CN105142621A

CN105142621A - 用于预防或治疗糖尿病和促进β-细胞存活的TPL2激酶抑制剂

Info

Publication number: CN105142621A
Application number: CN201380062760.9A
Authority: CN
Inventors: S·达勒; J-F·坦季; A·沃伊图希申; E·瓦兰
Original assignee: Universite de Montpellier I; National Institute of Health Sciences
Current assignee: Universite de Montpellier I; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite de Montpellier; National Institute of Health Sciences
Priority date: 2012-10-24
Filing date: 2013-10-24
Publication date: 2015-12-09
Also published as: IN2015DN03795A; WO2014064215A1; US20150297573A1; EP2911655A1

Abstract

本发明涉及Tpl2激酶抑制剂用于预防治疗糖尿病以及在许多应用中促进β-细胞存活和功能的用途。

Description

用于预防或治疗糖尿病和促进β-细胞存活的TPL2激酶抑制剂

技术领域

本发明涉及Tpl2激酶抑制剂用于促进β-细胞存活和功能的用途。这开辟了预防或治疗糖尿病的新的治疗领域。

背景技术

糖尿病特征在于空腹状态下或口服葡萄糖耐受测试期间施用葡萄糖之后升高水平的血糖(高血糖)。在I型糖尿病(TD1M)或胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)中，患者产生少量或不产生胰岛素(调节葡萄糖利用的激素)。T1DM是导致β-细胞破坏的自身免疫疾病，所述β-细胞是生物体中存在于胰岛中的唯一分泌胰岛素的细胞。通过自身免疫激活后的促炎性细胞因子介导β-细胞攻击。在过去的十年中，胰岛移植已成为T1DM的一种有前途的替代治疗。这种技术需要从死者捐赠胰腺分离胰岛并将它们移植到患者的肝脏。成功移植可改善血糖控制，减轻患者胰岛素依赖及提高生活质量。然而，临床结果并不总是归因于移植过程中或移植之后胰岛质量的显著损失。胰岛的损失由包括即刻血液介导的炎症反应(IBMIR)和适应性免疫反应在内的几个原因引起。增加的证据表明细胞因子在这两个过程中起到关键的作用。细胞因子本身可以直接触发胰岛细胞死亡。事实上，细胞因子如IL-1β(白细胞介素1β)、TNF-α(肿瘤坏死因子a)和IFN-γ(干扰素γ)在T1DM和胰岛移植中具有重要的促炎症和促凋亡作用。虽然胰岛移植后服用免疫抑制剂，但它们不靶向于细胞因子介导的对胰岛的损伤。抗-TNF当今被广泛用于胰岛移植以预防IBMIR：尽管它改善胰岛接受者的结果，它不能完全阻止炎症现象。在这种情况下，靶向于介导炎症的其他细胞因子将是非常重要的。

此外，2型糖尿病(T2DM)或者非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)是一个严重的健康问题，到2030年预计其将影响到世界各地的3.5亿以上的个体，其中约6000万将在欧洲。因为相关的发病率和死亡率，糖尿病是对健康和社会保障体系负担最高的一个，并且会随着人口的老龄化而增加。目前，没有可用的治疗可以阻止T2DM的进展。目前的治疗主要集中在降低血液血糖或降低胰岛素抵抗，这是不充分防止后续疾病进展和下游糖尿病并发症的治疗策略。事实上，国际健康组织强烈推荐开发作用于疾病的发病源的治疗而不仅仅是对其症状的治疗。因此，需要超越当今一代的抗血糖剂的创新治疗，来治疗T2DM患者并防止这种疾病的发生和发展。

应该记得，T2DM的病理生理特点在于外围慢性胰岛素抵抗和β细胞功能和质量的逐渐下降(Kudva等人，1997；DeFronzo1988)。肥胖是T2DM发展的主要风险因素(Burke等人，1999；CDC1997)，并且其被认为通过肥胖相关的胰岛素抵抗赋予T2DM增加的风险(Ludvik等人，1995)。然而，大多数肥胖人群(且相对胰岛素抵抗)不患糖尿病，而通过增加β细胞的胰岛素分泌来补偿(Polonsky2000)。因此，现在广为接受的是，T2DM的胰岛素抵抗(虽然其病理生理学很重要)不足以建立疾病，除非是β细胞功能的主要缺陷并存(Butler等人，2003；Leibowitz等人，2009年)。因此，旨在提高具有发展为T2DM的确定的高风险的人群中增加的β细胞功能和存活的药理学策略是减缓T2DM的进展或甚至防止T2DM所必不可少的。

应当进一步指出，虽然肥胖(一种状态其中其他方面健康的受试者具有身体质量指数(BMI)大于或等于30kg/m²)是T2DM的一个关键组成部分，但是特别是在西方世界，许多患者按传统标准是不超重的。因此患有T2DM的个人可呈现多变临床特点。因此，有许多消瘦型糖尿病患者(BMI低于25kg/m²，甚至低于20kg/m²的人群)和许多超重的但没有糖尿病的人群。相关并发症的临床表现和特征相对于肥胖者在T2DM的消瘦型患者中不同。因此，消瘦型T2DM可以被认为是一个独特的临床实体。在诊断的消瘦型患者更可能是老年人，并且可以具有对某些病理生理特征，特别是较少的胰岛素抵抗和较差的胰岛素分泌能力的倾向。一些研究提示在这种消瘦型患者中差的β细胞功能。

最近，已经变清楚，慢性炎症是T2DM的一个标志，其影响胰腺β-细胞的功能和质量。如前所述，由于不能适当补偿胰岛素抵抗，患者可因此成为糖尿病人。在人类中，胰岛内β细胞最初通过增加胰岛素输出补偿胰岛素抵抗。因此，由于β细胞质量增加不足(或实际下降)的T2DM的发作是由于相对于非糖尿病胰岛素抵抗个体的增加的β-细胞凋亡。

事实上，先天免疫系统的慢性活化被发现与β细胞功能和质量的减少有关。已发现T2DM患者的胰岛显示升高水平的促炎性细胞因子如IL-1β和TNF-α、多样化的趋化因子，并被巨噬细胞浸润(Donath和Shoelson，2011；Dinarello等人，2010)。长期暴露在高浓度的IL-1β对β细胞和人胰岛起不利的影响。将人胰岛暴露于代谢应激例如升高的葡萄糖(葡萄糖毒性)和棕榈酸酯(脂毒性)浓度增加IL-1β和趋化因子的水平。由巨噬细胞和/或β细胞产生的进入胰岛的炎性细胞因子可能有助于β细胞死亡和胰岛素分泌功能衰竭(Donath和Shoelson，2011；Dinarello等人，2010；Maedler等人，2002)。基于这些观察，用于T2DM治疗的免疫调节策略已经出现(等人，2012；Larsen等人，2009；Larsen等人，2007)。在用IL-1β受体拮抗剂(IL-1RA)治疗2型糖尿病患者中观察到非常温和降低的高血糖和改善的β细胞功能(Larsen等人，2007)，但没有观察到实际的临床影响。这第一次证明了在T2DM中使用免疫调节策略的概念，但靶向于其他细胞因子将可能更为有效。

在这些不同的情况中(T2DM、T1DM、胰岛移植)，特异性控制不仅由IL-1β诱导，也由其他细胞因子(TNF-α和IFN-γ)诱导的炎症反应的蛋白激酶可以是用于对抗β细胞衰竭的治疗性干预的令人感兴趣的靶点。已经报道胞外信号调节激酶(ERK)-1/2(p44/42促分裂原活化蛋白(MAP)激酶)的活化在IL-1β对β细胞的不利影响中发挥作用(Maedler等人，2004)。然而，必须指出的是，这取决于刺激的性质，ERK1/2通路参与β细胞内的广泛的生物过程(Maedler等人，2004；Costes等人，2006)。

作为例子，ERK1/2在葡萄糖介导的β细胞存活中起关键作用(Costes等人，2006)。同时，调节对细胞因子(IL-1β、TNF-α、IFN-γ)特异性反应的ERK1/2活性的蛋白的确认不仅可以对促进β细胞功能障碍的分子机制提供重要的新的见解，还可以建议这些蛋白作为治疗靶点，以减轻T2DM中的β细胞衰竭。

因此，确认特异性控制炎症反应诱导的促炎性细胞因子IL-1β、TNF-α和IFN-γ的新靶点，对于最佳预防或治疗糖尿病(例如T1DM和T2DM)，以及对于有效和安全的胰岛细胞移植可能是令人感兴趣的。

在数量庞大的潜在可靶向的激酶中，多年前公开了Tpl2激酶作为通过NFkB活性参与炎症的激酶，因为已表明Tpl2激酶导致p105的降解，并随之释放Rel亚单元。因此，在美国公开号2003/0319427中推测了治疗NFkB可能参与的自身免疫疾病，例如多发性硬化症(MS)、炎性肠病(IBS)、胰岛素依赖型糖尿病(T1DM)、银屑病和类风湿性关节炎以及很多其他疾病的基本原理，尽管没有公开关于T1DM的相关结果或具体的技术支持。

最近，通过使用Tpl2敲除(KO)小鼠研究了Tpl2激酶在介导肥胖相关的胰岛素抵抗中的作用(Perfield等人2011)，并且提示Tpl2激酶是用于改善与肥胖有关的代谢状态，特别是用于恢复胰岛素敏感性的有希望的治疗靶点。然而，另一个小组使用相同的Tpl2KO小鼠对这种初步的结果提出质疑，因为作者未能找到在调节肥胖相关的代谢紊乱中的任何显著作用(Lancaster等人，2012)，甚至他们的结论是Tpl2缺失加剧高脂肪(HF)饮食的影响(即相比于野生型小鼠的受损的胰岛素耐受性)。他们也没有观察到ERK1/2磷酸化中HF饮食诱导的增加，这驳斥了Tpl2激酶在体内调节对饮食反应的ERK激活中的突出作用。更令人感兴趣的是，他们公开在wt和Tpl2^-/-小鼠中一般胰岛形态是相似的。

发明内容

发明简述

如在下面实施例中所述，本发明人已证明MAP3激酶Tpl2特异性介导通过β细胞中炎性细胞因子诱导的信号通路，并在触发β细胞功能障碍和破坏中起到重要作用，而且Tpl2激酶抑制剂保护胰腺β细胞免于凋亡。因此，Tpl2激酶抑制剂有用于预防和治疗糖尿病并促进许多应用中的β细胞存活。更特别地，本发明人已表明，出乎意料的是，Tpl2激酶在小鼠和人胰岛中的β细胞中表达，并且通过IL-1β单独或细胞因子混合物(IL-1β+TNFα+IFNγ)特别参与ERK1/2的活化，并且已证明Tpl2激酶的药理学抑制防止ERK1/2的活化和IL-1β单独或细胞因子混合物的慢性暴露对β细胞和人胰岛的不利影响。重要的是，在葡萄糖介导的β细胞存活中被描述起关键作用的葡萄糖诱导的ERK1/2和P90RSK磷酸化(Costes等人，2006)均没有被Tpl2抑制剂治疗修饰。

在本公开之前，Tpl2激酶尚未被证明是表达于β细胞中，以及其调节信号通路如ERK1/2通路的作用是未知的，所述通路对导致T2DM的β细胞功能障碍和凋亡中所涉及的所述三大促炎性细胞因子反应中。

这些新的发现支持Tpl2激酶抑制剂的新型药物干预手段，例如通过抑制β细胞凋亡促进β细胞存活和功能。此外，本发明可用于通过促进移植物存活来增加胰岛细胞移植的效率，而不是通过目前的免疫抑制治疗来获得该增加的效率。

因此，本发明的这些和其他方面的非限制性技术方案如下：

在第一方面，本发明涉及一种Tpl2(TumorProgressionLocus-2肿瘤进展位点-2)激酶抑制剂，其用于在需要其的患者中预防或治疗糖尿病的用途。

在第二方面，本发明涉及一种Tpl2激酶基因表达抑制剂，其用于在需要其的患者中预防或治疗糖尿病的用途。

在第三方面，本发明涉及一种Tpl2激酶抑制剂或一种Tpl2激酶基因表达抑制剂，其用于在需要其的患者中改善胰腺β细胞的存活或功能的用途。

在第四方面，本发明涉及一种药物组合物或一种组分试剂盒(kit-of-part)，其包含Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂和抗糖尿病药物。

在第五方面，本发明涉及一种Tpl2激酶抑制剂或一种Tpl2激酶基因表达抑制剂，其用于增强抗糖尿病药物的临床疗效的用途。

在第六方面，本发明涉及一种Tpl2激酶抑制剂或一种Tpl2激酶基因表达抑制剂，其用于增强抗糖尿病药物的抗炎作用和/或保存抗糖尿病药物的胰腺β细胞活力和/或功能的用途。

在第七方面，本发明涉及一种适用于哺乳动物胰腺β细胞培养的培养基，其包含Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂。

在第八方面，本发明涉及一种体外或离体改善胰腺β细胞群的存活和/或功能的方法，所述方法包括使所述群接触培养基的步骤，所述培养基包含有效量的Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂。

在第九方面，本发明涉及一种用于改善胰腺β细胞移植物的存活和/或功能的方法，所述方法包括向具有胰腺β细胞移植物的患者施用有效量的Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂的步骤。

在又一个方面，本发明还涉及一种Tpl2激酶抑制剂或一种Tpl2激酶基因表达抑制剂，其用于在具有胰腺β细胞移植物的患者中预防或治疗即刻血液介导的炎症反应(IBMIR)的用途。

本发明因此包含：

一种通过将所述细胞暴露于Tpl2激酶抑制剂，来抑制在胰腺β细胞中对两种或多种促炎性细胞因子反应的ERK1/2和p90RSK活化(激酶活性)的方法。所述方法可以在体外、离体或体内进行。例如，β细胞可能存在于用于移植的胰岛细胞的制备中。

优选地，所述两种或多种促炎性细胞因子选自：IL-1β、TNF-α和IFN-γ。优选地，所述促炎性细胞因子至少包括IL-1β和TNF-α。优选地，Tpl2激酶抑制剂不是用来完全抑制Tpl2激酶(例如通过完整的基因敲除)。优选，例如足以达到50或60％的体内Tpl2激酶活性抑制的部分抑制。此外，所述抑制“特异性”对两种或多种促炎性细胞因子(例如由炎性巨噬细胞分泌的生理细胞因子和趋化因子)反应，但不抑制对葡萄糖反应的ERK1/2和p90RSK活化(激酶活性)。因此，所述的特异性特别有用于提供一个可行的药物干预，因为它不干扰葡萄糖介导的β细胞存活中的ERK1/2的作用。

因此，在本发明的实施方案中，在胰腺β细胞中对两种或多种促炎性细胞因子反应的ERK1/2和p90RSK活化(激酶活性)的抑制不损害葡萄糖介导的所述β细胞的存活。

此外，在本发明的实施方案中，在胰腺β细胞中对两种或多种促炎性细胞因子反应的ERK1/2和p90RSK活化(激酶活性)的抑制具有抑制所述胰腺β细胞的凋亡的作用，这可以例如通过分析所调用的裂解的半胱天冬酶-3和裂解的PARP的水平进行验证。

在这些和其他方面中，Tpl2激酶抑制剂任选与抗糖尿病药物联用如胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂，如二肽基肽酶-4(DPP-4)(导致GLP-1降解的酶)的抑制剂，例如以保护由于细胞因子诱导的胰岛素分泌失败而患有T2DM或存在患有T2DM风险的患者中的所述胰腺β细胞。如本文的实验结果所证明的，对具有确定发展为T2DM高风险的受试者应用所述抑制剂可以在受试者中显示进展，或者甚至防止T2DM。

此外，在这些和其他方面中，Tpl2激酶抑制剂任选用于抗糖尿病药物中如胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂，例如施用至胰腺β细胞移植物以防止接受患者中的IBMIR。

因此，抑制剂和任选的药物可以体内使用以最终改善葡萄糖耐量，同时降低空腹血糖(即抑制高血糖)和血清胰岛素水平和\或改善或增加所述细胞的胰岛素敏感性。优选地，这不会影响体重。

在本发明的其他方面，提供一种用于如上所述的方法中的肿瘤进展位点-2(Tpl2)激酶抑制剂，或者提供一种用于如上所述的方法中的Tpl2激酶抑制剂和一种抗糖尿病药物。

在本发明的其他方面，提供肿瘤进展位点-2(Tpl2)激酶抑制剂在制备用于如上所述的方法中的药物中的用途，或者提供Tpl2激酶抑制剂和抗糖尿病药物二者在制备这种药物中的用途。

下文中讨论本发明的这些和其他方面。

发明详述

如上所述，本发明基于以下发现：MAP3激酶Tpl2特异性介导由β细胞中的炎性细胞因子诱导的信号通路，并且在触发β细胞功能障碍和破坏中起到重要作用，Tpl2激酶抑制剂保护胰腺β细胞免于凋亡。因此，Tpl2激酶抑制剂有用于预防和治疗糖尿病并在许多应用中促进β细胞存活。

本发明人已经表明，Tpl2激酶表达于小鼠和人胰岛中的β细胞，并且通过IL-1β单独或细胞因子混合物(IL-1β+TNFα+IFNγ)特别参与ERK1/2的活化，并且已经证明Tpl2激酶的药理学抑制可防止ERK1/2的活化和IL-1β单独或细胞因子混合物的慢性暴露对β细胞和人胰岛的不利影响。

并且，本发明人已经表明，Tpl2激酶抑制剂通过增强例如其对胰腺β细胞活力和功能对抗促炎性细胞因子的的有益作用，也有用于改善DPP-4抑制剂(例如西他列汀(Sitagliptin))的GLP-1激动剂(例如毒蜥外泌肽-4(Exendin-4)、利拉鲁肽(liraglutide))的抗糖尿病功效。他们已经表明毒蜥外泌肽-4、利拉鲁肽、西他列汀和Tpl2激酶抑制剂的组合与单独的各个化合物相比，能更有效地保护β细胞对抗炎性细胞因子的不利作用。

基于Tpl2激酶失活的显著保护作用，他们已经发现，抑制Tpl2激酶显著地降低人胰岛中细胞因子诱导的胰岛素分泌失败。特别地，已发现使用Tpl2激酶抑制剂和毒蜥外泌肽-4的组合治疗人胰岛是可行的和功能性的，并且完全保护人胰岛免受细胞因子的不利影响。重要地，使用Tpl2激酶抑制剂增强毒蜥外泌肽-4在β细胞和人胰岛中对抗炎症的保护作用。

治疗方法和用途

本发明提供用于预防(例如预防性治疗)或治疗糖尿病的方法和组合物(例如药物组合物)。

在第一个方面，本发明涉及一种Tpl2激酶抑制剂，其用于在需要其的患者中预防或治疗糖尿病的用途。

如本文所使用，术语“肿瘤进展位点-2(Tpl2)激酶”指MAP3K家族中的丝氨酸/苏氨酸激酶(也称为COT和MAP3K8)，其是ERK1/2通路中MEK1/2的上游，已经表明其涉及TNF-α的产生和信号传导。示例性天然多核苷酸序列编码的人类Tpl2激酶由GenBank数据库以登录号NM_005204提供。

如本文所使用，术语“抑制剂”是指任何天然或合成的化合物，其能够降低基因产物的活性。因此，抑制剂可以抑制由基因直接或间接编码的蛋白的活性。例如可以通过结合于蛋白获得直接抑制，并由此防止蛋白结合于靶点(例如结合伴侣)或防止蛋白活性(如酶活性)。例如可以通过结合于蛋白的预定靶点例如结合伴侣获得间接抑制，由此阻断或降低蛋白的活性。

如本文所使用，术语“Tpl2激酶抑制剂”是指任何天然或合成的化合物，其导致Tpl2激酶的活性降低。典型地，Tpl2激酶抑制剂引起蛋白MEK的磷酸化水平的降低，并且还抑制对脂多糖(LPS)反应的TNF-α的产生，正如Kaila等人，2007中所描述。

本领域技术人员无需过度负担即可评估给定化合物是否是Tpl2激酶抑制剂。典型地，如果使用MEK作为底物在所述化合物的存在下进行Tpl2激酶酶法测定之后，与不存在所述化合物所培养的MEK相比，磷酸化的MEK水平降低，则该化合物被视为是Tpl2激酶抑制剂。磷酸化的MEK1蛋白的水平可以通过使用特异于所述MEK1蛋白的磷酸化形式的抗体的蛋白印迹(Westernblot)或ELISA进行测定。例如，可以使用GST-MEK1作为底物直接测定Tpl2/Cot激酶活性，并且可以通过ELISA来检测GST-MEK1的丝氨酸残基217和221的磷酸化，正如Kaila等人，2007中所描述。

此外，可以如Kaila等人，2007中所描述，体外(例如，在原代人单核细胞或人血液中)或体内(例如，LPS诱导的TNF-α产生的大鼠模型)测定给定化合物导致的TNF-α的抑制。

如本文所使用，“糖尿病”指广义类的代谢性疾病，其特征在于受损的胰岛素产生和葡萄糖耐受。糖尿病包括1型和2型糖尿病、妊娠糖尿病、糖尿病前期、胰岛素抵抗、代谢综合征、空腹血糖受损和糖耐量受损。1型糖尿病也称为胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)。所述术语在本文中可互换使用。2型也被称为非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)。

如本文所使用，术语“需要其的患者”是指已被诊断为1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病、糖尿病前期、胰岛素抵抗、代谢综合征、空腹血糖受损或糖耐量受损的受试者，或者指存在发展为任何这些疾病的风险的受试者。需要治疗的患者还包括那些遭受伤害、疾病或外科手术影响胰腺的患者，或者他们产生胰岛素的能力受损的个体。此类患者可以是任何哺乳动物，例如，人、狗、猫、马、猪、羊、牛、小鼠、大鼠或兔(优选人)。

在一个实施方案中，所述需要其的患者是肥胖患者。

如本文所用的术语“肥胖”是其中存在过量的身体脂肪的状态。肥胖的实用性定义是基于身体质量指数(BMI)，其计算为体重/身高米数的平方(kg/m²)。“肥胖”是指一种状态，其中一个其他方面健康的受试者具有大于或等于30kg/m²的BMI。“肥胖患者”是指具有大于或等于30kg/m²的BMI的其他方面健康的受试者。超重受试者是处于肥胖风险的受试者。

在另一实施方案中，所述需要其的患者为消瘦型患者。

因此，消瘦型患者是具有小于或等于25kg/m²或者甚至小于或等于20kg/m²的BMI的其他方面健康的受试者。

在一个实施方案中，所述需要其的患者为非胰岛素抵抗的患者。

如本文所使用的术语“预防疾病”并不是指绝对术语。相反，例如2型糖尿病的预防是指与疾病有关的发作的延迟、症状的频率减少、或症状的严重度减轻。因此，预防是指预防措施的宽泛概念，其将被本领域技术人员所理解。在一些情况下，症状的频率和严重度被降低至非病理学水平，例如使得个体不需要传统的胰岛素替代治疗。在一些情况中，接受根据本发明的Tpl2激酶抑制剂的患者的症状频率或严重度仅为未治疗的患有该疾病的个体所经历的症状频率或严重度的90、80、70、60、50、40、30、20、10、5或1％。

相似地，术语“治疗疾病”不是是指绝对术语。在一些情况中，根据本发明的Tpl2激酶抑制剂寻求降低导致糖尿病症状的胰岛素产生细胞的损失。在一些情况中，用本发明的抑制剂的治疗导致改善的预后或症状频率或严重度的降低。

在一个实施方案中，所述Tpl2激酶可以是低分子量拮抗剂，例如小的有机分子。

在一个特别的实施方案中，所述Tpl2激酶抑制剂及其制备方法描述于国际专利申请WO2006/124944，并具有下式(I)或其药学上可接受的盐：

(I)

其中：

R¹选自C_3-10环烷基、芳基、3-10元杂环烷基、和杂芳基，其各自任选被选自以下的1-4个基团取代：

a)卤素，b)CN，c)NO₂，d)N₃，e)OR⁷，f)NR⁸R⁹，g)氧代，h)硫代，i)S(O)_PR⁷，j)SO₂NR⁸R⁹，k)C(O)R⁷，l)C(O)OR⁷，m)C(O)NR⁸R⁹，n)Si(C_1-6烷基)₃，o)C_1-6烷基，p)C_2-6烯基，q)C_2-6炔基，r)C_1-6烷氧基，s)C_1-6烷基硫基，t)C_1-6卤代烷基，u)C_3-10环烷基，v)芳基，w)3-10元环杂烷基，和x)杂芳基，

其中o)-x)中的任何一个任选被1-4个R¹⁰基团取代；

R²选自C_3-10环烷基、芳基、3-10元杂环烷基、和杂芳基，其各自任选被选自以下的1-4个基团取代：

a)卤素，b)CN，c)NO₂，d)N₃，e)OR⁷，f)NR⁸R⁹，g)氧代，h)硫代，i)S(O)_PR⁷，j)SO₂NR⁸R⁹，k)C(O)R⁷，l)C(O)OR⁷，m)C(O)NR⁸R⁹，n)Si(C_1-6烷基)₃，o)C_1-6烷基，p)C_2-6烯基，q)C_2-6炔基，r)C_1-6烷氧基，s)C_1-6烷基硫基，t)C_1-6卤代烷基，u)C_3-10环烷基，v)芳基，w)3-10元杂环烷基，和x)杂芳基，

其中o)-x)中的任何一个任选被1-4个R¹⁰基团取代；

可替换地，R²选自卤素、任选被1-4个R¹⁰基团取代的C^1-6烷基、C_1-6卤代烷基、NR⁸R⁹、OR⁷、C(O)OR⁷、C(O)NR⁸R⁹、S(O)_pR⁷和N₃；

R³和R⁴独立地选自：

a)H，b)C(O)R⁷，c)C(O)OR⁷，d)C(O)NR⁸R⁹，e)C_1-6烷基，f)C_2-6烯基，g)C_2-6炔基，h)C_1-6卤代烷基，i)C_3-10环烷基，j)芳基，k)3-10元杂环烷基，和l)杂芳基，

其中e)-l)中的任何一个任选被1-4个R¹⁰基团取代；

R⁵和R⁶在每次出现时独立地选自：

a)H，b)卤素，c)OR⁷，d)NR⁸R⁹，e)C_1-6烷基，f)C_2-6烯基，g)C_2-6炔基，h)C_1-6卤代烷基，和i)芳基；

可替换地，任何两个R⁵或R⁶基团和它们所键合的碳可以形成羰基；

R⁷在每次出现时选自：

a)H，b)C(O)R¹¹，c)C(O)OR¹¹，d)C(O)NR¹¹R¹²，e)C_1-6烷基，f)C_2-6烯基，g)C_2-6炔基，h)C_1-6卤代烷基，i)C_3-10环烷基，j)芳基，k)3-10元杂环烷基，和l)杂芳基；

其中e)-l)中的任何一个任选被1-4个R¹³基团取代；

R⁸和R⁹在每次出现时独立地选自：

a)H，b)OR¹¹，c)SO₂R¹¹，d)C(O)R¹¹，e)C(O)OR¹¹，f)C(O)NR¹¹R¹²，g)C_1-6烷基，h)C_2-6烯基，i)C_2-6炔基，j)C_1-6卤代烷基，k)C_3-10环烷基，l)芳基，m)3-10元杂环烷基，和n)杂芳基；

其中g)-n)中的任何一个任选被1-4个R¹³基团取代；

R¹⁰在每次出现时独立地选自：

其中o)-x)中的任何一个任选被1-4个R¹³基团取代；

R¹¹和R¹²在每次出现时独立地选自：

a)H，b)C_1-6烷基，c)C_2-6烯基，d)C_2-6炔基，e)C_1-6卤代烷基，f)C_3-10环烷基，g)芳基，h)3-10元环杂烷基，和i)杂芳基，

其中b)-i)中的任何一个任选被1-4个R¹³基团取代；

R¹³在每次出现时独立地选自：

a)卤素，b)CN，c)NO₂，d)N₃，e)OH，f)O-C_1-6烷基，g)NH₂，h)NH(C_1-6烷基，i)N(C_1-6烷基)₂，j)NH(芳基)，k)NH(环烷基)，I)NH(杂芳基)，m)NH(杂环烷基)，n)氧代，o)硫代，p)SH，q)S(O)_p-C_1-6烷基，r)C(O)-C_1-6烷基，s)C(O)OH，t)C(O)O-C_1-6烷基，u)C(O)NH₂，v)C(O)NHC_1-6烷基，w)C(O)N(C_1-6烷基)₂，x)C_1-6烷基，y)C_2-6烯基，z)C_2-6炔基，aa)C_1-6烷氧基，bb)C_1-6烷基硫基，cc)C_1-6卤代烷基，dd)C_3-10环烷基，ee)芳基，ff)3-10元杂环烷基，和gg)杂芳基，

其中任何C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-10环烷基、芳基、3-10元杂环烷基、或杂芳基，单独或作为其他基团的一部分，任选被选自卤素、CN、NO₂、OH、O-C_1-6烷基、NH₂、NH(C_1-6烷基、N(C_1-6烷基)₂、NH(芳基)、NH(环烷基)、NH(杂芳基)、NH(杂环烷基)、氧代、硫代、SH、S(O)_p-C_1-6烷基、C(O)-C_1-6烷基、C(O)OH、C(O)O-C_1-6烷基、C(O)NH₂、C(O)NHC_1-6烷基、C(O)N(C_1-6烷基)₂、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基硫基、C_1-6卤代烷基、C_3-10环烷基、芳基、3-10元杂环烷基、和杂芳基中的一种或多种基团所取代；

m是0、1、2、3、或4；

n是0或1；和

p是0、1、或2。

在一个优选的实施方案中，所述Tpl2激酶抑制剂为4-(3-氯-4-氟苯氨基)-6-(吡啶-3-基-甲氨基)-3-氰基-[1,7]-萘啶，其具有下式：

在另一个优选的特别的实施方案中，所述Tpl2激酶抑制剂为Kaila等人，2007中所描述的4-环庚氨基-6-[(吡啶-3-基甲基)-氨基]-[1,7]-萘啶-3-甲腈，其具有下式：

在另一个特别的实施方案中，所述Tpl2激酶抑制剂及其制备方法描述于国际专利申请WO2006/124692中，并且其具有下式(II)或其药学上可接受的盐：

(II)

其中：

a)卤素，b)CN，c)NO₂，d)N₃，e)OR⁹，f)NR¹⁰R¹¹，g)氧代，h)硫代，i)S(O)PR⁹，j)SO₂NR¹⁰R¹¹，k)C(O)R⁹，l)C(O)OR⁹，m)C(O)NR¹⁰R¹¹，n)Si(C_1-6烷基)₃，o)C_1-6烷基，p)C_2-6烯基，q)C_2-6炔基，r)C_1-6烷氧基，s)C_1-6烷基硫基，t)C_1-6卤代烷基，u)C_3-10环烷基，v)芳基，w)3-10元环杂烷基，和x)杂芳基，

其中o)-x)中的任何一个任选被1-4个R¹²基团取代；

R²选自：

a)H，b)卤素，c)CN，d)NO₂，e)OR⁹，f)NR¹⁰R¹¹，g)S(O)PR⁹，h)SO₂NR¹⁰R¹¹，i)C(O)R⁹，j)C(O)OR⁹，k)C(O)NR¹⁰R¹¹，l)C_1-6烷基，m)C_2-6烯基，n)C_2-6炔基，o)C_1-6烷氧基，p)C_1-6烷基硫基，q)C_3-10环烷基，r)芳基，s)3-10元环杂烷基，和t)杂芳基，

其中l)-t)中的任何一个任选被1-4个R¹²基团取代；

R³选自：

a)H，b)卤素，c)CN，d)NO₂，e)OR⁹，f)NR¹⁰R¹¹，g)S(O)PR⁹，h)SO₂NR¹⁰R¹¹，i)C(O)R⁹，j)C(O)OR⁹，k)C(O)NR¹⁰R¹¹，l)C_1-6烷基，m)C_2-6烯基，n)C_2-6炔基，o)C_1-6烷氧基，p)C_1-6烷基硫基，q)C_1-6卤代烷基，r)C_3-10环烷基，s)芳基，t)3-10元环杂烷基，和u)杂芳基，

其中l)-u)中的任何一个任选被1-4个R¹²基团取代；

R⁴选自C_3-10环烷基、芳基、3-10元杂环烷基、和杂芳基，其各自任选被选自以下的1-4个基团取代：

a)卤素，b)CN，c)NO₂，d)OR⁹，e)NR¹⁰R¹¹，f)氧代，g)硫代，h)S(O)PR⁹，i)SO₂NR¹⁰R¹¹，j)C(O)R⁹，k)C(O)OR⁹，l)C(O)NR¹⁰R¹¹，m)Si(C_1-6烷基)₃，n)C_1-6烷基，o)C_2-6烯基，p)C_2-6炔基，q)C_1-6烷氧基，r)C_1-6烷基硫基，s)C_1-6卤代烷基，t)C_3-10环烷基，u)芳基，v)3-10元环杂烷基，和w)杂芳基，

其中n)-w)中的任何一个任选被1-4个R¹²基团取代；

可替换地，R⁴选自任选被1-4个R¹²基团取代的C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、OR⁹、NR¹⁰R¹¹、C(O)OR⁹、C(O)NR¹⁰R¹¹、S(O)_PR⁹、和N₃；

R⁵和R⁶在每次出现时独立地选自：

a)H，b)C(O)R⁹，c)C(O)OR9，d)C(O)NR¹⁰R¹¹，e)C_1-6烷基，f)C_2-6烯基，g)C_2-6炔基，h)C_1-6卤代烷基，i)C_3-10环烷基，j)芳基，k)3-10元环杂烷基，和l)杂芳基，

其中e)-l)中的任何一个任选被1-4个R¹²基团取代；

R⁷和R⁸在每次出现时独立地选自：

a)H，b)卤素，c)OR⁹，d)NR¹⁰R¹¹，e)C_1-6烷基，f)C_2-6烯基，g)C_2-6炔基，h)C_1-6卤代烷基，和i)芳基；

可替换地，任何两个R⁷或R⁸基团和它们所键合的碳可以形成羰基；

R⁹在每次出现时选自：

a)H，b)C(O)R¹³，c)C(O)OR¹³，d)C(O)NR¹³R¹⁴，e)C_1-6烷基，f)C_2-6烯基，g)C_2-6炔基，h)C_1-6卤代烷基，i)C_3-10环烷基，j)芳基，k)3-10元杂环烷基，和l)杂芳基；

其中e)-l)中的任何一个任选被1-4个R¹⁵基团取代；

R¹⁰和R¹¹在每次出现时独立地选自：

a)H，b)OR¹³，c)SO₂R¹³，d)C(O)R¹³，e)C(O)OR¹³，f)C(O)NR¹³R¹⁴，g)C_1-6烷基，h)C_2-6烯基，i)C_2-6炔基，k)C_1-6卤代烷基，I)C_3-10环烷基，m)芳基，n)3-10元杂环烷基，和o)杂芳基；

其中g)-o)中的任何一个任选被1-4个R¹⁵基团取代；

R¹²在每次出现时独立地选自：

a)卤素，b)CN，c)NO₂，d)N₃，e)OR⁹，f)NR¹⁰R¹¹，g)氧代，h)硫代，i)S(O)_PR⁹，j)SO₂NR¹⁰R¹¹，k)C(O)R⁹，l)C(O)OR⁹，m)C(O)NR¹⁰R¹¹，n)Si(C_1-6烷基)₃，o)C_1-6烷基，p)C_2-6烯基，q)C_2-6炔基，r)C_1-6烷氧基，s)C_1-6烷基硫基，t)C_1-6卤代烷基，u)C_3-10环烷基，v)芳基，w)3-10元环杂烷基，和x)杂芳基，

其中o)-x)中的任何一个任选被1-4个R¹³基团取代；

R¹³和R¹⁴在每次出现时独立地选自：

其中b)-j)中的任何一个任选被1-4个R¹⁵基团取代；

R¹⁵在每次出现时独立地选自：

a)卤素，b)CN，c)NO₂，d)N₃，e)OH，f)O-C_1-6烷基，g)NH₂，h)NH(C_1-6烷基)，i)N(C_1-6烷基)₂，j)NH(芳基)，k)NH(环烷基)，I)NH(杂芳基)，m)NH(杂环烷基)，n)氧代，o)硫代，p)SH，q)S(O)_p-C_1-6烷基，r)C(O)-C_1-6烷基，s)C(O)OH，t)C(O)O-C_1-6烷基，u)C(O)NH₂，v)C(O)NHC_1-6烷基，w)C(O)N(C_1-6烷基)₂，x)C_1-6烷基，y)C_2-6烯基，z)C_2-6炔基，aa)C_1-6烷氧基，bb)C_i-6烷基硫基，cc)C_1-6卤代烷基，dd)C_3-10环烷基，ee)芳基，ff)3-10元杂环烷基，和gg)杂芳基，

其中任何C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-10环烷基、芳基、3-10元杂环烷基、或杂芳基，单独或作为其他基团的一部分，任选被选自卤素、CN、NO₂、OH、O-C_1-6烷基、NH₂、NH(C_1-6烷基、N(C_1-6烷基)₂、NH(芳基)、NH(环烷基)、NH(杂芳基)、NH(杂环烷基)、氧代、硫代、SH、S(O)_p-C_1-6烷基、C(O)-C_1-6烷基、C(O)OH、、C(O)O-C_1-6烷基、C(O)NH₂、C(O)NHC_1-6烷基、C(O)N(C_1-6烷基)₂、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基硫基、C_1-6卤代烷基、C_3-10环烷基、芳基、3-10元杂环烷基、和杂芳基中的一种或多种基团所取代；

m是0、1、2、3、或4；

n是0或1；和

p是0、1、或2。

在一个特别的实施方案中，所述Tpl2激酶抑制剂为Wu等人，2009中所描述的8-氯-4-(3-氯-4-氟苯氨基)-6-((1-乙基哌啶-4-基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)甲氨基)喹啉-3-甲腈，其具有下式：

其他Tpl2激酶抑制剂描述于国际专利申请WO/0011910和WO2005/110140和George和Salmeron，2009中。

在第二个方面，本发明涉及一种Tpl2激酶基因表达抑制剂，其用于在需要其的患者中预防或治疗糖尿病的用途。

如本文所使用，术语“基因表达抑制剂”指天然或合成化合物，其具有抑制或明显降低基因表达的生物作用。因此，“Tpl2激酶基因表达抑制剂”指天然或合成化合物，其具有抑制或明显降低编码Tpl2激酶的基因表达的生物作用。

本发明所使用的Tpl2激酶基因表达抑制剂可以是基于反义寡核苷酸构建物。反义寡核苷酸包括反义RNA分子和反义DNA分子，将通过结合于Tpl2激酶mRNA起到直接阻断Tpl2激酶mRNA的翻译的作用，并因此在细胞中防止蛋白翻译或增加mRNA降解，因此降低Tpl2激酶的水平及其活性。例如可以通过常规的磷酸二酯技术合成反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸具有至少约15个碱基并互补于编码Tpl2激酶的mRNA转录序列的独特区，并且通过例如静脉注射或输液施用所述反义寡核苷酸。使用反义技术特异性抑制已知序列的基因的基因表达的方法是本领域公知的(例如，参见美国专利号6,566,135、6,566,131、6,365,354、6,410,323、6,107,091、6,064,321、和5,981,732)。

小的抑制性RNA(siRNA)也可以作为本发明所使用的Tpl2激酶基因表达抑制剂。可以通过使受试者或细胞与小的双链RNA(dsRNA)、或者导致小的双链RNA产生的载体或构建物接触来降低Tpl2激酶基因的表达，以使得Tpl2激酶基因表达被特异性抑制(即RNA干扰或RNAi)。对于已知序列的基因，选择适当的dsRNA或dsRNA编码的载体的方法是本领域熟知的(例如参见Tuschl,T.等人(1990)；EIbashir.S.M.等人(2001)；Hannon,GJ.(2002)；McManus,MT.等人(2002)；Brummelkamp,TR.等人(2002)；美国专利号6,573,099和6,506,559；和国际专利公开号WO01/36646、WO99/32619、和WO01/68836)。

在一个实施方案中，如以下的实施例部分所述，通过使用购自Dharmacon(ABgeneLtd，ThermoFisherScientific的子公司，Waltham，MA)的一套经验证的4种不同的19个核苷酸siRNA双链(“ON-TARGETplusSMARTpool”，L-091828-01-2005)抑制Tpl2激酶基因表达。

核酶也可用作本发明所使用的Tpl2激酶基因表达抑制剂。核酶是能够催化RNA特异性裂解的RNA酶分子。核酶作用的机制涉及将核酶分子序列特异性杂交于互补的靶RNA，然后内切核苷酸裂解。因此，特异地并有效地催化Tpl2激酶mRNA序列的内切核苷酸裂解的设计的发夹状或锤头状核酶分子在本发明的范围内是有用的。最初通过扫描靶分子的核酶裂解位点来确认任何潜在的RNA靶点中的特异性核酶裂解位点，其通常包括以下序列：GUA、GUU和GUC。一旦确定，可以评估对应于含有该裂解位点的靶基因的区域的约15至20个核糖核苷酸的短RNA序列用于预测结构特征，例如二级结构，其可以使寡核苷酸序列不适合。也可以使用例如核糖核酸酶保护测定法，通过测试它们杂交于互补寡核苷酸的可行性来评估候选靶标的适宜性。

可以通过已知的方法制备用作Tpl2激酶基因表达抑制剂的反义寡核苷酸和核酶。这些方法包括化学合成技术，例如，如通过固相亚磷酰胺的化学合成。可替换地，反义RNA分子可通过体外或体内编码RNA分子的DNA序列的转录而产生。这样的DNA序列可以被合并到各种各样的合并了合适的RNA聚合酶启动子如T7或SP6聚合酶启动子的载体中。本发明的寡核苷酸的各种修饰可以被引入作为增加细胞内稳定性和半衰期的一种方式。可能的修饰包括但不限于将核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的侧翼序列加入到分子的5'和/或3'末端，或者在寡核苷酸骨架内使用硫代磷酸酯或2'-O-甲基而不是磷酸二酯酶键。

本发明的反义寡核苷酸siRNA和核酶可以在体内单独递送或与载体联合递送。在其最广泛的意义上，“载体”是能够促进反义寡核苷酸siRNA或核酶核酸向细胞，优选表达Tpl2激酶的细胞转移的任何载体。优选地，载体转运核酸至与不存在载体所得到的降解程度相比具有减少的降解的细胞中。通常，用于本发明的载体包括但不限于，质粒、噬菌粒、病毒、其他衍生自病毒或细菌源的载体，其通过反义寡核苷酸siRNA或核酶核酸序列的插入或合并而被操控。病毒载体是载体的优选类型，并且包括但不限于来自下列病毒的核酸序列：逆转录病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒、哈维鼠肉瘤病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、和洛兹肉瘤病毒；腺病毒、腺相关病毒；SV40型病毒；多瘤病毒；爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒；乳头状瘤病毒；疱疹病毒；牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；和RNA病毒如逆转录病毒。人们可以容易地使用未命名但本领域已知的其他载体。

优选的病毒载体基于非细胞病变的真核病毒，其中非必需基因已被替换为感兴趣的基因。非细胞病变病毒包括逆转录病毒(例如，慢病毒)，其生命周期涉及基因组病毒RNA逆转录为DNA，随后原病毒整合到宿主细胞DNA中。逆转录病毒已被批准用于人类基因治疗试验。最有用的是那些复制缺陷型逆转录病毒(即，能够指导所需蛋白的合成，但不能制造感染颗粒)。这种遗传改变的逆转录病毒表达载体具有在体内高效率转导基因的一般作用。用于产生复制缺陷型逆转录病毒的标准方案(包括以下步骤：将外源性遗传物质合并入质粒，转染内衬质粒的包装细胞，通过包装细胞系生产重组逆转录病毒，从组织培养基收集病毒颗粒，以及用病毒颗粒感染靶细胞)在Kriegler，1990和Murry，1991中提供。

对于某些应用优选的病毒是腺病毒和腺相关病毒，它们是已经被批准用于人类基因治疗的双链DNA病毒。腺相关病毒可以被基因工程改造为复制缺陷型，并且能够感染广泛的细胞类型和物种。它还具有以下优势：例如，热和脂类溶剂稳定性；在不同谱系细胞，包括造血细胞中的高频率转导；和缺少双重感染抑制从而允许多个系列的转导。据报道，腺相关病毒可以位点特异性方式整合入人细胞DNA中，从而使插入诱变的可能性和逆转录病毒感染的插入基因表达特性的变化最小化。此外，在不存在选择压力下在大于100个通路的组织培养中已经跟随野生型腺相关病毒感染，这意味着腺相关病毒基因组整合是相对稳定的事件。腺相关病毒也以染色体外的样式起作用。

其他载体包括质粒载体。质粒载体已在本领域中被广泛描述并且是本领域技术人员所熟知的。例如参见Sambrook等人，1989。在过去的几年中，质粒载体已被用作DNA疫苗用于在体内递送编码抗原的基因至细胞。它们对此特别有利，因为其不具有与许多病毒载体相同的安全性问题。然而，这些质粒具有与宿主细胞相容的启动子，可以由质粒内可操控编码的基因表达肽。一些常用的质粒包括pBR322、pUC18、pUC19、pRC/CMV、SV40和pBlueScript。其他质粒是本领域普通技术人员所熟知的。此外，可使用限制性酶和连接反应定制质粒以除去和添加特异性DNA片段。质粒可以通过多种肠胃外、粘膜和局部途径递送。例如，DNA质粒可以通过肌内、皮内、皮下、或其他途径注射。其也可以通过鼻内喷雾剂或滴剂、直肠栓剂和口服施用。可以使用基因枪将其施用到表皮或粘膜表面。质粒可在水溶液中提供，在金颗粒上干燥或与另一DNA递送系统联合提供，所述另一DNA递送系统包括但不限于脂质体、树状聚合物、脂质卷(cochleate)和微胶囊。

本发明还涉及一种Tpl2激酶抑制剂或一种Tpl2激酶基因表达抑制剂，其用于在需要其的患者中改善胰腺β细胞的存活或功能的用途。

本发明还涉及一种预防或治疗糖尿病的方法，其包括向需要其的患者施用Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂。

Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂可以如下定义的药物组合物的形式施用。优选地，所述拮抗剂或抑制剂以治疗有效量施用。

“治疗有效量”是指以适用于任何医学治疗的合理的利益/风险比来预防或治疗糖尿病的足够量的Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂。

应当理解，本发明化合物的每日总使用量由主治医师在医学判断范围内来决定。对于任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物，患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间、给药途径和所采用的具体化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所采用的具体多肽的组合使用或一起使用的药物；和医药领域公知的类似因素。例如，本领域的技能范围之内公知的是：化合物的起始剂量水平在达到期望的治疗效果所需要的剂量以下，并且逐步增加剂量直至获得所期望的作用。但是，产品的日剂量可以从每日每成人0.01至1000mg的宽范围内变化。优选，对于待治疗患者的症状调整的剂量，组合物含有0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、250和500mg的活性成分。药物通常含有约0.01mg至约500mg的活性成分，优选1mg至约100mg的活性成分。药物的有效量通常以每天体重0.0002mg/kg至约20mg/kg，尤其是每天体重约0.001mg/kg至7mg/kg的剂量水平提供。

药物组合物

所述Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂可以与药学上可接受的赋形剂组合，并且任选地与缓释基质，例如可生物降解的聚合物组合，以形成治疗组合物。

在本发明的药物组合物中，单独或与另一活性成分组合的活性成分，可以作为与常规的药物载体的混合物，以单位给药形式施用于动物和人类。合适的单位给药形式包括口服-途径形式例如片剂、凝胶胶囊、粉剂、颗粒剂和口服混悬液或溶液、舌下和颊施用的形式、气雾剂、植入物、皮下、经皮、局部、腹膜内、肌肉内、静脉内、真皮下、经皮、鞘内和鼻内施用形式和直肠施用形式。

优选地，所述药物组合物含有用于可注射制剂的药学上可接受的载体。其可以特别是等渗、无菌、盐水溶液(磷酸二氢钠或磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或干的尤其是冻干组合物，其在加入无菌水或生理盐水(视情况而定)后允许注射溶液的构建。

适合于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散剂；包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液的制剂；和用于临时制备无菌注射溶液或分散剂的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，并且必须是达到易于注射(syringability)程度的流体。其必须在生产和储存条件下是稳定的，并且必须抗微生物如细菌和真菌的污染作用。

可以在适当地混合了表面活性剂例如羟丙基纤维素的水中制备含有游离碱或药理学上可接受的盐形式的本发明化合物的溶液。分散剂也可在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中和在油中制备。在常规储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。

可以将本发明的Tpl2激酶抑制剂的Tpl2激酶基因表达抑制剂配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基形成)，并且所述酸加成盐是与无机酸如，例如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的盐。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱如，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。

所述载体还可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、和蔬植物油。例如，通过使用包衣如卵磷脂，在分散体的情况下通过保持所需的粒径和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，获得微生物的预防作用。在许多情况中，优选包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，获得可注射组合物的延长吸收。

可以根据需要，通过在适当的溶剂中，以所需的量，将活性多肽与几种如上列举的其他成分合并，然后过滤灭菌，来制备无菌注射溶液。一般地，通过将各种灭菌的活性成分合并至包含基本分散介质和以上列举的所需的其他成分的无菌载体来制备分散体。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从之前的无菌过滤溶液得到活性成分和任何其他所需成分的粉末。

在配制后，以与剂型相容的方式和以治疗有效量施用溶液。所述制剂容易以各种剂型施用，例如，如上所述的注射溶液的类型，也可以使用药物释放胶囊等剂型。

对于在水溶液中的肠胃外施用，例如，如果需要该溶液应当被适当缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使得液体稀释剂等渗。这些特殊的水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这方面，根据本公开内容，可采用的无菌水性介质对本领域技术人员是已知的。例如，可以将一个剂量溶解于1ml等渗NaCl溶液中，并将其加入到1000ml皮下输液流体中或者将其注射于预输液的位点。根据待治疗患者的情况，可能有必要发生剂量的一些变化。负责施用的人会在任何情况下确定个体受试者合适的剂量。

本发明的Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂可以被配制成治疗混合物，以使得大约每剂量包含约0.0001至1.0mg，或约0.001至0.1mg，或约0.1至1.0或甚至约10mg以上。可以施用多个剂量。

除了被配制成用于肠胃外施用如静脉内或肌内注射的本发明化合物，其他药学上可接受的形式包括，例如片剂或其他用于口服施用的固体；脂质体制剂；缓释胶囊；以及目前使用的任何其他形式。

本发明的药物组合物可以包含另一种治疗活性剂。

在一个实施方案中，所述另一种治疗活性剂为如下所述的抗糖尿病药物。

在一个特别的方面，本发明还涉及一种药物组合物，其用于在如上所述的需要其的患者中改善胰腺β细胞的存活或功能的用途。

用于预防或治疗糖尿病的组分试剂盒

本发明的Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂也可用于与其他治疗活性剂，例如，抗糖尿病药物(例如，胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂)组合。

在一个实施方案中，所述Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达或含有其的药物组合物可以旨在与抗糖尿病药物分别、相继或同时施用。

更特别地，在本文所述的“组合”治疗中，两种或多种治疗或疗法被组合，例如相继或同时组合。所述试剂可同时或相继施用，并且可以各自变化的剂量方案和经由不同的途径施用。例如，当相继施用时，所述试剂可以在紧密间隔的时间间隔施用(例如，在5-10分钟的一段时间内)或在较长的时间间隔施用(例如1、2、3、4或更多小时的间隔，或如需要甚至更长的时间间隔)，精确的剂量方案与本文所述的治疗剂特性包括它们的协同效应相符。

所述试剂可以被一起配制在单一剂型中，或者可替换地，可以分别配制个体试剂，并任选与它们的使用说明一起呈现于试剂盒(例如，在泡罩包装中)形式中。

因此，在第三方面，本发明还涉及一种适合于预防或治疗糖尿病的组分试剂盒，其包含Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂和抗糖尿病药物。

在一个实施方案中，本发明的组分试剂盒可以包含：(i)如上所定义的Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂，和(ii)至少一种抗糖尿病药物，(i)和(ii)各自被布置以分别、相继或同时施用。

如本文所使用，“抗糖尿病药”是指任何天然或合成的化合物，其可以降低血液中的血糖水平，因此其可用于预防或治疗糖尿病。典型地，抗糖尿病药物包括(1)胰岛素以及胰岛素类似物(例如由EliLilly公司以商品名“Humalog”出售的赖脯胰岛素)或变体，(2)增加由胰腺分泌的胰岛素的量的试剂(例如，胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂、DPP-4抑制剂、和磺酰脲类)(3)增加靶器官对胰岛素敏感性的试剂(例如，双胍类和噻唑烷二酮类)，和(4)降低胃肠道吸收葡萄糖的速率的试剂(例如α-葡糖苷酶抑制剂)。

在一个特别的实施方案中，所述抗糖尿病药物是胰岛素。人胰岛素是在胰腺中的胰岛产生的51个氨基酸的肽激素。

在另一个特别的实施方案中，所述抗糖尿病药物是胰岛素类似物或变体。

人胰岛素具有三个伯氨基基团：A链的N-末端基团和B链的N-末端基团和Lys^B29的ε-氨基基团。在现有技术中已知一个或多个这些基团被取代的几种胰岛素类似物或变体，如WO2007/074133中所描述。本发明所设想的示例性胰岛素类似物包括在天然人胰岛素B链的第29位氨基酸和任选在其他位置修饰的胰岛素。例如，胰岛素的优选类似物是由EliLilly公司以商品名“Humalog”出售并在美国专利5,514,646中描述的赖脯胰岛素。这样的胰岛素类似物为其中B28是赖氨酸且B29是脯氨酸的胰岛素，即天然人胰岛素的氨基酸序列在B链的第28和29位的反转。

本发明的胰岛素类似物可以通过任何各种已知的肽合成技术包括经典(溶液)方法、固相方法、半合成方法以及最近可用的重组DNA方法来制备。

在一个特别的实施方案中，所述抗糖尿病药物是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂。

本发明所设想的示例性GLP-1受体激动剂包括但不限于，例如，在WO2008061355、WO2009080024、WO2009080032中所描述的艾塞那肽或其具体制剂，利拉鲁肽，他司鲁泰(taspoglutide)(R-1583)，阿必鲁泰(albiglutide)，利西拉来(lixisenatide)或已经在诺和诺德公司A/S的WO98/08871、WO2005027978、WO2006037811、WO2006037810中，在Zealand的WO01/04156中，或在Beaufour-Ipsen的WO00/34331中描述的那些，醋酸普兰林肽(pramlintideacetate)(Symlin；AmylinPharmaceuticals)，可吸入的GLP-1(MannKind的MKC-253)AVE-0010，BIM-51077(R-1583、ITM-077)，PC-DAC：毒蜥外泌肽-4(共价键合于重组人白蛋白的毒蜥外泌肽-4类似物)，生物素化的毒蜥外泌肽(WO2009107900)，如US2009238879中描述的毒蜥外泌肽-4的具体制剂，CVX-73，CVX-98和CVx-96(共价键合于具有GLP-1肽特异性结合位点的单克隆抗体的GLP-1类似物)，CNTO-736(键合于包括抗体的Fc部分的结构域的GLP-1类似物)，PGC-GLP-1(键合于纳米载体的GLP-1)，例如在D.Chen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA104(2007)943中描述的激动剂或调节剂，如WO2006124529、WO2007124461、WO2008062457、WO2008082274、WO2008101017、WO2008081418、WO2008112939、WO2008112941、WO2008113601、WO2008116294、WO2008116648、WO2008119238、WO2008148839、US2008299096、WO2008152403、WO2009030738、WO2009030771、WO2009030774、WO2009035540、WO2009058734、WO2009111700、WO2009125424、WO2009129696、WO2009149148中描述的那些，肽，例如奥尼匹肽(obinepitide)(TM-30338)，口服活性GLP-1类似物(例如诺和诺德公司的NN9924)，例如在WO2007104789、WO2009034119中所描述的胰淀素受体激动剂，如在WO2007120899、WO2008022015、WO2008056726中描述的人GLP-1类似物，例如在WO2008101017、WO2009155257、WO2009155258中描述的含有GLP-1和胰高血糖素残基的嵌合聚乙二醇化肽，如WO2009153960中所描述的糖基化GLP-1衍生物，以及口服活性降血糖成分。

在一个优选的实施方案中，所述GLP-1受体激动剂是毒蜥外泌肽-4或艾塞那肽。

毒蜥外泌肽-4描述于美国专利5,424,286中，并且是在毒蜥(Gilamonster)的唾液中发现的激素，其显示类似于人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的生物特性，并且是葡萄糖代谢和胰岛素分泌的调节剂。

艾塞那肽是39个氨基酸的肽并且是合成形式的毒蜥外泌肽-4，其增强由胰腺β细胞分泌的葡萄糖依赖性胰岛素并抑制不适当升高的胰高血糖素分泌。

在另一个优选的实施方案中，所述GLP-1受体激动剂是利拉鲁肽。

在另一特别的实施方案中，所述抗糖尿病药物是二肽基肽酶IV(DDP-4)抑制剂。

本发明可以设想的示例性的DDP-4抑制剂包括但不限于：维格列汀(vildagliptin)(LAF-237)、西他列汀(MK-0431)、磷酸西他列汀、沙格列汀(saxagliptin)(BMS-477118)、GSK-823093、PSN-9301、SYR-322、SYR-619、TA-6666、TS-021、GRC-8200(美罗利汀(melogliptin))、GW-825964X、KRP-104、DP-893、ABT-341、ABT-279或其另一种盐、S-40010、S-40755、PF-00734200、BI-1356、PHX-1149、DSP-7238、苯甲酸阿格列汀(alogliptin)、利格列汀(linagliptin)、美罗利汀、卡格列汀(carmegliptin)、或者在WO2003074500、WO2003106456、WO2004037169、WO200450658、WO2005037828、WO2005058901、WO2005012312、WO2005/012308、WO2006039325、WO2006058064、WO2006015691、WO2006015701、WO2006015699、WO2006015700、WO2006018117、WO2006099943、WO2006099941、JP2006160733、WO2006071752、WO2006065826、WO2006078676、WO2006073167、WO2006068163、WO2006085685、WO2006090915、WO2006104356、WO2006127530、WO2006111261、US2006890898、US2006803357、US2006303661、WO2007015767(LY-2463665)、WO2007024993、WO2007029086、WO2007063928、WO2007070434、WO2007071738、WO2007071576、WO2007077508、WO2007087231、WO2007097931、WO2007099385、WO2007100374、WO2007112347、WO2007112669、WO2007113226、WO2007113634、WO2007115821、WO2007116092、US2007259900、EP1852108、US2007270492、WO2007126745、WO2007136603、WO2007142253、WO2007148185、WO2008017670、US2008051452、WO2008027273、WO2008028662、WO2008029217、JP2008031064、JP2008063256、WO2008033851、WO2008040974、WO2008040995、WO2008060488、WO2008064107、WO2008066070、WO2008077597、JP2008156318、WO2008087560、WO2008089636、WO2008093960、WO2008096841、WO2008101953、WO2008118848、WO2008119005、WO2008119208、WO2008120813、WO2008121506、WO2008130151、WO2008131149、WO2009003681、WO2009014676、WO2009025784、WO2009027276、WO2009037719、WO2009068531、WO2009070314、WO2009065298、WO2009082134、WO2009082881、WO2009084497、WO2009093269、WO2009099171、WO2009099172、WO2009111239、WO2009113423、WO2009116067、US2009247532、WO2010000469、WO2010015664中描述的那些化合物。

在一个优选的实施方案中，所述DDP-4抑制剂是西他列汀。

还应当指出的是，DDP-4抑制剂可以与盐酸二甲双胍联合施用(例如Janumet^(R)，磷酸西他列汀与盐酸二甲双胍的固体组合，或Eucreas^(R)，维格列汀与盐酸二甲双胍的固体组合)。

在另一个特别的实施方案中，所述抗糖尿病药物为GPR40受体激动剂。

本发明所设想的示例性的GPR40受体激动剂包括但不限于那些，例如，在WO2007013689、WO2007033002、WO2007106469、US2007265332、WO2007123225、WO2007131619、WO2007131620、WO2007131621、US2007265332、WO2007131622、WO2007136572、WO2008001931、WO2008030520、WO2008030618、WO2008054674、WO2008054675、WO2008066097、US2008176912、WO2008130514、WO2009038204、WO2009039942、WO2009039943、WO2009048527、WO2009054479、WO2009058237、WO2009111056、WO2010012650、WO2011161030、WO2012004269、WO2012010413中描述的那些。

在一个优选的实施方案中，所述GPR40受体激动剂是TAK-875或AMG837。

在另一特别的实施方案中，所述抗糖尿病药是噻唑烷二酮，例如曲格列酮、环格列酮、吡格列酮、罗格列酮或由雷迪博士研究基金会(Dr.Reddy’sResearchFoundation)在WO97/41097中公开的化合物，特别是5-[[4-[(3,4-二氢-3-甲基-4-氧代-2-喹唑啉基甲氧基]-苯基]甲基]-2,4-噻唑烷二酮。

在另一特别的实施方案中，所述抗糖尿病药物是双胍，例如二甲双胍或它的一种盐。

本发明所设想的其他抗糖尿病药物包括但不限于例如，US2012/0004166中所描述的那些。

本发明还涉及一种用于预防或治疗糖尿病的组分试剂盒，其包含Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂和抗糖尿病药物。

本发明还涉及一种用于预防或治疗糖尿病的方法，其包括向需要其的患者施用组分试剂盒，所述组分试剂盒包含Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂和抗糖尿病药物。

本发明还涉及Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂用于增强抗糖尿病药物的临床疗效的用途。如本文所使用，术语“增强临床疗效”是指抗炎作用的改善和/或保存胰腺β细胞活力和功能的改善。

含有Tpl2激酶抑制剂的培养基

在第四个方面，本发明进一步涉及一种培养基，其包含如上所定义的Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂。

如本文所使用，术语“培养基”是指适合于体外或离体培养哺乳动物胰腺β-细胞，优选人类胰腺β-细胞的液体介质。

如本文所使用，“胰腺β-细胞”、“β胰岛细胞”、“产生胰岛素的细胞”及类似术语是指在胰岛中发现的胰腺内分泌细胞群。β胰岛细胞产生和分泌胰岛素和胰淀素至血流。

本发明所使用的培养基可以是基于水的介质，其包括如盐、营养素、矿物质、维生素、氨基酸、核酸、蛋白如细胞因子、生长因子和激素的物质的组合，所有这些均是细胞存活所需的。

例如，根据本发明的培养基可以是用于人的合成组织培养基例如RPMI(洛斯维公园纪念所培养基)或CMRL-1066(康诺特医学研究实验室)，其补充有如下进一步描述的必须添加剂(实施例部分)。

例如，在分离后，人胰岛培养于CMRL(康诺特医学研究实验室)1066培养基中(购自Sigma-Aldrich(C0422))，其含有5.6mmol/l葡萄糖并补充有10％胎牛血清(FBS)或人血清白蛋白(HSA)、100UI/ml青霉素、100mg/ml链霉素和2mM谷氨酰胺。

在一个优选的实施方案中，本发明的培养基不含有动物衍生物质。在一个优选的实施方案中，本发明的培养基基本上由合成化合物、人源的化合物和水组成。有利地，所述培养基可以被用于根据良好操作规范(在“GMP”条件下)培养细胞。

在一个优选的实施方案中，所述Tpl2激酶抑制剂是4-(3-氯-4-氟苯氨基)-6-(吡啶-3-基-甲氨基)-3-氰基-[1,7]-萘啶(其可购自Calbiochem)。典型地，所述Tpl2激酶抑制剂以1至20μM范围内的浓度，优选2至10μM范围内的浓度，甚至更优选约3μM的浓度，被添加至本发明的培养基中。

在一个实施方案中，所述培养基包含一种或多种例如如上所述的β细胞中发现的分离的胰腺内分泌细胞。

胰腺β-细胞的移植

在第五个方面，本发明涉及一种体外或离体改善胰腺β-细胞群的存活和/或功能的方法，所述方法包含使所述群接触培养基的步骤，所述培养基包含有效量的如上所定义的Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂。

如本文所使用，“改善细胞存活”是指与对照相比(例如在不治疗的相同条件下将存活的细胞数目)在给定条件下存活的细胞数目的增加。改善的细胞存活可以表示为比较值，例如如果细胞存活被改善两倍则为两倍细胞存活。改善的细胞存活可以由细胞凋亡的减少、细胞寿命的增加、或细胞功能和状态的改善所导致。在一些实施方案中，与对照水平相比，细胞存活被改善5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％。在一些实施方案中，细胞存活为对照水平的两倍、三倍、四倍、五倍、或十倍。可替换地，改善的细胞存活可以表示为细胞凋亡减少的百分比。在一些实施方案中，与对照样品相比，例如，细胞凋亡被降低10、20、30、40、50、60、70、80、90或高达100％。

本发明还涉及一种体外或离体预防或降低胰腺β-细胞群的炎症和/或凋亡的方法，所述方法包括使所述群接触培养基的步骤，所述培养基包含有效量的如上所定义的Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂。

在另一个方面，本发明涉及一种改善胰腺β-细胞移植物的存活和/或功能的方法，所述方法包括用含有有效量的如上所定义的Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂的培养基预培养胰腺β-细胞移植物的步骤。

在另一个方面，本发明涉及一种改善胰腺β-细胞移植物的存活和/或功能的方法，所述方法包含向所述具有胰腺β-细胞移植物的患者施用有效量的如上所定义的Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂的步骤。

在一个实施方案中，所述Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂在移植的最初阶段被施用于患者(接受者)。

在另一个方面，本发明涉及一种改善胰腺β-细胞移植物的存活和/或功能的方法，所述方法包括用含有有效量的如上所定义的Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂的培养基预培养胰腺β-细胞移植物的第一步骤和向所述具有预培养的胰腺β-细胞移植物的患者施用有效量的如上所定义的Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂的第二步骤。如本文所使用的“移植”是指将细胞引入个体(接受者或宿主)。“胰腺β-细胞移植物”指包含β-细胞的移植物，但其不必完全由β-细胞组成。

在另一个方面，提供用于移植的分离的胰腺β-细胞群，其中所述细胞在分离后被处理和/或在外源性Tpl2激酶抑制剂的存在下被处理。

所述被移植的细胞可以作为整个器官(例如胰腺)、很大程度上是完整的组织样本(例如组织移植，如胰岛移植)、或作为降解的细胞群(例如富含β-胰岛细胞)或纯化的β-细胞移植物被引入。被引入的细胞可以来源于另一个个体(异体移植)或来源于同一个体(自体移植)。在一些情况中，从个体移除细胞，在有利的条件下培养，并替换。在一些情况中，可以在合适的条件下培养未分化的或部分分化的细胞以分化为β-细胞，并移植到个体中。

在另一个方面，本发明涉及如上所述的Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂，其用于在具有胰腺β-细胞移植物的患者中预防或治疗即刻血液介导的炎症反应(IBMIR)的用途。

本发明还涉及一种在具有胰腺β-细胞移植物的患者中预防或治疗IBMIR的方法，所述方法包括向所述具有胰腺β-细胞移植物的患者施用有效量的如上所定义的Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂。

将通过以下附图和实施例进一步阐明本发明。然而，这些实施例和附图不应以任何方式被理解为限制本发明的范围。

附图说明

图1：Tpl2被表达并由β细胞中的IL-1β和细胞因子激活。A：从INS-1E细胞，或小鼠或人胰岛制备来自于溶解产物的蛋白。使用Tpl2抗体(1:250)使溶解产物经历蛋白印迹。B和C：在KRB缓冲液中，用单独的IL-1β(20ng/ml)(B)或细胞因子混合物(IL-1β(0.2ng/ml)、TNFα(50ng/ml)、和IFNγ(30ng/ml)(C)刺激INS-1Eβ-细胞持续指定的时间。用对抗Tpl2(1:250)或β肌动蛋白(1:5000)的抗体使溶解产物经历蛋白印迹。虚线代表来自未处理的对照细胞的100％蛋白量。显示了四个独立实验的代表性免疫印迹和定量。数据表示为未处理细胞中Tpl2蛋白量的百分比，并呈现为平均值±SEM。*P<0.05，和**P<0.01对比未处理的细胞。

图2和3：Tpl2的药理学抑制或沉默特异性阻止了在INS-1Eβ-细胞中对IL-1β和细胞因子反应的ERK1/2和p90RSK的活化。2A、2B、2C、3A和3C：在KRB缓冲液中，在2小时内，用或不用Tpl2抑制剂(Tpl2-I)(3μΜ)处理INS-1Eβ-细胞(2A、2B、2C和3A)或小鼠胰岛(3C)，然后用或不用单独的IL-1β(20ng/ml)(2A和2B)、细胞因子混合物(IL-1β(0.2ng/ml)、TNF-α(50ng/ml)、和IFN-γ(30ng/ml)(2C)，或葡萄糖(10mM)(3A)刺激INS-1Eβ-细胞(2A、2B、2C和3A)或小鼠胰岛(3C)20分钟。用对抗Tpl2(1:250)、磷酸化的或总的ERK1/2(1:2000)、磷酸化的或总的p38的(1:1000)、磷酸化的或总的p54/p46JNK(1:1000)或磷酸化的p90RSK(1:1000)的抗体使溶解产物经历蛋白印迹。显示四个或五个独立实验的定量。2D和3B：第一次40nMsiRNA转染后72小时，如上所述处理或未处理INS-1E细胞。通过如上所述的蛋白印迹分析磷酸化和总蛋白量。显示了三至五个实验的定量。数据表示为磷酸化的与总蛋白量的比例，并且表示为磷酸化相比于未处理的细胞中基础的倍数。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**P<0.01，和***P<0.001对比对照细胞中的刺激效果。

图4：在慢性细胞因子处理的INS-1细胞中和来自2型糖尿病动物模型的胰岛中的Tpl2表达。A和B：在RPMI培养基中，用或不用单独的IL-1β(20ng/ml)或细胞因子混合物(IL-1β(0.2ng/ml)、TNF-α(50ng/ml)、和IFN-γ(30ng/ml)刺激INS-1Eβ-细胞持续指定的时间。用对抗Tpl2(1:250)、裂解的半胱天冬酶-3(1:1000)、总的和裂解的PARP(1:1000)或β肌动蛋白(1:5000)的抗体使溶解产物经历蛋白印迹。虚线表示来自未处理的对照细胞的100％蛋白量。显示了四个独立实验的定量。C：从Wistar或GK大鼠胰岛制备来自溶解产物的蛋白并使用Tpl2抗体(1:250)或β肌动蛋白(1:5000)使其经历蛋白印迹。显示了每组六只大鼠的定量。D：在含有0.2％人白蛋白的RPMI培养基中，用或不用细胞因子混合物(IL-1β(1000U/ml)、TNF-α(1000U/ml)和IFN-γ(1000U/ml))刺激人胰岛72小时。用对抗Tpl2(1:250)或β肌动蛋白(1:5000)的抗体使溶解产物经历蛋白印迹。显示了四个独立的重复实验的定量(每份实验对应于来自一个人供体的胰岛)。对于整个图，数据被表示为不同蛋白与β肌动蛋白的蛋白量的比例，并表示为未处理的细胞(A，B)、Wistar大鼠胰岛(C)、或未处理的人胰岛(D)中的蛋白量的百分比。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01，和***P<0.001对比未处理的细胞(A和B)、Wistar大鼠胰岛(C)、或未处理的人胰岛(D)。

图5：INS-1E细胞中和小鼠胰岛中Tpl2抑制下的炎性细胞因子的细胞凋亡作用。A和C：在含0.5％BSA(A)或7.5％SVF(C)的RPMI培养基中，在2小时内，用或不用Tpl2抑制剂(3μΜ)处理INS-1Eβ细胞，然后用或不用Tpl2抑制剂(3μΜ)和单独的IL-1β(20ng/ml)刺激INS-1Eβ细胞48小时(A)，或者用或不用细胞因子混合物(IL-1β(0.2ng/ml)、TNFα(50ng/ml)、和IFNγ(30ng/ml)刺激INS-1Eβ细胞24小时(C)。用对抗裂解的半胱天冬酶-3(1:1000)、总的和裂解的PARP(1:1000)或β肌动蛋白(1:5000)的抗体使溶解产物经历蛋白印迹。显示了四个至十个独立实验的定量。数据表示为裂解的半胱天冬酶-3或裂解的PARP与β肌动蛋白的蛋白量的比例，并表示为这些蛋白相比于未处理细胞中基础的倍数。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01，和***P<0.001对比对照细胞中的刺激作用。B：在含有7.5％SVF的RPMI培养基中，用或不用每种细胞因子单独或三种的混合物(IL-1β(0.2ng/ml)、TNFα(50ng/ml)、或IFNγ(30ng/ml)刺激INS-1Eβ细胞24小时。用对抗裂解的半胱天冬酶-3(1:1000)或β肌动蛋白(1:5000)的抗体使溶解产物经历蛋白印迹。虚线表示来自未处理的对照细胞的100％半胱天冬酶-3的量。显示了四个独立实验的定量。数据被表示为未处理的细胞中裂解的半胱天冬酶-3蛋白量的百分比(半胱天冬酶-3/β肌动蛋白量之比)。数据表示为平均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，和***P<0.001对比未处理的对照细胞。D：在RPMI培养基中，用或不用细胞因子混合物(IL-1β(1000U/ml)、TNF-α(1000U/ml)和IFN-γ(1000U/ml))刺激分离的小鼠胰岛24小时。使用“半胱天冬酶3/7Assay”测定半胱天冬酶-3/7的活性。每一列表示8次重复实验的平均值±SEM(每份实验对应一只小鼠)。*P<0.05，**P<0.01，和***P<0.001对比对照胰岛中的刺激效果。

图6：Tpl2的抑制减少了由炎性细胞因子分泌的生理细胞因子和趋化因子的细胞凋亡作用。于37℃和5％CO₂/95％空气气氛下，将RAW264.7巨噬细胞保持在含有5％(体积/体积)热灭活的胎牛血清和抗生素的DMEM中。将RAW264.7细胞与LPS(脂多糖)(0.5ng/ml)孵育24小时，并将所得到的条件培养基转移到用或不用Tpl2抑制剂(5μΜ)处理的INS-1E细胞上。用对抗裂解的半胱天冬酶-3(1:1000)或HSP90(1:1000)的抗体使溶解产物经历蛋白印迹。显示了四个实验的代表性免疫印迹和定量。数据表示为裂解的半胱天冬酶-3与HSP90蛋白量的比例，并表示为裂解的半胱天冬酶-3相比于不用Tpl2抑制剂处理的对照培养基中细胞中基础的倍数。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05，对比对照细胞中的刺激效果。

图7：Tpl2的抑制降低了人胰岛中由细胞因子诱导的ERK1/2的活化。分离人胰岛，并在含有10％SVF的CMRL培养基中培养24-72小时用于恢复，用含有或不含有Tpl2抑制剂(3μΜ)的KRBH缓冲液处理2小时，然后用或不用细胞因子混合物(IL-1β(100U/ml)、TNF-α(500U/ml)和IFNγ(100U/ml))刺激20分钟。用对抗磷酸化ERK1/2(1:1000)或β肌动蛋白(1:2000)的抗体使溶解产物经历蛋白印迹。显示了三个独立实验的代表性免疫印迹和定量。数据表示为磷酸化ERK2与β肌动蛋白量的比率，并表示为相比于未处理胰岛中基础的增加倍数。数据表示为平均值±SEM表示。*P<0.05，对比对照细胞的刺激效果。

图8：Tpl2的体内抑制对初始重量和体重的作用。五周龄的db/db小鼠从JanvierLtd获得，并在整个研究中用标准饮食(4％脂肪)喂养。所有小鼠自由获取食物和新鲜水并保持在12小时白天/12小时黑夜循环中。在腹膜内(ip)施用葡萄糖、胰岛素或每日注射2.5mg/kgTpl2抑制剂或对应的载体之前直至处死当日记录体重。

图9：Tpl2的体内抑制对空腹血糖和血浆胰岛素水平的作用。五周龄的db/db小鼠从JanvierLtd获得，并在整个研究中用标准饮食(4％脂肪)喂养。所有小鼠自由获取食物和新鲜水并保持在12小时白天/12小时黑夜循环中。使用从每日接受2.5mg/kgTpl2抑制剂或对应载体注射的小鼠尾静脉获得的血液样品，用(VerioOnetouch，Lifescan，JohnsonandJohnsonCompany)血糖仪测定空腹血糖浓度。使用从研究的第一天的尾静脉或处死当天的颈动脉获得的血液样品，通过放射免疫测定(RIA大鼠胰岛素试剂盒，Millipore)定量血清胰岛素水平。

图10：Tpl2的体内抑制对糖耐量和胰岛素耐受性的作用。五周龄的db/db小鼠从JanvierLtd获得，并在整个研究中用标准饮食(4％脂肪)喂养。所有小鼠自由获取食物和新鲜水并保持在12小时白天/12小时黑夜循环中。小鼠每日接受2.5mg/kgTpl2抑制剂或对应载体的注射。在16小时过夜禁食后，通过ip施用1-2g/kg葡萄糖进行葡萄糖耐量试验，并且使用来自尾静脉的血液样品，用(VerioOnetouch，Lifescan，JohnsonandJohnsonCompany)血糖仪测定血糖浓度。按照向非禁食的小鼠ip施用0.75U胰岛素/kg体重的类似的方式进行胰岛素耐受性试验。

图11：GLP-1类似物(毒蜥外泌肽-4)/Tpl2抑制剂组合对INS-1E细胞的抗凋亡作用。在含有7.5％SVF的RPMI培养基中，在2小时内，用或不用Tpl2抑制剂(3μΜ)和/或毒蜥外泌肽-4(Ex-4)(20nM)处理INS-1Eβ细胞，然后用或不用Tpl2抑制剂(3μΜ)、毒蜥外泌肽-4(20nM)和/或细胞因子混合物(IL-1β(0.2ng/ml)、TNF-α(50ng/ml)、和IFN-γ(30ng/ml)刺激INS-1Eβ细胞24小时。用对抗裂解的半胱天冬酶-3(1:1000)、总的和裂解的PARP(1:1000)或β肌动蛋白(1:5000)的抗体使溶解产物经历蛋白印迹。显示了十个独立实验的代表性免疫印迹和定量。数据表示为裂解的半胱天冬酶-3或裂解的PARP与β肌动蛋白量的比例，并且表示为细胞因子处理的细胞中该比例的百分比(图中称为“对照％”，虚线代表100％蛋白量)。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01，和***P<0.001对比对照细胞中的细胞因子作用。

图12：GLP-1类似物(毒蜥外泌肽-4)/Tpl2抑制剂的组合保护人胰岛免于细胞因子诱导的胰岛素分泌功能衰竭。在含有0.2％人白蛋白的RPMI培养基中，在2小时内，用或不用Tpl2抑制剂(3μΜ)和/或毒蜥外泌肽-4(20nM)处理人胰岛，然后用或不用Tpl2抑制剂(3μΜ)、毒蜥外泌肽-4(20nM)和/或细胞因子混合物(IL-1β(1000U/ml)、TNF-α的(1000U/ml)和IFN-γ(1000U/ml)刺激人胰岛72小时，然后用于在KRB缓冲液中的葡萄糖-响应试验。刺激指数被定义为被刺激的(20mM葡萄糖)相比于基础(2.8mM葡萄糖)胰岛素分泌的比例。每一列表示5个重复实验的平均值±SEM(每份实验对应于一个人供体的胰岛)。*P<0.05，**P<0.01，和***P<0.001对比对照细胞中细胞因子的作用。

图13：另一种GLP-1类似物(利拉鲁肽)/Tpl2抑制剂的组合对INS-1E细胞的抗凋亡作用。在含有7.5％SVF的RPMI培养基中，在2小时内，用或不用Tpl2抑制剂(3μΜ)和/或利拉鲁肽(20nM)处理INS-1Eβ细胞，然后用或不用Tpl2抑制剂(3μΜ)、利拉鲁肽(20nM)和/或细胞因子混合物(IL-1β(0.2ng/ml)、TNF-α(50ng/ml)、和IFN-γ(30ng/ml)刺激INS-1Eβ细胞24小时。用对抗裂解的半胱天冬酶-3(1:1000)或β肌动蛋白(1:5000)的抗体使溶解产物经历蛋白印迹。显示了3个独立实验的代表性免疫印迹和定量。数据表示为裂解的半胱天冬酶-3与β肌动蛋白量的比例，并且表示为细胞因子处理的细胞中该比例的百分比(图中称为“对照％”，虚线代表100％蛋白量)。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01，和***P<0.001对比对照细胞中的细胞因子作用。

图14：GLP-1/DPP-4抑制剂/Tpl2抑制剂组合对INS-1E细胞的抗凋亡作用。在含有7.5％SVF的RPMI培养基中，在2小时内，用或不用Tpl2抑制剂(3μΜ)和/或GLP-1(20nM)、DPP-4抑制剂(西他列汀，20nM)处理INS-1Eβ细胞，然后用或不用Tpl2抑制剂(3μΜ)、GLP-1(20nM)、DPP-4抑制剂(西他列汀，20nM)和/或细胞因子混合物(IL-1β(0.2ng/ml)、TNF-α(50ng/ml)、和IFN-γ(30ng/ml)刺激INS-1Eβ细胞24小时。用对抗裂解的半胱天冬酶-3(1:1000)或β肌动蛋白(1:5000)的抗体使溶解产物经历蛋白印迹。显示3个独立实验的代表性免疫印迹和定量。数据表示为裂解的半胱天冬酶-3与β肌动蛋白量的比例，并且表示为细胞因子处理的细胞中该比例的百分比(图中称为“对照％”，虚线代表100％蛋白量)。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01，和***P<0.001对比对照细胞中的细胞因子作用。

具体实施方式

实施例：

实施例1：在鼠和人β细胞中以及鼠和人胰岛中Tpl2激酶的体外抑制

材料与方法

材料和试剂：RPMI(洛斯维公园纪念所培养基)培养基、胎牛血清(FCS)、人重组IL-1β和TNF-α、以及人和大鼠重组IFN-γ购自Invitrogen(LifeTechnologiesSAS，法国)。鼠IL-1β和TNF-α购自PreProtech(Neuilly，法国)。Tpl2激酶抑制剂[4-(3-氯-4-氟苯氨基)-6-(吡啶-3-基甲氨基)-3-氰基-[1,7]萘啶]获得自Calbiochem(LaJolla，CA)。GLP-1类似物，毒蜥外泌肽-4获得自Bachem(Budendorf，瑞士)。硝化纤维素转移膜(Protran)和色谱层析纸获得自Schleicher&Schuell(Dassel，德国)。高效化学发光薄膜购自Amerham(GEHealthcarelimited，白金汉郡，UK)。二辛可宁酸(BCA)和硫酸铜(II)溶液、胶原酶XI、和1077来自Sigma(St.Louis，MO)。增强化学发光试剂来自SantaCruzBiotechnology和PerkinElmer。

抗体：抗Tpl2和HRP-连接的抗小鼠IgG抗体获得自SantaCruzBiotechnology(SantaCruz，CA，美国)。抗ERK1/2(p44和p42MAPK)抗体获得自TransductionLaboratories(BDBiosciencesPharmingen，圣地亚哥，CA)，并且抗-β-肌动蛋白抗体获得自Sigma(St.Louis，MO)。对抗裂解的半胱天冬酶-3、裂解的和总的PARP、总p38MAPK、总SAPK/JNK(p46和p54SAPK/JNK)、磷酸化-p90RSK(Thr573)、磷酸化-MSK-1(Thr581)、磷酸化-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、磷酸化-p38MAPK(Thrl80/Tyrl82)、磷酸化-SAPK/JNK(Thrl83/Tyrl85)和辣根过氧化物酶(HRP)-连接的抗兔IgG的抗体购自CellSignalingTechnology(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)。

INS-1E细胞的培养：大鼠β细胞系INS-1E由Maechler博士(细胞生理学和代谢教研室，医学系，日内瓦大学，瑞士，日内瓦)提供。于37℃，在5％CO₂加湿气氛中，使用含有11.1mM葡萄糖并补充有7.5％热灭活的FCS、1mM丙酮酸钠、10mMHEPES、2mM谷氨酰胺、50μΜβ巯基乙醇、100U/ml青霉素、和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基，将细胞(传代60-95)以单层保持在培养中。在6孔板中，于约70％融合时，在INS-1E细胞中进行实验。

动物：雄性C57BL/6小鼠获得自CharlesRiver实验室(St.AubinlesElbeuf，法国)。糖尿病GK(Goto-Kakizaki)大鼠被安置并获得自CNRS(巴黎狄德罗大学，法国，巴黎)的自适应和功能生物学团体(adaptiveandfunctionalbiologyunity)。非糖尿病Wistar大鼠用作对照。所有动物保持在12小时白天，12小时黑夜循环，并被提供自由获得水和标准啮齿类饮食。根据CNRS动物护理和使用委员会的规则安置和处死动物。

鼠和大鼠胰岛的分离和培养：胰岛分离自雄性10-12周龄C57BL/6小鼠，然后通过胆管注射大约2ml1mg/ml胶原酶XI。然后取出胰腺，在37℃搅拌下孵育9分钟以完成消化，并使用Histopaque-1077梯度从外分泌胰腺组织分离胰岛。然后，以补充有1.2mMCaCl₂、1mMMgCl₂和5.6mM葡萄糖的冷PBS洗涤胰岛，显微镜下用手挑选，分离为200-300个胰岛构成的组，并在37℃(95％空气和5％CO₂)，在含有11.1mM葡萄糖并补充有10％FCS、2mM谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640中，保持培养至少24小时。在CNRS(巴黎狄德罗大学，法国，巴黎)的自适应和功能生物学团体，从8-10周龄的雄性Wistar和GK大鼠分离胰岛。

人胰岛的分离和培养：在FrenchAgencedelaBiomedecine和当地制度伦理委员会的同意下，从五个脑死亡的非肥胖非糖尿病捐献者收获了人类胰腺组织。在糖尿病细胞治疗实验室(研究生物治疗研究院，蒙彼利埃，法国)或在细胞分离和移植中心(日内瓦大学，瑞士，日内瓦)，根据自动化方法略加修改的版本(Ricordi等人，1988；Bucher等人，2005)分离人胰岛。在含有5.6mM葡萄糖并补充有10％FCS、100UI/ml青霉素、100mg/ml链霉素和2mM谷氨酰胺的CMRL1066(Mediatech，赫恩登，VA)培养基中培养胰岛，用于在暴露于药物前恢复1至5天。

INS-1E细胞中的Tpl2siRNA：使用购自Dharmacon(ABgeneLtd，ThermoFisherScientific的子公司，Waltham，MA)的一套经验证的4种不同的19个核苷酸的siRNA双链(“ON-TARGETplusSMARTpool”，L-091828-01-0005)，使INS-1E细胞中的Tpl2表达特异性沉默。使用siRNA对照(阳性和阴性对照为来自Dharmacon的“ON-TARGETplus亲环素B控制池-大鼠”和从“ON-TARGETplus非靶向池-大鼠”)确定我们的siRNA方法的特异性，如图2D和2F所示，这未能引起任何被研究的并用作内部负载对照的蛋白的表达的改变。简言之，在用Opti-MEM培养基中以2:1的比例制备的40nMsiRNA-Lipofectamine^TM2000复合物转染之前，在没有青霉素和链霉素的存在下，将50万INS-1E细胞的组维持在培养中24小时。转染后6小时，用补充有7.5％热灭活的FCS的新鲜不含抗生素的RPMI培养基更换之前的培养基。在第一次转染后24小时，进行第二次转染以改善转染效率。使用“siGLO绿色转染指示器”评估转染效率。在第一转染后至少50小时进行所有测定。

药物暴露：为了确定在急性细胞因子刺激对激酶磷酸化的作用中Tpl2的影响，在Krebs-RingerBicarbonate(KRB)缓冲液中进行短期实验，所述Krebs-RingerBicarbonate(KRB)缓冲液：对于INS-1E细胞为无葡萄糖HEPES平衡的KRB(KRBH)(135mMNaCl，3.6mMKCl，0.5mMNaH₂PO₄，0.5mMMgCl₂，1.5mMCaCl₂，5mMNaHCO₃，和10mMHEPES，pH7.4，含有0.1％BSA)；对于小鼠胰岛为KRB缓冲液(120mMNaCl，4.7mMKCl，1.2mMKH₂PO₄，1.2mMMgSO₄，2.5mMCaCl₂，和24mMNaHCO₃，pH7.4，含有0.1％BSA和1.1mM葡萄糖)。于37℃，用或不用Tpl2抑制剂(3μΜ)预孵育INS-1E细胞或小鼠胰岛(每种条件下200-300个胰岛)2小时，然后用或不用Tpl2抑制剂(3μΜ)、葡萄糖(10mM)、单独的IL-1β(10000U/ml，20ng/ml)、细胞因子混合物(IL-1β(100U/ml，0.2ng/ml)、TNFα(500U/ml，50ng/ml)、和IFNγ(100U/ml，30ng/ml)、或毒蜥外泌肽-4(20nM)孵育INS-1E细胞或小鼠胰岛不同的时间(0、5、10、20、或30分钟)。

为了评估在慢性暴露于细胞因子的条件下Tpl2的作用，在含有2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、和葡萄糖(对于INS-1E细胞和小鼠胰岛为11.1mM，和对于人胰岛为5.6mM)的RPMI1640培养基中进行长期实验。用热灭活的FCS(对于INS-1E细胞为7.5％和对于小鼠胰岛为10％)或白蛋白(对于INS-1E细胞为用于单独的IL-1β的0.5％BSA，对于人胰岛为2％人白蛋白)补充培养基。对于INS-1E细胞，所述培养基含有1mM丙酮酸钠、10mMHEPES、和50μΜβ-巯基乙醇。于37℃，用或不用Tpl2抑制剂(3μΜ)和毒蜥外泌肽-4(20nM)预孵育INS-1E细胞、小鼠胰岛(每种条件下5-10个胰岛)或人胰岛(每种条件下500-2000个IEQ)2小时，然后用或不用Tpl2抑制剂(3μΜ)、单独的IL-1β(10000U/ml，20ng/ml)、细胞因子混合物(对于INS-1E细胞和小鼠胰岛为IL-1β(100U/ml，0.2ng/ml)、TNF-α(500U/ml，50ng/ml)、和IFN-γ(100U/ml，30ng/ml)，对于人胰岛为IL-1β(1000U/ml，2ng/ml)、TNF-α(1000U/ml，28ng/ml)、和IFN-γ(1000U/ml，833ng/ml))、和毒蜥外泌肽-4(20nM)，孵育INS-1E细胞、小鼠胰岛或人胰岛不同的时间(0、8、16、24、36、48或72小时)。在蒙彼利埃的糖尿病细胞治疗实验室(研究生物治疗研究所，蒙彼利埃)进行对于人胰岛的所有实验。

蛋白印迹：按照实验，INS-1E细胞、小鼠(每种条件下200-300个胰岛)或大鼠(每种条件下300-500个胰岛)胰岛用冷PBS洗涤一次，并溶解在冷裂解缓冲液中(对于INS-1E细胞为50mMHEPES，1mMEDTA，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，1mMNa₃VO₄，10mM焦磷酸盐，100mMNaF，1％TritonX-100，0.1％SDS和1mg/ml杆菌肽；对于小鼠和人胰岛为50mMHEPES，4mMEDTA，1mMPMSF，1mMNa₃VO₄，10mM焦磷酸盐，100mMNaF，1％NonidetP-40，1mg/ml亮肽素，1mg/ml抑肽酶)。为了更好地溶解，添加裂解缓冲液和超声之前，将胰岛冷冻于液氮中。然后通过离心(4℃，13000rpm，30分钟)使细胞或胰岛溶解产物澄清，使用BCA方法确定蛋白浓度。通过在Laemmli样品缓冲液中煮沸5分钟使蛋白变性，并通过10或12.5％SDS-PAGE分离等量蛋白(15-30μg蛋白/泳道)，并将其转移至硝酸纤维素膜。室温(RT)阻断1小时后，用特定初级抗体(1:250至1:4000稀释度)将膜于4℃孵育过夜，然后用辣根过氧化物酶连接的第二抗体(1:2000)于RT孵育1小时。通过增强的化学发光检测使蛋白显像。数字化放射自显影，使用ImageJ软件(国立卫生研究院，贝塞斯达，MD)分析条带强度。

细胞和胰岛生存力：通过蛋白印迹评估，半胱天冬酶-3的17kDa裂解形式(其对应于半胱天冬酶-3的活化的预凋亡形式)的出现，以及DNA修复和细胞存活中涉及的核酶聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的89kDa裂解形式的出现，来考察凋亡的INS-1E细胞的存在。通过使用“半胱天冬酶3/7Assay”(PromegaCorp.Madison，Wisc.，USA)，根据制造商的说明书测定半胱天冬酶-3/7活性来评价小鼠胰岛的凋亡。该试剂盒基于由半胱天冬酶3和7裂解发光底物的DEVD序列而产生发光信号。简言之，在96孔板中孵育胰岛24小时后(每孔大约相等尺寸的10个胰岛)加入半胱天冬酶3/7-Glo试剂，并且于37℃孵育样品2小时。使用TECAN无限200平板阅读器测量发光。

胰岛素分泌测定：在RPMI中用或不用Tpl2抑制剂和细胞因子孵育72小时后，于37℃预孵育人分离的胰岛(每种条件下3×5个人胰岛当量(IEQ))1小时，以稳定于含有2.8mM葡萄糖的KRB缓冲液(24mMNaHCO₃，120mMNaCl，4.7mMKCl，1.2mMKH₂PO₄，1.2mMMgSO₄，2.5mMCaCl₂，和10mMHEPES，pH7.4，0.1％BSA)中，然后于2.8mM孵育1小时并在20mM葡萄糖中另外孵育1小时。收集等分的孵育缓冲液，通过离心使其澄清，并冷冻。通过乙醇酸进行总胰岛胰岛素含量的提取，随后进行超声。通过放射免疫法(Milipore，SASFRANCE)，按照制造商的说明书测量胰岛素释放和含量，并将刺激指数定义为被刺激的胰岛素分泌相比于基础胰岛素分泌的比例(ng/ml/胰岛/小时)，并通过胰岛素含量(ng/ml/胰岛)校正该指数

统计分析：所有实验均独立地重复至少三次。结果表示为N个独立实验的平均值±SEM。平均值之间的统计学显着性通过非配对学生t检验评估，或通过ANOVA和随后的Newman-Keuls或Bonferronipost-hoc分析评估。用GraphPadPrism5软件进行分析。P值<0.05被认为是显著性。*，P<0.05，**，P<0.01，***，P<0.001。

Tpl2的抑制降低了由炎性巨噬细胞分泌的生理细胞因子和趋化因子的细胞凋亡作用：于37℃和5％CO₂/95％空气气氛下，将RAW264.7巨噬细胞保持在含有5％(体积/体积)热灭活的胎牛血清和抗生素的DMEM中。将RAW264.7巨噬细胞与LPS(脂多糖)(0.5ng/ml)孵育24小时，并将所得到的条件培养基转移到用或不用Tpl2抑制剂(5μΜ)处理的INS-1E细胞上。用对抗裂解的半胱天冬酶-3(1:1000)或HSP90(1:1000)的抗体使溶解产物经历蛋白印迹。显示了四个实验的代表性免疫印迹和定量。数据表示为裂解的半胱天冬酶-3与HSP90蛋白量的比例，并表示为裂解的半胱天冬酶-3相比于不用Tpl2抑制剂处理的对照培养基中的细胞中基础的倍数。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05，对比对照细胞的刺激效果。

Tpl2抑制降低了人胰岛中的细胞因子诱导的ERK1/2活化：分离人胰岛，并在含有10％SVF的CMRL培养基中培养24-72小时用于恢复，用具有或不具有Tpl2抑制剂(3μΜ)的KRBH缓冲液处理2小时，然后用或不用细胞因子混合物(IL-1β(l00U/ml)、TNF-α(500U/ml)、和IFNγ(100U/ml))刺激20分钟。用对抗磷酸化ERK1/2(1:1000)或b-肌动蛋白(1:2000)的抗体使溶解产物经历蛋白印迹分析。显示了三个独立实验的代表性免疫印迹和定量。数据表示为磷酸化ERK2与b-肌动蛋白量的比例，并表示为相比于未处理的胰岛中的基础的增加倍数。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05，对比对照细胞的刺激效果。

结果

Tpl2的表达和活化。抗Tpl2抗体在INS-1E细胞、小鼠和人胰岛中检测到两个58和52kDa的条带(图1A)，其对应于已经被描述产生于可替换的翻译起始位点(Aoki等人，1993)的Tpl2的长(Tpl2_L)和短(Tpl2_S)同种型。相比于Tpl2_S，Tpl2_L被发现优先表达于INS-1E细胞、小鼠和人胰岛(图1A)。本发明人通过评价与其活化已显示密切相关的降解(Vougioukalaki等人，2011；Gantke等人，2011)考察了Tpl2是由IL1β激活还是由三种细胞因子(IL-1β、TNF-α、IFN-γ)的混合物激活。蛋白印迹分析揭示IL-1β和细胞因子混合物的刺激降低了Tpl2_L带位移，可能指示Tpl2_L磷酸化(见刺激5-10分钟)，并在处理20分钟后显著降低了总Tpl2蛋白表达并持续至少30分钟(图1B和1C)。尤其地，Tpl2_L是优先被磷酸化和降解的(图1B和1C)。

Tpl2在ERK1/2活化中的作用。为了研究β细胞中Tpl2的生物学，需要一种工具化合物，在所设计的Tpl2抑制剂中，本发明人使用了来自Calbiochem(网站：http://www.millipore.com/catalogue/item/616373-1mg)的Tpl2抑制剂。该Tpl2抑制剂以3μΜ浓度使用，因为已知5μΜ以下的浓度显示对于其他相关激酶例如MEK、MK2、Src、蛋白激酶C、和EGF受体的显著选择性。在防止ERK1/2级联活化的浓度(<5μΜ)下没有发现其他被Tpl2抑制剂抑制或活化的蛋白激酶。如图2A所示，当在3μΜ使用时，Tpl2抑制剂抑制INS-1E细胞中约60％的IL-1β诱导的ERK1/2磷酸化，这表明IL-1β刺激的ERK1/2磷酸化需要Tpl2的活化。p90核糖体S6激酶(p90RSK)(已知其位于ERK1/2的下游)被相同程度的抑制(图2A)。3μΜ的浓度或甚至10μΜ的高浓度(数据未显示)对于IL-1β诱导的p46/p54c-JunN-末端激酶(JNK)和p38磷酸化没有作用的事实(图2B)表明Tpl2抑制剂处理的特异性。Tpl2抑制剂的处理对于细胞因子诱导的ERK1/2磷酸化的50-60％的抑制进一步表明细胞因子刺激的ERK1/2磷酸化同样需要Tpl2活化(图2C)。由细胞因子诱导的p90RSK磷酸化被相同程度的抑制(图2C)。

他们采取了siRNA敲除战略，以沉默INS-1E细胞中Tpl2蛋白的表达。正如图2D所示，与对照siRNA转染INS-1E细胞相比，在Tpl2siRNA转染INS-1E细胞中，50％减少的Tpl2(Tpl2_L和Tpl2_S)蛋白表达抑制了约50％的由细胞因子诱导的ERK1/2磷酸化。p38的磷酸化在这些条件下没有受到影响(图2D)。使用药理学抑制或siRNA失效，这些结果表明，通过Tpl2的基础细胞表达，由INS-1E细胞中的急性IL-1β和细胞因子的刺激激活的主要通路是一种产生ERK1/2的通路。

重要地，INS-1E细胞的Tpl2抑制剂处理(图3A)和Tpl2siRNA转染(图3B)均没有修饰葡萄糖诱导的ERK1/2和p90RSK磷酸化(其被描述在葡萄糖介导的β细胞存活中起关键作用(Costes等人，2006))。总之，这些数据表明Tpl2参与对炎性刺激特异性反应的ERK1/2的活化。此外，相比于IL-1β或细胞因子的刺激(图1B和1C)，葡萄糖没有减少总Tpl2蛋白表达(数据未显示)，这表明葡萄糖不能激活β细胞中的Tpl2。

为了在多个生理模型中确认，Tpl2参与INS-1E细胞中证实的细胞因子诱导的ERK1/2磷酸化，他们使用从C57BL/6小鼠中分离的胰岛。用细胞因子处理胰岛刺激ERK1/2和p90RSK磷酸化(图3C)。在抑制ERK1/2和p90RSK磷酸化中Tpl2抑制剂处理是有效的(图3C)。

慢性细胞因子的处理增加了Tpl2的表达和在来自于2型糖尿病的动物模型的胰岛中Tpl2的表达是增加的。当用IL-1β或细胞因子混合物的急性处理(20-30分钟)诱导Tpl2降解(图1B和1C)时，长期暴露于IL-1β或细胞因子(8至24小时)增加了INS-1E细胞中Tpl2_L和Tpl2_S的蛋白表达约2至3倍(图4A和4B)。作为对照，β肌动蛋白的蛋白水平没有受到影响(数据未显示)。可检测的裂解的半胱天冬酶-3和裂解的PARP出现之前，IL-1β或细胞因子显着增加了Tpl2_L和Tpl2_S水平(图4A和4B)。24至48小时之间细胞因子的长期处理进一步增加了Tpl2_L和Tpl2_S的蛋白表达约5倍(图4B)。

本发明人接下来确定致糖尿病的环境(高血糖和炎症)是否会导致体内Tpl2蛋白的上调。他们使用GK大鼠模型，自发型2型糖尿病的最佳表征动物模型之一(Portha等人，2009)。GK大鼠显示高血糖，并且GK大鼠胰岛特征增加了几种炎症标记物包括IL-1β的表达和巨噬细胞浸润(Ehses等，2009年)。如图4C所示，与对照正常Wistar大鼠相比，在从GK大鼠分离的胰岛中发现Tpl2_L和Tpl2_S的蛋白表达分别显著增加约2和2.5倍，这表明致糖尿病环境导致体内Tpl2蛋白的上调。

也在人胰岛中评价Tpl2蛋白表达的水平。如图4D所示，慢性细胞因子处理(72小时)显著增加人胰岛中Tpl2_L和Tpl2_S的蛋白表达1.5和2倍。

Tpl2的抑制减少了INS-1E细胞和小鼠胰岛中炎性细胞因子的细胞凋亡作用。他们接下来通过测量裂解形式的半胱天冬酶-3和PARP(细胞凋亡的关键因子和标记物)的水平，确定Tpl2抑制是否可以修饰IL-1β或细胞因子的有毒的促凋亡作用。如图5A和5C所示，用Tpl2抑制剂单独长期处理INS-1E细胞没有增加INS-1E细胞的凋亡。将INS-1E细胞暴露于IL-1β>24小时的时间段导致显著的细胞凋亡(图4A和图5A)。尤其地，在用Tpl2抑制剂处理的INS-1E细胞中观察到由IL-1β诱导的裂解的半胱天冬酶-3和裂解的PARP水平的降低(分别约45和约30％)(图5A)。与先前发表的观察结果完全一致，相比于单独的细胞因子诱导的水平，裂解的半胱天冬酶-3的水平被三种细胞因子的混合物大幅度增加(图5B)。他们进一步验证了Tpl2抑制剂处理在降低这个大幅度的细胞凋亡水平上是否也有效。有趣的是，在用Tpl2抑制剂处理的INS-1E细胞中观察到由细胞因子混合物诱导的裂解的半胱天冬酶-3和裂解的PARP水平的降低(分别约30和约25％)(图5C)。

进一步在分离的小鼠胰岛中，考察了Tpl2潜在参与细胞因子诱导的细胞凋亡。尤其地，用Tpl2抑制剂处理的胰岛降低约50％的由细胞因子混合物诱导的裂解的半胱天冬酶-3/7活性的水平(图5D)。

Tpl2的抑制减少了由炎性巨噬细胞分泌的生理细胞因子和趋化因子的细胞凋亡作用。为了确定Tpl2的抑制是否能够保护胰腺β细胞免于由更多的生理细胞因子混合物诱导的细胞凋亡，用LPS(脂多糖)激活巨噬细胞谱系RAW264.7。在这种含有数种由活化的巨噬细胞分泌的细胞因子和趋化因子，如IL-1β、TNF-α和IL-6的条件培养基存在下培养INS-1E细胞。在这种条件培养基中，Tpl2的药理学抑制降低约55％的由24小时的INS-1E细胞培养诱导的裂解的半胱天冬酶-3的水平(图6)。

Tpl2的抑制降低了人胰岛中由细胞因子诱导的ERK1/2的活化：我们证实，用Tpl2抑制剂处理人胰岛，在抑制由细胞因子混合物诱导的ERK1/2磷酸化/活化方面显著有效。这些结果显示人胰岛中细胞因子刺激的ERK1/2信号通路的磷酸化需要Tpl2活化(图7)。

实施例2：体内Tpl2激酶的抑制减慢DB/DB小鼠中2型糖尿病的进展。前驱糖尿病和糖尿病db/db小鼠中葡萄糖稳态的改善伴有空腹血糖、空腹胰岛素血症的显著降低以及胰岛素敏感性的改善。

材料与方法

五周龄db/db小鼠获得自JanvierLtd，并在整个研究过程中用标准饮食(4％脂肪)喂养。所有小鼠自由获取食物和新鲜水并保持在12小时白天/12小时黑夜循环。在腹腔内(ip)施用葡萄糖、胰岛素或每日注射2.5mg/kgTpl2抑制剂和对应的载体之前直至处死当日记录体重。16小时过夜禁食后通过ip施用1-2g/kg葡萄糖进行葡萄糖耐量试验，使用来自尾静脉的血液样品，用(VerioOnetouch，Lifescan，JohnsonandJohnsonCompany)血糖仪测定血糖浓度。按照向非禁食的小鼠ip施用0.75U胰岛素/kg体重，以类似的方式进行胰岛素耐受性试验。使用在研究的第一天来自尾静脉或处死当日来自颈动脉的血液样品，通过放射免疫测定(RIA大鼠胰岛素试剂盒，Millipore)定量血清胰岛素水平。

结果

在db/db小鼠中观察到的2型糖尿病的前进发展伴随增加的体重、胰岛素抵抗、高血糖症和受损的葡萄糖耐量。因此，为了确定Tpl2抑制是否具有预防和/或治疗2型糖尿病的潜能，我们使用6周龄的db/+和db/db小鼠，分为3组(每日ip注射2.5mg/kgTpl2抑制剂或对应的载体)，经过2周研究，监视这些生理参数。

在6周龄db/db小鼠中，初始体重和空腹胰岛素水平显著高于db/+动物(图8和9)。相反地，各组之间的空腹血糖浓度没有统计学差异，这表明6周龄db/db小鼠在研究开始之前已经发展为高胰岛素血症但不是糖尿病。因此，在首次ip注射之前2天，相比于db/+动物，6周龄db/db小鼠中2g/kg葡萄糖耐量挑战受损(图10)。重要地，体重、葡萄糖耐量、空腹血糖和胰岛素水平在2组db/db小鼠之间相似。

令人该兴趣的是，在7天处理之后，Tpl2激酶抑制剂注射的db/db小鼠中，已经显著改善葡萄糖耐量挑战(图10B)。这种对葡萄糖耐量的改善也伴随如第14天观察到的显著减少的空腹血糖和血清胰岛素水平(图9)。因此，在用Tpl2激酶抑制剂处理db/db小鼠中，空腹血糖浓度和血清胰岛素水平分别从258.6+40.7mg/dL和11.3±1.2ng/ml降低至144.0+15.5mg/dL和4.3±0.4ng/ml(图9)。此外，如胰岛素耐受性试验中所评估的，施用载体的db/db小鼠显示显著降低的血糖中胰岛素依赖性的降低，这与db/db动物中胰岛素抵抗的发展相一致。在用Tpl2激酶抑制剂处理14天后，我们观察到胰岛素敏感性的显著改善(图10C)。最后，在处理2周后，在所有组中，总的体重均显著增加，相比于db/+动物，这些增加在db/db小鼠中更明显(图8)。更重要的是，在载体和Tpl2激酶抑制剂处理的db/db小鼠之间体重无差别，这表明在考察的2周期间，每日ip施用2.5mg/kgTpl2激酶抑制剂没有毒性(图8)。

体内研究的关键问题的总结

前驱糖尿病和糖尿病db/db小鼠中葡萄糖稳态的改善伴有空腹血糖、空腹胰岛素血症的显著降低以及胰岛素敏感性的改善。

-对体重没有影响

-db/db小鼠中葡萄糖耐量的改善

-空腹高血糖的改善(该观察结果使得我们设想：通过降低血液血糖Tpl2抑制可以减少微血管和大血管并发症、心血管危险因素、降低患癌症的风险、并改善与长寿相关的标记物)。

-血浆胰岛素血症的改善

-胰岛素敏感性的改善

实施例3：用于预防或治疗糖尿病的Tpl2激酶抑制剂和GPL-1激动剂(毒蜥外泌肽-4)的组合

材料与方法

材料与方法之前已经描述(特别是在“药物暴露”部分，其中公开了Tpl2抑制剂和毒蜥外泌肽-4的组合处理)。

结果

Tpl2抑制剂和GLP-1类似物的组合对INS-1E细胞产生强大的抗凋亡作用。临床前和临床研究表明，GLP-1受体激动剂(如毒蜥外泌肽-4)具有适度的抗炎作用(Pugazhenthi等人，2010)。为了验证同时抑制Tpl2是否可以体外改善GLP-1激动剂对β细胞存活的有益效果，首先考察Tpl2抑制剂单独、毒蜥外泌肽-4单独或Tpl2抑制剂/毒蜥外泌肽-4的组合对细胞因子有害作用下的INS-1E细胞的效果。重要地，Tpl2和毒蜥外泌肽-4治疗的药理学抑制的组合相比于单独的各个化合物对INS-1E细胞产生更有力的抗凋亡作用(图11)。

Tpl2抑制剂和GLP-1类似物的组合保护人胰岛免于细胞因子诱导的胰岛素分泌失败。β细胞的慢性细胞因子暴露不仅恶化β细胞存活而且恶化胰岛素分泌(Donath等人，2011)。基于INS-1E和小鼠胰岛中观察到的Tpl2失活的显著抗炎作用，本发明人最终证实Tpl2的失活是否可以阻止人胰岛中细胞因子诱导的胰岛素分泌失败。在存在或不存在细胞因子下，将人胰岛暴露于含有5.5mM葡萄糖的培养基中。

他们观察到，在人胰岛暴露于细胞因子混合物72小时中，对葡萄糖反应的胰岛素分泌(图中的刺激指数)被显著降低约40-50％(图12)。他们进一步考察用Tpl2抑制剂治疗人类胰岛是否保护它们免于胰岛素分泌功能障碍。他们观察到，用非细胞毒性浓度的Tpl2抑制剂处理人胰岛显著防止细胞因子诱导的胰岛素分泌失败约50％(图12)，这表明用Tpl2抑制剂处理的人胰岛是更可行的和功能性的，并被保护(但部分地)免于炎性细胞因子混合物的有害作用。

重要地，Tpl2抑制剂和毒蜥外泌肽-4治疗的组合完全防止细胞因子诱导的胰岛素分泌失败(图7)，这表明用Tpl2抑制剂和毒蜥外泌肽-4的组合处理人胰岛是可行的和功能性的，而且完全被保护免于细胞因子对β细胞葡萄糖传感和胰岛素分泌的有害影响。

实施例4：用于预防或治疗糖尿病的Tpl2激酶抑制剂和GPL-1激动剂(利拉鲁肽)的组合。Tpl2抑制剂和GLP-1类似物，利拉鲁肽的组合可以保护INS-1E细胞免于细胞因子诱导的凋亡。

材料与方法

在含有7.5％SVF的RPMI培养基中，用或不用Tpl2抑制剂(3μΜ)和/或利拉鲁肽(20nM)处理INS-1Eβ细胞2小时，然后用或不用Tpl2抑制剂(3μΜ)、利拉鲁肽(20nM)和/或细胞因子混合物(IL-1β(0.2ng/ml)、TNF-α(50ng/ml)、和IFN-γ(30ng/ml)刺激INS-1Eβ细胞24小时。用对抗裂解的半胱天冬酶-3(1:1000)或β肌动蛋白(1:5000)的抗体使溶解产物经历蛋白印迹。

结果

对细胞因子有害作用下的INS-1E细胞考察单独利拉鲁肽或利拉鲁肽/Tpl2抑制剂组合。我们发现Tpl2和利拉鲁肽的药理学抑制的组合相比于单独的各个化合物对INS-1E细胞产生更有力的抗凋亡作用(减少由细胞因子混合物诱导的裂解的半胱天冬酶-3的70/80％)(图13)。

实施例5：用于预防或治疗糖尿病的Tpl2激酶抑制剂和DPP-4抑制剂(西他列汀)的组合。Tpl2抑制剂和二肽基肽酶4抑制剂(DDP-4)(西他列汀)的组合保护INS-1E细胞免于细胞因子诱导的凋亡。

材料与方法

在含有7.5％SVF的RPMI培养基中，用或不用Tpl2抑制剂(3μΜ)和/或GLP-1(20nM)、DPP-4抑制剂(西他列汀，20nM)处理INS-1Eβ细胞2小时，然后用或不用Tpl2抑制剂(3μΜ)、GLP-1(20nM)、DPP-4抑制剂(西他列汀，20nM)和/或细胞因子混合物(IL-1β(0.2ng/ml)、TNF-α(50ng/ml)、和IFN-γ(30ng/ml)刺激INS-1Eβ细胞24小时。用对抗裂解的半胱天冬酶-3(1:1000)或β肌动蛋白(1:5000)的抗体使溶解产物经历蛋白印迹。

结果

对细胞因子有害作用下的INS-1E细胞考察GLP-1(20nM)和DPP-4抑制剂(西他列汀，20nM)或GLP-1(20nM)/DPP-4抑制剂(西他列汀，20nM)和Tpl2抑制剂(3μΜ)组合。我们发现Tpl2和GLP-1/DPP4抑制剂的药理学抑制的组合相比于单独的各个化合物对INS-1E细胞产生更有力的抗凋亡作用(减少由细胞因子诱导的裂解的半胱天冬酶-3的80％)(图14)。

讨论：

近年来，2型糖尿病研究的主要关注点在于阐明疾病的发病机理。已经清楚，慢性炎症是T2DM的标志，其影响β细胞功能和质量(Donath等人，2011)。用于治疗T2DM的免疫调节策略已经出现(等人，2012；Larsen等人，2009；Larsen等人，2007)。在用仅阻断IL-1β的有害作用的IL-1β受体拮抗剂(IL-1RA)治疗的T2D患者中观察到降低的高血糖症和改善的β细胞功能(Larsen等人，2007)。

本发明人提供的第一个证据是，使用Tpl2激酶抑制剂可以是减轻不仅由IL-1β诱导而且由促凋亡细胞因子混合物(IL-1β、TNF-α、IFN-γ)诱导的β细胞衰竭的关键治疗化合物。因此，使用Tpl2激酶抑制剂可以通过减少β细胞衰竭和由慢性炎症诱导的损伤而具有降低或停止T2DM发展的潜能，因此提供了其作用于疾病的发病机理的又一个证据。因此，靶向Tpl2激酶可以通过减轻疾病症状和并发症而具有对发挥主要影响的潜能使患有T2D的患者受益。这反过来将有助于减轻由T2DM并发症例如肾病、神经病、眼损伤或心血管疾病导致的日益增长的医疗保健和社会负担。

临床前和临床研究表明GLP-1受体激动剂(例如毒蜥外泌肽-4)除了改善β细胞存活外还具有温和的抗炎作用。他们发现人胰岛中毒蜥外泌肽-4对抗炎性细胞因子作用的保护作用被Tpl2激酶抑制剂增强。事实上，在炎性细胞因子的存在下，毒蜥外泌肽-4和Tpl2激酶抑制剂化合物的组合使用增加了β细胞和人胰岛的活力和功能，并且可以被用作更有力和更多效的抗糖尿病治疗。基于本发明的结果，GLP-1受体激动剂和Tpl2激酶抑制剂的组合可以代表一种新型的治疗策略，并且有利于治疗T2DM。该新型的药理学方法将作用于疾病的发病机理而不是仅作用于其症状。

使用Tpl2激酶抑制剂还可以代表胰岛移植过程中的一种潜在的治疗益处。实际上，80％移植的胰岛在移植后期间由于IBMIR导致的细胞凋亡而死亡，所述IBMIR尤其由包括IL-1β、TNF-α、和IFN-γ的细胞因子混合物介导(NiIsson等人，2011；vanderWindt等人，2007)。因此，关于胰岛移植的阻断IBMIR的重要性和增加的胰岛移植的成功率是目前特别关注的(NiIsson等人，2011；vanderWindt等人，2007)。靶向Tpl2激酶能够代表可临床应用于防止IBMIR的一种策略。

总体地，本发明的结果不仅提出Tpl2激酶抑制剂作为治疗化合物以减轻T2DM中观察到的β细胞衰竭，而且提供对于促进β细胞功能衰竭、β细胞中炎症的破坏作用的分子机制的重要的新视野。这些结果有利于详尽的分析由促炎性细胞因子特异性参与的信号传导分子机制，允许确认新的抗糖尿病靶点，其可以用于进一步的药物开发。最后，这些结果加强了新的具有体内优秀功效的Tpl2激酶抑制剂的工业开发，这将允许其被开发为新型抗糖尿病药物。

参考文献：

在整个本申请中，各种参考文献描述了本发明所属现有技术的状态。这些参考文献的公开文本在此以引用的形式并入本公开。

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Claims

1.一种肿瘤进展位点-2(Tpl2)激酶抑制剂，其用于在需要其的患者中预防或治疗糖尿病的用途。

2.一种Tpl2激酶基因表达抑制剂，其用于在需要其的患者中预防或治疗糖尿病的用途。

3.一种Tpl2激酶抑制剂或一种Tpl2激酶基因表达抑制剂，其用于在需要其的患者中改善胰腺β细胞的存活或功能的用途。

4.一种Tpl2激酶抑制剂或一种Tpl2激酶基因表达抑制剂，其用于在需要其的患者中预防2型糖尿病(TD2M)的用途。

5.根据权利要求1至4任一项所述用途的Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂，其中所述患者是消瘦型患者。

6.根据权利要求1至5任一项所述用途的Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂，其中所述Tpl2激酶抑制剂是4-(3-氯-4-氟苯氨基)-6-(吡啶-3-基-甲氨基)-3-氰基-[1,7]-萘啶。

7.一种药物组合物或一种组分试剂盒，其包含Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂和抗糖尿病药物。

8.根据权利要求7所述的药物组合物或组分试剂盒，其中所述抗糖尿病药物是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂。

9.根据权利要求8所述的药物组合物或组分试剂盒，其中所述GLP-1受体激动剂为毒蜥外泌肽-4、艾塞那肽或利拉鲁肽。

10.根据权利要求7所述的药物组合物或组分试剂盒，其中所述抗糖尿病药物是二肽基肽酶-4(DDP-4)抑制剂。

11.根据权利要求10所述的药物组合物或组分试剂盒，其中所述DDP-4抑制剂是西他列汀。

12.一种Tpl2激酶抑制剂或一种Tpl2激酶基因表达抑制剂，其用于增强抗糖尿病药物的临床疗效的用途。

13.一种Tpl2激酶抑制剂或一种Tpl2激酶基因表达抑制剂，其用于增强抗糖尿病药物的抗炎作用和/或保存抗糖尿病药物的胰腺β细胞活力和/或功能的用途。

14.一种适合于哺乳动物胰腺β细胞培养的培养基，其包含Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂。

15.根据权利要求14所述的培养基，其进一步包含5.6mmol/l葡萄糖、10％胎牛血清(FBS)或人血清白蛋白(HSA)、100UI/ml青霉素、100mg/ml链霉素和2mM谷氨酰胺。

16.一种体外或离体改善胰腺β细胞群的存活和/或功能的方法，所述方法包括使所述群接触培养基的步骤，所述培养基包含有效量的Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂。

17.一种用于改善胰腺β细胞移植物的存活和/或功能的方法，所述方法包括向具有胰腺β细胞移植物的患者施用有效量的Tpl2激酶抑制剂或Tpl2激酶基因表达抑制剂的步骤。

18.一种Tpl2激酶抑制剂或一种Tpl2激酶基因表达抑制剂，其用于在具有胰腺β细胞移植物的患者中预防或治疗即刻血液介导的炎症反应(IBMIR)的用途。