JP5669582B2 - グルカゴンアンタゴニスト - Google Patents

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Description

天然グルカゴンは、肝臓におけるグルコースの合成及び代謝の増強を介して血中グルコースレベルを調節する、２９アミノ酸のペプチドである。したがって、内因性グルカゴン作用の抑制は、糖尿病のような過剰グルコース産生により特徴付けられる状態を治療する薬剤の開発のための標的になってきた。
グルカゴンは、一般に、インスリンの作用に対抗する対抗制御ホルモンとして機能して、特に低血糖の場合に血中グルコースレベルを維持する。しかし、一部の１型又は２型糖尿病の患者では、絶対的又は相対的に上昇したグルカゴンレベルが低血糖状態に寄与することが示されている。健康な対照動物と１型及び２型糖尿病の動物モデルの両方において、選択的及び特異的抗体による循環グルカゴンの除去は、血糖レベルの低下をもたらした（Brand et al., Diabetologia 37, 985 (1994); Diabetes 43, [suppl 1], 172A (1994); Am. J. Physiol. 269, E469-E477 (1995); Diabetes 44 [suppl 1], 134A (1995); Diabetes 45, 1076 (1996)）。これらの研究は、グルカゴンアンタゴニスト作用が糖尿病の血糖制御に有用でありうることを示唆している。
グルカゴンは、７膜貫通Ｇタンパク質共役受容体ファミリーのグルカゴン−セクレチンブランチの一部である受容体に結合し、それを活性化することによって、作用を発揮する。受容体は、アデニリルシクラーゼを活性化するように機能して、ｃＡＭＰレベルの増加をもたらす。以前の報告は、ペプチドに基づいた（Unson, C. G. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264, 789-94, Ahn, J. et al. (2001) J. Peptide Research 58, 151-8 and Ahn J. et al. (2001) J. Med. Chem. 44, 1372-9を参照すること）、並びにヌクレオチドに基づいた（Sloop K. et al. (2004) J. Clinical Invest. 113, 1571-81）グルカゴンアンタゴニストを同定している。ペプチドに基づいた阻害は、受容体結合のレベルで作用し、一方、後者は、グルカゴン受容体に特異的な細胞内ｍＲＮＡを抑制するように機能する。
グルカゴン受容体のインヒビターが記載されており、一般にグルカゴンのアミノ酸配列に基づいている。１個以上のアミノ酸が欠失して又は置換されてグルカゴン受容体の強力なアンタゴニストを産生する幾つかの類縁体が記載されており、例えば〔ｄｅｓ Ｈｉｓ１〕〔Ｇｌｕ９〕−グルカゴンアミド（Unson et al., (1989) Peptides 10, 1171; Post et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1662）、ｄｅｓ Ｈｉｓ１，Ｐｈｅ６〔Ｇｌｕ９〕−グルカゴンアミド（Azizh et al., (1995) Bioorg. & Med. Chem. Lett. 16, 1849）及びＮｌｅ９，Ａｌａ１１，１６−グルカゴンアミド（Unson et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(17), 12548）である。他の類縁体には、グルカゴン配列の４位（Ahn J M et al. (2001) J. Pept. Res. 58(2): 151-8）、１位（Dharanipragada, R. et al. (1993) Int. J. Pept. Res. 42(1): 68-77）、並びに４、５、１２、１７及び１８位（Gysin B et al. 1986. Biochemistry. 25(25):8278-84）に置換のあるものが含まれる。
本明細書に記載されているように、天然グルカゴンペプチドの修飾を表す極めて強力なグルカゴンアンタゴニストが提供される。より詳細には、新規グルカゴンアンタゴニストは、天然グルカゴン配列のＮ末端の新規化学修飾を表し、見かけのアゴニスト活性を示さない高度に特異的なアンタゴニストを産生する。これらの化合物を、グルカゴンアゴニスト作用の抑制が望ましいあらゆる状況に使用することができる。一つの実施態様によると、この化合物を糖尿病の治療に使用することができる。
一つの実施態様によると、純粋なグルカゴンアンタゴニスト活性を有するグルカゴンの類縁体が提供される。グルカゴンアンタゴニストを、グルカゴン作動の抑制が望ましいあらゆる状況に使用することができる。最も直接的で見かけの使用は糖尿病の治療におけるものであり、高血糖症の前臨床モデルで血中グルコースの低下をもたらすグルカゴンアンタゴニスト作用が実証されている。これらのグルカゴンアンタゴニストを更に修飾して、母体化合物のアンタゴニスト活性を維持しながら、化合物の生物物理学的安定性及び／又は水性溶解度を改善することができる。
一つの実施態様によると、Ｎ末端からの最初の２〜５個のアミノ酸残基の欠失と、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、システインのスルホン酸誘導体、及び下記構造：
〔ここで、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル若しくはＣ２〜Ｃ４アルキニルである〕
を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体からなる群より選択されるアミノ酸による天然ペプチドの９位のアスパラギン酸の置換とによって修飾されている天然グルカゴンペプチドを含む、グルカゴンアンタゴニストが提供される。
一つの実施態様において、システインのスルホン酸誘導体は、システイン酸又はホモシステイン酸である。一つの実施態様において、Ｃ末端のアミノ酸における天然のカルボン酸は、アミド又はエステルのような電荷中性基に代えられている。
別の実施態様において、Ｎ末端からの最初の５個のアミノ酸残基の欠失と、天然のＮ末端のアミノ酸をヒドロキシル基に代える残りのＮ末端のアミノ酸（フェニルアラニン）の修飾（すなわち、Ｎ末端フェニル−乳酸（ＰＬＡ））とによって修飾されている天然グルカゴンペプチドを含む、グルカゴンアンタゴニストが提供される（本明細書において、ＰＬＡ６類縁体と呼ばれる）。ＰＬＡ６類縁体は、最初の５個のアミノ酸の欠失を含むがＮ末端天然フェニルアラニンを保持する類縁体と比べて、親和性を３倍に増加させ、アンタゴニスト作用の潜在能力を増加させる。更なる実施態様において、天然タンパク質の９位のアスパラギン酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、システインのスルホン酸誘導体、及び下記構造：
〔ここで、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル若しくはＣ２〜Ｃ４アルキニルである〕
を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体からなる群より選択されるアミノ酸から構成されている。
一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３７及び配列番号３８からなる群より選択される配列を含み、一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、配列番号７又は８の配列を含む。
一つの実施態様によると、ポリエチレングリコール鎖が１１、１２、１６、１９若しくは２４位又はＮ−若しくはＣ末端のアミノ酸でアミノ酸と共有結合しているペプチドであって、配列番号７又は配列番号３７の配列を含むグルカゴンアンタゴニストが提供される。一つの実施態様において、ポリエチレングリコール鎖が、配列番号９の１１位、配列番号１０の１６位、配列番号１１の１９位又は配列番号１２の１１と１９の両方の位置でアミノ酸に共有結合している、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２の配列を含むグルカゴンアンタゴニストが提供される。一つの実施態様において、約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する単一ポリエチレングリコール鎖が、グルカゴンアンタゴニストペプチドに共有結合している。別の実施態様において、少なくとも２０，０００ダルトンの分子量を有する単一ポリエチレングリコール鎖が、グルカゴンアンタゴニストペプチドに共有結合している。あるいは、グルカゴンアンタゴニストは、配列番号１２の配列を含み、１１と１９の両方の位置でアミノ酸に共有結合しているポリエチレングリコール鎖を有し、ここで２つのポリエチレングリコール鎖の合わせた分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンであるか又は２０，０００ダルトンを超える。
一つの実施態様において、配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３９又は配列番号４０のペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸が、配列番号１９の配列（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）を含む第２のペプチドに共有結合しているグルカゴンアンタゴニストが提供される。これらの化合物を、ＰＥＧ基と、配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３９又は配列番号４０における１１、１６、１９位から選択される位置でのグルカゴン類縁体との共有結合により更に修飾することができる。一つの実施態様において、配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３９又は配列番号３８のペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸が、配列番号５３の配列を含む第２のペプチドに共有結合しているグルカゴンアンタゴニストが提供される。
一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは本明細書に記載される構造Ａ−Ｂ−Ｃを含み、ここでＡは、
（ｉ）フェニル乳酸（ＰＬＡ）；
（ｉｉ）ＰＬＡのオキシ誘導体；
（ｉｉｉ）連続した２個のアミノ酸がエステル又はエーテル結合を介して結合しているアミノ酸２〜６個のペプチド
からなる群より選択され；
Ｂは、配列番号１のアミノ酸ｉ−２６を表し（ここでｉは、３、４、５、６又は７である）、更に、本明細書において更に記載される１つ以上のアミノ酸修飾を含んでもよく、そして
Ｃは、
（ｘ）Ｘ；
（ｘｉ）Ｘ−Ｙ；
（ｘｉｉ）Ｘ−Ｙ−Ｚ；
（ｘｉｉＩ）Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１０
（ここでＸは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はＮｌｅであり；Ｙは、Ａｓｎ又は荷電アミノ酸であり；Ｚは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）、ホモシステイン、アセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）又は荷電アミノ酸であり、Ｒ１０は、配列番号１９〜２１及び５３からなる群より選択される）；
（ｘｉｖ）Ｃ末端カルボキシレートがアミドで置換されている（ｘ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれか
からなる群より選択される。
別の実施態様において、天然グルカゴンの１〜５個のＮ末端のアミノ酸を欠失している及び／又はＰＬＡを含んでいる前述のいずかのグルカゴンアンタゴニストの可溶性は、荷電アミノ酸をペプチドのＣ末端部分、好ましくはグルカゴンアンタゴニストのＣ末端から２２位まで、に導入する置換及び／又は付加によりペプチドを修飾することによって改善することができる。更に、１、２又は３個の荷電アミノ酸を、Ｃ末端部分、好ましくは２２位（天然グルカゴンの２７位）からＣ末端まで、に導入してもよい。一つの実施態様によると、２３及び／又は２４位の天然アミノ酸が荷電アミノ酸で置換されている。また／或いは、更なる実施態様において、１〜３個の荷電アミノ酸もペプチドのＣ末端に付加されている。例示的な実施態様において、１、２個又は全ての荷電アミノ酸は、負に帯電している。一つの実施態様において、配列番号７又は配列番号８のグルカゴンアンタゴニストは更に修飾されて、２３及び／又は２４位で酸性アミノ酸置換を含む。一つの実施態様において、酸性アミノ酸は、アスパラギン酸又はグルタミン酸残基であり、グルカゴンアンタゴニストは、配列番号４１の配列を含む。
更なる実施態様において、天然グルカゴンの１〜５個のアミノ酸を欠失している及び／又はＰＬＡを含んでいるグルカゴンアンタゴニストの生理学的ｐＨでの安定性は、１０位のアスパラギン酸残基（天然グルカゴンの１５位）を、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸又はホモシステイン酸から選択されるアミノ酸で置換することによって改善できる。一つの実施態様によると、そのようなグルカゴンアンタゴニストは、配列番号３６又は配列番号４０の配列を含む。
本明細書に記載されているいずれかのグルカゴンアンタゴニストは更に修飾されて、望ましい活性を保持する位置で１個以上のα，α−二置換アミノ酸を含むことができる。幾つかの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストの１６、１７、１８、２０、２１、２４又は２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の１、２、３、４つ又はそれ以上の位置は、α，α−二置換アミノ酸で置換されている。例えば、グルカゴンアンタゴニストは、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）による１６位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）での置換を含むことができる。幾つかの実施態様において、１６、２０、２１又は２４位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の１、２、３つ又はそれ以上の位置がＡＩＢで置換されている。特定の態様において、１個以上のα，α−二置換アミノ酸を含むグルカゴンアンタゴニストは、Ｃ末端カルボキシレートを更に含む。
本明細書に記載されているいずれかのグルカゴンアンタゴニストは更に修飾されて、アシル基及び／又はアルキル基を含むことができ、ここでアシル又はアルキル基は、本明細書に記載されるように、スペーサーのアミノ酸に又はエステル、エーテル、チオエーテル、アミド若しくはアルキルアミン結合を介してグルカゴンアンタゴニストに結合している。
本明細書に記載されているいずれかのグルカゴンアンタゴニストを、グルカゴンペプチドのＣ末端の１又は２個のアミノ酸（すなわち、天然グルカゴンペプチドの２９位又は２８及び２９位）の切断又は欠失により更に修飾することができる。
グルカゴンアンタゴニスト活性を依然として保持できるような更なる修飾、例えば保存的置換をグルカゴンアンタゴニストに行うことができる。したがって、本発明は、本明細書に開示されているいずれかのグルカゴン類縁体が更に修飾されて、２、３、４、５、６、７、８又は９つまでの更なるアミノ酸修飾を含むことができ、依然としてグルカゴンアンタゴニストの所望の活性レベルをグルカゴン受容体に対して保持できることを考慮する。
本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニストの二量体も本開示に包含される。一つの実施態様において、配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９及び配列番号４０からなる群より独立して選択される２つのペプチドを含むグルカゴンアンタゴニスト二量体が提供され、ここで２つのグルカゴンアンタゴニストは、それぞれのペプチド鎖の１１又は１９位に独立して結合しているリンカーを介して互いに結合している。
一つの実施態様によると、本明細書に開示されている新規グルカゴンアンタゴニストを含む医薬組成物が提供される。一つの実施態様において、医薬組成物は、滅菌され多様な包装内に含有されている液剤を含む。医薬組成物は、患者に組成物を投与するための使い捨て装置を含むキットの一部として更に包装することができる。
一つの実施態様によると、予備処方された水性組成物を使用して高血糖症を素速く治療する方法が提供される。この方法は、本開示の新規修飾グルカゴンアンタゴニストを含む水性液剤の有効量を投与する工程を含む。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストはペグ化されており、ＰＥＧ鎖は、約５００〜約５，０００ダルトンの分子量を有する。一つの実施態様において、修飾グルカゴン液剤は、高血糖症に罹患している患者に組成物を投与するのに使用される装置に予め包装されている。
一つの実施態様によると、インスリン依存性患者において血中グルコースレベルを調節する改善された方法が提供される。この方法は、糖尿病を制御するのに治療上有効な量のインスリンを投与する工程及び本開示の新規修飾グルカゴンアンタゴニストを投与する工程を含み、これらの投与工程は、互いに１２時間以内に実施される。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト及びインスリンは、単一組成物として同時投与され、ここでグルカゴンペプチドは、約５，０００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有するＰＥＧ鎖でペグ化されている。
３７℃でそれぞれ２４、４８、７２、９６、１４４及び１６６時間インキュベートしたグルカゴンＣｙｓ２１−マレイミドＰＥＧ５κの安定性を表す棒グラフである。 ３７℃でそれぞれ２４、７２又は１４４時間インキュベートしたグルカゴンＣｙｓ２１−マレイミドＰＥＧ５κのｐＨ５でのＨＰＬＣ分析から生成したデータを表す。 列挙したＮ末端切断スルホン酸グルカゴンアンタゴニスト類縁体の結合アッセイから生成したデータを表す。 ｃＡＭＰ産生により測定した、列挙したペプチドアンタゴニストについてのグルカゴン受容体アンタゴニスト作用の測定により生成したデータを表す。 ｃＡＭＰ産生により測定した、列挙したグルカゴン類縁体についてのグルカゴン受容体アンタゴニスト作用の測定により生成したデータを表す。より詳細には、図５Ａは、グルカゴン類縁体〔Ｅ９〕Ｇ（２−２９）●、〔ｈＣ９（ＳＯ３Ｈ）〕Ｇ（２−２９）▲、〔ｈＣ９（ＳＯ３Ｈ）〕Ｇ（４−２９）▼、〔ｈＣ９（ＳＯ３Ｈ）〕Ｇ（５−２９）（左向き黒三角）及び〔ｈＣ９（ＳＯ３Ｈ）〕Ｇ（６−２９）（右向き黒三角）によるグルカゴン受容体の誘導を天然グルカゴン■と比較している。図５Ｂは、０．２nMのグルカゴンによるグルカゴン受容体の誘導に対する同じ類縁体の阻害効果に関するデータを提供する。略語：Ｅ９＝天然グルカゴンでは９位でのグルタミン酸の置換；Ｇ（Ｘ−２９）＝Ｘ−１アミノ酸でＮ末端が切断された天然グルカゴン；ｈＣ９（ＳＯ３Ｈ）＝天然グルカゴンでは９位でのホモシステイン酸。 Ｆｍｏｃ−ホモＣｙｓ（ＳＯ３Ｎａ）−ＯＨの合成の合成スキームを表す。Ｆｍｏｃ−ホモＣｙｓ（ＳＯ３Ｎａ）−ＯＨは、ＤＭＦ又はＮＭＰに良好に溶解し、自動ペプチド合成の際にＤＩＣ／ＨＯＢＴ又はＨＢＴＵ／ＨＯＢＴを使用して直接組み込むことができる。全てのｈＣ９（ＳＯ３Ｈ）に基づくグルカゴンアンタゴニスト類縁体は、固相ペプチド合成においてナトリウム形態のＦｍｏｃ−ホモＣｙｓ（ＳＯ３Ｎａ）−ＯＨを直接組み込むことによって合成した。 Ｎ末端のアミノ酸（天然グルカゴンの「残基６」）の修飾に関して異なる各グルカゴンアンタゴニストの結合親和性及びグルカゴン受容体活性を比較したデータを表す。 ｃＡＭＰ産生により測定した、０．８nMのグルカゴンによるグルカゴン受容体の誘導に対する、列挙したＰＬＡグルカゴン類縁体アンタゴニストの阻害効果の測定により生成したデータを表す。試験したＰＬＡ類縁体には、単独の天然グルカゴン■と比較した、〔ＰＬＡ６，Ｅ９〕Ｇ（６−２９）●、〔Ａｃ−ＰＬＡ６，Ｅ９〕Ｇ（６−２９）▲、〔ＰＬＡ４，Ｅ９〕Ｇ（４−２９）▼、〔ＰＬＡ５，Ｅ９〕Ｇ（５−２９）（左向き黒三角）が含まれる。略語：Ｅ９＝天然グルカゴンでは９位でのグルタミン酸の置換；Ｇ（Ａｃ−ＰＬＡ）＝アセチル化ＰＬＡ。
〔定義〕
本発明を記載し、特許請求するに際し、以下の用語を下記に記載した定義に従って使用する。
本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容される担体」には、リン酸緩衝食塩水、水、油／水又は水／油乳剤のような乳剤、並びに多様な種類の湿潤剤のような標準的な医薬担体のいずれかが含まれる。この用語は、また、ヒトを含む動物における使用が米国連邦政府の規制当局により承認されているか又は米国薬局方に記載されている作用物質のいずれかを包含する。
本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容される塩」は、母体化合物の生物学的活性を保持し、生物学的にも非生物学的にも有害ではない、化合物の塩を意味する。本明細書に開示されている化合物の多くは、アミノ及び／若しくはカルボキシル基又は同様の基の存在によって酸性及び／又は塩基性塩を形成することができる。
薬学的に許容される塩基性付加塩は、無機又は有機塩基から調製することができる。無機塩基から誘導される塩には、単なる例として、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム及びマグネシウム塩が含まれる。有機塩基から誘導される塩には、第一級、第二級及び第三級アミンの塩が含まれるが、これらに限定されない。
薬学的に許容される酸性付加塩は、無機又は有機塩基から調製することができる。無機酸から誘導される塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが含まれる。有機酸から誘導される塩には、醋酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などが含まれる。
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」には、特定の障害若しくは状態を予防すること、又は特定の障害若しくは状態に関連する症状を緩和すること、及び／又は前記症状を防止若しくは排除することが含まれる。
本明細書で使用されるとき、グルカゴンアンタゴニストの「有効」量又は「治療有効量」は、所望の効果をもたらすペプチドの非毒性であるが十分な量を意味する。例えば、一つの望ましい効果は、高血糖症の予防又は治療である。「有効」である量は、個人の年齢及び全身状態、投与様式などによって被験者毎に変わる。したがって、正確な「有効量」を規定することがいつも可能というわけではない。しかし、個別の症例における適切な「有効」量は、慣用的な実験を使用して当業者によって決定することができる。
用語「非経口的」は、消化管を介するのではなく、皮下、筋肉内、脊髄内又は静脈内のような他の経路によることを意味する。
本明細書で使用するとき、「グルカゴンペプチド」には、配列番号１のアミノ酸配列のペプチド、又は、配列番号１のアミノ酸配列の任意の誘導体であって、実施例１３に記載されているアッセイを使用してｃＡＭＰ産生により測定されたグルカゴン若しくはＧＬＰ−１受容体活性を刺激するような、アミノ酸の置換又は翻訳後修飾（例えば、メチル化、アシル化、ユビキチン化など）を含むペプチドのいずれかが含まれる。
用語「グルカゴンアンタゴニスト」は、グルカゴン活性に対抗して作用するか又はグルカゴン機能を妨げる化合物を意味する。例えば、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体に対してグルカゴンにより達成される最大反応の少なくとも６０％の阻害（例えば、少なくとも７０％の阻害）、好ましくは少なくとも８０％の阻害を示す。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体に対してグルカゴンにより達成される最大反応の少なくとも９０％の阻害を示す。特定の実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体に対してグルカゴンにより達成される最大反応の１００％の阻害を示す。加えて、約１μMの濃度のグルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体に対してグルカゴンにより達成される最大アゴニスト活性の約２０％未満を示す。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体に対してグルカゴンにより達成される最大アゴニスト活性の約１０％未満を示す。特定の実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体に対してグルカゴンにより達成される最大アゴニスト活性の約５％未満を示す。さらに別の特定の実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体に対してグルカゴンにより達成される最大アゴニスト活性の０％を示す。
「純粋なグルカゴンアンタゴニスト」は、実施例１３に記載されているような検証済インビトロモデルアッセイを使用してｃＡＭＰ産生により測定した場合、グルカゴン又はＧＬＰ−１受容体活性に対する検出可能な刺激を生じないようなグルカゴンアンタゴニストである。例えば、純粋なグルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体に対してグルカゴンにより達成される最大アゴニスト活性の約５％未満（例えば、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０％）を示し、ＧＬＰ−１受容体に対してＧＬＰ−１により達成され螺宇最大アゴニスト活性の約５％未満（例えば、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０％）を示す。
本明細書で使用されるとき、「グルカゴンアンタゴニスト誘導体」は、配列番号１のアミノ酸と６０％を超えるアミノ酸配列同一性を共有するが、グルカゴンアンタゴニスト活性を示すように修飾されているペプチドである。そのような修飾には、アミノ酸置換若しくは欠失、又はペプチドの翻訳後修飾（例えば、メチル化、アミド化、アシル化、ユビキチン化、ペグ化など）が含まれる。一つの例では、グルカゴンアンタゴニスト誘導体は、最初の５個のアミノ酸残基がＮ末端から欠失しているように、そして残りのＮ末端のアミノ酸（フェニルアラニン）のアミノ基がヒドロキシル基で置換されているように修飾された、配列番号１のグルカゴンペプチドを含む。
本明細書で使用されるとき、アミノ酸「修飾」は、アミノ酸の置換、付加又は欠失を意味し、ヒトタンパク質において一般的に見出される２０個のアミノ酸に加え、異形又は非天然のアミノ酸のいずれかによる、置換又は付加が含まれる。異形アミノ酸の商業供給源には、Sigma-Aldrich（Milwaukee, WI）、ChemPep Inc.（Miami, FL）及びGenzyme Pharmaceuticals（Cambridge, MA）が含まれる。異形アミノ酸は、商業供給者から購入する、新規に合成する、又は天然のアミノ酸を化学的に修飾する若しくは誘導体化して得ることができる。本明細書で使用されるとき、アミノ酸「置換」は、１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に代えることを意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「保存的アミノ酸置換」は、以下の５つの群の１つの範囲内の交換として定義される：
Ｉ．小型で脂肪族で非極性又は僅かに極性の残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、ＧＩｙ；
ＩＩ．極性の負荷電残基及びそれらのアミド：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
ＩＩＩ．極性の正荷電残基：
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）；
ＩＶ．大型で脂肪族の非極性残基：
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン；
Ｖ．大型の芳香族残基：
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン。
本明細書で使用されるとき、一般的用語「ポリエチレングリコール」又は「ＰＥＧ」は、一般式：Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ（ｎは９以上）により表される、分岐鎖又は直鎖の、エチレンオキシドと水の縮合ポリマーの混合物を意味する。更なる特定がない限り、この用語は、５００〜４０，０００ダルトンの範囲から選択される平均総分子量を有するエチレングリコールのポリマーを含むことが意図される。「ポリエチレングリコール」又は「ＰＥＧ」を数字の接尾辞と組み合わせて使用して、およその平均分子量を示す。例えば、ＰＥＧ−５，０００は、平均約５，０００の総分子量を有するポリエチレングリコールを意味する。
本明細書で使用するとき、用語「ペグ化」及び同様の用語は、ポリエチレングリコールポリマーを化合物に結合することにより天然状態から修飾された化合物を意味する。「ペグ化グルカゴンアンタゴニスト」は、共有結合しているＰＥＧ鎖を有するグルカゴンアンタゴニストである。
本明細書で使用されるとき、ペプチドに対する一般的な参照は、修飾されたアミノ及びカルボキシ末端を有するペプチドも包含することが意図される。例えば、末端カルボン酸の代わりにアミノ基を含むアミノ酸鎖は、標準的なアミノ酸を示すアミノ酸配列に包含されることが意図される。
本明細書で使用されるとき、「リンカー」は、２つの別々の実体を互いに結合する結合、分子、又は分子群である。リンカーは、２つの実体に最適な間隔をもたらしてもよいし、更に２つの実体が互いに分離することを可能にする不安定な結合を提供してもよい。不安定な結合には、光切断基、酸不安定部分、塩基不安定部分及び酵素切断基が含まれる。
本明細書で使用される「二量体」は、リンカーを介して互いに共有結合している２つのサブユニットを含む複合体である。二量体という用語は、意味を限定する言葉無しに使用される場合、ホモ二量体とヘテロ二量体の両方を包含する。ホモ二量体は、２つの同一のサブユニットを含み、一方、ヘテロ二量体は、異なる２つのサブユニットを含むが、２つのサブユニットは、実質的に互いに類似している。
本明細書で使用されるとき、用語「荷電アミノ酸」は、生理学的ｐＨの水溶液中に負に荷電（すなわち、脱プロトン化）している、又は正に荷電（すなわち、プロトン化）している側鎖を含むアミノ酸を意味する。例えば、負荷電アミノ酸には、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸及びホモグルタミン酸が含まれ、一方、正荷電アミノ酸には、アルギニン、リシン及びヒスチジンが含まれる。荷電アミノ酸には、ヒトタンパク質において一般的に見出される２０個のアミノ酸、また異形又は非天然アミノ酸のうちの荷電アミノ酸が含まれる。
本明細書で使用されるとき、「システインのスルホン酸誘導体」は、一般構造：
〔ここで、Ｘ６は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケン又はＣ２〜Ｃ４アルキニルである〕で示される化合物を意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「Ｃ１〜Ｃｎアルキル」（ここでｎは１〜６であることができる）は、１個から特定の個数までの炭素原子を有する、分岐鎖又は直鎖のアルキル基を表す。典型的なＣ１〜Ｃ６アルキル基には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「Ｃ２〜Ｃｎアルケニル」（ここでｎは２〜６であることができる）は、２個から特定の個数までの炭素原子及び少なくとも１つの二重結合を有する、オレフィン性不飽和の分岐鎖又は直鎖基を表す。そのような基の例には、１−プロペニル、２−プロペニル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、１，３−ブタジエニル（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ２）、１−ブテニル（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ３）、ヘキセニル、ペンテニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「Ｃ２〜Ｃｎアルキニル」（ここでｎは２〜６であることができる）は、２からｎ個までの炭素原子及び少なくとも１つの三重結合を有する不飽和の分岐鎖又は直鎖基を意味する。そのような例には、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「ｐＨ安定化グルカゴンアンタゴニスト」は、薬理学的な目的に使用される最も広いｐＨ範囲の水性緩衝液において、天然グルカゴンに比べて優れた安定性及び可溶性を示すグルカゴン類縁体を意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「酸性アミノ酸」は、例えばカルボン酸又はスルホン酸基のような、第２の酸性部分を含むアミノ酸を意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「患者」は、更なる指定のない限り、任意の家畜化された温血脊椎動物（例えば、家畜類、ウマ、ネコ、イヌ及び他のペット類が含まれるが、これらに限定されない）並びにヒトを包含することが意図される。
本明細書で使用されるとき、用語「約」は、記述されている値又は値の範囲よりも１０パーセント多い又は少ないことを意味するが、任意の値又は値の範囲をこの広義の定義にのみ指定することを意図しない。用語「約」に続くそれぞれの値又は値の範囲は、記述された絶対値又は値の範囲の実施態様も包含することが意図される。
〔実施態様〕
本明細書に開示されているものは、グルカゴン抑制に対して高度に特異的であり、かつ見かけのアゴニスト活性を有さないグルカゴンアンタゴニストである。そのようなグルカゴンアンタゴニストは、グルカゴンアゴニスト作用の抑制が望まれるあらゆる状況に利用される。例えば、グルカゴンアンタゴニスト作用が高血糖症の前臨床モデルにおいて血中グルコースの低下をもたらすことが実証されている糖尿病の治療に、グルカゴンアンタゴニストを使用することができる。
通常９位に生じるアスパラギン酸がグルタミン酸により又はシステイン酸に基づく誘導体により置換されているような、グルカゴンの特定の類縁体が開発されている。より詳細には、最初のアミノ酸の欠失（ｄｅｓ−Ｈｉｓ）及び９位のアスパラギン酸のグルタミン酸による置換が、グルカゴンアンタゴニストを産生する。グルカゴンの９位のアミノ酸を置換するスルホン酸置換基を有するグルカゴン誘導体は、カルボン酸に基づくアミノ酸と同様に機能するが、可溶性のような物理的特性に関して幾つかの重要な差がある。従来のｄｅｓ−Ｈｉｓ，Ｇｌｕ９グルカゴンアンタゴニストにおいて９位の等配電子グルタミン酸をホモシステイン酸（ｈＣｙｓＳＯ３）により置換すると、部分的なアンタゴニスト及び弱いアゴニストが保持される。
驚くべきことに、出願者たちは、例えば最初の５個のアミノ酸の除去（ｄｅｓ（１−５）を生じる）のような、追加のＮ末端残基の除去と、ｈＣｙｓ（ＳＯ３）、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、又は下記構造：
〔ここで、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル若しくはＣ２〜Ｃ４アルキニルである〕を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体による、９位（配列番号１の番号付けによる）での置換を行うことにより、高度に特異的で、強力で、アゴニスト特性の混入を有さないホルモンアンタゴニストとして機能する化合物がもたらされることを発見した。したがって、純粋なグルカゴンアンタゴニスト活性を示すグルカゴン誘導体ペプチドが本明細書に開示されている。一つの実施態様によると、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体が０．８nMのグルカゴンとグルカゴンアンタゴニストに同時に接触したとき、インビトロアッセイでｃＡＭＰ酸性により測定すると、グルカゴン受容体のグルカゴン誘導ｃＡＭＰ産生を最大で少なくとも５０％低減する活性を示す。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体のグルカゴン誘導ｃＡＭＰ産生を最大量で少なくとも８０％低減する。
一つの実施態様によると、配列番号１の野生型配列と比べて、Ｎ末端からの２〜５個のアミノ酸残基の欠失、及び、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、システインのスルホン酸誘導体、又は下記構造：
〔ここで、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル若しくはＣ２〜Ｃ４アルキニルである〕を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体による、天然タンパク質の９位のアスパラギン酸残基の置換、によって修飾されているグルカゴンペプチドを含む、グルカゴンアンタゴニスト誘導体が提供される。
特定の実施態様において、Ｎ末端からの２〜５個のアミノ酸残基の欠失及び天然グルカゴンの９位のＡｓｐの置換を含む前記グルカゴンアンタゴニストは、３つまでのアミノ酸修飾により更に修飾される。例えば、グルカゴンアンタゴニストは、１、２又は３つの保存的アミノ酸修飾を含むことができる。代替的に又は追加的に、グルカゴンアンタゴニストは、下記からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸修飾を含むことができる：
Ａ．１０、２０及び２４位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のうちの１若しくは２個のアミノ酸、又はＮ若しくはＣ末端のアミノ酸の、エステル、エーテル、チオエーテル、アミド若しくはアルキルアミン結合を介してアシル基若しくはアルキル基に共有結合しているアミノ酸による置換；
Ｂ．１６、１７、２０、２１及び２４位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のうちの１若しくは２個のアミノ酸、又はＮ若しくはＣ末端のアミノ酸の、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルチニン、ホモシステイン及びアセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群より選択されるアミノ酸による置換（ここで前記群のアミノ酸は親水性部分と共有結合している）；
Ｃ．Ｎ又はＣ末端への、親水性部分と共有結合したアミノ酸の付加；
Ｄ．システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸又はびホモシステイン酸による、１５位（配列番号１の番号付けによる）のＡｓｐの置換；
Ｅ．システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸又はホモシステイン酸による、１６位（配列番号１の番号付けによる）のＳｅｒの置換；
Ｆ．配列番号１のアミノ酸番号付けによる１６、２０、２１及び２４位のうちの１つ以上の位置でのＡＩＢによる置換；
Ｇ．配列番号１の番号付けによる２９位のアミノ酸、又は２８及び２９位の両方のアミノ酸の欠失；
Ｈ．２８位のＡｓｎ及び２９位のＴｈｒ（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のそれぞれ又は両方の荷電アミノ酸による置換、及び／又は、配列番号１のＣ末端への１〜２個の荷電アミノ酸の付加；
Ｉ．Ｌｅｕ又はノルロイシンによる２７位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のＭｅｔの置換；
Ｊ．配列番号１のＣ末端への、配列番号１９〜２１及び５３のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドの付加（ここで２９位（配列番号１の番号付けによる）のＴｈｒはＴｈｒ又はＧｌｙである）；並びに
Ｋ．アミド又はエステルによるＣ末端カルボキシレートの交換。
特定の実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、上記に記載されたアミノ酸修飾のＡ、Ｂ若しくはＣ、又はそれらの組み合わせを含む。さらに別の特定の実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、アミノ酸修飾のＡ、Ｂ及び／又はＣに加えて、上記に記載されたアミノ酸修飾のＤ〜Ｋ又はそれらの組み合わせを更に含む。
一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、最初の５個のアミノ酸がＮ末端から除去され、残りのＮ末端アミノ基がヒドロキシル基に代えられて（「ＰＬＡ６類縁体」）、配列番号３９のペプチドを産生する、グルカゴンペプチドを含む。出願者たちは、最初の５個のアミノ酸の欠失及び９位（天然のグルカゴンにおいて）のグルタミン酸の置換を有するグルカゴンアンタゴニスト類縁体における、フェニル−乳酸によるフェニルアラニンの置換が、これらのグルカゴンアンタゴニスト類縁体の潜在能力を更に増強することを見出した。
一つの実施態様において、配列番号３９のグルカゴンアンタゴニストペプチドは、一般構造：
〔ここで、Ｘ６は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケン又はＣ２〜Ｃ４アルキニルである〕で示されるアミノ酸により４位（天然グルカゴンの９位）のアスパラギン酸残基を置換することによって更に修飾されており、一つの実施態様では、ＸはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、別の実施態様では、ＸはＣ２アルキルである。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、最初の５個のアミノ酸がＮ末端から除去されており、かつ４位（天然グルカゴンの９位）のアスパラギン酸残基がシステイン酸又はホモシステイン酸で置換されているグルカゴンペプチドを含む。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、配列番号３９、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むグルカゴンペプチドを含む。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ここで４位のアミノ酸はホモシステイン酸である。
別の実施態様において、配列番号３９のグルカゴンアンタゴニストは、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、又は一般構造：
〔ここで、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル若しくはＣ２〜Ｃ４アルキニルである〕を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体による４位（天然グルカゴンの９位）のアスパラギン酸残基の置換によって、更に修飾されている。特定の実施態様において、Ｘは、Ｃ１又はＣ２アルキルである。
しかし、出願者たちは、ｄｅｓ １−５グルカゴン類縁体（すなわち、最初の５個のアミノ酸か欠失しているグルカゴン類縁体）において、ＰＬＡによってＮ末端フェニルアラニンを置換することによって、４位（天然グルカゴンの９位）の天然アスパラギン酸残基の更なる置換が、純粋なアンタゴニスト作用を示す類縁体を産生するのに必要ではなくなることを発見した。この結果は、グルカゴン（２−２９）類縁体の高度な親和性及び強力なアンタゴニストを産生するために４位の天然アスパラギン酸を置換しなければならないという従来技術の教示の観点からすると、驚くべきことである。ＰＬＡ置換の使用は、Ｇｌｕ９及びｈＣｙｓ（ＳＯ３Ｈ）９類縁体と同程度にまでＡｓｐ９類縁体の相対的な潜在能力を改善する（実施例の表６及び７を参照すること）。
３，４−２Ｆ−フェニルアラニン（３，４−２Ｆ−Ｐｈｅ）、２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）、Ｎ−アシル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）、アルファ−メチルヒドロケイ皮酸（ＭＣＡ）及びベンジルマロン酸（ＢＭＡ）を含む他のフェニルアラニン類縁体によるフェニルアラニン残基の置換は、ＰＬＡ置換と同等の効力では機能しなかった（図７を参照すること）。
４及び５位を含む６位以外（天然グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の部位でのＰＬＡの置換は、ＰＬＡ６類縁体が、僅かに延長したＮ末端を有するグルカゴン類縁体よりもかなり強力なアンタゴニストであること明らかにした（表８及び図８に表された結果を参照すること）。図８に表された結果は、ＰＬＡヒドロキシ基のアシル化がＰＬＡ６類縁体の効力に影響を与えないことも実証している。したがって、本発明は、Ｎ末端のアミノ酸がアシル化及びアルキル化「Ｏ末端」ペプチドで置換されている類縁体も含む。
更に、ＰＬＡ９置換は、アンタゴニストの効力を増大するのみならず、ペグ化においても重要な役割を果たす。ＰＬＡ６類縁体を、グルカゴンアゴニスト作用を回復することなく選択的にペグ化することができる。驚くべきことに、ＰＬＡ置換が不在であると、類縁体のペグ化はグルカゴンアゴニスト作用を誘発する。このグルカゴンアゴニスト作用は、ペグ化されたＰＬＡ６類縁体では見られない。３、６及び１９位（天然グルカゴンの８、１１及び１９位）並びＮ末端のアミノ酸残基を含む幾つかの部位がペグ化のために調査された（表１２を参照すること）。一つの実施態様において、ペグ化は１９位（天然グルカゴンの２４位）で行われるが、その部位は最も強力で選択的なグルカゴンアンタゴニスト作用を示す。
一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含み、ここでＡは、
（ｉ）フェニル乳酸（ＰＬＡ）；
（ｉｉ）ＰＬＡのオキシ誘導体；
（ｉｉｉ）連続した２個のアミノ酸がエステル又はエーテル結合を介して結合しているアミノ酸２〜６個のペプチド
からなる群より選択され；
Ｂは、配列番号１のアミノ酸ｉ−２６を表し（ここでｉは、３、４、５、６又は７である）、更に、下記からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸修飾を含んでもよく：
（ｉｖ）Ｇｌｕ、Ｃｙｓのスルホン酸誘導体、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、又は下記構造：
〔ここで、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル若しくはＣ２〜Ｃ４アルキニルである〕を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体による、９位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のＡｓｐの置換；
（ｖ）エステル、エーテル、チオエーテル、アミド、又はアルキルアミン結合を介してアシル又はアルキル基に共有結合しているアミノ酸による、１０、２０及び２４位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のうちの１又は２個のアミノ酸の置換；
（ｖｉ）Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルチニン、ホモシステイン及びアセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群より選択されるアミノ酸による、１６、１７、２０、２１及び２４位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のうちの１又は２個のアミノ酸の置換（ここで前記群のアミノ酸は親水性部分に共有結合している）；
（ｖｉｉ）システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸又はホモシステイン酸による１５位（配列番号１の番号付けによる）のＡｓｐの置換；
（ｖｉｉｉ）システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸又はホモシステイン酸による１６位（配列番号１の番号付けによる）のＳｅｒの置換；
（ｉｘ）配列番号１のアミノ酸番号付けによる１６、２０、２１及び２４位の１つ以上の位置でのＡＩＢによる置換、
そして
Ｃは、
（ｘ）Ｘ；
（ｘｉ）Ｘ−Ｙ；
（ｘｉｉ）Ｘ−Ｙ−Ｚ；
（ｘｉｉＩ）Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１０
（ここでＸは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はＮｌｅであり；Ｙは、Ａｓｎ又は荷電アミノ酸であり；Ｚは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）、ホモシステイン、アセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）又は荷電アミノ酸であり、Ｒ１０は、配列番号１９〜２１及び５３からなる群より選択される）；
（ｘｉｖ）Ｃ末端カルボキシレートがアミドで置換されている（ｘ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれか
からなる群より選択される。
特定の態様において、グルカゴンアンタゴニストは、ＰＬＡのオキシ誘導体を含む。本明細書で使用されるとき、「ＰＬＡのオキシ誘導体」は、ヒドロキシ基がＯ−Ｒ１１（ここでＲ１１は化学的部分である）に代えられているＰＬＡの修飾構造を含む化合物を意味する。この場合、ＰＬＡのオキシ誘導体は、例えばＰＬＡのエステル又はＰＬＡのエーテルであることができる。
ＰＬＡのオキシ誘導体を作製する方法は、当該技術分野において既知である。例えば、オキシ誘導体がＰＬＡのエステルである場合、エステルを、ＰＬＡのヒドロキシルと、求核剤を有するカルボニルとの反応により形成することができる。求核剤は、アミン又はヒドロキシルが含まれるが、これらに限定されない任意の適切な求核剤であることができる。したがって、ＰＬＡのエステルは、式ＩＶ：
〔式中、Ｒ７は、ＰＬＡのヒドロキシルと、求核剤を有するカルボニルとの反応により形成される〕で示される構造を含むことができる。
求核剤を有するカルボニル（ＰＬＡのヒドロキシルと反応してエステルを形成する）は、例えば、カルボン酸、カルボン酸誘導体又はカルボン酸の活性化エステルであることができる。カルボン酸誘導体は、塩化アシル、酸無水物、アミド、エステル又はニトリルでありうるが、これらに限定されない。カルボン酸の活性化エステルは、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、トシレート（Ｔｏｓ）、カルボジイミド又はヘキサフルオロホスフェートであることができる。幾つかの実施態様において、カルボジイミドは、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１，１′−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）又は１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＣＩＣＤ）である。幾つかの実施態様において、ヘキサフルオロホスフェートは、ヘキサフルオロホスフェート ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノンホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）及びｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）からなる群より選択される。
ヒドロキシル基（例えば、ＰＬＡのヒドロキシル）を用いる反応によりエーテルを作製する方法も当該技術分野において既知である。例えば、ＰＬＡのヒドロキシル基を、ハロゲン化アルキル又はトシル化アルキルアルコールと反応させて、エーテル結合を形成することができる。
一般に、化学的部分であるＲ１１は、グルカゴンアンタゴニストの活性を減少させないものである。幾つかの実施態様において、化学的部分は、グルカゴンアンタゴニストの活性、安定性及び／又は可溶性を増強する。
特定の実施態様において、酸素含有結合を介して（例えば、エステル又はエーテル結合を介して）ＰＬＡに結合している化学的部分は、ポリマー（例えば、ポリアルキレングリコール）、炭水化物、アミノ酸、ペプチド又は脂質、例えば脂肪酸又はステロイドである。
特定の実施態様において、化学的部分は、アミノ酸であり、更に、式ＩＶがデプシペプチドとなるように、ペプチドの一部であってもよい。この場合、ＰＬＡは、グルカゴンアンタゴニストがＰＬＡ残基の１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６個又はそれ以上）のアミノ酸Ｎ末端を含むように、グルカゴンアンタゴニストのＮ末端アミノ酸残基以外の位置にあることができる。例えば、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴンアンタゴニストのｎ位にＰＬＡを含むことができ、ここでｎは２、３、４、５又は６である。
ＰＬＡ残基のＮ末端のアミノ酸は、合成アミノ酸であってもよく、天然に存在するアミノ酸であってもよい。特定の実施態様において、Ｎ末端ＰＬＡであるアミノ酸は、天然アミノ酸である。一つの実施態様において、ＰＬＡのＮ末端であるアミノ酸は、天然グルカゴンのＮ末端のアミノ酸である。例えば、グルカゴンアンタゴニストは、Ｎ末端に、配列番号５４〜５８のいずれかのアミノ酸配列を含むことができ、ここでＰＬＡは、エステル結合を介してトレオニンに結合している：
配列番号５４ Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号５５ Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号５６ Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号５７ Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号５８ Ｔｈｒ−ＰＬＡ
別の実施態様において、１個以上のＮ末端のアミノ酸を天然グルカゴンのアミノ酸以外のアミノ酸で置換することができる。例えば、グルカゴンアンタゴニストが５又は６位のアミノ酸としてＰＬＡを含む場合、１位及び／又は２位のアミノ酸は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対して感受性を低減するアミノ酸であることができる。より詳細には、幾つかの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストの１位は、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン及びホモ−ヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸である。より詳細には、幾つかの実施態様において、アンタゴニストペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン及びアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選択されるアミノ酸である。また、例えば、グルカゴンアンタゴニストが４、５又は６位のアミノ酸としてＰＬＡを含む場合、グルカゴンアンタゴニストの３位のアミノ酸は、天然グルカゴンの天然グルタミン残基とは対照的に、グルタミン酸であることができる。本発明の例示的な実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、Ｎ末端に、配列番号５９〜６１のいずれかのアミノ酸配列を含む。
式ＩＶの化合物を含むグルカゴンアンタゴニストに関して、ポリマーは、ＰＬＡのヒドロキシル基と反応することができる限り、任意のポリマーであることができる。ポリマーは、天然では又は通常は求核剤を有するカルボニルを含むものであることができる。あるいは、ポリマーは、カルボニルを有するカルボニルを含むように誘導体化されているものであることができる。ポリマーは、以下のいずれかを誘導体化したポリマーであってもよい：ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン及びポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレートを含むその誘導体、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、 ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）及びポリ（オクタデシルアクリレート）を含むアクリル酸エステル及びメタクリル酸エステルのポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハロゲン化物、ポリ（酢酸ビニル）及びポリビニルピロリドンを含むポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン及びそのコポリマー、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシエチルセルロース、三酢酸セルロース及びセルロース硫酸ナトリウム塩を含むセルロース、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）及びポリ（エチレンテレフタレート）を含むポリエチレン、並びにポリスチレン。
ポリマーは、生分解性ポリマーであることができ、例えば、合成の生分解性ポリマー（例えば、乳酸とグリコール酸ポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）及びポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン））及び天然の生分解性ポリマー（例えば、アルギン酸塩及びデキストランを含む他の多糖類、セルロース、コラーゲン、その化学誘導体（化学基、例えばアルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、及び当業者により日常的に行われる他の修飾）、アルブミン及び他の親水性タンパク質（例えば、ゼイン、他のプロラミン及び疎水性タンパク質））、並びにこれらの任意のコポリマー又は混合物であることができる。一般に、これらの物質は、インビボにおける酵素的加水分解又は水への暴露によって、表面又はバルク侵食により分解される。
ポリマーは、生体付着性ポリマーであることができ、例えば、H. S. Sawhney, C. P. Pathak and J. A. Hubbell in Macromolecules, 1993, 26, 581-587により記載される生体侵食性ヒドロゲル（この教示は本明細書に組み込まれる）、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸塩、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）及びポリ（オクタデシルアクリレート）であることができる。
一つの実施態様において、ポリマーは水溶性ポリマーである。適切な水溶性ポリマーは、当該技術分野において既知であり、例として、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ；Klucel）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ；Methocel）、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルブチルセルロース、ヒドロキシプロピルペンチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース（Ethocel）、ヒドロキシエチルセルロース、多様なアルキルセルロース及びヒドロキシアルキルセルロース、多様なセルロースエーテル、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、酢酸ビニル／クロトン酸コポリマー、ポリ−ヒドロキシアルキルメタクリレート、ヒドロキシメチルメタクリレート、メタクリル酸コポリマー、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリレート、無水マレイン酸／メチルビニルエーテルコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム及びカルシウム、ポリアクリル酸、酸性カルボキシポリマー、カルボキシポリメチレン、カルボキシビニルポリマー、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、ポリメチルビニルエーテル−ｃｏ−無水マレイン酸、カルボキシメチルアミド、カリウムメタクリレートジビニルベンゼンコポリマー、ポリオキシエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、並びにこれらの誘導体、塩及び組み合わせが挙げられる。
特定の実施態様において、ポリマーは、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような、ポリアルキレングリコールである。
炭水化物は、アルファ離脱基を有するカルボニルを含む又は含むように構成される限り、任意の炭水化物であることができる。炭水化物は、例えば、アルファ離脱基を有するカルボニルを含むように誘導体化されているものであることができる。この場合、炭水化物を、単糖（例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース）、二糖（例えば、スクロース、ラクトース、マルトース）、オリゴ多糖（例えば、ラフィノース、スタキオース）、多糖（デンプン、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、カロース、ラミナリン、キシラン、マンナン、フコイダン、ガラクトマンナン）から誘導体化することができる。
式ＩＶの化合物を含むグルカゴンアンタゴニストに関して、脂質は、アルファ離脱基を有するカルボニルを含む、任意の脂質であることができる。脂質は、例えば、カルボニルを含むように誘導体化されたものであることができる。この場合、脂質は、以下のものの誘導体であることができる：脂肪酸（例えば、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸、エイコサノイド、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン、Ｎ−アシルエタノールアミン）、グリセロ脂質（例えば、一置換、二置換、三置換グリセロール）、グリセロリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴシン、セラミド）、ステロール脂質（例えば、ステロイド、コレステロール）、プレノール脂質、サッカロ脂質又はポリケチド、油、ロウ、コレステロール、ステロール、脂溶性のビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質。
一つの実施態様において、Ｒ７は、約１００kDa以下aの分子量、例えば９０kDa以下、約８０kDa以下、約７０kDa以下、約６０kDa以下、約５０kDa以下、約４０kDa以下の分子量を有する。したがって、Ｒ７は、約３５kDa以下、３０kDa以下、約２５kDa以下、約２０kDa以下、約１５kDa以下、約１０kDa以下、約５kDa以下、又は約１kDaの分子量を有することができる。
別の実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、Ａとして、連続した２個のアミノ酸がエステル又はエーテル結合を介して結合しているアミノ酸２〜６個のペプチドを含む。エステル又はエーテル結合は、例えば、アミノ酸２と３、３と４、４と５又は５と６の間にあることができる。更に、ペプチドを、ポリマー（例えば、親水性ポリマー）への結合を含む他の化学的部分への共有結合、アルキル化、又はアシル化により、更に修飾してもよい。
ペプチドは、ペプチドの連続した少なくとも２個のアミノ酸がエステル又はエーテル結合を介して結合している限り、合成又は天然の任意のアミノ酸を含むことができる。特定の実施態様において、ペプチドは天然グルカゴンのアミノ酸を含む。例えば、ペプチドは天然グルカゴン（配列番号１）のうちのｊから６個を含むことができ、ここでｊは１、２、３、４又は５である。あるいは、ペプチドは、１つ以上のアミノ酸修飾を有する、配列番号１のＮ末端に基づいたアミノ酸配列を含むことができる。１位及び／又は２位のアミノ酸は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対して感受性を低減させるアミノ酸であることができる。例えば、ペプチドは、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン及びホモ−ヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸を、グルカゴンアンタゴニストの１位に含むことができる。より詳細には、幾つかの実施態様において、アンタゴニストペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン及びアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選択されるアミノ酸である。また、例えば、グルカゴンアンタゴニストの３位のアミノ酸は、天然グルカゴンの天然グルタミン残基とは対照的に、グルタミン酸であることができる。したがって、グルカゴンアンタゴニストは、
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号６８）；
Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号６９）；又は
Ｘａａ３−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号７０）
のアミノ酸配列を含むことができ、
ここで、Ｘａａ１は、Ｈｉｓ、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン及びホモ−ヒスチジンからなる群より選択され；Ｘａａ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン及びアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選択され；そしてＸａａ３は、Ｇｌｎ又はＧｌｕである。
本発明は、グルカゴンアンタゴニストのＣ末端のアミノ酸が、天然アミノ酸に存在するカルボン酸基を置換しているアミド基を有する実施態様も包含する。
グルカゴンアンタゴニストを更に修飾して、ペプチドのグルカゴンアンタゴニスト活性を保持しながら、生理学的ｐＨの水溶液における可溶性を改善することができる。天然ペプチドの１、１６、１７、２０、２１、２４及び２９位に対応した位置又はＣ末端への親水性基の導入は、親化合物のアンタゴニスト活性を保持しながら、得られたグルカゴンアンタゴニストの、生理学的ｐＨを有する溶液における可溶性を改善することができる。したがって、一つの実施態様において、本開示のグルカゴンアンタゴニストは、天然グルカゴンペプチドの１、１６、１７、２０、２１、２４及び２９位のアミノ酸又はＮ若しくはＣ末端のアミノ酸に対応したアミノ酸の側鎖に共有結合している１つ以上の親水性基を含むように、更に修飾される、。更なる実施態様において、天然グルカゴンペプチドの１６及び２４位のアミノ酸に対応したアミノ酸の側鎖は、親水性基に共有結合しており、一つの実施態様において、親水性基はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
幾つかの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストがペグ化されている場合、グルカゴンアンタゴニストは、短縮されたグルカゴンペプチド、具体的には、「Ｎ末端」アミノ酸がＰＬＡ（フェニル−乳酸）であるグルカゴンペプチド６−２９を含む。そのようなグルカゴン誘導体は特有の効能を示す。これらは、天然Ｎ末端フェニルアラニンを有するものよりも強力なペプチドであり、ペグ化の結果、あらゆるグルカゴンアゴニスト作用を抑制し、このことは天然フェニルアラニンにおいて見られない。最後に、現在の文献は、９位の天然アスパラギン酸の置換がアンタゴニスト活性にとって必要であることを確立しているものの、そのような置換はＰＬＡ６−（６−２９）グルカゴン類縁体においてはもはや必要ではないという驚くべき結果を本発明者たちは発見した。
一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストのアミノ酸は少なくとも１つのシステイン残基で置換されており、ここでシステイン残基の側鎖は、例えばマレイミド、ビニルスルホン、２−ピリジルチオ、ハロアルキル及びハロアシルを含むチオール反応性試薬により更に修飾される。これらのチオール反応試薬は、カルボキシ、ケト、ヒドロキシ及び他のエーテル基、並びにポリエチレングリコール単位のような他の親水性部分を含有することができる。別の実施態様において、グルカゴンアンタゴニストのアミノ酸は、リシンで置換され、置換リシン残基の側鎖は、カルボン酸の活性エスエル（スクシンイミド、無水物など）又はポリエチレングリコールのような親水性部分のアルデヒドのような、アミン反応性試薬を使用して、更に修飾される。一つの実施態様によると、天然ペプチドの１２位に対応するリシン残基はアルギニンで置換され、天然ペプチドの１、１６、１７、２０、２１、２４若しくは２９位に対応するアミノ酸の１つに単一のリシン置換が挿入されるか、又は、グルカゴンアンタゴニストのＮ若しくはＣ末端にリシンが付加される。
別の実施態様において、天然ペプチドの２７位に対応するメチオニン残基をロイシン又はノルロイシンに変えて、ペプチドの酸化分解を防止する。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載されているグルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体における活性又は効力に影響を与えることなく、グルカゴンペプチドのＣ末端の１又は２個のアミノ酸の切断又は欠失（すなわち、天然グルカゴンの２９位又は２８及び２９位のアミノ酸の切断）により更に修飾される。この場合、本明細書に記載されているグルカゴンアンタゴニストは、例えば、天然グルカゴンペプチド（配列番号１）のアミノ酸１〜２７、１〜２８、２〜２７、２〜２８、３〜２７、３〜２８、４〜２７、４〜２８、５〜２７、５〜２８、６〜２７又は６〜２８から実質的に構成されるか又は構成され、本明細書に記載されているグルカゴンアンタゴニスト活性をもたらす１つ以上の修飾を有することができる。
本開示のグルカゴンアンタゴニストは、グルカゴンペプチドの機能にとって重要ではないことが知られている位置におけるアミノ酸置換も包含する。一つの実施態様において、置換は、配列番号３９の２、５、６、７、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、１９、２２、２３又は２４からなる群より選択される１、２又は３つの位置での保存的アミノ酸置換である。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、配列番号４２のペプチド誘導体を含み、ここでグルカゴンペプチドは、２、５、６、７、８、９、１２、１３及び１４位から選択される１〜３つのアミノ酸位置で配列番号４２に対して更なるアミノ酸置換を含む。一つの実施態様において、配列番号４２の２、５、６、８、９、１２、１３及び１４位での置換は、保存的アミノ酸置換である。一つの実施態様において、天然ペプチドの１６、１７、２０、２１、２４又は２９位に対応するアミノ酸、とりわけ２１及び／又は２４位に対応するアミノ酸はシステイン又はリシンで置換されており、ここで置換システイン又はリシン残基にはＰＥＧ鎖が共有結合している。
グルカゴンアンタゴニストがポリエチレングリコール鎖を含むこれらの実施態様において、ポリエチレン鎖は、直鎖の形態であってもよく、分岐鎖であってもよい。一つの実施態様によると、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約１０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一つの実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一つの実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一つの実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約１，０００〜約２，０００ダルトンから選択される平均分子量を有する。一つの実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約１，０００ダルトンの平均分子量を有する。
一つの実施態様によると、修飾グルカゴンアンタゴニストは、ペプチドに共有結合している２つ以上のポリエチレン鎖を含み、ここでグルカゴン鎖の総分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。一つの実施態様において、ペグ化グルカゴンアンタゴニストは、配列番号１２及び配列番号２２からなる群より選択されるペプチドを含み、ここで前記ペプチドは、１１及び１９位のアミノ酸に結合しているポリエチレングリコール鎖を含み、２つのＰＥＧ鎖の合わせた分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。
一つの実施態様によると、下記：
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ２（配列番号９）、
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ２（配列番号１０）、
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ２（配列番号１１）、及び
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ２（配列番号１２）
からなる群より選択される修飾グルカゴンペプチドを含むグルカゴンアンタゴニストが提供され、
ここで、４位のＸａａは、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸又はホモシステイン酸であり、７位のＸａａは、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり、１０位のＸａａは、アスパラギン酸、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸又はホモシステイン酸であり、１１位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン又はアセチルフェニルアラニンであり、１６位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン又はアセチルフェニルアラニンであり、１９位のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン及びアセチルフェニルアラニンであり、２２位のＸａａは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はＮｌｅであり、Ｒ１は、ＯＨ又はＮＨ２であり、そしてＲ２は、ＣＯＯＨ又はＣＯＮＨ２であり、ペプチドは、配列番号９の場合は１１位、配列番号１０の場合は１６位、配列番号１１の場合は１９位、配列番号１２の場合は１６又は１９位でペグ化されているが、但し、４位のＸａａがアスパラギン酸である場合は、Ｒ１はＯＨである。一つの実施態様によると、ペプチドは、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１の配列を含み、ここでＲ１はＯＨであり、そしてＲ２はＣＯＮＨ２である。一つの実施態様において、ペプチドは、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１の配列を含み、ここでＲ１はＯＨであり、Ｒ２はＣＯＮＨ２であり、そして４位のアミノ酸はアスパラギン酸であり、更なる実施態様において、そのようなペプチドは、配列番号１９の配列を含むカルボキシ末端延長を含む。
一つの実施態様によると、ペプチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１６からなる群より選択される配列を含み、ここでペプチドは、配列番号９及び配列番号１３の１１位でペグ化されており、配列番号１０の１６位でペグ化されており、そして配列番号１０及び配列番号１４の１９位でペグ化されている。一つの実施態様において、グルカゴンアゴニストは、配列番号１３及び配列番号１４のペプチドを含む。一つの実施態様において、本明細書に開示されているグルカゴンアゴニストのＣ末端のアミノ酸は、天然アミノ酸に存在するカルボン酸基の代わりにアミド基を有する。一つの実施態様によると、グルカゴンアンタゴニストは、配列番号１８の配列を含む。
一つの実施態様において、血漿タンパク質がペプチドのアミノ酸側鎖に共有結合してグルカゴンペプチドの可溶性、安定性及び／又は薬物動態を改善しているグルカゴンアンタゴニストが提供される。例えば、血清アルブミンを本明細書に提示されているグルカゴンアンタゴニストに共有結合することができる。一つの実施態様において、血漿タンパク質が、天然グルカゴンペプチドの１６、１７、２０、２１、２４又は２９位に対応するアミノ酸に共有結合している。より詳細には、一つの実施態様において、プラスミドタンパク質は、天然グルカゴンペプチドの１６又は２４位に対応するアミノ酸に結合しており、グルカゴンアンタゴニストは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３６、又は配列番号３９の配列を含む。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２からなる群より選択されるペプチドを含む。
一つの実施態様によると、免疫グロブリン分子のＦｃ部分を表す直鎖アミノ酸配列が、本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニストのアミノ酸側鎖に共有結合して、グルカゴンペプチドの可溶性、安定性及び／又は薬物動態を改善している、グルカゴンアンタゴニストが提供される。例えば、免疫グロブリン分子のＦｃ部分を表すアミノ酸配列は、配列番号７、配列番号３９のグルカゴンペプチド又はそのグルカゴン類縁体の１１、１２、１５、１６、１９、２１又は２４位に共有結合することができる。一つの実施態様において、Ｆｃペプチドは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号３６のグルカゴンアンタゴニストの１１又は１９位に共有結合している。Ｆｃ部分は、通常、ＩｇＧから単離されるが、任意の免疫グロブリンからのＦｃペプチドフラグメントも同等に機能するはずである。一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８及び配列番号３９からなる群より選択され、ここでＦｃ部分は、天然グルカゴンペプチドの１６、１７、２０、２１、２４又は２９位に対応する位置に結合している。一つの実施態様において、グルカゴン類縁体は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２からなる群より選択されるグルカゴンペプチドを含み、ここでＦｃペプチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１の場合はそれぞれ１１、１６又は１９位、配列番号１２の場合は１１と１９位の両方に配置されているアミノ酸の側鎖に結合している。
本開示は、本発明のグルカゴンペプチドが結合する、他の結合体も包含し、更にペプチドは、共有結合を介して結合してもよく、リンカーを介して結合してもよい。結合は、共有化学結合、静電気、水素、イオン、ファンデルワールスのような物理的な力又は疎水的若しくは親水的相互作用により達成することができる。多様な非共有結合系を使用することもでき、その例として、ビオチン−アビジン、リガンド／受容体、酵素／基質、核酸／核酸結合タンパク質、脂質／脂質結合タンパク質、細胞付着分子パートナー、又は互いに親和性を有する任意の結合パートナー若しくはそのフラグメントが挙げられる。
例示的な結合体には、異種ペプチド又はポリペプチド（例えば、血漿タンパク質を含む）、標的作用物質、免疫グロブリン又はその一部（例えば、可変部領域、ＣＤＲ若しくはＦｃ領域）、放射性同位体、蛍光体若しくは酵素標識のような診断用標識、水溶性ポリマーを含むポリマー、又は他の治療若しくは診断剤が含まれるが、これらに限定されない。一つの実施態様において、本発明のグルカゴンペプチド及び血漿タンパク質を含む結合体が提供され、ここで血漿タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、フィブリノゲン及びグロブリンからなる群より選択される。一つの実施態様において、結合体の血漿タンパク質部分は、アルブミン又はトランスフェリンである。幾つかの実施態様において、リンカーは、１〜約６０個、又は１〜３０個以上の原子長さ、２〜５個の原子、２〜１０個の原子、５〜１０個の原子又は１０〜２０個の原子長さの原子鎖を含む。幾つかの実施態様において、鎖原子は全て炭素原子である。幾つかの実施態様において、リンカーの主鎖の鎖原子は、Ｃ、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群より選択される。鎖原子及びリンカーは、より可溶性のある結合体をもたらすと予想される可溶性（親水性）に従って選択することができる。幾つかの実施態様において、リンカーは、酵素やその他の触媒による切断、又は、標的組織若しくは臓器若しくは細胞において見出される加水分解的条件による切断の対象となる官能基を提供する。幾つかの実施態様において、リンカーの長さは、立体障害の潜在性を低減するのに十分な長さである。リンカーが共有結合又はペプチジル結合であり、結合体は、ポリペプチドである場合、全体が融合タンパク質であることができる。そのようなペプチジルリンカーは任意の長さであることができる。例示的なリンカーは、約１〜５０個のアミノ酸長さ、５〜５０個、３〜５個、５〜１０個、５〜１５個又は１０〜３０個のアミノ酸長さである。そのような融合タンパク質は、当業者に既知の組み換え遺伝子操作法により産生することもできる。
天然グルカゴンの１５〜１６位のＡｓｐ−Ｓｅｒ配列は、水性緩衝液において天然ホルモンの早期化学切断をもたらす特有の不安定ジペプチドとして同定されている。例えば、０．０１NのＨＣｌに３７℃で２週間維持されたとき、５０％を超える天然グルカゴンがフラグメントに切断されうる。２つの遊離切断ペプチド１−１５及び１６−２９は、グルカゴン様生物学的活性を欠いており、したがって、グルカゴン及び関連する類縁体の水性の予備処方に対して制限となる。Ｇｌｕによる天然グルカゴンペプチドの１５位のＡｓｐの選択的化学置換は、１５−１６ペプチド結合の化学切断を実質的に排除することが観察されている。
したがって、本発明のグルカゴンアンタゴニストを同様に修飾して、水性緩衝液における早期化学切断に対する感受性を減少できることが予想される。一つの実施態様によると、本明細書に記載されているグルカゴンアンタゴニストを更に修飾して、天然グルカゴンペプチドの１５位に配置されている天然アスパラギン酸アミノ酸を、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換することによって、水溶液中の安定性を増強することができる。一つの実施態様によると、配列番号３９のグルカゴンアンタゴニストの１０位のアスパラギン酸残基を、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換することができ、一つの実施態様において、配列番号３９の１０位の天然アスパラギン酸はグルタミン酸で置換される。一つの実施態様によると、配列番号３６、配列番号４０及び配列番号４２からなる群より選択される配列を含む、水溶液中で改善された可溶性を有するグルカゴンアンタゴニストが提供される。更なる実施態様において、グルカゴンアンタゴニストはアミド化されている。
一つの実施態様によると、本明細書に記載されているグルカゴンアンタゴニストの分解を低減することによる安定性の増加は、グルタミン酸、システイン酸、ホモグルタミン酸又はホモシステイン酸による１６位（天然グルカゴンの番号付けによる）のセリンの置換によって達成することもできる。特定の実施態様において、１６位（天然グルカゴンの配列番号付けによる）のセリンは、グルタミン酸に代えられている。より特定的な態様において、そのような修飾を含むグルカゴンアンタゴニストは、Ｃ末端カルボキシレートを含み、アミド化されていない。
一つの実施態様において、配列番号７、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３及び配列番号４４からなる群より選択されるグルカゴンペプチドを含み、天然グルカゴンペプチドの１１、１２、１５、１６、１９及び／又は２４位に対応する位置での１つ以上の追加的なアミノ酸置換により更に修飾されているグルカゴンアンタゴニストが提供され、ここでアミノ酸置換は、例えばＰＥＧのような親水性部分との架橋に適した側鎖を有するアミノ酸による置換を含む。天然グルカゴンペプチドを、天然に存在するアミノ酸又は合成（非天然）アミノ酸で置換することができる。合成又は非天然アミノ酸は、インビボで天然には存在しないが、本明細書に記載されるペプチド構造に組み込むことができるアミノ酸を意味する。一つの実施態様において、配列番号７、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、又は配列番号４４の配列を含むペプチドであって、天然グルカゴンペプチドの２１又は２４位に対応する位置にポリエチレン鎖が更に結合しているグルカゴンアンタゴニストが提供される。更なる実施態様において、グルカゴンペプチドのＣ末端は修飾されて、カルボン酸基がアミド基で置換されている。
出願者たちは、電荷をカルボキシ末端に導入することによって、ペプチドのアゴニスト特性を保持しながら可溶性を増強するように、天然グルカゴンを修飾できることも発見した。増強された可溶性は、ほぼ中性のｐＨでのグルカゴン溶液の調製及び保存を可能にする。比較的中性のｐＨ（例えば、約６．０〜約８．０のｐＨ）でグルカゴン溶液を配合することは、グルカゴンペプチドの長期安定性を改善する。
ここでも、出願者たちは、本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニストを同様に修飾して、母体タンパク質のアンタゴニスト特性を保持しながら、比較的中性のｐＨ（例えば、約６．０〜約８．０のｐＨ）の水溶液における可溶性を増強できることを予測する。したがって、本発明の一つの実施態様は、野生型グルカゴン（配列番号１）の６〜２９位に存在する天然アミノ酸に対して、荷電アミノ酸による天然非荷電アミノ酸の置換により又はカルボキシ末端への荷電アミノ酸の付加によりペプチドに電荷を付加して更に修飾されている、配列番号３９のグルカゴンアンタゴニストを対象とする。一つの実施態様によると、配列番号３９のグルカゴンアンタゴニストの非荷電天然アミノ酸のうちの１〜３個は、荷電アミノ酸で置換されている。一つの実施態様において、荷電アミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群より選択される。より詳細には、出願者たちは、荷電アミノ酸による天然グルカゴンの２８及び／又は２９位に対応する位置で通常生じるアミノ酸の置換、及び／又はグルカゴンペプチドのカルボキシ末端への１〜２個の荷電アミノ酸の付加が、生理学的に関連するｐＨ（すなわち、約６．５〜約７．５のｐＨ）の水溶液におけるグルカゴンペプチドの可溶性及び安定性を増強することを発見した。したがって、本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニストのそのような修飾は、母体ペプチドの生物学的活性を保持しながら、特に約５．５〜約８．０の範囲のｐＨの水溶液における可溶性に同様の効果を有することが予測される。
一つの実施態様によると、配列番号３９のグルカゴンアンタゴニストは、負荷電アミノ酸（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）による天然グルカゴンの２８位及び／又は２９位に対応する天然アミノ酸の置換によって修飾されており、更に、ペプチドのカルボキシ末端への負荷電アミノ酸（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）の付加によって修飾されてもよい。別の実施態様において、配列番号３９の天然グルカゴンペプチドは、正荷電アミノ酸（例えば、リシン、アルギニン又はヒスチジン）による天然グルカゴンの２９位に対応する天然アミノ酸の置換によって修飾されており、更に、ペプチドのカルボキシ末端への１〜２個の正荷電アミノ酸（例えば、リシン、アルギニン又はヒスチジン）の付加により修飾されてもよい。一つの実施態様によると、改善された可溶性及び安定性を有するグルカゴン類縁体が提供され、ここで類縁体は、配列番号４１のアミノ酸配列を含むが、但し、配列番号４１の２３又は２４位のうちの少なくとも１個のアミノ酸は、酸性アミノ酸で置換されている、及び／又は、配列番号４１のカルボキシ末端に、追加の酸性アミノ酸が付加されている。一つの実施態様において、酸性アミノ酸は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より独立して選択される。
一つの実施態様によると、改善された可溶性及び安定性を有するグルカゴンアンタゴニストが提供され、ここでアンタゴニストは配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３又は配列番号４４のアミノ酸配列を含み、２３位又は２４位の少なくとも１個のアミノ酸は、非天然アミノ酸残基で置換されている（すなわち、類縁体の２３又は２４位に存在する少なくとも１個のアミノ酸は、配列番号７の対応する位置に存在するアミノ酸と異なる酸性アミノ酸である）。一つの実施態様によると、配列番号４１又は４２の配列を含むグルカゴンアゴニストが提供されるが、但し、２３位のアミノ酸がアスパラギンであって２４位のアミノ酸がトレオニンである場合、グルカゴンアンタゴニストのカルボキシ末端には、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＧｌｕからなる群より独立して選択される１〜２個のアミノ酸が更に付加される。
本開示は、第２のペプチドがグルカゴンアンタゴニストのＣ末端に融合しているグルカゴンアンタゴニスト融合タンパク質も包含する。より詳細には、融合タンパク質は、配列番号１９（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２０（Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ）又は配列番号２１（Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｒｇ）のアミノ酸配列がＣ末端のアミノ酸に更に結合している、配列番号４４のグルカゴンアンタゴニストペプチドを含むことができる。一つの実施態様において、配列番号１９（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列は、ペプチド結合を介して配列番号４２のグルカゴンアンタゴニストのアミノ酸２４に結合している。別の実施態様において、融合タンパク質は、配列番号１９（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列がアミノ酸２４に更に結合している、配列番号７、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１又は配列番号４３のグルカゴンアンタゴニストペプチドを含む。別の実施態様において、融合タンパク質は、配列番号２０、配列番号２１又は配列番号５３のアミノ酸配列がアミノ酸２４に更に結合している、配列番号７、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４１又は配列番号４３のグルカゴンアンタゴニストペプチドを含む。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストペプチドは、配列番号４６及び配列番号４７からなる群より選択される配列を含む。更なる実施態様において、融合ペプチドのＣ末端は修飾されて、カルボン酸基がアミド基に代えられている。
一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト融合ペプチドが提供されるが、ここで、融合ペプチドのグルカゴンアンタゴニスト部分は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１０、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号３９からなる群より選択され、配列番号１９の配列は、グルカゴンアンタゴニスト部分のカルボキシ末端に融合しており、ＰＧＥ鎖が存在する場合は、ＰＧＥ鎖は５００〜４，０００ダルトンの範囲から選択される。より詳細には、一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストセグメントは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号４６及び配列番号４７からなる群より選択され、ＰＧＥ鎖は、５００〜５，０００ダルトンの範囲から選択され、より好ましくは、一つの実施態様において、ＰＥＧ鎖は約１，０００ダルトンである。更なる実施態様において、Ｃ末端は修飾されて、カルボン酸基がアミド基に代えられている。
グルカゴンアンタゴニストは、１〜２個の荷電アミノ酸がカルボキシ末端へ更に付加されていてもよい。一つの実施態様において、１〜２個の荷電アミノ酸が配列番号４４のカルボキシ末端に付加される場合、アミノ酸は、例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸を含む負荷電アミノ酸である。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは配列番号４２の配列を含み、天然グルカゴンペプチドの対応する２７及び２８位の少なくとも１つは、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群より選択されるアミノ酸を含み、配列番号４２は更に、カルボキシ末端１〜２個の負荷電アミノ酸の付加によって修飾されていてもよい。一つの実施態様において、負荷電アミノ酸は、グルタミン酸又はアスパラギン酸である。
別の実施態様において、配列番号４２のグルカゴンアンタゴニストの可溶性は、親水性部分を１１、１２、１５、１６、１９又は２４位のアミノ酸残基に共有結合して改善することができ、一つの実施態様において、親水性部分は、１１、１６又は１９位のアミノ酸に結合しており、更なる実施態様において、親水性部分は、アミノ酸１９に結合している。一つの実施態様において、親水性部分は、血漿タンパク質であるか又は免疫グロブリンのＦｃ部分であり、別の実施態様において、親水性部分は、親水性炭化水素鎖である。一つの実施態様において、親水性部分は、約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有するポリエチレングリコールである。別の実施態様では、親水性部分は、少なくとも約２０，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールである。一つの実施態様において、ポリエチレン修飾グルカゴンアンタゴニストは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号４３、配列番号４４又は配列番号４５のアミノ酸配列を含む。
一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含み、ここでＡは、
（ｉ）フェニル乳酸（ＰＬＡ）；
（ｉｉ）ＰＬＡのオキシ誘導体；
（ｉｉｉ）連続した２個のアミノ酸がエステル又はエーテル結合を介して結合しているアミノ酸２〜６個のペプチド、
からなる群より選択され；
Ｂは、配列番号１のアミノ酸ｉ〜２６を表し（ここでｉは、３、４、５、６又は７である）、更に、下記からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸修飾を含んでもよく：
（ｉｖ）Ｇｌｕ、Ｃｙｓのスルホン酸誘導体、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、又は下記構造：
〔ここで、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル若しくはＣ２〜Ｃ４アルキニルである〕を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体による、９位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のＡｓｐの置換；
（ｖ）エステル、エーテル、チオエーテル、アミド又はアルキルアミン結合を介してアシル又はアルキル基に共有結合しているアミノ酸による、１０、２０及び２４位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のうちの１又は２個のアミノ酸の置換；
（ｖｉ）Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルチニン、ホモシステイン及びアセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群より選択されるアミノ酸による、１６、１７、２０、２１及び２４位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のうちの１又は２個のアミノ酸の置換（ここで前記群のアミノ酸は親水性部分に共有結合している）；
（ｖｉｉ）システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸又はホモシステイン酸による１５位（配列番号１の番号付けによる）のＡｓｐの置換；
（ｖｉｉｉ）システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸又はホモシステイン酸による１６位（配列番号１の番号付けによる）のＳｅｒの置換；
（ｉｘ）配列番号１のアミノ酸番号付けによる１６、２０、２１及び２４位の１つ以上の位置でのＡＩＢによる置換、
そして
Ｃは、
（ｘ）Ｘ；
（ｘｉ）Ｘ−Ｙ；
（ｘｉｉ）Ｘ−Ｙ−Ｚ；
（ｘｉｉＩ）Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１０
（ここでＸは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はＮｌｅであり；Ｙは、Ａｓｎ又は荷電アミノ酸であり；Ｚは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）、ホモシステイン、アセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）又は荷電アミノ酸であり、Ｒ１０は、配列番号１９〜２１及び５３からなる群より選択される）； 及び
（ｘｉｖ）Ｃ末端カルボキシレートがアミドで置換されている（ｘ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれか、
からなる群より選択される。
特定の態様において、グルカゴンアンタゴニストは、ＰＬＡのオキシ誘導体、例えばＰＬＡのエステル又はＰＬＡのエーテルを含む。一つの実施態様において、ＰＬＡのエステルは、式ＩＶ：
〔式中、Ｒ７は、ＰＬＡのヒドロキシルと、求核剤を有するカルボニルとの反応により形成される〕
で示される構造を含む。
特定の実施態様において、ＰＬＡのオキシ誘導体は、ポリマー（例えば、ポリアルキレングリコール）、炭水化物、アミノ酸、ペプチド及び脂質、例えば脂肪酸又はステロイドからなる群より選択される化学的部分を含み、ここで化学的部分は、酸素含有結合（例えば、エステル又はエーテル結合）を介してＰＬＡに結合している。
特定の実施態様において、化学的部分はアミノ酸であり、更に、式ＩＶがデプシペプチドとなるように、ペプチドの一部であってもよい。この場合、ＰＬＡは、グルカゴンアンタゴニストがＰＬＡ残基の１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６個又はそれ以上）のアミノ酸Ｎ末端を含むように、グルカゴンアンタゴニストのＮ末端のアミノ酸残基以外の位置にあることができる。例えば、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴンアンタゴニストのｎ位にＰＬＡを含むことができ、ここでｎは２、３、４、５又は６である。
ＰＬＡ残基のアミノ酸Ｎ末端は、合成アミノ酸であってもよく、天然に存在するアミノ酸であってもよい。特定の実施態様において、ＰＬＡのＮ末端であるアミノ酸は、天然のアミノ酸である。一つの実施態様において、ＰＬＡのＮ末端であるアミノ酸は、天然グルカゴンのＮ末端のアミノ酸である。例えば、グルカゴンアンタゴニストは、Ｎ末端に、配列番号５４〜５８のいずれかのアミノ酸配列を含むことができ、ここでＰＬＡは、エステル結合を介してトレオニンに結合している：
配列番号５４ Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号５５ Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号５６ Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号５７ Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号５８ Ｔｈｒ−ＰＬＡ
別の実施態様において、１個以上のＮ末端のアミノ酸を天然グルカゴンのアミノ酸以外のアミノ酸で置換することができる。例えば、グルカゴンアンタゴニストが５又は６位のアミノ酸としてＰＬＡを含む場合、１位及び／又は２位のアミノ酸は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対して感受性を低減するアミノ酸であることができる。より詳細には、幾つかの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストの１位は、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン及びホモ−ヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸である。より詳細には、幾つかの実施態様において、アンタゴニストペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン及びアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選択されるアミノ酸である。また、例えば、グルカゴンアンタゴニストが４、５又は６位のアミノ酸としてＰＬＡを含む場合、グルカゴンアンタゴニストの３位のアミノ酸は、天然グルカゴンの天然グルタミン残基とは対照的に、グルタミン酸であることができる。本発明の例示的な実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、Ｎ末端に、配列番号５９〜６１のいずれかのアミノ酸配列を含む。
式ＩＶの化合物を含むグルカゴンアンタゴニストに関して、ポリマーは、ＰＬＡのヒドロキシルと反応することができる限り、任意のポリマーであることができる。例えばポリマーは、天然では又は通常は求核剤を有するカルボニルを含むものであることができる。あるいは、ポリマーは、求核剤を有するカルボニルを含むように誘導体化されているものであることができる。ポリマーは、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン及びポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレートを含むその誘導体、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、 ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）及びポリ（オクタデシルアクリレート）を含むアクリル酸エステル及びメタクリル酸エステルのポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハロゲン化物、ポリ（酢酸ビニル）及びポリビニルピロリドンを含むポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン及びそのコポリマー、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシエチルセルロース、三酢酸セルロース及びセルロース硫酸ナトリウム塩を含むセルロース、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）及びポリ（エチレンテレフタレート）を含むポリエチレン、並びにポリスチレンのいずれかの誘導体化ポリマーであることができる。
ポリマーは、生分解性ポリマーであってもよく、例えば、合成の生分解性ポリマー（例えば、乳酸とグリコール酸ポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）及びポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン））及び天然の生分解性ポリマー（例えば、アルギン酸塩及びデキストランを含む他の多糖類、セルロース、コラーゲン、その化学誘導体（化学基、例えばアルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、及び当業者により日常的に行われる他の修飾）、アルブミン及び他の親水性タンパク質（例えば、ゼイン、他のプロラミン及び疎水性タンパク質））、並びにこれらの任意のコポリマー又は混合物であることができる。一般に、これらの物質は、インビボにおける酵素的加水分解又は水への暴露によって、表面又はバルク侵食により分解される。
ポリマーは、生体付着性ポリマーであってもよく、例えば、H. S. Sawhney, C. P. Pathak and J. A. Hubbell in Macromolecules, 1993, 26, 581-587により記載される（この教示は本明細書に組み込まれる）生体侵食性ヒドロゲル、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸塩、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）及びポリ（オクタデシルアクリレート）であることができる。
一つの実施態様において、ポリマーは水溶性ポリマーである。適切な水溶性ポリマーは、当該技術分野において既知であり、例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ；Klucel）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ；Methocel）、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルブチルセルロース、ヒドロキシプロピルペンチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース（Ethocel）、ヒドロキシエチルセルロース、多様なアルキルセルロース及びヒドロキシアルキルセルロース、多様なセルロースエーテル、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、酢酸ビニル／クロトン酸コポリマー、ポリ−ヒドロキシアルキルメタクリレート、ヒドロキシメチルメタクリレート、メタクリル酸コポリマー、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリレート、無水マレイン酸／メチルビニルエーテルコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム及びカルシウム、ポリアクリル酸、酸性カルボキシポリマー、カルボキシポリメチレン、カルボキシビニルポリマー、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、ポリメチルビニルエーテル−ｃｏ−無水マレイン酸、カルボキシメチルアミド、カリウムメタクリレートジビニルベンゼンコポリマー、ポリオキシエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、並びにこれらの誘導体、塩及び組み合わせが含まれる。
特定の実施態様において、ポリマーは、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような、ポリアルキレングリコールである。
炭水化物は、アルファ離脱基を有するカルボニルを含む又は含むように構成される限り、任意の炭水化物であることができる。炭水化物は、例えば、アルファ離脱基を有するカルボニルを含むように誘導体化されているものであることができる。この場合、炭水化物を、単糖（例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース）、二糖（例えば、スクロース、ラクトース、マルトース）、オリゴ多糖（例えば、ラフィノース、スタキオース）、多糖（デンプン、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、カロース、ラミナリン、キシラン、マンナン、フコイダン、ガラクトマンナン）から誘導体化することができる。
式ＩＶの化合物を含むグルカゴンアンタゴニストに関して、脂質は、アルファ離脱基を有するカルボニルを含む任意の脂質であることができる。脂質は、例えば、カルボニルを含むように誘導体化されたものであることができる。この場合、脂質は、脂肪酸（例えば、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸、エイコサノイド、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン、Ｎ−アシルエタノールアミン）、グリセロ脂質（例えば、一置換、二置換、三置換グリセロール）、グリセロリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴシン、セラミド）、ステロール脂質（例えば、ステロイド、コレステロール）、プレノール脂質、サッカロ脂質又はポリケチド、油、ロウ、コレステロール、ステロール、脂溶性のビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質の誘導体であることができる。
一つの実施態様において、Ｒ７は、約４０kDa以下の分子量を有する。したがって、Ｒ７は、約３５kDa以下、３０kDa以下、約２５kDa以下、約２０kDa以下、約１５kDa以下、約１０kDa以下、約５kDa以下又は１kDaの分子量を有する。
別の実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、Ａとして、連続した２個のアミノ酸がエステル又はエーテル結合を介して結合しているアミノ酸２〜６個のペプチドを含む。ペプチドは、ペプチドの連続した少なくとも２個のアミノ酸がエステル又はエーテル結合を介して結合している限り、合成又は天然の任意のアミノ酸を含むことができる。特定の実施態様において、Ａのペプチドは天然グルカゴンのアミノ酸を含む。例えば、ペプチドは天然グルカゴン（配列番号１）のうちのｊから６個を含むことができ、ここでｊは１、２、３、４又は５である。あるいは、ペプチドは、１つ以上のアミノ酸修飾を有する、配列番号１のＮ末端に基づいたアミノ酸配列を含むことができる。例えば、ペプチドは、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン及びホモ−ヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸を、グルカゴンアンタゴニストの１位に含むことができる。より詳細には、幾つかの実施態様において、アンタゴニストペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン及びアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選択されるアミノ酸である。また、例えば、グルカゴンアンタゴニストの３位のアミノ酸は、天然グルカゴンの天然グルタミン残基とは対照的に、グルタミン酸であることができる。したがって、グルカゴンアンタゴニストは、
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号６８）；
Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号６９）；又は
Ｘａａ３−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号７０）
のアミノ酸配列を含むことができ、
ここで、Ｘａａ１は、Ｈｉｓ、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン及びホモ−ヒスチジンからなる群より選択され；Ｘａａ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン及びアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選択され；そしてＸａａ３は、Ｇｌｎ又はＧｌｕである。
一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むグルカゴンアンタゴニストに関して、Ｂは、天然グルカゴンの、例えば配列番号１のアミノ酸ｉ−２６を表し（ここでｉは、３、４、５、６又は７である）、更に、１つ以上のアミノ酸修飾を含んでもよい。特定の実施態様において、Ｂは、配列番号１のアミノ酸７−２６を表し、更に修飾されていてもよい。
一つの実施態様において、Ｂは、３つまでのアミノ酸修飾により修飾されている。例えば、配列番号１の天然アミノ酸配列を表すＢは、１つ以上の保存的アミノ酸修飾で修飾されている。
別の実施態様において、Ｂは、本明細書に記載された（ｉｖ）〜（ｉｘ）からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸修飾を含む。特定の実施態様において、Ｂは、アミノ酸修飾（ｖ）及び（ｖｉ）のうちの１つ又は両方を含む。更なる特定の実施態様において、Ｂは、（ｖ）及び（ｖｉ）に加えて、（ｉｖ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）及び（ｉｘ）からなる群より選択されるアミノ酸修飾の１つ又は組み合わせを含む。
別の特定の実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、Ｃ末端に１個以上の荷電アミノ酸を含む。例えば、Ｙ及び／又はＺは、荷電アミノ酸、例えばＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕであることができる。さらに別の実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、ＺのＣ末端に１〜２個の荷電アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕ）含む。特定の態様において、１〜２個の荷電アミノ酸が後に続くＺは、Ｒ１０を含まない。
一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、本明細書に記載されているグルカゴンアンタゴニストのアミノ酸残基に共有結合している親水性部分を含む。例えば、グルカゴンアンタゴニストは、配列番号１の番号付けによる１、１６、２０、２１又は２４位のアミノ酸に共有結合している親水性部分を含むことができる。別の実施態様において、親水性部分は、グルカゴンアンタゴニストのＣ末端のアミノ酸に結合しており、このアミノ酸は、幾つかの場合では、ＺのＣ末端から１又は１１個目である。さらに別の実施態様において、ＡがＰＬＡ、ＰＬＡ−Ｐｈｅ又はＰＬＡ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅである場合は、親水性部分はＰＬＡに結合しており、ここでＰＬＡは修飾されて、親水性部分を含む。別の実施態様において、親水性部分を含むアミノ酸は、グルカゴンアンタゴニストのＮ又はＣ末端に付加されている。
別の実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、本明細書に記載されているアシル基又はアルキル基を含む。例えば、アシル化又はアルキル化は、配列番号１の番号付けによる１０、２０又は２４位のアミノ酸の側鎖の外で生じることができる。別の実施態様において、アシル化又はアルキル化は、グルカゴンアンタゴニストのＣ末端のアミノ酸の側鎖の外で生じるが、このアミノ酸は、幾つかの場合では、ＺＣ末端から１〜１１個目である。さらに別の実施態様において、ＡがＰＬＡ、ＰＬＡ−Ｐｈｅ又はＰＬＡ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅである場合、ＰＬＡは修飾されて、アシル又はアルキル基を含む。
本発明の特定の実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、配列番号６２、６４〜６７及び７１のいずれかのアミノ酸配列を含む。
開示されているグルカゴンアンタゴニストは、他のグルカゴンアンタゴニストについて以前に記載されているあらゆる使用に適していると考えられる。したがって、本明細書に記載されている修飾グルカゴンペプチドを、高血糖症の治療、又はグルカゴンの高血中レベル若しくは高血中グルコースレベルをもたらす他の代謝疾患の治療に使用することができる。一つの実施態様によると、本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニストを使用して治療される患者は、家畜化された動物であり、別の実施態様では、治療される患者はヒトである。研究は、糖尿病患者におけるグルカゴン抑制の欠如が、部分的にはグリコーゲン分解の促進を介した食後高血糖に寄与することを示唆している。経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）の際の血中グルコースの分析から、ソマトスタチン誘導グルカゴン抑制の存在又は不在にかかわらず、高グルカゴンレベルの被験者においてグルコースの有意な増加が示された。したがって、本発明のグルカゴンアンタゴニストは、高血糖症の治療に使用可能であり、また、Ｉ型真性糖尿病、ＩＩ型真性糖尿病又は妊娠糖尿病（インスリン依存性とインスリン非依存性のいずれかも）を含む多様な種類の糖尿病を治療すること、及び腎障害、網膜症及び血管疾患を含む糖尿病の合併症を低減することに有用であることが予想される。
エキセンディン−４は、３９個までのアミノ酸からなるペプチドである。ＧＬＰ−１として知られている受容体の強力な刺激物質である。このペプチドは、食欲を抑制し、減量を誘導することも報告されている。出願者たちは、エキセンディン−４の末端配列は、グルカゴンのカルボキシ末端へ付加されると、グルカゴンの生体活性を損なうことなく、グルカゴンの可溶性及び安定性を改善することを見出した。一つの実施態様によると、本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニストを、食欲を減退させるため又は体重の減少を促進するための方法として、患者に投与する。一つの実施態様によると、患者は家畜化された動物であり、別の実施態様では、治療される患者はヒトである。一つの実施態様において、エキセンディン−４の末端アミノ酸１０個（すなわち配列番号１９（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）の配列）は、本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニストのカルボキシ末端に結合している。これらの融合タンパク質は、食欲を抑制し、減量／体重維持を誘導する薬理学的活性を有すると予測される。一つの実施態様によると、本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニストは更に修飾されて、配列番号４２のグルカゴンアンタゴニストのアミノ酸２４に結合している配列番号１９（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列を含むことができ、個人に投与して減量を誘導する又は体重維持を援助することができる。より詳細には、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３及び配列番号４４からなる群より選択される配列を含むグルカゴンアンタゴニストであって、アミノ酸２４に配列番号１９（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列が更に結合しているグルカゴンペプチドを、食欲の抑制及び減量／体重維持の誘導に使用する。一つの実施態様において、投与されるグルカゴンアンタゴニストは、配列番号４６又は配列番号４７の配列を含む。
そのような食欲を減退する又は体重の減少を促進する方法は、体重の低減、体重増加の防止、又は、薬剤誘導肥満を含む多様な原因による肥満の治療、並びに、血管疾患（冠動脈疾患、発作、末梢血管疾患、虚血再灌流など）、高血圧、ＩＩ型糖尿病の発症、高脂血症及び筋骨格系疾患などの肥満に関連する合併症の低減に有用であることが予想される。
本発明のグルカゴンペプチドを、単独で又は他の抗糖尿病又は抗肥満剤と組み合わせて投与することができる。当該技術分野において既知であるか又は調査中の抗糖尿病剤には、インスリン；トルブタミド（Orinase）、アセトヘキサミド（Dymelor）、トラザミド（Tolinase）、クロルプロパミド（Diabinese）、グリピジド（Glucotrol）、グリブリド（Diabeta, Micronase, Glynase）、グリメピリド（Amaryl）又はグリクラジド（Diamicron）のようなスルホニル尿素；レパグリニド（Prandin）又はナテグリニド（Starlix）のようなメグリチニド；メトホルミン（Glucophage）又はフェンホルミンのようなビグアナイド；ロシグリタゾン（Avandia）、ピオグリタゾン（Actos）若しくはトログリタゾン（Rezulin）又は他のＰＰＡＲγインヒビターのようなチアゾリジンジオン；ミグリトール（Glyset）、アルカボース（Precose/Glucobay）のような炭水化物の消化を阻害するアルファグルコシダーゼインヒビター；エクセナチド（Byetta）又はプラムリンチド；ビルダグリプチン又はシタグリプチンのようなジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）インヒビター；ＳＧＬＴ（ナトリウム依存性グルコーストランスポーター１）インヒビター；又はＦＢＰａｓｅ（フルクトース１，６−ビスホスファターゼ）インヒビターが含まれる。
当該技術分野において既知であるか又は調査中の抗肥満剤には、フェネチルアミン型刺激薬、フェンテルミン、（更に、フェンフルラミン又はデクスフェンフルラミンも）、ジエチルプロピオン（Tenuate（登録商標））、フェンジメトラジン（Prelu-2（登録商標）、Bontril（登録商標））、ベンズフェタミン（Didrex（登録商標））、シブトラミン（Meridia（登録商標）、Reductil（登録商標））を含む食欲抑制薬；リモナバン（Acomplia（登録商標））、他のカンナビノイド受容体アンタゴニスト；オキシントモジュリン；塩酸フルオキセチン（Prozac）；Qnexa（トピラメート及びフェンテルミン）、Excalia（ブプロピオン及びゾニサミド）又はContrave（ブプロピオン及びナルトレキソン）；或いは、ゼニカル（Orlistat）若しくはCetilistat （ATL-962としても知られている）又はGT 389-255と類似しているリパーゼインヒビター類が含まれる。
本発明のグルカゴンアンタゴニストを、代謝性るいそうを罹患している患者に投与することもできる。癌患者の過半数が、意図されない進行性の減量、衰弱、並びに低体脂肪及び筋肉消失により特徴付けられる、代謝性るいそうを経験していると推定される。この症状は、ＡＩＤＳ患者において同様に一般的であり、細菌及び寄生虫疾患、リウマチ様関節炎、並びに腸、肝臓、肺及び心臓の慢性疾患においても存在しうる。通常、食欲不振に関連し、加齢の状態又は物理的外傷の結果として表れる可能性がある。代謝性るいそうは、生活の質を減少し、基礎状態を悪化させる症状であり、死亡の主な原因である。出願者たちは、本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニストを患者に投与して、代謝性るいそうを治療できると予測する。
本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニストを含む医薬組成物を、標準的な薬学的に許容される担体及び当業者に既知の投与経路を使用して、配合及び投与することができる。したがって、本開示は、本明細書に開示されている１つ以上のグルカゴンアンタゴニストを薬学的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物も包含する。医薬組成物は、グルカゴンアンタゴニストを唯一の薬学的活性成分として含んでもよいし、グルカゴンアンタゴニストを１つ以上の追加的な活性剤と組み合わせてもよい。一つの実施態様によると、本発明のグルカゴンアンタゴニストと、ＧＬＰ−１受容体を活性化する化合物（例えば、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１類縁体、エキセンディン−４類縁体又はそれらの誘導体）とを含む組成物が提供される。一つの実施態様によると、本発明のグルカゴンアンタゴニストと、インスリン又はインスリン類縁体とを含む組成物が提供される。あるいは、配列番号４２の配列を含み、配列番号４２のアミノ酸２４に配列番号１９（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列が更に結合しているペプチドと、抗肥満ペプチドとを含む、減量の誘導又は体重増加の防止のための組成物を提供することができる。適切な抗肥満ペプチドには、米国特許第５，６９１，３０９号、同第６，４３６，４３５号又は米国特許出願第２００５／０１７６６４３号に開示されているものが含まれ、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ（胃抑制ポリペプチド）、ＭＰ１、ＰＹＹ、ＭＣ−４、レプチンが含まれるが、これらに限定されない。
一つの実施態様によると、好ましくは滅菌され、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の純度レベルの、本明細書に開示されている任意の新規グルカゴンペプチドと、薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤とを含む、医薬組成物が提供される。そのような組成物は、少なくとも０．５mg/ml、１mg/ml、２mg/ml、３mg/ml、４mg/ml、５mg/ml、６mg/ml、７mg/ml、８mg/ml、９mg/ml、１０mg/ml、１１mg/ml、１２mg/ml、１３mg/ml、１４mg/ml、１５mg/ml、１６mg/ml、１７mg/ml、１８mg/ml、１９mg/ml、２０mg/ml、２１mg/ml、２２mg/ml、２３mg/ml、２４mg/ml、２５mg/ml、又はそれ以上の濃度で、グルカゴンペプチドを含有することができる。一つの実施態様において、医薬組成物は、滅菌された、更に多様な容器に保存されてもよい、水性液剤を含む。本発明の化合物を一つの実施態様に従って使用して、注射可能な予備処方された液剤を調製することができる。別の実施態様において、医薬組成物は凍結乾燥粉末剤を含む。医薬組成物を、患者に組成物を投与する使い捨て装置を含むキットの一部として更に包装することができる。容器又はキットにラベルを付けて常温又は冷蔵温度で保存することができる。
本明細書に記載されている全ての治療方法、医薬組成物、キット及び他の同様の実施態様は、グルカゴンアンタゴニストという用語の使用にはその薬学的に許容される塩が全て含まれることを考慮する。
グルカゴンアンタゴニストをペグ化することで、アンタゴニストの水溶性を改善することができる。しかし、ＰＥＧ鎖の長さを増大して又は複数のＰＥＧ鎖をペプチドに結合して、結合ＰＥＧの総分子量が５，０００ダルトンを超えると、修飾グルカゴンアンタゴニストの作用時間を遅延し始める。一つの実施態様によると、１つ以上のポリエチレングリコール鎖を含むペプチドであるグルカゴンアンタゴニストが提供され、ここで結合ＰＥＧの総分子量は、５，０００ダルトンを超え、一つの実施態様では、１０，０００ダルトンを超える。そのような修飾グルカゴンアンタゴニストは、活性の時間が遅くなるが、生体活性を失うことはない。したがって、そのような化合物を予防的に投与して、投与グルカゴンアンタゴニストの効果を延ばすことができる。
一つの実施態様において、ペグ化グルカゴンアンタゴニストは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号４３、配列番号４４及び配列番号４５からなる群より選択されるペプチドを含み、ここでペプチドの１１、１６又は１９位のアミノ酸残基の側鎖は１つ以上のポリエチレングリコール鎖に共有結合しており、ＰＥＧ鎖の総分子量は、約１０，０００ダルトンを超える。一つの実施態様において、ＰＥＧ鎖の分子量は、１０，０００超から４０，０００ダルトン以下である。一つの実施態様において、ペグ化グルカゴンアンタゴニストは、配列番号９及び配列番号４３のペプチドを含み、ここでペプチドの１１位のアミノ酸残基は、約１０，０００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有するポリエチレングリコール鎖に共有結合している。一つの実施態様において、ペグ化グルカゴンアンタゴニストは、配列番号１０及び配列番号４４のペプチドを含み、ここでペプチドの１６位のアミノ酸残基は、約１０，０００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有するポリエチレングリコール鎖に共有結合している。一つの実施態様において、ペグ化グルカゴンアンタゴニストは、配列番号１１及び配列番号４５のペプチドを含み、ここでペプチドの１９位のアミノ酸残基は、約１０，０００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有するポリエチレングリコール鎖に共有結合している。別の実施態様において、ペグ化ルカゴンアンタゴニストは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５又は配列番号１６のペプチドを含み、ここで共有結合しているＰＥＧ鎖は、少なくとも約１０，０００ダルトンの分子量を有し、一つの実施態様において、ＰＥＧの分子量は、約２０，０００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される。別の実施態様において、ペグ化グルカゴンアゴニストは、配列番号１２、配列番号１７又は配列番号２２のペプチドを含み、ここでＰＥＧ鎖は１１位及び１９位のアミノ酸残基に共有結合しており、２つのＰＥＧ鎖の合わせた分子量は少なくとも１０，０００ダルトンである。
本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニストを、例えばインスリンを含む他の活性剤と組み合わせて、過剰グルカゴン活性により特徴付けられている疾患又は状態を治療することができる。一つの実施態様において、１０，０００ダルトンを超える分子量を有するＰＥＧ鎖に共有結合するように修飾されたグルカゴンアンタゴニストを、インスリンと一緒に投与して、糖尿病患者の安定した血中グルコースレベルの維持を助けることができる。本開示のグルカゴンアンタゴニストを単一組成物でインスリンと同時投与することもできるし、インスリンとグルカゴンアンタゴニストを別々の液剤として同時に投与するか、あるいは、互いに異なる時間で投与することもできる。一つの実施態様において、インスリンを含む組成物及びグルカゴンアンタゴニストを含む組成物を、互いに１２時間以内に投与する。グルカゴンアンタゴニストと投与されたインスリンの正確な比率は、部分的には患者のグルカゴンレベルを決定することによって決まり、慣用的な実験により決定することができる。
本開示は、本明細書に開示されている修飾グルカゴンアンタゴニストの多量体も包含する。２つ以上の修飾グルカゴンペプチドを、標準的な結合剤及び当業者に既知の手順を使用して一緒に結合することができる。例えば、二量体は、２つの修飾グルカゴンアンタゴニスト、特にシステイン、リシン、オルチニン、ホモシステイン又はアセチルフェニルアラニン残基（例えば、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２）により（例えば、１１、１６又は１９位で）置換されているグルカゴンアンタゴニストから、二官能チオール架橋剤及び二官能アミン架橋剤の使用を介して形成することができる。二量体は、ホモ二量体であることができるか、あるいはヘテロ二量体であることができる。一つの実施態様において、二量体は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号４５、配列番号４６又は配列番号４７からなる群より独立して選択される２つのグルカゴンアンタゴニストから形成され、ここで２つのペプチドは、それぞれのペプチドの１１位、それぞれのペプチドの１６位、若しくはそれぞれのペプチド１９位、又はこれらの任意の組み合わせに結合しているリンカーを介して、互いに結合している。一つの実施態様において、結合は、それぞれのグルカゴンアンタゴニストペプチドのＣｙｓ１１とＣｙｓ１１又はＣｙｓ１９とＣｙｓ１９又はＣｙｓ１１とＣｙｓ１９残基の間のジスルフィド結合である。
同様に、二量体は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４２からなる群より独立して選択される２つのグルカゴンアンタゴニストペプチドから形成することができ、ここで結合は、天然グルカゴンペプチドに対応した１６、２１及び２４位から独立して選択されるアミノ酸位置の間で形成される。
一つの実施態様によると、それぞれ配列番号４６の配列を含む２つのグルカゴンアンタゴニストを含むグルカゴンアンタゴニスト二量体が提供され、ここで２つのアンタゴニストは、アミノ酸の２５位を介してジスルフィド結合により互いに結合している。別の実施態様において、それぞれ配列番号４７の配列を含む２つのグルカゴンアンタゴニストを含むグルカゴンアンタゴニスト二量体が提供され、ここで２つのアンタゴニストは、アミノ酸の３５位を介してジスルフィド結合により互いに結合している。一つの実施態様において、二量体は、配列番号４６と配列番号４７のグルカゴンアンタゴニストから形成され、１０位のアミノ酸はグルタミン酸である。
一つの実施態様において、二量体は、配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４０、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２からなる群より選択されるグルカゴンアンタゴニス融合ペプチドのホモ二量体及びそれらの薬学的に許容される塩を含む。一つの実施態様によると、リンカーを介して第２グルカゴンアンタゴニストに結合している第１グルカゴンアンタゴニスト（ここで、二量体の第１及び第２グルカゴンペプチドは、配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４２からなる群より独立して選択される）を含む二量体と、その薬学的に許容される塩が提供される。別の実施態様において、二量体の第１及び第２グルカゴンペプチドは、配列番号７、配列番号８、配列番号３６及び配列番号３９からなる群より独立して選択される。
別の実施態様において、二量体は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１からなる群より選択されるグルカゴンアンタゴニストのホモ二量体を含む。別の実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト二量体が提供され、ここで二量体の第１及び第２グルカゴンペプチドは、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８からなる群より独立して選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、二量体は、配列番号９、配列番号１１及び配列番号１２からなる群より選択されるグルカゴンアンタゴニストのホモ二量体を含み、ここでグルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドの１１又は１９位に共有結合しているポリエチレングリコール鎖を更に含む。
本発明の修飾グルカゴンペプチドを、一つの実施態様に従って、キットの一部として提供することができる。一つの実施態様において、グルカゴンアゴニストを、それを必要とする患者に投与するキットが提供され、ここでキットは、下記からなる群より選択される修飾グルカゴンアンタゴニストを含む：
１）配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３及び配列番号４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むグルカゴンアンタゴニスト；
２）ＰＥＧ鎖が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号４６及び配列番号４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むグルカゴンアンタゴニストの１１、１２、１５、１６、１９、２４又は３５位に共有結合しており、ＰＥＧ鎖が約５００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、ペグ化グルカゴンアンタゴニスト；
３）配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３及び配列番号４４からなる群より選択されるグルカゴンアンタゴニストを含む融合ペプチドと、前記グルカゴンアンタゴニストの末端アミノ酸に融合している配列番号１９のペプチド、並びに
４）グルカゴンアンタゴニストのカルボキシ末端に結合している配列番号１９（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列を更に含み、共有結合しているＰＥＧ鎖が約５００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する、ペグ化グルカゴンアンタゴニスト。
一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト組成物を患者に投与する装置を有するキットが提供される。キットは、多様な容器、例えばバイアル、チューブ、ボトルなどを更に含むことができる。好ましくは、キットは使用説明書も含む。一つの実施態様によると、キットの装置は、エアゾール・ディスペンサー装置であり、ここで組成物はエアゾール装置内に予め包装されている。別の実施態様において、キットは、シリンジ及び針を含み、一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニスト組成物は、シリンジの中に予め包装されている。
＜アルファ，アルファ二置換アミノ酸の組み込み＞
一つの実施態様によると、グルカゴンペプチドのＣ末端部分（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによるアミノ酸１２〜２９のあたり）に１つ以上のα，α−二置換アミノ酸を（アミノ酸置換又は挿入にいずれかにより）含む、グルカゴンアンタゴニストが提供される。特定の実施態様において、α，α−二置換アミノ酸は、メチル、エチル、プロピル及びｎ−ブチルから選択される同一若しくは異なる基により二置換されている又はシクロオクタン若しくはシクロヘプタンにより二置換されているアミノ酸（例えば、１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸）であるアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）の１つである。幾つかの実施態様において、１６、１７、１８、２０、２１、２４又は２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のうちの１、２、３、４つ又はそれ以上の位置は、α，α−二置換アミノ酸で置換されている。特定の実施態様において、１６、２０、２１又は２４位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のうちの１、２、３つ又は全ての位置は、ＡＩＢで置換されている。特定の態様において、グルカゴンアンタゴニストが１個以上のα，α−二置換アミノ酸、例えばＡＩＢを含む場合、グルカゴンアンタゴニストは、Ｃ末端カルボキシレートを含み、Ｃ末端でアミド化されていない。
＜親水性部分の結合＞
一つの実施態様において、本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニストの可溶性は、ペプチドへの親水性部分の共有結合により増強される。親水性部分を、タンパク質と活性化ポリマー分子との反応に使用される任意の適切な条件下でグルカゴンアンタゴニストに結合することができる。アシル化、還元的アルキル化、マイケル付加、チオールアルキル化又はＰＥＧ部分に対する反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基）と標的化合物に対する反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基）との他の化学選択的結合／連結方法を含む、当該技術分野において既知のあらゆる方法を使用することができる。水溶性ポリマーを１つ以上のタンパク質に結合するのに使用できる活性化基には、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシラン及び５−ピリジルが含まれるが、これらに限定されない。還元的アルキル化によりアンタゴニストペプチドに結合する場合、選択されるポリマーは、重合の程度が制御されるように単一の反応性アルデヒドを有するべきである。例えば、Kinstler et al., Adv. Drug. Delivery Rev. 54: 477-485 (2002); Roberts et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002)及びZalipsky et al., Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182 (1995)を参照すること。
適切な親水性部分には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えば、ＰＯＧ）、ポリオキシエチレン化ソルビトール、ポリオキシエチレン化グルコース、ポリオキシエチレン化グリセロール（ＰＯＧ）、ポリオキシアルキレン、ポリエチレングルコールプロピオンアルデヒド、エチレングルコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−又はアリールオキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリアセタール、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（ベータ−アミノ酸）（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）及び他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、コロン酸又は他の多糖ポリマー、フィコール又はデキストラン、並びにこれらの混合物が含まれる。
親水性部分、例えばポリエチレングリコール鎖は、幾つかの実施態様によると、約５００〜約４，００００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。一つの実施態様において、親水性部分、例えばＰＥＧは、約５００〜約５，０００ダルトン又は約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。別の実施態様において、親水性部分、例えばＰＥＧは、約１０，０００〜約２０，０００ダルトンの分子量を有する。さらに別の例示的な実施態様において、親水性部分、例えばＰＥＧは、約２０，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する。
一つの実施態様において、デキストランが親水性部分として使用される。デキストランは、主にα１−６結合により結合しているグルコースサブユニットの多糖ポリマーである。デキストランは、多くの分子量範囲、例えば約１kDから約１００kDまでの範囲、又は約５、１０、１５若しくは２０kDから約２０、４０、５０、６０、７０、８０若しくは９０kDまでの範囲で入手することができる。
直鎖又は分岐鎖ポリマーが考慮される。得られる結合体の調製物は、実質的に単分散又は多分散であることができ、アンタゴニストペプチド１つあたり約０．５、０．７、１、１．２、１．５又は２つのポリマー部分を有することができる。
一つの実施態様において、親水性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖であり、更に、１、１６、１７、２１、２４、２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の１つ以上、Ｃ末端延長内の位置、例えば３０位、又はＮ若しくはＣ末端のアミノ酸において、アンタゴニストと結合していてもよい。幾つかの実施態様において、その位置の天然アミノ酸は、アンタゴニストへの親水性部分の結合を促進するために、親水性部分との架橋に適した側鎖を有するアミノ酸で置換されている。例示的な実施態様において、その位置の天然アミノ酸は、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン又はアセチル−フェニルアラニン残基で置換されている。他の実施態様において、親水性基を含むように修飾されているアミノ酸が、ペプチドのＮ又はＣ末端に付加される。
＜結合体及び融合＞
本開示は、本発明のグルカゴンアンタゴニストが、結合体部分に結合する、他の結合体も包含し、結合は共有結合を介してでもリンカーを介してでもよい。結合は、共有化学結合、静電気、水素、イオン、ファンデルワールスのような物理力、又は疎水性若しくは親水性相互作用により達成することができる。ビオチン−アビジン、リガンド／受容体、酵素／基質、核酸／核酸結合タンパク質、脂質／脂質結合タンパク質、細胞付着分子パートナー又は互いに親和性を有する任意の結合パートナー若しくはそのフラグメントを含む、多様な非共有結合系を使用することもできる。
アンタゴニストを、アンタゴニストの標的アミノ酸残基と、これらの標的アミノ酸の選択された側鎖又はＮ若しくはＣ末端の残基と反応することができる有機誘導体化剤との反応により、直接共有結合を介して結合体部分に結合することができる。アンタゴニスト又は結合体の反応基には、例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基が含まれる。誘導体化剤には、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介して結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介して結合）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸又は当該技術分野に既知の他の作用物質が含まれる。あるいは、結合体部分を、多糖又はポリペプチド担体のような中間体担体を介してアンタゴニストに間接的に結合することもできる。多糖担体の例にはアミノデキストランが含まれる。適切なポリペプチド担体の例には、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、それらのコポリマー及びこれらのアミノ酸の混合ポリマー、並びに得られる装填担体に望ましい可溶性の特性を付与する他のもの、例えばセリンが挙げられる。
システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸又はクロロアセトアミドのようなα−ハロアセテート（及び対応するアミン）と反応して、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を与える。システイニルン残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、アルファ−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾエート、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、又は、クロロ−７−ニトロベンゾ−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させることによっても誘導体化される。
ヒスチジル残基は、ジエチルピロカーボネートとｐＨ５．５〜７．０で反応させることによって誘導体化されるが、それはこの作用物質がヒスチジル側鎖に比較的特異性があるからである。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用であり、反応は、好ましくは０．１Mカコジル酸ナトリウムによりｐＨ６．０で実施される。
リシニル及びアミノ末端残基は、無水コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応する。これらの作用物質による誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆転する効果を有する。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化するのに適した他の試薬には、メチルピコリンイミデート、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオンのようなイミドエステル及びグリオキシレートとのトランスアミダーゼ触媒反応が含まれる。
アルギニル残基は、１つ又は幾つかの従来の試薬、中でもフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンによる反応で修飾される。アルギニン残基の誘導体化のためには、グアニジン官能基のpKaが高いので、反応をアルカリ条件下で実施する必要がある。更に、これらの試薬は、リシンの基、またアルギニン−イプシロン−アミノ基と反応することができる。
チロシル残基の特定の修飾は、スペクトル標識をチロシル残基に導入するのに特に興味深く、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンによる反応によって行うことができる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンを使用して、Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体がそれぞれ形成される。
カルボニル側基（アスパルチル又はグルタミル）は、Ｒ及びＲ′が異なるアルキル基であるカルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ′）、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応により選択的に修飾される。更に、アスパルチル残基及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換される。
他の修飾としては、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)）、アスパラギン又はグルタミンの脱アミド化、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び／又はＣ末端カルボン酸基のアミド化若しくはエステル化が挙げられる。
別の種類の共有的修飾としては、アンタゴニストへのグリコシドの化学的又は酵素的結合が挙げられる。糖を、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン又はヒドロキシプロリンのような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）チロシン又はトリプトファンのような芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基、に結合することができる。これらの方法は、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０及びAplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
本明細書に記載されているグルカゴンアンタゴニストのいずれかに結合することができる例示的な結合体部分には、異種ペプチド又はポリペプチド（例えば、血漿タンパク質を含む）、標的作用物質、免疫グロブリン又はその一部（例えば、可変部領域、ＣＤＲ若しくはＦｃ領域）、放射性同位体、蛍光体若しくは酵素標識のような診断用標識、水溶性ポリマーを含むポリマー、又は他の治療若しくは診断剤が含まれるが、これらに限定されない。一つの実施態様において、本発明のグルカゴンアンタゴニスト及び血漿タンパク質を含む結合体が提供され、ここで血漿タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、フィブリノゲン及びグロブリンからなる群より選択される。
幾つかの実施態様において、リンカーは、１〜約６０個、又は１〜３０個以上の原子長さ、２〜５個の原子、２〜１０個の原子、５〜１０個の原子又は１０〜２０個の原子長さの原子鎖を含む。幾つかの実施態様において、原子鎖は全て炭素原子である。幾つかの実施態様において、リンカーの主鎖の原子鎖は、Ｃ、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群より選択される。原子鎖及びリンカーは、より可溶性のある結合体をもたらすと予想される可溶性（親水性）に従って選択することができる。幾つかの実施態様において、リンカーは、酵素や他の触媒による分解、又は、標的組織若しくは臓器若しくは細胞において見出される加水分解的条件による切断の対象となる官能基を提供する。幾つかの実施態様において、リンカーの長さは、立体障害の潜在性を低減するのに十分な長さである。リンカーが共有結合又はペプチジル結合であり、結合体がポリペプチドである場合、結合体はその全体が融合タンパク質であることができる。そのようなペプチジルリンカーは任意の長さであることができる。例示的なリンカーは、約１〜５０個のアミノ酸長さ、５〜５０個、３〜５個、５〜１０個、５〜１５個又は１０〜３０個のアミノ酸長さである。そのような融合タンパク質は、代替的には当業者に既知の組み換え遺伝子操作法により産生することもできる。
上記に記述したように、幾つかの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、免疫グロブリン又はその一部分（例えば、可変部領域、ＣＤＲ又はＦｃ領域）に結合、例えば融合している。既知の種類の免疫グロブリン（Ｉｇ）には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭが含まれる。Ｆｃ領域はＩｇ重鎖のＣ末端領域であり、これは、再循環（延長された半減期をもたらす）、抗体依存性細胞仲介細胞障害性（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）のような活性を実施するＦｃ受容体への結合に関与している。
例えば、幾つかの定義によると、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、重鎖のＣｙｓ２２６からＣ末端まで伸びている。「ヒンジ領域」は、一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０まで伸びている（他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、システイン結合に関わるシステインを整列することによりＩｇＧ１配列と整列させることができる）。ＩｇＧのＦｃ領域には２つの定常部ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３が含まれる。ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインは、通常、アミノ酸２３１からアミノ酸３４１まで伸びている。ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、通常、アミノ酸３４２から酸４４７まで伸びている。免疫グロブリン又は免疫グロブリンのフラグメント若しくは領域のアミノ酸番号付けに関する参照は、全て、Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.に基づいている。関連する実施態様において、Ｆｃ領域は、１つ以上の、ＣＨ１以外の免疫グロブリン重鎖の、天然の又は修飾された定常部領域、例えばＩｇＧ及びＩｇＡのＣＨ２及びＣＨ３領域、又はＩｇＥのＣＨ３及びＣＨ４領域を含むことができる。
適切な結合体部分は、ＦｃＲｎ結合部位を含む免疫グロブリン配列の一部を含む。サルベージ受容体であるＦｃＲｎは、免疫グロブリンを再循環して、血液循環に戻すことに関与する。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶構造解析に基づいて記載されている（Burmeister et al. 1994, Nature 372:379）。ＦｃＲｎへのＦｃの主な接触領域は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの接合部に近接している。Ｆｃ−ＦｃＲｎ接触点は、全て単一Ｉｇ重鎖の範囲内である。主な接触部位には、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１及び３１４、並びにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５〜３８７、４２８及び４３３〜４３６が含まれる。
幾つかの結合体部分は、ＦｃγＲ結合部位（１つ又は複数の）を含んでもよいし含まなくてもよい。ＦｃγＲは、ＡＤＣＣ及びＣＤＣに関与する。Ｆｃγｒと直接接触するＦｃ領域内の位置の例は、アミノ酸２３４〜２３９（低ヒンジ領域）、アミノ酸２６５〜２６９（Ｂ／Ｃループ）、アミノ酸２９７〜２９９（Ｃ′／Ｅループ）及びアミノ酸３２７〜３３２（Ｆ／Ｇ）ループである（Sondermann et al., Nature 406: 267-273, 2000）。ＩｇＥの低ヒンジ領域は、ＦｃＲＩ結合にも関わっている（Henry, et al., Biochemistry 36, 15568-15578, 1997）。ＩｇＡ受容体結合に関わる残基は、Lewisらにより記載されている（J Immunol. 175:6694-701, 2005）。ＩｇＥ受容体結合に関わるアミノ酸残基は、Sayers らにより記載されている（J Biol Chem. 279(34):35320-5, 2004）。
アミノ酸修飾を免疫グロブリンのＦｃ領域に行うことができる。そのようなＦｃ領域変異体は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン（残基３４２〜４４７）に少なくとも１つのアミノ酸修飾、及び／又はＦｃ領域のＣＨ２ドメイン（残基２３１〜３４１）に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。ＦｃＲｎに親和性の増加を付与すると考えられる突然変異には、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ及びＮ４３４Ａが含まれる（Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591）。他の突然変異は、ＦｃＲｎの親和性を有意に低減することなく、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及び／又はＦｃγＲＩＩＩＡへのＦｃ領域の結合を低減することができる。例えば、Ａｌａ又は他のアミノ酸によるＦｃ領域の２９７位のＡｓｎの置換は、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位を除去し、Ｆｃ領域の延長された半減期を伴って免疫原性の低減、また、ＦｃγＲへの結合の低減をもたらすことができる（Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591）。ＦｃγＲへの結合を低減する、ＩｇＧ１の２３３〜２３６位でのアミノ酸の修飾が行われた（Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 and Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613）。幾つかの例示的なアミノ酸置換は、米国特許第７，３５５，００８号及び同第７，３８１，４０８号に記載されており、それぞれその全体が参照として本明細書に組み込まれる。
本開示は、第２のペプチド又はポリペプチドがグルカゴンアンタゴニストの末端、例えばカルボキシ末端に融合している、グルカゴン融合ペプチド又はタンパク質も含む。幾つかの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストのカルボキシ末端に付加される第２ペプチドは、グルカゴンアンタゴニストのアミノ酸２９（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）に結合しているＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ、ＫＲＮＲＮＮＩＡ又はＫＲＮＲである。他の実施態様において、第２ペプチドはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳであり、ここでＸは、２０個の通常のアミノ酸、例えばグルタミン酸、アスパラギン酸又はグリシンのうちの１つから選択される。一つの実施態様において、Ｘは、アミノ酸の側鎖に共有結合している親水性部分を更に含むアミノ酸、例えばＣｙｓを表す。そのようなＣ末端延長は、可溶性を改善し、グルカゴン又はＧＬＰ−１活性も改善することができる。幾つかの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストがカルボキシ末端延長を更に含む場合、延長のカルボキシ末端のアミノ酸は、カルボン酸ではなくアミド基又はエステル基で終わる。
幾つかの実施態様において、例えばＣ末端延長を含むグルカゴンアンタゴニストにおいて、２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のトレオニンはグリシンに代えられている。例えば、２９位のトレオニンにグリシン置換を有し、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳのＣ末端延長を含むグルカゴンアンタゴニストは、同じＣ末端延長を含むように修飾された天然グルカゴンよりも、ＧＬＰ−１受容体に対して、４倍も効力がある。このＴ２９Ｇ置換を、本明細書に開示されている他の修飾と一緒に使用して、ＧＬＰ−１受容体に対するグルカゴンアンタゴニストの親和性を増強することができる。
幾つかの実施態様において、アミノ酸がＣ末端に付加されており、付加されるアミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸及びグリシンからなる群より選択される。
本開示は、本明細書に開示されている修飾グルカゴンアンタゴニストの多量体も包含する。２つ以上の修飾グルカゴンアンタゴニストを、標準的な結合剤及び当業者に既知の手順を使用して一緒に結合することができる。例えば、二量体は、２つの修飾グルカゴンアンタゴニスト、特にシステイン、リシン、オルチニン、ホモシステイン又はアセチルフェニルアラニン残基により置換されているグルカゴンアンタゴニストから、二官能チオール架橋剤及び二官能アミン架橋剤の使用を介して形成することができる。
＜アシル化及びアルキル化＞
幾つかの実施態様によると、本明細書に開示されているグルカゴンアンタゴニストは修飾されて、アシル基又はアルキル基を含む。アシル化又はアルキル化は、循環しているグルカゴンアンタゴニストの半減期を増加させることができる。アシル化又はアルキル化は、有利には、グルカゴン及び／若しくはＧＬＰ−１受容体に対して作用の開始を遅延する及び／若しくは作用の持続時間を延長する、並びに／又はＤＰＰ−ＩＶのようなプロテアーゼに対する耐性を改善する、並びに／又は可溶性を改善することができる。幾つかの実施態様において、アシル化グルカゴンアンタゴニストの効力は、非アシル化型のグルカゴンアンタゴニストに匹敵する。グルカゴンアンタゴニストを、親水性部分が結合している同じアミノ酸の位置又は異なるアミノ酸の位置でアシル化又はアルキル化することができる。
幾つかの実施態様において、本発明は、グルカゴンアンタゴニストの１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸に共有結合しているアシル基又はアルキル基を含むように修飾されているグルカゴンアンタゴニストを提供する。グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴンアンタゴニストの１０位のアミノ酸とアシル基又はアルキル基との間にスペーサーを更に含むことができる。幾つかの実施態様において、アシル基は、脂肪酸若しくは胆汁酸又はこれらの塩であり、例えばＣ４０〜Ｃ３０脂肪酸、Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸、コール酸、Ｃ４〜Ｃ３０アルキル、Ｃ８〜Ｃ２４アルキル又は胆汁酸のステロイド部分を含むアルキルである。スペーサーは、アシル又はアルキル基を結合するのに適した反応性基を有する任意の部分である。例示的な実施態様において、スペーサーは、アミノ酸、ジペプチド若しくはトリペプチド、又は親水性二官能スペーサーを含む。幾つかの実施態様において、スペーサーは、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ及びＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨを含むスペーサーからなる群より選択され、ここでｍは、１〜６の任意の整数であり、そしてｎは、２〜１２の任意の整数である。そのようなアシル化又はアルキル化グルカゴンアンタゴニストは、親水性部分を更に含んでもよく、これはポリエチレングリコールであってもよい。前述のグルカゴンアンタゴニストのいずれも、２つのアシル基若しくは２つのアルキル基又はそれらの組み合わせを含むことができる。
アシル化は、グルカゴンアンタゴニスト活性（及び場合によりＧＬＰ−１活性も）が保持される限り、Ｃ末端延長内の位置である１〜２９位のいずれかの位置、又はＣ末端のアミノ酸を含む、グルカゴンアンタゴニスト内の任意の位置で実施することができる。非限定例には、５、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８又は２９（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の位置が挙げられる。アシル基を、グルカゴンアンタゴニストのアミノ基に直接的に又はグルカゴンアンタゴニストのアミノ基にスペーサーを介して間接的に共有結合することができ、ここでスペーサーは、グルカゴンアンタゴニストのアミノ基とアシル基との間に位置している。グルカゴンアンタゴニストを、親水性部分が結合しているのと同じアミノ酸の位置又は異なるアミノ酸の位置でアシル化することができる。非限定例には、グルカゴンアンタゴニストの１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）でのアシル化、及び、Ｃ末端部分における１つ以上の位置、例えばＣ末端延長内の２４、２８若しくは２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）又はＣ末端（例えば、Ｃ末端Ｃｙｓの付加を介する）でのペグ化が挙げられる。
本発明の特定の態様において、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴンアンタゴニストのアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシル又はチオールの直接的なアシル化により修飾されて、アシル基を含む。幾つかの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、アミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル又はチオールを介して、直接アシル化される。幾つかの実施態様において、アシル化は、１０、２０、２４又は２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）においてである。この場合、アシル化グルカゴンアンタゴニストは、配列番号２のアミノ酸配列、又は本明細書に記載されている１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号２の修飾アミノ酸配列であって、１０、２０、２４及び２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の少なくとも１個が修飾されて、側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールを含む任意のアミノ酸となっているアミノ酸配列を含むことができる。本発明の幾つかの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストの直接アシル化は、１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル、又はチオールを介して生じる。
幾つかの実施態様において、側鎖アミンを含むアミノ酸は、式Ｉ：
で示されるアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式Ｉのアミノ酸は、ｎが４（Ｌｙｓ）であるか又はｎが３（Ｏｒｎ）であるアミノ酸である。
他の実施態様において、側鎖ヒドロキシルを含むアミノ酸は、式ＩＩ：
で示されるアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１（Ｓｅｒ）であるアミノ酸である。
さらに別の実施態様において、側鎖チオールを含むアミノ酸は、式ＩＩＩ：
で示されるアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１（Ｃｙｓ）であるアミノ酸である。
本発明の一つの実施態様において、アシル化グルカゴンアンタゴニストは、アンタゴニストとアシル基との間にスペーサーを含む。幾つかの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストはスペーサーと共有結合し、スペーサーはアシル基と共有結合している。幾つかの例示的な実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、スペーサーのアミン、ヒドロキシル又はチオールのアシル化により修飾されてアシル基を含み、ここでスペーサーは、グルカゴンアンタゴニストの１０、２０、２４若しくは２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の側鎖又はＣ末端のアミノ酸に結合している。スペーサーが結合しているアミノ酸は、スペーサーへの結合を可能にする部分を含む任意のアミノ酸であることができる。例えば、側鎖ＮＨ２、−ＯＨ又は−ＣＯＯＨを含むアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕ）が適している。この場合、アシル化グルカゴンアンタゴニストは、配列番号１のアミノ酸配列、又は、本明細書に記載されている１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号１の修飾アミノ酸配列を含んでもよく、ここで、１０、２０、２４及び２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の少なくとも１個が修飾されて、側鎖アミン、ヒドロキシル、又はカルボキシレートを含む任意のアミノ酸となっている。
幾つかの実施態様において、スペーサーは、側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含むアミノ酸であるか又は側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含むアミノ酸を含むジペプチド若しくはトリペプチドである。
アシル化がスペーサーのアミン基を介して生じる場合、アシル化は、アミノ酸のアルファアミン又は側鎖アミンを介して生じることができる。アルファアミンがアシル化される場合、スペーサーアミノ酸は、任意のアミノ酸であることができる。例えば、スペーサーアミノ酸は、疎水性アミノ酸、例えばＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒであることができる。あるいは、スペーサーアミノ酸は、酸性残基、例えばＡｓｐ及びＧｌｕであることができる。スペーサーアミノ酸の側鎖アミンがアシル化される場合、スペーサーアミノ酸は、側鎖アミンを含むアミノ酸、例えば式Ｉのアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ又はＯｒｎ）である。この場合、スペーサーアミノ酸のアルファアミンと側鎖アミンの両方ともアシル化されることが可能であり、それによりグルカゴンアンタゴニストがジアシル化される。本発明の実施態様はそのようなジアシル化分子を含む。
アシル化がスペーサーのヒドロキシル基を介して生じる場合、アミノ酸又はジペプチド若しくはトリペプチドのアミノ酸のうちの１個は、式ＩＩのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＳｅｒである。
アシル化がスペーサーのチオール基を介して生じる場合、アミノ酸又はジペプチド若しくはトリペプチドのアミノ酸のうちの１個は、式ＩＩＩのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＣｙｓである。
一つの実施態様において、スペーサーは、親水性二官能スペーサーを含む。特定の実施態様において、スペーサーは、アミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレートを含む。この場合、スペーサーは、例えばＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨを含むことができ（ここでｍは、１〜６の任意の整数であり、そしてｎは、２〜１２の任意の整数である）、その例として、Peptides International, Inc. (Louisville, KY)により販売されている８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸が挙げられる。
アミン、ヒドロキシル及びチオールを介したペプチドアシル化に適した方法は、当該技術分野において知られている。例えば、実施例１９（アミンを介したアシル化の方法）、Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382 (1996); Shimohigashi and Stammer, lnt J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982);及びPreviero et al., Biochim Biophys Acta 263: 7-13 (1972)（ヒドロキシルを介したアシル化の方法）;並びにSan and Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005)（チオールを介したアシル化の方法）; Bioconjugate Chem. "Chemical Modifications of Proteins: History and Applications" pages 1, 2-12 (1990); Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. "Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity" Vol. 6, No: 2 pp.171-176 (1989)を参照すること。
アシル化グルカゴンアンタゴニストのアシル基は、任意のサイズ、例えば任意の長さの炭素鎖であることができ、直鎖又は分岐鎖であることができる。本発明の幾つかの特定の実施態様において、アシル基は、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸である。例えば、アシル基は、Ｃ４脂肪酸、Ｃ６脂肪酸、Ｃ８脂肪酸、Ｃ１０脂肪酸、Ｃ１２脂肪酸、Ｃ１４脂肪酸、Ｃ１６脂肪酸、Ｃ１８脂肪酸、Ｃ２０脂肪酸、Ｃ２２脂肪酸、Ｃ２４脂肪酸、Ｃ２６脂肪酸、Ｃ２８脂肪酸又はＣ３０脂肪酸のいずれかであることができる。幾つかの実施態様において、アシル基は、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸、例えばＣ１４脂肪酸又はＣ１６脂肪酸である。
別の実施態様において、アシル基は胆汁酸である。胆汁酸は、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸及びコレステロール酸が含まれるが、これらに限定されない任意の適切な胆汁酸であることができる。
本明細書に記載されているアシル化グルカゴンアンタゴニストは更に修飾されて、親水性部分を含むことができる。幾つかの特定の実施態様において、親水性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含むことができる。親水性部分の組み込みは、本明細書に記載されたいずれかの方法のような任意の適切な手段によって達成することができる。この場合、アシル化グルカゴンアンタゴニストは、本明細書に記載されている修飾のいずれかを含む配列番号１を含むことができ、ここで、（ａ）１０、２０、２４及び２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の少なくとも１個のアミノ酸はアシル基を含み、（ｂ）Ｃ末端延長内の位置である１６、１７、２１、２４若しくは２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の少なくとも１個のアミノ酸又はＣ末端のアミノ酸は修飾されて、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ又はＡｃ−Ｐｈｅとなり、アミノ酸の側鎖は、親水性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合している。幾つかの実施態様において、アシル基は、１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）に結合しており、この結合はＣｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ又はＡｃ−Ｐｈｅを含むスペーサーを介してであってもよく、親水性部分は、２４位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のＣｙｓに組み込まれている。
あるいは、アシル化グルカゴンアンタゴニストは、スペーサーを含むことができ、ここでスペーサーは、アシル化され、かつ、修飾もされて親水性部分を含む。適切なスペーサーの非限定例には、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ及びＡｃ−Ｐｈｅからなる群より選択される１個以上のアミノ酸を含むスペーサーが挙げられる。
一つの実施態様によると、グルカゴンアンタゴニストは、循環の半減期を延長する、並びに／又は作用の開始を遅延する及び／若しくは持続時間を延長する、並びに／又はＤＰＰ−ＩＶのようなプロテアーゼに対する耐性を改善する目的で、エステル、エーテル、チオエーテル、アミド又はアルキルアミン結合を介して結合しているアルキル基を含むように修飾される。
アルキル化は、グルカゴンアンタゴニスト活性（及び場合によりＧＬＰ−１活性も）が保持される限り、１〜２９位のいずれかの位置、Ｃ末端延長内、又はＣ末端のアミノ酸を含む、グルカゴンアンタゴニスト内の任意の位置で実施することができる。非限定例には、５、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８又は２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）が挙げられる。アルキル基を、グルカゴンアンタゴニストのアミノ基に直接的に又はグルカゴンアンタゴニストのアミノ基にスペーサーを介して間接的に共有結合することができ、ここでスペーサーは、グルカゴンアンタゴニストのアミノ基とアルキル基との間に位置している。グルカゴンアンタゴニストを、親水性部分が結合している同じアミノ酸の位置又は異なるアミノ酸の位置でアルキル化することができる。非限定例には、グルカゴンアンタゴニストの１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）でのアルキル化、及びＣ末端部分における１つ以上の位置、例えばＣ末端延長内の２４、２８若しくは２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）又はＣ末端（例えば、Ｃ末端Ｃｙｓの付加を介する）でのペグ化が挙げられる。
本発明の特定の態様において、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴンアンタゴニストのアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシル又はチオールの直接的なアルキル化により修飾されて、アルキル基を含む。幾つかの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、アミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル又はチオールを介して直接アルキル化される。幾つかの実施態様において、アルキル化は、１０、２０、２４又は２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）においてである。この場合、アルキル化グルカゴンアンタゴニストは、配列番号２のアミノ酸配列、又は本明細書に記載されている１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号２の修飾アミノ酸配列であって、１０、２０、２４及び２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の少なくとも１個が修飾されて側鎖アミン、ヒドロキシル又はチオールを含む任意のアミノ酸となっているアミノ酸配列を含むことができる。本発明の幾つかの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストの直接アルキル化は、１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル又はチオールを介して生じる。
幾つかの実施態様において、側鎖アミンを含むアミノ酸は、式Ｉのアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式Ｉのアミノ酸は、ｎが４（Ｌｙｓ）であるか又はｎが３（Ｏｒｎ）であるアミノ酸である。
他の実施態様において、側鎖ヒドロキシルを含むアミノ酸は、式ＩＩのアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１（Ｓｅｒ）であるアミノ酸である。
さらに別の実施態様において、側鎖チオールを含むアミノ酸は、式ＩＩＩのアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＩのアミノ酸は、ｎが１（Ｃｙｓ）であるアミノ酸である。
本発明の一つの実施態様において、アルキル化グルカゴンアンタゴニストは、アンタゴニストとアルキル基との間にスペーサーを含む。幾つかの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストはスペーサーと共有結合し、スペーサーはアルキル基と共有結合している。幾つかの例示的な実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、スペーサーのアミン、ヒドロキシル又はチオールのアルキル化により修飾されてアルキル基を含み、ここでスペーサーは、グルカゴンアンタゴニストの１０、２０、２４又は２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の側鎖に結合している。スペーサーが結合しているアミノ酸は、スペーサーへの結合を可能にする部分を含む任意のアミノ酸であることができる。例えば、側鎖ＮＨ２、−ＯＨ又は−ＣＯＯＨを含むアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕ）が適している。この場合、アルキル化グルカゴンアンタゴニストは、配列番号１のアミノ酸配列、又は、本明細書に記載されている１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号１の修飾アミノ酸配列を含んでもよく、ここで、１０、２０、２４及び２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の少なくとも１個が修飾されて、側鎖アミン、ヒドロキシル、又はカルボキシレートを含む任意のアミノ酸となっている。
幾つかの実施態様において、スペーサーは、側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含むアミノ酸であるか、又は側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含むアミノ酸を含むジペプチド若しくはトリペプチドである。
アルキル化がスペーサーのアミン基を介して生じる場合、アルキル化は、アミノ酸のアルファアミン又は側鎖アミンを介して生じることができる。アルファアミンがアルキル化される場合、スペーサーアミノ酸は、任意のアミノ酸であることができる。例えば、スペーサーアミノ酸は、疎水性アミノ酸、例えばＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒであることができる。あるいは、スペーサーアミノ酸は、酸性残基、例えばＡｓｐ及びＧｌｕであることができる。スペーサーアミノ酸の側鎖アミンがアルキル化される場合、スペーサーアミノ酸は、側鎖アミンを含むアミノ酸、例えば式Ｉのアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ又はＯｒｎ）である。この場合、スペーサーアミノ酸のアルファアミンと側鎖アミンの両方ともアルキル化されることが可能であり、それによりグルカゴンアンタゴニストがジアルキル化される。本発明の実施態様はそのようなジアルキル化分子を含む。
アルキル化がスペーサーのヒドロキシル基を介して生じる場合、アミノ酸又はジペプチド若しくはトリペプチドのアミノ酸のうちの１個は、式ＩＩのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＳｅｒである。
アシル化がスペーサーのチオール基を介して生じる場合、アミノ酸又はジペプチド若しくはトリペプチドのアミノ酸のうちの１個は、式ＩＩＩのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＣｙｓである。
一つの実施態様において、スペーサーは、親水性二官能スペーサーを含む。特定の実施態様において、スペーサーは、アミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレートを含む。この場合、スペーサーは、例えばＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨを含むことができ（ここでｍは、１〜６の任意の整数であり、そしてｎは、２〜１２の任意の整数である）、その例として、Peptides International, Inc. (Louisville, KY)により販売されている８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸が挙げられる。
アミン、ヒドロキシル及びチオールを介したペプチドアルキル化に適した方法は、当該技術分野において知られている。例えば、ウィリアムソンエーテル合成を使用して、グルカゴンアンタゴニストとアルキル基との間にエーテル結合を形成することができる。また、ハロゲン化アルキルによるペプチドの求核置換反応は、エステル、エーテル、チオエーテル、アミド又はアルキルアミン結合のいずれかをもたらすことができる。
アルキル化グルカゴンアンタゴニストのアルキル基は、任意のサイズ、例えば任意の長さの炭素鎖であることができ、直鎖又は分岐鎖であることができる。本発明の幾つかの実施態様において、アルキル基は、Ｃ１〜Ｃ３０アルキルである。例えば、アルキル基は、Ｃ４アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ８アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１８アルキル、Ｃ２０アルキル、Ｃ２２アルキル、Ｃ２４アルキル、Ｃ２６アルキル、Ｃ２８アルキル又はＣ３０アルキルのいずれかであることができる。幾つかの実施態様において、アルキル基は、Ｃ８〜Ｃ２０アルキル、例えばＣ１４アルキル又はＣ１６アルキルである。
幾つかの実施態様において、アルキル基は、胆汁酸のステロイド部分、例えば、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸及びコレステロール酸を含む。
本明細書に記載されているアルキル化グルカゴンアンタゴニストは、更に修飾されて、親水性部分を含むことができる。幾つかの特定の実施態様において、親水性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含むことができる。親水性部分の組み込みは、本明細書に記載されたいずれかの方法のような任意の適切な手段によって達成することができる。この場合、アルキル化グルカゴンアンタゴニストは、配列番号１のアミノ酸配列、又は本明細書に記載されているアミノ酸修飾の１つ以上を含む配列番号１のアミノ酸配列を含むことができ、ここで、（ａ）１０、２０、２４及び２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の少なくとも１個のアミノ酸はアルキル基を含み、（ｂ）Ｃ末端延長内の位置である１６、１７、２１、２４若しくは２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の少なくとも１個のアミノ酸又はＣ末端のアミノ酸は修飾されて、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ又はＡｃ−Ｐｈｅとなり、アミノ酸の側鎖は、親水性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合している。幾つかの実施態様において、アルキル基は、１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）に結合しており（結合はＣｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ又はＡｃ−Ｐｈｅを含むスペーサーを介してでもよい）、親水性部分は、２４位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のＣｙｓに組み込まれている。
あるいは、アルキル化グルカゴンアンタゴニストは、スペーサーを含むことができ、ここでスペーサーは、アルキル化され、かつ、修飾もされて親水性部分を含む。適切なスペーサーの非限定例には、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ及びＡｃ−Ｐｈｅからなる群より選択される１個以上のアミノ酸を含むスペーサーが挙げられる。
〔実施例〕
本発明の化合物を、標準的な合成方法、組み換えＤＮＡ技術又はペプチド及び融合タンパク質を調製する他の任意の方法により調製することができる。特定の非天然アミノ酸は標準的な組み換えＤＮＡ技術により発現することができないが、それらを調製する技術は当該技術分野において知られている。非ペプチド部分を含む本発明の化合物を、適用可能であれば、標準的なペプチド化学反応に加えて、標準的な有機化学反応により合成することができる。
一般的合成プロトコール：
グルカゴン類縁体を、改良Applied Biosystem 430 Aペプチド合成機により、０．２mmolのBoc Thr(OBzl)Pam樹脂から出発し、ＨＢＴＵ活性化「Ｆａｓｔ Ｂｏｃ」単一カップリングを使用して合成した。Ｂｏｃアミノ酸及びＨＢＴＵは、Midwest Biotech（Fishers, IN）から得た。使用した側鎖保護基は、Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ｃｙｓ（ｐＭｅＢｚｌ）、Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）、Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｙｒ（２Ｂｒ−Ｚ）及びＴｒｐ（ＣＨＯ）であった。Ｎ末端Ｈｉｓの側鎖保護基はＢｏｃであった。
合成の完了したそれぞれのペプチジル樹脂を、ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンの溶液で処理して、トリプトファンからホルミル基を除去した。液体フッ化水素切断を、ｐ−クレゾール及びジメチルスルフィドの存在下で実施した。切断は、ＨＦ装置（Penninsula Labs）を使用して氷浴で１時間実施した。ＨＦを蒸発させた後、残渣をジエチルエーテルに懸濁し、固体物質を濾過した。ペプチドをそれぞれ３０〜７０mlの酢酸水溶液に抽出し、希釈アリコートをＨＰＬＣ〔Beckman System Gold、０．４６×５cmのZorbax C8、１ml/分、４５Ｃ、２１４nm、Ａ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル、１０分間かけて１０％から８０％Ｂの勾配〕により分析した。
精製を２．２×２５cmのKromasil C18カラムのＦＰＬＣにより実施し、その間、２１４nmのＵＶでモニタリングし、５分毎の画分を収集した。均質画分をまとめ、凍結乾燥して、生成物純度＞９５％を得た。正確な分子量及び純度は、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を使用して確認した。
一般的ペグ化プロトコール：（Ｃｙｓ−マレイミド）
典型的には、グルカゴンＣｙｓ類縁体をリン酸緩衝食塩水（５〜１０mg/ml）に溶解し、０．０１Mエチレンジアミン四酢酸を加える（総容量の１０〜１５％）。過剰（２倍）量のマレイミドメトキシＰＥＧ試薬（Nektar）を加え、反応物を室温で撹拌し、その間、ＨＰＬＣで反応進行をモニタリングする。８〜２４時間後、反応混合物を酸性化し、精製のために０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を使用する分取逆相カラムに装填する。適切な画分をまとめ、凍結乾燥して、所望のペグ化誘導体を得た。
〔実施例１〕
グルカゴンＣｙｓ１７（１−２９）及び同様のモノＣｙｓ類縁体の合成
６０mlの反応容器中の０．２mmolのBoc Thr(OBzl) Pam樹脂（SynChem Inc）及び以下の配列を、ＦａｓｔＢｏｃ ＨＢＴＵ活性化単一カップリングを使用する改良Applied Biosystems 430Aペプチド合成機に入れ、稼働した。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＣＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号３２）
以下の側鎖保護基を使用した：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｃｙｓ（ｐＭｅＢｚｌ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）、Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）、Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｒｐ（ＣＨＯ）及びＴｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）。合成の完了したペプチジル樹脂を２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドで処理して、Ｔｒｐホルミル保護を除去し、次にＨＦ反応容器に移し、真空下で乾燥した。１．０mlのｐ−クレゾール及び０．５mlのジメチルスルフィドを、磁気式撹拌バーと共に加えた。容器をＨＦ装置（Pennisula Labs）に取り付け、ドライアイス／メタノール浴で冷却し、蒸発させ、およそ１０mlの液体フッ化水素を填塞した。反応物を氷浴で１時間撹拌し、次にＨＦを減圧留去した。残渣をエチルエーテルに懸濁し、固体を濾過し、エーテルで洗浄し、ペプチドを５０mlの酢酸水溶液に抽出した。分析ＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml/分、４５Ｃ、２１４nm、Ａ緩衝液は０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂの勾配〕を少量の切断抽出物試料を用いて実施した。残りの抽出物を２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填し、Pharmacia FPLC系を使用してアセトニトリル勾配を実施した。５分毎の画分を収集し、その間、２１４nmのＵＶ（２．０A）でモニタリングした。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル。勾配＝４５０分間かけて３０％Ｂから１００％Ｂ。
最も純粋な生成物（４８−５２）を含有する画分をまとめて冷凍し、凍結乾燥して、３０．１mgを得た。生成物のＨＰＬＣ分析は、＞９０％の純度を示し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、所望の質量の３４２９．７を示した。グルカゴンＣｙｓ２１、グルカゴンＣｙｓ２４及びグルカゴンＣｙｓ２９を同様に調製した。
〔実施例２〕
グルカゴン−Ｃｅｘ及び他のＣ末端延長類縁体の合成
２８５mg（０．２mmol）のメトキシベンズヒドリルアミン樹脂（Midwest Biotech）を６０mlの反応容器に入れ、以下の配列を、ＦａｓｔＢｏｃ ＨＢＴＵ活性化単一カップリングを使用する改良Applied Biosystems 430Aペプチド合成機に入れ、稼働した。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３３）
以下の側鎖保護基を使用した：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｃｙｓ（ｐＭｅＢｚｌ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）、Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）、Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｒｐ（ＣＨＯ）及びＴｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）。合成の完了したペプチジル樹脂を２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドで処理して、Ｔｒｐホルミル保護を除去し、次にＨＦ反応容器に移し、真空下で乾燥した。１．０mlのｐ−クレゾール及び０．５mlのジメチルスルフィドを、磁気式撹拌バーと共に加えた。容器をＨＦ装置（Pennisula Labs）に取り付け、ドライアイス／メタノール浴で冷却し、蒸発させ、およそ１０mlの液体フッ化水素を填塞した。反応物を氷浴で１時間撹拌し、次にＨＦを減圧留去した。残渣をエチルエーテルに懸濁し、固体を濾過し、エーテルで洗浄し、ペプチドを５０mlの酢酸水溶液に抽出した。分析ＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml/分、４５Ｃ、２１４nm、Ａ緩衝液は０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液は０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂの勾配〕を切断抽出物のアリコートで実施した。残りの抽出物を２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填し、Pharmacia FPLC系を溶出に使用してアセトニトリル勾配を実施した。５分毎の画分を収集し、その間、２１４nmのＵＶ（２．０A）でモニタリングした。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル。勾配＝４５０分間かけて３０％Ｂから１００％Ｂ。画分５８〜６５をまとめて冷凍し、凍結乾燥して、１９８．１mgを得た。
生成物のＨＰＬＣ分析は、９５％を超える純度を示した。ＭＡＤＩ質量スペクトル分析は、所望の理論質量の４３１６．７を有する生成物の存在をＣ末端アミドとして示した。オキシントモジュリン及びオキシントモジュリン−ＫＲＮＲを、適切な装填ＰＡＭ樹脂から出発して、Ｃ末端カルボン酸として同様に調製した。
〔実施例３〕
グルカゴンＣｙｓ１７Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
１５．１mgのグルカゴンＣｙｓ１７（１−２９）及び２７．３mgの平均分子量５０００のメトキシポリ（エチレングリコール）マレイミド（ｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００、Nektar Therapeutics）を、３．５mlのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、０．５mlの０．０１Mエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を加えた。反応物を室温で撹拌し、反応の進行をＨＰＬＣ分析〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml/分、４５Ｃ、２１４nm、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂ〕によりモニタリングした。５時間後、反応混合物を２．２×２５cmのKromasil C18分取逆送カラムに装填した。アセトニトリル勾配をPharmacia FPLCにより実施し、その間、２１４nmのＵＶ波長でモニタリングした。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル、勾配＝４５０分間かけて３０％Ｂから１００％Ｂ。生成物に対応する画分をまとめて冷凍し、凍結乾燥して、２５．９mgを得た。
この生成物をＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml/分、４５Ｃ、２１４nm（０．５A）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂ〕により分析し、およそ９０％の純度を示した。ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）質量スペクトル分析は、８７００〜９５００の（ＰＥＧ誘導体に典型的な）広い質量範囲を示した。これは、出発グルカゴンペプチドの質量（３４２９）へのおよそ５，０００原子質量単位の追加を示す。
〔実施例４〕
グルカゴンＣｙｓ２１Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
２１．６mgのグルカゴンＣｙｓ２１（１−２９）及び２４mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００（Nektar Therapeutics）を、３．５mlのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、０．５mlの０．０１Mエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を加えた。反応物を室温で撹拌した。２時間後、更なる１２．７mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００を加えた。８時間後、反応混合物を２．２×２５cmのVydac C18分取逆相カラムに装填し、アセトニトリル勾配を４ml/分のPharmacia FPLCにより実施し、その間、５分毎の画分を収集した。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。勾配＝４５０分間かけて２０％から８０％Ｂ。
表れた生成物に対応する画分をまとめて冷凍し、凍結乾燥して、３４mgを得た。分析ＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml/分、４５Ｃ、２１４nm（０．５A）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂ〕による生成物の分析は、出発グルカゴンペプチドと異なる均質生成物を示した。ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）質量スペクトル分析は、８７００〜９７００の（ＰＥＧ誘導体に典型的な）広い質量範囲を示した。これは、出発グルカゴンペプチドの質量（３４７０）へのおよそ５，０００原子質量単位の追加を示す。
〔実施例５〕
グルカゴンＣｙｓ２４Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
２０．１mgのグルカゴンＣ２４（１−２９）及び３９．５mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００（Nektar Therapeutics）を、３．５mlのＰＢＳに撹拌しながら溶解し、０．５mlの０．０１M ＥＤＴＡを加えた。反応物を室温で７時間撹拌し、次に更なる４０mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００を加えた。およそ１５時間後、反応混合物を、２．２×２５cmのVydac C18分取逆相カラムに装填し、アセトニトリル勾配を、Pharmacia FPLCを使用して実施した。５分毎の画分を収集し、その間、２１４nmのＵＶ（２．０A）でモニタリングした。Ａ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ、勾配＝４５０分間かけて３０％Ｂから１００％Ｂ。生成物に対応する画分をまとめて冷凍し、凍結乾燥して、４５．８mgを得た。ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、最大９１７５．２の典型的なＰＥＧの幅広のシグナルを示し、これはグルカゴンＣ２４（３４５７．８）よりもおよそ５，０００原子質量単位だけ多い。
〔実施例６〕
グルカゴンＣｙｓ２４Ｍａｌ−ＰＥＧ−２０Ｋ
２５．７mgのグルカゴンＣ２４（１−２９）及び４０．７mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−２０Ｋ（Nektar Therapeutics）を、３．５mlのＰＢＳに室温で撹拌しながら溶解し、０．５mlの０．０１M ＥＤＴＡを加えた。６時間後、出発物質と生成物の比率は、ＨＰＬＣにより決定すると、およそ６０：４０であった。更なる２５．１mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−２０Ｋを加え、反応物を更に１６時間撹拌した。生成物比率が有意に改善されなかったので、反応混合物を、２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填し、４５０分かけて３０％Ｂから１００％Ｂへの勾配を使用するPharmacia FPLCにより精製した。Ａ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ、流量＝４ml／分、５分毎の画分を収集し、その間、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。均質な生成物を含有する画分をまとめて冷凍し、凍結乾燥して、２５．７mgを得た。分析ＨＰＬＣにより決定された純度は約９０％であった。ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、２３，０００から２７，０００の広域のピークを示し、これは出発グルカゴンＣ２４（３４５７．８）よりもおよそ２０，０００原子質量単位だけ多い。
〔実施例７〕
グルカゴンＣｙｓ２９Ｍａｌ−ＰＥＧ−５Ｋ
２０．０mgのグルカゴンＣｙｓ２９（１−２９）及び２４．７mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００（Nektar Therapeutics）を、３．５mlのＰＢＳに室温で撹拌しながら溶解し、０．５mlの０．０１M ＥＤＴＡを加えた。４時間後、更なる１５．６mgのｍＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００を加えて、反応の完了を促進した。８時間後、反応混合物を、２．２×２５cmのVydac C18分取逆相カラムに装填し、アセトニトリル勾配を、Pharmacia FPLC系により実施した。５分毎の画分を収集し、その間、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。画分７５〜９７をまとめて冷凍し、凍結乾燥して、ＨＰＬＣにより回収された出発物質（画分５８〜６３）と異なる、４０．０mgの生成物を得た。分析ＨＰＬＣ〔０．４６×５cmのZorbax C8、１ml/分、４５Ｃ、２１４nm（０．５A）、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ、勾配＝１０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂ〕による生成物の分析は、９５％を超える純度を示した。ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、８，０００〜１０，０００（最大９０２５．３）の範囲の質量を有するＰＥＧ成分の存在を示し、これは出発物質（３４８４．８）よりも５，５４０原子質量単位だけ多い。
〔実施例８〕
グルカゴンＣｙｓ２４（２−ブチロラクトン）
２４．７mgのグルカゴンＣｙｓ２４（１−２９）に、４mlの０．０５M重炭酸アンモニウム／５０％アセトニトリル及び５．５ulの２−ブロモ−４−ヒドロキシ酪酸−γ−ラクトンの溶液（アセトニトリル９００ul中１００ul）を加えた。室温で３時間撹拌した後、更なる１０５ulのラクトン溶液を反応溶液に加え、更に１５時間撹拌した。反応混合物を、１０％酢酸水溶液で１０mlに希釈し、２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填した。アセトニトリル勾配（４５０分かけて２０％Ｂから８０％Ｂ）をPharmacia FPLCにより実施し、その間、５分毎の画分を収集し、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。流量＝４ml／分、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。画分７４〜７７をまとめて冷凍し、凍結乾燥して、７．５mgを得た。ＨＰＬＣ分析は、９５％の純度を示し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、３５４０．７の質量又は出発物質よりも８４質量単位多い質量を示した。この結果は、単一ブチロラクトン部分の付加と一致している。
〔実施例９〕
グルカゴンＣｙｓ２４（Ｓ−カルボキシメチル）
１８．１mgのグルカゴンＣｙｓ２４（１−２９）を、９．４mlの０．１Mリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．２）に溶解し、０．６mlのブロモ酢酸溶液（アセトニトリル中１．３mg/ml）を加えた。反応物を室温で撹拌し、反応の進行を分析ＨＰＬＣにより追跡した。１時間後、更なる０．１mlのブロモ酢酸溶液を加えた。反応物を更に６０分間撹拌し、酢酸水溶液で酸性化し、精製のために２．２×２５cmのKromasil C18分取逆相カラムに装填した。アセトニトリル勾配をPharmacia FPLC（流量＝４ml／分）により実施し、その間、５分毎の画分を収集し、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。画分２６〜２９をまとめて冷凍し、凍結乾燥して、数mgの生成物を得た。分析ＨＰＬＣは、９０％の純度を示し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、所望の生成物の質量３５１５を確認した。
〔実施例１０〕
グルカゴンＣｙｓ２４マレイミド，ＰＥＧ−３．４Ｋ−二量体
１６mgのグルカゴンＣｙｓ２４及び１．０２mgのＭａｌ−ＰＥＧ−Ｍａｌ−３４００、平均分子量３４００のポリ（エチレングルコール）−ビス−マレイミド（Nektar Therpeutics）を、３．５ のリン酸緩衝食塩水及び０．５mlの０．０１M ＥＤＴＡに溶解し、反応物を室温で撹拌した。１６時間後、更なる１６mgのグルカゴンＣｙｓ２４を加え、撹拌を続けた。およそ４０時間後、反応混合物をPharmcia PepRPC 16/10カラムに装填し、アセトニトリル勾配をPharmacia FPLCにより実施し、その間、２分毎の画分を収集し、２１４nm（２．０A）のＵＶでモニタリングした。流量＝２ml／分、Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％ＡＣＮ。画分６９〜７４をまとめて冷凍し、凍結乾燥して、１０．４mgを得た。分析ＨＰＬＣは、９０％の純度を示し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、９５００〜１１，０００の範囲の成分を示し、これは所望の二量体と一致する。
〔実施例１１〕
グルカゴン可溶性アッセイ：
グルカゴン（又は類縁体）の溶液（１mg/ml又は３mg/ml）を０．０１NのＨＣｌで調製する。１００ulの原液を、０．０１NのＨＣｌで１mlに希釈し、ＵＶ吸光度（２７６nm）を決定する。残りの原液のｐＨを、２００〜２５０ulの０．１M Ｎａ２ＨＯＰ４（ｐＨ９．２）を使用して、ｐＨ７に調整する。溶液を４℃で一晩放置し、次に遠心分離する。次に１００ulの上澄みを、０．０１NのＨＣｌで１mlに希釈し、ＵＶ吸光度を決定する（２回繰り返す）。
初期吸光度の読み取りを容量の増加で補正し、以下の計算を使用して、溶解率％を確立する。
最終吸光度／初期吸光度×１００＝溶解率％
結果を表１に示し、表中、グルカゴン−Ｃｅｘは、野生型グルカゴン（配列番号１）への配列番号１９のカルボキシ末端の付加を表し、グルカゴン−Ｃｅｘ Ｒ１２は、配列番号４８を表す。
〔実施例１２〕
グルカゴン受容体結合アッセイ
グルカゴン受容体へのペプチドの親和性を、シンチレーション近接アッセイ技術を利用する競争結合アッセイにより測定した。シンチレーション近接アッセイ緩衝液（０．０５Mのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５MのＮａＣｌ、０．１％w/vのウシ血清アルブミン）により調製したペプチドの３倍希釈系列を、０．０５nMの（３−〔１２５Ｉ〕−ヨードチロシル）Ｔｙｒ１０グルカゴン（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）、１ウエルあたり１〜６マイクログラムの、ヒトグルカゴン受容体を過剰発現している細胞から調製した原形質膜画分、及び１mg／ウエルのポリエチレンイミン処理ムギ胚芽凝集素Ａ型シンチレーション近接アッセイビーズ（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）と共に、９６穴白色／透明底プレート（Corning Inc., Acton, MA）の中で混合した。ロータリー振とう器により８００rpmで５分間振とうしてから、プレートを室温で１２時間インキュベートし、次にMicroBetal450液体シンチレーションカウンター（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）で読み取った。試験試料の最高濃度よりも４倍高い濃度の「コールドの」天然リガンドを入れたウエルで非特異的結合（ＮＳＢ）放射能を測定し、競合物質を入れなかったウェルで総結合放射能を検出した。特異的結合の率を以下のように計算した：特異的結合率＝（（結合−ＮＳＢ）／（総結合−ＮＳＢ））×１００。ＩＣ５０値は、Originソフトウェア（OriginLab, Northampton, MA）を使用して決定した。
〔実施例１３〕
機能アッセイ−ｃＡＭＰ合成
ｃＡＭＰを誘導するグルカゴン類縁体の能力を、ホタルルシフェラーゼに基づいたレポーターアッセイにより測定した。グルカゴン受容体又はＧＬＰ−１受容体のいずれかと、ｃＡＭＰ応答配列に結合したルシフェラーゼ遺伝子とを同時形質移入されたＨＥＫ２９３細胞を、０．２５％ウシ増殖血清（HyClone, Logan, UT）が添加されたＤＭＥＭ（Invitrogen, Carlsbad, CA）中で１６時間培養することにより血清を取り除き、次にグルカゴン、ＧＬＰ−１又は新規グルカゴン類縁体のいずれかの希釈系列と共に、９６穴ポリ−Ｄ−リシン被覆「バイオコート」プレート（BD Biosciences, San Jose, CA）中で３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。インキュベーションの終了時に、１００マイクロリットルのLucLiteルミネセンス基質試薬（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）を各ウエルに加えた。プレートを短時間振とうし、暗黒で１０分間インキュベートし、発光をMicroBeta-1450液体シンチレーションカウンター（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）で測定した。有効５０％濃度は、Originソフトウェア（OriginLab, Northampton, MA）を使用して計算した。結果を図３、並びに表２及び３に示す。
＊−実験の数
＊−実験の数
〔実施例１４〕
グルカゴンＣｙｓ−マレイミドＰＥＧ類縁体の安定性アッセイ
各グルカゴン類縁体を水又はＰＢＳに溶解し、初期ＨＰＬＣ分析を実施した。ｐＨを調整した後（４、５、６、７）、試料を３７℃で特定の時間インキュベートし、ＨＰＬＣにより再び分析して、ペプチドの完全性を決定した。特定の目的とするペプチドの濃度を決定し、無傷のまま残っている率を初期分析と比較して計算した。グルカゴンＣｙｓ２１−マレイミドＰＥＧ５κについての結果を図１及び２に示す。
〔実施例１５〕
グルカゴン類縁体
グルカゴンアンタゴニストは以下の一般的な複数の戦略を使用して合成した。
Ｂｏｃ化学戦略による一般的なペプチド合成プロトコール：
グルカゴン類縁体を、改良Applied Biosystem 430Aペプチド合成機により、０．２mmolのＭＢＨＡ樹脂から又はＰａｍ樹脂に結合した第１アミノ酸から出発し、ＨＢＴＵ活性化「Ｆａｓｔ Ｂｏｃ」単一カップリングを使用して合成した。Ｂｏｃアミノ酸及びＨＢＴＵは、Midwest Biotech（Fishers, IN）から得た。使用した側鎖保護基は以下の通りであった：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ｃｙｓ（ｐＭｅＢｚｌ）、Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）、Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｙｒ（２Ｂｒ−Ｚ）及びＴｒｐ（ＣＨＯ）。自動固相合成の後、Ｎ末端の３−フェニル乳酸（ＰＬＡ）（Aldrich, Milwaukee, WI）を、手動で、ＢＥＰＢＴ（３−（ジエトキシ−ホスホリルオキシ）−３Ｈ−ベンゾ〔ｄ〕〔１，２，３〕トリアジン−４−オン、Synchem Inc., Aurora, OH）によりカップリングした。
ペプチド固相合成の後、合成の完了したそれぞれのペプチジル樹脂を２０％ピペラジン／ＤＭＦで処理して、トリプトファンからホルミル基を除去した。液体フッ化水素切断を、ｐ−クレゾール及びジメチルスルフィドの存在下で実施した。切断は、ＨＦ装置（Penninsula Labs）を使用して氷浴で１時間実施した。ＨＦを蒸発させた後、残渣をジエチルエーテルに懸濁し、固体物質を濾過した。ペプチドをそれぞれ３０〜７０mlの酢酸水溶液に抽出し、水で希釈し、凍結乾燥した。粗ペプチドを分析ＨＰＬＣで分析し、ペプチド分子量をＥＳＩ又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により調べた。ペプチドを一般的なＨＰＬＣ精製手順により精製した。
Ｆｍｏｃ化学戦略による一般的なペプチド合成プロトコール：
ペプチドは、カップリング試薬としてＤＩＣ／ＨＯＢＴを使用し、Rink ＭＢＨＡアミド樹脂を用いて又はWang樹脂（Novabiochem, San Diego, CA）に結合した第１アミノ酸を用いて、標準的Ｆｍｏｃ化学を使用するABI 433A自動ペプチド合成機により合成した。自動ペプチド合成の後、３−フェニル乳酸（ＰＬＡ）を、手動で、ＢＥＰＢＴによりカップリングした。Ｎ−Ｆｍｏｃ〔Ｎ−（９−フルオレニル）メトキシカルボニル〕アミノ酸の側鎖保護基は以下の通りであった：Ａｒｇ、Ｐｍｃ；Ａｓｐ、ＯｔＢｕ；Ｃｙｓ、Ｔｒｔ；Ｇｌｎ、Ｔｒｔ；Ｈｉｓ、Ｔｒｔ；Ｌｙｓ、Ｂｏｃ；Ｓｅｒ、ｔＢｕ、Ｔｙｒ、ｔＢｕ；及びＴｒｐ、Ｂｏｃ（Ｐｍｃ＝２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル、ＯｔＢｕ＝tert−ブチルエステル、Ｔｒｔ＝トリチル、Ｂｏｃ＝tert−ブチルオキシカルボニル及びｔＢｕ＝tert−ブチルエステル）。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳＯ３Ｎａ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−ホモＣｙｓ（ＳＯ３Ｎａ）−ＯＨを、システイン酸及びホモシステイン酸含有ペプチドの合成に使用した。ペプチドを、８５％ＴＦＡ、５％フェノール、５％水及び５％チオアニソール（ペプチドがシステインを含有する場合は２．５％ＥＤＴが添加された）を含有する切断カクテルにより樹脂から切断した。粗ペプチドをエーテルに沈殿させ、遠心分離し、凍結乾燥した。ペプチドを分析ＨＰＬＣで分析し、ＥＳＩ又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析法により調べた。ペプチドを一般的なＨＰＬＣ精製手順により精製した。
一般的な分析ＨＰＬＣ手順：
分析ＨＰＬＣは、流量１．０mL／分の勾配溶離及び２１４nmでのモニタリングを用いて、ZORBAX SB-C8カラム（０．４６×５cm、５μm、Agilent）を有するBeckman System GoldＨＰＬＣ系により実施した。勾配は、１０分間の１０％Ｂから８０％Ｂ、次に５分間の１０％Ｂに設定した。緩衝液Ａ＝０．１ＴＦＡ及びＢ＝０．１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル。
一般的な分取ＨＰＬＣ精製手順：
ペプチドは、典型的には、準分取ＨＰＬＣカラム（ZORBAX SB-C8、２１．２×２５０mm、７μm、Agilent）を有する４８６モニター系に接続したWaters 600Eにより、２１４nm又は２３０nMでモニタリングを行いながら精製した。緩衝液Ａ＝０．１ＴＦＡ／１０％アセトニトリル及びＢ＝０．１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル。精製に使用した勾配は、特に示されていない限り、１２ml／分の流量による４０分間の０〜３０％Ｂ、次に３０分間の３０〜５０％Ｂであった。画分を分析ＨＰＬＣで分析し、質量分析法により調べた。９０％を超える純度の画分を収集し、凍結乾燥し、保存した。６０〜９０％の純度の画分をまとめ、凍結乾燥し、再び精製した。
ペグ化グルカゴン類縁体の誘導体を、以下の一般的なＣｙｓ−マレイミド手順に従って調製した。典型的には、グルカゴンＣｙｓ類縁体をリン酸緩衝食塩水（５〜１０mg/ml）に溶解し、０．０１Mエチレンジアミン四酢酸を加える（総容量の１０〜１５％）。過剰（１．５〜２倍）量のマレイミドメトキシＰＥＧ試薬（Nektar, Huntsville, AL）を加え、反応物を室温で撹拌し、その間、ＨＰＬＣで反応進行をモニタリングする。２〜２４時間後、反応混合物を酸性化し、精製のため、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を使用する分取逆相カラムに装填する。適切な画分をまとめ、凍結乾燥して、所望のペグ化誘導体を得た。ＰＢＳ中で低い可溶性を示すペプチドについては、これらペプチドを２５％アセトニトリル水に又は０．１Mトリスを有する４〜６M尿素緩衝液（ｐＨ８．０〜８．５に調整）に溶解し、ＰＥＧ試薬と反応させた。
上記に記載された方法により合成された化合物の特定の実施例を以下に提示する。
Ｆｍｏｃ−ホモＣｙｓ（ＳＯ３Ｎａ）−ＯＨの調製
０．９２ｇ（５mmol）のＬ−ホモシステイン酸（Sigma, St. Louis, MO）及び０．５ｇ（１２．５mmol）のＮａＯＨを、氷浴で冷却した５０mlの水に溶解した。５０mlのジオキサン中の９−フルオレニルメチルスクシンイミジルカーボネート（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１．８６ｇ、５．５mmol）の溶液を一度に加えた。混合物を室温で４時間以上撹拌した。混合物を減圧下で蒸発させ、１００mlの水を加えた。水溶液をエーテルで洗浄し、次にイオン交換カラム（Amberlite IR-120B, H+form; GFS Chemicals, Columbus, OH）の中に通した。水性溶離液を凍結乾燥して、粘性で非晶質のＦｍｏｃ−ホモＣｙｓ（ＳＯ３Ｈ）−ＯＨ（１．６ｇ、３．９５mmol、収率７９．２％）を得た。次に上記の遊離酸を、氷浴中の、０．１６ｇ（４mmol）のＮａＯＨを含有する５０mlの水に加え、凍結乾燥して、量的なＦｍｏｃ−ホモＣｙｓ（ＳＯ３Ｈａ）−ＯＨを得たが、これは更に精製することなくＳＰＰＳに直接使用することができる。非晶質の凍結乾燥Ｆｍｏｃ−ホモＣｙｓ（ＳＯ３Ｈ）−ＯＨをエタノール／酢酸エステル（２：１）から再結晶させて、融点が２１５〜２１８℃及びＥＳＩ−ＭＳが４０４．２〔（Ｍ−Ｈ）＋、酸性形態〕の結晶質固体生成物を得る。
〔ＰＬＡ６，Ｅ９〕グルカゴン（６−２９）アミドの合成
ペプチド配列ＴＳＥＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号５１；〔Ｅ３〕グルカゴン（７−２９））を、最初に、カップリング試薬として０．１mmolのＤＩＣ／ＨＯＢＴを使用して、０．１mmolのRink ＭＢＨＡアミド樹脂を用いる０．１mmolのＦｍｏｃ／ＨＯＢＴ／ＤＣＣ化学プログラムを使用した、ABI 433A自動ペプチド合成機により固相合成した。以下のＦｍｏｃアミノ酸を使用した：Ａｌａ、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｍｅｔ、ＰＬＡ、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）及びＶａｌ。自動合成の後、ペプチジル樹脂を、３フェニル乳酸（８３mg、０．５mmol）及びＤＥＰＢＴ（１５０mg、０．５mmol）と、４mlの５％ＤＩＥＡ／ＤＭＦ中、約２時間手動でカップリングさせて、以下の配列を有するペプチジル樹脂を得た：ＨＯ−ＰＬＡ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＮＨ２（配列番号５０）。
ペプチジル樹脂を、０．５ｇのフェノール、０．５mlの水及び０．５mlのチオアニソールを添加した８．５mlのＴＦＡにより、室温で２時間処理した。ＴＦＡに溶解したペプチドを濾過し、４０mlのエーテルを加えて、ペプチドを沈殿させた。粗ペプチドを遠心分離し、酢酸水溶液に溶解し、凍結乾燥した。粗ペプチド収量は２００〜２５０mgであり、精製した後、収量は、純度９５％のペプチドが２５〜４０mg（総収率１０〜１５％）であった。ペプチドを一般的な分析ＨＰＬＣで分析したところ、７．６６分の保持時間を示し、ＥＳＩ−ＭＳ分析は、ペプチド分子量２９８６．３に相当する所望の質量である２９８６．０を示した。
同様の手順を使用して、分析ＨＰＬＣでの値７．２５分及び計算分子量の２９７３．３に相当するＥＳＩ−ＭＳでの値２９７３．５を有する〔ＰＬＡ６，Ｄ９〕グルカゴン（６−２９）アミド；分析ＨＰＬＣでの値７．４６分及び計算分子量の２９７３．３に相当するＥＳＩ−ＭＳでの値２９７３．０を有する〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｄ２８〕グルカゴン（６−２９）アミド；分析ＨＰＬＣでの値７．２０分及び計算分子量の３００２．３に相当するＥＳＩ−ＭＳでの値３００２．０を有する〔ＰＬＡ６，Ｃ８，Ｅ９〕グルカゴン（６−２９）アミド；分析ＨＰＬＣでの値７．３８分及び計算分子量の３００２．３に相当するＥＳＩ−ＭＳでの値３００２．０を有する〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ１６〕グルカゴン（６−２９）アミド；分析ＨＰＬＣでの値７．３３分及び計算分子量２９６１．３に相当するＥＳＩ−ＭＳでの値２９６１．０を有する〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４〕グルカゴン（６−２９）アミド；分析ＨＰＬＣでの値７．４３分及び計算分子量の２９４７．３に相当するＥＳＩ−ＭＳでの値２９４７．０を有する〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｃ２４〕グルカゴン（６−２９）アミド；分析ＨＰＬＣでの値７．２８分及び計算分子量の３９２４．３に相当するＭＡＬＤＩ−ＭＳでの値３９２５．５を有する〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ４０〕グルカゴン（６−４０）アミド、の各ペプチドを合成した。
〔ｈＣｙｓ（ＳＯ３Ｈ）９〕グルカゴン（６−２９）アミドの合成
ペプチド配列ＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮ（配列番号５１；グルカゴン（１０−２９））を、最初に、カップリング試薬として０．１mmolのＤＩＣ／ＨＯＢＴを使用して、０．１mmolのRink ＭＢＨＡアミド樹脂を用いる０．１mmolのＦｍｏｃ／ＨＯＢＴ／ＤＣＣ化学プログラムを使用した、ABI 433A自動ペプチド合成機により固相合成した。自動合成した後、ペプチジル樹脂を、Ｆｍｏｃ−ホモＣｙｓ（ＳＯ３Ｎａ）−ＯＨ（１３０mg、０．３mmol）、ＨＯＢＴ（４５．２mg、０．３３mol）及びＤＩＣ（５２．０ul、０．３３mol）と、４mlのＤＭＦ中、手動で約２時間カップリングさせた。ニンヒドリン試験の後、半分のペプチジル樹脂（０．０５mmol）を、残りの３つのアミノ酸Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＰｈｅと更に自動的に組み合わせて、以下の配列のペプチジル樹脂を得た：Ｈ２Ｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−ホモＣｙｓ（ＳＯ３Ｈ）−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＮＨ２（配列番号５２）。
以下のＦｍｏｃアミノ酸を使用した：Ａｌａ、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、ホモＣｙｓ（ＳＯ３Ｎａ）、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）及びＶａｌ。
ペプチジル樹脂を、０．５ｇのフェノール、０．５mlの水及び０．５mlのチオアニソールを添加した８．５mlのＴＦＡにより、室温で２時間処理した。ＴＦＡに溶解したペプチジルを濾過し、４０mlのエーテルを加えて、ペプチドを沈殿させた。粗ペプチドを遠心分離し、酢酸水溶液に溶解し、凍結乾燥した。粗ペプチド収量は１００〜１３０mgであり、精製した後、１５〜２０mg（総収率１０〜１５％）のペプチドを純度９５％で得た。ペプチドを一般的な分析ＨＰＬＣで分析したところ、６．７３分の保持時間を示し、ＥＳＩ−ＭＳ分析は、ペプチド分子量３０２１．３に相当する所望質量の３０２１．０を示した。
同様の手順によって、分析ＨＰＬＣでの保持時間６．８２分及び計算分子量の３１２２．４に相当するＥＳＩ−ＭＳでの値３１２２．５を有する〔ｈＣｙｓ（ＳＯ３Ｈ）９〕グルカゴン（５−２９）アミド；分析ＨＰＬＣでの保持時間６．８３分及び計算分子量の３１７９．３に相当するＥＳＩ−ＭＳでの値３１７８．５を有する〔ｈＣｙｓ（ＳＯ３Ｈ）９〕グルカゴン（４−２９）アミド；分析ＨＰＬＣの保持時間６．７９分及び計算分子量の３３９４．７に相当するＥＳＩ−ＭＳでの値３３９４．５を有する〔ｈＣｙｓ（ＳＯ３Ｈ）９〕グルカゴン（２−２９）アミド；分析ＨＰＬＣでの保持時間７．１７分及び計算分子量の３０２２．３に相当するＥＳＩ−ＭＳでの値３０２２．０を有する〔ＰＬＡ６，ｈＣｙｓ（ＳＯ３Ｈ）９〕グルカゴン（６−２９）アミド、を合成した。
〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４（１．２Ｋ）〕グルカゴン（６−２９）アミドの合成
２０mg（０．００６７５mmol）の〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４〕グルカゴン（６−２９）アミド及び１２．５mg（０．０１mmol）のｍ−ｄＰＥＧＴＭ２４−ＭＡＬ（分子量１２３９、Quanta biodesign Ltd. Powell, OH）を、９mlの２５％アセトニトリル水及び１mlの１Mトリス塩基緩衝液（ｐＨ８．０〜８．５に調整）に溶解した。反応物を室温で撹拌し、反応の進行を分析ＨＰＬＣによりモニターした。ＨＰＬＣにより初期生成物が何も検出されなかった後（約２時間後）、反応混合物を分取ＨＰＬＣにより直接精製した。
凍結乾燥した後、分析ＨＰＬＣの分析が７．４８分の保持時間を示し、計算〔Ｍ＋Ｈ２Ｏ〕の４２１８．０に相当するＥＳＩ−ＭＳの４２１８．５を示した、約１０〜１２mgの〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４（１．２Ｋ）〕グルカゴン（６−２９）アミドを得た。
同様の手順を使用して、分析ＨＰＬＣの分析が７．２５分の保持時間を示し、ＥＳＩ−ＭＳが計算分子量の４３２７．８に相当する４３２７．５を示す〔Ｃ５（１．２Ｋ），Ｅ９〕グルカゴン（５−２９）アミド；分析ＨＰＬＣの分析が７．２５分の保持時間を示し、ＥＳＩ−ＭＳが計算〔Ｍ＋Ｈ２Ｏ〕の４２５９．０に相当する４２６０．０を示す〔Ｃ８（１．２Ｋ），Ｅ９〕グルカゴン（６−２９）アミドを合成した。
〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４（２０Ｋ）〕グルカゴン（６−２９）アミドの合成
１５mg（０．００５mmol）の〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４〕グルカゴン（６−２９）アミド及び１４０mg（０．００６mmol）の２０Ｋ ｍ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（分子量約２２Ｋ、Nektar, Huntsville, AL）を、９mlの２５％アセトニトリル水及び１mlの１Mトリス塩基緩衝液（ｐＨ８．０〜８．５に調整）に溶解した。反応物を室温で撹拌し、反応の進行を分析ＨＰＬＣにより追跡した。ＨＰＬＣにより初期生成物が何も検出されなかった後（約６時間後）、反応混合物を分取ＨＰＬＣにより直接精製した。画分を、２１４nmの分析ＨＰＬＣにより調べ、また、２８０nmのＵＶで測定した。９０％のＨＰＬＣ純度を有し、ＵＶ測定による高吸光度（Ａ２８０nm＝１．０〜２．０）も有する画分をまとめ、凍結乾燥した。分析ＨＰＬＣの分析が８．５〜８．６分の保持時間を示し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳが２４Ｋ〜２６Ｋの広域質量分析を示す、約６０〜８０mgの〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４（２０Ｋ）〕グルカゴン（６−２９）アミドを得た。
同様の手順を使用して、〔ＰＬＡ６，Ｃ８（２０Ｋ），Ｅ９〕グルカゴン（６−２９）アミド、〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ１６（２０Ｋ）〕グルカゴン（６−２９）アミド、〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ４０（２０Ｋ）〕グルカゴン（６−４０）アミド、〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｃ１６（２０Ｋ）〕グルカゴン（６−２９）アミド及び〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｃ２４（２０Ｋ）〕グルカゴン（６−２９）アミドを合成した。
〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４（４０Ｋ）〕グルカゴン（６−２９）アミドの合成
１５mg（０．００５mmol）の〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４〕グルカゴン（６−２９）アミド及び２４０mg（０．００６mmol）の４０Ｋ ｍ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（分子量約４０Ｋ、Chirotech Technology Ltd., Cambs CB4 OWG, Germany）を、１８mlの２５％アセトニトリル水及び２mlの１Mトリス塩基緩衝液（ｐＨ８．０〜８．５に調整）に溶解した。反応物を室温で撹拌し、反応の進行を分析ＨＰＬＣによりモニターした。ＨＰＬＣにより初期生成物が何も検出されなかった後（約６時間後）、反応混合物を分取ＨＰＬＣにより直接精製した。画分を、２１４nmの分析ＨＰＬＣにより調べ、また、２８０nmのＵＶで測定した。９０％のＨＰＬＣ純度を有し、ＵＶ測定による高吸光度（Ａ２８０nm＝１．０〜２．０）も有する画分をまとめ、凍結乾燥した。分析ＨＰＬＣの分析が８．６０〜８．８分の保持時間を示す、約１００〜１２０mgの〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４（４０Ｋ）〕グルカゴン（６−２９）アミドを得ることができる。
同様の手順を使用して、〔ＰＬＡ６，Ｃ８（４０Ｋ），Ｅ９〕グルカゴン（６−２９）アミド、〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ１６（４０Ｋ）〕グルカゴン（６−２９）アミド、〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ４０（４０Ｋ）〕グルカゴン（６−４０）アミド、〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｃ１６（４０Ｋ）〕グルカゴン（６−２９）アミド及び〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｃ２４（４０Ｋ）〕グルカゴン（６−２９）アミドを合成した。
二量体〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４〕グルカゴン（６−２９）アミドの合成
２０mg（０．００６７５mmol）の〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４〕グルカゴン（６−２９）アミドを６mlのＰＢＳ緩衝液、１mlの１Mトリス塩基（ｐＨ８．０〜８．５に調整）及び３mlのＤＭＳＯに溶解した。反応混合物を開放容器中で撹拌し、分析ＨＰＬＣにより２時間毎にモニターした。初期生成物（ＨＰＬＣでのＲＴが７．４分）が無くなった後、そして二量体生成物（ＨＰＬＣでのＲＴが７．４分）が生成物において優勢になった後（１２時間後）、混合物を０．１％ＴＦＡ １０％アセトニトリル水で希釈し、分取ＨＰＬＣにより直接精製した。凍結乾燥した後、計算分子量の５９２０．６に相当するＥＳＩ−ＭＳでの値５９２０．０を有する、約６〜８mgの二量体〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４〕グルカゴン（６−２９）アミドを得た。
同様の手順を使用して、計算分子量の５９１６．６に相当するＥＳＩ−ＭＳでの値５９１６．０を有する二量体〔Ｃ９〕グルカゴン（６−２９）アミド、及び計算分子量の６１７４．８に相当するＥＳＩ−ＭＳでの値６１７４．０を有する二量体〔Ｃ５，Ｅ９〕グルカゴン（５−２９）アミドを合成した。
〔実施例１６〕
グルカゴン類縁体のアンタゴニスト活性
グルカゴン及び多様なグルカゴン誘導体インヒビターについて、受容体結合、ｃＡＭＰ誘導及びｃＡＭＰ阻害を比較した。受容体結合、ｃＡＭＰ誘導及びｃＡＭＰ阻害を測定するアッセイは、実質的に実施例１２及び１３にそれぞれ開示されているアッセイ系を使用して実施した。
グルカゴンアンタゴニスト活性を示す特定のグルカゴン類縁体を調製した。そのような化合物は、天然のＮ末端残基を有さず、天然グルカゴンでの９位にグルタミン酸置換を有する点において、天然グルカゴンと異なっている。表４は、幾つかの特定のグルカゴン類縁体アンタゴニストのグルカゴン受容体親和性及びアンタゴニスト活性を提示する。
Ｇｌｕ９は、天然グルカゴンの番号付けによる９位のグルタミン酸である。
表５のデータが示すように、一連のｈＣｙｓ９に基づいたアンタゴニストは、以前に報告されたＧｌｕ９に基づいたアンタゴニストと同等な効力又は選択性を発揮しない。化合物５Ｂ及び６Ｂは、いくらかのアンタゴニスト作用レベルを示すが、アゴニストとしての有効容量の３倍高い濃度においてのみ示す。しかし、Ｎ末端の複数のアミノ酸（天然グルカゴンの１位のアミノ酸に加えて）が除去されると、ｈＣｙｓ９に基づいたグルカゴンアンタゴニストの効力は増強される（表８を参照すること）。
＊アンタゴニストではない
上付きの数字により示されているものは、天然グルカゴンの番号付けによるアミノ酸位置である。
第１アミノ酸の切断及び９位（天然グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の置換により修飾されたグルカゴン及びグルカゴンペプチドのグルカゴン受容体親和性を、実質的に実施例１２に記載されたとおりに分析した。結果を表６に示す。
＊ＥＣ５０（nM）
ｈＧｌｕ＝ホモグルタミン酸
上付きの数字により示されているものは、天然グルカゴンの番号付けによるアミノ酸位置である。
Ｇｌｕ、ｈＧｌｕ、ＣＳＡ−１、ＣＳＡ−２及びβ−ｈＧｌｕにより９位で修飾されたペプチドを含む、試験された修飾グルカゴンに基づいたペプチドのうちの幾つかは、強力なグルカゴンアンタゴニスト活性を示した。
９位に修飾アミノ酸を含み、Ｎ末端切断と異なる延長を有するグルカゴンペプチドを、グルカゴンアンタゴニスト活性について分析した。試験したペプチドの結果を表７に示す。
上付きの数字により示されているものは、天然グルカゴンの番号付けによるアミノ酸位置である。
ａデータは、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＴＤである。
ｂｐＡ２、１単位のアゴニストの反応を０．５単位のアゴニストにより得られた反応にまで低減する、アンタゴニスト濃度の負の対数。データは、少なくとも２回の重複実験の平均±ＳＴＤである。
ｃ（Ｉ／Ａ）５０、阻害指数、添加された一定のグルカゴン（０．１〜０．２nM）に対するインヒビターのＩＣ５０比。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均であり、ＥＣ５０により規準化される。
ｄＮＡ、完全なアンタゴニストではない。
ｅＮＤ、検出されず。
図３は、Ｎ末端が１、３又は５個のアミノ酸の除去により更に短縮されているグルカゴンアンタゴニストの結合親和性を測定したデータを表す。より詳細には、ｈＣｙｓ９に基づいたグルカゴンアンタゴニストの結合親和性を、グルカゴン受容体への結合をＩ１２５標識グルカゴンと競争する能力について測定することによって調査した。結果は、第１残基の除去は親和性を低減するが、更なる除去は親和性を僅かしか変えず、依然としてナノモル親和性のリガンドを生じることを示している。図４は、ｃＡＭＰバイオアッセイにおいてグルカゴン作用を抑制する選択されたアンタゴニストの能力を示すデータを表す。驚くべきことに、５−２９ ｈＣｙｓ９に基づいたグルカゴンアンタゴニストは、文献における標準的なＧｌｕ９ ２−２９又はＬｅｕ４，Ｇｌｕ９ ４−２９よりも強力であり効果的であることが見出された。更に、５−２９又は６−２９ ｈＣｙｓ９類縁体は、測定されうるアゴニスト活性のない純粋に強力なアンタゴニスト作用を示した。
表８は、幾つかのホモシステイン酸修飾切断グルカゴンフラグメント類縁体のグルカゴン受容体親和性及びアンタゴニスト活性を提示する。ｄｅｓＨｉｓ１に基づいたｈＣｙｓ（ＳＯ３Ｈ）９に基づいたアンタゴニストは、以前に報告されたＧｌｕ９に基づいたアンタゴニスト〔ｄｅｓＨｉｓ１，Ｇｌｕ９〕グルカゴンペプチドと同等の効力を発揮する。３、４又は５個のアミノ酸の除去により更に短縮されたｈＣｙｓ（ＳＯ３Ｈ）９に基づいたグルカゴンアンタゴニストを研究した。受容体結合の結果は、第１残基の除去はグルカゴン受容体への化合物の親和性を低減するが、更なる除去は親和性を僅かしか変えず、依然としてナノモル親和性のリガンドを生じることを示している。
上付きの数字により示されているものは、天然グルカゴンの番号付けによるアミノ酸位置である。
図５Ａ及び５Ｂに表されたデータにより示されているように、４−２９、５−２９及び６−２９ ｈＣｙｓ（ＳＯ３Ｈ）９に基づいたペプチドは、驚くべきことに、全てグルカゴン作用の完全なアンタゴニストであり、一方、２−２９ペプチドは、グルカゴン活性を完全に抑制するには有効性が著しく低かった。図５Ａは、グルカゴン作用を完全に抑制することが２−２９ペプチドでは無力であるのは、これらの２つのペプチドがそれぞれ維持する残留グルカゴン作用の機能によるものであることを示している。
６−２９短縮グルカゴンアミド主鎖において通常６位に生じるフェニルアラニンをフェニル−乳酸（ＰＬＡ）で置換した、グルカゴンの特定の類縁体も開発した。ＰＬＡはフェニルアラニン（Ｐｈｅ）と等電子であるが、滴定可能な水素を有さない。表９及び１０に表されたデータは、ＰＬＡ６置換によって、天然Ａｓｐ９類縁体が純粋なアンタゴニスト作用を示すが、効力はＧｌｕ９及びｈＣｙｓ（ＳＯ３Ｈ）９類縁体よりも低減していることを示している。文献は、以前は、グルカゴン（２−２９）類縁体の高い親和性及び強力なアンタゴニスト作用のためには天然Ａｓｐ９残基がＧｌｕ９又はｈＣｙｓ（ＳＯ３Ｈ）９に変わる必要があると指摘していた。したがって、６−２９短縮グルカゴンアミド主鎖におけるＰｈｅのＰＬＡによる置換が、類縁体の相対的アンタゴニスト効力をＧｌｕ９及びｈＣｙｓ（ＳＯ３Ｈ）９類縁体と同程度にまで改善するのは、驚くべきことである。より詳細には、ＰＬＡ６類縁体は、天然Ｐｈｅ６類縁体と比べて、グルカゴン受容体への類縁体の親和性を３倍増加させるとともに、アンタゴニスト作用の効力も増加させる。
上付きの数字により示されているものは、天然グルカゴンの番号付けによるアミノ酸位置である。
上付きの数字により示されているものは、天然グルカゴンの番号付けによるアミノ酸位置である。
４及び５位を含むグルカゴン類縁体の異なる位置でのＰＬＡ置換の効果も調査した。表１１及び図８に表したデータは、ＰＬＡ６類縁体が、僅かに延長されたペプチドよりも明白に強力なアンタゴニストであることを示している。図８に表された結果は、ヒドロキシ基のアシル化がＰＬＡ６類縁体の効力に影響を与えないことも示している。
ＮＤ：検出されず
上付きの数字により示されているものは、天然グルカゴンの番号付けによるアミノ酸位置である。
表１２に表したデータは、ＰＬＡ６置換がペプチドを効力を増加させるばかりでなく、ペグ化において重要な役割も果たすことを示している。ＰＬＡ６類縁体を、グルカゴンアゴニスト作用を回復することなく選択的にペグ化することができる。天然Ｐｈｅ６類縁体は、驚くべきことに、ペグ化されるとアゴニスト作用の回復を示す。しかし、このアゴニスト作用の回復は、ＰＬＡ６ペプチド類縁体では観察されない。８、１１及び２４位（天然グルカゴンペプチドによる）のアミノ酸を含む幾つかの特定のペグ化部位を検査した。ＰＬＡ６類縁体の２４位でのペグ化は、最も強力で選択的なグルカゴンアンタゴニスト作用を示す。
〔実施例１７〕
本明細書に記載されているグルカゴンアンタゴニストを以下のようにアシル化する。
アシル化及び／又はペグ化ペプチドを以下のように調製する。ペプチドは、CS Bio 4886ペプチド合成機又はApplied Biosystems 430Aペプチド合成機のいずれかを使用して、固体支持樹脂上に合成する。Schnolzer et al., Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180-193（1992）に記載されているin situ中和化学を使用する。アシル化ペプチドの場合は、アシル化される標的アミノ酸残基（例えば、１０位）をＮε−ＦＭＯＣリシン残基で置換する。ＤＭＦ中の２０％ピペリジンによる完全Ｎ末端ＢＯＣ保護ペプチドの３０分間の処理によって、ＦＭＯＣ／ホルミル基を除去する。遊離ε−アミノＬｙｓ残基へのカップリングは、ＦＭＯＣ保護スペーサーアミノ基（例えば、ＦＭＯＣ−（Ｎ−ＢＯＣ）−トリプトファン−ＯＨ）又はアシル鎖（例えば、Ｃ１７−ＣＯＯＨ）のいずれかの１０倍モル過剰と、ＤＭＦ／ＤＩＥＡ中のＰｙＢＯＰ又はＤＥＰＢＴカップリング試薬とのカップリングにより達成される。その後のスペーサーアミノ酸のＦＭＯＣ基の除去に続いて、アシル鎖とのカップリングが繰り返される。１００％ＴＦＡによる最終処理は、あらゆる側鎖保護基及びＮ末端ＢＯＣ基の除去をもたらす。ペプチド樹脂を、５％ＤＩＥＡ／ＤＭＦで中和し、乾燥し、次にＨＦ／ｐ−クレゾール９５：５を０℃で１時間使用して支持体から切断する。エーテル抽出の後、５％ＨＯＡｃ溶液を使用して粗ペプチドを溶媒和する。次に溶液の試料を、正しい分子量のペプチドを含有しているかについてＥＳＩ−ＭＳにより確認する。正しいペプチドを、１００％ＣＨ３ＣＮ中の１０％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡから０．１％ＴＦＡの直線勾配を使用してＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。Vydac C18の２２mm×２５０mmタンパク質カラムを精製に使用する。アシル化ペプチド類縁体は、一般に、緩衝液比率の２０：８０で完全に溶離する。一部を一緒にプールし、分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより純度を調べる。純粋な画分を凍結乾燥して、白色の固体ペプチドを得る。
ペプチドのペグ化の場合は、４０kDaのメトキシポリ（エチレングルコール）マレイミド−プロピオンアミド（Chirotech Technology Ltd.）を、ペプチドとＰＥＧの両方を溶解して透明な溶液にするのに必要な最小量の溶媒（一般に、２〜３mgのペプチドを使用する反応において２mL未満）を使用して、７Mの尿素、５０mMのトリス−ＨＣｌ緩衝液中のモル当量のペプチドと反応させる。室温での激しい撹拌を開始して４〜６時間行い、反応物を分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析する。ペグ化生成物は、保持時間が減少しているので出発物質と異なっていると思われる。精製は、初期ペプチド精製に使用した条件と同じ条件のVydac C4カラムにより実施する。溶離は、緩衝液比率が５０：５０のあたりで生じる。純粋なペグ化ペプチドの画分が見出され、凍結乾燥する。
〔実施例１８〕
グルカゴンに基づいたデプシペプチド〔Ｔｈｒ５−Ｏ−ＰＬＡ６，Ｅ９〕グルカゴン（２−２９）アミド及び〔Ｔｈｒ５−Ｏ−ＰＬＡ６，Ｅ９〕グルカゴン（１−２９）アミドの合成を以下のように実施した。
ペプチド配列ＨＯ−ＰＬＡ−ＴＳＥＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ〔ＰＬＡ６，Ｅ９〕グルカゴン（６−２９）（配列番号７１）は、０．２mmolのＭＢＨＡアミド樹脂を用い、カップリング試薬としてＤＥＰＢＴを用いるABI 430A自動ペプチド合成機を使用した固相Ｂｏｃ化学により合成した。以下のＢｏｃアミノ酸を使用した：Ａｌａ、Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｘ）、Ｇｌｎ（Ｘａｎ）、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）、Ｍｅｔ、ＰＬＡ、Ｓｅｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｒｐ（ＨＯＣ）、Ｔｙｒ（２，６−ジ−Ｃｌ−Ｂｚｌ）及びＶａｌ。このペプチドに、ＤＣＭ中のＢｏｃ−Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ（２mmol）／ＤＩＣ（１mmol）／ＤＭＡＰ（０．２mmol）から構成される事前活性化対称無水物の溶液を用いて、約１６時間手動でカップリングすることによって、樹脂上にデプシペプチド（エステル結合）を形成した。残りのアミノ酸を標準的Ｂｏｃ化学によりカップリングして、以下の配列のデプシペプチジル樹脂を得た：Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｏ−ＰＬＡ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＮＨ２（配列番号６４）。
ペプチジル樹脂を液体フッ化水素で処理して、固体支持体から粗ペプチドを切断し、全ての保護基を除去した。デペシペプチドを、分取ＨＰＬＣにより精製し、ＭＳ及び分析ＨＰＬＣにより分析した。純粋なペプチドは、分析クロマトグラフィーにおいて単一ピークを示し、ＥＳＩ−ＭＳ分析において計算分子量の３３５９．６ダルトンに相当する所望の質量である３３５９．０を生じた。
同様の手順を使用して、Ｎ末端ヒスチジン残基の単一付加カップリングにより、デペシペプチド〔Ｔｈｒ５−Ｏ−ＰＬＡ６，Ｅ９〕グルカゴン（１−２９）アミド（配列番号６５）を合成した。純粋なペプチドは、分析クロマトグラフィーにより単一ピークを示し、ＥＳＩ−ＭＳ分析により計算分子量の３４９６．８ダルトンに相当する所望の質量の３４９５．９を生じた。
〔実施例１９〕
以下のペプチドを上記に一般的に記載されたように合成し、続いて、実施例１３に一般的に記載されているように、ヒトＧＬＰ−１受容体を発現する細胞からのｃＡＭＰ放出をアッセイすることにより、ＧＬＰ−１受容体を刺激する能力について試験し、また、ヒトグルカゴン受容体を発現して０．５nMのグルカゴンにより刺激された細胞からのｃＡＭＰ放出をアッセイすることによって、グルカゴン受容体を刺激する能力について試験した。アッセイの結果を表１３に示す。
（Ｏ＊）はデプシペプチド結合を表す。

Claims (16)

  1. 一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを有するグルカゴンアンタゴニストであって、
    Ａが、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選択され：
    （ｉ）フェニル乳酸（ＰＬＡ）；
    （ｉｉ）ＰＬＡのオキシ誘導体；
    （ｉｉｉ）連続した２個のアミノ酸がエステル又はエーテル結合を介して結合しているアミノ酸２〜６個のペプチド；
    Ｂが、配列番号１のアミノ酸ｉ−２６を表し、又は、Ｂが、下記（ｉｖ）〜（ｉｘ）からなる群より選択される、１つ以上のアミノ酸修飾を有する、配列番号１のアミノ酸ｉ−２６を表し（ここでｉは、３、４、５、６又は７であり）：
    （ｉｖ）Ｇｌｕ、Ｃｙｓのスルホン酸誘導体、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、又は下記構造：
    〔ここで、Ｘ5は、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ2〜Ｃ4アルケニル若しくはＣ2〜Ｃ4アルキニルである〕
    を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体による、９位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のＡｓｐの置換；
    （ｖ）エステル、エーテル、チオエーテル、アミド又はアルキルアミン結合を介してアシル又はアルキル基に共有結合しているアミノ酸による、１０、２０及び２４位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のうちの１又は２個のアミノ酸の置換；
    （ｖｉ）Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルチニン、ホモシステイン及びアセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群より選択されるアミノ酸による、１６、１７、２０、２１及び２４位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のうちの１又は２個のアミノ酸の置換（ここで前記群のアミノ酸は親水性部分に共有結合している）；
    （ｖｉｉ）システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、及びホモシステイン酸による１５位（配列番号１の番号付けによる）のＡｓｐの置換；
    （ｖｉｉｉ）システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸による１６位（配列番号１の番号付けによる）のＳｅｒの置換；
    （ｉｘ）配列番号１のアミノ酸番号付けによる１６、２０、２１及び２４位のうちの１つ以上の位置でのＡＩＢによる置換；
    そして
    Ｃが、下記（ｘ）〜（ｘｉｖ）からなる群より選択され：
    （ｘ）Ｘ；
    （ｘｉ）Ｘ−Ｙ；
    （ｘｉｉ）Ｘ−Ｙ−Ｚ；
    （ｘｉｉｉ）Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１０
    （ここでＸは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はＮｌｅであり；Ｙは、Ａｓｎ又は荷電アミノ酸であり；Ｚは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）、ホモシステイン、アセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）又は荷電アミノ酸であり、Ｒ１０は、配列番号１９〜２１及び５３からなる群より選択される）；並びに、
    （ｘｉｖ）Ｃ末端カルボキシレートがアミドで置換されている（ｘ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれかである、グルカゴンアンタゴニスト。
  2. 請求項１記載のグルカゴンアンタゴニストであって、
    Ａ． 前記ＰＬＡのオキシ誘導体は、エステル結合又はエーテル結合を介してアミノ酸、ペプチド、親水性ポリマー、アシル基又はアルキル基と結合しているＰＬＡ、
    Ｂ． 前記（ｉｉｉ）のペプチドは、配列番号１のアミノ酸ｊ〜６を含み、ここで、ｊは１、２、３、４又は５であり、
    Ｃ． Ｂは、配列番号１のアミノ酸７〜２６を表し、
    Ｄ． Ｙ又はＺが荷電アミノ酸である場合、該荷電アミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕからなる群より選択され、
    Ｅ． ＣがＸ−Ｙ−Ｚを含む場合、前記グルカゴンアンタゴニストは、ＺのＣ末端側に荷電アミノ酸１〜２個を更に含む、
    グルカゴンアンタゴニスト。
  3. 前記ＰＬＡのオキシ誘導体が、エステル結合を介してアミノ酸又はペプチドと共有結合しているＰＬＡを含むデプシペプチドである、
    請求項１又は２記載のグルカゴンアンタゴニスト。
  4. Ｂが、前記（ｖ）若しくは（ｖｉ）で示されたアミノ酸修飾、又はそれらの組み合わせを含む、
    請求項１〜３のいずれか１項記載のグルカゴンアンタゴニスト。
  5. Ａ．配列番号１の番号付けによる１６、２１又は２４位のアミノ酸残基又はＮ若しくはＣ末端の残基に、親水性部分が共有結合しており、
    Ｂ．エステル、エーテル、チオエーテル、アミド又はアルキルアミン結合を介して、アシル基又はアルキル基に共有結合したアミノ酸を含み、該アミノ酸が、１０、２０若しくは２４位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）にあるアミノ酸であるか、又はＮ若しくはＣ末端の残基である、
    請求項１〜４のいずれか１項記載のグルカゴンアンタゴニスト。
  6. 配列番号６２、６４〜６７及び７１のいずれかのアミノ酸配列、又は表４〜１２のいずれかに記載されているアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載のグルカゴンアンタゴニスト。
  7. 配列番号４２の配列を含むグルカゴンアンタゴニスト、又は、
    配列番号４２の誘導体を含み、該誘導体が、５、６、８、９、１２、１３及び１４位から選択される１〜３つのアミノ酸位置でのアミノ酸置換により、配列番号４２と異なっている、グルカゴンアンタゴニスト。
  8. 前記グルカゴンアンタゴニストが配列番号４２の配列を含む場合、
    Ｃ末端のアミノ酸は、天然アミノ酸に存在するカルボン酸基の代わりにアミド基を有し、
    前記配列番号４２の４位のアミノ酸は、アスパラギン酸であり、
    前記配列番号４２のカルボキシ末端のアミノ酸に融合した、配列番号１９のアミノ酸を更に含み、
    前記配列番号４２の１１、１６又は１９位のアミノ酸残基又はＮ若しくはＣ末端のアミノ酸に共有結合した、親水性部分を更に含み、
    配列番号４６又は配列番号４７の配列を更に含み、
    ２３位のアミノ酸がＡｓｎである場合、２４位のアミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群より選択され、且つ、２４位のアミノ酸がＴｈｒである場合、２３位のアミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群より選択され（配列番号４２のアミノ酸番号付けによる）、
    前記配列番号４２のカルボキシ末端に付加された、１〜２個のアミノ酸を更に含み、ここでカルボキシ末端に付加された該アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群より独立して選択され、
    前記配列番号４２の１０位のアミノ酸は、グルタミン酸、システイン酸、ホモグルタミン酸、及びホモシステイン酸からなる群より選択され、及び／又は
    配列番号７、配列番号８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、及び配列番号４１のいずれかの配列を更に含む、
    請求項７に記載のグルカゴンアンタゴニスト、
    又は、その薬学的に許容される塩。
  9. 前記親水性部分が、血漿タンパク質又は免疫グロブリンのＦｃ部分であるか、又は、ポリエチレングリコールである、
    請求項８記載のグルカゴンアンタゴニスト。
  10. 配列番号１のＮ末端からの２〜５個のアミノ酸残基の欠失と、
    配列番号１の９位のアスパラギン酸残基の、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、システインのスルホン酸誘導体、又は下記構造：
    〔ここで、Ｘ5は、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ2〜Ｃ4アルケニル若しくはＣ2〜Ｃ4アルキニルである〕
    を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体による置換と
    によって修飾されている天然グルカゴンのアミノ酸配列を含む、グルカゴンアンタゴニストである、グルカゴンアンタゴニスト。
  11. Ａ．前記システインのスルホン酸誘導体は、ホモシステイン酸であり、
    Ｂ．Ｘ5は、Ｃ1アルキル又はＣ2アルキルであり、及び／又は
    Ｃ．前記天然グルカゴンのアミノ酸配列は、３つまでのアミノ酸修飾により更に修飾されていてもよい、
    請求項１０に記載のグルカゴンアンタゴニスト。
  12. 前記３つまでのアミノ酸修飾が、下記Ａ〜Ｋから成る群より選択される、請求項１１記載のグルカゴンアンタゴニスト：
    Ａ．１０、２０及び２４位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のうちの１若しくは２個のアミノ酸、又はＮ若しくはＣ末端のアミノ酸の、アシル若しくはアルキル基を含むアミノ酸による置換；
    Ｂ．１６、１７、２０、２１及び２４位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のうちの１若しくは２個のアミノ酸、又はＮ若しくはＣ末端のアミノ酸の、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルチニン、ホモシステイン及びアセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群より選択されるアミノ酸による置換（ここで前記群のアミノ酸は親水性部分と共有結合している）；
    Ｃ．Ｎ又はＣ末端への、親水性部分と共有結合したアミノ酸の付加；
    Ｄ．システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸による、１５位（配列番号１の番号付けによる）のＡｓｐの置換；
    Ｅ．システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸による、１６位（配列番号１の番号付けによる）のＳｅｒの置換；
    Ｆ．配列番号１のアミノ酸番号付けによる１６、２０、２１及び２４位のうちの１つ以上の位置でのＡＩＢによる置換；
    Ｇ．配列番号１の番号付けによる２９位のアミノ酸、又は２８及び２９位の両方のアミノ酸の欠失；
    Ｈ．２８位のＡｓｎ及び２９位のＴｈｒ（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のそれぞれ又は両方の荷電アミノ酸による置換、及び／又は、配列番号１のＣ末端への１〜２個の荷電アミノ酸の付加；
    Ｉ．Ｌｅｕ又はノルロイシンによる２７位（配列番号１のアミノ酸番号付けによる）のＭｅｔの置換；
    Ｊ．配列番号１のＣ末端への、配列番号１９〜２１及び５３のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドの付加（ここで２９位（配列番号１の番号付けによる）のＴｈｒはＴｈｒ又はＧｌｙである）；並びに
    Ｋ．アミド又はエステルによるＣ末端カルボキシレートの交換。
  13. 請求項１２に記載されているアミノ酸修飾のうちのＡ、Ｂ若しくはＣ又はそれらの組み合わせを含む、請求項１２記載のグルカゴンアンタゴニスト。
  14. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載のグルカゴンアンタゴニストを２つ以上含む、二量体又は多量体、あるいは、
    請求項１〜１３のいずれか１項に記載のグルカゴンアンタゴニストと、異種ペプチドとを含む、結合体。
  15. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載のグルカゴンアンタゴニスト、請求項１４に記載の二量体若しくは多量体若しくはそれらの結合体、又はそれらの組み合わせと、薬学的に許容される担体とを含む、滅菌された医薬組成物。
  16. 患者における、高血糖症の治療、食欲の抑制、体重増加の低減、減量の誘導、又は代謝性るいそうの治療に使用するための組成物であって、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のグルカゴンアンタゴニスト、請求項１４に記載の二量体若しくは多量体若しくは結合体、又はそれらの組み合わせを含む、組成物。
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