CN106798737A - 用于防治肺纤维化的隐丹参酮类及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物技术领域，具体来说是一种用于防治肺纤维化的隐丹参酮类及其应用，隐丹参酮（Ⅰ）隐丹参酮是从植物丹参根部提取的醌类二萜，现代药理研究表明隐丹参酮具有抑菌作用、抗炎作用、类激素样药理作用，临床用于治疗心肌纤维化、肺部急性损伤、关节炎；可用于用于预防或/和治疗肺纤维化疾病药物，也可用于制备降低肺纤维化大鼠体重、肺系数、组织内羟脯氨酸含量药物，可用于制备降低肺泡灌洗液中IL‑1β、IL‑6、TNF‑α 含量药物和制备影响大鼠肺纤维化组织病理结构药物。（Ⅰ）

Description

用于防治肺纤维化的隐丹参酮类及其应用

技术领域

本发明涉及药物技术领域，具体来说是一种用于防治肺纤维化的隐丹参酮类及其应用。

背景技术

肺纤维化（pulmonary fibrosis ，PF）是病因未明的慢性、进展性间质型肺炎的一种特殊类型。发病人群为50～70岁，男性多发于女性。生存率低，早期症状不明显，目前治疗主要是以缓解病情为主。

肺组织分实质和间质两部分，实质是进行气体交换的场所，而间质则是肺纤维化的发生部位。过敏反应、环境颗粒、感染或机械性的损伤均可导致正常组织结构的破坏。急性受损的内皮细胞会释放炎症因子和启动抗纤溶系统凝集。同时血小板在受损部位大量聚集，形成富含纤维的凝块。在炎症阶段，趋化因子梯度会招募大量的炎症细胞如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等，它们分泌大量的细胞因子，如白介素 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TGF-β，促进上皮细胞向成纤维细胞以及成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，最终产生大量的细胞外基质。在纤维化阶段，细胞外基质如胶原、纤连蛋白通过整合素等细胞表面受体，介导下游信号的发生，导致肺组织的正常结构被增厚的纤维组织所填充，气体交换功能丧失和呼吸衰竭。

成纤维细胞异常活化分化成肌成纤维细胞，是肺纤维化合成大量的细胞外基质（ECM）的来源。目前可能导致肺纤维化的因素主要包括自身免疫性疾病、抗肿瘤药物的使用、误服农药、各种病毒感染以及长期吸入粉尘、长期吸烟等。肺动脉高压、慢性阻塞性肺疾病、肺癌、胃食管反流病和缺血性心脏病，是肺纤维化常见的合并症。

迄今为止，治疗肺纤维化的方法主要有肺移植，去除长期抗原刺激，和药物治疗。其中肺移植是终末肺阶段唯一有效的治疗方法，但由于缺乏适当的供体及免疫排斥反应，其开展受到很大的限制。而在药物治疗方面，糖皮质激素可以减轻炎症反应、抑制免疫过程，对以肺泡炎症为主的肺纤维化有着一定的帮助；但是对弥漫性肺纤维化病人疗效甚差，且长期使用糖皮质激素副作用太大。中药理肺化纤方等还处于初步发展阶段。吡啡尼酮是目前新的一种对抗纤维化治疗效果比较好的口服药物，但因其价格不菲，临床应用受限。

丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参Salv ia miltiorrhiza Bunge的干燥根及根茎，是最常用的活血化瘀中药之一，首载于《神农本草经》，具有去瘀止痛、养血安神的功效。现代药理研究表明，丹参具有保护血管内皮细胞、抗心律失常、抗动脉粥样硬化、改善微循环、保护心肌、抑制和解除血小板聚集、增加冠脉流量，提高机体耐缺氧能力，抑制胶原纤维的产生和促进纤维蛋白的降解，抗炎，抗脂质过氧化和清除自由基，以及保护肝细胞、抗肺纤维化等作用。

隐丹参酮是一种从中药丹参中提取的有效成分，IUPAC命名（R）-1，2，6，7，8，9-Hexahydro-1，6，6-trimethyl-phenanthro（1，2-b）furan-10，11-dione，英文名称Cryptotanshinone，分子式C₁₉H₂₀0₃，分子量294.33；CAS号35825-57-1，物理性质：橙色粉末。溶于甲醇、乙醇、苯、乙醚，易溶于丙酮、氯仿；与浓硫酸作用显红色，在避光及非溶液状态下最稳定。熔点184-185℃，易溶于氯仿，溶于甲醇等有机溶剂，微溶于水。

隐丹参酮是从植物丹参根部提取的醌类二萜，现代药理研究表明隐丹参酮具有抑菌作用、抗炎作用、类激素样药理作用，临床用于治疗心肌纤维化、肺部急性损伤、关节炎。迄今为止，未见隐丹参酮作为治疗肺纤维化的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供隐丹参酮在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途，隐丹参酮通过抑制肺成纤维细胞增殖、抑制肺成纤维细胞活化、降低肺纤维化组织内羟脯氨酸含量、降低肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量，具有防治肺纤维化的新用途。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种隐丹参酮（Ⅰ）或其药学上可接受盐或含有它们中任何一种药物组合物在制备药物中的应用；

（Ⅰ）。

进一步的，隐丹参酮或其药学上可接受盐用于预防或/和治疗肺纤维化疾病药物中的应用。

进一步的，所述隐丹参酮在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中时，抑制肺成纤维细胞活化或增殖的浓度为5～20 μM。

进一步的，所述隐丹参酮在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中时，抑制人胚肺成纤维细胞纤维蛋白表达的浓度为10～20 μM。

进一步的，所述隐丹参酮在用于治疗SD大鼠肺纤维化时，其使用剂量范围是6～60mg/kg。

进一步的，所述隐丹参酮在制备降低肺纤维化大鼠体重、肺系数、组织内羟脯氨酸含量药物中的用途。

进一步的，所述隐丹参酮在制备降低肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量药物中的用途。

进一步的，所述隐丹参酮在制备影响大鼠肺纤维化组织病理结构药物中的用途。

本发明的有益技术效果：隐丹参酮是从植物丹参根部提取的醌类二萜，现代药理研究表明隐丹参酮具有抑菌作用、抗炎作用、类激素样药理作用，临床用于治疗心肌纤维化、肺部急性损伤、关节炎；可用于用于预防或/和治疗肺纤维化疾病药物，也可用于制备降低肺纤维化大鼠体重、肺系数、组织内羟脯氨酸含量药物，可用于制备降低肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量药物和制备影响大鼠肺纤维化组织病理结构药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为隐丹参酮治疗28天对大鼠肺组织病理形态变化的影响（HE染色）；

图2为隐丹参酮治疗28天对大鼠肺组织病理形态变化的影响（MASSON染色）。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实验例1 隐丹参酮对人胚肺成纤维细胞（HLF）细胞增殖的影响：

（1）实验材料：HLF细胞购于中山大学实验动物中心。DMEM 培养基（美国Gibco）、类胎牛血清（美国Hyclone）、MTT（Sigma）；

（2）实验方法：5.0×10³的HLF细胞加入到96孔板的板孔中，培养24 h。吸出原培养液，加入含有不同浓度（2.5μM、5 μM、10 μM、20 μM）的隐丹参酮的完全培养液，以加入不含隐丹参酮的完全培养液作为正常对照。继续培养48 h，向每孔中加入20 μL的含有5 mg/mL MTT的磷酸盐缓冲盐水，培养4 h后，吸出每孔的培养液，每孔加入200 μL的二甲基亚砜（DMSO）。震荡15 min，在490 nm波长，检测各孔吸光度值，检测细胞活力；

（3）实验结果：详见表1。隐丹参酮在3.125-100μM范围内，没有明显细胞毒性

表1隐丹参酮对人胚肺成纤维细胞（HLF）增殖的细胞毒作用（`x±s）。

实验例2 隐丹参酮对TGF-β1刺激人胚肺成纤维细胞（HLF）细胞异常活化的影响：

（1）实验材料：HLF细胞购于中山大学实验动物中心。DMEM 培养基（美国Gibco）、类胎牛血清（美国Hyclone）、人转化生长因子-β1（HumanTGF-β1，PeproTech Inc）；

（2）实验方法：5.0×103的HLF细胞加入到96孔板的板孔中，培养24小时。将肺成纤维细胞分为：

TGF-β1处理组（5ng/mL作用时间48h）；TGF-β1处理组（5 ng/mL作用时间48h）+隐丹参酮2.5 μM；TGF-β1处理组（5 ng/mL作用时间48 h）+隐丹参酮5 μM；TGF-β1处理组（5 ng/mL作用时间48 h）+隐丹参酮10μM。TGF-β1处理组（5 ng/mL作用时间48 h）+隐丹参酮20 μM。48h后BrdU检测细胞增殖情况。以TGF-β1未刺激组作为对照，分析各组肺成纤维细胞增殖率的差异；

（3）实验结果见表2

表2 隐丹参酮对TGF-β1刺激肺成纤维细胞增殖的影响（`x±s）

#p<0.05vs Control; ##p<0.01vs Control;*p<0.05，**p<0.01 vs model.

表2结果可以看出，TGF-β1刺激肺成纤维细胞48 h，肺成纤维细胞增殖率明显增加，说明TGF-β1刺激肺成纤维细胞可以在体外诱导肺成纤维细胞增殖，而加隐丹参酮后5-20 μM48 h，明显抑制肺成纤维细胞增殖，说明隐丹参酮抑制肺成纤维细胞异常活化。

实验例3 隐丹参酮对TGF-β1刺激肺成纤维细胞纤维蛋白表达的影响：

（1）材料与方法：HLF细胞购于中山大学实验动物中心；

DMEM 培养基（美国Gibco）、人转化生长因子-β1（HumanTGF-β1，PeproTech Inc）、α-SMA抗体（Boster公司）、鼠二抗（ 美国Thermo）；胰蛋白酶、α-tubulin抗体（美国Sigma）、兔二抗（美国Promega）；

（2）试验方法：将细胞接种于6 孔板，胞培养箱中培养。当细胞生长融合至70～80%，用无血清培养基饥饿24 h，换新鲜培养液，将传代的HLF细胞分为：对照组、隐丹参酮组、隐丹参酮25 μM，作用时间48h TGF-β1处理组（5ng/mL作用时间48h）；TGF-β1处理组（5 ng/mL作用时间48h）+隐丹参酮25 μM；48 h后收获并裂解细胞提取细胞总蛋白。BCA测定蛋白浓度后，取23μg样品蛋白进行10%的十二烷基磺酸钠2聚丙烯酞胺（SDS-PAGE）凝胶变性电泳，然后转至（PVDF膜，α-tublin作内参，Western blot检测细胞α-SMA的表达。以TGF-β1未刺激组作为对照，使用Graph pad prism 统计软件进行数据统计，所有数据采用均数±标准差表示，各组之间的差异采用one-way ANOVA 分析；

（3）试验结果

表3 隐丹参酮对TGF-β1刺激肺成纤维细胞的α-SMA表达影响（n=4）

组别	COL-I（%）
		正常组	1.00±0.12
隐丹参酮组（20 μM）	1.22±0.21
		TGF一β1刺激组	2.08±0.76##
TGF一β1刺激+隐丹参酮组（10 μM）	1.15±0.17
		TGF一β1刺激+隐丹参酮组（20 μM）	0.90±0.64**

#p<0.05vs Control; ##p<0.01vs Control;*p<0.05，**p<0.01 vs model.

表3结果可以看出，TGF-β1刺激肺成纤维细胞48 h，纤维蛋白α-SMA表达明显下降，说明TGF-β1刺激肺成纤维细胞可以在体外诱导向肺成纤维母细胞转化，而加隐丹参酮25 μM后48 h，明显抑制α-SMA表达，说明隐丹参酮抑制肺成纤维细胞向肺成纤维母细胞转化。

实验例4 隐丹参酮对博莱霉素（BLM）诱导的肺纤维化模型大鼠的影响

用博莱霉素制作的肺纤维化模型，其病理组织学和生理学改变与人类肺纤维化近似，因此成为肺纤维化造模的常用药物。博莱霉素经气管滴注给药可诱导SD大鼠发生肺纤维化。在博来霉素给药后，灌胃给予药物隐丹参酮，剂量分别为6 mg/kg、20 mg/kg、60 mg/kg，对照组为等剂量的水；

（1）实验材料

实验动物：清洁级 SD（Sprague-Dawley）大鼠60只，8 周龄，体重 180-220g，雌性，购自于中山大学实验动物中心（许可证号：SYXK（粤）2011-0029），动物合格证编号:44008500011143，环境温度:20～26℃，湿度40～70%，自由摄食饮水；

博莱霉素（invitrogen）、吡非尼酮（上海麦克林）、羟脯氨酸检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）、隐丹参酮（中山大学药物化学研究所）；

隐丹参酮由中山大学药物化学研究所提供（批号：20071011，含量：95%），临用前称取60 mg CTS单体原料药至 10 mL 0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）中，震荡混匀制成混悬液，配成浓度为60 mg·mL⁻¹的高剂量 CTS，依次稀释得中剂量（20mg·mL⁻¹）、低剂量（6 mg·mL⁻¹）。灌胃给药体积均为 10 mL/kg；

（2）实验方法

动物分组：大鼠采用随机数字表法分成6组，每组10只，分别为对照组、模型组、隐丹参酮低、中、高剂量组、吡非尼酮组（60mg/kg）；

模型制备：大鼠博来霉素诱导的肺纤维化模型的建立：10%水合氯醛（3.5ml/kg）麻醉后，固定于手术台上，局部消毒后，用剪刀剪开喉部皮肤，做顿性分离逐渐使气管暴露，后用1ml 注射器吸取配备好的博莱霉素溶液 0.1ml（5mg/kg），向气管内快速注射，后垂直放置大鼠，将其左右旋转 3-4 周，使博莱霉素溶液均匀分布于肺部，后用针线缝合手术伤口，让大鼠自然清醒；

给药方案：各组动物经博莱霉素造模后，第二天开始大鼠每隔一天称重一次，按照相应的体重灌胃给药，正常组及模型组给予等体积生理盐水，阳性对照组给予吡非尼酮，各治疗组分别给予不同剂量的隐丹参酮。连续给药28天；

检测指标：实验第28天为终点，观察各组大鼠的大体情况并记录，后在水合氯醛腹腔麻醉的条件下，收集各组大鼠的肺泡灌洗液，称肺重，取血离心测定细胞因子，下半部分福尔马林溶液中固定，石蜡包埋切片，做HE染色和Masson染色；

（3）实验结果

1）隐丹参酮对博莱霉素诱导肺纤维化大鼠肺组织中羟脯氨酸（HYp）和肺系数的影响（x士s，n=10～12）

造模后给药28天，与正常对照组相比，模型组大鼠体重显著减轻，肺组织中羟脯氨酸含量显著增加（p<0.05），肺系数显著高于正常组（p<0.01）；隐丹参酮各剂量组大鼠体重显著增加，大鼠肺组织中羟脯氨酸的含量低于模型组，肺系数均低于模型组。阳性对照吡非尼酮组大鼠肺组织中羟脯氨酸含量与模型组相比显著降低（p<0.01），肺系数亦有所下降，见表4；

表4 隐丹参酮对博莱霉素诱导肺纤维化大鼠肺组织中羟脯氨酸（HYP）和肺系数的影响

#p<0.05vs Control; ##p<0.01vs Control;*p<0.05，**p<0.01 vs model.

2）隐丹参酮对肺纤维化大鼠肺泡灌洗液炎症细胞因子表达的影响

大鼠博莱霉素造模28天后，肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α 表达较空白对照组明显上升（p<0.01）；大鼠灌胃隐丹参酮后，能明显降低肺组织中以上细胞因子的表达），见表5；

表5隐丹参酮对肺纤维化大鼠肺组织中细胞因子表达的影响

组别	剂量（mg/kg）	IL-1β（ng/L）	IL-6（ng/L）	TNF-α（ng/mL）
					对照组（10mg/kg）		6.75±1.18	9.31±1.18	131.75±25.00
模型组（10mg/kg）
					吡非尼酮组	60
隐丹参酮组
					低剂量组	6	12.44±1.56
中剂量组	20
					高剂量组	60

注: #p<0.05vs Control; ##p<0.01vs Control;*p<0.05，**p<0.01 vs model.

3）隐丹参酮对肺纤维化大鼠肺组织病理结构改变的影响

HE染色结果显示：正常组大鼠肺组织结构完整清晰，肺泡壁未见增厚，肺泡腔透亮，腔内未见明显渗出，无炎性细胞浸润，无成纤维细胞增生。模型组大鼠肺泡结构破坏，肺泡间隔增宽，大量炎性细胞浸润及成纤维细胞增生，肺纤维化形成。隐丹参酮各给药组与模型组比较情况好转，病变范围明显减少，肺实质结构破坏较少。阳性对照吡非尼酮组病变程度较模型组有所减轻。见附图1；

马苏染色结果显示：正常对照组大鼠肺组织结构正常，纤维化模型组大鼠在肺泡间隔、肺泡壁，以及终末细支气管、呼吸性细支气管和小支气管管壁周围均可见到大量增生的蓝色胶原纤维，隐丹参酮各组与模型组相比纤维化程度轻，胶原总含量较少，表明隐丹参 有减轻胶原纤维增生，改善肺间质纤维化的作用，阳性对照吡非尼酮组病变程度较模型组有所减轻，见附图2。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语（包括技术术语和科学术语）具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。

最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.隐丹参酮（Ⅰ）或其药学上可接受盐或含有它们中任何一种药物组合物在制备药物中的应用；

（Ⅰ）。

2.根据权利要求1所述隐丹参酮或其药学上可接受盐用于预防或/和治疗肺纤维化疾病药物中的应用。

3.根据权利要求2所述隐丹参酮或其药学上可接受盐用于预防或/和治疗肺纤维化疾病药物中的应用，其特征在于，所述隐丹参酮在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中时，抑制肺成纤维细胞活化或增殖的浓度为5～20 μM。

4.根据权利要求2所述隐丹参酮或其药学上可接受盐用于预防或/和治疗肺纤维化疾病药物中的应用，其特征在于，所述隐丹参酮在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中时，抑制人胚肺成纤维细胞纤维蛋白表达的浓度为10～20 μM。

5.根据权利要求2所述隐丹参酮或其药学上可接受盐用于预防或/和治疗肺纤维化疾病药物中的应用，其特征在于，所述隐丹参酮在用于治疗SD大鼠肺纤维化时，其使用剂量范围是6～60 mg/kg。

6.根据权利要求1所述隐丹参酮或其药学上可接受盐或含有它们中任何一种药物组合物在制备药物中的应用，其特征在于，所述隐丹参酮在制备降低肺纤维化大鼠体重、肺系数、组织内羟脯氨酸含量药物中的用途。

7.根据权利要求1所述隐丹参酮或其药学上可接受盐或含有它们中任何一种药物组合物在制备药物中的应用，其特征在于，所述隐丹参酮在制备降低肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量药物中的用途。

8.根据权利要求1所述隐丹参酮或其药学上可接受盐或含有它们中任何一种药物组合物在制备药物中的应用，其特征在于，所述隐丹参酮在制备影响大鼠肺纤维化组织病理结构药物中的用途。