KR20160130842A - 옥신토모듈린 유사체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규의 옥신토모듈린 유사체에 관한 것으로, GCGR과 GLP-1R 이중 아고니스트 활성을 나타냈고, 높은 효소분해 안정성, 높은 생물활성을 구비하며, 부작용이 발생하지 않으므로, 과식증, 비만증과 과체중, 콜레스테롤의 상승 및 당뇨병을 치료하는 약물을 제조하는 데에 사용될 수 있다.

Description

옥신토모듈린 유사체{OXYNTOMODULIN ANALOGUE}
본 발명은 생물 화학 기술분야에 속한 것으로, 옥신토모듈린 유사체(Oxyntomodulin, OXM)의 폴리펩티드(polypeptide)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 신규 옥신토모듈린 유사체의 치료 용도에 관한 것이다.
당뇨병(Diabetes mellitus, DM)은 인슐린의 상대적 부족 또는 절대적 부족을 특징으로 하는 대사성 질환인 바, 인슐린의 상대적 부족 또는 절대적 부족은 고혈당을 야기하고, 나아가 3대 영양물질의 대사 문란을 초래하며, 결과적으로 환자의 정상적인 생리 기능에 영향주고 합병증을 야기한다. 전세계의 당뇨병 환자는 날로 늘어나는데, 20~79세 성인 중에서, 당뇨병 환자 인수는 2013년에 이미 3.82억에 도달하였고, 2030년에는 4.39억에 도달할 것으로 예측된다. 여기서, 중국은 세계 1위 당뇨병 대국인 바, 현재 중국의 당뇨병 환자는 약 1.1억이고, 아직도 신속하게 증장하고 있다. 비만증의 증가로 인해 당뇨병이 증가되는데, II형 당뇨병을 앓고 있는 약 90%의 환자들을 비만인 것으로 볼 수 있다. 전세계에서 2억 4천 6백만 인구가 당뇨병을 앓고 있고, 2025년에는 3억 8천만 인구들이 당뇨병을 앓고 있을 것으로 예측된다. 많은 사람들은 기타 심혈관 위험 요소도 가지고 있는 바, 고/비정상적인 저밀도지질단백질(low density lipoprotein, LDL) 및 트리글리세리(triglycerides)와 저 고밀도지질단백질(high density lipoprotein, HDL)을 포함한다. 당뇨병은 현재 완치될 수 없고, 환자는 평생 약물에 의존할 수 밖에 없다. 전통적인 항 당뇨병 약물은 각자 단점이 존재하기에, 신규 항 당뇨병 약물을 연구 개발하는 것이 절박하게 필요하다.
펩티드계 약물, 소분자 화학 약물과 고분자 단백질 약물을 비교했을 경우, 펩티드계 약물 자체는 하기와 같은 장점을 구비한다. 첫째, 대다수 이들은 내인성 펩티드 또는 기타 천연 펩티드에서 유래되고, 구조가 뚜렷하며, 작용 메커니즘이 명확하고; 둘째, 이들과 일반적인 소분자 약물을 비교했을 경우, 이들의 활성이 더 높고, 약물 사용량이 적으며, 독성 부작용이 더 낮고, 대사 최종산물은 아미노산(독성 부작용이 없음)이며; 셋째, 이들과 외인성 단백질을 비교했을 경우, 면역원성이 비교적 낮고, 화학합성을 할 수 있으며, 제품 순도가 높고, 품질을 제어할 수 있으며; 넷째, 폴리펩티드 약물은 때때로 위장관 소화를 회피할 수 있으므로, 단백질 분자가 소화 효소에 의해 파괴되어 경구 투여를 할 수 없는 폐단을 극복한다.
글루카곤 유사 펩티드(GlueagoN-like peptide-1, GLP-1)는 인크레틴(Incretin) 패밀리에 속한 것으로, 소장점막 L 세포에 의해 분비되는 폴리펩티드이고, GLP-1-(7-37)와 GLP-1-(7-36)-아미드인 두가지 활성 형태가 있다. GLP-1은 특이성 수용체인 글루카곤 유사 펩티드1수용체(GLP1R)와 결합하여 항 당뇨병 작용을 발휘하는데, 주요한 생리적 기능은, 췌장 β 세포 기능을 개선시키고, 인슐린 분비를 촉진시키며, 식후 혈당을 강하시켜 혈당 정상 상태를 유지시키고, 인슐린 생물 합성을 증강시키며, 글루카곤 분비를 억제시키고, 위장 연동 운동 특히 위 배출을 억제시킴으로써, 포만감을 증가시키고, 식욕을 감소시켜 체중을 제어하는 것이다. 기존의 항 당뇨병 약물과 비교했을 경우, GLP-1의 장점은 혈당 항상성을 유지시키고 체중을 효과적으로 제어하는 것이다(Cardiovascular effects of glucagonlike peptide-1 agonists, Am J Cardiol. 2011;108:33B-41B. Cardiovascular effects of the DPP-4 inhibitors, Diab Vasc Dis Res. 2012;9:109-16. Incretin mimetics as a novel therapeutic option for hepatic steatosis, Liver Int. 2006; 26:1015-7.). GLP-1의 반감기가 극히 짧기에, 분비후 디펩티딜펩티드가수분해효소-IV(Dipeptidyl-peptidase-IV, DPP-IV) 또는 뉴트럴 엔도펩티다제(Neutral endopeptidase, NEP)24.11에 의해 신속히 분해된다. 그러므로 GLP-1을 임상에 직접적으로 사용할 수 없고, 항 효소분해의 GLP-1 수용체 작용제에 대한 연구 개발이 필요하다.
하지만, 임상 시험에서 GLP-1 수용체 작용제의 단점도 아주 뚜렷하다는 것을 증명하였는 바, 주요하게 아래와 같은 몇가지 방면이 있다.
우선, 반감기가 비교적 짧음으로 인해 주사 빈도가 밀집해져, 환자를 불편하게 하고; 다음, 약물동태학 및 안전성이 모두 불명확하고, 인입된 외인성 화학 라디칼이 도대체 어떻게 대사되고, 어떻게 배출되며, 인체에 어떠한 영항을 주는지 모두 불명확하여, 추가적인 연구가 필요하다. 최신 전임상 연구는, 균형적인 글루카곤 유사 펩티드 1 수용체와 글루카곤 수용체(GLP-1R/GCGR) 이중 타켓 작용제는 단순한 GLP-1R 작용제보다 더 효과적이고, 쥐의 비만을 치료하는 더 안전적인 작용을 나타냈고, 동시에 혈당 제어 방면에서 개선된 바가 있다는 것을 표명하였다(A new glucagon and GLP-1 co-agonist eliminates obesity in rodents, Nat Chem Biol. 2009;5:749-57.). 이와 관련되는 것은 옥신토모듈린(Oxyntomodulin, OXM)에 대한 연구인 바, OXM는 장표피 L-세포에 의해 분비되는 짧은 펩티드 호르몬으로, 37개의 아미노산으로 조성되고, 글루카곤의 내원성 전구체이다. OXM는 균형적인 GLP-1R/GCG 이중 타켓 작용제인 바, 이가 멤브레인 글루카곤 수용체에 대한 효능은 GLP-1 수용체에 대한 효능보다 2배 낮고, 천연 멤브레인 글루카곤과 GLP-1이 이들 자체의 수용체에 대한 효능보다 낮다. 비록 천연적인 OXM 생물 활성이 비교적 낮지만, 임상 연구는, 4주 동안 지속적으로 피하에 천연 OXM를 주사하여도 여전히 환자의 체중을 현저하게 감소시킬 수 있고, 음식 섭취량을 감소시킬 수 있다는 것을 표명하였다.(Subcutaneous oxyntomodulin reduces body weight in overweight and obese subjects: a double-blind, randomized, controlled trial, Diabetes. 2005; 54:2390-5.) OXM는 아주 짧은 반감기를 가지고 있어, 세포 표면의 디펩티딜펩티드가수분해효소IV (DPP-IV)에 의해 신속하게 불활성화될 수 있고, 체내 안정성이 나쁘다.
GLP-1R/GCGR 상호 작용제(co-agonist)는 고지방식(high fat diet)으로 유도된 비만 래트(DIO rat)의 체중과 지방량을 현저하게 감소시키고, 그 어떠한 단순한 GLP-1R작용제보다 우월하며, 혈당 제어하는 데에 있어서 개선된 바가 있다는 것을 이미 증명하였다. 이러한 변화는 음식 섭취량의 감소와 에너지의 대량 소모와 관련된다. 또 다른 보도에서는, 프로테아제(protease) 내성을 구비하는 장기간 작용하는 GLP-1R/GCG 이중 타켓 작용제는 동일한 효능의 장기간 작용하는 GLP-1R작용제에 비해 체중을 현저하게 감소시킬 수 있고, 트리글리세리드를 감소킬 수 있으며, 항 고혈당 효과가 있다는 것을 보도하였다. 이 외에, 장기간 작용하는 GLP-1R/GCGR이중 타켓 작용제는 대사 지표, 예를 들어, 혈장 인슐린, 렙틴과 아디포넥틴을 개선시킬 수 있다(Unimolecular dual incretins maximize metabolic benefits in rodents, monkeys, and humans, Sci Transl Med. 2013;5:209.).
상술한 바를 종합하면, GLP-1R/GCGR이중 타켓 작용제를 연구 개발하는 것은 현재 당뇨병을 치료하는 폴리펩티드 약물을 연구 제조하는 주요한 방향이다. 최근 몇 년간, 연구원은 화학수식(chemical modification)을 통하여 몇가지 하루에 한번 주사하거나, 또는 일주에 한번 주사하는 잠재적인 OXM유사체를 개발하였다. 여기서, 가장 널리 사용되는 수식제는 메톡시폴리에틸렌글리콜(methoxypoly ethylene glycol, mPEG)이고, OXM의 분자 제거 체적을 증가시켜, 약물 분자의 신장 여과 클리어런스(clearance)를 감소시킴으로써, mPEG에 의해 수식된 약물 혈장 반감기를 연장시켜, 매주 주사하는 목표를 실현하도록 한다. 비록 이러한 방법은 폴리펩티드 약물의 반감기를 현저하게 향상시킬 수 있지만, 대부분 단백질의 생물 활성도 서로 상이한 수준으로 감소된다. 더 위험한 것은, mPEG는 인체에서 대사 불가능한 분자이기에, 이에 유도된 폴리펩티드 단백질계 약물은 신장의 액포화(vacuolization)를 초래할 수 있다(Short communication: renal tubular vacuolation in animals treated with polyethylene-glycol-conjugated proteins, Toxicol Sci. 1998; 42: 152-7; Safety assessment on polyethylene glycols (PEGs) and their derivatives as used in cosmetic products. Toxicology, 2005; 214:1-38.). mPEG 수식을 거친 절대다수의 약물 분자는 종양 치료에 사용되므로, PEG의 독성은 때때로 최대한 소홀하게 된다. 화학의 본질에서 출발하면, 폴리펩티드 서열을 최적화하여야만 폴리펩티드 약물의 생물화학과 생리적 특성을 근본적으로 해결할 수 있고, 이 또한 생물화학자가 공인하는 사실이다. 이 기초상에서, 생물화학 수단을 통하여 폴리펩티드 약물의 각종 활성과 안정성 지표를 더욱 향상시킨다.
본 발명의 목적은 옥신토모듈린 유사체를 제공하는 것이다. 본 발명자는 대량의 실험 연구를 거쳐 옥신토모듈린 분자를 개선하였는 바, 그 결과는 이러한 옥신토모듈린 유사체는 보다 긴 반감기를 구비하고, 인슐리노트로핀(insulinotropin) 활성을 구비하며, 부작용이 발생하지 않고, 당뇨병 등 질환의 치료에 사용된다는 것을 표명한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 옥신토모듈린 유사체의 치료 용도를 제공하는 것인 바, 신규 옥신토모듈린 유사체는 잠재적으로 당뇨병을 치료하는 신세대 약물로 할 수 있거나, 또는 혈당강하에 사용되거나, 또는 체중감소에 사용된다.
본 발명은 옥신토모듈린, 글루카곤 유사 펩티드, 익스에나티드(Exenatide) 및 글루카곤(Glucagon)의 모체 펩티드(maternal peptide)에 기반하여 개선된 것이다. 옥신토모듈린의 모체 펩티드는 하기와 같다(SEQ ID NO.25).
His-Ser-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Lys-Arg-AsN-Lys-AsN-AsN-Ile-Ala-OH
글루카곤 유사 펩티드(GLP-1)의 서열은 하기와 같다(SEQ ID NO.26).
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-GlN-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-OH
익스에나티드의 서열은 하기와 같다(SEQ ID NO.27).
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-GlN-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-AsN-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
글루카곤의 서열은 하기와 같다(SEQ ID NO.28).
His-Ser-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-OH
본 발명의 제1양태는 옥신토모듈린 유사체를 제공하는 바, 상기 옥신토모듈린 유사체는 하기와 같은 아미노산 서열로 표시되는 모체 펩티드를 함유한다.
His-Xaa2-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa10-Ser-Lys-Xaa13-Leu-Asp-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Ala-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Trp-Leu-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-COR1
여기서, R1 = -OH 또는 -NH2이고;
Xaa2 = Aib, Ser 또는 D-Ser이며;
Xaa10 = Lys 또는 Tyr이고;
Xaa13 = Lys 또는 Tyr이며;
Xaa16 = Ser, Aib, Lys 또는 Glu이고;
Xaa17 = Lys 또는 Arg이며;
Xaa18 = Arg 또는 Ala이고;
Xaa20 = His, Gln 또는 Lys이며;
Xaa21 = Asp 또는 Glu이고;
Xaa23 = IIe, Leu 또는 Val이며;
Xaa24 = Glu 또는 Gln이고;
Xaa27 = Met, Leu 또는 존재하지 않으며;
Xaa28 = Ser, Asn, Asp, Arg 또는 존재하지 않고;
Xaa29 = Ala, Gly, Thr 또는 존재하지 않으며;
Xaa30 = Gly 또는 존재하지 않고;
Xaa31 = Gly 또는 존재하지 않으며;
Xaa32 = Pro 또는 존재하지 않고;
Xaa33 = Ser 또는 존재하지 않으며;
Xaa34 = Ser 또는 존재하지 않고;
Xaa35 = Gly 또는 존재하지 않으며;
Xaa36 = Ala 또는 존재하지 않고;
Xaa37 = Pro 또는 존재하지 않으며;
Xaa38 = Pro 또는 존재하지 않고;
Xaa39 = Pro 또는 존재하지 않으며;
Xaa40 = Ser 또는 존재하지 않고;
상기 아미노산 서열에서, Xaa10, Xaa16, Xaa17 또는 Xaa20 중 적어도 하나는 Lys이며, 상기 적어도 하나의 Lys 또는 상기 서열의 제12 부위의 Lys의 측쇄와 친지방성의 치환기는 서로 연결되고, 연결 방식은, 상기 친지방성의 치환기가 이의 카르복시기와 하나의 가교 라디칼의 아미노기로 아미드 결합을 형성하며, 가교 라디칼의 아미노산 잔기의 카르복시기와 모체 펩티드의 Lys의 N-말단 잔기에서 하나의 아미드 결합을 형성하여 모체 펩티드에 연결시키는 것이며;
상기 가교 라디칼은 Glu, Asp 및/또는 (PEG)m이고, 여기서 m은 2~10의 정수이며; 상기 친지방성 치환기는 CH3(CH2)nCO- 또는 HOOC(CH2)nCO-로부터 선택되는 하나의 아실기이고, 여기서 n은 10~24의 정수이다.
바람직한 가교 라디칼은 Glu-(PEG)m 또는 Asp-(PEG)m 또는 (PEG)m일 수 있고, 연결 방식은 하기와 같다.
Figure pct00001
본 발명의 바람직한 화합물은 하기와 같은 아미노산 서열의 모체 펩티드를 함유한다.
His-Xaa2-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa10-Ser-Lys-Xaa13-Leu-Asp-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Ala-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Trp-Leu-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30- Xaa31- Xaa32- Xaa33- Xaa34- Xaa35- Xaa36- Xaa37-Xaa38- Xaa39- Xaa40-COR1
여기서, R1 = -NH2이고;
Xaa2 = Aib 또는 D-Ser이며;
Xaa10 = Lys 또는 Ty이고r;
Xaa13 = Lys 또는 Tyr이며;
Xaa16 = Ser, Aib, Glu 또는 Lys이고;
Xaa17 = Lys 또는 Arg이며;
Xaa18 = Arg 또는 Ala이고;
Xaa20 = His, Gln 또는 Lys이며;
Xaa21 = Asp 또는 Glu이고;
Xaa23 = IIe, Val이며;
Xaa24 = Glu 또는 Gln이고;
Xaa27 = Met 또는 Leu이며;
Xaa28 = Asn, Arg, Asp 또는 존재하지 않고;
Xaa29 = Gly, Thr 또는 존재하지 않으며;
Xaa30 = Gly 또는 존재하지 않고;
Xaa31= Gly 또는 존재하지 않으며;
Xaa32= Pro 또는 존재하지 않고;
Xaa33= Ser 또는 존재하지 않으며;
Xaa34= Ser 또는 존재하지 않고;
Xaa35= Gly 또는 존재하지 않으며;
Xaa36= Ala 또는 존재하지 않고;
Xaa37= Pro 또는 존재하지 않으며;
Xaa38= Pro 또는 존재하지 않고;
Xaa39= Pro 또는 존재하지 않으며;
Xaa40= Ser 또는 존재하지 않는다.
더욱 바람직한 화합물은 화합물1~화합물24인 바, 이는 모체 펩티드를 함유하고 SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.24로 표시되는 아미노산 서열을 구비한다.
본 발명의 전편 명세서에서, 통상적인 3레터 코드(three-letter code)를 사용하여 천연 아미노산을 대표하고, 공인하는 3레터 코드를 사용하여 기타 아미노산을 대표하는 바, 예를 들어, Aib(아미노이소부티르산(aminoisobutyric acid)), Orn (오르니틴(ornithine))이다.
본 발명의 화합물은 분자 내 가교(molecular bridge)는 분자의 나선구조를 안정시킬 수 있다는 이론에 기반하여, GLP-1R 또는 GCGR 수용체에 대한 효능 및/또는 선택성을 향상시킨다. 본 발명의 화합물은 서열에서 하나 또는 더 많은 분자 내 가교를 가지고 있다. 이러한 가교는 두개의 아미노산 잔기의 측쇄 사이에 형성되고, 상기 두개의 아미노산 잔기는 일반적으로 선형 서열 중의 세개의 아미노산에 의해 분리된다. 예를 들어, 상기 가교는 잔기쌍 12와 잔기쌍 16, 잔기쌍 16과 잔기쌍 20, 잔기쌍 17과 잔기쌍 21 또는 잔기쌍 20과 잔기쌍 24 측쇄 사이에서 형성될 수 있다. 두개의 측쇄는 이온의 상호 작용 또는 공유 결합을 통하여 서로 연결될 수 있다. 따라서, 이러한 잔기쌍은 역전하(opposite charges)를 가지는 측쇄를 포함함으로써, 이온의 상호 작용을 통하여 염다리를 형성할 수 있다. 예를 들어, 하나의 잔기는 Glu 또는 Asp일 수 있고, 다른 하나의 잔기는 Lys 또는 Arg일 수 있으며, Lys과 Glu가 매칭되거나, 또는 Lys과 Asp가 매칭되어 각각 반응을 진행하여 락탐(lactam) 고리를 형성할 수 있다.
본 발명의 화합물은 친지방성 치환기는 혈액 중의 알부민(albumin)과 결합할 수 있다는 이론에 기반하여, 본 발명의 화합물이 효소분해로부터 피면하도록 보호하여, 화합물의 반감기를 향상시킨다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 옥신토모듈린 유사체를 함유하는 약물 조성물을 제공하는 바, 상기 옥신토모듈린 유사체를 활성 성분으로 하여 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 보조 재료를 첨가하여 약물 조성물을 제조한다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 옥신토모듈린 유사체의 의약 용도를 제공하는 바, 세포와 동물 실험은, 본 발명의 옥신토모듈린 유사체가 혈당 강하 작용을 구비하고, 당뇨병을 치료하는 약물로 사용될 수 있으며, 본 발명의 옥신토모듈린 유사체는 체중을 감소시킬 수도 있고, 비만증을 치료하는 약물로서 잠재적인 용도를 구비한다는 것을 보여준다.
본 발명에서 제기된 GLP-1R/GCGR이중 타켓 작용제는 상동성(homology) 폴리펩티드이고, 본 발명에서의 상동성 폴리펩티드란 폴리펩티드가 원래 갖고 있는 글루카곤 유사 펩티드, 옥신토모듈린, 글루카곤 또는 익스에나티드 아미노산 서열를 의미하지만, 여기서 하나 또는 다수의 아미노산 잔기는 상이한 아미노산 잔기에 의해 이미 보존적 치환되고, 얻은 폴리펩티드는 본 발명을 실시하는 데에 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 체중증가를 방지하거나, 또는 체중감소를 촉진시키는 데에 사용될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 음식 섭취량의 감소 및/또는 에너지 소모 상승을 일으킬 수 있음으로써, 체중에 현저한 작용을 일으킬 수 있다. 체중에 대한 작용과는 별도로, 본 발명의 화합물은 콜레스테롤 순환 수준에 대해 유익한 작용이 있을 수 있다 (순환 LDL 수준을 감소시킬 수 있고 HDL/LDL의 비율을 향상시킬 수 있음). 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 체중 초과로 인한 또는 이를 특징으로 하는 그 어떠한 병증을 직접적 또는 간접적으로 치료하는데 사용될 수 있는 바, 예를 들어, 비만증, 병적인 비만증, 비만증과 관련되는 염증, 비만증과 관련되는 담낭 질환, 비만증으로 인한 수면무호흡증을 치료 및/또는 예방할 수 있다. 본 발명의 화합물은 대사 증후군, 고혈압, 죽상 경화성 이상 지혈증(atherogenic dyslipidemia), 아테롬성 동맥경화, 동맥경화, 관상동맥경화증 또는 중풍을 예방하는 데에 사용될 수도 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 이러한 병증에서의 작용은 폴리펩티드가 체중에 대한 작용에 의한 것일 수 있거나 또는 이와 관련될 수 있고, 또한 이가 체중에 대한 작용과 별도일 수 있다.
본 기술분야의 기술자는, 본 발명의 약물 조성물은 각종 약물 투여 방식에 적용된다고 이해할 수 있는 바, 예를 들어, 경구 투여, 경피 투여, 경맥 투여, 근육 내 투여, 국소 투여 등이다. 사용한 약물 투여 방식에 근거하여, 본 발명의 폴리펩티드 약물 조성물을 각종 적합한 제형으로 제조할 수 있는 바, 여기서 적어도 하나의 유효 조제량의 본 발명의 폴리펩티드와 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 약용 담체를 포함한다.
적당한 제형의 구현예로는 정제, 캡슐, 당의정제, 과립제, 경구 용액 및 시럽인 바, 피부 표면의 연고와 플라스터(plaster), 에어로졸, 비강 스프레이에 사용될 수 있고, 주사되는 무균 용액에 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 약물 조성물을 용액 또는 동결건조 분말로 제조하여 비경구 투여에 사용하도록 하고, 사용 전에 적당한 용매 또는 기타 약용으로 허용 가능한 담체를 첨가하여 분말을 다시 조제할 수 있으며, 액체 처방은 일반적으로 완충액, 등장액 및 수용액이다.
본 발명의 약물 조성물에서, 폴리펩티드의 사용량은 하나의 비교적 큰 범위 내에서 변동될 수 있는 바, 본 기술분야의 기술자는 일부 객관적인 요소, 예를 들어, 질환의 종류, 병세의 엄중한 정도, 환자의 체중, 제형, 약물 투여 경로 등 요소에 근거하여 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 장점:
1) 분자 수량이 동일한 경우, 천연 옥신토모듈린 유사체와 비교하면, 더 좋은 생물화학 활성을 구비한다.
2) 약물의 약물대사 실험에서 현저하게 연장된 반감기와 안정성을 보여준다.
3) 합성 수율이 높고, 안정성이 좋으며, 대량으로 생산하기 쉽고, 원가가 낮다.
구체적인 실시형태는 하기와 같은 서열을 구비하는 옥신토모듈린 유사체에 관한 것이다.
화합물1 (SEQ ID NO.1):
His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2H)-Ala-Ala-His-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Arg-Ala-NH2
화합물2 (SEQ ID NO.2):
His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2H)-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu-Arg-Ala-NH2
화합물3 (SEQ ID NO.3):
His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2H)-Ala-Ala-His-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-AsN-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
화합물4 (SEQ ID NO.4):
His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2H)-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu-AsN-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
화합물5 (SEQ ID NO.5):
His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-CO(CH2)14CH3)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
화합물6 (SEQ ID NO.6):
His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-CO(CH2)16CO2H)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
화합물7 (SEQ ID NO.7):
His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)14CH3)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
화합물8 (SEQ ID NO.8):
His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2H)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
화합물9 (SEQ ID NO.9):
His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys(PEG2-PEG2-CO(CH2)16CO2H)-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
화합물10 (SEQ ID NO.10):
His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)14CH3)-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
화합물11 (SEQ ID NO.11):
His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2H)-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
화합물12 (SEQ ID NO.12):
His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Lys(PEG2-PEG2-CO(CH2)16CO2H)-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
화합물13 (SEQ ID NO.13):
His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)14CH3)-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
화합물14 (SEQ ID NO.14):
His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2H)-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
화합물15 (SEQ ID NO.15):
His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys(PEG2-PEG2-CO(CH2)14CH3)-Lys-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
화합물16 (SEQ ID NO.16):
His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys(PEG2-PEG2-CO(CH2)16CO2H)-Lys-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
화합물17 (SEQ ID NO.17):
His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)14CH3)-Lys-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
화합물18 (SEQ ID NO.18):
His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2H)-Lys-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
화합물19 (SEQ ID NO.19):
His-Aib-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)14CH3)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Leu-Asp-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
화합물20 (SEQ ID NO.20):
His-Aib-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2H)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Leu-Asp-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
화합물21 (SEQ ID NO.21):
His-Aib-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)14CH3)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Leu-Asp-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
화합물22 (SEQ ID NO.22):
His-Aib-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2H)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Leu-Asp-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
화합물23 (SEQ ID NO.23):
His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys(PEG2-PEG2-CO(CH2)14CH3)-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu-AsN-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
화합물24 (SEQ ID NO.24):
His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)14CH3)-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu-AsN-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
상기 서열에서, Lys의 수식은 하기와 같은 구조 중의 하나일 수 있다.
Figure pct00002
친지방성 치환기와 연결되는 상기 Lys을 하기와 같은 것으로 교체할 수 있다.
Figure pct00003
본 발명에서 사용되는 약어의 구체적인 함의는 하기와 같다.
Boc는 t-부틸옥시카르보닐기 (t-Butyloxy carbonyl)이고, Fmoc는 플루오레닐메톡시카르보닐(fluorenylmethoxycarbonyl)이며, t-Bu는 t-부틸(t-butyl)이고, ivDDe는 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)-3-메틸-부틸(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)-3-methyl-butyl)의 제거와 친지방성 치환기이고, resin는 수지이며, TFA는 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)이고, EDT는 1,2-에탄디티올(1,2-Ethanedithiol)이며, Phenol은 페놀이고, FBS는 소태아혈청(fetal bovine serum)이고, HPLC는 고성능 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatograph)이며, GLP-1R은 글루카곤 유사 펩티드 1 수용체이고, mPEG은 메톡시폴리에틸렌글리콜이며, OXM은 옥신토모듈린이고, His은 히스티딘(histidine)이며, Ser은 세린(serine)이고, D-Ser은 D-형 세린이며, Gln은 글루타민(glutamine)이고, Gly은 글리신(glycine)이며, Glu은 글루탐산(glutamic acid)이고, Ala은 알라닌(alanine)이며, Thr은 트레오닌(threonine)이고, Lys은 리신(lysine)이며, Arg은 아르기닌(arginine)이고, Tyr은 티로신(tyrosine)이며, Asp은 아스파르트산(aspartic acid)이고, Trp은 트립토판(tryptophan)이며, Phe은 페닐알라닌(phenylalanine)이고, IIe은 이소류신(isoleucine)이며, Leu은 류신(Leucine)이고, Cys은 시스테인(cysteine)이며, Pro은 프롤린(proline)이고, Val은 발린(valine)이며, Met은 메티오닌(methionine)이고, Asn은 아스파라긴(asparagine)이다. HomoLys은 고시린(high lysine)이고, Orn은 오르니틴이며, Dap은 디아미노피멜산(diaminopimelic acid)이고, Dab은 2,4-디아미노부티르산(2,4-diaminobutyric acid)이다.
도1은 익스에나티드와 화합물4, 화합물5, 화합물6, 화합물7이 GLP-1R에 대한 자극 곡선이고;
도2는 글루카곤과 화합물4, 화합물5, 화합물6, 화합물7이 GCGR에 대한 자극 곡선이며;
도3은 익스에나티드(Ex-4), 화합물4, 화합물5, 화합물6 및 화합물7이 웅성 C57B1/6J 마우스에 포도당을 경구 투여한 후 인슐린 방출에 대한 영향을 나타내고, 대조군과 비교했을 경우 p < 0.05이며;
도4는 익스에나티드(Ex-4), 화합물19, 화합물20, 화합물21, 화합물22, 화합물23 및 화합물24가 웅성 C57B1/6J 마우스에 포도당을 경구 투여한 후 인슐린 방출에 대한 영향을 나타내고, 대조군과 비교했을 경우 p < 0.05이며;
도5는 폴리펩티드 화합물4, 화합물5, 화합물6 및 화합물7이 비만 마우스의 체중에 대한 영향을 나타내고, 대조군과 비교했을 경우 p < 0.05이다.
이하 실시예를 결부시켜 본 발명의 실시형태에 대해 상세하게 설명하지만, 본 기술분야의 기술자는, 하기 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것으로 이해할 것이고, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주해서는 안 된다. 실시예에서 구체적인 조건을 밝히지 않는 한, 통상적인 조건 또는 제조업체에서 건의한 조건에 따라 진행한다. 사용되는 시약 또는 기기는 생산업체를 밝히지 않는 한, 모두 시중에서 구매하여 얻은 통상적인 제품일 수 있다.
실시예1 모노- tert - 부틸에스테르 옥타데칸디오익산 (mono- tert - butylester octadecanedioic acid)의 합성:
옥타데칸디오익산(octadecanedioic acid)(31.4g, 100mmol)을 톨루엔(toluene)(250ml)에 현탁시키고, 혼합물을 가열하여 환류시킨다. N,N -디메틸포름아미드 디-tert-부틸아세탈(N,N-dimethylformamide di-tert-butyl acetal)(50.9g, 250mmol)을 4시간 내에 한 방울씩 첨가한다. 혼합물을 하룻밤 환류시킨다. 용매를 진공에서 제거하고, 50℃에서, 조물질을 DCM/초산에틸(500ml, 1:1)에 현탁시키고, 15분 동안 교반한다. 여과를 통하여 고체를 수집하고 DCM에서 연마시킨다. 여과하고, 진공에서 증발시켜, 조품인 20g의 모노-tert-부틸헥사데칸(mono-t-butyl hexadecane)을 얻는다. 이를 헵테인(200ml)으로 다시 결정시켜, 12.9g의 모노-tert-부틸에스테르 옥타데칸디오익산을 얻는다(33%). 다시 결정시키는 이외에, AcOEt/헵테인의 이산화규소 크로마토그램을 통하여 상기 모노에스테르를 정제할 수 있다. 1H-NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 2.35(t, 2H), 2.20(t, 2H), 1.65-1.55(m, 4H), 1.44(s, 9H), 1.34-1.20(m, 22H).
실시예2 폴리펩티드 화합물의 합성
폴리펩티드 화합물1과 폴리펩티드 화합물5의 합성을 예로 든다.
재료:
모든 아미노산은 NovaBiochem회사에서 구매한다. 특별한 설명이 없는 한, 기타 모든 시약은 모두 분석용 시약 (analytical reagent)이고, Sigma회사에서 구매한다. Protein Technologies PRELUDE 6 채널 펩티드 합성기를 사용한다. Phenomenex Luna C18 조제용 칼럼 (preparative column)(46mm x 250mm)으로 폴리펩티드를 정제한다. 고성능 액체 크로마토그래피는 Waters 회사의 제품이다. 질량 분석은 Agilent 질량 분석기(mass spectrograph)를 사용하여 측정한다.
방법:
1. 폴리펩티드 화합물1의 합성:
구조 서열:
His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2H)-Ala-Ala-His-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Arg-Ala-NH2
1a) 메인 펩티드 사슬 조립:
Fmoc/t-Bu 책략에 따라 CS336X 폴리펩티드 합성기(미국 C S Bio 회사)에서 0.25mol 규모의 하기와 같은 폴리펩티드를 합성한다.
Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(OtBu)-Lys(ivDde)-Ala-Ala-His(Boc)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Leu-Arg(pbf)-Ala-rink amide 수지
(1) 첫번째 단계: 0.75g의 Rink amide 수지를 디클로로메탄(dichloromethane)에 팽윤시키고, N,N -디메틸포름아미드(N,N -dimethylformamide)로 수지를 3번 세척한다.
(2) 2번째 단계: Rink amide 수지를 담체로 하고, 벤조트리아졸-N,N,N ',N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(benzotriazole-N,N,N ',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate), 1-히드록시벤조트리아졸(1-hydroxybenzotriazole) 및 N,N -디이소프로필에틸아민(N,N -diisopropylethylamine) 삼자를 물질의 질량비 1:1:1로 조제한 혼합액을 커플링제로 하고, N,N -디메틸포름아미드를 용매로 하여 프로세스 반응을 진행하며, 순차적으로 축합 반응을 진행하여 Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Leu-OH (2x), Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-His(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH (2x), Fmoc-Lys(ivDde)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gln(OtBu)-OH, Fmoc-D-Ser(t-Bu)-OH 및 Boc-His(Boc)-OH를 연결시켜, Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(OtBu)-Lys(ivDde)-Ala-Ala-His(Boc)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Leu-Arg(pbf)-Ala-rink amide 수지를 얻는데, 여기서, 매번 축합 반응에서 Fmoc로 보호된 아미노산의 재료 투입량과 수지의 사용량의 물질의 질량비는 1:1~6:1이고, 매번 축합 반응에서 벤조트리아졸-N,N,N ',N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트의 사용량과 Fmoc로 보호된 아미노산의 사용량의 물질의 질량의 비는 3:1이다.
1b) 1-(4,4-디메틸-2,6- 디옥소시클로헥실리덴 )-3- 메틸 -부틸기(ivDde)의 제거와 친지방성 치환기의 인입:
N-메틸피롤리돈 (N-Methyl pyrrolidone):디클로로메탄=1:1(체적비)인 욕액에서, 1a)에서 합성한 보호된 펩티딜 수지를 2번 세척하고, 새로 제조한 2.0%의 히드라진 수화물(Hydrazine hydrate) N-메틸피롤리돈 용액을 넣으며, 상기 반응 혼합물을 실온에서 12.0분 동안 흔든 다음 여과한다. 히드라진 처리 단계를 2번 반복하여 Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(OtBu)-Lys-Ala-Ala-His(Boc)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Leu-Arg(pbf)-Ala-rink amide 수지를 얻는다. 그 후 디클로로메탄과 N-메틸피롤리돈으로 수지를 충분히 세척한다. 여기에 FmocNH-PEG2-OH, 벤조트리아졸-N,N,N ',N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트, 1-히드록시벤조트리아졸, 에틸디이소프로필아민(ethyldiisopropylamine)의 N-메틸피롤리돈 혼합 커플링액을 넣고, 3.0 시간 동안 흔든 후, 여과하고, 세척하며 히드라진 처리 단계를 2번 반복하여 Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(OtBu)-Lys(Fmoc-PEG2-OH)-Ala-Ala-His(Boc)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Leu-Arg(pbf)-Ala-rink amide 수지를 얻으며, 피페리딘/N,N -디메틸포름아미드 용액으로 Fmoc 라디칼을 제거하고, Fmoc-PEG2-OH 커플링 반응을 한번 반복하여 Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(OtBu)-Lys(Fmoc-PEG2-PEG2-OH)-Ala-Ala-His(Boc)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Leu-Arg(pbf)-Ala-rink amide 수지를 얻는다. 피페리딘/ N,N -디메틸포름아미드 용액으로 Fmoc 라디칼을 제거한 다음, 통상적인 조건에 따라 순차적으로 Fmoc-Glu-OtBu, tBu로 독립적으로 보호된 C18 지방산(C18-fatty acids)을 커플링시켜 Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(OtBu)-Lys(Fmoc-PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2tBu)-Ala-Ala-His(Boc)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Leu-Arg(pbf)-Ala-rink amide 수지를 얻는다.
1c) 폴리펩티드의 전체 보호의 제거:
Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(OtBu)-Lys(Fmoc-PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2tBu)-Ala-Ala-His(Boc)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Leu-Arg(pbf)-Ala-rink amide 수지를 둥근 바닥 플라스크(round bottom flask)에 넣고, 아이스 배스에서, 절삭제 FA/EDT/Phenol/H2O(88/2/5/5, 체적비)를 넣으며, 승온시키고, 가수분해 용액을 25℃인 온도로 제어하며, 120분 동안 반응시킨다. 여과하고, 소량의 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)으로 여과 케이크를 3번 세척하며, 여과액을 합병한다. 교반 하에서 여과액을 아이스 에테르에 천천히 부어 넣는다. 1.0시간 이상 방치하여, 완전히 침전시킨다. 상청액을 제거하고, 침전 원심분리시키며, 아이스 에테르로 6번 세척하여 조품 화합물 His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2H)-Ala-Ala-His-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Arg-Ala-NH2을 얻는다.
1d) 폴리펩티드 화합물의 정제:
1c에서 얻은 조품을 5.0%의 초산이 아세토나이트릴:H2O = 1:1(체적비)인 용액에 용해시키고, 5.0m의 역상 C18를 거쳐 충진된 50mm x 250mm 칼럼에서 통과시켜 세미분취 고속액체 크로마토그래피(Semi-preparative HPLC)를 2번 진행하여 정제한다. 30~60%의 아세토나이트릴-0.1%의 트리플루오로아세트산/H2O를 사용하여 40mL/min 구배로 상기 칼럼을 45.0분 동안 용리(elution)시켜, 펩티드를 함유하는 조성성분을 수집하고, 농축시켜 아세토나이트릴을 제거한 후 동결건조시킨다. HPLC 순도가 95% 이상인 정제품을 얻는다. 고속액체 크로마토그래피/질량분석법(HPLC-MS)으로 분석하여 분리해 낸 산물의 양자화 분자 이온 피크의 m/z 값은 4116.0이고, 이론값은 4116.6이라는 것을 발견하였다.
2. 폴리펩티드 화합물5의 합성:
구조 서열:
His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-CO(CH2)14CH3)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
2a) 메인 펩티드 사슬 조립:
Fmoc/t-Bu 책략에 따라 CS336X 폴리펩티드 합성기(미국 C S Bio 회사)에서 0.25mol 규모의 하기와 같은 폴리펩티드를 합성한다.
Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Lys(ivDde)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Aib-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pro-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(t-Bu)-rink amide 수지
(1) 첫번째 단계: 0.75 gRink amide MBHA-LL수지(Novabiochem, loading 0.34mmol/g)를 디클로로메탄(DCM)에 1시간 동안 팽윤시키고, N,N -디메틸포름아미드(DMF)로 수지를 3번 충분히 세척한다.
(2) 2번째 단계: Rink amide 수지를 담체로 하고, o-(6-클로로-1-히드록시벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(o-(6-Chloro-1-hydrocibenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphat)(HCTU), 유기염기 N,N -디이소프로필에틸아민( N,N-Diisopropylethylamine)(DIEPA) 양자를 물질의 질량비 1:1로 혼합하여 커플링제로 하며, N,N -디메틸포름아미드(DMF)를 용매로 하여 프로세스 반응을 진행하며, 순차적으로 축합 반응을 진행하여 Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Pro-OH (3x), Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH (2x), Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH (2x), Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH (2x), Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Lys(ivDde)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-D-Ser(t-Bu)-OH, Boc-His(Boc)-OH를 연결시켜, Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Lys(ivDde)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Aib-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pro-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(t-Bu)-rink amide 수지를 얻는다. 이 다음, N,N -디메틸포름아미드(DMF), 디클로로메탄(DCM), 메탄올(Methanol), 디클로로메탄(DCM), N,N -디메틸포름아미드(DMF)로 순차적으로 수지를 각각 3번씩 세척한다.
설명해야 할 점은, 1) 여기서, 첫번째 아미노산 Fmoc-Ser(t-Bu)-OH의 재료 투입량과 수지 사용량의 물질의 질량비는 1:1~6:1이고; 2) 다음 매번 축합 반응에서 Fmoc로 보호된 아미노산, O-(6-클로로-1-히드록시벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(HCTU), 유기염기 N,N -디이소프로필에틸아민(DIEPA)의 사용량은 모두 과량으로 2~8배이며, 반응 시간은 1~5시간이다.
2b) 1-(4,4-디메틸-2,6- 디옥소시클로헥실리덴 )-3- 메틸 -부틸기(ivDde)의 제거와 친지방성 치환기의 인입:
N,N -디메틸포름아미드(DMF)/디클로로메탄(DCM) = 1:1 (체적비)인 용액에서 수지를 2번 세척하고, 새로 제조한 3.0%의 히드라진 수화물 N,N -디메틸포름아미드(DMF) 용액을 넣으며, 상기 반응 혼합물을 실온에서 10~30분 동안 흔든 다음 여과한다. 히드라진 처리 단계를 5번 반복하여 Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Lys-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Aib-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pro-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(t-Bu)-rink amide 수지를 얻는다. 이 다음, N,N -디메틸포름아미드(DMF), 디클로로메탄(DCM), 메탄올(Methanol), 디클로로메탄(DCM), N,N -디메틸포름아미드(DMF)로 순차적으로 수지를 각각 3번씩 충분히 세척한다.
FmocNH-PEG2-OH (Quanta BioDesign), o-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(o-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate)(HATU), 에틸디이소프로필아민(DIEPA)의 N,N -디메틸포름아미드(DMF) 혼합 커플링액(모두 과량으로 5배임)을 넣고, 2시간 동안 흔든 후, 여과한다. 이 다음, N,N -디메틸포름아미드(DMF), 디클로로메탄(DCM), 메탄올(Methanol), 디클로로메탄(DCM), N,N -디메틸포름아미드(DMF)로 순차적으로 수지를 각각 3번씩 충분히 세척하여 Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Lys(Fmoc-PEG2)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Aib-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pro-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(t-Bu)-rink amide 수지를 얻는다. 이 다음, N,N -디메틸포름아미드(DMF), 디클로로메탄(DCM), 메탄올(Methanol), 디클로로메탄(DCM), N,N -디메틸포름아미드(DMF)로 순차적으로 수지를 각각 3번씩 충분히 세척한다.
20%의 피페리딘(Piperidine)/N,N -디메틸포름아미드(DMF) 용액으로 Fmoc 라디칼을 제거하고(30분, 2번 반복하여 제거함), Fmoc-PEG2-OH, o-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU), 에틸디이소프로필아민(DIEPA)의 N,N -디메틸포름아미드(DMF) 혼합 커플링액(모두 과량으로 5배임)을 넣고, 커플링 반응을 진행하여 Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Lys(Fmoc-PEG2-PEG2)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Aib-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pro-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(t-Bu)-rink amide 수지를 얻는다. 이 다음, N,N -디메틸포름아미드(DMF), 디클로로메탄(DCM), 메탄올(Methanol), 디클로로메탄(DCM), N,N -디메틸포름아미드(DMF)로 순차적으로 수지를 각각 3번씩 충분히 세척한다.
20%의 피페리딘(Piperidine)/N,N -디메틸포름아미드(DMF) 용액으로 Fmoc 라디칼을 제거하고 (30분, 2번 반복하여 제거함), 팔미트산 (palmitic acid), o-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU), 에틸디이소프로필아민(DIEPA)의 N,N -디메틸포름아미드(DMF) 혼합 커플링액(모두 과량으로 5배임)을 넣고, 커플링 반응을 진행하여 Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Lys(PEG2-PEG2-C16)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Aib-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pro-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(t-Bu)-rink amide 수지를 얻는다. 이 다음, N,N -디메틸포름아미드(DMF), 디클로로메탄(DCM), 메탄올(Methanol), 디클로로메탄(DCM), N,N -디메틸포름아미드(DMF)로 순차적으로 수지를 각각 3번씩 충분히 세척한 후, 진공에서 흡입하여 건조한다.
2c) 폴리펩티드의 완전한 보호의 제거:
Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Lys(PEG2-PEG2-C16)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Aib-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pro-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(t-Bu)-rink amide 수지를 절삭제 TFA/Phenol/thioanisole/EDT/H2O (82.5:5:5:2.5:5, 체적비)에 넣고, 승온시키며, 가수분해 용액을 25℃인 온도로 제어하고, 2.5시간 동안 반응시킨다. 여과하고, 소량의 가수분해 용액으로 여과 케이크를 3번 세척하며, 여과액을 합병한다. 교반하에서 여과액을 아이스 에테르에 천천히 부어 넣는다. 2시간 이상 방치하여, 완전히 침전시키고, 침전 원심분리시키며, 아이스 에테르로 3번 세척하여 조품 화합물 His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-CO(CH2)14CH3)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2을 얻는다.
2d) 폴리펩티드 화합물의 정제:
2c)에서 얻은 조품을 아세토나이트릴(ACN)/H2O = 1:2(체적비)인 용액에 용해시키고, 5.0m 역상 C18를 거쳐 충진된 46mm x 250mm 칼럼에서 분취 HPLC로 정제한다. 30%의 아세토나이트릴(0.05%의 트리플루오로아세트산을 함유)/H2O(0.05%의 트리플루오로아세트산을 함유)에서 시작하여, 구배(1.33%/min의 속도로 아세토나이트릴을 첨가한 비율)로 15mL/min인 유속으로 상기 칼럼을 30분 동안 용리시켜, 펩티드를 함유하는 조성성분을 수집하고, 동결건조시켜 HPLC 순도가 95% 이상인 정제품(만약 순도가 요구에 도달하지 못하면, HPLC 정제를 한번 더 반복할 수 있음)을 얻는다. 고속액체 크로마토그래피/질량분석법으로 분리된 산물을 분석한다. 상기 합성 단계에 의하면, 본 발명의 합성물은 하기와 같은 폴리펩티드 화합물(표1)을 포함한다.
본 발명의 실시예에서 합성된 폴리펩티드 화합물 구조:
폴리펩티드
(SEQ ID NO.) 		서열 Theoretical Mass Observed Mass
1 His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2H)-Ala-Ala-His-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Arg-Ala-NH2 4114.1 4116.0
2 His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2H)-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu-Arg-Ala-NH2 4175.2 4176.9
3 His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2H)-Ala-Ala-His-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-AsN-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 4892.4 4894.8
4 His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2H)-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu-AsN-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 4953.5 4955.1
5 His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-CO(CH2)14CH3)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 4890.5 4891.5
6 His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-CO(CH2)16CO2H)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 4948.5 4949.6
7 His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)14CH3)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 5019.5 5020.6
8 His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2H)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser -NH2 5077.6 5078.5
9 His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys(PEG2-PEG2-CO(CH2)16CO2H)-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 5026.5 5027.6
10 His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)14CH3)-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 5097.6 5098.4
11 His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2H)-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 5155.6 5156.8
12 His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Lys(PEG2-PEG2-CO(CH2)16CO2H)-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 4955.5 4956.6
13 His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)14CH3)-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 5026.5 5027.6
14 His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2H)-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 5084.5 5085.6
15 His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys(PEG2-PEG2-CO(CH2)14CH3)-Lys-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 4890.5 4891.6
16 His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys(PEG2-PEG2-CO(CH2)16CO2H)-Lys-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 4948.5 4949.6
17 His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)14CH3)-Lys-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 5019.5 5020.6
18 His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2H)-Lys-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Met-AsN-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 5077.6 5078.3
19 His-Aib-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)14CH3)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Leu-Asp-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 4945.5 4946.9
20 His-Aib-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2H)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Leu-Asp-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 5002.6 5003.8
21 His-Aib-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)14CH3)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Leu-Asp-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 4901.8 4903.3
22 His-Aib-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)16CO2H)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-GlN-Asp-Phe-Val-GlN-Trp-Leu-Leu-Asp-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 4958.9 4960.3
23 His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys(PEG2-PEG2-CO(CH2)14CH3)-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu-AsN-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 4769.2 4770.3
24 His-(D-Ser)-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys(PEG2-PEG2-Glu-CO(CH2)14CH3)-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu-AsN-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 4897.5 4898.6
실시예3 GCGR과 GLP-1R 체외 활성 측정
Cisbo 회사에서 생산한 cAMP Assay Kit를 이용하여 글루카곤 유사 펩티드 1 수용체(glucagoN-like peptide 1, GLP-1 receptor)와 글루카곤 수용체(glucagon receptor)에 대한 자극 작용을 측정하고, 동시에 양성 대조 화합물 루카곤 유사 펩티드1(GLP-1), 익스에나티드 및 글루카곤의 조제량 효과 곡선을 검출하였다.
CRE-루시페라아제 시스템에 사용되고, 인체 GCGR 또는 GLP-1R를 안정하게 발현하는 HEK-293 세포를 각 웰이 98L의 DMEM/10%의 FBS인 배지이고 5000개의 세포인 조건에 따라 384 웰판에 접종시킨다. 접종한 이튿날, 2L의 측정할 샘플 구배를 전이시키고, 상기 세포와 혼합하여 12시간 동안 부화시킨다. 세포를 넣어 조제량 응답 곡선(상기 곡선은 EC50 값을 측정한 것임)을 획득하기 전에, 일반적으로 측정할 화합물을 위해, 0.005nM 내지 100.0nM을 포함하는 10가지 희석액과, 익스에나티드 표준품(항주파이타이생물화학과학기술유한회사(Hangzhou Peptide Biochem Co., Ltd)에서 구매하고, 순도>98%이며, 익스에나티드아세테이드(exenatideacetate), Cas No.: 141732-76-5)를 준비하고, 0.005nM 내지 100.0nM인 10가지 표준용액 및 글루카곤 표준품(Sigma-Aldrich회사에서 구매하고, 화번과 규격: 1294036-2X2.94MG, Cas No.: 16941-32-5)을 준비하며, 0.01nM 내지 100nM인 10가지 표준용액을 준비한다. 부화시킨 후, 10.0L의 루시페라아제 시약을 매 하나의 평판에 직접 넣고 가볍게 2분 동안 혼합한다. 평판을 Perkin Elmer 플레이트 레더(plate reader)에 놓고 수치를 읽는다. 이미지 소프트웨어 Prism 5로 화합물 농도 곡선을 제작하고, EC50 값을 산출한다.
옥신토모듈린(상해잉궁실업유한회사에서 구매하고, 화번: Es-1240)과 비교했을 경우, 본 발명의 화합물은 더 높은 상대적인 GLP-1R 선택성을 구비하고, 멤브레인 글루카곤 수용체와 GLP-1 수용체에 대한 효능이 더 높다.
본 발명은 폴리펩티드 화합물의 평균 EC50 값을 대표한다.
화합물 GLP-1R
(EC 50 , nM) 		GCGR
(EC 50 , nM) 		GLP-1R/GCGR
익스에나티드 0.02 >100 <0.0004
글루카곤 3.1 0.032 1000
옥신토모듈린 2.5 6.2 0.4
1 0.23 0.54 0.4
2 0.39 2.8 0.1
3 0.59 1.02 0.6
4 0.13 0.39 0.3
5 0.06 0.43 0.1
6 0.10 0.33 0.3
7 0.14 0.34 0.4
8 0.20 0.18 1.1
9 0.52 0.18 2.9
10 0.35 0.11 3.3
11 0.15 0.18 0.8
12 0.32 0.15 2.1
13 0.44 0.16 2.8
14 0.40 0.19 2.1
15 1.5 0.6 2.5
16 0.60 0.2 3
17 0.68 0.58 1.2
18 0.76 0.18 4.2
19 0.14 0.56 0.25
20 0.09 0.48 0.18
21 0.15 0.66 0.23
22 0.06 0.32 0.19
23 0.13 0.43 0.30
24 0.16 0.58 0.28
도1은 익스에나티드와 화합물4, 화합물5, 화합물6, 화합물7이 GLP-1R에 대한 자극 곡선이고;
도2는 글루카곤과 화합물4, 화합물5, 화합물6, 화합물7이 GCGR에 대한 자극 곡선이다.
실시예4 화합물4 , 화합물5 , 화합물6 , 화합물7 , 화합물19 , 화합물20 , 화합물21 , 화합물22, 화합물23, 화합물24 및 Ex-4 약물동태학 분석
경맥주사(IV) 또는 피하주사(SC) 경로를 통하여 웅성 CD1 웅성 마우스(남경대학모드동물연구센터)에 각각 250μg/kg의 조제량의 상기 실시예에서 제조한 화합물4, 화합물5, 화합물6, 화합물7, 화합물19, 화합물20, 화합물21, 화합물22, 화합물23 및 화합물24와 상업구매한 익스에나티드 정제품(Ex-4)을 사용하여 대조시험을 진행한다. 약물 투여 후의 0~24시간 내의 상이한 시간에 혈액 채취 처리를 진행하고, 매 하나의 샘플의 혈장을 수집하여 LC-MS/MS 측정법으로 분석한다. 모델의 의존(IV에 대해 얻은 데이터)과 모델의 비의존(SC에 대해 얻은 데이터)의 방법으로 약물동태학 파라미터를 산출한다. IV경로를 통하여 사용되는 화합물4, 화합물5, 화합물6, 화합물7, 화합물19, 화합물20, 화합물21, 화합물22, 화합물23 및 화합물24의 제거 반감기는 대략 4~6시간이고, 이가 피크에 도달하는 시간(Tmax)은 약 12시간이며, 익스에나티드의 제거 반감기는 대략 0.5시간이다. SC경로를 통하여 사용되는 화합물4, 화합물5, 화합물6, 화합물7, 화합물19, 화합물20, 화합물21, 화합물22, 화합물23 및 화합물24가 피크에 도달하는 시간(Tmax)은 약 12시간 이상이고, Ex-4의 제거 반감기는 대략 2시간이다. IV 또는 SC경로를 통하여 각각 사용되는 화합물4, 화합물5, 화합물6, 화합물7, 화합물19, 화합물20, 화합물21, 화합물22, 화합물23 및 화합물24는 모두 임상 부작용이 발생하지 않았다.
실시예5 화합물4 , 화합물5 , 화합물6 , 화합물7 , 화합물19 , 화합물20 , 화합물21 , 화합물22 , 화합물23 , 화합물24 및 Ex-4가 포도당 내량의 경구 투여에 대한 작용
12 내지 16주령의 웅성 C57B1/6J 마우스(남경대학모드동물연구센터)를 유사한 혈당(꼬리끝에서 획득한 혈액 샘플로 평가한 것임)을 랜덤으로 군을 나누고, 매 군에는 8마리가 있다. 금식(6시간)시킨 후 동물에 약물을 투여하고, 약 4시간 후, 초기 혈액 샘플(금식시 혈액의 포도당 수준)을 얻는다. 그 다음, 경구 투여 조제량의 포도당을 투여하고, 동물을 이의 사육 케이스(rearing cage)로 돌려보낸다(t=0). t=15분, t=30분, t=60분, t=90분 및 t=120분일 때 혈당을 측정한다. 다음, 경구 투여 조제량의 포도당을 반복하여 투여하고, 8시간 될 때까지 혈당을 추적한다. 폴리펩티드4, 폴리펩티드5, 폴리펩티드6, 폴리펩티드7, 폴리펩티드19, 폴리펩티드20, 폴리펩티드21, 폴리펩티드22, 폴리펩티드23 및 폴리펩티드24(화합물의 약물 투여량: 250μg/kg)는 경구 투여 포도당 내량을 현저히 감소시켰다. 소프트웨어 GraphPadPrism를 사용하여 데이터를 처리하고 혈당 변화 절곡선을 제작하며, 곡선에서의 면적을 산출하여 AUC도를 얻는다(도3 및 도4).
완충액(PBS)과 비교했을 경우, 익스에나티드(250μg/kg)는 첫번째 OGTT 곡선 시간대(1~120min)에서 이의 AUC는 현저히 감소될 수 있고(P<0.05), 그 다음의 3개의 OGTT 곡선 시간대(120~480min)에서 이의 AUC는 공백 대조군(P>0.05)에 가깝다. 완충액(PBS)과 비교했을 경우, 폴리펩티드4, 폴리펩티드5, 폴리펩티드6, 폴리펩티드7, 폴리펩티드19, 폴리펩티드20, 폴리펩티드21, 폴리펩티드22, 폴리펩티드23 및 폴리펩티드24는 4개의 OGTT 곡선 시간대(0~480min)에서 이의 AUC는 모두 현저히 감소되는 바(P<0.05), 실험결과는 폴리펩티드4, 폴리펩티드5, 폴리펩티드6, 폴리펩티드7, 폴리펩티드19, 폴리펩티드20, 폴리펩티드21, 폴리펩티드22, 폴리펩티드23 및 폴리펩티드24는 장기간 작용하는 혈당강하 효과가 있다는 것을 알려준다.
실시예6 화합물4 , 화합물5 , 화합물6 , 화합물7이 비만 마우스 체중에 대한 영향, 체중감소 연구
40마리의 25주된 DIO 쥐(남경대학모드동물연구센터)를 랜덤으로 5군(화합물4, 화합물5, 화합물6, 화합물7과 생리식염수군)으로 나누고, 매 군에는 8마리가 있으며, 기초 체중은 차이가 없고, 매 군의 쥐에 각각 화합물4(250μg/kg), 화합물5(250μg/kg), 화합물6(250μg/kg), 화합물7(250μg/kg) 및 생리식염수를 피하주사한 후 체중을 측량하는데, 생리식염수군과 비교했을 경우, 11일 내지 30일에, 화합물4, 화합물5, 화합물6, 화합물7를 주사한 군의 쥐의 체중이 생리식염수군(P<0.05) 보다 현저히 낮고, 체중은 약 20% 정도 감소되었다(도5).
공업 응용성
본 발명의 옥신토모듈린 유사체는 GCGR과 GLP-1R 이중 아고니스트 활성을 나타냈고, 반감기가 길며 높은 효소분해 안정성, 높은 생물활성을 구비하며, 부작용이 발생하지 않는다. 본 발명의 화합물의 합성 수율이 높고, 안정성이 좋으며, 대량으로 생산하기 쉽고, 원가가 낮으므로, 과식증, 비만증과 과체중, 콜레스테롤의 상승 및 당뇨병을 치료하는 약물을 제조하는 데에 사용될 수 있다.
이상, 본 발명을 상세하게 설명하였으나 본 발명을 한정하지 않고, 본 기술분야의 기술자는 본 발명에 근거하여 여러가지 변경과 변형을 진행할 수 있으며, 본 발명의 사상을 벗어나지 않으면, 응당 모두 본 발명에 첨부된 특허청구범위에 속해야 된다.
<110> JIANG, Xianxing <120> Oxyntomodulin Analogue <130> GS1546-15P420707 <150> CN 201410490280.9 <151> 2014-09-23 <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oxyntomodulin Analogue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> D-Ser <400> 1 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Lys Ala Ala His Asp Phe Val Glu Trp Leu Leu Arg Ala 20 25 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oxyntomodulin Analogue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> D-Ser <400> 2 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Leu Arg Ala 20 25 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oxyntomodulin Analogue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> D-Ser <400> 3 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Lys Ala Ala His Asp Phe Val Glu Trp Leu Leu Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro 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<222> (16) <223> Xaa=Aib <400> 12 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Lys Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Gly Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 40 <210> 13 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oxyntomodulin Analogue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> D-Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa=Aib <400> 13 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Lys Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Gly Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 40 <210> 14 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oxyntomodulin Analogue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> D-Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa=Aib <400> 14 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Lys Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Gly Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 40 <210> 15 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oxyntomodulin Analogue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> D-Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa=Aib <400> 15 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Lys Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Gly Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 40 <210> 16 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oxyntomodulin Analogue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> D-Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa=Aib <400> 16 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Lys Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Gly Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 40 <210> 17 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oxyntomodulin Analogue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> D-Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa=Aib <400> 17 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Lys Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Gly Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 40 <210> 18 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oxyntomodulin Analogue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> D-Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa=Aib <400> 18 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Lys Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Gly Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 40 <210> 19 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oxyntomodulin Analogue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa=Aib <400> 19 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Lys Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Leu Asp Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 20 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oxyntomodulin Analogue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa=Aib <400> 20 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Lys Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Leu Asp Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 21 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oxyntomodulin Analogue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa=Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa=Aib <400> 21 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Lys Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Leu Asp Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 22 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oxyntomodulin Analogue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa=Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa=Aib <400> 22 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Lys Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Leu Asp Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 23 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oxyntomodulin Analogue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> D-Ser <400> 23 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Leu Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 24 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oxyntomodulin Analogue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> D-Ser <400> 24 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Leu Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 25 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(37) <223> Parent Peptide of Oxyntomodulin <400> 25 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Lys Asn Asn Ile Ala 35 <210> 26 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> Glucagon-like Peptide <400> 26 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 27 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exenatide <400> 27 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 28 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(29) <223> Glucagon <400> 28 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr 20 25

Claims (11)

  1. 아미노산(amino acid) 서열 His-Xaa2-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa10-Ser-Lys-Xaa13-Leu-Asp-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Ala-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Trp-Leu-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-COR1로 표시되는 모체 펩티드(maternal peptide)를 함유하는 옥신토모듈린(oxyntomodulin) 유사체에 있어서,
    상기 서열에서,
    R1 = -OH 또는 -NH2이고;
    Xaa2 = Aib, Ser 또는 D-Ser이며;
    Xaa10 = Lys 또는 Tyr이고;
    Xaa13 = Lys 또는 Ty이며r;
    Xaa16 = Ser, Aib, Lys 또는 Glu이고;
    Xaa17 = Lys 또는 Arg이며;
    Xaa18 = Arg 또는 Ala이고;
    Xaa20 = His, Gln 또는 Lys이며;
    Xaa21 = Asp 또는 Glu이고;
    Xaa23 = IIe, Leu 또는 Val이며;
    Xaa24 = Glu 또는 Gln이고;
    Xaa27 = Met, Leu 또는 존재하지 않으며;
    Xaa28 = Ser, Asp, Asn, Arg 또는 존재하지 않고;
    Xaa29 = Ala, Gly, Thr 또는 존재하지 않으며;
    Xaa30 = Gly 또는 존재하지 않고;
    Xaa31 = Gly 또는 존재하지 않으며;
    Xaa32 = Pro 또는 존재하지 않고;
    Xaa33 = Ser 또는 존재하지 않으며;
    Xaa34 = Ser 또는 존재하지 않고;
    Xaa35 = Gly 또는 존재하지 않으며;
    Xaa36 = Ala 또는 존재하지 않고;
    Xaa37 = Pro 또는 존재하지 않으며;
    Xaa38 = Pro 또는 존재하지 않고;
    Xaa39 = Pro 또는 존재하지 않으며;
    Xaa40 = Ser 또는 존재하지 않고;
    상기 모체 펩티드의 아미노산 서열에서, Xaa10, Xaa16, Xaa17 또는 Xaa20 중 적어도 하나는 Lys이며, 상기 적어도 하나의 Lys 또는 상기 서열의 제12 부위의 Lys의 측쇄와 친지방성의 치환기는 서로 연결되고, 연결 방식은, 상기 친지방성의 치환기가 이의 카르복시기(carboxyl group)와 하나의 가교 라디칼의 아미노기(amino group)로 아미드 결합을 형성하며, 가교 라디칼의 아미노산 잔기의 카르복시기와 모체 펩티드의 Lys의 N-말단 잔기에서 하나의 아미드 결합을 형성하여 모체 펩티드에 연결시키는 것이며;
    상기 가교 라디칼은 Glu, Asp 및/또는 (PEG)m이고, m은 2~10의 정수이며; 상기 친지방성 치환기는 CH3(CH2)nCO- 또는 HOOC(CH2)nCO-로부터 선택되는 하나의 아실기이고, n은 10~24의 정수인 것을 특징으로 하는 옥신토모듈린 유사체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 가교 라디칼은 Glu-(PEG)m 또는 Asp-(PEG)m 또는 (PEG)m인 것을 특징으로 하는 옥신토모듈린 유사체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 가교 라디칼은 상기 아미노산 서열의 잔기쌍 12와 잔기쌍 16, 잔기쌍 16과 잔기쌍 20, 잔기쌍17과 잔기쌍 21 또는 잔기쌍 20과 잔기쌍 24 측쇄 사이에서 분자 다리를 형성하는 것을 특징으로 하는 옥신토모듈린 유사체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 친지방성 치환기와 연결되는 Lys는 HomoLys, Orn, Dap 또는 Dab에 의해 대체되는 것을 특징으로 하는 옥신토모듈린 유사체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 모체 펩티드의 아미노산 서열은 His-Xaa2-GlN-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa10-Ser-Lys-Xaa13-Leu-Asp-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Ala-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Trp-Leu-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-COR1 이고,
    상기 서열에서,
    R1 = -NH2이며;
    Xaa2 = Aib 또는 D-Ser이고;
    Xaa10 = Lys 또는 Tyr이며;
    Xaa13 = Lys 또는 Tyr이고;
    Xaa16 = Ser, Aib, Glu 또는 Lys이며;
    Xaa17 = Lys 또는 Arg이고;
    Xaa18 = Arg 또는 Ala이며;
    Xaa20 = His, Gln 또는 Lys이고;
    Xaa21 = Asp 또는 Glu이며;
    Xaa23 = IIe, Va이고l;
    Xaa24 = Glu 또는 Gln이며;
    Xaa27 = Met 또는 Leu이고;
    Xaa28 = Asn, Asp, Arg 또는 존재하지 않으며;
    Xaa29 = Gly, Thr 또는 존재하지 않고;
    Xaa30 = Gly 또는 존재하지 않으며;
    Xaa31= Gly 또는 존재하지 않고;
    Xaa32= Pro 또는 존재하지 않으며;
    Xaa33= Ser 또는 존재하지 않고;
    Xaa34= Ser 또는 존재하지 않으며;
    Xaa35= Gly 또는 존재하지 않고;
    Xaa36= Ala 또는 존재하지 않으며;
    Xaa37= Pro 또는 존재하지 않고;
    Xaa38= Pro 또는 존재하지 않으며;
    Xaa39= Pro 또는 존재하지 않고;
    Xaa40= Ser 또는 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 옥신토모듈린 유사체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 모체 펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO., SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.10, SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.18, SEQ ID NO.19, SEQ ID NO.20, SEQ ID NO.21, SEQ ID NO.22, SEQ ID NO.23 및 SEQ ID NO.24로부터 선택되는 서열인 것을 특징으로 하는 옥신토모듈린 유사체.
  7. 제1항 또는 제5항에 있어서,
    상기 아미노산 서열의 제10 부위, 제12 부위, 제16 부위, 제17 부위 또는 제20 부위가 Lys일 경우, 상기 Lys 측쇄와 연결되는 친지방성 치환기는 하기 구조 중의 하나인 것을 특징으로 하는 옥신토모듈린 유사체.
    Figure pct00004
  8. 제1항 또는 제5항에 따른 옥신토모듈린 유사체를 함유하는 약물 조성물.
  9. 제1항에 따른 옥신토모듈린 유사체가 당뇨병을 치료하는 약물을 제조하는 데에 있어서의 응용.
  10. 제1항에 따른 옥신토모듈린 유사체가 강당 약물을 제조하는 데에 있어서의 응용.
  11. 제1항에 따른 옥신토모듈린 유사체가 체중감소 약물을 제조하는 데에 있어서의 응용.
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