JP2013079256A

JP2013079256A - Ｇｌｐ−１ｐｅｇ化化合物

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Publication number: JP2013079256A
Application number: JP2012266820A
Authority: JP
Inventors: Wolfgang Glaesner; ヴォルフガング・グレースナー; John Philip Mayer; ジョン・フィリップ・マイヤー; Rohn Lee Millican Jr; ローン・リー・ミリカン・ジュニア; Andrew Mark Vick; アンドリュー・マーク・ビック; Lianshan Zhang; リアンシャン・チャン
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2005-05-13
Filing date: 2012-12-06
Publication date: 2013-05-02
Also published as: EA012442B1; WO2006124529A1; JP5225074B2; ATE482724T1; MX2007014052A; CN101166545B; RS51637B; IL186772A0; CA2608311A1; AU2006247734B2; KR20080025361A; CN101166545A; US8183340B2; HRP20100543T1; SI1881850T1; CA2608311C; DE602006017202D1; DK1881850T3; PT1881850E; NO20076415L

Abstract

【課題】非ＰＥＧ化ペプチドに比べて長期の半減期及び遅いクリアランスを有する生物活性のあるペプチドを提供する。
【解決手段】２つのポリエチレングリコール分子又はその誘導体に結合するＧＬＰ−１化合物。これらのＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物及び組成物は、血糖値を下げ、摂食量を減少させ、胃又は腸の内容物排出を減少させ、β細胞の数を増加させ、又は胃又は腸の運動性を低下させることによって、状態又は障害を治療する上で有用である。
【選択図】なし

Description

本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化されたグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）化合物並びに関連組成物、及び、血糖値を低下させ、摂食量を減少させ、胃又は腸の内容物排出を減少させ、β細胞の数及び／又は機能を向上及び／又はβ細胞アポトーシスを阻害し、或いは、胃又は腸の運動性を低下させることにより恩恵を受ける状態又は障害の治療に有用な方法に関する。

ＧＬＰ−１は、インスリン分泌の刺激、グルカゴン分泌の阻害、胃内容排出の阻害、胃運動若しくは腸運動の阻害、グルコース利用促進、及び体重減少などの多くの生物学的効果を誘発する。ＧＬＰ−１は更に、インスリン非依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）が進行するにつれて発生する膵臓β細胞の劣化を防止する作用を持つ。ＧＬＰ−１の重要な特徴は、低血糖症のリスクを伴わずにインシュリン分泌を促進する能力である。血糖値が上昇しているか否かに関わらずインシュリンの発現を上昇させる他の治療法と異なり、ＧＬＰ−１は血糖値が上昇している場合に限りインシュリン分泌を誘発する。

ＧＬＰ−１（１−３７）の活性は低く、また天然由来の２種の切断ペプチドであるＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ及びＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２はｉｎｖｉｖｏで急速に排除され生体内半減期が極めて短いという事実から、ＧＬＰ−１ペプチドを用いた治療の有用性には限界があった。内在的に産生されるジペプチジル−ペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）は、Ｎ末端ヒスチジン及びアラニン残基を除去することによって血中ＧＬＰ−１ペプチドを不活性化し、生体内半減期が短くなる主因であることが知られている。

さまざまなアプローチにより、天然のＧＬＰ−１よりも長期の半減期又は強力な効力を有するＧＬＰ−１化合物が開発されたが、さらにクリアランスを減少させ半減期を延長させることで長期間にわたり最小限の投与回数で済む治療用ＧＬＰ−１としての性能を最適化するためには別の化合物が必要である。国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００６０８２号明細書及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０００／１１８１４号明細書に、１つ以上のＰＥＧ分子とさまざまなＧＬＰ−１及びエキセンディン化合物との共有結合についての記載がある。これらの化合物の半減期は２４時間を上回ることもあり、長期間にわたり高血中濃度を維持しながらも、ＰＥＧ化されたＧＬＰ−１化合物の投与回数はより少なくて済む。

別の研究で、長期にわたる保存において、ＰＥＧ化ＧＬＰ−１又はＰＥＧ化エキセンディン化合物からのＰＥＧの分離が起きるという問題が明らかになった。その結果、遊離ＧＬＰ−１又はエキセンディンペプチドは、治療ウィンドウにおける初期ピーク濃度の暴露プロファイルを増加させる。これは、嘔気及び嘔吐の副作用を増加させる可能性がある。

本発明は、ＧＬＰ−１又はエキセンディン化合物に２つのＰＥＧ化部位を導入し、その後これらのＰＥＧ化部位を同時にＰＥＧ化することにより、長期間の保存及びＰＥＧ化ＧＬＰ−１又はＰＥＧ化エキセンディン化合物からのＰＥＧの分離に関連した課題を解決しようとするものである。このアプローチには、少なくとも４つの効果がある。第１に、化合物のＰＥＧ化は、その化合物の生体内半減期を劇的に改善する。第２に、化合物のＰＥＧ化はその化合物の吸収を遅くすることによって、副作用の原因と考えられる薬の初期バーストを軽減する。第３に、直鎖ＰＥＧをＰＥＧ化に直接用いることができ、合成手順が単純化される。第４に、タンデム型のＰＥＧ化は、同一のＧＬＰ−１又はエキセンディンペプチド分子から両方のＰＥＧが分離する可能性を減少させることにより、長期保管及びＰＥＧ化ＧＬＰ−１又はＰＥＧ化エキセンディン化合物からのＰＥＧの分離可能性に関連した問題を軽減する。

加えて、２つのＰＥＧ化部位をＧＬＰ−１又はエキセンディン化合物のＣ末端に導入し、その後これら２つのＰＥＧ化部位を同時にＰＥＧ化することによって、これらのＰＥＧ化化合物より活性が高く、少なくとも１つのＰＥＧ化部位が上記ペプチドのＣ端末に存在しないＰＥＧ化化合物が生成された。更に、２つのＰＥＧ化部位を含むリンカーをＧＬＰ−１化合物のＣ末端に付着し、これら２つのＰＥＧ化部位を同時にＰＥＧ化することによって、これらのＰＥＧ化化合物より活性が高く、リンカーのないＧＬＰ−１化合物のＣ末端にＰＥＧ化部位が付着したＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物が生成された。

この種のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物は、これらに限定されるものではないが、糖尿病、肥満、胃及び／又は腸の運動異常、β細胞欠乏症（例えば、β細胞の不足又は機能不全）、及び胃及び／又は腸の排出異常などの障害をもつ患者の治療に利用できる。本発明のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物は２４時間中に比較的少ない投与回数で済むという特有の利点があり、この種の治療を必要とする患者にとっての便宜及び患者の投与要件への適合可能性が向上する。

本願明細書において記載される本発明は、２つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子に共有結合しているＧＬＰ−１化合物又はＰＥＧがシステイン残基に接着したその誘導体を提供する。その結果、排出半減期が少なくとも１時間、少なくとも３、５、７、１０、１５、２０時間、又は少なくとも２４時間であるＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物が得られる。本発明のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物のクリアランス値は、２００ｍｌ／ｈ／ｋｇ以下、又は１８０、１５０、１２０、１００、８０、６０ｍｌ／ｈ／ｋｇ以下、又は５０、４０、又は２０ｍｌ／ｈ／ｋｇ未満である。

本発明のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物には、以下の式のアミノ酸配列が含まれる。Ｈｉｓ−Ｘａａ_８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｘａａ_２２−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ_３３−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ_４５−Ｘａａ_４６式Ｉ（配列番号：１）式中、Ｘａａ_８は、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ又はＴｈｒである。Ｘａａ_２２は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＬｙｓである。Ｘａａ_３３は、Ｖａｌ又はＩｌｅである。Ｘａａ_４６は、Ｃｙｓ又はＣｙｓ−ＮＨ_２である。及び、１つのＰＥＧ分子がＣｙｓ_４５に共有結合され、１つのＰＥＧ分子がＣｙｓ_４６又はＣｙｓ_４６−ＮＨ_２に共有結合されている。

好ましくは、式ＩのＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物において、Ｘａａ_８はＧｌｙ又はＶａｌであり、Ｘａａ_２２はＧｌｙ又はＧｌｕであり、Ｘａａ_３３はＶａｌ又はＩｌｅであり、Ｘａａ_４６はＣｙｓ又はＣｙｓ−ＮＨ_２である。さらに好ましくは、式ＩのＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物において、Ｘａａ_８はＶａｌであり、Ｘａａ_２２はＧｌｕであり、Ｘａａ_３３はＶａｌ又はＩｌｅであり、Ｘａａ_４６はＣｙｓ又はＣｙｓ−ＮＨ_２である。さらに好ましくは、式ＩのＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物において、Ｘａａ_８はＶａｌであり、Ｘａａ_２２はＧｌｕであり、Ｘａａ_３３はＶａｌであり、Ｘａａ_４６はＣｙｓである。さらに好ましくは、式ＩのＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物において、Ｘａａ_８はＶａｌであり、Ｘａａ_２２はＧｌｕであり、Ｘａａ_３３はＶａｌであり、Ｘａａ_４６はＣｙｓ−ＮＨ_２である。さらに好ましくは、式ＩのＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物において、Ｘａａ_８はＶａｌであり、Ｘａａ_２２はＧｌｕであり、Ｘａａ_３３はＩｌｅであり、Ｘａａ_４６はＣｙｓである。さらに好ましくは、式ＩのＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物において、Ｘａａ_８はＶａｌであり、Ｘａａ_２２はＧｌｕであり、Ｘａａ_３３はＩｌｅであり、Ｘａａ_４６はＣｙｓ−ＮＨ_２である。

本発明で使用するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーは、分子量が５００から１０万ダルトン、５０００から４万ダルトン、２万から６万ダルトン又は２万から４万ダルトンであり、直鎖状又は分枝状の分子であってもよく、従来技術において記載されているポリエチレングリコール誘導体であってもよい。本発明におけるＧＬＰ−１化合物に共有結合しているＰＥＧ分子は、特定の種類に限定されない。好ましくは、ＰＥＧは、２０キロダルトンの直鎖状メトキシＰＥＧマレイミドである。より好ましくは、ＰＥＧは、以下の化学式で示されるものである。

本発明はＧＬＰ−１受容体の刺激を必要とする患者のＧＬＰ−１受容体を刺激する方法であって、有効な量の本願明細書に記載されているＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物を投与するステップを含む。ＧＬＰ−１受容体の刺激を必要とする患者は、インスリン非依存性糖尿病、ストレス誘発性高血糖、肥満、胃及び／又は腸の運動異常又は排出異常、例えば過敏性大腸症候群、β細胞欠乏症及び機能性消化不良を有する患者を含む。

グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）は、食物の摂取に応答して腸のＬ細胞によって分泌される３７アミノ酸ペプチドである。多くのＧＬＰ−１類似体及び誘導剤が、従来技術において記載されている。本発明は、排出半減期の延長及び／又はクリアランスの低下をもたらすＧＬＰ−１化合物の修飾について開示する。ペプチドの特定のアミノ酸部位へのシステイン残基の導入は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はＰＥＧ誘導体が共有結合することによって、ＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物をもたらすことができるチオール基を提供する。

本願明細書で用いられる「ＧＬＰ−１化合物」には、天然由来のＧＬＰ−１、［ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ又はＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２］、ＧＬＰ−１類似体、ＧＬＰ−１誘導体、ＧＬＰ−１生物活性断片、拡張ＧＬＰ−１又は拡張ＧＬＰ−１ペプチドの類似体又は断片、エキセンディン−４類似体、及びエキセンディン−４誘導体が含まれる。好ましくは、ＧＬＰ−１類似体は、１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸がＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨにおける対応する位置のアミノ酸と異なるようにするためにＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨのアミノ酸配列又は拡張ＧＬＰ−１ペプチドを有するか、或いは、０、１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸が拡張ＧＬＰ−１ペプチドにおける対応する位置のアミノ酸と異なるようにするためにＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ又は修飾の断片を有する。

本発明のＧＬＰ−１化合物に関連して用いられる「ＰＥＧ化」という用語は、ポリエチレングリコール又はその誘導体の２つの分子を共有結合させることにより化学修飾されたＧＬＰ−１化合物を指す。さらに、「ＰＥＧ」という用語は、従来技術で周知のポリエチレングリコール又はその誘導体を指す（例えば、米国特許第５４４５０９０号明細書、米国特許第５９００４６１号明細書、米国特許第５９３２４６２号明細書、米国特許第６４３６３８６号明細書、米国特許第６４４８３６９号明細書、米国特許第６４３７０２５号明細書、米国特許第６４４８３６９号明細書、米国特許第６４９５６５９号明細書、米国特許第６５１５１００号明細書及び米国特許第６５１４４９１号明細書参照）。好ましくは、本発明のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物において、ＰＥＧ（又はその誘導体）は、ＧＬＰ−１化合物に導入された２つのシステイン残基に共有結合される。好ましくは、ＧＬＰ−１化合物に導入された２つのシステイン残基は、位置４５及び４６にある。

「インシュリン分泌促進作用」とは、血糖値の上昇に応答してインシュリン分泌を促進することによって、細胞によるグルコース摂取及び血漿グルコース値の低下をもたらす能力をいう。インシュリン分泌促進作用は、ＧＬＰ−１の受容体結合活性又は受容体活性化を測定するｉｎｖｉｖｏ実験及びｉｎｖｉｔｒｏ分析を含む、公知の方法で評価することができる（例えば、欧州特許第６１９３２２号明細書からＧｅｌｆａｎｄら、及び米国特許第５１２０７１２号において記載されている膵島細胞又はインスリノーマ細胞を使用する分析）。インシュリン分泌促進作用は、インシュリン濃度又はＣ−ペプチド濃度を測定することによって、ヒトにおいて通常の方法で測定される。本発明を目的として、ｉｎｖｉｔｒｏのＧＬＰ−１受容体のシグナリング分析を使用して本発明のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物がｉｎｖｉｖｏでインシュリン分泌促進作用を示すかどうかを判定する。インシュリン分泌促進作用は、ＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物が生物学的に活性であることを証明するために用いることができる作用である。本発明で例証されたすべてのＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物は、インシュリン分泌促進作用（実施例６を参照）を有する。

本願明細書で用いられる「ｉｎｖｉｔｒｏ効力」は、細胞系アッセイにおいてペプチドがＧＬＰ−１受容体を活性化させる能力の尺度である。ｉｎｖｉｔｒｏ効力は、「ＥＣ_５０」で示される。これは、単一の用量反応実験で５０％の活性を示す化合物の有効濃度である。本発明の目的のため、ｉｎｖｉｔｒｏ効力は、ヒトのＧＬＰ−１受容体を安定して発現させるＨＥＫ−２９３細胞を使用した蛍光分析により決定される。これらのＨＥＫ−２９３細胞には、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を促進するｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）を有するＤＮＡベクターが安定に取り込まれている。ＧＬＰ−１化合物又はＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物と受容体との相互作用により、ｃＡＭＰ応答エレメントの活性とそれに続くルシフェラーゼの発現をもたらすシグナルが開始される。実施例３に列挙されたＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物のＥＣ_５０値は、上記のルシフェラーゼ分析を使用して求めたものである。相対的なｉｎｖｉｔｒｏ効力の値は、Ｖａｌ_８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ又は天然由来のＧＬＰ−１を対照とし、その対照に１００％の基準値を割り当てることによって求めることができる。

「血漿半減期」という用語は、関連した分子の半分が除去される前に血漿内を循環する時間をいう。「排出半減期」は、同義的に用いられる。血漿半減期又は排出半減期に関連して使用される「延長される」又は「より長い」という用語は、ＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物の半減期が、同等の条件下での参照分子（例えば、ペプチドの非ＰＥＧ化形態又は天然のペプチド）の半減期に比べて、統計学的に有意な増加があることを示す。好ましくは、本発明のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物の排出半減期は少なくとも１時間、より好ましくは、少なくとも３、５、７、１０、１５、２０時間、及び最も好ましくは２４時間である。本願明細書の実施例４及び５において報告されている半減期は排出半減期であり、排出期間の対数線形率に対応する。当業者は、半減期がクリアランス及び分布容積の両方に関数として変化する導出パラメータであることを認識する。

クリアランスとは、薬物を排出する身体能力の基準である。例えば、薬物に対する修飾によってクリアランスが減少した場合、半減期は増大すると考えられる。しかしながら、この相互関係は、分布容積に変化がない場合だけ当てはまる。末端の対数線形半減期（ｔ_１／２）、クリアランス（Ｃ）、及び分布容積（Ｖ）間の有用な近似的関係は、以下の方程式で表される。
ｔ_１／２≒０．６９３（Ｖ／Ｃ）
クリアランスは、薬物の排出量を示すのではなく、排出するために必要な、薬物が完全に排除された血液又は血漿などの体液の量を示す。クリアランスは、単位時間あたりの量で表される。本発明のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物のクリアランス値は２００ｍｌ／ｈ／ｋｇ以下、１８０、１５０、１２０、１００、８０、６０ｍｌ／ｈ／ｋｇ以下若しくは５０、４０又は２０ｍｌ／ｈ／ｋｇ以下である（実施例４及び５を参照）。

本発明において、Ｃｙｓアミノ酸は、ＧＬＰ−１化合物の位置４５及び４６に組み込まれる。得られる分子は、Ｃｙｓアミノ酸においてＰＥＧ化され、未修飾の分子又は天然の分子よりも長い半減期を有すると共に、全て又は一部の生物活性を保持する修飾された分子となる。

本発明に用いられるＧＬＰ−１化合物は、液相ペプチド合成法又は固相ペプチド合成法の標準的な方法を用いて調製できる。

調製及び精製されたＧＬＰ−１化合物は、２つのＰＥＧ分子を共有結合することによりＰＥＧ化される。ＰＥＧをペプチドに共有接合する様々な方法が、従来技術で開示されている（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍら、ＡｄｖａｎｃｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖｉｅｗｓ、５４：４５９−４７６、２００２を参照）。カルボキシ末端におけるペプチドのＰＥＧ化は、組換えＧＬＰ−１ペプチドを前駆体として用いた酵素カップリング、又は従来技術において公知であり、記載されている別の方法で実施できる。例えば、米国特許第４３４３８９８号又はＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｅｐｔｉｄｅ＆ＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ．４３：１２７−３８、１９９４を参照。本発明のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物を調製する１つの方法では、ＰＥＧを上記ペプチドのチオール基に直接付着させるために、ＰＥＧ−マレイミドを使用する。チオール官能基の導入は、上記ペプチドの上記の位置にＣｙｓ残基を追加又は挿入して実施できる。チオール官能基は、上記ペプチドの側鎖上に導入することもできる（例えばチオール含有酸のリジンε−アミノ基のアシル化）。本発明のＰＥＧ化の方法では、マイケル付加を利用して安定性のチオエーテルリンカーを形成する。その反応は極めて特異的であり、他の官能基が存在する温和な条件下で起こる。ＰＥＧマレイミドが、明確な、生理活性ＰＥＧ−タンパク質接合体を調製するための反応性ポリマーとして使われた。上記反応を促進し完了させるために、ＰＥＧマレイミドに対するチオール含有ＧＬＰ−１化合物の過剰モルを上記手順において使用することが好ましい。上記反応は、好ましくはｐＨ４．０から９．０の間で、室温で、１〜４０時間行われる。ＰＥＧ化されていないチオール含有ペプチドの過剰分は、従来の分離法によってＰＥＧ化された生成物から直ちに分離される。ＧＬＰ−１化合物のＰＥＧ化に必要な条件例を、実施例１及び２に記載する。システインのＰＥＧ化は、ＰＥＧマレイミド又は分鎖状ＰＥＧマレイミドを用いて実施できる。好適なＰＥＧは、２０キロダルトンの直鎖状メトキシＰＥＧマレイミドである。

典型的な形態において、ＰＥＧは、末端ヒドロキシル基を有する直鎖状ポリマーであり、式ＨＯ−ＣＨ_２ＣＨ_２−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＯＨを有する。式中、ｎは約８〜約４０００である。末端の水素は、保護基（例えばアルキル基又はアリール基）によって置換できる。好ましくは、ＰＥＧは少なくとも１つのヒドロキシ基を有し、より好ましくは、それは末端ヒドロキシ基である。好ましくは、このヒドロキシ基が活性化して上記ペプチドと反応する。本発明に有用なＰＥＧには多くの形がある。従来技術にはＰＥＧの多数の誘導体が存在し、本発明において好適に使用される。（例えば米国特許第５４４５０９０号明細書、米国特許第５９００４６１号明細書、米国特許第５９３２４６２号明細書、米国特許第６４３６３８６号明細書、米国特許第６４４８３６９号明細書、米国特許第６４３７０２５号明細書、米国特許第６４４８３６９号明細書、米国特許第６４９５６５９号明細書、米国特許第６５１５１００号明細書及び６５１４４９１号明細書、及びＺａｌｉｐｓｋｙ、Ｓ．ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．６：１５０−１６５、１９９５を参照）。本発明のＧＬＰ−１化合物に共有結合しているＰＥＧ分子は、特定の種類に限らない。ＰＥＧの分子量は、好ましくは５００から１０万ダルトン、より好ましくは２万から６万ダルトン、最も好ましくは２万から４万ダルトンである。ＰＥＧは、直鎖状でも分鎖状でもよい。

本発明のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物は、天然由来のＧＬＰ−１、又はＶａｌ_８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの少なくとも０．５％のｉｎｖｉｔｒｏの生物活性を有する。本発明のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物は、天然由来のＧＬＰ−１、又はＶａｌ_８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの少なくとも１％のｉｎｖｉｔｒｏの生物活性を有する。本発明のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物は、天然由来のＧＬＰ−１、又はＶａｌ_８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの少なくとも３％のｉｎｖｉｔｒｏの生物活性を有する。このような生物活性は、本願明細書（実施例３）において記載されているｉｎｖｉｔｒｏ効力アッセイ、又は当技術分野において周知である他のＧＬＰ−１分析によって測定できる。本発明の一部のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物の生物活性は、特定の分析において測定された天然由来のＧＬＰ−１又はＶａｌ_８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの生物活性よりも低い場合があるが、この活性の低下は、この化合物の半減期が長いこと、及び／又はクリアランス値が低いことにより相殺される。

ＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物の投与は、当業者である医師によって有効性が認められている何れの経路を介してもよい。このような方法として挙げられるのが末梢腸管外法である。腸管外投与は、無菌シリンジ、又は注入ポンプなどの何らかの他の機械的装置による体内への剤形の注射として、医学文献で広く了知されている。末梢腸管外経路には、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内の投与経路が挙げられる。本発明のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物は、非腸管外経路である、経口、経直腸、経鼻、又は下気道経路による投与に適したものであってよい。これらの非腸管外経路のうち、下気道経路及び経口経路が好ましい。

本発明のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物は、多種多様な疾患及び状態を治療するために使用することができる。本発明のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物は主に、「ＧＬＰ−１受容体」と称される受容体上で作用することにより生物学的効果を奏する。従って、ＧＬＰ−１受容体刺激又はＧＬＰ−１化合物の投与に良好に応答する疾患及び／又は症状の患者を、本発明のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物で処置することができる。これらの患者は、「ＧＬＰ−１化合物での処置をする必要がある」又は「ＧＬＰ−１受容体刺激の必要がある」と称される。非インスリン依存性糖尿病、インスリン依存性糖尿病、脳梗塞症（国際公開第００／１６７９７号パンフレット参照）、心筋梗塞症（国際公開第９８／０８５３１号パンフレット参照）、肥満症（国際公開第９８／１９６９８号パンフレット参照）、術後の代謝変化（米国特許第６，００６，７５３号明細書参照）、機能性消化不良及び過敏性腸症候群（国際公開第９９／６４０６０号パンフレット参照）の患者が挙げられる。さらに、ＧＬＰ−１化合物での予防的処置を必要としている患者、例えば、非インスリン依存性糖尿病を発症する危険がある患者（国際公開第００／０７６１７号パンフレット参照）が挙げられる。耐糖能異常又は空腹時血糖障害の患者、患者の身長及び体躯に対する正常体重の約２５％以上を上回る体重の患者、膵部分切除の患者、親の１名以上が非インスリン依存性糖尿病である患者、妊娠性糖尿病の病歴がある患者、及び急性又は慢性膵炎の病歴がある患者は、非インスリン依存性糖尿病を発症する危険がある。

本願明細書において記載されているＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物の有効量とは、ＧＬＰ−１受容体刺激の必要がある患者に投与すると、許容できない副作用を起こすことなく所望の治療及び／又は予防効果が得られる量である。「所望の治療効果」は、以下の１つ以上を含む。１）疾患関連症状又は疾患関連状態の改善、２）疾患関連症状又は疾患関連状態の発現の遅延、３）未処置時よりも長期の生存、及び４）未処置時よりも高い生活の質。例えば、糖尿病の治療に対するＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物の「有効量」は、未処置時よりも血中グルコース濃度の大きな抑制をもたらし、この結果、網膜症、神経障害、又は腎臓病などの糖尿病合併症の発現の遅延をもたらすと考えられる量である。糖尿病の予防に対するＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物の「有効量」は、スルホニル尿素、チアゾリジンジオン、インスリン及び／又はビスグアニジンなどの抗血糖降下剤による処置が必要な高血糖の発現を、未処置時に比べて遅延させると考えられる量である。概して、本発明のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物は、血漿濃度が約５〜約２００ピコモル／リットルになるように投与される。Ｖａｌ_８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨのための最適血漿濃度は、３０〜約２００ピコモル／リットルの範囲内であることが確認された。

患者の血糖値を正常化するためのＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物の有効な投与量は、様々な因子に左右される。これら因子に含まれるものとして、限定されないが、患者の性別、体重及び年齢、血糖調節不能の重症度、投与の経路及びバイオアベイラビリティ、融合蛋白質の薬物動態プロファイル、効力並びに製剤が挙げられる。本発明のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物の一般的な投与量は、成人の場合約０．０１〜約１０００ｍｇ／日の範囲である。好ましくは、投与量は約０．１〜約１００ｍｇ／日の範囲、より好ましくは、約１．０〜約１０ｍｇ／日の範囲である。

本発明のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物は、２週に１回又は週に１回投与されることが好ましい。治療される疾患によっては、１週間に２〜３回など、ＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物の投与を更に高頻度必要とする場合もある。

「患者」は哺乳類、好ましくはヒトであるが、動物（例えば伴侶動物（例えばイヌ、ネコなど）、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、及び実験動物（例えばネズミ、マウス、モルモットなど））でもよい。

本発明のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物を生成するために用いるペプチドは、液相又は固相ペプチド合成技術の標準的な方法を用いて調製することができる。

本発明は、以下の実施例で例示される。これらの実施例は、いかなる形であれ限定することを意図しない。

実施例１ＧＬＰ−１関連アナログのＰＥＧ化
ＰＥＧ化反応は、チオエーテル結合が形成可能な条件下で実施する。具体的には、溶液のｐＨは約４〜９であり、チオール含有ペプチドの濃度はメトキシ−ＰＥＧ２−ＭＡＬ濃度の１〜１０倍の過剰モルである。ＰＥＧ化反応は、通常室温で実施する。その後、このＰＥＧ化ＧＬＰ−１ペプチドを、逆位相ＨＰＬＣイオン交換クロマトグラフィ又はサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を使用して分離する。ＰＥＧ化ＧＬＰ−１類似体を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＨＰＬＣ−ＳＥＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び／又はＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーを使用して特徴付ける。チオール含有ＧＬＰ−１ペプチドをポリエチレングリコール−マレイミド（ＰＥＧ−マレイミド）と反応させて、チオエーテル結合を介してＰＥＧが共有結合する誘導体を生成する。例えば、長さ４６アミノ酸、７．５ｍｇ、１．８μｍｏｌのＧＬＰ−１化合物を、２０ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．４の２００ｍＭのリン酸塩バッファ２ｍｌに溶解する。その後、上記溶液をアルゴン置換する。この溶液に、直鎖状又は分鎖状のＰＥＧマレイミドであるメトキシ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（ＳｈｅａｒｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．、ハンツヴィル、アラバマ）を４０ｍｇ添加する（ＰＥＧとペプチドのモル比は０．５５：１）。反応を２時間実施する。その後、ＰＥＧ化ペプチドの２５ｍｇをＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、サイズ排除ＨＰＬＣによって特徴付け、ｉｎｖｉｔｒｏ活性を試験する。

実施例２ＧＬＰ類似体による２Ｘ２０ｋＤａ−ＰＥＧ−マレイミド反応
ＧＬＰ−１類似体は、マレイミド活性化された直鎖状の２０ｋＤａのｍＰＥＧ（ＮＯＦ，Ｉｎｃ．）を使用して、導入されたシステイン残基において選択的にＰＥＧ化される。ＰＥＧ化反応のために、ＰＥＧ化するペプチドを１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのＮＨ４ＡｃバッファにｐＨ６．８で溶解し、１．２５倍の過剰モルのバルク２０ｋＤａ−ｍＰＥＧを添加する。反応は、室温で１〜４時間実施し、ＳＰ−セファロース陽イオン交換クロマトグラフィを使用して遊離ＰＥＧ及び遊離ペプチドからＰＥＧ化化合物を分離する。接合体は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって脱塩し、凍結乾燥する。

実施例３ｉｎｖｉｔｒｏ活性分析
ヒトＧＬＰ−１受容体を安定的に発現しているＨＥＫ−２９３細胞を、９６ウェルプレートに、３０，０００細胞数／ウェル／低血清ＤＭＥＭＦ１２培地８０μｌで、ＣＲＥ−ルシフェラーゼシステムを用いて播種する。播種の翌日に、０．５％ＢＳＡに溶解した被検蛋白質のアリコート２０μｌを混合して、細胞と５時間インキュベートする。通常、ＥＣ_５０値を求める用量反応曲線を作成するため、細胞へ添加する前に、試験ＧＬＰ−１化合物には０．００１ｎＭから１０ｎＭを含む１０倍希釈を調製し、Ｖａｌ_８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ標準には０．０００３ｎＭから３ｎＭを含む１０倍希釈を調製する。インキュベーション後に、１００μｌのルシフェラーゼ試薬を各プレートに直接添加して、２分間穏やかに混合する。プレートをＴｒｉ−ｌｕｘルミノメータに入れて、ルシフェラーゼ発現に起因する光出力量を計測する。式Ｉ（式中、Ｘａａ_８はＶａｌであり、Ｘａａ_２２はＧｌｕであり、Ｘａａ_３３はＩｌｅであり、Ｘａａ_４６はＣｙｓ−ＮＨ_２である）のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物の平均ＥＣ_５０値は、０．３６±０．０４ｎＭである。

実施例４誘導体化されたＧＬＰ−１ペプチドの薬物動態解析
式Ｉ（式中、Ｘａａ_８はＶａｌであり、Ｘａａ_２２はＧｌｕであり、Ｘａａ_３３はＩｌｅであり、Ｘａａ_４６はＣｙｓ−ＮＨ_２である）のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物を、０．１ｍｇ／ｋｇの量で雄のＳＤラットに静脈（ＩＶ）投与又は皮下（ＳＣ）投与する。投与後０から１９２時間の間のさまざまな時点で、上記動物（１群につき３匹のラット）から採血する。各サンプルから血漿を採集し、Ｎ末端に特異的なラジオイムノアッセイによって分析する。薬物動態学的パラメータは、モデル非依存の方法（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎＰｒｏ）を使用して算出される。ＩＶ投与によるＰＥＧ化ＧＬＰ−１類似体の排出半減期は約１．２日、一方ＳＣ投与によるＰＥＧ化ＧＬＰ−１類似体の排出半減期は約１．１日である。０．１ｍｇ／ｋｇのＩＶ又はＳＣ投与には、いかなる臨床的有害事象も見られなかった。上記化合物には、より長い排出半減期、遅いクリアランス、及び皮下バイオアベイラビリティ（約３０％）が認められる。これを示すデータを以下の表１に示す。
表１−
雄のＳＤラットに対する０．１ｍｇ／ｋｇの静脈又は皮下投与後の、式Ｉ（ここでＸａａ_８はＶａｌであり、Ｘａａ_２２はＧｌｕであり、Ｘａａ_３３はＩｌｅであり、Ｘａａ_４６はＣｙｓ−ＮＨ_２である）のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物のＭｅａｎ（±ＳＤ）ＰＫパラメータ値。

^ａ観察された最大血漿濃度。
^ｂ最大血漿濃度が観察された時間。
^ｃ０から最終時点において測定された血漿濃度−時間曲線下の面積。
^ｄ排出半減期。
^ｅバイオアベイラビリティの関数としての全身クリアランス。
^ｆバイオアベイラビリティの関数としての定常状態分布容積。
Ｖａｌ_８−ＧＬＰ（７−３７）ＯＨを、１０μｇ／ｋｇでフィッシャー３４４ラットに同様にＩＶ投与すると、以下に示す通り、大きく異なるクリアランス及び排出半減期値が得られる。
クリアランス：１４４９ｍｌ／ｈｒ／ｋｇ
ｔ１／２（ｈｒ）：０．０５

実施例５誘導体化されたＧＬＰ−１ペプチドの薬物動態学的分析
式Ｉ（式中、Ｘａａ_８はＶａｌであり、Ｘａａ_２２はＧｌｕであり、Ｘａａ_３３はＩｌｅであり、Ｘａａ_４６はＣｙｓ−ＮＨ_２である）のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物を、０．０１ｍｇ／ｋｇの量で雄のカニクイザルに皮下（ＳＣ）投与する。投与後０から１６８時間のさまざまな時点で、上記動物から採血する。各サンプルから血清を採集し、Ｎ末端に特異的なラジオイムノアッセイによって分析する。薬物動態学的パラメータは、モデル非依存の方法（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎＰｒｏ）を使用して算出される。これを示すデータを以下の表２に示す。
表２−
雄のカニクイザルに対する０．０１ｍｇ／ｋｇの皮下投与後の、式Ｉ（ここでＸａａ_８はＶａｌであり、Ｘａａ_２２はＧｌｕであり、Ｘａａ_３３はＩｌｅであり、Ｘａａ_４６はＣｙｓ−ＮＨ_２である）のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物のＭｅａｎ（±ＳＤ）ＰＫパラメータ値。

略語：ＳＤ＝標準偏差
^ａ観察された最大血清濃度。
^ｂ最大血清濃度が観察された時間。
^ｃ０から最終時間において測定された血清濃度−時間曲線下の面積。
^ｄ推定排出半減期。
^ｅバイオアベイラビリティの関数としての全身クリアランス。
^ｆバイオアベイラビリティの関数としての定常状態分布容積。

実施例６誘導体化されたＧＬＰ−１ペプチドの薬力学的分析
式Ｉ（式中、Ｘａａ_８はＶａｌであり、Ｘａａ_２２はＧｌｕであり、Ｘａａ_３３はＩｌｅであり、Ｘａａ_４６はＣｙｓ−ＮＨ_２である）のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物を、０．０１ｍｇ／ｋｇの量で雄のカニクイザルに皮下（ＳＣ）投与する。媒体対照（リン酸緩衝食塩水）のＳＣ投与直後、０．０１ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化ＧＬＰ−１類似体のＳＣ投与の１、５、及び７日後にグルコース静注を段階的に実施する。鎮静させたサルに対し１６時間の絶食後に、グルコース静注を段階的に実施する。ベースラインを定めるため、グルコース静注を開始する１０分前と開始の直前に血液サンプルを採取する。その後、１０ｍｇ／ｋｇ／分を２０分間、続いて２５ｍｇ／ｋｇ／分を２０分間のグルコース（デキストロース２０％）の静注を段階的に開始する。静注期間中、１０分間隔で血液サンプルを採取する。インシュリン濃度は、イムノアッセイで測定される。ＰＥＧ化ＧＬＰ―１類似体０．０１ｍｇ／ｋｇの１回のＳＣ注射後、インスリン分泌促進作用が少なくとも７日間呈される（偽薬比、Ｐ＜０．０００１）。これを示すデータを以下の表３に示す。
表３−
雄のカニクイザルに対する０．０１ｍｇ／ｋｇの皮下投与後の、式Ｉ（ここでＸａａ_８はＶａｌであり、Ｘａａ_２２はＧｌｕであり、Ｘａａ_３３はＩｌｅであり、Ｘａａ_４６はＣｙｓ−ＮＨ_２である）のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物のＭｅａｎ（±ＳＤ）ＰＤパラメータ値。

Claims

式：Ｈｉｓ−Ｘａａ_８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｘａａ_２２−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ_３３−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ_４５−Ｘａａ_４６（配列番号：１）
［式中、
Ｘａａ_８は、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ又はＴｈｒであり、
Ｘａａ_２２は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＬｙｓであり、
Ｘａａ_３３は、Ｖａｌ又はＩｌｅであり、
Ｘａａ_４６は、Ｃｙｓ又はＣｙｓ−ＮＨ_２であり、
１つのＰＥＧ分子は、Ｃｙｓ_４５に共有結合され、１つのＰＥＧ分子は、Ｃｙｓ_４６又はＣｙｓ_４６−ＮＨ_２に共有結合される］
で示されるアミノ酸配列を含んでなるＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物。
Ｘａａ_８がＧｌｙ又はＶａｌであり、Ｘａａ_２２がＧｌｙ又はＧｌｕである、請求項１に記載のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物。
Ｘａａ_８がＶａｌであり、Ｘａａ_２２がＧｌｕである、請求項２に記載のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物。
Ｘａａ_８がＶａｌであり、Ｘａａ_２２がＧｌｕであり、Ｘａａ_３３がＩｌｅであり、Ｘａａ_４６がＣｙｓ−ＮＨ_２である、請求項３に記載のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物。
前記ＰＥＧ分子が、２０キロダルトンの直鎖状メトキシＰＥＧマレイミドである、請求項１〜４のいずれかに記載のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物。
治療が必要な患者におけるインスリン非依存性糖尿病を治療する方法であって、請求項１〜５のいずれかに記載の有効量のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物を投与することを含んでなる方法。
治療が必要な患者における肥満症を治療する方法であって、請求項１〜５のいずれかに記載の有効量のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物を投与することを含む方法。
医薬として使用するための請求項１〜５のいずれかに記載のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物。
インスリン非依存性糖尿病又は肥満症の治療のための医薬の製造における請求項１〜６のいずれかに記載のＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物の使用。