CN102399284B - 狐狸生长激素释放激素cDNA及其应用 - Google Patents
狐狸生长激素释放激素cDNA及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102399284B CN102399284B CN 201010286381 CN201010286381A CN102399284B CN 102399284 B CN102399284 B CN 102399284B CN 201010286381 CN201010286381 CN 201010286381 CN 201010286381 A CN201010286381 A CN 201010286381A CN 102399284 B CN102399284 B CN 102399284B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fox
- cdna
- growth hormone
- releasing hormone
- hormone releasing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Abstract
本发明公开了狐狸生长激素释放激素cDNA基因的全长核苷酸序列和成熟肽的核苷酸序列以及其分别编码的蛋白质的氨基酸序列。狐狸的生长激素释放激素的cDNA序列是一个完整的开放阅读框，共321个核苷酸序列，共编码106个氨基酸；其成熟肽由132个核苷酸序列编码，共编码44个氨基酸残基。本发明可用于狐狸等经济动物的促生长。
Description
技术领域
本发明涉及克隆获得的狐狸生长激素释放激素cDNA及其应用。
背景技术
狐狸是一种经济价值很高的毛皮兽，其生长主要受垂体产生和释放的生长激素来控制，在达到体成熟后，生长激素的产生和释放随之减少。而生长激素又受到动物本身下丘脑产生的生长激素释放激素和生长激素释放抑制激素的双重控制。其中生长激素释放激素促进垂体产生和释放生长激素，而生长激素释放抑制激素则抑制生长激素的产生。二者协调作用，共同维持狐狸的生长速度。生长激素释放激素在丘脑下部的弓状核和腹内侧核产生，合成后即经轴突运输并分泌到正中隆起，由此经垂体门脉系统到达腺垂体。然后刺激腺垂体产生生长激素。以人的生长激素释放激素为例加以说明：人生长激素释放激素的前体是由108个氨基酸残基组成的多肽链，其中N端前20个氨基酸残基为信号肽序列，在穿膜时被切除，经过再加工，成熟的人生长激素释放激素含有44个氨基酸残基，44肽的顺序为：NH2-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-COOH。该成熟蛋白经垂体门脉系统到达腺垂体，并与分泌GH的嗜酸性细胞的膜上GHRH受体(GHRH-RP)结合，GHRH与受体结合后先激活一种对霍乱毒素敏感的Gs蛋白，进而Gs激活膜上的腺苷酸环化酶(AC)，使ATP转变为cAMP，导致cAMP水平上升。而cAMP水平的上升又会促进cAMP依赖性蛋白酶激酶A的调节亚基构象的改变并活化，促进相关蛋白的磷酸化，进而影响到细胞的活性。cAMP引起的GH分泌有Ca2+依赖性，当GHRH作用到生长激素分泌细胞时，60秒内会使Ca2+的浓度提高，从而促进GH分泌。有证据表明Ca2+的阻断可以终止cAMP对GH的释放作用。由此可见GHRH对GH的分泌是通过cAMP与Ca2+介导的，通过该过程调节GH的合成与释放[1]。由于GHRH呈脉冲式释放，相应的垂体的GH也呈脉冲式波动。
生长激素释放激素(GHRH)一般为44个氨基酸的多肽，完整的生物学活性决定于氨基酸的第1-29个氨基酸，半衰期7-50分钟，可见其作用时间之短。不同动物的生长激素释放激素分子大小略有不同，猪、牛、狗、人和绵羊等几种动物的GHRH蛋白发挥作用的活性形式是44个氨基酸残基的小肽。它们的同源性很高。如下所示：
狗：YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNREQGAKVRL
猪：YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNQEQGARVRL
牛：YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMNRQQGERNQEQGAKVRL
人：YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARL
绵羊：YADAIFTNSYRKILGQLSARKLLQDIMNRQQGERNQEQGAKVRL
相对应的不同动物生长激素释放激素的cDNA核苷酸序列的大小也有所不同，人的生长激素释放激素最早在1974被分离纯化并鉴定出来[2]。目前很多动物包括人的生长激素释放激素cDNA基因已经被克隆并公之于众。人的cDNA序列为327个核苷酸，小鼠312，大鼠315，狗、牛、猪均为321个。多数序列都进行了专利保护。如：
中国专利02100065.4保护了羊的生长激素释放激素的cDNA基因及其表达产物的应用。
00813372.7(超级活性的猪生长激素释放激素类似物)保护了优化了的猪GHRH的核苷酸和氨基酸序列。
03822291.4(GHRH类似物)保护了优化了的人GHRH的核苷酸序列和氨基酸。
200610017214.5保护了促进仔猪生长、提高仔猪免疫力的GHRH药物及制备方法。
200510061609.0保护了一种能促进人体长高的GHRH药物及其制剂。
200710068659.0保护了鹿茸促生长释放因子(DEER GHRF)提取及其制备方法。
CN1615151(用于治疗慢性病个体的质粒介导的补充)和CN1649496(改变个体的瘦体重和骨特性的组合物和方法)保护了根据不同动物基因序列进行了优化的GHRH的人工序列。
CN1635898对具有超级活性的猪生长激素释放激素类似物进行了保护。
美国专利7,351,815和7,361,642均对犬的生长激素释放激素的核苷酸序列和氨基酸序列进行了保护。
早在1997年，Draghia-Akli等通过肌肉注射猪GHRH表达质粒，实现了促进猪体重增加的效果[3]后续的实验也进一步证实了同样的结果[4，5，6]。在狗[7]、绵羊[8]体内也获得了较成功的实验结果。
发明内容
本发明的目的是提供一种克隆获得的狐狸生长激素释放激素cDNA及其应用。
为达到上述目的，我们根据其他动物GHRH的保守序列设计了一对引物：上游引物为(如SEQ ID No.5所示)：5′ATGCCACTCTGGGTGTTC 3′，下游引物为(如SEQ ID No.6所示)：5′TCATCCTTGGGAGTTCC 3′。然后制备狐狸下丘脑的总RNA，然后进行反转录，再进行PCR，最后克隆获得了狐狸GHRH的cDNA。其全序列如SEQ IDNo.4所示，其中GHRH成熟肽的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，它们分别编码的氨基酸序列分别如SEQ ID No.2和SEQ ID No.1所示。
根据本发明提供的狐狸GHRH成熟肽的cDNA，可以其为目的基因，采用真核表达载体如常用的pVAX1，将目的基因插入载体中，构建成真核表达载体，肌肉注射入狐狸腿部肌肉中，可获得狐狸生长速度加快，体重增加明显的结果。也可利用本发明提供的狐狸GHRH全序列，将其在常规表达系统中大量表达，获得狐狸GHRH，用于制备可促进经济动物狐狸的生长的活性物质。
附图说明
图1为本发明实施例构建的重组质粒的PCR鉴定图，其中：1：DL-2000plus Marker(5kb，3kb，2kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp)；2，3：阴性克隆；4，5：阳性克隆。
图2为本发明实施例构建的重组质粒pMD19-GHRHS酶切鉴定图，其中1：DL-2000 Marker(2kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp)；2：质粒pMD19-GHRHS；3：PCR鉴定；4：阴性对照；5：BamH I单切；6：Sph I单切；7：Sph I+BamH I双切。
图3为本发明实施例构建的重组质粒pVAX1-GHRHS酶切鉴定图，其中1：DL-2000 Marker(2kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp)；2：质粒pVAX1-GHRHS；3：BamH I单切；4：Not I单切；5：PCR鉴定；6：阴性对照；7：Not I+BamH I双切。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以狐狸GHRH成熟肽的核苷酸序列为目的基因，以pVAX1为真核表达载体，将目的基因插入载体中，构建成真核表达载体，肌肉注射入狐狸腿部肌肉中，可获得狐狸生长速度加快，体重增加明显的结果。
载体构建过程如下：用PCR方法将人生长激素的信号肽基因序列与狐狸生长激素释放激素的成熟肽基因序列串联，连接到T载体上(pMD19-GHRHS)，再用BamH I和EcoR I分别双切T载体上的目的基因和pVAX1空载体。将目的基因克隆入pVAX1载体中，经PCR和测序鉴定后(参见图1)，再将pMD19-GHRHS和pVAX1-GHRHS载体进行酶切鉴定(参见图2和3)。证实获得了pVAX1-GHRHS表达载体。将纯化后的表达载体以50μg-100μg/只，分别注射入20只2-4月龄的幼狐腿部肌肉，在取皮时称重，结果实验组比对照组平均增重高达800g。
其中含人生长激素信号肽的上游引物：ATGGCTACAGGCTCCCGGAC(如SEQ ID No.7所示)；下游引物：CTATCAGAGTCGTACCTTTGCT(如SEQ ID No.8所示)；PCR反应条件：95℃10min，94℃30sec，53℃30sec，72℃30sec30个循环；72℃10min；酶切条件：37℃。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
参考文献
1.Gracia-Navarro F，
JP，Malagon MM，Sánchez-Hormigo A，Luque RM，Hickey GJ，Peinado JR，Delgado E，Martínez-Fuentes AJ.Research progress in thestimulatory inputs regulating growth hormone(GH)secretion.Comp BiochemPhysiol B Biochem Mol Biol.2002 132(1)：141-50.
2.Currie B.L，Johansson K.N.，Greibrokk T.，Folkers K.，Bowers C.Y.Identification and purification of factor A-GHRH from hypothalami which releasesgrowth hormone.Biochem.Biophys.Res.Commun.1974，60(2)：605-9。
3.Draghia-Akli R，Fiorotto ML.A new plasmid-mediated approach tosupplement somatotropin production in pigs.J Anim Sci.2004 82(13_suppl)：E264-9。
4.陈理银，郭荣富，相振田，冯宇。猪生产中pGRF基因质粒应用研究，猪业科学，2006 8：14-6.
5.张勇，周安国，吴德，朱宇旌，王康宁，杨凤。仔猪骨骼肌注射pGRF基因质粒的促生长及代谢调控效应研究，畜牧兽医学报，2003 34(2)：147-51.
6.张利宇，孙宝忠，王敏，种京华。生长激素释放因子(GRF)基因质粒的研究进展，黑龙江畜牧兽医，20069：19-21.
7.Draghia-Akli R，Cummings KK，Khan AS，Brown PA，Carpenter RH.Effectsof plasmid-mediated growth hormone releasing hormone supplementation in young，healthy Beagle dogs.J Anim Sci.2003 81(9)：2301-10.
8.Meng QY，Chen ZQ，Yu ZQ，Xie QF，Li N.Increased body weight viainjecting myogenic Expression gowth hormone-releasing hormone(GHRH)plasmidDNA into sheep.Anim Biotech.2004 15(2)：175-92.
Claims (6)
1.一种狐狸生长激素释放激素前体肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.编码权利要求1所述的狐狸生长激素释放激素前体肽的cDNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
3.含有权利要求2所述cDNA的表达载体。
4.含有权利要求3所述表达载体的宿主。
5.氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的狐狸生长激素释放激素在促进狐狸生长中的应用。
6.权利要求2所述的cDNA和核苷酸序列为SEQ ID No.3所示的cDNA在制备促进狐狸生长的活性物质中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010286381 CN102399284B (zh) | 2010-09-17 | 2010-09-17 | 狐狸生长激素释放激素cDNA及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010286381 CN102399284B (zh) | 2010-09-17 | 2010-09-17 | 狐狸生长激素释放激素cDNA及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102399284A CN102399284A (zh) | 2012-04-04 |
| CN102399284B true CN102399284B (zh) | 2013-05-29 |
Family
ID=45881984
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201010286381 Expired - Fee Related CN102399284B (zh) | 2010-09-17 | 2010-09-17 | 狐狸生长激素释放激素cDNA及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102399284B (zh) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8889632B2 (en) | 2007-01-31 | 2014-11-18 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Stabilized p53 peptides and uses thereof |
| CN101730708B (zh) | 2007-03-28 | 2013-09-18 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 缝合多肽 |
| CA2807685C (en) | 2010-08-13 | 2020-10-06 | Aileron Therapeutics, Inc. | P53 derived peptidomimetic macrocycle |
| CN102399283B (zh) * | 2010-09-17 | 2013-05-29 | 中国农业大学 | 水貂生长激素释放激素cDNA及其应用 |
| CN102399284B (zh) * | 2010-09-17 | 2013-05-29 | 中国农业大学 | 狐狸生长激素释放激素cDNA及其应用 |
| US9096684B2 (en) | 2011-10-18 | 2015-08-04 | Aileron Therapeutics, Inc. | Peptidomimetic macrocycles |
| WO2013123266A1 (en) | 2012-02-15 | 2013-08-22 | Aileron Therapeutics, Inc. | Peptidomimetic macrocycles |
| US9604919B2 (en) | 2012-11-01 | 2017-03-28 | Aileron Therapeutics, Inc. | Disubstituted amino acids and methods of preparation and use thereof |
| AU2015320549A1 (en) | 2014-09-24 | 2017-04-13 | Aileron Therapeutics, Inc. | Peptidomimetic macrocycles and uses thereof |
| BR112017019738A2 (pt) | 2015-03-20 | 2018-05-29 | Aileron Therapeutics Inc | macrociclos peptidomiméticos e usos dos mesmos |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102399284A (zh) * | 2010-09-17 | 2012-04-04 | 中国农业大学 | 狐狸生长激素释放激素cDNA及其应用 |
-
2010
- 2010-09-17 CN CN 201010286381 patent/CN102399284B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102399284A (zh) * | 2010-09-17 | 2012-04-04 | 中国农业大学 | 狐狸生长激素释放激素cDNA及其应用 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Dynamics of GHRH in third-ventricle cerebrospinal fluid of cattle: Relationship with serum concentrations of GH and responses to appetite-regulating peptides;M.G. Thomas;《DOMESTIC ANIMAL ENDOCRINOLOGY》;20091231;第37卷;196-205 * |
| Growth hormone-releasing hormone (GHRH) polymorphisms associated with carcass traits of meat in Korean cattle;Hyun Sub Cheong;《BMC Genetics》;20060603;第7卷(第35期) * |
| Hyun Sub Cheong.Growth hormone-releasing hormone (GHRH) polymorphisms associated with carcass traits of meat in Korean cattle.《BMC Genetics》.2006,第7卷(第35期), |
| M.G. Thomas.Dynamics of GHRH in third-ventricle cerebrospinal fluid of cattle: Relationship with serum concentrations of GH and responses to appetite-regulating peptides.《DOMESTIC ANIMAL ENDOCRINOLOGY》.2009,第37卷196-205. |
| 生长激素释放肽在动物科学中的研究进展;陶 新;《中国兽药杂志》;20021231;第36卷(第12期);40-42 * |
| 陶 新.生长激素释放肽在动物科学中的研究进展.《中国兽药杂志》.2002,第36卷(第12期),40-42. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102399284A (zh) | 2012-04-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102399284B (zh) | 狐狸生长激素释放激素cDNA及其应用 | |
| CN102399283B (zh) | 水貂生长激素释放激素cDNA及其应用 | |
| Duguay et al. | Nucleotide sequence and tissue distribution of three insulin-like growth factor I prohormones in salmon. | |
| Doyon et al. | Corticotropin-releasing factor and neuropeptide Y mRNA levels are elevated in the preoptic area of socially subordinate rainbow trout | |
| Yoshiura et al. | Duality of gonadotropin in a primitive teleost, Japanese eel (Anguilla japonica) | |
| Moav et al. | Thyroid hormone increases transcription of growth hormone mRNA in rainbow trout pituitary | |
| Fradinger et al. | Characterization of the gene encoding both growth hormone-releasing hormone (GRF) and pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) in the zebrafish | |
| KR20020047096A (ko) | 초활성 돼지 성장 호르몬 분비 호르몬 유사체 | |
| Nam et al. | Molecular and functional analyses of growth hormone-releasing hormone (GHRH) from olive flounder (Paralichthys olivaceus) | |
| Jeh et al. | Recombinant flounder growth hormone from Escherichia coli: overexpression, efficient recovery, and growth-promoting effect on juvenile flounder by oral administration | |
| Wu et al. | Stimulatory effects of neuropeptide Y on the growth of orange-spotted grouper (Epinephelus coioides) | |
| Zhang et al. | Sex biased expression of ghrelin and GHSR associated with sexual size dimorphism in yellow catfish | |
| Chatterjee et al. | Molecular cloning of cDNA encoding thyroid stimulating hormone β subunit of bighead carp Aristichthys nobilis and regulation of its gene expression | |
| Iziga et al. | Molecular characterization and gene expression of thyrotropin-releasing hormone in Senegalese sole (Solea senegalensis) | |
| Zoeller et al. | Distribution of two distinct messenger ribonucleic acids encoding gastrin-releasing peptide in rat brain | |
| CN100435848C (zh) | 提高饲料效率和家畜生长速度的基因处理 | |
| EP1573046B1 (en) | Protease resistant ti-growth hormone releasing hormone | |
| CN101665539A (zh) | 重组融合蛋白ptd-max及其表达方法与应用 | |
| CN107569679B (zh) | Ace2在调控棕色脂肪组织活性中的应用 | |
| CN101897953B (zh) | 无创性高穿透性表皮生长因子及其应用 | |
| Xie et al. | Ghrelin and truncated ghrelin variant plasmid vectors administration into skeletal muscle augments long-term growth in rats | |
| Conlon et al. | Isolation and structural characterization of calcitonin gene-related peptide from the brain and intestine of the frog, Rana ridibunda | |
| SHAN et al. | cDNA cloning, expression and immunolocalization of growth hormone gene in Acipenser dabryanus | |
| Zhu et al. | Insulin-like growth factor I (IGF-I) in Chinese alligator, Alligator sinensis: molecular characterization, tissue distribution and mRNA expression changes during the active and hibernating periods | |
| Boonanuntanasarn et al. | Characterization of proopiomelanocortin in the snakeskin gourami (Trichopodus pectoralis) and its expression in relation to food intake |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130529 Termination date: 20130917 |