CN116867796A - 脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂联合用药预防或治疗非酒精性脂肪肝病 - Google Patents

脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂联合用药预防或治疗非酒精性脂肪肝病 Download PDF

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Abstract

本发明公开了脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂联合用药在预防或治疗非酒精性脂肪肝病中的应用。

Description

脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂联合用药预防或治疗非酒精性脂肪肝病 技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体地涉及到脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂两者协同作用治疗非酒精性脂肪肝病中的应用及由两者制备的联合用药物组合物。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种由过量的甘油三酯积累于肝脏导致的一种病理变化与酒精性肝炎相似但无过量饮酒的临床综合症，其主要包括简单的脂肪变性、肝炎、肝纤维化以及后期的肝硬化和肝癌(Ara JP.recent insigts into the pathogenosis of monalcoholic fatty liver disease.2018。Cai J,Zhang XJ,Li H.The Role of Innate Immune Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis.Hepatology 2019.)。据统计，全球大约有3-5％的人患有NAFLD，已经成为了美国肝移植的又一大常见因素。另外，肝脏疾病导致的心血管疾病的发病率和死亡率较正常人群也不断的增加(Tilg H,Moschen AR,Roden M.NAFLD and diabetes mellitus.Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2017；14:32-42。Meex RCR,Watt MJ.Hepatokines:linking nonalcoholic fatty liver disease and insulin resistance.Nat Rev Endocrinol 2017；13:509-520。Wree A,Broderick L,Canbay A,Hoffman HM,Feldstein AE.From NAFLD to NASH to cirrhosis-new insights into disease mechanisms.Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2013；10:627-636.)。所以，日益增长的NAFLD发病率势必会造成医疗资源的进一步紧张和消耗。但是治疗NAFLD的药物开发并不是一帆风顺。2020年5月，Genfit公司宣布elafibranor在对2期或3期的纤维化的NASH患者的III期研究中未达到主要终点。就连研究最快、最有希望的Ocaliva上市要求也遭到了惨拒，所以目前该领域亟需新的有效治疗药物(Intercept Receives Complete Response Letter from FDA for Obeticholic Acid for the Treatment of Fibrosis Due to NASH.pdf)。双靶点药物、多靶点药物以及协同用药逐渐成为了人们研究的热点和重点。因为肝脏疾病的发病机理较为复杂，涉及到多个代谢相关因素。此外，NAFLD发病较为缓慢， 药物的治疗周期较长，单个药物靶点的药物很可能存在靶点的过度抑制情况，产生毒副作用，所以寻求更加安全、有效的治疗策略成为了一项艰巨的科学任务。
多肽药物一般是指2-50个氨基酸组成的短肽，很多都是内源性多肽，浓度低，但是活性强，在调节机体生理功能时发挥着非常重要的作用(Suzuki R,Brown GA,Christopher JA,Scully CCG,Congreve M.Recent Developments in Therapeutic Peptides for the Glucagon-like Peptide 1and 2Receptors.J Med Chem 2020；63:905-927)。多肽药物具有以下优点：第一，它们大多数是内源性的，结构清楚，作用机制明确；第二，用药剂量小、毒副作用更低；第三，它们与外源蛋白质相比，免疫原较低，而且可以化学合成，产品纯度高，质量可控(Fosgerau K,Hoffmann T.Peptide therapeutics:current status and future directions.Drug Discov Today 2015；20:122-128。Townsend SA,Newsome PN.Review article:new treatments in non-alcoholic fatty liver disease.Aliment Pharmacol Ther 2017；46:494-507.)。因此对于需要长期用药的慢性疾病，多肽药物无疑是最理想的选择。
脂联素是由脂肪细胞产生的一种脂肪细胞因子(Alzahrani B,Iseli T,Ramezani-Moghadam M,Ho V,Wankell M,Sun EJ,Qiao L,et al.The role of AdipoR1 and AdipoR2 in liver fibrosis.Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis 2018；1864:700-708)。它通过与受体结合，对机体的糖脂代谢、胰岛素抵抗、炎症反应、氧化应激等发挥着重要的调节作用。此外，脂联素还与动脉粥样硬化、糖尿病、肝肾病等代谢疾病关系密切(Otvos L,Jr.,Knappe D,Hoffmann R,Kovalszky I,Olah J,Hewitson TD,Stawikowska R,et al.Development of second generation peptides modulating cellular adiponectin receptor responses.Front Chem 2014；2:93)。先前合成报道过脂联素受体1/2的双激动剂可以通过改善胞外基质的代谢和线粒体功能来减轻肝脏的纤维化。但是随着深入的研究发现胞外基质的代谢或降解具有一定的毒副作用，因为疾病状态下的胞外基质中含有大量的弹性蛋白，弹性蛋白的降解会产生一系列的具有不同的氨基酸序列的衍生多肽，它们可以通过激活下游通路进而调节一系列的生物活性。
因此如何能在治疗NAFLD的同时而又不产生其他毒副作用是现阶段亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种预防或治疗非酒精性脂肪肝病的联合用药物组合物以及脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体(ERC)抑制剂联合用药在预防或治疗非酒精性脂肪肝病中的应用，该脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂之间具有协同作用，同时联合用药具有改善或治疗非酒精性脂肪肝病的效果，具有无毒副作用或毒副作用小等特点。
为达上述目的，本发明提供一种脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂联合用药在预防或治疗非酒精性脂肪肝病中的应用。
该脂联素受体激动剂的氨基酸序列为P-X2-L-Y-X5-F-X7；其中X2、X5及X7中至少一个为非天然氨基酸，P为脯氨酸，L为亮氨酸，Y为酪氨酸，F为苯丙氨酸。氨基酸中20种天然氨基酸以外的氨基酸统称为非天然氨基酸，非天然氨基酸相比天然氨基酸具有性质稳定、半衰期长的优点。在现有蛋白或肽的基础上引入非天然氨基酸，能够得到位点特异性修饰的重组蛋白或多肽。P-X2-L-Y-X5-F-X7是以现有多肽Pep70(结构序列：PGLYYFD)为基础的合成肽，多肽Pep70能够通过结合脂联素受体-1，激活下游的AMPK信号通路，发挥调节糖脂代谢的作用。
优选的，脂联素受体激动剂氨基酸序列中的X2为非天然氨基酸。
优选的，脂联素受体激动剂氨基酸序列中的X2是正缬氨酸。
优选的，脂联素受体激动剂氨基酸序列中的X5为酪氨酸或丝氨酸。
优选的，脂联素受体激动剂氨基酸序列中的X7为丙氨酸或天冬氨酸。
优选的，脂联素受体激动剂氨基酸序列中的脯氨酸由氢或乙酰基修饰。
优选的，脂联素受体激动剂氨基酸序列中的脯氨酸由氢修饰，X2是正缬氨酸，X5为酪氨酸，X7为丙氨酸。
优选的，脂联素受体激动剂氨基酸序列中的脯氨酸由氢修饰，X2是正缬氨酸，X5为酪氨酸，X7为天冬氨酸。
优选的，脂联素受体激动剂氨基酸序列中的脯氨酸由氢修饰，X2是正缬氨酸，X5为丝氨酸，X7为天冬氨酸。
优选的，脂联素受体激动剂氨基酸序列中的脯氨酸由乙酰基修饰，X2是正缬氨酸，X5为丝氨酸，X7为丙氨酸。
最优选的，脂联素受体激动剂选自如下任一种多肽化合物：
化合物A1(SEQ ID NO.1)：
P(Nva)LYYFA
化合物A2(SEQ ID NO.2)：
P(Nva)LYYFD
化合物A3(SEQ ID NO.3)：
P(NVa)LYSFD
化合物A4(SEQ ID NO.4)：
P(NVa)LYSFA。
该弹性蛋白受体抑制剂含有以下氨基酸序列表示的母体肽：
R 1-Val-Xa2-Gly-Ser-Pro-Ser-Ala-Gln-Xa9-Xa10-Ala-Ser-Pro-Xa14，
其中，
R 1为：亲脂性取代基或不存在；
Xa2＝Val或Iva；
Xa9＝Asp或Glu；
Xa10＝Glu或Asp；
Xa14＝Leu或Ala；
当R 1不存在，Xa2＝Val，且Xa14＝Leu时，母体肽为非直链肽。
其中，当R 1为亲脂性取代基时，弹性蛋白受体抑制剂的氨基酸序列中第1位Val的氨基经由桥接基团与亲脂性取代基连接，所述桥接基团包含(PEG) m、或者包含(PEG) m和γGlu、或者包含(PEG) m和Asp，所述连接方式为所述第1位Val的氨基通过所述桥接基团中(PEG) m的聚乙二醇化修饰与亲脂性取代基相连；并且，所述亲脂性取代基为CH 3(CH 2) nC(O)-或HOOC(CH 2) nC(O)-且其酰基与所述桥接基团中包含的氨基形成酰胺键；其中，m为2-10的整数；n为14-20的整数；所述氨基酸序列的羧基端裸露羧基，或连接有氨基形成-CONH 2基团；所述连接方式参见图10。
其中，当R 1不存在时，弹性蛋白受体抑制剂的氨基酸序列中，第1位Val的氨基与第14位氨基酸的羧基通过形成酰胺键连接形成环肽化合物，其中所述的环肽化合物结构表示如下：
Xa2＝Val或Iva；
Xa9＝Asp或Glu；
Xa10＝Glu或Asp；
Xa14＝Leu或Ala。
根据本发明的具体实施方式，弹性蛋白受体抑制剂的氨基酸序列选自SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示的氨基酸序列其中之一。
根据本发明的具体实施方式，弹性蛋白受体抑制剂的氨基酸序列的第1位Val的氨基所连接的结构为：
优选的，本发明的弹性蛋白受体抑制剂为如下任一种多肽化合物：
化合物B1(SEQ ID NO.5)：
(PEG 2-PEG 2-γGlu-CO(CH 2) 18CO 2H)-Val-Val-Gly-Ser-Pro-Ser-Ala-Gln-Asp-Glu-Ala-Ser-Pro-Leu-NH 2
化合物B2(SEQ ID NO.6)：
(PEG 2-PEG 2-γGlu-CO(CH 2) 18CO 2H)-Val-Val-Gly-Ser-Pro-Ser-Ala-Gln-Asp-Glu-Ala-Ser-Pro-Ala-NH 2
化合物B3(SEQ ID NO.7)：
(PEG 2-PEG 2-γGlu-CO(CH 2) 18CO 2H)-Val-Iva-Gly-Ser-Pro-Ser-Ala-Gln-Asp-Glu-Ala-Ser-Pro-Leu-NH 2
化合物B4(SEQ ID NO.8)：
(PEG 2-PEG 2-γGlu-CO(CH 2) 18CO 2H)-Val-Val-Gly-Ser-Pro-Ser-Ala-Gln-Glu-Glu-Ala-Ser-Pro-Leu-NH 2
化合物B5(SEQ ID NO.9)：
(PEG 2-PEG 2-γGlu-CO(CH 2) 18CO 2H)-Val-Iva-Gly-Ser-Pro-Ser-Ala-Gln-Asp-Glu-Ala-Ser-Pro-Ala-NH 2
化合物B6(SEQ ID NO.10)：
(PEG 2-PEG 2-γGlu-CO(CH 2) 18CO 2H)-Val-Iva-Gly-Ser-Pro-Ser-Ala-Gln-Asp-Glu-Ala-Ser-Pro-Ala
化合物B7(SEQ ID NO.11)：
(PEG 2-PEG 2-γGlu-CO(CH 2) 18CO 2H)-Val-Iva-Gly-Ser-Pro-Ser-Ala-Gln-Glu-Glu-Ala-Ser-Pro-Ala-NH 2
化合物B8(SEQ ID NO.12)：
(PEG 2-PEG 2-γGlu-CO(CH 2) 18CO 2H)-Val-Iva-Gly-Ser-Pro-Ser-Ala-Gln-Glu-Glu-Ala-Ser-Pro-Ala
化合物B9(SEQ ID NO.13)：
(PEG 2-PEG 2-γGlu-CO(CH 2) 18CO 2H)-Val-Iva-Gly-Ser-Pro-Ser-Ala-Gln-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Ala-NH 2
化合物B10(SEQ ID NO.14)：
(PEG 2-PEG 2-γGlu-CO(CH 2) 18CO 2H)-Val-Val-Gly-Ser-Pro-Ser-Ala-Gln-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Ala-NH 2
化合物B11(SEQ ID NO.15)：
(PEG 2-PEG 2-γGlu-CO(CH 2) 18CO 2H)-Val-Iva-Gly-Ser-Pro-Ser-Ala-Gln-Glu-Glu-Ala-Ser-Pro-Leu-NH 2
化合物B12(SEQ ID NO.16)：
(PEG 2-PEG 2-γGlu-CO(CH 2) 18CO 2H)-Val-Val-Gly-Ser-Pro-Ser-Ala-Gln-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Leu-NH 2
化合物B13(SEQ ID NO.17)：
(PEG 2-PEG 2-γGlu-CO(CH 2) 18CH 3)-Val-Iva-Gly-Ser-Pro-Ser-Ala-Gln-Glu-Glu-Ala-Ser-Pro-Ala-NH 2
化合物B14(SEQ ID NO.18)：
(PEG 2-PEG 2-γGlu-CO(CH 2) 16CO 2H)-Val-Iva-Gly-Ser-Pro-Ser-Ala-Gln-Glu-Glu-Ala-Ser-Pro-Ala-NH 2
化合物B15(SEQ ID NO.19)：
(PEG 2-PEG 2-CO(CH 2) 18CO 2H)-Val-Iva-Gly-Ser-Pro-Ser-Ala-Gln-Glu-Glu-Ala-Ser-Pro-Ala-NH 2
化合物B16(SEQ ID NO.20)：
(PEG 2-PEG 2-CO(CH 2) 18CO 2H)-Val-Iva-Gly-Ser-Pro-Ser-Ala-Gln-Asp-Glu-Ala-Ser-Pro-Ala-NH 2
化合物B17(SEQ ID NO.21)：
化合物B18(SEQ ID NO.22)：
化合物B19(SEQ ID NO.23)：
化合物B20(SEQ ID NO.24)：
化合物B21(SEQ ID NO.25)：
化合物B22(SEQ ID NO.26)：
化合物B23(SEQ ID NO.27)：
化合物B24(SEQ ID NO.28)：
化合物B25(SEQ ID NO.29)：
非酒精性脂肪肝病包括非酒精性脂肪样变性、非酒精性脂肪肝炎、肝纤维化以及肝纤维化合并的肝硬化。
在预防或治疗非酒精性脂肪肝病时，本发明并不特别限制脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂的给药顺序，给药顺序并不影响本发明的治疗效果；本发明的脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂可以同时给药，也可以依次给药；依次给药的顺序既可以先给予脂联素受体激动剂再给予弹性蛋白受体抑制剂，也可以先给予弹性蛋白受体抑制剂再给予脂联素受体激动剂。
本发明并不特别限定脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂的浓度比；优选地，本发明的联合用药物组合物中脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂的浓度比为10：1至3：1。
更优选地，本发明的联合用药物组合物中脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂的浓度比为6：1至4：1。
本发明还提供一种预防或治疗非酒精性脂肪肝病的联合用药物组合物，该联合用药物组合物包括脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂。
本发明的联合用药物组合物可以为单一的复方制剂，也可以为脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂两种单独制剂的组合，两种单独制剂可同时施用，也可依次施用。
本发明的联合用药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。
本发明的联合用药物组合物适用于各种给药方式，例如口服给药、经皮给药、静脉给药、肌肉内给药、局部给药、经鼻给药等。根据所采用的给药方式，可将本发明的药物组合物制成各种合适的剂型。
适当剂型的实例为片剂、胶囊、糖衣片剂、粒剂、口服溶液和糖浆、用于皮肤表面的油膏和药贴、气雾剂、鼻喷剂以及可用于注射的无菌溶液。
本发明的药物组合物可以制成溶液或者冻干粉以用于胃肠外给药，在使用前可加入适当溶剂或其他可药用的载体将粉末重新配制，液体配方一般是缓冲 液、等渗溶液和水溶液。
本发明通过一系列的动物实验证实了脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂之间具有协同作用，同时脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂联合用药具有良好的改善或治疗非酒精性脂肪肝病的效果。
本发明采用脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂联合用药，在改善或治疗非酒精性脂肪肝病的过程中，脂联素受体激动剂本身可以显著的降低胞外基质的积累进而改善纤维化，同时脂联素受体激动剂降解胞外基质导致的EDPs的产生也能够被弹性蛋白受体抑制剂阻断，这样的协同作用极大的优化了药物效果。本发明脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂联合用药具有改善脂质代谢、炎症以及胞外基质的积累等效果。
脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂的联合使用不仅发挥了脂联素受体激动剂本身可以改善NAFLD的优势，并且还克服了其药物副作用，达到低毒，长久用药的目的。同时本发明经大量实验证实联合使用脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂的治疗效果远远大于单独使用脂联素受体激动剂或弹性蛋白受体抑制剂。
此外脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂都属于多肽化合物，与一些小分子相比具有较低的毒性，安全窗口更大，具有无毒副作用或毒副作用小等特点。
附图说明
图1：为MCD诱导的非酒精性脂肪肝炎小鼠经给药后胞外基质α-SMA的QPCR结果柱状图。
图2：为MCD诱导的非酒精性脂肪肝炎小鼠经给药后的H&E染色切片图。
图3：为MCD诱导的非酒精性脂肪肝炎小鼠经给药后的H&E染色阳性面积柱状图。
图4：为MCD诱导的非酒精性脂肪肝炎小鼠经给药后的CD68免疫染色切片图。
图5：为MCD诱导的非酒精性脂肪肝炎小鼠经给药后的CD68免疫染色阳性面积柱状图。
图6：为CCl 4诱导的肝纤维化小鼠经给药后胞外基质α-SMA的QPCR结果柱状图。
图7：为CCl 4诱导的肝纤维化小鼠经给药后的H&E染色切片图。
图8：为CCl 4诱导的肝纤维化小鼠经给药后的天狼星红染色切片图。
图9：为CCl 4诱导的肝纤维化小鼠经给药后的天狼星红染色阳性面积柱状图。
图10：为本发明弹性蛋白受体抑制剂中桥接基团与肽链的连接示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。除非另有说明，否则所用试剂或仪器均可以通过市购获得。
实例1、多肽化合物的合成
1.材料：
所有的氨基酸都购于NovaBiocH&Em公司。如果没有特别说明，其他所有试剂均为分析纯，购自Sigma公司。利用PH&Enomenex Luna C18制备柱(46mm x 250mm)用来纯化多肽。质谱分析采用Agilent质谱仪进行测定。
2.实验方法：
化合物采用Fmoc固相多肽的合成法，由羧基端向氨基端方向合成，按照上述氨基酸序列顺序依次连接。具体步骤如下：取Rink MBHA resin(1g，1.0eq，loading＝0.643mmol/g)置于多肽合成器中，加入5mL DCM，振摇30min活化树脂。加入20％的哌啶进行检测，树脂变蓝。将Fomc保护的氨基酸加入反应器中，通入氩气，反应2h。加入茚检试剂进行检测，茚检树脂变无色，加入哌啶脱掉保护剂，进行茚检检测，如果保护基脱掉，则依次进行下一步反应。其中茚检试剂的使用量为试剂1：试剂2：试剂3＝l：2：l(滴)。如此重复操作，直至合肽完成。最后利用冰乙醚洗涤沉淀切割后的多肽，然后进行高效液相色谱纯化。
实施列2、脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂联合作用对MCD诱 导的非酒精性脂肪肝炎的改善治疗作用。
1.模型的建立：
受试药物：随机选取脂联素受体激动剂A1、A3和弹性蛋白受体抑制剂B1、B17、B22，保存条件-80℃。
造模方法：由中山大学实验动物中心提供雄性C57BL/6J小鼠，小鼠体重18-22g，随机分成3个群组，每一群组78只小鼠，并将每一群组进一步随机分成13小组，各小组分别为：
1)对照组(MCS)+生理盐水，腹腔注射，n＝6；
2)模型组(MCD)+生理盐水，腹腔注射，n＝6；
3)模型组(MCD)+化合物A1，腹腔注射，n＝6；
4)模型组(MCD)+化合物A3，腹腔注射，n＝6；
5)模型组(MCD)+化合物B1，腹腔注射，n＝6；
6)模型组(MCD)+化合物B17，腹腔注射，n＝6；
7)模型组(MCD)+化合物B22，腹腔注射，n＝6；
8)模型组(MCD)+化合物A1+化合物B1，腹腔注射，n＝6；
9)模型组(MCD)+化合物A1+化合物B17，腹腔注射，n＝6；
10)模型组(MCD)+化合物A1+化合物B22，腹腔注射，n＝6；
11)模型组(MCD)+化合物A3+化合物B1，腹腔注射，n＝6；
12)模型组(MCD)+化合物A3+化合物B17，腹腔注射，n＝6；
13)模型组(MCD)+化合物A3+化合物B22，腹腔注射，n＝6。
其中，3个群组中脂联素受体激动剂(化合物A1、A3)与弹性蛋白受体抑制剂(化合物B1、B17、B22)的给药浓度比分别为3:1(300μg/kg：100μg/kg)、5:1(500μg/kg：100μg/kg)和10:1(1000μg/kg：100μg/kg)，脂联素受体激动剂(化合物A1、A3)每天给药一次，弹性蛋白受体抑制剂(化合物B1、B17、B22)每三天给药一次，给药6周后处死小鼠；MCD(蛋氨酸-胆碱缺乏的饲料)和MCS饲料均购自于江苏美迪森生物医药有限公司。
2.实验方法：
胞外基质蛋白α-SMA的QPCR实验：称取25mg组织，加入1mL Trizol，机械研磨，静置5分钟，加入1/5体积的氯仿，剧烈震荡15s，静置10分钟，12000rpm离心15分钟。吸取上清液，加入异丙醇沉淀RNA，静置10分钟， 12000rpm离心10分钟，弃上清。取沉淀物，加入75％的乙醇洗涤2次，7500rpm离心5分钟，弃上清。测蛋白浓度根据试剂盒的步骤对所提取的RNA进行反转和后续实验，试剂盒均购自于北京全式金生物技术公司。
苏木素-伊红(H&E)染色：取石蜡包埋的组织切片，60℃烘1h。脱蜡水化：二甲苯20分钟→二甲苯20分钟→无水酒精15分钟→无水酒精15分钟→95％酒精10分钟→90％酒精5分钟→80％酒精5分钟。染色：苏木精7分钟→自来水冲洗干净→1％盐酸乙醇分化1s→自来水冲洗→伊红染色15s-20s→自来水冲洗。脱水透明：75％酒精1s→85％酒精1s→95％酒精1s→100％酒精1s→二甲苯1s→二甲苯1s。封片晾干30分钟，树胶封片。其中H&E染色液购自于上海生工生物工程有限公司。
免疫组化：烘片、脱蜡，之后放入双蒸水中浸泡5分钟。抗原修复：将放病理切片的架子放于盛有柠檬酸的缓冲液(PH＝6.0)烧杯中，高温高压15分钟；取出烧杯，静置在室温，待温度下降至室温，然后取出片子，放入3％双氧水中10分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性，之后用PBS洗涤3次，每次5分。利用1％BSA对组织进行封闭1h。去除1％BSA，按说明书推荐比例滴加抗体于组织上，4℃过夜；第二天取出病理切片，待恢复室温之后加入连有辣根过氧化物酶的二抗，37℃孵育60min，然后用DAB(二氨基联苯胺)(TH&Ermo Scientific，USA)显色；用苏木素染液复染，用自来水冲洗5min，1％盐酸乙醇分化，再用自来水洗5min，脱水，风干，封片，拍照。其中CD68抗体购自于CST公司。
3.药效评价：
在MCD诱导的小鼠脂肪变性模型中，其表现特征为：中央静脉区域周围出现大量的甘油三酯积累，且诱导6周之后，肝脏中汇管区及肝小叶间隔有大量的炎症细胞浸润。给药三周之后，小鼠进行麻醉，并通过眼球后静脉丛取血进行血清学指标的检测。肝脏样本取其中肝脏小叶福尔马林固定并用于病理学分析。
图1为MCD诱导的非酒精性脂肪肝炎小鼠经给药后胞外基质α-SMA的QPCR结果柱状图。从图1的结果可以看出，本发明随机选用的化合物A1、A3和化合物B1、B17、B22的任何两个药物的联合使用对于MCD诱导的非酒精性脂肪肝炎都具有明显的改善效果，且改善效果均优于单独化合物A1、 A3或单独化合物B1、B17、B22给药。由此可以证明本发明联合使用脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂对于非酒精性脂肪肝炎具有明显的改善效果，且效果远远优于单独使用脂联素受体激动剂或弹性蛋白受体抑制剂。
图2为MCD诱导的非酒精性脂肪肝炎小鼠经给药后的H&E染色切片图；图3为MCD诱导的非酒精性脂肪肝炎小鼠经给药后的H&E染色阳性面积柱状图。选取MCS组、MCD组、MCD+化合物A1组、MCD组+化合物B22组、MCD组+化合物A3组、MCD组+化合物B1组、MCD组+化合物A1+化合物B22组、MCD组+化合物A3+化合物B1组进行H&E染色，染色结果如图2所示；计算H&E染色切片图中的阳性面积并制作柱状图，结果如图3所示。从图2和图3的结果可以看出，在MCD诱导6周后，小鼠肝脏中出现大量的脂质积累，给予药物治疗后，可以明显的看出小鼠肝脏中脂质积累得到了不同程度的改善，且联合使用脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂的效果明显优于单独使用脂联素受体激动剂或弹性蛋白受体抑制剂。
图4为MCD诱导的非酒精性脂肪肝炎小鼠经给药后的CD68免疫染色切片图；图5为MCD诱导的非酒精性脂肪肝炎小鼠经给药后的CD68免疫染色阳性面积柱状图。从图4至图5的结果可以看出，联合使用脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂明显的减少了脂质的积累。因为脂质的过度累计导致氧化应激以及炎症的发生，所以我们进一步检测了炎症相关表达。结果显示联合使用脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂能显著地改善炎症细胞的浸润，减少炎症的发生。
综合图1至图5胞外基质蛋白α-SMA的QPCR结果、H&E染色和CD68免疫染色结果可以明显看出，MCD造模6周后小鼠肝脏出现大量的空泡样变性并伴随着炎症细胞的浸润。给药治疗之后有不同程度的改善，联合使用脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂的效果远远优于单独使用联合使用脂联素受体激动剂或弹性蛋白受体抑制剂。
实施例3、脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂联合作用对CCl 4诱导的肝纤维化的改善治疗作用。
1.模型的建立：
受试药物：随机选取脂联素受体激动剂A1、A3和弹性蛋白受体抑制剂 B1、B17、B22，保存条件-80℃。
造模方法：由中山大学实验动物中心提供雄性C57BL/6J小鼠，小鼠体重18-22g，随机分成3个群组，每一群组78只小鼠，并将每一群组进一步随机分成13小组，各小组分别为：
1)对照组(Oil)+生理盐水，腹腔注射，n＝6；
2)模型组(CCl 4)+生理盐水，腹腔注射，n＝6；
3)模型组(CCl 4)+500μg/kg化合物A1，腹腔注射，n＝6；
4)模型组(CCl 4)+500μg/kg化合物A3，腹腔注射，n＝6；
5)模型组(CCl 4)+100μg/kg化合物B1，腹腔注射，n＝6；
6)模型组(CCl 4)+100μg/kg化合物B17，腹腔注射，n＝6；
7)模型组(CCl 4)+100μg/kg化合物B22，腹腔注射，n＝6；
8)模型组(CCl 4)+500μg/kg化合物A1+100μg/kg化合物B1，腹腔注射，n＝6；
9)模型组(CCl 4)+500μg/kg化合物A1+100μg/kg化合物B17，腹腔注射，n＝6；
10)模型组(CCl 4)+500μg/kg化合物A1+100μg/kg化合物B22，腹腔注射，n＝6；
11)模型组(CCl 4)+500μg/kg化合物A3+100μg/kg化合物B1，腹腔注射，n＝6；
12)模型组(CCl 4)+500μg/kg化合物A3+100μg/kg化合物B17，腹腔注射，n＝6；
13)模型组(CCl 4)+500μg/kg化合物A3+100μg/kg化合物B22，腹腔注射，n＝6。
其中，3个群组中脂联素受体激动剂(化合物A1、A3)与弹性蛋白受体抑制剂(化合物B1、B17、B22)的给药浓度比分别为3:1(300μg/kg：100μg/kg)、5:1(500μg/kg：100μg/kg)和10:1(1000μg/kg：100μg/kg)，脂联素受体激动剂(化合物A1、A3)每天给药一次，弹性蛋白受体抑制剂(化合物B1、B17、B22)每三天给药一次，给药6周后处死小鼠；CCl 4和Oil均购自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
2.实验方法：
胞外基质蛋白α-SMA的QPCR实验：称取25mg组织，加入1mL Trizol，机械研磨，静置5分钟，加入1/5体积的氯仿，剧烈震荡15s，静置10分钟，12000rpm离心15分钟。吸取上清液，加入异丙醇沉淀RNA，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，弃上清。取沉淀物，加入75％的乙醇洗涤2次，7500rpm离心5分钟，弃上清。测蛋白浓度后续根据试剂盒的步骤对所提取的RNA进行反转和后续实验，试剂盒均购自于北京全式金生物技术公司。
H&E染色：烘片、脱蜡；苏木素染色7分钟、自来水冲洗干净、1％盐酸乙醇分化1s、自来水冲洗、伊红染色、自来水冲洗、脱水透明、晾干、树胶封片。
天狼星红染色：烘片30分钟、脱蜡、双蒸水中静置5分钟、暗室里天狼星红染色60-80分钟、0.5％冰醋酸洗5下、最后在二甲苯中，未干封片。
3.药效评价：
在CCl 4诱导的肝脏纤维化模型中，其表现特征为：中央静脉区域周围有炎性细胞浸润，以及汇管区及肝小叶间隔有大量胶原纤维沉积等。
图6为CCl 4诱导的肝纤维化小鼠经给药后胞外基质α-SMA的QPCR结果柱状图。从图6的结果可以看出，本发明随机选用的化合物A1、A3和化合物B1、B17、B22的任何两个药物的联合使用对于CCl 4诱导的肝纤维化都具有明显的改善效果，且均改善效果均优于单独使用化合物A1、A3或单独使用化合物B1、B17、B22。由此可以证明本发明联合使用脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂对于肝纤维化具有明显的改善效果，且效果远远优于单独使用脂联素受体激动剂或弹性蛋白受体抑制剂。
图7为CCl 4诱导的肝纤维化小鼠经给药后的H&E染色切片图。从图7的结果可以看出，由CCl 4诱导6周之后，小鼠肝脏出现炎性细胞浸润、细胞坏死的情况，在给药之后得到了改善。联合使用脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂能明显地减少中央静脉区周围的炎性细胞浸润，且单独使用脂联素受体激动剂或弹性蛋白受体抑制剂的改善效果并不显著。
图8为CCl 4诱导的肝纤维化小鼠经给药后的天狼星红染色切片图；图9为CCl 4诱导的肝纤维化小鼠经给药后的天狼星红染色阳性面积柱状图。选取MCS组、MCD组、MCD+化合物A1组、MCD组+化合物B22组、MCD组+化合物A3组、MCD组+化合物B1组、MCD组+化合物A1+化合物B22组、 MCD组+化合物A3+化合物B1组进行天狼星红染色，染色结果如图8所示；计算天狼星红染色切片图中的阳性面积并制作柱状图，结果如图9所示。天狼星红是强碱性染料，易与胶原分子中的碱性基团结合，所以天狼星红可以反应胶原的沉积量。从图8至图9的结果可以看出，给予药物治疗之后，胶原沉积出现不同程度的改善。其中联合使用脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂小鼠肝脏中胶原的沉积量较少，说明联合使用脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂改善肝纤维化的效果明显优于单独使用脂联素受体激动剂或弹性蛋白受体抑制剂。
综合图7至图9的结果，在给予化合物治疗肝脏纤维化小鼠后，H&E染色和天狼星红染色结果可以看出，由CCl 4诱导肝纤维化之后出现的炎性细胞浸润，肝脏纤维化的情况在联合使用脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂之后得到了显著的改善，说明本发明联合使用脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂可以很好的改善肝脏纤维化。同时联合使用脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂的效果明显的远远优于单独使用脂联素受体激动剂或弹性蛋白受体抑制剂。
综上所述，本发明脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂联合用药取得了意想不到的效果，在治疗过程中脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂起协同作用，联合使用脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂的效果远远优于单独使用脂联素受体激动剂或弹性蛋白受体抑制剂。本发明联合使用脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂对于非酒精性脂肪肝病具有显著的治疗效果。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求书所界定的保护范围。

Claims (18)

  1. 脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂联合用药在预防或治疗非酒精性脂肪肝病中的应用。
  2. [根据细则26改正08.04.2021] 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脂联素受体激动剂的氨基酸序列为P-X2-L-Y-X5-F-X7；其中X2、X5及X7中至少一个为非天然氨基酸，P为脯氨酸，L为亮氨酸，Y为酪氨酸，F为苯丙氨酸。
  3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述脂联素受体激动剂的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中的一种。
  4. 根据权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述弹性蛋白受体抑制剂含有以下氨基酸序列表示的母体肽：
    R 1-Val-Xa2-Gly-Ser-Pro-Ser-Ala-Gln-Xa9-Xa10-Ala-Ser-Pro-Xa14，
    其中，
    R 1为：亲脂性取代基或不存在；
    Xa2＝Val或Iva；
    Xa9＝Asp或Glu；
    Xa10＝Glu或Asp；
    Xa14＝Leu或Ala；
    当R 1不存在，Xa2＝Val，且Xa14＝Leu时，母体肽为非直链肽。
  5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述弹性蛋白受体抑制剂的氨基酸序列选自SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29中的一种。
  6. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脂联素受体激动剂和所述弹性蛋白受体抑制剂同时给药。
  7. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脂联素受体激动剂和所述弹性蛋白受体抑制剂依次给药。
  8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述依次给药的顺序为先给予所述脂联素受体激动剂再给予所述弹性蛋白受体抑制剂。
  9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述依次给药的顺序为先给予所述弹性蛋白受体抑制剂再给予所述脂联素受体激动剂。
  10. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂的浓度比为10：1至3：1。
  11. 根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂的浓度比为6：1至4：1。
  12. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述非酒精性脂肪肝病包括非酒精性脂肪样变性、非酒精性脂肪肝炎、肝纤维化以及肝纤维化合并的肝硬化。
  13. 一种联合用药物组合物，适用于权利要求1-12任一项所述的预防或治疗非酒精性脂肪肝病中的应用，其特征在于，所述联合用药物组合物包括脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂。
  14. 根据权利要求13所述的联合用药物组合物，其特征在于，所述联合用药物组合物为单一的复方制剂。
  15. 根据权利要求13所述的联合用药物组合物，其特征在于，所述联合用药物组合物为脂联素受体激动剂和弹性蛋白受体抑制剂两种单独制剂的组合。
  16. 根据权利要求13所述的联合用药物组合物，其特征在于，所述联合用药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。
  17. 根据权利要求13所述的联合用药物组合物，其特征在于，所述联合用药物组合物为药学上可接受的剂型。
  18. 根据权利要求17所述的联合用药物组合物，其特征在于，所述剂型为片剂、胶囊、糖衣片剂、粒剂、口服溶液、糖浆、用于皮肤表面的油膏和药贴、气雾剂、鼻喷剂以及用于注射的无菌溶液中的至少一种。
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