CN115636876A - 胰高血糖素样肽-2突变体的定向化学偶联物及其应用 - Google Patents

胰高血糖素样肽-2突变体的定向化学偶联物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术及制药领域，具体地，本发明涉及胰高血糖素样肽‑2突变体的定向化学偶联物及其应用。本发明提供胰高血糖素样肽‑2突变体及其定向化学修饰而成的偶联物。所述胰高血糖素样肽‑2突变体，在人胰高血糖素样肽‑2基础上进行多个位点突变和羧基端延伸，定向化学修饰位点的引入，使得所述胰高血糖素样肽‑2突变体与天然人胰高血糖素样肽‑2具有一致的生物学活性，同时显著延长体内半衰期，缩短给药频率，达到治疗或预防短肠综合征、化疗药物或放射性治疗因素导致的肠粘膜损伤，以及溃疡性肠炎、慢性肠炎和非炎症性肠损伤疾病的目的。

Description

胰高血糖素样肽-2突变体的定向化学偶联物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术及制药领域，具体地，本发明涉及胰高血糖素样肽-2突变体的定向化学偶联物及其应用。
背景技术
胰高血糖素样肽-2(glucagon-like peptide-2，GLP-2)基因包含于胰高血糖素原的基因(proglucagon，PG)序列。胰高血糖素原的基因翻译后表达为含有160个氨基酸的单链前体蛋白，前体蛋白在激素原转化酶(prohormoneconvertases，PCs)作用下，生成一系列具有不同生物活性的胰高血糖素原衍生肽(Proglucagon-derived peptide，PGDP)，包括：胰高血糖素(glucagon)、肠高血糖素相关肽(glicentin relative peptides，GRPP)、中间肽-1(Intervening peptide-1，IP-1)、中间肽-2(Intervening peptide-1,IP-2)、胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)和胰高血糖素样肽-2(glucagon-likepeptide-2,GLP-2)，GLP-2位于单链前体蛋白的第126至158位，由33个氨基酸残基组成。
胰高血糖素样肽-2(GLP-2)是人体肠道L型细胞分泌的一种肠道激素，在体内具有多重生物学作用，主要包括：(1)刺激肠粘膜隐窝细胞的增殖和抑制其凋亡，从而促进肠粘膜的生长及损伤后的再生修复((DG Burrin等，Am J PhysiolGastrointest LiverPhysiol 279(6):G1249-1256，2000))；(2)刺激小肠绒毛的增长，从而促进肠道对营养物质的吸收((PALLE BJ等，Gastrpenterology 120：806-815，2001)；(3)增加肠粘膜厚度，提高肠道的屏障功能(Cameron HL等，Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol284(6)：G905-12，2003)；(4)抑制胃酸的分泌和胃的运动((Meier JJ等，Gastrpenterology 130(1)：44-54，2006)；(5)增加肠道的血液供应(Bremholm L等，Scand J Gastroenterol.44(3)：314-9，2009)。
胰高血糖素样肽-2(GLP-2)在人体内以1-33序列的活性形式存在，也有水解后的GLP-2(3-33)存在，但无生物学活性。天然的hGLP-2在人体内的半衰期是7min(P BJeppesen等Teduglutide(ALX-0600),a dipeptidyl peptidase IV resistantglucagon-like peptide 2analogue,improves intestinalfunction in short bowel syndromepatients)，易被二酰肽肽酶IV(DPP-IV)水解成无活性的GLP-2(3-33)，无活性的GLP-2(3-33)在体内的半衰期只有27min，经过一系列降解反应最终被肾脏清除(WENDY TAVARES等Enzymatic-and renal-dependent catabolism of the intestinotropic hormoneglucagon-like peptide-2in rats)。为解决体内半衰期短的问题，NPS公司在hGLP-21-33基础上，将第2位的丙氨酸突变为甘氨酸，突变后的GLP-2类似物可以抵抗DPP-IV降解，延长体内半衰期至2h。NPS公司将这个GLP-2类似物命名为Teduglutide，病人可以按照0.05mg/Kg剂量每天进行一次皮下注射，该药物于2012年被FDA批准用于治疗成人短肠综合征，在2019年又被批准可用于治疗儿童短肠综合征。其给药频率为一天一次，降低了患者的依从性，长效GLP-2类似物的研发迫在眉睫。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供胰高血糖素样肽-2突变体及其定向化学修饰而成的偶联物。所述胰高血糖素样肽-2突变体，在人胰高血糖素样肽-2基础上进行多个位点突变和羧基端延伸，定向化学修饰位点的引入，使得所述胰高血糖素样肽-2突变体与天然人胰高血糖素样肽-2具有一致的生物学活性，同时显著延长体内半衰期，缩短给药频率，达到治疗或预防短肠综合征、化疗药物或放射性治疗因素导致的肠粘膜损伤，以及溃疡性肠炎、慢性肠炎和非炎症性肠损伤疾病的目的。
为此，本发明一方面提供了一种胰高血糖素样肽-2突变体。根据本发明的实施例，与野生型胰高血糖素样肽-2的氨基酸序列相比，所述胰高血糖素样肽-2突变体的氨基酸序列中第30位氨基酸为非赖氨酸的碱性氨基酸，
其中，所述野生型胰高血糖素样肽-2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
SEQ ID NO:9氨基酸序列如下：HADGS-FSDEM-NTILD-NLAAR-DFINW-LIQTK-ITD。
根据本发明的实施例，所述胰高血糖素样肽-2突变体还具有以下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述胰高血糖素样肽-2突变体具有p.Lys30Arg或p.Lys30His突变。
根据本发明的实施例，所述胰高血糖素样肽-2突变体进一步具有p.Ala2Gly或p.Ala2Aib突变。
鉴于现有的hGLP-2类似物的半衰期较短，影响药效以及给药频率较高，降低了患者的依从性的问题，发明人创造性的发现，基于SEQ ID NO:9所示的野生型高血糖素样肽-2的氨基酸序列，对第30位氨基酸进行特定的突变，不会影响hGLP-2的生物活性，且有利于hGLP-2突变体在体内半衰期的延长，若在此基础上对第2位氨基酸进行特定的突变，能够进一步的延长该胰高血糖素样肽-2突变体在体内的半衰期，提高药效。
根据本发明的实施例，所述胰高血糖素样肽-2突变体的氨基酸序列为：HX1DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX2ITD，
其中，X1为Gly或Aib，X2为Arg或His。
本发明另一方面提供了一种胰高血糖素样肽-2突变体衍生物。根据本发明的实施例，所述胰高血糖素样肽-2突变体衍生物包括所述胰高血糖素样肽-2突变体、延伸氨基酸序列以及赖氨酸Lys，所述胰高血糖素样肽-2突变体的羧基端与所述延伸氨基酸序列的氨基端相连，所述延伸氨基酸序列的羧基端与所述赖氨酸相连。
根据本发明的实施例，所述胰高血糖素样肽-2突变体衍生物还具有以下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述延伸氨基酸序列选自(Gm1Sn1)x1、(Sn2Gm2)x2、(Gm3Sn3Gm4)x3和(Sn4Gm5Sn5)x4中的至少之一，
其中，m1表示甘氨酸的数量，n1表示丝氨酸的数量，x1表示(Gm1Sn1)肽段的重复次数，m1、n1为1～4之间的任意整数，x1为1～3之间的任意整数，m1+n1＝5，优选地，m1＝4，n1＝1，x1＝1或2。
根据本发明的实施例，m2表示甘氨酸的数量，n2表示丝氨酸的数量，x2表示(Sn2Gm2)肽段的重复次数，m2、n2为1～4之间的任意整数，x2为1～3之间的任意整数，m2+n2＝5，优选地，x2＝1。
根据本发明的实施例，m3、m4表示甘氨酸的数量，n3表示丝氨酸的数量，x3表示(Gm3Sn3Gm4)肽段的重复次数，m3、m4、n3为1～3之间的任意整数，x3为1～3之间的任意整数，m3+m4+n3＝5。
根据本发明的实施例，m5表示甘氨酸的数量，n4、n5表示丝氨酸的数量，x4表示(Sn4Gm5Sn5)肽段的重复次数，m5、n4、n5为1～3之间的任意整数，x4为1～3之间的任意整数，m5+n4+n5＝5。
根据本发明的实施例，所述胰高血糖素样肽-2突变体衍生物的氨基酸序列为：HX1DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX2ITDX3K，
其中，X1为Gly或Aib，X2为Arg或His，(Gm1Sn1)x1，且m1表示甘氨酸的数量，n1表示丝氨酸的数量，x1表示(Gm1Sn1)肽段的重复次数，m1、n1为1～4之间的任意整数，x1为1～3之间的任意整数，m1+n1＝5，优选地，m1＝4，n1＝1，x1＝1或2。
根据本发明的实施例，所述胰高血糖素样肽-2突变体衍生物的氨基酸序列如SEQID NO:1-4所示。
本发明另一方面提供了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码所述的胰高血糖素样肽-2突变体或所述的胰高血糖素样肽-2突变体衍生物。
本发明另一方面提供了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体包含所述的核酸分子。
本发明另一方面提供了一种宿主细胞。根据本发明的实施例，所述宿主细胞包含所述的核酸分子或所述的表达载体或表达所述的胰高血糖素样肽-2突变体或所述的胰高血糖素样肽-2突变体衍生物。
本发明另一方面提供了制备所述的胰高血糖素样肽-2突变体或所述的胰高血糖素样肽-2突变体衍生物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
在适于表达所述胰高血糖素样肽-2突变体或所述胰高血糖素样肽-2突变体衍生物的条件下培养所述的宿主细胞，以便生产所述胰高血糖素样肽-2突变体或所述胰高血糖素样肽-2突变体衍生物。
本发明另一方面提供了一种胰高血糖素样肽-2突变体偶联物或其药学上可接受的盐。根据本发明的实施例，其包括所述的胰高血糖素样肽-2突变体衍生物以及偶联物，
其中，所述胰高血糖素样肽-2突变体衍生物的羧基端的Lys与所述偶联物通过酰胺键相连。
本发明提供一种胰高血糖素样肽-2突变体偶联物，通过将hGLP-2的Ala2和Lys30进行突变，将羧基端延伸5-15个氨基酸，在延伸氨基酸的羧基末端设计赖氨酸，用于定向化学偶联，形成一种长效胰高血糖素样肽-2突变体偶联物，具有更长的体内半衰期。
根据本发明的实施例，所述胰高血糖素样肽-2突变体偶联物或其药学上可接受的盐还具有以下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述偶联物选自脂肪酸偶联物和聚乙二醇的至少之一。
根据本发明的实施例，所述脂肪酸偶联物包括脂肪链和连接物，所述脂肪链和连接物相连接，其中，所述脂肪链结构通式为HOOC-(CH2)a-COOH，a为12～24的整数，优选地，a为16或18。
根据本发明的实施例，所述连接物结构通式为(17-氨基-10-氧代-3,6,12,15-四氧杂-9-氮杂十七烷酸)b-(γGlu)c，b为1或2，c为1或2，优选地，b为1，c为1。
根据本发明的实施例，所述脂肪链和所述连接物通过酰胺键相连。
根据本发明的实施例，所述聚乙二醇分子量为5KDa～40KDa，优选20KDa。
根据本发明的实施例，所述聚乙二醇为直链或支链结构，优选为直链结构。
根据本发明的实施例，所述聚乙二醇为具有活化基团的聚乙二醇，所述活化基团选自N-羟基琥珀酰亚胺或酰氯。
本发明另一方面提供了所述的胰高血糖素样肽-2突变体、所述的胰高血糖素样肽-2突变体衍生物、所述的胰高血糖素样肽-2突变体偶联物或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗和/或预防肠道相关疾病。
本发明提供的胰高血糖素样肽-2突变体是独特设计的分子结构，是与天然hGLP-2相同的生物活性，向后延伸的羧基末端设计赖氨酸作为偶联物定向化学修饰位点。本发明提供的胰高血糖素样肽-2突变体脂肪酸偶联物通过与白蛋白可逆的结合具有显著延长体内半衰期的作用，缩短给药频率为一周给药一次，达到治疗或预防短肠综合征、化疗药物或放射性治疗因素导致的肠粘膜损伤，以及溃疡性肠炎、慢性肠炎和非炎症性肠损伤疾病的目的。
根据本发明的实施例，所述肠道相关疾病包括选自短肠综合征、化疗或放疗引起的肠粘膜损伤、溃疡性肠炎、慢性肠炎和非炎症性肠损伤的至少之一。
所述短肠综合征包括但不限于由手术切除导致的短肠综合征。
本发明另一方面提供了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括所述的胰高血糖素样肽-2突变体和/或所述的胰高血糖素样肽-2突变体衍生物和/或所述的胰高血糖素样肽-2突变体偶联物或其药学上可接受的盐。
本发明提供的药物组合物具有刺激肠粘膜生长、预防肠损伤、促进肠粘膜损伤后修复的作用和治疗肠道相关疾病的作用。
根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括缓冲盐、赋形剂、保护剂中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述缓冲盐选自醋酸盐、磷酸盐、硼酸盐、碳酸盐中的至少之一，优选为磷酸盐。
根据本发明的实施例，所述赋形剂选自甘露醇、蔗糖、麦芽糖、海藻糖中的至少之一，优选为甘露醇和/或海藻糖。
根据本发明的实施例，所述保护剂包括但不限于His、Gly、Ala、Arg，优选为His。
根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括其他治疗或预防肠道相关疾病的药物或癌症化疗和/或放疗药物。
根据本发明的实施例，所述药物组合物的剂型选自注射液、丸剂、冻干粉、片剂、胶囊或颗粒。
根据本发明的实施例，患有肠道相关疾病的病人使用本发明提供的药物组合物，按0.01-0.5mg/Kg剂量，通过皮下注射的方式实现每周给药一次。
本发明另一方面提供了一种药物单剂型。根据本发明的实施例，所述药物单剂型含有0.1-10mg的所述的胰高血糖素样肽-2突变体、所述的胰高血糖素样肽-2突变体衍生物、所述的胰高血糖素样肽-2突变体偶联物或其药学上可接受的盐。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了PT01的LC-MS检测结果；
图2显示了PF01的LC-MS检测结果；
图3显示了PT02的LC-MS检测结果
图4显示了PF01肽图检测结果；
图5显示了PF04肽图检测结果；
图6显示了Teduglutide、PT01、PT02、PT03和PT04胰高血糖素样肽-2突变体的体外细胞活性；
图7显示了Teduglutide(Tedu)、PF01与PF04在肠道化疗损伤动物模型中CIT(瓜氨酸)的变化，Model作为对照组；
图8显示了Teduglutide(Ted)、PF01与PF04在5-FU致肠道疾病上的药效学研究相关病例切片；
图9显示了PF01在吲哚美辛致肠道疾病上的药效学研究-体重；
图10显示了PF01在吲哚美辛致肠道疾病上的药效学研究-血清瓜氨酸含量；
图11显示了PF01在吲哚美辛致肠道疾病上的药效学研究-血清α-酸性蛋白含量统计结果；
图12显示了PF01在吲哚美辛致肠道疾病上的药效学研究-小肠组织上清液中α-酸性蛋白含量统计结果，其中，No Indo是指未注射吲哚美辛的对照组；
图13显示了PF01在食蟹猴体内药代动力学药时曲线；
图14显示了实施例2中所用的十八碳脂肪酸偶联物的化学结构；
图15显示了实施例2中所用的聚乙二醇偶联物结构。
具体实施方式
本发明提供一种胰高血糖素样肽-2突变体偶联物，发明人对天然GLP-2氨基酸序列进行了改造，并将其与不同分子量和结构的修饰剂进行化学偶联，形成多种结构的候选偶联化合物。具体地，通过将hGLP-2的Ala2和Lys30进行突变，将羧基端延伸5-15个氨基酸，在延伸氨基酸的羧基末端设计赖氨酸，用于定向化学偶联，形成一种长效胰高血糖素样肽-2突变体偶联物，具有更长的体内半衰期。本发明还提供了脂肪酸定向化学偶联的偶联物及其药物组合物，以及它们在治疗短肠综合征、化疗或放疗引起的肠粘膜损伤、溃疡性肠炎、慢性肠炎和非炎症性肠损伤中的用途。
根据本发明的一个具体的实施例，本发明提供的胰高血糖素样肽-2突变体化学偶联物包括胰高血糖素样肽-2突变体和与其定向化学偶联的偶联物。
其中，所述胰高血糖素样肽-2突变体与天然hGLP-2受体具有相同的生物活性。
根据本发明的一个具体的实施例，所述胰高血糖素样肽-2突变体以hGLP-2为基础进行突变，突变位点包括Ala2、Lys30及羧基末端氨基酸的延伸以及在延伸肽段羧基末端设计Lys。所述Ala2位点的突变可以是天然或非天然氨基酸，优选为Gly或Aib，Lys30位点突变为非赖氨酸的其他碱性氨基酸，优选为Arg，延伸肽段羧基末端增加的Lys用于定向化学偶联。
根据本发明的一个具体的实施例，Asp33羧基末端延伸氨基酸数量为5-15个，延伸氨基酸符合(Gm1Sn1)x1、(Sn2Gm2)x2、(Gm3Sn3Gm4)x3或(Sn4Gm5Sn5)x4。
根据本发明的一个具体的实施例，在(Gm1Sn1)x1结构中，m1表示甘氨酸的数量，n1表示丝氨酸的数量，x1表示(Gm1Sn1)肽段的重复次数，m1、n1为1～4之间的任意整数，x1为1～3之间的任意整数，m1+n1＝5，优选地，m1＝4，n1＝1，x1＝1或2。
根据本发明的一个具体的实施例，在(Sn2Gm2)x2结构中，m2表示甘氨酸的数量，n2表示丝氨酸的数量，x2表示(Sn2Gm2)肽段的重复次数，m2、n2为1～4之间的任意整数，x2为1～3之间的任意整数，m2+n2＝5，优选地，x2＝1。
根据本发明的一个具体的实施例，在(Gm3Sn3Gm4)x3结构中，m3、m4表示甘氨酸的数量，n3表示丝氨酸的数量，x3表示(Gm3Sn3Gm4)肽段的重复次数，m3、m4、n3为1～3之间的任意整数，x3为1～3之间的任意整数，m3+m4+n3＝5。
根据本发明的一个具体的实施例，在(Sn4Gm5Sn5)x4结构中，m5表示甘氨酸的数量，n4、n5表示丝氨酸的数量，x4表示(Sn4Gm5Sn5)肽段的重复次数，m5、n4、n5为1～3之间的任意整数，x4为1～3之间的任意整数，m5+n4+n5＝5。
根据本发明的一个具体的实施例，所述胰高血糖素样肽-2突变体的偶联物可以是脂肪酸偶联物或聚乙二醇偶联物。
根据本发明的一个具体的实施例，所述脂肪酸偶联物由脂肪链和连接物偶联而成，脂肪链符合由HOOC-(CH2)a-COOH结构，a为12～24的整数，表示(CH2)基团的重复次数，优选为16或18；连接物符合(17-氨基-10-氧代-3,6,12,15-四氧杂-9-氮杂十七烷酸)b-(γGlu)c结构，其中b是整数1或2，表示17-氨基-10-氧代-3,6,12,15-四氧杂-9-氮杂十七烷酸串联个数，优选为1；c是整数1或2，表示γGlu串联个数，优选为1。
所述连接物的Glu-α氨基与脂肪链羧基偶联，Glu-γ羧基与17-氨基-10-氧代-3,6,12,15-四氧杂-9-氮杂十七烷酸的氨基偶联，17-氨基-10-氧代-3,6,12,15-四氧杂-9-氮杂十七烷酸的羧基与胰高血糖素样肽-2突变体羧基末端赖氨酸ε氨基偶联。所述连接物与脂肪链的偶联关系可以是一对一，或二对一，所述胰高血糖素样肽-2突变体与脂肪酸偶联物的偶联关系可以是一对一或二对一，优选为一对一。
脂肪酸偶联物与本发明提供的胰高血糖素样肽-2突变体羧基末端Lys通过形成酰胺键完成定向化学偶联成为胰高血糖素样肽-2突变体偶联物。所述γGlu与17-氨基-10-氧代-3,6,12,15-四氧杂-9-氮杂十七烷酸偶联时的活化基团优选为N-羟基琥珀酰亚胺或酰氯，所述γGlu与脂肪酸偶联时的活化基团优选为N-羟基琥珀酰亚胺或酰氯，所述脂肪酸偶联物与胰高血糖素样肽-2突变体偶联时的活化基团优选为N-羟基琥珀酰亚胺或酰氯。
根据本发明的一个具体的实施例，所述聚乙二醇为直连或支链结构，优选为直链结构，所述聚乙二醇分子量为5KDa-40KDa，优选为20KDa，所述聚乙二醇与胰高血糖素样肽-2突变体偶联时的活化基团优选为N-羟基琥珀酰亚胺或酰氯。
所述胰高血糖素样肽-2突变体与天然人胰高血糖素样肽-2具有一致的生物学活性。
根据本发明一个具体的实施例，含有胰高血糖素样肽-2突变体偶联物的药物组合物包含包括但不限于胰高血糖素样肽-2突变体偶联物、缓冲盐、赋形剂、保护剂，所述缓冲盐包括但不限于醋酸盐、磷酸盐、硼酸盐、碳酸盐，优选为磷酸盐，所述赋形剂包括但不限于甘露醇、蔗糖、麦芽糖、海藻糖，优选为甘露醇和海藻糖，所述保护剂包括但不限于His、Gly、Ala、Arg。优选为His。
根据本发明一个具体的实施例，所述药物组合物可以制成注射液或冻干粉，优选为冻干粉，所述冻干粉复溶后能静脉注射、肌肉注射或皮下注射，优选为皮下注射。
根据本发明一个具体的实施例，所述胰高血糖素样肽-2突变体偶联物具有刺激肠粘膜生长、预防代谢性肠损伤、促进并保护肠粘膜损伤后修复的作用。所述粘膜损伤疾病包括但不限于手术切除导致的肠粘膜损伤，化疗或放射性治疗导致的肠粘膜损伤，以及溃疡性肠炎。所述胰高血糖素样肽-2突变体偶联物的药物组合物具有较长的体内半衰期。
发明人发现，改造后的GLP-2突变体多肽，PT01、PT02、PT03、PT04，其体外活性与天然人胰高血糖素样肽-2一致，与偶联物化学偶联形成的候选化合物，增强了体内半衰期，显著延长了候选化合物在体内的作用时间。具体地，hGLP-2在人体内的半衰期是7min，Teduglutide在大鼠体内的半衰期是0.5h，在人体内的半衰期是2h，PF04在大鼠体内的半衰期是19h，PF01在大鼠体内的半衰期是21h，在食蟹猴体内的半衰期是30h。
PT01的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：
HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTRITDGGGGSK
PT02的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：
HAibDGS-FSDEM-NTILD-NLAAR-DFINW-LIQTR-ITD-GGGGSK
PT03的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：
HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTRITDGGGGSGGGGSK
PT04的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)：
HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTHITDGGGGSK
根据本发明一个具体的实施例，肠道相关疾病的患者使用本发明提供的药物组合物，通过皮下注射，实现每周给药1次，每次给药剂量为0.01mg-0.5mg/Kg之间。
本发明的胰高血糖素样肽-2突变体的脂肪酸化学偶联产物给药后具有刺激肠粘膜生长、促进肠粘膜损伤后修复的作用，药效明显，在0.01mg-0.5mg/Kg剂量范围内有明显的剂量效应关系。
定义：
本发明所述的“胰高血糖素样肽-2突变体”是通过基因工程技术将天然胰高血糖素样肽-2突变而成，术语中“类似物”是指与天然胰高血糖素样肽-2至少有50％的序列一致性，术语中“天然胰高血糖素样肽-2”是指人胰高血糖素样肽-2，其氨基酸序列为HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(SEQ ID NO:9)，术语中“突变”指通过基因工程技术更改、缺失、插入、增加某段基因序列，术语中“基因工程技术”是本领域普通技术人员所熟知的技术。
本发明所述“突变”、“改造”可以互换使用；
本发明所述“非天然氨基酸”是指不能通过重组表达的氨基酸；
本发明所述“Aib”，指2-氨基异丁酸，为非天然氨基酸；
本发明所述“非碱性氨基酸”是指除α氨基以外无其它氨基，或不能电离出NH4+的氨基酸；
本发明中术语“定向化学修饰”、“化学修饰”、“修饰”、“定向化学偶联”、“化学偶联”、“偶联”可以互换使用，指修饰剂的羧基与赖氨酸ε氨基共价结合，术语中“修饰剂”是指用于蛋白质和多肽药物修饰的多聚物，如脂肪酸、聚乙二醇、多肽衍生物等。
众所周知，脂肪酸两端各有一个羧基，通常会将其中一段羧基用叔丁醇封闭，另一端羧基用于活化。经过活化的脂肪酸是指带有官能团(或活化基团)的脂肪酸衍生物，目前主要用于蛋白质以及多肽药物修饰。
本发明中用于定向化学修饰胰高血糖素样肽-2突变体的脂肪酸为带有活化基团的脂肪酸。脂肪酸的活性基团包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺、N-酰基脲、酰氯、活性酯或其他高化学反应基团，在特定的实施方式中，脂肪酸的活性基团为N-羟基琥珀酰亚胺。
本发明所述“胰高血糖素样肽-2突变体与脂肪酸偶联物的偶联关系可以是一对一或二对一，优选为一对一”，其中“一对一”指一个胰高血糖素样肽-2突变体与一个脂肪酸偶联物共价结合，其中“二对一”指两个胰高血糖素样肽-2突变体与一个脂肪酸偶联物共价结合。
本发明所述“候选化合物”、“偶联产物”、“偶联物”可以互换使用，指胰高血糖素样肽-2突变体偶联修饰剂后的产物。
本发明所述“裸肽”指未经过修饰的多肽或蛋白质。
本发明所述“十八碳脂肪酸修饰剂”、“十八碳修饰剂”、“18C”可以互换使用，指碳链骨架为十八碳。
本发明所述“十六碳脂肪酸修饰剂”、“十六碳修饰剂”、“16C”可以互换使用，指碳链骨架为十六碳。
本发明所述“十四碳脂肪酸修饰剂”、“十四碳修饰剂”、“14C”可以互换使用，指碳链骨架为十四碳。
本发明所述“二肽”指His-Aib肽，His表示组氨酸，Aib表示2-氨基异丁酸。
除非另有定义，本发明使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义，关于本领域的定义及术语，专业人员可以参考Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel)，氨基酸残基的缩写是本领域普通技术人员熟知的20个常用L-型氨基酸中的标准三字母或一字母代码。
本发明中胰高血糖素样肽-2突变体的定向化学偶联产物可单独或联合用于治疗血清瓜氨酸含量减少的肠道疾病。所述的肠道疾病，包括但不限于短肠综合征、化疗或放疗引起的肠损伤、肠功能不全导致的肠炎等。
本发明中胰高血糖素样肽-2突变体用作药物治疗因化疗导致的肠炎，患者可以是模式动物、儿童或成人代表，在具体的实施方案中，该偶联物可单独或联合使用，具有显著的促进小肠功能增强的作用。
本发明中所述胰高血糖素样肽-2突变体的定向化学偶联产物可以作为肠外营养支持的配合用药，具有改善肠道功能，增强肠道吸收的作用。
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。另外，本发明引用了公开文献或专利，这些文献及专利是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
本发明所述胰高血糖素样肽-2突变体可以采用重组表达、化学合成或两者结合的方式制备，所述重组表达用菌株包括但不限于大肠杆菌、酵母。
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1胰高血糖素样肽-2突变体的制备
PT01制备：根据SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,结合大肠杆菌偏爱密码子，设计SEQ ID NO:6核酸序列，用SEQ ID NO:6序列构建表达载体pet-9a质粒SEQ ID NO:6编码SEQID NO:1氨基酸序列)，将构建好的正确表达质粒转化大肠杆菌宿主菌，筛选获得重组表达菌株，重组菌株接种于YT培养液，经IPTG诱导后发酵培养，发酵液离心后收集菌体，-20℃保存备用。
发酵菌体经裂解后，利用一系列纯化层析柱和方法分离和浓缩PT01蛋白。简而言之，PT01吸附于离子交换树脂层析柱，用不同盐浓度洗脱，收集洗脱样品，通过反相色谱柱纯化，逐步提高流动相中有机溶剂含量进行线性梯度洗脱，收集含有PT01样品的流出液，冷冻干燥获得PT01原料。HPLC评估PT01原料的纯度大于98％，LC-MS验证PT01原料的分子量和氨基酸序列与理论值相同(如附图1所示)。
PT03制备方式和PT04制备方式均参考PT01的制备。
PT02制备：用核酸序列SEQ ID NO:7构建表达载体质粒(SEQ ID NO:7编码SEQ IDNO:8所示氨基酸序列)，将构建好的正确表达质粒转化大肠杆菌表达宿主菌，筛选获得重组表达菌株，重组菌株接种于YT培养基，经IPTG诱导后发酵培养，发酵液离心后收集菌体，-20℃保存备用。
发酵菌体经裂解后，利用一系列纯化层析柱和方法分离和浓缩PT02前蛋白。简而言之，PT02前蛋白吸附于离子交换树脂层析柱，用不同盐浓度洗脱，收集洗脱样品，通过反相色谱柱纯化，逐步提高流动相中有机溶剂含量进行线性梯度洗脱，收集含有PT02前蛋白的流出液，冷冻干燥获得PT02前蛋白干粉。HPLC测定PT02前蛋白的纯度大于98％，LC-MS验证PT02前蛋白的分子量和氨基酸序列与理论值相同。在碳酸盐缓冲中，缓冲离子强度为20-200mmol/L，修饰pH为9.0-11.0，蛋白浓度为5.0-25.0mg/ml，按摩尔比PT02前蛋白：二肽(His-Aib肽)＝1:1.2投入二肽(购买于成都普康生物科技有限公司)，室温下搅拌反应1-3h，通过反相硅胶柱层析除去游离的PT02前蛋白和游离的二肽，冷冻干燥获得PT02原料，HPLC评估PT02原料的纯度大于98％，LC-MS验证PT02原料的分子量与理论值相同(如图3所示)。
以下表1显示了本发明的部分胰高血糖素样肽-2突变体以及Teduglutide的氨基酸序列
Figure BDA0003171475460000081
Figure BDA0003171475460000091
SEQ ID NO:6核酸序列(编码SEQ ID NO:1氨基酸序列)如下：
5'-CATGGTGATGGTTCTTTTTCTGATGAAATGAATACTATTCTTGATAATCTTGCTGCTCGTGATTTTATTAATTGGCTTATTCAAACTCGTATTACTGATGGTGGTGGTGGTTCTAAA-3'
SEQ ID NO:7核酸序列(编码SEQ ID NO:8氨基酸序列)如下：
5'-GATGGTTCTTTTTCTGATGAAATGAATACTATTCTTGATAATCTTGCTGCTCGTGATTTTATTAATTGGCTTATTCAAACTCGTATTACTGATGGTGGTGGTGGTTCTAAA-3'
SEQ ID NO:8氨基酸序列如下：
DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTRITDGGGGSK
实施例2：胰高血糖素样肽-2突变体偶联物的制备
PF01制备：称量100mg PT01原料(重庆派金生物科技有限公司生产)于100ml烧杯，用10ml pH10.5的0.1mol/L碳酸盐溶液溶解，按摩尔比PT01：十八碳脂肪酸偶联物＝1:1.2加入540mg十八碳脂肪酸偶联物(购买于成都普康生物科技有限公司，十八碳脂肪酸偶联物结构如附图14所示)，25℃条件下搅拌反应1h，1mol/L HCl溶液调pH4.5终止反应，离心收集沉淀，加入适量的三氟乙酸搅拌反应1-2h，Tris缓冲溶解后挂载离子交换色谱柱，用不同浓度的盐洗脱，收集洗脱样品，用反相色谱柱对样品进行精纯化，RP-HPLC检测样品纯度>98％，LC-MS鉴定目标产物分子量与理论值一致(图2)，Trypsin蛋白酶与V8酶双酶切PF01，LC-MS鉴定十八碳脂肪酸偶联物偶联位点是羧基末端赖氨酸(图4中PF01肽图检测结果)。将PF01样品液低温冷冻干燥，收集样品保存在-15℃以下备用。
PF02制备方式和PF03制备方式均参考PF01的制备。
PF04制备：称量100mg PT01原料(重庆派金生物科技有限公司生产)于100ml烧杯，用10ml pH9.5的0.1mol/L碳酸盐溶液溶解，按摩尔比PT01：聚乙二醇偶联物＝1:1.2加入568mg聚乙二醇偶联物(购买于厦门赛诺邦格科技有限公司，结构如附图15所示)，25℃条件下搅拌反应1h，1mol/L HCl溶液调pH4.5终止反应，1mol/L Tris缓冲调pH7.5，挂载离子交换色谱柱，用不同浓度的盐洗脱，收集洗脱样品，用分子筛色谱柱对样品进行精纯化，RP-HPLC检测样品纯度>98％，Trypsin蛋白酶酶切PF04，LC-MS鉴定聚乙二醇偶联物偶联位点是羧基末端赖氨酸(图5中PF04肽图检测结果)。将PF04样品液低温冷冻干燥，收集干粉保存在-15℃以下备用。
表2：胰高血糖素样肽-2突变体PT01以及突变体偶联物的分子量测定
名称 结构 理论分子量 实测分子量 偶联位点
PT01 SEQ ID NO:1 4223.60 4223.51 —
PF01 PT01+十八碳脂肪酸偶联物 4939.60 4938.00 Lys
PF02 PT01+十六碳脂肪酸偶联物 4590.60 4549.26 Lys
PF03 PT01+十四碳脂肪酸偶联物 4434.04 4434.97 Lys
PF04 PT01+聚乙二醇偶联物 28411.20 — Lys
以上表2中LC-MS鉴定结果显示，PT01、PF01、PF02、PF03、PF04的实测分子量与理论值基本一致，并且鉴定出PF01、PF02、PF03、PF04中PT01与偶联物之间通过Lys偶联位点连接。
实施例3：胰高血糖素样肽-2突变体的体外细胞活性测定
取HEK-293-GLP-2R细胞(HEK-293细胞购买于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，GLP-2R受体基因序列由上海生博生物医药科技有限公司重组构建，重庆派金生物科技有限公司经转染筛选得HEK-293-GLP-2R细胞)测定胰高血糖素样肽-2突变体的体外活性。将实施例1中制备获得的胰高血糖样肽2突变体PT01、PT02、PT03、PT04和Teduglutide(NPS公司)分别用含1mM IBMX的稀释液将待测样品稀释到500ng/ml，以3倍倍比稀释8个梯度，再转移至含有生长状态良好的受体细胞的细胞培养孔，37℃、5％CO2培养15分钟。加入细胞裂解液，提取细胞裂解液并用cAMP检测试剂盒(RD公司)测定cAMP的OD值，利用“Originpro 2017”参数回归软件计算Teduglutide和胰高血糖素样肽-2突变体的EC50值，以检测其体外细胞活性。各样品体外细胞活性检测结果如表3所示。
表3：胰高血糖素样肽-2突变体的体外细胞活性
样品名称 氨基酸序列 EC50
Teduglutide HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD 100％
PT01 HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTRITDGGGGSK 125％
PT02 HAibDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTRITDGGGGSK 91％
PT03 HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTRITDGGGGSGGGGSK 118％
PT04 HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTHITDGGGGSK 109％
由表3结果可知，以Teduglutide体外细胞活性作为标准，PT01、PT03和PT04的体外细胞活性是Teduglutide的105％-130％。PT02的体外细胞活性与Teduglutide相当。
图6显示了Teduglutide、PT01、PT02、PT03和PT04的EC50曲线，曲线显示的活性趋势与表3的活性数据表现的趋势基本一致。
实施例4：胰高血糖素样肽-2突变体偶联物冻干粉制剂的制备
PF01制剂：配制磷酸盐缓冲溶液，加入His保护剂和甘露醇赋形剂搅拌溶解。磷酸盐浓度为35mmol/L，His浓度为50mmol/L，甘露醇含量为3％。称量100mg实施例2制备的PF01原料于100ml洁净烧杯，加入含有His和甘露醇的磷酸盐溶液搅拌溶解，用HCl或NaOH调解溶液pH至7.4±0.2。测定蛋白含量，无菌过滤后分装至西林瓶，低温冷冻干燥获得PF01制剂，轧盖贴签置于8℃以下保存备用。
PF04制剂的制备方式参考PF01制剂的制备方式(PF04由实施例2制备方法制得)。
实施例5：PF01、PF04促小肠增生实验
将Teduglutide(购买于NPS公司)、PF01制剂、PF04制剂和安慰剂用于小鼠实验，评价PF01促进小肠增生的效果。取40只未成年的昆明小鼠，体重10-20g，平均分成3组，每组10只。设置对照组每天皮下施用安慰剂，连续给药9d，Ted组按每天一次1mg/Kg皮下给药，连续给药9d，PF01组和PF04组按每三天给药一次3mg/Kg，一共给药3次。所有实验动物分别在给药前称量体重，给药后第10d称量体重、采血、测定小肠长度和小肠重量。
表4：PF01、PF04促进未成年小鼠小肠增长的实验结果
Figure BDA0003171475460000101
Figure BDA0003171475460000111
由表4可知，PF01组和PF04在小鼠体重、血清瓜氨酸和小肠长度、小肠重量指标上均优于Teduglutide组，其中PF01最优，3个给药组均优于对照组。
实施例6：PF01和PF04在5-FU致肠道疾病上的药效学研究
将Teduglutide(购买于NPS公司)、PF01、PF04和安慰剂用于大鼠实验，评价PF01和PF04在5-FU引起的大鼠腹泻和肠黏膜损伤模型上的疗效。取40只成年的SD大鼠，体重200-300g，平均分成4组，每组10只。设置Model组每天皮下施用安慰剂，连续给药9d，Ted组按每天一次1mg/Kg皮下给药，连续给药9d，PF01组和PF04组按每三天给药一次3mg/Kg，一共给药3次。所有大鼠分别在第4-6d按每天一次50mg/Kg腹腔注射5-FU，第一次给予5-FU后每天记录大鼠腹泻情况和体重变化，在第10d分别称量体重、采血、取空肠做病例切片。体重统计数据如表5所示，病例切片如图8所示。
腹泻情况按照分数进行标识，0分：不腹泻，1分：轻度腹泻，肛门上有粪便粘附，2分：中度腹泻，后腿和尾巴有粪便粘附，3分：重度腹泻，前腿和腹部有粪便粘附，4分：死亡。根据实验记录，统计结果如表5所示。
表5：PF01和PF04在大鼠模型中的药效评价
Figure BDA0003171475460000112
表6：各组腹泻情况得分统计
Figure BDA0003171475460000113
表6中分子表示腹泻得分，分母表示腹泻动物数量
表7各组血清瓜氨酸含量
Figure BDA0003171475460000114
Figure BDA0003171475460000121
图7显示了Teduglutide、PF01与PF04在肠道化疗损伤动物模型中CIT的变化。化疗前、化疗后48h及化疗后144h的变化趋势是一致的：PF01组瓜氨酸含量>PF04组>Ted组>Model组，化疗后96h，PF01组瓜氨酸含量与PF04组和Ted组基本一致，均高于Model组。
上述实验结果显示，在使用5-FU建立的肠道化疗损伤动物模型中，随着造模和给药进程，PF01与PF04均能明显减少由造模引起的体重降低、腹泻、血清瓜氨酸降低，并在造模后加快模型大鼠的体重和血清瓜氨酸水平的恢复。以上药效学作用均显著优于Ted组，其中PF01最优。检测结果与病例切片(图8)结果对应，病例切片从绒毛高度和隐窝细胞数量上判断，PF01组>PF04组>Ted组>对照组。
通过大鼠体重、腹泻、血清瓜氨酸含量、病例切片等指标判断，PF01在预防或治疗由5-FU药物引起的肠道疾病时的疗效均优于Ted，且PF01给药频率更低。说明PF01在预防或治疗因化疗药物引起的腹泻和肠粘膜损伤等肠道疾病时具显著的治疗效果。
实施例7：PF01在吲哚美辛致肠道疾病上的药效学研究
将Teduglutide(购买于NPS公司)、PF01和安慰剂用于大鼠实验，评价PF01在吲哚美辛引起的大鼠腹泻和肠黏膜损伤模型上的疗效。取40只成年的SD大鼠，体重200-300g，平均分成4组，每组10只。设置模型组、Ted组、PF1低剂量组、PF1高剂量组。模型组每天皮下给予等体积的PBS，连续给药12d，Ted组按每天一次0.6mg/Kg皮下给药，连续给药12d，PF01低剂量组按每三天给药一次0.6mg/Kg，一共给药4次，PF01高剂量组按每三天给药一次2.0mg/Kg，一共给药4次。所有组别大鼠分别在第4-5d按每天一次7mg/Kg单次腹腔注射吲哚美辛，首次给予吲哚美辛后每天记录大鼠体重变化，在第12d分别称量体重、采血、取空肠组织，测定血清中瓜氨酸含量，测定血清中α-酸性蛋白含量，测定小肠组织上清液中α-酸性蛋白含量。体重变化如图9所示，血清瓜氨酸含量统计结果如图10所示，血清α-酸性蛋白(α1-AGP)含量统计结果如图11所示，小肠组织上清液中α-酸性蛋白含量统计结果如图12所示。
实验结果显示，在使用吲哚美辛建立的肠道炎症动物模型中，随着造模和给药进程，PF01能够明显缓解由造模引起的体重降低、肠道组织及血清中α-酸性蛋白含量升高、血清瓜氨酸降低，并在造模后加快模型大鼠的体重和血清瓜氨酸水平的恢复。以上药效学作用均显著优于Ted组。
通过大鼠体重、血清瓜氨酸含量、血清α-酸性蛋白含量、小肠组织上清液中α-酸性蛋白含量指标判断，PF01在预防或治疗由吲哚美辛药物引起的肠道疾病时的疗效均优于Ted，且PF01给药频率更低。说明PF01在治疗药物引起的溃疡性肠炎等肠道疾病时具显著的治疗效果。
实施例8：PF01与PF04在大鼠体内的药代动力学研究
取10只成年的SD大鼠，体重200-300g，平均分成2组，每组5只。分别按照3mg/Kg单次皮下给药PF01和PF04。所有大鼠分别在给药前、给药后8h、24h、48h、72h、96h采集血清样本，用ELISA法测定血药浓度。
PF01与PF04在大鼠体内的Tmax基本一致，PF01在大鼠体内的T1/2为20.28h，PF04在大鼠体内的T1/2为17.63h，PF01在大鼠体内的Cmax为67.48μg/ml，PF04在大鼠体内的Cmax为57.28μg/ml。
实施例9：PF01在食蟹猴体内的药代动力学研究
取4只成年食蟹猴，雌雄各半。通过皮下注射的方式按0.05mg/Kg剂量单次给药PF01。动物于给药前、给药后4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、192h、288h的时间点采集血样，采用LC-MS/MS方法检测样本中PF01的浓度，使用代谢动力学数据分析软件WinNonlin对血浆浓度数据进行分析，图13显示了PF01在食蟹猴体内药代动力学药时曲线。利用非房室模型法(NCA)计算t1/2、Cmax、Tmax、AUC、Cl、Vd等。
实验结果可知，PF01在食蟹猴体内的T1/2、Cmax、Tmax平均值分别为30.92h、458.91ng/ml、12h。Cl平均值为2.27ml/h/kg，Vd平均值为101.13ml/kg，AUC为21.71h·μg/ml。从T1/2判断，PF01药物的体内半衰期比天然hGLP-2延长约100倍。本发明提供的胰高血糖素样肽-2突变体偶联物大大提高了胰高血糖素样肽-2在动物体内的半衰期。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆派金生物科技有限公司
<120> 胰高血糖素样肽-2突变体的定向化学偶联物及其应用
<130> BI3210524
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PT01的氨基酸序列
<400> 1
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Arg Ile Thr
20 25 30
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Lys
35
<210> 2
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PT02的氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2)
<223> 第1位氨基酸和第2位氨基酸之间插入Aib
<400> 2
His Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn Leu
1 5 10 15
Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Arg Ile Thr Asp
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Ser Lys
35
<210> 3
<211> 44
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PT03的氨基酸序列
<400> 3
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Arg Ile Thr
20 25 30
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys
35 40
<210> 4
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PT04的氨基酸序列
<400> 4
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr His Ile Thr
20 25 30
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Lys
35
<210> 5
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Teduglutide的氨基酸序列
<400> 5
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210> 6
<211> 117
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码PT01氨基酸序列的核酸序列
<400> 6
catggtgatg gttctttttc tgatgaaatg aatactattc ttgataatct tgctgctcgt 60
gattttatta attggcttat tcaaactcgt attactgatg gtggtggtgg ttctaaa 117
<210> 7
<211> 111
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码PT02前蛋白的核酸序列
<400> 7
gatggttctt tttctgatga aatgaatact attcttgata atcttgctgc tcgtgatttt 60
attaattggc ttattcaaac tcgtattact gatggtggtg gtggttctaa a 111
<210> 8
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PT02前蛋白的氨基酸序列
<400> 8
Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn Leu Ala
1 5 10 15
Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Arg Ile Thr Asp Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Lys
35
<210> 9
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 野生型胰高血糖素样肽-2的氨基酸序列
<400> 9
His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp

Claims (23)

1.一种胰高血糖素样肽-2突变体，其特征在于，与野生型胰高血糖素样肽-2的氨基酸序列相比，所述胰高血糖素样肽-2突变体的氨基酸序列中第30位氨基酸为非赖氨酸的碱性氨基酸，
其中，所述野生型胰高血糖素样肽-2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
2.根据权利要求1所述的胰高血糖素样肽-2突变体，其特征在于，所述胰高血糖素样肽-2突变体具有p.Lys30Arg或p.Lys30His突变。
3.根据权利要求1或2所述的胰高血糖素样肽-2突变体，其特征在于，所述胰高血糖素样肽-2突变体进一步具有p.Ala2Gly或p.Ala2Aib突变。
4.根据权利要求3所述的胰高血糖素样肽-2突变体，其特征在于，所述胰高血糖素样肽-2突变体的氨基酸序列为：HX1DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX2ITD，
其中，X1为Gly或Aib，X2为Arg或His。
5.一种胰高血糖素样肽-2突变体衍生物，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的胰高血糖素样肽-2突变体、延伸氨基酸序列以及赖氨酸Lys，所述胰高血糖素样肽-2突变体的羧基端与所述延伸氨基酸序列的氨基端相连，所述延伸氨基酸序列的羧基端与所述赖氨酸相连。
6.根据权利要求5所述的胰高血糖素样肽-2突变体衍生物，其特征在于，所述延伸氨基酸序列选自(Gm1Sn1)x1、(Sn2Gm2)x2、(Gm3Sn3Gm4)x3和(Sn4Gm5Sn5)x4中的至少之一，
其中，m1表示甘氨酸的数量，n1表示丝氨酸的数量，x1表示(Gm1Sn1)肽段的重复次数，m1、n1为1～4之间的任意整数，x1为1～3之间的任意整数，m1+n1＝5，优选地，m1＝4，n1＝1，x1＝1或2；
任选地，m2表示甘氨酸的数量，n2表示丝氨酸的数量，x2表示(Sn2Gm2)肽段的重复次数，m2、n2为1～4之间的任意整数，x2为1～3之间的任意整数，m2+n2＝5，优选地，x2＝1；
任选地，m3、m4表示甘氨酸的数量，n3表示丝氨酸的数量，x3表示(Gm3Sn3Gm4)肽段的重复次数，m3、m4、n3为1～3之间的任意整数，x3为1～3之间的任意整数，m3+m4+n3＝5；
任选地，m5表示甘氨酸的数量，n4、n5表示丝氨酸的数量，x4表示(Sn4Gm5Sn5)肽段的重复次数，m5、n4、n5为1～3之间的任意整数，x4为1～3之间的任意整数，m5+n4+n5＝5。
7.根据权利要求5所述的胰高血糖素样肽-2突变体衍生物，其特征在于，所述胰高血糖素样肽-2突变体衍生物的氨基酸序列为：HX1DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX2ITDX3K，
其中，X1为Gly或Aib，X2为Arg或His，(Gm1Sn1)x1，且m1表示甘氨酸的数量，n1表示丝氨酸的数量，x1表示(Gm1Sn1)肽段的重复次数，m1、n1为1～4之间的任意整数，x1为1～3之间的任意整数，m1+n1＝5，优选地，m1＝4，n1＝1，x1＝1或2。
8.根据权利要求5所述的胰高血糖素样肽-2突变体衍生物，其特征在于，所述胰高血糖素样肽-2突变体衍生物的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-4所示。
9.一种核酸分子，其特征在于，编码权利要求1～4中任一项所述的胰高血糖素样肽-2突变体或权利要求5～8中任一项所述的胰高血糖素样肽-2突变体衍生物。
10.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求9所述的核酸分子。
11.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求9所述的核酸分子或权利要求10所述的表达载体或表达权利要求1～4中任一项所述的胰高血糖素样肽-2突变体或权利要求5～8中任一项所述的胰高血糖素样肽-2突变体衍生物。
12.制备权利要求1～4中任一项所述的胰高血糖素样肽-2突变体或权利要求5～8中任一项所述的胰高血糖素样肽-2突变体衍生物的方法，其特在于，所述方法包括：
在适于表达所述胰高血糖素样肽-2突变体或所述胰高血糖素样肽-2突变体衍生物的条件下培养权利要求11所述的宿主细胞，以便生产所述胰高血糖素样肽-2突变体或所述胰高血糖素样肽-2突变体衍生物。
13.一种胰高血糖素样肽-2突变体偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，包括权利要求5～8中任一项所述的胰高血糖素样肽-2突变体衍生物以及偶联物，
其中，所述胰高血糖素样肽-2突变体衍生物的羧基端的Lys与所述偶联物通过酰胺键相连。
14.根据权利要求13所述的胰高血糖素样肽-2突变体偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述偶联物选自脂肪酸偶联物和聚乙二醇的至少之一。
15.根据权利要求14所述的胰高血糖素样肽-2突变体偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述脂肪酸偶联物包括脂肪链和连接物，所述脂肪链和连接物相连接，其中，所述脂肪链结构通式为HOOC-(CH2)a-COOH，a为12～24的整数，优选地，a为16或18；
任选地，所述连接物结构通式为(17-氨基-10-氧代-3,6,12,15-四氧杂-9-氮杂十七烷酸)b-(γGlu)c，b为1或2，c为1或2，优选地，b为1，c为1；
任选地，所述脂肪链和所述连接物通过酰胺键相连。
16.根据权利要求13所述的胰高血糖素样肽-2突变体偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述聚乙二醇分子量为5KDa～40KDa，
任选地，所述聚乙二醇为直链或支链结构，优选为直链结构，
任选地，所述聚乙二醇为具有活化基团的聚乙二醇，所述活化基团选自N-羟基琥珀酰亚胺或酰氯。
17.权利要求1～4中任一项所述的胰高血糖素样肽-2突变体、权利要求5～8中任一项所述的胰高血糖素样肽-2突变体衍生物、权利要求13～16中任一项所述的胰高血糖素样肽-2突变体偶联物或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防肠道相关疾病。
18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于，所述肠道相关疾病包括选自短肠综合征、化疗或放疗引起的肠粘膜损伤、溃疡性肠炎、慢性肠炎和非炎症性肠损伤的至少之一。
19.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1～4中任一项所述的胰高血糖素样肽-2突变体和/或权利要求5～8中任一项所述的胰高血糖素样肽-2突变体衍生物和/或权利要求13～16中任一项所述的胰高血糖素样肽-2突变体偶联物或其药学上可接受的盐。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物进一步包括缓冲盐、赋形剂、保护剂中的至少之一，
任选地，所述缓冲盐选自醋酸盐、磷酸盐、硼酸盐、碳酸盐中的至少之一，优选为磷酸盐，
任选地，所述赋形剂选自甘露醇、蔗糖、麦芽糖、海藻糖中的至少之一，优选为甘露醇和/或海藻糖，
任选地，所述保护剂包括但不限于His、Gly、Ala、Arg，优选为His。
21.根据权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，进一步包括其他治疗或预防肠道相关疾病的药物或癌症化疗和/或放疗药物。
22.根据权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型选自注射液、丸剂、冻干粉、片剂、胶囊或颗粒。
23.一种药物单剂型，其特征在于，其含有0.1-10mg的权利要求1～4中任一项所述的胰高血糖素样肽-2突变体、权利要求5～8中任一项所述的胰高血糖素样肽-2突变体衍生物、权利要求13～16中任一项所述的胰高血糖素样肽-2突变体偶联物或其药学上可接受的盐。
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