ES2579502T3 - Coagonistas de receptores de glucagón/GLP-1 - Google Patents

Coagonistas de receptores de glucagón/GLP-1 Download PDF

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Abstract

Péptido similar a glucagón que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 con (i) un aminoácido en la posición 10 que está acilado con un ácido graso C4 a C30 o está alquilado con un alquilo C4 a C30, y (ii) un ácido aminoisobutírico (AIB) en la posición 16, en el que dicho péptido similar a glucagón muestra una mayor actividad en el receptor de GLP-1 en comparación con el glucagón nativo, en el que dicho péptido similar a glucagón comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 con hasta diez modificaciones de aminoácidos, opcionalmente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 modificaciones de aminoácidos.

Description

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[0029] Por ejemplo, en este documento se proporciona un péptido similar al glucagón no nativo que difiere de SEQ ID NO: 1 por no más de 10 modificaciones de aminoácidos, que comprende un grupo acilo o grupo alquilo, en el que el grupo acilo o alquilo está unido a una espaciador y el espaciador está unido a la cadena lateral de un aminoácido en la posición 10 del péptido similar al glucagón, en el que, cuando dicho péptido similar al glucagón carece de un resto hidrófilo, por ejemplo, PEG, dicho péptido simnilar al glucagón exhibe al menos 20% (por ejemplo, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99%, aproximadamente el 100%, aproximadamente el 150%, aproximadamente el 200%, aproximadamente el 400%, aproximadamente el 500% o más) de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1. En algunas realizaciones, el péptido similar al glucagón presenta al menos 0,5% (por ejemplo, al menos 1%, al menos 2%, al menos 3%, al menos 4%, al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%) de la actividad del glucagón nativo en el receptor de glucagón, cuando el péptido similar al glucagón carece de un resto hidrófilo, por ejemplo, PEG. En algunas realizaciones, los péptidos similares al glucagón descritos anteriormente pueden exhibir cualquiera de las actividades anteriormente indicadas y no más de 1000%, 10000%, 100000%, o 1.000.000% de la actividad de glucagón nativo en el receptor de glucagón. En algunas realizaciones, los péptidos similares a glucagón descritos anteriormente pueden exhibir cualquiera de las actividades anteriormente indicadas y no más de 1000%, 10000%, 100000%, o 1.000.000% de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1.
[0030] La mayor actividad en el receptor de GLP-1 también es proporcionada por una modificación de aminoácidos en la posición 20. En una realización, la glutamina en la posición 20 se sustituye por otro aminoácido hidrófilo que tiene una cadena lateral que está cargada o tiene una capacidad de enlaces de hidrógeno, y tiene al menos aproximadamente 5 (o aproximadamente 4-6) átomos de longitud, por ejemplo, lisina, citrulina, arginina, u ornitina.
[0031] Cualquiera de las modificaciones descritas anteriormente que aumentan o disminuyen la actividad del receptor de glucagón y que aumentan la actividad del receptor de GLP-1 se pueden aplicar de forma individual o en combinación. Las combinaciones de las modificaciones que aumentan la actividad del receptor de GLP-1 pueden proporcionar una mayor actividad de GLP-1 que cualquiera de tales modificaciones tomadas de forma individual. Por ejemplo, se dan a conocer en el presente documento análogos de glucagón que comprenden modificaciones en la posición 16, en la posición 20, y en el grupo de ácido carboxílico C-terminal, opcionalmente con un enlace covalente entre los aminoácidos en las posiciones 16 y 20; análogos de glucagón que comprenden modificaciones en la posición 16 y en el grupo de ácido carboxílico C-terminal; análogos de glucagón que comprenden modificaciones en las posiciones 16 y 20, opcionalmente con un enlace covalente entre los aminoácidos en las posiciones 16 y 20; y análogos de glucagón que comprenden modificaciones en la posición 20 y en el grupo de ácido carboxílico Cterminal; opcionalmente con la condición de que el aminoácido en la posición 12 no es Arg; u opcionalmente con la condición de que el aminoácido en la posición 9 no es Glu.
[0032] Otras modificaciones en la posición 1 o 2, como se describe en el presente documento, pueden aumentar la resistencia del péptido a la escisión por la dipeptidil peptidasa IV (DPP IV). Por ejemplo, el aminoácido en la posición 2 puede estar sustituido por D-serina, D-alanina, valina, glicina, N-metil serina, N-metil alanina, o ácido aminoisobutírico. Alternativamente, o además, el aminoácido en la posición 1 puede estar sustituido por D-histidina, desaminohistidina, hidroxilo-histidina, acetil-histidina, homo-histidina, N-metil histidina, alfa-metil histidina, ácido imidazol acético, o ácido alfa,alfa-dimetil imidiazol acético (DMIA).
[0033] Se observó que las modificaciones en la posición 2 (por ejemplo, AIB en la posición 2) y en algunos casos modificaciones en la posición 1 pueden reducir la actividad de glucagón, a veces de manera significativa; sorprendentemente, esta reducción en la actividad del glucagón puede ser restaurada por la estabilización de la hélice alfa en la porción C-terminal de glucagón, por ejemplo, a través de un enlace covalente entre los aminoácidos en las posiciones "i" y "i + 4", por ejemplo, 12 y 16 , 16 y 20, o 20 y 24. En algunas realizaciones, este enlace covalente es un puente de lactama entre un ácido glutámico en la posición 16 y una lisina en la posición 20. En algunas realizaciones, este enlace covalente es un puente intramolecular diferente a un puente lactama. Por ejemplo, los métodos de unión covalente adecuados incluyen uno cualquiera o más de metátesis de olefinas, ciclación a base de lantionina, puente disulfuro o la formación de puentes que contienen azufre modificados, el uso de grupos ,-diaminoalcano, la formación de puentes de átomos metálicos, y otros medios de ciclación de péptidos.
[0034] Los péptidos similares a glucagón con actividad de GLP-1 que contienen una sustitución no conservadora de His en la posición 1 por un aminoácido grande, aromático (por ejemplo, Tyr) pueden retener la actividad de GLP-1 a condición de que la hélice alfa se estabilice a través de un puente intramolecular, por ejemplo, a través de un enlace covalente entre los aminoácidos en las posiciones "i" e "i + 4", por ejemplo, 12 y 16, 16 y 20, o 20 y 24. En algunas realizaciones, este enlace covalente es un puente lactama entre un ácido glutámico en la posición 16 y una lisina en la posición 20. En algunas realizaciones, este enlace covalente es un puente intramolecular que no es un puente lactama. Por ejemplo, los métodos de unión covalente adecuados incluyen uno cualquiera o más de metátesis de olefinas, ciclación a base de lantionina, puente disulfuro o la formación de puentes que contienen azufre modificados, el uso de grupos ,-diaminoalcano, la formación de puentes de átomos metálicos, y otros medios de ciclación de péptidos.
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posición de aminoácido donde se une un resto hidrófilo, o en una posición de aminoácido diferente. En algunas realizaciones, la invención proporciona un péptido similar al glucagón modificado para comprender un grupo acilo o un grupo alquilo unido covalentemente al aminoácido en la posición 10 del péptido similar al glucagón. El péptido similar al glucagón puede comprender adicionalmente un espaciador entre el aminoácido en la posición 10 del péptido similar al glucagón y el grupo grupo acilo o alquilo. En algunas realizaciones, el grupo acilo es un ácido graso o ácido biliar o sal del mismo, por ejemplo un ácido graso de C4 a C30, un ácido graso de C8 a C24, ácido cólico, un alquilo de C4 a C30, un alquilo de C8 a C24, o un grupo alquilo que comprende un resto esteroide de un ácido biliar. El espaciador es cualquier resto con grupos reactivos adecuados para la unión de grupos acilo o alquilo. En realizaciones de ejemplo, el espaciador comprende un aminoácido, un dipéptido, un tripéptido, un espaciador bifuncional hidrófilo, o un espaciador bifuncional hidrófobo. En algunas realizaciones, el espaciador se selecciona del grupo que consiste en: Trp, Glu, Asp, Cys y un espaciador que comprende NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH, en donde m es cualquier número entero de 1 a 6 y n es cualquier número entero de 2 a 12. Dichos péptidos similares al glucagón acilados o alquilados también pueden comprender además un resto hidrófilo, opcionalmente un polietilenglicol. Cualquiera de los péptidos similares a glucagón anteriores puede comprender dos grupos acilo o dos grupos alquilo, o una combinación de los mismos.
[0041] Por lo tanto, tal como se describe en el presente documento, se proporcionan análogos de glucagón o análogos coagonistas de glucagón de alta potencia que también exhiben una mejor solubilidad y/o estabilidad. Un análogo de glucagón de alta potencia de ejemplo muestra al menos aproximadamente 200% de la actividad del glucagón nativo en el receptor de glucagón, y opcionalmente es soluble a una concentración de al menos 1 mg/ml a un pH entre 6 y 8, o entre 6 y 9 , o entre 7 y 9 (por ejemplo, pH 7), y retiene opcionalmente al menos 95% del péptido original (por ejemplo 5% o menos del péptido original es degradado o eliminado) después de 24 horas a 25ºC. Como otro ejemplo, un análogo coagonista de glucagón de ejemplo muestra más de aproximadamente 40% o más de aproximadamente 60% de actividad, tanto en el receptor de glucagón como en el receptor de GLP-1 (en una relación entre aproximadamente 1:3 y 3:1, o entre aproximadamente 1:2 y 2:1), es opcionalmente soluble a una concentración de al menos 1 mg/ml a un pH entre 6 y 8 o entre 6 y 9, o entre 7 y 9 (por ejemplo, pH 7), y opcionalmente retiene al menos 95% del péptido original después de 24 horas a 25ºC. Otro análogo co-agonista de glucagón de ejemplo muestra aproximadamente 175% o más de la actividad de glucagón nativo en el receptor de glucagón y aproximadamente 20% o menos de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1, es opcionalmente soluble a una concentración de al menos 1 mg/ml a un pH entre 6 y 8 o entre 6 y 9, o entre 7 y 9 (por ejemplo, pH 7), y retiene opcionalmente al menos 95% del péptido original después de 24 horas a 25ºC. Aún otro análogo co-agonista de glucagón de ejemplo muestra aproximadamente 10% o menos de la actividad de glucagón nativo en el receptor de glucagón y al menos aproximadamente 20% de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1, es opcionalmente soluble en una concentración de al menos 1 mg/ml a un pH entre 6 y 8 o entre 6 y 9, o entre 7 y 9 (por ejemplo, pH 7), y retiene opcionalmente al menos 95% del péptido original después de 24 horas a 25ºC. Aún otro análogo co-agonista de glucagón de ejemplo muestra aproximadamente 10% o menos, pero por encima de 0,1%, 0,5% o 1% de la actividad de glucagón nativo en el receptor de glucagón y al menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% o más de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP1, es opcionalmente soluble a una concentración de al menos 1 mg/ml a un pH entre 6 y 8 o entre 6 y 9, o entre 7 y 9 (por ejemplo, pH 7), y, opcionalmente, retiene al menos 95% del péptido original después de 24 horas a 25ºC. En algunas realizaciones, los péptidos similares a glucagón exhiben no más de aproximadamente 100%, 1000%, 10000%, 100000%, o 1.000.000% de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1. En algunas realizaciones, tales análogos de glucagón retienen al menos 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 de los aminoácidos de origen natural en las posiciones correspondientes en el glucagón nativo (por ejemplo, tienen 1-7, 1-5 o 1-3 modificaciones relativas al glucagón de origen natural).
[0042] Cualquiera de los siguientes péptidos se excluye de los compuestos de la invención, aunque cualquiera de los siguientes péptidos que comprenden una o más modificaciones en los mismos como se describen en el presente documento, que presentan la actividad de GLP-1 o coagonista deseada, composiciones farmacéuticas, kits, y métodos de tratamiento que utilizan estos compuestos, pueden ser incluidos en la descripción: el péptido de SEQ ID NO: 1 con una sustitución [Arg12] y con una amida C-terminal; El péptido de SEQ ID NO: 1 con sustituciones [Arg12, Lys20] y con una amida C-terminal; El péptido de SEQ ID NO: 1 con sustituciones [Arg12, Lys24] y con una amida C-terminal; El péptido de SEQ ID NO: 1 con sustituciones [Arg12, Lys29] y con una amida C-terminal; El péptido de SEQ ID NO: 1 con una sustitución [Glu9]; El péptido de SEQ ID NO: 1 que carece de His1, con sustituciones [Glu9, Glu16, Lys29] y amida C-terminal; El péptido de SEQ ID NO: 1 con sustituciones [Glu9, Glu16, Lys29] y con una amida C-terminal; El péptido de SEQ ID NO: 1 con sustituciones [Lys13, Glu17] unidas a través de puente de lactama y con una amida C-terminal; El péptido de SEQ ID NO: 1 con sustituciones [Lys17, Glu21] unidas a través de puente de lactama y con una amida C-terminal; El péptido de SEQ ID NO: 1 que carece de His1 con sustituciones [Glu20, Lys24] unidas a través de puente de lactama.
[0043] Según una realización, se proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los nuevos péptidos similares a glucagón descritos en este documento, preferiblemente estéril y preferiblemente a un nivel de pureza de al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98% o 99%, y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden contener un péptido similar al glucagón en una concentración de al menos A, en donde A es 0,001 mg/ml, 0,01 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml,
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[0044] Según una realización, se proporciona un método para aumentar rápidamente el nivel de glucosa o el tratamiento de la hipoglucemia usando una composición acuosa preformulada de péptidos similares a glucagón. El método comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una solución acuosa que comprende un nuevo péptido similar a glucagón modificadode la presente descripción. En una realización, el péptido similar al glucagón se pegila en la posición 21 o 24 del péptido similar al glucagón y la cadena de PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 500 a aproximadamente 5000 Daltons. En una realización, la solución de glucagón modificado se preenvasa en un dispositivo que se utiliza para administrar la composición al paciente que sufre de hipoglucemia.
[0045] Según una realización se proporciona un método mejorado para regular los niveles de glucosa en sangre en pacientes dependientes de insulina. El método comprende las etapas de administrar insulina en una cantidad terapéuticamente eficaz para el control de la diabetes y administrar un nuevo péptido similar al glucagón modificado de la presente descripción en una cantidad terapéuticamente eficaz para la prevención de la hipoglucemia, en el que dichas etapas de administración se llevan a cabo en menos de doce horas una de la otra. En una realización el péptido similar al glucagón y la insulina se coadministran como una sola composición, en el que el péptido similar al glucagón se pegila con una cadena de PEG que tiene un peso molecular seleccionado entre el intervalo de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 40.000 Daltons
[0046] En otra realización, se proporciona un método para inducir la parálisis temporal del tracto intestinal. El método comprende la etapa de administrar uno o más de los péptidos similares al glucagón descritos en este documento a un paciente.
[0047] El síndrome metabólico, también conocido como síndrome metabólico X, síndrome de resistencia a la insulina
o síndrome de Reaven, es un trastorno que afecta a más de 50 millones de estadounidenses. El síndrome metabólico se caracteriza típicamente por una agrupación de al menos tres o más de los siguientes factores de riesgo: (1) la obesidad abdominal (tejido graso excesivo en y alrededor del abdomen), (2) la dislipidemia aterogénica (trastornos de grasa en la sangre incluyendo niveles altos de triglicéridos, bajo colesterol HDL y alto colesterol que aumentan la acumulación de placa en las paredes de las arterias), (3) la presión arterial elevada, (4) resistencia a la insulina o intolerancia a la glucosa, (5) estado protrombótico (por ejemplo, alto fibrinógeno o inhibidor-1 del activador de plasminógeno en sangre), y (6) estado proinflamatorio (por ejemplo, la proteína C reactiva elevada en la sangre). Otros factores de riesgo pueden incluir el envejecimiento, desequilibrio hormonal y la predisposición genética.
[0048] El síndrome metabólico se asocia con un aumento en el riesgo de enfermedad coronaria y otros trastornos relacionados con la acumulación de placa vascular, tal como un accidente cerebrovascular y enfermedad vascular periférica, que se refiere como enfermedades cardiovascular aterosclerótica (ASCVD). Los pacientes con síndrome metabólico pueden pasar de un estado de resistencia a la insulina en sus primeras etapas a diabetes de tipo II total con mayor riesgo de ASCVD. Sin pretender estar ligado por ninguna teoría en particular, la relación entre la resistencia a la insulina, el síndrome metabólico y la enfermedad vascular puede implicar uno o más mecanismos patogénicos simultáneos, incluyendo alteración de la vasodilatación estimulada por la insulina, la reducción asociada con la resistencia a la insulina en la disponibilidad de NO debido al aumento del estrés oxidativo, y anormalidades en las hormonas derivada de adipocitos, tales como la adiponectina (Lteif y Mather, Can J. Cardiol 20 (supl B): 66B-76B (2004)).
[0049] Según el Panel de Tratamiento de Adultos del Programa de Educación de Colesterol Nacional (ATP III) del 2001, cualquiera de tres de las siguientes características en el mismo individuo cumplen los criterios de síndrome metabólico: (a) la obesidad abdominal (circunferencia de cintura de más de 102 cm en los hombres y más de 88 cm en las mujeres); (b) los triglicéridos séricos (150 mg/dl o superior); (c) el colesterol HDL (40 mg/dl o más bajo en los hombres y 50 mg/dl o menor en las mujeres); (d) la presión arterial (130/85 o más); y (e) de glucosa en sangre en ayunas (110 mg/dl o superior). Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), un individuo que tiene niveles altos de insulina (una glucemia en ayunas elevada o una glucosa sola después de comida) con al menos dos de los siguientes criterios cumple con los criterios de síndrome metabólico: (a) la obesidad abdominal (relación cintura a cadera superior a 0,9, un índice de masa corporal de al menos 30 kg/m2, o una medida de cintura de más de 37 pulgadas); (b) panel de colesterol que muestra un nivel de triglicéridos de al menos 150 mg/dl o un colesterol HDL
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La figura 2 representa los datos generados a partir de análisis de HPLC de glucagón Cys21maleimidoPEG5K a pH 5 incubado a 37ºC durante 24, 72 o 144 horas, respectivamente. La figura 3 representa los datos que muestran la inducción de AMPc mediada por el receptor por análogos de glucagón. Más particularmente, la figura 3A compara la inducción del receptor de glucagón por análogos de glucagón E16, K20 , E15, E16 ▲, E16, K20 ▼, E15, E16 ◄, E16 ► y gluc-NH2 ■ Las figuras 4A y 4B representan los datos que muestran la inducción de AMPc mediada por el receptor por análogos de glucagón. Más particularmente, la figura 4A compara la inducción del receptor de glucagón por análogos de glucagón gluc-NH2 , E16Gluc-NH2 ▲, E3, E16 gluc-NH2 , Orn3, E16 gluc-NH2 ◄ y Nle3, E16 gluc-NH2 ► con respecto al glucagón nativo ■, mientras que la figura 4B compara la inducción del receptor de GLP-1 por los análogos de glucagón Gluc-NH2 , E16 Gluc-NH2 ▲, E3, E16Gluc-NH2 , Orn3, E16 Gluc -NH2 ◄ y Nle3, E16 Gluc-NH2 ► con respecto al GLP-1 nativo■. Las figuras 5A y 5B representan los datos que muestran la inducción de AMPc mediada por el receptor por análogos de glucagón. Más particularmente, la figura 5A compara la inducción del receptor de glucagón por análogos de glucagón (E16, K20 Gluc-NH 2  (5 nM, solución madre), E15, E16 Gluc-NH2 ▲ (5 nM, solución madre), E16, K20 Gluc-NH2 ▼ (10 nM, solución madre), E15, E16 Gluc-NH2 [◄] (10 nM, solución madre) y E16 Gluc-NH2 ► con relación al glucagón-NH2 ([■]), mientras que la figura 5B compara la inducción del receptor de GLP-1 por los análogos de glucagón (E16, K20 Gluc-NH2 2 , E15, E16 Gluc-NH2 A y E16 Gluc-NH2, ► relativos de GLP-1 (■) y glucagón-NH2 (). Las figuras 6A y 6B representan los datos que muestran la inducción de AMPc mediada por el receptor por análogos de glucagón. Más particularmente, la figura 6A compara la inducción del receptor de glucagón por análogos de glucagón (Gluc-NH2 , K12E16-NH2 lactama A, E16K20-NH2 lactama ▼, K20E24-NH2 lactama ◄ y E24K28-NH2 lactama ►) con respecto al glucagón (■), mientras que la figura 6B compara la inducción del receptor de GLP-1 por los análogos de glucagón (Gluc-NH2 , K12E16-NH2 lactama ▲, E16K20-NH2 lactama ▼, K20E24-NH2 lactamas ◄ y E24K28-NH2 lactama ►) en relación con GLP-1 (■). Las figuras 7A y 7B representan los datos que muestran la inducción de AMPc mediada por el receptor por análogos de glucagón. Más particularmente, la figura 7A compara la inducción del receptor de glucagón por análogos de glucagón (Gluc-NH2 , E16 Gluc-NH2, A, K12, E16 Gluc-NH2 lactama ▼, E16, K20 Gluc-NH2◄ y E16, K20 Gluc-NH2 lactama ►) con respecto al glucagón (■), mientras que la figura 7B compara la inducción del receptor de GLP-1 por los análogos de glucagón (Gluc-NH2 , E16 Gluc-NH2, ▲, K12, E16 Gluc-NH2 lactama ▼, E16, K20 Gluc-NH2 ◄ y E16, K20 Gluc-NH2 lactama ►) en relación con el GLP-1 (■). Las figuras 8A-8F representan los datos que muestran la inducción de AMPc de AMPc mediada por el receptor por análogos de glucagón en el receptor de glucagón (figuras 8A, 8C y 8E) o el receptor de GLP-1 (figuras 8B, 8C y 8F) en el que hE = ácido homoglutámico y hC = ácido homocisteico. Las figura 9A y 9B representan los datos que muestran la inducción de AMPc mediada por el receptor por análogos de glucagón GLP (17 a 26), en los que las posiciones de aminoácidos 17 a 26 de glucagón nativo (SEQ ID NO: 1) se han sustituido por los aminoácidos de las posiciones 17-26 de GLP-1 nativo (SEQ ID NO: 50). Más particularmente, la figura 9A compara la inducción del receptor de glucagón por los análogos de glucagón GLP (17 a 26) designados y la figura 9B compara la inducción del receptor de GLP-1 por los análogos de glucagón GLP (17 a 26) designados. Las figuras 10A-E son gráficos que proporcionan datos in vivo que demuestran la capacidad de los péptidos similares al glucagón de la presente invención para inducir la pérdida de peso en ratones inyectados por vía subcutánea con las cantidades indicadas de los respectivos compuestos. Los identificadores de secuencia para el péptido similar al glucagón que aparece en las figuras 10A -10E son los siguientes, para la figura 10A: Quimera 2 Aib2 C24 PEG de 40K (SEQ ID NO: 486), Aib2 C24 Quimera 2 40K lactama (SEQ ID NO: 504) y Aib2 E16 K20 Gluc-NH2 Lac 40K (SEQ ID NO: 528); figura 10B: Aib2 C24 Chi 2 lactama 40K (SEQ ID NO: 504), DMIA1 C24 Qui 2 lactama 40K (SEQ ID NO: 505), quimera 2 DMIA1 C24 40K (SEQ ID NO: 519), y quimera 2 Aib2 C24 40K ( SEQ ID NO: 486), en el que el número al final de la secuencia designa la dosis utilizada, ya sea 70 o 350 nmol/kg; figura 10C: AIB2 con lactama C24 40K (SEQ ID NO: 504), AIB2 E16 K20 con lactama C24 40K (SEQ ID NO: 528), DMIA1 E16 K20 con lactama C24 40K (SEQ ID NO: 510), DMIA1 E16 K20 con lactama CEX 40K (SEQ ID NO: 513) y DMIA1 E16 K20 sin lactama CEX 40K (SEQ ID NO: 529); figura 10D: AIB2 con lactama C24 40K (SEQ ID NO: 504), AIB2 E16 K20 con lactama C24 40K (SEQ ID NO: 528), DMIA1 E16 K20 con lactama C24 40K (SEQ ID NO: 510) y DMIA1 E16 K20 con lactama/Cex C24 40K (SEQ ID NO: 513), en el que el número al final de la secuencia designa la dosis utilizada, ya sea 14 o 70 nmol/kg/semana; figura 10E: AIB2 sin lactama C24 40K (SEQ ID NO: 486), Qui 2 AIB2 C24 CEX 40K (SEQ ID NO: 533), AIB2 E16 A18 K20 C24 40K (SEQ ID NO: 492), AIB2 sin lactama CEX G29 C40 40K (SEQ ID NO: 488), AIB2 sin lactama CEX C40 C41-2 (SEQ ID NO: 532), AIB2 sin lactama CEX C24 C40 2 (SEQ ID NO: 531) y AIB2 sin lactama C24 60K (SEQ ID NO: 498), en el que la designación de 40K o 60K representa el peso molecular de la cadena de polietileno unida al péptido similar al glucagón. Las figuras 11 a 13 son gráficos que proporcionan datos in vivo que demuestran la capacidad de los péptidos similares a glucagón acilados para inducir la pérdida de peso (Figura 11), reducir la ingesta de alimentos (Figura 12), y reducir los niveles de glucosa en sangre (Figura 13) en ratones inyectados por vía subcutánea con las cantidades indicadas de los compuestos. Las Figuras 14A y 14B representan datos que muestran la inducción de AMPc mediada por receptor de glucagón y GLP-1, respectivamente, por análogos de glucagón. La Figura 15 representa un gráfico de glucosa en la sangre (mg/dl) en función del tiempo (minutos) en ratones DIO tratados con 2 nmol/kg de vehículo solamente (triángulos), Quimera-2 AIB2, K10-C8 Cys24-40kD PEG (cuadrados en
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blanco), o una quimera-2 AIB2, K10-C16 Cys24-40kD PEG (triángulos invertidos), seguido de estimulación con glucosa 15 minutos después de la administración del péptido. La Figura 16 representa un gráfico de glucosa en la sangre (mg/dl) en función del tiempo (minutos) en ratones DIO tratados con 20 nmol/kg de vehículo solamente (triángulos), Quimera-2 AIB2, K10-C8 Cys24-40kD PEG (cuadrados en blanco), o una quimera-2 AIB2, K10-C16 Cys24-40kD PEG (triángulos invertidos), seguido de estimulación con glucosa 15 minutos después de la administración del péptido. La Figura 17 representa un gráfico de glucosa en la sangre (mg/dl) en función del tiempo (minutos) en ratones DIO tratados con 70 nmol/kg de vehículo solamente (triángulos invertidos), Quimera-2 AIB2, K10-C8 Cys24-40kD PEG (triángulos en blanco), quimera-2 AIB2, K10-C16 Cys24-40kD PEG (diamantes), o quimera 2-AIB2, Cys24-40kD PEG (cuadrados abiertos), seguido de estimulación con glucosa 15 minutos después de la administración del péptido. La Figura 18 representa un gráfico de glucosa en la sangre (mg/dl) en función del tiempo (minutos) en ratones DIO tratados con 70 nmol/kg de vehículo solamente (triángulos invertidos), Quimera-2 AIB2, K10-C8 Cys24-40kD PEG (triángulos en blanco), quimera-2 AIB2, K10-C16 Cys24-40kD PEG (diamantes), o quimera 2-AIB2, Cys24-40kD PEG (cuadrados abiertos), seguido de estimulación con glucosa 24 horas después de la administración del péptido. La Figura 19 representa un gráfico del cambio en el peso corporal (%) en función del tiempo (días) en ratones DIO tratados con 15 o 70 nmol/kg de vehículo solamente (diamantes con línea continua); Quimera-2 AIB2, Cys24-40kD PEG (15 nmol/kg, diamantes en blanco con línea de puntos; 70 nmol/kg, triángulos en blanco con línea continua); Quimera-2 AIB2, K10-C8 Cys24-40kD PEG (15 nmol/kg, triángulo sólido con línea de puntos; 70 nmol/kg, triángulo sólido con línea continua); Quimera-2 AIB2, K10-C16 Cys24-40kD PEG (15 nmol/kg, triángulo invertido con línea de puntos; 70 nmol/kg; triángulo invertido con línea continua). La Figura 20 representa un gráfico del cambio total en el peso corporal (%) en ratones 14 días después de las inyecciones QW de 10, 20, 40, o 80 nmol/kg de péptido A K10 –C14 o 20 nmol/kg Quimera-2 AIB2 K10-C8 Cys24-40kD
o un vehículo de control La Figura 21 representa un gráfico de los niveles de glucosa en sangre (mg/dl) en respuesta a una inyección de glucosa de los ratones inyectados con 10, 20, 40, o 80 nmol/kg de péptido AK10-C14 o 20 nmol/kg Quimera -2 AIB2 K10 -C8 Cys24-40kD o un vehículo de control 24 horas antes de la inyección de glucosa. La Figura 22 representa un gráfico del cambio total en el peso corporal (%) de los ratones inyectados con el control del vehículo, liraglutida, (C16) glucagón amida, E-E-C16 glucagón amida, AA-C16 glucagón amida, o AA-C16 glucagón amida en la dosis indicada. La Figura 23 representa un gráfico de la masa de grasa (g), medida en el día 7 del estudio de los ratones inyectados con el control del vehículo, liraglutida, (C16) glucagón amida, E-E-C16 glucagón amida, AA-C16 glucagón amida, o AA-C16 glucagón amida en la dosis indicada. La Figura 24 representa un gráfico del cambio de la glucosa en sangre (mg/dl; niveles del día 7 menos niveles del Día 0) de los ratones inyectados con el control del vehículo, liraglutida, (C16) glucagón amida, E-E-C16 glucagón amida, AA-C16 glucagón amida, o AA-C16 glucagón amida en la dosis indicada. La Figura 25 representa un gráfico de la elipticidad de residuos promedio en función de longitud de onda (nm) para el péptido X-PEG o péptido Y-PEG en fosfato 10 mM (pH 5,9) con o sin TFE al 10%. La Figura 26 representa un gráfico del % AMPc producido en respuesta a la unión de glucagón, GLP-1, péptido X, péptido X-PEG, péptido Y, o péptido Y-PEG a receptor de glucagón (izquierda) o receptor de GLP-1 (derecha) en función de la concentración de péptido (nM). La figura 27 representa una colección de gráficos que demuestran los efectos in vivo sobre A) el peso corporal, B) masa grasa, C) ingesta de alimentos, y D) niveles de glucosa en sangre en ayuno en ratones obesos tratados inducidos por dieta durante una semana con el control del vehículo, Péptido X-PEG, o péptido Y-PEG. Más específicamente, la figura 27A representa un gráfico del % de cambio en el peso corporal (BW) en función del tiempo (días), la figura 27B representa un gráfico del % de cambio en la masa grasa medida en el día 7 (en comparación con las mediciones iniciales de masa grasa), la Figura 27C representa un gráfico de la ingesta total de alimentos (g) durante el transcurso del estudio, medida en el día 7, y la figura 27D representa un gráfico del cambio de la glucosa en sangre (mg/dL) medidad en el día 7 (en comparación con los niveles iniciales de glucosa en sangre). La Figura 28 representa una colección de gráficos que demuestran los efectos in vivo sobre el peso corporal (Figuras 28A y 28C) y niveles de glucosa en sangre en ayuno (Figuras 28B y 28D) en ratones tratados con el péptido X-PEG (Figuras 28A y 28B) o péptido Y-PEG (Figuras 28C y 28D) a dosis variables (nmol/kg/semana). La figura 29 representa una colección de gráficos que muestran los efectos in vivo en A) peso corporal (BW), B) masa grasa corporal, C) ingesta global de alimentos, D) gasto de energía, E) cociente respiratorio, F) actividad locomotora, G) glucemia en sangre en ayunas, H) tolerancia a la glucosa, y I) los niveles totales de insulina en plasma en ratones obesos inducidos por la dieta tratados durante un mes con un vehículo de control, péptido X-PEG, o péptido Y-PEG. La Figura 30 representa una colección de gráficos que muestran los efectos in vivo en la semana 3 en mediciones colorimétricas de A) ingesta de alimentos, b) gasto total de energía, C) cociente respiratorio total, D) actividad locomotora, E) actividad total locomotora, F) área bajo la curva IPGTT, G) niveles plasmáticos de péptido C, H) expresión de pliegue de PEPCK/HPRT, e I) niveles de expresión del pliegue de G6P/HPRT ratones obesos inducidos por la dieta tratados durante un mes con un vehículo de control, péptido X-PEG, o péptido Y-PEG. La Figura 31 representa una colección de gráficos que muestran los efectos in vivo en plasma de A) colesterol, B) colesterol FPLC, C) triglicéridos, D) leptina, E) resistina, y F) de adiponectina en ratones obesos inducidos por la dieta tratados durante un mes con un vehículo de control, péptido X-PEG, o péptido Y-PEG.
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La Figura 32 representa una colección de gráficos que muestran los efectos in vivo sobre A) niveles de expresión de BAT UCP-1 y B) tejido adiposo blanco reflejado por la fosforilación de la lipasa sensible a hormona (pHSL) en ratones tratados con un vehículo de control, péptido X-PEG, o péptido Y-PEG. La Figura 33 representa una colección de gráficos que muestran los efectos in vivo de un vehículo de control, péptido X-PEG, o péptido Y-PEG en ratas DIO sobre A) el peso corporal y B) la masa de grasa. La Figura 33C representa un gráfico de la expresión relativa de CD68 con respecto a TFIIB evaluada cuantitativamente mediante RT-PCR a tiempo real en tejido adiposo epidiimal aislado de ratones tratados durante dos semanas con el péptido Y-PEG, péptido X-PEG, o vehículo. Los datos se presentan como la expresión relativa de ARNm de CD68 normalizada para la expresión de ARNm de TF1IB y expresado como media ± SEM. Las figuras 34A a 34F representan una colección de gráficos que muestran los efectos in vivo sobre el peso corporal (BW; 34A y 34B), masa grasa (34C), ingesta de alimentos (34D), y los niveles de glucosa en sangre (34E y 34F) en ratones knocked-out de GLP-1-R tratados con un vehículo de control, péptido X-PEG, o péptido y-PEG. Las figuras 35A a 35C representan una serie de gráficos que muestran los efectos in vivo sobre el peso corporal (35A), glucosa en sangre (35B), y la masa grasa (35C) en ratones DIO tratados con vehículo de control, péptido V, o péptido U.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0063] La presente invención se refiere a un péptido similar al glucagón según se define en el conjunto de reivindicaciones. La presente invención también se refiere a un conjugado, dímero o péptido de fusión que comprende un péptido similar al glucagón según se define en el conjunto de reivindicaciones. La presente invención se refiere además a una composición farmacéutica según se define en el conjunto de reivindicaciones. La presente invención se refiere además a un péptido similar al glucagón para el uso en el tratamiento de la diabetes
o la reducción del aumento de peso o la inducción de la pérdida de peso según se define en el conjunto de reivindicaciones.
DEFINICIONES
[0064] Al describir y reivindicar la invención, se utilizará la siguiente terminología según las definiciones establecidas a continuación.
[0065] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándar, tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones, tales como una emulsión de aceite/agua o agua/aceite y diversos tipos de agentes humectantes. El término también abarca cualquiera de los agentes aprobados por una agencia reguladora del gobierno federal de los EE.UU. o listados en la Farmacopea de los EE.UU. para su uso en animales, incluyendo seres humanos.
[0066] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales de compuestos que retienen la actividad biológica del compuesto parental, y que no son biológicamente o de otra manera indeseables. Muchos de los compuestos descritos en este documento son capaces de formar sales ácidas y/o básicas debido a la presencia de grupos amino y/o carboxilo o grupos similares a los mismos.
[0067] Las sales de adición de base farmacéuticamente aceptables se pueden preparar a partir de bases inorgánicas y orgánicas. Las sales derivadas de bases inorgánicas, incluyen, a modo de ejemplo solamente, sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio y magnesio. Las sales derivadas de bases orgánicas incluyen, pero sin limitación, sales de aminas primarlas, secundarias y terciarias.
[0068] Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables pueden prepararse a partir de ácidos inorgánicos y orgánicos. Las sales derivadas de ácidos inorgánicos incluyen ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, y similares. Las sales derivadas de ácidos orgánicos incluyen ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido plrúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-tolueno-sulfónico, ácido salicílico, y similares.
[0069] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "tratamiento" incluye la profilaxis del trastorno o afección específica, o alivio de los síntomas asociados con un trastorno o afección específica y/o prevención o eliminación de dichos síntomas. Por ejemplo, tal como se utiliza en el presente documento, el término “tratamiento de la diabetes” se referirá en general a la alteración de los niveles de glucosa en sangre en la dirección de los niveles normales y puede incluir aumentar o disminuir los niveles de glucosa en sangre dependiendo de una situación determinada.
[0070] Tal como se utiliza en el presente documento, una cantidad "eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un péptido de glucagón se refiere a una cantidad no tóxica pero suficiente del péptido para proporcionar el efecto deseado. Por ejemplo, un efecto deseado sería la prevención o el tratamiento de la hipoglucemia, tal como se mide,
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por ejemplo, por un aumento en el nivel de glucosa en sangre. Un efecto deseado alternativo para los péptidos de glucagón de la presente descripción incluiría el tratamiento de la hiperglucemia, por ejemplo, medida por un cambio en el nivel de glucosa en sangre cerca de lo normal, o la inducción de la pérdida de peso/prevención del aumento de peso, por ejemplo, medidos por la reducción en el peso corporal o prevenir o reducir un aumento en el peso corporal, o normalización de la distribución de grasa corporal. La cantidad que es "eficaz" variará de un sujeto a otro, dependiendo de la edad y el estado general de la persona, el modo de administración, y similares. Por lo tanto, no siempre es posible especificar una "cantidad eficaz" exacta. Sin embargo, una cantidad "eficaz" apropiada en cualquier caso individual puede ser determinada por un experto normal en la técnica usando experimentación de rutina.
[0071] El término "parenteral" significa no a través del canal alimentario, sino por alguna otra ruta, tal como subcutánea, intramuscular, intraespinal, o intravenosa.
[0072] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "purificado" y términos similares se refieren al aislamiento de una molécula o compuesto en una forma que está sustancialmente libre de contaminantes normalmente asociados con la molécula o compuesto en un medio nativo o natural. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "purificado" no requiere pureza absoluta; más bien, se pretende como una definición relativa. El término "polipéptido purificado" se utiliza aquí para describir un polipéptido que se ha separado de otros compuestos incluyendo, pero no limitado a, moléculas de ácidos nucleicos, lípidos e hidratos de carbono.
[0073] El término "aislado" requiere que el material de referencia se extraiga de su medio original (por ejemplo, el medio natural si es de origen natural). Por ejemplo, un polinucleótido de origen natural presente en un animal vivo no se aisla, pero el mismo polinucleótido, separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado.
[0074] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "péptido" abarca una secuencia de 3 o más aminoácidos y típicamente menos de 50 aminoácidos, en el que los aminoácidos son aminoácidos de origen natural
o no natural. Los aminoácidos de origen no natural se refieren a aminoácidos que no se producen naturalmente in vivo pero que, sin embargo, se pueden incorporar en las estructuras peptídicas descritas aquí.
[0075] Tal como se utiliza en el presente documento, los términos "polipéptido" y "proteína" son términos que se utilizan indistintamente para referirse a un polímero de aminoácidos, sin tener en cuenta la longitud del polímero. Típicamente, polipéptidos y las proteínas tienen una longitud de polímero que es mayor que la de "péptidos".
[0076] Un "péptido similar al glucagón" tal como se utiliza en el presente documento, incluye cualquier péptido que comprende, ya sea la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, o cualquier análogo de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, incluyendo sustituciones, adiciones, deleciones o modificaciones después de la traducción de aminoácidos (por ejemplo, metilación, acilación, alquilación, ubiquitinación, enlace covalente intramolecular, tal como la formación de puente de lactama, PEGilación, y similares) del péptido, donde el análogo estimula la actividad del receptor de glucagón o GLP-1, por ejemplo, medida por la producción de AMPc utilizando el ensayo descrito en el Ejemplo 14.
[0077] El término "agonista de glucagón" se refiere a un complejo que comprende un péptido similar al glucagón que estimula la actividad del receptor de glucagón, por ejemplo, medida por la producción de AMPc utilizando el ensayo descrito en el Ejemplo 14.
[0078] Tal como se usa en el presente documento un "análogo de agonista de glucagón" es un péptido similar al glucagón que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15, o un análogo de una secuencia de tal manera que se ha modificado para incluir una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos en una o más de las posiciones 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13 , 14, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 o 29.
[0079] Tal como se utiliza en el presente documento una "modificación" de aminoácido se refiere a una sustitución, adición o deleción de un aminoácido, e incluye la sustitución con o adición de cualquiera de los 20 aminoácidos que se encuentran comúnmente en las proteínas humanas, así como aminoácidos atípicos o no naturales. A lo largo de la solicitud, todas las referencias a una posición de aminoácido particular por número (por ejemplo, posición 28) se refieren al aminoácido en esa posición en el glucagón nativo (SEQ ID NO: 1) o la posición de aminoácido correspondiente en cualquiera de los análogos del mismo. Por ejemplo, una referencia en este documento a "posición 28" significaría la posición correspondiente 27 para un análogo de glucagón en la que el primer aminoácido de SEQ ID NO: 1 ha sido eliminado. Del mismo modo, una referencia en este documento a "posición 28" significaría la posición correspondiente 29 para un análogo de glucagón en el cual un aminoácido ha sido añadido antes del extremo N-terminal de SEQ ID NO: 1. Las fuentes comerciales de aminoácidos atípicos incluyen Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), ChemPep Inc. (Miami, FL) y Genzyme Pharmaceuticals (Cambridge, MA). Los aminoácidos atípicos se pueden comprar de proveedores comerciales, sintetizarse de novo, o modificarse o derivarse químicamente de otros aminoácidos.
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[0080] Tal como se usa en el presente documento un "coagonista de glucagón" es un péptido similar al glucagón que presenta actividad en el receptor de glucagón de al menos aproximadamente 10% a aproximadamente 500% o más con respecto al glucagón nativo y también exhibe actividad en el receptor de GLP-1 de aproximadamente al menos 10% a aproximadamente 200% o más con respecto al GLP-1 nativo.
[0081] Tal como se usa en el presente documento una "molécula coagonista de glucagón/GLP-1" es una molécula que presenta actividad en el receptor de glucagón de al menos aproximadamente 10% con respecto al glucagón nativo y también exhibe actividad en el receptor de GLP-1 de al menos aproximadamente 10% con respecto al GLP1 nativo.
[0082] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "glucagón nativo" se refiere a un péptido que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 1, y el término "GLP-1 nativo" es un término genérico que designa GLP-1 (7-36) amida (que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 52), GLP-1 (7-37) ácido (que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 50) o una mezcla de estos dos compuestos. Tal como se usa en este documento, una referencia general a "glucagon" o "GLP-1" en ausencia de cualquier designación adicional se pretende que signifique glucagón nativo o GLP-1 nativo, respectivamente.
[0083] Tal como se utiliza en el presente documento, una "sustitución" de aminoácido se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido diferente.
[0084] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sustitución conservadora de aminoácidos" se define aquí como los intercambios dentro de uno de los siguientes cinco grupos:
I. Residuos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;
II. Residuos polares cargados negativamente y sus amidas: Asp, Asn, Glu, Gln;
III. Residuos polares cargados positivamente: His, Arg, Lys; Ornitina (Orn)
IV.
Residuos alifáticos grandes, no polares: Met, Leu, lie, Val, Cys, norleucina (Nle), homocisteína
V.
Residuos aromáticos grandes: Phe, Tyr, Trp, acetil fenilalanina
[0085] Tal como se utiliza en el presente documento, el término general "cadena de polietilenglicol" o "cadena de PEG", se refiere a mezclas de polímeros de condensación de óxido de etileno y agua, en una cadena ramificada o lineal, representada por la fórmula general H(OCH2CH2)nOH, en la que n es al menos 9. En ausencia de cualquier caracterización adicional, el término pretende incluir polímeros de etilenglicol con un peso molecular total promedio seleccionado en el intervalo de 500 a 40.000 Daltons. "Cadena de polietilenglicol" o "cadena de PEG" se utiliza en combinación con un sufijo numérico para indicar el peso molecular promedio aproximado de los mismos. Por ejemplo, PEG-5000 se refiere a polietilenglicol que tiene un peso molecular promedio total de aproximadamente 5000.
[0086] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "pegilado" y términos similares se refieren a un compuesto que ha sido modificado de su estado nativo mediante la unión de una cadena de polietilenglicol al compuesto. Un "análogo de glucagón pegilado" es un análogo de glucagón que tiene una cadena de PEG unida covalentemente al análogo de glucagón.
[0087] Tal como se utiliza en el presente documento, una referencia general a un péptido pretende abarcar péptidos que tienen los extremos amino y carboxilo modificados. Por ejemplo, una cadena de aminoácidos que comprende un grupo amida en lugar del ácido carboxílico terminal pretende estar abarcado por una secuencia de aminoácidos que designa los aminoácidos estándar.
[0088] Tal como se utiliza en el presente documento, un "enlazador" es un enlace, molécula o grupo de moléculas que une dos entidades separadas entre sí. Los enlazadores pueden proporcionar el espaciado óptimo de las dos entidades, o pueden suministrar adicionalmente un enlace lábil que permite que las dos entidades estén separadas entre sí. Los enlaces lábiles incluyen grupos fotoescindibles, grupos lábiles a ácidos, grupos lábiles a bases y grupos escindibles por enzimas.
[0089] Tal como se utiliza en el presente documento, un "dímero" es un complejo que comprende dos subunidades unidas covalentemente entre sí a través de un enlazador. El término dímero, cuando se utiliza en ausencia de cualquier calificador, abarca tanto homodímeros como heterodímeros. Un homodímero comprende dos subunidades idénticas, mientras que un heterodímero comprende dos subunidades que difieren, aunque las dos subunidades son sustancialmente similares entre sí.
[0090] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "ácido amino cargado" se refiere a un aminoácido que comprende una cadena lateral que está cargada negativamente (es decir, desprotonada) o cargada
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[0104] Un aumento más modesto de la potencia de GLP-1 se proporciona modificando el aminoácido en la posición 10 para ser Trp.
[0105] Cualquiera de las modificaciones descritas anteriormente que aumentan o disminuyen la actividad del receptor de glucagón y que aumentan la actividad del receptor de GLP-1 se pueden aplicar de forma individual o en combinación. Cualquiera de las modificaciones descritas anteriormente también se puede combinar con otras modificaciones que confieren otras propiedades deseables, tales como aumento de la solubilidad y/o estabilidad y/o duración de la acción. Alternativamente, cualquiera de las modificaciones descritas anteriormente se puede combinar con otras modificaciones que no afectan sustancialmente a la solubilidad o estabilidad o actividad. Modificaciones de ejemplo incluyen, pero no se limitan a:
(A)
mejora de la solubilidad, por ejemplo, mediante la introducción de uno, dos, tres o más aminoácidos cargados a la porción C-terminal de glucagón nativo, preferiblemente en una posición C-terminal a la posición 27. Dicho aminoácido cargado se puede introducir mediante la sustitución de un aminoácido nativo por un aminoácido cargado, por ejemplo, en las posiciones 28 ó 29, o alternativamente mediante la adición de un aminoácido cargado, por ejemplo, después de la posición 27, 28 o 29. En realizaciones de ejemplo, uno, dos, tres o todos los aminoácidos cargados están cargados negativamente. En otras realizaciones, uno, dos, tres o todos los aminoácidos cargados están cargados positivamente. Tales modificaciones aumentan la solubilidad, por ejemplo, proporcionan al menos 2 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 25 veces, 30 veces o más solubilidad relativa al glucagón nativo a un pH determinado entre aproximadamente 5,5 y 8, por ejemplo, pH 7, cuando se mide después de 24 horas a 25ºC.
(B)
aumento de la solubilidad y la duración de la acción o la vida media en circulación mediante la adición de un resto hidrófilo, tal como una cadena de polietilenglicol, tal como se describe en el presente documento, por ejemplo en la posición 16, 17, 20, 21, 24 o 29, o en el aminoácido C-terminal del péptido.
(C)
Aumento, mediante la modificación del ácido aspártico en la posición 15, por ejemplo, por deleción o sustitución con ácido glutámico, ácido homoglutámico, ácido cisteico o ácido homocisteico. Tales modificaciones pueden reducir la degradación o la escisión en un pH dentro del intervalo de 5,5 a 8, por ejemplo, reteniendo al menos 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% del péptido original después de 24 horas a 25ºC.
(D)
aumento de la estabilidad por modificación de la metionina en la posición 27, por ejemplo, por sustitución por leucina o norleucina. Tales modificaciones pueden reducir la degradación oxidativa. La estabilidad también se puede aumentar mediante modificación de la Gln en la posición 20 o 24, por ejemplo, por sustitución por Ala, Ser, Thr, o AIB. Tales modificaciones pueden reducir la degradación que se produce a través de la desamidación de Gln. La estabilidad puede aumentarse mediante la modificación de Asp en la posición 21, por ejemplo, por sustitución por Glu. Tales modificaciones pueden reducir la degradación que se produce a través de la deshidratación de Asp para formar una succinimida cíclica intermedio seguido de isomerización a iso-aspartato.
(E)
aumento de la resistencia a la dipeptidil peptidasa IV (DPP IV) por modificación del aminoácido en la posición 1 o 2 tal como se describe en este documento.
(F)
sustituciones adiciones o deleciones conservadoras o no conservadoras, que no afectan a la actividad, por ejemplo, sustituciones conservadoras en una o más de las posiciones 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 o 29; deleciones en una o más de las posiciones 27, 28 o 29; o una deleción del aminoácido 29 combinada opcionalmente con una amida o éster C-terminal en lugar del grupo ácido carboxílico C-terminal;
(G)
adición de extensiones C-terminal tal como se describe en el presente documento;
(H)
aumento de la vida media en circulación y/o extensión de la duración de la acción y/o retraso del inicio de la acción, por ejemplo, a través de la acilación o alquilación del péptido similar al glucagón, tal como se describe en este documento o;
(I)
homodimerización o heterodimerización tal como se describe en el presente documento.
[0106] En realizaciones de ejemplo, el péptido similar al glucagón puede comprender un total de 1, hasta 2, hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 6, hasta 7, hasta 8, hasta 9, o hasta 10 modificaciones de aminoácido con respecto a la secuencia de glucagón nativo.
[0107] Otras modificaciones incluyen la sustitución de His en la posición 1 por un aminoácido grande, aromático (por ejemplo, Tyr, Phe, Trp o amino-Phe); Ser en la posición 2 por Ala; sustitución de Tyr en la posición 10 por Val o Phe ; sustitución de Lys en la posición 12 por Arg; sustitución de Asp en la posición 15 por Glu; sustitución de Ser en la posición 16 por Thr o AIB.
[0108] Una realización descrita en este documento se refiere a un agonista de glucagón que se ha modificado con respecto al péptido de tipo salvaje de His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (SEQ ID NO: 1) para mejorar la potencia del péptido en el receptor de glucagón. Sorprendentemente, los solicitantes han descubierto que la serina que normalmente se encuentra en la posición 16 del glucagón nativo (SEQ ID NO: 1) se puede sustituir por ciertos aminoácidos ácidos para mejorar la potencia de glucagón, en términos de su capacidad para estimular la síntesis de AMPc en un modelo de ensayo in vitro validado (véase el ejemplo 14). Más particularmente, esta sustitución mejora la potencia del análogo al menos 2 veces, 4 veces, 5 veces, y hasta 10 veces más en el receptor de glucagón. Esta sustitución también mejora la
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mediante la alineación de las cisteínas implicadas en la unión a cisteína). La región Fc de una IgG incluye dos dominios constantes, CH2 y CH3. El dominio CH2 de una región Fc de IgG humana normalmente se extiende desde el aminoácido 231 hasta el aminoácido 341. El dominio CH3 de una región Fc de IgG humana normalmente se extiende entre los aminoácidos 342 a 447. Las referencias a la numeración de amino ácidos de inmunoglobulinas o fragmentos de inmunoglobulina, o regiones, se basan todas en Kabat et al. 1991, Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico, Departamento de Salud Pública, Bethesda, MD. En realizaciones relacionadas, la región Fc puede comprender una o más regiones constantes modificadas o nativas de una cadena pesada de inmunoglobulina, diferente de CH1, por ejemplo, las regiones CH2 y CH3 de IgG e IgA, o las regiones CH3 y CH4 de IgE.
[0129] Los grupos de conjugado adecuados incluyen partes de secuencia de inmunoglobulina que incluyen el sitio de unión a FcRn. El FcRn, un receptor de salvamento, es responsable del reciclaje de inmunoglobulinas y su retorno a la circulación en la sangre. La región de la parte Fc de IgG que se une al receptor FcRn se ha descrito basándose en cristalografía de rayos X (Burmeister et al 1994, Nature 372:. 379). El área de contacto principal de la Fc con el FcRn está cerca de la unión de los dominios CH2 y CH3. Los contactos Fc-FcRn están todos dentro de una sola cadena pesada de Ig. Los sitios de contacto principales incluyen los residuos de aminoácidos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311, y 314 del dominio CH2 y los residuos de aminoácidos 385-387, 428, y 433-436 del dominio CH3.
[0130] Algunos grupos de conjugado pueden incluir o no un sitio o sitios de unión a FcR. FcR son responsables de ADCC y CDC. Los ejemplos de posiciones dentro de la región Fc que realizan un contacto directo con FcR son los aminoácidos 234-239 (región bisagra inferior), los aminoácidos 265-269 (bucle B/C), los aminoácidos 297-299 (bucle C’/E), y los aminoácidos 327-332 (bucle F/G) (Sondermann et al., Nature 406:. 267-273, 2000). La región bisagra inferior de IgE también se ha implicado en la unión a FcRI (Henry, et al., Biochemistry 36, 15568 a 15578, 1997). Los residuos implicados en la unión al receptor de IgA se describen en Lewis et al., (J Immunol. 175: 6694-701, 2005). Los residuos de aminoácidos implicados en la unión al receptor de IgE se describen en Sayers et al. (J Biol Chem. 279 (34): 35320-5, 2004).
[0131] Las modificaciones de aminoácidos pueden realizarse en la región Fc de una inmunoglobulina. Dichas regiones Fc variantes comprenden al menos una modificación de aminoácidos en el dominio CH3 de la región Fc (residuos 342-447) y/o al menos una modificación de aminoácido en el dominio CH2 de la región Fc (residuos 231341). Las mutaciones que se cree que transmiten una mayor afinidad por FcRn incluyen T256A, T307A, E380A, y N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276: 6591). Otras mutaciones pueden reducir la unión de la región Fc a FcRI, FcRIIA, FcRIIB, y/o FcRIIIA sin reducir significativamente la afinidad por FcRn. Por ejemplo, la sustitución de Asn en la posición 297 de la región Fc por Ala u otro aminoácido elimina un sitio de N-glicosilación altamente conservado y puede dar lugar a una inmunogenicidad reducida con una vida media prolongada concomitante de la región Fc, así como una unión reducida a FcRs (Routledge et al 1995, Transplantation 60: 847; Friend et al 1999, Transplantation 68: 1632; Shields y otros, 1995, J. Biol. Chem. 276: 6591). Se han realizado modificaciones de aminoácidos en las posiciones 236 233 de IgG1 han sido hechos que reducen la unión a FcRs (Ward y Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 y Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29: 2613). Algunas sustituciones de aminoácidos de ejemplo se describen en las Patentes de Estados Unidos 7.355.008 y 7.381.408
Proteína de fusión y la extensión terminal
[0132] La presente descripción también abarca péptidos o proteínas de fusión de glucagón en el que un segundo péptido o polipéptido se ha fusionado a un extremo terminal, por ejemplo, el extremo carboxi terminal del péptido similar al glucagón. Más particularmente, el péptido similar al glucagón de fusión puede comprender un agonista de glucagón de la SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10 que comprende además una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO: 27 (KRNRNNIA) o SEQ ID NO: 28 (KRNR) unido al aminoácido 29 del péptido similar al glucagón. En una realización, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO: 27 (KRNRNNIA) o SEQ ID NO: 28 (KRNR) está unida al aminoácido 29 del péptido similar al glucagón a través de un enlace peptídico. Los solicitantes han descubierto que en los péptidos de fusión de glucagón que comprenden el péptido de extensión C-terminal de exendina-4 (por ejemplo, SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 29), la sustitución del residuo treonina nativo en la posición 29 por glicina aumenta dramáticamente la actividad del receptor de GLP-1. Esta sustitución de aminoácido puede usarse en conjunción con otras modificaciones descritas en el presente documento para mejorar la afinidad de los análogos de glucagón por el receptor de GLP-1. Por ejemplo, la sustitución T29G se puede combinar con las sustituciones de aminoácidos S16E y N20K, opcionalmente con un puente de lactama entre los aminoácidos 16 y 20, y opcionalmente con adición de una cadena de PEG tal como se describe en el presente documento. En una realización, se proporciona un coagonista del receptor de glucagón/GLP-1, que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 64. En una realización, la parte del péptido similar al glucagón del péptido de fusión de glucagón se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 55 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, y SEQ ID NO: 5 en el que una cadena de PEG, cuando está presente en las posiciones 17, 21, 24, o el aminoácido C-terminal, o en 21 y 24, se selecciona del intervalo de 500 a
40.000 Daltons. Más particularmente, en una realización, el segmento de péptido similar al glucagón se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, y SEQ ID NO: 63, en el que la cadena de PEG se
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selecciona del intervalo de 500 a 5.000. En una realización, el péptido similar al glucagón es un péptido de fusión que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 65 en el que el péptido de la SEQ ID NO: 65 está unido al extremo carboxi-terminal de la SEQ ID NO: 55.
5 C-terminal de carga neutra
[0133] Según una realización, una modificación química adicional del péptido similar al glucagón de la SEQ ID NO: 10 otorga una mayor potencia del receptor de GLP-1 hasta un punto en el que la actividad relativa en los receptores de glucagón y GLP-1 es prácticamente equivalente. Por consiguiente, en una realización, se proporciona un coagonista de receptores de glucagón/GLP-1, en el que el aminoácido terminal de los péptidos similares al glucagón descritos en este documento tienen un grupo amida en lugar del grupo de ácido carboxílico que está presente en el aminoácido nativo. La actividad relativa del análogo de glucagón en los respectivos receptores de glucagón y GLP-1 se puede ajustar mediante modificaciones adicionales al péptido similar al glucagón para producir análogos que muestran aproximadamente 40% a aproximadamente 500% o más de la actividad de glucagón nativo en el receptor
15 de glucagón y de aproximadamente 20% a aproximadamente 200% o más de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1, por ejemplo, 50 veces, 100 veces o más aumento en relación con la actividad normal de glucagón en el receptor de GLP-1. En algunas realizaciones, los péptidos similares al glucagón descritos en este documento muestran hasta aproximadamente 100%, 1000%, 10000%, 100000%, o 1.000.000% de la actividad de glucagón nativo en el receptor de glucagón. En algunas realizaciones, los péptidos similares al glucagón descritos en este documento presentan hasta aproximadamente 100%, 1000%, 10000%, 100000%, o 1.000.000% de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP-1.
Estabilización de la hélice alfa/puentes intramoleculares
25 [0134] En una realización adicional, se proporcionan análogos de glucagón que muestran una mayor actividad agonista del receptor de GLP-1, en los que se forma un puente intramolecular entre dos cadenas laterales de aminoácidos para estabilizar la estructura tridimensional del extremo carboxi terminal del. Las cadenas laterales de dos aminoácidos pueden unirse entre sí a través de enlaces no covalentes, por ejemplo, enlaces de hidrógeno, interacciones iónicas, tales como la formación de puentes salinos, o por enlaces covalentes. Cuando las dos cadenas laterales de aminoácidos están unidas entre sí a través de uno o más enlaces covalentes, el péptido puede considerarse que comprende un puente intramolecular covalente. Cuando las dos cadenas laterales de aminoácidos están unidas entre sí a través enlaces no covalentes, por ejemplo, enlaces de hidrógeno, interacciones iónicas, el péptido puede considerarse en el presente documento que comprende un puente intramolecular no covalente.
35 [0135] En algunas realizaciones, se forma el puente intramolecular entre dos aminoácidos que están 3 aminoácidos separados, por ejemplo, aminoácidos en las posiciones i e i + 4, en donde i es un número entero entre 12 y 25 (por ejemplo, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 y 25). Más particularmente, las cadenas laterales de los pares de aminoácidos 12 y 16, 16 y 20, 20 y 24 o 24 y 28 (pares de aminoácidos en la que i = 12, 16, 20, o 24) están unidos entre sí y por lo tanto estabilizan la hélice alfa de glucagón. Alternativamente, i puede ser 17.
[0136] En algunas realizaciones específicas, en las que los aminoácidos en las posiciones i e i + 4 están unidas por un puente intramolecular, el tamaño del enlazador es de aproximadamente 8 átomos, o aproximadamente 7-9 átomos.
45 [0137] En otras realizaciones, se forma el puente intramolecular entre los dos aminoácidos que están dos aminoácidos separados, por ejemplo, aminoácidos en las posiciones j y j + 3, en el que j es cualquier número entero entre 12 y 26 (por ejemplo, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 y 26). En algunas realizaciones específicas, j es 17.
[0138] En algunas realizaciones específicas, en el que los aminoácidos en las posiciones j y j + 3 están unidos por un puente intramolecular, el tamaño del enlazador es de aproximadamente 6 átomos, o aproximadamente 5 a 7 átomos.
[0139] En otras realizaciones, se forma el puente intramolecular entre dos aminoácidos que están 6 aminoácidos
55 separados, por ejemplo, aminoácidos en las posiciones k y k + 7, en el que k es cualquier número entero entre 12 y 22 (por ejemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, y 22). En algunas realizaciones específicas, k es 12, 13, o 17. En una realización de ejemplo, k es 17.
[0140] Ejemplos de emparejamientos de aminoácidos que son capaces de unirse covalentemente para formar un puente de unión de seis átomos incluyen Orn y Asp, Glu y un aminoácido de la Fórmula I, en la que n es 2, y ácido homoglutámico y un aminoácido de la Fórmula I, en la que n es 1, en el que la Fórmula I es:
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[Fórmula I]
[0141] Ejemplos de emparejamientos de aminoácidos que son capaces de unirse covalentemente para formar un puente de unión que tiene siete átomos incluyen Orn-Glu (lactama); Lys-Asp (lactama); o Homoser-Homoglu (lactona). Ejemplos de emparejamientos de aminoácidos que pueden formar un enlazador de ocho átomos incluyen Lys-Glu (lactama); Homolys-Asp (lactama); Orn-Homoglu (lactama); 4-aminoPhe-Asp (lactama); o Tyr-Asp (lactona). Ejemplos de emparejamientos de aminoácidos que pueden formar un enlazador de nueve átomos incluyen Homolys-Glu (lactama); Lys-Homoglu (lactama); 4-aminoPhe-Glu (lactama); o Tyr-Glu (lactona). Cualquiera de las cadenas laterales de estos aminoácidos puede estar sustituida con grupos químicos adicionales, siempre y cuando la estructura tridimensional de la hélice alfa no se interrumpa. Un experto en la técnica puede imaginar emparejamientos alternativos o análogos o derivados de aminoácidos alternativos que crearían una estructura estabilizadora de tamaño similar y efecto deseado. Por ejemplo, un puente disulfuro homocisteína-homocisteína tiene 6 átomos de longitud y puede ser modificado adicionalmente para proporcionar el efecto deseado. Incluso sin enlace covalente, los emparejamientos de aminoácidos descritos anteriormente o emparejamientos similares que un experto en la técnica puede imaginar también pueden proporcionar estabilidad añadida a la hélice alfa a través de enlaces no covalentes, por ejemplo, mediante la formación de puentes salinos o interacciones de puentes de hidrógeno.
[0142] Otras realizaciones de ejemplo incluyen las siguientes parejas, opcionalmente con un puente de lactama: Glu en la posición 12 con Lys en la posición 16; Lys nativo en la posición 12 con Glu en la posición 16; Glu en la posición 16 con Lys en la posición 20; Lys en la posición 16 con Glu en la posición 20; Glu en la posición 20 con Lys en la posición 24; Lys en la posición 20 con Glu en la posición 24; Glu en la posición 24 con Lys en la posición 28; Lys en la posición 24 con Glu en la posición 28.
[0143] Según una realización, se proporciona un análogo de glucagón que presenta actividad coagonista de receptores de glucagón/GLP-1, en el que el análogo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11, 47, 48 y 49. En una realización, las cadenas laterales se unen covalentemente una con otra, y en una realización los dos aminoácidos están unidos el uno al otro para formar un anillo de lactama. El tamaño del anillo de lactama puede variar dependiendo de la longitud de las cadenas laterales de los aminoácidos, y en una realización, la lactama está formada por la unión de las cadenas laterales de un aminoácido de lisina a una cadena lateral de ácido glutámico.
[0144] El orden del enlace amida en el anillo de lactama se puede invertir (por ejemplo, un anillo de lactama se puede formar entre las cadenas laterales de Lys12 y Glu16 o alternativamente entre Glu12 y Lys16). Según una realización, se proporciona un análogo de glucagón de la SEQ ID NO: 45, en lel que al menos un anillo de lactama se forma entre las cadenas laterales de un par de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en los pares de aminoácidos 12 y 16, 16 y 20, 20 y 24 o 24 y 28. En una realización, se proporciona un coagonista de receptores de glucagón/GLP-1, en el que el coagonista comprende un análogo de péptido similar al glucagón de la SEQ ID NO: 20 en el que el péptido comprende un puente de lactama intramolecular formado entre las posiciones de aminoácido 12 y 16 o entre las posiciones de aminoácido 16 y 20. En una realización, se proporciona un coagonista de receptores de glucagón/GLP-1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 20, en el que un puente de lactama intramolecular se forma entre las posiciones de aminoácido 12 y 16, entre las posiciones de aminoácido 16 y 20, o entre las posiciones de aminoácidos 20 y 24 y el aminoácido en la posición 29 es glicina, en el que la secuencia de SEQ ID NO: 29 está unido al aminoácido C-terminal de la SEQ ID NO: 20. En una realización adicional, el aminoácido en la posición 28 es ácido aspártico.
[0145] Se puede utilizar puentes intramoleculares distintos de un puente de lactama para estabilizar la hélice alfa de los péptidos análogos de glucagón. En una realización, el puente intramolecular es un puente hidrófobo. En este caso, el puente intramolecular es opcionalmente entre las cadenas laterales de dos aminoácidos que son parte de la cara hidrofóbica de la hélice alfa del péptido análogo de glucagón. Por ejemplo, uno de los aminoácidos unidos por el puente hidrófobo puede ser el aminoácido en la posición 10, 14, y 18.
[0146] En un aspecto específico, la metátesis de olefinas se utiliza para reticular uno o dos giros de la hélice alfa del
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no covalente (por ejemplo, un puente de sal) o un puente intramolecular covalente (por ejemplo, una lactama). En algunas realizaciones, una, dos, tres o más de las posiciones 16, 20, 21 o 24 están sustituidos por AIB. Dicho péptido similar al glucagón puede comprender además una o más de las otras modificaciones descritas en el presente documento, incluyendo, pero no limitado a, acilación, alquilación, pegilación, deleción de 1-2 aminoácidos en el extremo C-terminal, adición de y/o sustitución por aminoácidos cargados en el extremo C-terminal, la sustitución del carboxilato C-terminal por una amida, la adición de una extensión C-terminal, y sustituciones de aminoácidos conservadoras y/o no conservadoras, tales como la sustitución de Met en la posición 27 por Leu o Nle, la sustitución de Asp en la posición 15 por Glu (o aminoácido similar), sustitución en la posición 1 y/o 2 por los aminoácidos que logran resistencia a DPP-IV proteasa, la sustitución de Ser en la posición 2 por Ala, la sustitución de Tyr en posición 10 por Val o Phe, sustitución de Lys en la posición 12 por Arg, la sustitución de Ser en la posición 16 por Thr o AIB, la sustitución de Gln en la posición 20 y/o 24 por Asp, Glu, o AIB, la sustitución de Ser en la posición 16 por Glu o Thr, Arg en la posición 18 por Ala, Gln en la posición 20 por Lys, Asp en la posición 21 por Glu, y Gln en la posición 24 por Asn o Cys. En algunas realizaciones, el péptido similar a glucagón anterior comprende una Gln o Gly en la posición 29 o la adición de una extensión C-terminal, por ejemplo, GGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 26) C-terminal al aminoácido en la posición 28. En un aspecto específico, el péptido similar al glucagón comprende uno o más de un grupo amida en lugar del carboxilato C-terminal, un grupo acilo, por ejemplo, un ácido graso C16, y un grupo hidrófilo, por ejemplo, un polietilenglicol (PEG).
[0154] Además, en otro aspecto específico, el péptido similar al glucagón comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-25, 30-64, y 66-555 que comprende no más de diez modificaciones con respecto a SEQ ID NO: 1 y que comprende una o más sustituciones de aminoácidos por AIB en las posiciones 16, 20, 21 y/o 24, en el que el péptido carece de un puente intramolecular, por ejemplo, un puente intramolecular covalente, entre las cadenas laterales de dos aminoácidos del péptido. Por consiguiente, en un aspecto más específico, el péptido similar al glucagón comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 556-561.
[0155] Según algunas realizaciones, el péptido similar a glucagón que carece de un puente intramolecular comprende una o más sustituciones en las posiciones de aminoácidos dentro 12 a 29 por un aminoácido ,disustituido y un grupo acilo o alquilo unido covalentemente a la cadena lateral del aminoácido en la posición 10 del péptido similar a glucagón. En realizaciones específicas, el grupo acilo o alquilo es no nativo en un aminoácido. En ciertos aspectos, el grupo acilo o alquilo es no nativo al aminoácido en la posición 10. En realizaciones de ejemplo, el péptido similar al glucagón que carece de un puente intramolecular comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 556-561 y un grupo acilo o alquilo unido covalentemente a la cadena lateral del aminoácido en la posición 10 del péptido similar al glucagón. Dichos péptidos similares a glucagón acilados o alquilados que carecen de un puente intramolecular muestran mayor actividad en los receptores de GLP-1 y glucagón en comparación con los péptidos homólogos no acilados. Una mejora adicional en la actividad en los receptores de GLP-1 y glucagón se puede lograr por los péptidos similares a glucagón acilados que carecen de un puente intramolecular mediante la incorporación de un espaciador entre el grupo acilo o alquilo y la cadena lateral del aminoácido en la posición 10 del péptido. La acilación y alquilación, con o sin la incorporación de espaciadores, se describen adicionalmente en este documento.
Modificación en la posición 1
[0156] Según una realización de la descripción, el péptido similar al glucagón con una mayor actividad de GLP-1 comprende (a) una sustitución de aminoácido de His en la posición 1 por un aminoácido grande aromático y (b) un puente intramolecular que estabiliza que la alfa-hélice en la porción C-terminal de la molécula (por ejemplo, alrededor de las posiciones 12 a 29). En una realización específica, el aminoácido en la posición 1 es Tyr, Phe, Trp, amino-Phe, nitro-Phe, cloro-Phe, sulfo-Phe, 4-piridil-Ala, metil-Tyr, o 3-amino Tyr. En un aspecto específico, el puente intramolecular está entre las cadenas laterales de dos aminoácidos que están separados por tres aminoácidos intermedios, es decir, entre las cadenas laterales de los aminoácidos i y i + 4. En algunas realizaciones, el puente intramolecular es un puente de lactama. En una realización más específica de la descripción, el péptido similar al glucagón comprende un aminoácido grande aromático en la posición 1 y un puente de lactama entre los aminoácidos en las posiciones 16 y 20 del péptido. Dicho péptido similar al glucagón puede comprender además uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o más) de las otras modificaciones descritas en el presente documento. Por ejemplo, el péptido similar al glucagón puede comprender una amida en lugar del carboxilato Cterminal. En consecuencia, en una realización, el péptido similar al glucagón comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 555.
Acilación
[0157] Según una realización, el péptido similar al glucagón comprende un grupo acilo, por ejemplo, un grupo acilo que es no nativo a un aminoácido de origen natural. El grupo acilo hace que el péptido tenga una o más de (i) una vida media prolongada en la circulación, (ii) un retraso en la aparición de la acción, (iii) una duración prolongada de acción, (iv) una resistencia mejorada a las proteasas, tales como DPP-IV, y (v) aumento de la potencia en los receptores de GLP-1 y glucagón. Como se muestra en el presente documento, los péptidos similares a glucagón acilados no muestran una disminución de la actividad en los receptores de glucagón y GLP-1 en comparación con el
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(Orn).
[0164] En otras realizaciones, el aminoácido que comprende un grupo hidroxilo en la cadena lateral es un aminoácido de Fórmula II:
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en la que n = 1 a 4 [Fórmula II]
En algunas realizaciones de ejemplo, el aminoácido de Fórmula II es el aminoácido en el que n es 1 (Ser).
[0165] En aún otras realizaciones, el aminoácido que comprende un tiol en la cadena lateral es un aminoácido de Fórmula III:
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en la que n = 1 a 4 [Fórmula III]
En algunas realizaciones de ejemplo, el aminoácido de Fórmula II es el aminoácido en el que n es 1 (Cys).
[0166] En otras realizaciones, el aminoácido que comprende una una amina, hidroxilo o tiol en la cadena lateral es
45 un aminoácido disustituido que comprende la misma estructura de fórmula I, fórmula II o fórmula II, excepto que elm hidrógeno unido al carbono alfa del aminoácido de fórmula I, fórmula II o fórmula III está sustituido por una segunda cadena lateral.
[0167] En una realización de la invención, el péptido de glucagón acilado comprende un espaciador entre el péptido y el grupo acilo. En algunas realizaciones, el péptido de glucagón está unido covalentemente al espaciador, que está unido covalentemente al grupo acilo.
[0168] En algunas realizaciones, el espaciador es un aminoácido que comprende una amina, hidroxilo o tiol en la cadena lateral o un dipéptido o tripéptido que comprende un aminoácido que comprende una amina, hidroxilo o tiol
55 en la cadena lateral. El aminoácido al que se une el espaciador puede ser cualquier aminoácido que comprenda un grupo que permita la unión al espaciador. Por ejemplo, un aminoácido que comprende NH2,-OH, o -COOH en la cadena lateral (por ejemplo, Lys, Orn, Ser, Asp, o Glu) es adecuado. En este sentido, el péptido de glucagón acilado puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, o una secuencia de aminoácidos modificada de la misma que comprende una o más de las modificaciones de aminoácidos descritas en el presente documento, con al menos uno de los aminoácidos en las posiciones 10, 20, 24, 29 y 40 modificado a cualquier aminoácido que comprende amina, hidroxilo, o carboxilato en la cadena lateral.
[0169] En algunas realizaciones, el espaciador es un aminoácido que comprende una amina, hidroxilo, o carboxilato en la cadena lateral, o un dipéptido o tripéptido que comprende un aminoácido que comprende una amina, hidroxilo,
65 o carboxilato en la cadena lateral.
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[0170] Cuando la acilación se produce a través de un grupo amina de un espaciador, la acilación puede tener lugar a través de la amina alfa del aminoácido o una amina de la cadena lateral. En el caso en el que se acila la amina alfa, el aminoácido espaciador puede ser cualquier aminoácido. Por ejemplo, el aminoácido espaciador puede ser un aminoácido hidrófobo, por ejemplo, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Met, Phe, Tyr, ácido 6-aminohexanoico, ácido 5aminovalérico, ácido 7-aminoheptanoico y ácido 8-aminooctanoico. Alternativamente, el aminoácido espaciador puede ser un residuo ácido, por ejemplo, Asp y Glu.
[0171] En el caso en el que se acila la amina de la cadena lateral del aminoácido espaciador, el aminoácido espaciador es un aminoácido que comprende una amina en la cadena lateral, por ejemplo, un aminoácido de Fórmula I (por ejemplo, Lys u Orn). En este caso, es posible acilar la amina alfa y la amina de la cadena lateral del aminoácido espaciador, de manera que el antagonista de glucagón se diacila. Las realizaciones de la descripción incluyen tales moléculas diaciladas.
[0172] Cuando la acilación se produce a través de un grupo hidroxilo de un espaciador, el aminoácido o uno de los aminoácidos del dipéptido o tripéptido puede ser un aminoácido de Fórmula II. En una realización de ejemplo específica, el aminoácido es Ser.
[0173] Cuando la acilación se produce a través de un grupo tiol de un espaciador, el aminoácido o uno de los aminoácidos del dipéptido o tripéptido puede ser un aminoácido de Fórmula III. En una realización de ejemplo específica, el aminoácido es Cys.
[0174] En algunas realizaciones, el espaciador es un espaciador bifuncional hidrófilo. En ciertas realizaciones, el espaciador bifuncional hidrófilo comprende dos o más grupos reactivos, por ejemplo, una amina, un hidroxilo, un tiol, y un grupo carboxilo o cualquiera de sus combinaciones. En ciertas realizaciones, el espaciador bifuncional hidrófilo comprende un grupo hidroxilo y un carboxilato. En otras realizaciones, el espaciador bifuncional hidrófilo comprende un grupo amina y un carboxilato. En otras realizaciones, el espaciador bifuncional hidrófilo comprende un grupo tiol y un carboxilato. En realizaciones específicas, el espaciador comprende un amino poli (alquiloxi) carboxilato. En este sentido, el espaciador puede comprender, por ejemplo, NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH, en el que m es cualquier número entero de 1 a 6 y n es cualquier número entero de 2 a 12, tal como, por ejemplo, ácido 8-amino-3,6dioxaoctanoico, que está disponible comercialmente de Peptides International, Inc. (Louisville, KY).
[0175] En algunas realizaciones, el espaciador es un espaciador bifuncional hidrófobo. Los espaciadores bifuncionales hidrófobos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Bioconjugate Techniques, GT Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996). En ciertas realizaciones, el espaciador bifuncional hidrófobo comprende dos o más grupos reactivos, por ejemplo, una amina, un hidroxilo, un tiol, y un grupo carboxilo o cualquiera de sus combinaciones. En ciertas realizaciones, el espaciador bifuncional hidrófobo comprende un grupo hidroxilo y un carboxilato. En otras realizaciones, el espaciador bifuncional hidrófobo comprende un grupo amina y un carboxilato. En otras realizaciones, el espaciador bifuncional hidrófobo comprende un grupo tiol y un carboxilato. Los espaciadores bifuncionales hidrófobos adecuados que comprenden un carboxilato, y un grupo hidroxilo o un grupo tiol son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ácido 8-hidroxioctanoico y ácido 8-mercaptooctanoico.
[0176] En algunas realizaciones, el espaciador bifuncional no es un ácido dicarboxílico que comprende un metileno no ramificado de 1-7 átomos de carbono entre los grupos carboxilato. En algunas realizaciones, el espaciador bifuncional es un ácido dicarboxílico que comprende un metileno no ramificado de 1-7 átomos de carbono entre los grupos carboxilato.
[0177] El espaciador (por ejemplo, aminoácido, dipéptido, tripéptido, espaciador bifuncional hidrófilo, o espaciador bifuncional hidrófobo) en realizaciones específicas tiene de 3 a 10 átomos (por ejemplo, 6 a 10 átomos de, (por ejemplo, 6, 7, 8, 9, o 10 átomos)) de longitud. En realizaciones más específicas, el espaciador tiene de aproximadamente 3 a 10 átomos (por ejemplo, 6 a 10 átomos) de longitud y el grupo acilo es un grupo acilo graso C12 a C18, por ejemplo, un grupo acilo graso C14, un grupo acilo graso C16, de manera que la longitud total del espaciador y grupo acilo es de 14 a 28 átomos, por ejemplo, aproximadamente 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, o 28 átomos. En algunas realizaciones, la longitud del espaciador y grupo acilo es de 17 a 28 (por ejemplo, 19 a 26, 19 a 21) átomos.
[0178] Según ciertas realizaciones anteriores, el espaciador bifuncional puede ser un aminoácido sintético o de origen natural (incluyendo, pero no limitado a, cualquiera de los descritos en el presente documento) que comprende una cadena principal de aminoácido que tiene de 3 a 10 átomos de longitud (por ejemplo, ácido 6-aminohexanoico, ácido 5-aminovalérico, ácido 7-aminoheptanoico, y ácido 8-aminooctanoico). Alternativamente, el espaciador puede ser un espaciador dipéptido o tripéptido que tiene una cadena principal peptídica que tiene de 3 a 10 átomos (por ejemplo, 6 a 10 átomos) de longitud. Cada aminoácido del espaciador dipéptido o tripéptido puede ser el mismo que
o diferente de otro aminoácido o aminoácidos del dipéptido o tripéptido y puede seleccionarse independientemente entre el grupo que consiste en: aminoácidos de origen natural y/o de origen no natural, incluyendo, por ejemplo, cualquiera de los isómeros D o L de los aminoácidos de origen natural (Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr), o cualquier isómero D o L de los aminoácidos de origen no natural seleccionados del grupo constituido por: -alanina (-Ala), N--metil alanina (Me-Ala), ácido aminobutírico (Abu),
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aminoácido (por ejemplo, ácido glutámico, ácido aspártico) del péptido de glucagón o pueden ser parte de la cadena principal del péptido.
[0186] En ciertas realizaciones, el péptido de glucagón se modifica para comprender un grupo acilo por acilación de un alcano de cadena larga por un separador que se une al péptido de glucagón. En aspectos específicos, el alcano de cadena larga comprende un grupo amina, hidroxilo, o tiol que reacciona con un grupo carboxilo, o forma activada del mismo, del espaciador. Los espaciadores adecuados que comprenden un grupo carboxilo, o forma activada del mismo, se describen en el presente documento e incluyen, por ejemplo, espaciadores bifuncionales, por ejemplo, aminoácidos, dipéptidos, tripéptidos, espaciadores bifuncionales hidrófilos y espaciadores bifuncionales hidrófobos.
[0187] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "forma activada de un grupo carboxilo" se refiere a un grupo carboxilo con la fórmula general R(C=O)X, en donde X es un grupo saliente y R es el péptido de glucagón
o el espaciador. Por ejemplo, las formas activadas de un grupo carboxilo pueden incluir, pero no se limitan a, cloruros de acilo, anhídridos, y ésteres. En algunas realizaciones, el grupo carboxilo activado es un éster con un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) como grupo saliente.
[0188] Con respecto a estos aspectos de la descripción, en el que se acila un alcano de cadena larga por el péptido de glucagón o el espaciador, el alcano de cadena larga puede ser de cualquier tamaño y puede comprender cualquier longitud de cadena de carbono. El alcano de cadena larga puede ser lineal o ramificado. En ciertos aspectos, el alcano de cadena larga es un alcano C4 a C30. Por ejemplo, el alcano de cadena larga puede ser cualquiera de un alcano C4, alcano C6, alcano C8, alcano C10, alcano C12, alcano C14, alcano C16, alcano C18, alcano C20, alcano C22, alcano C24, alcano C26, alcano C28, o un alcano C30. En algunas realizaciones, el alcano de cadena larga comprende un alcano C8 a C20, por ejemplo, un alcano C14, alcano C16, o un alcano C18.
[0189] Además, en algunas realizaciones, se acila una amina, hidroxilo, o grupo tiol del péptido de glucagón con un ácido colesterol. En realizaciones específicas, el péptido de glucagón está unido con el ácido colesterol a través de un espaciador de Cys modificado, es decir, un espaciador de ácido 3-mercaptopropiónico alquilado. El espaciador de des-amino Cys alquilado puede ser, por ejemplo, un espaciador de des-amino Cys que comprende un grupo
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[0190] Los péptidos de glucagón acilados descritos en este documento se pueden modificar adicionalmente para comprender un grupo hidrófilo. En algunas realizaciones específicas, el grupo hidrófilo puede comprender una cadena de polietilenglicol (PEG). La incorporación de un grupo hidrófilo se puede realizar a través de cualquier medio adecuado, tal como cualquiera de los métodos descritos en este documento. En este sentido, el péptido de glucagón acilado puede comprender la SEQ ID NO: 1, incluyendo cualquiera de las modificaciones descritas en el presente documento, en el que al menos uno de los aminoácidos en las posiciones 10, 20, 24, y 29 comprende un grupo acilo y al menos uno de los aminoácidos en las posiciones 16, 17, 21, 24, ó 29, una posición dentro de una extensión C-terminal, o el aminoácido C-terminal, se modifican a una Cys, Lys, Orn, homo-Cys, o Ac-Phe, y la cadena lateral del aminoácido está unida covalentemente a un grupo hidrófilo (por ejemplo, PEG). En algunas realizaciones, el grupo acilo está unido a la posición 10, opcionalmente a través de un espaciador que comprende Cys, Lys, Orn, homo-Cys, o Ac-Phe, y el grupo hidrófilo se incorpora en un residuo de Cys en la posición 24.
[0191] Alternativamente, el péptido de glucagón acilado puede comprender un espaciador, en el que el espaciador está acilado y modificado para comprender el grupo hidrófilo. Los ejemplos no limitantes de espaciadores adecuados incluyen un espaciador que comprende uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Cys, Lys, Orn, homo-Cys, y Ac-Phe.
[0192] En un aspecto específico de la descripción, el péptido similar al glucagón acilado comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 534-544 y 546-549.
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Alquilación
[0193] Según algunas realizaciones, el péptido de glucagón se modifica para comprender un grupo alquilo, por ejemplo, un grupo alquilo que no es natural en un aminoácido (por ejemplo, un grupo alquilo que es no nativo a un aminoácido natural). Sin que se una a ninguna teoría particular, se cree que la alquilación de péptidos de glucagón logrará similares efectos, si no iguales, que la acilación de los péptidos de glucagón, por ejemplo, una vida media prolongada en la circulación, un retraso en la aparición de la acción, una duración prolongada de la acción, una resistencia mejorada a las proteasas, tales como DPP-IV, y el aumento de la potencia en los receptores de GLP-1 y glucagón.
[0194] La alquilación puede llevarse a cabo en cualquier posición dentro del péptido del glucagón, incluyendo cualquiera de las posiciones 1-29, una posición dentro de una extensión C-terminal, o el aminoácido C-terminal, siempre que la actividad de glucagón se mantenga. Los ejemplos no limitantes incluyen las posiciones 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28, o 29. El grupo alquilo puede unirse covalentemente directamente a un aminoácido del péptido de glucagón, o indirectamente a un aminoácido del péptido de glucagón a través de un espaciador, en el que el espaciador se coloca entre el aminoácido del péptido de glucagón y el grupo alquilo. Los péptidos de glucagón se pueden alquilar en la misma posición de aminoácido en la que está unido un grupo hidrófilo,
o en una posición de aminoácido diferente. Los ejemplos no limitantes incluyen la alquilación en la posición 10 y la pegilación en una o más posiciones en la parte C-terminal del péptido de glucagón, por ejemplo, la posición 24, 28, ó 29, dentro de una extensión C-terminal, o en el extremo C-terminal (por ejemplo, a través de la adición de una Cys C-terminal).
[0195] En un aspecto específico de la invención, el péptido de glucagón se modifica para comprender un grupo alquilo mediante la alquilación directa de una amina, hidroxilo, o tiol de una cadena lateral de un aminoácido del péptido de glucagón. En algunas realizaciones, la alquilación es en la posición 10, 20, 24, ó 29. En este sentido, el péptido de glucagón alquilado puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, o una secuencia de aminoácidos modificada de la misma que comprende una o más de las modificaciones de aminoácidos descritas en el presente documento, con al menos uno de los aminoácidos en las posiciones 10, 20, 24, ó 29 modificado a cualquier aminoácido que comprende una amina, hidroxilo, o tiol en la cadena lateral. En algunas realizaciones específicas aquí descritas, la alquilación directa del péptido de glucagón se produce a través de la amina, hidroxilo, o tiol de la cadena lateral del aminoácido en la posición 10.
[0196] En algunas realizaciones, el aminoácido que comprende una amina en la cadena lateral es un aminoácido de Fórmula I. En algunas realizaciones de ejemplo, el aminoácido de Fórmula I es el aminoácido en el que n es 4 (Lys)
o n es 3 (Orn).
[0197] En otras realizaciones, el aminoácido que comprende un hidroxilo en la cadena lateral es un aminoácido de Fórmula II. En algunas realizaciones de ejemplo, el aminoácido de Fórmula II es el ácido amino en el que n es 1 (Ser).
[0198] En aún otras realizaciones, el aminoácido que comprende un tiol en la cadena lateral es un aminoácido de Fórmula III. En algunas realizaciones de ejemplo, el aminoácido de Fórmula II es el ácido amino en el que n es 1 (Cys).
[0199] En otras realizaciones, el aminoácido que comprende una amina hidroxilo, o tiol en la cadena lateral, es un aminoácido disustituido que comprende la misma estructura de la Fórmula I, Fórmula II o Fórmula III, excepto que el hidrógeno unido al carbono alfa del aminoácido de Fórmula I, Fórmula II, o fórmula III se sustituye por una segunda cadena lateral.
[0200] En una realización de la invención, el péptido de glucagón alquilado comprende un espaciador entre el antagonista y el grupo alquilo. En algunas realizaciones, el péptido de glucagón se une covalentemente al espaciador, que está unido covalentemente al grupo alquilo. En algunas realizaciones de ejemplo, el péptido de glucagón se modifica para comprender un grupo alquilo mediante la alquilación de una amina, hidroxilo, o tiol de un espaciador, cuyo espaciador está unido a una cadena lateral de un aminoácido en la posición 10, 20, 24, ó 29 del péptido de glucagón. El aminoácido al que se une el espaciador puede ser cualquier aminoácido que comprende un grupo que permite la unión al espaciador. Por ejemplo, un aminoácido que comprende NH2, -OH, o -COOH en la cadena lateral (por ejemplo, Lys, Orn, Ser, Asp, o Glu) es adecuado. En este sentido, el péptido de glucagón alquilado puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, o una secuencia de aminoácidos modificada de la misma que comprende una o más de las modificaciones de aminoácidos descritas en el presente documento, con al menos uno de los aminoácidos en las posiciones 10, 20, 24, y 29 modificado a cualquier aminoácido que comprende una amina, hidroxilo o carboxilato en la cadena lateral.
[0201] En algunas realizaciones, el espaciador es un aminoácido que comprende una amina, hidroxilo o tiol en la cadena lateral o un dipéptido o tripéptido que comprende un aminoácido que comprende una amina, hidroxilo, o tiol en la cadena lateral.
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alquilo C8, alquilo C10, alquilo C12, alquilo C14, alquilo C16, alquilo C18, alquilo C20, alquilo C22, alquilo C24, alquilo C26, alquilo C28, o un alquilo C30. En algunas realizaciones, el grupo alquilo es un alquilo C8 a C20, por ejemplo, un alquilo C14 o un alquilo C16.
[0211] En algunas realizaciones específicas, el grupo alquilo comprende un grupo esteroide de un ácido biliar, por ejemplo, ácido cólico, ácido quenodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido litocólico, ácido taurocólico, ácido glicocólico, y ácido colesterol.
[0212] En algunas realizaciones de la invención, el péptido de glucagón se modifica para comprender un grupo alquilo por reacción de un alcano nucleófilo de cadena larga con el péptido de glucagón, en el que el péptido de glucagón comprende un grupo saliente adecuado para la sustitución nucleófila. En aspectos específicos, el grupo nucleófilo del alcano de cadena larga comprende un grupo amina, hidroxilo, o tiol (por ejemplo, octadecilamina, tetradecanol, y hexadecanotiol). El grupo saliente del péptido de glucagón puede ser parte de una cadena lateral de un aminoácido o puede ser parte de la cadena principal del péptido. Los grupos salientes adecuados incluyen, por ejemplo, N-hidroxisuccinimida, halógenos, y ésteres de sulfonato.
[0213] En ciertas realizaciones, el péptido de glucagón se modifica para comprender un grupo alquilo haciendo reaccionar el alcano nucleófilo de cadena larga con un espaciador que está unido al péptido de glucagón, en el que el espaciador comprende el grupo saliente. En aspectos específicos, el alcano de cadena larga comprende un grupo amina, hidroxilo, o tiol. En ciertas realizaciones, el espaciador que comprende el grupo saliente puede ser cualquier espaciador discutido en el presente documento, por ejemplo, aminoácidos, dipéptidos, tripéptidos, espaciadores bifuncionales hidrófilos y espaciadores bifuncionales hidrófobos que comprende además un grupo saliente adecuado.
[0214] Con respecto a estos aspectos de la invención, en el que un alcano de cadena larga es alquilado por el péptido de glucagón o el espaciador, el alcano de cadena larga puede ser de cualquier tamaño y puede comprender cualquier longitud de cadena de carbono. El alcano de cadena larga puede ser lineal o ramificado. En ciertos aspectos, el alcano de cadena larga es un alcano C4 a C30. Por ejemplo, el alcano de cadena larga puede ser cualquiera de un alcano C4, alcano C6, alcano C8, alcano C10, alcano C12, alcano C14, alcano C16, alcano C18, alcano C20, alcano C22, alcano C24, alcano C26, alcano C28, o un alcano C30. En algunas realizaciones, el alcano de cadena larga comprende un alcano C8 a C20 alcano, por ejemplo, un alcano C14, alcano C16, o un alcano C18.
[0215] Además, en algunas realizaciones, la alquilación puede tener lugar entre el péptido de glucagón y un resto de colesterol. Por ejemplo, el grupo hidroxilo del colesterol puede desplazar un grupo saliente en el alcano de cadena larga para formar un producto peptídico colesterol-glucagón.
[0216] Los péptidos de glucagón alquilados descritos en este documento pueden modificarse adicionalmente para comprender un grupo hidrófilo. En algunas realizaciones específicas, el grupo hidrófilo puede comprender una cadena de polietilenglicol (PEG). La incorporación de un grupo hidrófilo se puede lograr a través de cualquier medio adecuado, tal como cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. En este sentido, el péptido de glucagón alquilado puede comprender la SEQ ID NO: 1, o una secuencia de aminoácidos modificada de la misma que comprende una o más de las modificaciones de aminoácidos descritas en este documento, en el que al menos uno de los aminoácidos en las posiciones 10, 20, 24, y 29 comprenden un grupo alquilo y al menos uno de los aminoácidos en la posición 16, 17, 21, 24, y 29, una posición dentro de una extensión C-terminal o el aminoácido Cterminal se modifican a una Cys, Lys, Orn, homo-Cys, o Ac-Phe, y la cadena lateral del aminoácido está unida covalentemente a un grupo hidrófilo (por ejemplo, PEG). En algunas realizaciones, el grupo alquilo está unido a la posición 10, opcionalmente a través de un espaciador que comprende Cys, Lys, Orn, homo-Cys, o Ac-Phe, y el grupo hidrófilo se incorpora en un residuo de Cys en la posición 24.
[0217] Alternativamente, el péptido de glucagón alquilado puede comprender un espaciador, donde el espaciador está alquilado y modificado para comprender el grupo hidrófilo. Ejemplos no limitantes de espaciadores adecuados incluyen un espaciador que comprende uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Cys, Lys, Orn, homo-Cys, y Ac-Phe.
Truncamiento C-terminal
[0218] En algunas realizaciones, los péptidos similares al glucagón descritos en el presente documento se modifican adicionalmente por truncamiento o deleción de uno o dos aminoácidos del extremo C-terminal del péptido similar al glucagón (es decir, la posición 29 y/o 28) sin afectar a la actividad y/o potencia en los receptores de glucagón y GLP
1. A este respecto, el péptido similar al glucagón puede comprender los aminoácidos 1-27 o 1-28 del péptido glucagón nativo (SEQ ID NO: 1), opcionalmente con una o más modificaciones descritas en este documento.
[0219] En una realización, el péptido agonista de glucagón truncado comprende la SEQ ID NO: 550 o la SEQ ID NO:
551. En otra realización, el péptido agonista de glucagón truncado comprende la SEQ ID NO: 552 o la SEQ ID NO:
553.
35 5
15
25
35
45
55
65
Residuos C-terminal cargados
[0220] La solubilidad del péptido similar al glucagón de la SEQ ID NO: 20 se puede mejorar más, por ejemplo, mediante la introducción de uno, dos, tres o más aminoácidos cargados en la porción C-terminal del péptido similar al glucagón de la SEQ ID NO: 20, preferiblemente en una posición C-terminal en la posición 27. Dicho aminoácido cargado se puede introducir mediante la sustitución de un aminoácido nativo por un aminoácido cargado, por ejemplo, en las posiciones 28 ó 29, o alternativamente mediante la adición de un aminoácido cargado, por ejemplo, después de la posición 27, 28 o 29. En realizaciones de ejemplo, uno, dos, tres o todos los aminoácidos cargados están cargados negativamente. Alternativamente, la solubilidad también se puede mejorar mediante la unión covalente de grupos hidrófilos, tales como polietilenglicol, al péptido.
Realizaciones de ejemplo
[0221] Según una realización, se proporciona un análogo de glucagón que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 55, en el que dicho análogo difiere de SEQ ID NO: 55 en 1 a 3 aminoácidos, seleccionados de las posiciones 1, 2, 3, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21, 24, 27, 28, y 29, en el que dicho péptido similar a glucagón muestra al menos 20% de la actividad de GLP-1 nativo en el receptor de GLP 1.
[0222] Según una realización, se proporciona un coagonista de receptores de glucagón/GLP-1 que comprende la secuencia: NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Asp-Phe-ValXaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO: 33), en la que Xaa en la posición 15 se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en Asp, Glu, ácido cisteico, ácido homoglutámico y ácido homocisteico, Xaa en la posición 16 se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en Ser, Glu, Gln, ácido homoglutámico y ácido homocisteico, Xaa en la posición 20 es Gln o Lys, Xaa en la posición 24 es Gln o Glu, Xaa en la posición 28 es Asn, Lys o un aminoácido ácido, Xaa en la posición 29 es Thr, Gly o un aminoácido ácido, y R es COOH o CONH2, con la condición de que cuando la posición 16 es serina, la posición 20 es Lys, o, alternativamente, cuando la posición 16 es serina, la posición 24 es Glu y, o bien la posición 20 o la posición 28 es Lys. En una realización, el coagonista de receptores de glucagón/GLP-1 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 33, en la que el aminoácido en la posición 28 es ácido aspártico y el aminoácido en la posición 29 es ácido glutámico. En otra realización, el aminoácido en la posición 28 es la asparagina nativa, el aminoácido en la posición 29 es glicina y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 65 está unida covalentemente al extremo carboxi de la SEQ ID NO: 33.
[0223] En una realización, se proporciona un coagonista que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 33, en la que un aminoácido ácido adicional se ha añadido al extremo carboxi del péptido. En una realización adicional, el aminoácido carboxi terminal del análogo de glucagón tiene una amida en lugar del grupo de ácido carboxílico del aminoácido natural. En una realización, el análogo de glucagón comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44.
[0224] Según una realización, se proporciona un análogo de péptido de glucagón de la SEQ ID NO: 33, en la que dicho análogo difiere de SEQ ID NO: 33 en 1 a 3 aminoácidos, seleccionados de las posiciones 1, 2, 3, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21 y 27, con la condición de que cuando el aminoácido en la posición 16 es serina, la posición 20 es lisina o se forma un puente de lactama entre el aminoácido en la posición 24 y el aminoácido en la posición 20 o la posición 28. Según una realización, el análogo difiere de SEQ ID NO: 33 en 1 a 3 aminoácidos seleccionadados de las posiciones 1, 2, 3, 21 y 27. En una realización, el análogo de péptido de glucagón de la SEQ ID NO: 33 difiere de la secuencia en 1 a 2 aminoácidos, o en una realización en un solo aminoácido, seleccionados de las posiciones 1, 2, 3, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21 y 27, con la condición de que cuando el aminoácido en la posición 16 es serina, la posición 20 es lisina o se forma un puente de lactama entre el aminoácido en la posición 24 y el aminoácido en la posición 20 o la posición 28.
[0225] Según otra realización, se proporciona un agonista de receptor GLP-1 relativamente selectivo que comprende la secuencia NH2-His-Ser-Xaa-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Asp-PheVal-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO: 53), en la que Xaa en la posición 3 se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en Glu, Orn o Nle, Xaa en la posición 15 se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en Asp, Glu, ácido cisteico, ácido homoglutámico y ácido homocisteico, Xaa en la posición 16 se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en Ser, Glu, Gln, ácido homoglutámico y ácido homocisteico, Xaa en la posición 20 es Gln o Lys, Xaa en la posición 24 es Gln o Glu, Xaa en la posición 28 es Asn, Lys o un aminoácido ácido, Xaa en la posición 29 es Thr, Gly o un aminoácido ácido, y R es COOH, CONH2, SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 29, con la condición de que cuando la posición 16 es serina, la posición 20 es Lys, o, alternativamente, cuando la posición 16 es serina, la posición 24 es Glu y la posición 20 o la posición 28 es Lys. En una realización, el aminoácido en la posición 3 es el ácido glutámico. En una realización, el aminoácido ácido sustituido en la posición 28 y/o 29 es ácido aspártico o ácido glutámico. En una realización, el péptido similar al glucagón, incluyendo un péptido coagonista, comprende la secuencia de SEQ ID NO: 33 que comprende además un aminoácido ácido adicional añadido al extremo carboxi del péptido. En una realización adicional, el aminoácido carboxi terminal del análogo de glucagón tiene una amida en lugar del grupo de ácido carboxílico del aminoácido natural.
36 5
15
25
35
45
55
65
[0226] Según una realización, se proporciona un coagonista de receptores de glucagón/GLP-1 que comprende un péptido similar al glucagón modificado seleccionado del grupo que consiste en: NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-ThrSer-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO: 34), en la que Xaa en la posición 15 se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en Asp, Glu, ácido cisteico, ácido homoglutámico y ácido homocisteico, Xaa en la posición 16 se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en Ser, Glu, Gln, ácido homoglutámico y ácido homocisteico, Xaa en la posición 20 es Gln o Lys, Xaa en la posición 24 es Gln o Glu y Xaa en la posición 28 es Asn, Asp o Lys, R es COOH o CONH2, Xaa en la posición 29 es Thr o Gly, y R es COOH, CONH2, SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 29, con la condición de que cuando la posición 16 es serina, la posición 20 es Lys, o, alternativamente, cuando la posición 16 es serina, la posición 24 es Glu y la posición 20 o la posición 28 es Lys. En una realización R es CONH2, Xaa en la posición 15 es Asp, Xaa en la posición 16 se selecciona del grupo de aminoácidos que consiste en Glu, Gln, ácido homoglutámico y ácido homocisteico, XaaS en las posiciones 20 y 24 son cada uno Gln, Xaa en la posición 28 es Asn o Asp y Xaa en la posición 29 es Thr. En una realización, XaaS en las posiciones 15 y 16 son cada uno Glu, XaaS en las posiciones 20 y 24 son cada uno Gln, Xaa en la posición 28 es Asn o Asp, Xaa en la posición 29 es Thr y R es CONH2.
[0227] Se ha descrito que ciertas posiciones del péptido glucagón nativo se pueden modificar manteniendo al menos parte de la actividad del péptido parental. Por consiguiente, los solicitantes prevén que uno o más de los aminoácidos situados en las posiciones 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 o 29 del péptido de SEQ ID NO: 11 puedan ser sustituidos por un aminoácido diferente del presente en el péptido de glucagón nativo, y aún conserve actividad en el receptor de glucagón. En una realización, se cambió el residuo de metionina presente en la posición 27 del péptido nativo por leucina o norleucina para evitar la degradación oxidativa del péptido. En otra realización, el aminoácido en la posición 20 se sustituye por Lys, Arg, Orn o Citrulina y/o la posición 21 se sustituye por Glu, ácido homoglutámico o ácido homocisteico.
[0228] En una realización, se proporciona un análogo de glucagón de la SEQ ID NO: 20, en la que de 1 a 6 aminoácidos seleccionados de las posiciones 1, 2, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21 , 27, 28 o 29 del análogo difieren de los correspondientes aminoácidos de SEQ ID NO: 1, con la condición de que cuando el aminoácido en la posición 16 es serina, la posición 20 es Lys, o, alternativamente, cuando la posición 16 es serina, la posición 24 es Glu y la posición 20 o la posición 28 es Lys. Según otra realización, se proporciona un análogo de glucagón de la SEQ ID NO: 20 en la que de 1 a 3 aminoácidos seleccionados de las posiciones 1, 2, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21 , 27, 28 o 29 del análogo difieren de los correspondientes aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En otra realización, se proporciona un análogo de glucagón de la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11, en la que de 1 a 2 aminoácidos seleccionados de las posiciones 1, 2, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 20 o 21 del análogo difieren de los correspondientes aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y en una realización adicional, dichos de uno a dos aminoácidos diferentes representan sustituciones conservadoras de aminoácidos en relación con el aminoácido presente en la secuencia de glucagón nativo (SEQ ID NO: 1). En una realización, se proporciona un péptido similar al glucagón de la SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO 15, en la que el péptido similar al glucagón comprende además uno, dos o tres sustituciones de aminoácidos en posiciones seleccionadas de las posiciones: 2, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 27 o 29. En una realización, las sustituciones en las posiciones 2, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 27 o 29 son sustituciones conservadoras de aminoácidos.
[0229] Según una realización, se proporciona un coagonista de receptores de glucagón/GLP-1 que comprende una variante de la secuencia de SEQ ID NO 33, en la que de 1 a 10 aminoácidos seleccionados de las posiciones 16, 17, 18, 20, 21 , 23, 24, 27, 28 y 29, respectivamente, de la variante difieren del correspondiente aminoácido de SEQ ID NO: 1. Según una realización, se proporciona una variante de la secuencia de SEQ ID NO 33, en la que la variante difiere de SEQ ID NO: 33 en una o más sustituciones de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Gln17, Ala18, Glu21, Ile23, Ala24, Val27 y Gly29. Según una realización, se proporciona un coagonista de los receptores de glucagón/GLP-1 que comprenden variantes de la secuencia de SEQ ID NO 33, en la que de 1 a 2 aminoácidos seleccionados de las posiciones 17-26 de la variante difieren de los correspondientes aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Según una realización, se proporciona una variante de la secuencia de SEQ ID NO 33, en la que la variante difiere de la SEQ ID NO: 33 en una sustitución de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gln17, Ala18, Glu21, Ile23 y Ala24. Según una realización, se proporciona una variante de la secuencia de SEQ ID NO 33, en la que la variante difiere de la SEQ ID NO: 33 en una sustitución de aminoácido en la posición 18, en la que el aminoácido sustituido se selecciona del grupo que consiste en Ala, Ser, Thr, y Gly. Según una realización, se proporciona una variante de la secuencia de SEQ ID NO 33 en la que la variante difiere de la SEQ ID NO: 33 en una sustitución de aminoácidos de Ala en la posición 18. Dichas variaciones están comprendidas por la SEQ ID NO: 55. En otra realización, se proporciona un coagonista de receptores de glucagón/GLP-1 que comprende variantes de la secuencia de SEQ ID NO 33, en la que de 1 a 2 aminoácidos seleccionados de las posiciones 17-22 de la variante difieren de los correspondientes aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y en una realización adicional se proporciona una variante de la SEQ ID NO 33, en la que la variante difiere de la SEQ ID NO: 33 en 1 o 2 sustituciones de aminoácidos en las posiciones 20 y 21. De conformidad con una realización, se proporciona un coagonista de receptores de glucagón/GLP-1 que comprende la secuencia: NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-SerLys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Ala-Xaa-Xaa-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Met-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO: 51), en la que Xaa en la posición 15 es Asp, Glu, ácido cisteico, ácido homoglutámico o ácido homocisteico, Xaa en la posición 16 es Ser, Glu, Gln, ácido homoglutámico o ácido homocisteico, Xaa en la posición 20 es Gln, Lys, Arg, Orn o citrulina, Xaa en la posición 21 es Asp, Glu, ácido homoglutámico o ácido homocisteico, Xaa en la posición 24 es Gln o Glu,
37 5
15
25
35
45
55
65
Xaa en la posición 28 es Asn, Lys o un aminoácido ácido, Xaa en la posición 29 es Thr o un aminoácido ácido y R es COOH o CONH2. En una realización, R es CONH2. Según una realización, se proporciona un coagonista de receptores de glucagón/GLP-1 que comprende una variante de la SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 o SEQ ID NO: 49, en el que la variante difiere de dicha secuencia en una sustitución de aminoácido en la posición 20. En una realización, la sustitución de aminoácido se selecciona del grupo que consiste en Lys, Arg, Orn o citrulina para la posición 20.
[0230] En una realización, se proporciona un agonista de glucagón que comprende un péptido análogo de la SEQ ID NO: 34, en la que el análogo difiere de SEQ ID NO: 34 por tener un aminoácido distinto de serina en la posición 2. En una realización, el residuo de serina es sustituido por ácido aminoisobutírico, D-alanina, y, en una realización, el residuo de serina se sustituye por ácido aminoisobutírico. Tales modificaciones suprimen la escisión por la dipeptidil peptidasa IV, manteniendo la potencia inherente del compuesto parental (por ejemplo, al menos 75, 80, 85, 90, 95%
o más de la potencia del compuesto parental). En una realización, se incrementa la solubilidad del análogo, por ejemplo, mediante la introducción de uno, dos, tres o más aminoácidos cargados a la porción C-terminal de glucagón nativo, preferiblemente en una posición C-terminal a la posición 27. En realizaciones de ejemplo, uno, dos, tres o todos los aminoácidos cargados están cargados negativamente. En otra realización, el análogo comprende, además, un aminoácido ácido sustituido por el aminoácido nativo en la posición 28 o 29 o un aminoácido ácido añadido al extremo carboxi del péptido de SEQ ID NO: 34.
[0231] En una realización, los análogos de glucagón descritos en el presente documento se modifican adicionalmente en la posición 1 o 2 para reducir la susceptibilidad a la escisión por la dipeptidil peptidasa IV. En una realización, se proporciona un análogo de glucagón de la SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15, en la que el análogo difiere de la molécula original en una sustitución en la posición 2 y exhibe una susceptibilidad (es decir, resistencia) reducida a la escisión por la dipeptidil peptidasa IV. Más particularmente, en una realización, la posición 2 del péptido análogo se sustituye por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D-serina, D-alanina, valina, ácido amino n-butírico, glicina, N-metilo serina y ácido aminoisobutírico. En una realización, la posición 2 del péptido análogo se sustituye por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D-serina, D-alanina, glicina, N-metil serina y ácido aminoisobutírico. En otra realización, la posición 2 del péptido análogo se sustituye por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D-serina, glicina, N-metil serina y ácido aminoisobutírico. En una realización, el péptido similar al glucagón comprende la secuencia de SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 22.
[0232] En una realización, se proporciona un análogo de glucagón de la SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15, en la que el análogo difiere de la molécula original en una sustitución en la posición 1 y muestra una susceptibilidad (es decir, resistencia) reducida a la escisión por la dipeptidil peptidasa IV. Más particularmente, la posición 1 del péptido análogo se sustituye por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D-histidina, ácido alfa,alfa-dimetil imizadol acético (DMIA), N-metil histidina, alfa-metil histidina, ácido imidazol acético, desaminohistidina, hidroxil-histidina, acetil-histidina y homo-histidina. En otra realización, se proporciona un agonista de glucagón que comprende un péptido análogo de la SEQ ID NO: 34, en la el análogo difiere de SEQ ID NO: 34 por tener un aminoácido distinto de histidina en la posición 1. En una realización, la solubilidad del análogo aumenta, por ejemplo, mediante la introducción de uno, dos, tres o más aminoácidos cargados a la porción C-terminal de glucagón nativo, preferiblemente en una posición C-terminal a la posición 27. En realizaciones de ejemplo, uno, dos, tres o todos los aminoácidos cargados están cargados negativamente. En otra realización el análogo comprende, además, un aminoácido ácido sustituido por el aminoácido nativo en la posición 28 o 29 o un aminoácido ácido añadido al extremo carboxi del péptido de SEQ ID NO: 34. En una realización, el aminoácido ácido es ácido aspártico o ácido glutámico.
[0233] En una realización, el coagonista de receptores de glucagón/GLP-1 comprende una secuencia de SEQ ID NO: 20 que comprende además una extensión carboxi terminal adicional de un aminoácido o un péptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28. En la realización en la que un único aminoácido se añade al extremo carboxi terminal de la SEQ ID NO: 20, el aminoácido se selecciona típicamente de uno de los 20 aminoácidos comunes, y en una realización el aminoácido carboxi terminal adicional tiene un grupo amida en lugar del ácido carboxílico del aminoácido nativo. En una realización, el aminoácido adicional se selecciona del grupo que consiste en ácido glutámico, ácido aspártico y glicina.
[0234] En una realización alternativa, se proporciona un coagonista de receptores de glucagón/GLP-1, en el que el péptido comprende al menos un anillo de lactama formado entre la cadena lateral de un residuo de ácido glutámico y un residuo de lisina, en el que el residuo de ácido glutámico y el residuo de lisina están separados por tres aminoácidos. En una realización, el aminoácido carboxi terminal del péptido similar al glucagón con lactama tiene un grupo amida en lugar del ácido carboxílico del aminoácido nativo. Más particularmente, en una realización se proporciona un coagonista de glucagón y GLP-1 que comprende un péptido similar al glucagón modificado seleccionado del grupo que consiste en:
NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu Met-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO: 66) NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Lys-Asp-Phe-Val-Gln-Trp Leu
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GLP-1
<0,01 100
Parental sin PEG
Paretal con PEG
% de Potencia Relativa al nativo
% de Potencia Relativa al nativo
AGONISTAS
GR GLP-1 GR GLP-1R
Quimera AIB2, Cys24 (SEQ ID Nº: 486)
15,4 160,6 2,6 82,5
Quimera AIB2, Cys29 (SEQ ID Nº: 487)
20,1 124,6 5,6 54,3
Quimera AIB2, Gly29,30 Cys40 Cex (SEQ ID Nº: 488)
2,2 359,1 0,3 68,8
Quimera AIB2, Gly29,30 Cys40 Cex Lactama (SEQ ID Nº: 489)
14,2 169,6 3,2 63,6
Quimera AIB2, Gly29,30 Cys24 Cex (SEQ ID Nº: 490)
2,5 457,8 0,2 95,4
Quimera AIB2, Gly29,30 Cys24 Cex Lactama (SEQ ID Nº: 488)
25,2 381,5 1,4 96,4
E16, K20AIB2, A18 Cys24 (SEQ ID Nº: 492)
- - 1,1 73,5
E16, K20AIB2, A18 Gly29,30 Cys24 Cex (SEQ ID Nº: 496)
- - 0,1 88,5
COAGONISTAS
GR GLP-1 GR GLP-1R
Quimera DMIA1, Cys24 Lactama (SEQ ID Nº: 505)
160,7 82,5 19,1 12,5
Quimera AIB2, Cys24 Lactama (SEQ ID Nº: 504)
114,2 230,4 9,2 38,0
Quimera DMIA1, Cys29 Lactama (SEQ ID Nº: 506)
- - - --
Quimera DMIA1, Gly29,30 Cys40 Cex Lactama (SEQ ID Nº: 507)
- - - --
E16, K20 DMIA1, Gly29, 30 Cys40 Cex Lactama (SEQ ID Nº 508)
- - - ---
Quimera DMIA1, Gly29,30 Cys24 Cex Lactama (SEQ ID Nº: 509)
- - - --
E16, K20 DMIA1, Cys24 Lactama (SEQ ID Nº 510)
- - 64,1 9,3
E16, K20 AIB2, Cys24 Lactama (SEQ ID Nº 517)
108,3 96,9 15,8 31,0
Quimera Cys24 (SEQ ID Nº: 518)
- - 19,8 29,3
E16, K20 DMIA1, Gly29, 30 Cys24 Cex Lactama (SEQ ID Nº 513)
116,0 78,3 12,6 11,3
Quimera DMIA1, Cys29 (SEQ ID Nº: 520)
- - 5,3 27,3
Quimera DMIA1, Cys24 (SEQ ID Nº: 519)
28,9 64,5 6,9 19,3
EJEMPLO 19
5 [0312] Los péptidos acilados y/o PEGilados se prepararon de la siguiente manera. Los péptidos se sintetizaron en una resina de soporte sólido utilizando un sintetizador de péptidos CS Bio 4886 o sintetizador de péptidos Applied Biosystems 430A. Se utilizó química de neutralización in situ tal como se describe por Schnolzer et al., Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180-193 (1992). Para los péptidos acilados, el residuo de aminoácido objetivo a ser acilado (por ejemplo, la posición diez) se sustituyó por un residuo de lisina FMOC en N-epsilon. El tratamiento del péptido 10 protegido con BOC N-terminal completado con piperidina al 20% en DMF durante 30 minutos eliminó los grupos formilo/FMOC. El acoplamiento al residuo de Lys con -amino libre se logró mediante el acoplamiento de un exceso molar de diez veces de un aminoácido espaciador protegido con FMOC (por ejemplo, FMOC-(N-BOC)-triptófano-OH) o cadena de acilo (por ejemplo, C17-COOH) y PyBOP o reactivo de acoplamiento DEPBT en DMF/DIEA. La eliminación posterior del grupo FMOC del aminoácido espaciador va seguido por la repetición de acoplamiento con 15 una cadena de acilo. El tratamiento final con 100% de TFA dio lugar a la eliminación de cualquier grupo protector de cadena lateral y el grupo BOC N-terminal. Las resinas peptídicas se neutralizaron con DIEA al 5%/DMF, se secaron, y a continuación se escindieron del soporte utilizando HF/p-cresol, 95:5, a 0ºC durante una hora. Después de extracción con éter, se utilizó una solución de HOAc al 5% para solvatar el péptido crudo. A continuación, se verificó una muestra de la solución para ver si contenía el péptido de peso molecular correcto por ESI-MS. Los péptidos 20 correctos se purifican mediante RP-HPLC usando un gradiente lineal de CH3CN al 10%/TFA al 0,1% a 0,1% de TFA en 100% de CH3CN. Se utilizó una columna de proteína Vydac C18 22 mm x 250 mm para la purificación. Los análogos de péptidos acilados completaron la elución generalmente en una relación de tampón de 20:80. Las porciones se agruparon y comprobó la pureza en una RP-HPLC analítica. Las fracciones puras se liofilizaron
65
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indicó que los islotes pancreáticos tendían a ser más pequeños después del tratamiento con péptido X-PEG (datos no mostrados).
EJEMPLO 50
[0399] Con el fin de diseccionar las aportaciones del los componentes agonistas de GLP-1 y GcgR de péptidos X-PEG e Y-PEG, cada uno se administró durante un mes a ratones knock out en el receptor de GLP-1 (GLP-1R -/-) mantenidos a una dieta alta en grasas. El Péptido X-PEG causó una reducción de peso corporal (p> 0,05; Figuras 34A y 34B) y la masa grasa (p> 0,05; Figura 34C) en comparación con solución salina. El Péptido Y-PEG causó una disminución significativa en el peso corporal (p = 0,0025) y la masa grasa (p = 0,0025) en los ratones GLP-1R -/ (Figuras 34A-34C). El Péptido X-PEG no tuvo efecto sobre la ingesta de alimentos en ratones GLP-1R -/, mientras que el péptido Y-PEG suprimió la ingesta de alimentos de manera significativa (p = 0,017) (Figura 34D). El Péptido Y-PEG (pero no el péptido X-PEG) tenían una tendencia a aumentar la glucosa en sangre en un ensayo de tolerancia a la glucosa en ausencia de un GLP-1R funcional (p = 0,03) (Figuras 34E y 34F), lo que implica que el componente GLP-1 del coagonista es necesario para proteger contra la hiperglucemia inducida por el glucagón.
EJEMPLO 51
[0400] Como una evaluación independiente del efecto de los péptidos X-PEG y Y-PEG que puede ser atribuible a agonismo de glucagón, se estudiaron dos agonistas peptídicos adicionales con potencia de GLP-1R comparable, pero actividad GcgR marcadamente diferente. Los dos péptidos (péptidos U y V) están relacionados con los péptidos X-PEG y Y-PEG. Los péptidos U y V comprendían la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 con las siguientes modificaciones: Glu en la posición 16, Gln en la posición 17, Ala en la posición 18, Lys en la posición 20, Glu en la posición 21, Ile en la posición 23, y Cys en la posición 24, pero comprendía una pegilación de 20 kd en la Cys en la posición 24 y no comprendían AIB en la posición 2. El péptido V, además, comprendía una sustitución de Gln3 por Glu que reducía selectivamente el agonismo de glucagón en más de diez veces. Ni el Péptido U ni el péptido V comprendían un puente de lactama. El tratamiento de ratones DIO cada día durante una semana a 50 nmol/kg s.c. con Péptido V reveló un efecto reducido sobre el peso corporal que bajaba en relación con el Péptido U (-9,09 ± 0,80 vs. -13,71 ± 0,92 g, respectivamente (p < 0,0001; Figura 35A).
EJEMPLO 52
[0401] Se sintetizaron péptidos similares al glucagón que comprenden un grupo acilo graso C16 unido a un residuo de Lys a través de un espaciador -Glu o un espaciador dipéptido -Glu--Glu, donde el residuo de Lys se encuentra en la posición 10 o en el extremo C-terminal (en la posición 29), como se describe esencialmente en el presente documento. Los péptidos se ensayaron para determinar las actividades in vitro en los receptores de glucagón y GLP1 como se describe en el presente documento. Los resultados se muestran en la Tabla 31.
TABLA 31
Péptido
SEQ ID NO: EC50 (nM) en Receptor de Glucagón EC50 (nM) en Receptor de GLP1
Acilado AA
Espaciador
Chi-2, d-Ser2
Lys10 E 643 0,011 0,0014
Chi-2, d-Ser2
Lys10 E-E 644 0,008 0,003
Chi-2, AIB2
Lys10 E 645 0,025 0,0014
Chi-2, AIB2
Lys10 E-E 646 0,014 0,003
Chi-2, AIB2, E3
Lys10 Ninguno 647 46,084 0,0018
Chi-2, AIB2, E3
Lys10 E-E 648 2,922 0,005
Chi-2, AIB2, I7
Lys10 E 649 0,014 0,004
Chi-2, AIB2, I7
Lys10 E-E 650 0,007 0,024 (0,044*)
DMIA1, E16/K20 lactama
Lys10 E 651 0,019 0,010
DMIA1, E16/K20 lactama
Lys10 E-E 652 0,014 0,006
DMIA1, E16/K20 lactama
Lys29 E 653 0,107 0,004
DMIA1, E16/K20 lactama
Lys29 E-E 654 0,025 0,070
AIB2, AIB16, A18, D28
Lys10 E-E 655 0,003 0,004
AIB2, AIB16, A18, D28
Lys10 E 656 0,006 0,004
EJEMPLO 53
83
[0402] Los péptidos que se muestran en la Tabla 32 se sintetizaron como se describe esencialmente en el presente documento:
TABLA 32
Nombre del péptido
SEQ ID NO: Secuencia
Quimera-2 Aib2C24Mal40KPEG
624 H(Aib)QGTFTSDYSKYLDEQAAKEFICWLMNTamida
Quimera-2 Aib2E 16K20lactamC24Mal40KPEG
625 H(Aib)QGTFTSDYSKYLDEQAAKEFICWLMNTamida
Glucagón Aib2E 16K20lactamC24amidaMal40KPEG
626 H(Aib)QGTFTSDYSKYLDERRAKDFVCWLMNTamida lactama
Glucagón Dmia1E16K20lactamaC24Mal40KPEG
628 (Dmia)SQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVCWLMNT -amida lactama
Glucagón Dmia1E16K20lactamaC24Mal40KPEG
629 (Dmia)SQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVCWLMNT -OH lactama
Glucagón Dmia1E16K20lactamaC24tioeter40KPEG
630 (Dmia)SQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVCWLMNT -amida lactama
Quimera2 Aib2E3C24-Tioeter40K PEG
631 H(Aib)EGTFTSDYSKYLDEQAAKEFICWLMNTamida
Glucagón DMIA1, E3, E15, E16, K20, C24-Peg
632 (Dmia)SEGTFTSDYSKYLEERRAKDFVC(PEG40 K)WLMNT-amida
Glucagón Aib2Aib16C24K10(rErEC14)C24PEG40KTE)amida
633 H(Aib)QGTFTSDK(rErE-C14)SKYLDAibRRAQDFVC(PEG40KTE)WLMNT -ami
Glucagon Aib2Aib16K10(AAC14)C24PEG40K TE amida
634 H(Aib)QGTFTSDK(AA-C14)SKYLDAibRRAQDFVC(PEG40KTE)WLMNT -amida
Glucagon Aib2Aib16K10(AA-C16) amida
635 H(Aib)QGTFTSDK(AA-C14)SKYLDAibRRAQDFVC(PEG40KTE)WLMNT -amida
Glucagon Aib2Aib16K10(rErE-C16) amida
636 H(Aib)QGTFTSD K(rErE-C16)SKYLDAibRRAQDFVQWLMNT amida
[0403] Todos los péptidos de la Tabla 32 demostraron potentes actividades in vitro en los receptores de glucagón y GLP-1, a excepción de los péptidos de SEQ ID NOs: 624, 631, y 632
10 [0404] Los péptidos de la serie A que comprende la secuencia de aminoácidos del glucagón nativo (SEQ ID NO: 1) a excepción de los cambios descritos en la Tabla 33, se sintetizaron como se describe esencialmente en el presente documento.
TABLA 33
Protección de DPP-IV
Estabilización de Hélice Alfa Posición 3 Cadena principal* ¿Amida C-Terminal?
DMIA en posición 1
AIB en la posición 16 Gln (tipo salvaje) Tipo salvaje Sí
AIB en posición 2
AIB en la posición 16 Gln (tipo salvaje) Tipo salvaje Sí
d-Ser en posición 2
AIB en la posición 16 Gln (tipo salvaje) Tipo salvaje Sí
DMIA en posición 1
AIB en la posición 16 Glu Tipo salvaje Sí
AIB en posición 2
AIB en la posición 16 Glu Tipo salvaje Sí
d-Ser en posición 2
AIB en la posición 16 Glu Tipo salvaje Sí
DMIA en posición 1
AIB en la posición 16 y 20 Gln (tipo salvaje) Tipo salvaje Sí
AIB en posición 2
AIB en la posición 16 y 20 Gln (tipo salvaje) Tipo salvaje Sí
d-Ser en posición 2
AIB en la posición 16 y 20 Gln (tipo salvaje) Tipo salvaje Sí
DMIA en posición 1
AIB en la posición 16 y 20 Glu Tipo salvaje Sí
84 85
AIB en posición 2
AIB en la posición 16 y 20 Glu Tipo salvaje Sí
d-Ser en posición 2
AIB en la posición 16 y 20 Glu Tipo salvaje Sí
DMIA en posición 1
Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Gln (tipo salvaje) Tipo salvaje Sí
AIB en posición 2
Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Gln (tipo salvaje) Tipo salvaje Sí
d-Ser en posición 2
Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Gln (tipo salvaje) Tipo salvaje Sí
DMIA en posición 1
Puente de lactama entre las cadenas laterales de Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Gln (tipo salvaje) Tipo salvaje Sí
AIB en posición 2
Puente de lactama entre las cadenas laterales de Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Gln (tipo salvaje) Tipo salvaje Sí
d-Ser en posición 2
Puente de lactama entre las cadenas laterales de Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Gln (tipo salvaje) Tipo salvaje Sí
DMIA en posición 1
Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Glu Tipo salvaje Sí
AIB en posición 2
Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Glu Tipo salvaje Sí
d-Ser en posición 2
Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Glu Tipo salvaje Sí
DMIA en posición 1
Puente de lactama entre las cadenas laterales de Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Glu Tipo salvaje Sí
AIB en posición 2
Puente de lactama entre las cadenas laterales de Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Glu Tipo salvaje Sí
d-Ser en posición 2
Puente de lactama entre las cadenas laterales de Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Glu Tipo salvaje Sí
DMIA en posición 1
Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Gln (tipo salvaje) Quimera 2 Sí
AIB en posición 2
Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Gln (tipo salvaje) Quimera 2 Sí
d-Ser en posición 2
Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Gln (tipo salvaje) Quimera 2 Sí
DMIA en posición 1
Puente de lactama entre las cadenas laterales de Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Gln (tipo salvaje) Quimera 2 Sí
AIB en posición 2
Puente de lactama entre las cadenas laterales de Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Gln (tipo salvaje) Quimera 2 Sí
d-Ser en posición 2
Puente de lactama entre las cadenas laterales de Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Gln (tipo salvaje) Quimera 2 Sí
DMIA en posición 1
Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Glu Quimera 2 Sí
AIB en posición 2
Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Glu Quimera 2 Sí
d-Ser en posición 2
Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Glu Quimera 2 Sí
DMIA en posición 1
Puente de lactama entre las cadenas laterales de Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Glu Quimera 2 Sí
AIB en posición 2
Puente de lactama entre las cadenas laterales de Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Glu Quimera 2 Sí
d-Ser en posición 2
Puente de lactama entre las cadenas laterales de Glu en la posición 16 y Lys en la posición 20 Glu Quimera 2 Sí

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  1. imagen1
    imagen2
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