の実施形態における類縁体は、少なくとも１個のアミノ酸修飾（任意に、最大１５のアミノ酸修飾）を含む配列番号１のアミノ酸配列と、類縁体の２９番目のアミノ酸よりＣ末端側で１〜２１個のアミノ酸からなる延長部分と、を有する。
特定の態様では、類縁体は、少なくとも１個のアミノ酸修飾を有し、最大１５個のアミノ酸修飾（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個のアミノ酸修飾、最大１０個のアミノ酸修飾など）を有する。特定の実施形態では、類縁体は、最大で１０個のアミノ酸修飾における少なくとも１個のアミノ酸修飾と、追加の保存的なアミノ酸修飾とを有する。保存的なアミノ酸修飾については、本明細書で説明する。
いくつかの態様では、アミノ酸修飾のうちの少なくとも１個が、類縁体のＣ末端領域に、安定化したα螺旋構造を与える。安定化したα螺旋構造を達成する修飾については、本明細書で説明する。たとえば、α螺旋／分子内架橋の安定化というタイトルのセクションを参照のこと。いくつかの態様では、類縁体は、類縁体の２つのアミノ酸の側鎖間に分子内架橋（共有結合の分子内架橋、非共有結合の分子内架橋など）を有する。特定の態様では、分子内架橋は、ｉ番目のアミノ酸の側鎖とｉ＋４番目のアミノ酸の側鎖とを結合し、ここで、ｉは、１２、１３、１６、１７、２０または２４である。他の態様では、分子内架橋によって、ｊ番目とｊ＋３番目のアミノ酸の側鎖を結合（ｊは１７である）するか、ｋ番目とｋ＋７番目のアミノ酸の側鎖を結合（ｋは１２〜２２の整数）する。特定の実施形態では、分子内架橋は、共有結合の分子内架橋、たとえば、ラクタム架橋である。特定の態様では、ラクタム架橋は、１６番目と２０番目のアミノ酸の側鎖を結合する。特定の態様では、１６番目および２０番目のアミノ酸の一方が正の電荷を持つアミノ酸であり、他方が負の電荷を持つアミノ酸である。たとえば、類縁体は、１６番目のＧｌｕと２０番目のＬｙｓの側鎖を結合するラクタム架橋を含むものであってもよい。他の態様では、負の電荷を持つアミノ酸と、正の電荷を持つアミノ酸が、塩結合を形成する。この場合、分子内架橋は、非共有結合の分子内架橋である。
特定の態様では、安定化されたα螺旋を与えるアミノ酸修飾は、配列番号１のアミノ酸にα，α−二置換アミノ酸を入れる挿入または配列番号１のアミノ酸からα，α−二置換アミノ酸への置換である。α螺旋を安定化するのに適したα，α−二置換アミノ酸については、本明細書にて説明し、たとえばＡＩＢがあげられる。いくつかの態様では、配列番号１の１６番目、２０番目、２１番目、２４番目のアミノ酸のうちの１つ、２つ、３つまたは４つ以上を、α，α−二置換アミノ酸、たとえばＡＩＢで置換する。特定の実施形態では、１６番目のアミノ酸はＡＩＢである。
ＧＩＰ受容体に対するアゴニスト活性を示す類縁体は、本明細書に記載したものなどの追加の修飾を含むものであってもよい。たとえば、アミノ酸修飾は、ＧＬＰ−１受容体およびグルカゴン受容体の一方または両方に対する活性を高めるまたは低下させることがある。アミノ酸修飾は、ペプチドの安定性を高める、たとえば、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ分解に対する耐性を高め、１５番目と１６番目のアミノ酸の間の結合を安定化することがある。アミノ酸修飾は、ペプチドの溶解性を高めるおよび／またはＧＩＰ受容体、グルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体のいずれかに対する類縁体の作用時間を変化させることがある。これらのタイプの修飾のいずれかの組み合わせが、ＧＩＰ受容体に対するアゴニスト活性を示す類縁体に存在してもよい。
したがって、いくつかの態様では、類縁体は、１７番目のＧｌｎ、１８番目のＡｌａ、２１番目のＧｌｕ、２３番目のＩｌｅ、２４番目のＡｌａまたはＣｙｓまたはこれらの保存的なアミノ酸置換のうち１個または２個以上を伴う配列番号１のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、類縁体は、Ｃ末端のαカルボキシレートに代えて、Ｃ末端のアミドを有する。特定の実施形態では、類縁体は、１番目、２番目または１番目と２番目にアミノ酸置換を有し、この置換（単数または複数）が、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ耐性を達成する。好適なアミノ酸置換については、本明細書で説明する。たとえば、１番目のＤＭＩＡおよび／または２番目のｄ−ＳｅｒまたはＡＩＢ。いくつかの実施形態では、２番目のアミノ酸はＤ−セリンではない。
上記に加えてあるいは上記に代えて、類縁体は、以下のうちの１つまたはいずれかの組み合わせを含むものであってもよい。（ａ）２番目のＳｅｒにおける、Ａｌａとの置換、（ｂ）３番目のＧｌｎにおける、Ｇｌｕまたはグルタミン類縁体との置換、（ｃ）７番目のＴｈｒにおける、Ｉｌｅとの置換、（ｄ）１０番目のＴｙｒにおける、Ｔｒｐあるいは、天然のアミノ酸に対して非天然のアシル基またはアルキル基を有するアミノ酸との置換、（ｅ）１２番目のＬｙｓにおける、Ｉｌｅとの置換、（ｆ）１５番目のＡｓｐにおける、Ｇｌｕとの置換、（ｇ）１６番目のＳｅｒにおける、Ｇｌｕとの置換、（ｈ）２０番目のＧｌｎにおける、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＡＩＢとの置換、（ｉ）２４番目のＧｌｎにおける、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＡＩＢとの置換、（ｊ）２７番目のＭｅｔにおける、ＬｅｕまたはＮｌｅとの置換、（ｋ）２９番目のＡｓｎにおける、電荷を持つアミノ酸、任意にＡｓｐまたはＧｌｕとの置換、（ｌ）２９番目のＴｈｒにおける、Ｇｌｙまたは電荷を持つアミノ酸、任意にＡｓｐまたはＧｌｕとの置換。
特定の態様では、類縁体は、ＧＩＰアゴニスト活性を与える１番目にアミノ酸修飾を持たない。いくつかの態様では、１番目のアミノ酸は、高分子芳香族アミノ酸、たとえばＴｙｒではない。いくつかの実施形態では、１番目のアミノ酸は、イミダゾール環、たとえば、Ｈｉｓ、Ｈｉｓの類縁体を有するアミノ酸である。特定の実施形態では、類縁体は、米国特許出願第６１／１５１，３４９に開示された化合物のいずれでもない。特定の態様では、類縁体は、配列番号６５７〜６６９のいずれかのアミノ酸配列を有する。
ＧＩＰ受容体に対するアゴニスト活性を示す類縁体に関して、類縁体は、１〜２１個のアミノ酸（５〜１９個、７〜１５個、９〜１２個のアミノ酸など）からなる延長部分を有する。類縁体の延長部分は、この延長部分が１〜２１個のアミノ酸であるかぎり、どのアミノ酸配列を含むものであってもよい。いくつかの態様では、延長部分は、７〜１５個のアミノ酸であり、他の態様では、延長部分は９〜１２個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、延長部分は、（ｉ）配列番号２６または６７４のアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号２６または６７４のアミノ酸配列との配列同一性が高い（少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％など）アミノ酸配列または（ｉｉｉ）１個または２個以上の保存的なアミノ酸修飾を有する、（ｉ）または（ｉｉ）のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、延長部分のアミノ酸のうちの少なくとも１個が、アシル化またはアルキル化されている。アシル基またはアルキル基を有するアミノ酸は、類縁体の延長部分のどの位置にあってもよい。特定の実施形態では、延長部分のアシル化またはアルキル化されたアミノ酸は、（配列番号１の番号で）類縁体の３７番目、３８番目、３９番目、４０番目、４１番目または４２番目に位置する。特定の実施形態では、アシル化またはアルキル化されたアミノ酸は、類縁体の４０番目に位置する。
例示としての実施形態では、アシル基またはアルキル基は、天然のアミノ酸に対して非天然のアシル基またはアルキル基である。たとえば、アシル基またはアルキル基は、Ｃ４〜Ｃ３０（Ｃ１２〜Ｃ１８など）の脂肪族アシル基またはＣ４〜Ｃ３０（Ｃ１２〜Ｃ１８など）のアルキルであってもよい。アシル基またはアルキル基は、本明細書で説明するうちのいずれであってもよい。
いくつかの実施形態では、アシル基またはアルキル基は、たとえばアミノ酸の側鎖を介して、アミノ酸に直接結合している。他の実施形態では、アシル基またはアルキル基は、スペーサー（アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサー、疎水性の二官能性スペーサーなど）を介して、アミノ酸に結合している。特定の態様では、スペーサーは、原子３〜１０個の長さである。いくつかの実施形態では、アミノ酸スペーサーは、γ−Ｇｌｕではない。いくつかの実施形態では、ジペプチドスペーサーは、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕではない。
また、例示としての実施形態では、アシル基またはアルキル基が結合しているアミノ酸は、たとえば、式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩのアミノ酸をはじめとして、本明細書で説明するうちのいずれであってもよい。アシル化またはアルキル化されたアミノ酸は、たとえばＬｙｓであってもよい。アシル基またはアルキル基を有する好適なアミノ酸ならびに、好適なアシル基およびアルキル基については、本明細書に記載してある。アシル化およびアルキル化というタイトルのセクションの教示内容を参照のこと。
他の実施形態では、延長部分の１〜６個のアミノ酸（１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個のアミノ酸など）は、正の電荷を持つアミノ酸、たとえば、Ｌｙｓなどの式ＩＶのアミノ酸である。本明細書で使用する場合、「正の電荷を持つアミノ酸」という表現は、生理的なｐＨで側鎖の原子に正の電荷を持つ天然または非天然のアミノ酸を示す。特定の態様では、正の電荷を持つアミノ酸は、３７番目、３８番目、３９番目、４０番目、４１番目、４２番目、４３番目のどこに位置していてもよい。具体的な実施形態では、正の電荷を持つアミノ酸は、４０番目に位置する。
他の例では、延長部分は、本明細書に記載するようにアシル化またはアルキル化され、本明細書に記載するような１〜６個の正の電荷を持つアミノ酸を有する。
さらに他の実施形態では、ＧＩＰ受容体に対するアゴニスト活性を示す類縁体は、（ｉ）少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する配列番号１、（ｉｉ）類縁体の２９番目のアミノ酸よりＣ末端側における、１〜２１個のアミノ酸（５〜１８個、７〜１５個、９〜１２個のアミノ酸など）からなる延長部分、（ｉｉｉ）Ｃ末端の延長部分の外側（１番目から２９番目の任意の位置など）に位置する、天然のアミノ酸に対して非天然のアシル基またはアルキル基を有するアミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、類縁体は、１０番目に、アシル化またはアルキル化されたアミノ酸を有する。特定の態様では、アシル基またはアルキル基は、Ｃ４〜Ｃ３０の脂肪族アシル基またはＣ４〜Ｃ３０のアルキル基である。いくつかの実施形態では、アシル基またはアルキル基は、スペーサー、たとえばアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサー、疎水性の二官能性スペーサー）を介して結合している。特定の態様では、類縁体は、１６番目のＧｌｕと２０番目のＬｙｓの間の塩結合あるいは、１６番目、２０番目、２１番目、２４番目のうちの１箇所、２箇所、３箇所または４箇所以上におけるα，α−二置換アミノ酸など、α螺旋を安定化するアミノ酸修飾を有する。具体的な態様では、類縁体は、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ耐性を与えるアミノ酸修飾、たとえば、１番目のＤＭＩＡ、２番目のＡＩＢをさらに有する。別のアミノ酸修飾を有する類縁体も、本明細書で考えられている。
特定の実施形態では、ＧＩＰ受容体の活性を有する類縁体は、ＧＩＰ受容体に対する活性が、天然のＧＩＰの少なくとも０．１％（少なくとも０．５％、１％、２％、５％、１０％、１５％または２０％など）である。いくつかの実施形態では、類縁体は、ＧＩＰ受容体に対する活性が、天然のＧＩＰの２０％を超える（５０％を超える、７５％を超える、１００％を超える、２００％を超える、３００％を超える、５００％を超えるなど）。いくつかの実施形態では、類縁体は、ＧＬＰ−１受容体およびグルカゴン受容体の一方または両方に対して、かなりのアゴニスト活性を示す。いくつかの態様では、これらの受容体（ＧＩＰ受容体およびＧＬＰ−１受容体および／またはグルカゴン受容体）に対する選択性が、１０００倍以内である。たとえば、ＧＩＰ受容体の活性を有する類縁体のＧＬＰ−１受容体に対する選択性は、ＧＩＰ受容体および／またはグルカゴン受容体に対する選択性の５００倍未満、１００倍、５０倍以内、２５倍以内、１５倍以内、１０倍以内）であってもよい。
特定の態様では、類縁体は、配列番号６５７〜６６９のいずれかの構造を有する。
いくつかの実施形態によれば、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、以下の修飾すなわち、２番目のＡＩＢ、３番目のＧｌｕ、１０番目のＬｙｓ、１６番目のＧｌｕ、１７番目のＧｌｎ、１８番目のＡｌａ、２０番目のＬｙｓ、２１番目のＧｌｕ、２３番目のＩｌｅ、２４番目のＡｌａを有する天然のグルカゴンのアミノ酸配列（配列番号１）を有する。ここで、１０番目のＬｙｓは、Ｃ１４またはＣ１６脂肪酸でアシル化され、Ｃ末端のカルボキシレートは、アミドに置き換えられている。具体的な実施形態では、このクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、そのＮ末端のアミノ酸を介してジペプチドＤ−Ｌｙｓ−サルコシンに結合している。
いくつかの実施形態によれば、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１アゴニスト活性および／またはグルカゴンアゴニスト活性を保持する、任意に最大で１個、２個、３個、４個または５個のさらなる修飾を有する、配列番号７０〜５１４、５１７〜５３４または５５４のいずれかのアミノ酸配列を有する、本質的にこのようなアミノ酸配列からなる、あるいは、このようなアミノ酸配列からなる。特定の実施形態では、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、配列番号５６２〜６８４および１７０１〜１７７６のいずれかのアミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、クラス３のグルカゴン関連ペプチドは、配列番号１８０１〜１９０８のいずれかのアミノ酸配列を有する。
クラス４のグルカゴン関連ペプチド
特定の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、クラス４のグルカゴン関連ペプチドである（たとえば、国際（ＰＣＴ）特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０９７３（その全体を本明細書に援用する）を参照のこと）。
以下のセクションに示す生物学的配列（配列番号１３０１−１３７１）はいずれも、国際特許出願公開ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０９７３における配列番号１〜７１に対応する。
活性
いくつかの実施形態によれば、クラス４のグルカゴン関連ペプチドが提供される（以下、「クラス４のペプチド」と呼ぶ）。特定の態様では、グルカゴンアンタゴニスト活性を有するクラス４のペプチドが提供される。グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン活性化作用の抑制が望ましい環境であれば、どのような環境でも使用されるであろう。最も直接的で明らかな用途は、高血糖症の前臨床モデルでグルカゴンの拮抗作用が示されている糖尿病の治療に適用して、血糖を低下させる用途であろう。グルカゴンアンタゴニストをさらに修飾し、親化合物のアンタゴニスト活性を維持したまま、化合物の生物物理学的安定性および／または水溶性を改善してもよい。特定の態様では、クラス４のペプチドは、純粋なグルカゴンアンタゴニストとして望ましい。
「グルカゴンアンタゴニスト」という用語は、グルカゴンの活性を低下させるまたはグルカゴンの機能を阻害する化合物を示す。たとえば、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体でグルカゴンが達成する最大限の反応の少なくとも６０％を阻害し（少なくとも７０％阻害するなど）、好ましくは、少なくとも８０％を阻害する。いくつかの実施形態では、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体でグルカゴンが達成する最大限の反応の少なくとも９０％を阻害する。具体的な実施形態では、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体でグルカゴンが達成する最大限の反応の１００％を阻害する。また、濃度約１μＭのグルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体でグルカゴンが達成する最大限の約２０％未満しかアゴニスト活性を示さない。いくつかの実施形態では、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体でグルカゴンが達成する最大限の約１０％未満しかアゴニスト活性を示さない。具体的な実施形態では、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体でグルカゴンが達成する最大限の約５％未満しかアゴニスト活性を示さない。さらにもうひとつの具体的な実施形態では、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体でグルカゴンが達成する最大限の０％しかアゴニスト活性を示さない。
「純粋なグルカゴンアンタゴニスト」とは、確立されたin vitroモデルでのアッセイを用いてｃＡＭＰの産生を基準に判断できる、グルカゴン受容体またはＧＬＰ−１受容体の活性の検出される刺激を生成しないグルカゴンアンタゴニストである（たとえば、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０９７３を参照のこと）。たとえば、純粋なグルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体でグルカゴンが達成する最大限の約５％未満（約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０％など）しかアゴニスト活性を示さなず、ＧＬＰ−１受容体でＧＬＰ−１が達成する最大限の約５％未満（約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０％など）しかアゴニスト活性を示さない。
したがって、いくつかの態様では、純粋なグルカゴンアンタゴニスト活性を示すクラス４のペプチドが提供される。いくつかの実施形態によれば、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体を０．８ｎＭのグルカゴンおよびグルカゴンアンタゴニストと同時に接触させると、in vitroアッセイでのｃＡＭＰの産生を基準に判断できる、グルカゴン受容体に対してグルカゴン誘導ｃＡＭＰ産生を最大で少なくとも５０％低下させる活性を示す。いくつかの実施形態では、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体に対してグルカゴン誘導ｃＡＭＰ産生を最大量で少なくとも８０％低下させる。
クラス４のペプチドは、グルカゴンアンタゴニストについて上述したどのような用途にも適していると考えられる。したがって、本明細書に記載のクラス４のペプチドを、高血糖症の治療またはグルカゴンの血中濃度またはグルコースの血中濃度が高いことで生じる他の代謝疾患の治療に用いることが可能である。いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示のクラス４のペプチドを用いて治療される患者は、飼いならされた動物であり、別の実施形態では、治療対象となる患者はヒトである。研究では、糖尿病患者におけるグルカゴン抑制の欠如は、ある程度、グリコーゲンの分解を加速させることで、食後高血糖症の一因となる。経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）にて血糖を分析したところ、ソマトスタチン誘導グルカゴンの抑制がなされる状態またはなされない状態で、グルカゴン濃度の高い治療対象者で、グルコースの有意な増加が認められた。したがって、本発明のクラス４のペプチドを高血糖症の治療に用いることが可能であり、糖尿病Ｉ型、真性糖尿病ＩＩ型または妊娠性糖尿病（インスリン依存性または非インスリン依存性）をはじめとするさまざまなタイプの糖尿病を治療し、胃障害、網膜症、血管疾患などの糖尿病の合併症を低減するのに有用であると思われる。
いくつかの実施形態では、エキセンディン−４の末端の１０個のアミノ酸（すなわち、配列番号１３１９（GPSSGAPPPS）の配列）を、クラス４のペプチドのカルボキシ末端に結合する。これらの融合タンパク質は、食欲を抑制し、体重減少／体重維持を誘導するための薬理学的活性を有するものと予想される。いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示のクラス４のペプチドを、配列番号１３４２のクラス４のペプチドの２４番目のアミノ酸に結合した配列番号１３１９（GPSSGAPPPS）のアミノ酸配列を含むようにさらに修飾し、対象個体に投与して体重減少を誘導する、あるいは、体重維持を助けることが可能である。特に、配列番号１３０２、配列番号１３０３、配列番号１３０４、配列番号１３０５、配列番号１３０６、配列番号１３０７、配列番号１３０８、配列番号１３３６、配列番号１３３９、配列番号１３４０、配列番号１３４１、配列番号１３４２、配列番号１３４３、配列番号１３４４からなる群から選択される配列を有し、かつ、クラス４のペプチドの２４番目のアミノ酸に結合した配列番号１３１９（GPSSGAPPPS）のアミノ酸配列をさらに有するクラス４のペプチドは、食欲を抑制し、体重減少／体重維持を誘導するのに用いられる。いくつかの実施形態では、投与されるクラス４のペプチドは、配列番号１３４６または配列番号１３４７の配列を有する。
食欲を低減し、あるいは体重減少を促進するための上述したような方法は、体重を落とし、体重増加を防止し、あるいは、薬物誘発性肥満をはじめとするさまざまな原因の肥満を治療し、血管疾患（冠動脈疾患、脳卒中、末梢血管疾患、虚血再灌流障害など）、高血圧症、ＩＩ型糖尿病の発症、高脂血症、筋骨格系疾患をはじめとする肥満に関連する合併症を軽減する上で、有用であると思われる。
本発明のクラス４のペプチドは、単独で投与してもよいし、他の抗糖尿病薬または抗肥満薬との組み合わせで投与してもよいものである。当分野で知られた抗糖尿病薬または研究中の抗糖尿病薬として、インスリン；トルブタミド（Orinase）、アセトヘキサミド（Dymelor）、トラザミド（Tolinase）、クロルプロパミド（Diabinese）、グリピジド（Glucotrol）、グリブリド（Diabeta、Micronase、Glynase）、グリメピリド（Amaryl）またはグリクラジド（Diamicron）などのスルホニル尿素；レパグリニド（Prandin）またはナテグリニド（Starlix）などのメグリチニド；メトホルミン（Glucophage）またはフェンホルミンなどのビグアナイド；ロシグリタゾン（Avandia）、ピオグリタゾン（Actos）またはトログリタゾン（Rezulin）などのチアゾリジンジオンまたは他のＰＰＡＲγ阻害薬；ミグリトール（Glyset）、アカルボース（Precose／Glucobay）；エクセナチド（Byetta）またはプラムリンチドなどの炭水化物の消化を阻害するαグルコシダーゼ阻害薬；ビルダグリプチンまたはシタグリプチンなどのジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）阻害薬；ＳＧＬＴ（ナトリウム依存性グルコーストランスポーター１）阻害剤；またはＦＢＰａｓｅ（フルクトース１，６−ビスホスファターゼ）阻害薬があげられる。
当分野で知られた抗肥満薬または研究中の抗肥満薬は、フェネチルアミンタイプの刺激薬、フェンテルミン（任意にフェンフルラミンまたはデクスフェンフルラミン併用）、ジエチルプロピオン（Tenuate（登録商標））、フェンジメトラジン（Prelu-2（登録商標）、Bontril（登録商標））、ベンズフェタミン（Didrex（登録商標））、シブトラミン（Meridia（登録商標）、Reductil（登録商標））；リモナバン（Acomplia（登録商標））、他のカンナビノイド受容体アンタゴニスト；オキシントモジュリン；塩酸フルオキセチン（Prozac）；Qnexa（トピラマートとフェンテルミンとの合剤）、Excalia（ブプロピオンおよびゾニサミド）またはContrave（ブプロピオンおよびナルトレキソン）；またはゼニカル（Orlistat）またはセチリスタット（ＡＴＬ−９６２としても知られる）またはＧＴ ３８９−２５５に類するリパーゼ阻害薬をはじめとする食欲抑制薬を含む。
また、本発明のクラス４のペプチドを、悪液質になった患者に投与することも可能である。悪液質は、意図的ではなく体重が減少しつづけ、衰弱し、体脂肪と筋肉が落ちることが特徴であり、がん患者の半数以上に悪液質が生じると推定される。この症候群はＡＩＤＳにも普通に見られ、細菌による疾患や寄生虫症、関節リウマチならびに、腸、肝臓、肺、心臓の慢性疾患に伴うこともある。これは通常、摂食障害に関連し、老化に伴う状態として、あるいは肉体的な外傷の結果として、顕在化することがある。悪液質は、生活の質を落とし、基礎疾患を悪化させる症状であり、主な死因のひとつでもある。本出願人らは、悪液質を治療するために、本明細書に開示のクラス４のペプチドを患者に投与可能であると予想している。
当業者に知られた標準的な薬学的に許容されるキャリアおよび投与経路を用いて、本明細書に開示のクラス４のペプチドを含む薬学的組成物を、調製し、患者に投与することが可能である。したがって、本開示は、本明細書に開示のクラス４のペプチド１つまたは２つ以上を、薬学的に許容されるキャリアとの組み合わせで含む薬学的組成物も包含する。この薬学的組成物は、クラス４のペプチドを、唯一の薬学的に活性な成分として含むものであってもよいし、クラス４のペプチドを、１種または２種以上の別の活性剤と組み合わせることも可能である。いくつかの実施形態によれば、本発明のクラス４のペプチドと、ＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１類縁体、エキセンディン−４類縁体またはこれらの誘導体など）を活性化する化合物とを含む、組成物が提供される。いくつかの実施形態によれば、本発明のクラス４のペプチドと、インスリンまたはインスリン類縁体とを含む、組成物が提供される。あるいは、配列番号１３４２の配列を有し、かつ、配列番号１３４２の２４番目のアミノ酸に結合した配列番号１３１９（GPSSGAPPPS）のアミノ酸配列と抗肥満ペプチドとをさらに有する、体重減少を誘導または体重増加を防止するために提供される組成物を提供することが可能である。好適な抗肥満ペプチドとして、米国特許第５，６９１，３０９号、同第６，４３６，４３５号または米国特許出願第２００５０１７６６４３号に開示されたものがあげられ、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ（胃抑制ポリペプチド）、ＭＰ１、ＰＹＹ、ＭＣ−４、レプチンを含むがこれらに限定されるものではない。
クラス４のペプチドの構造
いくつかの実施形態では、（グルカゴン、配列番号１３０１）の９番目の普通に生じるアスパラギン酸が、グルタミン酸を基にした誘導体またはシステイン酸を基にした誘導体で置換された、クラス４のグルカゴン関連ペプチドが提供される。特に、１番目のアミノ酸の欠失（デスヒスチジン）と、９番目のアスパラギン酸からグルタミン酸への置換によって、いくつかの態様では、クラス４のペプチドが生成される。グルカゴンの９番目のアミノ酸が置換された、スルホン酸置換基を有するクラス４のグルカゴン関連ペプチドは、カルボン酸を基にしたアミノ酸と似たような形で働くが、溶解性などの物性の点でいくつか重要な差異がある。ホモシステイン酸（ｈＣｙｓＳＯ３）を、従来のデスヒスチジンにおける９番目の等配電子でグルタミン酸と置換すると、９番目のアミノ酸がグルタミン酸であるクラス４のペプチドは、部分アンタゴニストと弱いアゴニストとを保持する。
いくつかの実施形態では、最初の２〜５個のアミノ酸が除去され、（配列番号１３０１の番号で）９番目が、ｈＣｙｓ（ＳＯ３）、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸あるいは、以下の構造を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体で置換された、クラス４のペプチドが提供される。
Figure 2013540102

式中、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニルまたはＣ２〜Ｃ４アルキニルであり、極めて特異的かつ活性が高く、アゴニスト特性を低下させないホルモンアンタゴニストとして作用する化合物を提供する。
いくつかの実施形態によれば、配列番号１３０１の野生型配列に比して、２〜５個のアミノ酸残基がＮ末端から欠失し、天然のタンパク質の９番目のアスパラギン酸残基が、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、システインのスルホン酸誘導体あるいは、以下の構造を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体で置換されたグルカゴンペプチドを有する、クラス４のペプチドが提供される。
Figure 2013540102

式中、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニルまたはＣ２〜Ｃ４アルキニルである。
具体的な一実施形態では、２〜５個のアミノ酸残基がＮ末端から欠失し、天然のグルカゴンの９番目のＡｓｐが置換されたクラス４のペプチドを、最大でアミノ酸修飾３個までさらに修飾する。たとえば、クラス４のペプチドは、１個、２個または３個の保存的なアミノ酸修飾を有するものであってもよい。上記に代えてまたは上記に加えて、クラス４のペプチドは、以下からなる群から選択される１個または２個以上のアミノ酸修飾を有するものであってもよい。
Ａ．（配列番号１３０１のアミノ酸番号で）１０番目、２０番目、２４番目の１個または２個のアミノ酸またはクラス４のペプチドのＮ末端またはＣ末端のアミノ酸を、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、アミド結合またはアルキルアミン結合を介してアシル基またはアルキル基に共有結合しているアミノ酸で置換、
Ｂ．（配列番号１３０１のアミノ酸番号で）１６番目、１７番目、２０番目、２１番目、２４番目の１個または２個のアミノ酸またはクラス４のペプチドのＮ末端またはＣ末端のアミノ酸を、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン、ホモシステイン、アセチルフェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群から選択されるアミノ酸（この群のアミノ酸は親水体に共有結合している）と置換、
Ｃ．親水体に共有結合しているアミノ酸を、クラス４のペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加、
Ｄ．（配列番号１３０１の番号で）１５番目のＡｓｐを、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸と置換、
Ｅ．（配列番号１３０１の番号で）１６番目のＳｅｒを、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸と置換、
Ｆ．配列番号１３０１のアミノ酸番号で１６番目、２０番目、２１番目、２４番目のうちの１箇所または２箇所以上における、ＡＩＢとの置換、
Ｇ．配列番号１３０１の番号で２９番目のアミノ酸または２８番目と２９番目のアミノ酸の欠失、
Ｈ．（配列番号１３０１のアミノ酸番号で）２８番目のＡｓｎと２９番目のＴｈｒの一方または両方を、電荷を持つアミノ酸で置換および／または配列番号１３０１のＣ末端に１〜２個の電荷を持つアミノ酸を付加、
Ｉ．（配列番号１３０１の番号で）２７番目のＭｅｔを、Ｌｅｕまたはノルロイシンと置換、
Ｊ．配列番号１９〜２１および５３のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドを、配列番号１３０１のＣ末端に付加（ここで、（配列番号１３０１の番号で）２９番目はＴｈｒまたはＧｌｙである）、
Ｋ．Ｃ末端のカルボキシレートを、アミドまたはエステルと置換。
具体的な実施形態では、クラス４のペプチドは、上述したようなＡ、ＢまたはＣのアミノ酸修飾またはこれらの組み合わせを有する。さらにもうひとつの具体的な実施形態では、クラス４のペプチドは、Ａ、Ｂおよび／またはＣのアミノ酸修飾（単数または複数）に加えて、上述したようなＤ〜Ｋのいずれかのアミノ酸修飾またはこれらの組み合わせをさらに有する。
いくつかの実施形態では、クラス４のペプチドは、Ｎ末端から最初の５個のアミノ酸を合成し、残りのＮ末端のアミノ基をヒドロキシ基に置換（「ＰＬＡ６類縁体」）して生成される、配列番号１３３９のペプチドであるグルカゴンペプチドを有する。本出願人らは、最初の５個のアミノ酸が欠失し、（天然のグルカゴンでみた）９番目のグルタミン酸が置換されたクラス４のペプチド類縁体のフェニルアラニンをフェニル乳酸で置換すると、これらのクラス４のペプチド類縁体の活性がさらに増強されることを見出した。
いくつかの実施形態では、配列番号１３３９のクラス４のペプチドのペプチドを、４番目（天然のグルカゴンであれば９番目）のアスパラギン酸残基を、以下に示す一般構造を有するアミノ酸と置換することによって、さらに修飾する。
Figure 2013540102

式中、Ｘ６は、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ２〜Ｃ３アルケンまたはＣ２〜Ｃ３アルキニルであり、いくつかの実施形態では、Ｘ６はＣ１〜Ｃ３アルキルであり、もうひとつの実施形態では、Ｘ６はＣ２アルキルである。いくつかの実施形態では、クラス４のペプチドは、最初の５個のアミノ酸がＮ末端から除去され、４番目（天然のグルカゴンであれば９番目）のアスパラギン酸残基がシステイン酸またはホモシステイン酸と置換された、グルカゴンペプチドを有する。いくつかの実施形態では、クラス４のペプチドは、配列番号１３３９、配列番号１３０７、配列番号１３０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するグルカゴンペプチドを有する。いくつかの実施形態では、クラス４のペプチドは、４番目のアミノ酸がホモシステイン酸である配列番号１３０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
もうひとつの実施形態では、配列番号１３３９のクラス４のペプチドを、４番目（天然のグルカゴンであれば９番目）のアスパラギン酸残基を、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸または以下に示す構造を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体で置換することによって、さらに修飾する。
Figure 2013540102

式中、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニルまたはＣ２〜Ｃ４アルキニルである。具体的な実施形態では、Ｘ５はＣ１またはＣ２アルキルである。
しかしながら、本出願人らは、純粋な拮抗作用を示す類縁体を生成するのに、デス１〜５グルカゴン類縁体（すなわち、最初の５個のアミノ酸が欠失したグルカゴン類縁体）において、Ｎ末端のフェニルアラニンをＰＬＡで置換すると、４番目（天然のグルカゴンであれば９番目）の天然のアスパラギン酸残基をさらに置換する必要はないことを見出した。グルカゴン（２−２９）類縁体の親和性および活性の高いアンタゴニストを生成するには、４番目の天然のアスパラギン酸残基を置換しなければならないという従来技術の教示内容を考慮すると、この結果は驚くべきものである。ＰＬＡ置換を用いることで、Ａｓｐ９類縁体の相対活性が、Ｇｌｕ９類縁体およびｈＣｙｓ（ＳＯ３Ｈ）９類縁体に匹敵する点まで改善される。
フェニルアラニン残基を、３，４−２Ｆ−フェニルアラニン（３，４−２Ｆ−Ｐｈｅ）、２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）、Ｎ−アシル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）、α−メチルヒドロケイ皮酸（ＭＣＡ）およびベンジルマロン酸（ＢＭＡ）をはじめとする他のフェニルアラニン類縁体と置換しても、ＰＬＡ置換ほど高い活性では作用しなかった。
（天然のグルカゴンのアミノ酸番号で）４番目および５番目を含む６番目以外の部位でＰＬＡを置換すると、ＰＬＡ６類縁体が、わずかに伸長させたＮ末端を有するグルカゴン類縁体よりも明らかに活性の高いアンタゴニストであることがわかる。また、本発明ｊは、Ｎ末端のアミノ基がアシル化およびアルキル化された「Ｏ末端」ペプチドで置換された類縁体も含む。
さらに、ＰＬＡ６置換は、アンタゴニストの活性を高めるだけでなく、ＰＥＧ化で重要な役割も果たす。ＰＬＡ６類縁体は、グルカゴン活性化作用を回復させることなく選択的にＰＥＧ化可能なものである。ＰＬＡ置換がない場合、驚くべきことに、類縁体のＰＥＧ化によってグルカゴン活性化作用が誘導される。このグルカゴン活性化作用は、ＰＥＧ化されたＰＬＡ６類縁体には見られない。３番目、６番目、１９番目（天然のグルカゴンの８番目、１１番目、１９番目）ならびにＮ末端のアミノ酸残基をはじめとするいくつかのＰＥＧ化部位を調査した。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化は、１９番目（天然のグルカゴンの２４番目）でなされる。この部位が最も活性が高く、かつ選択性の高いグルカゴン拮抗作用を示すからである。
いくつかの実施形態では、クラス４のペプチドは、Ａ−Ｂ−Ｃの一般構造を有し、ここで、Ａは以下の化合物からなる群から選択され、
（ｉ）フェニル乳酸（ＰＬＡ）
（ｉｉ）ＰＬＡのオキシ誘導体
（ｉｉｉ）ペプチドの２個の連続したアミノ酸がエステル結合またはエーテル結合を介して結合している、２〜６個のアミノ酸からなるペプチド
Ｂは、任意に、以下からなる群から選択される１個または２個以上のアミノ酸修飾を有する、配列番号１３０１のｉ番目〜２６番目（ｉは、３、４、５、６または７である）のアミノ酸を表し、
（ｉｖ）（配列番号１３０１のアミノ酸番号で）９番目のＡｓｐが、Ｇｌｕ、Ｃｙｓのスルホン酸誘導体、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸または以下に示す構造を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体で置換される
Figure 2013540102

（式中、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニルまたはＣ２〜Ｃ４アルキニルである。）
（ｖ）（配列番号１３０１のアミノ酸番号で）１０番目、２０番目、２４番目の１個または２個のアミノ酸を、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、アミド結合またはアルキルアミン結合を介してアシル基またはアルキル基に共有結合しているアミノ酸で置換
（ｖｉ）（配列番号１３０１のアミノ酸番号で）１６番目、１７番目、２０番目、２１番目、２４番目の１個または２個のアミノ酸を、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン、ホモシステイン、アセチルフェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群（この群のアミノ酸は、親水体に共有結合している）から選択されるアミノ酸で置換
（ｖｉｉ）（配列番号１３０１の番号で）１５番目のＡｓｐが、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換される
（ｖｉｉｉ）（配列番号１３０１の番号で）１６番目のＳｅｒが、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換される
（ｉｘ）配列番号１３０１のアミノ酸番号で１６番目、２０番目、２１番目、２４番目のうちの１箇所または２箇所以上で、ＡＩＢで置換
Ｃは、以下からなる群から選択される。
（ｘ）Ｘ
（ｘｉ）Ｘ−Ｙ
（ｘｉｉ）Ｘ−Ｙ−Ｚ
（ｘｉｉｉ）Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１０
ここで、Ｘは、Ｍｅｔ、ＬｅｕまたはＮｌｅであり、Ｙは、Ａｓｎまたは電荷を持つアミノ酸であり、Ｚは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）、ホモシステイン、アセチルフェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）または電荷を持つアミノ酸であり、Ｒ１０は、配列番号１３１９〜１３２１および１３５３からなる群から選択され、
（ｘｉｖ）Ｃ末端のカルボキシレートがアミドで置換されている、（ｘ）から（ｘｉｉｉ）のいずれか。
具体的な態様において、クラス４のペプチドは、ＰＬＡのオキシ誘導体を有する。本明細書で使用する場合、「ＰＬＡのオキシ誘導体」とは、ヒドロキシ基がＯ−Ｒ１１で置換された、ＰＬＡの修飾された構造を有する化合物を示し、式中、Ｒ１１は、化学部分である。この点について、ＰＬＡのオキシ誘導体は、たとえば、ＰＬＡのエステルまたはＰＬＡのエーテルであってもよい。
ＰＬＡのオキシ誘導体を生成する方法は、当分野で知られている。たとえば、オキシ誘導体がＰＬＡのエステルである場合、ＰＬＡのヒドロキシルと求核物質を持つカルボニルとの反応によって、エステルを形成してもよい。求核物質は、アミンまたはヒドロキシルを含むがこれらに限定されるものではない、好適な求核物質であればよい。したがって、ＰＬＡのエステルには、式ＩＶの構造を有するものを用いることが可能である。
Figure 2013540102

式中、Ｒ７は、ＰＬＡのヒドロキシルと求核物質を持つカルボニルとの反応時に形成されるエステルである。
求核物質を持つカルボニル（ＰＬＡのヒドロキシルと反応してエステルを形成する）は、たとえば、カルボン酸、カルボン酸誘導体またはカルボン酸の活性化エステルであってもよい。カルボン酸誘導体は、塩化アシル、酸無水物、アミド、エステルまたはニトリルであってもよいが、これらに限定されるものではない。カルボン酸の活性化エステルは、たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、トシレート（Ｔｏｓ）、カルボジイミドまたはヘキサフルオロホスフェートであってもよい。いくつかの実施形態では、カルボジイミドは、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）または１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣＤ）である。いくつかの実施形態では、ヘキサフルオロホスフェートは、ヘキサフルオロホスフェートベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−ホスフェート（ＨＢＴＵ）からなる群から選択される。
ヒドロキシ基（ＰＬＡのヒドロキシルなど）との反応からエーテルを生成する方法も、当分野で知られている。たとえば、ＰＬＡのヒドロキシ基を、ハロゲン化アルキルまたはトシル化アルキルアルコールと反応させ、エーテル結合を形成する。
通常、Ｒ１１の化学部分は、クラス４のペプチドの活性を低下させないものである。いくつかの実施形態では、化学部分は、クラス４のペプチドの活性、安定性および／または溶解性を高めるものである。
具体的な実施形態では、酸素含有結合を介して（エステル結合またはエーテル結合を介するなど）ＰＬＡに結合する化学部分は、ポリマー（ポリアルキレングリコールなど）、炭水化物、アミノ酸、ペプチドまたは脂質、たとえば、脂肪酸またはステロイドである。
具体的な実施形態では、化学部分はアミノ酸であり、これは任意に、式ＩＶがデプシペプチドになるようなペプチドの一部であってもよい。この点について、クラス４のペプチドが、ＰＬＡ残基より手前に１個または２個以上（１個、２個、３個、４個、５個、６個またはそれより多いなど）のアミノ酸のＮ末端を有するように、ＰＬＡがクラス４のペプチドのＮ末端のアミノ酸残基以外の位置にあってもよい。たとえば、クラス４のペプチドは、ｎ番目にＰＬＡを有するものであってもよく、ここで、ｎは、クラス４のペプチドの２、３、４、５または６である。

ＰＬＡ残基よりＮ末端側のアミノ酸は、合成であっても天然であってもよい。具体的な実施形態では、Ｎ末端ＰＬＡであるアミノ酸は、天然のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＰＬＡよりＮ末端側のアミノ酸は、天然のグルカゴンのＮ末端のアミノ酸である。たとえば、クラス４のペプチドは、Ｎ末端に、配列番号１３５４〜１３５８のいずれかのアミノ酸配列を有するものであってもよく、ここで、ＰＬＡは、エステル結合を介してスレオニンに結合している。
配列番号１３５４ Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号１３５５ Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号１３５６ Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号１３５７ Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号１３５８ Ｔｈｒ−ＰＬＡ
別の実施形態では、Ｎ末端のアミノ酸のうちの１個または２個以上を、天然のグルカゴンのアミノ酸以外のアミノ酸で置換してもよい。たとえば、クラス４のペプチドが、５番目または６番目のアミノ酸としてＰＬＡを有する場合、１番目および／または２番目のアミノ酸は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を低減するアミノ酸であってもよい。特に、いくつかの実施形態では、クラス４のペプチドの１番目は、Ｄ−ヒスチジン、α，α−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、α−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシルヒスチジン、アセチルヒスチジン、ホモヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸である。特に、いくつかの実施形態では、アンタゴニストペプチドの２番目は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群から選択されるアミノ酸である。また、たとえば、クラス４のペプチドが、４番目、５番目または６番目のアミノ酸としてＰＬＡを有する場合、クラス４のペプチドの３番目のアミノ酸は、天然のグルカゴンでは天然のグルタミン残基であるのに対し、グルタミン酸であってもよい。本発明の例示としての実施形態では、クラス４のペプチドは、Ｎ末端に、配列番号１３５９〜１３６１のいずれかのアミノ酸配列を有する。
式ＩＶの化合物を有するクラス４のペプチドに関して、ポリマーは、ＰＬＡのヒドロキシ基と反応できるものであれば、どのようなポリマーであってもよい。ポリマーは、自然にまたは普通に求核物質を持つカルボニルを有するものであってもよい。あるいは、ポリマーは、カルボニルを持つカルボニルを含むように誘導体化されたものであってもよい。ポリマーは、以下に示すいずれかの物質の誘導体化されたポリマーであってもよい：ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレンおよびこれらの誘導体（ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレートなど）、アクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルのポリマー（ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）など）、ポリビニルポリマー（ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリ（ビニルアセテート）、ポリビニルピロリドンなど）、ポリグリコライド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびこれらのコポリマー、セルロース（アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシ−プロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシルエチルセルロース、三酢酸セルロース、セルロース硫酸ナトリウム塩など）、ポリプロピレン、ポリエチレン（ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）など）、ポリスチレン。
ポリマーは、合成生分解性ポリマー（乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コカプロラクトン）など）、天然の生分解性ポリマー（たとえば、アルギン酸および他の多糖類（デキストランおよびセルロースを含む）、コラーゲン、これらの化学的誘導体（置換、化学基の付加、たとえば、アルキル、アルキレン、ヒドロキシル化、酸化ならびに、当業者によってルーチンになされる他の修飾）、アルブミンおよび他の親水性タンパク質（たとえば、ゼインおよび他のプロラミンおよび疎水性タンパク質））ならびにこれらのコポリマーまたは混合物をはじめとする、生分解性ポリマーであってもよい。通常、これらの物質は、in vivoでの酵素による加水分解または水への曝露によって、あるいは表面が浸食されたり、内部まで一挙に浸食されたりすることで、分解される。
ポリマーは、H. S. Sawhney, C. P. Pathak and J. A. Hubbell in Macromolecules, 1993, 26, 581-587（その教示内容を本明細書に援用する）に記載された生浸食性ハイドロゲル、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ酸無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）などの生付着性ポリマーであってもよい。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、水溶性ポリマーである。好適な水溶性ポリマーは当分野で知られており、たとえば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ；Klucel）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ；Methocel）、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルブチルセルロース、ヒドロキシプロピルペンチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース（Ethocel）、ヒドロキシエチルセルロース、さまざまなアルキルセルロースおよびヒドロキシアルキルセルロース、さまざまなセルロースエーテル、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルシウムカルボキシメチルセルロース、酢酸ビニル／クロトン酸コポリマー、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ヒドロキシメチルメタクリレート、メタクリル酸コポリマー、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリレート、無水マレイン酸／メチルビニルエーテルコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウムおよびポリアクリル酸カルシウム、ポリアクリル酸、酸性カルボキシポリマー、カルボキシポリメチレン、カルボキシビニルポリマー、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、ポリメチルビニルエーテルコ無水マレイン酸、カルボキシメチルアミド、カリウムメタクリレートジビニルベンゼンコポリマー、ポリオキシエチレングリコール、ポリエチレンオキシドならびに、これらの誘導体、塩および組み合わせがあげられる。
具体的な実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などをはじめとするポリアルキレングリコールである。
炭水化物は、α脱離基を持つカルボニルを有するまたは有するようにできるものであれば、どのような炭水化物であってもよい。炭水化物は、たとえば、α脱離基を持つカルボニルを有するように誘導体化されたものであってもよい。この点について、炭水化物は、単糖（グルコース、ガラクトース、フルクトースなど）、二糖（スクロース、ラクトース、マルトースなど）、オリゴ糖（ラフィノース、スタキオースなど）、多糖（スターチ、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、カロース、ラミナリン、キシラン、マンナン、フコイダン、ガラクトマンナンの誘導体化された形態であってもよい。
式ＩＶの化合物を有するクラス４のペプチドに関して、脂質は、α脱離基を持つカルボニルを有するどのような脂質であってもよい。脂質は、たとえば、カルボニルを有するように誘導体化されたものであってもよい。この点について、脂質は、脂肪酸（Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸、エイコサノイド、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン、Ｎ−アシルエタノールアミンなど）、グリセロ脂質（一置換グリセロール、二置換グリセロール、三置換グリセロールなど）、グリセロリン脂質（ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンなど）、スフィンゴ脂質（スフィンゴシン、セラミドなど）、ステロール脂質（ステロイド、コレステロールなど）、フェノール脂質、糖脂質またはポリケタイドの誘導体であってもよい。
オイル、ワックス、コレステロール、ステロール、脂溶性ビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質。
いくつかの実施形態では、Ｒ７は、分子量が約１００ｋＤａまたはそれ未満、たとえば、約９０ｋＤａまたはそれ未満、約８０ｋＤａまたはそれ未満、約７０ｋＤａまたはそれ未満、約６０ｋＤａまたはそれ未満、約５０ｋＤａまたはそれ未満、約４０ｋＤａまたはそれ未満である。したがって、Ｒ７は、分子量が約３５ｋＤａまたはそれ未満、約３０ｋＤａまたはそれ未満、約２５ｋＤａまたはそれ未満、約２０ｋＤａまたはそれ未満、約１５ｋＤａまたはそれ未満、約１０ｋＤａまたはそれ未満、約５ｋＤａまたはそれ未満あるいは、約１ｋＤａであってもよい。
別の実施形態では、クラス４のペプチドは、Ａとして２〜６個のアミノ酸からなるペプチドを有し、この場合、ペプチドの２個の連続したアミノ酸は、エステル結合またはエーテル結合を介して結合している。エステル結合またはエーテル結合は、たとえば、２番目と３番目のアミノ酸、３番目と４番目のアミノ酸、４番目と５番目のアミノ酸または５番目と６番目のアミノ酸の間であってもよい。任意に、ポリマー（親水性ポリマーなど）への結合を含むもうひとつの化学部分への共有結合、アルキル化またはアシル化によって、このペプチドをさらに修飾してもよい。
一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを有するクラス４のペプチドに関して、Ｂは、任意に１個または２個以上のアミノ酸修飾を有する、天然のグルカゴンのアミノ酸、たとえば、配列番号１３０１のｉ番目〜２６番目（ｉは、３、４、５、６または７である）を表す。具体的な実施形態では、Ｂは、任意にさらに修飾されている、配列番号１３０１の７番目〜２６番目のアミノ酸を表す。
いくつかの実施形態では、Ｂは、最大で３個のアミノ酸修飾によって修飾される。たとえば、配列番号１３０１の天然のアミノ酸配列を表すＢは、１個または２個以上の保存的なアミノ酸修飾によって修飾される。
もうひとつの実施形態では、Ｂは、本明細書に記載するような（ｉｖ）〜（ｉｘ）からなる群から選択される１個または２個以上のアミノ酸修飾を有する。具体的な実施形態では、Ｂは、アミノ酸修飾（ｖ）および（ｖｉ）の一方または両方を有する。別の具体的な実施形態では、Ｂは、（ｖ）および（ｖｉ）に加えて、（ｉｖ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）からなる群から選択されるアミノ酸修飾のうちの１つまたは組み合わせを有する。
もうひとつの具体的な実施形態では、クラス４のペプチドは、Ｃ末端に、１個または２個以上の電荷を持つアミノ酸を有する。たとえば、Ｙおよび／またはＺが、電荷を持つアミノ酸、たとえば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕであってもよい。さらにもうひとつの実施形態では、クラス４のペプチドは、１〜２個の電荷を持つアミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕなど）を、ＺよりＣ末端側に有する。具体的な態様において、Ｚに１〜２個の電荷を持つアミノ酸が続く場合、Ｒ１０は含まれない。
いくつかの実施形態におけるクラス４のペプチドは、本明細書に記載するようなクラス４のペプチドのアミノ酸残基に共有結合している親水体を有する。たとえば、クラス４のペプチドは、配列番号１３０１の番号で１番目、１６番目、２０番目、２１番目または２４番目でアミノ酸に共有結合している親水体を有するものであってもよい。もうひとつの実施形態では、親水体は、クラス４のペプチドのＣ末端のアミノ酸に結合し、これは、場合によってはＺよりアミノ酸１個または１１個、Ｃ末端側である。さらにもうひとつの実施形態では、親水体はＰＬＡに結合し、ＡがＰＬＡである場合、ＰＬＡ−ＰｈｅまたはＰＬＡ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅに結合し、この場合のＰＬＡは親水体を有するように修飾されている。もうひとつの実施形態では、親水体を有するアミノ酸を、クラス４のペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加する。もうひとつの実施形態では、クラス４のペプチドは、本明細書に記載するようなアシル基またはアルキル基を有する。たとえば、アシル化またはアルキル化は、配列番号１３０１の番号で１０番目、２０番目または２４番目のアミノ酸の側鎖から離れて生じるものであってもよい。別の実施形態では、アシル化またはアルキル化は、場合によってはＺよりアミノ酸１個または１１個、Ｃ末端側の、クラス４のペプチドのＣ末端のアミノ酸の側鎖から離れて生じる。さらにもうひとつの実施形態では、ＡがＰＬＡ、ＰＬＡ−ＰｈｅまたはＰＬＡ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅである場合、ＰＬＡは、アシル基またはアルキル基を含むように修飾される。
例示としての実施形態
クラス４のペプチドは、ペプチドの少なくとも２個の連続したアミノ酸がエステル結合またはエーテル結合を介して結合されているかぎり、合成または天然のどのようなアミノ酸を有するものであってもよい。具体的な実施形態では、ペプチドは、天然のグルカゴンのアミノ酸を有する。たとえば、ペプチドは、天然のグルカゴン（配列番号１３０１）のｊ番目〜６番目（ｊは、１、２、３、４または５である）を含むものであってもよい。あるいは、ペプチドは、１個または２個以上のアミノ酸が修飾された配列番号１３０１のＮ末端に基づくアミノ酸配列を含むものであってもよい。１番目および／または２番目のアミノ酸は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を低減するアミノ酸であってもよい。たとえば、ペプチドは、クラス４のペプチドの１番目に、Ｄ−ヒスチジン、α，α−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、α−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシルヒスチジン、アセチルヒスチジン、ホモヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸を含むものであってもよい。特に、いくつかの実施形態では、アンタゴニストのペプチドの２番目は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群から選択されるアミノ酸である。また、たとえば、クラス４のペプチドの３番目のアミノ酸は、天然のグルカゴンでは天然のグルタミン残基であるのに対し、グルタミン酸であってもよい。したがって、クラス４のペプチドは、以下に示すアミノ酸配列を有するものであってもよい。
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１３６８）
Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１３６９）または
Ｘａａ３−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１３７０）
ここで、Ｘａａ１は、Ｈｉｓ、Ｄ−ヒスチジン、α，α−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、α−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシルヒスチジン、アセチルヒスチジン、ホモヒスチジンからなる群から選択され、Ｘａａ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群から選択され、Ｘａａ３は、ＧｌｎまたはＧｌｕである。
また、本発明は、クラス４のペプチドのＣ末端のアミノ酸が、天然のアミノ酸に存在するカルボン酸基を置換するアミド基を有する、実施形態も包含する。
クラス４のペプチドがＰＥＧ化されているいくつかの実施形態では、クラス４のペプチドは、短くされたグルカゴンペプチド、特に６〜２９を有し、この場合の「Ｎ末端」アミノ酸はＰＬＡ（フェニル乳酸）である。このようなグルカゴン誘導体には、独特の利点がある。これらは天然のＮ末端フェニルアラニンを有するものよりも活性の高いペプチドであり、天然のフェニルアラニンには見られない、ＰＥＧ化によるグルカゴン活性化作用を抑制する。最後に、現時点での文献には、アンタゴニスト活性を得るには９番目の天然のアスパラギン酸を置換しなければならないことが示されているが、本出願人らは、ＰＬＡ６−（６−２９）グルカゴン類縁体ではこのような置換が必要ないという驚くべき結果を見出した。
いくつかの実施形態では、クラス４のペプチドのアミノ酸を少なくとも１個のシステイン残基で置換し、この場合のシステイン残基の側鎖を、マレイミド、ビニルスルホン、２−ピリジルチオ、ハロアルキル、ハロアシルなどをはじめとするチオール反応性試薬でさらに修飾する。これらのチオール反応性試薬は、カルボキシ基、ケト基、ヒドロキシ基、エーテル基ならびに、ポリエチレングリコール単位などの他の親水体を含むものであってもよい。別の実施形態では、クラス４のペプチドのアミノ酸をリジンで修飾し、ポリエチレングリコールなどの親水体のアルデヒドまたはカルボン酸の活性エステル（スクシンイミド、無水物など）などのアミン反応性試薬を用いて、置換するリジン残基の側鎖をさらに修飾する。いくつかの実施形態によれば、天然のペプチドの１２番目に相当するリジン残基をアルギニンに置換し、天然のペプチドの１番目、１６番目、１７番目、２０番目、２１番目、２４番目または２９番目に対応するアミノ酸のうちの１つに単一のリジン置換を挿入するか、クラス４のペプチドのＮ末端またはＣ末端にリジンを付加する。
もうひとつの実施形態では、天然のペプチドの２７番目に対応するメチオニン残基をロイシンまたはノルロイシンに変更して、ペプチドの酸化による分解を防止する。
いくつかの実施形態では、グルカゴンペプチドのＣ末端の１個または２個のアミノ酸の短縮すなわち欠失（すなわち、天然のグルカゴンの２９番目あるいは、２８番目と２９番目のアミノ酸の短縮）によって、グルカゴン受容体に対する活性（ａｃｔｉｖｉｔｙ）および／または活性（ｐｏｔｅｎｃｙ）影響することなく、本明細書に記載のクラス４のペプチドをさらに修飾する。この点について、本明細書に記載のクラス４のペプチドは、たとえば、本明細書に記載するようなクラス４のペプチドの活性が生じる１個または２個以上の修飾を有する、天然のグルカゴンペプチド（配列番号１３０１）の１番目〜２７番目、１番目〜２８番目、２番目〜２７番目、２番目〜２８番目、３番目〜２７番目、３番目〜２８番目、４番目〜２７番目、４番目〜２８番目、５番目〜２７番目、５番目〜２８番目、６番目〜２７番目または６番目〜２８番目のアミノ酸から本質的になるまたはこのようなアミノ酸からなるものであってもよい。
また、本明細書に開示のクラス４のペプチドは、グルカゴンペプチドの機能に重要ではないことが知られている位置でのアミノ酸置換も包含する。いくつかの実施形態では、置換は、配列番号１３３９の２番目、５番目、６番目、７番目、８番目、９番目、１２番目、１３番目、１４番目、１５番目、１６番目、１９番目、２２番目、２３番目または２４番目からなる群から選択される１箇所、２箇所または３箇所における保存的なアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、クラス４のペプチドは、配列番号１３４２の誘導体ペプチドを有し、ここで、グルカゴンペプチドは、２番目、５番目、６番目、８番目、９番目、１２番目、１３番目、１４番目から選択される１〜３箇所のアミノ酸で、配列番号１３４２に比してさらなるアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１３４２の２番目、５番目、６番目、８番目、９番目、１２番目、１３番目、１４番目での置換は、保存的なアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、天然のペプチドの１６番目、１７番目、２０番目、２１番目、２４番目または２９番目に対応するアミノ酸、特に、２１番目および／または２４番目を、システインまたはリジンで置換し、この場合のＰＥＧ鎖は、置換されたシステイン残基またはリジン残基に共有結合している。
いくつかの実施形態によれば、修飾されたクラス４のペプチドは、ペプチドに共有結合している２つまたは３つ以上のポリエチレングリコール鎖を有し、この場合のグルカゴン鎖の合計の分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化されたクラス４のペプチドは、配列番号１３１２および配列番号１３２２からなる群から選択されるペプチドを有する。当該ペプチドは、１１番目と１９番目でアミノ酸に結合したポリエチレングリコール鎖を含み、２つのＰＥＧ鎖の合計の分子量は約１，０００〜約５，０００ダルトンである。
いくつかの実施形態によれば、以下の配列からなる群から選択される修飾されたグルカゴンペプチドを含むクラス４のペプチドが提供される。
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ２（配列番号１３０９）
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ２（配列番号１３１０）
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ２（配列番号１３１１）
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ２（配列番号１３１２）
ここで、４番目のＸａａ＝アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸またはホモシステイン酸であり、７番目のＸａａ＝ＬｙｓまたはＡｒｇであり、１０番目のＸａａは、アスパラギン酸、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸であり、１１番目のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチルフェニルアラニンであり、１６番目のＸａａは、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチルフェニルアラニンであり、１９番目のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、アセチルフェニルアラニンであり、２２番目のＸａａ＝Ｍｅｔ、ＬｅｕまたはＮｌｅであり、Ｒ１はＯＨまたはＮＨ２であり、Ｒ２はＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２であり、ここで、配列番号１３０９の場合は１１番目で、配列番号１３１０の場合は１６番目で、配列番号１３１１の場合は１９番目で、配列番号１３１２は１６番目および１９番目で、ペプチドがＰＥＧ化されるが、ただし、４番目のＸａａ＝アスパラギン酸である場合、Ｒ１はＯＨである。いくつかの実施形態によれば、ペプチドは、配列番号１３０９、配列番号１３１０または配列番号１３１１の配列を有し、ここで、Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＣＯＮＨ２である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１３０９、配列番号１３１０または配列番号１３１１の配列を有し、ここで、Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＣＯＮＨ２であり、４番目のアミノ酸はアスパラギン酸であり、別の実施形態では、このようなペプチドは、配列番号１３１９の配列を有するカルボキシ末端の延長部分を有する。
いくつかの実施形態によれば、ペプチドは、配列番号１３０９、配列番号１３１０、配列番号１３１３、配列番号１３１４、配列番号１３１６からなる群から選択される配列を有し、このペプチドは、配列番号１３０９および配列番号１３１３の場合は１１番目でＰＥＧ化され、配列番号１３１０の場合は１６番目でＰＥＧ化され、配列番号１３１０および配列番号１３１４の場合は１９番目でＰＥＧ化される。いくつかの実施形態では、グルカゴンアゴニストは、配列番号１３１３または配列番号１３１４のペプチドを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のクラス４のペプチドのＣ末端のアミノ酸は、天然のアミノ酸に存在するカルボン酸基に代えてアミド基を有する。いくつかの実施形態によれば、クラス４のペプチドは、配列番号１３１８の配列を有する。
いくつかの実施形態によれば、グルカゴンペプチドの溶解性、安定性および／または薬物動態を改善するために、ペプチドのアミノ酸側鎖に血漿タンパク質が共有結合したクラス４のペプチドが提供される。たとえば、血清アルブミンを、本明細書で提示するクラス４のペプチドに共有結合することが可能である。いくつかの実施形態では、血漿タンパク質は、天然のグルカゴンペプチドの１６番目、１７番目、２０番目、２１番目、２４番目または２９番に対応するアミノ酸に共有結合している。特に、いくつかの実施形態では、血漿タンパク質は、天然のグルカゴンペプチドの１６番目または２４番目に対応するアミノ酸に結合し、ここで、クラス４のペプチドは、配列番号１３０３、配列番号１３０４、配列番号１３０５、配列番号１３０６、配列番号１３０７、配列番号１３０８、配列番号１３０９、配列番号１３１１、配列番号１３１２、配列番号１３２２、配列番号１３２３、配列番号１３２４、配列番号１３２５、配列番号１３２６、配列番号１３２７、配列番号１３２８、配列番号１３３６、配列番号１３３９の配列を有する。いくつかの実施形態では、クラス４のペプチドは、配列番号１３０９、配列番号１３１０、配列番号１３１１、配列番号１３１２からなる群から選択されるペプチドを有する。
いくつかの実施形態によれば、グルカゴンペプチドの溶解性、安定性および／または薬物動態を改善するために、免疫グロブリン分子のＦｃ部分を表す直鎖状のアミノ酸配列が、本明細書に記載のクラス４のペプチドのアミノ酸側鎖に共有結合している、クラス４のペプチドが提供される。たとえば、免疫グロブリン分子のＦｃ部分を表すアミノ酸配列を、配列番号１３０７、配列番号１３３９のグルカゴンペプチドまたはそれらのグルカゴン類縁体の１１番目、１２番目、１５番目、１６番目、１９番目、２１番目または２４番目に共有結合させてもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃペプチドは、配列番号１３０６、配列番号１３０７、配列番号１３０８または配列番号１３３６のクラス４のペプチドの１１番目または１９番目に共有結合している。Ｆｃ部分は通常、ＩｇＧから単離されるが、どの免疫グロブリン由来のＦｃペプチド断片も等しく機能するはずである。いくつかの実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号１３０３、配列番号１３０４、配列番号１３０５、配列番号１３０７、配列番号１３０８、配列番号１３３９からなる群から選択され、ここで、Ｆｃ部分は、天然のグルカゴンペプチドの１６番目、１７番目、２０番目、２１番目、２４番目または２９番目の対応する位置に結合している。いくつかの実施形態では、クラス４のペプチドは、配列番号１３０９、配列番号１３１０、配列番号１３１１、配列番号１３１２からなる群から選択されるグルカゴンペプチドを有し、Ｆｃペプチドは、それぞれ配列番号１３０９、配列番号１３１０、配列番号１３１１の１１番目、１６番目または１９番目と、配列番号１３１２の１１番目および１９番目の両方にあるアミノ酸の側鎖に結合している。
本発明の特定の実施形態では、クラス４のペプチドは、配列番号１３６２、１３６４〜１３６７、１３７１のいずれかのアミノ酸配列を有する。
溶解性を改善するための修飾
いくつかの態様において、クラス４のペプチドをさらに修飾して、グルカゴンアンタゴニスト活性を保持したまま、生理的なｐＨでの水溶液に対するペプチドの溶解性を改善してもよい。天然のペプチドの１番目、１６番目、１７番目、２０番目、２１番目、２４番目、２９番目に対応する位置またはＣ末端に親水基を導入することで、親化合物のアンタゴニスト活性を維持したまま、得られるクラス４のペプチドの、生理的なｐＨの溶液に対する溶解性を改善することが可能である。したがって、いくつかの実施形態では、天然のグルカゴンペプチドのアミノ酸の１番目、１６番目、１７番目、２０番目、２１番目、２４番目、２９番目に対応するアミノ酸の側鎖またはＮ末端またはＣ末端のアミノ酸の側鎖に共有結合している１個または２個以上の親水基を有するように、本明細書に開示のクラス４のペプチドをさらに修飾する。別の実施形態では、天然のグルカゴンペプチドのアミノ酸の１６番目および２４番目に対応するアミノ酸の側鎖は親水基に共有結合し、いくつかの実施形態では、親水基はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
本出願人らは、天然のグルカゴンのカルボキシ末端に電荷を導入することで、天然のグルカゴンを修飾して、ペプチドのアゴニスト特性を保持したままペプチドの溶解性を高められることを見出した。溶解性が高まると、グルカゴン溶液を、中性のｐＨ付近で調製および保管できるようになる。グルカゴン溶液を比較的中性のｐＨ（ｐＨ約６．０〜約８．０など）で調製すると、クラス４のペプチドの長期の安定性が改善される。
繰り返すが、本出願人らは、本明細書に開示のクラス４のペプチドを同様に修飾して、親タンパク質のアンタゴニスト特性を保持したまま、比較的中性のｐＨ（ｐＨ約６．０〜約８．０など）の水溶液に対するペプチドの溶解性を改善することが可能であると予測している。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、天然の電荷を持たないアミノ酸を電荷を持つアミノ酸で置換するか、電荷を持つアミノ酸をカルボキシ末端に付加することによって、ペプチドに電荷を付加するために、野生型グルカゴン（配列番号１３０１）の６番目〜２９番目に存在する天然のアミノ酸をさらに修飾した配列番号１３３９のクラス４のペプチドに関するものである。いくつかの実施形態によれば、配列番号１３３９のクラス４のペプチドの電荷を持たない天然のアミノ酸１〜３個を、電荷を持つアミノ酸で置換する。いくつかの実施形態では、電荷を持つアミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸からなる群から選択される。特に、本出願人らは、天然のグルカゴンに比して対応する２８番目および／または２９番目にある普通に生じるアミノ酸を電荷を持つアミノ酸で置換することおよび／または１〜２個の電荷を持つアミノ酸をクラス４のペプチドのカルボキシ末端に付加することで、生理的に関連するｐＨ（すなわち、ｐＨ約６．５〜約７．５）の水溶液に対するクラス４のペプチドの溶解性および当該水溶液中における安定性が高められることを見出した。したがって、親ペプチドの生物学的活性を保持したまま、特に約５．５〜約８．０の範囲のｐＨで、水溶液に対する溶解性に同様の作用を持つように、本明細書に開示のクラス４のペプチドの上記のような修飾が予想される
いくつかの実施形態によれば、天然のグルカゴンで対応する２８番目および／または２９番目における天然のアミノ酸を、負の電荷を持つアミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸など）で置換し、任意に、負の電荷を持つアミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸など）を、ペプチドのカルボキシ末端に付加することによって、配列番号１３３９のクラス４のペプチドを修飾する。別の実施形態では、天然のグルカゴンで対応する２９番目における天然のアミノ酸を、正の電荷を持つアミノ酸（リジン、アルギニンまたはヒスチジンなど）で置換し、任意に、１個または２個の正の電荷を持つアミノ酸（リジン、アルギニンまたはヒスチジンなど）を、ペプチドのカルボキシ末端に付加することによって、配列番号１３３９のクラス４のペプチドを修飾する。いくつかの実施形態によれば、溶解性と安定性が改善されたクラス４のペプチドが提供され、ここで、ペプチドは配列番号１３４１のアミノ酸配列を有し、ただし、配列番号１３４１の２３番目または２４番目における少なくとも１個のアミノ酸が酸性アミノ酸で置換されるおよび／または配列番号１３４１のカルボキシ末端に追加の酸性アミノ酸が付加される。いくつかの実施形態では、酸性アミノ酸は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモシステイン酸からなる群から独立に選択される。
いくつかの実施形態によれば、溶解性と安定性が改善されたクラス４のペプチドが提供され、ここで、アンタゴニストは、配列番号１３４１、配列番号１３４２、配列番号１３４３または配列番号１３４４のアミノ酸配列を有し、２３番目または２４番目のアミノ酸のうちの少なくとも１個が、非天然のアミノ酸残基で置換されている（すなわち、類縁体の２３番目または２４番目に存在する少なくとも１個のアミノ酸が、配列番号１３０７の対応する位置に存在するアミノ酸とは異なる酸性アミノ酸である）。いくつかの実施形態によれば、配列番号１３４１または１３４２の配列を有するグルカゴンアゴニストが提供され、ただし、２３番目のアミノ酸がアスパラギンであり、２４番目のアミノ酸がスレオニンである場合、ペプチドは、クラス４のペプチドのカルボキシ末端に付加された、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕからなる群から独立に選択される１〜２個のアミノ酸をさらに含む。
もうひとつの実施形態では、１１番目、１２番目、１５番目、１６番目、１９番目または２４番目のアミノ酸残基に親水体を共有結合することによって、配列番号１３４２のクラス４のペプチドの溶解性を改善することが可能であり、いくつかの実施形態では、親水体は１１番目、１６番目または１９番目のアミノ酸に結合し、別の実施形態では、親水体は１９番目のアミノ酸に結合している。いくつかの実施形態では、親水体は血漿タンパク質または免疫グロブリンのＦｃ部分であり、別の実施形態では、親水体は親水性の炭化水素鎖である。いくつかの実施形態では、親水体は、分子量が約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択されるポリエチレングリコールである。もうひとつの実施形態では、親水体は、分子量が少なくとも約２０，０００ダルトンのポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、ポリエチレンで修飾されたクラス４のペプチドは、配列番号１３０９、配列番号１３１０、配列番号１３１１、配列番号１３１２、配列番号１３４３、配列番号１３４４または配列番号１３４５のアミノ酸配列を有する。
安定性を改善するための修飾
天然のグルカゴンの１５番目と１６番目のＡｓｐ−Ｓｅｒ配列は、水性バッファーにおける天然のホルモンの早期の化学反応による切断につながる独特の不安定なジペプチドとして同定されている。たとえば、０．０１ＮのＨＣｌにて３７℃で２週間維持すると、天然のグルカゴンの５０％を超える部分が切断されて断片になってしまうことがある。この遊離した２つのペプチド断片１−１５および１６−２９は、グルカゴン様の生物学的活性を持たず、よって、グルカゴンおよびその関連の類縁体の水溶液による使用前調製に対する制約を示す。天然のグルカゴンペプチドの１５番目のＡｓｐをＧｌｕで選択的に化学置換すると、１５番目と１６番目のペプチド結合の化学反応による切断が、事実上なくなることが観察されている。
したがって、本発明のクラス４のペプチドを同様に修飾して、水性バッファーにおける早期の化学反応による切断に対する感受性を低減することが可能であると思われる。いくつかの実施形態によれば、水溶液中での安定性を高めるために、天然のグルカゴンペプチドの１５番目にある天然のアスパラギン酸のアミノ酸を、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換することによって、本明細書に記載のクラス４のペプチドを、さらに修飾することが可能である。いくつかの実施形態によれば、配列番号１３３９のクラス４のペプチドの１０番目のアスパラギン酸残基を、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換してもよく、いくつかの実施形態では、配列番号１３３９の１０番目の天然のアスパラギン酸をグルタミン酸で置換する。いくつかの実施形態によれば、水溶液中での安定性が改善されたクラス４のペプチドが提供され、ここで、アンタゴニストは、配列番号１３３６、配列番号１３４０、配列番号１３４２からなる群から選択される配列を有する。別の実施形態では、クラス４のペプチドがアミド化される。
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載のクラス４のペプチドの分解が低減されることによる安定性の向上を、（天然のグルカゴンの番号で）１６番目のセリンからグルタミン酸、システイン酸、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸への置換によって達成してもよい。具体的な実施形態では、（天然のグルカゴンの番号で）１６番目のセリンをグルタミン酸に置換する。一層具体的な態様では、このような修飾を有するクラス４のペプチドは、Ｃ末端のカルボキシレートを有し、アミド化されていない。
いくつかの実施形態によれば、配列番号１３０７、配列番号１３３６、配列番号１３３９、配列番号１３４０、配列番号１３４１、配列番号１３４２、配列番号１３４３、配列番号１３４４からなる群から選択されるグルカゴンペプチドを有し、天然のグルカゴンペプチドの１１番目、１２番目、１５番目、１６番目、１９番目および／または２４番目に対応する１個または２個以上の追加のアミノ酸置換によってさらに修飾される、クラス４のペプチドが提供される。ここで、アミノ酸置換は、親水体、たとえばＰＥＧとの架橋に適した側鎖を有するアミノ酸での置換であってもよい。ペプチドは、天然のアミノ酸で置換されてもよいし、合成（非天然）のアミノ酸で置換されてもよい。合成または非天然のアミノ酸は、in vivoでは天然に生じないが、本明細書に記載のペプチド構造に取り込むことは可能である。いくつかの実施形態では、ペプチドが、配列番号１３０７、配列番号１３３６、配列番号１３３９、配列番号１３４０、配列番号１３４１、配列番号１３４２、配列番号１３４３、配列番号１３４４の配列を有し、天然のグルカゴンペプチドの対応する２１番目または２４番目に結合したポリエチレングリコール鎖をさらに有する、クラス４のペプチドが提供される。別の実施形態では、クラス４のペプチドのＣ末端を、カルボン酸基がアミド基で置換されるように修飾する。
融合ペプチドと結合体
また、本開示は、クラス４のペプチドのＣ末端に第２のペプチドが融合した、クラス４のペプチドの融合ペプチドも包含する。特に、この融合ペプチドは、配列番号１３４４のクラス４のペプチドのペプチドを有するものであってもよく、このペプチドは、クラス４のペプチドのＣ末端のアミノ酸に結合した配列番号１３１９（GPSSGAPPPS）、配列番号１３２０（Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ）または配列番号１３２１（Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｒｇ）のアミノ酸配列をさらに有する。いくつかの実施形態では、配列番号１３１９（GPSSGAPPPS）のアミノ酸配列が、ペプチド結合を介して、配列番号１３４２のクラス４のペプチドの２４番目のアミノ酸に結合している。もうひとつの実施形態では、融合ペプチドは、配列番号１３０７、配列番号１３３６、配列番号１３３９、配列番号１３４０、配列番号１３４１または配列番号１３４３のクラス４のペプチドのペプチドを有し、クラス４のペプチドの２４番目のアミノ酸に結合した配列番号１３１９（GPSSGAPPPS）のアミノ酸配列をさらに有する。もうひとつの実施形態では、融合ペプチドは、配列番号１３０７、配列番号１３３６、配列番号１３３７、配列番号１３３８、配列番号１３３９、配列番号１３４１または配列番号１３４３のクラス４のペプチドのペプチドを有し、クラス４のペプチドの２４番目のアミノ酸に結合した配列番号１３２０、配列番号１３２１または配列番号１３５３のアミノ酸配列をさらに有する。いくつかの実施形態では、クラス４のペプチドの融合ペプチドは、配列番号１３４６および配列番号１３４７からなる群から選択される配列を有する。別の実施形態では、融合ペプチドのＣ末端を、カルボン酸基がアミド基に置換されるように修飾する。
いくつかの実施形態では、融合ペプチドのクラス４のペプチド部分が、配列番号１３０３、配列番号１３０４、配列番号１３０５、配列番号１３０６、配列番号１３０７、配列番号１３０８、配列番号１３０９、配列番号１３１１、配列番号１３１２、配列番号１３１３、配列番号１３１４、配列番号１３１５、配列番号１３１０、配列番号１３１６、配列番号１３１７、配列番号１３１８、配列番号１３３９からなる群から選択される、クラス４のペプチドの融合ペプチドが提供され、配列番号１３１９の配列は、クラス４のペプチド部分のカルボキシ末端に融合し、ここで、ＰＥＧ鎖が存在する場合には、このＰＥＧ鎖は、５００〜４０，０００ダルトンの範囲から選択される。特に、いくつかの実施形態では、クラス４のペプチドセグメントは、配列番号１３１３、配列番号１３１４、配列番号１３１５、配列番号１３１６、配列番号１３４６、配列番号１３４７からなる群から選択され、ここで、ＰＥＧ鎖は、約５００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択され、特に、いくつかの実施形態では、ＰＥＧ鎖は約１，０００ダルトンである。別の実施形態では、Ｃ末端を、カルボン酸基がアミド基で置換されるように修飾する。
クラス４のペプチドは、カルボキシ末端に付加された、１〜２個の電荷を持つアミノ酸をさらに有するものであってもよい。１〜２個の電荷を持つアミノ酸が配列番号１３４４のカルボキシ末端に付加されるいくつかの実施形態では、アミノ酸は、たとえば、グルタミン酸およびアスパラギン酸などの負の電荷を持つアミノ酸である。いくつかの実施形態では、クラス４のペプチドは、配列番号１３４２の配列を有し、天然のグルカゴンペプチドで対応する２７番目および２８番目のうちの少なくとも１つは、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸を有し、配列番号１３４２を、任意に、カルボキシ末端に付加される１〜２個の負の電荷を持つアミノ酸の付加を含むように修飾する。いくつかの実施形態では、負の電荷を持つアミノ酸は、グルタミン酸またはアスパラギン酸である。
過剰なグルカゴン活性を特徴とする疾患または状態を治療するために、本明細書に開示のクラス４のペプチドを、たとえばインスリンをはじめとする他の活性剤と組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、糖尿病患者で安定した血中グルコース濃度を維持しやすくするために、分子量が１０，０００ダルトンを超えるＰＥＧ鎖に共有結合するよう修飾されたクラス４のペプチドを、インスリンとの併用で投与してもよい。本開示のクラス４のペプチドは、単一の組成物としてインスリンと同時投与してもよいし、別々の溶液として同時に投与してもよく、あるいは、インスリンとクラス４のペプチドを互いに異なる時刻に投与してもよい。いくつかの実施形態では、インスリンを含む組成物と、クラス４のペプチドを含む組成物とを、互いに１２時間以内の間隔で投与する。投与されるインスリンに対するクラス４のペプチドの正確な比は、ある程度は患者のグルカゴン濃度についての判断に左右されることになり、ルーチンな実験で求めることが可能なものである。
ダイマーペプチド
また、本開示は、本明細書に開示の修飾されたクラス４のペプチドのマルチマーも包含する。修飾されたクラス４のペプチドのうち２つまたは３つ以上を、当業者に知られた標準的な結合剤と手順を用いて、互いに結合してもよい。たとえば、特に（１１番目、１６番目または１９番目などで）システイン残基、リジン残基、オルニチン残基、ホモシステイン残基またはアセチルフェニルアラニン残基で置換されたクラス４のペプチド（配列番号１３０９、配列番号１３１０、配列番号１３１１、配列番号１３１２など）の場合、二官能性のチオールクロスリンカーと二官能性のアミンクロスリンカーを使用して、２つの修飾されたクラス４のペプチドの間に、ダイマーを形成してもよい。ダイマーは、ホモダイマーであってもよいし、ヘテロダイマーであってもよい。いくつかの実施形態では、ダイマーは、配列番号１３０８、配列番号１３０９、配列番号１３１０、配列番号１３１１、配列番号１３１２、配列番号１３４５、配列番号１３４６または配列番号１３４７からなる群から独立に選択される２つのクラス４のペプチドの間に形成され、ここで、２つのペプチドは、各自ペプチドの１１番目、各ペプチドの１６番目または各ペプチドの１９番目またはこれらの任意の組み合わせに結合したリンカーを介して、互いに結合する。いくつかの実施形態では、結合は、それぞれのクラス４のペプチドのペプチドの１１番目のシステイン残基と１１番目のシステイン残基との間または１９番目のシステイン残基と１９番目のシステイン残基との間あるいは、１１番目のシステイン残基と１９番目のシステイン残基との間のジスルフィド結合である。
同様に、配列番号１３０３、配列番号１３０４、配列番号１３０５、配列番号１３０６、配列番号１３０７、配列番号１３０８、配列番号１３０９、配列番号１３１０、配列番号１３１１、配列番号１３１２、配列番号１３３６、配列番号１３３７、配列番号１３３８、配列番号１３３９、配列番号１３４２からなる群から独立に選択される２つのクラス４のペプチドのペプチド間に、ダイマーを形成してもよく、ここで、結合は、天然のグルカゴンペプチドでの１６番目、２１番目、２４番目から独立に選択されるアミノ酸の位置間に形成される。
いくつかの実施形態によれば、各々が配列番号１３４６の配列を有する２つのクラス４のペプチドを有する、クラス４のペプチドダイマーが提供され、ここで、２つのアンタゴニストは、アミノ酸の２５番目を介したジスルフィド結合によって、互いに結合している。もうひとつの実施形態では、各々が配列番号１３４７の配列を有する２つのクラス４のペプチドを含むクラス４のペプチドダイマーが提供され、ここで、２つのアンタゴニストは、アミノ酸の３５番目を介したジスルフィド結合によって、互いに結合している。いくつかの実施形態では、ダイマーは、１０番目のアミノ酸がグルタミン酸である配列番号１３４６および配列番号１３４７のクラス４のペプチドから形成される。
いくつかの実施形態では、ダイマーは、配列番号１３０７、配列番号１３０８、配列番号１３３６、配列番号１３３７、配列番号１３４０、配列番号１３３９、配列番号１３４０、配列番号１３４１、配列番号１３４２、当該クラス４のペプチドの薬学的に許容される塩からなる群から選択されるクラス４のペプチドの融合ペプチドのホモダイマーであってもよい。いくつかの実施形態によれば、リンカーを介して第２のクラス４のペプチドに結合した第１のクラス４のペプチドを含むダイマーが提供され、ここで、ダイマーの第１および第２のペプチドは、配列番号１３０７、配列番号１３０８、配列番号１３３６、配列番号１３３７、配列番号１３３９、配列番号１３４０、配列番号１３４１、配列番号１３４２、当該グルカゴンポリペプチドの薬学的に許容される塩からなる群から独立に選択される。もうひとつの実施形態では、ダイマーの第１および第２のクラス４のペプチドは、配列番号１３０７、配列番号１３０８、配列番号１３３６、配列番号１３３９からなる群から独立に選択される。
もうひとつの実施形態では、ダイマーは、配列番号１３２３、配列番号１３２４、配列番号１３２５、配列番号１３２６、配列番号１３２７、配列番号１３２８、配列番号１３２９、配列番号１３３０、配列番号１３３１からなる群から選択されるクラス４のペプチドのホモダイマーであってもよい。もうひとつの実施形態では、ダイマーの第１および第２のペプチドが、配番号１３２３、配列番号１３２４、配列番号１３２５、配列番号１３２６、配列番号１３２７、配列番号１３２８からなる群から独立に選択されるアミノ酸配列を有する、クラス４のペプチドダイマーが提供される。もうひとつの実施形態では、ダイマーは、配列番号１３０９、配列番号１３１１、配列番号１３１２からなる群から選択されるクラス４のペプチドのホモダイマーであってもよく、ここで、ペプチドは、グルカゴンペプチドの１１番目または１９番目に共有結合しているポリエチレングリコール鎖をさらに含むものであってもよい。
クラス４のグルカゴン関連ペプチドは、配列番号１３０１〜１３７１のいずれのアミノ酸配列を有するものであってもよく、任意に、グルカゴンアンタゴニスト活性を保持する、最大１個、２個、３個、４個または５個の修飾をさらに有する。
クラス５のグルカゴン関連ペプチド
特定の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、クラス５のグルカゴン関連ペプチドである（たとえば、国際（ＰＣＴ）特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１３３３（その全体を本明細書に援用する）を参照のこと）。
以下のセクションに示す生物学的配列（配列番号１４０１〜１５１８）はいずれも、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１３３３の配列番号１−１１８に対応する。
活性
特定の態様では、クラス５のグルカゴン関連ペプチド（以下、「クラス５のペプチド」と呼ぶ）は、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストであってもよい。グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストは、グルカゴン活性化作用の抑制が望ましく、同時にＧＬＰ−１活性の刺激も望ましい環境であれば、どのような環境でも使用される。たとえば、高血糖症の前臨床モデルでグルカゴンの拮抗作用が示されている糖尿病の治療において、血糖を低下させるためにＧＬＰ−１の刺激と併せてグルカゴンアンタゴニスト活性を使用することが可能であり、ＧＬＰ−１活性はインスリンの産生と関連している。ＧＬＰ−１活性を示す化合物は、肥満を治療し、体重増加を防止するのにも有用であることも知られている。
特定の態様では、クラス５のペプチドは、他のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストについて上述したどのような用途にも適していると思われる。これらの２種類の活性は、別々に、メタボリックシンドローム、特に糖尿病および肥満を治療する上で、極めて望ましい特性であることが示されている。グルカゴンアンタゴニスト活性は、グルカゴン活性化作用の抑制が望ましい環境であれば、どのような環境でも有用である。また、ＧＬＰ−１活性化作用は、インスリンの合成と分泌を刺激する一方で、膵臓からのグルカゴンの内在性分泌をさらに抑制する。２つの薬理学的作用が、代謝の異常を正常化するよう相乗的に機能する。したがって、高血糖症を治療またはグルカゴンの血中濃度またはグルコースの血中濃度が高いことで生じる他の代謝疾患を治療するために、クラス５のペプチドを用いることが可能である。いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示のクラス５のペプチドなどのグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを用いる治療の対象となる患者は、飼いならされた動物であり、別の実施形態では、治療対象となる患者はヒトである。研究では、糖尿病患者におけるグルカゴン抑制の欠如は、ある程度、グリコーゲンの分解を加速させることで、食後高血糖症の一因となる。経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）にて血糖を分析したところ、ソマトスタチン誘導グルカゴンの抑制がなされる状態またはなされない状態で、グルカゴン濃度の高い治療対象者で、グルコースの有意な増加が認められた。したがって、本明細書に記載のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストまたはクラス５のペプチドは、高血糖症の治療に使用でき、糖尿病Ｉ型、真性糖尿病ＩＩ型または妊娠性糖尿病（インスリン依存性または非インスリン依存性）をはじめとするさまざまなタイプの糖尿病を治療し、胃障害、網膜症、血管疾患などの糖尿病の合併症を低減するのに有用であると思われる。
食欲を低減し、あるいは体重減少を促進するための上述したような方法は、体重を落とし、体重増加を防止し、あるいは、薬物誘発性肥満をはじめとするさまざまな原因の肥満を治療し、血管疾患（冠動脈疾患、脳卒中、末梢血管疾患、虚血再灌流障害など）、高血圧症、ＩＩ型糖尿病の発症、高脂血症、筋骨格系疾患をはじめとする肥満に関連する合併症を軽減する上で、有用であると思われる。
当業者に知られた標準的な薬学的に許容されるキャリアおよび投与経路を用いて、クラス５のペプチドを含む薬学的組成物を、調製し、患者に投与することが可能である。したがって、したがって、本開示は、本明細書に開示のクラス５のペプチド１つまたは２つ以上を、薬学的に許容されるキャリアとの組み合わせで含む薬学的組成物も包含する。この薬学的組成物は、クラス５のペプチドを、唯一の薬学的に活性な成分として含むものであってもよいし、クラス５のペプチドを、１種または２種以上の別の活性剤と組み合わせることも可能である。いくつかの実施形態によれば、クラス５のペプチドと、インスリンまたはインスリン類縁体とを含む、組成物が提供される。あるいは、配列番号１４１５または配列番号１４５１の配列を有し、配列番号１４１５または配列番号１４５１の２４番目のアミノ酸に結合した配列番号１４２１（GPSSGAPPPS）または配列番号１４５０のアミノ酸配列と抗肥満ペプチドとをさらに有する、体重減少を誘導または体重増加を防止するために提供される組成物を提供することが可能である。好適な抗肥満ペプチドとして、米国特許第５，６９１，３０９号、同第６，４３６，４３５号または米国特許出願第２００５０１７６６４３号に開示されたものがあげられる。
クラス５のペプチドの構造
いくつかの実施形態によれば、Ｎ末端からの最初の１〜５個アミノ酸残基（最初のアミノ酸、最初の２個のアミノ酸、最初の３個のアミノ酸、最初の４個のアミノ酸、最初の５個のアミノ酸など）の欠失ならびに、たとえば、水素結合またはイオンの相互作用（塩結合の形成など）または共有結合による、（天然のグルカゴンペプチド配列で）１２番目と１６番目、１６番目と２０番目、２０番目と２４番目、２４番目と２８番目から選択されるアミノ酸の対の側鎖同士の結合による、化合物のＣ末端領域でのα螺旋構造の安定化（野生型グルカゴンすなわち配列番号１４０１のアミノ酸番号で１２番目〜２９番目のアミノ酸のあたり）によって修飾されたグルカゴンペプチドを含む、クラス５のペプチドが提供される。あるいは、所望の活性を保持する位置に、１個または２個以上のα，α−二置換アミノ酸を導入することで、１２番目〜２９番目の残基のあたりでのα螺旋の安定化を達成する。いくつかの実施形態では、クラス５のペプチドまたはその類縁体の（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２４番目または２９番目のうちの１箇所、２箇所、３箇所、４箇所または５箇所以上が、α，α−二置換アミノ酸で置換される。たとえば、クラス５のペプチドまたはその類縁体の（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１６番目をアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）で置換すると、塩結合またはラクタムが存在しない状態で、安定化したα螺旋が提供される。いくつかの実施形態では、（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１６番目、２０番目、２１番目または２４番目のうちの１箇所、２箇所、３箇所または４箇所以上を、ＡＩＢで置換する。
いくつかの実施形態によれば、ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対して天然のＧＬＰ−１が達成する最大限の活性化作用の少なくとも８０％を示し、in vitroアッセイでのｃＡＭＰの産生を基準に判断できる、グルカゴン受容体に対する最大限のグルカゴン誘導ｃＡＭＰ産生を少なくとも約５０％低減するグルカゴンアンタゴニスト活性を示す、クラス５のペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、クラス５のペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が天然のＧＬＰ−１の少なくとも９０％であり、グルカゴン受容体に対する最大限のグルカゴン誘導ｃＡＭＰ産生を少なくとも約８０％低減する、グルカゴンアンタゴニスト活性を示す。
いくつかの実施形態によれば、クラス５のペプチドは、配列番号１４０２の誘導体ペプチドを有し、この場合のペプチドは、配列番号１４０２に比して、１番目、２番目、４番目、５番目、６番目、７番目、８番目、９番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１５番目、１６番目、１９番目、２２番目、２４番目から選択される１〜３箇所のアミノ酸の位置でのアミノ酸置換をさらに有し、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が天然のＧＬＰ−１の少なくとも９０％であり、グルカゴン受容体に対する最大限のグルカゴン誘導ｃＡＭＰ産生を少なくとも約８０％低減する、グルカゴンアンタゴニスト活性を示す。
いくつかの実施形態では、クラス５のペプチドのＣ末端領域（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で１２番目〜２９番目のアミノ酸のあたり）のα螺旋構造を、たとえば、共有結合または非共有結合の分子内架橋の形成あるいは、１２番目〜２９番目あたりで、α螺旋を安定化するアミノ酸（α，α−二置換アミノ酸など）で置換するアミノ酸置換および／またはこれを挿入することによって、安定化する。いくつかの実施形態では、クラス５のペプチドまたはその類縁体の（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２４番目または２９番目のうちの１箇所、２箇所、３箇所、４箇所または５箇所以上を、α，α−二置換アミノ酸、たとえば、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）で置換する。たとえば、クラス５のペプチドまたはその類縁体の（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１６番目を、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）で置換する戸、塩結合またはラクタムが存在しない状態で、安定化したα螺旋が提供される。
いくつかの実施形態では、クラス５のペプチドは、配列番号１４１５または配列番号１４５１を有し、特に、配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７、配列番号１４０８、配列番号１４０９、配列番号１４１６、配列番号１４１７、配列番号１４１８、配列番号１４１９、配列番号１４２２、配列番号１４２３、配列番号１４２４、配列番号１４２５からなる群から選択される配列を有する。別の実施形態では、クラス５のペプチドは、配列番号１４１５または配列番号１４５１の誘導体ペプチドを有し、この場合のペプチドは、配列番号１４１５または配列番号１４５１に比して、１番目、２番目、５番目、６番目、８番目、９番目、１２番目、１３番目、１４番目から選択される１〜３箇所のアミノ酸の位置で、アミノ酸置換をさらに有する。いくつかの実施形態では、１番目、２番目、５番目、６番目、８番目、９番目、１２番目、１３番目、１４番目での置換は、保存的なアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、配列番号１４０５または配列番号１４０６の２４番目のスレオニンを、グリシンで置換する。
いくつかの実施形態によれば、クラス５のペプチドは、ペプチドのさらなる修飾を表すものであり、ここで、Ｎ末端での欠失に加え、天然のグルカゴンペプチドの６番目のフェニルアラニンが、たとえば、Ｎ末端のアミノ基に代えてヒドロキシ基を含むように修飾される。別の実施形態では、Ｃ末端のアミノ酸の天然のカルボン酸に代えて、アミドまたはエステルなどの電荷が中性の基が用いられる。
いくつかの実施形態によれば、天然のグルカゴンの最初の３個〜５個のアミノ酸が欠失され、天然のグルカゴンペプチドで９番目のアミノ酸が、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、システインのスルホン酸誘導体または以下に示す構造を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体からなる群から選択されるアミノ酸で置換された、クラス５のペプチドが調製される。
Figure 2013540102

式中、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニルまたはＣ２〜Ｃ４アルキニルであり、グルカゴンのＣ末端領域（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で１２番目〜２９番目のアミノ酸のあたり）のα螺旋構造が、たとえば、天然のグルカゴンペプチドで１２番目と１６番目のアミノ酸または１６番目と２０番目のアミノ酸の側鎖間に形成されたラクタム架橋によって安定化される。共有結合して原子７個の結合架橋を形成できるアミノ酸対形成の例を、本開示全体で詳細に説明する。いくつかの実施形態では、システインのスルホン酸誘導体は、システイン酸またはホモシステイン酸である。
いくつかの実施形態では、配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７または配列番号１４０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するクラス５が提供され、ここで、当該ペプチドは、配列番号１４０５の場合は７番目と１１番目、配列番号１４０６の場合は１１番目と１５番目、配列番号１４０７の場合は１５番目と１９番目、配列番号１４０８の場合は１９番目と２４番目のアミノ酸の側鎖間に形成されるラクタム環を有し、前記配列は各々、ペプチドに共有結合している親水体を含むようにさらに修飾される。特に、いくつかの実施形態では、ラクタムを持つクラス５のペプチド各々を、ポリエチレングリコール鎖の共有結合によって修飾する。たとえば、配列番号１４０５を有するクラス５のペプチドの場合、このペプチドを、１２番目、１５番目、１６番目、１９番目、２４番目からなる群から選択される位置でＰＥＧ化する；配列番号１４０６を有するクラス５のペプチドの場合、このペプチドを、１２番目、１６番目、１９番目、２４番目からなる群から選択される位置でＰＥＧ化する；配列番号１４０７を有するクラス５のペプチドの場合、このペプチドを、１１番目、１２番目、１６番目、２４番目からなる群から選択される位置でＰＥＧ化する；配列番号１４０８を有するクラス５のペプチドの場合、このペプチドを、１１番目、１２番目、１５番目、１６番目からなる群から選択される位置でＰＥＧ化する。いくつかの実施形態によれば、配列番号１４４７または配列番号１４４８を有するクラス５のペプチドが提供され、ここで、ペプチドは、配列番号１４４７または配列番号１４４８の配列で１２番目、１６番目、１９番目、２４番目からなる群から選択される位置でＰＥＧ化される。別の実施形態では、配列番号１４２１の配列をペプチドのカルボキシ末端に付加することで、配列番号１４４７または配列番号１４４８のペプチドを、さらに修飾する。
上記にて詳細に説明したように、特定の態様では、天然のグルカゴンの最初の５個のアミノ酸が欠失され、Ｎ末端のアミノ酸（フェニルアラニン）のアミノ基が、ヒドロキシ基で置換され（すなわち、最初のアミノ酸がフェニル乳酸である）、１２番目と１６番目、１６番目と２０番目、２０番目と２４番目、２４番目と２８番目から選択される１つまたは２ち以上のアミノ酸の対の側鎖が互いに結合しているため、クラス５のペプチドのα螺旋が安定化している、クラス５のペプチドが提供される。
いくつかの実施形態によれば、配列番号１４０２の１１番目（天然のグルカゴンのアミノ酸番号で１６番目）のセリン残基を、グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、スレオニンまたはグリシンからなる群から選択されるアミノ酸で置換することによって修飾された配列番号１４０２の配列を有する、クラス５のペプチドが提供される。いくつかの実施形態によれば、配列番号１４０２の１１番目のセリン残基を、グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換する。いくつかの実施形態では、セリン残基をグルタミン酸で置換する。いくつかの実施形態によれば、クラス５のペプチドは、配列番号１４３８の配列を有する。
いくつかの実施形態では、配列番号１４０２のペプチドのカルボキシ末端の三次元構造を安定化するために、２つのアミノ酸側鎖間に分子内架橋が形成された、クラス５のペプチドが提供される。特に、配列番号１４０２の７番目と１１番目、１１番目と１５番目、１５番目と１９番目または１９番目と２３番目のアミノ酸の対から選択される１個または２個以上のアミノ酸の側鎖を互いに結合することで、Ｃ末端領域のα螺旋を安定化する。２つの側鎖を、水素結合、イオンの相互作用（塩結合の形成など）または共有結合によって、互いに結合することが可能である。いくつかの実施形態によれば、リンカーのサイズは原子７〜９個であり、いくつかの実施形態では、リンカーのサイズは原子８個である。いくつかの実施形態では、クラス５のペプチドは、配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７、配列番号１４０８からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、クラス５のペプチドのＣ末端のアミノ酸は、天然のアミノ酸に存在するカルボン酸基を置換するアミド基を有する。
いくつかの実施形態によれば、類縁体が配列番号１４０９のアミノ酸配列を有するクラス５のペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１４０９のペプチドのカルボキシ末端の三次元構造を、ペプチドの側鎖間に共有結合を形成することで安定化する。いくつかの実施形態では、２つのアミノ酸側鎖を互いに結合し、ラクタム環を形成する。ラクタム環のサイズは、アミノ酸側鎖の長さに応じて可変であり、いくつかの実施形態では、リジンアミノ酸の側鎖をグルタミン酸の側鎖に結合することで、ラクタムを形成する。いくつかの実施形態では、クラス５のペプチドのＣ末端のアミノ酸は、天然のアミノ酸に存在するカルボン酸基を置換するアミド基を有する。
ラクタム環のアミド結合の順序を逆にしてもよい（ラクタム環を、１２番目のリジンと１６番目のグルタミン酸の側鎖間あるいは、１２番目のグルタミン酸と１６番目のリジンとの間に形成してもよいなど）。いくつかの実施形態によれば、配列番号１４０９の７番目と１１番目、１１番目と１５番目、１５番目と１９番目または１９番目と２３番目のアミノ酸の対からなる群から選択されるアミノ酸の側鎖対の間に少なくとも１個のラクタム環が形成される、配列番号１４０９のグルカゴン類縁体が提供される。いくつかの実施形態では、ペプチドが配列番号１４１０の配列を有し、当該配列は、配列番号１４１０の７番目と１１番目のアミノ酸の間または１１番目と１５番目のアミノ酸の間または１５番目と１９番目のアミノ酸の間に形成される分子内ラクタム架橋をさらに含む、クラス５のペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、ペプチドが配列番号１４１１の配列を有し、当該配列が、配列番号１４１１の７番目と１１番目のアミノ酸の間または１１番目と１５番目のアミノ酸の間に形成される分子内ラクタム架橋をさらに有する、クラス５のペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、クラス５のペプチドは、配列番号１４１７の配列を有する。
配列番号１４０５の誘導体を有する別のクラス５のペプチドが提供され、ここで、配列番号１４０５の１０番目（天然のグルカゴンの１５番目）のアスパラギン酸は、グルタミン酸、以下の一般構造を有するアミノ酸で置換されている。
Figure 2013540102

式中、Ｘ６は、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ２〜Ｃ３アルケンまたはＣ２〜Ｃ３アルキニルであり、いくつかの実施形態では、Ｘ６はＣ１〜Ｃ３アルキルであり、もうひとつの実施形態では、Ｘ６はＣ２アルキルである。いくつかの実施形態では、配列番号１４０９の１０番目（天然のグルカゴンの１５番目）が、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸、ホモグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換される、配列番号１４０９のクラス５のペプチド誘導体が提供される。別の実施形態では、配列番号１４０９の１０番目を、システイン酸またはホモシステイン酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換する。いくつかの実施形態では、配列番号１４０６、配列番号１４０７または配列番号１４０８の１０番目が、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸、ホモグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換される、配列番号１４０６、配列番号１４０７または配列番号１４０８のクラス５のペプチド誘導体が提供される。いくつかの実施形態では、クラス５のペプチドのＣ末端のアミノ酸は、天然のアミノ酸に存在するカルボン酸基に代えて、アミド基を有する。
いくつかの実施形態では、クラス５のペプチドのアミノ酸を少なくとも１個のシステイン残基で置換し、この場合のシステイン残基の側鎖を、マレイミド、ビニルスルホン、２−ピリジルチオ、ハロアルキル、ハロアシルなどをはじめとするチオール反応性試薬でさらに修飾する。これらのチオール反応性試薬は、カルボキシ基、ケト基、ヒドロキシ基、エーテル基ならびに、ポリエチレングリコール単位などの他の親水体を含むものであってもよい。別の実施形態では、クラス５のペプチドのアミノ酸をリジンで置換し、ポリエチレングリコールなどの親水体のアルデヒドまたはカルボン酸の活性エステル（スクシンイミド、無水物など）などのアミン反応性試薬を用いて、置換するリジン残基の側鎖をさらに修飾する。いくつかの実施形態によれば、配列番号１４０５のペプチドの７番目に対応するリジン残基をアルギニンに置換し、単一のリジン置換を、配列番号１４０５の１２番目、１５番目、１６番目、１９番目、２４番目に対応するアミノ酸の１つに代えて、挿入する。
もうひとつの実施形態では、本明細書に開示のクラス５のペプチドの２２番目に対応するメチオニン残基をロイシンまたはノルロイシンに変更して、ペプチドの酸化による分解を防止する。
さらに、いくつかの態様におけるクラス５のペプチドは、グルカゴン類縁体の機能に重要ではないことが知られている位置でのアミノ酸置換も包含する。いくつかの実施形態では、置換は、２番目、５番目、６番目、７番目、８番目、９番目、１２番目、１３番目、１４番目、１５番目、１６番目、１９番目、２２番目、２３番目または２４番目からなる群から選択される１箇所、２箇所または３箇所における保存的なアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、天然のグルカゴンペプチドの１６番目、１７番目、２０番目、２１番目、２４番目または２９番目に対応するアミノ酸、特に、天然のグルカゴンでの２１番目および／または２４番目を、システインまたはリジンで置換し、この場合のＰＥＧ鎖は、置換されたシステイン残基またはリジン残基に共有結合している。
いくつかの実施形態によれば、配列番号１４０９からなる配列を有し、ペプチドの１１番目、１２番目、１５番目、１６番目、１９番目および／または２４番目に対応する位置で、１個または２個以上の追加のアミノ酸置換（システインでの置換などを含む）によってさらに修飾された、クラス５のペプチドが提供され、この場合のアミノ酸置換は、ＰＥＧなどをはじめとする親水体との架橋に適した側鎖を有するアミノ酸を有する。この天然のグルカゴンについては、天然のアミノ酸で置換してもよいし、合成（非天然）のアミノ酸で置換してもよい。合成または非天然のアミノ酸は、in vivoでは天然に生じないが、本明細書に記載のペプチド構造に取り込むことは可能である。いくつかの実施形態では、ペプチドが配列番号１４０９の配列を有し、ペプチドの１６番目または１９番目に結合したポリエチレングリコール鎖をさらに有する、クラス５のペプチドが提供される。別の実施形態では、グルカゴン類縁体のＣ末端を、カルボン酸基がアミド基に置換されるように修飾する。
いくつかの実施形態によれば、以下の配列からなる群から選択されるグルカゴン類縁体を有する、クラス５のペプチドが提供される。
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ２（配列番号１４３９）
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ２（配列番号１４１３）
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ２（配列番号１４１４）
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ２（配列番号１４１２）
ここで、４番目のＸａａ＝アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸またはホモシステイン酸であり、１０番目のＸａａ＝Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸であり、１６番目のＸａａは、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチルフェニルアラニンであり、１９番目のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、アセチルフェニルアラニンであり、２２番目のＸａａ＝Ｍｅｔ、ＬｅｕまたはＮｌｅであり、Ｒ１は、ＯＨまたはＮＨ２であり、Ｒ２は、Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ（配列番号１４２１）、Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｘａａ（配列番号１４５０；ここで、Ｘａａは、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインまたはアセチルフェニルアラニンである）、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２であり、ここで、ペプチドは、配列番号１４１３の１６番目、配列番号１４１４の１９番目と配列番号１４１２の１６番目および１９番目で、任意にＰＥＧ化される。いくつかの実施形態では、配列番号１４１２〜１４１４および１４３９の２４番目のＴｈｒをＧｌｙで置換する。いくつかの実施形態によれば、ペプチドは、配列番号１３または配列番号１４１４の配列を有し、式中、Ｒ１はＯＨである。いくつかの実施形態によれば、ペプチドは、配列番号１４１３または配列番号１４１４の配列を有し、ここで、Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＣＯＮＨ２である。いくつかの実施形態によれば、ペプチドは、配列番号１４１３または配列番号１４１４の配列を有し、ここで、Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＣＯＮＨ２であり、２４番目のスレオニンはグリシンで置換される。
いくつかの実施形態では、クラス５のペプチドは、対応するアミノ酸の位置で、天然のグルカゴン残基（単数または複数）を置換することによって、天然のＧＬＰ−１の１個または２個以上のアミノ酸を有するようにさらに修飾される。たとえば、クラス５のペプチドは、（天然のグルカゴンのアミノ酸番号で）２番目、３番目、１７番目、１８番目、２１番目、２３番目、２４番目のいずれかに、１個または２個以上のアミノ酸置換を有するものであってもよい。具体的な実施形態では、以下のアミノ酸置換のうちの１個または２個以上で、クラス５のペプチドを修飾する：２番目のセリンをＡｌａで置換し、３番目のグルタミンをＧｌｕで置換し、１７番目のアルギニンをＧｌｎで置換し、１８番目のＡｒｇをＡｌａで置換し、２１番目のＡｓｐをＧｌｕで置換し、２３番目のバリンをＩｌｅで置換し、２４番目のＧｌｎをＡｌａで置換する（アミノ酸の位置は、天然のグルカゴン配列での位置である）。具体的な実施形態では、（天然のグルカゴンのアミノ酸番号で）２番目のセリンをＡｌａで置換し、３番目のグルタミンをＧｌｕで置換することによって、クラス５のペプチドを修飾する。もうひとつの具体的な実施形態では、以下のアミノ酸置換のすべてでクラス５のペプチドを修飾する。（天然のグルカゴンのアミノ酸番号で）１７番目のアルギニンをＧｌｎで置換し、１８番目のＡｒｇをＡｌａで置換し、２１番目のＡｓｐをＧｌｕで置換し、２３番目のバリンをＩｌｅで置換し、２４番目のＧｌｎをＡｌａで置換する。さらにもうひとつの具体的な実施形態では、（配列番号１４０１の番号で）２１番目のＧｌｕだけを含むようにクラス５のペプチドを修飾する。したがって、クラス５のペプチドは、配列番号１４６０〜１４７０、１４７３〜１４７８、１４８０〜１４８８、１４９０〜１４９６、１５０３、１５０４、１５０６、１５１４〜１５１８のいずれかのアミノ酸配列を有するものであってもよい。
また、本明細書で提供されるのは、（１）本明細書に記載の手段で安定化したα螺旋（たとえば、分子内架橋あるいは、（配列番号１４０１の番号で）１６番目での１個または２個以上のα，α二置換アミノ酸または酸性アミノ酸の取り込みまたはこれらの組み合わせ、（２）Ｃ末端のカルボキシレートに代えて、Ｃ末端のアミドまたはエステル、（３）一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを有するクラス５のペプチドまたはその結合体である。
ここで、Ａは以下の化合物からなる群から選択され、
（ｉ）フェニル乳酸（ＰＬＡ）
（ｉｉ）ＰＬＡのオキシ誘導体
（ｉｉｉ）ペプチドの２個の連続したアミノ酸がエステル結合またはエーテル結合を介して結合している、２〜６個のアミノ酸からなるペプチド
Ｂは、任意に、本明細書に記載するような１個または２個以上のアミノ酸修飾を有する、配列番号１４０１のｐ番目〜２６番目（ｐは、３、４、５、６または７である）のアミノ酸を表し、たとえば、クラス５のペプチドで説明したいずれかの修飾を含む。たとえば、１個または２個以上の修飾は、以下の修飾からなる群から選択される。
（ｉｖ）（配列番号１４０１のアミノ酸番号で）９番目のＡｓｐが、Ｇｌｕ、Ｃｙｓのスルホン酸誘導体、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸または以下に示す構造を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体で置換される
Figure 2013540102

（式中、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニルまたはＣ２〜Ｃ４アルキニルである）
（ｖ）（配列番号１４０１のアミノ酸番号で）１０番目、２０番目、２４番目の１個または２個のアミノ酸を、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、アミド結合またはアルキルアミン結合を介してアシル基またはアルキル基に共有結合しているアミノ酸で置換
（ｖｉ）（配列番号１４０１のアミノ酸番号で）１６番目、１７番目、２０番目、２１番目、２４番目の１個または２個のアミノ酸を、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン、ホモシステイン、アセチルフェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群（この群のアミノ酸は、親水体に共有結合している）から選択されるアミノ酸で置換
（ｖｉｉ）（配列番号１４０１の番号で）１５番目のＡｓｐが、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換される
（ｖｉｉｉ）（配列番号１４０１の番号で）１６番目のＳｅｒが、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換される
（ｉｘ）（配列番号１４０１のアミノ酸の番号で）１７番目のＡｒｇがＧｌｎで置換され、１８番目のＡｒｇがＡｌａで置換され、２１番目のＡｓｐがＧｌｕで置換され、２３番目のバリンがＩｌｅで置換され、２４番目のＧｌｎがＡｌａで置換される
（ｘ）（配列番号１４０１のアミノ酸番号で）１６番目のＳｅｒがＧｌｕで置換され、２０番目のグルタミンがＧｌｕで置換され、あるいは、２４番目のＧｌｎがＧｌｕで置換される
（一般構造Ａ−Ｂ−Ｃ）のＣは、以下からなる群から選択される。
（ｖｉｉ）Ｘ
（ｖｉｉｉ）Ｘ−Ｙ
（ｉｘ）Ｘ−Ｙ−Ｚ
（ｘ）Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１０
ここで、Ｘは、Ｍｅｔ、ＬｅｕまたはＮｌｅであり、Ｙは、Ａｓｎまたは電荷を持つアミノ酸であり、Ｚは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）、ホモシステイン、アセチルフェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）または電荷を持つアミノ酸であり、Ｒ１０は、配列番号１４２１、１４２６、１４２７、１４５０からなる群から選択される。
具体的な態様において、ペプチドは、ＰＬＡのオキシ誘導体を有する。本明細書で使用する場合、「ＰＬＡのオキシ誘導体」とは、ヒドロキシ基がＯ−Ｒ１１で置換された、ＰＬＡの修飾された構造を有する化合物を示し、式中、Ｒ１１は、化学部分である。この点について、ＰＬＡのオキシ誘導体は、たとえば、ＰＬＡのエステルまたはＰＬＡのエーテルであってもよい。
ＰＬＡのオキシ誘導体を生成する方法は、当分野で知られている。たとえば、オキシ誘導体がＰＬＡのエステルである場合、ＰＬＡのヒドロキシルと求核物質を持つカルボニルとの反応によって、エステルを形成してもよい。求核物質は、アミンまたはヒドロキシルを含むがこれらに限定されるものではない、好適な求核物質であればよい。したがって、ＰＬＡのエステルには、式ＩＶの構造を有するものを用いることが可能である。
Figure 2013540102

式中、Ｒ７は、ＰＬＡのヒドロキシルと求核物質を持つカルボニルとの反応時に形成されるエステルである。
求核物質を持つカルボニル（ＰＬＡのヒドロキシルと反応してエステルを形成する）は、たとえば、カルボン酸、カルボン酸誘導体またはカルボン酸の活性化エステルであってもよい。カルボン酸誘導体は、塩化アシル、酸無水物、アミド、エステルまたはニトリルであってもよいが、これらに限定されるものではない。カルボン酸の活性化エステルは、たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、トシレート（Ｔｏｓ）、カルボジイミドまたはヘキサフルオロホスフェートであってもよい。いくつかの実施形態では、カルボジイミドは、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）または１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣＤ）である。いくつかの実施形態では、ヘキサフルオロホスフェートは、ヘキサフルオロホスフェートベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−ホスフェート（ＨＢＴＵ）からなる群から選択される。
ヒドロキシ基（ＰＬＡのヒドロキシルなど）との反応からエーテルを生成する方法も、当分野で知られている。たとえば、ＰＬＡのヒドロキシ基を、ハロゲン化アルキルまたはトシル化アルキルアルコールと反応させ、エーテル結合を形成する。
具体的な実施形態では、酸素含有結合を介して（エステル結合またはエーテル結合を介するなど）ＰＬＡに結合する化学部分は、ポリマー（ポリアルキレングリコールなど）、炭水化物、アミノ酸、ペプチドまたは脂質、たとえば、脂肪酸またはステロイドである。
具体的な実施形態では、化学部分はアミノ酸であり、これは任意に、式ＩＶがデプシペプチドになるようなペプチドの一部であってもよい。この点について、ペプチドが、ＰＬＡ残基より手前に１個または２個以上（１個、２個、３個、４個、５個、６個またはそれより多いなど）のアミノ酸のＮ末端を有するように、ＰＬＡがペプチドのＮ末端のアミノ酸残基以外の位置にあってもよい。たとえば、ペプチドは、ｎ番目にＰＬＡを有するものであってもよく、ここで、ｎは、ペプチドの２、３、４、５または６である。
ＰＬＡ残基よりＮ末端側のアミノ酸は、合成であっても天然であってもよい。具体的な実施形態では、Ｎ末端ＰＬＡであるアミノ酸は、天然のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＰＬＡよりＮ末端側のアミノ酸は、天然のグルカゴンのＮ末端のアミノ酸である。たとえば、ペプチドは、Ｎ末端に、配列番号１４５２〜１４５６のいずれかのアミノ酸配列を有するものであってもよく、ここで、ＰＬＡは、エステル結合を介してスレオニンに結合している。
配列番号１４５２ Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号１４５３ Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号１４５４ Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号１４５５ Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号１４５６ Ｔｈｒ−ＰＬＡ
別の実施形態では、Ｎ末端のアミノ酸のうちの１個または２個以上を、天然のグルカゴンのアミノ酸以外のアミノ酸で置換してもよい。たとえば、ペプチドが、５番目または６番目のアミノ酸としてＰＬＡを有する場合、１番目および／または２番目のアミノ酸は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を低減するアミノ酸であってもよい。特に、いくつかの実施形態では、ペプチドの１番目は、Ｄ−ヒスチジン、α，α−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、α−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシルヒスチジン、アセチルヒスチジン、ホモヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸である。特に、いくつかの実施形態では、アンタゴニスト／アゴニストのペプチドの２番目は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）からなる群から選択されるアミノ酸である。また、たとえば、ペプチドが、４番目、５番目または６番目のアミノ酸としてＰＬＡを有する場合、ペプチドの３番目のアミノ酸は、天然のグルカゴンでは天然のグルタミン残基であるのに対し、グルタミン酸であってもよい。本発明の例示としての実施形態では、ペプチドは、Ｎ末端に、配列番号１４５７〜１４５９のいずれかのアミノ酸配列を有する。
式ＩＶの化合物を有するペプチドに関して、ポリマーは、ＰＬＡのヒドロキシ基と反応できるものであれば、どのようなポリマーであってもよい。ポリマーは、自然にまたは普通に求核物質を持つカルボニルを有するものであってもよい。あるいは、ポリマーは、カルボニルを持つカルボニルを含むように誘導体化されたものであってもよい。ポリマーは、以下に示すいずれかの物質の誘導体化されたポリマーであってもよい：ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレンおよびこれらの誘導体（ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレートなど）、アクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルのポリマー（ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）など）、ポリビニルポリマー（ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリ（ビニルアセテート）、ポリビニルピロリドンなど）、ポリグリコライド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびこれらのコポリマー、セルロース（アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシ−プロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシルエチルセルロース、三酢酸セルロース、セルロース硫酸ナトリウム塩など）、ポリプロピレン、ポリエチレン（ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）など）、ポリスチレン。
ポリマーは、合成生分解性ポリマー（乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コカプロラクトン）など）、天然の生分解性ポリマー（たとえば、アルギン酸および他の多糖類（デキストランおよびセルロースを含む）、コラーゲン、これらの化学的誘導体（置換、化学基の付加、たとえば、アルキル、アルキレン、ヒドロキシル化、酸化ならびに、当業者によってルーチンになされる他の修飾）、アルブミンおよび他の親水性のタンパク質（たとえば、ゼインおよび他のプロラミンおよび疎水性タンパク質））ならびにこれらのコポリマーまたは混合物をはじめとする、生分解性ポリマーであってもよい。通常、これらの物質は、in vivoでの酵素による加水分解または水への曝露によって、あるいは表面が浸食されたり、内部まで一挙に浸食されたりすることで、分解される。
ポリマーは、H. S. Sawhney, C. P. Pathak and J. A. Hubbell in Macromolecules, 1993, 26, 581-587（その教示内容を本明細書に援用する）に記載された生浸食性ハイドロゲル、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ酸無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）などの生付着性ポリマーであってもよい。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、水溶性ポリマーである。好適な水溶性ポリマーは当分野で知られており、たとえば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ；Klucel）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ；Methocel）、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルブチルセルロース、ヒドロキシプロピルペンチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース（Ethocel）、ヒドロキシエチルセルロース、さまざまなアルキルセルロースおよびヒドロキシアルキルセルロース、さまざまなセルロースエーテル、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルシウムカルボキシメチルセルロース、酢酸ビニル／クロトン酸コポリマー、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ヒドロキシメチルメタクリレート、メタクリル酸コポリマー、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリレート、無水マレイン酸／メチルビニルエーテルコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウムおよびポリアクリル酸カルシウム、ポリアクリル酸、酸性カルボキシポリマー、カルボキシポリメチレン、カルボキシビニルポリマー、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、ポリメチルビニルエーテルコ無水マレイン酸、カルボキシメチルアミド、カリウムメタクリレートジビニルベンゼンコポリマー、ポリオキシエチレングリコール、ポリエチレンオキシドならびに、これらの誘導体、塩および組み合わせがあげられる。
具体的な実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などをはじめとするポリアルキレングリコールである。
炭水化物は、α脱離基を持つカルボニルを有するまたは有するようにできるものであれば、どのような炭水化物であってもよい。炭水化物は、たとえば、α脱離基を持つカルボニルを有するように誘導体化されたものであってもよい。この点について、炭水化物は、単糖（グルコース、ガラクトース、フルクトースなど）、二糖（スクロース、ラクトース、マルトースなど）、オリゴ糖（ラフィノース、スタキオースなど）、多糖（スターチ、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、カロース、ラミナリン、キシラン、マンナン、フコイダン、ガラクトマンナンの誘導体化された形態であってもよい。
脂質は、α脱離基を持つカルボニルを有するどのような脂質であってもよい。脂質は、たとえば、カルボニルを有するように誘導体化されたものであってもよい。この点について、脂質は、脂肪酸（Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸、エイコサノイド、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン、Ｎ−アシルエタノールアミンなど）、グリセロ脂質（一置換グリセロール、二置換グリセロール、三置換グリセロールなど）、グリセロリン脂質（ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンなど）、スフィンゴ脂質（スフィンゴシン、セラミドなど）、ステロール脂質（ステロイド、コレステロールなど）、フェノール脂質、糖脂質またはポリケタイドの誘導体であってもよい。
オイル、ワックス、コレステロール、ステロール、脂溶性ビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質。
いくつかの実施形態では、Ｒ７は、分子量が約１００ｋＤａまたはそれ未満、たとえば、約９０ｋＤａまたはそれ未満、約８０ｋＤａまたはそれ未満、約７０ｋＤａまたはそれ未満、約６０ｋＤａまたはそれ未満、約５０ｋＤａまたはそれ未満、約４０ｋＤａまたはそれ未満である。したがって、Ｒ７は、分子量が約３５ｋＤａまたはそれ未満、約３０ｋＤａまたはそれ未満、約２５ｋＤａまたはそれ未満、約２０ｋＤａまたはそれ未満、約１５ｋＤａまたはそれ未満、約１０ｋＤａまたはそれ未満、約５ｋＤａまたはそれ未満あるいは、約１ｋＤａであってもよい。
別の実施形態では、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを有するペプチドは、Ａとして２〜６個のアミノ酸からなるペプチドを有し、この場合、Ａのペプチドの２個の連続したアミノ酸は、エステル結合またはエーテル結合を介して結合している。エステル結合またはエーテル結合は、たとえば、２番目と３番目のアミノ酸、３番目と４番目のアミノ酸、４番目と５番目のアミノ酸または５番目と６番目のアミノ酸の間であってもよい。任意に、ポリマー（親水性ポリマーなど）への結合を含むもうひとつの化学部分への共有結合、アルキル化またはアシル化によって、Ａのペプチドをさらに修飾してもよい。
具体的な実施形態では、ＰＬＡを有する上述したクラス５のペプチドを、ＰＬＡのエステルまたはＰＬＡのエーテルなどのＰＬＡのオキシ誘導体を有するように修飾する。たとえば、クラス５のペプチドは、配列番号１４０２、１４０５〜１４２０、１４２２〜１４２５、１４３２〜１４３６、１４３８、１４３９、１４４５、１４４６、１４５１のいずれのアミノ酸配列を有するものであってもよく、ここで、ＰＬＡは、エステル結合またはエーテル結合を介して、アミノ酸、ペプチド、ポリマー、アシル基またはアルキル基に結合している。アミノ酸、ペプチド、ポリマー、アシル基またはアルキル基は、本明細書に記載のいずれであってもよい。ＰＬＡがエステル結合を介してアミノ酸またはペプチドに結合している場合、クラス５のペプチドは、デプシペプチドであるとみなすことができる。
また、もうひとつの具体的な実施形態では、ＰＬＡを欠いた上述したクラス５のペプチドを、（天然のグルカゴンの番号で）７番目のアミノ酸よりＮ末端側の２個の連続したアミノ酸の間に少なくとも１個のエステル結合またはエーテル結合を有するように修飾する。具体的な実施形態では、クラス５のペプチドは、２個の連続したアミノ酸の間に、少なくとも１個のエステル結合またはエーテル結合を有する。一層具体的な実施形態では、クラス５のペプチドは、配列番号１４０１のＮ末端の６個のアミノ酸を有し、Ｎ末端の６個のアミノ酸の２個の連続したアミノ酸が、エステル結合またはエーテル結合を介して結合している。
Ａのペプチドは、少なくとも２個の連続したアミノ酸がエステル結合またはエーテル結合を介して結合されているかぎり、合成または天然のどのようなアミノ酸を有するものであってもよい。具体的な実施形態では、Ａのペプチドは、天然のグルカゴンのアミノ酸を有する。１番目および／または２番目のアミノ酸は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を低減するアミノ酸であってもよい。たとえば、Ａのペプチドは、１番目に、Ｄ−ヒスチジン、α，α−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、α−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシルヒスチジン、アセチルヒスチジン、ホモヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸を含むものであってもよい。特に、いくつかの実施形態では、Ａのペプチドの２番目は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）からなる群から選択されるアミノ酸である。また、たとえば、Ａのペプチドの３番目のアミノ酸は、天然のグルカゴンでは天然のグルタミン残基であるのに対し、グルタミン酸であってもよい。したがって、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃのペプチドは、以下に示すアミノ酸配列を有するものであってもよい。
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１５０７）
Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１５０８）または
Ｘａａ３−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１５０９）
ここで、Ｘａａ１は、Ｈｉｓ、Ｄ−ヒスチジン、α，α−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、α−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシルヒスチジン、アセチルヒスチジン、ホモヒスチジンからなる群から選択され、Ｘａａ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群から選択され、Ｘａａ３は、ＧｌｎまたはＧｌｕである。
いくつかの実施形態では、Ｂは、最大で３個のアミノ酸修飾によって修飾される。たとえば、配列番号１４０１の天然のアミノ酸配列を表すＢは、１個または２個以上の保存的なアミノ酸修飾によって修飾される。
もうひとつの実施形態では、Ｂは、本明細書に記載するような（ｉｖ）〜（ｘ）からなる群から選択される１個または２個以上のアミノ酸修飾を有する。具体的な実施形態では、Ｂは、アミノ酸修飾（ｖ）および（ｖｉ）の一方または両方を有する。別の具体的な実施形態では、Ｂは、（ｖ）および（ｖｉ）に加えて、（ｉｖ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘ）からなる群から選択されるアミノ酸修飾のうちの１つまたは組み合わせを有する。
本明細書で説明するように、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを有するペプチドは、本明細書に記載するように、Ｙおよび／またはＺなどのＣ末端に、１個または２個以上の電荷を持つアミノ酸を有するものであってもよい。上記に代えてまたは上記に加えて、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを有するペプチドは、ＣがＸ−Ｙ−Ｚを有する場合、ＺよりＣ末端側に、１〜２個の電荷を持つアミノ酸をさらに有するものであってもよい。電荷を持つアミノ酸は、たとえば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕのうちの１つであってもよい。具体的な実施形態では、ＹはＡｓｐである。
いくつかの実施形態では、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを有するペプチドは、（配列番号１４０１のアミノ酸番号で）１番目、１６番目、２０番目、２１番目または２４番目または一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを有するペプチドのＮ末端残基またはＣ末端残基に、アミノ酸残基に共有結合する親水体を有する。具体的な実施形態では、親水体は、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを有するペプチドのＣｙｓ残基に結合される。この点について、天然のグルカゴン（配列番号１４０１）の１６番目、２１番目、２４番目または２９番目のアミノ酸を、Ｃｙｓ残基で置換してもよい。あるいは、たとえば、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを有するペプチドが、Ｃ末端の延長部分（配列番号１４０１のアミノ酸番号での位置）を有する場合、親水体を有するＣｙｓ残基を、３０番目または４０番目として、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを有するペプチドのＣ末端に付加してもよい。あるいは、親水体を、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを有するペプチドのＰＬＡに、ＰＬＡのヒドロキシル部分を介して結合してもよい。親水体は、本明細書に記載のいずれであってもよく、たとえば、ポリエチレングリコールを含む。
具体的な態様において、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを有するペプチドは、分子内架橋の取り込みがゆえに、安定化されたα螺旋を有する。いくつかの実施形態では、分子内架橋はラクタム架橋である。ラクタム架橋は、（配列番号１４０１のアミノ酸番号で）９番目と１２番目のアミノ酸の間、１２番目と１６番目のアミノ酸の間、１６番目と２０番目のアミノ酸の間、２０番目と２４番目のアミノ酸の間または２４番目と２８番目のアミノ酸であってもよい。具体的な実施形態では、（配列番号１４０１のアミノ酸番号で）１２番目と１６番目のアミノ酸または１６番目と２０番目のアミノ酸を、ラクタム架橋によって結合する。他のラクタム架橋の位置も考えられている。
上記に加えてあるいは上記に代えて、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを有するペプチドは、たとえば、（配列番号１４０１のアミノ酸番号で）１６番目、２０番目、２１番目または２４番目のいずれかに、α，α−二置換アミノ酸を有するものであってもよい。いくつかの実施形態では、α，α−二置換アミノ酸はＡＩＢである。具体的な態様において、Ａｉｂは、（配列番号１４０１の番号で）１６番目に位置する。
上記に代えてまたは上記に加えて、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを有するペプチドを、（配列番号１４０１の番号で）１６番目に酸性アミノ酸を有するように修飾してもよく、この修飾はα螺旋の安定性を高めるものである。いくつかの実施形態では、酸性アミノ酸は、側鎖のスルホン酸または側鎖のカルボン酸を有するアミノ酸である。一層具体的な実施形態では、酸性アミノ酸は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ホモグルタミン酸、Ｃｙｓのスルホン酸誘導体、システイン酸、ホモシステイン酸、Ａｓｐ、以下に示す構造を有するＣｙｓのアルキル化された誘導体からなる群から選択される。
Figure 2013540102

式中、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニルまたはＣ２〜Ｃ４アルキニルである。
具体的な実施形態では、クラス５のペプチドは、配列番号１４６０〜１４７０、１４７３〜１４７８、１４８０〜１４８８、１４９０〜１４９６、１５０３、１５０４、１５０６、１５１４〜１５１８のいずれのアミノ酸配列を有するものであってもよく、あるいは、表１３のペプチド２〜６、表１４のペプチド１〜８、表１５のペプチド２〜６、８、９のアミノ酸配列を有する。
Figure 2013540102

Figure 2013540102

Figure 2013540102

いくつかの実施形態では、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを有するペプチドは、クラス５のペプチドである。具体的な実施形態では、ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対して天然のＧＬＰ−１が達成する最大限の活性化作用の少なくとも約５０％を示し、かつ、グルカゴン受容体で天然のグルカゴンが達成する最大限の反応の少なくとも約５０％を阻害する。もうひとつの具体的な実施形態では、ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対して天然のＧＬＰ−１が達成する最大限の活性化作用の少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％を示す。上記に代えてまたは上記に加えて、ペプチドは、受容体で天然のグルカゴンが達成する最大限の反応の少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％を阻害するものであってもよい。
いくつかの実施形態では、以下のものを有する、クラス５のペプチドまたはその結合体を有するペプチドが提供される。
（１）以下の修飾を含むがこれらに限定されるものではない、グルカゴンアンタゴニスト活性を与える修飾
（ａ）（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）６番目のＰｈｅからＰＬＡへの置換、任意に、野生型グルカゴンのＮ末端からの１〜５個のアミノ酸の欠失または
（ｂ）野生型グルカゴンのＮ末端からの２〜５個のアミノ酸の欠失；任意に、（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）野生型グルカゴンの９番目のＡｓｐから、グルタミン酸、ホモグルタミン酸またはシステインのスルホン酸誘導体への置換
（２）以下の修飾を含むがこれら限定されるものではない、ＧＬＰ−１アゴニスト活性を与える修飾
（ａ）野生型グルカゴンの１２番目〜２９番目、たとえば、（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２４番目または２９番目のうちの１箇所、２箇所、３箇所、４箇所または５箇所以上でのアミノ酸でのα，α−二置換アミノ酸の挿入または置換または
（ｂ）野生型グルカゴンの１２番目〜２９番目のアミノ酸への分子内架橋、たとえば塩結合またはラクタム架橋または他のタイプの共有結合の導入または
（ｃ）（天然のグルカゴンのアミノ酸番号で）２番目、３番目、１７番目、１８番目、２１番目、２３番目または２４番目１箇所または２箇所以上のアミノ酸から、ＧＬＰ−１の対応するアミノ酸への置換、たとえば、２番目のセリンをＡｌａで置換、３番目のグルタミンをＧｌｕで置換、１７番目のアルギニンをＧｌｎで置換、１８番目のＡｒｇをＡｌａで置換、２１番目のＡｓｐをＧｌｕで置換、２３番目のバリンをＩｌｅで置換および／または２４番目のＧｌｎをＡｌａで置換または
（ｄ）野生型グルカゴンのアミノ酸番号で１２番目〜２９番目のアミノ酸のあたりでα螺旋構造を安定化する他の修飾
（３）ＧＬＰ−１アゴニスト活性を高める他の修飾、たとえば、Ｃ末端のカルボキシレートに代えたＣ末端のアミドまたはエステルならびに、任意に
（４）以下の修飾のうちの１つまたは２つ以上
（ａ）たとえばＮ末端または６番目、１６番目、１７番目、２０番目、２１番目、２４番目、２９番目、４０番目またはＣ末端のアミノ酸でのポリエチレングリコールなどの親水体に対する共有結合および／または
（ｂ）アシル化またはアルキル化ならびに、任意に
（５）以下の追加の修飾のうちの１つまたは２つ以上
（ａ）意に、ＤＰＰ−ＩＶ切断に対する耐性を改善する、本明細書に記載するような１番目または２番目での修飾を伴う、Ｎ末端に対するアミノ酸の共有結合、たとえば、任意に（野生型グルカゴンの番号で）６番目でＰＬＡへのエステル結合を介したＮ末端に対する１〜５個のアミノ酸の共有結合
（ｂ）（野生型グルカゴンの番号で）２９番目および／または２８番目ならびに、任意に２７番目のアミノ酸の欠失
（ｃ）Ｃ末端に対するアミノ酸の共有結合
（ｄ）所望の活性を保持したままでの非保存的な置換、保存的な置換、付加または欠失、たとえば、２番目、５番目、７番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２４番目、２７番目、２８番目または２９番目のうちの１箇所または２箇所以上での保存的な置換、１０番目のＴｙｒからＶａｌまたはＰｈｅへの置換、１２番目のＬｙｓからＡｒｇへの置換、これらの位置の１個または２個以上のアミノ酸からＡｌａへの置換
（ｅ）グルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸またはホモシステイン酸で置換することなどによる１５番目のアスパラギン酸の修飾（この修飾が分解を低減することがある）；または１６番目のセリンの修飾、たとえば、スレオニン、ＡＩＢ、グルタミン酸の置換による修飾あるいは、原子４個の長さの側鎖を有する別の負の電荷を持つアミノ酸への置換あるいは、グルタミン、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸のうちの任意の１つへの置換による修飾（この修飾も同様に、１５番目のアスパラギン酸と１６番目のセリンとの間の結合の切断による分解を低減することがある）
（ｆ）酸化による分解を低減するための、ロイシンまたはノルロイシンで置換することなどによる２７番目のメチオニンの修飾
（ｇ）Ｇｌｎの脱アミド化によって起こる分解を低減するための、ＡｌａまたはＡｉｂで置換することなどによる２０番目または２４番目のＧｌｎの修飾
（ｈ）Ａｓｐが脱水し、環状スクシンイミド中間体を形成した後、イソアスパラギン酸へ異性体化することで生じる分解を低減するための、Ｇｌｕで置換することなどによる２１番目のＡｓｐの修飾
（ｊ）本明細書に記載するようなホモダイマー化またはヘテロダイマー化
（ｋ）上記の組み合わせ。
同一クラスの修飾を任意に組み合わせてもよいおよび／または異なるクラスの修飾を組み合わせてもよいことは、理解できよう。たとえば、（１）（ａ）の修飾を（２）（ａ）および（３）と組み合わせてもよい；（１）（ａ）の修飾を、ラクタム架橋または塩結合などの（２）（ｂ）および（３）と組み合わせてもよい；（１）（ａ）の修飾を（２）（ｃ）および（３）と組み合わせてもよい；（１）（ｂ）の修飾を（２）（ａ）および（３）と組み合わせてもよい；（１）（ｂ）の修飾をラクタム架橋または塩結合などの（２）（ｂ）および（３）と組み合わせてもよい；（１）（ｂ）の修飾を（２）（ｃ）および（３）と組み合わせてもよい；上記のいずれかを（４）（ａ）および／または（４）（ｂ）と組み合わせてもよい；および上記のいずれかを（５）（ａ）から（５）（ｋ）のいずれかと組み合わせてもよい。
例示としての実施形態では、α，α−二置換アミノ酸ＡＩＢを、１６番目、２０番目、２１番目または２４番目のうちの（野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）１箇所、２箇所、３箇所またはすべてで置換する。
例示としての実施形態では、分子内架橋は塩結合である。
他の例示としての実施形態では、分子内架橋は、ラクタム架橋などの共有結合である。いくつかの実施形態では、ラクタム架橋は、（配列番号１４０１のアミノ酸番号で）９番目と１２のアミノ酸、１２番目と１６番目のアミノ酸、１６番目と２０番目のアミノ酸、２０番目と２４番目のアミノ酸または２４番目と２８番目のアミノ酸の間である。
例示としての実施形態では、（配列番号１４０１の野生型グルカゴンのアミノ酸番号で）アシル化またはアルキル化は、６番目、１０番目、２０番目または２４番目またはＮ末端またはＣ末端である。
例示としての実施形態では、以下の修飾を含む。
（ｉ）（配列番号１４０１の番号で）１５番目のＡｓｐから、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸への置換
（ｉｉ）（配列番号１４０１の番号で）１６番目のＳｅｒから、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸への置換
（ｉｉｉ）２８番目のＡｓｎから電荷を持つアミノ酸への置換
（ｉｖ）２８番目のＡｓｎから、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモシステイン酸からなる群から選択される電荷を持つアミノ酸への置換
（ｖ）２８番目でのＡｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕへの置換
（ｖｉ）２８番目でのＡｓｐへの置換
（ｖｉｉ）２８番目でのＧｌｕへの置換
（ｖｉｉｉ）２９番目のＴｈｒから電荷を持つアミノ酸への置換
（ｉｘ）２９番目のＴｈｒから、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモシステイン酸からなる群から選択される電荷を持つアミノ酸への置換
（ｘ）２９番目でのＡｓｐ、ＧｌｕまたはＬｙｓへの置換
（ｘｉ）２９番目でのＧｌｕへの置換
（ｘｉｉ）２９番目の後ろに電荷を持つ１〜３個のアミノ酸の挿入
（ｘｉｉｉ）２９番目の後ろにＧｌｕまたはＬｙｓの挿入
（ｘｉｖ）２９番目の後ろにＧｌｙ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−Ｌｙｓの挿入
またはこれらの組み合わせ。
ＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性、グルカゴン受容体アンタゴニスト活性、ペプチドの溶解性および／またはペプチドの安定性を高める、上述した修飾を、個々に適用してもよいし、組み合わせで適用してもよい。
安定性を高めるための修飾
いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示のクラス５のペプチドを、クラス５のペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸（２４番目）に結合した配列番号１４２１（GPSSGAPPPS）または配列番号１４５０のアミノ酸配列を含むようにさらに修飾し、対象個体に投与して体重減少を誘導する、あるいは、体重維持を助けることが可能である。特に、クラス５のペプチドは、配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７、配列番号１４０８、配列番号１４０９、配列番号１４１２、配列番号１４１３、配列番号１４１４、配列番号１４１６、配列番号１４１７、配列番号１４１８、配列番号１４１９、配列番号１４２２、配列番号１４２３、配列番号１４２４、配列番号１４２５からなる群から選択される配列を有し、ペプチドまたはクラス５のペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸（２４番目）に結合した配列番号１４２１（GPSSGAPPPS）または配列番号１４５０のアミノ酸配列をさらに有し、食欲を抑制し、体重減少／体重維持を誘導するのに用いられる。いくつかの実施形態では、投与されるペプチドまたはクラス５のペプチドは、配列番号１４１６、配列番号１４１７、配列番号１４１８、配列番号１４１９からなる群から選択される配列を有し、クラス５のペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸（２４番目）に結合した配列番号１４２１（GPSSGAPPPS）のアミノ酸配列をさらに有する。いくつかの実施形態では、この方法は、配列番号１４４５または配列番号１４４６の配列を有するペプチドまたはクラス５のペプチドを投与することを含む。
したがって、本明細書に開示のクラス５のペプチドを同様に修飾して、水性バッファー中での早期の化学反応による切断に対する感受性を低減することが可能である。いくつかの実施形態によれば、天然のグルカゴンの対応する１５番目に位置する天然のアスパラギン酸のアミノ酸を、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換することによって、本明細書に記載のクラス５のペプチドを、水溶液中でのその安定性を高めるようにさらに修飾してもよい。いくつかの実施形態によれば、配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７または配列番号１４０８のクラス５のペプチドの１０番目におけるアスパラギン酸残基を、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換してもよく、いくつかの実施形態では、配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７または配列番号１４０８の１０番目の天然のアスパラギン酸を、グルタミン酸で置換する。いくつかの実施形態によれば、水溶液中での安定性が改善されたクラス５のペプチドが提供され、ここで、アンタゴニストは、配列番号１４０９の修飾された配列を有し、この修飾は、配列番号１４０９の１０番目のＡｓｐからＧｌｕへの置換を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１４２２、配列番号１４２３、配列番号１４２４、配列番号１４２５からなる群から選択される配列を有するクラス５のペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、クラス５のペプチドは、アミド化されている。
天然のグルカゴンの１５番目と１６番目のＡｓｐ−Ｓｅｒ配列は、水性バッファーにおける天然のホルモンの早期の化学反応による切断につながる独特の不安定なジペプチドとして同定されている。たとえば、０．０１ＮのＨＣｌにて３７℃で２週間維持すると、天然のグルカゴンの５０％を超える部分が切断されて断片になってしまうことがある。この遊離した２つのペプチド断片１−１５および１６−２９は、グルカゴン様の生物学的活性を持たず、よって、グルカゴンおよびその関連の類縁体の水溶液による使用前調製に対する制約を示す。天然のグルカゴンの１５番目のＡｓｐをＧｌｕで選択的に化学置換すると、１５番目と１６番目のペプチド結合の化学反応による切断が、事実上なくなることが観察されている。
一例としてのさらに別の実施形態では、特に酸性バッファーまたはアルカリ性バッファーでの経時的なペプチドの分解を低減するように、天然のグルカゴンの１５番目または１６番目に対応するアミノ酸を修飾することによって、上記の化合物のいずれかをさらに修飾して安定性を改善してもよい。
溶解性を高めるための修飾
クラス５のペプチドをさらに修飾して、特定の態様ではグルカゴンアンタゴニスト活性およびＧＬＰ−１アゴニスト活性を保持したまま、生理的なｐＨの水溶液に対するペプチドの溶解性を改善することが可能である。配列番号１４０５のペプチドの１２番目、１５番目、１６番目、１９番目および２４番目に対応する位置または配列番号１４０６のペプチドの１２番目、１６番目、１９番目または２４番目に対応する位置に親水基を導入することで、親化合物のグルカゴンアンタゴニスト活性およびＧＬＰアゴニスト活性を保持したまま、生理的なｐＨの溶液に対する、得られるペプチドの溶解性を改善することが可能である。したがって、いくつかの実施形態では、配列番号１４０５または配列番号１４０６のペプチドの１２番目、１５番目、１６番目、１９番目および２４番目のアミノ酸に対応するアミノ酸の側鎖に共有結合している１個または２個以上の親水基を有するようにさらに修飾された本明細書に開示のクラス５のペプチド。別の実施形態では、配列番号１４０５または配列番号１４０６のアミノ酸の１６番目および１９番目に対応するアミノ酸の側鎖は親水基に共有結合し、いくつかの実施形態では、親水基はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
カルボキシ末端に電荷を導することで、クラス５のグルカゴン関連ペプチドを修飾し、ペプチドのアゴニスト特性を維持したままペプチドの溶解性を高めることが可能である。溶解性が高まると、グルカゴン溶液を、中性のｐＨ付近で調製および保管できるようになる。グルカゴン溶液を比較的中性のｐＨ（ｐＨ約６．０〜約８．０など）で調製すると、クラス５のペプチドの長期の安定性が改善される。
本出願人らは、本明細書に開示のクラス５のペプチドを同様に修飾して、場合によっては、グルカゴンアンタゴニスト活性およびＧＬＰ−１活性を保持したまま、比較的中性のｐＨ（ｐＨ約６．０〜約８．０など）の水溶液に対する溶解性を高めることが可能であると予測している。したがって、いくつかの実施形態は、天然の電荷を持たないアミノ酸を電荷を持つアミノ酸で置換するか、電荷を持つアミノ酸をカルボキシ末端に付加することによって、ペプチドに電荷を付加するために、野生型グルカゴン（配列番号１４０１）の６番目〜２９番目に存在する天然のアミノ酸をさらに修飾した配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７または配列番号１４０８のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１に関するものである。いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示のクラス５のペプチドの電荷を持たない天然のアミノ酸１〜３個を、電荷を持つアミノ酸で置換する。いくつかの実施形態では、電荷を持つアミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸からなる群から選択される。特に、本出願人らは、（天然のグルカゴンに比して）対応する２８番目および／または２９番目にある普通に生じるアミノ酸を電荷を持つアミノ酸で置換することおよび／または１〜２個の電荷を持つアミノ酸をペプチドのカルボキシ末端に付加することで、生理的に関連するｐＨ（すなわち、ｐＨ約６．５〜約７．５）の水溶液に対するクラス５のペプチドの溶解性および当該水溶液中における安定性が高められることを見出した。したがって、親ペプチドの生物学的活性を保持したまま、特に約５．５〜約８．０の範囲のｐＨで、水溶液に対する溶解性に同様の作用を持つように、クラス５のペプチドの上記のような修飾が予想される
いくつかの実施形態によれば、これらの配列の２３番目および／または２４番目の天然のアミノ酸を、負の電荷を持つアミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸など）で置換し、任意に、負の電荷を持つアミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸など）を、ペプチドのカルボキシ末端に付加することによって、配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７または配列番号１４０８のクラス５のペプチドを修飾する。別の実施形態では、配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７または配列番号１４０８の２４番目の天然のアミノ酸を、正の電荷を持つアミノ酸（リジン、アルギニンまたはヒスチジンなど）で置換し、任意に、１個または２個の正の電荷を持つアミノ酸（リジン、アルギニンまたはヒスチジンなど）を、ペプチドのカルボキシ末端に付加することによって、配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７または配列番号１４０８を有するクラス５のペプチドを修飾する。いくつかの実施形態によれば、類縁体が、配列番号１４１５または配列番号１４５１のアミノ酸配列を有する、溶解性および安定性が改善されたクラス５のペプチドが提供される。ただし、配列番号１４１５または配列番号１４５１の２３番目または２４番目の少なくとも１個のアミノ酸が、酸性アミノ酸で置換および／または追加の酸性アミノ酸が配列番号１４１５または配列番号１４５１のカルボキシ末端に付加される。いくつかの実施形態では、酸性アミノ酸は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモシステイン酸からなる群から独立に選択される。
いくつかの実施形態によれば、アンタゴニストが、配列番号１４１６、配列番号１４１７、配列番号１４１８または配列番号１４１９のアミノ酸配列を有する、溶解性および安定性が改善されたクラス５のペプチドが提供される。いくつかの実施形態によれば、配列番号１４１６または配列番号１４１７を有するグルカゴンアゴニストが提供される。いくつかの実施形態では、クラス５のペプチドは、配列番号１４２０の配列を有する。
いくつかの実施形態によれば、配列番号１４１５または配列番号１４５１の配列を有する、クラス５のペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１４１５または配列番号１４５１の４番目は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸またはホモシステイン酸であり、いくつかの実施形態では、４番目は、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸またはホモシステイン酸であり、別の実施形態では、配列番号１４１５または配列番号１４５１の４番目は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、いくつかの実施形態では、配列番号１４１５または配列番号１４５１の４番目は、アスパラギン酸である。いくつかの実施形態では、配列番号１４１５の４番目がアスパラギン酸であり、配列番号１４１５の１０番目がグルタミン酸である、配列番号１４１５または配列番号１４５１の配列を有するクラス５のペプチドが提供される。別の実施形態では、配列番号１４１５または配列番号１４５１のＣ末端のアミノ酸を、天然のカルボン酸基をアミドまたはエステルなどの電荷が中性の基で置換するように修飾する。
クラス５のペプチド融合体
別の実施形態では、本明細書に記載のクラス５のペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸は、配列番号１４２１、１４２６、１４２７、１４５０からなる群から選択される配列を有する第２のペプチドに共有結合している。たとえば、いくつかの実施形態では、配列番号１４１５、配列番号１４５１、配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７、配列番号１４０８、配列番号１４１２、配列番号１４１３、配列番号１４１４、配列番号１４１６、配列番号１４１７、配列番号１４１８、配列番号１４１９、配列番号１４２２、配列番号１４２３、配列番号１４２４、配列番号１４２５のクラス５のペプチドは、配列番号１４２１（GPSSGAPPPS）、配列番号１４２６（KRNRNNIA）、配列番号１４２７（KRNR）、配列番号１４５０（GPSSGAPPPSX）からなる群から選択される配列を有する第２のペプチドに共有結合している。
いくつかの実施形態では、配列番号１４０５、配列番号１４０６、配列番号１４０７、配列番号１４０８、配列番号１４０９、配列番号１４２２、配列番号１４２３、配列番号１４２４、配列番号１４２５からなる群から独立に選択される２つの配列を有し、クラス５のペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸に結合した配列番号１４２１（GPSSGAPPPS）のアミノ酸配列をさらに有する、クラス５のペプチドダイマーが提供される。
いくつかの実施形態では、ペプチドのＣ末端の１個または２個のアミノ酸の短縮または欠失（すなわち、天然のグルカゴンの２９番目あるいは、２８番目と２９番目のアミノ酸の短縮）によって、クラス５のペプチドをさらに修飾する。好ましくは、短縮は、クラス５のペプチドの活性（グルカゴン拮抗作用／ＧＬＰ−１活性化作用など）に影響しない。
クラス５のペプチド結合体
グルカゴンペプチドが、任意に共有結合を介して、任意にリンカーを介して、結合体部分に結合している、クラス５のペプチドの結合体も提供される。
クラス５のペプチドがポリエチレングリコール鎖を有する実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、直鎖状であってもよいし、分岐状であってもよい。いくつかの実施形態によれば、ポリエチレングリコール鎖は、平均分子量が、約５００〜約１０，０００ダルトンの範囲から選択される。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、平均分子量が、約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、平均分子量が、約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、平均分子量が約１，０００〜約２，０００ダルトンから選択される。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、平均分子量が約１，０００ダルトンである。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化されたクラス５のペプチドは、配列番号１４１５または配列番号１４５１の配列からなるペプチドを有し、ここで、ポリエチレングリコール鎖は、配列番号１４１５または配列番号１４５１の１１番目、１２番目、１５番目、１６番目、１９番目、２４番目から選択されるアミノ酸に結合し、ＰＥＧ鎖の分子量は約１，０００〜約５，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化されたクラス５のペプチドは、配列番号１４１５または配列番号１４５１の配列からなるペプチドを有し、ここで、ポリエチレングリコール鎖は、配列番号１４１５または配列番号１４５１の１６番目または１９番目でアミノ酸に結合し、ＰＥＧ鎖の分子量は約１，０００〜約５，０００ダルトンである。別の実施形態では、修飾されたクラス５のペプチドは、このペプチドに共有結合している２つまたは３つ以上のポリエチレングリコール鎖を有し、この場合のグルカゴン鎖の合計の分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、クラス５のペプチドは、配列番号１４１５または配列番号１４５１の配列を有し、ポリエチレングリコール鎖は、配列番号１４１５または配列番号１４５１の１６番目および１９番目のアミノ酸に結合し、２つのＰＥＧ鎖の合計の分子量は約１，０００〜約５，０００ダルトンである。
クラス５のグルカゴン関連ペプチドは、任意に、グルカゴンアンタゴニスト活性およびＧＬＰ−１アゴニスト活性を保持する最大で１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの修飾をさらに有する、配列番号１４０１〜１５１８のいずれかのアミノ酸配列を有するものであってもよい。
ジペプチドプロドラッグ要素の構造が切断速度に対しておよぼす影響
本明細書にて上述したように、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドからのジペプチドプロドラッグ要素Ａ−Ｂが切断され、これによってプロドラッグが活性化する速度は、ジペプチドプロドラッグ要素のアミノ酸の構造（Ｎ−アルキル化、置換基数、長さまたはかさ高さを含む）ならびに立体異性に左右される。グルカゴンスーパーファミリーのペプチドからのジペプチドプロドラッグ要素Ａ−Ｂの切断速度は、形成時のＱの脱離基の安定性、求核性、立体障害にも左右される。これらの構造的な特徴のいくつかを、以下では、本発明の一部をなすカテゴリーＩ、カテゴリーＩＩ、カテゴリーＩＩＩで説明する。これらのカテゴリーから明示的に除外されるのは、本明細書に記載のサブカテゴリーのいずれかの一部に完全に包含されるおよび／またはこれと重なるかぎり、かつ、権利請求する主題に新規性を与えるのに必要な程度でのみ、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／６８７４５（２００９年１２月１８日出願）またはその配列表に開示されたペプチド配列ならびに、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／６８７４５（２００９年１２月１８日出願）に開示された（１）ジペプチドプロドラッグ要素、（２）Ａのアミノ酸および／または（３）Ｂのアミノ酸のサブカテゴリーである。
カテゴリーＩ：ジペプチドプロドラッグ要素のアミノ酸Ｂの組成
いくつかの実施形態では、ＰＢＳ中、生理的条件下で少なくとも約１時間から約１週間であるプロドラッグの半減期、たとえば、ＱからＡ−Ｂが化学的に切断される半減期（ｔ１／２）は、Ｂのアミノ酸におけるＮ−アルキル置換基の存在および長さに左右される。たとえば、Ｂのアミノ酸のＮ−アルキル置換基が短いプロドラッグ（Ｇｌｙ（Ｎ−メチル）など）のほうが、Ｂのアミノ酸のＮ−アルキル置換基が長いプロドラッグ（Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）など）よりもＡ−Ｂの切断速度が遅くなり、半減期は長くなる。
いくつかの実施形態では、プロドラッグの半減期は、ジペプチドプロドラッグ要素のＢのアミノ酸のβ位での置換の度合いに左右される。たとえば、β位で二置換されたＢのアミノ酸を有するプロドラッグ（Ｎ−アルキル化されたイソロイシンなど）のほうが、β位で一置換されたＢのアミノ酸を有するプロドラッグ（Ｎ−アルキル化されたロイシンなど）よりもＡ−Ｂの切断が遅くなり、半減期は長くなる。さらに、β位で一置換されたＢのアミノ酸を有するプロドラッグ（Ｎ−アルキル化されたロイシンなど）は、β位で未置換のＢのアミノ酸を有するプロドラッグ（Ｎ−アルキル化されたアラニンなど）よりもＡ−Ｂの切断が遅くなり、半減期は長くなる。さらに、β位に炭素を有するＢのアミノ酸を有するプロドラッグ（Ｎ−アルキル化されたアラニンなど）は、Ｂのアミノ酸にグリシンを有するプロドラッグよりもＡ−Ｂの切断が遅くなり、半減期は長くなる。
いくつかの実施形態では、プロドラッグの半減期は、Ｂのアミノ酸の側鎖のかさ高さに左右される。たとえば、Ｂのアミノ酸によりかさ高い側鎖を有するプロドラッグ（Ｎ−アルキル化されたフェニルアラニンなど）は、Ｂのアミノ酸によりかさの低い側鎖を有するプロドラッグ（Ｎ−アルキル化されたアラニンなど）よりもＡ−Ｂの切断が遅くなり、半減期は長くなる。
ジペプチドプロドラッグ要素のＢのアミノ酸の組成を、以下ではサブカテゴリーＩＡ、ＩＢ、ＩＣに分類可能である。通常、サブカテゴリーＩＡのジペプチドプロドラッグ要素が最も速く切断され、サブカテゴリーＩＣのジペプチドプロドラッグ要素が、切断されるのが最も遅い。
サブカテゴリーＩＡ：ジペプチドプロドラッグ要素のアミノ酸Ｂは、Ｎ−アルキル化されたグリシンである
いくつかの実施形態では、プロドラッグは、構造Ａ−Ｂ−Ｑを有する。
式中、Ｑはグルカゴンスーパーファミリーのペプチドであり、
ここで、Ａ−Ｂは、以下の構造を有する。
Figure 2013540102

式中、
Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１は、Ｎ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｒ４およびＲ８は、各々Ｈであり、
Ｒ５は、ＮＨＲ６であり、
Ｒ６は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであるか、あるいは、Ｒ５およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、（Ｃ２〜Ｃ７アルケニル）、ＯＣＦ３、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＣ、Ｏ（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、ＮＨＲ６、アリール、ヘテロアリールからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｂのアミノ酸は、グリシン（Ｎ−メチル）、グリシン（Ｎ−エチル）、グリシン（Ｎ−プロピル）、グリシン（Ｎ−ブチル）、グリシン（Ｎ−ペンチル）、グリシン（Ｎ−ヘキシル）、グリシン（Ｎ−ヘプチル）、グリシン（Ｎ−オクチル）からなる群から選択される。たとえば、Ｂのアミノ酸は、グリシン（Ｎ−メチル）またはグリシン（Ｎ−ヘキシル）であってもよい。
いくつかの実施形態では、Ｒ１およびＲ２がともに水素である場合、Ｒ３は、たとえばＡ−Ｂが脂肪族のアミンに結合すれば、Ｃ１〜Ｃ４アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１およびＲ２がともに水素である場合、Ｒ３は、たとえばＡ−Ｂが脂肪族のアミンに結合すれば、Ｃ５〜Ｃ８アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１またはＲ２のうちの少なくとも一方が水素ではない場合、Ｒ３は、たとえばＡ−Ｂが脂肪族のアミンに結合すれば、Ｃ１〜Ｃ４アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１またはＲ２のうちの少なくとも一方が水素ではない場合、Ｒ３は、たとえばＡ−Ｂが脂肪族のアミンに結合すれば、Ｃ５〜Ｃ８アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１およびＲ２がともに水素であり、Ｒ３がメチルである場合、Ａ−Ｂは、Ｆ７ＧＬＰ−１（８−３７）のαアミノ基に結合しない。
サブカテゴリーＩＢ：ジペプチドプロドラッグ要素のアミノ酸Ｂは、β位で未置換であるか一置換される
いくつかの実施形態では、プロドラッグは、構造Ａ−Ｂ−Ｑを有する。
式中、Ｑはグルカゴンスーパーファミリーのペプチドであり、
ここで、Ａ−Ｂは、以下の構造を有する。
Figure 2013540102

式中、
Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１は、Ｎ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｒ４は、ＣＨ３、ＣＨ２（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ＣＨ２（Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル）、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ１０アルキル）ＯＨ、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ１０アルキル）ＳＨ、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＣＯＮＨ２、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＣＯＯＨ、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＮＨ２、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、ＣＨ２（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ１２アルキル）（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１は、Ｎ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ８はＨであり、
Ｒ５は、ＮＨＲ６であるか、あるいは、Ｒ５およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ６は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、（Ｃ２〜Ｃ７アルケニル）、ＯＣＦ３、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＣ、Ｏ（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、ＮＨＲ６、アリール、ヘテロアリールからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、ＣＨ３、ＣＨ２（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）、ＣＨ２（Ｃ１〜Ｃ４）アルケニル、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＣＯＮＨ２、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＣＯＯＨ、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２からなる群から選択される。
これらの実施形態におけるＢのアミノ酸の非限定的な例として、アラニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ロイシン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、メチオニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、アスパラギン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、グルタミン酸（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、アスパラギン酸（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、グルタミン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ヒスチジン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、リジン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、アルギニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、セリン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、システイン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）があげられる。
いくつかの実施形態では、Ｂのアミノ酸は、アラニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ロイシン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、メチオニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、アスパラギン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、グルタミン酸（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、アスパラギン酸（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、グルタミン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ヒスチジン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、リジン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、アルギニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、セリン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、システイン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）からなる群から選択される。
たとえば、Ｂのアミノ酸は、アラニン（Ｎ−メチル）、ロイシン（Ｎ−メチル）、メチオニン（Ｎ−メチル）、アスパラギン（Ｎ−メチル）、グルタミン酸（Ｎ−メチル）、アスパラギン酸（Ｎ−メチル）、グルタミン（Ｎ−メチル）、ヒスチジン（Ｎ−メチル）、リジン（Ｎ−メチル）、アルギニン（Ｎ−メチル）、セリン（Ｎ−メチル）、システイン（Ｎ−メチル）を含むものであってもよい。
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、ＣＨ２（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ１２アルキル）（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１は、Ｎ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であり、かつ、Ｒ７は、ＨおよびＯＨからなる群から選択される。
これらの実施形態におけるＢのアミノ酸の非限定的な例として、フェニルアラニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、チロシン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、トリプトファン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）があげられる。いくつかの実施形態では、Ｂのアミノ酸は、フェニルアラニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、チロシン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、トリプトファン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）からなる群から選択される。たとえば、Ｂのアミノ酸は、フェニルアラニン（Ｎ−メチル）、チロシン（Ｎ−メチル）、トリプトファン（Ｎ−メチル）を含むものであってもよい。
いくつかの実施形態では、Ｂのアミノ酸はプロリンである。いくつかの実施形態では、プロリンはサブカテゴリーＩＢから除外される。
サブカテゴリーＩＣ：β位で二置換されたジペプチドプロドラッグ要素のアミノ酸Ｂ
いくつかの実施形態では、プロドラッグは、構造Ａ−Ｂ−Ｑを有する。
式中、Ｑはグルカゴンスーパーファミリーのペプチドであり、
ここで、Ａ−Ｂは、以下の構造を有する。
Figure 2013540102

式中、
Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１は、Ｎ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成するか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成し、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、
Ｒ４は独立に、ＣＨ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）２、ＣＨ（Ｃ２〜Ｃ８アルケニル）２、ＣＨ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）（ＯＨ）、ＣＨ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）（（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）ＳＨ）、ＣＨ（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）（（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）（ＮＨ２））からなる群から選択され
Ｒ８はＨであり、
Ｒ５は、ＮＨＲ６であるか、あるいは、Ｒ５およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
Ｒ６は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、（Ｃ２〜Ｃ７アルケニル）、ＯＣＦ３、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＣ、Ｏ（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、ＮＨＲ６、アリール、ヘテロアリールからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、ＣＨ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）２またはＣＨ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）ＯＨである。Ｂのアミノ酸の非限定的な例として、イソロイシン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、バリン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、スレオニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）があげられる。いくつかの実施形態では、Ｂのアミノ酸は、イソロイシン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、バリン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スレオニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）からなる群から選択される。たとえば、Ｂのアミノ酸は、イソロイシン（Ｎ−メチル）、バリン（Ｎ−メチル）、スレオニン（Ｎ−メチル）を含むものであってもよい。
カテゴリーＩＩ：ジペプチドプロドラッグ要素のアミノ酸Ａの組成
いくつかの実施形態では、プロドラッグの半減期は、Ａのアミノ酸のα位での置換基数に左右される。たとえば、α−一置換されたアミノ酸であるＡのアミノ酸を有するプロドラッグ（Ａｌａなど）は、α，α−二置換アミノ酸であるＡのアミノ酸を有するプロドラッグ（Ａｉｂなど）よりも切断が遅く、半減期が長い。
いくつかの実施形態では、プロドラッグの半減期は、Ａのアミノ酸のαアミノ基でのアルキル化の度合いに左右される。通常、アルキル化の度合いが大きくなればなるほど、切断速度は遅くなり、プロドラッグの半減期が長くなる。たとえば、Ｎ−アルキル化されたＡｌａを有するジペプチドプロドラッグ要素は、Ａｌａよりも遅く切断され、半減期は長くなる。
ジペプチドプロドラッグ要素のＡのアミノ酸の組成を、以下ではサブカテゴリーＩＩＡおよびＩＩＢに分類可能である。通常、サブカテゴリーＩＩＡのジペプチドプロドラッグ要素のほうが、サブカテゴリーＩＩＢのジペプチドプロドラッグ要素よりも速く切断される。
サブカテゴリーＩＩＡ：ジペプチドプロドラッグ要素のアミノ酸Ａは、α位で二置換される
いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素のＡのアミノ酸は、α位で二置換される。これらの実施形態では、サブカテゴリーＩＡ、ＩＢ、ＩＣに記載の構造のＲ１およびＲ２は独立に、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１は、Ｎ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成し、かつ、Ｒ７は、ＨおよびＯＨからなる群から選択される。
たとえば、Ａのアミノ酸は、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）を含むものであってもよい。
サブカテゴリーＩＩＢ：ジペプチドプロドラッグ要素のアミノ酸Ａは、α位で未置換であるか、一置換される
いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素のＡのアミノ酸は、α位で未置換であるか、一置換される。これらの実施形態では、サブカテゴリーＩＡ、ＩＢ、ＩＣに記載の構造のＲ１はＨであり、サブカテゴリーＩＡ、ＩＢ、ＩＣに記載の構造のＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｒ７は、ＨおよびＯＨからなる群から選択され、Ｗ１は、Ｎ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成するか、あるいは、Ｒ２およびＲ５は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成する。
いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素のＡのアミノ酸は、「ｄ」の立体異性を有する。これらの実施形態におけるＡのアミノ酸の非限定的な例として、リジン、システイン、アラニンがあげられる。たとえば、ｄ−リジン、ｄ−システイン、ｄ−アラニン。いくつかの実施形態では、ｄ−立体異性になると、プロドラッグペプチドのタンパク質の分解が減って半減期が長くなる場合がある。
いくつかの実施形態では、Ａのアミノ酸は、Ａｌａ（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ４アルキル）、Ｌｙｓ（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ４アルキル）、Ｃｙｓ（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ４アルキル）など、１〜４個の炭素原子を有する基でＮ−アルキル化される。たとえば、Ａのアミノ酸は、Ａｌａ（Ｎ−メチル）、Ｌｙｓ（Ｎ−メチル）、Ｃｙｓ（Ｎ−メチル）であってもよい。Ａのアミノ酸のＮ−アルキル化によって、ジペプチドプロドラッグ要素のＱからの切断速度が低下し、半減期が長くなる。
カテゴリーＩＩＩ：グルカゴンスーパーファミリーのペプチド（Ｑ）に対するジペプチドプロドラッグ要素（Ａ−Ｂ）の結合部位
いくつかの実施形態では、プロドラッグの半減期は、ジケトピペラジン形成時におけるＱの脱離基の立体障害、求核性、安定性に左右される。脱離基の立体障害が小さくなるか、脱離基の求核性が下がるか、あるいは、切断後の脱離基の安定性が増すと、プロドラッグの半減期は短くなる。Ｑの脱離基のタイプについては、サブカテゴリーＩＩＩＡおよびＩＩＩＢで後述するように、Ａ−ＢとＱのアミノ基との間の結合のタイプによって判断可能である。通常、サブカテゴリーＩＩＩＡのジペプチドプロドラッグ要素のほうが、サブカテゴリーＩＩＩＢのジペプチドプロドラッグ要素よりもゆっくりＱから切断され、半減期が長くなる。
サブカテゴリーＩＩＩＡ：Ｑの脂肪族アミノ基に結合したＡ−Ｂ
いくつかの実施形態では、本明細書にて上述したように、ＰＢＳ中、生理的条件下で、ＱからＡ−Ｂが化学的に切断される半減期（ｔ１／２）が少なくとも約１時間から約１週間であるプロドラッグを得られるように、Ａ−Ｂが、Ａ−ＢとＱの脂肪族アミノ基との間のアミド結合を介してＱに結合している。
いくつかの実施形態では、Ａ−Ｂは、Ａ−ＢとＱのＮ末端のアミノ酸のαアミノ基との間のアミド結合を介してＱに結合する。たとえば、ＰＢＳ中、生理的条件下で、ＱからＡ−Ｂが化学的に切断される半減期（ｔ１／２）が少なくとも約１時間から約１週間であるプロドラッグを得られるように、サブカテゴリーＩＡ、ＩＢ、ＩＣのいずれかのＢのアミノ酸を有するジペプチドプロドラッグ要素およびサブカテゴリーＩＩＡおよびＩＩＢのいずれかのＡのアミノ酸を、ＱのＮ末端のアミノ酸に結合してもよい。
いくつかの実施形態では、Ａ−Ｂは、Ａ−ＢとＱのアミノ酸の側鎖の脂肪族アミノ基との間のアミド結合を介してＱに結合する。たとえば、ＰＢＳ中、生理的条件下で、ＱからＡ−Ｂが化学的に切断される半減期（ｔ１／２）が少なくとも約１時間から約１週間であるプロドラッグを得られるように、サブカテゴリーＩＡ、ＩＢ、ＩＣのいずれかのＢのアミノ酸を有するジペプチドプロドラッグ要素およびサブカテゴリーＩＩＡおよびＩＩＢのいずれかのＡのアミノ酸を、Ｑのアミノ酸の側鎖の脂肪族アミノ基に結合してもよい。
いくつかの実施形態では、Ａ−Ｂが、Ａ−ＢとＱの脂肪族アミノ基との間のアミド結合を介してＱに結合している場合、Ａがα，α−二置換アミノ酸でなければならない（サブカテゴリーＩＩＡ）か、ＢがＮ−アルキル化されていなければならない（サブカテゴリーＩＡ、ＩＢまたはＩＣのいずれか）かの一方または両方である。たとえば、Ａがα−一置換アミノ酸（Ａｌａなど）であり、ＢがＮ−アルキル化されておらず、Ａ−ＢがＱの脂肪族アミノ基を介してＱに結合している場合、Ａ−Ｂが大幅に切断されることもない。
他の実施形態では、Ａ−ＢがＦ７ＧＬＰ−１（８−３７）のαアミノ基に結合している場合、Ａ−ＢはＧｌｙ−Ｇｌｙ（Ｎ−Ｍｅ）ではない。
他の任意の実施形態では、Ａ−Ｂが、Ａ−ＢとＱの脂肪族アミノ基との間のアミド結合を介してＱに結合し、かつ、Ａがα位で置換されていないアミノ酸（グリシンなど）であり、ＢがサブカテゴリーＩＡのアミノ酸（Ｎ−アルキル化されたグリシン）である場合、Ｂのアミノ酸のＮ−アルキル置換基は、少なくとも炭素原子５個の長さである（たとえば、Ｎ−Ｃ５〜Ｃ８アルキル）。
さらに他の実施形態では、Ａ−Ｂが、Ａ−ＢとＱの脂肪族アミノ基との間のアミド結合を介してＱに結合し、かつ、Ａのアミノ酸がα位で置換されていないか一置換されている（サブカテゴリーＩＩＢ）場合、Ｂのアミノ酸はプロリンではない。いくつかの実施形態では、Ａ−Ｂが、Ａ−ＢとＱの脂肪族アミノ基との間のアミド結合を介してＱに結合している場合、Ａ−ＢはＧｌｙ−Ｐｒｏではない。いくつかの実施形態では、Ｂのアミノ酸がプロリンである場合、Ａのアミノ酸は、サブカテゴリーＩＩＡのものである。
サブカテゴリーＩＩＩＢ：Ｑの芳香族アミノ基に結合したＡ−Ｂ
いくつかの実施形態では、本明細書にて上述したように、ＰＢＳ中、生理的条件下で、ＱからＡ−Ｂが化学的に切断される半減期（ｔ１／２）が少なくとも約１時間から約１週間であるプロドラッグを得られるように、Ａ−Ｂが、Ａ−ＢとＱのアミノ酸の側鎖の芳香族アミノ基との間のアミド結合を介してＱに結合する。たとえば、ＰＢＳ中、生理的条件下で、ＱからＡ−Ｂが化学的に切断される半減期（ｔ１／２）が少なくとも約１時間から約１週間であるプロドラッグを得られるように、サブカテゴリーＩＡ、ＩＢ、ＩＣのいずれかのＢのアミノ酸を有するジペプチドプロドラッグ要素およびサブカテゴリーＩＩＡおよびＩＩＢのいずれかのＡのアミノ酸を、Ｑのアミノ酸の側鎖の芳香族アミノ基に結合してもよい。
カテゴリーＩで定義したＢのアミノ酸のいずれかを、カテゴリーＩＩで定義したＡのアミノ酸のいずれかと組み合わせて、ジペプチドプロドラッグ要素を形成することが可能である。このジペプチドプロドラッグ要素を、カテゴリーＩＩＩに記載のどの位置に結合してもよい。プロドラッグの半減期については、
（ｉ）Ａのアミノ酸のα位の置換基数
（ｉｉ）Ａのアミノ酸とＢのアミノ酸のＮ−アルキル化の度合い
（ｉｉｉ）Ｂのアミノ酸のβ位の置換基数
（ｉｖ）Ｂのアミノ酸の側鎖のかさ高さ
（ｉｉｉ）ジケトピペラジン形成時におけるＱの脱離基の立体障害、求核性、安定性
を選択することで調整可能である。
ジペプチドプロドラッグ要素Ａ−Ｂの修飾
本明細書にてすでに説明したように、上述したジペプチドプロドラッグ要素を、親水体、アシル基またはアルキル基を有するようにさらに修飾することも可能である。いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、その側鎖アミノ基を介してアシル基またはアルキル基に結合したリジンを有する。いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、側鎖スルフヒドリル基を介して親水体（４０ｋＤのＰＥＧなど）に結合したシステインを有する。親水体、アシル基またはアルキル基については、ジペプチドプロドラッグ要素に直接結合してもよいし、スペーサーを介して結合してもよい。例示としてのいくつかの実施形態では、親水基、アルキル基および／またはアシル基は、ジペプチドプロドラッグ要素のＡのアミノ酸に結合する。
いくつかの実施形態では、以下のジペプチドプロドラッグ要素がＰＥＧ化される：ｄＣｙｓ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル） ｄＣｙｓ−Ｇｌｙ（Ｎ−メチル）、ｄＣｙｓ−Ｐｈｅ（Ｎ−メチル）。いくつかの実施形態では、以下のジペプチドプロドラッグ要素がアシル基を有する：ｄＬｙｓ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）、ｄＬｙｓ−Ｇｌｙ（Ｎ−メチル）、ｄＬｙｓ−Ｐｈｅ（Ｎ−メチル）。いくつかの実施形態では、以下のジペプチドプロドラッグ要素がアルキル基を有する：ｄＬｙｓ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）、ｄＬｙｓ−Ｇｌｙ（Ｎ−メチル）、ｄＬｙｓ−Ｐｈｅ（Ｎ−メチル）。
例示としての実施形態
本発明のジペプチドプロドラッグ要素は、カテゴリーＩのＢのアミノ酸のいずれかと、カテゴリーＩＩのＡのアミノ酸のいずれかとの組み合わせを有するものであってもよい。ジペプチドプロドラッグ要素のＡのアミノ酸とＢのアミノ酸に適したアミノ酸の非限定的な例を、以下の表にあげておく。
Figure 2013540102

Figure 2013540102

Figure 2013540102

Figure 2013540102

いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素は、Ａ１〜Ａ７７のうちのいずれか１つと、Ｂ１〜Ｂ１１３のうちのいずれか１つとの組み合わせを有する。たとえば、ジペプチドプロドラッグ要素のＡのアミノ酸とＢのアミノ酸との組み合わせとして、以下のものがあげられる：Ａ１−Ｂ１；Ａ１−Ｂ２；Ａ１−Ｂ３；Ａ１−Ｂ４；Ａ１−Ｂ５；Ａ１−Ｂ６；Ａ１−Ｂ７；Ａ１−Ｂ８；Ａ１−Ｂ９；Ａ１−Ｂ１０；Ａ１−Ｂ１１；Ａ１−Ｂ１２；Ａ１−Ｂ１３；Ａ１−Ｂ１４；Ａ１−Ｂ１５；Ａ１−Ｂ１６；Ａ１−Ｂ１７；Ａ１−Ｂ１８；Ａ１−Ｂ１９；Ａ１−Ｂ２０；Ａ１−Ｂ２１；Ａ１−Ｂ２２；Ａ１−Ｂ２３；Ａ１−Ｂ２４；Ａ１−Ｂ２５；Ａ１−Ｂ２６；Ａ１−Ｂ２７；Ａ１−Ｂ２８；Ａ１−Ｂ２９；Ａ１−Ｂ３０；Ａ１−Ｂ３１；Ａ１−Ｂ３２；Ａ１−Ｂ３３；Ａ１−Ｂ３４；Ａ１−Ｂ３５；Ａ１−Ｂ３６；Ａ１−Ｂ３７；Ａ１−Ｂ３８；Ａ１−Ｂ３９；Ａ１−Ｂ４０；Ａ１−Ｂ４１；Ａ１−Ｂ４２；Ａ１−Ｂ４３；Ａ１−Ｂ４４；Ａ１−Ｂ４５；Ａ１−Ｂ４６；Ａ１−Ｂ４７；Ａ１−Ｂ４８；Ａ１−Ｂ４９；Ａ１−Ｂ５０；Ａ１−Ｂ５１；Ａ１−Ｂ５２；Ａ１−Ｂ５３；Ａ１−Ｂ５４；Ａ１−Ｂ５５；Ａ１−Ｂ５６；Ａ１−Ｂ５７；Ａ１−Ｂ５８；Ａ１−Ｂ５９；Ａ１−Ｂ６０；Ａ１−Ｂ６１；Ａ１−Ｂ６２；Ａ１−Ｂ６３；Ａ１−Ｂ６４；Ａ１−Ｂ６５；Ａ１−Ｂ６６；Ａ１−Ｂ６７；Ａ１−Ｂ６８；Ａ１−Ｂ６９；Ａ１−Ｂ７０；Ａ１−Ｂ７１；Ａ１−Ｂ７２；Ａ１−Ｂ７３；Ａ１−Ｂ７４；Ａ１−Ｂ７５；Ａ１−Ｂ７６；Ａ１−Ｂ７７；Ａ１−Ｂ７８；Ａ１−Ｂ７９；Ａ１−Ｂ８０；Ａ１−Ｂ８１；Ａ１−Ｂ８２；Ａ１−Ｂ８３；Ａ１−Ｂ８４；Ａ１−Ｂ８５；Ａ１−Ｂ８６；Ａ１−Ｂ８７；Ａ１−Ｂ８８；Ａ１−Ｂ８９；Ａ１−Ｂ９０；Ａ１−Ｂ９１；Ａ１−Ｂ９２；Ａ１−Ｂ９３；Ａ１−Ｂ９４；Ａ１−Ｂ９５；Ａ１−Ｂ９６；Ａ１−Ｂ９７；Ａ１−Ｂ９８；Ａ１−Ｂ９９；Ａ１−Ｂ１００；Ａ１−Ｂ１０１；Ａ１−Ｂ１０２；Ａ１−Ｂ１０３；Ａ１−Ｂ１０４；Ａ１−Ｂ１０５；Ａ１−Ｂ１０６；Ａ１−Ｂ１０７；Ａ１−Ｂ１０８；Ａ１−Ｂ１０９；Ａ１−Ｂ１１０；Ａ１−Ｂ１１１；Ａ１−Ｂ１１２；Ａ１−Ｂ１１３；
Ａ２−Ｂ１；Ａ２−Ｂ２；Ａ２−Ｂ３；Ａ２−Ｂ４；Ａ２−Ｂ５；Ａ２−Ｂ６；Ａ２−Ｂ７；Ａ２−Ｂ８；Ａ２−Ｂ９；Ａ２−Ｂ１０；Ａ２−Ｂ１１；Ａ２−Ｂ１２；Ａ２−Ｂ１３；Ａ２−Ｂ１４；Ａ２−Ｂ１５；Ａ２−Ｂ１６；Ａ２−Ｂ１７；Ａ２−Ｂ１８；Ａ２−Ｂ１９；Ａ２−Ｂ２０；Ａ２−Ｂ２１；Ａ２−Ｂ２２；Ａ２−Ｂ２３；Ａ２−Ｂ２４；Ａ２−Ｂ２５；Ａ２−Ｂ２６；Ａ２−Ｂ２７；Ａ２−Ｂ２８；Ａ２−Ｂ２９；Ａ２−Ｂ３０；Ａ２−Ｂ３１；Ａ２−Ｂ３２；Ａ２−Ｂ３３；Ａ２−Ｂ３４；Ａ２−Ｂ３５；Ａ２−Ｂ３６；Ａ２−Ｂ３７；Ａ２−Ｂ３８；Ａ２−Ｂ３９；Ａ２−Ｂ４０；Ａ２−Ｂ４１；Ａ２−Ｂ４２；Ａ２−Ｂ４３；Ａ２−Ｂ４４；Ａ２−Ｂ４５；Ａ２−Ｂ４６；Ａ２−Ｂ４７；Ａ２−Ｂ４８；Ａ２−Ｂ４９；Ａ２−Ｂ５０；Ａ２−Ｂ５１；Ａ２−Ｂ５２；Ａ２−Ｂ５３；Ａ２−Ｂ５４；Ａ２−Ｂ５５；Ａ２−Ｂ５６；Ａ２−Ｂ５７；Ａ２−Ｂ５８；Ａ２−Ｂ５９；Ａ２−Ｂ６０；Ａ２−Ｂ６１；Ａ２−Ｂ６２；Ａ２−Ｂ６３；Ａ２−Ｂ６４；Ａ２−Ｂ６５；Ａ２−Ｂ６６；Ａ２−Ｂ６７；Ａ２−Ｂ６８；Ａ２−Ｂ６９；Ａ２−Ｂ７０；Ａ２−Ｂ７１；Ａ２−Ｂ７２；Ａ２−Ｂ７３；Ａ２−Ｂ７４；Ａ２−Ｂ７５；Ａ２−Ｂ７６；Ａ２−Ｂ７７；Ａ２−Ｂ７８；Ａ２−Ｂ７９；Ａ２−Ｂ８０；Ａ２−Ｂ８１；Ａ２−Ｂ８２；Ａ２−Ｂ８３；Ａ２−Ｂ８４；Ａ２−Ｂ８５；Ａ２−Ｂ８６；Ａ２−Ｂ８７；Ａ２−Ｂ８８；Ａ２−Ｂ８９；Ａ２−Ｂ９０；Ａ２−Ｂ９１；Ａ２−Ｂ９２；Ａ２−Ｂ９３；Ａ２−Ｂ９４；Ａ２−Ｂ９５；Ａ２−Ｂ９６；Ａ２−Ｂ９７；Ａ２−Ｂ９８；Ａ２−Ｂ９９；Ａ２−Ｂ１００；Ａ２−Ｂ１０１；Ａ２−Ｂ１０２；Ａ２−Ｂ１０３；Ａ２−Ｂ１０４；Ａ２−Ｂ１０５；Ａ２−Ｂ１０６；Ａ２−Ｂ１０７；Ａ２−Ｂ１０８；Ａ２−Ｂ１０９；Ａ２−Ｂ１１０；Ａ２−Ｂ１１１；Ａ２−Ｂ１１２；Ａ２−Ｂ１１３；
Ａ３−Ｂ１；Ａ３−Ｂ２；Ａ３−Ｂ３；Ａ３−Ｂ４；Ａ３−Ｂ５；Ａ３−Ｂ６；Ａ３−Ｂ７；Ａ３−Ｂ８；Ａ３−Ｂ９；Ａ３−Ｂ１０；Ａ３−Ｂ１１；Ａ３−Ｂ１２；Ａ３−Ｂ１３；Ａ３−Ｂ１４；Ａ３−Ｂ１５；Ａ３−Ｂ１６；Ａ３−Ｂ１７；Ａ３−Ｂ１８；Ａ３−Ｂ１９；Ａ３−Ｂ２０；Ａ３−Ｂ２１；Ａ３−Ｂ２２；Ａ３−Ｂ２３；Ａ３−Ｂ２４；Ａ３−Ｂ２５；Ａ３−Ｂ２６；Ａ３−Ｂ２７；Ａ３−Ｂ２８；Ａ３−Ｂ２９；Ａ３−Ｂ３０；Ａ３−Ｂ３１；Ａ３−Ｂ３２；Ａ３−Ｂ３３；Ａ３−Ｂ３４；Ａ３−Ｂ３５；Ａ３−Ｂ３６；Ａ３−Ｂ３７；Ａ３−Ｂ３８；Ａ３−Ｂ３９；Ａ３−Ｂ４０；Ａ３−Ｂ４１；Ａ３−Ｂ４２；Ａ３−Ｂ４３；Ａ３−Ｂ４４；Ａ３−Ｂ４５；Ａ３−Ｂ４６；Ａ３−Ｂ４７；Ａ３−Ｂ４８；Ａ３−Ｂ４９；Ａ３−Ｂ５０；Ａ３−Ｂ５１；Ａ３−Ｂ５２；Ａ３−Ｂ５３；Ａ３−Ｂ５４；Ａ３−Ｂ５５；Ａ３−Ｂ５６；Ａ３−Ｂ５７；Ａ３−Ｂ５８；Ａ３−Ｂ５９；Ａ３−Ｂ６０；Ａ３−Ｂ６１；Ａ３−Ｂ６２；Ａ３−Ｂ６３；Ａ３−Ｂ６４；Ａ３−Ｂ６５；Ａ３−Ｂ６６；Ａ３−Ｂ６７；Ａ３−Ｂ６８；Ａ３−Ｂ６９；Ａ３−Ｂ７０；Ａ３−Ｂ７１；Ａ３−Ｂ７２；Ａ３−Ｂ７３；Ａ３−Ｂ７４；Ａ３−Ｂ７５；Ａ３−Ｂ７６；Ａ３−Ｂ７７；Ａ３−Ｂ７８；Ａ３−Ｂ７９；Ａ３−Ｂ８０；Ａ３−Ｂ８１；Ａ３−Ｂ８２；Ａ３−Ｂ８３；Ａ３−Ｂ８４；Ａ３−Ｂ８５；Ａ３−Ｂ８６；Ａ３−Ｂ８７；Ａ３−Ｂ８８；Ａ３−Ｂ８９；Ａ３−Ｂ９０；Ａ３−Ｂ９１；Ａ３−Ｂ９２；Ａ３−Ｂ９３；Ａ３−Ｂ９４；Ａ３−Ｂ９５；Ａ３−Ｂ９６；Ａ３−Ｂ９７；Ａ３−Ｂ９８；Ａ３−Ｂ９９；Ａ３−Ｂ１００；Ａ３−Ｂ１０１；Ａ３−Ｂ１０２；Ａ３−Ｂ１０３；Ａ３−Ｂ１０４；Ａ３−Ｂ１０５；Ａ３−Ｂ１０６；Ａ３−Ｂ１０７；Ａ３−Ｂ１０８；Ａ３−Ｂ１０９；Ａ３−Ｂ１１０；Ａ３−Ｂ１１１；Ａ３−Ｂ１１２；Ａ３−Ｂ１１３；
Ａ４−Ｂ１；Ａ４−Ｂ２；Ａ４−Ｂ３；Ａ４−Ｂ４；Ａ４−Ｂ５；Ａ４−Ｂ６；Ａ４−Ｂ７；Ａ４−Ｂ８；Ａ４−Ｂ９；Ａ４−Ｂ１０；Ａ４−Ｂ１１；Ａ４−Ｂ１２；Ａ４−Ｂ１３；Ａ４−Ｂ１４；Ａ４−Ｂ１５；Ａ４−Ｂ１６；Ａ４−Ｂ１７；Ａ４−Ｂ１８；Ａ４−Ｂ１９；Ａ４−Ｂ２０；Ａ４−Ｂ２１；Ａ４−Ｂ２２；Ａ４−Ｂ２３；Ａ４−Ｂ２４；Ａ４−Ｂ２５；Ａ４−Ｂ２６；Ａ４−Ｂ２７；Ａ４−Ｂ２８；Ａ４−Ｂ２９；Ａ４−Ｂ３０；Ａ４−Ｂ３１；Ａ４−Ｂ３２；Ａ４−Ｂ３３；Ａ４−Ｂ３４；Ａ４−Ｂ３５；Ａ４−Ｂ３６；Ａ４−Ｂ３７；Ａ４−Ｂ３８；Ａ４−Ｂ３９；Ａ４−Ｂ４０；Ａ４−Ｂ４１；Ａ４−Ｂ４２；Ａ４−Ｂ４３；Ａ４−Ｂ４４；Ａ４−Ｂ４５；Ａ４−Ｂ４６；Ａ４−Ｂ４７；Ａ４−Ｂ４８；Ａ４−Ｂ４９；Ａ４−Ｂ５０；Ａ４−Ｂ５１；Ａ４−Ｂ５２；Ａ４−Ｂ５３；Ａ４−Ｂ５４；Ａ４−Ｂ５５；Ａ４−Ｂ５６；Ａ４−Ｂ５７；Ａ４−Ｂ５８；Ａ４−Ｂ５９；Ａ４−Ｂ６０；Ａ４−Ｂ６１；Ａ４−Ｂ６２；Ａ４−Ｂ６３；Ａ４−Ｂ６４；Ａ４−Ｂ６５；Ａ４−Ｂ６６；Ａ４−Ｂ６７；Ａ４−Ｂ６８；Ａ４−Ｂ６９；Ａ４−Ｂ７０；Ａ４−Ｂ７１；Ａ４−Ｂ７２；Ａ４−Ｂ７３；Ａ４−Ｂ７４；Ａ４−Ｂ７５；Ａ４−Ｂ７６；Ａ４−Ｂ７７；Ａ４−Ｂ７８；Ａ４−Ｂ７９；Ａ４−Ｂ８０；Ａ４−Ｂ８１；Ａ４−Ｂ８２；Ａ４−Ｂ８３；Ａ４−Ｂ８４；Ａ４−Ｂ８５；Ａ４−Ｂ８６；Ａ４−Ｂ８７；Ａ４−Ｂ８８；Ａ４−Ｂ８９；Ａ４−Ｂ９０；Ａ４−Ｂ９１；Ａ４−Ｂ９２；Ａ４−Ｂ９３；Ａ４−Ｂ９４；Ａ４−Ｂ９５；Ａ４−Ｂ９６；Ａ４−Ｂ９７；Ａ４−Ｂ９８；Ａ４−Ｂ９９；Ａ４−Ｂ１００；Ａ４−Ｂ１０１；Ａ４−Ｂ１０２；Ａ４−Ｂ１０３；Ａ４−Ｂ１０４；Ａ４−Ｂ１０５；Ａ４−Ｂ１０６；Ａ４−Ｂ１０７；Ａ４−Ｂ１０８；Ａ４−Ｂ１０９；Ａ４−Ｂ１１０；Ａ４−Ｂ１１１；Ａ４−Ｂ１１２；Ａ４−Ｂ１１３；
Ａ５−Ｂ１；Ａ５−Ｂ２；Ａ５−Ｂ３；Ａ５−Ｂ４；Ａ５−Ｂ５；Ａ５−Ｂ６；Ａ５−Ｂ７；Ａ５−Ｂ８；Ａ５−Ｂ９；Ａ５−Ｂ１０；Ａ５−Ｂ１１；Ａ５−Ｂ１２；Ａ５−Ｂ１３；Ａ５−Ｂ１４；Ａ５−Ｂ１５；Ａ５−Ｂ１６；Ａ５−Ｂ１７；Ａ５−Ｂ１８；Ａ５−Ｂ１９；Ａ５−Ｂ２０；Ａ５−Ｂ２１；Ａ５−Ｂ２２；Ａ５−Ｂ２３；Ａ５−Ｂ２４；Ａ５−Ｂ２５；Ａ５−Ｂ２６；Ａ５−Ｂ２７；Ａ５−Ｂ２８；Ａ５−Ｂ２９；Ａ５−Ｂ３０；Ａ５−Ｂ３１；Ａ５−Ｂ３２；Ａ５−Ｂ３３；Ａ５−Ｂ３４；Ａ５−Ｂ３５；Ａ５−Ｂ３６；Ａ５−Ｂ３７；Ａ５−Ｂ３８；Ａ５−Ｂ３９；Ａ５−Ｂ４０；Ａ５−Ｂ４１；Ａ５−Ｂ４２；Ａ５−Ｂ４３；Ａ５−Ｂ４４；Ａ５−Ｂ４５；Ａ５−Ｂ４６；Ａ５−Ｂ４７；Ａ５−Ｂ４８；Ａ５−Ｂ４９；Ａ５−Ｂ５０；Ａ５−Ｂ５１；Ａ５−Ｂ５２；Ａ５−Ｂ５３；Ａ５−Ｂ５４；Ａ５−Ｂ５５；Ａ５−Ｂ５６；Ａ５−Ｂ５７；Ａ５−Ｂ５８；Ａ５−Ｂ５９；Ａ５−Ｂ６０；Ａ５−Ｂ６１；Ａ５−Ｂ６２；Ａ５−Ｂ６３；Ａ５−Ｂ６４；Ａ５−Ｂ６５；Ａ５−Ｂ６６；Ａ５−Ｂ６７；Ａ５−Ｂ６８；Ａ５−Ｂ６９；Ａ５−Ｂ７０；Ａ５−Ｂ７１；Ａ５−Ｂ７２；Ａ５−Ｂ７３；Ａ５−Ｂ７４；Ａ５−Ｂ７５；Ａ５−Ｂ７６；Ａ５−Ｂ７７；Ａ５−Ｂ７８；Ａ５−Ｂ７９；Ａ５−Ｂ８０；Ａ５−Ｂ８１；Ａ５−Ｂ８２；Ａ５−Ｂ８３；Ａ５−Ｂ８４；Ａ５−Ｂ８５；Ａ５−Ｂ８６；Ａ５−Ｂ８７；Ａ５−Ｂ８８；Ａ５−Ｂ８９；Ａ５−Ｂ９０；Ａ５−Ｂ９１；Ａ５−Ｂ９２；Ａ５−Ｂ９３；Ａ５−Ｂ９４；Ａ５−Ｂ９５；Ａ５−Ｂ９６；Ａ５−Ｂ９７；Ａ５−Ｂ９８；Ａ５−Ｂ９９；Ａ５−Ｂ１００；Ａ５−Ｂ１０１；Ａ５−Ｂ１０２；Ａ５−Ｂ１０３；Ａ５−Ｂ１０４；Ａ５−Ｂ１０５；Ａ５−Ｂ１０６；Ａ５−Ｂ１０７；Ａ５−Ｂ１０８；Ａ５−Ｂ１０９；Ａ５−Ｂ１１０；Ａ５−Ｂ１１１；Ａ５−Ｂ１１２；Ａ５−Ｂ１１３；
Ａ６−Ｂ１；Ａ６−Ｂ２；Ａ６−Ｂ３；Ａ６−Ｂ４；Ａ６−Ｂ５；Ａ６−Ｂ６；Ａ６−Ｂ７；Ａ６−Ｂ８；Ａ６−Ｂ９；Ａ６−Ｂ１０；Ａ６−Ｂ１１；Ａ６−Ｂ１２；Ａ６−Ｂ１３；Ａ６−Ｂ１４；Ａ６−Ｂ１５；Ａ６−Ｂ１６；Ａ６−Ｂ１７；Ａ６−Ｂ１８；Ａ６−Ｂ１９；Ａ６−Ｂ２０；Ａ６−Ｂ２１；Ａ６−Ｂ２２；Ａ６−Ｂ２３；Ａ６−Ｂ２４；Ａ６−Ｂ２５；Ａ６−Ｂ２６；Ａ６−Ｂ２７；Ａ６−Ｂ２８；Ａ６−Ｂ２９；Ａ６−Ｂ３０；Ａ６−Ｂ３１；Ａ６−Ｂ３２；Ａ６−Ｂ３３；Ａ６−Ｂ３４；Ａ６−Ｂ３５；Ａ６−Ｂ３６；Ａ６−Ｂ３７；Ａ６−Ｂ３８；Ａ６−Ｂ３９；Ａ６−Ｂ４０；Ａ６−Ｂ４１；Ａ６−Ｂ４２；Ａ６−Ｂ４３；Ａ６−Ｂ４４；Ａ６−Ｂ４５；Ａ６−Ｂ４６；Ａ６−Ｂ４７；Ａ６−Ｂ４８；Ａ６−Ｂ４９；Ａ６−Ｂ５０；Ａ６−Ｂ５１；Ａ６−Ｂ５２；Ａ６−Ｂ５３；Ａ６−Ｂ５４；Ａ６−Ｂ５５；Ａ６−Ｂ５６；Ａ６−Ｂ５７；Ａ６−Ｂ５８；Ａ６−Ｂ５９；Ａ６−Ｂ６０；Ａ６−Ｂ６１；Ａ６−Ｂ６２；Ａ６−Ｂ６３；Ａ６−Ｂ６４；Ａ６−Ｂ６５；Ａ６−Ｂ６６；Ａ６−Ｂ６７；Ａ６−Ｂ６８；Ａ６−Ｂ６９；Ａ６−Ｂ７０；Ａ６−Ｂ７１；Ａ６−Ｂ７２；Ａ６−Ｂ７３；Ａ６−Ｂ７４；Ａ６−Ｂ７５；Ａ６−Ｂ７６；Ａ６−Ｂ７７；Ａ６−Ｂ７８；Ａ６−Ｂ７９；Ａ６−Ｂ８０；Ａ６−Ｂ８１；Ａ６−Ｂ８２；Ａ６−Ｂ８３；Ａ６−Ｂ８４；Ａ６−Ｂ８５；Ａ６−Ｂ８６；Ａ６−Ｂ８７；Ａ６−Ｂ８８；Ａ６−Ｂ８９；Ａ６−Ｂ９０；Ａ６−Ｂ９１；Ａ６−Ｂ９２；Ａ６−Ｂ９３；Ａ６−Ｂ９４；Ａ６−Ｂ９５；Ａ６−Ｂ９６；Ａ６−Ｂ９７；Ａ６−Ｂ９８；Ａ６−Ｂ９９；Ａ６−Ｂ１００；Ａ６−Ｂ１０１；Ａ６−Ｂ１０２；Ａ６−Ｂ１０３；Ａ６−Ｂ１０４；Ａ６−Ｂ１０５；Ａ６−Ｂ１０６；Ａ６−Ｂ１０７；Ａ６−Ｂ１０８；Ａ６−Ｂ１０９；Ａ６−Ｂ１１０；Ａ６−Ｂ１１１；Ａ６−Ｂ１１２；Ａ６−Ｂ１１３；
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Ａ７６−Ｂ１；Ａ７６−Ｂ２；Ａ７６−Ｂ３；Ａ７６−Ｂ４；Ａ７６−Ｂ５；Ａ７６−Ｂ６；Ａ７６−Ｂ７；Ａ７６−Ｂ８；Ａ７６−Ｂ９；Ａ７６−Ｂ１０；Ａ７６−Ｂ１１；Ａ７６−Ｂ１２；Ａ７６−Ｂ１３；Ａ７６−Ｂ１４；Ａ７６−Ｂ１５；Ａ７６−Ｂ１６；Ａ７６−Ｂ１７；Ａ７６−Ｂ１８；Ａ７６−Ｂ１９；Ａ７６−Ｂ２０；Ａ７６−Ｂ２１；Ａ７６−Ｂ２２；Ａ７６−Ｂ２３；Ａ７６−Ｂ２４；Ａ７６−Ｂ２５；Ａ７６−Ｂ２６；Ａ７６−Ｂ２７；Ａ７６−Ｂ２８；Ａ７６−Ｂ２９；Ａ７６−Ｂ３０；Ａ７６−Ｂ３１；Ａ７６−Ｂ３２；Ａ７６−Ｂ３３；Ａ７６−Ｂ３４；Ａ７６−Ｂ３５；Ａ７６−Ｂ３６；Ａ７６−Ｂ３７；Ａ７６−Ｂ３８；Ａ７６−Ｂ３９；Ａ７６−Ｂ４０；Ａ７６−Ｂ４１；Ａ７６−Ｂ４２；Ａ７６−Ｂ４３；Ａ７６−Ｂ４４；Ａ７６−Ｂ４５；Ａ７６−Ｂ４６；Ａ７６−Ｂ４７；Ａ７６−Ｂ４８；Ａ７６−Ｂ４９；Ａ７６−Ｂ５０；Ａ７６−Ｂ５１；Ａ７６−Ｂ５２；Ａ７６−Ｂ５３；Ａ７６−Ｂ５４；Ａ７６−Ｂ５５；Ａ７６−Ｂ５６；Ａ７６−Ｂ５７；Ａ７６−Ｂ５８；Ａ７６−Ｂ５９；Ａ７６−Ｂ６０；Ａ７６−Ｂ６１；Ａ７６−Ｂ６２；Ａ７６−Ｂ６３；Ａ７６−Ｂ６４；Ａ７６−Ｂ６５；Ａ７６−Ｂ６６；Ａ７６−Ｂ６７；Ａ７６−Ｂ６８；Ａ７６−Ｂ６９；Ａ７６−Ｂ７０；Ａ７６−Ｂ７１；Ａ７６−Ｂ７２；Ａ７６−Ｂ７３；Ａ７６−Ｂ７４；Ａ７６−Ｂ７５；Ａ７６−Ｂ７６；Ａ７６−Ｂ７７；Ａ７６−Ｂ７８；Ａ７６−Ｂ７９；Ａ７６−Ｂ８０；Ａ７６−Ｂ８１；Ａ７６−Ｂ８２；Ａ７６−Ｂ８３；Ａ７６−Ｂ８４；Ａ７６−Ｂ８５；Ａ７６−Ｂ８６；Ａ７６−Ｂ８７；Ａ７６−Ｂ８８；Ａ７６−Ｂ８９；Ａ７６−Ｂ９０；Ａ７６−Ｂ９１；Ａ７６−Ｂ９２；Ａ７６−Ｂ９３；Ａ７６−Ｂ９４；Ａ７６−Ｂ９５；Ａ７６−Ｂ９６；Ａ７６−Ｂ９７；Ａ７６−Ｂ９８；Ａ７６−Ｂ９９；Ａ７６−Ｂ１００；Ａ７６−Ｂ１０１；Ａ７６−Ｂ１０２；Ａ７６−Ｂ１０３；Ａ７６−Ｂ１０４；Ａ７６−Ｂ１０５；Ａ７６−Ｂ１０６；Ａ７６−Ｂ１０７；Ａ７６−Ｂ１０８；Ａ７６−Ｂ１０９；Ａ７６−Ｂ１１０；Ａ７６−Ｂ１１１；Ａ７６−Ｂ１１２；Ａ７６−Ｂ１１３；
Ａ７７−Ｂ１；Ａ７７−Ｂ２；Ａ７７−Ｂ３；Ａ７７−Ｂ４；Ａ７７−Ｂ５；Ａ７７−Ｂ６；Ａ７７−Ｂ７；Ａ７７−Ｂ８；Ａ７７−Ｂ９；Ａ７７−Ｂ１０；Ａ７７−Ｂ１１；Ａ７７−Ｂ１２；Ａ７７−Ｂ１３；Ａ７７−Ｂ１４；Ａ７７−Ｂ１５；Ａ７７−Ｂ１６；Ａ７７−Ｂ１７；Ａ７７−Ｂ１８；Ａ７７−Ｂ１９；Ａ７７−Ｂ２０；Ａ７７−Ｂ２１；Ａ７７−Ｂ２２；Ａ７７−Ｂ２３；Ａ７７−Ｂ２４；Ａ７７−Ｂ２５；Ａ７７−Ｂ２６；Ａ７７−Ｂ２７；Ａ７７−Ｂ２８；Ａ７７−Ｂ２９；Ａ７７−Ｂ３０；Ａ７７−Ｂ３１；Ａ７７−Ｂ３２；Ａ７７−Ｂ３３；Ａ７７−Ｂ３４；Ａ７７−Ｂ３５；Ａ７７−Ｂ３６；Ａ７７−Ｂ３７；Ａ７７−Ｂ３８；Ａ７７−Ｂ３９；Ａ７７−Ｂ４０；Ａ７７−Ｂ４１；Ａ７７−Ｂ４２；Ａ７７−Ｂ４３；Ａ７７−Ｂ４４；Ａ７７−Ｂ４５；Ａ７７−Ｂ４６；Ａ７７−Ｂ４７；Ａ７７−Ｂ４８；Ａ７７−Ｂ４９；Ａ７７−Ｂ５０；Ａ７７−Ｂ５１；Ａ７７−Ｂ５２；Ａ７７−Ｂ５３；Ａ７７−Ｂ５４；Ａ７７−Ｂ５５；Ａ７７−Ｂ５６；Ａ７７−Ｂ５７；Ａ７７−Ｂ５８；Ａ７７−Ｂ５９；Ａ７７−Ｂ６０；Ａ７７−Ｂ６１；Ａ７７−Ｂ６２；Ａ７７−Ｂ６３；Ａ７７−Ｂ６４；Ａ７７−Ｂ６５；Ａ７７−Ｂ６６；Ａ７７−Ｂ６７；Ａ７７−Ｂ６８；Ａ７７−Ｂ６９；Ａ７７−Ｂ７０；Ａ７７−Ｂ７１；Ａ７７−Ｂ７２；Ａ７７−Ｂ７３；Ａ７７−Ｂ７４；Ａ７７−Ｂ７５；Ａ７７−Ｂ７６；Ａ７７−Ｂ７７；Ａ７７−Ｂ７８；Ａ７７−Ｂ７９；Ａ７７−Ｂ８０；Ａ７７−Ｂ８１；Ａ７７−Ｂ８２；Ａ７７−Ｂ８３；Ａ７７−Ｂ８４；Ａ７７−Ｂ８５；Ａ７７−Ｂ８６；Ａ７７−Ｂ８７；Ａ７７−Ｂ８８；Ａ７７−Ｂ８９；Ａ７７−Ｂ９０；Ａ７７−Ｂ９１；Ａ７７−Ｂ９２；Ａ７７−Ｂ９３；Ａ７７−Ｂ９４；Ａ７７−Ｂ９５；Ａ７７−Ｂ９６；Ａ７７−Ｂ９７；Ａ７７−Ｂ９８；Ａ７７−Ｂ９９；Ａ７７−Ｂ１００；Ａ７７−Ｂ１０１；Ａ７７−Ｂ１０２；Ａ７７−Ｂ１０３；Ａ７７−Ｂ１０４；Ａ７７−Ｂ１０５；Ａ７７−Ｂ１０６；Ａ７７−Ｂ１０７；Ａ７７−Ｂ１０８；Ａ７７−Ｂ１０９；Ａ７７−Ｂ１１０；Ａ７７−Ｂ１１１；Ａ７７−Ｂ１１２；Ａ７７−Ｂ１１３；
サブカテゴリーＩＡ：ジペプチドプロドラッグ要素のアミノ酸Ｂは、Ｎ−アルキル化されたグリシンである
いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素のＢのアミノ酸は、Ｎ−アルキル化されたグリシンである。Ｂのアミノ酸としてＮ−アルキル化されたグリシンを有するジペプチドプロドラッグ要素の非限定的な例を、以下の表に示す。
Figure 2013540102
サブカテゴリーＩＢ：ジペプチドプロドラッグ要素のアミノ酸Ｂは、β位で未置換であるか一置換される
いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素のＢのアミノ酸は、β位で未置換であるか、あるいは、一置換されており、比較的かさ高くない側鎖を有する。β位で未置換であるか、あるいは一置換されたＢのアミノ酸と、比較的かさ高くない側鎖とを有するジペプチドプロドラッグ要素の非限定的な例を、以下の表に示す。
Figure 2013540102

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Figure 2013540102

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いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素のＢのアミノ酸は、以下の表に示すような、β位で一置換され、比較的かさ高の側鎖を有する。
Figure 2013540102

Figure 2013540102
サブカテゴリーＩＣ：β位で二置換されたジペプチドプロドラッグ要素のアミノ酸Ｂ
いくつかの実施形態では、ジペプチドプロドラッグ要素のＢのアミノ酸は、β位で二置換される。β位で二置換されたＢのアミノ酸を有するジペプチドプロドラッグ要素の非限定的な例を、以下の表に示す。
Figure 2013540102

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プロドラッグ
ジペプチドプロドラッグ要素は、グルカゴン関連ペプチドの活性に干渉する任意の位置を介して（たとえば、Ｎ末端のアミノ酸のαアミン、Ｑのアミノ酸の側鎖の脂肪族アミノ基（たとえば、リジン側鎖）、Ｑのアミノ酸の側鎖の芳香族アミノ基（たとえば、アミノフェニルアラニン、アミノナフチルアラニン、アミノトリプトファン、アミノフェニルグリシン、アミノホモフェニルアラニン）などで、以下のいずれかのグルカゴン関連ペプチドに結合する。Ａ−ＢがＱのアミノ酸の側鎖の脂肪族アミノ基に結合する場合の位置の例として、天然のグルカゴン（配列番号７０１）の１２番目、１６番目、１７番目、１８番目、２０番目、２８番目または２９番目があげられる。Ａ−ＢがＱのアミノ酸の側鎖の芳香族アミノ基に結合する場合の位置の例として、天然のグルカゴン（配列番号７０１）の１０番目、１３番目、２２番目または２５番目があげられる。いくつかの実施形態では、本発明のジペプチドプロドラッグ要素は、配列番号１〜５６４、５６６〜５７０、５７３〜５７５、５７７、５７９〜５８０、５８５〜６１２、６１６、６１８〜６３２、６３４〜６４２、６４７、６５７〜６８４、７０１〜７３２、７４２〜７６８、８０１〜８７８、８８３〜９１９、１００１〜１２６２、１３０１〜１３７１、１４０１〜１５１８、１７０１〜１７０８、１７１０、１７１１、１７３１〜１７３４、１７３８、１７４０、１７４１、１７４５、１７４７〜１７７６のうちのいずれか１つに結合する。たとえば、ジペプチドプロドラッグ要素は、配列番号７４２〜７６８のいずれか１つに結合可能である。
例示としてのいくつかの実施形態では、Ａｉｂ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）、ｄＬｙｓ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）、ｄＣｙｓ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）、ｄＡｌａ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）、Ａｉｂ−Ｇｌｙ（Ｎ−メチル）、ｄＬｙｓ−Ｇｌｙ（Ｎ−メチル）、ｄＣｙｓ−Ｇｌｙ（Ｎ−メチル）、ｄＡｌａ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）、Ａｉｂ−Ｐｈｅ（Ｎ−メチル）、ｄＬｙｓ−Ｐｈｅ（Ｎ−メチル）、ｄＣｙｓ−Ｐｈｅ（Ｎ−メチル）またはｄＡｌａ−Ｐｈｅ（Ｎ−メチル）を、配列番号７６９〜７９４で表示し、以下の表に示す、配列番号７４２〜７４５、７４８〜７７０のいずれかのＮ末端のαアミノ基に結合する。
Figure 2013540102

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使用方法
グルカゴンスーパーファミリーのペプチド
通常、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドまたはグルカゴン関連ペプチド（クラス１、クラス２、クラス３、クラス４またはクラス５のペプチドなど）を有するプロドラッグは、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドおよびグルカゴン関連ペプチドが用いられてきた用途であれば、どのような用途にも使用できる（上記にて詳細に説明したものなど）。たとえば、本明細書に開示の生体活性ペプチドプロドラッグ類縁体は、対応する親の生体活性ペプチドについて上述したいずれの用途にも適していると思われる。したがって、本明細書に記載のグルカゴン関連ペプチドプロドラッグ類縁体は、グルカゴンの血中濃度の高さ／低さまたはグルコースの血中濃度の高さ／低さに起因する低血糖症、高血糖症、糖尿病または他の代謝疾患の治療に使用可能である。いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示のプロドラッグを用いて治療される患者は、飼いならされた動物であり、別の実施形態では、治療対象となる患者はヒトである。
いくつかの実施形態では、プロドラッグを使用して、食欲を低減または抑制、食物摂取量を低減、体重減少を誘導または体重維持を補助する。食欲を低減し、あるいは体重減少を促進するための上述したような方法は、体重を落とし、体重増加を防止し、あるいは、薬物誘発性肥満をはじめとするさまざまな原因の肥満を治療し、血管疾患（冠動脈疾患、脳卒中、末梢血管疾患、虚血再灌流障害など）、高血圧症、ＩＩ型糖尿病の発症、高脂血症、筋骨格系疾患をはじめとする肥満に関連する合併症を軽減する上で、有用であると思われる。
他の実施形態では、非経口で栄養を摂取している患者または完全非経口栄養の患者に投与するなど、病院環境で非糖尿病患者への栄養の非経口投与と、プロドラッグとを併用する。非限定的な例として、手術患者、昏睡患者、消化管に病気のある患者または胃腸管が機能していない患者（外科手術での摘出、閉塞または吸収力の低下、クローン病、潰瘍性大腸炎、胃腸管の通過障害、胃腸管の瘻孔、急性膵炎、虚血性大腸炎、胃腸外科手術、特定の先天性胃腸管異常、手術による遷延性下痢または短腸症候群、ショック患者ならびに、脂質、電解質、ミネラル、ビタミン、アミノ酸のさまざまな組み合わせと一緒に炭水化物の非経口投与を受けている治療中の患者があげられる。非経口栄養組成物が消化される時点でグルカゴンスーパーファミリーのペプチドプロドラッグによって所望の生物学的作用が得られるかぎり、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドプロドラッグと非経口栄養組成物を、同時に、異なる時点で、互いに前後して投与することが可能である。たとえば、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドプロドラッグを２日に１回、１週間に３回、１週間に２回、１週間に１回、２週間ごと、３週間ごとまたは１か月ごとに投与しながら、非経口栄養を１日１回、１日２回または１日３回投与してもよい。
メタボリックシンドロームは、メタボリックシンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群またはＲｅａｖｅｎ症候群としても知られ、５０００万人を超える米国人に認められる障害である。メタボリックシンドロームは一般に、以下の危険因子のうち少なくとも３つまたは４つ以上に該当することを特徴とするものである：（１）腹部肥満（腹部およびその周辺の脂肪組織が過剰である）、（２）アテローム性脂質異常症（動脈壁へのプラークの蓄積を増やす、高トリグリセリド、高ＨＤＬコレステロール、高ＬＤＬコレステロールを含む血中脂質値の異常）、（３）血圧上昇、（４）インスリン抵抗性またはグルコース不耐性、（５）血栓形成傾向（たとえば、血中の高フィブリノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化因子阻害因子−１など）、（６）炎症誘発状態（血中のＣ反応性タンパク質など）。他の危険因子として、老化、ホルモンのアンバランス、遺伝的素因があげられる。
メタボリックシンドロームは、血管プラークの蓄積に関連する冠動脈心疾患ならびに、脳卒中およびアテローム動脈硬化性心血管疾患（ＡＳＣＶＤ）と呼ばれる末梢血管疾患などの他の障害の危険性の増加と関連している。メタボリックシンドロームの患者は、初期のインスリン抵抗性状態から完全に打撃を受けたＩＩ型糖尿病まで進行し、ＡＳＣＶＤの危険性がさらに高まる。特定の理論に拘泥することなく、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、血管疾患の関係は、インスリン刺激による血管拡張の障害、酸化ストレスが高まることによるインスリン抵抗性に関連したＮＯ利用率の低下、アディポネクチンなどの脂肪細胞由来のホルモンにおける異常（Lteif and Mather, Can. J. Cardiol. 20 (suppl. B):66B-76B (2004)）のうちの１つまたは２つ以上が同時に発症することにある。
2001 National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel(ATP III)によれば、同一の対象個体で以下の特徴のうち３つが当てはまる場合に、メタボリックシンドロームの基準を満たすことになる：（ａ）腹部肥満（ウェスト周りが男性で１０２ｃｍを超え、女性で８８ｃｍを超える）；（ｂ）血清トリグリセリド（１５０ｍｇ／ｄｌ以上）；（ｃ）ＨＤＬコレステロール（男性で４０ｍｇ／ｄｌ以下、女性で５０ｍｇ／ｄｌ以下）；（ｄ）血圧（１３０／８５以上；（ｅ）空腹時血糖（１１０ｍｇ／ｄｌ以上）。世界保健機関（ＷＨＯ）によれば、以下の基準のうち少なくとも２つが当てはまる、インスリンレベルが高い対象個体（空腹時血糖上昇または食後高血糖単独）は、メタボリックシンドロームの基準を満たす：（ａ）腹部肥満（ウェスト部と腰部の比が０．９を上回り、肥満度指数が少なくとも３０ｋｇ／ｍ２またはウェスト周りが３７インチを超える）；（ｂ）コレステロールパネルでトリグリセリドレベルが少なくとも１５０ｍｇ／ｄｌまたはＨＤＬコレステロールが３５ｍｇ／ｄｌ未満；（ｃ）血圧１４０／９０以上または高血圧の治療中）。（Mathur, Ruchi, “Metabolic Syndrome,” ed. Shiel, Jr., William C., MedicineNet.com, May 11, 2009）。
本明細書の目的で、2001 National Cholesterol Education Program Adult Treatment PanelまたはＷＨＯによって規定された基準の一方または両方を対象個体が満たす場合、その対象個体は、メタボリックシンドロームの状態にあるとみなす。
特定の理論に拘泥することなく、本明細書に記載のグルカゴンペプチドは、メタボリックシンドロームを治療するのに有用である。したがって、本発明では、治療対象者で、メタボリックシンドロームを予防または治療する、あるいは、その危険因子のうちの１つ、２つ、３つまたは４つ以上を低減する方法であって、その治療対象者に、本明細書に記載のグルカゴンペプチドを、メタボリックシンドロームまたはその危険因子を予防または治療するのに有効な量で投与することを含む、方法が提供される。
非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬＤ）は、単純性脂肪肝（脂肪過多症）から非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変（不可逆的、肝臓の瘢痕化が進行）まで、広い範囲の肝臓疾患を示す。ＮＡＦＬＤのすべての段階で、共通して、肝細胞（肝実質細胞）に脂肪の蓄積（脂肪浸潤）が認められる。単純性脂肪肝は、特定の種類の脂肪すなわちトリグリセリドが肝細胞に異常蓄積するもので、炎症または瘢痕化はない。ＮＡＳＨでは、脂肪の蓄積が肝臓でのさまざまな度合いの炎症（肝炎）および瘢痕化（線維症）と関連している。炎症細胞が肝細胞を破壊することもある（肝細胞の壊死）。「脂肪性肝炎」および「脂肪壊死（ｓｔｅａｔｏｎｅｃｒｏｓｉｓ）」という用語でステアト（ｓｔｅａｔｏ）は脂肪浸潤を示し、肝炎は肝臓における炎症を示し、壊死は破壊された肝細胞を示す。ＮＡＳＨは、最終的には肝臓の瘢痕化（線維症）に、さらには不可逆的かつ進行性の瘢痕化（肝硬変）につながることがある。ＮＡＳＨによって生じる肝硬変は、ＮＡＦＬＤのスペクトルで最も重篤な最終段階である。（Mendler, Michel, “Fatty Liver: Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) and Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH),” ed. Schoenfield, Leslie J., MedicineNet.com, August 29, 2005）。
アルコール性肝疾患またはアルコール誘発肝疾患は、アルコールの過剰摂取に関連するまたはこれによって生じる、病理学的に異なる３種類の肝疾患すなわち、脂肪肝（脂肪過多症）、慢性肝炎または急性肝炎、肝硬変を包含する。アルコール性肝炎は、臨床検査の異常だけが疾患を示す指標である軽度の肝炎から、黄疸（ビリルビンの貯留によって生じる皮膚の黄変）、肝性脳症（肝臓障害による神経の異常）、腹水症（腹部での体液蓄積）、食道静脈瘤の出血（食堂に静脈瘤が生じる）、凝血異常および昏睡などの合併症を伴う重篤な肝臓の機能障害までの範囲に至る。組織学的に、アルコール性肝炎は、肝細胞の風船様腫大による変性、好中球を伴う炎症、ときにはマロリー小体を伴う炎症（細胞の中間径フィラメントタンパク質の異常凝集）という見た目での特徴がある。肝硬変は、解剖学的に、肝臓全体に小結節が生じ、線維症を伴う。（Worman, Howard J., "Alcoholic Liver Disease", Columbia University Medical Centerのウェブサイト）。
特定の理論に拘泥することなく、本明細書に記載のクラス２およびクラス３のグルカゴン関連ペプチドは、脂肪過多症、脂肪性肝炎、肝炎、肝臓の炎症、ＮＡＳＨ、肝硬変またはこれらの合併症をはじめとするアルコール性肝疾患、ＮＡＦＬＤまたはそのいずれかのステージの治療に有用である。したがって、本発明は、治療対象者において、アルコール性肝疾患、ＮＡＦＬＤまたはそのいずれかのステージを予防または治療する方法であって、治療対象者に、本明細書に記載のクラス２またはクラス３のグルカゴンペプチドを、アルコール性肝疾患、ＮＡＦＬＤまたはそのステージを予防または治療するのに効果的な量で投与することを含む。このような治療方法は、以下の１つ、２つ、３つまたは４つ以上の低減を含む：肝脂肪含有量、肝硬変の出現または進行、肝細胞癌の出現、炎症の徴候、たとえば肝酵素レベル（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）および／またはアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）またはＬＤＨなど）の異常、血清フェリチン上昇、血清ビリルビン上昇および／または線維症の徴候、たとえばＴＧＦ−βレベルの上昇。好ましい実施形態では、クラス２またはクラス３のグルカゴンペプチドを用いて、単純性脂肪肝（脂肪過多症）よりも症状が進行し、炎症または肝炎の徴候が認められる患者を治療する。このような方法を用いると、たとえば、ＡＳＴレベルおよび／またはＡＬＴレベルを下げることができる。
ＧＬＰ−１およびエキセンディン−４には、神経保護作用があることがわかっている。本発明は、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、他の脱髄関連障害、老年認知症、皮質下性認知症、動脈硬化性認知症、エイズ関連認知症または他の認知症、中枢神経系のがん、外傷性脳損傷、脊髄損傷、脳卒中または脳虚血、脳血管炎、てんかん、ハンチントン病、トゥレット症候群、ギラン・バレー症候群、ウイルソン病、ピック病、炎症性神経疾患、脳炎、脳脊髄炎または髄膜炎（ウイルス性、真菌性または細菌性）または他の中枢神経系感染症、プリオン病、小脳性運動失調症、小脳変性症、脊髄小脳変性症候群、フリードライヒ運動失調症、毛細血管拡張性運動失調症、脊髄性筋萎縮症、進行性核上性麻痺、ジストニア、筋痙縮、振戦、網膜色素変性、線条体黒質変性症、ミトコンドリア脳筋症、神経セロイドリポフスチン症、肝性脳症、腎性脳症、代謝性脳症、毒物による脳症および放射能による脳損傷を含むがこれらに限定されるものではない神経変性疾患の治療に、本明細書に記載のグルカゴンスーパーファミリーのペプチドを用いる用途も提供するものである。
したがって、本発明では、治療対象者で、神経変性疾患を予防または治療する、あるいは、その危険因子のうちの１つ、２つ、３つまたは４つ以上を低減する方法であって、その治療対象者に、本明細書に記載のグルカゴンペプチドを、神経変性疾患またはその危険因子を予防または治療するのに有効な量で投与することを含む、方法が提供される。

本発明による治療方法は、非経口（静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内など）、くも膜下内、経皮、直腸、経口、経鼻または吸入による投与ををはじめとする標準的な投与経路を使用して、本明細書に開示のプロドラッグを患者に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、組成物を、任意にデポーに入れるまたは除放組成物の一部として、皮下投与または筋肉内投与する。
組成物および組み合わせ
本発明のプロドラッグは、単独で投与してもよいし、抗糖尿病薬または抗肥満薬などの第２の薬剤との組み合わせで投与してもよいものである。いくつかの態様では、プロドラッグを、第２のプロドラッグまたはグルカゴンスーパーファミリーのメンバー（たとえばグルカゴン関連ペプチドなど）との組み合わせで投与する。特定の実施形態では、プロドラッグを、インスリン、トルブタミド（Orinase）、アセトヘキサミド（Dymelor）、トラザミド（Tolinase）、クロルプロパミド（Diabinese）、グリピジド（Glucotrol）、グリブリド（Diabeta、Micronase、Glynase）、グリメピリド（Amaryl）またはグリクラジド（Diamicron）などのスルホニル尿素；レパグリニド（Prandin）またはナテグリニド（Starlix）などのメグリチニド；メトホルミン（Glucophage）またはフェンホルミンなどのビグアナイド；ロシグリタゾン（Avandia）、ピオグリタゾン（Actos）またはトログリタゾン（Rezulin）または他のＰＰＡＲγ阻害薬などのチアゾリジンジオン；ミグリトール（Glyset）、アカルボース（Precose／Glucobay）などの炭水化物の消化を阻害するαグルコシダーゼ阻害薬；エクセナチド（Byetta）またはプラムリンチド；ビルダグリプチンまたはシタグリプチンなどのジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−ＩＶ）阻害薬；ＳＧＬＴ（ナトリウム依存性グルコーストランスポーター１）阻害剤；またはＦＢＰａｓｅ（フルクトース１，６−ビスホスファターゼ）阻害薬などであるがこれらに限定されるものではない、抗糖尿病薬との組み合わせで投与する。
当分野で知られた抗肥満薬または研究中の抗肥満薬としては、フェネチルアミンタイプの刺激薬、フェンテルミン（任意にフェンフルラミンまたはデクスフェンフルラミン併用）、ジエチルプロピオン（Tenuate（登録商標））、フェンジメトラジン（Prelu-2（登録商標）、Bontril（登録商標））、ベンズフェタミン（Didrex（登録商標））、シブトラミン（Meridia（登録商標）、Reductil（登録商標））；リモナバン（Acomplia（登録商標））、他のカンナビノイド受容体アンタゴニスト；オキシントモジュリン；塩酸フルオキセチン（Prozac）；Qnexa（トピラマートとフェンテルミンとの合剤）、Excalia（ブプロピオンおよびゾニサミド）またはContrave（ブプロピオンおよびナルトレキソン）；またはゼニカル（Orlistat）またはセチリスタット（ＡＴＬ−９６２としても知られる）またはＧＴ ３８９−２５５に類するリパーゼ阻害薬があげられるが、これらに限定されるものではない。
本発明のプロドラッグを、悪液質になった患者に投与することも可能である。悪液質は、意図的ではなく体重が減少しつづけ、衰弱し、体脂肪と筋肉が落ちることが特徴であり、がん患者の半数以上に悪液質が生じると推定される。この症候群はＡＩＤＳにも普通に見られ、細菌による疾患や寄生虫症、関節リウマチならびに、腸、肝臓、肺、心臓の慢性疾患に伴うこともある。これは通常、摂食障害に関連し、老化に伴う状態として、あるいは肉体的な外傷の結果として、顕在化することがある。悪液質は、生活の質を落とし、基礎疾患を悪化させる症状であり、主な死因のひとつでもある。
当業者に知られた標準的な薬学的に許容されるキャリアおよび投与経路を用いて、本明細書に開示のプロドラッグを含む薬学的組成物を調製し、患者に投与することが可能である。したがって、本開示は、本明細書に開示のプロドラッグ１種類または２種類以上あるいは、その薬学的に許容される塩を、薬学的に許容されるキャリアとの組み合わせで含む薬学的組成物も包含する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、リン酸バッファー系にてｐＨ約４．０〜約７．０で濃度１ｍｇ／ｍｌのプロドラッグを含む。薬学的組成物は、プロドラッグを単独の薬学的に活性のある成分として含むものであってもよいし、あるいは、プロドラッグを１種類または２種類以上の別の活性剤と組み合わせてもよい。いくつかの実施形態によれば、本発明のプロドラッグを含む組成物が提供される。あるいは、プロドラッグおよび抗肥満ペプチドを含む、体重減少を誘導または体重増加を防止するために提供される組成物を提供することが可能である。好適な抗肥満ペプチドとして、米国特許第５，６９１，３０９号、同第６，４３６，４３５号または米国特許出願第２００５０１７６６４３号に開示されたものがあげられる。
いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示のいずれかの新規なプロドラッグを、好ましくは滅菌状態かつ好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の純度レベルで含み、なおかつ薬学的に許容される希釈剤、キャリアまたは賦形剤も含む、薬学的組成物が提供される。このような組成物は、本明細書で開示するような生体活性ペプチドプロドラッグ誘導体を含有するものであってもよく、この場合、得られる活性ペプチドは、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１７ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、１９ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２１ｍｇ／ｍｌ、２２ｍｇ／ｍｌ、２３ｍｇ／ｍｌ、２４ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌまたはこれより高い濃度で存在する。このような組成物は、本明細書で開示するようなクラス１、クラス２またはクラス３の生体活性ペプチドプロドラッグ誘導体を含有するものであってもよく、この場合、得られる活性ペプチドは、少なくともＡの濃度で存在し、ここで、Ａは、０．００１ｍｇ／ｍｌ、０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１７ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、１９ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２１ｍｇ／ｍｌ、２２ｍｇ／ｍｌ、２３ｍｇ／ｍｌ、２４ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌであるか、あるいは、それより高い。他の実施形態では、このような組成物は、クラス１、クラス２またはクラス３の活性ペプチドを、最大Ｂの濃度で含有するものであってもよく、ここで、Ｂは、３０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、２４ｍｇ／ｍｌ、２３ｍｇ／ｍｌ、２２ｍｇ／ｍｌ、２１ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、１９ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、１７ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌまたは０．１ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、組成物は、クラス１、クラス２またはクラス３のグルカゴン関連ペプチドを、Ａ〜Ｂｍｇ／ｍｌの濃度範囲、たとえば、０．００１〜３０．０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で含有するものであってもよい。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、滅菌され、任意にさまざまな容器内で保管された水溶液を含む。本発明の化合物を、いくつかの実施形態に従って使用して、注射用の予め処方された溶液を調製することが可能である。他の実施形態では、薬学的組成物は、凍結乾燥粉末を含む。この薬学的組成物を、組成物を患者に投与するための使い捨ての装置を含むキットの一部として、さらに包装してもよい。周囲室温または冷蔵温度での保管用に、容器またはキットにラベルを付してもよい。
本明細書に記載の治療方法、薬学的組成物、キット、他の類似の実施形態ではいずれも、プロドラッグ化合物が、そのすべての薬学的に許容される塩を含むことを企図している。
いくつかの実施形態では、プロドラッグ組成物を患者に投与するための装置を含むキットが提供される。このキットは、たとえば、バイアル、チューブ、ボトルなどの多岐にわたる容器をさらに含むものであってもよい。好ましくは、キットには、取扱説明書も含む。いくつかの実施形態によれば、キットの装置は、エアロゾル用の装置であり、この場合、組成物は、エアロゾル装置の中にあらかじめ封入されている。もうひとつの実施形態では、キットに注射器と針とを含み、いくつかの実施形態では、プロドラッグ組成物があらかじめ注射器に封入されている。
クラス１、クラス２、クラス３のグルカゴン関連ペプチドの薬学的調製物
いくつかの実施形態によれば、本開示のグルカゴンペプチドまたはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容されるキャリアとを含む、薬学的組成物が提供される。薬学的組成物は、酸性化剤、添加剤、吸着剤、エアロゾル噴霧剤、空気置換剤、アルカリ化剤、固化防止剤、抗凝固剤、抗菌防腐剤、抗酸化剤、抗腐食剤、基剤、バインダー、緩衝剤、キレート化剤、コーティング剤、着色剤、乾燥剤、洗浄剤、希釈剤、殺菌消毒剤、崩壊剤、分散剤、溶解促進剤、染色剤、軟化剤、乳化剤、乳化安定剤、フィラー、成膜剤、香気増強剤、香味剤、流動促進剤、ゲル化剤、造粒剤、保湿剤、潤滑剤、粘着付与剤、軟膏基剤、軟膏、油性担体、有機塩基、トローチ基剤、顔料、可塑剤、研磨剤、防腐剤、金属イオン封鎖剤、皮膚浸透剤、可溶化剤、溶媒、安定化剤、坐剤の基剤、表面活性剤、界面活性剤、懸濁剤、甘味剤、治療剤、濃化剤、等張化剤、毒性剤、増粘剤、吸水剤、水混和性共溶媒、軟水化剤または湿潤剤などの薬学的に許容される成分を含むものであってもよい。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、以下の成分のうちの１つまたは組み合わせを含む：アカシア、アセスルファムカリウム、アセチルクエン酸トリブチル、アセチルクエン酸トリエチル、寒天、アルブミン、アルコール、無水アルコール、変性アルコール、希アルコール、アロイリチン酸、アルギン酸、脂肪族ポリエステル、アルミナ、水酸化アルミニウム、ステアリン酸アルミニウム、アミロペクチン、α−アミロース、アスコルビン酸、アスコルビルパルミタート、アスパルテーム、注射用静菌水、ベントナイト、マグマベントナイト、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、ブロノポール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチルパラベン、ブチルパラベンナトリウム、アルギン酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、炭酸カルシウム、シクラミン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム（無水物、anhydrous）、リン酸水素カルシウム（無水物、dehydrate）、第三リン酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、ソルビン酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸カルシウム半水和物、キャノーラ油、カルボマー、二酸化炭素、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、β−カロテン、カラギーナン、ひまし油、硬化ひまし油、カチオン性乳化ワックス、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、粉末セルロース、ケイ化微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セトステアリルアルコール、セトリミド、セチルアルコール、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、コレステロール、酢酸クロルヘキシジン、グルコン酸クロルヘキシジン、塩酸クロルヘキシジン、クロロジフルオロエタン（ＨＣＦＣ）、クロロジフルオロメタン、クロロフロオロカーボン（ＣＦＣ）クロロフェノキシエタノール、クロロキシレノール、コーンシロップ固体、無水クエン酸、クエン酸一水和物、カカオバター、着色料、コーン油、綿実油、クレゾール、ｍ−クレゾール、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、シクラミン酸、シクロデキストリン、デキストレート、デキストリン、ブドウ糖、ブドウ糖（無水物）、ジアゾリジニル尿素、フタル酸ジブチル、セバシン酸ジブチル、ジエタノールアミン、フタル酸ジエチル、ジフルオロエタン（ＨＦＣ）、ジメチル−β−シクロデキストリン、Captisol（登録商標）などのシクロデキストリンタイプの化合物、ジメチルエーテル、フタル酸ジメチル、エデト酸二カリウム、エデト酸二ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、ドクサートカルシウム、ドクサートカリウム、ドクサートナトリウム、没食子酸ドデシル、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸、エグルミン、エチルアルコール、エチルセルロース、没食子酸エチル、ラウリン酸エチル、エチルマルトール、オレイン酸エチル、エチルパラベン、エチルパラベンカリウム、エチルパラベンナトリウム、エチルバニリン、フルクトース、フルクトース液、粉砕フルクトース、フルクトース（滅菌済）、粉末フルクトース、フマル酸、ゼラチン、グルコース、液体グルコース、飽和植物脂肪酸のグリセリド混合物、グリセリン、ベヘン酸グリセリル、モノオレイン酸グリセリル、モノステアリン酸グリセリル、自己乳化型モノステアリン酸グリセリル、パルミトステアリン酸グリセリル、グリシン、グリコール、グリコフロール、グアーガム、ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＣ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、高フルクトースシロップ、ヒト血清アルブミン、炭化水素（ＨＣ）、希塩酸、硬化植物油およびそのタイプＩＩ、ヒドロキシエチルセルロース、２−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、イミド尿素、インジゴカルミン、イオン交換体、酸化鉄、イソプロピルアルコール、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、等張食塩水、カオリン、乳酸、ラクチトール、ラクトース、ラノリン、ラノリンアルコール、ラノリン（無水物）、レシチン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、炭酸マグネシウム、正炭酸マグネシウム、炭酸マグネシウム（無水物）、炭酸水酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、ラウリル硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、トリケイ酸マグネシウム、トリケイ酸マグネシウム（無水物）、リンゴ酸、麦芽、マルチトール、マルチトール溶液、マルトデキストリン、マルトール、マルトース、マンニトール、中鎖トリグリセリド、メグルミン、メントール、メチルセルロース、メチルメタクリレート、オレイン酸メチル、メチルパラベン、メチルパラベンカリウム、メチルパラベンナトリウム、微結晶セルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム、鉱物油、軽鉱物油、鉱物油／ラノリンアルコール組成物、油、オリーブ油、モノエタノールアミン、モンモリロナイト、没食子酸オクチル、オレイン酸、パルミチン酸、パラフィン、ピーナッツ油、ワセリン、ワセリン／ラノリンアルコール組成物、医薬用つや出しコーティング液、フェノール、液状フェノール、フェノキシエタノール、フェノキシプロパノール、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀、ホウ酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、ポラクリリン、ポラクリリンカリウム、ポロキサマー、ポリデキストロース、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリアクリレート、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリメタクリレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンひまし油誘導体、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アルギン酸カリウム、安息香酸カリウム、炭酸水素カリウム、亜硫酸水素カリウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、クエン酸カリウム（無水物）、リン酸水素カリウム、ピロ亜硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、プロピオン酸カリウム、ソルビン酸カリウム、ポビドン、プロパノール、プロピオン酸、炭酸プロピレン、プロピレングリコール、アルギン酸プロピレングリコール、没食子酸プロピル、プロピルパラベン、プロピルパラベンカリウム、プロピルパラベンナトリウム、プロタミンスルファート、ナタネ油、リンゲル液、サッカリン、サッカリンアンモニウム、サッカリンカルシウム、サッカリンナトリウム、ベニバナ油、サポナイト、血清タンパク質、ゴマ油、コロイドシリカ、コロイド状二酸化アンモニウム、アルギン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム（無水物、anhydrous）、クエン酸ナトリウム（無水物、dehydrate）、塩化ナトリウム、シクラミン酸ナトリウム、ＥＤＴＡのナトリウム塩、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム（二塩基）、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム（三塩基）、プロピオン酸ナトリウム（無水物）、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、フマル酸ステアリルナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ソルビン酸、ソルビタンエステル（ソルビタン脂肪酸エステル）、ソルビトール、ソルビトール液７０％、ダイズ油、鯨蝋、スターチ、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルファ化デンプン、滅菌可能なトウモロコシデンプン、ステアリン酸、精製ステアリン酸、ステアリルアルコール、スクロース、糖、錠剤圧縮形成用糖、粉砂糖、徐放剤用糖、転化糖、糖タブ、サンセットイエローＦＣＦ、合成パラフィン、タルク、酒石酸、タートラジン、テトラフルオロエタン（ＨＦＣ）、カカオ油、チメロサール、二酸化チタン、アルファトコフェロール、トコフェロール酢酸エステル、α型ビタミンＥ、β−トコフェロール、δ−トコフェロール、γ−トコフェロール、トラガント、トリアセチン、クエン酸トリブチル、トリエタノールアミン、クエン酸トリエチル、トリメチル−β−シクロデキストリン、臭化トリメチルテトラデシルアンモニウム、トリスバッファー、ＥＤＴＡの三ナトリウム塩、バニリン、タイプＩの硬化植物油、水、軟水、硬水、二酸化炭素を含まない水、滅菌水、注射用水、吸入用滅菌水、注射用滅菌水、灌水用滅菌水、ワックス、アニオン性乳剤用蝋、カルナバワックス、カチオン性乳化ワックス、セチルエステルワックス、マイクロクリスタリンワックス、非イオン性乳剤用蝋、坐剤用蝋、白蝋、黄蝋、白色ワセリン、羊毛蝋、キサンタンガム、キシリトール、ゼイン、プロピオン酸亜鉛、亜鉛塩、ステアリン酸亜鉛あるいは、Handbook of Pharmaceutical Excipients, ThirdEdition, A. H. Kibbe (Pharmaceutical Press, London, UK, 2000)（その内容全体を本明細書に援用する）に記載の賦形剤。Remington’s Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980）、その内容全体を本明細書に援用する、には、薬学的に許容される組成物を調製するのに用いられるさまざまな成分ならびに、これを調製するための周知の技術が開示されている。従来の薬剤が薬学的組成物と不適合ではないかぎり、これを薬学的組成物に用いることも考えられている。補助的な活性成分を組成物に取り込むことも可能である。
本明細書に開示の薬学的調製物は、後述するように、短時間作用性、速放性、長時間作用性または持続性放出性になるように設計されてもよい。薬学的調製物は、即時放出、制御放出または除放用に調製されてもよい。本組成物は、たとえば、ミセルまたはリポソームあるいは、他の何らかのカプセル化形態をさらに含むものであってもよいし、あるいは、保存および／または送達効果を持続するために、長時間放出形態で投与してもよい。ここに開示の薬学的調製物を、たとえば、毎日（１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回）、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、毎週、２週間に１回、３週間に１回、毎月または２か月に１回など、どのような治療計画で投与してもよい。
いくつかの実施形態では、上記の成分（単数または複数）は、薬学的組成物中に、たとえば少なくともＡなど、どのような濃度で存在してもよい。ここで、Ａは、０．０００１％ｗ／ｖ、０．００１％ｗ／ｖ、０．０１％ｗ／ｖ、０．１％ｗ／ｖ、１％ｗ／ｖ、２％ｗ／ｖ、５％ｗ／ｖ、１０％ｗ／ｖ、２０％ｗ／ｖ、３０％ｗ／ｖ、４０％ｗ／ｖ、５０％ｗ／ｖ、６０％ｗ／ｖ、７０％ｗ／ｖ、８０％ｗ／ｖまたは９０％ｗ／ｖである。いくつかの実施形態では、上記の成分（単数または複数）は、薬学的組成物中に、たとえば、最大でＢなど、どのような濃度で存在してもよい。ここで、Ｂは、９０％ｗ／ｖ、８０％ｗ／ｖ、７０％ｗ／ｖ、６０％ｗ／ｖ、５０％ｗ／ｖ、４０％ｗ／ｖ、３０％ｗ／ｖ、２０％ｗ／ｖ、１０％ｗ／ｖ、５％ｗ／ｖ、２％ｗ／ｖ、１％ｗ／ｖ、０．１％ｗ／ｖ、０．００１％ｗ／ｖまたは０．０００１％である。他の実施形態では、上記の成分（単数または複数）は、薬学的組成物中に、たとえば約Ａから約Ｂなど、どのような濃度の範囲で存在してもよい。いくつかの実施形態では、Ａは０．０００１％、Ｂは９０％である。
薬学的組成物を、生理的に適応可能なｐＨが達成されるように調製してもよい。いくつかの実施形態では、薬学的組成物のｐＨは、処方と投与経路とに応じて、少なくとも５、少なくとも５．５、少なくとも６、少なくとも６．５、少なくとも７、少なくとも７．５、少なくとも８、少なくとも８．５、少なくとも９、少なくとも９．５、少なくとも１０または少なくとも１０．５、最大でｐＨ１１（１１を含む）であればよい。特定の実施形態では、薬学的組成物は、生理的に適応可能なｐＨを達成するための緩衝剤を含むものであってもよい。緩衝剤は、リン酸バッファー（ＰＢＳなど）、トリエタノールアミン、トリス、ビシン、ＴＡＰＳ、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸、ＭＥＳなど、所望のｐＨで緩衝作用のあるどのような化合物を含むものであってもよい。特定の実施形態では、バッファーの強度は少なくとも０．５ｍＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも３０ｍＭ、少なくとも４０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも６０ｍＭ、少なくとも７０ｍＭ、少なくとも８０ｍＭ、少なくとも９０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも１２０ｍＭ、少なくとも１５０ｍＭまたは少なくとも２００ｍＭである。いくつかの実施形態では、バッファーの強度は３００ｍＭ以下（たとえば、最大で２００ｍＭ、最大で１００ｍＭ、最大で９０ｍＭ、最大で８０ｍＭ、最大で７０ｍＭ、最大で６０ｍＭ、最大で５０ｍＭ、最大で４０ｍＭ、最大で３０ｍＭ、最大で２０ｍＭ、最大で１０ｍＭ、最大で５ｍＭ、最大で１ｍＭ）である。
本明細書に開示のプロドラッグ化合物は、標準的な合成方法、組換えＤＮＡ技術あるいは、ペプチドおよび融合タンパク質を調製する他の任意の方法で、調製できるものである。非天然のアミノ酸の中には標準的な組換えＤＮＡ技術では発現できないものもあるが、これらを調製するための技術は、当分野で知られている。非ペプチド部分を包含する本発明の化合物を、適切な場合は標準的なペプチド化学反応に加えて、標準的な有機化学反応で合成してもよい。
汎用的なＰＥＧ化プロトコール：（Ｃｙｓ−マレイミド）
一般に、システインを含有するグルカゴン関連ペプチドを、リン酸緩衝食塩水（５〜１０ｍｇ／ｍｌ）に溶解させ、０．０１メチレンジアミン四酢酸を加える（合計容量の１０〜１５％）。過剰な（２倍）マレイミドメトキシＰＥＧ試薬（Dow）を加え、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で反応の進み具合を観察しながら反応物を室温にて攪拌する。８〜２４時間後、反応混合物を酸性化し分取逆相カラムに通し、０．１％テトラフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／アセトニトリルを用いてグラジエントモードで精製する。適切な画分を合わせ、凍結乾燥して、所望のＰＥＧ化誘導体を得た。
実施例１
モデルペプチドにおけるジペプチドの切断半減期（ＰＢＳ中）の判断
モデルのヘキサペプチド（HSRGTF-NH2；配列番号７１５）をモデルとして用いて、アミド結合を介してヘキサペプチドに結合したさまざまなジペプチドの半減期を求めた。ペプチド合成装置でヘキサペプチドを合成した。合成の完全性と伸長可能なＮ末端の利用可能性を確認するために、ペプチド結合樹脂をフッ化水素酸（ＨＦ）で切断し、分析した。次に、Ｂｏｃ保護したサルコシンとリジンを続けてペプチド結合樹脂に導入し、ペプチドＡ（ジペプチド＋モデルペプチド）を生成した。ペプチドＡをＨＦで切断し、分取ＨＰＬＣで精製した。
ＨＰＬＣでの分画精製：
シリカ系の１×２５ｃｍのVydac C18（粒度５μ、細孔径３００Å）カラムにて、ＨＰＬＣ分析を用いて精製を実施した。使用した機器は以下の通りであった：Waters Associatesのモデル６００のポンプ、インジェクターのモデル７１７、ＵＶ検出器のモデル４８６。すべての試料に２３０ｎｍの波長を使用した。溶媒Ａには１０％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡを蒸留水に入れたもの、溶媒Ｂには０．１％ＴＦＡをＣＨ３ＣＮに入れたものを使用した。直線勾配を用いた（２時間でＢを０〜１００％）。流速を１０ｍＬ／分とし、分画量は４ｍＬとした。典型的には、約１５０ｍｇの粗ペプチドから、３０ｍｇの純粋なペプチド（収率約２０％）が得られた。
ペプチドＡを濃度１ｍｇ／ｍＬでリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）バッファー（ｐＨ７．４）に溶解させた。次に、これを水槽にて３７℃でインキュベートした。分析試料を異なる時点（５時間、８時間、２４時間、３１時間、４７時間）で回収し、同一容量の０．１％ＴＦＡで反応を止めた。ＨＰＬＣを用いて切断反応を監視した。データを液体クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）で定性的に監視し、ＨＰＬＣのPeak Simple Chromatographyソフトウェアで定量的に分析して、プロドラッグ修飾の保持時間と相対ピーク面積とを得た。
質量分析による分析
Sciex API-IIIエレクトロスプレー／四重極質量分析計を標準的なエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）のイオン源で用いて、質量スペクトルを得た。使用したイオン化状態は以下のとおりである：陽イオンモードでＥＳＩ；イオンスプレー電圧、３．９ｋＶ；オリフィス電位６０Ｖ。使用したネブライジングガスおよびカーテンガスは窒素で、流速０．９Ｌ／分であった。６００〜１８００トンプソン（Ｔｈ）の１ステップあたり０．５Ｔｈ、滞留時間２ミリ秒で質量スペクトルを記録した。試料（約１ｍｇ／ｍＬ）を１％酢酸とともに５０％アセトニトリル溶液に溶解し、外側のシリンジポンプで５μＬ／分で導入した。
ＰＢＳ液中でＥＳＩ ＭＳによってペプチドを分析した際、最初に、０．６μＬのＣ４樹脂の入ったZipTip固相抽出チップを、製造業者の指示に従って用いて脱塩した（Millipore Corporation, Billerica, MA、http://www.millipore.com/catalogue.nsf/docs/C5737を参照のこと）。
ＨＰＬＣでの分析
２１４ｎｍでＵＶ検出器を使用し、１５０ｍｍ×４．６ｍｍのC18 Vydacカラムを用いて、Beckman System Gold Chromatographyシステムで、ＨＰＬＣ分析を実施した。流速を１ｍＬ／分とした。溶媒Ａには０．１％ＴＦＡを蒸留水に加えたもの、溶媒Ｂには０．１％ＴＦＡを９０％ＣＨ３ＣＮに加えたものを用いた。直線勾配を用いた（１０分間でＢを０％〜３０％）。データを集め、Peak Simple Chromatographyソフトウェアで分析した。
それぞれのプロドラッグの解離速度定数の測定には、初期の切断速度を用いた。異なる回収時刻の各々について、プロドラッグと薬剤の濃度を、そのピーク面積「ａ」および「ｂ」からそれぞれ推定した（表１参照）。プロドラッグの濃度の対数をさまざまな時間間隔でプロットして、プロドラッグの一次解離速度定数を求めた。このプロットの勾配から速度定数「ｋ」が得られる。その上で、式ｔ１／２＝０．６９３／ｋを用いて、さまざまなプロドラッグの分解の半減期を計算した。
表１．ＰＢＳ中でのＡのペプチド（lys-sar-HSRGTF-NH2）の切断のＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳのデータ
Figure 2013540102
式ｔ１／２＝０．６９３／ｋを用いて、さまざまなプロドラッグの分解の半減期を計算し、モデルペプチドHSRGTF-NH2（配列番号７１５）でのlys-sarの組み合わせの半減期を求めたところ、１４．０時間であった。
実施例２
Ｄ−モデルペプチドにおけるジペプチドの切断半減期（血漿中）の判断
もうひとつのモデルのヘキサペプチド（dHdTdRGdTdF-NH2、配列番号７１６）をモデルとして用いて、血漿中でのジペプチドの組み合わせの半減期を求めた。モデルペプチドのプロドラッグ切断以外の酵素による切断を防止するために、Ｄアミノ酸を使用した。自動合成装置でヘキサペプチドを合成した。考えられる伸長Ｎ末端をプロドラッグの修飾に使用できることを確認するために、ペプチド結合樹脂をＨＦで切断して、有効性を確認した。次に、Ｂｏｃ保護したサルコシンとリジンを続けてペプチド結合樹脂に導入した。ペプチドＢ（ジペプチド＋ｄ−モデルペプチド）をＨＦで切断し、分取ＨＰＬＣで精製した。
ＨＰＬＣでの分画精製：
シリカ系の１×２５ｃｍのVydac C18（粒度５μ、細孔径３００Å）カラムにて、ＨＰＬＣ分析を用いて精製を実施した。使用した機器は以下の通りであった：Waters Associatesのモデル６００のポンプ、インジェクターのモデル７１７、ＵＶ検出器のモデル４８６。すべての試料に２３０ｎｍの波長を使用した。溶媒Ａには１０％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡを蒸留水に入れたもの、溶媒Ｂには０．１％ＴＦＡをＣＨ３ＣＮに入れたものを使用した。直線勾配を用いた（２時間でＢを０〜１００％）。流速を１０ｍＬ／分とし、分画量は４ｍＬとした。典型的には、約１５０ｍｇの粗ペプチドから、３０ｍｇの純粋なペプチド（収率約２０％）が得られた。
ペプチドＢを濃度２ｍｇ／ｍＬで血漿（ｐＨ７．４）に溶解させた。次に、これを３７℃の水槽でインキュベートした。分析試料を異なる時点（５時間、１１時間、２４時間、３２時間、４８時間）で回収した。試料を１０倍容量の０．１％ＴＦＡ／ＡＣＮで処理し、３０００ｒｐｍで遠心した。上清の液体を回収し、同一容量の０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏで希釈した。ＨＰＬＣを用いて切断反応を監視した。データをＬＣ−ＭＳで定性的に監視し、ＨＰＬＣのPeak Simple Chromatographyソフトウェアで定量的に分析して、保持時間と相対ピーク面積とを得た。
質量分析による分析
Sciex API-IIIエレクトロスプレー／四重極質量分析計を標準的なＥＳＩイオン源で用いて、質量スペクトルを得た。使用したイオン化状態は以下のとおりである：陽イオンモードでＥＳＩ；イオンスプレー電圧、３．９ｋＶ；オリフィス電位６０Ｖ。使用したネブライジングガスおよびカーテンガスは窒素で、流速０．９Ｌ／分であった。６００〜１８００トンプソンの１ステップあたり０．５Ｔｈ、滞留時間２ミリ秒で質量スペクトルを記録した。試料（約１ｍｇ／ｍＬ）を１％酢酸とともに５０％アセトニトリル溶液に溶解し、外側のシリンジポンプで５μＬ／分で導入した。
ＨＰＬＣでの分析
２１４ｎｍでＵＶ検出器を使用し、１５０ｍｍ×４．６ｍｍのC18 Vydacカラムを用いて、Beckman System Gold Chromatographyシステムで、ＨＰＬＣ分析を実施した。流速を１ｍＬ／分とした。溶媒Ａには０．１％ＴＦＡを蒸留水に加えたもの、溶媒Ｂには０．１％ＴＦＡを９０％ＣＨ３ＣＮに加えたものを用いた。直線勾配を用いた（１０分間でＢを０％〜３０％）。データを集め、Peak Simple Chromatographyソフトウェアで分析した。
それぞれのプロドラッグの解離速度定数の測定には、初期の切断速度を用いた。異なる回収時刻の各々について、プロドラッグと薬剤の濃度を、そのピーク面積「ａ」および「ｂ」からそれぞれ推定した（表２参照）。プロドラッグの濃度の対数をさまざまな時間間隔でプロットして、プロドラッグの一次解離速度定数を求めた。このプロットの勾配から速度定数「ｋ」が得られる。その上で、式ｔ１／２＝０．６９３／ｋを用いて、さまざまなプロドラッグの分解の半減期を計算した。
表２．血漿中でのＢのペプチド（lys-sar-dHdTdRGdTdF-NH2）の切断のＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳのデータ
Figure 2013540102
その上で、式ｔ１／２＝０．６９３／ｋを用いて、さまざまなプロドラッグの分解の半減期を計算した。この式を用いて、血漿中におけるＤ−モデルペプチドdHdTdRGdTdF-NH2（配列番号７１６）でのＬｙｓ−Ｓａｒの組み合わせの半減期を求めたところ、１８．６時間であった。
実施例３
実施例１で説明した手順を用いて、モデルのヘキサペプチド（HSRGTF-NH2；配列番号７１５）に結合したさまざまな別のジペプチドの切断半減期を求めた。これらの実験で生成されたデータを、表３および表４にあげておく。
表３．ＰＢＳ中、モデルのヘキサペプチドから、Ｎ末端のパラアミノフェニルアラニンの側鎖に結合したジペプチドＡ−Ｂの切断
Figure 2013540102

Figure 2013540102
表４．ＰＢＳ中、モデルのヘキサペプチド（X1-SRGTF-NH2（配列番号７３２））から、１番目（Ｘ１）でさまざまなアミノ酸に結合したジペプチドＡ−Ｂの切断
NH2-A-B-X1-SRGTF-NH2
Figure 2013540102
実施例４
グルカゴンおよびＧＬＰ−１類縁体の合成
グルカゴンおよびＧＬＰ−１の生体活性誘導体を調製できる可能性を調査するために、多数のペプチド類縁体を合成した。標準的な手順をここで簡単に説明し、詳細については後述する。
材料：
ＰＡＭ樹脂（ＰＡＭ樹脂は、ＯＣＨ２−フェニルアセトアミドメチル−コポリスチレン−１％ジビニルベンゼンである）、（１００〜１８０メッシュ、１％ＤＶＢ架橋ポリスチレン；担持量は０．７〜１．０ｍｍｏｌ／ｇ）、Ｂｏｃ保護したアミノ酸とＦｍｏｃ保護したアミノ酸を、Midwest Biotechから購入した。α−ヒドロキシ酸（フェニル乳酸およびグリコール酸）などの他の試薬は、Aldrichから購入した。Ｂｏｃ保護したアミノ酸を用いる固相ペプチド合成を、Applied Biosystem 430Aペプチド合成装置で実施した。Ｆｍｏｃ保護したアミノ酸の合成については、Applied Biosystems Model 433ペプチド合成装置を用いて実施した。デプシペプチドを、類似の手順で焼結反応容器にてマニュアルで合成した（Schnolzer, M., et al., (1992) Int J Pept Protein Res 40(3-4):180-193）。
ペプチド合成（Ｂｏｃアミノ酸／ＨＦ切断）：
これらの類縁体を、Applied Biosystem Model 430A Peptide Synthesizerで合成した。アミノ酸を連続的に加えることで、合成ペプチドを作製し、２ｍｍｏｌのＢｏｃ保護したアミノ酸を含むカートリッジに、１．９ｍｍｏｌ（０．５Ｍの溶液３．８ｍＬ）の３−（ジエトキシ−ホスホリルオキシ）−３Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアジン−４−オン（ＤＥＰＢＴ）のＤＭＦ溶液を加えて、各アミノ酸の活性化エステルを生成した。カートリッジに泡を立てて窒素ガスを通気して、アミノ酸を溶解させた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン１ｍＬをカートリッジに加え、エステルを合成した。この溶液を、ＰＡＭ樹脂に結合したＣ末端残基０．２ｍｍｏｌが入った反応容器に移し、数回ボルテックスし、１０分間かけて樹脂に結合させた。未反応の試薬を除去するための洗浄後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で５分間処理して、Ｎ末端のＢｏｃ保護基を除去した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、鎖が合成されるまで、このサイクルを所望の工程数だけ繰り返した。合成終了時（一般にアミノ酸３０個）の反応容器には、約１．２〜１．５ｇの保護されたペプチジル−ＰＡＭ樹脂が入っていた。樹脂をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で何度も洗浄し、トリフルオロ酢酸で処理し、最後のｔ−Ｂｏｃ保護基を除去して、最後にさらに数回、ＤＭＦ、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で洗浄して乾燥させた。
ペプチジル樹脂を無水ＨＦで処理し（このセクションで詳細を後述する手順）、これによって一般に約３５０ｍｇ（収率約５０％）の粗脱保護ペプチドが得られた。
ペプチド合成（Ｆｍｏｃアミノ酸／ＨＦ切断）：
選択的部位にいくつかのアミノ酸を使用し、この合成スキームをマニュアルで実施した。この作業では、さらに大きい合成戦略の一部として、内部のセリンプロドラッグを合成するだけのためにＦｍｏｃアミノ酸を使用した。ここで、合成にはＦｍｏｃ法が用いられているが、ペプチドは、常に、固体支持体からペプチドを切断するのにＨＦでの処理が必要にであるＰＡＭ樹脂上で合成された点に注意されたい。これらのペプチドの収率は、おおよそＢｏｃ／ＰＡＭ合成で上述したとおりである。
前のセクションで説明したようにして、合成を実施した。カップリング工程の終わりに、ペプチジル樹脂を２０％ピペリジンで処理し、Ｎ末端のＦｍｏｃ保護基を除去した。これをＤＭＦで繰り返し洗浄し、この繰り返しサイクルを所望の回数のカップリング工程分だけ繰り返した。合成全体の終わりにＤＣＭを用いてペプチジル樹脂を乾燥させ、無水ＨＦを用いて樹脂からペプチドを切断した。
デプシペプチド合成（アミノエステル形成）
この場合、ペプチジル樹脂は、Ｎ末端のアミンに代えてα−ヒドロキシル−Ｎ末端延長部分を有し、アシル化はα−ヒドロキシ基でなされた。この反応には、アミド結合を形成する反応よりも長い時間を要する。ヒドロキシ基のほうがアミンよりも弱い求核物質であるためである。反応時間は主に１２時間であった。
最初に、２ｍｍｏｌのＢｏｃ保護アミノ酸残基を２ｍＬのＤＣＭに加えた溶液の入ったカートリッジに、１ｍｍｏｌ（０．１５５ｍＬのジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を加えて、各アミノ酸の活性化エステルを生成した。このカートリッジを１０分間で１０℃まで冷却し、０．９ｍｍｏｌ（２４４ｍｇ）のジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）をカートリッジに加えて、エステル合成を加速した。この混合物をペプチジル樹脂の入った反応容器に移し、そこでペプチドを合成した。反応容器を１２時間攪拌した。
ＤＣＭを用いてペプチジル樹脂の水分を除去し、所望のペプチドの合成を継続した。合成全体の最後に、ＤＣＭを用いてペプチジル樹脂の水分を除去し、最後に無水ＨＦで処理して所望のペプチドを合成した。
Ｎ末端ヒドロキシルペプチド合成（α−ヒドロキシル−Ｎ末端延長部分）
この反応では、ペプチジル樹脂の遊離アミンが、α−ヒドロキシ酸と反応して、α−ヒドロキシル−Ｎ末端の延長部分が形成される。この点について、このような２種類のα−ヒドロキシ酸すなわち、グリコール酸（ＯＨ−グリシン）とフェニル乳酸（ＯＨ−フェニルアラニン）を使用した。これらの合成もマニュアルで実施した。α−ヒドロキシ酸を加えてペプチドを作製し、１ｍｍｏｌのＢｏｃ保護残基を２ｍＬのＤＭＦに加えた溶液の入ったカートリッジに、０．９ｍｍｏｌのＤＥＰＢＴ（２７０ｍｇ）を加えて、α−ヒドロキシ酸の活性化エステルを合成した。ＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、０．５ｍＬ）をカートリッジに加え、エステル合成を加速した。この混合物を、ペプチジル樹脂の入った反応容器に移し、そこでペプチドを合成した。反応時間は６時間であった。
ＤＣＭを用いてペプチジル樹脂の水分を除去し、所望のペプチドの合成を継続した。合成全体の最後に、ＤＣＭを用いてペプチジル樹脂の水分を除去し、無水ＨＦで切断して、遊離ペプチドを合成した。
ペプチジル樹脂のＨＦ処理
ペプチジル樹脂（３０ｍｇ〜２００ｍｇ）を、切断目的でフッ化水素（ＨＦ）反応容器に入れた。５００μＬのｐ−クレゾールを、カルボニウムイオンスカベンジャーとして容器に加えた。この容器をＨＦシステムに取り付け、メタノール／ドライアイス混合物に入れた。真空ポンプで容器から排気し、１０ｍＬのＨＦを蒸留してその反応容器に入れた。このペプチジル樹脂とＨＦとの反応混合物を０℃で１時間攪拌した後、容器を真空にして、ＨＦをすばやく除去した（１０〜１５分間）。この容器を慎重に取り出し、約３５ｍＬのエーテルを充填してペプチドを沈殿させ、ＨＦ処理によって生じた低分子有機保護基とｐ−クレゾールを抽出した。この混合物をテフロンフィルターで濾過し、２回繰り返して余分なクレゾールをすべて除去した。この濾液を廃棄した。沈殿したペプチドを約２０ｍＬの１０％酢酸（ａｑ）に溶解させた。この所望のペプチドを含有する濾液を回収し、凍結乾燥させた。
質量分析による分析
Sciex API-IIIエレクトロスプレー／四重極質量分析計を標準的なＥＳＩイオン源で用いて、質量スペクトルを得た。使用したイオン化状態は以下のとおりである：陽イオンモードでＥＳＩ；イオンスプレー電圧、３．９ｋＶ；オリフィス電位６０Ｖ。使用したネブライジングガスおよびカーテンガスは窒素で、流速０．９Ｌ／分であった。６００〜１８００トンプソンの１ステップあたり０．５Ｔｈ、滞留時間２ミリ秒で質量スペクトルを記録した。試料（約１ｍｇ／ｍＬ）を１％酢酸とともに５０％アセトニトリル溶液に溶解し、外側のシリンジポンプで５μＬ／分で導入した。
ＰＢＳ液中でＥＳＩ ＭＳによってペプチドを分析した際、最初に、０．６μＬのＣ４樹脂の入ったZipTip固相抽出チップを、製造業者の指示に従って用いて脱塩した（Millipore Corporation, Billerica, MA、ワールドワイドウェブでmillipore.com/catalogue.nsf/docs/C5737のMillipore社のウェブサイトを参照のこと）。
高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分析：
これらの粗ペプチドで予備分析を実施し、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）およびＭＡＬＤＩ分析を用いて、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）バッファー（ｐＨ、７．２）での相対的な変換率を概算で求めた。粗ペプチド試料をＰＢＳバッファーに１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させた。得られた溶液１ｍＬを１．５ｍＬのＨＰＬＣバイアルで保管し、これを密閉して３７℃でインキュベートした。１００μＬのアリコートをさまざまな間隔で抜き取り、室温まで冷却し、ＨＰＬＣで分析した。
２１４ｎｍでＵＶ検出器を使用して、Beckman System Gold Chromatographyシステムで、ＨＰＬＣ分析を実施した。ＨＰＬＣ分析は、１５０ｍｍ×４．６ｍｍのC18 Vydacカラムで実施した。流速を１ｍＬ／分とした。溶媒Ａには０．１％ＴＦＡを蒸留水に加えたもの、溶媒Ｂには０．１％ＴＦＡを９０％ＣＨ３ＣＮに加えたものを用いた。直線勾配を用いた（１５分間でＢを４０％〜７０％）。データを集め、Peak Simple Chromatographyソフトウェアで分析した。
それぞれのプロドラッグの解離速度定数の測定には、初期の加水分解速度を用いた。プロドラッグと薬剤の濃度を、それぞれのピーク面積から推定した。プロドラッグの濃度の対数をさまざまな時間間隔でプロットして、プロドラッグの一次解離速度定数を求めた。このプロットの勾配から速度定数「ｋ」が得られる。その上で、式ｔ１／２＝０．６９３／ｋを用いて、さまざまなプロドラッグの分解の半減期を計算した。
ＨＰＬＣでの分画精製：
適切なｔ１／２を示すプロドラッグを同定後、このプロドラッグを精製した。精製は、シリカ系の１×２５ｃｍのVydac C18（粒度５μ、細孔径３００Å）カラムにて、ＨＰＬＣ分析を用いて実施した。使用した機器は以下の通りであった：Waters Associatesのモデル６００のポンプ、インジェクターのモデル７１７、ＵＶ検出器のモデル４８６。すべての試料に２１４ｎｍの波長を使用した。溶媒Ａには１０％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡを蒸留水に入れたもの、溶媒Ｂには０．１％ＴＦＡをＣＨ３ＣＮに入れたものを使用した。直線勾配を用いた（２時間でＢを０〜１００％）。流速を１．２ｍＬ／分とし、分画量は６ｍＬとした。典型的には、約３５０ｍｇの粗ペプチドから、８０ｍｇの純粋なペプチド（収率約２３％）が得られた。
実施例５
バイオアッセイの実験デザイン：ｃＡＭＰ検出のためのルシフェラーゼを用いるレポーター遺伝子アッセイ
各グルカゴンおよびＧＬＰ−１類縁体またはプロドラッグがｃＡＭＰを誘導する機能を、ホタルルシフェラーゼを用いるレポーターアッセイで測定した。誘導されるｃＡＭＰ産生は、受容体に対するグルカゴンまたはＧＬＰ−１の結合と正比例する。ｃＡＭＰ応答配列に結合したルシフェラーゼ遺伝子とグルカゴンまたはＧＬＰ−１受容体をそれぞれコトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、バイオアッセイに使用した。
０．２５％ＢＧＳ（Bovine Growth Serum）（HyClone, Logan, UT）を加えたダルベッコ最小必須培地（Invitrogen, Carlsbad, CA）で１６時間培養して、培地から血清を合成した後、３７℃、５％ＣＯ２にて、９６ウェルのポリ−Ｄ−リジンコートディッシュ「Biocoat（登録商標）」プレート（BD Biosciences, San Jose, CA）で５時間、ＧＬＰ−１類縁体またはプロドラッグを段階希釈したものとインキュベートした。インキュベーション終了時、１００μＬのLucLite発光基質試薬（Perkin Elmer, Wellesley, MA）を各ウェルに加えた。プレートを軽く振盪し、暗所にて１０分間インキュベートし、発光をMicroBeta-1450液体シンチレーションカウンター（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）で測定した。Originソフトウェア（OriginLab, Northampton, MA）を用いて、５０％有効濃度（ＥＣ５０）を計算した。
実施例６
グルカゴン関連ペプチドアミド系プロドラッグの生体活性
Ｉ） ＧＬＰ−１
Ｃ２４ ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチド
（HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFICWLVKGR；配列番号７１７）をペプチド合成装置で合成した。考えられる伸長Ｎ末端をプロドラッグの修飾に使用できることを確認するために、小さな割合のペプチド結合樹脂をＨＦで切断し、合成の有効性を確認した。この合成ペプチドは、質量３３２９．８ダルトンである。実施例５で説明したＧＬＰ−１−受容体ルシフェラーゼアッセイで、ＧＬＰ−１の受容体結合活性を求めた。
ＩＩ） ジペプチドをＧＬＰのＮ末端に付加
ジケトピペラジン（ＤＫＰ）形成による分子内環化と切断に対し、傾向としてどのような差異があるかを研究するために、ジペプチドをグルカゴンまたはＧＬＰ−１のＮ末端に共有結合した。
生物学的に不活性なジペプチド伸長ＧＬＰ−１およびグルカゴン類縁体は、ＤＫＰの形成を伴うアミド結合の切断時に、活性のあるペプチド薬に変換された。ＧＬＰ−１類縁体のＡ−Ｂジペプチドのアミノ酸「Ｂ」としてのサルコシン（Ｓａｒ）またはプロリンで同じ変換を実施できる。式Ｉのジペプチドの第１（Ａ）および第２（Ｂ）のアミノ酸のα炭素上の置換基を化学的に修飾することで、さまざまな半減期のプロドラッグを想定した。たとえば、プロリンとアミノイソ酪酸（Ａｉｂ）とを有するジペプチドプロドラッグ要素を、Ｃ２４ ＧＬＰ（配列番号７１７）に連続的に導入したため、第１のペプチドをＡｉｂ−１−Ｐ０，Ｃ２４ＧＬＰ（７−３６）と名付けた。ここで、ペプチドの第１のアミノ酸（アミノ酸「Ｘａａ−１」）はアミノイソ酪酸であり、第２のアミノ酸（アミノ酸「Ｘａａ０」）はプロリンである。以下、取り上げるすべてのペプチドについて、同じ体系的な命名法を用いる。アミノ酸を３文字のアミノ酸コードに続いて上付の位置番号で表記する場合、各合成化合物の立体異性は、他に述べなければ、Ｌ異性体である。上述したような固相合成によって、ペプチドを合成的に調製した。合成をＥＳＩ−ＭＳ分析で確認した（３４７９．９Ｄａ）。
ＩＩＩ） ＧＬＰ−プロドラッグのＰＥＧ化
ＰＥＧ化は、ペプチドを保護し、腎臓によるペプチドの排出を低減するための有用な方法のひとつである。したがって、以下の実験では、プロドラッグＡｉｂ−１−Ｐ０，Ｃ２４ＧＬＰ（７−３６）を、Michael反応によって、Aｉｂ−１−Ｐ０，Ｃ２４ＧＬＰ（７−３６）の２４−Ｃｙｓの−ＳＨ基にて、マレイミド官能化ＰＥＧ（４０ｋＤａ）でＰＥＧ化した。このＰＥＧ化グルカゴン関連ペプチドを、４０ｋ ＰＥＧ−Ａｉｂ−１−Ｐ０，Ｃ２４ＧＬＰ（７−３６）と名付けた。このＰＥＧ化ペプチドを分取ＨＰＬＣで精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（４４０００〜４６０００、広いピーク）で確認した。
ＩＶ） ＰＢＳ中のＧＬＰ−１活性
考えられるＤＫＰ形成と、これと同時に生じる原薬の再生について探るために、ＰＢＳバッファー中、３７℃で約１０日間、４０ｋ ＰＥＧ−Ａｉｂ−１−Ｐ０，Ｃ２４ＧＬＰ（７−３６）をインキュベートした。試料を異なる時点（３０時間、５４時間、１６８時間、２４０時間）で回収した。ＤＫＰ形成によるジペプチドプロドラッグの切断後に回復されたＧＬＰ−１の活性について調べるために、回収した試料をすべてバイオアッセイで分析した。特に、実施例５で説明したＧＬＰ−受容体ルシフェラーゼアッセイで、ＧＬＰプロドラッグの受容体結合活性を求めた。
表５．ＰＢＳ中、４０ｋ ＰＥＧ−Ａｉｂ−１−Ｐ０，Ｃ２４ＧＬＰ（７−３６）の異なる時点におけるバイオアッセイデータ
Figure 2013540102
次に、式ｔ１／２＝０．６９３／ｋを用いて血漿中における原薬すなわち４０ｋ ＰＥＧ−Ａｉｂ−１−Ｐ０，Ｃ２４ＧＬＰ（７−３６）の分解の半減期を計算したところ、１４０時間であった。
Ｖ） 血漿中のＧＬＰ−１活性
考えられるＤＫＰ形成と、これと同時に生じる原薬の再生について探るために、血漿中、３７℃で約３０時間、ｄＬｙｓ−１−Ｓａｒ０，Ｃ２４ＧＬＰ（７−３６）をインキュベートした。試料を異なる時点（１時間、１２時間、３０時間）で回収した。ＤＫＰ形成によるＧＬＰ−１からのジペプチドの切断後に回復された活性について調べるために、回収した試料をすべてバイオアッセイで分析した。特に、実施例５で説明したＧＬＰ−受容体ルシフェラーゼアッセイで、ＧＬＰプロドラッグの受容体結合活性を求めた。
表６．血漿中、ｄＬｙｓ−１−Ｓａｒ０，Ｃ２４ＧＬＰ（７−３６）の異なる時点におけるバイオアッセイデータ
Figure 2013540102
次に、式ｔ１／２＝０．６９３／ｋを用いて血漿中における原薬すなわちｄＬｙｓ−１−Ｓａｒ０，Ｃ２４ＧＬＰ（７−３６）の分解の半減期を計算したところ、約１０時間であった。
実施例７
マウスにおけるグルカゴンスーパーファミリーのペプチドプロドラッグのin vivoでの作用
食餌で誘導した肥満（ＤＩＯ）マウスに、１週間分の用量のグルカゴンスーパーファミリーのペプチド（配列番号１〜６８４、１７０１〜１７７６、１８０１〜１９０８）を１回で腹腔内注射する。溶媒のみまたはグルカゴンスーパーファミリーのペプチド、約０．５ｎｍｏｌ／ｋｇ、３ｎｍｏｌ／ｋｇ、１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、１５ｎｍｏｌ／ｋｇまたは７０ｎｍｏｌ／ｋｇまたはグルカゴンスーパーファミリーのペプチドのプロドラッグ誘導体（ジペプチドは、アミド結合を介してグルカゴンスーパーファミリーのペプチドのＮ末端に結合し、ジペプチドは、Ａｉｂ−１ Ｐｒｏ０、Ａｉｂ−１ ｄＰｒｏ０、Ｌｙｓ−１ Ｓａｒ０、ｄＡｌａ−１ Ｐｒｏ０、Ａｃ−Ａｉｂ−１ Ｐｒｏ０、Ｌｙｓ−１（Ｘ） Ｓａｒ０（Ｘは、Ｌｙｓ側鎖に結合した１ＫのＰＥＧ鎖を表す）、Ｌｙｓ−１（Ｙ）Ｓａｒ０（Ｙは、Ｌｙｓ側鎖に結合したｔｅｒｔ−ブチルグリシンを表す）、ｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０、ｄＬｙｓ−１Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）０またはｄＬｙｓ−１ Ｆ（Ｎ−Ｍｅ）０（約０．５ｎｍｏｌ／ｋｇ、３ｎｍｏｌ／ｋｇ、１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、１５ｎｍｏｌ／ｋｇまたは７０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与）である）を初回注射後に、毎日マウスの体重を量る（Ｎ＝８）。
２５％（ｖ／ｖ）のグルコースを含有する生理食塩水を、０分の時点で、体重１ｋｇに対して１．５ｇの用量で注射する。−６０分、０分、１５分、３０分、６０分、１２０分の時点で、血中グルコース濃度を測定する。体重、食物摂取量、血糖、身体組成については、０日目と１日目に測定する。
実施例８
グルカゴン類縁体を投与したマウスで誘導した体重減少
食餌で誘導した肥満（ＤＩＯ）マウスに、１週間分の用量である１５ｎｍｏｌ／ｋｇまたは７０ｎｍｏｌ／ｋｇのグルカゴン類縁体を、１回で腹腔内注射した。溶媒のみ▼、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドＡ（「ペプチドＡ」）を１５ｎｍｏｌ／ｋｇ（右方向白三角）または７０ｎｍｏｌ／ｋｇ（右方向黒三角）またはペプチドＡのプロドラッグ誘導体（ジペプチドは、アミド結合を介してペプチドＡのＮ末端に結合し、ジペプチドは、Ａｉｂ−１ Ｐｒｏ０（１５ｎｍｏｌ／ｋｇ（○）または７０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与（●））、Ａｉｂ−１ ｄＰｒｏ０（７０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与（◇））、Ｌｙｓ−１ Ｓａｒ０（７０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与（◆））、ｄＡｌａ−１ Ｐｒｏ０（７０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与（左方向黒三角））またはＡｃ−Ａｉｂ−１ Ｐｒｏ０（７０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与（■））である）を初回注射後に、毎日マウスの体重を量った（Ｎ＝８）。この実験の結果を図１に示す。化合物Ａｃ−Ａｉｂ−１ Ｐｒｏ０ペプチドＡは、切断されてジケトピペラジンを形成することができないが、この化合物も溶媒の場合を上回るいくらかの活性を示す点に注意されたい。これはおそらく、プロドラッグの残留活性が低いことによるものである。ペプチドＡは、天然のグルカゴン（配列番号７０１）とは異なる７つの置換と、Ｃ末端アミドと、マレイミド官能化した４０ｋＤａのＰＥＧによるＰＥＧ化とを有する、グルカゴンのＰＥＧ化された類縁体である。
図２は、溶媒のみ（◆）、ペプチドＡ（▲０．５、右方向黒三角３、▼１５または左方向黒三角７０、単位はｎｍｏｌ／ｋｇ／日）またはＬｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（△０．５、右方向白三角３、▽１５または左方向白三角７０、単位はｎｍｏｌ／ｋｇ／日）を、１週間分の用量である０．５ｎｍｏｌ／ｋｇ、３ｎｍｏｌ／ｋｇ、１５ｎｍｏｌ／ｋｇまたは７０ｎｍｏｌ／ｋｇで１回で腹腔内注射した、食餌で誘導した肥満（ＤＩＯ）マウスの体重変化を示すグラフである。すべての用量で、２種類の薬剤は同様の効果を発揮しているように見え、このため、ジペプチドプロドラッグ要素を加えることによる利点は最小限であるように見える。これはおそらく、ジペプチドの酵素による切断と、投与されたプロドラッグの短時間での活性化によるものと思われる。
実施例９
グルカゴンプロドラッグ類縁体を用いるグルコース耐性試験
食餌で誘導した肥満（ＤＩＯ）マウス（Ｎ＝８）に、用量１５ｎｍｏｌ／ｋｇまたは７０ｎｍｏｌ／ｋｇで以下のうちの１つを腹腔内注射した。
（Ａ）ペプチドＡ（左方向白三角１５または左方向黒三角７０、単位はｎｍｏｌ／ｋｇ／日）
（Ｂ）Ｌｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（右方向白三角１５または右方向黒三角７０、単位はｎｍｏｌ／ｋｇ／日）または
（Ｃ）ｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（□１５または■７０、単位はｎｍｏｌ／ｋｇ／日）
２５％（ｖ／ｖ）のグルコースを含有する生理食塩水を、０分の時点で、体重１ｋｇあたり１．５ｇの用量で注射した。−６０分、０分、１５分、３０分、６０分、１２０分の時点で、血中グルコース濃度を測定した。図３に、この実験で得られたデータを示す。
図４は、−１５分の時点で、溶媒のみ（▼）を腹腔内注射するか、用量２ｎｍｏｌ／ｋｇで以下の化合物のうちの１つを腹腔内注射した、ＤＩＯマウス（Ｎ＝８）の血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示すグラフである。
（Ａ）Ｌｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（■）
（Ｂ）Ｌｙｓ−１（Ｘ）， Ｓａｒ０ペプチドＡ（▲）（Ｘは、Ｌｙｓ側鎖に結合した１ＫのＰＥＧ鎖を表す）
（Ｃ）Ｌｙｓ−１（Ｙ）， Ｓａｒ０ペプチドＡ（◆）（Ｙは、Ｌｙｓ側鎖に結合したｔｅｒｔ−ブチルグリシンを表す）
（Ｄ）ｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（右方向黒三角）。
２５％（ｖ／ｖ）のグルコースを含有する生理食塩水を、０分の時点で、体重１ｋｇあたり１．５ｇの用量で注射した。−１５分、０分、１５分、３０分、６０分、１２０分の時点で、血中グルコース濃度を測定した。
図５は、最初にグルカゴン関連ペプチドを注射した後、グルコース溶液を注射したＤＩＯマウス（Ｎ＝８）の血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示すグラフである。マウスには、−１５分の時点で、溶媒（▼）、２０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量のｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（右方向黒三角）を腹腔内注射するか、あるいは、用量０．６７ｎｍｏｌ／ｋｇで以下の化合物のうちの１つを腹腔内注射した。
（Ａ）Ｌｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（■）
（Ｂ）Ｌｙｓ−１（Ｘ）， Ｓａｒ０ペプチドＡ（▲）（Ｘは、Ｌｙｓ側鎖に結合した１ＫのＰＥＧ鎖を表す）
（Ｃ） Ｌｙｓ−１（Ｙ）， Ｓａｒ０ペプチドＡ（◆）（Ｙは、Ｌｙｓ側鎖に結合したｔｅｒｔ−ブチルグリシンを表す）
図３〜図５から得られるデータは、Ｌｙｓ−１， Ｓａｒ０ジペプチドが、Ｎ末端に結合するとプロドラッグ要素のように作用できないことを示している。しかしながら、このジペプチドのアミノ酸を修飾、特にＤ−アミノ酸（ｄＬｙｓ−１）を置換すると、化合物は不活性のままに保たれる（おそらく酵素による切断が防止されることによる）。プロドラッグは、ジペプチドプロドラッグ要素の構造および立体異性ならびに、求核物質の強さに応じて、あとから活性化される。図５に示すように、かなり高めの用量（２０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量ｖｓ０．６７ｎｍｏｌ／ｋｇの用量）ですら、ｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡはプロドラッグ作用を発揮する。
実施例１０
食餌で誘導した肥満（ＤＩＯ）マウス（Ｎ＝８）に、−６０分の時点で、用量１５ｎｍｏｌ／ｋｇまたは７０ｎｍｏｌ／ｋｇで以下の化合物のうちの１つを腹腔内注射した。
（Ａ）ペプチドＡ（△１５または▲７０、単位はｎｍｏｌ／ｋｇ／日）
（Ｂ）ｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（□１５または■７０、単位はｎｍｏｌ／ｋｇ／日）または
（Ｃ）Ｌｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（右方向白三角１５または右方向黒三角７０、単位はｎｍｏｌ／ｋｇ／日）。０分の時点と２４時間の時点で、２５％グルコースを含む生理食塩水を、体重１ｋｇあたり１．５ｇの用量で腹腔内注射した。−６０分、０分、１５分、３０分、６０分、１２０分の時点で、血中グルコース濃度を測定した。０日目と１日目に体重、食物摂取量、血糖、身体組成を測定し、１群あたりＮ＝８のＤＩＯマウスで初期平均体重は５５ｇであった。図６は、−６０分の時点で、溶媒のみ（▼）を腹腔内注射するか、あるいは、用量１５ｎｍｏｌ／ｋｇまたは７０ｎｍｏｌ／ｋｇで上述した化合物を腹腔内注射した、ＤＩＯマウス（Ｎ＝８）の血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）のグラフである。
２５％（ｖ／ｖ）のグルコースを含有する生理食塩水を、０分の時点および２４時間後に、体重１ｋｇあたり１．５ｇの用量で注射した。図示の血中グルコース濃度は、グルコース溶液の初回投与時（すなわち０分の時点）を基準に、−６０分、０分、１５分、３０分、６０分、１２０分の時点で測定したものである。
図７は、−６０分の時点で、溶媒のみ（▼）を腹腔内注射するか、あるいは、用量１５ｎｍｏｌ／ｋｇまたは７０ｎｍｏｌ／ｋｇで以下の化合物のうちの１つを腹腔内注射したＤＩＯマウス（Ｎ＝８）の血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示すグラフである。
（Ａ）ペプチドＡ（△１５または▲７０、単位はｎｍｏｌ／ｋｇ／日）
（Ｂ）ｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（◇１５または▽７０、単位はｎｍｏｌ／ｋｇ／日）または
（Ｃ）Ｌｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（◆１５または■７０、単位はｎｍｏｌ／ｋｇ／日）
２５％（ｖ／ｖ）のグルコースを含有する生理食塩水を、０分の時点および２４時間後に、体重１ｋｇあたり１．５ｇの用量で注射した。図示の血中グルコース濃度は、２４時間後に投与した２回目のグルコース溶液を基準に、０分、１５分、３０分、６０分、１２０分の時点で測定したものである。
図８は、図示の化合物を、用量１５ｎｍｏｌ／ｋｇまたは７０ｎｍｏｌ／ｋｇのいずれかで腹腔内注射したＤＩＯマウス（Ｎ＝８）での体重減少を示す。図示の体重は、化合物の投与後７日目に測定したものである。
実施例１１
食餌で誘導した肥満（ＤＩＯ）マウス（Ｎ＝８）に、２５％グルコースを含む生理食塩水を体重１ｋｇあたり１．５ｇ注射してグルコース負荷をかける２４時間前、８時間前、４時間前または１時間前に、溶媒のみまたは用量１５ｎｍｏｌ／ｋｇのプロドラッグペプチドを腹腔内注射した。図示の０分、１５分、３０分、６０分、１２０分の時点で、グルコース溶液での負荷を基準に血中グルコース濃度を測定した。この研究の結果を図９に示す。同図から、Ｌｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（図９Ａ）とｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＡ（図９Ｂ）はいずれも、溶媒対照よりも血糖の上昇を抑えることがわかる。この２種類のプロドラッグで得られた結果を比較すると、プロドラッグが循環している時間に対する血糖の初期制御の有効性の差がわかる。「ｄ」立体異性体を投与したマウスでは、負荷をかける１時間前にプロドラッグを投与すると血糖の初期制御（すなわち、早い時点）は悪く、負荷をかけるよりもかなり前に投与すると血糖の初期制御は良かった（プロドラッグ投与後８時間および２４時間の時点で初期制御が最大であったなど）。この研究結果は、「ｄ」立体異性体を有するプロドラッグが、「ｌ」立体異性体を有するプロドラッグよりも、長期にわたって不活性な形態のまま残っているという結論を裏付けるものである。
実施例１２
グルカゴンスーパーファミリーのペプチドＢ（「ペプチドＢ」）およびグルカゴンスーパーファミリーのペプチドＣ（「ペプチドＣ」）の３種類のプロドラッグを、以下の手順で合成した。
１） ｄＫ−Ｓａｒ−ペプチドＣ、ここで、ｄＫはＬｙｓのＤアイソフォームであり、Ｓａｒはサルコシンであり、ペプチドＣは、天然のグルカゴン（配列番号７０１）とは異なる８つの置換と、Ｃ末端アミドと、ヨードアセチル官能化４０ｋＤａ ＰＥＧでのＰＥＧ化とを有する、グルカゴンの類縁体である。
固相ペプチド合成を用いて、ペプチド配列を合成した。最後の残基であるＨｉｓのカップリングおよび脱保護後、ペプチド結合樹脂を、室温にて６時間、５倍過剰のＢｏｃ−サルコシン、ＤＥＰＢＴ、ＤＩＥＡをＤＭＦに入れた溶液と反応させた。反応をニヒドリン試験で監視した。よって、カップリング完了後、樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで３回洗浄した。Ｂｏｃ保護をＴＦＡで除去した。この樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦで洗浄し、ＤＩＥＡで中和した。この樹脂結合ペプチドを、５倍のＢｏｃ−ｄＬｙｓ、ＤＥＰＢＴ、ＤＩＥＡと、室温にて一晩さらに反応させた。次に、樹脂をＴＦＡで処理してＢｏｃ保護を除去し、ＤＣＭ、ＤＭＦで洗浄した。最後に、樹脂を２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液で処理して２５Ｔｒｐのホルミル基を除去し、真空下で乾燥させた。最終的には、４℃で１時間かけてＨＦとの反応によってペプチドを切断し、無水エチルエーテルで沈殿させた。濾過後、ペプチドが２０％アセトニトリル（ＭｅＣＮ）水溶液に溶解され、これを凍結乾燥して粉末にした。このペプチドを分取ＨＰＬＣで精製した（Ｃ５カラム；流速１０ｍｌ／分；バッファーＡ：１０％ＭｅＣＮおよび０．１％ＴＦＡの水溶液；バッファーＢ：０．１％ＴＦＡのＡＣＮ溶液；０〜４０％の直線勾配Ｂ％（０〜８０分間））。化合物をＥＳＩ−ＭＳで確認した（３６１２．８ダルトン）。
得られたペプチドを、２４−Ｃｙｓのチオール基のヨードアセチル官能化４０ｋＤａ ＰＥＧでＰＥＧ化した。このペプチドを、４Ｍの尿素／５０ｎＭのトリスバッファー（ｐＨ６．６）に、４℃で一晩かけて溶解させた。ＰＥＧ化ペプチドを分取ＨＰＬＣで精製し、同一性をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで確認した（４４０００〜４６０００、広いピーク）
２） ｄＫ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）−ペプチドＢ、ここで、ｄＫはＬｙｓのＤアイソフォームであり、Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）はＮ−ヘキシル−グリシンであり、ペプチドＢは、天然のグルカゴン（配列番号７０１）とは異なる８つの置換と、Ｃ末端アミドと、マレイミド官能化４０ｋＤａ ＰＥＧでのＰＥＧ化とを有する、グルカゴン類縁体である。
固相ペプチド合成を用いて、ペプチド配列を合成した。このペプチド結合樹脂を、室温にて２時間、５倍過剰のブロモ酢酸、ＤＩＣ、ＨＯＢＴをＤＭＦに入れた溶液と反応させた。ニヒドリン試験の結果が陰性であることが示された後、樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで３回洗浄した。次に、樹脂を、室温にて一晩、１０倍過剰のｎ−ヘキシルアミンおよびＤＩＥＡをＤＭＦに入れた溶液と反応させた。この樹脂結合ペプチドを、５倍のＢｏｃ−ｄＬｙｓ、ＤＥＰＢＴ、ＤＩＥＡと、室温にて一晩さらに反応させた。次に、樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで３回洗浄した。この樹脂結合ペプチドを、５倍のＢｏｃ−ｄＬｙｓ、ＤＥＰＢＴ、ＤＩＥＡと、室温にて２４時間さらに反応させた。樹脂をＴＦＡで処理してＢｏｃ保護を除去し、ＤＣＭおよびＤＭＦで洗浄した。最後に、樹脂を２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液で処理して２５Ｔｒｐのホルミル基を除去し、真空下で乾燥させた。最終的には、４℃で１時間かけてＨＦとの反応によってペプチドを切断し、無水エチルエーテルで沈殿させた。濾過後、ペプチドを２０％ＭｅＣＮ水溶液に再溶解させ、凍結乾燥して粉末にした。このペプチドを分取ＨＰＬＣで精製した（Ｃ５カラム；流速１０ｍｌ／分；Ａバッファー１０％ＭｅＣＮおよび０．１％ＴＦＡの水溶液；Ｂバッファー０．１％ＴＦＡのＭｅＣＮ溶液；０〜４０％の直線勾配Ｂ％（０〜８０分間））。化合物をＥＳＩ−ＭＳで確認したところ、質量は３６７７．０ダルトンであった。
得られたペプチドを、２４−Ｃｙｓのチオール基のマレイミド官能化４０ｋＤａ ＰＥＧでＰＥＧ化した。このペプチドを、４Ｍの尿素／５０ｎＭのトリスバッファー（ｐＨ６．６）に、４℃で一晩かけて溶解させた。ＰＥＧ化ペプチドを分取ＨＰＬＣで精製し、同一性をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで確認した（４４０００〜４６０００、広いピーク）。
３） ｄＫ−Ｆ（Ｎ−Ｍｅ）−ペプチドＣ、ここで、ｄＫはＬｙｓのＤアイソフォームであり、Ｆ（Ｎ−Ｍｅ）はＮ−メチルフェニルアラニンであり、ペプチドＣは、天然のグルカゴン（配列番号７０１）とは異なる８つの置換と、Ｃ末端アミドと、ヨードアセチル官能化４０ｋＤａ ＰＥＧでのＰＥＧ化とを有する、グルカゴンの類縁体である。固相ペプチド合成を用いて、ペプチド配列を合成した。ペプチド結合樹脂を、室温にて６時間、５倍過剰のＮ−メチルフェニルアラニン、ＤＥＰＢＴ、ＤＩＥＡをＤＭＦに入れた溶液と反応させた。ニヒドリン試験の結果が陰性であることが示された後、樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで３回洗浄した。次に、樹脂をＴＦＡで処理してＢｏｃ保護を除去し、ＤＣＭおよびＤＭＦで洗浄し、ＤＩＥＡで中和した。この樹脂結合ペプチドを、５倍のＢｏｃ−ｄＬｙｓ、ＤＥＰＢＴ、ＤＩＥＡと、室温にて一晩さらに反応させた。次に、樹脂をＴＦＡで除去してＢｏｃ保護を除去し、ＤＣＭおよびＤＭＦで洗浄した。最後に、樹脂を２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液で処理して２５Ｔｒｐのホルミル基を除去し、真空下で乾燥させた。最終的には、４℃で１時間かけてＨＦでペプチドを切断し、無水エチルエーテルで沈殿させた。濾過後、ペプチドを２０％ＭｅＣＮ水溶液に再溶解させ、凍結乾燥して粉末にした。このペプチドを分取ＨＰＬＣで精製した。ＨＰＬＣ条件：Ｃ５カラム；流速１０ｍｌ／分；Ａバッファー１０％ＭｅＣＮおよび０．１％ＴＦＡの水溶液；Ｂバッファー０．１％ＴＦＡのＭｅＣＮ溶液；０〜４０％の直線勾配Ｂ％（０〜８０分間）；ＰＥＧ−インスリンまたは類縁体を約３３％Ｂで回収した。所望の化合物をＥＳＩ−ＭＳで確認したところ、質量３７０１．０ダルトンであった。
得られたペプチドを、２４−Ｃｙｓのチオール基のヨードアセチル官能化４０ｋＤａ ＰＥＧでＰＥＧ化した。このペプチドを、４Ｍの尿素／５０ｎＭのトリスバッファー（ｐＨ６．６）に、４℃で一晩かけて溶解させた。ＰＥＧ化ペプチドを分取ＨＰＬＣで精製し、同一性をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで確認した（４４０００〜４６０００、広いピーク）。
同様の手順を用いて、配列番号１〜６８４、７０１〜７３１、８０１〜９１９、１００１〜１２６２、１３０１〜１３７１、１４０１〜１５１８、１７０１〜１７７６、１８０１〜１９０８のいずれかに結合したｄＬｙｓ−Ｎ−メチル−グリシン、ｄＬｙｓ−Ｎ−ヘキシル−グリシン、ｄＬｙｓ−Ｎ−メチル−フェニルアラニンを有するプロドラッグを合成する。
実施例１３
実施例１２で説明した３種類のプロドラッグのin vivoでの作用を、食餌で誘導した肥満（ＤＩＯ）マウス（系統：Ｃ５７Ｂｌ６）で試験した。マウス８匹ずつ９群（初期平均体重４４．５ｇ）に、溶媒のみあるいは、１０ｎｍｏｌ／ｋｇのプロドラッグペプチド（実施例１２）または親ペプチド（ジペプチドプロドラッグ部分のない非プロドラッグ形態）を皮下注射した。マウスは５．５月齢であり、約２か月間にわたって、規定の高脂肪飼料を給餌された。注射後０時間、２時間、４時間、２４時間、７２時間の時点で、血中グルコース濃度を測定した（図１１）。注射後１週間、体重を監視し、注射日を０日目として、０日目、１日目、３日目、５日目、７日目に体重を測定した（図１２）。１週間の研究の間、食物摂取量および体脂肪量も監視した。
親ペプチド、ｄＫ−Ｓａｒ含有プロドラッグまたはｄＫ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）プロドラッグを与えたマウスの体重は、溶媒対照を与えたマウスと比較して、研究期間をとおして順調に低下した。予想どおり、親ペプチドで体重の減少が最も大きく、プロドラッグを高用量で投与すると、親ペプチドと同一の作用が達成されると思われる。
血中グルコース濃度の変化（７日目〜０日目のレベル）は親ペプチドで最大であったが、ｄＫ−ＳａｒおよびｄＫ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）プロドラッグでも、溶媒対照と比較すれば相当な低下が認められた。
実施例１４
ジペプチドプロドラッグＡ−Ｂのアミノ酸「Ｂ」の側鎖および／またはα−アミンを置換することで、ＤＫＰ形成速度を調節した。表７に、実施例１２で得られたｄＫ−ＳａｒおよびｄＫ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）、ｄＫ−Ｆ（Ｎ−Ｍｅ）プロドラッグを用いた場合のＤＫＰ形成速度を示す。
表７．ＤＫＰ形成速度の調節
Figure 2013540102
実施例１５
実施例５で説明したＧＬＰ−受容体ルシフェラーゼアッセイを使用して、２０％ヒト血漿における以下のペプチドおよびプロドラッグの受容体結合活性を経時的に測定した。
（Ａ）ＧＬＰ−１（配列番号７０３）
（Ｂ）ペプチドＣ
（Ｃ）ｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０キメラペプチドＣまたは
（Ｄ）ｄＬｙｓ−１ Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）０ペプチドＢ
表８に示すように、ｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０およびｄＬｙｓ−１ Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）０プロドラッグの活性は、時間の経過とともに徐々に増加し、４８時間以内に天然のＧＬＰ−１に一致した（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。
表８．プロドラッグから活性のある薬剤への変換に対して時間がおよぼす影響
Figure 2013540102
実施例１６
痩せた、食餌で誘導した肥満マウス（Ｎ＝１４、系統：C57B16 WT））に、１週間分の用量である３ｎｍｏｌ／ｋｇ、１０ｎｍｏｌ／ｋｇまたは３０ｎｍｏｌ／ｋｇの溶媒または以下の化合物のうちの１つを１回で皮下注射した。
（Ａ）ペプチドＣ
（Ｂ）ｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＣまたは
（Ｃ）ｄＬｙｓ−１ Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）０ペプチドＢ
マウスの初期平均体重は３１．２ｇであり、１日目、３日目、５日目、７日目に体重を量った。血中グルコース濃度を、１日目、３日目、５日目に腹腔内で測定した。マウスは約５月齢であり、約５か月間にわたって定期的に固形飼料を給餌された。
研究結果を図１４〜図１５に示す。図１４は、１日目、３日目、５日目、７日目のＤＩＯマウスの体重変化を示すグラフである。図１５は、１日目（図１５Ａ）、３日目（図１５Ｂ）、５日目（図１５Ｃ）の血中グルコース濃度を示すグラフである。
実施例１７
実施例５で説明したＧＬＰ−１受容体アッセイを使用して、２０％ヒト血漿における以下のペプチドおよびプロドラッグの受容体結合活性を経時的に測定した。
（Ａ）ＧＬＰ−１
（Ｂ）ペプチドＣ
（Ｃ）ｄＬｙｓ−１ Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）０ペプチドＣ
（Ｄ）ｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＣ
（Ｅ）ｄＬｙｓ−１ Ｐｈｅ（Ｎ−メチル）０ペプチドＣ
表９に示すように、ｄＬｙｓ−１ Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）０、ｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０、ｄＬｙｓ−１ Ｐｈｅ（Ｎ−メチル）０プロドラッグの活性は、時間の経過とともに徐々に増加した（図１６Ａ〜図１６Ｃ）。表９から明らかなように、ジペプチドプロドラッグ要素の第２のアミノ酸の化学構造を変えることで、プロドラッグの半減期を調整することが可能である。
表９．プロドラッグのＥＣ５０およびプロドラッグから活性のある薬剤への変換に対して時間がおよぼす影響
Figure 2013540102
実施例１８
実施例５で説明したＧＬＰ−１受容体アッセイを使用して、２０％ヒト血漿における以下のペプチドおよびプロドラッグの受容体結合活性を経時的に測定した。
（Ａ）ＧＬＰ−１
（Ｂ）ペプチドＤ
（Ｃ）Ａｉｂ−１ Ｓａｒ０ペプチドＤ
（Ｄ）ｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０ペプチドＤ
（Ｅ）ｄＬｙｓ−１ Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）０ペプチドＤ
（Ｆ）ｄＬｙｓ−１ Ｐｈｅ（Ｎ−メチル）０ペプチドＤ
表１０に示すように、Ａｉｂ−１Ｓａｒ０、ｄＬｙｓ−１ Ｓａｒ０、ｄＬｙｓ−１ Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）０、ｄＬｙｓ−１ Ｐｈｅ（Ｎ−メチル）０プロドラッグの活性は、時間の経過とともに徐々に増加し、ジペプチドプロドラッグ要素の構造に左右された（図１７Ａ〜図１７Ｄ）。ペプチドＤすなわち、クラス２のグルカゴン関連ペプチドは、天然のグルカゴン（配列番号７０１）とは異なる３つの置換と、Ｃ末端の延長部分と、Ｃ末端アミドと、アシル化およびＰＥＧ化とを有する、グルカゴンの類縁体である。
表１０．プロドラッグから活性のある薬剤への変換に対して時間がおよぼす影響
Figure 2013540102
実施例１９
遺伝学的に交配した糖尿病／肥満マウス（Ｎ＝８、系統：オスdb/db(BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J)）に、溶媒または用量１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、３０ｎｍｏｌ／ｋｇまたは１００ｎｍｏｌ／ｋｇの以下の化合物のうちの１つを１回で皮下注射した。
（Ａ）ペプチドＤ
（Ｂ）Ａｉｂ−Ｓａｒ−ペプチドＤ
血中グルコース濃度を、０時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間の時点で腹腔内で測定した。マウスは約１０〜１１週齢（３３．４〜４５．６ｇ）で、公認されたピュリナげっ歯類飼料#5001で維持された。研究時、各群の動物が自由に食餌を摂取できるようにしておいた。
研究結果を図１８に示す。図１８は、７２時間の過程における血中グルコース濃度を示すグラフである。

Claims (56)

  1. 構造Ａ−Ｂ−Ｑを有するプロドラッグ。
    （式中、Ｑはグルカゴンスーパーファミリーのペプチドであり、
    Ａ−Ｂは、構造
    Figure 2013540102

    を有し、式中、
    Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１がＮ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成し、
    Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、
    Ｒ４およびＲ８は、各々Ｈであり、
    Ｒ５は、ＮＨＲ６であるか、あるいは、Ｒ５とＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
    Ｒ６は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
    Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、（Ｃ２〜Ｃ７アルケニル）、ＯＣＦ３、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＣ、Ｏ（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、ＮＨＲ６、アリール、ヘテロアリールからなる群から選択され、
    Ａ−Ｂは、Ａ−ＢとＱの脂肪族アミノ基との間のアミド結合を介してＱに結合し、
    ＱからＡ−Ｂが化学的に切断される半減期（ｔ１／２）が、ＰＢＳ中にて生理的条件下で、少なくとも約１時間から約１週間であるが、
    ただし、Ａ−ＢがＱのＮ末端のαアミノ基に結合し、かつ、（ｉ）Ｒ１およびＲ２がともにＨであり、（ｉｉ）Ｒ３がメチルである場合、Ｑは、Ｆ７ＧＬＰ−１（８−３７）ではない。）
  2. Ｂは、グリシン（Ｎ−メチル）、グリシン（Ｎ−エチル）、グリシン（Ｎ−プロピル）、グリシン（Ｎ−ブチル）、グリシン（Ｎ−ペンチル）、グリシン（Ｎ−ヘキシル）、グリシン（Ｎ−ヘプチル）、グリシン（Ｎ−オクチル）からなる群から選択される、請求項１に記載のプロドラッグ。
  3. Ｂは、グリシン（Ｎ−メチル）である、請求項２に記載のプロドラッグ。
  4. Ｂは、グリシン（Ｎ−ヘキシル）である、請求項２に記載のプロドラッグ。
  5. 構造Ａ−Ｂ−Ｑを有するプロドラッグ。
    （式中、Ｑはグルカゴンスーパーファミリーのペプチドであり、
    Ａ−Ｂは、構造
    Figure 2013540102

    を有し、式中、
    Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１がＮ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成し、
    Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、
    Ｒ４は、ＣＨ３、ＣＨ２（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ＣＨ２（Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル）、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ１０アルキル）ＯＨ、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ１０アルキル）ＳＨ、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＣＯＮＨ２、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＣＯＯＨ、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＮＨ２、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、ＣＨ２（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ１２アルキル）（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１は、Ｎ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
    Ｒ８は、Ｈであり、
    Ｒ５は、ＮＨＲ６であるか、あるいは、Ｒ５とＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
    Ｒ６は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
    Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、（Ｃ２〜Ｃ７アルケニル）、ＯＣＦ３、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＣ、Ｏ（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、ＮＨＲ６、アリール、ヘテロアリールからなる群から選択され、
    Ａ−Ｂは、Ａ−ＢとＱの脂肪族アミノ基との間のアミド結合を介してＱに結合し、
    ＱからＡ−Ｂが化学的に切断される半減期（ｔ１／２）が、ＰＢＳ中にて生理的条件下で、少なくとも約１時間から約１週間であり、
    任意に、Ａ−ＢとしてＧｌｙ−Ｐｒｏを除外する。）
  6. Ｒ４は、ＣＨ３、ＣＨ２（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）、ＣＨ２（Ｃ１〜Ｃ４）アルケニル、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＣＯＮＨ２、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＣＯＯＨ、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２からなる群から選択される、請求項５に記載のプロドラッグ。
  7. Ｂは、アラニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ロイシン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、メチオニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、アスパラギン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、グルタミン酸（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、アスパラギン酸（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、グルタミン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ヒスチジン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、リジン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、アルギニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、セリン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、システイン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）からなる群から選択される、請求項６に記載のプロドラッグ。
  8. Ｂは、アラニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ロイシン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、メチオニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、アスパラギン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、グルタミン酸（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、アスパラギン酸（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、グルタミン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ヒスチジン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、リジン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、アルギニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、セリン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、システイン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）からなる群から選択される、請求項７に記載のプロドラッグ。
  9. Ｂは、アラニン（Ｎ−メチル）、ロイシン（Ｎ−メチル）、メチオニン（Ｎ−メチル）、アスパラギン（Ｎ−メチル）、グルタミン酸（Ｎ−メチル）、アスパラギン酸（Ｎ−メチル）、グルタミン（Ｎ−メチル）、ヒスチジン（Ｎ−メチル）、リジン（Ｎ−メチル）、アルギニン（Ｎ−メチル）、セリン（Ｎ−メチル）、システイン（Ｎ−メチル）からなる群から選択される、請求項８に記載のプロドラッグ。
  10. Ｒ４は、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、ＣＨ２（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ１２アルキル）（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１は、Ｎ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であり、Ｒ７は、ＨおよびＯＨからなる群から選択される、請求項５に記載のプロドラッグ。
  11. Ｂは、フェニルアラニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、チロシン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、トリプトファン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）からなる群から選択される、請求項１０に記載のプロドラッグ。
  12. Ｂは、フェニルアラニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、チロシン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、トリプトファン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）からなる群から選択される、請求項１１に記載のプロドラッグ。
  13. Ｂは、フェニルアラニン（Ｎ−メチル）、チロシン（Ｎ−メチル）、トリプトファン（Ｎ−メチル）からなる群から選択される、請求項１２に記載のプロドラッグ。
  14. Ｂはプロリンである、請求項５に記載のプロドラッグ。
  15. 構造Ａ−Ｂ−Ｑを有するプロドラッグ。
    （式中、Ｑはグルカゴンスーパーファミリーのペプチドであり、
    Ａ−Ｂは、構造
    Figure 2013540102

    を有し、式中、
    Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１がＮ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成するか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成し、
    Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、
    Ｒ４は、ＣＨ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）２、ＣＨ（Ｃ２〜Ｃ８アルケニル）２、ＣＨ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）（ＯＨ）、ＣＨ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）（（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）ＳＨ）、ＣＨ（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）（（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）（ＮＨ２））からなる群から独立に選択され、
    Ｒ８は、Ｈであり、
    Ｒ５は、ＮＨＲ６であるか、あるいは、Ｒ５とＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
    Ｒ６は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
    Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、（Ｃ２〜Ｃ７アルケニル）、ＯＣＦ３、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＣ、Ｏ（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、ＮＨＲ６、アリール、ヘテロアリールからなる群から選択され、
    Ａ−Ｂは、Ａ−ＢとＱの脂肪族アミノ基との間のアミド結合を介してＱに結合し、
    ＱからＡ−Ｂが化学的に切断される半減期（ｔ１／２）が、ＰＢＳ中にて生理的条件下で、少なくとも約１時間から約１週間である。）
  16. Ｒ４は、ＣＨ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）２またはＣＨ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）ＯＨである、請求項１５に記載のプロドラッグ。
  17. Ｂは、イソロイシン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、バリン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、スレオニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）からなる群から選択される、請求項１６に記載のプロドラッグ。
  18. Ｂは、イソロイシン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、バリン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スレオニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）からなる群から選択される、請求項１７に記載のプロドラッグ。
  19. Ｂは、イソロイシン（Ｎ−メチル）、バリン（Ｎ−メチル）、スレオニン（Ｎ−メチル）からなる群から選択される、請求項１８に記載のプロドラッグ。
  20. 前記脂肪族アミノ基は、ＱのＮ末端のアミノ酸のαアミノ基である、請求項１に記載のプロドラッグ。
  21. 前記脂肪族アミノ基は、Ｑの側鎖の脂肪族アミノ基である、請求項１に記載のプロドラッグ。
  22. 構造Ａ−Ｂ−Ｑを有するプロドラッグ。
    （式中、Ｑはグルカゴンスーパーファミリーのペプチドであり、
    Ａ−Ｂは、構造
    Figure 2013540102

    を有し、式中、
    Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１がＮ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成し、
    Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、
    Ｒ４およびＲ８は、各々Ｈであり、
    Ｒ５は、ＮＨＲ６であるか、あるいは、Ｒ５とＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
    Ｒ６は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
    Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、（Ｃ２〜Ｃ７アルケニル）、ＯＣＦ３、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＣ、Ｏ（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、ＮＨＲ６、アリール、ヘテロアリールからなる群から選択され、
    Ａ−Ｂは、Ａ−ＢとＱのアミノ酸側鎖の芳香族アミノ基との間のアミド結合を介してＱに結合し、
    ＱからＡ−Ｂが化学的に切断される半減期（ｔ１／２）が、ＰＢＳ中にて生理的条件下で、少なくとも約１時間から約１週間である。）
  23. Ｂは、グリシン（Ｎ−メチル）、グリシン（Ｎ−エチル）、グリシン（Ｎ−プロピル）、グリシン（Ｎ−ブチル）、グリシン（Ｎ−ペンチル）、グリシン（Ｎ−ヘキシル）、グリシン（Ｎ−ヘプチル）、グリシン（Ｎ−オクチル）からなる群から選択される、請求項２２に記載のプロドラッグ。
  24. Ｂは、グリシン（Ｎ−メチル）である、請求項２３に記載のプロドラッグ。
  25. Ｂは、グリシン（Ｎ−ヘキシル）である、請求項２３に記載のプロドラッグ。
  26. 構造Ａ−Ｂ−Ｑを有するプロドラッグ。
    （式中、Ｑはグルカゴンスーパーファミリーのペプチドであり、
    Ａ−Ｂは、構造
    Figure 2013540102

    を有し、式中、
    Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１がＮ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成し、
    Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、
    Ｒ４は、ＣＨ３、ＣＨ２（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ＣＨ２（Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル）、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ１０アルキル）ＯＨ、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ１０アルキル）ＳＨ、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＣＯＮＨ２、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＣＯＯＨ、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＮＨ２、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、ＣＨ２（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ１２アルキル）（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１は、Ｎ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ４およびＲ３は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
    Ｒ８は、Ｈであり、
    Ｒ５は、ＮＨＲ６であるか、あるいは、Ｒ５とＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
    Ｒ６は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
    Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、（Ｃ２〜Ｃ７アルケニル）、ＯＣＦ３、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＣ、Ｏ（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、ＮＨＲ６、アリール、ヘテロアリールからなる群から選択され、
    Ａ−Ｂは、Ａ−ＢとＱのアミノ酸側鎖の芳香族アミノ基との間のアミド結合を介してＱに結合し、
    ＱからＡ−Ｂが化学的に切断される半減期（ｔ１／２）が、ＰＢＳ中にて生理的条件下で、少なくとも約１時間から約１週間である。）
  27. Ｒ４は、ＣＨ３、ＣＨ２（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）、ＣＨ２（Ｃ１〜Ｃ４）アルケニル、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＣＯＮＨ２、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＣＯＯＨ、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２からなる群から選択される、請求項２６に記載のプロドラッグ。
  28. Ｂは、アラニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ロイシン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、メチオニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、アスパラギン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、グルタミン酸（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、アスパラギン酸（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、グルタミン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ヒスチジン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、リジン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、アルギニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、セリン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、システイン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）からなる群から選択される、請求項２７に記載のプロドラッグ。
  29. Ｂは、アラニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ロイシン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、メチオニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、アスパラギン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、グルタミン酸（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、アスパラギン酸（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、グルタミン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ヒスチジン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、リジン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、アルギニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、セリン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、システイン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）からなる群から選択される、請求項２８に記載のプロドラッグ。
  30. Ｂは、アラニン（Ｎ−メチル）、ロイシン（Ｎ−メチル）、メチオニン（Ｎ−メチル）、アスパラギン（Ｎ−メチル）、グルタミン酸（Ｎ−メチル）、アスパラギン酸（Ｎ−メチル）、グルタミン（Ｎ−メチル）、ヒスチジン（Ｎ−メチル）、リジン（Ｎ−メチル）、アルギニン（Ｎ−メチル）、セリン（Ｎ−メチル）、システイン（Ｎ−メチル）からなる群から選択される、請求項２９に記載のプロドラッグ。
  31. Ｒ４は、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ３アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、ＣＨ２（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、ＣＨ２（Ｃ０〜Ｃ１２アルキル）（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１は、Ｎ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であり、Ｒ７は、ＨおよびＯＨからなる群から選択される、請求項２６に記載のプロドラッグ。
  32. Ｂは、フェニルアラニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、チロシン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、トリプトファン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）からなる群から選択される、請求項３１に記載のプロドラッグ。
  33. Ｂは、フェニルアラニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、チロシン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、トリプトファン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）からなる群から選択される、請求項３２に記載のプロドラッグ。
  34. Ｂは、フェニルアラニン（Ｎ−メチル）、チロシン（Ｎ−メチル）、トリプトファン（Ｎ−メチル）からなる群から選択される、請求項３３に記載のプロドラッグ。
  35. Ｂは、プロリンである、請求項２６に記載のプロドラッグ。
  36. 構造Ａ−Ｂ−Ｑを有するプロドラッグ。
    （式中、Ｑはグルカゴンスーパーファミリーのペプチドであり、
    Ａ−Ｂは、構造
    Figure 2013540102

    を有し、式中、
    Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１がＮ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成するか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成し、
    Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、
    Ｒ４は、ＣＨ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）２、ＣＨ（Ｃ２〜Ｃ８アルケニル）２、ＣＨ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）（ＯＨ）、ＣＨ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）（（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）ＳＨ）、ＣＨ（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）（（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）（ＮＨ２））からなる群から独立に選択され、
    Ｒ８は、Ｈであり、
    Ｒ５は、ＮＨＲ６であるか、あるいは、Ｒ５とＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成し、
    Ｒ６は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
    Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、（Ｃ２〜Ｃ７アルケニル）、ＯＣＦ３、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＣ、Ｏ（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１〜Ｃ７アルキル）、ＮＨＲ６、アリール、ヘテロアリールからなる群から選択され、
    Ａ−Ｂは、Ａ−ＢとＱのアミノ酸側鎖の芳香族アミノ基との間のアミド結合を介してＱに結合し、
    ＱからＡ−Ｂが化学的に切断される半減期（ｔ１／２）が、ＰＢＳ中にて生理的条件下で、少なくとも約１時間から約１週間である。）
  37. Ｒ４は、ＣＨ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）２またはＣＨ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）ＯＨである、請求項３６に記載のプロドラッグ。
  38. Ｂは、イソロイシン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、バリン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、スレオニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）からなる群から選択される、請求項３７に記載のプロドラッグ。
  39. Ｂは、イソロイシン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、バリン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スレオニン（Ｎ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル）からなる群から選択される、請求項３８に記載のプロドラッグ。
  40. Ｂは、イソロイシン（Ｎ−メチル）、バリン（Ｎ−メチル）、スレオニン（Ｎ−メチル）からなる群から選択される、請求項３９に記載のプロドラッグ。
  41. Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｗ１は、Ｎ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成し、Ｒ７は、ＨおよびＯＨからなる群から選択される、上記請求項のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
  42. Ａは、アミノイソ酪酸である、請求項４１に記載のプロドラッグ。
  43. Ｒ１はＨであり、Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２ ＋）ＮＨ２、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ２〜Ｃ５複素環）、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ７、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（Ｃ３〜Ｃ９ヘテロアリール）、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（Ｗ１）Ｃ１〜Ｃ１２アルキルからなる群から選択され、Ｒ７は、ＨおよびＯＨからなる群から選択され、Ｗ１は、Ｎ、Ｓ、Ｏからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルを形成するか、あるいは、Ｒ２およびＲ５は、これらが結合している原子と一緒になって、４員環、５員環または６員環の複素環を形成する、上記請求項のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
  44. Ａは、リジン、システイン、アラニンからなる群から選択される、請求項４３に記載のプロドラッグ。
  45. Ａは、ｄの立体異性を有する、請求項４３または４４に記載のプロドラッグ。
  46. Ａ−Ｂは、Ａｉｂ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）、ｄＬｙｓ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）、ｄＣｙｓ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）、ｄＡｌａ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）、Ａｉｂ−Ｇｌｙ（Ｎ−メチル）、ｄＬｙｓ−Ｇｌｙ（Ｎ−メチル）、ｄＣｙｓ−Ｇｌｙ（Ｎ−メチル）、ｄＡｌａ−Ｇｌｙ（Ｎ−ヘキシル）、Ａｉｂ−Ｐｈｅ（Ｎ−メチル）、ｄＬｙｓ−Ｐｈｅ（Ｎ−メチル）、ｄＣｙｓ−Ｐｈｅ（Ｎ−メチル）またはｄＡｌａ−Ｐｈｅ（Ｎ−メチル）からなる群から選択される、上記請求項のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
  47. Ｑは、配列番号１〜５６４、５６６〜５７０、５７３〜５７５、５７７、５７９〜５８０、５８５〜６１２、６１６、６１８〜６３２、６３４〜６４２、６４７、６５７〜６８４、７０１〜７３２、７４２〜７６８、８０１〜８７８、８８３〜９１９、１００１〜１２６２、１３０１〜１３７１、１４０１〜１５１８、１７０１〜１７０８、１７１０、１７１１、１７３１〜１７３４、１７３８、１７４０、１７４１、１７４５、１７４７〜１７７６からなる群から選択される、上記請求項のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
  48. Ｑは、配列番号７４２〜７６８からなる群から選択される、請求項４７に記載のプロドラッグ。
  49. 前記プロドラッグに共有結合している親水体をさらに含む、上記請求項のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
  50. 前記親水体は、ポリエチレングリコールである、請求項４９に記載のプロドラッグ。
  51. 前記ポリエチレングリコールは、Ａ−Ｂに共有結合している、請求項５０に記載のプロドラッグ。
  52. 前記ポリエチレングリコールは、スペーサーを介してＡ−Ｂに共有結合している、請求項５１に記載のプロドラッグ。
  53. 前記プロドラッグに共有結合しているアシル基またはアルキル基をさらに含む、上記請求項のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
  54. 前記アシル基またはアルキル基は、Ａ−Ｂに共有結合している、請求項５２に記載のプロドラッグ。
  55. 前記アシル基またはアルキル基は、スペーサーを介してＡ−Ｂに共有結合している、請求項５４に記載のプロドラッグ。
  56. ＱからＡ−Ｂが化学的に切断される半減期（ｔ１／２）は、ＰＢＳ中にて生理的条件下で、約６時間から約７２時間である、上記請求項のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
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