JP6861641B2 - グルカゴン受容体アンタゴニスト抗体を用いた肥満症および非アルコール性脂肪性肝疾患または非アルコール性脂肪性肝炎を治療するための方法 - Google Patents

グルカゴン受容体アンタゴニスト抗体を用いた肥満症および非アルコール性脂肪性肝疾患または非アルコール性脂肪性肝炎を治療するための方法 Download PDF

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Description

関連特許出願
本出願は、参照によりその全体が本明細書に援用される２０１５年４月２日に出願された米国仮出願第６２／１４２，２５７号の利益を主張するものである。
肥満症は脂肪組織量の過剰な蓄積をもたらす食欲抑制および／または代謝の複合的な医学的障害である。肥満症は重要な臨床的問題であり、西洋文化においては流行病になりつつあり、米国の１／３を超える成人集団に影響を与えている。合衆国内の約９７，０００，０００人の成人が過体重または肥満であると推定されている。さらに肥満症は早期死亡にも関連しており、脳卒中、心筋梗塞、うっ血性心不全、冠動脈心疾患、および突然死による死亡率および罹患率の有意な増加と関連している。また肥満症は、他の疾患とは独立して、および他の疾患と合併して、多くの健康問題を悪化させる。肥満症治療の主な目的は、過剰な体重の減少、肥満症が関連する罹患率および死亡率の改善または防止、並びに長期に亘る体重減少の維持である。
肥満症の流行に伴い、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）（そのより攻撃的な形態である非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を含む）も流行比率を増加させている（Sowers JR et al., Cardiorenal Med, 1:5-12, 2011）。米国におけるフルクトース消費量が過去３０年間で倍以上に増えていることから、肥満症およびＮＡＦＬＤの著しい増加は、一つには、多量の脂肪および糖（例えば、スクロースまたはフルクトース）を含有する西洋食（ＷＤ）の消費に原因があるようである（Barrera et al, Clin Liver Dis, 18:91-112, 2014）。ＮＡＦＬＤは、アルコールをほとんど消費しない個人に生じる肝臓の大滴性脂肪症を特徴とする。ＮＡＦＬＤの組織学的スペクトルには、脂肪症単独、脂肪肝および炎症の存在が含まれる。ＮＡＳＨは、肝臓における過剰な脂肪蓄積を特徴とするより重篤な慢性肝疾患であるが、未だ完全には理解されていない理由から、慢性炎症を誘導し、それにより進行性線維症（瘢痕）をもたらし、それにより肝硬変、肝細胞癌（ＨＣＣ）、最終的には肝不全および死亡に至らしめるものである（Brunt et al., Am. J. Gastroenterol. 94:2467-2474, 1999; Brunt, Semin. Liver Dis. 21:3-16, 2001; Takahashi Y et al., World J Gastroenterol, 18:2300-2308, 2012）。
ＮＡＳＨは蔓延がますます進み、アメリカ人の２％〜５％および世界人口の２％〜３％に発症している（Neuschwander-Tetri BA, Am J MEd Sci, 330:326-335, 2005）が、その根本原因は未だ不明である。ＮＡＳＨは中年の過体重または肥満である人に最も頻繁に発生する。多くのＮＡＳＨ患者が血液脂質（例えば、コレステロールおよびトリグリセリド）の増加、高インスリン血症、インスリン抵抗性を有しており、多くが糖尿病または糖尿病前症を有している。しかし、全ての肥満人または全ての糖尿病患者がＮＡＳＨを有しているわけではない。さらに、ＮＡＳＨ患者の中には、肥満でなく、糖尿病を有しておらず、正常な血中コレステロールおよび血中脂質を有している者もいる。ＮＡＳＨは、明白な危険因子もなく、さらには子供にでさえ発生する可能性がある。故に、ＮＡＳＨは単なる肝臓に影響を与える肥満症ではない。今のところ、ＮＡＳＨに対する特異療法は存在しない。この疾患を有する人に与えられる最も重要な勧告は、有酸素運動、食事および摂食行動の操作、並びに（肥満または過体重であれば）体重減少である。
進歩は継続されているが、肥満症およびその医学的結果の根底にある分子機構に関するさらなる研究、並びにその治療のための新たなアプローチが、今後も強く必要とされている。同様に、糖尿病患者および非糖尿病患者におけるＮＡＦＬＤを治療または防止する新たな方法も、依然として強く必要とされている。
本開示は部分的には、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質が、糖尿病患者および非糖尿病患者における、食事性肥満（ＤＩＯ）の治療並びにＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの治療のための、改善された有効な治療法をもたらし得るという、本発明者らの独自の洞察に基づいている。本発明者らは、ＤＩＯ患者および／またはＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ患者における（グルカゴン受容体の遮断を介した）グルコース生産の制御によりもたらされる有益な治療効果として、インスリン抵抗性の減少；高インスリン血症の減少または防止、肝臓における脂肪沈着の減少または防止；肝臓における炎症の減少または防止；脂質、例えば、肝臓トリアシルグリセロール、肝臓ジアシルグリセロール、およびセラミド、の蓄積の減少または防止；並びに肝臓における傷害の防止を挙げることができると提唱している。
すなわち、一態様において、本開示は、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨと診断された対象、またはＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨに罹患するリスクがある対象に、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する治療有効量の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質を投与することを含む、対象におけるＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨを治療または防止するための方法を含む。様々な実施形態において、単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、抗原結合性抗体断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’２、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄＡｂ、ナノボディ、ユニボディ、またはダイアボディから選択される抗体を含む。様々な実施形態において、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。様々な実施形態において、本開示はＮＡＦＬＤを治療するための方法を含む。様々な実施形態において、本開示はＮＡＳＨを治療するための方法を含む。
別の態様において、本開示は、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨと診断された対象、またはＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨに罹患するリスクがある対象に、（ａ）ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する治療有効量の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質、および（ｂ）抗肥満薬を投与することを含む、対象におけるＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨを治療または防止するための方法を含む。様々な実施形態において、単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、抗原結合性抗体断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’２、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄＡｂ、ナノボディ、ユニボディ、またはダイアボディから選択される抗体を含む。様々な実施形態において、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。様々な実施形態において、本開示はＮＡＦＬＤを治療するための方法を含む。様々な実施形態において、本開示はＮＡＳＨを治療するための方法を含む。様々な実施形態において、抗肥満薬は、腸選択的ＭＴＰ阻害剤、ＣＣＫａアゴニスト、５ＨＴ２ｃアゴニスト、ＭＣＲ４アゴニスト、リパーゼ阻害剤、オピオイドアンタゴニスト、オレオイル−エストロン、オビネピチド（obinepitide）、プラムリンチド（ＳＹＭＬＩＮ（登録商標））、テソフェンシン、レプチン、ブロモクリプチン、オルリスタット、ＡＯＤ−９６０４、およびシブトラミンから選択される。
別の態様において、本開示は、対象に、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する治療有効量の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質を投与することを含む、肥満に分類される（例えば、３０ｋｇ／ｍ２以上の肥満度指数（ＢＭＩ）を有する）対象を治療する方法に関する。様々な実施形態において、単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、抗原結合性抗体断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’２、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄＡｂ、ナノボディ、ユニボディ、またはダイアボディから選択される抗体を含む。様々な実施形態において、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
別の態様において、本開示は、対象に、（ａ）ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する治療有効量の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質、および（ｂ）抗肥満薬を投与することを含む、肥満に分類される（例えば、３０ｋｇ／ｍ２以上の肥満度指数（ＢＭＩ）を有する）対象を治療する方法に関する。様々な実施形態において、単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、抗原結合性抗体断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’２、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄＡｂ、ナノボディ、ユニボディ、またはダイアボディから選択される抗体を含む。様々な実施形態において、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。様々な実施形態において、抗肥満薬は、腸選択的ＭＴＰ阻害剤、ＣＣＫａアゴニスト、５ＨＴ２ｃアゴニスト、ＭＣＲ４アゴニスト、リパーゼ阻害剤、オピオイドアンタゴニスト、オレオイル−エストロン、オビネピチド（obinepitide）、プラムリンチド（ＳＹＭＬＩＮ（登録商標））、テソフェンシン、レプチン、ブロモクリプチン、オルリスタット、ＡＯＤ−９６０４、およびシブトラミンから選択される。
別の態様において、本開示は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療、予防および／または防止を目的とした医薬を調製するための、それを必要とする対象における、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する非天然の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質の使用に関する。
別の態様において、本開示は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の治療、予防および／または防止を目的とした医薬を調製するための、それを必要とする対象における、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する非天然の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質の使用に関する。
別の態様において、本開示は、肥満に分類される（例えば、３０ｋｇ／ｍ２以上の肥満度指数（ＢＭＩ）を有する）対象の治療を目的とした医薬を調製するための、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する非天然の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質の使用に関する。
様々な実施形態において、単離アンタゴニスト性結合タンパク質は、ヒトグルカゴン受容体に対して、少なくとも約１×１０−７Ｍ、少なくとも約１×１０−８Ｍ、少なくとも約１×１０−９Ｍ、少なくとも約１×１０−１０Ｍ、少なくとも約１×１０−１１Ｍ、または少なくとも約１×１０−１２Ｍの解離定数（ＫＤ）で結合する。
様々な実施形態において、単離アンタゴニスト性結合タンパク質は、配列番号２の重鎖可変領域をコードするアミノ酸配列および配列番号３の軽鎖可変領域をコードするアミノ酸配列を含む完全ヒト抗体である。
様々な実施形態において、単離アンタゴニスト性タンパク質は、配列番号４の重鎖可変領域をコードするアミノ酸配列および配列番号５の軽鎖可変領域をコードするアミノ酸配列を含む完全ヒト抗体である。
様々な実施形態において、単離アンタゴニスト性タンパク質は、配列番号６の重鎖可変領域をコードするアミノ酸配列および配列番号７の軽鎖可変領域をコードするアミノ酸配列を含む完全ヒト抗体である。
様々な実施形態において、単離アンタゴニスト性タンパク質は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む完全ヒト抗体である。
様々な実施形態において、単離アンタゴニスト性タンパク質は、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、および配列番号４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む完全ヒト抗体である。
様々な実施形態において、単離アンタゴニスト性タンパク質は、配列番号２８の重鎖可変領域をコードするアミノ酸配列および配列番号４７の軽鎖可変領域をコードするアミノ酸配列を含む完全ヒト抗体である。
様々な実施形態において、単離アンタゴニスト性タンパク質は、配列番号５１の重鎖をコードするアミノ酸配列および配列番号５２の軽鎖をコードするアミノ酸配列を含む完全ヒト抗体である。
様々な実施形態において、ヒトグルカゴン受容体と特異的に結合する単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質が、薬剤的に許容できる担体と混合されることにより、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、腹腔内注射、経皮注射（transdermal injection）、動脈内注射、胸骨内注射、くも膜下腔内注射、脳室内注射、尿道内注射、頭蓋内注射、滑液包内注射を介して、または点滴を介して対象に全身投与することができる医薬組成物が形成される。
最長２０週間に亘って評価された、高脂肪飼料（ＨＦＤ）ＤＩＯマウス試験における、本明細書に記載のビヒクル群、ＲＥＭＤ２．５９群、ペアフィード群、通常食群、および防止群の体重（ｇ）に対するインビボ効果を示すラインプロット。防止群以外の全ての群は、５７日目に治療を開始した（すなわち、９週目の初め）。防止群は、ＲＥＭＤ２．５９Ｃ抗体をＨＦＤ摂取の１日目から開始して毎週投与した。
最長２０週間に亘って評価された、ＨＦＤ ＤＩＯマウス試験における、本明細書に記載のビヒクル群、ＲＥＭＤ２．５９群、ペアフィード群、通常食群、および防止群の摂食量（ｋｃａｌ／ｇ／日）に対するインビボ効果を示すラインプロット。防止群以外の全ての群は、５７日目に治療を開始した（すなわち、９週目の初め）。防止群は、ＲＥＭＤ２．５９Ｃ抗体をＨＦＤ摂取の１日目から開始して毎週投与した。
最長１９週間に亘って評価された、ＨＦＤ ＤＩＯマウス試験における、本明細書に記載のビヒクル群、ＲＥＭＤ２．５９群、ペアフィード群、通常食群、および防止群の血糖（ｍｍｏｌ／Ｌ）に対するインビボ効果を示すラインプロット。防止群以外の全ての群は、５７日目に治療を開始した（すなわち、９週目の初め）。防止群は、ＲＥＭＤ２．５９Ｃ抗体をＨＦＤ摂取の１日目から開始して毎週投与した。
２０週目に評価された、ＨＦＤ ＤＩＯマウス試験における、本明細書に記載のビヒクル群、ＲＥＭＤ２．５９群、ペアフィード群、通常食群、および防止群の血糖（ｍｍｏｌ／Ｌ）に対する、ＲＥＭＤ２．５９の反復投与のインビボ効果を示すラインプロット。防止群以外の全ての群は、５７日目に治療を開始した（すなわち、９週目の初め）。防止群は、ＲＥＭＤ２．５９Ｃ抗体をＨＦＤ摂取の１日目から開始して毎週投与した。試験の終わり（すなわち、２０週目）に全ての動物に対して経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）を行った。
２０週目に評価された、ＨＦＤ ＤＩＯマウス試験における、本明細書に記載のビヒクル群、ＲＥＭＤ２．５９群、ペアフィード群、通常食群、および防止群のＡＵＣレベル（ｍｍｏｌ／Ｌ 分 血糖）を示す棒グラフ。防止群以外の全ての群は、５７日目に治療を開始した（すなわち、９週目の初め）。防止群は、ＲＥＭＤ２．５９Ｃ抗体をＨＦＤ摂取の１日目から開始して毎週投与した。
２０週間評価された、ＨＦＤ ＤＩＯマウス試験における、本明細書に記載のビヒクル群、ＲＥＭＤ２．５９群、ペアフィード群、通常食群、および防止群の、血清中のトリグリセリド（ＴＧ）レベル（ｍｍｏｌ／Ｌ）に対するインビボ効果を示す棒グラフ。防止群以外の全ての群は、５７日目に治療を開始した（すなわち、９週目の初め）。防止群は、ＲＥＭＤ２．５９Ｃ抗体をＨＦＤ摂取の１日目から開始して毎週投与した。
２０週間評価された、ＨＦＤ ＤＩＯマウス試験における、本明細書に記載のビヒクル群、ＲＥＭＤ２．５９群、ペアフィード群、通常食群、および防止群の、血清中の総コレステロール（ＴＣＨＯ）レベル（ｍｍｏｌ／Ｌ）に対するインビボ効果を示す棒グラフ。防止群以外の全ての群は、５７日目に治療を開始した（すなわち、９週目の初め）。防止群は、ＲＥＭＤ２．５９Ｃ抗体をＨＦＤ摂取の１日目から開始して毎週投与した。
２０週目に評価された、ＨＦＤ ＤＩＯマウス試験における、本明細書に記載のビヒクル群、ＲＥＭＤ２．５９群、ペアフィード群、通常食群、および防止群のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベル（Ｕ／Ｌ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベル（Ｕ／Ｌ）、γグルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）レベル（Ｕ／Ｌ）、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）レベル（Ｕ／Ｌ）に対するインビボ効果を示す棒グラフ。防止群以外の全ての群は、５７日目に治療を開始した（すなわち、９週目の初め）。防止群は、ＲＥＭＤ２．５９Ｃ抗体をＨＦＤ摂取の１日目から開始して毎週投与した。
２０週目に評価された、ＨＦＤ ＤＩＯマウス試験における、本明細書に記載のビヒクル群、ＲＥＭＤ２．５９群、ペアフィード群、通常食群、および防止群の、肝臓におけるトリグリセリド（ＴＧ）レベル（ｍｍｏｌ／Ｌ）に対するインビボ効果を示す棒グラフ。防止群以外の全ての群は、５７日目に治療を開始した（すなわち、９週目の初め）。防止群は、ＲＥＭＤ２．５９Ｃ抗体をＨＦＤ摂取の１日目から開始して毎週投与した。
２０週目に評価された、ＨＦＤ ＤＩＯマウス試験における、本明細書に記載のビヒクル群、ＲＥＭＤ２．５９群、ペアフィード群、通常食群、および防止群の、肝臓における総コレステロール（ＴＣＨＯ）レベル（ｍｍｏｌ／Ｌ）、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）レベル（ｍｇ／ｇ）、および低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）レベル（ｍｇ／ｇ）に対するインビボ効果を示す棒グラフ。防止群以外の全ての群は、５７日目に治療を開始した（すなわち、９週目の初め）。防止群は、ＲＥＭＤ２．５９Ｃ抗体をＨＦＤ摂取の１日目から開始して毎週投与した。
２０週間評価された、ＨＦＤ ＤＩＯマウス試験における、本明細書に記載のビヒクル群、ＲＥＭＤ２．５９群、ペアフィード群、通常食群、および防止群の、インスリンレベル（ｎｇ／ｍＬ）に対するインビボ効果を示す棒グラフ。防止群以外の全ての群は、５７日目に治療を開始した（すなわち、９週目の初め）。防止群は、ＲＥＭＤ２．５９Ｃ抗体をＨＦＤ摂取の１日目から開始して毎週投与した。インスリンレベルを、５７日目、８５日目、および１１３日目は６時間の絶食後に、１４１日目は１６時間の絶食後に検査した（ＯＧＴＴ試験をその日に行った）。
２０週目に評価された、ＨＦＤ ＤＩＯマウス試験における、本明細書に記載のビヒクル群、ＲＥＭＤ２．５９群、ペアフィード群、通常食群、および防止群の、レプチンレベル（ｎｇ／ｍＬ）に対するインビボ効果を示す棒グラフ。防止群以外の全ての群は、５７日目に治療を開始した（すなわち、９週目の初め）。防止群は、ＲＥＭＤ２．５９Ｃ抗体をＨＦＤ摂取の１日目から開始して毎週投与した。インスリンレベルを、５７日目、８５日目、および１１３日目は６時間の絶食後に、１４１日目は１６時間の絶食後に検査した（ＯＧＴＴ試験をその日に行った）。
２０週目に評価された、ＨＦＤ ＤＩＯマウス試験における、本明細書に記載のビヒクル群、ＲＥＭＤ２．５９群、ペアフィード群、通常食群、および防止群の、活性型グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）レベル（ｐＭ）に対するインビボ効果を示す棒グラフ。防止群以外の全ての群は、５７日目に治療を開始した（すなわち、９週目の初め）。防止群は、ＲＥＭＤ２．５９Ｃ抗体をＨＦＤ摂取の１日目から開始して毎週投与した。
２０週目に評価された、ＨＦＤ ＤＩＯマウス試験における、本明細書に記載のビヒクル群、ＲＥＭＤ２．５９群、ペアフィード群、通常食群、および防止群の白色脂肪組織（ＷＡＴ）、肝臓、筋肉および膵臓の湿重量（ｇ）を示す棒グラフ。防止群以外の全ての群は、５７日目に治療を開始した（すなわち、９週目の初め）。防止群は、ＲＥＭＤ２．５９Ｃ抗体をＨＦＤ摂取の１日目から開始して毎週投与した。
２０週目に評価された、ＨＦＤ ＤＩＯマウス試験における、本明細書に記載のビヒクル群、ＲＥＭＤ２．５９群、ペアフィード群、通常食群、および防止群のＩＨＣ結果（％インスリン面積／島面積および％グルカゴン面積（are）／島面積）を示す棒グラフ。防止群以外の全ての群は、５７日目に治療を開始した（すなわち、９週目の初め）。防止群は、ＲＥＭＤ２．５９Ｃ抗体をＨＦＤ摂取の１日目から開始して毎週投与した。
２０週目に評価された、ＨＦＤ ＤＩＯマウス試験における、本明細書に記載のビヒクル群、ＲＥＭＤ２．５９群、ペアフィード群、通常食群、および防止群の、種々の肝臓切片のＨ＆Ｅ組織染色の結果（２０×１０）。防止群以外の全ての群は、５７日目に治療を開始した（すなわち、９週目の初め）。防止群は、ＲＥＭＤ２．５９Ｃ抗体をＨＦＤ摂取の１日目から開始して毎週投与した。
本明細書において別途定義されない限り、本開示と関連して使用される科学用語および技術用語は当業者によって一般的に理解される意味を持つものとする。さらに、文脈から特に必要とされない限り、単数形の用語は複数のものを含むものとし、複数形の用語は単数のものを含むものとする。概して、本明細書に記載される細胞と組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、およびタンパク質と核酸の化学、およびハイブリダイゼーションと関連して使用される命名法およびそれらの技術は当技術分野において一般的に使用され、且つ、よく知られているものである。概して、本開示の方法および技術は別段の指示が無い限り当技術分野においてよく知られている従来法に従って、ならびに本明細書を通して引用および議論される様々な一般的参照文献およびより特定的な参照文献に記載されているように実施される。例えば、参照により本明細書に援用されるＳａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州（１９８９年）、およびＡｕｓｕｂｅｌら著、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、グリーン・パブリッシング・アソシエーツ（１９９２年）、ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ著、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州（１９９０年）を参照されたい。酵素反応および精製技術は製造業者の仕様書に従って、当技術分野において一般的に遂行されるように、または本明細書に記載されるように実施される。本明細書に記載される分析化学、有機合成化学、および医薬化学と関連して使用される命名法ならびにそれらの実験技法および実験技術は当技術分野において一般的に使用され、且つ、よく知られているものである。化学合成、化学分析、医薬調製、製剤、および送達、および患者の治療には標準的技術が使用される。
定義
「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語はそれぞれペプチド結合によって相互に結合した２個以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。これらの用語は、例えば、あるタンパク質配列の天然タンパク質と人工タンパク質、タンパク質断片およびポリペプチド類似体（改変タンパク質、変異体、および融合タンパク質等）ならびに翻訳後に改変されたか、または他の場合では共有結合または非共有結合によって改変されたタンパク質を包含する。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は単量体でも多量体でもあり得る。ある特定の実施形態において、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」はペプチド結合を介して連結しているα炭素を有するアミノ酸鎖である。したがって、その鎖の一方の末端（アミノ末端）の末端アミノ酸は遊離アミノ基を有し、その鎖の他方の末端（カルボキシ末端）の末端アミノ酸は遊離カルボキシル基を有する。本明細書において使用される場合、「アミノ末端」（Ｎ末端と略される）という用語はペプチドのアミノ末端のアミノ酸上の遊離α−アミノ基、またはそのペプチド内の他のいずれかの位置にあるアミノ酸のα−アミノ基（ペプチド結合に関与しているときはイミノ基）を指す。同様に、「カルボキシ末端」という用語はペプチドのカルボキシ末端上の遊離カルボキシル基、またはそのペプチド内の他のいずれかの位置にあるアミノ酸のカルボキシル基を指す。ペプチドにはまた、アミド結合と対照的にエーテル結合によって結合したアミノ酸などのペプチド模倣物を含むがこれらに限定されないあらゆるポリアミノ酸が基本的に含まれる。
ポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列は標準的な１文字または３文字の略記を用いて表示される。別段の指示が無い限り、ポリペプチド配列はそれらのアミノ末端を左側に有し、且つ、それらのカルボキシ末端を右側に有し、一本鎖核酸配列と二本鎖核酸配列のトップストランドはそれらの５’末端を左側に有し、且つ、それらの３’末端を右側に有する。ポリペプチドの特定の区域はアミノ酸８０〜１１９のようにアミノ酸残基番号によるか、またはＳｅｒ８０〜Ｓｅｒ１１９のようにその部位の実際の残基によって指定され得る。特定のポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列はどのくらいその配列が基準配列と異なっているか説明することによっても記載され得る。
本開示のポリペプチドにはあらゆる理由のために、例えば、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させるため、（２）酸化に対する感受性を低下させるため、（３）タンパク質複合体形成向けに結合親和性を変化させるため、（４）結合親和性を変化させるため、および（５）他の物理化学的特性または機能的特性を付与または改変するために多少なりとも改変されているポリペプチドが含まれる。例えば、単一アミノ酸置換または多重アミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）が天然配列の中に（例えば、分子間接触部を形成するドメインの外側にあるポリペプチド部分の中に）起きて良い。「保存的アミノ酸置換」は機能的に類似のアミノ酸によるアミノ酸のポリペプチド中での置換を指す。次の６群は相互に保存的置換物であるアミノ酸をそれぞれ含む。
アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、およびトレオニン（Ｔ）
アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）
アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）
アルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）
イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、およびバリン（Ｖ）
フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）
「非保存的アミノ酸置換」はこれらのクラスのうちの１つのクラスのメンバーによる別のクラスのメンバーに対する置換を指す。ある特定の実施形態によると、そのような変更を行うときにアミノ酸の疎水性親水性指標を考慮して良い。それぞれのアミノ酸にはその疎水性特性と電荷特性に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられている。疎水性親水性指標はイソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リシン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）である。
相互作用性生物学的機能をタンパク質に付与する際の疎水性親水性アミノ酸指標の重要性が当技術分野において理解されている（例えば、Ｋｙｔｅら著、１９８２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．誌、第１５７巻：１０５〜１３１頁を参照されたい）。ある特定のアミノ酸を類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸に対して置換して良く、それでもなお類似の生物活性が保持されることが知られている。疎水性親水性指標に基づいて変更を行う際に±２以内の疎水性親水性指標を有するアミノ酸の置換がある特定の実施形態に含まれる。±１以内の疎水性親水性指標を有するアミノ酸の置換がある特定の実施形態に含まれ、±０．５以内の疎水性親水性指標を有するアミノ酸の置換がある特定の実施形態に含まれる。
類似のアミノ酸の置換は、特にそれによって作製された生物学的に機能的なタンパク質またはペプチドを本明細書において開示されるように免疫学的実施形態に使用するつもりである場合、親水性に基づいて効果的に行われ得ることも当技術分野において理解されている。ある特定の実施形態において、タンパク質の最大局所的平均親水性はその隣接するアミノ酸の親水性によって影響され、そのタンパク質の免疫原性と抗原性、すなわちそのタンパク質の生物学的特性と相関する。
次の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リシン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変更を行う際に±２以内の親水性値を有するアミノ酸の置換がある特定の実施形態に含まれ、±１以内の親水性値を有するアミノ酸の置換がある特定の実施形態に含まれ、±０．５以内の親水性値を有するアミノ酸の置換がある特定の実施形態に含まれる。例となるアミノ酸置換が表１に示されている。
Figure 0006861641
当業者はよく知られている技術を用いて本明細書において明記されるポリペプチドの適切な変異体を決定することができる。ある特定の実施形態において、当業者は、活性にとって重要であると考えられていない領域を標的とすることによって活性を損なうことなく変更することができる分子の適切な領域を特定することができる。他の実施形態において、当業者は類似のポリペプチドの間で保存されているそれらの分子の残基および部分を特定することができる。追加の実施形態において、生物活性または構造にとって重要であり得る領域ですら、生物活性を損なうことがない、またはポリペプチド構造に悪影響を与えることがない保存的アミノ酸置換の対象とされ得る。
加えて、当業者は類似のポリペプチド中の残基であって、活性または構造にとって重要であるそれらの残基を特定する構造機能研究を再検討することができる。そのような比較を考慮すると、当業者はあるポリペプチド中のアミノ酸残基であって、類似のポリペプチドにおける活性または構造にとって重要なアミノ酸残基に対応するそれらアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者はそのような予測された重要なアミノ酸残基に対する化学的に類似のアミノ酸置換を選択することができる。
当業者は三次元構造およびアミノ酸配列を類似のポリペプチド中のその構造と関連して分析することもできる。そのような情報を考慮すると、当業者はポリペプチドのアミノ酸残基の整列をその三次元構造に関して予測することができる。ある特定の実施形態において、そのポリペプチドの表面上にあると予測されるアミノ酸残基は他の分子との重要な相互作用に関与し得るので、当業者はそのような残基に対して極端な変更を行わないことを選択することができる。また、当業者はそれぞれの所望のアミノ酸残基の位置に単一のアミノ酸置換を有する検査変異体を作製することができる。次に、当業者に知られている活性アッセイ法を用いてそれらの変異体をスクリーニングすることができる。適切な変異体についての情報を集めるためにそのような変異体を使用することが可能である。例えば、特定のアミノ酸残基に対する変更が活性の棄損、活性の望ましくない低下、または不適切な活性を引き起こすことが分かった場合、そのような変更を有する変異体を回避することができる。言い換えると、当業者は、さらなる置換が単独で、または他の突然変異と組み合わせて回避されるべき位置にあるアミノ酸をそのような日常の実験から集められた情報に基づいて容易に決定することができる。
本明細書において使用される「ポリペプチド断片」および「短縮型ポリペプチド」という用語は、対応する完全長タンパク質と比較してアミノ末端欠失および／またはカルボキシ末端欠失を有するポリペプチドを指す。ある特定の実施形態において、断片は、例えば、少なくとも５アミノ酸長、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも２５アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長、少なくとも１００アミノ酸長、少なくとも１５０アミノ酸長、少なくとも２００アミノ酸長、少なくとも２５０アミノ酸長、少なくとも３００アミノ酸長、少なくとも３５０アミノ酸長、少なくとも４００アミノ酸長、少なくとも４５０アミノ酸長、少なくとも５００アミノ酸長、少なくとも６００アミノ酸長、少なくとも７００アミノ酸長、少なくとも８００アミノ酸長、少なくとも９００アミノ酸長、または少なくとも１０００アミノ酸長であり得る。ある特定の実施形態において、断片は、例えば、多くとも１０００アミノ酸長、多くとも９００アミノ酸長、多くとも８００アミノ酸長、多くとも７００アミノ酸長、多くとも６００アミノ酸長、多くとも５００アミノ酸長、多くとも４５０アミノ酸長、多くとも４００アミノ酸長、多くとも３５０アミノ酸長、多くとも３００アミノ酸長、多くとも２５０アミノ酸長、多くとも２００アミノ酸長、多くとも１５０アミノ酸長、多くとも１００アミノ酸長、多くとも５０アミノ酸長、多くとも２５アミノ酸長、多くとも１０アミノ酸長、または多くとも５アミノ酸長でもあり得る。断片はその末端のうちの一方または両方のどちらかに１個以上の追加アミノ酸、例えば、異なる天然タンパク質に由来するアミノ酸の配列（例えば、Ｆｃドメインまたはロイシンジッパードメイン）または人工アミノ酸配列（例えば、人工リンカー配列）をさらに含み得る。
本明細書において使用される「ポリペプチド変異体」および「ポリペプチド突然変異体」という用語は、あるアミノ酸配列を備え、別のポリペプチド配列との関連で１個以上のアミノ酸残基がそのアミノ酸配列に挿入され、そのアミノ酸配列から欠失され、および／またはそのアミノ酸配列に置換されているポリペプチドを指す。ある特定の実施形態において、挿入、欠失、または置換されるアミノ酸残基の数は、例えば、少なくとも１アミノ酸長、少なくとも２アミノ酸長、少なくとも３アミノ酸長、少なくとも４アミノ酸長、少なくとも５アミノ酸長、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも２５アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長、少なくとも７５アミノ酸長、少なくとも１００アミノ酸長、少なくとも１２５アミノ酸長、少なくとも１５０アミノ酸長、少なくとも１７５アミノ酸長、少なくとも２００アミノ酸長、少なくとも２２５アミノ酸長、少なくとも２５０アミノ酸長、少なくとも２７５アミノ酸長、少なくとも３００アミノ酸長、少なくとも３５０アミノ酸長、少なくとも４００アミノ酸長、少なくとも４５０アミノ酸長、または少なくとも５００アミノ酸長であり得る。本開示の変異体には融合タンパク質が含まれる。
ポリペプチドの「誘導体」は化学的に改変されているポリペプチド、例えば、別の化学部分への結合、例えばポリエチレングリコールへの結合、アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）への結合、リン酸化、およびグリコシル化があるポリペプチドである。
「％配列同一性」という用語は本明細書において「％同一性」という用語と互換的に使用され、配列アラインメントプログラムを使用して整列させたときの２つ以上のペプチド配列の間のアミノ酸配列同一性のレベル、または２つ以上のヌクレオチド配列の間のヌクレオチド配列同一性のレベルを指す。例えば、本明細書において使用される場合、８０％の同一性は規定のアルゴリズムによって決定される８０％配列同一性と同じ事を意味し、所与の配列が別の長さの別の配列に対して少なくとも８０％同一であることを意味する。ある特定の実施形態において、その％同一性は、例えば、所与の配列に対する少なくとも６０％の、少なくとも６５％の、少なくとも７０％の、少なくとも７５％の、少なくとも８０％の、少なくとも８５％の、少なくとも９０％の、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の、またはそれよりも高い配列同一性から選択される。ある特定の実施形態において、その％同一性は、例えば、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、または約９５％〜約９９％の範囲内にある。
「％配列相同性」という用語は本明細書において「％相同性」という用語と互換的に使用され、配列アラインメントプログラムを使用して整列させたときの２つ以上のペプチド配列の間のアミノ酸配列相同性のレベル、または２つ以上のヌクレオチド配列の間のヌクレオチド配列相同性のレベルを指す。例えば、本明細書において使用される場合、８０％の相同性は規定のアルゴリズムによって決定される８０％配列相同性と同じ事を意味し、したがって所与の配列のホモログがその所与の配列のある長さにわたって８０％を超える配列相同性を有することを意味する。ある特定の実施形態において、その％相同性は、例えば、所与の配列に対する少なくとも６０％の、少なくとも６５％の、少なくとも７０％の、少なくとも７５％の、少なくとも８０％の、少なくとも８５％の、少なくとも９０％の、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の、またはそれより高い配列相同性から選択される。ある特定の実施形態において、その％相同性は、例えば、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、または約９５％〜約９９％の範囲内にある。
２つの配列間の同一性を決定するために使用され得る例となるコンピュータープログラムにはＮＣＢＩウェッブサイトにおいてインターネット上で公開されているＢＬＡＳＴプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、およびＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮからなるパッケージが含まれるがこれらに限定されない。Ａｌｔｓｃｈｕｌら著、１９９０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．誌、第２１５巻：４０３〜１０頁（公表された初期設定、すなわちｗ＝４、ｔ＝１７のパラメーターに特に関連して）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら著、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．誌、第２５巻：３３８９〜３４０２頁も参照されたい。配列検索は、所与のアミノ酸配列をＧｅｎＢａｎｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓおよび他の公開データベースの中のアミノ酸配列と比較して評価するときにＢＬＡＳＴＰプログラムを使用して実行されることが典型的である。ＢＬＡＳＴＸプログラムは全てのリーディングフレームで翻訳された核酸配列をＧｅｎＢａｎｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓおよび他の公開データベースの中のアミノ酸配列に対して検索することにとって好ましい。ＢＬＡＳＴＰとＢＬＡＳＴＸの両方は１１．０のオープンギャップペナルティ―と１．０の伸長ギャップペナルティ―という初期パラメーターを使用して実行され、且つ、ＢＬＯＳＵＭ−６２マトリックスを利用する。同文献を参照されたい。
パーセント配列同一性の算出に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間の類似性の統計分析も実施する（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ誌、第９０巻：５８７３〜５７８７頁（１９９３年）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの基準は最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、それは２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の整合が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、基準核酸に対する検査核酸の比較における最小和確率が例えば約０．１未満、約０．０１未満、または約０．００１未満である場合にその核酸はその基準配列に対して類似していると考えらえる。
「単離分子」という用語は（その分子が例えばポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体である場合に）その起源または誘導源によって（１）その分子の天然状態ではその分子に付随する天然結合成分と結合していない分子、（２）同じ種に由来する他の分子を実質的に含まない分子、（３）異なる種に由来する細胞によって発現される分子、または（４）自然界では生じない分子である。したがって、化学合成される分子、または自然界で起源となる細胞とは異なる細胞系で発現される分子は、その分子の天然結合成分から「単離」される。分子は、当技術分野においてよく知られている精製技術を用いて単離されることによって天然結合成分を実質的に含まないようにされても良い。分子の純度または均質性は当技術分野においてよく知られている多数の手段によってアッセイされ得る。例えば、ポリペプチド試料の純度は、当技術分野においてよく知られている技術を用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動およびそのポリペプチドを可視化するためのそのゲルの染色を用いてアッセイされ得る。ある特定の目的のためにＨＰＬＣまたは当技術分野においてよく知られている精製のための他の手段を用いることでより高い解像度が提供され得る。
タンパク質またはポリペプチドは、試料の少なくとも約６０％〜７５％が単一種のポリペプチドを示すときに「実質的に純粋」であり、「実質的に均質」であり、または「実質的に精製」されている。実質的に純粋なポリペプチドまたはタンパク質はタンパク質試料の約５０％（重量／重量）、６０％（重量／重量）、７０％（重量／重量）、８０％（重量／重量）、または９０％（重量／重量）を構成することが典型的であり、約９５％を構成することがより一般的であり、例えば、それは９９％を超える。タンパク質の純度または均質性は、タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動とそれに続く当技術分野においてよく知られている染色液によるそのゲルの染色時の単一ポリペプチドバンドの視覚化などの当技術分野においてよく知られている多数の手段によって示され得る。ある特定の目的のためにＨＰＬＣまたは当技術分野においてよく知られている精製のための他の手段を用いることでより高い解像度が提供され得る。
「抗原結合性拮抗タンパク質」は、抗原に結合する部分を含み、且つ、その抗原へのその単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質の結合を促進する構造をその抗原結合部分に採らせるスキャフォルドまたはフレームワーク部分を含んでも良いタンパク質である。抗原結合性拮抗タンパク質の例には抗体、抗体断片（例えば、抗体の抗原結合部分）、抗体誘導体、および抗体類似体が挙げられる。その単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は、例えば、移入されたＣＤＲまたはＣＤＲ派生物を有する代替的タンパク質スキャフォルドまたは人工スキャフォルドを含み得る。そのようなスキャフォルドには、例えば前記単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質の三次元構造を安定化するために導入された突然変異を含む抗体由来スキャフォルド、ならびに例えば生体適合性重合体を含む完全合成スキャフォルドが含まれるがこれらに限定されない。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒら著、２００３年、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ誌、第５３巻、第１号：１２１〜１２９頁（２００３年）、Ｒｏｑｕｅら著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．誌、第２０巻：６３９〜６５４頁（２００４年）を参照されたい。加えて、ペプチド抗体模倣物（「ＰＡＭ」）ならびにスキャフォルドとしてフィブロネクション成分を利用する抗体模倣物に基づくスキャフォルドを使用することができる。
単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は、例えば、天然免疫グロブリンの構造を有し得る。「免疫グロブリン」は四量体分子である。天然免疫グロブリンではそれぞれの四量体が二対の同一のポリペプチド鎖から構成され、それぞれのペアが１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に対して最終的な責任がある約１００アミノ酸〜１１０アミノ酸、またはそれより多くのアミノ酸からなる可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分はエフェクター機能に対して最終的な責任がある定常領域を規定する。ヒト軽鎖はカッパ軽鎖とラムダ軽鎖に分類される。重鎖はミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類され、その抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして規定する。軽鎖と重鎖の内部では可変領域と定常領域が約１２個以上のアミノ酸からなる「Ｊ」領域によって連結されており、重鎖はさらに約１０個多いアミノ酸からなる「Ｄ」領域も含む。Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第２版、レイブン・プレス、ニューヨーク（１９８９年））を全般的に参照されたい（全ての目的のために参照によりその全体が援用される）。完全な免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように各軽鎖／重鎖対の可変領域が抗体結合部位を形成する。
「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的または部分的にコードされ、且つ、腫瘍抗原に対する特異性または病理状態で過剰発現された分子に対する特異性を有する１つ以上のポリペプチドを含むタンパク質を指す。広く認められている免疫グロブリン遺伝子にはカッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミューの定常領域遺伝子、ならびにこれらの遺伝子のサブタイプおよび多種多様な免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖（ＬＣ）はカッパまたはラムダのどちらかとして分類される。重鎖（ＨＣ）はガンマ、ミュー、アルファ、デアルタ、またはイプシロンとして分類され、それらは次にそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの免疫グロブリンクラスを規定する。典型的な免疫グロブリン（例えば抗体）構造単位は四量体を含む。各四量体は二対の同一のポリペプチド鎖から構成され、それぞれのペアが１本の「軽」鎖（約２５ｋＤ）と１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は抗原認識に対して最終的な責任がある約１００アミノ酸〜１１０アミノ酸、またはそれより多くのアミノ酸からなる可変領域を規定する。
完全長抗体では各重鎖は重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶＨと略記される）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３ドメイン（および幾つかの例ではＣＨ４）から構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲまたはＶＬと略記される）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域はＣＬの１ドメインから構成される。ＶＨ領域とＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域が散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域にさらに細かく分割され得る。ＶＨとＶＬのそれぞれがアミノ末端からカルボキシ末端に向かって次の順序、すなわちＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置されている３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成される。フレームワーク領域とＣＤＲの範囲が規定されている。様々な軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列がヒトなどの種の内部で比較的に保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち構成要素である軽鎖と重鎖のフレームワーク領域複合体は三次元空間内でＣＤＲを配置および配列するように働く。免疫グロブリン分子はいずれかのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスの分子であり得る。
抗体は完全な免疫グロブリンとして、または多数のよく特徴づけられた断片として存在する。そのような断片には標的抗原に結合するＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、およびジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）が含まれる。ｓｃＦｖタンパク質は免疫グロブリンの軽鎖可変領域と免疫グロブリンの重鎖可変領域がリンカーによって結合している融合タンパク質であり、一方でｄｓＦｖではそれらの鎖の結合を安定化させるためにそれらの鎖に突然変異が形成されてジスルフィド結合が導入されている。様々な抗体断片が完全抗体の消化との関連で規定されており、当業者は化学的に、または組換えＤＮＡ法を利用することでそのような断片を新規に合成し得ることを理解する。したがって、本明細書において使用される場合、抗体という用語は、例えば、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、単ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、所望の生物活性を示す抗体断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、イントラボディ、および上記のいずれかのエピトープ結合断片または抗原結合断片を包含する。
Ｆａｂ断片はＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインを有する一価断片であり、Ｆ（ａｂ’）２断片はヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を有する二価断片であり、Ｆｄ断片はＶＨドメインとＣＨ１ドメインを有し、Ｆｖ断片はある抗体の単腕のＶＬドメインとＶＨドメインを有し、ｄＡｂ断片はＶＨドメイン、ＶＬドメイン、またはＶＨドメインもしくはＶＬドメインの抗原結合断片を有する（米国特許第６８４６６３４号明細書、第６６９６２４５号明細書、米国特許出願公開第０５／０２０２５１２号明細書、第０４／０２０２９９５号明細書、第０４／００３８２９１号明細書、第０４／０００９５０７号明細書、第０３／００３９９５８号明細書、Ｗａｒｄら著、Ｎａｔｕｒｅ誌、第３４１巻：５４４〜５４６頁（１９８９年））。
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、そのタンパク質鎖が自身の上に折り重なり、且つ、一価抗原結合部位を形成することを可能にするほど充分に長いリンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）を介して連続的なタンパク質鎖を形成するためにＶＬ領域とＶＨ領域が連結されている抗体である（例えば、Ｂｉｒｄら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第２４２巻：４２３〜２６頁（１９８８年）およびＨｕｓｔｏｎら著、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ誌、第８５巻：５８７９〜８３頁（１９８８年）を参照されたい）。ディアボディは、２本のポリペプチド鎖を含み、同じ鎖の上にある２つのドメインの間で対合させるにはあまりに短いリンカーによって連結されたＶＨドメインとＶＬドメインをそれぞれのポリペプチド鎖が含み、そうして各ドメインが別のポリペプチド鎖上にある相補的なドメインと対合するようになっている二価抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら著、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ誌、第９０巻：６４４４〜４８頁（１９９３年）、およびＰｏｌｊａｋら著、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ誌、第２巻：１１２１〜２３頁（１９９４年）を参照されたい）。ディアボディのそれら２本のポリペプチド鎖が同一である場合、それらの対合により生じるディアボディは２か所の同一の抗原結合部位を有することになる。２つの異なる抗原結合部位を有するディアボディを作製するために異なる配列を有するポリペプチド鎖が使用され得る。同様に、トリボディおよびテトラボディは、それぞれ３本および４本のポリペプチド鎖を含み、且つ、それぞれ同じでも異なっていても良い３か所および４か所の抗原結合部位を形成する抗体である。
単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は１か所以上の結合部位を有し得る。１か所より多くの結合部位が存在する場合、それらの結合部位は相互に同一であっても異なっていても良い。例えば、天然ヒト免疫グロブリンは２か所の同一な結合部位を有していることが典型的であり、一方で「二特異性」または「二官能性」抗体は２か所の異なる結合部位を有する。
「ヒト抗体」という用語にはヒト免疫グロブリン配列に由来する１つ以上の可変領域と定常領域を有する全ての抗体が含まれる。１つの実施形態において、それら可変ドメインと定常ドメインの全てがヒト免疫グロブリン配列に由来する（完全ヒト抗体）。これらの抗体は様々な方法で調製されて良く、それらの方法の例が下で説明されており、それらにはヒト重鎖および／または軽鎖コード遺伝子に由来する抗体を発現するように遺伝的に改変されているマウスの目的の抗原による免疫を介した方法が含まれる。
「ヒト化抗体」は、そのヒト化抗体がヒト患者に投与されたときにその抗体が非ヒト種抗体と比較して免疫応答を誘導する可能性が低くなるように、および／または程度が低い免疫応答を誘導するように、その非ヒト種に由来する抗体の配列と１か所以上のアミノ酸置換、欠失、および／または付加によって異なる配列を有する。１つの実施形態において、ヒト化抗体を作製するために非ヒト種抗体の重鎖および／または軽鎖のフレームワークドメインと定常ドメインの中のある特定のアミノ酸に突然変異が形成される。別の実施形態において、ヒト抗体の定常ドメインが非ヒト種の可変ドメインに融合される。別の実施形態において、非ヒト抗体がヒト患者に投与されたときのその抗体のあり得る免疫原性を減少させるためにその非ヒト抗体の１つ以上のＣＤＲ配列中の１個以上のアミノ酸残基が変更されるが、そのヒト化抗体の抗原への結合がその非ヒト抗体の抗原への結合よりもあまり悪くならないようにそれらの変更されるアミノ酸残基はその抗体の抗原への免疫特異的結合にとって重要ではないか、またはそのアミノ酸配列へ変更が保存的変更で行われるかのどちらかである。ヒト化抗体の作製法の例を米国特許第６０５４２９７号明細書、第５８８６１５２号明細書および第５８７７２９３号明細書に見ることができる。
抗体を含む本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は、１０−７Ｍまたはそれより低い解離定数（以下で定義されるＫｄ、または対応するＫｂ）値によって判定される高い結合親和性でヒトグルカゴン受容体などの抗原に結合する場合、その抗原に「特異的に結合」する。ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は他の種に由来するグルカゴン受容体にも同じ親和性、または異なる親和性で結合して良い。
「エピトープ」は単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質（例えば、抗体）が結合する分子のその部分である。エピトープはその分子の非連続的な部分（例えば、ポリペプチドの場合、そのポリペプチドの一次配列では連続していないが、そのポリペプチドの三次構造および四次構造の状況では抗原結合性拮抗タンパク質が結合するほど充分に相互に近傍にあるアミノ酸残基）を含み得る。
用語「血糖値（blood glucose level）」、または「血糖値（level of blood glucose）」は、血糖濃度を意味するものとする。ある実施形態では、血糖値は血漿グルコース値である。血漿グルコースは、例えばEtgen et al., Metabolism, 49(5): 684-688, 2000)に従って求めてもよいし、あるいは、D'Orazio et al., Clin. Chem. Lab. Med., 44(12):1486-1490, 2006に従って全体血糖濃度の変換から算出してもよい。
用語「正常血糖値（normal glucose level）」は、ヒトにおいて、空腹時血糖値では約１００ｍｇ／ｄＬ未満、食後２時間の血糖値では約１４５ｍｇ／ｄＬ未満、あるいは、ランダム血糖値検査の血糖値（random glucose）では１２５ｍｇ／ｄＬの、平均血漿グルコース値を指す。用語「血糖値上昇（elevated blood glucose level）」または「血糖値上昇（elevated levels of blood glucose）」は、臨床的に不適切な基底および食後の高血糖を示す対象において見られるもの等、または、経口グルコース負荷試験（ｏＧＴＴ）で対象において見られるもの等の、血糖値上昇を意味するものとし、「血糖値上昇」は、空腹時条件下で試験された場合は約１００ｍｇ／ｄＬ超であり、１時間の時点で試験された場合は約２００ｍｇ／ｄＬ超である。
用語「グルカゴン阻害剤」、「グルカゴン抑制剤」および「グルカゴンアンタゴニスト」は同義的に使用される。各々はグルカゴンシグナル伝達を検出可能に阻害する分子である。阻害剤によって引き起こされる阻害は、その阻害がグルカゴンシグナル伝達阻害を決定するものとして当該技術分野において認知および理解されるアッセイを用いて検出可能である限り、完了される必要はない。
「医薬組成物」は動物またはヒトにおける製薬学的用途にとって適切な組成物を指す。医薬組成物は薬理学的有効量および／または治療有効量の活性薬剤と薬学的に許容可能な担体を含む。「薬学的に許容可能な担体」は、動物またはヒトに投与されたときに有害反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応を引き起こすことがない組成物を指す。本明細書において使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」は標準的な医薬担体、ベヒクル、緩衝剤、およびリン酸緩衝生理食塩水溶液、５％ブドウ糖水溶液のような担体、および水中油型乳剤または油中水型乳剤のような乳剤、および様々な種類の湿潤剤、および／またはアジュバントのうちのいずれをも指す。適切な医薬担体と製剤はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２１版、２００５年、マック・パブリッシング社、イーストンの中に記載されている。「薬学的に許容可能な塩」は製薬学的用途のために化合物の中に製剤することができる、例えば、金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、等）およびアンモニアまたは有機アミンの塩をはじめとする塩である。
本明細書で使用される場合、ヒトグルカゴン受容体と特異的に結合する単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質の「治療有効量」は、開示および特許請求された方法に従って対象に与えられた場合に以下の生物活性のうちの１つをもたらす、係るタンパク質の量を指す：肥満症の治療；ＮＡＦＬＤの治療；ＮＡＳＨの治療；またはＮＡＳＨの一つもしくは複数の症状の低減、抑制、減弱、もしくは阻害。
用語「治療する（treat）」、「治療すること（treating）」および「治療（treatment）」は、有益または所望の臨床結果を得るためのアプローチを指す。さらに、本明細書における「治療」への言及は、治癒的、対症的および予防的な治療への言及を包含する。本開示の目的において、有益または所望の臨床結果には、限定はされないが、以下のうちの一つまたは複数が含まれる：約８０〜１８０ｍｇ／ｄＬ以内、もしくは約８０〜１７０ｍｇ／ｄＬ以内、もしくは約８０〜１６０ｍｇ／ｄＬ以内、もしくは約８０〜１５０ｍｇ／ｄＬ以内、もしくは約８０〜１４０ｍｇ／ｄＬ以内への血糖の改善、または、高血糖症、高グルカゴン血症（hyperglucanemia）、および高インスリン血症を含むがこれらに限定はされない、血糖値上昇と関連した、もしくは血糖値上昇からもたらされる、一つもしくは複数のあらゆる状態、疾患、もしくは症状における改善。
本明細書および添付されている特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「ａ」、「ｏｒ」、および「ｔｈｅ」は文脈から明確にそうではないことが示されていない限り複数の指示物を含む。本明細書に記載される本開示の態様とその変形例にはある態様と変形例から「なる」こと、および／または「基本的になる」ことが含まれることが理解される。
本明細書中の「約」が付いた値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーター自体を対象とする変量を含む（および、その変量を説明する）。例えば、「約Ｘ」を参照する説明は「Ｘ」の説明を含む。
肥満症
肥満症は、健康に悪影響を及ぼし得る程に過剰な体脂肪が肝臓を含む複数の組織に蓄積した、医学的状態である。典型的には肥満度指数（ＢＭＩ）（ある人間の体重をその人間の身長の二乗で割ることにより得られる測定値）が３０ｋｇ／ｍ２以上と定義され、肥満症の有病率は合衆国および他の多くの先進国において過去１０年で著しく増加し、世界的な公衆衛生上の懸念となった。
肥満症は、最も多くは、過剰な食物エネルギー摂取、身体活動の不足、および遺伝的感受性の組合せによって引き起こされるが、少数の症例では、遺伝子、内分泌障害、薬物治療、または精神病によって主に引き起こされる。肥満症は、様々な疾患、特に、心疾患、２型糖尿病、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ、閉塞性睡眠時無呼吸、ある種のがん、変形性関節症、および喘息、の可能性を増大する。合併症は、肥満症によって直接的に引き起こされるか、または、質の悪い食事もしくは座りがちなライフスタイル等の共通原因を共有するメカニズムを介して間接的に関連している。肥満症と特定の状態の間の関連の強さは様々である。最も強いものの１つは２型糖尿病との関連である。男性における糖尿病症例の６４％、および女性における症例の７７％の根底には過剰な体脂肪がある。
現在の治療様式としては、典型的には、食事および運動のプログラム、ライフスタイル管理、薬物療法、並びに外科手術が挙げられる。治療法の決定は、肥満症の重症度、付随する医学的状態の重症度、対象のリスク状態（subject risk status）、および対象の見込み（subject expectation）に基づいてなされる。心血管リスクおよび糖尿病発生率の顕著な改善が５〜１０％の体重減少によって観察されたが、これは、ベースライン値からの１０％の体重減少を目標閾値として推奨している肥満症治療のための診療ガイドラインを裏付けるものである。残念ながら、体重減少を促進する利用可能な薬理療法は、副作用、禁忌または陽性反応の欠如のために、多くの肥満対象に十分な恩恵を与えることができない（国立心臓・肺・血液研究所、Clinical guidelines on the identification, evaluation, and treatment of overweight and obesity in adults: the evidence report, NIH Publication No. 98-4083、１９９８年９月）。
肥満外科手術は、ＢＭＩが４０ｋｇ／ｍ２以上の対象に対する体重減少介入と見なすことができる。ＢＭＩが〜３５ｋｇ／ｍ２であり、関連する重篤な医学的状態を有する対象も、この治療選択肢の候補である。残念ながら、通常、出血、塞栓症または血栓症、創合併症、深部感染、肺合併症、および胃腸管閉塞を含む術後合併症が肥満外科手術から生じ；これらの合併症に対処するために、術後期に再手術が必要とする場合がある。術後期を過ぎた再手術またはコンバージョン手術の割合は肥満処置の種類に依存し、ある研究では１７％〜３１％の範囲であった。バイパス術には微量栄養素欠乏および蛋白・熱量不足栄養障害等の腸管吸収異常も典型的に見られ、生涯の栄養分供給が必要となる。肥満外科手術と関連した主要且つ重大な有害事象はよく起こることであり、実行された処置のおよそ４パーセントで観察される（それぞれ腹腔鏡下バンディングまたはバイパス術を受けた全対象の０．３〜２パーセントにおける死亡を含む）。
例えば食事性肥満（ＤＩＯ）を含む肥満症を治療する改善された、且つ／または新しい方法が、依然として強く必要とされていることは明らかである。本開示は、糖尿病患者および非糖尿病患者におけるＤＩＯの治療のための、改善された有効な治療法をもたらし得る、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合するアンタゴニスト性抗原結合タンパク質を提供する。
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は西洋人種に高度に蔓延している。最近の研究では、この疾患は、肥満個体においては７０％の頻度で、痩せた個体においては３５％の頻度で、発生し得ると示唆されている（Wanless IR, et al., Hepatology, 12:1106-1110, 1990）。ＮＡＦＬＤは、アルコールをほとんど消費しない個人に生じる肝臓の大滴性脂肪症を特徴とする。ＮＡＦＬＤの組織学的スペクトルは、単なる脂肪症単独、または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に分類される。いくつかの疫学的研究は飽和脂肪をより多く含む食事を関連付けている（Musso G, et al., Hepatology, 37:909-916, 2003）。しかしＮＡＦＬＤは、特に甘味飲料からの、フルクトースの摂取とも強く関連している（Ouyang X, et al., J Hepatol., 48:993-999, 2008）。古典的な西洋食は飽和脂肪および糖の両方を多く含む。
高脂肪・高糖質（例えば、グルコース、フルクトース等の単糖）な食事の消費に伴い発達する肝臓インスリン抵抗性（高血糖症および／または高インスリン血症を引き起こし得る）は、ＮＡＦＬＤに密接に関連している。肝臓インスリン抵抗性が３つのエネルギー代謝経路における機能障害によって引き起こされることを示唆する証拠が蓄積されている（Samuel et al, Cell, 148:852-871, 2012）。１つ目は、過剰な炭水化物流（例えば、グルコース、フルクトース）が、肝臓グルコース産生に対するインスリンの抑制効果への抵抗性および新規の脂質生合成（Ｉｄ）を介した炭素の過剰処分と関連しているというものである。２つ目は、脂質合成の増加（または脂質分泌／輸送の減少）が、不活性であるが、肝臓インスリン抵抗性を引き起こすと推定される生理活性脂質中間体のジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびセラミドのレベル増加としばしば完全にかみ合う、肝臓トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の蓄積をもたらすというものである（Kumashiro N et al, Proc Natl Acad Sci U S A, 108:16381-16385, 2011）。３つ目は、インスリン抵抗性に関与する脂肪肝が、ミトコンドリア機能の異常および肝臓脂肪酸酸化の異常と関連しているというものである（Rector RS et al., J Hepatol, 52:727-736, 2010）。
完全には理解されていない機構により、ＮＡＦＬＤは、より攻撃的な形態である非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）へと進行する場合や、あるいは、線維症、肝硬変、および肝細胞癌（ＨＣＣ）に進行する場合がある。ＮＡＳＨは現在では、アメリカ人の２％〜５％に発症し、肝硬変および永久的肝不全をもたらす可能性がある、進行性の代謝性肝疾患として認められている（Brunt et al., supra, 1999; Brunt, supra, 2001; Ludwig et al., J. Gastroenterol. Hepatol. 12:398-403, 1997）。正常肝臓からＮＡＳＨへの現在の発病モデルではツーヒット進行が示唆されている。最初に、インスリン抵抗性が肝細胞における脂質の蓄積を引き起こす（ファーストヒット）。次に、酸化的ストレス、脂質過酸化、直接的な脂質毒性、ミトコンドリア機能不全、および／または感染等の細胞傷害が肝炎を引き起こし（セカンドヒット）、その結果ＮＡＳＨがもたらされると提唱されている（Brunt, supra, 2001）。
脂質による肝臓鬱血は、重篤な肝臓インスリン抵抗性およびグルコース産生異常を引き起こす（Samuel et al., J. Biol. Chem. 279:32345-32353, 2004）。インスリン抵抗性により引き起こされる脂肪症は、肝臓の代謝性傷害に対する感受性を増加させることで、炎症、壊死、および線維症をもたらすと考えられている（James et al., Lancet 353:1634-1636, 1999; Ludwig et al., Mayo Clin. Proc. 55:434-438, 1980; Day, Gut 50:585-588, 2002; Browning et al., J. Clin. Invest. 114:147-152, 2004）。このように脂肪症はＮＡＳＨに常に伴うものであるが、肝生検によってしかＮＡＳＨは区別することができない。ＮＡＳＨの評価および重症度は、脂肪肝、肝炎、および肝傷害のパターンおよび程度に応じて組織学的になされ、当然、顕著なアルコール消費がない場合にのみ行われる（Brunt、上記参照、2001）。脂肪症は動物モデルおよびヒトモデルの両方で見られるが、ＮＡＳＨはヒトの条件においてのみ完全に理解されている（Browning et al.、上記参照、２００４）。従って、ＮＡＳＨで観察される臨床的変化を理解することが、この状態に対する治療方針の発達に不可欠である。
現在、ＮＡＳＨ患者の特定を可能にする良好な臨床マーカーは存在していない。同様に、ＮＡＳＨのさらなる疾患増悪を減速する、またはその経過に変化を与える治療法も存在していない。そのようなＮＡＳＨのマーカーおよび治療が当該技術分野では必要とされている。米国においてＮＡＳＨは、Ｃ型肝炎およびアルコール性肝疾患に続く、肝硬変の主な原因の１つに位置付けられている。従って、ＮＡＳＨを治療する方法が当該分野において必要とされている。本開示は、糖尿病患者および非糖尿病患者におけるＮＡＳＨの治療および防止のための、改善された有効な治療法をもたらし得る、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合するアンタゴニスト性抗原結合タンパク質を提供する。
グルカゴン受容体および抗原結合性拮抗タンパク質
グルカゴンは、プロホルモンとプロニューロペプチドの細胞内成熟に関与する神経内分泌特異的プロテアーゼであるプロホルモン転換酵素２（ＰＣ２）の細胞特異的発現によって膵臓α細胞においてそのプレプロ型をプロセッシングして作られる２９アミノ酸ホルモンである（Ｆｕｒｕｔａら著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．誌、第２７６巻：２７１９７〜２７２０２頁（２００１年））。生体内ではグルカゴンはインスリン作用に対する主要な逆調節性ホルモンである。空腹時にグルコースレベルの低下に応じてグルカゴン分泌が増加する。増加したグルカゴン分泌により、肝臓のグリコーゲン分解と糖新生の促進によるグルコース産生が刺激される（ＤｕｎｎｉｎｇおよびＧｅｒｉｃｈ著、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ誌、第２８巻：２５３〜２８３頁（２００７年））。したがって、グルカゴンは動物における正常なグルコースレベルの維持においてインスリンの効果を相殺する。
グルカゴンの生物学的効果には特異的な細胞表面受容体であるグルカゴン受容体への結合とその後の活性化が介在する。グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）はＧタンパク質共役受容体セクレチンサブファミリー（ファミリーＢ）のメンバーである。ヒトＧＣＧＲは４７７アミノ酸配列ＧＰＣＲであり、ＧＣＧＲのアミノ酸配列は種を越えてよく保存されている（Ｍａｙｏら著、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ．誌、第５５巻：１６７〜１９４頁、（２００３年））。グルカゴン受容体は主に肝臓で発現し、それは肝臓では肝臓でのグルコース産生を調節し、腎臓および膵島β細胞では糖新生におけるその役割を反映する。肝臓におけるグルカゴン受容体の活性化によりアデニルシクラーゼの活性およびホスホイノシトール代謝回転が刺激され、それが引き続いてホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ（ＦＢＰａｓｅ−１）、およびグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ−６−Ｐａｓｅ）を含む糖新生酵素の発現増加を引き起こす。加えて、グルカゴンシグナル伝達によってグリコーゲンホスホリラーゼが活性化され、グリコーゲンシンターゼが抑制される。高めの基底グルカゴンレベルと食後のグルカゴン分泌の抑制欠如がヒトにおいて糖尿病状態に寄与することが研究から示されている（Ｍｕｌｌｅｒら著、Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ誌、第２８３巻：１０９〜１１５頁（１９７０年））。したがって、ＧＣＧＲアンタゴニストを使用してグルカゴンの産生または機能を標的とすることによって血糖を制御し、低下させる方法が探索されている。
様々な実施形態において、本開示の抗原結合性拮抗タンパク質は、細胞上に発現される膜結合型グルカゴン受容体に結合し、グルカゴン受容体を介するグルカゴンシグナル伝達を阻害または遮断するように選択され得る。様々な実施形態において、本開示の抗原結合性拮抗タンパク質はヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する。様々な実施形態において、ヒトグルカゴン受容体に結合する本抗原結合性拮抗タンパク質は他の種のグルカゴン受容体に結合しても良い。幾つかの種のグルカゴン受容体のポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列が知られている（例えば、ヒト、ラット、マウスおよびカニクイザルのグルカゴン受容体のポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列についてのその具体的な教示のために参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第７９４７８０９号明細書を参照されたい）。本開示の様々な実施形態において、本抗原結合性拮抗タンパク質は配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する。
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）グルカゴン受容体アミノ酸配列
（受託番号ＡＡＩ０４８５５）
ＭＰＰＣＱＰＱＲＰＬＬＬＬＬＬＬＬＡＣＱＰＱＶＰＳＡＱＶＭＤＦＬＦＥＫＷＫＬＹＧＤＱＣＨＨＮＬＳＬＬＰＰＰＴＥＬＶＣＮＲＴＦＤＫＹＳＣＷＰＤＴＰＡＮＴＴＡＮＩＳＣＰＷＹＬＰＷＨＨＫＶＱＨＲＦＶＦＫＲＣＧＰＤＧＱＷＶＲＧＰＲＧＱＰＷＲＤＡＳＱＣＱＭＤＧＥＥＩＥＶＱＫＥＶＡＫＭＹＳＳＦＱＶＭＹＴＶＧＹＳＬＳＬＧＡＬＬＬＡＬＡＩＬＧＧＬＳＫＬＨＣＴＲＮＡＩＨＡＮＬＦＡＳＦＶＬＫＡＳＳＶＬＶＩＤＧＬＬＲＴＲＹＳＱＫＩＧＤＤＬＳＶＳＴＷＬＳＤＧＡＶＡＧＣＲＶＡＡＶＦＭＱＹＧＩＶＡＮＹＣＷＬＬＶＥＧＬＹＬＨＮＬＬＧＬＡＴＬＰＥＲＳＦＦＳＬＹＬＧＩＧＷＧＡＰＭＬＦＶＶＰＷＡＶＶＫＣＬＦＥＮＶＱＣＷＴＳＮＤＮＭＧＦＷＷＩＬＲＦＰＶＦＬＡＩＬＩＮＦＦＩＦＶＲＩＶＱＬＬＶＡＫＬＲＡＲＱＭＨＨＴＤＹＫＦＲＬＡＫＳＴＬＴＬＩＰＬＬＧＶＨＥＶＶＦＡＦＶＴＤＥＨＡＱＧＴＬＲＳＡＫＬＦＦＤＬＦＬＳＳＦＱＧＬＬＶＡＶＬＹＣＦＬＮＫＥＶＱＳＥＬＲＲＲＷＨＲＷＲＬＧＫＶＬＷＥＥＲＮＴＳＮＨＲＡＳＳＳＰＧＨＧＰＰＳＫＥＬＱＦＧＲＧＧＧＳＱＤＳＳＡＥＴＰＬＡＧＧＬＰＲＬＡＥＳＰＦ（配列番号１）
様々な実施形態において、それら引用された参照文献に記載されるグルカゴン受容体に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の（当技術分野において知られており、且つ、本明細書に記載される方法を用いて計算される）同一性を有するグルカゴン受容体に特異的に結合する本開示の抗原結合性拮抗タンパク質も本開示に含まれる。
本開示のアンタゴニスト性抗原結合タンパク質は、グルカゴンとその受容体との間の相互作用を遮断して、グルカゴンのグルコース増加作用を阻害する働きをする。すなわち、本開示のアンタゴニスト性抗原結合タンパク質の使用は、正常なグルコースレベルを達成することにより、糖尿病の一つもしくは複数の症状、または糖尿病によって引き起こされる長期的合併症、例えば、限定はされないが、高血糖症、高グルカゴン血症（hyperglucanemia）、および高インスリン血症、を改善または防止する、有効な手段である。本開示のアンタゴニスト性抗原結合タンパク質の使用はまた、非糖尿病患者において正常なグルコースレベルを達成することで、肥満症またはＮＡＦＬＤを含むがこれに限定はされない障害を有する対象における、高血糖症、高グルカゴン血症（hyperglucanemia）、および高インスリン血症のリスクを低下させる、並びに、そのような非糖尿病性障害を治療するための、有効な手段である。
ヒトグルカゴン受容体などの抗原に結合する抗体の作製方法が当業者に知られている。例えば、標的抗原ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を作製するための方法は、検出可能な免疫応答を刺激するために有効である量の、その標的抗原ポリペプチドを含む免疫原性組成物をマウスに投与すること、そのマウスから抗体産生細胞（例えば、脾臓由来細胞）を入手し、それらの抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合して抗体産生性ハイブリドーマを得ること、およびそれらの抗体産生性ハイブリドーマを検査してその標的抗原ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを特定することを含み得る。一旦ハイブリドーマが獲得されると、細胞培養物の中で、所望によりハイブリドーマ由来細胞が標的抗原ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する培養条件下でそのハイブリドーマを増殖させることができる。そのモノクローナル抗体はその細胞培養物から精製され得る。そこで、特に望ましい抗体を特定するために多種多様な技術が抗原／抗体相互作用の試験に利用可能である。
例えば、ライブラリーから組換え抗体を選択する方法、または全レパートリーのヒト抗体を産生することが可能な遺伝子導入動物（例えば、マウス）の免疫に依存する方法をはじめとした、必要な特異性を有する抗体を作製または単離する他の適切な方法を使用することができる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）誌、第９０巻：２５５１〜２５５５頁、１９９３年；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら著、Ｎａｔｕｒｅ誌、第３６２巻：２５５〜２５８頁、１９９３年；Ｌｏｎｂｅｒｇら、米国特許第５５４５８０６号明細書、およびＳｕｒａｎｉら、米国特許第５５４５８０７号明細書を参照されたい。
種々の方法で抗体を改変することができる。それらの抗体は単鎖抗体（小型モジュール免疫薬剤、すなわちＳＭＩＰ（商標）を含む）、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片等として作製され得る。抗体はヒト化され得る、キメラ化され得る、脱免疫化され得る、または完全ヒト型であり得る。多数の刊行物が多種多様な抗体とそのような抗体の作製方法について説明している。例えば、米国特許第６３５５２４５号明細書、第６１８０３７０号明細書、第５６９３７６２号明細書、第６４０７２１３号明細書、第６５４８６４０号明細書、第５５６５３３２号明細書、第５２２５５３９号明細書、第６１０３８８９号明細書、および第５２６０２０３号明細書を参照されたい。
キメラ抗体は当技術分野において知られている組換えＤＮＡ技術によって作製され得る。例えば、マウス（または他の種）モノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域をコードしている遺伝子を制限酵素で消化してマウスＦｃをコードする領域を取り外し、そしてヒトＦｃ定常領域をコードしている遺伝子の同等の部分を置換する（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際特許出願公開ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号明細書；Ａｋｉｒａら、欧州特許出願公開第１８４１８７号明細書；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｍ．、欧州特許出願公開第１７１４９６号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願公開第１７３４９４号明細書；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、国際出願公開第８６／０１５３３号パンフレット、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４８１６５６７号明細書；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願公開第１２５０２３号明細書；Ｂｅｔｔｅｒら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第２４０巻：１０４１〜１０４３頁、１９８８年；Ｌｉｕら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）誌、第８４巻：３４３９〜３４４３頁、１９８７年；Ｌｉｕら著、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．誌、第１３９巻：３５２１〜３５２６頁、１９８７年；Ｓｕｎら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）誌、第８４巻：２１４〜２１８頁、１９８７年；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら著、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．誌、第４７巻：９９９〜１００５頁、１９８７年；Ｗｏｏｄら著、Ｎａｔｕｒｅ誌、第３１４巻：４４６〜４４９頁、１９８５年、およびＳｈａｗら著、Ｊ．Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．誌、第８０巻：１５５３〜１５５９頁、１９８８年を参照されたい）。
抗体をヒト化するための方法が当技術分野において説明されている。幾つかの実施形態において、ヒト化抗体は非ヒトＣＤＲに加えてヒトではない起源から導入された１個以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は基本的にＷｉｎｔｅｒと共同研究者の方法に従い、超可変領域配列をヒト抗体の対応配列に対して置換することにより実施され得る（Ｊｏｎｅｓら著、Ｎａｔｕｒｅ誌、第３２１巻：５２２〜５２５頁、１９８６年；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら著、Ｎａｔｕｒｅ誌、第３３２巻：３２３〜３２７頁、１９８８年；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第２３９巻：１５３４〜１５３６頁、１９８８年）。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変領域よりもかなり小さな領域が非ヒト種に由来する対応配列によって置換されているキメラ抗体である（米国特許第４８１６５６７号明細書）。実際にはヒト化抗体は、数個の超可変領域残基と可能であれば数個のフレームワーク領域残基がげっ歯類抗体中の類似の部位の残基によって置換されているヒト抗体であることが典型的である。
Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５６９３７６１号は抗体のヒト化についてのＷｉｎｔｅｒらの方法に対する改良点を開示しており、ＣＤＲが折り畳まれてマウス抗体中に見出される結合可能構造になることを立体構造的または他の化学的不適合性のために妨げるそのヒト化フレームワーク中の構造的モチーフ内の問題に結合力喪失の原因があるとする前提に基づいている。この問題に対処するため、Ｑｕｅｅｎはヒト化されるマウス抗体のフレームワーク配列に対して直鎖ペプチド配列の状態で非常に相同的なヒトフレームワーク配列を使用することを教示している。したがって、Ｑｕｅｅｎの方法は種間でフレームワーク配列を比較することに焦点を当てている。典型的には、全ての利用可能なヒト可変領域配列を特定のマウス配列と比較し、対応するフレームワーク残基間のパーセンテージ同一性を算出する。それらのフレームワーク配列をヒト化プロジェクトに提供するために最も高いパーセンテージを有するヒト可変領域を選択する。ＱｕｅｅｎはＣＤＲを結合可能構造の中に支持ために重要なマウスフレームワーク由来のある特定のアミノ酸残基をヒト化フレームワークの中に保持することが重要であることも教示している。潜在的な重要度は分子モデルから評価される。保持される候補残基は典型的には直鎖配列の状態でＣＤＲに隣接する残基、またはどのＣＤＲ残基からでも物理的にその６Å以内にある残基である。
他のアプローチでは、特定のフレームワークアミノ酸残基の重要性は、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら著、１９８８年によって記載されるように低結合力ヒト化コンストラクトが一旦得られると個々の残基をマウス配列のものに戻し、抗原結合をアッセイすることによって実験的に決定される。フレームワーク配列中の重要なアミノ酸を特定するための別の例となるアプローチはＣａｒｔｅｒらの米国特許第５８２１３３７号およびＡｄａｉｒらの米国特許第５８５９２０５号によって開示されている。これらの参照文献は、フレームワーク内の特異的なＫａｂａｔ残基位置であって、ヒト化抗体中では結合力を維持するために対応するマウスのアミノ酸による置換を必要とし得る前記残基位置を開示している。
抗体をヒト化する「フレームワークシャッフリング」と呼ばれる別の方法は、個々のヒト生殖系列フレームワークをまとめたものにインフレームで融合された非ヒトＣＤＲ可変領域を含むコンビナトリアルライブラリーの作製に依存する（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら著、Ｍｅｔｈｏｄｓ誌、第３６巻：４３頁、２００５年）。次に良好な結合を保持するヒト化抗体をコードするクローンを特定するためにそれらのライブラリーがスクリーニングされる。
ヒト化抗体の作製の際に使用される軽鎖と重鎖の両方のヒト可変領域の選択が抗原性を低下させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法によると、げっ歯類抗体の可変領域の配列が公知のヒト可変ドメイン配列からなる全ライブラリーに対してスクリーニングされる。そして、そのげっ歯類抗体の可変領域の配列に最も近いヒト配列がヒト化抗体用のヒトフレームワーク領域（フレームワーク領域）として受け入れられる（Ｓｉｍｓら著、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．誌、第１５１巻：２２９６頁、１９９３年；Ｃｈｏｔｈｉａら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．誌、第１９６巻：９０１頁、１９８７年）。別の方法は、特定のサブグループの軽鎖可変領域または重鎖可変領域を有する全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用することができる（Ｃａｒｔｅｒら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）誌、第８９巻：４２８５頁、１９９２年；Ｐｒｅｓｔａら著、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．誌、第１５１巻：２６２３頁、１９９３年）。
ヒト可変領域の中に置換される非ヒト残基の選択は様々な因子によって影響を受け得る。これらの因子には、例えば、特定の位置にあるアミノ酸の希少性、ＣＤＲまたは抗原のどちらかとの相互作用の確率、および軽鎖可変ドメイン接触面と重鎖可変ドメイン接触面との間の接触面に参加する確率が含まれる（例えば、米国特許第５６９３７６１号明細書、第６６３２９２７号明細書、および第６６３９０５５号明細書を参照されたい）。これらの因子を分析するための１つの方法は非ヒト配列とヒト化配列の三次元モデルの使用を介したものである。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列のありそうな三次元立体配座構造を例示および提示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの提示物の調査により、候補免疫グロブリン配列の機能におけるそれらの残基のあり得る役割についての分析、例えば、候補免疫グロブリンの抗原への結合能力に影響を与える残基の分析が可能になる。標的抗原への増加した親和性などの所望の抗体特性を達成するために、このようにして非ヒト残基を選択し、ヒト可変領域残基に置換することができる。
完全ヒト抗体を作製するための方法が当技術分野において説明されている。例として、抗ＧＣＧＲ抗体またはその抗原結合性抗体断片を作製するための方法は、ファージ上でヒト抗体のライブラリーを合成するステップ、ＧＣＧＲまたはその抗体結合部分を用いてライブラリーをスクリーニングするステップ、ＧＣＧＲに結合するファージを単離するステップ、およびそのファージから抗体を獲得するステップを含む。別の例として、ファージディスプレイ技術に使用される抗体ライブラリーを調製するための１つの方法は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を備える非ヒト動物をＧＣＧＲまたはその抗原性部分で免疫して免疫応答を生じさせるステップ、その免疫された動物から抗体産生細胞を取り出すステップ、それらの取り出された細胞から本開示の抗体の重鎖と軽鎖をコードするＲＮＡを単離するステップ、そのＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作製するステップ、プライマーを使用してｃＤＮＡを増幅するステップ、およびファージディスプレイベクターにそのｃＤＮＡを挿入して抗体をファージ上に発現させるステップを含む。本開示の組換え抗ＧＣＧＲ抗体はこのようにして獲得され得る。
また、例として、本開示の組換えヒト抗ＧＣＧＲ抗体は、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることによっても単離され得る。そのライブラリーは、Ｂ細胞から単離されたｍＲＮＡより調製されたヒトＶＬ ｃＤＮＡとＶＨ ｃＤＮＡを使用して作製されたｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーであることが好ましい。そのようなライブラリーを調製し、そしてスクリーニングするための方法が当技術分野において知られている。ファージディスプレイライブラリーを作製するためのキットが市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａリコンビナント・アンティボディ・システム、カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。抗体ディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングにおいて使用され得る他の方法および試薬も存在する（例えば、全ての参照により本明細書に援用される米国特許第５２２３４０９号明細書、ＰＣＴ国際公開第９２／１８６１９号パンフレット、第９１／１７２７１号パンフレット、第９２／２０７９１号パンフレット、第９２／１５６７９号パンフレット、第９３／０１２８８号パンフレット、第９２／０１０４７号パンフレット、第９２／０９６９０号パンフレット、Ｆｕｃｈｓら著、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ誌、第９巻：１３７０〜１３７２頁（１９９１年）；Ｈａｙら著、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ誌、第３巻：８１〜８５頁、１９９２年；Ｈｕｓｅら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第２４６巻：１２７５〜１２８１頁、１９８９；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら著、Ｎａｔｕｒｅ誌、第３４８巻：５５２〜５５４頁、１９９０年；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら著、ＥＭＢＯ Ｊ．誌、１２巻：７２５〜７３４頁、１９９３年；Ｈａｗｋｉｎｓら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．誌、第２２６巻：８８９〜８９６頁、１９９２年；Ｃｌａｃｋｓｏｎら著、Ｎａｔｕｒｅ誌、第３５２巻：６２４〜６２８頁、１９９１年；Ｇｒａｍら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）誌、第８９巻：３５７６〜３５８０頁、１９９２年；Ｇａｒｒａｄら著、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ誌、第９巻：１３７３〜１３７７頁、１９９１年；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら著、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．誌、第１９巻：４１３３〜４１３７頁、１９９１年；およびＢａｒｂａｓら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）誌、第８８巻：７９７８〜７９８２頁、１９９１年）を参照されたい）。
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座の幾つか、または全てをゲノム内に含む非ヒト遺伝子導入動物、例えばＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）動物（Ａｂｇｅｎｉｘ社／Ａｍｇｅｎ社、フリーモント、カリフォルニア州）をヒトＩｇＥ抗原で免疫することによっても作製される。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスは、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座と軽鎖遺伝子座の大きな断片を含み、且つ、マウス抗体の産生が欠損している遺伝子改変マウス株である。例えば、Ｇｒｅｅｎら著、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ誌、第７巻：１３〜２１頁、１９９４年および米国特許第５９１６７７１号明細書、第５９３９５９８号明細書、第５９８５６１５号明細書、第５９９８２０９号明細書、第６０７５１８１号明細書、６０９１００１号明細書、第６１１４５９８号明細書、第６１３０３６４号明細書、第６１６２９６３号明細書、および第６１５０５８４号明細書を参照されたい。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスは成体様ヒトレパートリーの完全ヒト抗体を産生し、抗原特異的ヒト抗体を生成する。幾つかの実施形態において、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスは酵母人工染色体（ＹＡＣ）中のヒト重鎖遺伝子座とカッパ軽鎖遺伝子座のメガベースサイズの生殖系列構成断片の導入を介してヒト抗体Ｖ遺伝子レパートリーの約８０％を含む。他の実施形態において、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスはヒトラムダ軽鎖遺伝子座のほぼ全てをさらに含む。Ｍｅｎｄｅｚら著、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ誌、第１５巻：１４６〜１５６頁、１９９７年；ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ著、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．誌、第１８８巻：４８３〜４９５頁、１９９８年；および国際公開第９８／２４８９３号パンフレットを参照されたい。
様々な実施形態において、本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、組換え抗体、ディアボディ、キメラ化もしくはキメラ抗体またはその抗原結合断片、ヒト化抗体またはその抗原結合断片、完全ヒト抗体またはその抗原結合断片、ＣＤＲ移植抗体またはその抗原結合断片、単鎖抗体、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２、および合成もしくは半合成抗体である抗体またはその抗原結合性抗体断片を利用している。
様々な実施形態において、本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は、例えば、少なくとも約１×１０−７Ｍ、少なくとも約１×１０−８Ｍ、少なくとも約１×１０−９Ｍ、少なくとも約１×１０−１０Ｍ、少なくとも約１×１０−１１Ｍ、または少なくとも約１×１０−１２Ｍの解離定数（ＫＤ）でグルカゴン受容体抗原に結合する抗体または抗原結合断片を利用している。様々な実施形態において、本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は、例えば、少なくとも約１×１０−７Ｍから少なくとも約１×１０−８Ｍ、少なくとも約１×１０−８Ｍから少なくとも約１×１０−９Ｍ、少なくとも約１×１０−９Ｍから少なくとも約１×１０−１０Ｍ、少なくとも約１×１０−１０Ｍから少なくとも約１×１０−１１Ｍ、または少なくとも約１×１０−１１Ｍから少なくとも約１×１０−１２Ｍの範囲の解離定数（ＫＤ）でグルカゴン受容体抗原に結合する抗体または抗原結合断片を利用している。
グルカゴン受容体に対する抗体は、例えば、米国特許第５，７７０，４４５号；同第７，９４７，８０９号；同第７，９６８，６８６号；同第８，５４５，８４７号；同第８，７７１，６９６号；同第９，１０２，７３２号；同第９，２４８，１８９号；欧州特許出願第ＥＰ２０７４１４９Ａ２号；欧州特許第ＥＰ０６５８２００Ｂ１号；米国特許公開第２００９／００４１７８４号；同第２００９／０２５２７２７号；同第２０１３／０３４４５３８号；同第２０１４／０３３５０９１号；および同第２０１６００７５７７８号、並びに国際公開第２００８／０３６３４１号で記載されている。本発明の様々な実施形態において、単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は、例えば米国特許第７，９４７，８０９号および同第８，１５８，７５９号（各々、様々な抗ＧＣＧＲ抗体または抗ＧＣＧＲ抗原結合性フラグメントのポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列のその具体的な教示について、その全体が参照によって本明細書に援用される）に記載されるポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を含む、抗ＧＣＧＲ（「アンタゴニスト性」）抗体または抗ＧＣＧＲ抗原結合性フラグメントである。
本開示の様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号２に示される重鎖可変領域配列を備える抗体のものと同等以上の抗原結合親和性を有する抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号２に示される重鎖可変領域配列を備える抗体と同じエピトープに結合する抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号２に示される重鎖可変領域配列を備える抗体と競合する抗ＧＣＧＲ抗体である。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号２に示される重鎖可変領域配列の少なくとも１つ（例えば、２つ、または３つの）ＣＤＲを含む抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は配列番号２に示される重鎖可変領域配列を備える抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は配列番号２に示される重鎖可変領域配列、すなわち

ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＭＷＹＤＧＳＮＫＤＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＲＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＨＹＤＩＬＴＧＹＮＹＹＹＧＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号２）

を含む抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。
本開示の様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号３に示される軽鎖可変領域配列を備える抗体のものと同等以上の抗原結合親和性を有する抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号３に示される軽鎖可変領域配列を備える抗体と同じエピトープに結合する抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号３に示される軽鎖可変領域配列を備える抗体と競合する抗ＧＣＧＲ抗体である。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号３に示される軽鎖可変領域配列の少なくとも１つ（例えば、２つ、または３つの）ＣＤＲを含む抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は配列番号３に示される軽鎖可変領域配列を備える抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は配列番号３に示される軽鎖可変領域配列、すなわち

ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＦＶＴＹＹＣＬＱＨＮＳＮＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３）

を含む抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。
様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号２または３の配列と、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の観察された相同性を共有するアミノ酸配列を含む。
本開示の様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号４に示される重鎖可変領域配列を備える抗体のものと同等以上の抗原結合親和性を有する抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号４に示される重鎖可変領域配列を備える抗体と同じエピトープに結合する抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号４に示される重鎖可変領域配列を備える抗体と競合する抗ＧＣＧＲ抗体である。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号４に示される重鎖可変領域配列の少なくとも１つ（例えば、２つ、または３つの）ＣＤＲを含む抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は配列番号４に示される重鎖可変領域配列を備える抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は配列番号４に示される重鎖可変領域配列、すなわち

ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＭＷＹＤＧＳＮＫＤＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＨＹＤＩＬＴＧＹＮＹＹＹＧＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号４）

を含む抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。
本開示の様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号５に示される軽鎖可変領域配列を備える抗体のものと同等以上の抗原結合親和性を有する抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号５に示される軽鎖可変領域配列を備える抗体と同じエピトープに結合する抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号５に示される軽鎖可変領域配列を備える抗体と競合する抗ＧＣＧＲ抗体である。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号５に示される軽鎖可変領域配列の少なくとも１つ（例えば、２つ、または３つの）ＣＤＲを含む抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は配列番号５に示される軽鎖可変領域配列を備える抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は配列番号５に示される軽鎖可変領域配列、すなわち

ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＶＴＹＹＣＬＱＨＮＳＮＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５）

を含む抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。
様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号４または５の配列と、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の観察された相同性を共有するアミノ酸配列を含む。
本開示の様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号６に示される重鎖可変領域配列を備える抗体のものと同等以上の抗原結合親和性を有する抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号６に示される重鎖可変領域配列を備える抗体と同じエピトープに結合する抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号６に示される重鎖可変領域配列を備える抗体と競合する抗ＧＣＧＲ抗体である。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号６に示される重鎖可変領域配列の少なくとも１つ（例えば、２つ、または３つの）ＣＤＲを含む抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は配列番号６に示される重鎖可変領域配列を備える抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は配列番号６に示される重鎖可変領域配列、すなわち

ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＭＷＹＤＧＳＮＫＤＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＲＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＨＹＤＩＬＴＧＹＮＹＹＹＧＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号６）

を含む抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。
本開示の様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号７に示される軽鎖可変領域配列を備える抗体のものと同等以上の抗原結合親和性を有する抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号７に示される軽鎖可変領域配列を備える抗体と同じエピトープに結合する抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号７に示される軽鎖可変領域配列を備える抗体と競合する抗ＧＣＧＲ抗体である。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号７に示される軽鎖可変領域配列の少なくとも１つ（例えば、２つ、または３つの）ＣＤＲを含む抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は配列番号７に示される軽鎖可変領域配列を備える抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は配列番号７に示される軽鎖可変領域配列、すなわち

ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＦＶＴＹＹＣＬＱＨＮＳＮＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号７）

を含む抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。
様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号６または７の配列と、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の観察された相同性を共有するアミノ酸配列を含む。
本開示の様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号８に示される重鎖配列を備えるキメラ抗体のものと同等以上の抗原結合親和性を有する抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号８に示される重鎖配列を備える抗体と同じエピトープに結合する抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号８に示される重鎖配列を備える抗体と競合する抗ＧＣＧＲ抗体である。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号８に示される重鎖配列の少なくとも１つ（例えば、２つ、または３つの）ＣＤＲを含む抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は配列番号８に示される重鎖配列を備える抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号８に示される重鎖配列、すなわち

ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＬＲＧＶＱＣＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＭＷＹＤＧＳＮＫＤＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＲＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＨＹＤＩＬＴＧＹＮＹＹＹＧＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ（配列番号８）

を含む抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。
本開示の様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号９に示される軽鎖配列を備えるキメラ抗体のものと同等以上の抗原結合親和性を有する抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号９に示される軽鎖配列を備える抗体と同じエピトープに結合する抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号９に示される軽鎖配列を備える抗体と競合する抗ＧＣＧＲ抗体である。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号９に示される軽鎖配列の少なくとも１つ（例えば、２つ、または３つの）ＣＤＲを含む抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は配列番号９に示される軽鎖配列を備える抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は配列番号９に示される軽鎖配列、すなわち

ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＦＰＧＡＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＦＶＴＹＹＣＬＱＨＮＳＮＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ（配列番号９）

を含む抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。
様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号８または９の配列と、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の観察された相同性を共有するアミノ酸配列を含む。
本開示の様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８から選択される重鎖可変領域配列と配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、および配列番号４７から選択される軽鎖可変領域配列を備える抗ＧＣＧＲ抗体であり得る。様々な実施形態において、前記抗体は、配列番号１０〜２８または配列番号２９〜４７の配列と、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の観察された相同性を共有するアミノ酸配列を含む。
Figure 0006861641
様々な実施形態において、単離アンタゴニスト性抗体は、配列番号２８の重鎖可変領域をコードするアミノ酸配列および配列番号４７の軽鎖可変領域をコードするアミノ酸配列を含む完全ヒト抗体である。
本開示の単離抗ＧＣＧＲ抗体、本開示の抗体断片、または本開示の抗体誘導体は当技術分野において知られているあらゆる定常領域を含み得る。その軽鎖定常領域は、例えば、カッパまたはラムダタイプの軽鎖定常領域、例えばヒトカッパまたはラムダタイプの軽鎖定常領域であり得る。その重鎖定常領域は、例えば、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、またはミュータイプの重鎖定常領域、例えば、ヒトアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、またはミュータイプの重鎖定常領域であり得る。様々な実施形態において、前記軽鎖定常領域または重鎖定常領域は天然定常領域の断片、誘導体、変異体、または改変タンパク質である。
目的の抗体から異なるサブクラスまたはアイソタイプの抗体を誘導するための技術、すなわち、サブクラススイッチングが知られている。したがって、ＩｇＧ抗体が例えばＩｇＭ抗体に由来することも、その反対もあり得る。そのような技術により、所与の抗体（親抗体）の抗原結合特性を持つが、親抗体のものと異なる抗体アイソタイプまたはサブクラスに関連する生物学的特性も持つ新しい抗体の調製が可能になる。組換えＤＮＡ技術を用いても良い。特定の抗体ポリペプチドをコードするクローン化ＤＮＡ、例えば、所望のアイソタイプの抗体の定常ドメインをコードするＤＮＡをそのような技法に用いても良い。Ｌａｎｉｔｔｏら著、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．誌、第１７８巻：３０３〜１６頁（２００２年）も参照されたい。
様々な実施形態において、本開示の単離抗原結合タンパク質は配列番号４８に示されるカッパ軽鎖定常領域またはその断片を含む。様々な実施形態において、本開示の単離抗原結合タンパク質は配列番号４９に示されるラムダ軽鎖定常領域またはその断片を含む。様々な実施形態において、本開示の単離抗原結合タンパク質は配列番号５０に示されているＩｇＧ２重鎖定常領域またはその断片を含む。
様々な実施形態において、本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は配列番号５１に示される重鎖配列を備え、且つ、番号５２に示される軽鎖配列を備える。
本開示の様々な実施形態において、前記単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質はヘミボディである。「ヘミボディ」は、完全な重鎖、完全な軽鎖、およびその完全な重鎖のＦｃ領域と対合した２つ目の重鎖Ｆｃ領域を含む免疫学的に機能的な免疫グロブリン構築物である。その重鎖Ｆｃ領域とその第２重鎖Ｆｃ領域を連結するためにリンカーを用いることができるが、リンカーが必要なわけでもない。様々な実施形態において、前記ヘミボディは（ｉ）完全軽鎖と（ｉｉ）Ｆｃ領域（例えば、ＩｇＧ２ Ｆｃ領域）に融合した重鎖を含む一価抗原結合タンパク質である。ヘミボディを調製するための方法は、例えば、そのようなヘミボディの調製を教示する目的で本明細書における参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１２／０１９５８７９号明細書に記載されている。
医薬組成物
別の態様では本開示は１種類以上の薬学的に許容可能な担体と共に本明細書に記載される単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。本明細書に記載されるそれらの医薬組成物および使用方法は、下で詳細に説明されるように他の活性薬剤との併用（共投与）実施形態も包含する。
概して、本開示の前記アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は１種類以上の薬学的に許容可能な担体と合同した製剤として投与されるのに適している。「担体」という用語は、本開示の化合物以外のあらゆる成分を記述するために本明細書において使用される。担体の選択は特定の投与モード、溶解性と安定性に対する担体の効果、および剤形の性質などの因子に大いに依存することになる。本明細書において使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」には生理学的に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、被覆材、抗菌剤と抗真菌剤、等張化剤、および吸収遅延化剤などが含まれる。薬学的に許容可能な担体の幾つかの例は水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの組合せである。多くの事例において、前記組成物はその組成物の中に等張化剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール類、または塩化ナトリウムを含む。薬学的に許容可能な物質の追加例は湿潤剤、または湿潤もしくは乳化剤、保存剤、もしくは緩衝剤などの少量の補助物質であり、それらは前記抗体の有効期間または有効性を向上させる。本開示の医薬組成物およびそれらの調製方法は容易に当業者に明らかになる。そのような組成物およびそれらの調製方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、（マック・パブリッシング社、１９９５年）内に見出すことができる。概して、前記医薬組成物は、無菌であり、実質的に等張であり、且つ、米国食品医薬品局の全てのＧＭＰ規制を全面順守したものとして製剤される。
本開示の医薬組成物は典型的には非経口投与に適切である。本明細書において使用される場合、医薬組成物の「非経口投与」には患者組織の物理的裂傷形成とその組織のその裂傷を介した医薬組成物の投与を特徴とし、したがって一般的には血流、筋肉、または内臓へ直接的に投与することになるあらゆる投与経路が含まれる。したがって、非経口投与には医薬組成物の注射によるその組成物の投与、外科的切開を介したその組成物の塗布によるその組成物の投与、組織貫通性非外科的創傷を介したその組成物の塗布によるその組成物の投与などが含まれるがこれらに限定されない。具体的に、非経口投与は皮下注射または注入、腹膜内注射または注入、筋肉内注射または注入、胸骨内注射または注入、静脈内注射または注入、動脈内注射または注入、髄腔内注射または注入、脳室内注射または注入、尿道内注射または注入、頭蓋内注射または注入、滑膜内注射または注入、または腎臓透析注入技術を含むと考えられているがこれらに限定されない。
本開示の医薬組成物は、標準的な針および注射器を用いて皮下または静脈内に送達され得る。さらに皮下送達については、ペン型送達デバイスが、本開示の医薬組成物の送達に容易に適用される。このようなペン型送達デバイスは、再利用可能なものと、使い捨てのものがある。再利用可能なペン型送達デバイスは通常、医薬組成物を含有する交換可能カートリッジを利用する。カートリッジ内の全ての医薬組成物が投与され、カートリッジが空になった後、その空のカートリッジは容易に、廃棄し、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと交換することができる。ペン型送達デバイスはその後再利用することができる。使い捨てペン型送達デバイスには、交換可能カートリッジが存在しない。そうではなく、使い捨てペン型送達デバイスには、デバイス内部のリザーバーに保持された医薬組成物が予め充填されている。リザーバーから医薬組成物がなくなると、デバイス全体が廃棄される。多数の再利用可能なペン型およびオートインジェクター型の送達デバイスが、本開示の医薬組成物の皮下送達に適用されており、例えば、限定はされないが、ＡＵＴＯＰＥＮ（登録商標）（オーウェン・マンフォード社（Owen Mumford, Inc.）、ウッドストック、英国）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（登録商標）（ディストロニック・メディカル・システムズ社（Disetronic Medical Systems）、ブルクドルフ、スイス）、およびＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（登録商標）、ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（登録商標）ペン（イーライリリー社（Eli Lilly and Co.）、インディアナポリス、インディアナ州）が挙げられる。
非経口投与に適切な医薬組成物製剤は典型的には無菌水または無菌等張生理食塩水などの薬学的に許容可能な担体と混合されて有効成分を含むことが一般的である。そのような製剤はボーラス投与または連続投与に適切な形態で調製、包装、または販売されて良い。注射可能製剤は、保存剤を含むアンプルまたは複数回投与用容器などの単位剤形の状態で調製、包装、または販売されて良い。非経口投与用製剤には懸濁剤、水剤、油性ベヒクルまたは水性ベヒクル中の乳剤、ペースト剤などが含まれるがこれらに限定されない。そのような製剤は、懸濁化剤、安定化剤または分散化剤を含むがこれらに限定されない１種類以上の追加の成分をさらに含んで良い。非経口投与用製剤の１つの実施形態において、前記有効成分は、再構成された組成物の非経口投与前に適切なベヒクル（例えば無菌発熱性物質非含有水）と共に再構成されるように乾燥形状（すなわち、粉末形状または顆粒形状）で提供される。非経口製剤には塩、炭水化物および緩衝剤（好ましくは３から９までのｐＨ）などの担体を含み得る水剤も含まれるが、幾つかの用途について非経口製剤は無菌非水性溶液として、または無菌発熱性物質非含有水などの適切なベヒクルと併せて使用される乾燥体としてより適切に製剤され得る。例となる非経口投与剤形には無菌水溶液、例えばプロピレングリコール水溶液またはブドウ糖水溶液中の水剤または懸濁剤が含まれる。そのような剤形は所望により適切に緩衝化され得る。有用な他の非経口投与可能製剤には有効成分を微晶質形状またはリポソーマル調製物形状で含むものが含まれる。非経口投与用製剤は即時放出および／または調節放出されるように製剤され得る。放出調節製剤には遅延放出、持続性放出、パルス放出、制御放出、標的放出、およびプログラム放出が含まれる。
例えば、１つの態様では無菌注射溶液は、必要に応じて上に列記した成分のうちの１つ、またはそれらの成分の組合せを含む適切な溶媒の中に必要な量の前記単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質を包含し、その後にそれをフィルター滅菌することで調製され得る。概して、分散剤は、基礎分散媒と上で列挙した成分の中の必要とされる他の成分を含む無菌ベヒクルの中に前記活性化合物を包含することにより調製される。無菌注射溶液の調製用の無菌粉剤の場合では、以前に無菌濾過されたその溶液から真空乾燥および凍結乾燥などの調製方法によって追加のあらゆる所望の成分と前記有効成分からなる粉末が産生される。溶液の適正な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆材の使用によって、分散剤の場合は要求される粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。注射可能組成物の長期吸収は吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを前記組成物の中に含むことによって可能になる。様々な実施形態において、それら注射可能組成物は市販の使い捨て注射用器具を使用して投与される。
本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質を鼻腔内経路で投与することができ、または吸入により、典型的には乾燥粉剤吸入器からの（単独での、混合物としての、または、例えば、適切な薬学的に許容可能な担体と混合された混合成分粒子としての）乾燥粉剤の形状での吸入により投与することができ、適切な噴射剤の使用を含む、または含まない加圧容器、ポンプ、スプレー、噴霧器（好ましくは細かい霧を作製するために電気流体力学を使用する噴霧器）、またはネブライザからのエアロゾルスプレーとして投与することができ、または点鼻薬として投与することができる。
概して、その加圧容器、ポンプ、スプレー、噴霧器、またはネブライザは、本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質の溶液または懸濁液であって、例えば、前記活性薬剤の分散、溶解、またはその放出の長期化にとって適切な薬剤である噴射剤を溶媒として含む前記溶液または懸濁液を含有する
乾燥粉剤製剤または懸濁剤製剤の使用前に前記医薬製品は概して吸入による送達に適切なサイズ（典型的には５マイクロン未満）にまで微粉にされる。これはスパイラルジェットミリング、流動床ジェットミリング、ナノ粒子を形成するための超臨界流体プロセッシング、高圧ホモジナイゼーション、またはスプレー乾燥などのあらゆる適切な粉砕方法によって達成され得る。
吸入器または散布器の中に使用するためのカプセル、ブリスターおよびカートリッジは、本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質、適切な粉末基材、および性能調節剤からなる粉末混合物を含むように製剤され得る。
メントールおよびレボメントールなどの適切な着香料、またはサッカリンもしくはサッカリンナトリウムなどの甘味料を吸入／鼻腔内投与用の本開示の製剤に添加して良い。
吸入／鼻腔内投与用の製剤は即時放出および／または調節放出されるように製剤され得る。放出調節製剤には遅延放出、持続性放出、パルス放出、制御放出、標的放出、およびプログラム放出が含まれる。
乾燥粉剤吸入器およびエアロゾル剤の事例では投薬単位は計量された量を送達する弁によって決定される。本開示に準拠する単位は、計量された用量または「一吹き」の本開示の抗体を投与するように用意されていることが典型的である。全体的な１日用量は単回投与で投与されることが典型的であり、より一般的には一日を通して複数に分割された用量として投与される。
本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は経口投与用に製剤されても良い。経口投与はその化合物が胃腸管に入ることになる飲み込み、および／またはその化合物が口から直接的に血流に入るバッカル投与、舌投与、または舌下投与を含み得る。経口投与に適切な製剤には、錠剤、多粒子またはナノ粒子を含む軟質カプセル剤または硬質カプセル剤、液剤、または粉剤、ロゼンジ剤（液体充填型を含む）、チューイング剤、ゲル剤、急速分散剤形、フィルム剤、膣坐剤、スプレー剤、およびバッカル／粘膜付着パッチなどの固形系、半固形系、および液体系が含まれる。
経口用の医薬組成物は医薬組成物の製造についての技術分野に知られているあらゆる方法に従って調製されて良く、薬学的に洗練されており、且つ、口当たりが良い調製物を提供するためにそのような組成物は甘味剤からなる群より選択される１種類以上の薬剤を含んで良い。例えば、経口送達用錠剤を調製するために前記単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質が少なくとも１種類の医薬担体と混合され、そしてその固形製剤が胃腸管への送達用に公知の方法に従って圧縮されて錠剤に成形される。その錠剤組成物は添加物、例えばサッカリド担体またはセルロース担体、デンプンペーストまたはメチルセルロースなどの結合剤、充填剤、崩壊剤、または医薬調製物の製造に通常は使用されることが典型的である他の添加物と共に製剤されることが典型的である。経口送達用カプセル剤を調製するためにＤＨＥＡが少なくとも１種類の医薬担体と混合され、そしてその固形製剤が胃腸管への送達に適切なカプセル容器の中に入れられる。単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質を含む組成物は、参照により本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、１９９０年（マック・パブリッシング社、イーストン、ペンシルバニア州１８０４２）の第８９章に概ね記載されているように調製され得る。
様々な実施形態において、前記医薬組成物は、錠剤の製造にとって適切である無毒の薬学的に許容可能な担体と混合して単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質を含む経口送達用錠剤として製剤される。これらの担体は炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤、顆粒化剤および崩壊剤、例えばトウモロコシデンプン、ゼラチンまたはアカシアガム、および滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクであり得る。それらの錠剤は被覆されていなくても良く、または胃腸路における崩壊と吸収を遅らせることによってより長い期間にわたって持続性作用を提供するために公知の技術で被覆されても良い。例えば、モノステアリン酸グリセリルもしくはジノステアリン酸グリセリル単独またはワックスとそれらなどの時間遅延物質を用いて良い。
様々な実施形態において、前記医薬組成物は、前記単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質が不活性固形希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはカオリンと混合している硬質ゼラチンカプセル剤として、または前記単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質が水性媒体または油性媒体、例えばラッカセイ油、ピーナッツ油、液体パラフィン、またはオリーブ油と混合している軟質ゼラチンカプセル剤として製剤される。
液体製剤には懸濁剤、水剤、シロップ剤、およびエリキシル剤が含まれる。そのような製剤は（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースから作製された）軟質カプセル剤または硬質カプセル剤の中で充填剤として使用されて良く、典型的には担体、例えば水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、または適切な油と１種類以上の乳化剤および／または懸濁化剤を含む。液体製剤は例えばサシェの固形物の再構成によっても調製され得る。
当技術分野において受け入れられているペプチド、タンパク質または抗体のあらゆる投与方法が本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質を投与するために適切に用いられ得る。
治療方法
グルカゴン受容体とのそれらの相互作用により、本アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は、現在の治療に関連する望まれない副作用のうちの一つまたは複数を低減および／または排除しつつ、糖新生およびグリコーゲン溶解を制御することにより血糖値を低下させるのに、並びにまた、グルカゴンのその受容体との相互作用の遮断が有益である広範囲の状態および障害を治療するのに、有用である。
本開示の一態様において、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する治療有効量の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質を対象に投与することを含む、過剰なレベルのグルカゴン（高グルカゴン血症（hypergluconemia））および／または血糖を特徴とする障害または状態と診断された対象を治療するための方法が提供される。様々な実施形態において、アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は完全ヒトモノクローナル抗体であり、障害は肥満症である。様々な実施形態において、アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は完全ヒトモノクローナル抗体であり、障害はＮＡＦＬＤである。様々な実施形態において、アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は完全ヒトモノクローナル抗体であり、障害はＮＡＳＨである。
アンタゴニスト性抗原結合タンパク質、特に本開示によるヒト抗体は、有望な治療薬となるのに、完治させる必要も、あるいは疾患の全ての症状もしくは徴候を根絶する必要もない。関連分野で認知されているように、治療薬として使用される薬剤は、所与の病状の重症度を低減すればよく、有用な治療薬と見なされるために疾患の全ての徴候を根絶する必要はない。同様に、予防的に施される処置も、有望な予防薬となるために、状態の発生防止に完全に効果的である必要はない。単に、疾患の影響を低減すれば（例えば、その症状の数もしくは重症度を低減することにより、または別の治療の有効性を増加させることにより、または別の有益な作用をもたらすことにより）、あるいは、疾患が対象において発生もしくは悪化する可能性を減少させれば、十分である。本開示の一実施形態は、特定の障害の重症度を示す指標のベースラインを超える持続的な改善を誘導するのに十分な量および時間で、ヒト抗体等の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質を対象に投与することを含む、方法を対象とする。
本開示の様々な実施形態において、肥満症は、ＢＭＩ３０ｋｇ／ｍ２以上と定義される（国立衛生研究所、Clinical Guidelines on the Identification, Evaluation, and Treatment of Overweight and Obesity in Adults (1998)）。他の様々な実施形態において、本開示は、２５ｋｇ／ｍ２以上、２６ｋｇ／ｍ２以上、２７ｋｇ／ｍ２以上、２８ｋｇ／ｍ２以上、２９ｋｇ／ｍ２以上、２９．５ｋｇ／ｍ２以上、または２９．９ｋｇ／ｍ２以上の肥満度指数（ＢＭＩ）を特徴とする疾患、障害、または状態を包含することも意図され、これらは全て典型的には過体重と見なされる。
ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質、具体的には本開示の完全ヒト抗体は一定の期間にわたって定期的な間隔で例えば１回、または１回よりも多く投与されて良い。様々な実施形態において、完全ヒト抗体は一定の期間にわたって少なくとも１カ月以上につき一回、例えば１カ月につき一回、２か月につき一回、または３か月につき一回、または不確定の頻度でも投与される。慢性の病気の治療については長期治療が非常に有効であることが一般的である。しかしながら、急性の病気の治療についてはより短い期間の投与、例えば、１〜６週間までの投与で充分であり得る。概して、前記完全ヒト抗体は、患者が選択された指標または選択された複数の指標について基線よりも上の医学的に適切な程度の改善を示すまで投与される。
本明細書において提供される治療計画の一例は、血糖レベルが関与する病気を治療するために適切な投与量で単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質を週に一度、または２週間に一度皮下注射することを含む。単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質の週に一度、２週間に一度、または月に一度の投与は所望の結果が達成されるまで、例えば、患者の症状が治まるまで継続されることになる。治療は必要に応じて再開されて良く、あるいは維持用量が投与されて良い。
患者の血糖レベルは、あるとすれば幾らかでもそれらのレベルの変化を検出するためにヒト抗体などの単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質による治療の前、治療中、および／または治療後にモニターされて良い。幾つかの障害について、血糖上昇の発生率は疾患ステージなどの因子に従って変化し得る。グルコースレベルを測定するために公知の技術が用いられて良い。グルカゴンレベルも公知の技術、例えばＥＬＩＳＡを用いて患者の血液の中で測定されて良い。
治療的に有効な用量は、ＩＣ５０を決定することによって細胞培養アッセイから最初に推定され得る。その後、用量は、細胞培養において決定されるＩＣ５０を含む循環血漿中濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて定式化され得る。そのような情報はヒトにおける有用な用量をより精密に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、ＨＰＬＣまたはその治療薬に特異的な抗イディオタイプ抗体を使用する免疫アッセイによって測定され得る。患者の病気を診る個々の医師によって正確な組成物、投与経路、および投与量が選択され得る。
投与計画を調節して最適な所望の応答（例えば、治療的応答または予防的応答）をもたらすことができる。例えば、単回ボーラスを投与することができ、一定の期間にわたって数回に分割された用量（複数回用量または反復用量または維持用量）を投与することができ、そして急迫した治療状況によって示されるように比例的にその用量を減少または増加することができる。投与を簡単にし、且つ、投与量を均一にするために投薬単位剤形で非経口組成物を製剤することが特に有利である。本明細書において使用される投薬単位剤形は治療を受ける哺乳類対象への統一的な投与量として適切な物理的に別々の単位を指し、各単位は必要とされる医薬担体と共に所望の治療効果をもたらすように計算された所定の量の活性化合物を含む。本開示の投薬単位剤形の仕様は主に前記抗体に独特の特性、および達成されるべき特定の治療効果または予防効果によって決定づけられる。
したがって、当業者は本明細書において提供される開示に基づいて治療技術分野においてよく知られている方法に準拠して用量と投与計画が調節されることを理解することになる。すなわち、最大忍容用量を容易に確定することができ、検出可能な治療利益を患者に提供するための各薬剤を投与する時間的要求事項を決定できるように検出可能な治療利益をその患者に対して提供する有効量を決定することもできる。したがって、ある特定の用量と投与計画が本明細書において例示されるが、これらの例は本開示の実施に際して患者に提供され得る用量と投与計画を決して限定しない。
投与量の値は緩和されるべき病気の種類と重症度によって変化する場合があり得、それらは単回用量または複数回用量を含み得ることが特筆されるべきである。どの特定の患者についても具体的な投与計画は、その個人の要求と前記組成物の投与を行い、またはその投与を指揮する人物の専門的な判断に応じて時間と共に調節されるべきであること、および本明細書において明記される投与量範囲はただの例示であり、本請求の構成要素の範囲または実施を制限することを意図したものではないことがさらに理解されるべきである。さらに、本開示の組成物を用いる投与計画は疾患の種類、患者の年齢、体重、性別、医療状態、病気の重症度、投与経路、および使用される特定の抗体をはじめとする様々な因子に基づいて良い。したがって、投与計画は大幅に変化する場合があり得るが、それは標準的方法を用いて日常的に決定され得る。例えば、用量は薬物動態パラメーターまたは薬力学パラメーターに基づいて調節されて良く、それらのパラメーターは毒性効果および／または検査室値などの臨床効果を含み得る。したがって、本開示は当業者によって決定される患者内用量増加を包含する。適切な投与量および投与計画の決定は関連の技術分野においてよく知られており、本明細書において開示される教示が一旦提供されるとそのような決定が包含されることが当業者によって理解されることになる。
ヒト患者への投与について、本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質の毎月の総用量は、当然投与モードに応じて患者当たり０．５〜１２００ｍｇ、患者当たり０．５〜１１００ｍｇ、患者当たり０．５〜１０００ｍｇ、患者当たり０．５〜９００ｍｇ、患者当たり０．５〜８００ｍｇ、患者当たり０．５〜７００ｍｇ、患者当たり０．５〜６００ｍｇ、患者当たり０．５〜５００ｍｇ、患者当たり０．５〜４００ｍｇ、患者当たり０．５〜３００ｍｇ、患者当たり０．５〜２００ｍｇ、患者当たり０．５〜１００ｍｇ、患者当たり０．５〜５０ｍｇ、患者当たり１〜１２００ｍｇ、患者当たり１〜１１００ｍｇ、患者当たり１〜１０００ｍｇ、患者当たり１〜９００ｍｇ、患者当たり１〜８００ｍｇ、患者当たり１〜７００ｍｇ、患者当たり１〜６００ｍｇ、患者当たり１〜５００ｍｇ、患者当たり１〜４００ｍｇ、患者当たり１〜３００ｍｇ、患者当たり１〜２００ｍｇ、患者当たり１〜１００ｍｇ、または患者当たり１〜５０ｍｇの範囲内にあり得る。例えば、毎月の静脈内用量は患者当たり約１〜１０００ｍｇを必要とし得る。様々な実施形態において、本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は患者当たり約１〜５００ｍｇの毎月の静脈内用量で投与され得る。様々な実施形態において、本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は患者当たり約１〜４００ｍｇの毎月の静脈内用量で投与され得る。様々な実施形態において、本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は患者当たり約１〜３００ｍｇの毎月の静脈内用量で投与され得る。様々な実施形態において、本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は患者当たり約１〜２００ｍｇの毎月の静脈内用量で投与され得る。様々な実施形態において、本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は患者当たり約１〜１５０ｍｇの毎月の静脈内用量で投与され得る。様々な実施形態において、本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は患者当たり約１〜１００ｍｇの毎月の静脈内用量で投与され得る。様々な実施形態において、本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質は患者当たり約１〜５０ｍｇの毎月の静脈内用量で投与され得る。その毎月の総用量は単回用量または分割用量で投与されてよく、医師の裁量で本明細書において示された典型的な範囲から外れてよい。
本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質の治療有効量または予防有効量についての例となる非限定的な毎週または二週間毎の投与範囲は、体重に対して０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜９０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜８０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜７０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜６０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜４０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜５ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜４ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜３ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜４０ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜３０ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜４ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜３ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜２ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜１ｍｇ／ｋｇ、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜４０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜５ｍｇ／ｋｇ、０．１〜４ｍｇ／ｋｇ、０．１〜３ｍｇ／ｋｇ、０．１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ、１〜５０ｍｇ／ｋｇ、１〜４０ｍｇ／ｋｇ、１〜３０ｍｇ／ｋｇ、１〜２５ｍｇ／ｋｇ、１〜２０ｍｇ／ｋｇ、１〜１５ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜７．５ｍｇ／ｋｇ、１〜５ｍｇ／ｋｇ、１〜４ｍｇ／ｋｇ、１〜３ｍｇ／ｋｇ、１〜２ｍｇ／ｋｇであり得、または体重に対して１ｍｇ／ｋｇであり得る。投与量の値は緩和されるべき病気の種類と重症度によって変化する場合があり得ることが特筆されるべきである。どの特定の患者についても具体的な投与計画は、その個人の要求と前記組成物の投与を行い、またはその投与を指揮する人物の専門的な判断に応じて時間と共に調節されるべきであること、および本明細書において明記される投与量範囲はただの例示であり、本請求の構成要素の範囲または実施を制限することを意図したものではないことがさらに理解されるべきである。
様々な実施形態において、投与された総用量は、例えば、約１〜１０００μｇ／ｍｌ、約１〜７５０μｇ／ｍｌ、約１〜５００μｇ／ｍｌ、約１〜２５０μｇ／ｍｌ、約１０〜１０００μｇ／ｍｌ、約１０〜７５０μｇ／ｍｌ、約１０〜５００μｇ／ｍｌ、約１０〜２５０μｇ／ｍｌ、約２０〜１０００μｇ／ｍｌ、約２０〜７５０μｇ／ｍｌ、約２０〜５００μｇ／ｍｌ、約２０〜２５０μｇ／ｍｌ、約３０〜１０００μｇ／ｍｌ、約３０〜７５０μｇ／ｍｌ、約３０〜５００μｇ／ｍｌ、約３０〜２５０μｇ／ｍｌの範囲内の血漿中抗体濃度を達成する。
様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は、単剤療法またはインスリン補充と併用のどちらかで体重に対して０．０１ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して０．０２５ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して０．０５ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して０．０７５ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して０．１ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して０．２５ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して０．５ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して０．７５ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して１ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して１．５ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して２ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して２．５ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して３ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して３．５ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して４ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して４．５ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して５ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して５．５ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して６ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して６．５ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して７ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して７．５ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して８ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して８．５ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して９ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して９．５ｍｇ／ｋｇになる。様々な実施形態において、治療有効量の本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質に適した毎週または二週間毎の用量は体重に対して１０ｍｇ／ｋｇになる。
本開示の医薬組成物の毒性および治療指数は、例えばＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効である用量）のための細胞培養物または実験動物における標準的薬学的手法によって決定され得る。有毒な用量と治療的に有効な用量との間の用量の比率が治療指数であり、それは比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表され得る。大きい治療指数を示す組成物が一般的に好ましい。
様々な実施形態において、前記医薬組成物の単回投与または複数回投与が、患者が必要とし、且つ、患者によって認容される投与量および投与頻度に応じて行われる。あらゆる事象において、前記組成物は患者を効果的に治療するために本明細書において開示される単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質のうちの少なくとも１つを充分な量で提供するべきである。その投与量を一度投与することができるが、治療成果が達成されるまでか、または副作用のために治療の中断が許されるまでのどちらかで、その投与量を定期的に適用してよい。
単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質医薬組成物の投与頻度は、治療法および治療される特定の疾患の性質に応じたものとなる。対象は、毎週または毎月等の一定間隔を置いて、所望の治療結果が達成されるまで、治療され得る。例示的な投与頻度として、限定はされないが：ブレークなしで毎週１回；毎週１回、隔週で１回；２週間に１回；３週間に１回；ブレークなしで２週間毎週１回、その後月１回；ブレークなしで３週間毎週１回、その後月１回；月１回；２ヵ月に１回；３ヵ月に１回；４ヵ月に１回；５ヵ月に１回；もしくは６ヶ月に１回、または年１回が挙げられる。
本明細書において使用される場合、「共投与」、「共投与された」および「との併用で」という用語は本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質および１つ以上の他の治療薬に関して次のこと、すなわち、治療を必要とする患者への本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質と治療薬のそのような組合せの同時投与であって、そのような成分を実質的に同時に前記患者へ放出する単一の剤形に前記成分が一緒に製剤されるときの前記同時投与；治療を必要とする患者への本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質と治療薬のそのような組合せの実質的な同時投与であって、前記患者によって実質的に同時に取り込まれるとそのような成分を実質的に同時に前記患者へ放出する別々の剤形に前記成分が相互に離間して製剤されるときの前記実質的な同時投与；治療を必要とする患者への本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質と治療薬のそのような組合せの連続投与であって、各投与の間にかなりの時間間隔をあけて前記患者によって連続的に取り込まれるとそのような成分を実質的に異なる時間で前記患者へ放出する別々の剤形に前記成分が相互に離間して製剤されるときの前記連続投与；および治療を必要とする患者への本開示の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質と治療薬のそのような組合せの連続投与であって、各部分が同じ経路または異なる経路のどちらで投与されても良い場合にそのような成分が制御放出されると前記成分を同時および／または異なる時間で前記患者へ同時に、連続的に、および／または重複的に放出する単一の剤形に前記成分が一緒に製剤されるときの前記連続投与を意味するものとし、且つ、そのような投与を指し、且つ、そのような投与を含む。
本発明の化合物と組み合わせて使用してよい好適な医薬品として、抗肥満薬（食欲抑制薬を含む）、抗糖尿病薬、血糖降下薬、抗高脂血症薬、および降圧薬が挙げられる。
好適な抗肥満薬（そのうちいくつかは抗糖尿病薬としても作用し得る）として、１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ−１（１１β−ＨＳＤ１型）阻害剤、ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ−１）阻害剤、ＭＣＲ−４アゴニスト、コレシストキニン−Ａ（ＣＣＫ−Ａ）アゴニスト、モノアミン再取り込み阻害剤（シブトラミン等）、交感神経刺激薬、β３アドレナリンアゴニスト、ドパミンアゴニスト（ブロモクリプチン等）、メラニン細胞刺激ホルモン類似体、５ＨＴ２ｃアゴニスト、メラニン凝集ホルモンアンタゴニスト、レプチン（ＯＢタンパク質）、レプチン類似体、レプチンアゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、リパーゼ阻害剤（例えば、テトラヒドロリプスタチン、すなわちオルリスタット）、食欲低下剤（ボンベシンアゴニスト等）、神経ペプチド−Ｙアンタゴニスト（例えば、ベルネペリット（velneperit）等のＮＰＹ Ｙ５アンタゴニスト）、ＰＹＹ３〜３６（その類似体を含む）、ＢＲＳ３修飾薬、オピオイド（opiod）受容体サブタイプのアンタゴニスト混合物、甲状腺模倣薬（thyromimetic agent）、デヒドロエピアンドロステロンまたはその類似体、糖質コルチコイドのアゴニストまたはアンタゴニスト、オレキシンアンタゴニスト、グルカゴン様ペプチド−１アゴニスト、毛様体神経栄養因子（リジェネロン・ファーマシューティカルズ社（Regeneron Pharmaceuticals, Inc.）（ニューヨーク州タリータウン）およびプロクター・アンド・ギャンブル社（オハイオ州シンシナティー）から入手可能なＡＸＯＫＩＮＥ（登録商標）等）、ヒトアグーチ関連タンパク質（ＡＧＲＰ）阻害剤、ヒスタミン３アンタゴニストまたはインバースアゴニスト、ニューロメジンＵアゴニスト、ＭＴＰ／ＡｐｏＢ阻害剤（例えば、ジルロタピド、ＪＴＴ１３０、ウシスタピド（Usistapide）、ＳＬｘ４０９０等の腸選択的ＭＴＰ阻害剤）、オピオイドアンタゴニスト、μオピオイド受容体修飾薬（ＧＳＫ１５２１４９８を含むがこれに限定されない）、ＭｅｔＡｐ２阻害剤（ＺＧＮ−４３３を含むがこれに限定はされない）、グルカゴン、ＧＩＰおよびＧＬＰ１受容体のうち２つ以上に混合型調節作用を有する剤（ＭＡＲ−７０１またはＺＰ２９２９等）、ノルエピネフリントランスポーター阻害剤、カンナビノイド−１−受容体アンタゴニスト／インバースアゴニスト、グレリンアゴニスト／アンタゴニスト、オキシントモジュリンおよび類似体、モノアミン取り込み阻害剤（限定はされないが、テソフェンシン等）、オレキシンアンタゴニスト、組合せ剤（ブプロピオン＋ゾニサミド、プラムリンチド＋メトレレプチン、ブプロピオン＋ナルトレキソン、フェンテルミン＋トピラメート等）等が挙げられる。
様々な実施形態において、抗肥満薬は、腸選択的ＭＴＰ阻害剤（例えば、ジルロタピド、ミトラタピドおよびインプリタピド、Ｒ５６９１８（ＣＡＳ登録番号４０３９８７）およびＣＡＳ登録番号９１３５４１−４７−６）、ＣＣＫａアゴニスト（例えば、Ｎ−ベンジル−２−［４−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）−５−オキソ−１−フェニル−４，５−ジヒドロ−２，３，６，１０ｂ−−テトラアザ−ベンゾ［ｅ］アズレン−６−イル］−Ｎ−イソプロピル−アセトアミド（ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００５／１１６０３４または米国特許出願公開第２００５−０２６７１００Ａ１号に記載）、５ＨＴ２ｃアゴニスト（例えば、ロルカセリン（Lorcaserin））、ＭＣＲ４アゴニスト（例えば、米国特許第６，８１８，６５８号に記載の化合物）、リパーゼ阻害剤（例えば、セチリスタット）、ＰＹＹ３〜３６（本明細書で使用される場合、「ＰＹＹ３〜３６」はペグ化（peglated）ＰＹＹ３〜３６等の類似体、例えば米国特許出願公開第２００６／０１７８５０１号に記載されるもの、も包含する）、オピオイドアンタゴニスト（例えば、ナルトレキソン）、オレオイル−エストロン（ＣＡＳ登録番号１８０００３−１７−２）、オビネピチド（obinepitide）（ＴＭ３０３３８）、プラムリンチド（ＳＹＭＬＩＮ（登録商標））、テソフェンシン（ＮＳ２３３０）、レプチン、ブロモクリプチン、オルリスタット、ＡＯＤ−９６０４（ＣＡＳ登録番号２２１２３１−１０−３）およびシブトラミンから選択される。
様々な実施形態において、前記併用療法は同じ医薬組成物または別々の医薬組成物のどちらかの中にある前記単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質組成物と前記第２薬剤組成物を同時に投与することを含む。様々な実施形態において、単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質組成物と前記第２薬剤組成物は連続的に投与される、すなわち、前記単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質組成物は前記第２薬剤組成物の投与の前または後のどちらかに投与される。
様々な実施形態において、前記単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質組成物と前記第２薬剤組成物の投与は同時である、すなわち、前記単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質組成物と前記第２薬剤組成物の投与期間が相互に重なり合う。
様々な実施形態において、前記単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質組成物と前記第２薬剤組成物の投与は同時ではない。例えば、様々な実施形態において、前記単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質組成物の投与は前記第２薬剤組成物が投与される前に終了する。様々な実施形態において、前記第２薬剤組成物の投与は前記単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質組成物が投与される前に終了する。
様々な実施形態において、本開示は、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する治療有効量の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質を対象に投与することを含む、過体重または肥満の対象を治療するための方法を含む。
様々な実施形態において、本開示は、（ａ）ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する治療有効量の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質；および（ｂ）抗肥満薬を対象に投与することを含む、過体重または肥満の対象を治療するための方法を含む。
様々な実施形態において、本開示は、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨと診断された対象、またはＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨに罹患するリスクがある対象に、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する治療有効量の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質を投与することを含む、対象におけるＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨを治療または予防するための方法を含む。様々な実施形態において、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。様々な実施形態において、本開示はＮＡＦＬＤを治療するための方法を含む。様々な実施形態において、本開示はＮＡＳＨを治療するための方法を含む。
様々な実施形態において、本開示は、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨと診断された対象、またはＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨに罹患するリスクがある対象に、（ａ）ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する治療有効量の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質、および（ｂ）抗肥満薬を投与することを含む、対象におけるＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨを治療または予防するための方法を含む。様々な実施形態において、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。様々な実施形態において、本開示はＮＡＦＬＤを治療するための方法を含む。様々な実施形態において、本開示はＮＡＳＨを治療するための方法を含む。
別の態様において、本開示は、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する治療有効量の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質を対象に投与することを含む、ＮＡＳＨを発症する危険性がある対象（例えば、過体重もしくは肥満である対象またはＮＡＦＬＤを有する対象）を治療するための方法を提供する。
別の態様において、本開示は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療、予防および／または防止を目的とした医薬を調製するための、それを必要とする対象における、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する非天然の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質の使用に関する。
別の態様において、本開示は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の治療、予防および／または防止を目的とした医薬を調製するための、それを必要とする対象における、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する非天然の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質の使用に関する。
別の態様において、本開示は、肥満に分類される（例えば、３０ｋｇ／ｍ２以上の肥満度指数（ＢＭＩ）を有する）対象の治療を目的とした医薬を調製するための、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する非天然の単離アンタゴニスト性抗原結合タンパク質の使用に関する。
本発明を説明してきたが、以下の実施例は例示であり、限定するものではない。
実施例１
本実施例では、様々なＤＩＯマウスモデルにおけるグルコース生産の制御と肥満の発達との間の関係を評価する。具体的には、配列番号８に記載の重鎖配列および配列番号９に記載の軽鎖配列を含む抗ＧＣＧＲ抗体（「ＲＥＭＤ２．５９Ｃ」）のインビボ活性を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いた２０週齢ＤＩＯマウスモデルにおいて評価する。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、高脂肪食（「ＨＦＤ」）を給餌された場合に体脂肪量増加、高血糖症、および高インスリン血症を示すことから、肥満症研究に一般に使用される（REbuffe-Scrive, M et al., Metabolism, 42:1405-1409, 1993; Surwit, RS., Metabolism 44:645-651, 1995）。
本研究では、それぞれ１０匹の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、４〜６週齢、２０〜２２ｇ）からなる３つの群に、高脂肪食（ＨＦＤ）を８週間自由給餌する（以下、「ビヒクル群」または「ＲＥＭＤ２．５９群」または「ペアフィード群」）。１０匹の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、４〜６週齢、２０〜２２ｇ）からなる１つの群に、通常食（「固形飼料」）を８週間自由給餌する（以下、「通常食群」）。８匹の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（雄、４〜６週齢、２０〜２２ｇ）からなる１つの群に、８週間、ＨＦＤを給餌し、７．５ｍｇ／ｋｇのＲＥＭＤ２．５９抗体を週１回投与する（１日目に開始）（以下、「防止群」）。マウスは、一定の温度および湿度の層流室内で、各ケージに１匹ずつ飼育する。動物は、（２２±２℃）の温度および４０％〜７０％の相対湿度に維持された環境監視下の、換気の良いルーム内の、ポリカーボネートケージ内に収容する。蛍光照明により、１日当たりおよそ１２時間照明が与えられた。床敷材は軟木とし、週１回交換する。全手順を、実験動物の管理と使用に関するアメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）ガイドラインに従って実施した。
ＨＦＤ食餌の開始後の８週目に、「ビヒクル群」および「ペアフィード群」はＨＦＤのまま、「通常食群」は固形飼料のまま、全てに、週１回（５７日目に開始して２０週目まで）、皮下注射でビヒクル（ＰＢＳ）を投与する。ＨＦＤ「ＲＥＭＤ２．５９群」には、週１回（５７日目に開始して２０週目まで）、皮下注射で、７．５ｍｇ／ｋｇ（１０ｍＬ／ｋｇ）のＲＥＭＤ２．５９Ｃ抗体を投与する。ＨＦＤ「防止群」は、週１回、２０週目まで、皮下注射による７．５ｍｇ／ｋｇ（１０ｍＬ／ｋｇ）のＲＥＭＤ２．５９Ｃ抗体の投与を継続する。試験群割当の概略を以下の表２に記す。
Figure 0006861641
体重は試験全体を通じて毎週測定する。摂食量（食物ｉｎ／食物ｏｕｔ）は試験全体を通じて毎週記録する。「ＲＥＭＤ２．５９群」の処置後１週目の摂食量を毎日監視し、処置後７日目の量を用いて１０週目の「ペアフィード群」に給餌する。その後毎週、「ＲＥＭＤ２．５９群」の摂食量を毎週監視し、各週最後の摂食量を用いて翌週の「ペアフィード群」に給餌する。固形飼料を給餌される「通常食群」には、２０週間の試験全体を通じて同量の固形飼料を給餌する。
体重および摂食量に加えて、以下を含む、様々な他のパラメーターを、２０週間の試験全体を通じて測定した：
ｉ）空腹時血糖測定を、尾静脈から、週１回、Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋ Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）を用いて測定した（マウスは試験および空腹時血糖値の前に６時間絶食させる）；
ｉｉ）経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）を試験の最後に全ての動物に実施して、ＲＥＭＤ Ａｂ２．５９の反復投与効果を試験した。ベースライン（０時点）のグルコースレベルを、１６時間時間の絶食後に、グルコースチャレンジに先立って、測定した。２ｇ／ｋｇのグルコースを経口投与した後、Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｅｒｆｏｒｍａ Ｓｙｓｔｅｍを用いて様々な時点（３０、６０、１２０分）の血糖値を測定した；
ｉｉｉ）血清中の脂質プロファイルおよび血液生化学パラメーター（ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＧＴ、ＡＬＰ、ＴＧおよびＴＣＨＯ）を、試験全体を通じて検査した。血液試料は、８、１２、１６および２０週目に採取し、即座に４℃、４０００ｇ、１５分間の遠心分離により処理し、その後、新しい試験管に移した。ＴＯＳＨＩＢＡ ＴＢＡ−４０ＦＲ自動生化学分析装置を用いて、脂質プロファイルおよび血液生化学パラメーターを測定した；
ｉｖ）脂質プロファイル（ＴＧ、ＴＣＨＯ、ＨＤＬ−ＣおよびＬＤＬ−Ｃ）をプロトコルに従って動物の肝臓から抽出した後、ＴＯＳＨＩＢＡ ＴＢＡ−４０ＦＲ自動生化学分析装置を用いて、脂質プロファイルを測定した；
ｖ）全試験動物のインスリンレベルを８、１２、１６および２０週目に測定した。ＧＬＰ−１およびレプチンを試験の最後にＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。血清を分析に使用した；
ｖｉ）終了日に、ＯＧＴＴ試験後に剖検を行った。試験の最後に、組織または臓器を採取し、膵臓、白色脂肪組織（ＷＡＴ）、筋肉（腓腹筋）および肝臓の湿重量を測定した。これらの組織試料の半分をＨ＆Ｅ（肝臓およびＷＡＴ）またはＩＨＣ（膵臓）分析用に固定およびパラフィンブロック包埋した。視床下部、脳、心臓および膵臓、ＷＡＴ、筋肉、肝臓の残り部分は、−８０℃で保存するか、さらなる分析にかけた。上記の様々な測定および／または分析は、下記の追加の材料および方法セクションに記載の通りに行う。全ての統計検定を行い、有意水準は５％、すなわちＰ＜０．０５に設定した。試験設計の通りに、全ての測定パラメーターについて、群の平均および標準偏差を算出した。群間には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウェアによる１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いた。
結果
体重および摂食量：図１に示されるように、ＲＥＭＤ２．５９群は９週目から２０週目まで体重増加を効率的に減少させた。ＲＥＭＤ２．５９群のものと同量の一日食を９週目から２０週目まで与えられたペアフィード群は、ＲＥＭＤ２．５９群と比べて、同様の、しかしわずかに多い、体重増加を示した。この知見は、ＲＥＭＤ２．５９の効果が食物摂取の減少に限定されないことを示唆する。１週目から２０週目までＨＦＤと同時にＲＥＭＤ２．５９の毎週注射を与えられた防止群は、ＨＦＤの摂取にもかかわらず、他の全ての群と比較して最も少ない体重増加を示した。具体的には、防止群の平均体重（３５．３±３．０ｇ）は、試験の終わり（１４０日目、すなわち２０週目の終わり）に、ビヒクル群（５３．３±２．４ｇ）よりも３４％低く（Ｐ＜０．０１）、さらには通常食群（３８．６±３．１ｇ）よりも９％低かった。図２に示されるように、防止群は、グラム体重当たり、通常食群と同量のカロリーを消費した。一方、ＨＦＤ給餌群（ビヒクル群、ＲＥＭＤ２．５９群およびペアフィード群）は全て、グラム体重で調整された場合、ほぼ同量のカロリーを消費した。それでもなお、体重差を考慮に入れて、ビヒクル群は最大の平均体重を有するために、ＲＥＭＤ２．５９群およびペアフィード群と比較して、ビヒクル群は動物当たりより多量のカロリーを消費する。
空腹時血糖：図３に示されるように、９週目から開始されたＲＥＭＤ２．５９処置（すなわち、ＲＥＭＤ２．５９群）は、ビヒクル対照群よりも著しく低い血糖値をもたらした。ペアフィード群がＲＥＭＤ２．５９群よりずっと小規模のグルコース低下しか達成していないことから、この高血糖補正は、エネルギー消費の減少だけでは説明できない。防止群は、通常食対照群さえよりも低い、最低の空腹時血糖値プロファイルに至った。結論として、ビヒクル対照群から明らかなように、食餌誘発性の肥満症は高血糖症と明らかに関連している。
経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）から得られる血糖値：図４に示されるように、治療措置（ＲＥＭＤ２．５９群）として、または予防措置（防止群）として与えられたＲＥＭＤ２．５９は、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）において著しく低い血糖プロファイルをもたらした。しかし、無処置（ビヒクル群）または食事制限（ペアフィード群）は、ＯＧＴＴ中のグルコースレベルのベースライン上昇およびより高いグルコース変動域（glucose excursion）を特徴とし、より高いＯＧＴＴ後グルコースプロファイルをもたらす、糖尿病性のＯＧＴＴグルコースプロファイルを示した。図５に示されるように、ＯＧＴＴグルコース曲線下面積（ＡＵＣ）値によって、図４に示される知見の確認および裏付けがなされていると思われる。
脂質プロファイルおよび血液生化学的データ：図６に示されるように、トリグリセリド（ＴＧ）レベルは、ＨＦＤ給餌ビヒクル群と通常食対照群との間で有意な差異は無かった。ＲＥＭＤ２．５９処置はＴＧレベルに有意な影響を与えず、防止群は１６週目にＴＧレベルの減少を示したが、その変化は試験の終わりまで持続されなかった。すなわち、全体としてＲＥＭＤ２．５９は循環ＴＧレベルに大きな変化を与えなかった。図７に示されるように、総コレステロール（ＴＣＨＯ）レベルは、ＲＥＭＤ２．５９処置によって影響を受けなかったが（ビヒクル群とＲＥＭＤ２．５９群とを比較）、防止群（２０週目までに４７％まで）では通常食群に近いレベルにまで有意に減少された。
肝臓内脂質プロファイル分析：図９に示されるように、ＲＥＭＤ２．５９処置は、ビヒクル群マウスとの比較で、緩やかではあるが統計的に有意に、肝組織内ＴＧ含量を減少させた（１３１．６±４６．５ｍｇ／ｇ組織に対して１０２．０±４５．２ｍｇ／ｇ組織）。防止群は、ビヒクル群との比較で、８４％（１３１．６±４６．５ｍｇ／ｇ組織に対して２１．４±１４．５ｍｇ／ｇ組織）の肝臓ＴＧ含量の減少を示した。図１０に示されるように、総コレステロール（ＴＣＨＯ）、高密度リポタンパク質レベルおよび低密度リポタンパク質レベル（ＨＤＬ−ＣおよびＬＤＬ−Ｃ）は、ＲＥＭＤ２．５９処置または防止によって有意な影響を受けなかった。
ＧＬＰ−１、インスリンおよびレプチンの測定：図１１に示されるように、治療期間の全体を通して、２０週間の試験の最後まで、ＲＥＭＤ２．５９群および防止群は共に、インスリンレベルが通常食群で見られたレベルに戻された、またはそれよりも低くなったことから、高インスリン血症の補正において非常にロバストな効果を示した。ヒトの肥満症、２型糖尿病、およびＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨにおいて異脂肪血症は高インスリン血症と密接に関連しているため、このことはＲＥＭＤ２．５９の重要な生物学的作用を示している。図１２に示されるように、レプチンは防止群ではビヒクル群と比較して９２％ほども減少し、減少したレプチンレベルは通常食群のものよりも低かった。循環レプチンレベルは肥満症の程度を示すものであるため、このことは重要である。ＲＥＭＤ２．５９群はわずかに、ただし統計的に有意に、レプチンレベルを減少させた。図１３に示されるように、ＲＥＭＤ２．５９群は循環活性ＧＬＰ−１レベルにおける１０倍の増加を伴うが、防止群はそれを伴わず、このことは、ＲＥＭＤ２．５９を用いたグルカゴン受容体の遮断による食物摂取制御および他の代謝的利点におけるＧＬＰ−１による寄与を示唆している。実際に、ＲＥＭＤ２．５９の週１回処置は循環活性ＧＬＰ−１レベルにおいて１０倍近くの増加を誘導し、これは、さらなる体重減少効果の原因となり得る。
組織学および免疫組織化学の結果：図１４に示されるように、防止群は白色脂肪組織重量の有意な減少を示し、このことは、グルカゴン受容体の遮断が肥満の低減と関連していることを示唆している。防止群はまた、脂肪（ＴＧ）およびグリコーゲン含量の減少に関連し得る、肝臓湿重量の減少も示す。ＲＥＭＤ２．５９群は、防止群と同様に肝臓湿重量の減少を示したが、膵臓組織湿重量をわずかに増加させ、これは、島組織量における反応性増加によるものであり得る。図１５に示されるように、免疫化学（ＩＨＣ）染色された膵臓切片において、ＲＥＭＤ２．５９群は、防止群と同様に、インスリン面積／島面積の減少を示し、このことは集合的に、グルカゴン受容体シグナリングの遮断が、ランゲルハンス島β細胞に対する刺激およびインスリン合成／分泌に対する刺激を減弱したことを示唆している。このような組織学的知見は、ＲＥＭＤ２．５９群および防止群がより低い循環インスリンレベルを示した（図１１、上記）という知見と一致している。一方、ＲＥＭＤ２．５９群および防止群の両方がグルカゴン面積／島面積における著しい増加を誘導し、このことは、ランゲルハンス島α細胞からのグルカゴン合成／分泌の反応性フィードバック刺激を示唆している。
図１６に示されるように、以下の知見を得ることができる：１）ビヒクル群から得た肝組織は、これらのマウスの脂肪肝診断を確かにする、脂肪滴による豊富な液胞を示す；２）ＲＥＭＤ２．５９群から得た肝臓試料は、脂肪滴の密度およびサイズの著しい減少を示しているように見え、すなわち、明白な脂肪滴により占有される面積がビヒクル群のそれよりもずっと小さくなっているように見える；３）ペアフィード群から得た肝臓組織試料は、ビヒクル群で観察されたものからの脂肪滴の密度およびサイズの減少を、例えあるにしても、ほとんど示さない；４）通常食群から得た肝臓組織試料は、防止群のそれと同等の、目に見える脂肪滴を実質的含まない非常にきれいな肝臓切片を示す；５）防止群から得た肝臓組織試料は、通常食群のそれと同等の、目に見える脂肪滴を実質的に含まない非常にきれいな肝臓切片を示す。上記の組織学的証拠は、食餌誘発性肥満マウスにおける脂肪肝変化の補正、または防止における、アンタゴニスト性グルカゴン受容体抗体のロバストな効果を明確に示している。脂肪肝における組織学的改善は、肝臓組織診断からも明らかなように、高血糖症および高インスリン血症の補正、並びにグルコースおよび脂肪の代謝改善と密接に関連している。
実施例２
実施例１で示されたＲＥＭＤ２．５９Ｃ処置の有意な効果を考慮して、様々なマウスモデルにおけるグルコース生産の制御とＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの発達との関係を評価する。本実施例では、ＲＥＭＤ２．５９Ｃのインビボ活性を、ＮＡＳＨ派生ＨＣＣマウスモデル（ＳＴＡＭ（登録商標）モデル、Fujii et al, Med Mol Morphol, 46:141-152, 2013）において評価する。ＳＴＡＭ（登録商標）モデルでは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、生後２日目に２００μｇのＳＴＺの単回皮下注射を注入し、４週齢の後にＨＦＤまたは固形飼料を給餌する。雄マウスにおいて、この併用ＳＴＺ−ＨＦＤ処置は、ＨＦＤ給餌の１週間後に脂肪症および糖尿病の発達をもたらし、ＨＦＤの継続により、雄マウスは高血糖症および中等度の高脂血症と一緒に線維症、肝硬変および肝細胞癌（ＨＣＣ）を発達させ、故に、ヒトＮＡＳＨとよく似ている。ＳＴＺのみで処置された雄マウスおよびＳＴＺ−ＨＦＤで処置された雌マウスは糖尿病を発症するが、ＨＣＣは発達させない。
本研究では、各々１０匹の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、４〜６週齢、２０〜２２ｇ）からなる４つの群に、生後２日目に２００μｇ ＳＴＺの単回皮下注射を注入し、４週齢の後にＨＦＤを給餌し（「ＳＴＺ−ＨＦＤ群」）、１０匹の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、４〜６週齢、２０〜２２ｇ）からなる１つの群に、生後２日目に２００μｇ ＳＴＺの単回皮下注射を注入し、４週齢の後に通常食（固形飼料）を給餌した（「ＳＴＺ−固形飼料群」）。ＳＴＺ−固形飼料群は２４週間の研究の間ずっと固形飼料を継続し、ＳＴＺ−ＨＦＤ群は２４週間の研究の間ずっとＨＦＤを継続する。
５週齢目に、ＳＴＺ−固形飼料群には２４週齢までビヒクル（ＰＢＳ）を皮下注射で週１回投与し、１つのＳＴＺ−ＨＦＤ群には２４週齢まで７．５ｍｇ／ｋｇのＲＥＭＤ２．５９抗体を週１回投与する。８週齢目に、１つのＳＴＺ−ＨＦＤ群に２４週齢まで２．５ｍｇ／ｋｇのＲＥＭＤ２．５９抗体を週１回投与し、１つのＳＴＺ−ＨＦＤ群に２４週齢まで５．０ｍｇ／ｋｇのＲＥＭＤ２．５９抗体を週１回投与し、１つのＳＴＺ−ＨＦＤ群に２４週齢まで７．５ｍｇ／ｋｇのＲＥＭＤ２．５９抗体を週１回投与する。
２４週間の研究の全体を通じて、例えば以下を含む、様々なパラメーターを測定する：ｉ）体重（週１回）；ｉｉ）空腹時血糖測定（マウスを試験前に６時間絶食させ、空腹時血糖値をＡｃｃｕ−Ｃｈｅｋ Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）を用いて週１回尾静脈から測定する ；ｉｉｉ）血清ヘモグロビン−Ａ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）測定；ｉｖ）血清ＧＬＰ−１測定；ｖ）ラジオイムノアッセイ（リンコ社（Linco）、ミズーリ州セントチャールズ）により、血清インスリンレベルおよび血清レプチンレベル；ｖｉ）血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）測定；ｖｉｉ）血清アディポネクチン（adioponectin）測定；ｖｉｉｉ）血清脂質（例えば、総コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬおよびトリグリセリド）測定；および、ｉｘ）γグルタミルトランスペプチダーゼ（ＣＧＴ）測定。項目ｉｉｉ）〜ｉｘ）について、投与前および試験の最後に血液試料を、抗凝固剤を含まない管内に採取し、即座に遠心し、血清を評価用に別の試料管に移す。上記の様々な測定および／または分析は、下記の追加の材料および方法セクションに記載の通りに行う。
研究の最後に、肝臓を素早く摘出し、氷冷食塩水でリンスし、重量を計る。肝臓の一定分量を液体窒素中で急速凍結し、分析まで−８０℃で維持する。各々の肝臓の一部を、肝臓の適切な組織学的分析のために１０％ホルマリンで固定する。肝臓トリグリセリド（ＴＧ）含量、ジアシルグリセリド（ＤＧ）含量、およびセラミド含量の測定を、下記の追加の材料および方法セクションに記載の通りに行う。炎症、中心静脈線維症、および門脈路線維症を、下記の追加の材料および方法セクションに記載の通りに評価する。
実施例１に示された結果を考慮して、抗ＧＣＧＲ抗体を用いた野生型マウスの処置は、例えば、インスリン抵抗性の減少；高インスリン血症の減少または防止、肝臓における脂肪沈着の減少または防止；肝臓における炎症の減少または防止；脂質、例えば、肝臓トリアシルグリセロール、肝臓ジアシルグリセロール、およびセラミド、の蓄積の減少または防止；並びに肝臓における傷害の防止を含み得る有益な治療的効果を与え、そのようなマウスにおけるＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの発達が防止または治療されることで、糖尿病対象がＨＣＣを発達させるリスクが減少され得ると期待される。
実施例３
実施例１で示されたＲＥＭＤ２．５９Ｃ処置の有意な効果を考慮して、ＲＥＭＤ２．５９Ｃのインビボ活性をｄｂ／ｄｂマウスを用いるＮＡＳＨのマウスモデルにおいて評価する。本研究は２４週間の研究となる。追加で４８週間の研究を行う場合もある。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのｄｂ／ｄｂマウスをジャクソン研究所（バーハーバー、メーン州）から購入する。ｄｂ／ｄｂマウスは高レプチン血症、肥満および糖尿病のマウスである。メチオニンおよびコリン欠乏（ＭＣＤ）食を給餌されたｄｂ／ｄｂマウスは脂肪肝を自然に発症し、脂肪肝はＮＡＳＨへと進行する（Wortham et al., Dig Dis Sci., 53(10): 2761-2774、２００８年１０月）。各６匹の１０〜１２週齢ｄｂ／ｄｂマウスに、メチオニンおよびコリンを欠乏した食餌（ＭＣＤ）（ＭＰバイオメディカルズ社（MP Biomedicals）、オハイオ州ソロン、カタログ番号９６０４３９）もしくはメチオニンおよびコリンを添加した同一食餌（ＭＣＤＳ）（ＭＰバイオメディカルズ社、カタログ番号９６０４４１）を４週間、または、ＨＦＤ＋フルクトース西洋食（ＷＤ）（＃５８Ｙ１、テストダイエット社（TestDiet）、ミズーリ州セントルイス）、もしくは固形飼料（対照食）（＃５８Ｙ２、テストダイエット社、ミズーリ州セントルイス）を２４週間、自由給餌する。マウスは、２２℃、１２時間／１２時間の明暗サイクルで、鋼鉄製マイクロアイソレーターケージ内に個々に収容する。全手順を、実験動物の管理と使用に関するアメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）ガイドラインに従って実施した。マウスに、毎週または隔週で、皮下注射により、ビヒクル（１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、５％ソルビトール、および０．００４％ポリソルベート２０）、２．５ｍｇ／ｋｇ ＲＥＭＤ２．５９Ｃ抗体（「低用量」）、または５ｍｇ／ｋｇ ＲＥＭＤ２．５９Ｃ抗体（「高用量」）を、必要に応じて４週間または２４週間投与する。投与する用量は１０ｍｇ／ｋｇ／月を超過しないものとする。
４週間または２４週間の研究の全体を通じて、例えば以下を含む、様々なパラメーターを測定する：ｉ）体重（週１回）；ｉｉ）空腹時血糖測定（マウスを試験前に６時間絶食させ、空腹時血糖値をＡｃｃｕ−Ｃｈｅｋ Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）を用いて週１回尾静脈から測定する；ｉｉｉ）血清ヘモグロビン−Ａ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）測定；ｉｖ）血清ＧＬＰ−１測定；ｖ）ラジオイムノアッセイ（リンコ社（Ｌｉｎｃｏ）、ミズーリ州セントチャールズ）により、血清インスリンレベルおよび血清レプチンレベル；ｖｉ）血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）測定；ｖｉｉ）血清アディポネクチン（adioponectin）測定；ｖｉｉｉ）血清脂質（例えば、総コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬおよびトリグリセリド（ＴＧ））測定；および、ｉｘ）γグルタミルトランスペプチダーゼ（ＣＧＴ）測定。項目ｉｉｉ）〜ｉｘ）について、投与前および試験の最後に血液試料を、抗凝固剤を含まない管内に採取し、即座に遠心し、血清を評価用に別の試料管に移す。上記の様々な測定および／または分析は、下記の追加の材料および方法セクションに記載の通りに行う。
研究の最後に、肝臓を素早く摘出し、氷冷食塩水でリンスし、重量を計る。肝臓の一定分量を液体窒素中で急速凍結し、分析まで−８０℃で維持する。各々の肝臓の一部を、肝臓の適切な組織学的分析のために１０％ホルマリンで固定する。肝臓トリグリセリド（ＴＧ）含量、ジアシルグリセリド（ＤＧ）含量、およびセラミド含量の測定を、下記の追加の材料および方法セクションに記載の通りに行う。炎症、中心静脈線維症、および門脈路線維症を、下記の追加の材料および方法セクションに記載の通りに評価する。
実施例１に示された結果を考慮して、抗ＧＣＧＲ抗体を用いたｄｂ／ｄｂマウスの処置は、例えば、インスリン抵抗性の減少；高インスリン血症の減少または防止、肝臓における脂肪沈着の減少または防止；肝臓における炎症の減少または防止；脂質、例えば、肝臓トリアシルグリセロール、肝臓ジアシルグリセロール、およびセラミド、の蓄積の減少または防止；並びに肝臓における傷害の防止を含み得る有益な治療的効果を与え、そのようなマウスにおけるＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの発達が防止または治療され得ると期待される。
実施例４
本実施例は、ＮＡＳＨと診断された対象における完全ヒト抗ＧＣＧＲ抗体を用いた週１回処置の安全性、薬物動態および薬力学的効果を評価するための、無作為化、二重盲検、プラセボ対照、並行群間、多用量研究について記述する。処置は、処置の有効性および安全性を観察および定量化するのに十分な長さの、最長６または１２ヵ月継続し得る。
処置群には、プラセボ群、並びに様々な投与量の、配列番号５１に記載の重鎖配列および配列番号５２に記載の軽鎖配列を含む完全ヒト抗ＧＣＧＲ抗体（「ＲＥＭＤ−４７７」）で処置される処置群が含まれる。非プラセボ処置群の例としては、例えば、週あたり０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０７５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇのＲＥＭＤ−４７７注射を受ける対象、および、週あたり０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０７５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇのＲＥＭＤ−４７７注射を受ける対象が挙げられる。
主要評価項目としては、例えば、ベースライン時、試験終了まで４週間または８週間間隔での、ＭＲＩによる肝脂肪量の割合変化；ベースライン評価との比較で、試験終了時に、少なくとも１段階の肝線維症の改善を達成した、プラセボ処置患者に対するＲＥＭＤ−４７７処置患者の比率変化；並びに、ベースライン時、試験終了までの４週間間隔での、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、ビリルビンおよびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を含む肝臓酵素および代謝マーカーにおける変化が挙げられる。副次評価項目としては、例えば、処置前ベースライン時、および試験終了まで１週間間隔での、毎日モニターする一晩絶食後のグルコースの平均である、空腹時血糖値の変化；処置前ベースライン時、および試験終了まで１週間間隔での、血漿インスリンレベルの変化；処置前ベースライン時、および試験終了まで４週間または８週間間隔での、ヘモグロビンＡ１ｃレベル（長期的グルコース制御の指標）の変化；処置前ベースライン時、および試験終了まで８週間間隔での、経口グルコース負荷から０、３０、６０、９０および１２０分後に測定される、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）におけるグルコースプロファイルの変化；ベースライン時および試験終了時の、肝硬変を含むあらゆる判定事象（adjudicated event）の発症を有する患者の数、総死亡率、および肝臓に関連した臨床成績によって評価される、複合的な長期転帰；並びに、生活の質（36-Item Short-Form Health Survey［ＳＦ−３６］）アンケートのスコア変化が挙げられる。
追加の材料および方法
体重：全動物の体重を種々の研究の期間全体を通じて毎週測定する。
摂食量：全動物の摂食量を種々の研究の期間全体を通じて毎日および／または毎週測定する。
血糖：マウスを血糖検査前に午前９時から午後３時まで６時間絶食させ、空腹時血糖値をＡｃｃｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｅｒｆｏｒｍａ Ｓｙｓｔｅｍを用いて週１回の頻度で尾静脈から測定した。
経口グルコース負荷試験：ＲＥＭＤ Ａｂ２．５９の反復投与効果を検査するために、研究の最後に全ての動物に対してＯＧＴＴを行った。ベースライン（０時点）のグルコースレベルを、１６時間時間の絶食後に、グルコースチャレンジに先立って、測定した。２ｇ／ｋｇグルコースを経口投与した後、Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｅｒｆｏｒｍａ Ｓｙｓｔｅｍを用いて種々の時点（３０、６０、１２０分）で血糖値を測定した。
血液化学分析：１週おきの脂質プロファイルおよび末期血液生化学パラメーター（ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＧＴ、ＡＬＰ）を検査した。血液試料は、８、１２、１６および２０週目に採取し、即座に４℃、４０００ｇ、１５分間の遠心分離により処理し、その後、新しい試験管に移した。脂質プロファイルおよび血液生化学パラメーターはＴＯＳＨＩＢＡ ＴＢＡ−４０ＦＲ自動生化学分析装置を用いて測定した。
肝臓における脂質プロファイルの測定：脂質プロファイル（ＴＧ、ＴＣＨＯ、ＨＤＬ−ＣおよびＬＤＬ−Ｃ）をプロトコルに従って動物の肝臓から抽出した後、ＴＯＳＨＩＢＡ ＴＢＡ−４０ＦＲ自動生化学分析装置を用いて脂質プロファイルを測定した。
ＥＬＩＳＡキット分析：全試験動物のインスリンレベルを８、１２、１６および２０週目に測定した。ＧＬＰ−１およびレプチンを試験の最後にＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。分析には血清を用いた。
肝臓重量：試験の最後に、肝臓を素早く摘出し、氷冷食塩水でリンスし、重量を計る。肝臓の一定分量を液体窒素中で急速凍結し、分析まで−８０℃で維持する。各々の肝臓の一部を、組織学的検査のために１０％ホルマリンで固定する。
肝臓ＴＧ／ＤＧ／セラミド含量：全ての動物の肝臓トリグリセリド（ＴＧ）、ジアシルグリセリド（ＤＧ）、およびセラミドの含量を、試験の最後に測定する。肝臓試料を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１μＭ ＰＭＳＦを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中でホモジナイズし、各プロトコルに含まれる適切な内部標準を用いるクロロホルムへの抽出により脂質を単離する。抽出した脂質をメタノール／クロロホルム（４：１、体積比）中に再懸濁および希釈し、その後、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｒｕｍ Ｕｌｔｒａ機器（サンノゼ、カリフォルニア州）を用いるエレクトロスプレーイオン化質量分析により分析した。ＤＧ分子種を、以前に報告された通りに選択反応モニタリングを用いてナトリウムイオン付加物（sodiated adduct）として定量化し、それぞれの分子種の強度を内部標準ｄｉ−２０：０ ＤＧの強度に対して正規化した（Demarco VG et al., Endocrinology, 154:159-171, 2013）。ＴＧ脂肪族基を、ＴＧ種からの各脂肪酸のロスについてのニュートラルロススキャニング、および、それに対する内部標準Ｔｒｉ−１７：１ ＴＧ由来のニュートラルロス２６８の比較による、ＴＧフィンガープリント法によって、定量化した（Han et al., Anal Biochem, 295:88-100, 2001）。個々のセラミド分子種を、ニュートラルロス２５６を用いる陰イオンモードで、Ｉ型およびＩＩ型１３Ｃ同位体効果に対する補正後に、個々の分子種のイオン強度を内部標準（１７：０セラミド）のそれと比較することにより、定量化した。
組織学および免疫組織化学：ホルマリン固定した肝組織を加工し、５μｍ厚パラフィン切片に、組織学的分析用にヘマトキシリン‐エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色およびマッソントリクローム染色を行う。炎症をＨ＆Ｅ染色切片上で評価し、以下の通りの０〜３のスコアを与える：０、炎症無し；１、軽度；２、中程度；３、重度。線維症の程度をデジタル形態計測で評価する。各マウスから得られたトリクローム染色切片の５つの別々の領域を無作為に選択し、各領域内で、デジタル撮影された門脈路（portal track）および中心静脈を特定する。２０倍対物レンズを用い、目的の門脈路または中心静脈を視野の中心にして写真を撮って、各マウスの目的の５つの門脈／門脈周囲視野および５つの中心／中心周囲視野を得る。それぞれの目的視野において、線維症に対応するピクセルを、各標本における明瞭な線維症の染色に対応する青色スペクトルの狭帯域に基づいて測定し、それらの領域内の正常間質コラーゲンを慎重に除外する。Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ、バージョン５．０（レインディア・グラフィックス社（Reindeer Graphics）、ノースカロライナ州アシュビル）を用いて、線維症に対応するピクセルの数を各画像の総ピクセルの割合として測定する。各動物について、各標本から得られた５つの門脈／門脈周囲視野および５つの中心／中心周囲視野の結果を平均し、線維症を全断面積の割合として表す。
メチオニンおよびコリン欠乏（ＭＣＤ）食：本明細書で考察された食事法の中で、ＭＣＤ食は最も短い期間で最も重篤なＮＡＳＨ表現型をもたらす。ＭＣＤ食はスクロースおよび脂肪を多く含有するが、肝臓におけるβ酸化および超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の産生に不可欠なメチオニンおよびコリンを欠いている。これは、肝臓内の脂質の蓄積およびＶＬＤＬ合成の減少をもたらす（Anstee et al., Int J Exp Pathol, 87(1):1-16, 2006）。ＭＣＤ食はげっ歯類において２〜４週間で測定可能な脂肪肝（主に大滴性）を急速に誘導し、これはその後すぐに炎症および線維症に進行する。ＭＣＤ食中の脂肪レベルにはばらつきがあるが、典型的には約２０エネルギー％の脂肪を含有する。重要なことであるが、ＮＡＦＬＤのヒトまたは他の食餌誘発性げっ歯類モデルと異なり、ＭＣＤ食を給餌されたげっ歯類は体重を減らし（はるかに低いカロリー摂取のため）、インスリン抵抗性にならない。ＮＡＳＨを有する大部分のヒトは肥満であり且つインスリン抵抗性であるため、これはＭＣＤ食がヒトＮＡＳＨのモデルをつくる際の重要な違いとなる。
高脂肪食（ＨＦＤ）：ＨＦＤは、げっ歯類モデルにおいて、体重、体脂肪を増加させ、インスリン抵抗性を誘導することがよく知られている。ＨＦＤは、肝臓インスリン抵抗性だけでなく、肝脂肪レベルも極めて急速に（数日以内に）増加させ、その後、末梢性脂肪沈着の有意な増加を引き起こし得る。長期的には、ＨＦＤ誘導性肝脂肪蓄積は、直線的に進行しない場合があり、肝脂肪レベルは実際には減少し、その後長期のＨＦＤ摂取の間に再度増加し得る。同期間給餌される場合、ＨＦＤ摂取は、ＭＣＤ食により蓄積されるものと比較して、１０倍低い肝脂肪レベルをもたらす。通常ＨＦＤ摂取は、ＭＣＤ食と比較して、肝線維症を生じさせず、軽度の脂肪症を生じさせるのみであることから、これらの食餌制度（regime）間の重要な違いが強調される。用語「ＨＦＤ」が種々様々な食餌方式を包含すること、および、異なる組成の食餌は肝臓の表現型を様々に変化させると期待され得ることには、留意されたい。例示的なＨＦＤ食は、３６％の脂肪由来カロリー（９％のコーン油および２７％のバター）および糖無しの４３．２％の炭水化物由来カロリーから構成され得る。ＨＦＤ（リサーチ・ダイエット社（Research Diets）、Ｄ１２４９２、ＨＦＤ）をこれらの研究に使用した。
ＨＦＤ＋フルクトース食（西洋食（「ＷＤ」））：例示的なＷＤは、ＨＦＤと同一の、３６％の脂肪由来カロリー（９％のコーン油および２７％のバター）、および、例えばフルクトースを含む（例えば、３０％の糖由来カロリー）、４３．２％の炭水化物由来カロリーで構成され得る。
ＮＡＳＨマウスモデル：本開示の抗ＧＣＧＲ抗体は他の様々な公表済みＮＡＳＨマウスモデルのいずれにおいても評価することができる（例えば、Poekes et al., Archives of Public Health, 72(1): 07, 2014; Adorini et al., Drug Discovery Today, 17:988-997, 2012; Farrell et al., Liver Int., 34(7):1084-93, 2014; Aroor et al., Diabetes, http://dx.doi.10.1016/j.drudis.2012.05.012, Jan 20, 2015; Rooyen et al, Gastroenterology, 141(4):1393-1403, 2011; Ishimoto et al., Hepatology, 58(5):1632-1643, 2013; Farrell et al., Gut and Liver, 6(2):149-171, 2012; Sahai et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 287:G1035-G1043, 2004; Wortham et al., Dig Dis Sci, 53(10):2761-2774, 2008; Lieber et al, Am J Clin Nutr, 79:502-509, 2004を参照）。
本願で開示および特許請求される物品および方法は全て、本開示に照らして、不要な実験を行うことなく、作製および実行することができる。本開示の物品および方法が好ましい実施形態の観点から記述されたが、本開示の精神および範囲から逸脱しない範囲で物品および方法に変形を適用してよいことは、当業者には明らかである。当業者に明らかな、そのような変形形態および均等物は全て、現存するものであれ後に開発されるものであれ、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の精神および範囲に包含されると見なされる。本明細書で言及された特許、特許出願、および刊行物は全て、本開示が属する技術分野における当業者の水準を示すものである。全ての特許、特許出願、および刊行物は、あたかも個々の刊行物が、その全体があらゆる目的で参照により援用されると明確且つ個々に示されるのとの同程度に、それらの全体があらゆる目的で参照により本明細書に援用される。本明細書に例示的に記載された開示は、本明細書に特には開示されていないいかなる要素が存在せずとも、好適に実施することができる。すなわち、例えば、本明細書におけるどの場合でも、用語「を含む」、「から本質的になる」、および「からなる」のいずれも、他の２つの用語のいずれとも置き換えることができる。使用された用語および表現は、限定ではなく説明のための用語として使用されており、そのような用語および表現の使用に際して、示されそして説明された特徴またはその一部のいかなる均等物も排除する意図も無く、ただし、特許請求された本開示の範囲内で様々な変更形態が可能であると認識される。すなわち、本開示は好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示されたが、本明細書で開示された概念の変更および変形が当業者により行われてもよいこと、並びに、そのような変更および変形が添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲内であると見なされることを理解されたい。
配列表
添付されている配列表に挙げられているアミノ酸配列は米国特許法施行規則（３７ＣＦＲ）第１．８２２条において規定されるアミノ酸の標準的３文字コードを使用して示されている。
配列番号１はヒトグルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）分子のアミノ酸配列である（受託番号ＡＡＩ０４８５５）。
配列番号２は完全ヒト抗ＧＣＧＲ抗体の重鎖可変領域をコードするアミノ酸配列である。配列番号３は完全ヒト抗ＧＣＧＲ抗体の軽鎖可変領域をコードするアミノ酸配列である。
配列番号４は完全ヒト抗ＧＣＧＲ抗体の重鎖可変領域をコードするアミノ酸配列である。配列番号５は完全ヒト抗ＧＣＧＲ抗体の軽鎖可変領域をコードするアミノ酸配列である。
配列番号６は完全ヒト抗ＧＣＧＲ抗体の重鎖可変領域をコードするアミノ酸配列である。配列番号７は完全ヒト抗ＧＣＧＲ抗体の軽鎖可変領域をコードするアミノ酸配列である。
配列番号８はキメラ抗ＧＣＧＲ抗体の重鎖をコードするアミノ酸配列である。配列番号９はキメラ抗ＧＣＧＲ抗体の軽鎖をコードするアミノ酸配列である。
配列番号１０〜２８は様々な完全ヒト抗ＧＣＧＲ抗体の重鎖可変領域をコードするアミノ酸配列である。
配列番号２９〜４７は様々な完全ヒト抗ＧＣＧＲ抗体の軽鎖可変領域をコードするアミノ酸配列である。
配列番号４８はカッパ軽鎖定常領域をコードするアミノ配列である。配列番号４９はラムダ軽鎖定常領域をコードするアミノ配列である。
配列番号５０はＩｇＧ２重鎖定常領域をコードするアミノ配列である。
配列番号５１はヒト抗ＧＣＧＲ抗体の重鎖をコードするアミノ酸配列である。配列番号５２はヒト抗ＧＣＧＲ抗体の軽鎖をコードするアミノ酸配列である。

［配列表］
配列番号１ ‐ ヒトグルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）分子のアミノ酸配列
ＭＰＰＣＱＰＱＲＰＬＬＬＬＬＬＬＬＡＣＱＰＱＶＰＳＡＱＶＭＤＦＬＦＥＫＷＫＬＹＧＤＱＣＨＨＮＬＳＬＬＰＰＰＴＥＬＶＣＮＲＴＦＤＫＹＳＣＷＰＤＴＰＡＮＴＴＡＮＩＳＣＰＷＹＬＰＷＨＨＫＶＱＨＲＦＶＦＫＲＣＧＰＤＧＱＷＶＲＧＰＲＧＱＰＷＲＤＡＳＱＣＱＭＤＧＥＥＩＥＶＱＫＥＶＡＫＭＹＳＳＦＱＶＭＹＴＶＧＹＳＬＳＬＧＡＬＬＬＡＬＡＩＬＧＧＬＳＫＬＨＣＴＲＮＡＩＨＡＮＬＦＡＳＦＶＬＫＡＳＳＶＬＶＩＤＧＬＬＲＴＲＹＳＱＫＩＧＤＤＬＳＶＳＴＷＬＳＤＧＡＶＡＧＣＲＶＡＡＶＦＭＱＹＧＩＶＡＮＹＣＷＬＬＶＥＧＬＹＬＨＮＬＬＧＬＡＴＬＰＥＲＳＦＦＳＬＹＬＧＩＧＷＧＡＰＭＬＦＶＶＰＷＡＶＶＫＣＬＦＥＮＶＱＣＷＴＳＮＤＮＭＧＦＷＷＩＬＲＦＰＶＦＬＡＩＬＩＮＦＦＩＦＶＲＩＶＱＬＬＶＡＫＬＲＡＲＱＭＨＨＴＤＹＫＦＲＬＡＫＳＴＬＴＬＩＰＬＬＧＶＨＥＶＶＦＡＦＶＴＤＥＨＡＱＧＴＬＲＳＡＫＬＦＦＤＬＦＬＳＳＦＱＧＬＬＶＡＶＬＹＣＦＬＮＫＥＶＱＳＥＬＲＲＲＷＨＲＷＲＬＧＫＶＬＷＥＥＲＮＴＳＮＨＲＡＳＳＳＰＧＨＧＰＰＳＫＥＬＱＦＧＲＧＧＧＳＱＤＳＳＡＥＴＰＬＡＧＧＬＰＲＬＡＥＳＰＦ

配列番号２ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＨＣＶＲのアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＭＷＹＤＧＳＮＫＤＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＲＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＨＹＤＩＬＴＧＹＮＹＹＹＧＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号３ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＬＣＶＲのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＦＶＴＹＹＣＬＱＨＮＳＮＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ

配列番号４ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＨＣＶＲのアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＭＷＹＤＧＳＮＫＤＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＨＹＤＩＬＴＧＹＮＹＹＹＧＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号５ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＬＣＶＲのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＶＴＹＹＣＬＱＨＮＳＮＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ

配列番号６ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＨＣＶＲのアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＭＷＹＤＧＳＮＫＤＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＲＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＨＹＤＩＬＴＧＹＮＹＹＹＧＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号７ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＬＣＶＲのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＦＶＴＹＹＣＬＱＨＮＳＮＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ

配列番号８ ‐ ＧＣＧＲに結合するキメラ抗体の重鎖のアミノ酸配列
ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＬＲＧＶＱＣＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＭＷＹＤＧＳＮＫＤＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＲＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＨＹＤＩＬＴＧＹＮＹＹＹＧＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ

配列番号９ ‐ ＧＣＧＲに結合するキメラ抗体の軽鎖のアミノ酸配列
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＦＰＧＡＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＦＶＴＹＹＣＬＱＨＮＳＮＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ

配列番号１０ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＨＣＶＲのアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＬＳＤＧＲＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＤＹＥＩＬＴＧＹＧＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号１１ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＨＣＶＲのアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＬＮＤＧＲＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＤＹＥＩＬＴＧＹＧＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号１２ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＨＣＶＲのアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＧＡＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＹＹＤＹＡＧＳＶＫＳＲＩＮＩＮＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＱＶＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＤＲＳＳＧＷＮＥＧＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号１３ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＨＣＶＲのアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＤＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＬＳＳＤＧＮＮＫＹＣＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＴＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＥＶＹＹＤＩＬＴＧＹＹＤＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号１４ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＨＣＶＲのアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＴＹＦＷＴＷＩＲＱＦＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＦＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＹＹＤＩＬＴＧＥＤＹＳＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号１５ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＨＣＶＲのアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＩＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＲＶＳＳＮＧＡＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＹＹＤＹＡＧＳＶＫＳＲＩＮＩＮＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＱＶＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＳＳＧＷＮＥＧＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号１６ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＨＣＶＲのアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＴＹＦＷＴＷＩＲＱＦＰＧＥＧＬＥＷＩＧＹＩＦＹＳＧＮＴＮＹＮＰＳＬＴＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＹＹＤＩＬＴＧＥＤＹＳＹＧＩＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号１７ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＨＣＶＲのアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＩＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＮＤＧＳＮＫＹＹＡＤＦＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＤＹＤＩＬＴＧＮＧＶＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号１８ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＨＣＶＲのアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＴＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＧＳＳＳＬＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＨＭＮＳＬＲＤＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＲＹＮＷＮＤＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号１９ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＨＣＶＲのアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＧＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＧＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＦＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ

配列番号２０ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＨＣＶＲのアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＩＦＳＳＹＴＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＳＳＬＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＤＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＤＹＹＧＳＧＳＹＹＫＧＮＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号２１ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＨＣＶＲのアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＴＩＩＷＳＤＧＩＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＮＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＲＧＬＹＤＩＬＴＧＹＹＤＹＹＧＩＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号２２ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＨＣＶＲのアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＴＩＩＷＳＤＧＩＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＮＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＲＧＬＹＤＩＬＴＧＹＹＤＹＹＧＩＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号２３ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＨＣＶＲのアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＩＴＦＲＳＹＳＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号２４ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＨＣＶＲのアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＴＦＲＳＹＤＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＧＤＳＶＫＧＲＬＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＱＹＤＩＬＴＧＹＳＳＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ

配列番号２５ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＨＣＶＲのアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＨＫＹＹＥＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＧＶＹＹＣＡＲＶＧＹＧＳＧＷＹＥＹＹＹＨＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号２６ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＨＣＶＲのアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＭＷＹＤＧＳＮＫＤＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＲＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＨＹＤＩＬＴＧＹＮＹＹＹＧＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号２７ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＨＣＶＲのアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＭＷＹＤＧＳＮＫＤＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＲＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＨＹＤＩＬＴＧＹＮＹＹＹＧＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号２８ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＨＣＶＲのアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＩＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＳＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＦＲＤＮＳＫＫＴＬＹＬＱＭＮＲＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＧＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

配列番号２９ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＬＣＶＲのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＡＷＦＱＫＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＹＶＶＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＮＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＨＹＰＬＴＦＧＧＧＴＲＶＥＩＫＲ

配列番号３０ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＬＣＶＲのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＡＷＦＱＱＲＰＧＫＡＰＫＳＬＩＹＶＶＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＮＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＮＨＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ

配列番号３１ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＬＣＶＲのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＦＰＳＳＬＳＡＳＩＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＦＬＮＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＤＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＡＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＹＤＤＬＰＬＴＦＧＧＧＴＲＶＤＩＫＲ

配列番号３２ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＬＣＶＲのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＮＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ

配列番号３３ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＬＣＶＲのアミノ酸配列
ＱＮＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＶＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＦＧＶＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＮＳＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫＲ

配列番号３４ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＬＣＶＲのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＦＰＳＳＬＳＡＳＩＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＦＬＮＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＤＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＡＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＦＣＱＱＹＤＮＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫＲ

配列番号３５ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＬＣＶＲのアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＴＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＦＧＶＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＮＳＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫＲ

配列番号３６ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＬＣＶＲのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＤＭＹＬＡＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＫＦＳＧＳＧＦＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＩＦＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＶＫＲ

配列番号３７ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＬＣＶＲのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ

配列番号３８ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＬＣＶＲのアミノ酸配列
ＫＩＶＭＴＱＴＰＬＡＬＰＶＩＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＤＳＤＤＧＤＴＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＶＬＩＨＲＬＳＹＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＩＹＹＣＭＨＲＩＥＦＰＦＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ

配列番号３９ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＬＣＶＲのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＲＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ

配列番号４０ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＬＣＶＲのアミノ酸配列
ＧＩＶＬＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＥＡＬＱＴＭＣＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ

配列番号４１ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＬＣＶＲのアミノ酸配列
ＧＩＶＬＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＥＡＬＱＴＭＳＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ

配列番号４２ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＬＣＶＲのアミノ酸配列
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＦＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＴＬＬＤＳＤＤＧＮＴＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＲＬＩＹＴＬＳＹＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＩＹＹＣＭＱＨＩＥＦＰＳＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫＲ

配列番号４３ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＬＣＶＲのアミノ酸配列
ＳＹＥＬＴＱＰＰＳＶＳＶＳＰＧＱＴＡＳＩＴＣＳＧＤＫＬＧＤＫＹＡＳＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＶＬＶＩＹＱＳＴＫＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＭＤＥＡＤＹＹＣＱＡＷＤＳＳＴＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ

配列番号４４ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＬＣＶＲのアミノ酸配列
ＮＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＨＳＤＧＫＮＹＬＦＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＥＶＳＹＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＮＩＱＰＰＬＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫＲ

配列番号４５ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＬＣＶＲのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＦＶＴＹＹＣＬＱＨＮＳＮＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ

配列番号４６ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＬＣＶＲのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＦＶＴＹＹＣＬＱＨＮＳＮＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ

配列番号４７ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＬＣＶＲのアミノ酸配列
ＤＩＶＬＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＲＤＤＧＤＴＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＴＬＳＹＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＲＩＥＦＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫＲ

配列番号４８ ‐ カッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

配列番号４９ ‐ ラムダ軽鎖定常領域のアミノ酸配列
ＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ

配列番号５０ ‐ ＩｇＧ２重鎖定常領域のアミノ配列
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号５１ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＨＣのアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＭＷＹＤＧＳＮＫＤＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＲＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＨＹＤＩＬＴＧＹＮＹＹＹＧＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号５２ ‐ ＧＣＧＲに結合するヒト抗体のＬＣのアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＦＶＴＹＹＣＬＱＨＮＳＮＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

Claims (4)

  1. 非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療に使用するための医薬組成物であって、 前記医薬組成物が、（ｉ）ヒトグルカゴン受容体（ヒトＧＣＧＲ）に特異的に結合する完全ヒト抗体および（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含み、
    前記完全ヒト抗体が、
    配列番号２の重鎖可変領域のアミノ酸配列および配列番号３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むヒト抗ＧＣＧＲ抗体；
    配列番号４の重鎖可変領域のアミノ酸配列および配列番号５の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むヒト抗ＧＣＧＲ抗体；
    配列番号６の重鎖可変領域のアミノ酸配列および配列番号７の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むヒト抗ＧＣＧＲ抗体；および
    配列番号５１の重鎖のアミノ酸配列および配列番号５２の軽鎖のアミノ酸配列を含むヒト抗ＧＣＧＲ抗体
    からなる群から選択されることを特徴とする医薬組成物。
  2. 請求項１に記載の医薬組成物において、前記完全ヒト抗体が、配列番号５１の重鎖のアミノ酸配列および配列番号５２の軽鎖のアミノ酸配列を含むヒト抗ＧＣＧＲ抗体であることを特徴とする医薬組成物。
  3. 請求項１または２に記載の医薬組成物において、前記完全ヒト抗体の治療有効量が、１週間当たり、体重に対して、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜９０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜８０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜７０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜６０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜４０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜５ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜４ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜３ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜２ｍｇ／ｋｇ、および０．００１〜１ｍｇ／ｋｇからなる群から選択されることを特徴とする医薬組成物。
  4. 請求項３に記載の医薬組成物において、前記完全ヒト抗体の治療有効量が、１週間当たり、体重に対して、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇであることを特徴とする医薬組成物。
JP2017550154A 2015-04-02 2016-03-31 グルカゴン受容体アンタゴニスト抗体を用いた肥満症および非アルコール性脂肪性肝疾患または非アルコール性脂肪性肝炎を治療するための方法 Active JP6861641B2 (ja)

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US201562142257P 2015-04-02 2015-04-02
US62/142,257 2015-04-02
PCT/US2016/025336 WO2016161154A1 (en) 2015-04-02 2016-03-31 Methods for treating obesity and nonalcoholic fatty liver disease or nonalcoholic steatohepatitis using glucagon receptor antagonistic antibodies

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