CN111068042B - 一种多肽化合物在制备治疗非酒精性肝病、特发性肺间质纤维化和动脉硬化药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多肽化合物的用途，其具有高酶解稳定性、高生物活性、无不良反应等特点，该多肽化合物能够改善和治疗非酒精性肝病包括：脂肪肝、胆汁淤积性肝硬化、炎症及肝脏损伤和纤维化，同时也能改善和治疗特发性肺间质纤维化等伴随纤维化症状的肺病。

Description

一种多肽化合物在制备治疗非酒精性肝病、特发性肺间质纤 维化和动脉硬化药物中的应用
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体地，涉及一种激动剂多肽。本发明还涉及上述激动剂多肽对非酒精性肝病、特发性肺间质纤维化和动脉硬化等疾病的预防和/或治疗用途。
背景技术
非酒精性脂肪性肝脏疾病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)已被公认为世界范围内引发慢性肝脏疾病的主要病因。基于最新的数据调查结果显示，全世界有25％的成年人会受到NAFLD的影响，而在孩童中，NAFLD的普及度也已达到10％。NAFLD是因肝脏功能异常而导致的一系列疾病，包括单纯的脂肪变性，以及由其演变的非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis，NASH)，肝纤维化，肝硬化，甚至是肝癌。
尽管对于NAFLD的发病机制还存在很多不确定性，但“二次打击假说”是目前公认的用于解释NAFLD发展的主要理论。第一次打击会造成脂肪变性，其与胰岛素抵抗(insulinresistance，IR)密切相关，伴随着脂质生成及脂肪酸输出受损。第二次打击涉及到活性氧(reactive oxygen species，ROS)的输出，从而造成系统性氧化应激，进一步导致炎症和细胞毒性，最终造成NASH和纤维化。Schohraya Spahis小组提到了第三次打击假说，表明过度的氧化应激产生还会导致肝细胞的死亡，成熟肝细胞复制减少，造成肝硬化甚至是肝癌。总之，在肝脏中的脂肪累积(第一次打击)降低了肝脏对氧化应激的抵抗能力(第二次打击)，从而引发炎症，内质网(endoplasmic reticulum，ER)应激，线粒体损伤以及合成内源性抗氧化剂的能力减弱等。因此，在由多种因子导致的NAFLD疾病中，氧化应激在促进NAFLD肝脏损伤中发挥着很重要的作用。综上所述，抗氧化作用可以作为NAFLD的一种有效治疗手段。
Feiran Xu小组从菜籽中分离出菜籽蛋白，并进一步获取了其主要活性成分，在人克隆结肠腺癌细胞中展示了很好的抗氧化作用。但是这类多肽在NAFLD的作用还未见报道。基于以上描述，我们建立了两种细胞模型和三种动物模型用以模拟人的非酒精性脂肪性肝病和肝脏纤维化疾病，对菜籽蛋白的活性成分进行体外和体内药效评估，以期筛选出活性较好的化合物用于非酒精性脂肪性肝脏疾病的治疗。目前仍然缺乏有效的治疗NAFLD/NASH的药物，PPAR-γ类胰岛素增敏剂、奥贝胆酸等法尼酯衍生物X受体(FXR)激动剂作为新型的在研药物，其长期使用安全性以及治疗有效性均有待进一步证明(Armstrong MJ,Gaunt P,Aithal GP,et al.Lancet,2015.doi:10.1016/S0140-6736(15)00803-X.)。
此外，特发性肺纤维化(IPF)是一种原因不明的渐进性肺间质性疾病，表现为患者呼吸困难，肺功能不可逆下降甚至丧失，是慢性非肿瘤疾病中预后较差的一种疾病。大多数间质性肺疾病都有共同的病理基础过程。初期损伤之后发生肺泡炎，随着炎性-免疫反应的进展，炎症和异常修复导致肺间质细胞增殖，产生大量的胶原和细胞外基质。肺间质纤维化最终导致肺泡气体交换单元永久性丧失(Wolters PJ,Collard HR&Jones KD.Annu.Rev.Pathol.Mech.Dis.2014.9:157-179.)。
发明内容
本发明的目的是提供一种多肽化合物在制备用于预防或治疗非酒精性肝病、特发性肺间质纤维化、动脉硬化等疾病的药物中的应用。
本发明的多肽化合物在制备用于预防或治疗非酒精性肝病、特发性肺间质纤维化、动脉硬化等疾病的药物中的应用中涉及的多肽化合物含有以下氨基酸序列表示的母体肽，即菜籽蛋白来源的抗氧化多肽：
NH2-Xaa1-Xaa2-Asp-His-Asn-Asn-Pro-Gln-Xaa9-Xaa10-COR1
其中，R1＝-NH2或-OH；
Xaa1＝Tyr或不存在；
Xaa2＝Trp或不存在；
Xaa9＝Ile或不存在；
Xaa10＝Arg或不存在。
所述多肽化合物具有与亲脂性的取代基，和/或蛋白、抗体相连的衍生物及结构。
本发明还在于提供一种含有本发明的菜籽蛋白来源的抗氧化多肽的药物组合物，以所述菜籽蛋白来源的抗氧化多肽作为活性成分添加药学上可接受的载体和/或辅料制成药物组合物。
本发明的多肽对非酒精性脂肪性肝炎、肝脏纤维化疾病及相关肺纤维化疾病具有改善和治疗作用。本发明多肽可用于直接或间接治疗由非酒精性脂肪性肝炎和肝脏纤维化所引起的或者以其为特征的病症。
所述NAFLD包括单纯的非酒精性脂肪变性，非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化，胆汁淤积性肝硬化、肝纤维化合并的肝硬化，和肝癌。所述治疗NAFLD疾病可体现为脂肪变性的肝细胞数目减少，炎症减轻，细胞坏死和纤维化区域变小。
本发明多肽还可用于直接或间接治疗由特发性肺间质纤维化等伴随纤维化症状肺病所引起的或者以其为特征的病症。
本领域技术人员可以理解，本发明的药物组合物适用于各种给药方式，例如口服给药、经皮给药、静脉给药、肌肉内给药、局部给药、经鼻给药等。根据所采用的给药方式，可将本发明的多肽药物组合物制成各种合适的剂型，其中包含至少一种有效量的本发明的多肽和至少一种药学上可接受的药用载体。
适当剂型的实例为片剂、胶囊、糖衣片剂、粒剂、口服溶液和糖浆、用于皮肤表面的油膏和药贴、气雾剂、鼻喷剂、以及可用于注射的无菌溶液。含有本发明多肽的药物组合物可以制成溶液或者冻干粉以用于胃肠外给药，在使用前可加入适当溶剂或其他可药用的载体将粉末重新配制，液体配方一般是缓冲液、等渗溶液和水溶液。
本发明多肽在药物组合物中的用量可以在较大范围内变动，本领域技术人员可以根据一些客观的因素如疾病的种类、病情严重程度、患者体重、剂型、给药途径等因素很容易地加以确定。
本发明的优点在于：
1)筛选出具有更好的抗非酒精性肝炎、肝脏纤维化和肺纤维化疾病生物学活性的多肽；
2)与小分子化合物相比具有更低毒性，安全窗口更大，用量更小；
3)与大分子蛋白相比，制备成本更经济，可推广性更高。
在具体的实施方案中，涉及下述抗氧化多肽，其具有序列：
化合物1(涉及SEQ ID NO:1)：
NH2-Asp-His-Asn-Asn-Pro-Gln-Ile-Arg-CONH2
NH2-DHNNPQIR-CONH2
化合物2(涉及SEQ ID NO:2)：
NH2-Asp-His-Asn-Asn-Pro-Gln-Ile-Arg-COOH
NH2-DHNNPQIR-COOH
化合物3(涉及SEQ ID NO:3)：
NH2-Trp-Asp-His-Asn-Asn-Pro-Gln-Ile-Arg-CONH2
NH2-WDHNNPQIR-CONH2
化合物4(涉及SEQ ID NO:4)：
NH2-Tyr-Trp-Asp-His-Asn-Asn-Pro-Gln-CONH2
NH2-YWDHNNPQ-CONH2
化合物5(涉及SEQ ID NO:5)：
NH2-Tyr-Trp-Asp-His-Asn-Asn-Pro-Gln-Ile-Arg-CONH2
NH2-YWDHNNPQIR-CONH2
化合物6(涉及SEQ ID NO:6)：
NH2-Tyr-Trp-Asp-His-Asn-Asn-Pro-Gln-Ile-Arg-COOH
NH2-YWDHNNPQIR-COOH
附图说明
图1为示出PA诱导人肝癌细胞(HepG2)24h后，BSA组、PA组和多肽化合物1-6给药组的油红O染色结果对比图片及染色区域统计图
图2为示出多肽化合物1-6抑制人肝星状细胞LX-2细胞的统计柱状图
图3A为示出在HFD诱导的NASH模型中，腹腔注射化合物1和5，评价其对小鼠非酒精性脂肪性肝炎的治疗作用中的葡萄糖耐受实验(OGTT)实验结果折线图及柱状图
图3B为示出在HFD诱导的NASH模型中，腹腔注射化合物1和5，评价其对小鼠非酒精性脂肪性肝炎的治疗作用中的胰岛素抵抗实验(ITT)实验结果折线图及柱状图
图3C为示出在HFD诱导的NASH模型中，腹腔注射化合物1和5，评价其对小鼠非酒精性脂肪性肝炎的治疗作用中的染色结果对比图
图3D为示出在HFD诱导的NASH模型中，腹腔注射化合物1和5，评价其对小鼠非酒精性脂肪性肝炎的治疗作用中的糖原(PAS)染色结果对比图
图3E为油红O染色结果对比图片及染色区域统计图
图3F为示出在HFD诱导的NASH模型中，腹腔注射化合物1和5，评价其对小鼠非酒精性脂肪性肝炎的治疗作用中的血清学指标，谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性检测统计柱状图
图4A为示出在CCl4诱导的肝脏纤维化模型中，腹腔注射化合物1和5对小鼠肝脏纤维化的作用的H&E染色结果对比图
图4B为示出在CCl4诱导的肝脏纤维化模型中，腹腔注射化合物1和5对小鼠肝脏纤维化的作用的天狼星红染色结果对比图及染色区域统计图
图4C为示出在CCl4诱导的肝脏纤维化模型中，腹腔注射化合物1和5对小鼠肝脏纤维化的作用的CD68免疫组化染色结果对比图及染色区域统计图
图4D为示出在CCl4诱导的肝脏纤维化模型中，腹腔注射化合物1和5对小鼠肝脏纤维化的作用的血清学指标，谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性检测统计柱状图
图5A为示出在BDL(胆总管结扎)诱导的大鼠肝脏纤维化模型中，皮下注射化合物1和5对大鼠肝脏纤维化的作用的H&E染色结果对比图
图5B为示出在BDL(胆总管结扎)诱导的大鼠肝脏纤维化模型中，皮下注射化合物1和5对大鼠肝脏纤维化的作用的天狼星红染色结果对比图及染色区域统计图
图5C为示出在BDL(胆总管结扎)诱导的大鼠肝脏纤维化模型中，皮下注射化合物1和5对大鼠肝脏纤维化的作用的血清学指标，谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性检测统计柱状图
图6A为示出在博莱霉素诱导肺纤维化的动物模型中，皮下注射化合物5对小鼠肺纤维化的作用的H&E染色结果对比图
图6B为示出在博莱霉素诱导肺纤维化的动物模型中，皮下注射化合物5对小鼠肺纤维化的作用的masson染色结果对比图片及染色区域统计柱状图
具体实施方式
以下的实施例是便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实验结果采用GraphPad Prism软件分析，数据以平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，并通过t检验进行评价。模型组与对照组比较，以*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001表示，给药组与模型组比较，以#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001表示。Western blot结果采用Tanon图像分析软件进行分析。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的小鼠均为健康雄性C57BL/6J小鼠，6-8周大。大鼠均为健康雄性SD大鼠，体重200-230g。
下述实施例中的化合物1-6溶液均用无菌的PBS作为溶剂配制。
实施例1化合物1-6的制备：
化合物1-6采用Fmoc固相多肽合成法，由羧基端向氨基端方向合成，氨基酸连接顺序按照上述描述，依次连接。具体步骤如下：
①条件：采用MBHAR(Amide-MBHA-Resin酰胺保护的MBHA树脂)或者王树脂，以活化脂的方法，脱Fmoc保护基合成。
②茚检试剂：
试剂1：20g苯酚/5ml乙醇
试剂2：0.05 0.001M KCN(水)/2.5ml吡啶
试剂3：0.5g茚三酮/10ml乙醇
茚检试剂的使用，试剂1:试剂2:试剂3＝l:2:l(滴)，沸水中加热3-10min。
③过程：
A.处理树脂：称取一定量MBHA树脂(1％交联度，200-400目，取代值0.5mmol/g)于合成仪中，加入DCM搅拌30min，抽干，再用DMF洗4次，每次2min，挑取少量树脂进行茚检，若树脂颜色无改变，表明正常，可使用。
B.脱Fmoc保护：20％哌啶(溶于DMF中)洗4次，每次2min，然后用DMF洗4次，每次2min，在第3次洗之后茚检，茚检显蓝紫色表明Fmoc已脱，可接下一个氨基酸。
C.缩合反应：将氨基酸、HOBT、HBTU依次加入烧杯中，加入DMF使其溶解，DMF体积尽量小，加入DIEA启动反应后，立即加入到合成仪中，之后用少量DMF冲洗烧杯和合成仪壁(投料量＝树脂取代值(mmol/g)×m(树脂质量g)×M(肽的分子量g/mol)×几倍过量，氨基酸、HBTU、HOBT加入3倍过量，DIEA为液体碱，起到活化酯反应，加入6倍过量，保证每步接近99％成功)。整个反应体系用氩气保护。反应搅拌1h，抽干，用DMF洗3次，每次2min，茚检无改变，说明氨基酸已经接到树脂上。
D.每接一个氨基酸，都重复b、c，直至接肽完成为止。
E.多肽切割：
a.全部连接后，用20％哌啶脱F-moc保护，洗4次，每次2min，然后用DMF洗4次，每次2min，茚检显色后，用DCM洗2次，每次3min，甲醇洗1次，每次3min，再用DCM洗1次，每次3min，甲醇洗2次，每次3min。经过处理后，移开搅拌棒，用胶塞密封合成仪，再使用真空泵彻底抽干，至少2h以上，直至树脂完全干燥呈粉末状。
b.在抽干的合成仪中加入切割剂(TFA:Tis:水＝95:2.5:2.5(V/V/V))，反应3h，每20min搅拌1min，用圆底烧瓶收集切割剂，并用TFA洗涤2次，每次5min(5ml/次)，收集的TFA与之前收集的切割剂合并。
c.将所得的切割剂在旋转蒸发仪上减压抽干，把预先冷却的乙醚(50-80ml)加入到圆底烧瓶中，用力摇晃进行沉淀，静置。待白色固体沉淀到底部，使用滴管吸取上清液，加入分液漏斗中，补加等体积水，摇晃(中间放气几次)，静置。这时，分液漏斗内部的液体会进行分层，把下层水相流入圆底烧瓶中，将沉淀进行溶解(如果不好溶解，可加醋酸调节溶解性)。
d.轻轻摇晃圆底烧瓶(防止乳化)，使得溶解彻底，然后倒入分液漏斗，把水相流入烧杯收集，多洗几次，每次收集水相。
e.用保鲜膜密封烧杯，插孔、标记，-80℃过夜存放，然后真空冷冻干燥处理。
(2)粗肽脱盐
由于粗肽中存在反应过程中生成的副产物、盐和一些其他杂质，因此要对粗肽进行脱盐处理，初步除去杂质。首先称取一定量的sephadex G-25(约50-100目)，加入5-10倍去离子水，加热溶胀3h，装柱。待自然沉降完全后，用10％醋酸平衡柱子2h左右，然后上样、10％醋酸进行洗脱，收集核酸蛋白紫外检测仪220nm处有吸收峰的溶液，同样用保鲜膜密封烧杯，插孔、标记，-80℃过夜存放，然后真空冷冻干燥处理。
(3)脱盐产物的纯化和纯度分析
用高效液相色谱进行纯化：制备柱为C18反相制备柱，规格为XBridgeTMBEH130Prep C18(10μm，19×250mm)，洗脱体系为20％-80％乙腈/水/0.1％三氟乙酸，持续60min，流速：8ml/min，收集主峰。待真空冷冻干燥后，送质谱(ESI-MS)进行验证。
纯化产物的纯度分析：分析柱为C18反相制备柱，规格为XBridgeTMBEH130PrepC18(10μm，4.6×250mm)，洗脱体系为10％-90％乙腈/水/0.1％三氟乙酸，持续30min，流速：1ml/min，根据220nm色谱图积分，计算纯度。
合成的多肽采用高效液相色谱进行纯化(纯度>95％)，并通过高分辨质谱进行表征。
基于以上合成步骤，合成本发明的如下多肽化合物(表1)：
实施例2抗氧化多肽1-6的抗非酒精性肝炎及肝纤维化活性
2.1化合物1-6的体外细胞实验：
通过构建两种细胞模型(棕榈酸(palmitic acid，PA)诱导的人肝癌细胞(HepG2)脂肪变性模型和人肝星状细胞(LX-2)纤维化模型)，对化合物1-6活性成分进行初步测定。
2.1.1化合物1-6改善PA诱导的HepG2细胞脂肪变性：
待HepG2细胞贴壁生长24h，融合度达70-80％后，使用PA(终浓度为)诱导HepG2细胞24h，随后实验组加入100uM化合物1-6，对照组加入同等剂量的PBS，作用24h之后，进行油红O染色，检测药物对脂肪变性细胞的作用。图1中，红色区域为油红O染色区域，即脂滴累积区域。
结果显示：在棕榈酸(palmitic acid，PA)诱导的人肝癌细胞(HepG2)脂肪变性模型中，化合物1-6与对照组相比，均可降低细胞脂质累积，很好的改善HepG2细胞的脂肪变性，但化合物1、5和6效果更显著。
其中，使用到的实验方法如下：
A.配制油红O溶液。
1)油红O母液配制：称取0.5g油红O，溶于80ml异丙醇中，磁力搅拌2小时左右。
2)油红O稀释液：按照油红O母液：超纯水＝3:2比例，配制油红O稀释液，室温静置5-10min，双层滤纸过滤，备用。
B.油红O染色：在暗室中，取上述细胞爬片，滴加油红O，静置7min
2.1.2化合物1-6抑制人肝星状细胞LX-2活化：
LX-2细胞贴壁生长24h之后，实验组加入100uM化合物1-6，对照组加入同等剂量的PBS，作用48h之后，提取细胞总蛋白，进行Western Blot实验检测α-平滑肌细胞(α-smoothmuscle actin，α-SMA)蛋白的表达水平。结果如图2所示，化合物1-6处理LX-2细胞，能够很好的下调α-SMA的蛋白表达。由此可见，在体外的细胞实验中，化合物1-6均可体外抑制人肝星状细胞(LX-2)活化，其中化合物1、4和5抑制效果更明显。
2.2化合物1和5的体内动物实验：
我们选择化合物1和5通过四种动物疾病模型(非酒精性脂肪性肝炎模型、肝脏纤维化模型、胆汁淤积性肝脏纤维化模型和博莱霉素诱导肺纤维化的动物模型)进行体内药效评估。
2.2.1化合物1和5对HFD诱导的NASH模型的治疗作用：
(1)NASH模型的建立：
从中山大学实验动物中心购买雄性C57BL/6小鼠，体重20-22g。在温度25℃，12h/12h的明暗交替环境下饲养，适应环境1周后，开始喂养HFD饲料(D12492，Research Diets)，对照组喂养正常的对照饲料(D12450B，Research Diets)，喂养12周后，随机取出几只小鼠，取材，检测造模情况。确认造模成功之后，随机分成RCD组、HFD组、药物1组和药物5组，按照500ug/kg腹腔注射药物化合物1和5，对照组注射同等体积的PBS，每天给药，治疗4周后取材。
(2)在HFD诱导的NASH模型中，腹腔注射化合物1和5对小鼠非酒精性脂肪性肝炎的作用：
HFD诱导的NASH模型，其表现特征为：肥胖，胰岛素抵抗，高糖血症，血脂异常和肝脏脂肪空泡样变性等。在化合物1和5治疗HFD小鼠3周和4周的时候，我们分别进行了口服葡萄糖耐受实验(OGTT)和胰岛素耐受测试(ITT)，图3(A)和(B)实验结果显示与HFD组相比，化合物1和5组很好的改善了HFD小鼠口服葡萄糖耐受能力及胰岛素抵抗。在给药四周之后，我们对小鼠进行取材，通过眼球取血进行血清学指标检测，取肝脏组织用于病理学分析。在胰岛素抵抗存在的情况下，葡萄糖合成增加，糖酵解减少，糖原会储存在肝脏中，导致肝脏中糖原积累。由图3(D)糖原染色(PAS染色)结果表明HFD组的肝组织中确实存在明显的糖原累积，而在化合物1和5治疗之后，糖原明显减少。图3(C)的苏木精伊红(H&E)染色结果显示HFD组存在大片空泡区域，与之相比，化合物1和5组空泡数目明显减少。图3(E)为油红O染色，能更直观显示出HFD组有大面积的脂滴存在于空泡内，药物处理之后，脂滴数目明显减少。血清学检测(图3(F))显示，对比HFD组，化合物1和5处理之后，ALT和AST均下降，说明化合物1和5能改善肝脏损伤。
由以上结果可知：化合物1和5可显著改善葡萄糖耐受和胰岛素抵抗，减少肝脏脂肪变性和非酒精性脂肪性肝炎。
其中，使用到的实验方法如下：
A.OGTT：
小鼠过夜禁食后，腹腔注射化合物1和5(500ug/kg)或者同等体积的PBS。4h之后，按照2g/kg灌胃葡萄糖(浓度为400mg/ml)，在灌胃葡萄糖后，小鼠尾巴尖部取血，检测0、15、30、60和120min的血糖水平。
B.ITT：
OGTT测完一周之后，小鼠禁食5h，然后腹腔注射化合物1和5(500ug/kg)或者同等体积的PBS，并记录此时的血糖水平。1h后，按照0.25U/kg腹腔注射胰岛素，记录0、15、30、60和120min的血糖水平。
C.H&E染色：
1)烘片
取石蜡包埋的组织切片，60℃烘1h；
2)脱蜡、水化：
二甲苯20分钟→二甲苯20分钟→无水酒精15分钟→无水酒精15分钟→95％酒精10分钟→90％酒精5分钟→80％酒精5分钟；
3)染色：
苏木精7分钟→自来水冲洗干净→1％盐酸乙醇分化1s→自来水冲洗→伊红染色15s-20s→自来水冲洗；
4)脱水透明：
75％酒精1s→85％酒精1s→95％酒精1s→100％酒精1s→二甲苯→二甲苯；
5)封片：
晾干30min，树胶封片。
PAS染色：
流水冲3min→高碘酸氧化5min→双蒸水涮12下→Schiff试剂滴染15min(切片变成微粉红)→自来水冲洗5min→苏木素1min→水洗5min→脱水，干燥，封片；
2.2.2化合物1和5对CCl4诱导的肝脏纤维化模型的治疗作用：
(1)肝脏纤维化模型的建立：
从中山大学实验动物中心购买雄性C57BL/6小鼠，体重20-22g。在温度25℃，12h/12h的明暗交替环境下饲养，适应环境1周后，开始注射CCl4(按照1:4溶解在玉米油中)，对照组注射玉米油，腹腔注射3周后，随机取出几只小鼠，取材，看造模情况如何。确认造模成功之后，随机分成Oil组、CCl4组、药物1组和药物5组，按照500ug/kg腹腔注射药物化合物1和5，对照组注射同等体积的PBS，每天给药，治疗3周后取材。
(2)在CCl4诱导的肝脏纤维化模型中，腹腔注射化合物1和5对治疗小鼠肝脏纤维化的作用：
CCl4诱导的肝脏纤维化模型，其表现特征为：肝脏组织出现局部的炎症及细胞坏死，以及大片纤维化区域等。在化合物1和5治疗CCl4诱导的小鼠3周后，我们分别取了小鼠血液及肝脏用于血清学指标检测和病理学分析。由图4(A)H&E染色结果显示，相比Oil组，CCl4组确实出现明显的细胞坏死，及炎性细胞浸润，化合物1和5组有明显改善。此外，我们还进行了天狼星红染色，用以标记纤维化区域，图4(B)CCl4组有大片纤维化区域，化合物1和5有很好的改善纤维化的作用。图4(C)的CD68结果也进一步确认了化合物1和5较好的抗炎活性。图4(D)显示，对比CCl4组，化合物1和5处理之后，ALT和AST均下降，说明化合物1和5能改善由CCl4引起的肝脏损伤。
由以上结果可知，化合物1和5能抑制和治疗由CCl4诱导的肝脏纤维化，5能改善由CCl4引起的肝脏损伤，具有很好的肝保护作用，效果显著。
2.2.3化合物1和5对BDL(胆总管结扎)诱导的大鼠肝脏纤维化的治疗作用：
(1)肝脏纤维化模型的建立
从中山大学实验动物中心购买雄性SD大鼠，体重200-230g。在温度25℃，12h/12h的明暗交替环境下饲养，适应环境1周后。随机分为四组：假手术组(仅游离胆总管，不予结扎n＝8)，生理盐水组(BDL术后给予生理盐水皮下注射，n＝8)，BDL+药物1(BDL术后给予药物1皮下注射，n＝8)，BDL+药物5(BDL术后给予药物5皮下注射，n＝8)。
大鼠入室(SPF环境)检疫一周后，模型鼠及假手术组大鼠均采用0.6％戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉，麻醉后于超净台施行手术，模型鼠分离胆总管后双侧结扎，假手术组大鼠仅分理处胆总管，不予结扎，术后第二天开始给药干预，给药周期结束后收集血清、肝脏，进行血清学指标检测及病理学分析。
(2)在BDL(胆总管结扎)诱导的大鼠肝脏纤维化模型中，皮下注射化合物1和5对小鼠大鼠肝脏纤维化的治疗作用
BDL(胆总管结扎)诱导的大鼠肝脏纤维化模型，其表现特征为：中央静脉区域周围有炎性细胞浸润，肝细胞水肿变性，汇管区及肝小叶间隔有大量胶原纤维沉积。由图5(A)H&E染色结果显示，与假手术组相比，BDL手术组确实出现明显的细胞坏死，及炎性细胞浸润，化合物1和5组有明显治疗和改善作用。此外，我们还进行了天狼星红染色，用以标记纤维化区域，图5(B)BDL手术组有大片纤维化区域，化合物1和5有很好的改善纤维化的作用。对胶原纤维沉积的抑制率如下：胆管结扎组+生理盐水>胆管结扎组+药物1组>胆管结扎组+药物5组。
实验结果表明化合物1和5均能够明显改善BDL诱导的大鼠胆汁淤积性肝纤维化程度，且以化合物5改善作用尤为显著。
实施例3化合物5对肺纤维化的治疗药效研究
(1)材料和方法
动物：
8周龄SPF级雌性C57BL/6小鼠，20～25g，由广东省实验动物中心提供，并在中山大学药学院实验动物中心SPF级实验室进行实验。适应性喂养1周。饲养环境：温度20～25℃，湿度70％，12小时明暗周期可控的房间，自由获取食物和水。
药品与试剂：
博莱霉素(BLM，TCI公司购买)；戊巴比妥钠、注射用盐酸博莱霉素、羟脯氨酸(HYP)标准品(购自美国Sigma公司)。
(2)博莱霉素诱导肺纤维化的动物模型的建立:
将24只SPF级雌性C57BL/6小鼠随机分成3组(n＝8)，共3组：空白对照组(control)，博来霉素组(Bleomycin)和多肽药物给药组。我们选多肽化合物5进行对肺纤维化的干预治疗效果研究。将所有组C57BL/6小鼠用2％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，博来霉素组气管内一次性灌注5mg/kg博来霉素诱导产生肺纤维化。空白对照组(control)小鼠气管内灌注等量无菌生理盐水。5号给药组每天1次皮下注射200μg/kg相应的多肽药物，空白对照组(control)，博来霉素组(Bleomycin)皮下注射等量无菌生理盐水，连续给药21天，取材。
(3)化合物5对肺纤维化的治疗药效研究:
组织病理学检查
将小鼠右肺下叶剪下固定在体积分数为10％的中性甲醛中，苏木素-伊红染色(HE染色)和马松胶原染色(Masson染色)，胶原染色操作严格按照Masson染色试剂盒产品说明书进行。Image J软件计算相同面积图片中蓝色区域的面积(area)，再对面积值利用graphpad Prismversion6软件进行柱状图分析观察胶原沉积。
①如图6所示，小鼠肺脏HE染色结果：
空白对照组：肺组织结构清晰，无炎症细胞浸润；
博来霉素纤维化组：见肺泡间隔内成纤维细胞、上皮下肌成纤维细胞明显增多，毛细血管充血和淋巴细胞、巨噬细胞浸润的现象，纤维组织增生、肺泡间隔破坏，纤维组织成斑片状分布；
5号多肽给药组：显著减轻了肺泡结构紊乱，炎症细胞浸润；减少肺泡腔内细胞和纤维的堆积、降低胶原沉淀。给药组表现出了对肺纤维化进程的干预和治疗效果，能够有效地延缓肺纤维化进程。
②如图六所示：小鼠肺脏Masson染色结果：
空白对照组：小鼠肺组织马松染色见在支气管壁和血管壁存在少量结构性胶原，在肺组织未见明显的胶原沉积；
博莱霉素组：小鼠肺组织马松染色显示在肺组织存在大量束状蓝染的胶原组织；
5号给药组：小鼠肺组织马松染色见在支气管壁和血管壁存在少量结构性胶原，在肺组织未见明显的胶原沉积。
以上以实例方式对本发明进行了说明，尽管未示出，但本发明保护范围内的所有多肽均可实现本发明的技术效果，并且本领域技术人员可以本发明进行修改和变形，只要不脱离本发明的精神，均落入本发明所附权利要求的范围内。
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<110> 中山大学
<120> 一种多肽化合物在制备治疗非酒精性肝病、特发性肺间质纤维化和动脉硬化药物中的应用
<130> GD1899-18P115863
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 菜籽蛋白来源的抗氧化多肽
<400> 1
Asp His Asn Asn Pro Gln Ile Arg
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 菜籽蛋白来源的抗氧化多肽
<400> 2
Asp His Asn Asn Pro Gln Ile Arg
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 菜籽蛋白来源的抗氧化多肽
<400> 3
Trp Asp His Asn Asn Pro Gln Ile Arg
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 菜籽蛋白来源的抗氧化多肽
<400> 4
Tyr Trp Asp His Asn Asn Pro Gln
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 菜籽蛋白来源的抗氧化多肽
<400> 5
Tyr Trp Asp His Asn Asn Pro Gln Ile Arg
1 5 10
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 菜籽蛋白来源的抗氧化多肽
<400> 6
Tyr Trp Asp His Asn Asn Pro Gln Ile Arg
1 5 10

Claims (4)

1.一种多肽化合物在制备用于预防或治疗非酒精性脂肪肝炎或非酒精性脂肪样变性或肝纤维化或特发性肺间质纤维化的疾病的药物中的应用，所述多肽化合物选自以下任一种：
化合物1：
NH2-Asp-His-Asn-Asn-Pro-Gln-Ile-Arg-CONH2；
化合物5：
NH2-Tyr-Trp-Asp-His-Asn-Asn-Pro-Gln-Ile-Arg-CONH2。
2.一种多肽化合物在制备用于预防或治疗非酒精性脂肪样变性的药物中的应用，所述多肽化合物选自以下任一种：
化合物2：
NH2-Asp-His-Asn-Asn-Pro-Gln-Ile-Arg-COOH；
化合物3：
NH2-Trp-Asp-His-Asn-Asn-Pro-Gln-Ile-Arg-CONH2；
化合物6：
NH2-Tyr-Trp-Asp-His-Asn-Asn-Pro-Gln-Ile-Arg-COOH。
3.一种多肽化合物在制备用于预防或治疗肝纤维化的药物中的应用，所述多肽化合物为：
化合物4：
NH2-Tyr-Trp-Asp-His-Asn-Asn-Pro-Gln-CONH2。
4.根据权利要求1或2或3所述的应用，其特征在于，包括至少一种有效量的权利要求1或2或3所述的多肽和至少一种药效学上可接受的药用载体以制备多肽药物组合物，并制成各种合适的剂型。
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