CN107569679B

CN107569679B - Ace2在调控棕色脂肪组织活性中的应用

Info

Publication number: CN107569679B
Application number: CN201710795756.3A
Authority: CN
Inventors: 杨金奎; 曹曦; 史婷婷
Original assignee: Beijing Tongren Hospital
Current assignee: Beijing Tongren Hospital
Priority date: 2017-09-06
Filing date: 2017-09-06
Publication date: 2020-10-16
Anticipated expiration: 2037-09-06
Also published as: CN107569679A

Abstract

本发明专利申请公开了ACE2的应用，具体的，ACE2可以用于调控受试者体内棕色脂肪组织的活性；通过抑制或增强ACE2的活性以调控受试者体内棕色脂肪组织的活性，从而用于体温的调节以及肥胖症的治疗或预防。

Description

ACE2在调控棕色脂肪组织活性中的应用

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体涉及ACE2在调控棕色脂肪组织活性进而治疗相关疾病中的用途。

背景技术

人类和其他哺乳动物体内存在白色脂肪组织(White Adipose Tissue，WAT)和棕色脂肪组织(Brown adipose tissue，BAT)。白色脂肪组织占成人体质量的10％左右，主要功能是储存脂肪以作为人体能源库。棕色脂肪组织则是一种发热脂肪组织，含有丰富的线粒体，可分解代谢脂肪，以直接产生热量的方式来消耗能量，保护机体免受低体温带来的伤害。棕色脂肪组织这种燃烧脂肪的性质被认为是治疗肥胖和与肥胖相关的代谢疾病的重要目标，通过增加棕色脂肪组织的数量和活性来消耗脂肪，是一种安全有效的肥胖症治疗方法(钱杰等，“棕色脂肪组织与肥胖症药物治疗的新靶点”，《药学进展》，2012年第36卷第11期，487页)。

棕色脂肪是新陈代谢非常活跃的组织器官，负责非颤抖性产热和燃烧多余的能量。健康成人体内大约有50g左右的棕色脂肪，担负着燃烧每天摄取能量的20％，可以维持机体能量平衡。有效地增强棕色脂肪组织功能可以达到治疗肥胖的目的，丁国宪在专利文献 (CN102120034B，公开日期：20150211；CN102120755B，公开日期：20130403)中公开了可靶向棕色脂肪组织的多肽CKGGRAKDC-NH2，其能够提高棕色脂肪组织的活性，从而达到治疗肥胖的目的。此外，棕色脂肪组织与体温的调节也密切相关，棕色脂肪组织活性的提高能够加速脂肪消耗，提高热量的产生，从而提高受试者的体温，当新生儿体内棕色脂肪组织活性较低时，会导致其产热不足(“棕色脂肪与新生儿体温调节”，俞善昌等，《国外医学(儿科学分册)》，1982年02期)，这暗示了通过调控新生儿体内棕色脂肪组织的活性可以调节新生儿的体温。

本发明的发明人在研究血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme2，ACE2)的功能时，发现ACE2可用于调控棕色脂肪组织的活性，为相关疾病的治疗提供了新的思路。

发明内容

本发明的目的在于提供ACE2在调控棕色脂肪组织活性中的用途，ACE2可以通过调控棕色脂肪组织的活性来调节体温、治疗和/或预防肥胖。

本发明中的“ACE2”包括血管紧张素转换酶2全长蛋白或蛋白的功能结构域，也可以是保守多肽片段或活性多肽片段；可以是天然的血管紧张素转换酶2，也可以是血管紧张素转换酶2的突变体；在一个实施方式中，本发明的ACE2可以为人源ACE2、也可以为鼠源ACE2，鼠源ACE2可以为小鼠ACE2，也可以为大鼠ACE2，优选的，所述ACE2的序列为人源ACE2，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1，GenBank:BAB40370.1，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。

另一方面，本发明还提供了ACE2的衍生物，所述衍生物包括但不限于在ACE2的一个或多个氨基酸残基的侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、PEG(聚乙二醇)化、单甲氧基聚乙二醇(mPEG)化、Fc 融合或其他化学修饰得到的多肽。在一些实施方式中，在多肽的一个或多个氨基酸残基的侧链基团上、氨基端或羧基端引入PEG化、mPEG化修饰或与FC融合，从而可以提高多肽在体内的半衰期；优选的，PEG和mPEG的平均分子量选自0.1-100kDa、1-50kDa、10-40kDa 或20-30kDa，更优选的，选自100kDa、90kDa、80kDa、70kDa、60kDa、50kDa、45kDa、 40kDa、35kDa、30kDa、25kDa、20kDa、15kDa、10kDa、5kDa、4kDa、3kDa、2kDa、 1kDa、0.5kDa或0.1kDa；术语“Fc”是指Fc域或其片段，Fc可为氨基酸序列与自然界中 Fc区的氨基酸序列一致的天然Fc区，或氨基酸序列与天然Fc区的氨基酸序列至少有一个氨基酸不同的变异Fc区。

另一方面，本发明提供了ACE2的药学上可接受的酯和盐；酯可以包括羧基末端和/或羧基侧链的C_1-24脂肪烃酯，包括C_1-24或C_1-18或C_1-16或C_1-12或C_1-6烷基酯；盐通常是通过多肽与酸或碱反应形成的加成盐，所述成盐形式包括但不限于盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、钾盐、钠盐、钙盐、镁盐或三乙胺盐。

另一方面，通过抑制ACE2的活性可以降低受试者体内棕色脂肪组织的活性，所述抑制 ACE2的活性包括对ACE2基因的突变、敲除、敲低、沉默或失活。可以通过同源重组的方式进行ACE2的突变、敲除或插入失活；也可以利用siRNA沉默或失活ACE2的活性；还可以利用基因编辑的方式抑制或失活ACE2，基因编辑的方式包括锌指核酸酶技术(zinc fingernuclease，ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶技术(transcription activator-likeeffector nuclease, TALEN)和成簇规律间隔的短回文重复序列技术(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR/Cas9)，优选的，可以采用CRISPR/Cas9技术对ACE2进行基因编辑。

另一方面，通过增强ACE2的活性可以提高受试者体内棕色脂肪组织的活性，所述增强 ACE2的活性可以通过基因过表达实现。具体而言，可以通过向受试者体内导入编码基因、基因载体或包含载体的宿主细胞实现，载体可以选自原核表达载体和真核表达载体，真核表达载体优选哺乳动物表达载体，优选的，本发明采用腺病毒系统进行ACE2基因的过表达，所述表达载体优选为pcDNA3.1/myc-HisB(PCDB)(购自Sino-GenoMax,China)；除此之外，也可以通过诱导的方式激活受试者体内固有的ACE2来实现过表达，不需要导入额外的ACE2 基因。

另一方面，还可以通过施用ACE2、ACE2的衍生物、ACE2的药学上可接受的酯和/或盐、或者ACE2的衍生物的药学上可接受的酯和/或盐来增强ACE2的活性。可以采用任何可用的适于递送药物的方法和途径向受试者施用本发明的ACE2、ACE2的衍生物、ACE2的药学上可接受的酯和/或盐、或者ACE2的衍生物的药学上可接受的酯和/或盐，包括体内和体外方法，以及全身和局部施用途径；优选的，可以采用皮下施用、静脉内施用或肌内施用。

本发明还公开了ACE2通过调控受试者体内棕色脂肪组织的活性可以达到调节体温的效果；具体而言，抑制ACE2的活性可以降低棕色脂肪组织的活性，从而降低受试者的体温；增强ACE2的活性可以提高棕色脂肪组织的活性，从而能够加速脂肪消耗，提高热量的产生，提高受试者的体温，受试者可以为成人，也可以为新生儿；优选的，所述提高受试者体温是在低温环境下提高受试者体温。

本发明还公开了ACE2通过调控受试者体内棕色脂肪组织的活性可以达到治疗和/预防肥胖症的效果，具体而言，增强ACE2的活性可以提高棕色脂肪组织的活性，从而能够加速脂肪消耗，提高热量的产生，实现肥胖症的治疗和/或预防；优选的，可以在低温或非低温环境下通过调控受试者体内棕色脂肪组织的活性来预防和/或治疗肥胖。

另一方面，本发明的ACE2、ACE2的衍生物、ACE2的药学上可接受的酯和/或盐、或者ACE2的衍生物的药学上可接受的酯和/或盐、ACE2基因还可以与其他调控棕色脂肪组织活性的药物联用，所述药物可以为CN102120755B中所示的多肽CKGGRAKDC-NH2。

本发明证实了ACE2与棕色脂肪组织活性之间的关系，为棕色脂肪组织活性的调控以及相关疾病的治疗，提供了新的思路。

附图说明

图1 ACE2^-/y小鼠和ACE2 OE小鼠ACE2的Western Blot检测图，三组平行试验，WT：野生型对照小鼠，GFP：重组载体表达GFP作为对照组；结果显示ACE2^-/y小鼠ACE2表达明显下调、几乎检测不到，ACE2 OE小鼠的ACE2表达量显著高于GFP对照组。

图2 ACE2^-/y小鼠与对照组小鼠棕色脂肪相关功能蛋白UCP1，ATP5A的WesternBlot检测图，WT：野生型对照小鼠；结果显示ACE2^-/y小鼠棕色脂肪相关功能蛋白UCP1，ATP5A表达量显著低于对照组小鼠。

图3 ACE2 OE小鼠与对照组小鼠棕色脂肪相关功能蛋白UCP1和PGC-1α的WesternBlot 检测，GFP：重组载体表达GFP作为对照组；结果显示ACE2 OE小鼠棕色脂肪相关功能蛋白UCP1和PGC-1α表达量显著高于对照组小鼠。

图4 ACE2^-/y小鼠与ACE2 OE小鼠棕色脂肪相关功能基因qRT-PCR检测图；WT：野生型对照小鼠，GFP：重组载体表达GFP对照组；结果显示ACE2^-/y小鼠UCP1、PRDM16和 PPARγ2表达量显著低于WT小鼠，而ACE2 OE小鼠PRDM16、AP2、PGC1α、PGC1β和 CPT1α表达量显著高于GFP对照组。

图5 ACE2^-/y小鼠与对照组小鼠PET-CT检测图，WT：野生型对照小鼠；结果显示ACE2^-/y小鼠肩胛骨处棕色脂肪组织活性较对照组小鼠显著降低(图中圆圈标示处)(图5A)，进一步统计其活性相对数值，发现两组小鼠棕色脂肪组织活性存在显著差异(图5B)。

图6 ACE2 OE小鼠与对照组小鼠PET-CT检测图，GFP：重组载体表达GFP作为对照组；结果显示ACE2 OE小鼠肩胛骨处棕色脂肪组织活性较对照组小鼠显著增强(图中圆圈标示处)(图6A)，进一步统计其活性相对数值，发现两组小鼠棕色脂肪组织活性存在显著差异(图 6B)。

图7 ACE2^-/y小鼠与对照组小鼠体温检测图，WT：野生型对照小鼠；4℃冷处理后，ACE2^-/y小鼠体温显著低于对照组WT小鼠(图7A)；远红外照相检测结果同样显示，ACE2^-/y小鼠体温显著低于对照组WT小鼠(图7B)。

图8 ACE2 OE小鼠与对照组小鼠体温检测图，GFP：载体表达GFP作为对照组；4℃冷处理后，ACE2 OE小鼠体温显著高于对照组小鼠(图8A)；远红外照相检测结果同样显示，ACE2 OE小鼠体温显著高于对照组小鼠体温(图8B)。

图9 ACE2 OE小鼠与对照组小鼠代谢笼实验结果，(A)耗氧量，(B)二氧化碳排出，(C) 能量消耗(EE,Energy expenditure)，GFP：载体表达GFP作为对照组；结果显示ACE2 OE小鼠耗氧量，二氧化碳排出和能量消耗高于对照组小鼠(图9A，B，C)，说明增强ACE2的活性可以通过提高棕色脂肪组织的活性，从而加快肥胖小鼠能量代谢速率。

具体实施方式

实施例1材料和方法

1.1试验材料

ACE2基因敲除小鼠由(ACE2KO,ACE2^-/y)丹麦分子生物学技术研究所JosefPenninger 教授赠予，6周龄的C57BL/6J雄性小鼠买自北京维通利华实验动物技术有限公司。6周龄的db肥胖雄性小鼠买自南京大学模式动物遗传研究中心。所有小鼠均在SPF级鼠房饲养，饲养环境温度为22±2℃，湿度55±10％，12小时(8am-8pm)昼夜变化。小鼠随意进食和进水。实验结束后采用颈椎脱臼法处死小鼠，收集血液，取出肩胛骨棕色脂肪组织、附睾脂肪、皮下腹股沟脂肪、肝脏、肌肉等组织并立即放入-80℃保存。

1.2ACE2基因过表达

利用腺病毒进行ACE2基因的过表达，将ACE2编码基因构建到表达载体 pcDNA3.1/myc-HisB上，利用腺病毒将上述重组表达载体通过尾静脉注射到小鼠体内5×10⁸(particle forming units(pfu))溶于100μL的0.9％生理盐水)，七天后，进行相关实验；过表达ACE2的小鼠命名为ACE2 OE小鼠；其中，ACE2的氨基酸序列和基因序列分别如SEQ IDNo.1-2所示。对照组采用表达载体pcDNA3.1/myc-HisB表达GFP，按上述相同的操作方式进行对照组实验。

1.3小鼠能量代谢检测

1.3.1呼吸代谢检测

动物呼吸饮食测量仪(PANLAB，LE405，V3.2，LE400，V1.2，LE1305，V210409)检测实验小鼠耗氧量，称取体重，食物，设定程序，检测时间为大于48h，每次可同时检测6 只小鼠，保证食物、水供给正常，每次检测最好选择分别不同实验组。

1.3.2小鼠体温测定

1)准备好温度计及传感器，接通电源并打开温度计；2)将小鼠从笼子中取出,将小鼠的尾巴向上提起，露出肛门，将浸过预温甘油的传感器轻轻插入肛门，插入深度约1cm；3)将传感器保持在小鼠体内直到温度计上显示温度稳定，此时及路线数值便为小鼠的直肠温度或体温；4)将小鼠放回笼内，记录体温，用spss13.0软件分析实验结果。5)利用远红外相机检测小鼠表皮温度(E60:Compact Infrared Thermal Imaging Camera；FLIR,WestMalling,United Kingdom)。

1.3.3小鼠日基础摄食量检测

1)实验前将实验小鼠分开，每只鼠笼放入一只实验小鼠，供应正常的食物和水，待小鼠适应后再进行试验；2)实验第一天下午5点，更换新的笼子、垫料，称取鼠粮，记录为初始重量，保证饮水供应正常；3)第二天下午5点，收集鼠笼内剩余的粮食，称重，记录为最终鼠粮；4)重复步骤2)和步骤3)，连续检测一周；5)统计实验数据，得到的平均值即为小鼠日平均进食量。

1.4PET/CT成像

PET/CT成像在Inveon MM平台进行(Siemens Preclinical Solutions,Knoxville,TN,USA)。异氟烷麻醉小鼠，尾静脉注射18F-FDG(150mCi)到小鼠。在注射放射性示踪剂六十分钟后，将小鼠放置在PET/CT进行分析。

1.5Western Blot

1)分别配制5％的浓缩胶和12％的分离胶，先像玻璃空隙中注入分离胶，待其凝固后再将浓缩胶注入分离胶上层，插入梳子。2)配制Tris-甘氨酸电泳液，预冷后，将凝胶放入电泳槽中并加入电泳液，拔去梳子，在胶孔中加入蛋白液及5ul marker，先80V，至分离胶时改用120V电压电泳。3)配制电转液并放置于4℃，先将PVDF膜在无水甲醇中浸泡1min，然后将其与将滤纸、凝胶浸泡在电转液中，将PVDF膜贴在凝胶上，两面覆盖上滤纸，不要有气泡，将此装置按正负极顺序装在电转槽中，加入电转液，放置在冰上，电转100V,60min。4) 将PVDF膜放置于封闭液(5％的脱脂牛奶)中，置于摇床上约1个小时。5)用PE手套包装密封PVDF膜，按照0.1ml/cm2比例加入一抗，放置于摇床上，4℃过夜。6)取出PVDF膜，回收一抗，用TBST洗膜3次，10min/次，加入二抗溶液，放置于摇床上，室温1小时。7) 用TBST洗膜3次，10min/次，进行ECL显色。

1.6组织总RNA的提取及逆转录合成cDNA

1.6.1提取总RNA

1)将组织放入盛有液氮的研钵中磨成粉末状，把粉末转移到1.5ml无核酸酶的离心管中，并按照0.1g组织加入1ml Trizol的比例加入相应的Trizol，充分混匀研磨液，组织样品的总体积不能超过所用Trizol体积的十分之一。2)将研磨液在室温下静置5min，然后按每1mlTrizol 液中加入0.2ml氯仿的比例加入相应体积的氯仿，盖紧离心管盖并在涡旋振荡器上剧烈震荡 15s。3)超速离心机4℃，11000g离心15分钟。4)取上层水相于一新的无核酸酶的离心管中(注意不要取到下层沉淀)，按每1mlTrizol液加入0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，混匀后室温静置10分钟。5)超速离心机4℃，12000g离心10分钟。6)弃去上清液，按每 1mlTrizol液至少加入1ml75％乙醇的比例加入75％乙醇(DEPC水配制)，用涡旋振荡器震荡混匀。7)超速离心机4℃，7500g离心5分钟。8)弃去上清液，室温干燥5-10分钟(此时会看到管底有沉淀析出，即为RNA)，向离心管中加入DEPC水溶解RNA并保存于-80℃。

1.6.2RNA浓度及纯度的测定

取1ul总RNA置于紫外分光光度仪上测定260nm吸光度值，同时测定260/280值，其比值在1.8-2.0之间说明RNA纯度好，降解少。比值小于1.8，说明RNA内存在较多蛋白质残余；比值大于2.0，说明RNA有降解。

1.6.3逆转录总RNA合成cDNA

1)将以下组分加入无核酸酶的0.2ml离心管中，

2)混匀，65℃孵育5分钟后迅速置于冰上冷却。短暂离心后，加入以下组分：

3)混匀后37℃孵育2分钟。

4)在室温下加入1μl(200U)M-MLV逆转录酶，轻轻吹打混匀。

5)37℃孵育50分钟。

6)70℃孵育15分钟以终止反应。合成的cDNA保存于-20℃冰箱。

1.6.4实时荧光定量PCR反应(qRT-PCR)

根据NCBI提供的基因序列，根据在线引物设计网站“NCBI Primer-BLAST”设计引物 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

小鼠基因实时定量PCR上下游引物序列

配置qRT-PCR反应液(按照Applied BiosystemsViiA^TM7qRT-PCR system配制反应体系)

qRT-PCR反应程序：

分析扩增效率，并根据溶解曲线来判定反应的特异性

根据PCR扩增曲线得到的Ct值(threshold cycle number，阈值循环数)，

采用2-ΔCt法进行相对定量。将生理盐水组作为对照组。以CyclophilinA为内参，计算所有基因的mRNA的相对表达量。

1.7数据分析

采用SPSS13.0统计软件进行处理，各指标数据采用均数±标准误(x±s)表示，两组间进行独立样本t检验。P＜0.05被认为差异具有统计学意义。

实施例2ACE2基因功能的研究

对ACE2基因敲除小鼠(ACE2^-/y小鼠)和ACE2过表达小鼠(ACE2 OE小鼠)分别检测ACE2基因的表达，Western Blot结果显示ACE2^-/y小鼠ACE2表达几乎检测不到，而ACE2 OE小鼠ACE2表达量显著高于GFP对照组(图1)，表明ACE2^-/y小鼠中的ACE2活性被抑制，而ACE2 OE小鼠中的ACE2活性升高。

Western Blot检测结果显示，ACE2^-/y小鼠棕色脂肪组织相关功能蛋白UCP1，ATP5A表达量显著低于对照小鼠(图2)，而ACE2 OE小鼠棕色脂肪组织相关功能蛋白UCP1和PGC-1α表达量显著高于对照组小鼠(图3)，说明ACE2的活性会影响棕色脂肪组织相关功能蛋白的表达，暗示ACE2可能会影响棕色脂肪组织的活性。

qRT-PCR检测ACE2^-/y与ACE2 OE小鼠棕色脂肪组织相关功能基因UCP1、PRDM16、AP2、PGC1α、PGC1β、CPT1α和PPARγ2的表达，结果显示ACE2^-/y小鼠UCP1、PRDM16 和PPARγ2表达量显著低于WT小鼠，而ACE2 OE小鼠PRDM16、AP2、PGC1α、PGC1β和CPT1α表达量显著高于GFP对照组(图4)；这进一步反映ACE2的活性会影响棕色脂肪组织相关功能基因的表达。

利用PET-CT(SIEMENS,INVEON)检测ACE2^-/y小鼠、ACE2 OE小鼠以及对照组小鼠棕色脂肪组织的相对活性，结果显示ACE2^-/y小鼠肩胛骨处棕色脂肪活性较对照小鼠显著降低，进一步统计其活性相对数值，发现两组小鼠棕色脂肪活性存在显著差异(图5)，ACE2 OE小鼠肩胛骨处棕色脂肪活性较C57BL/6小鼠显著增强，进一步统计其活性相对数值，发现两组小鼠棕色脂肪活性存在显著差异(图6)；该结果表明ACE2能够调控棕色脂肪组织的活性，抑制ACE2的活性可以降低棕色脂肪组织的活性，增强ACE2的活性则可以增强棕色脂肪组织的活性。

4℃冷处理后，ACE2^-/y小鼠体温显著低于野生型WT小鼠(图7A)；远红外照相检测也发现，ACE2^-/-小鼠体温显著低于C57BL/6小鼠体温(图7B)。4℃冷处理后，ACE2 OE小鼠体温显著高于对照组小鼠(图8A)；远红外照相检测也发现，ACE2 OE小鼠体温显著高于对照组小鼠体温(图8B)；上述结果表明ACE2能够通过调控棕色脂肪组织的活性调节体温，抑制ACE2的活性可以降低体温，增强ACE2的活性则可以促进体温的升高。

代谢笼实验结果显示ACE2 OE小鼠耗氧量，二氧化碳排出和能量消耗高于野生型小鼠 (图9)，说明增强ACE2的活性可以通过提高棕色脂肪组织的活性，从而加快肥胖小鼠能量代谢速率，有助于肥胖症状的减缓和治疗。

上述实施例证实了ACE2可以调控棕色脂肪组织的活性，通过调控棕色脂肪组织的活性可以调节体温，并能够用于治疗或预防肥胖症。

本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

说明书核苷酸和氨基酸序列表

<110> 首都医科大学附属北京同仁医院

<120> ACE2在调控棕色脂肪组织活性中的应用

<130> 20170825

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 805

<212> PRT

<213> human

<400> 1

Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala

1 5 10 15

Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe

20 25 30

Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp

35 40 45

Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn

50 55 60

Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala

65 70 75 80

Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln

85 90 95

Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys

100 105 110

Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser

115 120 125

Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu

130 135 140

Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu

145 150 155 160

Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu

165 170 175

Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg

180 185 190

Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu

195 200 205

Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu

210 215 220

Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu

225 230 235 240

His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile

245 250 255

Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly

260 265 270

Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys

275 280 285

Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala

290 295 300

Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu

305 310 315 320

Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro

325 330 335

Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly

340 345 350

Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp

355 360 365

Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala

370 375 380

Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe

385 390 395 400

His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys

405 410 415

His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn

420 425 430

Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly

435 440 445

Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe

450 455 460

Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met

465 470 475 480

Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe

500 505 510

Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala

515 520 525

Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile

530 535 540

Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu

545 550 555 560

Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala

565 570 575

Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe

580 585 590

Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr

595 600 605

Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu

610 615 620

Lys Ser Ala Leu Gly Asp Arg Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met

625 630 635 640

Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu

645 650 655

Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val

660 665 670

Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro

675 680 685

Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile

690 695 700

Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn

705 710 715 720

Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln

725 730 735

Pro Pro Val Ser Ile Trp Leu Ile Val Phe Gly Val Val Met Gly Val

740 745 750

Ile Val Val Gly Ile Val Ile Leu Ile Phe Thr Gly Ile Arg Asp Arg

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Lys Lys Lys Asn Lys Ala Arg Ser Gly Glu Asn Pro Tyr Ala Ser Ile

770 775 780

Asp Ile Ser Lys Gly Glu Asn Asn Pro Gly Phe Gln Asn Thr Asp Asp

785 790 795 800

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<210> 2

<211> 2418

<212> DNA

<213> human

<400> 2

atgtcaagct cttcctggct ccttctcagc cttgttgctg taactgctgc tcagtccacc 60

attgaggaac aggccaagac atttttggac aagtttaacc acgaagccga agacctgttc 120

tatcaaagtt cacttgcttc ttggaattat aacaccaata ttactgaaga gaatgtccaa 180

aacatgaata acgctgggga caaatggtct gcctttttaa aggaacagtc cacacttgcc 240

caaatgtatc cactacaaga aattcagaat ctcacagtca agcttcagct gcaggctctt 300

cagcaaaatg ggtcttcagt gctctcagaa gacaagagca aacggttgaa cacaattcta 360

aatacaatga gcaccatcta cagtactgga aaagtttgta acccagataa tccacaagaa 420

tgcttattac ttgaaccagg tttgaatgaa ataatggcaa acagtttaga ctacaatgag 480

aggctctggg cttgggaaag ctggagatct gaggtcggca agcagctgag gccattatat 540

gaagagtatg tggtcttgaa aaatgagatg gcaagagcaa atcattatga ggactatggg 600

gattattgga gaggagacta tgaagtaaat ggggtagatg gctatgacta cagccgcggc 660

cagttgattg aagatgtgga acataccttt gaagagatta aaccattata tgaacatctt 720

catgcctatg tgagggcaaa gttgatgaat gcctatcctt cctatatcag tccaattgga 780

tgcctccctg ctcatttgct tggtgatatg tggggtagat tttggacaaa tctgtactct 840

ttgacagttc cctttggaca gaaaccaaac atagatgtta ctgatgcaat ggtggaccag 900

gcctgggatg cacagagaat attcaaggag gccgagaagt tctttgtatc tgttggtctt 960

cctaatatga ctcaaggatt ctgggaaaat tccatgctaa cggacccagg aaatgttcag 1020

aaagcagtct gccatcccac agcttgggac ctggggaaag gcgacttcag gatccttatg 1080

tgcacaaagg tgacaatgga cgacttcctg acagctcatc atgagatggg gcatattcag 1140

tatgatatgg catatgctgc acaacctttt ctgctaagaa atggagctaa tgaaggattc 1200

catgaagctg ttggggaaat catgtcactt tctgcagcca cacctaagca tttaaaatcc 1260

attggtcttc tgtcacccga ttttcaagaa gacaatgaaa cagaaataaa cttcctgctc 1320

aaacaagcac tcacgattgt tgggactctg ccatttactt acatgttaga gaagtggagg 1380

tggatggtct ttaaagggga aattcccaaa gaccagtgga tgaaaaagtg gtgggagatg 1440

aagcgagaga tagttggggt ggtggaacct gtgccccatg atgaaacata ctgtgacccc 1500

gcatctctgt tccatgtttc taatgattac tcattcattc gatattacac aaggaccctt 1560

taccaattcc agtttcaaga agcactttgt caagcagcta aacatgaagg ccctctgcac 1620

aaatgtgaca tctcaaactc tacagaagct ggacagaaac tgttcaatat gctgaggctt 1680

ggaaaatcag aaccctggac cctagcattg gaaaatgttg taggagcaaa gaacatgaat 1740

gtaaggccac tgctcaacta ctttgagccc ttatttacct ggctgaaaga ccagaacaag 1800

aattcttttg tgggatggag taccgactgg agtccatatg cagaccaaag catcaaagtg 1860

aggataagcc taaaatcagc tcttggagat agagcatatg aatggaacga caatgaaatg 1920

tacctgttcc gatcatctgt tgcatatgct atgaggcagt actttttaaa agtaaaaaat 1980

cagatgattc tttttgggga ggaggatgtg cgagtggcta atttgaaacc aagaatctcc 2040

tttaatttct ttgtcactgc acctaaaaat gtgtctgata tcattcctag aactgaagtt 2100

gaaaaggcca tcaggatgtc ccggagccgt atcaatgatg ctttccgtct gaatgacaac 2160

agcctagagt ttctggggat acagccaaca cttggacctc ctaaccagcc ccctgtttcc 2220

atatggctga ttgtttttgg agttgtgatg ggagtgatag tggttggcat tgtcatcctg 2280

atcttcactg ggatcagaga tcggaagaag aaaaataaag caagaagtgg agaaaatcct 2340

tatgcctcca tcgatattag caaaggagaa aataatccag gattccaaaa cactgatgat 2400

gttcagacct ccttttag 2418

Claims

1.ACE2（血管紧张素转化酶2，angiotensin converting enzyme 2）在非治疗目的调控受试者体内棕色脂肪组织活性中的应用。

2.ACE2在制备通过调控受试者体内棕色脂肪组织的活性来调节体温的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述受试者选自成人、新生儿。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述受试者为新生儿。

5.ACE2在制备通过提高受试者体内棕色脂肪组织的活性来预防和/或治疗肥胖的药物中的应用。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控受试者体内棕色脂肪组织活性为通过抑制ACE2的活性以降低受试者体内棕色脂肪组织的活性，或通过增强ACE2的活性以提高受试者体内棕色脂肪组织的活性。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述调控受试者体内棕色脂肪组织的活性来调节体温为通过抑制ACE2的活性以降低受试者体内棕色脂肪组织的活性从而降低受试者的体温，或通过增强ACE2的活性以提高棕色脂肪组织的活性从而提高受试者的体温。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在低温环境下提高受试者体温。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，通过增强ACE2的活性以提高棕色脂肪组织的活性。

10.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述抑制ACE2的活性包括对ACE2基因的突变、敲除、敲低、沉默或失活。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，采用siRNA或基因编辑的方式抑制ACE2的活性。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述基因编辑选自同源重组、锌指核酸酶技术（zinc finger nuclease，ZFN）、转录激活子样效应因子核酸酶技术(transcriptionactivator-like effector nuclease, TALEN)和成簇规律间隔的短回文重复序列技术(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)。

13.根据权利要求6-9任一项所述的应用，其特征在于，所述增强ACE2的活性通过以下任一方式或其组合来实现：

a、向受试者体内施用ACE2或ACE2的药学上可接受的盐，所述药学上可接受的盐包括盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、钾盐、钠盐、钙盐、镁盐或三乙胺盐；所述施用包括皮下施用、静脉内施用或肌内施用；

b、向受试者体内导入ACE2基因、包含ACE2基因的载体、或者包含上述载体的宿主细胞；

c、增加受试者固有的ACE2的活性，而不导入额外的ACE2或其编码基因。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述载体选自真核表达载体。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述真核表达载体选自哺乳动物表达载体。

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物表达载体为pcDNA3.1/myc-HisB。

17.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，通过诱导受试者固有的ACE2基因进行过表达以增加受试者固有的ACE2的活性。

18.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述ACE2选自人源ACE2或鼠源ACE2。

19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述鼠源ACE2选自小鼠ACE2或大鼠ACE2。

20.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，人源ACE2的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

21.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述ACE2、ACE2的药学上可接受的盐或者ACE2基因还可以与其他调控棕色脂肪组织活性的药物联用。

22.根据权利要求21所述的应用，其特征在于，其他调控棕色脂肪组织活性的药物为多肽CKGGRAKDC-NH2。