JP2005502332A - Ｇｍｇ−２ポリヌクレオチド及びポリペプチド並びにそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は肥満研究の分野に関する。肥満は重大な及び広くはびこった公共の健康問題である。化合物、球状ドメイン及びＧＭＧ−２コラーゲン様領域の全て又は部分を含むＧＭＧ−２ポリペプチド断片のホモ三量体はボディマスを減少させるため、体重減少を維持するため、及び肥満関連疾患及び障害を治療するための利用を有することが同定されている。これらの肥満関連疾患及び障害は高脂血症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、及び高血圧を含む。
Description
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は代謝研究の分野、特に肥満及び肥満関連疾患及び障害の治療に有効な化合物の発見に関する。本発明に係る方法により治療されることが構想される肥満関連疾患又は障害は、非限定的に、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、及び高血圧を含む。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
以下の議論は本発明の理解を促進することを意図されるが、本発明の前分野であるとは意図されず、許可されない。
肥満は深刻な、広くはびこる、及び増大している公衆の健康問題である。米国においては、人口の２０％は肥満である；欧州においては、それよりわずかに低い割合が肥満である［Ｆｒｉｅｄｍａｎ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ４０４：６３２−６３４］。肥満は呼吸器合併症及び変形性関節症に加えて、高血圧、心血管疾患、糖尿病、及び癌の増大した危険性に関連する［Ｋｏｐｅｌｍａｎ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ４０４：６３５−６４３］。ささやかな体重減少でさえもこれらの関連する状態を改善する。
【０００３】
体重増加又は減少の維持は、通常体重とは異なる体重の維持に対抗するエネルギー消費における代償的な変化に関連する［Ｌｅｉｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３２：６２１−８］。これらの変化は、部分的には、長期肥満治療の効果のなさの原因でありうる［Ｗａｄｄｅｎ（１９９３）Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ２２９：６８８−９３］。さらに、何人かの患者における体重増加後の減少したインスリン感受性並びにささやかな量の体重減少の炭水化物代謝及びインスリン感受性に対する有益な効果はよく証明されている［Ｏｌｅｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９７４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ５３：６４−７６］。
【０００４】
環境、食事、年齢及び運動を含む生活因子が肥満において役割を果たすことが証明されている一方で、双子研究、家族集団の分析、及び養子研究は全て、肥満は主に遺伝的因子の結果であることを示す［Ｂａｒｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０４：６４４−６５１］。これらの研究と一致して、増大する数の肥満関連遺伝子が同定されているという事実がある。いくつかのより広範囲に研究されている遺伝子はレプチン（ｏｂ）及びその受容体（ｄｂ）、プロ−オピオメラノコルチン（Ｐｏｍｃ）、メラノコルチン−４−受容体（Ｍｃ４ｒ）、アグーチタンパク質（Ａ y ）、カルボキシペプチダーゼＥ（ｆａｔ）、５−ヒドロキシトリプタミン受容体２Ｃ（Ｈｔｒ２ｃ）、無知の塩基性へリックス−ループ−へリックス２（ＮｈＩｈ２）、プロホルモン変換酵素Ｉ（ＰＣＳＫＩ）、及びチュービータンパク質（ｔｕｂｂｙ）をコードするものを含む［ｒｅｖ’ｄ ｉｎ Ｂａｒｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０４：６４４−６５１］。
【発明の開示】
【０００５】
発明の要約
本発明は、ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片といわれる、球状ドメインを含む全長ＧＭＧ−２ポリペプチドの断片がヒト及び他の哺乳類において体重減少、体重増加の予防、及び血中グルコース値の制御についての利用を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで予想されない効果を有するホモ三量体を形成するという発見に基づく。本発明はさらに、Ｎ−末端に配置された独特の領域内のシステイン残基でのヂスルフィド結合をとおして形成されるｇＧＭＧ−２ホモ三量体の複合体は、非複合体化ｇＧＭＧ−２ホモ三量体が有するよりも本明細書中で開示される活性についてより低い特異的活性を有するという発見に基づく。本発明はさらにコラーゲン様領域の全部又は一部を含むｇＧＭＧ−２−ポリペプチド断片は本明細書中に開示される活性を有するより安定なｇＧＭＧ−２ホモ三量体を形成するという発見に基づく。
【０００６】
哺乳類におけるホモ三量体ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片投与のこれらの予想されない効果はまた、筋肉細胞における増大した脂肪酸酸化、及び高脂肪／高スクロース食を消費する哺乳類における体重減少に加えて、エピネフリンの投与、「内部脂質」のｉ．ｖ．注入又は高脂肪試験食の投与により引き起こされた上昇した遊離脂肪酸値の減少を含む。ｇＧＭＧ−２ホモ三量体の複合体の投与は典型的に特異的な生物学的活性及び投与される量に因り、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで全く又は非常にわずかにしか効果がないので、これらの効果は予想されないものであり、驚くべきものである。効果がｇＧＭＧ−２ホモ三量体の複合体の投与に続いて観察される程度までの、効果に必要とされる複合体化したｇＧＭＧ−２ホモ三量体の値のために、その投与はここでほとんどの場合においてヒトへの可能性のある治療としては実行不可能である。対照的に、本発明に係る非複合体化ｇＧＭＧ−２ホモ三量体は根本的により効果的であり、そしてしたがってヒトにおける治療について実行可能である値で提供されうる。
【０００７】
したがって、本発明は、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を含む医薬の及び生理学的に許容される組成物並びに体重を減少させるため又は肥満関連疾患及び障害を治療するための前記ｇＧＭＧ−２の医薬の及び生理学的に許容される組成物の投与方法に加えて、ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、前記ｇＧＭＧ−２ポリヌクレオチドを含むベクター、及び前記ｇＧＭＧ−２ポリヌクレオチドについて組換えた細胞について示し、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びさらに、ここで、前記システイン残基はシステイン以外のアミノ酸で置換されているため又は前記断片は前記システイン残基まで伸びていないため、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はＮ−末端に配置された独特の領域内にシステイン残基を含まない。肥満関連活性のアゴニスト及びアンタゴニストを同定するための分析も本発明の部分である。
【０００８】
ホモ三量体ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性のアンタゴニストは悪液質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少、食欲不振、及び過食症を含む、本発明に係る他の代謝関連疾患又は障害の治療においても効果的であるはずである。好ましい態様においては、前記個体は哺乳類、好ましくはヒトである。
【０００９】
第一の局面において、本発明は精製された、単離された又は組換えられたｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を特徴付け、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は予想されない活性を有するホモ三量体を形成し、ここで、予想されない前記活性は脂肪分割、脂肪代謝、及びインスリン様活性から成る群から選ばれ、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチドはコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はＮ−末端に配置された独特の領域内でシステインについて、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチヂン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンから成る群から選ばれるシステイン以外のアミノ酸の置換を含み、好ましくは、ここで、前記置換されたアミノ酸はセリンである。好ましい態様においては、前記ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２の少なくとも６〜２８８以下の連続的なアミノ酸を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、６６、６９又は７０位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される；又は配列ＩＤ番号：４の少なくとも６〜２７８以下の連続的なアミノ酸を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ポリペプチドはコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、５６、５９又は６０位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される；又は配列ＩＤ番号：６の少なくとも６〜２５９以下の連続的なアミノ酸を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ポリペプチドはコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、３７、４０又は４１位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される。
【００１０】
他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化１】
から選ばれ、ここで、６６、６９又は７０位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸
【化２】
から選ばれ、ここで、５６、５９又は６０位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸
【化３】
から選ばれ、ここで、３７、４０又は４１位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される。さらに他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２の
【化４】
；又は配列ＩＤ番号：４の
【化５】
；又は配列ＩＤ番号：６の
【化６】
についてのアミノ酸から選ばれる。最も好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はヒトのものである。他のさらに好ましい態様においては、前記ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２、４又は６の対応する連続的なアミノ酸と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。上記に示されるように、活性を有するホモ三量体を形成するいかなるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片も除外されうる。
【００１１】
他の非常に好ましい態様においては、本発明はＧＭＧ−２ポリペプチド断片を特徴付け、ここで、前記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は脂質分割、脂質代謝、及びインスリン様活性から成る群から選ばれる予想されない活性を有するホモ三量体を形成し、ここで、前記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は精製された、単離された又は組換えられたｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はＮ−末端に配置された独特の領域内でシステインについてアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチヂン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンから成る群から選ばれるシステイン以外のアミノ酸の置換を含み、好ましくはここで、前記置換されたアミノ酸はセリンである。好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化７】
から選ばれ、ここで、６６、６９又は７０位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸
【化８】
から選ばれ、ここで、５６、５９又は６０位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸
【化９】
から選ばれ、ここで、３７、４０又は４１位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される。最も好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はヒトのものである。あるいは、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２の対応するアミノ酸５７〜２８８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸４７〜２７８若しくは配列ＩＤ番号：６の２８〜２５９と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む、主にそれから成る又はそれから成る。上記に示されるように、活性を有するホモ三量体を形成するいかなるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片も除外されうる。
【００１２】
他の非常に好ましい態様においては、本発明は、精製された、単離された又は組換えられたｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を特徴付け、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は予想されない活性を有するホモ三量体を形成し、ここで、予想されない前記活性は体重増加の予防、体重減少、及び体重減少の維持から成る群から選ばれ、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はＮ−末端に配置された独特の領域内でシステインについてアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチヂン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンから成る群から選ばれるシステイン以外のアミノ酸の置換を含み、好ましくはここで、前記置換されたアミノ酸はセリンである。好ましい態様においては、前記ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２の少なくとも６〜２８８以下の連続的なアミノ酸を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、６６、６９又は７０位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される又は配列ＩＤ番号：４の少なくとも６〜２７８以下の連続的なアミノ酸を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、５６、５９又は６０位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される又は配列ＩＤ番号：６の少なくとも６〜２５９以下の連続的なアミノ酸を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、３７、４０又は４１位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される。
【００１３】
他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化１０】
から選ばれ、ここで、６６、６９又は７０位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸
【化１１】
から選ばれ、ここで、５６、５９又は６０位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸
【化１２】
から選ばれ、ここで、３７、４０又は４１位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される。最も好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はヒトのものである。他のさらに好ましい態様においては、前記ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２、４又は６の対応する連続的なアミノ酸と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。上記に示されるように、活性を有するホモ三量体を形成するいかなるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片も除外されうる。
【００１４】
他の非常に好ましい態様においては、本発明はＧＭＧ−２ポリペプチド断片を特徴付け、ここで、前記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は体重増加の予防、体重減少、及び体重減少の維持から成る群から選ばれる予想されない活性を有するホモ三量体を形成し、及びここで、前記ポリペプチド断片は精製された、単離された又は組換えられたｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はＮ−末端に配置された独特の領域内でシステインについて、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチヂン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンから成る群から選ばれるシステイン以外のアミノ酸の置換を含み、好ましくは、ここで、前記置換されたアミノ酸はセリンである。好ましくは、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸５７〜２８８の少なくとも６の連続的なアミノ酸を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、６６、６９又は７０位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸４７〜２７８の少なくとも６の連続的なアミノ酸を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、ここで、５６、５９又は６０位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される又は配列ＩＤ番号：６の２８〜２５９アミノ酸の少なくとも６の連続的なアミノ酸を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、ここで、３７、４０又は４１位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される。
【００１５】
他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化１３】
から選ばれ、ここで、６６、６９又は７０位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸
【化１４】
から選ばれ、ここで、５６、５９又は６０位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸
【化１５】
から選ばれ、ここで、３７、４０又は４１位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される。最も好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はヒトのものである。あるいは、前記ｇＧＭＧ−２ド断片は配列ＩＤ番号：２の対応するアミノ酸５７〜２８８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸４７〜２７８若しくは配列ＩＤ番号：６の２８〜２５９と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む、主にそれから成る又はそれから成る。上記に示されるように、活性を有するホモ三量体を形成するいかなるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片も除外されうる。
【００１６】
さらに他の非常に好ましい態様において、本発明は精製された、単離された又は組換えられたｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を特徴付け、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は予想されない活性を有するホモ三量体を形成し、ここで、予想されない前記活性は脂肪分割、脂肪代謝、及びインスリン様活性から成る群から選ばれ、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は部分を含み、及びここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はＮ−末端に配置された独特の領域内のシステイン残基まで伸びない。好ましい態様においては、前記ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２の少なくとも６〜２８８以下の連続的なアミノ酸又は配列ＩＤ番号：４の少なくとも６〜２７８以下の連続的なアミノ酸、又は配列ＩＤ番号：６の少なくとも６〜２５９以下の連続的なアミノ酸を含む、主にそれから成る又はそれから成る。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸５７〜２８８、５８〜２８８、５９〜２８８、６０〜２８８、６１〜２８８、１４３〜２８８、１４４〜２８８、１５２〜２８８、１５３〜２８８、１６１〜２８８又は１６２〜２８８から選ばれる。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸４７〜２７８、４８〜２７８、４９〜２７８、５０〜２７８、５１〜２７８、１３３〜２７８、１３４〜２７８、１４２〜２７８、１４３〜２７８、１５１〜２７８又は１５２〜２７８から選ばれる。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸２８〜２５９、２９〜２５９、３０〜２５９、３１〜２５９、３２〜２５９、１１４〜２５９、１１４〜２５９、１１５〜２５９、１２３〜２５９、１２４〜２５９、１３２〜２５９又は１３３〜２５９から選ばれる。最も好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はヒトのものである。他のさらに好ましい態様においては、前記ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２、４又は６の対応する連続的なアミノ酸と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。上記に示されるように、活性を有するホモ三量体を形成するいかなるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片も除外されうる。
【００１７】
他の非常に好ましい態様において、本発明はＧＭＧ−２ポリペプチド断片を特徴付け、ここで、前記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は脂肪分割、脂肪代謝、及びインスリン様活性から成る群から選ばれる予想されない活性を有するホモ三量体を形成し、ここで、前記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は精製された、単離された又は組換えられたｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はＮ−末端に配置された独特の領域内のシステイン残基まで伸びない。好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸５７〜２８８、５８〜２８８、５９〜２８８、６０〜２８８、６１〜２８８、１４３〜２８８、１４４〜２８８、１５２〜２８８、１５３〜２８８、１６１〜２８８又は１６２〜２８８から選ばれる。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸４７〜２７８、４８〜２７８、４９〜２７８、５０〜２７８、５１〜２７８、１３３〜２７８、１３４〜２７８、１４２〜２７８、１４３〜２７８、１５１〜２７８又は１５２〜２７８から選ばれる。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸２８〜２５９、２９〜２５９、３０〜２５９、３１〜２５９、３２〜２５９、１１４〜２５９、１１４〜２５９、１１５〜２５９、１２３〜２５９、１２４〜２５９、１３２〜２５９又は１３３〜２５９から選ばれる。最も好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はヒトのものである。あるいは、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２の対応するアミノ酸５７〜２８８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸４７〜２７８と少なくとも７５％同一の又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸２８〜２５９と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む、主にそれから成る又はそれから成る。上記に示されるように、活性を有するホモ三量体を形成するいかなるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片も除外されうる。
【００１８】
他の非常に好ましい態様において、本発明は精製された、単離された又は組換えられたｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を特徴付け、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は予想されない活性を有するホモ三量体を形成し、ここで、予想されない前記活性は体重増加の予防、体重減少、及び体重減少の維持から成る群から選ばれ、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はＮ−末端に配置された独特の領域内のシステイン残基まで伸びない。好ましい態様においては、前記ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２の少なくとも６〜２８８以下の連続的なアミノ酸又は配列ＩＤ番号：４の少なくとも６〜２７８以下の連続的なアミノ酸又は配列ＩＤ番号：６の少なくとも６〜２５９以下の連続的なアミノ酸を含む、主にそれから成る又はそれから成る。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸５７〜２８８、５８〜２８８、５９〜２８８、６０〜２８８、６１〜２８８、１４３〜２８８、１４４〜２８８、１５２〜２８８、１５３〜２８８、１６１〜２８８又は１６２〜２８８から選ばれる。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸４７〜２７８、４８〜２７８、４９〜２７８、５０〜２７８、５１〜２７８、１３３〜２７８、１３４〜２７８、１４２〜２７８、１４３〜２７８、１５１〜２７８又は１５２〜２７８から選ばれる。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸２８〜２５９、２９〜２５９、３０〜２５９、３１〜２５９、３２〜２５９、１１４〜２５９、１１４〜２５９、１１５〜２５９、１２３〜２５９、１２４〜２５９、１３２〜２５９又は１３３〜２５９から選ばれる。最も好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はヒトのものである。他のさらに好ましい態様においては、前記ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２、４又は６の対応する連続的なアミノ酸と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。上記に示されるように、活性を有するホモ三量体を形成するいかなるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片も除外されうる。
【００１９】
他の非常に好ましい態様において、本発明はＧＭＧ−２ポリペプチド断片を特徴付け、ここで、前記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は体重増加の予防、体重減少、及び体重減少の維持から成る群から選ばれる予想されない活性を有するホモ三量体を形成し、及びここで、前記ポリペプチド断片は精製された、単離された又は組換えられたｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はＮ−末端に配置された独特の領域内のシステイン残基まで伸びない。好ましくは、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含む配列ＩＤ番号：２のアミノ酸５７〜２８８の少なくとも６の連続的なアミノ酸又はコラーゲン様領域の全部又は一部を含む配列ＩＤ番号：４のアミノ酸配列４７〜２７８の少なくとも６の連続的なアミノ酸又はコラーゲン様領域の全部又は一部を含む配列ＩＤ番号：６のアミノ酸２８〜２５９の少なくとも６の連続的なアミノ酸を含む、主にそれから成る又はそれから成る。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸５７〜２８８、５８〜２８８、５９〜２８８、６０〜２８８、６１〜２８８、１４３〜２８８、１４４〜２８８、１５２〜２８８、１５３〜２８８、１６１〜２８８又は１６２〜２８８から選ばれる。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸４７〜２７８、４８〜２７８、４９〜２７８、５０〜２７８、５１〜２７８、１３３〜２７８、１３４〜２７８、１４２〜２７８、１４３〜２７８、１５１〜２７８又は１５２〜２７８から選ばれる。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸２８〜２５９、２９〜２５９、３０〜２５９、３１〜２５９、３２〜２５９、１１４〜２５９、１１４〜２５９、１１５〜２５９、１２３〜２５９、１２４〜２５９、１３２〜２５９又は１３３〜２５９から選ばれる。最も好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はヒトのものである。あるいは、前記ｇＧＭＧ−２断片は配列ＩＤ番号：２の対応するアミノ酸５７〜２８８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸４７〜２７８と少なくとも７５％同一の又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸２８〜２５９と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む、主にそれから成る又はそれから成る。上記に示されるように、活性を有するホモ三量体を形成するいかなるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片も除外されうる。
【００２０】
他の非常に好ましい態様において、本発明は精製された、単離された又は組換えられたｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を特徴付け、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は、単量体ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片より顕著に大きな活性を有するホモ三量体を形成し、ここで、予想されない前記活性は平滑筋増殖の阻害、前炎症性サイトカインの発現の阻害、細胞接着分子の発現の阻害、及び組織因子の発現の阻害から成る群から選ばれ、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はＮ−末端に配置された独特の領域内のシステインについて、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチヂン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンから成る群から選ばれるシステイン以外のアミノ酸の置換を含み、好ましくはここで、前記置換されたアミノ酸はセリンである。
【００２１】
さらに好ましい態様においては、上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は（ｉ）遊離脂肪酸、（ｉｉ）グルコース、及び／又は（ｉｉｉ）トリグリセリドの循環（血液、血清又は血漿）値（濃度）を低くすることができるホモ三量体を形成する。さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は遊離脂肪酸値低下活性、グルコース値低下活性、及び／又はトリグリセリド値低下活性を示すホモ三量体を形成し、同じモル濃度での全長ＧＭＧ−２より顕著に大きな活性を有し、一過性の活性より大きなものを有し及び／又は維持された活性を有する。
【００２２】
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は、好ましくは以前に「肥満」であった及び現在は（本明細書中に定義される）「健康」である個体において、体重減少を維持するホモ三量体を形成するものである。
【００２３】
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は同じモル濃度の全長ＧＭＧ−２ポリペプチドと比較して、筋肉の脂質又は遊離脂肪酸酸化を顕著に刺激するホモ三量体を形成するものである。さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は無処理の細胞又は全長ＧＭＧ−２で処理した細胞と比較して、同じ断片の存在下で分化したＣ２Ｃ１２細胞を少なくとも１０％、２０％、３０％、３５％又は４０％多くオレイン酸酸化させるホモ三量体を形成するものである。
【００２４】
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は肝細胞系（好ましくはＢＰＲＣＬマウス肝細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２１７））における増大するレプチン取り込みで全長ＧＭＧ−２より少なくとも３０％より効果的であるホモ三量体を形成するものである。
【００２５】
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は特に高脂肪食後の、血漿遊離脂肪酸における食後増大を顕著に減少させるホモ三量体を形成するものである。
【００２６】
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は特に、高脂肪食後の、ケトン体産生を顕著に減少させる又は除去するホモ三量体を形成するものである。
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は骨格筋細胞においてグルコース取り込みを増大させるホモ三量体を形成するものである。
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は脂肪細胞においてグルコース取り込みを増大させるホモ三量体を形成するものである。
さらに好ましいＧＭＧ−２ポリペプチド断片は神経細胞においてグルコース取り込みを増大させるホモ三量体を形成するものである。
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は赤血球細胞においてグルコース取り込みを増大させるホモ三量体を形成するものである。
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は脳においてグルコース取り込みを増大させるホモ三量体を形成するものである。
【００２７】
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は食事、特に高炭水化物食後の血漿グルコースにおける食後増大を顕著に減少させるホモ三量体を形成するものである。
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は食事、特に高脂肪又は高炭水化物食後の血漿グルコースにおける食後増大を顕著に妨げるホモ三量体を形成するものである。
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はインスリン感受性を改善するホモ三量体を形成するものである。
【００２８】
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は損なわれたグルコース耐性からインスリン抵抗性への進行を阻害するホモ三量体を形成するものである。
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は筋肉マスを増大させるホモ三量体を形成するもの、好ましくは筋細胞数を増大させるもの、より好ましくは筋繊維数を増大させるものである。
【００２９】
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は体重肥大における増大を促進させるホモ三量体を形成するもの、好ましくは筋肉マスにおける増大を促進させる断片である。さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は、好ましくはｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の非存在下での平均成長速度より大きな成長速度で増大を促進させて、成長速度を促進させる。
【００３０】
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は新生哺乳類、好ましくは、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、ブタ、イヌ又はヒト新生児、より好ましくは０〜６月齢のヒト新生児、最も好ましくは０〜３月齢のヒト新生児における成長速度を促進するホモ三量体を形成するものである。さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は新生の体重不足の又は未熟の哺乳類、好ましくは、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、ブタ、イヌ又はヒトの体重不足の又は未熟の新生児、より好ましくは０〜６月齢のヒトの体重不足の又は未熟の新生児、最も好ましくは０〜３月齢のヒトの体重不足の又は未熟の新生児において成長速度を促進させるホモ三量体を形成するものである。
【００３１】
さらに好ましくはｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでホモ三量体を形成するものである。より好ましくはｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでホモ三量体を形成するものであり、ここで、少なくとも１０％，１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は前記ホモ三量体を含む。最も特に好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで脂質分割、脂質代謝、及びインスリン様活性から成る群から選ばれる活性を有するホモ三量体を形成するものである。また最も特に好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで体重増加の予防、体重減少、及び体重減少の維持から成る群から選ばれる活性を有するホモ三量体を形成するものである。上記に示すように、活性を有するホモ三量体を形成するいかなるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片も除外されうる。
【００３２】
さらに好ましい態様は本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を含む異種のポリペプチドを含む。より好ましいものは本発明に係る前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチドにＮ−末端で融合されたシグナルペプチドから成る前記異種のポリペプチドである。さらにより好ましい態様においては、前記シグナルペプチドは好ましくは配列ａｔｇｇｔａａｇａａｔｇｇｔｇｃｃｔｇｔｃｃｔｇｃｔｇｔｃｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｔｃｔｇｇｇｔｃｃｔｇｃｔｇｔｃｃｃｃのポリヌクレオチドによりコードされる、アミノ酸配列ＭＶＲＭＶＰＶＬＬＳＬＬＬＬＬＧＰＡＶＰのヒト亜鉛−アルファ２−糖タンパク質シグナルペプチドである。
【００３３】
第二の局面において、本発明は第一の局面において示した前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片又は全長ＧＭＧ−２ポリペプチドをコードする精製された、単離された又は組換えられたポリヌクレオチド又はその相補体を特徴付ける。さらなる態様においては、上記ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、一重鎖、及び二重鎖である。
【００３４】
第三の局面において、本発明は第二の局面において示した前記ポリヌクレオチドを含む、主にそれから成る又はそれから成る組換えベクターを特徴付ける。
【００３５】
第四の局面において、本発明は第三の局面において示した前記組換えベクターを含む、主にそれから成る又はそれから成る組換え細胞を特徴付ける。好ましい前記組換え細胞は原核又は真核組換え細胞である。好ましい前記原核組換え細胞はＥ． ｃｏｌｉ組換え細胞である。好ましい前記真核組換え細胞は哺乳類の組換え細胞である。特に好ましい哺乳類の組換え細胞はＣＯＳ組換え細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）組換え細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）組換え細胞、及び３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞組換え細胞から成る群から選ばれる。さらなる態様は本発明に係るポリヌクレオチドについて組換えられた宿主細胞を含む。好ましい前記宿主細胞は原核又は真核宿主細胞である。好ましい前記原核宿主細胞はＥ． ｃｏｌｉ宿主細胞である。好ましい前記真核宿主細胞は哺乳類の宿主細胞である。特に好ましい哺乳類の宿主細胞はＣＯＳ宿主細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）宿主細胞、及び３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞宿主細胞から成る群から選ばれる。
【００３６】
第五の局面において、本発明は第一の局面において示した前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片及び、あるいは、医薬の又は生理学的に許容される希釈剤を含む、主にそれから成る又はそれから成る医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。より好ましい前記医薬の又は生理学的に許容される組成物は第一の局面において示される前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片のホモ三量体及び、あるいは、医薬の又は生理学的に許容される希釈剤を含む、主にそれから成る又はそれから成る。前記医薬の又は生理学的に許容される組成物においては、好ましくは第一の局面の前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％がホモ三量体を含む。
【００３７】
第六の局面において、本発明はボディマスを減少させる必要のある個体に第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物を提供する又は投与することを含むボディマスを減少させる方法を特徴付ける。さらに好ましいものはその必要のある個体に第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物を提供する又は投与することを含む体脂肪マスを減少させる方法である。さらに好ましいものはその必要のある個体に第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物を提供する又は投与することを含むやせたボディマスを増大させる方法である。さらに好ましいものはその必要のある個体に第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物を提供する又は投与することを含む体重肥大又は身長の成長速度を増大させる方法である。
【００３８】
さらに好ましい態様においては、本発明は体重減少剤と共に彼らの体重を改善させるために肥満患者の補完の治療において使用されうる。体重減少剤の例はオーリスタットの如きリパーゼ阻害剤、及びシブトラミンの如きセロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）及びノルアドレナリン再取り込み阻害剤を含む。
【００３９】
さらに好ましい態様においては、本発明は減少したボディマスを維持する必要のある個体に第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物を提供する又は投与することを含む減少したボディマスを維持する方法を特徴付ける。さらに好ましいものは、その必要のある個体に、前記個体においてエネルギー取り込みを正常な値に戻し、及び前記個体において増大したエネルギー消費を維持する、第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物を提供する又は投与することを含む減少した体脂肪マスを維持する方法である。好ましくは、前記個体は（本明細書中で示される）彼らの肥満体重より１０〜２０％低い安定した体重を維持することができる。
【００４０】
他の好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明は体重減少を維持する方法として減少したエネルギー取り込み及び／又は増大したエネルギー消費と共に使用されうる。
【００４１】
またさらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物で処置されるべきボディマスを減少させる必要のある前記個体の同定はＧＭＧ−２シングルヌクレオチド多形性（ＳＮＰｓ）の遺伝子型計測又は前記個体からの臨床サンプルにおけるＧＭＧ−２ポリペプチド又はｍＲＮＡ値の計測を含む。好ましくは、前記臨床サンプルは血漿、尿、及び唾液から成る群から選ばれる。好ましくは、本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は、健康な、非肥満患者と比較して、全長ＧＭＧ−２又は天然にタンパク質分解的に切断されたＧＭＧ−２断片の血液、血清又は血漿値において少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減少を有する個体に投与される。
【００４２】
第七の局面において、本発明は上記処置の必要のある個体に第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物を提供する又は投与することを含む、肥満関連疾患又は障害の予防又は治療方法を特徴付ける。好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物で治療されるべき上記処置の必要のある前記個体の同定はＧＭＧ−２シングルヌクレオチド多形性（ＳＮＰｓ）遺伝子型計測又は前記個体からの臨床サンプルにおけるＧＭＧ−２ポリペプチド又はｍＲＮＡ値の計測を含む。好ましくは、前記臨床サンプルは血液、血清、血漿、尿、及び唾液から成る群から選ばれる。好ましくは、前記肥満関連疾患又は障害は肥満、損なわれたグルコース耐性、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、アテロームの疾患、心疾患、高血圧、卒中、シンドロームＸ、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ又はＩＩ型糖尿病）及びインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ又はＩ型糖尿病）から成る群から選ばれる。本発明に係る方法により処置されるべき糖尿病関連合併症は細小血管病変、眼の病変、網膜症、神経障害、及び腎臓病変を含む。心疾患は、非限定的に、心不全、冠状動脈不全、及び高血圧を含む。本発明に係る化合物により処置されるべき他の肥満関連障害は高脂血症及び尿酸過剰血症を含む。本発明に係るさらに他の代謝関連疾患又は障害は悪液質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少、食欲不振、及び過食症を含む。好ましい態様においては、前記個体は哺乳類、好ましくはヒトである。
【００４３】
関連した局面において、本発明は上記治療の必要のある個体に第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物を提供する又は投与することを含む炎症関連疾患又は障害の予防又は治療方法を特徴付ける。好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物で処置されるべき上記処置の必要のある前記個体の同定はＧＭＧ−２シングルヌクレオチド多形性（ＳＮＰｓ）の遺伝子型計測又は前記個体からの臨床サンプルにおけるＧＭＧ−２ポリペプチド又はｍＲＮＡ値の計測を含む。好ましくは、前記臨床サンプルは血液、血清、血漿、尿、及び唾液から成る群から選ばれる。好ましくは、前記炎症関連疾患又は障害は血管障害、疾患及び損傷、特に、アテローム性動脈硬化症の如き、過剰の炎症性応答により引き起こされるもの、狭心症、心筋梗塞、深層静脈の血栓症、末梢動脈閉塞、冠状心疾患（ＣＤＨ）、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、心不全、一過性の虚血性発作、血管形成後再狭窄、骨髄造血、及び播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）から成る群から選ばれる。好ましい態様においては、前記個体は哺乳類、好ましくはヒトである。
【００４４】
関連した局面において、本発明の態様は個体に第一の局面のポリペプチドを含む組成物を提供する又は投与する段階を含む、個体において所望の生物学的応答を引き起こす又は誘発する方法を含み、ここで、前記生物学的応答は：
（ａ）遊離脂肪酸の循環（血液、血清又は血漿）値（濃度）を低下させる；
（ｂ）グルコースの循環（血液、血清又は血漿）値（濃度）を低下させる；
（ｃ）トリグリセリドの循環（血液、血清又は血漿）値（濃度）を低下させる；
（ｄ）筋肉の脂質又は遊離脂肪酸酸化を刺激する；
（ｃ）肝臓又は肝細胞においてレプチン取り込みを増大させる；
（ｅ）特に高脂肪食後の血漿遊離脂肪酸における食後増大を減少させる；及び
（ｆ）特に高脂肪食後のケトン体産生を減少させる又は除去する；
（ｇ）特に筋肉、脂肪、肝臓又は脳でインスリンへの組織感受性を増大させる；
（ｈ）損なわれたグルコース耐性からインスリン抵抗性への進行を阻害する；
（ｉ）筋細胞タンパク質合成を増大させる；
（ｊ）脂肪細胞トリグリセリド内容量を減少させる；
（ｋ）食物又は代謝貯蓄からのエネルギー利用を増大させる；
（ｌ）成長速度、好ましくは大きさ又は身長における成長を増大させる；
（ｍ）筋肉成長を増大させる；及び
（ｎ）骨格成長を増大させる；
から成る群から選ばれ、及びさらにここで、前記生物学的応答は同じモル濃度の全長ＧＭＧ−２ポリペプチドにより引き起こされる又は誘導される生物学的応答より顕著に大きい又は少なくとも１０％、２０％、３０％、３５％又は４０％大きい；又はあるいはここで、前記生物学的応答は一過性の応答より大きい；又はあるいは前記生物学的応答は維持される。さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン治療と共に、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）を有する何人かのヒトにおいて血中グルコースを制御する方法として使用されうる。
【００４５】
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン治療と共に、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病）を有する何人かのヒトにおいて血中グルコースを制御する方法として使用されうる。
【００４６】
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン治療と共に、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）を有する何人かのヒトにおいて体重を制御する方法として使用されうる。
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン治療と共に、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病）を有する何人かのヒトにおいて体重を制御する方法として使用されうる。
【００４７】
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン治療を伴わずに、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）のみを有する何人かのヒトにおいて血中グルコースを制御する方法として使用されうる。
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン治療を伴わずに、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病）のみを有する何人かのヒトにおいて血中グルコースを制御する方法として使用されうる。
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン治療を伴わずに、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）のみを有する何人かのヒトにおいて体重を制御する方法として使用されうる。
【００４８】
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン治療を伴わずに、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病）のみを有する何人かのヒトにおいて体重を制御する方法として使用されうる。
【００４９】
さらに好ましい態様においては、本発明は経口インスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤と共に、ＮＩＤＤＭ患者の補充治療において彼らの体重又はグルコース制御を改善するために使用されうる。好ましくは、上記経口インスリン分泌促進剤は１，１−ヂメチル−２−（２−モルフォリノフェニル）グアニヂンフマル酸（ＢＴＳ６７５８２）又はトルブタミド、トラザミド、クロルプロパミド、グリベンクラミド、グリメピリド、グリピジド及びグリダジドから選ばれるスルフォニル尿素である。好ましくは、インスリン増感剤はメトフォルミン、シグリタゾン、トログリタゾン及びピオグリタゾンから選ばれる。
【００５０】
本発明はさらに経口インスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤なしに、ＮＩＤＤＭ患者のみの体重又はグルコース制御を改善する方法を提供する。
さらに好ましい態様においては、本発明は経口インスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤と共に、ＩＤＤＭ患者の補充の治療において彼らの体重又はグルコース制御を改善するために使用されうる。好ましくは、上記経口インスリン分泌促進剤は１，１−ヂメチル−２−（２−モルフォリノフェニル）グアニヂンフマル酸（ＢＴＳ６７５８２）又はトルブタミド、トラザミド、クロルプロパミド、グリベンクラミド、グリメピリド、グリピジド及びグリダジドから選ばれるスルフォニル尿素である。好ましくは、上記インスリン増感剤はメトフォルミン、シグリタゾン、トログリタゾン及びピオグリタゾンから選ばれる。
【００５１】
本発明はさらに経口インスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤なしに、ＩＤＤＭ患者のみの体重又はグルコース制御を改善する方法を提供する。
さらに好ましい態様においては、本発明は、例えば、同時に、別々に又は連続して使用される別々の投与単位の形態で、経口インスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤と共に、付随して又は同時に投与されうる（上記分泌促進剤の前若しくは後又は上記増感剤の前若しくは後）。したがって、本発明はさらにＮＩＤＤＭ又はＩＤＤＭ患者における体重又はグルコース制御の改善のための同時の、別々の又は連続した使用のための混合された調製物として医薬の又は生理学的許容される組成物及び経口インスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤の組成物を提供する。
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はさらにインスリン増感剤としての使用のための方法を提供する。
【００５２】
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン治療と共に、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）を有する何人かのヒトにおいてインスリン感受性を改善する方法として使用されうる。
【００５３】
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン治療と共に、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病）を有する何人かのヒトにおいてインスリン感受性を改善する方法として使用されうる。
【００５４】
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン治療を伴わずに、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）を有する何人かのヒトにおいてインスリン感受性を改善する方法として使用されうる。
【００５５】
第八の局面において、本発明は第一の局面において示されるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の作出方法を特徴付け、ここで、前記方法はタンパク質分解的な切断、組換え法及び人工合成から成る群から選ばれる。
【００５６】
第九の局面において、本発明は組換えｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片又は全長ＧＭＧ−２ポリペプチドの作出方法、その乳が前記組換えｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片又は全長タンパク質を含むトランスジェニック、非ヒト哺乳類を提供すること、及び前記非ヒト哺乳類の乳から前記組換えｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片又は前記全長ＧＭＧ−２ポリペプチドを精製することを含む方法を提供する。１の態様においては、前記非ヒト哺乳類はウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ又はマウスである。他の態様においては、上記方法は前記乳からシグナルペプチドを有しない組換え成熟ＧＭＧ−２ポリペプチドを精製することを含み、さらにｉｎ ｖｉｔｒｏで前記タンパク質を切断して所望のｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を得ることを含む。
【００５７】
第十の局面において、本発明は肥満関連疾患及び障害の治療及び／又はボディマスの減少のための第一の局面において示されるポリペプチドの使用を特徴付ける。好ましくは、前記肥満関連疾患及び障害は肥満、損なわれたグルコース耐性、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、アテロームの疾患、心疾患、高血圧、卒中、シンドロームＸ、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ又はＩＩ型糖尿病）及びインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ又はＩ型糖尿病）から成る群から選ばれる。本発明に係る方法により処置されるべき糖尿病関連合併症は細小血管病変、眼の病変、網膜症、神経障害、及び腎臓病変を含む。心疾患は、非限定的に、心不全、冠状動脈不全、及び高血圧を含む。本発明に係る化合物により処置されるべき他の肥満関連障害は高脂血症及び尿酸過剰血症を含む。好ましい態様においては、前記個体は哺乳類、好ましくはヒトである。
【００５８】
本発明はさらに体重増加の予防のための、体重減少のための、及び／又は体重減少の維持のための第一の局面のポリペプチドの使用を特徴付ける。好ましい態様においては、前記個体は哺乳類、好ましくはヒトである。
【００５９】
第十一の局面において、本発明は肥満関連疾患及び障害の治療のための及び／又はボディマスの減少のための医薬の調製についての第一の局面において示されるポリペプチドの使用を特徴付ける。好ましくは、前記肥満関連疾患又は障害は肥満、損なわれたグルコース耐性、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、アテロームの疾患、心疾患、高血圧、卒中、シンドロームＸ、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ又はＩＩ型糖尿病）及びインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ又はＩ型糖尿病）から成る群から選ばれる。本発明に係る方法により処置されるべき糖尿病関連合併症は細小血管病変、眼の病変、網膜症、神経障害、及び腎臓病変を含む。心疾患は、非限定的に、心不全、冠状動脈不全、及び高血圧を含む。本発明に係る化合物により処置されるべき他の肥満関連障害は高脂血症及び尿酸過剰血症を含む。本発明に係るさらに他の代謝関連疾患又は障害は悪液質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少、食欲不振、及び過食症を含む。好ましい態様においては、前記個体は哺乳類、好ましくはヒトである。
【００６０】
本発明はさらに体重増加の予防のための、体重減少のための、及び／又は体重減少の維持のための医薬の調製についての第一の局面のポリペプチドの使用を特徴付ける。好ましい態様においては、前記個体は哺乳類、好ましくはヒトである。
【００６１】
第十二の局面において、本発明はヒト又は動物の体の治療方法における使用のための、本発明の第一の局面のポリペプチド又は本発明の第五の局面の組成物を提供する。
【００６２】
第十三の局面において、本発明は個体に第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物又は第一の局面において示されるポリペプチドを提供することを含む体重を減少させる方法を特徴付ける。体重減少が美容目的で実施される場合、個体は少なくとも２０〜２５以下のＢＭＩを有する。肥満治療のための態様においては、上記個体は少なくとも２０のＢＭＩを有しうる。肥満治療のための１の態様は少なくとも２５のＢＭＩ値を有する個体の治療を提供する。肥満治療のための他の態様は少なくとも３０のＢＭＩ値を有する個体の治療を提供する。さらに他の態様は少なくとも４０のＢＭＩ値を有する個体の治療を提供する。あるいは、個体の体重増加のために上記ＢＭＩ値は少なくとも１５〜２０以下であるべきである。
【００６３】
関連した局面において、本発明は個体に第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物又は第一の局面において示されるポリペプチドを提供することを含む体重減少を維持する方法を特徴付ける。体重減少の維持が美容目的で実施される場合、上記個体は少なくとも２０〜２５以下のＢＭＩを有する。体重減少の維持の方法による肥満治療のための態様においては、上記個体は少なくとも２０のＢＭＩを有しうる。体重減少の維持の方法による肥満治療のための１の態様は少なくとも２５のＢＭＩ値を有する個体の治療を提供する。体重減少の維持の方法による肥満治療のための他の態様は少なくとも３０のＢＭＩ値を有する個体の治療を提供する。
【００６４】
第十四の局面において、本発明はボディマスを減少させるための及び／又は肥満関連疾患又は障害の治療又は予防のための第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。好ましくは、前記肥満関連疾患又は障害は肥満、損なわれたグルコース耐性、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、アテロームの疾患、心疾患、高血圧、卒中、シンドロームＸ、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ又はＩＩ型糖尿病）及びインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ又はＩ型糖尿病）から成る群から選ばれる。本発明に係る方法により処置されるべき糖尿病関連合併症は細小血管病変、眼の病変、網膜症、神経障害、及び腎臓病変を含む。心疾患は、非限定的に、心不全、冠状動脈不全、及び高血圧を含む。本発明に係る化合物により処置されるべき他の肥満関連障害は高脂血症及び尿酸過剰血症を含む。本発明に係るさらに他の肥満関連疾患又は障害は悪液質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少、食欲不振、及び過食症を含む。好ましい態様においては、前記個体は哺乳類、好ましくはヒトである。好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物で処置されるべき前記個体の同定はＧＭＧ−２シングルヌクレオチド多形性（ＳＮＰｓ）の遺伝子型計測又は前記個体からの臨床サンプルにおけるＧＭＧ−２ポリペプチド又はｍＲＮＡ値の計測を含む。好ましくは、前記臨床サンプルは血液、血清、血漿、尿、及び唾液から成る群から選ばれる。
【００６５】
関連した局面において、本発明は炎症性応答、好ましくは血管傷害又は損傷に関連した炎症性応答を減少させるための、及び／又は炎症関連疾患又は障害の治療又は予防のための第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。好ましくは、前記炎症関連疾患又は障害は血管障害、疾患及び損傷、特にアテローム性動脈硬化症の如き、過剰の炎症性応答により引き起こされるもの、狭心症、心筋梗塞、深層静脈の血栓症、末梢動脈閉塞、冠状心疾患（ＣＤＨ）、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、心不全、一過性の虚血性発作、血管形成後再狭窄、骨髄造血、及び播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）から成る群から選ばれる。好ましい態様においては、前記個体は哺乳類、好ましくはヒトである。好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物で処置されるべき前記個体の同定はＧＭＧ−２シングルヌクレオチド多形性（ＳＮＰｓ）の遺伝子型計測又は前記個体からの臨床サンプルにおけるＧＭＧ−２ポリペプチド又はｍＲＮＡ値の計測を含む。好ましくは、前記臨床サンプルは血液、血清、血漿、尿、及び唾液から成る群から選ばれる。
【００６６】
第十五の局面において、本発明は美容目的のための体重減少のための第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。
【００６７】
関連する局面において、本発明は美容目的のために体重減少を維持するための第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。
第十六の局面において、本発明は個体に第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物又は第一の局面において示されるポリペプチドを提供することを含むインスリン抵抗性の治療方法を特徴付ける。
【００６８】
第十七の局面において、本発明は肥満である又は絶食時高インスリン血を有する又は両方を有する、正常なグルコース耐性（ＮＧＴ）を有する個体の治療方法における第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。
さらに好ましい態様においては、本発明は妊娠糖尿病を有する個体の治療方法における第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。妊娠糖尿病は妊娠中、通常妊娠の第二又は第三トリメスター中の個体における糖尿病の発展をいう。
【００６９】
さらに好ましい態様においては、本発明は損なわれた絶食時グルコース（ＩＦＧ）を有する個体の治療方法における第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。損なわれた絶食時グルコース（ＩＦＧ）は、個体における絶食時血漿グルコース値が上昇しているが、明白な糖尿病の診断ではない、すなわち、血漿グルコース値が１２６ｍｇ／ｄｌ未満〜１１０ｍｇ／ｄｌ以上である状態である。
【００７０】
さらに好ましい態様においては、本発明は個体における損なわれたグルコース耐性（ＩＧＴ）の治療方法における第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。他のさらに好ましい態様においては、本発明は個体におけるＩＧＴの予防方法における第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。ＩＧＴを減少させる又は予防するための、すなわち、インスリン抵抗性を正常化させるための治療及び方法を提供することにより、ＮＩＤＤＭへの進行は遅延され又は妨げられうる。さらに、インスリン抵抗性を減少させる又は予防する治療及び方法を提供することにより、本発明はインスリン抵抗性症候群の表れを減少させる及び／又は予防する方法を提供する。
【００７１】
さらに好ましい態様においては、本発明は多嚢胞卵巣症候群（ＰＣＯＳ）を有する患者の治療方法において第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。ＰＣＯＳは閉経前の女性の最もよくある障害のうちである。インスリン増感剤はＰＣＯＳにおいて有効であることが示されている。したがって、本発明はインスリン抵抗性を減少させる、血中グルコースを正常化する、したがってＰＣＯＳを治療する及び／又は予防する方法を提供する。
【００７２】
さらに好ましい態様においては、本発明はインスリン抵抗性を有する患者の治療方法における第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。またさらに好ましい態様においては、インスリン抵抗性を有する患者はインスリン抵抗性を減少させる又は治療するために本発明に係る方法にしたがって処置される。インスリン抵抗性はまたしばしば感染及び癌にも関連しているので、本発明に係る方法にしたがうインスリン抵抗性の予防又は減少は感染及び癌を予防し又は減少させうる。
さらに好ましい態様においては、本発明に係る方法は患者、例えば、インスリン抵抗性を発展する増大した危険性を有すると知られる者においてインスリン抵抗性の発展を予防するために使用される。
【００７３】
第十八の局面において、本発明はホモ三量体ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性の１以上のアンタゴニストについての化合物のスクリーニング方法におけるホモ三量体ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の使用方法を特徴付け、ここで、前記活性は、非限定的に、体重減少、体重減少の維持、脂質分割、脂質代謝、及びインスリン様活性から選ばれる。
好ましい態様においては、前記化合物は、非限定的に、低分子量有機又は無機化合物、タンパク質、ペプチド、炭水化物又は脂質から選ばれる。
【００７４】
第十九の局面において、本発明は哺乳類、好ましくは新生ヒトに新生哺乳類、特に新生ヒトにより消費される食物中に存在するエネルギー及び他の栄養素、及び特に幼児処方又は母乳中のエネルギー及び他の栄養素の同化、利用又は貯蔵を促進する、改善する、高める又は増大させる栄養補助物を提供する。本発明のさらに好ましい態様は哺乳類、好ましくは新生ヒトに成長速度を促進させる、改善する、高める又は増大させる栄養補助物を提供することである。第一の局面のポリペプチドでの好ましい補給方法は、非限定的に：
（ａ）合成幼児処方への又は母乳への第一の局面のポリペプチドの直接の添加；
（ｂ）摂食前の、好ましくは摂食１〜１５分前の、より好ましくは摂食１〜５分前の、第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物の投与；及び
（ｃ）摂食後の、好ましくは摂食１〜１５分後の、より好ましくは摂食１〜５分後の、第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物の投与；
を含み、ここで、第一の局面に係るポリペプチド又は第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物の投与経路は経口の、頬の、鼻の及び筋内の経路、好ましくは経口経路から選ばれる。
【００７５】
さらに好ましい態様は第一の局面のポリペプチドを新生哺乳類、特に新生ヒトにより消費される食物中に存在するエネルギー及び他の栄養素、及び特に、幼児処方又は母乳中のエネルギー及び他の栄養素の同化、利用又は貯蔵を促進させる、改善する、高める又は増大させる方法において使用することに方向付けられる。さらに好まし態様は第一の局面のポリペプチドを新生哺乳類、好ましくはヒト新生児の成長速度を促進させる、改善する、高める又は増大させる方法において使用することに方向付けられる。さらに好ましいものは新生哺乳類、特に新生ヒトにより消費される食物中に存在するエネルギー及び他の栄養素、及び特に、幼児処方又は母乳中のエネルギー及び他の栄養素の同化、利用又は貯蔵を促進させる、改善する、高める又は増大させる方法において使用されうる、第一の局面のポリペプチドを含む組成物である。さらに好ましいものは新生哺乳類、好ましくはヒト新生児の成長速度を促進させる、改善する、高める又は増大させる方法において使用されうる、第一の局面のポリペプチドを含む組成物である。本発明のまたさらに好ましい態様は合成幼児乳処方及び第一の局面のポリペプチドを含む組成物に方向付けられる。
【００７６】
本発明の他の態様は合成幼児乳処方又は母乳の栄養価を高める又は改善するのに有用な第一の局面のポリペプチドを含む組成物を提供することである。さらに好ましいものは食事の栄養価を高める又は改善するために新生哺乳類の食事中へ混合するのに有用な組成物である。本発明のさらに他の態様は、新生哺乳類、特に未熟の、低体重の又は非常に低い誕生体重の新生児、好ましくはヒト新生児の食事及び摂食を改善するための技術及び日課を提供することである。
【００７７】
本発明に係る方法の好ましい局面において、個体に投与されるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片又はポリヌクレオチドの量はＧＭＧ−２ポリペプチドの循環（血液、血清又は血漿）値（濃度）をそれらの正常な値（非肥満個体における値）にするのに十分な量である。「正常値」は全ての循環するＧＭＧ−２ポリペプチド（全長ＧＭＧ−２及びその断片）の総濃度又は全ての循環するタンパク質分解的に切断されたＧＭＧ−２ポリペプチドのみの濃度として特定されうる。
【００７８】
本明細書中に開示される本発明に係る組成物の好ましい態様においては、本発明に係る組成物は、上記組成物がインスリン、インスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤と共にでなく単独で投与される前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片について予想される効果よりも大きな生物学的効果を産生するように、さらに第一の局面のｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片、インスリン、インスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤の組み合わせを含みうる。
【００７９】
さらなる態様においては、前記生物学的機能は、非限定的に、遊離脂肪酸値低下活性、グルコース値低下活性、トリグリセリド値低下活性、脂肪細胞の脂肪分解を刺激すること、筋肉の脂質又は遊離脂肪酸酸化を刺激すること、肝細胞系におけるレプチン取り込みを増大させること、高脂肪食のための血漿遊離脂肪酸又はグルコースにおける食後増大を顕著に減少させること、高脂肪食の結果としてのケトン体産生を顕著に減少させる又は除去すること、骨格筋細胞、脂肪細胞、赤血球又は脳におけるグルコース取り込みを増大させること、インスリン感受性を増大させること、損なわれたグルコース耐性からインスリン抵抗性への進行を阻害すること、ボディマスを減少せること、脂肪マスを減少させること、やせた筋肉マスを増大させること、代謝関連疾患又は障害の予防又は治療、非インスリン依存性真性糖尿病又は非インスリン依存性新生糖尿病を有する何人かのヒトにおいて血中グルコースを制御すること、インスリン抵抗性の治療又はインスリン抵抗性の発展の予防を含む。
【００８０】
上記に示されるように、活性を有するホモ三量体を形成するいかなるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片も除外されうる。
【００８１】
配列リストの簡単な説明
配列ＩＤ番号：１はその位置が特徴付けられるように示されるオープンリーディングフレームを有するｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
配列ＩＤ番号：２は配列ＩＤ番号：１のｃＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列である。
配列ＩＤ番号：３はその位置が特徴付けられるように示されるオープンリーディングフレームを有するｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
配列ＩＤ番号：４は配列ＩＤ番号：３のｃＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列である。
配列ＩＤ番号：５はその位置が特徴付けられるように示されるオープンリーディングフレームを有するｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
配列ＩＤ番号：６は配列ＩＤ番号：５のｃＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列である。
付属の配列リストはそれらを全体として本明細書中に援用する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８２】
発明の詳細な説明
本発明をより詳細に示す前に、以下の定義が本明細書中の本発明を示すために使用される用語の意味及び範囲を例示する及び定義するために示される。
本明細書中で相互交換可能に使用されるとき、上記用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」及び核酸は単鎖又は二重形の１以上のヌクレオチドのＲＮＡ、ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む。上記用語は少なくとも１の改変を含む「改変されたヌクレオチド」を含み、例のために及び限定ではなく：（ａ）代替の結合基、（ｂ）プリンの類似形態、（ｃ）ピリミヂンの類似形態又は（ｄ）類似の糖を含む。類似の結合基、プリン、ピリミヂン、及び糖の例のために、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９５／０４０６４を参照のこと。本発明に係るポリヌクレオチド配列は本分野において知られる精製方法を利用することに加えて、合成、組換え、ｅｘ ｖｉｖｏ産生又はそれらの組み合わせを含む既知の方法により調製されうる。
【００８３】
上記用語ポリヌクレオチド構築物、組換えポリヌクレオチド及び組換えポリペプチドは本分野におけるそれらの使用と一致して、本明細書中で使用される。上記用語「上流」及び「下流」は本分野におけるそれらの使用と一致して、本明細書中で使用される。上記用語「塩基対の」及び「Ｗａｔｓｏｎ ＆ Ｃｒｉｃｋ塩基対の」は本明細書中で相互変換可能に、及び本分野におけるそれらの使用と一致して使用される。同様に、上記用語「相補的な」、「その相補の」、「相補物」、「相補的なポリヌクレオチド」、「相補的な核酸」及び「相補的なヌクレオチド配列」は本明細書中で相互変換可能に及び本分野におけるそれらの使用と一致して使用される。
【００８４】
上記用語「精製された」は本明細書中で、非限定的に、他の核酸、炭水化物、脂質及び（上記ポリヌクレオチドの合成において使用される酵素の如き）タンパク質を含む他の化合物から分離された、本発明に係るポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドベクターを示すために使用される。「精製された」はまた、例えば、直鎖のポリヌクレオチドからの共有結合的に閉じたポリヌクレオチドの分離又はその逆をもいう。ポリヌクレオチドは少なくとも約５０％、６０％、７５％又は９０％のサンプルが単一のポリヌクレオチド配列を含むとき実質的に純粋である。いくつかの場合、このことはコンフォメーション（直鎖対共有結合的に閉じたもの）間の決定を含む。実質的に純粋なポリヌクレオチドは典型的に約５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９％重量／重量の核酸サンプルを含む。ポリヌクレオチドの純粋さ又は均質性は、サンプルのアガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いて上記ゲルを染色した際の単一のポリヌクレオチドバンドの可視化の如き、本分野において周知の多くの方法により示されうる。いくつかの目的のために、高分解がＨＰＬＣ又は本分野において周知の他の方法を用いることにより達成されうる。
【００８５】
同様に、上記用語「精製された」は本明細書中で、非限定的に、核酸、脂質、炭水化物及び他のタンパク質を含む他の化合物から分離された、本発明に係るポリペプチドを示すために使用される。いくつかの好ましい態様においては、ポリペプチドは少なくとも約５０％、６０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％のサンプルのポリペプチド分子が単一のアミノ酸配列を有するとき実質的に純粋である。いくつかの好ましい態様においては、実質的に純粋なポリペプチドは典型的に約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％重量／重量のタンパク質サンプルを含む。ポリペプチドの純粋さ又は均一性はサンプルのアガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いて上記ゲルを染色した際の単一のポリペプチドバンドの可視化の如き、本分野において周知の多くの方法により示される。いくつかの目的のために、高分解がＨＰＬＣ又は本分野において周知の他の方法を用いることにより達成されうる。
【００８６】
さらに、本明細書中で使用されるとき、上記用語「精製された」は絶対的な純粋さを必要としない；むしろ、それは比較的な定義として意図される。出発物質又は天然材料の少なくとも１オーダーの等級、好ましくは２又は３オーダー、及びより好ましくは４又は５オーダーの等級への精製が明白に企図される。あるいは、精製は異種のポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ又は両方）又はポリペプチドに比較した「少なくとも」パーセントの純粋さとして表現されうる。好ましい態様として、本発明に係るポリヌクレオチド又はポリペプチドは異種のポリヌクレオチド又はポリペプチドに比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、９９．５％又は１００％純粋である。さらに好ましい態様として、上記ポリヌクレオチド又はポリペプチドは異種のポリヌクレオチド又はポリペプチドに比較して９０％〜１００％（例えば、少なくとも９９．９９５％純粋）の、ある数字から少数点以下第三位までに及ぶ「少なくとも」の純粋さを有する。さらに、上記ポリヌクレオチド又はポリペプチドの純粋さは担体溶液以外の全ての材料及び化合物に比較した（上記に示した）パーセントとして表現されうる。小数点以下第三位までの、それぞれの数字は純粋さの個々の種として請求されうる。
【００８７】
上記用語「単離された」は上記材料がその源の環境（例えば、それが天然のものである場合は、天然の環境）から除去されることを必要とする。例えば、生存する動物中に存在する天然のポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていないが、天然の系においていくつかの又は全部の共存する材料から分離された同じポリヌクレオチド若しくはＤＮＡ又はポリペプチドは単離されている。上記ポリヌクレオチドはベクターの部分でありうる及び／又は上記ポリヌクレオチド又はポリペプチドは組成物の部分でありうる、及び上記ベクター又は組成物がその天然の環境の部分ではない点で単離されている。
【００８８】
「単離された」の定義から特定して排除されるものは：天然の染色体（例えば、染色体スプレッド）、人工的な染色体ライブラリー、ゲノムライブラリー、及びｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸調製物として又はトランスフェクトされた／形質転換された宿主細胞調製物として存在するｃＤＮＡライブラリーであり、ここで、宿主細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ不均一調製物である又は単一のコロニーの不均一集団としてまかれる。また特定して排除されるものは、５’ＥＳＴが上記ベクター分子内に５％（又はあるいは１％、２％、３％、４％、１０％、２５％、５０％、７５％又は９０％、９５％又は９９％）未満のいくつかの核酸挿入物を作出する上記ライブラリーである。さらに特定して排除されるものは全細胞ゲノムＤＮＡ又は全細胞ＲＮＡ調製物（機械的に切断された又は酵素的に消化された前記全細胞調製物を含む）である。さらに特定して排除されるものはｉｎ ｖｉｔｒｏ調製物としての又は（同じもののブロットトランスファーを含む）電気泳動により分離された不均一の混合物としての上記全細胞調製物であり、ここで、本発明に係るポリヌクレオチドはさらに（例えば、アガロースゲル又はナイロンブロット中の不均一のバンド集団から単一のバンドを削り取ることによりさらに分離して）電気泳動媒体中の異種のポリヌクレオチドから分離されていない。
【００８９】
上記用語「プライマー」は標的ヌクレオチド配列と相補的であり、そして標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせるために使用される特定のオリヌクレオチド配列を示す。プライマーはＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素により触媒されるヌクレオチドポリメライゼーションのための開始点としてはたらく。
【００９０】
上記用語「プローブ」はサンプル中に存在する特定のポリヌクレオチド配列を同定するために使用されうる、定義された核酸セグメント（又はヌクレオチドアナログセグメント、例えば、本明細書中以下に定義されるＰＮＡ）を示し、前記核酸セグメントは同定されるべき特定のポリヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。
【００９１】
上記用語「ポリペプチド」はポリマーの長さに関係なく、アミノ酸のポリマーをいう。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質はポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はまたポリペプチドの発現後修飾を特定しない又は排除しない。例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基等の共有結合的な結合を含むポリペプチドは上記用語ポリペプチドにより表現的に含まれる。また、天然の及び非天然の、本分野において知られる他の改変に加えて、（例えば、非天然のアミノ酸、関連しない生物系でのみ天然に起こるアミノ酸、哺乳類系から改変したアミノ酸を含む）アミノ酸の１以上のアナログを含むポリペプチド、置換された結合を有するポリペプチドも上記定義内に含まれる。本明細書中で使用されるとき、上記用語「ＧＭＧ−２」は一般的に、別段の定めなき限り、マウスの又はヒトのＧＭＧ−２をいう。
【００９２】
学説に制限されることなく、本発明に係る化合物／ポリペプチドは肝臓及び末梢組織間で食物脂質の分割を調節することができ、そしてしたがって、「肝臓及び末梢組織間の食物脂質の分割に関係する疾患」を治療すると考えられる。上記用語「末梢組織」は筋肉及び脂肪組織を含むと意味される。好ましい態様においては、本発明に係る化合物／ポリペプチドは筋肉へ食物脂質を筋肉へ分割する。代替の好ましい態様においては、上記食物脂質は脂肪組織へ分割される。他の好ましい態様においては、上記食物脂質は肝臓へ分割される。さらに他の好ましい態様においては、本発明に係る化合物／ポリペプチドは筋肉による食物脂質、好ましくは遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の酸化を増大させる又は減少させる。食物脂質は、非限定的に、トリグリセリド及び遊離脂肪酸を含む。
【００９３】
食物脂質の分割に関係すると考えられる好ましい疾患は肥満及び肥満、損なわれたグルコース耐性、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、アテロームの疾患、心疾患、高血圧、卒中、シンドロームＸ、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ又はＩＩ型糖尿病）及びインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ又はＩ型糖尿病）の如き肥満関連疾患及び障害を含む。本発明に係る方法により治療されるべき糖尿病関連合併症は細小血管病変、眼の病変、網膜症、神経障害、及び腎臓病変を含む。心疾患は、非限定的に、心不全、冠状動脈不全、及び高血圧を含む。本発明に係る化合物により治療されるべき他の肥満関連障害は高脂血症及び尿酸過剰血症を含む。本発明のさらに他の代謝関連疾患又は障害は悪疫質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少、食欲不振、及び過食症を含む。
【００９４】
上記用語「異種の」は、本明細書中で使用されるとき、本発明に係るＧＭＧ−２又はＧＭＧ−２ポリペプチド又はｇＧＭＧ−２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド以外のポリペプチド又はポリヌクレオチドを指すと意図される。
【００９５】
上記用語「含む（comprising）」、「から成る（consisting of）」及び「本質的にそれから成る（consisting essentially of）」はそれらの標準の意味にしたがって定義される。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐにおいて示される定義された意味は本分野における定義された意味を支配する、またフェデラル・サーキットの判例法において示される定義された意味はＭ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．中に示される意味を支配する。このことを念頭において、上記用語はそれぞれの用語に関連した特定の意味を結びつけるために本明細書をとおして互いに置換されうる。
【００９６】
上記用語本発明に係る特定のポリヌクレオチド「について組換えた宿主細胞」は前記細胞において天然に見られない方法で前記ポリヌクレオチドを含むよう人の手で変換された宿主細胞を意味する。例えば、前記宿主細胞は本発明に係る前記ポリヌクレオチドで一時的に又は安定的にトランスフェクトされ又は形質導入されうる。
【００９７】
上記用語「肥満」は、本明細書中で使用されるとき、体重のＷＨＯ分類において定義される（Ｋｏｐｅｌｍａｎ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０４：６３５６４３）。体重不足は１８．５未満である（やせた）；健康は１８．５〜２４．９である（正常）；１等級体重超過は２５．０〜２９．９である（体重超過）；２等級体重超過は３０．０〜３９．０である（肥満）；３等級体重超過は４０．０ＢＭＩ以上である。ＢＭＩはボディマスインデックス（病性の肥満）であり、及びｋｇ／ｍ2である。ウエスト周囲も代謝合併症の危険性を示すために使用されることができ、ここで、男性において、９４ｃｍ以上の周囲は増大した危険性を示し、そして１０２ｃｍ以上は実質的に増大した危険性を示す。女性についても同様に、８８ｃｍ以上は増大した危険性を示し、そして８８ｃｍ以上は実質的に増大した危険性を示す。上記ウエスト周囲は肋骨の下の境界線及び骨盤の上の境界線の間の中点でｃｍで計測される。肥満の他の基準は、非限定的に、カリパスを用いた皮膚の重なりの厚みのｃｍでの計測である、皮膚の重なり、及びやせたマスは主に電解質溶液であるため太ったマスよりも電流を伝導するという原理に基づいたバイオインピーダンスを含む；手足にわたり適用された弱い電流（インピーダンス）への抵抗の計測は経験的に由来する式を用いて体脂肪の見積もりを提供する。
【００９８】
上記用語「エネルギー取り込み」は、本明細書中で使用されるとき、総カロリー取り込み、すなわち、食物及び液体食物からの総エネルギーから個体へ取り込まれたエネルギーとして定義される。
【００９９】
上記用語「エネルギー消費」は、本明細書中で使用されるとき、休止中エネルギー消費（ＲＥＥ）、食事の熱効果（ＴＥＦ）、及び運動の如き活動を含む、総エネルギー消費（ＴＥＥ）として定義される。「エネルギー取り込み」及び「エネルギー消費」の両方はＲｏｓｅｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．により定義される［それらを全体として本明細書中に援用する、Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ（２０００）Ｊｕｎ；７１（６）：１４２１−３２］。
【０１００】
上記用語「体重減少の維持」は、本明細書中で使用されるとき、上記個体の開始の肥満体重より１０〜２０％低い個体における安定な体重の維持として定義される。好ましくは、体重減少後の新たに維持された体重は（本明細書中で定義されるとき）健康体重である。体重減少の維持が美容目的で実施されるとき、上記個体は少なくとも２０〜２５以下のＢＭＩを有する。体重減少の維持の方法による肥満治療について定義されるとき、上記個体は少なくとも２０のＢＭＩを有しうる。
【０１０１】
上記用語「糖尿病」は、本明細書中で使用されるとき、非限定的に、以下のリスト：糖尿病の症状（例えば、多尿、多渇症、多食症）に加えて２００ｍｇ／ｄｌ以上の不定期の血漿グルコース値、ここで、不定期の血漿グルコースは食事又は飲み物消費の時間に関係なく１日のいかなる時間でも定義される；１２６ｍｇ／ｄｌ以下の８時間絶食時血漿グルコース値；及び水中に溶解した７５ｇ無水物グルコースの経口投与２時間後の２００ｍｇ／ｄｌ以上の血漿グルコース値を含んだどの方法からもなされる糖尿病の通常の診断を含むと意図される。
【０１０２】
上記用語「損なわれたグルコース耐性（ＩＧＴ）」は、本明細書中で使用されるとき、明らかなＮＩＤＤＭ及び正常なグルコース耐性（ＮＧＴ）の間の中間である、インスリン抵抗性に関連した状態を示すと意図される。ＩＧＴ集団の高い割合が正常なグルコース耐性を有する者と比較してＮＩＤＤＭへ進行することが知られる（その開示をそれらを全体として本明細書中に援用する、Ｓａｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９８８；３１９：１５００−６）。したがって、ＩＧＴを減少させる又は予防する、すなわち、インスリン抵抗性を正常化する治療及び方法を提供することにより、ＮＩＤＤＭへの進行は遅延され又は妨げられうる。ＩＧＴは、患う者の食後グルコース応答が食事２時間後の血漿グルコース値により評価されるとき異常であると決定される、手順により診断される。この試験において、計測された量のグルコースが患者に与えられ、及び血中グルコース値が規則的な間隔で、通常はじめの２時間については３０分毎及びその後１時間毎に計測される。「正常な」又は非ＩＧＴ個体において、グルコース値ははじめの２時間の間１４０ｍｇ／ｄｌ未満の値まで上がり、そしてその後急速に落ちる。ＩＧＴ個体においては、上記血中グルコース値はより高く、そして降下値は遅い速度である。
【０１０３】
上記用語「インスリン抵抗性症候群」は、本明細書中で使用されるとき、高血圧及び成熟前アテローム性動脈硬化血管疾患の如き、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）の発展において重要な役割をはたす一連の事件を推進する、インスリン抵抗性を補償するための試みから生ずる異常性のクラスターを含むと意図される。増大した血漿トリグリセリド及び減少したＨＤＬ−コレステロール濃度、ＣＡＤに関連すると知られる状態もインスリン抵抗性に関連すると報告されている。したがって、インスリン抵抗性を減少させる又は予防する治療及び方法を提供することにより、本発明はインスリン抵抗性症候群の発現を減少させる及び／又は予防する方法を提供する。
【０１０４】
上記用語「多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）」は、本明細書中で使用されるとき、この集団の５〜１０％に影響する、高アンドロゲン症、慢性無排卵、インスリン活性における欠陥、インスリン分泌、卵巣ステロイド症及びフィブリン溶解により特徴付けられる、閉経前の女性の病因論的に割り当てられない障害を示すと意図される。ＰＣＯＳを有する女性はしばしばインスリン抵抗性であり、及び人生の三十代及び四十代にグルコース非耐性又はＮＩＤＤＭを発展する増大した危険性にある（Ｄｕｎａｉｆ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ８１：３２９９、その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する）。高アンドロゲン症も、これらの状態が閉経前の女性において起こるとき、Ａ型症候群から、妖精症及び脂肪組織萎縮性糖尿病をとおして、Ｂ型症候群までの、さまざまな多様のインスリン抵抗性状態の特徴である。高インスリン血症はそれ自体、高アンドロゲン症を引き起こすことが示されている。インスリン増感剤、例えば、トログリタゾンはインスリン抵抗性のヒトにおけるように、ＰＣＯＳにおいて有効であり、そして特に、インスリン活性における欠陥、インスリン分泌、卵巣ステロイド症及びフィブリン溶解が改善されることが知られている（Ｅｈｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １００：１２３０、その開示をそれらを全体として本明細書中に援用する）。
【０１０５】
上記用語「インスリン抵抗性」は、本明細書中で使用されるとき、静脈内グルコース耐性試験又は絶食時インスリン値の計測の如き、いくつかの方法のいずれかによりなされる、通常のインスリン抵抗性の診断を含むと意図される。絶食時インスリン値の高さ及びインスリン抵抗性の程度の間に優れた相関性があることがよく知られる。それゆえ、どの正常グルコース耐性（ＮＧＴ）個体がインスリン抵抗性を有するかを同定する目的のために、上昇した絶食時インスリン値をインスリン抵抗性についての代理のマーカーとして使用することができる。これを行うための他の方法はＴｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｃｉｎｅ， Ｎｏ．３，ｐｐ． １１８８（１９９５）（その開示をそれらを全体として本明細書中に援用する）中に開示されるアプローチにしたがうこと、すなわち、処置群への加入についての開始基準として肥満患者を選択することである。何人かの肥満患者は損なわれたグルコース耐性（ＩＧＴ）を有し、一方、他の者は正常なグルコース耐性（ＮＧＴ）を有する。主に全ての肥満患者はインスリン抵抗性である、すなわち、ＮＧＴ肥満患者でさえインスリン抵抗性であり、及び絶食時高インスリン血症を有する。それゆえ、本発明にしたがう治療の標的は肥満である又は絶食時高インスリン血症を有する又は両方を有するＮＧＴ個体として定義されうる。
【０１０６】
インスリン抵抗性の診断はまた正常血糖グルコースクランプ試験を用いてもなされうる。この試験は一定のインスリン融合及びさまざまな速度のグルコース融合の同時の投与を含む。３〜４時間続く上記試験の間、上記血漿グルコース濃度はグルコース値を５〜１０分毎に計測し、そしてその後血漿グルコース値を変化させないように保つためにさまざまな速度のグルコース融合を調節することにより正常血糖値に一定に保たれる。これらの状況下で、血流へのグルコース加入の速度は体内のグルコース処理の全体の速度と等しい。基礎状態（インスリン融合なし）及びインスリン融合状態におけるグルコース処理の速度間の差はインスリン仲介グルコース取り込みを示す。正常な個体において、インスリンは体全体のグルコース処理において鋭い及び大きな増大を引き起こすが、ＮＩＤＤＭ患者においては、インスリンのこの効果は非常に鈍く、そして正常の２０〜３０％しかない。ＩＧＴ又はＮＧＴを有するインスリン抵抗性患者において、インスリン刺激されたグルコース処理の速度は正常及びＮＩＤＤＭの間のおよそ真ん中である。例えば、約１００μＵ／ｍｌ（生理学的値）の定常血漿インスリン濃度で、正常な患者におけるグルコース処理速度は約７ｍｇ／ｋｇ／分である。ＮＩＤＤＭ患者においては、それは約２．５ｍｇ／ｋｇ／分であり、及びＩＧＴを有する患者（又はＮＧＴを有するインスリン抵抗性患者）においては、それは約４〜５ｍｇ／ｋｇ／分である。このことは高く再現可能であり、そして正確な試験はこれらのカテゴリー内で患者を区別しうる。患者がよりインスリン抵抗性になればなるほど、絶食時インスリン値が上がることも知られる。正常血糖グルコースクランプ試験により計測したとき、絶食時インスリン値の高さ及びインスリン抵抗性の大きさの間に優れた正の相関があり、そしてそれゆえ、このことはインスリン抵抗性の代理の計測として絶食時インスリン値を用いることについての根本理由を提供する。
【０１０７】
上記用語「肝臓及び末梢組織間で食物脂質の分割について作用する剤」は以前に示されるように肝臓及び末梢組織の間で食物脂質の分割を調節する本発明に係る化合物又はポリペプチドをいう。好ましくは、上記剤は筋肉による食物脂質、好ましくは、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の酸化を増大させる又は減少させる。好ましくは、上記剤は個体の体重を減少させる若しくは増大させる又は肥満、損なわれたグルコース耐性、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、アテロームの疾患、心疾患、高血圧、卒中、シンドロームＸ、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ又はＩＩ型糖尿病）及びインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ又はＩ型糖尿病）の如き、肥満関連疾患又は障害を治療する又は予防するために使用される。本発明に係る方法により処置されるべき糖尿病関連合併症は細小血管病変、眼の病変、網膜症、神経障害、及び腎臓病変を含む。心疾患は、非限定的に、心不全、冠状動脈不全、及び高血圧を含む。本発明に係る化合物により処置されるべき他の肥満関連障害は高脂血症及び尿酸過剰血症を含む。本発明に係るさらに他の肥満関連疾患又は障害は悪液質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少、食欲不振、及び過食症を含む。
【０１０８】
上記用語「肝臓及び末梢組織の間で食物脂質の分割について作用する剤への応答」は、非限定的に、個体における、化合物を代謝する能力、プロドラッグを活性薬に変換する能力、並びに薬物の薬物動態（吸収、分布、排出）及び薬力学（受容体関連）を含む、薬物効果をいう。
【０１０９】
上記用語「肝臓及び末梢組織の間の食物脂質の分割について作用する剤への副作用」は上記薬物の第一の薬理学的活性の延長から生ずる治療の悪い効果を又は上記薬物の独特の宿主因子との相互作用から生ずる特異的な悪い反応をいう。「肝臓及び末梢組織の間の食物脂質の分割について作用する剤への副作用」は、非限定的に、皮膚科の、血液学の又は肝臓学の毒性の如き悪い反応を含むことができ、そしてさらに胃腸の及び小腸の潰瘍、血小板機能における妨害、腎臓損傷、腎炎、おびただしい水っぽい分泌物を伴う血管運動神経性鼻炎、血管運動神経性水腫、一般的なじんま疹、及び喉頭の水腫及び気管支収縮への気管支喘息、低血圧、及び卒中を含む。
【０１１０】
上記用語「ＧＭＧ−２関連疾患及び障害」は、本明細書中で使用されるとき、ＧＭＧ−２の異常な機能を含む又はＧＭＧ−２値若しくは活性の調節により治療され若しくは予防されうる疾患又は障害をいう。「ＧＭＧ−２の異常な機能」は、非限定的に、ＧＭＧ−２の異常な発現値（増大した又は減少した、しかし好ましくは減少した）、ＧＭＧ−２の異常な活性（増大した又は減少した）、及びリガンド又は結合相手との異常な相互作用（増大した又は減少した）を含む。「異常」により、正常な細胞、組織若しくは患者において見られる又は上記病気の開始の前に細胞、組織若しくは患者において以前に見られた型又は活性の値からの変化が意味される。好ましい態様においては、これらのＧＭＧ−２関連疾患及び障害は肥満及び以前に示した肥満関連疾患及び障害を含む。
【０１１１】
上記用語「美容処置」は、上記個体が臨床的に肥満又は臨床的にやせではない場合に個体のボディマスを増大させる又は減少させる本発明に係る化合物又はポリペプチドでの処置を含むと意味される。したがって、これらの個体は臨床的な肥満の境界より低い（例えば、２５ｋｇ／ｍ2未満の）及び臨床的なやせの境界より高い（例えば、１８．５ｋｇ／ｍ2超の）ボディマスインデックス（ＢＭＩ）を有する。さらに、これらの個体は好ましくは健康である（例えば、本発明の肥満関連疾患又は障害を有しない）。「美容処置」はまた、いくつかの状況において、脂肪組織における、より位置づけられた増大、例えば、特に、例えば、ウエスト若しくは尻の周り又は尻及び腿の周りの増加又は減少を含むとも意味される。これらの脂肪組織の位置づけられた増加又は減少は例えば、ウエスト又は尻の大きさにおける増大又は減少により同定されうる。
【０１１２】
上記用語「予防する」は、本明細書中で使用されるとき、肥満又はＧＭＧ−２に関連した異常の身体の現れを予防するために疾患又は状態の臨床的な症状の開始前に化合物を投与することをいう。あるいは、上記用語「予防する」は疾患又は状態に関連した臨床的な症状の重篤さの減少を示すために使用されうる。
【０１１３】
上記用語「治療する」は、本明細書中で使用されるとき、臨床的症状の開始後に化合物を投与することをいう。
【０１１４】
上記用語「処置の必要のある」は、本明細書中で使用されるとき、個体又は動物が処置を必要とする又は処置から恩恵を得るであろうという、処置する者（例えば、ヒトの場合は、医師、看護士、看護従業者等；非ヒト哺乳類を含む、動物の場合は獣医学者）によりなされる判断をいう。この判断は、処置する者の経験の範囲内であるが、上記個体又は動物が本発明に係る化合物により治療されうる状態の結果として、病気である又は病気になるであろうという知識を含む、さまざまな因子に基づいてなされる。
【０１１５】
上記用語「処置についての必要性を認める」は、個体が上記「美容処置」の下で議論されるように美容理由のために体重減少を所望するというサブ臨床的な決定をいう。他の態様における上記用語「処置についての必要性を認める」は動物の所有者が上記動物の美容処置のためになすという決定をいいうる。
【０１１６】
上記用語「個体」又は「患者」は、本明細書中で使用されるとき、哺乳類、好ましくはマウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ又は霊長類、及び好ましくはヒトを含む動物をいう。上記用語は男性若しくは女性又は両方を特定し、あるいは男性若しくは女性を排除しうる。
【０１１７】
上記用語「非ヒト動物」は鳥類及びより通常には哺乳類、好ましくは霊長類、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ又はげっ歯類、より好ましくはラット又はマウスの如き動物を含む、非ヒト脊椎動物をいう。上記用語「動物」及び「哺乳類」は上記用語「非ヒト」と先に付かない限りはヒト患者を表現的に含む。
【０１１８】
本発明者はｇＧＭＧ−２と呼ばれる、ＧＭＧ−２の断片が高脂肪／スクロース食を摂食したマウスにおいて血漿遊離脂肪酸、グルコース、及びトリグリセリドの食後応答を顕著に減少させることができることを見つけた。レプチン、インスリン又はグルカゴンの値には顕著な効果はなかった。さらに、ｇＧＭＧ−２はｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏでの筋肉の遊離脂肪酸酸化を増大させることを見つけた。さらに、ｇＧＭＧ−２は１９日間高脂肪／スクロース食を摂食したマウスにおいて体重増加を減少させ、そしてその後増大を妨げることが示された。同じ高脂肪／スクロース食で６ヶ月間維持したマウスにおいて、ｇＧＭＧ−２処置は高脂肪／スクロース食で維持したにも関わらず、顕著に１６日間にわたる維持された体重減少をもたらした。
【０１１９】
本発明は遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の分割における及びエネルギーホメオスタシスの制御のための重要な新規ツールとしてＧＭＧ−２ポリペプチド断片の使用を含む。循環から顕著に脂質を除去し、そしてＦＦＡ酸化を引き起こしうる組織の筋肉は定量的に最も重要である。球状ＧＭＧ−２は食物摂取を妨害することなく体重を制御する独特な及び新規な薬理学的ツールである。
【０１２０】
本発明の好ましい態様
Ｉ． 本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片
ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで計測可能な活性を有するＧＭＧ−２ポリペプチド断片が同定された。これらの活性は、非限定的に、高脂肪／スクロース食を摂食したマウスにおける血漿遊離脂肪酸、グルコース、及びトリグリセリドの食後応答の減少（実施例８又は１１）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの筋肉遊離脂肪酸酸化における増大（実施例１０）、及び高脂肪／スクロース食のマウスにおける維持された体重減少（実施例２）を含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性についての他の分析はまた実施例をとおしても提供され、そして同等の分析は当業者により設計されうる。
【０１２１】
対照的に、上記「無傷の」又は「全長の」ＧＭＧ−２ポリペプチドは本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片について同定されたｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ活性のいずれも有しない。ほとんどの場合、上記活性は存在しない又は最小値であり、使用される分析においてコントロール値にわたり検出できない。他の場合には、上記活性は計測されうるが、非常に減少された値で存在する及び／又は本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片と比較して１モーラー基準で非常により多くのタンパク質を必要とする（例えば、実施例１０を参照のこと）。本明細書中で使用されるとき、「無傷の」又は「全長の」ＧＭＧ−２ポリペプチドにより、Ｎ−末端メチオニンからＣ−末端停止コドンまでの、ＧＭＧ−２ポリペプチドの全長ポリペプチド配列が意味される。無傷の又は全長のＧＭＧ−２ポリペプチドの例は配列ＩＤ番号：２、４及び６において見られる。上記用語「ＧＭＧ−２ポリペプチド断片」は、本明細書中で使用されるとき「肥満関連活性」又は「インスリン様活性」を有する「無傷の」又は「全長の」ＧＭＧ−２ポリペプチドの断片をいう。上記用語「ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片」は球状ドメインから成るポリペプチド断片をいい、そしてしたがって「ＧＭＧ−２ポリペプチド断片」よりも狭い言葉である。上記用語「断片」は無傷の又は全長のＧＭＧ−２ポリペプチドの部分と全く同じであるが、全部ではない配列を有するポリペプチドを意味する。上記断片は「遊離状態」（すなわち、他のポリペプチドの部分ではない又はそれに融合されていない）で存在しうる又は１以上の断片は単一のポリペプチド内に存在しうる。ｇＧＭＧ−２断片は、別段の定めなき限り、全長ＧＭＧ−２ポリペプチドの連続的な断片である。
【０１２２】
上記用語「肥満関連活性」は、本明細書中で使用されるとき、少なくとも１の、及び好ましくは全ての本明細書中で示されるＧＭＧ−２ポリペプチド断片についての活性をいう。これらの活性の決定についての分析は本明細書中に提供され（例えば、実施例４〜１６）、そして同等の分析は当業者により設計されうる。場合により、「肥満関連活性」は脂質分割、脂質代謝、及びインスリン様活性又はこれらのカテゴリーの１のうちの活性から成る群から選ばれうる。「脂質分割」活性により脂肪組織、肝臓、及び筋肉を含む、主要な組織群間での食物脂質の配置に影響する能力が意味される。本発明者は、本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片は筋肉、肝臓又は脂肪組織への脂質分割において役割をはたすことを示した。「脂質代謝」活性により脂質の代謝に影響する能力が意味される。本発明者は、本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片は遊離脂肪酸酸化実験をとおして筋肉において脂質の代謝を増大させる能力並びに血漿及び筋肉においてトリグリセリドの値に一過的に影響する能力に加えて、血漿において遊離脂肪酸の値に影響する能力を有することを示した。「インスリン様」活性により血漿におけるグルコース値を調節するＧＭＧ−２ポリペプチド断片の能力が意味される。本発明者は、ＧＭＧ−２ポリペプチド断片はインスリン値に顕著に影響しないが、インスリンの効果と同様にグルコース値に強く影響することを見つけた。これらの効果はｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体の複合体の存在下では見られない又はｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体の複合体と比較して非複合体ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片三量体の存在下で顕著に大きい。
【０１２３】
上記用語「顕著に大きい」は、本明細書中で使用されるとき、同じ分析におけるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体の複合体の活性と比較した、肥満関連分析における非複合体化ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体の活性の比較をいう。本明細書中で使用されるとき、「顕著に」により、当業者により典型的に決定されるように、統計的に顕著であることが意味される。例えば、データは典型的に平均±ＳＥＭとして計算される、及びｐ値＜０．０５は統計的に顕著であると考えられる。統計的分析はそれぞれの研究において適切なように、典型的にｔｈｅ ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ又はｔｈｅ ｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔのいずれかを用いてなされる。全長ＧＭＧ−２ポリペプチドの存在と比較した、本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片の存在の結果としての活性における顕著な変化の例は少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％のあるパラメーターにおける増大又は減少を含む。１以上の、しかし全てである必要はないが、計測可能なパラメーターは無傷のＧＭＧ−２ポリペプチドの存在下と比較して、ＧＭＧ−２ポリペプチド断片の存在下で顕著に変化するであろう。
【０１２４】
代表的な「肥満関連分析」は実施例において提供される。これらの分析は、非限定的に、食後応答の計測方法、遊離脂肪酸酸化の計測方法、及び体重調節の計測方法を含む。好ましい態様においては、上記食後応答は非ヒト動物、好ましくはマウスにおいて計測される。好ましい態様においては、食物脂質、好ましくは遊離脂肪酸及び／又はトリグリセリドにおける変化が計測される。他の態様においては、非限定的に、グルコース、インスリン、及びレプチンの値を含む、他の生理学的パラメーターが計測される。他の好ましい態様においては、遊離脂肪酸酸化はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで細胞において、好ましくは非ヒト動物、好ましくはマウスの筋肉細胞又は組織において計測される。さらに他の好ましい態様においては、体重調節は高脂肪／スクロース食のヒト又は非ヒト動物、好ましくはげっ歯類（ラット又はマウス）、霊長類、イヌ、ネコ又はブタにおいて計測される。場合により、「肥満関連活性」は本明細書中で特異的に同定される他の活性を含む。一般的に、肥満及び代謝研究の分野に関連する「計測可能なパラメーター」は遊離脂肪酸値、遊離脂肪酸酸化、トリグリセリド値、グルコース値、インスリン値、レプチン値、食物摂取、体重、レプチン及びリポタンパク質結合、取り込み及び分解並びに脂肪分解刺激された受容体（ＬＳＲ）発現から成る群から選ばれうる。
【０１２５】
これらの肥満関連分析において、本発明に係る好ましいＧＭＧ−２ポリペプチド断片であるが、全長ＧＭＧ−２ポリペプチドではないものは、食後脂肪血、遊離脂肪酸値、トリグリセリド値、グルコース値、遊離脂肪酸酸化、及び体重から成る群から選ばれる少なくとも１の計測可能なパラメーターにおいて顕著な変化を引き起こしうる。あるいは、本発明に係る好ましいＧＭＧ−２ポリペプチド断片であるが、全長ＧＭＧ−２ポリペプチドではないものは、ＬＳＲ活性における増大、レプチン活性における増大及びリポタンパク質活性における増大から成る群から選ばれる少なくとも１の計測可能なパラメーターにおける顕著な変化を有しうる。「ＬＳＲ」活性により、レプチン及びリポタンパク質を結合し、取り込み、及び分解するその能力に加えて、細胞表面上の又は特定のコンフォメーションのＬＳＲの発現が意味される。「レプチン」活性により、血液脳関を介するその輸送、及び潜在的にはＬＳＲが仲介因子又は唯一の仲介因子である必要はないこれらの発現に加えて、ＬＳＲによるその結合、取り込み及び分解が意味される。同様に、「リポタンパク質」活性により、ＬＳＲが仲介因子又は唯一の仲介因子である必要はないこれらの発現に加えて、そのＬＳＲによる結合、取り込み及び分解が意味される。
【０１２６】
本発明は単離された、精製された又は組換えられたＧＭＧ−２ポリペプチドについてｉｎｔｅｒ ａｌｉａで示される。本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチドは美容処置として又は代謝関連疾患及び障害の治療若しくは予防のために体重を（ＧＭＧ−２ポリペプチドのアンタゴニストを用いて）減少させる又は増大させるために有用である。ＧＭＧ−２ポリペプチドはＧＭＧ−２ポリペプチド活性のアゴニスト又はアンタゴニストについてのスクリーニング分析において；ＧＭＧ−２断片のＮ−末端のヂペプチヂルペプチダーゼ切断、好ましくは配列ＩＤ番号：２ＧＭＧ−２ポリペプチド断片１４４〜２８８のＮ−末端ＳＰヂペプチドの切断又は配列ＩＤ番号：４のＧＭＧ−２ポリペプチド断片１３４〜２７８のＮ−末端ＳＰヂペプチドの切断又は配列ＩＤ番号：６のＧＭＧ−２ポリペプチド断片１１５〜２５９のＮ−末端ＳＰヂペプチドの切断又は配列ＩＤ番号：２のＧＭＧ−２断片１６２〜２８８のＮ−末端ＴＡヂペプチドの切断又は配列ＩＤ番号：２のＧＭＧ−２断片１５２〜２７８のＮ−末端ＴＡヂペプチドの切断又は配列ＩＤ番号：６のＧＭＧ−２断片１３３〜２５９のＮ−末端ＴＡヂペプチドの切断のアンタゴニストについてのスクリーニング分析において；ＧＭＧ−２ポリペプチド特異的抗体を生じるために；及び診断分析においてｉｎｔｅｒ ａｌｉａで有用である。美容処置のために又は代謝関連疾患、障害又は状態の処置又は予防のために使用されるとき、１以上のＧＭＧ−２ポリペプチド断片が患者に提供されうる。したがって、全長タンパク質のさまざまな断片がさまざまな処置計画における使用のために「カクテル」中に混合されうる。
【０１２７】
上記全長ＧＭＧ−２ポリペプチドは：
１．配列ＩＤ番号：２のアミノ酸１〜５６又は配列ＩＤ番号：４の１〜４６又は配列ＩＤ番号：６の１〜２７からのＮ−末端の推定されているシグナル配列；
２．配列ＩＤ番号：２のアミノ酸５７〜１０６又は配列ＩＤ番号：４の４７〜９６又は配列ＩＤ番号：６の２８〜７７からの独特の領域；
３．配列ＩＤ番号：２のアミノ酸１０７〜１４８又は配列ＩＤ番号：４の９７〜１３８又は配列ＩＤ番号：６の７８〜１１９からのコラーゲン様領域；及び
４．配列ＩＤ番号：２のアミノ酸１５５〜２８８又は配列ＩＤ番号：４の１４５〜２７８又は配列ＩＤ番号：６の１２６〜２５９からのＣ１ｑホモロジーの球状領域
を含む、少なくとも４の明らかな領域から成る。
【０１２８】
上記用語「コラーゲン残基」はアミノ酸三重グリシン、Ｘ、Ｙ、を意味する本分野における標準の様式で使用され、ここで、Ｘ及びＹはいかなるアミノ酸でもありうる。
【０１２９】
本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片は単離された形態で好ましく提供される、及び部分的に又は実質的に精製されうる。ＧＭＧ−２ポリペプチド断片の組換えて作出された変形はＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７（１）：３１〜４０）により示される１段階法により又は本明細書中に示される若しくは本分野において知られる方法により実質的に精製されうる。本分野の断片はまたタンパク質精製の本分野において知られる方法により本発明に係るポリペプチド断片に対して方向付けられた抗体を用いて天然の又は組換えられた源からも精製されうる。
【０１３０】
ＧＭＧ−２ポリペプチド断片の部分的な精製又は選択に関連する本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片の調製はまた特定して企図される。これらの粗い調製物は、おそらく少ない追加の精製段階を用いてはいるが、上記断片の完全な精製の前の、ＧＭＧ−２ポリペプチド断片を発現する細胞の濃度の結果であると構想される。ＧＭＧ−２ポリペプチド断片を発現する細胞はペレット中に存在し、それらは溶解される又は例えば、上記粗いポリペプチドは凍結乾燥される。
【０１３１】
ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は全長ＧＭＧ−２ポリペプチド未満の少なくとも６の連続的なアミノ酸から１アミノ酸の長さの整数でありうる。したがって、配列ＩＤ番号：２のポリペプチドについて、ＧＭＧ−２ポリペプチドは、例えば、６〜２８７の連続的なアミノ酸の整数でありうる。上記用語「整数」は、本明細書中で使用されるとき、その数学的な意味であり、及びしたがって、代表的な整数は、非限定的に：
【化１６】
を含む。
【０１３２】
上記に示されるそれぞれのＧＭＧ−２ポリペプチド断片はそのＮ−末端及びＣ−末端位についてさらに特定されうる。例えば、配列ＩＤ番号：２のある無傷の及び連続的な全長ポリペプチド配列についての、配列ＩＤ番号：２の全長ポリペプチド未満の６の連続的なアミノ酸から１のアミノ酸までの断片が占有しうるＮ−末端及びＣ−末端位のそれぞれの組み合わせは本発明に含まれる。したがって、６の連続的なアミノ酸断片は、２４４の連続的なアミノ酸断片の
【化１７】
から成る群から選ばれる位置を占有しうる。２３８の連続的なアミノ酸断片は１〜２３８、２〜２３８、３〜２４０、４〜２４１、５〜２４２、６〜２４３及び７〜２４４から成る群から選ばれる位置を占有しうる。同様に、配列ＩＤ番号：２における６アミノ酸〜２８７アミノ酸の大きさの全ての他の断片により、及び配列ＩＤ番号：４における６アミノ酸〜２７７アミノ酸の大きさの全ての他の断片により、及び配列ＩＤ番号：６における６アミノ酸〜２５８アミノ酸の大きさの全ての他の断片により占有される上記位置は本発明に含まれる、及びまたこれらの２の例に基づいて直ちに認識されうる、及びそれゆえ、本明細書を不必要に長くさせない目的のために単に個々に挙げられない。さらに、配列ＩＤ番号：２、４又は６における連続的なアミノ酸の６〜最後のアミノ酸の隣までの断片により占有される位置は本発明に含まれる、及びまた２の例に基づいて直ちに認識されうる、及びしたがって、本明細書を不必要に長くさせない目的のために単に個々に挙げられない。さらに、いかなる他の全長ＧＭＧ−２ポリペプチド未満の６の連続的なアミノ酸から１アミノ酸の断片により占有される位置はこれらの２の例に基づいて認識されうる、及びそれゆえ、本明細書を不必要に長くさせない目的のために単に個々に挙げられない。
【０１３３】
２３８の連続的なアミノ酸断片は配列ＩＤ番号：２の１〜２３８、２〜２３９、３〜２４０、４〜２４１、５〜２４２、６〜２４３及び７〜２４４から成る群から選ばれる位置を占有しうる。同様に、配列ＩＤ番号：２の６アミノ酸〜２８４アミノ酸の大きさの全ての他の断片により占有される位置は本発明に含まれる、及びまた上記に挙げられる６、５０、１００又は２８４の連続的なアミノ酸の断片についての例に基づいて直ちに認識されうる、及びそれゆえ、本明細書を不必要に長くさせない目的のために単に個々に挙げられない。さらに、配列ＩＤ番号：４の６〜２１７の連続的なアミノ酸の断片により占有される位置は本発明に含まれる、及びまたこれらの２の例に基づいて直ちに認識されうる、及びそれゆえ、本明細書を不必要に長くさせない目的のために単に個々に挙げられない。好ましい態様においては、予想されない活性を有する、ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片、及び同じものをコードするポリヌクレオチドは配列ＩＤ番号：２の
【化１８】
から番号付けられるアミノ酸から選ばれ、ここで、位置６６、６９又は７０のシステインは前記置換アミノ酸により置換される。好ましい態様においては、予想されない活性を有する、ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片、及び同じものをコードするポリヌクレオチドは配列ＩＤ番号：４の
【化１９】
から番号付けられるアミノ酸から選ばれ、ここで、位置５６、５９又は６０のシステインは前記置換アミノ酸により置換される。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸
【化２０】
から選ばれ、ここで、位置３７、４０又は４１のシステインは前記置換アミノ酸により置換される。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有する、ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片、及び同じものをコードするポリヌクレオチドは配列ＩＤ番号：２の
【化２１】
から番号付けられるアミノ酸から選ばれる。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有する、ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片、及び同じものをコードするポリヌクレオチドは配列ＩＤ番号：６の
【化２２】
から番号付けられるアミノ酸から選ばれる。
【０１３４】
本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はあるいは式「ｎ〜ｃ」（包括的な）により示されうる；ここで、「ｎ」は上記ポリペプチドの（配列リストにより定義される）Ｎ−末端のほとんどのアミノ酸位置に等しく、及び「ｃ」は（配列リストにより定義される）Ｃ−末端のほとんどのアミノ酸位置に等しい；及びさらにここで、「ｎ」が１〜本発明に係る全長ポリペプチド配列のアミノ酸数の整数から５をひいたものに等しい（配列ＩＤ番号：２について２８３及び配列ＩＤ番号：４について２７３及び配列ＩＤ番号：６について２５４）；及びここで、「ｃ」は６〜全長ポリペプチド配列のアミノ酸数の整数に等しい（配列ＩＤ番号：２について２８８及び配列ＩＤ番号：４について２７８及び配列ＩＤ番号：６について２５９）；及びここで「ｎ」は「ｃ」より少なくとも６小さい整数である。それゆえ、配列ＩＤ番号：２について、「ｎ」は
【化２３】
から成るリストから選ばれる整数である、及び「ｃ」は
【化２４】
から成る群から選ばれる整数である・・・（２４５〜２８８のそれぞれの整数、包括的に）。「ｎ」及び「ｃ」位置のそれぞれの組み合わせは本発明の特定の態様として含まれる。さらに、式「ｎ」〜「ｃ」は「ｎ１〜ｎ２」〜「ｃ１〜ｃ２」として改変されうる、ここで、「ｎ１〜ｎ２」及び「ｃ１〜ｃ２」は配列リストのアミノ酸位置を示す上記２の整数から選ばれる位置範囲を示す。代替の式は「ｎ１〜ｎ２」〜「ｃ」及び「ｎ」〜「ｃ１〜ｃ２」を含む。好ましい態様においては、本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片は、配列ＩＤ番号：２のｎ１＝５７、ｎ２＝１５５、及びｃ＝２８８の式により；又は配列ＩＤ番号：４のｎ１＝４７、ｎ２＝１４５、及びｃ＝２７８の式により又は配列ＩＤ番号：６のｎ１＝２８、ｎ２＝１２６、及びｃ＝２５９により示されうる。
【０１３５】
これらの特定の態様、及び本明細書中に示される他のポリペプチド及びポリヌクレオチド断片の態様は「少なくとも」、「に等しい」、「以下の」、「未満の」、「少なくとも＿であるが＿未満の」又は「＿〜＿の」特定の大きさ又は特定のＮ−末端及び／又はＣ−末端位置として改変されうる。本発明のいかなる態様を示すために使用される全ての範囲も、特別に別段の定めなき限り、包括的であることが留意される。
【０１３６】
本発明はまたＮ−末端及びＣ−末端位置により特定される個々の断片の又は上記に示されるアミノ酸残基の大きさにより特定される断片の排除も提供する。さらに、Ｎ−末端及びＣ−末端位置により又は上記に示されるアミノ酸残基の大きさにより特定される断片の数は個々の種として排除されうる。さらに、Ｎ−末端及びＣ−末端位置により又は上記に示されるアミノ酸残基の大きさにより特定される断片の数は組み合わせでポリペプチド断片を作出しうる及び場合により非ＧＭＧ−２ポリペプチド配列をも含みうる。
【０１３７】
本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は、改変されたｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を含む、上記に示されるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の変形、断片、アナログ及び誘導体を含む。
【０１３８】
上記球状Ｃ−末端Ｃ１ｑホモロジー領域の全部又は一部から成る及び予想されない脂質分割、脂質代謝、及びインスリン様活性を有する、本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片の適切な及び効果的な生成を促進する、ｉｎ ｖｉｖｏの本発明に係る全長ＧＭＧ−２ポリペプチドのタンパク質分解的切断は複雑な制御を受けやすいと考えられる。前記タンパク質分解的切断は代替のスプライシングをとおしてプロテアーゼ切断部位の選択的な提示により部分的に制御される。前記タンパク質分解的切断はさらに上記プロテアーゼの値で、例えば、上記プロテアーゼの組織分布の値で及び上記プロテアーゼの量の値で制御され、それ自体は炎症に関連するものの如き生理学的シグナルにより制御されうる。球状Ｃ−末端Ｃ１ｑホモロジー領域の全部又は一部から成る及び予想されない脂質分割、脂質代謝、及びインスリン様活性を有する、本発明に係る特に好ましいＧＭＧ−２ポリペプチド断片はｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質分解的に生成されると考えられる配列ＩＤ番号：２、４又は６の前記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片である。特に好ましいものは１４４位での配列ＩＤ番号：２のコラーゲナーゼ切断により作出される、配列ＩＤ番号：２の約アミノ酸１４４〜２８８のＧＭＧ−２断片である。特に好ましいものは１３４位での配列ＩＤ番号：２のコラーゲナーゼ切断により作出される配列ＩＤ番号：４の約アミノ酸１３４〜２７８のＧＭＧ−２断片である。特に好ましいものは１１５位での配列ＩＤ番号：６のコラーゲナーゼ切断により作出される、配列ＩＤ番号：６の約アミノ酸１１５〜２５９のＧＭＧ−２断片である。特に好ましいものは１１４位での配列ＩＤ番号：２のマトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）切断により作出される、配列ＩＤ番号：２の約アミノ酸１１４〜２８８のＧＭＧ−２断片である。特に好ましいものは１３４位での配列ＩＤ番号：４のマトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）切断により作出される、配列ＩＤ番号：４の約アミノ酸１３４〜２７８のＧＭＧ−２断片である。特に好ましいものは１１５位での配列ＩＤ番号：６のマトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）切断により作出される、配列ＩＤ番号：６の約アミノ酸１１５〜２５９のＧＭＧ−２断片である。特に好ましいものは１５２、１５３、１６１又は１６２位での配列ＩＤ番号：２のプラスミン切断により作出される、配列ＩＤ番号：２の約アミノ酸１５２〜２８８、１５３〜２８８、１６１〜２８８又は１６２〜２８８のＧＭＧ−２断片である。特に好ましいものは１４２、１４３、１５１又は１５２位での配列ＩＤ番号：４のプラスミン切断により作出される、配列ＩＤ番号：４の約アミノ酸１４２〜２７８、１４３〜２７８、１５１〜２７８又は１５２〜２７８のＧＭＧ−２断片である。特に好ましいものは１２３、１２４、１３２又は１３３位での配列ＩＤ番号：６のプラスミン切断により作出される、配列ＩＤ番号：６のアミノ酸１２３〜２５９、１２４〜２５９、１３２〜２５９又は１３３〜２５９のＧＭＧ−２断片である。
【０１３９】
本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチドは改変されたＧＭＧ−２ポリペプチドを含む、上記に示されるＧＭＧ−２ポリペプチドの変形、断片、アナログ及び誘導体を含む。
【０１４０】
変形
本発明に係るｇＧＭＧ−２断片配列のいくつかのアミノ酸は上記タンパク質の構造又は機能に顕著な影響を与えることなく変形されうること；活性を決定する断片配列中の重要なアミノ酸があるであろうことは当業者により認識されるであろう。したがって、本発明はさらに上記に示される肥満関連活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の変形含む。上記変形は活性にほとんど影響を与えないために、本分野において知られる一般規則にしたがって選択される天然の突然変異又は人の操作からの１以上のアミノ酸欠失、挿入、反転、繰り返し、及び置換を有するＧＭＧ−２断片配列を含む。表現形としてサイレントなアミノ酸置換を作出する方法についてのガイダンスは以下に提供される。
【０１４１】
アミノ酸配列の変化への耐性の研究については２の主なアプローチがある（Ｂｏｗｉｅ， ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１３０６〜１０を参照のこと）。第一の方法は、突然変異が自然選択により許容される又は拒絶される、進化のプロセスによる。第二のアプローチはクローニングした遺伝子の特定の位置にアミノ酸変化を導入する遺伝子工学又は機能的に維持される配列を同定するスクリーニングを用いる。
これらの研究は、タンパク質が驚くべきことにアミノ酸置換に耐性であることを明らかにし、そしてそのアミノ酸変化は上記タンパク質のある位置で許容されやすいことを示す。例えば、ほとんどの埋もれたアミノ酸残基は非極性側鎖を必要とし、その一方で表面側鎖の特徴は一般的にほとんど保存されていない。他の上記表現形としてサイレントな置換はＢｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．（ｓｕｐｒａ）及び本明細書中に引用される文献により示される。
【０１４２】
連続的な置換基として典型的に見られるものは脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＰｈｅの間の互いの置換；ヒドロキシル基Ｓｅｒ及びＴｈｒの交換；酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕの交換；アミド残基Ａｓｎ及びＧｌｎの間の置換；塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇの交換；及び芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。さらに、以下のアミノ酸群は一般的に同等の変化を示す：（１）Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；（２）Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；（３）Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；（４）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；（５）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ。
【０１４３】
同様に、機能に重要な本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片配列におけるアミノ酸は、位置特異的突然変異又はアラニンスキャニング突然変異の如き、本分野において知られる方法によっても同定されうる（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４（４９０８）：１０８１−５を参照のこと）。後者の手順は上記分子内の残基毎に単一のアラニン変異を導入する。生ずる変異分子はその後上記に示される分析を用いて肥満関連活性について試験される。特別興味深いのは、凝集が少ないことの如き、非常に所望される改良された特性を有するタンパク質を作出しうる、電荷を有するアミノ酸の他の電荷を有する又は中性アミノ酸での置換である。凝集は活性を減少させるのみでなく、凝集物は免疫原性でありうるため、医薬の又は生理学的に許容される調剤を調製するとき問題でありうる（例えば、Ｐｉｎｃｋａｒｄ， ｅｔ ａｌ．， （１９６７）Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：３３１−３４０；Ｒｏｂｂｉｎｓ， ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｊｕｌ；３６（７）：８３８−４１；及び Ｃｌｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， （１９９３）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ． １０（４）：３０７−７７を参照のこと）。
【０１４４】
したがって、本発明に係るｇＧＭＧ−２断片の断片、誘導体、アナログ又はホモログは、例えば、：（ｉ）１以上のアミノ酸残基が保存された又は保存されていないアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）で置換される及び上記置換アミノ酸残基は遺伝子コードによりコードされるものでありうる又はありえない（すなわち、非天然のアミノ酸でありうる）もの；又は（ｉｉ）１以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの；又は（ｉｉｉ）ｇＧＭＧ−２断片が、上記断片の半減期を増大させる化合物の如き他の化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合されるもの；又は（ｉｖ）追加のアミノ酸が、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチド又はリーダー若しくは分泌配列又は断片の上記形態の精製に使用される配列又はプロタンパク質配列の如き、断片の上記形態と融合されるものでありうる。上記断片、誘導体及びアナログは本明細書中の教示から当業者の範囲内にあると考えられる。
【０１４５】
本発明のさらなる態様は少なくとも１の保存されたアミノ酸置換であるが５０以下の保存されたアミノ酸置換、４０以下の保存されたアミノ酸置換、３０以下の保存されたアミノ酸置換、及び２０以下の保存されたアミノ酸置換を含む、アミノ酸配列を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。少なくとも１であるが、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１以下の保存されたアミノ酸置換を有するｇＧＭＧ−２断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドも提供される。
【０１４６】
本発明のさらなる態様は前記ポリペプチド断片のＮ−末端の改変をとおしてヂペプチヂルペプチダーゼ切断に耐性にされたＧＭＧ−２ポリペプチド断片に関する。好ましい態様においては、前記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸１４４〜２８８若しくは１６２〜２８８又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸１３４〜２７８若しくは１５２〜２７８又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸１１５〜２５９若しくは１３３〜２５９から選ばれる。好ましい態様においては、前記ヂペプチヂルペプチダーゼ切断は前記好ましい断片からのヂペプチヂルペプチダーゼによるＮ−末端ヂペプチドＳＰ又はＴＡの除去を引き起こす。他の好ましい態様においては、前記ヂペプチヂルペプチダーゼはヂペプチヂルペプチダーゼから成るヒト血漿である。他の好ましい態様においては、前記ヂペプチヂルペプチダーゼは、非限定的に、ヒトＣＤ２６及びヒトアトラクチンから選ばれる。さらに好ましい態様においては、前記ヂペプチヂルペプチダーゼは溶解性のヒトＣＤ２６又は溶解性のヒトアトラクチンから選ばれる。好ましい態様においては、前記Ｎ−末端の改変は、非限定的に、グリケーション［Ｈａｒｔｅ（２００１）Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ９６：９５−１０４、その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する］、Ｎ−メチル化、アルファ−メチル化、デスアミデーション［Ｇａｌｌｗｉｔｚ（２０００）Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ８６：１０３−１１１、その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する］又は１以上のＮ−末端アミノ酸のキラリティーの変化［Ｓｉｅｇｅｌ（１９９９）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ２９：６１０−６１４、その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する］から選ばれる。したがって、本発明は前記ポリペプチド断片のＮ−末端の改変をとおしてヂペプチヂルペプチダーゼ切断に耐性にされたＧＭＧ−２ポリペプチド断片又はその変形をも含む。
【０１４７】
本発明に係る改変されたｇＧＭＧ−２断片の他の特定の態様はタンパク質分解に耐性のポリペプチド、例えば、−ＣＯＮＨ−ペプチド結合が１以上の以下の（ＣＨ２ＮＨ）還元結合；（ＮＨＣＯ）レトロ逆結合；（ＣＨ２−Ｏ）メチレン−オキシ結合；（ＣＨ２−Ｓ）チオメチレン結合；（ＣＨ２ＣＨ２）カルバ結合；（ＣＯ−ＣＨ２）セトメチレン結合：（ＣＨＯＨ−ＣＨ２）ヒドロキシエチレン結合；（Ｎ−Ｎ）結合；Ｅ−アルセン結合；又は−ＣＨ＝ＣＨ−結合により改変された及び置換された、ｇＧＭＧ−２断片である。したがって、本発明は少なくとも１のペプチド結合が上記に示されるように改変されたｇＧＭＧ−２断片又はその変形をも含む。
【０１４８】
さらに、アミノ酸はＬ又はＤ体のキラリティーを有する。いくつかの態様においては、体内での半減期を延ばすために本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片においてアミノ酸のキラリティーを変えることが好ましい。したがって、いくつかの態様においては、１以上のアミノ酸は好ましくはＬ配置で存在する。他の態様においては、１以上のアミノ酸は好ましくはＤ配置で存在する。
【０１４９】
パーセント同一性
本発明に係るポリペプチドは上記に示したｇＧＭＧ−２断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをも含む。ｇＧＭＧ−２断片アミノ酸配列と少なくとも、例えば、９５％「同一の」アミノ酸配列を有するポリペプチドにより、上記アミノ酸配列が上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片アミノ酸配列の１００アミノ酸当たり５までのアミノ酸変化を含みうることを除いては、ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片配列と同一であることが意味される。上記引用配列は上記配列リストの配列に対応する配列を有する上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片である。したがって、ｇＧＭＧ−２断片アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、上記配列中の５％（１００のうちの５）までのアミノ酸残基が挿入され、欠失され又は上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片配列と比較して他のアミノ酸で置換されうる。これらの変化はアミノ若しくはカルボキシ末端又は上記配列内又は上記配列内の１以上の連続的な基の中の残基間に個々に散在するそれらの末端位間のどこでも起こりうる。
【０１５０】
実質的な問題として、特定のポリペプチドがｇＧＭＧ−２断片にパーセント同一であるか否かは既知のコンピュータプログラムを用いて慣用的に決定されうる。上記アルゴリズム及びプログラムは、非限定的に、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、及びＣＬＵＳＴＡＬＷを含む（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５（８）：２４４４−８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５（３）：４０３−４１０；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２（２）：４６７３−４６８０；Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２６６：３８３−４０２；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：３３８９−３４０２；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６−２７２）。特に好ましい態様においては、タンパク質及び核酸配列ホモロジーはＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（“ＢＬＡＳＴ”）を用いて評価され、それは本分野において周知である（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７（６）：２２６４−８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０， １９９３， １９９７， ａｌｌ ｓｕｐｒａを参照のこと）。特に、５の特定のＢＬＡＳＴプログラムは以下のタスクを行うために使用される：
【０１５１】
（１）ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴ３はタンパク質配列データベースに対してアミノ酸クエリー配列を比較する；
（２）ＢＬＡＳＴＮはヌクレオチド配列データベースに対してヌクレオチドクエリー配列を比較する；
（３）ＢＬＡＳＴＸはタンパク質配列データベースに対してクエリーヌクレオチド配列（両方の鎖）の６フレームの概念上の翻訳産物を比較する；
（４）ＴＢＬＡＳＴＮは全ての６のリーディングフレーム（両方の鎖）において翻訳されるヌクレオチド配列データベースに対してクエリータンパク質配列を比較する；及び
（５）ＴＢＬＡＳＴＸはヌクレオチド配列データベースの６フレーム翻訳物に対してヌクレオチドクエリー配列の６フレーム翻訳物を比較する。
【０１５２】
上記ＢＬＡＳＴプログラムは、クエリーアミノ又は核酸配列及び好ましくはタンパク質又は核酸配列データベースから得られる試験配列の間で、本明細書中で「ハイスコアリング セグメントペア」と呼ぶ、類似のセグメントを同定することにより相同的配列を同定する。ハイスコアリング セグメントペアは、その多くが本分野において知られるスコアリングマトリックスの方法により好ましく同定される（すなわち、並べられる）。好ましくは、使用されるスコアリングマトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである（Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６（５０６２）：１４４３−５；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １７（１）：４９−６１を参照のこと）。より好ましくないが、ＰＡＭ又はＰＡＭ２５０マトリックスも使用されうる（例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ， ｅｄｓ， （１９７８）Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｄｉｓｔａｎｃｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ： Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ： Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照のこと）。上記ＢＬＡＳＴプログラムは同定された全てのハイスコアリング セグメントペアの統計的な顕著性を評価し、そして好ましくはユーザーが特定したパーセントホモロジーの如き、ユーザーが特定した顕著性の閾値を満足するセグメントを選択する。好ましくは、ハイスコアリング セグメントペアの統計的な顕著性はＫａｒｌｉｎの統計的な顕著性の式を用いて評価される（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７（６）：２２６４−８を参照のこと）。上記ＢＬＡＳＴプログラムはデフォルトパラメーターで又はユーザーにより提供される改変されたパラメーターで使用されうる。好ましくは、上記パラメーターはデフォルトパラメーターである。
【０１５３】
全体的な配列整合とも言われる、クエリー配列（本発明に係る配列）及び問題の配列の間の最もよい全体的な適合を決定するための好ましい方法はＢｒｕｔｌａｇ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｏｍｐ． Ａｐｐ． Ｂｉｏｓｃｉ． ６：２３７−２４５のアルゴリズムに基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定されうる。配列整合において上記クエリー及び問題の配列は両方アミノ酸配列である。前記全体的な配列整合の結果はパーセント同一性である。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整合において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ＝２５、Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝配列の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝２４７又は問題のアミノ酸配列の長さのいずれか短い方である。
【０１５４】
上記問題の配列が内部の欠失のためでなく、Ｎ−又はＣ−末端欠失のためにクエリー配列よりも短い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムは全体的なパーセント同一性を計算するとき上記問題の配列のＮ−及びＣ−末端切断を考慮しないので、パーセント同一性での上記の結果を手で補正しなければならない。クエリー配列に比較して、Ｎ−及びＣ−末端で切断された問題の配列については、上記パーセント同一性は問題の配列のＮ−及びＣ−末端である、対応する問題の残基と適合／整合しないクエリー配列の残基の数を、上記クエリー配列の総塩基のパーセントとして、計算することにより補正される。残基が適合／整合するか否かはＦＡＳＴＤＢ配列整合の結果により決定される。このパーセントはその後特定のパラメーターを用いて上記ＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算された、パーセント同一性から引かれ、最終的なパーセント同一性スコアに到達する。この最終的なパーセント同一性スコアは本発明の目的のために使用されるものである。上記クエリー配列と適合／整合しない上記問題の配列のＮ−及びＣ−末端の残基のみがパーセント同一性スコアを手で調節する目的のために考慮される。すなわち、上記問題の配列の最も遠いＮ−及びＣ−末端残基の外のクエリーアミノ酸残基のみ。
【０１５５】
例えば、９０アミノ酸残基の問題の配列がパーセント同一性を決定するために１００残基のクエリー配列と整合される。欠失が問題の配列のＮ−末端で起こる、及びそのため、上記ＦＡＳＴＤＢ整合はＮ−末端のはじめの残基と適合／整合しない。１０の対にならない残基は配列の１０％（適合しないＮ−及びＣ−末端の残基の数／クエリー配列における残基の総数）を示すので、１０％はＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されるパーセント同一性スコアから引かれる。残りの９０残基が完全に適合する場合、最終的なパーセント同一性は９０％であろう。
【０１５６】
他の例においては、９０残基の問題の配列が１００残基のクエリー配列と比較される。今度は、欠失は内部であるので、上記クエリー配列と適合／整合しない問題の配列のＮ−又はＣ−末端の残基はない。この場合には、ＦＡＳＴＤＢにより計算されるパーセント同一性は手動で補正されない。再び、上記クエリー配列と適合／整合しない、ＦＡＳＴＤＢ整合において示される、上記問題の配列のＮ−及びＣ−末端の外の残基位置のみが手動で補正される。他の手動の補正は本発明の目的のためになされない。
【０１５７】
産生
本開示をとおして、ＧＭＧ−２ポリペプチド断片が議論されるときはいつでも、ｇＧＭＧ−２断片がＧＭＧ−２ポリペプチド断片の好ましいサブセットとして含まれることが特別に意図されることに注意すべきである。
【０１５８】
ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は好ましくはヒト又は哺乳類の組織サンプルから単離される又はヒト又は哺乳類の細胞内のヒト又は哺乳類の遺伝子から発現される。本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片は本分野において知られる日常の発現方法を用いて作出されうる。所望のポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドは便利な宿主について好適な発現ベクター中へライゲーションされる。真核細胞及び原核細胞宿主系の両方が組換えポリペプチド断片の形成において使用される。上記ポリペプチド断片はその後溶解した細胞から又は培養培地から単離され、そしてその意図される使用に必要とされる程度まで精製される。精製は本分野において知られる技術、例えば、ディファレンシャル抽出、塩画分化、クロマトグラフィー、遠心分離等による。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓを参照のこと。また、ＧＭＧ−２ポリペプチド断片について以前に使用される方法についての実施例１〜３を参照のこと。
【０１５９】
代替の態様においては、本発明に係るポリペプチドは乳から単離される。上記ポリペプチドは全長ＧＭＧ−２ポリペプチドとして精製されることができ、それはその後、適切な場合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで切断されてＧＭＧ−２断片を作出する、又は、あるいは、ＧＭＧ−２断片それ自体が上記乳から精製されうる。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｎｅｗ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓｉｍｏｎ Ｒｏｅ，ＡＥＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈａｒｗｅｌｌ； Ｃｌａｒｋ（１９９８）Ｊ Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ３：３３７−５０；Ｗｉｌｋｉｎｓ ａｎｄ Ｖｅｌａｎｄｅｒ（１９９２）４９：３３３−８；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ６，１４０，５５２；６，０２５，５４０；Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｖｏｌ．１，ｐｐ．３−８（１９９０）；Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ７：３１−７；Ｄｅｇｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ ７９９：１２５−３７；Ｗｉｌｋｉｎｓ（１９９３）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｕｐｐｌ．０（１７ ｐａｒｔ Ａ）：３９において教示されるものを含む、多くの方法のいずれも乳からの本ポリペプチドを精製するために使用されることができる；そのそれぞれの全開示を本明細書中に援用する。典型的な態様においては、乳は脂質画分を分離するために例えば、比較的遅いスピードで遠心分離される、及び上記水性上清はその後残る「ホエー」画分から乳中のカゼインを分離するためにより速いスピードで遠心分離される。しばしば、生物医薬タンパク質がこのホエー画分中に見られ、及び標準のクロマトグラフィーの又は例えば、本明細書中のどこかに示されるタンパク質精製に通常使用される他の手順を用いてこの画分から単離されうる。１の好ましい態様においては、ＧＭＧ−２ポリペプチドはＧＭＧ−２ポリペプチドに特異的な抗体を用いて、例えば、アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製される。さらに、方法、例えば、電気泳動又は特定の大きさのタンパク質を単離するための他の方法は特定のＧＭＧ−２断片を単離するために使用されうる。ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は哺乳類の乳中に天然に存在することが発見されている（例えば、実施例１８を参照のこと）ので、これらの方法を用いて単離されるＧＭＧ−２ポリペプチドは天然でありうる又は以下に示すように、非ヒト哺乳類の乳腺におけるタンパク質の組換えの産生の結果でありうる。１の上記態様において、上記ＧＭＧ−２断片は異種の、抗原性ポリペプチド配列を有する融合タンパク質として産生され、その抗原性配列は、例えば、標準の免疫アフィニティー法を用いて、上記タンパク質を精製するために使用されうる。
【０１６０】
さらに、より短いタンパク質断片は化学合成により作出されうる。あるいは、本発明に係るタンパク質はヒト又は非ヒト動物の細胞又は組織から抽出される。タンパク質を精製する方法は本分野において知られ、そして粒子を破壊するための界面活性剤又はカオトロピック剤の使用、続いてディファレンシャル抽出並びにイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、濃度にしたがった沈降分離、及びゲル電気泳動による上記ポリペプチドの分離を含む。
【０１６１】
いかなるＧＭＧ−２断片ｃＤＮＡもＧＭＧ−２ポリペプチド断片を発現するために使用されうる。発現されるべきＧＭＧ−２断片をコードする核酸は慣用のクローニング技術を用いて発現ベクター中のプロモーターに実施可能に結合される。発現ベクター中のＧＭＧ−２断片ｃＤＮＡインサートは：（後に改変されるべき）全長ＧＭＧ−２ポリペプチド；全長ＧＭＧ−２ポリペプチドよりも６アミノ酸〜１アミノ酸少ないもの；ｇＧＭＧ−２断片；又は変形及び％類似のポリペプチドについてのコード配列を含みうる。
【０１６２】
上記発現ベクターは本分野において知られる哺乳類、酵母、昆虫又は菌の発現系のいずれでもあり、それらのうちのいくつかは本明細書中に示され、そしてその例は実施例（実施例１〜３）中に与えられる。商業的に入手可能なベクター及び発現系はＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を含むさまざまな供給者から入手可能である。所望の場合は、発現を高める及び適切なタンパク質折りたたみを促進するために、上記配列のコドンコンテクスト及びコドンペアリングは、その開示をそれらを全体として本明細書中に援用するＨａｔｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第５，０８２，７６７号により説明されるように、発現ベクターが導入される特定の発現生物について最適化されうる。
【０１６３】
ＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードする核酸が開始部位としてはたらくメチオニンを欠く場合、開始メチオニンは慣用の技術を用いて核酸のはじめのコドンの隣に導入されうる。同様に、上記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片ｃＤＮＡからの挿入物がポリＡシグナルを欠く場合、この配列は、例えば、ＢｇｌＩ及びＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ酵素を用いてｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのポリＡシグナルを切り出し、そしてそれを哺乳類の発現ベクターｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に導入することにより、上記構築物に加えられうる。ｐＸＴ１はモロニーマウス白血病ウイルスからのＬＴＲｓ及びギャグ遺伝子の一部を含む。上記構築物中のＬＴＲｓの一部は効果的で安定的なトランスフェクションを許す。上記ベクターは単純ヘルペスチミヂンキナーゼプロモーター及び選択可能なネオマイシン遺伝子を含む。
【０１６４】
ＧＭＧ−２断片をコードする核酸は、所望のＧＭＧ−２ｃＤＮＡに相補的な、及び５’プライマー中に導入されたＰｓｔＩ及び対応するｃＤＮＡ３’プライマーの５’末端でＢｇｌＩＩについての制限エンドヌクレアーゼ配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＧＭＧ−２ヌクレオチド配列を含むベクターから、上記ＧＭＧ−２断片をコードする配列がポリＡシグナルに関して適切に位置付けられることを確実にすることに留意しながら、ＰＣＲにより得られうる。生ずるＰＣＲ反応から得られた精製した断片はＰｓｔＩで消化され、エキソヌクレアーゼで平滑末端にされ、ＢｇｌＩＩで消化され、精製され、そしてｐＸＴ１にライゲーションされて、ポリＡシグナルを含むことになり、そしてＢｇｌＩＩで消化される。代替の方法は実施例１〜３中に示される。
【０１６５】
ＧＭＧ−２断片を発現するベクターのマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞へのトランスフェクションはポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する１の態様である。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの宿主細胞への導入はリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、陽イオン性脂質仲介トランスフェクション、エレクトロポーレーション、トランスダクション、感染又は他の方法により影響されうる。上記方法はＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）の如き、多くの標準の研究室マニュアル中に示される。本発明に係るポリペプチドは実際に組換えベクターを欠く宿主細胞により発現されうることが特に企図される。細胞内で本発明に係るＧＭＧ−２断片を発現させる方法は実施例１〜３中に示される。
【０１６６】
本発明に係るポリペプチド（すなわち、ｇＧＭＧ−２断片）は硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法により組換え細胞培養物から回復され及び精製されうる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（“ＨＰＬＣ”）が精製に使用される。本発明に係るポリペプチド、及び好ましくは上記分泌された形態も：直接単離され又は培養された、体液、組織及び細胞を含む、天然の源からの精製した産物；化学合成手順の産物；及び例えば、菌類、酵母、高等植物、昆虫、及び哺乳類細胞を含む原核細胞又は真核細胞宿主からの組換え技術により作出された産物から回復されうる。
【０１６７】
組換え産生手順において使用される宿主に因り、本発明に係るポリペプチドはグリコシル化されうる又は非グリコシル化されうる。好ましくは、本発明に係るポリペプチドを含むＧＭＧ−２球状ドメインは非グリコシル化される。さらに、本発明に係るポリペプチドは、いくつかの場合宿主仲介プロセスの結果として、開始の改変されたメチオニン残基をも含みうる。したがって、翻訳開始コドンによりコードされるＮ−末端メチオニンは一般的に全ての真核細胞において翻訳後にタンパク質から高い率で除去されることが本分野において周知である。ほとんどのタンパク質についてのＮ−末端メチオニンはほとんどの原核生物においても効果的に除去される一方で、いくつかのタンパク質については、この原核生物除去プロセスが上記Ｎ−末端メチオニンが共有結合的に結合しているアミノ酸の性質に因り、不十分である。
【０１６８】
本明細書中で議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加えて、本発明は、内因性の遺伝子材料（例えば、コード配列）を欠失させる又は置き換えるよう、及び／又は本発明に係るポリヌクレオチドに実施可能に関連し、そして内因性のポリヌクレオチドを活性化する、変化させる、及び／又は増幅させる遺伝子材料（例えば、異種のポリヌクレオチド配列）を含むよう作り変えた、脊椎動物起源、特に哺乳類起源の初代の、二代目の、及び不死化した宿主細胞をも含む。例えば、本分野において知られる技術は相同組換えを介して異種のコントロール領域（例えば、プロモーター及び／又はエンハンサー）及び内因性のポリヌクレオチド配列を実施可能に関連させるために使用されることができ、例えば、１９９７年６月２４日発行の米国特許第５，６４１，６７０号；１９９６年９月２６日公開の国際公開番号ＷＯ ９６／２９４１１；１９９４年８月４日公開の国際公開番号ＷＯ ９４／１２６５０；Ｋｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６（２２）：８９３２−５；Ｋｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６（２２）：８９２７−３１；及びＺｉｊｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２（６２４８）：４３５−８を参照のこと；そのそれぞれの開示はそれらを全体として本明細書中に援用する。
【０１６９】
改変
さらに、本発明に係るポリペプチドは本分野において知られる技術を用いて化学合成されうる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９９３ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ；ａｎｄ Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１０（５９７３）：１０５−１１を参照のこと）。例えば、本発明に係る比較的短い断片はペプチド合成機の使用により合成されうる。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸又は化学アミノ酸アナログが上記断片配列中に置換又は追加として導入されうる。非古典的アミノ酸は、非限定的に、通常のアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ヂアミノブチル酸、ａ−アミノイソブチル酸、４−アミノブチル酸、Ａｂｕ、２−アミノブチル酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサノン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソブチル酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグルシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、ｂ−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸の如きデザイナーアミノ酸、及び一般のアミノ酸アナログを含む。さらに、上記アミノ酸はＤ（右旋性）又はＬ（左旋性）でありうる。
【０１７０】
本発明は例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／防御基による誘導体化、タンパク質分解的切断、抗体分子又は他の細胞内リガンドへの結合等により翻訳中又は後に特異に改変されたポリペプチド断片を含む。多くの化学修飾のいずれも、非限定的に、臭化シアノーゲン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学的切断；アセチル化、フォルミル化、酸化、還元；タニカマイシンの存在下での代謝合成；等を含む既知の技術により行われうる。
【０１７１】
本発明に含まれる追加の翻訳後修飾は、例えば、Ｎ−結合又はＯ−結合炭水化物鎖、Ｎ−末端又はＣ−末端のプロセッシング、アミノ酸骨格への化学基の結合、Ｎ−結合又はＯ−結合炭水化物鎖の化学修飾、及び原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ−末端メチオニン残基の追加又は欠失を含む。上記ポリペプチド断片は、上記ポリペプチドの検出及び単離を許すための酵素的な、蛍光の、同位体の又はアフィニティーの標識の如き、検出可能な標識と共にも改変されうる。
【０１７２】
また本発明により、上記ポリペプチドの増大した溶解性、安定性及び循環時間又は減少した免疫原性の如き、追加の利点を提供しうる本発明に係るポリペプチドの化学修飾された誘導体が提供される。米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと。誘導体化のための化学基はポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリヴィニルアルコール等の如き、水溶解性ポリマーから選ばれうる。上記ポリペプチドは上記分子内でランダムな位置で又は上記分子内で前決定された位置で改変されることができ、そして１、２、３又はそれ以上の結合した化学基を含みうる。
【０１７３】
上記ポリマーはいかなる分子量からもなることができ、そして枝分かれしうる又は枝分かれしない。ポリエチレングリコールについて、好ましい分子量は取り扱い及び製造の容易さのために、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａである（上記用語「約」はポリエチレングリコールの調製物において、いくつかの分子は示した分子量より重く、いくつかはより軽いであろうということを示す）。他の大きさは、所望の治療プロファイル（例えば、所望される維持された放出の長さ、ある場合は生物学的活性への効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度又は欠如及び上記ポリエチレングリコールの治療タンパク質又はアナログへの他の既知の効果）に因り使用されうる。
【０１７４】
上記ポリエチレングリコール分子（又は他の化学基）は上記ポリペプチドの機能的な又は抗原性のドメインへの効果を考慮して上記ポリペプチドに結合されるべきである。当業者に入手可能ないくつかの結合方法がある、例えば、本明細書中に援用するＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦへのＰＥＧのカップリング）、また塩化トレシルを用いたＧＭ−ＣＳＦのペジレーションを報告するＭａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０（８）：１０２８−３５を参照のこと。例えば、ポリエチレングリコールは遊離アミノ又はカルボキシル基の如き、反応基を介してアミノ酸残基をとおして共有結合されうる。反応基は活性化されたポリエチレングリコール分子が結合されうるものである。遊離アミノ酸を有するアミノ酸残基はリジン残基及びＮ−末端アミノ酸残基を含みうる；遊離カルボキシル基を有するものはアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基及びＣ−末端アミノ酸残基を含みうる。サルフヒドリル基もポリエチレングリコール分子の結合のために反応基として使用されうる。治療目的のために好ましいものはＮ−末端又はリジン基での結合の如き、アミノ基での結合である。
【０１７５】
Ｎ−末端で化学修飾されたタンパク質が特に所望されうる。本組成物の例示としてポリエチレングリコールを用いて、（分子量、枝分かれ等による）さまざまなポリエチレングリコール分子、反応混合物中のポリエチレングリコール分子のタンパク質（ポリペプチド）分子に対する割合、達成されるべきペジレーション反応の型、及び選択されたＮ−末端にペジル化されたタンパク質を得る方法が選択されうる。Ｎ−末端にペジル化した調製物を得る方法（すなわち、必要で有ればこの基を他のモノペジル化基から分離すること）はペジル化タンパク質分子の集団からのＮ−末端ペジル化材料の精製によりうる。Ｎ−末端で化学修飾された選択的タンパク質は、特定のタンパク質における誘導体化について入手可能な異なる型の第一アミノ基（リジン対Ｎ−末端）の特異な反応性を活用する、還元アルキル化により完成されうる。適切な反応条件下で、重合体を含むカルボニル基でのＮ−末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０１７６】
さらなる好ましい態様においては、本発明はボディマスを減少させる必要のある個体に第一の局面のＧＭＧ−２ポリペプチド断片のヂペプチヂルペプチダーゼ切断のアンタゴニストの供給又は投与と共に、第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物を提供する又は投与することを含むボディマスの減少方法を特徴付ける。
【０１７７】
好ましい前記アンタゴニストはアルファ−アミノアルキルリン酸のヂエステルのペプチヂル誘導体である（米国特許第５，５４３，３９６号、その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する）。より好ましい前記ペプチヂル誘導体はＡｌａ−ＰｒｏP（ＯＺ）2、ＡｃＯＨ．Ａｌａ−ＰｉｐP（Ｏｐｈ）2、ＨＣｌ．Ａｌａ−ＰｒｏP（Ｏｐｈ−４Ｃｌ）2、ＨＣｌ．Ａｌａ−ＰｉｐP（Ｏｐｈ−４Ｃｌ）2又は２ＨＣｌ．Ｌｙｓ−ＰｉｐP（Ｏｐｈ−４Ｃｌ）2から選ばれ、ここで、Ｚはアリール基、置換されたアリール基又は非常にフルオロ化されたアルキル基を示し、ＰｒｏPはリン酸プロリン誘導体を示し、及びＰｉｐPはリン酸ピペリヂルを示す（米国特許第５，５４３，３９６号、その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する）。
【０１７８】
他の好ましい前記アンタゴニストは一般式Ｚ−Ｘａａ−Ｙ’の化合物であり、ここで、Ｘａａはアミノ酸であり、Ｚは保護基であり、及びＹ’はさまざまな型の環状構造の１である（米国特許第６，０９０，７８６号、その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する）。より好ましいものはＺが存在しうる又は存在しない、及びベンジルオキシカルボニルの如き保護基を示す；Ｘａａがアラニン、メチオニン、アルギニン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、プロリン、アスパラギン、セリン、システイン、スレオニン、グリシン、チロシン、グルタミン酸、トリプトファン、グルタミン、バリン、イソロイシン、リジン、ロイシン、Ｌ−チオプロリン、Ｌ−ホモプロリン、Ｌ−１，２，３，４，テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）、Ｌ−２，３−ヂヒドロインドール−２−カルボン酸、Ｌ−ナフチルグリシン、Ｌ−フェニルグリシン、Ｌ−４−フェニルプロリン、Ｏ−ベンジルチロシン、オメガ−Ｚリジン又はオメガ−アセチルリジンを示す；及びＹ’はピローリヂド、フォスフォネート又はフォスフィネート誘導体又は還元ペプチドを示す前記化合物；又はその医薬として許容される塩である（米国特許第６，０９０，７８６号、その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する）。
他の好ましい前記アンタゴニストはサルフォスチンである（米国特許第６，２１４，３４０号、その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する）。
【０１７９】
他の好ましい前記アンタゴニストはＮ−（置換されたグリシル）−２−シアノピローリヂンである（米国特許第６，１６６，０６３号）。より好ましい前記Ｎ−（置換されたグリシル）−２−シアノピローリヂンはピローリヂン，１−［［（３，５−ヂメチル−１−アダマンチル）アミノ］−アセチル］−２−シアノ−，（Ｓ）−；ピローリヂン，１−［［（３−エチル−１−アダマンチル）アミノ］−アセチル］−２−シアノ−，（Ｓ）−；ピローリヂン、１−［［（３−メトキシ−１−アダマンチル）アミノ］−アセチル］−２−シアノ−，（Ｓ）−；ピローリヂン，１−［［［３−［［（ｔ−ブチルアミノ）カルボニル］オキシ］−１−アダマンチル］アミノ］−アセチル］−２−シアノ−，（Ｓ）−；ピローリヂン、１−［［［３−［［［（４−メトキシフェニル）アミノ］−カルボニル］オキシ］−１−アダマンチル］アミノ］−アセチル］−２−シアノ，（Ｓ）−；ピローリヂン、１−［［［（３−［［（フェニルアミノ）カルボニル］オキシ］−１−アダマンチル］アミノ］−アセチル］−２−シアノ−，（Ｓ）−；ピローリヂン，１−［［（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）アミノ］−アセチル］−２−シアノ−，（Ｓ）−；ピローリヂン，１−［［（３−アセチルオキシ−１−アダマンチル）アミノ］−アセチル］−２−シアノ−，（Ｓ）−；ピローリヂン，１−［［［（３−［［［（ヂイソプロピル）アミノ］カルボニル］オキシ］−１−アダマンチル］アミノ］−アセチル−２−シアノ−，（Ｓ）−；ピローリヂン，１−［［［３−［［［（シクロヘキシル）アミノ］カルボニル］オキシ］−１−アダマンチル］アミノ］−アセチル］−２−シアノ−，（Ｓ）−；ピローリヂン，１−［［（３−エトキシ−１−アダマンチル）アミノ］−アセチル］−２−シアノ−，（Ｓ）−；又はそれぞれの場合においては、それらの医薬として許容される酸添加塩から選ばれる（米国特許第６，１６６，０６３号）。
【０１８０】
他の好ましい前記アンタゴニストは式＃＃ＳＴＲ１＃＃のテトラヒドロイソキノリン３−カルボキサミド誘導体である（米国特許第６，１７２，０８１号）。より好ましいものはＸがＣＨ2、Ｓ、Ｏ又はＣ（ＣＨ3）2である；Ｒ1及びＲ2が独立に水素、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アラルコキシ又はハロゲンである、前記誘導体及びその医薬として許容される塩である（米国特許第６，１７２，０８１号）。
【０１８１】
他の好ましい前記アンタゴニストはバリン−ピローリヂドである［Ｄｅａｃｏｎ（２００１）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５０：１５８８−１５９７、その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する］。
【０１８２】
複合体（多量体）
本発明に係るポリペプチド断片は単量体又は複合体で存在しうる。最も好ましくは、本発明に係るポリペプチド断片はホモ三量体である。したがって、本発明は本発明に係るポリペプチド断片の単量体及び複合体、それらの調製、及びそれらを含む組成物（好ましくは、医薬の又は生理学的に許容される組成物）に関連する。特定の態様においては、本発明に係るポリペプチドはホモ三量体である。さらなる態様においては、本発明に係る複合体はホモ三量体を含む、主にそれから成る又はそれから成る。
【０１８３】
本発明に含まれる複合体はホモ体又はヘテロ体でありうる。本明細書中で使用されるとき、上記用語ホモ体は（本明細書中に示されるこれらのポリペプチド断片に対応するポリペプチド断片、変形、スプライス変形、及び融合タンパク質を含む）本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片に対応するポリペプチドのみを含む複合体をいう。これらのホモ体は同一の又は異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド断片を含みうる。特定の態様においては、本発明に係るホモ体は同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド断片のみを含む複合体である。他の特定の態様においては、本発明に係るホモ体は異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド断片を含む複合体である。特定の態様においては、本発明に係る複合体は（例えば、同一の又は異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド断片を含む）ホモ二量体又は（例えば、同一の及び／又は異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド断片を含む）ホモ三量体である。追加の態様においては、本発明に係るホモの複合体は少なくとも１のホモ二量体、少なくとも１のホモ三量体又は少なくとも１のホモ四量体である。より好ましくは、本発明に係るホモの複合体はホモ三量体である。さらにより好ましくは、本発明に係る前記ホモ三量体はｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体である。最も好ましくは、本発明に係る前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体は脂質分割、脂質代謝、及びインスリン様活性から成る群から選ばれる活性を有する。また最も好ましくは、本発明に係る前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体は体重増加の予防、体重減少、及び体重減少の維持から成る群から選ばれる活性を有する。
【０１８４】
本明細書中で使用されるとき、上記用語ヘテロ体は本発明に係るポリペプチドに加えて、１以上の異種のポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質又はそのポリペプチド断片に対応する）を含む複合体をいう。特定の態様においては、本発明に係る複合体はヘテロ二量体、ヘテロ三量体又はヘテロ四量体である。追加の態様においては、本発明に係るヘテロの複合体は少なくとも１のヘテロ二量体、少なくとも１のヘテロ三量体又は少なくとも１のヘテロ四量体である。
【０１８５】
本発明に係る複合体は疎水性、親水性、イオン性及び／又は共有結合の結果でありうる及び／又は例えば、リポソーム形成により間接的に結合されうる。したがって、最も好ましい態様においては、本発明に係るホモ三量体は本発明に係るポリペプチドが溶液中で互いに接触するとき形成される。他の態様においては、例えば、ヘテロ三量体又はヘテロ四量体の如き、本発明に係るヘテロ複合体は本発明に係るポリペプチドが溶液中で（本発明に係る融合タンパク質中の異種のポリペプチド配列に対する抗体を含む）本発明に係るポリペプチドに対する抗体と接触するとき形成される。他の態様においては、本発明に係る複合体は本発明に係るポリペプチドと及び／又はその間で共有結合により形成される。上記共有結合は上記ポリペプチド配列中に含まれる１以上のアミノ酸残基（例えば、配列リスト中に引用される又は沈殿されたクローンによりコードされるポリペプチド中に含まれるもの）を含みうる。１の場合においては、上記共有結合はポリペプチド配列内に位置されるシステイン残基の間のクロス結合であり、それは天然（すなわち、天然に起こる）ポリペプチド内で相互作用する。他の場合においては、上記共有結合は化学又は組換え操作の結果である。あるいは、上記共有結合は本発明に係る融合タンパク質中の異種のポリペプチド配列中に含まれる１以上のアミノ酸残基に関連しうる。
【０１８６】
本発明に係る特定の好ましい態様においては、本発明に係る前記複合体はｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体である。最も好ましくは、本発明に係る前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体は脂質分割、脂質代謝、及びインスリン様活性から成る群から選ばれる活性を有する。また最も好ましくは、本発明に係る前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体は体重増加の予防、体重減少、及び体重減少の維持から成る群から選ばれる活性を有する。
【０１８７】
１の例においては、共有結合は本発明に係る融合タンパク質中に含まれる異種の配列の間である（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の例においては、上記共有結合は（本明細書中に示される）本発明に係るＦｃ融合タンパク質中に含まれる異種の配列の間である。他の特定の例においては、本発明に係る融合タンパク質の共有結合は、例えば、オセテオプロテゲリンの如き、共有結合した複合体を形成することのできる他のタンパク質からの異種のポリペプチド配列の間である（例えば、国際公開番号：ＷＯ ９８／４９３０５を参照のこと、その内容をそれらを全体として本明細書中に援用する）。他の態様においては、本発明に係る２以上のポリペプチドはペプチド結合をとおして結合される。例は（本明細書中に援用する）米国特許第５，０７３，６２７号中に示されるそれらのペプチド結合を含む。ペプチド結合により分離される本発明に係る複数のポリペプチドを含むタンパク質は慣用の組換えＤＮＡ技術を用いて作出されうる。
【０１８８】
本発明に係る複合体ポリペプチドの他の調製方法はロイシンジッパー又はイソロイシンジッパーポリペプチド配列に融合した本発明に係るポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパー及びイソロイシンジッパードメインはそれらが発見されたタンパク質の複合体化を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパーはもともといくつかのＤＮＡ−結合タンパク質中で同定され、そしてそれ以来さまざまな異なるタンパク質中で発見されている（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． Ｊｕｌ；２（７）：７８６−８００）。既知のロイシンジッパーのうちには二量体化する又は三量体化する天然のペプチド及びその誘導体がある。本発明に係る溶解性の複合体タンパク質を作出するために好適なロイシンジッパードメインの例はＰＣＴ出願ＷＯ ９４／１０３０８中に示されるものであり、本明細書中に援用する。溶液中で二量体化する又は三量体化するポリペプチド配列に融合された本発明に係るポリペプチドを含む組換え融合タンパク質は好適な宿主細胞中に発現され、そして生ずる溶解性の複合体融合タンパク質は本分野において知られる技術を用いて培養上清から回復される。
【０１８９】
本発明に係る三量体ポリペプチドは高められた生物学的活性の利点を提供しうる。好ましいロイシンジッパー基及びイソロイシン基は優先的に三量体を形成するものである。１の例はＨｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９４）３４４（２〜３）：１９１−５中及び米国特許出願シリアル番号 ０８／４４６，９２２号中に示される、肺の界面活性タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーであり、本明細書中に援用する。天然の三量体タンパク質に由来する他のペプチドは本発明に係る三量体ポリペプチドの調製において使用されうる。他の例においては、本発明に係るタンパク質はＦｌａｇ（商標）及びＦｌａｇ（商標）ポリペプチド配列を含む本発明に係る融合タンパク質中に含まれるポリペプチド配列の間の相互作用により結合される。さらなる態様においては、本発明に係るタンパク質は本発明に係るＦｌａｇ（商標）融合タンパク質中に含まれる異種のポリペプチド配列及び抗Ｆｌａｇ（商標）抗体の間の相互作用により結合される。
【０１９０】
本発明に係る複合体は本分野において知られる化学技術を用いて作出されうる。例えば、本発明に係る複合体中に含まれることが所望されるポリペプチドは本分野において知られるリンカー分子及びリンカー分子長最適化技術を用いて化学的にクロスリンクされうる（例えば、それを全体として本明細書中に援用する米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明に係る複合体は上記複合体中に含まれることが所望されるポリペプチドの配列内に位置するシステイン残基の間で１以上の分子内クロスリンクを形成する本分野において知られる技術を用いて作出されうる（例えば、それを全体として本明細書中に援用する米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明に係るポリペプチドは上記ポリペプチドのＣ−末端又はＮ−末端へのシステイン又はビオチンの追加により慣例的に改変されることができ、そして本分野において知られる技術は１以上のこれらの改変したポリペプチドを含む複合体を作出するために適用されうる（例えば、それを全体として本明細書中に援用する米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本分野において知られる少なくとも３０の技術が本発明に係る複合体中に含まれることが所望されるポリペプチド成分を含むリポソームを作出するために適用されうる（例えば、それを全体として本明細書中に援用する米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０１９１】
あるいは、本発明に係る複合体は本分野において知られる遺伝子工学技術を用いて作出されうる。１の態様においては、本発明に係る複合体中に含まれるポリペプチドは本明細書中に示される又はそうでなければ本分野において知られる融合タンパク質技術を用いて組換え体として作出される（例えば、それを全体として本明細書中に援用する米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の態様においては、本発明に係るホモ二量体をコードするポリヌクレオチドは本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をリンカーポリペプチドをコードする配列に、そしてその後さらに（リーダー配列を欠く）もとのＣ−末端からＮ−末端への逆向きのポリペプチドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチドにつなげることにより作出される（例えば、それを全体として本明細書中に援用する米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。他の態様においては、本明細書中において示される又はそうでなければ本分野において知られる組換え技術は膜貫通ドメイン（又は疎水性の若しくはシグナルペプチド）を含む本発明に係る組換えポリペプチドを作出するために適用され、そしてそれは膜再構成技術によりリポソーム中に導入されうる（例えば、それを全体として本明細書中に援用する米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０１９２】
ＩＩ． 本発明に係るＧＭＧ−２ポリヌクレオチド
好ましいポリヌクレオチドは全長ＧＭＧ−２及び本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードするものである。全長ＧＭＧ−２及びｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードする組換えポリヌクレオチドは、非限定的に、肥満関連疾患及び障害の治療及び／又は予防及び／又はボディマスを減少させることに加えて、その活性のアゴニスト及びアンタゴニストについてのスクリーニング分析、診断スクリーニング、及び抗体作成を含む、さまざまな方法における使用のためのその精製を促進することに加えて、非限定的に、その活性のアンタゴニスト及びアゴニストについてのスクリーニング分析における使用のための組換え細胞中でポリペプチドを発現することを含む、さまざまな方法で使用されうる。
【０１９３】
本発明は全長ＧＭＧ−２及びｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片及び本明細書中に示されるそのさまざまなポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドに関連する。これらのポリヌクレオチドは精製され、単離され、及び／又は組換えでありうる。全ての場合においては、本発明に係る所望のＧＭＧ−２及びｇＧＭＧ−２ポリヌクレオチドは本明細書中に示される及び議論される肥満関連活性を有する本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードするものである。
【０１９４】
断片
ポリヌクレオチド断片は全長ＧＭＧ−２ポリペプチドの全体ではないが、部分として全て同じである配列又は特定のｇＧＭＧ−２ポリペプチドヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである。上記断片は「遊離状態」で、すなわち、他のポリヌクレオチドの部分又はそれに融合された状態ではなく、存在しうる又はそれらは、それらが部分又は領域を形成する他の非ＧＭＧ−２又は非ｇＧＭＧ−２（異種の）ポリヌクレオチド内に含まれうる。しかしながら、いくつかのｇＧＭＧ−２ポリヌクレオチド断片は単一のポリヌクレオチド内に含まれうる。
【０１９５】
本発明に係るＧＭＧ−２ポリヌクレオチドは無傷のＧＭＧ−２ポリペプチドをコードする全長ポリヌクレオチド配列未満の１８連続塩基〜１８連続塩基、例えば、配列ＩＤ番号：１、３又は５中の全長ＧＭＧ−２ポリペプチドポリヌクレオチド配列を含む。この態様の１の局面においては、上記ポリヌクレオチドは本発明に係るポリヌクレオチドの少なくとも
【化２５】
の連続したヌクレオチドを含む。
【０１９６】
上記の好ましい核酸の大きさに加えて、さらに好ましい核酸は少なくとも１８ヌクレオチドを含み、ここで、「少なくとも１８」は１８及び配列ＩＤ番号：１、３又は５中に又は本明細書中のどこかに示される無傷のＧＭＧ−２ポリペプチドｃＤＮＡの３’端ヌクレオチド位より１８ヌクレオチド少ない整数の間の整数として定義される。
【０１９７】
本発明に係る好ましいポリヌクレオチドとしてさらに含まれるものは、さらにそれらの５’及び３’位の点で特定される、上記に示される、少なくとも１８ヌクレオチドの長さの核酸断片である。上記５’及び３’位は以下の配列リスト中に示される位置数により示される。対立遺伝子の及び縮合した及び他の変形については、１位はＯＲＦの５’端ヌクレオチドとして定義される、すなわち、残りのヌクレオチドと共に開始コドン（ＡＴＧ）のヌクレオチド「Ａ」は連続的に番号付けされる。それゆえ、ポリヌクレオチド断片発明、長さが少なくとも１８の連続したヌクレオチドが本発明に係る無傷のＧＭＧ−２ポリペプチドポリヌクレオチド上を占めうる、５’及び３’ヌクレオチド位のどの組み合わせも個々の種として本発明に含まれる。５’及び３’により特定されるポリヌクレオチド断片は即座に構想されることができ、それゆえ本明細書を不必要に長くさせない目的のために単独で個々には列挙されない。
【０１９８】
本発明に係るポリヌクレオチド断片の上記種はあるいは、式「ｘ〜ｙ」により示されることができ、ここで、「ｘ」は上記ポリヌクレオチドの５’端ヌクレオチドに等しい及び「ｙ」は３’端ヌクレオチド位に等しい；及びさらに、ここで、「ｘ」は１〜本発明に係るポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数引く１８の間の整数に等しい、及びここで、「ｙ」は１９〜本発明に係るポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数の間の整数に等しい；及びここで、「ｘ」は少なくとも１８「ｙ」より小さい整数である、ということが留意される。
【０１９９】
本発明は５’及び３’位により特定される本発明に係るポリヌクレオチド断片又は上記に示されるヌクレオチドにおける大きさにより特定されるポリヌクレオチドの種の排除をも提供する。５’及び３’位により又はヌクレオチドにおける大きさにより特定された断片の数は、上記に示されるように、排除されうる。
【０２００】
本発明に係るＧＭＧ−２ポリヌクレオチド断片は本明細書中に示されるＧＭＧ−２断片をコードする１８の連続的な塩基〜全長ポリヌクレオチド配列を含む。この態様の１の局面においては、上記ポリヌクレオチドは本発明に係るポリヌクレオチドの少なくとも
【化２６】
の連続的なヌクレオチドを含む。
【０２０１】
上記の好ましい核酸の大きさに加えて、さらに好ましい核酸は少なくとも１８ヌクレオチドを含み、ここで、「少なくとも１８」は１８〜本明細書中のｇＧＭＧ−２断片ｃＤＮＡの３’端ヌクレオチド位に対応する整数の間の整数として定義される。
【０２０２】
本発明に係る好ましいポリヌクレオチドとしてさらに含まれるものは、さらにそれらの５’及び３’位の点で特定される、上記に示される、長さが少なくとも１８ヌクレオチドの核酸断片である。上記５’及び３’位は以下の配列リスト中に示される位置数により示される。対立遺伝子の及び縮合した及び他の変形については、１位はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’端ヌクレオチドとして定義される、すなわち、残りのヌクレオチドと共に開始コドン（ＡＴＧ）のヌクレオチド「Ａ」は連続的に番号付けられる。それゆえ、ポリヌクレオチド断片発明、長さが少なくとも１８の連続したヌクレオチドが本発明に係るｇＧＭＧ−２断片ポリヌクレオチド上を占めうる、５’及び３’ヌクレオチド位のどの組み合わせも個々の種として本発明に含まれる。５’及び３’位により特定されるポリヌクレオチド断片は即座に構想されることができ、そしてそれゆえ、本明細書を不必要に長くさせない目的のために単独で個々には列挙されない。
【０２０３】
本発明に係るポリヌクレオチド断片の上記の種はあるいは、式「ｘ〜ｙ」により示されることができ；ここで、「ｘ」は上記ポリヌクレオチドの５’端ヌクレオチド位に等しい及び「ｙ」は３’端ヌクレオチド位に等しい；及びさらに、ここで、「ｘ」は１〜本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数引く１８の間の整数に等しい、及びここで、「ｙ」は９〜本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数の間の整数に等しい；及びここで、「ｘ」は少なくとも１８「ｙ」より小さい整数である、ということが留意される。「ｘ」及び「ｙ」位のどの組み合わせも本発明に係る特定の態様として含まれる。さらに、式「ｘ」〜「ｙ」は「ｘ１−ｘ２」〜「ｙ１−ｙ２」として改変されることができ、ここで、「ｘ１−ｘ２」及び「ｙ１−ｙ２」は配列リストの２のヌクレオチド位から選ばれる位置範囲を示す。代替の式は「ｘ１−ｘ２」〜「ｙ」及び「ｘ」〜「ｙ１−ｙ２」を含む。
【０２０４】
これらの特定の態様、及び本明細書中に示される他のポリヌクレオチド断片の態様は「少なくとも」、「に等しい」、「以下の」、「未満の」、「少なくとも＿であるが＿以下の」又は「＿〜＿の」特定の大きさ又は特定の５’及び／又は３’位であるとして改変されうる。本発明はまた、５’及び３’位により特定される本発明に係るポリヌクレオチド断片又は上記に示されるヌクレオチドにおける大きさにより特定されるポリヌクレオチドの種の排除をも提供する。５’及び３’位により又はヌクレオチドにおける大きさにより特定される断片の数は、上記に示されるように、排除されうる。
【０２０５】
変形
他の好ましい態様においては、ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードするｇＧＭＧ−２ポリヌクレオチドの変形が構想される。ポリヌクレオチドの変形は、上記用語が本明細書中で使用されるとき、その配列が引用ポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドの変形は天然の対立変形の如き、天然の変形でありうる又はそれは天然に起こることが知られていない変形でありうる。上記ポリヌクレオチドの非天然の変形は、ポリヌクレオチド、細胞又は生物に適用されるものを含む、突然変異技術により行われうる。一般的に、差異は制限されるので、上記引用のヌクレオチド配列及び変形が非常に全体的に似ており、及び多くの領域で同一である。
【０２０６】
上記に示されるものと実質的に異なる配列を含むが、遺伝子コードの縮重のために、本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド変形もまた特定して構想される。当業者にとって上記に示される縮重変形を作出すること、例えば、特定の宿主についてコドン発現を最適化する（例えば、ヒトｍＲＮＡ中のコドンを他の哺乳類又は菌類の宿主細胞により好まれるものに変える）ことも通常の作業であろう。
【０２０７】
上記に示されるように、変形ポリヌクレオチドは天然の対立遺伝子変形の如き天然に又は組換え法により起こりうる。「対立遺伝子変形」により、生物の染色体上のある位置を占める遺伝子のいくつかの代替の形態の１が意図される（例えば、Ｂ． Ｌｅｗｉｎ， （１９９０） Ｇｅｎｅｓ ＩＶ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。非天然の変形は本分野において知られる突然変異技術を用いて作出されうる。上記核酸変形はヌクレオチド置換、欠失又は付加により作出されるものを含む。上記置換、欠失又は付加は１以上のヌクレオチドを含みうる。コード領域における変化は保存された又は保存されていないアミノ酸置換、欠失又は付加を作出しうる。この中で特に好ましいものはサイレント置換、付加及び欠失であり、それは本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の特性及び活性を変化させない。またこの点において好ましいものは保存された置換である。
【０２０８】
変形ポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチド変化は好ましくはサイレントであり、それはそれらが上記ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を変化させないことを意味する。しかしながら、ヌクレオチド変化は上記引用配列によりコードされるポリペプチド中のアミノ酸置換、付加、欠失、融合及び切除をもたらしうる。
【０２０９】
上記ヌクレオチド置換が１以上のアミノ酸変化をもたらした場合には、好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は本発明の好ましい態様のＩ節中に示される１以上の肥満関連活性を保持するものを含む。
【０２１０】
「同じ活性を保持する」により、分析において変形ｇＧＭＧ−２ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを用いて計測される活性が本明細書中の実施例の節中で示されるｇＧＭＧ−２断片を用いて計測される活性の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％及び１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％又は１２５％以下であることが意味される。
【０２１１】
活性が「増大される」により、分析において変形ｇＧＭＧ−２ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを用いて計測される活性が本明細書中の実施例の節中に示されるｇＧＭＧ−２断片を用いて計測される活性の少なくとも１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３２５％、３５０％、３７５％、４００％、４５０％又は５００％であることが意味される。
【０２１２】
活性が「減少される」により、分析において変形ｇＧＭＧ−２ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを用いて計測される活性が本明細書中の実施例の節中で示されるｇＧＭＧ−２断片を用いて計測される活性の少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％又は５０％減少されることが意味される。
【０２１３】
パーセント同一性
本発明はさらに配列ＩＤ番号：１若しくは配列ＩＤ番号：３若しくは配列ＩＤ番号：５のポリヌクレオチド配列又は本発明の好ましい態様の節Ｉ中に示される肥満関連活性を有するポリペプチドをコードするその断片に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の配列を有する核酸分子に方向付けられる。もちろん、上記遺伝子コードの縮重のために、当業者は、配列ＩＤ番号：１、３若しくは５中に示される核酸配列又はその断片に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の多数の核酸分子は生物学的活性を有するポリペプチドをコードするであろうことを即座に認識するであろう。実際に、これらのヌクレオチド配列の縮重した変形は全て同じポリペプチドをコードするので、これは上記に示される比較分析を行うことなしに当業者に明らかであろう。縮合した変形でない上記核酸分子について、妥当な数が生物学的活性を有するポリペプチドをコードするであろうということもさらに本分野において認識されるであろう。これは、さらに本発明の好ましい態様の節Ｉで以前に示されるように、当業者はタンパク質機能に顕著に影響をほとんど及ぼさないであろう又は及ぼさないであろうアミノ酸置換（例えば、１の脂肪族アミノ酸を第二の脂肪族アミノ酸で置換すること）について完全に理解するからである。
【０２１４】
本発明に係る引用ヌクレオチド配列に少なくとも、例えば、９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにより、上記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、上記ポリヌクレオチド配列がｇＧＭＧ−２断片をコードする引用ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチド当たり５までの点突然変異を含みうる点を除いては、上記引用配列と同一であることが意図される。他の表現では、引用ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド配列を得るために、上記引用配列中の５％までのヌクレオチドが欠失され、挿入され又は他のヌクレオチドで置換されうる。上記クエリー配列は本明細書中で示されるように特定される全体配列又は断片でありうる。
【０２１５】
特定の核酸分子又はポリペプチドが本発明に係るヌクレオチド配列に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるか否かを決定する及び定義する方法は既知のコンピュータプログラムを用いて行われうる。包括的な配列整合とも言われる、クエリー配列（本発明に係る配列）及び問題の配列の間の最もよい全体的な適合を決定するための好ましい方法はＢｒｕｔｌａｇ ｅｔ ａｌ．，（（１９９０）Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ ６（３）：２３７−４５）のアルゴリズムに基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定されうる。配列整合において、上記クエリー及び問題の配列は両方ＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列ははじめにＵ’ｓをＴ’ｓに変換することにより比較されうる。前記包括的な配列整合の結果はパーセント同一性である。パーセント同一性を計算するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整合において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ，ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４，Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１，Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０，Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０，Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１，Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５，Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ０．０５， Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００又はより短いほうの問題のヌクレオチド配列の長さである。
【０２１６】
内部の欠失のためでなく、５’又は３’欠失のために、上記問題の配列が上記クエリー配列よりも短い場合、手動の補正が上記結果についてなされなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムはパーセント同一性を計算するとき、問題の配列の５’及び３’切除を考慮しないからである。上記クエリー配列に比較して、５’又は３’端で切除された問題の配列について、上記パーセント同一性は適合／整合しない、上記問題の配列の５’及び３’である上記クエリー配列の塩基数を、上記クエリー配列の総塩基のパーセントとして計算することにより補正される。ヌクレオチドが適合／整合するか否かはＦＡＳＴＤＢ配列整合の結果により決定される。このパーセントは特定のパラメーターを用いて上記ＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されるパーセント同一性から引かれ、最終的なパーセント同一性スコアに到達する。この補正されたスコアは本発明に係る目的のために使用されるものである。上記クエリー配列と適合／整合しない、ＦＡＳＴＤＢ整合により表された、上記問題の配列の５’及び３’ヌクレオチドより外のヌクレオチドのみがパーセント同一性スコアを手動で調節する目的のために計算される。
【０２１７】
例えば、９０ヌクレオチドの問題の配列はパーセント同一性を決定するために１００ヌクレオチドのクエリー配列に対して整合される。欠失が上記問題の配列の５’端で起こり、それゆえ、上記ＦＡＳＴＤＢ整合は５’端ではじめの１０ヌクレオチドの適合／整合を示さない。上記１０の対でないヌクレオチドは配列の１０％を示し（適合しない５’及び３’端のヌクレオチド数／上記クエリー配列中のヌクレオチドの総数）、そのため１０％はＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されたパーセント同一性スコアから引かれる。残りの９０ヌクレオチドが完全に適合した場合は、最終的なパーセント同一性は９０％であろう。
【０２１８】
他の例においては、９０ヌクレオチドの問題の配列は１００ヌクレオチドのクエリー配列と比較される。今度は、欠失が内部欠失であるため、上記クエリーと適合／整合しない問題の配列の５’又は３’上のヌクレオチドはない。この場合においては、ＦＡＳＴＤＢにより計算されたパーセント同一性は手動で補正されない。再び、上記クエリー配列と適合／整合しない問題の配列の５’及び３’のヌクレオチドのみが手動で補正される。他の手動の補正は本発明に目的のために行われない。
【０２１９】
融合
本発明にさらに含まれるものは追加の異種のアミノ酸配列についてのコード配列にフレームで融合される本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。例えば、非限定的に、非コード５’及び３’配列、ベクター配列、精製、プロービング又はプライミングに使用される配列を含む、追加の、非コード配列を共に有する本発明に係るポリペプチドをコードする核酸も本発明に含まれる。例えば、異種の配列は転写、及びｍＲＮＡプロセッシング、例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合及び安定性において役割を果たしうる転写された、翻訳されない配列を含む。上記異種の配列はあるいは追加の機能を提供する追加のコード配列を含みうる。したがって、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列の如き、タグ配列に融合されうる。本発明のこの局面のいくつかの好ましい態様においては、上記タグアミノ酸配列は、それらの多くが商業的に入手可能である、その他の中で、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， ９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ， ９１３１１）において提供されるタグの如き、ヘキサ−ヒスチヂンペプチドである。例えば、ヘキサ−ヒスチヂンは融合タンパク質の便利な精製を提供する（Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６（３）：８２１−４を参照のこと）。上記「ＨＡ」タグはインフルエンザヘマググルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する精製に有用な他のペプチドである（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｃｅｌｌ ３７（３）：７６７−７８を参照のこと）。上記に議論されるように、他の上記融合タンパク質はＮ−又はＣ−末端でＦｃに融合されたｇＧＭＧ−２断片ｃＤＮＡを含む。
【０２２０】
ＩＩＩ． 本発明に係る組換えベクター
上記用語「ベクター」は、二重鎖又は一重鎖である、及び細胞宿主中に又は単細胞の若しくは複数の細胞の宿主生物中に移行されることが要求される少なくとも１の問題のポリヌクレオチドを含む、環状の又は直鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子を示すために本明細書中で使用される。
本発明は本明細書中に示されるポリヌクレオチドのいずれか１を含む組換えベクターに関連する。
【０２２１】
本発明は本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターのファミリーを含む。
第一の好ましい態様においては、本発明に係る組換えベクターは好適な細胞宿主中で挿入されたポリヌクレオチドを増幅するために使用され、このポリヌクレオチドは組換えベクターが複製する度に増幅される。上記挿入されたポリヌクレオチドは本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードするものでありうる。
【０２２２】
本発明にしたがう組換えベクターの第二の好ましい態様は本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターから成る。いくつかの態様においては、発現ベクターは本発明に係るＧＭＧ−２断片、好ましくは本発明において示される改変されたＧＭＧ−２断片を発現するために使用され、それはその後精製され、そして、例えば、肥満関連疾患のための治療として又は単に個体のボディマスを減少させるために使用されうる。
【０２２３】
発現は、適切なシグナルが上記ベクター中に提供されることを必要とし、前記シグナルは宿主細胞内で問題の遺伝子の発現を駆動する、ウイルス及び哺乳類源からのエンハンサー／プロモーターの如き、さまざまな調節エレメントを含む。上記産物を発現する永久的な、安定な細胞クローンを確立するためのドミナント薬物選択マーカーは、それらが上記薬物選択マーカーの発現を上記ポリペプチドの発現にリンクさせるエレメントであるので、一般的に本発明に係る発現ベクター中に含まれる。
より特に、本発明はＧＭＧ−２ポリペプチド断片から選ばれる調節配列の制御下で又はあるいは外因性の調節配列の制御下で、本発明に係るＧＭＧ−２断片若しくは本明細書中で示される改変されたＧＭＧ−２断片又はその変形若しくは断片をコードする核酸を含む発現ベクターに関連する。
【０２２４】
その結果、本発明に係る好ましい発現ベクターは：（ａ）それに実施可能に結合したコードポリヌクレオチドの発現を駆動させる、ＧＭＧ−２断片調節配列；及び（ｂ）好適な細胞宿主及び／又は宿主生物内でのその発現を許す調節配列に実施可能に結合される、本発明に係るＧＭＧ−２断片コード配列から成る群から選ばれる。
【０２２５】
本発明に係るベクター中で見られうるエレメントのいくつかは以下の節中にさらに詳細に示される。
【０２２６】
１）本発明に係る発現ベクターの一般的特徴：
本発明にしたがう組換えベクターは、非限定的に、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（菌人工染色体）、ファージ、ファージミド、コスミド、プラスミド又は染色体の、非染色体の、半合成若しくは合成ＤＮＡから成りうる直鎖ＤＮＡ分子を含む。上記組換えベクターは：
（１）遺伝子発現において調節的な役割を有する遺伝子エレメント又はエレメント、例えば、プロモーター又はエンハンサー。エンハンサーは、転写を増大させるためのプロモーターにはたらく通常約１０〜３００ｂｐの長さのＤＮＡのシス活性エレメントである；
（２）転写されてｍＲＮＡになり、最終的に翻訳されてポリペプチドになる構造的な又はコード配列であって、前記構造的な又はコード配列は（１）中に示される調節エレメントに実施可能に結合される；及び
（３）適切な転写開始及び停止配列。酵母又は真核細胞発現系における使用のために意図された構造単位は好ましくは宿主細胞による翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。あるいは、組換えタンパク質がリーダー又は輸送配列なしに発現されるとき、それはＮ−末端残基を含みうる。この残基は続いて最終産物を作出するために発現された組換えタンパク質から切断されうる又はされない；
の集合から成る転写単位を含みうる。
【０２２７】
一般的に、組換え発現ベクターは複製の起源、宿主細胞の形質転換を許す選択可能なマーカー、及び下流の構造配列の直接の転写のための高い発現率の遺伝子に由来するプロモーターを含むであろう。上記異種の構造配列は翻訳開始及び停止配列、及び好ましくは翻訳されたタンパク質のペリプラズミックスペース又は細胞外媒体中への方向性のある分泌を可能にするリーダー配列と共に適切なファージ中に並べられる。上記ベクターが哺乳類宿主細胞中で所望の配列をトランスフェクトする及び発現するために適合された特定の態様においては、好ましいベクターは所望の宿主内における複製起源、好適なプロモーター及びエンハンサー、及び必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、転写停止配列、及び５’−フランキング非転写配列を含むであろう。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起源、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス及びポリアデニル化部位は必要とされる非転写遺伝子エレメントを提供するために使用されうる。
【０２２８】
２）調節エレメント
プロモーター
【０２２９】
本発明に係る発現ベクターにおいて使用される好適なプロモーター領域は異種の遺伝子が発現される細胞宿主を考慮に入れて選択される。問題の核酸配列の発現を制御するために使用される特定のプロモーターは、それが標的細胞において核酸の発現を方向付けることができる限りは、重要でないと考えられている。したがって、ヒト細胞が標的であるとき、例えば、ヒト又はウイルスプロモーターの如き、ヒト細胞において発現されることが可能なプロモーターの制御の隣に及び下流に核酸コード領域を位置づけることが好ましい。使用されるプロモーターは構成的又は誘導的でありうる。
【０２３０】
好適なプロモーターは、それが発現を制御する上記核酸について異種でありうる又はあるいは発現されるべきコード配列を含むもとのポリヌクレオチドについて内因性でありうる。さらに、上記プロモーターは一般的に、上記構築物プロモーター／コード配列が挿入された上記組換えベクター配列について異種である。
【０２３１】
プロモーター領域は、例えば、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター及びより好ましくはｐＫＫ２３２−８及びｐＣＭ７ベクターを用いて所望の遺伝子から選ばれうる。好ましい菌プロモーターはＬａｃＩ、ＬａｃＺ、Ｔ３又はＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｇｐｔ、ｌａｍｂｄａ ＰＲ、ＰＬ及びｔｒｐプロモーター（ＥＰ ００３６７７６）ポリヘドリンプロモーター、又はバキュロウイルスからのｐ１０タンパク質プロモーター（Ｋｉｔ Ｎｏｖａｇｅｎ）（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３（１２）：２１５６−６５；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， １９９２）、ｌａｍｂｄａ ＰＲ プロモーター又はｔｒｃプロモーターである。
【０２３２】
真核細胞プロモーターはＣＭＶ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ、ＨＳＶチミヂンキナーゼ、ｅａｒｌｙ ａｎｄ ｌａｔｅ ＳＶ４０、レトロウイルスからのＬＴＲｓ、及びマウスメタロチオネイン−Ｌを含む。さらに、脂肪組織、筋肉組織又は肝臓における発現を促進するものの如き、特定の細胞型について特異的なプロモーターが選択されうる。便利なベクター及びプロモーターの選択は当業者の水準内でよい。
【０２３３】
プロモーターの選択は遺伝子工学の当業者の能力の範囲内でよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， Ｖｏｌ．１，２，３（１９８９）を又はＦｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙにより示される手順を引用しうる。
【０２３４】
他の調節エレメント
ｃＤＮＡ挿入物が使用される場合、典型的に遺伝子転写産物の適切なポリアデニル化に影響させるためにポリアデニル化シグナルを含むことが所望されるであろう。上記ポリアデニル化シグナルの性質は本発明の成功的な実施に重要ではないと考えられており、及びヒト成長ホルモン及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの如きどんな上記配列も使用されうる。発現カセットのエレメントとしてターミネーターも企図される。これらのエレメントはメッセージの値を高める及び上記カセットから他の配列への読みとばしを最小限にする役割を果たしうる。上記に示される適切なＤＮＡ配列を含むベクターは適切な宿主を形質転換するために利用され、所望のポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現を可能にしうる。
【０２３５】
３）選択可能なマーカー
上記マーカーは上記細胞に発現構築物を含む細胞の容易な同定を可能にする同定可能な変化を与えるであろう。形質転換された宿主細胞の選択についての上記選択可能なマーカー遺伝子は好ましくはヂヒドロフォレート還元酵素又は真核細胞培養についてのネオマイシン耐性、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについてのＴＲＰ１又はＥ． ｃｏｌｉにおけるテトラサイクリン、リファムピシン若しくはアンピシリン耐性又はマイコバクテリアについてのレバンサッカレースであり、この後者のマーカーは陰性選択マーカーである。
【０２３６】
４）好ましいベクター
菌ベクター
代表的な、しかし非限定的な例として、菌類についての有用な発現ベクターはｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝子エレメントを含む商業的に入手可能なプラスミド由来の選択可能なマーカー及び菌の複製起源を含みうる。上記商業的なベクターは、非限定的に、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）ａｎｄ ｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ）を含む。
【０２３７】
多くの他の好適なベクターは当業者に知られ、そして以下の菌のベクターのように、商業的に入手可能である：ｐＴｒｃ−Ｈｉｓ、ｐＥＴ３０−Ｈｉｓ、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；ｐＱＥ−３０（ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ）。
【０２３８】
バキュロウイルスベクター
本発明に係るポリペプチドの発現について好適なベクターは昆虫細胞内及び昆虫細胞系内で増殖されうるバキュロウイルスベクターである。特定の好適な宿主ベクター系はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａに由来するＳＦ９細胞系（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １７１１）をトランスフェクトするために使用されるｐＶＬ１３９２／１３９３バキュロウイルストランスファーベクター（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）である。
【０２３９】
さらに好適なバキュロウイルスベクターは当業者に知られており、例えば、ＦａｓｔＢａｃＨＴである。バキュロウイルス発現系におけるＡＰＭ１球状ヘッドポリペプチドの発現について好適な他のベクターは、非限定的に、Ｃｈａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｄｅｃ；１８（Ｐｔ３）：２５９−７３）；Ｖｌａｓａｋ ｅｔ ａｌ．（１９８３；Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｅｐ １；１３５（１）：１２３−６）；及びＬｅｎｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６；Ｇｅｎｅ Ｍａｒ ９；１６９（２）：１８７−９０）により示されるものを含む。
【０２４０】
哺乳類ベクター
本発明に係るポリペプチドの発現についてさらに好適なベクターは哺乳類ベクターである。いくつかの好適なベクター系は当業者に知られ、例えば、ｐｃＤＮＡ４ＨｉｓＭａｘ、ｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏ−Ｈｉｓ及びｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏである。
【０２４１】
ウイルスベクター
１の特定の態様においては、上記ベクターはアデノウイルスに由来する。本発明にしたがう好ましいアデノウイルスベクターはＦｅｌｄｍａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｇ（１９９９６；Ｓｅｍｉｎ Ｉｎｔｅｒｖ Ｃａｒｄｉｏｌ １（３）：２０３−８）又はＯｈｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９４；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５（５１７３）：７８１−４）により示されるものである。本発明に係るこの特定の態様にしたがう他の好ましい組換えアデノウイルスはヒトアデノウイルス２若しくは５型（Ａｄ２若しくはＡｄ５）又は動物起源のアデノウイルス（フランス特許出願第ＦＲ−９３．０５９５４号）である。
【０２４２】
レトロウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクターは一般的に、特にヒトを含む哺乳類へのｉｎ ｖｉｖｏの外因性のポリヌクレオチドの輸送についての選択の組換え遺伝子デリバリー系であると理解される。これらのベクターは遺伝子の細胞への効果的なデリバリーを提供し、及び上記輸送された核酸は安定に宿主の染色体ＤＮＡに統合される。
【０２４３】
本発明に係るレトロウイルスｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子デリバリー媒体の調製又は構築に特に好ましいレトロウイルスはＭｉｎｋ−Ｃｅｌｌ Ｆｏｃｕｓ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｖｉｒｕｓ、マウス肉腫ウイルス、Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓウイルス及びラウス肉腫ウイルスから成る群から選ばれるレトロウイルスを含む。特に好ましいマウス白血病ウイルスは４０７０Ａ及び１５０４Ａウイルス、Ａｂｅｌｓｏｎ（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＶＲ−９９９）、Ｆｒｉｅｎｄ（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＶＲ−２４５）、Ｇｒｏｓｓ（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＶＲ−５９０）、Ｒａｕｓｃｈｅｒ（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＶＲ−９９８）及びモロニーマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＶＲ−１９０；ＰＣＴ出願番号ＷＯ ９４／２４２９８）を含む。特に好ましいラウス肉腫ウイルスはＢｒｙａｎ ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒ（ＡＴＣＣ Ｎｏｓ ＶＲ−３３４、ＶＲ−６５７、ＶＲ−７２６、ＶＲ−６５９及びＶＲ−７２８）を含む。他の好ましいレトロウイルスベクターはＲｏｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９６）、ＰＣＴ出願番号ＷＯ ９３／２５２３４、ＰＣＴ出願番号ＷＯ ９４／０６９２０、Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，（（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６（２３）：９０７９−８３）、Ｊｕｌａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３：３２５１−３２５５及びＮｅｄａ ｅｔ ａｌ．（（１９９１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６（２２）：１４１４３−６）中に示されるものである。本発明により企図されるさらに他のウイルスベクター系はアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）から成る。上記アデノ関連ウイルスはアデノウイルス又はヘルペスウイルスの如き他のウイルスを効果的な複製及び生産的なライフサイクルのためのヘルパーウイルスとして必要とする天然の欠陥ウイルスである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８：９７−１２９）。それは、そのＤＮＡを非分割細胞内へ統合することができ、及び高頻度の安定な統合を示す数少ないウイルスの１でもある（Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７（３）：３４９−５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６３（９）：３８２２−８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ５９：５６１−５６９）。ＡＡＶの１の有益な特性は形質転換された細胞に比較して初代細胞を変換することについてのその減少した効率に由来する。
【０２４４】
５）組換えベクターのデリバリー
【０２４５】
本発明に係るポリヌクレオチドの発現に影響を与えるために、これらの構築物は細胞内にデリバリーされなければならない。このデリバリーは細胞系を形質転換するための実験室手順におけるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで又はいくつかの疾患状態の治療におけるように、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで行われうる。
１の機構は上記発現構築物が感染性のウイルス粒子内に封じ込められるウイルス感染である。
【０２４６】
ポリヌクレオチドの培養哺乳類細胞への移行のためのいくつかの非ウイルス法も本発明により企図され、そして、非限定的に、リン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５４（２）：５３６−９；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７（８）：２７４５−５２）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｇｏｐａｌ，（１９８５）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ５（５）：１１８８−９０）、エレクトロポーレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ６（２）：７１６−８；Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１（２２）：７１６１−５）、ダイレクトマイクロインジェクション（Ｈａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０１（３）：１０９４−９）、ＤＮＡ−ｌｏａｄｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（Ｎｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７２１（２）：１８５−９０；Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９７９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７６（７）：３３４８−５２）、及び受容体仲介トランスフェクション（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，（１９８７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２（１０）：４４２９−３２；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７（３）：８８７−９２）を含む。これらの技術のいくつかはｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの使用にうまく適合されうる。
【０２４７】
上記発現ポリヌクレオチドが上記細胞内へデリバリーされたとき、それは宿主細胞のゲノム内へ安定的に統合されうる。この統合は相同組換えを介した同種の位置及び方向でありうる（遺伝子置換）又はそれはランダムな、非特異的な位置内に統合されうる（遺伝子拡大）。またさらなる態様においては、上記核酸はＤＮＡの分離したエピソームのセグメントとして細胞内に安定的に維持されうる。上記核酸セグメント又は「エピソーム」は宿主細胞周期とは独立して又は同調して維持及び複製をさせるのに十分な配列をコードする。
【０２４８】
タンパク質又はペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで脊椎動物の細胞内部へデリバリーするための方法についての１の特異的な態様は生理学的に許容される担体及び問題のポリペプチドを実施可能にコードする裸のポリヌクレオチドを含む調製物を上記細胞を含む組織の間隙の空間内へ導入する段階を含み、それにより上記裸のポリヌクレオチドは上記細胞内部へ取り込まれ、そして生理学的効果を有する。このことはｉｎ ｖｉｔｒｏの移行に特に適用可能であるが、ｉｎ ｖｉｖｏにも適用可能でありうる。
【０２４９】
「裸の」ポリヌクレオチドを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの使用のための組成物はＴａｓｃｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（８）：８８８−８９２の及びＨｕｙｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（（１９９６）Ｎａｔ Ｍｅｄ ２（８）：８９３−８）の記事中に加えて、ＰＣＴ出願番号ＷＯ ９０／１１０９２（Ｖｉｃａｌ Ｉｎｃ．）中及びＰＣＴ出願番号ＷＯ ９５／１１３０７（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ， ＩＮＳＥＲＭ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ ｄ’ Ｏｔｔａｗａ）中に示される。
【０２５０】
本発明のさらに他の態様においては、本発明に係るポリヌクレオチド構築物を含む、本発明に係る裸のポリヌクレオチドの細胞内への移行は粒子爆弾（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）で進行されることができ、前記粒子は、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（（１９９０）Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ Ｆｅｂ；１７（２）：９７−１０３）により示されるように、それらが細胞膜を通り抜け、そしてそれらを殺さずに細胞内へ入ることを可能にする高速に加速されたＤＮＡでコーティングした微小な発射物である。
さらなる態様においては、本発明に係るポリヌクレオチドはリポソーム内へ閉じこめられうる（Ｇｈｏｓｈ ａｎｄ Ｂａｃｃｈａｗａｔ，（１９９１）Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｉａｇｎ Ｔｈｅｒ ４：８７−１０３；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｇｅｎｅ １０：８７−９４；Ｎｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １４９：１５７−７６）。これらのリポソームはさらにレプチン、トリグリセリド、ＡＣＲＰ３０又は他の既知のＬＳＲリガンドを上記リポソーム膜内に導入することによりＬＳＲを発現する細胞に標的化されうる。
【０２５１】
特定の態様においては、本発明は本明細書中に示されるＧＭＧ−２球状ヘッドポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ産生のための組成物を提供する。それは、生理学的に許容される担体中で、及び上記組織の細胞に前記ポリペプチドを発現させるための組織内への導入に好適な溶液中に、このポリペプチドを実施可能にコードする裸のポリヌクレオチドを含む。
【０２５２】
所望の宿主生物に注入されるべきベクターの量は注入部位により変化する。表示的な用量としては、０．１〜１００μｇのベクターが動物の身体、好ましくは哺乳類の身体、例えば、マウスの身体内へ注入されるであろう。
本発明にしたがう上記ベクターの他の態様においては、それは宿主細胞内に、好ましくは治療されるべき動物から以前に回収された宿主細胞及びより好ましくは筋細胞の如き体細胞内にｉｎ ｖｉｔｒｏで導入されうる。次の段階において、所望のＧＭＧ−２球状ヘッドポリペプチド又はその所望の断片をコードするベクターで形質転換された細胞は組換えタンパク質を局所的に又は体系的に上記身体内へデリバリーするために動物の身体内へ再導入される。
【０２５３】
ＩＶ． 本発明に係る組換え細胞
本発明の他の目的は本明細書中に示されるポリヌクレオチドの１、及びより正確には、「本発明に係るポリヌクレオチド」中に示されるもののいずれか１の如き、本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドについて組換えられた、すなわち形質転換された又はトランスフェクトされた宿主細胞から成る。これらのポリヌクレオチドは一過性の又は安定的なトランスフェクションの結果として細胞内に存在しうる。本発明は「本発明に係る組換えベクター」中に示されるもののいずれか１の如き組換えベクターで形質転換された（原核細胞）又はトランスフェクトされた（真核細胞）宿主細胞を含む。
【０２５４】
一般的に、本発明に係る組換え宿主細胞は本明細書中に示される少なくとも１の本発明に係るポリヌクレオチド又は組換えベクターを含む。
【０２５５】
本発明に係る組換えベクターについての宿主として使用される好ましい宿主細胞は以下のものである：
ａ）原核宿主細胞：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎｓ（ＬＥ．ＤＨ５−α ｓｔｒａｉｎ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの如き種からの株、並びに
ｂ）真核宿主細胞：ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＣＬ２；Ｎｏ ＣＣＬ２．１；Ｎｏ ＣＣＬ２．２）、Ｃｖ １細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＲＬ１６５０；Ｎｏ ＣＲＬ１６５１）、Ｓｆ−９細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＲＬ１７１１）、Ｃ１２７細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＲＬ−１８０４）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＲＬ−６３６１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＣＬ−６１）、ヒト腎臓２９３（ＡＴＣＣ Ｎｏ ４５５０４；Ｎｏ ＣＲＬ−１５７３）、ＢＨＫ（ＥＣＡＣＣＮｏ ８４１００５０１；Ｎｏ ８４１１１３０１）、ＰＬＣ細胞、ＨｅｐＧ２、及びＨｅｐ３Ｂ。
【０２５６】
上記宿主細胞内の構築物は組換え配列によりコードされる遺伝子産物を作出するために慣用の方法で使用されうる。
好適な宿主の形質転換及び上記宿主の適切な細胞濃度への成長に続いて、上記選択されたプロモーターは温度移行又は化学誘導の如き、適切な方法により誘導され、そして細胞は追加の期間培養される。
【０２５７】
細胞は典型的に遠心分離により回収され、物理的又は化学的方法により破壊され、及び生ずる粗い抽出物がさらなる精製のために保持される。
【０２５８】
タンパク質の発現において使用される微生物細胞は、凍結融解周期、超音波処理、機械的破壊又は細胞溶解剤の使用を含む、慣用の方法により破壊されうる。上記方法は当業者に周知である。
【０２５９】
さらに、本発明にしたがって、これらの組換え細胞は動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはマウス、ラット、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、及びヒトを含まない霊長類から成る群から選ばれるものにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで作出されうる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで作出された組換え細胞も例えば、後に動物において外科的に移植されうる。ｉｎ ｖｉｖｏの組換え細胞を作出する方法は本分野で周知である。
【０２６０】
本発明は：ａ）外因性（異種の）ポリヌクレオチドを標的遺伝子の内因性の染色体ＤＮＡに挿入する、ｂ）内因性の染色体ＤＮＡを欠失させる、及び／又はｃ）内因性の染色体ＤＮＡを外因性のポリヌクレオチドで置換するよう作り変えられた、脊椎動物起源、好ましくは哺乳類起源及び特にヒト起源の初代の、二代目の、及び不死化された相同的に組換えた宿主細胞をも含む。ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失、及び／又は置換は標的遺伝子のコード配列で及び／又は上記標的遺伝子と実施可能に関連したプロモーター及びエンハンサー配列の如き、調節領域でありうる。
【０２６１】
本発明はさらにｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで相同的に組換えられた宿主細胞を作出する方法に関連し、ここで、上記細胞で通常には発現されない標的遺伝子の発現は変化される。好ましくは、上記変化は通常の成長条件下又は標的遺伝子によりコードされるポリペプチドを作出するために好適な条件下で標的遺伝子の発現を引き起こす。上記方法は：（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでポリヌクレオチド構築物、（ｉ）標的配列；（ｉｉ）調節配列及び／又はコード配列；及び（ｉｉｉ）必要であれば、それによりトランスフェクトされた細胞を作出する対になっていないスプライスドナー部位を含むポリヌクレオチド構築物で上記細胞をトランスフェクトする；及び（ｂ）相同組換えに適切な条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞を維持する段階を含む。
【０２６２】
本発明はさらに、（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでポリヌクレオチド構築物、（ｉ）標的配列；（ｉｉ）調節配列及び／又はコード配列；及び（ｉｉｉ）必要であれば、それによりトランスフェクトされた細胞を作出する、対になっていないスプライスドナー部位を含むポリヌクレオチド構築物で上記細胞をトランスフェクトする；及び（ｂ）それにより相同的に組換えられた細胞を作出する、相同組換えに適切な条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞を維持する；及び（ｃ）上記遺伝子の発現に適切な条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで相同的に組換えられた細胞を維持する段階を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで細胞内で標的化された遺伝子の発現を変化させる方法に関連し、ここで、上記遺伝子は上記細胞内で通常には発現されない。
【０２６３】
本発明はさらに、ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでポリヌクレオチド構築物、（ｉ）標的配列；（ｉｉ）調節配列及び／又はコード配列；及び（ｉｉｉ）必要であれば、それによりトランスフェクトされた細胞を作出する、対になっていないスプライスドナー部位を含むポリヌクレオチド構築物で上記細胞をトランスフェクトする；（ｂ）それにより相同的に組換えられた細胞を作出する、相同組換えに適切な条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞を維持する；及びそれにより上記ポリペプチドを作出する、上記遺伝子の発現に適切な条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで相同的に組換えられた細胞を維持する段階を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで細胞内で標的化された内因性の遺伝子の発現を変化させることにより本発明に係るポリペプチドを作出する方法に関し、ここで上記遺伝子は細胞内で通常には発現されない。
【０２６４】
本発明はさらに上記遺伝子が通常には発現されない細胞型内で、標的化された遺伝子の発現を変化させるポリヌクレオチド構築物にも関する。これは、ポリヌクレオチド構築物が標的細胞の染色体ＤＮＡ内へ挿入されるとき起こり、ここで、上記ポリヌクレオチド構築物は：ａ）標的配列；ｂ）調節配列及び／又はコード配列；及びｃ）必要であれば、対になっていないスプライスドナー部位を含む。上記に示されるポリヌクレオチド構築物もさらに含まれ、ここで、上記構築物はさらにポリペプチドをコードする及び染色体ＤＮＡでの相同組換えの後に標的内因性遺伝子のフレーム内にあるポリヌクレオチドを含む。
【０２６５】
上記組成物は作出されうる、及び方法は米国特許第６，０５４，２８８号；第６，０４８，７２９号；第６，０４８，７２４号；第６，０４８，５２４号；第５，９９４，１２７号；第５，９６８，５０２号；第５，９６５，１２５号；第５，８６９，２３９号；第５，８１７，７８９号；第５，７８３，３８５号；第５，７３３，７６１号；第５，６４１，６７０号；第５，５８０，７３４号；国際公開番号：ＷＯ ９６／２９４１１、ＷＯ ９４／１２６５０；及びＫｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０：７０５−７３０により示される科学記事中に示されるものの如き、本分野において知られる技術により行われ、そのそれぞれの開示はそれらを全体として本明細書中に援用する。
【０２６６】
哺乳類の、及び典型的にヒトの細胞におけるＧＭＧ−２遺伝子発現は不完全にさせられうる又はあるいはそれは本発明にしたがうＧＭＧ−２ポリヌクレオチドによる動物細胞のゲノム中のＧＭＧ−２遺伝子相対物の置換を伴うＧＭＧ−２ゲノム又はｃＤＮＡ配列の挿入で高められうる。これらの遺伝子変化は以前に示された特定のＤＮＡ構築物を用いて相同組換え事件により作出されうる。
【０２６７】
使用されうる宿主細胞の１種は、マウスの接合体の如き、哺乳類の接合体である。例えば、マウスの接合体は問題の精製したＤＮＡ分子、例えば、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３０μＭ スペルミン、及び７０μＭ スペルミヂンを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２５０μＭ ＥＤＴＡ中でＢＡＣ挿入物については１ｎｇ／ｍｌ〜Ｐ１バクテリオファージ挿入物については３ｎｇ／μｌの濃度範囲に以前に調節された精製したＤＮＡ分子でのマイクロインジェクションを経験しうる。マイクロインジェクションされるべきＤＮＡが大きな大きさを有するとき、Ｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ（（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２（６４１７）：２５８−６１）により示されるように、ポリアミン及び高塩濃度がこのＤＮＡの機械的な破壊を避けるために使用されうる。
【０２６８】
本明細書中で示されるＤＮＡ構築物を含む、本発明に係るポリヌクレオチドのいずれか１は胚性幹（ＥＳ）細胞系，好ましくはマウスＥＳ細胞系中に導入されうる。ＥＳ細胞系は移植前未分化胚芽細胞の内部細胞マスの多分化能の、拘束されていない細胞に由来する。好ましいＥＳ細胞系は以下のものである：ＥＳ−Ｅ１４ＴＧ２ａ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１８２１）、ＥＳ−Ｄ３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１９３４及びＮｏ． ＣＲＬ−１１６３２）、ＹＳ００１（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−１１７７６）、３６．５（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−１１１１６）。ＥＳ細胞を拘束されていない状態に維持するために、それらはこの胚の表現型を保存する適切なシグナルを提供する及びＥＳ細胞粘着のためのマトリックスとしてはたらく成長を阻害されたフィーダー細胞の存在下で培養される。好ましいフィーダー細胞はＡｂｂｏｎｄａｎｚｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２２５：８０３−２３）により示されるように、培養中に維持された実質上いかなるマウス株の１３日〜１４日胚の組織からも確立された及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎ（（１９８７）Ｅｍｂｒｙｏ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ． Ｉｎ： Ｅ．Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ Ｅｄ． Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ）により示されるように、照射により又はＰｅａｓｅ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ（１９９０；Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １９０（２）：２０９−１１）により示されるように、ＬＩＦの阻害的濃度の存在により成長を阻害された初代胚線維芽細胞である。
【０２６９】
宿主細胞中の構築物は組換え配列によりコードされた遺伝子産物を作出するために慣用の方法で使用されうる。
【０２７０】
好適な宿主の形質転換及び上記宿主の適切な細胞濃度への成長に続いて、上記選択されたプロモーターが温度移行又は化学誘導の如き、適切な方法により誘導され、及び細胞は追加の期間培養される。細胞は典型的に遠心分離により回収され、物理的又は化学的方法により破壊され、そして生ずる粗い抽出物はさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現において使用される微生物細胞は凍結融解周期、超音波処理、機械的破壊又は細胞溶解剤の使用を含む、いかなる慣用の方法によっても破壊されうる。上記方法は当業者に周知である。
【０２７１】
ＩＶ． トランスジェニック動物
本発明は組換えＧＭＧ−２ポリペプチド、すなわち、組換えｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片又は全長ＧＭＧ−２ポリペプチドを発現する非ヒト動物及び植物の作出のための方法及び組成物をも提供する。上記動物又は植物はトランスジェニックでありうる、すなわち、それらの細胞のそれぞれはＧＭＧ−２ポリペプチドをコードする遺伝子を含む、又はあるいは、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは動物又は植物の体細胞内へ、例えば、哺乳類の乳房の分泌上皮細胞内へ導入されうる。好ましい態様においては、上記非ヒト動物はウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ又はウサギの如き哺乳類である。さらに好ましい態様においては、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片又は前記全長ＧＭＧ−２ポリペプチドをコードする前記遺伝子は配列ＩＤ番号：５のポリヌクレオチドを含む。
【０２７２】
哺乳類の如きトランスジェニック動物を作出する方法は当業者に周知であり、そして上記方法は本発明において使用されうる。簡単に述べると、トランスジェニック哺乳類は、例えば、問題のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでＥＳ細胞の如き多分化能の幹細胞をトランスフェクトすることにより作出されうる。うまく形質転換されたＥＳ細胞はその後初期段階の胚に導入されることができ、その後それは同じ種の哺乳類の子宮内へ移植される。いくつかの場合、上記形質転換された（「トランスジェニックの」）細胞は生ずる動物の生殖細胞系の部分を含むであろう、及び生殖細胞系にトランスジェニック細胞を含む成体動物はその後他の動物と交配されるとこができ、それにより最終的にそれらの細胞のそれぞれにトランスジーンを有するトランスジェニック動物の集団を作出し、及びそれはそれらの子孫のそれぞれに上記トランスジーンを安定的に受け渡しうる。上記ポリヌクレオチドを導入する他の方法は、例えば、問題のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを受精した卵又は初期段階の胚にマイクロインジェクションにより導入して使用されうる。あるいは、上記トランスジーンは上記トランスジーンを含むレトロウイルスでの接合体の感染により動物内に導入されうる（Ｊａｅｎｉｓｃｈ， Ｒ．（１９７６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７３， １２６０−１２６４）。トランスジェニック動物の作出方法は、例えば、Ｗａｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９２ ４９（２）：１１３−２０；Ｈｏｇａｎ， ｅｔ ａｌ．（１９８６）ｉｎ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．中に；ＷＯ ９１／０８２１６中に；又は米国特許第４，７３６，８６６号中に示される。
【０２７３】
好ましい方法においては、上記ポリヌクレオチドは受精した卵母細胞内へマイクロインジェクトされる。典型的に、受精した卵母細胞は標準の技術を用いてマイクロインジェクトされ、及びその後「移植前胚」が得られるまでｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される。上記移植前胚は好ましくは約１６〜１５０細胞を含む。受精した卵母細胞を移植前段階まで培養する方法は、例えば、Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（（１９８４）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １０１，４１４）；Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．（（１９８６）ｉｎ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ）（マウス胚について）；Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ， ３１５， ６８０）（ウサギ及びブタの胚について）；Ｇａｎｄｏｌｆｉ ｅｔ ａｌ．（（１９８７）Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔ ８１， ２３−２８）；Ｒｅｘｒｏａｄ ｅｔ ａｌ．（（１９８８）Ｊ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ ６６， ９４７−９３５）（ヒツジの胚について）；及びＥｙｅｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（（１９８９）Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔ ８５， ７１５−７２０；Ｃａｍｏｕｓ ｅｔ ａｌ．（（１９８４）Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔ ７２， ７７９−７８５）；及びＨｅｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．（（１９８７）Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２７， ５９６８）（ウシの胚について）により示され、そのそれぞれの開示はそれらを全体として本明細書中に援用する。移植前胚はその後上記トランスジーンが導入されたときの発達段階に因り、トランスジェニック又はキメラ動物の誕生を可能にするために標準の方法により適切な雌に移植される。
【０２７４】
トランスジーン導入の頻度はしばしば低いので、移植前胚におけるトランスジーン統合の検出がしばしば本明細書中に示される方法のいずれかを用いて所望される。いくつかの方法のいずれかは移植前胚においてトランスジーンの存在を検出するために使用されうる。例えば、１以上の細胞が移植前胚から除去されることができ、そして上記除去された細胞（単一）又は細胞（複数）におけるトランスジーンの存在又は不在は標準の方法、例えば、ＰＣＲを用いて検出されうる。あるいは、トランスジーンの存在は標準の方法を用いて子宮内又は分娩後に検出されうる。
【０２７５】
本発明の特定の好ましい態様においては、それらの乳中に組換えＧＭＧ−２ポリペプチドを分泌するトランスジェニック哺乳類が作出される。乳腺は高く効果的なタンパク質産生器官であるので、上記方法はリットル当たりグラムの範囲の、及びしばしば顕著にもっと多くのタンパク質濃度を作出するために使用されうる。好ましくは、乳腺における発現は乳腺特異的プロモーター及び、場合により、他の調節エレメントに上記ＧＭＧ−２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを実施可能に連結することにより達成される。好適なプロモーター及び他のエレメントは、非限定的に、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターに加えて、哺乳類の短い及び長いＷＡＰ、アルファ、ベータ、及びカッパー、カゼイン、アルファ及びベータラクトグロブリン、ベータ−ＣＮ ５’遺伝子に由来するものを含む。上記プロモーター及び他のエレメントは、非限定的に、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウサギ、及びモルモットを含む、哺乳類に由来しうる。プロモーター及び他の調節配列、ベクター及び他の関連技術は、例えば、Ｃｌａｒｋ（１９９８）Ｊ Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ３：３３７−５０；Ｊｏｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：１６０−４；米国特許第５，９９４，６１６号；第６，１４０，５５２号；第６，０１３，８５７号；Ｓｏｈｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １８：８４５−５２；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ （Ｊａｐａｎ）１２６：３２０−５；Ｓｏｕｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｅｕｒｏ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６０：５３３−９；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｈｉｎ Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈ １３：２７１−６；Ｒｉｊｎｋｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｔｒａｎｓｇｅｎ Ｒｅｓ ７：５−１４；Ｋｏｒｈｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｅｕｒｏ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２４５ ：４８２−９；Ｕｕｓｉ−Ｏｕｋａｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｔｒａｎｓｇｅｎ Ｒｅｓ ６：７５−８４；Ｈｉｔｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ７：２４７−５２；Ｐｌａｔｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｔｒａｎｓｇｅｎ Ｒｅｓ ３：９９−１０８；Ｈｅｎｇ−Ｃｈｅｒｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｎｉｍａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ ４：８９−１０７；及びＣｈｒｉｓｔａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｕｒｏ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６７：１６６５−７１により提供され、そのそれぞれの全体の開示は本明細書中に援用する。
【０２７６】
他の態様においては、本発明に係るポリペプチドは上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｖｏで乳腺の体細胞、例えば、乳房の分泌上皮細胞に導入することにより乳中に作出されうる。例えば、プラスミドＤＮＡは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストランと関連して（例えば、Ｈｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １５２３：１６１−１７１を参照のこと）、上記構築物の受容体仲介エンドサイトーシスを引き起こしうるリガンドと関連して（例えば、Ｓｏｂｏｌｅｖ ｅｔ ａｌ．（１９９８）２７３：７９２８−３３を参照のこと）乳頭管をとおして又はレトロウイルスベクター、例えば、Ｇｉｂｂｏｎサル白血病ウイルスの如きウイルスベクターで（例えば、Ａｒｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：６８４０−６８４４を参照のこと）融合されうる。これらの態様のいずれにおいても、上記ポリヌクレオチドは上記に示されるように、乳腺特異的プロモーター又はあるいは、ＣＭＶ若しくはＭｏＭＬＶ ＬＴＲの如き強く発現するプロモーターに実施可能に連結されうる。
【０２７７】
本発明における使用のためのベクター、プロモーター、調節エレメント等の好適性は乳房上皮細胞、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭａｃＴ細胞（ウシ乳房上皮細胞）又はＧＭＥ細胞（ヤギ乳房上皮細胞）の如き、細胞に事前にトランスフェクトすること、及び上記細胞におけるトランスジーンのトランスフェクション及び発現の効率を評価することにより評価されうる。
【０２７８】
ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために、上記ポリヌクレオチドはいかなる濃度範囲（例えば、１〜５００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜１００μｇ／ｍｌ）でも、いかなる容積（例えば、１〜１００ｍｌ、好ましくは１〜２０ｍｌ）でも、好適な調剤中で投与されることができ、そして何回（例えば、１、２、３、５又は１０回）でも、どんな頻度（例えば、１、２、３，５、１０又は何日毎）でも、投与されうる。好適な濃度、頻度、投与様式等は特定のポリヌクレオチド、ベクター、動物等に因るであろう、そして当業者により容易に決定されうる。
【０２７９】
好ましい態様においては、Ｇｉｂｂｏｎサル白血病ウイルスベクターの如きレトロウイルスベクターがＡｒｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：６８４０−６８４４）中に示されるように使用される。レトロウイルス感染は典型的に細胞分裂を必要とするので、乳腺における細胞分裂は、例えば、エストラヂオールベンゾエート、プロゲステロン、レゼルピン又はデキサメタゾンの如き因子を用いて、上記ベクターの投与と共に刺激されうる。さらに、レトロウイルス及び他の感染方法はポリブレンの如き付属の化合物を用いて促進されうる。
【０２８０】
乳からＧＭＧ−２ポリペプチドを得るための本明細書中に示される方法のいずれにおいても、得られる乳の量、及びしたがって作出されるＧＭＧ−２ポリペプチドの量は、乳汁分泌誘導の標準の方法を用いて、例えば、ヘキセストロール、エストロゲン、及び／又はプロゲステロンを用いて高められうる。
【０２８１】
上記態様において使用されるポリヌクレオチドは全長ＧＭＧ−２ポリペプチド又はｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードしうる。典型的に、上記コードされたポリペプチドは乳中への上記タンパク質の分泌を確実にするためにシグナル配列を含むであろう。全長ＧＭＧ−２配列が使用される場合、上記全長タンパク質は、例えば、乳から単離され、そして好適なプロテアーゼを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで切断されうる。あるいは、第二の、プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドが上記動物内へ又は乳腺細胞内へ導入されることができ、これによりプロテアーゼの発現はｉｎ ｖｉｖｏでのＧＭＧ−２ポリペプチドの切断をもたらし、それにより乳からのｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の直接の単離が可能になる。
【０２８２】
Ｖ． 本発明に係る医薬の又は生理学的に許容される組成物
本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は単独で又はそれらが好適な担体又は賦形剤と混合される医薬の又は生理学的に許容される組成物中で非ヒト動物及び／又はヒトに投与されうる。上記医薬の又は生理学的に許容される組成物はその後治療的に有効な量で提供される。治療的に有効な量とは本明細書中で示される方法により決定される肥満関連疾患又は障害の症状又は生理学的状態の予防又は緩和をもたらすのに十分なｇＧＭＧ−２断片の量をいう。治療的に有効な用量は美容理由のためにこの影響を所望するヒトにおいて体重減少又は体重増加の予防又は体重増加の割合における増大の予防のために必要なｇＧＭＧ−２断片の量をいう。本発明に係るｇＧＭＧ−２断片の治療的に有効な用量は継続した期間の使用又は投与で体重減少又は体重増加を促進するのに十分な量である。ＧＭＧ−２ポリペプチド断片の調合及び投与の技術は“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ中に見られうる。
【０２８３】
本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片が治療する又は予防するために使用されうる他の疾患又は障害は、非限定的に、肥満及び肥満、損なわれたグルコース耐性、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、アテロームの疾患、心疾患、高血圧、卒中、シンドロームＸ、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ又はＩＩ型糖尿病）及びインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ又はＩ型糖尿病）の如き、肥満関連疾患及び障害を含む。本発明に係る方法により処置されるべき糖尿病関連合併症は細小血管病変、眼の病変、網膜症、神経障害、及び腎臓病変を含む。心疾患は、非限定的に、心不全、冠状動脈不全、及び高血圧を含む。本発明に係る化合物により処置されるべき他の肥満関連障害は高脂血症及び尿酸過剰血症を含む。本発明に係るさらに他の肥満関連疾患又は障害は悪液質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少、食欲不振、及び過食症を含む。上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は仕事又は運動の間の身体のパフォーマンスを高める又は一般の健康意識を高めるためにも使用されうる。身体のパフォーマンス活性は、歩く、走る、飛ぶ、持ち上げる及び／又は登ることを含む。
【０２８４】
上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片又はそのアンタゴニストも脂肪酸代謝、より特には、いくつかの長鎖多不飽和脂肪酸の産出を調節することにより失読症、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、注意欠陥／活動過剰障害（ＡＤＨＤ）、及び統合失調症の如き精神障害を治療するためにも使用されうる。さらに好ましい態様は、治療の必要のある患者に（あるいは時間を決めた日の基礎で）、前記動物又はヒト患者において前炎症性サイトカイン及び／又は（ｉｉ）細胞接着分子値を減少させるのに十分な用量及び期間で、ホモ三量体ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片（又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を投与することを含む、アテローム性動脈硬化症の如き、炎症関連障害の予防又は治療のための方法に関する。
【０２８５】
本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は単独で又は他の医薬として又は生理学的に許容される化合物と共に提供されうることが明白に考えられる。肥満及び他の疾患及び障害の治療に有用な他の化合物は最近本分野で周知である。
【０２８６】
好ましい態様においては、上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は本明細書中で示される及び本分野において知られる方法を用いてインスリン抵抗性及び糖尿病の治療に有用であり、そこで使用される。より特に、好ましい態様は動物又はヒト患者におけるグルコース代謝の治療的改変及び調節のためのプロセスに関し、それは処置の必要のある患者に（あるいは時間を決めた日の基礎で）前記動物又はヒト患者において血漿グルコース値を減少させるのに十分な投与量及び期間で、ＧＭＧ−２ポリペプチド断片（又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を投与することを含む。
さらなる好ましい態様は処置の必要のある患者に（あるいは時間を決めた日の基礎で）前記動物又はヒト患者において血漿グルコース値を減少させるのに十分な投与量及び期間で、ＧＭＧ−２ポリペプチド断片（又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を投与することを含む、糖尿病の予防又は治療のための方法に関連する。
【０２８７】
投与経路
好適な投与経路は、本分野において知られる方法を用いた、包膜内の、直接の室内の、静脈内の、腹腔内の、鼻内の、肺内の（吸入の）又は眼内の注入に加えて、経口の、鼻の、直腸の、粘膜を介した又は小腸の投与、筋内、皮下、髄内注入を含む非経口デリバリーを含む。体重減少を促進させるための化合物を投与する特に有用な方法は、例えば、ＧＭＧ−２又はｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を延長された期間デリバリーするための装置の、受容者の腹腔への外科的埋め込みを含む。他の特に好ましい投与経路はエーロゾル及び補給調剤である。本発明の医薬の維持された放出調剤、特に補給剤は明白に企図される。
【０２８８】
組成物／調合
本発明にしたがう使用のための医薬の又は生理学的に許容される組成物及び医薬は賦形剤及び補助剤を含む１以上の生理学的に許容される担体を用いて慣用の方法で調合されうる。適切な調剤は選択される投与経路に因る。
本明細書中に示されるいくつかの医薬は医薬として又は生理学的許容される担体及び少なくとも１の本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片であるポリペプチドを含むであろう。注入のために、本発明に係る剤は水溶液中に、好ましくはＨａｎｋ’ｓ溶液、Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ溶液の如き生理学的に融和性の緩衝液又はリン酸又は重炭酸緩衝液の如き生理学的塩緩衝液中に調合されうる。粘膜を介した投与のために、浸透されるべき境界に対して適切な浸透剤が調剤中に使用される。上記浸透剤は一般的に本分野において知られる。
【０２８９】
経口で取られうる医薬の又は生理学的に許容される調製物は、ゼラチン及びグリセロール又はソルビトールの如き可塑剤から成るやわらかい、密閉されたカプセルに加えて、ゼラチンから成る押しばめカプセルを含む。上記押しばめカプセルはラクトースの如き充填剤、デンプンの如き結合剤、及び／又はタルク又はステアリン酸マグネシウムの如き潤滑剤、及び、場合により、安定化剤と混合された活性成分を含みうる。やわらかいカプセルにおいて、上記活性化合物は脂っぽい脂、液体パラフィン又は液体ポリエチレングリコールの如き、好適な液体中に溶解又は懸濁されうる。さらに、安定化剤が添加されうる。経口投与のための全ての調剤は上記投与のために好適な投与量であるべきである。
【０２９０】
頬の投与のために、上記組成物は慣用の方法で調合される錠剤又は舐剤の形態をとりうる。
吸入による投与のために、本発明にしたがう使用のための化合物は、好適な気体の駆出剤、例えば、二酸化炭素の使用を伴って、加圧パック又は噴霧器からのエーロゾルスプレイ提示の形態で便利にデリバリーされる。加圧エーロゾルの場合、上記投与単位は計測された量デリバリーするための弁を提供することにより決定されうる。吸入器又は粉吹き器における使用のための、例えば、ゼラチンから成るカプセル及びカートリッヂは化合物及びラクトース又はデンプンの如き好適な粉末基礎の粉末混合物を含んで調合されうる。
【０２９１】
上記化合物は注入による、例えば、ボーラス注入又は連続した融合による非経口投与のために調合されうる。注入のための調剤は単位投与形態で、添加された保存剤と共に、例えば、アンプルで又は複数の用量の容器で提示されうる。上記組成物は水性媒体中の懸濁物、溶液又はエマルジョンの如き形態をとりうる、及び懸濁、安定化及び／又は分散剤の如き調合剤を含みうる。
【０２９２】
非経口投与のための医薬の又は生理学的に許容される調剤は水溶性形態の活性化合物の水溶液を含む。水性懸濁物はカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランの如き、上記懸濁物の粘性を増大させる物質を含みうる。場合により、上記懸濁物は高く濃縮された溶液の調製を可能にするために好適な安定化剤又は上記化合物の溶解性を増大させる剤をも含みうる。
【０２９３】
あるいは、上記活性成分は、使用前に、滅菌ピローゲンフリー水の如き、好適な媒体を伴う構成のための粉末の又は凍結乾燥された形態で存在しうる。
以前に示された調剤に加えて、上記化合物は補給調製物としても調合されうる。上記長期活性調剤は埋め込み（例えば、皮下に又は筋内に）により又は筋内注入により投与されうる。したがって、例えば、上記化合物は好適な重合体の又は疎水性の材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）若しくはイオン交換樹脂と共に又はゆるやかに溶解する誘導体として、例えば、ゆるやかに溶解する塩として調合されうる。
【０２９４】
さらに、上記化合物は治療用剤を含む固体の疎水性重合体の半浸透性マトリックスの如き、維持された放出系を用いてデリバリーされうる。さまざまな維持された放出材料が確立されており、そして当業者に周知である。維持された放出カプセルはそれらの化学的性質に因り、数週間〜１００日間にわたり上記化合物を放出しうる。
上記治療用試薬の化学的性質及び生物学的安定性に因り、タンパク質安定化のための追加の策が使用されうる。
【０２９５】
上記医薬の又は生理学的に許容される組成物は好適な固体又はジェル相の担体又は賦形剤を含みうる。上記担体又は賦形剤の例は、非限定的に、カルシウムカーボネート、リン酸カルシウム、さまざまな糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、及びポリエチレングリコールの如き重合体を含む。
【０２９６】
効果的な用量
本発明における使用のための好適な医薬の又は生理学的に許容される組成物は上記活性成分がそれらの意図された目的を達成するために有効な量で含まれる組成物を含む。より特には、治療として有効な量は処置されるべき患者の存在する症状の発展を妨げるために又は緩和するために有効な量を意味する。上記有効な量の決定は、特に本明細書中に提供される詳細な開示の観点で、当業者の能力の範囲内である。
【０２９７】
本発明に係る方法において使用される化合物のために、上記治療的に有効な用量ははじめに細胞培養分析から見積もられうる。例えば、用量はｉｎ ｖｉｔｒｏ系におけるレプチン又はリポタンパク質取り込み又は結合を増大させるために示される濃度点又は範囲を含む又は包含する循環濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて調合されうる。上記情報はヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用されうる。
【０２９８】
治療的に有効な用量は患者における症状の緩和をもたらす化合物の量をいう。上記化合物の毒性及び治療的有効性は、例えば、ＬＤ５０（試験集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ５０（上記集団の５０％中で治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養又は実験動物において標準の医薬手順により決定されうる。毒性及び治療的有効性の間の上記用量の割合は治療的指標であり、そしてそれはＬＤ５０及びＥＤ５０の間の割合として表現されうる。高い治療的指標を示す化合物は好ましい。
【０２９９】
これらの細胞培養分析及び動物研究から得られたデータはヒトにおける使用のための用量範囲の調合において使用されうる。上記化合物の用量は好ましくは、ほとんど又は全く毒性を伴わないで、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。上記用量は使用される投与形態及び利用される投与経路に因り、この範囲内で変化しうる。上記厳格な調剤、投与経路及び投与量は患者の状態の観点から個々の医師により選択されうる（例えば、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．， １９７５， ｉｎ “Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”， Ｃｈ．１を参照のこと）。
【０３００】
投与量及び間隔は、特定の状況に因り、体重減少又は増加を維持する又は予防するために十分な上記活性化合物の血漿値を提供するために個々に調節されうる。これらの効果を達成するために必要な用量は個体の性質及び投与経路に因るであろう。
【０３０１】
投与間隔は最小有効濃度についての値を用いて決定されうる。化合物は１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％；及び最も好ましくは５０〜９０％の期間、血漿値を上記最小有効濃度超に保つ投与計画を用いて投与されるべきである。局所投与又は選択的取り込みの場合、上記薬物の有効な局所濃度は血漿濃度に関連しえない。
【０３０２】
組成物の量は、もちろん、処置されるべき患者に、患者の体重、苦痛の重篤さ、投与様式及び主治医の判断に因るであろう。
循環血漿トリグリセリドリッチリポタンパク質の値における減少を含む、所望の結果を達成するために日で又は規則的な基礎で投与されうる、本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片の量のための好ましい投与範囲は０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇボディマスに及ぶ。より好ましい投与範囲は０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇである。もちろん、これらの日の用量は日の過程の間定期的に少量でデリバリーされ又は投与されうる。これらの用量範囲は好ましい範囲であるのみであり、本発明の限定ではないと意図されることが留意される。
【０３０３】
ＶＩ． 治療方法
ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片でのマウスの治療は増大した筋肉酸化に加えて、減少したトリグリセリド値、減少した遊離脂肪酸値、減少したグルコース値、及び減少した体重をもたらす。
【０３０４】
本発明は上記治療の必要のある個体に本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を提供することを含む肥満関連疾患及び障害を予防する又は治療する方法についてｉｎｔｅｒ ａｌｉａで示される。好ましくは、上記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片はｉｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで肥満関連活性を有する。好ましくは上記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は好ましくは経口で取られる医薬組成物中で個体に提供される。好ましくは、上記個体は哺乳類、及び最も好ましくはヒトである。好ましい態様においては、上記肥満関連疾患又は障害はアテローム性動脈硬化症、心血管疾患、損なわれたグルコース耐性、インスリン抵抗性、高血圧、卒中、シンドロームＸ、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病及び脂肪組織萎縮性糖尿病から成る群から選ばれる。本発明に係る方法により処置されるべき糖尿病関連合併症は細小血管病変、眼の病変、網膜症、神経障害、及び腎臓病変を含む。心疾患は、非限定的に、心不全、冠状動脈不全、及び高血圧を含む。本発明に係る化合物により処置されるべき他の肥満関連障害は高脂血症、高トリグリセリド血症、及び尿酸過剰血症を含む。本発明に係るさらに他の肥満関連疾患又は障害は悪液質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、新生物関連体重減少、食欲不振、及び過食症を含む。非常に好ましい態様においては、医薬組成物中のＧＭＧ−２ポリペプチドポリペプチド断片が美容理由のために健康な個体において体重を調節するために使用される。
【０３０５】
本発明は上記治療の必要のある個体に（本発明の好ましい態様の節ＶＩ中及び実施例中で示される）本発明に係る分析により同定された化合物を提供することを含む、肥満関連疾患及び障害を予防する又は治療する方法をも特徴付ける。好ましくは、これらの化合物はｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞、ｅｘ ｖｉｖｏで筋肉において又は動物モデルにおいてｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の効果に拮抗する又は作用する。あるいは、これらの化合物はレプチン及び／又はリポタンパク質取り込み及び／又は結合へのｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の効果に作用する又は拮抗する。場合により、これらの化合物はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片のＬＳＲとの相互作用、結合又は取り込みを妨げる。好ましくは、上記化合物は好ましくは経口で取られる医薬組成物中で個体に提供される。好ましくは、上記個体は哺乳類、及び最も好ましくはヒトである。好ましい態様においては、上記肥満関連疾患又は障害は肥満及びアテローム性動脈硬化症、心疾患、損なわれたグルコース耐性、インスリン抵抗性、高血圧、卒中、シンドロームＸ、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、及び脂肪萎縮性糖尿病の如き、肥満関連疾患及び障害から成る群から選ばれる。本発明に係る方法により処置されるべき糖尿病関連合併症は細小血管病変、眼の病変、網膜症、神経障害、及び腎臓病変を含む。心疾患は、非限定的に、心不全、冠状動脈不全、及び高血圧を含む。本発明に係る化合物により処置されるべき他の肥満関連障害は高脂血症、高トリグリセリド血症、及び尿酸過剰血症を含む。本発明に係るさらに他の肥満関連疾患又は障害は悪液質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、新生物関連体重減少、食欲不振、及び過食症を含む。非常に好ましい態様においては、上記医薬組成物は美容理由のための体重減少を調節するために使用される。
【０３０６】
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的許容される組成物の本発明はインスリン療法と共に、いくつかの個体、特にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病又はインスリン抵抗性を有する者において、血中グルコースを制御するための方法として使用されうる。またさらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明は、非限定的に、アテローム性動脈硬化症、冠状心疾患、心筋梗塞、及び播種性血管内共凝集を含む、炎症性障害を治療するための方法として使用されうる。
【０３０７】
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン療法と共に、いくつかの個体、特にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病又はインスリン抵抗性を有する者において体重を制御するための方法として使用されうる。
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン療法を伴わずに、単独で、いくつかの個体、特にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病又はインスリン抵抗性を有する者において、血中グルコースを制御するための方法として使用されうる。
【０３０８】
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン療法を伴わずに、単独で、いくつかの個体、特にＩＩ型糖尿病又はインスリン抵抗性を有する者において、体重を制御するための方法として使用されうる。
【０３０９】
さらに好ましい態様においては、本発明は補充的な治療において、特にいくつかの個体、特にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病又はインスリン抵抗性を有する者において、経口インスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤と共に、それらの体重又はグルコース制御を改善するために使用されうる。好ましくは、上記経口インスリン分泌促進剤は１，１−ヂメチル−２−（２−モルフォリノフェニル）グアニヂンフマル酸（ＢＴＳ６７５８２）又はトルブタミド、トラザミド、クロルプロパミド、グリベンクラミド、グリメピリド、グリピジド及びグリダジドから選ばれるスルフォニル尿素である。好ましくは、上記インスリン増感剤はメトフォルミン、シグリタゾン、トログリタゾン及びピログリタゾンから選ばれる。
【０３１０】
本発明はさらにインスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤を伴わずに、単独で、いくつかの個体、特にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病又はインスリン抵抗性を有する者の体重又はグルコース制御を改善する方法を提供する。
【０３１１】
さらに好ましい態様においては、本発明は、例えば、同時に、別々に又は（分泌促進剤の前若しくは後又は増感剤の前若しくは後に）連続して使用される別々の投与単位の形態で、経口インスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤と付随して又は同時に投与されうる。したがって、本発明はさらにいくつかの個体、特にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病又はインスリン抵抗性を有する者における体重又はグルコース制御の改善のための同時の、別々の又は連続した使用のための混合された調製物として医薬の又は生理学的に許容される組成物及び経口インスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤の組成物を提供する。
【０３１２】
さらなる好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はさらにインスリン増感剤としての使用のための方法を提供する。
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン療法と共に、いくつかの個体、特にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病又はインスリン抵抗性を有する者においてインスリン感受性を改善するための方法として使用されうる。
【０３１３】
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン療法を伴わずに、いくつかの個体、特にＩＩ型糖尿病又はインスリン抵抗性を有する者においてインスリン感受性を改善するための方法として使用されうる。
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はさらに損なわれたグルコース耐性からインスリン抵抗性への進行の阻害剤としての使用のための方法を提供する。
【０３１４】
より一般には、本発明は、個体がＧＭＧ−２マーカーについて特定の遺伝子型を有することが示される又はそれらがコントロール値、例えば、非疾患個体の代表的な値に比較して又は疾患又は状態の開始前のその個体に比較して、減少された量の血漿ＧＭＧ−２、全長又は好ましくはＧＭＧ−２のより生物学的に活性な断片を有することが示される、ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片での治療について示される。どちらの場合にも、治療は医薬として許容されるｇＧＭＧ−２又はＧＭＧ−２ポリペプチド断片を上記個体に提供することを含む。提供されるｇＧＭＧ−２断片の厳格な量は医師の案内の下の臨床試験をとおして決定されるであろうが、１日当たり１個体当たり５〜７ｍｇの範囲内であることが予想されるであろう。一般的に、好ましい範囲は１日当たり１個体当たり０．５〜１４ｍｇであろう、非常に好ましい範囲は１日当たり１個体当たり１〜１０ｍｇである。ｇＧＭＧ−２又はＧＭＧ−２ポリペプチド断片での治療から恩恵を得うる個体は少なくとも２の方法：血漿血清値決定及び遺伝子タイピングをとおして同定されうる。
【０３１５】
ＧＭＧ−２値
予備研究は肥満のヒトは非肥満のヒトより全長ＧＭＧ−２の低い値を有することを示した。本発明は全長ＧＭＧ−２の低い値を有する個体の本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片での治療を構想する。さらに、本発明は好ましくは低い値のＧＭＧ−２の生物学的に活性な断片を有する個体の本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片での治療について示される。さらなる態様においては、本発明に係るＧＭＧ−２又はＧＭＧ−２ポリペプチド断片は個体、好ましくは肥満個体に投与され、その全長ＧＭＧ−２（又はあるいは成熟ＧＭＧ−２ポリペプチド断片）の値は非肥満個体、好ましくは本分野における正常標準を用いて医師により決定された健康な個体の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、約１００％又は１００％より低い。個体において全長ＧＭＧ−２の値を決定する及び比較する方法は本分野において周知であり、そして、非限定的に、Ｒａｄｉｏ Ｉｍｍｕｎｅ Ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ドットブロットの如きフォーマットで又は例えば、分析の一部としてＧＭＧ−２に特異的な抗体を用いることを含む。ＳＮＰｓを有するタンパク質に対するものに加えて、ＧＭＧ−２及びその断片に対する抗体を作出する、及びＧＭＧ−２及びその断片を検出する方法は本発明に含まれ、そしてＰＣＴ／ＩＢ９９／０１８５８、米国出願第０９／４３４，８４８号、及びＷＯ ９９／０７７３６中で議論され、図画、図面又は表を含むそれらを全体として本明細書中に援用する。さらに、本発明に係るＧＭＧ−２／ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片に特異的な抗体、それらの作出、及びそれらの使用は本明細書中に示される。
【０３１６】
ＶＩＩ． ＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性の調節剤の同定のための分析
本発明は細胞内でｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性を調節する１以上の化合物についてのスクリーニング方法を特徴付け、それは上記細胞について試験されるべき可能性のある化合物を提供することを含み、そしてそこで、ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片効果又は活性の調節は１以上の化合物を示す。使用されうる例示的な分析は実施例４〜５、７〜１４、１６、及び１８中に示される。ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片単独の効果に比較した、それらの阻害性の又は刺激性の活性について試験されるべき化合物がこれらの分析に添加されるであろう。効果がｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の添加に基づいて観察される他の分析も細胞に対するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性又はｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の存在の効果の調節剤についてスクリーニングするために使用されうる。重要な段階は未知の化合物を適用すること及びその後ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片のみが上記細胞に適用されるときに見られるものからの変化についての分析をモニターすることである。変化はｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片単独と比較して上記化合物及びｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の存在下で顕著に異なる何らかのものとして定義される。この場合、顕著に異なるは少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％の計測可能な効果における「増大」又は「減少」であろう。
【０３１７】
上記用語「調節」は、本明細書中で使用されるとき、活性における計測可能な変化をいう。例は、非限定的に、脂肪分解刺激された受容体（ＬＳＲ）調節、レプチン調節、リポタンパク質調節、血漿ＦＦＡ値、ＦＦＡ酸化、ＴＧ値、グルコース値、及び体重を含む。これらの効果はｉｎ ｖｉｔｒｏ又は好ましくはｉｎ ｖｉｖｏでありうる。活性の調節は上記活性における増大又は減少でありうる。したがって、ＬＳＲ活性は増大され又は減少されうる、レプチン活性は増大され又は減少されうる、及びリポタンパク質活性は増大され又は減少されうる。同様に、ＦＦＡ、ＴＧ、及びグルコース値（及び体重）はｉｎ ｖｉｖｏで増大され又は減少されうる、遊離脂肪酸化はｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで増大され又は減少されうる。
【０３１８】
「ＬＳＲ」活性により、そのレプチン及びリポタンパク質を結合する、取り込む及び分解する能力に加えて、上記細胞表面での、特に特定のコンフォメーションでのＬＳＲの発現が意味される。「レプチン」活性によりその血液脳関門を介した輸送、及び潜在的にＬＳＲが必ずしも仲介因子又は唯一の仲介因子ではないこれらの出現に加えて、そのＬＳＲによる結合、取り込み及び分解が意味される。同様に、「リポタンパク質」活性によりＬＳＲが必ずしも仲介因子又は唯一の仲介因子ではないこれらの出現に加えて、ＬＳＲによるその結合、取り込み及び分解が意味される。例示的な分析は実施例４〜５、７〜１４、１６、及び１８中に提供される。これらの分析及び他の同等の分析はｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性を調節する化合物を決定する／同定するために使用されうる。好ましくは全ての活性が調節されるが、いくつかの場合、いくつかの、しかし全てではないｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性を調節する化合物を同定することは重要でありうる。
【０３１９】
上記用語「増大させる」は、本明細書中で使用されるとき、その非存在下のｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の効果と比較していくつかの計測可能な方法においてｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性を増大させる化合物の能力をいう。上記化合物の存在の結果として、レプチン結合及び／又は取り込みは、例えば、上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片のみの存在下のコントロールに比較して、増大しうる。好ましくは、活性における増大は上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の存在下における活性の値に比較して少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％である。
【０３２０】
同様に、上記用語「減少させる」は、本明細書中で使用されるとき、その非存在下でのｇＧＭＧ−２断片の効果に比較していくつかの計測可能な方法において活性を減少させる化合物の能力をいう。例えば、上記化合物の存在はマウスにおいてＦＦＡ、ＴＧ、及びグルコースの血漿濃度を減少させる。また化合物の存在の結果としてレプチン結合及び／又は取り込みは、例えば、上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片のみの存在下のコントロールに比較して、減少されうる。好ましくは、活性における減少は上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片のみの存在下における活性の値に比較して少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％である。
【０３２１】
本発明は、ａ）細胞をｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片及び候補化合物と接触させる；ｂ）ＬＳＲ調節、レプチン調節、リポタンパク質調節、ＦＦＡ酸化調節から成る群から選ばれる結果を検出する；及びｃ）ここで前記結果が前記細胞が上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片のみと接触するときの前記結果と異なる場合、前記結果は前記可能性のある化合物を同定することを含む、ボディマスを調節する必要のある個体においてボディマスを調節する可能性のある化合物を同定する方法を特徴付ける。
【０３２２】
好ましい態様においては、前記接触はさらに前記ＬＳＲのリガンドを含む。好ましくは、前記リガンドはサイトカイン、リポタンパク質、遊離脂肪酸、及びＣ１ｑから成る群から選ばれ、及びより好ましくは前記サイトカインはレプチンであり、及び最も好ましくは前記レプチンは米国仮出願第６０／１５５，５０６号中に示されるレプチンポリペプチド断片であり、図面、図画又は表を含むそれを全体として本明細書中に援用する。
【０３２３】
他の好ましい態様において、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はマウスのものである又はヒトのものである。他の好ましい態様において、前記細胞はＰＬＣ、ＣＨＯ−Ｋ１、Ｈｅｐ３Ｂ、及びＨｅｐＧ２から成る群から選ばれる。
【０３２４】
さらに他の好ましい態様において、前記リポタンパク質調節は結合、取り込み、及び分解から成る群から選ばれる。好ましくは、前記調節は前記結合、取り込み又は分解における増大である。あるいは、前記調節は前記結合、取り込み又は分解における減少である。
【０３２５】
他の好ましい態様において、レプチン調節は結合、取り込み、分解、及び輸送から成る群から選ばれる。好ましくは、前記調節は前記結合、取り込み、分解又は輸送における増大である。あるいは、前記調節は前記結合、取り込み、分解又は輸送における減少である。好ましくは、前記輸送は血液脳関門を介する。
さらに他の好ましい態様において、前記ＬＳＲ調節は前記細胞の表面上の発現である。好ましくは、前記検出はＦＡＣＳを含み、より好ましくは前記検出はさらに前記ＬＳＲに特異的に結合する抗体を含み、及び最も好ましくは前記抗体は前記ＬＳＲのカルボキシ末端に特異的に結合する。
【０３２６】
さらに他の好ましい態様において、前記可能性のある化合物はペプチド、ペプチドライブラリー、非ペプチドライブラリー、ペプトイド、脂肪酸、リポタンパク質、医薬、抗体、小分子、及びプロテアーゼから成る群から選ばれる。本発明の他の特性及び利点は図面の簡単な説明及び実施例中に示される。これらはいかなる場合でも例示するのみであり、本発明を限定するものではないことが意味される。この明細書をとおして、さまざまな出版物、特許及び公開された特許出願が引用される。本明細書中に引用されるこれらの出版物、特許及び公開された特許明細書の開示は本明細書中に援用する。
【０３２７】
ＶＩＩＩ． エピトープ及び抗体融合
本発明の好ましい態様はエピトープを有するポリペプチド及びエピトープを有するポリペプチド断片に方向付けられる。これらのエピトープは「抗原エピトープ」又は「抗原エピトープ」及び「免疫原生エピトープ」の両方でありうる。「免疫原生エピトープ」は上記ポリペプチドが免疫原であるときｉｎ ｖｉｖｏで抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。一方、抗体が結合するポリペプチドの領域は「抗原決定基」又は「抗原エピトープ」として定義される。タンパク質の免疫原生エピトープの数は一般的に抗原エピトープの数より少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３９９８４００２を参照のこと。特定のエピトープが免疫原生でなくても、しかしながら抗体はエピトープに対してｉｎ ｖｉｔｒｏで作出されうるので、それは有用であることが特に留意される。
エピトープは上記エピトープに独特の空間的なコンフォメーションにおいて少なくとも３アミノ酸を含みうる。一般的に、エピトープは少なくとも６の上記アミノ酸、及びよりしばしば少なくとも８〜１０の上記アミノ酸から成る。好ましい態様において、抗原エピトープは３〜５０の整数の数のアミノ酸を含む。エピトープとして機能する断片は慣用の方法により作出されうる。例えば、米国特許第４，６３１，２１１号中にさらに示される、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， Ｒ． Ａ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）を参照のこと。免疫原生エピトープを作り上げるアミノ酸を決定する方法はｘ線結晶学、２次元核磁気共鳴、及びエピトープマッピングを含む、例えば、Ｈ． Ｍａｒｉｏ Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）により示されるＰｅｐｓｃａｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１：３９９８−４００２；ＰＣＴ出願第ＷＯ ８４／０３５６４；及びＰＣＴ出願第ＷＯ ８４／０３５０６。他の例はＪａｍｅｓｏｎ ａｎｄ Ｗｏｌｆ， Ｃｏｍｐ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ． ４：１８１−１８６（１９８８）のアルゴリズムである（前記引用文献はそれらを全体として援用する）。上記Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原分析は、例えば、ＰＲＯＴＥＡＮコンピュータプログラムを用いて、デフォルトパラメーターを用いて行われうる（Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０ Ｗｉｎｄｏｗｓ， ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｉｎｃ．， １２２８ Ｓｏｕｔｈ Ｐａｒｋ Ｓｔｒｅｅｔ Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＴ）。
【０３２８】
本発明に係るエピトープを有する断片は好ましくは本発明に係るポリペプチドの６〜５０のアミノ酸（すなわち、６〜５０の整数、包括的）を含む。また、６〜配列リストの全長配列の整数の抗原断片も本発明に含まれる。６〜本発明に係るポリペプチドの全長配列の整数の、全ての配列の組み合わせが含まれる。上記エピトープを有する断片は、本発明に係るポリペプチド断片について上記に示されるように、（亜属として）連続するアミノ酸残基の数により又は（種として）特定のＮ−末端及びＣ−末端位により特定されうる。本発明に係るエピトープを有する断片の数も同じ方法で排除されうる。
【０３２９】
抗原エピトープは、例えば、エピトープを特異的に結合するモノクローナル抗体を含む、抗体を作出するのに有用である（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８４；ａｎｄ Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ， Ｊ． Ｇ． ｅｔ ａｌ．， １９８３を参照のこと）。上記抗体はその後本明細書中に示される、診断及び組織／細胞同定技術の如きさまざまな技術において、及び精製方法において使用される。
【０３３０】
同様に、免疫原生エピトープは本分野において周知の方法にしたがって抗体を誘導するために使用されうる（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ； Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ； Ｃｈｏｗ， Ｍ． ｅｔ ａｌ；（１９８５）ａｎｄ Ｂｉｔｔｌｅ， Ｆ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．， （１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原生エピトープは配列リストのポリペプチドを含む。上記免疫原生エピトープは、必要であれば、（ウサギ又はマウスの如き）動物系にアルブミンの如き、担体タンパク質と共に提示されうる。少なくとも８〜１０アミノ酸を含む免疫原生エピトープは（例えば、ウェスタンブロットにおいて）非常に少なくとも変性したポリペプチド中の直鎖エピトープに結合することができる抗体を作出するのに十分であることが示されている。
【０３３１】
本発明に係るエピトープを有するポリペプチドは、非限定的に、ｉｎ ｖｉｖｏ免疫化、ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫化、及びファージディスプレイ法を含む、本分野において周知の方法にしたがって抗体を誘導するために使用される（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ； Ｗｉｌｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ， ａｎｄ Ｂｉｔｔｌｅ， ｅｔ ａｌ．， １９８５を参照のこと）。ｉｎ ｖｉｖｏ免疫化が使用される場合、動物は遊離ペプチドで免疫化されうる；しかしながら、抗ペプチド抗体タイターは上記ペプチドをキーホールカサガイヘマシアニン（ＫＬＨ）又は破傷風変性毒素の如き、巨大分子担体にカップリングすることによりブーストされうる。例えば、システイン残基を含むペプチドはマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＭＢＳ）の如きリンカーを用いて担体にカップリングされうる、一方で、他のペプチドはグルタルアルデヒドの如きより一般的な結合剤を用いて担体にカップリングされうる。ウサギ、ラット及びマウスの如き動物は、例えば、約１００μｇｓのペプチド又は担体タンパク質及びＦｒｅｕｎｄ’ｓ補助剤を含むエマルジョンの腹腔内及び／又は皮内注入により遊離した又は担体にカップリングされたペプチドで免疫化される。何度かのブースター注入が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを用いたＥＬＩＳＡ分析により検出されうる、抗ペプチド抗体の有用なタイターを提供するために、例えば、約２週間の間隔で必要とされうる。免疫化された動物からの血清中の抗ペプチド抗体のタイターは、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、本分野において周知の方法にしたがって上記ペプチドの固体支持への吸着及び選択された抗体の溶離により、増大されうる。
【０３３２】
当業者は、上記に議論されるように、非限定的に、免疫原生又は抗原エピトープを含むポリペプチドを含む本発明に係るポリペプチドは異種のポリペプチド配列に融合されうることを理解するであろう。例えば、本発明に係るポリペプチドは免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の一部を含む一定の領域又は一定の領域の一部（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ドメイン全体及びそれらの一部を含むそれらの組み合わせ）に融合されることができ、キメラポリペプチドをもたらす。これらの融合タンパク質は精製を容易にし、及びｉｎ ｖｉｖｏでの増大した半減期を示す。これは、例えば、ヒトＣＤ４−ポリペプチドのはじめの２ドメイン及び哺乳類免疫グロブリンの重又は軽鎖の一定の領域のさまざまなドメインから成るキメラタンパク質について示されている（例えば、ＥＰＡ ０，３９４，８２７号；及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８８を参照のこと）。ＩｇＧ部分のためにヂスルフィド結合二量体構造を有する融合タンパク質は単量体ポリペプチド又はその断片のみより他の分子の結合及び中和においてより有効でありうる（例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９５を参照のこと）。上記エピトープをコードする核酸は発現されたポリペプチドの検出及び精製において補助するためのエピトープタグとして問題の遺伝子と結合されうる。
【０３３３】
本発明に係る追加の融合タンパク質は遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング又はコドンシャッフリング（集合的に「ＤＮＡシャッフリング」と言われる）の技術をとおして作出されうる。ＤＮＡシャッフリングは本発明に係るポリペプチドの活性を調節し、それにより上記ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストを効果的に作出するために使用されうる。例えば、米国特許第５，６０５，７９３号；第５，８１１，２３８号；第５，８３４，２５２号；第５，８３７，４５８号；及びＰａｔｔｅｎ， Ｐ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ， Ｓ．， （１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎ， Ｌ． Ｏ．， ｅｔ ａｌ（１９９９）；及びＬｏｒｅｎｚｏ， Ｍ．Ｍ．ａｎｄ Ｂｌａｓｃｏ， Ｒ．，（１９９８）を参照のこと。（この書類のそれぞれは本明細書中に援用する）。１の態様において、本発明に係るコードポリヌクレオチド又はそれによりコードされるポリペプチドの１以上の成分、モチーフ、節、部分、ドメイン、断片等は１以上の異種の分子の１以上の成分、モチーフ、節、部分、ドメイン、断片等と結合されうる。
【０３３４】
抗体
本発明はさらに上記ポリペプチドに、及びより特に本発明に係るポリペプチドのエピトープに特異的に結合する、抗体及びＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）に関する。本発明に係る抗体は（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む）ＩｇＧ、（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ、及びＩｇＹを含む。本明細書中で使用されるとき、上記用語「抗体」（Ａｂ）は、単鎖の抗体全体を含む抗体全体、及びその抗原結合断片を含むことが意味される。好ましい態様において、上記抗体は本発明に係るヒト抗原結合抗体断片であり、非限定的に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ）２及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ヂスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）及びＶL又はＶHドメインを含む断片を含む。上記抗体は鳥類及び哺乳類を含む動物源からでありうる。好ましくは、上記抗体はヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウシ又はニワトリのものである。
【０３３５】
単鎖抗体を含む、抗原結合抗体断片は単独で又は以下の：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインの全部又は部分と共に可変領域（単数又は複数）を含みうる。また可変領域（単数又は複数）及びヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインのいかなる組み合わせも本発明に含まれる。本発明はさらに、本発明に係るポリペプチドに特異的に結合する、キメラの、ヒト化された、並びにヒトモノクローナル及びポリクローナル抗体を含む。本発明はさらに本発明に係る抗体に抗イディオタイプである抗体を含む。
本発明に係る抗体は単一特異的、二特異的、及び三特異的でありうる又は大きな複合特異性を有しうる。複合特異的抗体は本発明に係るポリペプチドの異なるエピトープに特異的でありうる又は異種のポリペプチド又は固体支持材料の如き、異種の組成に加えて本発明に係るポリペプチドについて特異的でありうる。例えば、ＷＯ ９３／１７７１５；ＷＯ ９２／０８８０２；ＷＯ ９１／００３６０；ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔ， Ａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）；米国特許第５，５７３，９２０号、第４，４７４，８９３号、第５，６０１，８１９号、第４，７１４，６８１号、第４，９２５，６４８号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ， Ｓ． Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９２）を参照のこと。
【０３３６】
本発明に係る抗体は本発明に係るポリペプチドのエピトープ（単数又は複数）又はエピトープ結合部分（単数又は複数）について示される又は特定されることができ、それは上記抗体により認識され又は特異的に結合される。本発明の分泌されたタンパク質のタンパク質の場合、上記抗体は本発明に係る核酸によりコードされる全長タンパク質、本発明に係る核酸によりコードされる成熟タンパク質（すなわち、シグナルペプチドの切断により作出されるタンパク質）、本発明に係る核酸によりコードされるシグナルペプチド又は本発明に係る他のポリペプチドを特異的に結合しうる。それゆえ、上記エピトープ（単数又は複数）又はエピトープを有するポリペプチド部分（単数又は複数）は、例えば、Ｎ−末端及びＣ−末端位により、連続したアミノ酸残基の大きさにより又は本明細書中に示される別の方法で、本明細書中に示されるように特定されうる。本発明に係るエピトープ又はポリペプチドを特異的に結合する抗体は個々の種として排除されうる。それゆえ、本発明は本発明に係る特定のポリペプチドを特異的に結合する抗体を含み、そして同じものの排除を可能にする。
【０３３７】
本発明に係る抗体はそれらの交差反応性の点でも示され又は特定されうる。本発明に係るポリペプチドの他のアナログ、オーソログ又はホモログに特異的に結合しない抗体が含まれる。（例えば、ＦＡＳＴＤＢ及び本明細書中で示されるパラメーターを用いて、本分野において知られる及び本明細書中で示される方法を用いて計算されるように）９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、及び５０％未満の同一性でポリペプチドを結合しない本発明に係るポリペプチドに対する抗体も本発明に含まれる。さらに（本明細書中で示されるように）厳格なハイブリダイゼーション条件下で本発明に係るポリヌクレオチドとハイブリダイズする、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのみを結合する抗体も本発明に含まれる。本発明に係る抗体はそれらの結合アフィニティーの点でも示され又は特定されうる。好ましい結合アフィニティーは５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、及び１０-15Ｍ未満の解離定数又はＫｄ値を有するものを含む。
【０３３８】
本発明に係る抗体は、非限定的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの診断及び治療方法を含む、本発明に係るポリペプチドを精製する、検出する、及び標的化するための本分野において知られる方法を含む使用を有する。例えば、上記抗体は生物学的サンプル中の本発明に係るポリペプチドの定性的な及び定量的な計測値についての免疫分析における使用を有しうる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８を参照のこと）。
【０３３９】
本発明に係る抗体は単独で又は他の組成物と共に使用されうる。上記抗体はさらにポリペプチド又は他の組成物にＮ−又はＣ−末端で異種のポリペプチドに組換えて融合され又は（共有及び非共有結合を含んで）化学的に結合されうる。例えば、本発明に係る抗体は検出分析における標識として有用な分子及び異種のポリペプチド、薬物又は毒素の如き、エフェクター分子に組換えて融合され又は結合されうる。例えば、ＷＯ ９２／０８４９５；ＷＯ ９１／１４４３８；ＷＯ ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；及びＥＰ ０ ３９６ ３８７を参照のこと。
【０３４０】
本発明に係る抗体は本分野において知られる好適な方法により調製されうる。例えば、本発明に係るポリペプチド又はその抗原性断片はポリクローナル抗体を含む血清の産出を誘導するために動物に投与されうる。上記用語「モノクローナル抗体」はハイブリドーマ技術をとおして作出される抗体に限定されない。上記用語「抗体」は少なくとも１の結合ドメインから成るポリペプチド又はポリペプチド群をいい、ここで、結合ドメインは抗原の抗原決定基の特性と相補的な内部表面の形及び電荷分布を有する３次元の結合空間を形成する抗体分子の可変ドメインの折りたたみから形成され、それが上記抗原との免疫学的反応を可能にする。上記用語「モノクローナル抗体」は真核細胞の、原核細胞の又はファージのクローンを含む、単一のクローンに由来する抗体をいい、それが作出される方法ではない。モノクローナル抗体はハイブリドーマ、組換え体、及びファージディスプレイ技術の使用を含む本分野において知られる広くさまざまな技術を用いて調製されうる。
【０３４１】
ハイブリドーマ技術は本分野において知られるものを含む（例えば、Ｈａｒｌｏｗｅｔ ａｌ． １９８８；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ， １９８１を参照のこと）。（前記引用文献はそれらを全体として援用する）。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、例えば、（Ｆａｂ断片を作出するために）パパイン又は（Ｆ（ａｂ’）２断片を作出するために）ペプシンの如き酵素を用いて、タンパク質分解的切断によりハイブリドーマ作出抗体から作出されうる。
【０３４２】
あるいは、本発明に係る抗体は本分野において知られる方法を用いて組換えＤＮＡ技術の適用をとおして又は合成化学をとおして作出されうる。例えば、本発明に係る抗体は本分野において知られるさまざまなファージディスプレイ法を用いて調製されうる。ファージディスプレイ法において、機能的な抗体ドメインはそれらをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上に提示される。所望の結合特性を有するファージは抗原、典型的に固体表面又はビーズに結合された又は捕獲された抗体で直接選択することによりレパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒト又はマウスの）から選ばれる。これらの方法で使用されるファージは典型的にファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換えて融合されたＦａｂ、Ｆｖ又はヂスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するｆｄ及びＭ１３を含む繊維状ファージである。本発明に係る抗体を作出するために使用されうるファージディスプレイ法の例はＢｒｉｎｋｍａｎ Ｕ． ｅｔ ａｌ．（１９９５）；Ａｍｅｓ， Ｒ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ， Ｃ． Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ， Ｄ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．（１９９４）；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＷＯ ９０／０２８０９；ＷＯ ９１／１０７３７；ＷＯ ９２／０１０４７；ＷＯ ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９５／１５９８２；ＷＯ ９５／２０４０１；及び米国特許第５，６９８，４２６号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，７５０，７５３号、第５，８２１，０４７号、第５，５７１，６９８号、第５，４２７，９０８号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０，２２５号、第５，６５８，７２７号及び第５，７３３，７４３号中に開示されるものを含む。
【０３４３】
上記の引用文献中に示されるように、ファージ選択後、上記ファージからの抗体コード領域は単離され、そしてヒト抗体又は他の所望の抗原結合断片を含む、抗体全体を作出するために使用され、そして哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び菌を含む所望の宿主中で発現されうる。例えば、組換えてＦａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ）２及びＦ（ａｂ’）２断片を作出するための技術はＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ， Ｒ． Ｌ． ｅｔ ａｌ．（１９９２）；及びＳａｗａｉ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．（１９９５）；及びＢｅｔｔｅｒ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．（１９８８）中に開示されるものの如き本分野において知られる方法を用いても使用されうる。
【０３４４】
単鎖Ｆｖｓ及び抗体を作出するために使用されうる技術の例は米国特許第４，９４６，７７８号及び第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）；Ｓｈｕ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．（１９９３）；及びＳｋｅｒｒａ， Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９８８）中に示されるものを含む。ヒトにおける抗体のｉｎ ｖｉｖｏの使用及びｉｎ ｖｉｔｒｏ検出分析を含む、いくつかの使用のために、キメラの、ヒト化された又はヒトの抗体を使用することが好まれうる。キメラ抗体を作出する方法は本分野において知られる。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，（１９９５）；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ， Ｓ． Ｄ． ｅｔ ａｌ．（１９８９）；及び米国特許第５，８０７，７１５号を参照のこと。抗体はＣＤＲ−グラフティング（ＥＰ ０ ２３９ ４００；ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，５３０，１０１号；及び第５，５８５，０８９号）、ベニアリング又は再舗装（ＥＰ ０ ５９２ １０６；ＥＰ ０ ５１９ ５９６；Ｐａｄｌａｎ Ｅ． Ａ．， １９９１；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ Ｇ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， １９９４；Ｒｏｇｕｓｋａ Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， １９９４）、及び鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含むさまざまな技術を用いてヒト化されうる。ヒト抗体は上記に示されるファージディスプレイ法を含む本分野において知られるさまざまな方法により作出されうる。また、米国特許第４，４４４，８８７号、第４，７１６，１１１号、第５，５４５，８０６号、及び第５，８１４，３１８号；ＷＯ ９８／４６６４５；ＷＯ ９８／５０４３３；ＷＯ ９８／２４８９３；ＷＯ ９６／３４０９６；ＷＯ ９６／３３７３５；及びＷＯ ９１／１０７４１も参照のこと。
【０３４５】
本発明に係るポリペプチドに組換えて融合された又は（共有結合的な及び非共有結合的な結合を含む）化学的に結合された抗体は本発明中にさらに含まれる。上記抗体は本発明に係るポリペプチド以外の抗原に特異的でありうる。例えば、抗体は本発明に係るポリペプチドを特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に融合する又は結合することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで本発明に係るポリペプチドを特定の細胞型に標的化するために使用されうる。本発明に係るポリペプチドに融合される又は結合される抗体は本分野において知られる方法を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫分析及び精製方法においても使用されうる（例えば、Ｈａｒｂｏｒ ｅｔ ａｌ． ｓｕｐｌａ；ＷＯ ９３／２１２３２；ＥＰ ０ ４３９ ０９５；Ｎａｒａｍｕｒａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． １９９４；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓ， Ｓ． Ｏ． ｅｔ ａｌ．， １９９２；Ｆｅｌｌ， Ｈ． Ｐ． ｅｔ ａｌ．，１９９１を参照のこと）。
【０３４６】
本発明はさらに可変領域以外の抗体ドメインに融合された又は結合された本発明に係るポリペプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明に係るポリペプチドは抗体Ｆｃ領域又はその一部に融合され又は結合されうる。本発明に係るポリペプチドに融合された抗体部分はヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメイン又はドメイン全体若しくはその一部の組み合わせを含みうる。本発明に係るポリペプチドは上記ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増大させるために又は本分野において知られる方法を用いた免疫分析における使用のために上記抗体部分に融合され又は結合されうる。上記ポリペプチドは複合体を形成するために上記抗体部分に融合され又は結合されうる。例えば、本発明に係るポリペプチドに融合されたＦｃ部分はＦｃ部分の間のヂスルフィド結合をとおして二量体を形成しうる。より高度に複合体化した形態は上記ポリペプチドをＩｇＡ及びＩｇＭの一部に融合することにより作出されうる。本発明に係るポリペプチドを抗体の一部に融合する又は結合する方法は本分野において知られる。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、第５，６２２，９２９号、第５，３５９，０４６号、第５，３４９，０５３号、第５，４４７，８５１号、第５，１１２，９４６号；ＥＰ ０ ３０７ ４３４、ＥＰ ０ ３６７ １６６；ＷＯ ９６／０４３８８、ＷＯ ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ， Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９１）；Ｚｈｅｎｇ， Ｘ． Ｘ． ｅｔ ａｌ．（１９９５）；及びＶｉｌ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．（１９９２）を参照のこと。
【０３４７】
本発明はさらに本発明に係るポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストとしてはたらく抗体に関連する。例えば、本発明は部分的に又は完全に、本発明に係るポリペプチドとの受容体／リガンド相互作用を破壊する抗体を含む。受容体特異的抗体及びリガンド特異的抗体の両方が含まれる。リガンド結合を妨げないが、受容体活性化を妨げる受容体特異的抗体が含まれる。受容体活性化（すなわち、シグナリング）は本明細書中に示される技術により又は本分野において知られる別の方法で決定されうる。リガンド結合及び受容体活性化の両方を妨げる受容体特異的抗体も含まれる。そのように、リガンドに結合し、それにより受容体活性化を妨げるが、リガンドが受容体に結合することを妨げない抗体に加えて、リガンドに結合する及び上記リガンドの上記受容体への結合を妨げる中和抗体が含まれる。上記受容体を活性化する抗体がさらに含まれる。これらの抗体はリガンド仲介受容体活性化により影響される生物学的活性の全部の又は全部未満のアゴニストとしてはたらきうる。上記抗体は本明細書中に開示される特異的活性を含む生物学的活性についてのアゴニスト又はアンタゴニストとして特定されうる。上記抗体アゴニストは本分野において知られる方法を用いて作出されうる。例えば、ＷＯ ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．（１９９８）；Ｃｈｅｎ， Ｚ． ｅｔ ａｌ．（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐ， Ｊ． Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９８）；Ｚｈｕ， Ｚ． ｅｔ ａｌ． （１９９８）；Ｙｏｏｎ， Ｄ． Ｙ． ｅｔ ａｌ．（１９９８）；Ｐｒａｔ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．；Ｐｉｔａｒｄ， Ｖ． ｅｔ ａｌ．（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎ， Ｎ． Ｇ． ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．； Ｔａｒｙｍａｎ， Ｒ． Ｅ． ｅｔ ａｌ．（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒ， Ｙ． Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．（１９９６）を参照のこと。
【０３４８】
上記に議論されるように、本発明に係るポリペプチドの抗体は、今度は、当業者に周知の技術を用いて本発明に係るポリペプチドを「真似る」抗イディオタイプ抗体を作出するために利用されうる（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ ａｎｄ Ｂｏｎａ（１９８９）；ａｎｄ Ｎｉｓｓｉｎｏｆｆ（１９９１）を参照のこと）。例えば、結合し、及びポリペプチド複合体化を又は本発明に係るポリペプチドのリガンドへの結合を競合的に阻害する抗体は、ポリペプチド複合体化又は結合ドメインを「真似る」及び、結果として、ポリペプチド又はそのリガンドに結合する及び中和する抗イディオタイプを作出するために使用されうる。上記中和抗イディオタイプ抗体は本発明に係るポリペプチドを結合するために又はそのリガンド／受容体を結合し、及びそれによりその生物学的活性をブロックするために使用されうる。
【０３４９】
本発明は本発明に係る突然変異された全長又は成熟ポリペプチドに又は上記突然変異されたポリペプチドのエピトープを含むその断片又は変形に特異的に結合することのできる精製された又は単離された抗体にも関する。他の好ましい態様においては、本発明は本発明に係るポリペプチドの少なくとも１０の連続したアミノ酸を含む及び特性を引き起こす突然変異によりコードされうる少なくとも１のアミノ酸を含むポリペプチドに結合することのできる抗体に関する。
【０３５０】
本発明に係るポリペプチドの、抗体が結合するものとは異なる種を発現する、野生型の又はトランスジェニックの、非ヒト動物又は哺乳類が所望され、そして本発明に係るポリペプチドを発現しない動物（すなわち、ノックアウト動物）は抗体の調製に特に有用である。遺伝子ノックアウト動物は本発明に係るポリペプチドの暴露された領域の全部又はほとんどを外来抗原として認識するであろう、そしてそれゆえ、エピトープのより広い配列で抗体を作出する。さらに、１０〜３０アミノ酸しか有しない、より小さいポリペプチドは本発明に係るポリペプチドのいずれか１への特異的結合を得るために有用であり得る。さらに、抗原配列に似る本発明に係るポリペプチドの種を作出する動物の体液性の免疫系は動物の固有のポリペプチド種及び抗原配列の差を好ましく認識し、そして上記抗原配列におけるこれらの独特の部位に対する抗体を作出するであろう。上記技術は本発明に係るポリペプチドのいずれか１に特異的に結合する抗体を得ることにおいて特に有用であろう。
【０３５１】
プロトコールにしたがって調製される抗体調製物は生物学的サンプル中の抗原を有する物質の濃度を決定する定量的な免疫分析において有用である；それらはまた生物学的サンプル中の抗原の存在を同定するために半定量的に又は定量的に使用されうる。上記抗体は上記タンパク質を発現する細胞を殺す又は体内の上記タンパク質の値を減少させるための治療用組成物においても使用されうる。
【０３５２】
本発明に係る抗体は本分野において知られる放射活性の、蛍光の又は酵素の標識のいずれか１により標識化されうる。
したがって、本発明は生物学的サンプル中で本発明にしたがって本発明に係るポリペプチドの存在を特異的に検出するための方法にも方向付けられ、前記方法は以下の段階：
ａ）本発明に係るポリペプチドを含むことが疑われる生物学的サンプルを得ること；
ｂ）上記生物学的サンプルを抗原抗体結合について好適な条件下で本発明に係るポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル又はモノクローナル抗体に接触させること；及び
ｃ）形成された抗原−抗体複合体を検出すること
を含む。
【０３５３】
本発明は生物学的サンプル中で本発明に係るポリペプチドの存在をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するための診断キットにも関し、ここで、前記キットは：
ａ）場合により、標識化された、本発明に係るポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル又はモノクローナル抗体；
ｂ）形成された抗原−抗体複合体の検出を可能にする試薬
を含み、前記試薬は場合により、より特には上記に挙げたモノクローナル又はポリクローナル抗体がそれ自体標識化されない場合に、標識を有する又は標識化試薬によりそれ自体認識されることができる。
【０３５４】
Ａ． ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体産生
示されるように同定された及び単離されたペプチドのいずれかのエピトープに対するモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒ， Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）の古典的な方法又はその誘導される方法にしたがって、マウスハイブリドーマから調製されうる。簡単に述べると、マウスにそこから由来した数マイクログラムの選択されたタンパク質又はペプチドを数週間にわたり反復して接種する。上記マウスをその後殺し、及び脾臓の抗体産生細胞を単離する。上記脾臓細胞をポリエチレングリコールの方法によりマウスミエローマ細胞と融合し、そして過剰の融合されない細胞をアミノプテリンを含む選択的媒体（ＨＡＴ媒体）上での系の成長により破壊する。うまく融合した細胞を希釈し、そして上記希釈物の等分をマイクロタイタープレートのウェル中に置き、培養物の成長を継続させる。抗体産出コロニーを、もともとＥｎｇｖａｌｌ， Ｅ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ７０：４１９（１９８０）により示されたＥｌｉｓａ、及びその誘導される方法の如き、免疫分析手順により上記ウェルの上清液体における抗体の検出により同定する。選択された陽性クローンは展開され、そしてそれらのモノクローナル抗体産物は使用のために回収されうる。モノクローナル抗体産生の詳細な手順はＤａｖｉｓ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． Ｓｅｃｔｉｏｎ ２１−２中に示される。
【０３５５】
Ｃ−末端Ｃ１ｑホモロジー領域の全部又は一部から成るＧＭＧ−２ポリペプチド断片に特異的に結合するが、Ｎ−末端ヂペプチドがヂペプチヂルペプチダーゼによりタンパク質分解的に除去された前記断片には特異的に結合しないモノクローナル抗体も本発明にまた特に含まれる［Ｄｅａｃｏｎ（２０００）Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ８５：３５７５−３５８１ その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する］。好ましい前記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸１４４〜２８８若しくは１６２〜２８８又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸１３４〜２７８若しくは１５２〜２７８又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸１１５〜２５９若しくは１３３〜２５９から選ばれる。モノクローナル抗体を作出する方法は当業者に知られる。ＧＭＧ−２（１４４〜２８８）を含むサンプルを得る、ＧＭＧ−２（１４６〜２８８）を含むサンプルを得る、前記抗体を１４４〜２８８と接触させる、前記抗体を１４６〜２８８と接触させる、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）により１４４〜２８８に及び１４６〜２８８に結合する抗体の値を定量する：段階を含む、モノクローナル抗体を選択する方法もさらに特に含まれ、ここで、前記モノクローナル抗体は配列ＩＤ番号：２の１４４〜２８８に特異的に結合するが、配列ＩＤ番号：２の１４６〜２８８には特異的に結合しない。１３４〜２７８を含むサンプルを得る、１３６〜２７８を含むサンプルを得る、前記抗体を１３４〜２７８と接触させる、前記抗体を１３６〜２７８と接触させる、ＥＬＩＳＡにより１３４〜２７８に及び１３６〜２７８に結合する抗体の値を定量する：段階を含む、モノクローナル抗体の選択方法もさらに特に含まれ、ここで、前記モノクローナル抗体は配列ＩＤ番号：４の１３４〜２７８に特異的に結合するが１３６〜２７８には特異的に結合しない。１１５〜２５９を含むサンプルを得る、１１７〜２５９を含むサンプルを得る、前記抗体を１１５〜２５９と接触させる、前記抗体を１１７〜２５９と接触させる、ＥＬＩＳＡにより１１５〜２５９に及び１１７〜２５９に結合する抗体の値を定量する：段階を含む、モノクローナル抗体の選択方法もまたさらに特に含まれ、ここで、前記モノクローナル抗体は配列ＩＤ番号：６の１１５〜２５９に特異的に結合するが１１７〜２５９には特異的に結合しない。１６２〜２８８を含むサンプルを得る、１６４〜２８８を含むサンプルを得る、前記抗体を１６２〜２８８と接触させる、前記抗体を１６４〜２８８と接触させる、ＥＬＩＳＡにより１６２〜２８８に及び１６４〜２８８に結合する抗体の値を定量する：段階を含む、モノクローナル抗体の選択方法もまたさらに特に含まれ、ここで、前記モノクローナル抗体は配列ＩＤ番号：２の１６２〜２８８に特異的に結合するが１６４〜２８８には特異的に結合しない。１５２〜２７８を含むサンプルを得る、１５４〜２７８を含むサンプルを得る、前記抗体を１５２〜２７８と接触させる、前記抗体を１５４〜２７８と接触させる、ＥＬＩＳＡにより１５２〜２７８に及び１５４〜２７８に結合する抗体の値を定量する：段階を含む、モノクローナル抗体の選択方法もまたさらに特に含まれ、ここで、前記モノクローナル抗体は配列ＩＤ番号：４の１５２〜２７８に特異的に結合するが１５４〜２７８には特異的に結合しない。１３３〜２５９を含むサンプルを得る、１３５〜２５９を含むサンプルを得る、前記抗体を１３３〜２５９と接触させる、前記抗体を１３５〜２５９と接触させる、ＥＬＩＳＡにより１３３〜２５９に及び１３５〜２５９に結合する抗体の値を定量する：段階を含む、モノクローナル抗体の選択方法もまたさらに特に含まれ、ここで、前記モノクローナル抗体は配列ＩＤ番号：６の１３３〜２５９に特異的に結合するが１３５〜２５９には特異的に結合しない。
【０３５６】
Ｂ． 免疫化によるポリクローナル抗体産生
単一のタンパク質の不均一のエピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清は好適な動物を、免疫原生を高めるために改変されない又は改変されうる、上記に示されたものに由来する発現されたタンパク質又はペプチドで免疫化することにより調製されうる。有効なポリクローナル抗体産生は抗原及び宿主種の両方に関する多くの因子により影響される。例えば、小分子は他のものよりも免疫原生を有し難い傾向があり、そして担体及び補助剤の使用を必要としうる。また、宿主動物は接種の部位及び用量に応答して変化し、不十分な又は過剰の用量の抗原は低いタイター抗血清をもたらす。複数の皮内部位で投与される小用量（ｎｇレベル）の抗原は最も信頼可能であるように見える。ウサギについての有効な免疫化プロトコールはＶａｉｔｕｋａｉｔｉｓ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ３３：９８８−９９１（１９７１）中に見られうる。
【０３５７】
ブースター注入は規則的な間隔で与えられることができ、そして抗血清は、例えば、上記抗原の既知の濃度に対するアガー中の二重免疫拡散法により、半定量的に決定される、その抗体タイターが落ちはじめるとき、回収される。例えば、Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ， Ｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈａｐ． １９ ｉｎ： Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄ． Ｗｉｅｒ（ｅｄ）Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（１９７３）を参照のこと。抗体の安定した濃度は通常０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌの血清（約１２ μＭ）の範囲内である。抗原についての抗血清のアフィニティーは、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ， Ｄ．， Ｃｈａｐ． ４２ ｉｎ：Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２ｄ Ｅｄ．（Ｒｏｓｅ ａｎｄ Ｆｒｉｅｄｍａｎ， Ｅｄｓ．）Ａｍｅｒ． Ｓｏｃ． Ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ． Ｃ． （１９８０）により示されるように、競合的結合曲線を準備することにより決定される。
【０３５８】
いずれかのプロトコールにしたがって調製された抗体調製物は生物学的サンプル中の抗原を有する物質の濃度を決定する定量的免疫分析において有用である；それらはまた生物学的サンプル中の抗原の存在を半定量的に又は定性的に同定するためにも使用されうる。上記抗体は上記タンパク質を発現する細胞を殺す又は体内の上記タンパク質の値を減少させるための治療用組成物においても使用されうる。
【０３５９】
本発明の他の特性及び利点は図面の簡単な説明及び実施例中に示される。これらはいかなる場合にも単に例示であり、本発明を限定するとは意味されない。本明細書をとおして、さまざまな出版物、特許及び公開特許出願が引用される。本明細書中に引用されるこれらの出版物、特許及び公開特許出願の開示は、本開示に援用する。
【０３６０】
ＩＸ． ホモ三量体ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性のアンタゴニストの同定のための分析
本発明はヂペプチヂルペプチダーゼによるＧＭＧ−２ポリペプチド断片のＮ−末端の切断をブロックする１以上のアンタゴニスト化合物のためのスクリーニング方法を特徴付ける。好ましい前記化合物は、非限定的に、小分子量有機又は無機化合物、タンパク質、ペプチド、炭水化物又は脂質から選ばれる。好ましい前記ヂペプチヂルペプチダーゼはヂペプチヂルペプチダーゼから成るヒト血漿である。好ましいヂペプチヂルペプチダーゼは、非限定的に、ヒトＣＤ２６又はヒトアトラクチンから選ばれる。さらに好ましいヂペプチヂルペプチダーゼは、非限定的に、水溶性ヒトＣＤ２６又は水溶性ヒトアトラクチンから選ばれる。水溶性ヒトＣＤ２６は当業者に周知の方法を用いて組換え法により作出される（米国特許第６，２６５，５５１号 その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する）。水溶性ヒトアトラクチンは当業者に周知の方法を用いて組換え法により作出される（国際特許出願番号 ＷＯ １５６５１Ａ１ その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する）。好ましい前記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸１４４〜２８８若しくは１６２〜２８８又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸１３４〜２７８若しくは１５２〜２７８又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸１１５〜２５９若しくは１３３〜２５９から選ばれる。配列ＩＤ番号：２の前記好ましいＧＭＧ−２ポリペプチド断片（１４４〜２８８）の前記ヂペプチヂルペプチダーゼ切断はＮ−末端のヂペプチドＳＰを除去する。配列ＩＤ番号：２の前記好ましいＧＭＧ−２ポリペプチド断片（１６２〜２８８）の前記ヂペプチヂルペプチダーゼ切断はＮ−末端のヂペプチドＴＡを除去する。配列ＩＤ番号：４の前記好ましいＧＭＧ−２ポリペプチド断片（１３４〜２７８）の前記ヂペプチヂルペプチダーゼ切断はＮ−末端のヂペプチドＳＰを除去する。配列ＩＤ番号：４の前記好ましいＧＭＧ−２ポリペプチド断片（１５２〜２７８）の前記ヂペプチヂルペプチダーゼ切断はＮ−末端のヂペプチドＴＡを除去する。配列ＩＤ番号：６の前記好ましいＧＭＧ−２ポリペプチド断片（１１５〜２５９）の前記ヂペプチヂルペプチダーゼ切断はＮ−末端のヂペプチドＳＰを除去する。配列ＩＤ番号：６の前記好ましいＧＭＧ−２ポリペプチド断片（１３３〜２５９）の前記ヂペプチヂルペプチダーゼ切断はＮ−末端のヂペプチドＴＡを除去する。
【０３６１】
本発明はさらに：ａ）前記ホモ三量体ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を前記化合物と接触させる又はさせない；ｂ）活性に基づいて結果を検出する、ここで、前記活性は、非限定的に、脂質分割、脂質代謝、及びインスリン様活性から選ばれる；及びｃ）化合物ありの前記結果が化合物なしの前記結果と異なる場合、前記結果は前記化合物をホモ三量体ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性のアンタゴニストとして同定する：を含む、ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性の前記アンタゴニストのついての化合物のスクリーニング方法を特徴付ける。
【実施例】
【０３６２】
実施例
【０３６３】
以下の実施例は例示的な目的のために提供され、限定の意味ではない。当業者は本明細書中の開示に基づいて同等の分析及び方法を設計することができるであろう、その全ては本明細書の一部を形成する。
【０３６４】
本明細書をとおして使用される上記用語全長ＧＭＧ−２ポリペプチドはタンパク質ホモログマウスＡＣＲＰ３０［Ｓｃｈｅｒｅｒ， ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｅｒｕｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｃ１ｑ， ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ ｉｎ ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ”；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０， ２６７４６−２６７４９（１９９５）］、マウスＡｄｉｐｏＱ［Ｈｕ， ｅｔ ａｌ．，“ＡｄｉｐｏＱ ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ａｄｉｐｏｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｏｂｅｓｉｔｙ”， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１， １０６９７−１０７０３（１９９６）］、ヒトＡＰＭ１［Ｍａｅｄａ， ｅｔ ａｌ．，“ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ａｄｉｐｏｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ， ＡＰＭ１（ＡｄｉＰｏｓｅ Ｍｏｓｔ ａｂｕｎｄａｎｔ Ｇｅｎｅ ｔｒａｓｃｒｉｐｔ １）”， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２２１， ２８６−２８９（１９９６）］及びヒトＧＢＰ２８［Ｎａｋａｎｏ， ｅｔ ａｌ．， “Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＢＰ２８， ａ ｎｏｖｅｌ ｇｅｌａｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ”， Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１２０， ８０３−８１２（１９９６）］を含むと意図されることに注意すべきである。ＧＭＧ−２はまた他のホモログを含むと意図される。ｇＧＭＧ−２は球状ドメインから成る全長ＧＭＧ−２ポリペプチドのポリペプチド断片をいうと理解される。
【０３６５】
実施例１： ＧＭＧ−２ ＤＮＡのノザン分析
発達の異なる段階におけるマウス胚に加えて、異なるヒト組織（成人及び胎児）及び細胞系におけるＧＭＧ−２発現の分析はＣｌｏｎｔｅｃｈから購入されるポリＡ+ＲＮＡブロット（例えば、＃７７８０−１、７７５７−１、７７５６−１、７７６８−１及び７７６３−１）を用いることにより達成される。ＲＮＡプローブの標識化はＡｍｂｉｏｎからのＲＮＡ Ｓｔｒｉｐ−ＥＺキットを用いて製造業者の教示どおりに行われる。ＲＮＡプローブのＲＮＡブロットへのハイブリダイゼーションはＵｌｔｒａｈｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ａｍｂｉｏｎ）で行われる。簡単に述べると、ブロットを５８℃（低い厳格さ）又は６５℃（高い厳格さ）で３０分間、前ハイブリダイゼーションする。標識化したプローブ（２×１０6ｃｐｍ／ｍｌ）を添加後、ブロットを一晩（１４〜２４時間）ハイブリダイズし、及び２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで５０℃で２×２０分間（低い厳格さ）、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで５８℃で２×２０分間（中間の厳格さ）及び１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６５℃で２×２０分間（高い厳格さ）洗浄する。洗浄完了後、ブロットをフォスフォイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）上に１〜３日暴露する。
【０３６６】
実施例２： 代謝関連活性のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
ＧＭＧ−２ポリペプチドのさまざまな調製物及びさまざまな配列変形の活性を以下に提供されるものを含むさまざまなｉｎ ｖｉｔｒｏ分析を用いて評価する。これらの分析はまたＧＭＧ−２ポリペプチドアンタゴニスト及びアゴニストを発展させるために使用されうるものの例示である。そうするために、候補分子の存在下での、例えば、レプチン及び／又はＬＳＲ活性に対する、上記分析におけるＧＭＧ−２ポリペプチドの効果は上記候補分子の非存在下の分析におけるＧＭＧ−２ポリペプチドの効果と比較されうる。ＧＭＧ−２ポリペプチドは高カフェテリア食のマウスにおいて体重を減少させると考えられているので（実施例５）、これらの分析はまた体重を減少させる（又は増大させる）ための候補治療を同定するためにもはたらく。
【０３６７】
肝細胞系
ＧＭＧ−２ポリペプチドのＬＳＲへの効果の試験は、例えば、ＰＬＣ、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ（ヒト）、Ｈｅｐａ１〜６、ＢＰＲＣＬ（マウス）又はＭＣＡ−ＲＨ７７７、ＭＣＡ−ＲＨ８９９４（ラット）を含む、肝細胞系を用いて行われうる。
【０３６８】
ＢＰＲＣＬマウス肝細胞（ＡＴＣＣ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）をグルタミン及びペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（高グルコース）中６−ウェルプレート中に３００，０００細胞／ウェルの濃度で置く（０日目）（Ｂｉｈａｉｎ ＆ Ｙｅｎ， １９９２）。培地を２日目に変える。３日目、コンフルエント単層をリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）（２ｍＬ／ウェル）で一回洗浄する。細胞を０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、３．７ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、ｐＨ７．５を含むＤＭＥＭ中の増大する濃度の組換えＡｄｉｐｏＱ（ＡＱ）又は球状ＡｄｉｐｏＱ（ＡＱ−ＧＨ）で３７℃で３０分間インキュベートする。１０ｎｇ／ｍＬ125Ｉ−マウスレプチン（特異的活性、２２１００ｃｐｍ／ｎｇ）の添加後、インキュベーションを３７℃で３時間続ける。単層を０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳで続けて２回、続いて、ＰＢＳ／ＢＳＡで１回、及びその後ＰＢＳで続けて２回洗浄する。細胞を０．２４ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｎ ＮａＯＨで溶解する。溶解物を管内に回収し、そしてガンマカウンター内で計測する。
【０３６９】
血液脳関門モデル：
脳におけるＧＭＧ−２ポリペプチドのレプチン輸送に対する効果は脳由来細胞を用いて決定されうる。構想される１の方法は、ＬＳＲ又は他の受容体を介したレプチン（又は他の分子）の輸送に対するＧＭＧ−２ポリペプチドの効果を試験するために脳毛細管内皮細胞及び星状細胞の共培養を使用する、Ｄｅｈｏｕｃｋ， ｅｔ ａｌ（Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ５４：１７９８−８０１，１９９０；図面、表又は図画を含むそれらを全体として本明細書中に援用する）により示される血液／脳関門モデルを用いることである。
【０３７０】
この分析はＧＭＧ−２ポリペプチドの脳へのレプチン輸送に対する潜在的な効果の表示でありうる、及びＧＭＧ−２ポリペプチド変形を脳におけるＬＳＲ又は他の受容体をとおしたレプチン輸送を調節するそれらの能力についてスクリーニングするために使用されうる。さらに、ＧＭＧ−２ポリペプチドのＬＳＲ又は他の受容体をとおしたレプチン輸送に対する効果の推定上のアゴニスト及びアンタゴニストもこの分析を用いてスクリーニングされうる。血液／脳関門を介するレプチンの増大した輸送はおそらくその満腹因子としての活性を増大させるであろう。
【０３７１】
ＬＳＲ発現のＦＡＣＳ分析
ＧＭＧ−２ポリペプチドのＬＳＲに対する効果は、抗ＬＳＲ抗体及び蛍光二次抗体を用いて、フロー表面サイトメトリーにより細胞表面上のＬＳＲ発現値を計測することにより決定されうる。フローサイトメトリーは生物学的粒子の特性を計測するために使用されるレーザーに基づいた技術である。フローサイトメトリーの根底にある原理は光が分散され、励起源からの光が動く粒子にぶつかるとき蛍光が吸収されるというものである。
これはＧＭＧ−２ポリペプチドの推定上のアゴニスト及びアンタゴニストに加えて、ＧＭＧ−２ポリペプチド及び変形をスクリーニングするために容易に適合しうるハイスループット分析である。２の分析は以下に提供される。上記抗体、細胞系及びＧＭＧ−２ポリペプチドアナログは実験に因り変化しうるが、ヒト細胞系、ヒト抗ＬＳＲ抗体及び球状ＧＭＧ−２がヒトを治療するために使用されるべき変形、アゴニスト、及びアンタゴニストについてスクリーニングするために使用されうる。
【０３７２】
分析１：
細胞を回収及びＦＡＣＳによる分析前に無傷のＧＭＧ−２ポリペプチド（又は無処理の）で前処理する。細胞を非酵素解離溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いて回収し、及びその後１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ中で抗ＬＳＲ ８１Ｂ又は関連性のない抗血清の１：２００希釈で４℃で１時間インキュベートする。同じ緩衝液で２回洗浄後、ヤギ抗ウサギＦＩＴＣ結合抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ， Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ， ＰＡ）を細胞に添加し、続いてさらに４℃で３０分間インキュベートする。洗浄後、上記細胞を２％フォルマリン中に固定する。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）上で行う。
【０３７３】
分析２：
細胞を分析前に４８時間、製造業者の教示にしたがってＴ１７５フラスコ中で培養する。
細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳ、フィルター滅菌）で１回洗浄し、及びフラスコから１０ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液中に手動でかきとる。上記細胞懸濁物を１５ｍＬ円錐管に移し、及び１２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離する。上清を捨て、及び細胞を４℃に冷却した１０ｍＬ ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁する。細胞カウントを行い、及び上記細胞濃度をＦＡＣＳ緩衝液で１×１０6細胞／ｍＬの濃度に合わせる。１ミリリットルの細胞懸濁物を分析のために４８ウェルプレートのそれぞれのウェルに添加した。細胞を１２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離する。プレートをチェックし、細胞がペレット化していることを確認して、上記上清を除去し、そして細胞をヴォルテックスミキサー上でプレートを揺らすことにより再懸濁する。１ミリリットルのＦＡＣＳ緩衝液をそれぞれのウェルに添加し、続いて、１２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離する。細胞洗浄といわれるこれを全部で３回行った。
【０３７４】
適切なワーキング希釈液（例えば、１：２５、１：５０、１：１００、１：２００、１：４００、１：５００、１：８００、１：１０００、１：２０００、１：４０００、１：５０００又は１：１００００）を決定するためのスクリーニング実験において滴定された、一次抗体を総容積５０μＬ ＦＡＣＳ緩衝液中の細胞に添加する。プレートを光から保護して４℃で１時間インキュベートする。インキュベーションに続いて、細胞を上記に示したように３回洗浄する。適切なワーキング希釈液（例えば、１：２５、１：５０、１：１００、１：２００、１：４００、１：５００、１：８００、１：１０００、１：２０００、１：４０００、１：５０００又は１：１００００）を決定するためのスクリーニング実験において滴定された、適切な二次抗体を総容積５０μＬ ＦＡＣＳ緩衝液中の細胞に添加する。プレートを光から保護して４℃で１時間インキュベートする。インキュベートに続いて、細胞を上記に示したように３回洗浄する。最後の洗浄の際、細胞を５００μＬ ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、そしてＦＡＣＳ取得管に移す。サンプルを光から保護して氷上に置き、そして１時間以内に分析する。
【０３７５】
蛍光マイクロスコピーにより検出されるＧＭＧ−２ポリペプチドの細胞結合及び取り込み
ＧＭＧ−２ポリペプチドの蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合：１ｍｇ／ｍＬ濃度の精製されたＧＭＧ−２タンパク質をＳｉｇｍａのＦｌｕｏｒｏＴａｇＦＩＴＣ結合キット（Ｓｔｏｃｋ Ｎｏ．ＦＩＴＣ−１）を用いてＦＩＴＣで標識化する。ＧＭＧ−２タンパク質標識化のために、スモールスケール結合についてのＳｉｇｍａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ中に概略されるプロトコールにしたがった。
【０３７６】
細胞培養：Ｃ２Ｃ１２マウス骨格筋細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ＣＲＬ−１７７２）及びＨｅｐａ−１−６マウス肝細胞（ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ＣＲＬ−１８３０）をウェル当たり２×１０5細胞の細胞濃度で６ウェルプレート中にまく。Ｃ２Ｃ１２及びＨｅｐａ−１−６細胞を分析前に２４〜４８時間容器の教示にしたがって培養する。細胞が８０％コンフルエントになったとき分析を行う。
【０３７７】
マイクロスコピーを用いたＦＩＴＣ標識化したＧＭＧ−２タンパク質細胞結合及び取り込み：Ｃ２Ｃ１２及びＨｅｐａ−１−６細胞をヒトＬＳＲ（８１Ｂ：ヒトＬＳＲのＮ−末端配列；マウスＬＳＲとクロス反応しない及び９３Ａ：Ｃ−末端配列、マウスＬＳＲとクロス反応する）に対して方向付けられた抗体又はｇＣ１ｑｒ（９５３）に対して方向付けられた抗血清の存在下／非存在下で３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートする。ＬＳＲ抗体を２μｇ／ｍＬの濃度で培地に添加する。上記抗ｇＣ１ｑｒ抗血清を２．５μＬの容積の希釈しない血清（高濃度）又は１：１００希釈（低濃度）で培地に添加する。特定した抗体でのインキュベーションに続いて、ＦＩＴＣ−ＧＭＧ−２ポリペプチド（５０ｎＭ／ｍＬ）をそれぞれの細胞培養ウェルに添加する。細胞を再び３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートする。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞をウェルから１ｍＬのＰＢＳ中にかきとる。細胞懸濁物をエッペンドルフチューブに移し、そして１０００ｒｐｍで２分間遠心分離する。上清を除去し、そして細胞を２００μＬのＰＢＳ中に再懸濁する。ＦＩＴＣ−ＧＭＧ−２ポリペプチドの結合及び取り込みを４０×倍率で蛍光マイクロスコピーにより分析する。
【０３７８】
この分析はＧＭＧ−２ポリペプチドの細胞への取り込み及び／又は結合を促進する又は妨げる剤を同定するために有用でありうる。
【０３７９】
リポタンパク質受容体としてのＬＳＲに対する効果
ＬＳＲのリポタンパク質結合、内面化及び分解活性に対するＧＭＧ−２タンパク質の効果も試験されうる。ＬＳＲのリポタンパク質受容体としての計測はＢｉｈａｉｎ ＆ Ｙｅｎ，（（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｍａｙ １９；３１（１９）：４６２８−３６；その図画、表又は図面を含むそれらを全体として本明細書中に援用する）において示される。ＧＭＧ−２タンパク質のＬＳＲ（又は他の受容体）のリポタンパク質結合、内面化及び分解活性に対する効果は、追加のコントロールとしての無処理の細胞を伴って、無傷のＧＭＧ−２タンパク質のそれと比較されうる。この分析は代謝関連活性のアゴニスト及びアンタゴニストに加えて、ＧＭＧ−２タンパク質の活性及び阻害変形についてスクリーニングするためにも使用されうる。
【０３８０】
ヒト肝ＰＬＣ細胞（ＡＴＣＣ容器）をグルタミン及びペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（高グルコース）中の６ウェルプレート中に３００，０００細胞／ウェルの濃度で置く（０日目）（Ｂｉｈａｉｎ ＆ Ｙｅｎ， １９９２）。培地を２日目に変える。３日目、コンフルエント単層をリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）（２ｍＬ／ウェル）で一回洗浄する。細胞を０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、３．７ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ、ｐＨ７．５中の１０ｎｇ／ｍＬヒト組換えレプチンで３７℃で３０分間インキュベートし、続いて増大する濃度のＧＭＧ−２ポリペプチドで３７℃でさらに３０分間インキュベートする。０．８ｍＭオレイン酸及び２０μｇ／ｍＬ125Ｉ−ＬＤＬの添加後、インキュベーションを３７℃で２時間続ける。単層を０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳで続けて２回洗浄し、続いて、ＰＢＳ／ＢＳＡで１回、及びその後ＰＢＳで続けて２回洗浄する。125Ｉ−ＬＤＬのオレイン酸誘導結合、取り込み及び分解の量を以前に示したように（Ｂｉｈａｉｎ ＆ Ｙｅｎ， １９９２， ｓｕｐｒａ）計測する。結果は三重決定の平均として示される。
【０３８１】
本発明者はＧＭＧ−２タンパク質の添加はリポタンパク質受容体としてのＬＳＲの増大した活性を引き起こすと考える。ＬＤＬのオレイン酸誘導結合及び取り込みは分解に比較してＧＭＧ−２タンパク質により影響されやすい。この増大したＬＳＲ活性は食後状態の間のトリグリセリドリッチリポタンパク質の高められたクリアランスを可能性としてもたらしうる。したがって、より多くの食物脂肪が脂肪組織中に沈積されるより、肝臓をとおして除去されうる。
【０３８２】
この分析はＬＳＲ活性（又は他の受容体をとおしたリポタンパク質取り込み、結合及び分解）を増大させる又は減少させる、及びしたがってトリグリセリドリッチリポタンパク質のクリアランス速度に影響する化合物（又はアゴニスト若しくはアンタゴニスト）の効率を決定するために使用されうる。
【０３８３】
筋肉分化に対する効果
Ｃ２Ｃ１２細胞（マウス骨格筋細胞系；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７２２， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を完全なＤＭＥＭ（ｗ／グルタミン、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ等）＋１０％ＦＣＳ中の薄く（約１５〜２０％）まく。２日後、それらは８０〜９０％コンフルエントになる。このとき、培地をＤＭＥＭ＋２％ウマ血清に変え、分化を許す。上記培地を毎日変える。豊富な筋管形成が２％ウマ血清にして３〜４日後に起こるが、Ｃ２Ｃ１２分化の正確な時間経過は他の事実の間で、それらがどのくらい継代されているか及びそれらがどのくらい維持されているかに因る。
【０３８４】
ＧＭＧ−２タンパク質の存在の筋肉分化に対する効果を試験するために、ＧＭＧ−２（１〜２．５μｇ／ｍＬ）を上記細胞がまだＤＭＥＭ ｗ／１０％ ＦＣＳ中にある、まいた日の後添加する。上記細胞をまいた２日後（ＧＭＧ−２がはじめに添加された１日後）、約８０〜９０％コンフルエントで、上記培地をＤＭＥＭ＋２％ウマ血清＋ＧＭＧ−２に変える。
【０３８５】
筋細胞脂肪酸酸化に対する効果
Ｃ２Ｃ１２細胞を４日間、２μｇ／ｍＬのＧＭＧ−２タンパク質の存在下又は非存在下で分化させる。４日目、オレイン酸酸化速度を１−14Ｃ−オレイン酸（０．２ｍＭ）の14ＣＯ2への変換を９０分間計測することにより決定する。この実験はＧＭＧ−２ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニスト又は活性化剤及び阻害剤に加えて、活性ポリペプチド及びペプチドについてのスクリーニングをするために使用されうる。
【０３８６】
ＧＭＧ−２のオレイン酸酸化の速度に対する効果は分化したＣ２Ｃ１２細胞（マウス骨格筋細胞；ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ＣＲＬ−１７７２）において及び肝細胞細胞系（Ｈｅｐａ１−６； ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ＣＲＬ−１８３０）において比較されうる。培養細胞を製造業者の教示にしたがって維持する。上記オレイン酸酸化分析は以前に示したように行われる（Ｍｕｏｉｏ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３３８；７８３−７９１）。簡単に述べると、ほぼコンフルエントの単層を低血清分化培地（ＤＭＥＭ、２．５％ウマ血清）中で４日間保ち、このとき筋管の形成が最大になる。肝細胞を１０％ＦＣＳで補充した同じＤＭＥＭ培地中で２日間保つ。実験の１時間前に、上記培地を除去し、そして１ｍＬの前インキュベーション培地（ＭＥＭ、２．５％ウマ血清、３ｍＭ グルコース、４ｍＭ グルタミン、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１％ＦＦＡフリーＢＳＡ、０．２５ｍＭ オレイン酸、５μｇ／ｍＬ ジェンタマイシン）を添加する。酸化実験の開始に、14Ｃ−オレイン酸（１μＣｉ／ｍＬ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を添加し、そして細胞を２．５μｇ／ｍＬ ＧＭＧ−２非存在下／存在下で３７℃で９０分間インキュベートする。インキュベーション時間の後、０．７５ｍＬの培地を除去し、そして筋ＦＦＡ酸化実験について以下に示されるように14Ｃ酸化産物について分析する。
【０３８７】
培養細胞におけるオレイン酸酸化後のトリグリセリド及びタンパク質分析
オレイン酸酸化分析のための培地の移行に続いて、細胞を氷上におく。トリグリセリド及びタンパク質内容量を決定するために、細胞を残りの培地を除去するために１ｍＬの１×ＰＢＳで洗浄する。それぞれのウェルに３００μＬの細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ）を添加し、そして３７℃で１０分間インキュベートする。プレートを細胞をゆるめるために軽くたたき、そして０．５ｍＬの１×ＰＢＳを添加する。上記細胞懸濁物をエッペンドルフチューブに移し、それぞれのウェルを追加の０．５ｍＬの１×ＰＢＳですすぎ、そして適切なエッペンドルフチューブに移す。サンプルを室温で１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。上清を捨て、そして７５０μＬの１×ＰＢＳ／２％ｃｈａｐｓを細胞ペレットに添加する。細胞懸濁物をヴォルテックスし、そして氷上に１時間おく。サンプルをその後１３０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離する。上清を新しい管に移し、そして分析するまで−２０℃で凍らせる。それぞれのサンプルにおけるトリグリセリド値の定量的な計測はＳｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧＰＯ−ＴＲＩＮＤＥＲ酵素キットを用いて決定される。上記マニュアル中に概略される手順を以下の例外をともなって厳守する：分析を４８ウェルプレート中で行い、３５０μＬのサンプル容積を分析し、コントロールブランクは３５０μＬ ＰＢＳ／２％ｃｈａｐｓから成り、及び標準はキット中に提供される１０μＬ標準及び６９０μＬ ＰＢＳ／２％ｃｈａｐｓを含む。サンプルの分析をＰａｃｋａｒｄ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｃｏｕｎｔ上で５５０ｎＭの波長で行う。タンパク質分析を製造業者の教示にしたがってＢＣＡタンパク質分析（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて２５μＬのそれぞれの上清サンプルについて行う。サンプルの分析はＰａｃｋａｒｄ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｃｏｕｎｔ上で５５０ｎＭの波長で行う。
【０３８８】
筋細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏグルコース取り込み
Ｌ６筋細胞をＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ）から得、そして７〜１１継代で使用する。細胞を標準の組織培養培地ＤＭＥＭ中で維持し、そしてグルコース取り込みを以前に示されているように（Ｗａｌｋｅｒ， Ｐ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｌ６ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ， ｂｉｏｓｙｔｈｅｓｉｓ， ａｎｄ ｍＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ． ＪＢＣ ２６５（３）：１５１６−１５２３；ａｎｄ Ｋｉｌｐ， Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｘｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｂｙ ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ ｉｎ Ｌ６ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０（５）：２５３５−２５４４、その開示をそれらを全体として本明細書中に援用する）インスリン（１０-8Ｍ）の存在下又は非存在下でＧＭＧ−２ポリペプチド断片あり又はなしで［3Ｈ］−２−デオキシグルコース（２ＤＧ）を用いて評価する。２ＤＧの取り込みをコントロール（添加されたインスリン又はＧＭＧ−２ポリペプチド断片なし）と比較したパーセント変化として表す。値は実験当たり４ウェルの平均±ＳＥＭとして表される。ウェルのセット間の差はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔにより評価され、確率値ｐ＜０．０５は顕著であると考えられる。
【０３８９】
実施例３： ＧＭＧ−２ポリペプチドの高脂肪食を与えたマウスへの効果
実験を約６週齢Ｃ５７Ｂ１／６マウス（群当たり８）を用いて行う。全てのマウスを個々に飼う。上記マウスをそれぞれの実験をとおして高脂肪食で維持する。上記高脂肪食（カフェテリア食；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ， Ｉｎｃ．からのＤ１２３３１）は以下の組成を有する：タンパク質ｋｃａｌ％１６、スクロースｋｃａｌ％２６、及び脂肪ｋｃａｌ％５８。上記脂肪は主に水素化したココナッツ油から成る。
【０３９０】
マウスが高脂肪食を６日間摂取した後、マイクロ−浸透ポンプをイソフルラン麻酔を用いて挿入し、そして全長ＧＭＧ−２ポリペプチド、ＧＭＧ−２ポリペプチド断片、塩水、及び関連のないペプチドをマウスに皮下で（ｓ．ｃ．）１８日間、提供するために使用する。ＧＭＧ−２ポリペプチドは１００、５０、２５、及び２．５μｇ／日の用量で提供され、そして関係のないペプチドは１０μｇ／日で提供される。体重を高脂肪食の１、３及び５日目に、及びその後処置の開始後毎日計測する。最後の血液サンプルを心穿刺により取り、そしてトリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール（ＴＣ）、グルコース、レプチン、及びインスリン値を決定するために使用する。日当たりに消費された食物量もそれぞれの群で決定される。
【０３９１】
実施例４： ヒトにおける代謝関連活性の試験
ヒトにおけるＧＭＧ−２ポリペプチドの効果の試験は医師の推奨及び確立されたガイドラインにしたがって行われる。マウスにおいて試験されるパラメーターはヒトにおいても試験される（例えば、食物摂取、体重、ＴＧ、ＴＣ、グルコース、インスリン、レプチン、ＦＦＡ）。生理学的因子は短期間にわたり変化を示すことが予想される。体重増加における変化はより長い期間を必要としうる。さらに、上記食物は慎重にモニターされる必要があるであろう。ＧＭＧ−２ポリペプチド、好ましくはＣ１ｑホモロジー領域を含むＧＭＧ−２ポリペプチドは７０ｋｇのヒト当たり約６ｍｇタンパク質又は１日当たり約１０ｍｇの日の用量で与えられうる。他の用量は、例えば、１日当たり１ｍｇ又は５ｍｇ〜１日当たり２０ｍｇ、５０ｍｇ又は１００ｍｇまで試験されうる。
【０３９２】
実施例５： マウス脂肪萎縮性糖尿病モデルにおける代謝関連活性の試験
以前に、レプチンは先天性脂肪異栄養症を有するマウスにおいてインスリン抵抗性及び真性糖尿病をくつがえすことが報告された（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４０１：７３−７６（１９９９）；図画、図面又は表を含むそれらを全体として本明細書中に援用する）。レプチンは脂肪萎縮性糖尿病の異なる脂肪異栄養マウスモデルにおいて、より効果的でないことが発見された（Ｇａｖｒｉｌｏｖａ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ４０３：８５０（２０００）；図画、図面又は表を含むそれらを全体として本明細書中に援用する）。本発明は単独の又はレプチン、レプチンペプチド（米国仮出願番号６０／１５５，５０６）若しくは他の化合物を伴うこのモデルにおけるインスリン抵抗性及び高血糖症を減少させるためのＧＭＧ−２ポリペプチドの使用を含む。分析はＡ−ＺＩＰ／Ｆ−１マウスを用いた、以前にＧａｖｒｉｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．（（２０００）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｎｏｖ；４９（１１）：１９１０−６；（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｆｅｂ ２４；４０３（６７７２）：８５０）中に示されるものを、ＧＭＧ−２ポリペプチドが実施例３（又は実施例６〜８）において以前に示された方法を用いて投与されるであろうことを除いては、含む。上記マウスのグルコース及びインスリン値は試験されるであろう、そして典型的に私たちの実験において計測されるレプチン、ＦＦＡ、及びＴＧ値の如き他の因子に加えて、上記食物摂取及び肝重量がモニターされる（実施例３、上記又は実施例６〜８を参照のこと）。
【０３９３】
実施例６： Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＧＭＧ−２ポリペプチドの血漿遊離脂肪酸に対する効果
正常なＣ５７ＢＬ６／ＪマウスにおけるＧＭＧ−２ポリペプチドの食後脂肪血（ＰＰＬ）に対する効果が試験される。
この実験において使用されるマウスは実験前２時間絶食され、その後基礎の血液サンプルが取られる。全ての血液サンプルがＥＤＴＡでコーティングした毛細管を用いて尾から取られる（それぞれの時点で５０μＬ）。０時（８：３０ ＡＭ）に、標準高脂肪食（６ｇバター、６ｇヒマワリ油、１０ｇ非脂肪乾燥乳、１０ｇスクロース、Ｎｂ＃６，ＪＦ，ｐｇ．１にしたがう１２ｍＬの新たに調製した蒸留水）が全ての動物に胃管栄養（ｖｏｌ．＝体重の１％）により与えられる。
【０３９４】
上記高脂肪食後即座に、２５μｇ ＧＭＧ−２ポリペプチドが１００μＬ塩水中でｉ．ｐ．で注入される。上記同じ用量（１００μＬ中２５μｇ／ｍＬ）が再び４５分に及び１時間４５分に注入される。コントロール動物は塩水（３×１００μＬ）を注入される。無処理の及び処理した動物は変換モードで扱われる。
【０３９５】
血液サンプルは１時間間隔で取られ、そして即座に氷上に置かれる。血漿はそれぞれの時点に続いて遠心分離により調製される。血漿は−２０℃で保持され、そして遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、トリグリセリド（ＴＧ）及びグルコースは標準の試験キット（Ｓｉｇｍａ ａｎｄ Ｗａｋｏ）を用いて２４時間以内に決定される。制限される入手可能な血漿量のため、グルコースは集められたサンプルを用いて二重で決定される。それぞれの時点について、処置群当たり８動物全てからの等用量の血漿が集められる。
【０３９６】
実施例７： Ｃ５７ ＢＬ／６マウスにおけるＧＭＧ−２ポリペプチドの血漿レプチン及びインスリンに対する効果
正常なＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスにおける食後脂肪血（ＰＰＬ）の間のＧＭＧ−２ポリペプチドの血漿レプチン及びインスリン値への効果が試験される。上記実験手順は、血液が、ＲＩＡによるレプチン及びインスリンの決定について必要とされるより多くの血液サンプルを得るために０、２及び４時間にのみ取られることを除いては、実施例６において示されるものと同じである。
【０３９７】
簡単に述べると、１６のマウスは実験前２時間絶食され、その後基礎の血液サンプルが取られる。全ての血液サンプルがＥＤＴＡコーティングされた毛細管を用いて尾から取られる（それぞれの時点で１００μＬ）。０時（９：００ ＡＭ）に、標準の高脂肪食（実施例６を参照のこと）が全ての動物に胃管栄養（ｖｏｌ．＝体重の１％）により与えられる。高脂肪食後即座に、２５μｇのＧＭＧ−２ポリペプチドが１００μＬ塩水中でｉ．ｐ．で注入される。上記同じ用量（１００μＬ中２５μｇ）が再び４５分に及び１時間４５分に注入される（処置群）。コントロール動物は塩水（３×１００μＬ）を注入される。無処理の及び処置した動物は変換モードで扱われる。
【０３９８】
血液サンプルは即座に氷上に置かれ、そして血漿はそれぞれの時点に続いて遠心分離により調製される。血漿は−２０℃で保持され、そして遊離脂肪酸（ＦＦＡ）が標準の試験キット（Ｗａｋｏ）を用いて２４時間以内に決定される。レプチン及びインスリンは製造業者のプロトコールにしたがってＲＩＡ（ＭＬ−８２Ｋ及びＳＲＩ−１３Ｋ、ＬＩＮＣＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｓｔ Ｃｈａｒｌｅｓ， ＭＯ）により決定される。しかしながら、２０μＬの血漿のみが使用される。それぞれの決定は二重で行われる。限られる入手可能な血漿の量のために、レプチン及びインスリンは両方の群でそれぞれの２動物の４プールにおいて決定される。
【０３９９】
実施例８： Ｃ５７ ＢＬ／６マウスにおけるＧＭＧ−２ポリペプチドの血漿ＦＦＡ、ＴＧ及びグルコースに対する効果
正常なＣ５７ＢＬ６／ＪマウスにおいてＧＭＧ−２ポリペプチドの食後脂肪血（ＰＰＬ）中の血漿ＦＦＡ、ＴＧ、グルコース、レプチン及びインスリン値に対する効果が示されている。高脂肪食の正常なＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスに与えられるＧＭＧ−２ポリペプチド（２．５μｇ／日）から生ずる体重減少も示されている（実施例３）。
【０４００】
上記実験手順は実施例６中で示されるものと同様である。簡単に述べると、１４のマウスは実験前２時間絶食され、その後基礎血液サンプルが取られる。全ての血液サンプルがＥＤＴＡコーティングされた毛細管を用いて尾から取られる（それぞれの時点で５０μＬ）。０時（９：００ ＡＭ）に、標準の高脂肪食（実施例６を参照のこと）が全ての動物に胃管栄養（ｖｏｌ．＝体重の１％）により与えられる。高脂肪食後即座に、４のマウスは２５μｇのＧＭＧ−２ポリペプチドを１００μＬ塩水中でｉ．ｐ．で注入される。上記同じ用量（１００μＬ中２５μｇ）が再び４５分に及び１時間４５分に注入される。第二の処置群は同じ間隔で５０μｇのＧＭＧ−２ポリペプチドを３回受ける。コントロール動物は塩水（３×１００μＬ）を注入される。無処理の及び処理された動物は変換モードで扱われる。
【０４０１】
血液サンプルは即座に氷上に置かれる。血漿はそれぞれの時点に続いて遠心分離により調製される。血漿は−２０℃で保持され、そして遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、トリグリセリド（ＴＧ）及びグルコースが標準の試験キット（Ｓｉｇｍａ ａｎｄ Ｗａｋｏ）を用いて２４時間以内に決定される。
【０４０２】
実施例９： エピネフリン注入後のＦＦＡに対するＧＭＧ−２ポリペプチドの効果
マウスにおいて、血漿遊離脂肪酸は高脂肪／スクロース試験食の胃管内投与後に増大する。これらの遊離脂肪酸はほとんど脂肪分解酵素、すなわち、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）及び肝臓リパーゼ（ＨＬ）の活性により作出される。この種において、これらの酵素は内皮に結合して及び血漿中に遊離循環して顕著な量で見られる。血漿遊離脂肪酸の他の源はβ−アドレナリン性刺激後に脂肪組織から遊離脂肪酸を放出するホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）である。ＧＭＧ−２ポリペプチドがＨＳＬにより放出される遊離脂肪酸の代謝をも制御するかどうか試験するために、マウスはエピネフリンを注入される。
２群のマウスは腹腔内注入によりエピネフリン（５μｇ）を与えられる。処理群はエピネフリンの１時間前及び再びエピネフリンと共にＧＭＧ−２ポリペプチド（２５μｇ）を注入され、一方でコントロール動物は塩水を受ける。血漿は単離され、そして遊離脂肪酸及びグルコースは上記に示されるように計測される（実施例８）。
【０４０３】
実施例１０： 筋ＦＦＡ酸化に対するＧＭＧ−２ポリペプチドの効果
筋遊離脂肪酸酸化に対するＧＭＧ−２ポリペプチドの効果を調査するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスからの無傷の後肢筋が単離され、そしてＦＦＡ酸化がオレイン酸を基質として用いて計測される（Ｃｌｅｅ， Ｓ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｖｅｓｓｅｌ ｗａｌｌ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｐａｓｅ ｈａｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ， Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ４１， ５２１−５３１（２０００）；Ｍｕｏｉｏ， Ｄ． Ｍ． Ｄｏｈｍ， Ｇ． Ｌ．， Ｔａｐｓｃｏｔｔ， Ｅ． Ｂ． ＆ Ｃｏｌｅｍａｎ， Ｒ． Ａ． Ｌｅｐｔｉｎ ｏｐｐｏｓｅｓ ｉｎｓｕｌｉｎ’ｓ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｉｎ ｍｕｓｃｌｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｏｂｅｓｅ ｏｂ／ｏｂ ｍｉｃｅ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２７６， Ｅ９１３−９２１（１９９９））。単離された筋におけるオレイン酸酸化は以前に示されるように計測される（Ｃｕｅｎｄｅｔ ｅｔ ａｌ（１９７６）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ５８：１０７８−１０８８；Ｌｅ Ｍａｒｃｈａｎｄ−Ｂｒｕｓｔｅｌ， Ｙ．， Ｊｅａｎｒｅｎａｕｄ， Ｂ． ＆ Ｆｒｅｙｃｈｅｔ， Ｐ． Ｉｎｓｕｌｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｏｌｅｕｓ ｍｕｓｃｌｅ ｏｆ ｌｅａｎ ａｎｄ ｏｂｅｓｅ ｍｉｃｅ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２３４， Ｅ３４８−Ｅ３５８（１９７８））。簡単に述べると、マウスを断頭により殺し、そしてヒラメ筋及びＥＤＬ筋をすばやく後肢から単離する。それぞれの筋の遠位の腱を異なる媒体間での移行を促進するために縫合して一つの塊にする。全てのインキュベーションはＦＦＡフリーウシ血清アルブミン（フラクションＶ、ＲＩＡグレード、Ｓｉｇｍａ）及び５ｍＭグルコース（Ｓｉｇｍａ）で補充された１．５ｍＬのＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ重炭酸緩衝液（１１８．６ｍＭ ＮａＣｌ、４．７６ｍＭ ＫＣｌ、１．１９ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１．１９ｍＭ ＭｇＳＯ4、 ２．５４ｍＭ ＣａＣｌ2、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ3、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）中で３０℃で行われる。上記実験をとおしてオレイン酸（Ｓｉｇｍａ）の総濃度は０．２５ｍＭである。全ての媒体はインキュベーション前に酸素化される（９５％Ｏ2；５％ＣＯ2）。上記気体混合物はガスウォッシャー（Ｋｏｎｔｅｓ Ｉｎｃ．， Ｖｉｎｅｌａｎｄ， ＮＪ）をとおして泡立たせることにより実験をとおして水和される。
【０４０４】
筋を酸素化でインキュベーション媒体中で３０分間すすぐ。上記筋をその後新しい媒体（１．５ｍＬ）に移し、１μＣｉ／ｍＬ［１−14Ｃ］オレイン酸（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の存在下で３０℃でインキュベートする。この媒体を含む上記インキュベーションバイアルをゴムの隔壁で密閉し、そこからＷｈａｔｍａｎ ｐａｐｅｒ（１．５ｃｍ×１１．５ｃｍ）の１片を有する中心ウェルが懸濁される。
【０４０５】
一定の酸素化を伴う１０分間のはじめのインキュベーションの後、気体循環を外環境から系を閉じるために除去し、そして上記筋を３０℃で９０分間インキュベートする。この期間の最後に、０．４５ｍＬのＳｏｌｖａｂｌｅ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｍｅｒｉｄｅｎ， ＣＴ）を中心ウェル中のＷｈａｔｍａｎ ｐａｐｅｒ上に注入し、そして上記筋によるオレイン酸酸化を上記バイアルを氷上に移すことにより停止する。
【０４０６】
５分後、上記筋を媒体から除去し、そして０．５ｍＬ媒体の等分も除去する。上記バイアルを再び閉じ、そして１ｍＬの３５％過塩素酸をゴムの隔壁をとおして貫通することにより媒体中へシリンジで注入する。酸化された媒体から放出されるＣＯ2は中心ウェル中のＳｏｌｖａｂｌｅにより回収される。３０℃での９０分の回収期間後、Ｗｈａｔｍａｎ ｐａｐｅｒを中心ウェルから除去し、そして１５ｍＬのシンチレーション液（ＨｉｏｎｉｃＦｌｏｕｒ， Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｍｅｒｉｄｅｎ， ＣＴ）を含むシンチレーションバイアル中におく。14Ｃ放射活性の量を液体シンチレーション計測により定量する。オレイン酸酸化の速度は９０分／筋ｇで産生されるｎｍｏｌオレイン酸として表される。
【０４０７】
ＧＭＧ−２のオレイン酸酸化に対する効果を試験するために、これらのタンパク質を最終濃度２．５μｇ／ｍＬで媒体に添加し、そして上記手順をとおして媒体中で維持する。
【０４０８】
実施例１１： マウスから単離された筋肉及び肝臓におけるトリグリセリドに対するＧＭＧ−２ポリペプチドの効果
ＧＭＧ−２ポリペプチドにより誘導された増大したＦＦＡ酸化は筋肉又は肝臓への増大したＦＦＡデリバリーをも伴うかどうかを決定するために、上記後肢筋肉及び肝臓トリグリセリド内容量がマウスのＧＭＧ−２ポリペプチド処理の後計測される。肝臓サンプルに加えて後肢筋肉は処理及び無処理動物から除去され、そして上記トリグリセリド及び遊離脂肪酸濃度が標準の脂質抽出法（Ｓｈｉｍａｂｕｋｕｒｏ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｄｉｒｅｃｔ ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌｅｐｔｉｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４， ４６３７−４６４１（１９９７））にしたがって決定され、続いて標準の試験キットを用いたＴＧ及びＦＦＡ分析がされる。
【０４０９】
実施例１２： 内部脂質注入後のＦＦＡに対するＧＭＧ−２ポリペプチドの効果
２群のマウスに、小腸吸収をバイパスして、血漿ＦＦＡにおける突然の上昇を作出するために、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ−２０％（Ｃｌｉｎｔｅｃ）の３０μＬボーラスを静脈内（尾の静脈）注入する（Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄは栄養治療において使用される静脈内脂肪エマルジョンである）。処理群（ＧＭＧ−２ポリペプチド−処理）にＩｎｔｒａｌｉｐｉｄが与えられる３０及び６０分前にＧＭＧ−２ポリペプチド（２５μｇ）を注入し、一方で、コントロール動物（コントロール）は塩水を受ける。血漿を単離し、そしてＦＦＡを以前に示されるように計測する。Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ注入により誘導されるピークに続く血漿ＦＦＡにおける減少に対するＧＭＧ−２ポリペプチドの効果がその後モニターされる。
【０４１０】
実施例１３： 筋細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏグルコース取り込み
Ｌ６筋細胞はＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ）から得られ、そして継代７〜１１で使用される。細胞は標準の組織培養培地ＤＭＥＭ中で維持され、そしてグルコース取り込みを以前に示されているように（Ｗａｌｋｅｒ， Ｐ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｌ６ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ， ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ａｎｄ ｍＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ． ＪＢＣ ２６５（３）：１５１６−１５２３；及びＫｉｌｐ Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｘｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｂｙ ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ ｉｎ Ｌ６ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０（５）：２５３５−２５４４、その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する）、インスリン（１０．ｓｕｐ．−８Ｍ）存在下又は非存在下でＧＭＧ−２ポリペプチドあり又はなしで［．ｓｕｐ．３Ｈ］−２−デオキシグルコース（２ＤＧ）を用いて評価される。２ＤＧの取り込みはコントロール（添加されたインスリン又はＧＭＧ−２なし）と比較したパーセント変化として表される。値は実験当たり４ウェルのセットの平均±ＳＥＭとして表される。ウェルのセット間の差はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔにより評価され、確率値ｐ＜０．０５は顕著であると考えられる。
【０４１１】
実施例１４： げっ歯類糖尿病モデルにおける代謝関連活性についてのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
代謝プロファイルは肥満及び糖尿病のさまざまな動物モデル間で異なるので、複数モデルの分析がＧＭＧ−２ポリペプチドの高血糖症、高インスリン血症、高脂血症及び肥満に対する効果を分離するために取られる。実験動物のコロニーにおける突然変異及び食計画に対する異なる感受性は肥満及びインスリン抵抗性と関連しうる非インスリン依存性糖尿病を有する動物モデルの開発をなした。マウスにおけるｄｂ／ｄｂ及びｏｂ／ｏｂの如き遺伝子モデル（Ｄｉａｂｅｔｅｓ， （１９８２）３１（１）：１−６を参照のこと）及びｚｕｃｋｅｒラットにおけるｆａ／ｆａが疾患の病態生理を理解する及び新規抗糖尿病化合物の効果を試験するためにさまざまな研究室により開発されている（Ｄｉａｂｅｔｅｓ， （１９８３）３２：８３０−８３８；Ａｎｎｕ． Ｒｅｐ． Ｓａｎｋｙｏ Ｒｅｓ． Ｌａｂ．（１９９４）．４６：１−５７）。ホモ接合動物、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＵＳにより開発されたＣ５７ ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂマウスは肥満、高血糖症、高インスリン血症及びインスリン抵抗性であり（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， （１９９０）８５：９６２−９６７）、一方で、ヘテロ接合体はやせ及び正常血糖である。ｄｂ／ｄｂモデルにおいて、マウスは年齢と共にインスリン血症を発展的に発達し、それは血糖値が不十分に制御されるときヒトＩＩ型糖尿病の後期の段階において通常観察される特徴である。膵臓の状態及びその過程は上記モデルにより変化する。このモデルは真性ＩＩ型糖尿病のものに似ており、本発明に係る化合物は血糖及びトリグリセリド低下活性について試験される。Ｚｕｃｋｅｒ（ｆａ／ｆａ）ラットは重篤に肥満、高インスリン血症、及びインスリン抵抗性であり（Ｃｏｌｅｍａｎ， Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３１：１，１９８２；Ｅ Ｓｈａｆｒｉｒ， ｉｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ；Ｈ． Ｒｉｆｋｉｎ ａｎｄ Ｄ． Ｐｏｒｔｅ， Ｊｒ． Ｅｄｓ．（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｅｄ． ４， １９９０），ｐｐ． ２９９−３４０）、そして上記ｆａ／ｆａ変異はマウスｄｂ変異と同等のラットでありうる（Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ６９：２１７−２２０， １９９２； Ｔｒｕｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：７８０６， １９９１）。Ｔｕｂｂｙ（ｔｕｂ／ｔｕｂ）マウスは顕著な高血糖を伴わず、肥満、軽いインスリン抵抗性及び高インスリン血症により特徴付けられる（Ｃｏｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｈｅｒｅｄｉｔｙ ８１：４２４，１９９０）。
【０４１２】
以前に、レプチンは先天性脂肪異栄養症を有するマウスにおいてインスリン抵抗性及び真性糖尿病を後退させることが報告された（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ４０１：７３−７６（１９９９））。レプチンは脂肪萎縮性糖尿病の異なる脂肪異栄養症マウスモデルにおいて効果的でないことがわかった（Ｇａｖｒｉｌａｖａ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ４０３：８５０（２０００）；図画、図面又は表を含むそれらを全体として本明細書中に援用する）。
【０４１３】
化学的に誘導された糖尿病についてのストレプトゾトシン（ＳＴＺ）モデルは肥満の非存在下での高血糖症の効果を調べるために試験される。ＳＴＺ処理動物はインスリンを欠き、そして重篤に高血糖である（Ｃｏｌｅｍａｎ， Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３１：１， １９８２；Ｅ． Ｓｈａｆｒｉｒ， ｉｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ； Ｈ． Ｒｉｆｋｉｎ ａｎｄ Ｄ． Ｐｏｒｔｅ， Ｊｒ． Ｅｄｓ．（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｅｄ． ４， １９９０），ｐｐ．２９９−３４０）。肥満が遺伝子モデルにおけるよりも重篤でなく、そして過食症、高インスリン血症及びインスリン抵抗性を伴わず発展する、化学的に誘導された肥満についてのグルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）モデル（Ｏｌｎｅｙ， Ｓｃｉｅｎｃｅ １６４：７１９， １９６９； Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉ． Ｅｘｐ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５：４１，１９７８）も調べられる。最後に、肥満の誘導についての非化学的、非遺伝的モデルはげっ歯類にａｄ ｌｉｂｉｔｕｍで高脂肪／高炭水化物（カフェテリア食）食を給餌することを含む。
【０４１４】
本発明はどの又は全ての上記げっ歯類糖尿病モデルにおける又はＩ型若しくはＩＩ型糖尿病又は以前に示される他の好ましい代謝疾患を有するヒト又は他の動物に基づくモデルにおけるインスリン抵抗性及び高血糖を減少させるためのＧＭＧ−２ポリペプチドの使用を含む。本発明に係る組成物中で、上記ＧＳＳＰ４ポリペプチドは、所望の場合、単独で又は組み合わせで、インスリン、レプチン（米国仮出願番号６０／１５５，５０６）又はトログリタゾンの如き、他の融和性の生理学的に活性な抗糖尿病剤と関連されうる。分析は、ＧＳＳＰ４ポリペプチドが腹腔内、皮下、筋内又は静脈内投与されることを除いては、Ａ−ＺＩＰ／Ｆ−１マウスを用いた、Ｇａｖｒｉｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．（（２０００）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｎｏｖ；４９（１１）：１９１０−６；（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｆｅｂ ２４；４０３（６７７２）：８５０）中に以前に示されるものを含む。上記マウスのグルコース及びインスリン値は試験され、そして典型的に私たちの実験で計測されるレプチン、ＦＦＡ、及びＴＧ値の如き他の因子に加えて、食物摂取及び肝臓重量がモニターされる。
【０４１５】
ＧＭＧ−２ポリペプチドの抗高血糖活性についてのｉｎ ｖｉｖｏ分析
遺伝子的に変換された肥満糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）（雄、７〜９週齢）を２２．ｄｅｇｒｅｅ． Ｃ． 及び５０％比較湿度で標準の研究室条件下で飼い（７〜９マウス／ケージ）、ａｄ ｌｉｂｉｔｕｍでＰｕｒｉｎａげっ歯類食の餌及び水で維持する。処置前、血液をそれぞれの動物の尾の静脈から回収し、そして血中グルコース濃度をＯｎｅ Ｔｏｕｃｈ Ｂａｓｉｃ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｍｏｎｉｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅｓｃａｎ）を用いて決定する。２５０〜５００ｍｇ／ｄｌの血漿グルコース値を有するマウスが使用される。それぞれの処理群は、研究の開始に平均グルコース値がそれぞれの群で同等になるように分配された７のマウスから成る。ｄｂ／ｄｂマウスに上記マウスに皮下で（ｓ．ｃ．）ＧＭＧ−２ポリペプチド、塩水、及び関連のないペプチドを提供するために、イソフルラン麻酔を用いて挿入された、マイクロ−浸透ポンプにより投与する。血液を４時間の間１時間毎に及び投与後２４、３０時間に尾の静脈からサンプリングし、血中グルコース濃度について分析する。食物を投与後０〜４時間は取り出し、その後再導入する。個体の体重及び平均食物消費（それぞれのケージ）も２４時間後に計測する。群間の顕著な差（ＧＭＧ−２処理を塩水処理に比較して）はＳｔｕｄｅｎｔ ｔ−ｔｅｓｔを用いて評価される。
【０４１６】
ｉｎ ｖｉｖｏインスリン感受性分析
ｉｎ ｖｉｖｏインスリン感受性は以下のプロトコールにしたがって２段階高インスリン血−正常血糖クランプを利用して調べられる。実施例２中に示されるどの又は全てのさまざまなモデルからのげっ歯類を実験手順の前に少なくとも１週間飼う。頸静脈及び頸動脈カテーテルの設置のための手術をケタミン及びキシラジン（ｉ．ｍ．）麻酔を用いて滅菌条件下で行う。手術後、全てのげっ歯類の意識を回復させ、そして個々のケージに置く。ＧＭＧ−２ポリペプチド又は媒体を完全な回復後及び続く２日間、頸静脈をとおして投与する。最後の処理１６時間後、高インスリン血−正常血糖クランプを行う。げっ歯類をリストレイナーに置き、そして４．ｍｕ Ｃｉ［３−．ｓｕｐ．３Ｈ］グルコース（ＮＥＮ）のボーラスを投与し、続いて０．２．ｍｕ．Ｃｉ／分（２０．ｍｕ．ｌ／分）の用量でトレーサーを連続して融合する。トレーサー融合の開始２時間後、３の血液サンプル（それぞれ０．３ｍｌ）を基礎の計測のために１０分間隔（−２０〜０分）で回収する。インスリン融合をその後開始し（５ｍＵ／ｋｇ／分）、そして１００．ｍｕ．ｌ血液サンプルを血漿グルコースをモニターするために１０分毎に取る。３０％グルコース溶液を正常血糖を達成する及び維持するために血漿グルコース値に基づいて第二のポンプを用いて融合する。定常状態が５ｍＵ／ｋｇ／分インスリン（安定グルコース融合速度及び血漿グルコース）で確立されたら、３の追加の血液サンプル（それぞれ０．３ｍｌ）をグルコース、［３−．ｓｕｐ．３Ｈ］グルコース及びインスリン（１００〜１２０分）の計測のために得る。インスリンのより高い用量（２５ｍＵ／ｋｇ／分）をその後投与し、そしてグルコース融合速度を第二の正常血糖クランプについて調節し、そして血液サンプルを分で取る。グルコース特異的活性を脱タンパク質血漿において決定し、そしてＲｄ及び肝臓グルコースアウトプット（ＨＧＯ）の計算を、示されるように（Ｌａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０：４３， １９９２）行う。基礎の期間での並びに５及び２５ｍＵ／ｋｇ／分融合後の血漿インスリン値をその後決定し、そしてＧＭＧ−２処理及び媒体処理げっ歯類間で比較する。
【０４１７】
グルコースホメオスタシスのインスリン制御は２の主な成分；末梢グルコース取り込みの刺激及び肝臓グルコースアウトプットの抑制を有する。グルコースクランプにおけるトレーサー研究を用いて、上記インスリン応答のどの部分がＧＭＧ−２ポリペプチドにより影響されるかを決定することが可能である。
【０４１８】
実施例１５： ＧＭＧ−２ポリペプチド断片のヂペプチヂルペプチダーゼ切断についての分析
ＧＭＧ−２（配列ＩＤ番号：２の１４４〜２８８若しくは１６２〜２８８又は配列ＩＤ番号：４の１３４〜２７８若しくは１５２〜２７８又は配列ＩＤ番号：６の１１５〜２５９若しくは１３３〜２５９）ポリペプチド断片のヂペプチヂルペプチダーゼ切断は無傷のＧＭＧ−２ポリペプチド断片に特異的に結合するが、Ｎ−末端ヂペプチドＥＰが除去された前記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片には特異的に結合しないモノクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡにより決定される。すなわち、前記抗体はＧＭＧ−２（配列ＩＤ番号：２の１４４〜２８８若しくは１６２〜２８８又は配列ＩＤ番号：４の１３４〜２７８若しくは１５２〜２７８又は配列ＩＤ番号：６の１１５〜２５９若しくは１３３〜２５９）に結合するが、ＧＭＧ−２（配列ＩＤ番号：２の１４６〜２８８若しくは１６４〜２８８又は配列ＩＤ番号：４の１３６〜２７８若しくは１５４〜２７８又は配列ＩＤ番号：６の１１７〜２５９若しくは１３５〜２５９）には結合しない。ヂペプチヂルペプチダーゼは、非限定的に、ヂペプチヂルペプチダーゼ、水溶性ヒトＣＤ２６又は水溶性ヒトアトラクチンから成るヒト血漿から選ばれる。
【０４１９】
簡単に述べると、ＧＭＧ−２（５μｌ、１００ｆｍｏｌ）を血漿サンプル（９５μｌ）に添加し、そして３７℃で１時間インキュベートし、その後分解されずに残るＧＭＧ−２ポリペプチド断片の量を無傷のＧＭＧ−２ポリペプチド断片について特異的なモノクローナル抗体を用いて酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）により決定する。リファレンスとして、ＧＭＧ−２ポリペプチド断片（５μｌ、１００ｆｍｏｌ）を熱不活性化血漿（９５μｌ）に添加し、それは０．０１ｍｍｏｌ／ｌバリン−ピローリヂド及び５００ＫＩＥ／ｍｌアプロチニンを含む。リファレンスにおけるヂペプチヂルペプチダーゼ活性を０として定義すること及びサンプルにおける無傷のＧＭＧ−２ポリペプチド断片の量をリファレンスと比較することにより、ＧＭＧ−２ポリペプチド断片のヂペプチヂルペプチダーゼ切断の程度がリファレンスに比較して計算され、そしてパーセントとして表される。
【０４２０】
実施例１６： マウスにおける体重減少の維持に対するｇＡＣＲＰ３０の効果
ａＡＣＲＰ３０の体重減少維持特性を示すために、正常マウスを体重減少を促進するよう減少したカロリー食におく。上記減少したカロリー食を、上記マウスがそれらの開始体重の１０％を失うまで続ける。第二の群のマウスを、上記マウスがそれらの開始体重の２０％を失うまで体重減少食で続ける。上記マウスにその後２．５μｇ／日のｇＡＣＲＰ３０、５μｇ／日のＡＣＲＰ３０又は生理学的塩水をデリバリーする浸透ポンプ（Ａｌｚｅｔ、 Ｎｅｗａｒｋ、 ＤＥ）を手術で埋め込む。上記マウスを正常食に戻し、そしてそれらの体重を１０日間にわたり記録する。１０日後、ｇＡＣＲＰ３０で処置されたマウスは塩水で処置されたマウスより低い体重を有するという結果は、ｇＡＣＲＰ３０での処置は体重減少の維持を促進する証拠を提供すると取られるであろう。
【０４２１】
実施例１７： ＧＭＧ−２及びその断片の可溶化
ベクター構築物： 配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化２７】
ここで、６６、６９又は７０位でのシステインはシステイン以外のアミノ酸により置換される；配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化２８】
；配列ＩＤ番号：４のアミノ酸
【化２９】
ここで、５６、５９又は６０位でのシステインはシステイン以外のアミノ酸により置換される；又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸
【化３０】
；又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸
【化３１】
ここで、３７、４０又は４１位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される、から選ばれるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは菌発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓ中にクローニングされる。
【０４２２】
配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化３２】
ここで、６６、６９又は７０位のシステインはシステイン以外のアミノ酸により置換される；配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化３３】
；配列ＩＤ番号：４のアミノ酸
【化３４】
ここで、５６、５９又は６０位のシステインはシステイン以外のアミノ酸により置換される；又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸４７〜２７８、４８〜２７８、４９〜２７８、５０〜２７８、５１〜２７８、１３３〜２７８、１３４〜２７８、１４２〜２７８、１４３〜２７８、１５１〜２７８若しくは１５２〜２７８；又はＩＤ番号：６のアミノ酸
【化３５】
ここで、３７、４０又は４１位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される、から選ばれるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは改変された菌発現ベクターｐＥＴ３０ａ（上記ＧＭＧ−２ポリペプチドのＣ−末端にＨｉｓ Ｔａｇを提供する）中にクローニングされる。
配列ＩＤ番号：２のアミノ酸１〜２８８又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸１〜２７８又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸１〜２５９から選ばれるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはバキュロウイルス発現ベクターＦａｓｔＢａｃＨＴ中にクローニングされる。本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片にＮ−末端で融合されたヒト亜鉛−アルファ２−糖タンパク質シグナルペプチドから成る異種のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはバキュロウイルス発現ベクターＦａｓｔＢａｃＨＴ中にクローニングされ、ここで前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化３６】
ここで６６、６９又は７０位のシステインはシステイン以外のアミノ酸により置換される；配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化３７】
；配列ＩＤ番号：４のアミノ酸
【化３８】
ここで、５６、５９又は６０位のシステインはシステイン以外のアミノ酸により置換される；又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸
【化３９】
；又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸
【化４０】
ここで、３７、４０又は４１位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される、から選ばれる。
【０４２３】
配列ＩＤ番号：２のアミノ酸１〜２８８又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸１〜２７８又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸１〜２５９を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは哺乳類の発現ベクターｐｃＤＮＡ４ＨｉｓＭａｘ中にクローニングされる。本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片にＮ−末端で融合されたヒト亜鉛−アルファ２−糖タンパク質シグナルペプチドから成る異種のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは哺乳類の発現ベクターｐｃＤＮＡ４ＨｉｓＭａｘ中にクローニングされ、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化４１】
ここで、６６、６９又は７０位のシステインはシステイン以外のアミノ酸により置換される；配列ＩＤ番号：２のアミノ酸５７〜２８８、５８〜２８８、５９〜２８８、６０〜２８８、６１〜２８８、１４３〜２８８、１４４〜２８８、１５２〜２８８、１５３〜２８８、１６１〜２８８又は１６２〜２８８；配列ＩＤ番号：４のアミノ酸
【化４２】
ここで、５６、５９又は６０位のシステインはシステイン以外のアミノ酸により置換される；又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸
【化４３】
；又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸
【化４４】
ここで、３７、４０又は４１位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される、から選ばれる。
【０４２４】
配列ＩＤ番号：２のアミノ酸１〜２８８又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸１〜２７８又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸１〜２５９を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏ中にクローニングされる。本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片にＮ−末端で融合されたヒト亜鉛−アルファ２−糖タンパク質シグナルペプチドから成る異種のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏ中にクローニングされ、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化４５】
ここで、６６、６９又は７０位のシステインはシステイン以外のアミノ酸により置換される；配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化４６】
；配列ＩＤ番号：４のアミノ酸
【化４７】
ここで、５６、５９又は６０位のシステインはシステイン以外のアミノ酸により置換される；又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸
【化４８】
；又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸
【化４９】
ここで、３７、４０又は４１位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される、から選ばれる。
【０４２５】
あるいは、配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化５０】
ここで、６６、６９又は７０位のシステインはシステイン以外のアミノ酸により置換される；配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化５１】
；配列ＩＤ番号：４のアミノ酸
【化５２】
ここで、５６、５９又は６０位のシステインはシステイン以外のアミノ酸により置換される；又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸
【化５３】
；又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸
【化５４】
ここで、３７、４０又は４１位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される、を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは好ましくは、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＥＴ３０ａ、ＦａｓｔＢａｃＨＴ、ｐｃＤＮＡ４Ｈｉｓ又はｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏから選ばれる、菌の、哺乳類の又はバキュロウイルスの発現ベクター中にクローニングされる。さらにあるいは、本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片にＮ−末端で融合されたヒト亜鉛−アルファ２−糖タンパク質シグナルペプチドから成る異種のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは好ましくは、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＥＴ３０ａ、ＦａｓｔＢａｃＨＴ、ｐｃＤＮＡ４Ｈｉｓ又はｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏから選ばれる、菌の、哺乳類の又はバキュロウイルスの発現ベクター中にクローニングされ、ここで前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化５５】
ここで、６６、６９又は７０位のシステインはシステイン以外のアミノ酸により置換される；配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化５６】
；配列ＩＤ番号：４のアミノ酸
【化５７】
ここで、５６、５９又は６０位のシステインはシステイン以外のアミノ酸により置換される；又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸
【化５８】
；又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸
【化５９】
ここで、３７、４０又は４１位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される、から選ばれる。
【０４２６】
あるいは、配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化６０】
ここで、６６、６９又は７０位のシステインはシステイン以外のアミノ酸により置換される；配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化６１】
；配列ＩＤ番号：４のアミノ酸
【化６２】
ここで、５６、５９又は６０位のシステインはシステイン以外のアミノ酸により置換される；又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸
【化６３】
；又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸
【化６４】
ここで、３７、４０又は４１位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される、から選ばれるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはＰｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ（酵母）発現ベクター、好ましくはＰＨＩＬ−ＳＩ中にクローニングされる。さらにあるいは、本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片にＮ−末端で融合されたヒト亜鉛−アルファ２−糖タンパク質シグナルペプチドから成る異種のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはＰｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ（酵母）発現ベクター、好ましくはＰＨＩＬ−Ｓ１中にクローニングされ、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２の
【化６５】
ここで、６６、６９又は７０位のシステインはシステイン以外のアミノ酸により置換される；配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化６６】
；配列ＩＤ番号：４のアミノ酸
【化６７】
ここで、５６、５９又は６０位のシステインはシステイン以外のアミノ酸により置換される；又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸
【化６８】
；又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸
【化６９】
ここで、３７、４０又は４１位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される、から選ばれる。
【０４２７】
実施例１８： 幼児処方補助栄養
以下の例はｇＧＭＧ−２ポリペプチドを補助栄養援助として新生児に投与する方法を示し、さらにｇＧＭＧ−２−強化ヒト母乳又は非ヒト源からのｇＧＭＧ−２−強化乳置換調剤を投与することにより新生児の成長を促進する方法を提供する。脱水された又は凍結乾燥されたｇＧＭＧ−２ポリペプチド粉末は汲み出されたヒト母乳（新たに汲み出された又は保存後事前に温められた）又は非ヒト源からの事前に温められた乳置換調剤に５〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０〜８００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは６５〜６５０ｎｇ／ｍｌの範囲で、直接添加される。本発明に係るポリペプチドでの補助は日をとおして給食毎にヒト母乳又は母乳置換の瓶での給食において、幼児、特に早産の幼児に提供され、そして誕生から６月齢まで提供され続ける。早産の幼児は低い誕生体重又は非常に低い誕生体重のものでありうる。
【０４２８】
本研究の第一の目的は、ヒト乳（ＨＭ）又はヒト乳置換（ＨＭＳ）に添加される本発明に係るポリペプチドが早産の幼児において許容される成長を援助することを示すことである。第二の目的は栄養モジュールを消費する成熟前幼児の血清生物化学物質（すなわち、タンパク質状態、カルシウム、アルカリフォスファターゼ）、耐性、臨床的問題、及び病的性質を評価することである。他の第二の目的は本発明に係る補助組成物を早産の幼児における成長を促進するために何年間か使用されている商業的な強化粉末と比較することである。意図〜処置の、予想される、ランダム化された、二重盲検の、複数中心研究が給食毎に商業的に入手可能な粉末化されたヒト母乳強化剤（Ｅｎｆａｍｉｌ． ＲＴＭ． Ｈｕｍａｎ Ｍｉｌｋ Ｆｏｒｔｉｆｉｅｒ， ｃｏｎｔｒｏｌ）又は本発明に係る補助ポリペプチド（試験）粉末（実験）で補助された早産の母乳を受ける早産の幼児を評価するために行われる。患者は登録され、そして誕生から２１日までそれぞれの強化剤粉末についてランダム化される。研究１日目は試験粉末の強化が開始し、そして上記患者が少なくとも１００ｍＬ／ｋｇ／日の摂取に達する時である。人体測定学的指標、血清生物化学物質、摂取、耐性、及び病的性質のデータが評価される。それぞれの幼児は退院まで研究される；人体測定学的変数（体重、身長、及び頭部周囲）のみが研究２９日後に集められる。成熟前幼児は研究調査員と共同研究することに同意した新生児集中治療単位から採用される。妊娠齢について適切な体重を有し、そして１６００ｇ前後の重さの、妊娠３３週齢前後に生まれた単独の、双子の又は三つ子の幼児は参加に適格性を有する。１４４の幼児がコントロール又は実験のいずかにランダム化される；７０の早産の幼児はコントロール群にランダム化され、そして７４の早産の幼児は実験群にランダム化される。上記ランダム化は誕生体重及び性別について釣り合っている。
【０４２９】
独立変数（処置）はＨＭ又はＨＭＳに添加されるコントロール強化粉末及び実験試験粉末である。両方の強化剤（試験及びコントロール）は粉末化された形態で小さな包で提供され、そして２５ｍＬのＨＭ又はＨＭＳに添加される。第一の成果変数は研究１日目〜研究２９日目まで又は退院のどちらか早い方までの体重増加（ｇ／ｋｇ／日）である。第二の成果変数は身長増加（ｍｍ／日）並びにタンパク質状態、電解質状態、鉱物ホメオスタシス、及びビタミンＡ及びＥ状態を評価するための血清生物化学物質である。血清生物化学物質はまた医薬チャートにおいて記録されるスケジュール化されていない研究室結果をも含む。第三の変数は頭部周囲の増加（ｍｍ／日）、病歴、摂取、耐性、臨床的問題／病的性質、呼吸状態、抗生物質使用、及び輸血の回数を含む。研究期間の平均総エネルギー摂取は１１８ｋｃａｌ／ｋｇ／日前後で、群間で異ならない。
【０４３０】
実施例１９： ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片によるホモ三量体形成の評価
ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片によるホモ三量体形成は分析遠心分離における沈降平衡、分子量を正確に及び形の如き他の物理学的因子に因らず決定する方法を用いて評価される。
候補ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体を、例えば、１６／６０ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲルろ過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の如きゲルろ過の方法を含むプロトコールを用いて精製する。前記精製された候補ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体タンパク質濃度は５．７ｍＭリン酸（ｐＨ７．５）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ中３μＭに作出される。サンプルはＢｅｃｋｍａｎ ＸＬ−Ａ分析超遠心分離内で８，０００ｒｐｍで１０℃で１８時間遠心分離され、その後吸収が記録される。上記データを、均一種の沈降を示す以下の式にＭａｃＮｏｎｌｉｎ ＰＰＣを用いて、包括的にフィットする：Ａｂｓ＝Ｂ＋Ａ’ｅｘｐ［Ｈ×Ｍ（ｘ2−ｘ0 2）］、ここでＡｂｓ＝半径ｘでの吸収、Ａ’＝リファレンス半径ｘ０での吸収、Ｈ＝（１−υρ）ω2／２ＲＴ、Ｒ＝気体定数、Ｔ＝Ｋｅｌｖｉｎでの温度、υ＝部分的な特異的容積＝０．７１８９６１３１ｍＬ／ｇ、ρ＝溶媒濃度＝１．００６１ｇ／ｍｌ、ω＝ｒａｄｉａｎｓ／ｓでの角度速度、Ｍ＝見かけの分子量、及びＢ＝溶媒吸収（ブランク）。
【０４３１】
実施例２０： タンパク質キナーゼＣアルファ（ＰＫＣα）のリン酸化状態に対するＧＭＧ−２ポリペプチドの効果
細胞を５μｇ／ｍｌ ＧＭＧ−２ポリペプチド又は生理学的塩水で５、１０、３０、及び６０分間処置する。細胞をその後洗浄し、そして５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．２５％ デオキシコール酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１：１００ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｉ及びＩＩ（Ｓｉｇｍａ）、及びＣｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）中ですすぐ。Ｓｅｒ６５７−リン酸化ＰＫＣαの量を上記セリン／スレオニン残基がリン酸化されたときのみ保存された疎水性Ｃ−末端ＦＸＸＦ（Ｓ／Ｔ）（Ｆ／Ｙ）モチーフを認識するアフィニティー精製したＰＫＣ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてウェスタンブロット分析により評価した。個々のレーンにおけるタンパク質の総量をβ−チューブリン（Ｓｉｇｍａ）に対するモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロットにより正規化する。
【０４３２】
実施例２１： ＮＦ−κＢ活性化に対するＧＭＧ−２ポリペプチドの効果
ＧＭＧ−２ポリペプチドによるＮＦ−κＢの活性化
ルシフェラーゼ活性を、プロテインキナーゼＫ及び熱処理の前及び後に、２００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ（Ｅ． ｃｏｌｉ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ０５５：Ｂ５、Ｓｉｇｍａ）又は５μｇ／ｍｌ ＧＭＧ−２ポリペプチドでの一晩のインキュベートに続いてトランスフェクトされた細胞において計測する。細胞をＦｕＧｅｎｅ ６ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて製造業者の教示にしたがってＥ−セレクチンプロモータールシフェラーゼ構築物［Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ Ｕ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｓｅｐ；１４（９）：５８２０−３１、それらを全体として本明細書中に援用する］及び内部トランスフェクション効率コントロールとしてＣＭＶプロモーター−β−ガラクトシダーゼでトランスフェクトする。インキュベーションは通常の成長培地で行われる。内毒素汚染について試験するために、ＧＭＧ−２ポリペプチド及びＬＰＳをプロテインキナーゼＫ（０．２ｍｇ／ｍｌ）で５０℃で９０分間、続いて９９℃で１２分間処理する。消化に対するＬＰＳの抵抗性及びＧＭＧ−２ポリペプチドの感受性は後者の活性は菌の内毒素による汚染のためではないことを確立する。
【０４３３】
ＧＭＧ−２ポリペプチドによるＩκＢ−αのＳｅｒ３２リン酸化及び分解
細胞を通常の成長培地で２００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ又は５μｇ／ｍｌ ＧＭＧ−２ポリペプチドで処理する。３０及び１２０分のインキュベーション後、細胞をＣａ2+及びＭｇ2+を含むＰＢＳで洗浄し、そして本明細書中に示されるように溶解する。溶解物中のリン酸化された及び総ＩκＢ−αの量をアフィニティー精製したＳｅｒ３２リン−特異的抗体及び異なるリン酸化状態に依存しないＩκＢ−α抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてウェスタンブロット分析により評価する。
【０４３４】
実施例２２： 異なる組織源からのＰｏｌｙ Ａ＋及びトータルＲＮＡのｉＡＦＬＰ遺伝子発現プロファイリング分析の効果
Ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ｉＡＦＬＰ）法を“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｂｙ ｉＡＦＬＰ： Ａ ＰＣＲ ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ”（Ｋａｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．９：１３０５−１３１２，１９９９）と題された記事から適合させる。
【０４３５】
ｉＡＦＬＰ遺伝子発現はＡｍｂｉｏｎ（＃７９６１−肝臓、７９６７−心臓、７９６３−脳、７９８３−骨格筋、７９５１−胎盤、及び７９５１−小腸）及びＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（＃Ｄ６００５−０１−脂肪組織）からそれぞれ購入される異なる成人ヒト組織からのＰｏｌｙ Ａ＋ ＲＮＡ及びトータルＲＮＡを用いて行われる。トータルＲＮＡは３７℃で３０分間ＤＮａｓｅ処理される。２０μｇのトータルＲＮＡ又は２μｇのＰｏｌｙＡ＋ ＲＮＡをＲｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅにより供給されるｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを用いて製造業者の教示にしたがってｄｓｃＤＮＡに変換する。上記精製された及び定量されたｄｓｃＤＮＡをＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓにより供給されるＭｂｏＩ制限酵素キットを用いて製造業者の教示にしたがって切断する。３分の１のＭｂｏＩ切断ｄｓｃＤＮＡをＲｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅにより供給されるＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて製造業者の教示にしたがってリン酸化アダプターカセットプライマーにつなげる。上記つなげられたｄｓｃＤＮＡを最終濃度１ｎｇ／μｌにグリコーゲン及びＤＩ水中に希釈する。１ｎｇを０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＰＣＲ緩衝液、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、２μＭ Ｖｉｃ蛍光標識化Ｔ７プライマー、２μＭの遺伝子特異的逆プライマー、８％グリセロール、及び１Ｕｎｉｔ Ａｍｐｌｉｔａｇ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む１０μｌの最終ＰＣＲマスターミックス容積に添加する。上記鋳型を９５℃で１０分間インキュベートし、９５℃で３０秒間変性させ、６０℃で１分間アニーリングさせ、３５サイクル７２℃で３０秒間伸長させ、及び１サイクル７２℃で７分間伸長させる。
ＰＣＲ反応はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ’ｓ ９７００ ＧｅｎｅＡｍｐ ｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒを用いて行われる。１μｌのＰＣＲ反応を１：１００に希釈する。１μｌの希釈されたＰＣＲ産物を０．１μｌのＬｉｚ ５００ ｓｉｚｅ ｓｔａｎｄａｒｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び８．９μｌのＨｉＤｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と混合する。上記混合物を９５℃で５分間変性させる。１μｌの変性した混合物を３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中にロードし、そして大きさにより分ける。異なる大きさにされた断片の分析はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより供給されるＧｅｎｅｓｃａｎソフトウェアパッケージにより製造業者の教示にしたがって行われる。
【０４３６】
【化７０】
【化７１】
【０００１】
発明の分野
本発明は代謝研究の分野、特に肥満及び肥満関連疾患及び障害の治療に有効な化合物の発見に関する。本発明に係る方法により治療されることが構想される肥満関連疾患又は障害は、非限定的に、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、及び高血圧を含む。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
以下の議論は本発明の理解を促進することを意図されるが、本発明の前分野であるとは意図されず、許可されない。
肥満は深刻な、広くはびこる、及び増大している公衆の健康問題である。米国においては、人口の２０％は肥満である；欧州においては、それよりわずかに低い割合が肥満である［Ｆｒｉｅｄｍａｎ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ４０４：６３２−６３４］。肥満は呼吸器合併症及び変形性関節症に加えて、高血圧、心血管疾患、糖尿病、及び癌の増大した危険性に関連する［Ｋｏｐｅｌｍａｎ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ４０４：６３５−６４３］。ささやかな体重減少でさえもこれらの関連する状態を改善する。
【０００３】
体重増加又は減少の維持は、通常体重とは異なる体重の維持に対抗するエネルギー消費における代償的な変化に関連する［Ｌｅｉｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３２：６２１−８］。これらの変化は、部分的には、長期肥満治療の効果のなさの原因でありうる［Ｗａｄｄｅｎ（１９９３）Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ２２９：６８８−９３］。さらに、何人かの患者における体重増加後の減少したインスリン感受性並びにささやかな量の体重減少の炭水化物代謝及びインスリン感受性に対する有益な効果はよく証明されている［Ｏｌｅｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９７４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ５３：６４−７６］。
【０００４】
環境、食事、年齢及び運動を含む生活因子が肥満において役割を果たすことが証明されている一方で、双子研究、家族集団の分析、及び養子研究は全て、肥満は主に遺伝的因子の結果であることを示す［Ｂａｒｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０４：６４４−６５１］。これらの研究と一致して、増大する数の肥満関連遺伝子が同定されているという事実がある。いくつかのより広範囲に研究されている遺伝子はレプチン（ｏｂ）及びその受容体（ｄｂ）、プロ−オピオメラノコルチン（Ｐｏｍｃ）、メラノコルチン−４−受容体（Ｍｃ４ｒ）、アグーチタンパク質（Ａ y ）、カルボキシペプチダーゼＥ（ｆａｔ）、５−ヒドロキシトリプタミン受容体２Ｃ（Ｈｔｒ２ｃ）、無知の塩基性へリックス−ループ−へリックス２（ＮｈＩｈ２）、プロホルモン変換酵素Ｉ（ＰＣＳＫＩ）、及びチュービータンパク質（ｔｕｂｂｙ）をコードするものを含む［ｒｅｖ’ｄ ｉｎ Ｂａｒｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０４：６４４−６５１］。
【発明の開示】
【０００５】
発明の要約
本発明は、ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片といわれる、球状ドメインを含む全長ＧＭＧ−２ポリペプチドの断片がヒト及び他の哺乳類において体重減少、体重増加の予防、及び血中グルコース値の制御についての利用を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで予想されない効果を有するホモ三量体を形成するという発見に基づく。本発明はさらに、Ｎ−末端に配置された独特の領域内のシステイン残基でのヂスルフィド結合をとおして形成されるｇＧＭＧ−２ホモ三量体の複合体は、非複合体化ｇＧＭＧ−２ホモ三量体が有するよりも本明細書中で開示される活性についてより低い特異的活性を有するという発見に基づく。本発明はさらにコラーゲン様領域の全部又は一部を含むｇＧＭＧ−２−ポリペプチド断片は本明細書中に開示される活性を有するより安定なｇＧＭＧ−２ホモ三量体を形成するという発見に基づく。
【０００６】
哺乳類におけるホモ三量体ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片投与のこれらの予想されない効果はまた、筋肉細胞における増大した脂肪酸酸化、及び高脂肪／高スクロース食を消費する哺乳類における体重減少に加えて、エピネフリンの投与、「内部脂質」のｉ．ｖ．注入又は高脂肪試験食の投与により引き起こされた上昇した遊離脂肪酸値の減少を含む。ｇＧＭＧ−２ホモ三量体の複合体の投与は典型的に特異的な生物学的活性及び投与される量に因り、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで全く又は非常にわずかにしか効果がないので、これらの効果は予想されないものであり、驚くべきものである。効果がｇＧＭＧ−２ホモ三量体の複合体の投与に続いて観察される程度までの、効果に必要とされる複合体化したｇＧＭＧ−２ホモ三量体の値のために、その投与はここでほとんどの場合においてヒトへの可能性のある治療としては実行不可能である。対照的に、本発明に係る非複合体化ｇＧＭＧ−２ホモ三量体は根本的により効果的であり、そしてしたがってヒトにおける治療について実行可能である値で提供されうる。
【０００７】
したがって、本発明は、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を含む医薬の及び生理学的に許容される組成物並びに体重を減少させるため又は肥満関連疾患及び障害を治療するための前記ｇＧＭＧ−２の医薬の及び生理学的に許容される組成物の投与方法に加えて、ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、前記ｇＧＭＧ−２ポリヌクレオチドを含むベクター、及び前記ｇＧＭＧ−２ポリヌクレオチドについて組換えた細胞について示し、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びさらに、ここで、前記システイン残基はシステイン以外のアミノ酸で置換されているため又は前記断片は前記システイン残基まで伸びていないため、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はＮ−末端に配置された独特の領域内にシステイン残基を含まない。肥満関連活性のアゴニスト及びアンタゴニストを同定するための分析も本発明の部分である。
【０００８】
ホモ三量体ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性のアンタゴニストは悪液質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少、食欲不振、及び過食症を含む、本発明に係る他の代謝関連疾患又は障害の治療においても効果的であるはずである。好ましい態様においては、前記個体は哺乳類、好ましくはヒトである。
【０００９】
第一の局面において、本発明は精製された、単離された又は組換えられたｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を特徴付け、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は予想されない活性を有するホモ三量体を形成し、ここで、予想されない前記活性は脂肪分割、脂肪代謝、及びインスリン様活性から成る群から選ばれ、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチドはコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はＮ−末端に配置された独特の領域内でシステインについて、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチヂン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンから成る群から選ばれるシステイン以外のアミノ酸の置換を含み、好ましくは、ここで、前記置換されたアミノ酸はセリンである。好ましい態様においては、前記ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２の少なくとも６〜２８８以下の連続的なアミノ酸を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、６６、６９又は７０位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される；又は配列ＩＤ番号：４の少なくとも６〜２７８以下の連続的なアミノ酸を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ポリペプチドはコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、５６、５９又は６０位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される；又は配列ＩＤ番号：６の少なくとも６〜２５９以下の連続的なアミノ酸を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ポリペプチドはコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、３７、４０又は４１位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される。
【００１０】
他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【００１１】
他の非常に好ましい態様においては、本発明はＧＭＧ−２ポリペプチド断片を特徴付け、ここで、前記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は脂質分割、脂質代謝、及びインスリン様活性から成る群から選ばれる予想されない活性を有するホモ三量体を形成し、ここで、前記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は精製された、単離された又は組換えられたｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はＮ−末端に配置された独特の領域内でシステインについてアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチヂン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンから成る群から選ばれるシステイン以外のアミノ酸の置換を含み、好ましくはここで、前記置換されたアミノ酸はセリンである。好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化７】
【化８】
【化９】
【００１２】
他の非常に好ましい態様においては、本発明は、精製された、単離された又は組換えられたｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を特徴付け、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は予想されない活性を有するホモ三量体を形成し、ここで、予想されない前記活性は体重増加の予防、体重減少、及び体重減少の維持から成る群から選ばれ、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はＮ−末端に配置された独特の領域内でシステインについてアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチヂン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンから成る群から選ばれるシステイン以外のアミノ酸の置換を含み、好ましくはここで、前記置換されたアミノ酸はセリンである。好ましい態様においては、前記ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２の少なくとも６〜２８８以下の連続的なアミノ酸を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、６６、６９又は７０位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される又は配列ＩＤ番号：４の少なくとも６〜２７８以下の連続的なアミノ酸を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、５６、５９又は６０位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される又は配列ＩＤ番号：６の少なくとも６〜２５９以下の連続的なアミノ酸を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、３７、４０又は４１位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される。
【００１３】
他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【００１４】
他の非常に好ましい態様においては、本発明はＧＭＧ−２ポリペプチド断片を特徴付け、ここで、前記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は体重増加の予防、体重減少、及び体重減少の維持から成る群から選ばれる予想されない活性を有するホモ三量体を形成し、及びここで、前記ポリペプチド断片は精製された、単離された又は組換えられたｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はＮ−末端に配置された独特の領域内でシステインについて、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチヂン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンから成る群から選ばれるシステイン以外のアミノ酸の置換を含み、好ましくは、ここで、前記置換されたアミノ酸はセリンである。好ましくは、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸５７〜２８８の少なくとも６の連続的なアミノ酸を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、６６、６９又は７０位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸４７〜２７８の少なくとも６の連続的なアミノ酸を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、ここで、５６、５９又は６０位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される又は配列ＩＤ番号：６の２８〜２５９アミノ酸の少なくとも６の連続的なアミノ酸を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、ここで、３７、４０又は４１位のシステインは前記置換アミノ酸により置換される。
【００１５】
他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【００１６】
さらに他の非常に好ましい態様において、本発明は精製された、単離された又は組換えられたｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を特徴付け、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は予想されない活性を有するホモ三量体を形成し、ここで、予想されない前記活性は脂肪分割、脂肪代謝、及びインスリン様活性から成る群から選ばれ、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は部分を含み、及びここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はＮ−末端に配置された独特の領域内のシステイン残基まで伸びない。好ましい態様においては、前記ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２の少なくとも６〜２８８以下の連続的なアミノ酸又は配列ＩＤ番号：４の少なくとも６〜２７８以下の連続的なアミノ酸、又は配列ＩＤ番号：６の少なくとも６〜２５９以下の連続的なアミノ酸を含む、主にそれから成る又はそれから成る。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸５７〜２８８、５８〜２８８、５９〜２８８、６０〜２８８、６１〜２８８、１４３〜２８８、１４４〜２８８、１５２〜２８８、１５３〜２８８、１６１〜２８８又は１６２〜２８８から選ばれる。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸４７〜２７８、４８〜２７８、４９〜２７８、５０〜２７８、５１〜２７８、１３３〜２７８、１３４〜２７８、１４２〜２７８、１４３〜２７８、１５１〜２７８又は１５２〜２７８から選ばれる。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸２８〜２５９、２９〜２５９、３０〜２５９、３１〜２５９、３２〜２５９、１１４〜２５９、１１４〜２５９、１１５〜２５９、１２３〜２５９、１２４〜２５９、１３２〜２５９又は１３３〜２５９から選ばれる。最も好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はヒトのものである。他のさらに好ましい態様においては、前記ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２、４又は６の対応する連続的なアミノ酸と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。上記に示されるように、活性を有するホモ三量体を形成するいかなるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片も除外されうる。
【００１７】
他の非常に好ましい態様において、本発明はＧＭＧ−２ポリペプチド断片を特徴付け、ここで、前記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は脂肪分割、脂肪代謝、及びインスリン様活性から成る群から選ばれる予想されない活性を有するホモ三量体を形成し、ここで、前記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は精製された、単離された又は組換えられたｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はＮ−末端に配置された独特の領域内のシステイン残基まで伸びない。好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸５７〜２８８、５８〜２８８、５９〜２８８、６０〜２８８、６１〜２８８、１４３〜２８８、１４４〜２８８、１５２〜２８８、１５３〜２８８、１６１〜２８８又は１６２〜２８８から選ばれる。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸４７〜２７８、４８〜２７８、４９〜２７８、５０〜２７８、５１〜２７８、１３３〜２７８、１３４〜２７８、１４２〜２７８、１４３〜２７８、１５１〜２７８又は１５２〜２７８から選ばれる。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸２８〜２５９、２９〜２５９、３０〜２５９、３１〜２５９、３２〜２５９、１１４〜２５９、１１４〜２５９、１１５〜２５９、１２３〜２５９、１２４〜２５９、１３２〜２５９又は１３３〜２５９から選ばれる。最も好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はヒトのものである。あるいは、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２の対応するアミノ酸５７〜２８８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸４７〜２７８と少なくとも７５％同一の又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸２８〜２５９と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む、主にそれから成る又はそれから成る。上記に示されるように、活性を有するホモ三量体を形成するいかなるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片も除外されうる。
【００１８】
他の非常に好ましい態様において、本発明は精製された、単離された又は組換えられたｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を特徴付け、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は予想されない活性を有するホモ三量体を形成し、ここで、予想されない前記活性は体重増加の予防、体重減少、及び体重減少の維持から成る群から選ばれ、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はＮ−末端に配置された独特の領域内のシステイン残基まで伸びない。好ましい態様においては、前記ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２の少なくとも６〜２８８以下の連続的なアミノ酸又は配列ＩＤ番号：４の少なくとも６〜２７８以下の連続的なアミノ酸又は配列ＩＤ番号：６の少なくとも６〜２５９以下の連続的なアミノ酸を含む、主にそれから成る又はそれから成る。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸５７〜２８８、５８〜２８８、５９〜２８８、６０〜２８８、６１〜２８８、１４３〜２８８、１４４〜２８８、１５２〜２８８、１５３〜２８８、１６１〜２８８又は１６２〜２８８から選ばれる。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸４７〜２７８、４８〜２７８、４９〜２７８、５０〜２７８、５１〜２７８、１３３〜２７８、１３４〜２７８、１４２〜２７８、１４３〜２７８、１５１〜２７８又は１５２〜２７８から選ばれる。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸２８〜２５９、２９〜２５９、３０〜２５９、３１〜２５９、３２〜２５９、１１４〜２５９、１１４〜２５９、１１５〜２５９、１２３〜２５９、１２４〜２５９、１３２〜２５９又は１３３〜２５９から選ばれる。最も好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はヒトのものである。他のさらに好ましい態様においては、前記ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２、４又は６の対応する連続的なアミノ酸と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。上記に示されるように、活性を有するホモ三量体を形成するいかなるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片も除外されうる。
【００１９】
他の非常に好ましい態様において、本発明はＧＭＧ−２ポリペプチド断片を特徴付け、ここで、前記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は体重増加の予防、体重減少、及び体重減少の維持から成る群から選ばれる予想されない活性を有するホモ三量体を形成し、及びここで、前記ポリペプチド断片は精製された、単離された又は組換えられたｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を含み、主にそれから成り又はそれから成り、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はＮ−末端に配置された独特の領域内のシステイン残基まで伸びない。好ましくは、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含む配列ＩＤ番号：２のアミノ酸５７〜２８８の少なくとも６の連続的なアミノ酸又はコラーゲン様領域の全部又は一部を含む配列ＩＤ番号：４のアミノ酸配列４７〜２７８の少なくとも６の連続的なアミノ酸又はコラーゲン様領域の全部又は一部を含む配列ＩＤ番号：６のアミノ酸２８〜２５９の少なくとも６の連続的なアミノ酸を含む、主にそれから成る又はそれから成る。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸５７〜２８８、５８〜２８８、５９〜２８８、６０〜２８８、６１〜２８８、１４３〜２８８、１４４〜２８８、１５２〜２８８、１５３〜２８８、１６１〜２８８又は１６２〜２８８から選ばれる。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸４７〜２７８、４８〜２７８、４９〜２７８、５０〜２７８、５１〜２７８、１３３〜２７８、１３４〜２７８、１４２〜２７８、１４３〜２７８、１５１〜２７８又は１５２〜２７８から選ばれる。他の好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸２８〜２５９、２９〜２５９、３０〜２５９、３１〜２５９、３２〜２５９、１１４〜２５９、１１４〜２５９、１１５〜２５９、１２３〜２５９、１２４〜２５９、１３２〜２５９又は１３３〜２５９から選ばれる。最も好ましい態様においては、予想されない活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はヒトのものである。あるいは、前記ｇＧＭＧ−２断片は配列ＩＤ番号：２の対応するアミノ酸５７〜２８８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸４７〜２７８と少なくとも７５％同一の又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸２８〜２５９と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む、主にそれから成る又はそれから成る。上記に示されるように、活性を有するホモ三量体を形成するいかなるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片も除外されうる。
【００２０】
他の非常に好ましい態様において、本発明は精製された、単離された又は組換えられたｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を特徴付け、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は、単量体ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片より顕著に大きな活性を有するホモ三量体を形成し、ここで、予想されない前記活性は平滑筋増殖の阻害、前炎症性サイトカインの発現の阻害、細胞接着分子の発現の阻害、及び組織因子の発現の阻害から成る群から選ばれ、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はコラーゲン様領域の全部又は一部を含み、及びここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はＮ−末端に配置された独特の領域内のシステインについて、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチヂン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンから成る群から選ばれるシステイン以外のアミノ酸の置換を含み、好ましくはここで、前記置換されたアミノ酸はセリンである。
【００２１】
さらに好ましい態様においては、上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は（ｉ）遊離脂肪酸、（ｉｉ）グルコース、及び／又は（ｉｉｉ）トリグリセリドの循環（血液、血清又は血漿）値（濃度）を低くすることができるホモ三量体を形成する。さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は遊離脂肪酸値低下活性、グルコース値低下活性、及び／又はトリグリセリド値低下活性を示すホモ三量体を形成し、同じモル濃度での全長ＧＭＧ−２より顕著に大きな活性を有し、一過性の活性より大きなものを有し及び／又は維持された活性を有する。
【００２２】
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は、好ましくは以前に「肥満」であった及び現在は（本明細書中に定義される）「健康」である個体において、体重減少を維持するホモ三量体を形成するものである。
【００２３】
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は同じモル濃度の全長ＧＭＧ−２ポリペプチドと比較して、筋肉の脂質又は遊離脂肪酸酸化を顕著に刺激するホモ三量体を形成するものである。さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は無処理の細胞又は全長ＧＭＧ−２で処理した細胞と比較して、同じ断片の存在下で分化したＣ２Ｃ１２細胞を少なくとも１０％、２０％、３０％、３５％又は４０％多くオレイン酸酸化させるホモ三量体を形成するものである。
【００２４】
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は肝細胞系（好ましくはＢＰＲＣＬマウス肝細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２１７））における増大するレプチン取り込みで全長ＧＭＧ−２より少なくとも３０％より効果的であるホモ三量体を形成するものである。
【００２５】
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は特に高脂肪食後の、血漿遊離脂肪酸における食後増大を顕著に減少させるホモ三量体を形成するものである。
【００２６】
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は特に、高脂肪食後の、ケトン体産生を顕著に減少させる又は除去するホモ三量体を形成するものである。
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は骨格筋細胞においてグルコース取り込みを増大させるホモ三量体を形成するものである。
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は脂肪細胞においてグルコース取り込みを増大させるホモ三量体を形成するものである。
さらに好ましいＧＭＧ−２ポリペプチド断片は神経細胞においてグルコース取り込みを増大させるホモ三量体を形成するものである。
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は赤血球細胞においてグルコース取り込みを増大させるホモ三量体を形成するものである。
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は脳においてグルコース取り込みを増大させるホモ三量体を形成するものである。
【００２７】
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は食事、特に高炭水化物食後の血漿グルコースにおける食後増大を顕著に減少させるホモ三量体を形成するものである。
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は食事、特に高脂肪又は高炭水化物食後の血漿グルコースにおける食後増大を顕著に妨げるホモ三量体を形成するものである。
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はインスリン感受性を改善するホモ三量体を形成するものである。
【００２８】
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は損なわれたグルコース耐性からインスリン抵抗性への進行を阻害するホモ三量体を形成するものである。
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は筋肉マスを増大させるホモ三量体を形成するもの、好ましくは筋細胞数を増大させるもの、より好ましくは筋繊維数を増大させるものである。
【００２９】
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は体重肥大における増大を促進させるホモ三量体を形成するもの、好ましくは筋肉マスにおける増大を促進させる断片である。さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は、好ましくはｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の非存在下での平均成長速度より大きな成長速度で増大を促進させて、成長速度を促進させる。
【００３０】
さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は新生哺乳類、好ましくは、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、ブタ、イヌ又はヒト新生児、より好ましくは０〜６月齢のヒト新生児、最も好ましくは０〜３月齢のヒト新生児における成長速度を促進するホモ三量体を形成するものである。さらに好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は新生の体重不足の又は未熟の哺乳類、好ましくは、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、ブタ、イヌ又はヒトの体重不足の又は未熟の新生児、より好ましくは０〜６月齢のヒトの体重不足の又は未熟の新生児、最も好ましくは０〜３月齢のヒトの体重不足の又は未熟の新生児において成長速度を促進させるホモ三量体を形成するものである。
【００３１】
さらに好ましくはｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでホモ三量体を形成するものである。より好ましくはｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでホモ三量体を形成するものであり、ここで、少なくとも１０％，１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は前記ホモ三量体を含む。最も特に好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで脂質分割、脂質代謝、及びインスリン様活性から成る群から選ばれる活性を有するホモ三量体を形成するものである。また最も特に好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで体重増加の予防、体重減少、及び体重減少の維持から成る群から選ばれる活性を有するホモ三量体を形成するものである。上記に示すように、活性を有するホモ三量体を形成するいかなるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片も除外されうる。
【００３２】
さらに好ましい態様は本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を含む異種のポリペプチドを含む。より好ましいものは本発明に係る前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチドにＮ−末端で融合されたシグナルペプチドから成る前記異種のポリペプチドである。さらにより好ましい態様においては、前記シグナルペプチドは好ましくは配列ａｔｇｇｔａａｇａａｔｇｇｔｇｃｃｔｇｔｃｃｔｇｃｔｇｔｃｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｔｃｔｇｇｇｔｃｃｔｇｃｔｇｔｃｃｃｃのポリヌクレオチドによりコードされる、アミノ酸配列ＭＶＲＭＶＰＶＬＬＳＬＬＬＬＬＧＰＡＶＰのヒト亜鉛−アルファ２−糖タンパク質シグナルペプチドである。
【００３３】
第二の局面において、本発明は第一の局面において示した前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片又は全長ＧＭＧ−２ポリペプチドをコードする精製された、単離された又は組換えられたポリヌクレオチド又はその相補体を特徴付ける。さらなる態様においては、上記ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、一重鎖、及び二重鎖である。
【００３４】
第三の局面において、本発明は第二の局面において示した前記ポリヌクレオチドを含む、主にそれから成る又はそれから成る組換えベクターを特徴付ける。
【００３５】
第四の局面において、本発明は第三の局面において示した前記組換えベクターを含む、主にそれから成る又はそれから成る組換え細胞を特徴付ける。好ましい前記組換え細胞は原核又は真核組換え細胞である。好ましい前記原核組換え細胞はＥ． ｃｏｌｉ組換え細胞である。好ましい前記真核組換え細胞は哺乳類の組換え細胞である。特に好ましい哺乳類の組換え細胞はＣＯＳ組換え細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）組換え細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）組換え細胞、及び３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞組換え細胞から成る群から選ばれる。さらなる態様は本発明に係るポリヌクレオチドについて組換えられた宿主細胞を含む。好ましい前記宿主細胞は原核又は真核宿主細胞である。好ましい前記原核宿主細胞はＥ． ｃｏｌｉ宿主細胞である。好ましい前記真核宿主細胞は哺乳類の宿主細胞である。特に好ましい哺乳類の宿主細胞はＣＯＳ宿主細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）宿主細胞、及び３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞宿主細胞から成る群から選ばれる。
【００３６】
第五の局面において、本発明は第一の局面において示した前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片及び、あるいは、医薬の又は生理学的に許容される希釈剤を含む、主にそれから成る又はそれから成る医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。より好ましい前記医薬の又は生理学的に許容される組成物は第一の局面において示される前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片のホモ三量体及び、あるいは、医薬の又は生理学的に許容される希釈剤を含む、主にそれから成る又はそれから成る。前記医薬の又は生理学的に許容される組成物においては、好ましくは第一の局面の前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％がホモ三量体を含む。
【００３７】
第六の局面において、本発明はボディマスを減少させる必要のある個体に第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物を提供する又は投与することを含むボディマスを減少させる方法を特徴付ける。さらに好ましいものはその必要のある個体に第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物を提供する又は投与することを含む体脂肪マスを減少させる方法である。さらに好ましいものはその必要のある個体に第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物を提供する又は投与することを含むやせたボディマスを増大させる方法である。さらに好ましいものはその必要のある個体に第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物を提供する又は投与することを含む体重肥大又は身長の成長速度を増大させる方法である。
【００３８】
さらに好ましい態様においては、本発明は体重減少剤と共に彼らの体重を改善させるために肥満患者の補完の治療において使用されうる。体重減少剤の例はオーリスタットの如きリパーゼ阻害剤、及びシブトラミンの如きセロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）及びノルアドレナリン再取り込み阻害剤を含む。
【００３９】
さらに好ましい態様においては、本発明は減少したボディマスを維持する必要のある個体に第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物を提供する又は投与することを含む減少したボディマスを維持する方法を特徴付ける。さらに好ましいものは、その必要のある個体に、前記個体においてエネルギー取り込みを正常な値に戻し、及び前記個体において増大したエネルギー消費を維持する、第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物を提供する又は投与することを含む減少した体脂肪マスを維持する方法である。好ましくは、前記個体は（本明細書中で示される）彼らの肥満体重より１０〜２０％低い安定した体重を維持することができる。
【００４０】
他の好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明は体重減少を維持する方法として減少したエネルギー取り込み及び／又は増大したエネルギー消費と共に使用されうる。
【００４１】
またさらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物で処置されるべきボディマスを減少させる必要のある前記個体の同定はＧＭＧ−２シングルヌクレオチド多形性（ＳＮＰｓ）の遺伝子型計測又は前記個体からの臨床サンプルにおけるＧＭＧ−２ポリペプチド又はｍＲＮＡ値の計測を含む。好ましくは、前記臨床サンプルは血漿、尿、及び唾液から成る群から選ばれる。好ましくは、本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は、健康な、非肥満患者と比較して、全長ＧＭＧ−２又は天然にタンパク質分解的に切断されたＧＭＧ−２断片の血液、血清又は血漿値において少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減少を有する個体に投与される。
【００４２】
第七の局面において、本発明は上記処置の必要のある個体に第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物を提供する又は投与することを含む、肥満関連疾患又は障害の予防又は治療方法を特徴付ける。好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物で治療されるべき上記処置の必要のある前記個体の同定はＧＭＧ−２シングルヌクレオチド多形性（ＳＮＰｓ）遺伝子型計測又は前記個体からの臨床サンプルにおけるＧＭＧ−２ポリペプチド又はｍＲＮＡ値の計測を含む。好ましくは、前記臨床サンプルは血液、血清、血漿、尿、及び唾液から成る群から選ばれる。好ましくは、前記肥満関連疾患又は障害は肥満、損なわれたグルコース耐性、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、アテロームの疾患、心疾患、高血圧、卒中、シンドロームＸ、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ又はＩＩ型糖尿病）及びインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ又はＩ型糖尿病）から成る群から選ばれる。本発明に係る方法により処置されるべき糖尿病関連合併症は細小血管病変、眼の病変、網膜症、神経障害、及び腎臓病変を含む。心疾患は、非限定的に、心不全、冠状動脈不全、及び高血圧を含む。本発明に係る化合物により処置されるべき他の肥満関連障害は高脂血症及び尿酸過剰血症を含む。本発明に係るさらに他の代謝関連疾患又は障害は悪液質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少、食欲不振、及び過食症を含む。好ましい態様においては、前記個体は哺乳類、好ましくはヒトである。
【００４３】
関連した局面において、本発明は上記治療の必要のある個体に第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物を提供する又は投与することを含む炎症関連疾患又は障害の予防又は治療方法を特徴付ける。好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物で処置されるべき上記処置の必要のある前記個体の同定はＧＭＧ−２シングルヌクレオチド多形性（ＳＮＰｓ）の遺伝子型計測又は前記個体からの臨床サンプルにおけるＧＭＧ−２ポリペプチド又はｍＲＮＡ値の計測を含む。好ましくは、前記臨床サンプルは血液、血清、血漿、尿、及び唾液から成る群から選ばれる。好ましくは、前記炎症関連疾患又は障害は血管障害、疾患及び損傷、特に、アテローム性動脈硬化症の如き、過剰の炎症性応答により引き起こされるもの、狭心症、心筋梗塞、深層静脈の血栓症、末梢動脈閉塞、冠状心疾患（ＣＤＨ）、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、心不全、一過性の虚血性発作、血管形成後再狭窄、骨髄造血、及び播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）から成る群から選ばれる。好ましい態様においては、前記個体は哺乳類、好ましくはヒトである。
【００４４】
関連した局面において、本発明の態様は個体に第一の局面のポリペプチドを含む組成物を提供する又は投与する段階を含む、個体において所望の生物学的応答を引き起こす又は誘発する方法を含み、ここで、前記生物学的応答は：
（ａ）遊離脂肪酸の循環（血液、血清又は血漿）値（濃度）を低下させる；
（ｂ）グルコースの循環（血液、血清又は血漿）値（濃度）を低下させる；
（ｃ）トリグリセリドの循環（血液、血清又は血漿）値（濃度）を低下させる；
（ｄ）筋肉の脂質又は遊離脂肪酸酸化を刺激する；
（ｃ）肝臓又は肝細胞においてレプチン取り込みを増大させる；
（ｅ）特に高脂肪食後の血漿遊離脂肪酸における食後増大を減少させる；及び
（ｆ）特に高脂肪食後のケトン体産生を減少させる又は除去する；
（ｇ）特に筋肉、脂肪、肝臓又は脳でインスリンへの組織感受性を増大させる；
（ｈ）損なわれたグルコース耐性からインスリン抵抗性への進行を阻害する；
（ｉ）筋細胞タンパク質合成を増大させる；
（ｊ）脂肪細胞トリグリセリド内容量を減少させる；
（ｋ）食物又は代謝貯蓄からのエネルギー利用を増大させる；
（ｌ）成長速度、好ましくは大きさ又は身長における成長を増大させる；
（ｍ）筋肉成長を増大させる；及び
（ｎ）骨格成長を増大させる；
から成る群から選ばれ、及びさらにここで、前記生物学的応答は同じモル濃度の全長ＧＭＧ−２ポリペプチドにより引き起こされる又は誘導される生物学的応答より顕著に大きい又は少なくとも１０％、２０％、３０％、３５％又は４０％大きい；又はあるいはここで、前記生物学的応答は一過性の応答より大きい；又はあるいは前記生物学的応答は維持される。さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン治療と共に、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）を有する何人かのヒトにおいて血中グルコースを制御する方法として使用されうる。
【００４５】
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン治療と共に、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病）を有する何人かのヒトにおいて血中グルコースを制御する方法として使用されうる。
【００４６】
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン治療と共に、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）を有する何人かのヒトにおいて体重を制御する方法として使用されうる。
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン治療と共に、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病）を有する何人かのヒトにおいて体重を制御する方法として使用されうる。
【００４７】
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン治療を伴わずに、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）のみを有する何人かのヒトにおいて血中グルコースを制御する方法として使用されうる。
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン治療を伴わずに、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病）のみを有する何人かのヒトにおいて血中グルコースを制御する方法として使用されうる。
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン治療を伴わずに、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）のみを有する何人かのヒトにおいて体重を制御する方法として使用されうる。
【００４８】
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン治療を伴わずに、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病）のみを有する何人かのヒトにおいて体重を制御する方法として使用されうる。
【００４９】
さらに好ましい態様においては、本発明は経口インスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤と共に、ＮＩＤＤＭ患者の補充治療において彼らの体重又はグルコース制御を改善するために使用されうる。好ましくは、上記経口インスリン分泌促進剤は１，１−ヂメチル−２−（２−モルフォリノフェニル）グアニヂンフマル酸（ＢＴＳ６７５８２）又はトルブタミド、トラザミド、クロルプロパミド、グリベンクラミド、グリメピリド、グリピジド及びグリダジドから選ばれるスルフォニル尿素である。好ましくは、インスリン増感剤はメトフォルミン、シグリタゾン、トログリタゾン及びピオグリタゾンから選ばれる。
【００５０】
本発明はさらに経口インスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤なしに、ＮＩＤＤＭ患者のみの体重又はグルコース制御を改善する方法を提供する。
さらに好ましい態様においては、本発明は経口インスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤と共に、ＩＤＤＭ患者の補充の治療において彼らの体重又はグルコース制御を改善するために使用されうる。好ましくは、上記経口インスリン分泌促進剤は１，１−ヂメチル−２−（２−モルフォリノフェニル）グアニヂンフマル酸（ＢＴＳ６７５８２）又はトルブタミド、トラザミド、クロルプロパミド、グリベンクラミド、グリメピリド、グリピジド及びグリダジドから選ばれるスルフォニル尿素である。好ましくは、上記インスリン増感剤はメトフォルミン、シグリタゾン、トログリタゾン及びピオグリタゾンから選ばれる。
【００５１】
本発明はさらに経口インスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤なしに、ＩＤＤＭ患者のみの体重又はグルコース制御を改善する方法を提供する。
さらに好ましい態様においては、本発明は、例えば、同時に、別々に又は連続して使用される別々の投与単位の形態で、経口インスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤と共に、付随して又は同時に投与されうる（上記分泌促進剤の前若しくは後又は上記増感剤の前若しくは後）。したがって、本発明はさらにＮＩＤＤＭ又はＩＤＤＭ患者における体重又はグルコース制御の改善のための同時の、別々の又は連続した使用のための混合された調製物として医薬の又は生理学的許容される組成物及び経口インスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤の組成物を提供する。
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はさらにインスリン増感剤としての使用のための方法を提供する。
【００５２】
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン治療と共に、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）を有する何人かのヒトにおいてインスリン感受性を改善する方法として使用されうる。
【００５３】
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン治療と共に、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病）を有する何人かのヒトにおいてインスリン感受性を改善する方法として使用されうる。
【００５４】
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン治療を伴わずに、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）を有する何人かのヒトにおいてインスリン感受性を改善する方法として使用されうる。
【００５５】
第八の局面において、本発明は第一の局面において示されるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の作出方法を特徴付け、ここで、前記方法はタンパク質分解的な切断、組換え法及び人工合成から成る群から選ばれる。
【００５６】
第九の局面において、本発明は組換えｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片又は全長ＧＭＧ−２ポリペプチドの作出方法、その乳が前記組換えｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片又は全長タンパク質を含むトランスジェニック、非ヒト哺乳類を提供すること、及び前記非ヒト哺乳類の乳から前記組換えｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片又は前記全長ＧＭＧ−２ポリペプチドを精製することを含む方法を提供する。１の態様においては、前記非ヒト哺乳類はウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ又はマウスである。他の態様においては、上記方法は前記乳からシグナルペプチドを有しない組換え成熟ＧＭＧ−２ポリペプチドを精製することを含み、さらにｉｎ ｖｉｔｒｏで前記タンパク質を切断して所望のｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を得ることを含む。
【００５７】
第十の局面において、本発明は肥満関連疾患及び障害の治療及び／又はボディマスの減少のための第一の局面において示されるポリペプチドの使用を特徴付ける。好ましくは、前記肥満関連疾患及び障害は肥満、損なわれたグルコース耐性、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、アテロームの疾患、心疾患、高血圧、卒中、シンドロームＸ、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ又はＩＩ型糖尿病）及びインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ又はＩ型糖尿病）から成る群から選ばれる。本発明に係る方法により処置されるべき糖尿病関連合併症は細小血管病変、眼の病変、網膜症、神経障害、及び腎臓病変を含む。心疾患は、非限定的に、心不全、冠状動脈不全、及び高血圧を含む。本発明に係る化合物により処置されるべき他の肥満関連障害は高脂血症及び尿酸過剰血症を含む。好ましい態様においては、前記個体は哺乳類、好ましくはヒトである。
【００５８】
本発明はさらに体重増加の予防のための、体重減少のための、及び／又は体重減少の維持のための第一の局面のポリペプチドの使用を特徴付ける。好ましい態様においては、前記個体は哺乳類、好ましくはヒトである。
【００５９】
第十一の局面において、本発明は肥満関連疾患及び障害の治療のための及び／又はボディマスの減少のための医薬の調製についての第一の局面において示されるポリペプチドの使用を特徴付ける。好ましくは、前記肥満関連疾患又は障害は肥満、損なわれたグルコース耐性、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、アテロームの疾患、心疾患、高血圧、卒中、シンドロームＸ、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ又はＩＩ型糖尿病）及びインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ又はＩ型糖尿病）から成る群から選ばれる。本発明に係る方法により処置されるべき糖尿病関連合併症は細小血管病変、眼の病変、網膜症、神経障害、及び腎臓病変を含む。心疾患は、非限定的に、心不全、冠状動脈不全、及び高血圧を含む。本発明に係る化合物により処置されるべき他の肥満関連障害は高脂血症及び尿酸過剰血症を含む。本発明に係るさらに他の代謝関連疾患又は障害は悪液質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少、食欲不振、及び過食症を含む。好ましい態様においては、前記個体は哺乳類、好ましくはヒトである。
【００６０】
本発明はさらに体重増加の予防のための、体重減少のための、及び／又は体重減少の維持のための医薬の調製についての第一の局面のポリペプチドの使用を特徴付ける。好ましい態様においては、前記個体は哺乳類、好ましくはヒトである。
【００６１】
第十二の局面において、本発明はヒト又は動物の体の治療方法における使用のための、本発明の第一の局面のポリペプチド又は本発明の第五の局面の組成物を提供する。
【００６２】
第十三の局面において、本発明は個体に第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物又は第一の局面において示されるポリペプチドを提供することを含む体重を減少させる方法を特徴付ける。体重減少が美容目的で実施される場合、個体は少なくとも２０〜２５以下のＢＭＩを有する。肥満治療のための態様においては、上記個体は少なくとも２０のＢＭＩを有しうる。肥満治療のための１の態様は少なくとも２５のＢＭＩ値を有する個体の治療を提供する。肥満治療のための他の態様は少なくとも３０のＢＭＩ値を有する個体の治療を提供する。さらに他の態様は少なくとも４０のＢＭＩ値を有する個体の治療を提供する。あるいは、個体の体重増加のために上記ＢＭＩ値は少なくとも１５〜２０以下であるべきである。
【００６３】
関連した局面において、本発明は個体に第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物又は第一の局面において示されるポリペプチドを提供することを含む体重減少を維持する方法を特徴付ける。体重減少の維持が美容目的で実施される場合、上記個体は少なくとも２０〜２５以下のＢＭＩを有する。体重減少の維持の方法による肥満治療のための態様においては、上記個体は少なくとも２０のＢＭＩを有しうる。体重減少の維持の方法による肥満治療のための１の態様は少なくとも２５のＢＭＩ値を有する個体の治療を提供する。体重減少の維持の方法による肥満治療のための他の態様は少なくとも３０のＢＭＩ値を有する個体の治療を提供する。
【００６４】
第十四の局面において、本発明はボディマスを減少させるための及び／又は肥満関連疾患又は障害の治療又は予防のための第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。好ましくは、前記肥満関連疾患又は障害は肥満、損なわれたグルコース耐性、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、アテロームの疾患、心疾患、高血圧、卒中、シンドロームＸ、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ又はＩＩ型糖尿病）及びインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ又はＩ型糖尿病）から成る群から選ばれる。本発明に係る方法により処置されるべき糖尿病関連合併症は細小血管病変、眼の病変、網膜症、神経障害、及び腎臓病変を含む。心疾患は、非限定的に、心不全、冠状動脈不全、及び高血圧を含む。本発明に係る化合物により処置されるべき他の肥満関連障害は高脂血症及び尿酸過剰血症を含む。本発明に係るさらに他の肥満関連疾患又は障害は悪液質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少、食欲不振、及び過食症を含む。好ましい態様においては、前記個体は哺乳類、好ましくはヒトである。好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物で処置されるべき前記個体の同定はＧＭＧ−２シングルヌクレオチド多形性（ＳＮＰｓ）の遺伝子型計測又は前記個体からの臨床サンプルにおけるＧＭＧ−２ポリペプチド又はｍＲＮＡ値の計測を含む。好ましくは、前記臨床サンプルは血液、血清、血漿、尿、及び唾液から成る群から選ばれる。
【００６５】
関連した局面において、本発明は炎症性応答、好ましくは血管傷害又は損傷に関連した炎症性応答を減少させるための、及び／又は炎症関連疾患又は障害の治療又は予防のための第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。好ましくは、前記炎症関連疾患又は障害は血管障害、疾患及び損傷、特にアテローム性動脈硬化症の如き、過剰の炎症性応答により引き起こされるもの、狭心症、心筋梗塞、深層静脈の血栓症、末梢動脈閉塞、冠状心疾患（ＣＤＨ）、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、心不全、一過性の虚血性発作、血管形成後再狭窄、骨髄造血、及び播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）から成る群から選ばれる。好ましい態様においては、前記個体は哺乳類、好ましくはヒトである。好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物で処置されるべき前記個体の同定はＧＭＧ−２シングルヌクレオチド多形性（ＳＮＰｓ）の遺伝子型計測又は前記個体からの臨床サンプルにおけるＧＭＧ−２ポリペプチド又はｍＲＮＡ値の計測を含む。好ましくは、前記臨床サンプルは血液、血清、血漿、尿、及び唾液から成る群から選ばれる。
【００６６】
第十五の局面において、本発明は美容目的のための体重減少のための第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。
【００６７】
関連する局面において、本発明は美容目的のために体重減少を維持するための第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。
第十六の局面において、本発明は個体に第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物又は第一の局面において示されるポリペプチドを提供することを含むインスリン抵抗性の治療方法を特徴付ける。
【００６８】
第十七の局面において、本発明は肥満である又は絶食時高インスリン血を有する又は両方を有する、正常なグルコース耐性（ＮＧＴ）を有する個体の治療方法における第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。
さらに好ましい態様においては、本発明は妊娠糖尿病を有する個体の治療方法における第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。妊娠糖尿病は妊娠中、通常妊娠の第二又は第三トリメスター中の個体における糖尿病の発展をいう。
【００６９】
さらに好ましい態様においては、本発明は損なわれた絶食時グルコース（ＩＦＧ）を有する個体の治療方法における第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。損なわれた絶食時グルコース（ＩＦＧ）は、個体における絶食時血漿グルコース値が上昇しているが、明白な糖尿病の診断ではない、すなわち、血漿グルコース値が１２６ｍｇ／ｄｌ未満〜１１０ｍｇ／ｄｌ以上である状態である。
【００７０】
さらに好ましい態様においては、本発明は個体における損なわれたグルコース耐性（ＩＧＴ）の治療方法における第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。他のさらに好ましい態様においては、本発明は個体におけるＩＧＴの予防方法における第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。ＩＧＴを減少させる又は予防するための、すなわち、インスリン抵抗性を正常化させるための治療及び方法を提供することにより、ＮＩＤＤＭへの進行は遅延され又は妨げられうる。さらに、インスリン抵抗性を減少させる又は予防する治療及び方法を提供することにより、本発明はインスリン抵抗性症候群の表れを減少させる及び／又は予防する方法を提供する。
【００７１】
さらに好ましい態様においては、本発明は多嚢胞卵巣症候群（ＰＣＯＳ）を有する患者の治療方法において第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。ＰＣＯＳは閉経前の女性の最もよくある障害のうちである。インスリン増感剤はＰＣＯＳにおいて有効であることが示されている。したがって、本発明はインスリン抵抗性を減少させる、血中グルコースを正常化する、したがってＰＣＯＳを治療する及び／又は予防する方法を提供する。
【００７２】
さらに好ましい態様においては、本発明はインスリン抵抗性を有する患者の治療方法における第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物を特徴付ける。またさらに好ましい態様においては、インスリン抵抗性を有する患者はインスリン抵抗性を減少させる又は治療するために本発明に係る方法にしたがって処置される。インスリン抵抗性はまたしばしば感染及び癌にも関連しているので、本発明に係る方法にしたがうインスリン抵抗性の予防又は減少は感染及び癌を予防し又は減少させうる。
さらに好ましい態様においては、本発明に係る方法は患者、例えば、インスリン抵抗性を発展する増大した危険性を有すると知られる者においてインスリン抵抗性の発展を予防するために使用される。
【００７３】
第十八の局面において、本発明はホモ三量体ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性の１以上のアンタゴニストについての化合物のスクリーニング方法におけるホモ三量体ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の使用方法を特徴付け、ここで、前記活性は、非限定的に、体重減少、体重減少の維持、脂質分割、脂質代謝、及びインスリン様活性から選ばれる。
好ましい態様においては、前記化合物は、非限定的に、低分子量有機又は無機化合物、タンパク質、ペプチド、炭水化物又は脂質から選ばれる。
【００７４】
第十九の局面において、本発明は哺乳類、好ましくは新生ヒトに新生哺乳類、特に新生ヒトにより消費される食物中に存在するエネルギー及び他の栄養素、及び特に幼児処方又は母乳中のエネルギー及び他の栄養素の同化、利用又は貯蔵を促進する、改善する、高める又は増大させる栄養補助物を提供する。本発明のさらに好ましい態様は哺乳類、好ましくは新生ヒトに成長速度を促進させる、改善する、高める又は増大させる栄養補助物を提供することである。第一の局面のポリペプチドでの好ましい補給方法は、非限定的に：
（ａ）合成幼児処方への又は母乳への第一の局面のポリペプチドの直接の添加；
（ｂ）摂食前の、好ましくは摂食１〜１５分前の、より好ましくは摂食１〜５分前の、第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物の投与；及び
（ｃ）摂食後の、好ましくは摂食１〜１５分後の、より好ましくは摂食１〜５分後の、第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物の投与；
を含み、ここで、第一の局面に係るポリペプチド又は第五の局面において示される医薬の又は生理学的に許容される組成物の投与経路は経口の、頬の、鼻の及び筋内の経路、好ましくは経口経路から選ばれる。
【００７５】
さらに好ましい態様は第一の局面のポリペプチドを新生哺乳類、特に新生ヒトにより消費される食物中に存在するエネルギー及び他の栄養素、及び特に、幼児処方又は母乳中のエネルギー及び他の栄養素の同化、利用又は貯蔵を促進させる、改善する、高める又は増大させる方法において使用することに方向付けられる。さらに好まし態様は第一の局面のポリペプチドを新生哺乳類、好ましくはヒト新生児の成長速度を促進させる、改善する、高める又は増大させる方法において使用することに方向付けられる。さらに好ましいものは新生哺乳類、特に新生ヒトにより消費される食物中に存在するエネルギー及び他の栄養素、及び特に、幼児処方又は母乳中のエネルギー及び他の栄養素の同化、利用又は貯蔵を促進させる、改善する、高める又は増大させる方法において使用されうる、第一の局面のポリペプチドを含む組成物である。さらに好ましいものは新生哺乳類、好ましくはヒト新生児の成長速度を促進させる、改善する、高める又は増大させる方法において使用されうる、第一の局面のポリペプチドを含む組成物である。本発明のまたさらに好ましい態様は合成幼児乳処方及び第一の局面のポリペプチドを含む組成物に方向付けられる。
【００７６】
本発明の他の態様は合成幼児乳処方又は母乳の栄養価を高める又は改善するのに有用な第一の局面のポリペプチドを含む組成物を提供することである。さらに好ましいものは食事の栄養価を高める又は改善するために新生哺乳類の食事中へ混合するのに有用な組成物である。本発明のさらに他の態様は、新生哺乳類、特に未熟の、低体重の又は非常に低い誕生体重の新生児、好ましくはヒト新生児の食事及び摂食を改善するための技術及び日課を提供することである。
【００７７】
本発明に係る方法の好ましい局面において、個体に投与されるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片又はポリヌクレオチドの量はＧＭＧ−２ポリペプチドの循環（血液、血清又は血漿）値（濃度）をそれらの正常な値（非肥満個体における値）にするのに十分な量である。「正常値」は全ての循環するＧＭＧ−２ポリペプチド（全長ＧＭＧ−２及びその断片）の総濃度又は全ての循環するタンパク質分解的に切断されたＧＭＧ−２ポリペプチドのみの濃度として特定されうる。
【００７８】
本明細書中に開示される本発明に係る組成物の好ましい態様においては、本発明に係る組成物は、上記組成物がインスリン、インスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤と共にでなく単独で投与される前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片について予想される効果よりも大きな生物学的効果を産生するように、さらに第一の局面のｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片、インスリン、インスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤の組み合わせを含みうる。
【００７９】
さらなる態様においては、前記生物学的機能は、非限定的に、遊離脂肪酸値低下活性、グルコース値低下活性、トリグリセリド値低下活性、脂肪細胞の脂肪分解を刺激すること、筋肉の脂質又は遊離脂肪酸酸化を刺激すること、肝細胞系におけるレプチン取り込みを増大させること、高脂肪食のための血漿遊離脂肪酸又はグルコースにおける食後増大を顕著に減少させること、高脂肪食の結果としてのケトン体産生を顕著に減少させる又は除去すること、骨格筋細胞、脂肪細胞、赤血球又は脳におけるグルコース取り込みを増大させること、インスリン感受性を増大させること、損なわれたグルコース耐性からインスリン抵抗性への進行を阻害すること、ボディマスを減少せること、脂肪マスを減少させること、やせた筋肉マスを増大させること、代謝関連疾患又は障害の予防又は治療、非インスリン依存性真性糖尿病又は非インスリン依存性新生糖尿病を有する何人かのヒトにおいて血中グルコースを制御すること、インスリン抵抗性の治療又はインスリン抵抗性の発展の予防を含む。
【００８０】
上記に示されるように、活性を有するホモ三量体を形成するいかなるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片も除外されうる。
【００８１】
配列リストの簡単な説明
配列ＩＤ番号：１はその位置が特徴付けられるように示されるオープンリーディングフレームを有するｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
配列ＩＤ番号：２は配列ＩＤ番号：１のｃＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列である。
配列ＩＤ番号：３はその位置が特徴付けられるように示されるオープンリーディングフレームを有するｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
配列ＩＤ番号：４は配列ＩＤ番号：３のｃＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列である。
配列ＩＤ番号：５はその位置が特徴付けられるように示されるオープンリーディングフレームを有するｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
配列ＩＤ番号：６は配列ＩＤ番号：５のｃＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列である。
付属の配列リストはそれらを全体として本明細書中に援用する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８２】
発明の詳細な説明
本発明をより詳細に示す前に、以下の定義が本明細書中の本発明を示すために使用される用語の意味及び範囲を例示する及び定義するために示される。
本明細書中で相互交換可能に使用されるとき、上記用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」及び核酸は単鎖又は二重形の１以上のヌクレオチドのＲＮＡ、ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む。上記用語は少なくとも１の改変を含む「改変されたヌクレオチド」を含み、例のために及び限定ではなく：（ａ）代替の結合基、（ｂ）プリンの類似形態、（ｃ）ピリミヂンの類似形態又は（ｄ）類似の糖を含む。類似の結合基、プリン、ピリミヂン、及び糖の例のために、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９５／０４０６４を参照のこと。本発明に係るポリヌクレオチド配列は本分野において知られる精製方法を利用することに加えて、合成、組換え、ｅｘ ｖｉｖｏ産生又はそれらの組み合わせを含む既知の方法により調製されうる。
【００８３】
上記用語ポリヌクレオチド構築物、組換えポリヌクレオチド及び組換えポリペプチドは本分野におけるそれらの使用と一致して、本明細書中で使用される。上記用語「上流」及び「下流」は本分野におけるそれらの使用と一致して、本明細書中で使用される。上記用語「塩基対の」及び「Ｗａｔｓｏｎ ＆ Ｃｒｉｃｋ塩基対の」は本明細書中で相互変換可能に、及び本分野におけるそれらの使用と一致して使用される。同様に、上記用語「相補的な」、「その相補の」、「相補物」、「相補的なポリヌクレオチド」、「相補的な核酸」及び「相補的なヌクレオチド配列」は本明細書中で相互変換可能に及び本分野におけるそれらの使用と一致して使用される。
【００８４】
上記用語「精製された」は本明細書中で、非限定的に、他の核酸、炭水化物、脂質及び（上記ポリヌクレオチドの合成において使用される酵素の如き）タンパク質を含む他の化合物から分離された、本発明に係るポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドベクターを示すために使用される。「精製された」はまた、例えば、直鎖のポリヌクレオチドからの共有結合的に閉じたポリヌクレオチドの分離又はその逆をもいう。ポリヌクレオチドは少なくとも約５０％、６０％、７５％又は９０％のサンプルが単一のポリヌクレオチド配列を含むとき実質的に純粋である。いくつかの場合、このことはコンフォメーション（直鎖対共有結合的に閉じたもの）間の決定を含む。実質的に純粋なポリヌクレオチドは典型的に約５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９％重量／重量の核酸サンプルを含む。ポリヌクレオチドの純粋さ又は均質性は、サンプルのアガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いて上記ゲルを染色した際の単一のポリヌクレオチドバンドの可視化の如き、本分野において周知の多くの方法により示されうる。いくつかの目的のために、高分解がＨＰＬＣ又は本分野において周知の他の方法を用いることにより達成されうる。
【００８５】
同様に、上記用語「精製された」は本明細書中で、非限定的に、核酸、脂質、炭水化物及び他のタンパク質を含む他の化合物から分離された、本発明に係るポリペプチドを示すために使用される。いくつかの好ましい態様においては、ポリペプチドは少なくとも約５０％、６０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％のサンプルのポリペプチド分子が単一のアミノ酸配列を有するとき実質的に純粋である。いくつかの好ましい態様においては、実質的に純粋なポリペプチドは典型的に約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％重量／重量のタンパク質サンプルを含む。ポリペプチドの純粋さ又は均一性はサンプルのアガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いて上記ゲルを染色した際の単一のポリペプチドバンドの可視化の如き、本分野において周知の多くの方法により示される。いくつかの目的のために、高分解がＨＰＬＣ又は本分野において周知の他の方法を用いることにより達成されうる。
【００８６】
さらに、本明細書中で使用されるとき、上記用語「精製された」は絶対的な純粋さを必要としない；むしろ、それは比較的な定義として意図される。出発物質又は天然材料の少なくとも１オーダーの等級、好ましくは２又は３オーダー、及びより好ましくは４又は５オーダーの等級への精製が明白に企図される。あるいは、精製は異種のポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ又は両方）又はポリペプチドに比較した「少なくとも」パーセントの純粋さとして表現されうる。好ましい態様として、本発明に係るポリヌクレオチド又はポリペプチドは異種のポリヌクレオチド又はポリペプチドに比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、９９．５％又は１００％純粋である。さらに好ましい態様として、上記ポリヌクレオチド又はポリペプチドは異種のポリヌクレオチド又はポリペプチドに比較して９０％〜１００％（例えば、少なくとも９９．９９５％純粋）の、ある数字から少数点以下第三位までに及ぶ「少なくとも」の純粋さを有する。さらに、上記ポリヌクレオチド又はポリペプチドの純粋さは担体溶液以外の全ての材料及び化合物に比較した（上記に示した）パーセントとして表現されうる。小数点以下第三位までの、それぞれの数字は純粋さの個々の種として請求されうる。
【００８７】
上記用語「単離された」は上記材料がその源の環境（例えば、それが天然のものである場合は、天然の環境）から除去されることを必要とする。例えば、生存する動物中に存在する天然のポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていないが、天然の系においていくつかの又は全部の共存する材料から分離された同じポリヌクレオチド若しくはＤＮＡ又はポリペプチドは単離されている。上記ポリヌクレオチドはベクターの部分でありうる及び／又は上記ポリヌクレオチド又はポリペプチドは組成物の部分でありうる、及び上記ベクター又は組成物がその天然の環境の部分ではない点で単離されている。
【００８８】
「単離された」の定義から特定して排除されるものは：天然の染色体（例えば、染色体スプレッド）、人工的な染色体ライブラリー、ゲノムライブラリー、及びｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸調製物として又はトランスフェクトされた／形質転換された宿主細胞調製物として存在するｃＤＮＡライブラリーであり、ここで、宿主細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ不均一調製物である又は単一のコロニーの不均一集団としてまかれる。また特定して排除されるものは、５’ＥＳＴが上記ベクター分子内に５％（又はあるいは１％、２％、３％、４％、１０％、２５％、５０％、７５％又は９０％、９５％又は９９％）未満のいくつかの核酸挿入物を作出する上記ライブラリーである。さらに特定して排除されるものは全細胞ゲノムＤＮＡ又は全細胞ＲＮＡ調製物（機械的に切断された又は酵素的に消化された前記全細胞調製物を含む）である。さらに特定して排除されるものはｉｎ ｖｉｔｒｏ調製物としての又は（同じもののブロットトランスファーを含む）電気泳動により分離された不均一の混合物としての上記全細胞調製物であり、ここで、本発明に係るポリヌクレオチドはさらに（例えば、アガロースゲル又はナイロンブロット中の不均一のバンド集団から単一のバンドを削り取ることによりさらに分離して）電気泳動媒体中の異種のポリヌクレオチドから分離されていない。
【００８９】
上記用語「プライマー」は標的ヌクレオチド配列と相補的であり、そして標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせるために使用される特定のオリヌクレオチド配列を示す。プライマーはＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素により触媒されるヌクレオチドポリメライゼーションのための開始点としてはたらく。
【００９０】
上記用語「プローブ」はサンプル中に存在する特定のポリヌクレオチド配列を同定するために使用されうる、定義された核酸セグメント（又はヌクレオチドアナログセグメント、例えば、本明細書中以下に定義されるＰＮＡ）を示し、前記核酸セグメントは同定されるべき特定のポリヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。
【００９１】
上記用語「ポリペプチド」はポリマーの長さに関係なく、アミノ酸のポリマーをいう。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質はポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はまたポリペプチドの発現後修飾を特定しない又は排除しない。例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基等の共有結合的な結合を含むポリペプチドは上記用語ポリペプチドにより表現的に含まれる。また、天然の及び非天然の、本分野において知られる他の改変に加えて、（例えば、非天然のアミノ酸、関連しない生物系でのみ天然に起こるアミノ酸、哺乳類系から改変したアミノ酸を含む）アミノ酸の１以上のアナログを含むポリペプチド、置換された結合を有するポリペプチドも上記定義内に含まれる。本明細書中で使用されるとき、上記用語「ＧＭＧ−２」は一般的に、別段の定めなき限り、マウスの又はヒトのＧＭＧ−２をいう。
【００９２】
学説に制限されることなく、本発明に係る化合物／ポリペプチドは肝臓及び末梢組織間で食物脂質の分割を調節することができ、そしてしたがって、「肝臓及び末梢組織間の食物脂質の分割に関係する疾患」を治療すると考えられる。上記用語「末梢組織」は筋肉及び脂肪組織を含むと意味される。好ましい態様においては、本発明に係る化合物／ポリペプチドは筋肉へ食物脂質を筋肉へ分割する。代替の好ましい態様においては、上記食物脂質は脂肪組織へ分割される。他の好ましい態様においては、上記食物脂質は肝臓へ分割される。さらに他の好ましい態様においては、本発明に係る化合物／ポリペプチドは筋肉による食物脂質、好ましくは遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の酸化を増大させる又は減少させる。食物脂質は、非限定的に、トリグリセリド及び遊離脂肪酸を含む。
【００９３】
食物脂質の分割に関係すると考えられる好ましい疾患は肥満及び肥満、損なわれたグルコース耐性、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、アテロームの疾患、心疾患、高血圧、卒中、シンドロームＸ、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ又はＩＩ型糖尿病）及びインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ又はＩ型糖尿病）の如き肥満関連疾患及び障害を含む。本発明に係る方法により治療されるべき糖尿病関連合併症は細小血管病変、眼の病変、網膜症、神経障害、及び腎臓病変を含む。心疾患は、非限定的に、心不全、冠状動脈不全、及び高血圧を含む。本発明に係る化合物により治療されるべき他の肥満関連障害は高脂血症及び尿酸過剰血症を含む。本発明のさらに他の代謝関連疾患又は障害は悪疫質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少、食欲不振、及び過食症を含む。
【００９４】
上記用語「異種の」は、本明細書中で使用されるとき、本発明に係るＧＭＧ−２又はＧＭＧ−２ポリペプチド又はｇＧＭＧ−２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド以外のポリペプチド又はポリヌクレオチドを指すと意図される。
【００９５】
上記用語「含む（comprising）」、「から成る（consisting of）」及び「本質的にそれから成る（consisting essentially of）」はそれらの標準の意味にしたがって定義される。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐにおいて示される定義された意味は本分野における定義された意味を支配する、またフェデラル・サーキットの判例法において示される定義された意味はＭ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．中に示される意味を支配する。このことを念頭において、上記用語はそれぞれの用語に関連した特定の意味を結びつけるために本明細書をとおして互いに置換されうる。
【００９６】
上記用語本発明に係る特定のポリヌクレオチド「について組換えた宿主細胞」は前記細胞において天然に見られない方法で前記ポリヌクレオチドを含むよう人の手で変換された宿主細胞を意味する。例えば、前記宿主細胞は本発明に係る前記ポリヌクレオチドで一時的に又は安定的にトランスフェクトされ又は形質導入されうる。
【００９７】
上記用語「肥満」は、本明細書中で使用されるとき、体重のＷＨＯ分類において定義される（Ｋｏｐｅｌｍａｎ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０４：６３５６４３）。体重不足は１８．５未満である（やせた）；健康は１８．５〜２４．９である（正常）；１等級体重超過は２５．０〜２９．９である（体重超過）；２等級体重超過は３０．０〜３９．０である（肥満）；３等級体重超過は４０．０ＢＭＩ以上である。ＢＭＩはボディマスインデックス（病性の肥満）であり、及びｋｇ／ｍ2である。ウエスト周囲も代謝合併症の危険性を示すために使用されることができ、ここで、男性において、９４ｃｍ以上の周囲は増大した危険性を示し、そして１０２ｃｍ以上は実質的に増大した危険性を示す。女性についても同様に、８８ｃｍ以上は増大した危険性を示し、そして８８ｃｍ以上は実質的に増大した危険性を示す。上記ウエスト周囲は肋骨の下の境界線及び骨盤の上の境界線の間の中点でｃｍで計測される。肥満の他の基準は、非限定的に、カリパスを用いた皮膚の重なりの厚みのｃｍでの計測である、皮膚の重なり、及びやせたマスは主に電解質溶液であるため太ったマスよりも電流を伝導するという原理に基づいたバイオインピーダンスを含む；手足にわたり適用された弱い電流（インピーダンス）への抵抗の計測は経験的に由来する式を用いて体脂肪の見積もりを提供する。
【００９８】
上記用語「エネルギー取り込み」は、本明細書中で使用されるとき、総カロリー取り込み、すなわち、食物及び液体食物からの総エネルギーから個体へ取り込まれたエネルギーとして定義される。
【００９９】
上記用語「エネルギー消費」は、本明細書中で使用されるとき、休止中エネルギー消費（ＲＥＥ）、食事の熱効果（ＴＥＦ）、及び運動の如き活動を含む、総エネルギー消費（ＴＥＥ）として定義される。「エネルギー取り込み」及び「エネルギー消費」の両方はＲｏｓｅｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．により定義される［それらを全体として本明細書中に援用する、Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ（２０００）Ｊｕｎ；７１（６）：１４２１−３２］。
【０１００】
上記用語「体重減少の維持」は、本明細書中で使用されるとき、上記個体の開始の肥満体重より１０〜２０％低い個体における安定な体重の維持として定義される。好ましくは、体重減少後の新たに維持された体重は（本明細書中で定義されるとき）健康体重である。体重減少の維持が美容目的で実施されるとき、上記個体は少なくとも２０〜２５以下のＢＭＩを有する。体重減少の維持の方法による肥満治療について定義されるとき、上記個体は少なくとも２０のＢＭＩを有しうる。
【０１０１】
上記用語「糖尿病」は、本明細書中で使用されるとき、非限定的に、以下のリスト：糖尿病の症状（例えば、多尿、多渇症、多食症）に加えて２００ｍｇ／ｄｌ以上の不定期の血漿グルコース値、ここで、不定期の血漿グルコースは食事又は飲み物消費の時間に関係なく１日のいかなる時間でも定義される；１２６ｍｇ／ｄｌ以下の８時間絶食時血漿グルコース値；及び水中に溶解した７５ｇ無水物グルコースの経口投与２時間後の２００ｍｇ／ｄｌ以上の血漿グルコース値を含んだどの方法からもなされる糖尿病の通常の診断を含むと意図される。
【０１０２】
上記用語「損なわれたグルコース耐性（ＩＧＴ）」は、本明細書中で使用されるとき、明らかなＮＩＤＤＭ及び正常なグルコース耐性（ＮＧＴ）の間の中間である、インスリン抵抗性に関連した状態を示すと意図される。ＩＧＴ集団の高い割合が正常なグルコース耐性を有する者と比較してＮＩＤＤＭへ進行することが知られる（その開示をそれらを全体として本明細書中に援用する、Ｓａｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９８８；３１９：１５００−６）。したがって、ＩＧＴを減少させる又は予防する、すなわち、インスリン抵抗性を正常化する治療及び方法を提供することにより、ＮＩＤＤＭへの進行は遅延され又は妨げられうる。ＩＧＴは、患う者の食後グルコース応答が食事２時間後の血漿グルコース値により評価されるとき異常であると決定される、手順により診断される。この試験において、計測された量のグルコースが患者に与えられ、及び血中グルコース値が規則的な間隔で、通常はじめの２時間については３０分毎及びその後１時間毎に計測される。「正常な」又は非ＩＧＴ個体において、グルコース値ははじめの２時間の間１４０ｍｇ／ｄｌ未満の値まで上がり、そしてその後急速に落ちる。ＩＧＴ個体においては、上記血中グルコース値はより高く、そして降下値は遅い速度である。
【０１０３】
上記用語「インスリン抵抗性症候群」は、本明細書中で使用されるとき、高血圧及び成熟前アテローム性動脈硬化血管疾患の如き、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）の発展において重要な役割をはたす一連の事件を推進する、インスリン抵抗性を補償するための試みから生ずる異常性のクラスターを含むと意図される。増大した血漿トリグリセリド及び減少したＨＤＬ−コレステロール濃度、ＣＡＤに関連すると知られる状態もインスリン抵抗性に関連すると報告されている。したがって、インスリン抵抗性を減少させる又は予防する治療及び方法を提供することにより、本発明はインスリン抵抗性症候群の発現を減少させる及び／又は予防する方法を提供する。
【０１０４】
上記用語「多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）」は、本明細書中で使用されるとき、この集団の５〜１０％に影響する、高アンドロゲン症、慢性無排卵、インスリン活性における欠陥、インスリン分泌、卵巣ステロイド症及びフィブリン溶解により特徴付けられる、閉経前の女性の病因論的に割り当てられない障害を示すと意図される。ＰＣＯＳを有する女性はしばしばインスリン抵抗性であり、及び人生の三十代及び四十代にグルコース非耐性又はＮＩＤＤＭを発展する増大した危険性にある（Ｄｕｎａｉｆ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ８１：３２９９、その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する）。高アンドロゲン症も、これらの状態が閉経前の女性において起こるとき、Ａ型症候群から、妖精症及び脂肪組織萎縮性糖尿病をとおして、Ｂ型症候群までの、さまざまな多様のインスリン抵抗性状態の特徴である。高インスリン血症はそれ自体、高アンドロゲン症を引き起こすことが示されている。インスリン増感剤、例えば、トログリタゾンはインスリン抵抗性のヒトにおけるように、ＰＣＯＳにおいて有効であり、そして特に、インスリン活性における欠陥、インスリン分泌、卵巣ステロイド症及びフィブリン溶解が改善されることが知られている（Ｅｈｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １００：１２３０、その開示をそれらを全体として本明細書中に援用する）。
【０１０５】
上記用語「インスリン抵抗性」は、本明細書中で使用されるとき、静脈内グルコース耐性試験又は絶食時インスリン値の計測の如き、いくつかの方法のいずれかによりなされる、通常のインスリン抵抗性の診断を含むと意図される。絶食時インスリン値の高さ及びインスリン抵抗性の程度の間に優れた相関性があることがよく知られる。それゆえ、どの正常グルコース耐性（ＮＧＴ）個体がインスリン抵抗性を有するかを同定する目的のために、上昇した絶食時インスリン値をインスリン抵抗性についての代理のマーカーとして使用することができる。これを行うための他の方法はＴｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｃｉｎｅ， Ｎｏ．３，ｐｐ． １１８８（１９９５）（その開示をそれらを全体として本明細書中に援用する）中に開示されるアプローチにしたがうこと、すなわち、処置群への加入についての開始基準として肥満患者を選択することである。何人かの肥満患者は損なわれたグルコース耐性（ＩＧＴ）を有し、一方、他の者は正常なグルコース耐性（ＮＧＴ）を有する。主に全ての肥満患者はインスリン抵抗性である、すなわち、ＮＧＴ肥満患者でさえインスリン抵抗性であり、及び絶食時高インスリン血症を有する。それゆえ、本発明にしたがう治療の標的は肥満である又は絶食時高インスリン血症を有する又は両方を有するＮＧＴ個体として定義されうる。
【０１０６】
インスリン抵抗性の診断はまた正常血糖グルコースクランプ試験を用いてもなされうる。この試験は一定のインスリン融合及びさまざまな速度のグルコース融合の同時の投与を含む。３〜４時間続く上記試験の間、上記血漿グルコース濃度はグルコース値を５〜１０分毎に計測し、そしてその後血漿グルコース値を変化させないように保つためにさまざまな速度のグルコース融合を調節することにより正常血糖値に一定に保たれる。これらの状況下で、血流へのグルコース加入の速度は体内のグルコース処理の全体の速度と等しい。基礎状態（インスリン融合なし）及びインスリン融合状態におけるグルコース処理の速度間の差はインスリン仲介グルコース取り込みを示す。正常な個体において、インスリンは体全体のグルコース処理において鋭い及び大きな増大を引き起こすが、ＮＩＤＤＭ患者においては、インスリンのこの効果は非常に鈍く、そして正常の２０〜３０％しかない。ＩＧＴ又はＮＧＴを有するインスリン抵抗性患者において、インスリン刺激されたグルコース処理の速度は正常及びＮＩＤＤＭの間のおよそ真ん中である。例えば、約１００μＵ／ｍｌ（生理学的値）の定常血漿インスリン濃度で、正常な患者におけるグルコース処理速度は約７ｍｇ／ｋｇ／分である。ＮＩＤＤＭ患者においては、それは約２．５ｍｇ／ｋｇ／分であり、及びＩＧＴを有する患者（又はＮＧＴを有するインスリン抵抗性患者）においては、それは約４〜５ｍｇ／ｋｇ／分である。このことは高く再現可能であり、そして正確な試験はこれらのカテゴリー内で患者を区別しうる。患者がよりインスリン抵抗性になればなるほど、絶食時インスリン値が上がることも知られる。正常血糖グルコースクランプ試験により計測したとき、絶食時インスリン値の高さ及びインスリン抵抗性の大きさの間に優れた正の相関があり、そしてそれゆえ、このことはインスリン抵抗性の代理の計測として絶食時インスリン値を用いることについての根本理由を提供する。
【０１０７】
上記用語「肝臓及び末梢組織間で食物脂質の分割について作用する剤」は以前に示されるように肝臓及び末梢組織の間で食物脂質の分割を調節する本発明に係る化合物又はポリペプチドをいう。好ましくは、上記剤は筋肉による食物脂質、好ましくは、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の酸化を増大させる又は減少させる。好ましくは、上記剤は個体の体重を減少させる若しくは増大させる又は肥満、損なわれたグルコース耐性、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、アテロームの疾患、心疾患、高血圧、卒中、シンドロームＸ、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ又はＩＩ型糖尿病）及びインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ又はＩ型糖尿病）の如き、肥満関連疾患又は障害を治療する又は予防するために使用される。本発明に係る方法により処置されるべき糖尿病関連合併症は細小血管病変、眼の病変、網膜症、神経障害、及び腎臓病変を含む。心疾患は、非限定的に、心不全、冠状動脈不全、及び高血圧を含む。本発明に係る化合物により処置されるべき他の肥満関連障害は高脂血症及び尿酸過剰血症を含む。本発明に係るさらに他の肥満関連疾患又は障害は悪液質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少、食欲不振、及び過食症を含む。
【０１０８】
上記用語「肝臓及び末梢組織の間で食物脂質の分割について作用する剤への応答」は、非限定的に、個体における、化合物を代謝する能力、プロドラッグを活性薬に変換する能力、並びに薬物の薬物動態（吸収、分布、排出）及び薬力学（受容体関連）を含む、薬物効果をいう。
【０１０９】
上記用語「肝臓及び末梢組織の間の食物脂質の分割について作用する剤への副作用」は上記薬物の第一の薬理学的活性の延長から生ずる治療の悪い効果を又は上記薬物の独特の宿主因子との相互作用から生ずる特異的な悪い反応をいう。「肝臓及び末梢組織の間の食物脂質の分割について作用する剤への副作用」は、非限定的に、皮膚科の、血液学の又は肝臓学の毒性の如き悪い反応を含むことができ、そしてさらに胃腸の及び小腸の潰瘍、血小板機能における妨害、腎臓損傷、腎炎、おびただしい水っぽい分泌物を伴う血管運動神経性鼻炎、血管運動神経性水腫、一般的なじんま疹、及び喉頭の水腫及び気管支収縮への気管支喘息、低血圧、及び卒中を含む。
【０１１０】
上記用語「ＧＭＧ−２関連疾患及び障害」は、本明細書中で使用されるとき、ＧＭＧ−２の異常な機能を含む又はＧＭＧ−２値若しくは活性の調節により治療され若しくは予防されうる疾患又は障害をいう。「ＧＭＧ−２の異常な機能」は、非限定的に、ＧＭＧ−２の異常な発現値（増大した又は減少した、しかし好ましくは減少した）、ＧＭＧ−２の異常な活性（増大した又は減少した）、及びリガンド又は結合相手との異常な相互作用（増大した又は減少した）を含む。「異常」により、正常な細胞、組織若しくは患者において見られる又は上記病気の開始の前に細胞、組織若しくは患者において以前に見られた型又は活性の値からの変化が意味される。好ましい態様においては、これらのＧＭＧ−２関連疾患及び障害は肥満及び以前に示した肥満関連疾患及び障害を含む。
【０１１１】
上記用語「美容処置」は、上記個体が臨床的に肥満又は臨床的にやせではない場合に個体のボディマスを増大させる又は減少させる本発明に係る化合物又はポリペプチドでの処置を含むと意味される。したがって、これらの個体は臨床的な肥満の境界より低い（例えば、２５ｋｇ／ｍ2未満の）及び臨床的なやせの境界より高い（例えば、１８．５ｋｇ／ｍ2超の）ボディマスインデックス（ＢＭＩ）を有する。さらに、これらの個体は好ましくは健康である（例えば、本発明の肥満関連疾患又は障害を有しない）。「美容処置」はまた、いくつかの状況において、脂肪組織における、より位置づけられた増大、例えば、特に、例えば、ウエスト若しくは尻の周り又は尻及び腿の周りの増加又は減少を含むとも意味される。これらの脂肪組織の位置づけられた増加又は減少は例えば、ウエスト又は尻の大きさにおける増大又は減少により同定されうる。
【０１１２】
上記用語「予防する」は、本明細書中で使用されるとき、肥満又はＧＭＧ−２に関連した異常の身体の現れを予防するために疾患又は状態の臨床的な症状の開始前に化合物を投与することをいう。あるいは、上記用語「予防する」は疾患又は状態に関連した臨床的な症状の重篤さの減少を示すために使用されうる。
【０１１３】
上記用語「治療する」は、本明細書中で使用されるとき、臨床的症状の開始後に化合物を投与することをいう。
【０１１４】
上記用語「処置の必要のある」は、本明細書中で使用されるとき、個体又は動物が処置を必要とする又は処置から恩恵を得るであろうという、処置する者（例えば、ヒトの場合は、医師、看護士、看護従業者等；非ヒト哺乳類を含む、動物の場合は獣医学者）によりなされる判断をいう。この判断は、処置する者の経験の範囲内であるが、上記個体又は動物が本発明に係る化合物により治療されうる状態の結果として、病気である又は病気になるであろうという知識を含む、さまざまな因子に基づいてなされる。
【０１１５】
上記用語「処置についての必要性を認める」は、個体が上記「美容処置」の下で議論されるように美容理由のために体重減少を所望するというサブ臨床的な決定をいう。他の態様における上記用語「処置についての必要性を認める」は動物の所有者が上記動物の美容処置のためになすという決定をいいうる。
【０１１６】
上記用語「個体」又は「患者」は、本明細書中で使用されるとき、哺乳類、好ましくはマウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ又は霊長類、及び好ましくはヒトを含む動物をいう。上記用語は男性若しくは女性又は両方を特定し、あるいは男性若しくは女性を排除しうる。
【０１１７】
上記用語「非ヒト動物」は鳥類及びより通常には哺乳類、好ましくは霊長類、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ又はげっ歯類、より好ましくはラット又はマウスの如き動物を含む、非ヒト脊椎動物をいう。上記用語「動物」及び「哺乳類」は上記用語「非ヒト」と先に付かない限りはヒト患者を表現的に含む。
【０１１８】
本発明者はｇＧＭＧ−２と呼ばれる、ＧＭＧ−２の断片が高脂肪／スクロース食を摂食したマウスにおいて血漿遊離脂肪酸、グルコース、及びトリグリセリドの食後応答を顕著に減少させることができることを見つけた。レプチン、インスリン又はグルカゴンの値には顕著な効果はなかった。さらに、ｇＧＭＧ−２はｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏでの筋肉の遊離脂肪酸酸化を増大させることを見つけた。さらに、ｇＧＭＧ−２は１９日間高脂肪／スクロース食を摂食したマウスにおいて体重増加を減少させ、そしてその後増大を妨げることが示された。同じ高脂肪／スクロース食で６ヶ月間維持したマウスにおいて、ｇＧＭＧ−２処置は高脂肪／スクロース食で維持したにも関わらず、顕著に１６日間にわたる維持された体重減少をもたらした。
【０１１９】
本発明は遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の分割における及びエネルギーホメオスタシスの制御のための重要な新規ツールとしてＧＭＧ−２ポリペプチド断片の使用を含む。循環から顕著に脂質を除去し、そしてＦＦＡ酸化を引き起こしうる組織の筋肉は定量的に最も重要である。球状ＧＭＧ−２は食物摂取を妨害することなく体重を制御する独特な及び新規な薬理学的ツールである。
【０１２０】
本発明の好ましい態様
Ｉ． 本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片
ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで計測可能な活性を有するＧＭＧ−２ポリペプチド断片が同定された。これらの活性は、非限定的に、高脂肪／スクロース食を摂食したマウスにおける血漿遊離脂肪酸、グルコース、及びトリグリセリドの食後応答の減少（実施例８又は１１）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの筋肉遊離脂肪酸酸化における増大（実施例１０）、及び高脂肪／スクロース食のマウスにおける維持された体重減少（実施例２）を含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性についての他の分析はまた実施例をとおしても提供され、そして同等の分析は当業者により設計されうる。
【０１２１】
対照的に、上記「無傷の」又は「全長の」ＧＭＧ−２ポリペプチドは本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片について同定されたｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ活性のいずれも有しない。ほとんどの場合、上記活性は存在しない又は最小値であり、使用される分析においてコントロール値にわたり検出できない。他の場合には、上記活性は計測されうるが、非常に減少された値で存在する及び／又は本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片と比較して１モーラー基準で非常により多くのタンパク質を必要とする（例えば、実施例１０を参照のこと）。本明細書中で使用されるとき、「無傷の」又は「全長の」ＧＭＧ−２ポリペプチドにより、Ｎ−末端メチオニンからＣ−末端停止コドンまでの、ＧＭＧ−２ポリペプチドの全長ポリペプチド配列が意味される。無傷の又は全長のＧＭＧ−２ポリペプチドの例は配列ＩＤ番号：２、４及び６において見られる。上記用語「ＧＭＧ−２ポリペプチド断片」は、本明細書中で使用されるとき「肥満関連活性」又は「インスリン様活性」を有する「無傷の」又は「全長の」ＧＭＧ−２ポリペプチドの断片をいう。上記用語「ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片」は球状ドメインから成るポリペプチド断片をいい、そしてしたがって「ＧＭＧ−２ポリペプチド断片」よりも狭い言葉である。上記用語「断片」は無傷の又は全長のＧＭＧ−２ポリペプチドの部分と全く同じであるが、全部ではない配列を有するポリペプチドを意味する。上記断片は「遊離状態」（すなわち、他のポリペプチドの部分ではない又はそれに融合されていない）で存在しうる又は１以上の断片は単一のポリペプチド内に存在しうる。ｇＧＭＧ−２断片は、別段の定めなき限り、全長ＧＭＧ−２ポリペプチドの連続的な断片である。
【０１２２】
上記用語「肥満関連活性」は、本明細書中で使用されるとき、少なくとも１の、及び好ましくは全ての本明細書中で示されるＧＭＧ−２ポリペプチド断片についての活性をいう。これらの活性の決定についての分析は本明細書中に提供され（例えば、実施例４〜１６）、そして同等の分析は当業者により設計されうる。場合により、「肥満関連活性」は脂質分割、脂質代謝、及びインスリン様活性又はこれらのカテゴリーの１のうちの活性から成る群から選ばれうる。「脂質分割」活性により脂肪組織、肝臓、及び筋肉を含む、主要な組織群間での食物脂質の配置に影響する能力が意味される。本発明者は、本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片は筋肉、肝臓又は脂肪組織への脂質分割において役割をはたすことを示した。「脂質代謝」活性により脂質の代謝に影響する能力が意味される。本発明者は、本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片は遊離脂肪酸酸化実験をとおして筋肉において脂質の代謝を増大させる能力並びに血漿及び筋肉においてトリグリセリドの値に一過的に影響する能力に加えて、血漿において遊離脂肪酸の値に影響する能力を有することを示した。「インスリン様」活性により血漿におけるグルコース値を調節するＧＭＧ−２ポリペプチド断片の能力が意味される。本発明者は、ＧＭＧ−２ポリペプチド断片はインスリン値に顕著に影響しないが、インスリンの効果と同様にグルコース値に強く影響することを見つけた。これらの効果はｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体の複合体の存在下では見られない又はｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体の複合体と比較して非複合体ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片三量体の存在下で顕著に大きい。
【０１２３】
上記用語「顕著に大きい」は、本明細書中で使用されるとき、同じ分析におけるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体の複合体の活性と比較した、肥満関連分析における非複合体化ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体の活性の比較をいう。本明細書中で使用されるとき、「顕著に」により、当業者により典型的に決定されるように、統計的に顕著であることが意味される。例えば、データは典型的に平均±ＳＥＭとして計算される、及びｐ値＜０．０５は統計的に顕著であると考えられる。統計的分析はそれぞれの研究において適切なように、典型的にｔｈｅ ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ又はｔｈｅ ｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔのいずれかを用いてなされる。全長ＧＭＧ−２ポリペプチドの存在と比較した、本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片の存在の結果としての活性における顕著な変化の例は少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％のあるパラメーターにおける増大又は減少を含む。１以上の、しかし全てである必要はないが、計測可能なパラメーターは無傷のＧＭＧ−２ポリペプチドの存在下と比較して、ＧＭＧ−２ポリペプチド断片の存在下で顕著に変化するであろう。
【０１２４】
代表的な「肥満関連分析」は実施例において提供される。これらの分析は、非限定的に、食後応答の計測方法、遊離脂肪酸酸化の計測方法、及び体重調節の計測方法を含む。好ましい態様においては、上記食後応答は非ヒト動物、好ましくはマウスにおいて計測される。好ましい態様においては、食物脂質、好ましくは遊離脂肪酸及び／又はトリグリセリドにおける変化が計測される。他の態様においては、非限定的に、グルコース、インスリン、及びレプチンの値を含む、他の生理学的パラメーターが計測される。他の好ましい態様においては、遊離脂肪酸酸化はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで細胞において、好ましくは非ヒト動物、好ましくはマウスの筋肉細胞又は組織において計測される。さらに他の好ましい態様においては、体重調節は高脂肪／スクロース食のヒト又は非ヒト動物、好ましくはげっ歯類（ラット又はマウス）、霊長類、イヌ、ネコ又はブタにおいて計測される。場合により、「肥満関連活性」は本明細書中で特異的に同定される他の活性を含む。一般的に、肥満及び代謝研究の分野に関連する「計測可能なパラメーター」は遊離脂肪酸値、遊離脂肪酸酸化、トリグリセリド値、グルコース値、インスリン値、レプチン値、食物摂取、体重、レプチン及びリポタンパク質結合、取り込み及び分解並びに脂肪分解刺激された受容体（ＬＳＲ）発現から成る群から選ばれうる。
【０１２５】
これらの肥満関連分析において、本発明に係る好ましいＧＭＧ−２ポリペプチド断片であるが、全長ＧＭＧ−２ポリペプチドではないものは、食後脂肪血、遊離脂肪酸値、トリグリセリド値、グルコース値、遊離脂肪酸酸化、及び体重から成る群から選ばれる少なくとも１の計測可能なパラメーターにおいて顕著な変化を引き起こしうる。あるいは、本発明に係る好ましいＧＭＧ−２ポリペプチド断片であるが、全長ＧＭＧ−２ポリペプチドではないものは、ＬＳＲ活性における増大、レプチン活性における増大及びリポタンパク質活性における増大から成る群から選ばれる少なくとも１の計測可能なパラメーターにおける顕著な変化を有しうる。「ＬＳＲ」活性により、レプチン及びリポタンパク質を結合し、取り込み、及び分解するその能力に加えて、細胞表面上の又は特定のコンフォメーションのＬＳＲの発現が意味される。「レプチン」活性により、血液脳関を介するその輸送、及び潜在的にはＬＳＲが仲介因子又は唯一の仲介因子である必要はないこれらの発現に加えて、ＬＳＲによるその結合、取り込み及び分解が意味される。同様に、「リポタンパク質」活性により、ＬＳＲが仲介因子又は唯一の仲介因子である必要はないこれらの発現に加えて、そのＬＳＲによる結合、取り込み及び分解が意味される。
【０１２６】
本発明は単離された、精製された又は組換えられたＧＭＧ−２ポリペプチドについてｉｎｔｅｒ ａｌｉａで示される。本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチドは美容処置として又は代謝関連疾患及び障害の治療若しくは予防のために体重を（ＧＭＧ−２ポリペプチドのアンタゴニストを用いて）減少させる又は増大させるために有用である。ＧＭＧ−２ポリペプチドはＧＭＧ−２ポリペプチド活性のアゴニスト又はアンタゴニストについてのスクリーニング分析において；ＧＭＧ−２断片のＮ−末端のヂペプチヂルペプチダーゼ切断、好ましくは配列ＩＤ番号：２ＧＭＧ−２ポリペプチド断片１４４〜２８８のＮ−末端ＳＰヂペプチドの切断又は配列ＩＤ番号：４のＧＭＧ−２ポリペプチド断片１３４〜２７８のＮ−末端ＳＰヂペプチドの切断又は配列ＩＤ番号：６のＧＭＧ−２ポリペプチド断片１１５〜２５９のＮ−末端ＳＰヂペプチドの切断又は配列ＩＤ番号：２のＧＭＧ−２断片１６２〜２８８のＮ−末端ＴＡヂペプチドの切断又は配列ＩＤ番号：２のＧＭＧ−２断片１５２〜２７８のＮ−末端ＴＡヂペプチドの切断又は配列ＩＤ番号：６のＧＭＧ−２断片１３３〜２５９のＮ−末端ＴＡヂペプチドの切断のアンタゴニストについてのスクリーニング分析において；ＧＭＧ−２ポリペプチド特異的抗体を生じるために；及び診断分析においてｉｎｔｅｒ ａｌｉａで有用である。美容処置のために又は代謝関連疾患、障害又は状態の処置又は予防のために使用されるとき、１以上のＧＭＧ−２ポリペプチド断片が患者に提供されうる。したがって、全長タンパク質のさまざまな断片がさまざまな処置計画における使用のために「カクテル」中に混合されうる。
【０１２７】
上記全長ＧＭＧ−２ポリペプチドは：
１．配列ＩＤ番号：２のアミノ酸１〜５６又は配列ＩＤ番号：４の１〜４６又は配列ＩＤ番号：６の１〜２７からのＮ−末端の推定されているシグナル配列；
２．配列ＩＤ番号：２のアミノ酸５７〜１０６又は配列ＩＤ番号：４の４７〜９６又は配列ＩＤ番号：６の２８〜７７からの独特の領域；
３．配列ＩＤ番号：２のアミノ酸１０７〜１４８又は配列ＩＤ番号：４の９７〜１３８又は配列ＩＤ番号：６の７８〜１１９からのコラーゲン様領域；及び
４．配列ＩＤ番号：２のアミノ酸１５５〜２８８又は配列ＩＤ番号：４の１４５〜２７８又は配列ＩＤ番号：６の１２６〜２５９からのＣ１ｑホモロジーの球状領域
を含む、少なくとも４の明らかな領域から成る。
【０１２８】
上記用語「コラーゲン残基」はアミノ酸三重グリシン、Ｘ、Ｙ、を意味する本分野における標準の様式で使用され、ここで、Ｘ及びＹはいかなるアミノ酸でもありうる。
【０１２９】
本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片は単離された形態で好ましく提供される、及び部分的に又は実質的に精製されうる。ＧＭＧ−２ポリペプチド断片の組換えて作出された変形はＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７（１）：３１〜４０）により示される１段階法により又は本明細書中に示される若しくは本分野において知られる方法により実質的に精製されうる。本分野の断片はまたタンパク質精製の本分野において知られる方法により本発明に係るポリペプチド断片に対して方向付けられた抗体を用いて天然の又は組換えられた源からも精製されうる。
【０１３０】
ＧＭＧ−２ポリペプチド断片の部分的な精製又は選択に関連する本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片の調製はまた特定して企図される。これらの粗い調製物は、おそらく少ない追加の精製段階を用いてはいるが、上記断片の完全な精製の前の、ＧＭＧ−２ポリペプチド断片を発現する細胞の濃度の結果であると構想される。ＧＭＧ−２ポリペプチド断片を発現する細胞はペレット中に存在し、それらは溶解される又は例えば、上記粗いポリペプチドは凍結乾燥される。
【０１３１】
ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は全長ＧＭＧ−２ポリペプチド未満の少なくとも６の連続的なアミノ酸から１アミノ酸の長さの整数でありうる。したがって、配列ＩＤ番号：２のポリペプチドについて、ＧＭＧ−２ポリペプチドは、例えば、６〜２８７の連続的なアミノ酸の整数でありうる。上記用語「整数」は、本明細書中で使用されるとき、その数学的な意味であり、及びしたがって、代表的な整数は、非限定的に：
【化１６】
【０１３２】
上記に示されるそれぞれのＧＭＧ−２ポリペプチド断片はそのＮ−末端及びＣ−末端位についてさらに特定されうる。例えば、配列ＩＤ番号：２のある無傷の及び連続的な全長ポリペプチド配列についての、配列ＩＤ番号：２の全長ポリペプチド未満の６の連続的なアミノ酸から１のアミノ酸までの断片が占有しうるＮ−末端及びＣ−末端位のそれぞれの組み合わせは本発明に含まれる。したがって、６の連続的なアミノ酸断片は、２４４の連続的なアミノ酸断片の
【化１７】
【０１３３】
２３８の連続的なアミノ酸断片は配列ＩＤ番号：２の１〜２３８、２〜２３９、３〜２４０、４〜２４１、５〜２４２、６〜２４３及び７〜２４４から成る群から選ばれる位置を占有しうる。同様に、配列ＩＤ番号：２の６アミノ酸〜２８４アミノ酸の大きさの全ての他の断片により占有される位置は本発明に含まれる、及びまた上記に挙げられる６、５０、１００又は２８４の連続的なアミノ酸の断片についての例に基づいて直ちに認識されうる、及びそれゆえ、本明細書を不必要に長くさせない目的のために単に個々に挙げられない。さらに、配列ＩＤ番号：４の６〜２１７の連続的なアミノ酸の断片により占有される位置は本発明に含まれる、及びまたこれらの２の例に基づいて直ちに認識されうる、及びそれゆえ、本明細書を不必要に長くさせない目的のために単に個々に挙げられない。好ましい態様においては、予想されない活性を有する、ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片、及び同じものをコードするポリヌクレオチドは配列ＩＤ番号：２の
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【０１３４】
本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はあるいは式「ｎ〜ｃ」（包括的な）により示されうる；ここで、「ｎ」は上記ポリペプチドの（配列リストにより定義される）Ｎ−末端のほとんどのアミノ酸位置に等しく、及び「ｃ」は（配列リストにより定義される）Ｃ−末端のほとんどのアミノ酸位置に等しい；及びさらにここで、「ｎ」が１〜本発明に係る全長ポリペプチド配列のアミノ酸数の整数から５をひいたものに等しい（配列ＩＤ番号：２について２８３及び配列ＩＤ番号：４について２７３及び配列ＩＤ番号：６について２５４）；及びここで、「ｃ」は６〜全長ポリペプチド配列のアミノ酸数の整数に等しい（配列ＩＤ番号：２について２８８及び配列ＩＤ番号：４について２７８及び配列ＩＤ番号：６について２５９）；及びここで「ｎ」は「ｃ」より少なくとも６小さい整数である。それゆえ、配列ＩＤ番号：２について、「ｎ」は
【化２３】
【化２４】
【０１３５】
これらの特定の態様、及び本明細書中に示される他のポリペプチド及びポリヌクレオチド断片の態様は「少なくとも」、「に等しい」、「以下の」、「未満の」、「少なくとも＿であるが＿未満の」又は「＿〜＿の」特定の大きさ又は特定のＮ−末端及び／又はＣ−末端位置として改変されうる。本発明のいかなる態様を示すために使用される全ての範囲も、特別に別段の定めなき限り、包括的であることが留意される。
【０１３６】
本発明はまたＮ−末端及びＣ−末端位置により特定される個々の断片の又は上記に示されるアミノ酸残基の大きさにより特定される断片の排除も提供する。さらに、Ｎ−末端及びＣ−末端位置により又は上記に示されるアミノ酸残基の大きさにより特定される断片の数は個々の種として排除されうる。さらに、Ｎ−末端及びＣ−末端位置により又は上記に示されるアミノ酸残基の大きさにより特定される断片の数は組み合わせでポリペプチド断片を作出しうる及び場合により非ＧＭＧ−２ポリペプチド配列をも含みうる。
【０１３７】
本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は、改変されたｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を含む、上記に示されるｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の変形、断片、アナログ及び誘導体を含む。
【０１３８】
上記球状Ｃ−末端Ｃ１ｑホモロジー領域の全部又は一部から成る及び予想されない脂質分割、脂質代謝、及びインスリン様活性を有する、本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片の適切な及び効果的な生成を促進する、ｉｎ ｖｉｖｏの本発明に係る全長ＧＭＧ−２ポリペプチドのタンパク質分解的切断は複雑な制御を受けやすいと考えられる。前記タンパク質分解的切断は代替のスプライシングをとおしてプロテアーゼ切断部位の選択的な提示により部分的に制御される。前記タンパク質分解的切断はさらに上記プロテアーゼの値で、例えば、上記プロテアーゼの組織分布の値で及び上記プロテアーゼの量の値で制御され、それ自体は炎症に関連するものの如き生理学的シグナルにより制御されうる。球状Ｃ−末端Ｃ１ｑホモロジー領域の全部又は一部から成る及び予想されない脂質分割、脂質代謝、及びインスリン様活性を有する、本発明に係る特に好ましいＧＭＧ−２ポリペプチド断片はｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質分解的に生成されると考えられる配列ＩＤ番号：２、４又は６の前記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片である。特に好ましいものは１４４位での配列ＩＤ番号：２のコラーゲナーゼ切断により作出される、配列ＩＤ番号：２の約アミノ酸１４４〜２８８のＧＭＧ−２断片である。特に好ましいものは１３４位での配列ＩＤ番号：２のコラーゲナーゼ切断により作出される配列ＩＤ番号：４の約アミノ酸１３４〜２７８のＧＭＧ−２断片である。特に好ましいものは１１５位での配列ＩＤ番号：６のコラーゲナーゼ切断により作出される、配列ＩＤ番号：６の約アミノ酸１１５〜２５９のＧＭＧ−２断片である。特に好ましいものは１１４位での配列ＩＤ番号：２のマトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）切断により作出される、配列ＩＤ番号：２の約アミノ酸１１４〜２８８のＧＭＧ−２断片である。特に好ましいものは１３４位での配列ＩＤ番号：４のマトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）切断により作出される、配列ＩＤ番号：４の約アミノ酸１３４〜２７８のＧＭＧ−２断片である。特に好ましいものは１１５位での配列ＩＤ番号：６のマトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）切断により作出される、配列ＩＤ番号：６の約アミノ酸１１５〜２５９のＧＭＧ−２断片である。特に好ましいものは１５２、１５３、１６１又は１６２位での配列ＩＤ番号：２のプラスミン切断により作出される、配列ＩＤ番号：２の約アミノ酸１５２〜２８８、１５３〜２８８、１６１〜２８８又は１６２〜２８８のＧＭＧ−２断片である。特に好ましいものは１４２、１４３、１５１又は１５２位での配列ＩＤ番号：４のプラスミン切断により作出される、配列ＩＤ番号：４の約アミノ酸１４２〜２７８、１４３〜２７８、１５１〜２７８又は１５２〜２７８のＧＭＧ−２断片である。特に好ましいものは１２３、１２４、１３２又は１３３位での配列ＩＤ番号：６のプラスミン切断により作出される、配列ＩＤ番号：６のアミノ酸１２３〜２５９、１２４〜２５９、１３２〜２５９又は１３３〜２５９のＧＭＧ−２断片である。
【０１３９】
本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチドは改変されたＧＭＧ−２ポリペプチドを含む、上記に示されるＧＭＧ−２ポリペプチドの変形、断片、アナログ及び誘導体を含む。
【０１４０】
変形
本発明に係るｇＧＭＧ−２断片配列のいくつかのアミノ酸は上記タンパク質の構造又は機能に顕著な影響を与えることなく変形されうること；活性を決定する断片配列中の重要なアミノ酸があるであろうことは当業者により認識されるであろう。したがって、本発明はさらに上記に示される肥満関連活性を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の変形含む。上記変形は活性にほとんど影響を与えないために、本分野において知られる一般規則にしたがって選択される天然の突然変異又は人の操作からの１以上のアミノ酸欠失、挿入、反転、繰り返し、及び置換を有するＧＭＧ−２断片配列を含む。表現形としてサイレントなアミノ酸置換を作出する方法についてのガイダンスは以下に提供される。
【０１４１】
アミノ酸配列の変化への耐性の研究については２の主なアプローチがある（Ｂｏｗｉｅ， ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１３０６〜１０を参照のこと）。第一の方法は、突然変異が自然選択により許容される又は拒絶される、進化のプロセスによる。第二のアプローチはクローニングした遺伝子の特定の位置にアミノ酸変化を導入する遺伝子工学又は機能的に維持される配列を同定するスクリーニングを用いる。
これらの研究は、タンパク質が驚くべきことにアミノ酸置換に耐性であることを明らかにし、そしてそのアミノ酸変化は上記タンパク質のある位置で許容されやすいことを示す。例えば、ほとんどの埋もれたアミノ酸残基は非極性側鎖を必要とし、その一方で表面側鎖の特徴は一般的にほとんど保存されていない。他の上記表現形としてサイレントな置換はＢｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．（ｓｕｐｒａ）及び本明細書中に引用される文献により示される。
【０１４２】
連続的な置換基として典型的に見られるものは脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＰｈｅの間の互いの置換；ヒドロキシル基Ｓｅｒ及びＴｈｒの交換；酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕの交換；アミド残基Ａｓｎ及びＧｌｎの間の置換；塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇの交換；及び芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。さらに、以下のアミノ酸群は一般的に同等の変化を示す：（１）Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；（２）Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；（３）Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；（４）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；（５）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ。
【０１４３】
同様に、機能に重要な本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片配列におけるアミノ酸は、位置特異的突然変異又はアラニンスキャニング突然変異の如き、本分野において知られる方法によっても同定されうる（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４（４９０８）：１０８１−５を参照のこと）。後者の手順は上記分子内の残基毎に単一のアラニン変異を導入する。生ずる変異分子はその後上記に示される分析を用いて肥満関連活性について試験される。特別興味深いのは、凝集が少ないことの如き、非常に所望される改良された特性を有するタンパク質を作出しうる、電荷を有するアミノ酸の他の電荷を有する又は中性アミノ酸での置換である。凝集は活性を減少させるのみでなく、凝集物は免疫原性でありうるため、医薬の又は生理学的に許容される調剤を調製するとき問題でありうる（例えば、Ｐｉｎｃｋａｒｄ， ｅｔ ａｌ．， （１９６７）Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：３３１−３４０；Ｒｏｂｂｉｎｓ， ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｊｕｌ；３６（７）：８３８−４１；及び Ｃｌｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， （１９９３）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ． １０（４）：３０７−７７を参照のこと）。
【０１４４】
したがって、本発明に係るｇＧＭＧ−２断片の断片、誘導体、アナログ又はホモログは、例えば、：（ｉ）１以上のアミノ酸残基が保存された又は保存されていないアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）で置換される及び上記置換アミノ酸残基は遺伝子コードによりコードされるものでありうる又はありえない（すなわち、非天然のアミノ酸でありうる）もの；又は（ｉｉ）１以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの；又は（ｉｉｉ）ｇＧＭＧ−２断片が、上記断片の半減期を増大させる化合物の如き他の化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合されるもの；又は（ｉｖ）追加のアミノ酸が、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチド又はリーダー若しくは分泌配列又は断片の上記形態の精製に使用される配列又はプロタンパク質配列の如き、断片の上記形態と融合されるものでありうる。上記断片、誘導体及びアナログは本明細書中の教示から当業者の範囲内にあると考えられる。
【０１４５】
本発明のさらなる態様は少なくとも１の保存されたアミノ酸置換であるが５０以下の保存されたアミノ酸置換、４０以下の保存されたアミノ酸置換、３０以下の保存されたアミノ酸置換、及び２０以下の保存されたアミノ酸置換を含む、アミノ酸配列を有するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。少なくとも１であるが、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１以下の保存されたアミノ酸置換を有するｇＧＭＧ−２断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドも提供される。
【０１４６】
本発明のさらなる態様は前記ポリペプチド断片のＮ−末端の改変をとおしてヂペプチヂルペプチダーゼ切断に耐性にされたＧＭＧ−２ポリペプチド断片に関する。好ましい態様においては、前記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸１４４〜２８８若しくは１６２〜２８８又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸１３４〜２７８若しくは１５２〜２７８又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸１１５〜２５９若しくは１３３〜２５９から選ばれる。好ましい態様においては、前記ヂペプチヂルペプチダーゼ切断は前記好ましい断片からのヂペプチヂルペプチダーゼによるＮ−末端ヂペプチドＳＰ又はＴＡの除去を引き起こす。他の好ましい態様においては、前記ヂペプチヂルペプチダーゼはヂペプチヂルペプチダーゼから成るヒト血漿である。他の好ましい態様においては、前記ヂペプチヂルペプチダーゼは、非限定的に、ヒトＣＤ２６及びヒトアトラクチンから選ばれる。さらに好ましい態様においては、前記ヂペプチヂルペプチダーゼは溶解性のヒトＣＤ２６又は溶解性のヒトアトラクチンから選ばれる。好ましい態様においては、前記Ｎ−末端の改変は、非限定的に、グリケーション［Ｈａｒｔｅ（２００１）Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ９６：９５−１０４、その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する］、Ｎ−メチル化、アルファ−メチル化、デスアミデーション［Ｇａｌｌｗｉｔｚ（２０００）Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ８６：１０３−１１１、その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する］又は１以上のＮ−末端アミノ酸のキラリティーの変化［Ｓｉｅｇｅｌ（１９９９）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ２９：６１０−６１４、その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する］から選ばれる。したがって、本発明は前記ポリペプチド断片のＮ−末端の改変をとおしてヂペプチヂルペプチダーゼ切断に耐性にされたＧＭＧ−２ポリペプチド断片又はその変形をも含む。
【０１４７】
本発明に係る改変されたｇＧＭＧ−２断片の他の特定の態様はタンパク質分解に耐性のポリペプチド、例えば、−ＣＯＮＨ−ペプチド結合が１以上の以下の（ＣＨ２ＮＨ）還元結合；（ＮＨＣＯ）レトロ逆結合；（ＣＨ２−Ｏ）メチレン−オキシ結合；（ＣＨ２−Ｓ）チオメチレン結合；（ＣＨ２ＣＨ２）カルバ結合；（ＣＯ−ＣＨ２）セトメチレン結合：（ＣＨＯＨ−ＣＨ２）ヒドロキシエチレン結合；（Ｎ−Ｎ）結合；Ｅ−アルセン結合；又は−ＣＨ＝ＣＨ−結合により改変された及び置換された、ｇＧＭＧ−２断片である。したがって、本発明は少なくとも１のペプチド結合が上記に示されるように改変されたｇＧＭＧ−２断片又はその変形をも含む。
【０１４８】
さらに、アミノ酸はＬ又はＤ体のキラリティーを有する。いくつかの態様においては、体内での半減期を延ばすために本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片においてアミノ酸のキラリティーを変えることが好ましい。したがって、いくつかの態様においては、１以上のアミノ酸は好ましくはＬ配置で存在する。他の態様においては、１以上のアミノ酸は好ましくはＤ配置で存在する。
【０１４９】
パーセント同一性
本発明に係るポリペプチドは上記に示したｇＧＭＧ−２断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをも含む。ｇＧＭＧ−２断片アミノ酸配列と少なくとも、例えば、９５％「同一の」アミノ酸配列を有するポリペプチドにより、上記アミノ酸配列が上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片アミノ酸配列の１００アミノ酸当たり５までのアミノ酸変化を含みうることを除いては、ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片配列と同一であることが意味される。上記引用配列は上記配列リストの配列に対応する配列を有する上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片である。したがって、ｇＧＭＧ−２断片アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、上記配列中の５％（１００のうちの５）までのアミノ酸残基が挿入され、欠失され又は上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片配列と比較して他のアミノ酸で置換されうる。これらの変化はアミノ若しくはカルボキシ末端又は上記配列内又は上記配列内の１以上の連続的な基の中の残基間に個々に散在するそれらの末端位間のどこでも起こりうる。
【０１５０】
実質的な問題として、特定のポリペプチドがｇＧＭＧ−２断片にパーセント同一であるか否かは既知のコンピュータプログラムを用いて慣用的に決定されうる。上記アルゴリズム及びプログラムは、非限定的に、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、及びＣＬＵＳＴＡＬＷを含む（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５（８）：２４４４−８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５（３）：４０３−４１０；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２（２）：４６７３−４６８０；Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２６６：３８３−４０２；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：３３８９−３４０２；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６−２７２）。特に好ましい態様においては、タンパク質及び核酸配列ホモロジーはＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（“ＢＬＡＳＴ”）を用いて評価され、それは本分野において周知である（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７（６）：２２６４−８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０， １９９３， １９９７， ａｌｌ ｓｕｐｒａを参照のこと）。特に、５の特定のＢＬＡＳＴプログラムは以下のタスクを行うために使用される：
【０１５１】
（１）ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴ３はタンパク質配列データベースに対してアミノ酸クエリー配列を比較する；
（２）ＢＬＡＳＴＮはヌクレオチド配列データベースに対してヌクレオチドクエリー配列を比較する；
（３）ＢＬＡＳＴＸはタンパク質配列データベースに対してクエリーヌクレオチド配列（両方の鎖）の６フレームの概念上の翻訳産物を比較する；
（４）ＴＢＬＡＳＴＮは全ての６のリーディングフレーム（両方の鎖）において翻訳されるヌクレオチド配列データベースに対してクエリータンパク質配列を比較する；及び
（５）ＴＢＬＡＳＴＸはヌクレオチド配列データベースの６フレーム翻訳物に対してヌクレオチドクエリー配列の６フレーム翻訳物を比較する。
【０１５２】
上記ＢＬＡＳＴプログラムは、クエリーアミノ又は核酸配列及び好ましくはタンパク質又は核酸配列データベースから得られる試験配列の間で、本明細書中で「ハイスコアリング セグメントペア」と呼ぶ、類似のセグメントを同定することにより相同的配列を同定する。ハイスコアリング セグメントペアは、その多くが本分野において知られるスコアリングマトリックスの方法により好ましく同定される（すなわち、並べられる）。好ましくは、使用されるスコアリングマトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである（Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６（５０６２）：１４４３−５；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １７（１）：４９−６１を参照のこと）。より好ましくないが、ＰＡＭ又はＰＡＭ２５０マトリックスも使用されうる（例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ， ｅｄｓ， （１９７８）Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｄｉｓｔａｎｃｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ： Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ： Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照のこと）。上記ＢＬＡＳＴプログラムは同定された全てのハイスコアリング セグメントペアの統計的な顕著性を評価し、そして好ましくはユーザーが特定したパーセントホモロジーの如き、ユーザーが特定した顕著性の閾値を満足するセグメントを選択する。好ましくは、ハイスコアリング セグメントペアの統計的な顕著性はＫａｒｌｉｎの統計的な顕著性の式を用いて評価される（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７（６）：２２６４−８を参照のこと）。上記ＢＬＡＳＴプログラムはデフォルトパラメーターで又はユーザーにより提供される改変されたパラメーターで使用されうる。好ましくは、上記パラメーターはデフォルトパラメーターである。
【０１５３】
全体的な配列整合とも言われる、クエリー配列（本発明に係る配列）及び問題の配列の間の最もよい全体的な適合を決定するための好ましい方法はＢｒｕｔｌａｇ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｏｍｐ． Ａｐｐ． Ｂｉｏｓｃｉ． ６：２３７−２４５のアルゴリズムに基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定されうる。配列整合において上記クエリー及び問題の配列は両方アミノ酸配列である。前記全体的な配列整合の結果はパーセント同一性である。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整合において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ＝２５、Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝配列の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝２４７又は問題のアミノ酸配列の長さのいずれか短い方である。
【０１５４】
上記問題の配列が内部の欠失のためでなく、Ｎ−又はＣ−末端欠失のためにクエリー配列よりも短い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムは全体的なパーセント同一性を計算するとき上記問題の配列のＮ−及びＣ−末端切断を考慮しないので、パーセント同一性での上記の結果を手で補正しなければならない。クエリー配列に比較して、Ｎ−及びＣ−末端で切断された問題の配列については、上記パーセント同一性は問題の配列のＮ−及びＣ−末端である、対応する問題の残基と適合／整合しないクエリー配列の残基の数を、上記クエリー配列の総塩基のパーセントとして、計算することにより補正される。残基が適合／整合するか否かはＦＡＳＴＤＢ配列整合の結果により決定される。このパーセントはその後特定のパラメーターを用いて上記ＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算された、パーセント同一性から引かれ、最終的なパーセント同一性スコアに到達する。この最終的なパーセント同一性スコアは本発明の目的のために使用されるものである。上記クエリー配列と適合／整合しない上記問題の配列のＮ−及びＣ−末端の残基のみがパーセント同一性スコアを手で調節する目的のために考慮される。すなわち、上記問題の配列の最も遠いＮ−及びＣ−末端残基の外のクエリーアミノ酸残基のみ。
【０１５５】
例えば、９０アミノ酸残基の問題の配列がパーセント同一性を決定するために１００残基のクエリー配列と整合される。欠失が問題の配列のＮ−末端で起こる、及びそのため、上記ＦＡＳＴＤＢ整合はＮ−末端のはじめの残基と適合／整合しない。１０の対にならない残基は配列の１０％（適合しないＮ−及びＣ−末端の残基の数／クエリー配列における残基の総数）を示すので、１０％はＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されるパーセント同一性スコアから引かれる。残りの９０残基が完全に適合する場合、最終的なパーセント同一性は９０％であろう。
【０１５６】
他の例においては、９０残基の問題の配列が１００残基のクエリー配列と比較される。今度は、欠失は内部であるので、上記クエリー配列と適合／整合しない問題の配列のＮ−又はＣ−末端の残基はない。この場合には、ＦＡＳＴＤＢにより計算されるパーセント同一性は手動で補正されない。再び、上記クエリー配列と適合／整合しない、ＦＡＳＴＤＢ整合において示される、上記問題の配列のＮ−及びＣ−末端の外の残基位置のみが手動で補正される。他の手動の補正は本発明の目的のためになされない。
【０１５７】
産生
本開示をとおして、ＧＭＧ−２ポリペプチド断片が議論されるときはいつでも、ｇＧＭＧ−２断片がＧＭＧ−２ポリペプチド断片の好ましいサブセットとして含まれることが特別に意図されることに注意すべきである。
【０１５８】
ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は好ましくはヒト又は哺乳類の組織サンプルから単離される又はヒト又は哺乳類の細胞内のヒト又は哺乳類の遺伝子から発現される。本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片は本分野において知られる日常の発現方法を用いて作出されうる。所望のポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドは便利な宿主について好適な発現ベクター中へライゲーションされる。真核細胞及び原核細胞宿主系の両方が組換えポリペプチド断片の形成において使用される。上記ポリペプチド断片はその後溶解した細胞から又は培養培地から単離され、そしてその意図される使用に必要とされる程度まで精製される。精製は本分野において知られる技術、例えば、ディファレンシャル抽出、塩画分化、クロマトグラフィー、遠心分離等による。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓを参照のこと。また、ＧＭＧ−２ポリペプチド断片について以前に使用される方法についての実施例１〜３を参照のこと。
【０１５９】
代替の態様においては、本発明に係るポリペプチドは乳から単離される。上記ポリペプチドは全長ＧＭＧ−２ポリペプチドとして精製されることができ、それはその後、適切な場合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで切断されてＧＭＧ−２断片を作出する、又は、あるいは、ＧＭＧ−２断片それ自体が上記乳から精製されうる。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｎｅｗ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓｉｍｏｎ Ｒｏｅ，ＡＥＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈａｒｗｅｌｌ； Ｃｌａｒｋ（１９９８）Ｊ Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ３：３３７−５０；Ｗｉｌｋｉｎｓ ａｎｄ Ｖｅｌａｎｄｅｒ（１９９２）４９：３３３−８；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ６，１４０，５５２；６，０２５，５４０；Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｖｏｌ．１，ｐｐ．３−８（１９９０）；Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ７：３１−７；Ｄｅｇｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ ７９９：１２５−３７；Ｗｉｌｋｉｎｓ（１９９３）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｕｐｐｌ．０（１７ ｐａｒｔ Ａ）：３９において教示されるものを含む、多くの方法のいずれも乳からの本ポリペプチドを精製するために使用されることができる；そのそれぞれの全開示を本明細書中に援用する。典型的な態様においては、乳は脂質画分を分離するために例えば、比較的遅いスピードで遠心分離される、及び上記水性上清はその後残る「ホエー」画分から乳中のカゼインを分離するためにより速いスピードで遠心分離される。しばしば、生物医薬タンパク質がこのホエー画分中に見られ、及び標準のクロマトグラフィーの又は例えば、本明細書中のどこかに示されるタンパク質精製に通常使用される他の手順を用いてこの画分から単離されうる。１の好ましい態様においては、ＧＭＧ−２ポリペプチドはＧＭＧ−２ポリペプチドに特異的な抗体を用いて、例えば、アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製される。さらに、方法、例えば、電気泳動又は特定の大きさのタンパク質を単離するための他の方法は特定のＧＭＧ−２断片を単離するために使用されうる。ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は哺乳類の乳中に天然に存在することが発見されている（例えば、実施例１８を参照のこと）ので、これらの方法を用いて単離されるＧＭＧ−２ポリペプチドは天然でありうる又は以下に示すように、非ヒト哺乳類の乳腺におけるタンパク質の組換えの産生の結果でありうる。１の上記態様において、上記ＧＭＧ−２断片は異種の、抗原性ポリペプチド配列を有する融合タンパク質として産生され、その抗原性配列は、例えば、標準の免疫アフィニティー法を用いて、上記タンパク質を精製するために使用されうる。
【０１６０】
さらに、より短いタンパク質断片は化学合成により作出されうる。あるいは、本発明に係るタンパク質はヒト又は非ヒト動物の細胞又は組織から抽出される。タンパク質を精製する方法は本分野において知られ、そして粒子を破壊するための界面活性剤又はカオトロピック剤の使用、続いてディファレンシャル抽出並びにイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、濃度にしたがった沈降分離、及びゲル電気泳動による上記ポリペプチドの分離を含む。
【０１６１】
いかなるＧＭＧ−２断片ｃＤＮＡもＧＭＧ−２ポリペプチド断片を発現するために使用されうる。発現されるべきＧＭＧ−２断片をコードする核酸は慣用のクローニング技術を用いて発現ベクター中のプロモーターに実施可能に結合される。発現ベクター中のＧＭＧ−２断片ｃＤＮＡインサートは：（後に改変されるべき）全長ＧＭＧ−２ポリペプチド；全長ＧＭＧ−２ポリペプチドよりも６アミノ酸〜１アミノ酸少ないもの；ｇＧＭＧ−２断片；又は変形及び％類似のポリペプチドについてのコード配列を含みうる。
【０１６２】
上記発現ベクターは本分野において知られる哺乳類、酵母、昆虫又は菌の発現系のいずれでもあり、それらのうちのいくつかは本明細書中に示され、そしてその例は実施例（実施例１〜３）中に与えられる。商業的に入手可能なベクター及び発現系はＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を含むさまざまな供給者から入手可能である。所望の場合は、発現を高める及び適切なタンパク質折りたたみを促進するために、上記配列のコドンコンテクスト及びコドンペアリングは、その開示をそれらを全体として本明細書中に援用するＨａｔｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第５，０８２，７６７号により説明されるように、発現ベクターが導入される特定の発現生物について最適化されうる。
【０１６３】
ＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードする核酸が開始部位としてはたらくメチオニンを欠く場合、開始メチオニンは慣用の技術を用いて核酸のはじめのコドンの隣に導入されうる。同様に、上記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片ｃＤＮＡからの挿入物がポリＡシグナルを欠く場合、この配列は、例えば、ＢｇｌＩ及びＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ酵素を用いてｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのポリＡシグナルを切り出し、そしてそれを哺乳類の発現ベクターｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に導入することにより、上記構築物に加えられうる。ｐＸＴ１はモロニーマウス白血病ウイルスからのＬＴＲｓ及びギャグ遺伝子の一部を含む。上記構築物中のＬＴＲｓの一部は効果的で安定的なトランスフェクションを許す。上記ベクターは単純ヘルペスチミヂンキナーゼプロモーター及び選択可能なネオマイシン遺伝子を含む。
【０１６４】
ＧＭＧ−２断片をコードする核酸は、所望のＧＭＧ−２ｃＤＮＡに相補的な、及び５’プライマー中に導入されたＰｓｔＩ及び対応するｃＤＮＡ３’プライマーの５’末端でＢｇｌＩＩについての制限エンドヌクレアーゼ配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＧＭＧ−２ヌクレオチド配列を含むベクターから、上記ＧＭＧ−２断片をコードする配列がポリＡシグナルに関して適切に位置付けられることを確実にすることに留意しながら、ＰＣＲにより得られうる。生ずるＰＣＲ反応から得られた精製した断片はＰｓｔＩで消化され、エキソヌクレアーゼで平滑末端にされ、ＢｇｌＩＩで消化され、精製され、そしてｐＸＴ１にライゲーションされて、ポリＡシグナルを含むことになり、そしてＢｇｌＩＩで消化される。代替の方法は実施例１〜３中に示される。
【０１６５】
ＧＭＧ−２断片を発現するベクターのマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞へのトランスフェクションはポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する１の態様である。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの宿主細胞への導入はリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、陽イオン性脂質仲介トランスフェクション、エレクトロポーレーション、トランスダクション、感染又は他の方法により影響されうる。上記方法はＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）の如き、多くの標準の研究室マニュアル中に示される。本発明に係るポリペプチドは実際に組換えベクターを欠く宿主細胞により発現されうることが特に企図される。細胞内で本発明に係るＧＭＧ−２断片を発現させる方法は実施例１〜３中に示される。
【０１６６】
本発明に係るポリペプチド（すなわち、ｇＧＭＧ−２断片）は硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法により組換え細胞培養物から回復され及び精製されうる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（“ＨＰＬＣ”）が精製に使用される。本発明に係るポリペプチド、及び好ましくは上記分泌された形態も：直接単離され又は培養された、体液、組織及び細胞を含む、天然の源からの精製した産物；化学合成手順の産物；及び例えば、菌類、酵母、高等植物、昆虫、及び哺乳類細胞を含む原核細胞又は真核細胞宿主からの組換え技術により作出された産物から回復されうる。
【０１６７】
組換え産生手順において使用される宿主に因り、本発明に係るポリペプチドはグリコシル化されうる又は非グリコシル化されうる。好ましくは、本発明に係るポリペプチドを含むＧＭＧ−２球状ドメインは非グリコシル化される。さらに、本発明に係るポリペプチドは、いくつかの場合宿主仲介プロセスの結果として、開始の改変されたメチオニン残基をも含みうる。したがって、翻訳開始コドンによりコードされるＮ−末端メチオニンは一般的に全ての真核細胞において翻訳後にタンパク質から高い率で除去されることが本分野において周知である。ほとんどのタンパク質についてのＮ−末端メチオニンはほとんどの原核生物においても効果的に除去される一方で、いくつかのタンパク質については、この原核生物除去プロセスが上記Ｎ−末端メチオニンが共有結合的に結合しているアミノ酸の性質に因り、不十分である。
【０１６８】
本明細書中で議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加えて、本発明は、内因性の遺伝子材料（例えば、コード配列）を欠失させる又は置き換えるよう、及び／又は本発明に係るポリヌクレオチドに実施可能に関連し、そして内因性のポリヌクレオチドを活性化する、変化させる、及び／又は増幅させる遺伝子材料（例えば、異種のポリヌクレオチド配列）を含むよう作り変えた、脊椎動物起源、特に哺乳類起源の初代の、二代目の、及び不死化した宿主細胞をも含む。例えば、本分野において知られる技術は相同組換えを介して異種のコントロール領域（例えば、プロモーター及び／又はエンハンサー）及び内因性のポリヌクレオチド配列を実施可能に関連させるために使用されることができ、例えば、１９９７年６月２４日発行の米国特許第５，６４１，６７０号；１９９６年９月２６日公開の国際公開番号ＷＯ ９６／２９４１１；１９９４年８月４日公開の国際公開番号ＷＯ ９４／１２６５０；Ｋｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６（２２）：８９３２−５；Ｋｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６（２２）：８９２７−３１；及びＺｉｊｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２（６２４８）：４３５−８を参照のこと；そのそれぞれの開示はそれらを全体として本明細書中に援用する。
【０１６９】
改変
さらに、本発明に係るポリペプチドは本分野において知られる技術を用いて化学合成されうる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９９３ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ；ａｎｄ Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１０（５９７３）：１０５−１１を参照のこと）。例えば、本発明に係る比較的短い断片はペプチド合成機の使用により合成されうる。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸又は化学アミノ酸アナログが上記断片配列中に置換又は追加として導入されうる。非古典的アミノ酸は、非限定的に、通常のアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ヂアミノブチル酸、ａ−アミノイソブチル酸、４−アミノブチル酸、Ａｂｕ、２−アミノブチル酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサノン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソブチル酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグルシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、ｂ−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸の如きデザイナーアミノ酸、及び一般のアミノ酸アナログを含む。さらに、上記アミノ酸はＤ（右旋性）又はＬ（左旋性）でありうる。
【０１７０】
本発明は例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／防御基による誘導体化、タンパク質分解的切断、抗体分子又は他の細胞内リガンドへの結合等により翻訳中又は後に特異に改変されたポリペプチド断片を含む。多くの化学修飾のいずれも、非限定的に、臭化シアノーゲン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学的切断；アセチル化、フォルミル化、酸化、還元；タニカマイシンの存在下での代謝合成；等を含む既知の技術により行われうる。
【０１７１】
本発明に含まれる追加の翻訳後修飾は、例えば、Ｎ−結合又はＯ−結合炭水化物鎖、Ｎ−末端又はＣ−末端のプロセッシング、アミノ酸骨格への化学基の結合、Ｎ−結合又はＯ−結合炭水化物鎖の化学修飾、及び原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ−末端メチオニン残基の追加又は欠失を含む。上記ポリペプチド断片は、上記ポリペプチドの検出及び単離を許すための酵素的な、蛍光の、同位体の又はアフィニティーの標識の如き、検出可能な標識と共にも改変されうる。
【０１７２】
また本発明により、上記ポリペプチドの増大した溶解性、安定性及び循環時間又は減少した免疫原性の如き、追加の利点を提供しうる本発明に係るポリペプチドの化学修飾された誘導体が提供される。米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと。誘導体化のための化学基はポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリヴィニルアルコール等の如き、水溶解性ポリマーから選ばれうる。上記ポリペプチドは上記分子内でランダムな位置で又は上記分子内で前決定された位置で改変されることができ、そして１、２、３又はそれ以上の結合した化学基を含みうる。
【０１７３】
上記ポリマーはいかなる分子量からもなることができ、そして枝分かれしうる又は枝分かれしない。ポリエチレングリコールについて、好ましい分子量は取り扱い及び製造の容易さのために、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａである（上記用語「約」はポリエチレングリコールの調製物において、いくつかの分子は示した分子量より重く、いくつかはより軽いであろうということを示す）。他の大きさは、所望の治療プロファイル（例えば、所望される維持された放出の長さ、ある場合は生物学的活性への効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度又は欠如及び上記ポリエチレングリコールの治療タンパク質又はアナログへの他の既知の効果）に因り使用されうる。
【０１７４】
上記ポリエチレングリコール分子（又は他の化学基）は上記ポリペプチドの機能的な又は抗原性のドメインへの効果を考慮して上記ポリペプチドに結合されるべきである。当業者に入手可能ないくつかの結合方法がある、例えば、本明細書中に援用するＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦへのＰＥＧのカップリング）、また塩化トレシルを用いたＧＭ−ＣＳＦのペジレーションを報告するＭａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０（８）：１０２８−３５を参照のこと。例えば、ポリエチレングリコールは遊離アミノ又はカルボキシル基の如き、反応基を介してアミノ酸残基をとおして共有結合されうる。反応基は活性化されたポリエチレングリコール分子が結合されうるものである。遊離アミノ酸を有するアミノ酸残基はリジン残基及びＮ−末端アミノ酸残基を含みうる；遊離カルボキシル基を有するものはアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基及びＣ−末端アミノ酸残基を含みうる。サルフヒドリル基もポリエチレングリコール分子の結合のために反応基として使用されうる。治療目的のために好ましいものはＮ−末端又はリジン基での結合の如き、アミノ基での結合である。
【０１７５】
Ｎ−末端で化学修飾されたタンパク質が特に所望されうる。本組成物の例示としてポリエチレングリコールを用いて、（分子量、枝分かれ等による）さまざまなポリエチレングリコール分子、反応混合物中のポリエチレングリコール分子のタンパク質（ポリペプチド）分子に対する割合、達成されるべきペジレーション反応の型、及び選択されたＮ−末端にペジル化されたタンパク質を得る方法が選択されうる。Ｎ−末端にペジル化した調製物を得る方法（すなわち、必要で有ればこの基を他のモノペジル化基から分離すること）はペジル化タンパク質分子の集団からのＮ−末端ペジル化材料の精製によりうる。Ｎ−末端で化学修飾された選択的タンパク質は、特定のタンパク質における誘導体化について入手可能な異なる型の第一アミノ基（リジン対Ｎ−末端）の特異な反応性を活用する、還元アルキル化により完成されうる。適切な反応条件下で、重合体を含むカルボニル基でのＮ−末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０１７６】
さらなる好ましい態様においては、本発明はボディマスを減少させる必要のある個体に第一の局面のＧＭＧ−２ポリペプチド断片のヂペプチヂルペプチダーゼ切断のアンタゴニストの供給又は投与と共に、第五の局面において示される前記医薬の又は生理学的に許容される組成物を提供する又は投与することを含むボディマスの減少方法を特徴付ける。
【０１７７】
好ましい前記アンタゴニストはアルファ−アミノアルキルリン酸のヂエステルのペプチヂル誘導体である（米国特許第５，５４３，３９６号、その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する）。より好ましい前記ペプチヂル誘導体はＡｌａ−ＰｒｏP（ＯＺ）2、ＡｃＯＨ．Ａｌａ−ＰｉｐP（Ｏｐｈ）2、ＨＣｌ．Ａｌａ−ＰｒｏP（Ｏｐｈ−４Ｃｌ）2、ＨＣｌ．Ａｌａ−ＰｉｐP（Ｏｐｈ−４Ｃｌ）2又は２ＨＣｌ．Ｌｙｓ−ＰｉｐP（Ｏｐｈ−４Ｃｌ）2から選ばれ、ここで、Ｚはアリール基、置換されたアリール基又は非常にフルオロ化されたアルキル基を示し、ＰｒｏPはリン酸プロリン誘導体を示し、及びＰｉｐPはリン酸ピペリヂルを示す（米国特許第５，５４３，３９６号、その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する）。
【０１７８】
他の好ましい前記アンタゴニストは一般式Ｚ−Ｘａａ−Ｙ’の化合物であり、ここで、Ｘａａはアミノ酸であり、Ｚは保護基であり、及びＹ’はさまざまな型の環状構造の１である（米国特許第６，０９０，７８６号、その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する）。より好ましいものはＺが存在しうる又は存在しない、及びベンジルオキシカルボニルの如き保護基を示す；Ｘａａがアラニン、メチオニン、アルギニン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、プロリン、アスパラギン、セリン、システイン、スレオニン、グリシン、チロシン、グルタミン酸、トリプトファン、グルタミン、バリン、イソロイシン、リジン、ロイシン、Ｌ−チオプロリン、Ｌ−ホモプロリン、Ｌ−１，２，３，４，テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）、Ｌ−２，３−ヂヒドロインドール−２−カルボン酸、Ｌ−ナフチルグリシン、Ｌ−フェニルグリシン、Ｌ−４−フェニルプロリン、Ｏ−ベンジルチロシン、オメガ−Ｚリジン又はオメガ−アセチルリジンを示す；及びＹ’はピローリヂド、フォスフォネート又はフォスフィネート誘導体又は還元ペプチドを示す前記化合物；又はその医薬として許容される塩である（米国特許第６，０９０，７８６号、その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する）。
他の好ましい前記アンタゴニストはサルフォスチンである（米国特許第６，２１４，３４０号、その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する）。
【０１７９】
他の好ましい前記アンタゴニストはＮ−（置換されたグリシル）−２−シアノピローリヂンである（米国特許第６，１６６，０６３号）。より好ましい前記Ｎ−（置換されたグリシル）−２−シアノピローリヂンはピローリヂン，１−［［（３，５−ヂメチル−１−アダマンチル）アミノ］−アセチル］−２−シアノ−，（Ｓ）−；ピローリヂン，１−［［（３−エチル−１−アダマンチル）アミノ］−アセチル］−２−シアノ−，（Ｓ）−；ピローリヂン、１−［［（３−メトキシ−１−アダマンチル）アミノ］−アセチル］−２−シアノ−，（Ｓ）−；ピローリヂン，１−［［［３−［［（ｔ−ブチルアミノ）カルボニル］オキシ］−１−アダマンチル］アミノ］−アセチル］−２−シアノ−，（Ｓ）−；ピローリヂン、１−［［［３−［［［（４−メトキシフェニル）アミノ］−カルボニル］オキシ］−１−アダマンチル］アミノ］−アセチル］−２−シアノ，（Ｓ）−；ピローリヂン、１−［［［（３−［［（フェニルアミノ）カルボニル］オキシ］−１−アダマンチル］アミノ］−アセチル］−２−シアノ−，（Ｓ）−；ピローリヂン，１−［［（５−ヒドロキシ−２−アダマンチル）アミノ］−アセチル］−２−シアノ−，（Ｓ）−；ピローリヂン，１−［［（３−アセチルオキシ−１−アダマンチル）アミノ］−アセチル］−２−シアノ−，（Ｓ）−；ピローリヂン，１−［［［（３−［［［（ヂイソプロピル）アミノ］カルボニル］オキシ］−１−アダマンチル］アミノ］−アセチル−２−シアノ−，（Ｓ）−；ピローリヂン，１−［［［３−［［［（シクロヘキシル）アミノ］カルボニル］オキシ］−１−アダマンチル］アミノ］−アセチル］−２−シアノ−，（Ｓ）−；ピローリヂン，１−［［（３−エトキシ−１−アダマンチル）アミノ］−アセチル］−２−シアノ−，（Ｓ）−；又はそれぞれの場合においては、それらの医薬として許容される酸添加塩から選ばれる（米国特許第６，１６６，０６３号）。
【０１８０】
他の好ましい前記アンタゴニストは式＃＃ＳＴＲ１＃＃のテトラヒドロイソキノリン３−カルボキサミド誘導体である（米国特許第６，１７２，０８１号）。より好ましいものはＸがＣＨ2、Ｓ、Ｏ又はＣ（ＣＨ3）2である；Ｒ1及びＲ2が独立に水素、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アラルコキシ又はハロゲンである、前記誘導体及びその医薬として許容される塩である（米国特許第６，１７２，０８１号）。
【０１８１】
他の好ましい前記アンタゴニストはバリン−ピローリヂドである［Ｄｅａｃｏｎ（２００１）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５０：１５８８−１５９７、その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する］。
【０１８２】
複合体（多量体）
本発明に係るポリペプチド断片は単量体又は複合体で存在しうる。最も好ましくは、本発明に係るポリペプチド断片はホモ三量体である。したがって、本発明は本発明に係るポリペプチド断片の単量体及び複合体、それらの調製、及びそれらを含む組成物（好ましくは、医薬の又は生理学的に許容される組成物）に関連する。特定の態様においては、本発明に係るポリペプチドはホモ三量体である。さらなる態様においては、本発明に係る複合体はホモ三量体を含む、主にそれから成る又はそれから成る。
【０１８３】
本発明に含まれる複合体はホモ体又はヘテロ体でありうる。本明細書中で使用されるとき、上記用語ホモ体は（本明細書中に示されるこれらのポリペプチド断片に対応するポリペプチド断片、変形、スプライス変形、及び融合タンパク質を含む）本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片に対応するポリペプチドのみを含む複合体をいう。これらのホモ体は同一の又は異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド断片を含みうる。特定の態様においては、本発明に係るホモ体は同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド断片のみを含む複合体である。他の特定の態様においては、本発明に係るホモ体は異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド断片を含む複合体である。特定の態様においては、本発明に係る複合体は（例えば、同一の又は異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド断片を含む）ホモ二量体又は（例えば、同一の及び／又は異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド断片を含む）ホモ三量体である。追加の態様においては、本発明に係るホモの複合体は少なくとも１のホモ二量体、少なくとも１のホモ三量体又は少なくとも１のホモ四量体である。より好ましくは、本発明に係るホモの複合体はホモ三量体である。さらにより好ましくは、本発明に係る前記ホモ三量体はｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体である。最も好ましくは、本発明に係る前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体は脂質分割、脂質代謝、及びインスリン様活性から成る群から選ばれる活性を有する。また最も好ましくは、本発明に係る前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体は体重増加の予防、体重減少、及び体重減少の維持から成る群から選ばれる活性を有する。
【０１８４】
本明細書中で使用されるとき、上記用語ヘテロ体は本発明に係るポリペプチドに加えて、１以上の異種のポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質又はそのポリペプチド断片に対応する）を含む複合体をいう。特定の態様においては、本発明に係る複合体はヘテロ二量体、ヘテロ三量体又はヘテロ四量体である。追加の態様においては、本発明に係るヘテロの複合体は少なくとも１のヘテロ二量体、少なくとも１のヘテロ三量体又は少なくとも１のヘテロ四量体である。
【０１８５】
本発明に係る複合体は疎水性、親水性、イオン性及び／又は共有結合の結果でありうる及び／又は例えば、リポソーム形成により間接的に結合されうる。したがって、最も好ましい態様においては、本発明に係るホモ三量体は本発明に係るポリペプチドが溶液中で互いに接触するとき形成される。他の態様においては、例えば、ヘテロ三量体又はヘテロ四量体の如き、本発明に係るヘテロ複合体は本発明に係るポリペプチドが溶液中で（本発明に係る融合タンパク質中の異種のポリペプチド配列に対する抗体を含む）本発明に係るポリペプチドに対する抗体と接触するとき形成される。他の態様においては、本発明に係る複合体は本発明に係るポリペプチドと及び／又はその間で共有結合により形成される。上記共有結合は上記ポリペプチド配列中に含まれる１以上のアミノ酸残基（例えば、配列リスト中に引用される又は沈殿されたクローンによりコードされるポリペプチド中に含まれるもの）を含みうる。１の場合においては、上記共有結合はポリペプチド配列内に位置されるシステイン残基の間のクロス結合であり、それは天然（すなわち、天然に起こる）ポリペプチド内で相互作用する。他の場合においては、上記共有結合は化学又は組換え操作の結果である。あるいは、上記共有結合は本発明に係る融合タンパク質中の異種のポリペプチド配列中に含まれる１以上のアミノ酸残基に関連しうる。
【０１８６】
本発明に係る特定の好ましい態様においては、本発明に係る前記複合体はｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体である。最も好ましくは、本発明に係る前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体は脂質分割、脂質代謝、及びインスリン様活性から成る群から選ばれる活性を有する。また最も好ましくは、本発明に係る前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体は体重増加の予防、体重減少、及び体重減少の維持から成る群から選ばれる活性を有する。
【０１８７】
１の例においては、共有結合は本発明に係る融合タンパク質中に含まれる異種の配列の間である（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の例においては、上記共有結合は（本明細書中に示される）本発明に係るＦｃ融合タンパク質中に含まれる異種の配列の間である。他の特定の例においては、本発明に係る融合タンパク質の共有結合は、例えば、オセテオプロテゲリンの如き、共有結合した複合体を形成することのできる他のタンパク質からの異種のポリペプチド配列の間である（例えば、国際公開番号：ＷＯ ９８／４９３０５を参照のこと、その内容をそれらを全体として本明細書中に援用する）。他の態様においては、本発明に係る２以上のポリペプチドはペプチド結合をとおして結合される。例は（本明細書中に援用する）米国特許第５，０７３，６２７号中に示されるそれらのペプチド結合を含む。ペプチド結合により分離される本発明に係る複数のポリペプチドを含むタンパク質は慣用の組換えＤＮＡ技術を用いて作出されうる。
【０１８８】
本発明に係る複合体ポリペプチドの他の調製方法はロイシンジッパー又はイソロイシンジッパーポリペプチド配列に融合した本発明に係るポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパー及びイソロイシンジッパードメインはそれらが発見されたタンパク質の複合体化を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパーはもともといくつかのＤＮＡ−結合タンパク質中で同定され、そしてそれ以来さまざまな異なるタンパク質中で発見されている（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． Ｊｕｌ；２（７）：７８６−８００）。既知のロイシンジッパーのうちには二量体化する又は三量体化する天然のペプチド及びその誘導体がある。本発明に係る溶解性の複合体タンパク質を作出するために好適なロイシンジッパードメインの例はＰＣＴ出願ＷＯ ９４／１０３０８中に示されるものであり、本明細書中に援用する。溶液中で二量体化する又は三量体化するポリペプチド配列に融合された本発明に係るポリペプチドを含む組換え融合タンパク質は好適な宿主細胞中に発現され、そして生ずる溶解性の複合体融合タンパク質は本分野において知られる技術を用いて培養上清から回復される。
【０１８９】
本発明に係る三量体ポリペプチドは高められた生物学的活性の利点を提供しうる。好ましいロイシンジッパー基及びイソロイシン基は優先的に三量体を形成するものである。１の例はＨｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９４）３４４（２〜３）：１９１−５中及び米国特許出願シリアル番号 ０８／４４６，９２２号中に示される、肺の界面活性タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーであり、本明細書中に援用する。天然の三量体タンパク質に由来する他のペプチドは本発明に係る三量体ポリペプチドの調製において使用されうる。他の例においては、本発明に係るタンパク質はＦｌａｇ（商標）及びＦｌａｇ（商標）ポリペプチド配列を含む本発明に係る融合タンパク質中に含まれるポリペプチド配列の間の相互作用により結合される。さらなる態様においては、本発明に係るタンパク質は本発明に係るＦｌａｇ（商標）融合タンパク質中に含まれる異種のポリペプチド配列及び抗Ｆｌａｇ（商標）抗体の間の相互作用により結合される。
【０１９０】
本発明に係る複合体は本分野において知られる化学技術を用いて作出されうる。例えば、本発明に係る複合体中に含まれることが所望されるポリペプチドは本分野において知られるリンカー分子及びリンカー分子長最適化技術を用いて化学的にクロスリンクされうる（例えば、それを全体として本明細書中に援用する米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明に係る複合体は上記複合体中に含まれることが所望されるポリペプチドの配列内に位置するシステイン残基の間で１以上の分子内クロスリンクを形成する本分野において知られる技術を用いて作出されうる（例えば、それを全体として本明細書中に援用する米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明に係るポリペプチドは上記ポリペプチドのＣ−末端又はＮ−末端へのシステイン又はビオチンの追加により慣例的に改変されることができ、そして本分野において知られる技術は１以上のこれらの改変したポリペプチドを含む複合体を作出するために適用されうる（例えば、それを全体として本明細書中に援用する米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本分野において知られる少なくとも３０の技術が本発明に係る複合体中に含まれることが所望されるポリペプチド成分を含むリポソームを作出するために適用されうる（例えば、それを全体として本明細書中に援用する米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０１９１】
あるいは、本発明に係る複合体は本分野において知られる遺伝子工学技術を用いて作出されうる。１の態様においては、本発明に係る複合体中に含まれるポリペプチドは本明細書中に示される又はそうでなければ本分野において知られる融合タンパク質技術を用いて組換え体として作出される（例えば、それを全体として本明細書中に援用する米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の態様においては、本発明に係るホモ二量体をコードするポリヌクレオチドは本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をリンカーポリペプチドをコードする配列に、そしてその後さらに（リーダー配列を欠く）もとのＣ−末端からＮ−末端への逆向きのポリペプチドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチドにつなげることにより作出される（例えば、それを全体として本明細書中に援用する米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。他の態様においては、本明細書中において示される又はそうでなければ本分野において知られる組換え技術は膜貫通ドメイン（又は疎水性の若しくはシグナルペプチド）を含む本発明に係る組換えポリペプチドを作出するために適用され、そしてそれは膜再構成技術によりリポソーム中に導入されうる（例えば、それを全体として本明細書中に援用する米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０１９２】
ＩＩ． 本発明に係るＧＭＧ−２ポリヌクレオチド
好ましいポリヌクレオチドは全長ＧＭＧ−２及び本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードするものである。全長ＧＭＧ−２及びｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードする組換えポリヌクレオチドは、非限定的に、肥満関連疾患及び障害の治療及び／又は予防及び／又はボディマスを減少させることに加えて、その活性のアゴニスト及びアンタゴニストについてのスクリーニング分析、診断スクリーニング、及び抗体作成を含む、さまざまな方法における使用のためのその精製を促進することに加えて、非限定的に、その活性のアンタゴニスト及びアゴニストについてのスクリーニング分析における使用のための組換え細胞中でポリペプチドを発現することを含む、さまざまな方法で使用されうる。
【０１９３】
本発明は全長ＧＭＧ−２及びｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片及び本明細書中に示されるそのさまざまなポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドに関連する。これらのポリヌクレオチドは精製され、単離され、及び／又は組換えでありうる。全ての場合においては、本発明に係る所望のＧＭＧ−２及びｇＧＭＧ−２ポリヌクレオチドは本明細書中に示される及び議論される肥満関連活性を有する本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードするものである。
【０１９４】
断片
ポリヌクレオチド断片は全長ＧＭＧ−２ポリペプチドの全体ではないが、部分として全て同じである配列又は特定のｇＧＭＧ−２ポリペプチドヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである。上記断片は「遊離状態」で、すなわち、他のポリヌクレオチドの部分又はそれに融合された状態ではなく、存在しうる又はそれらは、それらが部分又は領域を形成する他の非ＧＭＧ−２又は非ｇＧＭＧ−２（異種の）ポリヌクレオチド内に含まれうる。しかしながら、いくつかのｇＧＭＧ−２ポリヌクレオチド断片は単一のポリヌクレオチド内に含まれうる。
【０１９５】
本発明に係るＧＭＧ−２ポリヌクレオチドは無傷のＧＭＧ−２ポリペプチドをコードする全長ポリヌクレオチド配列未満の１８連続塩基〜１８連続塩基、例えば、配列ＩＤ番号：１、３又は５中の全長ＧＭＧ−２ポリペプチドポリヌクレオチド配列を含む。この態様の１の局面においては、上記ポリヌクレオチドは本発明に係るポリヌクレオチドの少なくとも
【化２５】
【０１９６】
上記の好ましい核酸の大きさに加えて、さらに好ましい核酸は少なくとも１８ヌクレオチドを含み、ここで、「少なくとも１８」は１８及び配列ＩＤ番号：１、３又は５中に又は本明細書中のどこかに示される無傷のＧＭＧ−２ポリペプチドｃＤＮＡの３’端ヌクレオチド位より１８ヌクレオチド少ない整数の間の整数として定義される。
【０１９７】
本発明に係る好ましいポリヌクレオチドとしてさらに含まれるものは、さらにそれらの５’及び３’位の点で特定される、上記に示される、少なくとも１８ヌクレオチドの長さの核酸断片である。上記５’及び３’位は以下の配列リスト中に示される位置数により示される。対立遺伝子の及び縮合した及び他の変形については、１位はＯＲＦの５’端ヌクレオチドとして定義される、すなわち、残りのヌクレオチドと共に開始コドン（ＡＴＧ）のヌクレオチド「Ａ」は連続的に番号付けされる。それゆえ、ポリヌクレオチド断片発明、長さが少なくとも１８の連続したヌクレオチドが本発明に係る無傷のＧＭＧ−２ポリペプチドポリヌクレオチド上を占めうる、５’及び３’ヌクレオチド位のどの組み合わせも個々の種として本発明に含まれる。５’及び３’により特定されるポリヌクレオチド断片は即座に構想されることができ、それゆえ本明細書を不必要に長くさせない目的のために単独で個々には列挙されない。
【０１９８】
本発明に係るポリヌクレオチド断片の上記種はあるいは、式「ｘ〜ｙ」により示されることができ、ここで、「ｘ」は上記ポリヌクレオチドの５’端ヌクレオチドに等しい及び「ｙ」は３’端ヌクレオチド位に等しい；及びさらに、ここで、「ｘ」は１〜本発明に係るポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数引く１８の間の整数に等しい、及びここで、「ｙ」は１９〜本発明に係るポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数の間の整数に等しい；及びここで、「ｘ」は少なくとも１８「ｙ」より小さい整数である、ということが留意される。
【０１９９】
本発明は５’及び３’位により特定される本発明に係るポリヌクレオチド断片又は上記に示されるヌクレオチドにおける大きさにより特定されるポリヌクレオチドの種の排除をも提供する。５’及び３’位により又はヌクレオチドにおける大きさにより特定された断片の数は、上記に示されるように、排除されうる。
【０２００】
本発明に係るＧＭＧ−２ポリヌクレオチド断片は本明細書中に示されるＧＭＧ−２断片をコードする１８の連続的な塩基〜全長ポリヌクレオチド配列を含む。この態様の１の局面においては、上記ポリヌクレオチドは本発明に係るポリヌクレオチドの少なくとも
【化２６】
【０２０１】
上記の好ましい核酸の大きさに加えて、さらに好ましい核酸は少なくとも１８ヌクレオチドを含み、ここで、「少なくとも１８」は１８〜本明細書中のｇＧＭＧ−２断片ｃＤＮＡの３’端ヌクレオチド位に対応する整数の間の整数として定義される。
【０２０２】
本発明に係る好ましいポリヌクレオチドとしてさらに含まれるものは、さらにそれらの５’及び３’位の点で特定される、上記に示される、長さが少なくとも１８ヌクレオチドの核酸断片である。上記５’及び３’位は以下の配列リスト中に示される位置数により示される。対立遺伝子の及び縮合した及び他の変形については、１位はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’端ヌクレオチドとして定義される、すなわち、残りのヌクレオチドと共に開始コドン（ＡＴＧ）のヌクレオチド「Ａ」は連続的に番号付けられる。それゆえ、ポリヌクレオチド断片発明、長さが少なくとも１８の連続したヌクレオチドが本発明に係るｇＧＭＧ−２断片ポリヌクレオチド上を占めうる、５’及び３’ヌクレオチド位のどの組み合わせも個々の種として本発明に含まれる。５’及び３’位により特定されるポリヌクレオチド断片は即座に構想されることができ、そしてそれゆえ、本明細書を不必要に長くさせない目的のために単独で個々には列挙されない。
【０２０３】
本発明に係るポリヌクレオチド断片の上記の種はあるいは、式「ｘ〜ｙ」により示されることができ；ここで、「ｘ」は上記ポリヌクレオチドの５’端ヌクレオチド位に等しい及び「ｙ」は３’端ヌクレオチド位に等しい；及びさらに、ここで、「ｘ」は１〜本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数引く１８の間の整数に等しい、及びここで、「ｙ」は９〜本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数の間の整数に等しい；及びここで、「ｘ」は少なくとも１８「ｙ」より小さい整数である、ということが留意される。「ｘ」及び「ｙ」位のどの組み合わせも本発明に係る特定の態様として含まれる。さらに、式「ｘ」〜「ｙ」は「ｘ１−ｘ２」〜「ｙ１−ｙ２」として改変されることができ、ここで、「ｘ１−ｘ２」及び「ｙ１−ｙ２」は配列リストの２のヌクレオチド位から選ばれる位置範囲を示す。代替の式は「ｘ１−ｘ２」〜「ｙ」及び「ｘ」〜「ｙ１−ｙ２」を含む。
【０２０４】
これらの特定の態様、及び本明細書中に示される他のポリヌクレオチド断片の態様は「少なくとも」、「に等しい」、「以下の」、「未満の」、「少なくとも＿であるが＿以下の」又は「＿〜＿の」特定の大きさ又は特定の５’及び／又は３’位であるとして改変されうる。本発明はまた、５’及び３’位により特定される本発明に係るポリヌクレオチド断片又は上記に示されるヌクレオチドにおける大きさにより特定されるポリヌクレオチドの種の排除をも提供する。５’及び３’位により又はヌクレオチドにおける大きさにより特定される断片の数は、上記に示されるように、排除されうる。
【０２０５】
変形
他の好ましい態様においては、ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードするｇＧＭＧ−２ポリヌクレオチドの変形が構想される。ポリヌクレオチドの変形は、上記用語が本明細書中で使用されるとき、その配列が引用ポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドの変形は天然の対立変形の如き、天然の変形でありうる又はそれは天然に起こることが知られていない変形でありうる。上記ポリヌクレオチドの非天然の変形は、ポリヌクレオチド、細胞又は生物に適用されるものを含む、突然変異技術により行われうる。一般的に、差異は制限されるので、上記引用のヌクレオチド配列及び変形が非常に全体的に似ており、及び多くの領域で同一である。
【０２０６】
上記に示されるものと実質的に異なる配列を含むが、遺伝子コードの縮重のために、本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド変形もまた特定して構想される。当業者にとって上記に示される縮重変形を作出すること、例えば、特定の宿主についてコドン発現を最適化する（例えば、ヒトｍＲＮＡ中のコドンを他の哺乳類又は菌類の宿主細胞により好まれるものに変える）ことも通常の作業であろう。
【０２０７】
上記に示されるように、変形ポリヌクレオチドは天然の対立遺伝子変形の如き天然に又は組換え法により起こりうる。「対立遺伝子変形」により、生物の染色体上のある位置を占める遺伝子のいくつかの代替の形態の１が意図される（例えば、Ｂ． Ｌｅｗｉｎ， （１９９０） Ｇｅｎｅｓ ＩＶ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。非天然の変形は本分野において知られる突然変異技術を用いて作出されうる。上記核酸変形はヌクレオチド置換、欠失又は付加により作出されるものを含む。上記置換、欠失又は付加は１以上のヌクレオチドを含みうる。コード領域における変化は保存された又は保存されていないアミノ酸置換、欠失又は付加を作出しうる。この中で特に好ましいものはサイレント置換、付加及び欠失であり、それは本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の特性及び活性を変化させない。またこの点において好ましいものは保存された置換である。
【０２０８】
変形ポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチド変化は好ましくはサイレントであり、それはそれらが上記ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を変化させないことを意味する。しかしながら、ヌクレオチド変化は上記引用配列によりコードされるポリペプチド中のアミノ酸置換、付加、欠失、融合及び切除をもたらしうる。
【０２０９】
上記ヌクレオチド置換が１以上のアミノ酸変化をもたらした場合には、好ましいｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は本発明の好ましい態様のＩ節中に示される１以上の肥満関連活性を保持するものを含む。
【０２１０】
「同じ活性を保持する」により、分析において変形ｇＧＭＧ−２ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを用いて計測される活性が本明細書中の実施例の節中で示されるｇＧＭＧ−２断片を用いて計測される活性の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％及び１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％又は１２５％以下であることが意味される。
【０２１１】
活性が「増大される」により、分析において変形ｇＧＭＧ−２ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを用いて計測される活性が本明細書中の実施例の節中に示されるｇＧＭＧ−２断片を用いて計測される活性の少なくとも１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３２５％、３５０％、３７５％、４００％、４５０％又は５００％であることが意味される。
【０２１２】
活性が「減少される」により、分析において変形ｇＧＭＧ−２ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを用いて計測される活性が本明細書中の実施例の節中で示されるｇＧＭＧ−２断片を用いて計測される活性の少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％又は５０％減少されることが意味される。
【０２１３】
パーセント同一性
本発明はさらに配列ＩＤ番号：１若しくは配列ＩＤ番号：３若しくは配列ＩＤ番号：５のポリヌクレオチド配列又は本発明の好ましい態様の節Ｉ中に示される肥満関連活性を有するポリペプチドをコードするその断片に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の配列を有する核酸分子に方向付けられる。もちろん、上記遺伝子コードの縮重のために、当業者は、配列ＩＤ番号：１、３若しくは５中に示される核酸配列又はその断片に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の多数の核酸分子は生物学的活性を有するポリペプチドをコードするであろうことを即座に認識するであろう。実際に、これらのヌクレオチド配列の縮重した変形は全て同じポリペプチドをコードするので、これは上記に示される比較分析を行うことなしに当業者に明らかであろう。縮合した変形でない上記核酸分子について、妥当な数が生物学的活性を有するポリペプチドをコードするであろうということもさらに本分野において認識されるであろう。これは、さらに本発明の好ましい態様の節Ｉで以前に示されるように、当業者はタンパク質機能に顕著に影響をほとんど及ぼさないであろう又は及ぼさないであろうアミノ酸置換（例えば、１の脂肪族アミノ酸を第二の脂肪族アミノ酸で置換すること）について完全に理解するからである。
【０２１４】
本発明に係る引用ヌクレオチド配列に少なくとも、例えば、９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにより、上記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、上記ポリヌクレオチド配列がｇＧＭＧ−２断片をコードする引用ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチド当たり５までの点突然変異を含みうる点を除いては、上記引用配列と同一であることが意図される。他の表現では、引用ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド配列を得るために、上記引用配列中の５％までのヌクレオチドが欠失され、挿入され又は他のヌクレオチドで置換されうる。上記クエリー配列は本明細書中で示されるように特定される全体配列又は断片でありうる。
【０２１５】
特定の核酸分子又はポリペプチドが本発明に係るヌクレオチド配列に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるか否かを決定する及び定義する方法は既知のコンピュータプログラムを用いて行われうる。包括的な配列整合とも言われる、クエリー配列（本発明に係る配列）及び問題の配列の間の最もよい全体的な適合を決定するための好ましい方法はＢｒｕｔｌａｇ ｅｔ ａｌ．，（（１９９０）Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ ６（３）：２３７−４５）のアルゴリズムに基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定されうる。配列整合において、上記クエリー及び問題の配列は両方ＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列ははじめにＵ’ｓをＴ’ｓに変換することにより比較されうる。前記包括的な配列整合の結果はパーセント同一性である。パーセント同一性を計算するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整合において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ，ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４，Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１，Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０，Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０，Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１，Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５，Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ０．０５， Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００又はより短いほうの問題のヌクレオチド配列の長さである。
【０２１６】
内部の欠失のためでなく、５’又は３’欠失のために、上記問題の配列が上記クエリー配列よりも短い場合、手動の補正が上記結果についてなされなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムはパーセント同一性を計算するとき、問題の配列の５’及び３’切除を考慮しないからである。上記クエリー配列に比較して、５’又は３’端で切除された問題の配列について、上記パーセント同一性は適合／整合しない、上記問題の配列の５’及び３’である上記クエリー配列の塩基数を、上記クエリー配列の総塩基のパーセントとして計算することにより補正される。ヌクレオチドが適合／整合するか否かはＦＡＳＴＤＢ配列整合の結果により決定される。このパーセントは特定のパラメーターを用いて上記ＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されるパーセント同一性から引かれ、最終的なパーセント同一性スコアに到達する。この補正されたスコアは本発明に係る目的のために使用されるものである。上記クエリー配列と適合／整合しない、ＦＡＳＴＤＢ整合により表された、上記問題の配列の５’及び３’ヌクレオチドより外のヌクレオチドのみがパーセント同一性スコアを手動で調節する目的のために計算される。
【０２１７】
例えば、９０ヌクレオチドの問題の配列はパーセント同一性を決定するために１００ヌクレオチドのクエリー配列に対して整合される。欠失が上記問題の配列の５’端で起こり、それゆえ、上記ＦＡＳＴＤＢ整合は５’端ではじめの１０ヌクレオチドの適合／整合を示さない。上記１０の対でないヌクレオチドは配列の１０％を示し（適合しない５’及び３’端のヌクレオチド数／上記クエリー配列中のヌクレオチドの総数）、そのため１０％はＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されたパーセント同一性スコアから引かれる。残りの９０ヌクレオチドが完全に適合した場合は、最終的なパーセント同一性は９０％であろう。
【０２１８】
他の例においては、９０ヌクレオチドの問題の配列は１００ヌクレオチドのクエリー配列と比較される。今度は、欠失が内部欠失であるため、上記クエリーと適合／整合しない問題の配列の５’又は３’上のヌクレオチドはない。この場合においては、ＦＡＳＴＤＢにより計算されたパーセント同一性は手動で補正されない。再び、上記クエリー配列と適合／整合しない問題の配列の５’及び３’のヌクレオチドのみが手動で補正される。他の手動の補正は本発明に目的のために行われない。
【０２１９】
融合
本発明にさらに含まれるものは追加の異種のアミノ酸配列についてのコード配列にフレームで融合される本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。例えば、非限定的に、非コード５’及び３’配列、ベクター配列、精製、プロービング又はプライミングに使用される配列を含む、追加の、非コード配列を共に有する本発明に係るポリペプチドをコードする核酸も本発明に含まれる。例えば、異種の配列は転写、及びｍＲＮＡプロセッシング、例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合及び安定性において役割を果たしうる転写された、翻訳されない配列を含む。上記異種の配列はあるいは追加の機能を提供する追加のコード配列を含みうる。したがって、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列の如き、タグ配列に融合されうる。本発明のこの局面のいくつかの好ましい態様においては、上記タグアミノ酸配列は、それらの多くが商業的に入手可能である、その他の中で、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， ９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ， ９１３１１）において提供されるタグの如き、ヘキサ−ヒスチヂンペプチドである。例えば、ヘキサ−ヒスチヂンは融合タンパク質の便利な精製を提供する（Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６（３）：８２１−４を参照のこと）。上記「ＨＡ」タグはインフルエンザヘマググルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する精製に有用な他のペプチドである（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｃｅｌｌ ３７（３）：７６７−７８を参照のこと）。上記に議論されるように、他の上記融合タンパク質はＮ−又はＣ−末端でＦｃに融合されたｇＧＭＧ−２断片ｃＤＮＡを含む。
【０２２０】
ＩＩＩ． 本発明に係る組換えベクター
上記用語「ベクター」は、二重鎖又は一重鎖である、及び細胞宿主中に又は単細胞の若しくは複数の細胞の宿主生物中に移行されることが要求される少なくとも１の問題のポリヌクレオチドを含む、環状の又は直鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子を示すために本明細書中で使用される。
本発明は本明細書中に示されるポリヌクレオチドのいずれか１を含む組換えベクターに関連する。
【０２２１】
本発明は本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターのファミリーを含む。
第一の好ましい態様においては、本発明に係る組換えベクターは好適な細胞宿主中で挿入されたポリヌクレオチドを増幅するために使用され、このポリヌクレオチドは組換えベクターが複製する度に増幅される。上記挿入されたポリヌクレオチドは本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードするものでありうる。
【０２２２】
本発明にしたがう組換えベクターの第二の好ましい態様は本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターから成る。いくつかの態様においては、発現ベクターは本発明に係るＧＭＧ−２断片、好ましくは本発明において示される改変されたＧＭＧ−２断片を発現するために使用され、それはその後精製され、そして、例えば、肥満関連疾患のための治療として又は単に個体のボディマスを減少させるために使用されうる。
【０２２３】
発現は、適切なシグナルが上記ベクター中に提供されることを必要とし、前記シグナルは宿主細胞内で問題の遺伝子の発現を駆動する、ウイルス及び哺乳類源からのエンハンサー／プロモーターの如き、さまざまな調節エレメントを含む。上記産物を発現する永久的な、安定な細胞クローンを確立するためのドミナント薬物選択マーカーは、それらが上記薬物選択マーカーの発現を上記ポリペプチドの発現にリンクさせるエレメントであるので、一般的に本発明に係る発現ベクター中に含まれる。
より特に、本発明はＧＭＧ−２ポリペプチド断片から選ばれる調節配列の制御下で又はあるいは外因性の調節配列の制御下で、本発明に係るＧＭＧ−２断片若しくは本明細書中で示される改変されたＧＭＧ−２断片又はその変形若しくは断片をコードする核酸を含む発現ベクターに関連する。
【０２２４】
その結果、本発明に係る好ましい発現ベクターは：（ａ）それに実施可能に結合したコードポリヌクレオチドの発現を駆動させる、ＧＭＧ−２断片調節配列；及び（ｂ）好適な細胞宿主及び／又は宿主生物内でのその発現を許す調節配列に実施可能に結合される、本発明に係るＧＭＧ−２断片コード配列から成る群から選ばれる。
【０２２５】
本発明に係るベクター中で見られうるエレメントのいくつかは以下の節中にさらに詳細に示される。
【０２２６】
１）本発明に係る発現ベクターの一般的特徴：
本発明にしたがう組換えベクターは、非限定的に、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（菌人工染色体）、ファージ、ファージミド、コスミド、プラスミド又は染色体の、非染色体の、半合成若しくは合成ＤＮＡから成りうる直鎖ＤＮＡ分子を含む。上記組換えベクターは：
（１）遺伝子発現において調節的な役割を有する遺伝子エレメント又はエレメント、例えば、プロモーター又はエンハンサー。エンハンサーは、転写を増大させるためのプロモーターにはたらく通常約１０〜３００ｂｐの長さのＤＮＡのシス活性エレメントである；
（２）転写されてｍＲＮＡになり、最終的に翻訳されてポリペプチドになる構造的な又はコード配列であって、前記構造的な又はコード配列は（１）中に示される調節エレメントに実施可能に結合される；及び
（３）適切な転写開始及び停止配列。酵母又は真核細胞発現系における使用のために意図された構造単位は好ましくは宿主細胞による翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。あるいは、組換えタンパク質がリーダー又は輸送配列なしに発現されるとき、それはＮ−末端残基を含みうる。この残基は続いて最終産物を作出するために発現された組換えタンパク質から切断されうる又はされない；
の集合から成る転写単位を含みうる。
【０２２７】
一般的に、組換え発現ベクターは複製の起源、宿主細胞の形質転換を許す選択可能なマーカー、及び下流の構造配列の直接の転写のための高い発現率の遺伝子に由来するプロモーターを含むであろう。上記異種の構造配列は翻訳開始及び停止配列、及び好ましくは翻訳されたタンパク質のペリプラズミックスペース又は細胞外媒体中への方向性のある分泌を可能にするリーダー配列と共に適切なファージ中に並べられる。上記ベクターが哺乳類宿主細胞中で所望の配列をトランスフェクトする及び発現するために適合された特定の態様においては、好ましいベクターは所望の宿主内における複製起源、好適なプロモーター及びエンハンサー、及び必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、転写停止配列、及び５’−フランキング非転写配列を含むであろう。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起源、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス及びポリアデニル化部位は必要とされる非転写遺伝子エレメントを提供するために使用されうる。
【０２２８】
２）調節エレメント
プロモーター
【０２２９】
本発明に係る発現ベクターにおいて使用される好適なプロモーター領域は異種の遺伝子が発現される細胞宿主を考慮に入れて選択される。問題の核酸配列の発現を制御するために使用される特定のプロモーターは、それが標的細胞において核酸の発現を方向付けることができる限りは、重要でないと考えられている。したがって、ヒト細胞が標的であるとき、例えば、ヒト又はウイルスプロモーターの如き、ヒト細胞において発現されることが可能なプロモーターの制御の隣に及び下流に核酸コード領域を位置づけることが好ましい。使用されるプロモーターは構成的又は誘導的でありうる。
【０２３０】
好適なプロモーターは、それが発現を制御する上記核酸について異種でありうる又はあるいは発現されるべきコード配列を含むもとのポリヌクレオチドについて内因性でありうる。さらに、上記プロモーターは一般的に、上記構築物プロモーター／コード配列が挿入された上記組換えベクター配列について異種である。
【０２３１】
プロモーター領域は、例えば、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター及びより好ましくはｐＫＫ２３２−８及びｐＣＭ７ベクターを用いて所望の遺伝子から選ばれうる。好ましい菌プロモーターはＬａｃＩ、ＬａｃＺ、Ｔ３又はＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｇｐｔ、ｌａｍｂｄａ ＰＲ、ＰＬ及びｔｒｐプロモーター（ＥＰ ００３６７７６）ポリヘドリンプロモーター、又はバキュロウイルスからのｐ１０タンパク質プロモーター（Ｋｉｔ Ｎｏｖａｇｅｎ）（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３（１２）：２１５６−６５；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， １９９２）、ｌａｍｂｄａ ＰＲ プロモーター又はｔｒｃプロモーターである。
【０２３２】
真核細胞プロモーターはＣＭＶ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ、ＨＳＶチミヂンキナーゼ、ｅａｒｌｙ ａｎｄ ｌａｔｅ ＳＶ４０、レトロウイルスからのＬＴＲｓ、及びマウスメタロチオネイン−Ｌを含む。さらに、脂肪組織、筋肉組織又は肝臓における発現を促進するものの如き、特定の細胞型について特異的なプロモーターが選択されうる。便利なベクター及びプロモーターの選択は当業者の水準内でよい。
【０２３３】
プロモーターの選択は遺伝子工学の当業者の能力の範囲内でよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， Ｖｏｌ．１，２，３（１９８９）を又はＦｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙにより示される手順を引用しうる。
【０２３４】
他の調節エレメント
ｃＤＮＡ挿入物が使用される場合、典型的に遺伝子転写産物の適切なポリアデニル化に影響させるためにポリアデニル化シグナルを含むことが所望されるであろう。上記ポリアデニル化シグナルの性質は本発明の成功的な実施に重要ではないと考えられており、及びヒト成長ホルモン及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの如きどんな上記配列も使用されうる。発現カセットのエレメントとしてターミネーターも企図される。これらのエレメントはメッセージの値を高める及び上記カセットから他の配列への読みとばしを最小限にする役割を果たしうる。上記に示される適切なＤＮＡ配列を含むベクターは適切な宿主を形質転換するために利用され、所望のポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現を可能にしうる。
【０２３５】
３）選択可能なマーカー
上記マーカーは上記細胞に発現構築物を含む細胞の容易な同定を可能にする同定可能な変化を与えるであろう。形質転換された宿主細胞の選択についての上記選択可能なマーカー遺伝子は好ましくはヂヒドロフォレート還元酵素又は真核細胞培養についてのネオマイシン耐性、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについてのＴＲＰ１又はＥ． ｃｏｌｉにおけるテトラサイクリン、リファムピシン若しくはアンピシリン耐性又はマイコバクテリアについてのレバンサッカレースであり、この後者のマーカーは陰性選択マーカーである。
【０２３６】
４）好ましいベクター
菌ベクター
代表的な、しかし非限定的な例として、菌類についての有用な発現ベクターはｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝子エレメントを含む商業的に入手可能なプラスミド由来の選択可能なマーカー及び菌の複製起源を含みうる。上記商業的なベクターは、非限定的に、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）ａｎｄ ｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ）を含む。
【０２３７】
多くの他の好適なベクターは当業者に知られ、そして以下の菌のベクターのように、商業的に入手可能である：ｐＴｒｃ−Ｈｉｓ、ｐＥＴ３０−Ｈｉｓ、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；ｐＱＥ−３０（ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ）。
【０２３８】
バキュロウイルスベクター
本発明に係るポリペプチドの発現について好適なベクターは昆虫細胞内及び昆虫細胞系内で増殖されうるバキュロウイルスベクターである。特定の好適な宿主ベクター系はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａに由来するＳＦ９細胞系（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １７１１）をトランスフェクトするために使用されるｐＶＬ１３９２／１３９３バキュロウイルストランスファーベクター（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）である。
【０２３９】
さらに好適なバキュロウイルスベクターは当業者に知られており、例えば、ＦａｓｔＢａｃＨＴである。バキュロウイルス発現系におけるＡＰＭ１球状ヘッドポリペプチドの発現について好適な他のベクターは、非限定的に、Ｃｈａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｄｅｃ；１８（Ｐｔ３）：２５９−７３）；Ｖｌａｓａｋ ｅｔ ａｌ．（１９８３；Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｅｐ １；１３５（１）：１２３−６）；及びＬｅｎｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６；Ｇｅｎｅ Ｍａｒ ９；１６９（２）：１８７−９０）により示されるものを含む。
【０２４０】
哺乳類ベクター
本発明に係るポリペプチドの発現についてさらに好適なベクターは哺乳類ベクターである。いくつかの好適なベクター系は当業者に知られ、例えば、ｐｃＤＮＡ４ＨｉｓＭａｘ、ｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏ−Ｈｉｓ及びｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏである。
【０２４１】
ウイルスベクター
１の特定の態様においては、上記ベクターはアデノウイルスに由来する。本発明にしたがう好ましいアデノウイルスベクターはＦｅｌｄｍａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｇ（１９９９６；Ｓｅｍｉｎ Ｉｎｔｅｒｖ Ｃａｒｄｉｏｌ １（３）：２０３−８）又はＯｈｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９４；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５（５１７３）：７８１−４）により示されるものである。本発明に係るこの特定の態様にしたがう他の好ましい組換えアデノウイルスはヒトアデノウイルス２若しくは５型（Ａｄ２若しくはＡｄ５）又は動物起源のアデノウイルス（フランス特許出願第ＦＲ−９３．０５９５４号）である。
【０２４２】
レトロウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクターは一般的に、特にヒトを含む哺乳類へのｉｎ ｖｉｖｏの外因性のポリヌクレオチドの輸送についての選択の組換え遺伝子デリバリー系であると理解される。これらのベクターは遺伝子の細胞への効果的なデリバリーを提供し、及び上記輸送された核酸は安定に宿主の染色体ＤＮＡに統合される。
【０２４３】
本発明に係るレトロウイルスｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子デリバリー媒体の調製又は構築に特に好ましいレトロウイルスはＭｉｎｋ−Ｃｅｌｌ Ｆｏｃｕｓ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｖｉｒｕｓ、マウス肉腫ウイルス、Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓウイルス及びラウス肉腫ウイルスから成る群から選ばれるレトロウイルスを含む。特に好ましいマウス白血病ウイルスは４０７０Ａ及び１５０４Ａウイルス、Ａｂｅｌｓｏｎ（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＶＲ−９９９）、Ｆｒｉｅｎｄ（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＶＲ−２４５）、Ｇｒｏｓｓ（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＶＲ−５９０）、Ｒａｕｓｃｈｅｒ（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＶＲ−９９８）及びモロニーマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＶＲ−１９０；ＰＣＴ出願番号ＷＯ ９４／２４２９８）を含む。特に好ましいラウス肉腫ウイルスはＢｒｙａｎ ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒ（ＡＴＣＣ Ｎｏｓ ＶＲ−３３４、ＶＲ−６５７、ＶＲ−７２６、ＶＲ−６５９及びＶＲ−７２８）を含む。他の好ましいレトロウイルスベクターはＲｏｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９６）、ＰＣＴ出願番号ＷＯ ９３／２５２３４、ＰＣＴ出願番号ＷＯ ９４／０６９２０、Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，（（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６（２３）：９０７９−８３）、Ｊｕｌａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３：３２５１−３２５５及びＮｅｄａ ｅｔ ａｌ．（（１９９１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６（２２）：１４１４３−６）中に示されるものである。本発明により企図されるさらに他のウイルスベクター系はアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）から成る。上記アデノ関連ウイルスはアデノウイルス又はヘルペスウイルスの如き他のウイルスを効果的な複製及び生産的なライフサイクルのためのヘルパーウイルスとして必要とする天然の欠陥ウイルスである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８：９７−１２９）。それは、そのＤＮＡを非分割細胞内へ統合することができ、及び高頻度の安定な統合を示す数少ないウイルスの１でもある（Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７（３）：３４９−５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６３（９）：３８２２−８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ５９：５６１−５６９）。ＡＡＶの１の有益な特性は形質転換された細胞に比較して初代細胞を変換することについてのその減少した効率に由来する。
【０２４４】
５）組換えベクターのデリバリー
【０２４５】
本発明に係るポリヌクレオチドの発現に影響を与えるために、これらの構築物は細胞内にデリバリーされなければならない。このデリバリーは細胞系を形質転換するための実験室手順におけるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで又はいくつかの疾患状態の治療におけるように、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで行われうる。
１の機構は上記発現構築物が感染性のウイルス粒子内に封じ込められるウイルス感染である。
【０２４６】
ポリヌクレオチドの培養哺乳類細胞への移行のためのいくつかの非ウイルス法も本発明により企図され、そして、非限定的に、リン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５４（２）：５３６−９；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７（８）：２７４５−５２）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｇｏｐａｌ，（１９８５）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ５（５）：１１８８−９０）、エレクトロポーレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ６（２）：７１６−８；Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１（２２）：７１６１−５）、ダイレクトマイクロインジェクション（Ｈａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０１（３）：１０９４−９）、ＤＮＡ−ｌｏａｄｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（Ｎｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７２１（２）：１８５−９０；Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９７９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７６（７）：３３４８−５２）、及び受容体仲介トランスフェクション（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，（１９８７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２（１０）：４４２９−３２；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７（３）：８８７−９２）を含む。これらの技術のいくつかはｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの使用にうまく適合されうる。
【０２４７】
上記発現ポリヌクレオチドが上記細胞内へデリバリーされたとき、それは宿主細胞のゲノム内へ安定的に統合されうる。この統合は相同組換えを介した同種の位置及び方向でありうる（遺伝子置換）又はそれはランダムな、非特異的な位置内に統合されうる（遺伝子拡大）。またさらなる態様においては、上記核酸はＤＮＡの分離したエピソームのセグメントとして細胞内に安定的に維持されうる。上記核酸セグメント又は「エピソーム」は宿主細胞周期とは独立して又は同調して維持及び複製をさせるのに十分な配列をコードする。
【０２４８】
タンパク質又はペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで脊椎動物の細胞内部へデリバリーするための方法についての１の特異的な態様は生理学的に許容される担体及び問題のポリペプチドを実施可能にコードする裸のポリヌクレオチドを含む調製物を上記細胞を含む組織の間隙の空間内へ導入する段階を含み、それにより上記裸のポリヌクレオチドは上記細胞内部へ取り込まれ、そして生理学的効果を有する。このことはｉｎ ｖｉｔｒｏの移行に特に適用可能であるが、ｉｎ ｖｉｖｏにも適用可能でありうる。
【０２４９】
「裸の」ポリヌクレオチドを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの使用のための組成物はＴａｓｃｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（８）：８８８−８９２の及びＨｕｙｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（（１９９６）Ｎａｔ Ｍｅｄ ２（８）：８９３−８）の記事中に加えて、ＰＣＴ出願番号ＷＯ ９０／１１０９２（Ｖｉｃａｌ Ｉｎｃ．）中及びＰＣＴ出願番号ＷＯ ９５／１１３０７（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ， ＩＮＳＥＲＭ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ ｄ’ Ｏｔｔａｗａ）中に示される。
【０２５０】
本発明のさらに他の態様においては、本発明に係るポリヌクレオチド構築物を含む、本発明に係る裸のポリヌクレオチドの細胞内への移行は粒子爆弾（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）で進行されることができ、前記粒子は、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（（１９９０）Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ Ｆｅｂ；１７（２）：９７−１０３）により示されるように、それらが細胞膜を通り抜け、そしてそれらを殺さずに細胞内へ入ることを可能にする高速に加速されたＤＮＡでコーティングした微小な発射物である。
さらなる態様においては、本発明に係るポリヌクレオチドはリポソーム内へ閉じこめられうる（Ｇｈｏｓｈ ａｎｄ Ｂａｃｃｈａｗａｔ，（１９９１）Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｉａｇｎ Ｔｈｅｒ ４：８７−１０３；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｇｅｎｅ １０：８７−９４；Ｎｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １４９：１５７−７６）。これらのリポソームはさらにレプチン、トリグリセリド、ＡＣＲＰ３０又は他の既知のＬＳＲリガンドを上記リポソーム膜内に導入することによりＬＳＲを発現する細胞に標的化されうる。
【０２５１】
特定の態様においては、本発明は本明細書中に示されるＧＭＧ−２球状ヘッドポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ産生のための組成物を提供する。それは、生理学的に許容される担体中で、及び上記組織の細胞に前記ポリペプチドを発現させるための組織内への導入に好適な溶液中に、このポリペプチドを実施可能にコードする裸のポリヌクレオチドを含む。
【０２５２】
所望の宿主生物に注入されるべきベクターの量は注入部位により変化する。表示的な用量としては、０．１〜１００μｇのベクターが動物の身体、好ましくは哺乳類の身体、例えば、マウスの身体内へ注入されるであろう。
本発明にしたがう上記ベクターの他の態様においては、それは宿主細胞内に、好ましくは治療されるべき動物から以前に回収された宿主細胞及びより好ましくは筋細胞の如き体細胞内にｉｎ ｖｉｔｒｏで導入されうる。次の段階において、所望のＧＭＧ−２球状ヘッドポリペプチド又はその所望の断片をコードするベクターで形質転換された細胞は組換えタンパク質を局所的に又は体系的に上記身体内へデリバリーするために動物の身体内へ再導入される。
【０２５３】
ＩＶ． 本発明に係る組換え細胞
本発明の他の目的は本明細書中に示されるポリヌクレオチドの１、及びより正確には、「本発明に係るポリヌクレオチド」中に示されるもののいずれか１の如き、本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドについて組換えられた、すなわち形質転換された又はトランスフェクトされた宿主細胞から成る。これらのポリヌクレオチドは一過性の又は安定的なトランスフェクションの結果として細胞内に存在しうる。本発明は「本発明に係る組換えベクター」中に示されるもののいずれか１の如き組換えベクターで形質転換された（原核細胞）又はトランスフェクトされた（真核細胞）宿主細胞を含む。
【０２５４】
一般的に、本発明に係る組換え宿主細胞は本明細書中に示される少なくとも１の本発明に係るポリヌクレオチド又は組換えベクターを含む。
【０２５５】
本発明に係る組換えベクターについての宿主として使用される好ましい宿主細胞は以下のものである：
ａ）原核宿主細胞：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎｓ（ＬＥ．ＤＨ５−α ｓｔｒａｉｎ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの如き種からの株、並びに
ｂ）真核宿主細胞：ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＣＬ２；Ｎｏ ＣＣＬ２．１；Ｎｏ ＣＣＬ２．２）、Ｃｖ １細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＲＬ１６５０；Ｎｏ ＣＲＬ１６５１）、Ｓｆ−９細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＲＬ１７１１）、Ｃ１２７細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＲＬ−１８０４）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＲＬ−６３６１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＣＣＬ−６１）、ヒト腎臓２９３（ＡＴＣＣ Ｎｏ ４５５０４；Ｎｏ ＣＲＬ−１５７３）、ＢＨＫ（ＥＣＡＣＣＮｏ ８４１００５０１；Ｎｏ ８４１１１３０１）、ＰＬＣ細胞、ＨｅｐＧ２、及びＨｅｐ３Ｂ。
【０２５６】
上記宿主細胞内の構築物は組換え配列によりコードされる遺伝子産物を作出するために慣用の方法で使用されうる。
好適な宿主の形質転換及び上記宿主の適切な細胞濃度への成長に続いて、上記選択されたプロモーターは温度移行又は化学誘導の如き、適切な方法により誘導され、そして細胞は追加の期間培養される。
【０２５７】
細胞は典型的に遠心分離により回収され、物理的又は化学的方法により破壊され、及び生ずる粗い抽出物がさらなる精製のために保持される。
【０２５８】
タンパク質の発現において使用される微生物細胞は、凍結融解周期、超音波処理、機械的破壊又は細胞溶解剤の使用を含む、慣用の方法により破壊されうる。上記方法は当業者に周知である。
【０２５９】
さらに、本発明にしたがって、これらの組換え細胞は動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはマウス、ラット、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、及びヒトを含まない霊長類から成る群から選ばれるものにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで作出されうる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで作出された組換え細胞も例えば、後に動物において外科的に移植されうる。ｉｎ ｖｉｖｏの組換え細胞を作出する方法は本分野で周知である。
【０２６０】
本発明は：ａ）外因性（異種の）ポリヌクレオチドを標的遺伝子の内因性の染色体ＤＮＡに挿入する、ｂ）内因性の染色体ＤＮＡを欠失させる、及び／又はｃ）内因性の染色体ＤＮＡを外因性のポリヌクレオチドで置換するよう作り変えられた、脊椎動物起源、好ましくは哺乳類起源及び特にヒト起源の初代の、二代目の、及び不死化された相同的に組換えた宿主細胞をも含む。ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失、及び／又は置換は標的遺伝子のコード配列で及び／又は上記標的遺伝子と実施可能に関連したプロモーター及びエンハンサー配列の如き、調節領域でありうる。
【０２６１】
本発明はさらにｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで相同的に組換えられた宿主細胞を作出する方法に関連し、ここで、上記細胞で通常には発現されない標的遺伝子の発現は変化される。好ましくは、上記変化は通常の成長条件下又は標的遺伝子によりコードされるポリペプチドを作出するために好適な条件下で標的遺伝子の発現を引き起こす。上記方法は：（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでポリヌクレオチド構築物、（ｉ）標的配列；（ｉｉ）調節配列及び／又はコード配列；及び（ｉｉｉ）必要であれば、それによりトランスフェクトされた細胞を作出する対になっていないスプライスドナー部位を含むポリヌクレオチド構築物で上記細胞をトランスフェクトする；及び（ｂ）相同組換えに適切な条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞を維持する段階を含む。
【０２６２】
本発明はさらに、（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでポリヌクレオチド構築物、（ｉ）標的配列；（ｉｉ）調節配列及び／又はコード配列；及び（ｉｉｉ）必要であれば、それによりトランスフェクトされた細胞を作出する、対になっていないスプライスドナー部位を含むポリヌクレオチド構築物で上記細胞をトランスフェクトする；及び（ｂ）それにより相同的に組換えられた細胞を作出する、相同組換えに適切な条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞を維持する；及び（ｃ）上記遺伝子の発現に適切な条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで相同的に組換えられた細胞を維持する段階を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで細胞内で標的化された遺伝子の発現を変化させる方法に関連し、ここで、上記遺伝子は上記細胞内で通常には発現されない。
【０２６３】
本発明はさらに、ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでポリヌクレオチド構築物、（ｉ）標的配列；（ｉｉ）調節配列及び／又はコード配列；及び（ｉｉｉ）必要であれば、それによりトランスフェクトされた細胞を作出する、対になっていないスプライスドナー部位を含むポリヌクレオチド構築物で上記細胞をトランスフェクトする；（ｂ）それにより相同的に組換えられた細胞を作出する、相同組換えに適切な条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞を維持する；及びそれにより上記ポリペプチドを作出する、上記遺伝子の発現に適切な条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで相同的に組換えられた細胞を維持する段階を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで細胞内で標的化された内因性の遺伝子の発現を変化させることにより本発明に係るポリペプチドを作出する方法に関し、ここで上記遺伝子は細胞内で通常には発現されない。
【０２６４】
本発明はさらに上記遺伝子が通常には発現されない細胞型内で、標的化された遺伝子の発現を変化させるポリヌクレオチド構築物にも関する。これは、ポリヌクレオチド構築物が標的細胞の染色体ＤＮＡ内へ挿入されるとき起こり、ここで、上記ポリヌクレオチド構築物は：ａ）標的配列；ｂ）調節配列及び／又はコード配列；及びｃ）必要であれば、対になっていないスプライスドナー部位を含む。上記に示されるポリヌクレオチド構築物もさらに含まれ、ここで、上記構築物はさらにポリペプチドをコードする及び染色体ＤＮＡでの相同組換えの後に標的内因性遺伝子のフレーム内にあるポリヌクレオチドを含む。
【０２６５】
上記組成物は作出されうる、及び方法は米国特許第６，０５４，２８８号；第６，０４８，７２９号；第６，０４８，７２４号；第６，０４８，５２４号；第５，９９４，１２７号；第５，９６８，５０２号；第５，９６５，１２５号；第５，８６９，２３９号；第５，８１７，７８９号；第５，７８３，３８５号；第５，７３３，７６１号；第５，６４１，６７０号；第５，５８０，７３４号；国際公開番号：ＷＯ ９６／２９４１１、ＷＯ ９４／１２６５０；及びＫｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０：７０５−７３０により示される科学記事中に示されるものの如き、本分野において知られる技術により行われ、そのそれぞれの開示はそれらを全体として本明細書中に援用する。
【０２６６】
哺乳類の、及び典型的にヒトの細胞におけるＧＭＧ−２遺伝子発現は不完全にさせられうる又はあるいはそれは本発明にしたがうＧＭＧ−２ポリヌクレオチドによる動物細胞のゲノム中のＧＭＧ−２遺伝子相対物の置換を伴うＧＭＧ−２ゲノム又はｃＤＮＡ配列の挿入で高められうる。これらの遺伝子変化は以前に示された特定のＤＮＡ構築物を用いて相同組換え事件により作出されうる。
【０２６７】
使用されうる宿主細胞の１種は、マウスの接合体の如き、哺乳類の接合体である。例えば、マウスの接合体は問題の精製したＤＮＡ分子、例えば、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３０μＭ スペルミン、及び７０μＭ スペルミヂンを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２５０μＭ ＥＤＴＡ中でＢＡＣ挿入物については１ｎｇ／ｍｌ〜Ｐ１バクテリオファージ挿入物については３ｎｇ／μｌの濃度範囲に以前に調節された精製したＤＮＡ分子でのマイクロインジェクションを経験しうる。マイクロインジェクションされるべきＤＮＡが大きな大きさを有するとき、Ｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ（（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２（６４１７）：２５８−６１）により示されるように、ポリアミン及び高塩濃度がこのＤＮＡの機械的な破壊を避けるために使用されうる。
【０２６８】
本明細書中で示されるＤＮＡ構築物を含む、本発明に係るポリヌクレオチドのいずれか１は胚性幹（ＥＳ）細胞系，好ましくはマウスＥＳ細胞系中に導入されうる。ＥＳ細胞系は移植前未分化胚芽細胞の内部細胞マスの多分化能の、拘束されていない細胞に由来する。好ましいＥＳ細胞系は以下のものである：ＥＳ−Ｅ１４ＴＧ２ａ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１８２１）、ＥＳ−Ｄ３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１９３４及びＮｏ． ＣＲＬ−１１６３２）、ＹＳ００１（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−１１７７６）、３６．５（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−１１１１６）。ＥＳ細胞を拘束されていない状態に維持するために、それらはこの胚の表現型を保存する適切なシグナルを提供する及びＥＳ細胞粘着のためのマトリックスとしてはたらく成長を阻害されたフィーダー細胞の存在下で培養される。好ましいフィーダー細胞はＡｂｂｏｎｄａｎｚｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２２５：８０３−２３）により示されるように、培養中に維持された実質上いかなるマウス株の１３日〜１４日胚の組織からも確立された及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎ（（１９８７）Ｅｍｂｒｙｏ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ． Ｉｎ： Ｅ．Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ Ｅｄ． Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ）により示されるように、照射により又はＰｅａｓｅ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ（１９９０；Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １９０（２）：２０９−１１）により示されるように、ＬＩＦの阻害的濃度の存在により成長を阻害された初代胚線維芽細胞である。
【０２６９】
宿主細胞中の構築物は組換え配列によりコードされた遺伝子産物を作出するために慣用の方法で使用されうる。
【０２７０】
好適な宿主の形質転換及び上記宿主の適切な細胞濃度への成長に続いて、上記選択されたプロモーターが温度移行又は化学誘導の如き、適切な方法により誘導され、及び細胞は追加の期間培養される。細胞は典型的に遠心分離により回収され、物理的又は化学的方法により破壊され、そして生ずる粗い抽出物はさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現において使用される微生物細胞は凍結融解周期、超音波処理、機械的破壊又は細胞溶解剤の使用を含む、いかなる慣用の方法によっても破壊されうる。上記方法は当業者に周知である。
【０２７１】
ＩＶ． トランスジェニック動物
本発明は組換えＧＭＧ−２ポリペプチド、すなわち、組換えｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片又は全長ＧＭＧ−２ポリペプチドを発現する非ヒト動物及び植物の作出のための方法及び組成物をも提供する。上記動物又は植物はトランスジェニックでありうる、すなわち、それらの細胞のそれぞれはＧＭＧ−２ポリペプチドをコードする遺伝子を含む、又はあるいは、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは動物又は植物の体細胞内へ、例えば、哺乳類の乳房の分泌上皮細胞内へ導入されうる。好ましい態様においては、上記非ヒト動物はウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ又はウサギの如き哺乳類である。さらに好ましい態様においては、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片又は前記全長ＧＭＧ−２ポリペプチドをコードする前記遺伝子は配列ＩＤ番号：５のポリヌクレオチドを含む。
【０２７２】
哺乳類の如きトランスジェニック動物を作出する方法は当業者に周知であり、そして上記方法は本発明において使用されうる。簡単に述べると、トランスジェニック哺乳類は、例えば、問題のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでＥＳ細胞の如き多分化能の幹細胞をトランスフェクトすることにより作出されうる。うまく形質転換されたＥＳ細胞はその後初期段階の胚に導入されることができ、その後それは同じ種の哺乳類の子宮内へ移植される。いくつかの場合、上記形質転換された（「トランスジェニックの」）細胞は生ずる動物の生殖細胞系の部分を含むであろう、及び生殖細胞系にトランスジェニック細胞を含む成体動物はその後他の動物と交配されるとこができ、それにより最終的にそれらの細胞のそれぞれにトランスジーンを有するトランスジェニック動物の集団を作出し、及びそれはそれらの子孫のそれぞれに上記トランスジーンを安定的に受け渡しうる。上記ポリヌクレオチドを導入する他の方法は、例えば、問題のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを受精した卵又は初期段階の胚にマイクロインジェクションにより導入して使用されうる。あるいは、上記トランスジーンは上記トランスジーンを含むレトロウイルスでの接合体の感染により動物内に導入されうる（Ｊａｅｎｉｓｃｈ， Ｒ．（１９７６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７３， １２６０−１２６４）。トランスジェニック動物の作出方法は、例えば、Ｗａｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９２ ４９（２）：１１３−２０；Ｈｏｇａｎ， ｅｔ ａｌ．（１９８６）ｉｎ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．中に；ＷＯ ９１／０８２１６中に；又は米国特許第４，７３６，８６６号中に示される。
【０２７３】
好ましい方法においては、上記ポリヌクレオチドは受精した卵母細胞内へマイクロインジェクトされる。典型的に、受精した卵母細胞は標準の技術を用いてマイクロインジェクトされ、及びその後「移植前胚」が得られるまでｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される。上記移植前胚は好ましくは約１６〜１５０細胞を含む。受精した卵母細胞を移植前段階まで培養する方法は、例えば、Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（（１９８４）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １０１，４１４）；Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．（（１９８６）ｉｎ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ）（マウス胚について）；Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ， ３１５， ６８０）（ウサギ及びブタの胚について）；Ｇａｎｄｏｌｆｉ ｅｔ ａｌ．（（１９８７）Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔ ８１， ２３−２８）；Ｒｅｘｒｏａｄ ｅｔ ａｌ．（（１９８８）Ｊ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ ６６， ９４７−９３５）（ヒツジの胚について）；及びＥｙｅｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（（１９８９）Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔ ８５， ７１５−７２０；Ｃａｍｏｕｓ ｅｔ ａｌ．（（１９８４）Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔ ７２， ７７９−７８５）；及びＨｅｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．（（１９８７）Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２７， ５９６８）（ウシの胚について）により示され、そのそれぞれの開示はそれらを全体として本明細書中に援用する。移植前胚はその後上記トランスジーンが導入されたときの発達段階に因り、トランスジェニック又はキメラ動物の誕生を可能にするために標準の方法により適切な雌に移植される。
【０２７４】
トランスジーン導入の頻度はしばしば低いので、移植前胚におけるトランスジーン統合の検出がしばしば本明細書中に示される方法のいずれかを用いて所望される。いくつかの方法のいずれかは移植前胚においてトランスジーンの存在を検出するために使用されうる。例えば、１以上の細胞が移植前胚から除去されることができ、そして上記除去された細胞（単一）又は細胞（複数）におけるトランスジーンの存在又は不在は標準の方法、例えば、ＰＣＲを用いて検出されうる。あるいは、トランスジーンの存在は標準の方法を用いて子宮内又は分娩後に検出されうる。
【０２７５】
本発明の特定の好ましい態様においては、それらの乳中に組換えＧＭＧ−２ポリペプチドを分泌するトランスジェニック哺乳類が作出される。乳腺は高く効果的なタンパク質産生器官であるので、上記方法はリットル当たりグラムの範囲の、及びしばしば顕著にもっと多くのタンパク質濃度を作出するために使用されうる。好ましくは、乳腺における発現は乳腺特異的プロモーター及び、場合により、他の調節エレメントに上記ＧＭＧ−２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを実施可能に連結することにより達成される。好適なプロモーター及び他のエレメントは、非限定的に、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターに加えて、哺乳類の短い及び長いＷＡＰ、アルファ、ベータ、及びカッパー、カゼイン、アルファ及びベータラクトグロブリン、ベータ−ＣＮ ５’遺伝子に由来するものを含む。上記プロモーター及び他のエレメントは、非限定的に、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウサギ、及びモルモットを含む、哺乳類に由来しうる。プロモーター及び他の調節配列、ベクター及び他の関連技術は、例えば、Ｃｌａｒｋ（１９９８）Ｊ Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ３：３３７−５０；Ｊｏｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：１６０−４；米国特許第５，９９４，６１６号；第６，１４０，５５２号；第６，０１３，８５７号；Ｓｏｈｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １８：８４５−５２；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ （Ｊａｐａｎ）１２６：３２０−５；Ｓｏｕｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｅｕｒｏ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６０：５３３−９；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｈｉｎ Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈ １３：２７１−６；Ｒｉｊｎｋｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｔｒａｎｓｇｅｎ Ｒｅｓ ７：５−１４；Ｋｏｒｈｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｅｕｒｏ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２４５ ：４８２−９；Ｕｕｓｉ−Ｏｕｋａｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｔｒａｎｓｇｅｎ Ｒｅｓ ６：７５−８４；Ｈｉｔｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ７：２４７−５２；Ｐｌａｔｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｔｒａｎｓｇｅｎ Ｒｅｓ ３：９９−１０８；Ｈｅｎｇ−Ｃｈｅｒｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｎｉｍａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ ４：８９−１０７；及びＣｈｒｉｓｔａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｕｒｏ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６７：１６６５−７１により提供され、そのそれぞれの全体の開示は本明細書中に援用する。
【０２７６】
他の態様においては、本発明に係るポリペプチドは上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｖｏで乳腺の体細胞、例えば、乳房の分泌上皮細胞に導入することにより乳中に作出されうる。例えば、プラスミドＤＮＡは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストランと関連して（例えば、Ｈｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １５２３：１６１−１７１を参照のこと）、上記構築物の受容体仲介エンドサイトーシスを引き起こしうるリガンドと関連して（例えば、Ｓｏｂｏｌｅｖ ｅｔ ａｌ．（１９９８）２７３：７９２８−３３を参照のこと）乳頭管をとおして又はレトロウイルスベクター、例えば、Ｇｉｂｂｏｎサル白血病ウイルスの如きウイルスベクターで（例えば、Ａｒｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：６８４０−６８４４を参照のこと）融合されうる。これらの態様のいずれにおいても、上記ポリヌクレオチドは上記に示されるように、乳腺特異的プロモーター又はあるいは、ＣＭＶ若しくはＭｏＭＬＶ ＬＴＲの如き強く発現するプロモーターに実施可能に連結されうる。
【０２７７】
本発明における使用のためのベクター、プロモーター、調節エレメント等の好適性は乳房上皮細胞、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭａｃＴ細胞（ウシ乳房上皮細胞）又はＧＭＥ細胞（ヤギ乳房上皮細胞）の如き、細胞に事前にトランスフェクトすること、及び上記細胞におけるトランスジーンのトランスフェクション及び発現の効率を評価することにより評価されうる。
【０２７８】
ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために、上記ポリヌクレオチドはいかなる濃度範囲（例えば、１〜５００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜１００μｇ／ｍｌ）でも、いかなる容積（例えば、１〜１００ｍｌ、好ましくは１〜２０ｍｌ）でも、好適な調剤中で投与されることができ、そして何回（例えば、１、２、３、５又は１０回）でも、どんな頻度（例えば、１、２、３，５、１０又は何日毎）でも、投与されうる。好適な濃度、頻度、投与様式等は特定のポリヌクレオチド、ベクター、動物等に因るであろう、そして当業者により容易に決定されうる。
【０２７９】
好ましい態様においては、Ｇｉｂｂｏｎサル白血病ウイルスベクターの如きレトロウイルスベクターがＡｒｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：６８４０−６８４４）中に示されるように使用される。レトロウイルス感染は典型的に細胞分裂を必要とするので、乳腺における細胞分裂は、例えば、エストラヂオールベンゾエート、プロゲステロン、レゼルピン又はデキサメタゾンの如き因子を用いて、上記ベクターの投与と共に刺激されうる。さらに、レトロウイルス及び他の感染方法はポリブレンの如き付属の化合物を用いて促進されうる。
【０２８０】
乳からＧＭＧ−２ポリペプチドを得るための本明細書中に示される方法のいずれにおいても、得られる乳の量、及びしたがって作出されるＧＭＧ−２ポリペプチドの量は、乳汁分泌誘導の標準の方法を用いて、例えば、ヘキセストロール、エストロゲン、及び／又はプロゲステロンを用いて高められうる。
【０２８１】
上記態様において使用されるポリヌクレオチドは全長ＧＭＧ−２ポリペプチド又はｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードしうる。典型的に、上記コードされたポリペプチドは乳中への上記タンパク質の分泌を確実にするためにシグナル配列を含むであろう。全長ＧＭＧ−２配列が使用される場合、上記全長タンパク質は、例えば、乳から単離され、そして好適なプロテアーゼを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで切断されうる。あるいは、第二の、プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドが上記動物内へ又は乳腺細胞内へ導入されることができ、これによりプロテアーゼの発現はｉｎ ｖｉｖｏでのＧＭＧ−２ポリペプチドの切断をもたらし、それにより乳からのｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の直接の単離が可能になる。
【０２８２】
Ｖ． 本発明に係る医薬の又は生理学的に許容される組成物
本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は単独で又はそれらが好適な担体又は賦形剤と混合される医薬の又は生理学的に許容される組成物中で非ヒト動物及び／又はヒトに投与されうる。上記医薬の又は生理学的に許容される組成物はその後治療的に有効な量で提供される。治療的に有効な量とは本明細書中で示される方法により決定される肥満関連疾患又は障害の症状又は生理学的状態の予防又は緩和をもたらすのに十分なｇＧＭＧ−２断片の量をいう。治療的に有効な用量は美容理由のためにこの影響を所望するヒトにおいて体重減少又は体重増加の予防又は体重増加の割合における増大の予防のために必要なｇＧＭＧ−２断片の量をいう。本発明に係るｇＧＭＧ−２断片の治療的に有効な用量は継続した期間の使用又は投与で体重減少又は体重増加を促進するのに十分な量である。ＧＭＧ−２ポリペプチド断片の調合及び投与の技術は“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ中に見られうる。
【０２８３】
本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片が治療する又は予防するために使用されうる他の疾患又は障害は、非限定的に、肥満及び肥満、損なわれたグルコース耐性、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、アテロームの疾患、心疾患、高血圧、卒中、シンドロームＸ、非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ又はＩＩ型糖尿病）及びインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ又はＩ型糖尿病）の如き、肥満関連疾患及び障害を含む。本発明に係る方法により処置されるべき糖尿病関連合併症は細小血管病変、眼の病変、網膜症、神経障害、及び腎臓病変を含む。心疾患は、非限定的に、心不全、冠状動脈不全、及び高血圧を含む。本発明に係る化合物により処置されるべき他の肥満関連障害は高脂血症及び尿酸過剰血症を含む。本発明に係るさらに他の肥満関連疾患又は障害は悪液質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、癌関連体重減少、食欲不振、及び過食症を含む。上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は仕事又は運動の間の身体のパフォーマンスを高める又は一般の健康意識を高めるためにも使用されうる。身体のパフォーマンス活性は、歩く、走る、飛ぶ、持ち上げる及び／又は登ることを含む。
【０２８４】
上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片又はそのアンタゴニストも脂肪酸代謝、より特には、いくつかの長鎖多不飽和脂肪酸の産出を調節することにより失読症、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、注意欠陥／活動過剰障害（ＡＤＨＤ）、及び統合失調症の如き精神障害を治療するためにも使用されうる。さらに好ましい態様は、治療の必要のある患者に（あるいは時間を決めた日の基礎で）、前記動物又はヒト患者において前炎症性サイトカイン及び／又は（ｉｉ）細胞接着分子値を減少させるのに十分な用量及び期間で、ホモ三量体ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片（又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を投与することを含む、アテローム性動脈硬化症の如き、炎症関連障害の予防又は治療のための方法に関する。
【０２８５】
本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は単独で又は他の医薬として又は生理学的に許容される化合物と共に提供されうることが明白に考えられる。肥満及び他の疾患及び障害の治療に有用な他の化合物は最近本分野で周知である。
【０２８６】
好ましい態様においては、上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は本明細書中で示される及び本分野において知られる方法を用いてインスリン抵抗性及び糖尿病の治療に有用であり、そこで使用される。より特に、好ましい態様は動物又はヒト患者におけるグルコース代謝の治療的改変及び調節のためのプロセスに関し、それは処置の必要のある患者に（あるいは時間を決めた日の基礎で）前記動物又はヒト患者において血漿グルコース値を減少させるのに十分な投与量及び期間で、ＧＭＧ−２ポリペプチド断片（又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を投与することを含む。
さらなる好ましい態様は処置の必要のある患者に（あるいは時間を決めた日の基礎で）前記動物又はヒト患者において血漿グルコース値を減少させるのに十分な投与量及び期間で、ＧＭＧ−２ポリペプチド断片（又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を投与することを含む、糖尿病の予防又は治療のための方法に関連する。
【０２８７】
投与経路
好適な投与経路は、本分野において知られる方法を用いた、包膜内の、直接の室内の、静脈内の、腹腔内の、鼻内の、肺内の（吸入の）又は眼内の注入に加えて、経口の、鼻の、直腸の、粘膜を介した又は小腸の投与、筋内、皮下、髄内注入を含む非経口デリバリーを含む。体重減少を促進させるための化合物を投与する特に有用な方法は、例えば、ＧＭＧ−２又はｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を延長された期間デリバリーするための装置の、受容者の腹腔への外科的埋め込みを含む。他の特に好ましい投与経路はエーロゾル及び補給調剤である。本発明の医薬の維持された放出調剤、特に補給剤は明白に企図される。
【０２８８】
組成物／調合
本発明にしたがう使用のための医薬の又は生理学的に許容される組成物及び医薬は賦形剤及び補助剤を含む１以上の生理学的に許容される担体を用いて慣用の方法で調合されうる。適切な調剤は選択される投与経路に因る。
本明細書中に示されるいくつかの医薬は医薬として又は生理学的許容される担体及び少なくとも１の本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片であるポリペプチドを含むであろう。注入のために、本発明に係る剤は水溶液中に、好ましくはＨａｎｋ’ｓ溶液、Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ溶液の如き生理学的に融和性の緩衝液又はリン酸又は重炭酸緩衝液の如き生理学的塩緩衝液中に調合されうる。粘膜を介した投与のために、浸透されるべき境界に対して適切な浸透剤が調剤中に使用される。上記浸透剤は一般的に本分野において知られる。
【０２８９】
経口で取られうる医薬の又は生理学的に許容される調製物は、ゼラチン及びグリセロール又はソルビトールの如き可塑剤から成るやわらかい、密閉されたカプセルに加えて、ゼラチンから成る押しばめカプセルを含む。上記押しばめカプセルはラクトースの如き充填剤、デンプンの如き結合剤、及び／又はタルク又はステアリン酸マグネシウムの如き潤滑剤、及び、場合により、安定化剤と混合された活性成分を含みうる。やわらかいカプセルにおいて、上記活性化合物は脂っぽい脂、液体パラフィン又は液体ポリエチレングリコールの如き、好適な液体中に溶解又は懸濁されうる。さらに、安定化剤が添加されうる。経口投与のための全ての調剤は上記投与のために好適な投与量であるべきである。
【０２９０】
頬の投与のために、上記組成物は慣用の方法で調合される錠剤又は舐剤の形態をとりうる。
吸入による投与のために、本発明にしたがう使用のための化合物は、好適な気体の駆出剤、例えば、二酸化炭素の使用を伴って、加圧パック又は噴霧器からのエーロゾルスプレイ提示の形態で便利にデリバリーされる。加圧エーロゾルの場合、上記投与単位は計測された量デリバリーするための弁を提供することにより決定されうる。吸入器又は粉吹き器における使用のための、例えば、ゼラチンから成るカプセル及びカートリッヂは化合物及びラクトース又はデンプンの如き好適な粉末基礎の粉末混合物を含んで調合されうる。
【０２９１】
上記化合物は注入による、例えば、ボーラス注入又は連続した融合による非経口投与のために調合されうる。注入のための調剤は単位投与形態で、添加された保存剤と共に、例えば、アンプルで又は複数の用量の容器で提示されうる。上記組成物は水性媒体中の懸濁物、溶液又はエマルジョンの如き形態をとりうる、及び懸濁、安定化及び／又は分散剤の如き調合剤を含みうる。
【０２９２】
非経口投与のための医薬の又は生理学的に許容される調剤は水溶性形態の活性化合物の水溶液を含む。水性懸濁物はカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランの如き、上記懸濁物の粘性を増大させる物質を含みうる。場合により、上記懸濁物は高く濃縮された溶液の調製を可能にするために好適な安定化剤又は上記化合物の溶解性を増大させる剤をも含みうる。
【０２９３】
あるいは、上記活性成分は、使用前に、滅菌ピローゲンフリー水の如き、好適な媒体を伴う構成のための粉末の又は凍結乾燥された形態で存在しうる。
以前に示された調剤に加えて、上記化合物は補給調製物としても調合されうる。上記長期活性調剤は埋め込み（例えば、皮下に又は筋内に）により又は筋内注入により投与されうる。したがって、例えば、上記化合物は好適な重合体の又は疎水性の材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）若しくはイオン交換樹脂と共に又はゆるやかに溶解する誘導体として、例えば、ゆるやかに溶解する塩として調合されうる。
【０２９４】
さらに、上記化合物は治療用剤を含む固体の疎水性重合体の半浸透性マトリックスの如き、維持された放出系を用いてデリバリーされうる。さまざまな維持された放出材料が確立されており、そして当業者に周知である。維持された放出カプセルはそれらの化学的性質に因り、数週間〜１００日間にわたり上記化合物を放出しうる。
上記治療用試薬の化学的性質及び生物学的安定性に因り、タンパク質安定化のための追加の策が使用されうる。
【０２９５】
上記医薬の又は生理学的に許容される組成物は好適な固体又はジェル相の担体又は賦形剤を含みうる。上記担体又は賦形剤の例は、非限定的に、カルシウムカーボネート、リン酸カルシウム、さまざまな糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、及びポリエチレングリコールの如き重合体を含む。
【０２９６】
効果的な用量
本発明における使用のための好適な医薬の又は生理学的に許容される組成物は上記活性成分がそれらの意図された目的を達成するために有効な量で含まれる組成物を含む。より特には、治療として有効な量は処置されるべき患者の存在する症状の発展を妨げるために又は緩和するために有効な量を意味する。上記有効な量の決定は、特に本明細書中に提供される詳細な開示の観点で、当業者の能力の範囲内である。
【０２９７】
本発明に係る方法において使用される化合物のために、上記治療的に有効な用量ははじめに細胞培養分析から見積もられうる。例えば、用量はｉｎ ｖｉｔｒｏ系におけるレプチン又はリポタンパク質取り込み又は結合を増大させるために示される濃度点又は範囲を含む又は包含する循環濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて調合されうる。上記情報はヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用されうる。
【０２９８】
治療的に有効な用量は患者における症状の緩和をもたらす化合物の量をいう。上記化合物の毒性及び治療的有効性は、例えば、ＬＤ５０（試験集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ５０（上記集団の５０％中で治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養又は実験動物において標準の医薬手順により決定されうる。毒性及び治療的有効性の間の上記用量の割合は治療的指標であり、そしてそれはＬＤ５０及びＥＤ５０の間の割合として表現されうる。高い治療的指標を示す化合物は好ましい。
【０２９９】
これらの細胞培養分析及び動物研究から得られたデータはヒトにおける使用のための用量範囲の調合において使用されうる。上記化合物の用量は好ましくは、ほとんど又は全く毒性を伴わないで、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。上記用量は使用される投与形態及び利用される投与経路に因り、この範囲内で変化しうる。上記厳格な調剤、投与経路及び投与量は患者の状態の観点から個々の医師により選択されうる（例えば、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．， １９７５， ｉｎ “Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”， Ｃｈ．１を参照のこと）。
【０３００】
投与量及び間隔は、特定の状況に因り、体重減少又は増加を維持する又は予防するために十分な上記活性化合物の血漿値を提供するために個々に調節されうる。これらの効果を達成するために必要な用量は個体の性質及び投与経路に因るであろう。
【０３０１】
投与間隔は最小有効濃度についての値を用いて決定されうる。化合物は１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％；及び最も好ましくは５０〜９０％の期間、血漿値を上記最小有効濃度超に保つ投与計画を用いて投与されるべきである。局所投与又は選択的取り込みの場合、上記薬物の有効な局所濃度は血漿濃度に関連しえない。
【０３０２】
組成物の量は、もちろん、処置されるべき患者に、患者の体重、苦痛の重篤さ、投与様式及び主治医の判断に因るであろう。
循環血漿トリグリセリドリッチリポタンパク質の値における減少を含む、所望の結果を達成するために日で又は規則的な基礎で投与されうる、本発明に係るＧＭＧ−２ポリペプチド断片の量のための好ましい投与範囲は０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇボディマスに及ぶ。より好ましい投与範囲は０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇである。もちろん、これらの日の用量は日の過程の間定期的に少量でデリバリーされ又は投与されうる。これらの用量範囲は好ましい範囲であるのみであり、本発明の限定ではないと意図されることが留意される。
【０３０３】
ＶＩ． 治療方法
ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片でのマウスの治療は増大した筋肉酸化に加えて、減少したトリグリセリド値、減少した遊離脂肪酸値、減少したグルコース値、及び減少した体重をもたらす。
【０３０４】
本発明は上記治療の必要のある個体に本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を提供することを含む肥満関連疾患及び障害を予防する又は治療する方法についてｉｎｔｅｒ ａｌｉａで示される。好ましくは、上記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片はｉｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで肥満関連活性を有する。好ましくは上記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は好ましくは経口で取られる医薬組成物中で個体に提供される。好ましくは、上記個体は哺乳類、及び最も好ましくはヒトである。好ましい態様においては、上記肥満関連疾患又は障害はアテローム性動脈硬化症、心血管疾患、損なわれたグルコース耐性、インスリン抵抗性、高血圧、卒中、シンドロームＸ、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病及び脂肪組織萎縮性糖尿病から成る群から選ばれる。本発明に係る方法により処置されるべき糖尿病関連合併症は細小血管病変、眼の病変、網膜症、神経障害、及び腎臓病変を含む。心疾患は、非限定的に、心不全、冠状動脈不全、及び高血圧を含む。本発明に係る化合物により処置されるべき他の肥満関連障害は高脂血症、高トリグリセリド血症、及び尿酸過剰血症を含む。本発明に係るさらに他の肥満関連疾患又は障害は悪液質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、新生物関連体重減少、食欲不振、及び過食症を含む。非常に好ましい態様においては、医薬組成物中のＧＭＧ−２ポリペプチドポリペプチド断片が美容理由のために健康な個体において体重を調節するために使用される。
【０３０５】
本発明は上記治療の必要のある個体に（本発明の好ましい態様の節ＶＩ中及び実施例中で示される）本発明に係る分析により同定された化合物を提供することを含む、肥満関連疾患及び障害を予防する又は治療する方法をも特徴付ける。好ましくは、これらの化合物はｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞、ｅｘ ｖｉｖｏで筋肉において又は動物モデルにおいてｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の効果に拮抗する又は作用する。あるいは、これらの化合物はレプチン及び／又はリポタンパク質取り込み及び／又は結合へのｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の効果に作用する又は拮抗する。場合により、これらの化合物はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片のＬＳＲとの相互作用、結合又は取り込みを妨げる。好ましくは、上記化合物は好ましくは経口で取られる医薬組成物中で個体に提供される。好ましくは、上記個体は哺乳類、及び最も好ましくはヒトである。好ましい態様においては、上記肥満関連疾患又は障害は肥満及びアテローム性動脈硬化症、心疾患、損なわれたグルコース耐性、インスリン抵抗性、高血圧、卒中、シンドロームＸ、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、及び脂肪萎縮性糖尿病の如き、肥満関連疾患及び障害から成る群から選ばれる。本発明に係る方法により処置されるべき糖尿病関連合併症は細小血管病変、眼の病変、網膜症、神経障害、及び腎臓病変を含む。心疾患は、非限定的に、心不全、冠状動脈不全、及び高血圧を含む。本発明に係る化合物により処置されるべき他の肥満関連障害は高脂血症、高トリグリセリド血症、及び尿酸過剰血症を含む。本発明に係るさらに他の肥満関連疾患又は障害は悪液質、るいそう、ＡＩＤＳ関連体重減少、新生物関連体重減少、食欲不振、及び過食症を含む。非常に好ましい態様においては、上記医薬組成物は美容理由のための体重減少を調節するために使用される。
【０３０６】
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的許容される組成物の本発明はインスリン療法と共に、いくつかの個体、特にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病又はインスリン抵抗性を有する者において、血中グルコースを制御するための方法として使用されうる。またさらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明は、非限定的に、アテローム性動脈硬化症、冠状心疾患、心筋梗塞、及び播種性血管内共凝集を含む、炎症性障害を治療するための方法として使用されうる。
【０３０７】
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン療法と共に、いくつかの個体、特にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病又はインスリン抵抗性を有する者において体重を制御するための方法として使用されうる。
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン療法を伴わずに、単独で、いくつかの個体、特にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病又はインスリン抵抗性を有する者において、血中グルコースを制御するための方法として使用されうる。
【０３０８】
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン療法を伴わずに、単独で、いくつかの個体、特にＩＩ型糖尿病又はインスリン抵抗性を有する者において、体重を制御するための方法として使用されうる。
【０３０９】
さらに好ましい態様においては、本発明は補充的な治療において、特にいくつかの個体、特にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病又はインスリン抵抗性を有する者において、経口インスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤と共に、それらの体重又はグルコース制御を改善するために使用されうる。好ましくは、上記経口インスリン分泌促進剤は１，１−ヂメチル−２−（２−モルフォリノフェニル）グアニヂンフマル酸（ＢＴＳ６７５８２）又はトルブタミド、トラザミド、クロルプロパミド、グリベンクラミド、グリメピリド、グリピジド及びグリダジドから選ばれるスルフォニル尿素である。好ましくは、上記インスリン増感剤はメトフォルミン、シグリタゾン、トログリタゾン及びピログリタゾンから選ばれる。
【０３１０】
本発明はさらにインスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤を伴わずに、単独で、いくつかの個体、特にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病又はインスリン抵抗性を有する者の体重又はグルコース制御を改善する方法を提供する。
【０３１１】
さらに好ましい態様においては、本発明は、例えば、同時に、別々に又は（分泌促進剤の前若しくは後又は増感剤の前若しくは後に）連続して使用される別々の投与単位の形態で、経口インスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤と付随して又は同時に投与されうる。したがって、本発明はさらにいくつかの個体、特にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病又はインスリン抵抗性を有する者における体重又はグルコース制御の改善のための同時の、別々の又は連続した使用のための混合された調製物として医薬の又は生理学的に許容される組成物及び経口インスリン分泌促進剤又はインスリン増感剤の組成物を提供する。
【０３１２】
さらなる好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はさらにインスリン増感剤としての使用のための方法を提供する。
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン療法と共に、いくつかの個体、特にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病又はインスリン抵抗性を有する者においてインスリン感受性を改善するための方法として使用されうる。
【０３１３】
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はインスリン療法を伴わずに、いくつかの個体、特にＩＩ型糖尿病又はインスリン抵抗性を有する者においてインスリン感受性を改善するための方法として使用されうる。
さらに好ましい態様においては、前記医薬の又は生理学的に許容される組成物の本発明はさらに損なわれたグルコース耐性からインスリン抵抗性への進行の阻害剤としての使用のための方法を提供する。
【０３１４】
より一般には、本発明は、個体がＧＭＧ−２マーカーについて特定の遺伝子型を有することが示される又はそれらがコントロール値、例えば、非疾患個体の代表的な値に比較して又は疾患又は状態の開始前のその個体に比較して、減少された量の血漿ＧＭＧ−２、全長又は好ましくはＧＭＧ−２のより生物学的に活性な断片を有することが示される、ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片での治療について示される。どちらの場合にも、治療は医薬として許容されるｇＧＭＧ−２又はＧＭＧ−２ポリペプチド断片を上記個体に提供することを含む。提供されるｇＧＭＧ−２断片の厳格な量は医師の案内の下の臨床試験をとおして決定されるであろうが、１日当たり１個体当たり５〜７ｍｇの範囲内であることが予想されるであろう。一般的に、好ましい範囲は１日当たり１個体当たり０．５〜１４ｍｇであろう、非常に好ましい範囲は１日当たり１個体当たり１〜１０ｍｇである。ｇＧＭＧ−２又はＧＭＧ−２ポリペプチド断片での治療から恩恵を得うる個体は少なくとも２の方法：血漿血清値決定及び遺伝子タイピングをとおして同定されうる。
【０３１５】
ＧＭＧ−２値
予備研究は肥満のヒトは非肥満のヒトより全長ＧＭＧ−２の低い値を有することを示した。本発明は全長ＧＭＧ−２の低い値を有する個体の本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片での治療を構想する。さらに、本発明は好ましくは低い値のＧＭＧ−２の生物学的に活性な断片を有する個体の本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片での治療について示される。さらなる態様においては、本発明に係るＧＭＧ−２又はＧＭＧ−２ポリペプチド断片は個体、好ましくは肥満個体に投与され、その全長ＧＭＧ−２（又はあるいは成熟ＧＭＧ−２ポリペプチド断片）の値は非肥満個体、好ましくは本分野における正常標準を用いて医師により決定された健康な個体の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、約１００％又は１００％より低い。個体において全長ＧＭＧ−２の値を決定する及び比較する方法は本分野において周知であり、そして、非限定的に、Ｒａｄｉｏ Ｉｍｍｕｎｅ Ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ドットブロットの如きフォーマットで又は例えば、分析の一部としてＧＭＧ−２に特異的な抗体を用いることを含む。ＳＮＰｓを有するタンパク質に対するものに加えて、ＧＭＧ−２及びその断片に対する抗体を作出する、及びＧＭＧ−２及びその断片を検出する方法は本発明に含まれ、そしてＰＣＴ／ＩＢ９９／０１８５８、米国出願第０９／４３４，８４８号、及びＷＯ ９９／０７７３６中で議論され、図画、図面又は表を含むそれらを全体として本明細書中に援用する。さらに、本発明に係るＧＭＧ−２／ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片に特異的な抗体、それらの作出、及びそれらの使用は本明細書中に示される。
【０３１６】
ＶＩＩ． ＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性の調節剤の同定のための分析
本発明は細胞内でｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性を調節する１以上の化合物についてのスクリーニング方法を特徴付け、それは上記細胞について試験されるべき可能性のある化合物を提供することを含み、そしてそこで、ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片効果又は活性の調節は１以上の化合物を示す。使用されうる例示的な分析は実施例４〜５、７〜１４、１６、及び１８中に示される。ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片単独の効果に比較した、それらの阻害性の又は刺激性の活性について試験されるべき化合物がこれらの分析に添加されるであろう。効果がｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の添加に基づいて観察される他の分析も細胞に対するｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性又はｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の存在の効果の調節剤についてスクリーニングするために使用されうる。重要な段階は未知の化合物を適用すること及びその後ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片のみが上記細胞に適用されるときに見られるものからの変化についての分析をモニターすることである。変化はｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片単独と比較して上記化合物及びｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の存在下で顕著に異なる何らかのものとして定義される。この場合、顕著に異なるは少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％の計測可能な効果における「増大」又は「減少」であろう。
【０３１７】
上記用語「調節」は、本明細書中で使用されるとき、活性における計測可能な変化をいう。例は、非限定的に、脂肪分解刺激された受容体（ＬＳＲ）調節、レプチン調節、リポタンパク質調節、血漿ＦＦＡ値、ＦＦＡ酸化、ＴＧ値、グルコース値、及び体重を含む。これらの効果はｉｎ ｖｉｔｒｏ又は好ましくはｉｎ ｖｉｖｏでありうる。活性の調節は上記活性における増大又は減少でありうる。したがって、ＬＳＲ活性は増大され又は減少されうる、レプチン活性は増大され又は減少されうる、及びリポタンパク質活性は増大され又は減少されうる。同様に、ＦＦＡ、ＴＧ、及びグルコース値（及び体重）はｉｎ ｖｉｖｏで増大され又は減少されうる、遊離脂肪酸化はｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで増大され又は減少されうる。
【０３１８】
「ＬＳＲ」活性により、そのレプチン及びリポタンパク質を結合する、取り込む及び分解する能力に加えて、上記細胞表面での、特に特定のコンフォメーションでのＬＳＲの発現が意味される。「レプチン」活性によりその血液脳関門を介した輸送、及び潜在的にＬＳＲが必ずしも仲介因子又は唯一の仲介因子ではないこれらの出現に加えて、そのＬＳＲによる結合、取り込み及び分解が意味される。同様に、「リポタンパク質」活性によりＬＳＲが必ずしも仲介因子又は唯一の仲介因子ではないこれらの出現に加えて、ＬＳＲによるその結合、取り込み及び分解が意味される。例示的な分析は実施例４〜５、７〜１４、１６、及び１８中に提供される。これらの分析及び他の同等の分析はｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性を調節する化合物を決定する／同定するために使用されうる。好ましくは全ての活性が調節されるが、いくつかの場合、いくつかの、しかし全てではないｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性を調節する化合物を同定することは重要でありうる。
【０３１９】
上記用語「増大させる」は、本明細書中で使用されるとき、その非存在下のｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の効果と比較していくつかの計測可能な方法においてｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性を増大させる化合物の能力をいう。上記化合物の存在の結果として、レプチン結合及び／又は取り込みは、例えば、上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片のみの存在下のコントロールに比較して、増大しうる。好ましくは、活性における増大は上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片の存在下における活性の値に比較して少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％である。
【０３２０】
同様に、上記用語「減少させる」は、本明細書中で使用されるとき、その非存在下でのｇＧＭＧ−２断片の効果に比較していくつかの計測可能な方法において活性を減少させる化合物の能力をいう。例えば、上記化合物の存在はマウスにおいてＦＦＡ、ＴＧ、及びグルコースの血漿濃度を減少させる。また化合物の存在の結果としてレプチン結合及び／又は取り込みは、例えば、上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片のみの存在下のコントロールに比較して、減少されうる。好ましくは、活性における減少は上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片のみの存在下における活性の値に比較して少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％である。
【０３２１】
本発明は、ａ）細胞をｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片及び候補化合物と接触させる；ｂ）ＬＳＲ調節、レプチン調節、リポタンパク質調節、ＦＦＡ酸化調節から成る群から選ばれる結果を検出する；及びｃ）ここで前記結果が前記細胞が上記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片のみと接触するときの前記結果と異なる場合、前記結果は前記可能性のある化合物を同定することを含む、ボディマスを調節する必要のある個体においてボディマスを調節する可能性のある化合物を同定する方法を特徴付ける。
【０３２２】
好ましい態様においては、前記接触はさらに前記ＬＳＲのリガンドを含む。好ましくは、前記リガンドはサイトカイン、リポタンパク質、遊離脂肪酸、及びＣ１ｑから成る群から選ばれ、及びより好ましくは前記サイトカインはレプチンであり、及び最も好ましくは前記レプチンは米国仮出願第６０／１５５，５０６号中に示されるレプチンポリペプチド断片であり、図面、図画又は表を含むそれを全体として本明細書中に援用する。
【０３２３】
他の好ましい態様において、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片はマウスのものである又はヒトのものである。他の好ましい態様において、前記細胞はＰＬＣ、ＣＨＯ−Ｋ１、Ｈｅｐ３Ｂ、及びＨｅｐＧ２から成る群から選ばれる。
【０３２４】
さらに他の好ましい態様において、前記リポタンパク質調節は結合、取り込み、及び分解から成る群から選ばれる。好ましくは、前記調節は前記結合、取り込み又は分解における増大である。あるいは、前記調節は前記結合、取り込み又は分解における減少である。
【０３２５】
他の好ましい態様において、レプチン調節は結合、取り込み、分解、及び輸送から成る群から選ばれる。好ましくは、前記調節は前記結合、取り込み、分解又は輸送における増大である。あるいは、前記調節は前記結合、取り込み、分解又は輸送における減少である。好ましくは、前記輸送は血液脳関門を介する。
さらに他の好ましい態様において、前記ＬＳＲ調節は前記細胞の表面上の発現である。好ましくは、前記検出はＦＡＣＳを含み、より好ましくは前記検出はさらに前記ＬＳＲに特異的に結合する抗体を含み、及び最も好ましくは前記抗体は前記ＬＳＲのカルボキシ末端に特異的に結合する。
【０３２６】
さらに他の好ましい態様において、前記可能性のある化合物はペプチド、ペプチドライブラリー、非ペプチドライブラリー、ペプトイド、脂肪酸、リポタンパク質、医薬、抗体、小分子、及びプロテアーゼから成る群から選ばれる。本発明の他の特性及び利点は図面の簡単な説明及び実施例中に示される。これらはいかなる場合でも例示するのみであり、本発明を限定するものではないことが意味される。この明細書をとおして、さまざまな出版物、特許及び公開された特許出願が引用される。本明細書中に引用されるこれらの出版物、特許及び公開された特許明細書の開示は本明細書中に援用する。
【０３２７】
ＶＩＩＩ． エピトープ及び抗体融合
本発明の好ましい態様はエピトープを有するポリペプチド及びエピトープを有するポリペプチド断片に方向付けられる。これらのエピトープは「抗原エピトープ」又は「抗原エピトープ」及び「免疫原生エピトープ」の両方でありうる。「免疫原生エピトープ」は上記ポリペプチドが免疫原であるときｉｎ ｖｉｖｏで抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。一方、抗体が結合するポリペプチドの領域は「抗原決定基」又は「抗原エピトープ」として定義される。タンパク質の免疫原生エピトープの数は一般的に抗原エピトープの数より少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３９９８４００２を参照のこと。特定のエピトープが免疫原生でなくても、しかしながら抗体はエピトープに対してｉｎ ｖｉｔｒｏで作出されうるので、それは有用であることが特に留意される。
エピトープは上記エピトープに独特の空間的なコンフォメーションにおいて少なくとも３アミノ酸を含みうる。一般的に、エピトープは少なくとも６の上記アミノ酸、及びよりしばしば少なくとも８〜１０の上記アミノ酸から成る。好ましい態様において、抗原エピトープは３〜５０の整数の数のアミノ酸を含む。エピトープとして機能する断片は慣用の方法により作出されうる。例えば、米国特許第４，６３１，２１１号中にさらに示される、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， Ｒ． Ａ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）を参照のこと。免疫原生エピトープを作り上げるアミノ酸を決定する方法はｘ線結晶学、２次元核磁気共鳴、及びエピトープマッピングを含む、例えば、Ｈ． Ｍａｒｉｏ Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）により示されるＰｅｐｓｃａｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１：３９９８−４００２；ＰＣＴ出願第ＷＯ ８４／０３５６４；及びＰＣＴ出願第ＷＯ ８４／０３５０６。他の例はＪａｍｅｓｏｎ ａｎｄ Ｗｏｌｆ， Ｃｏｍｐ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ． ４：１８１−１８６（１９８８）のアルゴリズムである（前記引用文献はそれらを全体として援用する）。上記Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原分析は、例えば、ＰＲＯＴＥＡＮコンピュータプログラムを用いて、デフォルトパラメーターを用いて行われうる（Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０ Ｗｉｎｄｏｗｓ， ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｉｎｃ．， １２２８ Ｓｏｕｔｈ Ｐａｒｋ Ｓｔｒｅｅｔ Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＴ）。
【０３２８】
本発明に係るエピトープを有する断片は好ましくは本発明に係るポリペプチドの６〜５０のアミノ酸（すなわち、６〜５０の整数、包括的）を含む。また、６〜配列リストの全長配列の整数の抗原断片も本発明に含まれる。６〜本発明に係るポリペプチドの全長配列の整数の、全ての配列の組み合わせが含まれる。上記エピトープを有する断片は、本発明に係るポリペプチド断片について上記に示されるように、（亜属として）連続するアミノ酸残基の数により又は（種として）特定のＮ−末端及びＣ−末端位により特定されうる。本発明に係るエピトープを有する断片の数も同じ方法で排除されうる。
【０３２９】
抗原エピトープは、例えば、エピトープを特異的に結合するモノクローナル抗体を含む、抗体を作出するのに有用である（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８４；ａｎｄ Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ， Ｊ． Ｇ． ｅｔ ａｌ．， １９８３を参照のこと）。上記抗体はその後本明細書中に示される、診断及び組織／細胞同定技術の如きさまざまな技術において、及び精製方法において使用される。
【０３３０】
同様に、免疫原生エピトープは本分野において周知の方法にしたがって抗体を誘導するために使用されうる（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ； Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ； Ｃｈｏｗ， Ｍ． ｅｔ ａｌ；（１９８５）ａｎｄ Ｂｉｔｔｌｅ， Ｆ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．， （１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原生エピトープは配列リストのポリペプチドを含む。上記免疫原生エピトープは、必要であれば、（ウサギ又はマウスの如き）動物系にアルブミンの如き、担体タンパク質と共に提示されうる。少なくとも８〜１０アミノ酸を含む免疫原生エピトープは（例えば、ウェスタンブロットにおいて）非常に少なくとも変性したポリペプチド中の直鎖エピトープに結合することができる抗体を作出するのに十分であることが示されている。
【０３３１】
本発明に係るエピトープを有するポリペプチドは、非限定的に、ｉｎ ｖｉｖｏ免疫化、ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫化、及びファージディスプレイ法を含む、本分野において周知の方法にしたがって抗体を誘導するために使用される（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ； Ｗｉｌｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ， ａｎｄ Ｂｉｔｔｌｅ， ｅｔ ａｌ．， １９８５を参照のこと）。ｉｎ ｖｉｖｏ免疫化が使用される場合、動物は遊離ペプチドで免疫化されうる；しかしながら、抗ペプチド抗体タイターは上記ペプチドをキーホールカサガイヘマシアニン（ＫＬＨ）又は破傷風変性毒素の如き、巨大分子担体にカップリングすることによりブーストされうる。例えば、システイン残基を含むペプチドはマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＭＢＳ）の如きリンカーを用いて担体にカップリングされうる、一方で、他のペプチドはグルタルアルデヒドの如きより一般的な結合剤を用いて担体にカップリングされうる。ウサギ、ラット及びマウスの如き動物は、例えば、約１００μｇｓのペプチド又は担体タンパク質及びＦｒｅｕｎｄ’ｓ補助剤を含むエマルジョンの腹腔内及び／又は皮内注入により遊離した又は担体にカップリングされたペプチドで免疫化される。何度かのブースター注入が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを用いたＥＬＩＳＡ分析により検出されうる、抗ペプチド抗体の有用なタイターを提供するために、例えば、約２週間の間隔で必要とされうる。免疫化された動物からの血清中の抗ペプチド抗体のタイターは、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、本分野において周知の方法にしたがって上記ペプチドの固体支持への吸着及び選択された抗体の溶離により、増大されうる。
【０３３２】
当業者は、上記に議論されるように、非限定的に、免疫原生又は抗原エピトープを含むポリペプチドを含む本発明に係るポリペプチドは異種のポリペプチド配列に融合されうることを理解するであろう。例えば、本発明に係るポリペプチドは免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の一部を含む一定の領域又は一定の領域の一部（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ドメイン全体及びそれらの一部を含むそれらの組み合わせ）に融合されることができ、キメラポリペプチドをもたらす。これらの融合タンパク質は精製を容易にし、及びｉｎ ｖｉｖｏでの増大した半減期を示す。これは、例えば、ヒトＣＤ４−ポリペプチドのはじめの２ドメイン及び哺乳類免疫グロブリンの重又は軽鎖の一定の領域のさまざまなドメインから成るキメラタンパク質について示されている（例えば、ＥＰＡ ０，３９４，８２７号；及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８８を参照のこと）。ＩｇＧ部分のためにヂスルフィド結合二量体構造を有する融合タンパク質は単量体ポリペプチド又はその断片のみより他の分子の結合及び中和においてより有効でありうる（例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９５を参照のこと）。上記エピトープをコードする核酸は発現されたポリペプチドの検出及び精製において補助するためのエピトープタグとして問題の遺伝子と結合されうる。
【０３３３】
本発明に係る追加の融合タンパク質は遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング又はコドンシャッフリング（集合的に「ＤＮＡシャッフリング」と言われる）の技術をとおして作出されうる。ＤＮＡシャッフリングは本発明に係るポリペプチドの活性を調節し、それにより上記ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストを効果的に作出するために使用されうる。例えば、米国特許第５，６０５，７９３号；第５，８１１，２３８号；第５，８３４，２５２号；第５，８３７，４５８号；及びＰａｔｔｅｎ， Ｐ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ， Ｓ．， （１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎ， Ｌ． Ｏ．， ｅｔ ａｌ（１９９９）；及びＬｏｒｅｎｚｏ， Ｍ．Ｍ．ａｎｄ Ｂｌａｓｃｏ， Ｒ．，（１９９８）を参照のこと。（この書類のそれぞれは本明細書中に援用する）。１の態様において、本発明に係るコードポリヌクレオチド又はそれによりコードされるポリペプチドの１以上の成分、モチーフ、節、部分、ドメイン、断片等は１以上の異種の分子の１以上の成分、モチーフ、節、部分、ドメイン、断片等と結合されうる。
【０３３４】
抗体
本発明はさらに上記ポリペプチドに、及びより特に本発明に係るポリペプチドのエピトープに特異的に結合する、抗体及びＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）に関する。本発明に係る抗体は（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む）ＩｇＧ、（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ、及びＩｇＹを含む。本明細書中で使用されるとき、上記用語「抗体」（Ａｂ）は、単鎖の抗体全体を含む抗体全体、及びその抗原結合断片を含むことが意味される。好ましい態様において、上記抗体は本発明に係るヒト抗原結合抗体断片であり、非限定的に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ）２及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ヂスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）及びＶL又はＶHドメインを含む断片を含む。上記抗体は鳥類及び哺乳類を含む動物源からでありうる。好ましくは、上記抗体はヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウシ又はニワトリのものである。
【０３３５】
単鎖抗体を含む、抗原結合抗体断片は単独で又は以下の：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインの全部又は部分と共に可変領域（単数又は複数）を含みうる。また可変領域（単数又は複数）及びヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインのいかなる組み合わせも本発明に含まれる。本発明はさらに、本発明に係るポリペプチドに特異的に結合する、キメラの、ヒト化された、並びにヒトモノクローナル及びポリクローナル抗体を含む。本発明はさらに本発明に係る抗体に抗イディオタイプである抗体を含む。
本発明に係る抗体は単一特異的、二特異的、及び三特異的でありうる又は大きな複合特異性を有しうる。複合特異的抗体は本発明に係るポリペプチドの異なるエピトープに特異的でありうる又は異種のポリペプチド又は固体支持材料の如き、異種の組成に加えて本発明に係るポリペプチドについて特異的でありうる。例えば、ＷＯ ９３／１７７１５；ＷＯ ９２／０８８０２；ＷＯ ９１／００３６０；ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔ， Ａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）；米国特許第５，５７３，９２０号、第４，４７４，８９３号、第５，６０１，８１９号、第４，７１４，６８１号、第４，９２５，６４８号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ， Ｓ． Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９２）を参照のこと。
【０３３６】
本発明に係る抗体は本発明に係るポリペプチドのエピトープ（単数又は複数）又はエピトープ結合部分（単数又は複数）について示される又は特定されることができ、それは上記抗体により認識され又は特異的に結合される。本発明の分泌されたタンパク質のタンパク質の場合、上記抗体は本発明に係る核酸によりコードされる全長タンパク質、本発明に係る核酸によりコードされる成熟タンパク質（すなわち、シグナルペプチドの切断により作出されるタンパク質）、本発明に係る核酸によりコードされるシグナルペプチド又は本発明に係る他のポリペプチドを特異的に結合しうる。それゆえ、上記エピトープ（単数又は複数）又はエピトープを有するポリペプチド部分（単数又は複数）は、例えば、Ｎ−末端及びＣ−末端位により、連続したアミノ酸残基の大きさにより又は本明細書中に示される別の方法で、本明細書中に示されるように特定されうる。本発明に係るエピトープ又はポリペプチドを特異的に結合する抗体は個々の種として排除されうる。それゆえ、本発明は本発明に係る特定のポリペプチドを特異的に結合する抗体を含み、そして同じものの排除を可能にする。
【０３３７】
本発明に係る抗体はそれらの交差反応性の点でも示され又は特定されうる。本発明に係るポリペプチドの他のアナログ、オーソログ又はホモログに特異的に結合しない抗体が含まれる。（例えば、ＦＡＳＴＤＢ及び本明細書中で示されるパラメーターを用いて、本分野において知られる及び本明細書中で示される方法を用いて計算されるように）９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、及び５０％未満の同一性でポリペプチドを結合しない本発明に係るポリペプチドに対する抗体も本発明に含まれる。さらに（本明細書中で示されるように）厳格なハイブリダイゼーション条件下で本発明に係るポリヌクレオチドとハイブリダイズする、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのみを結合する抗体も本発明に含まれる。本発明に係る抗体はそれらの結合アフィニティーの点でも示され又は特定されうる。好ましい結合アフィニティーは５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、及び１０-15Ｍ未満の解離定数又はＫｄ値を有するものを含む。
【０３３８】
本発明に係る抗体は、非限定的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの診断及び治療方法を含む、本発明に係るポリペプチドを精製する、検出する、及び標的化するための本分野において知られる方法を含む使用を有する。例えば、上記抗体は生物学的サンプル中の本発明に係るポリペプチドの定性的な及び定量的な計測値についての免疫分析における使用を有しうる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８を参照のこと）。
【０３３９】
本発明に係る抗体は単独で又は他の組成物と共に使用されうる。上記抗体はさらにポリペプチド又は他の組成物にＮ−又はＣ−末端で異種のポリペプチドに組換えて融合され又は（共有及び非共有結合を含んで）化学的に結合されうる。例えば、本発明に係る抗体は検出分析における標識として有用な分子及び異種のポリペプチド、薬物又は毒素の如き、エフェクター分子に組換えて融合され又は結合されうる。例えば、ＷＯ ９２／０８４９５；ＷＯ ９１／１４４３８；ＷＯ ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；及びＥＰ ０ ３９６ ３８７を参照のこと。
【０３４０】
本発明に係る抗体は本分野において知られる好適な方法により調製されうる。例えば、本発明に係るポリペプチド又はその抗原性断片はポリクローナル抗体を含む血清の産出を誘導するために動物に投与されうる。上記用語「モノクローナル抗体」はハイブリドーマ技術をとおして作出される抗体に限定されない。上記用語「抗体」は少なくとも１の結合ドメインから成るポリペプチド又はポリペプチド群をいい、ここで、結合ドメインは抗原の抗原決定基の特性と相補的な内部表面の形及び電荷分布を有する３次元の結合空間を形成する抗体分子の可変ドメインの折りたたみから形成され、それが上記抗原との免疫学的反応を可能にする。上記用語「モノクローナル抗体」は真核細胞の、原核細胞の又はファージのクローンを含む、単一のクローンに由来する抗体をいい、それが作出される方法ではない。モノクローナル抗体はハイブリドーマ、組換え体、及びファージディスプレイ技術の使用を含む本分野において知られる広くさまざまな技術を用いて調製されうる。
【０３４１】
ハイブリドーマ技術は本分野において知られるものを含む（例えば、Ｈａｒｌｏｗｅｔ ａｌ． １９８８；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ， １９８１を参照のこと）。（前記引用文献はそれらを全体として援用する）。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、例えば、（Ｆａｂ断片を作出するために）パパイン又は（Ｆ（ａｂ’）２断片を作出するために）ペプシンの如き酵素を用いて、タンパク質分解的切断によりハイブリドーマ作出抗体から作出されうる。
【０３４２】
あるいは、本発明に係る抗体は本分野において知られる方法を用いて組換えＤＮＡ技術の適用をとおして又は合成化学をとおして作出されうる。例えば、本発明に係る抗体は本分野において知られるさまざまなファージディスプレイ法を用いて調製されうる。ファージディスプレイ法において、機能的な抗体ドメインはそれらをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上に提示される。所望の結合特性を有するファージは抗原、典型的に固体表面又はビーズに結合された又は捕獲された抗体で直接選択することによりレパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒト又はマウスの）から選ばれる。これらの方法で使用されるファージは典型的にファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換えて融合されたＦａｂ、Ｆｖ又はヂスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するｆｄ及びＭ１３を含む繊維状ファージである。本発明に係る抗体を作出するために使用されうるファージディスプレイ法の例はＢｒｉｎｋｍａｎ Ｕ． ｅｔ ａｌ．（１９９５）；Ａｍｅｓ， Ｒ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ， Ｃ． Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ， Ｄ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．（１９９４）；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＷＯ ９０／０２８０９；ＷＯ ９１／１０７３７；ＷＯ ９２／０１０４７；ＷＯ ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９５／１５９８２；ＷＯ ９５／２０４０１；及び米国特許第５，６９８，４２６号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，７５０，７５３号、第５，８２１，０４７号、第５，５７１，６９８号、第５，４２７，９０８号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０，２２５号、第５，６５８，７２７号及び第５，７３３，７４３号中に開示されるものを含む。
【０３４３】
上記の引用文献中に示されるように、ファージ選択後、上記ファージからの抗体コード領域は単離され、そしてヒト抗体又は他の所望の抗原結合断片を含む、抗体全体を作出するために使用され、そして哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び菌を含む所望の宿主中で発現されうる。例えば、組換えてＦａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ）２及びＦ（ａｂ’）２断片を作出するための技術はＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ， Ｒ． Ｌ． ｅｔ ａｌ．（１９９２）；及びＳａｗａｉ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．（１９９５）；及びＢｅｔｔｅｒ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．（１９８８）中に開示されるものの如き本分野において知られる方法を用いても使用されうる。
【０３４４】
単鎖Ｆｖｓ及び抗体を作出するために使用されうる技術の例は米国特許第４，９４６，７７８号及び第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）；Ｓｈｕ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．（１９９３）；及びＳｋｅｒｒａ， Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９８８）中に示されるものを含む。ヒトにおける抗体のｉｎ ｖｉｖｏの使用及びｉｎ ｖｉｔｒｏ検出分析を含む、いくつかの使用のために、キメラの、ヒト化された又はヒトの抗体を使用することが好まれうる。キメラ抗体を作出する方法は本分野において知られる。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，（１９９５）；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ， Ｓ． Ｄ． ｅｔ ａｌ．（１９８９）；及び米国特許第５，８０７，７１５号を参照のこと。抗体はＣＤＲ−グラフティング（ＥＰ ０ ２３９ ４００；ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，５３０，１０１号；及び第５，５８５，０８９号）、ベニアリング又は再舗装（ＥＰ ０ ５９２ １０６；ＥＰ ０ ５１９ ５９６；Ｐａｄｌａｎ Ｅ． Ａ．， １９９１；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ Ｇ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， １９９４；Ｒｏｇｕｓｋａ Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， １９９４）、及び鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含むさまざまな技術を用いてヒト化されうる。ヒト抗体は上記に示されるファージディスプレイ法を含む本分野において知られるさまざまな方法により作出されうる。また、米国特許第４，４４４，８８７号、第４，７１６，１１１号、第５，５４５，８０６号、及び第５，８１４，３１８号；ＷＯ ９８／４６６４５；ＷＯ ９８／５０４３３；ＷＯ ９８／２４８９３；ＷＯ ９６／３４０９６；ＷＯ ９６／３３７３５；及びＷＯ ９１／１０７４１も参照のこと。
【０３４５】
本発明に係るポリペプチドに組換えて融合された又は（共有結合的な及び非共有結合的な結合を含む）化学的に結合された抗体は本発明中にさらに含まれる。上記抗体は本発明に係るポリペプチド以外の抗原に特異的でありうる。例えば、抗体は本発明に係るポリペプチドを特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に融合する又は結合することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで本発明に係るポリペプチドを特定の細胞型に標的化するために使用されうる。本発明に係るポリペプチドに融合される又は結合される抗体は本分野において知られる方法を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫分析及び精製方法においても使用されうる（例えば、Ｈａｒｂｏｒ ｅｔ ａｌ． ｓｕｐｌａ；ＷＯ ９３／２１２３２；ＥＰ ０ ４３９ ０９５；Ｎａｒａｍｕｒａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． １９９４；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓ， Ｓ． Ｏ． ｅｔ ａｌ．， １９９２；Ｆｅｌｌ， Ｈ． Ｐ． ｅｔ ａｌ．，１９９１を参照のこと）。
【０３４６】
本発明はさらに可変領域以外の抗体ドメインに融合された又は結合された本発明に係るポリペプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明に係るポリペプチドは抗体Ｆｃ領域又はその一部に融合され又は結合されうる。本発明に係るポリペプチドに融合された抗体部分はヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメイン又はドメイン全体若しくはその一部の組み合わせを含みうる。本発明に係るポリペプチドは上記ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増大させるために又は本分野において知られる方法を用いた免疫分析における使用のために上記抗体部分に融合され又は結合されうる。上記ポリペプチドは複合体を形成するために上記抗体部分に融合され又は結合されうる。例えば、本発明に係るポリペプチドに融合されたＦｃ部分はＦｃ部分の間のヂスルフィド結合をとおして二量体を形成しうる。より高度に複合体化した形態は上記ポリペプチドをＩｇＡ及びＩｇＭの一部に融合することにより作出されうる。本発明に係るポリペプチドを抗体の一部に融合する又は結合する方法は本分野において知られる。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、第５，６２２，９２９号、第５，３５９，０４６号、第５，３４９，０５３号、第５，４４７，８５１号、第５，１１２，９４６号；ＥＰ ０ ３０７ ４３４、ＥＰ ０ ３６７ １６６；ＷＯ ９６／０４３８８、ＷＯ ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ， Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９１）；Ｚｈｅｎｇ， Ｘ． Ｘ． ｅｔ ａｌ．（１９９５）；及びＶｉｌ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．（１９９２）を参照のこと。
【０３４７】
本発明はさらに本発明に係るポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストとしてはたらく抗体に関連する。例えば、本発明は部分的に又は完全に、本発明に係るポリペプチドとの受容体／リガンド相互作用を破壊する抗体を含む。受容体特異的抗体及びリガンド特異的抗体の両方が含まれる。リガンド結合を妨げないが、受容体活性化を妨げる受容体特異的抗体が含まれる。受容体活性化（すなわち、シグナリング）は本明細書中に示される技術により又は本分野において知られる別の方法で決定されうる。リガンド結合及び受容体活性化の両方を妨げる受容体特異的抗体も含まれる。そのように、リガンドに結合し、それにより受容体活性化を妨げるが、リガンドが受容体に結合することを妨げない抗体に加えて、リガンドに結合する及び上記リガンドの上記受容体への結合を妨げる中和抗体が含まれる。上記受容体を活性化する抗体がさらに含まれる。これらの抗体はリガンド仲介受容体活性化により影響される生物学的活性の全部の又は全部未満のアゴニストとしてはたらきうる。上記抗体は本明細書中に開示される特異的活性を含む生物学的活性についてのアゴニスト又はアンタゴニストとして特定されうる。上記抗体アゴニストは本分野において知られる方法を用いて作出されうる。例えば、ＷＯ ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．（１９９８）；Ｃｈｅｎ， Ｚ． ｅｔ ａｌ．（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐ， Ｊ． Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９８）；Ｚｈｕ， Ｚ． ｅｔ ａｌ． （１９９８）；Ｙｏｏｎ， Ｄ． Ｙ． ｅｔ ａｌ．（１９９８）；Ｐｒａｔ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．；Ｐｉｔａｒｄ， Ｖ． ｅｔ ａｌ．（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎ， Ｎ． Ｇ． ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．； Ｔａｒｙｍａｎ， Ｒ． Ｅ． ｅｔ ａｌ．（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒ， Ｙ． Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．（１９９６）を参照のこと。
【０３４８】
上記に議論されるように、本発明に係るポリペプチドの抗体は、今度は、当業者に周知の技術を用いて本発明に係るポリペプチドを「真似る」抗イディオタイプ抗体を作出するために利用されうる（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ ａｎｄ Ｂｏｎａ（１９８９）；ａｎｄ Ｎｉｓｓｉｎｏｆｆ（１９９１）を参照のこと）。例えば、結合し、及びポリペプチド複合体化を又は本発明に係るポリペプチドのリガンドへの結合を競合的に阻害する抗体は、ポリペプチド複合体化又は結合ドメインを「真似る」及び、結果として、ポリペプチド又はそのリガンドに結合する及び中和する抗イディオタイプを作出するために使用されうる。上記中和抗イディオタイプ抗体は本発明に係るポリペプチドを結合するために又はそのリガンド／受容体を結合し、及びそれによりその生物学的活性をブロックするために使用されうる。
【０３４９】
本発明は本発明に係る突然変異された全長又は成熟ポリペプチドに又は上記突然変異されたポリペプチドのエピトープを含むその断片又は変形に特異的に結合することのできる精製された又は単離された抗体にも関する。他の好ましい態様においては、本発明は本発明に係るポリペプチドの少なくとも１０の連続したアミノ酸を含む及び特性を引き起こす突然変異によりコードされうる少なくとも１のアミノ酸を含むポリペプチドに結合することのできる抗体に関する。
【０３５０】
本発明に係るポリペプチドの、抗体が結合するものとは異なる種を発現する、野生型の又はトランスジェニックの、非ヒト動物又は哺乳類が所望され、そして本発明に係るポリペプチドを発現しない動物（すなわち、ノックアウト動物）は抗体の調製に特に有用である。遺伝子ノックアウト動物は本発明に係るポリペプチドの暴露された領域の全部又はほとんどを外来抗原として認識するであろう、そしてそれゆえ、エピトープのより広い配列で抗体を作出する。さらに、１０〜３０アミノ酸しか有しない、より小さいポリペプチドは本発明に係るポリペプチドのいずれか１への特異的結合を得るために有用であり得る。さらに、抗原配列に似る本発明に係るポリペプチドの種を作出する動物の体液性の免疫系は動物の固有のポリペプチド種及び抗原配列の差を好ましく認識し、そして上記抗原配列におけるこれらの独特の部位に対する抗体を作出するであろう。上記技術は本発明に係るポリペプチドのいずれか１に特異的に結合する抗体を得ることにおいて特に有用であろう。
【０３５１】
プロトコールにしたがって調製される抗体調製物は生物学的サンプル中の抗原を有する物質の濃度を決定する定量的な免疫分析において有用である；それらはまた生物学的サンプル中の抗原の存在を同定するために半定量的に又は定量的に使用されうる。上記抗体は上記タンパク質を発現する細胞を殺す又は体内の上記タンパク質の値を減少させるための治療用組成物においても使用されうる。
【０３５２】
本発明に係る抗体は本分野において知られる放射活性の、蛍光の又は酵素の標識のいずれか１により標識化されうる。
したがって、本発明は生物学的サンプル中で本発明にしたがって本発明に係るポリペプチドの存在を特異的に検出するための方法にも方向付けられ、前記方法は以下の段階：
ａ）本発明に係るポリペプチドを含むことが疑われる生物学的サンプルを得ること；
ｂ）上記生物学的サンプルを抗原抗体結合について好適な条件下で本発明に係るポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル又はモノクローナル抗体に接触させること；及び
ｃ）形成された抗原−抗体複合体を検出すること
を含む。
【０３５３】
本発明は生物学的サンプル中で本発明に係るポリペプチドの存在をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するための診断キットにも関し、ここで、前記キットは：
ａ）場合により、標識化された、本発明に係るポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル又はモノクローナル抗体；
ｂ）形成された抗原−抗体複合体の検出を可能にする試薬
を含み、前記試薬は場合により、より特には上記に挙げたモノクローナル又はポリクローナル抗体がそれ自体標識化されない場合に、標識を有する又は標識化試薬によりそれ自体認識されることができる。
【０３５４】
Ａ． ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体産生
示されるように同定された及び単離されたペプチドのいずれかのエピトープに対するモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒ， Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）の古典的な方法又はその誘導される方法にしたがって、マウスハイブリドーマから調製されうる。簡単に述べると、マウスにそこから由来した数マイクログラムの選択されたタンパク質又はペプチドを数週間にわたり反復して接種する。上記マウスをその後殺し、及び脾臓の抗体産生細胞を単離する。上記脾臓細胞をポリエチレングリコールの方法によりマウスミエローマ細胞と融合し、そして過剰の融合されない細胞をアミノプテリンを含む選択的媒体（ＨＡＴ媒体）上での系の成長により破壊する。うまく融合した細胞を希釈し、そして上記希釈物の等分をマイクロタイタープレートのウェル中に置き、培養物の成長を継続させる。抗体産出コロニーを、もともとＥｎｇｖａｌｌ， Ｅ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ７０：４１９（１９８０）により示されたＥｌｉｓａ、及びその誘導される方法の如き、免疫分析手順により上記ウェルの上清液体における抗体の検出により同定する。選択された陽性クローンは展開され、そしてそれらのモノクローナル抗体産物は使用のために回収されうる。モノクローナル抗体産生の詳細な手順はＤａｖｉｓ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． Ｓｅｃｔｉｏｎ ２１−２中に示される。
【０３５５】
Ｃ−末端Ｃ１ｑホモロジー領域の全部又は一部から成るＧＭＧ−２ポリペプチド断片に特異的に結合するが、Ｎ−末端ヂペプチドがヂペプチヂルペプチダーゼによりタンパク質分解的に除去された前記断片には特異的に結合しないモノクローナル抗体も本発明にまた特に含まれる［Ｄｅａｃｏｎ（２０００）Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ８５：３５７５−３５８１ その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する］。好ましい前記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸１４４〜２８８若しくは１６２〜２８８又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸１３４〜２７８若しくは１５２〜２７８又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸１１５〜２５９若しくは１３３〜２５９から選ばれる。モノクローナル抗体を作出する方法は当業者に知られる。ＧＭＧ−２（１４４〜２８８）を含むサンプルを得る、ＧＭＧ−２（１４６〜２８８）を含むサンプルを得る、前記抗体を１４４〜２８８と接触させる、前記抗体を１４６〜２８８と接触させる、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）により１４４〜２８８に及び１４６〜２８８に結合する抗体の値を定量する：段階を含む、モノクローナル抗体を選択する方法もさらに特に含まれ、ここで、前記モノクローナル抗体は配列ＩＤ番号：２の１４４〜２８８に特異的に結合するが、配列ＩＤ番号：２の１４６〜２８８には特異的に結合しない。１３４〜２７８を含むサンプルを得る、１３６〜２７８を含むサンプルを得る、前記抗体を１３４〜２７８と接触させる、前記抗体を１３６〜２７８と接触させる、ＥＬＩＳＡにより１３４〜２７８に及び１３６〜２７８に結合する抗体の値を定量する：段階を含む、モノクローナル抗体の選択方法もさらに特に含まれ、ここで、前記モノクローナル抗体は配列ＩＤ番号：４の１３４〜２７８に特異的に結合するが１３６〜２７８には特異的に結合しない。１１５〜２５９を含むサンプルを得る、１１７〜２５９を含むサンプルを得る、前記抗体を１１５〜２５９と接触させる、前記抗体を１１７〜２５９と接触させる、ＥＬＩＳＡにより１１５〜２５９に及び１１７〜２５９に結合する抗体の値を定量する：段階を含む、モノクローナル抗体の選択方法もまたさらに特に含まれ、ここで、前記モノクローナル抗体は配列ＩＤ番号：６の１１５〜２５９に特異的に結合するが１１７〜２５９には特異的に結合しない。１６２〜２８８を含むサンプルを得る、１６４〜２８８を含むサンプルを得る、前記抗体を１６２〜２８８と接触させる、前記抗体を１６４〜２８８と接触させる、ＥＬＩＳＡにより１６２〜２８８に及び１６４〜２８８に結合する抗体の値を定量する：段階を含む、モノクローナル抗体の選択方法もまたさらに特に含まれ、ここで、前記モノクローナル抗体は配列ＩＤ番号：２の１６２〜２８８に特異的に結合するが１６４〜２８８には特異的に結合しない。１５２〜２７８を含むサンプルを得る、１５４〜２７８を含むサンプルを得る、前記抗体を１５２〜２７８と接触させる、前記抗体を１５４〜２７８と接触させる、ＥＬＩＳＡにより１５２〜２７８に及び１５４〜２７８に結合する抗体の値を定量する：段階を含む、モノクローナル抗体の選択方法もまたさらに特に含まれ、ここで、前記モノクローナル抗体は配列ＩＤ番号：４の１５２〜２７８に特異的に結合するが１５４〜２７８には特異的に結合しない。１３３〜２５９を含むサンプルを得る、１３５〜２５９を含むサンプルを得る、前記抗体を１３３〜２５９と接触させる、前記抗体を１３５〜２５９と接触させる、ＥＬＩＳＡにより１３３〜２５９に及び１３５〜２５９に結合する抗体の値を定量する：段階を含む、モノクローナル抗体の選択方法もまたさらに特に含まれ、ここで、前記モノクローナル抗体は配列ＩＤ番号：６の１３３〜２５９に特異的に結合するが１３５〜２５９には特異的に結合しない。
【０３５６】
Ｂ． 免疫化によるポリクローナル抗体産生
単一のタンパク質の不均一のエピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清は好適な動物を、免疫原生を高めるために改変されない又は改変されうる、上記に示されたものに由来する発現されたタンパク質又はペプチドで免疫化することにより調製されうる。有効なポリクローナル抗体産生は抗原及び宿主種の両方に関する多くの因子により影響される。例えば、小分子は他のものよりも免疫原生を有し難い傾向があり、そして担体及び補助剤の使用を必要としうる。また、宿主動物は接種の部位及び用量に応答して変化し、不十分な又は過剰の用量の抗原は低いタイター抗血清をもたらす。複数の皮内部位で投与される小用量（ｎｇレベル）の抗原は最も信頼可能であるように見える。ウサギについての有効な免疫化プロトコールはＶａｉｔｕｋａｉｔｉｓ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ３３：９８８−９９１（１９７１）中に見られうる。
【０３５７】
ブースター注入は規則的な間隔で与えられることができ、そして抗血清は、例えば、上記抗原の既知の濃度に対するアガー中の二重免疫拡散法により、半定量的に決定される、その抗体タイターが落ちはじめるとき、回収される。例えば、Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ， Ｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈａｐ． １９ ｉｎ： Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄ． Ｗｉｅｒ（ｅｄ）Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（１９７３）を参照のこと。抗体の安定した濃度は通常０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌの血清（約１２ μＭ）の範囲内である。抗原についての抗血清のアフィニティーは、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ， Ｄ．， Ｃｈａｐ． ４２ ｉｎ：Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２ｄ Ｅｄ．（Ｒｏｓｅ ａｎｄ Ｆｒｉｅｄｍａｎ， Ｅｄｓ．）Ａｍｅｒ． Ｓｏｃ． Ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ． Ｃ． （１９８０）により示されるように、競合的結合曲線を準備することにより決定される。
【０３５８】
いずれかのプロトコールにしたがって調製された抗体調製物は生物学的サンプル中の抗原を有する物質の濃度を決定する定量的免疫分析において有用である；それらはまた生物学的サンプル中の抗原の存在を半定量的に又は定性的に同定するためにも使用されうる。上記抗体は上記タンパク質を発現する細胞を殺す又は体内の上記タンパク質の値を減少させるための治療用組成物においても使用されうる。
【０３５９】
本発明の他の特性及び利点は図面の簡単な説明及び実施例中に示される。これらはいかなる場合にも単に例示であり、本発明を限定するとは意味されない。本明細書をとおして、さまざまな出版物、特許及び公開特許出願が引用される。本明細書中に引用されるこれらの出版物、特許及び公開特許出願の開示は、本開示に援用する。
【０３６０】
ＩＸ． ホモ三量体ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性のアンタゴニストの同定のための分析
本発明はヂペプチヂルペプチダーゼによるＧＭＧ−２ポリペプチド断片のＮ−末端の切断をブロックする１以上のアンタゴニスト化合物のためのスクリーニング方法を特徴付ける。好ましい前記化合物は、非限定的に、小分子量有機又は無機化合物、タンパク質、ペプチド、炭水化物又は脂質から選ばれる。好ましい前記ヂペプチヂルペプチダーゼはヂペプチヂルペプチダーゼから成るヒト血漿である。好ましいヂペプチヂルペプチダーゼは、非限定的に、ヒトＣＤ２６又はヒトアトラクチンから選ばれる。さらに好ましいヂペプチヂルペプチダーゼは、非限定的に、水溶性ヒトＣＤ２６又は水溶性ヒトアトラクチンから選ばれる。水溶性ヒトＣＤ２６は当業者に周知の方法を用いて組換え法により作出される（米国特許第６，２６５，５５１号 その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する）。水溶性ヒトアトラクチンは当業者に周知の方法を用いて組換え法により作出される（国際特許出願番号 ＷＯ １５６５１Ａ１ その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する）。好ましい前記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸１４４〜２８８若しくは１６２〜２８８又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸１３４〜２７８若しくは１５２〜２７８又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸１１５〜２５９若しくは１３３〜２５９から選ばれる。配列ＩＤ番号：２の前記好ましいＧＭＧ−２ポリペプチド断片（１４４〜２８８）の前記ヂペプチヂルペプチダーゼ切断はＮ−末端のヂペプチドＳＰを除去する。配列ＩＤ番号：２の前記好ましいＧＭＧ−２ポリペプチド断片（１６２〜２８８）の前記ヂペプチヂルペプチダーゼ切断はＮ−末端のヂペプチドＴＡを除去する。配列ＩＤ番号：４の前記好ましいＧＭＧ−２ポリペプチド断片（１３４〜２７８）の前記ヂペプチヂルペプチダーゼ切断はＮ−末端のヂペプチドＳＰを除去する。配列ＩＤ番号：４の前記好ましいＧＭＧ−２ポリペプチド断片（１５２〜２７８）の前記ヂペプチヂルペプチダーゼ切断はＮ−末端のヂペプチドＴＡを除去する。配列ＩＤ番号：６の前記好ましいＧＭＧ−２ポリペプチド断片（１１５〜２５９）の前記ヂペプチヂルペプチダーゼ切断はＮ−末端のヂペプチドＳＰを除去する。配列ＩＤ番号：６の前記好ましいＧＭＧ−２ポリペプチド断片（１３３〜２５９）の前記ヂペプチヂルペプチダーゼ切断はＮ−末端のヂペプチドＴＡを除去する。
【０３６１】
本発明はさらに：ａ）前記ホモ三量体ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を前記化合物と接触させる又はさせない；ｂ）活性に基づいて結果を検出する、ここで、前記活性は、非限定的に、脂質分割、脂質代謝、及びインスリン様活性から選ばれる；及びｃ）化合物ありの前記結果が化合物なしの前記結果と異なる場合、前記結果は前記化合物をホモ三量体ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性のアンタゴニストとして同定する：を含む、ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片活性の前記アンタゴニストのついての化合物のスクリーニング方法を特徴付ける。
【実施例】
【０３６２】
実施例
【０３６３】
以下の実施例は例示的な目的のために提供され、限定の意味ではない。当業者は本明細書中の開示に基づいて同等の分析及び方法を設計することができるであろう、その全ては本明細書の一部を形成する。
【０３６４】
本明細書をとおして使用される上記用語全長ＧＭＧ−２ポリペプチドはタンパク質ホモログマウスＡＣＲＰ３０［Ｓｃｈｅｒｅｒ， ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｅｒｕｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｃ１ｑ， ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ ｉｎ ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ”；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０， ２６７４６−２６７４９（１９９５）］、マウスＡｄｉｐｏＱ［Ｈｕ， ｅｔ ａｌ．，“ＡｄｉｐｏＱ ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ａｄｉｐｏｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｏｂｅｓｉｔｙ”， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１， １０６９７−１０７０３（１９９６）］、ヒトＡＰＭ１［Ｍａｅｄａ， ｅｔ ａｌ．，“ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ａｄｉｐｏｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ， ＡＰＭ１（ＡｄｉＰｏｓｅ Ｍｏｓｔ ａｂｕｎｄａｎｔ Ｇｅｎｅ ｔｒａｓｃｒｉｐｔ １）”， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２２１， ２８６−２８９（１９９６）］及びヒトＧＢＰ２８［Ｎａｋａｎｏ， ｅｔ ａｌ．， “Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＢＰ２８， ａ ｎｏｖｅｌ ｇｅｌａｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ”， Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１２０， ８０３−８１２（１９９６）］を含むと意図されることに注意すべきである。ＧＭＧ−２はまた他のホモログを含むと意図される。ｇＧＭＧ−２は球状ドメインから成る全長ＧＭＧ−２ポリペプチドのポリペプチド断片をいうと理解される。
【０３６５】
実施例１： ＧＭＧ−２ ＤＮＡのノザン分析
発達の異なる段階におけるマウス胚に加えて、異なるヒト組織（成人及び胎児）及び細胞系におけるＧＭＧ−２発現の分析はＣｌｏｎｔｅｃｈから購入されるポリＡ+ＲＮＡブロット（例えば、＃７７８０−１、７７５７−１、７７５６−１、７７６８−１及び７７６３−１）を用いることにより達成される。ＲＮＡプローブの標識化はＡｍｂｉｏｎからのＲＮＡ Ｓｔｒｉｐ−ＥＺキットを用いて製造業者の教示どおりに行われる。ＲＮＡプローブのＲＮＡブロットへのハイブリダイゼーションはＵｌｔｒａｈｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ａｍｂｉｏｎ）で行われる。簡単に述べると、ブロットを５８℃（低い厳格さ）又は６５℃（高い厳格さ）で３０分間、前ハイブリダイゼーションする。標識化したプローブ（２×１０6ｃｐｍ／ｍｌ）を添加後、ブロットを一晩（１４〜２４時間）ハイブリダイズし、及び２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで５０℃で２×２０分間（低い厳格さ）、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで５８℃で２×２０分間（中間の厳格さ）及び１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６５℃で２×２０分間（高い厳格さ）洗浄する。洗浄完了後、ブロットをフォスフォイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）上に１〜３日暴露する。
【０３６６】
実施例２： 代謝関連活性のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
ＧＭＧ−２ポリペプチドのさまざまな調製物及びさまざまな配列変形の活性を以下に提供されるものを含むさまざまなｉｎ ｖｉｔｒｏ分析を用いて評価する。これらの分析はまたＧＭＧ−２ポリペプチドアンタゴニスト及びアゴニストを発展させるために使用されうるものの例示である。そうするために、候補分子の存在下での、例えば、レプチン及び／又はＬＳＲ活性に対する、上記分析におけるＧＭＧ−２ポリペプチドの効果は上記候補分子の非存在下の分析におけるＧＭＧ−２ポリペプチドの効果と比較されうる。ＧＭＧ−２ポリペプチドは高カフェテリア食のマウスにおいて体重を減少させると考えられているので（実施例５）、これらの分析はまた体重を減少させる（又は増大させる）ための候補治療を同定するためにもはたらく。
【０３６７】
肝細胞系
ＧＭＧ−２ポリペプチドのＬＳＲへの効果の試験は、例えば、ＰＬＣ、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ（ヒト）、Ｈｅｐａ１〜６、ＢＰＲＣＬ（マウス）又はＭＣＡ−ＲＨ７７７、ＭＣＡ−ＲＨ８９９４（ラット）を含む、肝細胞系を用いて行われうる。
【０３６８】
ＢＰＲＣＬマウス肝細胞（ＡＴＣＣ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）をグルタミン及びペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（高グルコース）中６−ウェルプレート中に３００，０００細胞／ウェルの濃度で置く（０日目）（Ｂｉｈａｉｎ ＆ Ｙｅｎ， １９９２）。培地を２日目に変える。３日目、コンフルエント単層をリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）（２ｍＬ／ウェル）で一回洗浄する。細胞を０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、３．７ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、ｐＨ７．５を含むＤＭＥＭ中の増大する濃度の組換えＡｄｉｐｏＱ（ＡＱ）又は球状ＡｄｉｐｏＱ（ＡＱ−ＧＨ）で３７℃で３０分間インキュベートする。１０ｎｇ／ｍＬ125Ｉ−マウスレプチン（特異的活性、２２１００ｃｐｍ／ｎｇ）の添加後、インキュベーションを３７℃で３時間続ける。単層を０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳで続けて２回、続いて、ＰＢＳ／ＢＳＡで１回、及びその後ＰＢＳで続けて２回洗浄する。細胞を０．２４ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｎ ＮａＯＨで溶解する。溶解物を管内に回収し、そしてガンマカウンター内で計測する。
【０３６９】
血液脳関門モデル：
脳におけるＧＭＧ−２ポリペプチドのレプチン輸送に対する効果は脳由来細胞を用いて決定されうる。構想される１の方法は、ＬＳＲ又は他の受容体を介したレプチン（又は他の分子）の輸送に対するＧＭＧ−２ポリペプチドの効果を試験するために脳毛細管内皮細胞及び星状細胞の共培養を使用する、Ｄｅｈｏｕｃｋ， ｅｔ ａｌ（Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ５４：１７９８−８０１，１９９０；図面、表又は図画を含むそれらを全体として本明細書中に援用する）により示される血液／脳関門モデルを用いることである。
【０３７０】
この分析はＧＭＧ−２ポリペプチドの脳へのレプチン輸送に対する潜在的な効果の表示でありうる、及びＧＭＧ−２ポリペプチド変形を脳におけるＬＳＲ又は他の受容体をとおしたレプチン輸送を調節するそれらの能力についてスクリーニングするために使用されうる。さらに、ＧＭＧ−２ポリペプチドのＬＳＲ又は他の受容体をとおしたレプチン輸送に対する効果の推定上のアゴニスト及びアンタゴニストもこの分析を用いてスクリーニングされうる。血液／脳関門を介するレプチンの増大した輸送はおそらくその満腹因子としての活性を増大させるであろう。
【０３７１】
ＬＳＲ発現のＦＡＣＳ分析
ＧＭＧ−２ポリペプチドのＬＳＲに対する効果は、抗ＬＳＲ抗体及び蛍光二次抗体を用いて、フロー表面サイトメトリーにより細胞表面上のＬＳＲ発現値を計測することにより決定されうる。フローサイトメトリーは生物学的粒子の特性を計測するために使用されるレーザーに基づいた技術である。フローサイトメトリーの根底にある原理は光が分散され、励起源からの光が動く粒子にぶつかるとき蛍光が吸収されるというものである。
これはＧＭＧ−２ポリペプチドの推定上のアゴニスト及びアンタゴニストに加えて、ＧＭＧ−２ポリペプチド及び変形をスクリーニングするために容易に適合しうるハイスループット分析である。２の分析は以下に提供される。上記抗体、細胞系及びＧＭＧ−２ポリペプチドアナログは実験に因り変化しうるが、ヒト細胞系、ヒト抗ＬＳＲ抗体及び球状ＧＭＧ−２がヒトを治療するために使用されるべき変形、アゴニスト、及びアンタゴニストについてスクリーニングするために使用されうる。
【０３７２】
分析１：
細胞を回収及びＦＡＣＳによる分析前に無傷のＧＭＧ−２ポリペプチド（又は無処理の）で前処理する。細胞を非酵素解離溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いて回収し、及びその後１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ中で抗ＬＳＲ ８１Ｂ又は関連性のない抗血清の１：２００希釈で４℃で１時間インキュベートする。同じ緩衝液で２回洗浄後、ヤギ抗ウサギＦＩＴＣ結合抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ， Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ， ＰＡ）を細胞に添加し、続いてさらに４℃で３０分間インキュベートする。洗浄後、上記細胞を２％フォルマリン中に固定する。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）上で行う。
【０３７３】
分析２：
細胞を分析前に４８時間、製造業者の教示にしたがってＴ１７５フラスコ中で培養する。
細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳ、フィルター滅菌）で１回洗浄し、及びフラスコから１０ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液中に手動でかきとる。上記細胞懸濁物を１５ｍＬ円錐管に移し、及び１２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離する。上清を捨て、及び細胞を４℃に冷却した１０ｍＬ ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁する。細胞カウントを行い、及び上記細胞濃度をＦＡＣＳ緩衝液で１×１０6細胞／ｍＬの濃度に合わせる。１ミリリットルの細胞懸濁物を分析のために４８ウェルプレートのそれぞれのウェルに添加した。細胞を１２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離する。プレートをチェックし、細胞がペレット化していることを確認して、上記上清を除去し、そして細胞をヴォルテックスミキサー上でプレートを揺らすことにより再懸濁する。１ミリリットルのＦＡＣＳ緩衝液をそれぞれのウェルに添加し、続いて、１２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離する。細胞洗浄といわれるこれを全部で３回行った。
【０３７４】
適切なワーキング希釈液（例えば、１：２５、１：５０、１：１００、１：２００、１：４００、１：５００、１：８００、１：１０００、１：２０００、１：４０００、１：５０００又は１：１００００）を決定するためのスクリーニング実験において滴定された、一次抗体を総容積５０μＬ ＦＡＣＳ緩衝液中の細胞に添加する。プレートを光から保護して４℃で１時間インキュベートする。インキュベーションに続いて、細胞を上記に示したように３回洗浄する。適切なワーキング希釈液（例えば、１：２５、１：５０、１：１００、１：２００、１：４００、１：５００、１：８００、１：１０００、１：２０００、１：４０００、１：５０００又は１：１００００）を決定するためのスクリーニング実験において滴定された、適切な二次抗体を総容積５０μＬ ＦＡＣＳ緩衝液中の細胞に添加する。プレートを光から保護して４℃で１時間インキュベートする。インキュベートに続いて、細胞を上記に示したように３回洗浄する。最後の洗浄の際、細胞を５００μＬ ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、そしてＦＡＣＳ取得管に移す。サンプルを光から保護して氷上に置き、そして１時間以内に分析する。
【０３７５】
蛍光マイクロスコピーにより検出されるＧＭＧ−２ポリペプチドの細胞結合及び取り込み
ＧＭＧ−２ポリペプチドの蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合：１ｍｇ／ｍＬ濃度の精製されたＧＭＧ−２タンパク質をＳｉｇｍａのＦｌｕｏｒｏＴａｇＦＩＴＣ結合キット（Ｓｔｏｃｋ Ｎｏ．ＦＩＴＣ−１）を用いてＦＩＴＣで標識化する。ＧＭＧ−２タンパク質標識化のために、スモールスケール結合についてのＳｉｇｍａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ中に概略されるプロトコールにしたがった。
【０３７６】
細胞培養：Ｃ２Ｃ１２マウス骨格筋細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ＣＲＬ−１７７２）及びＨｅｐａ−１−６マウス肝細胞（ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ＣＲＬ−１８３０）をウェル当たり２×１０5細胞の細胞濃度で６ウェルプレート中にまく。Ｃ２Ｃ１２及びＨｅｐａ−１−６細胞を分析前に２４〜４８時間容器の教示にしたがって培養する。細胞が８０％コンフルエントになったとき分析を行う。
【０３７７】
マイクロスコピーを用いたＦＩＴＣ標識化したＧＭＧ−２タンパク質細胞結合及び取り込み：Ｃ２Ｃ１２及びＨｅｐａ−１−６細胞をヒトＬＳＲ（８１Ｂ：ヒトＬＳＲのＮ−末端配列；マウスＬＳＲとクロス反応しない及び９３Ａ：Ｃ−末端配列、マウスＬＳＲとクロス反応する）に対して方向付けられた抗体又はｇＣ１ｑｒ（９５３）に対して方向付けられた抗血清の存在下／非存在下で３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートする。ＬＳＲ抗体を２μｇ／ｍＬの濃度で培地に添加する。上記抗ｇＣ１ｑｒ抗血清を２．５μＬの容積の希釈しない血清（高濃度）又は１：１００希釈（低濃度）で培地に添加する。特定した抗体でのインキュベーションに続いて、ＦＩＴＣ−ＧＭＧ−２ポリペプチド（５０ｎＭ／ｍＬ）をそれぞれの細胞培養ウェルに添加する。細胞を再び３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートする。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞をウェルから１ｍＬのＰＢＳ中にかきとる。細胞懸濁物をエッペンドルフチューブに移し、そして１０００ｒｐｍで２分間遠心分離する。上清を除去し、そして細胞を２００μＬのＰＢＳ中に再懸濁する。ＦＩＴＣ−ＧＭＧ−２ポリペプチドの結合及び取り込みを４０×倍率で蛍光マイクロスコピーにより分析する。
【０３７８】
この分析はＧＭＧ−２ポリペプチドの細胞への取り込み及び／又は結合を促進する又は妨げる剤を同定するために有用でありうる。
【０３７９】
リポタンパク質受容体としてのＬＳＲに対する効果
ＬＳＲのリポタンパク質結合、内面化及び分解活性に対するＧＭＧ−２タンパク質の効果も試験されうる。ＬＳＲのリポタンパク質受容体としての計測はＢｉｈａｉｎ ＆ Ｙｅｎ，（（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｍａｙ １９；３１（１９）：４６２８−３６；その図画、表又は図面を含むそれらを全体として本明細書中に援用する）において示される。ＧＭＧ−２タンパク質のＬＳＲ（又は他の受容体）のリポタンパク質結合、内面化及び分解活性に対する効果は、追加のコントロールとしての無処理の細胞を伴って、無傷のＧＭＧ−２タンパク質のそれと比較されうる。この分析は代謝関連活性のアゴニスト及びアンタゴニストに加えて、ＧＭＧ−２タンパク質の活性及び阻害変形についてスクリーニングするためにも使用されうる。
【０３８０】
ヒト肝ＰＬＣ細胞（ＡＴＣＣ容器）をグルタミン及びペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（高グルコース）中の６ウェルプレート中に３００，０００細胞／ウェルの濃度で置く（０日目）（Ｂｉｈａｉｎ ＆ Ｙｅｎ， １９９２）。培地を２日目に変える。３日目、コンフルエント単層をリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）（２ｍＬ／ウェル）で一回洗浄する。細胞を０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、３．７ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ、ｐＨ７．５中の１０ｎｇ／ｍＬヒト組換えレプチンで３７℃で３０分間インキュベートし、続いて増大する濃度のＧＭＧ−２ポリペプチドで３７℃でさらに３０分間インキュベートする。０．８ｍＭオレイン酸及び２０μｇ／ｍＬ125Ｉ−ＬＤＬの添加後、インキュベーションを３７℃で２時間続ける。単層を０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳで続けて２回洗浄し、続いて、ＰＢＳ／ＢＳＡで１回、及びその後ＰＢＳで続けて２回洗浄する。125Ｉ−ＬＤＬのオレイン酸誘導結合、取り込み及び分解の量を以前に示したように（Ｂｉｈａｉｎ ＆ Ｙｅｎ， １９９２， ｓｕｐｒａ）計測する。結果は三重決定の平均として示される。
【０３８１】
本発明者はＧＭＧ−２タンパク質の添加はリポタンパク質受容体としてのＬＳＲの増大した活性を引き起こすと考える。ＬＤＬのオレイン酸誘導結合及び取り込みは分解に比較してＧＭＧ−２タンパク質により影響されやすい。この増大したＬＳＲ活性は食後状態の間のトリグリセリドリッチリポタンパク質の高められたクリアランスを可能性としてもたらしうる。したがって、より多くの食物脂肪が脂肪組織中に沈積されるより、肝臓をとおして除去されうる。
【０３８２】
この分析はＬＳＲ活性（又は他の受容体をとおしたリポタンパク質取り込み、結合及び分解）を増大させる又は減少させる、及びしたがってトリグリセリドリッチリポタンパク質のクリアランス速度に影響する化合物（又はアゴニスト若しくはアンタゴニスト）の効率を決定するために使用されうる。
【０３８３】
筋肉分化に対する効果
Ｃ２Ｃ１２細胞（マウス骨格筋細胞系；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７２２， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を完全なＤＭＥＭ（ｗ／グルタミン、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ等）＋１０％ＦＣＳ中の薄く（約１５〜２０％）まく。２日後、それらは８０〜９０％コンフルエントになる。このとき、培地をＤＭＥＭ＋２％ウマ血清に変え、分化を許す。上記培地を毎日変える。豊富な筋管形成が２％ウマ血清にして３〜４日後に起こるが、Ｃ２Ｃ１２分化の正確な時間経過は他の事実の間で、それらがどのくらい継代されているか及びそれらがどのくらい維持されているかに因る。
【０３８４】
ＧＭＧ−２タンパク質の存在の筋肉分化に対する効果を試験するために、ＧＭＧ−２（１〜２．５μｇ／ｍＬ）を上記細胞がまだＤＭＥＭ ｗ／１０％ ＦＣＳ中にある、まいた日の後添加する。上記細胞をまいた２日後（ＧＭＧ−２がはじめに添加された１日後）、約８０〜９０％コンフルエントで、上記培地をＤＭＥＭ＋２％ウマ血清＋ＧＭＧ−２に変える。
【０３８５】
筋細胞脂肪酸酸化に対する効果
Ｃ２Ｃ１２細胞を４日間、２μｇ／ｍＬのＧＭＧ−２タンパク質の存在下又は非存在下で分化させる。４日目、オレイン酸酸化速度を１−14Ｃ−オレイン酸（０．２ｍＭ）の14ＣＯ2への変換を９０分間計測することにより決定する。この実験はＧＭＧ−２ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニスト又は活性化剤及び阻害剤に加えて、活性ポリペプチド及びペプチドについてのスクリーニングをするために使用されうる。
【０３８６】
ＧＭＧ−２のオレイン酸酸化の速度に対する効果は分化したＣ２Ｃ１２細胞（マウス骨格筋細胞；ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ＣＲＬ−１７７２）において及び肝細胞細胞系（Ｈｅｐａ１−６； ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ＣＲＬ−１８３０）において比較されうる。培養細胞を製造業者の教示にしたがって維持する。上記オレイン酸酸化分析は以前に示したように行われる（Ｍｕｏｉｏ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３３８；７８３−７９１）。簡単に述べると、ほぼコンフルエントの単層を低血清分化培地（ＤＭＥＭ、２．５％ウマ血清）中で４日間保ち、このとき筋管の形成が最大になる。肝細胞を１０％ＦＣＳで補充した同じＤＭＥＭ培地中で２日間保つ。実験の１時間前に、上記培地を除去し、そして１ｍＬの前インキュベーション培地（ＭＥＭ、２．５％ウマ血清、３ｍＭ グルコース、４ｍＭ グルタミン、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１％ＦＦＡフリーＢＳＡ、０．２５ｍＭ オレイン酸、５μｇ／ｍＬ ジェンタマイシン）を添加する。酸化実験の開始に、14Ｃ−オレイン酸（１μＣｉ／ｍＬ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を添加し、そして細胞を２．５μｇ／ｍＬ ＧＭＧ−２非存在下／存在下で３７℃で９０分間インキュベートする。インキュベーション時間の後、０．７５ｍＬの培地を除去し、そして筋ＦＦＡ酸化実験について以下に示されるように14Ｃ酸化産物について分析する。
【０３８７】
培養細胞におけるオレイン酸酸化後のトリグリセリド及びタンパク質分析
オレイン酸酸化分析のための培地の移行に続いて、細胞を氷上におく。トリグリセリド及びタンパク質内容量を決定するために、細胞を残りの培地を除去するために１ｍＬの１×ＰＢＳで洗浄する。それぞれのウェルに３００μＬの細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ）を添加し、そして３７℃で１０分間インキュベートする。プレートを細胞をゆるめるために軽くたたき、そして０．５ｍＬの１×ＰＢＳを添加する。上記細胞懸濁物をエッペンドルフチューブに移し、それぞれのウェルを追加の０．５ｍＬの１×ＰＢＳですすぎ、そして適切なエッペンドルフチューブに移す。サンプルを室温で１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。上清を捨て、そして７５０μＬの１×ＰＢＳ／２％ｃｈａｐｓを細胞ペレットに添加する。細胞懸濁物をヴォルテックスし、そして氷上に１時間おく。サンプルをその後１３０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離する。上清を新しい管に移し、そして分析するまで−２０℃で凍らせる。それぞれのサンプルにおけるトリグリセリド値の定量的な計測はＳｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧＰＯ−ＴＲＩＮＤＥＲ酵素キットを用いて決定される。上記マニュアル中に概略される手順を以下の例外をともなって厳守する：分析を４８ウェルプレート中で行い、３５０μＬのサンプル容積を分析し、コントロールブランクは３５０μＬ ＰＢＳ／２％ｃｈａｐｓから成り、及び標準はキット中に提供される１０μＬ標準及び６９０μＬ ＰＢＳ／２％ｃｈａｐｓを含む。サンプルの分析をＰａｃｋａｒｄ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｃｏｕｎｔ上で５５０ｎＭの波長で行う。タンパク質分析を製造業者の教示にしたがってＢＣＡタンパク質分析（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて２５μＬのそれぞれの上清サンプルについて行う。サンプルの分析はＰａｃｋａｒｄ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｃｏｕｎｔ上で５５０ｎＭの波長で行う。
【０３８８】
筋細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏグルコース取り込み
Ｌ６筋細胞をＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ）から得、そして７〜１１継代で使用する。細胞を標準の組織培養培地ＤＭＥＭ中で維持し、そしてグルコース取り込みを以前に示されているように（Ｗａｌｋｅｒ， Ｐ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｌ６ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ， ｂｉｏｓｙｔｈｅｓｉｓ， ａｎｄ ｍＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ． ＪＢＣ ２６５（３）：１５１６−１５２３；ａｎｄ Ｋｉｌｐ， Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｘｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｂｙ ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ ｉｎ Ｌ６ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０（５）：２５３５−２５４４、その開示をそれらを全体として本明細書中に援用する）インスリン（１０-8Ｍ）の存在下又は非存在下でＧＭＧ−２ポリペプチド断片あり又はなしで［3Ｈ］−２−デオキシグルコース（２ＤＧ）を用いて評価する。２ＤＧの取り込みをコントロール（添加されたインスリン又はＧＭＧ−２ポリペプチド断片なし）と比較したパーセント変化として表す。値は実験当たり４ウェルの平均±ＳＥＭとして表される。ウェルのセット間の差はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔにより評価され、確率値ｐ＜０．０５は顕著であると考えられる。
【０３８９】
実施例３： ＧＭＧ−２ポリペプチドの高脂肪食を与えたマウスへの効果
実験を約６週齢Ｃ５７Ｂ１／６マウス（群当たり８）を用いて行う。全てのマウスを個々に飼う。上記マウスをそれぞれの実験をとおして高脂肪食で維持する。上記高脂肪食（カフェテリア食；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ， Ｉｎｃ．からのＤ１２３３１）は以下の組成を有する：タンパク質ｋｃａｌ％１６、スクロースｋｃａｌ％２６、及び脂肪ｋｃａｌ％５８。上記脂肪は主に水素化したココナッツ油から成る。
【０３９０】
マウスが高脂肪食を６日間摂取した後、マイクロ−浸透ポンプをイソフルラン麻酔を用いて挿入し、そして全長ＧＭＧ−２ポリペプチド、ＧＭＧ−２ポリペプチド断片、塩水、及び関連のないペプチドをマウスに皮下で（ｓ．ｃ．）１８日間、提供するために使用する。ＧＭＧ−２ポリペプチドは１００、５０、２５、及び２．５μｇ／日の用量で提供され、そして関係のないペプチドは１０μｇ／日で提供される。体重を高脂肪食の１、３及び５日目に、及びその後処置の開始後毎日計測する。最後の血液サンプルを心穿刺により取り、そしてトリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール（ＴＣ）、グルコース、レプチン、及びインスリン値を決定するために使用する。日当たりに消費された食物量もそれぞれの群で決定される。
【０３９１】
実施例４： ヒトにおける代謝関連活性の試験
ヒトにおけるＧＭＧ−２ポリペプチドの効果の試験は医師の推奨及び確立されたガイドラインにしたがって行われる。マウスにおいて試験されるパラメーターはヒトにおいても試験される（例えば、食物摂取、体重、ＴＧ、ＴＣ、グルコース、インスリン、レプチン、ＦＦＡ）。生理学的因子は短期間にわたり変化を示すことが予想される。体重増加における変化はより長い期間を必要としうる。さらに、上記食物は慎重にモニターされる必要があるであろう。ＧＭＧ−２ポリペプチド、好ましくはＣ１ｑホモロジー領域を含むＧＭＧ−２ポリペプチドは７０ｋｇのヒト当たり約６ｍｇタンパク質又は１日当たり約１０ｍｇの日の用量で与えられうる。他の用量は、例えば、１日当たり１ｍｇ又は５ｍｇ〜１日当たり２０ｍｇ、５０ｍｇ又は１００ｍｇまで試験されうる。
【０３９２】
実施例５： マウス脂肪萎縮性糖尿病モデルにおける代謝関連活性の試験
以前に、レプチンは先天性脂肪異栄養症を有するマウスにおいてインスリン抵抗性及び真性糖尿病をくつがえすことが報告された（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４０１：７３−７６（１９９９）；図画、図面又は表を含むそれらを全体として本明細書中に援用する）。レプチンは脂肪萎縮性糖尿病の異なる脂肪異栄養マウスモデルにおいて、より効果的でないことが発見された（Ｇａｖｒｉｌｏｖａ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ４０３：８５０（２０００）；図画、図面又は表を含むそれらを全体として本明細書中に援用する）。本発明は単独の又はレプチン、レプチンペプチド（米国仮出願番号６０／１５５，５０６）若しくは他の化合物を伴うこのモデルにおけるインスリン抵抗性及び高血糖症を減少させるためのＧＭＧ−２ポリペプチドの使用を含む。分析はＡ−ＺＩＰ／Ｆ−１マウスを用いた、以前にＧａｖｒｉｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．（（２０００）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｎｏｖ；４９（１１）：１９１０−６；（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｆｅｂ ２４；４０３（６７７２）：８５０）中に示されるものを、ＧＭＧ−２ポリペプチドが実施例３（又は実施例６〜８）において以前に示された方法を用いて投与されるであろうことを除いては、含む。上記マウスのグルコース及びインスリン値は試験されるであろう、そして典型的に私たちの実験において計測されるレプチン、ＦＦＡ、及びＴＧ値の如き他の因子に加えて、上記食物摂取及び肝重量がモニターされる（実施例３、上記又は実施例６〜８を参照のこと）。
【０３９３】
実施例６： Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＧＭＧ−２ポリペプチドの血漿遊離脂肪酸に対する効果
正常なＣ５７ＢＬ６／ＪマウスにおけるＧＭＧ−２ポリペプチドの食後脂肪血（ＰＰＬ）に対する効果が試験される。
この実験において使用されるマウスは実験前２時間絶食され、その後基礎の血液サンプルが取られる。全ての血液サンプルがＥＤＴＡでコーティングした毛細管を用いて尾から取られる（それぞれの時点で５０μＬ）。０時（８：３０ ＡＭ）に、標準高脂肪食（６ｇバター、６ｇヒマワリ油、１０ｇ非脂肪乾燥乳、１０ｇスクロース、Ｎｂ＃６，ＪＦ，ｐｇ．１にしたがう１２ｍＬの新たに調製した蒸留水）が全ての動物に胃管栄養（ｖｏｌ．＝体重の１％）により与えられる。
【０３９４】
上記高脂肪食後即座に、２５μｇ ＧＭＧ−２ポリペプチドが１００μＬ塩水中でｉ．ｐ．で注入される。上記同じ用量（１００μＬ中２５μｇ／ｍＬ）が再び４５分に及び１時間４５分に注入される。コントロール動物は塩水（３×１００μＬ）を注入される。無処理の及び処理した動物は変換モードで扱われる。
【０３９５】
血液サンプルは１時間間隔で取られ、そして即座に氷上に置かれる。血漿はそれぞれの時点に続いて遠心分離により調製される。血漿は−２０℃で保持され、そして遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、トリグリセリド（ＴＧ）及びグルコースは標準の試験キット（Ｓｉｇｍａ ａｎｄ Ｗａｋｏ）を用いて２４時間以内に決定される。制限される入手可能な血漿量のため、グルコースは集められたサンプルを用いて二重で決定される。それぞれの時点について、処置群当たり８動物全てからの等用量の血漿が集められる。
【０３９６】
実施例７： Ｃ５７ ＢＬ／６マウスにおけるＧＭＧ−２ポリペプチドの血漿レプチン及びインスリンに対する効果
正常なＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスにおける食後脂肪血（ＰＰＬ）の間のＧＭＧ−２ポリペプチドの血漿レプチン及びインスリン値への効果が試験される。上記実験手順は、血液が、ＲＩＡによるレプチン及びインスリンの決定について必要とされるより多くの血液サンプルを得るために０、２及び４時間にのみ取られることを除いては、実施例６において示されるものと同じである。
【０３９７】
簡単に述べると、１６のマウスは実験前２時間絶食され、その後基礎の血液サンプルが取られる。全ての血液サンプルがＥＤＴＡコーティングされた毛細管を用いて尾から取られる（それぞれの時点で１００μＬ）。０時（９：００ ＡＭ）に、標準の高脂肪食（実施例６を参照のこと）が全ての動物に胃管栄養（ｖｏｌ．＝体重の１％）により与えられる。高脂肪食後即座に、２５μｇのＧＭＧ−２ポリペプチドが１００μＬ塩水中でｉ．ｐ．で注入される。上記同じ用量（１００μＬ中２５μｇ）が再び４５分に及び１時間４５分に注入される（処置群）。コントロール動物は塩水（３×１００μＬ）を注入される。無処理の及び処置した動物は変換モードで扱われる。
【０３９８】
血液サンプルは即座に氷上に置かれ、そして血漿はそれぞれの時点に続いて遠心分離により調製される。血漿は−２０℃で保持され、そして遊離脂肪酸（ＦＦＡ）が標準の試験キット（Ｗａｋｏ）を用いて２４時間以内に決定される。レプチン及びインスリンは製造業者のプロトコールにしたがってＲＩＡ（ＭＬ−８２Ｋ及びＳＲＩ−１３Ｋ、ＬＩＮＣＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｓｔ Ｃｈａｒｌｅｓ， ＭＯ）により決定される。しかしながら、２０μＬの血漿のみが使用される。それぞれの決定は二重で行われる。限られる入手可能な血漿の量のために、レプチン及びインスリンは両方の群でそれぞれの２動物の４プールにおいて決定される。
【０３９９】
実施例８： Ｃ５７ ＢＬ／６マウスにおけるＧＭＧ−２ポリペプチドの血漿ＦＦＡ、ＴＧ及びグルコースに対する効果
正常なＣ５７ＢＬ６／ＪマウスにおいてＧＭＧ−２ポリペプチドの食後脂肪血（ＰＰＬ）中の血漿ＦＦＡ、ＴＧ、グルコース、レプチン及びインスリン値に対する効果が示されている。高脂肪食の正常なＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスに与えられるＧＭＧ−２ポリペプチド（２．５μｇ／日）から生ずる体重減少も示されている（実施例３）。
【０４００】
上記実験手順は実施例６中で示されるものと同様である。簡単に述べると、１４のマウスは実験前２時間絶食され、その後基礎血液サンプルが取られる。全ての血液サンプルがＥＤＴＡコーティングされた毛細管を用いて尾から取られる（それぞれの時点で５０μＬ）。０時（９：００ ＡＭ）に、標準の高脂肪食（実施例６を参照のこと）が全ての動物に胃管栄養（ｖｏｌ．＝体重の１％）により与えられる。高脂肪食後即座に、４のマウスは２５μｇのＧＭＧ−２ポリペプチドを１００μＬ塩水中でｉ．ｐ．で注入される。上記同じ用量（１００μＬ中２５μｇ）が再び４５分に及び１時間４５分に注入される。第二の処置群は同じ間隔で５０μｇのＧＭＧ−２ポリペプチドを３回受ける。コントロール動物は塩水（３×１００μＬ）を注入される。無処理の及び処理された動物は変換モードで扱われる。
【０４０１】
血液サンプルは即座に氷上に置かれる。血漿はそれぞれの時点に続いて遠心分離により調製される。血漿は−２０℃で保持され、そして遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、トリグリセリド（ＴＧ）及びグルコースが標準の試験キット（Ｓｉｇｍａ ａｎｄ Ｗａｋｏ）を用いて２４時間以内に決定される。
【０４０２】
実施例９： エピネフリン注入後のＦＦＡに対するＧＭＧ−２ポリペプチドの効果
マウスにおいて、血漿遊離脂肪酸は高脂肪／スクロース試験食の胃管内投与後に増大する。これらの遊離脂肪酸はほとんど脂肪分解酵素、すなわち、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）及び肝臓リパーゼ（ＨＬ）の活性により作出される。この種において、これらの酵素は内皮に結合して及び血漿中に遊離循環して顕著な量で見られる。血漿遊離脂肪酸の他の源はβ−アドレナリン性刺激後に脂肪組織から遊離脂肪酸を放出するホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）である。ＧＭＧ−２ポリペプチドがＨＳＬにより放出される遊離脂肪酸の代謝をも制御するかどうか試験するために、マウスはエピネフリンを注入される。
２群のマウスは腹腔内注入によりエピネフリン（５μｇ）を与えられる。処理群はエピネフリンの１時間前及び再びエピネフリンと共にＧＭＧ−２ポリペプチド（２５μｇ）を注入され、一方でコントロール動物は塩水を受ける。血漿は単離され、そして遊離脂肪酸及びグルコースは上記に示されるように計測される（実施例８）。
【０４０３】
実施例１０： 筋ＦＦＡ酸化に対するＧＭＧ−２ポリペプチドの効果
筋遊離脂肪酸酸化に対するＧＭＧ−２ポリペプチドの効果を調査するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスからの無傷の後肢筋が単離され、そしてＦＦＡ酸化がオレイン酸を基質として用いて計測される（Ｃｌｅｅ， Ｓ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｖｅｓｓｅｌ ｗａｌｌ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｐａｓｅ ｈａｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ， Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ４１， ５２１−５３１（２０００）；Ｍｕｏｉｏ， Ｄ． Ｍ． Ｄｏｈｍ， Ｇ． Ｌ．， Ｔａｐｓｃｏｔｔ， Ｅ． Ｂ． ＆ Ｃｏｌｅｍａｎ， Ｒ． Ａ． Ｌｅｐｔｉｎ ｏｐｐｏｓｅｓ ｉｎｓｕｌｉｎ’ｓ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｉｎ ｍｕｓｃｌｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｏｂｅｓｅ ｏｂ／ｏｂ ｍｉｃｅ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２７６， Ｅ９１３−９２１（１９９９））。単離された筋におけるオレイン酸酸化は以前に示されるように計測される（Ｃｕｅｎｄｅｔ ｅｔ ａｌ（１９７６）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ５８：１０７８−１０８８；Ｌｅ Ｍａｒｃｈａｎｄ−Ｂｒｕｓｔｅｌ， Ｙ．， Ｊｅａｎｒｅｎａｕｄ， Ｂ． ＆ Ｆｒｅｙｃｈｅｔ， Ｐ． Ｉｎｓｕｌｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｏｌｅｕｓ ｍｕｓｃｌｅ ｏｆ ｌｅａｎ ａｎｄ ｏｂｅｓｅ ｍｉｃｅ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２３４， Ｅ３４８−Ｅ３５８（１９７８））。簡単に述べると、マウスを断頭により殺し、そしてヒラメ筋及びＥＤＬ筋をすばやく後肢から単離する。それぞれの筋の遠位の腱を異なる媒体間での移行を促進するために縫合して一つの塊にする。全てのインキュベーションはＦＦＡフリーウシ血清アルブミン（フラクションＶ、ＲＩＡグレード、Ｓｉｇｍａ）及び５ｍＭグルコース（Ｓｉｇｍａ）で補充された１．５ｍＬのＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ重炭酸緩衝液（１１８．６ｍＭ ＮａＣｌ、４．７６ｍＭ ＫＣｌ、１．１９ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１．１９ｍＭ ＭｇＳＯ4、 ２．５４ｍＭ ＣａＣｌ2、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ3、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）中で３０℃で行われる。上記実験をとおしてオレイン酸（Ｓｉｇｍａ）の総濃度は０．２５ｍＭである。全ての媒体はインキュベーション前に酸素化される（９５％Ｏ2；５％ＣＯ2）。上記気体混合物はガスウォッシャー（Ｋｏｎｔｅｓ Ｉｎｃ．， Ｖｉｎｅｌａｎｄ， ＮＪ）をとおして泡立たせることにより実験をとおして水和される。
【０４０４】
筋を酸素化でインキュベーション媒体中で３０分間すすぐ。上記筋をその後新しい媒体（１．５ｍＬ）に移し、１μＣｉ／ｍＬ［１−14Ｃ］オレイン酸（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の存在下で３０℃でインキュベートする。この媒体を含む上記インキュベーションバイアルをゴムの隔壁で密閉し、そこからＷｈａｔｍａｎ ｐａｐｅｒ（１．５ｃｍ×１１．５ｃｍ）の１片を有する中心ウェルが懸濁される。
【０４０５】
一定の酸素化を伴う１０分間のはじめのインキュベーションの後、気体循環を外環境から系を閉じるために除去し、そして上記筋を３０℃で９０分間インキュベートする。この期間の最後に、０．４５ｍＬのＳｏｌｖａｂｌｅ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｍｅｒｉｄｅｎ， ＣＴ）を中心ウェル中のＷｈａｔｍａｎ ｐａｐｅｒ上に注入し、そして上記筋によるオレイン酸酸化を上記バイアルを氷上に移すことにより停止する。
【０４０６】
５分後、上記筋を媒体から除去し、そして０．５ｍＬ媒体の等分も除去する。上記バイアルを再び閉じ、そして１ｍＬの３５％過塩素酸をゴムの隔壁をとおして貫通することにより媒体中へシリンジで注入する。酸化された媒体から放出されるＣＯ2は中心ウェル中のＳｏｌｖａｂｌｅにより回収される。３０℃での９０分の回収期間後、Ｗｈａｔｍａｎ ｐａｐｅｒを中心ウェルから除去し、そして１５ｍＬのシンチレーション液（ＨｉｏｎｉｃＦｌｏｕｒ， Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｍｅｒｉｄｅｎ， ＣＴ）を含むシンチレーションバイアル中におく。14Ｃ放射活性の量を液体シンチレーション計測により定量する。オレイン酸酸化の速度は９０分／筋ｇで産生されるｎｍｏｌオレイン酸として表される。
【０４０７】
ＧＭＧ−２のオレイン酸酸化に対する効果を試験するために、これらのタンパク質を最終濃度２．５μｇ／ｍＬで媒体に添加し、そして上記手順をとおして媒体中で維持する。
【０４０８】
実施例１１： マウスから単離された筋肉及び肝臓におけるトリグリセリドに対するＧＭＧ−２ポリペプチドの効果
ＧＭＧ−２ポリペプチドにより誘導された増大したＦＦＡ酸化は筋肉又は肝臓への増大したＦＦＡデリバリーをも伴うかどうかを決定するために、上記後肢筋肉及び肝臓トリグリセリド内容量がマウスのＧＭＧ−２ポリペプチド処理の後計測される。肝臓サンプルに加えて後肢筋肉は処理及び無処理動物から除去され、そして上記トリグリセリド及び遊離脂肪酸濃度が標準の脂質抽出法（Ｓｈｉｍａｂｕｋｕｒｏ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｄｉｒｅｃｔ ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌｅｐｔｉｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４， ４６３７−４６４１（１９９７））にしたがって決定され、続いて標準の試験キットを用いたＴＧ及びＦＦＡ分析がされる。
【０４０９】
実施例１２： 内部脂質注入後のＦＦＡに対するＧＭＧ−２ポリペプチドの効果
２群のマウスに、小腸吸収をバイパスして、血漿ＦＦＡにおける突然の上昇を作出するために、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ−２０％（Ｃｌｉｎｔｅｃ）の３０μＬボーラスを静脈内（尾の静脈）注入する（Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄは栄養治療において使用される静脈内脂肪エマルジョンである）。処理群（ＧＭＧ−２ポリペプチド−処理）にＩｎｔｒａｌｉｐｉｄが与えられる３０及び６０分前にＧＭＧ−２ポリペプチド（２５μｇ）を注入し、一方で、コントロール動物（コントロール）は塩水を受ける。血漿を単離し、そしてＦＦＡを以前に示されるように計測する。Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ注入により誘導されるピークに続く血漿ＦＦＡにおける減少に対するＧＭＧ−２ポリペプチドの効果がその後モニターされる。
【０４１０】
実施例１３： 筋細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏグルコース取り込み
Ｌ６筋細胞はＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ）から得られ、そして継代７〜１１で使用される。細胞は標準の組織培養培地ＤＭＥＭ中で維持され、そしてグルコース取り込みを以前に示されているように（Ｗａｌｋｅｒ， Ｐ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｌ６ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ， ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ａｎｄ ｍＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ． ＪＢＣ ２６５（３）：１５１６−１５２３；及びＫｉｌｐ Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｘｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｂｙ ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ ｉｎ Ｌ６ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０（５）：２５３５−２５４４、その開示はそれらを全体として本明細書中に援用する）、インスリン（１０．ｓｕｐ．−８Ｍ）存在下又は非存在下でＧＭＧ−２ポリペプチドあり又はなしで［．ｓｕｐ．３Ｈ］−２−デオキシグルコース（２ＤＧ）を用いて評価される。２ＤＧの取り込みはコントロール（添加されたインスリン又はＧＭＧ−２なし）と比較したパーセント変化として表される。値は実験当たり４ウェルのセットの平均±ＳＥＭとして表される。ウェルのセット間の差はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔにより評価され、確率値ｐ＜０．０５は顕著であると考えられる。
【０４１１】
実施例１４： げっ歯類糖尿病モデルにおける代謝関連活性についてのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
代謝プロファイルは肥満及び糖尿病のさまざまな動物モデル間で異なるので、複数モデルの分析がＧＭＧ−２ポリペプチドの高血糖症、高インスリン血症、高脂血症及び肥満に対する効果を分離するために取られる。実験動物のコロニーにおける突然変異及び食計画に対する異なる感受性は肥満及びインスリン抵抗性と関連しうる非インスリン依存性糖尿病を有する動物モデルの開発をなした。マウスにおけるｄｂ／ｄｂ及びｏｂ／ｏｂの如き遺伝子モデル（Ｄｉａｂｅｔｅｓ， （１９８２）３１（１）：１−６を参照のこと）及びｚｕｃｋｅｒラットにおけるｆａ／ｆａが疾患の病態生理を理解する及び新規抗糖尿病化合物の効果を試験するためにさまざまな研究室により開発されている（Ｄｉａｂｅｔｅｓ， （１９８３）３２：８３０−８３８；Ａｎｎｕ． Ｒｅｐ． Ｓａｎｋｙｏ Ｒｅｓ． Ｌａｂ．（１９９４）．４６：１−５７）。ホモ接合動物、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＵＳにより開発されたＣ５７ ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂマウスは肥満、高血糖症、高インスリン血症及びインスリン抵抗性であり（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， （１９９０）８５：９６２−９６７）、一方で、ヘテロ接合体はやせ及び正常血糖である。ｄｂ／ｄｂモデルにおいて、マウスは年齢と共にインスリン血症を発展的に発達し、それは血糖値が不十分に制御されるときヒトＩＩ型糖尿病の後期の段階において通常観察される特徴である。膵臓の状態及びその過程は上記モデルにより変化する。このモデルは真性ＩＩ型糖尿病のものに似ており、本発明に係る化合物は血糖及びトリグリセリド低下活性について試験される。Ｚｕｃｋｅｒ（ｆａ／ｆａ）ラットは重篤に肥満、高インスリン血症、及びインスリン抵抗性であり（Ｃｏｌｅｍａｎ， Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３１：１，１９８２；Ｅ Ｓｈａｆｒｉｒ， ｉｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ；Ｈ． Ｒｉｆｋｉｎ ａｎｄ Ｄ． Ｐｏｒｔｅ， Ｊｒ． Ｅｄｓ．（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｅｄ． ４， １９９０），ｐｐ． ２９９−３４０）、そして上記ｆａ／ｆａ変異はマウスｄｂ変異と同等のラットでありうる（Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ６９：２１７−２２０， １９９２； Ｔｒｕｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：７８０６， １９９１）。Ｔｕｂｂｙ（ｔｕｂ／ｔｕｂ）マウスは顕著な高血糖を伴わず、肥満、軽いインスリン抵抗性及び高インスリン血症により特徴付けられる（Ｃｏｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｈｅｒｅｄｉｔｙ ８１：４２４，１９９０）。
【０４１２】
以前に、レプチンは先天性脂肪異栄養症を有するマウスにおいてインスリン抵抗性及び真性糖尿病を後退させることが報告された（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ４０１：７３−７６（１９９９））。レプチンは脂肪萎縮性糖尿病の異なる脂肪異栄養症マウスモデルにおいて効果的でないことがわかった（Ｇａｖｒｉｌａｖａ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ４０３：８５０（２０００）；図画、図面又は表を含むそれらを全体として本明細書中に援用する）。
【０４１３】
化学的に誘導された糖尿病についてのストレプトゾトシン（ＳＴＺ）モデルは肥満の非存在下での高血糖症の効果を調べるために試験される。ＳＴＺ処理動物はインスリンを欠き、そして重篤に高血糖である（Ｃｏｌｅｍａｎ， Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３１：１， １９８２；Ｅ． Ｓｈａｆｒｉｒ， ｉｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ； Ｈ． Ｒｉｆｋｉｎ ａｎｄ Ｄ． Ｐｏｒｔｅ， Ｊｒ． Ｅｄｓ．（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｅｄ． ４， １９９０），ｐｐ．２９９−３４０）。肥満が遺伝子モデルにおけるよりも重篤でなく、そして過食症、高インスリン血症及びインスリン抵抗性を伴わず発展する、化学的に誘導された肥満についてのグルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）モデル（Ｏｌｎｅｙ， Ｓｃｉｅｎｃｅ １６４：７１９， １９６９； Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉ． Ｅｘｐ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５：４１，１９７８）も調べられる。最後に、肥満の誘導についての非化学的、非遺伝的モデルはげっ歯類にａｄ ｌｉｂｉｔｕｍで高脂肪／高炭水化物（カフェテリア食）食を給餌することを含む。
【０４１４】
本発明はどの又は全ての上記げっ歯類糖尿病モデルにおける又はＩ型若しくはＩＩ型糖尿病又は以前に示される他の好ましい代謝疾患を有するヒト又は他の動物に基づくモデルにおけるインスリン抵抗性及び高血糖を減少させるためのＧＭＧ−２ポリペプチドの使用を含む。本発明に係る組成物中で、上記ＧＳＳＰ４ポリペプチドは、所望の場合、単独で又は組み合わせで、インスリン、レプチン（米国仮出願番号６０／１５５，５０６）又はトログリタゾンの如き、他の融和性の生理学的に活性な抗糖尿病剤と関連されうる。分析は、ＧＳＳＰ４ポリペプチドが腹腔内、皮下、筋内又は静脈内投与されることを除いては、Ａ−ＺＩＰ／Ｆ−１マウスを用いた、Ｇａｖｒｉｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．（（２０００）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｎｏｖ；４９（１１）：１９１０−６；（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｆｅｂ ２４；４０３（６７７２）：８５０）中に以前に示されるものを含む。上記マウスのグルコース及びインスリン値は試験され、そして典型的に私たちの実験で計測されるレプチン、ＦＦＡ、及びＴＧ値の如き他の因子に加えて、食物摂取及び肝臓重量がモニターされる。
【０４１５】
ＧＭＧ−２ポリペプチドの抗高血糖活性についてのｉｎ ｖｉｖｏ分析
遺伝子的に変換された肥満糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）（雄、７〜９週齢）を２２．ｄｅｇｒｅｅ． Ｃ． 及び５０％比較湿度で標準の研究室条件下で飼い（７〜９マウス／ケージ）、ａｄ ｌｉｂｉｔｕｍでＰｕｒｉｎａげっ歯類食の餌及び水で維持する。処置前、血液をそれぞれの動物の尾の静脈から回収し、そして血中グルコース濃度をＯｎｅ Ｔｏｕｃｈ Ｂａｓｉｃ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｍｏｎｉｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅｓｃａｎ）を用いて決定する。２５０〜５００ｍｇ／ｄｌの血漿グルコース値を有するマウスが使用される。それぞれの処理群は、研究の開始に平均グルコース値がそれぞれの群で同等になるように分配された７のマウスから成る。ｄｂ／ｄｂマウスに上記マウスに皮下で（ｓ．ｃ．）ＧＭＧ−２ポリペプチド、塩水、及び関連のないペプチドを提供するために、イソフルラン麻酔を用いて挿入された、マイクロ−浸透ポンプにより投与する。血液を４時間の間１時間毎に及び投与後２４、３０時間に尾の静脈からサンプリングし、血中グルコース濃度について分析する。食物を投与後０〜４時間は取り出し、その後再導入する。個体の体重及び平均食物消費（それぞれのケージ）も２４時間後に計測する。群間の顕著な差（ＧＭＧ−２処理を塩水処理に比較して）はＳｔｕｄｅｎｔ ｔ−ｔｅｓｔを用いて評価される。
【０４１６】
ｉｎ ｖｉｖｏインスリン感受性分析
ｉｎ ｖｉｖｏインスリン感受性は以下のプロトコールにしたがって２段階高インスリン血−正常血糖クランプを利用して調べられる。実施例２中に示されるどの又は全てのさまざまなモデルからのげっ歯類を実験手順の前に少なくとも１週間飼う。頸静脈及び頸動脈カテーテルの設置のための手術をケタミン及びキシラジン（ｉ．ｍ．）麻酔を用いて滅菌条件下で行う。手術後、全てのげっ歯類の意識を回復させ、そして個々のケージに置く。ＧＭＧ−２ポリペプチド又は媒体を完全な回復後及び続く２日間、頸静脈をとおして投与する。最後の処理１６時間後、高インスリン血−正常血糖クランプを行う。げっ歯類をリストレイナーに置き、そして４．ｍｕ Ｃｉ［３−．ｓｕｐ．３Ｈ］グルコース（ＮＥＮ）のボーラスを投与し、続いて０．２．ｍｕ．Ｃｉ／分（２０．ｍｕ．ｌ／分）の用量でトレーサーを連続して融合する。トレーサー融合の開始２時間後、３の血液サンプル（それぞれ０．３ｍｌ）を基礎の計測のために１０分間隔（−２０〜０分）で回収する。インスリン融合をその後開始し（５ｍＵ／ｋｇ／分）、そして１００．ｍｕ．ｌ血液サンプルを血漿グルコースをモニターするために１０分毎に取る。３０％グルコース溶液を正常血糖を達成する及び維持するために血漿グルコース値に基づいて第二のポンプを用いて融合する。定常状態が５ｍＵ／ｋｇ／分インスリン（安定グルコース融合速度及び血漿グルコース）で確立されたら、３の追加の血液サンプル（それぞれ０．３ｍｌ）をグルコース、［３−．ｓｕｐ．３Ｈ］グルコース及びインスリン（１００〜１２０分）の計測のために得る。インスリンのより高い用量（２５ｍＵ／ｋｇ／分）をその後投与し、そしてグルコース融合速度を第二の正常血糖クランプについて調節し、そして血液サンプルを分で取る。グルコース特異的活性を脱タンパク質血漿において決定し、そしてＲｄ及び肝臓グルコースアウトプット（ＨＧＯ）の計算を、示されるように（Ｌａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０：４３， １９９２）行う。基礎の期間での並びに５及び２５ｍＵ／ｋｇ／分融合後の血漿インスリン値をその後決定し、そしてＧＭＧ−２処理及び媒体処理げっ歯類間で比較する。
【０４１７】
グルコースホメオスタシスのインスリン制御は２の主な成分；末梢グルコース取り込みの刺激及び肝臓グルコースアウトプットの抑制を有する。グルコースクランプにおけるトレーサー研究を用いて、上記インスリン応答のどの部分がＧＭＧ−２ポリペプチドにより影響されるかを決定することが可能である。
【０４１８】
実施例１５： ＧＭＧ−２ポリペプチド断片のヂペプチヂルペプチダーゼ切断についての分析
ＧＭＧ−２（配列ＩＤ番号：２の１４４〜２８８若しくは１６２〜２８８又は配列ＩＤ番号：４の１３４〜２７８若しくは１５２〜２７８又は配列ＩＤ番号：６の１１５〜２５９若しくは１３３〜２５９）ポリペプチド断片のヂペプチヂルペプチダーゼ切断は無傷のＧＭＧ−２ポリペプチド断片に特異的に結合するが、Ｎ−末端ヂペプチドＥＰが除去された前記ＧＭＧ−２ポリペプチド断片には特異的に結合しないモノクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡにより決定される。すなわち、前記抗体はＧＭＧ−２（配列ＩＤ番号：２の１４４〜２８８若しくは１６２〜２８８又は配列ＩＤ番号：４の１３４〜２７８若しくは１５２〜２７８又は配列ＩＤ番号：６の１１５〜２５９若しくは１３３〜２５９）に結合するが、ＧＭＧ−２（配列ＩＤ番号：２の１４６〜２８８若しくは１６４〜２８８又は配列ＩＤ番号：４の１３６〜２７８若しくは１５４〜２７８又は配列ＩＤ番号：６の１１７〜２５９若しくは１３５〜２５９）には結合しない。ヂペプチヂルペプチダーゼは、非限定的に、ヂペプチヂルペプチダーゼ、水溶性ヒトＣＤ２６又は水溶性ヒトアトラクチンから成るヒト血漿から選ばれる。
【０４１９】
簡単に述べると、ＧＭＧ−２（５μｌ、１００ｆｍｏｌ）を血漿サンプル（９５μｌ）に添加し、そして３７℃で１時間インキュベートし、その後分解されずに残るＧＭＧ−２ポリペプチド断片の量を無傷のＧＭＧ−２ポリペプチド断片について特異的なモノクローナル抗体を用いて酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）により決定する。リファレンスとして、ＧＭＧ−２ポリペプチド断片（５μｌ、１００ｆｍｏｌ）を熱不活性化血漿（９５μｌ）に添加し、それは０．０１ｍｍｏｌ／ｌバリン−ピローリヂド及び５００ＫＩＥ／ｍｌアプロチニンを含む。リファレンスにおけるヂペプチヂルペプチダーゼ活性を０として定義すること及びサンプルにおける無傷のＧＭＧ−２ポリペプチド断片の量をリファレンスと比較することにより、ＧＭＧ−２ポリペプチド断片のヂペプチヂルペプチダーゼ切断の程度がリファレンスに比較して計算され、そしてパーセントとして表される。
【０４２０】
実施例１６： マウスにおける体重減少の維持に対するｇＡＣＲＰ３０の効果
ａＡＣＲＰ３０の体重減少維持特性を示すために、正常マウスを体重減少を促進するよう減少したカロリー食におく。上記減少したカロリー食を、上記マウスがそれらの開始体重の１０％を失うまで続ける。第二の群のマウスを、上記マウスがそれらの開始体重の２０％を失うまで体重減少食で続ける。上記マウスにその後２．５μｇ／日のｇＡＣＲＰ３０、５μｇ／日のＡＣＲＰ３０又は生理学的塩水をデリバリーする浸透ポンプ（Ａｌｚｅｔ、 Ｎｅｗａｒｋ、 ＤＥ）を手術で埋め込む。上記マウスを正常食に戻し、そしてそれらの体重を１０日間にわたり記録する。１０日後、ｇＡＣＲＰ３０で処置されたマウスは塩水で処置されたマウスより低い体重を有するという結果は、ｇＡＣＲＰ３０での処置は体重減少の維持を促進する証拠を提供すると取られるであろう。
【０４２１】
実施例１７： ＧＭＧ−２及びその断片の可溶化
ベクター構築物： 配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化２７】
【化２８】
【化２９】
【化３０】
【化３１】
【０４２２】
配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化３２】
【化３３】
【化３４】
【化３５】
配列ＩＤ番号：２のアミノ酸１〜２８８又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸１〜２７８又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸１〜２５９から選ばれるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはバキュロウイルス発現ベクターＦａｓｔＢａｃＨＴ中にクローニングされる。本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片にＮ−末端で融合されたヒト亜鉛−アルファ２−糖タンパク質シグナルペプチドから成る異種のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはバキュロウイルス発現ベクターＦａｓｔＢａｃＨＴ中にクローニングされ、ここで前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化３６】
【化３７】
【化３８】
【化３９】
【化４０】
【０４２３】
配列ＩＤ番号：２のアミノ酸１〜２８８又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸１〜２７８又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸１〜２５９を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは哺乳類の発現ベクターｐｃＤＮＡ４ＨｉｓＭａｘ中にクローニングされる。本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片にＮ−末端で融合されたヒト亜鉛−アルファ２−糖タンパク質シグナルペプチドから成る異種のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは哺乳類の発現ベクターｐｃＤＮＡ４ＨｉｓＭａｘ中にクローニングされ、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化４１】
【化４２】
【化４３】
【化４４】
【０４２４】
配列ＩＤ番号：２のアミノ酸１〜２８８又は配列ＩＤ番号：４のアミノ酸１〜２７８又は配列ＩＤ番号：６のアミノ酸１〜２５９を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏ中にクローニングされる。本発明に係るｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片にＮ−末端で融合されたヒト亜鉛−アルファ２−糖タンパク質シグナルペプチドから成る異種のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏ中にクローニングされ、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化４５】
【化４６】
【化４７】
【化４８】
【化４９】
【０４２５】
あるいは、配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化５０】
【化５１】
【化５２】
【化５３】
【化５４】
【化５５】
【化５６】
【化５７】
【化５８】
【化５９】
【０４２６】
あるいは、配列ＩＤ番号：２のアミノ酸
【化６０】
【化６１】
【化６２】
【化６３】
【化６４】
【化６５】
【化６６】
【化６７】
【化６８】
【化６９】
【０４２７】
実施例１８： 幼児処方補助栄養
以下の例はｇＧＭＧ−２ポリペプチドを補助栄養援助として新生児に投与する方法を示し、さらにｇＧＭＧ−２−強化ヒト母乳又は非ヒト源からのｇＧＭＧ−２−強化乳置換調剤を投与することにより新生児の成長を促進する方法を提供する。脱水された又は凍結乾燥されたｇＧＭＧ−２ポリペプチド粉末は汲み出されたヒト母乳（新たに汲み出された又は保存後事前に温められた）又は非ヒト源からの事前に温められた乳置換調剤に５〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０〜８００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは６５〜６５０ｎｇ／ｍｌの範囲で、直接添加される。本発明に係るポリペプチドでの補助は日をとおして給食毎にヒト母乳又は母乳置換の瓶での給食において、幼児、特に早産の幼児に提供され、そして誕生から６月齢まで提供され続ける。早産の幼児は低い誕生体重又は非常に低い誕生体重のものでありうる。
【０４２８】
本研究の第一の目的は、ヒト乳（ＨＭ）又はヒト乳置換（ＨＭＳ）に添加される本発明に係るポリペプチドが早産の幼児において許容される成長を援助することを示すことである。第二の目的は栄養モジュールを消費する成熟前幼児の血清生物化学物質（すなわち、タンパク質状態、カルシウム、アルカリフォスファターゼ）、耐性、臨床的問題、及び病的性質を評価することである。他の第二の目的は本発明に係る補助組成物を早産の幼児における成長を促進するために何年間か使用されている商業的な強化粉末と比較することである。意図〜処置の、予想される、ランダム化された、二重盲検の、複数中心研究が給食毎に商業的に入手可能な粉末化されたヒト母乳強化剤（Ｅｎｆａｍｉｌ． ＲＴＭ． Ｈｕｍａｎ Ｍｉｌｋ Ｆｏｒｔｉｆｉｅｒ， ｃｏｎｔｒｏｌ）又は本発明に係る補助ポリペプチド（試験）粉末（実験）で補助された早産の母乳を受ける早産の幼児を評価するために行われる。患者は登録され、そして誕生から２１日までそれぞれの強化剤粉末についてランダム化される。研究１日目は試験粉末の強化が開始し、そして上記患者が少なくとも１００ｍＬ／ｋｇ／日の摂取に達する時である。人体測定学的指標、血清生物化学物質、摂取、耐性、及び病的性質のデータが評価される。それぞれの幼児は退院まで研究される；人体測定学的変数（体重、身長、及び頭部周囲）のみが研究２９日後に集められる。成熟前幼児は研究調査員と共同研究することに同意した新生児集中治療単位から採用される。妊娠齢について適切な体重を有し、そして１６００ｇ前後の重さの、妊娠３３週齢前後に生まれた単独の、双子の又は三つ子の幼児は参加に適格性を有する。１４４の幼児がコントロール又は実験のいずかにランダム化される；７０の早産の幼児はコントロール群にランダム化され、そして７４の早産の幼児は実験群にランダム化される。上記ランダム化は誕生体重及び性別について釣り合っている。
【０４２９】
独立変数（処置）はＨＭ又はＨＭＳに添加されるコントロール強化粉末及び実験試験粉末である。両方の強化剤（試験及びコントロール）は粉末化された形態で小さな包で提供され、そして２５ｍＬのＨＭ又はＨＭＳに添加される。第一の成果変数は研究１日目〜研究２９日目まで又は退院のどちらか早い方までの体重増加（ｇ／ｋｇ／日）である。第二の成果変数は身長増加（ｍｍ／日）並びにタンパク質状態、電解質状態、鉱物ホメオスタシス、及びビタミンＡ及びＥ状態を評価するための血清生物化学物質である。血清生物化学物質はまた医薬チャートにおいて記録されるスケジュール化されていない研究室結果をも含む。第三の変数は頭部周囲の増加（ｍｍ／日）、病歴、摂取、耐性、臨床的問題／病的性質、呼吸状態、抗生物質使用、及び輸血の回数を含む。研究期間の平均総エネルギー摂取は１１８ｋｃａｌ／ｋｇ／日前後で、群間で異ならない。
【０４３０】
実施例１９： ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片によるホモ三量体形成の評価
ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片によるホモ三量体形成は分析遠心分離における沈降平衡、分子量を正確に及び形の如き他の物理学的因子に因らず決定する方法を用いて評価される。
候補ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体を、例えば、１６／６０ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲルろ過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の如きゲルろ過の方法を含むプロトコールを用いて精製する。前記精製された候補ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片ホモ三量体タンパク質濃度は５．７ｍＭリン酸（ｐＨ７．５）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ中３μＭに作出される。サンプルはＢｅｃｋｍａｎ ＸＬ−Ａ分析超遠心分離内で８，０００ｒｐｍで１０℃で１８時間遠心分離され、その後吸収が記録される。上記データを、均一種の沈降を示す以下の式にＭａｃＮｏｎｌｉｎ ＰＰＣを用いて、包括的にフィットする：Ａｂｓ＝Ｂ＋Ａ’ｅｘｐ［Ｈ×Ｍ（ｘ2−ｘ0 2）］、ここでＡｂｓ＝半径ｘでの吸収、Ａ’＝リファレンス半径ｘ０での吸収、Ｈ＝（１−υρ）ω2／２ＲＴ、Ｒ＝気体定数、Ｔ＝Ｋｅｌｖｉｎでの温度、υ＝部分的な特異的容積＝０．７１８９６１３１ｍＬ／ｇ、ρ＝溶媒濃度＝１．００６１ｇ／ｍｌ、ω＝ｒａｄｉａｎｓ／ｓでの角度速度、Ｍ＝見かけの分子量、及びＢ＝溶媒吸収（ブランク）。
【０４３１】
実施例２０： タンパク質キナーゼＣアルファ（ＰＫＣα）のリン酸化状態に対するＧＭＧ−２ポリペプチドの効果
細胞を５μｇ／ｍｌ ＧＭＧ−２ポリペプチド又は生理学的塩水で５、１０、３０、及び６０分間処置する。細胞をその後洗浄し、そして５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．２５％ デオキシコール酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１：１００ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｉ及びＩＩ（Ｓｉｇｍａ）、及びＣｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）中ですすぐ。Ｓｅｒ６５７−リン酸化ＰＫＣαの量を上記セリン／スレオニン残基がリン酸化されたときのみ保存された疎水性Ｃ−末端ＦＸＸＦ（Ｓ／Ｔ）（Ｆ／Ｙ）モチーフを認識するアフィニティー精製したＰＫＣ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてウェスタンブロット分析により評価した。個々のレーンにおけるタンパク質の総量をβ−チューブリン（Ｓｉｇｍａ）に対するモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロットにより正規化する。
【０４３２】
実施例２１： ＮＦ−κＢ活性化に対するＧＭＧ−２ポリペプチドの効果
ＧＭＧ−２ポリペプチドによるＮＦ−κＢの活性化
ルシフェラーゼ活性を、プロテインキナーゼＫ及び熱処理の前及び後に、２００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ（Ｅ． ｃｏｌｉ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ０５５：Ｂ５、Ｓｉｇｍａ）又は５μｇ／ｍｌ ＧＭＧ−２ポリペプチドでの一晩のインキュベートに続いてトランスフェクトされた細胞において計測する。細胞をＦｕＧｅｎｅ ６ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて製造業者の教示にしたがってＥ−セレクチンプロモータールシフェラーゼ構築物［Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ Ｕ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｓｅｐ；１４（９）：５８２０−３１、それらを全体として本明細書中に援用する］及び内部トランスフェクション効率コントロールとしてＣＭＶプロモーター−β−ガラクトシダーゼでトランスフェクトする。インキュベーションは通常の成長培地で行われる。内毒素汚染について試験するために、ＧＭＧ−２ポリペプチド及びＬＰＳをプロテインキナーゼＫ（０．２ｍｇ／ｍｌ）で５０℃で９０分間、続いて９９℃で１２分間処理する。消化に対するＬＰＳの抵抗性及びＧＭＧ−２ポリペプチドの感受性は後者の活性は菌の内毒素による汚染のためではないことを確立する。
【０４３３】
ＧＭＧ−２ポリペプチドによるＩκＢ−αのＳｅｒ３２リン酸化及び分解
細胞を通常の成長培地で２００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ又は５μｇ／ｍｌ ＧＭＧ−２ポリペプチドで処理する。３０及び１２０分のインキュベーション後、細胞をＣａ2+及びＭｇ2+を含むＰＢＳで洗浄し、そして本明細書中に示されるように溶解する。溶解物中のリン酸化された及び総ＩκＢ−αの量をアフィニティー精製したＳｅｒ３２リン−特異的抗体及び異なるリン酸化状態に依存しないＩκＢ−α抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてウェスタンブロット分析により評価する。
【０４３４】
実施例２２： 異なる組織源からのＰｏｌｙ Ａ＋及びトータルＲＮＡのｉＡＦＬＰ遺伝子発現プロファイリング分析の効果
Ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ｉＡＦＬＰ）法を“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｂｙ ｉＡＦＬＰ： Ａ ＰＣＲ ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ”（Ｋａｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．９：１３０５−１３１２，１９９９）と題された記事から適合させる。
【０４３５】
ｉＡＦＬＰ遺伝子発現はＡｍｂｉｏｎ（＃７９６１−肝臓、７９６７−心臓、７９６３−脳、７９８３−骨格筋、７９５１−胎盤、及び７９５１−小腸）及びＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（＃Ｄ６００５−０１−脂肪組織）からそれぞれ購入される異なる成人ヒト組織からのＰｏｌｙ Ａ＋ ＲＮＡ及びトータルＲＮＡを用いて行われる。トータルＲＮＡは３７℃で３０分間ＤＮａｓｅ処理される。２０μｇのトータルＲＮＡ又は２μｇのＰｏｌｙＡ＋ ＲＮＡをＲｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅにより供給されるｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを用いて製造業者の教示にしたがってｄｓｃＤＮＡに変換する。上記精製された及び定量されたｄｓｃＤＮＡをＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓにより供給されるＭｂｏＩ制限酵素キットを用いて製造業者の教示にしたがって切断する。３分の１のＭｂｏＩ切断ｄｓｃＤＮＡをＲｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅにより供給されるＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて製造業者の教示にしたがってリン酸化アダプターカセットプライマーにつなげる。上記つなげられたｄｓｃＤＮＡを最終濃度１ｎｇ／μｌにグリコーゲン及びＤＩ水中に希釈する。１ｎｇを０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＰＣＲ緩衝液、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、２μＭ Ｖｉｃ蛍光標識化Ｔ７プライマー、２μＭの遺伝子特異的逆プライマー、８％グリセロール、及び１Ｕｎｉｔ Ａｍｐｌｉｔａｇ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む１０μｌの最終ＰＣＲマスターミックス容積に添加する。上記鋳型を９５℃で１０分間インキュベートし、９５℃で３０秒間変性させ、６０℃で１分間アニーリングさせ、３５サイクル７２℃で３０秒間伸長させ、及び１サイクル７２℃で７分間伸長させる。
ＰＣＲ反応はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ’ｓ ９７００ ＧｅｎｅＡｍｐ ｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒを用いて行われる。１μｌのＰＣＲ反応を１：１００に希釈する。１μｌの希釈されたＰＣＲ産物を０．１μｌのＬｉｚ ５００ ｓｉｚｅ ｓｔａｎｄａｒｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び８．９μｌのＨｉＤｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と混合する。上記混合物を９５℃で５分間変性させる。１μｌの変性した混合物を３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中にロードし、そして大きさにより分ける。異なる大きさにされた断片の分析はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより供給されるＧｅｎｅｓｃａｎソフトウェアパッケージにより製造業者の教示にしたがって行われる。
【０４３６】
【化７０】
Claims (9)
- 個体に担体及びホモ三量体ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を含む組成物を投与することを含む、当該個体における循環遊離脂肪酸値を低下させる方法であって、ここで、前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列番号２の
- 前記方法はさらにボディマスを減少させる、請求項１に記載の方法。
- 前記ｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片は配列番号２の
- 担体及び請求項３に記載のｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片を含む組成物。
- 請求項３に記載のｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド又はその相補物。
- 担体及び請求項５に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む組成物。
- 請求項３に記載のｇＧＭＧ−２ポリペプチド断片をコードする単離されたポリヌクレオチド配列を含むベクター。
- 担体及び請求項７に記載のベクターを含む組成物。
- 請求項７に記載のベクターを含む形質転換された宿主細胞。
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