KR101011081B1 - Ｐｅｇ화된 ｇｌｐ-1 화합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PEG화되지 않은 펩티드에 비해 연장된 반감기 및 더 느린 클리어런스를 갖는 생물학적 활성 펩티드를 생성하는, 2개의 폴리에틸렌 글리콜 분자와 결합된 GLP-1 화합물 또는 그의 유도체를 제공한다. 상기 PEG화된 GLP-1 화합물 및 조성물은 혈당 저하, 음식 섭취 감소, 위 또는 장 배출 감소, 베타 (ß) 세포 수 증가 또는 위 또는 장 운동성 감소가 이로운 질병 또는 장애를 치료하는 데 유용하다.
GLP-1, PEG화, 당뇨, 비만, 반감기, 클리어런스

Description

ＰＥＧ화된 ＧＬＰ-1 화합물 {GLP-1 PEGYLATED COMPOUNDS}
본 발명은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 개질된 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1) 화합물 및 관련 조성물 및 혈당 저하, 음식 섭취 감소, 위 또는 장 배출 감소, 베타 (ß) 세포 수 및/또는 기능의 증가 및/또는 ß 세포 아폽토시스의 억제, 또는 위 또는 장 운동성의 감소가 이로운 질병 또는 장애를 치료하는 데 유용한 방법에 관한 것이다.
GLP-1은 인슐린 분비 자극, 글루카곤 분비 억제, 위 배출 억제, 위 운동성 또는 장 운동성 억제, 글루코스 이용 증대, 및 체중 감소 유도와 같은 수많은 생물학적 효과를 유도한다. GLP-1은 추가로 인슐린 비의존성 당뇨병 (NIDDM)이 진행되면서 발생하는 췌장 ß-세포 퇴화를 막는 역할을 할 수 있다. GLP-1의 중요한 특성은 연관된 저혈당 위험 없이 인슐린 분비를 자극하는 능력이다. 글루코스 수치가 상승되었는지에 관계 없이 인슐린 발현을 증가시킴으로써 작용하는 다른 치료제와는 달리, GLP-1은 오직 글루코스 수치가 상승되었을 때에만 인슐린 분비를 유도한다.
GLP-1(1-37)의 활성이 불량하고, 2개의 자연 발생 말단절단 펩티드 GLP-1(7- 37)OH 및 GLP-1(7-36)NH2가 생체내에서 빠르게 소실되고 극히 짧은 체내 반감기를 갖는다는 사실 때문에, GLP-1 펩티드를 포함하는 치료법의 유용성은 제한되어 왔다. 내생적으로 생성된 디펩티딜-펩티다제 IV (DPP-IV)가 N-말단 히스티딘 및 알라닌 잔기를 제거함으로써 순환 GLP-1 펩티드를 불활성화시키고, 이것이 생체내 짧은 반감기의 주요 원인이라는 것이 공지되어 있다.
다양한 접근법에 의해 본래의 GLP-1에 비해 더 긴 반감기 또는 더 우수한 효능을 갖는 GLP-1 화합물이 얻어졌지만, 클리어런스를 감소시키고 반감기를 증가시킴으로써 장기간 동안 최소의 횟수로 투여할 수 있는 치료제로서 유용하도록 GLP-1의 능력을 최적화시킨 추가의 화합물이 요구된다. 국제 출원 번호 PCT/US2004/006082 및 PCT/US2000/11814에는 다양한 GLP-1 및 엑센딘 화합물에 하나 이상의 PEG 분자를 공유 부착시키는 것이 기재되어 있다. 상기 화합물은 24시간을 초과하는 반감기를 가질 수 있어, 장기간에 걸쳐 화합물의 높은 혈액 수치를 유지하면서도 PEG화된 GLP-1 화합물의 투여 횟수를 줄일 수 있게 해 준다.
추가의 조사에 따르면, 장기간 보관시 PEG화된 GLP-1 또는 엑센딘 화합물로부터 PEG 분리가 발생한다는 문제가 나타났다. 그 결과, 유리 GLP-1 또는 엑센딘 펩티드는 치료 범위(therapeutic window)를 넘어서까지 초기 피크 농도 노출 프로파일을 증가시킨다. 이는 오심 및 구토라는 부작용을 증가시킬 가능성이 있다.
본 발명은 2개의 PEG화 부위를 GLP-1 또는 엑센딘 화합물에 도입시킨 후, 상기 2개의 PEG화 부위를 동시에 PEG화함으로써, 장기간의 보관 및 PEG화된 GLP-1 또 는 엑센딘 화합물로부터의 잠재적인 PEG 분리와 관련된 문제를 극복하려는 것이다. 이러한 접근법의 장점은 적어도 4가지 측면에 걸쳐있다. 첫째, 화합물의 PEG화는 화합물의 생체내 반감기를 극적으로 개선시킬 것이다. 둘째, 화합물의 PEG화는 화합물의 흡수 속도를 감소시켜, 부작용의 원인이라고 약물의 초기 방출(burst)을 감소시킬 것이다. 셋째, 선형 PEG를 PEG화에 직접 사용할 수 있어 합성 절차를 단순화시킬 것이다. 넷째, 직렬 PEG화는 동일한 GLP-1 또는 엑센딘 펩티드 분자로부터 두 PEG 모두가 분리될 가능성을 감소시킴으로써, 장기간의 보관 및 PEG화된 GLP-1 또는 엑센딘 화합물로부터의 잠재적인 PEG 분리와 연관된 문제를 완화시킬 것이다.
또한, 2개의 PEG화 부위를 화합물의 C-말단에서 GLP-1 또는 엑센딘 화합물에 도입시킨 후 상기 2개의 PEG화 부위를 동시에 PEG화함으로써, PEG화 부위 중 적어도 하나가 펩티드의 C-말단에 존재하지 않는 PEG화된 화합물보다 우수한 활성을 갖는 PEG화된 화합물이 얻어진다. 추가로, GLP-1 화합물의 C-말단에 2개의 PEG화 부위를 포함하는 연결기를 부착시킨 후 상기 2개의 PEG화 부위를 동시에 PEG화함으로써, PEG화 부위가 연결기 없이 GLP-1 화합물의 C-말단에 부착된 PEG화된 화합물보다 우수한 활성을 갖는 PEG화된 GLP-1 화합물이 얻어진다.
이러한 PEG화된 GLP-1 화합물은 당뇨, 비만, 위 및/또는 장 운동 이상, 베타 (ß) 세포 결핍 (예컨대 불충분 또는 무기능 ß 세포), 및 위 및/또는 장 배출 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는 장애를 가진 대상체를 치료하기 위해 의약용으로 사용될 수 있으며, 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물이 24시간의 기간 동안 더 적은 횟수의 투여를 요구하므로, 이러한 치료가 필요한 대상체에게 주는 편리함과 투여 요구사항에 대한 대상체의 순응 가능성 둘 다를 증가시킨다는 특별한 장점을 갖는다.
발명의 요약
본원에 기재된 발명은 두 분자의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 공유 부착되며, 이 때 각 PEG가 시스테인 잔기에 부착되는 GLP-1 화합물 또는 그의 유도체를 제공하며, 이로써 PEG화된 GLP-1 화합물의 제거 반감기가 1시간 이상, 또는 3, 5, 7, 10, 15, 20시간 이상 또는 24시간 이상이 된다. 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물은 200 ml/h/kg 이하, 또는 180, 150, 120, 100, 80, 60 ml/h/kg 이하, 또는 50, 40 또는 20 ml/h/kg 미만의 클리어런스 값을 갖는다.
본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물은 하기 화학식 I의 아미노산 서열을 포함한다:
His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys45-Xaa46 (서열 1)
상기 식에서,
Xaa8은 D-Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Ser, 또는 Thr이고;
Xaa22는 Gly, Glu, Asp, 또는 Lys이고;
Xaa33은 Val 또는 Ile이고;
Xaa46은 Cys 또는 Cys-NH2이며;
1개의 PEG 분자가 Cys45에 공유 부착되고, 1개의 PEG 분자가 Cys46 또는 Cys46-NH2에 공유 부착된다.
바람직하게는, 화학식 I의 PEG화된 GLP-1 화합물의 경우 Xaa8은 Gly 또는 Val이고; Xaa22는 Gly 또는 Glu이고; Xaa33은 Val 또는 Ile이고; Xaa46은 Cys 또는 Cys-NH2이다. Xaa8이 Val이고; Xaa22가 Glu이고; Xaa33이 Val 또는 Ile이고; Xaa46이 Cys 또는 Cys-NH2인 화학식 I의 PEG화된 GLP-1 화합물도 바람직하다. Xaa8이 Val이고; Xaa22가 Glu이고; Xaa33이 Val이고; Xaa46이 Cys인 화학식 I의 PEG화된 GLP-1 화합물도 바람직하다. Xaa8이 Val이고; Xaa22가 Glu이고; Xaa33이 Val이고; Xaa46이 Cys-NH2인 화학식 I의 PEG화된 GLP-1 화합물도 바람직하다. Xaa8이 Val이고; Xaa22가 Glu이고; Xaa33이 Ile이고; Xaa46이 Cys인 화학식 I의 PEG화된 GLP-1 화합물도 바람직하다. Xaa8이 Val이고; Xaa22가 Glu이고; Xaa33이 Ile이고; Xaa46이 Cys-NH2인 화학식 I의 PEG화된 GLP-1 화합물도 바람직하다.
본 발명에 사용된 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG") 중합체는 분자량이 500 내지 100,000 달톤, 또는 5,000 내지 40,000 달톤, 또는 20,000 내지 60,000 달톤, 또는 20,000 내지 40,000 달톤이며, 선형 또는 분지형 분자일 수 있고, 당업계에 공지된 바와 같은 폴리에틸렌 글리콜 유도체일 수 있다. 본 발명에서의 GLP-1 화합물에 공유 부착된 PEG 분자를 특정 유형에 제한시키려는 것은 아니다. 바람직하게는 PEG는 20 킬로달톤의 선형 메톡시 PEG 말레이미드이다. 더욱 바람직하게는 PEG는
Figure 112007080893537-pct00001
이다.
본 발명은 본원에 기재된 PEG화된 GLP-1 화합물의 유효량을 GLP-1 수용체의 자극이 필요한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 GLP-1 수용체를 자극시키는 방법을 포함한다. GLP-1 수용체 자극이 필요한 대상체에는 인슐린 비의존성 당뇨, 스트레스로 유발된 고혈당, 비만, 예를 들어 과민성 장 증후군을 포함하는 위 및/또는 장 운동성 또는 배출 장애, 베타 (ß) 세포 결핍, 및 기능성 소화불량을 가진 대상체가 포함된다.
글루카곤 유사 펩티드 1 (GLP-1)은 음식 섭취에 대한 반응으로 장의 L-세포에 의해 분비되는, 37개의 아미노산으로 된 펩티드이다. 다수의 GLP-1 유사체 및 유도체가 당업계에 공지되어 있다. 본 발명은 제거 반감기 연장 및/또는 클리어런스 감소를 가져오는 GLP-1 화합물에 대한 개질을 공개한다. 시스테인 잔기를 펩티드의 특정 아미노산 부위에 도입시키면 티올기가 제공되는데, 여기에 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 PEG 유도체가 공유 부착되어 PEG화된 GLP-1 화합물을 생성할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "GLP-1 화합물"로는 본래의 GLP-1, [GLP-1(7-37)OH 또는 GLP-1(7-36)NH2], GLP-1 유사체, GLP-1 유도체, GLP-1 생물학적 활성 단편, 연장된 GLP-1 또는 연장된 GLP-1 펩티드의 유사체 또는 단편, 엑센딘-4 유사체 및 엑센딘-4 유도체가 포함된다. 바람직하게는, GLP-1 유사체는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산이 GLP-1(7-37)OH 또는 GLP-1(7-37)OH 단편의 상응하는 위치의 아미노산과 상이하도록 변형된 GLP-1(7-37)OH, 또는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산이 연장된 GLP-1 펩티드의 상응하는 위치의 아미노산과 상이하도록 변형된 연장된 GLP-1 펩티드의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 GLP-1 화합물을 언급할 때의 용어 "PEG화된"은 2 분자의 폴리에틸렌 글리콜 또는 그의 유도체의 공유 부착에 의해 화학적으로 개질된 GLP-1 화합물을 의미한다. 또한, 용어 "PEG"는 당업계에 공지된 바와 같은 폴리에틸렌 글리콜 또는 그의 유도체를 의미하는 것으로 의도된다 (예컨대, 미국 특허 5,445,090호; 5,900,461호; 5,932,462호; 6,436,386호; 6,448,369호; 6,437,025호; 6,448,369호; 6,495,659호; 6,515,100호 및 6,514,491호 참조). 바람직하게는, 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물에서, PEG (또는 그의 유도체)는 GLP-1 화합물 중의 2개의 도입된 시스테인 잔기에 공유 부착된다. 바람직하게는, GLP-1 화합물 중의 2개의 도입된 시스테인 잔기는 위치 45 및 46에 존재한다.
"인슐린자극 활성"은 상승된 글루코스 수치에 대한 반응으로 인슐린 분비를 자극함으로써, 세포에 의한 글루코스 흡수 및 혈장 글루코스 수치 감소를 야기하는 능력을 의미한다. 인슐린자극 활성은 GLP-1 수용체 결합 활성 또는 수용체 활성화를 측정하는 생체내 실험 및 시험관내 분석을 비롯한 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 겔판드(Gelfand) 등의 EP 619,322 및 미국 특허 5,120,712호에 각각 기재된 바와 같은 췌장 섬세포 또는 인슐린종 세포를 사용한 분석으로 평가할 수 있다. 인슐린자극 활성은 인슐린 수치 또는 C-펩티드 수치를 측정함으로써 인간에서 일상적으로 측정된다. 본 발명의 목적상, 시험관내 GLP-1 수용체 신호전달 분석을 사용하여 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물이 생체내에서 인슐린자극 활성을 발휘할지의 여부를 결정한다. 인슐린자극 활성은 PEG화된 GLP-1 화합물이 생물학적 활성임을 증명하기 위해 사용할 수 있는 활성이다. 예로 든 모든 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물은 인슐린자극 활성을 갖는다 (실시예 6 참조).
본원에 사용된 "시험관내 효능"은 세포-기준 분석에서 GLP-1 수용체를 활성화시키는 펩티드 능력의 척도이다. 시험관내 효능은 단회 용량-반응 실험에서 50% 활성을 야기하는 화합물의 유효 농도인 "EC50"으로 표현한다. 본 발명의 목적상, 시험관내 효능은 인간 GLP-1 수용체를 안정적으로 발현하는 HEK-293 세포를 사용한 형광 분석을 이용하여 결정한다. 상기 HEK-293 세포는 루시퍼라제 유전자의 발현을 촉진하는 cAMP 반응 요소 (CRE)를 갖는 DNA 벡터를 안정적으로 통합시켰다. GLP-1 화합물 또는 PEG화된 GLP-1 화합물과 수용체의 상호작용은 신호를 개시하며, 이는 cAMP 반응 요소의 활성화 및 그 후의 루시퍼라제 발현을 유발시킨다. 실시예 3에 나열된 PEG화된 GLP-1 화합물에 대한 EC50 값은 상기 기재한 루시퍼라제 분석을 이용하여 결정하였다. 상대적 시험관내 효능 값은 대조군으로서 Val8-GLP-1(7-37)OH 또는 본래의 GLP-1을 사용하고, 대조군을 참고값 100%로 잡아 확립할 수 있다.
용어 "혈장 반감기"는 소실되기 전에 관련 분자의 절반이 혈장에 순환하는 시간을 의미한다. 달리 사용되는 용어는 "제거 반감기"이다. 혈장 반감기 또는 제거 반감기와 관련하여 용어 "연장" 또는 "더욱 긴"은 유사한 조건하에 결정했을 때 참고 분자 (예컨대, 펩티드의 PEG화되지 않은 형태 또는 본래의 펩티드)의 반감기에 비해 PEG화된 GLP-1 화합물의 반감기에서 통계학적으로 유의한 증가가 있음을 나타낸다. 바람직하게는, 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물은 1시간 이상, 더욱 바람직하게는 3, 5, 7, 10, 15, 20시간 이상, 가장 바람직하게는 24시간 이상의 제거 반감기를 갖는다. 실시예 4 및 5에 보고된 반감기는 제거 반감기이며, 이는 최종 로그-선형 제거율에 상응하는 값이다. 당업자는 반감기가 클리어런스 및 분포 부피 모두의 함수로서 변화되는 파생 파라미터임을 인식한다.
클리어런스는 신체의 약물 제거 능력의 척도이다. 예컨대 약물에 대한 개질에 의해 클리어런스가 감소되면, 반감기는 증가되리라고 기대할 수 있다. 그러나, 분포 부피에 변화가 없을 때에만 상기와 같은 역비례 관계가 정확하다. 최종 로그-선형 반감기 (t½), 클리어런스 (C), 및 분포 부피 (V)의 유용한 대략적 관계는 하기 식으로 나타내어진다: t½ ≒ 0.693 (V/C). 클리어런스는 얼마나 많은 약물이 제거되는지를 나타내는 것이 아니라, 제거정도를 설명하기 위해 약물을 전혀 함유하지 않아야 하는 혈액 또는 혈장과 같은 생물학적 유체의 부피를 나타내는 것이다. 클리어런스는 시간 단위 당 부피로서 표현된다. 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물은 200 ml/h/kg 이하, 또는 180, 150, 120, 100, 80, 60 ml/h/kg 이하, 또는 50, 40 또는 20 ml/h/kg 이하의 클리어런스 값을 갖는다 (실시예 4 및 5 참고).
본 발명에서, Cys 아미노산은 GLP-1 화합물의 위치 45 및 46에 편입된다. 생성된 분자는 Cys 아미노산에서 PEG화되어, 개질되지 않은 분자 또는 본래의 분자의 반감기보다 더 긴 반감기를 가지면서 생물학적 활성의 전부 또는 일부를 보유하는 개질된 분자를 생성한다.
본 발명에 사용하기 위한 GLP-1 화합물은 용액상 또는 고체상 펩티드 합성 기술의 표준 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
일단 GLP-1 화합물을 제조하고 정제하면, GLP-1 화합물에 2개의 PEG 분자를 공유적으로 연결시킴으로서 PEG화시킨다. PEG를 펩티드에 공유적으로 접합시키는 다양한 방법들이 선행 문헌에 기재되어 있다 (검토 문헌으로는 [Roberts, M. et al. Advanced Drug Delivery Reviews, 54:459-476, 2002] 참조). 카르복시-말단에서의 펩티드의 PEG화는 전구체로서 재조합 GLP-1 펩티드를 이용하는 효소적 커플링 또는 당업계에 공지되고 기재된 다른 방법을 통해 수행할 수 있다. 예컨대 미국 특허 4,343,898호 또는 문헌 [International Journal of Peptide & Protein Research.43:127-38, 1994]를 참조한다. 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물을 제조하기 위한 한 방법은 PEG를 펩티드의 티올기에 직접적으로 부착하기 위한 PEG-말레이미드의 사용을 포함한다. 티올 관능기의 도입은 상기 기재된 위치의 펩티드 상에 또는 펩티드 내로 Cys 잔기를 부가하거나 삽입함으로써 달성할 수 있다. 티올 관능기가 펩티드의 측쇄에 도입될 수도 있다 (예컨대 티올-함유 산에 의한 리신 ε-아미노기의 아실화). 본 발명의 PEG화 방법은 마이클 부가반응을 사용하여 안정한 티오에테르 연결기를 형성한다. 상기 반응은 매우 특이적이며, 다른 관능기의 존재시에도 온화한 조건하에서 이루어진다. PEG 말레이미드는 익히 정의된 생물활성 PEG-단백질 복합체를 제조하기 위한 반응성 중합체로서 사용되어 왔다. 상기 절차는 반응을 완전하게 하기 위하여 PEG 말레이미드에 비해 몰과량의 티올-함유 GLP-1 화합물을 사용하는 것이 바람직하다. 반응은 바람직하게는 pH 4.0 내지 9.0, 실온에서 1 내지 40시간 동안 수행한다. 여분의 PEG화되지 않은 티올-함유 펩티드는 통상적인 분리 방법에 의해 PEG화된 생성물로부터 쉽게 분리된다. GLP-1 화합물의 PEG화에 요구되는 예시적인 조건은 실시예 1 및 2에 기재되어 있다. 시스테인 PEG화는 PEG 말레이미드 또는 두 갈래로 갈라진(bifurcated) PEG 말레이미드를 이용하여 수행할 수 있다. 바람직한 PEG는 20 킬로달톤의 선형 메톡시 PEG 말레이미드이다.
전형적인 형태로서, PEG는 말단 히드록실기를 갖는 선형 중합체이고, HO-CH2CH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH (여기서 n은 약 8 내지 약 4000임)의 화학식을 갖는다. 말단 수소는 알킬 또는 아릴기와 같은 보호기로 치환될 수 있다. 바람직하게는, PEG는 1개 이상의 히드록시기를 갖고, 더욱 바람직하게는 이는 말단 히드록시기이다. 이는 바람직하게는 활성화되어 펩티드와 반응하는 상기 히드록시기이다. 본 발명에 유용한 PEG의 많은 형태가 존재한다. 수많은 PEG 유도체가 당업계에 존재하며, 본 발명에 사용하기에 적합하다 (예컨대, 미국 특허 5,445,090호; 5,900,461호; 5,932,462호; 6,436,386호; 6,448,369호; 6,437,025호; 6,448,369호; 6,495,659호; 6,515,100호 및 6,514,491호 및 문헌 [Zalipsky, S. Bioconjugate Chem. 6:150-165, 1995] 참조). 본 발명에서 GLP-1 화합물에 공유 부착된 PEG 분자는 특정 유형에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. PEG의 분자량은 바람직하게는 500 내지 100,000 달톤, 더욱 바람직하게는 20,000 내지 60,000 달톤, 가장 바람직하게는 20,000 내지 40,000 달톤이다. PEG는 선형 또는 분지형일 수 있다.
본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물은 본래의 GLP-1 또는 Val8-GLP-1(7-37)OH의 활성의 0.5% 이상인 시험관내 생물학적 활성을 갖는다. 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물은 본래의 GLP-1 또는 Val8-GLP-1(7-37)OH의 활성의 1% 이상인 시험관내 생물학적 활성을 갖는다. 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물은 본래의 GLP-1 또는 Val8-GLP-1(7-37)OH의 활성의 3% 이상인 시험관내 생물학적 활성을 갖는다. 이러한 생물학적 활성은 본원에 기재된 바와 같은 시험관내 효능 분석 (실시예 3) 또는 당업계에 공지된 다른 GLP-1 분석에 의해 결정할 수 있다. 몇몇 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물은 특정 분석으로 측정했을 때 본래의 GLP-1 또는 Val8-GLP-1(7-37)OH의 활성보다 낮은 생물학적 활성을 가질 수 있지만, 상기 활성 감소는 화합물의 연장된 반감기 및/또는 보다 낮은 클리어런스 값으로 보상된다.
PEG화된 GLP-1 화합물의 투여는 숙련된 의사에 의해 효과적이라고 공지되어 있는 임의의 경로를 통해 실시할 수 있다. 말초 장관외법이 이러한 한 방법이다. 장관외 투여는 의학 문헌에 따르면 멸균 시린지 또는 주입 펌프와 같은 몇몇 다른 기계적 장치에 의한 체내로의 투여형인 주사라고 통상적으로 이해된다. 말초 장관외 경로에는 정맥내, 근육내, 피하, 및 복강내 투여 경로가 포함될 수 있다. 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물은 또한 비장관외 경로인 경구, 직장, 비측 또는 하기도 경로에 의해 투여될 수 있다. 이들 비장관외 경로 중에서, 하기도 경로 및 경구 경로가 바람직하다.
본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물을 사용하여 다양한 질환 및 장애를 치료할 수 있다. 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물은 일차적으로 "GLP-1 수용체"라고 언급되는 수용체에서 작용함으로써 생물학적 효과를 나타낸다. 그러므로, GLP-1 수용체 자극 또는 GLP-1 화합물의 투여에 호의적으로 반응하는 질환 및/또는 장애가 있는 대상체는 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물로 치료할 수 있다. 상기 대상체는 "GLP-1 화합물로의 치료가 필요함" 또는 "GLP-1 수용체 자극이 필요함"과 같이 언급된다. 여기에는 인슐린 비의존성 당뇨, 인슐린 의존성 당뇨, 졸중 (WO 00/16797 참조), 심근 경색증 (WO 98/08531 참조), 비만 (WO 98/19698 참조), 수술 후 이화대사 변화 (미국 특허 6,006,753호 참조), 기능성 소화불량 및 과민성 장 증후군 (WO 99/64060 참조)을 가진 대상체가 포함된다. 여기에는 또한 GLP-1 화합물로의 예방적 치료가 요구되는 대상체, 예컨대 인슐린 비의존성 당뇨가 발전될 위험이 있는 대상체 (WO 00/07617 참조)도 포함된다. 당 내성 장애 또는 공복 당 장애를 가진 대상체, 체중이 대상체의 키 및 체형에 대한 정상 체중의 약 25% 초과인 대상체, 부분 췌장절제술을 경험한 대상체, 부모 중 한 명 이상이 인슐린 비의존성 당뇨인 대상체, 임신중 당뇨가 있었던 대상체 및 급성 또는 만성 췌장염을 가졌던 대상체는 인슐린 비의존성 당뇨로 발전될 위험이 있다.
본원에 기재된 PEG화된 GLP-1 화합물의 유효량이란 GLP-1 수용체 자극이 필요한 대상체에게 투여했을 때 허용불가능한 부작용을 일으키지 않으면서 원하는 치료적 및/또는 예방적 효과를 야기하는 양이다. "원하는 치료 효과"에는 1) 질환 또는 장애와 관련된 증상(들)의 완화; 2) 질환 또는 장애와 관련된 증상의 개시(onset) 지연; 3) 치료하지 않았을 때에 비해 증가된 수명; 및 4) 치료하지 않았을 때에 비해 더 우수한 삶의 질 중 하나 이상이 포함된다. 예를 들어, 당뇨 치료를 위한 PEG화된 GLP-1 화합물의 "유효량"이란, 치료하지 않았을 때에 비해 혈당 농도를 더욱 잘 제어함으로써 망막병증, 신경병증 또는 신장 질환과 같은 당뇨성 합병증의 개시를 지연시킬 수 있는 양이다. 당뇨 예방을 위한 PEG화된 GLP-1 화합물의 "유효량"이란, 치료하지 않았을 때에 비해 설포닐 우레아, 티아졸리디네디온, 메트포르민, 인슐린 및/또는 비스구아니딘과 같은 항고혈당 약물로의 치료가 요구되는 혈당 수치 상승의 개시를 지연시킬 수 있는 양이다. 전형적으로, 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물은 혈장 수치가 약 5 피코몰/리터 내지 약 200 피코몰/리터 범위이도록 투여될 것이다. Val8-GLP-1(7-37)OH의 경우 최적 혈장 수치는 30 피코몰/리터 내지 약 200 피코몰/리터인 것으로 결정되었다.
환자의 혈당을 정상화하는 데 유효한 PEG화된 GLP-1 화합물의 투여량은 대상체의 성별, 체중 및 연령, 혈당 조절 불능의 중증도, 투여 경로 및 생체이용률, PEG화된 GLP-1 화합물의 약동학적 프로파일, 효능, 및 제형을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 인자에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물의 경우 전형적인 투여량 범위는 성인의 경우 1일 당 약 0.01 mg 내지 약 1000 mg 범위일 것이다. 바람직하게는, 투여량은 1일 당 약 0.1 mg 내지 약 100 mg, 더욱 바람직하게는 약 1.0 mg/일 내지 약 10 mg/일의 범위이다.
본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물은 매 2주 당 1회 또는 1주 1회로 투여하는 것이 바람직하다. 치료할 질환에 따라서, PEG화된 GLP-1 화합물을 1주 당 2 내지 3회와 같이 더 빈번하게 투여하는 것이 필요할 수 있다.
"대상체"는 포유동물, 바람직하게는 인간이지만, 동물, 예컨대, 반려 동물 (예컨대, 개, 고양이 등), 농장 동물 (예컨대, 소, 양, 돼지, 말 등) 및 실험실 동물 (예컨대, 래트, 마우스, 기니피그 등)일 수도 있다.
본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물을 생성하기 위해 사용되는 펩티드는 용액상 또는 고체상 펩티드 합성 기술의 표준 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 예시되나, 어떠한 방식으로든 이에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1 - GLP-1 관련 유사체의 PEG화:
PEG화 반응을 티오에테르 결합의 형성을 허용하는 조건하에서 수행하였다. 구체적으로, 용액의 pH는 약 4 내지 9의 범위이고, 티올-함유 펩티드 농도는 메톡시-PEG2-MAL 농도의 1 내지 10 몰과량 범위이었다. PEG화 반응은 보통은 실온에서 수행하였다. 이어서, PEG화된 GLP-1 펩티드를 역상 HPLC 이온 교환 크로마토그래피, 또는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 이용하여 단리하였다. PEG화된 GLP-1 유사체를 분석용 RP-HPLC, HPLC-SEC, SDS-PAGE, 및/또는 MALDI 질량 분석법을 이용하여 특성화하였다.
티올-함유 GLP-1 펩티드를 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드 (PEG-말레이미드)와 반응시켜 PEG가 티오에테르 결합을 통해 공유 부착된 유도체를 생성하였다. 예를 들어, 길이 46aa인 GLP-1 화합물 7.5 mg, 1.8 μmol을 20 mM EDTA를 함유하는 200 mM 인산염 완충액 (pH 7.4) 2 ml 중에 용해시켰다. 이어서, 용액을 아르곤으로 퍼징하였다. 상기 용액에 메톡시-PEG-MAL 40 mg, 선형 또는 두 갈래로 갈라진 PEG 말레이미드 (쉬어워터 폴리머스, 인크. 알라바마 헌츠빌 소재) (PEG 대 펩티드 0.55:1 몰/몰 비)를 첨가하였다. 반응을 2시간 동안 수행하였다. 이어서, PEG화된 펩티드 25 mg을 RP-HPLC로 정제하고, 크기 배제 HPLC로 특성화하고, 시험관내 활성에 대해 시험하였다.
실시예 2 - GLP 유사체와의 2X20kDa-PEG-말레이미드 반응
GLP-1 유사체를 말레이미드-활성화 선형 20 kDa mPEG (노프, 인크.(NOF, Inc.))를 이용하여 도입된 시스테인 잔기에서 선택적으로 PEG화시켰다. PEG화 반응의 경우, PEG화될 펩티드를 10 mM EDTA를 함유하는 100 mM NH4Ac 완충액 (pH 6.8)에 용해시키고, 벌크 20 kDa-mPEG 1.25배 몰과량을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1 내지 4시간 동안 교반하고, SP-세파로즈(Sepharose) 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 유리 PEG 및 유리 펩티드로부터 PEG화된 화합물을 분리시켰다. 복합체를 RP-HPLC로 탈염화하고, 동결건조하였다.
실시예 3 - 시험관내 활성 분석
CRE-루시퍼라제 시스템을 이용하여 인간 GLP-1 수용체를 안정적으로 발현하는 HEK-293 세포를 저혈청 DMEM F12 매질 80 ㎕ 당 웰 당 30,000개 세포로 96웰 플레이트로 시딩하였다. 시딩 다음날, 0.5% BSA에 용해된 시험 단백질 20 ㎕ 분취액을 혼합하고, 5시간 동안 상기 세포와 함께 인큐베이션하였다. 일반적으로 시험 GLP-1 화합물을 위해 0.001 nM 내지 10 nM을 함유하는 10개의 희석물을 제조하고, Val8-GLP-1(7-37)OH 표준을 위해 0.0003 nM 및 3 nM을 함유하는 것을 제조한 후, 세포로 첨가하여 용량 반응 곡선을 생성하고, 이로부터 EC50 값을 결정하였다. 인큐베이션 후, 루시퍼라제 시약 100 ㎕를 각 플레이트로 직접 첨가하고, 2분 동안 온화하게 혼합하였다. 플레이트를 트리-럭스(Tri-lux) 발광분석기에 두고, 루시퍼라제 발현으로 인한 빛 생산을 계산하였다. Xaa8이 Val이고; Xaa22가 Glu이고; Xaa33이 Ile이고; Xaa46이 Cys-NH2인 화학식 I의 PEG화된 GLP-1 화합물에 대한 평균 EC50 값은 0.36±0.04 nM이었다.
실시예 4 - 유도체화된 GLP-1 펩티드의 약동학적 분석
Xaa8이 Val이고; Xaa22가 Glu이고; Xaa33이 Ile이고; Xaa46이 Cys-NH2인 화학식 I의 PEG화된 GLP-1 화합물을 수컷 SD 래트에 0.1 mg/kg의 투여량으로 정맥내 (IV) 또는 피하 (SC) 경로로 투여하였다. 동물 (군 당 3마리 래트)을 투여 후 0 내지 192시간의 다양한 시간에서 출혈시켰다. 각 샘플로부터 혈장을 수집하고, N-말단 특이적 방사선면역분석으로 분석하였다. 약동학적 파라미터를 모델-비의존성 방법 (WinNonlin Pro)을 이용하여 계산하였다. IV 투여에 의한 경우 PEG화된 GLP-1 유사체는 대략 1.2일의 제거 반감기를 가진 반면, SC 투여에 의한 경우 PEG화된 GLP-1 유사체는 대략 1.1일의 제거 반감기를 가졌다. 반대의 임상적 관찰이 없었던 것은 0.1 mg/kg의 IV 또는 SC 투여와 관련이 있었다. 상기 화합물에 대해 연장된 제거 반감기, 느린 클리어런스 및 피하 생체이용률 (대략 30%)이 관찰되었다. 대표적 데이타를 표 1에 나타낸다.
수컷 SD 래트에 0.1 mg/kg을 정맥내 또는 피하 투여한 후의, Xaa8이 Val이고; Xaa22가 Glu이고; Xaa33이 Ile이고; Xaa46이 Cys-NH2인 화학식 I의 PEG화된 GLP-1 화합물에 대한 평균 (±SD) PK 파라미터 값.
경로 Cmax a
(ng/mL)		 Tmax b
(시간)		 AUC0-최종 c
(ng*h/mL)		 t1/2 d
(시간)		 CL/Fe
(mL/h/kg)		 Vss/Ff
(mL/kg)
IV 2020
(235)		 0.08
(0.00)		 52292
(4546)		 25.8
(2.2)		 1.9
(0.2)		 54
(2.5)
SC
(SD)		 191
(31)		 24.0
(0.0)		 15423
(2821)		 28.3
(0.8)		 6.5
(1.2)		 268
(56)
a 관찰된 최대 혈장 농도.
b 관찰된 최대 혈장 농도의 시간.
c 0에서 최종 시점까지 혈장 농도-시간 곡선하 면적.
d 제거 반감기.
e 생체이용률의 함수로서 총 신체 클리어런스.
f 생체이용률의 함수로서 정상 상태 분포 부피.
Val8-GLP(7-37)OH를 피셔(Fischer) 344 래트에 10 ㎍/kg의 투여량으로 유사하게 IV 투여하였을 때, 하기 나열한 바와 같이 매우 상이한 클리어런스 및 제거 반감기 값이 수득되었다.
클리어런스: 1449 ml/시간/kg
t1/2 (시간): 0.05
실시예 5 - 유도체화된 GLP-1 펩티드의 약동학적 분석
Xaa8이 Val이고; Xaa22가 Glu이고; Xaa33이 Ile이고; Xaa46이 Cys-NH2인 화학식 I의 PEG화된 GLP-1 화합물을 수컷 필리핀 원숭이(cynomolgus monkey)에 0.01 mg/kg의 투여량으로 피하 (SC) 경로로 투여하였다. 상기 동물을 투여 후 0 내지 168시간의 다양한 시간에서 출혈시켰다. 약동학적 파라미터를 모델-비의존성 방법 (WinNonlin Pro)을 이용하여 계산하였다. 대표적 데이타를 표 2에 나타낸다.
수컷 필리핀 원숭이에 0.01 mg/kg을 피하 투여한 후의, Xaa8이 Val이고; Xaa22가 Glu이고; Xaa33이 Ile이고; Xaa46이 Cys-NH2인 화학식 I의 PEG화된 GLP-1 화합물에 대한 평균 (±SD) PK 파라미터 값.
동물 # Cmax a
(ng/mL)		 Tmax b
(시간)		 AUC0-최종 c
(ng*h/mL)		 t1/2 d
(시간)		 CL/Fe
(mL/h/kg)		 Vss/Ff
(mL/kg)
평균
SD		 69.49
17.07		 48
0		 7464.78
1612.03		 75.69
11.67		 1.06
0.26		 117.15
44.89
약어: SD = 표준 편차
a 관찰된 최대 혈장 농도.
b 관찰된 최대 혈장 농도의 시간.
c 0에서 최종 시점까지 혈장 농도-시간 곡선하 면적.
d 제거 반감기 추정치.
e 생체이용률의 함수로서 총 신체 클리어런스.
f 생체이용률의 함수로서 정상 상태 분포 부피.
실시예 6 - 유도체화된 GLP-1 펩티드의 약력학적 분석
Xaa8이 Val이고; Xaa22가 Glu이고; Xaa33이 Ile이고; Xaa46이 Cys-NH2인 화학식 I의 PEG화된 GLP-1 화합물을 수컷 필리핀 원숭이에 0.01 mg/kg의 투여량으로 피하 (SC) 경로로 투여하였다. 비히클 대조군 (인산염 완충화된 염수)의 SC 투여 직후 및 0.01 mg/kg PEG화된 GLP-1 유사체의 SC 투여 후 1, 5, 및 7일에 단차(stepped) 정맥내 글루코스 주입을 수행하였다. 16시간 금식 후 진정된 원숭이에서 단차 정맥내 글루코스 주입 절차를 수행하였다. 글루코스 주입 시작 10분 전 및 글루코스 주입 시작 직전에 혈액 샘플을 배출시켜 기저치를 정의하였다. 이어서, 글루코스 (20% 덱스트로스)의 단차 주입을 20분 동안 10 mg/kg/분의 속도로 개시한 후, 추가의 20분 동안 25 mg/kg/분 주입을 수행하였다. 혈액 샘플을 주입 기간 내내 10분 간격으로 취하였다. 인슐린 수치를 면역분석으로 결정하였다. 0.01 mg/kg PEG화된 GLP-1 유사체의 단일 SC 주사 후 7일 이상 동안 인슐린자극 활성 (플라시보에 대한 값; p<0.0001)을 증명하였다. 대표적 데이타를 표 3에 나타낸다.
수컷 필리핀 원숭이에 0.01 mg/kg을 피하 투여한 후의, Xaa8이 Val이고; Xaa22가 Glu이고; Xaa33이 Ile이고; Xaa46이 Cys-NH2인 화학식 I의 PEG화된 GLP-1 화합물에 대한 평균 (±SD) PK 파라미터 값.
인슐린 AUC
군 AUC최종 (pM*분)
비히클 평균 14983
SD 5789
SE 2363
1일 평균 30862
SD 10770
SE 4397
5일 평균 27203
SD 6507
SE 2657
7일 평균 28542
SD 7685
SE 3137
SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> GLP-1 Pegylated Compounds <130> X-17063 <160> 1 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Ser, or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Ala is D-isomer <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 is Gly, Glue, Asp, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa at position 27 is Val or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa at position 40 is Cys or Cys-NH2 <400> 1 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Xaa Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys Xaa 35 40

Claims (13)

  1. 하기 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 디-PEG화된 GLP-1 화합물.
    <화학식 I>
    His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys45-Xaa46 (서열 1)
    상기 식에서,
    Xaa8은 D-Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Ser, 또는 Thr이고;
    Xaa22는 Gly, Glu, Asp, 또는 Lys이고;
    Xaa33은 Val 또는 Ile이고;
    Xaa46은 Cys 또는 Cys-NH2이며;
    1개의 PEG 분자가 Cys45에 공유 부착되고, 1개의 PEG 분자가 Cys46 또는 Cys46-NH2에 공유 부착된다.
  2. 제1항에 있어서, Xaa8이 Gly 또는 Val이고, Xaa22가 Gly 또는 Glu인 디-PEG화된 GLP-1 화합물.
  3. 제2항에 있어서, Xaa8이 Val이고, Xaa22가 Glu인 디-PEG화된 GLP-1 화합물.
  4. 제3항에 있어서, Xaa8이 Val이고, Xaa22가 Glu이고, Xaa33이 Ile이고, Xaa46이 Cys-NH2인 디-PEG화된 GLP-1 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 PEG 분자가 약 5,000 내지 약 40,000 달톤의 분자량을 갖는 것인 디-PEG화된 GLP-1 화합물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 PEG 분자가 약 20,000 내지 약 60,000 달톤의 분자량을 갖는 것인 디-PEG화된 GLP-1 화합물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 PEG 분자가 약 20,000 내지 약 40,000 달톤의 분자량을 갖는 것인 디-PEG화된 GLP-1 화합물.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 PEG 분자가 20,000 달톤의 분자량을 갖는 것인 디-PEG화된 GLP-1 화합물.
  9. 제7항에 있어서, 각각의 PEG 분자가 선형 메톡시 PEG 말레이미드인 디-PEG화된 GLP-1 화합물.
  10. 제8항에 있어서, 각각의 PEG 분자가 선형 메톡시 PEG 말레이미드인 디-PEG화된 GLP-1 화합물.
  11. 제1항의 디-PEG화된 GLP-1 화합물을 포함하는, 인슐린 비의존성 당뇨 또는 비만의 치료용 의약.
  12. 제9항의 디-PEG화된 GLP-1 화합물을 포함하는, 인슐린 비의존성 당뇨 또는 비만의 치료용 의약.
  13. 제10항의 디-PEG화된 GLP-1 화합물을 포함하는, 인슐린 비의존성 당뇨 또는 비만의 치료용 의약.
KR1020077026259A 2005-05-13 2006-05-11 Ｐｅｇ화된 ｇｌｐ-1 화합물 KR101011081B1 (ko)

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