CN108310366A - 重组sfrp5蛋白在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属生物制药领域，涉及重组sfrp5蛋白在制备非酒精性脂肪性肝炎药物中的用途，尤其是重组sfrp5蛋白在制备改善非酒精性脂肪性肝炎的炎症和脂肪病变药物中的用途。本发明经实验结果显示，在甲硫氨酸和胆碱缺乏(Methionine and choline deficient diet，MCDD)食物诱导的小鼠可成功制备非酒精性脂肪性肝炎的动物模型，还证实经sfrp5重组蛋白干预可减少非酒精性脂肪性肝炎动物模型的肝脏组织的炎症损伤和脂肪病变，从而减少非酒精性脂肪性肝炎的炎症和脂肪病变，其作用机制与通过抑制库普细胞激活与WNT‑TLR通路有关；所述的重组sfrp5蛋白可用于制备治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物。

Description

重组sfrp5蛋白在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的 用途

技术领域

本发明属生物制药领域，涉及重组sfrp5蛋白在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的用途，尤其是重组sfrp5制备在减少非酒精性脂肪性肝炎的炎症和脂肪病变的药物中的用途。

背景技术

据报道，非酒精性脂肪肝病(non alcoholic fatty liver disease，NAFLD)在肥胖流行的背景下日益引起重视，其发病率约为30％左右，NALFD作为肥胖和代谢综合征的致病因素之一与心脑血管不良预后相关，更是慢性肝病不良结局的主要原因，可见其影响危害之广。研究显示，NALFD疾病谱包括单纯脂肪病变、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、纤维化和肝硬化。非酒精性脂肪性肝炎是非酒精性脂肪性肝病进展的核心环节，表现为肝脏脂肪病变合并小叶炎症和纤维化，可进一步发展为肝硬化和肝癌，如在美国许多不明原因的肝纤维被归结到非酒精脂肪性肝炎，1/3的肝癌与非酒精性脂肪肝炎有关，在2000年到2010年期间由于NASH原因行肝移植的比例从1.2％上升到7.4％，在中国与非病毒性肝炎导致的肝癌发生机会增加也与NASH的日益流行有关；有研究报道，单纯的脂肪肝可以逆转，一旦肝脏炎症激活则后期的肝脏纤维化乃至癌变不可逆转，因此NASH治疗是预防NALFD不良预后进展的核心环节。

临床实践中对NASH治疗的手段有限，目前有循证医学依据的有效药物包括吡格列酮和维生素E，但疗效仍未尽人意，仍有探索NASH的新发病机制和新的潜在治疗药物必要。目前对NASH确切的细胞和分子生物学发病机制并不完全清楚，通常用“多次打击学说”来解释：由于环境因素、个体的遗传背景和肠道微生物等相互之间的复杂作用和对话造成NALFD不同阶段疾病谱同时或先后发生，这种相互作用可造成单纯的肝脂肪病变、自身免疫系统激活、炎症、细胞死亡或进行性的肝脏损伤。近几年脂肪组织与肝脏的对话日益引起重视，脂肪组织被认为不光是能量贮存器官更是内分泌器官，其分泌的脂肪细胞因子参与能量调节及炎症平衡的调节，如IL6或TNFα受体缺乏的小鼠不易出现高脂饮食诱导的脂肪肝和脂肪性肝炎，而相反作为抗炎因子脂联素缺乏的小鼠容易出现脂肪肝和脂肪性肝炎及肝癌，因此脂肪细胞因子可能是今后NASH发病机制研究和治疗的重要方向，尤其是那些本身参与能量调节并且与肝脏炎症、纤维化和肿瘤发生密切相关的脂肪细胞因子。有学者试图用重组脂联素蛋白用于肥胖和NASH治疗，但几个方面限制了脂联素的进一步临床应用：脂联素蛋白获取涉及复杂的转录后修饰以及几种多聚体的正确组装表达非常困难；天然脂联素半衰期短、发挥活性需要的有效浓度高使得商品化应用的性价比不高。

SFRP5是近几年发现的以脂肪组织分泌为主的细胞因子，属于WNT通路的重要调节蛋白，包括富含半胱氨酸的结合区域CRD和NTR like superfamily的功能区域，有初步的基础研究和临床研究提示该蛋白的生物活性可能与脂联素比较类似,具有抗炎和改善代谢的活性，如血清SFRP5水平可能与糖尿病、肥胖有关，肥胖糖尿病患者SFRP5水平较正常人下降，使用GLP-1激动剂利拉鲁肽治疗减重后SFRP5因子水平增加，SFRP5基因敲除小鼠模型容易出现肥胖和脂肪炎症，应用sfrp5腺病毒过表达技术可改善肥胖和脂肪组织炎症及脂肪肝；SFRP5经典的作用机制被认为与wnt5a或wnt3a细胞外结合，从而阻断wnt蛋白(如wnt3a和wnt5a蛋白)与其细胞膜受体(frizzled protein，FZ)结合介导的wnt下游通路。

迄今为止，尚未见有关重组sfrp5蛋白用于改善非酒精性脂肪性肝炎的报道。

与本发明有关的参考文献有：

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发明内容

本发明的目的是提供重组sfrp5蛋白在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的用途，尤其是重组sfrp5在制备改善非酒精性脂肪性肝炎的炎症和脂肪病变药物中的用途。

本发明经实验证实甲硫氨酸和胆碱缺乏(Methionine and choline deficientdiet，MCDD)食物诱导的小鼠可成功制备非酒精性脂肪性肝炎的动物模型，而且还证实经sfrp5重组蛋白干预可减少非酒精性脂肪性肝炎动物模型的肝脏组织的炎症损伤和脂肪病变，从而减少非酒精性脂肪性肝炎的炎症和脂肪病变。

本发明中，所述的重组sfrp5蛋白通过下述方法制备：

SFRP-5(30-317aa)：NM_003015.2，采用优化了大肠杆菌表达基因，构建新的BL21DE3-pET30-SFRP-5(其中含优化后的原核DNA序列)

所述的Sfrp5蛋白氨基酸序列为：

MHHHHHHHHHHGGGSGGGSGGGSYPYDVPDYAEEYDYYGWQAEPLHGRSYSKPPQCLDIPADLPLCHTVGYKRMRLPNLLEHESLAEVKQQASSWLPLLAKRCHSDTQVFLCSLFAPVCLDRPIYPCRSLCEAVRAGCAPLMEAYGFPWPEMLHCHKFPLDNDLCIAVQFGHLPATAPPVTKICAQCEMEHSADGLMEQMCSSDFVVKMRIKEIKIENGDRKLIGAQKKKKLLKPGPLKRKDTKRLVLHMKNGAGCPCPQLDSLAGSFLVMGRKVDGQLLLMAVYRWDKKNKEMKFAVKFMFSYPCSLYYPFFYGAAEPH.

Molecular Weight 36096.08Daltons，320Amino Acids，8.173IsolectricPoint。

所述的重组sfrp5蛋白表达纯化过程如图1所示：其中，

A：BL21DE3-pET30-SFRP-5表达鉴定，M Marker(97.4kd，66.2kd，43.1kd，31.2kd，21.2kd，14.4kd)，1.BL21DE3-pET30-SFRP-5(含优化后的原核DNA序列)诱导4h菌体超声破碎沉淀；2.BL21DE3-pET30-SFRP-5(含优化后的原核DNA序列)诱导4h菌体超声破碎上清液；3.BL21DE3-pET30-SFRP-5(含优化后的原核DNA序列)诱导4h结果；4.BL21DE3-pET30-SFRP-5(含优化后的原核DNA序列)诱导0h结果；

B：破碎细菌的蛋白上清液进行疏水层析，将细菌上清液蛋白加入2M硫酸铵，再进行洗脱，M Marker(97.4kd，66.2kd，43.1kd，31.2kd，21.2kd，14.4kd)，1-9洗脱结果；

C:将疏水层析洗脱液调节PH8.0，进行离子交换层析，1：DEAE上样前样品；2：DEAE穿透样品；3：20mM PB 50mMNaclPH 8.0洗脱-1；M：Marker(130kd，100kd，70kd，55kd，35kd，25kd，15kd，10kd)；4：20mM PB 50mMNaclPH 8.0洗脱-2；5：20mM PB50mMNaclPH 8.0洗脱-3；6：20mM PB 50mMNaclPH 8.0洗脱-4；7：20mM PB 100mMNaclPH8.0洗脱-1；8：20mM PB100mMNaclPH 8.0洗脱-2；9：20mM PB 100mMNaclPH 8.0洗脱-3；

D：亲和层析：将离子交换层析的20mM PB 50mMNaclPH 8.0洗脱液，进行镍柱亲和层析。1：Ni上样前样品；2：Ni穿透样品；3：20mM PB 0.15MNaCl 5mM咪唑PH8.0洗脱-1；MMarker(130kd，100kd，70kd，55kd，35kd，25kd，15kd，10kd)；4：20mM PB 0.15MNaCl 5mM咪唑PH8.0洗脱-2；5：20mM PB 0.15MNaCl 5mM咪唑PH8.0洗脱-3；6：20mM PB 0.15MNaCl 30mM咪唑PH8.0洗脱-1；7：20mM PB 0.15MNaCl 30mM咪唑PH8.0洗脱-2；8：20mM PB 0.15MNaCl30mM咪唑PH8.0洗脱-3；9：20mM PB 0.15MNaCl 30mM咪唑PH8.0洗脱-4。

更具体的，本发明进行了以下实验，结果证实所述的重组sfrp5通过抑制wnt和TLR介导的库普细胞激活,减轻MCDD诱导的肝脏炎症和脂肪病变，所述的重组sfrp5可制备治疗非酒精性脂肪肝炎症的药物。

本发明进行了下述实验，

(1)非酒精性脂肪性肝炎小鼠动物模型制备

(2)血清转氨酶检测

(3)肝脏病理的炎症，脂质评分

(4)肝脏炎症因子表达的定量PCR检测

(5)肝脏库普细胞的免疫组化标记

(6)sfrp5与wnt5a的特异结合实验

(7)肝脏TLR通路改变。

结果显示，

(1)MCDD可成功诱导非酒精性脂肪性肝炎的小鼠动物模型

首先证实正常小鼠予MCDD饲料干预2周后小鼠出现肝脏转氨酶升高，肝脏组织病理提示肝细胞明显的脂肪变性和炎症坏死，而正常对照组无此改变，证明模型诱导成功。

(2)重组sfrp5干预可改善MCDD引起的肝脏转氨酶变化

采用皮下注射重组sfrp5蛋白0.5ug每天两次方案给药，生理盐水作对照，普通饲料喂养小鼠8周后，分为三组，一组为继续普通饲料，一组为甲硫氨酸和胆碱缺乏(Methionine and choline deficient diet，MCDD)喂养+生理盐水组干预两周，一组为甲硫氨酸和胆碱缺乏(Methionine and choline deficient diet，MCDD)喂养+sfrp5蛋白组干预两周，断颈处死小鼠，取血，检测血清转氨酶ALT和AST水平。结果显示，普通饲料组小鼠肝脏转氨酶正常，MCDD饲料+生理盐水组ALT和AST明显升高，而MCDD饲料+sfrp5干预组较MCDD饲料+生理盐水组其转氨酶明显下降，结果表明，注射重组水sfrp5可改善MCDD诱导的肝脏炎症损伤，表现为改善肝脏转氨酶水平降低。

(3)重组sfrp5对肝脏病理的炎症，脂质评分

采用皮下注射重组sfrp5蛋白0.5ug每天两次方案给药，生理盐水作对照，普通饲料喂养小鼠8周后，分为三组，一组为继续普通饲料，一组为甲硫氨酸和胆碱缺乏(Methionine and choline deficient diet，MCDD)喂养+生理盐水组干预两周，一组为甲硫氨酸和胆碱缺乏(Methionine and choline deficient diet，MCDD)喂养+sfrp5蛋白组干预两周。断颈处死小鼠，取肝脏组织，中性甲醛固定，HE染色，按照指南肝脏病理评分标准，请病理医生进行盲法评测。结果显示，MCDD+生理盐水组其脂肪病变评分和炎症病变评分明显增加(分别为2.20±0.63和2.00±0.47)，而使用sfrp5干预后，其脂肪病变和炎症病变评分明显改善，表现为评分下降(分别为1.40±0.97和1.40±0.70)；

(4)重组sfrp5蛋白干预后对肝脏炎症因子表达变化的影响

分组方法同上，采用定量PCR方法，结果显示，与生理盐水干预相比，sfrp5蛋白干预组可减少肝脏炎症因子表达，表现为IL6、TNFα、IL1β和MCP1表达水平降低。

(5)重组sfrp5减少肝脏库普细胞激活

分组方法同上，用F4/80抗体标记肝脏切片的肝脏库普细胞(免疫组化)，用定量PCR检测肝脏组织的F4/80mRNA表达，结果发现MCDD+生理盐水组较普通饲料喂养小鼠F4/80标记的阳性库普细胞比例明显增加，定量PCR显示F4/80mRNA表达增加，使用重组sfrp5干预后，F4/80标记的阳性库普细胞比例减少加，定量PCR显示F4/80mRNA表达减少，提示sfrp5可减少肝脏库普细胞激活；

(6)重组sfrp5在体外与wnt5a特异结合的实验

将不同浓度梯度的sfrp5蛋白包被在ELISA 96孔板管壁，加入含不同浓度梯度的活性重组wnt5a蛋白，再加入wnt5a抗体，加入带HRP的二抗，判断sfrp5蛋白是否能特异结合wnt5a蛋白。结果显示：当包被蛋白sfrp5浓度为0ug/mL时，随着wnt5a浓度增加吸光度并没有增加，而随着sfrp5包被浓度的增加，吸光度逐渐增加，同时随着wnt5a浓度的增加吸光度也逐渐增加，说明sfrp5能特异结合wnt5a蛋白。

(7)重组sfrp5对TLR通路的影响

应用基因芯片技术，结果显示重组sfrp5改善MCDD诱导的肝脏脂肪性炎症改变主要涉及TLR通路的改变，定量PCR证实重组sfrp5蛋白可减少肝脏组织TLR2、TLR4、MyD88、NFkβ和PI3K通路改变，从而抑制库普细胞的炎症激活，从而减轻肝脏的炎症损伤；结合sfrp5的主要作用机制为结合wnt5a阻断WNT通路，表明其主要作用机制为通过与wnt5a结合，阻断wnt5a介导的TLR通路，从而抑制库普细胞激活，改善肝脏的炎症和脂肪病变。

本发明所述的重组sfrp5通过抑制wnt和TLR介导的库普细胞激活,减轻MCDD诱导的肝脏炎症和脂肪病变，因此，所述的重组sfrp5可用于制备治疗非酒精性脂肪肝炎症的药物。

附图说明

图1：SFRP5蛋白的表达与纯化过程，其中，

图A：BL21DE3-pET30-SFRP-5表达鉴定，M Marker(97.4kd，66.2kd，43.1kd，31.2kd，21.2kd，14.4kd)，1.BL21DE3-pET30-SFRP-5(含优化后的原核DNA序列)诱导4h菌体超声破碎沉淀；2.BL21DE3-pET30-SFRP-5(含优化后的原核DNA序列)诱导4h菌体超声破碎上清液；3.BL21DE3-pET30-SFRP-5(含优化后的原核DNA序列)诱导4h结果；4.BL21DE3-pET30-SFRP-5(含优化后的原核DNA序列)诱导0h结果；

图B：破碎细菌的蛋白上清液进行疏水层析，将细菌上清液蛋白加入2M硫酸铵，再进行洗脱，M Marker(97.4kd，66.2kd，43.1kd，31.2kd，21.2kd，14.4kd)，1-9洗脱结果；

图C:将疏水层析洗脱液调节PH8.0，进行离子交换层析，1：DEAE上样前样品；2：DEAE穿透样品；3：20mM PB 50mMNaclPH 8.0洗脱-1；M：Marker(130kd，100kd，70kd，55kd，35kd，25kd，15kd，10kd)；4：20mM PB 50mMNaclPH 8.0洗脱-2；5：20mM PB 50mMNaclPH 8.0洗脱-3；6：20mM PB 50mMNaclPH 8.0洗脱-4；7：20mM PB100mMNaclPH 8.0洗脱-1；8：20mMPB 100mMNaclPH 8.0洗脱-2；9：20mM PB 100mMNaclPH8.0洗脱-3；

图D：亲和层析：将离子交换层析的20mM PB 50mMNaclPH 8.0洗脱液，进行镍柱亲和层析。1：Ni上样前样品；2：Ni穿透样品；3：20mM PB 0.15MNaCl 5mM咪唑PH8.0洗脱-1；MMarker(130kd，100kd，70kd，55kd，35kd，25kd，15kd，10kd)；4：20mM PB 0.15MNaCl 5mM咪唑PH8.0洗脱-2；5：20mM PB 0.15MNaCl 5mM咪唑PH8.0洗脱-3；6：20mM PB 0.15MNaCl 30mM咪唑PH8.0洗脱-1；7：20mM PB0.15MNaCl 30mM咪唑PH8.0洗脱-2；8：20mM PB 0.15MNaCl 30mM咪唑PH8.0洗脱-3；9：20mM PB 0.15MNaCl 30mM咪唑PH8.0洗脱-4。

图2显示了重组SFRP5蛋白可减少MCD诱导的NASH动物模型的脂肪病变和炎症，其中，2a-2b显示了重组sfrp5可改善MCDD诱导的非酒精性脂肪性肝炎的炎症和脂肪病变评分，值采用均数+标准差，每组n＝5，*P<0.05；2c显示在MCDD诱导的非酒精性脂肪性肝炎中，重组sfrp5可改善肝组织的转氨酶ALT和AST升高；

数值采用均数+标准差，每组n＝5，*P<0.05。

图3显示了使用重组sfrp5可降低MCDD诱导的非酒精性脂肪性肝炎的肝脏组织炎症因子IL6、TNFα、IL1β和MCP1表达水平，值采用均数+标准差，每组n＝5，*P<0.05。

图4显示了重组sfrp5可减少库普细胞的数目和F4/80mRNA表达，其中，

A：sfrp5干预2周后，普通饲料对照组，MCDD+生理盐水对照组，MCDD+sfrp5干预组其肝脏组织F4/80免疫组化图片(标记库普细胞)，

B：sfrp5干预2周后，普通饲料对照组，MCDD+生理盐水对照组，MCDD+sfrp5干预组其肝脏组织F4/80mRNA的定量PCR结果。

图5重组蛋白SFRP5的鉴定和体外活性实验，其中，

A：纯化后的SFRP5蛋白的SDS-PAGE电泳图，1：纯化的sfrp-5(还原，加DTT)，M：Marker(130kd，100kd，70kd，55kd，35kd，25kd，15kd，10kd)，2.：纯化的sfrp-5(非还原)；

B：纯化后的SFRP5蛋白的western blot，1：纯化的SFRP-5(还原DTT)，2.：纯化的SFRP-5(非还原)，M：Marker(130kd，100kd，70kd，55kd，35kd，25kd，15kd，10kd)，一抗SFRP5((E-19)sc-4331，lot#2511，goat polyclonal IgG,santa criz biotechnology)，一抗使用浓度为1:1000，二抗也为1:1000；

C；纯化蛋白的HPLC图；

D：验证重组SFRP5蛋白与wnt5a特异结合的原理图；

E：体外结合曲线提示SFRP5能与wnt5a特异结合，将纯化获取不同浓度梯度的SFRP5蛋白包被在96孔板上，加入足够量的有活性的Wnt5a蛋白分子(WN645，R&D公司)过夜孵育使Wnt5a结合SFRP5，然后加入Wnt5a的一抗(R&D公司，MAB645)，再加入含DAB的二抗，显色，测定其OD值，制作亲和力曲线，当SFRP5未包被在管壁时，无论wnt5a浓度多少吸光度在本底水平，当SFRP5包被在管壁时，随着wnt5a浓度的增加，吸光度增加，在同样wnt5a浓度下，随着SFRP5包被浓度增加，吸光度增加，说明SFRP5与wnt5a特异吸附。

图6重组sfrp5对TLR通路的影响，其中

a-c:基因芯片结合生物学信息分析技术技术提示sfrp5改善非酒精性脂肪性肝炎的机制涉及WNT-TLR通路，

d：定量PCR证实sfrp5改善非酒精性脂肪性肝炎的机制涉及TLR2、TLR4、MyD88、NFkβ和PI3K通路改变。

具体实施方式

本实施方式中，

1、材料和方法

(1)试剂和抗体

多聚甲醛，石蜡，人重组sfrp5(自主原核表达、纯化)，人WNT5a蛋白购自R&Dsystems(Mneapolis,MN,美国)公司。一抗包括Human Wnt-5a Monoclonal rat Antibody(R&D,Las Vegas,NV,美国)，F4/80抗体(R&D,Las Vegas,NV,美国)。二抗包括Rat IgGHorseradish Peroxidaseconjugated Antibody(R&D,Las Vegas,NV,美国)PCR扩增试剂盒(Taq)_生工生物工程(上海)股份有限公司)。

(2)MCDD动物模型制作

所有实验经过中科院动物关爱和使用委员会核准。本发明采用雄性成年C57小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司提供，上海，中国)。普通饲料喂养小鼠8周后，分为三组，一组为继续普通饲料，一组为甲硫氨酸和胆碱缺乏饲料(Methionine and cholinedeficient diet，MCDD)喂养两周。2周后断颈处死小鼠，取肝脏组织，4％中性甲醛固定，HE染色，按照指南肝脏病理评分标准，经病理医生进行盲法评测。

实施例1

(1)重组sfrp5干预改善MCDD引起的肝脏转氨酶变化

采用皮下注射重组sfrp5蛋白0.5ug每天两次方案给药，生理盐水作对照，普通饲料喂养小鼠8周后，分为三组，一组为继续普通饲料，一组为甲硫氨酸和胆碱缺乏饲料(Methionine and choline deficient diet，MCDD)喂养+生理盐水组干预两周，一组为甲硫氨酸和胆碱缺乏(Methionine and choline deficient diet，MCDD)喂养+sfrp5蛋白组干预两周，自由进食，断颈处死小鼠，取血，按常规生化方法检测血清转氨酶ALT和AST水平；

(2)重组sfrp5对肝脏病理的炎症，脂质评分

采用皮下注射重组sfrp5蛋白0.5ug每天两次方案给药，生理盐水作对照，普通饲料喂养小鼠8周后，分为三组，一组为继续普通饲料，一组为甲硫氨酸和胆碱缺乏(Methionine and choline deficient diet，MCDD)喂养+生理盐水组干预两周，一组为甲硫氨酸和胆碱缺乏(Methionine and choline deficient diet，MCDD)喂养+sfrp5蛋白组干预两周。断颈处死小鼠，取肝脏组织，中性甲醛固定，HE染色，按照指南肝脏病理评分标准，请病理医生进行盲法评测；

(3)重组sfrp5蛋白干预后对肝脏炎症因子表达变化的影响

分组方法同上，采用定量PCR方法，具体PCR参数参照试剂盒.

(4)重组sfrp5减少肝脏库普细胞激活

分组方法同上，用F4/80抗体(1：500)标记肝脏切片的肝脏库普细胞(免疫组化)，用定量PCR检测肝脏组织的F4/80mRNA表达；

(5)重组sfrp5在体外与wnt5a特异结合的实验

将不同浓度梯度的sfrp5蛋白(0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、25(ug/mL))包被在ELISA 96孔板管壁，加入含不同浓度梯度的活性重组wnt5a蛋白(0、100、200、500、1000(ng/mL))，再加入wnt5a抗体(1:200)，加入带HRP的二抗(1:1000)，判断sfrp5蛋白是否能特异结合wnt5a蛋白。结果显示：当包被蛋白sfrp5浓度为0ug/mL时，随着wnt5a浓度增加吸光度并没有增加，而随着sfrp5包被浓度的增加，吸光度逐渐增加，同时随着wnt5a浓度的增加吸光度也逐渐增加，说明sfrp5能特异结合wnt5a蛋白；

(6)重组sfrp5对TLR通路的影响

应用基因芯片技术(Illumina，MouseWG-6v2.0Expression BeadChip，MCD+saline组vs MCD+SFRP5组，每组样本各3个)，应用生物信息学方法如KEGG进行涉及通路改变的聚类分析；

(7)数据分析

数据用平均值±SD表示，采用单因素方差分析后经Boneferroni多组比较进行统计分析；采用Kruskal–Wallis test分析后经Dunn多组比较进行行为学数据的统计分析；两组比较时，采用未配对双尾Student t检验。P<0.05视为有统计学差异；

实验结果显示：

MCD动物模型制作中，所有实验经过中科院动物关爱和使用委员会核准，本发明采用雄性成年C57小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司提供，上海，中国)；

普通饲料喂养小鼠8周后，分为二组，一组为继续普通饲料，一组为甲硫氨酸和胆碱缺乏(Methionine and choline deficient diet，MCDD)喂养两周，2周后断颈处死小鼠，取肝脏组织，中性甲醛固定，HE染色，按照指南肝脏病理评分标准，经病理医生进行盲法评测，结果显示，MCDD组其脂肪病变评分和炎症病变评分明(为2.20±0.63和2.00±0.47)，而普通饲料喂养组其脂肪病变和炎症评分明显增加；证明MCDD诱导的非酒精脂肪性肝炎动物模型制作成功；

重组sfrp5干预可改善MCDD引起的肝脏转氨酶变化：

采用皮下注射重组sfrp5蛋白0.5ug每天两次方案给药，生理盐水作对照，普通饲料喂养小鼠8周后，分为三组，一组为继续普通饲料，一组为甲硫氨酸和胆碱缺乏(Methionine and choline deficient diet，MCDD)喂养+生理盐水组干预两周，一组为甲硫氨酸和胆碱缺乏(Methionine and choline deficient diet，MCDD)喂养+sfrp5蛋白组干预两周，断颈处死小鼠，取血，检测血清转氨酶ALT和AST水平。结果显示，普通饲料组小鼠肝脏转氨酶ALT(40.40±18.70)，AST(125.40±18.70)，MCDD饲料+生理盐水组ALT(315.40±225.80)和AST(439.80±151.70)明显升高，而MCDD饲料+sfrp5干预组较MCDD饲料+生理盐水组其转氨酶为ALT(202±93.0)，AST(302±100.30)，差异具有显著性。结果表明，注射重组sfrp5可改善MCDD诱导的肝脏炎症损伤，表现为改善肝脏转氨酶水平降低；

重组sfrp5对肝脏病理的炎症，脂质评分：

采用皮下注射重组sfrp5蛋白0.5ug每天两次方案给药，生理盐水作对照，普通饲料喂养小鼠8周后，分为三组，一组为继续普通饲料，一组为甲硫氨酸和胆碱缺乏(Methionine and choline deficient diet，MCDD)喂养+生理盐水组干预两周，一组为甲硫氨酸和胆碱缺乏(Methionine and choline deficient diet，MCDD)喂养+sfrp5蛋白组干预两周。断颈处死小鼠，取肝脏组织，中性甲醛固定，HE染色，按照指南肝脏病理评分标准，请病理医生进行盲法评测。结果显示，MCDD+生理盐水组其脂肪病变评分和炎症病变评分明显增加(分别为2.20±0.63和2.00±0.47)，而使用sfrp5干预后，其脂肪病变和炎症病变评分明显改善，表现为评分下降(分别为1.40±0.97和1.40±0.70)，说明sfrp5可改善肝脏炎症和脂肪病变；

重组sfrp5蛋白干预后对肝脏炎症因子表达变化的影响：

分组方法同上，采用定量PCR方法，结果显示，与生理盐水干预相比，sfrp5蛋白干预组可减少肝脏炎症因子表达，表现为IL6(7.21±0.89vs 9.23±0.95)、TNFα(6.56±0.91vs 8.76±1.03)、MCP-1(3.29±0.72vs 10.27±1.46)和IL1β(5.48±15.10±1.12)表达水平降低；

重组sfrp5减少肝脏库普细胞激活；

分组方法同上，用F4/80抗体标记肝脏切片的肝脏库普细胞(免疫组化)，用定量PCR检测肝脏组织的F4/80mRNA表达，结果发现MCDD+生理盐水组较普通饲料喂养小鼠F4/80标记的阳性库普细胞比例明显增加，定量PCR显示F4/80mRNA表达增加，使用重组sfrp5干预后，F4/80标记的阳性库普细胞比例减少加，定量PCR显示F4/80mRNA表达减少(3.52±0.89vs 20.20±3.45)，提示sfrp5可减少肝脏库普细胞激活；

重组sfrp5在体外与wnt5a特异结合的实验；

将不同浓度梯度的sfrp5蛋白(0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、25(ug/mL))包被在ELISA 96孔板管壁，加入含不同浓度梯度的活性重组wnt5a蛋白(0、100、200、500、1000(ng/mL))，再加入wnt5a抗体(1:200)，加入带HRP的二抗(1:1000)，判断sfrp5蛋白是否能特异结合wnt5a蛋白。结果显示：当包被蛋白sfrp5浓度为0ug/mL时，随着wnt5a浓度增加吸光度并没有增加，而随着sfrp5包被浓度的增加，吸光度逐渐增加，同时随着wnt5a浓度的增加吸光度也逐渐增加，说明sfrp5能特异结合wnt5a蛋白；

(7)重组sfrp5对TLR通路的影响；

应用基因芯片技术(illumina，MouseWG-6v2.0Expression BeadChip，MCD+saline组vs MCD+SFRP5组，每组样本各3个)，显示重组sfrp5改善MCDD诱导的肝脏脂肪性炎症改变主要涉及TLR通路的改变，定量PCR证实重组sfrp5蛋白可减少肝脏组织TLR2(4.21±0.93vs10.45±2.85)、TLR4(2.46±0.53vs 4.86±0.71)、MyD88(1.75±0.30vs 6.08±1.16)、NFkβ(2.54±0.43vs 3.97±0.22)和PI3K(2.30±0.54vs 3.25±0.86)通路改变，从而抑制库普细胞的炎症激活，从而减轻肝脏的炎症损伤。

本发明经试验表明，所述的重组sfrp5通过抑制wnt和TLR介导的库普细胞激活,减轻MCDD诱导的肝脏炎症和脂肪病变，所述的重组sfrp5可用于制备治疗非酒精性脂肪肝炎症的药物。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学附属华山医院

<120> 重组sfrp5蛋白在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的用途

<130> 20170115

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 320

<212> PRT

<213> Sfrp5蛋白

<400> 1

Met His His His His His His His His His His Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

20 25 30

Glu Glu Tyr Asp Tyr Tyr Gly Trp Gln Ala Glu Pro Leu His Gly Arg

35 40 45

Ser Tyr Ser Lys Pro Pro Gln Cys Leu Asp Ile Pro Ala Asp Leu Pro

50 55 60

Leu Cys His Thr Val Gly Tyr Lys Arg Met Arg Leu Pro Asn Leu Leu

65 70 75 80

Glu His Glu Ser Leu Ala Glu Val Lys Gln Gln Ala Ser Ser Trp Leu

85 90 95

Pro Leu Leu Ala Lys Arg Cys His Ser Asp Thr Gln Val Phe Leu Cys

100 105 110

Ser Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Arg Pro Ile Tyr Pro Cys Arg

115 120 125

Ser Leu Cys Glu Ala Val Arg Ala Gly Cys Ala Pro Leu Met Glu Ala

130 135 140

Tyr Gly Phe Pro Trp Pro Glu Met Leu His Cys His Lys Phe Pro Leu

145 150 155 160

Asp Asn Asp Leu Cys Ile Ala Val Gln Phe Gly His Leu Pro Ala Thr

165 170 175

Ala Pro Pro Val Thr Lys Ile Cys Ala Gln Cys Glu Met Glu His Ser

180 185 190

Ala Asp Gly Leu Met Glu Gln Met Cys Ser Ser Asp Phe Val Val Lys

195 200 205

Met Arg Ile Lys Glu Ile Lys Ile Glu Asn Gly Asp Arg Lys Leu Ile

210 215 220

Gly Ala Gln Lys Lys Lys Lys Leu Leu Lys Pro Gly Pro Leu Lys Arg

225 230 235 240

Lys Asp Thr Lys Arg Leu Val Leu His Met Lys Asn Gly Ala Gly Cys

245 250 255

Pro Cys Pro Gln Leu Asp Ser Leu Ala Gly Ser Phe Leu Val Met Gly

260 265 270

Arg Lys Val Asp Gly Gln Leu Leu Leu Met Ala Val Tyr Arg Trp Asp

275 280 285

Lys Lys Asn Lys Glu Met Lys Phe Ala Val Lys Phe Met Phe Ser Tyr

290 295 300

Pro Cys Ser Leu Tyr Tyr Pro Phe Phe Tyr Gly Ala Ala Glu Pro His

305 310 315 320

Claims (4)

1.重组sfrp5在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的用途。

2.重组sfrp5在制备减少MCD诱导的非酒精性脂肪性肝炎药物中的用途。

3.按权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述重组sfrp5通过WNT和TLR通路实现对库普细胞激活的抑制。

4.按权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述重组sfrp5通过抑制WNT和TLR介导的库普细胞激活,减轻MCDD诱导的肝脏炎症和脂肪病变实现改善非酒精性脂肪性肝炎。