TW200920404A

TW200920404A - Glucagon antagonists

Info

Publication number: TW200920404A
Application number: TW097141806A
Authority: TW
Inventors: Richard Dimarchi; Bin Yang
Original assignee: Univ Indiana Res & Tech Corp
Priority date: 2007-10-30
Filing date: 2008-10-30
Publication date: 2009-05-16
Also published as: CA2707861A1; JP2011502155A; MX2010004297A; AU2008318986B2; HK1143994A1; WO2009058662A2; AR069110A1; WO2009058662A3; CL2008003222A1; EP2217701A4; ES2509883T3; EP2217701B9; PE20091393A1; JP5669582B2; AU2008318986A1; US8981047B2; US20120122783A1; EP2217701B1; EP2217701A2

Description

200920404 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於一種胰高血糖素擷抗劑之設計，特別是關於一種胰高血糖素擷抗劑。【先前技術】天然胰高血糖素是一種由29個胺基酸所組成之胜肽，可經由在肝臟中促進葡萄糖合成及流動以調控血糖濃度。因此，抑制胰高血糖素内分泌作用可作為葡萄糖過度生成之相關藥物之發展標的之一，例如糖尿病。胰高血糖素一般係作為操抗性調節荷爾蒙，可對抗胰島素之作用，用以維持血液中葡萄糖濃度，特別是血糖過少之情況。然而，在某些糖尿病第一型及第二型之病人，顯示出絕對或相對血糖濃度之增高會造成高血糖之情況。在健康控制組動物及糖尿病第一型及第二型之動物組中，以特定抗體移除累積之胰高血糖素皆可降低其血糖值。（Brand et al·， Diabetologia 37, 985 (1994); Diabetes 43, [suppl 1], 172A (1994); Am. J. Physiol. 269, E469-E477 (1995); Diabetes 44 [suppl 1], 134A (1995); Diabetes 45，1076 (1996))此些學術研究顯示擷抗作用對於糖尿病患者血糖值之控制是有助益的。胰高血糖素係經由結合及活化其受體以產生功用，其受 200920404 體為7-穿膜G-蛋白偶合受體家族之胰高血糖素小腸内泌素分支之一部分。受體係藉由一種腺苷酸環化酵素活性之作用使 cAMP增加。在先前研究文獻已證明其胜肽基礎（參閱Unson, C. G. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264, 789-94, Ahn, J. et al. (2001) J. Peptide Research 58, 151-8 and Ahn J. et al. (2001) J. Med Chem. 44，1372-9)及核苷酸性（81〇〇卩1<：.61&1.(2004)>1· Clinical Invest. 113，1571-81)之胰高血糖素擷抗作用。胜肽基礎之抑制作用係利用與受體之結合產生功用，而核苷酸性之抑制作用係利用抑制細胞内胰高血糖素受體之mRNA而產生功用。胰高血糖素受體之抑制子已被發現，其係以胰高血糖素之胺基酸序列為基礎。有些類似物係以刪除或取代之一或多個胺基酸以生成有效的胰高血糖素受體之操抗劑，例如，[des Hisl] [Glu9]-glucagon amide (Unson et al., (1989) Peptides 10, 1171; Post et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1662), des Hisl, Phe6 [Glu9]-glucag〇n amide (Azizh et al., (1995) Bioorg. & Med. Chem. Lett. 16, 1849)及 Nle9,

Alai 1,16-glucagon amide (Unson et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(17), 12548)其他的相似物包括例如在胰高血糖素序列第4 號位置（Ahn J M et al. (2001) J. PePt. Res· 58(2):151-8)，1 (Dharanipragada, R. et al. (1993) Int. J. Pept. Res. 42(1): 68-77) 200920404 及弟 4’5’ 12’17，is 號位置（Gysin B et al. 1986. Biochemistry. 25(25):8278-84)予以取代。【發明内容】本發明所欲解決之技術問題然而’胰高血糖素受體之抑制子已被發現，其係以胰高血糖素之胺基酸序列為基礎。有些類似物係以刪除或取代之一或多個胺基酸以生成有效的胰高血糖素受體之擷抗劑，例如’ [des Hisl] [Glu9]-glucagon amide (Unson et al., (1989) Peptides 10, 1171； Post et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1662), des Hisl, Phe6 [Glu9]-glucagon amide (Azizh et al., (1995) Bioorg. & Med. Chem..Lett. 16, 1849)及 Nle9, Alai 1,16-glucagon amide (Unson et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(17)，12548).其他的相似物包括例如在胰高血糖素序列第 4 號位置（Ahn J M et al. (2001) J. Pept· Res. 58(2):151-8), 1 (Dharanipragada, R. et al. (1993) Int.· J. Pept. Res. 42(1)： 68-77) 及第 4 ’ 5 ’ 12 ’ 17 ’ 18 號位置（Gysin B et al· 1986. Biochemistry. 25(25):8278-84)予以取代。緣此’本發明之主要目的即是提供一種高效能胰高血糖素擷抗劑以代表天然胰高血糖素胜肽。 200920404 本發明解決問題之技術手段 — 本發明為解決習知技術之問題所採用之技術手段係在一只轭例中，提供一具有胰高血糖素擷抗劑活性之類似物。胰间血糖素擷抗劑將可用於傾向於抑制胰高血糖素活化之環境下。最明顯接近於此情況即是使用於臨床前高血糖模式以產生低血糖之糖尿病治療。當要維持原擷抗活性時，這些胰高血糖素擷抗劑可被進一步地修飾以改善生物物理穩定性及該成分之水溶性。在一貫施例中，提供一胰高血糖素擷抗劑，包括有一經刪除胺基端第2-5位置之胺基酸之天然胰高血糖素胜肽，以及將第9 5虎位置之天冬胺酸取代為選自由下列胺基酸組成之群組中之胺基酸：麩胺酸、同麩胺酸、卜同麩胺酸（一種半胱胺酸之磺酸衍生物）或一種半胱胺酸之烷羧化衍生物、或一種由半胱胺酸衍生出且包含下列化學結構之羧基烷衍生物：

COOH 其中X5係為（VC4烷基、 X5 \

COOH C2-C4烯屬烴或c2-C4炔基 200920404 在一貫把例中’該半胱胺酸之磺酸衍生物係為半胱磺胺酉欠或同半耽石頁胺酸。在一實施例中，羧基端之羧基被取代為不帶電之中性基’例如氨或酯。在另一實施例中，提供一胰高血糖素擷抗劑（參閱在此所 (之PLA6類似物）’其組成為一經由在胺基端前5個胺基酸刪除修飾’以及將剩餘之胺基端胺基酸（苯丙胺酸）之胺基端胺基取代S氫氧基（例如，—胺基端為苯基乳酸(pLA))之天然胰咼血糖素胜肽。相對於刪除了前五個胺基酸但保留在胺基端苯丙胺酸之情況，該PLA6類似物增加了三倍的親和力，以及擷抗之效果。在另一實施例中’原生蛋白質第九號位置之天冬胺酸係可為由同麩胺酸、0_同麩胺酸（一種半胱胺酸之磺酸何生物）或一種半胱胺酸之烷羧化衍生物、或一種包含下列化學結構之烷羧化衍生物，上述所組成之群組中選出之一胺美酸：

H2C\

COOH 其中X5係為CVC4烷基，（：2_(：4烯屬烴4C2_C4炔基在一貫施例中，胰高血糖素擷抗劑係包括選自由下列序 200920404 列所組成之群組：SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 及 SEQ ID NO: 38，以及在另一實施例中，胰高血糖素擷抗劑係包括選自SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8。在一實施例中，提供一胰高血糖素擷抗劑係包括SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 37之序列，其中一聚乙二醇鏈係共價鍵結於第11，12, 16, 19或24號位置之胺基酸，或鍵結於胜肽之N或羧基端。在一實施例中，提供一胰高血糖素擷抗劑係包括 SEQ ID N〇：9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 或 SEQ ID NO: 12之序列，其中一聚乙二醇鏈係共價鍵結於SEQ ID NO: 9之第11號位置胺基酸，SEQ ID NO: 10之第16號位置胺基酸of，SEQ ID NO: 11之第19號位置胺基酸或同時鍵結在SEQ ID NO: 12之第11及19號位置胺基酸。在一實施例中，聚乙二醇鏈之分子量係為在1000-5000道耳吞之範圍中，且共價鍵結於胰高血糖素擷抗劑胜肽。在另一實施例中，聚乙二醇鏈之分子量係為在20000-5000道耳吞之範圍中，且共價鍵結於胰高血糖素擷抗劑胜肽。另外，胰高血糖素擷抗劑之序列包括SEQ ID NO: 12，且具有單一聚乙二醇鏈，其共價鍵結於第11及19位置之胺基酸，其中二組合後之聚乙二醇鏈之分子量範圍係在1000-5000道耳吞之範圍或大於20000道耳吞。 200920404 在一實施例中，提供一胰高血糖素擷抗劑其中SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39 或 SEQ ID NO: 40之羧基端胺基酸係共價鍵結於一具有SEQ ID NO: 19 (GPSSGAPPPS)之第二胜肽。該些成分可進一步地經由 ' PEG與胰高血糖素類似物之SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39 或 SEQ ID NO: 40 之第 11， r 16, 19號位置鍵結之修飾作用。在一實施例中，提供一胰高血糖素擷抗劑其中 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39或SEQ ID NO: 40之羧基端胺基酸係共價鍵結於一具有SEQ ID NO: 53之第二胜肽。在一實施例中，胰高血糖素擷抗劑係由在此所述之 A-B-C結構組成，其中A係選自由下列成份所組成之群組： ⑴苯基乳酸（PLA); (ii)苯基乳酸之氧化衍生物； i (iii) 一種2-6個胺基酸組成之胜肽，且該胜肽之其中兩連續胺基酸係由一酯鍵或一醚鍵鍵結連接； B代表SEQ ID NO: 1之胺基酸i到26，其中i係為3, 4, 5, 6, 或7之中隨意地由一或多個胺基酸修飾所組成，如在此進一步所述；而C係為選自由下列成份所組成之群組： (X) X; (xi) X-Y; -12 - 200920404 (xii) X-Y-Z;以及 (xiii) X-Y-Z-R10, 其中X係為Met, Leu，或Nle ; Y係為Asn或一帶電荷之胺基酸；Z係為蘇胺酸、甘胺酸、半胱胺酸、離胺酸、烏胺酸 (Orn)、同半胱胺酸或乙醯苯丙胺酸(Ac-Phe)，或帶電荷之胺基酸，其中R10係選自由SEQ ID NOs: 19-21及53所組成之群組；以及；以及 (xiv) 任何（X)〜（xiii)之一，其中叛基端羧基係由胺基所取代。在另一實施例中，任何缺少天然胰高血糖素之胺基端五個胺基酸及/或包括PLA之胰高血糖素擷抗劑，其溶解度可經由在羧基端取代或加上帶電荷胺基酸之修飾作用而增加，較佳地在胰高血糖素擷抗劑之羧基端至第22號位置（天然胰高血糖素之第27號位置）。在一實施例中，天然胰高血糖素之第 23及/或24號位置經由一帶電荷胺基酸所取代，及/或在進一步實施例中羧基端加上三個帶電荷胺基酸。在應用例中，一、二或全部之帶電荷胺基酸係為帶負電荷之胺基酸。在一實施例中，SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8之胰高血糖素擷抗劑係進一步地包括在第23及/或24號位置由酸性胺基酸取代修飾。在一實施例中，酸性胺基酸係為天冬胺酸或麩胺酸殘基，且胰高血糖素擷抗劑包括SEQ ID NO: 41之序列。 -13 - 200920404 在進、步實施例中，缺少天然胰高血糖素第u號位置胺基^及/或包括pla之胰高血糖素操抗劑，在生理pH範圍内^疋度可增加’主要經由在第1G號位置之天冬胺酸(天然肤高血·糖素之第1 5跋, , 〜位置）取代為遥自下列胺基酸所組成之群’、且之胺基，.麵胺酸、半胱續胺酸、同麩胺酸、同半脱績月女酉夂在實知例中，胰高血糖素擷抗劑包括SEQ山NO: 36 或SEQ ID NO: 40之序列。任何在此提到之騰冑血糖素操抗劑可以進—步地修飾為包括-或多個保留有活性之α，α_雙取代胺基酸。在某些實施例中，胰高血糖素擷抗劑之第16, 17, 18,2〇,21，24或”號位置（依據野生型胰高血糖素之胺基酸序列號）之其中一、二、

三、四或更多，係由α，α_雙取代胺基酸所取代。例如，胰高血糖素擷抗劑包括第16號位置（依據野生型胰高血糖素之胺基酸序列號）取代為氨基異丁酸（ΑΙΒ)。在某些實施例中，胰高血糖素擷抗劑之第16, 17, 18, 2〇, 21，24或29號位置(依據野生型胰高血糖素之胺基酸序列號）之其中一、二、三或更多，係由ΑΙΒ所取代。在特定方面來說，胰高血糖素擷抗劑具有一或多個（X，ct-雙取代胺基酸，更進一步地具有羧基端羧化物。任何在此提到之胰高血糖素擷抗劑可以進一步地修飾為包括有一醯基及/或一烷基，該醯基或烷基係可透過一酯基、醚基、硫醯基、胺基或烷化胺基，以結合於一間隔子或胰高 • 14 - 200920404 血糖素操抗劑。任何在此提到之胰高血糖素擷抗劑可以進一步地以截斷、刪除一或二個羧基端之胺基酸進行修飾作用（例如，天然胰高血糖素肽之第29號位置，或第28及29號位置）。添加修飾作用，例如保留性取代，可能使胰高血糖素擷抗劑仍可保留其擷抗活性。因此，本發明係在使任何在此揭露之胰高血糖素類似物可進一步地修飾為包括有2, 3, 4, 5, 6, 7, 8或9種胺基酸修飾作用，且仍可保留對胰高血糖素受體具有良好活性。在此揭露之胰高血糖素擷抗劑之二聚體亦包含在本發明之範圍中。在一實施例中，提供一胰高血糖素擷抗劑之二聚體，其包括之二胜肽係分別地選自下列序列組成之群組：SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39以及SEQ ID NO: 40，其中該二胰高血糖素擷抗劑彼此間係經由肽鍵鍵結於第11或19號位置之胺基酸。在一實施例中，提供一藥物成分，該藥物成分包括在此所揭露之騰高血糖素操抗劑。在一實施例中，一藥物成分包括一在不同包裝且滅菌過之溶液。藥物成分可進一步部分地包裝於一套件組中，該套件組包括有一可拋式裝置，可供一病人使用。在一實施例中，提供一快速治療高血糖之方法，係使用 -15 - 200920404 -經㈣4之水性溶液。該方法包括使用—有效劑量之水溶液，財包括有本料㈣露之經修飾之胰高血糖素=::7貫施例中’提供—經聚乙二醇化修飾之胰高血“ ’且该聚乙二醇鏈之分子量範圍為500-5000道耳吞:施例中，該經過軸之胰高血糖素擷抗劑溶液經過二t於;·裝置中，以提供給一具有高血糖症狀之病患。 y中Μ供—對於胰島素依賴型病患調控血糖 2良》。該方法包括施予—有效藥理劑量之胰島素以控病：：予一本發明所揭露之經修飾作用之胰高血糖、中該各實施步驟係分別在12小時内完成。在_ 貫把例中’姨島素以及該胰高血糖制抗劑制時以單一人 =施’其中該胰高血糖素榻抗劑係經聚乙二醇化修錦， ♦乙二醇鏈之分子量範圍為5000-40000道耳吞。本發明對照先前技術之功效 =本發明所制之技術手段，此種新型的胰高血糖辛學二：：出：天然胰高血糖素之胺基端序列進行新型的化進活性。、/ 種南專—性掏抗劑以展現出不明顯的促成分可制詩任何抑伽高域素活化之環 :。據其中一實施例，該成分可被利用於治療糖尿財 -16 - 200920404 本發明所採用的具體實施例，將藉由以下之實施例及附呈圖式作進一步之說明。【實施方式】定義

在本發明之說明及請求項中，將使用依照下列定義之專門用語。如在此所使用，所謂「藥學上可接受載體」包括任何標準的藥學載體，例如磷酸鹽緩衝液，諸如油/水、水/油乳化劑，，各種濕潤劑。這些專門用語包含了任何經由美國聯邦政府官理機構所准許或美國藥典中可使用於動物，包括人類之成分。如在此所使用 '樂学上可接受鹽類」係指包括各種，留有生物活性之鹽類成份，且非為生物上或其他方面所 1 :在此所揭露之係、可藉由胺基、絲或其他相似的官能基而形成酸性或驗性鹽類。接受驗性添加鹽類可經由無機或有機驗製成。 :鎂Γ: 類，包括納鹽、钾鹽、鋰鹽、錄鹽、_ :鎮鹽。由有機驗衍生之鹽類，包括但不限於例如一級、：級'三級胺。一樂學上可接受酸性添加鹽類可經由無機或有機酸製成。 17 200920404 由無機酸衍生之鹽類，包括氯化氫、嗅化氫、硫酸、硝酸、磷酸等。由有機酸衍生之鹽類，包括醋酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸'苯曱酸、肉桂酸、杏仁酸、甲基磺酸、乙基磺酸、P-甲苯石黃酸、水楊酸等。如在此所指之’’治療，，，係包括預防特定疾病或症狀，或減輕特定之疾病或症狀及/或防止或消除該病症。如在此所指胰高血糖素擷抗劑之「有效」之劑量或「藥理上有效」之劑量，仙—無毒性且具有足夠量以提供有效療效之胜肽。例如以-有效療效將可預防或治療高血糖症狀。所謂「有療效」的劑量係視情況而不同，視年齡及個人之一般情況’施用之方式料。因此，無法做到所謂定義出一精確的「有效劑量」。然而，用在任何人之一適當「有效」劑量可經由在該領域具有通常知識者藉經驗之累積所決定。」广所謂「腸胃外的」係指非經由消化道，而是藉由其他路徑例如皮下、肌肉内、脊椎内，或靜脈内。、在此所述之「胰高血糖素胜肽」，包括SEQ出no. 1之胺基酸序列，或任何由SEQIDNQ:丨之胺基酸序列所衍生之胜肽，包括胜肽之胺基酸取代㈣譯後修飾作用（例如甲其化、乙醯化、泛素化等等)，以刺激胰高血糖素或⑽]二活性，如實施例13中所述之測量cAMP之生成量。又组 -18 - 200920404 血糖「姨高血糖素擷抗劑」，係指那些可擷抗胰高 _ 4抑制胰咼血糖素功能之成分。例如二抑制作用之胰高血糖素擷抗劑(例如一制作用）及較佳地，至少80%之抑制作用，其係作用在胰高血糖素受體最夷间血糖素晒系又溫之戒大反應。在—實施例搪素擷抗難由胰高血射仙在胰高血糖素ad 應上表現出至少90%之抑制作用。在—特定實施例中取姨古血搪素擷㈣在纟胰高㈣素作时胰高錢 ^ 反應上表現幻00%之抑制作用。同時，以丨 =取大素擷抗劑，於胰高血糖素作用在 μ《胰南血糖京作用在胰南血糖素受體之下，表規 200/0之激動活性。在一實施例中，胰高血糖素汽抗~ 之激動活性。在一特定實施上t::表現出少於_ 血糖素作用在胰高血糖素受體 q素操抗劑於騰高性。在另一转0 m 士下表現出少於5 %之激動活作用在胰*血楂：：：胰高血糖素擷抗劑於胰高血糖素在胰问血糖素受體之下，表現出0。/。之激動活性。” -種「純“血糖相抗劑」，係指 :高血糖素或⑽-1受體活性之姨高刪利用有效的體外模型測試量測cAMk : ^ 例中所述。舉例來說’純胰高二作用在姨高血糖素受體之下m㈣π血糖素下表現出少於5%之激動活性（例如 -19 · 200920404 少於4%，少於3%，少於2%，少於1%及大約為0%)，以及於GLP-1作用在GLP-1受體之下，表現出少於5%之激動活性 (例如少於4%，少於3%，少於2%，少於1%及大約為0%)。如在此使用之「胰高血糖素擷抗劑」衍生物係為一種胜肽，其胺基酸序列係與SEQ ID NO: 1胺基酸序列相似度超過 60%，但係經由修飾以表現出胰高血糖素擷抗劑活性。該些修飾作用包括有胺基酸取代、刪除或後修飾作用（例如甲基化、胺化、醯化、泛素化、聚乙二醇化等等）。在一實施例中，胰高血糖素擷抗劑衍生物包括有經過修飾以具有刪除胺基端前 5個胺基酸之SEQ ID NO: 1之胰高血糖素胜肽，以及使胺基端殘存之胺基酸（苯丙胺酸）之胺基取代為氫氧基。如在此使用之胺基酸之”修飾作用”係指胺基酸之取代、添加或刪除，且包括取代或添加人類中常見的20種胺基酸，以及非自然產生之非典型胺基酸。非典型胺基酸之購買來源包括有 Sigma-Aldrich (Milwaukee，WI)，ChemPep Inc. (Miami, FL),以及 Genzyme Pharmaceuticals (Cambridge, MA)等公司。非典型胺基酸可經由供應商所購得、再合成、化學修飾或經由自然產生之胺基酸所衍生得到。如在此使用之”取代作用”係指以另一不同之胺基酸取代原來之一胺基酸。如在此使用之用語”保留性胺基酸取代”，其在此係定義為下列五種群組之一。 -20 - 200920404 ι. 較小、脂紡族、非極性或小部分極性之胺基酸： Ala, Ser, Thr, Pro, Gly; II. 極性、帶負電荷之胺基酸及其氨基化合物：

Asp, Asn, Glu, Gin; III. 極性、帶負電荷殘基之胺基酸：

His, Arg, Lys; Ornithine (Orn) IV. 較大、脂紡族、非極性之胺基酸：

Met, Leu, lie, Vals Cys, Norleucine (Nle), homocysteine V. 較大、芳香族之胺基酸：

Phe, Tyr, Trp, acetyl phenylalanine 在此使用的一般用語”p〇lyethylene glyC〇l”或”peg"(聚乙二醇），係指混合環氧乙烷及水之濃縮聚合物，以支鏈或直鏈之方式，以一般化學式表示為H(OCH2CH2)nOH，其中η至少為9。在沒有更進一步特徵下，該用語係指包括以平均分子量在500到40,000道耳吞之間之聚乙二醇聚合物。聚乙二醇係在字尾標記數字以表示其大略之平均分子量。例如，PEG-5,000 係指平均分子量約在5,〇〇〇之聚乙二醇。在此使用之用語”pegylated"(聚乙二醇化）及其相似用語係指一種成分之天然狀態經由結合聚乙二醇之修飾作用。一” 聚乙二醇化之胰高血糖素擷抗劑”係指將一聚乙二醇鏈共價鍵結於一肤高血糖素掏抗劑。 -21 - 200920404 在此所提及之胜肽係指一具有修飾之胺基端及羧基端。例如，在羧基端取代為醯胺基之一胺基酸鏈，係由標準胺基酸所組成之胺基酸序列。在此所指的「連結子」係為一種鍵結，經由分子間或基團間結合將二分開之實體彼此結合。連結子可提供兩實體間理想之間距，或可進一步地供應一不安定的連結，以使兩實體間彼此相隔。不穩定的連結包括可光分裂性基團、酸性不安定基團、鹼性不安定基團及可酵素分裂基圑。在此所指的「二聚體」係為由兩次單元經由一連結子以將兩者共價鍵結之複合物。在此所指的二聚體，在沒有進一步限制用語情況下，包含同二聚體及異二聚體。同二聚體係由二相同之次單元所組成，反之異二聚體係由·二不相同之次單元所組成，儘管兩次單元實質上相似。如本文所使用之用語「帶電胺基酸」係指包含在生理pH 下之水溶液中帶負電（即去質子化）或帶正電（即質子化）之側鏈的胺基酸。舉例來說，帶負電的胺基酸包括天冬胺酸、麩胺酸、半胱磺胺酸、同半胱磺胺酸、及升麩胺酸，而帶正電的胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸。帶電胺基酸包括在20 種常見於人類蛋白質中之胺基酸、以及非典型或非自然產生之胺基酸中的帶電胺基酸。如本文所使用之用語「半胱胺酸之硫酸衍生物」係指下列化 -22 - 200920404 學結構式所表示之成分： h2n' ，C〇〇h x6' sso. ’乂中X6係為，一1-C4烷基，C2_C4烯屬烴或c2-c4炔基。 = -Cn炫基」之用語中的n可以由w，如在此使用、表支鏈或錢雜基具有由-到特定數目的碳原子。，、型的CrC6燒基包括但不受限如下，甲基、乙基、里丙烷基、丁基、異丁基、第_ 八等此類。弟一丁基第二丁基、戊基、己基「c2-cn烯屬烴」之用語中的n可以由2〜6，如在此使用的’其代表—稀烴類的不飽和支鏈或直鏈基團，且有由二到特定數目㈣料且具有至少—雙鍵。這類㈣團包括但不文限如下，！-丙烯基、2_丙烯基（_CH2_CH= q 基，（_CH=CHCH=CH2)、！_丁烯其广，式 ^ 2) 1 丁烯基（-ch=chch2Ch3)、戊烯基、己缔基等此類。「C2-Cn块基」之用語令的n可以由2〜6，係指一不飽和支鏈或直鏈基團，具有由2到n個碳原子且具有至少。這類的基團包括但不受限如下，κ丙块基、2_丙块基丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基等此類。、 • 23 - 200920404 如本文所使用之用語「酸驗值穩定胰高血糖素操抗劑」係指-胰高血糖素㈣物相對於天然胰高血糖素可表現出較佳穩定性及溶解度，且在水溶液巾有較大的pH範圍，以應用於藥理用途。 “ 如本文所使用之用語「酸性胺基酸」係指包含第二個酸性基團，包括例如羧酸基或磺酸基。如本文所使用之用語「病患」在無進—步限定下，係指包含任何溫血脊椎之馴養動物(包括例如但不受限家畜如下，馬、貓、狗及其他寵物）及人類。如本文所使用之用語「大約」係指大於或小於某數值或該數㈣_在1G個百分比内，但並非指定任何數值或該數直的=圍僅能在此限制内。每個數值或其_以「大約」之 ^ 述h’同％包含了實施例中所陳述的絕對數值或該數實施例 i糖素之抑此種制作用具有高度專本文所揭路之胰高血糖素操抗劑係對於姨高腩古品她主，，且不具有明顯的激動劑活性。此種之产产由 4係了利用於任何希望抑制胰高血糖素活化之％&中。例如胰高血糖辛 1匕令胰高血糖她财應m㈣尿病，其 '"匕係由尚血糖之前臨床模型所表現，以降低 • 24 - 200920404 血液中葡萄糖量。 .特定的胰高血糖素相似物在先前已發展，其第9號位置，天冬胺酸被麩胺酸或半胱磺胺酸之衍生物所取代/特別疋冊i除第1號位置的胺基酸（des_His)，且將第9號位置的天 ;月女I取代為麩胺酸以生成胰高血糖素擷抗劑。將第9號位置之胺基酸取代為具有硫酸取代基之胰高也糖素衍生物，其可相似地表現出羧基胺基酸特性，但在物理特性方面仍具有部分關鍵性差異’例如溶解度之部分。傳統的如_仙，⑺的胰高血糖素擷抗劑在第9號位置的亞硫酸同半胱胺酸 (ysS〇3)取代為電子等排的麵胺酸後，仍保留有部份擷抗劑及少許的激動劑特性。意外地，發明人發現到將胺基端殘基除去後，包括例如有，删除珂5個胺基酸（產生des(1_5))，以及第9號位置以選自由下列胺基酸組成之群組之胺基酸取代（根據seqidn〇: i 之順序）_亞硫酸同半胱胺酸，同麩胺酸，同麩胺酸，或半胱胺酸之羧基烷類衍生物具有下列結構者： ό 2 Η

COOH

Η ο ο C -25 - 200920404 β其中X5係為Cl-C4烷基，C2-C4烯屬烴或c2-c4炔基，以提供—化合物，其可表現出具高度專—性的、有效的、且無激動劑活性之荷_蒙掏抗劑特性。因此，在此揭露一胰高 A糖素何生性胜狀’可表現出純粹的膜高企糖素操抗劑活陡在一實施例中，胰高血糖素擷抗劑可降低胰高血糖素受 f 體受胰高血糖素引發產生AMP大約至少50%，其係在胰高血糖素叉體同時處理〇·8ηΜ之胰高血糖素及胰高血糖素操抗劑之下，並以體外測定eAMP之產生。在—實_中，騰高血糖素操抗劑降低胰高血糖素受體受胰高血糖素引發產生 cAMP之最大量相比約至少8〇%。在-貫施例中’提供_胰高血糖素擷抗劑，相對於野生型之SEQ m NO: i序列而t，其包括—修飾過之胰高血糖素胜肽’藉由刪除胺基端前2〜5個胺基酸，且將第9號位置天 1.' I胺酸取代為麩胺酸'同麩胺酸、β_同麵胺酸、半胱胺酸之石兰酸衍生物或一種由半胱胺酸杆斗+ B h人之貝裡田千耽岐何生出且包含下列化學基烷衍生物：硬 h2n

h2c s

x5 \

-26 - COOH 200920404 其中X5係為C1-C4燒灵^ 凡卷，CyC：4烯屬烴或c2-C4炔基在一實施例中，提供—眩一，、夷向血糖素擷抗劑，其包括一修

飾過之胰高血糖素胜肽，藉A ^ ^ 精由刪除胺基端前2〜5個胺基酸，將第9號位置天冬胺酸取代為艇吐μ 乂与麩胺酸，且更進一步將至多三個胺基酸進行修飾。例如，腌古 — __ 姨阿血糖素擷抗劑可包括一、二或三個保留性之胺基酸修飾。币了擇一或同時地，胰高血糖素

擷抗劑可包括一或多個胺美赌欠之一妆暴齩修飾作用，其係選自下列群組 Α.取代下列位置胺基酸之其中之一或二，帛1〇、2〇及24 號位置（依據SEQID職！之胺基酸序列），或在胰高糖素钻抗劑之胺基端或羧基端胺基酸透過一酯、峻Ail謎、氣或烷基胺鍵合以共價結合。 B·取代下列位置胺基酸之其中之一或二，帛16、17、2〇、 =及24號位置（依據SEQ m N〇: i之胺基酸序列），或在胰两血糖素擷抗劑之胺基端或羧基端胺基酸取代為下列胺基組成之群組之^_，半胱胺酸、離胺酸、鳥月女酸、同半胱胺酸以及乙醯苯丙胺酸，其中群組中之月女基酸係結合於其親水性之基團； C. 添加—共價鍵結於親水性基團之胺基酸於胰高血糖素擷抗劑之胺基端或羧基端； D. 將第15 5虎位置之天冬胺酸（依據SEq ID N〇: i之胺基 -27 - 200920404 酸序列）取代為半胱磺胺酸、麩胺酸、同麩胺酸以及同半磺胺酸； . E.將第16號位置之絲胺酸(依據SEQ ID NO: 1之胺基酸序列）取代為半胱磺酸、麩胺酸、同麩胺酸以及同半石黃胺酸； F. 將第16、20、21、24號位置之一或多個位置取代為氨 ( 基異丁酸，依據SEQ IDNO: 1之胺基酸序列； G. 刪除第29號位置或第28及29號位置胺基酸，依據SEq ID NO: 1之胺基酸序列； H. 將第28號位置之天冬醯胺酸及第29號位置之蘇胺酸 (依據SEQ ID NO: 1之胺基酸序列）之一或兩者同時取代為帶電荷胺基酸及/或在SEQ ID NO: 1之羧基端添加一至二個帶電荷胺基酸； I·將第27號位置之甲硫胺酸（依據SEQIDN〇: i之胺基 I: 酸序列）取代為白胺酸或正白胺酸； J.添加一胜肽，其胺基酸序列具有SEQ ID N〇: i中第 19-21號位置及羧基端第53號位置，其中第29號位置係為蘇胺酸或甘胺酸；以及 κ·將羧基端羧基取代為氨或酯。

在一特定實施例中，胰高血_糖素擷抗劑包含一前述之A -28 - 200920404 B或C之胺基酸修飾作用之一或其組合。在另—實施例中，胰高血糖素擷抗劑更包含一前述之D至K之胺基酸修飾作用之一或其組合，同時包括A，B，及/或C之胺基酸修飾作用。在一實施例中，胰高血糖素擷抗劑包括一胰高血糖素胜肽其中私基端$ 5個胺基酸被刪除，且剩餘之胺基端之胺基取代為氫氧基”PLA6相似物，，，以產生SEq ID N〇: %之胜肽。本發明人發現將前5個胺基酸被刪除且經取代第9號位置麩胺酸之胰高血糖素擷抗劑相似物（與天然胰高血糖素相比）之苯丙胺酸以苯乳酸取代後，可進—步地增強胰高血糖素揭抗劑相似物之效能。在一實施例中，SEQ ID N0: 39之騰高血糖素榻抗劑胜肤可進一步藉由將第4號位置（天_高血糖素之第9號位之天冬胺酸取代為具有下列結構之胺基酸： h2n 、s〇, 其中系為Cl-c4烷基,㈣烯係為以烷基，及在另—實施制/ C2_C4炔基，以及> 力貝知例中x係為貫施例中’胰高血糖素操抗劑包 ·" 胰巧血糖素胜肽，其中 -29 - 200920404 胺ί端前5個胺基酸被删除，且第4號位置（天然姨高血糖素之第9射之天冬胺酸取代為半料㈣或同半耽續胺在實把例中，胰南血糖素摘抗劑包括一姨高也糖素胜肽’該姨高血糖素胜肽之胺基酸序列包括選自下列群組··卿 =NO. 39, SEQ ID NO: 7 及 SEq iD Ν〇· 8 在一實施例中^夷南血糖素摘抗劑之胺基酸序列包括SEQIDN0: 39,其中第4 5虎位置胺基酸係為同半胱磺胺酸。在另-實施例中，SEQIDNO:39之騰高血糖素榻抗劑更進一步將第4號位置天冬胺酸（天然胰高血糖素之第9號位置）取代為麵胺酸、同麵胺酸、β·同麩胺酸，或一種由半胱胺酸衍生出且包含下列化學結構之羧基烷衍生物： η2ν

H2C \s

COOH I ‘ x5 \

COOH 其中X5係為C1-C4院基，CVC4烯屬烴或C2_C4块芙在一特定實施例中，χ係為Ci或C2烷基。然而’本發明人發現將des 1 -5胰高血糖素相似物（例士月^ 5個胺基酸被刪除之胰高血糖素相似物）之胺基端笨丙胺萨 -30 - 200920404 取代為PLA，而進一步將第4號位置（天然胰高血糖素之第9 號位置）天冬胺酸取代，對於產生一具有純粹擷抗作用之胰高血糖素擷抗劑相似物是非必要的。此結果相當令人驚訝，因為習知技術中，將第4號位置（天然胰高血糖素之第9號位置） • 之胺基酸取代已使胰高血糖素相似物之胰高血糖素擷抗劑產生高度結合力及效能是必要的。利用PLA之取代改善了 Asp9 \ 相似物之相對效能，和Glu9及hCys(S03H)9相似物相比（參表 6、7之實施例）。以苯丙胺酸相似物取代苯丙胺酸，包括 3,4-2F-phenylalnine (3,4-2F-Phe), 2-naphthyalanine (2-Nal), N-acy 1-phenylalanine (Ac-Phe), alpha-methylhydrocinnamic acid (MCA)以及 benzylmalonic acid (BMA)，並無法表現如 PLA取代作用之效果。若以PLA取代於第6號位置（依據天然胰高血糖素之順序） I 以外之其他位置，包括第4及5號位置，可使此PLA6相似物成為更有效能之操抗劑’和胺基端些微延伸之胰高血糖素擷抗劑相比（參表8及第8圖之結果）。第8圖之結果顯示，PLA 氫氧基的醯化並不影響PLA6相似物之效能。因此，本發明包括一相似物，其胺基端胺基被醯化及烷化之「〇端」胜肽所取代。進一步地，PLA6取代作用不僅增加擷抗效能，也在聚乙 -31 - 200920404 烯二醇化中扮演-重要角色。PLA6相似物可在未回復胰高血糖素激動活性下被選擇性地聚乙烯二醇化。在無pLA6取代時，相似物之聚乙稀二醇化意外地可誘導騰高血糖素激動活性。某些聚乙烯二醇化之位置已被研究，例如第3,6及19號位置（天舰高血糖素之第8, u及19號位置）以及胺基端胺基基（麥表12)。在一實施例中，在第19號位置（天然胰高血糖素之帛24 ?虎位置）進行聚乙烯二醇化，可表現出最具效能及選擇性的胰高血糖素擷抗性。在 Λ她例中，胰高血糖素擷抗劑係由在此所述之 A-B-C結構組成，其中a係選自下列群組： ⑴苯基乳酸（PLA); (η)苯基乳酸之氧化衍生物； (in) 一種2-6個胺基酸組成之胜肽，且該胜肽之其中兩連續胺基酸係由一酯鍵或一醚鍵鍵結連接； =代表SEQIDNO: 1之胺基酸丨到26,其中；係為3,4,5,6, 或7之中避擇性地由一或多個胺基酸修飾群組所組成，包括： (lv)第9號位置之天冬胺酸（依據seqidn〇: }之胺基酸序列）取代為麵胺酸，半胱胺酸之硫酸化衍生物，同麵胺黾，同麵胺酸或一種半胱胺酸之烷羧化衍生物、或一種由半胱胺酸衍生出且包含下列化學結構之羧基烷衍 -32 - 200920404 生物： Ή2Ν'

,COOH H2C、 X5,

、COOH 其中X5係為CVC4烧基，CVC4烯屬烴或C2-C4炔基 (v)取代下列位置胺基酸之其中之一或二，第丨ο、α及24 號位置（依據SEQ ID NO: 1之胺基酸序列），以一共價結合結合於酯、醚、硫醚、醯胺或烷基胺鍵合之胺基酸取代； (Vi)取代下列位置胺基酸之其中之一或二，第16、17、20、 21及24號位置（依據SEQIDN〇: !之胺基酸序列），以下列胺基酸組成之群組之一：半胱胺酸、離胺酸、鳥胺酸、同半胱胺酸以及乙醯苯丙.胺酸(Ac_phe)，其中群組中之胺基酸係共價結合於其親水性之基團； (vii)將第丨5號位置之天冬胺酸（依據SEQIDNa i之胺基馱序列）取代為半胱磺酸、麩胺酸、同麩胺酸以及同半績胺酸； (V111)將第16號位置之絲胺酸（依據SEQ ID N〇:丨之胺基 200920404 酸序列）取代為半胱磺酸、麩胺酸、同麩胺酸以及同半磺胺酸； (ix)將第16、20、21及24號位置之一或多個位置取代為氨基異丁酸’依據SEQ ID NO: 1之胺基酸序列；而C係為選自下列群組： (X) X; (xi) X-Y; (xii) X-Y-Z;以及 (xiii) X-Y-Z-R10, 其中又係為1\4札1^11，或]^^;丫係為^11或一帶電荷之胺基駄，z係為蘇胺酸、甘胺酸、半胱胺酸、離胺酸、鳥胺酸(0rn)、同半胱胺酸或乙醯苯丙胺酸(Ac_Phe)，或帶電荷之胺基酸，其中Rl〇係選自由SEQIDNOs: 19-21及53所組成之群組，以及 (χ1ν)任何（X)到（xiii)其中羧基端羧基係由胺基所取代。在一特定方面來看，胰高血糖素擷抗劑包括一苯基乳酸之虱化衍生物。本文所述之「苯基乳酸之氧化衍生物」係指有本基乳酸之修飾結構之化合物，如氫氧基被取代為〇 Ru ’其中Rn係為一化學基團。就此來看，苯基乳酸之氧 -34 - 200920404 化衍生物可以是，例如一苯基乳酸之酷或謎。製造苯基乳酸之氧化衍生物係為該領域所熟習之技術。例如，苯基乳酸之氧化衍生物為一苯基乳酸之酯時，酯基可以藉由PLA之氫氧基與具有親核性之羰基反應形成。親核反應可以是經由任何適當的親核劑，包括但不限於例如胺或氫氧基。因此，苯基乳酸之酯可包括分子式IV之結構：

分子式IV 其中R7係為一藉由PLA之氫氧基與具有親核性之羰基反應形成的酯。具有親核性之羰基（與PLA之氫氧基反應以形成酯）可以是，例如一羧酸，一叛酸衍生物，或一缓酸的活化醋。缓酸衍生物可以是，但不受限於例如一酿氯化物、酸酐化物、氨基化合物、酯或亞硝酸鹽。羧酸之活化酯可以是例如N-羥基琥珀硫亞氨(NHS)，曱苯磺酸鹽（Tos)，碳二醯胺或六氟磷酸 -35 - 200920404 鹽。而在某些實施例中，酸酐化物係為1，3-二環己基碳二亞胺 (DCC)，1，1’-合劑幾基二味《坐（CDI) ’卜乙基-3-(3-二甲氨基丙基）’碳二醯胺氫溴化鹽（EDC)或1，3-雙異丙基碳二醯胺 (DICD)。在某些實施例中，六氟磷酸鹽係選自由下列組成之君羊組：hexafluorophosphate

benzotriazol-l-yl-oxy-tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate (BOP), benzotriazol-l-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP), 2-(lH-7-azabenzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyl uronium hexafluorophosphate (HATU)，以及 o-benzotriazole-N，N，N，，N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-pho sphate (HBTU). 以氫氧基參與反應製造醚之方法係為該領域之習知技術 (例如苯乳酸之氫氧基）。舉例來說，可利用苯乳酸之氫氧基與鹵化烷或曱苯磺酸烷醇以形成一酯鍵。一般而言，Rn之化學基團不會降低胰高血糖素擷抗劑之活性。而在某些實施例中，此化學基團會促進胰高血糖素擷抗劑之活性、穩定性，以及\或溶解度。在一特定實施例中，透過一含氧的鍵結以結合於苯乳酸 (例如透過一酯或醚鍵）之化學基團係為一聚合物（例如一聚烯烴基二醇），一碳水化合物、一胺基酸、一胜肽、或一脂質， -36 - 200920404 例如脂肪酸或是類固醇。在一特定實施例中，其化學基團係為一胺基酸，選擇性地，可為胜肽之一部份，例如在化學式IV中為一縮酯環肽。就此來看，苯乳酸可能在胰高血糖素擷抗劑之胺基端胺基酸殘基以外之位置，例如胰高血糖素擷抗劑包括一或多個（例如 1，2, 3, 4, 5, 6,或更多）胺基端胺基酸於苯乳酸殘基。舉例來說，胰高血糖素擷抗劑可包括苯乳酸在位置η，其中η為胰高血糖素擷抗劑之第2, 3, 4, 5,或6號位置。胺基酸之胺基端結合於苯乳酸殘基可以經由合成反應或自然發生。在一特定實施例中，在胺基酸之胺基端結合苯乳酸殘基係為自然發生。在一實施例中，胺基端結合苯乳酸殘基之胺基酸係為天然胰高血糖素之胺基端胺基酸。舉例來說，胰高血糖素擷抗劑之胺基端胺基酸序列可包括SEQ ID NOs: 54-58之一，其中苯乳酸係透過酯鍵結合於蘇胺酸：

SEQ ID NO: 54 His-Ser-Gln-Gly-Thr-PLA SEQ ID NO: 55 Ser-Gln-Gly-Thr^PLA SEQ ID NO: 56 Gln-Gly-Thr-PLA SEQ ID NO: 57 Gly-Thr-PLA SEQ ID NO: 58 Thr-PLA 在另一實施例中，胺基端其中之一或多個胺基酸可以被 -37 - 200920404 取代為天然胰高血糖素所包含之其他胺基酸。例如，當胰高血糖素擷抗劑在第5或6號位置為苯乳酸時，可降低其第j 及/或2號位置之胺基酸對於第四型二肽肽酶之敏感性。更進 V地在某些Λ知例中，胰高血糖素操抗劑之第丨號位置係選自下列群組之胺基酸：D_組胺酸、31咖，雙甲基口米。坐乙酸（DMIA)、N-甲基組胺酸、alpha_甲基組胺酸、味唾乙酸、去胺基組胺酸、烴基組胺酸、乙醯組胺酸及同組胺酸。更進v地在某些貫把例中，胰高血糖素擷抗劑之第2號位置係選自下列群組之胺基酸：絲胺酸、㈣胺酸、Μ 胺酸、«酸、甘胺酸、N„甲基絲胺酸，1甲基丙胺酸以及月女基異丁酸(AIB)。同時，例如當胰高血糖素操抗劑在第心5 或6號位置為苯乳酸時，胰高血糖素擷抗叙第3號位置係 =麩胺酸’和天然胰高血糖素擷抗劑在該位置祕酿胺酸之情形相反。在本發明之一應用例中，胰高血糖基端胺基酸序列係為SEQIDN〇s: 59_61之—。。月當胰高血糖素擷抗劑包括化學式IV之結構時，此聚入物可以是任何可與苯乳酸之氫氧基反應之聚合物：： ==具有一親核性之幾基。另外，該聚合物也可以由衍 /、有親核性之碳基。該聚合物可以是一由下列物:聚酿胺 '聚伽、聚烯及其街生物、，二工土乳化物、聚烯fe基㈣，下列成分聚合物，包括： -38 - 200920404 丙烯酸樹脂、曱基丙烯酯，包括聚（甲基丙烯酸甲I旨）、聚（甲基丙烯酸乙酯）、聚（甲基丙烯酸丁酯）、聚（曱基丙烯酸異丁酯）、聚（甲基丙烯酸己酯）、聚（曱基丙烯酸異葵酯）、聚（甲基丙烯酸十二酯）、聚（甲基苯丙烯酸酯）、聚（曱基丙烯酸酯）、聚（異丙基丙烯酸酯）、聚（異丁基丙烯酸酯），及聚（丙烯酸十八

(. 酯）；聚乙烯化合物，包括聚乙烯醇、聚乙烯酯、聚乙烯醚、裝乙稀鹵化物、聚（醋酸乙烯）、聚乙烯吼嘻烧酮、聚乙交醇、聚矽氧烷、聚氨酯及其共聚物，纖維素包括烷基纖維素、烴基烷纖維素、纖維素酯、纖維素醚、硝化纖維素、曱基纖維素、乙酸纖維素、丙酸纖維素、丁酸纖維素、丁酸乙酸纖維素、醋酸鄰苯上曱酸纖維素、磺酸鈉鹽纖維素，聚丙烯，聚乙烯包括聚（乙二醇）、聚（環氧乙烯），聚（對苯二甲酸乙二西及聚笨乙烯。曰該聚合物可以是一可生物分解之聚合物，包括一合成性可生物分解聚合物（例如乳酸及乙醇酸之聚合物、㈣、聚（正）醋、聚氨基卸酸、聚（丁酸）、聚（戊酸），以及聚己内S旨），以及一種自然性可生物分解之聚合物（例如藻酸及其他多醃類包括葡萄聚糖、纖維素、膠原蛋白），及其化學射物（化學基團 :取代、添加，例如燒基、炔屬烴、氫氧化、氧化，及i他二領域具有通常知識者所熟習之修飾作用），血清白蛋白及其親水性蛋白f (例如玉蜀黍蛋白質及谷醇溶蛋白以及疏水ς -39 - 200920404 蛋白質））’及其共聚合體或混合物。一般而言，此些材料可經酵素Jc解或紅由體内水分，藉由表面或整體侵错而分解。该聚合物可以是一具生物黏性之聚合物，例如H s y，C. p. pathak and J. A. Hubbell 在 Macromolecules 993’ 26’ 581-587 所發表的 bioerodible hydrogel，如在此所

述’聚透明質酸、路蛋白、明膠、明膠蛋白、聚酐、聚丙稀酸、1酸、幾丁質、聚（甲基丙烯酸曱酷）、聚（甲基丙稀酸乙酯）、聚（甲基丙烯酸丁酯）、聚（甲基丙烯酸異丁酯）、聚（曱基 :烯：己酯)、聚(甲基丙烯酸異葵酯)' 聚(曱基丙烯酸十二醋）、聚（甲基苯丙稀酸醋）、聚（甲基丙烯酸稀酸醋）、聚（異丁基丙稀_)，及聚；(丙烯酸)十八^；'。丙基丙具方&例中’此聚合物係為一水溶性聚合物 v p π丨工來奶。週當的 ’溶性聚合物包括在該領域熟習此技藝者所知，例如聚乙婦吼略烧酮、㈣基纖維素(Hpc;❿叫、經丙基甲基纖维本 (HPMC; Methocel)、經丙基乙基纖維素、㈣基丁基纖維素丁、經丙基戊基纖維素、經丙基乙基纖維素、甲基纖維纖維素（Ethocel)、羥乙基纖維素，各種 :、土缺本^ 分裡把化緘維素、烴烷化纖、准素，各種_維素、縣纖維素、基纖維素、_ 甲基纖維素、醋酸乙稀/巴域絲物，各縣烴 ^丙煙甲基甲基丙烯酸、甲基丙《共聚物、聚甲基⑽酸 -丙《甲酯、馬來酐/甲基乙烯醋共聚物、聚烯醇、納及每 -40 - 200920404 聚丙烯酸、聚丙烯酸、酸性羧基聚合物、羧酸聚曱烷、羧酸烯聚合物、聚氧化乙烧、聚氧化丙烧共聚物、曱基乙烯基醚-馬來酐共聚物、羧曱基醯胺、鉀曱基丙烯酯-二烯苯共聚物、聚乙二醇、聚環氧乙烷，及其衍生物、鹽類及其組合。在一實施例中，此聚合物係為一聚稀烴基二醇，包括例如聚乙二醇（PEG)。此碳水化合物可以是任何由一羰基結合一 α殘基團所組成之碳水化合物。此碳水化合物可以是由一幾基結合一 α殘基團所衍生之碳水化合物。就此而言，此碳水化合物可以是由單糖（例如葡萄糖、半乳糖、果糖），雙糖（例如蔗糖、乳糖、麥芽糖），寡糖（例如棉子糖、木蘇糖），多糖（例如澱粉 '澱粉酵素、支鏈澱粉、纖維素、幾丁質、愈傷葡聚糖，海帶聚糖，木聚糖，甘露聚糖，岩藻依多糖，半乳糖甘露聚糖）所衍生之碳水化合物。就包括化學式IV之胰高血糖素擷抗劑而言，其脂質可以是任何由一羰基結合一 α殘基團所組成之脂質。此脂質可以是由一幾基結名—α殘基團所衍生之脂質。就此而言，此脂質可以是脂肪酸之衍生物（例如C4-C30之脂肪酸、二十酸、前列腺素、白三烯素、凝血脂素、Ν-醯基膽胺），甘油脂（例如單、雙、三取代甘油），甘油ί粦脂（ί粦脂醯膽驗、ί粦脂酿肌醇、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸），鞘脂質（e.g.,鞘胺醇、腦醯 -41 - 200920404 胺），固醇類（e.g.，類固醇、膽固醇），戊烯醇，糖脂質，聚酮。油、臘質、膽固醇、固醇、脂溶性維他命、單酸甘油、二酸甘油、三酸甘油、磷脂質。在一實施例中’ R7之分子量約在l〇〇kDa以下，例如約 90kDa以下，約80kDa以下，約70kDa以下，約60kDa以下，約50kDa以下，約40kDa以下。同理，R7之分子量可以在35kDa 以下’例如約30kDa以下，約25kDa以下，約20kDa以下，約15kDa以下，約i〇kDa以下，約5kDa以下，或約ikDa。在另一實施例中’胰高jk糖素擷抗劑包括如A，其2-6 個胺基酸其中兩連續胺基酸係由酯鍵或醚鍵所連結。酯或醚鍵結可以是例如在第2、3胺基酸之間，第3、4胺基酸之間，第4、5胺基酸之間，第5、6胺基酸之間。胰高血糖素擷抗劑亦可進一步地修飾，包括藉由共價鍵結於另一化學官能基，包括結合於一聚合物（例如親水性聚合物）、烷化或醯化。 ί 該胜肽可包括任何合成或自然生成之胺基酸，其中兩連續胺基酸係由酯鍵或醚鍵所連結。在一特定實施例中，該胜肽ι括天然胰同血糖素之胺基酸序列。例如，該胜肽可包括天然胰高血糖素之j到6(SEQIDNO:l)，其中j為卜2、3、 4或5。另外，此胜肽可包括SEQIDN〇: i之胺基端序列加上夂或夕個如基酸修飾。第！號位置或第2號位置之胺基酸可 I1牛低/、對於第四型二肽肽酶之敏感性。舉例來說，胰高血糖 -42 - 200920404 素擷抗劑之第1號位置係為選自下列群組之胺基酸：D-組胺酸、alpha, alpha-雙曱基°米吐乙酸（DMIA)、N-甲基組胺酸、 alpha-曱基組胺酸、咪唑乙酸、去胺基組胺酸、烴基組胺酸' 乙醯組胺酸及同組胺酸。更進一步地，在某些實施例中，胰高血糖素擷抗劑之第2號位置係選自下列群組之胺基酸： D-serine, D-alanine, valine, glycine, N-methyl serine, N-methyl alanine, and aminoisobutyric acid (AIB)同時，胰高血糖素擷抗劑之第3號位置係為麩胺酸，和天然胰高血糖素擷抗劑在該位置為麩醯胺酸之情形相反。據此，胰高血糖素擷抗劑之胺基酸序列可包括如下：

Xaai-Xaa2-Xaa3-Thr-Gly-Phe (SEQ ID NO: 68);

Xaa2-Xaa3-Thr-Gly-Phe (SEQ ID NO: 69);或

Xaa3-Thr-Gly-Phe (SEQ ID NO: 70); 其中Xaai係為選自下列群組：組胺酸、D-組胺酸，alpha, alpha-雙曱基咪唑乙酸(DMIA)、N-曱基組胺酸、alpha-曱基組胺酸、咪唑乙酸、去胺基組胺酸、氫氧基組胺酸、乙醯化組胺酸及同組胺酸，Xaa2係為選自下列群組：絲胺酸、D-絲胺酸、D-丙胺酸、纈氨酸、甘胺酸、N-曱基絲胺酸，N-曱基丙胺酸以及胺基異丁酸(AIB)，以及Xaa3係為麩胺酸或麩 -43 - 200920404 酿胺酸。本發明之實施例亦包含胰高血糖素擷抗劑之羧基端胺基酸之羧酸被取代為氨基基團之實施例。胰尚血糖素擷抗劑可進一步地修飾以增加在生理pH範圍水浴液中的溶解度，且可保留胰高血糖素擷抗劑活性。在天然胜肽的1，16，17, 20, 21，24及29號位置引入親水性基團，或是在羧基端，可以增加在生理pH範圍水溶液中的溶解度，也可保留胰高血糖素擷抗劑活性。因此，在一實施例中胰高血糖素擷抗劑可進一步修飾為包括一或多個親水性基團，共價鍵結於胺基酸的側鏈，對應於天然胜肽的胺基端或羧基端之第1，16, 17, 20, 21，24及29號位置。在另一實施例中，對應於天然胜肽的第i6及24號位置，共價鍵結於親水性基團，且在一實施例中，親水性基團係為聚乙二醇(pEG)。 a在某些實施例中，胰高血糖素擷抗劑係為聚乙二醇化，夷尚血糖素擷抗劑包括較短的胰高血糖素胜肽，在，，胺基端” 6 29位置之胺基酸係為苯基乳酸add)。此些胰 1糖素揭抗劑係具有獨特的優點。和胺基端為苯丙胺酸之 /、、、:胰n血糖素相比，此些胰高血糖素擷抗劑係為具有較佳立胜肽且由於聚乙二醇化，某些未見於天然苯丙胺酸之部份1可抑制胰高血糖素激動活性。最後，除本文所述 "號位置私基酸之取代係為擷抗活性所需之外，發明人 -44 - 200920404 亦發現一驚人結果，即是在PLA6_(6_29)胰高血糖素相似物中不再需要此種取代作用。在一實施例中，胰高血糖素擷抗劑之胺基酸至少取代為一半胱胺酸，其中半胱胺酸之側鏈殘基更修飾為一硫醇活性劑，包括例如馬來酰亞氨基、乙烯基砜、2-吡啶二硫化物、鹵化烷，以及hal〇acy。此些硫醇活性劑可包括羧基、醐基、氫氧基及醚基等，且親水性基團係為例如聚乙二醇單元。在另一實施例中，胰高血糖素擷抗劑之一胺基酸取代為離胺酸’且其取代之離胺酸之側鏈更可以胺類活性劑例如羧酸之糾生醋（例如丁二酰亞氨、酐等）進行修飾，或是親水性基團之私例如聚乙m施例中，相料天然姨高血糖素胜肽第12號位置之—離胺酸被取代為精胺酸，及―取代之離胺酸被插入至天然胰高血糖素胜肽第1，16,^20,2124或29 號位置’歧—離㈣添加至胰高血糖素擷抗劑之胺基端或在，—實施例中，將天舰肽第27號位置之甲硫胺酸取代為白胺酸或正白胺酸以防止胜肽之氧化分解。在實施例中，任何在此提到之胰高血糖素用:戴斷、刪除一或二個編之胺基酸進行修飾作用（例如，天'然胰高血糖素肽之第29號位置或第心心位置)’且不影響對於胰高血糖素受體之活性及/或效能。就： -45 - 200920404 rnj a 今、人r/τ迎心耿问皿糖京擷抗劑係可主要地包天然胰高血糖素肽（SEQ ID NO. 1)之！ π】。匕或包括

；i-z/, 1-28, 2-27 2-7R 3-27, 3-28, 4_27, 4_28, 5_27, 5_28, 6_27，’ ，七斗、# , 月女基酸，且且有一或多個修飾作用以達到本文所述< 冑古 /、性。 Μ之騰π血糖素掏抗劑活

本文中所揭露之胰高血糖素擷抗劑亦包含在某些位置之胺基酸取代作用，且該独置在原本之騰高血糖素錄中= 認為是不重要的。在-實施例中，該些取代作用係、為在某_ 至二個位置之保留性胺基酸取代作用，該些位置係包括選自由下列位置組成之群組：SEQIDN〇:39之第2, 5,6 7 8 9 A 13, 14, 15, 16, 19,22,23 或 24 號位置。在;_實施例中，’ 胰高血糖素擷抗劑包括一 SEQ〗D Ν〇· 42之衍生性胜肽，其中胰高血糖素胜肽更包括一胺基酸取代作用，位於相對於seq ID NO: 42之一至三個位置，該些位置係包括選自由下列位置組成之群組：SEQ ID N0: 42 之第 2, 5, 6, 8, 9, 12, 13 或 14 號位置。在一實施例中，SEQ IDN0: 4‘2 之第 2, 5, 6, 8, 9, 12, 13 或Η號位置之取代作用係為保留性胺基酸取代作用。在一實轭例中，相對於天然胰高血糖素胜肽之第16, 17, 20, 21，24或 "唬位置，且更進一步地在第21及/或24號位置被取代為半胱胺酸或離胺酸，其中一聚乙二烯鏈係共價結合於該取代後之半耽胺酸或離胺酸。 -46 - 200920404 在此些實施例中，胰高血糖素擷抗劑包括一聚乙二醇鏈，其可以為一直鏈或支鏈之形式。在一實施例中，聚乙二醇鏈之平均分子量係為選自500-10,000道耳吞之範圍。在一實施例中，聚乙二醇鏈之平均分子量係為選自1，000-5,000道耳吞之範圍。在一實施例中，聚乙二醇鏈之平均分子量係為選自1，000-2,000道耳吞之範圍。在一實施例中，聚乙二醇鏈之平均分子量大約係1,000道耳吞。在一實施例中，修飾過之胰高血糖素擷抗劑包括共價結合有兩個或兩個以上之聚乙二醇鏈，其中總分子量係為約 1，000-5,000道耳吞之範圍。在一實施例中，聚乙二醇化之胰高血糖素擷抗劑包括一胜肽，該胜肽係包括選自由下列序列組成之群組：SEQ ID NO: 12,及SEQ ID NO: 22，其中該胜肽包括在第11及19號位置結合一聚乙二醇鏈，且聚乙二醇鏈之分子量係為約1，000-5,000道耳吞之範圍。在一實施例中，胰高血糖素擷抗劑包括一胜肽係選自由下列序列組成之群組： ‘

Ri-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Arg-Arg -Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu- Xaa-Asn-Thr-R2 (SEQ ID NO: 9),

Ri-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Xaa-Phe-Val-Gln-Trp-Leu- Xaa-Asn-Thr-R2 (SEQ ID -47 - 200920404 NO: 10)，

Ri-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Asn-Thr-R2 (SEQ ID NO: 11)以及

Ri-Phe-Thr-Ser-Xaa-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Xaa-Phe-Val-Xaa-Trp-Leu- Xaa-Asn-Thr-R2 (SEQ ID NO: 12)，其中在第4號位置之Xaa =天冬胺酸、麩胺酸、半胱磺胺酸、同半胱磺胺酸，在第7號位置之Xaa=離胺酸或精胺酸，在第 10號位置之Xaa =天冬胺酸、半胱磺胺酸、麩胺酸、同半麩胺酸、同半胱碜胺酸，在第11號位置之Xaa =絲胺酸、離胺酸、半胱胺酸、鳥胺酸、同半胱胺酸或乙醯化苯丙胺酸，在第16號位置之Xaa =天冬胺酸、離胺酸、半胱胺酸、鳥胺酸、同半胱胺酸或乙醯化苯丙胺酸，在第19號位置之Xaa =麩醯胺酸、離胺酸、半胱胺酸、鳥胺酸‘、同半胱胺酸或乙醯化苯丙胺酸，在第22號位置之Xaa =曱硫胺酸、白胺酸或正白胺酸，R!係為氫氧基或胺基，且R2係為羧基或酰胺基，其中該胜肽係在SEQ ID NO: 9之第11號位置、SEQ ID NO: 10之第16號位置、SEQ ID NO: 11之第19號位置、SEQ ID NO: 12 之第16及19號位置聚乙二醇化。 -48 - 200920404 在一實施例中，該胜肽係包括選自由SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16 所組成之群組，其中該胜肽係在SEQ ID NO: 9,. SEQ ID NO: 13之第11號位置、SEQ ID NO: 10之第16號位置、SEQ ID NO: ' 10, SEQ ID NO: 14之第19號位置聚乙二醇化。在一實施例中，在此揭露之胰高血糖素擷抗劑之羧基端胺基酸具有一取 Γ 代羧酸基之醯胺基。在一實施例中，胰高血糖素擷抗劑係包括SEQ ID NO: 18之序列。在一實施例中，提供一胰高血糖素擷抗劑其中一血漿蛋白共價結合於其胺基酸之側鏈，以促進其溶解度、穩定性及/ 或胰高血糖素胜肽之藥物動力學。例如，血清蛋白可共價結合於本文所述之胰高血糖素擷抗劑。在一實施例中，血漿蛋白共價結合於一胺基酸，該胺基酸位置係為相對於天然胰高血糖素胜肽之第16, 17, 20, 21, 24或29號位置。更，在一實 I , 施例中，血漿蛋白共價結合於天然胰高血糖素胜肽之第16或 24號位置胺基酸，其中胰高血糖素擷抗劑包括SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 39.在一實施例中，胰高血糖素擷抗 -49 - 200920404 劑包括一胜肽，係選自由下列序列所組成之群組jEQ仍N〇: 9，SEQIDNO:l〇，SEQIDN〇:li 以及 SEqjDN〇:12. 在一實施例中，提供一胰高血糖素擷抗劑其中一線性胺基酸序列代表免疫球蛋白分子的Fc部位，共價連結本文所述之姨兩血糖素掏抗劑之一胺基酸之側鏈，以促進其溶解度、穩定性及/或胰咼血糖素胜肽之藥物動力學。代表免疫球蛋白分子Fc部位之胺基酸序列可共價鍵結於SEq m N〇: 7, seq 10 1^0:39之胰高血糖素胜肽之第11,12,15，16,19,21或24 號位置，或是胰高血糖素之相似物。在一實施例中，代表免疫球蛋白分子Fc部位之胺基酸序列係共價鍵結於SEq ID N〇: 6’ SEQ ID NO: 7’ SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 36 之胰高血糖素擷抗劑胜肽之第11, 19號位置。通常以部位係由IgG分離出來，但由任何免疫球蛋白分離出來的Fc部位應具有功效。在κ把例中，胰两血糖素操抗劑包括一胰高血糖素胜肽， δ亥胜肽係為選自由下列序列所組成之群組：SEq ID no: 3 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8, 及SEQ ID NO: 39，其中Fc部位係結合於相對於天然胰高血糖素胜肽之第16, 17, 20, 21，24或29號位置。在一實施例中，胰尚血糖素擷抗劑包括一胰高血糖素胜肽，該胜肽係為選自由下列序列所組成之群組：SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1〇, SEQIDNO:ll及SEQIDN0:12，其中^部位係分別地結 -50 - 200920404 合於 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: π 之第 u 16或19號位置，且同時結合於SEQ ID N〇: 12之第u及 19號位置。

本文所揭露同時包括在本文之胰高血糖素胜肽所結合的其他結合物，選擇性地透過共價鍵結及透過一連結子，以結合於該結合物。該連結可經由化學共價鍵，物理力例如靜電力、風鍵、離子鍵、凡得瓦力、親水性或疏水性作用力。可利用各财㈣料價鍵結方式，包括生物素·抗生物白，配體/叉體，酵素/受質，核㈣/核㈣結合W :=蛋白，細胞黏合分子；或任何結合該結合物或;：此間具有親和力之片段。攸如-:：二可！:ΓΓ限於’一異質胜肽或多肽(包括例显邻位 “巴藥劑’-免疫球蛋白或其部位(例如變呉部位、CDR部位或Fc卹私、又素、螢光、或酵素 ^)’ 一診斷標記例如放射線同位他醫療或診斷㈣合物包括水溶性聚合物，或其本發明之姨高二:肽Π:蛋:供-結合物，其包括自由下列蛋白質所組成之群,且.：’其中血漿蛋白係選原、球蛋白。在—實施例中，έ 7、運鐵蛋白、纖維素蛋白或運鐵蛋白。在某些實施二:基團係為白個原子或更多之鏈長。_5、210 υ包括由Li，〇、5-10、10-20個原子之鏈長。 * 5!. 200920404 在某二Λ〜财’組成連結子之骨幹之鍵原子係選自由下列 #·；!甘成之群組·兔、氧、氮及硫。鏈原子及結合子係選自期望之溶解度(親水性）’以提供—更易溶解之結合物。音^些貫施例中，連結子提供—官能基，該官能基易受到酵甘'刀=或其他催化劑或在標的組織會器官或細胞中水解。在二-只細例中，連結子之長度足以減少立體結構障礙之效 :。若連結子係、為—共價鍵或—肽鍵且結合物 f合物㈣—融合蛋白。此類肽連結子可以為任何長 …兄明例之連結子係由約㈣胺基酸長度，5_5m，w =胺基酸長度。融合蛋白可以擇―地藉由該領域具通节知識者所熟知的基因重組卫程方法所生成。高血糖素之第15·16號位置之天冬跡絲胺酸 =:作為一獨特且不穩定之雙肽，可導致天然荷爾蒙在 =液中過早的化學分解。例如，當維持在請㈣丨，η % ::’錯！1過50%之天然胰高血糖素可能分解成片段。兩且二:：t M5 &16-29係缺乏類騰高血糖素生化活性妒赌^液中預先形成胰高血糖素及其相似物。在天 =南血糖素第15號位置天冬胺酸取代為麵胺酸之選擇性取代貫際上排除了在第15_16號位置胜肽鍵之切開。因此’可預期本發明之胰高血飾以降低在水性緩衝液中早期分解之敏感二： -52 - 200920404 例，胰高血糖素擷抗劑可進一步地修飾，將第15號位置之天冬胺酸取代為選自由下列胺基酸組成之群組，以增加在水溶液中之穩定度，該群組包括：半胱磺酸、麵胺酸、同麩胺酸以及时續胺酸。依據一實施例，SEQ m N〇: 39之姨高血糖頡抗劑之第10號位置之天冬胺酸可取代為選自由下列胺基酸組成之群組：半胱續酸、㈣酸、同麩胺酸以及同半績胺酸，且在一實施例中，SEQ m N〇: 39之第1〇號位置之天久 :==:酸。在一實施例中’提供-胰高血糖素擷抗石、又土 ’ ☆解度’其'^胰高血糖素操抗劑係包括選自由 SE〇rr 成之群組：SEQID N〇:36, seq id 耻及胺化。42纟進—步實施例中胰高血糖素掏抗劑係為醒穩定:，亦d:第？:糖素擷抗劑藉由減少分解以增加之順序)取代為麵胺酸、同麵胺酸、胰“糖素酸。在另-實施例中，胰高血糖素 ^文以及同半石頁胺 (依據天块胰古〜掭本 '、邊抗㈣弟16號位置絲胺酸 :天J“血糖素之順序)被取看，姨馬血糖素操抗劍之修飾文更進步來胺化。匕括—竣基端羧酸且未醯在Ά把例中提供一胰高血韓素胜肽，係選自由下列序列组成之=抗劍，包括一姨高血成之群組：SEQIDN〇:7 Seq -53 - 200920404 ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 以及 SEQ ID NO: 44,更藉由在胰高血糖素胜肽之第11, 12, 15, 16, 19及/或24號位置之一或多個位置進行取代修飾，其中取代修飾包括以一具有適於交叉結合於親水性基圑之侧鏈之胺基酸進行取代，包括例如聚乙二醇。天然胰高血糖素胜肽可以一天然的或合成的 (非天然生成的）胺基酸進行取代。合成的（非天然生成的）係指非在體内生成之胺基酸，然而，可與在此所述之胜肽進行作用。在一實施例中提供一胰高血糖素擷抗劑，其中該胜肽包括 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40，SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 以及 SEQ ID NO: 44,且更包括一聚乙烯鏈，結合於對應天然胰高血糖素胜肽之第21及24號位置。在更進一步實施例中，胰高血糖素胜肽之羧基端藉由醯胺基取代羧酸基進行修飾。發明人同時發現到，天然胰高血糖素可藉由在羧基端修飾帶電荷以增加胰高血糖素的溶解度。增加其溶解度可使胰高jk糖素溶液製備或保存於中性pH值之環境。在相對中性pH 值（例如pH值約在6.0至8.0之間）之溶液中製備胰高血糖素可增加胰高血糖素胜肽之穩定性。同時本發明人發現，本文中的天然胰高血糖素擷抗劑可藉由相似的修飾作用增加騰高血糖素操抗劑在相對中性pH值 -54 - 200920404 (例如pH值約在6.0至8.0之間）之溶液中的溶解度。據此，本發明之一實施例指出，SEQ ID NO: 39之胰高血糖素擷抗劑更進一步地修飾，相對於在野生型胰高血糖素（SEQ ID NO: 1) 之第6-29號位置藉由將不帶電荷之胺基酸取代為帶電荷之胺基酸增加以攜帶電荷，或在叛基端添加帶有電荷之胺基酸。在一實施例中，SEQ ID NO: 39之胰高血糖素擷抗劑之1-3個不帶電荷之胺基酸被取代為一帶電荷之胺基酸。在一實施例中，該帶電荷之胺基酸係選自由下列胺基酸組成之群組：離胺酸、精胺酸、組胺酸、天冬胺酸及麩胺酸。特別是，本發明人發現到，在相對於天然胰高血糖素之第28及/或29號位置天然形成之胺基酸取代為帶電荷之胺基酸，及/或在羧基端添加1 -2.個帶有電荷之胺基酸，以增進在生理pH值範圍（例如 pH值約在6.5至7.5之間）之溶液中的溶解度及穩定性。因此，在此所揭露之胰高血糖素擷抗劑之同類的修飾作用被預期在水性溶液中亦具有相似的功效，特別是在pH範圍在約5.5-8.0 之間，用以保存原胜肽之生物活性時。在一實施例中，SEQ ID NO: 39之胰高血糖素擷抗劑在相對於天然胰高血糖素之第28及/或29號位置天然形成之胺基酸取代為帶負電荷之胺基酸（例如天冬胺酸及麩胺酸），以及選擇性地添加帶負電荷之胺基酸於該胜肽之羧基端。在一實施例中，SEQ ID NO: 39之胰高血糖素擷抗劑在相對於天然胰高 -55 - 200920404 血糖素之第29號位置天然形成之胺基酸取代為帶正電荷之胺基酸（例如離胺酸、精胺酸、組胺酸），以及選擇性地添加帶正電荷（例如離胺酸、精胺酸、組胺酸）之胺基酸於該胜肽之羧基端。在一實施例中，提供一具有較佳溶解度及穩定性之胰高也糖素相似物，其中該相似物包括SEQ ID NO·· 41，且其中 SEQ ID NO: 41之第23或24號位置之至少一胺基酸被取代為 f 酸性胺基酸，及/或在SEQ ID NO: 41之羧基端添加一酸性胺基酸。在一實施例中，酸性胺基酸係選自由下列胺基酸組成之群組：天冬胺酸、麩胺酸、半胱磺胺酸、同半胱磺胺酸。在一實施例中，提供一具有較佳溶解度及穩定性之胰高血糖素擷抗劑，該胰高血糖素擷抗劑之胺基酸序列包括seq ID NO: 41，SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 或 SEQ ID N0: :4,且其中第23或24號位置之至少一胺基酸被取代為非天然月:基酉义（例如’第23或24號位置之至少—胺基酸取代為酸性 &基酸’且該酸性胺基酸係不同於對應SEQ ID NO: 7相同位置之胺基酸）。在-實_中，提供^騰高血糖素激動劑包括 Q N〇. 41或42，且第23號位置係為天冬醯胺酸，且第 24號位置係為蘇胺酸，該胜肽更進—步包括^胺基酸添加於其絲端，《基Μ選自由下列絲酸㈣之群組··離胺酸、精胺酸、組胺酸、天冬胺酸或麵胺酸。本發明亦提供-姨高血糖㈣抗㈣合胜肽，其中在該 -56 - 200920404 融合胜狀叛基端結合一第二胜狀。更進一步地，融合胜狀可包括一具有SEQ ID NO: 44之胰高血糖素擷抗劑胜肽，且更包括在其羧基端結合有 SEQ ID NO: 19 (GPSSGAPPPS)，SEQ ID NO: 20 (Lys Arg Asn Arg Asn Asn lie Ala )或 SEQ ID NO: 21 (Lys Arg Asn Arg).在一實施例中，SEQ ID NO: 19之胺基酸序列（GPSSGAPPPS)係透過一肽鍵結合於胰高血糖素擷抗劑之第24號位置之胺基酸。在另一實施例中，融合胜肽可包括一具有 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO·· 41 或 SEQ ID NO·· 43 之胰高血糖素擷抗劑胜肽，且更包括在其第24號位置胺基酸結合有SEQ ID NO: 19 (GPSSGAPPPS).在另一實施例中，融合胜肽可包括一具有 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 或 SEQ ID NO: 43 之胰高血糖素擷抗劑胜肽，且更包括在其第24號位置胺基酸結合有 SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 或 SEQ ID NO: 53. 在一實施例中，胰高血糖素擷抗劑融合胜肽包括一序列，係選自由下列序列組成之群組：SEQ ID NO: 46及SEQ ID NO 47.在進一步實施例中，融合胜肽之羧基端羧酸取代為一醯胺基。在一實施例中，提供一胰高血糖素擷抗劑融合胜肽其中該融合胜肽之胰高血糖素擷抗劑部分係選自由下列序列組成 -57 - 200920404 之群組：SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO·· 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 以及 SEQ ID NO: 39,且 SEQ ID NO: 19 融合至胰高血糖素擷抗劑部分之羧基端，且其中PEG鏈之分子量 ( 係為500 - 40,000道耳吞。特別是在一實施例中，胰高血糖素擷抗劑係選自由下列序列組成之群組：SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 46 及SEQ ID NO: 47且其中PEG鏈之分子量係為500 - 5,000道耳吞，且在另一實施例中，PEG鏈之分子量係約為1，000道耳吞。在進一步實施例中，融合胜肽之羧基端羧酸取代為一醯胺基。胰高血糖素擷抗劑可進一步地包括添加1-2個帶電荷之 I, 胺基酸至羧基端。在一實施例中，其中添加1-2個帶電荷之胺基酸至SEQ ID NO: 44之羧基端，該胺基酸係為帶負電荷之胺基酸，包括例如麩胺酸及天冬胺酸。在一實施例中，胰高血糖素擷抗劑包括SEQ ID NO: 42，其中對應於天然胰高血糖素胜肽之第27及28號位置之至少其中之一係選自由下列胺基酸組成之群組：天冬胺酸、麩胺酸，且其中SEQ ID NO: 42 係選擇性地進行修飾包括在羧基端添加1-2個帶負電荷之胺 -58 - 200920404 基酸。在—實施例中，帶負電荷天冬胺酸。、土酉夂係為例如麩胺酸及在另—實施例中，SEQ ID N〇. 4 溶解度可藉由共價鍵結一親水性基夷== 4 24 ® 示 1J，12，15，16，19 、° 0於第11，16或19號位置，在進一步皆團係結合於第19心署/ 貫把例中，親水性基血將… 貫施例中，親水性基團係為- 水其園免疫球蛋白之Fe部位，且在另—實施例中，親 ^ 碳氫化合物鏈。在—實施财，親水性基團係為聚乙二醇，其分子量範圍係約為1，G0() _ 5’_道耳吞。在另一實施例中，親水性基團係為聚乙二醇，其分子量至少為20’〇〇〇逼耳吞。在一實施例中，該經過聚乙稀化修飾的胰高血糖素擷抗劑包括SEQ m N〇: 9, SEQ m N〇: 1〇, seq m NO: 11，SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 43, SEQ ID N0: 44 或 SEQ ID NO： 45. 在一貫施例中，胰高血糖素擷抗劑係由在此所述之 A-B-C結構組成’其中a係選自下列群組： ⑴苯基乳酸（PLA); (ii) 苯基乳酸之氧化衍生物； (iii) 一種2-6個胺基酸組成之胜肽，且該胜肽之其中兩連續 -59 - 200920404 胺基酸係由一酯鍵或一醚鍵鍵結連接 B代表SEQIDNO: 1之胺基酸^丨26，其中量係為3,4, 5, 6,或7之中隨意地由一或多個胺基酸修飾所組成，其中該胺 - 基酸修飾係選自下列群組： (iv)第9號位置之天冬胺酸（依據SEq m N〇: 1之胺基酸序 ( 列）取代為麩胺酸，半胱胺酸之硫酸化衍生物，同麵胺酉文β同麵I女酸或一種半胱胺酸之烧叛化衍生物、或一種由半胱胺酸衍生出且包含下列化學結構之羧基烷衍生物： η2ν、

,CO〇H H2C、

S

I X5'

COOH 其中X5係為Ci-Q烧基，C2_C4屬烴或C2_C4块基 Ο)取代下列位置胺基酸之其中之—或二，第⑺、α及 24號位置（依據SEQ m N〇:丨之胺基酸序列），以一共價結合結合於_ m _或垸基胺鍵合之胺基酸取代； -60 - 200920404 (Vi)取代下列位置胺基酸之其中之一或二，第16、17、 20、21及24號位置（依據SEq ID no: 1之胺基酸序列）’以下列胺基酸組成之群組之一：半胱胺酸、離胺酸、鳥胺酸、同半胱胺酸以及乙醯苯丙胺酸 (Ac-Phe)，其中群組中之胺基酸係共價結合於其親水性之基團； ' (Vll)將第15號位置之天冬胺酸（依據SEQ ID NO: 1 之fe基I序列）取代為半胱續酸、麵胺酸、同麩胺酸以及同半磺胺酸； (vm)將第16號位置之絲胺酸(依據SEQ IDN〇: i之胺基敲序列）取代為半胱磺酸、麩胺酸、同麩胺酸以及同半石黃胺酸； (i X)將第16、2 0、21及2 4號位置之一或多個位置取代為氨基異丁酸，依據SEQidn〇: i之胺基酸序列；而C係為選自下列群組：， (X) X; (xi) X-Y； (xii) X-Y-Z;以及 (xiii) X-Y-Z-RlO, 其中乂係為勤山〜或服：丫係為八犯或一帶電荷之胺 -61- 200920404 基酸；z係為蘇胺酸、甘胺酸、半胱胺酸、離胺酸、鳥胺酸 (Orn)、同半胱胺酸或乙醯苯丙胺酸(Ac-Phe)，或帶電荷之胺基酸，其中R10係選自由SEQ ID NOs: 19-21及53所組成之群組；以及 (xiv)任何（X)到（xiii)其中羧基端羧基係由胺基所取代。在一特定方面來看，胰高血糖素擷抗劑包括一苯基乳酸之氧化衍生物。例如一苯基乳酸之醋或謎。在一實施例中，苯基乳酸之酯包括分子式IV :

分子式IV 其中R7係為一藉由PLA之氫氧基與具有親核性之羰基反應形成的酯。在一特定實施例中，笨基乳酸之氧化衍生物包括一化學 -62 - 200920404 基團組，丰暴團係選自由聚合物(例如聚乙二醇)組成之韵碳水化合物、—脸A缺 n. nL ^ 胺基馱、一胜肽、或一脂質肪酸或是類固醇，Α由—_ & m J ^ ^其中该化學基團係透過含賴)連結於苯基乳酸。 ⑼如s曰或在一特定實施例中，其化學基團係、為-胺基酸，選擇性地，可為胜肽之-部份，例如在化學式IV中為一縮醋環狀。就此來看κ酸可能在胰高血糖素擷抗劑之胺基端胺基酸殘基以外之位置，例如胰高血糖侧抗劑包括—或多個（例如 1，2, 3, 4, 5, 6,或更多）胺基端胺基酸於苯乳酸殘基。舉例來說，胰高血糖素擷抗劑可包括笨乳酸在位置n，豆血糖素掏抗劑之第2,3,4,5，或6號位置。為姨同胺基酸之胺基端結合於苯乳酸殘基可以經由合成反應或自然發生。在一特定實施例中，在胺基酸之胺基端結合苯乳酸殘基係為自然發生。在一實施例中，胺基端結合笨乳酸殘基之胺基酸係為天然胰高血糖素之胺基端胺基酸。舉例來說，姨尚血糖素操抗劑之胺基端胺基酸序列可包括SEQ ID NOs· 54-58之一 ’其中苯乳酸係透過酯鍵結合於蘇胺酸：

SEQ ID NO: 54 His-Ser-Gln-Gly-Thr-PLA SEQ ID NO: 55 Ser-Gln-Gly-Thr-PLA

SEQ ID NO: 56 Gln-Gly-Thr-PLA -63 - 200920404

SEQ ID NO: 57 Gly-Thr-PLA SEQIDNO:58 Thr-PLA 在另《把例中’胺基端其中之—或多個胺基酸可以被取代為天然胰高血糖素所包含之其他胺基酸。例如，當胰高血糖素掘抗劑在第5或6號位置為苯乳酸時，可降低其第！及/或2號位置之胺基酸對於第四型二肽肽酶之敏感性了更進 -步地，在某些實施例中，胰高血糖素操抗劑之第i號位置係選自下列群組之胺基酸：D_組胺酸、alpha, alpha_雙甲基。米坐乙酉文（DMIA)、N-曱基組胺酸、alpha_甲基組胺酸“米唾乙酸、去胺基組胺酸、烴基組胺酸、乙醯組胺酸及同組胺酸。更進v地在某些Λ知例中，胰高血糖素擷抗劑之第2號位置係選自下列群組之胺基酸：絲胺酸、D_絲㈣、酸、绳氨酸、甘胺酸、N_甲基絲胺酸，N_甲基丙胺酸以及胺基異丁酸(AIB)。同時，例如當胰高血糖素擷抗劑在第45 或6號位置為苯錢時，胰高血糖素擷抗社第3號位置係 ^麩胺酸’和天然胰高血糖素操抗劑在該位置為_胺酸之 f月幵/相反。在本發明之—應用例中，胰高血糖素操抗劑之胺基端胺基酸序列係為SEQ ID N〇s: 59_61之一。當胰高血糖素擷抗劑包括化學式IV之結構時，此聚合物可以是任何可與苯乳酸之氫氧基反應之聚合物。該聚合物可 -64 - 200920404 以天然地具有一親核性之羰基。另外，該聚合物也可以由衍生地具有親核性之㈣。該聚合物可以是—由下列群組得到之衍生聚合物，聚醯胺、聚碳酸酯、聚烯及其衍生物，包括聚烯烴基氧化物、聚烯烴基噻唑，下列成分聚合物，包括：丙烯月曰、甲基丙烯酯，包括聚（甲基丙烯酸甲酯）、聚（甲基丙烯酸乙酯）、聚（甲基丙烯酸丁酯）、聚（甲基丙烯酸異丁酯）、聚（曱基丙烯酸己酯）、聚（曱基丙烯酸異葵酯）、聚（甲基丙烯酸十二酯）、聚（甲基苯丙烯酸酯）、聚（甲基丙烯酸酯）、聚（異丙基丙烯酸s旨）、聚（異丁基丙稀酸醋），及聚（丙稀酸十八 :旨)；?么乙烯化合物，包括聚乙烯醇、聚乙烯酯、聚乙烯醚、 ♦乙烯鹵化物、聚（醋酸乙烯）、聚乙烯吼p各烧酮、聚乙交醇、聚石夕氧烧、聚氨S旨及其共聚物，纖維素包括絲纖維素、煙基烷纖維素、纖維素酯、纖維素醚、硝化纖維素、曱基纖維素、乙酸纖維素、丙酸纖維素、丁酸纖維素、τ酸乙酸纖維素、醋酸鄰苯二甲酸纖維素、磺酸鈉鹽纖維素，聚丙烯，聚乙烯包括聚（乙二醇）' 聚（環氧乙烯），聚（對苯二甲酸乙二酯及聚苯乙烯。該聚合物可以是一可生物分解之聚合物，包括一合成性可生物分解聚合物（例如乳酸及乙醇酸之聚合物 '聚酐、聚（正）酯、聚氨基鉀酸酯、聚（丁酸）' 聚（戊酸），以及聚己内酯），以及-種自然性可生物分解之聚合物（例如藻酸及其他多酶類包 -65 - 200920404 H聚糖、纖維素、㈣蛋白），及其化學衍生物(化學基團 ,㈣添加，例如炫基、块屬烴、氫氧化、氧化，及其他二親2有通常知識者所熟習之修飾作用），料白蛋白及其蛋白^蛋白質（例如玉蜀黍蛋白質及谷醇溶蛋白以及疏水性由酵:/及其共聚合體或混合物。一般而言，此些材料可經酵素水解或經由體内水分，藉由表面或整體侵钱而分解。该聚合物可以是-具生物黏性之聚合物，例如H. s. awhney, C. P. Pathak and J. A. Hubbell ^ Macromolecules, ，26, 581_587 所發表的 bi〇er〇dible ，如在此所 y，透明質酸、路蛋白、明膠 '日轉蛋白 '聚酐、聚丙稀 T、澡酸' 幾丁質、聚（曱基丙晞酸曱醋）、聚（甲基丙稀酸乙酯I聚（甲基丙烯酸丁酯）、聚（甲基丙烯酸異丁酯）、聚（甲基 =稀酸己自旨）、聚（曱基丙稀酸異葵醋）、聚（甲基丙稀酸十二酿）、聚（甲基苯丙稀酸S旨）、聚（甲基丙稀酸醋）、聚（異丙基丙烯酸酯)、聚(異丁基丙烯酸酯)，及聚(丙烯酸十八酯)。在貝知例中，此聚合物係為^-水溶性聚合物。適當的水溶性聚合物包括在該領域熟習此技藝者所知，例如聚^ t各㈣、經丙基纖維素（HPC; Klucel)、經丙基甲基纖维素 (HPMC; MethQeei)、㈣基乙基纖維素、㈣基丁基纖維素、經丙基戊基纖維素、經丙基乙基纖維素、甲基纖維素、乙^ 纖維素(Ethocd)、經乙基纖維素，各種烧化纖維素、煙烧化^ -66 - 200920404 維素，各種酯纖維素、羧基纖維素、鈉羧曱基纖維素、鈣羧曱基纖維素、醋酸乙烯/巴豆酸共聚物，各種聚烴烷甲基丙烯酸、烴甲基曱基丙烯酸、甲基丙烯酸共聚物、聚曱基丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、馬來酐/甲基乙烯酯共聚物、聚烯醇、鈉及鈣聚丙烯酸、聚丙烯酸、酸性羧基聚合物、羧酸聚曱烷、羧酸烯聚合物、聚氧化乙烷、聚氧化丙烷共聚物、曱基乙烯基醚-馬來酐共聚物、羧曱基醯胺、鉀甲基丙烯酯-二烯苯共聚物、聚乙二醇、聚環氧乙烷，及其衍生物、鹽類及其組合。在一實施例中，此聚合物係為一聚烯烴基二醇，包括例如聚乙二醇（PEG)。此碳水化合物可以是任何由一羰基結合一 a殘基團所組成之碳水化合物。此碳水化合物可以是由一羰基結合一 α殘基團所衍生之碳水化合物。就此而言，此碳水化合物可以是由單糖（例如葡萄糖、半乳糖、果糖），雙糖（例如蔗糖、乳糖、麥芽糖），寡糖（例如棉子糖、木蘇糖），多糖(例如澱粉、澱粉酵素、支鏈澱粉、纖維素、幾丁質、愈傷葡聚糖、海帶聚糖、木聚糖、甘露聚糖、岩澡依多糖、半乳糖甘露聚糖）所少亍生之碳水化合物。就包括化學式IV之胰高血糖素擷抗劑而言，其脂質可以是任何由一羰基結合一α殘基圑所組成之脂質。此脂質可以是由一羰基結合一 α殘基團所衍生之脂質。就此而言，此脂 -67 - 200920404 質可以是脂肪酸之衍生物（例如C4_C30之脂肪酸、二十酸，前列腺素，白二烯素，凝血脂素，N_醯基膽胺），甘油脂（例如單、雙、二取代甘油）’甘油磷脂（磷脂醯膽鹼、磷脂醯肌醇、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸），勒脂質（e.g•，鞘胺醇、腦醯胺），固醇類（e.g.，類固醇、膽固醇），戊烯醇，糖脂質，聚嗣。油、臘質、膽固醇、固醇、脂溶性維他命、單酸甘油、二酸甘油、三酸甘油、磷脂質。在一實把例中，R7之分子量約在4〇kDa或更少。因此， R7之刀子里約在35 kDa或更少，約在3G kDa或更少，約在 25 _或更少，約在20 kDa或更少，約在15 kDa或更少，約在H)kDa，更少’約在'5咖或更少，約在或更少。在另一實施例中，胰高血糖素掏抗劑包括如A，其2_6 個胺基u兩連續胺基酸係由g旨鍵或_鍵所連結。該胜肽 σ，括'何D成或自然生成之胺基酸，其中兩連續胺基酸係由g曰鍵或輯所連結。在—特定實施例巾，該胜肽包括天然 2血糖素之絲酸序列。例如’難肽可包括天然胰高血糖素之jflj6(SEQlD耻…其中如、2、3、4或5。另括SEQIDN0:1之胺基端序列加上—或多個號位置或第2號位置之胺基酸可降低其對之第肽酶之敏感性。舉例來說，胰高血糖素榻抗劑 ^係為選自下列群組之胺基酸：D-组胺酸、alpha， -68- 200920404 alpha-雙曱基σ米。坐乙酸（DMI A)、N-甲基組胺酸、alpha-甲基組胺酸、咪唑乙酸、去胺基組胺酸、烴基組胺酸、乙醯組胺酸及同組胺酸。更進一步地，在某些實施例中，胰高血糖素擷抗劑之第2號位置係選自下列群組之胺基酸：絲胺酸、D-絲胺酸、D-丙胺酸、纈氨酸、甘胺酸、N-甲基絲胺酸，N-曱基丙胺酸以及胺基異丁酸(AIB)。同時，胰高血糖素擷抗劑之第3號位置係為麩胺酸，和天然胰高血糖素擷抗劑在該位置為麩醯胺酸之情形相反。據此，胰高血糖素擷抗劑之胺基酸序列可包括如下：

Xaaj-Xaas-Xaas-Thr-Gly-Phe (SEQ ID NO: 68);

Xaa2-Xaa3-Thr-Gly-Phe (SEQ ID NO: 69);或

Xaa3-Thr-Gly-Phe (SEQ ID NO: 70); 其中XaaHf、為選自下列群組：組胺酸、D-組胺酸、alpha, alpha-雙曱基咪唑乙酸（DMIA)、N-甲基組胺酸、alpha-曱基組胺酸、咪唑乙酸、去胺基組胺酸、氫氧基組胺酸、乙醯化組胺酸及同組胺酸，Xaa2係為選自下列群組：絲胺酸、D-絲胺酸、D-丙胺酸、纈氨酸、甘胺酸、N-曱基絲胺酸，N-曱基丙胺酸以及胺基異丁酸（AIB)，以及Xaa3係為麩胺酸或麩醯胺酸。 -69 - 200920404 就胰高血糖素擷抗劑係由A_B_C結構組成而言，B代表SEQ IDN〇: 1之胺基酸】到26,其中1係為3,4,5,6，或7 :中隨意地由-或多個絲酸修騎組成。在—特定實施例中，B代表SEQ ID N〇: 1之胺基酸第7 — 26號位置，且較佳地步地修飾。

在-實施例中，B具有至多三個胺基酸修飾。例如，B 代表在SEQ ID N0:〗具有至少_或更多的保留性胺基酸修飾0 在另-實施例中，B包括-或多個胺基酸修飾，該胺基酸修飾係選自如本文所述之（iv)至㈣所組成之群組。在一特定實施财，B包括如本文所述之(v) & (w)之一或二者之胺基酸修飾。在一進一步實施例中，B包括選自由㈣、 ()(VU〇及（1X)，同時包括（V)及（vi)之胺基酸修娜组成之群組之一或其組合。在另特疋貝知例中，胰局血糖素擷抗劑包括在敌基端具有-或多個帶電荷之胺基酸。例如，γ及/或2可以是離胺酸、精胺酸、組胺酸、天冬胺酸及麵胺酸。在又一實施例中，騰高血糖素掘抗劑包括在具有W個帶電荷之胺基酸（例如離胺酸、精《、組胺酸、天冬胺酸及麩胺酸），由絲端往z。更進-步來說，2伴隨在W個帶電荷之胺基酸且不包括R10。 -70- 200920404

在一實施例中，胰高血糖素擷抗劑包括有一親水性基團，共價結合於胰高血糖素擷抗劑之胺基酸殘基，如本文所述。例如，胰高血糖素擷抗劑包括有一親水性基團，共價結合於胰咼血糖素擷抗劑之第丨，16, 20, 21，或24號位置，依據SEQ ID NO: 1之順序。在另一實施例中，親水性基團係結合於胰高血糖素擷抗劑之絲端絲酸，在某㈣施例巾，係為由羧基端往Z第1或U號位置胺基酸。在又一實施例中，親水，基團係結合於苯乳酸，t A為苯乳酸、苯乳酸苯丙胺酸或苯礼酸-蘇胺酸-苯丙胺酸，其中苯乳酸係經過修飾以包括親水 f基團在又貝施例中，在胰高jk糖素擷抗劑之N或叛基端添加有一具有親水性基團之胺基酸。隹一貫施例中职向血糖常擷抗劑包括如本文所述之一酿基或烧基。例如，酿化或烧化作用可發生在第％ %或％號位置胺基酸之側鏈，依據SEQ ID NO: 1之順序。在另—每 _中’醯化或統作用可發生在姨高血糖㈣抗劑之^ 端胺基酸’在某些情況下，係為躲端往2第ι或^二胺基酸。在又一實施例中，者A為I ^ ；〇斗、# „ J Ψ田Α為本札酸、苯乳酸-苯丙胺酿 ^本礼酸蘇胺酸·苯丙㈣，其中苯乳酸係經過修飾包括有— 醒基或炫基。 ’ 在本發明之實施例中胰高血糖素擷抗劑之胺基酸序列 -71 - 200920404 包括 SEQ ID N0s: 62, 64·67,及 7ι 任何之一。 :本文所揭露之姨高血糖素#|抗劑可適用於任何用途，如先則所述的其他胰高血糖侧抗劑。因此，在此所述血糖素擷抗财用於治療高血糖症，或其他導因於 ” 膜高血糖素或血液中葡萄糖過高之代謝疾病。依據一實中: 例在此所逃之以胰高血糖素擷抗劑治療之病患係為—.訓養在其他實施例中係、為人類。研究指出，缺之抑制胰南血糖素之糖尿病患者導致餐後高血糖，某種程度上係經由加速肝聽分解作用。由口服㈣糖耐受試驗(QGTT)之血糖分析’且在有或沒有體抑素誘導騰高錄素抑制之之下，顯示在，高胰高血糖素時血糖濃度也大量增加。因此，本發明之 η糖素擷抗劑可用於治療高血糖症，且寄望於對治療各種不同類型的糖尿病也有效，包括第—型、第：型或孕期型糖尿病’或是胰島素依賴型、非胰島素依賴型糖尿病，且降低糖尿病併發症例如腎疾病、視網膜病變及血管疾病。 ^ dm 4 ’是—種由39個胺基酸組成之胜肽。其為一種對於又體之強力刺激物如G L p小此胜肽被報導具有抑制食慾續體重下降之功效。本發明人發現，當在μ“之末 ^序列添加至胰高血糖素的叛基端可增加其溶解度及穩定 f生且不會減損胰高血糖素之生物活性。在一實施例中，在 " 胰，血糖素掏抗劑被施予患者作為降低食慾及體重 -72 - 200920404 的方法。在一實施例中，患者係為一刷養動物，且在其他實施例中係為人類。在一實施例中，Exendin-4之末端10個序列 (例如SEQ ID NO: 19 (GPSSGAPPPS))結合到胰高血糖素擷抗劑之羧基端。此種融合蛋白質被寄望對於降低食慾、體重及體重維持具有藥理活性。在一實施例中，胰高血糖素擷抗劑可進一步地被修飾，包括將胺基酸序列SEQ ID NO: 19 (GPSSGAPPPS)結合至SEQ ID NO: 42之胰高血糖素擷抗劑第 24號位置胺基酸，且施予患者以降低及維持體重。特別是，胰高血糖素擷抗劑胜肽包括選自由下列序列組成之群組：SEQ ID NO: 2， SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 以及 SEQ ID NO: 44，且進一步包括將 SEQ ID NO: 19 (GPSSGAPPPS)結合至 SEQ ID NO: 42 之胰高血糖素擷抗劑第24號位置胺基酸，以降低食慾、體重及維持體重。在一實施例中，施予患者之胰高血糖素擷抗劑係包括 SEQ ID NO: 46 或 SEQ ID NO: 47。此種用以減少食慾及促進體重流失之方法也被期望可用於減輕體重，避免體重回復，或是治療各種原因的肥胖，包括藥物引起的肥胖，及減少因肥胖引起的併發症例如血管疾病（冠狀動脈疾病、心臟病、週邊血管疾病、缺血再灌注損傷 -73 - 200920404 等），高血壓，第二型糖尿病的發生，高血脂及肌骨骼疾病。本發明之胰高血糖素胜肽可單獨使用，或與其它抗糖尿病或抗肥胖藥劑合併使用。該領域所熟知或正在研究中的抗糖尿病藥物包括胰島素，續醯尿素類例如tolbutamide (Orinase), acetohexamide (Dymelor), tolazamide (Tolinase), chlorpropamide (Diabinese), glipizide (Glucotrol), glyburide (Diabeta, Micronase，Glynase)，glimepiride (Amaryl)，或是雙胍類例如 metformin (Glucophage)或 phenformin,或是胰島素增敏藥物例如 rosiglitazone (Avandia)，pioglitazone (Actos)， ortroglitazone(Rezulin)，或其他PPAR//抑制劑，可抑制碳水化合物分解的alpha糖解酵素抑制劑，例如miglitol (Glyset)， acarbose (Precose/Glucobay); exenatide (Byetta) 或 pramlintide ;第四型二肽肽酶抑制劑，例如vildagliptin or sitagliptin;第一型鈉依賴型葡萄糖運送子抑制劑；或果糖-1, 6-雙磷酸酶抑制劑。該領域所熟知的抗肥胖藥劑包括食慾抑制劑，包括苯乙胺型興奮劑，phentermine (optionally with fenfluramine or dexfenfluramine), diethylpropion (Tenuate®), phendimetrazine (Prelu-2®, Bontril®)，benzphetamine (Didrex®)，sibutramine (Meridia®，Reductil®) ; rimonabant (Acomplia®);其他大麻受體榻抗劑；腸道荷爾蒙；鹽酸氟西汀（Prozac) ； Qnexa -74 - 200920404 (topiramate and phentermine), Excalia (bupropion and zonisamide) or Contrave (bupropion and naltrexone)；或月旨肪分解酵素抑制劑，類似於 xenical (Orlistat)或 Cetilistat (also known as ATL-962),或 GT 389-255 〇本發明之胰高血糖素擷抗劑亦可施予在那些具有分解代謝消痩症狀之病患上。估計超過一半的癌症患者具有分解代謝消瘦之情形，也就是體重快速下降、虛弱，且體脂肪及肌肉的降低。這些症狀同樣出現在愛滋病患者身上，且亦表現於細菌及寄生蟲疾病患者，風濕性關節炎患者，及慢性的腸、肝臟、肺臟及心臟疾病患者。通常與厭食症有關，以及出現於老化或是生理創傷的結果。分解代謝消瘦係為一種會降低生活品質的症狀，使已知情況更加惡化，甚至會致死。本發明人預期在此所述之胰高血糖素擷抗劑可施加於有分解代謝消痩症狀之患者身上。藥學組成物包括在此所揭露之胰高血糖素擷抗劑，可配製且施用於患者’利用標準醫學可接受載體及該領域專門人士所熟知的施加路徑。據此，本發明同時包括藥學組成物，該藥學組成物包括一或多個在此所揭露之胰高血糖素擷抗劑與醫學可接受載體之組合。藥學組成物可單獨包括胰高血糖素擷抗劑作為完全的藥學活性成分，亦可將胰高血糖素擷抗劑與一或多種附加活性劑作為組合。在一實施例中，提供一 -75 - 200920404

藥學組成物包括本發明之胰高血糖素擷抗劑以及一活化 GLP-1受器之成份（例如GLP-l, GLP-1相似物，exendin-4相似物，或其衍生物）。在一實施例中，提供一藥學組成物包括本發明之胰高血糖素擷抗劑以及胰島素或胰島素相似物。另 ' 外，提供一可導致體重降低或防止體重回復之成分，包括SEQ ID NO: 42之序列，更包括將安基酸序列SEQ ID NO: 19 f "； (GPSSGAPPPS)連結於SEQ ID NO: 42之第24號位置胺基酸，以及一抗肥胖胜肽。適當的抗肥胖胜肽包括在美國專利 5,691,309號、6,436,435號或是美國公開20050176643號所揭露，且包括但不受限於如GLP-1，胃抑素（Gastric Inhibitory Polypeptide), MP1 , PYY, MC-4,瘦體蛋白。在一實施例中，提供一藥學組成物包括本發明所揭露之胰高血糖素胜肽，較佳地為無菌的且純度在至少為90%, 91%, 92%，93%, 94%, 95%, 96%，97%, 98% 或 99%，以及以一醫藥 k』可接受稀釋度，載體或輔藥。此成分包括胰高血糖素胜肽，其濃度至少為〇·5 mg/ml, 1 mg/ml, 2‘mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml, 16 mg/ml, 17 mg/ml, 18 mg/ml, 19 mg/ml, 20 mg/ml, 21 mg/ml, 22 mg/ml, 23 mg/ml, 24 mg/ml, 25 mg/ml或更高。在一實施例中，此藥學組成物包括無菌的水溶液，且存放於不同的容器中。該成分 -76 - 200920404 可依據一實施例使用，先配製成一預配製溶液以供注射使用。在其他實施例中，此藥學組成物包括凍乾之粉末。該藥學組成物可進一步包裝成套件之一部份，該套件包括用於施加於患者之可拋式裝置。該容器或套件可標示儲存於常溫或低溫下。在本文所提到的醫療方法、藥學組成物、套件及其他相似實施例，係考量到胰高血糖素擷抗劑包括其所有醫藥上可接受之鹽的使用。聚乙二醇化之胰高血糖素擷抗劑可增進其水溶性。然而，增加聚乙二醇鏈長度，或結合複數個聚乙二醇鏈於胜肽，例如聚乙二醇鏈分子量在大於5,000道耳吞，可延長其作用時間。依據一實施例》.提供一膜高血糖素擷抗劑其中包括一或多個聚乙二醇鏈，聚乙二醇鏈之總和分子量大於5,000道耳吞，且在另一實施例中，聚乙二醇鏈之總和分子量大於10,000 道耳吞。此種經過修飾的胰高血糖素擷抗劑可延長其作用時間，且不會減少其生物活性。據此‘，此成分可預防性地施用以延長其胰高血糖素擷抗劑施用之效果。在一實施例中，聚乙二醇化之胰高血糖素擷抗劑包括選自由下列序列組成之群組：SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 及 SEQ ID NO: 45，其中第 11, 16 或 19 號 -77 - 200920404 位置胺基酸殘基之側鏈係共價結合一或多個聚乙二醇鏈，其中聚乙二醇鏈之總和分子量約大於10,000道耳吞。在一實施例中，聚乙二醇鏈之總和分子量約大於10,000道耳吞，且小於或等於40,000道耳吞。在一實施例中，聚乙二醇化之胰高血糖素擷抗劑包括SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 43，其中第 11號位置胺基酸殘基之側鏈係共價結合一或多個聚乙二醇 f 鏈，其中聚乙二醇鏈之總和分子量範圍約在10,000 - 40,000 道耳吞。在一實施例中，聚乙二醇化之胰高血糖素擷抗劑包括SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 44，其中第16號位置胺基酸殘基之側鏈係共價結合一或多個聚乙二醇鏈，其中聚乙二醇鏈之總和分子量範圍約在10,000 - 40,000道耳吞。在一實施例中，聚乙二醇化之胰高血糖素擷抗劑包括SEQ ID NO: 11 或SEQ ID NO: 45，其中第19號位置胺基酸殘基之側鏈係共價結合一或多個聚乙二醇鏈，其中聚乙二醇鏈之總和分子量 I 範圍約在10,000 - 40,000道耳吞。在一實施例中，聚乙二醇化之胰高血糖素擷抗劑包括SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16，其中第19號位置胺基酸殘基之側鏈係共價結合一或多個聚乙二醇鏈，其中聚乙二醇鏈之總和分子量約為10,000道耳吞，在另一實施例中聚乙二醇鏈之總和分子量範圍約在20,000 - 40,000道耳吞。在一實施例中，聚乙二醇化之胰高血糖素擷抗劑包括SEQ ID NO: 12, -78 - 200920404

SEQ m NO: 17 or SEQ ID N0: 22，其中第 U 及 19 號位置胺基釀殘基之側鏈係共價結合一或多個聚乙二醇鏈，其中聚乙二醇鏈之總和分子量約為丨〇,〇〇〇道耳吞。 X 在此所揭露之胰高血糖素掏抗劑可與其他活性劑植合使用，包括例如胰島素，以治療因過度胰高血糖素活性導_ 疾病或症狀。在-實施例中’經聚乙二醇化修飾之胰高血糖素擷抗劑共價結合一分子量約大於10,000道耳吞之聚乙二醇鏈’可用以配合胰島素之使用，以幫助維持糖尿病患者之血糖濃度。在此所揭露之胰高血糖侧抗劑可與胰島素作為單 -成分共同施用，作為不同成分同時間施用，或另外地，可將胰高血糖素擷抗劑與胰島素在不同時間施H實施例中，成刀包括胰島素及另一成分包括姨高血糖素類抗劑，分別在12小時内施用。胰高血糖素掏抗劑與胰島素施用之正確比例應視糖尿病患者之血糖濃度_，以及由經驗累積進行判斷。本發明所揭露亦包含本文所述之已修飾的胰高血糖素擷抗劑之聚合體。兩個以上的胰高血糖素·劑胜肽可利用該領域所熟知的連結劑予以诖姓。点丨丄一 t 丁運，例如，可在兩個已修飾的胰南血糖素擷抗劑之間利用雔功鉍 ,> ,^ 用又功此硫醇交又連結劑或雙功能胺劑將其連結形成二聚體，特別是姨高血糖素榻抗雜，16或19號位置）被以半胱胺酸、離胺酸、鳥胺 -79 . 200920404 酸' 同半胱胺酸或乙醯苯丙胺酸（例如SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO; 10, SEQ ID NO: 11 以及 SEQ ID NO: 12)所取代。該二聚體可以是同二聚體或是異二聚體。在一實施例中，該二聚體可經由兩胰高血糖素擷抗劑所形成，其中該胰高血糖素擷抗劑胜肽係分別選自由下列序列所組成之群組：SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46,或 SEQ ID NO: 47，其中兩胰高血糖素擷抗劑胜肽係透過一連結子將兩者的第11號位置、第16號位置、第19號位置之一或其組合予以連結。在一實施例中，其連結係為一雙硫鍵，分別形成於兩胜肽之 Cysll 到 Cysll，或 Cysl9 到 Cysl9，或 Cysll 到 Cysl9 之間。相似地，一二聚體可經由兩胰高血糖素擷抗劑所形成，其中該胰高血糖素擷抗劑胜肽係分別選自由下列序列所組成之群組：SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 以及 SEQ ID NO: 42，其中連結之胺基酸位置係分別選自由下列位置組成之群組：第16, 21及24號位置。在一實施例中，提供一胰高血糖素擷抗劑之二聚體，各 -80 - 200920404 個胰高血糖素擷抗劑包括SEQ ID NO: 46，其中兩胰高血糖素擷抗劑胜肽係透過一雙硫鍵將兩胰高血糖素擷抗劑之第25號位置胺基酸予以連結。在另一實施例中，提供一胰高血糖素擷抗劑之二聚體，各個胰高血糖素擷抗劑包括SEQ ID NO: 47，其中兩胰高血糖素擷抗劑胜肽係透過一雙硫鍵將兩胰高血糖素擷抗劑之第35號位置胺基酸予以連結。在一實施例中，提供一二聚體，係分別由SEQ ID NO: 46及SEQ ID NO·· 47之胰高血糖素擷抗劑所形成，其中SEQ ID NO: 47之第10 號位置胺基酸係為麩胺酸。在一實施例中，該二聚體係為同二聚體，係包括二胰高血糖素擷抗劑融合蛋白，其中該胰高血糖素擷抗劑融合蛋白係選自由下列序列所組成之群組：SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQID NO: 40, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42,以及該胰高血糖素擷抗劑之藥學上可接受鹽類。在一實施例中，提供一二聚體，該二聚體係由一第二胰高血糖素擷抗劑與一第二胰高血糖素擷抗劑透過一連結子結合而成，其中該第一胰高血糖素擷抗劑及第二胰高血糖素擷抗劑係分別選自由下列序列所組成之群組：SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41,，及SEQ ID NO: 42，以及該胰高血糖素擷抗 -81 - 200920404 劑之藥學上可接受鹽類。在另一實施例中，該第一胰高血糖素擷抗劑及第二胰高血糖素擷抗劑係分別選自由下列序列所組成之群組：SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 36 及 SEQ ID NO: 39。在另一實施例中，該二聚體係為由胰高血糖素擷抗劑所組成之同二聚體，其中該胰高血糖素擷抗劑選自由下列序列所組成之群組：SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 3卜在另一實施例中，提供一胰高血糖素擷抗劑二聚體，係由一第一胰高血糖素與一第二胰高血糖素透過一連結子結合而成，其中該第一胰高血糖素擷抗劑及第二胰高血糖素擷抗劑係分別選自由下列序列所組成之群組：SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 及 SEQ ID NO: 28。在另一實施例中，提供一胰高血糖素擷抗劑同二聚體，係選自由下列序列所組成之群組：SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12，其中胰高血糖素擷抗劑更包括一聚乙二醇鏈，共價鍵結於胰高血糖素擷抗劑之第11、19號位置。在一實施例中，本發明之胰高血糖素胜肽係為套件之一部分。在一實施例中，該套件係用以將該胰高血糖素擷抗劑施用於所需之患者，其中該套件包括一經過修飾之胰高血糖 -82 - 200920404 素擷抗劑，其中該胰高血糖素擷抗劑選自由下列序列所組成之群組： (1) 一胰高血糖素擷抗劑選自由下列序列所組成之群組： SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41，SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 及 SEQ ID NO: 44 ； (2) —聚乙二醇化胰高血糖素擷抗劑，其中該聚乙二醇鏈係共價鍵結於胰高血糖素擷抗劑之第11,12, 15, 16, 19, 24 或35號位置，其中該胰高血糖素擷抗劑選自由下列序列所組成之群組：SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 46 及 SEQ ID NO: 47,其中該聚乙二醇之分子量範圍約在500 -40,000道耳吞； (3) —融合胜肽包括一胰高血糖素擷抗劑，其中該胰高血糖素擷抗劑選自由下列序列所組成之群組·· SEQ ID NO·· 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 及 SEQ ID NO: 44，且 SEQ ID NO: 19 之胜肽融合於該胰高血糖素擷抗劑之末端胺基酸； -83 - 200920404 聚乙二酵化胰高血糖素操抗劑，包括在該胰高也糖素 .擷抗劑之羧基端結合有SEQ ID N(> 19 (GPSSGAPPPS)，其中該共價鍵結之聚乙二醇之分子量範圍約在500 - 40,〇〇〇道耳吞；刀里在-貫施例中，提供-套件’包括可將胰高血糖素押抗别成分施用於患者之裝置。該套件更包括各種不同之容写，例如小藥瓶、試管、瓶子’及相似物。較佳地，套件中㈣ :使用說明書。在一實施例中，該套件之裂置係為喷霧分配置’其中該成分係預先包裝於喷霧裝置内。在另—實施中，套件包括有一注射器及一針頭，^ T H及在一貫施例中，胰高血糖素擷抗劑係預先包裝於注射器中。結合α, α-雙取代胺基酸在-實施例中，提供-胰高血糖雜抗劑，包括在姨高企糖素擷抗劑（約在第12_29號位置胺基酸，依據野生型姨高血糖素之序列）讀基端部分具有—❹個α，α•雙取代胺基酸 (胺基酸取代或插人）。在—特定實_巾，α，α•雙取代胺基酸係為-氨基異丁酸(ΑΙΒ)，-種以相同或不同基團進行雙取代之胺基酸’其中該基團係選自由下列基團組成之群組：甲基、乙基、丙基、丁基’或以環辛烧、環庚烧(例如卜胺基環辛烧 -1-羧酸）。在某些實施例中，胰高赢糖素擷抗劑之第16,17,18, -84 - 200920404 2〇, 21，24或29號位置(依據野生型胰高血糖素之胺基酸序列 5椒其中一、二、三、四或更多，係由α，《-雙取代胺基酸所取代。在-特定實施例中’姨高血糖素擷抗劑之第Μ 2〇 Μ 或24號位置（依據野生型胰高血糖素之胺基酸序列號）之其中 -、二、三、四或更多’係由氨基異丁酸所取代。在一特定實施例中，胰高血糖素擷抗劑具有—或多個α，α_雙取代胺基酸，例如氨基異丁酸，且該胰高血糖素擷抗劑具有緩基端^ 酸且在缓基端未被酿胺化。與親水性基團之結合在一實施例t，本文所揭露之胰高血糖素擷抗劑可共價結合親水性基團以增加其溶解度。親水性基團可在任何適當條件下結合於胰高血糖素擷抗劑，以使蛋白質與一活性聚分子反應。任何在該領域所熟知的技術皆可被使用，包括經由 fe化、還原性烷化、邁克爾加成反應、硫醇烷化，或其他化學選擇性連結/結合方法，透過將聚乙二醇之反應基團（例如醛基、胺基、酯基 '硫醇基、α_含氯乙酰基' 馬來醯亞胺基、胼基）。活化基團可被用於將水溶性聚合物連結於一或多個蛋白質，包括在無砜、順丁烯醯亞胺、硫氫基、.硫醇基、三氟曱基石頁酸鹽、tresylate，azidirine、環氧乙烧及5-吡啶基之情況下。若利用還原性烷化法結合時，該聚合物應具有一 -85 - 200920404 單一的活性醛基’可控制聚合反應的程度。可參閱例如Kinstler et al., Adv. Drug. Delivery Rev. 54: 477-485 (2002); Roberts et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002); and Zalipsky et al., Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182 (1995). 合適的親水性基團包括聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇，glycol， polyoxyethylated polyols (例如 POG)，polyoxyethylated sorbitol, polyoxyethylated glucose, polyoxyethylated glycerol (POG), polyethylene glycol propionaldehyde,乙二醇 / 丙二醇之共聚物，甲氧基聚乙二醇，mono-(C 1 -C10) alkoxy- 〇r aryloxy-聚乙二醇，羧曱基纖維素，聚縮醛，聚乙烯醇(PVA)，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3二氧戊烷，乙烯/馬來酸酐共聚物，聚(beta-胺基酸）（同聚合物或隨意共聚合物），聚（η-乙烯基。比洛烧酮）聚乙二醇 > propropylene glycol homopolymers (PPG)，及其他 polyakylene oxides ，polypropylene oxide/ethylene oxide copolymers,或其他多糖高分子，聚罈體或葡聚糖及其混合物。在某些實施例中，該親水性基團例如聚乙二醇鏈，其分子量範圍係為500 - 40,000道耳呑。在一實施例中，該親水性基團例如聚乙二醇鏈，其分子量範圍係為500 — 5,000道耳吞，或1,000 - 5，000道耳吞。在另一實施例中，該親水性基團例如聚乙二醇鏈，其分子量範圍係為10,000 - 20,000道耳 -86 - 200920404 例中，該親水性基團例如聚乙圍係為20，_-4〇,〇〇〇道耳吞。葡萄二^親水_。_係為 ί ==種分子量範圍，例如約1千道耳吞千】 9〇千道5耳Γί 5, 1〇, 15 或 20 至 2〇, 3〇, 4〇, 5〇, 6〇, 7〇, 80 或工作= 型。或分支型聚合物皆是可考慮的。導致結合之製備且右u分散或多分散，且可使每胰高血糖素操抗劑約 /、◎'…，….[“聚合物基團。

X.J 醇鏈，其分在-實施例中，該親水性基團係為一聚乙二醇(PE⑺鍵，選擇性地連結余胰高血糖素榻抗劑之—或多個位置，包括L % 17, 21，24, 29號位置（依據野生㈣高血糖素之序列），在竣基端序列範圍内的位置，例如第3G號位置，或在n或幾基端胺基酸位置。在某些實_巾，雇來位置的絲酸被取代為具有適於蚊連結的側鏈的胺基酸，以幫助親水性基團連結於胰高血糖素榻抗劑。在說明例中，原來位置的胺基酸被取代為離胺酸、半胱胺酸、鳥胺酸、同半胱胺酸或乙醯化苯兩胺酸。在某些實施例中，胺基酸經過修飾具有親水性基團，並添加於胰高血糖素操抗劑的N或叛基端。 -87 - 200920404 連結物及融合物本文所揭路同日t包括在本文之騰高血糖素胜肽所結合的 -他結合物，選擇性地透過共價鍵結及透過—連結子，以结合於，結合物。該連結可經由化學共價鍵，物理力例如靜電力、風鍵、離子鍵、凡得瓦力、親水性或疏水性作用力。可

利用各種不同的非共價鍵結方式，包括生物素·抗生物素蛋白，配體/受體，酵素/受質，核苦酸/核苦酸結合蛋白，脂質/脂質 2蛋白，細胞黏合分子；餘何結合該結合物或其彼此間具有親和力之片段。胰高血糖素擷抗劑可結合於一結合基團，透過標的胺基酸直接共價鍵結於—有機衍生物，可與選擇性之側鏈或是該 =胺基酸之絲端、縣端絲酸進行反應。胰高血糖素劑或連結物之反應基團包括例如搭基、胺基、醋基、硫醇基 ' …含氯乙酰基 '馬㈣亞胺基、胼基。有機衍生物包括列如馬來酰亞胺㈣酰亞賴（透過半胱胺酸殘基結合），經基丁二酿亞胺（透過離胺酸殘基結合），戊二搭，破拍酸肝，或盆 =在該領域所熟知成分。另外，結合基團可間接地透過一中介載體結合於胰高血糖素擷抗劑，例如多I❹肽載體。多 :載體包括例如胺葡聚糖。多肽載體包括例如聚離胺酸，聚楚胺酸’聚天冬胺酸，其共聚合物，以及其胺基酸或其他胺 -88 - 200920404 基酸之混合聚合物，例如絲胺酸，以提供其載體良好的可溶性結構。半胱胺醯基通常會與α-函代乙酸醋（及相關胺類）進行反應，例如氯乙酸或氯乙醯胺，以產生羧曱基或 carboxyamidomethyl之衍生物。半胱胺酸殘基亦會衍生自與 bromotrifluoroacetone, alpha-bromo-P-(5-imidozoyl)prop ionic acid, chloroacetyl phosphate, N-alkylmaleimides, 3-nitro-2-pyridyl disulfide, methyl 2-pyridyl disulfide, p-chloromercuribenzoate, 2-chloromercuri-4-nitrophenol, 或 chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l，3-diazole 之反應中。組胺醯基會衍生自與焦碳酸二乙酯在pH值為5.5-7.0之反應下，因為此化合物對於組胺酸側鏈之相對專一性較高。對溴苯醯甲基溴同樣具有作用；此反應之較佳條件係在0.1M 之二甲石申酸納且pH = 6.0。離胺醯基及胺基端殘基會與琥妯酸及其他羧酸酐進行反應。和此些成分之衍生反應可反轉改變離胺醯基所帶電荷。其他適於衍生具有alpha-胺殘基的包括有亞胺酯，例如methyl picolinimidate, pyridoxal phosphate, pyrid〇xaj chloroborohydride, trinitrobenzenesulfonic ac^ O-methylisourea，2,4-pentanedione，以及與乙搭酸之轉胺酶催化反應。 -89 - 200920404 精胺隨基可藉由與某些傳統成份發生反應進行修飾，包括苯曱醯甲醛、2,3-丁二酮、1，2-環己二酮及茚三酮。精胺醯 ' 基之衍生反應需要在鹼性環境下’因其胍功能基具有較高的 - ΡΚ&。更進一步地，此些成分除可與精胺酸的基團發生反應外，亦可與精胺酸的epsilon-胺基反應。 p 酪胺酸的特定修飾可經由在酪胺酸殘基之引介光譜樣記完成’此標記係經由芳香族重氮成分或四頌基甲烧之反應形成。最常見地，將N-乙醯咪唑及四硝基甲烷用以分別形成〇_ 乙醯酪胺醯類及3-氮衍生物。‘ 羧酸側基團（天冬胺醯或縠胺醯）係選擇性地藉由與碳化二亞胺（R-N=ON-R’)反應修飾，其中尺及R，係為不同烷基團，例如1-環已基-3-(2-嗎琳基-4-乙基）-碳化二亞胺或乙基 -3-(4-azonia-4,4-雙曱基戊基）-碳化二亞胺。更進一步地，天冬 1 / 胺基或縠胺基藉由與銨離子反應而轉變為天冬醯胺基或縠醯胺基。 ‘ 其他修飾作用包括脯胺酸及離胺酸的氫氧化，絲胺酸及蘇胺酸的磷酸化，離胺酸、精胺酸及組胺酸的側鏈之alpha_ 氨基的曱基化（T. E. Creighton，Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983))，天冬醯胺酸或麩醯胺酸的去醯胺化，胺基端氨基的乙醯化’及/或羧基端羧酸基的醯胺化或酯化。 -90 - 200920404 另一種共價修飾包括化學地或酵素地偶合糖苷結合於胰高血糖素擷抗劑。糖類可結合於精胺酸及組胺酸，自由羧酸基，自由硫氫基(例如半胱胺酸），絲胺酸、蘇胺酸及氫氧化脯胺酸的自由氫氧基，在酪胺酸或色胺酸之芳香基，麩醯胺酸的醯胺基。這些方法在下列文獻中有描述，參閱公開於1987 年9月11曰的W〇87/05330號前案，以及in ApUn and

Wriston，CRC Crit· Rev. Biochem” pp. 259-306 (1981)。連結基團可結合於任何在此所描述的胰高血糖素擷抗劑，包括但不受限於一異源性胜肽或一多胜肽（包括例如血漿蛋白），一標靶藥物，一免疫球蛋白或其蛋白質（例如可變區， CDR或Fc部位），一診斷標記例如同位素、螢光或酵素標記，一聚合物包括水溶性聚合物，或其他治療性或診斷性藥物。在-貫把例中提供-結合物’其包括—本發明的騰高灰糖素摘抗劑，以及-血聚蛋白，其中血漿蛋白係選自由下列蛋白組成之群組：白蛋白、運鐵蛋白、纖維素原、球蛋白。夕在某些實施例中，連結子包括由㈣、U個原子或更多之鏈長’ 2_5、2·ΐ〇、5·1〇、1〇_2〇個原子之鏈長。在某些實施例令，組料結子之骨幹之鏈原子係選自由下列元素= 之群組：碳、氧、氮及硫。鏈原子及結合子係選自依據其期望之溶解度（親水性），以提供—更易溶解之結合物。在某些實施例中，連結子提供-官能基，㈣能基易受_素分解^ -91 - 200920404 其2催化«在標的組織會器宫“射 =為連=子之長度足以減少立體結構障礙之二子係為-共價鍵或-肽鍵絲合物係為—多肽，^ 係為一融合蛋白。此類肽連結子、α σ , 以為任何長度。說明例之連…子係由約㈣胺基酸長度，5_50,3_5，㈣，5七，或10_30 月女基酸長度。融合蛋白可以埋 ,I 〆去所糟由該領域具有通常知識者所热知的基因重組工程方法所生成。如前所述，在某些實施例中，胰高血糖素操抗劑結合有，例如融合於-免疫球蛋白或其部位（例如可變區，咖或& 立）。已知的免疫球蛋白（Ig)種類包括收队袖，㈣或 IgM A部位係為免疫球蛋白重鏈的叛基端部位，用以結合於以受體以表現活性例如再利用（以延長其半生期），抗體_毒权細胞反應（ADCC)，及補體依賴毒殺細胞反應（CDc)。

V 舉例來說，依據某些定義而言’人類免疫球蛋白lgG之重鏈Fc部位由Cys226延伸至重鏈Fc部位的缓基端。「枢紐部位」一般是由人類免疫球蛋白igG1的Glu216延伸至 Pro230 (其他種類的免疫球蛋白igG的樞紐部位可對齊於 IgGl糸列，藉由對齊於那些包含在半胱胺酸連結的半胱胺酸）。人類免疫球蛋白IgG的Fc部位包括兩不變區域CH2及 CH3。人類免疫球蛋白IgG的Fc部位之CH2區係由第231號位置延伸至j41號位置。人類免疫球蛋白igG的fc部位之ch2 -92 - 200920404 區係由第342號位置延伸至447號位置。免疫球蛋白、其片段或區域的胺基酸順序係依據Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health，Bethesda，Md.在一相關實施例中，Fc部位可包括一或多個天然或修飾過的免疫球蛋白重鏈的不變區域，和CH1相較之下，例如，免疫球蛋白IgG及IgA的CH2與CH3區域，或免疫球蛋白IgE的CH3及CH4區域。適合的連結基團包括免疫球蛋白序列之部分例如FcRn 結合部。FcRn是一種拯救受體，負責免疫球蛋白的再利用且將其送回血液中循環。FcRn部位中結合IgG之區域已利用X 光結晶法顯示（Burmeister et al. 1994, Nature 372:379)。FcRn 和Fc主要接觸之區域係接近於CH2和CH3連接的位置。主要接觸之位置包括CH2之胺基酸序列第248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291，308-311，及 314 號位置，以及 CH3 之胺基酸序列第385-387，428，及433-436號位置。某些連結基團可以包括或不包括FcyR部。FcyR部係用以負責ADCC及CDC進行。Fc區域與FcyR部直接接觸的位置在於第234-239號胺基酸（低枢紐部位），第265-269號胺基酸（B/C loop)，第 297-299 號胺基酸（C7E loop)，及第 327-332 號胺基酸(F/G loop)。IgE的低彳區紐部位也包括在FcRI結合中 (Henry，et al·，Biochemistry 36，15568-15578, 1997)。IgA 受體 -93 - 200920404 結合的殘基已發表於 Lewis et al.，（J Immunol. 175:6694-701 2005)。IgE受體結合的殘基已發表於（J Biol Chem. 279(34):35320-5, 2004)。免疫球蛋白之Fc區域亦可形成胺基酸修飾。此可變的 Fc區域至少包括一胺基酸修飾在Fc區域之CH3區（第 342-447號位置），及/或至少一胺基酸修飾在Fc區域之區（第231-341號位置）。某些突變據信可增加對FcRn之親和力，包括 T256A、T307A、E380A 及 N434A(Shields et ai 2001, J_ Biol. Chem. 276:6591)。其他突變可減少Fc區域對 FcyRI、FcyRIIA、FcyRIIB,及/或 FcyRIIIA 之親和力，在不明顯減少FcRn的親和力情形下。例如，將Fc區域第297 號位置的天冬醯胺酸取代為丙胺酸或其他胺基酸，可除去高度保留的N-部，以及伴隨著Fc區域半生期的延長而導致免疫力的降低，同時也減少結合於FcyRs(Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591)。在 IgGl 之第233-236號位置的胺基酸修飾可減少結合於Fcylls (Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 及 Armour et al· 1999, Eur. J. Immunol· 29:2613)。有些胺基酸取代公開於在 US Patents 7,355,008 及 7,381,408。本發明亦包括胰高血糖素融合胜肽或蛋白質，其中一第 -94 - 200920404 二胜肽或多胜肽融合在其末端，例如在胰高血糖素擷抗劑之羧基端。在某些實施例中，融合在胰高血糖素擷抗劑之羧基端的第二胜肽係為GPSSGAPPPS, KRNRNNIA或KRNR連結於其第29號位置胺基酸（依據野生型胰高血糖素之胺基酸序列號）。在其他實施例中，第二胜肽係為XGPSSGAPPPS，其中X係選自由20種常見胺基酸組成之群組，例如麩胺酸、天冬胺酸或甘胺酸。在一實施例中，X代表一胺基酸例如半胱胺酸，進一步包括一共價結合於該胺基酸的親水性基團。諸如此種之羧基端衍生物可增進其溶解度，同時也增加了胰高血糖素或GLP-1活性。在某些實施例中，其中胰高血糖素擷抗劑進一步包括一羧基端之延伸，該延伸之末端係為一胺基或一酯基，而非一羧酸。在某些實施例中，例如在胰高血糖素擷抗劑中包括有羧基端延伸，第29號位置之蘇胺酸（依據野生型胰高血糖素之胺基酸序列號）被取代為甘胺酸。舉例來說，胰高血糖素擷抗劑中包括有羧基端延伸以及第29號位置之蘇胺酸被取代為甘胺酸，和天然胰高血糖素第29號位置之蘇胺酸被取代為甘胺酸比較之下，前者對GLP-1受體可具有4倍活性。此T29G的取代可與其他在此所述的修飾同時具有作用，以增進胰高血糖素擷抗劑對GLP-1受體的親和力。在某些實施例中，添加一胺基酸於其羧基端，且該胺基 -95 - 200920404 酸係選自由下列胺基酸組成之群組：麩胺酸、天冬胺酸及甘胺酸。 >本發明所揭露亦包含本文所述之已修㈣胰高血糖素操 U之♦合體。兩個以上的姨高血糖素擷抗劑胜肽可利用該 .領域所熟知的連結劑予以連結。例如，可在兩個已修#_ 南血糖素擷抗劑之間湘雙魏硫醇交又連結劑或雙功能胺 1'類交叉連結劑將其連結形成二聚體，特別是胰高血糖素擷抗劑（位於11，16或19號位置）被以半胱胺酸、離胺酸、鳥胺酉文同半胱胺酸或乙醯苯丙胺酸（例如SEQ ID NO: 9 SEQ ID no:io，SEQIDNO:11 以及 seqidn〇:i2)所取代。醯化作用及烧化作用在某些實施例中’本文所揭露的胰高血糖素擷抗劑係修飾為具有-Si基或-烧基。酿化作用及烧化作用可增加姨高 I 血糖素擷抗劑在循環利用時的半生期。酿化作用及统化作用可進一步延長啟動作用及/或延長作用於胰高血糖素及/或 GLP-1受體之時間，及/或增進對於蛋白酶例如Dppqv之抵抗性及/或其可溶性。在某些實施例中，經過醯化之胰高血糖素操抗劑與沒有經㈣化之胰高血糖㈣抗劑比較其效能。姨高血糖素擷抗劑可在同一胺基酸上進行酿化及烧化作用，該胺基酸結合有一親水性基團，或在不同位置胺基酸上。 -96 - 200920404 在某些實施财’提供—胰高血糖素擷抗劑料以包括有-酿基或絲，共價鍵結於胰高血糖素榻抗劑之第1〇號位置胺基酸(依據野生型胰高血糖素之胺基酸序列號）。騰高域素觀几劑可進-步包括—間隔子，在胰高血糖素操抗劑之第 5虎位置絲酸與其gf基或絲之間。在某些實施例中，該醯基可以是一脂肪酸、膽酸或其鹽類，例如C4_C3〇脂肪酸γ C8 - C24脂肪酸、植物性膽酸，C4 - C30烷基，C8 _ C24烷基，或是一包括有膽酸之固醇基團之烷基。該間隔子可以是任何適於結合制基或絲之反應基團。在說明例中，間隔子包括-胺基酸、-雙胜肽或―三胜肽，或親水性雙功能間隔子。在某些實施例中’間隔子係選自由下列胺基酸所組成之群組：色胺酸、麵胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸，及一間隔子包括NH2(CH2CH2〇)n(CH2)m⑶㈣其中m係為任何由卜6 之整數之-’ n係為任何由2_12之整數之—。此酿化或烧化之胰高血糖素掘抗劑可進—步包括_親水性基團，選擇性地可為-聚乙二醇。任何如前所述之胰高血糖素擷抗劑可包括兩醯基或兩院基，或其組合。 k化作用可發生在胰高血糖素擷抗劑之任何位置，包括第1-29唬位置胺基酸之在羧基端延伸之其中一位置，或在羧基纟而胺基鲅，以提供其胰高血糖素擷抗劑活性（且選擇生地匕括GLP-1活性）。在非限定實施例中包括第5, -97 - 200920404 13’ 14’=’ 17, 18, 19, 20, 21，24, 27, 28,或 29 號位置（依據野生型胰高血糖素之胺基酸序列號）。該酿基可直接共價鍵社於騰高血糖素操抗劑之-胺基酸，或透過—間隔子間接地^價鍵結於膜高血糖素㈣劑之—胺基酸，其中該間隔子係位在胰高血糖侧抗敎胺級_基之間。膜高血糖素操抗^ 可在同-絲酸上進行醯化仙，該絲酸結合有親水^ 團，或在不同位置胺基酸上。在非限定實施例中包括在第號位置（雜野生型胰高域素之絲酸序舰）進行酿化，且在幾基端部位之—或多個位置進行聚乙二醇化（㈣野生型騰 :血糖素之胺基酸序列號），例如在第24、2δ或29號位置(依虞野生型胰高血糖素之胺基酸序列號），在—缓基端延伸段，或在竣基端末端（例如透過在縣端添加—半胱胺酸）。，本發明之特點而言，提供—胰高血糖錢抗劑修飾以 =括有—« ’係藉由在胰高血糖讀抗韻基酸側鍵之胺土㈣基、或硫醇基進行直㈣化作用。在某些實施例中，糖素掏抗劑係藉由直接在胺基酸側鍵之胺基 '氮氧硫醇基進行酿化作用。在某些實施例中，騰高 =化之姨高血糖素榻抗劑可包括有_卿:心基酸的絲酸，其包括有—❹個本賴述的胺傅作用，發生在第1〇,2〇, μ及29號位置(依據野生 -98 - 200920404 型胰高血糖素之胺基酸序列號）之胺基酸側鏈之胺基、氫氧基、或硫醇基。在某些實施财，胰高血糖素餘劑之直接酿化作用係發生在第K)號位置（依據野生型胰高血糖素之胺基酸序列號）胺基酸側鏈之胺基、氫氧基、或在某些實施财，該絲酸包括基其結構如下列之分子式I : Η

Η2ν-c-COOH (CH2)n I . nh2 其中n = 1到4 [分子式I] V. 如下’該胺基酸包括一氣氧基側鏈，其結構 -99 - 200920404 Η Η2Ν-C-COOH (CH2)nI OH 其中η = 1到4 [分子式II] 在某些實施例中 (Ser) ° 包括刀子式II之胺基酸其中η為在其他實施例中如下列之分子式in: 該胺基酸包括一硫醇基側鏈，其結構

Η2Ν-c-COOH (CH2)nI SH 在某些實施例中 (Ser)。其中η = 1至4 [分子式III] 包括分子式III之胺基酸其令 η為1 二本=:實施例中，酿化之姨高血糖素㈣偷曰d，在胰南血糖素劑舰基之間。在某些實施例中，姨南血糖素操抗劑係共價結合—間隔子，係、共價結合在 -100 - 200920404 ι基在某些貫施例中，胰高血糖素擷抗劑經過修飾以具有醯基係藉由在間隔子之胺基、氫氧基、或硫醇基進行醯化作用所形成。間隔子係結合於胺基酸側鏈之第10，20, 24, 或29唬位置（依據野生型胰高血糖素之胺基酸序列號），或在胰高血糖素擷抗劑之羧基端胺基酸。結合於間隔子之胺基酸包括一基團以幫助結合於間隔子。例如，一胺基酸包括一側鏈顺2, -OH，或_c〇〇H (例如以，〇m，—均，或 Glu)。就此而言，醯化之胰高血糖素擷抗劑可包括seqidN〇: 1之序列，或其經過修飾之胺基酸序列包括一或多個在此所述之胺基Isl修飾’發生在第10，20，24或29號位置（依據野生型胰高血糖素之胺基酸序列號）之至少其中之一，其中的胺基、氫氧基或羧基側鏈。在某些實施例中’間隔子係、為—胺基酸，包括有—胺基、氫氧基或硫醇基側鏈，或是一雙胜肽、三胜肽，其包括有一具有胺基、氫氧基或硫醇基側鏈之胺基酸。當S!«生在間隔子的絲時，此作料發生在胺基酸的alpha胺基或其側鏈的胺基。當發生在胺基酸的&丨咖胺基時’間隔子的胺基酸可以是任何—種胺基酸。例如，間隔子的胺基酸可以是疏水性胺基酸，例如Gly，Ala，Vai,[叫，Iie， Trp, Met, Phe，Tyr· $外’間隔子胺基酸可以是一酸性胺基 • 101 · 200920404 酸，例如Asp及Glu當發生在間隔子胺基酸的側鏈胺基時，間Pw子的知基酸係為具有一側鏈胺基的胺基酸，例如具有分子式I的胺基酸（例如Lys或0rn)。就此情況而言，其有可月b同k發生在間隔子胺基酸的alpha胺基或其側鏈的胺基，以致於胰高血糖素擷抗劑係為雙醯化的情況。實施例中包括此種雙醯化的分子。當醯化發生在間隔子的氫氧基時，發生此作用的胺基酸或在雙胜肽、三胜肽的胺基酸可以是一具有分子式π的胺基酸。在一特定實施例中，此胺基酸係為絲胺酸。、®醯化杳生在間隔子的硫醇基時，發生此作用的胺基酸 0在雙胜肽、三胜肽的胺基酸可以是—具有分子式III的胺基酸。在一特定實施例中，此胺基酸係為半胱胺酸。在戸'轭例中，此間隔子包括一親水性雙功能間隔子。在一特定實施财，此_子包括—氨基纽氧缓酸。就此而言，間隔子可包括例如NH2(CH2CH20)n(CH2)mc00H，其中 m係為在1-6之間的任意整數，h係為在2_12之間的任咅整數，例如8_氨基_3，6_二氧雜辛酸，可由Peptides Int⑽如㈣，

Inc· (Louisville，KY)購得。、在β胜肽之胺基、氫氧基及硫醇基上進行醯化作用之適當方法已是相當習知’例如第19說明例（用以在胺基進行酿化作用之方法），MiIler，BiGchem B—hys Res ^麵仙 218 -102 - 200920404 377-382 (1996); Shimohigashi and Stammer, Int J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982); and Previero et al., Biochim Biophys Acta 263: 7-13 (1972)(用以在氫氧基進行醯化作用之方法）; 以及 San and Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005)(用以在硫醇基進行酿化作用之方法）；Bioconjugate Chem. "Chemical Modifications of Proteins: History and Applications" pages 1, 2-12 (1990); Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. "Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity" Vol. 6, No: 2 pp.171-176 (1989) 在醯化之胰高血糖素擷抗劑中的醯基可以具有各種大小，例如各種長度的碳鏈，且可以是直線型或支鏈型。在本發明之某些實施例中，醯基可以可以是C4 - C30之脂肪酸。例如，醯基可以可以是一 C4脂肪酸，一 C4脂肪酸，C6脂肪酉曼，C8月旨月方酉楚，C10月旨月方酉复，C12月旨月方酉楚，C14月旨画交，C16 脂肪酸，C18脂肪酸，C20脂肪酸，C22脂肪酸，C24脂肪酸， C26脂肪酸，C28脂肪酸，或C30脂肪酸。在某些實施例中，醯基可以可以是C8 - C20之脂肪酸，例如一 C14脂肪酸或一 C16脂肪酸。在另外一實施例中，醯基可以是一膽汁酸。膽汁酸可以是任何適當的膽汁酸，包括但不受限於如下：膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸、甘膽酸、牛磺膽酸及膽固醇酸。 -103 - 200920404 本文中所述之醯化之胰高血糖素擷抗劑可進一步包括有 -親水性基團。在某些實施例中，親水性基團可包二一聚乙二醇(PEG)鏈。該親水性基團可經由任何適當的方法形成，例如在本文中所述之各種方法。就此而言，醒化之胰高血糖素擷抗劑可包括SEQ ID NO:卜其包括在本文所述之修飾作用，發生在帛10, 20, 24,或29號位置胺基酸(依據野生型胰高血糖素之胺基酸序列號），其包括在第16, 17,21，24,或29 號位置胺基酸（依據野生型胰高血糖素之胺基酸序列號），在羧基端延伸範圍内的位置，或在羧基端胺基酸修飾為半胱胺酸、離胺酸、烏胺酸、同半胱胺酸或乙醯化苯丙胺酸，以及其胺基酸側鏈共價鍵結有一親水性基團（例如聚乙二醇）。在某些實施例中，醯基係結合於第1〇號位置胺基酸(依據野生型胰高血糖素之胺基酸序列號），選擇性地透過一間隔子結合，間隔子包括可以是半胱胺酸、離胺酸、鳥胺酸、同半胱胺酸或乙醯化苯丙胺酸，以及親水性基團可以結合於第24號位置的半胱胺酸（依據野生型胰高血糖素之胺基酸序列號）。另外，醯化之胰高血糖素擷抗劑可包括一間隔子，其中該間隔子同時醯化且經過修飾以包括親水性基團。在—非限制性實施例中，適當的間隔子包括一或多個選自由下列胺基酸組成之群組：半胱胺酸、離胺酸、鳥胺酸、同半胱胺酸或乙醯化苯丙胺酸。 -104 - 200920404 依據一實施例，胰高血糖素擷抗劑可經過修飾以包括一 1合於胰高血糖素擷抗劑之烧基，其係經由H ^基y 、胺基或烧化胺基結合，以增加姨高血糖素掏抗劑在㈣用時的半生期，及/或延長啟動作用及/或延長作用時間，及/或增進對於蛋白酶例如DPP_IV之抵抗性。烷化作用可發生在胰高血糖素擷抗劑的任何位置，包括第1-29號位置之任—位置，烧化作用可發生在胰高血糖素顧劑之任何位置，包括第U9號位置胺基酸之_，在叛基端延伸之其中—位置’或在—羧基端胺基酸，以提供並保留姨兩血糖素擷抗劑活性（且選擇性地包括GLpq活性）。在非限定實施例中包括第 5，10，η，12，13，14，16，17，1δ，19,2〇,2ι:24, j7, 28,或29號位置（依據野生型胰高血糖素之胺基酸序列 j)。該醯基可直接共價鍵結於胰高血糖素擷抗劑之一胺基酸，或透過一間隔子間接地共價鍵結於胰高血糖素擷抗劑之

方胺基S文其中a亥間隔子係位在胰高血糖素擷抗劑之胺基酸與醯基之間。胰高血糖素擷抗劑可在同一胺基酸上進行醯化作用，δ亥胺基酸結合有親水性基團，或在不同位置胺基酸上。在非限定實施例中包括在第1G號位置（依據野生型胰高血糖素之胺基酸序列號）進行醯化’且在羧基端部位之一或多個位置進行聚乙二醇化（依據野生型胰高血糖素之胺基酸序列唬）’例如在第24、28或29號位置（依據野生型胰高血糖素之 -105 - 200920404 胺基酸序列號），在-羧基端延伸段，或在缓基端末端（例如透過在幾基端添加一半胱胺酸）。在-特定實⑽Μ，胰高血糖素魏劑可經由修鄉以包括-烧基’係藉在下壯置直魏化形成··胰^糖素榻抗劑胺基酸側鏈的胺基、氫氧基或硫醇基。在某些實施例中，胰高，糖素擷抗射在胰高血糖㈣抗劑胺基酸側鍵的胺基、氫氧基或硫醇基直接烧化。在某些實施例中，胰高血糖素擷抗劑可在胰高血糖素擷抗劑胺基酸側鏈的胺基、氫氧基或硫醇基直㈣化。在某些實_中，騰高*糖素擷抗紅以匕作用係發生在第10,20,24,‘或29號位置（依據野生型姨尚血糖素之胺基酸序龍）。就此而言，烧化之姨高血糖素揭 =劑可包括有SEQIDN〇:2之序列，或是—料的胺基酸，包括有一或多個本所所述的胺基酸修飾作用，發生在第^ 2〇, 24,及29號位置（依據野生型騰高血糖素之胺基酸序列號）之胺基酸側鏈之胺基、氫氧基、或硫醇基。在某些特定實施例中’胰高血糖錢抗劑可麵高讀素魏㈣ig號位置據野生龍高血糖素之絲酸相號）之絲酸側鍵的胺基、氫氧基或硫醇基直接烷化。在某些實施例中’具有胺基側鍵之一胺基酸，其結構係 =子式丨。在某些說明例中，其中胺基酸之44(Lys)或η 為 3 (〇rn)。 -106- 200920404 7在其他實施例中，具有氫氧基側鏈之一胺基酸，其結構係為分子式II。在某些說明例中，其中胺基酸之_ /(、㈣。在其他貫施例中，具有硫醇基侧鏈之一胺基酸，其結構係為分子式III。在某些„财，其巾胺基酸之n為〗ϋ。在本發明之一實施例中，烷化之胰高血糖素擷抗劑包括一間隔子，在胰高血糖素擷抗劑與烷基之間。在某些實施例中，胰南血糖素擷抗劑係共價結合一間隔子，係共價結合在烷基在某些貫施例中，胰高血糖素擷抗劑經過修飾以具有烷基，係藉由在間隔子之胺朞、氫氧基、或硫醇基進行烷化作用所形成。間隔子係結合於胺基酸側鏈之第丨〇，20，或29號位置（依據野生型胰高血糖素之胺基酸序列號）。結合於間隔子之胺基酸包括一基團以幫助結合於間隔子。例如，一胺基酸包括一側鏈ΝΗ2，__〇Η，或—c〇〇H (例如Lys, Ο% Ser，Asp，或Glu)。就此而言，烷化之胰高血糖素擷抗劑可包括SEQ ID NO: 1之序列，或其經過修飾之胺基酸序列包括一或多個在此所述之胺基酸修飾，發生在第1〇, 2〇, 24，或29 號位置（依據野生型胰高血糖素之胺基酸序列號）之至少其中之一，其中的胺基、氫氧基或羧基側鏈。在某些實施例中，間隔子係為一胺基酸，包括有一胺基、氫氧基或硫醇基側鏈，或是一雙胜肽、三胜肽，其包括有一具有胺基、氫氧基或硫醇基侧鏈之胺基酸。 -107 - 200920404 當烧化發生在間隔子的絲時，此仙可發生在胺基酸的alpha胺基或其側鏈的胺基。當發生在胺基酸的31咖胺基時，間隔子的胺基酸可以是任何一種胺基酸。例如，間隔子的胺基酸可以是疏水性胺基酸，例如A、[⑶，Hi Trp, Met, Phe, Tyr‘另外，間隔子胺基酸可以是一酸性胺基酸，例如Asp及GIu.當發生在間隔子胺基酸的側鏈胺基 %，間隔子的胺基酸係為具有一側鏈胺基的胺基酸，例如具有分子式I的胺基酸(例如Lys或0rn)。就此情況而言，其有可能同時發生在間隔子胺基酸的alpha絲或其側鍵的胺基，以致於胰高血糖素擷抗劑係為雙烷化的情況。實施例中包括此種雙烷化的分子。、當烷化發生在間隔子的氫氧基時，發生此作用的胺基酸或在雙胜肽、三胜肽的胺基酸可以是一具有分子式π的胺基馱。在一特定實施例中，此胺基酸係為絲胺酸。 ,田统化叙生在間隔子的硫醇基時，發生此作用的胺基酸或在雙胜肽、三胜肽的胺基酸可以是一具有分子式III的胺基酸。在一特定實施例中，此胺基酸係為半胱胺酸。在貝知例中’此間隔子包括一親水性雙功能間隔子。在一特定實施例中，此間隔子包括一氨基多烷氧羧酸。就此而έ ’間隔子可包括例如NH2(CH2CH2〇)n(CH2)mCOOH，其中 ^係為在I-6之間的任意整數，且η係為在2-12之間的任意 -108 - 200920404 整數，例如8-氨基-3,6-二氧雜辛酸，可由pepudes —細i〇蛾 Inc: (Louisville, KY)購得。在胜肽之胺基、氫氧基及硫醇基上進行醯化作用之適當方法已是相當習知。例如種威廉森嶋合成法，可用於在胰高血糖素擷抗劑及烷基之間形成—醚鍵結。同時，以一烷基鹵化物在胜肽上進行親核性取代反應可形成酯基、醚基、硫醯基、胺基或烷化胺基之一。在烷化之胰高血糖素擷抗劑中的醯基可以具有各種大小，例如各種長度的碳鏈，且可以是直線型或支鏈型。在本發明之某些實施例中，此烷基係為C1〜C30烷。例如，可以是 C4 烷 ' C6 烷、C8 烷 ' Ci〇烷、Ci2 烷、C14 烷、C16 烷、⑴ 烷、C20烷、C22烷、C24烷' C26烷、C28烷或是C30烷。在某些實施例中，此烷基係為C8〜C20烷，例如一 C14烧或一 C16 炫。在某些特定實施例中，烷基可以包括一膽汁酸的固醇基團，例如膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸、甘膽酸、牛續膽酸及膽固醇酸。本文中所述之烷化之胰高血糖素擷抗劑可進一步包括有一親水性基團。在某些實施例中，親水性基團可包括一聚乙二醇（PEG)鏈。該親水性基團可經由任何適當的方法形成，例如在本文中所述之各種方法。就此而言，烷化之胰高血糖素 • 109 - 200920404 擷抗劑可包括SEQ ID N0: i，其包括在本文所述之修飾作用：赉生在第10，20，24，或29號位置胺基酸(依據野生型胰南血糖素之胺基酸序列號），其包括在第16, 17, 21, 24，或29 唬位置胺基酸(依據野生型胰高血糖素之胺基酸序列號），在羧基端延伸範圍内的位置，或在羧基端胺基酸修飾為半胱胺酸、離胺醆' 鳥胺酸、同半胱胺酸或乙醯化苯丙胺酸，以及其胺基酸側鏈共價鍵結有—親水性基團（例如聚乙二醇）。在某些實施例中’《係結合於第號位置胺基酸(依據野生型姨高血糖素之胺基酸序列號），選擇性地透過一間隔子結合，間隔子包括可以是半胱胺酸、離胺酸、鳥胺酸、同半胱胺酸或乙酿化苯丙賴，以及親水性基團可以結合於第24號位置的半胱k (依據野生型胰南血糖素之胺基酸序列號）。另外，烷化之胰高血糖素擷抗劑可包括一間隔子，直中該間隔子同時垸化且經過修㈣包括親水性基團。在一非限施例中，適當的間隔子包括—或多個選自由下列胺基群組：半胱胺酸、離胺酸‘、烏胺酸、同半胱胺酸或乙fe化本丙胺酸。貫施例 -110 - 200920404 定非天然胺基酸無法以一般DNA重組技術表現，但其製備技術在該領域仍屬習知。本發明之成份包括非胜肽部分可經由標準有機化學反應合成，或以標準胜肽化學反應亦可適用。一般合成方案：於經修改的應用生物系統（Applied Biosystem) 430 A肽合成器上使用HBTU-活化之「Fast Boc」單一偶合劑自0.2毫莫耳之Boc Thr(OBzI)Pam樹脂開始合成得胰高血糖素類似物。Boc 胺基酸及 HBTU 係自 Midwest Biotech (Fishers，IN) 賭得。所使用之側鏈保護基為：Arg(Tos)、Asn(Xan)、 Asp(OcHex)、Cys(pMeBzl)、His(Bom)、Lys(2Cl-Z)、Ser(OBzl)、 Thr(OBzl)、Tyr(2Br-Z)、及 Trp(CHQ)。N-端 His 上之側鏈保護基為Boc。用哌啶於二甲基曱醯胺中之20%溶液處理各完成的肽基樹脂，以移除色胺酸之曱醯基。在對曱酚及二曱硫之存在下進行液態氟化氫分裂。分裂係使用HF裝置（Penninsula Labs) 於冰浴中進行1小時。於蒸發掉HF後，將殘留物懸浮於乙醚中並過濾出固體物質。將各肽萃取至30-70毫升之乙酸水溶液中，並利用 HPLC[Beckman System Gold，0.46x5cm Zorbax C8，lml/min，45C， 214nm，A 缓衝液=0.1%TFA， -Ill 200920404 B=0.1%TFA/90%乙腈，於10分鐘内10%至80%B之梯度]分析經稀釋的等分試樣。於FPLC上在2.2 X 25公分Kromasil C18管柱上進行純 ' 化，同時並監測214奈米處之UV且收集5分鐘的收集份。將

- 均勻的收集份組合並凍乾得>95%之產物純度。使用MALDI 質譜分析確認準確的分子質量及純度。 f 一般聚乙二醇化步驟：（半胱胺酸-馬來酰亞氨基）典型上，將胰高血糖素Cys.類似物溶解於墙酸鹽緩衝鹽水（5-10毫克/毫升）中，及加入0.01M乙二胺四乙酸（總體積之10-15%)。加入過量（2倍）的順丁烯二醯亞胺基曱氧基PEG 試劑（Nektar)，且將反應於室溫下攪拌同時並利用HPLC監測反應之進行。於8-24小時後，將反應混合物酸化，且裝填於製備型逆相管柱上，以使用〇.l%TFA/乙腈梯度進行純化。 ^ 將適當的收集份組合並凍乾得期望的聚乙二醇化類似物。實施例1 胰高血糖素Cys17(l-29)及類似單Cys類似物之合成使用FastBoc HBTU-活化之單一偶合劑將存於60毫升反應容器中之0.2毫莫耳Boc Thr(OBzl)Pam樹脂（SynChem Inc)及以下序列輸入及於經修改的應用生物系統430 A肽合成器上執 -112- 200920404 行。 HSQGTFTSDYSKYLDSCRAQDFVQWLMNT (SEQ ID NO: 32) • 使用以下之側鏈保護基：Arg(Tos)、Asp(OcHex)、

Asn(Xan)、Cys(pMeBzl)、Glu(OcHex)、His(Boc)、Lys(2Cl-Z)、 Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Trp(CHO)、及 Tyr(Br-Z)。矛ij 用 20%。底唆 ( /二甲基曱醯胺處理完成的肽基樹脂，以移除Trp甲醯基保護，然後轉移至HF反應容器中並於真空中乾燥。加入ι·〇毫升對曱酚及0.5毫升二曱硫連同一磁石攪拌棒。將容器連接至 HF裝置（Penninsula Labs)，於乾冰/曱醇浴中冷卻，抽真空，及凝結入大約10毫升之液態氟化氫。將反應於冰浴中攪拌1 小時，然後於真空中移除HF。將殘留物懸浮於乙醚中；將固體過濾，以乙醚洗滌，且將肽萃取至50毫升乙酸水溶液中。利用分裂萃取物之小樣品進行分析HPLC[0.46 X 5 cm Zotbax C C8，1 ml/min，45C，214nm，A 緩衝液為 0.1%TFA，B 緩衝液為 0.1%TFA/90%ACN，梯度=於 10 分鐘内 10%B 至 80%b]。將剩餘的萃取物裝填於2.2 x 25公分Kromasil C18製備型逆相管柱上，且使用Pharmacia FPLC系統執行乙腈梯度。收集 5分鐘的收集份，同時並監測214奈米處之。 A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50% 乙腈。梯度=於 450 分鐘内 30%B 至 100%B。 -113 - 200920404 將含有最純產物（48-52)的收集份組合冰凍，且凍乾得 30.1毫克。產物的HPLC分析顯示純度>90%，且MALDI質譜分析顯示3429.7之期望質量。類似地製備得胰高血糖素 Cys21、胰高血糖素Cys24、及胰高血糖素Cys29。實施例2 胰高血糖素-Cex及其他C-端延伸類似物之合成將285毫克（0.2毫莫耳）曱氧二苯曱基胺樹脂（Midwest Biotech) 置於60毫升反應容器中，且使用FastBoc HBTU-活化之單一偶合劑於經修改的Applied Biosystems 430A肽合成器上輸入並執行以下序列。 HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 33) 使用以下之側鏈保護基：Arg(Tos)、Asp(〇cHex)、

Asn(Xan)、Cys(pMeBzl)、Glu(OcHex)、His(Boc)、Lys(2Cl-Z)、

Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Trp(CHO)、及 Tyr(Br-Z)。利用 2〇〇/0。底。定 /二甲基曱醯胺處理完成的肽基樹脂，以移除Trp甲酿基保護，然後轉移至HF反應容器中並於真空中乾燥。加入1〇毫升對甲酚及0·5毫升二曱硫連同一磁石攪拌棒。將容器連接至 HF裝置（Pennisula Labs) ’於乾冰/曱醇浴中冷卻，抽真空， • 114 - 200920404 及凝結入大約1 〇窀升之液悲氟化虱。將反應於冰浴中授拌玉小時，然後於真空中移除HF。將殘留物懸浮於乙醚中；將固體過濾，以乙醚洗蘇，且將肽萃取至5 0毫升乙酸水溶液中。對分裂萃取物之等分試樣進行分析hplc[0.46 χ 5 cm zorbax C8 , 1 ml/min , 45C，214nm，A 緩衝液為〇1%TFA，B 緩衝液為 0· 1 %TFA/90%ACN ’ 梯度=於 10 分鐘内 i〇%b 至 8〇%B]。將萃取物裝填於2.2 χ 25公分Kromasil cig製備型逆相管柱上，且使用Pharmacia FPLC系執行乙腈梯度以進行溶離。收集5分鐘的收集份’同時並監測214奈米處之uv(2.0A)。 A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%乙腈。梯度=於 450 分鐘内 30%B至1〇〇%Β。將收集份58-65組合，冰凍且珠乾得198.1 毫克。產物的HPLC分析顯示純度大於95%。MALDI質譜分析顯示存在作為C-端醯胺產物之4316.7之期望理論質量。以經適當裝填之PAM樹脂開始，類似地製備得作為C-端羧酸的調酸素及調酸素-KRNR。實施例3

胰高血糖素Cys17 Mal-PEG-5K 將15.1毫克之胰高血糖素Cysl7(l-29)及27.3毫克之甲氧基聚 -115 - 200920404 (乙二醇）順丁烯二醯亞胺平均 M.W.5000 (mPEG-Mal-5000, Nel^tar Therapeutics)溶解於3.5毫升之鱗酸鹽緩衝鹽水（PBS) 中，並加入0.5毫升之0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)。將反應 ' 於室溫下攪拌，並利用HPLC分析[0.46 X 5 cm Zorbax C8， lml/min ，45C ，214nm (0.5A) ，A=0.1%TFA ， B=0.1Q/〇TFA/90%ACN，梯度=於 10 分鐘内 10%B 至 80%B]監 (" 測反應之進行。於5小時後，將反應混合物裝填於2.2 X 25公分Kromasil C18製備型逆相管柱上。於Pharn^acia FPLC上執行乙腈梯度，同時並監測214奈米處之UV波長且收集5分鐘之收集份。 A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%乙腈，梯度=於 450 分鐘内自 30%B至100%B。將相當於產物的收集份組合，冰凍且凍乾得 25.9毫克。 1..: 於 HPLC[0.46 X 5 cm Zorbax C8，1 ml/min，45C，2l4nm (0_5A)，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/90%ACN，梯度=於 i〇分鐘内自10%B至80%B]上分析此產物，其顯示純度大約為 90%。MALDI(基質輔助雷射脫附游離）質譜分析顯示8700至 9500之寬廣質量範圍（PEG衍生物之典型值）。此顯示將大約 5,000 a.m.u力口成至起始胰高血糖素肽（3429)之質量。 -116 - 200920404 實施例4

胰亭血糖素Cys21 Mal-PEG-5K 將21.6毫克之胰高血糖素Cys21(l-29)及24毫克之 - mPEG-MAL-5000(Nektar Therapeutics)溶解於 3.5 毫升之填酸 - 鹽缓衝鹽水（PBS)中，並加入0·5毫升之o.oiM乙二胺四乙酸 (EDTA)。將反應於室溫下授拌。於2小時後，力口入另一 12.7 C 毫克之mPEG-MAL-5000。於8小時後，將反應混合物裝填於 2.2 X 25公分Vydac C18製備型逆相管柱上，且於Pharmacia FPLC上於4毫升/分鐘下執行&腈梯度，同時收集5分鐘之收集份。A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%ACN。梯度=於 450 分鐘内自20%至80%B。將對應於出現產物的收集份組合，冰凍且凍乾得34毫克。利用分析 HPLC[0.46 X 5 cm Zorbax C8，1 ml/min，45C， 214nm (0.5A)，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/90%ACN，梯度=於 ί : 10分鐘内自10%B至80%B]分析產物顯示不同於起始胰高血糖素肽的均勻產物。MALDI(基質輔勗雷射脫附游離）質譜分析顯示8700至9700之寬廣質量範圍（PEG類似物之典型值）。此顯示將大約5,000 a.m.u加成至起始胰高血糖素肽（3470)之質量° 實施例5 -117 - 200920404

胰高血糖素Cys24 Mal-PEG-5K 在攪拌下將20.1毫克之胰高血糖素C24(l-29)及39.5毫克之 mPEG-Mal-5000(Nektar Therapeutics)溶解於 3.5 毫升之 PBS中，並加入0.5毫升之0.01M EDTA。將反應於室溫下授拌7小時，然後加入另一 40毫克之mPEG-Mal-5000。於大約 15小時後，將反應混合物裝填於2.2 X 25公分Vydac C18势備型逆相管柱上，且使用Pharmacia FPLC執行乙腈梯度。收集收集份同時並監測214奈米（2.0A)處之UV。A，緩彳舒广 =0.1%TFA，B 緩衝液=0.1%TFA/50%ACN，梯度=於 ' 分鐘内自30%B至100%B。將相當於產物的收集份組合，、水且凍乾得45.8毫克。MALDI質譜分析顯示最大值彳立# 9175.2(其大約比胰高血糖素C24(3457.8)多5,0〇〇 a.m.u)之典型的PEG寬信號。、

貫施例6

胰高血糖素 Cys24 Mal-PEG-20K 在室溫於攪拌下將25·7毫克之胰高血糖素Cys24 (1_29)及宅克之 mPEG-Mal-20K(Nektar Therapeutics)溶解於 3 5 古升 PBS中，並加入0.5毫升之0.01M EDTA。於6小样你可便，如利用HPLC所測得，起始物料對產物之比大約為60:4(^ 一 25.1毫克之mPEG-Mal-20K且使反應再多攪拌ι6 , 加入另卜時。產 -118 - 200920404 物比率並未顯著地改良，因此將反應混合物裝填於2.2 x 25公分Kromasil C18製備型逆相管柱上，且於Pharmacia FPLC上使用於450分鐘内自30%B至100%B之梯度進行純化。A緩衝液=0.1%TFA，B 緩衝液=0.1%TFA/50%ACN ’ 流率=4 毫升 /分鐘，且收集5分鐘之收集份同時並監測214奈米（2.0A) 處之UV。將含有均勻產物的收集份組合，冰凍且凍乾得25.7 毫克。利用分析HPLC測得之純度為〜90%。MALDI質譜分析顯示自23,000至27,000之寬峰，其大約比起始胰高血糖素 C24(3457.8)多 20,000 a.m.u.。實施例7

胰高血糖素Cys29 Mal-PEG-5K 在室溫於攪拌下將20.0毫克之胰高血糖素Cys29 (1-29) 及 24.7 毫克之 mPEG-Mal-5000(Nektar Therapeutics)溶解於 3.5 毫升之PBS中，並加入0·5毫升之0·01Μ EDTA。於4小時後，加入另一 15.6毫克之mPEG-Mal-5000以驅使反應完全。於8 小時後，將反應混合物裝填於2.2 X 25公分Vydac C18製備型逆相管柱上，且於Pharmacia FPLC系統上執行乙腈梯度。收集5分鐘之收集份同時並監測214奈米（2.0A)處之UV。 A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%ACN。將收集份 75-97 組合，冰凍且凍乾得40.0毫克之不同於在HPLC上之回收起始物料 -119- 200920404 (收集份58-63)的產物。利用分析HPLC[0.46 χ 5 cm Zorbax C8，1 ml/min，45C，214nm (0.5A)，A=0.1%TFA， B=0.1°/〇TFA/90%ACN，梯度=於 10 分鐘内自 l〇%B 至 80%JB] 分析產物顯示純度大於95%。MALDI質譜分析顯示存在具 8,000至10,000之質量範圍（最大值在9025.3)的卩£0成分，其較起始物料（3484.8)大 5,540 &.111.11.。實施例8 騰高血糖素Cys24 (2- 丁内酯）於24.7毫克之胰高血糖素Cys24 (1-29)中加入4毫升之 0.05M碳酸氫銨/5〇〇/〇乙腈及5.5微升之2-溴-4-羥基丁酸_丫_ 内酯之溶液（1〇〇微升於900微升乙腈中）。於在室溫下攪拌3 小時後，將另一 1〇5微升之内酯溶液加至反應混合物，將其再多攪拌15小時。以10%乙酸水溶液將反應混合物稀釋至ι〇耄升，並將其裝填於2·2 χ 25公分Kr〇masil C18製備型逆相官柱上。於Pharmacia FPLC上執行乙腈梯度（於45〇分鐘内自 20%B至8〇〇/oB)，同時收集5分鐘之收集份並監測214奈米 (2·〇Α)處之 UV。流率=4 毫升/分鐘，A=0.1%TFA，B=〇.l%TFA /50%ACN。將收集份74_77組合，冰凍且凍乾得7 5毫克。 HPLC分析顯示純度為95%，且MALDI質譜分析顯示354〇 7 之質量或較起始物料多84個質量單位。此結果與加入單一的 -120 - 200920404 丁内酯部分一致。實施例9 胰高血糖素Cys24 (S-羧甲基）將18.1宅克之胰高血糖素Cys24〇_29)溶解於9 4毫升之 0.1M，義緩衝液(册9·2)中，並加w.6毫升之溴乙酸溶液 (I.3毛克於乙腈巾）。將反應於室溫下麟並利用分析 HPLC追縱反應的進行。於工小時後，加入另—〇1毫升之漠乙酸溶液。將反應再多祕6G分鐘，然後用乙酸水溶液酸化

*P ___ Co Ο H 0 SEQ ID NO： 34

H S Q G T

4 20 50S 2

Molecular Weight = 3541 91 Exact Mass =3538 MolecularFormula = C155H226N 亚裝填於2.2 x 25公分Kromasil C18製備型逆相管柱上進行純化。於Pharmacia FPLC(流率μ毫升/分鐘）上執行乙猜梯度，同時收集5分鐘之收集份並監測214奈米（2 〇A)處之uv。 A=0.1〇/〇TFA，B=0.1%TFA/50%ACN。將收集份 26_29 組合，冰凍且凍乾得數毫克之產物。分析HPLC顯示純度為90%，且MALDI質譜分析確認之期望產物質量為3515。貫施例10 -121 - 200920404 胰高血糖素Cys24順丁烯二醯亞胺基，ρΕ(3_3·4κ_二聚體將10毫克之胰高血糖素cys24及1.02毫克之 Mal-PEG-Mal-3400 ’聚（乙二醇）_雙_順丁烯二醯亞胺平均M.w. 3400(Nektar Therpeutics)溶解於3 5毫升磷酸鹽緩衝鹽水及〇 5 毫升之0.01M EDTA中，並將反應於室溫下攪拌。於16小時後，加入另一 16毫克之胰高血糖素Cys24並持續攪拌。於大約40小時後，將反應混合物裝填於pharmcia PepRPC 16/10 管柱上，並於Pharmacia FPLC上執行乙腈梯度，同時收集2 分鐘之收集份並監測214奈米（2·0Α)處之UV。流率=2毫升/ 分鐘，A=0.1%TFA，B=0.1%TFA/50%ACN。將收集份 69-74 組合，冰凍且凍乾得10.4毫克。分析HPLC顯示純度為90%，且MALDI質譜分析顯示在9,500-11，000範圍内之成分，其與期望的二聚體一致。

GlucagonCys24(1-29)

3457.80 3457.80 3572.00 10487.60 實施例11 -122 - 200920404 胰高血糖素溶解度檢定法：製備存於0.01N HC1中之胰高血糖素（或類似物）的溶液（1 毫克/毫升或3毫克/毫升）。用0.01N HC1將100微升之儲備溶液稀釋至1毫升，並測定UV吸光度（276奈米）。使用 200-250微升之0.1M Na2HP04 (pH9.2)將剩餘儲備溶液之pH 調整至pH7。使溶液於4°C下靜置隔夜然後離心。接著用0.01N HC1將100微升之上清液稀釋至1毫升，並測定UV吸光度（重複兩次）。起始吸光度讀數補償體積之增加，且使用以下計算於確定溶解度百分比：最終吸光度 -X 100=溶解百分比起始吸光度結果示於表1，其中胰高血糖素-Cex代表野生型胰高血糖素（SEQ ID NO: 1)加上SEQ ID NO: 26之羧基端加成且胰高血糖素-Cex R12 代表 SEQ ID NO: 39。表1胰高血糖素類似物之溶解度數據類似物溶解百分比膜南血·糖素 16 123 - 200920404 胰高血糖素-Cex，R12 104 胰高jk糖素-Cex 87 調酸素 104 胰高血糖素，Cysl7PEG5K 94 胰高血糖素，Cys21PEG5K 105 胰高血糖素，Cys24PEG5K 133 實施例12 胰高血糖素受體結合檢定法利用閃爍親近（scintillation proximity)檢定技術於競爭結合檢定法中量測肽對胰高血糖素受體的親和力。將於閃爍親近檢定缓衝液（0.05 M Tris-HCb pH 7.5，0.15 M NaCM，0.1〇/〇 w/v牛血清白蛋白）中製得之肽的連續3倍稀釋液於96孔白色 /透明底盤（Corning Inc.，Acton, MA)中與 0.05 nM (3-[1251]_峨路胺酿基）TyrlO胰高血糖素（Amersham Biosciences, Piscataway，NJ)(每孔1-6微克）、由過度表現人類胰高血糖素受體之細胞製備得之細胞質膜片段、及1毫克/孔之經聚乙二醇亞胺處理之小麥胚芽凝集素（agglutinin) A型閃燦親近檢定珠粒（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)混合。當於旋轉搖盪器上在800 rpm下搖盪5分鐘後，將盤於室溫下培養12 小時，然後於MicroBetal450液體閃爍計數器（Perkin-Elmer， -124 - 200920404

Wellesley，ΜΑ)上進行讀取。於具有較測試樣品中之最高濃度大4倍濃度之「冷」天然配體的孔中量測非特異結合(NSB)放射性，且於沒有競爭物的孔中偵測總結合放射性。特異結合百分比係計算如下：特異結合％=((結合-NSB)/(總結合 -NSB))X100。IC50 值係經由使用 Origin 軟體（OriginLab， Northampton, ΜΑ)而測得。實施例13 功能檢定法-cAMP合成於基於螢火蟲螢光素酵素之報告檢定法中量測胰高血糖素類似物誘發cAMP的能力。經由於經補充0.25%牛生長血清 (HyClone, Logan, UT)之 DMEM(Invitrogen, Carlsbad, CA)中培養16小時，然後再用胰高血糖素、GLP-1或新穎胰高血糖素類似物之連續稀釋液於37°C，於96孔經塗布聚-D-離胺酸之「Biocoat」盤（BD Biosciences, San Jose，CA)中之 5%C 02 下培養5小時，而將經共轉染胰高血糖‘素受體或GLP-1受體之 HEK293細胞及鍵結至cAMP反應元件之螢光素酵素基因除去血清。於培養結束時，將1〇〇微升之LucLite發光基質試劑 (Perkin-Elmer，Wellesley, MA)添加至各孔。將盤短暫地振搖，於暗處培養1 〇分鐘，並於MicroBeta-1450液體閃爍計數器 (Perkin-Elmer, Wellesley, MA)上測量光輸出。經由使用 Origin -125 - 200920404 軟體(OriginLab, Northampton, ΜΑ)計算表 2 利用具有C-端延伸之胰高血糖素類似物的cAMP誘導 __I ' "" 肽 -—--- cAMP誘導胰高血糖素受體 GLP-1受體 EC5〇, nM N* EC5〇, nM N _ 月夷南血糖素 0.22 ± 0.09 14 3.85 ±1.64 10 GLP-1 2214.00 ± 182.43 2 0.04 ± 0.01 14 __^馬血糖素Cex 0.25 ± 0.15 6 2.75 ± 2.03 7 調酸素 ------ 1 3.25 ± 1.65 5 2.53 ± 1.74 5 素 KRNR 2.77 ± 1.74 4 3.21 土 0.49 2 胰高血糖素R1 2 -—--— 0.41 士 0.17 6 0.48 ± 0.11 5 騰向血糖素 R12 Cex 0.35 ± 0.23 10 1.25 土 0.63 10 胰兩血糖素 R12 K20 ----- 0.84 ± 0.40 5 0.82 ± 0.49 5 姨高血糖素 R12 K24 ------- 1.00 士 0_39 4 1.25 土 0.97 5 騰鬲血糖素 R12 K29 " _______J 0.81 士 0.49 5 0.41 ± 0.24 6 -126 - 200920404

月夷南血糖素酿胺 0.26 ± 0.15 3 1.90 ± 0.35 2 調酸素C24 2.54 ± 0.63 2 5.27 ± 0.26 2 調酸素 C24 PEG 20K 0.97 ± 0.04 1 1.29 ± 0.11 1 *-實驗數目 127 - 200920404 表3 利用聚乙二醇化胰高血糖素類似物的cAMP誘導 cAMP誘導肽騰雨血糖素受體\ GLP-1受體 EC50，nM N* EC50，nM N 膜局血糖素 0.33 士 0.23 18 12.71 ±3.74 2 胰高血糖素C17 PEG 5K 0.82 ± 0.15 4 55.86 ± 1.13 2 胰高血糖素C21 PEG 5K 0.37 ± 0.16 6 11.52 ± 3.68 2 胰高血糖素C24 PEG 5K 0.22 ± 0.10 12 13.65 ± 2.95 4 胰高血糖素C29 PEG 5K 0.96 土 0.07 2 12.71 ± 3.74 2 胰高血糖素C24 PEG 20K 0.08 ± 0.05 3 未測定胰高血糖素C24二聚體 0.10 ± 0.05 3 未測定 GLP-1 > 1000 0.05 ± 0.02 4 實驗數目 -128 - 200920404 實施例14 胰高血糖素Cys-順丁烯二醯亞胺基PEG類似物之穩定性檢定法將各胰高血糖素類似物溶解於水或PBS中，並進行起始 HPLC分析。於調整pH(4、5、6、7)後，將樣品於37°C下在指定的期間内培養，並再次利用HPLC分析以測定肽的完整性。測定特定相關肽之濃度，並相對於起始分析計算保持完整的百分比。關於胰高血糖素Cys21-順丁烯二醯亞胺基PEG5K 的結果示於圖1及2。實施例15 胰高血糖素擷抗劑胰高血糖素擷抗劑係由下列步驟所合成：

Boc-chemistry strategy之一般胜肽合成步驟：於經修正過的應用生物系統（Applied Biosystem) 430 A肽合成器上，使用HBTU-活化之「FastBoc」單一偶合劑，由0.2 毫莫耳之MBHA樹脂或結合第一胺基酸之Pam樹脂開始，合成得到胰高血糖素相似物。Boc胺基酸及HBTU係為Midwest Biotech (Fishers，IN)購得。所使用之侧鏈保護基為：Arg(Tos)、 Asn(Xan)、Asp(OcHex)、Cys(pMeBzl)、His(Bom)、Lys(2Cl-Z)、 Ser(OBzl)、Thr(OBzl)、Tyr(2Br-Z)、及Trp(CHO)。N-端His上 -129 - 200920404 之側鏈保護基為Boc。在自動固相合成反應後，以N-terminal 3- phenyllactic acid (PLA) (Aldrich, Milwaukee, WI)，配合使用 BEPBT(3-(Diethoxy-phosphoryloxy)-3H-benzo[d][l ,2,3]triazin- 4- one, Synchem Inc., Aurora, OH) 在胜肽固相合成反應後，每個結束肽樹酯以20% piperdine/DMF進行處理，以移除色胺酸之曱醯基，在對曱酚及二甲硫之存在下進行液態氟化氫分裂。分裂係使用HF裝置 (Penninsula Labs)於冰浴中進行1小時。於蒸發掉HF後，將殘留物懸浮於乙醚中並過濾出固體物質。將各肽萃取至30-70毫升之乙酸水溶液中並以水稀釋且將其凍乾。原胜肽以HPLC進行分析，並以ESI或MALDI-TOF質譜儀分析其分子量。該胜肽以一般HPLC純化步驟進行純化。以Fmoc化學法進行一般性胜肽合成以ABI 433A自動化胜肽合成器以Fmoc化學法進行，以 Rink MBHA amide樹脂或以DIC/HOBT作為偶合劑之結合第一胺基酸之Wang樹脂（Novabiochem, San Diego, CA)，合成得到該胜肽。在自動化胜肽合成後，3-苯乳酸（PLA)手動地以BEPBT 偶合。N -Fmoc [N-(9-fluorenyl)methoxycarbonyl]胺基酸所使用之側鏈保護基如下：Arg，Pmc; Asp，OtBu; Cys，Trt; Gln，Trt; His, Trt; Lys, Boc; Ser, tBu，Tyr, tBu ;以及以Trp，Boc (Pmc = -130 - 200920404 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl, OtBu = tert-butyl ester, Trt = trityl, Boc = tert-butyloxycarbonyl, and tBu = tert-butyl ester). Fmoc-Cys(S03Na)-OH 及

Fmoc-homoCys(S03Na)-OH使用於合成包括有半胱績胺酸及同半胱磺胺酸之胜肽。N-端His上之側鏈保護基為Boc。將該胜肽與樹脂分離時係使用分離混合劑，包括85%TFA, 5% phenol, 5% water and 5% thioanisole (當胜肽包括有半胱胺酸時添加2.5% EDT)。原胜肽以醚沉澱法、離心法及凍乾法處理。再以HPLC分析且以ESI或MALDI-TOF質譜分析確認。再以一般HPLC純化步驟進行純化。一般HPLC分析步驟： HPLC以ZORBAX SB-C8管柱（0.46 X 5cm，5 m, Agilent) 之Beckman System Gold HPLC system進行，以流速在 1.0 mL/min及監控在214nm之梯度洗出。梯度設定為1〇%Β到 80%B超過10分鐘，再以10%B進行5‘分鐘，缓衝液A=0.1%TFA andB=0.1%TFA/90% 亞硝酸鹽。 —般製備性HPLC純化步驟：純化胜肽時係以Waters 600E，配合使用具有半製備性HPLC 管柱（ZORBAX SB-C8, 21.2x250mm，7 m，Agilent)之486 監 -131 - 200920404 測系統，在214nm或230nM下進行監測。缓衝液A=0.1%TFa/ 10%亞硝酸鹽以及B=〇. 1 %TFA/90%亞硝酸鹽。該些用於純化之梯度為0-30%B進行40分鐘，再以30-50%B流速為12ml/min進 - 行大於30分鐘。該些收集份以HPLC分析且以質譜分析確認。 - 收集該些純度超過90%之收集份，凍乾且保存。混合該些純度為60-90%之收集份’凍乾後再次純化。 ( 以半胱胺酸-馬來酰亞氨基步驟製備聚乙二醇化之胰高血糖素相似物。一般而言，胰高血糖素Cys相似物係溶解於礙酸鹽緩衝液（5-i〇mg/mi)，且添加o.oiM乙二胺四醋酸納 (EDTA)(總體積之1(M5%)。當以HpLCg測反應進行時，添加過量（1.5 21倍）的馬來醯亞胺基曱氧基PEG試劑（Nektar，

Huntsville，AL)並在室溫下攪拌。2_24小時後，使反應混合物酸化並注入反相管柱以〇1%TFA/乙晴梯度進行純化。將適當的餾份混合且凍乾以得到聚乙二醇化之衍生物。對於在p B §中 ( 低溶解度之胜肽，將其溶解在25%乙晴水或4 6]VI尿素〇 1M

Tris(pH調整為8.0 8.5)緩衝液並與‘聚乙二醇藥劑進行反應 s亥成份之特定貫施例係經由以下所述之方法所合成.

製備 Fm〇c-h〇m〇cys(S〇3Na)_〇H 、將0.9UL-同半胱石黃胺酸（5麵〇16)⑸啊，％ ^心，以及0.5克之氫氧化鈉（125mm〇溶，毛升冰浴之水 -132 - 200920404 中。將9-Fluorenylmethyl succinimidyl carbonate (Fmoc-OSu) (1.86g, 5.5mmole)溶液加入50ml二氧陸圜。混合液在室溫下攪拌4小時。混合液在減壓下蒸發且加入1〇〇 ml水。該溶液以乙鍵清洗且通過離子交換管柱（Amberlite IR-120B，H+form; GFS - Chemicals, Columbus, OH))。該洗出液凍乾以產生黏性非結晶之 Fmoc-homoCys(S03H)-OH (1.6g，3.95mmole,產量為 Ο 79.2%)。前述之自由酸加入50ml含有0.16g (4mmole) NaOH且冰浴之水中，康乾後得到定量之Fmoc-homoCys(S〇3Na)-OH，可直接使用於SPPS ，不需要進一步純化。 Fmoc-homoCys(S03Na)-OH可再結晶於乙醇/醋酸酯（2:1)以產生實體結晶產物，其熔點為215-218°C且ESI-MS 404.2[(M-H)+, acid form]。利用 O.lmmole Fmoc/HOBT/DCC 化學法，以O.lmmole RinkMBHA胺基樹脂，利用DIC/HOBT作為偶合劑，在ABI ϋ 433Α自動胜肽合成器上，以第一固相合成具有胺基酸序列 TSEYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT之胜肽。使用下列之Fmoc 胺基酸：Ala, Arg(Pmc), Asp(OtBu), Asn(Trt), Glu(OtBu), Gln(Trt), Leu, Lys(Boc), Met, PLA, Ser(tBu), Thr(tBu), Trp(Boc)，Tyr(tBu),以及Val.在自動胜肽合成後，該胜肽樹月旨以3-苯乳酸（83mg, 0.5mmole)手動地耗合，以在4ml 5%DIEA/DMF 之DEPBT(150mg, 0.5mmole)進行約 2小時，以 -133 - 200920404 得到具有下列序列之胜肽樹脂： HO-PLA-Thr-Ser-Glu-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-A la-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 50)。胜肽樹脂以8.5ml TFA加上0.5g酸，0.5ml的水以及 0.5ml曱基苯基硫醚，在室溫下處理約2小時。該胜肽溶解於 TFA中過濾，且加入40ml的乙醚進行沉澱。沉澱得到粗胜肽，溶解於乙酸中並凍乾。粗胜肽產量約200 250mg，在純化後得到純度95%之胜肽25 40mg (10 15%總產量）。該胜肽以 HPLC分析後顯示保留時間約為7.66分鐘，且ESI-MS顯示質量為2986.0，對應於分子量為2986.3之胜肽。以相同的步驟合成胜肽[PLA6, D9]glucagon(6-29) amide，HPLC 7.25分鐘及ESI-MS 2973·5對應於計算出的分子量為2973.3 ; [PLA6, D9, D28]glucagon(6-29) amide HPLC 7.46 分鐘及ESI-MS 2973.0對應於計算出的分子量為2973.3 ; [PLA6, D9, E9]glucagon(6-29) amide HPLC 7.20 分鐘及 ESI-MS 3002.0對應於計算出的分子量為3002.3 ; [PLA6, E9, C16]glucagon(6-29) amide HPLC 7.38 分鐘及 ESI-MS 3002.0 對應於計算出的分子量為3002.3 ; [PLA6, E9, C24]glucagon(6-29) amide HPLC 7.33 分鐘及 ESI-MS 2961.0 134 - 200920404 對應於計算出的分子量為2961.3 ; [PLA6， D9, C24]glucagon(6-29) amide HPLC 7.43 分鐘及ESI-MS 2947.0 對應於計算出的分子量為2947.3 ; [PLA6, E9, C40]glucagon(6-40) amide HPLC 7.28 分鐘及 MALDI-MS 3925.5對應於計算出的分子量為3924.3。合成[hCys(S03H)9]glucagon (6-29) amide 利用 O.lmmole Fmoc/HOBT/DCC 化學法，以O.lmmole RinkMBHA胺基樹脂，利用DIC/HOBT作為偶合劑，在ABI 433A自動胜肽合成器上，以第一固相合成具有胺基酸序列 YSKYLDSRRAQDFVQWLMNT (SEQ ID NO: 51; glucagon(10-29))之胜肽。在自動胜肽合成後，該胜肽樹脂以 Fmoc-homoCys(S03Na)-OH (130mg, 0.3mmole), HOBT (45.2mg, 0.33mole)以及 DIC (52.0ul, 0.33mole)在4ml DMF 進行約2小時。在寧海準試驗之後，一半劑量的胜肽樹脂(0.05 mmole)自動地結合於3種胺基酸：絲胺酸、蘇胺酸及苯丙胺酸，以得到具有下列序列之胜肽樹脂： H2N-Phe-Thr-Ser-homoCys(S03H)-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-S er-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-N H2 (SEQ ID NO: 52). 使用下列的 Fmoc 胺基酸：Ala, Arg(Pmc)，Asp(OtBu), -135 - 200920404

Asn(Trt), Gln(Trt), homoCys(S03Na), Leu, Lys(Boc), Met, Phe, Ser(tBu), Thr(tBu), Trp(Boc), Tyr(tBu),以及 Val o 胜肽樹脂以8.5ml TFA加上0.5g紛，〇.5ml的水以及 0.5ml曱基苯基硫醚，在室溫下處理約2小時。該胜肽溶解於 TFA中過濾，且加入40ml的乙醚進行沉澱。沉澱得到粗胜肽，溶解於乙酸中並凍乾。粗胜肽產量約100 130mg，在純化後得到純度95%之胜肽15 20mg (10 15%總產量）。該胜肽以 «^1^分析後顯示保留時間約為6.73分鐘，且£31-]^18顯示質量為3021.0，對應於分子量為3021.3之胜肽。以相同方式合成[hCys(S03H)9]glucagon (5-29) amide，該胜肽以^1?1^分析後顯示保留時間約為6.82分鐘，且£81-1^8顯示質量為3122.5，對應於分子量為3122.4之胜肽；合成 [hCys(S03H)9]glucagon (4-29) amide，該胜肽以HPLC分析後顯示保留時間約為6.83分鐘，且ESI-MS顯示質量為3178.5，對應於分子量為3179.3之胜肽；合成[hCys(S03H)9]glucagon (2-29) amide，該胜肽以HPLC分析後‘顯示保留時間約為6.79分鐘，且ESI-MS顯示質量為3394.5，對應於分子量為3394.7之胜肽；合成[PLA6, hCys(S03H)9]glucagon (6-29) amide，該胜肽以HPLC分析後顯示保留時間約為7.17分鐘，且ESI-MS顯示質量為3022.0，對應於分子量為3022.3之胜肽。合成[PLA6, E9, C24(1.2K)]glucagon (6-29) amide -136 - 200920404 將 20mg ( 0.00675mmole)之[PLA6, E9，C24]glucagon (6-29) amide及 12.5mg (O.Olmmole) m_dPEGTM24 -MAL(MW 1239, Quanta biodesign Ltd. Powell, OH)，溶解於9ml 25% 乙晴水以及lml 1M Tris base緩衝液(pH調整為8·0 8.5)。將反應於室溫下攪拌並利用分析HPLC追蹤反應的進行。在HPLC偵測不到初始產物後（約2小時），以製備性HPLC純化該混合物。在凍乾後，得到約10 12 mg [PLA6，Ε9, C24(1.2K)]glucagon (6-29) amide,以HPLC分析後顯示保留時間約為7.48分鐘，且ESI-MS顯示質量為4218.5，對應於分子量為4218.0 (含水分子）。以相同方式合成[C5(1.2K)，E9]glucagon (5-29) amide，以 HPLC分析後顯示保留時間約為7.25分鐘，且ESI-MS顯示質量為4327.5’對應於分子量為4327.8;合成[C8(1.2K)，E9]glucagon (6-29) amide，以HPLC分析後顯示保留時間約為7.25分鐘，且 ESI-MS顯示質量為4260.0，對應於分子量為4259.0。合成[PLA6, E9, C24(20K)]glucagon (6-29) amide 15mg ( 0.005mmole) [PLA6, E9, C24]glucagon (6-29) amide以及 140mg (0.006mmole) 20K mPEG—MAL(MW 22k, Nektar, Huntsville, AL)溶解於9ml 25% 乙晴水以及 lml 1M Tris base 緩衝液(pH調整為8.0 8.5)。將反應於室溫下攪拌並利用分析 HPLC追蹤反應的進行。在HPLC偵測不到初始產物後（約6小 -137 - 200920404 時），以製備性HPLC純化該混合物。以分析HPLC在波長2l4nm 確認該餾份，且以波長280nm之UV測量。該餾份具有90% HPLC純度以及對波長280nm之UV具有高吸光值 (A280nm=1.0 2.0)，將其混合並凍乾。可得到約60 80 mg 之[PLA6, E9，C24(20K)]glucagon (6-29) amide，以 HPLC分析後顯示保留時間約為8.5 8.6分鐘，且厘八1^01-1^5顯示質量為 24K〜26K之間。以相同方式合成[PLA6，C8(20K), E9]glucagon (6-29) amide, [PLA6, E9, C16(20K)]glucagon (6-29) amide, [PLA6, E9, C4 0(2 OK)] glucagon (6-40) amide, [PLA6, D9, C16(20K)]glucagon (6-29) amide and [PLA6, D9，' C24(20K)]glucagon (6-29) amide. 合成[PLA6, E9, C24(40K)]glucagon (6-29) amide 將 15mg ( 0.005mmole) [PLA6, E9, C24]glucagon (6-29) amide .以及（0.006mmole) 40K mPEG-MAL(MW 40^

Chirotech Technology Ltd.，Cambs CB4 OWG, German)溶解於 18ml 25%乙晴水以及2ml 1M Tris base缓衝液（pH調整為 8.0 8.5)。將反應於室溫下攪拌並利用分析HPLC追蹤反應的進行。在HPLC偵測不到初始產物後（約6小時），以製備性HPLC 純化該混合物。以分析HPLC在波長214nm確認該館份，且以 -138 - 200920404 波長280nm之UV測量。該餾份具有90% HPLC純度以及對波長280nm之UV具有高吸光值（A280nm=1.0 2.0)，將其混合並凍乾。可得到約 1〇〇 120 mg之[PLA6, E9, C24(40K)]ghicagon (6-29) amide，以HPLC分析後顯示保留時間約為8.60 8.8分鐘。以相同方式合成[PLA6，C8(40K), E9]glucagon (6-29) ( amide, [PLA6, E9, C16(40K)]glucagon (6-29) amide and [PLA6, E9， C40(40K)] glucagon (6-40) amide, [PLA6, D9,

Cl 6(40K)] glucagon (6-29) amide 以及 [PLA6, D9, C24(40K)]glucagon (6-29) amide. 合成[PLA6, E9, C24(40K)]glucagon (6-29) amide二聚體將 20mg ( 0.00675mmole) [PLA6, E9, C24]glucagon (6-29) amide溶解於6ml PBS緩衝液，lml 1M Tris base缓衝液(pH調整為8.0 8·5)，以及3ml DMSO。將反應於開放之容器中及室 (/ 溫下攪拌，並利用分析HPLC每2小時追蹤反應的進行。在 HPLC偵測不到初始產物後（HPLC滯暂時間7.4分鐘），二聚體產物（HPLC滯留時間7.9分鐘）係為主要產物（在12小時後），以 0.1%TFA10%乙晴水稀釋該混合物，以製備性HPLC純化該混合物。在凍乾後得到約 6-8mg之[PLA6, E9, C24]glucagon (6-29) amide二聚體，ESI-MS顯示質量為5920.0，對應於分子量為 5920.6. -139 - 200920404 以相同方式合成 [C9]glucagon(6-29) amide二聚體， ESI.-MS顯示質量為5916.0，對應於分子量為5916.6 ;以及合成 [C5, E9]glucagon(5-29) amide二聚體，ESI-MS顯示質量為 6174.0，對應於分子量為6174.8 實施例16 胰高血糖素之擷抗劑活性胰高血糖素與各種不同衍生抑制物比較其受體結合、 c.AMP誘導及cAMP抑制。此測試用以測定受體結合及cAMP 誘導及cAMP抑制，係分別以實施例12、13所揭露之測定方法進行。製備可表現胰高血糖素擷抗劑活性之特定胰高血糖素相似物。此成分不同於天然胰高血糖素，因其具有天然胰高血糖素胺基端殘基，且和天然胰高血糖素相較具有第9號位置取代為麩胺酸之修飾。表4提供特譯鄧胰高血糖素擷抗劑相似物之腺高血糖素受體親和力及操抗活性。表4:具麩胺酸修飾之胺基端截斷胰高血糖素相似物及其胰高会糖素擷抗劑活性__^_ 胜肽受體結合 cAMP抑制 -140 - 200920404 IC5〇(nM) IC5〇(nM) 騰南血糖素 1-2.5 N/A [Glu9]胰高血糖素(aa2-29)-NH2 14 部份擷抗劑 [Glu9]胰高血糖素(aa4-29)-NH2 136 128 [Glu9]胰高血糖素(aa5-29)-NH2 37 74 [Glu9]胰高血糖素(aa6-29)-NH2 36 97 Glu9係為第9號位置為麩胺酸，依據天然胰高血糖素之序列如表5所指出，一系列hCys9-based擷抗劑並未表現如之前報告的Glu9-based擷抗劑一般有效地或選擇性地。成分5B及6B顯示出某些程度之擷抗活性，但僅在濃度高出其激動劑有效劑量三倍時。然而，當胺基端胺基酸（及天然胰高血糖素之第1號位置）移除時，hCys9-based騰高血糖素掘抗劑的效能有所增加（參閱表8)。

表胰高血糖素擷抗劑相似物之受體結合及c AMP抑制結果成胜肽受體結合 cAMP cAMP 份誘導抑制編 IC50(nM) EC50(nM) IC50(nM) 號 141 200920404 騰南血糖素 1.75-0.31 0.21±0.11 N/A [desHisl, Glu9]胰高血糖素-NH2 36.90±0.32 65±37 1862±1234 [desHisl, Glu9，Phe25，Leu27]騰高血糖素-NH2 12.59±0.41 81±23 N/A* 5 [desHis 1, desPhe6]胰高血糖素 -NH2 129.55±44.9 1178±105 N/A* 6 [desHis 1，Leu4，Glu9]膜高血糖素-NH2 36.88±0.03 318±112 102±52 4B [desHisl, hCys9(S03-), Phe25, Leu27]胰高血糖素-NH2 13.90±0.37 430±45 N/A* 5B [desHisl, desPhe6, hCys9(S03-), Phe25，Leu27]胰高血糖素-NH2 53.32±9.97 3212±368 9217士3176 6B [desHisl, Leu4, hCys9(S〇3-)， Phe25, Leu27]胰高血糖素-NH2 1614±1132 4456±1469 *表示非擷抗劑上標之號碼表示相對於天然胰高血糖素之胺基酸位置胰高血糖素及在第1號胺基酸截斷及第9號位置（依據天然胰高血糖素順序）取代修飾的胰高血糖素之受體結合親和力，以實施例12所述之分析方法，結果如表6所示。

-142 - 200920404 胜肽編號. 胜肽第9號殘基 ICs〇(nM)a 胰高血糖素 .COOH h2n,/Ns'cooh Asp 1.50(1.0〜2_5)* I [desHis1, Glu9]姨高血糖素 -nh2 ^^•COOH h2n'^Sn'cooh Glu 14.08 ±0.34 2 [hGlu9]胰高血糖素 ^\^,COOH Η,Ν^^ΟΟΟΗ 8·10±0_40 (aa2-29)-NH2 hGlu -*» [(CSA-1]9]胰高血糖素 S^^COOH HiN'^'COOH 12.66±0.13 (aa2-29)-NH2 CSA-1 4 [(CSA-2)9]胰高血糖素 (aa2-29)-NH2 ^，S'v^X'COOH HiN^^COOH CSA-2 13.28 ±0.78 5 [β-hGlu9]肤高血糖素 ^^COOH H!NA^cooh 37.10 土 0.34 (aa2-29)-NH2 β-hGlu 6 [(NSG-1)9]胰高血糖素 .COOH H 983 ± 82 (aa2-29)-NH2 NSG-1 7 ! [CNSG-2)9]胰高血糖素 ,COOH H 2348 ±382 (aa2-29)-NH2 NSG-2 *EC50 (nM) hGlu=同麩胺酸；上標之號碼表示相對於天然胰高血糖素之胺基酸位置 -143 - 200920404 以某些胰高血糖素修飾的胜肽進行測試，包括在第9號位置修飾為麩胺酸、同麩胺酸、CSA-1，CSA-2及β-同麩胺酸，表現出胰高血糖素擷抗劑活性。胰高血糖素胜肽包括第9號位置胺基酸修飾，且具有不同的胺基端截斷，進行其胰高血糖素擷抗劑活性分析。此些胜肽之測試結果如表7所示。 -144 - 200920404 表7 胜狀編胜肽第9號 IC50 (nM)a cAMP 號· 殘基 pA2b (I/A)50c 8 [Glu9]膜高血糖素 (aa4-29)-NH2 Glu 136.0 士 17.84 7.05 ± 1.01 1375 9 [Leu4，Glu9]膜高血糖素(aa4-29)-NH2 Glu 36.38 ±8·69 NAd NA 10 [Glu9]胰高血糖素 (aa5-29)-NH2 Glu 37.38 ±3.41 6.94 ±0.34 390 11 [Glu9]胰高血糖素 (aa6-29)-NH2 Glu 36.35 ±5.23 7.16 ±0.27 486 12 [hGlu9]膜高血糖素 (aa6-29)-NH2 hGIu 162.9 ±70.8 6.27 ±0.11 2361 13 [(CSA-1)9]胰高血糖素 (aa6-29)-NH2 CSA-l 107.3 ±5.37 6.68 ± 1.05 506 14 [(CSA-2)9]胰高血糖素 (aa6-29)-NH2 CSA-2 146.4 ±36.9 6.64 ±0.29 580 15 膜南血糖素 (aa6-29)-NH2 Asp 1894 ±383 6.94 ±0.63 1730 -145 - 200920404

16 [Lys9]姨高jk糠素 (aa6-29)-NH2 —------ Lys 5779± 1382 ------ 6.58 ± 0.60 1990 17 [Glu9]姨r%血糖f (aa7-29)-NH2 ----[ Glu >10000 —~~~--- NDe ND 上標之號碼表示相對於天然胰高血糖素之胺基酸位置 j此資料之平均似標準差係以至少三次獨立實驗所得。 b PA2··指頁抗劑濃度之負值對數，和〇 5單位相較下減少^單位激動劑之反應。此資料之平均值土標準差，以至少兩次驗所得。 . 、 c(i/a)5。：抑制指標，抑制劑IC5G與添加胰高血糖素減) 之比例。此資料之平均值±標準差，以至少三次獨立實驗所得’且由EC50標準化。 NA ·非完全的揭抗劑。 e ND :未檢測出。苐3圖表示測量胰高血糖素擷抗劑之結合親合力結果，胺基，進一步縮短為截斷或5個胺基酸。特別是，hcys9_based 胰尚血糖素擷抗劑之結合親合力藉由量測與〗丨2 5標定之胰高血糖素之競爭結合於胰高血糖素受體。結果顯示刪除第i殘:減少親=力，但進—步的刪除僅些微改變其親和力，仍產2如奈米莫耳親和力之配體。第4圖顯示在cAMP生化測試中，選 -146 - 200920404 擇擷抗劑以抑制胰高血糖素活性之能力。令人驚訝地，發現到相較於Glu9 2-29或Leu4, Glu9 4-29，5-29 hCys9-based胰高血糖素擷抗劑更為有效。更進一步地，5-29或6-29 hCys9顯示出其完全有效的擷抗性，且並未量測出任何激動活性。表8提供同半胱磺胺酸經截斷修飾之相似物片段之胰高血糖素受體親和力及操抗活性。desHisl-based hCys(S〇3H)9-based顯示如先前報告之Glu9- based antagonist [desHis1，Glu9]胰高血糖素胜肽的效能表現。更進一步截短的 hCys(S03H)9-based胰高血糖素擷抗劑係截去3, 4或5個胺基酸。受體結合結果顯示，刪除第1號位置胺基酸降低其對於胰高血糖素受體之親和力，但進一步的刪除僅些微改變其親和力，仍產生如奈米莫耳親和力之配體。 147 - 200920404 表8 :同半胱磺胺酸經截斷修飾之胰高血糖素片段相似物及其胰高血糖素擷抗活性胜肽 IC50(nM) cAMP pA2 IC50(nM) 膜局血糖素 1.0〜2_5 (EC50) [desHis 1，Glu9]胰高血糖素 -NH2 14.08 ±0.34 ΝΑ 1089 (部份擷抗劑） [hCys9(S03H)]胰高血糖素 (aa2-29)-NH2 13.16± 1.0 ΝΑ 146.6 (部份擷抗劑） [hCys9(S03H)]胰高血糖素 (aa4-29)-NH2 41.55 ±4.79 7·22± 1.09 68.4 [hCys9(S03H)]胰高血糖素 (aa5-29)-NH2 33.85 ±9.38 6.77 ±0.33 98.3 [hCys9(S〇3H)]胰高血糖素 (aa6-29)-NH2 59.11 ± 18.10 7.16±0.51 133.4 上標之號碼表示相對於天然胰高血糖素之胺基酸位置如第 5A及5B 圖所示，4-29, 5-29 及 6-29 hCys(S03H)9-based 胜肽皆具有完全抑制胰高血糖素之活性，但2-29胜肽僅具有少 -148 - 200920404 血糖素擷抗·性。第5A_示㈣職無法完 =月夷兩血糖素活性係因為料職具有殘存㈣高血糖動活性之功能。、特定胰高血糖素相似物已在發展中，自然情況下的第6 號位置之苯丙胺酸被取代為苯乳酸(PLA)，並在6_29截斷的姨高血糖素醯胺主幹上。苯乳酸係與苯丙胺酸等電性，但不具有可滴疋的氫。表9及1〇說明了在pla6取代的情況下，天然的 Asp9具有完全的擷抗性，但在效能上較低於Giw及 hCys(S〇3H)。先别文獻指出，將肤南金糖素（2_29)相似物之 Asp9取代為Glu9或hCys(S〇3H)9’可具有較高親和力及完全的擷抗性。因此，令人驚訝的是，在6_29截斷的胰高血糖素醯胺主幹之苯丙胺酸被取代為苯乳酸可促進相較於Glu9及 hCyS(S〇3H)9之相對擷抗效能。更明確地，PLA6相似物增加了對於胰高血糖素受體三倍的親和力，且增加了相對於Phe6更好的擷抗效能。 -149 - 200920404 表9 :第9號殘基取代之胰高血糖素擷抗劑相似物及其胰高血糖素擷抗劑活性 IC50(nM) cAMP 胜肽第9號殘基受體結合 pA2 IC50(nM) 月夷1¾血糖素 Asp 1.0 〜2.5 0.05-0.15 (EC50) [E9]胰高血糖素 (aa6-29)-NH2 Glu 36_35‘士5.23 7.16±0.27 97.2 [hCys(S03)9]胰高血糖素 (aa6-29)-NH2 hCys(S03 ) 59.11 ± 18.10 7.16±0_51 133.4 [hE9]胰高血糖素 (aa6-29)-NH2 hGlu 162.9 ±70.8 6.27 ±0.11 472.2 [C9(SCH2CO〇H)]胰高血糖素(aa6-29)-NH2 CSA-1 107.3 ±5_37 6.68 ± 1.05 101.2 [C9(SCH2CH2COOH)]胰高血糖素(aa6-29)-NH2 CSA-2 146.4 ±36.9 6.64 ±0.29 116 月夷高血糠素(aa6-29)-NH2 Asp 1670 ±-- 6.94 ±0.63 346 [K9]胰高血糖素 Lys 3236 ±-- 6.58 士 0.60 398 -150 - 200920404 (aa6-29)-NH2 上標之號碼表示相對於天然胰高血糖素之胺基酸位置 200920404 表10 :第9號殘基取代之[PLA6]胰高血糖素（6-29)相似物及其碌高血糖素擷抗劑活性_

胜肽 IC50(nM) (受體結合） IC50(nM) (cAMP,抑制騰高血糖素擷抗劑） 0.1 nM 或 0.2nM 溶解度 (%, pH 6-8) 月夷南血糖素 1.96 ±0.61 0.09 (EC50) [PLA6, D9]胰高血糖素 (aa6-29)-NH2 13.85 土 3_22 6.90 11 [PLA6, D9]胰高血糖素 (aa6-29)-COOH 15.51 ±3.86 13.20 96 [PLA6, E9]胰高血糖素 (aa6-29)-NH2 12.33 ±2.24 2.39 42.40 11 [PLA6，hCys(S03)9]胰高血糖素(aa6-29)-NH2 14.20 ±0.45 40.20 [PLA6, D9, D28]腺高血糖素(aa6-29)-NH2 9.0 士 1.24 1.32 100 1 [PLA6，E9]胰高血糖素 40.28±11.29 24.75 16 152 - 200920404 (aa6-29+CEX)-NH2 上標之號碼表示相對於天然胰高血糖素之胺基酸位置在胰高血糖素相似物各個位置取代為PLA之效果，包括發生在第4及5號位置。該資料呈現於表11及第8圖中，其顯示PLA6 相似物和較長的胜肽相比，其效能更佳。在第8圖結果顯示氫氧基的醯化作用並不影響PLA6相似物效能。 -153 - 200920404 表11 :在第4、5及6號位置之PLA取代之相似物，及其擷抗活性胜肽 IC50(nM) (受體結合） IC50(nM) (cAMP，抑制0.8mM胰高血糖素）胰高血糖素 1.0-2.5 1.44 (EC50+) [PLA6，E9]姨兩血糖素 (aa6-29)-NH2 12.34±0.13 64.8 ±3.4 [Ac-PLA6，E9]胰高血糖素 (aa6-29)-NH2 ND 38.1 ±9.2 [PLA5，E9]胰高血糖素 (aa5-29)-NH2 ND 328 ±25 [PLA4，E9]胰高血糖素 ND 84.4 ± 19.5 (aa4-29)-NH2 (部份激動劑） ND:未檢測出 ^ 上標之號碼表示相對於天然胰高血糖素之胺基酸位置表12之結果顯示之PLA6取代並非只增加胜肽效能，同時在聚乙二醇化反應中扮演重要角色。PLA6相似物可選擇性地聚乙二醇化，在沒有恢復胰高血糖素激動活性之下。天然Phe6相似物令人驚訝地顯示出，當聚乙二醇化時可恢復激動活性。測試了某些特定聚乙二醇化位置，包括在第 -154 - 200920404 8、11及24號位置（相對於天然胰高血糖素胜肽）。在第24 號位置聚乙二醇化之相似物顯示出最佳之效能及選擇性胰高血糖素擷抗劑活性。 ( \ 155 - 200920404 表12 :聚乙二醇化胺基端截斷胰高血糖素相似物及其胰高血糖素擷抗劑擷抗活性胜肽 IC50(nM) (受體結合） IC50(nM) (cAMP，抑制 0.2mM 膜高血糖素） [C8(20kDaPEG)，E9]胰高血糖素 (aa6-29)-NH2 >1000 非擷抗劑 [PLA6, C8(20kDaPEG)，E9]胰高血糖素(aa6-29)-NH2 303 ± 1今 236 [E9, C11 (20kDaPEG)]胰高血糖素 (aa6-29)-NH2 >1000 非擷抗劑 [PLA6, E9, Cll(20kDaPEG)]胰高血糖素(aa6-29)-NH2 776±161 664 [Ε9· C24 (20kDaPEG)]胰高血糖素 (aa6-29)-NH2 >1000 ‘ 非擷抗劑 [PLA6, E9, C24(20kDaPEG)]胰高血糖素(aa6-29)-NH2 90 ±7 126 [MCA6, E9, C24(20kDaPEG)]胰高血糖素(aa6-29)-NH2 208 ±57 非擷抗劑 [C5(1.2kDaPEG). E9]胰高血糖素 1081士268 2281 -156 - 200920404 (aa5-29) -NH2 [C5(5kDaPEG)，E9]胰高血糖素 (aa5-29) -NH2 634±174 1608 [C5(20kDaPEG)，E9]胰高血糖素 (aa5-29) -NH2 331±74 976 [d-Cys5(20kDaPEG)，E9]胰高血糖素(aa5-29) -NH2 >10000 14764 [K5(CH2CH2S-20kDaPEG)5 E9]胰高血糖素(aa5-29) -NH2 >10000 非擷抗劑 3.4kDaPEG-dimer[C5, E9]胰高血糖素(aa5-29) -NH2 435±256 1343 [PLA6, C8(1.2kDaPEG), E9]胰高血糖素(aa6-29) -NH2 220±36 非擷抗劑 [PLA6, C8(5kDaPEG)，E9]胰高血糖素(aa6-29) -NH2 948±297 216 [PLA6, C8(20kDaPEG)，E9]胰高血糠素(aa6-29) -NH2 303土14 92 [PLA6, E9，C24(1. 2kDaPEG)]胰高血糖素(aa6-29) -NH2 4.7±0.4 18 [PLA6, E9, C24(20kDaPEG)]胰高血糖素(aa6-29) -NH2 90 士 7 126 • 157 - 200920404

[MCA6, E9，C24(20kDaPEG)]胰高血糖素(aa6-29) -NH2 208±57 非擷抗劑 [Phe6, E9, C24(20kDaPEG)]胰高血糖素(aa6-29) -NH2 >10000 非擷抗劑 -158 - 200920404 實施例17 本文所述之胰高血糖素擷抗劑進行醯化作用如下： ‘製備化及/或^^乙·一醇之胜狀如下。該胜肽係在·—固相樹脂上合成，並以CS Bio 4886胜肽合成器或Applied Biosystems 430A胜肽合成器。利用所述之原位中和化學法 Schnolzer et al·，Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180-193 (1992).對於驢化胜肽，欲進行酿化的標的胺基酸位置（例如第10號位置）取代為Ν ε -FMOC離胺酸殘基。以 N-terminally BOC保護胜肽，及20%派咬之DMF，處理約 30分鐘以移除FMOC/曱酰基。藉由加入1〇倍莫耳量的 F Μ 0 C -保護間隔子胺基酸（例如

FMOC-(N-BOC)-Tryptophan-OH)或醯鏈（例如 C17-C00H) 及PyBOP或DEPBT偶合劑之DMF/DIEA，以結合於自由的ε-amino Lys殘基。除去間隔子胺基酸的FMOC基，藉由重複的連結一醯鏈。最後處理以100% TFA，以除去任何側鏈保護基以及胺基端BOC基。胜肽樹脂以5% DIEA/DMF 中和’乾燥，再以HF/p-cresol，95:5, 0oC處理1小時從樹脂分離。接著進行萃取，將粗胜肽溶解於5% HOAc溶液中。以ESI-MS確認溶液中樣本之分子量是否正確。正確的胜肽則以 10% CH3CN/0.1% TFA 到 0.1% TFA 之 1〇〇〇/0 CH3CN 線性梯度的 RP-HPLC 純化。以 Vydac C18 22 mm X 2 50 mm蛋白質管柱進行純化。酿化胜肽相似物一般係在 20 : 80之緩衝液比例沖出。各收集分集中在一起且以 -159 - 200920404 RP-HPLC接認其純度。純的收集分經過滚乾後產生白色固體的胜肽。對於胜肽聚乙二醇化，以40 kDa之曱氧基聚（乙二醇）馬來酿亞胺基-丙酿胺（Chirotech Technology Ltd.)，與相同莫耳量的胜肽在7M尿素，50mM Tris-HCl下，利用少量的溶劑將胜肽及聚乙二醇溶解到乾淨溶液中（使用2-3毫克胜肽之反應時，係少於2毫升）。在室溫下激烈攪拌4-6小時’並以RP-HPLC進行分析。聚乙二醇化產物由初產物區別出來，以較少的滯留時間。純化係以Vydac C4管柱，以相似於初胜肽純化之步驟進行。約在缓衝液比例為50 : 50 沖出。純的聚乙二醇胜肽之收集分被發現並進行凍乾。實施例18 glucagon-based 之縮 | 旨環肽[Thr5-0-PLA6, E9]glucagon (2-29) amide [Thr5-0-PLA6, E9]glucagon (1-29) amide之合成，係以下列步驟進行：利用固相Boc-chemistry，以ABI 430A自動胜肽合成器，以 0.2mmoleMBHA酿胺樹脂及DEPBT作為偶合劑，合成胜肽序列為 HO-PL A-TSE YSKYLDSRRAQDFVQ WLMNT [PLA6, E9]glucagon(6-29) (SEQ ID NO: 71)。使用下列Boc 胺基酸：Ala, Arg(Tos), Asp(OcHx), Asn(Xan), Glu(OcHx)， Gln(Xan), Leu, Lys(2-Cl-Z), Met, PLA, Ser(OBzl), Thr(OBzl), Trp(HOC)，Tyr(2.6-di-Cl-Bzl)，及 Val 此胜肽形成一縮酯環 -160 - 200920404 肽（酯鍵）於樹脂，經由手動偶合於一預活化並具有 Boc-Thr(OBzl)-OH (2mmole) / DIC (lmmole) / DMAP (0.2mmole)之DCM的對稱性酐溶液約16小時。剩餘的胺基酸係以標準Boc-chemistry得到具有下列序列之縮酯環肽 . 樹脂：

Ser-Gln-Gly-Thr-O-PLA-Thr-Ser-Glu-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-A sp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn- f"'> Thr-NH2 (SEQ ID NO: 64). 胜肽樹脂以液態氟化氫將粗胜肽由固相分離下來且除去所有保護基。縮酯環肽係以製備性HPLC純化，且以MS 及分析HPLC進行分析。純化的胜肽在分析光譜顯示單一波峰，及ESI-MS分析得到質量為3359.0，而對應計算為3359.6 的分子量。以相同的步驟’以組胺酸胺基端殘基單一附加偶合，合成縮酯環肽[Thr5-〇-PLA6, E9]glucagon (1-29) amide l (SEQ ID N0: 65)。純化的胜肽在分析光譜顯示單一波峰，及£51-河8分析得到質量為3359.〇，而對應計算為3359 6的分子量。實施例19 下列胜肽係以前述方法合成，並接著藉由量測由表現 cAMP之細胞釋放出cAMP以測試刺激GLp_ 1受體的能力，以及藉由量測由表現CAMP之細胞釋放出cAMp以測試匕刺激膜高血糖素受體的能力，且以0.5 nM進行刺激，如實施例13 -161 - 200920404 所述。結果顯示於表13中。表13 騰兩血糖素掘抗劑 GLP-1激動性胜肽 IC50(nM，抑制 0.5nM G) EC50(nM) 胰高血糖素 0.005 ± 0.008 GLP-1 0.005 ±0.002 [PLA6, E9]胰高血糖素(6-29) PLA TSEYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT-NH2 (SEQIDNO: 71) 23.75 ±4.16 無激動性 [PLA6, D9, D28]胰高血糖素(6-29) PLA TSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMDT-NH2 (SEQIDNO: 62) 9.03 ± 1.54 746.0 ±225.7 [E9]胰高血糖素（2-29) ‘ SQGTFTSEYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT-NH2 (SEQIDNO: 63) 340.0 士 149.0 2719.8± 2136.4 [Thr5-0-PLA6, E9]胰高血糖素(2-29) SQGT(0*)FTSEYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT-NH2 (SEQ ID NO: 64) 6.49 ±2.17 1305.6±241.5 -162 - 200920404 [Thr5-0-PLA6, E9]胰高血糖素(1-29) 14.19 ±7.89 721.0 士 35.5 HSQGT(0*)FTSEYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT-NH2 (SEQ ID NO: 65) (〇*)表示縮酯環肽鍵由以上之實施例可知，本發明所提供之++確具產業上之利用價值，故本發明業已符合於專利之要件。惟以上之敘述僅為本發明之較佳實施例說明，凡精於此項技藝者當可依據上述之說明而作其它種種之改良，惟這些改變仍屬於本發明之發明精神及以下所界定之專利範圍中。【圖式簡單說明】第1圖係為一柱狀圖，顯示胰高血糖素

Cys21-maleimidoPEG5K 分別在 37°C 下 24, 48, 72, 96, 144及166小時後之穩定性；第2圖顯示胰高血糖素Cys21-maleimidoPEG5K分別在pH =5，37°C下24, 72,及144小時後之HPLC分析結果； ’ 第3圖係顯示表列之經由胺基端截斷胺基磺酸之胰高血糖素擷抗劑相似物進行結合分析之結果；第4圖係顯示測量胰高血糖素受體與表列之胰高血糖素之擷抗作用，其係經由cAMP之生成所測定；第5A及5B圖係顯示測量胰高血糖素受體與表列之胰高血糖素之擷抗作用，其係經由cAMP之生成所測定。第 -163 - 200920404 5A圖係胰高血糖素受體經由胰高血糖素類似物 [E9]G(2-29) ·, [hC9(S03H)]G(2-29) A, [hC9(S03H)]G(4-29) ▼，[hC9(S03H)]G(5-29) ◄及 [hC9(S03H)]G(6-29) ◄，相對於天然胰高血糖素所誘導之比較情形。第5B圖係提供關於以相同之類似物對於在以0.2 nM胰高血糖素誘導胰高血糖素受體下之抑制作用。縮寫：E9 ==在天然之胰高血糖素在第 9號位置取代為麩胺酸；G(X-29)=天然之胰高血糖素在胺基端戴斷為X - 1胺基酸；hC9(S03H)= 相對於天然之胰高血糖素在第9號位置取代為同半胱磺胺酸。 . 第6圖係顯示合成Fmoc-homoCys(S03Na)-〇H之合成流

程。Fmoc-homoCys(S03Na)-OH 可溶於 DMF 或 NMP 中，且在自動合成胜肽之步驟中可直接利用 DIC/HOBT 或 HBTU/HOBT。所有 hC9(S03H)-based 之胰南血糖素擷抗劑相似物係經由鈉型態之 Fmoc-homoCys(S03Na)-OH以固相合成法所合成。第7圖係顯示胰高血糖素擷抗劑之結合親和力比較及經由胺基端胺基酸不同修飾後之胰高血糖素擷抗劑之胰南JEL糖素受體活性（天然胰高血糖素之第6號殘基）；第8圖係顯示測里表列之PLA騰高jk糖素擷抗劑相似物在 0.8 nM之胰高血糖素下誘導胰高血糖素受體之擷抗作用’其係經由cAMP之生成所測定。受測之Pla -164 -

Claims

200920404 相似物包括[PLA6, E9]G(6-29) ·，[Ac-PLA6， E9]G(6-29) A, [PLA4, E9]G(4-29) T, [PLA5, E9]G(5-29) ◄，與天然胰高血糖素之活性單獨作比較。縮寫：E9 ==在天然之胰高血糖素在第9號位置取代為麩胺酸，G(Ac-PLA)係為乙醯化苯乳酸。【主要元件符號說明】 t **>

-165 - 200920404 十、申請專利範圍： 1- 種胰鬲血糖素擷抗劑，包括SEQ ID NO: 42之序列， •或其氧化衍生物。 2.如申凊專利範圍第1項所述之胰高血糖素擷抗劑，包括 SEQ ID NO: 42 之序列。 3·如申凊專利範圍第1或2項所述之胰高血糖素擷抗劑，其中该姨高血糖素擷抗劑之羧基端胺基酸具有一醯胺基，以取代其羧酸基。 4·如申請專利範圍第丨或2項所述之胰高血糖素擷抗劑，其中該第4號位置胺基酸係為天冬胺酸。 5·如申请專利範圍第1或2項所述之胰高血糖素擷抗劑，更包括SEQ ID NO: 19之序列，融合於SEq ID N〇: 42 之羧基端胺基酸。 6·如申請專利範圍第丨《2項所述之姨高血糖素摘抗劑，更包括一親水性基團共價鍵結於SEQ ID N〇: 42之第、16或19號位置，或在姨高血糖素操抗劑之胺基端或羧基端胺基酸，以及該胰高血糖素胜肽之藥學上可接受鹽類。 -166 - 200920404 7.如申明專利_第6項所述之胰高血糖素擷抗劑，龙中該親水性基團係為—血漿蛋白或是免疫球蛋白之&、位口丨 8·如申請專利範圍第6項所述之胰高血糖素擷抗劑，其中 5玄親水性基團係為聚乙二醇。 9·如申4專利範圍第8項所述之騰高血糖素擷抗劑，其中该聚乙二醇鏈之分子量係為至少2〇,〇〇〇道耳吞。 10.如申明專利範圍第8項所述之胰高血糖素擷抗劑，其中該聚乙二醇鏈之分子量範圍係為L000〜5,〇〇〇道耳吞。 11 ·如申叫專利範圍第8項所述之騰高灰糖素操抗劑，其中該胰高血糖素擷抗劑包括SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1〇, SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 或SEQ ID NO: 45之序列。 12.如申请專利範圍第丨或2項所述之胰高血糖素擷抗劑，其中該胰高血糖素擷抗劑包括SEQ ID N〇：46或SEQ ID NO: 47之序列。 1j.如申请專利範圍第丨或2項所述之胰高血糖素擷抗劑， -167 - 200920404 其中该第23號位置為天冬酿胺酸時，該第24號位置之胺，_選自由天冬胺酸及麵胺酸組成之群組，以及當 ^第24號位置為蘇胺酸時，該第23號位置之胺基酸係 •選自由天冬胺酸及麩胺酸組成之群組。如申請專利第丨$ 2項所述之騰高血糖素操抗劑，更包括1〜2個胺基酸添加至具有SEQ m N〇: 42之胰高血糖素榻抗劑之祕端，其中該添加线基端之胺基酸係選自由天冬胺酸及麩胺酸組成之群組。 K如申請專利範圍第“戈2項所述之胰高血糖素擷抗劑， 1中SEQ ID NO: 42之第10號位置之胺基酸係選自由甦胺酸、半胱績胺酸、同麵胺酸、同半胱續胺酸組成之群組。 16.如申請專利範圍第i 項所述之胰高血糖素操抗劑，其中該胰高血糖素擷抗劑包括碎Q ID N〇: 7、SEQ m NO: 8、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40 及 SEQ ID no- 41 之序列。汝申明專利範圍第16項所述之胰高血糖素操抗劑，更包括SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 53之序列’融合於該騰高灰糖素擷抗劑之羧基端胺基酸。 -168 - 200920404 a如申請翻第16韻叙胰高血糖素触劑，更包括—親水性基團共價鍵結於SEQidn〇:42之第Μ 或19纽置’或在胰高血糖素擷抗劑之胺基端或缓其 •端胺基酸，以及該胰高血糖素胜肽之藥學上可接受鹽類t • 19.如申請專利範圍第a項所述之胰高血糖素掏抗劑，宜中該親水性基團係為聚乙二醇。 /、 2〇·如申請專利範圍第16項所述之姨高血糖素榻抗劑，具有 SEQ ID NO: 41之序列’其中該第4號位置係為天冬胺酸，且該第1〇號位置係為麩胺酸。 21.如申請專利範圍第16項所述之胰高血糖素掏抗劑，其中該胰高血糖素擷抗劑包括SEQidn〇: 8、seqidn^ p 或 SEQ ID NO: 38。 2'如申請專利範圍第21項所述之姨高血糖素操抗劑，更包括SEQ ID NO·· 19之序列，融合於該胰高血糖素操抗劑之鲮基端胺基酸。 23.如申請專利範圍第21項所述之胰高血糖素擷抗劑，更包括一親水性基團共價鍵結於SEQ][DN〇:42之第n、16 或19唬位置，或在胰高血糖素擷抗劑之胺基端或羧基端胺基酸，以及該胰高血糖素胜肽之藥學上可接受鹽類。 -169 - 200920404 24·^申％專利範圍第丨或2項所述之胰高血糖素掘抗劑，其中该胰高血糖素擷抗劑包括SEQ ID NO: 42胜肽之衍生物，其中該胰高血糖素擷抗劑與SEQ仍N〇: 42胜肽 .之區別在於具有1〜3個胺基酸取代，該胺基酸係選自第 5'6'8、9、12、13 及 14 號位置之一。 25. 如珂述申請專利範圍之任何一項所述之胰高血糖素擷抗劑，其中該氧化衍生物係為SEQIDN〇:42之酯或醚。 26. —種胰高血糖素擷抗劑，包括以天然胰高血糖素之胺基酸序列經由在SEQ ID NO: .1之胺基端刪除2〜5個胺基酸，且在SEQ ID NO: 1第9號位置之天冬胺酸取代為楚胺酸、同麩胺酸、β-同麩胺酸（一種半胱胺酸之错酸衍生物）或一種半胱胺酸之烷羧化衍生物、或一種由半耽胺酸衍生出且包含下列化學結構之羧基烷衍生物： η2ν

H2C COOH

S X5 \ COOH 其中X5係為C1-C4烧基’ C；2-C4稀屬烴或C2-C4快美 -170 - 200920404 27.如申請專利範圍第26項所述之胰高血糖素操抗劑，其中該半胱胺酸之磺酸衍生物係為同半胱磺胺酸。 28..如申請專利範圍第26項所述之胰高血糖素擷抗劑，其中 Xs係為ci烷基或C2烷基。 29.如:請專利範圍第26至28項妹—項所述之胰高血糖素結抗劑，其中該胰高血糖素擷抗劑之胺基酸序列更包括修飾為至多三個胺基酸修飾。 3'如申請專利範圍第29項所述之胰高血糖素減劑，其中遠至多三個胺紐修飾係選自由下列修飾作肋成之群組： A·取代下列位置胺基酸之其中之—或二，第】卜如及 24號位置（依據SEQIDN〇·· !之胺基酸序列），或在胰高血糖素擷抗劑之胺基端或羧基端胺基酸透過一 §曰、醚、硫醚、氨或烷基胺鍵合以入· 下列位置胺基酸之其中之一或二;:17、 =、21、及24號位置（依據SEQ ID NO:〗之胺基醆序 ^) ’或在胰高血糖素榻抗劑之胺基端或幾基端胺基 2代為下列胺基酸組成之群組之一，半耽胺酸、離胺酉夂、烏胺酸、同半胱胺酸以及乙酿苯丙胺酸，其中匸群組令之胺基酸係結合於其親水性之基團 C.添加—共價鍵結於親水性基團之胺基醆於胰高血糖 -17】· 200920404 素擷抗劑之胺基端或羧基端； D.將第15號位置之天冬胺酸（依據SEQ ID N〇: }之胺基Sic序列）取代為半胱續酸、麵胺酸、同麩胺酸以及 . 同半磺胺酸； . E•將第16號位置之絲胺酸(依據SEQ ID NO: 1之胺基酸序列）取代為半胱磺酸、麩胺酸、同麩胺酸以及同半續胺酸； f 將弟16 20 21、24號位置之一或多個位置取代為氨基異丁酸，依據SEQ ID NO: 1之胺基酸序列； G. 刪除第29號位置或第28及29號位置胺基酸，依據 SEQ ID NO: 1之胺基酸序列； H. 將第28號位置之天冬醯胺酸及第29號位置之蘇胺 (依據SEQ ID NO: 1之胺基酸序列）之一或兩者同時取代為帶電荷胺基酸及/或在SEQIDN〇: i之羧基端添加一至二個帶電荷胺基酸； I L將第27號位置之曱硫胺酸（依據SEQ ID NO: 1之胺基酉文序列）取代為白胺酸或正白胺酸；】·添加一胜肽，其胺基酸序列具有SEQ IDN〇: i中第 …2〗號位置及羧基端第53號位置，其中第29號位置係為蘇胺酸或甘胺酸； K.將羧基端羧基取代為氨或酯。几如申請專利範圍第30項所述之姨高血糖素擷抗劑，包括如第30項所述之Α、βκ之修料用之一或其組合。 -172 · 200920404 32. 如申請專利範圍第31項所述之胰高血糖素擷抗劑，更包括如第30項所述之D〜K之修飾作用之一或其組合。 33. ·一種二聚體，係由如申請專利範圍第1或2項所述之胰同血糖素擷抗劑所組成，且該兩胰高血糖素擷抗劑之間係經由一連結子所連結。士申明專利範圍苐3 3項所述之胰南血糖素擷抗劑，其中組成§亥二聚體之兩胰高血糖素擷抗劑係分別選自由下列序列組成之群組：SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1〇及 SEQ ID NO·· Π，且該胰高血糖素擷抗劑係彼此經由一連、口子結合於各騰高血糖素擷抗劑之第1 1或1 9號位置。 •35.-種樂物成分’包括如第丨或2項所述之胰高血糖素摘抗劑’以及一藥學上可接受載體。 36. 一種_成分，包括如第17項所述之胰高血糖素掏抗劑或其藥學上可接受鹽類，以及一藥學上可接受載體。 37· 一種利用經過前配製之水性成分以治療高血糖之方法，該方法包括施以如第3 5項所述成份之有效劑量之步驟。 j8. 一種降低食慾、減少體重或引發體重流失之方法，該方括施以包括胰高血糖素擷抗劑之成份之有效劑 -173 - 200920404 里，該胰高血糖素擷抗劑包括SEQ ID NO: 42之序列 39·如申請專利範圍第38項所述之方法，其中該月夷高血糖素榻抗劍進—步包括SEQIDNa· 19之相， ID NO: 42之窥基端。、SEQ 復—種治療病患之分解代謝消瘦之方法，包括施以一包括胰高血糖素擷抗劑之成份之有效劑量，該胰高血糖素操抗劑包括SEQ ID NO: 42之序列。札如申請專利範圍第40項所述之方法，其中該姨高血糖素操抗劑進- #包括SEQ ID N0·· ! 9之序列，融合於SEQ iD NO: 42之羧基端。 42.—種胰高血糖素擷抗劑，包括由中A係選自下列群組： A-B-C結構所組成其 (i) 苯基乳酸（JPLA); (ii) 苯基乳酸之氧化衍生物; (叫:種2.6健基酸組成之胜狀，且該胜肽之其中兩連續胺基酸係由一酯鍵或一醚鍵鍵結連接. B代表SEQIDN〇:1之胺基酸UiJ26°，其中’i係為3 + 5、6或7之中隨意地由-或多個胺基酸修飾所組成，如在此進-步所述；rfij C係為選自下列群組： -174 - 200920404 (iv)第9號位置之天冬胺酸（依據SEQ ID NO: 1之胺基酸序列）取代為麩胺酸，半胱胺酸之硫酸化衍生物，同麵胺酸’ β-同麵胺酸或一種半胱胺酸之烷羧化衍生物、或一種由半胱胺酸衍生出且包含下列化學結構之羧基烷衍生物：

H2C\ x5 'COOH 其中Χ5係為C1-C4院基、C2-C4烯屬烴或C2-C4炔基； (v)取代下列位置胺基酸之其中之一或二，第1〇、2〇及24號位置（依據SEQ ID NO: 1之胺基酸序列），以一共價結合結合於酯、醚、硫醚、醯胺或烷基胺鍵合之胺基酸取代； ‘ (Vi)取代下列位置胺基酸之其中之一或二，第ΐ6、π、 20、21及24號位置（依據SEQ ID NO: 1之胺基酸序列），以下列胺基酸組成之群組之一：半胱胺酸、離胺酸、鳥胺酸、同半胱胺酸以及乙醯苯丙胺酸 (Ac-Phe)，其中群組中之胺基酸係共價結合於其親水性之基團； -175 - 200920404 (vn)將第15號位置之天冬胺酸（依據SEQiDN〇·· }之胺基駄序列）取代為半胱磺胺酸、麵胺酸、同甦胺酸以及同半耽續胺酸； .(V111)將第16號位置之絲胺酸（依據SEQ N〇·· i之胺基酸序列）取代為半胱磺胺酸、麩胺酸、同麩胺酸以及同半胱磺胺酸； (i X)將第i 6、2 0、2!及2 4號位置之一或多個位置取代為氨基異丁酸，依據SEqIDN〇. !之胺基酸序列；而C係為選自下列群組： (X) X; (xi) X-Y; (xii) X-Y-Z;以及 (xiii) X-Y-Z-R10, 其中乂係為1^卟1^11，或刈6;¥係為八511或一帶電荷之胺基酸；z係為蘇胺酸、甘胺酸、半胱胺酸、離胺酸、鳥胺酸（〇rn)、同半胱胺酸或乙醯苯丙胺酸 (Ac-Phe)，或帶電荷之胺基酸，其中R1〇係選自由 SEQ ID NOs: 19-21及53所組成之群組；以及 (xiv) (x)至（xiii)任何之一其羧基端羧基係由胺基所取代。 43.如申請專利範圍第42項所述之方法，其中該笨乳酸之氧化衍生物係為苯乳酸之酯。 -176 - 200920404 a t叫專利範圍第43項所述之胰高血糖素擷抗劑，其中 —乳^之氧化衍生物係為苯乳酸結合於一胺基酸、胜肽、親水性聚合物、醯基或烷基，透過一酯鍵或醚鍵連結0 =:明專利範圍第44項所述之胰高血糖素擷抗劑，其中 j笨礼k之氧化;^生物係為—縮酯環肽，包括將苯乳酸結合於一胺基酸、胜肽、親水性聚合物、醯基或烷基，透過一酯鍵或醚鍵連結。 46·如申清專利範圍第45項所述之胰高血糖素擷抗劑，其中該胺基酸係為Xaas，或其中該胜肽包括 Xaa2-Xaa3 或 Xaa丨-Xaas-Xaa3 ’其中該Xaa3係為鞑胺酸或麩醯胺酸， Xaa2係遠自由下列胺基酸組成之群組：絲胺酸、絲胺酸、D-丙胺酸、纈氨酸、甘胺酸、N_曱基絲胺酸、 N-甲基丙胺酸以及胺基異丁酸（AIB);且Xaai係選自由下列基組成之群組：組胺酸、D-組胺酸、aipha、 alpha·雙曱基咪唑乙酸(DMIA)、N_曱基組胺酸、alpha_ 曱基組胺酸、咪唑乙酸、去胺基組胺酸、烴基組胺酸、乙醯化組胺酸及同組胺酸。 47.如申請專利範圍第42項所述之胰高血糖素擷抗劑，其中 (iii)之胜肽包括SEQ ID NO: 1之j〜6胺基酸，其中j係為 1、2、3、4 或 5。 -177 - 200920404 48.如申凊專利範圍第42至47項之任一項所述之胰高血糖素擷抗劑，其中B代表SEQ ID NO: 1之第7〜26號胺基酸0 49.如申清專利範圍第42至48項之任一項所述之胰高血糖素擷抗劑，其巾B代表⑺及(vi)之胺基酸修飾之-或其組合。項所述之騰南血糖素榻抗劑，其中 (vii)、（viii)、（ix)組成之群組， 50.如申請專利範圍第49 B更包括選自由（iv)、其中之一或其組合。 i申=專利轨圍帛42 JL 5G項之任—項所述之膦高血糖二D抗^ 中Y或Z係為-帶電荷之胺基酸，該帶電订之基自由下列胺基酸細成之群組：離胺酸、精胺酸、组胺酸、天冬胺酸及麵胺酸。 52.如申請專利範圍第42至53項之任一素擷抗劑，更包括在羧基端往z具有酸’當C包括χ_γ_ζ時。項所述之胰高血糖 1〜2個帶電荷胺基如申請專利範圍第42至52 素擷抗劑，更包括有一朝^ 項所述之胰高血糖 _辛汽& " 7 ,基團，共價結合於胰高血掏“之苐16、21或24號位置，依據SEQ則0: -178 - 200920404 1 |l|?| ,、* 、，或胰高血糖素擷抗劑之胺基端或羧基端殘基。 :明專利範圍第42至53項之任一項所述之胰高血糖 °抗θ]包括一胺基酸透過一 g旨、醚、硫峻、氨或烧基胺共知鍵結於第10、20及24號位置（依據SEQ ID NO: 1之胺基酸序列）之醯基或烷基，或在胰高血糖素擷抗劑之胺基端或羧基端胺基酸。 55. 如申請專利範圍帛42纟54項之任—項所述之姨高血糖素擷抗劑’包括SEQ ID NOs: 62、64-67及71之任一序列，或如表4〜12所述之任一序列。 56. —種二聚體或多聚體，係包括二或多個如專利範圍丄〜 32以及第42〜55項之任一項所述之胰高血糖素擷抗劑。 56.—種結合物，包括如專利範圍1〜32以及第42〜55項之任 —項所述之胰高血糖素擷抗劑以及一異質胜狀或—夕肽。 > 58. —種藥物成份’包括如專利範圍以及第42〜55項任一項所述之胰高血糖素擷抗劑，第56項所述之_浐體’苐5 7項所述之結合物之· ·~或其組合。 59. —種治療高血糖患者之方法，包括對患者施以如第工 -179 - 200920404 所述之藥物成份之有效劑量 60. 一種降低食慾、 .法包括對患者施量0 減少體重料發體重流失之方法，該方以如第58項所述之藥物絲之有效劑 61. 一種治療病患之分解代謝消瘦之方法如第58項所述之藥物成份之有效劑量包括對患者施以 • 180 · 200920404 序列表 <110>印地安那大學研究及技術公司. <120>胰高血糖素擷抗劑 <130> 29920-79399 (31135/43853) <150> 60/983783 <151> 2000-01-01 <160> 71 <170> PatentIn version 3·5 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213 > 智人種(H〇m〇 sapiens) <400> 1 His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 15 10 15 Arg Arg Ala Gin Asp Phe Val Gin Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 2 ' <211> 28 <212> PRT ’ <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <22 3 >腺高血糖素相似物 <220> <2 21> MISC_FEATURE ‘ <222> (8)..(8) <223 > Xaa係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <400> 2 Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg 1 5 10 15 Arg Ala Gin Asp Phe Val Gin Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 3 200920404 <211> 27 <212> PRT <213>人工序列 -2-<220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC—FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <220> <221> MISC一FEATURE <222> ⑺…⑺ <223> Xaa係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <400> 3 Gin Gly Thr Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg 1 5 10 15 Ala Gin Asp Phe Val Gin Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 4 <211> 26 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE * <2 2 3 :>胰高血糖素相似物 <22〇> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa 係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <400> 4 Gly Thr Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala 15 10 15 200920404 Gin Asp Phe Val Gin Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 5 <211> 25 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> -3- <221 > MISC一FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223 > Xaa 係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <40〇> 5 Thr Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin 1 5 10 15 Asp Phe Val Gin Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 6 <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 <220> ' <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223>騰高血糖素相似物 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) · · (4) <223 > Xaa係為 glutamic acid, cysteic acid或homocysteic acid <220> <221> MISC FEATURE 200920404 <222> (22)..(22) <223> Xaa在22號位置係為Met, Leu或Nle <400> 6 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Xaa Asn Thr 20 <210> Ί <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 <220>

<223>合成多肽 <220> <221> MOD_RES -4- <222> (1) · . (1) <223 > N端胺基被取代為烴基 ‘ <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) . . (4) <223> Xaa係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <220> <221 > MISC—FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle 1 <400> 7 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 is Phe Val Gin Trp Leu Xaa Asn Thr 20 <210> 8 <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 <220> 200920404 <223>合成多肽 <220> <221> MOD_RES <222> (1) . . (1) <223> N端胺基被取代為烴基 <220> <22*1> MISC—FEATURE <222> (22)·.(22) - <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <220> - <221> MOD_RES <222> (24) . . (24) <223> C端alpha羧基被取代為醯胺基 ' <400> 8 Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Xaa Asn Thr 20 * <210> 9 <211> 24 <212> PRT <2 13 >人工序列 -5-<22〇> <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223 >胰高血糖素相似物 1 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223 > N端胺基被取代為烴基 <22〇> <221> MISC^FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa 係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid 200920404 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)…（7) <223> Xaa係為 Lys 或 Arg <220> <221> MISC_FEATURE <22.2> (11) . . (11) <223> Xaa 係為Lys, Cys, 〇rn, homocysteine or acetyl phenyalanine <220> <221> MISC一FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <400> 9 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Xaa Tyr Leu Asp Xaa Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Xaa Asn Thr 20 <210> 10 * <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC一FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <220> <221> M〇D_RES 1 <222> (1)..(1) <223> N端胺基被取代為烴基 <220> -6 - <221> MISCOFEATURE <222> (4)..(4) <223 > Xaa 係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <220> 200920404 <221> MISC—FEATURE <222> (7) . . (7) <223> Xaa係為 is Lys 或 Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223>Xaa係、為 Lys, Cys, 〇rn, homocysteine 或 acetyl phenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <400> 10 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Xaa Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Xaa 15 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Xaa Asn Thr 20 <210> 11 <211> 24 * <212> PRT <213>人工序列 <220> <223 >合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223>騰高血糖素相似物 <220> <221> MOD_RES <222> (1) . . (1) ' <223 > N端胺基被取代為煙基 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) . . (4) <223> Xaa4系為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <220> <221> MISC：—FEATURE <222> (7) . . (7) 200920404 <223 > Xaa係為 Lys 或 Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19) . . (19) <223 > Xaa<系為 Lys , Cys, 〇rn, homocysteine或acetyl phenylalanine -7-<22_0> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223 > Xaa 係為 Met, Leu 或 Nle <400> 11 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Xaa Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 / Phe Val Xaa Trp Leu Xaa Asn Thr 20 <210> 12 <211> 24 <212> PRT ' <213>人工序列 <220 > <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <220> <221> MOD_RES <222> (1) . . (1) <22 3> 1>1端胺基被取代為fe基 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) ... (4) <223 > Xaa 係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <22〇> <221> MISC_FEATURE <222> (7) . . (7) <223> Xaa係為 Lys 或 Arg 200920404 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11) . . (11) <223>Xaa係為 Lys, Cys, 〇rn, homocysteine 或 acetyl phenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <22*2> (19) . . (19) <223> Xaa4系為 Lys, Cys, 〇rn, homocysteine或acetyl phenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22) ..(22) <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <400> 12 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Xaa Tyr Leu Asp Xaa Arg Arg Ala Gin Asp 1 5 10 15 -8 - Phe Val Xaa Trp Leu Xaa Asn Thr 20 ' <210> 13 <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223>姨高血糖素相似物 <220> ‘ <221> M0D_RES <222> (1)..(l) <223 > 1>1端胺基被取代為煙基 <220> <221> MISC—FEATURE <222> (4) . . (4) <223> Xaa 係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <220> 200920404 <221> M〇D_RES <222> (11) . · (11) <223> <220> 聚乙二醇化 <221> MISC_FEATURE (222 > (22) . . (22) <22_3> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <400> 13 - Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Cys Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 - Phe Val Gin Trp Leu Xaa Asn Thr 20 <210> 14 (: <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 ‘ <220> <221> MISC—FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <220> -9- <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <22 3 > N端胺基被取代為經基 ί " 、<22〇> <2 21> MISC_FEATURE ( <222> (4) . . (4) <223> Xaa係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <22〇> <221> M〇D_RES <222> (19) . . (19) <223> 聚乙二醇化 <22〇> <221> MISC FEATURE -10 - 200920404 <222> (22) . . (22) <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <400> 14 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp 1 5 10 15 Phe Val Cys Trp Leu Xaa Asn Thr . 20 <210> 15 <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223>姨高血糖素相似物 <220> <221> MOD_RES ' <222> (1) . . (1) <223> N端胺基被取代為經基 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223 > Xaa 係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <220> <221> MISC_FEATURE ‘ <222> (22) . . (22) <223> Xaa#^ Met, Leu ^ Nle <220> <221> MISC^FEATURE <222> (24)..(24) <223> 2〇kDa聚乙二醇基團結合於Cysteine第24號位置 -10-<220> <221> M〇D_RES <222> (24)..(24) 200920404 <223>聚乙二醇化 -10- <400> 15 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Xaa Asn Cys ' 20 <210> 16 <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC^FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <220> <221> MOD—RES ' <222> (1)..(1) <2 23> N端胺基被取代為烴基 — <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) . . (4) <223> Xaa係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <220> <221> M〇D_RES <222> (19) . . (19) <223> <220> 聚乙二醇化 <221> MISC_FEATURE <222> (22) . . (22) <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <400> 16 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 Phe Val Lys Trp Leu Xaa Asn Thr -12 - 200920404 20 <210> 17 <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 -11-<220> <221> MISC_FEATURE ' <223 >騰向血糖素相似物 <220> - <221> MOD—RES <222> (1)..(1) <22 3 > N端胺基被取代為烴基 f <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223 > Xaa 係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <220> <221> M〇D_RES <222> (ID . · (ID <223> 聚乙二醇化 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <4〇〇> 17 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Cys Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 Phe Val Cys Trp Leu Xaa Asn Thr 20 <210> 18 <211> 24 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多月太 -13 - 200920404 <220> <221> MI SC一 FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <220> <221> MOD_RES <222> (1) . . (1) <22'3> N端胺基被取代為烴基 <220> <221> MISC一FEATURE <222> (4) . . (4) <223> Xaa係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid -12-<220> <221> MISCOFEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle -12-<220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> C端alpha鼓基被取代為酿胺基 <4〇0> 18 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Cys Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Xaa Asn Thr 20 * <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <22〇> <223>合成多肽 <220> <221> MISC—FEATURE <223>胜肽片段係代表Exendin-4之C端10個胺基酸 <400> 19 -14 - 200920404 Ser 10 Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro 1 5 <21〇> 20 <211> 8 <212> PRT <213>人工序列 <22.0> <223>合成多肽 <220> <221> MISC__FEATURE <223>胜肽片段係代表調酸素之C端8個胺基酸 of <400> 20 Lys Arg Asn 1 <210> 21 <211> 4 <212> PRT Arg Asn Asn lie Ala 5 <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 -13-<220> <221> MISC_FEATURE <223 >胜肽片段係代表調酸素C端4個胺基酸 <400> 21 Lys Arg Asn Arg 1 <21〇> 22 <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <22〇> <221> MISC_FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <220> -15 - 200920404 <221> MISC—FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa係為 Lys 或 Arg <220> <221> MISC—FEATURE <222> (11)..(11) <223>Xaa4系為 Lys, Cys, 〇rn, homocycstein 或 acetylphenyalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223>Xaa係為 Lys, Cys, 〇rn, homocycstein 或 acetylphenyalanine <400> 22 Phe Thr Ser Arg Tyr Ser Xaa Tyr Leu Asp Xaa Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 Phe Val Xaa Trp Leu Met Asn Thr 20 <210> 23 <211> 34 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC—FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <220> -14- <221> MISC_FEATURE <222> (4) . . (4) <223> Xaa係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa係為 Lys 或 Arg <220> <221> MISC FEATURE -16 - 200920404 <222> (16) . . (16) <223>Xaa係為 Lys, Cys, 〇rn, homocysteine 或 acetyl phenylalanine <220> <221> MISC一FEATURE <222> (22)…（22) <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <400> 23 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Xaa Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Xaa 15 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Xaa Asn Thr Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro 20 25 30 Pro Ser <2.10> 24 <211> 32 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <220> <221> MISC__FEATURE <222> (4) . . (4) <223> Xaa係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid.或 homocysteic acid <220> <221> MISC_ —FEATURE <222 > (7)..(7) <223 > Xaa係為Lys或Arg <220> <221> MISC_ FEATURE <222> (19). .(19) <223>Xaa4系為 Lys, Cys, 〇rn, homocysteine 或 acetyl phenylalanine -15-<220> -17 - 200920404 <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223>聚乙二醇化 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <400> 24 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Xaa Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 lie Ala Phe Val Xaa Trp Leu Xaa Asn Thr Lys Arg Asn Arg Asn Asn 20 25 30 <210> 25 <211> 34 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa係為 Lys 或 Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19) . . (19) <223>Xaaj系為 Lys, Cys, 〇rn, homocysteine 或 acetyl phenylalanine <220> <221> MOD—RES <222> (19) . . (19) -18- 200920404 <223>聚乙二醇化 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22) . . (22) <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <400> 25 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Xaa Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 -16- Phe Val Xaa Trp Leu Xaa Asn Thr Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro 20 25 30 Pro Ser <210> 26 <211> 32 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 ‘ <220> <2 21> MISC_FEATURE <223 >騰兩血糖素相似物 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) . . (4) <223> Xaa係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <22〇> <221> MISC_ —FEATURE <222> ⑺…⑺ <223> Xaa係為Lys或Arg <220> <221> MISC_ •FEATURE <222> (16). ,.(16) <223 > Lys, Cys 7 Orn, homocysteine acetyl phenylalanine <220> <221> M0D_RES <222> (16),.(16) -19 - 200920404 <223>聚乙二醇化 <220> <221> MISC一FEATURE <222> (22)…（22) <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <400> 26 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Xaa Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Xaa 15 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Xaa Asn Thr Lys Arg Asn Arg Asn Asn lie Ala 20 25 30 <210> 27 <211> 28 <212> PRT <213>人工序列 -17-<220> <223>合成多肽 <220> * <221> MISC一FEATURE <223 >胰高血糖素相似物 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4).,(4) <223 > Xaa 係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) . . (7) <222 > Xaa係為Lys或Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaaif；^ Lys, Cys, Orn, homocysteine ^ acetyl phenylalanine <220> <221> M〇D—RES <222> (16) . . (16) <223>聚乙二醇化 -20 - 200920404 <220> <221> MISC一FEATURE <222> (22) . . (22) <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <400> 27 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Xaa Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Xaa 1 5 l〇 15 Phe Val Gin Trp Leu Xaa Asn Thr Lys Arg Asn Arg ' 20 25 <210> 28 * <211> 28 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC—FEATURE <223>騰高血糠素相似物 <220> <221> MISC—FEATURE <222> (4)..(4) <223 > Xaa % aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 气 homocysteic acid -18 ~ <220> <2 21> MISCOFEATURE <222> (7) . . (7) 1 <223 > Xae係為 Lys 或 Arg <22〇> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223>Xaai糸為 Lys, Cys, 〇rn, homocysteine 或 acetyl phenylalanine <22〇> <221> M0D__RES <222> (19)..(19) <223>聚乙二醇化 <220> 200920404 <221> MISC一FEATURE <222> (22)..(22) < 2 2 3 > Xaa係為 Me t / Leu 或 Nle <400> 28 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Xaa Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 is Phe Val Xaa Trp Leu Xaa Asn Thr Lys Arg Asn Arg 20 25 <210> 29 <211> 34 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC一FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <220> <221> MOD_RES <222> (1) . . (1) <223 > N端胺基被取代為烴基 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <22〇> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223 ：> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <40〇> 29 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 -19 - Phe Val Gin Trp Leu Xaa Asn Thr Gly Pr〇 Ser Ser Gly Ala Pro Pro 20 25 30 Pro Ser -22 - 200920404 <210> 30 <211> 32 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223 > N端胺基被取代為烴基 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223 > Xaa 係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <22〇> <221> MISC_FEATURE <222> (22) . . (22) <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <4〇〇> 30 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Xaa Asn Thr Lys Arg Asn Arg Asn Asn lie Ala 20 25 30 <210> 31 <211> 28 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <22 1> MISC__FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <22〇> 23 - 200920404 <221> M〇D一RES -20- <222> ⑴..⑴ <223> N端胺基被取代為烴基 <220> <221> MISC—FEATURE <222> (4) . . (4) <223> Xaa係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <400> 31 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Cys 1 5 l〇 15 Phe Val Gin Trp Leu Xaa Asn Thr Lys Arg Asn Arg 20 2 5 <210> 32 <211> 29 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC—FEATURE <223>腺高血糖素相似物 <400> 32 His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 l〇 15 Cys Arg Ala Gin Asp phe Val Gin Trp Leu Met Asn Thr 2〇 25 <210> 33 <211> 39 <212> PRT <213> 人工序列 <22〇> 24 200920404 <223>合成多肽 <220> <221> MISC—FEATURE <223>騰高血糠素相似物 <400> 33 Hia Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 15 10 15 -21- Arg Arg Ala Gin Asp Phe Val Gin Trp Leu Met Asn Thr Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 34 <211> 29 <212> PRT <213>人工序列 <220> ‘ <223>合成多肽 <22 0 > <221> MI SC一 FEATURE <223 >胰高血糖素相似物 <220> <221> MOD一RES <222> (24) . . (24) <223> 2-丁内S旨結合於Cysteine之硫醇基 <400> 34 His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 15 10 15 Arg Arg Ala Gin Cys Phe Val Gin Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <21〇> 35 <211> 29 <212> PRT <213> <220> 人工序列 <223> <220> 合成多肽 <221> MISC FEATURE 25 - 200920404 <223>胰高血糖素相似物 <220> <221> MOD一RES <222> (24〉 ··（24) <223>羧甲基結合於Cysteine之硫醇基 <400> 35 His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 -22- Arg Arg Ala Gin Cys Phe Val Gin Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 36 <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221 > MI SC—FEATURE <223>狹高血糖素相似物 <220> <221> M〇D_RES <222> (1) . . (1) <223> N端胺基被取代為烴基 <22〇> <221> MISC一FEATURE <222> (4) . . (4) ‘ <223> Xaa係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <220> <221> MISC—FEATURE <222> (22) . . (22) <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <400> 36 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Ser Arg Arg Ala Gin Asp 1 5 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Xaa Asn Thr -26 - 20 20200920404 <210> 37 <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC__FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <220> <221> MOD_RES <222> (1) . . (1) <223> N端胺基被取代為烴基 <220> <221> MISC_FEATURE -23- . <222> (22)..(22) <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <40〇> 37 Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Xaa Asn Thr 20 <210> 38 <211> 24 <212> PRT ‘ <213>人工序列 <22〇> <223>合成多肽 <220> <22 1> MISC__FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <22〇> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> N端胺基被取代為烴基 <220> * 27 - 200920404 <221> MISC—FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <400> 38 Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Ser Arg Arg Ala Gin Asp 1 5 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Xaa Asn Thr 20 <210> 39 <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <2 23 >胰高血糖素相似物， <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223 > N端胺基被取代為烴基 -24-<220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) . . (4) <223> Xaa係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic f acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22) . . (22) <223 > Xss 係'為 Met, L g u 5χ Nle <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23) . . (23) <223> Xaai系為 Asn, Asp, Glu, cysteic acid 或 homocysteic acid <220> <221> MISC FEATURE -28- 200920404 <222> (24)..(24) <223> Xaa id Thr, Asp, Glu, cysteic acid 或 homocysteic acid <400> 39 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Xaa Xaa Xaa 20 <210> 40 <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC—FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <220> . <221> MOD__RES <222> (1)..(1) <223> N端胺基被取代為烴基 <220> <221> MISC^FEATURE <222> (4)..(4) <223 > Xaa 係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <220> ‘ <221> MISC一FEATURE <222> (10) . . (10) <223>Xaai%^ Glu, cysteic acid, homoglutamic acid ^ homocysteic acid <22〇> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) -25- <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <220> <221> MISC FEATURE -29 - 200920404 <222> (23)..(23) <223> Xaa係為Asn或一酸性胺基酸 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa係為Thr或一酸性胺基酸 <400> 40 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Xaa Ser Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Xaa Xaa Xaa 20 <210> 41 <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC—FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <220> <221> MOD—RES <222> (1) . . (1) <223 > N端胺基被取代為fe基 <220> <221> MISC—FEATURE <222> (4)..(4) <223 > Xaa 係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <220> <221> MISC—FEATURE <222> (10)..(10) <223>Xaai%J； Glu, cysteic acid, homoglutamic acid ^ homocysteic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) -30 - 200920404 <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23) . . (23) <223> Xaa係為 Asn, Asp 或 Glu <22 0> <221> MISC_FEATURE -26- <222> (24) · · (24) <223> Xaa係為 Thr, glu 或 Asp <400> 41 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Xaa Ser Arg Arg Ala Gin Asp 1 5 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Xaa Xaa Xaa 20 <210> 42 <211> 24 . <212> PRT < 213 >人工序列 <220 > <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <220> <221> MOD_RES <222> (1) . . (1) ( <223> ]>1端胺基被取代為fe基 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) · . (4) <223 > Xaa 係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223>Xaa.^$j Glu, cysteic acid, homoglutamic acid ^ homocysteic 200920404 acid <220> <221> MISC—FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <220> <221> MISC—FEATURE <222> (23) . . (23) <223> Xaa係為Asn或一酸性胺基酸 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa係為Thr或一酸性胺基酸 <40〇> 42 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Xaa Ser Arg Arg Ala Gin Asp 1 5 10 15 -2 7- Phe Val Gin Trp Leu Xaa Xaa Xaa 20 <210> 43 <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 <22〇> <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <220> <221> M〇D—RES <222> (1) . . (1) <2 2 3 > 1^端胺基被取代為fe基 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223 > Xaa 係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid 200920404 <220> <221> MISC_FEATURE (222> (10) . . (10) <223 > Xaa <系為 Asp, Glu, cysteic acid, homoglut ami c acid 或 homocysteic acid <22_0> <221> MOD_RES <222> (11) . . (11) <223> 20kDa聚乙二醇基團結合於第11號位置之Xaa <22〇> <221> MISC_FEATURE <222> (22)…（22) <223 > Xaa 係為 Met, Leu 或 Nle <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223 > Xaa係為Asn或一酸性胺基酸 ‘ <22〇> <221> MISC—FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa係為Thr或一酸性胺基酸 <40〇> 43 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Xaa Cys Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Xaa Xaa Xaa 20 -28- 1 <21〇> 44 <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <22〇> 200920404 <221> MOD__RES <222> (1) . . (1) <223> N端胺基被取代為烴基 <220> <221> MISC__FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa 4系為 Asp, Glu, cysteic acid, homoglutamic acid 或 homocysteic acid <22〇> <221> M〇D_RES <222> (16)..(16) <223> 20kDa聚乙二醇基團結合於第16號位置之Xaa <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)…（22) <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa係為Asn或一酸性胺基酸 <22〇> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223 > Xaa係為Thr或一酸性胺基酸 <400> 44 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Xaa Ser Arg Arg Ala Gin Cys 15 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Xaa Xaa Xaa 20 <210> 45 <211> 24 -34 - 200920404 <212> PRT -29- <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223>胰高血糖素相似物 " <220> <221> MOD_RES ' <222> (1)..(1) <223 > N端胺基被取代為烴基 <220> <2 21> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) acid 或 <223> Xaa係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic homocysteic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10) . . (10) acid 或 <223 > Xaa % ikj Asp, Glu, cysteic acid, homoglutamic homocysteic acid <220> <221> M〇D_RES ' <222> (19)..(19) <223>聚乙二醇化 1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <2 23 > 係為 Met, Leu 或 Nle <220> <221> MISC_FEATURE (222> (23) . . (23) <223> Xaa可以是任何天然胺基酸 <220> <221> MISC FEATURE -35 - 200920404 <222> (24) . . (24) <223> Xaa係為Thr或一酸性胺基酸 <400> 45 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Xaa Ser Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 Phe Val Cys Trp Leu Xaa Xaa Xaa 20 <210> 46 ' <211> 35 <212> PRT " <213>人工序列 <220> -30- <223>合成多肽 <220> <221> MISC^FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> N端胺基被取代為烴基 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) . . (4) <223> Xaa係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <22〇> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223 > Xaa i糸為 Asp, Glu, cysteic acid, homoglutamic acid 或 homocysteic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22) . . (22) < 2 2 3 > Xs3·係為 Met, Leu 或 Mle <220> -36 - 200920404 <221> MISC—FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa係為Asn或一酸性胺基酸 <220> <221> MISC—FEATURE <222> (24)..(24) <22*3> Xaa係為Thr或一酸性胺基酸 <220> " <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) acetyl phenyalanine ' <223 > Xaa4系為 Lys, Cys ,〇rn, h〇m〇cycsteiri 或 <220> <221> M〇D_RES <222> (25)..(25) Tyr Ser Lys Tyr Leu Xaa Ser 5 10 Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro 25 Arg Arg Ala Gin Asp 15 Ser Ser Gly Ala Pro 30 <223>聚乙二醇化 <4〇0> 46 Phe Thr Ser Xaa 1 Phe Val Gin Trp 20 Pro Pro Ser 35 -31- <21〇> 47 <211> 35 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC—FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <22〇> <221> M0D_RES <222> (1)..(1) <223> N端胺基被取代為烴基 <22〇> <221> MISC FEATURE -37 - 200920404 <222> (4)..(4) <223> Xaa係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <220> <221> MISC一FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa 係為 Asp, Glu, cysteic acid, homoglutamic acid 或 homocysteic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa係為 Met, Leu 或 Nle <220> <221> MISC一FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa係為Asn或一酸性胺基酸 ‘ <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa係為Thr或一酸性胺基酸 <220> <221> MISC—FEATURE <222> (35) . . (35) <223 > Xaaif,^ Lys, Cys, Orn, homocysteine ^ acetyl phenyalanine <220> <221> M0D_RES ‘ <222> (35)..(35) <223>聚乙二醇基團化 <4〇〇> 47 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Xaa Ser Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Xaa Xaa Xaa Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro 20 25 30 Pro Ser Xaa 38 - 35 200920404 <210> 48 <211> 39 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC—FEATURE <223>胰高血糖素相似物 <400> 48 His Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Ser 15 10 15 Arg Arg Ala Gin Asp Phe Val Gin Trp Leu Met Asn Thr Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 49 <211> 35 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223〉胰高血糖素相似物 <22〇> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> N端胺基被取代為烴基 <22〇> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa係為 aspartic acid, glutamic acid, cysteic acid 或 homocysteic acid <22〇> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) -39 - 200920404 <223> <220> Xaa係為Lys或 Arg <221> -33- MISC—FEATURE <222> (22) . · (22) <223> <22·0> Xaa係為 Met · Leu 或 Nle <221> MISC_FEATURE <222> (35) . . (35) <223>Xaa^i系為 Lys, Cys, 〇rn, homocysteine 或 acetyl phenyalanine <220> <221> M〇D—RES <222> (35) . . (35) <223>聚乙二醇化 <400> 49 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Xaa Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Xaa Asn Thr Giy Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro 20 25 30 Pro Ser Xaa 35 <210> 50 <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> -<221> MISC—FEATURE <223>腺高血糖素相似物 <220> <221> MOD_RES <222> (1),.(1) <223> 1^端胺基被取代為煙基 <400> 50 Phe Thr Ser Glu Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp 1 5 i〇 Phe Val Gin Trp Leu Met Asn Thr -40 - 15 20 20200920404 <210> 51 <211> 20 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223 >合成多肽 -34-<220> <221> MISC_FEATURE <223〉膜高血糖素相似物 <400> 51 Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arq Arg Ala Gin Asp Phe Val Gin Trp 15 10 15 Leu Met Asn Thr 20 <210> 52 <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 <22〇> <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223〉胰高血糖素相似物 <22〇> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223 > Xaai%^ Homocysteic acid <400> 52 Phe Thr Ser Xaa Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Met Asn Thr <210> 53 <211> 11 <212> PRT <213> 人工序列 200920404 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC一FEATURE <223>月生月太片段係代表C端10 amino acids of Exendin-4 <220> <221> MISC—FEATURE <222> (11) . . (11) <223>XaaY系為 Lys, Cys, 〇rn, homocysteine 或 acetyl phenyalanine <400> 53 -35- Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa 15 10 <210> 54 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223 ：> Xaa係為苯乳酸 <400> 54 His Ser Gin Gly Thr Xaa 1 5 <210> 55 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <22 3 > Xaa係為苯乳酸 <40〇> 55 -42 - 200920404 Ser Gin Gly Thr Xaa 1 5 <210> 56 <211> 4 <212> PRT <213> 人工序列 <22*0> <223> 合成多月太 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) · ·⑷ <223> Xaa係為苯乳酸 <400> 56 Gin Gly Thr Xaa 1 -36- <210> 57 <211> 3 <2 12 > PRT <213> 人工序列 <22〇> <223> 合成多狀 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) . . (3) <223> 係為本乳酸 <400> 57 Gly Thr Xaa 1 <21〇> 58 <211> 2 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多狀 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) ..(2) -43 200920404 <223> Xaa係為苯乳酸 <400> 58 Thr Xaa 1 <210> 59 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC—FEATURE <222> (1) . . (1) <223 > Xaa係為選自由下歹|J組成之群組：His , D-histidine , alpha, alpha-dimethyl imidiazole acetic acid (DMIA), N-methyl histidine, alpha-methyl histidine, imidazole acetic acid, desaminohistidine, hydroxyl-histidine, acetyl-histidine 及 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa係為選自由下歹丨J組成之君羊組：Ser, D-serine, D-alanine, Val, Gly, N-methyl serine, N-methyl alanine,及胺基異丁酸（AIB) -37- <220> <221> ：MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa係為選自由下列組成之群組：Glu或Gin <22〇> <221> MISC_FEATURE <222> (6) . . (6) <223> Xaa係為苯乳酸 <400> 59 Xaa Xaa Xaa Gly Thr Xaa 1 5 <21〇> 60 <211> 5 <212> PRT -44 - 200920404 <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223 > Xaa係為選自由下歹丨J組成之群組：Ser, D-serine, D-alanine, Val, Gly, N-methyl serine, N-methyl alanine,及 — 胺基異丁酸（AIB) <220> ' <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa係為選自由下列組成之群組：Glu或Gin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa係為本乳酸 <400> 60 Xaa Xaa Gly Thr Xaa 1 5 <210> 61 <211> 4 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE ； <222> (1) .•⑴ <223> Xaa係為選自由下歹組成之群組：Glu及Gin -38- <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) · _ (4) <223> XaH係為本乳酸 <400> 61 Xaa Gly Thr Xaa 1 45 - 200920404 <210> 62 <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <22_0> <221> MISC_FEATURE " <223> Peptide AL <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) - <2 23> N端胺基被取代為烴基 <220> <221> MOD_RES <222> (24) . . (24) <223> C^^alpha羧基選擇性地取代為醯胺基 <400> 62 Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp 1 5 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Met Asp Thr 20 <210> 63 <211> 28 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 合成多肽 <220> <221> MISC_FEATURE <223> Peptide AM <220> <221> M〇D_RES <222> (28)..(28) <223> C端alpha羧基選擇性地取代為醯胺基 <400> 63 -39- Ser Gin Gly Thr Phe Thr Ser Glu Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg -46 - 200920404 丄 5 10 15 Arg Ala Gin Asp Phe Val Gin Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 64 <211> 28 <21·2> PRT <213> 人工序列 - <220> <223> 合成多肽 - <220> <221> MISC—FEATURE <223> Peptide AN f1 <220> <221> MI SC一FEATURE <222> ⑷· ·⑸ <223> 第4號位置Threonine及第5號位置苯乳酸藉由酯鍵連結 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) . . (5) c223> Xaa係為笨乳酸 <220> <221> MOD_RES <222> (28) . . (28) <223> 羧基選擇性地取代為醯胺基 <220> <221> MOD_RES <222> (28) . . (28) ‘ <223> C端alpha羧基選擇性地取代為醯胺基 <400> 64 Ser Arg 15 Ser Gin Gly Thr Xaa Thr Ser Glu Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp 15 10 Arg Ala Gin Asp Phe Val Gin Trp Leu Met Asn Thr 2〇 25 210> 65 211> 29 212> PRT 213> 人工序列 47 <220> 200920404 <223>合成多肽 <220> <221 > MISC一FEATURE -40- <223> Peptide AO <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) . . (6) <223>第5號位置Threonine及第6號位置笨乳酸藉由醋鍵連結 <220> <221> MISC—FEATURE <222> (6) . . (6) <22 3> Xaa係為苯乳酸 <220> <221> MOD—RES <222> (29) . . (29) <223> C端alpha叛基選擇性地取代為醒胺基 <400> 65 His Ser Gin Gly Thr Xaa Thr Ser Glu Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gin Asp Phe Val Gin Trp Leu Met Asn Thr 2〇 25 <21〇> 66 <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 <220> ' <223>合成多肽 <220> <221> MISC—FEATURE <223> Peptide AQ <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> N端胺基被取代為烴基 <220> <221> MISC—FEATURE <222> (11) . . (11) -48 - 200920404 <223> Xaa係為胺基異丁酸 <400> 66 Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Met Asn Thr • 20 <210> 67 <211> 24 -41- <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC一FEATURE <223> Peptide AT <220> ' <221> MOD一RES <222> (1)..(1) <223> N端胺基被取代為烴基 <400> 67 Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Met Asn Thr 20 <210> 68 <211> 6 ^ <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MISC一FEATURE <222> (1) . . (1) <223> Xaa係為選自由下列組成之群組：His, D-histidine, alpha, alpha-dimethyl imidiazole acetic acid (DMIA), N-methyl histidine, alpha-methyl histidine, imidazole acetic acid, desaminohistidine, hydroxyl-histidine, acetyl-histidine A -49 - 200920404 <220> <221 > MISC—FEATURE <222> (2) . . (2) c223> Xaa係為選自由下列組成之群組：Ser, D-serine, D-alanine, Val, Gly, N-methyl serine, N-methyl alanine,及胺基異丁酸（AIB) <220> <221> MISC一FEATURE <222> (3) . . (3) <223> Xaa係為選自由下列組成之群組：Glu或Gin <400> 68 Xaa Xaa Xaa Thr Gly Phe 1 5 <210> 69 -42- <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <22MISC—FEATURE <222> (1) · · (1) <223> Xaa係為選自由下列組成之群組：Ser, D-serine, D-alanine, Val, Gly, N-methyl serine, N-methyl alanine,及胺基異丁酸（AIB) <220> ‘ <221> MISC__FEATURE <222> (2) . . (2) <223> Xaa係為選自由下列組成之群組·· Glu或Gin <400> 69 Xaa Xaa Thr Gly Phe 1 <210> 70 <211〉 4 <212> PRT <213> 人工序列 <220> -50 - 200920404 <223>合成多肽 <220> <221> MISC—FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa係為選自由下列組成之群組：Glu或Gin <400> 70 Xaa Thr Gly Phe 1 <210> 71 <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成多肽 <220> <221> MOD—RES <222> (1)..(1) <223 > N端胺基被取代為經基 <220> <221> MISC一FEATURE <222> (24)..(24) -43- <223> 0：端31口卜3羧基選擇性地取代為醯胺基 <400> 71 Phe Thr Ser Glu Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gin Asp 15 10 15 Phe Val Gin Trp Leu Met Asn Thr 20 -51 -