KR101972617B1 - 글루카곤/glp-1 수용체 공동-항진제들 - Google Patents

글루카곤/glp-1 수용체 공동-항진제들 Download PDF

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Abstract

고유의 글루카곤과 비교하여 GLP-1 수용체에서 강화된 활성을 나타내는 펩티드 및 변이 펩티드를 제공한다.

Description

글루카곤/GLP-1 수용체 공동-항진제들{GLUCAGON/GLP-1 RECEPTOR CO-AGONISTS}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2012년 6월 22일자로 제출된 미국 가출원 번호 61/500,027 및 2012년 10월 14일자로 제출된 미국 가출원 번호 61/547,360를 우선권으로 주장하며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
전자적으로 제출되는 재료의 참고자료 통합
다음에 컴퓨터-판독가능한 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록은 전체가 참고자료에 통합된 것으로 동시에 제출하며, 이는 다음과 같다: 2012년 5월 25일자로 만들어진 15kilobyte ACII (Text)"07012KL_PCT_Sequence_Listing.txt"
배경
프레-프로글루카곤은 포도당 항성성, 인슐린 분비, 위 비움(emptying), 및 장의 성장을 포함하는 다양한 생리학적 기능, 뿐만 아니라 음식 섭취의 조절에 관련된 글루카곤, 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1), 글루카곤-유사 펩티드-2 (GLP-2) 및 옥신토모둘린 (OXM)을 포함하는, 글루카곤, 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1), 글루카곤-유사 펩티드-2 (GLP-2) 및 옥신토모둘린 (OXM) 글루카곤을 포함하는 다수의 상이한 프로글루카곤-유도된 펩티드의 형성을 위하여 상이한 조직에서 진행되는 158개 아미노산 전구물질 폴리펩티드이다. 글루카곤은 프레-프로글루카곤의 아미노산 33 내지 61에 대응하는 29개 아미노산 펩티드이며, 한편 GLP-1은 프레-프로글루카곤의 아미노산 72 내지 108에 대응하는 37개 아미노산으로 생산된다. GLP-1(7-36) 아미드 또는 GLP-1(7-37) 산은 GLP-1의 생물학적으로 우세한 형태이며, 이는 GLP-1 수용체에서 필수적으로 등가 활성을 설명한다.
혈당감소증 동안, 혈당 수준이 정상 아래로 떨어지면, 글루카곤은 간에게 글리코겐을 분해해서 포도당을 방출하라는 신호를 보내고, 이로써, 혈당 수준은 정상 수준으로 상승되게 된다. 혈당감소증은 당뇨병으로 인하여 고혈당증 (상승된 혈당 수준) 환자들에서 인슐린 요법의 공통적인 부작용이다. 따라서, 포도당 조절에서 글루카곤의 가장 인지된 역할은 인슐린 작용에 대항하고, 혈당 수준을 유지시키는 것이다.
GLP-1은 글루카곤과 비교되는 상이한 생물학적 활성을 유도한다. 이의 작용은 인슐린 합성 및 분비의 자극, 글루카곤 분비의 억제, 및 음식 섭취의 억제를 포함한다. GLP-1은 당뇨병에서 고혈당증을 감소시키는 것으로 나타났다. GLP-1와 약 50% 아미노산 동일성을 공유하는 도마뱀 독의 펩티드인 Exendin-4는 GLP-1 수용체를 활성화시키고, 유사하게 당뇨병에서 고혈당증을 감소시키는 것으로 나타났다.
GLP-1 및 exendin-4는 당뇨병에 유익할 것이며, 또한 비만 환자에게도 유익한 효과인 음식 섭취를 감소시키고, 체중 감소를 촉진시키는 것으로 또한 증명되었다. 비만 환자는 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 심혈관 질환, 및 근골격 질환의 위험이 더 높다.
요약
본 개시내용은 글루카곤 수용체에서 활성을 나타내고, GLP-1 수용체에서 활성을 나타내고, 또는 글루카곤 수용체 및 GLP-1 수용체 각각에서 활성을 나타내는 펩티드 및 변이 펩티드를 제공한다. 예시적인 구체예들에서, 현재 공개된 펩티드 및 변이 펩티드는 고유의 글루카곤과 비교하였을 때, GLP-1 수용체에서 강화된 활성을 나타낸다. 예시적인 측면에서, 펩티드 및 변이 펩티드는 GIP 수용체에 비교하여 인간 GLP-1 수용체에 대해 최소한 100-배 선택성을 나타낸다.
본 개시내용은 이종구조의 모이어티에 접합된 본 명세서에서 기술된 임의의 펩티드 및 변이 펩티드를 포함하는 접합체(conjugates)를 더 제공한다. 예시적인 측면에서, 이종구조의 모이어티는 펩티드 또는 단백질이며, 접합체는 융합 펩티드 또는 키메라 펩티드이다. 예시적인 측면에서, 이종구조의 모이어티는 폴리머, 이를 테면, 폴리에틸렌 글리콜이다. 본 개시내용은 본 명세서에서 기술된 임의의 펩티드 및 변이 펩티드를 포함하는 이합체 및 다중합체를 더 제공한다.
본 개시내용은 본 명세서에서 기술된 임의의 펩티드 및 변이 펩티드 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제약학적 조성물, 뿐만 아니라 환자의 질환 또는 의학적 상태 (이를 테면, 대사 증후군, 당뇨병, 비만, 간 지방증, 신경퇴행성 질환, 혈당감소증)을 치료 또는 예방하는 방법을 더 제공한다. 이 방법은 이 질환 또는 의학적 상태를 치료하는데 효과량으로, 제약학적 조성물로 선택적으로 제형화된 현재 공개된 펩티드 또는 펩티드 변이체를 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
도 1은 비이클 대조군 또는 서열 번호: 12, 17, 18, 또는 19의 펩티드의 용량으로 처리된 DIO 마우스의 점증적 체중 변화 (grams)의 그래프를 나타내며, 이는 실시예 7에서 상세하게 설명된다.
도 2는 비이클 대조군 또는 서열 번호: 12, 17, 18, 또는 19의 펩티드의 용량으로 처리된 DIO 마우스의 기저(basal) 포도당 (mg/dl)의 그래프를 나타내는데, 이는 실시예 7에서 상세하게 설명된다.
도 3A는 비이클 대조군, Liraglutide (Lira), 또는 서열 번호: 17 또는 20의 펩티드의 용량으로 처리된 비만 레소스 원숭이의 점증적 체중 변화 (%)를 나타내는데, 이는 실시예 8에서 상세하게 설명된다.
도 3B는 비이클 대조군, Liraglutide, 또는 서열 번호: 17 또는 20의 펩티드의 용량으로 처리된 비만 레소스 원숭이의 점증적 음식 섭취(0일 시점에서 음식 섭취의 비율로 나타냄)의 그래프를 나타내는데, 이는 실시예 8에서 상세하게 설명된다.
도 4는 비이클 대조군 또는 서열 번호: 17의 펩티드 용량으로 처리된 당뇨병성 레소스 원숭이의 혈당 수준 (mg/dL)의 그래프를 나타내는데, 이는 실시예 9에서 상세하게 설명된다.
정의
여기에서 사용된 것과 같이, "약(about)"은 언급된 값 또는 값의 범위를 약 10%이상 또는 그 미만도 포함하나, 임의의 값 또는 값의 범위를 광범위한 정의로만 나타내려는 의도는 아니다. "약"이 붙은 각 값 또는 값의 범위에는 언급된 절대치 또는 값의 범위의 구체예를 포함한다.
여기에서 사용된 것과 같이, "제약학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 표준적인 제약학적 담체중 임의의 것을 포함하는데, 예를 들면, 인산염 완충된 염 용액, 물, 오일/물 또는 물/오일 에멸젼과 같은 에멸젼 및 다양한 타입의 습윤제 등이 포함된다. 이 용어에는 또한, 미국 정부의 규제관청에서 승인한 임의의 물질 또는 인간을 포함하는 동물에 사용하기 위한 US 약전에 열거된 임의의 물질도 포함된다.
여기에서 사용된 것과 같이, "제약학적으로 허용가능한 염"은 모 화합물의 생물학적 활성을 보유하나, 생물학적이지 않은 화합물의 염을 지칭하고, 그렇지 않으면 바람직하지 않다. 여기에서 설명되는 화합물들 중 많은 것들은 아미노 및/또는 카르복실기 또는 이에 유사한 기의 존재에 의해 산 및/또는 염기성 염을 형성할 수 있다.
제약학적으로 허용가능한 염기 첨가 염은 무기 및 유기 염기로부터 제조될 수 있다. 무기 염기로부터 유도된 염에는 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘 및 마그네슘 염이 포함된다. 유기 염기로부터 유도된 염에는 1차, 2차 및 3차 아민이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
여기에서 사용된 것과 같이, "치료하는(treating)"은 특정 질환 또는 장애의 예방, 또는 특정 질환 또는 장애와 연관된 증상의 완화 및/또는 이와 같은 증상의 방지 또는 제거를 포함한다. 예를 들면, 여기에서 사용된 것과 같이, "당뇨병의 치료"은 일반적으로 정상적인 수준으로 혈당 수준을 변경시키는 것을 말하며, 주어진 상황에 따라 혈당 수준의 증가 또는 감수시키는 것을 포함할 수도 있다.
여기에서 사용된 것과 같이, 글루카곤 펩티드의 "유효량(effective amount)" 또는 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"은 원하는 효과를 제공하기 위한 펩티드의 비독성이면서 충분한 양을 말한다. 예를 들면, 하나의 바람직한 효과는 예를 들면, 혈당 수준이 정상 수준에 근접하도록 혈당 수준 변화로 측정되거나, 또는 체중 감소의 유도/체중 증가 예방이 포함되는데, 예를 들면, 체중의 감소 또는 체중 증가의 예방 또는 감소에 의해 측정되거나 체지방 분포의 정상화로 측정되는 것과 같이, 고혈당증의 치료 또는 예방이 될 것이다. "유효량(effective)"은 개체의 나이, 전반적인 상태, 투여 방법 및 이와 유사한 것들에 따라 개체마다 달라질 것이다. 따라서, 정확한 "유효량"을 명시하는 것이 항상 가능한 것은 아니다. 그러나, 임의 개인의 경우 적절한 "유효량"은 통상적인 실험을 통하여 본 발명 분야의 숙지된 기술을 가진 자가 결정할 수 있을 것이다.
"장관외(parenteral)"란 소화관이 아닌 피하, 근육내, 척수내 또는 정맥과 같은 일부 다른 경로를 통한다는 것을 의미한다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "펩티드"는 2가지 이상의 아미노산 서열, 일반적으로 50개 미만의 아미노산으로 구성된 서열이 포함되는데, 이때, 아미노산은 자연적으로 생성되는 또는 코드화된 또는 자연적으로 생성되지 않는 또는 비-코드화된 아미노산이다. 자연적으로 생성되지 않는 아미노산은 in vivo에서는 자연적으로 생성되지 않는 아미노산을 말하는데, 그럼에도 불구하고, 여기에서 설명되는 펩티드 구조에 통합될 수 있다. 여기에서 이용된"비-코드화된"은 다음의 20개 아미노산중 임의의 L-이성체가 아닌 아니노산을 말한다: Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr. 여기에서 사용된 것과 같이,"코드화된(Coded)"은 다음 20개 아미노산중 임의의 L-이성체인 아미노산을 언급한다: Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr. 일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 펩티드 및 변이 펩티드는 서열 번호: 1 (길이가 29개의 아미노산)와 대략 동일한 길이를 가진다, 이를 테면 길이가 25-35개의 아미노산이다. 예시적인 길이는 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 아미노산 길이다.
일반적으로, 폴리펩티드 및 단백질은 "펩티드" 길이보다는 큰 중합체 길이를 가진다.
출원을 통하여, 숫자를 통하여(가령, 위치 28) 특정 아미노산에 대한 모든 언급은 고유 글루카곤 (서열 번호: 1)에서 그 위치의 아미노산 또는 이의 임의의 유사체의 대응하는 아미노산 위치를 말한다. 예를 들면, "위치 28" 이란 서열 번호: 1의 제 1 아미노산이 결손된 글루카곤 유사체의 경우 대응하는 위치 27을 의미한다. 유사하게, "위치 28"은 서열 번호: 1의 N 말단에 한 개 아미노산이 첨가된 글루카곤 유사체의 경우에는 대응하는 위치 29를 의미할 것이다. 여기에서 사용된 것과 같이, "아미노산 변형(modification)"은 (i) 서열 번호: 1 의 아미노산을 상이한 아미노산 (자연적으로-발생되는 또는 코드화된 또는 비-코드화된 또는 비-자연적으로-발생되는 아미노산)으로 치환 또는 대체, (ii) 서열 번호: 1에 아미노산 (자연적으로-발생되는 또는 코드화된 또는 비-코드화된 또는 비-자연적으로-발생되는 아미노산)의 추가 또는 (iii) 서열 번호: 1의 하나 이상의 아미노산 결손을 말한다.
2개 아미노산 서열에 있어서 "동일성 비율(Percent identity)"은 두 서열이 최대 대응을 얻도록 배열된 경우(이를 테면, 최적의 배열을 위하여 갭이 도입될 수 있음), 제 2 참조 서열의 아미노산에 정합(동일)되는 제 1 서열의 수를 기준 서열의 길이로 나눈 것을 말한다.
아미노산 "변형(modification)"은 하나의 아미노산이 또다른 아미노산으로 대체되는 것을 의미한다. 일부 구체예들에서, 아미노산 치환 또는 대체는 보전적 아미노산 치환, 가령, 하나 이상의 위치 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 또는 29에서 아미노산의 보존적 치환이다. 여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "보전적(conservative) 아미노산 치환"은 하나의 아미노산을 가령, 크기, 전하, 소수성, 친수성, 및/또는 방향족성과 같은 유사한 성질을 가진 또다른 아미노산으로 대체하는 것으로, 다음의 5가지 기 중에서 하나 안에서 교환된 것이다:
I. 작은 지방족, 비극성 또는 약간 극성 잔기:
Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;
II. 극성, 음 전하를 띈 잔기 및 이들의 아미드 및 에스테르:
Asp, Asn, Glu, Gln, 시스테인산 및 호모시스테인산;
III. 극성, 양 전하를 띈 잔기:
His, Arg, Lys; 오르니틴 (Orn)
IV. 큰, 지방족, 비극성 잔기:
Met, Leu, He, Val, Cys, 노르루이신 (Nle), 호모시스테인
V. 큰, 방향족 잔기:
Phe, Tyr, Trp, 아세틸 페닐알라닌
일부 구체예들에서, 아미노산 치환은 보전적 아미노산 치환이 아니며, 가령, 비-보전적 아미노산 치환이다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "전하를 띈 아미노산" 또는 "전하를 띈 잔기"는 생리학적 pH의 수용액에서 음전하를 띈(가령, 양성자를 제거한) 또는 양전하를 띈(가령, 양성자를 얻은) 측쇄를 포함하는 아미노산을 말한다. 예를 들면 음전하를 띈 아미노산들은 아스파르트산, 글루타민산, 시스테인산, 호모시스테인산, 그리고 호모글루타민산을 포함하며, 양전하를 띈 아미노산들은 아르기닌, 리신 및 히스트딘을 포함한다. 하전된 아미노산들은 20 개의 코드화된 아미노산들 가운데 하전된 아미노산들 뿐만 아니라, 비전형적 또는 비-자연적으로 생성되는 또는 비-코드화된 아미노산을 포함한다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "산성 아미노산"은 제 2 산성 모이어티 (아미노산의 카르복시산 이외에), 예를 들면, 측쇄 카르복시산 또는 술폰산 기를 포함하는 아미노산을 말한다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "아실화된 아미노산"은 생산되는 수단에 관계없이(이를 테면 이 아미노산이 펩티드에 통합되기에 앞서 아실화, 또는 펩티드로 통합된 후에 아실화) 자연적으로 생성되는 아미노산에 비-고유한 아실 기를 포함하는 아미노산을 지칭한다.
여기에서 사용된 것과 같이 용어 "알킬화된 아미노산"은 생산되는 수단에 관계없이, 자연적으로 생성되는 아미노산에 비-고유한 알킬 기를 포함하는 아미노산을 지칭한다. 따라서, 본 개시내용의 아실화된 아미노산 및 알킬화된 아미노산은 코드화안된(non-coded) 아미노산이다.
여기에서 사용된 것과 같이, 제 2 수용체와 비교하여 제 1 수용체에 대한 분자의 "선택성"은 다음의 역(inverse) 비율을 말한다: 제2 수용체에서 분자의 EC50을 제 1 수용체에서 분자의 EC50으로 나눈다. 예를 들면, 제 1 수용체에서 1nM의 EC50을 가지고, 제 2 수용체에서 100nM의 EC50을 가진 분자는 제 2 수용체에 비교하여 제 1 수용체에 대하여 100-배 선택성을 가진다.
여기에서 사용된 것과 같이, 분자의 "글루카곤 효능" 또는 "고유 글루카곤과 비교한 효능"은 글루카곤 수용체에서 분자의 EC50을 글루카곤 수용체에서 고유 글루카곤의 EC50으로 나눈 역(inverse) 비율을 말한다.
여기에서 사용된 것과 같이, 분자의 "GLP-1 효능" 또는 "고유 GLP-1과 비교한 효능"은 GLP-1 수용체에서 분자의 EC50을 GLP-1 수용체에서 고유 GLP-1의 EC50으로 나눈 비율을 말한다.
구체예들
본 개시내용은 GLP-1 수용체에서 활성을 나타내고, 글루카곤 수용체에서 활성을 나타내고, 또는 GLP-1 수용체 및 글루카곤 수용체 모두에서 활성을 나타내는 펩티드 및 변이 펩티드를 제공한다. 이점에 있어서, 본 개시내용은 GLP-1 수용체 항진제 펩티드, 글루카곤 수용체 항진제 펩티드, 및 GLP-1/글루카곤 수용체 공동-항진제 펩티드를 제공한다. 예시적인 구체예들에서, 현재 공개된 펩티드 및 변이 펩티드는 고유의 인간 글루카곤 (서열 번호: 1)과 비교하였을 때, GLP-1 수용체에서 강화된 활성 또는 더 큰 효능을 나타낸다. 예시적인 구체예들에서, 본 개시내용의 펩티드 및 변이 펩티드는 고유의 인간 GLP-1 (서열 번호: 2) 또는 이의 활성형태중 하나(서열 번호: 5 및 6)와 비교하였을 때, GLP-1 수용체에서 더 큰 효능을 나타낸다. 예시적인 구체예들에서, 펩티드 및 변이 펩티드는 고유의 인간 GLP-1와 비교하였을 때, 글루카곤 수용체에서 더 큰 효능을 나타낸다. 예시적인 구체예들에서, 펩티드 및 변이 펩티드는 고유의 인간 글루카곤과 비교하였을 때, 글루카곤 수용체에서 더 큰 효능을 나타낸다.
예시적인 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 펩티드 및 변이 펩티드는 고유의 글루카곤 또는 고유의 GLP-1과 비교하여 성질의 기타 개선점을 나타내는데, 이를 테면, 더 큰 안정성, 더 큰 용해성, 순환계에서 연장된 반감기, 작용의 지연된 개시, 작용의 연장된 지속기간, 둔화된 절정 (이를 테면, 상대적으로 감소된 평균 절정 혈장 농도), 및 DPP-IV와 같은 프로테아제에 개선된 저항성을 나타낸다.
본 명세서에서 설명된 펩티드 및 변이 펩티드는 고유의 인간 글루카곤 (서열 번호: 1)의 아미노산 서열에 기초되며, "펩티드", "변이 펩티드","글루카곤 유사체", "유사체", 또는 "글루카곤 펩티드"로 기술된다. "유사체" 또는 "변이체" 또는 "변형"과 같은 용어들은 새로 합성된 펩티드 또는 단백질을 포괄하고, 임의의 특정 변형 단계의 실행을 요구하지 않는 것으로 이해된다. 일부 측면에서, 본 명세서에서 설명된 펩티드 및 변이 펩티드는 서열 번호: 1에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개의 아미노산 변형을 포함하는 서열 번호:1의 변형된 아미노산 서열을 포함하고, 일부 경우들에서, 본 명세서에서 더 설명되는 것과 같이 16개 또는 그 이상 (이를 테면, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26개) 아미노산 변형을 포함한다. 글루카곤 유사체 및/또는 글루카곤 펩티드의 다음의 설명은 따라서 고유의 인간 글루카곤 (서열 번호: 1)과 본 개시 내용의 펩티드 또는 변이 펩티드 사이에 유사성 수준과 무관하게, 현재 공개된 임의의 펩티드 및 변이 펩티드에 적용된다.
본 명세서에서 기술된 임의의 펩티드 서열은 추가적인 아미노산 변형이 통합됨으로써 더 다양해질 수 있는데; 예를 들면, 본 명세서에서 기술된 임의의 변형, 이를 테면, 본 명세서에서 기술된 위치에서, 또는 보존적 치환들의 통합에 의해, 또는 해당 위치에서 고유의 글루카곤 아미노산 (서열 번호: 1 참고)으로 복귀함으로써 변형됨으로써 더 다양해질 수 있는 것도 고려된다. 예시적인 구체예들에서, 이런 변형은 이를 테면, 아실화, 알킬화, 페길화, C-말단에서 절두(truncation), 위치 1, 2, 3, 7, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 27, 28, 및 29중 하나 또는 그 이상에서 아미노산의 치환을 포함한다. 예를 들면, 본 명세서에서 공개된 임의의 펩티드 서열이 페길화를 목적으로 Cys를 포함하는 경우, 변이 펩티드는 페길화를 위하여 상이한 아미노산을 이용할 수 있다. 또다른 예로써, 변이 펩티드는 상이한 위치 (이를 테면, 기존의 Cys를 상이한 아미노산으로 대체, 제안된 페길화 위치에 새로운 Cys 삽입, 및 새로운 Cys를 페길화)에서 페길화될 수 있다. 추가 실시예에서, 본 명세서에서 공개된 임의의 펩티드가 아실화를 목적으로 Lys를 포함하는 경우, Lys는 상이한 위치로 이동될 수 있고, 새로운 위치가 아실화된다. 본 명세서에서 설명된 임의의 구체예들에서, 변이 펩티드는 부모 펩티드 길이에 걸쳐 또는 부모 펩티드의 아미노산 1-29에 걸쳐, 부모 펩티드에 대해 예를 들면, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일할 수 있다(이를 테면, 부모 펩티드와 비교하여, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 추가적인 변형이 통합될 수 있다).
본 명세서에서 공개된 임의의 펩티드의 접합체, 융합 단백질 및 다중합체 또한 고려된다.
펩티드 및 변이 펩티드의 활성
글루카곤 수용체에서 항진 활성
예시적인 구체예들에서, 본 개시내용의 펩티드 및 변이 펩티드는 글루카곤 수용체에서 약 1000 μM 또는 미만 (이를 테면, 약 750 μM 또는 미만, 약 500 μM 또는 미만, 약 250 μM 또는 미만, 약 100 μM 또는 미만, 약 75 μM 또는 미만, 약 50 μM 또는 미만, 약 25 μM 또는 미만, 약 10 μM 또는 미만, 약 5 μM 또는 미만, 또는 약 1 μM 또는 미만)의 EC50 활성을 나타낸다. 예시적인 구체예들에서, 펩티드 및 변이 펩티드는 글루카곤 수용체 활성화에 대해 나노몰 범위의 EC50을 나타낸다. 예를 들면, 현재 공개된 펩티드 및 변이 펩티드는 글루카곤 수용체에서 EC50을 나타내는데, 이는 약 1000 nM 또는 미만 (이를 테면, 약 750 nM 또는 미만, 약 500 nM 또는 미만, 약 250 nM 또는 미만, 약 100 nM 또는 미만, 약 75 nM 또는 미만, 약 50 nM 또는 미만, 약 25 nM 또는 미만, 약 10 nM 또는 미만, 약 5 nM 또는 미만, 또는 약 1 nM 또는 미만)이다. 예시적인 구체예들에서, 펩티드 및 변이 펩티드는 글루카곤 수용체에서 피코몰 범위의 EC50을 나타낸다. 따라서, 예시적인 측면에서, 펩티드 및 변이 펩티드는 글루카곤 수용체 활성화에 대해 약 1000 pM 또는 미만 (이를 테면, 약 750 pM 또는 미만, 약 500 pM 또는 미만, 약 250 pM 또는 미만, 약 100 pM 또는 미만, 약 75 pM 또는 미만, 약 50 pM 또는 미만, 약 25 pM 또는 미만, 약 10 pM 또는 미만, 약 5 pM 또는 미만, 또는 약 1 pM 또는 미만)의 EC50을 나타낸다. 더 낮은 EC50은 이 수용체에서 더 높은 활성 또는 효능을 나타내는 것으로 이해된다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 글루카곤 유사체는 글루카곤 수용체에서 약 0.001 pM 또는 그 이상, 약 0.01 pM 또는 그 이상, 또는 약 0.1 pM 또는 그 이상의 EC50을 나타낸다. 글루카곤 수용체 활성화 (글루카곤 수용체 활성)은 글루카곤 수용체를 과다발현시키는 HEK293세포에서 cAMP 유도를 측정하는 시험관 분석에 의해 측정될 수 있는데, 이를 테면, 실시예 2에서 설명되는 것과 같이, cAMP 반응 요소에 연결된 루시퍼라제 유전자 및 글루카곤 수용체를 인코드하는 DNA로 공동-형질감염된 HEK293 세포를 분석함으로써 측정될 수 있다.
예시적인 구체예들에서, 현재 공개된 펩티드 및 변이 펩티드는 고유의 글루카곤 (글루카곤 효능)과 비교하여 글루카곤 수용체에서 약 0.001% 또는 그 이상, 약 0.01% 또는 그 이상, 약 0.1% 또는 그 이상, 약 0.5% 또는 그 이상, 약 1% 또는 그 이상, 약 5% 또는 그 이상, 약 10% 또는 그 이상, 약 20% 또는 그 이상, 약 30% 또는 그 이상, 약 40% 또는 그 이상, 약 50% 또는 그 이상, 약 60% 또는 그 이상, 약 75% 또는 그 이상, 약 100% 또는 그 이상, 약 125% 또는 그 이상, 약 150% 또는 그 이상, 약 175% 또는 그 이상, 약 200% 또는 그 이상, 약 250% 또는 그 이상, 약 300% 또는 그 이상, 약 350% 또는 그 이상, 약 400% 또는 그 이상, 약 450% 또는 그 이상, 또는 약 500% 또는 더 높은 활성을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에서 설명된 펩티드 및 변이 펩티드는 고유의 글루카곤과 비교하여, 글루카곤 수용체에서 약 5000% 또는 미만 또는 약 10,000% 또는 미만 활성을 나타낸다. 수용체의 고유 리간드에 대하여 수용체에서 글루카곤 유사체의 활성은 고유의 리간드에 대해 글루카곤 유사체에 대한 EC50의 역(inverse) 비율로 계산된다.
일부 구체예들에서, 펩티드 및 변이 펩티드는 글루카곤 수용체에서만 실질적인 활성(효능)을 나타내고, GLP-1 수용체에서 활성이 거의 없다. 따라서, 일부 구체예들에서, 펩티드 및 변이 펩티드는 "순수한 글루카곤 수용체 항진제"로 간주되거나 또는 "글루카곤/GLP-1 수용체 공동-항진제"로 간주되지 않는다. 일부 구체예들에서 이들 펩티드 및 변이 펩티드는 본 명세서에서 기술된 글루카곤 수용체에서 임의의 활성 또는 효능 수준을 나타내지만, GLP-1 수용체에서 실질적으로 적은 활성(효능)을 가진다. 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 GLP-1 수용체에서 EC50 글루카곤 수용체에서 EC50보다 100-배 또는 그 이상의 EC50을 나타낸다.
GLP-1 수용체에서 항진 활성
예시적인 구체예들에서, 펩티드 및 변이 펩티드는 GLP-1 수용체 활성화에 대하여 약 1000 μM 또는 미만 (이를 테면, 약 750 μM 또는 미만, 약 500 μM 또는 미만, 약 250 μM 또는 미만, 약 100 μM 또는 미만, 약 75 μM 또는 미만, 약 50 μM 또는 미만, 약 25 μM 또는 미만, 약 10 μM 또는 미만, 약 5 μM 또는 미만, 또는 약 1 μM 또는 미만)의 EC50을 나타낸다. 예시적인 구체예들에서, 펩티드 및 변이 펩티드는 GLP-1 수용체에서 약 1000 nM 또는 미만 (이를 테면, 약 750 nM 또는 미만, 약 500 nM 또는 미만, 약 250 nM 또는 미만, 약 100 nM 또는 미만, 약 75 nM 또는 미만, 약 50 nM 또는 미만, 약 25 nM 또는 미만, 약 10 nM 또는 미만, 약 5 nM 또는 미만, 또는 약 1 nM 또는 미만)의 EC50을 나타낸다. 예시적인 구체예들에서, 펩티드 및 변이 펩티드는 GLP-1 수용체에서 피코몰 범위의 EC50을 보유한다. 따라서, 일부 구체예들에서, 펩티드 및 변이 펩티드는 GLP-1 수용체 활성화에 대해 약 1000 pM 또는 미만 (이를 테면, 약 750 pM 또는 미만, 약 500 pM 또는 미만, 약 250 pM 또는 미만, 약 100 pM 또는 미만, 약 75 pM 또는 미만, 약 50 pM 또는 미만, 약 25 pM 또는 미만, 약 10 pM 또는 미만, 약 5 pM 또는 미만, 또는 약 1 pM 또는 미만)의 EC50을 나타낸다. 더 낮은 EC50은 이 수용체에서 더 높은 활성 또는 효능을 나타내는 것으로 이해된다.
예시적인 구체예들에서, 본 명세서에서 설명된 펩티드 및 변이 펩티드는 GLP-1 수용체에서 약 0.001 pM 또는 그 이상, 약 0.01 pM 또는 그 이상, 또는 약 0.1 pM 또는 그 이상의 EC50을 나타낸다. GLP-1 수용체 활성화 (GLP-1 수용체 활성)는 GLP-1을 과다발현시키는 HEK293세포에서 cAMP 유도를 측정하는 시험관 분석에 의해 측정될 수 있는데, 이를 테면, 실시예 2에서 설명되는 것과 같이, cAMP 반응 요소에 연결된 루시퍼라제 유전자 및 글루카곤 수용체를 인코드하는 DNA로 공동-형질감염된 HEK293 세포를 분석함으로써 측정될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 개시내용의 펩티드 및 변이 펩티드는 고유의 GLP-1 (GLP-1 효능)과 비교하여, GLP-1 수용체에서 약 0.001% 또는 그 이상, 약 0.01% 또는 그 이상, 약 0.1% 또는 그 이상, 약 0.5% 또는 그 이상, 약 1% 또는 그 이상, 약 5% 또는 그 이상, 약 10% 또는 그 이상, 약 20% 또는 그 이상, 약 30% 또는 그 이상, 약 40% 또는 그 이상, 약 50% 또는 그 이상, 약 60% 또는 그 이상, 약 75% 또는 그 이상, 약 100% 또는 그 이상, 약 125% 또는 그 이상, 약 150% 또는 그 이상, 약 175% 또는 그 이상, 약 200% 또는 그 이상, 약 250% 또는 그 이상, 약 300% 또는 그 이상, 약 350% 또는 그 이상, 약 400% 또는 그 이상, 약 450% 또는 그 이상, 또는 약 500% 또는 더 높은 활성을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에서 설명된 펩티드 및 변이 펩티드는 고유의 GLP-1 (GLP-1 효능)에 비교하여, GLP-1 수용체에서 약 5000% 또는 미만 또는 약 10,000% 또는 미만의 활성을 나타낸다.
일부 구체예들에서, 펩티드 및 변이 펩티드는 GLP-1 수용체에서만 실질적인 활성 (효능)을 나타내고, 글루카곤 수용체에서 활성을 거의 또는 전혀 나타내지 않는다. 일부 구체예들에서, 펩티드 및 변이 펩티드는 "순수 GLP-1 수용체 항진제"로 간주되거나 또는 "글루카곤/GLP-1 수용체 공동-항진제"로 간주되지 않는다. 일부 구체예들에서 이들 펩티드 및 변이 펩티드는 본 명세서에서 기술된 GLP-1 수용체에서 임의의 활성 또는 효능 수준을 나타내지만, 글루카곤 수용체에서 실질적으로 적은 활성 (효능)을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 펩티드 및 변이 펩티드는 GLP-1 수용체에서 EC50보다 100-배 또는 그 이상의 EC50을 글루카곤 수용체에서 나타낸다.
GLP-1 수용체 및 글루카곤 수용체에서 항진 활성
예시적인 구체예들에서, 펩티드 및 변이 펩티드는 GLP-1 수용체 및 글루카곤 수용체에서 모두 활성을 나타내고, 그리고 "글루카곤/GLP-1 수용체 공동-항진제"로 간주될 수 있다. 예시적인 구체예들에서, 펩티드 및 변이 펩티드 글루카곤 수용체에서 활성(이를 테면, EC50 또는 비교 활성 또는 효능)은 GLP-1 수용체에서 이의 활성으로부터 약 50-배, 약 40-배, 약 30-배, 약 20-배, 약 10-배, 또는 약 5 배 상이하다 (더 높은 또는 더 낮은) 범위내에 있다. 예시적인 측면에서, 펩티드 또는 변이 펩티드의 글루카곤 효능은 GLP-1 효능으로부터 약 25-, 약 20-, 약 15-, 약 10-배, 또는 5-배 상이하다 (더 높은 또는 더 낮은) 범위내에 있다. 예시적인 측면에서, 펩티드 또는 변이 펩티드의 글루카곤 효능은 이의 GLP-1 효능과는 약 25-, 약 20-, 약 15-, 약 10-, 또는 약 5-배 더 낮은 범위내에 있다.
예시적인 구체예들에서, 공동-항진제는 글루카곤 수용체와 GLP-1 수용체에서 대략적으로 대등하거나 또는 글루카곤 수용체보다 GLP-1 수용체에서 상대적으로 더 강하다. 예를 들면, GLP-1 수용체에서 펩티드 또는 변이 펩티드의 비교 활성 또는 EC50 또는 효능으로 나눈 글루카곤 수용체에서 펩티드 또는 변이 펩티드의 비교 활성 또는 EC50 또는 효능의 비율은 X 미만, 또는 대략 X인데, 이때 X는 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 또는 5에서 선택된다. 예시적인 구체예들에서, GLP-1 수용체에서 펩티드 또는 변이 펩티드의 비교 활성 또는 EC50 또는 효능으로 나눈 글루카곤 수용체에서 펩티드 또는 변이 펩티드의 비교 활성 또는 EC50 또는 효능의 비율은 약 1 이고, 5 미만 (이를 테면, 약 4, 약 3, 약 2, 약 1)이다. 예시적인 구체예들에서, 글루카곤 수용체에서 펩티드 또는 변이 펩티드의 비교 활성 또는 EC50 또는 효능으로 나눈 GLP-1 수용체에서 펩티드 또는 변이 펩티드의 비교 활성 또는 EC50 또는 효능의 비율은 5 미만(이를 테면, 약 4, 약 3, 약 2, 약 1)이다. 예시적인 구체예들에서, 펩티드 또는 변이 펩티드의 GLP-1 효능의 GLP-1 효능과 비교하였을 때, 펩티드 또는 변이 펩티드의 글루카곤 효능 비율은 Y 미만, 또는 대략 Y인데, 여기에서 Y는 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 및 5로부터 선택된다. 예시적인 구체예들에서, 펩티드 또는 변이 펩티드의 GLP-1 효능과 비교하여 펩티드 또는 변이 펩티드의 글루카곤 효능 비율은 5 미만(이를 테면, 약 4, 약 3, 약 2, 약 1)이다. 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 글루카곤 수용체에서 EC50은 GLP-1 수용체에서의 EC50보다 2-10배(이를 테면, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배) 더 크다.
예시적인 구체예들에서, 펩티드는 주로 글루카곤 항진제이며, 글루카곤 수용체에서 GLP-1 수용체보다 상대적으로 더 강력한 활성을 가진다(이를 테면 펩티드는 GLP-1 수용체와 비교하였을 때 글루카곤 수용체에서 5배 또는 그 이상의 효능이 있다). 예를 들면, 글루카곤 수용체에서 펩티드 또는 변이 펩티드의 비교 활성 또는 EC50 또는 효능으로 나눈 GLP-1 수용체에서 펩티드 또는 변이 펩티드의 비교 활성 또는 EC50 또는 효능의 비율은 V 미만, 또는 대략 V이고, 여기에서 V는 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 또는 5로부터 선택된다. 일부 구체예들에서, 펩티드 또는 변이 펩티드의 글루카곤 효능과 비교하여 펩티드 또는 변이 펩티드의 GLP-1 효능의 비율은 W 미만, 또는 대략 W이며, 여기에서 W는 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 및 5으로부터 선택된다. 일부 구체예들에서, 펩티드 또는 변이 펩티드는 GLP-1 수용체 (GLP-1 효능)에서 고유의 GLP-1의 활성의 최소한 0.1% (이를 테면, 약 0.5% 또는 그 이상, 약 1% 또는 그 이상, 약 5% 또는 그 이상, 약 10% 또는 그 이상, 또는 그 이상)를 나타내고, 글루카곤 수용체에서 고유의 글루카곤 활성(글루카곤 효능)의 최소한 0.1% (이를 테면, 약 0.5% 또는 그 이상, 약 1% 또는 그 이상, 약 5% 또는 그 이상, 약 10% 또는 그 이상, 또는 그 이상)를 나타낸다.
GIP 수용체에서 활성
글루카곤 수용체 및/또는 GLP-1 수용체에서 활성인 것에 추가적으로, 본 명세서에서 설명된 펩티드 및 변이 펩티드는 일부 측면에서, GIP 수용체에서 낮은 항진 활성을 나타낸다. 이러한 측면에서, 바람직하게는 이러한 펩티드 및 변이 펩티드는 GIP 수용체와 비교하여 GLP-1 수용체에 대해 최소한 100-배 선택적이다.
다른 측면들에서, 그러나, 펩티드 또는 변이 펩티드는 GIP 수용체에서 상당한 활성을 나타내는데, 이를 테면 GIP 수용체에서 이 유사체의 EC50은 임의선택적으로 GLP-1 수용체에서 이의 EC50과는 약 50-배 미만으로 상의하고, 임의선택적으로, 여기에서 이 유사체의 GIP 효능은 이 유사체의 GLP-1 효능의 약 50-배 범위 안에 있다. 예시적인 구체예들에서, 펩티드는 GIP 수용체 활성화에 대해 약 1 μM 또는 미만, 또는 100 nM 또는 미만, 또는 약 75, 50, 25, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 nM 또는 미만의 EC50 활성을 나타낸다. 더 낮은 EC50은 이 수용체에서 더 높은 활성 또는 효능을 나타내는 것으로 이해된다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에서 설명된 펩티드 및 변이 펩티드는 GIP 수용체에서 약 0.001 nM, 0.01 nM, 또는 0.1 nM의 EC50을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에서 설명된 펩티드 및 변이 펩티드는 약 100 nM의 EC50을 나타낸다. 수용체 활성화는 이 수용체를 과다발현시키는 HEK293세포에서 cAMP 유도를 측정하는 시험관 분석에 의해 측정될 수 있는데, 이를 테면, 실시예 2에서 설명되는 것과 같이, cAMP 반응 요소에 연결된 루시퍼라제 유전자 및 이 수용체를 인코드하는 DNA로 공동-형질감염된 HEK293 세포를 분석함으로써 측정될 수 있다.
일부 구체예들에서, 현재 공개된 펩티드 및 변이 펩티드는 고유의 GIP (GIP 효능)와 비교하여 GIP 수용체에서 최소한 약 0.1%, 1%, 10%, 50%, 100%, 150%, 또는 200% 또는 더 높은 활성을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에서 설명된 펩티드 및 변이 펩티드는 고유의 GIP와 비교하여 GIP 수용체에서 1000%, 10,000%, 100,000%, 또는 1,000,000% 활성을 나타낸다. 이 수용체의 고유 리간드와 비교하여 글루카곤 펩티드의 활성(효능)은 고유의 리간드와 비교하여 펩티드에 대한 EC50의 역 비율로 계산된다.
따라서, 본 개시내용의 한 측면은 글루카곤 수용체 및 GIP 수용체 ("글루카곤/GIP 공동-항진제") 모두에서 활성을 나타내는 펩티드 및 변이 펩티드를 제공한다. 일부 구체예들에서, GIP 수용체에서 펩티드의 EC50은 글루카곤 수용체에서 이의 EC50보다 약 50-배, 40-배, 30-배 또는 20-배 미만으로 상이하다(더 높은 또는 더 낮은). 일부 구체예들에서, 펩티드의 GIP 효능은 이의 글루카곤 효능과는 약 500-, 450-, 400-, 350-, 300-, 250-, 200-, 150-, 100-, 75-, 50-, 25-, 20-, 15-, 10-, 또는 5-배 미만으로 상이하다(더 높은 또는 더 낮은). 일부 구체예들에서, GLP-1 활성은 이를 테면, 위치 7에서 아미노산 변형, 위치 27 또는 28의 아미노산의 C-말단에 아미노산(들)의 결손, 또는 이의 조합에 의해 상당히 감소되거나 또는 파괴되었다.
본 개시내용의 대체 측면에서, 본 개시내용의 펩티드 및 변이 펩티드는 GLP-1 및 GIP 수용체에서 활성을 나타내지만, 위치 3에서 Gln의 아미노산 변형으로 인하여, 글루카곤 수용체에서 상당한 활성을 나타내지 않는다("GIP/GLP-1 공동-항진제"). 예를 들면, 이 위치에서 산성, 염기성, 또는 소수성 아미노산 (글루타민산, 오르니틴, 노르루이신)으로 치환은 글루카곤 활성을 감소시킨다. 다른 측면들에서, 펩티드 및 변이 펩티드는 각 글루카곤, GIP 및 GLP-1 수용체 ("글루카곤/GIP/GLP-1 삼-항진제")에서 활성을 나타낸다. 예를 들면, 이들 후자 측면중 어느 것에서, GIP 수용체에서 펩티드의 EC50은 GLP-1 수용체에서의 이의 EC50보다 약 50-배, 40-배, 30-배 또는 20-배 미만으로 상이하다(더 높은 또는 더 낮은). 일부 구체예들에서, 펩티드의 GIP 효능은 이의 GLP-1 효능보다 약 25-, 20-, 15-, 10-, 또는 5-배 미만으로 상이하다(더 높은 또는 더 낮은). 일부 구체예들에서, 이들 펩티드는 글루카곤 수용체에서 고유의 글루카곤 활성의 약 10% 또는 미만을 나타내고, 이를 테면 약 1-10%, 또는 약 0.1-10%, 또는 약 0.1% 이상 그러나 약 10% 미만이다.
접합체(Conjugates)들의 활성
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 설명된 펩티드 및 변이 펩티드는 상기에서 설명된 것과 같이 글루카곤 수용체에서 활성 또는 효능을 나타내고 및/또는 GLP-1 수용체에서 활성을 나타내고 및/또는 GIP 수용체에서 활성을 나타내고, 펩티드 또는 변이 펩티드가 접합체의 일부분 인 경우(이를 테면, 이종구조의 모이어티, 이를 테면, 친수성 모이어티, 이를 테면, 폴리에틸렌 글리콜에 접합된 경우), 펩티드 또는 변이 펩티드는 접합체의 일부가 아닌 경우였을 때보다 더 낮은(가령, 더 낮은 효능 또는 더 높은 EC50) 활성을 나타낸다. 일부 측면에서, 접합체의 일부가 아닌 경우의 펩티드 또는 변이 펩티드는 글루카곤 수용체 및/또는 GLP-1 수용체에서 접합체의 일부인 펩티드 또는 변이 펩티드의 효능보다 약 10-배 또는 그 이상의 효능을 나타낸다. 일부 측면에서, 접합안된 경우의 펩티드 또는 변이 펩티드는 접합된 펩티드 또는 변이 펩티드의 효능의 약 10-배, 약 15-배, 약 20-배, 약 25-배, 약 30-배, 약 35-배, 약 40-배, 약 45-배, 약 50-배, 약 100-배, 또는 훨씬 더 큰-배수의 효능을 나타낸다.
글루카곤 유사체의 구조
아실화
일부 구체예에 따르면, 글루카곤 유사체는 아실화된 아미노산 (이를 테면, 코드화안된 아실화된 아미노산 (이를 테면, 자연적으로 생성되는 아미노산에 비고유한 아실 기를 포함하는 아미노산))을 포함한다. 일부 구체예들에서 아실화된 아미노산은 글루카곤 유사체가 (i) 순환계에서 연장된 반감기, (ii) 작용의 지연된 개시, (iii) 작용의 연장된 지속기간, (iv) DPP-IV와 같은 프로테아제에 대하여 개선된 저항성, 및 (v) GLP-1 및 글루카곤 수용체중 하나 또는 둘 모두에서 증가된 효능중 하나 이상을 가지도록 한다. 본 명세서에서 나타낸 것과 같이, 아실화된 글루카곤 유사체는 대응하는 아실화안된 글루카곤 유사체와 비교하여 글루카곤 및 GLP-1 수용체에서 삼소된 활성을 나타내지 않는다. 오히려, 일부 경우들에서, 아실화된 글루카곤 유사체는 GLP-1 및 글루카곤 수용체에서 실질적으로 증가된 활성을 나타낸다. 따라서, 아실화된 글루카곤 유사체의 효능은 강화되지 않았다면, 글루카곤 유사체의 아실화안된 형태에 필적한다.
한 구체예에 따르면, 글루카곤 유사체는 순환계에서 반감기의 연장 및/또는 작용 개시의 지연 및/또는 작용 기간의 연장 및/또는 프로테아제 예를 들면, DPP-IV에 대한 저항성을 개선시키기 위한 목적으로 에스테르, 티오에스테르, 또는 아미드 링키지를 통하여 글루카곤 유사체에 부착된 아실기를 포함하도록 변형된다.
아실화는 글루카곤 및/또는 GLP-1 활성이 강화되지 않는다면, 유지되는 조건하에 위치 1-29, 29번째 아미노산 (이를 테면, 위치 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 등에서 아미노산, C-말단 연장 안에 있는 한 위치의 아미노산 또는 C-말단에서 아미노산)에 대한 C-말단 위치중 임의의 위치를 포함하는 글루카곤 유사체 안의 임의의 위치에서 실행될 수 있다, 비제한적 예로는 위치 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28, 또는 29를 포함한다. 예시적인 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 9, 10, 12, 16, 및 20으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 위치에 있는 아실화된 아미노산을 포함한다. 예시적인 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 10, 12, 및 16으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 위치에 있는 아실화된 아미노산을 포함한다. 예시적인 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 9, 10, 12, 16, 및 20으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 위치에 있는 아실화된 아미노산을 포함한다. 예시적인 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 위치 10 및 12중 하나 또는 그 이상의 위치에 있는 아실화된 아미노산을 포함한다. 예시적인 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 아실화된 아미노산 at 위치 12에 있는 아실화된 아미노산을 포함한다. 예시적인 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 9, 10, 12, 16, 20, 및 37-43 (이를 테면, 40)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 위치에서 C-말단 연장 및 아실화된 아미노산을 포함한다. 특정 구체예들에서, 아실화는 글루카곤 유사체의 위치 10에서 일어나고, 글루카곤 유사체는 분자내(intramolecular) 다리, 이를 테면, 분자내 공유 다리 (이를 테면, 락탐 다리)가 없다. 분자내 다리가 결여된 이러한 아실화된 글루카곤 유사체는 분자내 공유 다리가 결여된 비-아실화된 대응하는 유사체와 비교하였을 때, 그리고 위치 10 이외의 위치에서 아실화된 분자내 다리가 결여된 대응하는 유사체와 비교하였을 때, GLP-1 및 글루카곤 수용체에서 강화된 활성을 설명한다. 본 명세서에서 나타낸 것과 같이, 위치 10에서의 아실화는 글루카곤 수용체에서 거의 활성을 나타내지 않는 글루카곤 유사체를 글루카곤 및 GLP-1 수용체 모두에서 활성을 가지는 글루카곤 유사체로 변형시킬 수도 있다. 따라서, 아실화가 일어나는 위치는 글루카곤 유사체의 전체 활성 프로파일을 변경시킬 수 있다.
일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 친수성 모이어티가 연결된 동일한 아미노산 위치, 또는 상이한 아미노산 위치에서 아실화된다. 비제한적 예로는 위치 10에서 아실화 및 글루카곤 유사체의 C-말단 부분에서 하나 또는 그 이상의 위치, 이를 테면, 위치 24, 28 또는 29, C-말단 연장부 내에, 또는 C-말단 (이를 테면, C-말단 Cys 추가를 통하여)에서 페길화를 포함한다.
아실기는 글루카곤 유사체의 아미노산에 직접적으로 공유적으로 연결될 수 있거나, 또는 스페이스(spacer)를 통하여 글루카곤 유사체의 아미노산에 간접적으로 연결될 수 있는데, 여기에서 스페이스는 글루카곤 유사체의 아미노산과 아실기 사이에 위치한다.
특정 측면에서, 글루카곤 유사체는 글루카곤 유사체의 아미노산 측쇄의 아민, 하이드록시 또는 티올의 직접적인 아실화에 의하여 아실기를 포함하도록 변형된다. 일부 구체예들에서, 아실화는 위치 10, 20, 24, 또는 29에서 일어난다. 이점에 있어서, 아실화된 글루카곤 유사체는 서열 번호 : 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 여기에서 논의된 것과 같이, 위치 10, 20, 24, 및 29의 아미노산 중 하나가 측쇄 아민, 하이드록시, 또는 티올을 포함하는 임의의 아미노산으로 변형된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 서열 번호 : 1의 변형된 아미노산 서열을 포함할 수도 있다. 일부 특정 구체예들에서, 글루카곤 유사체의 직접적인 아실화는 위치 10의 아미노산의 측쇄 아민, 하이드록시, 또는 티올을 통하여 일어난다.
일부 구체예에서, 측쇄 아민을 포함하는 아미노산은 화학식 I의 아미노산이다:
Figure 112014006402078-pct00001
여기서 n = 1 내지 4
[화학식 I]
일부 예시적인 구체예들에서, 화학식 I의 아미노산은 n이 4 (Lys)이거나 또는 n 이 3 (Orn)인 아미노산이다.
다른 구체예들에서, 측쇄 하이드록시를 포함하는 아미노산은 화학식 II의 아미노산이다:
Figure 112014006402078-pct00002
여기서 n = 1 내지 4
[화학식 II]
일부 예시적인 구체예들에서, 화학식 II의 아미노산은 n이 1 (Ser)인 아미노산이다.
다른 구체예들에서, 측쇄 티올을 포함하는 아미노산은 화학식 III의 아미노산이다:
Figure 112014006402078-pct00003
여기서 n = 1 내지 4
[화학식 III]
일부 예시적인 구체예에서, 화학식 III의 아미노산은 n이 1 (Cys)인 아미노산이다.
다른 구체예에서, 측쇄 아민, 하이드록시, 또는 티올을 포함하는 아미노산은 화학식 I, II, 또는 III의 동일한 구조지만, 단지 화학식 I, II, 또는 III의 아미노산의 알파 탄소에 결합된 수소가 제 2 측쇄로 대체된, 이중치환된 아미노산이다.
일부 구체예에서, 아실화된 글루카곤은 유사체와 아실기 사이에 스페이스를 포함한다. 일부 구체예에서, 글루카곤 유사체는 아실기에 공유적으로 부착되어 있는 스페이스에 공유 결합된다.
일부 구체예들에서, 스페이스는 측쇄 아민, 히드록실 또는 티올을 포함하는 아미노산 또는 측쇄 아민, 히드록실 또는 티올을 포함하는 아미노산을 포함하는 이펩티드 또는 삼펩티드이다. 스페이스가 부착된 아미노산은 스페이스에 링크를 할 수 있는 모이어티를 포함하는 임의의 아미노산(예를 들면, 단일 또는 이중 α-치환된 아미노산)일 수 있다. 예를 들면, 측쇄 NH2, -OH, 또는 -COOH (예를 들면, Lys, Orn, Ser, Asp, 또는 Glu)를 포함하는 아미노산이 적합하다. 이 점에 있어서, 아실화된 글루카곤 유사체는 서열 번호: 1의 아미노산, 또는 여기에서 논의된 것과 같이, 위치 10, 20, 24, 및 29의 아미노산 중 하나가 측쇄 아민, 하이드록시, 또는 카르복시산염을 포함하는 임의의 아미노산으로 변형된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 서열 번호 : 1의 변형된 아미노산 서열을 포함할 수도 있다.
일부 구체예들에서, 스페이스는 측쇄 아민, 하이드록시, 또는 티올을 포함하는 아미노산, 측쇄 아민, 하이드록시, 또는 티올을 포함하는 아미노산으로 구성된 이가 펩티드 또는 삼가펩티드다.
아실화가 스페이스의 아민기를 통하여 일어날 경우, 아실화는 아미노산의 알파 아민 또는 측쇄 아민을 통하여 일어날 수 있다. 알파 아민이 아실화된 경우라면, 스페이스의 아미노산은 임의의 아미노산이 될 수 있다. 예를 들면, 스페이스의 아미노산은 소수성 아미노산, 예를 들면, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Met, Phe, Tyr, 6-아미노 헥사논산, 5-아미노 발레르산, 7-아미노 헵타논산, 및 8-아미노옥타논산이 될 수 있다. 대안으로, 스페이스의 아미노산은 산성 잔기, 예를 들면, Asp, Glu, 호모글루타민산, 호모시스테인산, 시스테인산, 감마-글루탐산이 될 수 있다.
스페이스의 아미노산의 측쇄 아민이 아실화된 경우에, 스페이스의 아미노산은 측쇄 아민을 포함하는 아미노산, 예를 들면, 화학식 I의 아미노산(예를 들면, Lys 또는 Orn)이 된다. 이 경우, 스페이스의 아미노산의 알파 아민 및 측쇄 아민 모두 아실화되는 것이 가능하여, 이런 글루카곤 유사체는 이중-아실화된다. 본 발명의 구체예들은 이와 같은 이중-아실화된 분자들을 포함한다.
아실화는 스페이스의 하이드록시기를 통하여 일어나고, 아미노산 또는 이가펩티드 또는 삼가펩티드의 아미노산 중 하나는 화학식 II의 아미노산이 될 수 있다. 특정 예시적인 구체예에서, 아미노산은 Ser이다.
아실화는 스페이스의 티올기를 통하여 일어나고, 아미노산 또는 이가펩티드 또는 삼가펩티드의 아미노산 중 하나는 화학식 III의 아미노산이 될 수 있다. 특정 예시적인 구체예에서, 아미노산은 Cys이다.
일부 구체예들에서, 스페이스는 친수성 2기능성 스페이스다. 특정 구체예에서, 친수성 2기능성 스페이스는 두 개이상의 반응기 예를 들면, 아민, 하이드록시, 티올, 카르복실기 또는 이의 복합을 포함한다. 특정 구체예들에서, 친수성 2기능성 스페이스는 하이드록시기 및 카르복시산염을 포함한다. 다른 구체예들에서, 친수성 2기능성 스페이스는 아민기 및 카르복시산염을 포함한다. 다른 구체예들에서, 친수성 2기능성 스페이스는 티올기 및 카르복시산염을 포함한다. 특정 구체예에서, 스페이스는 아미노 폴리(알킬옥시)카르복시산염을 포함한다. 이에 대하여, 스페이스는 예를 들면, NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH(여기서, m은 1 내지 6까지 중 임의의 정수가 되며, n은 2 내지 12까지의 정수중 임의의 정수가 된다)를 포함하며, 예를 들면, 8-아미노-3,6-디옥사옥타논산을 포함하며, 이는 Peptide International, Inc. (Louisville, KY)에서 시판된다.
일부 구체예들에서, 스페이스는 소수성 2기능성 스페이스다. 소수성 2기능성 스페이스는 본 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996)-참고문헌으로 결합됨. 특정 구체예들에서, 소수성 2기능성 스페이스는 두 개 이상의 반응 기, 예를 들면, 아민, 하이드록시, 티올, 및 카르복실기 또는 이의 임의의 복합을 포함한다. 특정 구체예에서, 소수성 2기능성 스페이스는 하이드록시기 및 카르복시산염을 포함한다. 다른 구체예들에서, 소수성 2기능성 스페이스는 아민기 및 카르복시산염을 포함한다. 다른 구체예들에서, 소수성 2기능성 스페이스는 티올기 및 카르복시산염을 포함한다. 카르복시산염, 그리고 하이드록시기 또는 티올기를 포함하는 적합한 소수성 2기능성 스페이스는 본 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 8-하이드록시옥타논산 및 8-멀캅토옥타논산을 포함한다.
일부 구체예들에서, 2기능성 스페이스는 카르복시산염 기 사이에 1-7개 탄소원자로 된 비-분지형, 메틸렌을 포함하는 디카르복실산은 아니다. 일부 구체예들에서, 2기능성 스페이스는 카르복시산염 기 사이에 1-7개 탄소원자로 된 비-분지형, 메틸렌을 포함하는 디카르복실산이다.
특정 구체예에서, 스페이스 (예를 들면, 아미노산, 이가 펩티드, 삼가펩티드, 친수성 2기능성, 또는 소수성 2기능성 스페이스)는 길이가 3 내지 10개 원자 (예를 들면, 6 내지 10 원자, 예를 들면, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 원자)가 된다. 좀더 특정한 구체예들에서, 스페이스는 길이가 약 3 내지 10개 원자 (예를 들면, 6 내지 10 원자)이며, 아실기는 C12 내지 C18의 지방성 아실기, 예를 들면, C14 지방성 아실기, C16 지방성 아실기가 되며, 스페이스와 아실기의 전체 길이는 14 내지 28개 원자, 예를 들면, 약 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 원자의 길이가 된다. 일부 구체예에서, 스페이스 및 아실기의 길이는 17 내지 28개 (예를 들면, 19 내지 26개, 19 내지 21개)의 원자다.
특정 전술한 구체예에 따르면, 2기능성 스페이스는 3 내지 10개의 원자 길이로 된 아미노산 기본 골격을 포함하는 합성되거나 또는 자연적으로 생성되는 아미노산 (여기에서 설명되는 것을 포함하나 이에 한정되지 않음) 아미노산(예를 들면, 6-아미노 헥사논산, 5-아미노발레르산, 7-아미노헵타논산, 및 8-아미노옥타논산)이 될 수 있다. 대안으로, 스페이스는 3 내지 10개 원자 (예를 들면, 6 내지 10개 원자)의 길이로 된 펩티드 기본 골격을 가지는 이가 펩티드 또는 삼가 펩티드 스페이스다. 이가 펩티드 또는 삼가 펩티드 스페이스의 각 아미노산은 이가 펩티드 또는 삼가 펩티드의 다른 아미노산과 동일하거나 다를 수 있고, 다음으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있다: 자연적으로 생성되는 또는 코드화된 및/또는 코드화안된 또는 자연적으로 생성되지 않는 아미노산, 예를 들면, 자연적으로 생성되는 아미노산 (Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, He, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr)의 D 또는 L 이성체중 임의의 것, 또는 다음의 군으로부터 선택된 자연적으로 생성되지 않는 아미노산의 D 또는 L 이성체:β-알라닌 (β-Ala), N-α-메틸-알라닌 (Me-Ala), 아미노부티르산 (Abu), γ-아미노부티르산 (γ-Abu), 아미노헥사논산 (ε-Ahx), 아미노이소부티르산 (Aib), 아미노메틸피롤 카르복실산, 아미노피페르딘카르복실산, 아미노세린 (Ams), 아미노테트라하이드로피란-4-카르복실산, 아르기닌 N-메톡시-N-메틸 아미드, β-아스파르트산 (β-Asp), 아제티딘 카르복실산, 3-(2-벤조티아졸일)알라닌, 알파-tert-부틸글리신, 2-아미노-5-우레이도-n-발레르산 (시트룰린, Cit), β-시클로헥실알라닌 (Cha), 아세트아미도메틸-시스테인, 디아미노부타논산(Dab), 디아미노프로피온산 (Dpr), 디하이드록시페닐알라닌 (DOPA), 디메틸티아졸리딘(DMTA), γ-글루타민산 (γ-Glu), 호모세린 (Hse), 하이드록시프롤린 (Hyp), 이소루이신 N-메톡시-N-메틸 아미드, 메틸-이소루이신 (MeIIe), 이소니페코틴산(Isn), 메틸-루이신 (MeLeu), 메틸-리신, 디메틸-리신, 트리메틸-리신, 메타노프롤린, 메티오닌-술폭시드(Met(O)), 메티오닌-술폰 (Met(O2)), 노르루이신 (Nle), 메틸-노르루이신 (Me-Nle), 노르발린 (Nva), 오르니틴 (Orn), 파라-아미노벤조산 (PABA), 페니실아민 (Pen), 메틸페닐알라닌 (MePhe), 4-클로로페닐알라닌 (Phe(4-Cl)), 4-플로오르페닐알라닌 (Phe(4-F)), 4-니트로페닐알라닌 (Phe(4-NO2)), 4-시아노페닐알라닌 ((Phe(4-CN)), 페닐글리신 (Phg), 피페리디닐알라닌, 피페리디닐글리신, 3,4-데하이드로프롤린, 피롤리디닐알라닌, 사르코신(Sar), 셀레노시스테인 (Sec), 0-벤질-포스포세린, 4-아미노-3-하이드록시-6-메틸헵타논산 (Sta), 4-아미노-5-시클로헥실-3-하이드록시펜타논산(ACHPA), 4-아미노-3-하이드록시-5-페닐펜타논산(AHPPA), l,2,3,4,-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-카르복실산 (Tic), 테트라하이드로피란글리신, 티에닐알라닌 (Thi), O-벤질-포스포티로신, O-포스포티로신, 메톡시티로신, 에톡시티로신, O-(비스-디메틸아미노-포스포노)-티로신, 티로신 설페이트 테트라부틸아민, 메틸-발린 (MeVal) 및 알킬화된 3-멀캅토프로피온산.
일부 구체예에서, 스페이스는 전반적으로 음 전하를 포함한다. 일부 구체예에서, 이가 펩티드는 일반 구조 A-B의 이가 펩티드 중 임의의 것이 아니며, 여기서 A는 Gly, Gln, Ala, Arg, Asp, Asn, Ile, Leu, Val, Phe, 및 Pro으로 구성된 군으로부터 선택되며, B는 Lys, His, Trp으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 이펩티드 스페이스는 Ala-Ala, β-Ala-β-Ala, Leu-Leu. Pro-Pro, γ-아미노부틸산-γ아미노부틸산, Glu-Glu, 및 γ-Glu-γGlu으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 예시적인 구체예에서, 글루카곤 유사체는 스페이스의 아민, 하이드록시 또는 티올의 아실화에 의한 아실기를 포함하도록 변형되며, 이때 스페이스는 아미노산 위치 10, 20, 24, 또는 29의 아미노산 측쇄 또는 글루카곤 유사체의 C-말단 아미노산에 부착된다.
좀더 특이적인 구체예에서, 아실기는 글루카곤 유사체의 위치 10의 아미노산에 부착되고, 스페이스 및 아실기의 길이는 14 내지 28개의 원자가 된다. 일부 측면에서, 위치 10 또는 40의 아미노산은 화학식 I의 아미노산, 예를 들면, Lys, 또는 화학식 I과 연관된 이중치환된 아미노산이다. 더욱 특이적인 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 분자내 다리, 예를 들면, 공유적 분자내 다리가 없다. 글루카곤 유사체는 예를 들면, 유사체의 알파 헬릭스 구조의 안정화를 위하여 하나이상의 알파, 알파-이중치환된 아미노산, 예를 들면, AIB를 포함하는 펩티드가 될 수 있다.
아민, 하이드록시 및 티올을 통한 펩티드 아실화의 적합한 방법들은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 실시예 19 (아민을 통한 아실화 방법), Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382 (1996); Shimohigashi and Stammer, lnt J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982); and Previero et al., Biochim Biophys Acta 263: 7-13 (1972) (하이드록시를 통한 아실화 방법); 그리고 San and Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005) (티올을 통한 아실화 방법); Bioconjugate Chem . "Chemical Modifications of Proteins: History and Applications" pages 1 , 2-12 (1990); Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. "Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity" Vol. 6, No: 2 pp.171-176 (1989)을 참고한다.
아실화된 아미노산의 아실기는 임의의 길이가 될 수 있는데, 예를 들면, 임의 길이의 탄소 사슬이 되며, 선형 또는 분지형이 될 수 있다. 특정 구체예들에서, 아실기는 C4 내지 C30의 지방산이다. 예를 들면, 아실기는 C4 지방산, C6 지방산, C8 지방산, C10 지방산, C12 지방산, C14 지방산, C16 지방산, C18 지방산, C20 지방산, C22 지방산, C24 지방산, C26 지방산, C28 지방산, 또는 C30 지방산 중 하나가 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 아실기는 C8 내지 C20의 지방산, 예를 들면, C14 지방산 또는 C16의 지방산이다.
대안적 구체예에서, 아실기는 담즙산(bile acid)이다. 담즙산은 콜린산(cholic acid), 케노데옥시콜린산, 데옥시콜린산, 리토콜린산, 타우로콜린산, 글리코콜린산 및 콜레스테롤 산을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 담즙산이 될 수 있다.
일부 구체예에서, 글루카곤 유사체는 글루카곤 유사체의 긴 사슬 알칸의 아실화에 의한 아실기를 포함하도록 변형된다. 특정 측면들에서, 긴 사슬 알칸은 글루카곤 유사체의 카르복실기 또는 이의 활성형과 반응하는 아민, 하이드록시, 또는 티올기 (예를 들면, 옥타데실아민, 테트라데카놀 및 헥사데칸티올)를 포함한다. 글루카곤 유사체의 카르복실기, 또는 이의 활성형은 글루카곤 유사체의 아미노산(예를 들면, 글루타민산, 아스파르트산)의 측쇄의 일부분이거나 또는 펩티드 기본구조의 일부가 될 수 있다.
특정 구체예에서, 글루카곤 유사체는 글루카곤 유사체에 부착된 스페이스에 의하여 긴 사슬 알칸의 아실화에 의한 아실기를 포함하도록 변형된다. 특정 측면들에서, 긴 사슬 알칸은 스페이스의 카르복실기, 또는 이의 활성화된 형태와 반응하는 아민, 하이드록시, 또는 티올기를 포함한다. 카르복실기 또는 이의 활성화된 형태를 포함하는 적절한 스페이스는 여기에서 설명되며, 예를 들면, 2기능성 스페이스, 예를 들면, 아미노산, 이가 펩티드, 삼가 펩티드, 친수성 2기능성 스페이스 및 소수성 2기능성 스페이스를 포함한다.
여기에서 사용된 바와 같이, "카르복시기의 활성화된 형"은 일반식 R(C=O)X의 카르복실기(여기서 X는 이탈기가 되며, R은 글루카곤 유사체 또는 스페이스가 된다)를 말한다. 예를 들면, 카르복시의 활성화된 형에는 아실 클로라이드, 안하이드리드, 에스테르가 포함되나 이에 한정되지는 않는다. 일부 구체예들에서, 활성화된 카르복실기는 N-하이드록시숙시니미드 에스테르 (NHS) 이탈기를 가지는 에스테르다.
긴 사슬 알칸은 글루카곤 유사체 또는 스페이스에 의해 아실화되는 이와 같은 측면에 대하여, 긴 사슬 알칸은 임의의 크기가 될 수 있으며, 임의의 길이의 탄소 사슬을 포함할 수 있다. 긴 사슬 알칸은 선형 또는 분지형이다. 특정 측면에서, 긴 사슬 알칸은 C4 내지 C30의 알칸이다. 예를 들면, 긴 사슬 알칸은 C4 알칸, C6 알칸, C8 알칸, C1O 알칸, C12 알칸, C14 알칸, C16 알칸, C18 알칸, C20 알칸, C22 알칸, C24 알칸, C26 알칸, C28 알칸, 또는 C30 알칸 중 임의의 것이 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 긴 사슬 알칸은 C8 내지 C20의 알칸, 예를 들면, C14 알칸, C16 알칸, 또는 C18 알칸을 포함한다.
또한, 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체의 아민, 하이드록시, 또는 티올기는 콜레스테롤산으로 아실화된다. 특정 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 알킬화된 탈(des)-아미노 Cys 스페이스를 통하여 콜레스테롤산에 링크된다. 알킬화된 탈-아미노 Cys 스페이스는 예를 들면, 도데카에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하는 탈-아미노-Cys 스페이스일 수 있다. 한 구체예에서, 글루카곤 유사체는 다음의 구조를 포함한다:
Figure 112014006402078-pct00004
본 명세서에서 설명되는 아실화된 글루카곤 유사체는 친수성 모이어티를 포함하도록 추가 변형될 수 있다. 일부 특정 구체예들에서, 친수성 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 쇄를 포함할 수 있다. 친수성 모이어티의 통합은 임의의 적절한 수단, 예를 들면, 본 명세서에서 설명된 임의의 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 이점에 있어서, 아실화된 글루카곤 유사체는 여기에서 설명되는 변형들중 임의의 것을 포함하는, 서열 번호: 1을 포함하는데, 여기서, 유사체의 위치 10, 20, 24, 또는 29의 아미노산중 적어도 하나는 아실기가 되며, 위치 16, 17, 21, 24, 또는 29 또는 C-말단 연장부 내의 위치 또는 C-말단 아미노산의 아미노산 중 적어도 하나는 Cys, Lys, Orn, 호모-Cys, 또는 Ac-Phe으로 변형되며, 아미노산의 측쇄는 친수성 모이어티 (예를 들면, PEG)에 공유적으로 결합된다. 일부 구체예들에서, 아실기는 위치 10에 부착되거나, 그리고 선택적으로 Cys, Lys, Orn, 호모-Cys, 또는 Ac-Phe을 포함하는 스페이스를 통하여 부착되며, 친수성 모이어티는 위치 24의 Cys 잔기에 통합된다.
대안으로, 아실화된 글루카곤 유사체는 스페이스를 포함하는데, 이때 스페이스는 아실화 및 변형 둘 다 되어 친수성 모이어티를 포함한다. 적절한 스페이스의 비-제한적 실시예로는 Cys, Lys, Orn, 호모-Cys, 및 Ac-Phe로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 스페이스를 포함한다.
알킬화
일부 구체예에 따르면, 글루카곤 유사체는 알킬화된 아미노산(가령, 코드화안된 알킬화된 아미노산(예를 들면, 자연적으로 생성되는 아미노산에 고유한 것이 아닌 알킬기)를 포함하도록 변형된다. 임의의 특정 이론에 구속됨이 없이, 글루카곤 유사체의 알킬화는 글루카곤 유사체의 아실화와 동일하지는 않더라도 유사한 효과를 가지는데, 예를 들면, 순환계에서 증가된 반감기, 작용의 지연된 개시, 작용의 연장된 기간, 프로테아제, 예를 들면, DPP-IV에 대한 저항성의 개선, GLP-1 및 글루카곤 수용체에서 증가된 효능을 가진다.
알킬화는 글루카곤 활성 또는 GLP-1 활성이 유지된다는 전제하에, 글루카곤 유사체 안에서 아미노산 위치 1-29, 29번째 잔기에 대해 C-말단의 아미노산 위치, 이를 테면, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 등, C-말단 연장 안에 한 위치, 또는 C-말단을 포함하나 이에 한정되지 않는, 아실화를 위한 부위로 본 명세서에서 기술된 위치중 임의의 것에서 실행될 수 있다. 비제한적 예로는 위치 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28, 또는 29를 포함한다. 예시적인 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 위치 9, 10, 12, 16, 및 20으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 위치에서 알킬화된 아미노산을 포함한다. 예시적인 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 위치 10, 12, 및 16으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 위치에서 알킬화된 아미노산을 포함한다. 예시적인 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 위치 9, 10, 12, 16, 및 20으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 위치에서 알킬화된 아미노산을 포함한다. 예시적인 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 위치 10 및 12로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 위치에서 알킬화된 아미노산을 포함한다. 예시적인 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 위치 12에서 알킬화된 아미노산을 포함한다. 예시적인 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 C-말단 연장과 위치 9, 10, 12, 16, 20, 및 37-43 (이를 테면, 40)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 위치에서 알킬화된 아미노산을 포함한다. 알킬기는 글루카곤 유사체의 아미노산에 직접적으로 공유적으로 연결되거나, 또는 스페이스를 통하여 글루카곤 유사체의 아미노산에 간접적으로 연결되며, 여기에서 스페이스는 글루카곤 유사체의 아미노산과 알킬기 사이에 위치된다. 글루카곤 유사체는 친수성 모이어티가 연결된 것과 동일한 위치에서, 또는 상이한 아미노산 위치에서 알킬화된다. 비제한적 예로는 위치 10에서 아실화 및 글루카곤 유사체의 C-말단 부분에서 하나 또는 그 이상의 위치, 이를 테면, 위치 24, 28 또는 29, C-말단 연장부 내에, 또는 C-말단 (이를 테면, C-말단 Cys 추가를 통하여)에서 페길화를 포함한다.
특정 측면에서, 글루카곤 유사체는 글루카곤 유사체의 아미노산 측쇄의 아민, 하이드록시 또는 티올의 직접적인 알킬화에 의한 알킬기를 포함하도록 변형된다. 일부 구체예들에서, 알킬화는 글루카곤 유사체의 위치 10, 20, 24, 또는 29에서 일어난다. 이에 대하여, 알킬화된 글루카곤 유사체는 서열 번호: 2의 아미노산 서열, 또는 여기에서 설명된 하나 이상의 아미노산 변형들을 포함하는 이의 변형된 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 위치 10, 20, 24, 및 29의 아미노산들 중 적어도 하나는 측쇄 아민, 하이드록시 또는 티올을 포함하는 임의의 아미노산으로 변형된다. 일부 특정 구체예들에서, 글루카곤 유사체의 직접적인 알킬화는 위치 10의 아미노산의 측쇄 아민, 하이드록시 또는 티올을 통하여 일어난다.
일부 구체예들에서, 측쇄 아민을 포함하는 아미노산은 화학식 I의 아미노산이다. 일부 예시적인 구체예에서, 화학식 I의 아미노산은 화학식 I에서 n은 4인 아미노산(Lys) 또는 n은 3인 아미노산(Orn)이 된다.
다른 구체예들에서, 측쇄 하이드록시를 포함하는 아미노산은 화학식 II의 아미노산이다. 일부 예시적인 구체예에서, 화학식 II의 아미노산은 화학식 II에서 n은 1인 아미노산(Ser)이 된다.
다른 구체예에서, 측쇄 티올을 포함하는 아미노산은 화학식 III의 아미노산이다. 일부 예시적인 구체예에서, 화학식 III의 아미노산은 화학식 III에서 n은 1 인 아미노산(Cys)이 된다.
다른 구체예에서, 측쇄 아민, 하이드록시 또는 티올을 포함하는 아미노산은 화학식 I, II, 또는 III의 동일한 구조지만, 단지 화학식 I, II, 또는 III의 아미노산의 알파 탄소에 결합된 수소가 제 2 측쇄로 대체된, 이중치환된 아미노산이다.
일부 구체예들에서, 알킬화된 글루카곤 유사체는 유사체와 알킬기 사이에 스페이스를 포함한다. 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 스페이스에 공유적으로 결합되며, 이때 스페이스는 알킬기에 공유적으로 결합된다. 일부 예시적인 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 스페이스의 아민, 하이드록시 또는 티올에 의한 알킬화에 의한 알킬기를 포함하도록 변형되는데, 이때 스페이스는 글루카곤 유사체의 위치 10, 20, 24, 또는 29의 아미노산 측쇄에 부착된다. 스페이스가 부착된 아미노산은 스페이스에 링크를 할 수 있는 모이어티를 포함하는 임의의 아미노산일 수 있다. 예를 들면, 측쇄 NH2, -OH, 또는 -COOH (예를 들면, Lys, Orn, Ser, Asp, 또는 Glu)를 포함하는 아미노산이 적합하다. 이 점에 있어서, 아실화된 글루카곤 유사체는 여기에서 논의된 것과 같이, 위치 10, 20, 24, 및 29의 아미노산 중 하나가 측쇄 아민, 하이드록시, 또는 카르복시산염을 포함하는 임의의 아미노산으로 변형된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 서열 번호: 1의 변형된 아미노산 서열을 포함할 수도 있다.
일부 구체예들에서, 스페이스는 측쇄 아민, 하이드록시 또는 티올을 포함하는 아미노산, 측쇄 아민, 하이드록시, 또는 티올을 포함하는 아미노산으로 구성된 이가 펩티드 또는 삼가펩티드다.
알킬화가 스페이스의 아민기를 통하여 일어날 경우, 알킬화는 아미노산의 알파 아민 또는 측쇄 아민을 통하여 일어날 수 있다. 알파 아민이 알킬화된 경우라면, 스페이스의 아미노산은 임의의 아미노산이 될 수 있다. 예를 들면, 스페이스의 아미노산은 소수성 아미노산, 예를 들면, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Met, Phe, Tyr, 6-아미노 헥사논산, 5-아미노 발레르산, 7-아미노 헵타논산, 및 8-아미노옥타논산이 될 수 있다. 대안으로, 알킬화가 산성 잔기의 알파 아민에서 일어난다면 스페이스의 아미노산은 산성 잔기, 예를 들면, Asp 및 Glu이 될 수 있다. 스페이스 아미노산의 측쇄 아민이 알킬화된 경우에, 스페이스의 아미노산은 측쇄 아민을 포함하는 아미노산, 예를 들면, 화학식 I의 아미노산(예를 들면, Lys 또는 Orn)이 된다. 이 경우, 스페이스의 아미노산의 알파 아민 및 측쇄 아민 모두 알킬화되는 것이 가능하여, 이런 글루카곤 유사체는 이중-알킬화된다. 본 발명의 구체예들은 이와 같은 이중-알킬화된 분자들을 포함한다.
알킬화는 스페이스의 하이드록시기를 통하여 일어나고, 아미노산 또는 이가펩티드 또는 삼가펩티드의 아미노산 중 하나는 화학식 II의 아미노산이 될 수 있다. 특정 예시적인 구체예에서, 아미노산은 Ser이다.
알킬화는 스페이스의 티올기를 통하여 일어나고, 아미노산 또는 이가펩티드 또는 삼가펩티드의 아미노산 중 하나는 화학식 III의 아미노산이 될 수 있다. 특정 예시적인 구체예에서, 아미노산은 Cys이다.
일부 구체예에서, 스페이스는 친수성 2기능성 스페이스다. 특정 구체예에서, 친수성 2기능성 스페이스는 두 개 이상의 반응기 예를 들면, 아민, 하이드록시, 티올, 카르복실기 또는 이의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서, 친수성 2기능성 스페이스는 하이드록시기 및 카르복시산염을 포함한다. 다른 구체예들에서, 친수성 2기능성 스페이스는 아민기 및 카르복시산염을 포함한다. 다른 구체예들에서, 친수성 2기능성 스페이스는 티올기 및 카르복시산염을 포함한다. 특정 구체예에서, 스페이스는 아미노 폴리(알킬옥시)카르복시산염을 포함한다. 이에 대하여, 스페이스는 예를 들면, NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH(여기서, m은 1 내지 6까지 중 임의의 정수가 되며, n은 2 내지 12까지의 정수중 임의의 정수가 된다)를 포함하며, 예를 들면, 8-아미노-3,6-디옥사옥타논산을 포함하며, 이는 Peptide International, Inc. (Louisville, KY)에서 시판된다.
일부 구체예에서, 스페이스는 소수성 2기능성 스페이스다. 소수성 2기능성 스페이스는 본 기술 분야에 공지되어 있다. 특정 구체예에서, 소수성 2기능성 스페이스는 두 개 이상의 반응 기, 예를 들면, 아민, 하이드록시, 티올, 및 카르복실기 또는 이의 임의의 복합을 포함한다. 특정 구체예에서, 소수성 2기능성 스페이스는 하이드록시기 및 카르복시산염을 포함한다. 다른 구체예들에서, 소수성 2기능성 스페이스는 아민기 및 카르복시산염을 포함한다. 다른 구체예들에서, 친수성 2기능성 스페이스는 티올기 및 카르복시산염을 포함한다. 카르복시산염, 그리고 하이드록시기 또는 티올기를 포함하는 적합한 소수성 2기능성 스페이스는 본 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 8-하이드록시옥타논산 및 8-멀캅토옥타논산을 포함한다.
특정 구체예들에서, 스페이스 (예를 들면, 아미노산, 이가 펩티드, 삼가펩티드, 친수성 2기능성, 또는 소수성 2기능성 스페이스)는 길이가 3 내지 10개 원자 (예를 들면, 6 내지 10 원자, 예를 들면, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 원자)가 된다. 좀더 특정한 구체예들에서, 스페이스는 길이가 약 3 내지 10개 원자 (예를 들면, 6 내지 10 원자)이며, 아실기는 C12 내지 C18의 지방성 아실기, 예를 들면, C14 지방성 아실기, C16 지방성 아실기가 되며, 스페이스와 아실기의 전체 길이는 14 내지 28개 원자, 예를 들면, 약 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 원자의 길이가 된다. 일부 구체예에서, 스페이스 및 아실기의 길이는 17 내지 28개 (예를 들면, 19 내지 26개, 19 내지 21개)의 원자다.
특정 전술한 구체예들에 따르면, 2기능성 스페이스는 3 내지 10개 원자의 길이로 된 아미노산 기본 골격을 포함하는 합성되거나 또는 자연적으로 생성되지 않는 또는 코드화안된 아미노산(예를 들면, 6-아미노 헥사논산, 5-아미노발레르산, 7-아미노헵타논산, 및 8-아미노옥타논산)이 될 수 있다. 대안으로, 스페이스는 3 내지 10개 원자 (예를 들면, 6 내지 10개 원자)의 길이로 된 펩티드 기본 골격을 가지는 이가 펩티드 또는 삼가 펩티드 스페이스다. 이가 펩티드 또는 삼가 펩티드 스페이스는 여기에서 명시된 것을 포함하는 자연적으로 생성되는 및/또는 자연적으로 생성되지 않는 또는 코드화안된 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 구체예에서, 스페이스는 전체적으로 음전하, 예를 들면, 하나 또는 두 개의 음전하를 띈 아미노산을 포함한다. 일부 구체예들에서, 이가 펩티드 스페이스는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다: Ala-Ala, β-Ala- β-Ala, Leu-Leu, Pro-Pro, γ-아미노부티르산-γ-아미노부티르산, 및 γ-Glu-γ-Glu.
아민, 하이드록시, 및 티올을 통한 펩티드 알킬화의 적절한 방법들은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, Williamson 에테르 합성은 글루카곤 유사체의 하이드록시기와 알킬기 사이에 에테르 링키지를 형성시키는데 이용될 수 있다. 또한, 알킬 할로겐화물과 펩티드의 친핵성 치환 반응으로 에테르, 티오에테르, 또는 아미노 링키지 중 하나를 만들 수 있다.
알킬화된 글루카곤 유사체의 알킬기는 임의의 크기가 될 수 있으며, 임의의 길이의 탄소 사슬을 포함할 수 있으며, 선형 또는 분지형이다. 일부 구체예에서, 알킬기는 C4 내지 C30의 알킬이다. 예를 들면, 알킬기는 C4 알킬, C6 알킬, C8 알킬, C1O 알킬, C12 알킬, C14 알킬, C16 알킬, C18 알킬, C20 알킬, C22 알킬, C24 알킬, C26 알킬, C28 알킬, 또는 C30 알킬 중 임의의 것이 될 수 있다. 일부 구체예에서, 알킬은 C8 내지 C20의 알킬, 예를 들면, C14 알킬 또는 C16 알킬을 포함한다.
일부 특정 구체예들에서, 알킬기는 담즙산, 예를 들면, 콜린산, 케노데옥시콜린산, 데옥시콜린산, 리토콜린산, 타우로콜린산, 글리코콜린산 및 콜레스테롤 산의스테로이드 모이어티를 포함한다.
일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 친핵성, 긴 사슬 알칸을 글루카곤 유사체와 반응시켜 알킬화된 아미노산을 포함하는데, 여기서, 글루카곤 유사체는 친핵성 치환에 적합한 이탈기를 포함한다. 특정 측면들에서, 긴 사슬 알칸의 친핵성기는 아민, 하이드록시 또는 티올기 (예를 들면, 옥타데실아민, 테트라데카놀 및 헥사데칸티올)를 포함한다. 글루카곤 유사체의 이탈기는 아미노산의 측쇄의 일부분이거나, 펩티드 기본 골격의 일부분이 될 수 있다. 적합한 이탈기는 예를 들면, N-하이드록시숙시니미드, 할로겐, 및 술폰산염 에스테르를 포함한다.
특정 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 친핵성, 긴 사슬 알칸과 글루카곤 유사체에 부착된 스페이스와 반응시킴으로써 알킬기를 포함하도록 변형되는데, 여기서, 스페이스는 이탈기를 포함한다. 특정 측면들에서, 긴 사슬 알칸은 아민, 하이드록시 또는 티올기를 포함한다. 특정 구체예들에서, 이탈기를 포함하는 스페이스는 여기에서 논의된 임의의 스페이스가 될 수 있는데, 예를 들면, 아미노산, 이가 펩티드, 삼가 펩티드, 친수성 2기능성 스페이스, 적합한 이탈기를 더 포함하는 소수성 2기능성 스페이스가 될 수 있다.
긴 사슬 알칸은 글루카곤 유사체 또는 스페이스에 의해 알킬화되는 본 발명의 이와 같은 측면에 있어서, 긴 사슬 알칸은 임의의 크기가 될 수 있으며, 임의의 길이의 탄소 사슬을 포함할 수 있다. 긴 사슬 알칸은 선형 또는 분지형이다. 특정 측면에서, 긴 사슬 알칸은 C4 내지 C30의 알칸이다. 예를 들면, 긴 사슬 알칸은 C4 알칸, C6 알칸, C8 알칸, C1O 알칸, C12 알칸, C14 알칸, C16 알칸, C18 알칸, C20 알칸, C22 알칸, C24 알칸, C26 알칸, C28 알칸, 또는 C30 알칸 중 임의의 것이 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 긴 사슬 알칸은 C8 내지 C20의 알칸, 예를 들면, C14 알칸, C16 알칸, 또는 C18 알칸을 포함한다.
또한, 일부 구체예들에서, 알킬화는 글루카곤 유사체와 콜레스테롤 모이어티 사이에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 콜레스테롤의 하이드록시기는 긴 사슬 알칸상의 이탈기를 치환시켜, 콜레스테롤-글루카곤 유사체 산물이 형성된다.
여기에서 논의된 바와 같은 알킬화된 글루카곤 유사체는 친수성 모이어티를 포함하도록 더 변형될 수 있다. 일부 특정 구체예에서, 친수성 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 사슬를 포함한다. 친수성 모이어티의 통합은 임의의 적합한 수단들, 예를 들면, 여기에서 설명되는 임의의 방법에 의해 이루어질 수 있다. 이점에 있어서, 알킬화된 글루카곤 유사체는 여기에서 설명된 아미노산 변형들 중 하나 이상을 포함하는 변형된 아미노산 서열을 포함하는 변형된 서열 번호: 1을 포함할 수 있고, 여기에서, 위치 10, 20, 24, 및 29의 아미노산들 중 최소 하나는 알킬기를 포함하고, 위치 16, 17, 21 , 24, 및 29, C-말단 연장 연장부내의 위치 또는 C- 말단 아미노산 중 적어도 하나는 변형된 Cys, Lys, Orn, 호모-Cys, 또는 Ac-Phe으로 변형되며, 그리고 아미노산의 측쇄는 친수성 모이어티 (예를 들면, PEG)에 공유 결합된다. 일부 구체예에서, 알킬기는 위치 10에서, 선택적으로 Cys, Lys, Om, 호모-Cys, 또는 Ac-Phe를 포함하는 스페이스를 통하여 부착되며, 그리고 친수성 모이어티는 위치 24의 Cys 잔기에 통합된다.
대안으로, 알킬화된 글루카곤 유사체는 스페이스를 포함하는데, 여기서, 스페이스는 알킬화되고, 친수성 모이어티를 포함하도록 변형된다. 적합한 스페이스의 비-제한적 실시예에는 Cys, Lys, Orn, 호모-Cys, 및 Ac-Phe으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 스페이스가 포함된다.
알파 헬릭스 및 알파 헬릭스 조장 아미노산의 안정화
임의의 특정 이론에 결부되지 않고, 본 명세서에서 기술된 글루카곤 유사체는 나선 구조, 이를 테면, 알파 헬릭스를 포함한다. 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체은 알파 나선 구조를 안정화시키는 아미노산을 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, 글루카곤 유사체는 하나 또는 그 이상 알파 헬릭스 조장 아미노산을 포함한다. 여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "알파 헬릭스 조장(promoting) 아미노산"은 글루카곤 유사체의 일부인 알파 헬릭스의 안정성을 증가시키는 아미노산을 의미한다. 알파 헬릭스 조장 아미노산은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, Lyu et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 88: 5317-5320 (1991); Branden & Tooze, Introduction to Protein Structure, Garland Publishing, New York, NY, 1991; Fasman, Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Con형성, ed. Fasman, Plenum, NY, 1989). 본 명세서의 목적에 적합한 알파 헬릭스 조장 아미노산은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 알라닌, 노르발린, 노르루이신, 알파 아미노부틸산, 알파-아미노이소부틸산, 류신, 이소류신, 발린, 및 이와 유사한 것. 일부 구체예들에서, 알파 헬릭스 조장 아미노산은 자연적으로 생성되는 단백질에서 발현되는 알파 헬릭스의 일부인 임의의 아미노산, 이를 테면, Leu, Phe, Ala, Met, Gly, Ile, Ser, Asn, Glu, Asp, Lys, Arg이다.
일부 구체예들에서, 알파 헬릭스 조장 아미노산은 글리신 또는 알라닌과 비교하였을 때 알파 헬릭스에 더 많은 안정성을 제공한다. 일부 구체예들에서, 알파 헬릭스 조장 아미노산는 알파, 알파 이중-치환된 아미노산이다.
알파 헬릭스: 알파 헬릭스 조장 아미노산의 위치
일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 고유의 글루카곤 (서열 번호: 1)과 유사한 아미노산 서열을 포함하고, 글루카곤 유사체는 최소한 하나의 알파 헬릭스 조장 아미노산을 포함한다. 일부 구체예들에서, 알파 헬릭스 조장 아미노산은 위치 12 내지 29중 임의의 위치 (고유의 글루카곤 (서열 번호: 1)의 번호매김에 따라)에 위치된다. 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 서열 번호: 1의 변형된 아미노산 서열을 포함하고, 위치 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29중 하나 또는 그 이상의 위치에서 최소한 하나의 알파 헬릭스 조장 아미노산을 포함한다. 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 위치 16, 17, 20, 및 21중 하나, 둘, 셋 또는 이들 모두에서 알파 헬릭스 조장 아미노산을 포함한다.
알파 헬릭스: 알파, 알파 이중-치환된 아미노산
일부 구체예들에서, 알파 헬릭스 조장 아미노산은 알파,알파 이중-치환된 아미노산이다. 특정 구체예들에서, 알파, 알파 이중-치환된 아미노산은 R1 및 R2를 포함하는데, 이들 각각은 알파 탄소에 결합되며, 여기에서 각 R1 및 R2는 히드록실, 아미드, 티올, 할로로 임의선택적으로 치환된 C1-C4 알킬로 구성된 군에서 독립적으로 선택되거나, 또는 R1 및 R2는 이들에 부착된 알파 탄소와 함께 고리(이를 테면, C3-C8 고리)를 형성한다. 일부 구체예들에서, 각 R1 및 R2는 메틸, 에틸, 프로필, 및 n-부틸로 구성된 군으로부터 선택되고, 또는 R1 및 R2는 함께 시클로옥탄 또는 시클로헵탄 (이를 테면, 1-아미노시클로옥탄-1-카르복실산)을 형성한다. 일부 구체예들에서, R1 및 R2는 동일하다. 일부 구체예들에서, R1은 R2와 상이하다. 특정 측면에서, 각 R1 및 R2는 C1-C4 알킬이다. 일부 측면에서, 각 R1 및 R2는 C1 또는 C2 알킬이다. 일부 구체예들에서, 각 R1 및 R2는 메틸이며, 알파, 알파 이중치환된 아미노산은 알파-아미노이소부틸산 (AIB)이다.
일부 측면에서, 본 명세서에서 기술된 글루카곤 유사체은 하나 또는 그 이상 알파, 알파 이중-치환된 아미노산을 포함하고, 글루카곤 유사체는 특히 분자내 공유 다리 (이를 테면, 락탐)가 부족한데, 알파, 알파 이중치환된 아미노산은 공유 다리 없이 알파 헬릭스를 안정화시킬 수 있다. 일부 측면에서, 글루카곤 유사체는 C-말단(위치 12-29 주변)에서 하나 또는 그 이상 알파, 알파 이중-치환된 아미노산을 포함한다. 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체의 위치 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 28, 또는 29중 하나, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상은 α, α-이중치환된 아미노산, 이를 테면, 아미노 이소부틸산 (AIB), 메틸, 에틸, 프로필, 및 n-부틸에서 선택된 동일한 또는 상이한 기로 이중 치환된, 또는 시클로옥탄 또는 시클로헵탄 (이를 테면, 1-아미노시클로옥탄-1-카르복실산)으로 이중치환된 아미노산으로 치환된다. 예를 들면, 위치 16을 AIB로 치환시키면 분자내 다리, 이를 테면, 비-공유 분자내 다리 (이를 테면, 염 다리) 또는 분자내 공유 다리 (이를 테면, 락탐) 없이 GLP-1 활성을 강화시킨다. 일부 구체예들에서, 위치 16, 20, 21 또는 24중 하나, 둘, 셋 또는 그 이상은 AIB로 치환된다. 특정 구체예들에서, 고유의 인간 글루카곤 (서열 번호: 1)의 위치 2, 16에 대응하는 아미노산중 하나 또는 둘 모두가 알파, 알파 이중치환된 아미노산, 가령 AIB로 치환된다.
일부 구체예에 따르면, 분자내 다리가 없는 글루카곤 유사체는 α, α-이중치환된 아미노산으로 하나 또는 그 이상의 치환과 글루카곤 유사체의 위치 10에서 아미노산의 측쇄에 공유적으로 부착된 아실 또는 알킬기를 포함한다. 특정 구체예들에서, 아실 또는 알킬기는 아미노산에서 자연적으로 생성되지 않는다. 특정 측면에서, 아실 또는 알킬기는 위치 10의 아미노산에서 비-고유한 것이다. 분자내 다리가 부족한 이러한 아실화된 또는 알킬화된 글루카곤 펩티드는 비-아실화된 대응하는 펩티드와 비교하였을 때, GLP-1 및 글루카곤 수용체에서 강화된 활성을 나타낸다. GLP-1 및 글루카곤 수용체에서 활성의 추가 강화는 아실 또는 알킬기와 이 유사체의 위치 10의 아미노산 측쇄 사이에 스페이스를 통합시킴으로써 분자내 다리가 부족한 아실화된 글루카곤 펩티드에 의해 획득될 수 있다. 스페이스의 통합과 함께 또는 스페이스의 통합없이, 아실화 및 알킬화는 본 명세서에서 더 설명된다.
알파 헬릭스: 분자내 다리
일부 구체예들에서, 알파 헬릭스 조장 아미노산은 분자내 다리를 통하여 글루카곤 유사체의 또다른 아미노산에 연결된 아미노산이다. 이러한 구체예들에서, 분자내 다리를 통하여 연결된 이들 두 아미노산 각각은 알파 헬릭스 조장 아미노산으로 간주된다. 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 하나 또는 두개의 분자내 다리를 포함한다. 일부 특이적 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 최소한 하나의 또다른 알파 헬릭스 조장 아미노산, 이를 테면, 알파, 알파-이중치환된 아미노산과 복합된 하나의 분자내 다리를 포함한다.
일부 구체예들에서, 분자내 다리는 예를 들면, van der Waals 상호작용, 수소 결합, 이온 결합, 소수성 상호작용, 쌍극자-쌍극자 상호작용, 및 이와 유사한 것을 포함하는, 비공유 결합을 통하여 글루카곤 유사체의 두 부분을 연결시키는 다리다. 이점에 있어서, 글루카곤 유사체는 특정 측면에서 비-공유 분자내 다리를 포함한다. 일부 구체예들에서, 비-공유 분자내 다리는 염 다리이다.
일부 구체예들에서, 분자내 다리는 공유 결합을 통하여 이 유사체의 두 부분을 연결하는 다리다. 이점에 있어서, 글루카곤 유사체는 특정 측면에서 분자내 공유 다리를 포함한다.
일부 구체예들에서, 분자내 다리 (이를 테면, 비-공유 분자내 다리, 공유 분자내 다리)는 3개의 아미노산이 떨어져 있는, 이를 테면, 위치 i 및 i+4에서의 두 아미노산 사이에 형성되는데, 여기에서 i는 12와 25 사이의 임의의 정수 (이를 테면, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 및 25)이다. 더 구체적으로, 아미노산 쌍 12와 16, 16과 20, 20과 24 또는 24와 28의 측쇄 (i = 12, 16, 20, 또는 24인 아미노산 쌍)는 서로 연결되고, 따라서 글루카곤 알파 헬릭스를 안정화시킨다. 대안으로, i는 17일 수 있다. 일부 특이적 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 아미노산 17과 21 사이의 분자내 다리를 포함한다. 일부 특이적 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 위치 16과 20 또는 12와 16의 아미노산 사이에 분자내 다리와 위치 17과 21의 아미노산 사이에 제 2 분자내 다리를 포함한다. 하나 또는 그 이상 분자내 다리를 포함하는 글루카곤 유사체가 본 명세서에서 고려된다. 특정 구체예들에서, 여기에서 위치 i 및 i+4에서 아미노산은 분자내 다리에 의해 연결되며, 링커의 크기는 약 8개 원자, 또는 약 7-9개 원자이다.
다른 구체예들에서, 분자내 다리는 2개 아미노산이 떨어져 있는, 이를 테면, 위치 j와 j+3에서 두 아미노산 사이에서 형성되는데, 여기에서 j는 12과 26 사이의 임의의 정수(이를 테면, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 및 26)이다. 일부 특이적 구체예들에서, j는 17이다. 특정 구체예들에서, 여기에서 위치 j와 j+3에서 아미노산은 분자내 다리에 의해 연결되며, 링커의 크기는 약 6개 원자, 또는 약 5-7개 원자이다.
여전히 다른 구체예들에서, 분자내 다리는 6개 아미노산이 떨어져 있는, 이를 테면, 위치 k와 k+7에서 두 아미노산 사이에서 형성되는데, 여기에서 j는 12과 22 사이의 임의의 정수(이를 테면, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 및 22)이다. 일부 특이적 구체예들에서, k는 12, 13, 또는 17이다. 예시적인 구체예에서, k는 17이다.
알파 헬릭스: 분자내 다리에 관련된 아미노산
6개-원자 연결 다리를 형성하기 위하여 결합(공유적으로 또는 비공유적으로)할 수 있는 아미노산 쌍을 형성하는 예로는 Orn과 Asp, Glu와 화학식 I의 아미노산(여기에서 n은 2임), 그리고 호모글루타민산과 화학식 I(여기에서 n은 1임)의 아미노산을 포함하고, 여기에서 화학식 I은 다음과 같다:
Figure 112014006402078-pct00005
여기에서 n = 1 내지 4
[화학식 I]
7개-원자 연결 다리를 형성하기 위하여 결합(공유적으로 또는 비공유적으로)할 수 있는 아미노산 쌍을 형성하는 예로는 Orn-Glu (락탐 고리); Lys-Asp (락탐); 또는 호모ser-호모glu (락톤)을 포함한다. 8개-원자 링커를 형성할 수 있는 아미노산 쌍을 형성하는 예로는 Lys-Glu (락탐); 호모lys-Asp (락탐); Orn-호모glu (락탐); 4-아미노Phe-Asp (락탐); 또는 Tyr-Asp (락톤)을 포함한다. 9개-원자 링커를 형성할 수 있는 아미노산 쌍을 형성하는 예로는 호모lys-Glu (락탐); Lys-호모glu (락탐); 4-아미노Phe-Glu (락탐); 또는 Tyr-Glu (락톤)을 포함한다. 이들 아미노산에서 임의의 측쇄는 알파-헬릭스의 3차원 구조가 파괴되지 않는 한, 추가 화학기로 추가적으로 치환될 수 있다. 당업계 숙련자는 유사한 크기의 안정화된 구조 및 바람직한 효과를 창조할 수 있는 화학적으로 변형된 유도체를 포함하는, 대안 쌍형성 또는 대안 아미노산 유사체를 상상할 수 있을 것이다. 예를 들면, 호모시스테인-호모시스테인 이황화 다리는 길이가 6개 원자이며, 바람직한 효과를 제공하기 위하여 추가 변형될 수 있다.
공유 링키지가 없더라도, 상기에서 설명된 아미노산 쌍형성(pairings) (또는 당업자는 유사한 쌍형성을 생각할 수 있다)은 비-공유 결합, 예를 들면, 염 다리의 형성 또는 수소-결합 상호작용을 통하여, 알파-헬릭스에 추가적인 안정성을 또한 제공할 수 있다. 따라서, 염 다리는 Orn과 Glu; Lys과 Asp; 호모-세린과 호모-글루타민산염; Lys과 Glu; Asp과 Arg; 호모-Lys과 Asp; Orn과 호모-글루타민산염; 4-아미노Phe과 Asp; Tyr과 Asp; 호모-Lys과 Glu; Lys과 호모-Glu; 4-아미노Phe과 Glu; 또는 Tyr과 Glu 사이에 형성될 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 유사체는 다음의 아미노산 쌍중 임의의 것에서 염 다리를 형성한다: Orn과 Glu; Lys과 Asp; Lys과 Glu; Asp과 Arg; 호모-Lys과 Asp; Orn과 호모-글루타민산염; 호모-Lys과 Glu; 그리고 Lys과 호모-Glu. 염 다리는 반대로 하전된 측쇄의 다른 쌍들 사이에 형성될 수 있다. 이를 테면, Kallenbach et al., Role of Peptide Bond in Protein Structure and Folding, in The Amide linkage: Structural Significance in Chemistry, Biochemistry, and Materials Science, John Wiley & Sons, Inc. (2000) 참고.
일부 구체예들에서, 비-공유 분자내 다리는 소수성 다리다. 한 구체예에 따르면, 유사체의 알파 헬릭스는 위치 j와 j+3 또는 i와 i+4에서 소수성 아미노산의 통합을 통하여 안정화된다. 예를 들면, i는 Tyr일 수 있고, i+4는 Val 또는 Leu일 수 있으며; i는 Phe일 수 있고, i+4는 Met일 수 있고; 또는 i는 Phe일 수 있고 i+4는 Ile일 수 있다. 본 명세서에서의 목적을 위하여 상기 아미노산 쌍형성이 역전될 수 있는데, 위치 i에서 아미노산은 i+4에 대안으로 위치될 수 있고, 한편 i+4 아미노산은 위치 i에 위치될 수 있다. j와 j+3에서 적합한 아미노산 쌍형성이 있을 수 있음을 또한 이해할 것이다.
알파 헬릭스: 공유 분자내 다리
일부 구체예들에서, 공유 분자내 다리는 락탐 고리 또는 락탐 다리이다. 락탐 고리의 크기는 아미노산 측쇄의 길이에 따라 달라지는데, 한 구체예에서, 락탐은 아스파르트산 측쇄에 오르니틴 측쇄를 연결시킴으로써 형성된다. 락탐 다리 및 이를 만드는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, Houston, Jr., et al., J Peptide Sci 1: 274-282 (2004), 및 본 명세서의 실시예 1 참고. 일부 구체예들에서, 이 유사체는 서열 번호: 1의 변형된 서열 및 i와 i+4사이에서 락탐 다리를 포함하는데, 여기에서 I는 상기에서 정의된 바와 같다. 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 2개의 락탐 다리를 포함하는데: 하나는 위치 16과 20의 아미노산 사이, 그리고 또다른 하나는 위치 17과 21의 아미노산 사이. 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 한 개의 락탐 다리와 한 개의 염 다리를 포함한다. 추가 예시적인 구체예들은 "실시예"로 된 부분에서 설명된다. 추가 예시적인 구체예들은 임의선택적으로 락탐 다리를 가진, 다음의 쌍형성을 포함한다: 위치 12의 Glu와 위치 16의 Lys; 위치 12의 고유의 Lys과 위치 16의 Glu; 위치 16의 Glu와 위치 20의 Lys; 위치 16의 Lys와 위치 20의 Glu; 위치 20의 Glu과 위치 24의 Lys; 위치 20의 Lys과 위치 24의 Glu; 위치 24의 Glu과 위치 28의 Lys; 위치 24의 Lys과 위치 28의 Glu.
일부 구체예들에서, 공유 분자내 다리는 락톤이다. 락톤 다리를 만드는 적합한 방법들은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, Sheehan et al., J Am Chem Soc 95: 875-879 (1973) 참고.
일부 측면에서, 올레핀 복분해(metathesis)는 모든-탄화수소 교차-연결 시스템을 이용하여 이 유사체의 알파 헬릭스의 하나 또는 두 개의 턴(turn)을 교차 연결시키는데 이용된다. 이 경우에서 글루카곤 유사체는 j와 j+3 또는 i와 i+4 위치에서 R 또는 S 입체 화학으로 배열되고, 다양한 길이의 올레핀 측쇄를 보유하는 α-메틸화된 아미노산을 포함한다. 일부 구체예들에서, 올레핀 측면은 (CH2)n을 포함하는데, 여기에서 n은 1 내지 6 사이의 임의의 정수다. 일부 구체예들에서, n은 8개 원자 길이의 교차-연결에서는 3이다. 일부 구체예들에서, 6개 원자 길이의 교차-연결에서는 n은 2이다. 올레핀 교차-연결을 포함하는 예시적인 글루카곤 유사체는 본 명세서에서 서열 번호: 17로 설명된다. 이러한 분자내 다리를 형성하는 적합한 방법들은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122: 5891-5892 (2000) 및 Walensky et al., Science 305: 1466-1470 (2004) 참고. 대안 구체예들에서, 이 유사체는 인접 나선 턴에 위치한 O-알릴 Ser 잔기들을 포함하는데, 이들은 루테늄-촉매화된 고리 닫힘 복분해를 통하여 서로 다리를 형성한다. 교차-연결의 이러한 절차는 예를 들면, Blackwell et al., Angew, Chem., Int. Ed. 37: 3281-3284 (1998)에서 설명된다.
특정 측면에서, 시스틴의 펩티드모방체로써 광범위하게 채택되는 비천연 티오-디알라닌 아미노산, 란티오닌을 이용하여 알파 헬릭스의 한 개 턴을 교차-연결한다. 란티오닌-기반의 고리형성의 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, Matteucci et al., Tetrahedron Letters 45: 1399-1401 (2004); Mayer et al., J. Peptide Res. 51: 432-436 (1998); Polinsky et al., J. Med. Chem. 35: 4185-4194 (1992); Osapay et al., J. Med. Chem. 40: 2241-2251 (1997); Fukase et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 65: 2227-2240 (1992); Harpp et al., J. Org. Chem. 36: 73-80 (1971); Goodman and Shao, Pure Appl. Chem. 68: 1303-1308 (1996); 및 Osapay and Goodman, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1599-1600 (1993).
일부 구체예들에서, 위치 i와 i+7에서 2개의 Glu 잔기 사이에 α, ω-디아미노알칸 테터(tethers), 이를 테면, 1,4-디아미노프로판 및 1,5-디아미노펜탄을 이용하여 이 유사체의 알파 헬릭스를 안정화시킨다. 이러한 테터는 디아미노알칸 테터의 길이에 따라, 길이가 9개 원자 또는 그 이상의 다리 형성으로 이어진다. 이러한 테터와 함께 교차 연결된 펩티드를 만드는 적합한 방법들은 당업계에서 설명된다. 예를 들면, Phelan et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 455-460 (1997).
여전히 다른 구체예들에서, 이황화 다리를 이용하여 이 유사체의 알파 헬릭스의 하나 또는 2개의 턴을 교차-연결시킨다. 대안으로, 등배 전자의(isosteric) 거대고리형성을 초래하는 황원자 하나 또는 두 개 모두가 메틸렌 기로 대체된 변형된 이황화 다리를 이용하여 이 유사체의 알파 헬릭스를 안정화시킨다. 이황화 다리 또는 황-기반의 고리형성으로 펩티드를 변형시키는 적합한 방법은 예를 들면, Jackson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 9391-9392 (1991) 및 Rudinger 및 Jost, Experientia 20: 570-571 (1964)에서 설명된다.
여전히 다른 구체예들에서, 이 유사체의 알파 헬릭스는 j와 j+3, 또는 i와 i+4에 위치된 2개의 His 잔기들 또는 His와 Cys 쌍에 의해 금속 원자 결합을 통하여 안정화된다. 금속 원자는 예를 들면, Ru(III), Cu(II), Zn(II), 또는 Cd(II)일 수 있다. 이러한 금속 결합-기반의 알파 헬릭스 안정화 방법들은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, Andrews 및 Tabor, Tetrahedron 55: 11711-11743 (1999); Ghadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 1630-1632 (1990); 및 Ghadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 9063-9064 (1997).
이 유사체의 알파 헬릭스는 펩티드 고리형성의 다른 수단을 통하여 대안으로 안정화될 수 있는데, 이 수단은 Davies, J. Peptide. Sci. 9: 471-501 (2003)에서 검토된다. 알파 헬릭스는 아미드 다리, 티오에테르 다리, 티오에스테르 다리, 요소 다리, 카르밤산염 다리, 술폰아미드 다리, 및 이와 유사한 것의 형성을 통하여 안정화될 수 있다. 예를 들면, 티오에스테르 다리는 C-말단과 Cys 잔기의 측쇄 사이에 형성될 수 있다. 대안으로, 티오에스테르는 티올 (Cys) 및 카르복실산 (이를 테면, Asp, Glu)을 가진 아미노산 측쇄를 통하여 형성될 수 있다. 또다른 방법에서, 교차-연결 물질, 가령 디카르복실산, 이를 테면, 수베르산 (옥탄디온산), 등은 아미노산 측쇄의 2개의 기능기, 이를 테면, 자유 아미노기, 히드록실기, 티올기 및 이의 조합 사이에 연결을 도입시킬 수 있다.
DPP-IV 저항성 펩티드
일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 위치 1 또는 2, 또는 위치 1 및 2 모두에서 이가펩티드 펩티다제 IV (DPP IV) 절단(cleavage)에 대하여 글루카곤 유사체의 저항성을 성취하는 아미노산을 포함한다. 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산을 위치 1에 포함한다: D-히스티딘, 데스아미노히스티딘, 히드록실-히스티딘, 아세틸-히스티딘, 호모-히스티딘, N-메틸 히스티딘, 알파-메틸 히스티딘, 이미다졸 아세트산, 또는 알파, 알파-디메틸 이미다졸 아세트산 (DMIA). 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 위치 2에서 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산을 포함한다: D-세린, D-알라닌, 발린, 글리신, N-메틸 세린, N-메틸 알라닌, 또는 알파, 아미노이소부틸산. 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 위치 2에서 DPP IV에 대하여 글루카곤 유사체의 저항성을 성취하는 아미노산을 포함하는데, DPP IV에 대하여 글루카곤 유사체의 저항성을 성취하는 아미노산은 D-세린이 아니다.
일부 측면에서, DPP IV에 대하여 글루카곤 유사체의 저항성을 성취하는 아미노산을 포함하는 글루카곤 유사체는 이를 테면, 위치 "i"과 "i+4"이를 테면, 12와 16, 16과 20, 또는 20 과 24 사이의 아미노산에서 공유 결합의 형성을 통하여글루카곤의 C-말단에서 발견되는 알파 헬릭스를 안정화시키는 아미노산 변형을 더 포함한다, 일부 구체예들에서, 이 공유 결합은 위치 16에서 글루타민산과 위치 20에서 리신 사이에 락탐 다리다. 일부 구체예들에서, 이 공유 결합은 락탐 다리 이외의 분자내 다리다. 예를 들면, 적합한 공유 결합 방법은 올레핀 복분해, 란티오닌-기반의 고리형성, 이황화 다리 또는 변형된 황-보유 다리 형성, α, ω-디아미노알칸 테터의 이용, 금속-원자 다리의 형성, 및 펩티드 고리형성의 기타 수단중 임의의 하나 또는 그 이상을 포함한다.
위치 1의 변형
일부 특이적 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 (a) 위치 1에서 His은 큰, 방향족 아미노산으로의 아미노산 치환 및 (b) 이 분자의 C-말단 부분(이를 테면, 대략 위치 12-29)에 있는 알파-헬릭스를 안정화시키는 분자내 다리를 포함한다. 특정 구체예들에서, 위치 1에서 아미노산은 Tyr, Phe, Trp, 아미노-Phe, 니트로-Phe, 염소-Phe, 황-Phe, 4-피리딜-Ala, 메틸-Tyr, 또는 3-아미노 Tyr로 대체된다. 분자내 다리는 일부 구체예들에서 본 명세서에서 기술된 것들중 임의의 것이다. 일부 측면에서, 분자내 다리는 3개의 사이에 있는 아미노산에 의해 떨어져 있는 2개 아미노산의 측쇄, 가령, 아미노산 i와 i+4의 측쇄 사이에 있다. 일부 구체예들에서, 분자내 다리는 락탐 다리다. 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 위치 1에서 큰, 방향족 아미노산과 이 유사체의 위치 16과 20의 아미노산 사이에 락탐 다리를 포함한다. 이러한 글루카곤 유사체는 일부 측면에서 본 명세서에서 기술된 하나 또는 그 이상 (이를 테면, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 그 이상)의 다른 변형을 더 포함한다. 예를 들면, 글루카곤 유사체는 C-말단 카르복실레이트 위치에 아미드를 포함할 수 있다. 또한, 일부 구체예들에서, 이러한 글루카곤 유사체는 위치 17에서 하나 또는 그 이상의 큰 지방족 아미노산, 위치 18에서 이미다졸 보유 아미노산, 및 위치 19에서 양전하를 띈 아미노산을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 위치 1에서 변형과 분자내 다리는 위치 17-19에서 아미노산 서열 Ile-His-Gln을 더 포함한다. 이러한 변형은 GLP-1 수용체 및 글루카곤 수용체에서 글루카곤 유사체의 활성 파괴없이 만들어질 수 있다. 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 추가적으로 아실화된 또는 알킬화된 아미노산 잔기를 포함한다.
위치 3의 변형
일부 구체예들에서, 서열 번호: 1 (Gln3)의 세 번째 아미노산은 산성, 염기성, 또는 소수성 아미노산 잔기로 치환되고, 이러한 변형으로 글루카곤 수용체 활성이 감소된다. 일부 구체예들에서, 산성, 염기성, 또는 소수성 아미노산은 글루타민산, 오르니틴, 노르루이신이다. 일부 측면에서, 잔기들중 하나로의 변형으로 글루카곤 유사체가 실질적으로 감소된 또는 파괴된 글루카곤 수용체 활성을 나타내도록 유도된다. 일부 측면에서, 예를 들면, 글루타민산, 오르니틴, 또는 노르루이신으로 치환된 글루카곤 유사체는 글루카곤 수용체에서 고유 글루카곤 활성의 약 10% 또는 미만, 이를 테면,약 1-10%, 또는 약 0.1-10%, 또는 약 0.1% 이상이지만 약 10% 미만을 나타내고, 한편 GLP-1 수용체에서 GLP-1 활성의 최소한 20%를 나타낸다. 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 고유의 글루카곤 활성의 약 0.5%, 약 1% 또는 약 7%를 나타내고, 한편 GLP-1 수용체에서 GLP-1 활성의 최소한 20%를 나타낸다.
일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체의 서열 번호:1의 위치 3에 있는 글루타민은 활성 글루카곤 수용체에서 실질적인 활성의 상없이 글루카곤 유사체로 치환되며, 일부 경우들에서, 글루카곤 수용체 활성이 강화된다. 일부 구체예들에서, 글루타민 유사체는 구조 I, II 또는 III의 측쇄를 포함하는 자연적으로 생성되는 또는 비-자연적으로 생성되는 또는 코드화안된 아미노산이다:
Figure 112014006402078-pct00006
구조 I
Figure 112014006402078-pct00007
구조 II
Figure 112014006402078-pct00008
구조 III
여기에서 R1은 C0-3 알킬 또는 C0-3 헤테로알킬이며; R2는 NHR4 또는 C1-3 알킬이며; R3은 C1-3 알킬이며; R4는 H 또는 C1-3 알킬이며; X는 NH, O, 또는 S이고; 및 Y는 NHR4, SR3, 또는 OR3이다. 일부 구체예들에서, X는 NH이고 또는 Y는 NHR4이다. 일부 구체예들에서, R1은 C0-2 알킬 또는 C1 헤테로알킬이다. 일부 구체예들에서, R2는 NHR4 또는 C1 알킬이다. 일부 구체예들에서, R4는 H 또는 C1 알킬이다. 예시적인 구체예들에서, 구조 I의 측쇄를 포함하는 아미노산이 제공되는데, R1은 CH2-S이고, X는 NH이고, R2는 CH3(아세트아미도메틸-시스테인, C(Acm))이며; R1은 CH2이고, X는 NH이고, 및 R2는 CH3(아세틸디아미노부타논산, Dab(Ac))이고; R1은 C0 알킬이고, X는 NH이고, R2는 NHR4이고, 및 R4는 H (카르바모일디아미노프로피온산, Dap(요소))이고; 또는 R1은 CH2-CH2이고, X는 NH이고, 및 R2는 CH3 (아세틸오르니틴, Orn(Ac))이다. 예시적인 구체예들에서, 구조 II의 측쇄를 포함하는 아미노산이 제공되는데, 여기에서 R1은 CH2이고, Y는 NHR4이고, R4는 CH3(메틸글루타민, Q(Me))이다; 예시적인 구체예들에서, 구조 III의 측쇄를 포함하는 아미노산이 제공되는데 여기에서 R1은 CH2이고 R4는 H (메티오닌-술폭시드, M(O))이고; 특정 구체예들에서, 위치 3의 아미노산은 Dab(Ac)으로 치환된다. 예를 들면, 글루카곤 항진제는 2009년 6월 16일자로 제출된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2009/047438(이의 전문이 여기에 참고자료로 편입된다)의 서열 목록에서 서열 번호: 595, 서열 번호: 601 서열 번호: 603, 서열 번호: 604, 서열 번호: 605, 및 서열 번호: 606의 변형된 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 여기에서 이들 아미노산 서열은 본 명세서에서 기술된 것과 같이 변형되는데, 이를 테면, 최소한 3개의 알파 헬릭스 조장 아미노산을 포함하도록 변형되고, (i) 위치 10에서 아실화된 또는 알킬화된 아미노산이 포함되도록, (ii) 위치 16에서 알파 헬릭스 조장 아미노산이 포함되도록, (iii) 위치 17 및/또는 18에서 지방족 아미노산이 포함되도록, 그리고 (iv) 위치 27에 대해 C-말단에 위치한 최소한 하나의 하전된 아미노산이 포함되도록 변형되며, 그리고 임의선택적으로, 추가 변형이 포함되도록 변형된다; 글루카곤 유사체의 대응하는 위치에서 Exendin-4 (서열 번호: 8)의 아미노산 18-24의 최소한 3개의 아미노산을 포함하도록 변형된다.
위치 7의 변형
일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 위치 7에서 아미노산 변형을 가진 변형된 서열 번호: 1을 포함한다. 일부 측면에서, 서열 번호: 1의 위치 7의 아미노산(Thr)은 큰 지방족 아미노산, 이를 테면, Ile, Leu, Ala, 및 이와 유사한 것으로 치환된다. 이러한 변형은 GLP-1 수용체에서 글루카곤 유사체의 활성을 급격하게 감소시키는 것으로 생각된다.
위치 15의 변형
일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 안정성을 개선시키는 위치 15의 아미노산 변형을 가진 변형된 서열 번호:1을 포함한다. 일부 측면에서, 서열 번호: 1의 위치 15에서 아미노산은 결실되거나 또는 글루타민산, 호모글루타민산, 시스테인산 또는 호모시스테인산으로 치환된다. 이러한 변형은 산성 또는 알칼리 완충액, 이를 테면, 5.5 내지 8 범위의 pH의 완충액에서 특히, 시간의 경과에 따라 유사체의 분해 또는 절단을 감소시킨다. 일부 구체예들에서, 이러한 변형을 포함하는 글루카곤 유사체는 25℃에서 24시간 후에 고유 유사체의 최소한 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 유지한다.
위치 16의 변형
한 구체예에 따르면, 강화된 효능 및 임의선택적으로 개선된 용해도 및 안정성을 가지는 글루카곤 유사체가 제공된다. 한 구체예에서, 강화된 글루카곤 및 GLP-1 효능은 고유의 글루카곤 (서열 번호: 1)의 위치 16에서 아미노산 변형에 의해 제공된다. 비제한적 실시예를 통하여, 이러한 강화된 효능은 위치 16에서 자연적으로 생성되는 세린이 글루타민산 또는 4개 원자 길이를 가진 측쇄를 보유하는 또다른 음-하전된 아미노산으로 치환에 의해 제공될 수 있거나, 또는 대안으로 글루타민, 호모글루타민산, 또는 호모시스테인산, 또는 길이가 약 4 (또는 3-5) 원자를 가지고, 측쇄 보유 최소한 하나의 헤테로원자, (이를 테면, N, O, S, P)를 가진 하전된 아미노산중 임의의 하나로 치환에 의해 제공될 수 있다. 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 위치 16의 Ser이 글루타민산, 글루타민, 호모글루타민산, 호모시스테인산, 트레오닌 또는 글리신으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산으로의 치환을 포함하는 변형된 서열 번호:1을 포함한다. 일부 측면에서, 위치 16의세린 잔기는 글루타민산, 글루타민, 호모글루타민산 및 호모시스테인산으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된다. 일부 특정 측면에서, 위치 16의 세린 잔기는 글루타민산 또는 이의 보존적 치환 (이를 테면 Exendin-4 아미노산)으로 치환된다.
대안 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 위치 16의 Ser이 Thr 또는 AIB 또는 전술한 것과 같이 또다른 알파 헬릭스 조장 아미노산으로 치환에 의해 변형된 서열 번호:1의 변형된 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 알파 헬릭스 조장 아미노산은 j+3 또는 i+4에서 아미노산과 비-공유 분자내 다리를 형성한다.
위치 17-18에서 변형
일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 위치 17 및 18에서 이염기성 Arg-Arg 부위가 제거된 변형된 서열 번호:1을 포함한다. 임의의 특정 이론에 결부되지 않고, 일부 구체예들에서, 이염기성 부위의 제거는 글루카곤 유사체의 생체내 효과를 개선시킨다. 일부 측면에서, 이점에 있어서, 글루카곤 유사체는 서열 번호: 1의 위치 17 및 18중 하나 또는 두 개 모두 아미노산이 염기성이 아닌 아미노산, 이를 테면, 지방족 아미노산으로 치환됨으로써 변형된다. 일부 구체예들에서, 위치 17 또는 18의 아미노산중 하나는 결손되거나 또는 위치 17과 18 사이에 한 아미노산이 삽입된다. 일부 구체예들에서, 위치 17에서 Arg은 본 명세서에서 기술된 것과 같은 또다른 아미노산, 이를 테면, Gln, 친수성 모이어티를 포함하는 아미노산, 알파 헬릭스 조장 아미노산으로 치환된다. 일부 구체예들에서, 알파 헬릭스 조장 아미노산은 j+3 또는 i+4에서 아미노산과 비-공유 분자내 다리를 형성한다. 일부 구체예들에서, 위치 18에서 Arg는 본 명세서에서 기술된 것과 같이 또다른 아미노산으로 치환된다. 예시적인 측면에서, 위치 18에서 아미노산은 알파, 알파, 이중치환된 아미노산, 이를 테면, AIB이다. 일부 측면에서, 위치 18에서 아미노산은 작은 지방족 아미노산, 이를 테면, Ala이다. 일부 특정 측면에서, 위치 18에서 아미노산은 작은 지방족 아미노산, 이를 테면, Ala, 및 위치 17에서 Arg는 변형되지 않고 유지된다.
위치 20의 변형
위치 20의 아미노산 변형에 의해 또한 GLP-1 수용체에서 강화된 활성이 또한 제공된다. 일부 구체예들에서, 위치 20의 글루카곤은 상기에섯 설명된 것과 같이, 알파 헬릭스 조장 아미노산으로 치환된다. 일부 구체예들에서, 알파 헬릭스 조장 아미노산은 j-3 또는 i-4에서 아미노산과 비-공유 분자내 다리를 형성한다. 일부 특이적 구체예들에서 아미노산은 하전된 또는 수소-결합을 형성하는 능력을 가지고, 길이는 최소한 약 5 (또는 약 4-6) 원자를 가진 측쇄를 보유하는 친수성 아미노산, 예를 들면, 리신, 시투룰린, 아르기닌, 또는 오르니틴이며, 그리고 임의선택적으로 위치 16의 또다른 알파 헬릭스 조장 아미노산, 이를 테면 음전하를 띈 아미노산과 함께 염 다리를 형성한다. 일부 특정 측면들에서 이러한 변형은 Gln의 탈아미드화를 통하여 발생되는 분해를 감소시키고, 일부 구체예들에서, GLP-1 수용체에서 글루카곤 유사체의 활성을 증가시킨다. 일부 측면에서, 위치 20의 아미노산은 Glu 또는 Lys 또는 AIB이다.
위치 21, 23, 24, 및 28에서 변형
일부 구체예들에서, 위치 21 및/또는 위치 24은 알파 헬릭스 조장 아미노산으로의 치환에 의해 변형된다. 일부 구체예들에서, 알파 헬릭스 조장 아미노산은 j-3 또는 i-4에서 아미노산과 함께 비-공유 분자내 다리를 형성한다. 일부 측면에서, 알파 헬릭스 조장 아미노산은 AIB이다.
예시적인 구체예들에서, 위치 23의 아미노산은 Ile이다.
예시적인 측면에서, 위치 28의 아미노산은 알파, 알파, 이중치환된 아미노산, 이를 테면, AIB이다.
하전된 C-말단
일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 아미노산 치환 및/또는 이 유사체의 C-말단 부분으로 하전된 아미노산을 도입시키는 아미노산 추가에 의해 변형된다. 일부 구체예들에서, 이러한 변형은 안정성 및 용해도를 강화시킨다. 여기에서 사용된 것과 같이 용어 "하전된 아미노산" 또는 "하전된 잔기"은 생리학적 pH의 수성 용액에서 음-하전된 (가령, 탈-양성자화된) 또는 양-하전된 (가령, 양성자가 추가된) 측쇄를 포함하는 아미노산을 지칭한다. 일부 측면에서, 이런 아미노산 치환 및/또는 하전된 아미노산 변형을 도입하는 추가는 서열 번호: 1의 위치 27에 대해 C-말단 위치에 있다. 일부 구체예들에서, 하나, 둘 또는 셋(그리고 일부 경우들에서, 셋 이상의) 하전된 아미노산은 C-말단 부분 (이를 테면, 위치 27의 C-말단 위치(들)) 안에 도입된다. 일부 구체예에 따르면, 위치 28 및/또는 29의 고유의 아미노산(들)은 하전된 아미노산으로 치환되며, 및/또는 추가 구체예에서, 1 내지 3개의 하전된 아미노산이 이 유사체의 C-말단에 또한 추가된다. 예시적인 구체예들에서, 하나, 둘 또는 모든 하전된 아미노산은 음-하전된다. 일부 구체예들에서 음-하전된 아미노산은 아스파르트산, 글루타민산, 시스테인산, 호모시스테인산, 또는 호모글루타민산이다. 일부 측면에서, 이러나 변형은 용해도를 증가시키는데, 이를 테면, 약 5.5 및 8, 이를 테면, pH 7의 주어진 pH에서, 25℃에서 24시간 후에 측정되었을 때, 고유 글루카곤과 비교하여 최소한 2-배, 5-배, 10-배, 15-배, 25-배, 30-배 또는 더 큰 용해성을 제공한다
C-말단 절두
일부 구체예에 따르면, 본 명세서에서 공개된 글루카곤 유사체는 하나 또는 두 개의 아미노산 잔기들이 C-말단에서 절두되어 변형된다. 이러한 변형된 글루카곤 펩티드는 본 명세서에서 나타낸 것과 같이, 글루카곤 수용체 및 GLP-1 수용체에서 유사한 활성 및 효능을 보유한다. 이점에 있어서, 글루카곤 펩티드는 임의선택적으로 본 명세서에서 기술된 임의의 추가적인 변형과 함께, 고유의 글루카곤 유사체 (서열 번호: 1)의 아미노산 1-27 또는 1-28을 포함할 수 있다.
하전-중성 C-말단
일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 아미드 또는 에스테르와 같은 하전-중성 기로 대체된, 변형된 서열 번호:1을 포함한다. 임의의 특정 이론에 결부되지 않고, 이러한 변형은 특정 측면에서 GLP-1 수용체에서 글루카곤 유사체의 활성을 증가시킨다. 따라서, 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 아미드화된 펩티드이고, C-말단 잔기는 아미노산의 알파 카르복실레이트를 대신하여 아미드를 포함한다. 여기에서 사용된 것과 같이 펩티드 또는 유사체에 대한 일반적인 참조는 변형된 아미노 말단, 카르복시 말단, 또는 아미노 및 카르복시 말단 모두를 보유하는 펩티드를 포괄하는 의도다. 예를 들면, 말단 카르복실산을 대신하여 아미드 기로 구성된 아미노산 쇄는 표준 아미노산으로 지정된 아미노산 서열에 포괄된다.
기타 변형들
일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 다음의 아미노산 변형을 추가적으로 또는 대안으로 포함한다:
(i) 위치 2의 Ser은 Ala으로 치환;
(ii) 위치 10의 Tyr은 Val 또는 Phe, 또는 Trp으로 치환;
(iii) 위치 12의 Lys은 Arg으로 치환;
(iv) 위치 17의 Arg은 Gln 또는 작은 지방족 아미노산, 이를 테면, Ala, 또는 큰 지방족 아미노산, 이를 테면, Ile으로 치환;
(v) 위치 18의 Arg은 작은 지방족 아미노산, 이를 테면, Ala; 또는 이미다졸-보유 아미노산, 이를 테면, His으로 치환;
(vi) 위치 19의 Ala은 양전하를 띈 아미노산, 이를 테면, Gln으로 치환;
(vii) 위치 23의 Val은 Ile으로 치환, 그리고
(viii) 위치 29의 Thr은 Gly 또는 Gln으로 치환.
일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체의 안정성은 위치 27에서 메티오닌의 변형, 예를 들면, 류신 또는 노르루이신으로 치환에 의해 증가된다. 이러한 변형은 산화성 분해를 감소시킬 수 있다. 안정성은 위치 20 또는 24 또는 28에서 Gln의 변형 이를 테면, Ala, Ser, Thr, 또는 AIB으로 치환에의해 또한 증가될 수 있다. 이러한 변형은 Gln의 탈아미드화를 통하여 분해를 감소시킬 수 있다. 안정성은 위치 21에서 Asp의 변형, 이를 테면, 또다른 산성 잔기, 이를 테면, Glu에 의한 치환에 의해 증가될 수 있다. 이러한 변형은 환형 숙시니미드 중간생성물의 형성과 이어서 이성체화에 의해 이소-아스파르트산염의 형성을 위하여 Asp의 탈수를 통하여 분해를 감소시킬 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 글루카곤 유사체는 이를 테면, 이황화 다리를 통하여 당화되고, 아미드화되고, 카르복실레이트화되고, 인산화되고, 에스테르화되고, N-아실화되고, 환형화되거나 또는 염으로 전환되거나(이를 테면, 산 추가 염, 염기성 추가 염), 및/또는 임의선택적으로 이합체화되거나, 다중합체화되거나, 또는 폴리머화되거나, 또는 접합된다.
글루카곤 수용체 활성을 증가 또는 감소시키고, GLP-1 수용체 활성을 증가시키는 이런 변형을 포함하는, 본 명세서에서 기술된 임의의 이러한 변형은 개별적으로 또는 조합에 의해 적용될 수 있다. GLP-1 수용체 활성을 증가시크는 이런 변형의 조합은 단독으로 취한 경우보다 더 높은 GLP-1 활성을 제공할 수 있다.
예시적인 구체예들
본 개시내용은 고유의 인간 글루카곤의 구조와 유사한 구조를 포함하고, 강화된 항진제 GLP-1 수용체에서 활성을 나타내고, 고유의 인간 글루카곤과 비교하여 GLP-1 수용체에서 강화된 항진 활성을 나타내는 펩티드를 제공한다. 글루카곤은 정상적으로 GLP-1 수용체에서 고유-GLP-1의 활성의 약 1%를 보유하고, 한편 GLP-1은 정상적으로 글루카곤 수용체에서 고유의 글루카곤의 활성의 약 0.01% 미만을 보유한다. 따라서, 본 개시내용의 펩티드는 GLP-1 수용체에서 고유의 GLP-1 활성의 1% 이상을 나타낸다. 예시적인 구체예들에서, 본 개시내용의 펩티드는 GLP-1 수용체에서 고유의-GLP-1 활성의 약 5% 또는 그 이상, 약 10% 또는 그 이상, 약 15% 또는 그 이상, 약 20% 또는 그 이상, 약 25% 또는 그 이상, 약 30% 또는 그 이상, 약 35% 또는 그 이상, 약 40% 또는 그 이상, 약 45% 또는 그 이상, 약 50% 또는 그 이상, 약 55% 또는 그 이상, 약 60% 또는 그 이상, 약 65% 또는 그 이상, 약 70% 또는 그 이상, 약75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 그 이상, 또는 약 95% 또는 그 이상을 나타낸다. 예시적인 측면에서, 본 개시내용의 펩티드는 GLP-1 수용체에서 고유의 GLP-1보다 더 큰 활성을 나타낸다. 따라서, 예시적인 측면에서, 본 개시내용의 펩티드는 GLP-1 수용체에서 고유의-GLP-1의 활성의 약 100% 또는 그 이상을 나타낸다. 예시적인 측면에서, 본 개시내용의 펩티드는 GLP-1 수용체에서 고유의-GLP-1 활성의 약 150% 또는 그 이상, 약 200% 또는 그 이상, 약 250% 또는 그 이상, 약 300% 또는 그 이상, 약 350% 또는 그 이상, 약 400% 또는 그 이상, 약 450% 또는 그 이상, 약 500% 또는 그 이상, 약 550% 또는 그 이상, 약 600% 또는 그 이상, 약 650% 또는 그 이상, 약 700% 또는 그 이상, 약 750% 또는 그 이상, 약 800% 또는 그 이상, 약 850% 또는 그 이상, 약 900% 또는 그 이상, 약 950% 또는 그 이상, 또는 약 1000% 또는 그 이상을 나타낸다.
예시적인 구체예들에서, 펩티드는 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함한다.
예시적인 구체예들에서, 펩티드는 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함한다.
예시적인 구체예들에서, 펩티드는 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함한다.
예시적인 구체예들에서, 펩티드는 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함한다.
예시적인 구체예들에서, 펩티드는 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하고 GIP 수용체에 비교하여 인간 GLP-1 수용체에 대해 최소한 100-배 선택성을 나타낸다.
예시적인 구체예들에서, 펩티드는 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용은 현재 공개된 펩티드중 하나의 아미노산 서열과 매우 유사한 아미노산 서열을 포함하는 변이 펩티드를 더 제공한다. 예시적인 구체예들에서, 변이 본 개시내용의 변이 펩티드는 서열 번호: 12-17중 임의의 펩티드의 아미노산 서열의 아미노산 1-29에 대해 최소한 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는데, 여기에서 변이 펩티드는 GLP-1 수용체, 글루카곤 수용체, 및 GIP 수용체에서 부모 펩티드의 활성을 유지하고(이를 테면, GIP 수용체에 비교하여 인간 GLP-1 수용체에 대해 최소한 100-배 선택성을 나타내고), 임의선택적으로 최소한 1%의 GLP-1 효능을 나타내고; 또는 여기에서 GIP 수용체에서 펩티드의 EC50은 GLP-1 수용체에서 이의 EC50으로부터 100-배 미만으로 상이하다). 예시적인 구체예들에서, 변이 본 개시내용의 펩티드는 GIP 수용체에 비교하여 인간 GLP-1 수용체에 대하여 최소한 100-배 이상으로 더 큰 선택성을 나타내는 것을 포함한다.
예시적인 구체예들에서, 본 개시내용의 변이 펩티드는 본 개시내용의 펩티드의 아미노산 서열에 근거하지만, 하나 또는 그 이상 아미노산 위치, 예를 들면, 위치 1, 위치 2, 위치 3, 위치 7, 위치 10, 위치 12, 위치 15, 위치 16, 위치 17, 위치 18, 위치 20, 위치 21, 위치 23, 위치 24, 위치 27, 위치 28, 위치 29을 포함하나 이에 한정되지 않는 위치에서 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 측면에서, 변이 펩티드는 부모 펩티드와 비교하여 보존적 치환을 포함할 수 있고, 본 명세서에서 기술된 임의의 아미노산 변형을 포함할 수 있고, 또는 고유의 글루카곤 서열 (서열 번호: 1)에서 그 위치에 존재하는 아미노산으로 복귀되는 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 예시적인 측면에서, 변이 본 개시내용의 펩티드는 본 개시내용의 펩티드의 아미노산 서열에 근거되지만, 다음과 같이 하나 또는 그 이상이 상이한 아미노산 서열을 포함한다:
a) 변이 펩티드는 아실화된 아미노산 또는 알킬화된 아미노산을 포함하고;
b) 아실화된 아미노산 또는 알킬화된 아미노산은 그 위치에서 고유의 글루카곤 (서열 번호: 1)의 대응하는 아미노산으로 대체되거나 또는 고유의 아미노산의 보존적 치환, 및 임의선택적으로 새로운 아실화된 또는 알킬화된 아미노산이 상이한 위치에 도입된다;
c) 변이 펩티드는 친수성 모이어티에 공유적으로 부착된 아미노산을 포함한다;
d) 친수성 모이어티에 공유적으로 부착된 아미노산은 그 위치에서 고유의 글루카곤 (서열 번호: 1)의 대응하는 아미노산으로 대체되고, 임의선택적으로 새로운 친수성 모이어티에 공유적으로 부착된 아미노산이 상이한 위치에 도입된다;
e) 변이 펩티드의 C-말단 아미노산은 C-말단 알파 카르복실레이트를 대신하하여 C-말단 아미드를 포함한다;
f) 위치 1 내지 29중 임의의 위치의 아미노산은 그 위치에서 고유의 글루카곤 (서열 번호: 1)의 대응하는 아미노산으로 대체된다;
g) 또는 이의 임의의 조합들.
전술한 변이 펩티드중 임의의 것에 대하여, 예시적인 구체예들에서, 변이 펩티드는 위치 16, 17, 21, 24, 29에서, C-말단 연장 안에 한 위치에서, 또는 C-말단에서 한 아미노산에 공유적으로 부착된 친수성 모이어티를 포함한다. 예시적인 측면에서, 변이 펩티드는 친화력 모이어티에 공유적으로 부착된 Cys, Lys, Orn, 호모시스테인, 및 Ac-Phe를 포함고하고, 임의선택적으로, 여기에서 Cys, Lys, Orn, 호모시스테인, 또는 Ac-Phe는 위치 16, 17, 21, 24, 29에서, C-말단 연장 안에 한 위치에서, 또는 변이 펩티드의 C-말단에 위치된다. 예시적인 측면에서, 친수성 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜이다.
예시적인 측면에서, 변이 펩티드는 위치 10에서 임의선택적으로 아실화된 또는 알킬화된 아미노산을 포함한다. 예시적인 측면에서, 변이 펩티드는 C8 내지 C20 알킬쇄, C12 내지 C18 알킬쇄, 또는 C14 또는 C16 알킬쇄를 포함하는 아실화된 또는 알킬화된 아미노산을 포함한다. 예시적인 측면에서, 변이체 펩티드는 화학식 I, 화학식 II, 또는 화학식 III의 아실화된 또는 알킬화된 아미노산, 임의선택적으로, 여기에서 화학식 I의 아미노산은 Lys인, 아실화된 또는 알킬화된 아미노산을 포함한다.
예시적인 측면에서, 변이 본 개시내용의 펩티드는 아실화된 또는 알킬화된 아미노산을 포함하는데, 여기에서 아실기 또는 알킬기는 스페이스를 통하여 아미노산에 공유적으로 부착되며, 임의선택적으로, 여기에서 스페이스는 아미노산 또는 이가펩티드다. 예시적인 구체예들에서, 스페이스는 하나 또는 두 개의 산성 잔기들을 포함한다.
임의의 전술한 예시적인 구체예들에서, 본 개시내용의 임의의 펩티드 또는 변이 펩티드는 약 20 또는 미만 (이를 테면, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.10, 0. 05, 0. 025, 0. 01, 0.001)인 (글루카곤 수용체에서 EC50 활성)/(GLP-1 수용체에서 EC50)를 나타낸다.
임의의 전술한 예시적인 구체예들에서, 본 개시내용의 임의의 펩티드 또는 변이 펩티드는 20 이상(이를 테면, 21, 25, 30, 40, 50 , 60, 70, 80, 90, 100, 250, 500, 750, 1000, 또는 그 이상)의 (글루카곤 수용체에서 EC50 활성)/(EC50GLP-1 수용체에서 EC50)를 나타낸다.
임의의 전술한 예시적인 구체예들에서, 본 개시내용의 임의의 펩티드 또는 변이 펩티드는 GLP-1 수용체에서 EC50 글루카곤 수용체에서 EC50보다 2배 내지 10배 (이를 테면, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-배) 더 큰 EC50을 나타낸다.
배제(EXCLUSIONS)
예시적인 구체예들에서, 다음의 펩티드중 임의의 하나는 본 명세서에서 기술된 글루카곤 유사체로부터 배제되는데, 바람직한 GLP-1 또는 공동-항진제 활성을 나타내는 본 명세서에서 기술된 것과 같은 하나 또는 그 이상의 추가 변형을 포함하는 다음의 임의의 펩티드, 제약학적 조성물, 키트 및 이러한 화합물들을 이용하는 치료 방법은 본 발명에 포함될 수 있다: [Arg12] 치환을 가지고 C-말단 아미드를 가진 서열 번호:1의 펩티드; [Arg12,Lys20] 치환 및 C-말단 아미드를 가지는 서열 번호:1의 펩티드; [Arg12,Lys24] 치환 및 C-말단 아미드를 가지는 서열 번호:1의 펩티드; [Arg12,Lys29] 치환 및 C-말단 아미드를 가지는 서열 번호:1의 펩티드; [Glu9] 치환을 가지는 서열 번호:1의 펩티드; His1이 누락되고, [Glu9, Glu16, Lys29] 치환 및 C-말단 아미드를 가지는 서열 번호:1의 펩티드; [Glu9, Glu16, Lys29] 치환 및 C-말단 아미드를 가진 서열 번호:1의 펩티드; 락탐 다리를 통하여 연결된 [Lys13, Glu17] 치환 및 C-말단 아미드를 가진 서열 번호:1의 펩티드; 락탐 다리를 통하여 연결된 [Lys17, Glu21] 치환 및 C-말단 아미드를 가진 서열 번호:1의 펩티드; His1이 누락되고, 락탐 다리를 통하여 연결된 [Glu20, Lys24] 치환을 가진 서열 번호:1의 펩티드. 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 2009년 2월 19일자로 제출되고, 8월 26일자로 WO 2010/096052로 공개된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2009/034448; 2009년 12월 18일자로 제출되고 2010년 8월 26일자로 WO 2010/096142로 공개된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2009/068678; 2009년 6월 16일자로 제출되고, 2009년 12월 23일자로 WO 2009/155258로 공개된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2009/047438; 2008년 2월 13일자로 제출되고, 2008년 8월 21일자로 WO 2008/101017로 공개된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2008/053857; 2010년 12월 9일자로 제출된 국제 특허 출원 번호PCT/US2010/059724; 2009년 6월 16일자로 제출되고, 2010년 1월 28일자로 WO2010/011439로 공개된 국제 특허 출원 PCT/US2009/047447; 2010년 6월 16일자로 제출되고, 2010년 12월 23일자로 WO2010/148089로 공개된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2010/38825; 2011년 1월 26일자로 제출된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/022608; 및 2010년 12월 22일자로 제출된 미국 가출원 번호 61/426,285에서 개시된 임의의 펩티드는 아니며; 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 위치 29 다음 C-말단에 연결된 서열 KRNRNNIA의 전부 또는 일부, 이를 테면 KRNR을 포함하지 않는다.
펩티드를 만드는 방법
본 개시내용의 글루카곤 유사체는 당업계에 공지되어 있는 방법들에 의해 수득할 수 있다. 펩티드들을 새로 합성하는 적합한 방법들은 예를 들면, Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2005; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000; and U.S. Patent No. 5,449,752에서 설명하고 있다.
또한, 본 내용의 유사체들이 임의의 비-코드화된 또는 비-천연 아미노산을 포함하지 않는 경우들에서, 이 글루카곤 유사체는 표준 재조합 방법들을 이용하여 유사체들의 아미노산 서열을 인코드하는 핵산을 이용하여 재조합적으로 생산할 수 있다. 예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994 참고.
일부 구체예들에서, 본 내용의 글루카곤 유사체들은 단리된다. 일부 구체예들에서, 본 내용의 글루카곤 유사체들은 정제된다. "순도(purity)"는 상대적인 용어이며, 절대적인 순도 또는 절대적인 풍부 또는 절대적인 선별로 반드시 해석될 필요가 없다는 것으로 받아드린다. 일부 측면들에서, 순도는 최소한 또는 약 50%, 최소한 또는 약 60%, 최소한 또는 약 70%, 최소한 또는 약 80%, 또는 최소한 또는 약 90% (가령, 최소한 또는 약 91%, 최소한 또는 약 92%, 최소한 또는 약 93%, 최소한 또는 약 94%, 최소한 또는 약 95%, 최소한 또는 약 96%, 최소한 또는 약 97%, 최소한 또는 약 98%, 최소한 또는 약 99% 또는 거의 100%이다.
일부 구체예들에서, 여기에서 설명된 이 펩티드들은 Synpep (Dublin, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD), 및 Multiple Peptide Systems (San Diego, CA)와 같은 회사에서 상업적으로 합성된다. 이 점에 있어서, 이 펩티드들을 합성하고, 재조합하고, 분리하고, 및/또는 정제된다.
접합체(CONJUGATES)
본 발명은 이종구조의 모이어티에 접합된 하나 또는 그 이상의 본 명세서에서 기술된 글루카곤 유사체를 포함하는 접합체를 더 제공하는데, 여기에서 접합체는 고유의 글루카곤과 비교하였을 때, GLP-1 수용체에서 강화된 활성을 나타내고, GIP 수용체에 비교하여 인간 GLP-1 수용체에 대해 최소한 100-배 이상의 선택성을 나타낸다. 여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "이종구조의 모이어티"은 용어 "접합체 모이어티"과 동의어인데, 본 명세서에서 기술된 글루카곤 유사체들와는 상이한 임의의 분자(화학적 또는 생화학적, 자연적으로 발생되는 또는 비-코드화된)를 지칭한다. 여기에서 설명된 임의의 유사체들에게 연결될 수 있는 예시적인 접합체 모이어티들은 이종구조의 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들면, 혈장 단백질), 표적화 물질, 면역글로블린 또는 이의 일부분 (가령, 가변 영역, CDR, 또는 Fc 영역), 방사능동위원소, 형광단 또는 효소 라벨와 같은 진단용 라벨, 수용성 폴리머를 포함한 폴리머, 또는 기타 치료 또는 진단제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 유사체와 혈장 단백질을 포함하는 접합체가 제공되는데, 여기서 혈장 단백질은 알부민, 트란스페린, 피브리노겐 그리고글로블린으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예들에서, 이 접합체의 혈장 단백질 모이어티는 알부민 또는 트란스페린이다. 일부 구체예들에서, 이 접합체는 여기에서 설명된 글루카곤 유사체들중 하나 이상의 펩티드와 다음중 하나 이상을 포함한다: 펩티드 (여기에서 설명된 글루카곤 및/또는 GIP 수용체 활성 글루카곤), 폴리펩티드, 핵산 분자, 항체 또는 이의 단편, 폴리머, 양자점(quantum dot), 작은 분자, 톡신, 진단제, 탄수화물, 아미노산.
일부 구체예들에서, 이종구조의 모이어티는 여기에서 설명된 글루카곤 및/또는 GLP-1 수용체 활성 유사체와는 별개의 펩티드이며, 이 접합체는 융합 펩티드 또는 키메라 펩티드이다. 일부 구체예들에서, 이종구조의 모이어티는 1-21개 아미노산의 펩티드 연장부이다. 특정 구체예들에서, 연장부는 글루카곤 유사체의 C-말단, 가령, 위치 29의 아미노산에 부착된다.
일부 특정 측면에서, 연장은 단일 아미노산 또는 이가펩티드다. 특정 구체예들에서, 연장은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산을 포함한다: 하전된 아미노산 (이를 테면, 음-하전된 아미노산 (이를 테면, Glu), 양전하를 띈 아미노산), 친수성 모이어티를 포함하는 아미노산. 일부 측면에서, 연장은 Gly, Glu, Cys, Gly-Gly, Gly-Glu이다.
일부 구체예들에서, 연장은 서열 번호: 9 (GPSSGAPPPS), 서열 번호: 10 (GGPSSGAPPPS), 서열 번호: 8 (KRNRNNIA), 또는 서열 번호: 11 (KRNR)의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 측면에서, 아미노산 서열은 글루카곤 유사체의 C-말단 아미노산, 이를 테면, 위치 29의 아미노산에 부착된다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 13-16의 아미노산 서열은 펩티드 결합을 통하여 글루카곤 유사체들의 아미노산 29에 결합된다. 일부 특이적 구체예들에서, 글루카곤 유사체의 위치 29의 아미노산은 Gly이고, Gly는 서열 번호: 8-11의 아미노산 서열중 하나에 융합된다.
일부 구체예들에서, 이종구조의 모이어티는 폴리머이다. 일부 구체예들에서, 폴리머는 다음으로 구성된 군으로부터 선택되나 이에 한정되지 않는다: 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 폴리알킬렌 그리고 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 산화물, 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 폴리(메틸 메타아크릴레이트), 폴리(에틸 메타아크릴레이트), 폴리(부틸메타아크릴레이트), 폴리(이소부틸 메타아크릴레이트), 폴리(헥실메타아크릴레이트), 폴리(이소데실 메타아크릴레이트), 폴리(라우릴 메타아크릴레이트), 폴리(페닐 메타아크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 그리고 폴리(옥타데실 아크릴레이트)을 포함하는 아크릴 및 메타아크릴 에스테르의 폴리머, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 에스테르, 폴리비닐 할로겐화물, 폴리(비닐 아세테이트), 및 폴리비닐피롤리돈을 포함하는 폴리비닐 폴리머, 폴리글리코리드, 폴리실옥산, 폴리우레탄 및 이의 코-폴리머, 알킬 셀룰로오즈, 하이드록시알킬 셀룰로오즈, 셀룰로오즈 에테르, 셀룰로오즈 에스테르, 니트로 셀룰로오즈, 메틸 셀룰로오즈, 에틸 셀룰로오즈, 하이드록시프로필 셀룰로오즈, 하이드록시-프로필 메틸 셀룰로오즈, 하이드록시부틸 메틸 셀룰로오즈, 셀룰로오즈 아세테이트, 셀룰로오즈 프로피오네이트, 셀룰로오즈 아세테이트 부티레이트, 셀룰로오즈 아세테이트 프탈레이트, 카르복실에틸 셀룰로오즈, 셀룰로오즈 트리아세테이트, 그리고 셀룰로오즈 술페이트 나트륨 염을 포함하는 셀룰로오즈, 폴리프로필렌, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 산화물), 및 폴리(에틸렌 테레프탈레이트)를 포함하는 폴리에틸렌, 그리고 폴리스티렌.
일부 측면들에서, 폴리머는 합성 생분해가능한 폴리머 (가령, 젖산 산과 글리콜린산의 폴리머, 폴리무수물, 폴리(오르소)에스테르, 폴리우레탄, 폴리(부트 산), 폴리(발레르산), 그리고 폴리(락티드-코카프로락톤))을 포함하는 생분해가능한 폴리머, 그리고 천연 생분해가능한 폴리머 (가령, 알긴산 및 덱스트란 및 셀룰로오즈를 포함하는 기타 폴리사카라이드, 콜라겐, 이의 화학적 유도체(화학적기의 치환, 추가, 예를 들면, 알킬, 알킬렌, 하이드록실화, 산화, 그리고 당업계의 당업자에 의해 통상적으로 실시되는 기타 변형), 알부민 그리고 기타 친수성 단백질 (가령, 제인 및 기타 프로아민 및 소수성 단백질)), 그리고 임의의 코폴리머 또는 이의 혼합물일 수 있다. 일반적으로, 이러한 물질들은 효소적 가수분에 생체내 물에 노출, 표면 또는 대량 부식(bulk erosion)에 의해 분해된다.
일부 측면들에서, 폴리머는 생체흡착성 폴리머일 수 있는데, 가령, H. S. Sawhney, C. P. Pathak 및 J. A. Hubbell in Macromolculars, 1993, 26, 581-587에서 설명된 생체부식성 하이드로겔(전문이 참고문헌에 통합된다), 폴리히알루론산, 카제인, 젤라틴, 글루틴, 폴리무수물, 폴리아크릴산, 알긴산, 키토산, 폴리(메틸 메타아크릴레이트s), 폴리(에틸 메타아크릴레이트), 폴리(부틸메타아크릴레이트), 폴리(이소부틸 메타아크릴레이트), 폴리(헥실메타아크릴레이트), 폴리(이소데실 메타아크릴레이트), 폴리(라우릴 메타아크릴레이트), 폴리(페닐 메타아크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 그리고 폴리(옥타데실 아크릴레이트)이다.
일부 구체예들에서, 폴리머는 수용성 폴리머 또는 친수성 폴리머다. 친수성 폴리머는 "친수성 모이어티"에서 추가 설명된다. 적합한 수용성 폴리머는 당업계에 공지되어 있고, 그리고 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필 셀룰로오즈 (HPC; Klucel), 하이드록시프로필 메틸셀룰로오즈 (HPMC; Methocel), 니트로셀룰로오즈, 하이드록시프로필 에틸셀룰로오즈, 하이드록시프로필 부틸셀룰로오즈, 하이드록시프로필 펜틸셀룰로오즈, 메틸 셀룰로오즈, 에틸셀룰로오즈 (Ethocel), 하이드록시에틸 셀룰로오즈, 다양한 알킬 셀룰로오즈 및 하이드록시알킬 셀룰로오즈, 다양한 셀룰로오즈 에테르, 셀룰로오즈 아세테이트, 카르복시메틸 셀룰로오즈, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오즈, 칼슘 카르복시메틸 셀룰로오즈, 비닐 아세테이트/크로톤 산 코폴리머, 폴리-하이드록시알킬 메타아크릴레이트, 하이드록시메틸 메타아크릴레이트, 메트아크릴산 코폴리머, 폴리메트아크릴산, 폴리메틸메타아크릴레이트, 말레 무수물/메틸 비닐 에테르 코폴리머, 폴리 비닐 알코올, 나트륨 및 칼슘 폴리아크릴산, 폴리아크릴산, 산성 카르복시 폴리머, 카르복시폴리메틸렌, 카르복시비닐 폴리머, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 코폴리머, 폴리메틸비닐에테르 코-말레 무수물, 카르복시메틸아미드, 칼륨 메타아크릴레이트 디비닐벤젠 코-폴리머, 폴리옥시에틸렌글리콜, 폴리에틸렌 산화물, 그리고 이의 유도체, 염, 및 복합물을 포함한다.
특정 구체예들에서, 폴리머는 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함하는 폴리알킬렌 글리콜이다.
일부 구체예들에서, 이종구조의 모이어티는 탄수화물이다. 일부 구체예들에서, 탄수화물은 모노사카라이드 (가령, 포도당, 갈락토즈, 푸락토즈), 디사카라이드 (가령, 슈크로즈, 락토즈, 말토즈), 올리고사카라이드 (가령, 라피노즈, 스타키오스), 폴리사카라이드 (전분, 아밀라제, 아밀로펙틴, 셀룰로오즈, 치틴, 칼로즈, 라미나린, 크실란, 만난, 푸코이단, 갈락토만난이다.
일부 구체예들에서, 이종구조의 모이어티는 지질이다. 일부 구체예들에서, 지질은 지방 산, 에이코사노이드, 프로스타글란딘, 루코트리엔, 트롬복산, N-아실 에탄올아민), 글리세롤리피드(가령, 모노-, 디-, 트리-치환된 글리세롤), 글리세로포스포지질 (가령, 포스파딜콜린, 포스파딜이노시톨, 포스파딜에탄올아민, 포스파딜세린), 스핑고리피드(가령, 스핑고신, 세라미드), 스테롤 지질 (가령, 스테로이드, 콜레스테롤), 프레놀 지질, 사카로리피드, 또는 폴리케티드, 오일, 왁스, 콜레스테롤, 스테롤, 지용성 비타민, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 포스포지질이다.
일부 구체예들에서, 이종구조의 모이어티는 본 명세서에서 개시된 유사체에 비-공유 또는 공유 결합을 통하여 부착된다. 특정 측면에서, 이종구조의 모이어티는 링커를 통하여 본 명세서에서 개시된 이 유사체에 부착된다. 링키지는 공유 화학 결합, 물리적인 힘 이를 테면, 정전기, 수소, 이온성, van der Waals, 또는 소수성 또는 친수성 상호작용에 의해 이루어질 수 있다. 바이오틴-아비딘, 리간드/수용체, 효소/기질, 핵산/핵산 결합 단백질, 지질/지질 결합 단백질, 세포 흡착 분자 파트너; 또는 서로에 대해 친화력을 보유하는 임의의 결합 파트너 또는 이의 단편들을 포함하는, 다양한 비-공유 커플링 시스템이 이용될 수 있다.
일부 구체예들에서, 글루카곤은 유사체들의 표적화된 아미노산 잔기를 이들 표적화된 아미노산의 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응시킬 수 있는 유기 유도화된 물질과 반응시킴으로써 직접적인 공유 링키지를 통하여 접합체 모이어티들에 연결된다. 유사체들 또는 접합체 모이어티의 반응기는 가령, 알데히드, 아미노, 에스테르, 티올, α-할로아세틸, 말레이미도 또는 하이드라지노 기를 포함한다. 유도체화 물질은 예를 들면, 말레이미도벤조일 술포숙시니미드 에스테르 (시스테인 잔기들을 통한 콘쥬게이션), N-하이드록시숙시니미드 (리신 잔기들을 통하여), 글루타알데히드, 숙신 무수물 또는 당업계에 공지되어 있는 다른 물질들을 포함한다. 대안으로, 이 접합체 모이어티들은 폴리사카라이드 또는 폴리펩티드 담체들과 같은 중간 담체들을 통하여 간접적으로 유사체들에게 연결될 수 있다. 폴리사카라이드 담체들의 예는 아미노덱스트란을 포함한다. 적합한 폴리펩티드 담체의 예는 폴리리신, 폴리글루타민산, 폴리아스파르트산, 이의 코폴리머, 그리고 이들 아미노산과 다른 아미노산 가령, 생성된 부하된 담체 상에 원하는 가용성 성질을 부여하는 세린의 혼합 폴리머를 포함한다.
시스테인 잔기는 α-할로아세테이트 (및 상응하는 아민), 가령, 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 가장 흔하게 반응하여, 카르복시메틸 또는 카르복시아미도메틸 유도체를 제공한다. 시스테인 잔기는 또한 브로모트리플루오르아세톤, 알파-브로모-β-(5-이미다조일)프로피온산, 클로로아세틸 인산염, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 이황화물, 메틸 2-피리딜 이황화물, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀, 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과 반응하여 유도화될 수 있다.
히스티딜 잔기는 디에틸피로카르보네이트와 pH 5.5-7.0에서 반응하여 유도화되는데, 이 물질은 히스티딜 측쇄에 상대적으로 특이적이다. 파라-브로모펜아실 브롬화물 또한 유용하며; 반응은 0.1 M 나트륨 카코딜에이트, pH 6.0에서 선호적으로 실시된다.
리신 및 아미노-말단 잔기는 숙신 또는 다른 카르복실산 무수물과 반응한다. 이러한 물질의 유도화는 리신 잔기의 전하를 역전시키는 효과를 가진다. 알파-아미노-함유 잔기를 유도화시키는 다른 적합한 시약들은 이미도에스테르 가령, 메틸 피콜리니미데이트, 피리독살 인산염, 피리독살, 클로로보로하이드라이드, 트리니트로벤젠술폰산, O-메틸이소우레아, 2,4-펜탄디온, 및 글리옥실레이트와 트란스아미나제-촉매된 반응을 포함한다.
아르기닐 잔기는 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-사이클로헥산디온, 및 닌히드린과 같은 하나 또는 몇 가지 통상적인 시약과의 반응에 의해 변형된다. 시아르기닌 잔기의 유도화는 구아니딘 기능기의 높은 pKa 때문에 알칼리 조건에서 반응이 일어나야 한다. 더욱이, 이러한 시약들은 리신기 뿐만 아니라 아르기닌 입실론-아미노기와도 반응할 수 있다.
티로실 잔기의 특이적 변형은 방향족 디아조니움 화합물 또는 테트라니트로메탄과의 반응에 의해 티로실 잔기로 스펙트럼 라벨의 도입시에 특정 성질을 가지도록 만들 수 있다. 가장 흔하게는, N-아세틸이미다졸과 테트라니트로메탄을 이용하여 차례로 O-아세틸 티로실 종 및 3-니트로 유도체를 만든다.
카르복실 측쇄 기들(아스파르틸 또는 글루타밀)은 카르보디이미드 (R-N=C=N-R')과의 반응에 의해 선택적으로 변형되며, 이 식에서 R 및 R'은 상이한 알킬기, 가령 1-사이클로헥실-3-(2-몰포리닐-4-에틸) 카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸) 카르보디이미드다. 더욱이, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기은 암모늄 이온과 반응에 의해 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환된다.
다른 변형은 프롤린 및 리신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 포스포릴화, 리신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 알파-아미노기의 메틸화(T. E. Creighton, Proteins: Structure 및 Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), 아스파라진 또는 글루타민의 아미드제거반응, N-말단 아민의 아세틸화, 및/또는 C-말단 카르복실산기의 아미드화 또는 에스테르화를 포함한다.
또 다른 유형의 공유 변형은 펩티드에 화학적 또는 효소에 의한 커플링 글리코시드를 수반한다. 슈가는 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복실기, (c) 시스테인의 것과 같은 유리 설퍼히드릴기, (d) 세린, 트레오닌, 또는 하이드록시프롤린의 것과 같은 유리 하이드록실기, (e) 티로신, 또는 트립토판의 것과 같은 방향족 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착될 수 있다. 이러한 방법들은 1987년 9월 11일에 공개된 WO87/05330에서 설명되며, 그리고 Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)에서도 설명되고 있다.
일부 구체예들에서, 이 글루카곤 유사체들은 글루카곤 유사체의 아미노산 측쇄와 이종구조의 모이어티 사이에 공유 링키지를 통하여 구조의 모이어티에 접합된다. 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 위치 16, 17, 21, 24, 또는 29의 아미노산 측쇄, C-말단 연장부내 위치, 또는 C-말단 아미노산의 측쇄를 통하여, 또는 이들 위치의 조합을 통하여 이종구조의 모이어티에 접합된다. 일부 측면들에서, 이종구조의 모이어티에 공유적으로 연결된 아미노산 (가령, 이종구조의 모이어티를 포함하는 아미노산)은 Cys, Lys, Orn, 호모-Cys, 또는 Ac-Phe이며, 아미노산의 측쇄는 이종구조의 모이어티에 공유적으로 결합된다.
일부 구체예들에서, 이 접합체는 이종구조의 모이어티에 글루카곤 유사체를 결합시키는 링커를 포함한다. 일부 측면들에서, 링커는 원자가 1 내지 약 60, 또는 1 내지 30개 또는 그 이상의 원자, 2 내지 5개 원자, 2 내지 10개 원자, 5 내지 10개 원자, 또는 10 내지 20개 원자 길이의 쇄를 포함한다. 일부 구체예들에서, 쇄의 원자는 모두 탄소 원자다. 일부 구체예들에서, 링커의 골격내 쇄 원자는 C, O, N, 및 S로 구성된 군으로부터 선택된다. 쇄 원자 및 링커는 가용성이 더 큰 접합체를 제공하기 위하여 예상 용해도(친수성)에 따라 선택될 수 있다. 일부 구체예들에서, 링커는 표적 조직 또는 장기 또는 세포에서 볼 수 있는 효소 또는 다른 촉매 또는 조건에 의해 절단되는 기능기를 제시한다. 일부 구체예들에서, 링커는 공간적 방해의 가능성을 감소시킬 정도의 충분한 길이를 가진다. 링커가 공유 결합 또는 펩티드 결합이고, 그리고 접합체가 폴리펩티드라면, 전체적인 접합체는 융합 단백질일 수 있다. 이러한 펩티드 링커는 임의의 길이를 가진다. 예시적인 링커는 길이가 약 1 내지 50개 아미노산, 5 내지 50개, 3 내지 5개, 5 내지 10개, 5 내지 15개, 또는 10 내지 30개 아미노산이다. 대안으로 이러한 융합 단백질은 당업계 숙련자에 공지된 재조합 유전 공학 방법에 의해 만들어질 수 있다.
접합체: Fc 융합
상기에서 언급된 바와 같이, 일부 구체예들에서, 이 펩티드들은 접합되는데, 가령, 면역글로블린 또는 이의 부분 (가령 가변 부위, CDR, 또는 Fc 부분)에 융합된다. 공지된 유형의 면역글로블린 (Ig)은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM을 포함한다. Fc 부분은 Ig 중쇄의 C-말단 부분이며, 리사이클링(반감기를 연장시킨다), 항체 의존적 세포-중개된 세포독성 (ADCC), 및 보체 의존적 세포독성 (CDC)과 같은 활성을 가지는 Fc 수용체에 결합을 맡고 있다.
예를 들면, 일부 정의에 따르면, 인간 IgG 중쇄 Fc 부분은 중쇄의 Cys226으로부터 C-말단까지 이어진다. "힌지 부분(hinge region)"은 일반적으로 인간 IgG1의 Glu216에서 Pro230까지다(다른 IgG 이소타입의 힌지 부분은 시스테인 결합에 관여한 시스테인의 배열에 의해 IgG1 서열과 나란히 배열될 수 있다). IgG의 Fc 부분은 두 개의 불변 도메인 CH2 와 CH3을 포함한다. 인간 IgG Fc 부분의 CH2 도메인은 보통 아미노산 231에서부터 아미노산 341까지 이어져 있다. 인간 IgG Fc 부분의 CH3도메인은 아미노산 342 부터 447까지 이어진다. 면역글로블린 또는 면역글로블린 단편들, 또는 부분의 아미노산 번호 매김에 참조자료는 Kabat et al. 1991, Sequences of proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md에 근거한다. 관련된 구체예들에서, Fc 부분은 CH1이외의 면역글루블린 중쇄의 하나 이상 고유 또는 변형된 불변부, 예를 들면, IgG 및 IgA의 CH2 및 CH3 부분, 또는 IgE의 CH3 및 CH4 부분을 포함할 수 있다.
적합한 접합체 모이어티는 FcRn 결합 부위를 포함하는 면역글로블린 서열의 일부를 포함한다. 구출 수용체인 FcRn은 면역글로블린 리사이클링 및 혈액내 순환계로 복귀를 담당한다. FcRn 수용체에 결합하는 IgG의 Fc 일부분의 부위는 X-선 결정학 (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379)에 근거하여 설명되었다. FcRn과 Fc의 주요 접촉 지역은 CH2 및 CH3 도메인의 접합점 부근이다. Fc-FcRn 접촉점은 모두 단일 Ig 중쇄내에 있다. 주요 접촉 부위는 CH2 도메인의 아미노산 잔기 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311, 및 314와, 그리고 CH3 도메인의 아미노산 잔기 385-387, 428, 및 433-436을 포함한다.
일부 접합체 모이어티는 FcγR 결합 부위를 포함할 수도 있고, 또는 포함하지 않을 수도 있다. FcγR은 ADCC 및 CDC를 담당한다. FcγR와 직접적인 접촉을 하는 Fc 부분내의 위치의 예는 아미노산 234-239 (하부 힌지 부분), 아미노산 265-269 (B/C 루프), 아미노산 297-299 (C'/E 루프), 그리고 아미노산 327-332 (F/G) 루프 (Sondermann et al., Nature 406: 267-273, 2000)다. IgE의 하부 힌지 부분은 FcRI 결합에 또한 연루되어 있다 (Henry, et al., Biochemistry 36, 15568-15578, 1997). IgA 수용체 결합에 관여하는 잔기들은 Lewis et al., (J Immunol. 175:6694-701, 2005)에서 설명되고 있다. IgE 수용체 결합에 관여하는 아미노산 잔기들은 Sayers et al. (J Biol Chem. 279(34):35320-5, 2004)에 설명되고 있다.
면역글로블린의 Fc 부분에 아미노산 변형이 있을 수 있다. 이러한 변이체 Fc 부분은 Fc 부분의 CH3 도메인(잔기 342-447)내에 최소한 하나의 아미노산 변형 및/또는 Fc 부분의 CH2 도메인(잔기 231-341)내에 최소한 하나의 아미노산 변형을 포함한다. FcRn에 대한 친화력을 증가시키는 것으로 보여지는 돌연변이는 T256A, T307A, E380A, 및 N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591)을 포함한다. 다른 돌연변이들은 FcRn에 대한 친화력의 심각한 감소없이 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, 및/또는 FcγRIIIA에 대한 Fc 부분의 결합을 감소시킬 수 있다. 예를 들면, Fc 부분의 위치 297에서 Ans을 Ala 또는 다른 아미노산으로 치환하면 고도로 보존된 N-글리코실화 부위가 제거되고, 그리고 Fc 부분의 반감기의 연장과 수반되어 면역원성의 감소, 뿐만 아니라 FcγRs에 대한 감소된 결합을 초래한다(Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591). IgG1의 위치 233-236에서 아미노산 변형으로 FcγRs에 대한 결합이 감소된다 (Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 and Armour et al. 1999, Eur.J. Immunol. 29:2613). 일부 예시적인 아미노산 치환은 미국 특허 제7,355,008호 및 제7,381,408로에서 설명되고 있으며, 이들 각각은 전문이 참고문헌에 통합된다.
접합체:친수성 모이어티들
본 명세서에서 기술된 글루카곤 유사체들은 생리학적 pH에서 고유 글루카곤과 비교하여 높은 생물학적 활성은 유지하면서, 수용액내 용해도 및 안정성을 개선시키기 위하여 추가 변형될 수 있다. PEG 기와 같은 친수성모이어티들은 활성화된 폴리머 분자와 반이 반응하는데 이용되는 임의의 적합한 조건들하에서 유사체들에게 부착될 수 있다. 아실화, 환원성 알킬화, Michael 추가, 티올 알킬화 또는 PEG 모이어티 (가령, 알데히드, 아미노, 에스테르, 티올, α-할로아세틸, 말레이미도 또는 하이드라지노 기)상의 반응기를 통하여 표적 화합물상의 반응기 (가령, 알데히드, 아미노, 에스테르, 티올, α-할로아세틸, 말레이미도 또는 하이드라지노기)에 다른 화학선택성 콘쥬게이션/결찰 방법을 포함하는 임의의 당업계에 공지된 방법들이 이용될 수 있다. 하나 이상의 단백질에 수용성 폴리머를 연결시키는데 이용되는 활성화기는 술폰, 말레이미드, 설퍼히드릴, 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지드린, 옥시란 및 5-피리딜을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 환원성 알킬화에 의해 펩티드에 부착된다면, 선택되는 폴리머는 폴리머화 수준이 조절되도록 단일 반응성 알데히드를 보유해야만 한다. 예를 들면, Kinstler et al., Adv. Drug. Delivery Rev . 54: 477-485 (2002); Roberts et al., Adv . Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002); 및 Zalipsky et al., Adv . Drug Delivery Rev . 16: 157-182 (1995).
특정 측면들에서, 티올을 보유하는 유사체들의 아미노산 잔기는 PEG와 같은 친수성 모이어티로 변형된다. 일부 구체예들에서, 티올은 Michael 추가 반응에서 말레이미드-활성화된 PEG로 변형되어, 하기에 나타낸 것과 같이 티오에테르 결합을 포함하는 페길화된 유사체가 된다:
Figure 112014006402078-pct00009
.
일부 구체예들에서, 티올은 친핵성치환 반응에서 할로아세틸-활성화된 PEG로 변형되어, 하기에 나타낸 것과 같이 티오에테르 결합을 포함하는 페길화된 유사체가 된다:
Figure 112014006402078-pct00010
적합한 친수성 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (가령, POG), 폴리옥시에틸화된 솔비톨, 폴리옥시에틸화된 포도당, 폴리옥시에틸화된 글리세롤 (POG), 폴리옥시알킬렌, 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 코폴리머, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 모노-(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜, 카르복시메틸셀룰로오즈, 폴리아세탈, 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥소란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레 무수물 코폴리머, 폴리 (.베타.-아미노산) (동종폴리머 또는 랜덤 코폴리머중 하나), 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종폴리머 (PPG) 및 기타 폴리알키렌 산화물, 폴리프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 코폴리머, 콜론산 또는 다른 폴리사카라이드 폴리머, Ficoll 또는 덱스트란 및 이의 혼합물들을 포함한다. 덱스트란은 주로 알파-1-6 결합에 의해 연결된 포도당 소단위의 폴리사카라이드 폴리머다. 덱스트란은 다양한 분자량 범위로 이용되는데, 가령, 약 1 kD 내지 약 100 kD, 또는 약 5, 10, 15 또는 20 kD 내지 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90 kD로 이용된다. 선형 또는 가지형 폴리머들을 고려한다. 접합체의 생성된 조제물은 기본적으로 단분산(monodisperse) 또는 다분산(polydisperse)일 수 있으며, 유사체당 약 0.5개, 0.7개, 1개, 1.2개, 1.5개 또는 2개 폴리머 모이어티들을 보유할 수 있다.
일부 구체예들에서, 이 접합체의 펩티드는 글루카곤 유사체의 아미노산 측쇄와 친수성 모이어티 사이에 공유 링키지를 통하여 친수성 모이어티에 접합된다. 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 위치 16, 17, 21, 24, 29, 40에서의 아미노산 잔기의 측쇄, C-말단 연장부내에서 아미노산 잔기의 측쇄, 또는 C-말단 아미노산의 아미노산 측쇄 또는 이들 위치의 조합을 통하여 친수성 모이어티에 접합된다. 일부 구체예들에서, 친수성 모이어티에 공유적으로 연결된 아미노산(가령, 친수성 모이어티를 포함하는 아미노산)은 Cys, Lys, Orn, 호모-Cys, 또는 아세틸 페닐알라닌 (Ac-Phe)이며, 이들 아미노산의 측쇄는 친수성 모이어티(가령, PEG)에 공유적으로 연결된다.
접합체: rPEG
일부 구체예들에서, 본 발명의 접합체는 화학적 PEG와 유사한 확장된 형태를 만들 수 있는 보조 유사체에 융합된 펩티드(가령, 재조합 PEG (rPEG) 분자)를 포함하며, 이러한 것들은 국제 특허 출원 공개 WO2009/023270 및 U.S. 특허 출원 공개 US2008/0286808에서 설명되고 있다. 일부 측면들에서 rPEG 분자는 폴리에틸렌 글리콜이 아니다. 일부 측면에서, rPEG 분자는 하나 이상의 글리신, 세린, 글루타민산, 아스파르트산, 알라닌, 또는 프롤린을 포함하는 폴리펩티드다. 일부 측면들에서, rPEG는 가령, 폴리-글리신, 폴리-세린, 폴리-글루타민산, 폴리-아스파르트산, 폴리-알라닌, 또는 폴리-프롤린와 같은 동종폴리머다. 다른 구체예들에서, rPEG는 두 가지 유형의 반복된 아미노산 가령, 폴리(Gly-Ser), 폴리(Gly-Glu), 폴리(Gly-Ala), 폴리(Gly-Asp), 폴리(Gly-Pro), 폴리(Ser-Glu), 등을 포함한다. 일부 측면들에서, rPEG는 세 가지 상이한 유형의 아미노산, 가령, 폴리(Gly-Ser-Glu)다. 특정 측면들에서, rPEG는 글루카곤 및/또는 GIP 항진제 유사체의 반감기를 증가시킨다. 일부 측면들에서, rPEG는 순(net) 양전하 또는 순 음전하다. 일부 측면들에서 rPEG는 2차 구조가 없다. 일부 구체예들에서, rPEG는 10개 이상의 아미노산 길이를 가지고, 그리고 일부 구체예들에서, 약 40 내지 약 50개의 아미노산 길이를 가진다. 일부 측면들에서, 보조 펩티드는 펩티드 결합 또는 단백질분해효소 절단 부위를 통하여 본 발명의 유사체의 N- 또는 C- 말단에 융합되거나, 본 발명의 펩티드의 루프안으로 삽입된다. 일부 측면들에서, rPEG는 친화력 테그를 포함하거나 또는 5 kDa이상의 PEG에 연결된다. 일부 구체예들에서, rPEG는 본 발명의 유사체에게 증가된 유체역학적 반경, 혈청 반감기, 프로테아제 저항성, 또는 용해도를 부여하고, 그리고 일부 측면들에서 펩티드에 감소된 면역원성을 부여한다.
접합체:다량체들
본 발명은 동종- 또는 이종-다향체 또는 동종- 또는 이종-이합체를 포함하는 본 명세서에서 기술된 유사체의 다량체 또는 이합체를 더 제공한다. 두 개 또는 그 이상의 유사체들은 표준 연결 물질 및 당업계에 공지되어 있는 방법에 의해 연결될 수 있다. 예를 들면, 이합체는 시스테인, 리신 오르니틴, 호모시스테인 또는 아세틸 페닐알라닌 잔기로 치환된 유사체의 경우에 특히, 이중기능성 티올 교차연결기 및 이중기능성 아민 교차연결기의 사용을 통하여 두 개의 펩티드 사에에 형성될 수 있다. 이합체는 동종이합체 또는 대안으로 이종이합체일 수 있다. 특정 구체예들에서, 2개(또는 그 이상) 펩티드를 연결하는 링커는 PEG, 가령, 5 kDa PEG, 20 kDa PEG다. 일부 구체예들에서, 링커는 이황화물 결합이다. 예를 들면, 이령체의 각 단량체는 Cys 잔기 (가령, 말단 또는 내부에 위치한 Cys)을 포함할 수 있고, 각 Cys 잔기의 황 원자가 이황화물 결합 형성에 참여한다. 일부 측면들에서, 단량체들은 말단 아미노산 (가령, N-말단 또는 C-말단), 내부 아미노산, 또는 최소한 하나의 단량체의 말단 아미노산 및 최소한 하나의 다른 단량체의 내부 아미노산을 통하여 연결된다. 특정 측면들에서, 단량체들은 N-말단 아미노산을 통하여 연결되지 않는다. 일부 측면들에서, 다량체의 단량체들은 각 단량체의 C-말단 아미노산이 서로 연결된 "꼬리에 꼬리 연결(tail-to-tail)" 배향으로 서로 연결된다.
제약학적 조성물, 용도 및 키트
염
일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체는 염, 가령, 제약학적으로 허용가능한 염의 형태로 이 조성물 (또는 접합체 )내에 존재한다. 여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 부모 화합물의 생물학적 활성을 유지하지만, 생물학적이지 않거나 또는 바람직하지 않은 화합물들의 염을 지칭한다. 이러한 염들은유사체들의 최종 분리 및 정제하는 동안 원래 위치에서 준비되거나 또는 자유 염기 기능을 적합한 산과 반응시켜 별도로 준비할 수도 있다. 여기에서 설명된 화합물들중 많은 것들은 아미노 및/또는 카르복실기 또는 이에 유사한 기들의 조 T하에 산 및/또는 염기 염을 형성할 수 있다.
제약학적으로 허용가능한 산 첨가 염은 무기 및 유기산으로부터 제조할 수 있다. 대표적인 산 첨가 염은 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 구연산염, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 중황산염, 중황산 나트륨, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포 술포네이트, 디글루코네이트, 글리세로포스페이트, 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 푸마레이트, 하이드로염화물, 하이드로브롬화물, 하이드로요오드화물, 2-하이드록시에탄술포네이트 (이소티오네이트), 락테이트, 말레이트, 메탄 술포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌 술포네이트, 옥살레이트, 팔미토에이트, 펙티네이트, 과황산염, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙신산염, 황산염, 타르타르산염, 티오시안산염, 인산염, 글루탐산염, 중탄산염, p-톨루엔술포네이트, 및 운데카노에이트를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 무기산으로부터 유도된 염은 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산, 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 유기산으로부터 유도된 염은 아세트산, 트리플로오르아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 주석산, 구연산산, 벤조산, 시나민산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔-술폰산, 살리실산, 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 제약학적으로 허용가능한 산 첨가 염을 만들기 위해 이용할 수 있는 산의 예는 예를 들면, 가령, 염화수소산, 브롬화수소산, 술폰산, 인산과 같은 무기산을 포함하고, 그리고 가령, 옥살산, 말레산, 숙신산, 및 구연산과 같은 유기산을 포함한다.
염기성 첨가 염은 살리실산 원천의 최종 분리 및 정제하는 동안 원 위치에서 준비되거나, 또는 제약학적으로 허용가능한 금속 양이온의 수산화물, 탄산염, 또는 중탄산염과 카르복시산-보유 모이어티를 반응시키거나 또는 암모니아 또는 유기 1차, 2차 또는 3차 아민과 카르복시산-보유 모이어티를 반응시켜 준비할 수 있다. 제약학적으로 허용가능한 염은 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 망간 및 알루미늄과 같은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속계 양이온 염, 및 이와 유사한 것들, 그리고 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸암모늄, 디메틸암모늄, 트리메틸암모늄, 트리에틸암모늄, 디에틸암모늄, 그리고 에틸암모늄을 포함하는 비독성 4차 암모니아 및 아민 양이온을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 염기 첨가 염을 만드는데 유용한 다른 대표적인 유기 아민은 예를 들면, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페리딘, 피페라진, 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 유기 염기로부터 유도된 염은 1차, 2차 및 3차 아민의 염을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
더욱이, 염기성 질소-보유 기는 메틸, 에틸, 프로필, 및 부틸 염화물, 브롬화물 및 요오드화물과 같은 저가 알킬 할로겐화물; 데실, 라우릴, 미리스틸, 및 스테아릴 염화물, 브롬화물 및 요오드화물과 같은 장쇄(long chain) 할로겐화물; 아릴알킬 할로겐화물 유사 벤질 및 펜에틸 브롬화물 및 기타등등과 같이 본 내용의 유사체와 함께 4가화 될 수 있다(quaternize). 이에 의해 수용성 또는 지용성 또는 분산가능한 산물이 수득된다.
제형화(Formulations)
일부 구체예들에 따르면, 본 내용의 글루카곤 유사체들 또는 이의 제약학적으로 허용가능한 염 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제약학적 조성물이 제공된다. 제약학적 조성물은 임의의 제약학적으로 허용가능한 성분들, 예를 들면, 산성화제, 첨가제, 흡수제, 에어로졸 추진제, 공기 대체제, 알킬리화제, 케이킹방지제, 항응고제, 항균성 보존제, 항산화제, 살균제, 베이스, 결합제, 완충제, 킬레이트제, 코팅제, 발색제, 건조제, 계면활성제, 희석제, 살균제, 붕해제, 분산제, 해리 강화제, 염료, 연화제, 유화제, 에멸젼 안정화제, 충진제, 필름 형성제, 풍미 강화제, 풍미제, 유동 강화제, 겔형성제, 과립형성제, 습윤제, 윤활제, 점막흡착제, 연고 베이스, 연고, 유질 비이클, 유기 염기, 방향제 베이스, 안료, 가소제, 연마제, 보존제, 격리제, 피부 침투제, 가용화제, 용매, 안정화제, 좌약 베이스, 표면활성제, 계면활성제, 현탁제, 감미제, 치료제, 염도조절제, 독성화제, 점성-증강제, 물-흡수제, 물-혼화성 공용매, 물 연화제 또는 습윤제를 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 제약학적 조성물은 다음의 성분들중 임의의 하나 또는 복합물을 포함한다: 아카시아, 아세술팜 칼륨, 아세틸트리부틸 구연산염, 아세틸트리에틸 구연산염, 한천, 알부민, 알코올, 탈수된 알코올, 변성된 알코올, 희석된 알코올, 알루리틱 산, 알긴 산, 지방족 폴리에스테르, 알루미나, 수산화 알루미늄, 스트레이트 알루미늄, 아밀로펙틴, α-아밀로즈, 아스코르브산, 아스코르빌 팔미테이트, 아스파르탐, 주사용 정균수, 벤토나이트, 벤토나이트 마그마, 벤잘코니움 클로라이드, 벤제토니움 클로라이드, 벤조산, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 브로노폴, 부틸화된 하이드록시아니솔, 부틸화된 하이드록시톨루엔, 부틸파라벤, 부틸파라벤 나트륨, 칼슘 알긴산, 칼슘 아스코르베이트, 탄산 칼슘염, 사이클로메이트 칼슘, 이염기성 무수 인산칼슘염, 이염기성 탈수화된 인산칼슘염, 삼염기성 인산칼슘 염, 프로피오네이트 칼슘, 실리케이트 칼슘, 소르베이트 칼슘, 스테아레이트 칼슘 , 술페이트 칼슘, 술페이트 헤미하이드레이트 칼슘, 카놀라 오일, 카르보머, 이산화탄소, 카르복시메틸 셀룰로오즈 칼슘, 카르복시메틸 셀룰로오즈 나트륨, β-카로텐, 카라기닌, 카스터 오일, 수소화된 카스터 오일, 양이온성 유상 왁스, 셀룰로오즈 아세테이트, 셀룰로오즈 아세테이트 프탈레이트, 에틸 셀룰로오즈, 미정질 셀룰로오즈, 분말화된 셀룰로오즈, 규화된 미정질 셀룰로오즈, 카르복시메틸 셀룰로오즈 나트륨, 쎄토스테아릴 알코올, 테트리미드, 세틸 알코올, 클로로헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 콜레스테롤, 클로로헥시딘 아세테이트, 클로로헥시딘 글루코네이트, 클로로헥시딘 하이드로클로라이드, 클로로디플루오르에탄 (HCFC), 클로로디플루오르메탄, 클로로플루오르탄소 (CFC) 클로로펜옥시에탄올, 클로로실레놀, 옥수수 시럽 고체, 무수 구연산, 구연산 모노하이드레이트, 코코아 기름, 발색제, 옥수수 오일, 목화씨 오일, 크레졸, m-크레졸, o-크레졸, p-크레졸, 크로스카르멜로즈 나트륨, 크로스포비돈, 사이클라민 산, 사이클로덱스트린, 덱스트레이트, 덱스트린, 덱스트로즈, 덱스트로즈 무수물, 디아졸리디닐 요소, 디부틸 프탈레이트, 디부틸 세바케이트, 디에탄올아민, 디에틸 프탈레이트, 디플루오르에탄 (HFC), 디메틸-β-사이클로덱스트린, 사이클로덱스트린-유형화합물 가령, Captisol, 디메틸 에테르, 디메틸 프탈레이트, 에덴테이트 이칼륨, 에덴테이트 이나트륨, 이나트륨 수소 인산염, 도쿠세이트 칼슘, 도쿠세이트 칼륨, 도쿠세이트 나트륨, 도데실 갈레이트, 도데실트리메틸암모늄 브롬화물, 에덴테이트 칼슘 이나트륨, 에디트 산, 에글루민, 에틸 알코올, 에틸셀룰로오즈, 에틸 갈레이트, 에틸 라우레이트, 에틸 말톨, 에틸 올레이트, 에틸파라벤, 에틸파라벤 칼륨, 에틸파라벤 나트륨, 에틸 바닐린, 푸락토즈, 푸락토즈 액체, 가공된 푸락토즈, 발열원-없는 푸락토즈, 분말화된 푸락토즈, 푸마르산, 젤라틴, 포도당, 액화 포도당, 포화된 식물성 지방산의 글리세리드 혼합물, 글리세린, 글리세릴 베헤네이트, 글리세릴 모노라우레이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 자가-유화성 글리세릴 모노스테아레이트, 글리셀리 팔미토스테아레이트, 글리신, 글리콜, 글리코푸롤, 구아르 검, 헵타플루오르프로판 (HFC), 헥사데실트리메틸암모늄 브롬화물, 고푸락토즈 시럽, 인간 혈청 알부민, 탄화수소(HC), 희석 염산, 수소화된 식물성 오일, 유형II, 하이드록시에틸 셀룰로오즈, 2-하이드록시에틸-β-사이클로덱스트린, 하이드록시프로필 셀룰로오즈, 저-치환된 하이드록시프로필 셀룰로오즈, 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오즈, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오즈 프탈레이트, 이미드우레아, 인디고 카르민, 이온 교환물질, 철 산화물, 이소프로필 알코올, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 등장성 염, 카올린, 젖산, 락티톨, 락토즈, 라놀린, 라놀린 알코올, 무수 라놀린, 레시틴, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 탄산 마그네슘염, 정상적인 탄산 마그네슘염, 무수 탄산마그네슘염, 수산화 탄산 마그네슘염, 수산화 마그네슘염, 마그네슘 라우릴 술페이트, 산화 마그네슘염. 실리케이트 마그네슘, 스테아레이트 마그네슘, 트리실리케이트 마그네슘, 무수 트리실리케이트 마그네슘, 말산, 말토, 말티톨, 말티톨 용액, 말토덱스트린, 말톨, 말토즈, 만니톨, 중쇄 트리글리세리드, 메글루민, 멘톨, 메틸셀룰로오즈, 메틸 메타아크릴레이트, 메틸 올레이트, 메틸파라벤, 메틸파라벤 칼륨, 메틸파라벤 나트륨, 미정질 셀룰로오즈 및 카르복시메틸셀룰로오즈 나트륨, 미네랄 오일, 가벼운미네랄 오일, 미네랄 오일 및 라놀린 알코올, 오일, 올리브 오일, 모노에탄올아민, 몬트모리로나이트, 옥틸 칼레이트, 올레산, 팔미트산, 파라핀, 땅콩 오일, 바세린, 바세린 및 라놀린 알코올, 제약학적 글레이즈, 페놀, 액화된 페놀, 펜옥시에탄올, 펜옥시프로판올, 페닐에틸 알코올, 페닐머큐리 아세테이트, 페닐머큐리 붕산염, 페닐머큐리 질산염, 폴라크린, 폴라크린 칼륨, 폴리옥사머, 폴리덱스트로즈, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 산화물, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 폴리머, 폴리메타아크릴레이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 카스터 오일 유도체, 폴리옥시에틸렌 솔비톨 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 알긴산 칼륨, 벤조산 칼륨 , 중탄산 칼륨, 중아황산 칼륨, 염화칼륨, 구연산 칼륨염, 무수 구연산 칼륨, 칼륨 수소 인산염, 메타중아황산 칼륨, 일염기 인산 칼륨, 프로피오네이트 칼륨, 소르베이트 칼륨, 포비돈, 프로판올, 프로피온산, 프로필렌 탄산염, 프로필렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 알긴산, 프로필 갈레이트, 프로필파라벤, 프로필파라벤 칼륨, 프로필파라벤 나트륨, 프로타아민 술페이트, 평지씨 오일, 링거 용액, 사카린, 사카린 암모늄, 사카린 칼슘, 사카린 나트륨, 잇꽃 오일, 사포나이트, 혈청 단백질, 참깨 오일, 콜로이드성 실리카, 콜로이드성 실리콘 이산화물, 알긴산 나트륨, 아스코르베이트 나트륨, 벤조산 나트륨, 중탄산 나트륨, 중아황산 나트륨, 염화 나트륨, 무수 구연산 나트륨, 탈수된 구연산 나트륨, 염화 나트륨, 사이클라메이트 나트륨, 에덴테이트 나트륨, 도데실 술페이트 나트륨, 라우릴 술페이트 나트륨, 메타중아황산 나트륨, 인산 나트륨, 이염기성, 인산나트륨, 일염기성 인산나트륨, 삼염기, 무수 프로피오네이트 나트륨, 프로피오네이트 나트륨, 소르베이트 나트륨, 전분 글리콜레이트 나트륨, 스테아릴 푸마레이트 나트륨, 아황산 나트륨염, 소르브산, 소르비탄 에스테르 (소르비탄 지방성 에스테르), 솔비톨, 솔비톨 용액 70%, 대두 오일, 경랍 왁스, 전분, 옥수수 전분, 감자 전분, 사전-젤라틴화된 전분, 멸균화되는 옥수수 전분, 스테아르산, 정제된 스테아르산, 스테아릴 알코올, 슈크로즈, 슈가, 압축성 슈가, 제과용 슈가, 구형 슈가, 인버트 슈가, Sugartab, Sunset Yellow FCF, 합성 파라핀, 활석, 타르타르산, 타르트라진, 테트라플루오르에탄 (HFC), 테오브로마 오일, 티메로살, 이산화 티타늄, 알파 토코페롤, 코토페릴 아세테이트, 알파 토코페릴 산 숙시네이트, 베타-토코페롤, 델타-토코페롤, 감마-토코페롤, 트라가탄, 트리아세틴, 트리부틸 구연산염, 트리에탄올아민, 트리에틸 구연산염, 트리메틸-β-사이클로덱스트린, 트리메틸테트라데실암모늄 브롬화물, 트리스 완충액, 트리나트륨 에덴테이트, 바닐린, 유형 I 수소화된 식물성 오일, 물, 연수, 경수, 이산화탄소-없는 물, 발열원 없는 물, 주사용 물, 흡입용 멸균수, 주사용 멸균수, 자극용 멸균수, 왁스, 음이온성 유화용 왁스, 카르나우바 왁스, 양이온성 유화용 왁스, 세틸 에스테르 왁스, 미정질 왁스, 비-이온성 유화용 왁스, 좌약 왁스, 백색 왁스, 황색 왁스, 백색 바세린, 양모지, 산탄검, 자일리톨, 제인, 프로피오네이트 아연, 아연 염, 스테아레이트 아연, 또는 Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, A. H. Kibbe (Pharmaceutical Press, London, UK, 2000)에 있는 임의의 부형제-. 이 문헌은 전문이 참고문헌에 통합된다. Remingtons Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980)-전문이 참고문헌에 통합된다-에서는 제약학적으로 허용되는 조성물을 제조하는데 이용되는 다양한 성분들과, 이들의 조제를 위한 공지된 기술을 공개한다. 임의의 통상적인 물질이 제약학적 조성물과 양립하지 못하는 경우를 제외하고, 제약학적 조성물에 이들의 이용이 고려된다. 보충 활성 성분들로 조성물에 통합될 수 있다.
일부 구체예들에서, 전술한 성분(들)은 제약학적 조성물에 임의의 농도로 존재할 수 있는데, 예를 들면, 최소한 A의 농도, 여기서 A는 0.0001% w/v, 0.001% w/v, 0.01% w/v, 0.1% w/v, 1% w/v, 2% w/v, 5% w/v, 10% w/v, 20% w/v, 30% w/v, 40% w/v, 50% w/v, 60% w/v, 70% w/v, 80% w/v, 또는 90% w/v이다. 일부 구체예들에서, 전술한 성분(들)은 제약학적 조성물에 임의의 농도로 존재할 수 있는데, 예를 들면, 많아야 B의 농도, 예를 들면, 여기서 B는 90% w/v, 80% w/v, 70% w/v, 60% w/v, 50% w/v, 40% w/v, 30% w/v, 20% w/v, 10% w/v, 5% w/v, 2% w/v, 1% w/v, 0.1% w/v, 0.001% w/v, 또는 0.0001% 이다. 다른 구체예들에서, 전술한 성분(들)은 제약학적 조성물에 예를 들면, 약 A 내지 약 B의 농도 범위로 존재할 수 있다. 일부 구체예들에서, A는 0.0001%이며, B는 90%이다.
제약학적 조성물은 생리학적으로 양립가능한 pH를 수득하도록 조제될 수 있다. 일부 구체예들에서, 제약학적 조성물의 pH는 제제 및 투여 경로에 따라, 최소한 5, 최소한 5.5, 최소한 6, 최소한 6.5, 최소한 7, 최소한 7.5, 최소한 8, 최소한 8.5, 최소한 9, 최소한 9.5, 최소한 10, 또는 최소한 10.5 내지 최대 pH 11이다. 특정 구체예들에서, 제약학적 조성물은 생리학적 필적가능한 pH를 수득하기 위하여 완충제를 포함할 수 있다. 완충제는 원하는 pH에서 완충능력이 있는 임의의 화합물, 예를 들면, 인산염 완충액(가령 PBS), 트리에탄올아민, Tris, 비신, TAPS, 트리신, HEPES, TES, MOPS, PIPES, 카코딜에이트, MES, 및 기타를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 완충액의 강도는 최소한 0.5 mM, 최소한 1 mM, 최소한 5 mM, 최소한 10 mM, 최소한 20 mM, 최소한 30 mM, 최소한 40 mM, 최소한 50 mM, 최소한 60 mM, 최소한 70 mM, 최소한 80 mM, 최소한 90 mM, 최소한 100 mM, 최소한 120 mM, 최소한 150 mM, 또는 최소한 200 mM이다. 일부 구체예들에서, 완충액의 강도는 많아야 300 mM (가령, 많아야 200 mM, 많아야 100 mM, 많아야 90 mM, 많아야 80 mM, 많아야 70 mM, 많아야 60 mM, 많아야 50 mM, 많아야 40 mM, 많아야 30 mM, 많아야 20 mM, 많아야 10 mM, 많아야 5 mM, 많아야 1 mM)이다.
투여 경로
다음의 투여 경로에 대한 논의는 예시적인 구체예를 설명하기 위하여 단순히 제공되는 것이며, 임의의 방식으로던 이 범위로 제한시키고자 하는 것으로 해석되어서는 안된다.
경구 투여에 적합한 제제는 (a) 액체 용액, 가령, 물, 염 또는 오렌지 쥬스와 같은 희석제에 용해된 본 내용의 유사체들의 유효량; (b) 캡슐, 사셋(sachets), 테블릿, 마름모형 정제(lozenge), 및 트로치(troches), 이들 각각은 고형 또는 과립의 예정된 양의 활성 성분을 담고 있다; (c) 분말; (d) 적절한 액체내 현탁액; 그리고 (e) 적합한 유액. 액체 제형은 제약학적으로 허용가능한 계면활성제와 함께 또는 없이, 물 및 알코올, 예를 들면, 에탄올, 벤질 알코올, 그리고 폴리에틸렌 알코올과 같은 희석제를 포함할 수 있다. 캡슐 형은 예를 들면, 계면활성제, 윤활제, 및 비활성 충전제, 가령, 락토즈, 슈크로즈, 인산칼슘염, 그리고 옥수수 전분을 포함하는 통상의 경질 또는 연질 껍질의 젤라틴 유형이 될 수 있다. 태블릿 형은 하나 이상의 락토즈, 슈크로즈, 만니톨, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산, 미정질 셀룰로오즈, 아카시아, 젤라틴, 구아르검, 콜로이드성 이산화실리콘, 크로스카르멜로즈 나트륨, 활석, 스테아테이트 마그네슘, 스테아테이트 칼슘, 스테아테이트 아연, 스테아르산, 그리고 기타 부형제, 발색제, 희석제, 완충제, 붕해제, 가습제, 보존제, 풍미제, 그리고 기타 약리학적으로 필적가능한 부형제를 포함할 수 있다. 마름모형 정제는 보퉁 슈크로즈와 아카시아 또는 트라가탄과 같은 풍미제내에 본 내용의 유사체를 포함할 수 있으며, 뿐만 아니라 젤라틴 및 글리세린, 또는 슈크로즈 및 아카시아, 유액, 겔과 같은 비활성 염기 및 당업계에 공지되어 있는 부형제를 포함하는 이와 유사한 것들내에 본 내용의 유사체를 포함하는 향정을 포함할 수 있다.
본 공개된 유사체 단독으로 또는 다른 적합한 성분들과 복합하여 폐 투여를 통하여 전달될 수 있고, 그리고 흡입을 통하여 투여되는 에어로졸 제형으로 만들어질 수 있다. 이러한 에어로졸 제형은 가압된 허용가능한 추진체, 가령, 디클로로디플루오르메탄, 프로판, 질소, 및 이와 유사한 것들내에 배치될 수 있다. 또한 분무기(nebulizer) 또는 스프레이(atomizer)와 같은 가압되지 않은 조제물로 조제될 수도 있다. 이러한 분무 제형을 점막에 분무하는데 이용할 수도 있다. 일부 구체예들에서, 이 유사체는 분말 혼합물 또는 미립자 또는 나노입자로 조제된다. 적합한 폐 제형은 당업계에 공지되어 있다. 가령, Qian et al., Int J Pharm 366: 218-220 (2009); Adjei and Garren, Pharmaceutical Research, 7(6): 565-569 (1990); Kawashima et al., J Controlled Release 62(1-2): 279-287 (1999); Liu et al., Pharm Res 10(2): 228-232 (1993); 국제 특허 출원 공개 번호. WO 2007/133747 및 WO 2007/141411 참고.
장관외 투여에 적합한 제형은 항-산화제, 완충액, 세균 발육 억제제 및 의도된 수령인의 혈액에 대해 제형의 등장성을 부여하는 용질을을 포함하는 수성 및 비-수성, 등장성 멸균 주사 용액, 그리고 현탁제, 가용화제, 농후제, 안정화제 그리고 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁제를 포함한다. 용어 "장관외("parenteral")은 소화관을 통하지 않고, 피하, 근육내, 척수 또는 정맥과 같은 일부 다른 경로를 통한다는 의미다. 본 내용의 유사체는 물, 염, 수성 덱스트로즈 및 관련된 당 용액, 알코올, 가령, 에탄올 또는 헥사데실 알코올, 글리콜, 가령, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜, 디메틸술폭시드, 글리세롤, 케탈 가령, 2,2-디메틸-153-디옥솔란-4-메탄올, 에테르, 폴리(에틸렌글리콜) 400, 오일, 지방 산, 지방 산 에스테르 또는 글리세리드, 또는 아세틸화된 지방 산 글리세리드를 포함하는 멸균 액체 또는 액체 혼합물과 같은 제약학적 담체내 생리학적으로 허용가능한 희석액으로 투여될 수 있으며, 비누 또는 계면활성제와 같은 제약학적으로 허용가능한 계면활성제, 현탁제, 가령 펙틴, 카르보머, 메틸셀룰로오즈, 하이드록시프로필메틸셀룰로오즈, 또는 카르복시메틸셀룰로오즈, 또는 유화제와 같은 또는 기타 약학 어쥬번트의 첨가와 함께, 또는 이들 첨가없이 투여된다.
장관외 제형에 이용될 수 있는 오일은 광유, 동물, 식물 또는 합성 오일을 포함한다. 오일의 특정 예는 땅콩, 콩, 참깨, 목화씨, 옥수수, 올리브, 바세린 및 미네랄을 포함한다. 장관외 제형에 이용되는 적합한 지방산은 올레산, 스테아린산 및 이소스테아린산을 포함한다. 에틸 올레이트 및 이소프로필 미리스테이트는 적합한 지방산 에스테르의 예가 된다.
장관외 제형에 사용하는데 적합한 비누는 지방 알카리 금속, 암모늄, 및 트리에탄올아민 염을 포함하며, 그리고 적합한 계면활성제는 (a) 양이온 계면활성제, 예를 들면, 디메틸 디알킬 암모늄 할로겐화물, 그리고 알킬 피리디니움 할로겐화물, (b) 음이온성 계면활성제 예를 들면, 알킬, 아릴, 및 올레핀 술포네이트s, 알킬, 올레핀, 에테르, 그리고 모노글리세리드 황산염, 그리고 술포숙신산염, (c) 비이온성 계면활성제, 예를 들면, 지방 아민 산화물, 지방산 알카놀아미드, 그리고 폴리옥시에틸렌폴리프로필렌 코폴리머들, (d) 양쪽성 계면활성제, 예를 들면, 알킬-β-아미노프로피오네이트, 그리고 2-알킬-이미다졸린 4차 암모늄 염, 그리고 (e) 이의 혼합물들을 포함한다.
장관외 제형은 단위-약량 또는 다중-약량 밀봉 용기, 가령, 앰플 및 바이알에 제공될 수 있으며, 그리고 사용 직전 멸균 액체 부형제, 예를 들면, 주사용 물의 추가만 필요한 냉동-건조된(동결건조) 조건에서 보관할 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액을 멸균 분말, 과립 및 이미 설명된 테블릿으로부터 만들 수 있다.
본 발명에 따른 주사용 제제도 있다. 주사용 조성물을 위한 유효한 제약학적 담체의 필요는 당업자에게 잘 공지된 사실이다(가령, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., pages 238-250 (1982), 그리고 ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., pages 622-630 (1986)).
추가로, 본 내용의 유사체는 유화용 베이스 또는 수용성 베이스와 같은 다양한 베이스를 혼합시킴으로써 직장 투여용 좌약으로 만들 수 있다. 질 투여용 제형은 활성 성분에 추가하여 적합하다고 당업계에 공지되어 있는 이러한 담체들을 포함하는 질좌약(pessaries), 탑폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 스프레이 제형으로 제시될 수 있다.
상기-설명된 제약학적 조성물에 추가하여, 본 내용의 유사체는 사이클로덱스트린 함입 복합체와 같은 복합체, 또는 리포좀으로 조제될 수 있다는 것을 당업자는 인지할 수 있을 것이다.
투약량(Dose)
본 내용의 유사체는 글루카곤 수용체 길항성 및 GLP-1 수용체 항진성, 또는 글루카곤 수용체/GLP-1 수용체 공동-항진성이 역할을 하는 질환 또는 의학적 상태를 치료하는 방법에 유익할 것으로 본다. 본 내용을 위하여, 투여된 본 유사체의 양 또는 투약량은 합당한 시간대에 걸쳐 피험자 또는 동물에서 가령, 치료 또는 예방 반응을 달성하는데 충분해야만 한다. 예를 들면, 본 내용의 유사체의 약량은 여기에서 설명된 세포로부터 cAMP 분비를 자극하는데 충분해야 하고 또는 포유류에서 약 1 내지 4 분, 1 내지 4 시간 또는 1 내지 4 주 또는 그 이상, 가령, 5 내지 20주 이상 기간 동안 혈당 수준, 지방 수준, 음식 섭취 수준 또는 체중을 감소시키는데 충분해야만 한다. 특정 구체예들에서, 기간은 더 길어질 수 있다. 이 투약량은 본 내용의 특정 유사체의 효과, 동물(가령, 인간)의 상태, 뿐만 아니라 치료해야할 동물(가령, 인간)의 체중에 의해 결정될 것이다.
투여되는 투약량을 결정하는 많은 분석들이 당업계에 공지되어 있다. 여기에서 사용하기 위한 목적으로, 상이한 투약량이 제공된 각 포유류 모임에서 포유류에 본 내용의 주어진 약량의 유사체를 투여할 때 혈당이 감소되는 수준을 비교하는 것을 포함하는 분석을 이용하여 포유류에게 투여될 출발 약량을 결정할 수 있다. 특정 약량의 투여시 혈당 수준이 감소되는 수준은 당업계에 공지되어 있는 방법들을 이용하여 분석할 수 있는데, 예를 들면, 실시예 4에서 설명된 방법들을 포함한다.
본 개시내용의 유사체의 투여량은 본 개시내용의 특정 유사체의 투여와 수반되는 임의의 부작용의 존재, 성질 및 그 정도에 의해 또한 결정될 것이다. 일반적으로, 의사는 나이, 체중, 전반적인 건강, 식사, 성별, 투여되는 본 내용의 유사체, 투여 경로, 치료해야할 상태의 중증도, 얻고자 하는 임상 효과와 같은 다양한 인자들을 고려하여 각 개별 환자를 치료하기 위하여 본 내용의 조성물의 약량을 결정할 수 있다. 예를 들면, 본 발명을 이에 한정시키지는 않지만, 본 개시내용의 유사체의 투여량은 일일 치료되는 대상의 체중 kg 당 약 0.0001 내지 약 1 g, 약 0.0001 내지 약 0.001 g, 또는 약 0.01 mg 내지 약 1 g이 될 수 있다.
일부 구체예들에서, 제약학적 조성물은 환자에게 투여하기에 적합한 수준의 순도에서 본 명세서에서 기술된 임의의 유사체를 포함한다. 일부 구체예들에서, 이 유사체는 최소한 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 순도와 제약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 보유한다. 일부 측면에서, 제약학적 조성물은 최소한 A 농도로 본 명세서에서 개시된 유사체를 포함하는데, 여기에서 A는 약 0.001 mg/ml, 약 0.01 mg/ml, 0 약 1 mg/ml, 약 0.5 mg/ml, 약 1 mg/ml, 약 2 mg/ml, 약 3 mg/ml, 약 4 mg/ml, 약 5 mg/ml, 약 6 mg/ml, 약 7 mg/ml, 약 8 mg/ml, 약 9 mg/ml, 약 10 mg/ml, 약 11 mg/ml, 약 12 mg/ml, 약 13 mg/ml, 약 14 mg/ml, 약 15 mg/ml, 약 16 mg/ml, 약 17 mg/ml, 약 18 mg/ml, 약 19 mg/ml, 약 20 mg/ml, 약 21 mg/ml, 약 22 mg/ml, 약 23 mg/ml, 약 24 mg/ml, 약 25 mg/ml 또는 더 높다. 일부 구체예들에서, 제약학적 조성물은 많아야 B 농도의 본 명세서에서 개시된 유사체를 포함하는데, 여기에서 B는 약 30 mg/ml, 약 25 mg/ml, 약 24 mg/ml, 약 23, mg/ml, 약 22 mg/ml, 약 21 mg/ml, 약 20 mg/ml, 약 19 mg/ml, 약 18 mg/ml, 약 17 mg/ml, 약 16 mg/ml, 약 15 mg/ml, 약 14 mg/ml, 약 13 mg/ml, 약 12 mg/ml, 약 11 mg/ml, 약 10 mg/ml, 약 9 mg/ml, 약 8 mg/ml, 약 7 mg/ml, 약 6 mg/ml, 약 5 mg/ml, 약 4 mg/ml, 약 3 mg/ml, 약 2 mg/ml, 약 1 mg/ml, 또는 약 0.1 mg/ml이다. 일부 구체예들에서, 조성물은 A 내지 B mg/ml 농도 범위, 예를 들면, 약 0.001 내지 약 30.0 mg/ml의 유사체를 함유할 수 있다.
표적화된 형(Targeted Forms)
당업자는 본 내용의 유사체는 다양한 방식으로 변형될 수 있고, 이러한 변형을 통하여 본 내용의 유사체의 치료 또는 예방 효과를 증가시킬 수 있다는 것을 용이하게 인지할 것이다. 예를 들면, 본 내용의 유사체는 표적 모이어티에 직접적으로 또는 링커를 통한 간접적으로 접합될 수 있다. 표적 모이어티들에게 화합물, 가령 여기에서 설명된 글루카곤 유사체들을 접합시키는 과정은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, Wadhwa et al., J Drug Targeting, 3, 111-127 (1995) 및 미국 특허 제5,087,616호. 여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "표적 모이어티"은 세포-표면 수용체를 특이적으로 인지하고 이에 결합하는 임의의 분자 또는 물질을 말하며, 표적 모이어티가 세포 표면에서 수용체 (GLP-1 수용체)가 발현되는 세포 집단으로 본 내용의 유사체를 운반하는 것을 지시한다. 표적 모이어티들은 항체 또는 이의 단편들, 펩티드들, 호르몬, 성장 인자들, 사이토킨, 그리고 세포 표면 수용체(가령, 상피 성장 인자 수용체 (EGFR), T-세포 수용체 (TCR), B-세포 수용체 (BCR), CD28, 혈소판-유도된 성장 인자수용체 (PDGF), 니코틴 아세틸콜린 수용체 (nAChR), 등.)에 결합하는 임의의 기타 천연 또는 비-천연 리간드들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 여기에서 사용된 것과 같이, "링커"은 두 개의 별개 엔터티를 서로 결합시키는 결합, 분자 또는 분자군이다. 링커는 두 개 엔터티에 최적의 공간을 제공할 수 있고, 또는 두 개 엔터티가 서로 분리되어 있는 것을 허용하는 불안정한(Labile) 링키지를 더 공급할 수 잇다. 불안정한 링키지는 광분해기, 산-불안정한 모이어티들, 염기-불안정한 모이어티들 그리고 효소-절단가능한 기를 포함한다. 일부 구체예들에서, "링커"는 표적 모이어티에 본 내용의 유사체를 연결하는 임의의 물질 또는 분자를 말한다. 본 내용의 유사체의 기능, 가령, 당뇨병 또는 비만을 치료하기 위하여 세포로부터 cAMP 분비를 자극시킬 수 있는 능력을 간섭하지 않는다면, 당업자는 본 내용의 유사체의 기능에 필수적이 아닌 본 내용의 유사체 상의 부위가 링커를 부착하거나 및/또는 표적 모이어티로 최적 부위라는 것을 인지한다.
조절 방출 제형
대안으로, 여기에서 설명된 글루카곤 유사체들은 데포우(depot) 형으로 변형될 수 있는데, 본 내용의 유사체가 투여된 신체로 방출되는 방식이 신체내 위치 및 시간에 대해 조절되는 방식이다(예를 들면, 미국 특허 제4,450,150호). 본 내용의 유사체의 데포우 형은 예를 들면, 본 내용의 유사체와 폴리머와 같은 다공성 또는 비-다공성 물질을 포함하는 이식가능한 조성물이 될 수 있는데, 여기서 본 내용의 유사체는 이 물질에 의해 포집되거나 또는 이 물질을 통하여 및/또는 물질의 분해를 통하여 확산될 수 있다. 그 다음 데포우는 신체내 원하는 위치로 이식하고, 본 내용의 유사체는 예정된 속도에서 이식물로부터 방출된다.
특정 측면들에서, 제약학적 조성물은 임의의 유형의 생체내 방출 프로파일을 보유하도록 변형된다. 일부 측면들에서, 제약학적 조성물은 즉시 방출, 조절된 방출, 지속 방출, 연장된 방출, 지연 방출 또는 이중-상 방출 제형이다. 조절된 방출을 위한 펩티드를 제형화하는 방법들은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, Qian et al., J Pharm 374: 46-52 (2009) 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2008/130158, WO2004/033036; WO2000/032218; 및 WO 1999/040942.
본 조성물들은 예를 들면, 미셀(micelles) 또는 리포좀 또는 일부 다른 포집화된 형태를 더 포함할 수 있고, 연장된 보관 및/또는 운반 효과를 제공하기 위하여 연장된 방출 형으로 투여될 수 있다.
공개된 약학 제형은 임의의 섭생에 따라 투여될 수 있는데, 예를 들면, 매일 (일일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 1일 4회, 1일 5회, 1일 6회), 이틀에 한번, 삼일에 한번, 사일에 한번, 오일에 한번, 육일에 한번, 일주일에 한번, 이주에 한번, 삼주에 한번 또는 두 달에 한 번으로 투여된다.
조합(combinations)
여기에서 설명된 이 글루카곤 유사체들은 단독으로 투여될 수 있거나 또는 여기에서 설명된 임의의 질환 또는 의학적 상태를 치료 또는 예방하는 것을 목적으로 하는 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 여기에서 설명된 글루카곤 유사체들은 항-당뇨제 또는 항-비만제와 함께(동시에 또는 연속적으로) 투여될 수 있다. 당업계에 공지되어 있는 또는 연구중인 항-당뇨제는 인슐린, 렙틴, 펩티드 YY (PYY), 췌장 펩티드 (PP), 섬유아세포 성장 인자 21 (FGF21), Y2Y4 수용체 항진제들, 술포닐우레아, 가령 톨부타미드(Orinase), 아세토헥사미드(Dymelor), 톨아자미드(Tolinase), 클로로프로파미드(Diabinese), 글리피지드(Glucotrol), 글리부리드(Diabeta, Micronase, Glynase), 글리메피리드(Amaryl), 또는 글리클라지드(Diamicron); 메글리티니드, 가령, 레파글리니드(Prandin) 또는 네이트글리니드(Starlix); 비구아니드, 가령, 메트포르민(Glucophage) 또는 펜포르민; 티아졸리딘에디온, 가령, 로시글리타존(Avandia), 피오글리타존(Actos), 또는 트로글리타존 (Rezulin), 또는 기타 PPARγ 억제제; 탄수화물 소화를 방해하는 알파 글루코시다아제 억제제, 가령, 미글리톨(Glyset), 아카르보스(Precose/Glucobay); 엑세나티드(Byetta) 또는 프람리니티드; 디펩티딜 펩티다제-4 (DPP-4) 억제제 가령, 빌다클립틴 또는 시타글립틴; SGLT (나트륨-의존적 포도당 수송자 1) 억제제; 또는 FBPase (푸락토즈 1,6-비스포스파타제) 억제제를 포함한다.
당업계에 공지된 또는 연구중인 항-비만제는 펜에틸아민 유형자극제, 펜테르민(선택적으로 펜플러아민 또는 덱스펜플러아민), 디에틸프로피온 (Tenuate), 펜디메트라진(Prelu-2, Bontril), 벤즈페타민(Didrex), 시부트라민(Meridia, Reductil)을 포함하는 식욕 억제제; 리모나반트(Acomplia), 기타 캐나비노이드수용체 길항제; 옥시토모둘린; 플루옥세틴 하이드로클로라이드(Prozac); Qnexa (토피라메이트 및 펜테르민), Excalia (부프로피온 및 조니스아미드) 또는 Contrave (부프로피온 및 날트렉손); 또는 세니칼(Orlistat) 또는 Cetilistat (ATL-962로도 알려짐), 또는 GT 389-255과 유사한 리파제 억제제를 포함한다.
일부 구체예들에서, 여기에서 설명된 펩티드는 비-알코올성 지방간 질환 또는 NASH의 치료용 물질과 공동-투여된다. 비-알코올성 지방간 질환을 치료하는데 이용되는 물질은 우르소데옥시콜린산 (a.k.a., Actigall, URSO, 및 Ursodiol), 메트포르민(Glucophage), 로시글리타존(Avandia), 클로피브레이트, 겜피브로질, 폴리믹신 B, 및 베타인을 포함한다.
일부 구체예들에서 여기에서 설명된 펩티드들은 신경퇴행성 질환, 가령, Parkinson 질환을 치료하는 물질과 함께 투여된다. 항-파킨슨 질환 물질은 당업계에 공지되어 있고, 레보도파, 카르비도파, 항콜린제, 브로모트립틴, 프라미펙솔, 그리고 로피니롤, 아만타딘 및 로사글린을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 내용에서 볼 때, 본 발명은 제약학적 조성물들과 기타 치료제중 하나를 더 포함하는 키트를 더 제공한다. 추가 치료제는 본 내용의 유사체와 동시 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 일부 측면들에서, 이 유사체는 추가 치료제 이전에 투여되고, 다른 측면들에서, 이 유사체는 추가 치료제 이후에 투여된다.
용도( Uses )
글루카곤 유사체들 및 관련 조성물들은 질환 또는 의학적 이상을 치료하는데 유용한 것으로 간주되는데, 가령, 글루카곤 수용체, GLP-1 수용체, 또는 이 둘 모두 수용체에서 활성의 부족은 질환 또는 의학적 이상의 개시 및/또는 진행의 요인이다. 따라서, 본 발명은 환자에서 질환 또는 의학적 이상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 여기서 질환 또는 의학적 이상은 GLP-1 수용체 활성화 및/또는 글루카곤 수용체 활성화의 부족이 질환 또는 의학적 이상의 개시 및/또는 진행과 관련된 의학적 이상 질환이다. 이 방법은 이 질환 또는 의학적 이상을 치료 또는 예방하기 위하여 여기에서 설명된 임의의 것에 따라 유효량의 유사체를 환자에게 제공하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 질환 또는 의학적 이상은 대사증후군이다. 대사 증후군 X로 알려진 대사 증후군, 인슐린 저항성 증후군 또는 Reaven 증후군으로 공지되기도 한 대사 증후군은 5천만이상의 미국인에 영향을 끼치는 장애다. 대사 증후군은 일반적으로 다음의 위험 요소들중 최소한 3개 이상의 무리를 이루는 특징을 가진다: (1) 복부 비만 (복부에 또는 복부 주변에 과도한 지방 조직), (2) 아테롬을 발생시키는 이상지질혈증(동맥 벽에 플락의 축적을 높이는 시키는 고 트리글리세리드, 저 HDL 콜레스테롤 및 고 LDL 콜레스테롤을 포함하는 혈액 지질 장애), (3) 상승된 혈압, (4) 인슐린 저항성 또는 포도당 불내증, (5) 프로트롬빈 상태(가령, 혈액내 높은 피브리노겐 또는 플라스미노겐 플라스미노겐 활성물질 억제제-1), 그리고 (6) 사전-염증 상태(가령, 혈액내 상승된 C-반응성 단백질). 다른 위험 인자들은 노화, 호르몬 불균형 및 유전적 경향을 포함할 수 있다.
대사 증후군은 관상 동맥 심장 질환 및 아테롬성 심혈관 질환(ASCVD)로 불리기도 하는, 발작 및 말초 맥관 질환과 같은 맥관 플락 축적과 관련된 기타 장애의 증가된 위험과 관련된다. 대사 증후군 환자는 초기 인슐린 저항성 상태로부터 ASCVD의 위험이 더 커진 만개된 유형 II 당뇨병으로 진행될 수 있다. 임의의 특정 이론에 결부되지 않고, 인슐린 저항성, 대사 증후군 그리고 맥관 질환 사이의 관계는 손상된 인슐린-자극된 맥관팽창, 강화된 산화성 스트레스로 인하여 NO 이용성에서 인슐린 저항성-관련된 감소, 그리고 아디포넥틴과 같은 지방세포-유도된 호르몬의 이상을 포함하는 하나 이상의 동시발생적 병인성 기전이 관련될 것이다 (Lteif 및 Mather, Can. J. Cardiol. 20 (suppl. B):66B-76B (2004)).
2001 National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel (ATP III)에 따르면, 동일한 개체에서 다음 특징중 임의의 세 가지가 대사 증후군에 대한 기준에 부합된다: (a) 복부 비만 (남성의 경우 복부 둘레가 102 cm 이상, 여성의 경우 88 cm 이상); (b) 혈청 트리글리세리드 (150 mg/dl 또는 이상); (c) HDL 콜레스테롤 (남성의 경우 40 mg/dl 또는 이하 그리고 여성의 경우 50 mg/dl 또는 이하); (d) 혈압 (130/85 또는 이상); 그리고 (e) 공복 혈당 (110 mg/dl 또는 이상). 세계 보건 기구(WHO)에 따르면, 다음 기준중 최소한 두 가지를 가지며, 높은 인슐린 수준 (상승된 공복 혈당 또는 식후에만 상승된 포도당)을 가지는 개체는 대사 증후군의 기준에 부합된다: (a) 복부 비만 (엉덩이에 대한 허리의 비가 0.9이상, 최소한 30 kg/㎡의 체질량지수, 또는 37 인치 이상의 허리); (b) 콜레스테롤 패널에서 트리글리세리드 수준이 최소한 150 mg/dl 또는 HDL 콜레스테롤이 35 mg/dl보다 더 낮을 경우; (c) 140/90 또는 이상의 혈압, 또는 고혈압 치료중). (Mathur, Ruchi, Metabolic syndrome, ed. Shiel, Jr., William C., MedicineNet.com, May 11, 2009).
여기에서 목적을 위해, 2001 National Cholestrol Education Program Adult Treatment Panel 또는 WHO에서 제시한 기준중 하나 또는 두 개에 모두 부합되는 경우, 이 개체는 대사 증후군을 앓고 있는 것으로 간주된다.
특정 이론에 결부되지 않고, 여기에서 설명되는 펩티드는 대사 증후군의 치료에 유용하다. 따라서, 본 발명은 대사 증후군을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하거나, 개체에서 대사증후군의 위험 인자들중 하나, 둘, 셋이상을 감소시키는 방법을 제시하는데, 이 방법은 대사 증후군을 방지 또는 치료, 또는 대사증후군의 위험 인자들을 방지 또는 치료하는데 효과량의 여기에서 설명된 유사체를 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 이 방법은 과혈당 의학 이상을 치료한다. 특정 측면들에서, 과혈당 의학 이상은 인슐린-의존적 또는 비-인슐린-의존적, 당뇨병, 진성 당뇨병 유형 I, 진성 당뇨병 유형 II, 또는 임신성 당뇨병이다. 일부 측면들에서, 이 방법은 신증, 망막증 및 맥관 질환을 포함하는 하나 이상의 당뇨병 합병증을 감소시킴으로써 과혈당 의학 이상을 치료한다.
일부 측면들에서, 질환 또는 의학적 이상은 비만이다. 일부 측면들에서, 비만은 약물에 의해 유도된 비만이다. 일부 측면들에서, 이 방법은 환자에게서 체증 증가를 예방 또는 감소 또는 체중 감소를 증가시킴으로써 비만을 치료한다. 일부 측면들에서, 이 방법은 환자에서 식욕을 감소시키고, 음식 섭취를 줄이고, 지방 수준을 낮춤으로써 비만을 치료하거나, 또는 위장관계를 통한 음식의 이동 속도를 감소시킴으로써 비만을 치료한다.
비만은 다른 질환의 개시 또는 진행과 관련있기 때문에, 비만 치료 방법은 맥관 질환 질환 (관상 동맥 질환, 발작, 말초 맥관 질환, 허혈성 재관류 등), 고혈압, 유형 II 당뇨병, 고지질혈증, 그리고 골근육계 질환을 포함하는 비만과 연관된 합병증을 감소시키는 방법에 더 유용하다. 따라서, 본 발명은 이들 비만-관련된 합병증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
일부 구체예들에서, 질환 또는 의학적 이상은 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)이다. 비-알코올성 지방간질환(NAFLD)은 단순한 지방간(지방증)부터 비알코올성 지방간염(NASH), 간경변(비가역적, 간의 진행된 반흔)까지 광범위한 간질환을 지칭한다. 모든 단계의 NAFLD는 간 세포내에 지방의 축적(지방 침윤)을 공통으로 가진다. 단순 지방간은 특정 유형의 지방, 트리글리세리드가 염증 또는 반흔없이 간 세포에 비정상적으로 축적된 것이다. NASH에서, 지방 축적은 간의 다양한 수준의 염증 (간염) 및 반흔 (섬유증)과 관련된다. 염증성 세포는 간 세포를 파괴시킬 수 있다(간 세포 괴사). 용어 "지방간염(steatohepatitis)" 및 "지방괴사(steatonecrosis)"에서, 지방(steato)은 지방성 침윤을 말하고, 간염(hepatitis)은 간에 염증을 말하며, 괴사(necrosis)는 파괴된 간 세포를 말한다. NASH는 결국 간의 반흔(섬유증)을 유도하고, 그 다음 비가역적, 진행된 반흔 (간경변)으로 이어질 수 있다. NASH에 의한 간경변은 NAFLD 스펙트럼에서 최종, 가장 심각한 상태다. (Mendler, Michel, Fatty Liver: Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) and Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH), ed. Schoenfield, Leslie J., MedicineNet.com, August 29, 2005).
알코올성 간질환, 또는 알코올-유도된 간질환은 알코올의 과도한 소비와 관련된 또는 이를 원인으로 한 세 가지 병리학적으로 별개의 간 질환, 즉, 지방간(steatosis), 만성 또는 급성 간염, 그리고 간경변을 포함한다. 알코올성 간염은 약간 간염-단순히 질환만을 나타내는 비정상적인 테스트-에서부터 황달(빌리루빈 유치에 의한 노란색 피부)과 같은 합병증을 가진 심각한 간 기능이상, 간성 뇌병증(간 부전에 의한 신경 기능이상), 복수(복부에 액체 축적), 출혈성 식도 정맥류(식도의 정맥류 정맥), 비정상적 혈액 응고 및 혼수상태까지 이를 수 있다. 조직학적으로, 알코올 간염은 간세포의 팽창성 변성(ballooning degeneration), 호중구의 염증, 가끔 Mallory 체(세포 중간생성물 필라멘트 단백질의 비정상적인 응집)과 같은 특징적인 외형을 가진다. 간경변은 해부학적으로 섬유화와 복합된 간에 퍼져있는 유괴를 특징으로 한다(Worman, Howard J., alcoholic Liver Disease, Columbia University Medical Center website).
임의의 특정 이론에 결부되지 않고, 여기에서 설명되는 유사체는 예를 들면, 지방간, 지방간염, 간염, 간염증, NSAH, 간경변 또는 이의 복합을 포함하는 알코올성 간질환, NAFLD, 또는 이의 임의의 상태의 치료에 유용하다. 따라서, 본 발명은 개체에서 알코올성 간 질환, NAFLD, 또는 임의의 상태를 방지 또는 치료하는 방법을 제공하는데, 알코올성 간질환, NAFLD, 또는 이의 상태를 방지 또는 치료하는데 유효한 양의 여기에서 설명되는 유사체를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 이러한 치료 방법은 다음중 하나, 둘, 셋 이상의 감소를 포함한다; 간 지방 함량, 간경변 발생 또는 진행, 간세포 암종의 발생, 염증의 징후, 가령 비정상적 간 효소 수준 (가령, 아스파르테이트 아미노전이효소 AST 및/또는 알라닌 아미노전이효소 ALT, 또는 LDH), 상승된 혈청 페리틴, 상승된 혈청 빌리루빈, 및/또는 섬유증의 징후, 가령 상승된 TGF-베타 수준. 바람직한 구체예에서, 펩티드는 단순 지방성 간 (지방간)을 넘어, 염증 또는 간염의 징후를 나타내는 환자를 치료하는데 이용된다. 이러한 방법들은 예를 들면, AST 및/또는 ALT 수준의 감소를 초래할 수 있다.
GLP-1 및 엑센딘-4는 일부 신경보호 효과를 나타내는 것으로 나타났다. 본 발명은 또한 신경퇴행성 질환을 치료하는데, 글루카곤 유사체를 이용하는데, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 다발성 경색, 근위축성 측색 경화증, 기타 수초제거 관련 장애, 노인성 치매, 피질 하부 치매, 동맥경화성 치매, AIDS-관련된 치매, 또는 기타 치매, 중추 신경계 암, 외상에 의한 뇌 손상, 척수 손장, 발작, 또는 대뇌 허혈, 뇌 맥관염, 간질, 헌팅턴 질환, 토우렛(Tourette) 증후군, 길랑-바레(Guillain Barre) 증후군, 윌슨(Wilson) 질환, 피크(Pick) 질환, 신경염증 장애, 뇌염, 뇌척수염 또는 바이러스, 곰팡이 또는 세균성 뇌수막염, 또는 다른 중추신경계 감염, 프라이온 질환, 뇌성 운동실조, 뇌성 변성, 척수소뇌변성 증후군, 프리드리히(Friedreichs) 운동실조, 모세혈관 확장성 운동실조, 척추성 근위축증, 진행성 핵상마비, 긴장이상, 근육 강직, 떨림, 색소성 망막염, 줄무늬체흑색질 변성, 미토콘리이아성 뇌척수병증, 신경 세로이드 리포푸스신증, 간성뇌병증, 신장뇌병증, 대사성 뇌병증, 독소-유도된 뇌병증, 그리고 방사능-유도된 뇌 손상을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구체예들에서, 질환 또는 의학적 상태는 저혈당증이다. 일부 구체예에서, 환자는 당뇨환자이며, 저혈당증은 인슐린 투여에 의해 유도된다. 일부 측면에서, 이 방법은 인슐린과 복합하여 본 개시내용의 유사체를 제공하고, 유사체가 인슐린 다량 투여(bolus administration)의 저혈당 효과를 완충시키는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 글루카곤 유사체들은 병원 환경에서 비-당뇨 환자, 가령, 장관외 영양소를 제공받는 또는 전체 장관외 영양소를 제공받는 환자에게 장관외 영양소 투여와 함께 이용될 수 있다. 비-제한적인 예는 외과수술 환자, 혼수 상태 환자, 소화기관 질환자 또는 비-기능성 위장관(가령, 외과적으로 제거, 차단 또는 손상된 흡수력, 크론 질환, 궤양성 결장염, 위장관 폐쇄, 위장관 기공, 급성 췌장염, 허혈성 장, 1차 위장 외과술, 특정 선천성 위장관 이상, 장기 설사 또는 외과술에 의한 짧은 장 증후군, 쇼크 환자를 포함하며, 그리고 회복기의 환자들은 흔히 지질, 전해질, 미네랄, 비타민 및 아미노산의 다양한 복합물과 함께 탄수화물의 장관외 투여를 받는다. 단서 조항으로, 장관외 영양 조성물이 소화될 때 글루카곤 유사체들이 원하는 생물학적 효과를 발휘한다면, 여기에서 설명된 글루카곤 유사체들과 장관외 영양 조성물은 동시에 투여되거나, 상이한 횟수로, 서로에 대해 전, 또는 후에 투여될 수 있다. 예를 들면, 장관외 영양물은 하루에 1회, 2회 또는 3회 투여될 수 있으며, 글루카곤 유사체들은 2일에 한번, 1주일에 3회, 1주일에 2회, 1주일에 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 한달에 1회 투여된다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "치료하다" 및 "예방하다" 뿐만 아니라 이로부터 파생된 단어들은 반드시 100% 치료 또는 예방을 의미하는 것은 아니다. 오히려, 당업자는 잠재적 장점 또는 치료 효과를 보유하는 다양한 치료 또는 예방이 있다는 것을 인지할 것이다. 이에 대해, 방법들은 포유류에서 질환 또는 의학적 이상을 치료 또는 예방하는 임의의 수준의 임의의 양을 제공할 수 있다. 더욱이, 이 방법에 의해 제공되는 치료 또는 예방은 질환 또는 의학적 이상의 하나 이상의 증상 또는 상태를 치료 또는 예방하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 비만을 치료하는 방법에 있어서, 일부 구체예들에서 이 방법은 환자가 섭취하는 음식의 양을 감소시키거나, 또는 지방 수준을 감소시킨다. 또한, 여기에서 사용을 위한 목적으로, "예방(prevention)"은 질환 또는 이의 증상 또는 상태의 개시를 지연하는 것을 포함할 수 있다.
상기 치료 방법에 있어서, 환자는 임의의 숙주가 된다. 일부 구체예들에서, 숙주는 포유동물이다. 여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "포유동물"은 단공류 동물(monotreme), 육아낭(marsupial), 그리고 태반 분류군(placental taxas)중 임의의 것을 포함하는 포유동물 종류의 임의의 척추 동물을 말한다. 일부 구체예들에서, 포유동물은 로덴티아(Rodentia) 목 가령, 마우스 및 헴스터의 포유동물, 그리고 로고모르파(Logomorpha) 목, 가령, 토끼와 같은 포유동물 목중 하나이다. 특정 구체예들에서, 포유동물은 고양잇과(Felines (고양이))와 갯과(개)를 포함하는 카르니보라(Carnivora) 목이다. 특정 구체예들에서, 포유동물은 소과(Bovines (소)와 돼지과(돼지)의 페르소닥틸라(Perssodactyla) 목, 말과(Equines (말)을 포함하는 Artiodactyla 목이다. 일부 경우들에서, 포유동물은 영장류(Primates), 쎄보이드(Ceboids), 또는 씨모이드(Simoids) (원숭이) 또는 안트로포이드(Anthropoids) 목 (인간 및 유인원)이다. 특정 구체예들에서, 포유동물은 인간이다.
키트
한 구체예에 따르면, 본 개시내용의 글루카곤 유사체는 키트의 일부로 제공될 수 있다. 따라서, 일부 구체예들에서, 글루카곤 유사체, 이를 테면, 글루카곤 항진제 펩티드를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하기 위한 키트가 제공되는데, 여기에서 키트는 본 명세서에서 기술된 것과 같이 글루카곤 유사체를 포함한다.
한 구체예에서 환자에게 글루카곤 조성물을 투여하기 위한 장치, 이를 테면, 주사기 바늘, 펜 장치, 제트 주입기 또는 기타 바늘없는 주사기가 키트에 제공된다. 이 키트에는 임의선택적으로 동결건조된 형태 또는 수용액 안에 글루카곤 유사체를 보유하는 하나 또는 그 이상 용기, 이를 테면, 바이알, 튜브, 병, 단일 또는 다중-챔버로 된 사전-충전된 주사기, 카트릿지, 주입 펌프(외부 또는 이식가능한), 제트 주입기, 사전-충전된 펜 장치 및 이와 유사한 것이 대안으로 또는 추가로 포함될 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 키트들은 사용 지침을 포함한다.
한 구체예에 따르면, 이 키트의 장비는 에어로졸 분배 장치이고, 여기서 이 조성물은 에어로졸 장치내에 사전 포장된다. 또다른 구체예에서, 이 키트는 주사기와 바늘을 포함하며, 한 구체예에서, 멸균 조성물은 주사기내에 사전 포장된다.
다음의 실시예는 본 발명을 단순히 설명하기 위하여 제공된 것이며, 이의 범위를 어떠한 방식으로던 제한하고자 함은 아니다.
실시예
실시예 1
글루카곤의 펩티드 단편들의 합성
재료:
실시예에서 설명된 모든 펩티드들은 다른 언급이 없는 한, 아미드화된다.
MBHA 수지 (4-메틸벤즈하이드릴아민 폴리스티렌 수지)가 펩티드 합성 동안에 이용되었다. MBHA 수지, 100-180 메쉬, 1% DVB 가교된 폴리스티렌; 부하율 0.7-1.0 mmol/g), Boc-보호된 그리고 Fmoc 보호된 아미노산은 Midwest Biotech으로부터 구입하였다. Boc-보호된 아미노산을 이용하여 고형상 펩티드 합성은 Applied Biosystem 430A 펩티드 합성기 상에서 실행하였다. Fmoc 보호된 아미노산 합성은 Applied Biosystems Model 433 펩티드 합성기를 이용하여 실행하였다.
펩티드 합성 (Boc 아미노산/HF 절단):
이들 유사체들의 합성은 Applied Biosystem Model 430A 펩티드 합성기에서 실행하였다. 합성 펩티드들은 2 mmol의 Boc 보호된 아미노산을 포함하는 카트릿지에 아미노산을 연속 첨가하여 작제되었다. 특히, 합성은 Boc DEPBT-활성화된 단일 결합을 이용하여 실행하였다. 결합(coupling) 단계 종료시, 펩티딜-수지는 TFA로 처리하여 N-말단 Boc 보호기를 제거하였다. DMF으로 반복적으로 세척하였고, 이러한 반복 과정은 원하는 횟수의 결합 단계동안 반복하였다. 어셈블리 후, 측쇄 보호, Fmoc는 20% 피페리딘 처리에 의해 제거되었고, DIC를 이용하여 아실화를 실행하였다. 전체 합성 종료시에 펩티딜-수지는 DCM을 이용하여 건조하였고, 그리고 이 펩티드는 무수 HF와 수지로부터 절단되었다.
락탐화를 위하여, Glu 및 Lys 용 직각(orthogonal) 보호기 (가령,Glu(Fm), Lys(Fmoc))가 선택되었다. 보호기를 제거한 후, 그리고 HF 절단 전, 고리화는 이미 설명된 바와 같이 실행하였다(가령, 국제 특허 출원 공개 번호 WOO2008/101017).
펩티드-수지의 HF 처리
펩티드-수지는 무수 HF로 처리하였고, 이로써 일반적으로 정제안된 보호되지 않은 펩티드 약 350㎎ (~50% 수율)을 만들었다. 특히, 펩티드-수지(30㎎ 내지 200㎎)은 절단을 위하여 플루오르화 수소(HF) 반응 용기에 두었다. 500 μL의 p-크레졸은 카보니움 이온 소거제로써 용기에 추가되었다. 용기는 HF 시스템에 부착되고, 메탄올/드라이아이스 혼합물에 담구었다. 진공 펌프를 이용하여 용기를 비우고, 10 mL의 HF를 반응 용기로 증류되었다. 이러한 펩티드 수지 및 HF 반응 혼합물은 0℃에서 한 시간 동안 교반되었고, 진공을 만든 후, HF를 신속하게 빼내었다 (10-15분). 용기를 조심스럽게 제거한 후, 약 35 mL의 에테르를 채워, 펩티드를 침번시키고, 그리고 HF 처리로 인한 p-크레졸 및 작은 분자 유기 보호기를 추출하였다. 이 혼합물은 테플론 필터를 이용하여 여과되고, 과량의 모든 크레졸이 제거되도록 두 차례 반복하였다. 이 여과액을 버렸다. 침전된 펩티드는 대략 20 mL의 10% 아세트산 (aq)에 용해되었다. 원하는 펩티드를 포함하고 있는 여과액을 수거하였고, 동결건조하였다.
정제안된 용해된 펩티드의 분석용 HPLC 분석은 다음의 조건하에서 실행되었다 [4.6 X 30 mm Xterra C8, 1.50 mL/min, 220 nm, A 완충액 0.1% TFA/10% ACN, B 완충액 0.1% TFA/100% ACN, 구배 5-95%B,15 분]. 추출물은 물로 2배 희석시키고, 2.2 X 25 cm Vydac C4 예비 역상 컬럼에 로딩하였고, Waters HPLC 시스템 (A 완충액 0.1% TFA/10% ACN, B 완충액 0.1% TFA/10% CAN 및 구배 0-100% B, 120 분, 유속 15.00 ml/min) 상에서 아세토니트릴 구배를 이용하여 용리시켰다. HPLC analysis of the 정제된 펩티드의 HPLC 분석에서 95% 이상 순도를 설명하였고, 펩티드의 동일성을 확인하기 위하여 전자분무 이온화 질량 스펙트럼 분석(electrospray ionization mass spectral analysis)을 이용하였다.
펩티드 아실화 (Peptide Acylation)
아실화된 펩티드는 다음과 같이 준비된다. 펩티드는 CS Bio 4886 펩티드 합성기 또는 Applied Biosystems 430A 펩티드 합성기를 이용하여 고형 기질 수지상에서 합성된다. In situ 중화 화학은 Schnolzer et al., Int.J. Peptide Protein Res. 40: 180-193 (1992)에서 설명된 것과 같이 이용된다. 아실화된 펩티드의 경우, 아실화(예를 들면, 서열 번호 :3의 아미노산 번호매김에 따라 위치 10)되는 표적 아미노산 잔기는 N ε-FMOC 리신 잔기로 치환된다. 완전한 N-말단 BOC 보호된 펩티드를 20% 피페르딘/DMF로 30분간 처리하면 FMOC/포르밀기가 제거된다. 자유 ε-아미노 Lys 잔기에 커플링은 10배 과량 몰 농도의 FMOC-보호된 스페이스 아미노산 (가령, FMOC-(N-BOC)-트립토판-OH) 또는 아실 사슬 (가령, CH3(CH2)14-COOH)와 DMF/DIEA내에 PyBOP 또는 DEPBT 커플링 시약을 이용하여 수득된다. 연속하여 스페이스 아미노산의 FMOC 기 제거에 이어 아실 사슬로 커플링을 반복한다. 100% TFA으로 최종 처리하면 임의의 측쇄 보호기 및 N-말단 BOC 기가 제거된다. 펩티드 수지는 5% DIEA/DMF로 중화시키고, 건조시키고, 그 다음 HF/p-크레졸, 95:5를 이용하여 0℃에서 1시간 동안 기질로부터 절단시킨다. 에테르 추출후, 5% HOAc 용액을 이용하여 정제안된 펩티드를 용매화시켰다. ESI-MS을 이용하여 용액 샘플에 수정된 분자량의 펩티드가 포함되었다는 것이 증명된다. 정확한 펩티드는 선형 그라디언트 10% CH3CN/0.1% TFA 내지 0.1 % TFA/100% CH3CN을 이용하여 RP-HPLC에 의해 정제된다. Vydac Cl8 22 mm x 250 mm 단백질 컬럼이 정제에 이용된다. 아실화된 펩티드 유사체는 일반적으로 20:80 비율의 완충액에 의해 완전히 용출된다. 부분들을 합치고, 분석용 RP-HPLC 상에서 순도를 점검하였다. 순수 분취물은 동결건조시켜 백색 고체 펩티드를 만든다.
펩티드가 락탐 다리와 아실화될 표적 잔기를 포함하는 경우, 아실화는 이 펩티드 기본골격에 이 아미노산을 첨가할 때 상기에서 설명한 것과 같이 실행된다.
펩티드 페길화(Peptide PEGylation)
펩티드 페길화를 위하여, 40 kDa의 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 아이도아세타아미드(NOF)는 맑은 용액(2-3mg 펩티드를 이용하는 경우 일반적으로 2㎖ 미만)에 펩티드와 PEG를 용해시키는데 필요한 최소한의 양을 이용한 7M 우레아, 5OmM 트리tm-HCl 완충액에 당량의 펩티드와 반응된다. 실온에서 왕성하게 교반이 4-6시간동안 시작되고, 반응물은 분석용 RP-HPLC에 의해 분석된다. 페길화된 산물은 감소된 보유시간을 가지는 출발 물질과는 구별된다. 정제는 Vydac C4 컬럼에서 처음 펩티드 정제에 이용된 것과 유사한 조건으로 실시된다. 용리는 일반적으로 50:50의 완충액에서 일어난다. 순수한 페길화된 펩티드들이 수거되고, 동결건조된다. 반응마다 다양하지만 수율은 50%이상이었다.
질량 분석을 이용한 분석
표준 전자 분무 이온화기(ESI) 이온 소스를 갖춘 Sciex API-III 전자분무 사중극 질량분석기를 이용하여 질량 스펙트럼을 얻었다. 이용되는 이온화 조건은 다음과 같다: 양이온-모드에서의 ESI; 이온 분무 전압, 3.9 kV; 구멍 전위, 60 V. 이용된 분무 및 막 기체는 0.9 L/min의 유속에서 질소였다. 0.5 Th per step 및 2 msec dwell 시간에서 600-1800 Thompsons (Th)으로부터 질량 스펙트럼이 기록되었다. 시료(약 1mg/mL)는 50% 수성 아세토니트릴과 1% 아세트산에서 용해되고, 그리고 5 μL/min의 속도로 외부 주사 펌프에 의해 도입되었다.
펩티드가 ESI-MS에 의해 PBS 용액내에서 분석될 때, 제조업자(Millipore Corporation, Billerica, MA, http://www.millipore.com/catalogue.nsf/docs/C5737)의 지시에 따라, 이 펩티드들은 우선 0.6㎕ C4 수지를 포함하는 ZipTip 고형상 추출 팁을 이용하여 탈염되었다.
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 MALDI 분석을 이용하여 인산염 완충액(PBS)(pH, 7.2)에서 이들의 상대적인 전환율을 예측하기 위하여 이들 정제안된 펩티드들로 예비 분석을 실행하였다. 정제안된 펩티드 시료는 1 mg/ml의 농도로 PBS 완충액에 용해시켰다. 생성된 용액 1 ml는 1.5 ml HPLC 바잉알에 보관하였고, 그 다음 밀봉하고, 37℃에서 항온처리하였다. 다양한 시간대에서 100μl 분량을 빼내고, 실온으로 냉각시키고, HPLC로 분석하였다.
214 nm에서의 UV 탐지기와 150 mm × 4.6 mm C8 Vydac 컬럼을 이용하여, Beckman System Gold Chromatography 시스템을 이용하여 HPLC 분석이 실행되었다. 유속은 1 mL/min이었다. 용매 A는 증류수내 0.1% TFA를 포함하고, 용매 B는 90% CH3CN중 0.1% TFA를 포함하였다. 선형 구배가 이용되었다(15분내 40% ~ 70%의 B). Peak Simple Chromatography 소프트웨어를 이용하여 데이터를 수거하였고, 분석하였다.
가수분해 초기 속도를 이용하여 해당 프로드럭의 해리에 대한 속도 상수를 측정하였다. 프로드럭 및 약물의 농도는 이들의 피크 면적으로부터 추정하였다. 프로드럭의 1차 해리 속도 상수는 다양한 시간 간격에서 프로드럭의 농도의 로그를 플롯팅하여 결정하였다 . 이 플롯의 기울기는 속도 상수 'k다. 다양한 프로드럭의 분해 반감기는 식 t = 0.693/k를 이용하여 계산되었다.
실시예 2
서열 번호: 17의 펩티드 합성
펩티드 서열 번호: 17은 Fmoc/t-Bu 화학을 이용하여 고형 상에 의해 합성되었다. 펩티드의 준비를 위하여, 0.5 g의 2-클로로트리틸-수지 (100-200 메쉬, 1.18 mmol/g) (GL Biochem)는 0.8 당량(eq.). Fmoc-Gln(Trt)-OH, 2시간 동안 건성 DCM(디클로로메탄) 안에서 아미노산 디이소프로필에틸아민과 비교하여 4 eq.과 함께 항온처리함으로써 우선 유도되었다. 그 다음 펩티드 서열 어셈블리는 펩티드 다중합성기 APEX396 (Advanced Biotech) 상에서 실행되었다. 모든 아미노산은 DMF (N,N-디메틸 포름아미드)에서 0.5M 농도로 용해되었다. 아실화 반응은 아미노 기가 없는 수지에서 6-배 과량의 활성화된 아미노산과 함께 60분 동안 실행되었다. Aib2, Aib16, Asp15, His1에 대해 이중 아실화가 실행되었다. 아미노산은 등몰량의 HATU (2-(1H-7-아자벤조트이라졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸 우로니움 헥사플로오르포스페이트), DMF에서 0.5M 용액, 및 2-배 몰 과량의 DIEA (N,N-디이소프로필에틸아민), NMP (1-메틸-2-피롤리디논)에서 2M 용액으로 활성화되었다.
측쇄 보호기는 다음과 같다: Asp 및 Glu, Ser, Thr 및 Tyr의 경우 tert-부틸; Asn, Gln 및 His의 경우 트리틸; Lys, Trp의 경우 tert-부톡시-카르보닐; 그리고 Arg의 경우 2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로벤조퓨란-5-술포닐; Boc-His(Trt)-OH이 합성에 이용되었다.
측쇄 상에서 유도화된 위치 10의 리신은 Lys(Alloc)으로 통합되었다. 어셈블리 종료시에, Alloc 보호기는 제거되었고, 활성화물질로써 HBTU (4 eq.; (O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로니움 헥사플로오르포스페이트), 및 DIPEA (8 eq.)를 이용하여, 2개의 γ-카르복시글루타민산 잔기들 (4 eq.)과 팔미트산(4 eq.)을 응축시킴으로써 합성이 완료되었다.
합성의 종료시, 건조 펩티드-수지는 실온에서 2시간 동안 25 mL의 절단 혼합물, 88% 트리플로오르아세트산 (TFA), 5% 페놀, 2% 트리이소프로필실란 및 5% 물로 개별적으로 처리되었다. 수지는 여과되고, 용액의 용적은 감소되며, 그 다음 펩티드를 침전시키기 위하여 차가운 메틸-t-부틸 에테르에 추가되었다. 원심분리 후, 펩티드 펠렛은 유기 소거물질(scavengers)을 제거하기 위하여 새로 만든 차가운 메틸-t-부틸 에테르로 세척되었다. 이 공정은 2회 반복되었다. 최종 펠렛은 건조되었고, H2O, 20% 아세토니트릴에 재현탁되었고, 및 동결건조되었다.
정제안된 펩티드는 용리제로써 (A) 0.1% TFA/물과 (B) 0.1% TFA/아세토니트릴을 이용하여 예비 Waters XBridge C18 (50 x 150 mm, 5 μm)를 이용한 역-상 HPLC에 의해 정제되었다. 분석용 UPLC는 용매로써 H2O, 0.1% TFA (A) 및 CH3CN, 0.1% TFA (B)를 이용하여 45℃에서 BEH130, C18 Acquity , 1.7 ㎛ 컬럼, 2.1 x 100 mm, (Waters)으로 Waters Chromatograph에서 실행되었다. 정제된 펩티드는 Waters SQ Detector 상에서 전자분무 질량분석에 의해 특징화되었다.
실시예 3
cAMP를 유도하는 글루카곤 유사체의 능력은 반딧불이 루시퍼라제-기초한 리포터 분석에서 측정되었다. 유도된 cAMP 생산은 글루카곤, GLP-1 수용체 또는 GLP-1 수용체와 cAMP-반응성 요소에 결합하는 글루카곤 단편에 직접적으로 비례한다. cAMP 반응 요소에 링크된 루시퍼라제 유전자와 글루카곤 또는 GLP-1 수용체로 각각 공동 형질감염된 HEK293 세포를 생분석에 이용하였다.
이 세포들은 0.25% 소 성장 혈청(HyClone, Logan, UT)이 보충된 DMEM(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 16시간 배양하여 혈청을 제거하였고, 그 다음 37℃, 5% CO2, 96 웰 폴리-D-리신-피복된 "Biocoat" 플레이트(BD Biosciences, San Jose, CA)에서 5시간 동안 글루카곤 단편들의 연속 희석물과 함께 항온처리되었다. 항온처리 종료 시점에 100㎕의 LucLite 발광 기질 시약(Perkin-Elmer, Wellesley, MA)을 각 웰에 추가하였다. 플레이트를 간단하게 흔들고, 10분간 어두운 곳에서 항온처리한 후, 방출되는 광은 MicroBeta-1450 액체 섬광 카운터에서 측정되었다(Perkin-Elmer, Wellesley, MA). 효과적인 50% 농도(EC50)는 Origin software (OriginLab, Northampton, MA.)를 이용하여 계산되었다.
실시예 4
서열 번호:17의 펩티드의 시험관내 항진제 효능은 인간 GLP-1R, GCGR 또는 GIPR를 안정적으로 발현시키는 중국 헴스터 난소 세포(CHO-K1)를 이용하여 측정되었다. GLP-1R 및 GCGR 안정적 세포계 동계 모음은 Jump-In™ 표적화된 통합 기술을 이용하여 Invitrogen™에 의해 생성되었고, 안정적인 CHO/GIPR 계통은 클론 선택용 제한 희석과 함께 전통적인 클로닝 및 형질감염 기술(랜덤 통합)을 이용하여 생성되었다. DiscoveRx Hithunter™ cAMP XS+ 분석 키트(cat# 90-0075L)를 이용하여 키트 사용지침에 따라 다양한 세포계통에서 cAMP 생산을 자극하는 펩티드들의 능력을 시험관에서 테스트하였다. 펩티드 50% 효과 농도 (EC50)는 GraphPad Prism 4 소프트웨어(GraphPad Software, San Diego, CA)로 펩티드 용량에 대해 발광 값을 플롯팅함으로써, 비-선형 회귀 분석 4-매개변수 곡선 피팅에 의해 산출되었다.
실시예 5
서열 목록에서 설명된 것과 같은 아미노산 서열을 보유하는 펩티드는 실시예 1 또는 2에서 기본적으로 설명된 것과 같이 만들었고, 실시예 3 또는 4에서 기본적으로 설명된 것과 같이 각 글루카곤 수용체 및 GLP-1 수용체에서 시험관 항진제 활성에 대해 후속적으로 테스트되었다. 일부 경우들에서, GIP 수용체에서 시험관내 항진제 활성이 또한 테스트되었다. 결과는 하기 표 1에 나타낸다.
서열 번호 서열
글루카곤 수용체에서 EC50 (nM) GLP-1 수용체에서 EC50 (nM) GIP 수용체에서 EC50 (nM)
12 HaibQGTFTSDK(γGlu-γGlu-C16)SKYLDAibRAAQDFVQWLMDTKγGlu-아미드 0.010 0.003 12.763
13 HaibQGTFTSDYSKYLDERRAaibEFVC(40K-TE PEG)WLLDTKγE-아미드 2.806 0.567
 139.639
14 HsQGTFTSDK(γGlu-C16)SKYLDERAAQDFVQWLLDTKγGlu-아미드 0.003 0.003 976
15 HaibQGTFTSDK(γGlu-γGlu-C16)SKYLDaibRAAQDFVQWLMornDTKQ-acid 0.006 0.005 1.901
16 HaibQGTFTSDK(γGlu-γGlu-C16)SKYLDaibRAAQDFVQWLLDTKQ-acid 0.015 0.019 1.038
17 HaibQGTFTSD K(Glu-Glu-C16) SKYLD aib RAAQDFVQWLMNTKGlu-아미드 0.11 0.075 > 2000
서열 번호:12~16의 펩티드에 대한 EC50값은 실시예 3의 과정을 이용하여 획득되었다. 서열 번호:17의 펩티드에 대한 EC50값은 실시예 4의 과정을 이용하여 획득되었다.
표 1에 나타낸 것과 같이, 많은 펩티드들은 GLP-1 수용체에서 나노물 또는 피코몰 범위에서 EC50을 나타낸다.
실시예 6
식이 유도화된 비만 (DIO) 마우스는 한 집단에 8마리씩 나누고, 각 집단의 최초 평균 체중이 측정된다. 마우스 각 집단에게는 1주일간 펩티드 또는 비이클 대조군의 일일 투여량이 피하로 주사된다. 이 연구에서 테스트된 펩티드는 서열 번호: 12-16의 펩티드들이다. 투여된 용량은 테스트된 각 펩티드에 대해 1 내지 10 nmol/kg 사이에서 변화되었다. 테스트 기간 동안 주기적으로 체중, 체성분(body composition), 음식 섭취, 및 혈당 수준이 측정되었다.
혈당 수준에 있어서 이들 펩티드의 효과를 더 잘 측정하기 위하여, db/db 마우스를 이용하여 제 2 실험이 실행된다. 이 실험에서, db/db 마우스는 한 집단에 8마리씩 나누고, 각 집단의 최초 평균 체중이 측정된다. 각 마우스 집단에게 서열 번호: 12-16중 하나의 펩티드의 단일 투여량이 피하로 주사되고, 여기에서 투여량은 3 내지 30 nmole/kg 범위에 있다. 테스트 기간 동안 주기적으로 체중, 체성분, 음식 섭취, 및 혈당 수준이 측정되었다.
실시예 7
본 발명의 특정 펩티드의 생체내 효과는 16 주 동안 고지방 식사를 하고, 초기 체중이 ~ 47 g인 식사에 의해 유도된 비만(DIO) 마우스에서 확인되었다. 마우스에게 9일간 매일 비이클 대조군 또는 펩티드 투여량이 투여되었다. 이 연구에서 테스트된 펩티드는 서열 번호: 12의 펩티드, 서열 번호: 17의 펩티드, 서열 번호: 18의 펩티드, 및 서열 번호: 19의 펩티드가 포함되었다. 각 펩티드의 투여량은 변화되었고-서열 번호: 12, 17, 및 19의 각 펩티드는 3 nmol/kg 또는 9 nmol/kg의 양으로 투여되었고, 한편 서열 번호: 18의 펩티드는 1 nmol/kg, 3 nmol/kg, 또는 9 nmol/kg의 투여량으로 투여되었다. 연구 동안 매일 누적 체중 변화 (grams)가 측정되었고, 결과는 도 1에 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
본 연구에서 테스트된 각 펩티드는 체중을 감소시키는 효과가 나타났다. 펩티드 3 nmol/kg 투여량 또는 9 nmol/kg 투여량으로 투여된 마우스의 각 집단은 연구 1일째와 같이 빨리 감소된 체중을 보였다(비이클-처리된 마우스와 비교하였을 때). 연구 9일째, 서열 번호: 12의 펩티드 3 nmol/kg를 투여받은 마우스는 대략 5.3% 체중 감소를 나타내었다. 한편 서열 번호: 12의 펩티드 9 nmol/kg를 투여받은 마우스는 대략 29.8% 체중 감소를 나타내었다. 연구 9일째, 서열 번호: 17의 펩티드 3 nmol/kg를 투여받은 마우스는 대략 9.6% 체중 감소를 나타내었고, 한편 서열 번호: 17의 펩티드 9 nmol/kg를 투여받은 마우스는 대략 35.5% 체중 감소를 나타내었다. 연구 9일 째, 서열 번호: 18의 펩티드 3 nmol/kg를 투여받은 마우스는 대략 12.3% 체중 감소를 나타내었고, 한편 서열 번호: 18의 펩티드 9 nmol/kg를 투여받은 마우스는 대략 26.8% 체중 감소를 나타내었다. 연구 9일 째, 서열 번호: 19의 펩티드 3 nmol/kg를 투여받은 마우스는 대략 8.1% 체중 감소를 나타내었고, 한편 서열 번호: 19의 펩티드 9 nmol/kg를 투여받은 마우스는 대략 31.5% 체중 감소를 나타내었다.
점증적 체중 변화에 추가하여, DIO 마우스의 주변환경(ambient) 포도당 수준이 측정되었다. 도 2에 나타낸 것과 같이, 서열 번호: 18의 펩티드 3 nmol/kg 또는 9 nmol/kg 투여량을 투여받은 마우스는 4일째 주변환경 포도당이 상당히 감소된 것으로 나타났다(-29% vs. 비이클; P < 0.05). 서열 번호: 19의 펩티드 9 nmol/kg 투여량을 투여받은 마우스는 4일째 포도당 수준이 대략 40% 감소된 것으로 나타났고(비이클 대조군 마우스와 비교하였을 때; P < 0.05), 7일째 포도당 수준이 대략 39% 감소된 것으로 나타났고(비이클 대조군 마우스와 비교하였을 때; P < 0.05), 그리고 9일째 포도당 수준이 대략 26% 감소된 것으로 나타났다(비이클 대조군 마우스와 비교하였을 때; P < 0.05).
서열 번호: 17의 펩티드 9 nmol/kg 투여량을 투여받은 마우스는 4일째 포도당 수준이 대략 48% 감소된 것으로 나타났고(비이클 대조군 마우스와 비교하였을 때; P < 0.05), 9일째 포도당 수준이 대략 45% 감소된 것으로 나타났다(비이클 대조군 마우스와 비교하였을 때; P < 0.05). 서열 번호: 17의 펩티드 3 nmol/kg 투여량을 투여받은 마우스는 4일째 포도당 수준이 대략 28% 감소된 것으로 나타났고(비이클 대조군 마우스와 비교하였을 때; P < 0.05), 9일째 포도당 수준이 대략 19% 감소된 것으로 나타났다(비이클 대조군 마우스와 비교하였을 때; P < 0.05)
실시예 8
본 발명의 펩티드의 생체내 효과는 비만 레소스 원숭이에게 21일간 비이클 대조군, 시판되는 이용가능한 상품 (Liraglutide), 서열 번호: 20의 펩티드, 또는 서열 번호: 17의 펩티드를 매일 투여함으로써 확인되었다. Liraglutide는 20 μg/kg의 투여량이 s.c.로 투여되었고 한편 서열 번호: 17 및 서열 번호: 20의 각 펩티드는 3 μg/kg의 투여량이 s.c로 투여되었다. 모든 펩티드는 레소스 원숭이 (> 98%)에게서 필적할 수준의 약동학(t1/2 ~10 h) 및 유사한 혈장 단백질 결합을 보유한다. 체중 및 음식 섭취가 측정되었다.
도 3A에 나타낸 것과 같이, 서열 번호: 17의 펩티드를 투여받은 비만 원숭이는 Liraglutide 및 서열 번호: 20의 펩티드와 비교하였을 때 우수한 체중 감소(-1.2 kg vs. 기저 및 비이클, P < 0.05)를 나타내었다.
Liraglutide (-13.1 ± 1.9%) 또는 서열 번호: 17의 펩티드 (-25.7% ± 3.2%, P < 0.05 vs. Liraglutide)로 처리후 음식 섭취에서 상당한 감소가 관찰되었다(도 3B에서 변화% vs. 기저수준으로 나타냄). 1주일의 세척 기간 후, 서열 번호: 17의 펩티드로 처리된 동물은 장기적 처리(28일차) 동안 감소된 체중의 대부분을 다시 획득하였다. 도 3A 및 3B, 데이터는 평균 ± SEM. * P < 0.05 vs 비이클, ^P < 0.05 서열 번호: 17의 펩티드 vs. Liraglutide로 나타낸다.
실시예 9
본 발명의 펩티드의 생체내 효과는 연령이 16-26세이고 평균 체중이 ~22kg인 당뇨병 레소스 원숭이 (n=7)에서 테스트되었다. 연령이 16-26세이고 평균 체중이 ~22kg인 당뇨병 레소스 원숭이에게 10일간 비이클 대조군, Liraglutide 10 μg/kg의 투여량으로 s.c.로 투여하거나 또는 서열 번호: 17의 펩티드를 1 μg/kg의 투여량으로 s.c.로 투여하였다.
체중은 연구 동안 측정되었고, 치료 기간 동안 이들 동물에서 체중 효과는 관찰되지 않았다.
각 처리 종료시, 공복 혈당(FBG)이 우선 측정되고, Meal Tolerance Test (MTT)이 측정되어, 내당성이 평가되었다. 도 4에 나타낸 것과 같이, 서열 번호: 17의 펩티드로 처리된 당뇨병 원숭이는 상당히 감소된 FBG를 나타낸다(120 ± 20 vs. 158 ± 15 mg/mL, 서열 번호: 17의 펩티드 vs. 비이클 (-25%), P<0.05; 도 4). 또한, 서열 번호: 17의 펩티드로 처리된 원숭이는 MTT 동안 비이클 대조군 원숭이와 비교하였을 때 개선된 내당성을 나타낸다(도 4). 데이터는 도 4에서 평균 ± SEM. *P < 0.05 vs 비이클로 나타낸다.
여기에서 언급된 모든 문헌들, 공개, 특허 출원 및 특허는 이들 각 문헌들이 개별적으로 또는 명시적으로 참고문헌으로 통합되어 있다고 한 것과 같은 수준으로 여기에 통합된다.
단수 부정관사 및 정관사("a", "an" 및 "the" )의 이용은 본 발명에서 다른 명시적인 언급이 없는 한, 단수 및 복수 모두를 포함하는 것으로 간주된다. 포함하는 및 보유하는, 함유하는("comprising," "having," "including," 및 "containing")은 다른 언급이 없는 한, 개방적 용어(예를 들면, 포함하나 이에 한정되지 않는)로 간주된다.
여기에서 언급된 수치의 범위는 다른 명시적인 언급이 없는 한, 각 범위내에 속하는 별도의 수치 및 각 끝점을 지칭하며, 끝점은 개별적으로 언급된 것과 같이 명세서에 통합된다.
여기에서 언급된 모든 방법은 다른 명시적인 언급이 없는 한 임의 적합한 순서대로 실시될 수 있다. 임의의 그리고 모든 실시예 또는 예시적인 용어 (예를 들면, "예를 들면,")은 본 발명을 더 잘 설명하기 위함이며, 다른 언급이 없는 한, 이 범위로 제한시키고자 함이 아니다. 명세서에서는 본 발명을 실행하는데 필수적인 임의의 비-청구된 요소를 지적하는 용어는 없다.
본 발명을 실행함에 있어서 발명자들이 알고있는 가장 적합한 방식을 포함한 본 발명의 바람직한 구체예가 제공된다. 이들 바람직한 구체예의 변이 또한 설명을 참고하면 본 발명 분야의 업자들에게는 자명할 것이다. 발명자들은 당업자가 이와 같은 변이들을 적절하게 이용할 수 있을 것으로 기대되며, 여기에서 설명된 것과 같이 본 발명을 실행할 수 있다. 더욱이, 설명된 모든 가능한 변이들에서 임의의 복합 또한 다른 명시적인 언급이 없는 한, 본 발명의 범주내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> DiMarchi, Richard <120> Glucagon/GLP-1 Receptor Co-Agonists <130> 31135/46342 PCT <150> US-61/500,027 <151> 2011-06-22 <150> US-61/547,360 <151> 2011-10-14 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Native human glucagon <400> 1 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 2 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> GLP-1 <400> 2 His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val 1 5 10 15 Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu 20 25 30 Val Lys Gly Arg Gly 35 <210> 3 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> GLP-2 <400> 3 His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 4 <211> 37 <212> PRT <213> Homo 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Claims (30)

  1. 서열 번호: 17의 아미노산 서열로 구성된 펩티드, 또는 이의 제약학적으로 허용가능한 염.
  2. 삭제
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  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 청구항 1에 따른 펩티드 또는 이의 제약학적으로 허용가능한 염, 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 당뇨병 치료를 위한 제약학적 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 항-당뇨병 또는 항-비만 물질을 포함하는 제약학적 조성물.
  11. 청구항 1에 있어서, 당뇨병 치료용 약물의 제조에 사용하기 위한, 펩티드 또는 이의 제약학적으로 허용가능한 염.
  12. 청구항 1에 있어서, 비만 치료용 약물의 제조에 사용하기 위한, 펩티드 또는 이의 제약학적으로 허용가능한 염.
  13. 청구항 1에 있어서, 대사 증후군 치료용 약물의 제조에 사용하기 위한, 펩티드 또는 이의 제약학적으로 허용가능한 염.
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