EA020596B1 - Аналоги глюкагона - Google Patents

Abstract

Изобретение обеспечивает вещества и способы стимуляции снижения веса или предотвращения увеличения веса, в том числе при лечении сахарного диабета, метаболического синдрома и ассоциированных заболеваний. В частности, настоящее изобретение относится к новым пептидам-аналогам глюкагона, эффективным в таких способах. Действие указанных пептидов может быть обусловлено наличием повышенной селективности в отношении к рецептору GLP-1, по сравнению с глюкагоном человека.

Description

Изобретение относится к аналогам глюкагона и их применению в медицине, например при лечении избыточного потребления пищи, ожирения и лишнего веса.

Предпосылки создания изобретения

Препроглюкагон представляет собой пептид-предшественник из 158 аминокислот, который претерпевает дифференциальный процессинг в тканях с образованием ряда структурно схожих производных от проглюкагона пептидов, в том числе глюкагона (О1и), глюкагон-подобного пептида 1 (д1исадоп-йке рерббе-1, ОЬР-1), глюкагон-подобного пептида 2 (ОЬР-2), оксинтомодулина (ОХМ). Эти молекулы вовлечены в различные физиологические процессы, включающие поддержание гомеостаза глюкозы, секрецию инсулина, опорожнение желудка и рост кишечника, а также регуляцию потребления пищи.

Глюкагон представляет собой пептид из 29 аминокислот, соответствующий аминокислотам 53-81 препроглюкагона и имеющий последовательность Н18-8ег-О1п-О1у-ТЬг-РЬе-ТЬг-8ег-А5р-Туг-8ег-Ьу8-ТугЬеи-Л8р-§ег-Лг§-Лг§-Л1а-О1п-Л8р-РЬе-Уа1-О1п-Тгр-Ьеи-Ме1-Л8п-ТЬг (8ЕЦ ГО N0: 1). Оксинтомодулин (ОХМ) представляет собой пептид из 37 аминокислот, включающий полноразмерную последовательность глюкагона из 29 аминокислот с дополнительным карбоксиконцевым октапептидом (аминокислоты 82-89 препроглюкагона, имеющие последовательность Ьу8-Аг§-А8п-Ат§-А8п-А8п-11е-А1а (8ЕЦ ГО N0: 2) и известные как промежуточный пептид 1 (ш1етуешп§ рерббе 1, 1Р-1); таким образом, полноразмерная последовательность оксинтомодулина человека представляет собой Н18-8ег-О1п-О1у-ТЬт-РЬе-ТЬг-8егА8р-Туг-8ег-Ьу8-Туг-Ьеи-А8р-8ег-Агд-Агд-А1а-О1п-А8р-РЬе-Уа1-О1п-Тгр-Ьеи-Ме1-А8п-ТЬг-Ьу8-Агд-А5пАт§-А8п-А8п-11е-А1а) (8ЕЦ ГО N0: 3). Основной биологически активный фрагмент ОЬР-1 образуется в виде пептида из 30 аминокислот, амидированного по С-концу, который соответствует аминокислотам 98127 препроглюкагона.

Глюкагон способствует поддержанию уровня глюкозы в крови путем связывания с рецепторами глюкагона на поверхности гепатоцитов, в результате чего в печени посредством гликогенолиза высвобождается глюкоза, запасаемая в форме гликогена. При истощении запасов гликогена глюкагон стимулирует в печени синтез глюкозы посредством глюконеогенеза. Глюкоза поступает в кровоток, предотвращая развитие гипогликемии.

ОХМ выбрасывается в кровь в ответ на прием пищи, пропорционально калорийности пищи. Показано, что ОХМ подавляет аппетит и потребление пищи у человека (Сокеп е1 а1., 1оитпа1 оГ Епбостто1о§у апб Ме1аЬо118ш, 88, 4696-4701, 2003; \0 2003/022304). В дополнение к таким аноректическим эффектам, аналогичным действию ОЬР-1, ОХМ также, вероятно, регулирует вес тела посредством другого механизма, поскольку крысы, получавшие оксинтомодулин, демонстрировали меньшее увеличение массы тела, чем группа крыс, получающих одинаковое кормление (В1оот, Епбостшо1о§у 2004, 145, 2687). Лечение страдающих ожирением грызунов с помощью ОХМ также повышает их толерантность к глюкозе (Раг1е\'Пе1 е1 а1., Ат 1. РЬу8ю1 Епбосгто1 Ме1аЬ. 294, Е142-7, 2008) и снижает увеличение массы тела (\0 2003/022304).

ОХМ активирует рецепторы как глюкагона, так и ОЬР-1, при этом является в два раза более эффективным по отношению к рецепторам глюкагона, чем к рецепторам ОЬР-1, но менее эффективен, чем нативный глюкагон и ОЬР-1 по отношению к их соответствующим рецепторам. Глюкагон человека также способен активировать оба рецептора, хотя и с большим предпочтением к рецептору глюкагона, чем к рецептору ОЬР-1. С другой стороны, ОЬР-1 не способен активировать рецепторы глюкагона. Механизм действия оксинтомодулина не до конца исследован. В частности, неизвестно, опосредуется ли действие этого гормона через рецепторы ОЬР-1 и глюкагона, или же через один или несколько не идентифицированных рецепторов.

Известны другие пептиды, связывающиеся как с рецептором глюкагона, так и с рецептором ОЬР-1, активирующие их (Н)от1 е1 а1., 1оитпа1 оГ Вю1ощса1 Скет181ту, 269, 30121-30124,1994) и способствующие снижению увеличения массы тела и уменьшению потребления пищи (\0 2006/134340, \0 2007/100535, \\'0 2008/101017).

Ожирение, представляющее собой глобально нарастающую проблему здоровья человека, ассоциировано с различными заболеваниями, в частности с сердечно-сосудистыми заболеваниями (СС3), сахарным диабетом 2 типа, синдромом обструктивного апноэ сна, некоторыми видами рака и остеоартритом.

Как следствие, ожирение приводит к снижению продолжительности жизни. По прогнозам 2005 года от Всемирной организации здравоохранения во всем мире 400 млн взрослых (в возрасте старше 15 лет) страдают ожирением. В настоящее время в США ожирение считается второй после курения ведущей причиной предотвратимой смертности.

Распространение ожирения вызывает увеличение заболеваемости диабетом, и около 90% людей, страдающих диабетом 2 типа, можно рассматривать как страдающих ожирением. В мире 246 млн человек страдают диабетом, а к 2025 году по оценкам число больных диабетом составит 380 млн. У многих больных имеются дополнительные факторы риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе высокое содержание или аберрантные формы ЛПНП и триглицеридов и низкий уровень ЛПВП.

Люди с сахарным диабетом в 2-4 раза более склонны к развитию сердечно-сосудистых заболеваний, чем люди, не страдающие диабетом, что делает его наиболее частым осложнением сахарного диабета. На

- 1 020596 сердечно-сосудистые заболевания приходится около 50% смертности среди людей, страдающих диабетом. У молодых людей, страдающих диабетом, ишемическая болезнь сердца (ИБС) развивается в 12-40 раз чаще, чем у молодых людей, не страдающих диабетом; наряду с высокой заболеваемостью и распространенностью ожирения и сахарного диабета 2 типа процент смертности и летальности, связанный с этими нарушениями обмена веществ, подчеркивает медицинскую потребность в эффективных способах их лечения.

Таким образом, существует сильно выраженная медицинская потребность в лечении ожирения и в повышении толерантности к глюкозе.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает соединение, имеющее формулу Κ?-Χ-Ζ-Κ², где К¹ представляет собой Н, С_1-4алкил, ацетил, формил, бензоил или трифторацетил;

К² представляет собой ОН или ΝΗ₂;

X представляет собой пептид, имеющий формулу I

Н18-§ег-О1п-О1у-ТЬг-РЬе-ТЬг-§ег-Л8р-Туг-§ег-Ьу8-Туг-Ьеи-Л8р-О1и-Лгд-Лгд-Л1а-Ьу8-Л8р-РЬе-11е-О1и-ТгрЬеи-Ьеи-Бег-А1а (БЕС) ГО N0: 4) или отличается от формулы I не более чем в четырех из следующих положений, при этом, если присутствует отличие от формулы I:

остаток в положении 2 выбран из Э-Бег, Λίό;

остаток в положении 16 выбран из Бег, Акр, Ьук, Лгд;

остаток в положении 18 представляет собой А1а;

остаток в положении 20 выбран из О1п, Агд, О1и, Акр;

остаток в положении 21 представляет собой О1и;

остаток в положении 23 представляет собой Уа1;

остаток в положении 24 выбран из О1п, Акр, Ьук, Агд, А1а;

остаток в положении 27 выбран из Мер Сук, Ьук;

остаток в положении 28 выбран из Акп, Агд, Ьук, А1а, О1и, Акр и остаток в положении 29 выбран из ТЬг, Агд;

Ζ отсутствует или имеет последовательность из 1 -20 аминокислотных единиц, выбранную из группы, включающей А1а, Ьеи, Бег, ТЬг, Туг, Сук, О1и, Ьук, Агд, ОЬи, Орг и Огп;

или фармацевтически приемлемую соль указанного соединения.

В некоторых вариантах реализации X отличается от формулы I не более чем в четырех из следующих положений, при этом, если присутствует отличие от формулы I:

остаток в положении 2 выбран из Ό-Бег, АЬ; остаток в положении 16 выбран из Бег, Акр, Ьук; остаток в положении 20 выбран из О1п, Агд, О1и; остаток в положении 27 выбран из Мер Сук, Ьук; и остаток в положении 28 выбран из Акп, Агд, А1а.

В некоторых вариантах реализации X может отличаться от формулы I не более чем в трех из следующих положений, при этом, если присутствует отличие от формулы I:

остаток в положении 2 выбран из Ό-Бег, АЬ; остаток в положении 16 выбран из Бег, Акр, Ьук и остаток в положении 20 выбран из О1п, Агд, О1и.

В альтернативных вариантах реализации X может отличаться от формулы I не более чем в четырех из следующих положений, при этом, если присутствует отличие от формулы I:

остаток в положении 2 выбран из Ό-Бег, АЬ; остаток в положении 16 выбран из Бег, Акр, Ьук; остаток в положении 18 представляет собой А1а и остаток в положении 20 выбран из О1п, Агд, О1и.

В других вариантах реализации X может отличаться от формулы I не более чем в четырех из следующих положений, при этом, если присутствует отличие от формулы I:

остаток в положении 23 представляет собой Уа1; остаток в положении 24 выбран из О1п, Акр, Ьук, Агд, А1а; остаток в положении 27 выбран из Мер Сук, Ьук и остаток в положении 28 выбран из Акп, Агд, Аа.

В любом варианте реализации, описанном выше, остатки в положениях 16 и 20 могут быть способны формировать соляной мостик. Примеры подходящих пар остатков включают:

16-Акр, 20-Ьук;

16-О1и, 20-Ьук;

16-Акр, 20-Агд;

16-О1и, 20-Агд;

16-Ьук, 20-Акр;

- 2 020596

16-Лг§, 20-Αδρ;

16-Ьу§, 20-О1и;

16-Лг§, 20-О1и.

В качестве дополнения или альтернативы, остатки в положениях 20 и 24 могут быть способны формировать соляной мостик. Примеры подходящих пар остатков включают:

20-Άδρ, 24-^уδ;

20-С1и, 24-^уδ;

20-Αδρ, 24-Лг§;

20-С1и, 24-Лг§;

20-^уδ, 24-Αδρ;

20-Лг§, 24-Αδρ;

20-^уδ, 24-О1и;

20-Лг§, 24-О1и.

Без противоречия определениям, изложенным выше, может быть желательно, чтобы X включал одну или более из следующих комбинаций остатков:

20-^уδ, 24-О1и;

20-^уδ, 23-11е, 24-О1и;

16-О1и, 20-^уδ, 24-О1и;

16-О1и, 20-^уδ;

16-О1и, 20-^уδ, 29-Л1а;

16-О1и, 20-^уδ, 23-11е, 24-О1и;

16-О1и, 20-^уδ, 23-11е, 24-О1и, 29-Л1а;

16-О1и, 20-^уδ, 24-О1и, 29-Л1а;

20-^уδ, 23-11е, 24-О1и, 29-Л1а;

27- Беи, 28-5ег, 29-Л1а;

29-Л1а;

16-5ег;

20-С1и;

23- Уа1;

24- О1и;

16-8ег, 20-С1и;

16-Αδρ, 20-Лг§, 24-Αδρ;

16-^уδ, 20-О1и;

24-Дгу или

28- Αγ§.

Например, Х может иметь последовательность:

ΗδΟΟΤΡΤδΟΥδΚΥΙ_ΟΕΚΒΑΟΟΕΙΕννΐ_Ι_δΑ (δΕΟ Ю ΝΟ: 5); ΗδΟ6ΤΡΤδϋΥδΚΥΙ_0ΕΒΒΑΚ0ΡνΕννΐ.Ι_δΑ (δΕΟ Ю ΝΟ: 6); ΗδΟΟΤΕΤδϋΥδΚΥΙ_ΟΕΒΚΑΚΟΕΙθννΐ_ΙδΑ (δΕΟ Ю ΝΟ: 7); ΗδΟΟΤΕΤδΟΥδΚΥΙ_ΟδΒΒΑΟΟΕΙΕννΐ_Ι_δΑ (δΕΟ Ю ΝΟ: 8); ΗδΟΟΤΕΤδϋΥδΚΥΙ_ΟΟΚΚΑΚΟΕΙθννΐ_1_δΑ (δΕΟ Ю ΝΟ: 9); ΗδΟΟΤΕΤδϋΥδΚΥΙ_ΟΚΚΚΑΕΟΕΙΚννΐ_Ι_δΑ (δΕΟ Ю ΝΟ: 10); ΗδΟΟΤΡΤδϋΥδΚΥΙ_ΟΕΚΚΑΚϋΡΙΒννΐ_Ι_δΑ (δΕΟ Ю ΝΟ: 11); ΗδΟΟΤΕΤδΟΥδΚΥΙ-ΟΕΚΒΑΚΟΡΙΕννίΙΚΑ (δΕΟ Ю ΝΟ: 12); ΗδΟΘΤΡΤδΟΥδΚΥΙ_ϋδΒΒΑΚΟΕΙΕννΐ_Ι_δΑ (δΕΟ Ю ΝΟ: 13); ΗδΟΘΤΡΤδΟΥδΚΥΙ_ΟΕΚΑΑΚΟΡΙΕ\Λ/Ι_Ι_δΑ (δΕΟ Ю ΝΟ: 14); ΗδΟΟΤΕΤδΟΥδΚΥΙ_ΟΕΚΚΑΚΟΕΙϋννΐ_Ι_δΑ(δΕΟ Ю ΝΟ: 15); ΗδΟΘΤΕΤδΟΥδΚΥΙ_ϋΕΚΚΑΚΟΕΙΕννΐ_Ι_ΑΑ (δΕΟ Ю ΝΟ: 16) иии ΗδΟΘΤΕΤδΟΥδΚΥΙ_ΟΕΚΒΑΚΟΡΙΕννΐ_Ι_δΑ (δΕΟ Ю ΝΟ: 17).

Настоящее изобретение также обеспечивает нуклеиновую кислоту (которая может представлять собой ДНК или РНК), кодирующую соединение согласно настоящему изобретению, экспрессионный вектор, содержащий такую нуклеиновую кислоту, и клетку-хозяин, содержащую такую нуклеиновую кислоту или экспрессионный вектор.

Еще в одном своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает композицию, включающую пептид-аналог глюкагона, как определено в настоящем изобретении, или соль или его производное, нуклеиновую кислоту, кодирующую такой пептид-аналог глюкагона, экспрессионный вектор, содержащий такую нуклеиновую кислоту, или клетку-хозяина, содержащую такую нуклеиновую кислоту или экспрессионный вектор, в смеси с носителем. В предпочтительных вариантах реализации указанная композиция

- 3 020596 представляет собой фармацевтически приемлемую композицию, а указанный носитель представляет собой фармацевтически приемлемый носитель. Пептид-аналог глюкагона может представлять собой фармацевтически приемлемую кислотно-аддитивную соль аналога глюкагона.

Описанные соединения находят применение для предотвращения увеличения веса или для стимуляции снижения веса. Предупреждение означает ингибирование или уменьшение набора веса, по сравнению с отсутствием лечения, и необязательно подразумевает полное прекращение увеличения веса тела. Пептиды согласно настоящему изобретению могут обусловливать снижение потребления пищи и/или увеличение расхода энергии, в результате чего наблюдается влияние на вес тела. Независимо от их влияния на вес тела, соединения согласно настоящему изобретению могут оказывать благоприятное влияние на толерантность к глюкозе и уровень циркулирующего холестерина, будучи способными снижать циркулирующие ЛЛНП и повышать соотношение ЛПВП/ЛПНП. Таким образом, соединения согласно настоящему изобретению можно применять для прямой или косвенной терапии любого патологического состояния, вызванного или характеризующегося избыточной массой тела, например, лечения и/или профилактики ожирения, патологического ожирения, воспалительного процесса, связанного с ожирением, заболевания желчного пузыря, связанного с ожирением, апноэ сна, индуцированного ожирением. Указанные соединения также можно применять для лечения метаболического синдрома, резистентности к инсулину, нарушения толерантности к глюкозе, сахарного диабета 2-го типа, артериальной гипертензии, атерогенной дислипидемии, атеросклероза, артериосклероза, ишемической болезни сердца или инсульта. Действие соединений согласно настоящему изобретению при таких патологических состояниях может быть результатом их влияния или быть связано с их влиянием на массу тела, или может не зависеть от него.

Таким образом, изобретение предусматривает применение соединения согласно настоящему изобретению для лечения состояния, как описано выше, у индивидов, нуждающихся в таком лечении.

Изобретение также обеспечивает соединение согласно настоящему изобретению для применения в способе лечения, особенно для применения в способе лечения состояния, как описано выше. Изобретение также обеспечивает применение соединения согласно настоящему изобретению с целью получения лекарственного средства для лечения состояния, как описано выше.

Как уже было упомянуто, настоящее изобретение распространяется на экспрессионные векторы, содержащие описанные выше последовательности нуклеиновых кислот, которые могут быть комбинированы с последовательностями, регулирующими их экспрессию, и клетки-хозяева, содержащие экспрессионные векторы. Предпочтительно клетки-хозяева способны экспрессировать и секретировать соединения согласно настоящему изобретению. В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения соединений, включающий культивирование указанных клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии соединения, и очистку соединения, полученного таким образом.

Изобретение также обеспечивает нуклеиновую кислоту согласно изобретению, экспрессионный вектор согласно изобретению или клетку-хозяина, способную экспрессировать и секретировать соединения согласно изобретению, для применения в способах лечения. Следует иметь в виду, что указанные нуклеиновые кислоты, экспрессионный вектор и клетки-хозяева можно применять для лечения любого из нарушений, описанных в настоящем изобретении, которые можно лечить с помощью указанных соединений. При упоминании терапевтической композиции, содержащей соединение согласно настоящему изобретению, вариантов введения соединения согласно изобретению или любого терапевтического применения таких соединений также подразумевается эквивалентное применение нуклеиновых кислот, экспрессионного вектора или клетки-хозяина согласно изобретению, если из контекста не следует иное.

Описание графических материалов

Фиг. 1. Влияние ΖΡ2663 на толерантность к глюкозе при оральном тесте у мышей бЬ/бЬ.

У мышей ИЬ/бЬ, не получавших корм в течение ночи, брали первичные образцы крови (уровень глюкозы в крови натощак) перед введением (внутрибрюшинно) наполнителя или ΖΡ2663 (45 нмоль/кг). Через 15 мин мышам перорально вводили глюкозу (1 г/кг в 5 мл/кг) и измеряли уровень глюкозы в крови при 1=30 мин, 1=60 мин, 1=120 мин и 1=240 мин. Измеряли разницу по сравнению с базовым уровнем глюкозы (1=0) для каждого момента времени и определяли площадь под кривой АИС_{0-240 мин}. ΖΡ2663 значительно увеличивал толерантность к глюкозе у мышей бЬ/бЬ, страдающих диабетом.

Фиг. 2. Влияние ΖΡ2663 на потребление корма у мышей.

Группы мышей (разделенных в соответствии с массой тела) не получавших корм в течение ночи, обрабатывали ΡΥΥ3-36 (30 нмоль/кг) (внутренний положительный контроль), глюкагоном (500 нмоль/кг), ΖΡ2663 (500 нмоль/кг) или наполнителем. Через 1 ч мышам давали предварительно взвешенный корм, оценивали потребление корма путем взвешивания оставшегося корма после одного часа и рассчитывали значения относительно массы тела (мг пищи/г массы тела). ΡΥΥ (3-36) демонстрировал аноректический эффект, как и ожидалось на основании полученных ранее результатов. ΖΡ2663 (500 нмоль/кг) вызывал значительное сокращение потребления корма в течение первого часа после инъекции пептида. Глюкагон не оказывал влияние на потребление корма.

Фиг. 3. Влияние 28-дневного лечения с помощью ΖΡ2663 на увеличение массы тела у мышей с алиментарным ожирением (ИЮ).

- 4 020596

Самцов мышей С57В1/6 содержали на диете с высоким содержанием жиров (НЕЙ) и вводили им (дважды в день, подкожно) ΖΡ2663 (500 нмоль/кг) или наполнитель. Контрольной группе мышей, не страдающих ожирением, которых содержали на обычном рационе, вводили наполнитель (ί'ΉΟ\ν) согласно схеме, указанной для группы мышей ΌΙΟ. Массу тела измеряли ежедневно и с учетом массы тела вводили мышам дозы пептида на протяжении всего исследования. ΖΡ2663 замедлял увеличение массы тела на том же уровне, что и при содержании мышей на обычном рационе.

Фиг. 4. Влияние обработки двойным агонистом О1и-ОЬР-1 мышей ΌΙΟ в течение 4 недель (дважды в день) на концентрацию холестерина ЛПНП.

Эффект ОХМ (Р=0,002) и ΖΡ2663 (Р=0,0001) является статистически значимым по сравнению с наполнителем.

Фиг. 5. Влияние обработки двойным агонистом О1и-ОЬР-1 мышей ΌΙΟ в течение 4 недель (дважды в день) на соотношение ЛПВП/ЛПНП.

В качестве наполнителя для ОХМ и эксендина-4 применяли ФСБ (рН 7,4), в качестве наполнителя для ΖΡ2663 применяли ацетат (рН 5,0). Эффект ОХМ (Р=0,002%) и ΖΡ2663 (Р=0,05%) является статистически значимым по сравнению с наполнителем.

Подробное описание изобретения

В настоящем описании используется стандартный однобуквенный и трехбуквенный код для обозначения природных аминокислот, а также общепринятый трехбуквенный код для других аминокислот, таких как Λίό (α-аминоизомасляная кислота), Огп (орнитин), ЭЬи (2,4-диаминомасляная кислота) и Эрт (2,3-диаминопропановая кислота).

Термин нативный глюкагон относится к природному глюкагону человека, имеющему последовательность ΟΙγ-ΤΙΐΓ-ΡΙιο-ΤΙΐΓ-δοΓ-Αφ-ΤΥΓ-δοΓ-Εγδ-ΤΥΓ-Εοιι-Αφ-δοΓ-ΑΓβ-ΑΓβ-ΑΙα-ΟΙη-Αφ-ΡΙιο-ναΙ-ΟΙη-ΤΓρБси-Мс1-А5п-ТПг-ОН (ЛЕС) ΙΌ ΝΟ: 1).

Термины оксинтомодулин и ОХМ относятся к природному оксинтомодулину человека, имеющему последовательность Η-Ηίδ-3θΓ-01η-01γ-ΤΗΓ-ΡΗο-ΤΗΓ-3θΓ-Αδρ-ΤγΓ-8θΓ-Εγδ-ΤγΓ-Εου-Αδρ-8θΓ-ΑΓ§-ΑΓ§Α1α-Ο1η-Αδρ-ΡΡθ-να1-Ο1η-Ττρ-Ρθυ-Μθΐ-Αδη-ΤΗτ-Ργδ-Α§-Αδη-Ατ§-Αδη-Αδη-Ι1θ-Α1α-ΟΗ (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 3).

Изобретение обеспечивает соединения, как определено выше. Во избежание неправильного толкования, в приводимых в настоящем изобретении определениях, как правило, предполагается, что последовательность X отличается от формулы Ι только по тем положениям, для которых указано, что в них могут присутствовать отличия. Предполагается, что аминокислоты в последовательности X можно пронумеровать последовательно с 1 по 29 в общепринятом направлении от Ν-конца к С-концу. При упоминании положения в пределах X подразумевается соответствующее положение в пределах нативного глюкагона человека и других молекул.

Соединения согласно настоящему изобретению могут содержать один или более внутримолекулярный мостик в пептидной последовательности X. Каждый такой мостик образуется между боковыми цепями двух аминокислотных остатков X, которые, как правило, разделены тремя аминокислотами в линейной последовательности X (т.е. между аминокислотой А и аминокислотой А+4).

В частности, мостик может быть образован между боковыми цепями остатков пар 12 и 16, 16 и 20, 17 и 21, 20 и 24 или 24 и 28. Две боковые цепи могут быть соединены друг с другом посредством ионных взаимодействий или через ковалентные связи. Таким образом, эти пары могут включать остатки противоположно заряженных боковых цепей для формирования солевого мостика посредством ионных взаимодействий. Например, один из остатков может представлять собой О1и или Αδρ, тогда как другой может представлять собой Εγδ или Ατ§. Взаимодействие пары Εγδ и О1и и Αδρ Εγδ может также реагировать на форму лактамного кольца. Кроме того, Τγτ и О1и или Τγτ и Αδρ способны образовывать лактоновое кольцо.

В частности, остатки в положениях 16 и 20, и/или 20 и 24 могут формировать внутримолекулярные мостики. Примеры подходящих пар остатков в этих положениях включают:

16-Αδρ, 20-Εγδ;

16-О1и, 20-Εγδ;

16-Αδρ, 20-Αγ§;

16-О1и, 20-Ατ§;

16-Εγδ, 20-Αδρ;

16-Ατ§, 20-Αδρ;

16-Εγδ, 20-О1и;

16-Ατ§, 20-О1и и/или

20-Αδρ, 24-Εγδ;

20-О1и, 24-Εγδ;

20-Αδρ, 24-Ατ§;

20-О1и, 24-Ατ§;

20-Εγδ, 24-Αδρ;

20-Ατ§, 24-Αδρ;

20-Εγδ, 24-О1и, 20-Ατ§, 24-О1и.

- 5 020596

Вне связи с какой-либо конкретной теорией считается, что такие внутримолекулярные мостики стабилизируют альфа-спиральную структуру молекулы и таким образом повышают эффективность и/или селективность в отношении рецепторов СЬР-1 и, возможно, рецептора глюкагона. Вне связи с какойлибо конкретной теорией, остатки аргинина в положениях 17 и 18 нативного глюкагона обеспечивают значительную селективность по отношению к рецептору глюкагона. Гидрофобный остаток (например, А1а) в положении 18 может повысить эффективность по отношению как к рецептору СЬР-1, так и к рецептору глюкагона.

Замена в положении 23 (например, на 11е) может усиливать эффективность и/или селективность в отношении рецептора СЬР-1.

Замена в положении 24 (например, на С1и) может усиливать эффективность и/или селективность в отношении рецептора СЬР-1.

Вне связи с какой-либо конкретной теорией, остатки в положениях 27, 28 и 29 нативного глюкагона, как было показано, обеспечивают значительную селективность по отношению к рецептору глюкагона. Замены по одному, двум или всем трем из этих положений в последовательности нативного глюкагона может увеличить эффективность и/или селективность по отношению к рецептору СЬР-1 без существенного снижения эффективности по отношению к рецептору глюкагона. Конкретные примеры включают Ьеи в положении 27, 8ег в положении 28 и А1а в положении 29.

Замена природного остатка Ме! в положении 27 (например, на Ьеи или Ьук, в частности на Ьеи) также снижает возможность окисления, таким образом увеличивая химическую стабильность соединений согласно настоящему изобретению.

Замена природного остатка Акп в положении 28 (например, на 8ег, Агд или А1а) также снижает вероятность дезамидирования в кислом растворе, таким образом увеличивая химическую стабильность соединений согласно настоящему изобретению.

Эффективность и/или селективность по отношению к рецептору СЬР-1 также можно увеличить путем введения остатков, которые могут формировать амфипатическую спиральную структуру, потенциально без значительной потери эффективности по отношению к рецептору глюкагона. Это может быть достигнуто путем введения заряженных остатков в одно или более из положений 16, 20, 24 и 28. Таким образом, все остатки в положениях 16 и 20 могут быть заряженными, все остатки в положениях 16, 20 и 24 могут быть заряженными, или все остатки в положениях 16, 20, 24 и 28 могут быть заряженными. Например, остаток в положении 16 может представлять собой С1и, Ьук или Акр. Остаток в положении 20 может представлять собой Ьук, Агд или С1и. Остаток в положении 24 может представлять собой С1и, Акр, Ьук или Агд. Остаток в положении 28 может представлять собой Агд.

Замена одного или обоих природных остатков С1п в положениях 20 и 24 также снижает возможность дезамидирования в кислом растворе, таким образом увеличивая химическую стабильность соединений согласно настоящему изобретению. Остаток в положении 24 может представлять собой С1и, Акр, Ьук Агд или А1а.

Соединение согласно настоящему изобретению может содержать С-концевую пептидную последовательность Ζ из 1-20 аминокислот, например, для стабилизации конформации и/или вторичной структуры пептида-аналога глюкагона, и/или для обеспечения большей устойчивости к ферментативному гидролизу пептида-аналога глюкагона, например, как описано в νθ 99/46283.

Если присутствует, Ζ представляет собой пептидную последовательность из 1-20 аминокислотных остатков, например из 1-15, более предпочтительно из 1-10, в частности из 1-7 аминокислотных остатков, например 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислотных остатков, например из 6 аминокислотных остатков. Каждый из аминокислотных остатков в пептидной последовательности Ζ может быть независимо выбран из А1а, Ьеи, 8ег, ТЬг, Туг, С1и, Ьук, Агд, ЭЬи (2,4-диаминомасляной кислоты), ΌρΓ (2,3диаминопропановой кислоты) и От (орнитина). Предпочтительно аминокислотные остатки выбраны из 8ег, ТЬг, Туг, Сук, С1и, Ьук, Агд, ОЬи, ΌρΓ и От, более предпочтительно только из С1и, Ьук, и Сук. Вышеупомянутые аминокислоты могут находиться либо в Ό-, либо в Ь-конфигурации, но предпочтительно находятся в Ь-конфигурации. Особенно предпочтительными последовательностями Ζ являются последовательности из четырех, пяти, шести или семи последовательных остатков лизина (т.е. Ьук₃, Ьук₄, Ьук₅, Ьук₆ или Ьук₇), и в особенности пяти или шести последовательных остатков лизина. Другие примеры последовательностей Ζ приведены в νθ 01/04156. В качестве альтернативы, остаток на С-конце последовательности Ζ может представлять собой остаток Сук. Такой остаток может способствовать модификации (например, ПЭГилированию) указанного соединения. В таких вариантах реализации длина последовательности Ζ может, например, составлять только одну аминокислоту (т.е. Ζ=Сук) или длина может составлять две, три, четыре, пять, шесть или даже более аминокислот. Другие аминокислоты, таким образом, служат спейсером между пептидом X и концевым остатком Сук.

Пептидная последовательность Ζ имеет не более 25% идентичности по последовательности с соответствующей последовательностью участка 1Р-1 ОХМ человека (который имеет последовательность ЬукАгд-Акп-Агд-Акп-Акп-11е-А1а).

Процент (%) идентичности последовательности аминокислот данной пептидной или полипептидной последовательности по отношению к другой полипептидной последовательности (например, 1Р-1)

- 6 020596 рассчитывают как процент аминокислотных остатков в данной пептидной последовательности, которые совпадают с соответствующими аминокислотными остатками в соответствующей последовательности указанного другого полипептида при выравнивании двух последовательностей относительно друг друга при введении пробелов для оптимального выравнивания в случае необходимости. Значения % идентичности могут быть определены с помощью ^и-ВЬА8Т-2 (Л115с1ш1 с1 а1., Ме1йоЙ8 ίη Еп/уто1оду, 266:460480 (1996)). АЕ-ВЕЛ8Т-2 использует несколько параметров поиска, большинство из которых установлены в виде значений по умолчанию. Регулируемые параметры устанавливаются с помощью следующих значений: интервал перекрывания=1, доля перекрываний=0,125, порог слова (Т)=11. Значение % идентичности по последовательности аминокислот рассчитывают как количество совпадающих идентичных остатков, определенных с помощью ^и-ВЬА8Т-2, деленное на общее количество остатков эталонной последовательности (при этом пробелы, введенные ^и-ВЬА8Т-2 в эталонную последовательность с целью максимального счета выравнивания, не учитывают), умноженное на 100.

Таким образом, при оптимальном выравнивании Ζ с 8 аминокислотами из ΙΡ-1 он имеет не более двух аминокислот, которые идентичны соответствующим аминокислотам ΙΡ-1.

Одна или несколько боковых цепей аминокислот в соединении согласно настоящему изобретению может быть конъюгирована с липофильным заместителем. Липофильный заместитель может быть ковалентно связан с атомом боковой цепи аминокислоты, или, в качестве альтернативы, может быть конъюгирован с боковой цепью аминокислотой посредством спейсера. Аминокислота может представлять собой часть пептида X или часть пептида Ζ.

Вне связи с какой-либо теорией считается, что указанный липофильный заместитель связывает альбумин в кровотоке, таким образом экранируя соединения согласно настоящему изобретению от ферментативной деградации, что может увеличивать период полужизни соединений. Спейсер, если он присутствует, применяют, чтобы обеспечить промежуток между соединением и указанным липофильным заместителем.

Липофильный заместитель может быть присоединен к боковой цепи аминокислоты или спейсеру через сложный эфир, сульфонильный эфир, тиоэфир, амид или сульфаниламид. Соответственно, подразумевается, что предпочтительно липофильный заместитель включает ацильную группу, сульфонильную группу, атом Ν, атом О или атом 8, которые являются частью сложного эфира, сульфонильного эфира, тиоэфира, амида или сульфаниламида. Предпочтительно ацильная группа в составе липофильного заместителя образует часть амида или сложного эфира с боковой цепью аминокислоты или спейсером.

Липофильный заместитель может включать углеводородную цепь, содержащую от 4 до 30 атомов углерода. Предпочтительно указанный заместитель содержит по меньшей мере 8 или 12 атомов углерода, предпочтительно он содержит 24 атомов углерода или менее либо 20 атомов углерода или менее. Углеводородная цепь может быть линейной или разветвленной и может быть насыщенной или ненасыщенной. Подразумевается, что углеводородная цепь предпочтительно содержит замещающую группу, которая присоединена к боковой цепи аминокислоты или спейсера, например ацильную группу, сульфонильную группу, атом Ν, атом О или атом 8. Наиболее предпочтительно углеводородная цепь замещена ацилом, и соответственно углеводородная цепь может быть частью алканоильной группы, например пальмитоила, капроила, лауроила, миристоила или стеароила.

Соответственно, липофильный заместитель может иметь формулу, представленную ниже

А может представлять собой, например, ацильную группу, сульфонильную группу, ΝΗ, Ν-алкил, атом О или атом 8, предпочтительно ацил;

η - целое число от 3 до 29, предпочтительно по меньшей мере 7 или по меньшей мере 11, а более предпочтительно 23 или менее, более предпочтительно 19 или менее.

Указанная углеводородная цепь может содержать дополнительный заместитель. Например, углеводородная цепь может дополнительно содержать до трех заместителей, выбранных из ΝΗ₂, ОН и СООН. Если углеводородная цепь содержит дополнительный заместитель, предпочтительно она содержит только один заместитель. В качестве альтернативы или дополнения, углеводородная цепь могут включать циклоалкан или гетероциклоалкан, например, как показано ниже:

Предпочтительно циклоалкан или гетероциклоалкан представляет собой шестичленное кольцо. Наиболее предпочтительно он представляет собой пиперидин.

В качестве альтернативы, липофильный заместитель может содержать в основе циклопентанофенантреновый остов, который может быть частично или полностью ненасыщенным или насыщенным. Каждый атом углерода в остове может быть замещен группой Ме или ОН. Например, липофильный заместитель может представлять собой холил, дезоксихолил или литохолил.

Как упоминалось выше, липофильный заместитель может быть конъюгирован с боковой цепью аминокислоты посредством спейсера. Если присутствует, указанный спейсер присоединен к липофильному заместителю и боковой цепи аминокислоты. Спейсер может быть присоединен к липофильному

- 7 020596 заместителю и боковой цепи аминокислоты, независимо, посредством сложного эфира, сульфонильного эфира, тиоэфира, амида или сульфаниламида. Соответственно, он может содержать два фрагмента, независимо выбранных из ацила, сульфонила, атома Ν, атома О или атома 8. Спейсер может иметь формулу

где В и Ό независимо выбраны из ацила, сульфонила, ΝΗ, Ν-алкила, атома О или атома 8, предпочтительно из ацила и ΝΗ.

Предпочтительно η представляет собой целое число от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 5. Спейсер может быть дополнительно замещен одним или более заместителем, выбранным из алкила-С_1-б, алкиламина-С_0-6, алкилгидрокси-С_0-6 и алкилкарбокси-С_0-6.

В качестве альтернативы, указанный спейсер может содержать два или более повторяющихся звена, которые имеют указанную выше формулу. В, Ό и η выбирают для каждого повторного звена независимым образом. Смежные повторяющиеся звенья могут быть ковалентно связаны друг с другом через соответствующие группы В и Ό. Например, группы В и Ό из смежных повторяющихся звеньев могут в совокупности образовывать сложный эфир, сульфонильный эфир, тиоэфир, амид или сульфаниламид. Свободные звенья В и Ό с каждого конца спейсера присоединены к боковой цепи аминокислоты и липофильному заместителю, как описано выше.

Предпочтительно указанный спейсер содержит пять или менее, четыре или менее или три или менее повторяющихся звеньев. Наиболее предпочтительно спейсер содержит два повторяющихся звена или одно звено.

Указанный спейсер (или одно или более повторяющееся звено спейсера, если он содержит повторяющиеся звенья) может представлять собой, например, природную или неприродную аминокислоту. Подразумевается, что для аминокислот, имеющих функционализированные боковые цепи, В и/или Ό могут представлять собой фрагмент боковой цепи аминокислоты. Спейсер может быть любой природной или неприродной аминокислотой. Например, спейсер (или одно или более повторяющееся звено спейсера, если он содержит повторяющиеся звенья) может представлять собой С1у, Рго, А1а, Уа1, Ьеи, 11е, Ме1, Сук, РНе, Туг, Тгр, Ηίκ, Ьук, Агд, 01η, Акп, а-С1и, у-С1и, Акр, 8ег ТНг. СаНа, ΑίΗ, β-Α1α, 5-аминопентаноил, 6-аминогексаноил, 7-аминогептаноил, 8-аминооктаноил, 9-аминононаноил или 10-аминодеканоил.

Например, указанный спейсер может представлять собой одну аминокислоту, выбранную из у-С1и, СаНа, Н-А1а и а-С1у.

Липофильный заместитель может быть конъюгирован с боковой цепью любой из аминокислот соединений согласно настоящему изобретению. Предпочтительно боковая цепь аминокислоты включает карбокси, гидрокси, тиол, амидные или аминогруппы для образования сложного эфира, сульфонильного эфира, тиоэфира, амида или сульфаниламида со спейсером или липофильным заместителем. Например, липофильный заместитель может быть конъюгирован с Акп, Акр, С1и, С1п, Ηίκ, Ьук, Агд, 8ег, ТНг, Туг, Тгр, Сук или ЭНи, Эрт и Огп. Предпочтительно липофильный заместитель конъюгирован с Ьук. Однако любая аминокислота, обозначенная как Ьук в формулах, приведенных в настоящем изобретении, может быть замещена на ЭНи, Орт и Огп, при присоединении липофильного заместителя.

Пример липофильного заместителя и спейсера представлен в приведенной ниже формуле

Здесь, Ьук из соединения согласно настоящему изобретению ковалентно присоединен к у-С1и (спейсер) посредством амидной группы. Пальмитоил ковалентно присоединен к спейсеру у-С1и посредством амидной группы.

В качестве альтернативы или дополнения, одна или более боковая цепь аминокислоты в соединении согласно настоящему изобретению может быть конъюгирована с полимерной группой, например, с целью увеличения растворимости и/или периода полужизни ш νίνο (например, в плазме крови) и/или биодоступности. Также известно, что такая модификация уменьшает выведение из организма (например, выведение через почки) терапевтических белков и пептидов.

Полимерная группа предпочтительно растворима в воде (является амфифильной или гидрофильной), нетоксична и фармацевтически инертна. Подходящие полимерные группы включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), гомо- или сополимеры ПЭГ, монометил-замещенные полимеры ПЭГ (МПЭГ), или полиоксиэтилен глицерол (ПОГ). См., например, !п1. 1. Неша1о1оду 68:1 (1998); Вюсопщда1е СНет. 6:150

- 8 020596 (1995); апб Сгк. Кеу. Ткегар. Эгид Сатег §ук. 9:249 (1992).

Другие подходящие полимерные группы включают полиаминокислоты, такие как полилизин, полиаспарагиновую кислоту и полиглутаминовую кислоту (см., например, СотЬо1/. е! а1. (1995), Вюсоп)ида1е Скет., νοί. 6: 332-351; Нибес/, е! а1. (1992), Вюсои)ида1е Скет., νοί. 3, 49-57; Ткикаба, е! а1. (1984), 1. ЫаЙ. Сапсег 1пк!., νοί. 73: 721-729; и Рга!ек1, е! а1. (1985), Вг. 1. Сапсег, νοί. 52: 841-848).

Полимерная группа может быть линейной или разветвленной. Она может иметь молекулярную массу 500-40000 Да, например 500-10000, 1000-5000, 10000-20000 или 20000-40000 Да.

Соединение согласно настоящему изобретению может содержать две или более такие группы, в этом случае суммарный молекулярный вес всех таких групп, как правило, попадает в диапазоны, указанные выше.

Полимерные группы могут быть соединены (посредством ковалентной связи) с амино, карбоксильной или тиоловой группой боковой цепи аминокислоты. Предпочтительными примерами являются тиоловые группы остатков Сук и эпсилон-аминогруппы остатков Ьук, и также можно применять карбоксильные группы остатков Акр и С1и.

Специалисту в данной области хорошо известны соответствующие способы, которые можно применять для реакции сочетания. Например, ПЭГ фрагмент, несущий метоксигруппу, может быть присоединен к тиоловой группе Сук посредством малеимидной связи с помощью регентов, коммерчески доступны от Ыек1аг Ткегареийск АЬ. Более подробную информацию о подходящих химических группах см. также в νθ 2008/101017 и источниках, приведенных выше.

Синтез пептидов.

Соединения согласно настоящему изобретению можно получить с помощью стандартных способов синтеза, с помощью рекомбинантных систем для экспрессии или любым другим способом, известным в данной области. Таким образом, аналоги глюкагона могут быть синтезированы рядом способов, включая, например, способ, включающий:

(а) синтез пептида твердофазным или жидкофазным способом, последовательно или путем соединения фрагментов, с последующим выделением и очисткой конечного пептида;

(б) экспрессию генетической конструкции нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, в клеткехозяине и выделение продукта экспрессии из культуры клеток хозяина или (в) осуществление внеклеточной экспрессии ίη νίίτο генетической конструкции нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, и выделение продукта экспрессии;

или любую комбинацию способов (а), (б) и (в) с получением фрагментов пептида с последующим соединением фрагментов для получения пептида, и выделение пептида.

Предпочтителен синтез аналогов согласно настоящему изобретению с помощью твердофазного или жидкофазного синтеза пептидов. Этот аспект рассмотрен в νθ 98/11125 и, среди множества других источников, Рйпар1ек апб ргасйсе ο£ юйб-ркаке рерйбе куп!кеык. Ιη: §уп!кейс Рерйбек (2пб Ебкюп) и примерах, приведенных в настоящем документе.

Для рекомбинантной экспрессии фрагменты нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению, как правило, помещают в соответствующие векторы для получения векторов для клонирования или экспрессионных векторов, несущих фрагменты нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению; такие новые векторы также являются частью изобретения. Векторы могут, в зависимости от цели и типа назначения, представлять собой плазмиды, фаги, космиды, минихромосомы или вирусы; кроме того, чистая ДНК, которая только временным образом экспрессируется в определенных клетках, также представляет собой важный вектор. Предпочтительные вектора для клонирования или экспрессионные векторы (плазмидные векторы) согласно настоящему изобретению способны к автономной репликации, тем самым обеспечивая высокую копийность для целей высокого уровня экспрессии или высокого уровня репликации для последующего клонирования.

В общих чертах, экспрессионный вектор включает в себя следующие особенности в направлении 5'^3', которые функциональным образом соединены друг с другом: промотор, управляющий экспрессией фрагмента нуклеиновой кислоты изобретения, при необходимости последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей лидерный пептид, обеспечивающий секрецию (во внеклеточную фазу или, где это применимо, в периплазму); фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий пептид согласно настоящему изобретению, и, при необходимости последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терминатор. Перечисленные компоненты могут включать в себя дополнительные особенности, такие как селективные маркеры и точки начала репликации. При работе с экспрессионным вектором в штаммахпродуцентах или в клеточных линиях может быть предпочтительно, чтобы вектор был способен интегрироваться в геном клетки-хозяина. Специалисты, хорошо знакомые с соответствующими векторами, способны сконструировать вектора в соответствии с их специфическими требованиями.

Векторы согласно настоящему изобретению применяют для трансформации клеток-хозяев для получения соединения согласно изобретению. Такие трансформированные клетки, которые также являются частью настоящего изобретения, могут быть культивируемыми клетками или клеточными линиями, используемыми для размножения фрагментов нуклеиновых кислот и векторов изобретения, или их можно применять для производства рекомбинантных пептидов согласно настоящему изобретению.

- 9 020596

Предпочтительными трансформированными клетками согласно настоящему изобретению являются микроорганизмы, такие как бактерии (например, виды рода ЕксйейсЫа (например, Е.еой), ВасШик (например, ВасШик киЫШк), 8а1тоие11а или МусоЪас1егшт (желательно непатогенные, например, М. Βονίκ ВСС)), дрожжи (такие как, ЗассЬаготусек се^еν^5^ае) и простейшие. Кроме того, трансформированные клетки могут быть получены из многоклеточного организма, т.е. это могут быть клетки грибов, насекомых, растений или млекопитающих. Для целей клонирования и/или оптимизированной экспрессии предпочтительно, чтобы трансформированная клетка была способна к репликации фрагмента нуклеиновых кислот изобретения. Клетки, экспрессирующие фрагмент нуклеиновой кислоты, являются полезным осуществлением изобретения; их можно применять для мелкомасштабной или крупномасштабной продукции пептида согласно настоящему изобретению.

При производстве пептида согласно настоящему изобретению с помощью трансформированных клеток, удобно, хотя это и не является существенным, чтобы продукт экспрессии секретировался в культуральную среду.

Эффективность.

Связывание соответствующих соединений с рецепторами к ОЬР-1 или глюкагону (О1и) можно использовать как индикатор агонистической активности, но, в целом, предпочтительнее использовать биологический тест, который позволяет оценить внутриклеточный путь передачи сигнала, индуцированный связыванием соединения с соответствующим рецептором. Например, активация рецепторов глюкагона агонистом глюкагона стимулирует образование клеточного циклического АМФ (цАМФ). Сходным образом, активация ОЬР-1 рецепторов агонистом ОЬР-1 стимулирует образование клеточного цАМФ. Таким образом, выработку цАМФ в подходящих клетках, экспрессирующих один из этих двух рецепторов, можно использовать для мониторинга активности соответствующих рецепторов. Применение подходящей пары типов клеток, каждый из которых экспрессирует только один тип рецептора, соответственно, можно использовать для определения агонистической активности в отношении обоих типов рецепторов.

Специалистам известны подходящие способы анализа; примеры приведены ниже. Рецепторы к ОЬР-1 и/или глюкагону могут иметь последовательности рецепторов, как описано в примерах. Например, в тестах можно использовать рецептор к глюкагону человека (глюкагон-К), имеющий первичный регистрационный номер, О1: 4503947 и/или рецептор к глюкагон-подобному пептиду 1 человека (ОЬР1К), имеющий первичный регистрационный номер О1: 166795283 (в случаях, где приведены последовательности белка-предшественника, следует понимать, что для анализа необходимо использовать зрелый белок, в котором отсутствует сигнальная последовательность).

Значение ЕС₅₀ можно использовать в качестве численной меры агонистической эффективности данного рецептора. Значение ЕС₅₀ представляет собой единицу измерения концентрации соединения, необходимой для достижения половины максимальной активности соединения в конкретном анализе. Так, например, соединение с ЕС₅₀[ОЬР-1] ниже, чем ЕС₅₀[ОЬР-1] глюкагона, в конкретном анализе может рассматриваться как соединение с более высокой эффективностью связывания с ОЬР-1, чем глюкагон.

Соединения, описанные в данном изобретении, как правило, представляют собой двойные агонисты О1и-ОЬР-1, т.е. они способны стимулировать образование цАМФ при связывании как с рецептором глюкагона, так и с рецептором ОЬР-1. Стимулирование каждого рецептора можно измерить в независимых тестах, а затем сравнить полученные значения друг с другом.

При сравнении значения ЕС₅₀ рецептора глюкагона (ЕС₅₀ [Глюкагон-К]) со значением ЕС₅₀ для рецептора ОЬР-1 (ЕС₅₀ [ОЬР-1К]) для данного соединения можно рассчитать относительную селективность глюкагона (%) для данного соединения как

Относительная селективность Г люкагон-К [соединение] = (1/ЕС₅₀ [Глюкагон-К])х100/(1/ЕС₅₀ [Глюкагон-К] + 1/ЕС₅₀ [ОЬР-1К])

Относительную ОЬР-1К селективность также можно рассчитать как

Относительная ОЬР-1К селективность [соединение] = (1/ЕС₅₀ [ОЬР-1К])х100/(1/ЕС₅₀ [Глюкагон-К] + 1/ЕС₅₀ [ОЬР-1К])

Относительная селективность соединения позволяет сравнить влияние на рецептор ОЬР-1 или глюкагона с его эффектом на другой рецептор. Например, чем больше относительная селективность соединения относительно ОЬР-1, тем более эффективно дано соединение по отношению к рецептору ОЬР-1, по сравнению с рецептором к глюкагону.

При использовании тестов, описанных ниже, авторы изобретения обнаружили, что относительная селективность ОЬР-1 в сравнении с глюкагоном человека составляет примерно 5%.

Соединения согласно настоящему изобретению имеют более высокую относительную селективность по отношению к ОЬР-1К, чем глюкагон человека. Таким образом, при конкретном уровне агонистической активности по отношению к рецептору глюкагона, соединение будет демонстрировать более высокий уровень агонистической активности ОЬР-1К (т.е. большую эффективность по отношению к рецептору ОЬР-1), чем глюкагон. Следует иметь в виду, что абсолютные значения эффективности конкретного соединения по отношению к рецептору глюкагона и ОЬР-1 могут быть выше, ниже или прибли- 10 020596 зительно равны аналогичным значениям для нативного глюкагона человека при условии, что достигается соответствующая относительная селективность к СЬР-1К.

Тем не менее, соединения согласно настоящему изобретению могут иметь более низкое значение ЕС₅₀ [СЬР-1К], чем глюкагон человека. Соединения могут иметь более низкое значение ЕС₅₀ [СЬР-1-К], чем глюкагон, сохраняя при этом ЕС₅₀ [Глюкагон-К], которое менее чем в 10 раз выше, чем у глюкагона человека, менее чем в 5 раз выше, чем у глюкагона человека, или менее чем в 2 раза выше, чем у глюкагона человека.

Соединения согласно настоящему изобретению могут характеризоваться значением ЕС₅₀ [Глюкагон-К], которое менее чем в два раза отличается от аналогичного значения для глюкагона человека. Указанные соединения могут характеризоваться значением ЕС₅₀ [Глюкагон-К], которое менее чем в два раза отличается от значения для глюкагона человека, и значением ЕС₅₀ [ОЬР-1К], которое составляет менее половины от значения для глюкагона человека, менее пятой части от значения для глюкагона человека или менее одной десятой от значения для глюкагона человека.

Относительная селективность СЬР-1 соединений согласно настоящему изобретению может составлять от 5 до 95%. Например, соединения согласно настоящему изобретению могут иметь относительную селективность 5-20%, 10-30%, 20-50%, 30-70% или 50-80%, или 30-50%, 40-60%, 50-70% или 75-95%.

Терапевтическое применение.

Соединения согласно настоящему изобретению могут обеспечить перспективный подход для лечения ожирения и метаболических заболеваний, включая диабет типа 2.

Сахарный диабет, который часто называют просто как диабет, представляет собой синдром нарушения обмена веществ, обычно вследствие сочетания наследственных и экологических причин, выражающийся в аномально высоком уровне сахара в крови (гипергликемия).

Уровень глюкозы в крови находится под контролем гормона инсулина, производимого бетаклетками поджелудочной железы. Диабет развивается из-за разрушения продуцирующих инсулин панкреатических бета-клеток (при диабете 1 типа) или из-за устойчивости к воздействию инсулина (при гестационном диабете), а затем потери бета-клеток (при диабете 2 типа). Оба типа диабета приводят к гипергликемии, что во многом является причиной острых признаков диабета: чрезмерной выработке мочи, вызывающей компенсационную жажду и увеличение потребления жидкости, ухудшении зрения, необъяснимой потери веса, вялости, а также изменений в энергетическом обмене.

Метаболический синдром характеризуется группой метаболических факторов риска у отдельно взятого человека. Они включают в себя абдоминальное ожирение (избыточная жировая ткань вокруг внутренних органов брюшной полости), атерогенную дислипидемию (нарушения жиров в крови, включая высокий уровень триглицеридов, низкий уровень холестерина ЛНВП и/или высокий ЛПНП холестерина, что способствует образованию бляшек на стенках артерий), повышенное кровяное давление (гипертония), резистентность к инсулину и нарушение устойчивости к глюкозе, протромботическое состояние (например, высокий уровень фибриногена и ингибитора активатора плазминогена-1 в крови) и провоспалительное состояние (например, повышенный уровень С-реактивного белка в крови).

Индивиды с метаболическим синдромом имеют повышенный риск развития диабета типа 2, а также ишемической болезни сердца и других заболеваний, связанных с другими проявлениями атеросклероза (например, инсульта и заболевания периферических сосудов). Доминирующими основными факторами риска для этого синдрома представляются абдоминальное ожирение, резистентность к инсулину и нарушение толерантности к глюкозе. Резистентность к инсулину представляет собой общее метаболическое нарушение, при котором организм не способен эффективно использовать инсулин.

Вне связи с какой-либо конкретной теорией считается, что соединения согласно настоящему изобретению действуют как двойные агонисты С1иСЬР-1. Двойной агонист сочетает в себе действие глюкагона на жировой обмен с влиянием СЬР-1 на уровень глюкозы в крови и прием пищи. Соединения согласно настоящему изобретению, таким образом, могут действовать в синергетическом режиме и ускорять устранение излишних жировых отложений, вызвать устойчивое снижение веса и непосредственно снижать аномальный уровень глюкозы до нормального без риска гипогликемии, которая связана с сопутствующим использованием СЬР-1 агонистов и сульфонилмочевины.

Синергетический эффект двойных агонистов С1иСЬР-1 может также привести к снижению сердечно-сосудистых факторов риска, таких как высокий уровень холестерина и ЛПНП, а также изменить устойчивость к глюкозе, приведенные факторы могут быть полностью независимы от их влияния на массу тела.

Соединения согласно настоящему изобретению можно применять в качестве лекарственного средства для предотвращения увеличения веса, способствующего снижению веса, устранению избыточной массы тела или лечения ожирения (например, контроль аппетита, питания, приема пищи, калорий, и/или расхода энергии), в том числе патологического ожирения, а также сопутствующих заболеваний и состояний, включая, но не ограничивая, ожирение, связанное с воспалением, ожирение, связанное с заболеванием желчного пузыря, и ожирение, индуцирующее апноэ сна. Соединения согласно настоящему изобретению можно также применять для лечения метаболического синдрома, резистентности к инсулину, нарушения толерантности к глюкозе, сахарного диабета 2 типа, артериальной гипертензии, атерогенной

- 11 020596 дислипидемии, атеросклероза, артериосклероза, ишемической болезни сердца и инсульта. Все эти патологические состояния могут быть связаны с ожирением. Тем не менее, влияние соединений изобретения на указанные патологические состояния может быть опосредовано в целом или частично через влияние на вес тела, или может быть независимым от него.

Фармацевтические композиции.

Соединения согласно настоящему изобретению или их соли могут быть приготовлены как фармацевтические смеси, пригодные для хранения или введения, которые обычно содержат терапевтически эффективное количество соединения согласно настоящему изобретению, или его соли в фармацевтически приемлемом носителе.

Терапевтически эффективное количество соединения согласно настоящему изобретению будет зависеть от пути введения, типа млекопитающего, которого лечат, и физических характеристик конкретного рассматриваемого млекопитающего. Эти факторы и их отношение к определению этого количества хорошо известны квалифицированным врачам. Это количество и способ введения могут быть адаптированы для достижения оптимальной эффективности и могут зависеть от таких факторов, как вес, диета, одновременное лечение другими препаратами и других факторов, хорошо известных квалифицированным врачам. Для определения размеров доз и режима дозирования, наиболее подходящего для человека, можно руководствоваться результатами согласно настоящему изобретению, которые могут быть подтверждены в тщательно спланированных клинических испытаниях.

Эффективная доза и протокол лечения может быть определен с помощью традиционных средств, начиная с низкой дозы на лабораторных животных, а затем посредством увеличения дозы параллельным наблюдением эффектов, а также путем систематического изменения режима дозирования. Многочисленные факторы должны рассматриваться врачом при определении оптимальной дозы для данной персоны. Такие соображения известны специалистам.

Термин фармацевтически приемлемый носитель включает любой из стандартных фармацевтических носителей. Фармацевтически приемлемые носители для терапевтического применения хорошо известны в фармакологии и описаны, например, в РеттдЮпА РЬагтасеиИса1 8аспсс5. Маск РиЪНзЫпд Со. (А.К. Сеииаго еДД 1985). Например, можно применять стерильный физиологический раствор и фосфатно-солевой буфер при слегка подкисленных или физиологических значениях рН. рН-буферными агентами могут быть фосфат, цитрат, ацетат, (трис/гидроксиметил)аминометан (ТРИС), Ν-трис(гидроксиметил)метил-З-аминопропансульфоновая кислота (ТАР8), бикарбонат аммония, диэтаноламин, гистидин, который представляет собой предпочтительный буфер, аргинин, лизин, или ацетат, или их смеси. Термин в дальнейшем включает любой агент, указанный в Фармакопее США для применения у животных, включая человека.

Термин фармацевтически приемлемые соли относится к солям соединений. Соли включают фармацевтически приемлемые соли, такие как кислотно-аддитивные соли и основные соли. Примерами кислотно-аддитивных солей являются гидрохлориды, цитраты и ацетаты. Примерами основных солей являются соли, где катион выбран из щелочных металлов, таких как натрий и калий, щелочно-земельных металлов, таких как кальций, и ионы аммония + Ν(Κ³)3(Κ⁴), где К³ и К⁴ независимо обозначают необязательно замещенный С1-6алкил, необязательно замещенный С_2-балкенил, необязательно замещенный арил или необязательно замещенный гетероарил. Другие примеры фармацевтически приемлемых солей описаны в Кет1пд1оп'8РЬагтасеи11са18с1епсе8, 17'¹' еДбоп. ЕД ЛИотоР. Сеииаго (ЕД), МагкРиЪНзЫидСотрапу, Еа81оп, РА, И8А, 1985 и в более поздних изданиях, а также в энциклопедии фармацевтической технологии.

Лечение представляет собой подход для получения полезных или желаемых клинических результатов. Для целей данного изобретения полезные или желаемые клинические результаты включают, но не ограничиваются перечисленным, облегчение симптомов, уменьшение степени тяжести заболевания, стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) состояния болезни, задержку или замедление прогрессирования заболевания, улучшение или паллиативное лечение болезненного состояния, и ремиссию (частичную или полную), независимо от того, обнаружены или не обнаружены. Лечение может также означать продление срока жизни по сравнению с ожидаемым сроком жизни при отсутствии лечения. Лечение является вмешательством, осуществляемым с целью предотвращения развития или изменения патологии расстройства. Соответственно, термин лечение относится как к терапевтическим, так и к профилактическим и предупредительным мерам. К тем, кто нуждается в лечении, относятся носители заболевания, а также те лица, у которых необходимо предотвратить развитие заболевания.

Фармацевтические композиции могут быть в форме дозы для однократного введения. В таком виде смесь разделена на единичные дозы, содержащие соответствующие количества активного компонента. Единичная доза может быть подготовлена для упаковки, содержащей дискретные количества препаратов, например, пакетик таблеток, капсул и порошков во флаконах или ампулах. Единичная доза может быть также в виде капсул, облаток или таблеток, или это может быть соответствующее количество любой из этих упаковочных форм. Упаковка может быть предоставлена в виде разовой дозы в инъекционной форме, например в виде ручки. Смеси могут быть разработаны для любого приемлемого способа и вида введения. Фармацевтически приемлемые носители или разбавители включают те, которые исполь- 12 020596 зуются в составах, пригодных для перорального, ректального, назального, местного (в том числе защечного и подъязычного), вагинального или парентерального (включая подкожные, внутримышечные, внутривенные, внутрикожные и трансдермальные) введения. Смеси могут быть удобно представлены в форме единичной дозы и могут быть получены любым из способов, хорошо известных в области фармацевтики.

Для соединений, описанных в настоящем изобретении, в особенности подходят подкожные или трансдермальные способы введения.

Комбинированная терапия.

Соединения согласно настоящему изобретению можно вводить в рамках комбинированной терапии с агентом для лечения сахарного диабета, ожирения или гипертонии.

В таких случаях два указанных активных агента можно назначать совместно или по отдельности, как часть одного и того же фармацевтического препарата, или в виде отдельных препаратов.

Таким образом, соединение согласно настоящему изобретению (или его соль) можно применять в сочетании с антидиабетическими агентами, включая, но не ограничиваясь приведенными примерами, метформин, сульфонилмочевину, глинид, ΌΡΡ-ΐν ингибитор, глитазон или инсулин. В предпочтительном варианте соединения или соли согласно настоящему изобретению применяют в комбинации с инсулином, ΌΡΡ-ΐν ингибитором, сульфонилмочевиной или метформином, особенно с сульфонилмочевиной или метформином, для достижения адекватного контроля гликемии. В еще более предпочтительном варианте соединения или соли применяют в комбинации с инсулином или аналогом инсулина для достижения адекватного контроля гликемии. Примеры аналогов инсулина включают, но не ограничиваются перечисленными, Ьайик, Νονοπιρίά. Нита1од, Ыоуот1 и АсЛарйаиеНМ.

Соединение или соль можно, кроме того, применять в комбинации с агентами против ожирения включая, но не ограничиваясь данными примерами, агонист рецептора глюкагон-подобного пептида 1, пептид ΥΥ или его аналог, антагонист каннабиноидного рецептора 1, ингибитор липазы, агонист рецептора 4 меланокортина или антагонист концентрирующего гормональных рецептора 1 меланина.

Аналог соединения согласно настоящему изобретению или его соль можно применять в комбинации с агентами от гипертонии, включая, но не ограничиваясь данными примерами, ингибитор ангиотензин-превращающего фермента, блокатор рецептора ангиотензина ΐΐ, диуретики, бета-блокаторы или блокаторы кальциевых каналов.

Методы

Общий синтез аналогов глюкагона.

Твердофазный синтез пептидов осуществляли, как СППС на синтезаторе, оборудованном микроволнами, с использованием стандартной Ртое-стратегии в ΝΜΡ на полистирольной смоле (Теи1аСе18Кат). НАТИ вместе с ΌΙΡΕΑ в качестве основания использовали в качестве связывающего реагента. Пиперидин (20% в ΝΜΡ) использовали для снятия защиты. Псевдопролины: Ριποο-Ρ1β;-Τ1ιγ (Ρδί. Ме, Мерго)-ОН и Ртос-Акр-8ег (Ρδί. Ме, Мерго)-ОН (приобретены у ШуаВюсНет) использовали, где это было применимо.

Отщепление.

Синтезированный пептид отщепляли от смолы путем обработки 95/2.5/2.5% (у/у) ТРА/Т18/вода при комнатной температуре в течение 2 ч. Для пептидов с метионином в последовательности использовали смесь 95/5% (у/у) ТРА/ΕΌΤ. Большинство ТРА удаляли при пониженном давлении, синтезированный пептид осаждали, промывали диэтиловым эфиром и высушивали до постоянной массы при комнатной температуре.

Общий синтез ацилированных аналогов глюкагона.

Неочищенный пептида синтезировали, как описано выше для общего синтеза аналогов глюкагона, за исключением, что неочищенный пептид ацилировали по боковой цепи остатка лизина, пока пептид был связан со смолой и полностью защищен по группам боковых цепей, за исключением эпсилон-амина на лизине, который должен быть ацилирован. Лизин, который должен быть ацилирован, вводили с помощью Ртос-Ьук (|уЭбе)-ОН. Ν-конец пептида защищали группой Вос с использованием Вос₂О в NΜΡ. В то время как пептид был связан со смолой, защитную группу 1уЭбе избирательно отщепляли при помощи 2% гидразин гидрата в ИМБ. Незащищенная боковая цепь лизина сначала связывается с спейсерной аминокислотой, как Ртос-С1и-О1Ви, с которой снимали защиту пиперидином и ацилировали жирными кислотами с использованием стандартной методологии связывания пептида, как описано выше. Наоборот, гистидин на Ν-конце может быть включен в начало, как Вос-Нй (Вос)-ОН. Отщепление от смолы и очистку осуществляли, как описано выше.

Анализ стабильности пептида.

Аналоги глюкагона инкубировали в виде твердых соединений при 40°С и растворяли в виде растворов в 0,1 М водной НС1 (2 мг/мл). Растворы инкубировали при 40°. Оставшиеся интактными аналоги глюкагона измеряли путем ОФ-ВЭЖХ путем интеграции УФ-сигнала при 220 нм. Процент оставшихся интактными аналогов глюкагона представляет собой меру относительной стабильности. Твердые и растворенные соединения глюкагона перед анализом разводили в растворителях для ВЭЖХ до концентрации 0,2 мг/мл и анализировали в соответствующих временных точках.

- 13 020596

Таблица 1

Параметры аналитической ВЭЖХ

Колонка	Сетю! С18 150x3мм
Градиент (время; % В)	(0-Змин; 18%В) (3-22мин; 45%В) (22-23мин; 95%В) (23-24мин; 18%В) (24-ЗОмин; 18%В)
Растворитель А	0.1 % ТРА в 1% Μθ0Ν:Μ0νν
Растворитель Б	0.085 % ТРА вМеСЫ
Поток	0.300 мл/мин
Объём инъекции	35 мкл
Температура колонки.	30“С
Детекция УФ	220 нм

Получение клеточных линий, экспрессирующих глюкагон и ОЬР-1 рецептор человека.

кДНК, кодирующую рецептор глюкагона человека (глюкагон-К) (первичный регистрационный номер Р47871) и рецептор глюкагон-подобного пептида 1 человека (ОЬР-1К) (первичный регистрационный номер Р43220), клонировали из клонов кДНК ВС104854 (МОС: 132514Дтаде: 8143857) или ВС112126 (МОС: 138331ДМАОЕ: 8327594) соответственно. ДНК, кодирующую рецептор глюкагона или ОЬР-1-К, амплифицировали методом ПЦР с использованием праймеров, в состав которых входят концевые сайты рестрикции для субклонирования. К 5'-концу праймера дополнительно присоединяли близкую к консенсусу последовательности Козака для обеспечения эффективной трансляции. Отсутствие ошибок в ДНК, кодирующей О1и-садоп-К и ОЬР-1-К, проверяли путем секвенирования ДНК. ПЦР-продукты, кодирующие О1исадоп-К или ОЬР-1-К, субклонировали в экспрессионный вектор млекопитающих, содержащий ген устойчивости к неомицину (О418).

Экспрессионные векторы млекопитающих, кодирующие О1исадоп-К или ОЬР-1-К, трансфицировали в НЕК293 путем стандартного способа трансфекции с фосфатом кальция. Через 48 ч после трансфекции клетки высевали для ограничения разбавления клонирования и отбирали на культуральной среде с 1 мг/мл О418. Три недели спустя 12 выживших колоний, клетки которых экспрессировали рецептор глюкагона и ОЬР-1-К, собрали, размножали и применяли в анализе по определению эффективности в отношении к рецептору глюкагона и ОЬР-1-К, как описано ниже. Для анализа профиля соединений был выбран один клон, экспрессирующий рецептор глюкагона, и один клон, экспрессирующий ОЬР-1-К.

Анализ эффективности по отношению к рецептору глюкагона и рецептору ОЬР-1.

Клетки НЕК293, экспрессирующие рецептор глюкагона человека, или рецептор ОЬР-1 человека, высевали в количестве 40000 клеток на лунку в 96-луночные микротитровальные планшеты, покрытые 0,01% поли-Ь-лизином, и выращивали в течение 1 дня в культуре в 100 мкл культуральной среды. В день анализа культуральную среду удаляли и клетки промывали однократно 200 мкл буфера Тугойе. Клетки инкубировали в 100 мкл буфера Тугойе, содержащего возрастающие концентрации тестовых пептидов, 100 мкл IΒМX и 6 мМ глюкозу, в течение 15 мин при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 25 мкл 0,5 М НС1, инкубировали на льду в течение 60 мин. Содержание цАМФ оценивали при помощи набора Р1акЬР1а1е®сАМР от Рег-кш-Е1тег. ЕС₅₀ и относительную эффективность по сравнению с эталонными соединениями (глюкагон и ОЬР-1) оценивали путем программного совмещения с кривой.

Липолиз в первичных адипоцитах крыс.

Эффект аналогов глюкагона на липолиз исследовали на первичных культурах адипоцитов крыс. Адипоциты выделяли из эпидидимальной жировой ткани, полученной от нормальных молодых половозрелых крыс Бргадие-ЭаМеу. Куски жира измельчали и инкубировали на шейкере (220 об/мин) с коллагеназой (1 мг/мл) в буфер Кребса-Рингера, содержащего 4% ВБА (ККВ-БСА) в течение 60 мин при 37°С. Суспензию фильтровали через нейлоновый фильтр (размер пор 160 мкм), фильтрат центрифугировали при 200хд в течение 3 мин. Среду под верхним плавающим слоем адипоцитов удаляли пастеровской пипеткой. Адипоциты промывали 3 раза в ККВ-ВБА буфере, ресуспендировали и центрифугировали. Адипоциты ресуспендировали в ККВ-ВБА буфере, смешивали и инкубировали на шейкере с тестовыми соединениями в 96-луночных глубоких планшетах (50 000 клеток/лунку) в общем объеме 1 мл при 37°С в течение 60 мин. Планшеты оставляли на льду в течение не менее 10 мин после инкубации с последующим центрифугированием при 200хд в течение 3 мин. 300 мкл буфера из-под слоя адипоцитов помещали в 96-луночные глубокие планшеты. Этот процесс повторяли еще два раза, затем объединяли 3 экстракта, собранные от каждой культуры. Г лицерин, образовавшийся в результате липолиза в культурах адипоцитов, измеряли путем добавления реагента свободного глицерина (200 мкл) к аликвотам экстракт адипоцитов (25 мкл), инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин и измеряли оптическую плотность при 540 нм.

Оральный тест на толерантность к глюкозе (ОТТГ) у мышей йЬ/йЬ.

У мышей йЬ/йЬ ЭЬи, не получавших корм в течение ночи, брали первичные образцы крови (уровень глюкозы в крови натощак) перед введением (внутрибрюшинно) наполнителя (ацетатный буфер, 20 мМ

- 14 020596 уксусная кислота, 250 мМ маннитол, рН 5,0) или тестируемых соединений (5 мл/кг, в.б.) эксендин-4 (0,56, 1,67 и 5,0 нмоль/кг ув ФСБ) и ΖΡ2663 (8ЕЦ ГО N0: 4) (5 и 45 нмоль/кг). В ходе эксперимента мышам не давали корм, во избежание эффекта смешения с потребляемым кормом. Через 15 мин мышам перорально вводили глюкозу (1 г/кг в 5 мл/кг) и измеряли уровень глюкозы в крови при 4=30 мин, 4=60 мин, 4=120 мин и 4=240 мин.

Измеряли разницу по сравнению с базовым уровнем глюкозы (4=0) для каждого момента времени и определяли площадь под кривой ЛИС_{0-240 мин}. Статистический анализ значений ЛИС путем однофакторного дисперсионного анализа и апостериорного анализа Даннетта проводили с помощью программы ОгарЬРаЛ Ρπδΐη версии 4. Различия рассматривали как статистически значимые при р<0,05.

Потребление корма у нормальных мышей.

За неделю до исследования мышам С57В1/6 (8 недель) (N=9-12 животных в каждой группе) вводили путем ежедневных инъекций (подкожно) 0,2 мл наполнителя и адаптировали мышей к условиям эксперимента путем их взвешивания дважды в неделю. За один день до начала эксперимента мышей разделяли на группы со схожими значениями массы тела (МТ). Группам мышей, не получавших корма в течение ночи, вводили (10 мкл раствора тестируемого соединения/г МТ, подкожно) ΡΥΥ3-36 (30 нмоль/кг; внутренний положительный контроль), глюкагон (500 нмоль/кг) и ΖΡ2663 (8ЕЦ ГО N0: 4) (500 нмоль/кг) или наполнитель (ФСБ). Через 1 ч мышам давали предварительно взвешенный корм, оценивали потребление корма путем взвешивания оставшегося корма после 1 ч и рассчитывали значения относительно массы тела (мг пищи/кг МТ). Статистический анализ данных по потреблению корма путем однофакторного дисперсионного анализа и апостериорного анализа Даннетта проводили с помощью программы ОтарЬРаЛ Ргют версии 4. Различия рассматривали как статистически значимые при р<0,05.

Влияние 28-дневного лечения мышей с алиментарным ожирением (ΌΙ0) с помощью агониста ОЬР1 и двойного агониста О1иОЬР-1 на массу тела и содержание холестерина в плазме.

За четыре недели до медикаментозного лечения самцов мышей С57В1/6 (7 недель) (N=9-12 животных в каждой группе) сажали на диету с высоким содержание жиров (ΗΡΌ) и устанавливали им цикл дня и ночи при 2000/0800 час. Экспериментальных животных подготавливали к лечению путем ежедневных инъекций (п/к) по 0,1 мл наполнителя и адаптировали их к условиям эксперимента путем взвешивания дважды в неделю перед введением лекарственного препарата. За день до начала эксперимента мышей разделяли на группы со схожими значениями массы тела (МТ) и на следующий день группам мышей вводили (дважды в день, п/к) ΖΡ2663 (8ЕЦ ГО N0: 4) (500 нмоль/кг) или наполнители (ацетатный буфер 20 мМ уксусная кислота, 250 мМ маннитол, рН 5,0). Оксинтомодулин и эксендин-4 вводили в растворе ФСБ (рН 7.4; 2.5 мкл/г МТ), тогда как ΖΡ2663 (8ЕЦ ГО N0: 4) вводили в изотоническом ацетатном буфере (рН 4,8; 2,5 мкл/г МТ). Контрольной группе мышей, не страдающих ожирением, которых содержали на обычном рационе, вводили наполнитель согласно схеме, указанной для группы мышей ΌΙ0. Массу тела измеряли ежедневно и с учетом массы тела вводили мышам дозы пептида на протяжении всего исследования. Животные не получали корм в течение ночи перед умерщвлением. Образцы крови глаза (0,6 мл ЭДТА) собирали на следующее утро непосредственно перед смещением шейных позвонков. Образцы плазмы крови хранили при температуре -80°С перед анализом на содержание холестерина, ЛПВП и ЛЛНП с использованием коммерчески доступных наборов. Увеличение массы тела рассчитывали для каждого животного, вычитая значение его массы в момент начала лечения.

Эффект лечения на увеличение массы тела и содержание холестерина оценивали с помощью 2факторного дисперсионного анализа с повторными измерениями и апостериорного теста Бонферрони с использованием программы Отар№аЛ Ρπδΐη версии 4. Различия рассматривали как статистически значимые при р<0,05.

Результаты

Пример 1. Стабильность пептида.

Данные по инкубации в стрессирующем растворе НС1 приведены в табл. 2. Все соединения в виде сухого вещества оказались стабильными в течение 5 недель при температуре 40°С, выход составил более 90% чистоты. Однако данные по кислотной деградации соединений указывают на то, что аналог глюкагона в четыре раза более стабилен по сравнению с нативным глюкагоном.

Таблица 2

Стабильность пептида

соединение ΖΡ	Восстановление (%) пептид в сух. веществе	Восстановление (%) 0.1МНС1
глюкагон	91	15
2663	95	71

- 15 020596

Пример 2. Эффективность по отношению к рецепторам глюкагона и ΟΕΡ-1.

Таблица 3

Значения ЕС₅₀ рецепторов глюкагона и ΟΕΡ-1

		ΟΙ.Ρ-1Κ экм (нмоль)	οί-ик ЭК 50 (нмоль)
Глюкагон		2,0	0.10
ОХМ		1,0	0,50
эксендин- 4		0,02	>1,000,
ΖΡ2663 (ЗЕО ГО ΝΟ: 4)	Η-Η5Ο6ΤΡΤ50Υ5ΚΥ10ΕΚΒΑΚϋΕΙΕννΐ 1.5Α-ΝΗ2	0,06	0,06
Ю060082 (ЗЕО ГО ΝΟ: 5)‘	Η-Η5ΟΟΤΕΤ5ΟΥ5ΚΥΙ_ΟΕΚΚΑΟΟΕΙΕννΐ_ί_5Α-ΝΗ2	0,09	0,12
Ю06-	Η-Η3Ο<3ΤΡΤ30Υ3ΚΥ10ΕΡΡΑΚϋΡνΕννΐ15Α-	0,08	0,12

0083 (ЗЕО ГО ΝΟ: 6)‘	ΝΗ2
Ю060084 (ЗЕО ГО ΝΟ: 7)‘	Η-Η30ΘΤΡΤ50Υ3ΚΥί0ΕΡΚΑΚ0ΕΙ0ννί15Α-ΝΗ2	0,07	0,13
1.0060090 (ЗЕО ГО ΝΟ: 8)’	Η-Η300ΤΡΤ30Υ5ΚΥ103ΕΚΑΟΟΕ1Εννΐ15Α-ΝΗ2	0,15	0,22
1.0060093 (ЗЕО ГО ΝΟ: 9)*	Н-НЗОеТЕТЗОУЗКУЮОРРгАРОЕГО^ИЗА- ΝΗ2	0,07	0,10
1.0060094 (ЗЕО ГО ΝΟ: 10)*	ΡΙΉ50ΘΤΡΤ50 Υ5ΚΥΙ_ϋ ΚΡΒΑΕϋ ΡΙКУ/ИЗА-Ы Η2	0,16	0,25
1.0060128 (ЗЕО ГО ΝΟ: 11)*	Η-Η300ΤΡΤ5ϋΥ3ΚΥΙ_0 ΕΚΡΑΚϋ ΡΙ К^ИЗА-Ы Η2	0,16	0,22
1.0060138 (ЗЕО ГО ΝΟ: 12)*	Η-Η30ΘΤΡΤ30Υ3ΚΥίΌ ЕРРАКО ΡΙ ΕΙΜ-Ι-βΑ-Ν Η2	0,29	0,38
Ю060081 (ЗЕО ГО ΝΟ: 13)’	Η-Η306ΤΡΤ30Υ3ΚΥΙ_03ΚΒΑΚ0 ΡΙ Ε ννϋβΑ-Ν Η2	0,14	0,23
1.0060108 (ЗЕО ГО ΝΟ: 14)*	Η-Η5Ο6ΤΡΤ30Υ3ΚΥΙ.0ΕΚΑΑΚ0ΡΙΕννΐ-Ι-5Α-ΝΗ2	0,53	0,81
1.0060129 (ЗЕО ГО ΝΟ: 15)*	Η-Η306ΤΕΤ50Υ3ΚΥ10ΕΡΒΑΚ0ΡΙ0ννΐ Ι 5Α-ΝΗ2	0,20	0,24
Ю060136 (ЗЕО ГО ΝΟ: 16)*	Н-Н50еТРТ50УЗКУЮЕР1РАК0Р1Е\Л/Ш\А-ЫН2	0,22	0,33
Ю060295 (ЗЕО ГО ΝΟ: 17)*	Η-Η3ΟΘΤΡΤ50Υ3ΚΥ!.0ΕΚΚΑΚ0ΡΙΕννΐ-Ι-3Α-ΟΗ	0,28	0,12

Соединения, обозначенные *, представляют собой неочищенные пептиды со степенью чистоты менее 90%. Значения ЕС₅₀ скорректированы для степени чистоты 50%.

- 16 020596

Пример 3. Анализ липолиза.

Таблица 4

Стимуляция липолиза в первичных культурах адипоцитов крыс (более подробную информацию см. в разделе Методы)

Соединение	ЕС50 (нМ)
Эксендин -4	нет эффекта
Глюкэгон	6
ОХМ	180
ΖΡ2663 {ЗЕО Ю N0: 4)	4,4

Эксендин-4 и ОХМ не оказывали влияния или оказывали незначительное влияние на липолиз в первичных культурах адипоцитов. ΖΡ2663 (8ЕЦ ГО N0: 4) оказался сопоставим по эффективности с глюкагоном и в 40 раз эффективнее, чем ОХМ. Тот факт, что 4-недельное лечение мышей ΌΙ0 с помощью ΖΡ2663 (8ЕЦ ГО N0: 4) вызывало значительное снижение отложения жира, соответствует наблюдаемому эффекту (табл. 4) на липидный обмен липолиз в первичных культурах адипоцитов.

Пример 4. Влияние на толерантность к глюкозе в оральном тесте у мышей ЛН/ЛН.

ΖΡ2663 (8ЕЦ ГО N0: 4) достоверно повышал толерантность к глюкозе, измеренную в ходе ОТТГ у страдающих диабетом мышей ЛН/ЛН (фиг. 1). ΖΡ2663 (8ЕЦГО N0: 4) усиливал толерантность к глюкозе на 64,9% при 45 нмоль/кг.

Пример 5. Влияние на потребление корма у мышей.

Животные, которым вводили наполнитель, потребляли 0,033±0,001 г корма на 1 г массы тела в течение первого часа (фиг. 2). ΡΥΥ(3-36) демонстрировал аноректический эффект, как ожидалось на основании предыдущих результатов. ΖΡ2663 (8ЕЦ ГО N0: 4) (500 нмоль/кг) значительно снижал потребление корма в течение первого часа после инъекции пептида (фиг. 2). Глюкагон не влияет на рацион питания.

Пример 6. Влияние подкожного введения на увеличение массы тела у мышей с алиментарным ожирением (ΌΙ0).

ΖΡ2663 (8ЕЦ ГО N0: 4) снижал увеличение массы тела до уровня, наблюдаемого при кормлении обычным кормом (фиг. 3). Увеличение массы тела было значительно снижено по сравнению с группой, получавшей наполнитель.

Пример 7. Влияние на ЛПНП и ЛПВП.

Эксендин-4 представляет собой очень эффективный агонист 0ΕΡ-1Κ, но он не оказывает влияния на С1иК и не демонстрировал эффекта в анализе липолиза на адипоцитах крыс, описанного выше. Кроме того, эксендин-4 не влияет на концентрацию в крови общего холестерина, ЛПВП, ЛПНП или соотношение ЛПВП/ЛПНП (фиг. 4, 5).

В отличие от этого, лечение мышей ΌΙ0 с помощью ΖΡ2663 (8ЕЦ ГО N0: 4) оказывало значительное влияние на концентрацию в крови холестерина ЛННП (Р=0,0001), а также на соотношение ЛНВП/ЛННП (Р=0,0006) по сравнению с наполнителем (фиг. 4, 5).

Claims (26)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение, имеющее формулу

   Κ’-Χ-Ζ-Κ², где Κ¹ представляет собой Н, С1_-4алкил, ацетил, формил, бензоил или трифторацетил;

   Κ² представляет собой ОН или :кН₂;

   Χ представляет собой пептид, который имеет формулу Ι Η^κ-8е^-С1η-С1у-ТН^-ΡНе-ТН^-8е^-Ακρ-Ту^-8е^-^уκ-Ту^-^еи-Ακρ-С1и-Α^д-Α^д-Α1а-^уκ-Ακρ-ΡНе-I1е-С1и-Т^ρЬеи-Ьеи-8ег-А1а (8ЕО ГО N0: 4) или отличается от формулы Ι не более чем в четырех из следующих положений, при этом, если присутствует отличие от формулы Ι:

   остаток в положении 2 выбран из Э-8ег, АН;

   остаток в положении 16 выбран из 8ег, Акр, Ьук, Агд;

   остаток в положении 18 представляет собой А1а;

   остаток в положении 20 выбран из С1п, Агд, С1и, Акр;

   остаток в положении 21 представляет собой С1и;

   остаток в положении 23 представляет собой Уа1;

   остаток в положении 24 выбран из С1п, Акр, Ьук, Агд, А1а;

   остаток в положении 27 выбран из Ме), Сук, Ьук;

   остаток в положении 28 выбран из Акп, Агд, Ьук, А1а, С1и, Акр;

   Ζ отсутствует или представляет собой последовательность из 1-20 аминокислотных остатков, выбранных из группы, включающей А1а, Ьеи, 8ег, ТНг, Туг, Сук, С1и, Ьук, Агд, ЭНи, Орт и 0гп,

   - 17 020596 или фармацевтически приемлемая соль указанного соединения.
2. 2. Соединение по п.1, где X отличается от формулы I не более чем в четырех из следующих положений, при этом, если присутствует отличие от формулы Ι:

   остаток в положении 2 выбран из О-8ег, Λίό; остаток в положении 16 выбран из 8ег, Акр, Ьук; остаток в положении 20 выбран из О1п, Агд, С1и; остаток в положении 27 выбран из Ме1, Сук, Ьук и остаток в положении 28 выбран из Акп, Агд, А1а.
3. 3. Соединение по п.2, где X отличается от формулы I не более чем в трех из следующих положений, при этом, если присутствует отличие от формулы Ι:

   остаток в положении 2 выбран из 0-8ег, Λίό; остаток в положении 16 выбран из 8ег, Акр, Ьук и остаток в положении 20 выбран из С1п, Агд, С1и.
4. 4. Соединение по п.1, где X отличается от формулы I не более чем в четырех из следующих положений, при этом, если присутствует отличие от формулы I:

   остаток в положении 2 выбран из 0-8ег, АЪ; остаток в положении 16 выбран из 8ег, Акр, Ьук; остаток в положении 18 представляет собой А1а и остаток в положении 20 выбран из С1п, Агд, С1и.
5. 5. Соединение по п.1, где пептид X отличается от формулы I не более чем в четырех из следующих положений, при этом, если присутствует отличие от формулы I:

   остаток в положении 23 представляет собой Уа1; остаток в положении 24 выбран из С1п, Акр, Ьук, Агд, А1а; остаток в положении 27 выбран из Ме1, Сук, Ьук и остаток в положении 28 выбран из Акп, Агд, А1а.
6. 6. Соединение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что остатки в положениях 16 и 20 и/или 20 и 24 способны образовывать соляной мостик.
7. 7. Соединение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что X включает одну или более из следующих комбинаций остатков:

   20-Ьук, 24-С1и;

   20-Ьук, 23-Пе, 24-С1и;

   16-С1и, 20-Ьук, 24-С1и;

   16-С1и, 20-Ьук;

   16-С1и, 20-Ьук, 29-А1а;

   16-С1и, 20-Ьук, 23-Пе, 24-С1и;

   20-Ьук, 23-Пе, 24-С1и;

   27- Ьеи, 28-8ег, 29-А1а;

   16-8ег;

   20-С1п;

   23- Уа1;

   24- С1п;

   16-8ег, 20-С1п;

   16-Акр, 20-Агд, 24-Акр;

   16-Ьук, 20-С1и;

   24-Агд или

   28- Агд.
8. 8. Соединение по п.1, отличающееся тем, что X имеет последовательность:

   - 18 020596

   Η50ΟΤΕΤ50Υ3ΚΥΙ_05ΚΚΑΚ0ΕΙΕννΐ_Ι_3Α(5Ε0 Ю ΝΟ: 13); Η30ΟΤΕΤ30Υ3ΚΥΙ_0ΕΡΚΑ0ϋΗΕννΐ_Ι_5Α (ЗЕО Ю ΝΟ: 5); Η500ΤΡΤ50Υ3ΚΥΙ_0ΕΚΚΑΚ0ΕνΕ\Λ/Ι_1_5Α (ЗЕО Ю ΝΟ: 6); Η50ΟΤΡΤ50Υ5ΚΥΙ_0ΕΡΚΑΚ0ΕΙ0ννΐ_Ι_5Α (ЗЕО Ю ΝΟ: 7); Η50ΘΤΕΤ50Υ3ΚΥΙ_03ΡΡΑ00ΕΙΕννΐ_Ι_5Α (ЗЕО Ю ΝΟ: 8); Η5ΟΘΤΕΤ3ΟΥ3ΚΥΙ_Ο0ΡΚΑΚ0ΡΙ0ννΐ_13Α (ЗЕО Ю ΝΟ: 9); Η50ΟΤΡΤ30Υ5ΚΥΙ_0ΚΡΡΑΕϋΡΙΚννΐ_Ι_5Α (ЗЕО Ю ΝΟ: 10); Η5ΟΟΤΡΤ3ΟΥ5ΚΥΙϋΕΚΡΑΚΟΡΙΡννΐ_Ι_5Α (ЗЕО Ю ΝΟ: 11); Η50ΟΤΡΤ50Υ8ΚΥΙ_0ΕΡΡΑΚϋΡΙΕννΐ_Ι_ΡΑ (ЗЕО Ю ΝΟ: 12); Η30ΘΤΡΤ5ϋΥ3ΚΥ10ΕΡΑΑΚ0ΡΙΕννΐ15Α (ЗЕО Ю ΝΟ: 14); Η50ΘΤΡΤ30Υ3ΚΥΙ_0ΕΡΚΑΚ0ΡΙ0ννΐ_1_8Α (ЗЕО Ю ΝΟ: 15); Η300ΤΡΤ50Υ3ΚΥΙ_0ΕΚΚΑΚ0ΡΙΕννΐ_ΙΑΑ (ЗЕО Ю ΝΟ: 16) или Η50ΘΤΡΤ50Υ5ΚΥΙ_0ΕΚΡΑΚ0ΡΙΕννΐ_Ι_5Α (ЗЕО Ю ΝΟ: 17).
9. 9. Соединение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что К¹ представляет собой Н.
10. 10. Соединение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что К² представляет собой

    ΝΗ₂.
11. 11. Соединение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что Ζ имеет не более 25% идентичности по последовательности с соответствующим участком последовательности 1Р-1 оксинтомодулина человека, имеющего последовательность Еук-Лг§-Лкп-Аг§-Лкп-Лкп-11е-А1а.
12. 12. Соединение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что Ζ содержит Сук в качестве остатка на С-конце.
13. 13. Соединение по любому из пп.1-10, отличающееся тем, что Ζ отсутствует.
14. 14. Соединение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что одна или более боковая цепь аминокислоты в указанном соединении, например в пептиде X, конъюгирована с липофильным заместителем или полимерной группой.
15. 15. Нуклеиновая кислота, кодирующая соединение по любому из предыдущих пунктов.
16. 16. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.15.
17. 17. Клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту по п.15 или экспрессионный вектор по п.16.
18. 18. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому одному из пп.1-14 в смеси с фармацевтически приемлемым носителем.
19. 19. Применение соединения по любому из пп.1-14 при получении лекарственного средства для предотвращения увеличения веса, стимуляции снижения веса или для лечения патологического состояния, вызванного или ассоциированного с избыточной массой тела или ожирением, в том числе патологического ожирения, воспалительного процесса, связанного с ожирением, заболевания желчного пузыря, связанного с ожирением, апноэ сна, индуцированного ожирением, или для лечения резистентности к инсулину, нарушения толерантности к глюкозе, сахарного диабета 2 типа, гипертензии, атерогенной дислипидемии, атеросклероза, артериосклероза, ишемической болезни сердца или инсульта.
20. 20. Применение нуклеиновой кислоты по п.15 при получении лекарственного средства для предотвращения увеличения веса, стимуляции снижения веса или для лечения патологического состояния, вызванного или ассоциированного с избыточной массой тела или ожирением, в том числе патологического ожирения, воспалительного процесса, связанного с ожирением, заболевания желчного пузыря, связанного с ожирением, апноэ сна, индуцированного ожирением, или для лечения резистентности к инсулину, нарушения толерантности к глюкозе, сахарного диабета 2 типа, гипертензии, атерогенной дислипидемии, атеросклероза, артериосклероза, ишемической болезни сердца или инсульта.
21. 21. Применение экспрессионного вектора по п.16 при получении лекарственного средства для предотвращения увеличения веса, стимуляции снижения веса или для лечения патологического состояния, вызванного или ассоциированного с избыточной массой тела или ожирением, в том числе патологического ожирения, воспалительного процесса, связанного с ожирением, заболевания желчного пузыря, связанного с ожирением, апноэ сна, индуцированного ожирением, или для лечения резистентности к инсулину, нарушения толерантности к глюкозе, сахарного диабета 2 типа, гипертензии, атерогенной дислипидемии, атеросклероза, артериосклероза, ишемической болезни сердца или инсульта.
22. 22. Применение клетки-хозяина по п.17 при получении лекарственного средства для предотвращения увеличения веса, стимуляции снижения веса или для лечения патологического состояния, вызванного или ассоциированного с избыточной массой тела или ожирением, в том числе патологического ожирения, воспалительного процесса, связанного с ожирением, заболевания желчного пузыря, связанного с ожирением, апноэ сна, индуцированного ожирением, или для лечения резистентности к инсулину, нарушения толерантности к глюкозе, сахарного диабета 2 типа, гипертензии, атерогенной дислипидемии, атеросклероза, артериосклероза, ишемической болезни сердца или инсульта.

    - 19 020596
23. 23. Соединение по любому из пп.1-14 для применения в способе предотвращения увеличения веса, стимуляции снижения веса или для лечения патологического состояния, вызванного или ассоциированного с избыточной массой тела или ожирением, в том числе патологического ожирения, воспалительного процесса, связанного с ожирением, заболевания желчного пузыря, связанного с ожирением, апноэ сна, индуцированного ожирением, или для лечения резистентности к инсулину, нарушения толерантности к глюкозе, сахарного диабета 2 типа, гипертензии, атерогенной дислипидемии, атеросклероза, артериосклероза, ишемической болезни сердца или инсульта.
24. 24. Нуклеиновая кислота по п.15 для применения в способе предотвращения увеличения веса, стимуляции снижения веса или для лечения патологического состояния, вызванного или ассоциированного с избыточной массой тела или ожирением, в том числе патологического ожирения, воспалительного процесса, связанного с ожирением, заболевания желчного пузыря, связанного с ожирением, апноэ сна, индуцированного ожирением, или для лечения резистентности к инсулину, нарушения толерантности к глюкозе, сахарного диабета 2 типа, гипертензии, атерогенной дислипидемии, атеросклероза, артериосклероза, ишемической болезни сердца или инсульта.
25. 25. Экспрессионный вектор по п.16 для применения в способе предотвращения увеличения веса, стимуляции снижения веса или для лечения патологического состояния, вызванного или ассоциированного с избыточной массой тела или ожирением, в том числе патологического ожирения, воспалительного процесса, связанного с ожирением, заболевания желчного пузыря, связанного с ожирением, апноэ сна, индуцированного ожирением, или для лечения резистентности к инсулину, нарушения толерантности к глюкозе, сахарного диабета 2 типа, гипертензии, атерогенной дислипидемии, атеросклероза, артериосклероза, ишемической болезни сердца или инсульта.
26. 26. Клетка-хозяин по п.17 для применения в способе предотвращения увеличения веса, стимуляции снижения веса или для лечения патологического состояния, вызванного или ассоциированного с избыточной массой тела или ожирением, в том числе патологического ожирения, воспалительного процесса, связанного с ожирением, заболевания желчного пузыря, связанного с ожирением, апноэ сна, индуцированного ожирением, или для лечения резистентности к инсулину, нарушения толерантности к глюкозе, сахарного диабета 2 типа, гипертензии, атерогенной дислипидемии, атеросклероза, артериосклероза, ишемической болезни сердца или инсульта.