CN103491974A - 用于提高中性溶酶的表达与活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用颗粒体蛋白前体多肽或效应物提高中性溶酶在例如额皮质或内嗅皮质中的表达或活性的方法和组合物。本发明还涉及使用颗粒体蛋白前体多肽或效应物减少神经变性疾病患者脑中的小胶质细胞的方法。

Description

用于提高中性溶酶的表达与活性的方法
发明领域
本发明涉及使用颗粒体蛋白前体(progranulin)多肽或效应物提高中性溶酶在例如额皮质(frontal cortex)或内嗅皮质(entorhinal cortex)中的表达或活性的方法和组合物。本发明还涉及使用颗粒体蛋白前体多肽或效应物减少神经变性疾病患者脑中的小胶质细胞的方法。
背景和简述
颗粒体蛋白前体(PGRN)是一种生长因子样蛋白质，它参与调节包括发育、伤口愈合、血管生成、神经元细胞的生长和维持及炎症在内的多个过程。在多种神经变性疾病中显示PGRN表达发生改变，所述神经变性疾病包括克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)、运动神经元病和阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)。例如，神经变性疾病遗传病因学的最新研究表明，PGRN基因的可遗传性突变可导致因神经元存活减少所引起的成人发病型神经变性疾病。
选择性神经元细胞死亡是各种神经变性病症的共同标志。散发形式的阿尔茨海默病、帕金森病(Parkinson's disease)和Lou Gehrig病(Lou Gehrig's disease) (肌萎缩性侧索硬化(ALS))与通过兴奋性神经毒性、氧化应激、电子传递链的部分抑制、细胞膜和线粒体膜破坏、细胞器改变、染色质改变、普通和特殊的基因毒性作用以及细胞表面蛋白受体和效应物的抑制和/或过度活化而引起的神经元细胞死亡的环境因素相关联。实验和临床文献支持兴奋性神经毒素在某些形式的神经变性、特别是在ALS和阿尔茨海默病中的可能作用。具体地讲，谷氨酸转运异常与ALS相关，并且已表明软骨藻酸，一种红藻氨酸受体(即离子营养型(ionotrophic)谷氨酸受体)激动剂，是在某些形式的记忆丧失中的病因，与阿尔茨海默病中报道的很类似。氧化应激也与所述疾病状态相关。
目前，没有治愈ALS、阿尔茨海默病(AD)或帕金森病的办法。现有治疗一般包括由医生尽力来减缓症状的发展并使患者更舒适。虽然有多种药物正在开发中，且少数经FDA批准用于治疗(利鲁唑，用于ALS；左旋多巴，用于帕金森病；认知增强剂，例如安理申，用于AD)，但这些治疗仅掩盖了神经疾病的发展，可产生边缘地延长一些患者生命的作用。因此，十分需要针对神经变性疾病治疗的方法和组合物。
通过下面列举的项目描述本发明的若干实施方案：
1. 一种用于提高神经变性疾病患者的额皮质或内嗅皮质中的中性溶酶的活性的方法，所述方法包括给予患者包含颗粒体蛋白前体多肽的组合物的步骤，其中患者的额皮质或内嗅皮质中的中性溶酶的活性提高。
2. 一种用于提高神经变性疾病患者的额皮质或内嗅皮质中的中性溶酶的表达的方法，所述方法包括给予患者包含颗粒体蛋白前体多肽的组合物的步骤，其中患者的额皮质或内嗅皮质中的中性溶酶的表达提高。
3. 一种用于提高神经变性疾病患者的额皮质或内嗅皮质中的中性溶酶的活性的方法，所述方法包括给予患者包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物的步骤，其中患者的额皮质或内嗅皮质中的中性溶酶的活性提高。
4. 一种用于提高神经变性疾病患者的额皮质或内嗅皮质中的中性溶酶的表达的方法，所述方法包括给予患者包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物的步骤，其中患者的额皮质或内嗅皮质中的中性溶酶的表达提高。
5. 一种用于减少神经变性疾病患者脑中的小胶质细胞的方法，所述方法包括给予患者包含颗粒体蛋白前体多肽的组合物的步骤，其中患者脑中的小胶质细胞减少。
6. 一种用于减少神经变性疾病患者脑中的小胶质细胞的方法，所述方法包括给予患者包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物的步骤，其中患者脑中的小胶质细胞减少。
7. 一种用于提高无神经变性疾病的个体脑中的中性溶酶的活性或表达以预防神经变性疾病的方法，所述方法包括给予所述个体包含颗粒体蛋白前体多肽的组合物的步骤，其中神经变性疾病得到预防。
8. 一种用于提高无神经变性疾病的个体脑中的中性溶酶的活性或表达以预防神经变性疾病的方法，所述方法包括给予所述个体包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物的步骤，其中神经变性疾病得到预防。
9. 第1、2、5或7项中任一项的方法，其中给予患者的颗粒体蛋白前体多肽的量为约1 ng/kg患者体重-约1 mg/kg患者体重的范围。
10. 第9项的方法，其中给予患者的颗粒体蛋白前体多肽的量为约1 ng/kg患者体重-约500 ng/kg患者体重的范围。
11. 第9项的方法，其中给予患者的颗粒体蛋白前体多肽的量为约1 ng/kg患者体重-约100 ng/kg患者体重的范围。
12. 第1、2、5、7或9-11项中任一项的方法，其中包含颗粒体蛋白前体多肽的组合物适于胃肠外给药。
13. 第12项的方法，其中胃肠外给药的途径选自皮内、皮下、肌内、腹膜内、静脉内、心室内、鞘内、大脑内和髓内(intracordally)。
14. 第3、4、6或8项中任一项的方法，其中给予患者的效应物的量为约1 ng/kg患者体重-约1 mg/kg患者体重的范围。
15. 第14项的方法，其中给予患者的效应物的量为约1 ng/kg患者体重-约500 ng/kg患者体重的范围。
16. 第14项的方法，其中给予患者的效应物的量为约1 ng/kg患者体重-约100 ng/kg患者体重的范围。
17. 第3、4、6、8或14-16项中任一项的方法，其中包含效应物的组合物适于胃肠外给药。
18. 第17项的方法，其中胃肠外给药的途径选自皮内、皮下、肌内、腹膜内、静脉内、心室内、鞘内、大脑内和髓内。
19. 第1-4项中任一项的方法，其中所述神经变性疾病是阿尔茨海默病。
20. 第5或6项中任一项的方法，其中所述神经变性疾病选自帕金森病、阿尔茨海默病和肌萎缩性侧索硬化。
21. 第1、2、5或7项中任一项的方法，其中所述颗粒体蛋白前体多肽与SEQ ID NO: 2具有至少95%同源性。
22. 第3、4、6或8项中任一项的方法，其中所述效应物是包含与SEQ ID NO: 1有至少95%同源性的核酸的载体。
23. 第1-4或7-8项中任一项的方法，其中所述中性溶酶降低斑块负荷(plaque burden)。
在本文描述的各个实施方案的任一个中，可存在下列特征，适用时提供本发明的其它实施方案。
对于所有实施方案，还考虑了实施方案的任何可适用的组合。上述实施方案的任何可适用的组合被视为与本发明一致。
附图简述
图1显示ND-602提高海马颗粒体蛋白前体(PGRN)的表达。组图A显示Tg2576小鼠的海马的冠状切片显微照片中颗粒体蛋白前体的免疫荧光检测。原始放大倍数20x。组图B显示颗粒体蛋白前体含量的光密度定量。平均值+/- S.E.M.，** P<0.001，*P< 0.05。
图2显示ND-602改变内嗅皮质和额皮质中的PGRN含量。组图A显示内嗅皮质中PGRN含量在统计学上显著升高，和组图B表明ND602治疗的Tg2576小鼠的额皮质中PGRN升高的趋势。平均值+/- S.E.M。** P<0.001，* P< 0.05。
图3显示ND-602提高Tg2576小鼠中的海马中性溶酶表达。显微照片显示在用对照载体(组图A，GFP)或ND-602 (组图B，PGRN)治疗后的海马中性溶酶表达。图表显示中性溶酶表达的光密度定量(组图C)。平均值+/- S.E.M。** P<0.001，*P< 0.05。
图4显示ND-602提高正常C57/BL6小鼠中中性溶酶的海马表达(组图A)。在ND-602治疗小鼠的额皮质中观察到中性溶酶活性提高的趋势(组图B)。每毫克湿组织重量中性溶酶活性的定量，平均值+/- S.E.M.。** P<0.001，*P< 0.05。
图5显示在归一化至毫克湿组织重量时ND-602提高海马蛋白质含量(组图A)，当中性溶酶活性归一化至组织蛋白质含量时，这导致稳定的中性溶酶活性图(组图B)。
图6显示其中递送了ND-602的脑区。
图7显示ND-602减少Tg2576小鼠的海马中的斑块负荷。组图A显示检测斑块的硫黄素S组织化学(原始放大倍数20x)。硫黄素S反应性斑块的光密度定量表明在海马中显著减少(组图B)。平均值+/- S.E.M.。** P<0.001，*P< 0.05。
图8显示ND-602改变Tg2576小鼠的内嗅皮质和额皮质中的斑块负荷。硫黄素S反应性斑块的光密度定量表明在内嗅皮质中显著减少(组图A)和额皮质中斑块负荷减少的趋势(组图B)。平均值+/- S.E.M.。*P< 0.05。
图9显示ND-602导致由Tg2576动物的海马中小胶质细胞的细胞数减少表明的神经炎症减轻。显微照片表明ND-602治疗的Tg2576动物中ILB4反应性小胶质细胞减少(组图A：GFP；组图B：GFAP；组图C：ND-602；组图D：ND-602)。ILB4反应性的光密度定量显示与ND-602输注同侧的小胶质细胞的细胞数显著减少(组图E)。平均值+/- S.E.M.。** P<0.001。
发明详述
本文提供用于提高神经变性疾病患者的内嗅皮质或额皮质中的中性溶酶的活性或表达的方法和组合物。在一个说明性实施方案中，可通过给予患者包含颗粒体蛋白前体多肽或改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物来提高患者的内嗅皮质或额皮质中的中性溶酶的活性或表达，其中患者的内嗅皮质或额皮质中的中性溶酶的活性提高。
在另一个实施方案中，可将颗粒体蛋白前体多肽或效应物给予无神经变性疾病的个体以预防神经变性疾病的发生。在该实施方案中，可通过给予所述个体包含颗粒体蛋白前体多肽或改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物来提高个体的脑中的中性溶酶的表达或活性。可在例如个体的内嗅皮质或额皮质中提高中性溶酶的活性或表达。
在另一个实施方案中，可通过给予神经变性疾病患者包含颗粒体蛋白前体多肽或改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物来减少所述患者的脑中的小胶质细胞的数目，其中个体的脑中的小胶质细胞减少。
在上述说明性实施方案中，神经变性疾病可由环境危害介导。
本文所用的“颗粒体蛋白前体”或“颗粒体蛋白前体多肽”是指选自以下的多肽：SEQ ID NO. 2的多肽，与SEQ ID NO. 2有约95%同源性、约96%、约97%、约98%、约99%同源性的多肽；SEQ ID NO. 12的多肽，与SEQ ID NO. 12有约95%同源性、约96%、约97%、约98%、约99%同源性的多肽；SEQ ID NO. 3的多肽，与SEQ ID NO. 3有约95%同源性、约96%、约97%、约98%、约99%同源性的多肽；SEQ ID NO. 4的多肽，与SEQ ID NO. 4有约95%同源性、约96%、约97%、约98%、约99%同源性的多肽；SEQ ID NO. 5的多肽，与SEQ ID NO. 5有约95%同源性、约96%、约97%、约98%、约99%同源性的多肽；SEQ ID NO. 6的多肽，与SEQ ID NO. 6有约95%同源性、约96%、约97%、约98%、约99%同源性的多肽；SEQ ID NO. 7的多肽，与SEQ ID NO. 7有约95%同源性、约96%、约97%、约98%、约99%同源性的多肽；SEQ ID NO. 8的多肽，与SEQ ID NO. 8有约95%同源性、约96%、约97%、约98%、约99%同源性的多肽；或SEQ ID NO. 9的多肽，与SEQ ID NO. 9有约95%同源性、约96%、约97%、约98%、约99%同源性的多肽。
在另一个实施方案中，可以使用SEQ ID NO. 10的多肽，与SEQ ID NO. 10有约95%同源性、约96%、约97%、约98%或约99%同源性的多肽。在另一个实施方案中，可以使用SEQ ID NO. 11的多肽，与SEQ ID NO. 11有约95%同源性、约96%、约97%、约98%或约99%同源性的多肽。
人颗粒体蛋白前体SEQ ID NO: 2
Figure DEST_PATH_IMAGE002
人颗粒体蛋白前体DNA SEQ ID NO: 1
Figure DEST_PATH_IMAGE004
小鼠颗粒体蛋白前体SEQ ID NO: 12
Figure DEST_PATH_IMAGE006
小鼠颗粒体蛋白前体DNA SEQ ID NO: 13
Figure DEST_PATH_IMAGE008
SEQ ID NO: 3 hGrnA
Figure DEST_PATH_IMAGE010
SEQ ID NO: 4 hGrnB
Figure DEST_PATH_IMAGE012
SEQ ID NO: 5 hGrnC
Figure DEST_PATH_IMAGE014
SEQ ID NO: 6 hGrnD
Figure DEST_PATH_IMAGE016
SEQ ID NO: 7 hGrnE
Figure DEST_PATH_IMAGE018
SEQ ID NO: 8 hGrnF
SEQ ID NO: 9 hGrnG
Figure DEST_PATH_IMAGE022
SEQ ID NO: 10 grn D
Figure DEST_PATH_IMAGE024
SEQ ID NO: 11 grn F
Figure DEST_PATH_IMAGE026
如本领域技术人员所熟知，通过保守取代改变蛋白质的任何非关键氨基酸不显著改变该蛋白质的活性，因为被用来置换天然氨基酸的氨基酸的侧链能够形成与被置换的氨基酸侧链类似的键和接触。
非保守取代是可能的，只要这些取代不过度影响颗粒体蛋白前体多肽的活性和/或降低其功效。
本领域熟知的氨基酸的“保守取代”或多肽的“保守取代变体”是指这样的氨基酸取代，其保持：1)多肽骨架的结构(例如β折叠或α螺旋结构)；2)氨基酸的电荷或疏水性；和3)侧链的庞大性或这些性质的任一种或多种。更具体地讲，众所周知的术语“亲水残基”是指丝氨酸或苏氨酸。“疏水残基”是指亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸。“带正电荷的残基”是指赖氨酸、精氨酸或组氨酸。“带负电荷的残基”是指天冬氨酸或谷氨酸。具有“庞大侧链”的残基是指苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸。
术语“保守氨基酸取代”是本领域众所周知的，是指特定氨基酸被具有类似性质(例如类似的电荷或疏水性或类似的庞大性)的氨基酸取代。实例包括天冬氨酸取代谷氨酸或异亮氨酸取代亮氨酸。表1列出了说明性保守氨基酸取代的列表。保守取代变体：1)相对于亲本序列可只具有保守氨基酸取代，2)相对于亲本序列具有至少90%的序列同一性，优选至少95%的同一性、96%的同一性、97%的同一性、98%的同一性或99%或更大的同一性；和3)保持颗粒体蛋白前体多肽的活性。在这一方面，本发明涉及上述多肽序列的任何保守取代变体。这类变体被视为颗粒体蛋白前体。
表1
氨基酸 用以下氨基酸置换
丙氨酸 D-Ala、Gly、Aib、β-Ala、L-Cys、D-Cys
精氨酸 D-Arg、Lys、D-Lys、Orn、D-Orn
天冬酰胺 D-Asn、Asp、D-Asp、Glu、D-Glu、Gln、D-Gln
天冬氨酸 D-Asp、D-Asn、Asn、Glu、D-Glu、Gln、D-Gln
半胱氨酸 D-Cys、S-Me-Cys、Met、D-Met、Thr、D-Thr
谷氨酰胺 D-Gln、Asn、D-Asn、Glu、D-Glu、Asp、D-Asp
谷氨酸 D-Glu、D-Asp、Asp、Asn、D-Asn、Gln、D-Gln
甘氨酸 Ala、D-Ala、Pro、D-Pro、Aib、β-Ala
异亮氨酸 D-Ile、Val、D-Val、Leu、D-Leu、Met、D-Met
亮氨酸 Val、D-Val、Met、D-Met、D-Ile、D-Leu、Ile
赖氨酸 D-Lys、Arg、D-Arg、Orn、D-Orn
甲硫氨酸 D-Met、S-Me-Cys、Ile、D-Ile、Leu、D-Leu、Val、D-Val
苯丙氨酸 D-Phe、Tyr、D-Tyr、His、D-His、Trp、D-Trp
脯氨酸 D-Pro
丝氨酸 D-Ser、Thr、D-Thr、别-Thr、L-Cys、D-Cys
苏氨酸 D-Thr、Ser、D-Ser、别-Thr、Met、D-Met、Val、D-Val
酪氨酸 D-Tyr、Phe、D-Phe、His、D-His、Trp、D-Trp
缬氨酸 D-Val、Leu、D-Leu、Ile、D-Ile、Met、D-Met
在一个说明性的方面，神经变性疾病可包括但不限于帕金森病和包括进行性核上性麻痹的帕金森综合征(parkinsonism)、阿尔茨海默病和运动神经元病(例如肌萎缩性侧索硬化)或通过改变颗粒体蛋白前体表达介导的任何其它神经变性疾病。
在另一个实施方案中，提供药物组合物。所述药物组合物包含治疗上有效量的颗粒体蛋白前体和药学上可接受的载体，其中治疗上有效量包含有效提高神经变性疾病患者的内嗅皮质或额皮质中或无神经变性疾病的个体的脑中的中性溶酶的活性或表达的颗粒体蛋白前体的量。在另一个实施方案中，药物组合物包含治疗上有效量的颗粒体蛋白前体和药学上可接受的载体，其中治疗上有效量包含有效减少神经变性疾病患者的脑中的小胶质细胞的量。
包含颗粒体蛋白前体多肽的组合物的单位日剂量可根据患者状况、正接受治疗的疾病状态、颗粒体蛋白前体的给药途径和组织分布及共同使用其它治疗性治疗的可能性而显著改变。待给予患者的颗粒体蛋白前体的有效量以体表面积、患者体重、患者状况的医生评价等为基础。在一个说明性的实施方案中，颗粒体蛋白前体的有效剂量范围为约1 ng/kg患者体重-约1 mg/kg患者体重，更优选约1 ng/kg患者体重-约500 ng/kg患者体重，且最优选约1 ng/kg患者体重-约100 ng/kg患者体重。
在另一个说明性的实施方案中，颗粒体蛋白前体多肽的有效剂量的范围可为约1 pg/kg患者体重-约1 mg/kg患者体重。在不同的说明性实施方案中，有效剂量的范围可为约1 pg/kg患者体重-约500 ng/kg患者体重、约500 pg/kg患者体重-约500 ng/kg患者体重、约1 ng/kg患者体重-约500 ng/kg患者体重、约100 ng/kg患者体重-约500 ng/kg患者体重和约1 ng/kg患者体重-约100 ng/kg患者体重。
在另一个说明性的实施方案中，颗粒体蛋白前体多肽的有效剂量的范围可为约1 μg/kg患者体重-约1 mg/kg患者体重。在不同的说明性实施方案中，有效剂量的范围可为约1 μg/kg患者体重-约500 μg/kg患者体重、约500 ng/kg患者体重-约500 μg/kg患者体重、约1 μg/kg患者体重-约500 μg/kg患者体重、约0.1 μg/kg患者体重-约5 μg/kg患者体重、约0.1 μg/kg患者体重-约10 μg/kg患者体重和约0.1 μg/kg患者体重-约100 μg/kg患者体重。
优选胃肠外例如皮内、皮下、肌内、腹膜内、静脉内、心室内、鞘内、大脑内或髓内(脊柱)给予患者包含颗粒体蛋白前体的组合物。或者，可通过其它医学上的有用方法将颗粒体蛋白前体组合物给予患者，并且可使用任何有效的剂量和合适的治疗剂型，包括延长释放剂型或持续释放剂型。可通过注射给予。还可使用慢速泵递送包含颗粒体蛋白前体的组合物。
胃肠外剂型的实例包括活性剂在等渗盐水、5%葡萄糖或其它众所周知的药学上可接受的液体载体(例如液体醇、二醇、酯和酰胺)中的水性溶液。本发明的胃肠外剂型可呈可复溶(reconstitutable)的冻干物的形式，所述冻干物包含一定剂量的包含颗粒体蛋白前体的组合物。在本实施方案的一个方面，可给予本领域已知的多种延长释放剂型或持续释放剂型的任一种，例如在美国专利号4,713,249、5,266,333和5,417,982中描述的可生物降解的碳水化合物基质，所述专利的公开内容通过引用结合到本文中。
在一个说明性的实施方案中，描述了用于胃肠外给予的含有颗粒体蛋白前体的通用药物制剂，其包含：a)药学上活性量的颗粒体蛋白前体；b)药学上可接受的pH缓冲剂，以提供约pH 4.5-约pH 9范围的pH；c)离子强度调节剂，其浓度范围为约0-约250毫摩尔/升；和d)水溶性粘度调节剂，其浓度范围为约0.5%-约7%的总配方重量；或a)、b)、c)和d)的任何组合。
在不同的说明性实施方案中，用于本文所述组合物和方法的pH缓冲剂是技术人员已知的那些缓冲剂，包括例如乙酸盐、硼酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐缓冲剂，以及盐酸、氢氧化钠、氧化镁、磷酸二氢钾、碳酸氢盐、氨、碳酸、盐酸、柠檬酸钠、柠檬酸、乙酸、磷酸氢二钠、硼砂、硼酸、氢氧化钠、二乙基巴比妥酸和蛋白质以及各种生物缓冲剂，例如TAPS、Bicine、Tris、Tricine、HEPES、TES、MOPS、PIPES、Cacodylate和MES。
在另一个说明性的实施方案中，离子强度调节剂包括本领域已知的那些离子强度调节剂，例如甘油、丙二醇、甘露糖醇、葡萄糖、右旋糖、山梨糖醇、氯化钠、氯化钾和其它电解质。
有用的粘度调节剂包括但不限于离子和非离子水溶性聚合物；交联丙烯酸聚合物例如“卡波姆”家族的聚合物，例如可以Carbopol(R)商标市售获得的羧基聚亚烷基类；亲水聚合物，例如聚环氧乙烷、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和聚乙烯醇；纤维素类聚合物和纤维素类聚合物衍生物，例如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素和醚化纤维素；树胶，例如西黄蓍胶和黄原胶；藻酸钠；明胶、透明质酸及其盐、脱乙酰壳多糖、吉兰糖(gellan)或其任何组合。优选非酸性粘度增强剂，例如使用中性或碱性剂以利于实现制剂所需的pH。如果需要均匀的凝胶，则可加入分散剂例如醇、山梨糖醇或甘油，或者可通过研磨、机械混合或搅拌或其组合来分散胶凝剂。在一个实施方案中，粘度增强剂也可提供上述基料。在一个优选的实施方案中，粘度调节剂是例如通过醚化或酯化而被改性的纤维素。
在不同的说明性实施方案中，提供颗粒体蛋白前体组合物，所述组合物可包含单独或与至少一种其它作用剂(例如赋形剂和/或稳定化合物(stabilizaing compound)和/或增溶剂)组合的颗粒体蛋白前体多肽的全部或部分，并且可在任何无菌的生物相容性药用载体中给予，所述药用载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、葡萄糖和水。合适的赋形剂为碳水化合物或蛋白质填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；来自玉米、小麦、稻、马铃薯等的淀粉；纤维素，例如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；树胶，包括阿拉伯胶和西黄蓍胶；以及蛋白质，例如明胶和胶原。合适的崩解剂或增溶剂包括琼脂、藻酸或其盐，例如藻酸钠。
在说明性的实施方案中，可将颗粒体蛋白前体多肽单独给予患者，或将其与其它作用剂、药物或激素组合或者在与一种或多种赋形剂或其它药学上可接受的载体混合的药物组合物中给予患者。在一个实施方案中，药学上可接受的载体是药学上惰性的。在另一个实施方案中，可将颗粒体蛋白前体单独给予患有神经系统疾病的患者或无神经变性疾病的个体。
可以采用给予包含颗粒体蛋白前体的组合物的任何有效的方案。例如，可将包含颗粒体蛋白前体的组合物按单剂量给予，或者可将包含颗粒体蛋白前体的组合物分开并按每日多剂量方案给予。此外，交错方案(例如每周1-3天)可以用作每日治疗的替代方案，且对于本发明的目的，这类间断性或交错性每日方案被视为等同于每日治疗，并属于本发明的范围。在一个实施方案中，用多次注射包含颗粒体蛋白前体的组合物来治疗患者或无神经变性疾病的个体。在另一个实施方案中，以例如12-72小时间隔或以48-72小时间隔，用包含颗粒体蛋白前体的组合物给患者注射多次(例如约2次直到约50次)。在最初的一次或多次注射后，可以几天或数月的间隔，给予患者包含颗粒体蛋白前体的组合物的额外注射，所述额外注射防止疾病复发。或者，包含颗粒体蛋白前体的组合物的最初一次或多次注射可防止疾病复发。在另一个说明性的实施方案中，可将包含颗粒体蛋白前体的组合物给予无神经变性疾病的个体以预防神经变性疾病。
在另一个说明性的实施方案中，可通过给予神经变性疾病患者包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物(例如编码治疗性分子的DNA，例如编码颗粒体蛋白前体或颗粒体蛋白前体的部分的DNA)或效应物组合的组合物，来治疗所述患者，其中用包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物治疗患者提高神经变性疾病患者的内嗅皮质或额皮质中的或无神经变性疾病的患者的脑的任何部分中的中性溶酶的活性或表达。
在另一个实施方案中，可通过给予神经变性疾病患者包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物或效应物组合的组合物来治疗所述患者，其中用包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物治疗患者减少神经变性疾病患者的脑中的小胶质细胞。
在另一个实施方案中，可将包含效应物的组合物给予无神经变性疾病的个体以预防神经变性疾病。
在本文所述的涉及颗粒体蛋白前体效应物的给予的任何实施方案中，可采用任何制剂、治疗方案、剂量方案等。
在又一个实施方案中，提供药物组合物。所述药物组合物包含治疗上有效量的改变颗粒体蛋白前体表达的效应物和药学上可接受的载体，其中治疗上有效量包含能够提高神经变性疾病患者的内嗅皮质或额皮质中的中性溶酶的活性或表达的量。
在另一个实施方案中，提供用于提高神经变性疾病患者的内嗅皮质或额皮质中的中性溶酶的活性或表达的方法。所述方法包括给予神经变性疾病患者治疗上有效量的改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的步骤，其中效应物的量有效提高神经变性疾病患者的内嗅皮质或额皮质中的中性溶酶的活性或表达。
在另一个实施方案中，提供减少神经变性疾病患者的脑中的小胶质细胞的方法。所述方法包括给予神经变性疾病患者治疗上有效量的改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的步骤，其中效应物的量有效减少神经变性疾病患者的脑中的小胶质细胞。
在上述实施方案中，可将包含效应物的组合物给予无神经变性疾病的个体以预防神经变性疾病。
本文所用的改变颗粒体蛋白前体表达的效应物意指提高颗粒体蛋白前体在靶细胞中表达的核酸(例如DNA、cDNA或mRNA) (例如SEQ ID NO. 1)。本文所用的靶细胞包括神经元细胞。包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物的单位日剂量可根据患者状况、正接受治疗的疾病状态、效应物的分子量、其给药途径和组织分布及共同使用其它治疗性治疗的可能性而显著变化。待给予患者的有效量以体表面积、患者体重和患者状况的医生评价为基础。在一个说明性的实施方案中，效应物的有效剂量的范围可为约1 ng/kg患者体重-约1 mg/kg患者体重，更优选约1 ng/kg患者体重-约500 ng/kg患者体重，且最优选约1 ng/kg患者体重-约100 ng/kg患者体重。
在另一个说明性的实施方案中，效应物的有效剂量的范围可为约1 pg/kg患者体重-约1 mg/kg患者体重。在不同的说明性实施方案中，有效剂量的范围可为约1 pg/kg患者体重-约500 ng/kg患者体重、约500 pg/kg患者体重-约500 ng/kg患者体重、约1 ng/kg患者体重-约500 ng/kg患者体重、约100 ng/kg患者体重-约500 ng/kg患者体重和约1 ng/kg患者体重-约100 ng/kg患者体重。
在另一个说明性的实施方案中，效应物的有效剂量的范围可为约100万个效应物分子/70 kg患者-约10亿个效应物分子/70 kg患者。在不同的说明性实施方案中，有效剂量的范围可为约100万个效应物分子/70 kg患者-约5亿个效应物分子/70 kg患者、约200,000个效应物分子/70 kg患者-约2亿个效应物分子/70 kg患者、约100万个效应物分子/70 kg患者-约2亿个效应物分子/70 kg患者。
优选胃肠外(例如皮内、皮下、肌内、腹膜内、静脉内、心室内、鞘内、大脑内或髓内(脊柱))给予患者包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物。或者，可通过其它医学上的有用方法将包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物给予患者，可使用任何有效剂量和合适的治疗剂型，包括延长释放剂型。可通过注射实现给药。
包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物优选胃肠外注射，这类注射可以是皮内注射、腹膜内注射、皮下注射、肌内注射、静脉内注射、心室内注射、鞘内注射、大脑内注射或髓内注射(脊柱)。包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物还可使用慢速泵递送。另外，合适的途径可例如包括口服或跨粘膜给予。还可按下述实现改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的胞内治疗性给予。
胃肠外剂型的实例包括活性剂在等渗盐水、5%葡萄糖或其它众所周知的药学上可接受的液体载体(例如液体醇、二醇、酯和酰胺)中的水性溶液。本发明的胃肠外剂型可呈可复溶的冻干物的形式，所述冻干物包含一定剂量的包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物。在本实施方案的一个方面，可以给予本领域已知的多种延长释放剂型的任一种，例如在美国专利号4,713,249、5,266,333和5,417,982中描述的可生物降解的碳水化合物基质，所述专利的公开内容通过引用结合到本文中。
可以采用用于给予包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物的任何有效方案。例如，可以按单剂量给予包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物，或者可以按多剂量给予包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物。此外，交错方案(例如每周1-3天)可以用作每日治疗的替代方案，且对于本发明的目的，这类间断性或交错性的每日方案被视为等同于每天治疗，并属于本发明的范围。在一个实施方案中，用一次或多次注射包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物治疗患者。在另一个实施方案中，例如以12-72小时间隔或48-72小时间隔，用包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物多次(例如约2次直到约50次)注射患者。可以在最初的一次或多次注射后，以几天或数月的间隔，给予患者包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物的额外注射，所述额外注射防止疾病复发。或者，包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物的最初的一次或多次注射可防止疾病复发。在另一个实施方案中，可将包含效应物的组合物给予无神经变性疾病的个体以预防神经变性疾病。
在不同的说明性实施方案中，本发明描述的组合物包含编码颗粒体蛋白前体或其部分的分离且纯化的核酸序列。纯化核酸的方法为本领域技术人员所熟知。在一个实施方案中，所述序列与指导颗粒体蛋白前体表达的调节序列有效连接。在其它实施方案中，所述序列与异源或同源启动子有效连接。在其它另外的实施方案中，所述序列包含在载体内。在一些实施方案中，载体在宿主细胞(例如神经元细胞)内。在一个实施方案中，载体是慢病毒载体(例如Invitrogen，Carlsbad，CA)。
本文所用术语载体用于指将DNA或mRNA区段转移至患者细胞的核酸分子。载体含有所述核酸序列和为有效连接的核酸编码序列在患者中表达所必需的合适核酸序列。载体能够表达插入载体中的核酸分子，并且能够产生多肽或蛋白质或其部分。表达所必需的核酸序列通常包括启动子、操纵基因(任选)和核糖体结合位点，通常连同其它序列例如增强子及终止信号和多腺苷酸化信号一起。
如果使用细胞以递送核酸，则可通过用核酸转导、转染、显微注射或电穿孔细胞将核酸导入细胞。当外源或异源核酸已被导入细胞内时，递送细胞可被这些核酸转化、转导或转染(例如通过磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺(polybrene)介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂转染、原生质体融合、反转录病毒感染、生物射弹(biolistics)等)。例如，转化DNA (transforming DNA)可与或不与构成递送细胞的基因组的染色体DNA整合(共价连接)。例如，在哺乳动物细胞中，转化DNA可保持在游离基因元件(例如质粒)中。在真核细胞中，稳定转化的细胞是这样的细胞，其中转化DNA已整合至染色体中，使得通过染色体复制被子细胞遗传。
本文所用的改变颗粒体蛋白前体表达的效应物可包含颗粒体蛋白前体核酸，且颗粒体蛋白前体核酸包含完整的颗粒体蛋白前体编码序列、其部分或本文所述的同源序列。
在另一个说明性的实施方案中，可通过本领域已知的任何方案，例如在美国专利号6,333,194、7,105,342和7,112,668 (通过引用结合到本文中)中描述的方案，将颗粒体蛋白前体核酸掺入载体中，并且给予患者。在说明性的实施方案中，可将颗粒体蛋白前体核酸体外导入从患者器官中提取的细胞，其中将该改进的细胞然后重新导入体内，或者直接体内导入合适的组织或使用靶向的载体-颗粒体蛋白前体核酸构建体导入颗粒体蛋白前体。在不同的说明性实施方案中，可使用例如病毒载体、反转录病毒载体，或非病毒方法例如转染、裸DNA注射、电穿孔、声孔效应(sonoporation)、基因枪(例如通过使用高压气体将DNA包被的金颗粒射入细胞)、合成的寡聚体、脂质复合物(lipoplexes)、多聚复合物(polyplexes)、病毒颗粒或树枝状大分子(dendrimer)，将颗粒体蛋白前体核酸导入细胞或器官。
在其中处理细胞或器官的一个实施方案中，可使用病毒载体将颗粒体蛋白前体核酸导入细胞或器官。病毒载体可以是本领域已知的任何病毒载体。例如，病毒载体可以是腺病毒载体、慢病毒载体、反转录病毒载体、腺伴随病毒载体、疱疹病毒载体、改进的疱疹病毒载体等。在一个实施方案中，载体是慢病毒载体(例如Invitrogen，Carlsbad，CA)。在其中细胞被转染的另一个说明性的实施方案中，可通过直接DNA转染(脂转染、磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔等)，将颗粒体蛋白前体核酸导入细胞。
在不同的说明性实施方案中，颗粒体蛋白前体核酸可以是例如DNA分子、RNA分子、cDNA分子或包含颗粒体蛋白前体核酸的表达构建体。
可通过通常用来制备或分离核酸的任何常规方法，来制备或分离本文所述的颗粒体蛋白前体核酸，所述颗粒体蛋白前体核酸包括SEQ ID. No. (1)和(13)的核酸。例如，可通过本领域已知的方法，使用市售可获得的试剂和合成仪化学合成DNA和RNA分子。可通过本领域通常用于纯化核酸的任何常规方法纯化本文所述的颗粒体蛋白前体核酸。例如，可使用电泳方法和本领域已知的核酸纯化试剂盒(例如Quiagen试剂盒)纯化颗粒体蛋白前体核酸。适于使用病毒载体递送或适于通过直接DNA转染导入细胞的颗粒体蛋白前体核酸还可使用本领域已知的任何重组方法制备。
具有修饰的核苷间键的核酸也可用于本文所述的方法和组合物。可使用本领域已知的试剂和方法，例如用于合成含有以下核苷间键的核酸的方法，来合成含有修饰的核苷间键的核酸：膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲氧基乙基氨基磷酸酯、甲缩醛(formacetal)、硫代甲缩醛(thioformacetal)、二异丙基甲硅烷基、乙酰胺酯(acetamidate)、氨基甲酸酯、二亚甲基-硫化物(-CH2-S-CH2-)、二亚甲基-亚砜(-CH2-SO-CH2-)、二亚甲基-砜(-CH2-SO2-CH2-)、2'-O-烷基和2'-脱氧-2'-氟代硫代磷酸酯核苷间键。
修饰的颗粒体蛋白前体序列，即不同于编码天然颗粒体蛋白前体的序列的序列也包括在本发明中，只要修饰序列仍编码以更低或更高的活性水平显示天然颗粒体蛋白前体的生物活性的蛋白质即可。这些修饰的颗粒体蛋白前体序列包括由点突变引起的修饰、因遗传密码的简并或天然存在的等位基因变体所致修饰和由遗传工程引入的其它修饰，以产生重组颗粒体蛋白前体核酸。
颗粒体蛋白前体核酸包括与SEQ ID No.1或13或者与同颗粒体蛋白前体SEQ ID No.1或13的DNA编码序列的互补序列在高严格性条件下杂交的核酸有95%同源性的核酸。本文所用术语杂交用于指互补核酸的配对。杂交和杂交强度(例如核酸间的缔合强度)受诸如核酸间的互补程度、所涉及条件的严格性、所形成的杂合体的Tm (解链温度)和核酸内G:C比率等因素的影响。本文所用术语严格性用于指进行核酸杂交时的温度、离子强度和其它化合物(例如有机溶剂)存在与否的条件。
在一个说明性的实例中，高严格性条件可意指在5X SSPE和50%甲酰胺中于65℃杂交，并在0.5X SSPE中于65℃洗涤。在另一个说明性的实例中，高严格性条件可意指在由50%甲酰胺(v/v)、10%硫酸葡聚糖、1 x Denhardt溶液、20 mM磷酸钠(pH 6.5)、5 x SSC和200 μg鲑精DNA/ml杂交缓冲液组成的杂交缓冲液中于55℃杂交18-24小时，用2 x SSC、1% SDS在室温下洗涤4次(每次5分钟)，然后用0.1 x SSC于50-55℃洗涤15分钟。在另一个说明性的实例中，高严格性杂交的条件描述于Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(2001)，其通过引用结合到本文中。在某些说明性的方面，杂交沿核酸全长发生。
在本发明的情况下，高严格性杂交的检测表明与例如本文提供的核酸有强的结构相似性或结构同源性(例如核苷酸结构、碱基组成、排列或顺序)。
还包括与颗粒体蛋白前体的DNA编码序列SEQ ID NO. 1或13具有约80%、约85%、约90%、约95%、96%、97%、98%和99%同源性的核酸分子。本文所用的两个序列间的百分比同源性相当于两个序列间的百分比同一性。可例如通过使用GAP程序(Genetics Computer Group，软件；目前可通过http://www.accelrys.com上的Accelrys获得)进行序列间百分比同一性或同源性的测定，并且可使用例如ClustalW算法(VNTI软件，InforMax Inc.)进行比对。可使用目标核酸序列搜索序列数据库。数据库搜索的算法通常以BLAST软件(Altschul等，1990)为基础。在一些实施方案中，可沿核酸全长测定百分比同源性或同一性。
本文所用的术语互补是指嘌呤和嘧啶核苷酸序列通过氢键缔合形成双链核酸分子的能力。鸟嘌呤和胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶及腺嘌呤和尿嘧啶是互补的，且当两个核酸分子具有互补序列时，能够通过氢键缔合导致双链核酸分子的形成。互补序列可以是DNA或RNA序列。互补的DNA或RNA序列称为互补序列。互补性可以是部分的，其中仅一些核酸碱基按照碱基配对原则匹配。或者，核酸间可存在完全或总体互补性。
在说明性的实施方案中，神经变性疾病是由对患者的环境危害介导的。本文所用的由对患者的环境危害介导的神经变性疾病意指由环境危害引起的而不是由改变颗粒体蛋白前体表达的颗粒体蛋白前体基因的可遗传性突变引起的疾病。可遗传性突变是患者DNA中的永久突变，可遗传给患者的后代。然而，这些说明性的实施方案并不意味着排除修饰基因的等位基因变体的影响，所述修饰基因例如参与致使个体对神经变性疾病发生更敏感或更不敏感的神经毒素的代谢。本文所用的这些修饰基因可改变发病过程。
由对患者的环境危害介导的神经变性疾病可以是与通过改变基因表达直接或间接引起神经元细胞死亡的环境因素有关的散发病。在不同的其它说明性实施方案中，环境危害源自于患者的饮食或是内源合成的结果，或两者都有。在一个说明性的实施方案中，环境危害促使在体内引起有害作用的化合物的合成。神经元细胞死亡可通过各种方式(包括但不限于兴奋性神经毒性或氧化应激)发生。例如，环境毒素藉以导致神经元细胞死亡的各种方式在美国专利申请公布号2006-0252705中进行描述，所述申请公布通过引用结合到本文中。
在另一个说明性的实施方案中，神经变性疾病状态由兴奋性神经毒素介导。兴奋性神经毒素是通过导致神经元细胞死亡的受体(例如兴奋性神经递质谷氨酸的受体)过度活化而损伤神经元的一类物质。兴奋性神经毒素的实例包括兴奋性氨基酸，其可在中枢神经系统中产生损害。兴奋性神经毒素的其它实例包括但不限于甾醇葡糖苷(包括β-谷甾醇-β-D-葡糖苷和胆固醇葡糖苷)、甲硫氨酸亚砜亚胺和本领域已知的在患者中诱导神经兴奋性神经毒性反应的其它物质。在一个说明性实施方案中，兴奋性神经毒素是甾醇糖苷。在其它说明性的实施方案中，甾醇糖苷选自β-谷甾醇-β-D-葡糖苷和胆固醇葡糖苷或其类似物或衍生物。
在一个说明性的实施方案中，神经变性疾病选自帕金森病、阿尔茨海默病和ALS。神经系统疾病，包括阿尔茨海默病、帕金森病和ALS，一般导致可在临床上观察到的行为缺陷。这些疾病靶向导致神经病理和行为症状的神经元群。阿尔茨海默病涉及大脑皮质和海马各区的神经元的死亡，并导致认知功能(例如记忆和学习)丧失。帕金森病导致黑质-纹状体系统的部分的变性。初始阶段涉及来自黑质的含有多巴胺的神经元的末端突出丧失。接着，黑质中的神经元胞体死亡，影响运动控制，并导致震颤和步态障碍。
运动神经元病的一个实例是肌萎缩性侧索硬化(ALS)。ALS主要涉及脊柱和皮质的运动神经元的丧失，这导致日趋严重的麻痹且最终死亡。ALS的早期症状包括但不限于足下垂或患者腿、足或踝无力；手无力或笨拙；肌肉痉挛及臂、肩和舌颤搐。ALS一般影响咀嚼、吞咽、说话和呼吸，最终导致进行这些功能所需要的肌肉麻痹。Shaw等，Neuroscience and Biobehavioral Reviews, 27: 493 (2003)给出了各种神经系统疾病的综述，所述文献通过引用结合到本文中。本发明的方法和组合物可用于人类临床医学和兽医学应用两者。本文所述方法和组合物可单独或与其它方法或组合物组合使用。
在另一个说明性的实施方案中，可通过给予神经变性疾病患者包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物(例如编码治疗性分子的DNA)或效应物的组合的组合物来治疗所述患者，其中用包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物治疗患者减轻患者神经系统疾病的症状。使用介导颗粒体蛋白前体表达的效应物的上述实施方案的任一个都可适用于本实施方案。
在又一个实施方案中，提供药物组合物。所述药物组合物包含治疗上有效量的改变颗粒体蛋白前体表达的效应物和药学上可接受的载体，其中治疗上有效量包含能够减轻神经变性疾病患者的神经变性疾病症状或预防无神经变性疾病的个体的神经变性疾病症状的量。使用介导颗粒体蛋白前体表达的效应物的上述实施方案(例如制剂实施方案、剂量方案实施方案、治疗方案实施方案等)的任一个都适用于本实施方案。
实施例1
动物
在野生型C57BL/6小鼠或阿尔茨海默病的Tg2576小鼠模型中进行慢病毒输注。阿尔茨海默病的Tg2576小鼠模型在仓鼠朊病毒蛋白启动子控制下高水平表达APP的Swedish突变(APPK67ON,M671L)。这些小鼠产生高水平的脑Αβ，并在海马、内嗅皮质和额皮质内出现淀粉状蛋白斑块形式的进行性且年龄相关的沉积，这与在人中所见类似。为了评价颗粒体蛋白前体对这些斑块出现的影响及其对中性溶酶表达的作用，通过用编码绿色荧光蛋白(GFP)或颗粒体蛋白前体(PGRN)的重组慢病毒载体单侧海马内输注，来治疗8月龄小鼠。然后在12月龄时通过灌注处死动物。然后针对颗粒体蛋白前体的表达、斑块负荷和中性溶酶的表达对组织进行分析。
动物：用Tg2576小鼠的研究使用20-25 g雌性小鼠。将动物关养在12小时光/暗周期和任意获得标准食物与水的控温环境下。本研究所用方法获Mayo基金公共机构动物管理与使用委员会(Mayo Foundation Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC))批准。
通过贲门灌注0.9%盐水处死小鼠，取出脑，在4%的低聚甲醛中固定后用于组织化学和免疫组织化学分析。在恒冷箱切片机上切取对称的20 μm厚的冠状切片，并保存于Millonigs溶液中备用。
实施例2
显微镜检查
使用Motic B5 Professional Series 3.0 (Motic Instruments Inc.，Richmond，Canada)照相机和Zeiss Axiovert Epiflorescence 2000显微镜获取小鼠切片的显微镜检查和所有显微照片。利用Motic B5 Professional，Motic Images Advanced 3.0和具有AxioCam HRM的Zeiss Axiovert Zoom Axiovision 3.1分析数据。
实施例3
慢病毒载体
通过杀稻瘟素抗性测定法，测定表达颗粒体蛋白前体的慢病毒载体(Invitrogen Corporation (Carlsbad，CA))效价为1X 108 TU/mL。将慢病毒保存在于-80℃冷藏的冷冻小瓶中直到注射日。
实施例4
颗粒体蛋白前体的免疫组织化学
在室温下，在轻轻搅动的同时，在1X TBS-triton (20 mM Tris，pH= 7.4和0.9% NaCl、0.3% triton X-100)中洗涤自由漂浮的切片3 X 10分钟。然后在室温下，在轻轻搅动的同时将切片在含5%驴血清的TBS-t中封闭30分钟。在这之后，将切片暴露于绵羊抗颗粒体蛋白前体抗体(R&D Systems，在2%驴血清中1:1000的稀释液)中，在轻轻搅动的同时，首先在室温下2小时，接着于4℃温育过夜。次日，除去第一抗体，在室温下在1X TBS-t中轻轻搅动洗涤切片3 X 10分钟。然后在室温下，在轻轻搅动的同时将切片暴露于第二抗体(驴抗绵羊，Invitrogen：Molecular Probes目录号A-21097，1:500稀释于1%驴血清/TBSt)4小时。在室温下，在1X TBS-t中轻轻搅动下洗涤3 X 10分钟除去第二抗体。然后使用Fluoromount G (Electron Microscopy Sciences，目录号17984-25)将切片铺在载玻片上，用24 x 60 mm 0号盖玻片(Electron Microscopy Sciences，目录号63751-01)覆盖，并拍照。结果见图1。
实施例5
颗粒体蛋白前体的免疫组织化学
图2提供的结果使用与实施例4所述相同的方案获得。
实施例6
中性溶酶的免疫反应性
中性溶酶被视为淀粉状蛋白-β降解的限速酶。测定了颗粒体蛋白前体对中性溶酶蛋白质表达(图3)和中性溶酶活性(参见下图4和图5)两者的作用。组织的全部操作同上文对于颗粒体蛋白前体的免疫组织化学所述。在此，切片用5%的山羊血清封闭，并且使用的第一抗体为兔抗中性溶酶(在2%的山羊血清中1:500的稀释液，Millipore目录号AB5458)。第二抗体为山羊抗兔1:500的稀释液(Invitrogen：Molecular Probes目录号A-11037)。
实施例7
中性溶酶的活性
在已进行慢病毒输注的野生型C57/BL6小鼠中进行本测定。群体饲养的雌性C57/BL6小鼠(3月龄)购自Charles River (St. Hyacinth Qc)。所有动物程序获爱德华王子岛大学大西洋兽医学院动物管理委员会批准，并且与之前用于病毒输注到Tg2576小鼠的所述操作相同。在病毒输注之后一个月，通过断头(decapitation)处死动物，将脑分块以包括整个背侧海马或额区(n=6只动物)。结果如图4和图5所示。
DAGNPG (N-丹酰基-α-Gly-D-硝基-Phe-Gly，其按在P'1位置具有芳族部分和在P'2位置具有短残基的脑啡肽仿制)是NEP的内部猝灭底物。NEP把DAGNPG降解为DAG (Km=45 μM，V=0.65 μmol/mg蛋白质/分钟)，且释放的丹酰基可在342 nm的波长下激发，并在562 nm下发射。ACE也可降解DAGNPG，因此ACE抑制剂是分析NEP活性所必需的(必须使用至少0.5 μM卡托普利预温育10分钟)。NEP在50 mM Tris HCL (pH 7.4)中具有最佳活性，并且被20 nM Thiorphan抑制(Ki=3 nM)。
组织裂解：
将称重过的组织放入冰冷的50 mM Tris-HCl，pH 7.4中(3mg/ml)。然后将在组织在设置在位置1的匀浆器(VWR，VBI 25型)中，在冰上通过30个冲程匀浆。通过使用微探针，在设置# 5下，在冰上超声处理15秒钟(Fisher Scientific Sonic Dismembrator 100型)，来完成组织的进一步破坏。将匀浆物转移到无菌微量离心管中，在4℃下以10,000 x g离心30分钟。然后将上清液转移到另一个无菌离心管，并重复相同的离心。然后使用200 μl的该上清液来测定中性溶酶的活性。
酶测定：
在有或没有Thiorphan (Sigma，目录号T6031，最终浓度20 nM)的情况下，将卡托普利(Sigma，目录号C40402，最终浓度0.5 μM)加入到200 μ1最终体积的样品中。使反应混合物在37℃下温育30分钟，之后将1 mM DAGNPG (N-丹酰基-α-Gly-D-硝基-Phe-Gly，Sigma，目录号D2155，最终浓度50 μM)加入样品中，混合并在37℃下再温育2小时。通过加热至100℃ 5分钟使酶活性变性来终止反应。将所得混合物在室温下以5,000 x g离心5分钟。取出175 μl所得上清液，稀释入400μl的50mM Tris-HCL，pH 7.4中，混合(涡旋10秒钟)。然后将200微升混合物等分至96孔板中，使用Spectra max M2 (Molecular Devices)读板仪，在550 nM发射下读数(在355 nM下激发)。
实施例8
中性溶酶的活性和表达
按实施例7中所述(参见图4和图5)，进行了中性溶酶的活性测定。使用牛血清白蛋白作为标准品，按照生产商的说明书，使用市购可得的蛋白质测定试剂盒(Thermo Scientific，目录号232225)，进行基于二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)的蛋白质测定法(参见图5)。
实施例9
颗粒体蛋白前体效应物的给予
动物使用异氟烷(1%)麻醉，并置于Kopf立体定位支架上。对于海马转导，以0.25 μl/分钟的速率，经通过聚乙烯管(50 PE)连接到由Harvard泵驱动的50 μl Hamilton注射器的输注套管，将GFP或PGRN慢病毒载体单侧注射入左海马(A.P.-1.7，M.L.-151.5，D.V.-2.3) (2μl/部位)。在输注后，在抽出前，允许载体从套管向外扩散4分钟(图6)。
实施例10
由颗粒体蛋白前体效应物引起的斑块负荷减少
为了检测淀粉状蛋白沉积物，将切片在去离子水中漂洗5分钟，然后在室温下避光暴露于新鲜制备的1%硫黄素S (Sigma目录号T1892)的水溶液中20分钟。在70%乙醇:水溶液中差异化染色5分钟。在这之后，通过在去离子水中漂洗2 x 5秒钟除去乙醇。然后如在上文在颗粒体蛋白前体IHC方案中所述将切片封片用于拍照。结果如图7所示。
实施例11
由颗粒体蛋白前体效应物引起的斑块负荷减少
按照实施例10中所述进行该测定。结果如图8所示。
实施例12
由颗粒体蛋白前体效应物引起的小胶质细胞减少
得自Griffonia Simplificolia的同工凝集素B4与小胶质细胞尤其是活化的小胶质细胞紧密结合。评价了颗粒体蛋白前体治疗对针对在Tg2576小鼠中发展中的神经病理的神经炎症反应的作用(参见图9)。在室温下，将自由漂浮的切片在1X TBS-t中轻轻搅动下洗涤3 X 10分钟。然后在室温下，将切片在含5%山羊血清的TBS-t中轻轻搅动下封闭30分钟。在这之后，将切片在4℃下暴露于FITC缀合的ILB4 (在3%山羊血清中1:100的稀释液，Vector labs目录号FL1201)中轻轻搅动下过夜。次日在室温下，在轻轻搅动的同时，通过在1X TBS-t中洗涤3 X 10分钟，除去未结合的ILB4-FITC。然后使用Fluoromount G (Electron Microscopy Sciences，目录号17984-25)将切片铺在载玻片上，用24 x 60mm 0号盖玻片(Electron Microscopy Sciences，目录号63751-01)覆盖并拍照。
定量分析：
使用计算机辅助成像分析系统和Zeiss Axiovision 4.7成像分析软件，通过对每只动物的4个冠状切片中存在的整个海马及内嗅皮质和额皮质的区域拍照，来完成颗粒体蛋白前体IHC的光密度定量(图1、2) (n= 12)。应用相同的分析来评价中性溶酶IHC(图3)。通过应用Axiovision软件分析使用20X物镜获得的图像，测量每个区被硫黄素S阳性成分占据的总面积的%，来测定海马、内嗅皮质和额皮质中的斑块负荷(图7和图8)。
为了测定ILB4阳性小胶质细胞的数目(图9)，对每只动物的4个含有海马的冠状切片进行了评价(n=12)。对于中性溶酶活性测定，从没有Thiorphan时获得的活性中减去具有Thiorphan时所测定的活性。对于所有分析，研究人员对治疗条件不知情。
统计分析：
采用双向方差分析，对数据进行了分析。在获得显著性F值时，应用Newman-Keuls事后检验，进行计划的成对比较。当p < 0.05时，差异被视为在统计学上显著。
虽然本文公开了本发明的各种实施方案，但是按照本领域技术人员的普通常识，可在本发明的范围内进行许多改变和修改。这类修改包括本发明任何方面的已知同等物的替换，目的是以基本相同的方式达到相同的结果。数字范围包括界定该范围的数值。在本说明书中，措词“包含”用作开放式术语，实质上等同于短语“包括但不限于”，并且措词“包含”具有相应的含义。本文参考文献的引用不应解释为承认所述参考文献是本发明的现有技术。本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，均通过引用结合到本文中，如同具体而单独地说明每个单独的出版物通过引用结合到本文中一样，并且如同完全在本文中阐明一样。本发明包括基本上按上文所述并参照实施例和附图的所有实施方案和变化。

Claims (23)

1. 一种用于提高神经变性疾病患者的额皮质或内嗅皮质中的中性溶酶的活性的方法，所述方法包括给予所述患者包含颗粒体蛋白前体多肽的组合物的步骤，其中所述患者的额皮质或内嗅皮质中的中性溶酶的活性提高。
2. 一种用于提高神经变性疾病患者的额皮质或内嗅皮质中的中性溶酶的表达的方法，所述方法包括给予所述患者包含颗粒体蛋白前体多肽的组合物的步骤，其中所述患者的额皮质或内嗅皮质中的中性溶酶的表达提高。
3. 一种用于提高神经变性疾病患者的额皮质或内嗅皮质中的中性溶酶的活性的方法，所述方法包括给予所述患者包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物的步骤，其中所述患者的额皮质或内嗅皮质中的中性溶酶的活性提高。
4. 一种用于提高神经变性疾病患者的额皮质或内嗅皮质中的中性溶酶的表达的方法，所述方法包括给予所述患者包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物的步骤，其中所述患者的额皮质或内嗅皮质中的中性溶酶的表达提高。
5. 一种用于减少神经变性疾病患者脑中的小胶质细胞的方法，所述方法包括给予所述患者包含颗粒体蛋白前体多肽的组合物的步骤，其中所述患者脑中的小胶质细胞减少。
6. 一种用于减少神经变性疾病患者脑中的小胶质细胞的方法，所述方法包括给予所述患者包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物的步骤，其中所述患者脑中的小胶质细胞减少。
7. 一种用于提高无神经变性疾病的个体脑中的中性溶酶的活性或表达以预防神经变性疾病的方法，所述方法包括给予所述个体包含颗粒体蛋白前体多肽的组合物的步骤，其中所述神经变性疾病得到预防。
8. 一种用于提高无神经变性疾病的个体脑中的中性溶酶的活性或表达以预防神经变性疾病的方法，所述方法包括给予所述个体包含改变颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物的步骤，其中所述神经变性疾病得到预防。
9. 权利要求1、2、5或7中任一项的方法，其中给予患者的颗粒体蛋白前体多肽的量为约1 ng/kg患者体重-约1 mg/kg患者体重的范围。
10. 权利要求9的方法，其中给予患者的颗粒体蛋白前体多肽的量为约1 ng/kg患者体重-约500 ng/kg患者体重的范围。
11. 权利要求9的方法，其中给予患者的颗粒体蛋白前体多肽的量为约1 ng/kg患者体重-约100 ng/kg患者体重的范围。
12. 权利要求1、2、5、7或9-11中任一项的方法，其中所述包含颗粒体蛋白前体多肽的组合物适于胃肠外给药。
13. 权利要求12的方法，其中所述胃肠外给药的途径选自皮内、皮下、肌内、腹膜内、静脉内、心室内、鞘内、大脑内和髓内。
14. 权利要求3、4、6或8中任一项的方法，其中给予患者的效应物的量为约1 ng/kg患者体重-约1 mg/kg患者体重的范围。
15. 权利要求14的方法，其中给予患者的效应物的量为约1 ng/kg患者体重-约500 ng/kg患者体重的范围。
16. 权利要求14的方法，其中给予患者的效应物的量为约1 ng/kg患者体重-约100 ng/kg患者体重的范围。
17. 权利要求3、4、6、8或14-16中任一项的方法，其中所述包含效应物的组合物适于胃肠外给药。
18. 权利要求17的方法，其中所述胃肠外给药的途径选自皮内、皮下、肌内、腹膜内、静脉内、心室内、鞘内、大脑内和髓内。
19. 权利要求1-4中任一项的方法，其中所述神经变性疾病是阿尔茨海默病。
20. 权利要求5或6中任一项的方法，其中所述神经变性疾病选自帕金森病、阿尔茨海默病和肌萎缩性侧索硬化。
21. 权利要求1、2、5或7中任一项的方法，其中所述颗粒体蛋白前体多肽与SEQ ID NO: 2具有至少95%的同源性。
22. 权利要求3、4、6或8中任一项的方法，其中所述效应物是包含与SEQ ID NO: 1有至少95%的同源性的核酸的载体。
23. 权利要求1-4或7-8中任一项的方法，其中所述中性溶酶降低斑块负荷。
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