CN106727916A - 罗勒多糖提取物在制备治疗肺纤维化药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种罗勒多糖提取物在制备治疗肺纤维化药物中的应用,是罗勒多糖提取物作为治疗肺纤维化的新用途,属于中药治疗肺纤维化的技术领域。本发明罗勒多糖能够减轻肺组织形态学病变、能够降低肺组织胶原蛋白沉积、能够减少肺组织羟脯氨酸含量、可以抑制人Ⅱ型肺上皮细胞来源的A549永生化细胞株的成纤维化形态改变、可以抑制人Ⅱ型肺上皮细胞来源的A549永生化细胞株的col Ⅰ基因表达,降低细胞内羟脯氨酸含量。罗勒多糖提取物在对于体内外IPF模型均具有一定的抑制纤维化或胶原产生的作用,是一种潜在的治疗肺纤维化的中药提取物。
Description
技术领域
本发明具体涉及的是罗勒多糖提取物在制备肺纤维化药物中的应用,是罗勒多糖提取物作为治疗肺纤维化的新用途,属于中药治疗肺纤维化的技术领域。
背景技术
纤维化疾病发病率和死亡率不断升高,纤维化疾病发病人群众多。尽管近年来对纤维化过程的认识有显著进展,但纤维化疾病的致病因素以及病理机制尚不完全清楚,目前尚无逆转或完全阻止纤维化疾病发展的有效治疗方法。纤维化疾病可累及多个脏器或者多系统,包括肺脏、肝脏、肾脏、心脏纤维化,以及系统性硬化症、多灶性纤维化、硬皮病等等,其共同特征是大量的成纤维细胞聚集、细胞外基质在组织中的过度沉积、组织损伤所致的结构破坏,组织器官功能不断丧失。
肺纤维化以弥漫性肺泡单位肺泡炎症伴间质性纤维化为基本病变的一组疾病,此类疾病数量较大,病因多种多样,但无论肺纤维化的病因如何,大多数肺纤维化都有共同的病理过程,特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是肺纤维化疾病中最常见的类型,约占肺纤维化患者的一半以上,也是各种纤维化疾病中发展恶化最快,。IPF是一种特殊形式的未知病因的慢性、不可逆进展性纤维化间质性肺炎,病因尚未完全明确,吸烟,环境和职业暴露,病毒感染,胃酸反流和遗传倾向为IPF风险因素,临床表现为渐进性、不可逆的呼吸困难和咳嗽,几乎所有的IPF患者最终死于呼吸衰竭。IPF的以普通型间质性肺炎为特征性病理改变,主要表现为弥漫性肺泡炎、肺泡单位结构紊乱和肺纤维化,广泛纤维化使肺组织变硬,顺应性降低,临床表现呈个体异质性,为渐进性、不可逆的呼吸困难和咳嗽,突然加重,几乎所有的IPF患者最终死于呼吸衰竭。IPF患者确诊后的中位生存期为3-5年,比肺腺癌预后更差。目前用于治疗IPF的药物很少,吡啡尼酮于2008年首先在日本用于IPF治疗;2014年吡啡尼酮和尼达尼布被美国FDA批准用于特异性地治疗IPF;目前我国只有吡啡尼酮被批准用于治疗IPF。以上药物的疗效均不理想,不能够逆转或阻止IPF的病情发展。肺移植是治疗特发性肺纤维化最有效手段,但由于供体来源有限而制约了其应用,并且在移植后的中位生存期低于五年。随着环境恶化、人口老龄化、病毒感染增多等相关因素影响,IPF发病率不断升高,因此研发新的IPF有效治疗药物将带来巨大的社会效益和经济效益。
中药以其副作用小作用全面,不易产生依赖性等特点引起越来越多学者的注意,从中医药中寻找疾病治疗药物被公认为是新药研发有效途径。近年来,医学工作者用中医药防治器官纤维化取得了较好的疗效,实验研究与临床应用均已证实了中医药治疗肺纤维化疾病确有疗效。
肺组织发生纤维化时大量细胞外基质聚集肺泡间隔,致使肺组织弹性变小,肺通气量降低,肺功能下降。Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ,colⅠ),是肺组织发生纤维化时细胞外基质的主要构成组分,因此,colⅠ的变化被用来作为反映肺纤维化程度的主要指标。作为colⅠ中含量最高的氨基酸,羟脯氨酸是衡量机体胶原组织代谢的重要指标,羟脯氨酸浓度与colⅠ含量成正比。因此,羟脯氨酸含量也被用来作为判断纤维化程度。
目前尚未有罗勒多糖提取物具有治疗包括IPF在内的纤维化疾病作用的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种罗勒多糖提取物在制备肺纤维化药物中的应用,是罗勒多糖提取物的一种新用途,目前没有任何报道表明罗勒多糖提取物可以用于肺纤维化疾病的治疗。
本发明采用以下技术方案:
罗勒多糖提取物在制备治疗肺纤维化药物中的应用,所述罗勒多糖提取物是从植物罗勒单味药中采用下述方法提纯得到的:
将罗勒药材用粉碎机粉碎,将粉碎的罗勒粉用85%乙醇脱脂两次后真空脱水干燥,得到脱脂罗勒粉。在脱脂罗勒粉中加入适量的水煎煮两遍后,过滤收集煎煮液,将两次收集的煎煮液合并后,放入浓缩罐中进行浓缩,使其相对密度达到1.08~1.10,然后将浓缩液冷却至4℃,加入5倍液体量的95%乙醇静置沉淀48小时,收集沉淀物得到罗勒多糖粗品,再将罗勒多糖粗品加适量水溶解,过滤后浓缩,使其相对密度达到1.08~1.10,然后冷却至4℃,在浓缩液中加入5倍量95%乙醇静置沉淀48小时,收集沉淀物,真空干燥脱水即得到罗勒多糖提取物成品。
本发明的罗勒多糖提取物可制成一切药学可接受口服和非口服制剂形式。
罗勒为一种草本植物,别名“金不换”或“九层塔”。罗勒多糖提取物是从植物边罗勒全草提取分离出来的,主要成分为总多糖,为浅棕色微甜粉末或颗粒,易溶于水,分子量为10000~90000。
在本发明中,我们利用了博莱霉素诱导的C57/BL6小鼠作为IPF动物模型,TGF-β诱导的A549细胞模型常作为IPF体外模型,以colⅠ表达和羟脯氨酸含量变化,结果病理学手段对中药罗勒多糖提取物治疗IPF的作用进行了评价。
博莱霉素是应用最为广泛的一种IPF动物模型造模诱导物,它首先被发现是在临床应用时可以引起患者发生肺纤维化,是通过直接的DNA链断裂以及产生自由基诱导氧化应激而导致肺损伤。博莱霉素已被用于制备多种动物IPF模型,包括小鼠,大鼠,豚鼠,仓鼠,兔子,狗和灵长类动物,其中小鼠最常见,在小鼠种系的选择上,C57/BL6小鼠一般容易发生博莱霉素诱导的肺纤维化。TGF-β被认为是最重要的致纤维化因子,它通过特定的信号通路发挥作用。当TGF-β1被活化,调节相关基因转录,发生上皮间质转化,合成细胞间基质,促进纤维化。A549细胞是来源于人肺泡上皮细胞的一个永生化细胞株,保持了典型的Ⅱ型肺上皮细胞的主要特征,常被用来作为有效的工具研究Ⅱ型肺上皮细胞的生物学变化。TGF-β诱导的A549细胞模型常被用作IPF发病机理和药物作用研究的体外细胞模型。
本发明的有益效果是:
(1)罗勒多糖提取物能够减轻博莱霉素诱导的C57BL/6小鼠肺组织形态学病变。
(2)罗勒多糖提取物能够降低博莱霉素诱导的C57BL/6小鼠肺组织胶原蛋白沉积。
(3)罗勒多糖提取物能够减少博莱霉素诱导的C57BL/6小鼠肺组织羟脯氨酸含量。
(4)罗勒多糖提取物可以抑制TGF-β诱导的人Ⅱ型肺上皮细胞来源的A549永生化细胞株的成纤维化形态改变。
(5)罗勒多糖提取物可以抑制TGF-β诱导的人Ⅱ型肺上皮细胞来源的A549永生化细胞株的colⅠ基因表达,降低细胞内羟脯氨酸含量。
(6)罗勒多糖提取物在体外细胞实验中工作浓度未见细胞毒性。
附图说明
图1为罗勒多糖提取物治疗IPF模型小鼠的肺病理观察,28d(HE染色,×100)。
图2为罗勒多糖提取物治疗IPF模型小鼠的肺病理观察,Masson染色结果。
图3是罗勒多糖提取物对A549细胞形态变化的影响结果图(×100)。
图4是罗勒多糖提取物对A549细胞内colⅠmRNA表达的影响结果图,图中与模型组比较,*P﹤0.05,**P﹤0.01。
图5是罗勒多糖提取物对A549细胞裂解液HYP含量影响图,图中与模型组比较,*P﹤0.05,**P﹤0.01。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的内容做进一步的详细说明。
实施例1
罗勒多糖提取物对治疗肺纤维化的体内药效学研究
博莱霉素是最常用的肺纤维化模型诱导剂,在临床应用时可以引起少数患者发生肺纤维化,目前已被用于制备多种动物的IPF模型。本发明的药物对于博莱霉素诱导的C57BL/6小鼠IPF模型动物具有治疗作用。
8周龄雄性C57BL/6雄性小鼠,购自济南朋悦实验动物繁育有限公司(合格证号:NO.37009200003495);罗勒多糖提取物由山东中医药大学天然药物实验室采用本发明方法提取;戊巴比妥钠:中国医药集团上海化学试剂公司,用生理盐水配制成2%溶液后按照2ml/Kg体重腹腔注射;注射用盐酸博莱霉素,日本化药株式会社生产,每瓶15mg,造模用量为1.5mg/kg。
动物分组与手术造模:随机分成5组,分别为假手术组、模型组、罗勒多糖大、中、小剂量组,每组8只。小鼠适应性饲养3天,第4天手术造模。手术方法:小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,用鼠板固定四肢及头部,行正中纵向切口,钝性分离肌肉、组织直至暴露气管。按1.5mg/Kg剂量用0.1ml加样器抽取用生理盐水配制的博莱霉素溶液100μl,经气管软骨环间隙朝向心端刺入气管,回抽见空气且无阻力后,将药液缓慢注入气管。注入结束后将鼠板直立并迅速旋转抖动,让药液在小鼠肺内均匀分布,假手术组小鼠注入100μl生理盐水。缝合切口,右侧卧静置,待其自然苏醒。造模7天后开始灌胃给药,将药物溶解至合适剂量,每只小鼠均按0.3ml/只/天灌胃分别给予生理盐水、罗勒多糖提取物(100mg/kg/天、50mg/kg/天、25mg/kg/天)和吡啡尼酮(50mg/kg/天);手术后第28天末次给药后处死。所有动物取右上肺,4%甲醛液固定,脱水、石蜡包埋、切片后,行HE和MASSON染色后,在光学显微镜下观察照相。
1.HE染色结果
假手术组小鼠肺组织结构清晰,肺泡间隔正常,无明显明炎症细胞浸润及纤维组织增生的表现;模型组小鼠肺组织炎症改变和纤维组织增生,多数肺泡腔变窄、结构破坏明显,肺泡间隔增厚;罗勒多糖提取物各组与模型组相比炎症细胞浸润减少,肺泡有部分破坏,肺泡间隔增厚程度较模型轻,结构较正常。结果见图1。
2.Masson染色结果
Masson染色是显示胶原纤维的经典方法。染色后胶原纤维呈现淡绿色或蓝色,组织绿色或蓝色面积与组织胶原含量成正比。发生肺纤维化时,肺泡间细胞基质沉积,胶原纤维增多,Masson染色后绿色或蓝色面积增加。实验结果表明,与假手术组比较,模型组胶原染色面积明显增多;与模型组比较,罗勒多糖提取物各组胶原染色面积明显减少。
从HE与Masson染色结果可见,假手术组肺组织结构清晰,无出血点,胶原沉积量少;阴性对照组肺壁明显增厚,肺间隔明显缩小,实质性病变呈片状,胶原明显沉积;阳性对照组肺泡壁无明显增厚,间隔清晰,少量胶原沉积;罗勒3剂量组肺泡结构都比较清晰,无明显增厚,实质性病变少见。
实施例2
罗勒多糖提取物对治疗肺纤维化的体外药效学研究
本发明的药物对IPF常用细胞模型具有治疗作用。
罗勒多糖提取物由山东中医药大学天然药物实验室采用本发明方法提取,使用前用PBS缓冲液配制成浓度为10mg/mL的储备液,灭菌后分装冻存;RPMI 1640培养基(批号:8115400)由Gibco公司生产;新生牛血清由杭州四季青工程材料有限公司生产;重组人TGF-β(产品编号:100-21,批号:0614209-1)由PEPROTECH公司生产;RNA提取试剂RNAiso Plus(批号:AKA2603),逆转录试剂盒RT reagent Kit with gDNA Eraser(批号:AK3001),qPCR试剂盒,Premix Ex TaqTMⅡ(批号:AK7001)均由宝生物(大连)工程有限公司生产;羟脯氨酸ELISA试剂盒(产品编号:FU-R2590,批号:201512)由biofine公司生产。A549细胞株常规培养于含10%新生牛血清的RPMI1640培养基中,在5%CO2、37℃、饱和湿度条件下培养,0.25%胰酶消化传代。所有实验均使用对数生长期细胞。将细胞分为三组,分别为:(1)正常对照组,加入2mL 2%新生牛血清的RPMI 1640培养液;(2)模型组:TGF-β1组,加入用2%新生牛血清RPMI1640配制的含有5ng/mL TGF-β的培养液2mL;(3)罗勒多糖提取物组:TGF-β1加罗勒多糖提取物组,在TGF-β1组的基础上,加入罗勒多糖提取物溶液,使其在培养液中的终浓度为200ug/mL。以往的实验结果表明,单独使用罗勒多糖提取物处理细胞48小时,罗勒多糖提取物剂量在200μg/mL以下对A549细胞株均无明显细胞毒作用,剂量在400~800μg/mL时出现对细胞株细胞活力抑制的趋势,但与阴性对照组比较差异无统计学意义。根据我们药的筛选预实验结果,我们选用200ug/mL作为罗勒多糖提取物的实验用剂量。所有实验均用六孔板进行细胞培养,取对数生长期A549细胞经0.25%胰酶消化后,离心收集细胞,用10%新生牛血清的RPMI1640重悬成单细胞悬液,调整密度为1.0×105/mL,接种于6孔培养板中,每孔加入2mL细胞悬液,孵育24小时,待细胞贴壁后,弃去原培养液,按细胞分组分别加入培养液,TGF-β及罗勒多糖提取物。计量资料采用SPSS19.0统计学软件进行数据分析,各实验组数据均以均数±标准差表示,多个样本均数采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD检验。以P﹤0.05或P﹤0.01表示差异有统计学意义。
1.细胞形态学观察
按照上述分组将处理细胞,放入培养箱继续培养48小时后,、倒置相差显微镜下观察细胞形态变化并拍照记录。结果表明:A549细胞为梭形或不规则多边形呈上皮细胞样形态,细胞排列规则,模型组:A549细胞+TGF-β,细胞形态明显变瘦变长,细胞与细胞间距离变大,细胞由上皮细胞形态向成纤维细胞形态转变,罗勒多糖组细胞形态比较正常组稍有拉长,细胞与细胞之间有较小距离,与模型组比较细胞部分拉长其程度也减轻,细胞与细胞界限变小说明罗勒多糖提取物可以抑制部分细胞上皮间质转化,使细胞维持上皮样形态。结果如图3所示。
2.RT-qPCR检测colⅠmRNA的表达
按以上分组将细胞培养48小时后,收集细胞,用RNAiso Plus提取细胞总RNA,用RT reagent Kit反转录为cDNA,使用Premix Ex TaqTMll试剂盒进行PCR扩增。以上实验步骤均按照说明书操作。引物均由宝生物(大连)工程有限公司合成并纯化,序列如下:ColⅠ(NM_000088),上游引物:5′gcttggtccacttgcttgaaga3′,下游引物:5′-gagcattgcctttgattgctg-3′;内参β-actin(NM_001101.3),上游引物:5′-tgacgtggacatccgcaaag-3′,下游引物:5′-ctggaaggtggacagcgagg-3′。PCR扩增反应条件:聚合酶的活化95℃,30s;PCR扩增40个循环(95℃,5s;57℃,30s;72℃,30s)。实验结果采用mRNA相对表达量=2-ΔΔCt×100%算出结果,ΔΔCt=[Ctcoll/E-cadherin/Vimentin/α-SMA(目的基因)-Ctβ-actin(内参照)]实验组-[Ctcoll/E-cadherin/Vimentin/α-SMA(目的基因)-Ctβ-actin(内参照)]对照组。结果表明:与对照组比较,模型组colⅠ基因表达明显上调(P﹤0.01);与模型组相比,罗勒多糖组colⅠ基因表达下调(P﹤0.05)。以上结果表明罗勒多糖能够下调TGF-β诱导的A549细胞colⅠ基因表达。具体结果如图4所示。
3.ELISA法检测测羟脯氨酸含量变化
羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)的测定:将培养48小时后的细胞消化离心,PBS洗两次,离心3分钟,1000r/min,PBS重悬细胞调整细胞密度至1.0×106/mL,-80℃反复冻融3次使细胞充分裂解,3000r/min离心20分钟,收集上清液用于检测。按ELISA试剂盒说明书步骤进行操作如下:将裂解液上清液和梯度稀释的标准品平分别加入预先包被有HYP单抗的酶标板中,同时设空白孔(空白孔不加样品及酶标试剂,其余各操作步骤相同),37℃温箱孵育30分钟;洗板五次;加入HRP的HYP抗体酶标试剂,置37℃温箱孵育30分钟;洗板五次;加入TMB底物进行显色反应,37℃避光孵育15分钟后,加入终止液,在酶标仪测量450nm波长吸光度(OD值),以空白孔调零,绘制标准品标准曲线,计算裂解液上清液的HYP浓度。结果分析:根据已知的浓度标准品和其吸光度得出标准品直线回归方程:Y=161.0X-7.411(r2=0.999)。与正常对照组比较,模型组羟脯氨酸含量增加(P﹤0.05);与模型组比较,罗勒多糖提取物组羟脯氨酸含量减少(P﹤0.05),具体结果如图5所示。
综上所述,罗勒多糖提取物在对于体内外IPF模型均具有一定的抑制纤维化或胶原产生的作用,是一种潜在的治疗肺纤维化的中药提取物。
Claims (2)
1.罗勒多糖提取物在制备治疗肺纤维化药物中的应用,其特征在于,所述罗勒多糖提取物是从植物罗勒单味药中采用下述方法提纯得到的:
将罗勒药材用粉碎机粉碎,将粉碎的罗勒粉用85%乙醇脱脂两次后真空脱水干燥,得到脱脂罗勒粉。在脱脂罗勒粉中加入适量的水煎煮两遍后,过滤收集煎煮液,将两次收集的煎煮液合并后,放入浓缩罐中进行浓缩,使其相对密度达到1.08~1.10,然后将浓缩液冷却至4℃,加入5倍液体量的95%乙醇静置沉淀48小时,收集沉淀物得到罗勒多糖粗品,再将罗勒多糖粗品加适量水溶解,过滤后浓缩,使其相对密度达到1.08~1.10,然后冷却至4℃,在浓缩液中加入5倍量95%乙醇静置沉淀48小时,收集沉淀物,真空干燥脱水即得到罗勒多糖提取物成品。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述罗勒多糖提取物可以制成一切药学可接受口服和非口服制剂形式。
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