TWI554518B - 升糖素／ｇｌｐ－１受體共促效劑 - Google Patents

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Description

升糖素/GLP-1受體共促效劑
本發明係關於升糖素/GLP-1受體共促效劑。
相關申請案之交叉參考
本申請案要求2011年6月22日申請之美國臨時申請案第61/500,027號及2011年10月14日申請之美國臨時申請案第61/547,360號之優先權，該等申請案各自以全文引用之方式併入本文中。
以引用之方式併入以電子方式提交之材料與本文同時提交之電腦可讀核苷酸/胺基酸序列以全文引用之方式併入本文中，且標識如下：11.2千位元組ACII(文本)檔案，名稱為「46342_SeqListing.txt」，於2012年5月25日創建。
升糖素原前體為158個胺基酸之前驅多肽，其在不同組織中經加工形成多種不同升糖素原衍生之肽，包括升糖素、升糖素樣肽-1(GLP-1)、升糖素樣肽-2(GLP-2)及調酸素(oxyntomodulin；OXM)，該等肽參與廣泛多種生理功能，包括葡萄糖恆定、胰島素分泌、胃排空及腸生長，以及調節食物攝取。升糖素為對應於升糖素原前體之胺基酸33至61的29個胺基酸之肽，而GLP-1產生為對應於升糖素原前體之胺基酸72至108的37個胺基酸之肽。GLP-1(7-36)醯胺或GLP-1(7-37)酸為GLP-1之生物有效形 式，其對GLP-1受體顯示基本上相等之活性。
在低血糖症期間，此時血糖含量下降低於正常值，則升糖素通知肝臟分解糖原及釋放葡萄糖，從而使血糖含量上升至正常含量。低血糖症為患有由糖尿病導致之高血糖症(血糖含量升高)之患者中胰島素療法之常見副作用。因此，葡萄糖調節中升糖素之最公認作用為對抗胰島素之作用及維持血糖含量。
GLP-1具有相比於升糖素不同之生物活性。其作用包括刺激胰島素合成及分泌、抑制升糖素分泌及抑制食物攝取。GLP-1已顯示降低糖尿病患者之高血糖。艾塞納肽-4(Exendin-4)，一種來自蜥蜴毒液之與GLP-1共享約50%胺基酸一致性的肽，活化GLP-1受體且同樣顯示降低糖尿病，患者之高血糖。
亦有證據證明GLP-1與艾塞納肽-4可減少食物攝取及促進體重減輕，此作用將不僅有益於糖尿病患者而且亦有益於罹患肥胖症之患者。患有肥胖症之患者具有較高的糖尿病、高血壓、高脂血症、心血管疾病及肌肉骨骼疾病之風險。
本發明提供對升糖素受體顯示活性、對GLP-1受體顯示活性或對升糖素受體及GLP-1受體各自均顯示活性的肽及變異型肽。在示範性實施例中，本發明揭示之肽及變異型肽對GLP-1受體顯示與天然升糖素相比增強之活 性。在示範性態樣中，肽及變異型肽顯示對人類GLP-1受體相對於GIP受體至少100倍之選擇性。
本發明進一步提供包含本文所述之任何肽及變異型肽結合於異源部分之結合物。在示範性態樣中，異源部分為肽或蛋白質且結合物為融合肽或嵌合肽。在示範性態樣中，異源部分為聚合物，例如聚乙二醇。本發明此外提供包含本文所述之任何肽及變異型肽的二聚物及多聚物。
本發明另外提供包含本文所述之任何肽及變異型肽及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物以及治療或預防患者之疾病或醫學病狀(例如代謝症候群、糖尿病、肥胖症、肝脂肪變性、神經退化性疾病、低血糖症)之方法。該方法包括向患者投與有效治療疾病或醫學病狀之量的視情況調配為醫藥組合物之本發明揭示之肽或變異型肽。
定義
如本文所用之術語「約」意謂比所述值或值之範圍大或小10%，但不欲將任何值或值之範圍指定為僅此較寬定義。之前有術語「約」之各值或值之範圍亦意欲涵蓋所述絕對值或值之範圍的實施例。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」包括任何標準醫藥載劑，諸如磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液、水、乳液(諸如油/水或水/油乳液)及各種類型之濕潤劑。該術 語亦涵蓋由美國鄰邦政府管理機構批准或美國藥典(US Pharmacopeia)中所列供在動物(包括人類)中使用之任何藥劑。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之鹽」係指化合物的保留親本化合物之生物活性且在生物學上或其他方面並無不合需要之鹽。本文揭示之許多化合物由於存在胺基及/或羧基或與其類似之基團而能夠形成酸及/或鹼鹽。
醫藥學上可接受之鹼加成鹽可由無機及有機鹼製備。僅舉例而言，衍生自無機鹼之鹽包括鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽及鎂鹽。衍生自有機鹼之鹽包括(但不限於)一級胺、二級胺及三級胺之鹽。
如本文所用，術語「治療」包括預防特定病症或病狀，或減輕與特定病症或病狀相關之症狀及/或預防或消除該等症狀。舉例而言，如本文所用之術語「治療糖尿病」一般將指朝正常含量之方向改變葡萄糖血液含量，且視指定情形而定，可包括增加或減少血糖含量。
如本文所用，升糖素肽之「有效」量或「治療有效量」係指肽的無毒但足以提供所要作用之量。舉例而言，一種所要作用為預防或治療高血糖症(例如，如藉由血糖含量變化更接近正常含量所量測)，或誘發體重減輕/預防體重增加(例如，如藉由體重降低所量測)，或預防或減少體重之增加，或使身體脂肪分佈趨於正常。「有效」之量將視個體之年齡及一般狀況、投藥模式及其類似因素而 在個體與個體之間不同。因此，並不總是可指定精確「有效量」。然而，任何個別情況下之適當「有效」量可由一般技術者使用常規實驗確定。
術語「非經腸」意謂不經由消化道，而是藉由一些其他途徑，例如皮下、肌肉內、脊柱內或靜脈內。
如本文所用，術語「肽」涵蓋具有3個或3個以上胺基酸且通常少於100個胺基酸之鏈，其中該等胺基酸為天然存在或編碼或非天然存在或非編碼之胺基酸。非天然存在之胺基酸係指在活體內並不天然存在，然而可併入本文所述之肽結構中之胺基酸。如本文所用之「非編碼」係指不為任何以下20種胺基酸之L-異構體的胺基酸：Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr。如本文所用之「編碼」係指為任何以下20種胺基酸之L-異構體的胺基酸：Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr。在一些實施例中，本文所述之肽及變異型肽與SEQ ID NO：1(其長29個胺基酸)具有大致相同之長度，例如長25-35個胺基酸。示範性長度包括長29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個胺基酸。
通常，多肽及蛋白質具有大於「肽」之長度的聚合物長度。
在本申請案通篇中，所有以數字提及特定胺基酸位置 (例如位置28)係指天然升糖素(SEQ ID NO：1)中之彼位置上或其任何類似物中之相應胺基酸位置上的胺基酸。舉例而言，本文提及「位置28」將意謂SEQ ID NO：1之第一胺基酸已缺失之升糖素類似物的相應位置27。類似地，本文提及「位置28」將意謂SEQ ID NO：1之N端之前添加了一個胺基酸之升糖素類似物的相應位置29。如本文所用，「胺基酸修飾」係指(i)SEQ ID NO：1之胺基酸取代或置換為不同胺基酸(天然存在或編碼或非編碼或非天然存在之胺基酸)，(ii)添加胺基酸(天然存在或編碼或非編碼或非天然存在之胺基酸)至SEQ ID NO：1，或(iii)自SEQ ID NO：1缺失一或多個胺基酸。
關於兩個胺基酸序列之「一致性百分比」係指當將兩個序列對準以達成最大對應性(例如可引入空隙以達成最佳對準)時，第一序列中匹配(一致於)第二參考序列中之胺基酸的胺基酸數目除以參考序列之長度。
胺基酸「修飾」係指插入、缺失一個胺基酸或一個胺基酸取代為另一胺基酸。在一些實施例中，胺基酸取代或置換為保守性胺基酸取代，例如位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29中一或多者上之胺基酸的保守性取代。如本文所用，術語「保守性胺基酸取代」為一個胺基酸置換為另一具有類似性質(例如尺寸、電荷、疏水性、親水性及/或芳香性)之胺基酸，且包括以下五個群組之一內的交換： I.小型脂族、非極性或稍帶極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；II.極性、帶負電荷殘基及其醯胺及酯：Asp、Asn、Glu、Gln、半胱胺酸及高半胱胺酸；III.極性、帶正電荷殘基：His、Arg、Lys；鳥胺酸(Orn)IV.大型、脂族、非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val、Cys、正白胺酸(Nle)、高半胱胺酸V.大型、芳族殘基：Phe、Tyr、Trp、乙醯基苯丙胺酸
在一些實施例中，胺基酸取代不為保守性胺基酸取代，例如為非保守性胺基酸取代。
如本文所用，術語「帶電胺基酸」或「帶電殘基」係指包含在生理pH值下在水溶液中帶負電荷(亦即去質子化)或帶正電荷(亦即質子化)之側鏈的胺基酸。舉例而言，帶負電荷胺基酸包括天冬胺酸、麩胺酸、半胱胺酸、高半胱胺酸及高麩胺酸，而帶正電荷胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸。帶電胺基酸包括20種編碼胺基酸中的帶電胺基酸以及非典型或非天然存在或非編碼之胺基酸。
如本文所用，術語「酸性胺基酸」係指包含第二酸性部分(除胺基酸之羧酸以外)，包括例如羧酸或磺酸基的胺基酸。
如本文所用，術語「醯化胺基酸」係指與醯基所產生之方式無關(例如胺基酸併入肽中之前醯化或併入肽中之後醯化)，包含對於天然存在之胺基酸而言非原生之醯基的胺基酸。
如本文所用，術語「烷基化胺基酸」係指與烷基所產生之方式無關，包含對於天然存在之胺基酸而言非原生之烷基的胺基酸。因此，本發明之醯化胺基酸及烷基化胺基酸為非編碼胺基酸。
如本文所用，術語分子對於第一受體相對於第二受體之「選擇性」係指以下比率：分子對於第二受體之EC50除以分子對於第一受體之EC50。舉例而言，對於第一受體具有1 nM之EC50且對於第二受體具有100 nM之EC50的分子具有對於第一受體相對於第二受體100倍之選擇性。
如本文所用，術語「天然升糖素」係指由SEQ ID NO：1之序列組成之肽，且術語「天然GLP-1」為表示GLP-1(7-36)醯胺、GLP-1(7-37)酸或該兩種化合物之混合物的通用術語。
如本文所用，分子之「升糖素效力」或「與天然升糖素相比之效力」係指分子對於升糖素受體之EC50除以天然升糖素對於升糖素受體之EC50的反比。
如本文所用，分子之「GLP-1效力」或「與天然GLP-1相比之效力」係指分子對於GLP-1受體之EC50除以天然GLP-1對於GLP-1受體之EC50的反比。
實施例
本發明提供對GLP-1受體顯示活性、對升糖素受體顯示活性或對GLP-1受體與升糖素受體兩者均顯示活性的肽及變異型肽。在此方面，本發明提供GLP-1受體促效劑肽、升糖素受體促效劑肽及GLP-1/升糖素共促效劑肽。在示範性實施例中，本發明揭示之肽及變異型肽對GLP-1受體顯示與天然人類升糖素(SEQ ID NO：1)相比增強之活性或較高之效力。在示範性實施例中，本發明之肽及變異型肽對GLP-1受體顯示與天然人類GLP-1(SEQ ID NO：2)或其活性形式(SEQ ID NO：5及6)之一相比較高之效力。在示範性實施例中，肽及變異型肽對升糖素受體顯示與天然人類GLP-1相比較高之效力。在示範性實施例中，肽及變異型肽對升糖素受體顯示與天然人類升糖素相比較高之效力。
在示範性實施例中，本文所述之肽及變異型肽相對於天然升糖素或天然GLP-1顯示其他性質之改良，諸如較高穩定性、較高溶解度、延長之循環半衰期、延遲之作用起始、延長之作用持續時間、減幅之峰值(例如相對降低之平均峰值血漿濃度)及提高之對蛋白酶(諸如DPP-IV)之抗性。
本文所述之肽及變異型肽係基於天然人類升糖素之胺基酸序列(SEQ ID NO：1)，且在本文中描述為「肽」、「變異型肽」、「升糖素類似物」、「類似物」或「升糖素肽」。應瞭解，諸如「類似物」或「變異體」或「修飾」之術 語涵蓋從頭合成之肽或蛋白質，且不需要執行任何特定修飾步驟。在一些態樣中，本文所述之肽或變異型肽包含相對於SEQ ID NO：1包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個胺基酸修飾，且在一些情況下包含16個或16個以上(例如17、18、19、20、21、22、23、24、25、26個)胺基酸修飾之經修飾SEQ ID NO：1胺基酸序列，如本文進一步描述。因此升糖素類似物及/或升糖素肽之以下描述適用於本文揭示之任何肽及變異型肽，而與天然人類升糖素(SEQ ID NO：1)與本發明之肽或變異型肽之間的相似度無關。
預期本文所述之任何肽序列可藉由併入另外之胺基酸修飾；例如藉由在例如本文所述之位置包括本文所述之任何修飾，或藉由併入保守性取代，或藉由在彼位置恢復成天然升糖素胺基酸(參見SEQ ID NO：1)而進一步變化。在示範性實施例中，修飾包括例如醯化、烷基化、聚乙二醇化、C端之截短、位置1、2、3、7、10、12、15、16、17、18、19、20、21、23、24、27、28及29中一或多者上胺基酸之取代。舉例而言，在本文揭示之任何肽序列出於聚乙二醇化目的包括Cys之情況下，變異型肽可使用不同胺基酸用於聚乙二醇化。作為另一實例，變異型肽可在不同位置聚乙二醇化(例如將現有Cys置換為不同胺基酸、在預定聚乙二醇化位置插入新Cys且使新Cys聚乙二醇化)。作為另一實例，在本文揭示之任何肽序列出於醯化目的包括Lys之情況下，可使Lys 移動至不同位置且使新位置醯化。在本文所述之任何實施例中，變異型肽可與親本肽在親本肽之長度上或在親本肽之胺基酸1-29上例如80%、85%、90%或95%一致(例如可相比於親本肽併有1、2、3、4或5個額外修飾)。
亦涵蓋本文揭示之任何肽序列之結合物、融合蛋白及多聚物。
肽及變異型肽之活性
對升糖素受體之促效劑活性
在示範性實施例中，本發明之肽及變異型肽對升糖素受體顯示約1000 μM或1000 μM以下(例如約750 μM或750 μM以下、約500 μM或500 μM以下、約250 μM或250 μM以下、約100 μM或100 μM以下、約75 μM或75 μM以下、約50 μM或50 μM以下、約25 μM或25 μM以下、約10 μM或10 μM以下、約5 μM或5 μM以下或者約1 μM或1 μM以下)之EC50。在示範性實施例中，肽及變異型肽顯示在奈莫耳濃度範圍內之升糖素受體活化EC50。舉例而言，本發明揭示之肽及變異型肽對升糖素受體顯示為約1000 nM或1000 nM以下(例如約750 nM或750 nM以下、約500 nM或500 nM以下、約250 nM或250 nM以下、約100 nM或100 nM以下、約75 nM或75 nM以下、約50 nM或50 nM以下、約25 nM或25 nM以下、約10 nM或10 nM以下、約5 nM或5 nM以下或者約1 nM或1 nM以下)之EC50。在示範性實施例中，肽及變異型肽對升糖素受體顯示在皮莫耳濃度範圍 內之EC50。因此，在示範性態樣中，肽及變異型肽顯示約1000 pM或1000 pM以下(例如約750 pM或750 pM以下、約500 pM或500 pM以下、約250 pM或250 pM以下、約100 pM或100 pM以下、約75 pM或75 pM以下、約50 pM或50 pM以下、約25 pM或25 pM以下、約10 pM或10 pM以下、約5 pM或5 pM以下或者約1 pM或1 pM以下)之升糖素受體活化EC50。應瞭解，較低EC50指示對受體之較高活性或效力。
在一些實施例中，本文所述之升糖素類似物對升糖素受體顯示為約0.001 pM或0.001 pM以上、約0.01 pM或0.01 pM以上或者約0.1 pM或0.1 pM以上之EC50。升糖素受體活化(升糖素受體活性)可藉由量測過度表現升糖素受體之HEK293細胞中之cAMP誘導的活體外分析來量測，例如分析經編碼升糖素受體之DNA及如實例2所述連接於cAMP反應性元件之螢光素酶基因共轉染的HEK293細胞。
在示範性實施例中，本發明揭示之肽及變異型肽對升糖素受體顯示相對於天然升糖素為約0.001%或0.001%以上、約0.01%或0.01%以上、約0.1%或0.1%以上、約0.5%或0.5%以上、約1%或1%以上、約5%或5%以上、約10%或10%以上、約20%或20%以上、約30%或30%以上、約40%或40%以上、約50%或50%以上、約60%或60%以上、約75%或75%以上、約100%或100%以上、約125%或125%以上、約150%或150%以上、約175%或 175%以上、約200%或200%以上、約250%或250%以上、約300%或300%以上、約350%或350%以上、約400%或400%以上、約450%或450%以上或者約500%或更高之活性(升糖素效力)。在一些實施例中，本文所述之肽及變異型肽對升糖素受體顯示相對於天然升糖素為約5000%或5000%以下或者約10,000%或10,000%以下之活性。升糖素類似物對受體相對於該受體之天然配位體的活性計算為升糖素類似物相對於天然配位體之EC50的反比。
在一些實施例中，肽及變異型肽僅對升糖素受體顯示實質性活性(效力)且對GLP-1受體顯示極小活性至無活性。因此，在一些實施例中，肽及變異型肽視為「純升糖素受體促效劑」或不視為「升糖素/GLP-1受體共促效劑」。在一些實施例中，該等肽及變異型肽對升糖素受體顯示本文所述之任何程度之活性或效力，但對GLP-1受體具有實質上較低之活性(效力)。在一些實施例中，升糖素類似物對GLP-1受體顯示為對升糖素受體之EC50之100倍或100倍以上之EC50。
對GLP-1受體之促效劑活性
在示範性實施例中，肽及變異型肽顯示約1000 μM或1000 μM以下(例如約750 μM或750 μM以下、約500 μM或500 μM以下、約250 μM或250 μM以下、約100 μM或100 μM以下、約75 μM或75 μM以下、約50 μM或50 μM以下、約25 μM或25 μM以下、約10 μM或10 μM以下、約5 μM或5 μM以下或者約1 μM或1 μM以下) 之GLP-1受體活化EC50。在示範性實施例中，肽及變異型肽對GLP-1受體顯示為約1000 nM或1000 nM以下(例如約750 nM或750 nM以下、約500 nM或500 nM以下、約250 nM或250 nM以下、約100 nM或100 nM以下、約75 nM或75 nM以下、約50 nM或50 nM以下、約25 nM或25 nM以下、約10 nM或10 nM以下、約5 nM或5 nM以下或者約1 nM或1 nM以下)之EC50。在示範性實施例中，肽及變異型肽對GLP-1受體具有在皮莫耳濃度範圍內之EC50。因此，在一些實施例中，肽及變異型肽顯示約1000 pM或1000 pM以下(例如約750 pM或750 pM以下、約500 pM或500 pM以下、約250 pM或250 pM以下、約100 pM或100 pM以下、約75 pM或75 pM以下、約50 pM或50 pM以下、約25 pM或25 pM以下、約10 pM或10 pM以下、約5 pM或5 pM以下或者約1 pM或1 pM以下)之GLP-1受體活化EC50。應瞭解，較低EC50指示對受體之較高活性或效力。
在示範性實施例中，本文所述之肽及變異型肽對GLP-1受體顯示為約0.001 pM或0.001 pM以上、約0.01 pM或0.01 pM以上或者約0.1 pM或0.1 pM以上之EC50。GLP-1受體活化(GLP-1受體活性)可藉由量測過度表現GLP-1受體之HEK293細胞中之cAMP誘導的活體外分析來量測，例如分析經編碼GLP-1受體之DNA及如實例2所述連接於cAMP反應性元件之螢光素酶基因共轉染的HEK293細胞。
在一些實施例中，本發明之肽及變異型肽對GLP-1受體顯示相對於天然GLP-1為約0.001%或0.001%以上、約0.01%或0.01%以上、約0.1%或0.1%以上、約0.5%或0.5%以上、約1%或1%以上、約5%或5%以上、約10%或10%以上、約20%或20%以上、約30%或30%以上、約40%或40%以上、約50%或50%以上、約60%或60%以上、約75%或75%以上、約100%或100%以上、約125%或125%以上、約150%或150%以上、約175%或175%以上、約200%或200%以上、約250%或250%以上、約300%或300%以上、約350%或350%以上、約400%或400%以上、約450%或450%以上或者約500%或更高之活性(GLP-1效力)。在一些實施例中，本文所述之肽及變異型肽對GLP-1受體顯示相對於天然GLP-1為約5000%或5000%以下或者約10,000%或10,000%以下之活性。
在一些實施例中，肽及變異型肽僅對GLP-1受體顯示實質性活性(效力)且對升糖素受體顯示極小活性至無活性。在一些實施例中，肽及變異型肽視為「純GLP-1受體促效劑」或不視為「升糖素/GLP-1受體共促效劑」。在一些實施例中，該等肽及變異型肽對GLP-1受體顯示本文所述之任何程度之活性或效力，但對升糖素受體具有實質上較低之活性(效力)。在一些實施例中，肽及變異型肽對升糖素受體顯示為對GLP-1受體之EC50之100倍或100倍以上之EC50。
對GLP-1受體及升糖素受體之促效劑活性
在示範性實施例中，肽及變異型肽對GLP-1受體與升糖素受體兩者均顯示活性且可視為「升糖素/GLP-1受體共促效劑」。在示範性實施例中，肽及變異型肽對升糖素受體之活性(例如EC50或相對活性或效力)與其對GLP-1受體之活性(例如EC50或相對活性或效力)有約50倍、約40倍、約30倍、約20倍、約10倍或約5倍以內之不同(較高或較低)。在示範性態樣中，肽或變異型肽之升糖素效力與其GLP-1效力有約25倍、約20倍、約15倍、約10倍或約5倍以內之不同(較高或較低)。在示範性態樣中，肽或變異型肽之升糖素效力在其GLP-1效力之約1/25倍、約1/20倍、約1/15倍、約1/10倍或約1/5倍以內。
在示範性實施例中，共促效劑對GLP-1受體與對升糖素受體相比大致等效或相對更有效。舉例而言，肽或變異型肽對升糖素受體之相對活性或EC50或效力除以肽或變異型肽對GLP-1受體之相對活性或EC50或效力的比率小於X或約為X，其中X係選自100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在示範性實施例中，肽或變異型肽對升糖素受體之EC50或效力或相對活性除以肽或變異型肽對GLP-1受體之EC50或效力或相對活性的比率約為1或小於5(例如約4、約3、約2、約1)。在示範性實施例中，肽或變異型肽對GLP-1受體之EC50或效力或相對活性除以肽或變異型肽對升糖素受體之EC50或效力或相對活性的比率小於5(例如約4、約3、約2、約1)。 在示範性實施例中，肽或變異型肽之升糖素效力相比於肽或變異型肽之GLP-1效力的比率小於Y或約為Y，其中Y係選自100、75、60、50、40、30、20、15、10及5。在示範性實施例中，肽或變異型肽之升糖素效力相比於肽或變異型肽之GLP-1效力的比率小於5(例如約4、約3、約2、約1)。在一些實施例中，升糖素類似物對升糖素受體具有為對GLP-1受體之EC50之2倍至10倍(例如2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍)大的EC50。
在示範性實施例中，肽主要為升糖素促效劑且對升糖素受體比對GLP-1受體相對更有效(例如肽對升糖素受體之效力相比於對GLP-1受體之效力為5倍或5倍以上)。舉例而言，肽或變異型肽對GLP-1受體之相對活性或效力或EC50除以肽或變異型肽對升糖素受體之相對活性或效力或EC50的比率小於V或約為V，其中V係選自100、75、60、50、40、30、20、15、10或5。在一些實施例中，肽或變異型肽之GLP-1效力相比於肽或變異型肽之升糖素效力的比率小於W或約為W，其中W係選自100、75、60、50、40、30、20、15、10及5。在一些實施例中，肽或變異型肽顯示天然GLP-1對GLP-1受體之活性的至少0.1%(例如約0.5%或0.5%以上、約1%或1%以上、約5%或5%以上、約10%或10%以上或更高)(GLP-1效力)且顯示天然升糖素對升糖素受體之活性的至少0.1%(例如約0.5%或0.5%以上、約1%或1%以上、約5%或5%以 上、約10%或10%以上或更高)(升糖素效力)。
對GIP受體之活性
除對升糖素受體及/或GLP-1受體具有活性外，在一些態樣中，本文所述之肽及變異型肽亦對GIP受體顯示低促效劑活性。在該等態樣中，該等肽及變異型肽較佳對GLP-1受體之選擇性相對於GIP受體為至少100倍。
然而在其他態樣中，肽或變異型肽對GIP受體顯示明顯活性，例如類似物對GIP受體之EC50與其對GLP-1受體之EC50的不同小於約50倍，視情況其中類似物之GIP效力在該類似物之GLP-1效力的約50倍以內。在示範性實施例中，肽顯示約1 μM或1 μM以下、或100 nM或100 nM以下、或約75、50、25、10、8、6、5、4、3、2或1 nM或1 nM以下之GIP受體活化活性EC50。應瞭解，較低EC50指示對受體之較高活性或效力。在一些實施例中，本文所述之肽及變異型肽對GIP受體顯示為約0.001 nM、0.01 nM或0.1 nM之EC50。在一些實施例中，本文所述之肽及變異型肽對GIP受體顯示不超過約100 nM之EC50。受體活化可藉由量測過度表現該受體之HEK293細胞中之cAMP誘導的活體外分析來量測，例如分析經編碼該受體之DNA及如實例2所述連接於cAMP反應性元件之螢光素酶基因共轉染的HEK293細胞。
在一些實施例中，本發明揭示之肽及變異型肽對GIP受體顯示相對於天然GIP為至少約0.1%、1%、10%、50%、100%、150%或200%或更高之活性(GIP效力)。在一些實 施例中，本文所述之肽及變異型肽對GIP受體顯示之活性相對於天然GIP不超過1000%、10,000%、100,000%或1,000,000%。升糖素肽對受體相對於該受體之天然配位體的活性(效力)計算為該肽相對於天然配位體之EC50的反比。
因此，本發明之一個態樣提供對升糖素受體及GIP受體兩者均顯示活性之肽及變異型肽(「升糖素/GIP共促效劑」)。在一些實施例中，肽對GIP受體之EC50與其對升糖素受體之EC50的不同小於約50倍、40倍、30倍或20倍(較高或較低)。在一些實施例中，肽之GIP效力與其升糖素效力的不同小於約500倍、450倍、400倍、350倍、300倍、250倍、200倍、150倍、100倍、75倍、50倍、25倍、20倍、15倍、10倍或5倍(較高或較低)。在一些實施例中，GLP-1活性例如藉由位置7上之胺基酸修飾、位置27或28上胺基酸之C端方向胺基酸的缺失或其組合而顯著降低或破壞。
在本發明之替代態樣中，本發明之肽及變異型肽因位置3上Gln之胺基酸修飾而對GLP-1及GIP受體顯示活性，但不對升糖素受體顯示顯著活性(「GIP/GLP-1共促效劑」)。舉例而言，此位置上取代為酸性、鹼性或疏水性胺基酸(麩胺酸、鳥胺酸、正白胺酸)降低升糖素活性。在其他態樣中，肽及變異型肽對升糖素、GIP及GLP-1受體各自均顯示活性(「升糖素/GIP/GLP-1三重促效劑」)。舉例而言，在任一該等後者態樣中，肽對GIP受體之EC50 與其對GLP-1受體之EC50的不同小於約50倍、40倍、30倍或20倍(較高或較低)。在一些實施例中，肽之GIP效力與其GLP-1效力的不同小於約25倍、20倍、15倍、10倍或5倍(較高或較低)。在一些實施例中，該等肽具有天然升糖素對升糖素受體之活性的約10%或10%以下，例如約1-10%，或約0.1-10%，或高於約0.1%但低於約10%。
結合物之活性
在一些實施例中，本文所述之肽及變異型肽如上文所述對升糖素受體顯示活性或效力及/或對GLP-1受體顯示活性及/或對GIP受體顯示活性，且當該肽或變異型肽為結合物之一部分(例如結合於異源部分，例如親水性部分，例如聚乙二醇)時，與該肽或變異型肽不為結合物之一部分時相比，該肽或變異型肽顯示較低之活性(亦即較低效力或較高EC50)。在一些態樣中，肽或變異型肽在不為結合物之一部分時顯示對升糖素受體及/或GLP-1受體之效力為該肽或變異型肽為結合物之一部分時之效力的約10倍或更高。在一些態樣中，肽或變異型肽在未結合時對升糖素受體及/或GLP-1受體顯示之效力為該肽或變異型肽在結合時之效力的約10倍、約15倍、約20倍、約25倍、約30倍、約35倍、約40倍、約45倍、約50倍、約100倍或甚至更高倍數。
升糖素類似物之結構
醯化
根據一些實施例，升糖素類似物包含醯化胺基酸(例如非編碼醯化胺基酸(例如包含對於天然存在之胺基酸而言為非原生之醯基的胺基酸))。在一些實施例中，醯化胺基酸使升糖素類似物具有以下性質中之一或多者：(i)延長之循環半衰期、(ii)延遲之作用起始、(iii)延長之作用持續時間、(iv)提高之對蛋白酶(諸如DPP-IV)之抗性及(v)對GLP-1及升糖素受體中一者或兩者之效力增加。如本文所示，醯化升糖素類似物對升糖素及GLP-1受體並不顯示與相應未醯化升糖素類似物相比降低之活性。而是在一些情況下，醯化升糖素類似物實際上對GLP-1及升糖素受體顯示增加之活性。因此，醯化升糖素類似物之效力與升糖素類似物之未醯化型式相當(若未增強)。
根據一個實施例，升糖素類似物出於延長循環半衰期及/或延遲作用起始及/或延長作用持續時間及/或提高對諸如DPP-IV之蛋白酶之抗性的目的包含經由酯、硫酯或醯胺鍵聯連接於升糖素類似物的醯基。
醯化可在升糖素類似物內之任何位置上進行，包括以下任何位置：位置1-29、第29胺基酸之C端方向位置(例如位置30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47等、C端延伸內之位置或在C端上之胺基酸)，其限制條件為升糖素及/或GLP-1活性得到保留(若未增強)。非限制性實例包括位置5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29。在示範性實施例中，升糖素類似物在選自 由以下組成之群的一或多個位置包含醯化胺基酸：9、10、12、16及20。在示範性實施例中，升糖素類似物在選自由以下組成之群的一或多個位置包含醯化胺基酸：10、12及16。在示範性實施例中，升糖素類似物在選自由以下組成之群的一或多個位置包含醯化胺基酸：9、10、12、16及20。在示範性實施例中，升糖素類似物在一或多個位置10及12包含醯化胺基酸。在示範性實施例中，升糖素類似物在位置12包含醯化胺基酸。在示範性實施例中，升糖素類似物包含C端延伸且在選自由以下組成之群的一或多個位置包含醯化胺基酸：9、10、12、16、20及37-43(例如40)。在特定實施例中，醯化發生於升糖素類似物之位置10且升糖素類似物缺乏分子內橋鍵，例如共價分子內橋鍵(例如內醯胺橋鍵)。缺乏分子內橋鍵之該等醯化升糖素類似物對GLP-1及升糖素受體顯示與缺乏共價分子內橋鍵之相應未醯化類似物相比及與在除位置10以外之位置醯化的缺乏分子內橋鍵之相應類似物相比增強之活性。如本文所示，位置10上之醯化甚至可使對升糖素受體具有極低活性之升糖素類似物轉型為對升糖素及GLP-1受體兩者均具有活性之升糖素類似物。因此，進行醯化之位置可改變升糖素類似物之總體活性概況。
在一些實施例中，升糖素類似物在連接親水性部分之相同胺基酸位置醯化，或在不同胺基酸位置醯化。非限制性實例包括在位置10醯化及在升糖素類似物之C端部分中之一或多個位置(例如位置24、28或29、C端延伸 內或在C端(例如經由添加C端Cys))聚乙二醇化。
醯基可直接共價連接於升糖素類似物之胺基酸，或經由間隔子間接共價連接於升糖素類似物之胺基酸，其中該間隔子定位於升糖素類似物之胺基酸與醯基之間。
在特定態樣中，升糖素類似物經修飾以藉由對升糖素類似物之胺基酸之側鏈之胺、羥基或硫醇進行直接醯化而包含醯基。在一些實施例中，醯化位於升糖素類似物之位置10、20、24或29。在此方面，醯化之升糖素類似物可包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，或其包含一或多個本文所述之胺基酸修飾的經修飾胺基酸序列，其中該類似物之位置10、20、24及29上之至少一個胺基酸修飾成包含側鏈胺、羥基或硫醇之任何胺基酸。在一些特定實施例中，升糖素類似物之直接醯化經由位置10上胺基酸之側鏈胺、羥基或硫醇進行。
在一些實施例中，包含側鏈胺之胺基酸為式I之胺基酸：
在一些示範性實施例中，式I之胺基酸為其中n為4(Lys)或n為3(Orn)之胺基酸。
在其他實施例中，包含側鏈羥基之胺基酸為式II之胺 基酸：
在一些示範性實施例中，式II之胺基酸為其中n為1之胺基酸(Ser)。
在其他實施例中，包含側鏈硫醇之胺基酸為式III之胺基酸：
在一些示範性實施例中，式III之胺基酸為其中n為1之胺基酸(Cys)。
在其他實施例中，包含側鏈胺、羥基或硫醇之胺基酸為包含式I、式II或式III之相同結構的二取代胺基酸，除了鍵結於式I、式II或式III之胺基酸之α碳的氫經第二側鏈置換以外。
在一些實施例中，醯化升糖素在類似物與醯基之間包含間隔子。在一些實施例中，升糖素類似物共價結合於間隔子，該間隔子共價結合於醯基。
在一些實施例中，間隔子為包含側鏈胺、羥基或硫醇之胺基酸，或包含含側鏈胺、羥基或硫醇之胺基酸的二肽或三肽。間隔子所連接之胺基酸可為包含允許連接於間隔子之部分的任何胺基酸(例如單重或雙重α取代之胺基酸)。舉例而言，包含側鏈NH2、-OH或COOH之胺基酸(例如Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)為適合的。在此方面，醯化之升糖素類似物可包含胺基酸序列SEQ ID NO：1，或其包含一或多個本文所述之胺基酸修飾的經修飾胺基酸序列，其中位置10、20、24及29上之至少一個胺基酸修飾成包含側鏈胺、羥基或羧酸酯基之任何胺基酸。
在一些實施例中，間隔子為包含側鏈胺、羥基或硫醇之胺基酸，或包含含側鏈胺、羥基或硫醇之胺基酸的二肽或三肽。
當醯化經由間隔子之胺基進行時，醯化可經由胺基酸之α胺或側鏈胺進行。在α胺醯化之情況下，間隔子之胺基酸可為任何胺基酸。舉例而言，間隔子之胺基酸可為疏水性胺基酸，例如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr、6-胺基己酸、5-胺基戊酸、7-胺基庚酸及8-胺基辛酸。或者，間隔子之胺基酸可為酸性殘基，例如Asp、Glu、高麩胺酸、高半胱胺酸、半胱胺酸、γ-麩胺酸。
在間隔子之胺基酸之側鏈胺醯化之情況下，間隔子之胺基酸為包含側鏈胺之胺基酸，例如式I胺基酸(例如Lys或Orn)。在此情況下，間隔子之胺基酸之α胺及側鏈胺 兩者均可能醯化，使得升糖素類似物經二醯化。本發明之實施例包括該等二醯化分子。
當醯化經由間隔子之羥基進行時，胺基酸或二肽或三肽之一個胺基酸可為式II之胺基酸。在一特定示範性實施例中，胺基酸為Ser。
當醯化經由間隔子之硫醇基進行時，胺基酸或二肽或三肽之一個胺基酸可為式III之胺基酸。在一特定示範性實施例中，胺基酸為Cys。
在一些實施例中，間隔子為親水性雙官能間隔子。在某些實施例中，親水性雙官能間隔子包含兩個或兩個以上反應性基團，例如胺、羥基、硫醇及羧基或其組合。在某些實施例中，親水性雙官能間隔子包含羥基及羧酸酯基。在其他實施例中，親水性雙官能間隔子包含胺基及羧酸酯基。在其他實施例中，親水性雙官能間隔子包含硫醇基及羧酸酯基。在一特定實施例中，間隔子包含胺基聚(烷氧基)羧酸酯。在此方面，間隔子可包含例如NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH，其中m為1至6之任何整數且n為2至12之任何整數，諸如8-胺基3,6-二氧雜辛酸，其可購自Peptides International,Inc.(Louisville,KY)。
在一些實施例中，間隔子為疏水性雙官能間隔子。疏水性雙官能間隔在此項技術中為已知的。參見例如Bioconjugate Techniques,G.T.Hermanson(Academic Press,San Diego,CA,1996)，其以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，疏水性雙官能間隔子包含兩個 或兩個以上反應性基團，例如胺、羥基、硫醇及羧基或其組合。在某些實施例中，疏水性雙官能間隔子包含羥基及羧酸酯基。在其他實施例中，疏水性雙官能間隔子包含胺基及羧酸酯基。在其他實施例中，疏水性雙官能間隔子包含硫醇基及羧酸酯基。包含羧酸酯基及羥基或硫醇基之適合疏水性雙官能間隔子在此項技術中為已知的且包括例如8-羥基辛酸及8-巰基辛酸。
在一些實施例中，雙官能間隔子不為在羧酸酯基之間包含具有1-7個碳原子之未分支亞甲基的二羧酸。在一些實施例中，雙官能間隔子為在羧酸酯基之間包含具有1-7個碳原子之未分支亞甲基的二羧酸。
在特定實施例中，間隔子(例如胺基酸、二肽、三肽、親水性雙官能間隔子或疏水性雙官能間隔子)長3至10個原子(例如6至10個原子(例如6、7、8、9或10個原子)。在更特定實施例中，間隔子長約3至10個原子(例如6至10個原子)且醯基為C12至C18脂肪醯基，例如C14脂肪醯基、C16脂肪醯基，使得間隔子與醯基之總長度為14至28個原子，例如約14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28個原子。在一些實施例中，間隔子與醯基之長度為17至28(例如19至26、19至21)個原子。
根據某些前述實施例，雙官能間隔子可為包含長3至10個原子之胺基酸主鏈(例如6-胺基己酸、5-胺基戊酸、7-胺基庚酸及8-胺基辛酸)的合成或天然存在之胺基酸 (包括(但不限於)本文所述之任何胺基酸)。或者，間隔子可為具有長3至10個原子(例如6至10個原子)之肽主鏈的二肽或三肽間隔子。二肽或三肽間隔子之各胺基酸可與該二肽或三肽之其他胺基酸相同或不同且可獨立地選自由以下組成之群：天然存在或編碼及/或非編碼或非天然存在之胺基酸，包括例如天然存在之胺基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr)之任何D或L異構體，或選自由以下組成之群之非天然存在或非編碼之胺基酸之任何D或L異構體：β-丙胺酸(β-Ala)、N-α-甲基-丙胺酸(Me-Ala)、胺基丁酸(Abu)、γ-胺基丁酸(γ-Abu)、胺基己酸(ε-Ahx)、胺基異丁酸(Aib)、胺基甲基吡咯甲酸、胺基哌啶甲酸、胺基絲胺酸(Ams)、胺基四氫哌喃-4-甲酸、精胺酸N-甲氧基-N-甲基醯胺、β-天冬胺酸(β-Asp)、氮雜環丁烷甲酸、3-(2-苯并噻唑基)丙胺酸、α-第三丁基甘胺酸、2-胺基-5-脲基-正戊酸(瓜胺酸，Cit)、β-環己基丙胺酸(Cha)、乙醯胺基甲基-半胱胺酸、二胺基丁酸(Dab)、二胺基丙酸(Dpr)、二羥基苯丙胺酸(DOPA)、二甲基噻唑啶(DMTA)、γ-麩胺酸(γ-Glu)、高絲胺酸(Hse)、羥脯胺酸(Hyp)、異白胺酸N-甲氧基-N-甲基醯胺、甲基-異白胺酸(Melle)、六氫異煙酸(Isn)、甲基-白胺酸(MeLeu)、甲基-離胺酸、二甲基-離胺酸、三甲基-離胺酸、甲醇基脯胺酸、甲硫胺酸-亞碸(Met(O))、甲硫胺酸-碸(Met(O2))、正白胺酸(Nle)、甲基-正白胺酸(Me-Nle)、正 纈胺酸(Nva)、鳥胺酸(Orn)、對胺基苯甲酸(PABA)、青黴胺(Pen)、甲基苯丙胺酸(MePhe)、4-氯苯丙胺酸(Phe(4-Cl))、4-氟苯丙胺酸(Phe(4-F))、4-硝基苯丙胺酸(Phe(4-NO2))、4-氰基苯丙胺酸((Phe(4-CN))、苯基甘胺酸(Phg)、哌啶基丙胺酸、哌啶基甘胺酸、3,4-去氫脯胺酸、吡咯啶基丙胺酸、肌胺酸(Sar)、硒半胱胺酸(Sec)、O-苄基-磷酸絲胺酸、4-胺基-3-羥基-6-甲基庚酸(Sta)、4-胺基-5-環己基-3-羥基戊酸(ACHPA)、4-胺基-3-羥基-5-苯基戊酸(AHPPA)、1,2,3,4,-四氫-異喹啉-3-甲酸(Tic)、四氫哌喃甘胺酸、噻吩基丙胺酸(Thi)、O-苄基-磷酸酪胺酸、O-磷酸酪胺酸、甲氧基酪胺酸、乙氧基酪胺酸、O-(雙-二甲基胺基-膦酸基)-酪胺酸、硫酸酪胺酸四丁基胺、甲基-纈胺酸(MeVal)及烷基化3-巰基丙酸。
在一些實施例中，間隔子包含總體負電荷，例如包含一個或兩個帶負電荷胺基酸。在一些實施例中，二肽不為通用結構A-B之任何二肽，其中A係選自由Gly、GIn、Ala、Arg、Asp、Asn、Ile、Leu、Val、Phe及Pro組成之群，其中B係選自由Lys、His、Trp組成之群。在一些實施例中，二肽間隔子係選自由以下組成之群：Ala-Ala、β-Ala-β-Ala、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-胺基丁酸-γ-胺基丁酸、Glu-Glu及γ-Glu-γ-Glu。
在一些示範性實施例中，升糖素類似物經修飾以藉由對間隔子之胺、羥基或硫醇進行醯化而包含醯基，該間隔子係連接於位置10、20、24或29之胺基酸之側鏈或 升糖素類似物之C端胺基酸。
在更特定實施例中，醯基係連接於升糖素類似物之位置10之胺基酸且間隔子與醯基之長度為14至28個原子。在一些態樣中，位置10之胺基酸為式I之胺基酸(例如Lys)或與式I相關之二取代胺基酸。在更特定實施例中，升糖素類似物缺乏分子內橋鍵，例如共價分子內橋鍵。升糖素類似物例如可為包含一或多個α,α-二取代胺基酸(例如AIB)以使類似物之α螺旋穩定之升糖素類似物。
經由胺、羥基及硫醇進行肽醯化之適合方法在此項技術中為已知的。參見例如實例19(經由胺進行醯化之方法)，Miller,Biochem Biophys Res Commun 218：377-382(1996)；Shimohigashi及Stammer,Int J Pept Protein Res 19：54-62(1982)；及Previero等人，Biochim Biophys Acta 263：7-13(1972)(經由羥基進行醯化之方法)；及San及Silvius,J Pept Res 66：169-180(2005)(經由硫醇進行醯化之方法)；Bioconjugate Chem.「Chemical Modifications of Proteins：History and Applications」第1,2-12頁(1990)；Hashimoto等人，Pharmacuetical Res.「Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity」第6卷，第2號，第171-176頁(1989)。
醯化胺基酸之醯基可具有任何大小，例如任何長度之碳鏈，且可為直鏈或分支鏈。在一些特定實施例中，醯基為C4至C30脂肪酸。舉例而言，醯基可為以下任一者： C4脂肪酸、C6脂肪酸、C8脂肪酸、C10脂肪酸、C12脂肪酸、C14脂肪酸、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28脂肪酸或C30脂肪酸。在一些實施例中，醯基為C8至C20脂肪酸，例如C14脂肪酸或C16脂肪酸。
在一替代實施例中，醯基為膽汁酸。膽汁酸可為任何適合膽汁酸，包括(但不限於)膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸、石膽酸、牛膽酸、甘膽酸及膽固醇酸。
在一些實施例中，升糖素類似物包含藉由以升糖素類似物醯化長鏈烷烴而醯化之胺基酸。在特定態樣中，長鏈烷烴包含與升糖素類似物之羧基或其活化形式反應之胺、羥基或硫醇基(例如十八胺、十四醇及十六烷硫醇)。升糖素類似物之羧基或其活化形式可為升糖素類似物之胺基酸(例如麩胺酸、天冬胺酸)之側鏈的一部分或可為類似物主鏈之一部分。
在某些實施例中，升糖素類似物經修飾以藉由以連接於升糖素類似物之間隔子醯化長鏈烷烴而包含醯基。在特定態樣中，長鏈烷烴包含與間隔子之羧基或其活化形式反應之胺、羥基或硫醇基。包含羧基或其活化形式之適合間隔子描述於本文中且包括例如雙官能間隔子，例如胺基酸、二肽、三肽、親水性雙官能間隔子及疏水性雙官能間隔子。
如本文所用，術語「羧基之活化形式」係指具有通式R(C=O)X之羧基，其中X為離去基且R為升糖素類似物或 間隔子。舉例而言，羧基之活化形式可包括(但不限於)醯氯、酸酐及酯。在一些實施例中，活化羧基為具有N-羥基丁二醯亞胺酯(NHS)離去基之酯。
關於其中長鏈烷烴由升糖素類似物或間隔子醯化之該等態樣，長鏈烷烴可具有任何大小且可包含任何長度之碳鏈。長鏈烷烴可為直鏈或分支鏈。在某些態樣中，長鏈烷烴為C4至C30烷烴。舉例而言，長鏈烷烴可為C4烷烴、C6烷烴、C8烷烴、C10烷烴、C12烷烴、C14烷烴、C16烷烴、C18烷烴、C20烷烴、C22烷烴、C24烷烴、C26烷烴、C28烷烴或C30烷烴中之任一者。在一些實施例中，長鏈烷烴包含C8至C20烷烴，例如C14烷烴、C16烷烴或C18烷烴。
此外，在一些實施例中，升糖素類似物之胺、羥基或硫醇基經膽固醇酸醯化。在一特定實施例中，升糖素類似物經由烷基化消-胺基Cys間隔子(亦即烷基化3-巰基丙酸間隔子)連接於膽固醇酸。烷基化消-胺基Cys間隔子可為例如包含十二乙二醇部分之消-胺基-Cys間隔子。在一個實施例中，升糖素類似物包含以下結構：
本文所述之醯化升糖素類似物可經進一步修飾以包含親水性部分。在一些特定實施例中，親水性部分可包含聚乙二醇(PEG)鏈。親水性部分之併入可經由適合方式實現，諸如本文所述之任何方法。在此方面，醯化升糖素類似物可包含包括本文所述之任何修飾之SEQ ID NO：1，其中該類似物之位置10、20、24及29上胺基酸中之至少一者包含醯基且位置16、17、21、24或29、C端延伸內位置上之胺基酸或C端胺基酸中之至少一者經修飾成Cys、Lys、Orn、高半胱胺酸或Ac-Phe，且該胺基酸之側鏈共價鍵結於親水性部分(例如PEG)。在一些實施例中，醯基視情況經由包含Cys、Lys、Orn、高半胱胺酸或Ac-Phe之間隔子連接於位置10，且親水性部分在位置24上之Cys殘基處併入。
或者，醯化升糖素類似物可包含間隔子，其中該間隔子同時經醯化及修飾以包含親水性部分。適合間隔子之非限制性實例包括包含一或多個選自由以下組成之群之胺基酸的間隔子：Cys、Lys、Orn、高半胱胺酸及Ac-Phe。
烷基化
根據一些實施例，升糖素類似物包含烷基化胺基酸(例如非編碼烷基化胺基酸(例如包含對於天然存在之胺基酸而言為非原生之烷基的胺基酸))。不受限於任何特定理論，咸信升糖素類似物之烷基化達成與升糖素類似物之醯化類似(若非相同)之作用，例如延長之循環半衰期、延遲之作用起始、延長之作用持續時間、提高之對蛋白酶 (諸如DPP-IV)之抗性及增加的對GLP-1及升糖素受體之效力。
烷基化可在升糖素類似物內之任何位置上進行，包括本文描述為用於醯化之位點的任何位置，包括(但不限於)以下任何位置：胺基酸位置1-29、第29殘基之C端方向胺基酸位置(例如30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47等、C端延伸內之位置或在C端)，其限制條件為升糖素活性或GLP-1活性得到保留。非限制性實例包括位置5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29。在示範性實施例中，升糖素類似物在選自由以下組成之群的一或多個位置包含烷基化胺基酸：9、10、12、16及20。在示範性實施例中，升糖素類似物在選自由以下組成之群的一或多個位置包含烷基化胺基酸：10、12及16。在示範性實施例中，升糖素類似物在選自由以下組成之群的一或多個位置包含烷基化胺基酸：9、10、12、16及20。在示範性實施例中，升糖素類似物在一或多個位置10及12包含烷基化胺基酸。在示範性實施例中，升糖素類似物在位置12包含烷基化胺基酸。在示範性實施例中，升糖素類似物包含C端延伸且在選自由以下組成之群的一或多個位置包含烷基化胺基酸：9、10、12、16、20及37-43(例如40)。烷基可直接共價連接於升糖素類似物之胺基酸，或經由間隔子間接共價連接於升糖素類似物之胺基酸，其中該間隔子定位於升糖素類似物 之胺基酸與烷基之間。升糖素類似物可在連接親水性部分之相同胺基酸位置烷基化，或在不同胺基酸位置烷基化。非限制性實例包括在位置10烷基化及在升糖素類似物之C端部分中之一或多個位置(例如位置24、28或29、C端延伸內或在C端(例如經由添加C端Cys))聚乙二醇化。
在特定態樣中，升糖素類似物經修飾以藉由對升糖素類似物之胺基酸之側鏈之胺、羥基或硫醇進行直接烷基化而包含烷基。在一些實施例中，烷基化位於升糖素類似物之位置10、20、24或29。在此方面，烷基化之升糖素類似物可包含胺基酸序列SEQ ID NO：2，或其包含一或多個本文所述之胺基酸修飾的經修飾胺基酸序列，其中位置10、20、24及29上之至少一個胺基酸修飾成包含側鏈胺、羥基或硫醇之任何胺基酸。在一些特定實施例中，升糖素類似物之直接烷基化經由位置10上胺基酸之側鏈胺、羥基或硫醇進行。
在一些實施例中，包含側鏈胺之胺基為式I之胺基酸。在一些示範性實施例中，式I之胺基酸為其中n為4(Lys)或n為3(Orn)之胺基酸。
在其他實施例中，包含側鏈羥基之胺基酸為式II之胺基酸。在一些示範性實施例中，式II之胺基酸為其中n為1之胺基酸(Ser)。
在其他實施例中，包含側鏈硫醇之胺基酸為式III之胺基酸。在一些示範性實施例中，式III之胺基酸為其中n 為1之胺基酸(Cys)。
在其他實施例中，包含側鏈胺、羥基或硫醇之胺基酸為包含式I、式II或式III之相同結構的二取代胺基酸，除了鍵結於式I、式II或式III之胺基酸之α碳的氫經第二側鏈置換以外。
在一些實施例中，烷基化升糖素類似物在類似物與烷基之間包含間隔子。在一些實施例中，升糖素類似物共價結合於間隔子，該間隔子共價結合於烷基。在一些示範性實施例中，升糖素類似物經修飾以藉由對間隔子之胺、羥基或硫醇進行烷基化而包含醯基，該間隔子係連接於升糖素類似物之位置10、20、24或29上之胺基酸之側鏈。間隔子所連接之胺基酸可為包含允許連接於間隔子之部分的任何胺基酸。舉例而言，包含側鏈NH2、-OH或COOH之胺基酸(例如Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)為適合的。在此方面，烷基化之升糖素類似物可包含含一或多個本文所述之胺基酸修飾的經修飾之胺基酸序列SEQ ID NO：1，其中位置10、20、24及29上之至少一個胺基酸修飾成包含側鏈胺、羥基或羧酸酯基之任何胺基酸。
在一些實施例中，間隔子為包含側鏈胺、羥基或硫醇之胺基酸，或包含含側鏈胺、羥基或硫醇之胺基酸的二肽或三肽。
當烷基化經由間隔子之胺基進行時，烷基化可經由胺基酸之α胺或側鏈胺進行。在α胺烷基化之情況下，間隔子之胺基酸可為任何胺基酸。舉例而言，間隔子之胺 基酸可為疏水性胺基酸，例如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr、6-胺基己酸、5-胺基戊酸、7-胺基庚酸及8-胺基辛酸。或者，間隔子之胺基酸可為酸性殘基(例如Asp及Glu)，其限制條件為烷基化在酸性殘基之α胺上進行。在間隔子之胺基酸之側鏈胺烷基化之情況下，間隔子之胺基酸為包含側鏈胺之胺基酸，例如式I胺基酸(例如Lys或Orn)。在此情況下，間隔子之胺基酸之α胺及側鏈胺兩者均可能烷基化，使得升糖素類似物經二烷基化。本發明之實施例包括該等二烷基化分子。
當烷基化經由間隔子之羥基進行時，胺基酸或二肽或三肽之一個胺基酸可為式II之胺基酸。在一特定示範性實施例中，胺基酸為Ser。
當烷基化經由間隔子之硫醇基進行時，胺基酸或二肽或三肽之一個胺基酸可為式III之胺基酸。在一特定示範性實施例中，胺基酸為Cys。
在一些實施例中，間隔子為親水性雙官能間隔子。在某些實施例中，親水性雙官能間隔子包含兩個或兩個以上反應性基團，例如胺、羥基、硫醇及羧基或其組合。在某些實施例中，親水性雙官能間隔子包含羥基及羧酸酯基。在其他實施例中，親水性雙官能間隔子包含胺基及羧酸酯基。在其他實施例中，親水性雙官能間隔子包含硫醇基及羧酸酯基。在一特定實施例中，間隔子包含胺基聚(烷氧基)羧酸酯。在此方面，間隔子可包含例如NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH，其中m為1至6之任何整數 且n為2至12之任何整數，諸如8-胺基3,6-二氧雜辛酸，其可購自Peptides International,Inc.(Louisville,KY)。
在一些實施例中，間隔子為疏水性雙官能間隔子。在某些實施例中，疏水性雙官能間隔子包含兩個或兩個以上反應性基團，例如胺、羥基、硫醇及羧基或其組合。在某些實施例中，疏水性雙官能間隔子包含羥基及羧酸酯基。在其他實施例中，疏水性雙官能間隔子包含胺基及羧酸酯基。在其他實施例中，疏水性雙官能間隔子包含硫醇基及羧酸酯基。包含羧酸酯基及羥基或硫醇基之適合疏水性雙官能間隔子在此項技術中為已知的且包括例如8-羥基辛酸及8-巰基辛酸。
在特定實施例中，間隔子(例如胺基酸、二肽、三肽、親水性雙官能間隔子或疏水性雙官能間隔子)長3至10個原子(例如6至10個原子(例如6、7、8、9或10個原子))。在更特定實施例中，間隔子長約3至10個原子(例如6至10個原子)且烷基為C12至C18烷基，例如C14烷基、C16烷基，使得間隔子與烷基之總長度為14至28個原子，例如約14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28個原子。在一些實施例中，間隔子與烷基之長度為17至28(例如19至26、19至21)個原子。
根據某些前述實施例，雙官能間隔子可為包含長3至10個原子之胺基酸主鏈(例如6-胺基己酸、5-胺基戊酸、7-胺基庚酸及8-胺基辛酸)的合成或非天然存在或非編碼 之胺基酸。或者，間隔子可為具有長3至10個原子(例如6至10個原子)之肽主鏈的二肽或三肽間隔子。二肽或三肽間隔子可由天然存在或編碼及/或非編碼或非天然存在之胺基酸(包括例如本文教示之任何胺基酸)構成。在一些實施例中，間隔子包含總體負電荷，例如包含一個或兩個帶負電荷胺基酸。在一些實施例中，二肽間隔子係選自由以下組成之群：Ala-Ala、β-Ala-β-Ala、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-胺基丁酸-γ-胺基丁酸及γ-Glu-γ-Glu。
經由胺、羥基及硫醇進行肽烷基化之適合方法在此項技術中為已知的。舉例而言，可使用威廉姆森醚合成(Williamson ether synthesis)來在升糖素類似物之羥基與烷基之間形成醚鍵聯。此外，肽與烷基鹵化物之親核取代反應可產生醚、硫醚或胺基鍵聯中之任一者。
烷基化升糖素類似物之烷基可具有任何大小，例如任何長度之碳鏈，且可為直鏈或分支鏈。在一些實施例中，烷基為C4至C30烷基。舉例而言，烷基可為C4烷基、C6烷基、C8烷基、C10烷基、C12烷基、C14烷基、C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基或C30烷基中之任一者。在一些實施例中，烷基為C8至C20烷基，例如C14烷基或C16烷基。
在一些特定實施例中，烷基包含膽汁酸(例如膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸、石膽酸、牛膽酸、甘膽酸及膽固醇酸)之類固醇部分。
在本發明之一些實施例中，升糖素類似物包含藉由使 親核性長鏈烷烴與升糖素類似物而烷基化之胺基酸，其中該升糖素類似物包含適於親核性取代之離去基。在特定態樣中，長鏈烷烴之親核性基團包含胺、羥基或硫醇基(例如十八胺、十四醇及十六烷硫醇)。升糖素類似物之離去基可為胺基酸之測量之一部分或可為肽主鏈之一部分。適合離去基包括例如N-羥基丁二醯亞胺、鹵素及磺酸酯。
在某些實施例中，升糖素類似物經修飾以藉由使親核性長鏈烷烴與連接於升糖素類似物之間隔子反應而包含烷基，其中該間隔子包含離去基。在特定態樣中，長鏈烷烴包含胺、羥基或硫醇基。在某些實施例中，包含離去基之間隔子可為更包含適合離去基之本文論述之任何間隔子，例如胺基酸、二肽、三肽、親水性雙官能間隔子及疏水性雙官能間隔子。
關於本發明之其中長鏈烷烴由升糖素類似物或間隔子烷基化之該等態樣，長鏈烷烴可具有任何大小且可包含任何長度之碳鏈。長鏈烷烴可為直鏈或分支鏈。在某些態樣中，長鏈烷烴為C4至C30烷烴。舉例而言，長鏈烷烴可為C4烷烴、C6烷烴、C8烷烴、C10烷烴、C12烷烴、C14烷烴、C16烷烴、C18烷烴、C20烷烴、C22烷烴、C24烷烴、C26烷烴、C28烷烴或C30烷烴中之任一者。在一些實施例中，長鏈烷烴包含C8至C20烷烴，例如C14烷烴、C16烷烴或C18烷烴。
此外，在一些實施例中，烷基化可在升糖素類似物與 膽固醇部分之間進行。舉例而言，膽固醇之羥基可置換長鏈烷烴上之離去基以形成膽固醇-升糖素類似物產物。
本文所述之烷基化升糖素類似物可經進一步修飾以包含親水性部分。在一些特定實施例中，親水性部分可包含聚乙二醇(PEG)鏈。親水性部分之併入可經由適合方式實現，諸如本文所述之任何方法。在此方面，烷基化升糖素類似物可包含含一或多個本文所述之胺基酸修飾之經修飾SEQ ID NO：1，其中位置10、20、24及29上胺基酸中之至少一者包含烷基且位置16、17、21、24或29、C端延伸內位置上之胺基酸或C端胺基酸中之至少一者經修飾成Cys、Lys、Orn、高半胱胺酸或Ac-Phe，且該胺基酸之側鏈共價鍵結於親水性部分(例如PEG)。在一些實施例中，烷基視情況經由包含Cys、Lys、Orn、高半胱胺酸或Ac-Phe之間隔子連接於位置10，且親水性部分在位置24上之Cys殘基處併入。
或者，烷基化升糖素類似物可包含間隔子，其中該間隔子同時經烷基化及修飾以包含親水性部分。適合間隔子之非限制性實例包括包含一或多個選自由以下組成之群之胺基酸的間隔子：Cys、Lys、Orn、高半胱胺酸及Ac-Phe。
α螺旋及α螺旋促進胺基酸之穩定化
不受限於任何特定理論，本文所述之升糖素類似物包含螺旋結構，例如α螺旋。在一些實施例中，升糖素類似物包含使α螺旋結構穩定之胺基酸。因此，在一些態 樣中，升糖素類似物包含一或多個α螺旋促進胺基酸。如本文所用，術語「α螺旋促進胺基酸」係指使α螺旋作為其中一部分之升糖素類似物之該α螺旋之穩定性增加的胺基酸。α螺旋促進胺基酸在此項技術中為已知的。參見例如Lyu等人，Proc Natl Acad Sci U.S.A.88：5317-5320(1991)；Branden及Tooze,Introduction to Protein Structure,Garland Publishing,New York,NY,1991；Fasman,Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation,Fasman編，Plenum,NY,1989)。用於本文目的之適合α螺旋促進胺基酸包括(但不限於)：丙胺酸、正纈胺酸、正白胺酸、α胺基丁酸、α-胺基異丁酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸及其類似物。在一些實施例中，α螺旋促進胺基酸為作為天然存在之蛋白質中發現之α螺旋之一部分的任何胺基酸，例如Leu、Phe、Ala、Met、Gly、Ile、Ser、Asn、Glu、Asp、Lys、Arg。
在一些實施例中，α螺旋促進胺基酸使α螺旋之穩定性與甘胺酸或丙胺酸相比更穩定。在一些實施例中，α螺旋促進胺基酸為α,α二取代胺基酸。
α螺旋：α螺旋促進胺基酸之位置
在一些實施例中，升糖素類似物包含與天然升糖素(SEQ ID NO：1)類似之胺基酸序列且該升糖素類似物包含至少一個α螺旋促進胺基酸。在一些實施例中，α螺旋促進胺基酸位於位置12至29中之任一者(根據天然升糖 素(SEQ ID NO：1)之編號)。在一些實施例中，升糖素類似物包含經修飾之胺基酸序列SEQ ID NO：1且例如在位置12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29中之一或多者上包含至少一個α螺旋促進胺基酸。在一些實施例中，升糖素類似物在位置16、17、20及21中之一者、兩者、三者或全部上包含α螺旋促進胺基酸。
α螺旋：α,α二取代胺基酸
在一些實施例中，α螺旋促進胺基酸為α,α二取代胺基酸。在特定實施例中，α,α二取代胺基酸包含各自鍵結於α碳之R1及R2，其中R1及R2各自獨立地選自由視情況經羥基、醯胺、硫醇、鹵基取代之C1-C4烷基組成之群，或R1及R2與其所連接之α碳一起形成環(例如C3-C8環)。在一些實施例中，R1及R2各自選自由以下組成之群：甲基、乙基、丙基及正丁基，或R1與R2一起形成環辛烷或環庚烷(例如1-胺基環辛烷-1-甲酸)。在一些實施例中，R1與R2相同。在一些實施例中，R1與R2不同。在某些態樣中，R1及R2各自為C1-C4烷基。在一些態樣中，R1及R2各自為C1或C2烷基。在一些實施例中，R1及R2各自為甲基，使得該α,α二取代胺基酸為α-胺基異丁酸(AIB)。
在一些態樣中，本文所述之升糖素類似物包含一或多個α,α二取代胺基酸且升糖素類似物明確缺乏共價分子內橋鍵(例如內醯胺)，因為該α,α二取代胺基酸能夠在不 存在共價橋鍵之情況下使α螺旋穩定。在一些態樣中，升糖素類似物在C端(約位置12-29)包含一或多個α,α二取代胺基酸。在一些實施例中，升糖素類似物之位置16、17、18、19、20、21、24、28或29中之一者、兩者、三者、四者或四者以上取代為α,α二取代胺基酸，該α,α二取代胺基酸為例如胺基異丁酸(AIB)、經選自甲基、乙基、丙基及正丁基之相同或不同基團二取代之胺基酸，或經環辛烷或環庚烷二取代之胺基酸(例如1-胺基環辛烷-1-甲酸)。舉例而言，位置16上取代為AIB可在不存在分子內橋鍵(例如非共價分子內橋鍵(例如鹽橋)或共價分子內橋鍵(例如內醯胺))之情況下增強GLP-1活性。在一些實施例中，位置16、20、21或24中之一者、兩者、三者或三者以上取代為AIB。在特定實施例中，對應於天然人類升糖素(SEQ ID NO：1)之位置2、16之胺基酸中的一者或兩者取代為諸如AIB之α,α二取代胺基酸。
根據一些實施例，缺乏分子內橋鍵之升糖素類似物在胺基酸位置12-29內包含一或多個取代為α,α二取代胺基酸的取代且在升糖素類似物之位置10上包含共價連接於胺基酸之側鏈的醯基或烷基。在特定實施例中，醯基或烷基並不天然存在於胺基酸上。在某些態樣中，醯基或烷基對位置10上之胺基酸而言為非原生的。該等缺乏分子內橋鍵之醯化或烷基化升糖素肽對GLP-1及升糖素受體顯示與未醯化對應肽相比增強之活性。對GLP-1及升糖素受體之活性進一步增強可藉由經由在醯基或烷 基與類似物位置10上胺基酸之側鏈之間併入間隔子而醯化之缺乏分子內橋鍵之升糖素肽來達成。在併入或未併入間隔子之情況下醯化及烷基化在本文中進一步描述。
α螺旋：分子內橋鍵
在一些實施例中，α螺旋促進胺基酸為經由分子內橋鍵連接於升糖素類似物之另一胺基酸的胺基酸。在該等實施例中，經由分子內橋鍵連接之該兩個胺基酸各自視為α螺旋促進胺基酸。在一些實施例中，升糖素類似物包含一個或兩個分子內橋鍵。在一些特定實施例中，升糖素類似物包含一個分子內橋鍵與至少另一α螺旋促進胺基酸(例如α,α二取代胺基酸)之組合。
在一些實施例中，分子內橋鍵為經由非共價鍵連接升糖素類似物之兩個部分的橋鍵，該等非共價鍵包括例如範德華相互作用(van der Waals interaction)、氫鍵、離子鍵、疏水相互作用、偶極-偶極相互作用及其類似物。在此方面，在某些態樣中，升糖素類似物包含非共價分子內橋鍵。在一些實施例中，非共價分子內橋鍵為鹽橋。
在一些實施例中，分子內橋鍵為經由共價鍵連接類似物之兩個部分的橋鍵。在此方面，在某些態樣中，升糖素類似物包含共價分子內橋鍵。
在一些實施例中，分子內橋鍵(例如非共價分子內橋鍵、共價分子內橋鍵)形成於隔開3個胺基酸之兩個胺基酸(例如位置i及i+4上之胺基酸)之間，其中i為12與 25之間的任何整數(例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24及25)。更特定言之，胺基酸對12與16、16與20、20與24或24與28(其中i=12、16、20或24之胺基酸對)之側鏈彼此連接且因此使升糖素α螺旋穩定。或者，i可為17。在一些特定實施例中，升糖素類似物在胺基酸17與21之間包含分子內橋鍵。在一些特定實施例中，升糖素類似物在位置16與20或12與16上之胺基酸之間包含分子內橋鍵且在位置17與21上之胺基酸之間包含第二分子內橋鍵。本文涵蓋包含一或多個分子內橋鍵之升糖素類似物。在位置i及i+4上之胺基酸由分子內橋鍵連接之特定實施例中，連接子之大小為約8個原子或約7-9個原子。
在其他實施例中，分子內橋鍵形成於隔開兩個胺基酸之兩個胺基酸(例如位置j及j+3上之胺基酸)之間，其中j為12與26之間的任何整數(例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25及26)。在一些特定實施例中，j為17。在位置j及j+3上之胺基酸由分子內橋鍵連接之特定實施例中，連接子之大小為約6個原子或約5至7個原子。
在其他實施例中，分子內橋鍵形成於隔開6個胺基酸之兩個胺基酸(例如位置k及k+7上之胺基酸)之間，其中k為12與22之間的任何整數(例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21及22)。在一些特定實施例中，k為12、13或17。在一示範性實施例中，k為17。
α螺旋：分子內橋鍵中涉及之胺基酸
能夠鍵結(共價或非共價)以形成六個原子之連接橋鍵之胺基酸配對之實例包括Orn與Asp、Glu與式I胺基酸(其中n為2)以及高麩胺酸與式I胺基酸(其中n為1)，其中式I為：
能夠鍵結以形成七個原子之連接橋鍵之胺基酸配對之實例包括Orn-Glu(內醯胺環)；Lys-Asp(內醯胺)；或高絲胺酸-高麩胺酸(內酯)。可形成八個原子之連接子之胺基酸配對之實例包括Lys-Glu(內醯胺)；高離胺酸-Asp(內醯胺)；Orn-高麩胺酸(內醯胺)；4-胺基Phe-Asp(內醯胺)；或Tyr-Asp(內酯)。可形成九個原子之連接子之胺基酸配對之實例包括高離胺酸-Glu(內醯胺)；Lys-高麩胺酸(內醯胺)；4-胺基Phe-Glu(內醯胺)；或Tyr-Glu(內酯)。該等胺基酸之任何側鏈可另外經其他化學基團取代，只要α螺旋之三維結構不被破壞即可。一般技術者可設想產生具有類似大小及所要作用之穩定化結構之替代配對或替代胺基酸類似物，包括經化學修飾之衍生物。舉例而言，高半胱胺酸-高半胱胺酸二硫橋鍵長6個原子且可經進一步修飾以提供所要作用。
甚至在無共價鍵聯時，本文所述之胺基酸配對(或一般技術者可設想之類似配對)亦可經由非共價鍵，例如經由形成鹽橋或氫鍵結相互作用而對α螺旋提供附加之穩定性。因此，鹽橋可於以下之間形成：Orn與Glu；Lys與Asp；高絲胺酸與高麩胺酸；Lys與Glu；Asp與Arg；高離胺酸與Asp；Orn與高麩胺酸；4-胺基Phe與Asp；Tyr與Asp；高離胺酸與Glu；Lys與高麩胺酸；4-胺基Phe與Glu；或Tyr與Glu。在一些實施例中，類似物在任何以下胺基酸對之間包含鹽橋：Orn與Glu；Lys與Asp；Lys與Glu；Asp與Arg；高離胺酸與Asp；Orn與高麩胺酸；高離胺酸與Glu；及Lys與高麩胺酸。鹽橋亦可形成於其他帶相反電荷側鏈之對之間。參見例如Kallenbach等人，Role of the Peptide Bond in Protein Structure and Folding,The Amide Linkage：Structural Significance in Chemistry,Biochemistry,and Materials Science,John Wiley & Sons,Inc.(2000)。
在一些實施例中，非共價分子內橋鍵為疏水性橋鍵。根據一個實施例，類似物之α螺旋經由在位置j及j+3或i及i+4上併入疏水性胺基酸而穩定化。舉例而言，i可為Tyr且i+4可為Val或Leu；i可為Phe且i+4可為Met；或i可為Phe且i+4可為Ile。應瞭解，出於本文之目的，上述胺基酸配對可反轉，使得位置i上之所述胺基酸可替代地位於i+4，而i+4胺基酸可位於i位置。亦應瞭解，j及j+3可形成適合胺基酸配對。
α螺旋：共價分子內橋鍵
在一些實施例中，共價分子內橋鍵為內醯胺環或內醯胺橋鍵。內醯胺環之大小可視胺基酸側鏈之長度而變化，且在一個實施例中，內醯胺係藉由連接鳥胺酸之側鏈與天冬胺酸側鏈而形成。內醯胺橋鍵及其製備方法在此項技術中為已知的。參見例如Houston,Jr.等人，J Peptide Sci 1：274-282(2004)及本文之實例1。在一些實施例中，類似物包含經修飾之序列SEQ ID NO：1及i與i+4之間的內醯胺橋鍵，其中i係如上文所定義。在一些實施例中，升糖素類似物包含兩個內醯胺橋鍵：一個在位置16與20上之胺基酸之間且另一個在位置17與21上之胺基酸之間。在一些實施例中，升糖素類似物包含一個內醯胺橋鍵及一個鹽橋。其他示範性實施例在本文中描述於名稱為「實例」之部分中。其他示範性實施例包括視情況具有內醯胺橋鍵之以下配對：位置12上之Glu與位置16上之Lys；位置12上之原生Lys與位置16上之Glu；位置16上之Glu與位置20上之Lys；位置16上之Lys與位置20上之Glu；位置20上之Glu與位置24上之Lys；位置20上之Lys與位置24上之Glu；位置24上之Glu與位置28上之Lys；位置24上之Lys與位置28上之Glu。
在一些實施例中，共價分子內橋鍵為內酯。製備內酯橋鍵之適合方法在此項技術中為已知的。參見例如Sheehan等人，J Am Chem Soc 95：875-879(1973)。
在一些態樣中，使用烯烴複分解反應來使用全烴交聯 系統使類似物之α螺旋之一個或兩個轉角交聯。在此情況下，升糖素類似物在j及j+3或i及i+4位置包含帶有不同長度之烯烴側鏈且組態成R或S立體化學的α甲基化胺基酸。在一些實施例中，烯烴側鏈包含(CH2)n，其中n為1至6之間的任何整數。在一些實施例中，n對於8個原子之交聯長度為3。在一些實施例中，n對於6個原子之交聯長度為2。包含烯烴交聯之示範性升糖素類似物在本文中描述為SEQ ID NO：17。形成該等分子內橋鍵之適合方法描述於此項技術中。參見例如Schafmeister等人，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)及Walensky等人，Science 305：1466-1470(2004)。在替代實施例中，類似物包含位於相鄰螺旋轉角上之O-烯丙基Ser殘基，該等殘基經由釕催化之閉環複分解反應橋接在一起。該等交聯程序描述於例如Blackwell等人，Angew,Chem.,Int.Ed.37：3281-3284(1998)中。
在特定態樣中，使用作為半胱胺酸之肽模擬物廣泛採用之非天然硫醇-二丙胺酸羊毛硫胺酸用於交聯α螺旋之一個轉角。基於羊毛硫胺酸之適合環化方法在此項技術中為已知的。參見例如Matteucci等人，Tetrahedron Letters 45：1399-1401(2004)；Mayer等人，J.Peptide Res.51：432-436(1998)；Polinsky等人，J.Med.Chem.35：4185-4194(1992)；Osapay等人，J.Med.Chem.40：2241-2251(1997)；Fukase等人，Bull.Chem.Soc.Jpn.65：2227-2240(1992)；Harpp等人，J.Org.Chem.36： 73-80(1971)；Goodman及Shao,Pure Appl.Chem.68：1303-1308(1996)；及Osapay及Goodman,J.Chem.Soc.Chem.Commun.1599-1600(1993)。
在一些實施例中，使用位置i及i+7上兩個Glu殘基之間的α,ω-二胺基烷烴系鏈(例如1,4-二胺基丙烷及1,5-二胺基戊烷)來使類似物之α螺旋穩定。該等系鏈導致形成長9個原子或9個原子以上之橋鍵，視二胺基烷烴系鏈之長度而定。產生經該等系鏈交聯之肽之適合方法描述於此項技術中。參見例如Phelan等人，J.Am.Chem.Soc.119：455-460(1997)。
在其他實施例中，使用二硫橋鍵來交聯類似物之α螺旋之一個或兩個轉角。或者，使用一個或兩個硫原子經亞甲基置換從而產生同電子排列大環化之經修飾二硫橋鍵來使類似物之α螺旋穩定。用二硫橋鍵或基於硫之環化來修飾肽之適合方法描述於例如Jackson等人，J.Am.Chem.Soc.113：9391-9392(1991)及Rudinger及Jost,Experientia 20：570-571(1964)中。
在其他實施例中，類似物之α螺旋經由位於j及j+3或i及i+4之兩個His殘基或His與Cys對結合金屬原子而穩定化。金屬原子可為例如Ru(III)、Cu(II)、Zn(II)或Cd(II)。該等基於金屬結合之α螺旋穩定化方法在此項技術中為已知的。參見例如Andrews及Tabor,Tetrahedron 55：11711-11743(1999)；Ghadiri等人，J.Am.Chem.Soc.112：1630-1632(1990)；及Ghadiri等人，J.Am. Chem.Soc.119：9063-9064(1997)。
類似物之α螺旋可替代地經由其他肽環化方法穩定化，該等方法評述於Davies,J.Peptide.Sci.9：471-501(2003)中。α螺旋可經由形成醯胺橋鍵、硫醚橋鍵、硫酯橋鍵、脲橋鍵、胺基甲酸酯橋鍵、磺醯胺橋鍵及其類似物來穩定化。舉例而言，可在C端與Cys殘基之側鏈之間形成硫酯橋鍵。或者，可經由具有硫醇之胺基酸(Cys)與具有羧酸之胺基酸(例如Asp、Glu)之側鏈形成硫酯。在另一方法中，交聯劑(諸如二羧酸，例如辛二酸(辛烷二酸)等)可在胺基酸側鏈之兩個官能基(諸如遊離胺基、羥基、硫醇基及其組合)之間引入連接。
DPP-IV抗性肽
在一些實施例中，升糖素類似物在位置1或2上或在位置1與2兩者上包含使升糖素類似物獲得對二肽基肽酶IV(DPP IV)裂解之抗性的胺基酸。在一些實施例中，升糖素類似物在位置1上包含選自由以下組成之群之胺基酸：D-組胺酸、消胺基組胺酸、羥基-組胺酸、乙醯基-組胺酸、高組胺酸、N-甲基組胺酸、α-甲基組胺酸、咪唑乙酸或α,α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)。在一些實施例中，升糖素類似物在位置2上包含選自由以下組成之群之胺基酸：D-絲胺酸、D-丙胺酸、纈胺酸、甘胺酸、N-甲基絲胺酸、N-甲基丙胺酸或α胺基異丁酸。在一些實施例中，升糖素類似物在位置2上包含使升糖素類似物獲得對DPP IV之抗性的胺基酸且使升糖素類似物獲得對DPP IV之抗性的胺基酸不為D-絲胺酸。
在一些態樣中，包含使升糖素類似物獲得對DPP IV之抗性之胺基酸的升糖素類似物更包含使升糖素C端部分中存在之α螺旋穩定(例如經由位置「i」與「i+4」，例如12與16、16與20或20與24上之胺基酸之間的共價鍵)的胺基酸修飾。在一些實施例中，此共價鍵為位置16上之麩胺酸與位置20上之離胺酸之間的內醯胺橋鍵。在一些實施例中，此共價鍵為除內醯胺橋鍵以外之分子內橋鍵。舉例而言，適合共價鍵結方法包括以下中之任一或多者：烯烴複分解、基於羊毛硫胺酸之環化、二硫橋鍵或經修飾之含硫橋鍵形成、使用α,ω-二胺基烷烴系鏈、形成金屬原子橋鍵及其他肽環化方法。
位置1之修飾
在一些特定實施例中，升糖素類似物包含(a)位置1上之His取代為大型芳族胺基酸的胺基酸取代及(b)使分子C端部分(例如約位置12-29)中之彼α螺旋穩定的分子內橋鍵。在特定實施例中，位置1上之胺基酸置換為Tyr、Phe、Trp、胺基-Phe、硝基-Phe、氯-Phe、磺酸基-Phe、4-吡啶基-Ala、甲基-Tyr或3-胺基Tyr。在一些實施例中，分子內橋鍵為本文所述之任何分子內橋鍵。在一些態樣中，分子內橋鍵位於由三個插入胺基酸隔開之兩個胺基酸之側鏈之間，亦即胺基酸i與i+4之側鏈之間。在一些實施例中，分子內橋鍵為內醯胺橋鍵。在一些實施例中，升糖素類似物在位置1上包含大型芳族胺基酸且在類似 物之位置16與20上之胺基酸之間包含內醯胺橋鍵。在一些態樣中，該升糖素類似物更包含一或多個(例如兩個、三個、四個、五個或五個以上)本文所述之其他修飾。舉例而言，升糖素類似物可包含醯胺替代C端羧酸酯。此外，在一些實施例中，該等升糖素類似物更包含以下一或多者：位置17上之大型脂族胺基酸、位置18上之含咪唑胺基酸及位置19上之帶正電荷胺基酸。在一些實施例中，包含位置1上之修飾及分子內橋鍵之升糖素類似物進一步在位置17-19上包含胺基酸序列Ile-His-Gln。該等修飾可在不破壞升糖素類似物對GLP-1受體及升糖素受體之活性之情況下進行。在一些實施例中，升糖素類似物另外包含醯化或烷基化胺基酸殘基。
位置3之修飾
在一些實施例中，將SEQ ID NO：1之第三胺基酸(Gln3)取代為酸性、鹼性或疏水性胺基酸殘基且該修飾使升糖素受體活性降低。在一些實施例中，酸性、鹼性或疏水性胺基酸為麩胺酸、鳥胺酸、正白胺酸。在一些態樣中，經此等殘基之一者修飾使得升糖素類似物顯示實質上降低或破壞之升糖素受體活性。在一些態樣中，經例如麩胺酸、鳥胺酸或正白胺酸取代之升糖素類似物具有天然升糖素對升糖素受體之活性之約10%或10%以下，例如約1-10%或約0.1-10%，或高於約0.1%但低於約10%，同時顯示GLP-1對GLP-1受體之活性的至少20%。在一些實施例中，升糖素類似物顯示天然升糖素活性之約0.5%、 約1%或約7%，同時顯示GLP-1對GLP-1受體之活性的至少20%。
在一些實施例中，使升糖素類似物在SEQ ID NO：1位置3上之麩胺醯胺在不實質性損失對升糖素受體之活性的情況下取代為麩胺醯胺類似物，且在一些情況下增強升糖素受體活性。在一些實施例中，麩胺醯胺類似物為包含結構I、II或III之側鏈之天然存在或非天然存在或非編碼之胺基酸：
其中R1為C0-3烷基或C0-3雜烷基；R2為NHR4或C1-3烷基；R3為C1-3烷基；R4為H或C1-3烷基；X為NH、O或S；且Y為NHR4、SR3或OR3。在一些實施例中，X為NH或Y為NHR4。在一些實施例中，R1為C0-2烷基或C1雜烷基。在一些實施例中，R2為NHR4或C1烷基。在一些實施例中，R4為H或C1烷基。在示範性實施例中，提供包含結構I之側鏈之胺基酸，其中R1為CH2-S，X為NH且R2為CH3(乙醯胺基甲基-半胱胺酸，C(Acm))；R1為CH2，X為NH且R2為CH3(乙醯基二胺基丁酸，Dab(Ac))；R1為C0烷基，X為NH，R2為NHR4且R4為H(胺甲醯基 二胺基丙酸，Dap(urea))；或R1為CH2-CH2，X為NH且R2為CH3(乙醯基鳥胺酸，Orn(Ac))。在示範性實施例中，提供包含結構II之側鏈之胺基酸，其中R1為CH2，Y為NHR4且R4為CH3(甲基麩胺醯胺，Q(Me))。在示範性實施例中，提供包含結構III之側鏈之胺基酸，其中R1為CH2且R4為H(甲硫胺酸-亞碸，M(O))。在特定實施例中，位置3上之胺基酸取代為Dab(Ac)。舉例而言，升糖素促效劑可包含2009年6月16日申請之國際專利申請案第PCT/US2009/047438號之序列表之SEQ ID NO：595、SEQ ID NO：601、SEQ ID NO：603、SEQ ID NO：604、SEQ ID NO：605及SEQ ID NO：606的經修飾胺基酸序列，該申請案以全文引用之方式併入本文中，其中該等胺基酸序列如本文進一步描述經修飾，例如經修飾以包含至少三個α螺旋促進胺基酸，經修飾以包含(i)位置10上之醯化或烷基化胺基酸、(i)位置16上之α螺旋促進胺基酸、(iii)位置17及/或18上之脂族胺基酸及(iv)位於位置27之C端方向之至少一個帶電荷胺基酸，及視情況選用之其他修飾；經修飾以在升糖素類似物之相應位置上包含艾塞納肽-4(SEQ ID NO：8)之胺基酸18-24之至少三個胺基酸。
位置7之修飾
在一些實施例中，升糖素類似物包含在位置7上具有胺基酸修飾之經修飾SEQ ID NO：1。在一些態樣中，將SEQ ID NO：1位置7上之胺基酸(Thr)取代為大型脂族胺基酸，例如Ile、Leu、Ala及其類似物。咸信該等修飾顯著降低 升糖素類似物對GLP-1受體之活性。
位置15之修飾
在一些實施例中，升糖素類似物包含在位置15上具有提高穩定性之胺基酸修飾之經修飾SEQ ID NO：1。在一些態樣中，SEQ ID NO：1位置15上之胺基酸經缺失或取代為麩胺酸、高麩胺酸、半胱胺酸或高半胱胺酸。該等修飾減少類似物隨時間之降解或裂解，尤其在酸性或鹼性緩衝液中，例如pH值在5.5至8範圍內之緩衝液。在一些實施例中，包含此修飾之升糖素類似物在25℃下24小時後保留原始類似物之至少75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。
位置16之修飾
根據一個實施例，提供具有增強之效力及視情況提高之溶解度及穩定性的升糖素類似物。在一個實施例中，增強之升糖素及GLP-1效力由天然升糖素(SEQ ID NO：1)位置16上之胺基酸修飾提供。作為非限制性實例，該增強之效力可藉由使位置16上天然存在之絲胺酸取代為麩胺酸或取代為另一具有長度為4個原子之側鏈之帶負電荷胺基酸，或者取代為麩胺酸、高麩胺酸或高半胱胺酸或者具有含至少一個雜原子(例如N、O、S、P)之側鏈且側鏈長度為約4(或3-5)個原子之帶電荷胺基酸中之任一者來提供。在一些實施例中，升糖素類似物包含經修飾之SEQ ID NO：1，其包含位置16上之Ser取代為選自由麩胺酸、麩胺醯胺、高麩胺酸、高半胱胺酸、酥胺酸 或甘胺酸組成之群之胺基酸的取代。在一些態樣中，位置16上之絲胺酸殘基取代為選自由麩胺酸、麩胺醯胺、高麩胺酸及高半胱胺酸組成之群的胺基酸。在一些特定態樣中，位置16上絲胺酸殘基取代為麩胺酸或其保守性取代(例如艾塞納肽-4胺基酸)。
在替代實施例中，升糖素類似物包含經修飾之SEQ ID NO：1序列，其經在位置16上之Ser取代為Thr或AIB或如上所述之另一α螺旋促進胺基酸的取代修飾。在一些實施例中，α螺旋促進胺基酸與j+3或i+4上之胺基酸形成非共價分子內橋鍵。
位置17-18上之修飾
在一些實施例中，升糖素類似物包含經修飾之SEQ ID NO：1，其中位置17及18上之二鹼性Arg-Arg位點經消除。不受限於任何特定理論，咸信在一些實施例中，該二鹼性位點之消除提高升糖素類似物之活體內功效。在一些態樣中，升糖素類似物關於此點藉由使SEQ ID NO：1位置17及18上胺基酸中之一者或兩者取代為非鹼性之胺基酸，例如取代為脂族胺基酸來修飾。在一些實施例中，使位置17或18上胺基酸中之一者缺失或在位置17與18之間插入胺基酸。在一些實施例中，使位置17上之Arg取代為如本文所述之另一胺基酸，例如Gln、包含親水性部分之胺基酸、α螺旋促進胺基酸。在一些實施例中，α螺旋促進胺基酸與j+3或i+4上之胺基酸形成非共價分子內橋鍵。在一些實施例中，使位置18上之Arg 取代為如本文所述之另一胺基酸。在示範性態樣中，位置18上之胺基酸為α,α二取代胺基酸，例如AIB。在一些態樣中，位置18上之胺基酸為小型脂族胺基酸，例如Ala。在一些態樣中，位置18上之胺基酸為小型脂族胺基酸，例如Ala，且位置17上之Arg保持未修飾。
位置20之修飾
對GLP-1受體之增強之活性亦由位置20上之胺基酸修飾提供。在一些實施例中，使位置20上之麩胺醯胺置換為如上文所述之α螺旋促進胺基酸，例如AIB。在一些實施例中，α螺旋促進胺基酸與j-3或i-4上之胺基酸形成非共價分子內橋鍵。在一些特定實施例中，該胺基酸為具有帶電荷或能夠氫鍵結且長至少約5(或約4-6)個原子之側鏈的親水性胺基酸，例如離胺酸、瓜胺酸、精胺酸或鳥胺酸，且視情況與位置16上之另一α螺旋促進胺基酸(例如帶負電荷胺基酸)形成鹽橋。在一些特定態樣中，該等修飾減少經由Gln之去醯胺化而發生之降解，且在一些實施例中增加升糖素類似物對GLP-1受體之活性。在一些態樣中，位置20上之胺基酸為Glu或Lys或AIB。
位置21、23、24及28上之修飾
在一些實施例中，位置21及/或位置24藉由取代為α螺旋促進胺基酸而經修飾。在一些實施例中，α螺旋促進胺基酸與j-3或i-4上之胺基酸形成非共價分子內橋鍵。在一些態樣中，α螺旋促進胺基酸為AIB。
在示範性實施例中，位置23上之胺基酸為Ile。
在示範性態樣中，位置28上之胺基酸為α,α二取代胺基酸，例如AIB。
帶電荷之C端
在一些實施例中，升糖素類似物藉由在類似物之C端部分中引入帶電荷胺基酸之胺基酸取代及/或添加而經修飾。在一些實施例中，該等修飾增強穩定性及溶解度。如本文所用，術語「帶電胺基酸」或「帶電殘基」係指包含在生理pH值下在水溶液中帶負電荷(亦即去質子化)或帶正電荷(亦即質子化)之側鏈的胺基酸。在一些態樣中，引入帶電荷胺基酸修飾之該等胺基酸取代及/或添加位於SEQ ID NO：1位置27之C端方向位置。在一些實施例中，在C端部分內(例如位置27之C端方向位置)引入一個、兩個或三個(且在一些情況下多於三個)帶電荷胺基酸。根據一些實施例中，使位置28及/或29上之天然胺基酸取代為帶電荷胺基酸，及/或在另一實施例中，亦向類似物之C端添加一個至三個帶電荷胺基酸。在示範性實施例中，帶電荷胺基酸中之一者、兩者或全部帶負電荷。在一些實施例中，帶負電荷胺基酸為天冬胺酸、麩胺酸、半胱胺酸、高半胱胺酸或高麩胺酸。在一些態樣中，該等修飾增加溶解度，例如提供當在25℃下24小時後量測時，在約5.5與8之間的指定pH值(例如pH 7)下相對於天然升糖素至少2倍、5倍、10倍、15倍、25倍、30倍或30倍以上之溶解度。
C端截短
根據一些實施例，本文揭示之升糖素類似物藉由使C端截短一個或兩個胺基酸殘基而經修飾。如本文所示，該等經修飾之升糖素肽保留對升糖素受體及GLP-1受體之類似活性及效力。在此方面，升糖素肽可包含天然升糖素類似物(SEQ ID NO：1)之胺基酸1-27或1-28，視情況具有本文所述之任何其他修飾。
電荷中性C端
在一些實施例中，升糖素類似物包含經修飾之SEQ ID NO：1，其中C端胺基酸之羧酸置換為電荷中性基團，諸如醯胺或酯。不受限於任何特定理論，在某些態樣中，該等修飾增加升糖素類似物對GLP-1受體之活性。因此，在一些實施例中，升糖素類似物為醯胺化之肽，使得C端殘基包含醯胺替代胺基酸之α羧酸酯。如本文所用，對肽或類似物之一般性提及意欲涵蓋具有經修飾之胺基端、羧基端或胺基端與羧基端兩者的肽。舉例而言，包含醯胺基替代末端羧酸之胺基酸鏈意欲由表示標準胺基酸之胺基酸序列涵蓋。
其他修飾
在一些實施例中，升糖素類似物另外或替代地包含以下胺基酸修飾：(i)位置2上之Ser取代為Ala；(ii)位置10上之Tyr取代為Val或Phe或Trp；(iii)位置12上之Lys取代為Arg； (iv)位置17上之Arg取代為Gln或小型脂族胺基酸(例如Ala)或大型脂族胺基酸(例如Ile)；(v)位置18上之Arg取代為小型脂族胺基酸(例如Ala)或含咪唑胺基酸(例如His)；(vi)位置19上之Ala取代為帶正電荷胺基酸(例如Gln)；(vii)位置23上之Val取代為Ile，及(viii)位置29上之Thr取代為Gly或Gln。
在一些實施例中，升糖素類似物之穩定性藉由修飾位置27上之甲硫胺酸(例如藉由取代為白胺酸或正白胺酸)而增加。該等修飾可減少氧化降解。穩定性亦可藉由修飾位置20或24或28上之Gln(例如藉由取代為Ala、Ser、Thr或AIB)而增加。該等修飾可減少經由Gln之去醯胺化而發生之降解。穩定性可藉由修飾位置21上之Asp(例如藉由取代為另一酸性殘基，例如Glu)而增加。該等修飾可減少經由Asp脫水形成環狀丁二醯亞胺中間物，接著異構化為異天冬胺酸而發生之降解。
在一些實施例中，本文所述之升糖素類似物經糖基化、醯胺化、羧化、磷酸化、酯化、N-醯化、經由例如二硫橋鍵環化，或轉化為鹽(例如酸加成鹽、鹼加成鹽)，及/或視情況二聚化、多聚化或聚合或結合。
本文所述之任何修飾(包括例如增加或降低升糖素受體活性及增加GLP-1受體活性之修飾)可個別地或組合應用。增加GLP-1受體活性之修飾之組合可提供比單獨取用任何該等修飾高的GLP-1活性。
示範性實施例
本發明提供包含與天然人類升糖素之結構類似之結構且顯示與天然人類升糖素相比對GLP-1受體之促效劑活性增強的肽。升糖素通常具有天然GLP-1對GLP-1受體之活性的約1%，且GLP-1通常具有天然升糖素對升糖素受體之活性的小於約0.01%。因此，本發明之肽顯示天然GLP-1對GLP-1受體之活性的大於1%。在示範性實施例中，本發明之肽顯示天然GLP-1對GLP-1受體之活性的大於5%或約5%、大於10%或約10%、大於15%或約15%、大於20%或約20%、大於25%或約25%、大於30%或約30%、大於35%或約35%、大於40%或約40%、大於45%或約45%、大於50%或約50%、大於55%或約55%、大於60%或約60%、大於65%或約65%、大於70%或約70%、大於75%或約75%、大於80%或約80%、大於85%或約85%、大於90%或約90%或大於95%或約95%。在實例態樣中，本發明之肽顯示大於天然GLP-1的對GLP-1受體之活性。因此，在示範性態樣中，本發明之肽顯示天然GLP-1對GLP-1受體之活性的大於100%或約100%。在示範性態樣中，本發明之肽顯示天然GLP-1對GLP-1受體之活性的大於150%或約150%、大於200%或約200%、大於250%或約250%、大於300%或約300%、大於350%或約350%、大於400%或約400%、大於450%或約450%、大於500%或約500%、大於550%或約550%、大於600%或約600%、大於650%或約650%、大於700% 或約700%、大於750%或約750%、大於800%或約800%、大於850%或約850%、大於900%或約900%、大於950%或約950%或大於1,000%或約1,000%。
在示範性實施例中，肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：12。
在示範性實施例中，肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：13。
在示範性實施例中，肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：14。
在示範性實施例中，肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：15。
在示範性實施例中，肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：16且顯示對人類GLP-1受體相對於GIP受體至少100倍之選擇性。
在示範性實施例中，肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：17。
本發明進一步提供包含與本發明所揭示肽中之一者之胺基酸序列高度類似之胺基酸序列的變異型肽。在示範性實施例中，本發明之變異型肽包含與SEQ ID NO：12-17中任一者之肽之胺基酸序列之胺基酸1-29至少80%、85%、90%或95%一致的胺基酸序列，其中該變異型肽保留親本肽對GLP-1受體、升糖素受體及GIP受體之活性(例如顯示對人類GLP-1受體相對於GIP受體至少100倍之選擇性)，及視情況至少1%之GLP-1效力；或其中該肽對GIP受體之EC50與其對GLP-1受體之EC50的不同小於100倍)。在示範性實施例中，本發明之變異型肽包含顯示對人類GLP-1受體相對於GIP受體至少100倍高之選擇性。
在示範性實施例中，本發明之變異型肽包含基於本發 明肽之胺基酸序列的胺基酸序列，但在一或多個胺基酸位置上不同，該等胺基酸位置包括(但不限於)位置1、位置2、位置3、位置7、位置10、位置12、位置15、位置16、位置17、位置18、位置20、位置21、位置23、位置24、位置27、位置28、位置29。在示範性態樣中，變異型肽可包含相對於親本肽保守之取代，可包含本文所述之任何胺基酸修飾，或可包含恢復成天然升糖素序列(SEQ ID NO：1)中彼位置上存在之胺基酸的胺基酸修飾。在示範性態樣中，本發明之變異型肽包含基於本發明肽之胺基酸序列的胺基酸序列，但以以下方式中之一或多者而不同：a)該變異型肽包含醯化胺基酸或烷基化胺基酸；b)醯化胺基酸或烷基化胺基酸置換為天然升糖素(SEQ ID NO：1)在彼位置上之相應胺基酸或天然胺基酸之保守性取代，且視情況在不同位置引入新的醯化或烷基化胺基酸；c)該變異型肽包含共價連接於親水性部分之胺基酸；d)共價連接於親水性部分之胺基酸置換為天然升糖素(SEQ ID NO：1)在彼位置上之相應胺基酸，且視情況在不同位置引入新的共價連接於親水性部分之胺基酸；e)該變異型肽之C端胺基酸包含C端醯胺替代C端α羧酸酯；f)位置1至29中任一者上之胺基酸置換為天然升糖素(SEQ ID NO：1)在彼位置上之相應胺基酸； g)或其任何組合。
關於任何前述變異型肽，在示範性實施例中，該變異型肽包含共價連接於位置16、17、21、24、29、C端延伸內之位置或C端上之胺基酸的親水性部分。在示範性態樣中，變異型肽包含共價連接於親水性部分之Cys、Lys、Orn、高半胱胺酸及Ac-Phe，視情況其中該Cys、Lys、Orn、高半胱胺酸或Ac-Phe位於該變異型肽之位置16、17、21、24、29、C端延伸內之位置或C端。在示範性態樣中，親水性部分為聚乙二醇。
在示範性態樣中，變異型肽視情況在位置10上包含醯化或烷基化胺基酸。在示範性態樣中，變異型肽包含含C8至C20烷基鏈、C12至C18烷基鏈或C14或C16烷基鏈之醯化或烷基化胺基酸。在示範性態樣中，變異型肽包含為式I、式II或式III之醯化或烷基化胺基酸的醯化或烷基化胺基酸，視情況其中該式I胺基酸為Lys。
在示範性態樣中，本發明之變異型肽包含醯化或烷基化胺基酸，其中醯基或烷基經由間隔子共價連接於胺基酸，視情況其中該間隔子為胺基酸或二肽。在示範性實施例中，間隔子包含一個或兩個酸性殘基。
在任何前述示範性實施例中，任何本發明之肽或變異型肽顯示(對升糖素受體之EC50)/(對GLP-1受體之EC50)為約20或20以下(例如20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.25、0.10、0.05、0.025、0.01、0.001)。
在任何前述示範性實施例中，任何本發明之肽或變異型肽顯示(對升糖素受體之EC50)/(對GLP-1受體之EC50)大於20(例如21、25、30、40、50、60、70、80、90、100、250、500、750、1000或1000以上)。
在任何前述示範性實施例中，任何本發明之肽或變異型肽顯示對GLP-1受體之EC50為對升糖素受體之EC50的兩倍至十倍(例如3、4、5、6、7、8、9倍)大。
排除
在示範性實施例中，以下肽中之任一者自本文所述之升糖素類似物排除，不過包含一或多個如本文所述之對其之進一步修飾且顯示所要GLP-1或共促效劑活性的任何以下肽、醫藥組合物、套組及使用該等化合物之治療方法可包括於本發明中：具有[Arg12]取代且具有C端醯胺之SEQ ID NO：1之肽；具有[Arg12,Lys20]取代且具有C端醯胺之SEQ ID NO：1之肽；具有[Arg12,Lys24]取代且具有C端醯胺之SEQ ID NO：1之肽；具有[Arg12,Lys29]取代且具有C端醯胺之SEQ ID NO：1之肽；具有[Glu9]取代之SEQ ID NO：1之肽；缺失His1、具專有[GIu9,Glu16,Lys29]取代且具有C端醯胺之SEQ ID NO：1之肽；具有[Glu9,Glu16,Lys29]取代且具有C端醯胺之SEQ ID NO：1之肽；具有經由內醯胺橋鍵連接之[Lys13,Glu17]取代且具有C端醯胺之SEQ ID NO：1之肽；具有經由內醯胺橋鍵連接之[Lys17,Glu21]取代且具有C端醯胺之SEQ ID NO：1之肽；缺失His1、具有經由內醯胺橋鍵連接之 [Glu20,Lys24]取代之SEQ ID NO：1之肽。在一些實施例中，升糖素類似物不為任何以下文獻中揭示之任何肽：2009年2月19日申請且於2010年8月26日公開為WO 2010/096052之國際專利申請案第PCT/US2009/034448號；2009年12月18日申請且於2010年8月26日公開為WO 2010/096142之國際專利申請案第PCT/US2009/068678號；2009年6月16日申請且於2009年12月23日公開為WO 2009/155258之國際專利申請案第PCT/US2009/047438號；2008年2月13日申請且於2008年8月21日公開為WO 2008/101017之國際專利申請案第PCT/US2008/053857號；2010年12月9日申請之國際專利申請案第PCT/US2010/059724號；2009年6月16日申請且於2010年1月28日公開為WO2010/011439之國際專利申請案第PCT/US2009/047447號；2010年6月16日申請且於2010年12月23日公開為WO2010/148089之國際專利申請案第PCT/US2010/38825號；2011年1月26日申請之國際專利申請案第PCT/US2011/022608號；及2010年12月22日申請之美國臨時申請案第61/426,285號；該等文獻各自以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，升糖素類似物不包括位置29之後連接於C端之序列KRNRNNIA的全部或一部分，例如KRNR。
製備肽之方法
本發明之升糖素類似物可藉由此項技術中已知之方法 獲得。從頭合成肽之適合方法描述於以下文獻中：例如Chan等人，Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis,Oxford University Press,Oxford,United Kingdom,2005；Peptide and Protein Drug Analysis,Reid,R.編，Marcel Dekker,Inc.,2000；Epitope Mapping,Westwood等人編，Oxford University Press,Oxford,United Kingdom,2000；及美國專利第5,449,752號。
此外，在本發明之類似物不包含任何非編碼或非天然胺基酸之情況下，升糖素類似物可使用編碼該類似物之胺基酸序列的核酸使用標準重組方法重組製造。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第3版，Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY 2001；及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons,NY,1994。
在一些實施例中，本發明之升糖素類似物經分離。在一些實施例中，本發明之升糖素類似物經純化。.應認識到，「純度」為相對術語，且不必解釋為絕對純度或絕對濃化或絕對選擇。在一些態樣中，純度為至少或約50%，為至少或約60%，為至少或約70%，為至少或約80%，為至少或約90%(例如至少或約91%，至少或約92%，至少或約93%，至少或約94%，至少或約95%，至少或約96%，至少或約97%，至少或約98%，至少或約99%，或為約100%。
在一些實施例中，本文所述之肽係由公司商業合成，該等公司為諸如Synpep(Dublin,CA)、Peptide Technologies Corp.(Gaithersburg,MD)及Multiple Peptide Systems(San Diego,CA)。在此態樣中，該等肽可為合成、重組、經分離及/或經純化的。
結合物
本發明進一步提供包含與異源部分結合之本文所述之一或多種升糖素類似物的結合物，其中該結合物顯示對GLP-1受體之活性與天然升糖素相比增強，且顯示對人類GLP-1受體相對於GIP受體至少100倍高之選擇性。如本文所用，術語「異源部分」與術語「結合物部分」同義且係指與本文所述之升糖素類似物不同的任何分子(化學或生物化學、天然存在或非編碼)。可連接於本文所述之任何類似物的示範性結合物部分包括(但不限於)異源肽或多肽(包括例如血漿蛋白質)、靶向劑、免疫球蛋白或其部分(例如可變區、CDR或Fc區)、診斷標記(諸如放射性同位素、螢光團或酶促標記)、聚合物(包括水溶性聚合物)或其他治療劑或診斷劑。在一些實施例中，提供包含本發明之類似物及血漿蛋白質之結合物，其中該血漿蛋白質係選自由白蛋白、轉鐵蛋白、纖維蛋白原及球蛋白組成之群。在一些實施例中，結合物之血漿蛋白質部分為白蛋白或轉鐵蛋白。在一些實施例中，結合物包含一或多種本文所述之升糖素類似物及一或多種以下：肽(其不同於本文所述之升糖素及/或GLP-1受體活性升糖素類 似物)、多肽、核酸分子、抗體或其片段、聚合物、量子點、小分子、毒素、診斷劑、碳水化合物、胺基酸。
在一些實施例中，異源部分為不同於本文所述之升糖素及/或GLP-1受體活性類似物之肽且結合物為融合肽或嵌合肽。在一些實施例中，異源部分為1-21個胺基酸之肽延伸。在特定實施例中，延伸係連接於升糖素類似物之C端，例如連接於位置29上之胺基酸。
在一些特定態樣中，延伸為單個胺基酸或二肽。在特定實施例中，延伸包含選自由以下組成之群之胺基酸：帶電荷胺基酸(例如帶負電荷胺基酸(例如Glu)、帶正電荷胺基酸)、包含親水性部分之胺基酸。在一些態樣中，延伸為Gly、Glu、Cys、Gly-Gly、Gly-Glu。
在一些實施例中，延伸包含胺基酸序列SEQ ID NO：9(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：10(GGPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：8(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：11(KRNR)。在特定實施例中，該胺基酸序列係經由升糖素類似物之C端胺基酸，例如位置29上之胺基酸連接。在一些實施例中，胺基酸序列SEQ ID NO：13-16係經由肽鍵結合於升糖素類似物之胺基酸29。在一些特定實施例中，升糖素類似物位置29上之胺基酸為Gly且該Gly融合於胺基酸序列SEQ ID NO：8-11中之一者。
在一些實施例中，異源部分為聚合物。在一些實施例中，聚合物係選自由以下組成之群：聚醯胺、聚碳酸酯、聚伸烷基及其衍生物(包括聚伸烷二醇、聚環氧烷、聚對 苯二甲酸伸烷酯)、丙烯酸酯及甲基丙烯酸酯之聚合物(包括聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸異丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸異癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸異丙酯)、聚(丙烯酸異丁酯)及聚(丙烯酸十八烷酯))、聚乙烯基聚合物(包括聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯基鹵化物、聚(乙酸乙烯酯)及聚乙烯基吡咯啶酮)、聚乙交酯、聚矽氧烷、聚胺基甲酸酯及其共聚物、纖維素(包括烷基纖維素、羥烷基纖維素、纖維素醚、纖維素酯、硝化纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丁基甲基纖維素、乙酸纖維素、丙酸纖維素、乙酸丁酸纖維素、乙酸鄰苯二甲酸纖維素、羧乙基纖維素、三乙酸纖維素及硫酸纖維素鈉鹽)、聚丙烯、聚伸乙基(包括聚(乙二醇)、聚(環氧乙烷)及聚(對苯二甲酸伸乙酯))及聚苯乙烯。
在一些態樣中，聚合物為可生物降解聚合物，包括合成可生物降解聚合物(例如乳酸及乙醇酸之聚合物、聚酸酐、聚(原)酯、聚胺基甲酸酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)及聚(丙交酯-共己內酯))，及天然可生物降解聚合物(例如海藻酸鹽及其他多醣，包括聚葡萄糖及纖維素、膠原蛋白、其化學衍生物(取代、添加化學基團(例如烷基、伸烷基)、羥基化、氧化及熟習此項技術者常規進行之其他修飾)、白蛋白及其他親水性蛋白質(例如玉米蛋白及其他醇溶 穀蛋白(prolamine)及疏水性蛋白質))，以及其任何共聚物或混合物。一般而言，此等物質因酶促水解或活體內暴露於水、因表面或整體侵蝕而降解。
在一些態樣中，聚合物為生物黏附性聚合物，諸如由H.S.Sawhney,C.P.Pathak及J.A.Hubbell於Macromolecules,1993,26,581-587(該文獻之教示內容併入本文中)中描述之生物侵蝕性水凝膠、聚玻糖醛酸、酪蛋白、明膠、麩酪素、聚酸酐、聚丙烯酸、海藻酸鹽、幾丁聚醣、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸異丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸異癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸異丙酯)、聚(丙烯酸異丁酯)及聚(丙烯酸十八烷酯)。
在一些實施例中，聚合物為水溶性聚合物或親水性聚合物。親水性聚合物在本文中進一步描述於「親水性部分」下。適合水溶性聚合物在此項技術中為已知的且包括例如聚乙烯基吡咯啶酮、羥丙基纖維素(HPC；Klucel)、羥丙基甲基纖維素(HPMC；Methocel)、硝化纖維素、羥丙基乙基纖維素、羥丙基丁基纖維素、羥丙基戊基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素(Ethocel)、羥乙基纖維素、各種烷基纖維素及羥烷基纖維素、各種纖維素醚、乙酸纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈣、乙酸乙烯酯/巴豆酸共聚物、聚甲基丙烯酸羥烷基酯、甲基丙烯酸羥甲酯、甲基丙烯酸共聚物、聚甲基丙 烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、順丁烯二酸酐/甲基乙烯基醚共聚物、聚乙烯醇、鈉及鈣聚丙烯酸、聚丙烯酸、酸性羧基聚合物、羧基聚亞甲基、羧基乙烯基聚合物、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、聚甲基乙烯基醚共-順丁烯二酸酐、羧甲基醯胺、甲基丙烯酸鉀二乙烯基苯共聚物、聚氧乙二醇、聚環氧乙烷及其衍生物、鹽及組合物。
在特定實施例中，聚合物為聚烷二醇，包括例如聚乙二醇(PEG)。
在一些實施例中，異源部分為碳水化合物。在一些實施例中，碳水化合物為單醣(例如葡萄糖、半乳糖、果糖)、二醣(例如蔗糖、乳糖、麥芽糖)、寡醣(例如棉籽糖、水蘇糖)、多醣(澱粉、澱粉酶、澱粉果膠、纖維素、幾丁質、愈創聚葡糖、昆布糖、木聚糖、甘露聚糖、岩藻聚糖、半乳甘露聚糖。
在一些實施例中，異源部分為脂質。在一些實施例中，脂質為脂肪酸、二十碳烯酸、前列腺素、白三烯、血栓素、N-醯基乙醇胺、甘油脂質(例如單取代、二取代、三取代甘油)、甘油磷脂(例如磷脂醯膽固醇、磷脂醯肌醇、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸)、神經脂質(例如神經胺醇、神經醯胺)、固醇脂質(例如類固醇、膽固醇)、異戊烯醇脂質、醣脂或聚酮、油、膽固醇、固醇、脂溶性維生素、單甘油酯、二甘油酯、三甘油酯、磷脂。
在一些實施例中，異源部分係經由非共價或共價鍵結連接於本發明之類似物。在某些態樣中，異源部分係經 由連接子連接於本發明之類似物。連接可藉由共價化學鍵、物理力(諸如靜電、氫、離子、範德華或疏水性或親水性相互作用)來實現。可使用多種非共價偶合系統，包括生物素-抗生物素蛋白、配位體/受體、酶/受質、核酸/核酸結合蛋白、脂質/脂質結合蛋白、細胞黏附分子搭配物；或其彼此具有親和力之任何結合搭配物或片段。
在一些實施例中，藉由使類似物之目標胺基酸殘基與能夠與該等目標胺基酸之所選側鏈或N端或C端殘基反應之有機衍生劑反應來使升糖素類似物經由直接共價鍵聯連接於結合物部分。類似物或結合物部分上之反應性基團包括例如醛、胺基、酯、硫醇、α-鹵基乙醯基、順丁烯二醯亞胺基或肼基。衍生劑包括例如順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基磺酸基丁二醯亞胺酯(經由半胱胺酸殘基結合)、N-羥基丁二醯亞胺(經由離胺酸殘基)、戊二醛、丁二酸酐或此項技術中已知之其他試劑。或者，結合物部分可經由中間載體，諸如多醣或多肽載體間接連接於類似物。多醣載體之實例包括胺基聚葡萄糖。適合多肽載體之實例包括聚離胺酸、聚麩胺酸、聚天冬胺酸、其共聚物，及此等胺基酸與其他(例如絲胺酸)之混合聚合物，以對所得負載載體賦予所需溶解度性質。
最通常使半胱胺醯基殘基與α-鹵基乙酸鹽(及相應胺)(諸如氯乙酸、氯乙醯胺)反應以得到羧甲基或羧醯胺基甲基衍生物。半胱胺醯基亦藉由與溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙醯基磷酸酯、N-烷基順丁二醯 亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫醚、甲基2-吡啶基二硫醚、對氯汞基苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑反應而衍生化。
組胺醯基殘基藉由與二乙基焦碳酸酯在pH 5.5-7.0下反應而衍生化，此係因為此試劑對組胺醯基側鏈相對具特異性。對溴苯甲醯甲基溴亦適用；該反應較佳在0.1 M二甲胂酸鈉中在pH 6.0下進行。
離胺醯基及胺基端殘基與丁二酸酐或其他羧酸酐反應。用此等試劑衍生化具有逆轉離胺醯基殘基之電荷的作用。用於衍生化含α-胺基之殘基的其他適合試劑包括醯亞胺酯，諸如甲基吡啶亞胺甲酯、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氫化物、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲、2,4-戊二酮及轉胺酶催化之與乙醛酸酯之反應。
精胺醯基殘基藉由與一種或若干種常規試劑反應而修飾，該等試劑其中有苯基乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-環己二酮及茚三酮。精胺酸殘基之衍生化因為胍官能基之高pKa而需要反應在鹼性條件下進行。此外，此等試劑可與離胺酸之基團以及精胺酸ε-胺基反應。
可進行對酪胺醯基殘基之特定修飾，其中特別關注藉由與芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應將光譜標記引入酪胺醯基殘基中。最通常使用N-乙醯基咪唑及四硝基甲烷來分別形成O-乙醯基酪胺醯基物質及3-硝基衍生物。
羧基側基(天冬胺醯基或麩胺醯基)係藉由與碳化二亞胺(R-N=C=N-R')反應來選擇性修飾，其中R與R'為不同烷 基，諸如1-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮陽離子-4,4-二甲基戊基)碳化二亞胺。此外，天冬胺醯基及麩胺醯基殘基藉由與銨離子反應而轉化為天冬醯胺醯基及麩胺醯胺醯基殘基。
其他修飾包括脯胺酸及離胺酸之羥基化；絲胺醯基或酥胺醯基殘基之羥基之磷酸化；離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基之甲基化(T.E.Creighton,Proteins：Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco，第79-86頁(1983))；天冬醯胺或麩胺醯胺之去醯胺化；N端胺之乙醯化；及/或C端羧酸基團之醯胺化或酯化。
另一類型之共價修飾涉及糖苷與類似物之化學或酶促偶合。糖可連接於(a)精胺酸及組胺酸，(b)遊離羧基，(c)遊離氫硫基，諸如半胱胺酸之遊離氫硫基，(d)遊離羥基，諸如絲胺酸、酥胺酸或羥脯胺酸之遊離羥基，(e)芳族殘基，諸如酪胺酸或色胺酸之芳族殘基，或(f)麩胺醯胺之醯胺基。該等方法描述於1987年9月11日公開之WO87/05330及Aplin及Wriston,CRC Crit.Rev.Biochem.，第259-306頁(1981)中。
在一些實施例中，升糖素類似物經由升糖素類似物胺基酸之側鏈與異源部分之間的共價鍵聯結合於異源部分。在一些實施例中，升糖素類似物經由位置16、17、21、24或29、C端延伸內之位置上之胺基酸或C端胺基酸或該等位置之組合的側鏈結合於異源部分。在一些態 樣中，共價連接於異源部分之胺基酸(例如包含異源部分之胺基酸)為Cys、Lys、Orn、高半胱胺酸或Ac-Phe，且該胺基酸之側鏈共價鍵結於異源部分。
在一些實施例中，結合物包含連接升糖素類似物與異源部分之連接子。在一些態樣中，連接子包含1至約60個原子、或1至30個原子或更長、2至5個原子、2至10個原子、5至10個原子或10至20個原子長之鏈。在一些實施例中，鏈原子全部為碳原子。在一些實施例中，連接子主鏈中之鏈原子係選自由C、O、N及S組成之群。鏈原子及連接子可根據其預期溶解性(親水性)進行選擇以提供更可溶之結合物。在一些實施例中，連接子提供可由目標組織或器官或細胞中存在之酶或其他催化劑或水解條件裂解之官能基。在一些實施例中，連接子之長度足夠長以減少位阻之可能。若連接子為共價鍵或肽鍵且結合物為多肽，則整個結合物可為融合蛋白。該等肽基連接子可為任何長度。示範性連接子長約1至50個胺基酸，長5至50個、3至5個、5至10個、5至15個或10至30個胺基酸。該等融合蛋白可替代地藉由一般技術者已知之重組基因工程改造方法製造。
結合物Fc融合體
如上所述，在一些實施例中，使類似物結合，例如融合於免疫球蛋白或其部分(例如可變區、CDR或Fc區)。已知類型之免疫球蛋白(Ig)包括IgG、IgA、IgE、IgD或IgM。Fc區為Ig重鏈之C端區，其負責結合執行諸如再循環(產 生延長之半衰期)、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)之活性的Fc受體。
舉例而言，根據一些定義，人類IgG重鏈Fc區自Cys226伸展至重鏈之C端。「鉸鏈區」通常自人類IgG1之Glu216延伸至Pro230(其他IgG同型之鉸鏈區可藉由對準半胱胺酸鍵結中所涉及之半胱胺酸而與IgG1序列比對)。IgG之Fc區包括兩個恆定域CH2及CH3。人類IgG Fc區之CH2域通常自胺基酸231延伸至胺基酸341。人類IgG Fc區之CH3域通常自胺基酸342延伸至447。提及免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或區之胺基酸編號均係基於Kabat等人1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Public Health,Bethesda,Md。在一相關實施例中，Fc區可包含一或多個來自免疫球蛋白重鏈之除CH1以外的天然或經修飾之恆定區，例如IgG及IgA之CH2及CH3區，或IgE之CH3及CH4區。
適合結合物部分包括免疫球蛋白序列中包括FcRn結合位點之部分。救助受體FcRn負責免疫球蛋白之再循環及使其返回至血液循環中。IgG之Fc部分中結合FcRn受體之區已基於X射線結晶學進行了描述(Burmeister等人1994,Nature 372：379)。Fc與FcRn之主要接觸區在CH2與CH3之接點附近。Fc-FcRn接觸全部在單一Ig重鏈內。主要接觸位點包括CH2域之胺基酸殘基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311及314以及CH3域之胺基酸殘基385-387、428及433-436。
一些結合物部分可包括或可不包括Fcγ R結合位點。Fcγ R負責ADCC及CDC。Fc區內形成與Fcγ R之直接接觸之位置的實例為胺基酸234-239(下鉸鏈區)、胺基酸265-269(B/C環)、胺基酸297-299(C'/E環)及胺基酸327-332(F/G)環(Sondermann等人，Nature 406：267-273,2000)。亦已發現IgE之下鉸鏈區牽涉於FcRI結合中(Henry等人，Biochemistry 36,15568-15578,1997)。IgA受體結合中涉及之殘基描述於Lewis等人(J lmmunol.175：6694-701,2005)中。IgE受體結合中涉及之胺基酸殘基描述於Sayers等人(J Biol Chem.279(34)：35320-5,2004)中。
可對免疫球蛋白之Fc區進行胺基酸修飾。該等變異型Fc區包含Fc區CH3域(殘基342-447)中之至少一個胺基酸修飾及/或Fc區CH2域(殘基231-341)中之至少一個胺基酸修飾。咸信使對FcRn之親和力增加之突變包括T256A、T307A、E380A及N434A(Shields等人2001,J.Biol.Chem.276：6591)。其他突變可減弱Fc區與Fcγ RI、Fcγ RIIA、Fcγ RIIB及/或Fcγ RIIIA之結合而不顯著減弱對FcRn之親和力。舉例而言，Fc區位置297上之Asn取代為Ala或另一胺基酸移除高度保守之N-糖基化位點且可產生降低免疫原性且同時延長Fc區之半衰期以及減弱與Fcγ R之結合(Routledge等人1995,Transplantation 60：847；Friend等人1999,Transplantation 68：1632；Shields等人1995,J.Biol.Chem.276：6591)。已進行使與 Fcγ R之結合減弱的IgG1位置233-236上之胺基酸修飾(Ward及Ghetie 1995,Therapeutic Immunology 2：77及Armour等人1999,Eur.J.Immunol.29：2613)。一些示範性胺基酸取代描述於美國專利7,355,008及7,381,408中，該等專利各自以全文引用之方式併入本文中。
結合物親水性部分
本文所述之升糖素類似物可經進一步修飾以提高其在水溶液中在生理pH值下之溶解度及穩定性，同時保留相對於天然升糖素之高生物活性。可在用於使蛋白質與活化之聚合物分子反應之任何適合條件下將諸如PEG基團之親水性部分連接於類似物。可使用此項技術中已知之任何方式，包括經由醯化、還原烷基化、邁克爾加成(Michael addition)、硫醇烷基化或經由PEG部分上之反應性基團(例如醛、胺基、酯、硫醇、α-鹵基乙醯基、順丁烯二醯亞胺基或肼基)與目標化合物上之反應性基團(例如醛、胺基、酯、硫醇、α-鹵基乙醯基、順丁烯二醯亞胺基或肼基)的其他化學選擇性結合/連接方法。可用於連接水溶性聚合物與一或多種蛋白質之活化基團包括(但不限於)碸、順丁烯二醯亞胺、氫硫基、硫醇、三氟甲磺酸酯基、三氟乙磺酸酯基、吖丁啶、環氧乙烷、5-吡啶基及α-鹵化醯基(例如α-碘乙酸、α-溴乙酸、α-氯乙酸)。若藉由還原烷基化連接於類似物，則所選聚合物應具有單一還原性醛以使得聚合度受到控制。參見例如Kinstler等人，Adv.Drug.Delivery Rev.54：477-485(2002)； Roberts等人，Adv.Drug Delivery Rev.54：459-476(2002)；及Zalipsky等人，Adv.Drug Delivery Rev.16：157-182(1995)。
在特定態樣中，類似物中具有硫醇之胺基酸殘基經諸如PEG之親水性部分修飾。在一些實施例中，硫醇在邁克爾加成反應中經順丁烯二醯亞胺活化之PEG修飾以產生包含以下所示之硫醚鍵聯的聚乙二醇化類似物：
在一些實施例中，硫醇在親核取代反應中經鹵基乙醯基活化之PEG修飾以產生包含以下所示之硫醚鍵聯的聚乙二醇化類似物：
適合親水性部分包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧乙基化多元醇(例如POG)、聚氧乙基化山梨糖醇、聚氧乙基化葡萄糖、聚氧乙基化甘油(POG)、聚氧伸烷基、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇之共聚物、單甲氧基-聚乙二醇、單(C1-C10)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇、羧甲基纖維素、聚縮醛、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚(β-胺基酸)(均聚物或隨機共聚物)、聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物(PPG)及其他聚環氧烷、聚 環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、結腸酸或其他多醣聚合物、聚蔗糖(Ficoll)或聚葡萄糖及其混合物。聚葡萄糖為葡萄糖次單元之多醣聚合物，主要由α1-6鍵聯連接。聚葡萄糖可以許多分子量範圍獲得，例如約1 kD至約100 kD，或約5、10、15或20 kD至約20、30、40、50、60、70、80或90 kD。涵蓋線性或分支聚合物。所得結合物製劑可基本上為單分散性或多分散性，且每個類似物可具有約0.5、0.7、1、1.2、1.5或2個聚合物部分。
在一些實施例中，升糖素類似物經由升糖素類似物胺基酸之側鏈與親水性部分之間的共價鍵聯結合於親水性部分。在一些實施例中，升糖素類似物經由位置16、17、21、24或29、C端延伸內之位置上之胺基酸或C端胺基酸或該等位置之組合的側鏈結合於親水性部分。在一些態樣中，共價連接於親水性部分之胺基酸(例如包含親水性部分之胺基酸)為Cys、Lys、Orn、高半胱胺酸或Ac-Phe，且該胺基酸之側鏈共價鍵結於親水性部分(例如PEG)。
結合物rPEG
在一些實施例中，本發明之結合物包含融合於能夠形成與化學PEG類似之延伸構形之輔助類似物(例如重組PEG(rPEG)分子)的具有升糖素及/或GLP-1促效劑活性之類似物，該輔助類似物為諸如國際專利申請公開案第WO2009/023270號及美國專利申請公開案第US20080286808號中所述者。在一些態樣中，rPEG分子為包含甘胺酸、絲胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、丙胺酸或 脯胺酸中之一或多者之多肽。在一些態樣中，rPEG為均聚物，例如聚甘胺酸、聚絲胺酸、聚麩胺酸、聚天冬胺酸、聚丙胺酸或聚脯胺酸。在其他實施例中，rPEG包含兩種類型之重複胺基酸，例如聚(Gly-Ser)、聚(Gly-Glu)、聚(Gly-Ala)、聚(Gly-Asp)、聚(Gly-Pro)、聚(Ser-Glu)等。在一些態樣中，rPEG包含三種不同類型之胺基酸，例如聚(Gly-Ser-Glu)。在特定態樣中，rPEG使升糖素及/或GLP-1促效劑類似物之半衰期增加。在一些態樣中，rPEG包含淨正電荷或淨負電荷。在一些態樣中，rPEG缺乏二級結構。在一些實施例中，rPEG之長度大於或等於10個胺基酸，且在一些實施例總，長度為約40至約50個胺基酸。在一些態樣中，輔助肽經由肽鍵或蛋白酶裂解位點融合於本發明類似物之N端或C端，或插入本發明類似物之環中。在一些態樣中，rPEG包含親和力標簽或連接於大於5 kDa之PEG。在一些實施例中，rPEG使本發明之類似物具有增加之流體動力學半徑、血清半衰期、蛋白酶抗性或溶解度，且在一些態樣中使類似物具有降低之免疫原性。
，結合物多聚物
本發明進一步提供本文所揭示類似物之多聚物或二聚物，包括均多聚物、雜多聚物或均二聚物或雜二聚物。兩個或兩個以上類似物可使用熟習此項技術者已知之標準連接劑及程序連接在一起。舉例而言，可經由使用雙官能性硫醇交聯劑及雙官能性胺交聯劑在兩個肽之間形 成二聚物，尤其對於已經半胱胺酸、離胺酸鳥胺酸、高半胱胺酸或乙醯基苯丙胺酸殘基之類似物而言。二聚物可為均二聚物或者可為雜二聚物。在某些實施例中，連接兩個(或兩個以上)類似物之連接子為PEG，例如5 kDaPEG、20kDa PEG。在一些實施例中，連接子為二硫鍵。舉例而言，二聚物之各單體可包含Cys殘基(例如末端或內部定位Cys)且各Cys殘基之硫原子參與二硫鍵之形成。在一些態樣中，單體經由末端胺基酸(例如N端或C端)、經由內部胺基酸或經由至少一個單體之末端胺基酸及至少一個另外之單體之內部胺基酸連接。在特定態樣中，單體不經由N端胺基酸連接。在一些態樣中，多聚物之單體以「尾對尾」方向連接在一起，其中各單體之C端胺基酸連接在一起。
醫藥組合物、用途及套組
鹽
在一些實施例中，升糖素類似物呈鹽形式，例如醫藥學上可接受之鹽。如本文所用，術語「醫藥學上可接受之鹽」係指化合物的保留親本化合物之生物活性且在生物學上或其他方面並無不合需要之鹽。該等鹽可在類似物之最終分離及純化期間原位製備，或藉由使遊離鹼官能基與適合酸反應而單獨製備。本文揭示之許多化合物由於存在胺基及/或羧基或與其類似之基團而能夠形成酸及/或鹼鹽。
醫藥學上可接受之酸加成鹽可由無機及有機酸製備。 代表性酸加成鹽包括(但不限於)乙酸鹽、己二酸鹽、海藻酸鹽、檸檬酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、硫酸氫鈉、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、二葡萄糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、反丁烯二酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙烷磺酸鹽(乙磺酸鹽)、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、甲烷磺酸鹽、菸鹼酸鹽、2-萘磺酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、磷酸鹽、麩胺酸鹽、碳酸氫鹽、對苯磺酸鹽及十一烷酸鹽。衍生自無機酸之鹽包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及其類似物。衍生自有機酸之鹽包括乙酸、三氟乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、丁二酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、杏仁酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、對苯磺酸、水楊酸及其類似物。可用於形成醫藥學上可接受之酸加成鹽之酸的實例包括例如無機酸，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸及磷酸；及有機酸，例如草酸、順丁烯二酸、丁二酸及檸檬酸。
鹼加成鹽亦可在水楊酸來源之最終分離及純化期間原位製備或藉由使含羧酸部分與適合鹼(諸如醫藥學上可接受之金屬陽離子之氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽)或與氨或有機一級、二級或三級胺反應來製備。醫藥學上可接受之鹽包括(但不限於)基於鹼金屬或鹼土金屬之陽離 子，諸如鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽及鋁鹽及其類似物，及無毒四級氨及胺陽離子，包括銨、四甲基銨、四乙基銨、甲基銨、二甲基銨、三甲基銨、三乙基銨、二乙基銨及乙基銨，以及其他。適用於形成鹼加成鹽之其他代表性有機胺包括例如乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪及其類似物。衍生自有機鹼之鹽包括(但不限於)一級胺、二級胺及三級胺之鹽。
此外，含鹼性氮之基團可用本發明之類似物作為低碳烷基鹵化物(諸如甲基、乙基、丙基及丁基之氯化物、溴化物及碘化物)；長鏈鹵化物(諸如癸基、月桂基、肉豆蔻基及硬脂基之氯化物、溴化物及碘化物)；芳烷基鹵化物(如苄基及苯乙基之溴化物)及其他來四級銨化。由此獲得水或油可溶性或可分散性產物。
調配物
根據一些實施例，提供一種醫藥組合物，其中該組合物包含本發明之升糖素類似物或其醫藥學上可接受之鹽及醫藥學上可接受之載劑。醫藥組合物可包含任何醫藥學上可接受之成分，包括例如酸化劑、添加劑、吸附劑、氣霧劑推進劑、空氣置換劑、鹼化劑、防結塊劑、抗凝劑、抗微生物防腐劑、抗氧化劑、殺菌劑、基質、黏合劑、緩衝劑、螯合劑、包衣劑、著色劑、乾燥劑、清潔劑、稀釋劑、消毒劑、崩解劑、分散劑、溶解增強劑、染料、潤膚劑、乳化劑、乳液穩定劑、填充劑、成膜劑、風味增強劑、調味劑、流動增強劑、膠凝劑、造粒劑、 保濕劑、潤滑劑、黏膜黏附劑、軟膏基質、軟膏、油性媒劑、有機基質、糖錠基質、色素、塑化劑、拋光劑、防腐劑、螯隔劑、皮膚滲透劑、增溶劑、溶劑、穩定劑、栓劑基質、表面活性劑、界面活性劑、懸浮劑、甜味劑、治療劑、增稠劑、張力劑、毒性劑、增黏劑、吸水劑、水可混溶共溶劑、水軟化劑或濕潤劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含以下組分中之任一者或其組合：阿拉伯膠、艾斯沙芬鉀(acesulfame potassium)、檸檬酸乙醯三丁酯、檸檬酸乙醯三乙酯、瓊脂、白蛋白、酒精、脫水酒精、變性酒精、稀酒精、油桐酸、海藻酸、脂族聚酯、氧化鋁、氫氧化鋁、硬脂酸鋁、澱粉果膠、α-直鏈澱粉、抗壞血酸、抗壞血酸棕櫚酸酯、阿斯巴甜、注射用抑菌水、膨潤土、膨潤土乳漿、氯苄烷銨、苄索氯銨、苯甲酸、苄醇、苯甲酸苄酯、溴硝丙二醇、丁基羥基甲氧苯、丁基羥基甲苯、羥苯甲酸丁酯、羥苯甲酸丁酯鈉、海藻酸鈣、抗壞血酸鈣、碳酸鈣、環己胺磺酸鈣、無水磷酸氫鈣、脫水磷酸氫鈣、磷酸鈣、丙酸鈣、矽酸鈣、山梨酸鈣、硬脂酸鈣、硫酸鈣、半水合硫酸鈣、菜籽油、卡波姆(carbomer)、二氧化碳、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、β-胡蘿蔔素、角叉菜膠、蓖麻油、氫化蓖麻油、陽離子性乳化蠟、乙酸纖維素、乙酸鄰苯二甲酸纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素、粉狀纖維素、矽酸化微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、鯨蠟硬脂醇、溴化十六基三甲銨、鯨蠟醇、氯己定、氯 丁醇、氯甲酚、膽固醇、乙酸氯己定、葡萄糖酸氯己定、鹽酸氯己定、氯二氟乙烷(HCFC)、氯二氟甲烷、氯氟烴(CFC)氯苯氧基乙醇、氯二甲苯酚、玉米糖漿固體、無水檸檬酸、單水合檸檬酸、可可脂、著色劑、玉米油、棉籽油、甲酚、間甲酚、鄰甲酚、對甲酚、交聯羧甲纖維素鈉、交聯聚維酮、環己胺磺酸、環糊精、葡萄糖結合劑、糊精、右旋糖、無水右旋糖、重氮烷基咪唑脲、鄰苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、二乙醇胺、鄰苯二甲酸二乙酯、二氟乙烷(HFC)、二甲基-β-環糊精、環糊精型化合物(諸如Captisol®)、二甲醚、鄰苯二甲酸二甲酯、乙二胺四乙酸二鉀、乙二胺四乙酸二鈉、磷酸氫二鈉、多庫酯鈣(docusate calcium)、多庫酯鉀、多庫酯鈉、沒食子酸十二烷酯、溴化十二烷基三甲基銨、乙二胺四乙酸鈣二鈉、乙二胺四乙酸、乙葡胺、乙醇、乙基纖維素、沒食子酸乙酯、月桂酸乙酯、乙基麥芽醇、油酸乙酯、羥苯甲酸乙酯、羥苯甲酸乙酯鉀、羥苯甲酸乙酯鈉、乙基香草素、果糖、液體果糖、研磨果糖、無熱原質果糖、粉狀果糖、反丁烯二酸、明膠、葡萄糖、液體葡萄糖、飽和植物脂肪酸之甘油酯混合物、甘油、山崳酸甘油酯、單油酸甘油酯、單硬酯酸甘油酯、自乳化單硬酯酸甘油酯、棕櫚基硬脂酸甘油酯、甘胺酸、二醇、四氫呋喃聚乙二醇醚、瓜爾膠、七氟丙烷(HFC)、溴化十六烷基三甲基銨、高果糖糖漿、人類血清白蛋白、烴(HC)、稀鹽酸、II型氫化植物油、羥乙基纖維素、2-羥乙基-β-環糊精、 羥丙基纖維素、低取代羥丙基纖維素、2-羥丙基-β-環糊精、羥丙基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、咪唑烷脲、靛紅(indigo carmine)、離子交換劑、鐵氧化物、異丙醇、肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、等張生理食鹽水、高嶺土、乳酸、乳糖醇、乳糖、羊毛脂、羊毛脂醇、無水羊毛脂、卵磷脂、矽酸鎂鋁、碳酸鎂、常態碳酸鎂、無水碳酸鎂、鹼式碳酸鎂、氫氧化鎂、月桂基硫酸鎂、氧化鎂、矽酸鎂、硬脂酸鎂、三矽酸鎂、無水三矽酸鎂、蘋果酸、麥芽、麥芽醇、麥芽醇溶液、麥芽糊精、麥芽酚、麥芽糖、甘露糖醇、中鏈三甘油酯、葡甲胺、薄荷腦、甲基纖維素、甲基丙烯酸甲酯、油酸甲酯、羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸甲酯鉀、羥苯甲酸甲酯鈉、微晶纖維素及羧甲基纖維素鈉、礦物油、輕質礦物油、礦物油及羊毛脂醇、油、橄欖油、單乙醇胺、蒙脫土、沒食子酸辛酯、油酸、棕櫚酸、石蠟、花生油、石蠟油、石蠟油及羊毛脂醇、醫藥用釉料、苯酚、液態苯酚、苯氧基乙醇、苯氧基丙醇、苯乙醇、乙酸苯汞、硼酸苯汞、硝酸苯汞、波拉克林(polacrilin)、波拉克林鉀、帕洛沙姆(poloxamer)、聚葡萄糖、聚乙二醇、據環氧乙烷、聚丙烯酸酯、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚甲基丙烯酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、海藻酸鉀、苯甲酸鉀、碳酸氫鉀、硫酸氫鉀、氯化鉀、檸檬酸鉀、無水檸檬酸鉀、 磷酸氫鉀、偏亞硫酸氫鉀、磷酸二氫鉀、丙酸鉀、山梨酸鉀、普維酮、丙醇、丙酸、碳酸丙二酯、丙二醇、丙二醇海藻酸酯、沒食子酸丙酯、羥苯甲酸丙酯、羥苯甲酸丙酯鉀、羥苯甲酸丙酯鈉、硫酸魚精蛋白、菜籽油、林格氏溶液(Ringer's solution)、糖精、糖精銨、糖精鈣、糖精鈉、葵花籽油、皂土、血清蛋白質、芝麻油、膠態矽石、膠態二氧化矽、海藻酸鈉、抗壞血酸鈉、苯甲酸鈉、碳酸氫鈉、亞硫酸氫鈉、氯化鈉、無水檸檬酸鈉、脫水檸檬酸鈉、氯化鈉、環己胺磺酸鈉、乙二胺四乙酸鈉、十二烷基硫酸鈉、月桂基硫酸鈉、偏亞硫酸氫鈉、磷酸鈉、磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉、無水磷酸鈉、丙酸鈉、山梨酸鈉、澱粉乙醇酸鈉、硬脂基反丁烯二酸鈉、亞硫酸鈉、山梨酸、脫水山梨糖醇酯(脫水山梨糖醇脂肪酸酯)、山梨糖醇、70%山梨糖醇溶液、大豆油、鯨蠟、澱粉、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、預膠凝化澱粉、可滅菌玉米澱粉、硬脂酸、純化硬脂酸、硬脂醇、蔗糖、糖、可壓縮糖、調味糖、糖丸、轉化糖、蔗糖-轉化糖聚合物(Sugartab)、日落黃FCF(Sunset Yellow FCF)、合成石蠟、滑石、酒石酸、酒石黃、四氟乙烷(HFC)、可可油、硫柳汞、二氧化鈦、α生育酚、生育酚乙酸酯、酸式琥珀酸α生育酚酯、β-生育酚、δ-生育酚、γ-生育酚、黃芪膠、三乙醯甘油、檸檬酸三丁酯、三乙醇胺、檸檬酸三乙酯、三甲基-β-環糊精、溴化三甲基十四烷銨、tris緩衝液、乙二胺四乙酸三鈉、香草素、I型氫化植物油、水、軟水、硬水、無 二氧化碳水、無熱原質水、注射用水、吸入用無菌水、注射用無菌水、灌洗用無菌水、蠟、陰離子性乳化蠟、棕櫚蠟、陽離子性乳化蠟、鯨蠟酯蠟、微晶蠟、非離子性乳化蠟、栓劑蠟、白蠟、黃蠟、白石蠟油、羊毛脂、三仙膠、木糖醇、玉米蛋白、丙酸鋅、鋅鹽、硬脂酸鋅或以下文獻中之任何賦形劑：Handbook of Pharmaceutical Excipients，第三版，A.H.Kibbe(Pharmaceutical Press,London,UK,2000)，該文獻以全文引用之方式併入本文中。以全文引用之方式併入本文中之Remington's Pharmaceutical Sciences，第十六版，E.W.Martin(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1980)揭示用於調配醫藥學上可接受之組合物之各種組分及其已知製備技術。除非任何習知藥劑與醫藥組合物不相容。否則涵蓋其在醫藥組合物中之使用。補充活性成分亦可併入組合物中。
在一些實施例中，前述組分可以任何濃度(諸如至少A)存在於醫藥組合物中，其中A為0.0001% w/v、0.001% w/v、0.01% w/v、0.1% w/v、1% w/v、2% w/v、5% w/v、10% w/v、20% w/v、30% w/v、40% w/v、50% w/v、60% w/v、70% w/v、80% w/v或90% w/v。在一些實施例中，前述組分可以任何濃度(諸如至多B)存在於醫藥組合物中，其中B為90% w/v、80% w/v、70% w/v、60% w/v、50% w/v、40% w/v、30% w/v、20% w/v、10% w/v、5% w/v、2% w/v、1% w/v、0.1% w/v、0.001% w/v或0.0001%。在 其他實施例中，前述組分可以任何濃度範圍(諸如約A至約B)存在於醫藥組合物中。在一些實施例中，A為0.0001%且B為90%。
醫藥組合物可經調配以達成生理上相容之pH值。在一些實施例中，視調配物及投藥途徑而定，醫藥組合物之pH值可為至少5、至少5.5、至少6、至少6.5、至少7、至少7.5、至少8、至少8.5、至少9、至少9.5、至少10或至少10.5直至且包括pH 11。在某些實施例中，醫藥組合物可包含緩衝劑以達成生理上相容之pH值。緩衝劑可包括能夠在所要pH值下緩衝之任何化合物，諸如磷酸鹽緩衝液(例如)、三乙醇胺、Tris、N,N-二羥乙基甘胺酸、TAPS、N-三(羥甲基)甲基甘胺酸、HEPES、TES、MOPS、PIPES、二甲胂酸鹽、MES及其他。在某些實施例中，緩衝液之強度為至少0.5 mM、至少1 mM、至少5 mM、至少10 mM、至少20 mM、至少30 mM、至少40 mM、至少50 mM、至少60 mM、至少70 mM、至少80 mM、至少90 mM、至少100 mM、至少120 mM、至少150 mM或至少200 mM。在一些實施例中，緩衝液之強度不超過300 mM(例如至多200 mM、至多100 mM、至多90 mM、至多80 mM、至多70 mM、至多60 mM、至多50 mM、至多40 mM、至多30 mM、至多20 mM、至多10 mM、至多5 mM、至多1 mM)。
投藥途徑
以下關於投藥途徑之論述僅提供用於說明示範性實施 例且不應以任何方式解釋為限制範疇。
適於經口投藥之調配物可由以下組成：(a)液體溶液，諸如有效量之本發明類似物溶解於諸如水、生理食鹽水或橙汁之稀釋劑中；(b)膠囊、藥囊、錠劑、口含錠及片劑，各自含有預定量之活性成分，呈固體或顆粒形式；(c)散劑；(d)於適當液體中之懸浮液；及(e)適合乳液。液體調配物可包括稀釋劑，諸如水及醇，例如乙醇、苄醇及聚乙二醇，添加有或未添加醫藥學上可接受之界面活性劑。膠囊形式可為普通硬殼或軟殼明膠型，其含有例如界面活性劑、潤滑劑及惰性填充劑，諸如乳糖、蔗糖、磷酸鈣及玉米澱粉。錠劑形式可包括以下一或多者：乳糖、蔗糖、甘露糖醇、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、海藻酸、微晶纖維素、阿拉伯膠、明膠、瓜爾膠、膠態二氧化矽、交聯羧甲纖維素鈉、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、硬脂酸及其他賦形劑、著色劑、稀釋劑、緩衝劑、崩解劑、濕潤劑、防腐劑、調味劑及其他藥理學上相容之賦形劑。口含錠形式可包含本發明之類似物於調味劑(通常為蔗糖)及阿拉伯膠或黃芪膠中，以及糖錠包含本發明類似物於惰性基質(諸如明膠及甘油)或蔗糖及阿拉伯膠、乳液、凝膠及其類似物中，另外含有諸如此項技術中所已知之賦形劑。
本發明之類似物單獨或與其他適合組分組合可經由肺部投藥來傳遞且可製備成氣霧劑調配以便經由吸入投與。此等氣霧劑調配物可置放於加壓可接受推進劑(諸如 二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣及其類似物)中。其亦可調配成用於非加壓製劑之醫藥劑，諸如於噴霧器或霧化器中。該等噴霧調配物亦可用於噴灑黏膜。在一些實施例中，將類似物調配成粉末摻合物或微粒或奈米粒子。適合肺部調配物在此項技術中為已知的。參見例如Qian等人，Int J Pharm 366：218-220(2009)；Adjei及Garren,Pharmaceutical Research,7(6)：565-569(1990)；Kawashima等人，J Controlled Release 62(1-2)：279-287(1999)；Liu等人，Pharm Res 10(2)：228-232(1993)；國際專利申請公開案第WO 2007/133747號及第WO 2007/141411號。
適於非經腸投藥之調配物包括水性及非水性等張無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使調配物與預定接受者之血液等張的溶質；及水性及非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑。術語「非經腸」意謂不經由消化道，而是藉由一些其他途徑，諸如皮下、肌肉內、脊柱內或靜脈內。本發明之類似物可利用生理上可接受之稀釋劑於醫藥載劑中投與，該醫藥載劑為諸如無菌液體或液體混合物，包括水、生理食鹽水、右旋糖水溶液及相關糖溶液、醇(諸如乙醇或十六烷醇)、二醇(諸如丙二醇或聚乙二醇)、二甲亞碸、甘油、縮酮(諸如2,2-二甲基-l53-二氧戊環-4-甲醇)、醚、聚(乙二醇)400、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯或乙醯化脂肪酸甘油酯，添加有或未添加醫 藥學上可接受之界面活性劑，諸如皂類或清潔劑、懸浮劑(諸如果膠、卡波姆、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或羧甲基纖維素)或乳化劑及其他醫藥佐劑。
可用於非經腸調配物中之油包括石蠟油、動物、植物或合成油。油之特定實例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄欖油、石蠟油及礦物油。用於非經腸調配物中之適合脂肪酸包括油酸、硬脂酸及異硬脂酸。油酸乙酯及肉豆蔻酸異丙酯為適合脂肪酸酯之實例。
適用於非經腸調配物中皂類包括脂肪鹼金屬鹽、銨鹽及三乙醇胺鹽，且適合清潔劑包括(a)陽離子性清潔劑，諸如二甲基二烷基銨鹵化物及烷基吡錠鹵化物，(b)陰離子性清潔劑，諸如磺酸烷酯、芳酯及烯烴酯、硫酸烷酯、烯烴酯、醚酯及單甘油酯、及磺酸基丁二酸酯，(c)非離子性清潔劑，諸如脂肪胺氧化物、脂肪酸烷醇醯胺及聚氧乙烯聚丙烯共聚物，(d)兩性清潔劑，諸如烷基-β-胺基丙酸酯及2-烷基-咪唑啉四級銨鹽，及(e)其混合物。
非經腸調配物可於單位劑量或多劑量密封容器(諸如安瓿及小瓶)中提供，且可儲存於冷凍乾燥(凍乾)條件下，其僅需要在臨使用前添加無菌液體賦形劑，例如注射用水。臨時注射溶液及懸浮液可由此項技術中已知之種類的無菌粉末、顆粒及錠劑製備。
可注射調配物係根據本發明。用於可注射組合物之有效醫藥載劑之要求為一般技術者所熟知(參見例如Pharmaceutics and Pharmacy Practice,J.B.Lippincott Company,Philadelphia,PA,Banker及Chalmers編，第238-250頁(1982)，及ASHP Handbook on Injectable Drugs,Toissel，第4版，第622-630頁(1986))。
另外，本發明之類似物可藉由與多種基質(諸如乳化基質或水溶性基質)混合而製備成用於直腸投藥之栓劑。適於陰道投藥之調配物可提供為子宮托、衛生棉塞、乳膏、凝膠、糊劑、泡沫體或噴霧劑配方，該等調配物除活性成分外亦含有諸如此項技術中已知為適當之載劑。
熟習此項技術者應瞭解，除上述醫藥組合物外，本發明之類似物亦可調配為包涵體複合物，諸如環糊精包涵體複合物，或脂質體。
劑量
咸信本發明之類似物適用於治療升糖素受體促效作用、GLP-1受體促效作用或升糖素受體/GLP-1受體共促效作用起作用之疾病或醫學病狀。出於本發明之目的，所投與本發明類似物之量或劑量應足以在個體或動物體內持續合理時間框實現例如治療或預防反應。舉例而言，本發明類似物之劑量應在自投藥時間開始約1至4分鐘、1至4小時或1至4週或更長，例如5至20週或20週以上之時期內足以刺激cAMP自如本文所述之細胞分泌或足以降低哺乳動物之血糖含量、脂肪含量、食物攝取量或體重。在某些實施例中，時期可甚至更長。劑量將由本發明特定類似物之功效及動物(例如人類)之狀況以及待治療動物(例如人類)之體重決定。
許多用於測定所投與劑量之分析在此項技術中為已知的。出於本文之目的，包含比較在一組各自給予不同劑量類似物之哺乳動物中投與指定劑量之本發明類似物至哺乳動物後血糖含量降低之程度的分析可用於確定投與至哺乳動物之起始劑量。投與某一劑量後血糖含量降低之程度可藉由此項技術中已知之方法來分析，該等方法包括例如如本文實例4中所述之方法。
本發明類似物之劑量亦藉由可能伴隨本發明特定類似物之投與之任何不良副作用的存在、性質及程度來確定。通常，主治醫師將考慮多種因素來決定用於治療各個別患者之本發明類似物之劑量，該等因素為諸如年齡、體重、一般健康狀況、飲食、性別、待投與之本發明類似物、投藥途徑及所治療病狀之嚴重性。舉例而言且不欲限制本發明，本發明類似物之劑量可為每天每公斤所治療個體之體重約0.0001至約1 g，每天每公斤體重約0.0001至約0.001 g，或每天每公斤體重約0.01 mg至約1 g。
在一些實施例中，醫藥組合物包含適於投與患者之純度的本文揭示之任何類似物。在一些實施例中，類似物之純度為至少約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少A之濃度的本發明類似物，其中A為約約0.001 mg/ml、約0.01 mg/ml、0約1 mg/ml、約0.5 mg/ml、 約1 mg/ml、約2 mg/ml、約3 mg/ml、約4 mg/ml、約5 mg/ml、約6 mg/ml、約7 mg/ml、約8 mg/ml、約9 mg/ml、約10 mg/ml、約11 mg/ml、約12 mg/ml、約13 mg/ml、約14 mg/ml、約15 mg/ml、約16 mg/ml、約17 mg/ml、約18 mg/ml、約19 mg/ml、約20 mg/ml、約21 mg/ml、約22 mg/ml、約23 mg/ml、約24 mg/ml、約25 mg/ml或更高。在一些實施例中，醫藥組合物包含至多B之濃度的類似物，其中B為約30 mg/ml、約25 mg/ml、約24 mg/ml、約23,mg/ml、約22 mg/ml、約21 mg/ml、約20 mg/ml、約19 mg/ml、約18 mg/ml、約17 mg/ml、約16 mg/ml、約15 mg/ml、約14 mg/ml、約13 mg/ml、約12 mg/ml、約11 mg/ml、約10 mg/ml、約9 mg/ml、約8 mg/ml、約7 mg/ml、約6 mg/ml、約5 mg/ml、約4 mg/ml、約3 mg/ml、約2 mg/ml、約1 mg/ml或約0.1 mg/ml。在一些實施例中，組合物可含有濃度範圍為A至B mg/ml之類似物，例如約0.001至約30.0 mg/ml。
靶向形式
一般技術者將容易地瞭解，本發明之類似物可以任何數量之方式修飾，以使得本發明類似物之治療或預防功效經由修飾而增加。舉例而言，本發明之類似物可直接或經由連接子間接結合於靶向部分。結合化合物(例如本文所述之升糖素類似物)與靶向部分之實踐在此項技術中為已知的。參見例如Wadhwa等人，J Drug Targeting,3,111-127(1995)及美國專利第5,087,616號。如本文所用 之術語「靶向部分」係指特異性識別及結合細胞表面受體之任何分子或藥劑，以使得靶向部分引導本發明類似物傳遞至表面上表現該受體(升糖素受體、GLP-1受體)之細胞群體。靶向部分包括(但不限於)抗體或其片段、肽、激素、生長因子、細胞激素及結合細胞表面受體(例如上皮生長因子受體(EGFR)、T細胞受體(TCR)、B細胞受體(BCR)、CD28、血小板衍生生長因子受體(PDGF)、菸鹼乙醯膽鹼受體(nAChR)等)之任何其他天然或非天然配位體。如本文所用，「連接子」為使兩個單獨實體彼此結合之分子之鍵、分子或基團。連接子可提供兩個實體之最佳間隔或可進一步供應允許兩個實體彼此隔開之不穩定鍵聯。不穩定鍵聯包括光可裂解基團、酸不穩定性部分、鹼不穩定性部分及酶可裂解基團。在一些實施例中，術語「連接子」係指橋接本發明類似物與靶向部分之任何藥劑或分子。一般技術者認識到，本發明類似物上本發明類似物之功能所不必需之位點為連接連接子及/或靶向部分之理想位點，其限制條件為連接子及/或靶向部分在連接於本發明之類似物後不干擾本發明類似物之功能，亦即刺激cAMP自細胞分泌、治療糖尿病或肥胖症之能力。
控制釋放調配物
或者，本文所述之升糖素類似物可修飾成儲槽形式，以使得本發明類似物釋放至其所投與之身體內之方式關於時間及體內位置為受控的(參見例如美國專利第 4,450,150號)。本發明類似物之儲槽形式可為例如包含本發明類似物及多孔或無孔物質(諸如聚合物)之可植入組合物，其中本發明類似物由該物質囊封或擴散於該物質中及/或由無孔物質之降解而擴散。接著將儲槽植入體內之所要位置，且本發明之類似物以預定速率自植入物釋放。
在某些態樣中，醫藥組合物經修飾以具有任何類型之活體內釋放概況。在一些態樣中，醫藥組合物為即刻釋放、控制釋放、持續釋放、延長釋放、延遲釋放或雙相釋放調配物。調配用於控制釋放之肽的方法在此項技術中為已知的。參見例如Qian等人，J Pharm 374：46-52(2009)及國際專利申請公開案第WO 2008/130158號；第WO2004/033036號；第WO2000/032218號；及第WO 1999/040942號。
本發明可更包含例如微胞或脂質體或一些其他囊封形式，或可以延長釋放形式投與以提供延長之儲存及/或傳遞作用。所揭示之醫藥組合物可根據任何方案投與，該方案包括例如每天(每天1次、每天2次、每天3次、每天4次、每天5次、每天6次)、每兩天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次、每週一次、每兩週一次、每三週一次、每月一次或每兩月一次。
組合
本文所述之升糖素類似物可單獨或與其他旨在治療或預防本文所述之任何疾病或醫學病狀的治療劑組合投 與。舉例而言，本文所述之升糖素類似物可與(同時或依序)抗糖尿病劑或抗肥胖劑共投與。此項技術中已知或正在研究中之抗糖尿病劑包括胰島素、瘦素(leptin)、肽YY(PYY)、胰臟肽(PP)、纖維母細胞生長因子21(FGF21)、Y2Y4受體促效劑、磺醯脲(諸如甲苯磺醯丁脲(tolbutamide)(Orinase)、乙醯苯磺醯環己脲(acetohexamide)(Dymelor)、杜拉唑胺(tolazamide)(Tolinase)、氯磺丙脲(chlorpropamide)(Diabinese)、克吡噻(glipizide)(Glucotrol)、甘布若(glyburide)(Diabeta、Micronase、Glynase)、馬爾胰(glimepiride)(Amaryl)或葛立克拉(gliclazide)(Diamicron)；美格替奈(meglitinide)，諸如利泊格(repaglinide)(Prandin)或替格利尼得(nateglinide)(Starlix)；雙胍(biguanide)，諸如鹽酸二甲二胍(metformin)(Glucophage)或苯乙雙胍(phenformin)；噻唑啶二酮(thiazolidinedione)，諸如羅格列酮(rosiglitazone)(Avandia)、比格列酮(pioglitazone)(Actos)或曲格列酮(troglitazone)(Rezulin)，或其他PPARγ抑制劑；抑制碳水化合物消化之α葡糖苷酶抑制劑，諸如米格列醇(miglitol)(Glyset)、阿卡波糖(acarbose)(Precose/Glucobay)；伊森泰德(exenatide)(Byetta)或普蘭林肽(pramlintide)；二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制劑，諸如維達列汀(vildagliptin)或西他列汀(sitagliptin)；SGLT(鈉依賴性葡萄糖轉運體1)抑制劑； 葡萄糖激酶活化因子(GKA)；升糖素受體拮抗劑(GRA)；或FBPase(果糖1,6-雙磷酸酯酶)抑制劑。
此項技術中已知或正在研究中之抗肥胖劑包括食欲抑制劑，包括苯乙胺型刺激物、苯丁胺(phentermine)(視情況與氯苯丙胺(fenfluramine)或右旋芬氟拉明(dexfenfluramine))、二乙胺苯丙酮(diethylpropion)(Tenuate®)、苯二甲嗎啉(phendimetrazine)(Prelu-2®、Bontril®)、苄非他明(benzphetamine)(Didrex®)、西布曲明(sibutramine)(Meridia®、Reductil®)；利莫那班(rimonabant)(Acomplia®)、其他大麻受體拮抗劑；調酸素(oxyntomodulin)；鹽酸氟希定(fluoxetine hydrochloride)(Prozac)；Qnexa(托吡酯(topiramate)與苯丁胺)、Excalia(安非他酮(bupropion)與唑尼沙胺(zonisamide))或Contrave(安非他酮與納曲酮(naltrexone))；或脂肪酶抑制劑，類似於XENICAL(Orlista)或Cetilistat(亦稱為ATL-962)或GT 389-255。
在一些實施例中，本文所述之肽與用於治療非酒精性脂肪肝病或NASH之藥劑共投與。用於治療非酒精性脂肪肝病之藥劑包括熊去氧膽酸(亦稱為Actigall、URSO及Ursodiol)、二甲二胍(Glucophage)、羅格列酮(Avandia)、氯貝特(Clofibrate)、健菲布旨(Gemfibrozil)、多黏菌素B(Polvmixin B)及甜菜鹼(Betaine)。
在一些實施例中，本文所述之肽與用於治療神經退化 性疾病(例如帕金森氏病(Parkinson’s Disease))之藥劑共投與。此外，抗帕金森氏病劑在此項技術中為已知的且包括(但不限於)左旋多巴(levodopa)、卡比度巴(carbidopa)、抗膽鹼激導性劑、溴隱亭(bromocriptine)、普拉克索(pramipexole)及羅匹尼羅(ropinirole)、金剛烷胺(amantadine)及雷沙吉蘭(rasagiline)。
鑒於前述內容，本發明進一步提供另外包含該等其他治療劑之一者的醫藥組合物及套組。該另外之治療劑可與本發明之類似物同時或依序投與。在一些態樣中，類似物在另外之治療劑之前投與，而在其他態樣中，類似物在另外之治療劑之後投與。
用途
預期本文所述之升糖素類似物及相關醫藥組合物適用於治療疾病或醫學病狀，其中例如缺乏對升糖素受體、GLP-1受體或該兩種受體之活性為該疾病或醫學病狀發作及/或進展之因素。因此，本發明提供治療或預防患者之疾病或醫學病狀的方法，其中該疾病或醫學病狀為缺乏GLP-1受體活化及/或升糖素受體活化與該醫學病狀之疾病之發作及/或進展相關的醫學病狀之疾病。該方法包括向患者提供有效治療或預防疾病或醫學病狀之量的根據本文所述之任何類似物的類似物。
在一些實施例中，疾病或醫學病狀為代謝症候群。代謝症候群(亦稱為代謝症候群X、胰島素抗性症候群或Reaven症候群)為影響超過5千萬美國人之病症。代謝症 候群之特徵通常在於叢集至少三種或三種以上一些風險因素：(1)腹部肥胖(腹部內或周圍脂肪組織過多)、(2)致動脈粥樣硬化血脂異常(血脂障礙，包括高三甘油酯、低HDL膽固醇及高LDL膽固醇，其增強動脈壁中斑塊之積累)、(3)血壓升高、(4)胰島素抗性或葡萄糖不耐、(5)血栓前狀態(例如血液中高纖維蛋白原或纖溶酶原活化因子抑制因子-1)及(6)促發炎狀態(例如血液中C反應性蛋白質升高)。其他風險因素可包括老化、激素失衡及遺傳素因。
代謝症候群與冠心病及與血管斑塊積累相關之其他病症之風險增加相關，該等病症為諸如中風及周邊血管疾病，稱為粥樣動脈硬化心血管病(ASCVD)。患有代謝症候群之患者可自處於早期之胰島素抗性狀態發展成完全成熟之II型糖尿病，且風險進一步增加。不欲受限於任何特定理論，胰島素抗性、代謝症候群及血管疾病之間的關係一或多種共同發病機制，包括胰島素刺激之血管舒張障礙、由氧化應力增強所致之胰島素抗性相關性NO可用性降低，及脂肪細胞衍生之激素(諸如脂聯素(adiponectin))異常(Lteif及Mather,Can.J.Cardiol.20(增刊B)：66B-76B(2004))。
根據2001國家膽固醇教育計劃(2001 National Cholesterol Education Program)成人治療組(Adult Treatment Panel；ATP III)，同一個體中出現任何三種以下性狀符合代謝症候群之標準：(a)腹部肥胖(男性腰圍超 過102 cm及女性腰圍超過88 cm)；(b)血清三甘油酯(150 mg/dl或150 mg/dl以上)；(c)HDL膽固醇(男性40 mg/dl或40 mg/dl以下及女性50 mg/dl或50 mg/dl以下)；(d)血壓(130/85或130/85以上)；及(e)空腹血糖(110 mg/dl或110 mg/dl以上)。根據世界衛生組織(World Health Organization；WHO)，具有高胰島素含量(空腹血糖升高或餐後葡萄糖升高單獨)及至少兩種以下標準之個體符合代謝症候群之標準：(a)腹部肥胖(腰臀比大於0.9、身體質量指數為至少30 kg/m2或腰部量測值超過37吋)；(b)膽固醇試紙顯示三甘油酯含量為至少150 mg/dl或HDL膽固醇低於35 mg/dl；(c)血壓為140/90或140/90以上，或正在治療高血壓)。(Mathur,Ruchi,「Metabolic Syndrome,」Shiel,Jr.編，William C.,MedicineNet.com,2009年5月11日)。
出於本文之目的，若個體符合2001國家膽固醇教育計劃成人治療組或WHO所述之準則中任一者或兩者之準則，則彼個體視為罹患代謝症候群。
不受限於任何特定理論，本文所述之肽適用於治療代謝症候群。因此，本發明提供預防或治療個體之代謝症候群或減少其一種、兩種、三種或三種以上風險因素之方法，其包括向該個體提供有效預防或治療代謝症候群或其風險因素之量的本文所述之類似物。
在一些實施例中，該方法治療高血糖醫學病狀。在某些態樣中，高血糖醫學病狀為糖尿病、I型糖尿病、II型 糖尿病或胰島素依賴性或非胰島素依賴性之妊娠性糖尿病。在一些態樣中，該方法藉由減少糖尿病之一或多種併發症(包括腎病變、視網膜病變及血管疾病)來治療高血糖醫學病狀。
在一些態樣中，疾病或醫學病狀為肥胖症。在一些態樣中，肥胖症為藥物誘發之肥胖症。在一些態樣中，該方法藉由預防或減少體重增加或增加患者之體重減輕來治療肥胖症。在一些態樣中，該方法藉由降低食欲、減少食物攝取、降低患者體內脂肪之含量或降低食物移動穿過胃腸系統之速率來治療肥胖症。
因為肥胖症與其他疾病之發作或進展相關，所以治療肥胖症之方法另外適用於減少與肥胖症相關之併發症之方法中，該等併發症包括血管疾病(冠心病、中風、周邊血管疾病、缺血再灌注等)、高血壓、II型糖尿病發作、高脂血症及肌肉骨骼疾病。本發明因此提供治療或預防該等肥胖症相關性併發症之方法。
在一些實施例中，疾病或醫學病狀為非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。NAFLD係指廣泛範圍之肝臟疾病，範圍自單純脂肪肝(脂肪變性)至非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)至肝硬化(肝臟之不可逆晚期瘢痕形成)。NAFLD之所有病期均共同在肝臟細胞(肝細胞)中具有脂肪累積(脂肪浸潤)。單純脂肪肝為某些類型之脂肪、三甘油酯在肝臟細胞中異常累積但無發炎或瘢痕形成。在NASH中，脂肪累積與不同程度之肝臟發炎(肝炎)及瘢痕形成(纖維化)相關。 發炎性細胞可破壞肝臟細胞(肝細胞壞死)。在術語「脂肪變性肝炎」及「脂肪變性壞死」中，脂肪變性係指脂肪浸潤，肝炎係指肝臟中之發炎，且壞死係指肝臟細胞破壞。NASH可最終導致肝臟瘢痕形成(纖維化)且接著導致不可逆晚期瘢痕形成(肝硬化)。由NASH導致之肝硬化為NAFLD範圍內之最後且最嚴重之病期。(Mendler,Michel,「Fatty Liver：Nonalcoholic Fatty Liver Disease(NAFLD)and Nonalcoholic Steatohepatitis(NASH)」，Schoenfield編，Leslie J.,MedicineNet.com,2005年8月29日)。
酒精性肝病或究竟誘發之肝病涵蓋與酒精過度消費或由酒精過度消費引起的三種發病機制不同之肝病：脂肪肝(脂肪變性)、慢性或急性肝炎及肝硬化。酒精性肝炎之範圍可為輕度肝炎(具有僅指示疾病之實驗室測試異常)至伴有以下併發症之重度肝功能異常，該等併發症為諸如黃疸病(由膽紅素滯留引起之黃色皮膚)、肝性腦病變(由肝衰竭引起之神經功能異常)、腹水(腹部流體累積)、出血性食道靜脈曲張(食道中之靜脈曲張)、凝血異常及昏迷。在組織學上，酒精性肝炎具有伴有肝細胞脹大性退化之特徵性外觀、伴隨嗜中性白血球及有時摩氏體(Mallory body)(細胞中間絲蛋白之異常聚集)之發炎。肝硬化在解剖學上之特徵在於肝臟中與纖維化組合之廣泛結節。(Worman,Howard J.,「Alcoholic Liver Disease」,Columbia University Medical Center網站)。
不受限於任何特定理論，本文所述之類似物適用於治 療酒精性肝病、NAFLD或其任何病期，包括例如肝硬化、脂肪變性肝炎、肝炎、肝臟發炎、NASH、肝硬化或其併發症。因此，本發明提供預防或治療個體之酒精性肝病、NAFLD或其任何病期之方法，其包括向個體提供有效預防或治療酒精性肝病、NAFLD或其任何病期之量的本文所述之類似物。該等治療方法包括減少以下中之一者、兩者、三者或三者以上：肝臟脂肪含量、肝硬化之發生率或進展、肝細胞癌之發生率、發炎徵象，例如異常肝酶含量(例如天冬胺酸轉胺酶AST及/或丙胺酸轉胺酶ALT或LDH)、血清鐵蛋白升高、血清膽紅素升高，及/或纖維化徵象，例如TGF-β含量升高。在較佳實施例中，肽用於治療發展至超過單純脂肪肝(脂肪變性)且顯示發炎或肝炎徵象之患者。該等方法可導致例如AST及/或ALT含量降低。
GLP-1及艾塞那肽-4已顯示具有一些神經保護作用。本發明亦提供本文所述之升糖素類似物在治療神經退化性疾病中之用途，該等神經退化性疾病包括(但不限於)阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、多發性硬化症、肌萎縮性側索硬化、其他脫髓鞘相關病症、老年癡呆症、腦皮質下癡呆、動脈硬化性癡呆、AIDS相關性癡呆或其他癡呆、中樞神經系統癌症、外傷性腦損傷、脊髓損傷、中風或腦缺血、腦血管炎、癲癇、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、妥瑞症侯群(Tourette's syndrome)、古裡安巴瑞症候群 (Guillain Barresyndrome)、威爾森氏病(Wilson disease)、匹克氏病(Pick's disease)、神經發炎性病症、腦炎、病毒、真菌或細菌起源之腦脊髓炎或腦膜炎、或其他中樞神經系統感染、朊病毒疾病、小腦性共濟失調、小腦退化、脊髓小腦退化症候群、弗裡德裡希共濟失調(Friedreichs ataxia)、共濟失調微血管擴張症、脊髓發育不良、進行性核上麻痹、肌張力不全、肌痙攣、震顫、色素性視網膜炎、紋狀體黑質變性、粒線體腦肌病、神經性類蠟脂褐質病、肝性腦病變、腎性腦病變、代謝性腦病變、毒素誘發之腦病變及輻射誘發之腦損傷。
在一些實施例中，疾病或醫學病狀為低血糖症。在一些實施例中，患者為糖尿病患者且低血糖症由投與胰島素誘發。在特定態樣中，方法包括提供本發明類似物與胰島素之組合以使得類似物緩衝快速注射投與胰島素之低血糖作用。
在一些實施例中，升糖素類似物係與在醫院配置中向非糖尿病患者(例如接受非經腸營養或總非經腸營養之患者)非經腸投與營養物結合使用。非限制性實例包括手術患者、昏迷患者、消化道疾病患者或無功能胃腸道(例如由於手術移除、吸收能力阻斷或障礙、克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、胃腸道阻塞、胃腸道瘺、急性胰臟炎、腸缺血、胃腸大手術、某些先天性胃腸道異常、長期腹瀉或由手術導致之短腸症候群、休克患者及經歷癒合過程之患者通常接受非經腸投與碳水化 合物以及脂質、電解質、礦物質、維生素及胺基酸之各種組合。升糖素類似物及非經腸營養組合物可在同時、不同時間、彼此之前或之後投與，其限制條件為升糖素類似物在非經腸營養組合物正在消化時發揮所要生物作用。舉例而言，非經腸營養物可每天投與1次、2次或3次，而升糖素類似物每隔一天一次、每週三次、每週兩次、每週一次、每2週一次、每3週一次或每月一次投與。
如本文所用，術語「治療」及「預防」以及以其為詞幹之用語不必暗含100%或完全治療或預防。相反，存在一般技術者公認為具有潛在效益或治療效果之不同程度的治療或預防。在此方面，本發明之方法可提供任何量之任何程度的對哺乳動物之疾病或醫學病狀的治療或預防。此外，由該方法提供之治療或預防可包括治療或預防該疾病或醫學病狀之一或多種病狀或症狀。舉例而言，關於治療肥胖症之方法，在一些實施例中，該方法達成患者之食物攝取或脂肪含量降低。此外，出於本文之目的，「預防」可涵蓋延遲疾病或其症狀或病狀之發作。
關於上述治療方法，患者為任何宿主。在一些實施例中，宿主為哺乳動物。如本文所用，術語「哺乳動物」係指哺乳綱(mammalia class)之任何脊椎動物，包括(但不限於)單孔類、有袋類及胎盤類中之任一者。在一些實施例中，哺乳動物為嚙齒目(order Rodentia)哺乳動物(諸如小鼠及倉鼠)及兔形目(order Logomorpha)哺乳動物(諸如 兔)中之一者。在某些實施例中，哺乳動物係來自食肉目(order Carnivora)，包括貓科動物(貓)及犬科動物(狗)。在某些實施例中，哺乳動物係來自偶蹄目(order Artiodactyla)(包括牛科動物(奶牛)及豬科動物(豬))或奇蹄目(order Perssodactyla)(包括馬科動物(馬))。在一些情況下，哺乳動物為靈長目(order Primate)、卷尾猴科或猿猴科(猴)或類人猿目(order Anthropoids)(人類及猿)。在特定實施例中，哺乳動物為人類。
套組
根據一個實施例，本發明之升糖素類似物可作為套組之一部分提供。因此，在一些實施例中，提供用於投與升糖素類似物(例如升糖素促效劑肽)至有需要之患者的套組，其中該套組包含如本文所述之升糖素類似物。
在一個實施例中，套組具有用於投與升糖素組合物至患者之裝置，例如注射器針、筆式裝置、噴射注射器或其他無針注射器。套組可替代地或另外包括一或多個容器，例如小瓶、管、瓶、單隔室或多隔室預填充注射器、藥筒、輸注泵(外用或可植入)、噴射注射器、預填充筆式裝置及其類似物，該等容器視情況含有呈凍乾形式或水溶液形式之升糖素類似物。在一些實施例中，套組包含使用說明書。根據一個實施例，套組之裝置為氣霧劑分配裝置，其中組合物預包裝於該氣霧劑裝置內。在另一實施例中，套組包含注射器及針，且在一個實施例中，無菌升糖素組合物預包裝於該注射器內。
給出以下實例僅用於說明本發明且不以任何方式限制其範疇。
實例 實例1
合成升糖素之肽片段
材料：
除非另外規定，否則本文在實例中所述之所有肽均經醯胺化。
MBHA樹脂(在肽合成期間使用4-甲基二苯亞甲基胺聚苯乙烯樹脂。MBHA樹脂，100-180目，1% DVB交聯之聚苯乙烯；負載量0.7-1.0 mmol/g)、經Boc保護及經Fmoc保護之胺基酸係購自Midwest Biotech。在Applied Biosystem 430A肽合成儀上使用經Boc保護之胺基酸執行固相肽合成。使用Applied Biosystems 433型肽合成儀執行經Fmoc保護之胺基酸之合成。
肽合成(Boc胺基酸/HF裂解)：
在Applied Biosystem 430A型肽合成儀上執行此等類似物之合成。藉由依序添加胺基酸至含有2 mmol經Boc保護之胺基酸之濾筒中構建合成肽。特定言之，使用經Boc DEPBT活化之單偶合進行該合成。在偶合步驟結束時，用TFA處理肽基樹脂以移除N端Boc保護基。將其用DMF反復洗滌且對所要數目之偶合步驟重複此重複循環。組裝後，藉由20%哌啶處理移除側鏈保護Fmoc且使用DIC進行醯化。整個合成結束時之肽基樹脂藉由使用 DCM加以脫水，且用無水HF將肽自樹脂裂解。
對於內醯胺化，選擇正交保護基用於Glu及Lys(例如Glu(Fm)、Lys(Fmoc))。移除保護基後且在HF裂解之前，如先前所述執行環化(參見例如國際專利申請公開案第WO2008/101017號)。
肽基樹脂之HF處理
用無水HF處理肽基樹脂，且此舉通常產生約350 mg(約50%產率)脫除保護基之粗肽。特定言之，將肽基樹脂(30 mg至200 mg)置於氟化氫(HF)反應容器中進行裂解。添加500 μL對甲酚至該容器中作為碳陽離子去除劑。將容器接附至HF系統且浸入甲醇/乾冰混合物中。將容器用真空泵抽真空且蒸餾10 ml HF至反應容器中。肽基樹脂與HF之此反應混合物在0℃下攪拌一小時，其後建立真空且將HF快速抽空(10-15 min)。小心移除容器且用約35 ml乙醚填充以使肽沈澱且萃取對甲酚及由HF處理產生之小分子有機保護基。利用鐵氟龍(teflon)過濾器過濾此混合物且重複兩次以移除全部過量甲酚。棄去此濾液。沈澱之肽溶解於約20 ml 10%乙酸(水溶液)中。收集含有所要肽之此濾液且凍乾。
在以下條件下進行溶解之粗肽的分析型HPLC分析[4.6×30 mm Xterra C8，1.50 mL/min，220 nm，A緩衝液0.1% TFA/10% CAN，B緩衝液0.1% TFA/100% CAN，梯度經15分鐘5-95%B]。萃取物用水稀釋兩倍且加載至2.2×25 cm Vydac C4製備型逆相管柱上且在Waters HPLC 系統上使用乙腈梯度溶離(A緩衝液為0.1% TFA/10% CAN，B緩衝液為0.1% TFA/10% CAN且梯度為經120分鐘0-100% B，流速為15.00 ml/min。經純化肽之HPLC分析顯示純度大於95%且使用電噴灑離子化質譜分析來證實肽之身份。
肽醯化
如下製備醯化肽。使用CS Bio 4886肽合成儀或Applied Biosystems 430A肽合成儀在固體支撐樹脂上合成肽。如Schnolzer等人，Int.J.Peptide Protein Res.40：180-193(1992)所述使用原位中和化學。對於醯化肽，將待醯化之目標胺基酸殘基(例如相對於SEQ ID NO：3之胺基酸位置編號之位置10)取代為N ε-FMOC離胺酸殘基。用20%哌啶之DMF溶液處理完成之N端BOC保護肽30分鐘移除FMOC/甲醯基。藉由在DMF/DIEA中偶合10倍莫耳過量經FMOC保護之間隔子胺基酸(例如FMOC-Glu-OtBu)或醯基鏈(例如CH3(CH2)14-COOH)與PyBOP或DEPBT偶合試劑來達成與遊離ε-胺基Lys殘基之偶合。隨後移除間隔子胺基酸之FMOC基團，接著重複與醯基鏈之偶合。最終用100% TFA處理使得任何側鏈保護基及N端BOC基團移除。將肽樹脂用5% DIEA/DMF中和，乾燥，且接著使用HF/對甲酚95：5在0℃下一小時自支撐物裂解。乙醚萃取後，使用5% HOAc溶液來使粗肽溶劑化。接著藉由ESI-MS驗證溶液之樣品含有正確分子量之肽。藉由RP-HPLC使用線性梯度10% CH3CN/0.1% TFA至含0.1% TFA之100% CH3CN來純化正確肽。純化使用Vydac C1822 mm×250 mm蛋白質管柱。醯化肽類似物通常由20：80之緩衝液比率完全溶離。將各部分彙集在一起且在分析型RP-HPLC上檢查純度。凍乾純溶離份產生白色固體肽。
若肽包含內醯胺橋鍵及待醯化之目標殘基，則在將彼胺基酸添加至肽主鏈後如上所述進行醯化。
肽聚乙二醇化
對於肽聚乙二醇化，使40 kDa甲氧基聚(乙二醇)碘乙醯胺(NOF)與莫耳當量之肽於使用使肽與PEG兩者溶解成澄清溶液所需之最少量之溶劑(對於使用2-3 mg肽之反應通常少於2 mL)的7 M尿素、50 mM Tris-HCl緩衝液中反應。在室溫下用力攪拌4-6小時且藉由分析型RP-HPLC對反應進行分析。聚乙二醇化產物因滯留時間減少而表現得與起始物質不同。於Vydac C4管柱上利用與初始肽純化所用類似之條件進行純化。溶離在約50：50之緩衝液比率下進行。發現純聚乙二醇化肽之溶離份且凍乾。產率高於50%，根據反應而不同。
使用質譜之分析
使用具有標準ESI離子源之Sciex API-III電噴灑四極質譜儀獲得質譜。所用離子化條件如下：ESI為正離子模式；離子噴灑電壓3.9 kV；孔口電位60 V。所用霧化氣體及氣簾為流速為.9 L/min之氮氣。質譜以每步0.5 Th及2 msec停留時間自600湯普森(Thompson)記錄至1800湯普森。樣品(約1 mg/mL)溶解於含1%乙酸之50%乙腈水 溶液中且藉由外部注射泵以5 μL/min之速率引入。
當藉由ESI MS在PBS中分析肽時，首先使用含有0.6 μL C4樹脂之ZipTip固相萃取尖端根據製造商提供之說明使其脫鹽(Millipore Corporation,Billerica,MA，參見全球資訊網之Millipore網站millipore.com/catalogue.nsf/docs/C5737)。
高效液相層析(HPLC)分析
使用高效液相層析(HPLC)及MALDI分析於磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)緩衝液(pH 7.2)中用此等粗肽進行初步分析以獲得其相對轉化率之近似值。將粗肽樣品以1 mg/ml之濃度溶解於PBS緩衝液中。1 ml所得溶液儲存於1.5 ml HPLC小瓶中，該小瓶接著密封且於37℃下培育。以不同時間間隔取出100 μl之等分試樣，冷卻至室溫且藉由HPLC進行分析。
使用Beckman系統金層析系統(Beckman System Gold Chromatography system)使用UV偵測器在214 nm下進行HPLC分析。在150 mm×4.6 mm C18 Vydac管柱上進行HPLC分析。流速為1 ml/min。溶液A含有0.1% TFA於蒸餾水中，且溶劑B含有0.1% TFA於90% CH3CN中。採用線性梯度(15分鐘內40%至70%B)。收集資料且使用峰值簡單層析軟體(Peak Simple Chromatography software)進行分析。
水解之初始速率用於量測各別前藥解離之速率常數。前藥及藥物之濃度分別根據其峰面積進行估算。藉由將 前藥在不同時間間隔之濃度之對數繪圖來測定前藥之一階解離速率常數。此圖之斜率給出速率常數『k』。接著藉由使用式t1/2=.693/k來計算各種前藥降解之半衰期。
實例2
合成Seq ID No.17之肽
藉由固相使用Fmoc/t-Bu化學合成肽seq ID no.17。對於製備該肽將0.5 g 2-氯三苯甲基-樹脂(100-200目，1.18 mmol/g)(GL Biochem)首先藉由與0.8當量(eq.)Fmoc-Gln(Trt)-OH、相對於胺基酸4當量之二異丙基乙胺(DIPEA)於無水DCM(二氯甲烷)中一起培育2小時。接著在肽多合成儀APEX396(Advanced Biotech)上進行肽序列組裝。將所有胺基酸以0.5 M濃度溶解於DMF(N,N-二甲基甲醯胺)中。用相對於樹脂遊離胺基6倍過量之活化胺基酸進行醯化反應60分鐘。對於Aib2、Aib16、Asp15、His1進行雙重醯化。胺基酸用等莫耳量之HATU(六氟磷酸2-(1H-7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲陽離子；於DMF中之0.5 M溶液)及2倍莫耳過量之DIEA(N,N-二異丙基乙胺；於NMP(1-甲基-2-吡咯啶酮)中之2 M溶液)活化。
側鏈保護基為：第三丁基用於Asp及Glu、Ser、Thr及Tyr；三苯甲基用於Asn、Gln及His；第三丁氧基-羰基用於Lys、Trp；且2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺醯基用於Arg；在合成中使用Boc-His(Trt)-OH。
待在側鏈上衍生化之位置10上離胺酸以Lys(Alloc)形 式併入。組裝結束時，移除Alloc保護基且藉由使用HBTU(4當量；(六氟磷酸O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲陽離子)及DIPEA(8當量)作為活化劑縮合兩個γ-羧基麩胺酸殘基(4當量)及棕櫚酸(4當量)來完成合成。
合成結束時，用25 mL裂解混合物88%三氟乙酸(TFA)、5%苯酚、2%三異丙基矽烷及5%水在室溫下個別地處理無水肽樹脂2小時。過濾樹脂且縮減溶液體積，接著添加至冷甲基第三丁基醚中以使肽沈澱。離心後，用新鮮冷甲基第三丁基醚洗滌肽離心塊以移除有機去除劑。該過程重複兩次。乾燥最終離心塊，再懸浮於H2O、20%乙腈中且凍乾。
藉由逆相HPLC使用製備型Waters XBridge C18(50×150 mm，5 μm)且使用(A)含0.1% TFA之水及(B)含0.1% TFA之乙腈作為溶離劑對粗肽進行純化。在Waters Chromatograph上用BEH130,C18 Acquity,1.7 μm管柱2.1×100 mm(Waters)在45℃下使用H2O、0.1% TFA(A)及CH3CN、0.1% TFA(B)作為溶劑進行分析型UPLC。經純化之肽藉由電噴灑質譜在Waters SQ偵測器上進行表徵。
實例3
在基於螢火蟲螢光素酶之報導體分析中量測各肽誘導cAMP之能力。所誘導之cAMP產生與升糖素片段與升糖素或GLP-1受體之結合成正比。該生物分析採用經分別升糖素或GLP-1受體與連接於cAMP反應性元件之螢光素酶基因共轉染之HEK293細胞。
細胞藉由在補充有0.25%牛生長血清(HyClone,Logan,UT)之杜貝卡改良最低必需培養基(Dulbecco-modified Minimum Essential Medium)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中培養進行血清剝奪且接著在37℃、5% CO2下於96孔聚D-離胺酸塗佈之「Biocoat」培養盤(BD Biosciences,San Jose,CA)中與升糖素片段之連續稀釋液一起培育5小時。培育結束時，向各孔中添加100 μL LucLite發光受質試劑(Perkin Elmer,Wellesley,MA)。短暫振盪培養盤，在黑暗中培育10分鐘且在MicroBeta-1450液體閃爍計數器(Perkin-Elmer,Wellesley,MA)上量測光輸出。藉由使用Origin軟體(OriginLab,Northampton,MA)計算有效50%濃度(EC50)。
實例4
使用穩定表現人類GLP-1R、GCGR或GIPR之中國倉鼠卵巢細胞(CHO-K1)測定SEQ ID NO.17之肽之活體外促效劑效力。GLP-1R及GCGR穩定細胞系同基因池由InvitrogenTM使用其Jump-InTM靶向整合技術產生，而穩定CHO/GIPR細胞系經由經典選殖及轉染技術(隨機整合)且進行有限稀釋以便選擇純系來產生。使用DiscoveRx HithunterTM cAMP XS+分析套組(目錄號90-0075L)根據套組說明書在活體外測試肽在各種細胞系中刺激cAMP產生之相對能力。藉由非線性回歸分析4參數曲線擬合用GraphPad Prism 4軟體(GraphPad Software,San Diego,CA)藉由將發光值針對肽劑量繪圖來計算肽50%有效濃度 (EC50)。
實例5
基本上如實例1或2中所述製備具有如序列表中所述之胺基酸序列之肽且隨後基本上如實例3或4中所述測試對升糖素受體及GLP-1受體每一者之活體外促效劑活性。在一些情況下，亦測試對GIP受體之活體外促效劑活性。結果展示於下表1中。
使用實例3之程序獲得SEQ ID No.12-16之肽之EC50值。使用實例4之程序獲得SEQ ID NO 17之肽之EC50值。
如表1中所示，許多肽顯示對GLP-1受體之EC50在奈 莫耳濃度或皮莫耳濃度範圍內。
實例6
將飲食誘發性肥胖症(DIO)小鼠分成每組八隻小鼠之多個組，且測定各組之最初平均體重。每天一次向各組之小鼠皮下注射一定劑量之肽或媒劑對照持續一週。此研究中測試之肽為SEQ ID NO：12-16之肽。對於所測試之各肽，所投與之劑量在1 nmol/kg與10 nmol/kg之間變化。在整個測試期中定期測定體重、身體組成、食物攝取及血糖含量。
為更好地測定該等肽對血糖含量之影響，用db/db小鼠進行第二次實驗。在此實驗中，將db/db小鼠分成每組八隻小鼠之多個組，且測定各組之最初平均體重。向各組之小鼠皮下注射單次劑量之SEQ ID NO：12-16中之一者之肽，其中該劑量在3 nmole/kg與30 nmole/kg範圍內。在整個測試期中定期測定體重、身體組成、食物攝取及血糖含量。
實例7
在保持高脂肪飲食16週且具有約47 g之最初體重的飲食誘發性肥胖症(DIO)小鼠中確認本發明之某些肽的活體內作用。每天一次向小鼠投與媒劑對照或一定劑量之肽持續9天。此研究中測試之肽包括SEQ ID NO：12之肽、SEQ ID NO：17之肽、SEQ ID NO：18之肽及SEQ ID NO：19之肽。各肽之劑量不同-SEQ ID NO：12、17及19之各肽以3 nmol/kg或9 nmol/kg之劑量投與，而SEQ ID NO：18 之肽以1 nmol/kg、3 nmol/kg或9 nmol/kg之劑量投與。研究之每天量測累積體重變化(以公克計)且結果展示於第1圖中。資料表示為平均值±SEM。
此研究中測試之各肽顯示體重降低作用。以3 nmol/kg劑量或9 nmol/kg劑量投與肽之各組小鼠在早達研究第1天即顯示體重降低(與媒劑處理小鼠相比較)。在研究第9天，投與3 nmol/kg之SEQ ID NO：12肽之小鼠顯示約5.3%體重降低，而投與9 nmol/kg劑量SEQ ID NO：12肽之小鼠顯示約29.8%體重減輕。在研究第9天，投與3 nmol/kg之SEQ ID NO：17肽之小鼠顯示約9.6%體重降低，而投與9 nmol/kg之SEQ ID NO：17肽之小鼠顯示約35.5%體重減輕。在研究第9天，投與3 nmol/kg之SEQ ID NO：18肽之小鼠顯示約12.3%體重降低，而投與9 nmol/kg之SEQ ID NO：18肽之小鼠顯示約26.8%體重減輕。在此研究第9天，投與3 nmol/kg之SEQ ID NO：19肽之小鼠顯示約8.1%體重降低，而投與9 nmol/kg之SEQ ID NO：19肽之小鼠顯示約31.5%體重減輕。
除累積體重變化外，亦量測DIO小鼠之周圍葡萄糖含量。如第2圖中所示，投與3 nmol/kg或9 nmol/kg劑量SEQ ID NO：18肽之小鼠顯示到第4天周圍葡萄糖顯著降低(相對於媒劑-29%；P<0.05)。給予9 nmol/kg之SEQ ID NO：19肽之小鼠顯示在第4天葡萄糖含量降低約40%(相比於媒劑對照小鼠；P<0.05)、在第7天葡萄糖含量降低約39%(相比於媒劑對照小鼠；P<0.05)及在第9天葡萄糖 含量降低約26%(相比於媒劑對照小鼠；P<0.05)。
給予9 nmol/kg之SEQ ID NO：17肽之小鼠顯示在第4天葡萄糖含量降低約48%(相比於媒劑對照小鼠；P<0.05)、在第9天葡萄糖含量降低約45%(相比於媒劑對照小鼠；P<0.05)。給予3 nmol/kg之SEQ ID NO：17肽之小鼠顯示在第7天葡萄糖含量降低約28%(相比於媒劑對照小鼠；P<0.05)及在第9天葡萄糖含量降低約19%(相比於媒劑對照小鼠；P<0.05)。
實例8
藉由每天一次投與媒劑對照、市售產品(利拉魯肽(Liraglutide))、SEQ ID NO：20之肽或SEQ ID NO：17之肽持續21天在肥胖恆河猴中確認本發明肽之活體內作用。利拉魯肽以20 μg/kg之劑量皮下投與，而SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：20之肽以3 μg/kg之劑量皮下投與。所有肽在恆河猴體內具有類似之藥物動力學(t1/2為約10小時)及類似之血漿蛋白質結合(>98%)。量測體重及食物攝取。
如第3A圖中所示，投與SEQ ID NO：17肽之肥胖猴與利拉魯肽及SEQ ID NO：20之肽相比，顯示更佳之體重減輕(相對於基線及媒劑為-1.2 kg，P<0.05)。
用利拉魯肽(-13.1±1.9%)或用SEQ ID NO：17之肽(-25.7%±3.2%，相對於利拉魯肽P<0.05)治療後觀察到食物攝取顯著減少(第3B圖中表示相對於基線之變化%)。 一週洗脫(wash-out)後，用SEQ ID NO：17之肽治療之動物再次獲得在長期治療期間減輕之大量體重(第28天)。在 第3A圖及3B中，資料表示為平均值±SEM。＊相對於媒劑P<0.05，^SEQ ID NO：17之肽相對於利拉魯肽P<0.05。
實例9
在年齡為16-26歲且具有約22 kg之平均體重的糖尿病恆河猴(n=7)中測試本發明肽之活體內作用。向年齡為16-26歲且平均體重為約22 kg之糖尿病恆河猴(n=7)投與媒劑對照、10 μg/kg皮下劑量之利拉魯肽或1 μg/kg皮下劑量之SEQ ID NO：17肽持續10天。
在研究期間量測體重且發現在治療期期間在該等動物中未觀察到體重影響。
在各治療結束時，首先量測空腹血糖(FBG)，接著進行膳食耐量測試(Meal Tolerance Test；MTT)以評估葡萄糖耐受性。如第4圖中所示，用SEQ ID NO：17肽治療之糖尿病猴顯示FBG顯著降低(120±20 mg/mL相對於158±15 mg/mL，SEQ ID NO：17肽相對於媒劑(-25%)，P<0.05；第4圖)。此外，用SEQ ID NO：17肽治療之猴顯示與媒劑對照猴相比在MTT期間之葡萄糖耐受性提高(第4圖)。資料在第4圖中表示為平均值±SEM。＊相對於媒劑P<0.05。
本文中所引用包括公開案、專利申請案及專利在內之所有參考文獻以引用之方式併入本文中，程度仿佛各參考文獻個別地且明確地指示以引用之方式併入且其全文在本文中闡明一般。
除非本文另外指示或與上下文明顯衝突，否則在描述本發明之上下文中(尤其在以下申請專利範圍之上下文 中)術語「一(a/an)」及「該(the)」及類似指示物之使用視為涵蓋單數及複數。除非另外說明，否則術語「包含」、「具有」、「包括」及「含有」視為開放性術語(亦即意謂「包括(但不限於)」)。
除非本文另外指示，否則本文中引述值之範圍僅欲用作個別地提及屬□該範圍之各個別值及各端點的速記法，且各個別值及端點併入本說明書中仿佛其在本文中個別地引述一般。
除非本文另外指示或以其他方式與上下文明顯衝突，否則本文所述之所有方法可以任何適合次序執行。除非另外聲明，否則本文提供之任何及所有實例或示範性用語(例如「諸如」)之使用僅欲更好地說明本發明且並不對本發明之範疇施加限制。本說明書中之用語均不應視為指示任何未主張之要素為實施本發明所必需。
本文描述本發明之較佳實施例，包括本發明者已知用於實施本發明之最佳模式。一般技術者在閱讀前述描述後可顯而易知彼等較佳實施例之變化。本發明者預期熟習此項技術者適當時採用該等變化，且本發明者預期以與本文明確說明不同之其他方式實施本發明。因此，適用法律允許時，本發明包括此後所附申請專利範圍中引述之標的物的所有修改及等效物。此外，除非本文另外指示或以其他方式與上下文明顯衝突，否則上述要素以其所有可能變化的任何組合由本發明涵蓋。
第1圖呈現用媒劑對照或一定劑量之SEQ ID NO：12、17、18或19之肽處理的DIO小鼠之累積體重變化(公克)之圖，如實例7中所詳述。
第2圖呈現用媒劑對照或一定劑量之SEQ ID NO：12、17、18或19之肽處理的DIO小鼠之基底葡萄糖(mg/dl)之圖，如實例7中所詳述。
第3A圖呈現用媒劑對照、利拉魯肽(Liraglutide；Lira)或一定劑量之SEQ ID NO：17或20之肽處理的肥胖恆河猴之累積體重變化(%)之圖，如實例8中所詳述。
第3B圖呈現用媒劑對照、利拉魯肽或一定劑量之SEQ ID NO：17或20之肽處理的肥胖恆河猴之累積食物攝取(表示為第0天食物攝取之百分比)之圖，如實例8中所詳述。
第4圖呈現用媒劑對照或一定劑量之SEQ ID NO：17之肽處理的糖尿病恆河猴之血糖含量(mg/dL)之圖，如實例9中所詳述。
<110> DiMarchi等人
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<223> GLP-2
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<223> GLP-1(7-37酸)
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<222> (31)..(31)
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<212> PRT
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<222> (2)..(2)
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<223> 經C16脂肪醯基經由γ-Glu間隔子醯化
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 利拉魯肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> 經C16脂肪醯基經由γ-Glu間隔子醯化
<400> 21
<210> 22
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為AIB
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 經C16脂肪醯基經由γ-Glu-γ-Glu間隔子醯化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Xaa為AIB
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28)..(28)
<223> Xaa為Orn
<400> 22

Claims (14)

  1. 一種肽，其包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列或其醫藥學上可接受之鹽。
  2. 如申請專利範圍第1項之肽，其包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列。
  3. 一種肽，其由SEQ ID NO：17之胺基酸序列，或其醫藥學上可接受之鹽所組成。
  4. 如申請專利範圍第3項之肽，其由SEQ ID NO：17之胺基酸序列所組成。
  5. 一種結合物，其包含與異源部分結合之如申請專利範圍第3項之肽，或其醫藥學上可接受之鹽，其中該結合物顯示對GLP-1受體之活性與天然升糖素相比增強，且顯示對該人類GLP-1受體相對於GIP受體至少100倍高之選擇性。
  6. 如申請專利範圍第5項之結合物，其中該異源部分包含以下一或多者：肽、多肽、核酸分子、抗體或其片段、聚合物、量子點、小分子、毒素、診斷劑，或其醫藥學上可接受之鹽。
  7. 如申請專利範圍第6項之結合物，其中該異源部分為肽且該結合物為融合肽或嵌合肽，或其醫藥學上可接受之鹽。
  8. 如申請專利範圍第7項之結合物，其包含該肽之位置31上胺基酸之C端方向上具有1-21個胺基酸之延伸，或 其醫藥學上可接受之鹽。
  9. 如申請專利範圍第8項之結合物，其中該延伸係選自由以下組成之群：Gly、Glu、Cys、Gly-Gly、Gly-Glu、GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：9)或GGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：10)，或其醫藥學上可接受之鹽。
  10. 一種二聚物或多聚物，其包含如申請專利範圍第1至4項中任一項之肽，或其醫藥學上可接受之鹽。
  11. 一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第1至4項中任一項之肽，或其醫藥學上可接受之鹽；如申請專利範圍第5至9項中任一項之結合物，或其醫藥學上可接受之鹽；或其組合，及醫藥學上可接受之載劑。
  12. 如申請專利範圍第11項之醫藥組合物，其包含抗糖尿病劑或抗肥胖劑。
  13. 一種如申請專利範圍第1至4項中任一項之肽，或其醫藥學上可接受之鹽；如申請專利範圍第5至9項中任一項之結合物，或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用於治療疾病或醫學病狀之藥物。
  14. 如申請專利範圍第13項之用途，其中該疾病或醫學病狀係選自由以下組成之群：代謝症候群、糖尿病、肥胖症、肝脂肪變性及神經退化性疾病。
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